(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択された温度または温度範囲において経時的に反応を行う方法であって、該方法は、以下：
複数の別個の反応チャンバーを収容するためのアレイデバイスを提供する工程であって、該アレイデバイスは、複数の層から形成されるエラストマーブロックを備え、ここで少なくとも１つの層は、該層の中に形成される少なくとも１つの凹部を有し、該凹部は、該凹部を備える該層と一体型の少なくとも１つの湾曲可能な膜を有し、該アレイデバイスは、熱伝達デバイスをさらに備え、該熱伝達デバイスは、硬い熱伝導性のプレートであり、該エラストマーブロックに結合され、かつ、熱制御源に接触するように構成されている、工程；
熱制御源を含む熱制御デバイスを提供する工程；
該アレイデバイスに、所望の反応を実行するための試薬を導入する工程；および
該熱伝達デバイスが該熱制御源と熱的に連通するように、該アレイデバイスを該熱制御デバイスと接触させる工程であって、その結果、少なくとも１つの該反応チャンバーにおける該反応の温度が、該熱制御源の温度の変化の結果として変化する、工程、
を包含し、該熱制御デバイスが、該熱伝達デバイスへ力を加えて熱伝達デバイスを該熱制御源に向けて動かすのに適合している、方法。
【請求項２】
前記熱伝達デバイスが、光反射性材料を備える、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記硬い熱伝導性のプレートが研磨されたシリコンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記力が、磁力、静電気力、または真空を含む、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記力が、前記熱制御デバイスまたは前記熱伝達デバイスの表面に形成されたチャネルを通して該熱伝達デバイスへ加えられる真空を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記熱制御デバイスの前記表面と前記熱伝達デバイスの表面との間で達成される真空のレベルを検出する工程をさらに包含する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記真空のレベルが所定のレベルを超えない場合に、警告が現れるか、または再調整プロトコルが連動し、ここで、該再調整プロトコルが、真空を除去し、かつ、前記アレイデバイスを前記熱制御源に対して再配置することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記アレイデバイスを前記熱制御デバイスと接触させる工程は、１つ以上の機械的位置決めデバイスまたは電気機械的位置決めデバイスを用いることによって実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記方法の実行を自動で制御およびモニタリングする工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法の実行を自動で制御およびモニタリングする工程は、前記熱制御デバイスに前記アレイデバイスを導入するため、および該熱制御デバイスから該アレイデバイスを取り外すためのロボットの制御システムに操作可能に連通されている自動制御システムにより実施される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記反応の進行をモニタリングする工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権主張）
本願は、以下の出願の各々に対する優先権を主張する：
２００５年２月１４日に出願された米国特許出願第１１／０５８，１０６号；２００５年１月２５日に出願された米国特許出願第１１／０４３，８９５号；２００４年６月２３日に出願された米国特許出願第１０／８７６，０４６号；および２００４年５月２日に出願された米国特許出願第１０／８３７，８８５号。これらの各々は、全ての目的のためにその全体が参考として援用される。
【０００２】
（関連出願への相互参照）
本願はまた、２００４年４月５日に出願された米国特許出願第１０／８１８，６４２号；２００３年４月３日に出願された米国仮特許出願第６０／４６０，６３４号；２００４年４月５日に出願された米国特許出願第１０／８１９，０８８号；２００４年４月５日に出願された米国特許出願第１０／８１８，６４２号；２００２年１１月２７日に出願された米国特許出願第１０／３０６，７９８号；２００２年６月２４日に出願された米国仮特許出願第６０／３９１，５２９号；および米国仮特許出願第６０／３３５，２９２号にも関連する。これらの各々は、全ての目的のためにその全体が本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
近年、種々の化学的および生化学的な分析および合成（いずれも調製的用途および分析的用途のため）を実施する微小流体システムを開発および製造するための協調した努力がなされている。マクロ規模で実施される分析および合成に対して微細化によって現実化され得る顕著な利益から、このようなデバイスを作製するという目標が生じている。このような利益としては、分析または合成を行うために利用されるデバイスのために必要とされる実質的な時間、経費および空間の減少が挙げられる。さらに、微小流体デバイスは、自動システムと一緒に使用するのに適合しており、それによってさらなる経費削減および人の関与の減少による操作者の誤差の減少というさらなる利益を提供するという潜在性を有する。微小流体デバイスは種々の用途における使用が提唱されており、その用途としては、例えば、キャピラリー電気泳動、ガスクロマトグラフィーおよび細胞分離が挙げられる。
【０００４】
しかしながら、これらの利益の実現は、これまで製造されてきた微小流体デバイスに関連する種々の複雑さのために、しばしば挫折している。例えば、現在の微小流体デバイスの多くは、シリカベースの基板から製造されているが、これらの材料は、機械加工が困難かつ複雑であり、そしてそのような材料から作製されたデバイスは脆弱である。さらに、多くの現存する微小流体デバイスを通しての流体の移送には、そのデバイスを通して制御された様式で流体を移送するための複雑な電場の制御が必要とされる。
【０００５】
従って、微小流体デバイスを用いて達成され得る前述の利益と、それに対する現存するデバイスの現在の制限との観点から、種々の化学的および生化学的分析を実施するのに使用するために設計された微小流体デバイスに対する必要性が存在する。現代生化学におけるその重要性のため、他のタイプの分析における使用のための十分な汎用性も同様に有しながら、種々の核酸増幅反応を行うのに用いられ得るデバイスに対する必要性が特に存在する。
【０００６】
核酸増幅を行う能力を備えたデバイスは、多様な有用性を有する。例えば、そのようなデバイスは、目的の特定の標的核酸がサンプル中に存在しているかまたは存在していないかのいずれであるかを決定するための分析ツールとして使用され得る。従って、このデバイスは、特定の病原体（例えば、ウイルス、細菌または菌類）の存在について、および同定目的（例えば、実父確定および法医学的用途）のために試験するのに使用され得る。そのようなデバイスはまた、以前に特定の疾患または遺伝病と関連付けられている具体的な核酸の検出または特徴付けにも使用され得る。分析用ツールとして使用される場合、このデバイスはまた、遺伝型決定分析および遺伝子発現分析（例えば、ディファレンシャル遺伝子発現研究）を行うのに使用され得る。あるいは、このデバイスは、さらなる分析（例えば、増幅産物の配列決定、細胞型決定、ＤＮＡフィンガープリントなど）のために十分な核酸を増幅するために、調製的な様式で使用され得る。増幅された産物はまた、種々の遺伝子工学的用途（例えば、所望のタンパク質産物の産生のための細胞の形質転換に使用され得るベクターへの挿入）においても使用され得る。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（要旨）
熱サイクリング反応（例えば、核酸増幅反応）を行うために使用され得るデバイスを含む、微小流体分析を行うための種々のデバイスおよび方法が本明細書中において提供される。このデバイスは、エラストマー構成要素を備える点で従来の微小流体デバイスとは異なり、いくつかの例では、このデバイスのほとんどまたは全てがエラストマー材料から構成される。
【０００８】
特定のデバイスが、そのデバイスを通る溶液の流れを制御するための１つ以上のエラストマーバルブを備えるデバイスを用いた熱サイクリング反応（例えば、ＰＣＲ）を行うように設計される。従って、この設計のデバイスを用いて増幅反応を行うための方法もまた、提供される。
【０００９】
いくつかのデバイスは、反応部位として機能する領域を備えるブラインド（ｂｌｉｎｄ）フローチャネルを備える。特定のそのようなデバイスは、エラストマー材料内に形成されたフローチャネル、およびそのフローチャネルと流体連通している複数のブラインドフローチャネルを備え、各ブラインドフローチャネルの領域が反応部位を規定している。このデバイスはまた、このブラインドフローチャネルの各々に重なり、そして交差している１つ以上の制御チャネルを備え得、ここでエラストマー膜が、各交差部においてこのブラインドフローチャネルからその１つ以上の制御チャネルを分離している。このようなデバイスにおけるこのエラストマー膜は、駆動力に応答して、そのブラインドフローチャネル内に湾曲するかまたはそのブラインドフローチャネルから離脱するように配置される。このデバイスは、エラストマー材料内に形成され、フローチャネルおよび／または１つ以上の反応部位に重なる複数の保護チャネルを、必要に応じてさらに備えることができる。この保護チャネルは、デバイスのフローチャネルおよび反応部位からの蒸発を減少させるために、その中を流体を通すように設計される。さらに、このデバイスは必要に応じて、反応部位の各々に配置される１つ以上の試薬を備える。
【００１０】
特定のデバイスにおいて、上記フローチャネルは、複数のフローチャネルのうちの１つであり、このフローチャネルの各々は、それから分岐する多数のブラインドフローチャネルと流体連通している。この設計のデバイスでは、いくつかの例では、複数のフローチャネルが互いに相互連結され、その結果流体が単一の注入口を介して各々の反応部位内に導入され得る。しかしながら他のデバイスにおいては、複数のフローチャネルは互いに分離され、その結果１つのフローチャネル内に導入される流体は別のフローチャネルに流れることはできず、そして各フローチャネルは一端または両端に注入口を備え、この流入口に流体が導入され得る。
【００１１】
他のデバイスは、少なくとも５０部位／ｃｍ２の密度を有する反応部位のアレイを備え、この反応部位は代表的にはエラストマー材料中に形成される。他のデバイスはさらにより高い密度（例えば、少なくとも２５０部位／ｃｍ２、５００部位／ｃｍ２または１０００部位／ｃｍ２）を有する。
【００１２】
さらに他のデバイスは、エラストマー基板中に形成された反応部位を備え、そこで反応を行うための試薬は非共有結合的に固定される。この試薬は、本質的に任意のタイプの反応を行うための１つ以上の試薬であり得る。いくつかのデバイスにおける試薬は、核酸増幅反応を行うための１つの試薬を包含する。従って、いくつかのデバイスにおいて、この試薬は、プライマー、ポリメラーゼおよび１つ以上のヌクレオチドを含む。他のデバイスでは、この試薬は核酸の鋳型である。
【００１３】
種々のマトリクスベースまたはアレイベースのデバイスもまた提供される。特定のこれらのデバイスは、以下：
（ｉ）エラストマー基板に形成された第一の複数のフローチャネル、
（ｉｉ）第一の複数のフローチャネルと交差してアレイの反応部位を規定する、エラストマー基板に形成された第二の複数のフローチャネル、
（ｉｉｉ）第一および第二の複数のフローチャネル内に配置された複数の分離バルブであって、このバルブが駆動されて各反応部位内の溶液を他の反応部位における溶液から分離することができる、分離バルブ、ならびに
（ｉｖ）１つ以上のフローチャネルおよび／または１つ以上の反応部位に重なり、反応部位からの溶液の蒸発を防ぐ、複数の保護チャネル、
を備える。
【００１４】
上述のデバイスは、温度制御が関与する反応（例えば、核酸分析の熱サイクリング）を含む多数の異なるタイプの反応を行うのに使用され得る。特定のブラインドチャネルタイプのデバイスを用いて行われる方法は、微小流体デバイスを提供する工程を包含する。このデバイスは、エラストマー材料内に形成されたフローチャネル；およびこのフローチャネルと流体連通している複数のブラインドフローチャネルを備え、各ブラインドフローチャネルの末端が反応部位を規定している。少なくとも１つの試薬が各反応部位に導入され、次いで反応が１つ以上のこの反応部位において検出される。この方法は、必要に応じて、この反応部位内の少なくとも１つの試薬を加熱する工程を包含する。従って、例えば方法は、核酸増幅反応のための構成要素を導入する工程、および次いでその構成要素を熱サイクリングして増幅産物を形成する工程を包含する。
【００１５】
他の方法は、１つ以上の反応部位を備える微小流体デバイスを提供する工程を包含し、各反応部位は、エラストマー基板上に非共有結合的に配置された、分析を行うための第一の試薬を含む。次いで第二の試薬が１つ以上の反応部位に導入され、それによって第一の試薬および第二の試薬が混合されて反応混合物を形成する。１つ以上の反応部位における第一の試薬と第二の試薬との間の反応が、続いて検出される。
【００１６】
さらに他の方法は、微小流体デバイスを提供する工程を包含し、この微小流体デバイスは、基板内に形成された反応部位のアレイを備え、少なくとも５０部位／ｃｍ２の密度を有する。少なくとも１つの試薬が、各反応部位に導入される。次いで少なくとも１つの反応部位における反応が検出される。
【００１７】
なお他の方法は、微小流体デバイスを提供する工程を包含し、この微小流体デバイスは、エラストマー基板中に形成された少なくとも１つの反応部位、および同様にそのエラストマー基板中に形成された複数の保護チャネルを備える。少なくとも１つの試薬が各反応部位に導入され、次いでその反応部位内で加熱される。流体が、加熱の前またはその間に保護チャネル内を流れ、少なくとも１つの反応部位からの蒸発を減少させる。その少なくとも１つの反応部位内での反応が、続いて検出される。
【００１８】
デバイスからの流体の蒸発を減少させるように設計されたさらなるデバイスもまた、提供される。一般的に、そのようなデバイスは、エラストマー基板に形成された微小流体ネットワークの一部である空洞；およびその空洞に重なり、かつその空洞からエラストマー膜で分離された複数の保護チャネルを備える。そのようなデバイスにおける保護チャネルは、（ｉ）その中を溶液が流れるのを可能にし、かつ（ｉｉ）その結果保護チャネルへの駆動力を加える際にその膜が湾曲することにより、その空洞に流入、流出またはその中を通るときに実質的な減少がない、ようなサイズである。他のそのようなデバイスは、（ｉ）１つ以上のフローチャネルおよび／または１つ以上の反応部位；ならびに（ｉｉ）微小流体システムに重なり、そこからエラストマーによって分離される複数の保護チャネルを備え、ここで保護チャネル間の間隙は１μｍと１ｍｍとの間である。他のデバイスにおいて、その間隙は、５μｍと５００μｍとの間であり、他のデバイスでは１０μｍと１００μｍとの間であり、さらに他のデバイスでは４０μｍと７５μｍとの間である。
【００１９】
特定の微小流体デバイスの反応部位において核酸分析を行うための組成物もまた、提供される。特定のそのような組成物としては、以下の１つ以上が挙げられる：エラストマー材料上のタンパク質結合部位を遮断する因子および界面活性剤。この遮断因子は、代表的には、タンパク質（例えば、ゼラチンまたはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のようなアルブミン）からなる群より選択される。この界面活性剤は、例えばＳＤＳまたはＴｒｉｔｏｎであり得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
（詳細な説明）
（Ｉ．定義）
他に規定されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明において使用される多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（第２版、１９９４）；ＴＨＥ  ＣＡＭＢＲＩＤＧＥ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（Ｗａｌｋｅｒ編、１９８８）；ＴＨＥ  ＧＬＯＳＳＡＲＹ  ＯＦ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ、第５版、Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒら（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；およびＨａｌｅ
＆  Ｍａｒｈａｍ、ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ（１９９１）。本明細書中で使用される場合、以下の用語は、そうでないと明記されない限り、それらに属する意味を有する。
【００２１】
「フローチャネル」とは、一般に、それを通って溶液が流れ得る流路をいう。
【００２２】
用語「バルブ」とは、他に示されない限り、フローチャネルおよび制御チャネルが交差し、そしてエラストマー膜で分離される構成をいう。このエラストマー膜は、駆動力に応答してフローチャネルに湾曲またはフローチャネルから離脱し得る。
【００２３】
「ブラインドチャネル」または「行き止まりチャネル（ｄｅａｄ−ｅｎｄ  ｃｈａｎｅｌ）」とは、入口を有しているが別の出口を有していないフローチャネルをいう。従って、ブラインドチャネル内へのおよびブラインドチャネルからの溶液の流れは、同じ場所で起こる。1つ以上のブラインドチャネルを満たすプロセスは、ときに、単に「ブラインド
注入」といわれる。
【００２４】
「分離された反応部位」とは、一般的に、デバイス上に存在する他の反応部位と流体連通していない反応部位をいう。ブラインドチャネルに関して使用される場合、この分離された反応部位は、ブラインドチャネルに連結されたバルブによって遮断され得るブラインドチャネルの端部における領域である。
【００２５】
「孔」とは、デバイスの外部ポートと1つ以上のフローチャネルとの間に流体のアクセスを提供するためにエラストマーデバイス内に形成されたチャネルをいう。従って、孔は、例えばサンプル流入口および流出口として機能し得る。
【００２６】
用語「エラストマー」および「エラストマーの」は、当該分野で使用される一般的な意味を有する。従って、例えばＡｌｌｃｏｃｋら（Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版）は、そのガラス遷移温度と液化温度との間の温度にて存在するポリマーとして一般にエラストマーを説明している。エラストマー材料は、伸縮特性を示す。なぜなら、そのポリマー鎖は容易に力に応答して、その力の非存在下では骨格鎖が元の形状をとるために反動し、骨格鎖がまっすぐに戻るのを可能にするねじりの動きを起こすからである。一般的に、力が加えられた場合はエラストマーは変形するが、次いでその力が取り除かれたときに、その元の形状に戻る。エラストマー材料によって示されるこの伸縮性は、Ｙｏｕｎｇモジュラスによって特徴付けられ得る。本明細書中で開示される、上記微小流体デバイスにおいて使用されるエラストマー材料は、代表的に、約１Ｐａ〜１ＴＰａの間の、他の例においては約１０Ｐａ〜１００ＧＰａの間の、なお他の例では約２０Ｐａ〜１ＧＰａの間の、なお他の例では約５０Ｐａ〜１０ＭＰａの間の、そして特定の例では約１００Ｐａ〜１ＭＰａの間のＹｏｕｎｇモジュラスを有する。これらの範囲外のＹｏｕｎｇモジュラスを有するエラストマー材料もまた、特定の用途の必要性に依存して使用され得る。
【００２７】
本明細書中に記載される微小流体デバイスのいくつかは、ＧＥ  ＲＴＶ  ６１５（処方物）、ビニルシラン架橋（タイプ）シリコンエラストマー（ファミリー）のようなエラストマーポリマーから製造される。しかしながら、本発明の微小流体システムは、この１つの処方物、タイプまたはこのファミリーのポリマーには限定されず、むしろほぼいずれのエラストマーポリマーが適している。非常に多様なポリマー化学物質、前駆体、合成方法、反応条件および潜在的な添加剤を考慮すると、一体型のエラストマー微小バルブおよびポンプを作製するのに使用され得る多数の可能なエラストマーシステムが存在する。材料の選択は、代表的に、行われる用途のために必要とされる具体的な材料の特性（例えば、溶媒耐性、剛性、ガス透過性、および／または温度安定性）に依存する。本明細書中で開示される微小流体デバイスの構成成分の製造において使用され得るエラストマー材料のタイプに関するさらなる詳細は、Ｕｎｇｅｒら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８：１１３−１１６、ならびにＰＣＴ公報ＷＯ０２／４３６１５およびＷＯ０１／０１０２５に記載されている。これらは、その全体が全ての目的のために本明細書中に援用される。
【００２８】
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」は、本明細書中では、任意の長さのヌクレオチド（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない）のポリマー形態を包含するように使用される。
これらの用語間に意図される長さの差異は存在しない。さらに、これらの用語は、分子の一次構造のみをいう。従って、特定の実施形態において、これらの用語は、三本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡならびに三本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＲＮＡを包含し得る。これらはまた、メチル化およびまたはキャッピングによるような改変形態および非改変形態のポリヌクレオチドも包含する。より具体的には、用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、Ｎ−グリコシドまたはＣ−グリコシドのプリンまたはピリミジン塩基である任意の他の型のポリヌクレオチド、ならびに非ヌクレオチド骨格を含む他のポリマー（例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））およびポリモルホリノ（Ａｎｔｉ−Ｖｉｒａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ、Ｏｒｅｇｏｎ、Ｎｅｕｇｅｎｅとして市販されている）ポリマー、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡにおいて見られるような塩基対合および塩基堆積を可能にする構成で核酸塩基を含むポリマーを提供する他の合成配列特異的核酸ポリマー）を包含する。
【００２９】
「プローブ」は、１つ以上の型の化学結合を通して相補的配列の標的核酸に結合し得る核酸である。この化学結合は、通常は水素結合の形成による相補的塩基対合により、それによって二本鎖構造を形成する。プローブは、「プローブ結合部位」に結合またはハイブリダイズする。プローブは、特にそのプローブが一端その相補的な標的にハイブリダイズしたら、そのプローブの容易な検出を可能にするように、検出可能な標識で標識され得る。プローブに結合される標識は、例えば化学的手段または物理学的手段によって検出され得る、当該分野において公知の任意の種々の異なる標識を包含し得る。プローブに結合され得る適した標識としては、放射能、蛍光、発色団、質量標識、電子密度粒子、磁性粒子、スピン標識、化学発光を発する分子、電気化学的に活性な分子、酵素、補因子および酵素基質が挙げられるが、これらに限定されない。プローブは、サイズがかなり変動し得る。いくつかのプローブは、比較的短い。一般的に、プローブは、少なくとも７〜１５ヌクレオチド長である。他のプローブは、少なくとも２０、３０または４０ヌクレオチド長である。なお他のプローブは、いくらか長く、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０ヌクレオチド長である。なお他のプローブはさらに長く、少なくとも１００、１５０、２００またはそれより大きいヌクレオチド長である。プローブは、前述の範囲内に入る任意の具体的な長さでもあり得る。
【００３０】
「プライマー」は、適切な条件下（すなわち、４種の異なるヌクレオチド三リン酸および重合のための因子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）の存在下）で、適切な緩衝液中で適した温度において、鋳型依存性ＤＮＡ合成の開示点として作用することができる一本鎖ポリヌクレオチドである。プライマーの適切な長さは、そのプライマーの意図されている使用に依存するが、代表的には、少なくとも７ヌクレオチド長であり、より代表的には１０ヌクレオチド長〜３０ヌクレオチド長の範囲である。他のプライマーは、いくらか長い（例えば、３０〜５０ヌクレオチド長）のものであり得る。短いプライマー分子は、一般的に、鋳型と十分に安定なハイブリッド複合体を形成するために、より低い温度を必要とする。プライマーは、鋳型の正確な配列を反映している必要はないが、鋳型とハイブリダイズするために十分に相補的でなければならない。用語「プライマー部位」または「プライマー結合部位」とは、プライマーがハイブリダイズする標的ＤＮＡのセグメントをいう。用語「プライマー対」は、増幅対象ＤＮＡ配列の５’末端の相補体にハイブリダイズする５’「上流プライマー」と、増幅対象配列の３’末端にハイブリダイズする３’「下流プライマー」とのセットを意味する。
【００３１】
「完全に相補的な」プライマーは、そのプライマーの全長にわたって完全に相補的な配列を有し、ミスマッチを有さない。プライマーは代表的に、標的配列の一部（部分配列）に完全に相補的である。「ミスマッチ」とは、プライマーにおけるヌクレオチドと、アライメントされている標的核酸におけるヌクレオチドとが、相補的ではない部位をいう。用語「実質的に相補的」とは、プライマーに関連して使用される場合、プライマーはその標的配列に完全には相補的ではないが；代わりに、そのプライマーは所望のプライマー結合部位においてそのそれぞれの鎖と選択的にハイブリダイズするのにだけ十分に相補的であることを意味する。
【００３２】
用語「相補的」とは、１つの核酸が、別の核酸分子と同一であるか、または選択的にハイブリダイズすることを意味する。ハイブリダイゼーションの選択性は、全体的に特異性を欠く場合よりもハイブリダイゼーションが選択的である場合に存在する。代表的に、選択的なハイブリダイゼーションは、１本の少なくとも１４〜２５ヌクレオチドにわたって少なくとも約５５％、好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７５％、そして最も好ましくは少なくとも９０％の同一性が存在する場合に起こる。好ましくは、一方の核酸は、他方の拡散に特異的にハイブリダイズする。Ｍ．Ｋａｎｅｈｉｓａ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：２０３（１９８４）を参照のこと。
【００３３】
用語「標識」とは、物理的、化学的、電磁的および他の関連する分析技術によって検出され得る分子または分子の態様をいう。使用され得る検出可能な標識の例としては、放射能、蛍光、発色団、質量標識、電子密度粒子、磁性粒子、スピン標識、化学発光を発する分子、電気化学的に活性な分子、核酸プローブに連結する酵素、補因子および酵素基質が挙げられるが、これらに限定されない。用語「検出可能に標識された」とは、因子が標識と結合体化されているか、または別個の標識に結合体化されることなく検出されることを可能にする、ある固有の特性（例えば、サイズ、形状または色）を有していることを意味する。
【００３４】
「多型マーカー」または「多型部位」は、分岐が生じる遺伝子座である。好ましいマーカーは少なくとも２つの対立遺伝子を有し、各々が選択された集団の１％より多い頻度で発生し、そしてより好ましくは、１０％または２０％より多い頻度で発生する。多型遺伝子座は、１塩基対もの小ささであり得る。多型マーカーとしては、制限酵素断片長多型、タンデムリピートの可変数（ＶＮＴＲ）、超可変領域、ミニサテライト、ジヌクレオチドリピート、トリヌクレオチドリピート、テトラヌクレオチドリピート、単純配列リピート、Ａｌｕのような挿入エレメントが挙げられる。第一に同定される対立遺伝子形態が参照形態として任意に指定され、他の対立遺伝子の形態は代替対立遺伝子または改変体対立遺伝子形態と指定される。選択された集団において最も頻繁に発生している対立遺伝子形態が、時として野生型形態といわれる。２倍体生物は、対立遺伝子形態についてホモ接合型であってもヘテロ接合型であってもよい。２つの対立遺伝子は多型は２つの形態を有する。３つの対立遺伝子多型は、３つの形態を有する。
【００３５】
「一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）」（ＳＮＰ）は、単一のヌクレオチドによって占められる多型部位において発生し、対立遺伝子配列間のバリエーションの部位である。この部位は、通常、高度に保存された対立遺伝子の配列（例えば、その集団の１／１００未満または１／１０００未満しか変動しない配列）の前後に存在する。一塩基多型は、通常、その多型部位における１つのヌクレオチドの別のヌクレオチドに代えての置換に起因して生じる。トランジションは、あるプリンの別のプリンへの置換またはあるピリミジンの別のピリミジンへの置換である。トランスバーションは、プリンからピリミジンまたはピリミジンからプリンへの置換である。一塩基多型はまた、参照対立遺伝子に対して、ヌクレオチドの欠失またはヌクレオチドの挿入からも生じ得る。
【００３６】
「試薬」とは、反応において使用される任意の因子を広範にいう。試薬としては、自身でモニターされ得る単一の因子（例えば、加熱される際にモニターされる物質）または２つ以上の混合物が挙げられ得る。試薬は、生きているものもよいし（例えば、細胞）、生きているものでなくてもよい。核酸増幅反応のための例示的な試薬としては、緩衝液、金属イオン、ポリメラーゼ、プライマー、鋳型核酸、ヌクレオチド、標識、色素、ヌクレアーゼなどが挙げられるが、これらに限定されない。酵素反応のための試薬としては、例えば、基質、補因子、共役酵素、緩衝液、金属イオン、インヒビター、およびアクチベーターが挙げられる。細胞ベースの反応のための試薬としては、細胞、細胞特異的色素および細胞レセプターに結合するリガンド（例えば、アゴニストおよびアンタゴニスト）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
「リガンド」は、そのリガンドに特異的または非特異的に結合する別の分子（すなわち、「抗リガンド」）が存在する任意の分子である。この結合は、抗リガンドによるリガンドの一部の認識による。
【００３８】
（ＩＩ．概要）
独自のフローチャネル構造を有する多数の異なる微小流体デバイス（ときにチップとも呼ばれる）が、本明細書中で提供され、同様に種々のハイスループット分析を行うためのそのようなデバイスの使用も提供される。このデバイスは、温度制御を必要とする分析、特に熱サイクリング（例えば、核酸増幅反応）に関する分析における使用のために設計される。この微小流体デバイスは、特定の設計の特徴を組み込み、この特徴は、多くの従来の微小流体デバイスよりも顕著に小さいフットプリントを与え、そのデバイスが他の手段に容易に統合されるのを可能にし、自動化された分析を提供する。
【００３９】
この微小流体デバイスのうちのいくつかは、本明細書中では代表的に「ブラインドチャネル」または「ブラインドフィル（ｂｌｉｎｄ  ｆｉｌｌ）」と呼ばれる設計を使用する。これらは、定義の節において示されるように、溶液がそのブラインドチャネルに１つの末端からのみ流入および流出し得るように閉じた末端または分離された末端を有するフローチャネルである（すなわち、ブラインドチャネルについては、別個の入口および出口が存在しない）。これらのデバイスでは、分離された反応部位を形成するためにそのブラインドチャネルの領域を分離するのに、各ブラインドチャネルあたり１個のバルブのみが必要とされる。このタイプのデバイスの製造の間、分析を行うための１つ以上の試薬が、その反応部位に配置され、それによってインプットおよびアウトプットの数の顕著な減少をもたらす。さらに、このブラインドチャネルは、チャネルの相互接続ネットワークに接続され、その結果全ての反応部位が、単一の限られた数のサンプルインプットによって充填され得る。インプットおよびアウトプットにおける複雑さの減少および各反応部位を分離する１個のバルブのみの使用に起因して、反応部位のために利用可能な空間が増加する。したがって、これらのデバイスの特徴は、各デバイスが多数（例えば、数万まで）の反応部位を備えることができ、そして高い反応部位密度（例えば、１０００〜４０００反応部位／ｃｍ２を超える）を達成し得ることを意味する。個別にも集合的にも、これらの特徴はまた、従来の微小流体デバイスと比較した場合の本発明の微小流体デバイスのサイズにおける顕著な減少へと直接転換されている。
【００４０】
本明細書中で開示される他の微小流体デバイスは、マトリクス設計を使用する。一般的に、このタイプの微小流体デバイスは、複数の交差する水平方向および垂直方向のフローチャネルを使用し、その交差点において反応部位のアレイを規定する。従って、この設計のデバイスはまた、反応部位のアレイを有するが、この設計で多数のサンプルに適応するために多数のサンプル注入口および対応する出口が存在する。切り替え可能な流れアレイ構造と呼ばれるバルブシステムによって、横方向のみまたはフローチャネルを通って選択的に溶液が流れることが可能になり、それによりマトリクスにおける種々のフローチャネルの切り替え可能な分離が可能になる。従って、ブラインドチャネルデバイスは、限られた数のサンプルを用いて異なる条件下で多数の分析を行うために設計される一方、マトリクスデバイスは、限られた数の条件下で多数のサンプルを分析するように構築される。なお他のデバイスは、これら２つの設計タイプの混成である。
【００４１】
上記の微小流体デバイスは、種々の構成要素（例えば、フローチャネル、制御チャネル、バルブおよび／またはエラストマー材料でできたポンプ）を利用することによって一部はさらに特徴付けられる。いくつかの例において、本質的に完全なデバイスは、エラストマー材料から作製される。結果的に、このようなデバイスは、シリコンベースの材料から形成される大多数の従来の微小流体デバイスとは、形態および機能が顕著に異なる。
【００４２】
このデバイスの設計は、多数の種々の加熱システムと組み合わせて利用されることを可能にする。従って、このデバイスは、温度制御を必要とする種々の分析を行なうのに有用
である。さらに、加熱適用において使用するための微小流体デバイスは、反応部位からのサンプルの蒸発を最小限にするために、さらなる設計特徴を組み込ませ得る。この型のデバイスは、一般に、エラストマーデバイス内に形成される多数の保護チャネルを備え、この保護チャネル内を水が流れて、エラストマー材料内の水蒸気圧を増加させ、このデバイスは、そのエラストマー材料から形成され、それによって反応部位からのサンプルの蒸発を減少させる。
【００４３】
別の実施形態において、熱サイクリングデバイスは、微小流体デバイスの温度を制御するために使用され得る。好ましくは、この微小流体デバイスは、その微小流体デバイスと熱的に接触させるように適合される。この微小流体デバイスが、基板物質（例えば、ガラススライド）またはキャリアプレートの底（例えば、プラスチックキャリア）によって支持される場合、窓は、キャリアまたはスライドの領域内に形成され、その結果微小流体デバイス、好ましくはエラストマーブロックを有するデバイスは、熱サイクリングデバイスの加熱／冷却ブロックと直接接触し得る。好ましい実施形態において、この加熱／冷却ブロックは、その中に溝を有し、微小流体デバイス、好ましくは、反応が生じる部分に吸引力を加えるための真空供給源と連絡する。あるいは、硬い、熱伝導性のプレートは、効率的な熱伝導を生じるための加熱ブロックおよび冷却ブロックと結合する微小流体デバイスに結合され得る。
【００４４】
特定のデバイスのアレイフォーマットは、そのデバイスがハイスループットを達成し得ることを意味する。集合的に、ハイスループット性能および温度制御性能は、そのデバイスを、多数の核酸増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応−ＰＣＲ）を行なうために有用なものにする。このような反応は、このデバイスの有用性の例示として（特に温度制御を必要とする任意の反応における使用の例示として）本明細書中で詳細に考察される。しかし、このデバイスが、これらの特定の適用に限定されないことが理解されるべきである。このデバイスは、広範な種々の他の型の分析または反応に利用され得る。例としては、タンパク質−リガンド相互作用および細胞と種々の化合物との間の相互作用が挙げられる。さらなる例は、以下で提供される。
【００４５】
（ＩＩＩ．微小流体デバイスの一般的構造）
（Ａ．ポンプおよびバルブ）
本明細書中に開示される微小流体デバイスは、代表的に少なくとも一部は、エラストマー材料から構成され、単層および多層のソフトリソグラフィ（ＭＳＬ）技術および／または犠牲層カプセル化法（ｓａｃｒｉｆｉｃｉａｌ−ｌａｙｅｒ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ）により構築される（例えば、Ｕｎｇｅｒら、（２０００）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８：１１３−１１６およびＰＣＴ公開ＷＯ  ０１／０１０２５、これらは両方とも全ての目的のためにその全体が本明細書中に参考として援用される）。このような方法を利用して、微小流体デバイスは、そのデバイスのフローチャネルを通って流れる溶液が少なくとも一部は、エラストマー膜またはセグメントによりフローチャネルから分離された一つ以上の制御チャネルで制御されるように設計され得る。この膜またはセグメントは、フローチャネル内に偏向され得るか、またはフローチャネルから引っ込められ、そのフローチャネルには、制御チャネルに作動力を適用することによって制御チャネルが結合されている。膜が、フローチャネル内に偏向されるか、またはフローチャネルから引っ込む程度を制御することによって、溶液の流れは、遅くなり得るか、またはフローチャネルを通して完全に遮断され得る。Ｕｎｇｅｒら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８：１１３−１１６およびＰＣＴ公開ＷＯ／０２／４３６１５およびＷＯ  ０１／０１０２５に広範に詳細に記載されるように、この型の制御チャネルおよびフローチャネルの組み合わせを使用して、溶液の流れを調節するための種々の異なる型のバルブおよびポンプを作製し得る。
【００４６】
本明細書中に提供されるデバイスは、試薬が反応することが可能である反応部位を選択的に分離するために、このようなポンプおよびバルブを組み込む。反応部位は、デバイス内の多数の異なる位置のいずれかに位置し得る。例えば、いくつかのマトリクス型のデバイス内では、反応部位は、一組のフローチャネルの交点に位置する。ブラインドチャネルデバイスでは、反応部位は、ブラインドチャネルの末端に位置する。
【００４７】
このデバイスが、温度制御反応（例えば、熱サイクリング反応）に利用される場合、以下により詳細に記載されるように、エラストマーデバイスは、代表的に支持体（例えば、ガラススライド）に固定される。次いで、生じる構造物は、例えば、種々の反応部位の温度を制御するために、温度制御プレート上に配置され得る。熱サイクリング反応の場合、このデバイスは、多数の熱サイクリングプレートの任意のものの上に配置され得る。
【００４８】
このデバイスは、比較的光学的に透明なエラストマー材料から作製されるので、反応は、微小流体デバイスの本質的に任意の位置で、種々の異なる検出システムを使用して容易にモニタリングされ得る。しかし、最も代表的には、検出は、それ自体の反応部位（例えば、フローチャネルの交点またはフローチャネルのブラインド端部を備える領域内）で行われる。このデバイスが、実質的に透明な材料から製造されるという事実はまた、従来のシリコンベースの微小流体デバイスと一緒には使用不可能である特定の検出システムが、現在のデバイスと一緒に利用され得ることを意味する。検出は、デバイス内に組み込まれたか、またはデバイスからは離れているが、検出されるべきデバイスの領域内に整列した検出器を用いて達成され得る。
【００４９】
（Ｂ．保護チャネル）
本明細書中に提供されるエラストマー微小流体デバイスからのサンプルおよび試薬の蒸発を減少させるために、複数の保護チャネルが、そのデバイス中に形成され得る。この保護チャネルは、代表的にフローチャネルおよび／または反応部位を覆うエラストマーの層に形成される点で制御チャネルに類似している。従って、制御チャネルと同様に、保護チャネルは、その下にあるフローチャネルおよび／または反応部位から、エラストマー材料の膜またはセグメントにより分離される。しかし、制御チャネルとは違って、保護チャネルは、断面積はかなり小さい。一般に、より小さい面積を有する膜は、同じ適用圧力下では、より大きい面積の膜より偏向が小さい。保護チャネルは、溶液（代表的に水）が保護チャネル内に流動することを可能にするような圧力に設計される。保護チャネルに由来する水蒸気は、フローチャネルまたは反応部位に隣接するエラストマーの細孔に拡散し得、従って、フローチャネルまたは反応部位に隣接する水蒸気の濃度を増加させ、そこからの溶液の蒸発を減少させる。
【００５０】
一般に、保護チャネルは、十分に小さく、従って加圧される場合、保護チャネルを下にあるフローチャネルまたは反応部位から分離する膜は、保護チャネルが覆うフローチャネルまたは反応部位内、それらの外またはそれらを通して溶液が流れることを実質的に制限しない。本文脈中で使用される場合、用語「実質的に制限する」または他の類似する用語は、フローチャネルまたは反応部位内、それらの外またはそれらを通して流れる溶液が、保護チャネルを通した溶液の流れを達成するように保護チャネルが加圧されない場合の同じ条件下でのフローチャネルまたは反応部位内の溶液の流れ、それらへの溶液の流れ、またはそれらを通した溶液の流れと比較して、４０％超に、代表的には３０％未満に、通常は２０％未満に、そしていくつかの場合には１０％未満に減少しないことを意味する。通常、このことは、保護チャネルが１００μｍ２と５０，０００μｍ２との間の断面積、またはその間の任意の整数または整数でない断面積を有することを意味する。従って、例えば、いくつかの例において、その断面積は、５０，０００μｍ２未満であり、他の例において１０，０００μｍ２未満であり、さらに他の例において、１，０００μｍ２未満であり、なお他の例において、１００μｍ２未満である。保護チャネルは、任意の種々の形状をとり得、それらとしては、円形、楕円形、正方形、長方形、六角形、および八角形の形状が挙げられるが、それらに限定されない。
【００５１】
保護チャネルは、熱サイクリング反応を行なうために必要とする時間の間かつその条件下で、サンプルおよび試薬のデバイスからの蒸発を５０％未満、他の例においては４５％未満、４０％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満または１％未満減少させるように設計される。従って、例えば、４０サイクル行なう代表的なＰＣＲ反応は、１２０分以内に行われ得る。保護チャネルシステムは、以下のセットの制限に対するほぼこの時間枠の間の蒸発を減少させるように設計される。このレベルの蒸発の減少を達成するために、保護チャネルは、代表的に少なくとも１０ライン／ｃｍ２〜１０００ライン／ｃｍ２の密度で、またはその間の任意の整数の密度レベルで存在する。より詳細には、保護チャネルは、一般的に少なくとも２５ライン／ｃｍ２、他の例では少なくとも５０ライン／ｃｍ２、さらに他の例では少なくとも１００ライン／ｃｍ２、そしてなお他の例では少なくとも５００ライン／ｃｍ２である。このレベルの蒸発の減少を達成するために、保護チャネルは、代表的に、一つのラインの外側の端から隣接するラインの最も近い外側の端まで測定した場合、１ｍｍ〜１μｍの間の間隔、またはその間の任意の整数の密度レベルで存在する。より詳細には、保護チャネルは、一般的に、５００μｍ〜５μｍの間の間隔を開け、他の例では、１００μｍ〜１０μｍの間、なお他の例では、７５μｍ〜４０μｍの間の間隔を開けている。従って、その間隔は、代表的に、少なくとも１μｍであるが、１ｍｍ未満であり、他の例では、５００μｍ未満であり、さらに他の例では、４００μｍ未満であり、なお他の例では、３００μｍ未満であり、他の例では、２００μｍ未満であり、なお他の例では、１００μｍ未満、５０μｍ未満または２５μｍ未満である。
【００５２】
保護チャネルは、チャネルの別個のネットワークとして形成され得るか、または制御チャネルの枝分かれであるチャネルより小さくてもよい。保護チャネルは、デバイスを越えて延び得るか、またはデバイスの特定の領域のみを超えてのび得る。代表的に、保護チャネルは、エバポレーションが最初に関係する最初に位置であるので、フローチャネルおよび反応部位に隣接してそれらをの上に配置される。特定のマトリクスデバイス上の保護チャネルの例示的な位置は図１Ｃに示され、特定のブラインドチャネルデバイス上の例示的な位置は、図３Ｂおよび図３Ｃに示され、以下でより詳細に考察される。
【００５３】
保護チャネルを通して流れる溶液としては、水の蒸発を減少させ得る任意の物質が挙げられる。この物質は、フローラインおよび／または反応部位に隣接する水の蒸発の濃度を増加させる物質であるか、または、フローラインおよび／または反応部位からの水蒸気をブロックするにもかかわらず、水蒸気の濃度を増加させない物質（ブロッキング因子）であり得る。従って、一つの選択肢は、本質的に任意の水溶液を利用することであり、その場合、適切な溶液としては、水および緩衝溶液（例えば、ＴａｑＭａｎ緩衝溶液およびリン酸緩衝生理食塩水）が挙げられるが、これらに限定されない。適切なブロッキング因子としては、例えば、鉱油が挙げられる。
【００５４】
保護チャネルは、代表的に、ＭＳＬ技術および／または上記で引用した犠牲層カプセル化法を利用してエラストマー内に形成される。
【００５５】
以下の節は、温度制御を必要とする分析（例えば、核酸増幅反応）を含む種々の分析を実施するために利用され得る多数の特定の配置をより詳細に記載する。しかし、これらの配置は、例示的であり、これらのシステムの改変は当業者に明らかになることが理解されるべきである。
【００５６】
（ＩＶ．マトリクス設計）
（概要）
マトリクス設計を使用するデバイスは、一般的に、アレイの接合部を形成するように交差する複数の垂直フローチャネルおよび水平フローチャネルを有する。種々のサンプルおよび試薬（または試薬のセット）が、それぞれのフローチャネルに導入され得るので、多数のサンプルが、比較的多数の反応条件に対して高スループットフォーマットで試験され得る。従って、例えば、異なるサンプルがＭ個の異なる垂直フローチャネルのそれぞれに導入され、異なる試薬（または試薬のセット）が、Ｎ個の水平フローチャネルのそれぞれに導入される場合、Ｍ×Ｎ個の異なる反応が、同時に行なわれ得る。代表的に、マトリクスデバイスは、垂直フローチャネルおよび水平フローチャネルの切替可能な分離を可能にするバルブを備える。別の言い方をすると、バルブは、垂直フローチャネルまたは水平フローチャネルのみを通って選択的に流れることを可能にするように配置される。この型のデバイスは、サンプルの型および数、ならびに試薬の数および型の選択に関して可撓性を可能にするので、これらのデバイスは、比較的多数の反応条件に対して多数のサンプルのスクリーニングが所望される分析を行なうのに十分に適している。マトリクスデバイスは、サンプルおよび反応物の蒸発の防止を補助するために、必要に応じて保護チャネルを組込み得る。
【００５７】
本発明は、デバイスを通したコントロールラインおよび流体ラインを組み立てるために、微小流体デバイスの層の間に流体連通孔を利用する高密度マトリクス設計物を提供する。例えば、２つの層のエラストマーブロックの各層に流体ラインを有することにより、より高密度の反応セル配置が可能になる。図２１は、例示的なマトリクス設計物を示し、それぞれ流体チャネルを有する第１のエラストマー層２１１０（一番目の層）および第２のエラストマー層２１２０（二番目の層）がその中に形成される。例えば、第１の層２１１０内の試薬流体チャネルは、孔２１３０を介して第２の層２１２０内の試薬流体チャネルに接続されるが、第２の層２１２０は、その中にサンプルチャネルを有し、そのサンプルチャネルおよび試薬チャネルは、それぞれサンプルおよび試薬チャンバ２１８０内で終結する。サンプルチャンバおよび試薬チャンバ２１８０は、インターフェースチャネル２１５０を通して互いに流体連通され、そのインターフェースチャネル２１５０は、それと結合したインターフェースバルブ２１４０を有し、反応セル２１６０のチャンバ２１８０のそれぞれの間の流体連通を制御する。使用する場合、インターフェースが最初に閉じられ、試薬が、試薬注入口から試薬チャネルに導入され、サンプルが、サンプル注入口を通してサンプルチャネルに導入され、次いで、封じ込めバルブ２１７０が閉鎖され、各反応セル２１６０を他の反応セル２１６０から分離する。一旦反応セル２１６０が分離されると、インターフェースバルブ２１４０は開放され、サンプルチャンバおよび試薬チャンバに互いとの流体連通を引き起こし、その結果所望の反応が起こり得る。
【００５８】
従って、本発明の好ましい局面は、Ｍ個の異なるサンプルとＮ個の異なる試薬とを反応させるための微小流体デバイスを提供し、以下：複数の反応セル（各反応セルはサンプルチャンバおよび試薬チャンバを備える）、サンプルチャンバと試薬チャンバとの間の流体連通を制御するためにインターフェースチャネルに連結したインターフェースバルブを有するインターフェースチャネルを介して流体連通するサンプルチャンバおよび試薬チャンバ、サンプルチャンバとそれぞれ流体連通する複数のサンプル注入口、試薬チャンバとそれぞれ流体連通する複数の試薬注入口を備え、サンプル注入口または試薬注入口の一方は、サンプルチャンバの内の一つまたは試薬チャンバの内の一つとぞれぞれ孔を介して流体連通している。特定の実施形態は、一緒に結合した複数の層から形成されたエラストマーブロック内に形成される反応セルを有し、インターフェースバルブは、偏向可能膜であり；サンプルチャネルを介してサンプルチャンバと流体連通するサンプル注入口を有し、試薬注入口は、試薬チャネルを介して試薬チャンバと流体連通し、サンプルチャネルの一部および試薬チャネルの一部は、互いにほぼ平行に配向されており、封じ込めバルブを通した流体連通を制御するための、それぞれと連結した封じ込めバルブを有し；サンプルチャネルと連絡したバルブを有し、試薬チャネルと連絡したバルブは、共通封じ込め制御チャネルを通して互いに作動可能に連絡し；封じ込め共通制御チャネルは、サンプルチャネルまたは試薬チャネルの一方にほぼ垂直な列に沿って配置される。
【００５９】
本発明の別の局面は、以下の工程を包含する、エラストマーブロック内に特徴を作製するための方法を提供する：第１のエラストマー層を提供する工程；上記第１のエラストマー層の表面上にフォトレジスト層を適用する工程；上記フォトレジスト層に光パターンを適用し、反応フォトレジスト材料のパターンを形成する工程；第１のエラストマー層の表面上の反応したフォトレジストのパターンを残しておいて未反応のフォトレジスト材料を除去する工程；第１のエラストマー表面にエッチング試薬を適用して反応したフォトレジスト材料のパターンにより覆われていない第一のエラストマー層の表面をエッチングして、それによって、反応したフォトレジストのパターンによって覆われていない第１のエラストマー層の領域を除去する工程；および反応したフォトレジスト材料のパターンに対応するエラストマー層のパターンを置いておく工程。本方法の特定の好ましい実施形態は、反応したフォトレジスト材料のパターンを除去する工程を有すること；除去する工程がエラストマー層の表面に接着テープを適用することによって引き起こされ、次いで、反応したフォトレジスト材料のパターンのいくつかまたは全てがエラストマー層の表面から除去される間に、エラストマー層から接着テープを分離すること；ＳＵ８であるフォトレジストを有すること；エッチング試薬が、テトラブチルアンモニウムフルオライド三水和物を含むこと；孔である特徴を有すること；一緒に結合した複数のエラストマー層を含むエラストマーブロックを有することであって、２つ以上のエラストマー層がその中に形成された凹部を有し、一つのエラストマー層の一つの凹部が、孔を介して別のエラストマー層の凹部と連絡することを包含する。
【００６０】
本発明の微小流体デバイスは、Ｕｎｇｅｒにより２００４年３月２９日に出願された、係属中の共同所有する米国特許出願番号第６０／５５７，７１５号に記載されるキャリアデバイスにさらに組み込まれ得、この特許出願は、全ての目的で本明細書中に援用される。Ｕｎｇｅｒのキャリアは、オンボード継続流体圧を提供し、バルブ閉塞を流体圧（例えば、ハウス気圧）の供給源から離れて維持する。Ｕｎｇｅｒは、その中に記載されるとおり本発明のバルブを荷電し、作動するための自動化システムをさらに提供する。別の好ましい実施形態では、アキュムレーターを負荷し、バルブを作動するための自動化システムは、微小流体デバイスの一つ以上の表面に対して対合する圧盤を有するデバイスを使用し、この圧盤は、制御された真空もしくは加圧供給源と流体連通する少なくとも二つ以上のポートを備え、微小流体デバイスの操作部分のための機械的部分（例えば、チェックバルブが挙げられるが、これらに限定されない）を備え得る。
【００６１】
本発明の別の局面は、エラストマーブロック、キャリアを安定化するための基板としての使用を提供し、好ましくは、以下の特徴の一つ以上を有する：キャリア内またはキャリアとともに形成された少なくとも一つのチャネルを通してエラストマーブロックと流体連通するウェルまたはレザバ；キャリア内またはキャリアとともに形成された少なくとも一つのチャネルを通してエラストマーブロックと流体連通するアキュムレーター；およびエラストマーブロックと流体連通する流体ポートであって、好ましくは真空または加圧の自動化供給源（例えば、上記の自動化システム）にアクセス可能である流体ポート、ここで、この自動化供給源は、流体ポートと対合したポートを有する圧盤をさらに備え、自動化システムの間に別個の流体連通を形成し、流体圧または真空をエラストマーブロックに適用する。特定の実施形態において、自動化供給源は、アキュムレーター内に維持された圧力を増加させるおよび減少させるためにキャリアと連結する一つ以上のアキュムレーターとの流体連通を作製し得る。特定の実施形態において、キャリアはさらに、微小流体デバイスと接触するキャリアの範囲内に位置する領域をさらに備え得、その領域は、キャリアの別の部分とは異なる材料から作製され、その領域の材料は、改良した熱伝導およびキャリアの他の部分とは異なる分布特性に関して選択される。改良した熱伝導および分布に対する好ましい材料としては、シリコーンが挙げられるが、これに限定されず、好ましくは、高度に磨いたシリコン（例えば、半導体分野で磨いたウエハとまたはウエハから切断した部分（例えば、チップ）として利用可能な型のシリコン）が挙げられる。
【００６２】
本発明の別の局面は、熱供給源（例えば、ＰＣＲサーモサイクラーであるが、これに限定されない）を使用することを提供し、この熱供給源は、元の製造された状態から改変され得、その熱供給源は、キャリアの部分と対合し得る熱的に調節された部分、好ましくはキャリアの熱伝導部分および熱分配部分を有し、それによりキャリアの熱伝導部分および熱分配部分を介してエラストマーブロックを温度制御する。好ましい実施形態において、熱接触は、真空の供給源を熱供給源の熱調節された部分内に形成される一つ以上のチャネルに適用することにより改善され、そのチャネルは、キャリアの熱伝導部分および熱分配部分の表面に接触するように形成され、キャリアの熱伝導部分および熱分配部分に吸引を適用し、それらの位置を維持する。好ましい実施形態において、キャリアの熱伝導部分および熱分配部分は、キャリアと物理的に接触していないが、熱伝導部分および熱分配部分をエラストマーブロックのみに添付し、熱伝導部分および熱分配部分の縁を取り囲むギャップを配置することによりキャリアによる過流の（ｐａｒａｓｉｔｉｃ）温度効果を減少させることにより、そのキャリアおよびエラストマーブロックと結合している。本明細書中に記載される本発明の多くの局面において、好ましいエラストマーブロックは、本明細書中には記載されない当該分野の任意の公知の微小流体デバイスと取り替えることができることを理解すべきであり、そのデバイスとしては、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｒ）、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡのＧｅｎｅ  Ｃｈｉｐ（Ｒ）またはＣａｌｉｐｅｒ  ｏｆ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡのＧｅｎｅ  Ｃｈｉｐ（Ｒ）が挙げられる。Ｓｏａｎｅ、Ｐａｒｃｅ、Ｆｏｄｏｒ、Ｗｉｌｄｉｎｇ、Ｅｋｓｔｒｏｍ、ＱｕａｋｅまたはＵｎｇｅｒに発行された米国特許は、熱的な利点および改良点（例えば、吸引の位置、エラストマーブロックの使用との関連で上記の流体デバイスの他の領域への過流熱伝導の減少）を利用して、本発明のエラストマーブロックと取替えられ得る微小流体デバイスまたは中規模の流体デバイスを記載する。
【００６３】
（Ｂ．例示的な設計および使用）
図１Ａは、一つの例示的なマトリクスデバイスの例証を提供する。このデバイス１００は、７個の垂直なフローチャネル１０２および７個の水平なフローチャネル１０４を備え、これらは交差し、４９個の異なる交差点のアレイすなわち反応部位１０６を形成する。従って、この特定のデバイスは、７個のサンプルが、７個の異なる試薬または試薬のセットと反応することを可能にする。垂直な向きの溶液の流れを調節する行バルブ１１０は、単一の注入口１１４で全て作動され得る制御チャネル１１８により制御され得る。
【００６４】
同様に、列バルブ１０８は、水平な向きの溶液の流れを調節し；これらは、単一コントロール注入口１１２により作動される制御チャネル１１６により制御される。図１Ａに示すように、列バルブ１０８を調節する制御チャネル１１６は、その位置によって幅が変動する。制御チャネル１１６が、垂直フローチャネル１０２と交差する場合、制御チャネル１１６は、作動する場合、垂直フローチャネル１０２を通る溶液の流れを実質的に減少させるように垂直フローチャネル１０２に偏向しないように十分に細い。しかし、制御チャネル１１６の幅は、制御チャネル１１６が一方の水平フローチャネル１０４の上にある場合、増加し、このことにより、制御チャネルの膜は、水平フローチャネル１０４を通る溶液の流れをブロックするように十分に大きくされる。
【００６５】
作動中は、試薬Ｒ１〜Ｒ７は、そのそれぞれの水平フローチャネル１０４に導入され、サンプルＳ１〜Ｓ７は、そのそれぞれの垂直フローチャネル１０２に注入される。従って、水平フローチャネル１０４内の試薬は、交差点１０６で垂直フローチャネル１０２のそれぞれのサンプルと混合され、この特定のデバイスにおいて、この交差点１０６は、ウェルまたはチャンバの形状である。従って、核酸増幅反応の特定の場合において、例えば、増幅反応に必要な試薬は、水平フローチャネル１０４のそれぞれに導入される。種々の核酸テンプレートが、垂直フローチャネル１０２に導入される。特定の分析において、水平フローチャネル１０４のそれぞれに導入される試薬混合物の一部として導入されるプライマーは、フローチャネル間で異なり得る。このことは、各核酸テンプレートが、多数の異なるプライマーと反応することを可能にする。
【００６６】
図１Ｂ〜Ｅは、デバイスが分析の間にどのように作動するかをより詳細に図示するために、図１Ａに示されるデバイスの隣接する反応部位の拡大した平面図を示す。明瞭性の目的のために、交差点１０６は、反応ウェルの形状で示されず、制御チャネル１１６、１１８は省略され、行および列バルブ１１０、１０８のみが示される（長方形）。図１Ｂに示されるように、分析は、行バルブ１１０を閉鎖し、列バルブ１０８を開放して水平なフローチャネル１０４を通る溶液の流れを可能にし、一方で垂直フローチャネル１０２を通る流れをブロックすることにより開始される。次いで、試薬Ｒ１は、水平フローチャネル１０４に導入され、水平フローチャネル１０４の全長に渡って完全に流れ、従って全ての反応部位１０６が満たされる。水平チャネル１０４を通した溶液の流れは、外部ポンプにより達成され得るが、より代表的には、例えば、Ｕｎｇｅｒら、（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８：１１３〜１１６およびＰＣＴ公開ＷＯ０１／０１０２５号に詳細に記載されるように、ぜん動ポンプをエラストマーデバイス自体の中に組み込むことにより達成される。
【００６７】
一旦Ｒ１が、導入されると、列バルブ１０８が閉鎖され、行バルブ１０２が開放される（図１Ｃを参照のこと）。このことは、サンプルＳ１およびＳ２が垂直フローチャネル１０２に導入され、そのそれぞれのフローチャネルを通って流れることを可能にする。サンプルが垂直フローチャネル１０２を通って流れるときに、Ｒ１を反応部位１０６から排出し、従って、サンプルを反応部位１０６に置いたままにする。次いで、図１Ｄに示すように、列バルブ１０８は開放され、Ｓ１およびＳ２が拡散し、Ｒ１と混合することを可能にする。従って、サンプルと反応物との混合物（Ｒ１Ｓ１およびＲ１Ｓ２）が各交差点の領域、すなわち反応部位１０６で得られる。Ｓ１およびＳ２がＲ１とともに拡散するために十分な時間を可能にした後、全ての列バルブ１０８および行バルブ１１０が閉鎖され、そのそれぞれの反応部位１０６の領域内のＳ１およびＳ２を分離し、Ｓ１およびＳ２の混合を防止する（図１Ｅを参照のこと）。次いで、混合物は反応することが可能となり、その反応物は、交差点１０６または交差点１０６を含む交差した形状の領域をモニタリングすることにより検出される。加熱（例えば、増幅反応の間の熱サイクリング）を必要とする分析のために、デバイスは、ヒーター上に配置され、サンプルが分離されたままである間加熱される。
【００６８】
図１Ａに示すデバイスの改変版が、図１Ｆに示されている。一般的な構造は、図１Ａに示した構造と多くの類似点を有し、両方の図に共通の要素は、同じ参照番号を共有する。図１Ｆに図示されるデバイス１５０は、共通の注入口１２４に結合する水平フローチャネル１０４の対である点が異なる。このことは二組の試薬が、注入口１２４への単一の注入のみを備える２つの隣接するフローチャネルに導入されることを本質的に可能とする。共通の注入口の使用は、垂直フローチャネル１０２に関してさらに拡張される。この特定の例において、各サンプルは、サンプル注入口１２０への単一の注入を備える５つの垂直フローチャネル１０２に導入される。従って、この特定のデバイスには、サンプルおよび試薬の各特定の組合せに対する１０個の繰り返された反応が本質的に存在する。当然のことながら、繰り返された反応の数は、共通の注入口１２０、１２４に接続された垂直フローチャネル１０２および／または水平フローチャネル１０４の数を変更することにより所望のとおり変化され得る。
【００６９】
図１Ｆに示すデバイスはまた、排出口１３２に対する溶液の流れを制御するために使用され得る制御チャネル１３０を調節する別個の制御チャネル注入口１２８、および排出口１３６への溶液の流れを調節する制御チャネル１３４を制御する別の制御チャネル注入口１３２を備える。さらに、デバイス１５０は保護チャネル１３８を取り込む。この特定の設計において、保護チャネル１３８は、制御チャネル１１６の一部として形成される。上に示したように、保護チャネル１３８は、列バルブ１０８より小さく；結果的に保護チャネル１３８の膜は、溶液の流れが中断されるように下層にある水平フローチャネル１０４に偏向されない。
【００７０】
最後に、図１Ｆに示す設計物は、反応が、水平フローラインと垂直フローラインとの交差点のウェル中で生じるというものでなく、交差点自体の中では生じるという点で異なっている。
【００７１】
（Ｖ．ブラインドチャネルの設計）
（Ａ．概略）
ブラインドチャネル設計を利用するデバイスは、特定の特徴を有する。第一に、そのデバイスは、一つ以上のブラインドチャネルが枝分かれする一つ以上のフローチャネルを備える。上に示したように、このようなチャネルの末端領域は、反応部位としての役目を果たし得る。フローチャネルの上に置くことにより形成されるバルブは、ブラインドチャネルの末端で反応部位を分離するために作動され得る。バルブは、反応部位を切替可能に分離するための機構を提供する。
【００７２】
第二に、ブラインドチャネルと連絡するフローチャネルネットワークは、全てもしくはほとんどの反応部位が単一または限られた数（例えば、５個未満または１０個未満）の注入口で満たされ得るように構成される。ブラインドフローチャネルを満たす能力は、そのデバイスがエラストマー材料から作製されるので、可能になる。エラストマー材料は、十分に多孔性であり、従ってフローチャネルおよびブラインドチャネル内の空気は、溶液がチャネル内に導入されるときにこれらの孔を通って漏れ出ることが可能である。他の微小流体デバイスで利用される材料の多孔性がないことにより、ブラインドチャネル設計の使用を不可能にする。これは、通気口がどこか流体の経路に沿って提供されない限り溶液が注入される場合ブラインドチャネル内の空気が、決して漏れ出ないためである。
【００７３】
第三の特徴は、一つ以上の試薬が、製造の間に反応部位内のエラストマーの基部層上に非共有結合的に配置されていることである（製造プロセスのさらなる詳細については以下を参照のこと）。試薬は、非共有結合的に結合される。なぜならば、試薬は、サンプルが反応部位に導入されるときに溶解するように設計されるからである。分析の数を最大にするために、種々の反応物または反応物のセットが、異なる反応部位のそれぞれに配置される。
【００７４】
特定のブラインドチャネルデバイスは、反応部位がアレイの形態で配置されるように設計される。
【００７５】
従って、核酸増幅反応を行なうために設計されるブラインドチャネルデバイスにおいて、例えば、伸長反応を行なうために必要な一種以上の試薬が、デバイスの製造の間に各反応部位に配置される。このような試薬としては、例えば、以下の内の全てまたはいくつかが挙げられる：プライマー、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、補因子、金属イオン、緩衝液、介在性色素など。ハイスループット分析を最大にするために、ＤＮＡの異なる領域を増幅するために選択される異なるプライマーが、各反応部位に配置される。結果的に、核酸テンプレートが注入口を介して反応部位に導入される場合、多数の伸長反応が、テンプレートの異なるセグメントで実行され得る。増幅反応に必要な熱サイクリングは、デバイスを熱サイクリングプレート上に配置し、種々の必要な温度の間でデバイスをサイクリングすることにより達成され得る。
【００７６】
試薬は、種々の方法で固定され得る。例えば、いくつかの例において、一種以上の試薬が、非共有結合的に反応部位に配置されるが、他の例においては、一種以上の試薬が、その反応部位で基板に共有結合される。共有結合する場合、試薬は、リンカーを介して基板に結合され得る。種々のリンカー型（例えば、光化学／感光性リンカー、熱不安定性リンカーおよび酵素により切断され得るリンカーなど）が利用され得る。いくつかのリンカーは、二機能性（すなわち、そのリンカーは、各末端に機能性基を含み、それは、リンカーが結合すべき成分上に位置する基と反応性である）であり、その各末端の機能性基は、同じであっても異なっていてもよい。いくつかのアッセイで使用され得る適切なリンカーの例としては、直鎖または分岐鎖の炭素リンカー、複素環リンカーおよびペプチドリンカーが挙げられる。種々の型のリンカーが、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌｉｎｏｉから入手可能であり、ＥＰＡ１８８，２５６号、米国特許第４，６７１，９５８号；同第４，６５９，８３９号、同第４，４１４，１４８号、同第４，６６９，７８４号、同第４，６８０，３３８号、４，５６９，７８９号、および４，５８９，０７１号、およびＥｇｇｅｎｗｅｉｌｅｒ，Ｈ．Ｍ．による、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｇｅｎｔ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  １９９８、３、５５２に記載されている。ＮＶＯＣ（６ニトロベラトリルオキシカルボニル）リンカーおよび他のＮＶＯＣ関連リンカーは、適した光化学リンカーの例である（例えば、ＷＯ９０／１５０７０およびＷＯ９２／１００９２を参照のこと）。プロテアーゼ切断部位を有するペプチドは、例えば、米国特許第５，３８２，５１３号に考察される。
【００７７】
図２は、ブラインドチャネル設計を利用する一つの例示的なデバイスの単純化した平面図である。デバイス２００は、エラストマー基板２０２内に形成されるフローチャネル２０４およびそこから枝分かれする一組の分岐フローチャネル２０６を備える。各分岐フローチャネル２０６は、反応部位２０８で終結し、それによって反応部位のアレイを形成する。膜２１２によって分岐フローチャネル２０６から分離される制御チャネル２１０は、分岐フローチャネル２０６の上に置く。制御チャネル２１０の作動は、膜２１２を分岐フローチャネル２０６内に偏向させ（すなわち、バルブとして機能させるため）、従って、反応部位２０８のそれぞれが他の反応部位から分離されることを可能にする。
【００７８】
このようなデバイスの操作は、試験サンプルをフローチャネル２０４内に注入し、その後溶液を分岐チャネル２０６のそれぞれに流す工程を包含する。一旦サンプルが各分岐チャネル２０６を満たすと、制御チャネル２１０が作動し、バルブ／膜２１２の活性化を引き起こし、分岐チャネル２０６内に偏向させ、それにより各反応部位２０８を密閉する。サンプルが、反応部位２０８内に流入し、その中に留まるので、サンプルは反応部位２０８のそれぞれにおいて事前にスポットされた試薬を溶解する。一旦溶解すると、その試薬は、サンプルと反応し得る。バルブ２１２は、拡散することにより、各反応部位２０８で溶解した試薬が混合することを防止する。次いで、サンプルと試薬との間の反応が、代表的に反応部位２０８内で検出される。反応は、必要に応じて以下の温度制御の節に記載されるように加熱され得る。
【００７９】
図３Ａは、多少複雑な複合体ブラインドフローチャネル設計の例を例証する。この特定の設計物３００において、１セットの水平フローチャネル３０４のそれぞれは、各末端で２つの垂直フローチャネル３０２と接続する。複数の分岐フローチャネル３０６は、水平フローチャネル３０４のそれぞれから延びている。この特定の設計物における分岐フローチャネル３０４は、交互に配置され、従って、任意の所定の水平フローチャネル３０４に取り付けられた分岐チャネル３０６は、水平フローチャネル３０４に直接隣接して結合する２つの分岐チャネル３０６の間に配置されるか、またはフローチャネル３０４および垂直フローチャネル３０２の一方に直接隣接して結合する分岐フローチャネル３０６の間に配置される。図３Ａに示される設計物と同様に、各分岐フローチャネル３０２は、反応部位３０８内で終結する。また、図３Ａに示す設計物と一致して制御チャネル３１０は、それぞれの分岐チャネルの上に置き、膜３１２によって下にある分岐チャネルから分離される。制御チャネルは、ポート３１６で作動する。垂直フローチャネル３０２および水平フローチャネル３０４は、相互接続され、従って、サンプルの注入口３１４への注入は、水平フローチャネルと垂直フローチャネルとのネットワークを通る溶液の流れを可能にし、最終的に分岐フローチャネル３０６を介した反応部位３０８のそれぞれへの流れを可能にする。
【００８０】
従って、作動中、サンプルは、注入口に注入され、溶液を各反応部位に導入する。一旦反応部位が満たされると、バルブ／膜が作動し、制御チャネルをポートにて加圧することにより反応部位内に溶液を捕捉する。事前に反応部位内に配置された試薬は、反応部位内に再懸濁され、それにより各反応部位内に配置された試薬とサンプルとの間の反応が可能になる。反応部位内での反応は、検出器によりモニタリングされる。先と同様に、反応は、必要に応じて以下の温度制御の節に示す方法に従って制御可能に加熱される。
【００８１】
図３Ａに例証される一般的設計物のさらにより複雑なバージョンが、図３Ｂに示される。図３Ｂに示されるデバイスは、図３Ａに示される水平の分岐フローチャネル３０２の組織化単位が複数回繰り返されるデバイスである。図３Ｂに示されるデバイスは、加熱（例えば、熱サイクリング）を含む適用に利用されるデバイスに保護チャネル３２０を備えることをさらに例証する。保護チャネル３２０のフローチャネル３０４および分岐チャネル３０６に対する例示的な配向は、図３Ｂの右のパネルに示される拡大図に示される。保護チャネル３２０は、分岐フローチャネル３０６および反応部位３０８の上に置く。上に議論したように、水は、デバイス３００の加熱の間に保護チャネル３２０を通して流れ、デバイス内の水の局所的な濃度を増加させ、それによって、フローチャネル３０６内および反応部位３０８内の溶液からの水の蒸発を減少させる。
【００８２】
この節の発端で議論したブラインドチャネルデバイスの特徴は、デバイスのフットプリントを最小化し、デバイス上に多数の反応部位が形成されることを可能にし、高密度が得られる。例えば、２５００個の反応部位を有するこの型のデバイスは、標準的な顕微鏡スライド（２５ｍｍ×７５ｍｍ）上に適合するように容易に製造され得る。上述の特徴はまた、非常に高い密度の反応部位が、ブラインドチャネル設計を利用するデバイスを用いて得られることを可能にする。例えば、少なくとも５０、６０、７０、８０、９０または１００個の反応部位／ｃｍ２、またはその間の任意の整数の密度値が容易に得られ得る。しかし、特定のデバイスは、さらに高い密度範囲（例えば、１００〜４０００反応部位／ｃｍ２またはその間の任意の整数の密度値）を有する。例えば、いくつかのデバイスは、少なくとも１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００部位／ｃｍ２の密度を有する。少なくとも２０００、３０００または４０００部位／ｃｍ２の非常に高密度を有するデバイスもまた入手可能である。このような高密度は、直接デバイス上の非常に多数の反応部位と解釈される。ブラインドチャネル構造を利用するデバイスは、代表的に少なくとも１０〜１００個、またはその間の任意の整数の値の反応部位を有する。より代表的には、そのデバイスは、少なくとも１００個〜１０００個、またはその間の任意の整数の部位を有する。より高い密度のデバイスはさらにより多くの反応部位（例えば、少なくとも１，０００〜１００，０００個の反応部位、またはその間の任意の整数の部位）を有し得る。従って、特定のデバイスは、デバイスの全体の大きさに依存して少なくとも１００、５００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００または１００，０００個の反応部位を有する。
【００８３】
得られ得る多数の反応部位および密度はまた、非常に小さいウェルまたは穴を作る能力の結果である。例えば、穴またはウェルは代表的に５０ｎＬ未満の体積を有し、他の例では、４０ｎＬ未満、３０ｎＬ未満、２０ｎＬ未満または１０ｎＬ未満の体積、なお他の例では、５ｎＬ未満または１ｎＬ未満の体積を有する。特定の例では、特定のデバイスは、長さ３００ミクロン、幅３００ミクロン、深さ１０ミクロンのウェルを有する。
【００８４】
本明細書中に提供されるブラインドチャネルデバイスは、ＰＣＴ／ＵＳ０１／４４５４９（ＷＯ０２／４３６１５として公開される）およびＰＣＴ／ＵＳ０２／１０８７５（ＷＯ０２／０８２０４７として公開される）に考察される特定の設計の特徴および方法論を利用し得、それらとしては、例えば、デッドエンドチャネル（ｄｅａｄ−ｅｎｄｅｄ  ｃｈａｎｎｅｌ）を満たすための戦略、液体プライミング、圧縮ガス放出プライミングならびに微小流体チャネルを満たす間にガスを置換するための種々の方法が挙げられる。これらのＰＣＴ公開は、両方ともその全体が全ての目的のために本明細書中に参考として援用される。
【００８５】
（ＶＩ．ハイブリッド設計）
なお他のデバイスは、マトリクスのハイブリッドおよびブラインドフィル設計である。この型のデバイスの設計は、各水平フローチャネルがそれ自体のサンプル注入口ポートに接続し、水平フローチャネルが垂直フローチャネルを介して相互接続していないことを除いて、図３Ａに示すブラインドチャネルデバイスに類似している。結果的に、任意の所定の水平フローチャネルに導入されたサンプルは、その水平フローチャネルおよびそれに接続する反応部位のみを満たす。それに対して、図３Ａに示すブラインドフローチャネルデバイスにおいて、サンプルは、垂直フローチャネル３０２を介して水平フローチャネル３０４の間に流れ得る。
【００８６】
この一般的なデバイスの例を図４に示す。デバイス４００は、複数の水平フローチャネル４０４を備え、そのぞれぞれは、そこから延びる複数の分岐フローチャネル４０６およびそれ自体のサンプル注入口４１４を有する。コントロール４１０は、分岐フローチャネル４０６のそれぞれの上におき、膜（バルブ）４１２は、下にある分岐フローチャネル４０６から制御チャネル４１０を分離する。ブラインドフローチャネル設計と同様に、注入口４１６にて制御チャネルの作動は、膜４１２の分岐フローチャネル４０６内への偏向および反応部位４０８の分離を引き起こす。この設計のバリエーションにおいて、各水平フローチャネル４０４は、各末端に注入口４１４を備え得、従って、サンプルが両方の末端から導入されることを可能にする。
【００８７】
いくつかの例において、試薬は、そのデバイスの製造の間に反応部位に配置される。このことは、そのマトリクスデバイスに必要とされる、時間を消費する試薬の添加を必要とすることなく、短い時間で比較的多数の反応条件下で多数のサンプルが試験されることを可能にする。あるいは、反応混合物は、チップへの注入の前に調製され得る。一旦混合物が注入されると、それらは、分析され得るか、またはさらに処理され得る（例えば、加熱され得る）。
【００８８】
種々のサンプルを水平フローチャネルのそれぞれに注入することにより、多数のサンプルが迅速に分析され得る。試薬が反応部位に事前に配置されたと仮定すると、任意の所定の水平フローチャネルと結合した各反応部位での同じ試薬の存在は、各サンプルを用いた複数の反復反応を行なうための容易な方法を提供する。その代わりに反応部位での試薬が任意の所定のフローチャネルに対して異なる場合、各サンプルは、本質的に同時に種々の異なる反応条件に暴露される。
【００８９】
従って、本明細書中に提供されるデバイスは、種々の異なる型の研究に対して特別に調整される。研究がユーザーの制御した条件下で比較的多数の異なるサンプルのスクリーニングを含む（例えば、ユーザーの選択した１００個の試薬に対して１００個のサンプル）場合、マトリクスデバイスは、有用な溶液を提供する。しかし、研究が広範な種々の反応条件下で一つ、または限られた数のサンプルの分析を含む場合（例えば、１０，０００個の反応条件に対して１個のサンプル）、ブラインドチャネル設計は、有用である。最後に、試薬を注入することなく、規定の反応条件に対して比較的多数のサンプルを試験すること（例えば、事前に規定した１００個の試薬に対して１００個のサンプル）を望む場合、ハイブリッドデバイスは有用である。
【００９０】
（ＶＩＩ．温度制御）
（Ａ．デバイスおよび構成要素）
微小流体デバイスの選択された領域またはそのデバイス全体の温度を制御するために、種々の精巧さの多数の異なる選択肢が利用可能である。従って、本明細書中で使用される場合、用語温度コントローラーは、微小流体デバイス全体または微小流体デバイスの一部内（例えば、特定の温度領域内で、またはブラインドチャネル型微小流体デバイスのマトリクス内の一つ以上の接合部で）の温度を調節し得るデバイスまたは要素を広くいうことを意味する。
【００９１】
一般的に、このデバイスは、デバイスを温度循環させるために、熱サイクリングプレート上に配置される。種々のこのようなプレートが商業的供給源から容易に入手可能であり、例えば、ＴｈｅｒｍｏＨｙｂａｉｄ  Ｐｘ２（Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＭＡ）、ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＰＴＣ−２００（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｐａｒｔ＃  Ｅ５３３１（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）、Ｔｅｃｈｎｅ  Ｐａｒｔ＃  ２０５３３０（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）が挙げられる。
【００９２】
アレイデバイスは、熱制御デバイスと接触し、従って、熱制御デバイスは、熱制御供給源と熱的に連絡し、少なくとも１つの反応チャンバ内の反応の温度が、熱制御供給源の温度の変化の結果として変化する。
【００９３】
異なる実施形態において、熱伝達デバイスは、半導体（例えば、シリコン）を含んでいてもよく、反射性材料を含んでいてもよく、そして／または金属を含んでいてもよい。
【００９４】
上記熱制御デバイスは、熱制御供給源に対して、熱伝達デバイスを推進するために熱伝達デバイスに力を加えるように適合され得る。その力は、異なる実施形態において、磁力、静電気力または真空力を含み得る。例えば、一実施形態において、その力は、熱制御デバイスまたは熱伝達デバイスの表面に形成されるチャネルを介して熱伝達デバイスに対して適用される真空力を含む。熱制御デバイスの表面と熱伝達デバイスの表面との間で達成される真空のレベルが検出され得る。このような検出は、真空の供給源の位置から遠位のチャネルに沿った位置に配置された真空レベル検出器を用いて行なわれ得る。真空が前もって設定されたレベルを上回らない場合、警告が鳴るか、再調整プロトコルが連動し得る。
【００９５】
アレイデバイスは、一種以上の機械的または電気機械的な位置決めデバイスの使用により、熱制御デバイスと接触し得る。この方法の実施は、自動的に制御され、モニタリングされ得る。例えば、このような自動制御およびモニタリングは、熱制御デバイスからアレイデバイスを導入し、除去するためのロボットの制御システムと作動可能に連絡した自動制御システムを用いて実施され得る。反応の進行もモニタリングされ得る。
【００９６】
熱制御デバイスを備えるユニットが提供され得る。アレイデバイスおよび熱制御デバイスを備えるシステムが提供され得る。
【００９７】
熱サイクリング工程の正確さを確実にするために、特定のデバイスにおいて、そのデバイスの種々の領域で温度を検出するセンサーを組み込むことが有用である。温度を検出するための一つの構造物は、熱電対である。このような熱電対は、基板材料の下にパターン化した薄いフィルムワイヤとして、またはその微小加工エラストマー材料内に直接組み込まれたワイヤとして作製され得る。
【００９８】
温度はまた、電気抵抗の変化を介して計測され得る。例えば、従来の技術を利用して下にある半導体基板に加工されたサーミスタの抵抗の変化は、所定の温度変化に対して較正され得る。あるいは、サーミスタは、直接微小加工エラストマー材料内に挿入され得る。抵抗により温度を検出するためのなお別のアプローチは、Ｗｕら、「ＭＥＭＳ  Ｆｌｏｗ  Ｓｅｎｓｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｎａｎｏ−ｆｌｕｉｄｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ、Ａ８９、１５２−１５８、（２００１）に記載され、これは、本明細書中にその全体が参考として援用される。この文献は、温度の制御および計測の両方に対するドープされたポリシリコン構造物の使用を記載する。ポリシリコンおよび他の半導体材料のために、抵抗の温度係数は、ドーパントの同一性および量により正確に制御され得、従って、所定の適用に対するセンサーの性能を最適化する。
【００９９】
温度クロマティック材料（ｔｈｅｒｍｏ−ｃｈｒｏｍａｔｉｃ  ｍａｔｅｒｉａｌ）は、増幅デバイスの領域の温度を検出するために利用可能な別の型の構造物である。特に、特定の材料は、異なる温度を通り抜けると劇的かつ再現可能に色を変化する。このような材料が、異なる温度を通り抜けるときに溶液に添加され得る。温度クロマティック材料は、下にある基板またはエラストマー材料内に組み込まれて形成され得る。あるいは、温度クロマティック材料は、粒子の形態でサンプル溶液に添加され得る。
【０１００】
温度を検出するための別のアプローチは、赤外線カメラの使用を介する。顕微鏡と接続した赤外線カメラが利用されて、増幅構造物全体の温度プロフィールを決定し得る。エラストマー材料の照射に対する透過性は、この分析を容易にする。
【０１０１】
温度検出のためのなお別のアプローチは、焦電センサーの使用を介する。特に、いくつかの結晶性物質、特に圧電挙動を示す物質もまた焦電効果を示す。この効果は、物質の結晶格子の分極の原因となる現象を記載し、従って、物質を越える電圧は、温度に高度に依存する。このような物質が基板またはエラストマー上に組み込まれ得、温度を検出するために利用され得る。
【０１０２】
他の電気的な現象（例えば、キャパシタンスおよびインダクタンス）は、本発明の実施形態に従って、温度を検出するために利用され得る。
【０１０３】
（Ｂ．正確な熱サイクリング（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｉｎｇ）の評価）
下記の製作のセクションでより詳細に記載されるように、ブラインドチャネルデバイスは、試薬が配置される基底層を有する。フローチャネルおよび制御チャネルを備える２つの層を含む構造物は、上記フローチャネルが沈積された試薬と整列するように基底層上の表面を覆う。次いで、この基底層の反対側は、基材（例えば、ガラス）上に配置される。通常、反応が起こる反応部位は、基材／ガラスの界面から約１００〜１５０ミクロン上である。熱拡散率についての公知の式および上記デバイスに利用されるエラストマーおよびガラスについて適切な値を使用して、反応部位内の温度がコントローラーが維持を求める温度に達するために必要とされる時間を計算し得る。表１に示される計算値は、反応部位が約１００〜１５０ミクロンであるデバイス（すなわち、本明細書において記載されるデバイスについての代表的な距離）において利用されるものよりもかなり厚いエラストマーおよびガラスの層を使用した場合でさえも、その温度が迅速に達成されることを実証する。
【０１０４】
（表１：示した時間期間におけるＰＤＭＳおよびガラス層を通した計算された熱拡散長）
【０１０５】
【表１】
0005502275.tif 000002
図５は、ブラインドチャネルデバイスを使用して所望の温度が達成される速度を示す。
【０１０６】
別の実施形態において、温度は、既知のｔｍを有する二重鎖オリゴヌクレオチドポリマーを使用することによって測定され得、ここでその挿入（ｉｎｔｅｒｃｏｌｌａｔｉｏｎ）によって、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズまたは変性されたことを示す介在性色素（ｉｎｔｅｒｃｏｌｌａｔｉｏｎｇ  ｄｙｅ）（例えば、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（ＴＭ）またはエチジウムブロマイド）は、例えば、反応チャンバーのアレイを有する微小流体デバイスのチャンバーに上記オリゴヌクレオチドを含む溶液を色素と共に導入することによって、各チャンバーの温度の程度がアレイのいたる箇所で一定であることを決定するために、使用され得る。この実施形態において、温度がｔｍを超えて上昇した場合、介在性色素は、そのオリゴヌクレオチドが一本鎖オリゴヌクレオチドに変性（ｄｅｎａｔａｔｕｒａｔｉｏｎ）する際に、オリゴヌクレオチドに対する関係を変化させる。あるいは、温度がｔｍを超え、そして低くなる場合、その時にアニーリングされているオリゴヌクレオチドへの色素の挿入がモニタリングされ得る。本質的に、色素の使用は、オリゴヌクレオチドのｔｍに関連する温度変化に応答して、特性（例えば、蛍光）を変化させる「オリゴヌクレオチドサーモメーター」を提供する。選択されたｔｍを有するオリゴヌクレオチドの設計または使用によって、同様の様式で反応チャンバーのアレイが温度を変化させる程度が、決定され得る。
【０１０７】
（ＶＩＩＩ．検出）
（Ａ．概要）
多くの異なる検出ストラテジーが、本明細書において提供される微小流体デバイスを用いて利用され得る。適切なシステムの選択は、事象の型および／または検出される因子に関して部分的に知られている。検出器は、多くの異なるシグナル型を検出するために設計され得、これらのシグナル型としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：放射性同位体、フルオロフォア、発色団、電子密度粒子、磁性粒子、スピン標識、化学発光を発する分子、電気化学的に活性な分子、酵素、補因子、核酸プローブおよび酵素基質に関連した酵素からのシグナル。
【０１０８】
本発明の微小流体デバイスで使用するために適切な例証的な検出方法論としては、光散乱、マルチチャネル蛍光検出、ＵＶおよび可視波長吸収、ルミネセンス、示差反射、および共焦点レーザースキャニング法が挙げられるが、これらに限定されない。特定の適用において使用され得るさらなる検出方法としては、シンチレーション近接アッセイ技術、放射化学検出、蛍光偏光、蛍光相関分光（ＦＣＳ）、時間分解エネルギー移動（ＴＲＥＴ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）およびバリエーション（例えば、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ））が挙げられる。さらなる検出オプションとしては、電気抵抗、抵抗率、インピーダンス、および電圧センシングが挙げられる。
【０１０９】
検出は、「検出セクション」または「検出領域」において起こる。これらの用語および他の関連する用語は、検出が起こる微小流体デバイスの部分をいう。上記に示されるように、ブラインドチャネル設計を利用するデバイスに関して、上記検出セクションは、一般的に、各反応部位に連結するバルブによって単離される反応部位である。マトリクスベースのデバイスのための検出セクションは、通常、インターセクションに隣接するフローチャネルの領域、インターセクション自体、またはインターセクションと周囲領域とを含む領域内にある。
【０１１０】
上記検出セクションは、顕微鏡、ダイオード、光刺激デバイス（例えば、レーザー）、光電子増倍管、プロセッサー、および前述のものの組み合わせのうちの１以上と連絡し得、これらは共働して特定の事象および／または因子に関連するシグナルを検出する。多くの場合、検出されるシグナルは、光学的検出器によって検出セクション中で検出される光学的シグナルである。光学的検出器は、１以上のフォトダイオード（例えば、アバランシェフォトダイオード）、光ファイバー光ガイドリーディング（ｆｉｂｅｒ−ｏｐｔｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｇｕｉｄｅ  ｌｅａｄｉｎｇ）（例えば、光電子増倍管、顕微鏡、および／またはビデオカメラ（例えば、ＣＣＤカメラ））を備え得る。
【０１１１】
検出器は、微小流体デバイス内に微小加工（ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅ）されてもよいし、別個のエレメントであってもよい。上記検出器が別個のエレメントとして存在し、微小流体デバイスが複数の検出セクションを備える場合、検出は、任意の所定のモーメントにおける単一検出セクション内で起こり得る。あるいは、スキャニング系が使用されてもよい。例えば、特定の自動系が、微小流体デバイスに関して光供給源をスキャンし、他の系は、検出器上の発光をスキャンするか、またはマルチチャネル検出器を備える。特定の説明的な実施例として、上記微小流体デバイスは、移動可能な（ｔｒａｎｓｌａｔａｂｌｅ）ステージに結合され、顕微鏡の対物レンズの下でスキャンされ得る。次いで、このように得られたシグナルは、シグナルの解析および処理のためのプロセッサーに対して経路を定められる。光電子増倍管のアレイもまた利用され得る。さらに、全ての異なる検出セクションからのシグナルを収集すると同時に各セクションからのシグナルを決定する能力を有する光学系が、利用され得る。
【０１１２】
外部検出器も利用可能である。なぜならば、提供されるデバイスは、モニタリングされる波長において光学的に透明な物質から完全に作製されるか、または主にそれらの物質から作製されるからである。この特徴は、本明細書において記載されるデバイスが従来のシリコンベースの微小流体デバイスによっては可能でない多くの光学的検出系を利用することを可能にする。
【０１１３】
特に好ましい検出器は、ＣＣＤカメラと、大きな視野および多くのアパーチャを提供して各反応チャンバーから収集される光の量を最大化する光学的経路とを使用する。この点に関して、上記ＣＣＤは、光検出器のアレイとして使用され、ここで、各ピクセルまたはピクセルの群は、アレイの像を生じるために使用されるチャンバーではなく反応チャンバーに対応する。従って、光学は、画質が低下または焦点がずれて各反応チャンバーからより多くの光を収集する光学系の被写界深度を増加させるように変更され得る。好ましい実施形態において、高いアスペクト比を使用すること、またはサンプルを濃縮するための円柱チャンバーが光学系の光軸に沿った検出器によって、そして好ましくは被写界深度を増加させるために像の焦点をずらすことによって、応答指令信号を送られることは有用である。低ＮＡレンズ系の使用、好ましくは左右対称レンズ系が使用される。検出器デバイス、例えば、画像化されるエラストマーブロックの領域のサイズ、またはそれより大きいサイズを有する１以上のＣＣＤデバイスを使用することもまた、有用である。低ＮＡ光学と共に使用される場合、改善された検出感度が実現され得る。
【０１１４】
検出器は、検出可能なシグナルを生じるレポーターを刺激するための光供給源を備え得る。利用される光供給源の型は、部分的に、活性化されるレポーターの性質に依存する。適切な光供給源としては、レーザー、レーザーダイオードおよび高強度ランプが挙げられるが、これらに限定されない。レーザーが利用される場合、そのレーザーを利用して１セットの検出セクションまたは単一検出セクション全体をスキャンし得る。レーザーダイオードは、微小流体デバイス自体に微細加工され得る。あるいは、レーザーダイオードは、熱サイクリング反応を実施するために利用される微小流体デバイスに隣接して配置される別のデバイスに製作され得、それによってダイオードからのレーザー光は、検出セクションに向けられる。
【０１１５】
検出は、多くの非光学的アプローチも同様に含み得る。例えば、検出器はまた、例えば、温度センサー、伝導度センサー、電位差測定センサー（例えば、ｐＨ電極）および／または電流測定センサー（例えば、酸化反応および還元反応をモニタリングするため）を備え得る。
【０１１６】
多くの市販の外部検出器が利用され得る。蛍光標識試薬の調製が容易であるので、これらの多くは蛍光検出器である。利用可能な検出器の特定の例としては、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＡｒｒａｙＷｏＲｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ，Ｉｓｓａｑｕａｈ，ＷＡ）が挙げられるが、これに限定されない。
【０１１７】
（Ｂ．増幅核酸の検出）
（１．介在性色素）
二本鎖ＤＮＡへの結合の際にのみ蛍光を発する特定の介在性色素が、二本鎖増幅ＤＮＡを検出するために使用され得る。適切な色素の例としては、ＳＹＢＲＴＭおよびＰｉｃｏ  Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．ｏｆ  Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲから入手）、エチジウムブロマイド、ヨウ化プロピジウム、クロモマイシン、アクリジンオレンジ、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、Ｔｏｔｏ−１、Ｙｏｙｏ−１、およびＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールヒドロクロライド）が挙げられるが、これらに限定されない。介在性色素の使用に関するさらなる考察は、Ｚｈｕら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６６：１９４１−１９４８（１９９４）（これはその全体が本明細書において参考として援用される）によって提供される。
【０１１８】
（２．ＦＲＥＴベースの検出方法）
この型の検出方法は、ドナー／アクセプターフルオロフォア対中のドナー（レポーター）および／またはアクセプター（クエンチャー）フルオロフォアからの蛍光の変化を検出する工程を包含する。ドナーおよびアクセプターのフルオロフォア対は、上記ドナーの発光スペクトルが上記アクセプターの励起スペクトルと重なるように選択される。従って、フルオロフォアの対が互いに十分に近接してもたらされる場合、ドナーからアクセプターへのエネルギー移動が起こり得る。このエネルギー移動が、検出され得る。
【０１１９】
（ＦＲＥＴおよびテンプレート伸長反応）
これらの方法は、一般的にドナー／アクセプター対の１つのメンバーで標識されたプライマーと、ドナー／アクセプター対の他のメンバーで標識されたヌクレオチドとを利用する。テンプレート依存伸長反応の間にプライマーに標識ヌクレオチドを組み込む前に、上記ドナーおよびアクセプターは、エネルギー移動が起こり得ないように十分離れて配置される。しかし、標識ヌクレオチドがプライマーに組み込まれてその配置が十分に近い場合、エネルギー移動が起こり、それが検出され得る。これらの方法は、一塩基多型を検出する際の一塩基対伸長反応の実施において特に有用であり（前出）、米国特許第５，９４５，２８３号およびＰＣＴ公開公報ＷＯ  ９７／２２７１９に記載される。
【０１２０】
（定量的ＲＴ−ＰＣＲ）
種々の、いわゆる「リアルタイム増幅」方法または「リアルタイム定量的ＰＣＲ」方法もまた、増幅プロセスの間またはその後に形成される増幅産物の量を測定することによって、サンプル中に存在する標的核酸の量を決定するために利用され得る。蛍光発生ヌクレアーゼアッセイは、本明細書において記載されるデバイスを用いて首尾よく使用され得るリアルタイム定量方法の１つの特定の例である。増幅産物の形成をモニタリングするこの方法は、二重標識の蛍光発生オリゴヌクレオチドプローブを使用してＰＣＲ産物蓄積を連続的に測定することを包含する。参考文献において、このアプローチは、しばしば「ＴａｑＭａｎ」方法といわれる。
【０１２１】
このようなアッセイで使用されるプローブは、代表的には、２種の異なる蛍光色素で標識される短い（約２０〜２５塩基）ポリヌクレオチドである。このプローブの５’末端は、代表的にはレポーター色素に結合され、３’末端はクエンチャー色素に結合されるが、これらの色素は、同様にプローブ上の他の位置に結合されてもよい。上記プローブは、標的核酸上のプローブ結合部位と少なくとも実質的な配列相補性を有するように設計される。プローブ結合部位に隣接する領域に結合する上流および下流のＰＣＲプライマーはまた、上記反応混合物中に含まれる。
【０１２２】
プローブがインタクトである場合、２つのフルオロフォアの間でエネルギー移動が起こり、クエンチャーは、レポーターからの発光をクエンチする。ＰＣＲの伸長期の間、上記プローブは、Ｔａｑポリメラーゼのような核酸ポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によって切断され、それによってポリヌクレオチド−クエンチャーからレポーターが放出されて適切な検出器によって測定され得るレポーター発光強度の増加を生じる。
【０１２３】
例えば、蛍光発生アッセイの間に作製されるような蛍光発光を測定するために特異的に適合された１つの検出器は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．ｉｎ  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡによって製造されたＡＢＩ  ７７００である。この機器と共に提供されるコンピューターソフトウェアは、増幅の過程の間のレポーターおよびクエンチャーの蛍光強度を記録し得る。次いで、これらの記録された値を使用して、継続的に標準化レポーター発光強度の増加を計算し得、最終的に増幅されたｍＲＮＡの量を定量し得る。
【０１２４】
増幅生成物の濃度をリアルタイムで決定するための蛍光発生方法の理論および操作に関するさらなる詳細は、例えば、以下に記載される：Ｇｅｌｆａｎｄらに対する米国特許第５，２１０，０１５号、Ｌｉｖａｋらに対する米国特許第５，５３８，８４８号、およびＨａａｌａｎｄに対する米国特許第５，８６３，７３６号、ならびにＨｅｉｄ，Ｃ．Ａ．ら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，６：９８６−９９４（１９９６）；Ｇｉｂｓｏｎ，Ｕ．Ｅ．Ｍら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９９５−１００１（１９９６）；Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｐ．  Ｍ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：７２７６−７２８０，（１９９１）；およびＬｉｖａｋ，Ｋ．Ｊ．ら，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ３５７−３６２（１９９５）（これらの各々は、その全体が本明細書において参考として援用される）。
【０１２５】
従って、増幅反応が進行するにつれて、結合する色素の量が増加し、同時にシグナルの量が増加する。
【０１２６】
例えば、上記に記載された介在性色素は、定量的ＰＣＲ方法に対する異なるアプローチにおいても利用され得る。上記したように、これらの色素は、二本鎖ＤＮＡに優先的に結合し（例えば、ＳＹＢＲ  ＧＲＥＥＮ）、一旦結合するとシグナルのみを生じる。従って、増幅反応が進行するにつれて、結合する色素の量が増加し、同時に検出され得るシグナルが増加する。
【０１２７】
（分子ビーコン）
分子ビーコンに関して、増幅産物の相補性領域にハイブリダイズする場合のプローブのコンホメーションの変化は、検出可能なシグナルを形成させる。プローブ自体は、２つのセクションを含む：１つは５’末端のセクションであり、もう一方は３’末端のセクションである。これらのセクションは、プローブ結合部位にアニーリングするプローブのセクションに隣接し、互いに相補的である。一方の末端セクションは、代表的にレポーター色素に結合され、もう一方の末端セクションは、通常クエンチャー色素に結合される。
【０１２８】
溶液において、上記２つの末端セクションは互いにハイブリダイズしてヘアピンループを形成し得る。このコンホメーションにおいて、レポーター色素とクエンチャー色素とは、そのレポーター色素からの蛍光がクエンチャー色素によって効率的にクエンチされるように十分に近接している。対照的に、ハイブリダイズしたプローブは、クエンチングの程度が低下する直鎖状のコンホメーションを生じる。従って、２種の色素について発光変化をモニタリングすることによって、増幅産物の形成を間接的にモニタリングすることが可能である。この型のプローブおよびこれらの使用の方法は、さらに、例えば以下に記載される：Ｐｉａｔｅｋ，Ａ．Ｓ．ら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：３５９−６３（１９９８）；Ｔｙａｇｉ，Ｓ．およびＫｒａｍｅｒ，Ｆ．Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：３０３−３０８（１９９６）；およびＴｙａｇｉ，Ｓ．ら，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４９−５３（１９９８）（これらの各々は、全ての目的のために、その全体が本明細書において参考として援用される）。
【０１２９】
（インベーダー）
インベーダーアッセイ（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））は、ＳＮＰ遺伝型決定のために使用され、そして単一プローブと名付けられるオリゴヌクレオチド（これは、標的核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）または多型部位に相補的である）を利用する。インベーダーオリゴと名付けられる第二のオリゴヌクレオチドは、同じ５’ヌクレオチド配列を含むが、３’ヌクレオチド配列は、ヌクレオチド多型を含む。このインベーダーオリゴは、標的核酸に対するシグナルプローブの結合に干渉し、それによってシグナルプローブの５’末端は多型を含むヌクレオチドにおいて「フラップ」を形成する。この複合体は、Ｃｌｅａｖａｓｅ酵素と呼ばれる構造特異的エンドヌクレアーゼによって認識される。Ｃｌｅａｖａｓｅは、ヌクレオチドの５’フラップを切断する。放出されたフラップは、ＦＲＥＴ標識を有する第三のプローブに結合し、それによってＣｌｅａｖａｓｅ酵素によって認識される別の二重鎖構造体を形成する。今回は、上記Ｃｌｅａｖａｓｅ酵素は、クエンチャーからフルオロフォアを切断して除き、蛍光シグナルを生成する。ＳＮＰ遺伝子型決定のために、上記シグナルプローブは、参照（野生型）対立遺伝子または改変体（変異体）対立遺伝子のいずれかとハイブリダイズするように設計される。ＰＣＲとは異なり、核酸の増幅を用いないシグナルの線形的増幅が存在する。当業者を手引きするために十分なさらなる詳細は、例えば、Ｎｅｒｉ，Ｂ．Ｐ．ら，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ３８２６：１１７−１２５，２０００）によって提供される。
【０１３０】
（Ｎａｓｂａ）
核酸配列ベースの増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＮＡＳＢＡ）は、テンプレートとしてＲＮＡを使用する検出方法である。ＲＮＡに対して相補的なプライマーは、Ｔ７プロモーター部位のための配列を含む。このプライマーは、テンプレートＲＮＡと添加された逆転写酵素（ＲＴ）との結合を可能にし、３’から５’に相補鎖を作製する。続いて、ＲＮａｓｅ  ＨがＲＮＡを分解するために添加され、１本鎖ｃＤＮＡはそのまま残る。次いで、プライマーの第二のコピーが１本鎖ｃＤＮＡに結合し、二本鎖ｃＤＮＡとなり得る。第１のプライマーによってｃＤＮＡ配列に組み込まれたＴ７プロモーター部位から多くのＲＮＡコピーを作製するために、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼが添加される。言及される全ての酵素は、４１℃において機能し得る（例えば、Ｃｏｍｐｔｏｎ，Ｊ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３５０：９１−９１，１９９１を参照のこと）。
【０１３１】
（Ｓｃｏｒｐｉｏｎ）
この方法は、例えばＴｈｅｌｗｅｌｌ  Ｎ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２８：３７５２−３７６１，２０００（これは、全ての目的のためにその全体が参考として援用される）によって記載され、図２０はそのスキームを示す。ここでＳｃｏｒｐｉｏｎプロービング機構は以下のとおりである。工程１：標的およびＳｃｏｒｐｉｏｎステム配列（ｓｔｅｍ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の最初の変性。工程２：標的に対するＳｃｏｒｐｉｏｎプライマーのアニーリング。工程３：Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマーの伸長が、二本鎖ＤＮＡを生じる。工程４：工程３で産生された二本鎖ＤＮＡの変性。これによってＳｃｏｒｐｉｏｎプライマーが結合された一本鎖の標的分子が生じる。工程５：冷却の際、分子内様式でＳｃｏｒｐｉｏｎプローブ配列がその標的に結合する。これは相補的な標的鎖の分子内結合に関して好ましい。Ｓｃｏｒｐｉｏｎ（図２４に示される）は、上記プローブの５’側および３’側の相補的なステム配列によってヘアピンループコンフィグレーションに保持される特異的プローブ配列からなる。５’末端に結合するフルオロフォアは、上記ループの３’末端に結合した部分（通常は、メチルレッド）によってクエンチされる。ヘアピンループは、ＰＣＲ停止配列（ストッパー）を介してプライマーの５’末端に連結される。ＰＣＲ増幅の間のプライマーの伸長の後、その特異的なプローブ配列は、ＤＮＡの同じ鎖内の相補体に結合し得る。このハイブリダイゼーション事象がヘアピンループを開裂し、それによって蛍光はもはやクエンチされず、そしてシグナルの増加が観察される。ＰＣＲ停止配列は、特異的標的配列の非存在下においてヘアピンループを開裂させるリードスルーを妨げる。このようなリードスルーは、非特異的ＰＣＲ産物（例えば、プライマーダイマーまたはミスプライミング（ｍｉｓｐｒｉｍｉｎｇ）事象）の検出をもたらす。
【０１３２】
（３．容量性ＤＮＡ検出）
１−ｋＨｚの電場を核酸が通過することによって引き起こされるＤＮＡ濃度と静電容量の変化との間には、直線的な関係が存在する。この関係は、種に依存しないことが見出されている（例えば、Ｓｏｈｎら，（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：１０６８７−１０６９０を参照のこと）。従って、特定のデバイスにおいて、フローチャネル内（例えば、図１の実質的に円形のフローチャネル、または図２の反応チャンバー）の核酸は、そのような場に供されて増幅産物の濃度を決定する。あるいは、増幅産物を含有する溶液が回収され、次いで電場に供される。
【０１３３】
（ＩＸ．反応を行うための混合物の組成）
本明細書において開示される微小流体デバイスを用いて行われる反応は、代表的には、その反応を促進するために特定の添加剤と共に行われる。だから、例えば、試薬が沈積されるデバイスの場合においては、これらの添加剤は、例えば反応部位において１以上の反応物と共にスポットされ得る。添加剤の１つのセットは、エラストマー基材上でタンパク質結合部位をブロックするブロッキング試薬である。多くの異なるタンパク質（例えば、ゼラチンおよび種々のアルブミンタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン））およびグリセロールを含む、多種多様なこのような化合物が利用され得る。
【０１３４】
界面活性添加物もまた有用であり得る。多くの種々の界面活性剤の任意のものが、利用され得る。例としては、ＳＤＳおよび種々のＴｒｉｔｏｎ界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３５】
核酸増幅反応の特定の場合において、多くの種々の型の添加剤が含まれ得る。１つのカテゴリーは、その増幅反応を促進するエンハンサーである。このような添加剤としては、核酸中の二次構造を低減させる試薬（例えば、ベタイン）、およびミスプライミング事象を低減させる因子（例えば、塩化テトラメチルアンモニウム）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３６】
いくつかのポリメラーゼが増強された結果を与えることも、特定の増幅反応を行う際に見出されている。例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて良好な結果が得られた一方、いくつかの例において、Ｆｉｎｎｚｙｍｅ，  Ｅｓｐｏｏ，  Ｆｉｎｌａｎｄから入手したＤｙＮＡｚｙｍｅポリメラーゼを使用して改善された反応が得られた。このポリメラーゼは、好熱性細菌であるＴｈｅｒｍｕｓ  ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓに由来する。利用され得る他の例示的なポリメラーゼとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ｒＴＨポリメラーゼＸＬ（これは、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）とＴｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ（Ｔｌｉ）との組み合わせである）、超好熱性古細菌Ｐｙｒｏｓｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｅｉ（Ｐｗｏ）、およびＴｇｏ  ＤＮＡポリメラーゼ。反応混合物中で２以上のポリメラーゼを合わせてＰＣＲ反応の忠実度または感度を上昇させることもまた、有用であり得る。他の試薬（例えば、ＤＭＳＯ）の添加（特に、介在性色素を含むものをＰＣＲカクテルに添加すること）は、反応の実施をさらに援助し得る。コントロールライン（ｌｉｎｅ）流体にグリセロールまたはＰＥＧ溶液を使用することはまた、ＰＣＲ反応の性能を改善し得る。
【０１３７】
本明細書において開示される特定のデバイスを用いて反応（核酸増幅反応を含む）を行う際に有用な添加剤に関するさらなる詳細は、下の実施例に提供される。
【０１３８】
（Ｘ．例示的適用）
本明細書において提供される微小流体デバイスは多くの反応部位を含むように製造され得るので、このデバイスは、多種多様なスクリーニング方法および分析方法において有用である。一般的に、上記デバイスは、検出可能なシグナルを形成するために反応する物質種、または検出可能なシグナルを生じる別の物質種との相互作用に関する生成物との間の反応を検出するために利用され得る。種々の型の温度制御システムの使用を考慮して、上記デバイスはまた、温度制御に必要とされる多くの異なる型の分析または反応において利用され得る。
【０１３９】
（Ａ．核酸増幅反応）
本明細書に開示されるデバイスを利用して、本質的に全ての型の核酸増幅反応を行い得る。従って、例えば、増幅反応は、直線的な増幅（単一プライマーによる増幅）であってもよいし、指数関数的な増幅（すなわち、順方向および逆方向のプライマーセットによって行われる増幅）であってもよい。
【０１４０】
ブラインドチャネル型デバイスが核酸増幅反応を行うために利用される場合、代表的に反応部位内に沈積される試薬は、所望の型の増幅反応を行うために必要な試薬である。通常、このことは、以下のもの（例えば、プライマー、ポリメラーゼ、ヌクレオチド、金属イオン、緩衝液、および補因子）の一部または全てが沈積されることを意味する。このような場合に反応部位に導入されるサンプルは、核酸テンプレートである。あるいは、しかし、このテンプレートは沈積され得、そして増幅試薬が反応部位に流れ得る。上で議論したとおり、マトリクスデバイスが増幅反応を行うために利用される場合、核酸テンプレートを含有するサンプルは垂直方向のフローチャネルを通って流れ、そして増幅試薬は水平方向のフローチャネルを通って流れるか、あるいは核酸テンプレートを含有するサンプルは水平方向のフローチャネルを通って流れ、そして増幅試薬は垂直方向のフローチャネルを通って流れる。
【０１４１】
ＰＣＲはおそらく最も知られた増幅技術であるが、本デバイスはＰＣＲ増幅を行うことに限定されない。行われ得る増幅反応の他の型としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：（ｉ）リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：５６０（１９８９）ならびにＬａｎｄｅｇｒｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：１０７７（１９８８）を参照のこと）；（ｉｉ）転写増幅（Ｋｗｏｈら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３（１９８９）を参照のこと）；（ｉｉｉ）自立的配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：１８７４（１９９０）を参照のこと）；ならびに（ｉｖ）核酸ベースの配列増幅（ＮＡＳＢＡ）（Ｓｏｏｋｎａｎａｎ，Ｒ．およびＭａｌｅｋ，Ｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５６３−６５（１９９５）を参照のこと）。前述の参考文献の各々は、全ての目的のためにその全体が本明細書において参考として援用される。
【０１４２】
得られた増幅産物の検出は、増幅ＤＮＡを検出するための、前出に記載された任意の検出方法を使用して達成され得る。
【０１４３】
（Ｂ．ＳＮＰ分析および遺伝子型決定）
（１．概要）
宿主生物または感染生物のいずれかの、ゲノム改変に関連する多くの疾患は、少数のヌクレオチドの変化の結果であり、しばしば単一ヌクレオチドの変化に関連する。このような単一のヌクレオチド変化は、一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）または単にＳＮＰといわれ、ＳＮＰが起こる部位は、代表的には多型部位といわれる。本明細書において記載されるデバイスは、そのような多型部位に存在するヌクレオチドの同一性を決定するために利用され得る。この性能を拡張すると、上記デバイスは、遺伝子型決定分析において利用され得る。遺伝子型決定は、二倍体生物（すなわち、各遺伝子の２つのコピーを有する生物）が、参照対立遺伝子の２つのコピー（参照型ホモ接合体）、参照対立遺伝子および改変体対立遺伝子の各１コピー（すなわち、ヘテロ接合体）を含むか否か、または改変体対立遺伝子の２つのコピー（すなわち、改変体型ホモ接合体）を含むか否かの決定を包含する。遺伝子型決定分析を行う場合、本発明の方法は、単一改変体部位を問いただす（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅ）ために利用され得る。しかし、多重化に関するセクションにおいて以下にさらに記載されるように、この方法は、多くの異なるＤＮＡ遺伝子座（同じ遺伝子、異なる遺伝子、またはその組み合わせのいずれか）において個体の遺伝子型を決定するためにも使用され得る。
【０１４４】
遺伝子型決定分析を行うために利用されるべきデバイスは、適切な大きさの反応部位を利用して、統計学的な観点から、二倍体被験体について２つの対立遺伝子の各々のコピーが有効なＤＮＡ濃度で反応部位に存在することが確実になるように設計される。さもなければ、単に第二の対立遺伝子のコピーが反応部位に存在しないというだけの理由で、ヘテロ接合体がホモ接合体であることを示唆する結果が分析から得られる。以下の表２は、本明細書において記載されるデバイスによって利用され得る種々の例示的なＤＮＡ濃度において１ｎｌの反応容量中に存在するゲノムのコピー数を示す。
【０１４５】
（表２：示されるＤＮＡ濃度における１ｎＬ容量中に存在するゲノムコピーの数）
【０１４６】
【表２】
0005502275.tif 000003
一般的な問題として、サンプルの確率論的比率に起因して、増幅反応が開始される前に存在するコピー数は、測定における誤差の可能性を決定する。特定のデバイスを使用する遺伝子型決定分析は、代表的に約０．１０μｇ／μＬのＤＮＡ濃度を有するサンプルを用いて行われるが、本発明は、反応部位１つにつき単一のゲノムが存在する濃度においてＴａｑＭａｎ反応を首尾よく行う。
【０１４７】
（２．方法）
遺伝子型決定分析は、種々の異なるアプローチを使用して行われ得る。これらの方法において、「イエス」または「ノー」の結果を得ることが一般的に十分である。すなわち、検出は、所定の対立遺伝子が存在するか否かという質問に回答し得ることのみを必要とする。従って、分析は、潜在的に多型部位において１つの対立遺伝子の存在を検出するのに必要とされるプライマーまたはヌクレオチドによってのみ行われ得る。しかし、より代表的には、潜在的に多型部位で各対立遺伝子の存在を検出するためのプライマーおよびヌクレオチドが含まれる。適切なアプローチの例は以下である。
【０１４８】
（単一塩基対伸長（ＳＢＰＥ）反応）
ＳＢＰＥ反応は、遺伝子型決定分析を行うために特異的に開発された技術の１つである。多くのＳＰＢＥアッセイが開発されているが、一般的なアプローチはかなり似ている。代表的には、これらのアッセイは、標的核酸に対して相補的であるプライマーをハイブリダイズする工程を包含し、これによってそのプライマーの３’末端が直接改変体部位の５’であるか、またはそれに隣接するようになる。改変体部位およびポリメラーゼを占めるヌクレオチドに対して相補的である１以上の標識された伸長可能でないヌクレオチドの存在下において、伸長は行われる。この伸長可能でないヌクレオチドは、一旦プライマーに組み込まれた場合にポリメラーゼによるさらなる伸長を妨げるヌクレオチドアナログである。添加された伸長可能でないヌクレオチドが、改変体部位でのヌクレオチドに相補的である場合、標識された伸長可能でないヌクレオチドは、上記プライマーの３’末端に組み込まれて、標識された伸長産物を産生する。従って、伸長プライマーは、そのヌクレオチドが標的核酸の改変体部位に存在することの指標を提供する。このような方法および関連する方法は、例えば、米国特許第５，８４６，７１０号；米国特許第６，００４，７４４号；米国特許第５，８８８，８１９号；米国特許第５，８５６，０９２号；および米国特許第５，７１０，０２８号；ならびにＷＯ  ９２／１６６５７に議論されている。
【０１４９】
伸長産物の検出は、前出の検出セクションにおける伸長反応について記載されたＦＲＥＴ検出アプローチを利用して検出され得る。従って、例えば、本明細書に記載されたデバイスを使用して、ドナー／アクセプターフルオロフォアの１つのメンバーで標識されたプライマー、１個〜４個の標識された伸長可能でないヌクレオチド（１を超える伸長可能でないヌクレオチドが含まれる場合、示差的に標識される）、およびポリメラーゼを含む試薬混合物が、反応部位に導入される（または前もってスポットされる）。次いで、テンプレートＤＮＡを含むサンプルが反応部位に導入されて、テンプレート伸長が起こり得る。形成される任意の伸長産物は、ＦＲＥＴシグナルの形成によって検出される（例えば、米国特許第５，９４５，２８３号およびＰＣＴ公開公報ＷＯ  ９７／２２７１９を参照のこと）。この反応は、上記に記載される温度制御方法および機器を使用してシグナルを増加させるために、必要に応じて熱サイクリング的に行われ得る（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｄ）。
【０１５０】
（定量的ＰＣＲ）
遺伝子型決定分析は、先立って記載された定量的ＰＣＲ方法を使用して行われ得る。この場合において、対立遺伝子形態の各々に相補的な示差的に標識されたプローブは、プライマー、ヌクレオチドおよびポリメラーゼと一緒に試薬として含まれる。しかし、反応は、単一プローブのみを使用して行われ得るが、このことから、シグナルの欠如が特定の遺伝子座が存在しないことに起因するのか、または単なる反応の失敗に起因するのかということに関しては、あいまいさが生じ得る。多型部位について２つの対立遺伝子が可能性があるような代表的な２対立遺伝子（ｂｉａｌｌｅｌｉｃ）の場合については、２つの示差的に標識されたプローブは、各々がその対立遺伝子の１つに対して完全に相補的であり、これらのプローブは、通常は試薬混合物中に、増幅プライマー、ヌクレオチドおよびポリメラーゼと一緒に含まれる。標的ＤＮＡを含むサンプルは、反応部位に導入される。プローブが相補的である対立遺伝子が標的ＤＮＡ中に存在する場合、次いで増幅が起こり、それによって上記の検出おいて記載されたように検出可能なシグナルを生じる。示差的シグナルが得られた場合には、多型部位においてヌクレオチドの同一性が決定され得る。両方のシグナルが検出される場合、その場合は両方の対立遺伝子が存在する。反応の間の熱サイクリングは、前出の温度制御セクションにおいて記載されるように行われる。
【０１５１】
（Ｂ．遺伝子発現分析）
（１．概要）
遺伝子発現分析は、１以上の遺伝子が特定の細胞において発現されるレベルを決定する工程を包含する。決定は定性的であり得るが、一般的には定量的である。示差的遺伝子発現分析において、１つの細胞（例えば、試験細胞）における遺伝子のレベルは、別の細胞（コントロール細胞）の同じ遺伝子の発現レベルと比較される。多種多様なこのような比較がなされ得る。例としては、健康な細胞と疾患細胞との間の比較、１種の薬物で処置された個体由来の細胞と別の未処置個体由来の細胞との間の比較、特定の毒物に曝された細胞と曝されていない細胞との間の比較などが挙げられるが、これらに限定されない。試験細胞とコントロール細胞との間で発現レベルが異なる遺伝子は、治療のためのマーカーおよび／または標的として役立ち得る。例えば、特定の群の遺伝子が健康細胞よりも疾患細胞においてアップレギュレートされることが見出される場合、そのような遺伝子は、その疾患のマーカーとして機能し得、診断試験のための基準として利用され得る可能性がある。これらの遺伝子は標的でもあり得る。上記疾患を処置するためのストラテジーとしては、アップレギュレートされた遺伝子の発現の低下をもたらす手順が挙げられる。
【０１５２】
本明細書において開示されるデバイスの設計は、種々の遺伝子発現分析を容易にするのに有用である。上記デバイスは多くの反応部位を含むので、多くの遺伝子および／またはサンプルが同時に試験され得る。例えば、ブラインドフローチャネルデバイスを使用して、数百〜数千の遺伝子の発現レベルが同時に決定され得る。上記デバイスはまた、示差的遺伝子発現分析を容易にする。例えば、マトリクス設計を用いて、健康細胞から得られたサンプルを１つのフローチャネルで試験しながら、疾患細胞からのサンプルをすぐ近くの隣接チャネルにおいて試験することが可能である。この特徴は、検出の容易さおよび結果の正確さを増強する。なぜならば、２つのサンプルが、同じデバイスで同時に、そして同じ条件下で試験されるからである。
【０１５３】
（２．サンプルの調製および濃度）
遺伝子の転写レベル（そしてそれによって発現レベル）を測定するために、その遺伝子もしくは遺伝子フラグメントのｍＲＮＡ転写産物を含む核酸サンプル、またはそのｍＲＮＡ転写産物に由来する核酸が得られる。ｍＲＮＡ転写産物に由来する核酸とは、その合成のためにｍＲＮＡ転写産物またはそのサブ配列が最終的にテンプレートとして役立つ核酸を指す。従って、ｍＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡ、ｃＤＮＡから転写されるＲＮＡ、ｃＤＮＡから増幅されるＤＮＡ、増幅ＤＮＡから転写されるＲＮＡは、全て上記ｍＲＮＡ転写産物に由来し、このような由来産物の検出は、サンプル中のもとの転写産物の存在および／またはアバンダンスの指標である。従って、適切なサンプルとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：遺伝子のｍＲＮＡ転写産物、ｍＲＮＡから逆転写されるｃＤＮＡ、ｃＤＮＡから転写されるｃＲＮＡ、遺伝子から増幅されるＤＮＡ、増幅ＤＮＡから転写されるＲＮＡ。
【０１５４】
いくつかの方法において、核酸サンプルは、生物学的サンプルから単離される全ｍＲＮＡである；他の例において、上記核酸サンプルは、生物学的サンプルからの全ＲＮＡである。用語「生物学的サンプル」は、本明細書において使用される場合、生物からか、または生物の構成要素から得られるサンプル（例えば、細胞、生物学的組織および流体）をいう。いくつかの方法において、上記サンプルはヒト患者由来である。このようなサンプルとしては、痰、血液、血球（例えば、白血球）、組織もしくは細針生検サンプル、尿、腹水、および胸膜液（ｆｌｅｕｒａｌ  ｆｌｕｉｄ）、またはそれらからの細胞が挙げられる。生物学的サンプルはまた、組織学的な目的のために採取された凍結切片のような組織の切片を含み得る。多くの場合、２つのサンプルが比較目的のために提供される。上記サンプルは、例えば、異なる細胞または組織型に由来しても、異なる個体に由来しても、２種の異なる処理（例えば、薬物処理とコントロール処理）に供された、同じもとのサンプルに由来してもよい。
【０１５５】
ｍＲＮＡの単離に対して選択されていない任意のＲＮＡ単離技術が、このようなＲＮＡサンプルの精製のために利用され得る。例えば、核酸の単離および精製の方法は、以下において詳細に記載される：ＷＯ  ９７／１０３６５、ＷＯ９７／２７３１７、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙの第３章：  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  Ｉ．Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ（編））Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）；Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙの第３章：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ  １．Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，（Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ（編））Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）；およびＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，（１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．  Ｍ．ら（編））Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７−１９９３）。多数の組織サンプルは、当該分野で公知の技術（例えば、米国特許第４，８４３，１５５号に記載されるＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ，Ｐ．の１工程ＲＮＡ単離プロセスが挙げられる）を使用して容易に処理され得る。
【０１５６】
記載されるデバイスを利用する遺伝子発現分析において、結果に影響する重要な因子は、サンプル中の核酸濃度である。コピー数が少ない場合、ノイズは、コピー数の平方根に比例する。従って、受容可能であるとみなされる誤差のレベルは、必要とされるコピー数に左右される。特定のサンプル容量において必要とされるコピー数は、必要とされるＤＮＡ濃度を与える。必ずしも最適である必要はないが、定量反応は、５０％までの誤差レベル（しかし、好ましくはより低いレベル）で行われ得る。１ナノリットル容量を仮定した場合の特定の誤差レベルを達成するために必要とされるＤＮＡ濃度を表３に示す。理解され得るように、例えば特定のデバイスで使用される１ナノリットル容量は、微小流体デバイスを用いて実行可能な濃度において十分なコピー数の遺伝子発現産物を有する。
【０１５７】
（表３．遺伝子発現−ＤＮＡ定量）
【０１５８】
【表３】
0005502275.tif 000004
さらなる計算により、１ナノリットルの反応部位を利用する本明細書において提供される特定のデバイスは、正確な発現結果を達成するための十分なＤＮＡを含むことを実証する。具体的には、代表的なｍＲＮＡ調製手順は、約１０μｇのｍＲＮＡを生じる。代表的に、１つの細胞あたり各ｍＲＮＡの１〜１０，０００コピーが存在することが実証されている。任意の所定の細胞内で発現されるｍＲＮＡのうちで、大体、４種の最も一般的なメッセージが、総ｍＲＮＡレベルの約１３％を構成する。従って、このように高く発現されたメッセージは、１．３μｇのｍＲＮＡを含む（各々、４×１０−１２モルまたは約２．４×１０１２コピー）。前述の発現範囲を考慮して、まれなメッセージが、約２×１０−８コピーのレベルで存在することが予測される。標準的分析においてｍＲＮＡサンプルが１０μｌ中に溶解されている場合、まれなメッセージの濃度は約２×１０７コピー／μｌであり、この濃度は、１ｎｌウェルあたり２０，０００コピー（または４×１０１１Ｍ）に対応する。
【０１５９】
（３．方法）
代表的に、発現分析は定量分析を包含するので、検出は、上記に記載される定量的リアルタイムＰＣＲ方法のうちの１つを使用して、代表的には達成される。従って、ＴａｑＭａｎアプローチが利用される場合、反応部位に導入される（または前もってスポットされる）試薬は、プライマー、標識プローブ、ヌクレオチド、およびポリメラーゼのうちの１つまたは全てを含み得る。介在性色素が利用される場合、上記反応試薬混合物は、代表的に、プライマー、ヌクレオチド、ポリメラーゼ、および介在性色素のうちの１つまたは全てを含む。
【０１６０】
（Ｄ．多重化）
本明細書において記載されるアレイベースのデバイス（例えば、図１Ａ、１Ｆ、２、３Ａおよび３Ｂ、ならびに添付されるテキストを参照のこと）は、本来、同時に多数の増幅反応を行うために設計される。しかし、この特徴は、各反応部位内で多重分析（例えば、遺伝子型決定および発現分析）を行うことによってさらに容易に拡張され得る。
【０１６１】
多重増幅は、熱サイクリングプロセスの間に、例えば、目的の特定の標的核酸に各々特異的な複数のプライマーを利用することによって、単一の反応部位内でさえ行われ得る。異なる増幅産物の存在は、示差的に標識されたプローブを使用して定量的ＲＴ−ＰＣＲ反応を行うことによってか、または示差的に標識された分子ビーコンを使用することによって検出され得る（前出を参照のこと）。このようなアプローチにおいて、各々の示差的に標識されたプローブは、特定の増幅標識にのみハイブリダイズするように設計される。利用される異なる標識の賢明な選択によって、単一の反応の異なる波長において、異なる標識が励起および／または検出される分析が、行われ得る。このようなアプローチで適している適切な蛍光標識の選択に関するさらなる指標としては、以下が挙げられる：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（Ｐｅｓｃｅら（編））Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９７１）；Ｗｈｉｔｅら，Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９７０）；Ｂｅｒｌｍａｎ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒａ  ｏｆ  Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，第２版，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９７１）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｃｏｌｏｕｒ  ａｎｄ  Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，（１９７６）；Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ（Ｂｉｓｈｏｐ（編））．Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９７２３；ならびにＨａｕｇｌａｎｄ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ（１９９２）。
【０１６２】
多重遺伝子型決定および発現分析は、必要に応じて各反応部位で行われ得る。例えばＴａｑＭａｎのような定量的ＰＣＲ方法が利用される場合、目的の標的ＤＮＡの異なる領域を増幅するためのプライマーは、単一反応部位内に含まれる。各領域について示差的に標識されたプローブを利用して、形成される産物を識別する。
【０１６３】
（Ｅ．非核酸分析）
上記デバイスは、多種多様な核酸分析を行うために有用であるが、このデバイスはまた、同様に多くの他の適用においても利用され得る。上に示されるように、上記デバイスは、検出可能なシグナルまたは反応産物との相互作用の際にシグナルを生じる検出試薬と反応し得る反応産物を生じる、２種以上の物質種の間の任意の相互作用を本質的に分析するために利用され得る。
【０１６４】
従って、例えば、上記デバイスは、特定の所望の活性を有する試験因子を同定するために、多くのスクリーニング適用において利用され得る。特定の実施例として、上記デバイスは、１以上の酵素の基質またはインヒビターとしての活性について化合物をスクリーニングするために利用され得る。このような分析において、試験化合物および他の必要な酵素アッセイ試薬（例えば、緩衝液、金属イオン、補因子および基質）が、反応部位に導入される（さもなければ、前もって沈積される）。次いで酵素サンプルが導入され、そして反応（上記試験化合物が基質である場合）または反応の阻害（上記試験化合物がインヒビターである場合）が検出される。このような反応または阻害は、標準的な技術（例えば、基質の喪失および／もしくは生成物の出現を直接的または間接的にモニタリングすること）によって達成され得る。
【０１６５】
十分に大きいフローチャネルおよび反応部位を備えるデバイスは、細胞と１以上の試薬との間の相互作用を検出するための細胞アッセイを行うために利用され得る。例えば、特定の分析は、特定の細胞型がサンプル中に存在するか否かということの決定を包含する。このことを達成するための１つの例は、特定の細胞型と優先的に反応する細胞特異的色素を利用することである。従って、このような色素は、反応部位に導入され得、次いで細胞が添加され得る。細胞の染色は、標準的な顕微鏡的技術を使用して検出され得る。別の例として、試験化合物は、細胞応答（例えば、シグナル伝達経路）の誘発または阻害の能力についてスクリーニングされ得る。このような分析において、試験化合物が部位に導入され、次いで細胞が添加される。次いで、反応部位は、細胞反応の形成を検出するために調べられる。
【０１６６】
関連デバイスおよびこのようなデバイスの適用に関するさらなる考察は、同時係属かつ共同所有の米国仮特許出願６０／３３５，２９２（２００１年１１月３０日出願）に記載されており、これは、全ての目的のためにその全体が本明細書において参考として援用される。
【０１６７】
（ＸＩ．製作）
（一般的局面）
上で示唆されるように、提供される微小流体デバイスは、一般的に、単一および多層のソフトリソグラフィー（ｍｕｌｔｉｌａｙｅｒ  ｓｏｆｔ  ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ）（ＭＳＬ）技術および／または犠牲層カプセル化法（ｓａｃｒｉｆｉｃｉａｌ−ｌａｙｅｒ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）を利用して構築される。基本的なＭＳＬアプローチは、一連のエラストマー層を小型機械鋳型で鋳造する工程、その鋳型から層を取り出す工程、次いでその層を一緒に融合させる工程を包含する。犠牲層カプセル化アプローチにおいては、フォトレジストのパターンをチャネルが所望される場所に沈積する。これらの技術および微小流体デバイスを製造する方法におけるこれらの技術の使用は、例えば、以下に詳細に議論される：Ｕｎｇｅｒら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８：１１３−１１６，Ｃｈｏｕら，（２０００）「Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｅｌａｓｔｏｍｅｒ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ−Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ  ａｎｄ  ＤＮＡ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，  ｉｎ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｔａｔｅ  Ａｃｔｕａｔｏｒ  ａｎｄ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ」，Ｈｉｌｔｏｎ  Ｈｅａｄ，Ｓ．Ｃ．；ならびにＰＣＴ公開公報ＷＯ０１／０１０２５（これらの各々は、全ての目的のためにその全体が本明細書において参考として援用される）。
【０１６８】
手短に言えば、前述の製作方法は、フォトレジスト（Ｓｈｉｐｌｅｙ  ＳＪＲ  ５７４０）による写真平版によってシリコンウェーハ上に、上層（例えば、制御チャネルを有するエラストマー層）および下層（例えば、フローチャネルを有するエラストマー層）のための母鋳型（ｍｏｔｈｅｒ  ｍｏｌｄ）を製作する工程を包含する。チャネルの高さは、スピンコーティング速度によって正確に制御され得る。フォトレジストチャネルは、フォトレジストをＵＶ光に曝露して次いで顕色（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）することによって形成される。熱再フロープロセスおよび保護処置は、代表的にＭ．Ａ．Ｕｎｇｅｒ，Ｈ．−Ｐ．Ｃｈｏｕ，Ｔ．Ｔｈｒｏｓｅｎ，Ａ．ＳｃｈｅｒｅｒおよびＳ．Ｒ．Ｑｕａｋｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０００）２８８：１１３によって記載されとおりに達成され、これはその全体が本明細書において参考として援用される。次いで、混合した２部のシリコンエラストマー（ＧＥ  ＲＴＶ  ６１５）が、それぞれ下の鋳型に落ち込み（ｓｐｕｎ）そして上の鋳型に注がれる。ここで、またスピンコーティングを利用して下側のポリマー流体層の厚さを制御し得る。部分的に硬化した上側層は、８０℃のオーブンで２５分間焼くことによって鋳型からはがされ、下側層に並べて組み立てられる。８０℃で１．５時間の最後の焼きをして、これらの２つの層を不可逆的に結合させる。一旦、下側のシリコン母鋳型からはがれると、このＲＴＶデバイスは、代表的にＨＣＬで処理される（０．１Ｎ、８０℃で３０分）。この処理は、一部のＳｉ−Ｏ−Ｓｉ結合を切断するために作用し、それによってヒドロキシ基が露出して、上記チャネルをより親水性にする。
【０１６９】
次いでこのデバイスは、必要に応じて支持体上に密封してシールされ得る。この支持体は、本質的にはいずれの材料から製造されてもよいが、その表面は、形成されるシールが第一に接着力に起因する場合、良好なシールを確実にするように平坦であるべきである。適切な支持体の例としては、ガラス、プラスチックなどが挙げられる。
【０１７０】
前述の方法に従って形成されるデバイスは、フローチャネルの１つの壁を形成する基材（例えば、ガラススライド）を生じる。あるいは、一旦母鋳型から除かれたデバイスは、薄いエラストマー膜にシールされ、それによってフローチャネルは、エラストマー材料に全体的に囲まれる。次いで、得られるエラストマーデバイスは、必要に応じて基材支持体に連結され得る。
【０１７１】
（Ｂ．ブラインドチャネル設計を利用するデバイス）
（１．層形成）
製造の間に試薬が反応部位に沈積されるブラインドチャネル設計に基づく微小流体デバイスは、代表的には３層から形成される。下側の層は、試薬が沈積される層である。その下側の層は、上記のＭＬＳ方法に関して列挙される参考文献中で記載されるように、種々のエラストマー材料から形成され得る。代表的には、上記材料は、ポリジメチルシロキサン（ＰＭＤＳ）エラストマーである。特定のデバイスのために所望される反応部位の配置および位置に基づいて、適切な試薬がスポットされるべき下側層上の位置を決定することが可能である。ＰＭＤＳは親水性であるので、沈積された水性スポットは、小さくなって非常に小さなスポットを形成する。沈積された試薬は、試薬とエラストマーの表面との間に共有結合が形成されないように沈積される。なぜならば、上に記載されたように、上記試薬は、試薬が反応部位に導入されたときに、サンプル溶液中に溶解することが意図されるからである。
【０１７２】
上記デバイスの他の２つの層は、フローチャネルが形成される層であり、そして制御チャネルおよび任意の保護チャネルが形成される層である。これら２つの層は、このセクションの前の方に記載された一般的方法に従って調製される。次いで、得られる２層の構築物は、試薬が沈積される第１の層の上に配置される。これら３層の組成物の特異的な例は、以下のとおりである（成分Ｂに対する成分Ａの比）：第１の層（サンプル層）３０：１（重量）；第２の層（フローチャネル層）３０：１；および第３の層（コントロール層）４：１。しかし、これらのエラストマー成分の他の組成物および比は、同様に利用され得る。２以上の層または基材を結合する他の方法の使用には、エラストマーブロックまたは上記微小流体デバイスの他の部分を形成するための、接着剤またはプラズマ結合（好ましくは、エアープラズマ結合）が挙げられ得る。いくつかの実施形態において、孔を介して他の層と相互に連結したさらなる層（好ましくはエラストマー層）を使用して、エラストマーブロックの単位面積あたりの反応物の密度を上昇し得るか、またはエラストマーブロックのサイズを減少させ得る。
【０１７３】
このプロセスの間、上記反応部位は、沈積された試薬と共に整列され、試薬が適切な反応部位内に位置決めされるようになる。図６は、デバイスの４つの角から得た図を示す。これらの図は、沈積された試薬が前述のアプローチを利用して反応部位内に正確に整列され得ることを実証する。これらの図は、分岐フローチャネルの末端に位置決めされた保護チャネルおよび反応部位を示す。白色の円は、反応部位に対して沈積された試薬の位置を示す。示されるように、各試薬スポットは、十分にその反応部位の範囲内である。
【０１７４】
（２．スポッティング）
上記試薬は、多くの市販の試薬スポッターのいずれかを利用して、種々の確立されたスポッティング技術を用いて堆積され得る。上記デバイスの調製で利用され得る適切なスポッターの例としては、ピンスポッター、アコースティックスポッター、自動マイクロピペッター、電気泳動ポンプ、インクジェットプリンタデバイス、インクドロッププリンタ、および特定の浸透圧ポンプが挙げられる。市販のスポッターとしては、Ｃａｒｔｅｓｉａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＭｉｃｒｏＳｙｓ  ５１００（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）、Ｈｉｔａｃｈ  ＳＰＢＩＯ（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）、Ｇｅｎｅｔｉｘ  Ｑ−Ａｒｒａｙ（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ４１７（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）およびＰａｃｋａｒｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＳｐｏｔＡｒｒａｙ（Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）が挙げられる。一般的に、試薬の非常に小さいスポットが堆積される；通常は、１０ｎｌ未満のスポットが堆積され、他の例では、５ｎｌ未満、２ｎｌ未満または１ｎｌ未満、そしてさらに他の例では、０．５ｎｌ未満、０．２５ｎｌ未満、または０．１ｎｌ未満のスポットが堆積される。
【０１７５】
材料のアレイはまた、Ｆｏｄｅｒら、米国特許第５，４４５，９３４号：発明の名称「Ａｒｒａｙ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｏｎ  ａ  ｓｏｌｉｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ」（これは、参考として本明細書に援用される）に記載される方法によって形成され得、ここで、オリゴヌクレオチドプローブ（例えば、ＳＮＰプローブ）は、空間光指向性フォトリソグラフィーを用いてインサイチュで合成される。このようなアレイは、本発明の微小流体デバイスの基板またはベース（ｂａｓｅ）として使用され、その結果、反応部位に対応する基板の領域（例えば、ブラインドフィルチャンバ（ｂｌｉｎｄ  ｆｉｌｌ  ｃｈａｍｂｅｒ））が、その基板の既知の位置に配置された１つまたは好ましくは１つよりも多いオリゴヌクレオチドプローブを含む。分割する微小流体構造物の場合（例えば、本明細書の図１５に示されるもの）において、反応部位（曲がった流体チャネルに沿って正方形の箱で示される）は、複数の異なるＳＮＰプローブを含み、好ましくは個体の集団から個体を同定するのに適切なＳＮＰプローブのコレクションを含み、そして好ましくは、この曲がった流体チャネルに沿った複数の反応部位（複数の個体に由来する核酸配列を含む流体サンプルが曲がったフローチャネルに導入された場合）および作動される場合に曲がったフローチャネルと連絡する複数のバルブは、曲がったフローチャネルを分割し、それによって、各反応部位中の流体サンプルの画分を含むように、各反応部位を互いから分離する。サンプルの成分の増幅は、各反応部位内に位置するＳＮＰプローブのアレイに結合するために分子（例えば、核酸分子）の数を増加するように行われ得る。いくつかの実施形態では、曲がった流体チャネルに沿った各々の反応部位は、同じアレイであり、すなわち、配置された同じＳＮＰプローブを有し、そして他の実施形態では、曲がった流体チャネルに沿った２つ以上の反応部位は、異なるセットのＳＮＰプローブを有する。他の分割した流体チャネルアーキテクチャ（例えば、分岐システムおよび／または分岐した分岐システムなど）もまた使用され得る。他の配置技術（例えば、本明細書で記載されるスポッティング）も同様に、曲がった流体チャネルまたは一般的に分岐した流体チャネルに沿った分割可能な反応部位内に位置するアレイを形成するために使用され得る。
【０１７６】
以下の実施例は、本明細書中で開示されるデバイスおよび方法の特定の局面をさらに示すために提供される。これらの実施例は、本発明を限定するものとみなされるべきではない。
【実施例】
【０１７７】
（実施例１）
（シグナル強度評価）
Ｉ．緒言
この一連の実験の目的は、本明細書に示される設計の微小流体デバイスを用いて、Ｍａｃｒｏ  ＴａｑＭａｎ反応に関して５０％を超えるシグナル強度で、成功したＰＣＲ反応が行われ得ることを実証することであった。
【０１７８】
ＩＩ．微小流体デバイス
ＭＳＬプロセスを用いて組み立てられる三層微小流体デバイスを設計し、以下の実施例で記載される実験を行うために組み立てた。図７Ａはこのデバイスの断面図を示す。示されるように、このデバイス７００は、フローチャネルが形成される層７２２を備える。この流体層７２２は、上にある層７２０と下にあるシーリング層７２４の間にはさまれ、この上にある層は、制御層および保護層を備える。このシーリング層７２４は、フローチャネルの片側を形成する。こうして得られる三層構造物は、基板７２６（この例では、スライドまたはカバースリップ）に固定され、このことが構造的な固さを提供し、熱伝導率を増加させ、そして微小流体デバイス７００の底部からの蒸発を防止することに役立つ。
【０１７９】
図７Ｂは、フロー層７２２におけるフローチャネルの設計、ならびに制御／保護層７２０における制御チャネルおよび保護チャネルの設計の概略図を示す。デバイス７００は、１０個の独立したフローチャネル７０２からなり、各々はそれ自体の入口７０８を有し、そしてブラインドチャネル７０４を分岐し、各ブラインドチャネル７０４は１ｎｌの反応部位７０６を有する。デバイス７００は、制御ライン７１２のネットワークを含み、このネットワークは、十分な圧力が適用されるときに反応部位７０６を分離し、一連の保護チャネル７１６もまた、液体が反応部位７０６から蒸発することを妨げるために備えられる；流体は入口７１８を介して導入される。
【０１８０】
ＩＩ．実験のセットアップ
男性のヒトゲノムＤＮＡに由来するβ−アクチン遺伝子のエキソン３（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）を増幅するために、β−アクチンプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブを用いるＰＣＲ反応をデバイス７００で行った。このＴａｑＭａｎ反応は、以下の成分からなる：１×  ＴａｑＭａｎ緩衝液Ａ（５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０１Ｍ  ＥＤＴＡ、６０ｎＭ  受動的参照１（Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  １）（ＰＲ１）、ｐＨ８．３）；３．５〜４．０ｍＭ  ＭｇＣｌ；２００ｎＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、４００ｎＭ  ｄＵＴＰ；３００ｎＭ  β−アクチン順方向プライマーおよび逆方向プライマー；２００ｎＭ  ＦＡＭ標識β−アクチンプローブ；０．０１Ｕ／μｌ  ＡｍｐＥｒａｓｅＵＮＧ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ  ＣＡ）；０．１〜０．２Ｕ／μｌ  ＤｙＮＡｚｙｍｅ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅ，Ｅｓｐｏｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ）；０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ−ｘ−１００（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）；０．８μｇ／μｌ  ゼラチン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；５．０％  グリセロール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）；脱イオン水ならびに男性のゲノムＤＮＡ。この反応成分を、２５μｌの総反応容積を生じるように添加した。標的ＤＮＡ以外のすべての上記ＴａｑＭａｎ反応成分からなるネガティブコントロール（コントロール）を、ＰＣＲ反応の各セットに含めた。
【０１８１】
一旦、上記ＴａｐＭａｎ反応サンプルおよびコントロールを準備すると、１ｍｌシリンジに取り付けたゲルローディングピペットチップを用いることによって、それらを微小流体デバイス７００に注入した。このピペットチップを反応サンプルで満たし、次いで、７０８を介して流体に挿入した。すべてのブラインドチャネル７０４および反応部位７０６が満たされるまでシリンジに背圧を適用することによって、手動でフローチャネル７０２を満たした。すべてのサンプルがフローライン７０２、７０４に充填された後に、制御ライン７１２を脱イオン水で満たし、１５〜２０ｐｓｉに加圧した。この加圧した制御ライン７１２を作動させてバルブを閉じ、サンプルを１ｎｌのウェル７０６に分離した。次いで、保護チャネル７１６を脱イオン水で満たし、５〜７ｐｓｉに加圧した。ミネラルオイル（１５μｌ）（Ｓｉｇｍａ）をサーモサイクラーのフラットプレートに置き、次いで、微小流体デバイス／カバーガラス７００をこのサーモサイクラーに置いた。次いで、初期傾斜（ｉｎｉｔｉａｌ  ｒａｍｐ）、および３段階もしくは２段階のいずれかの熱サイクリングプロフィールを用いて、微小流体デバイス７００を熱サイクリングした：
１．  ９５℃まで初期傾斜し、１分間維持する（７５℃まで１秒あたり１．０℃、９５℃まで１秒あたり０．１℃）
２．  ３段階の熱サイクリングを４０サイクル（９２℃で３０秒間、５４℃で３０秒間、そして７２℃で１分間）；または
３．  ２段階の熱サイクリングを４０サイクル（９２℃で３０秒間、そして６０℃で６０秒間）。
【０１８２】
残りの反応混合物を含むＭｉｃｒｏＡｍｐチューブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）（これらを微小流体デバイスで行った反応と区別するためにＭａｃｒｏ  ＴａｑＭａｎ反応と称する）を、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）に置き、９６００モードで熱サイクリングした。このＭａｃｒｏ  ＴａｑＭａｎ反応は、微小流体デバイスで行った反応に対するマクロ的なコントロールとしての役割を果たした。上記Ｍａｃｒｏ  ＴａｑＭａｎ反応について初期傾斜速度を制御しなかったこと以外は上記微小流体デバイスのプロトコルと一致するように、熱サイクリングプロトコルを設定した。
【０１８３】
一旦、熱サイクリングが完了すると、制御ラインおよび保護ラインを減圧し、チップをガラススライド（ＶＷＲ，Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）に移した。次いで、このチップを、改変キャリアとともにＡｒｒａｙ  ＷｏＲｘ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ，Ｉｓｓａｑｕａｈ，ＷＡ）に置いた。蛍光強度を、３つの異なる励起／放射波長について測定した：４７５／５１０ｎｍ（ＦＡＭ）、５１０／５６０ｎｍ（ＶＩＣ）、および５８０／６４０ｎｍ（受動的参照１（ＰＲ１））。Ａｒｒａｙ  Ｗｏｒｋｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して、微小流体デバイスにおける蛍光を画像化し、各１ｎｌウェルのシグナル強度およびバックグラウンド強度を測定した。次いで、この結果をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌファイルを用いて分析して、β−アクチンＴａｑＭａｎ反応についてのＦＡＭ／ＰＲ１比を計算した。従来のＭａｃｒｏ  ＴａｑＭａｎについて、製造業者によって提供されたプロトコル（ＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ試薬キットプロトコル）に記載される計算を使用して、標的ＤＮＡに対するポジティブサンプルを決定した。サンプルのＦＡＭ／ＰＲ１比をコントロールのＦＡＭ／ＰＲ１比で除算することによって、シグナル強度を計算した。成功した反応を、９９％の信頼閾値レベルを超えるサンプル比として規定した。
【０１８４】
ＩＩＩ．結果
最初に、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）をＴａｑＭａｎ反応で使用し、１．５〜２．０のＦＡＭ／ＰＲ１／コントロール比を生じ、５．０〜１４．０のＭａｃｒｏ  ＴａｑＭａｎ反応比と比較した。結果はポジティブであったが、シグナル強度の増加が望ましかった。それゆえ、ＤｙＮＡｚｙｍｅポリメラーゼの熱安定性、校正、および不純物に対する抵抗性に起因して、ＡｍｐｌｉＴａｑ  ＧｏｌｄポリメラーゼをＤｙＮＡｚｙｍｅポリメラーゼに置き換えた。０．０２５Ｕ／μｌの標準的なＭａｃｒｏ  ＴａｑＭａｎ  ＤｙＮＡｚｙｍｅ濃度を、微小流体実験で使用した。このＤｙＮＡｚｙｍｅへのポリメラーゼの変更は、３．５〜５．８のＦＡＭ／ＲＯＸ／コントロール比を生じた。シグナル強度は改善されたが、一貫した結果を得ることは困難であった。理由として、いくつかのタンパク質がＰＤＭＳに結合すること、ポリメラーゼの濃度が増加したこと、および表面を改変する添加物が含まれていたことが分かっている。２つの増加させた濃度のＤｙＮＡｚｙｍｅについて試験した（微小流体デバイス中、１ｎｌあたり１００ｐｇまたは１０ｐｇのゲノムＤＮＡで、Ｍａｃｒｏ  ＴａｑＭａｎについての標準的な濃度の８倍（０．２Ｕ／μｌ）および４倍（０．１Ｕ／μｌ））。ゼラチン、グリセロール、および０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ−ｘ−１００を添加して、ポリメラーゼがＰＤＭＳに結合しないようにした。微小流体デバイス（チップ）およびＭａｃｒｏ  ＴａｑＭａｎコントロールの反応の結果を、図８に示す。
【０１８５】
微小流体ＴａｑＭａｎ反応比は、４．９〜８．３の範囲であり、一方Ｍａｃｒｏ  ＴａｑＭａｎ反応は、７．７〜９．７の範囲である。したがって、チップにおけるＴａｑＭａｎ反応のシグナル強度は、Ｍａｃｒｏ  ＴａｑＭａｎ反応の８７％までである。４倍のＤｙＮＡｚｙｍｅと８倍のＤｙＮＡｚｙｍｅとの間で有意な相違は存在しなかった。この結果は、ＰＣＲ反応が、Ｍａｃｒｏ  ＴａｑＭａｎ反応と比較した場合に、微小流体デバイスにおいて５０％よりも高いシグナル強度で行われ得ることを示す。この結果は、少なくとも４回の試みを通じて一貫している。
【０１８６】
（実施例２）
（スポッティング試薬）
Ｉ．緒言
本実験の目的は、微小流体デバイスにおける成功したスポット状の（ｓｐｏｔｔｅｄ）ＰＣＲ反応を実証することであった。この文脈において用語「スポット状の（ｓｐｏｔｔｅｄ）」とは、基板に試薬の小さな液滴（スポット）を置くことを指し、次いで、この基板は組み立てられて微小流体デバイスの一部になる。スポットした試薬は、一般的に、ＰＣＲを行うために必要とされる試薬混合物のサブセットである。
【０１８７】
ＩＩ．手順
Ａ．試薬のスポッティング
コンタクトプリンティングプロセスによって、通常の試薬のスポッティングを行った。試薬を一連の供給源のウェルから金属ピンに取り、このピンを標的基板に接触させることによって堆積させた。このプリンティングプロセスは、図９にさらに概説される。示されるように、試薬を供給源（例えば、マイクロタイタープレート）から取り、次いで、この充填したピンを基板と接触させることによってプリントした。脱イオン水中での攪拌からなる洗浄工程の後、真空乾燥させた。この試薬スポットをプリントするために使用したシステムは、ＴｅｌｅＣｈｅｍ「ＣｈｉｐＭａｋｅｒ」ブランドのピンを使用するＣａｒｔｅｓｉａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＭｉｃｒｏＳｙｓ  ５１００（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）であるが、他のシステムが上に記載されるように使用され得る。
【０１８８】
使用したピンは、Ｔｅｌｅｃｈｅｍ  ＣｈｉｐＭａｋｅｒ  ４ピンであり、このピンは、エレクトロ・ミルド・スロット（ｅｌｅｃｔｏ−ｍｉｌｌｅｄ  ｓｌｏｔ）（図９を参照のこと）を組み込んで、取り込み容積を増加させる（それゆえ、プリント可能なスポットの数が増加する）。使用した操作条件（代表的には、７５％相対湿度および温度約２５℃）下で、１つのピンで１回の充填サイクルあたり、１００個よりも多くのスポットがプリントされた。上の条件下で、ＰＤＭＳ基板上にスポットされた試薬の容積は、０．１ｎＬのオーダーである。
【０１８９】
ピンの先端部の寸法は、１２５×１２５μｍである。乾燥した試薬の最終的なスポットは、この寸法よりも実質的に小さい（直径７μｍほど）が、ピンサイズは、下限を容易に達成可能なスポット間隔に規定する。この達成可能な間隔は、最終的なデバイスにおける最も小さいウェルとウェルとのピッチを決定する。このようなデバイスおよび上記の方法を使用して、１８０μｍの間隔を有するアレイを達成した。ワーキングチップに構築したアレイは、６００ミクロン〜１３００ミクロンの間隔を有する傾向がある。
【０１９０】
スポッティングを一度に１つのピンのみを用いて行った。しかし、使用するシステムは、３２ピンまで適合し得るピンヘッドを有する。標準的なサイズのチップ（２０×２５ｍｍのオーダーのアレイの寸法）をプリンティングすることは、５分とかからない。
【０１９１】
Ｂ．スポットしたチップの組み立て
上記ＰＣＲデバイスのフロー層および制御層を、上に記載される通常のＭＳＬプロセスに従って組み立てる。微小流体デバイスの設計は、実施例１に記載されるものと同じである。平行して、３０：１の構成比Ａ：Ｂを有する１５０μｍの厚さのＰＤＭＳからなる基板層を、無地のシリコンウエハーのスピンコーティングを介して形成し、次いで、８０℃で９０分間硬化させる。
【０１９２】
硬化させた無地の基板層のＰＤＭＳ（図７Ａのシーリング／基板層７２４）は、試薬のスポッティングのための標的としての役割を果たす。スポットのパターンは、基板上にプリンティングされ、この基板はまだ無地のウエハーにある。ＰＣＲ反応のためにスポットした試薬は、増幅すべき特定の遺伝子に対して特異的なプライマーおよびプローブであった。スポットした試薬は、１：１：１の体積比の、３００ｎＭ  β−アクチン順方向プライマー（ＦＰ）、３００ｎＭ  β−アクチン逆方向プライマー（ＲＰ）、および２００ｎＭ  β−アクチンプローブ（Ｐｒｂ）を含んでいた。いくつかの場合において、スポットした混合物を濃縮することによって化学反応をさらに調整することが有用である。プライマーおよびプローブの濃度が、通常のマクロ的なレシピ値と等しいように、またはそれよりもわずかに高いように濃度を調整することにより、一貫して良好な結果が得られることが見出されている。したがって、スポットした試薬を、マクロ反応の３倍および４倍の濃度に濃縮する。試薬の濃縮は、加熱かつ真空遠心し、相対的なＦＰ：ＲＰ：Ｐｒｂ比を変えないＣｅｎｔｒｉｖａｐ中で行われる。増大したスポット濃度は、試薬を１ｎＬの反応容積に再懸濁する場合に、正しい最終濃度をもたらす。スポットされる試薬はプライマーおよびプローブに限定される必要はない：そしてまた３つすべて（ＦＰ、ＲＰおよびＰｒｂ）をスポットしなくてもよい。プローブのみをスポットする適用、またはプライマーのうちの一方をスポットする適用さえ行われ得る。サンプルプライマー／プローブセットがＴａｑＭａｎ  β−アクチンおよびＴａｑＭａｎ  ＲＮＡｓｅ−Ｐである実験を行った。
【０１９３】
基板層へのスポッティングプロセスの後に、組み合わせたフロー層と制御層（すなわち、図７Ａの層７２０および７２２）とを、スポットパターンと整列させ、接触させた。８０℃で６０分〜９０分間さらに熱して、基板を残りのチップと結合させた。チップを組み立てた後、（実施例１に記載した）ＰＣＲ反応の残りの成分をこのチップのフローチャネルに注入し、チップを実施例１に記載されるように熱サイクリングする。
【０１９４】
ＩＩＩ．結果
プライマー（順方向プライマーおよび逆方向プライマー）とプローブ分子とをスポットしたデバイスを用いて、ＰＣＲ反応が首尾よくかつ再現可能に行われた。反応が首尾よく行われたチップに由来するデータの例を、図１０に示す。
【０１９５】
スポットした試薬は、実施例１に規定されるような成功したＰＣＲ反応をもたらした。２段階および３段階の熱サイクリングプロトコルを用いて、成功した反応が行われた。
【０１９６】
（実施例３）
（遺伝子タイピング）
Ｉ．緒言
以下の実験の目的は、本明細書に記載されるような微小流体デバイスまたはチップを利用して遺伝子タイピング実験が行われ得ることを実証することであった。具体的には、上記デバイスで行われる反応が十分な感度を有するかどうかを決定し、そしてβ−アクチンのほかに、他のプライマー／プローブセットが微小流体デバイスで実施され得ることを確実にするように、これらの実験を設計した。
【０１９７】
ＩＩ．方法／結果
Ａ．ＲＮａｓｅ  Ｐ実験
ＲＮａｓｅ  Ｐ  ＴａｑＭａｎ反応（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を、実施例１に記載されるように微小流体デバイスで行って、他のプライマー／プローブセットが検出可能な結果を生じることを実証した。ＲＮａｓｅ  Ｐプライマー／プローブセットがβ−アクチンプライマー／プローブセットと対照的に単一コピー遺伝子（２コピー／ゲノム）を検出するので、ＲＮａｓｅ  Ｐ反応もまたより高いレベルの感度を必要とする。β−アクチンセットは、単一コピーβ-アクチン遺伝子および数
個の偽遺伝子を検出し、これは１ゲノムあたりまとめて合計およそ１７コピーである。β−アクチンプライマー／プローブセットをＲＮａｓｅ  Ｐプライマー／プローブセットに置き換えたことを除いて実施例１に記載したものと同じ成分で、ＲＮａｓｅ  Ｐ反応を行った。さらに、蛍光シグナルを増強するために、ＲＮａｓｅ  Ｐプライマー／プローブセットを、製造業者の推奨する値の４倍で使用した。ＶＩＣ色素をＲＮａｓｅ  Ｐに対するプローブに結合させ、この分析をＶＩＣ／ＰＲ１比に集中した。４回の実験のうちの１つの結果を、図１１に示す。
【０１９８】
Ｍａｃｒｏ  ＴａｑＭａｎ反応についてのＶＩＣ／ＰＲ１／コントロール比は、１．２３である。微小流体デバイスにおけるＴａｑＭａｎ反応についての対応する比は、１．１１および１．１２である。微小流体デバイスにおけるゲノムＤＮＡサンプルの比は、９９％の信頼閾値レベルを上回る。さらに、微小流体デバイスにおけるＴａｑＭａｎ反応のシグナル強度は、Ｍａｃｒｏ  ＴａｑＭａｎ反応の５０％および９３．７％である。微小流体デバイスにおけるコントロールのＴａｑＭａｎ反応は、０．００６および０．０１２の標準偏差を有し、これは、微小流体デバイスにわたる反応の一貫性を示す。したがって、上記チップにおけるＴａｑＭａｎ反応が、１ゲノムあたり２コピーを検出するのに十分に感度がよいことが決定される。
【０１９９】
Ｂ．ＤＮＡ希釈実験
微小流体デバイスにおけるＴａｑＭａｎ反応の感度をさらに決定するために、β−アクチンプライマー／プローブセットを用いて、ゲノムＤＮＡの希釈物を試験した。反応組成は、４倍のＤｙＮＡｚｙｍｅおよびゲノムＤＮＡの希釈物を用いて、概して、実施例１に記載されるように構成した。ゲノムＤＮＡを、０．２５ｐｇ／ｎｌ（これは、１ｎｌあたり約１コピーに対応する）まで希釈した。１つの希釈シリーズの結果を、図１２に示す。
【０２００】
ポアソン分布によれば、平均標的数が１の場合、ウェルの総数の３７％がネガティブであるべきである。ウェル番号５、６および７は、計算閾値よりも下であり、したがって、ネガティブである。このことは、微小流体チップにおけるβ−アクチンＴａｑＭａｎ反応が、１ｎｌあたり平均１コピーを検出し得ることを示唆する。したがって、微小流体デバイスにおける反応の感度は、遺伝子タイピング実験を行うのに十分である。
【０２０１】
Ｃ．遺伝子タイピング実験
微小流体デバイスにおけるＴａｑＭａｎは少ない標的数を検出し得るので、ＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ：一塩基多型）遺伝子タイピングの予備試験を、Ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  Ａｌｌｅｌｉｃ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、ＣＹＰ２Ｄ６  Ｐ４５０シトクロム遺伝子に対して行った。このキットは、１つのプライマーセットおよび２つのプローブ；野生型対立遺伝子もしくは参照対立遺伝子に対して標識されたＦＡＭ、ＣＹＰ２Ｄ６＊１、およびＣＹＰ２Ｄ６＊３変異体対立遺伝子もしくは改変体遺伝子に対して標識されたＶＩＣを含む。ゲノムＤＮＡとともに各々の対立遺伝子に対するポジティブコントロール（ＰＣＲ産物）を、実施例１に記載される条件と同じ条件を用いて、上記デバイスで試験した。１つの実験に由来する結果を、図１３および図１４に示す。実験を少なくとも３回繰り返して、結果を確認し、信頼性を実証した。
【０２０２】
図１３に示されるように、Ａｌ−１（対立遺伝子１、ＣＹＰ２Ｄ６＊１野生型対立遺伝子）およびゲノムＤＮＡ（１００ｐｇ／ｎｌ）は、それぞれ、３．５および２．２の平均ＶＩＣ／ＰＲ１／コントロール比を生じ、これは、このゲノムＤＮＡがＣＹＰ２Ｄ６＊１（野生型対立遺伝子）に対してポジティブであったことを示す。これらの値は、反応についての閾値限界を上回る。微小流体デバイスにおけるＴａｑＭａｎ反応のシグナル強度は、それぞれ、Ｍａｃｒｏ  ＴａｑＭａｎコントロールの５９％および４０％である。Ａｌ−２（対立遺伝子２、ＣＹＰ２Ｄ６＊３変異体対立遺伝子もしくは改変体遺伝子）（これは、ＶＩＣチャネルにおいてネガティブであるべきである）は、コントロールを超えるいくつかのシグナルを示し（１．５）、これは、ＦＡＭ蛍光が検出器のＶＩＣチャネルに漏れることに起因するものと思われる。この漏出は、改善された検出プロセスによって最小限にされ得る。
【０２０３】
Ａｌ−２ポジティブコントロールは、３．０の平均ＦＡＭ／ＰＲ１／コントロール比を生じ、これは、Ｍａｃｒｏ  ＴａｑＭａｎシグナルの３７％であり、計算閾値限界を上回った（図１４を参照のこと）。ゲノムサンプルは、ＣＹＰ２Ｄ６＊３変異体対立遺伝子に対してネガティブであり、ＣＹＰ２Ｄ６＊３対立遺伝子の頻度が低いので予期された結果である。再度、検出器のＦＡＭチャネルへのＡｌ−１、ＶＩＣプローブのいくらかの漏出が存在するようである。全体的に、ＳＮＰ検出反応は、微小流体デバイスで成功した。
【０２０４】
（実施例４）
（ゲル電気泳動によるＰＣＲの確認）
Ｉ．緒言
ＤＮＡの増幅を証明する代替的な方法が微小流体デバイスで生じるように、ゲル電気泳動によってＰＣＲ産物を検出するための実験を行った。ＴａｑＭａｎプローブを省きβ−アクチン順方向プライマーをＦＡＭに結合させたことを除いて、ＰＣＲ反応組成は実施例１に記載したとおりであった。
【０２０５】
ＩＩ．手順
Ａ．微小流体デバイス
ＭＳＬプロセスを使用して製造される三層微小流体デバイスを、本実施例に記載される実験を行うために設計し、製造した；図１５は、この設計の概略図を示す。このデバイス１５００は、概して、サンプル領域１５０２および制御領域１５０４からなる。サンプル領域１５０２は、フローチャネル１５０６に沿って配置された長方形で表される３４１個の１ｎｌ反応部位１５０８を含み、このフローチャネルは、入口孔１５１０および出口孔１５１２を備える。制御領域１５０４は、３つの制御フローチャネル１５１４を含み、各々が１０個の１ｎｌの反応部位１５１８（これもまた長方形で表される）および入口孔１５１６を含む。制御ライン１５２２のネットワークは、十分な圧力が入口孔１５２４に適用される場合に、各々の反応部位１５０８、１５１８を分離する。一連の保護チャネル１５２０は、液体が反応部位１５０８、１５１８からエバポレートするのを防ぐために備えられる。このデバイスは、実施例１に記載されるように三層デバイスである（図７Ａを参照のこと）。この全チップがカバースリップに置かれる。
【０２０６】
Ｂ．実験のセットアップ
微小流体デバイス１５００を充填し、実施例１に記載される３つの温度プロフィールを用いて熱サイクリングした。残りの反応サンプルを、微小流体デバイス１５００に関する熱サイクリングプロフィールと同じ熱サイクリングプロフィールを用いてＧｅｎｅＡｍｐ  ９７００で熱サイクリングした。熱サイクリングが完了した後、反応生成物を回収した。増幅されたＤＮＡを回収するために、３μｌの水をサンプル入力孔１５０６に注入し、そして３〜４μｌの生成物を出口孔１５１２から取り出した。デバイス１５００およびＭａｃｒｏ反応からの反応生成物を、２μｌのＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（ＵＳＢ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）（これは、ＤＮＡエキソヌクレアーゼＩおよびＳｈｒｉｍｐアルカリホスファターゼからなる）で処理して、過剰なヌクレオチドおよびプライマーを除去した。Ｍａｃｒｏ生成物を、１：１０〜１：１０６に希釈した。デバイス１５００からの生成物を脱水し、４μｌのホルムアミドに再懸濁させた。
【０２０７】
ＩＩＩ．結果
両方の生成物を、ネガティブコントロールとともに、ポリアクリルアミドゲルで分析した。図１６は、ゲル電気泳動の結果を示す。長さ２９４塩基対の適切なサイズのＤＮＡバンドが、図１６で観察される。
【０２０８】
Ｍａｃｒｏ反応に由来する生成物は、ゲルの左手側に示され、これは、β−アクチンＰＣＲ産物の予測されるサイズである約２９４塩基対に対応する。ネガティブコントロールは、ＰＣＲ産物を欠く。同様に、上記デバイスに由来する生成物は、予測されるβ−アクチンＰＣＲ産物を生じた。したがって、標的ＤＮＡは、微小流体デバイスで増幅された。
【０２０９】
（実施例５）
（大規模な分割）
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、分子生物学において必須のツールになっている。感度（ＤＮＡの単一分子の増幅）、特異性（一塩基ミスマッチを区別すること）およびダイナミックレンジ（リアルタイム計測で１０５）の組み合わせは、ＰＣＲを既存の最も強力な分析ツールの１つにする。ＰＣＲの性能により反応容積が減少するように改善されることが実証された：本発明者らは、単一の微小流体チップで、１反応あたり９０ｐＬの容積で単一のテンプレート分子感度で、２１，０００の同時ＰＣＲ反応を行った。
【０２１０】
図１７ａ〜図１７ｄは、微小流体デバイスを分割する単一のバンク（ｂａｎｋ）および二重のバンクを示す。ここで、多層ソフトリソグラフィー（ＭＳＬ）（１）を使用して、エラストマー微小流体チップを作製し、このチップは、数種の液体サンプルの各々を多数の分離した反応容積に大規模に分割するための能動バルブを使用する。入口１７０３（これは、微小流体デバイス１７０１の分岐した分割チャネルシステム１７０５に連絡している（図１７ｂ））へのサンプルの注入の後、各サンプルの２４００の９０ｐＬ容積１７０９を、単純な微小流体チャネルに沿って間隔をあけた閉鎖バルブ１７０７によって分離する（図１７ｄ）。次いで、このチップデバイスを、フラットプレートサーモサイクラーで熱サイクリングし、市販の蛍光読み取り器で画像化する。
【０２１１】
テンプレートＤＮＡの濃度を変化させ、そしてポジティブなＴａｑｍａｎｔｍシグナルを生じたウェルの数を測定することによって、上記チップにおいてＰＣＲの性能を評価した。本発明者らは、１ウェルあたりの平均コピー数が少ない場合にデジタル増幅が観察されることを見出した（図１８ａおよび図１８ｂ）。１ウェルあたりの平均コピー数が１未満である場合でも、強いポジティブシグナルおよび明らかにネガティブなシグナルの混合が観察される；これは、単一コピーの標的でも良好な増幅が生じ得ることを意味する。ポジティブなウェルの数は、ポアソン分布によって１以上の標的のコピーを有すると計算されたウェルの数と一致した（図１９）。この結果は、このシステムが単一コピーの標的からでも一貫して増幅を生じることを実証する。微小流体ＴａｑｍａｎｔｍＰＣＲに由来する蛍光シグナル強度は、同じＤＮＡ濃度でのＭａｃｒｏ  ＰＣＲ反応（このマクロ反応は、１反応あたり１０４を超えるテンプレートコピーを含んでいたが）に匹敵した。
【０２１２】
おそらく観察された忠実度の主な源は、標的の有効濃度である：９０ｐＬ容積中の単一分子は、５μＬ容積中の単一分子よりも５５，０００倍濃縮されている。標的の分子数（ｎｔ）は変化せず（すなわち、ｎｔ＝１）、副反応を生じ得る分子の数（ｎｓ）（すなわち、サンプル中のプライマーダイマーおよび非相補的ＤＮＡ配列）は容積に対して直線的に比例する（すなわち、ｎｓ∝Ｖ）ので、副反応に対する標的の比は、容積に対して反比例（ｎｔ／ｎｓ∝１／Ｖ）する。副反応はＰＣＲの失敗の主な原因であるので（４）、反応の容積を減少させることに対する利点は明らかである。
【０２１３】
テンプレートの単一コピーからのＰＣＲ増幅は、以前に報告されている（５）。しかし、マクロ容積中の単一コピーから信頼性のある増幅を得る現在の方法は、多くの場合、変更された熱サイクリングプロトコル（例えば、長い伸長時間、多くのサイクル数）、ミスプライミングおよび非特異的な増幅に対する予防（例えば、「ホットスタート」ＰＣＲ（ポリメラーゼの熱活性化）、「ブースター」ＰＣＲ、非特異的なハイブリダイゼーションを減少させるための添加物など）を必要とし、ほとんどの場合、２ラウンドのＰＣＲ（第一のＰＣＲのアリコートが第二の反応においてテンプレートとして使用される）で完了する。対照的に、このシステムは、標準的な条件（既製のプライマーおよびプローブ）ならびに１ラウンドの標準的な熱サイクリングプロトコルを用いて、単一コピーから信頼性のある増幅を達成する。完全に封入されれば、環境汚染に対してほぼ耐えられる。多くの数のＰＣＲ反応を行う能力は、同時に、マクロ容積と比較して明らかなロジスティックな費用利益および時間利益を与える（２１，０００個の反応を備える１つのチップ  対  ２１９個の個々の９６ウェルプレート、ならびに関連する時間、機器およびトラッキングインフラ）。
【０２１４】
デジタルＰＣＲ読み出しを伴う大規模分割の原理は、サンプル中の標的濃度の絶対的定量化に使用され得る。例えば、単純に特定の対立遺伝子もしくは上に記載される多くの対立遺伝子に対してポジティブであるウェルの数をカウントすることによってプールされたゲノムＤＮＡサンプルを遺伝子タイピングするために、使用され得る。副反応に対する増大した抵抗性に起因して、野生型ＤＮＡのバックグラウンドにおける変異体を定量すること（癌の検出において関係する問題）においても有用であるはずである。分割することによる濃縮の一般的な原理はまた、単一の分子、細菌、ウイルスまたは細胞の検出が目的である他の反応（例えば、タンパク質検出のためのＥＬＩＳＡ反応）においても有用であり得る。デジタルＰＣＲは、Ｂｒｏｗｎら、米国特許第６，１４３，４９６号、発明の名称「Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｓａｍｐｌｉｎｇ，ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ，ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｈａｖｉｎｇ  ｎａｎｏｌｉｔｅｒ−ｓｉｚｅｄ  ｃｈａｍｂｅｒｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｆｉｌｌｉｎｇ  ｃｈａｍｂｅｒｓ」、およびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎら、米国特許第６，４４６，７０６号、発明の名称「Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ」によって記載されており、これらの両方はその全体が参考として本明細書に援用される。微小流体工学を用いて達成され得る小さい容積は、大規模な並列度および非常に高い標的  対  バックグラウンドの濃度比の両方を可能にする。高い標的  対  バックグラウンド比は、単一分子増幅の忠実さを可能にする。これらの因子は、ＰＣＲについてより小さいものが現実にはより良いことを示唆する。
【０２１５】
本発明は、微小流体環境においてデジタルＰＣＲを行うための方法およびデバイスを提供し、この方法は、流体チャネルをその中に有する微小流体デバイスを提供する工程であって、この流体チャネルはこのチャネルに結合される２つ以上のバルブを有し、このバルブは、作動されるときに、流体チャネルを２つ以上の反応部位もしくはチャンバに分割し得る、工程；少なくとも１つの標的核酸ポリマーを含むサンプルを導入する工程；バルブを作動させて、流体サンプルを２つ以上の部分に分割する工程であって、少なくとも１つの部分が標的核酸ポリマーを含み、別の部分は標的核酸ポリマーを含まない、工程；標的核酸ポリマーを増幅する工程；ならびに標的分子を含む流体チャネル部分の数を決定する工程を包含する。好ましい実施形態では、微小流体デバイスは、エラストマー材料を含み、より好ましくは、エラストマー材料を含む少なくとも１つの層を含む。特定の好ましい実施形態では、微小流体デバイスはさらに、湾曲可能な膜を含み、この湾曲可能な膜は、流体チャネル内の流体の流れを制御するように、および／または流体チャネルの一部分を別の部分から分割するように流体チャネル内および流体チャネル外に湾曲可能であり、好ましくは、この湾曲可能な膜は、デバイスに形成されるチャネルもしくは凹部を有する微小流体デバイスの層に不可欠であり、そして好ましくは、湾曲可能な膜は、第一の層における第一のチャネルがその微小流体デバイスの第二の層における第二のチャネルによって重なる場合に形成される。いくつかの実施形態では、サンプル流体は、増幅反応を行うのに必要な成分のすべてを含むが、他の実施形態では、微小流体デバイスは、サンプル流体の導入前に、増幅反応の少なくとも１つの成分を含む。いくつかの実施形態では、微小流体デバイスはさらに検出試薬を含み、好ましくは、標的核酸ポリマーの少なくとも一部分に相補的な１つ以上の核酸ポリマー、好ましくは、微小流体デバイスの反応部位もしくはチャンバ内に別々に配置される複数の異なる核酸ポリマーを含む。
【０２１６】
増幅は、熱サイクリング反応（例えば、ＰＣＲ）、または等温反応（例えば、米国特許出願番号第１０／１９６，７４０号（これは、ＵＳ  ２００３／０１３８８００  Ａ１として公開されている）（これは、等温増幅スキームを教示する目的のためにその全体が参考として本明細書に援用される）においてＶａｎ  Ｎｅｓｓらによって記載されるような反応）によって達成され得る。
【０２１７】
本発明はさらに、特に、タンパク質の変性温度がそのタンパク質が別の部分（例えば、リガンドまたは化合物あるいは他のタンパク質）と相互作用するときに変化する場合に、タンパク質の構造変化（例えば、変性）を測定するために蛍光色素（例えば、ＳＹＢＥＲ  Ｇｒｅｅｎ（ＴＭ））を用いるタンパク質マイクロ熱量アッセイを提供する。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（ＴＭ）を用いることのさらなる利点は、このＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（ＴＭ）が他のＵＶ領域の色素よりも短い波長で使用され、それゆえ、多くのプラスチック材料で典型的に関連するバックグラウンドの問題を減少させることである。
【０２１８】
図２２Ｂは、図２２Ａに示される構成要素を備え、そしてさらに、完全な微小流体デバイス２８９９（図２２Ｃ）を形成するために、基板２８００のエラストマーブロック位置２８０７に、付着されたか、または、より好ましくは、接着剤を用いて接着され、そして、なおより好ましくは、好ましくは接着剤を使用せず、直接接着された、エラストマーブロック２８０８を備える、完全な微小流体デバイス２８９９の分解図を示す。エラストマーブロック２８０８内には、１以上の孔２８１４と流体連通する、１以上のチャネルがあり、この孔は、今度は、エラストマーブロック内のチャネルと、基板内のチャネルとの間に流体連通を提供し、次いで、基板２８００のウェル２８０５とエラストマーブロック２８０８内のチャネルとの間に流体連通を提供するために、ウェルの列２８０６ａ〜ｄ内のウェル２８０５につながる。蓄圧器ウェルの上部２８０９および２８１０は、蓄圧器ウェル２８０１および２８０２に取り付けられて、蓄圧器チャンバ２８１５および２８１６を形成する。蓄圧器ウェルの上部２８０９および２８１０は、それぞれ、バルブ２８１２および２８１１を備え、これらは、好ましくは、圧力下で蓄圧器チャンバ２８１５および２８１６内に気体を導入および保持するためのチェックバルブである。バルブ２８１１および２８１２は、ドライウェル２８０２および２８０４の内側に据え付けられ、液体が、蓄圧器チャンバ２８１５および２８１６内に存在する場合、バルブ２８１１および２８１２と接触しない状態を保つ。バルブ２８１１および２８１２は、好ましくは、シェーブ、ピンなどを、好ましいチェックバルブ内に押し付けて、チェックバルブの自己封鎖力に打ち克って、蓄圧器チャンバからの圧力の解放を可能にして、蓄圧器チャンバ内に含まれる流体の圧力を減少させることによって、機械的に開放され得る。
【０２１９】
図２２Ｂは、図２２Ａに示される構成要素を備え、そしてさらに、完全な微小流体デバイス２８９９（図２２Ｃ）を形成するために、基板２８００のエラストマーブロック位置２８０７に、付着されたか、または、より好ましくは、接着され、そして、なおより好ましくは、好ましくは接着剤を使用せず、直接接着された、エラストマーブロック２８０８を備える、完全な微小流体デバイス２８９９の分解図を示す。エラストマーブロック２８０８内には、１以上の孔２８１４と流体連通する、１以上のチャネルがあり、この孔は、今度は、エラストマーブロック内のチャネルと、基板内のチャネルとの間に流体連通を提供し、次いで、基板２８００のウェル２８０５とエラストマーブロック２８０８内のチャネルとの間に流体連通を提供するために、ウェルの列２８０６ａ〜ｄ内のウェル２８０５につながる。蓄圧器ウェルの上部２８０９および２８１０は、蓄圧器ウェル２８０１および２８０２に取り付けられて、蓄圧器チャンバ２８１５および２８１６を形成する。蓄圧器ウェルの上部２８０９および２８１０は、それぞれ、バルブ２８１２および２８１１を備え、これらは、好ましくは、圧力下で蓄圧器チャンバ２８１５および２８１６内に気体を導入および保持するためのチェックバルブである。バルブ２８１１および２８１２は、ドライウェル２８０２および２８０４の内側に据え付けられ、液体が、蓄圧器チャンバ２８１５および２８１６内に存在する場合、バルブ２８１１および２８１２と接触しない状態を保つ。バルブ２８１１および２８１２は、好ましくは、シェーブ、ピンなどを、好ましいチェックバルブ内に押し付けて、チェックバルブの自己封鎖力に打ち克って、蓄圧器チャンバからの圧力の解放を可能にして、蓄圧器チャンバ内に含まれる流体の圧力を減少させることによって、機械的に開放され得る。
【０２２０】
図２２Ｄは、微小流体デバイス２８９９およびウェル２８０５の平面図を示し、ここで、ポートは、基板２８００内（好ましくは、ウェル２８０５に対向する基板２８００の側面上）に形成されるチャネル内に、ウェルから流体を通過させるために、ウェルの基部（好ましくは底部）、あるいは、ウェル２８０５の側部に隣接して配置されている。特に好ましい実施形態において、基板２８００は、内部に凹部が成形されており、この凹部は、シーリング層（好ましくは、接着フィルムまたはシーリング層）によって、チャネル内に作製されている。
【０２２１】
基板２８００およびその関連する構成要素は、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、高密度ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレンＰＴＦＥまたはテフロン（登録商標）（Ｒ）などのポリマー、ガラス、石英、または金属（例えば、アルミニウム）、透明材料、ポリシリコンなどから製作され得る。アキュムレーターウェル上部２８０９および２８１０は、接近ねじ２８１３をさらに備え得、これは、アキュムレーターチャンバー２８１５および２８１６からガスまたは液体を導入または除去するために取り外され得る。好ましくは、バルブ２８１２および２８１１は、流体圧力を解放するために作動され得、そうでなければ、アキュムレーターチャンバー２８１５および２８１６の内側に保持される。ノッチ２８１７は、微小流体デバイスの、その他の機器、例えば、微小流体デバイスまたはその中で実施される反応を作動または分析するために用いられる機器中への正確な配置を支援するために用いられる。図２２Ｄは、エラストマーブロック領域２８０７を取り囲む水和チャンバー２８５０をさらに描写し、これは、水和カバー２８５１で覆われ得、加湿チャンバーを形成し、このエラストマーブロックの周りの湿度の制御を容易にする。湿度は、揮発性の液体、例えば、水を、好ましくは、吸い取り材料またはスポンジを濡らすことによって加湿チャンバー２８５１に添加することにより増加され得る。好ましくは、ポリビニルアルコールが用いられる。湿度制御は、好ましくは、吸い取り材料またはスポンジを濡らすために用いられるポリビニルアルコールと水との比率を変えることによって達成され得る。水和はまた、ＨＵＭＩＤＩＰＡＫ（商標）加湿パッケージのような湿度制御デバイスを用いることにより制御され得、これは、例えば、所望の湿度レベルを維持するために適切な塩濃度を有する塩溶液を保持する、水蒸気透過性であるが液体不透過性のエンベロープを用いる。Ｓａａｒｉらによる米国特許第６，２４４，４３２号を参照のこと。この特許は、湿度制御デバイスおよび方法の特定の目的を含むすべての目的のために本明細書中に参考として援用される。水和カバー２８５０は、好ましくは、使用の間にエラストマーブロック内の事象が見えることを妨げないよう透明である。同様に、エラストマーブロック領域２８０７の下の基板２８００の部分は、好ましくは透明であるが、不透過性または反射性であっても良い。
【０２２２】
図２２Ｅは、エラストマーブロック２８０８とは反対の基板２８００の側面に取り付けられるシール層２８８１に沿ったエラストマーブロック領域２８０７中に位置されるエラストマーブロック８０８を備えた基板２８００の断面図を描写している。ウェル２８０５は、第１のポート２８９０、チャネル２８７０、および第２のポート２８９２を通じ、そして基板２８００の上面２８９７によってシールされチャネル２８８５を形成するエラストマー層２８０８の凹部中へと、エラストマーブロック２８０８と流体連通している。シール層２８８１は、基板２８００の底面２８９８に成形または機械加工される凹部からチャネル２８７０を形成する。シール層２８８１は、好ましくは、透明材料であり、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、またはポリプロピレンである。１つの実施形態では、シール層２８８１は、接着テープにおけるように可撓性であり、そして接着剤または熱シールでのように結合により、または圧縮によるように機械的に基板２８００に取り付けられ得る。好ましくは、シール層２８８１のための材料は、最小の漏れで流体チャネルを形成するために各々の凹部とともに流体シールを形成するように順応している。シール層２８８１は、剛直であるさらなる支持層（図示せず）によってさらに支持され得る。別の実施形態では、シール層２８８１は剛直である。
【０２２３】
流体の至近距離からの詳細は、エラストマーブロック２８０８と基板２８００のエラストマーブロック領域２８０７との間の界面を示す。同時係属中のＧｒｏｓｓｍａｎらによる米国特許出願第１１／０４３，３９５号中に記載されように、エラストマーブロックは、一緒に結合されたエラストマー材料の複数層から形成され得、エラストマーブロックを形成し、この特許出願は、本明細書中およびこの特許出願で記載されるすべての目的のため、および集積キャリアおよび自動作動デバイスの使用に関するさらなる詳細を開示する目的のために本明細書中に援用される。好ましくは、エラストマーブロックの少なくとも２つの層は凹部を有する。例えば、その中に形成された凹部を有する第１のエラストマー層は、その中に形成された凹部を有する第２のエラストマー層に結合され、その中に形成された凹部を有するエラストマーブロックを形成する。第１のエラストマー層の凹部は、全体または部分的に閉鎖され、第１のエラストマー層中にチャネルを形成する。第２のエラストマー層中に形成された凹部は、同様に、このエラストマー層が基板に結合されるとき全体または部分的に閉鎖され、第２のエラストマー層中にチャネルを形成し、それによって、その中に形成されたチャネルを備えた複数層を有する微小流体デバイスを形成する。
【０２２４】
図２３では、その中に形成された第１の凹部２９０１を備えた底面を有する第１のエラストマー層２９２０、ならびに上面およびその中に形成された第２の凹部２９０５を備えた底面を有する第２のエラストマー層２９２３は、一緒に結合されて、第１の凹部２９０１および第２のエラストマー層２９２３の上面から形成されるチャネル２９０７を有するエラストマーブロックを形成する。基板２８００は、第２のエラストマー層２９２３の底面に取り付けられ、基板２８００の上面２８９７および第２のエラストマー層２９２３の底面からチャネル２９０９を形成する。ポート２８９２は、基板２８００のチャネル２８７２を、基板２８００の上面によって部分的に形成される第２のエラストマー層のチャネル２９０９と連結し得る。あるいは、図２３に示されるように、ポート２８９２は、基板２８００のチャネル２８７２を、孔２９５０を通りエラストマーブロック２８０８の第１のエラストマー層２９２０のチャネル２９０７と連結する。孔２９５０は、エラストマー層２９２０とのその結合の前に、基板表面２８９７にほぼ垂直に形成され、好ましくは第２のエラストマー層２９２３中に形成され、そしてより好ましくは、第１および第２のエラストマー層が一緒に結合された後に形成される。同時係属中であり、そして２００４年３月２９日に出願され、本出願人に譲渡されたＵｎｇｅｒによる米国仮特許出願第６０／５５７、７１５号を参照のこと。この特許出願は、すべての目的および自動化レーザーアブレーションシステムおよび方法を用いる形成を経由する教示の特有の目的のために参考として援用される。孔を生成するための例示の方法は、第２のエラストマー層２９２３を形成する間のマイクロ製作、レーザー穿孔、ＣＯ２レーザーを用いたレーザー穿孔、エキシマレーザーを用いたレーザー穿孔、機械的穿孔、およびコアリング（心抜）を含み、好ましくは、ここで、上記穿孔は、ロボット穿孔システム、好ましくはｘ、ｙ自動化ステージを有するシステムによって実施される。
【０２２５】
図２３は、本明細書中に記載される微小流体デバイス中の孔の別の好ましい使用の断面図を描写する。微小流体ブロック２９２１は、その中に形成された第１の層の凹部（または第２の層に結合されるときチャネル）２９０７を有する第１の層２９２０、およびその中の第２の層の凹部（または基板に結合されるときチャネル）を有する第２の層２９２３を含む。２つの第２の層のチャネルは、２つ以上の孔２９５０により第１の層のチャネルを通って流体連通している。好ましくは、少なくとも１つの孔２９５０が、基板の凹部２８９２（またはシール層（図示せず）が基板２８００に結合される場合、チャネル）を通って基板２８００のウェル２９９９とさらに流体連通している。少なくとも１つの第２の層のチャネル２９０９は、流体連通することなく第１の層のチャネル２９０７の一部によって重複される。図２３に示される実施形態では、微小流体デバイスの単位面積あたりの反応および／または検出ゾーンのより高い密度が達成され得る。なぜなら、１つの層中の流体チャネルが、同じ層内の介在する流体チャネルの上また下に経路を取り得るからである。アブレーション残渣チャンバー２９８９が、レーザー切除孔２９５０から生成された残渣を捕捉するために存在する。残渣チャンバー２９８９は、２層キャスティング法により層２９２０中にキャストされ得、ここで、フォトレジストの第１の層がパターン化および顕色された後、フォトレジストの第２の層が第１のパターンの上に重層され、そして第２のパターンが第１のフォトレジスト層のパターンの上に、フォトレジストのパターンの領域が異なる高さであり得るように形成される。複数の層が互いの上に構築され得、変化する高さのパターンを生成する。異なるフォトレジスト材料もまた、例えば、フォトレジストの上層が加熱されるとき再び流れ得るように用いられ得、その一方、下層は、同じ加熱温度で実質的に再び流れないフォトレジストから作製される。
【０２２６】
本発明のフローチャネルは、必要に応じて、異なる断面サイズおよび形状で設計され得、それらの所望の適用に依存して異なる利点を提供する。例えば、下部フローチャネルの断面形状は、その全長に沿って、または上部交差チャネルの下に配置される領域のいずれかに、湾曲した上面を有し得る。このような湾曲した上面は、以下のようにバルブのシールを容易にする。本発明によって企図される膜厚みプロフィールおよびフローチャネル断面は、矩形、台形、円形、楕円、放物線、双曲線、および多角形、ならびに上記形状の断面を含む。フローチャネル中に突出部を備えた実施形態または凹面を有する実施形態のようなより複雑な断面形状もまた、本発明によって企図される。
【０２２７】
さらに、本発明を、フローチャネルの壁および天井がエラストマーから形成され、そしてチャネルの床が下にある基板から形成される実施形態と組合せて主に記載されているけれども、本発明は、この特定の配向に制限されない。フローチャネルの天井のみがエラストマーから構築されて、チャネルの壁および床はまた、下にある基板中に形成され得る。このエラストマーフローチャネル天井は、付与される作動力に応答してチャネル中に下方に突出し、それによって、このフローチャネルを通る材料の流れを制御する。一般に、モノリシックなエラストマー構造物が、微小流体用途のために好ましい。しかし、基板中に形成されたチャネルを採用することが、このような配置が利点を提供するような場合には、有用であり得る。例えば、光学的導波管を含む基板は、この光学的導波管が、光りを、微小流体チャネルの側面に特異的に向けるように構築され得る。
【０２２８】
本発明の微小流体デバイスは、スタンドアローンのデバイスとして用いられ得るか、または、好ましくは、本発明により提供されるシステムの一部として用いられ得る。図２４は、微小流体デバイスを作動するロボットステーションの斜視図を描写する。自動化空気力制御およびアキュムレーターチャージングステーション３２００は、図２２Ａ〜２２Ｅに描写されるタイプのような本発明の微小流体デバイス３２０５を保持するための受容ベイ３２０３を含む。プラテン３２０７は、微小流体デバイス３２０５の上面３２０９と接触するように適合される。プラテン３２０７は、その中に微小デバイス３２０５と整列するポートを有し、流体圧力、好ましくはガス圧力を微小流体デバイス３２０５内のウェルおよびアキュムレーターに提供する。１つの実施形態では、プラテン３２０７は、アーム３２１１の動きによって微小流体デバイス３２０５の上面３２２１に対して押され、このアームは、ピボット３２１３上にヒンジ付けされ、そして１つの端部でアーム３２１１に取り付けられ、そして他方の端部でプラットホーム３２１７に取り付けられるピストン３２１５によって動かされる。ピストン３２１５に沿ったセンサーは、ピストンの動きを検出し、そしてピストン位置に関する情報を、コントローラー、好ましくはソフトウェアスクリプトに従うコンピューター（図示せず）の制御下のコントローラーにリレーする。プレート検出器３２１９は、受容ベイ３２０３の内側の微小流体デバイス３２０５の存在を検出し、そして好ましくは、微小流体デバイス３２０５の適正な配向を検出し得る。これは、例えば、微小流体デバイス３２０５の側面から光を反射することにより微小流体デバイス３２０５の存在および配向を光学的に検出することにより生じ得る。プラテン３２０７は、ロボットにより、空気力により、電気的に、などで低下され得る。いくつかの実施形態では、プラテン３２０７は、手動で低下され、デバイス３２０５に係合させる。
【０２２９】
１つの実施形態では、プラテン３２０７に至る流体ラインは、アーム３２１１内に位置し、そして流体圧力源、好ましくは、コントローラーの制御下の自動空気力圧力源に連結される。この圧力源は、プラテン３２０７のプラテン面（図示せず）内のポートに制御された流体圧力を提供し、微小流体デバイス３２０５に制御された加圧流体を提供する。プラテン３２０７の微細位置決めが、少なくとも一部、ジンバル接続部３２２３を採用することにより達成され、ここで、プラテン３２０７は、微小流体デバイス３２０５の上面３２２１に垂直な軸の周りで角運動し得るようにアーム３２１１に取り付けられる。
【０２３０】
図２５は微小流体デバイス３２０５の上面３２２１に対して押されたプラテン３２０７の一部切断側面図を描写している。プラテン３２０７は、微小流体デバイス３２０５の上面３２２１に対して押され、微小流体デバイス３２０５とプラテン面３２２７との間、またはデバイス３２０５の一部と面３２２７の一部との間に流体密なシールを形成する。プラテン面３２２７は、１つの実施形態では、弾性エラストマー、好ましくは化学薬品抵抗性ゴムなどのような対応材料を含むか、またはそれから作製される。プラテン３２０７の内側には、別個の流体圧力ライン、好ましくはガス圧力ラインがあり、これは、微小流体デバイス３２０５の上面３２２１上の種々の位置と嵌合する。チェックバルブパージアクチュエーター３２３３がまた示され、これは、好ましくは空気力により作動され、そしてこれは、作動されるとき、ピン３２３１をチェクバルブ２８１２中に下方に押し、流体圧力を開放および軽減するか、またはその開放抵抗性に打ち勝つことによりチェックバルブ２８１２を通る流体の導入を許容する。１つの実施形態では、プラテン３２０７は、第１および第２のパージアクチュエーター３２３３を有し、これらは、チェックバルブ２８１１および２８１２と係合する（図２２Ｂを参照のこと）。
【０２３１】
別の実施形態では、チップまたはデバイス３２０５は、通常は閉鎖された閉じ込めおよび／またはインターフェースバルブとともに製造される。この実施形態では、アキュムレーターは、インキュベーションの間にバルブの閉じを保持するために必ずしも必要ではないであろう。圧力は、インターフェースおよび／または閉じバルブが開かれるように所望されるとき、キャリアまたはデバイス３２０５ウェル領域に付与され得る。すべてまたは大部分のその他の時間の間には、上記バルブは閉鎖されたままであり得、種々のチップ実験を互いから分離し、そして／またはチップ上の試薬ウェルおよびタンパク質ウェルを互いから分離する。
【０２３２】
図２５は、微小流体デバイス３２０５の上面３２２１に対して押されるプラテン３２０７の一部切り欠き図を描写し、ここで、圧力腔３２５５が、上面３２２１のリッジ３２５０に対してプラテン面３２２７を接触することによりウェルの列２８０６の上に形成される。流体圧力、好ましくはガス圧力が、次いで、流体をチャージングステーション３２００のアーム３２１１を下方に走る圧力ラインから圧力腔３２５５中に導入することにより圧力腔３２２５に付与される。圧力は、チャージングステーション３２００と組み合わされた圧力調節器により、好ましくはコンピューター制御下にあるチャージングステーションコントローラーによって送られる信号に従って出力圧力を変更し得る、電気的に制御された可変圧力調節器によって好ましくは調節される。圧力腔３２５５の内側の流体圧力は、次に、基板２８００内のチャネルを通り、そしてチャネルおよび／またはエラストマーブロック２８０８のチャンバー中へのウェル２８０５内の液体を流し、チャネルまたはチャンバーを充填するか、または好ましくは先に記載のような偏向可能な膜バルブである、エラストマーブロック２８０８の偏向可能な部分を作動する。
【０２３３】
図２７Ａおよび２７Ｂは、システム３５００の、そしてより特定すればインターフェースプレート３５２０の特定の実施形態を描写している。図２７Ａでは、インターフェースプレート３５２０は、集積チップおよびキャリア３４００に、その特定領域を流体的にシールする様式で連結されている。特に、流体シールが、インターフェースプレート３５２０とキャリア３４００およびチップの１つ以上の領域（例えば、第１のタンパク質領域３４３０、第２のタンパク質領域３４３２、第１のウェル領域３４２０、第２のウェル領域３４２２、インターフェースアキュムレーター３４６０、チェックバルブ３４６５、閉じ込めアキュムレーター３４５０、および／またはチェックバルブ３４５５）との間に提供される。１つの実施形態では、インターフェースプレート３５２０は、領域３４２０、３４２２、３４３０、３４３２、ならびにアキュムレーター３４５０および３４６０に流体シールを提供する。１つの実施形態では、インターフェースプレート３５２０は、図２７Ｂに最もよく観察されるように、１つ以上のチェックバルブアクチュエーター３５７０を提供する。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、インターフェースプレート３５２０は、すべての所望の流体シールをキャリア３４００および微小流体デバイスに提供する。そのようにすることで、インターフェースプレート３５２０は、シールガスケット３５８０を含み得る。シールガスケット３５８０は、広範な範囲の材料を含み得、制限されないで、シリコンゴム、エラストマーなどを含む。いくつかの実施形態では、ガスケット３５８０は、所望の位置で流体シールを支援して形成する対応材料を含む。この様にして、システム３５００は、チップおよびキャリア３４００の適切な領域に所望の圧力を提供し得る。その他の実施形態では、インターフェースプレート３５２０は、２つ以上の構成要素である。例えば、キャリア３４００および微小流体デバイス上の領域またはポートは、各々、そのポートまたは領域に適合するよう適合された別個のプレート３５２０に流体的に連結され得る。システム３５００は、次いで、種々のポートまたは領域のために必要な数のインターフェースプレート３５２０を含む。さらに、いくつかの実施形態では、１つを超える領域またはポートが、特定のインターフェースプレート３５２０に連結され、その一方、その他の領域またはポートが別個のインターフェースプレート３５２０に連結される。インターフェースプレートおよびキャリア／チップ領域およびポートのその他の組み合わせが、本発明の範囲内に入る。
【０２３５】
システム３５００の作動は、１つの実施形態において、１つ以上のキャリア３４００の受容ステーション（単数または複数）３５１０中への装填を含む。いくつかの実施形態では、キャリア３４００は、それに結合された微小流体デバイスを含み、そして上記キャリアを受容ステーション３５１０中に配置する前にキャリアウェル中に装填される所望の試薬およびタンパク質を有する。その他の実施形態では、上記キャリア３４００は、受容ステーション３５１０中に配置され、そして次に、試薬およびタンパク質が装填される。キャリア３４００は、さらに、水和流体で装填され得る。水和流体は、水和チャンバー３４４０中に配置され得る。キャリア３４００がシステム３５００中に装填された後、インターフェースプレート３５２０が低下されるか、またはそうでなければ、キャリア３４００を係合するために移動される。プレート３５２０は、手動により、ロボットにより、またはそうでなければ低下され、チップ／キャリア３４００の部分またはすべてを流体的にシールする。水和流体は、インターフェースアキュムレーター３４６０および／または閉じ込めアキュムレーター３４５０に提供され、そしてインターフェースプレート３５２０に連結された圧力源を用い、アキュムレーター３４５０、３４６０に適切な圧力を付与することによってチップ中に流す。特定の実施形態では、システム３５００は、このプロセスを自動的に実施し、これは、特定の実施形態では、水和流体がキャリア３４００に添加された後、約２０時間以内に生じる。結果として、このチップは、水圧流体で十分に装填され、本明細書中、そしてより詳細には、本明細書中に参考として先に援用された特許および出願に記載されるように、チップ閉じ込めおよび／またはインターフェースバルブを作動する。
【０２３６】
試薬およびサンプルを含む溶液は、適切な入口の周りで適切にシールされたチップ領域に所望の圧力を付与することによりチップ中に分与される。例えば、約１ｐｓｉと約３５ｐｓｉとの間の圧力を第１および第２のウェル領域３４２０および３４２２に付与することは、試薬をチップ中に流すよう作動する。同様に、約１ｐｓｉと約３５ｐｓｉとの間の圧力を第１および第２のタンパク質領域３４３０および３４３２に付与することは、タンパク質をチップ中に流すよう作動する。特定の実施形態では、これは、チップに水圧流体を装填した後約６０分以内に起こる。一旦、上記溶液が、チップ内の所望のウェル、チャンバー、リザーバーなどに流されると、チップ内のインターフェースバルブが、インターフェースアキュムレーター３４６０中のチェックバルブ３４６５を解放することによって開かれる。特定の実施形態では、チェックバルブ３４６５が解放され、システム３５００が、チェックバルブ３４６５に係合するチェックバルブアクチュエーター３５７０を能動化するとき、チップ中のインターフェースバルブを開く。いくつかの実施形態では、チェックバルブアクチュエーター３５７０は、インターフェースアキュムレーター３４６０内の圧力を解放するために、チェックバルブ３４６５に係合するよう適合されたピン、ポストなどを含む。代替の実施形態では、チェックバルブ３４６５は、手動で解放または開かれる。
【０２３７】
上記溶液が、拡散、またはチャンバー中の流体の移動を増加するために、対流混合またはインターフェースバルブの反復開放および閉鎖のようなその他のプロセスを用いて、所望の時間の間混合されるようにされた後、このインターフェースバルブは閉鎖される。閉鎖されたインターフェースバルブおよび閉じ込めバルブを維持するために、圧力がアクチュエーター３４５０および／または３４６０に付与される。キャリア３４００は、本明細書中に記載されるプロセスにおけるインキュベーション、または貯蔵、または使用のためにシステム３５００から除去され得る。アクチュエーター３４５０および３４６０は、閉じ込めおよびインターフェースバルブが開くことを防ぐか、または支援して防ぐために、数時間から数日まで、所望の時間の間この圧力を保持する。特定の実施形態では、アクチュエーター３４５０および３４６０は、チップ内の圧力を、閉じ込めおよび／またはインターフェースバルブを閉鎖して維持するために十分な閾値圧力を超えて維持する。１つの実施形態では、アクチュエーター３４５０および３４６０は、圧力を、少なくとも２日、少なくとも７日、などの間、閾値圧力を超えて維持する。所定の時間、アクチュエーター３４５０および３４６０は、インキュベーション温度に一部依存して所望の圧力を維持する。所望のインキュベーション期間長さおよび／またはインキュベーション条件に一部依存して、キャリア３４００は、アクチュエーター３４５０、３４６０を再チャージまたは再加圧するためにシステム３５００に戻され得る。この様にして、上記インキュベーション期間は、このようであり得る。
【０２３８】
特定の実施形態では、集積キャリア３４００および微小流体デバイスは、本発明のシステムを用いることにより本発明の実施形態による所望の実験を実施するために適合されている。より詳細には、図２６Ａに示されるように、システム３５００は、各々がキャリア３４００を受容するように適合された１つ以上の受容ステーション３５１０を含む。特定の実施形態では、システム３５００は、４つの受容ステーション３５１０を含むが、より少ないか、またはより多い数のステーション３５１０が本発明の代替の実施形態で提供される。図２６Ｂは、インターフェースプレート３５２０の下でステーション３５１０中に配置されたキャリア３４００およびデバイスを組み合わせて描写する。インターフェースプレート３５２０は、図２６Ｂで下方に移動するように適合され、インターフェースプレート３５２０は、キャリア３４００の上面およびその微小流体デバイスに係合する。いくつかの実施形態では、ステーション３５１０およびプラテン３５２０は、ステーション３２００およびプラテン３２０７と同様である。インターフェースプレート３５２０は、流体、圧力などを受容するよう適合されているキャリア３４００中の領域との連結のための１つ以上のポート３５２５を含む。いくつかの実施形態では、インターフェースプレート３５２０は、２つのポート、３つのポート、４つのポート、５つのポート、６つのポート、７つのポート、８つのポート、９つのポート、１０のポート、などを含む。好ましい実施形態では、インターフェースプレート３５２０は、キャリア３４００の所望の領域に圧力を提供するために６つのライン、チェックバルブ３４５５および３４６５を能動化するための機構を提供するために２つのラインに連結される。
【０２３９】
図２６Ａに示されるように、システム３５００は、１つの実施形態では、ラップトップコンピューターまたはその他の計算デバイス３５３０と関連するプロセッサーであるプロセッサーをさらに含む。計算デバイス３５３０は、ソフトウェア、スクリプトなど、本発明の所望のプロセスを実施するためのソフトウェア、スクリプトなどを維持するように適合されたメモリーを含む。さらに、計算デバイス３５３０は、微小流体デバイスの研究および分析の結果を描写するためのスクリーン３５４０を含み、そして１つの実施形態では、ＧＵＩディスプレイがシステム３５００とともに用いられる。システム３５００は、インターフェースプレート（単数または複数）３５２０と流体により連結されている微小流体デバイスに加圧流体、ガスなどを送達するための、１つ以上の圧力源（加圧流体、ガスなど）と連結される。
【０２４０】
図２７Ａおよび２７Ｂは、システム３５００の特定の実施形態、そしてより詳細には、インターフェースプレート３５２０を描写する。図２７Ａにおいて、インターフェースプレート３５２０は、集積チップおよびキャリア３４００に、その特定の領域を流体的にシールする様式で連結される。特に、流体シールは、インターフェースプレート３５２０と、第１のタンパク質領域３４３０、第２のタンパク質領域３４３２、第１のウェル領域３４２０、第２のウェル領域３４２２、インターフェースアキュムレーター３４６０、チェックバルブ３４６５、閉じ込めアキュムレーター３４５０、および／またはチェックバルブ３４５５のようなキャリア３４００およびチップの１つ以上の領域との間の流体シールが提供される。１つの実施形態では、インターフェースプレート３５２０は、領域３４２０、３４２２、３４３０、３４３２に対する、そしてアキュムレーター３４５０および３４６０に対する流体シールを提供する。１つの実施形態では、インターフェースプレート３５２０は、図２７Ｂで最も良く観察されるように、１つ以上のチェックバルブアクチュエーター３５７０を提供する。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、インターフェースプレート３５２０は、キャリア３４００および微小流体デバイスにすべての所望の流体シールを提供する。そのようにすることで、インターフェースプレート３５２０は、シールガスケット３５８０を含み得る。シールガスケット３５８０は、広範な範囲の材料を含み得、制限されないで、シリコンゴム、エラストマーなどを含む。いくつかの実施形態では、ガスケット３５８０は、所望の位置で流体シールを支援して形成する対応材料を含む。この様にして、システム３５００は、チップおよびキャリア３４００の適切な領域に所望の圧力を提供し得る。その他の実施形態では、インターフェースプレート３５２０は、２つ以上の構成要素である。例えば、キャリア３４００および微小流体デバイス上の領域またはポートは、各々、そのポートまたは領域に適合するよう適合された別個のプレート３５２０に流体的に連結され得る。システム３５００は、次いで、種々のポートまたは領域のために必要な数のインターフェースプレート３５２０を含み得る。さらに、いくつかの実施形態では、１つを超える領域またはポートが、特定のインターフェースプレート３５２０に連結され、その一方、その他の領域またはポートが別個のインターフェースプレート３５２０に連結される。インターフェースプレートおよびキャリア／チップ領域およびポートのその他の組み合わせがまた、本発明の範囲内に入る。
【０２４２】
システム３５００の作動は、１つの実施形態において、１つ以上のキャリア３４００の受容ステーション（単数または複数）３５１０中への装填を含む。いくつかの実施形態では、キャリア３４００は、それに結合された微小流体デバイスを含み、そして上記キャリアを受容ステーション３５１０中に配置する前にキャリアウェル中に装填される所望の試薬およびタンパク質を有する。その他の実施形態では、上記キャリア３４００は、受容ステーション３５１０中に配置され、そして次に、試薬およびタンパク質が装填される。キャリア３４００は、さらに、水和流体で装填され得る。水和流体は、水和チャンバー３４４０中に配置され得る。キャリア３４００がシステム３５００中に装填された後、インターフェースプレート３５２０が低下されるか、またはそうでなければ、キャリア３４００を係合するために移動される。プレート３５２０は、手動により、ロボットにより、またはそうでなければ低下され、チップ／キャリア３４００の部分またはすべてを流体的にシールする。水和流体は、インターフェースアキュムレーター３４６０および／または閉じ込めアキュムレーター３４５０に提供され、そしてインターフェースプレート３５２０に連結された圧力源を用い、アキュムレーター３４５０、３４６０に適切な圧力を付与することによってチップ中に流される。特定の実施形態では、システム３５００は、このプロセスを自動的に実施し、これは、特定の実施形態では、水和流体がキャリア３４００に添加された後、約２０時間以内に生じる。結果として、このチップは、水圧流体で十分に装填され、本明細書中、そしてより詳細には、本明細書中に参考として先に援用された特許および出願に記載されるように、チップ閉じ込めおよび／またはインターフェースバルブを作動する。
【０２４３】
試薬およびサンプルを含む溶液は、適切な入口の周りで適切にシールされたチップ領域に所望の圧力を付与することによりチップ中に分与される。例えば、約１ｐｓｉと約３５ｐｓｉとの間の圧力を第１および第２のウェル領域３４２０および３４２２に付与することは、試薬をチップ中に流れるよう作動する。同様に、約１ｐｓｉと約３５ｐｓｉとの間の圧力を第１および第２のタンパク質領域３４３０および３４３２に付与することは、タンパク質をチップ中に流れるよう作動する。特定の実施形態では、これは、チップに水圧流体を装填した後約６０分以内に起こる。一旦、上記溶液が、チップ内の所望のウェル、チャンバー、リザーバーなどに流されると、チップ内のインターフェースバルブが、インターフェースアキュムレーター３４６０中のチェックバルブ３４６５を解放することによって開かれる。特定の実施形態では、チェックバルブ３４６５が解放され、システム３５００が、チェックバルブ３４６５に係合するチェックバルブアクチュエーター３５７０を能動化するとき、チップ中のインターフェースバルブを開く。いくつかの実施形態では、チェックバルブアクチュエーター３５７０は、インターフェースアキュムレーター３４６０内の圧力を解放するために、チェックバルブ３４６５に係合するよう適合されたピン、ポストなどを含む。代替の実施形態では、チェックバルブ３４６５は、手動で解放または開かれる。
【０２４４】
上記溶液が、拡散、またはチャンバー中の流体の移動を増加するために、対流混合またはインターフェースバルブの反復開放および閉鎖のようなその他のプロセスを用いて、所望の時間の間混合されるようにされた後、このインターフェースバルブは閉鎖される。閉鎖されたインターフェースバルブおよび閉じ込めバルブを維持するために、圧力がアクチュエーター３４５０および／または３４６０に付与される。キャリア３４００は、本明細書中に記載されるプロセスにおけるインキュベーション、または貯蔵、または使用のためにシステム３５００から除去され得る。アクチュエーター３４５０および３４６０は、閉じ込めおよびインターフェースバルブが開くことを防ぐか、または支援して防ぐために、数時間から数日まで、所望の時間の間この圧力を保持する。特定の実施形態では、アクチュエーター３４５０および３４６０は、チップ内の圧力を、閉じ込めおよび／またはインターフェースバルブを閉鎖して維持するために十分な閾値圧力を超えて維持する。１つの実施形態では、アクチュエーター３４５０および３４６０は、圧力を、少なくとも２日、少なくとも７日、などの間、閾値圧力を超えて維持する。所定の時間、アクチュエーター３４５０および３４６０は、インキュベーション温度に一部依存して所望の圧力を維持する。所望のインキュベーション期間長さおよび／またはインキュベーション条件に一部依存して、キャリア３４００は、アクチュエーター３４５０、３４６０を再チャージまたは再加圧するためにシステム３５００に戻され得る。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、本明細書中にほぼ記載されたように、集積チップキャリア（ＩＣＣ）およびそれに取り付けられたエラストマーチップが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を容易にするために用いられる。しかし、ＰＣＲチップを用いてＰＣＲを試みるとき、プラスチックＩＣＣの熱伝導性は、このエラストマーチップに宿される反応のアレイの間で均一な熱フィールドを効率的に生成しないかも知れない。例えば、図２８Ａに描写されるＩＣＣは、その他のプロセスの中でタンパク質結晶化のために有用であるが、それに結合されたチップに十分に均一に熱を移さないかも知れない。さらに、図２８ＡのＩＣＣの操作は、そのＩＣＣがプラテンに対して保持される必要があり得る。図２９Ａに示されるように、圧縮力の適用は、このチップに悪影響を及ぼし得る。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、改善された均質の熱場が図２８Ｂと併せて記載されるＩＣＣ実施形態を用いて提供され、そして改善されたＩＣＣ保持方法が図２９Ｂに示される。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、エラストマーチップは、ＩＣＣとの流体接続がそのエラストマーチップの外面に位置付けられるように設計される。この様式において、ＩＣＣの一部は、流体輸送について依存される必要はない。ＩＣＣ  ３８００の１つのこのような実施形態が、図２８Ａに示される。いくつかの実施形態では、ＩＣＣ表面と接触していないエラストマーチップの領域は、反応チャンバのアレイが置かれるところである。この反応領域３８１０は、エラストマーチップ、およびそのチップの下側（他の場合にＩＣＣのプラスチック部分と接触するエラストマーブロックの側）に対して嵌合される導電性材料を備える。反応領域３８１０のサイズおよび形状は、本発明の範囲内で変化し得、図２９Ｃに示される一実施形態は、ＩＣＣとチップとの間の関係を示す。
【０２４７】
この様式において、（例えば、ＰＣＲ装置からの）熱エネルギーは、最小のもしくは減少された熱インピーダンスでエラストマーブロックに伝達され得る。いくつかの実施形態では、熱伝導性材料は、シリコン（Ｓｉ）を含む。特定の実施形態では、研磨され滑らかにされたシリコンウエハーに由来するシリコン（半導体産業で使用されるものと類似かまたは同じ）が使用される。他の熱インピーダンスの低い材料もまた、求められる熱プロフィールの性質に依存して、本発明の範囲内で使用され得る。いくつかの実施形態では、熱伝導性材料は、低い熱質量（すなわち、良好な熱良導体であるが、温度で迅速な変化を生じる材料（例えば、銅））を有する。いくつかの実施形態では、リアルタイムでまたはＰＣＲ反応の終点分析のときに、研磨されたシリコンを使用して、ミラー効果を増強し、このシステムで使用される検出器によって集められ得る光の量を増大させる。これらの利益はまた、等温反応を改善し得る。
【０２４８】
ＩＣＣ  ３８００を用いて、ＰＣＲを行うことを望む者は、エラストマーブロックの反応領域を熱制御源と嵌合させることによってＰＣＲを行い得る。この熱制御源は、ＰＣＲ機、加熱プラテン、別個の熱源などを備え得る。いくつかの実施形態では、ＩＣＣは、平底の反応プレートを許容する標準的なＰＣＲ機に適合し、そして／または平らな熱プレートを有し、ここで、チューブベースのＰＣＲの種々の形式のためのアダプタが使用され得る。しかし、これらの構成の各々は、一般的に、図２９Ａに示されるように良好な均一な熱的接触を得るためにプレートを下向きに圧迫することに依存する。本発明のいくつかの実施形態では、可塑性のバルブおよびエラストマーチャンバが変形し、そのエラストマーチップ内で望ましくない流体作用が生じるので、エラストマーチップは下向きの圧迫は受け入れられない。
【０２４９】
他の実施形態では、ＩＣＣを下向きに圧迫することの負の効果は、真空チャックを使用して、他の場合には露出したエラストマーブロックの下側に結合された熱材料に対して嵌合させることによって減少されるかまたは回避される。この様式において、真空がチャックに適用されるときに、真空チャックとＩＣＣの熱材料との間に密なシールが作製される。図２９Ｂに示されるような一実施形態では、真空チャック３９５０は、熱制御源（例えば、１以上のＰｅｌｔｉｅｒデバイス）に結合される良好な熱良導体である１以上の材料を含むか、またはそのような材料から作製される。一実施形態では、複数の熱制御が使用されて、反応のアレイ間の熱勾配を生成する。
【０２５０】
使用において、ＩＣＣは真空チャック３９５０の上に配置され、集積チップ３９１０および真空チャックを備えるＩＣＣ  ３９３０の熱部分３９２０に接触するように下に下げられるかまたは他の場合には移動される。この場合も、一実施形態では、熱部分３９２０はシリコンを含む。熱部分３９２０は、エラストマーブロックまたはチップ３９１０に連結するように描かれ、そのような連結は、いくつかの実施形態では接着剤などを用いて達成される。示されるように、ブロック３９１０は、ＩＣＣ  ３９３０に係合し、一実施形態では、ギャップ３９４０が熱部分３９２０とＩＣＣ  ３９３０との間で維持される。ギャップ３９４０は、ＩＣＣ  ３９３０を熱ヒート源（例えば、チャックまたはプラテン３９５０）から熱的に分離することを補助する。さらに、一実施形態において、ギャプ３９４０は、ブロック３９１０および／または熱部分３９２０のいくらかの湾曲を許容する。この様式において、ギャップ３９４０は、いくつかの実施形態では、真空が１以上の真空ポート３９６０を通ってチャック３９５０に適用されて熱部分３９２０がチャック３９５０の方に引っ張られるときに、シールを形成することを補助する。達成される真空の量は、良好な熱的接触が、チャック３９５０と熱部分３９２０との間に実際に作製されたことを確認するためにモニタリングされ得る。いくつかの実施形態では、真空チャックの１以上のポートが、真空のレベルをモニタリングするために使用される。図２９Ｄおよび図３０に示されるような特定の実施形態では、真空のレベルをモニタリングするために使用される１以上のポートは、その真空ポートの遠位に配置され、互いに通路（好ましくは、蛇行した狭い通路）を通じて流体連通する。この様式において、真空チャックの一方の側−ＩＣＣの熱部分の間の差異が、真空チャックの他方の側−ＩＣＣの熱部分と比較されて、真空チャックにおいてＩＣＣを再配置する試みが、存在する場合には真空の喪失の問題を解決し得る。これは、自動または手動、あるいはそれらのいくらかの組み合わせのいずれかで行われる反復性のプロセスである。
【０２５１】
図３０は、本発明に従うチャックの一実施形態を示す。真空チャック熱部分領域にわたる示差真空レベルの正確な測定を達成するため、そしてＩＣＣの熱部分に均質なまたは比較的均質な真空の適用を行うために使用される蛇行した通路の性質は、本発明の範囲内で変更され得る。このアプローチを使用することによって、ＰＣＲ反応を行うために使用されるエラストマーブロックは、通常の下向きの圧迫が使用されるときにそのエラストマーブロックのエラストマー（湾曲可能な）部分の機能性を損なうことなく、ＰＣＲ機と良好に熱的接触し得る。
【０２５２】
本発明は、その特定の実施形態を参照して本明細書に記載されているが、一定の許容範囲の改変、種々の変更および置き換えが上述の開示で意図され、そしていくつかの場合において、本発明のいくつかの特徴が、上に記載されるような本発明の範囲から逸脱することなく、他の特徴の対応する使用を伴わずに利用されることが理解される。例えば、上に記載される圧力ベースの作動システムに加えて、任意の静電作動システムおよび磁気作動システムもまた企図される。熱膨張または液体から気体を発生させることのいずれかによって、熱エネルギーの適用に基づいて制御チャネルにおける流体の流れを引き起こすことによってデバイスを作動させることも可能である。さらに、別の実施形態では、タンパク質および試薬をチップに入れるために、遠心力が使用される。したがって、特定の状況または材料を本発明の本質的な範囲および精神から逸脱することなく、本発明の教示に適合させるように、多くの改変がなされ得る。本発明は、本発明を実施するために企図される最良の形態として開示される特定の実施形態に限定されないが、本発明は、添付の特許請求の範囲内に入るすべての実施形態および等価物を包含することが意図される。
【０２５３】
（参考）
１．Ｕｎｇｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８，１１３−１１６（２０００）。
【０２５４】
２．サンプルチャネルおよび制御ラインは、「ブラインドフィリング」で充填される−ＰＤＭＳは、十分にガス透過性であり、数ｐｓｉで加圧された液体は、ガスをチャネルから外に出し、チャネルを液体で完全に満たす。Ｈａｎｓｅｎら、ＰＮＡＳ  ９９，１６５３１−１６５３６（２００２）を参照のこと。
【０２５５】
３．ヒトβ−アクチン遺伝子の２９４ｂｐセグメントを、５’−エキソヌクレアーゼアッセイ（Ｔａｑｍａｎ）を使用して増幅した。順方向プライマーおよび逆方向プライマーの配列は、それぞれ、５’−ＴＣＡＣＣＣＡＣＡＣＴＧＴＧＣＣＣＡＴＣＴＡＣＧＡ３’および５’−ＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＣＴＣＡＴＴＧＣＣＡＡＴＧＧ３’であった。図１ｂは、ＴＡＭＲＡベースのＦＲＥＴプローブ、配列５’−（ＦＡＭ）ＡＴＧＣＣＣ−Ｘ（ＴＡＭＲＡ）−ＣＣＣＣＣＡＴＧＣＣＡＴＣＣＴＧＣＧＴｐ−３’を用いて取得した。図１ｃのデータは、暗いクエンチャーベースのプローブを用いて取得した。なぜなら多数のこれらのプライマー−プローブセットが市販されているからである。反応物は、１×  Ｔａｑｍａｎ緩衝液Ａ（５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０１Ｍ  ＥＤＴＡ、６０ｎＭ  受動的参照１、ｐＨ  ８．３）、４ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００ｎＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、４００ｎＭ  ｄＵＴＰ、３００ｎＭ  順方向プライマー、３００ｎＭ  逆方向プライマー、２００ｎＭ  プローブ、０．０１Ｕ／μＬ  Ａｍｐｅｒａｓｅ  ＵＮＧ（すべてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）、０．２Ｕ／μＬ  ＤｙＮＡｚｙｍｅ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅ，Ｅｓｐｏｏ，Ｆｉｎｌａｎｄ）、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ−ｘ−１００、０．８μｇ／μｌ  ゼラチン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、５．０％  グリセロール、脱イオン水およびヒト雄性ゲノムＤＮＡ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含んだ。
【０２５６】
４．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  Ｔｓｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ｏｎ  “Ｇｅｎｅ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，ＬＪ  ＭｃＢｒｉｄｅ，Ｋ  Ｌｉｖａｋ，Ｍ  Ｌｕｃｅｒｏら、編者、Ｆｒａｎｃｏｉｓ  Ｆｅｒｒｅ，Ｂｉｒｋａｕｓｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ  ｐ  ９７−１１０，１９９８。
【０２５７】
Ｅ．Ｔ．Ｌａｇａｌｌｙ，Ｉ．Ｍｅｄｉｎｔｚ，Ｒ．Ａ．Ｍａｔｈｉｅｓ，Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７３（３），５６５−５７０（２００１）、ならびにＢ．Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｋ．Ｗ．Ｋｉｎｚｌｅｒ，ＰＮＡＳ  ９６，９２３６−９２４１（１９９９）を参照のこと。
【０２５８】
本明細書に記載される実施例および実施形態は、例示目的のみのためであり、そしてそれを考慮して種々の改変または変更が当業者に示唆され、その種々の改変または変更は、本明細書の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲の内に包含されるべきであることが理解される。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、あたかも各々個々の刊行物、特許または特許出願が明確かつ個々に参考として援用されるべきであることが示されているかのように、同程度までのすべての目的のためにその全体が参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０２５９】
【図１−１】図１Ａは、垂直または水平に交差する流体チャネルのマトリクス設計の例示的なデバイスの概略図である。
【図１−２】図１Ｂ〜図１Ｅは、図１Ａにおいて示されたデバイスの一部の拡大図を示し、そしてその操作を図示する。
【図１−３】図１Ｆは、サンプルの蒸発を減少させるための保護チャネルを使用する別の例示的なマトリクス設計デバイスの概略図である。
【図２】図２は、例示的なブラインドチャネルデバイスの平面図である。
【図３】図３Ａは、別の例示的なブラインドチャネルデバイスの平面図である。図３Ｂは、図３Ａに示された一般的な設計の単位に基づいたより複雑なブラインドチャネルデバイスの概略図である。
【図４】図４は、ハイブリッド設計を使用するデバイスの平面図である。
【図５】図５は、熱サイクリング反応を行うための上昇および下降時間を示すグラフである。
【図６】図６は、ブラインドチャネルタイプのデバイスにおける反応部位内のスポットされた試薬の位置を示し、そのデバイスの隅部における反応部位内の試薬の適切な整列を図示している。
【図７】図７Ａおよび図７Ｂは、それぞれ、別のハイブリッドタイプの微小流体デバイスの断面図および概略図であり、実施例１〜４に記載される実験を行うために使用されるデバイスのタイプを示す。
【図８】図８は、平均ＦＡＭ／ＰＲ１コントロール比が６種の異なるβアクチンＴａｑｍａｎ反応に対してプロットされている棒グラフを示す。この反応は、図７Ｂで示される微小流体デバイス（チップ）（無地の棒）およびＭａｃｒｏ  ＴａｑＭａｎ反応（斜線付きの棒）における熱サイクリングであった。コントロールは、ＤＮＡなしで設定された第一および第四の棒である。誤差バーは、その比の標準偏差である。
【図９】図９は、例示的なピンスポッティングプロセスを示す図である。試薬は供給源（例えば、マイクロタイタープレート）からピックアップされ、次いで充填されたピンを基板と接触させることによってプリントされる。洗浄工程は、脱イオン水でかきまぜ、次いで真空乾燥することからなる。
【図１０】図１０は、実施例２に記載される実験に基づいた、実施例１（図７Ｂを参照のこと）に記載された微小流体デバイス（チップ）についてのＦＡＭシグナル強度を示す棒グラフである。このデータは、参照レーンのＦＡＭ／ＰＲ１比によってスケーリングされた（ＦＡＭシグナル／ＰＲ１シグナル）の形式である。誤差バーは、レーンの標準偏差である。「１．３×」および「１×」の表記は、その通常の値に対して、スポッティングされたプライマーおよびプローブの濃度を指す。
【図１１】図１１は、Ｍａｃｒｏ  ＴａｑＭａｎ（縞の棒）、および微小流体デバイスにおけるＴａｇ  Ｍａｎ反応（無地の棒）についての９〜１０個のウェルに対する平均ＶＩＣ／ＰＦ１／コントロール比を示す棒グラフである。２つのネガティブコントロール（コントロール）および１００ｐｇ／ｎｌのゲノムＤＮＡを含む２つのサンプルを、標準量の４倍のプライマー／プローブを用いて上で記載された反応構成成分で熱サイクリングした。誤差バーは、平均の比の標準偏差を示す。
【図１２】図１２は、微小流体デバイスの単一フローチャネルから分岐する各１０〜１ｎｌウェルについてのＦＡＭ／ＰＲ１／コントロール比を示す棒グラフである（図７Ｂを参照のこと）。ゲノムＤＮＡの量は、０．２５ｐｇ／ｎｌであり、これは１ウェルあたり平均標的１コピーをもたらす。
【図１３】図１３は、図７Ｂにおいて示された微小流体デバイスを使用した、ＣＹＰ２Ｄ６  ＳＮＰ反応についての平均ＶＩＣ／ＰＲ１／コントロール比を示す棒グラフである。対立遺伝子１（Ａｌ−１）は、参照または野生型対立遺伝子ＣＹＰ２Ｄ６＊１に対するＶＩＣプローブについてのポジティブコントロールである。対立遺伝子２（Ａｌ−２）は、改変体または変異体対立遺伝子であるＣＹＰ２Ｄ６＊３に対するＦＡＭプローブについてのポジティブコントロールである。コントロールはＤＮＡ鋳型を有さない。ゲノムＤＮＡを、１００ｐｇ／ｎｌまたは２０ｐｇ／ｎｌのいずれかで使用した。誤差バーは、その比の標準偏差である。
【図１４】図１４は、図７Ｂにおいて示された微小流体デバイスにおけるＣＹＰ２Ｄ６  ＳＮＰ反応についての平均ＦＡＭ／ＰＲ１／コントロール比を示す棒グラフである。サンプルは、図１３に関して、および実施例３において記載されたものと同じである。
【図１５】図１５は、実施例４における実験のために使用された微小流体デバイスの概略図である。
【図１６】図１６は、Ｍａｃｒｏ  ＰＣＲおよび図７Ｂにおいて示された微小流体デバイスにおけるＰＣＲ反応由来のＰＣＲ産物を含むポリアクリルアミドゲルである。左側の結果は、種々のＤＮＡ塩基対長の適切な移動を示す。散在したバンドを含むレーンは、分子量マーカーである。「Ｍａｃｒｏ」と標識されたレーンは異なる希釈度におけるマクロ反応由来のＰＣＲ産物である。「Ｉｎ  Ｃｈｉｐ」と標識されたレーンは、チップ内で生成されたＰＣＲ産物である。ゲルの至るところに多くのバンドを含むレーンは、非特異的なバックグラウンドシグナルである。
【図１７】図１７ａ〜図１７ｄは、バルブがオフの状態およびバルブ駆動状態における仕切られた微小流体デバイスの２つの好ましい設計物を示す。
【図１８Ａ】図１８ａは、熱サイクリング反応が実施された後の仕切られた微小流体デバイスの画像を示す。図１８ａは、２色の画像を示す。
【図１８Ｂ】図１８ｂは、熱サイクリング反応が実施された後の仕切られた微小流体デバイスの画像を示す。図１８ｂは、コントロールの赤色シグナルの減算後に残ったシグナルを示す。
【図１９】図１９は、ポジティブウェルの数に対して１ウェルあたりの平均コピー数を比較したグラフを示す。
【図２０】図２０は、等温の増幅スキームであるＳＣＯＲＰＩＯＮを示す。
【図２１】図２１は、例示的なマトリクス微量流体デバイスの平面図を示す。
【図２２】図２２Ａは、本発明の実施形態に従う、一体型の蓄圧ウェルを有する微小流体デバイスの基板を示す。図２２Ｂは、図８Ａにおいて示され、かつさらにエラストマーブロックを備える微小流体デバイスの分解図である。図２２Ｃは、図２２Ｂにおいて示される微小流体デバイスの全体図である。図２２Ｄは、図２２Ｂに示される微小流体デバイスの平面図である。図２２Ｅは、図２２Ｂに示される微小流体デバイスの断面図を示す。
【図２３】図２３は、本発明の微小流体デバイスのいくつかの実施形態における使用のための孔の断面図である。
【図２４】図２４は、本発明に従う微小流体デバイスを作動させるためのステーションの斜視図である。
【図２５】図２５は、本発明の実施形態に従う微小流体デバイスの上面に向けて動かされたプラテンの断面図である。
【図２６Ａ】図２６Ａは、本発明の実施形態に従うシステムの単純化された全体図である。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、図２６Ａのシステムにおける受容ステーションの斜視図である。
【図２６Ｃ】図２６Ｃは、本発明の別の実施形態に従うプレートインターフェースまたはプラテン内での流体の経路の後部の平面図である。
【図２７Ａ】図２７Ａは、本発明の実施形態に従う、キャリアに嵌められたインターフェースプレートを示す側面の断面図である。
【図２７Ｂ】図２７Ｂは、本発明の実施形態に従う、キャリアに嵌められたインターフェースプレートを示す側面の断面図である。
【図２８】図２８Ａは、本発明の実施形態に従う一体型のキャリアの斜視図である。図２８Ｂは、ＰＣＲと一緒に使用するための本発明の別の実施形態に従う一体型のキャリアの斜視図である。
【図２９】図２９Ａは、図２８Ａのキャリアを保持するためのシステムの単純化した断面図である。図２９Ｂは、図２８Ｂのキャリアを保持するためのシステムの単純化した断面図である。図２９Ｃは、図２８Ｂのキャリアの一部の単純化した平面図である。図２９Ｄは、図２９Ｂのシステムと一緒に使用するための真空チャックの単純化した平面図である。
【図３０】図３０は、図２８Ｂのシステムと一緒に使用するための真空チャックの単純化した全体図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７ａ】
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【図１７ｂ】
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【図１７ｃ】
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【図１７ｄ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
0005502275.tif 000036
【図２２Ｂ】
0005502275.tif 000037
【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
0005502275.tif 000043
【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２７Ａ】
0005502275.tif 000047
【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９】
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【図３０】
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