(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
臍帯血由来間葉系幹細胞を多孔質のスキャホールドに播種し、
該スキャホールドに播種された前記臍帯血由来間葉系幹細胞を培養し、
前記臍帯血由来間葉系幹細胞を培養する間、前記スキャホールドおよび臍帯血由来間葉系幹細胞に応力を与えて培養軟骨を形成し、
前記スキャホールドは、気孔率が７５−９０％になるような連続した気孔構造を持つ多孔質のコラーゲンまたはゼラチンからなる培養軟骨製造方法。
【請求項２】
臍帯血由来間葉系幹細胞を多孔質のスキャホールドに播種し、
該スキャホールドに播種された前記臍帯血由来間葉系幹細胞を培養し、
前記臍帯血由来間葉系幹細胞を培養する間、前記スキャホールドおよび臍帯血由来間葉系幹細胞に応力を与えて製造され、
前記スキャホールドは、気孔率が７５−９０％になるような連続した気孔構造を持つ多孔質のコラーゲンまたはゼラチンからなる培養軟骨。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、培養軟骨製造方法および培養軟骨に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、骨髄由来間葉系幹細胞から軟骨形成を誘導する方法が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
【特許文献１】特許３７８１４３３号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかし、骨髄液を採取するには侵襲性が高く、また微量の軟骨しか形成させることができないという不都合がある。
本発明は、骨髄由来間葉系幹細胞を用いた方法に比べて低侵襲で細胞ソースを獲得でき、多量の軟骨を形成できる培養軟骨製造方法および培養軟骨を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、臍帯血由来間葉系幹細胞を多孔質のスキャホールドに播種し、該スキャホールドに播種された前記臍帯血由来間葉系幹細胞を培養し、前記臍帯血由来間葉系幹細胞を培養する間、前記スキャホールドおよび臍帯血由来間葉系幹細胞に応力を与えて培養軟骨を形成する培養軟骨製造方法を提供する。
【０００５】
上記発明においては、前記スキャホールドは、気孔率が７５−９０％になるような連続した気孔構造を持つ多孔質のコラーゲンまたはゼラチンからなることが好ましい。
【０００６】
また、本発明は、臍帯血由来間葉系幹細胞を多孔質のスキャホールドに播種し、該スキャホールドに播種された前記臍帯血由来間葉系幹細胞を培養し、前記臍帯血由来間葉系幹細胞を培養する間、前記スキャホールドおよび臍帯血由来間葉系幹細胞に応力を与えて製造される培養軟骨を提供する。
上記発明においては、前記スキャホールドが、気孔率が７５−９０％になるような連続した気孔構造を持つ多孔質のコラーゲンまたはゼラチンからなっていてもよい。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、骨髄由来間葉系幹細胞を用いた方法に比べて低侵襲で細胞ソースを獲得でき、多量の軟骨を形成できるという効果を奏する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明の一実施形態に係る培養軟骨製造方法および培養軟骨について、図１を参照して以下に説明する。  
本実施形態に係る培養軟骨製造方法は、臍帯血由来間葉系幹細胞を多孔質のスキャホールドに播種するステップＳ１と、該スキャホールドに播種された前記臍帯血由来間葉系幹細胞を、スキャホールドおよび臍帯血由来間葉系幹細胞に応力を与えて培養するステップＳ２とを備えている。
スキャホールドは、気孔率が７５−９０％になるような連続した気孔構造を持つ多孔質のコラーゲンまたはゼラチンであることが好ましい。
【０００９】
本実施形態に係る軟骨製造方法によれば、骨髄由来間葉系幹細胞を使用することなく、臍帯血由来間葉系幹細胞を使用するので、患者に対する侵襲が少なくて済み、患者にかかる負担を軽減することができるという利点がある。
したがって、低侵襲で細胞ソースを獲得でき、多量の軟骨を形成することができるという利点がある。
【実施例】
【００１０】
次に、本実施形態に係る軟骨製造方法および培養軟骨の一実施例について説明する。
（実施例１）Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの実験
１５mlのポリプロピレン製チューブに臍帯血由来間葉系幹細胞を２×１０５個加え、遠心分離によりペレットを形成させ、１０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−β３および５００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ−２を含む軟骨誘導培地［ＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ）、５０ｍｇ／ｍＬのＩＴＳ＋Ｐｒｅｍｉｘ、１０−７Ｍのデキサメサゾン、５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸二リン酸、４０μｇ／ｍＬのプロリン、１００μｇ／ｍＬのピルビン酸］で培養した。
【００１１】
その結果、誘導に伴い（１〜６週間）、ペレットの大きさと透明度が増大し、軟骨関連遺伝子のＳｏｘ９、コラーゲンタイプ２Ａ１、アグリカン、コラーゲンタイプ１０Ａ１を発現した。培養３週目のペレットのパラフィン切片を作製し、トルイジンブルー染色した結果、赤紫色（メタクロマジー）に染色された。
【００１２】
また、免疫染色により軟骨細胞マーカーのタイプＩＩコラーゲンも陽性反応を示した。これらの結果から、臍帯血由来間葉系幹細胞は軟骨細胞に分化できることが明らかになった。さらに、他の組織由来の間葉系幹細胞である骨髄由来間葉系幹細胞から誘導した軟骨様ペレットに比べ、その大きさが著しく増大していた。このことから、軟骨再生における間葉系幹細胞ソースとして臍帯血由来間葉系幹細胞は有力なものであることが実証された。
【００１３】
（実施例２）Ｉｎ  ｖｉｖｏでの実験
直径５ｍｍ、高さ３ｍｍからなるコラーゲンスポンジに臍帯血由来間葉幹系細胞を１×１０６個包埋し、軟骨分化誘導培地で２週間培養した。
その後、細胞を含むコラーゲンスポンジを５週齢のヌードマウス皮下に移植した。
【００１４】
その結果、図２（ａ）に示されるように、移植後４週目で白く堅い組織が形成された。その組織のパラフィン切片を作製し、図２（ｂ）に示されるようにトルイジンブルー染色したところ、図２（ｃ）に示されるようにメタクロマジーに染色された円形の軟骨様細胞がみられた。また、軟骨細胞マーカーのタイプＩＩコラーゲンに対する抗体により免疫染色を行った結果、図２（ｄ）に示されるように、円形の軟骨様細胞の周囲に陽性反応が示された。
これらの結果から、臍帯血由来間葉系幹細胞はヌードラット関節下環境において軟骨形成することが明らかになった。
【００１５】
（実施例３）任意の軟骨組織の製造、培養中のスキャホールドへの刺激
実施例２における臍帯血由来間葉系幹細胞の培養中、培養液交換時または１日おきにスキャホールド上に１ｇのウエイトを置いて６０Ｇで１分間の遠心力を与えた。
その結果、コラーゲンのスキャホールドは、細胞が均質に分布した移植しやすい平板状の形状に変化した。さらに、ウエイトを置かないものに比べて軟骨形成能優位であった。
なお、上記実施形態においてはスキャホールドとしては、コラーゲンを用いてきたが、これに代えてゼラチンでも同様の培養軟骨が形成される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明の一実施形態に係る培養軟骨製造方法を示すフローチャートである。
【図２】図１の軟骨細胞製造方法により製造された培養軟骨を示す（ａ）写真、（ｂ）トルイジンブルー染色された培養軟骨の写真、（ｃ）（ｂ）のＡ部の拡大写真、（ｄ）軟骨細胞マーカーのタイプＩＩコラーゲンに対する抗体による免疫染色結果をそれぞれ示す図である。
【符号の説明】
【００１７】
Ｓ１  播種ステップ
Ｓ２  培養ステップ
【図１】
0005495486.tif 000002
【図２】
0005495486.tif 000003