(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
コハク酸生産能を有するコリネ型細菌であって、ピルベートオキシダーゼの活性が低下するように改変され、さらに、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低下されたコリネ型細菌またはその固定化菌体を、嫌気的条件下において、炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素を含有する反応液中で有機原料に作用させることにより、該反応液中にコハク酸を生成蓄積させ、該反応液からコハク酸を採取することを特徴とするコハク酸の製造方法。
【請求項２】
前記ピルベートオキシダーゼが、下記（Ａ）又は（Ｂ）に記載のタンパク質である請求項１に記載のコハク酸の製造方法、
（Ａ）配列番号４９に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、又は
（Ｂ）配列番号４９に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、ピルベートオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項３】
染色体上のピルベートオキシダーゼ遺伝子が破壊されたことによりピルベートオキシダーゼ活性が低下した、請求項１又は２に記載のコハク酸の製造方法。
【請求項４】
前記ピルベートオキシダーゼ遺伝子が、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡである請求項３に記載のコハク酸の製造方法、
（ａ）配列番号４８の塩基番号９９６−２７３２の塩基配列を含むＤＮＡ、又は
（ｂ）配列番号４８の塩基番号９９６−２７３２の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ピルベートオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
前記コリネ型細菌が、さらに、ホスホトランスアセチラーゼ、アセテートキナーゼ及びアセチルCoAハイドロラーゼからなる群より選ばれる１種又は２種以上の酵素の活性が低下するように改変されたコリネ型細菌である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のコハク酸の製造方法。
【請求項６】
コリネ型細菌が、さらに、ピルベートカルボキシラーゼ活性が上昇するように改変されたコリネ型細菌である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のコハク酸の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法によりコハク酸を製造する工程、及び得られたコハク酸を重合させる工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵工業に関し、コリネ型細菌を利用した発酵法によりコハク酸を効率よく製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
コハク酸などの非アミノ有機酸を発酵により生産する場合、通常、Anaerobiospirillum（アナエロビオスピリラム）属、Actinobacillus（アクチノバチルス）属等の嫌気性細菌が用いられている（特許文献１、２、又は非特許文献１参照）。嫌気性細菌を用いる場合は、生産物の収率が高いが、その一方では、増殖するために多くの栄養素を要求するために、培地中に多量のＣＳＬ（コーンスティープリカー）などの有機窒素源を添加する必要がある。これらの有機窒素源を多量に添加することは培地コストの上昇をもたらすだけでなく、生産物を取り出す際の精製コストの上昇にもつながり経済的でない。【０００３】
コリネ型細菌のような好気性細菌を好気性条件下で一度培養し、菌体を増殖させた後、集菌、洗浄し、静止菌体として酸素を通気せずにコハク酸を生産する方法も知られている（特許文献３又は４参照）。この場合、菌体を増殖させるに当たっては、有機窒素の添加量が少なくてよく、簡単な培地で十分増殖できるため経済的ではあるが、目的とするコハク酸の生成量、生成濃度、及び菌体当たりの生産速度の向上、製造プロセスの簡略化等改善の余地があった。【０００４】
また、コリネ型細菌を代表とする好気性細菌を酸素制限条件で培養を行うと乳酸、酢酸等の目的物質以外の有機酸が副生物として過剰に蓄積し、菌体生育が抑制され、発酵生産性が大幅に低下する。また、副生物の有機酸を中和するためのカウンターイオンも過剰に必要となり、経済的でない。このような課題を解決するために、副生乳酸に関してはラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低減したコリネ型細菌を用いることにより、その低減化が行われている（特許文献５参照）。【０００５】
しかし、上記ラクテートデヒドロゲナーゼ活性の低減したコリネ型細菌でも酢酸が著量副生する。エシェリヒア属細菌においては、これまでに培養液中の酢酸低減の解決手段として、酢酸資化遺伝子(aceP)の発現を強化する方法（特許文献６参照）、ACEタンパク質をコードする遺伝子の発現を強化する方法（特許文献７参照）等が知られている。これらは培養液中に放出された酢酸を積極的に資化させることにより酢酸の副生減を図るものである。また、エシェリヒア属細菌において、酢酸の生合成を弱化することにより副生酢酸を抑制する方法として、フォスフォアセチルトランスフェラーゼとラクテートデヒドロゲナーゼを欠損させたエシェリヒア・コリを用いたコハク酸の製造方法（特許文献８参照）が知られている。【０００６】
コリネ型細菌において、酢酸資化に関与する酵素としてアセテートキナーゼ、フォスフォトランスアセチラーゼ（非特許文献２参照）が報告されている。また、酢酸生成には、ピルベートオキシダーゼ（特許文献９参照）、アシルフォスファターゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アセチルCoAハイドロラーゼ等複数の酵素が関与することが推定される。しかしながら、どの酵素が酢酸合成に寄与しているか明確でなかったため、今まで、コリネ型細菌で酢酸生合成系酵素を低下させた菌株を用いてコハク酸生産を行う方法は知られていなかった。【０００７】
ピルベートオキシダーゼは、ピルビン酸と水から、酢酸を生成する酵素（EC 1.2.2.2）であり、ピルベートオキシダーゼを欠損させた腸内細菌群を用いたL−アミノ酸の製造方法(特許文献１０参照)、ピルベートオキシダーゼを欠損させた腸内細菌群を用いたＤ−パントテン酸の製造方法（特許文献１１参照）、ピルベートオキシダーゼを欠損させたコリネ型細菌を用いたＤ−パントテン酸の製造方法（特許文献１２参照）が知られている。
コリネバクテリウム・グルタミカムでもピルベートオキシダーゼの遺伝子配列は明らかになっており、ピルベートオキシダーゼ遺伝子の発現を低下させたコリネ型細菌を用いたＬ−アミノ酸の製造法も知られていた（特許文献１３参照）。しかし、コリネ型細菌において、ピルベートオキシダーゼのコハク酸生合成系への関与は知られておらず、嫌気発酵条件でピルベートオキシダーゼ遺伝子を発現させて解析した報告もなかった。
【特許文献１】米国特許第５，１４３，８３３号明細書
【特許文献２】米国特許第５，５０４，００４号明細書
【特許文献３】特開平１１−１１３５８８号公報
【特許文献４】特開平１１−１９６８８８号公報
【特許文献５】特開平１１−２０６３８５号公報
【特許文献６】特開平６−１４７８１号公報
【特許文献７】特開平７−６７６８３号公報
【特許文献８】国際公開第９９／０６５３２号パンフレット
【特許文献９】欧州特許出願公開第１０９６０１３号明細書
【特許文献１０】国際公開第０２／３６７９７号パンフレット
【特許文献１１】国際公開第０２／０７２８５５号パンフレット
【特許文献１２】国際公開第０２/２９０２０号パンフレット
【特許文献１３】欧州特許出願公開第１ １０８ ７９０号明細書
【非特許文献１】International Journal of Systematic Bacteriology, vol. 49, p207-216、 1999年
【非特許文献２】Microbiology. 1999 Feb;145 (Pt 2):503-13
【発明の開示】
【０００８】
本発明は、コハク酸を効率よく生産することのできるコリネ型細菌を提供することを課題とする。
【０００９】
本研究者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、コリネ型細菌においてピルベートオキシダーゼ活性を低下させることにより、酢酸の副生が低減して、コハク酸が効率よく生産されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
即ち、本発明は、以下のとおりである。
（１）コハク酸生産能を有するコリネ型細菌であって、ピルベートオキシダーゼの活性が低下するように改変されたコリネ型細菌。
（２）  前記ピルベートオキシダーゼが、下記（Ａ）又は（Ｂ）に記載のタンパク質である請求項１に記載のコリネ型細菌、
（Ａ）配列番号４９に示すアミノ酸配列を有するタンパク質、又は
（Ｂ）配列番号４９に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、ピルベートオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
（３）  染色体上のピルベートオキシダーゼ遺伝子が破壊されたことによりピルベートオキシダーゼ活性が低下した、（１）又は（２）のコリネ型細菌。
（４）  前記ピルベートオキシダーゼ遺伝子が、下記（ａ）又は（ｂ）に記載のＤＮＡである（３）のコリネ型細菌、
（ａ）配列番号４８の塩基番号９９６−２７３２の塩基配列を含むＤＮＡ、又は
（ｂ）配列番号４８の塩基番号９９６−２７３２の塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ピルベートオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（５）  さらに、ホスホトランスアセチラーゼ、アセテートキナーゼ及びアセチルCoAハイドロラーゼからなる群より選ばれる１種又は２種以上の酵素の活性が低下するように改変された、（１）〜（４）のいずれかのコリネ型細菌。
（６）  さらに、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低下するように改変された（１）〜（５）のいずれかのコリネ型細菌。
（７）  さらに、ピルベートカルボキシラーゼ活性が上昇するように改変された（１）〜（６）のいずれかのコリネ型細菌。
（８）  （１）〜（７）のいずれかのコリネ型細菌またはその処理物を、炭酸イオン、重炭酸イオンまたは二酸化炭素を含有する反応液中で有機原料に作用させることにより、該反応液中にコハク酸を生成蓄積させ、該反応液からコハク酸を採取することを特徴とするコハク酸の製造方法。
（９）  嫌気的条件下において、前記細菌又はその処理物を有機原料に作用させることを特徴する（８）の製造方法。
（１０）  （８）又は（９）の方法によりコハク酸を製造する工程、及び得られたコハク酸を重合させる工程を含む、コハク酸含有ポリマーの製造方法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】プラスミドpBS3の構築手順を示す図。
【図２】プラスミドpBS4Sの構築手順を示す図。
【図３】プラスミドpΔldh56-1の構築手順を示す図。
【図４】プラスミドpBS4S::ΔpoxBの構築手順を示す図。
【図５】poxB破壊株及び対照株の酢酸の副生率を示す図。
【図６】プラスミドpBS5T::Δackの構築手順を示す図。
【図７】プラスミドpBS5T::Δpta-ackの構築手順を示す図。
【図８】プラスミドpBS5T::ΔpoxBの構築手順を示す図。
【図９】プラスミドpBS4S::Δachの構築手順を示す図。
【図１０】プラスミドpBS5T::Δacpの構築手順を示す図。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する【００１３】
＜１＞本発明に用いられるコリネ型細菌
本発明において、「コリネ型細菌」とは、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが、現在コリネバクテリウム属に分類されている細菌も含み（Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255(1981)）、またコリネバクテリウム属と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。このようなコリネ型細菌の例として以下のものが挙げられる。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム
ブレビバクテリウム・フラバム
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム【００１４】
本発明において、「コハク酸生産能」とは、本発明のコリネ型細菌を培養したときに、培地中にコハク酸を蓄積する能力をいう。このコハク酸生産能は、コリネ型細菌が本来的に有するものであってもよく、育種によって付与される性質であってもよい。【００１５】
育種によってコハク酸生産能を付与するには、代謝制御変異株の取得、目的物質の生合成系酵素が増強された組換え株の創製等、従来、コリネ型細菌の育種に採用されてきた方法を適用することが出来る（アミノ酸発酵、（株）学会出版センター、1986年5月30日初版発行、第７７〜１００頁参照）。これらの方法において、付与される代謝制御変異や増強される目的物質生合成系酵素の増強等の性質は、単独でもよく、2種又は3種以上であってもよい。代謝制御変異等の性質の付与と、生合成系酵素の増強が組み合わされてもよい。コハク酸生合成系酵素としては、例えば、後述するようなピルビン酸カルボキシラーゼが挙げられる。【００１６】
コハク酸生産能を有するコリネ型細菌の特に好ましい具体例としては、ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低下したブレビバクテリウム・フラバムMJ233Δldh株（特開平１１−２０６３８５号公報）や、ピルビン酸カルボキシラーゼ又はホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性が強化されたブレビバクテリウム・フラバムMJ233/pPCPYC株（国際公開第01/27258号パンフレット、特開平１１−１９６８８７号公報 ）、またブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９７）、同ＭＪ−２３３  ＡＢ−４１（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１４９８）、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス  ＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテリウム・グルタミカム  ＡＴＣＣ３１８３１、及びブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＡＴＣＣ１３８６９等が挙げられる。なお、ブレビバクテリウム・フラバムは、現在、コリネバクテリウム・グルタミカムに分類される場合もあり（Lielbl, W., Ehrmann, M., Ludwig, W. and Schleifer, K. H., International Journal of Systematic Bacteriology, 1991, vol. 41, p255-260）、上記ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株、及びその変異株ＭＪ−２３３  ＡＢ−４１株は、それぞれ、コリネバクテリウム・グルタミカムＭＪ−２３３株及びＭＪ−２３３  ＡＢ−４１株と同一の株であるものとする。【００１７】
＜２＞本発明のコリネ型細菌の構築
本発明のコリネ型細菌は、上記のようなコハク酸生産能を有するコリネ型細菌であって、かつピルベートオキシダーゼ活性が低下するように改変されたコリネ型細菌である。本発明のコリネ型細菌の育種において、コハク酸生産能の付与とピルベートオキシダーゼ（EC 1.2.2.2）活性を低下させる改変は、どちらを先に行ってもよい。【００１８】
「ピルベートオキシダーゼ活性」は、ピルビン酸と水から酢酸を生成する反応を触媒する活性をいう。「ピルベートオキシダーゼ活性が低下するように改変された」とは、ピルベートオキシダーゼ活性が、非改変株、例えば野生株のコリネ型細菌の比活性よりも低くなったことをいう。ピルベートオキシダーゼ活性は非改変株と比較して、菌体当たり50％以下に低下していることが好ましく、30％以下に低下していることがより好ましく、10％以下に低下していることが特に好ましい。「低下」には活性が完全に消失した場合も含まれる。なお、活性の比較対照となる野生株のコリネ型細菌としては、例えば、野生株としてはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869、非改変株としてはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムΔldh株が挙げられる。ピルベートオキシダーゼ活性は、Changらの方法（Chang Y. and Cronan J. E. JR,J.Bacteriol.151,1279-1289(1982)）により、活性を測定することによって確認することができる。【００１９】
上記活性を有するピルベートオキシダーゼとしては、例えば、配列番号４９に示すアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。また、ピルベートオキシダーゼ活性を有する限りにおいて、配列番号４９に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有するものであってもよい。ここで、数個とは、例えば、２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜５個を意味する。【００２０】
「ピルベートオキシダーゼ活性が低下するように改変された」とは、例えば、細胞あたりのピルベートオキシダーゼの分子数が低下した場合や、分子あたりのピルベートオキシダーゼ活性が低下した場合等が該当する。具体的には、染色体上のピルベートオキシダーゼをコードする遺伝子を欠損させたり、プロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。染色体上のピルベートオキシダーゼ遺伝子としては、例えば、配列番号４８の塩基番号９９６〜２７３２の塩基配列を含むＤＮＡを挙げることができる。また、ピルベートオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、配列番号４８の塩基番号９９６〜２７３２の塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。【００２１】
ピルベートオキシダーゼ遺伝子（以下poxB遺伝子と呼ぶ）の取得は、例えば、GenBankに登録されている配列（GenBank Accession No． NC_003450の2776766-2778505番目の相補鎖）に基づき、合成オリゴヌクレオチドを合成し、コリネバクテリウム・グルタミカムの染色体を鋳型としてＰＣＲ反応を行うことによってクローニングできる。また、近年ゲノムプロジェクトにより、塩基配列が決定されているブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム等のコリネ型細菌の配列も利用できる。染色体ＤＮＡは、ＤＮＡ供与体である細菌から、例えば、斎藤、三浦の方法（H. Saito and K.Miura, Biochem.B iophys. Acta, 72, 619 (1963)、生物工学実験書、日本生物工学会編、９７〜９８頁、培風館、１９９２年参照）等により調製することができる。【００２２】
上記のようにして調製したpoxB遺伝子又はその一部を遺伝子破壊に使用することができる。ただし、遺伝子破壊に用いる遺伝子は破壊対象のコリネ型細菌の染色体ＤＮＡ上のpoxB遺伝子（例えば、配列番号４８の塩基番号９９６−２７３２の塩基配列を有する遺伝子）と相同組換えを起こす程度の相同性を有していればよいため、このような相同遺伝子も使用することができる。ここで、相同組換えを起こす程度の相同性とは、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上の相同性を意味する。また、上記遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るＤＮＡ同士であれば、相同組換えは起こり得る。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で、１回より好ましくは２〜３回洗浄する条件が挙げられる。【００２３】
上記のような遺伝子を使用し、例えば、poxB遺伝子の部分配列を欠失し、正常に機能するピルベートオキシダーゼを産生しないように改変した欠失型poxB遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡでコリネ型細菌を形質転換し、欠失型遺伝子と染色体上の遺伝子で組換えを起こさせることにより、染色体上のpoxB遺伝子を破壊することが出来る。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による遺伝子破壊は既に確立しており、直鎖状ＤＮＡを用いる方法や温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある（米国特許第6303383号明細書、又は特開平05-007491号公報）。また、上述のような相同組換えを利用した遺伝子置換により遺伝子破壊は、宿主上で複製能力を持たないプラスミドを用いても行うことが出来る。【００２４】
欠失型のpoxB遺伝子を宿主染色体上のpoxB遺伝子と置換するには、例えば以下のようにすればよい。まず、温度感受性複製起点、欠失型poxB遺伝子、レバンシュークラーゼをコードするsacB遺伝子及びクロラムフェニコール等の薬剤耐性を示すマーカー遺伝子を挿入して組換え用プラスミドを調製する。【００２５】
ここで、レバンシュークラーゼをコードするsacB遺伝子は、染色体上からベクター部分が脱落した菌株を効率よく選択する為に使用される遺伝子である（Schafer,A.et al.Gene 145 (1994)69-73）。すなわち、コリネ型細菌では、レバンシュークラーゼを発現させると、シュークロースを資化することによって生成したレバンが致死的に働き、生育することが出来ない。従って、レバンシュークラーゼを搭載したベクターが染色体上に残ったままの菌株をシュークロース含有プレートで培養すると生育できず、ベクターが脱落した菌株のみシュークロース含有プレートで選択することが出来る。【００２６】
sacB遺伝子又はその相同遺伝子は、以下のような配列の遺伝子を用いることが出来る。
バチルス・ズブチルス：sacB  GenBank Accession Number X02730（配列番号４１）
バチルス・アミロリキュファシエンス：sacB  GenBank Accession Number X52988
ザイモモナス・モビリス：sacB  GenBank Accession Number L33402
バチルス・ステアロサーモフィラス：surB  GenBank Accession Number U34874
ラクトバチルス・サンフランシセンシス：frfA  GenBank Accession Number AJ508391
アセトバクター・キシリナス：lsxA  GenBank Accession Number AB034152
グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィカス：lsdA GenBank Accession Number L41732【００２７】
次に、上記組換えプラスミドでコリネ型細菌を形質転換する。形質転換は、これまでに報告されている形質転換法に従って行えばよい。例えば、エシェリヒア・コリＫ−１２について報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増加させる方法（Mandel,M.and Higa,A., J.Mol.Biol.,53 ,159 (1970) ）があり、バチルス・ズブチルスについて報告されているような、増殖段階の細胞からコンピテントセルを調整しＤＮＡを導入する方法（Dancan,C.H., Wilson,G.A and Young,F.E , Gene ,1,153（1977） ）がある。あるいは、バチルス・ズブチルス、放線菌類及び酵母について知られているようなＤＮＡ受容菌の細胞を組換えＤＮＡをＤＮＡ受容菌に導入する方法（Chang.S. and Choen,S.N., Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb,M.J., Ward,J.M. and Hopwood,O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen,A., Hicks,J.B. and Fink,G.R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)）も応用できる。また、コリネ型細菌の形質転換は、電気パルス法（杉本ら、特開平2-207791号公報）によっても行うことができる。【００２８】
コリネ型細菌の温度感受性プラスミドとしては、p48K及びpSFKT2（以上、特開2000-262288号公報参照）、pHSC4（フランス特許公開1992年2667875号公報、特開平5-7491号公報参照）等が挙げられる。これらのプラスミドは、コリネ型細菌中で少なくとも25℃では自律複製することができるが、37℃では自律複製できない。pHSC4を保持するエシェリヒア・コリAJ12571は、1990年10月11日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現独立行政法人 産業技術総合研究所 特許微生物寄託センター）（〒305-5466 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に受託番号FERM P-11763として寄託され、1991年8月26日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-3524の受託番号で寄託されている。【００２９】
上記のようにして得られる形質転換体を温度感受性複製起点が機能しない温度（25℃）で培養し、プラスミドを導入した株を取得する。プラスミド導入株を高温で培養し、温度感受性プラスミドを脱落させ、抗生物質を含有するプレートに本菌株を塗布する。温度感受性プラスミドは高温で複製できないので、プラスミドが脱落した菌株は、抗生物質を含有したプレートでは生育出来ないが、ごくわずかの頻度であるが、プラスミド上のpoxB遺伝子と染色体上のpoxB遺伝子と組換えを起こした菌株が出現する。【００３０】
こうして染色体に組換えＤＮＡが組み込まれた株は、染色体上にもともと存在するpoxB遺伝子配列との組換えを起こし、染色体のpoxB遺伝子と欠失型のpoxB遺伝子との融合遺伝子２個が組換えＤＮＡの他の部分（ベクター部分、温度感受性複製起点及び薬剤耐性マーカー）を挟んだ状態で染色体に挿入されている。【００３１】
次に、染色体ＤＮＡ上に欠失型のpoxB遺伝子のみを残すために、ベクター部分（温度感受性複製起点及び薬剤耐性マーカーを含む）とともに染色体ＤＮＡから脱落させる。その際、正常なpoxB遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、欠失型poxB遺伝子が切り出される場合と、反対に欠失型ach遺伝子が染色体ＤＮＡ上に残され、正常なpoxB遺伝子が切り出される場合がある。いずれの場合も、温度感受性複製起点が機能する温度で培養すれば、切り出されたＤＮＡはプラスミド状で細胞内に保持される。次に、温度感受性複製起点が機能しない温度で培養すると、プラスミド上のpoxB遺伝子は、プラスミドとともに細胞から脱落する。そして、PCRまたはサザンハイブリダイゼーション等により、染色体上に欠失型poxB遺伝子が残った株を選択することによってpoxB遺伝子が破壊された株を取得することができる。【００３２】
なお、上記温度感受性プラスミドに換えて、コリネ型細菌内で複製能を持たないプラスミドを用いても、同様の遺伝子破壊を行うことが出来る。コリネ型細菌内で複製能を持たないプラスミドは、エシェリヒア・コリで複製能力を持つプラスミドが好ましく、例えば、pHSG299(宝バイオ社製）pHSG399( 宝バイオ社製)等が挙げられる。【００３３】
なお、ピルベートオキシダーゼの活性を低下させる方法としては、上述の遺伝子操作法以外に、コリネ型細菌を、紫外線照射またはＮ−メチルーＮ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理し、ピルベートオキシダーゼの活性が低下した菌株を選択する方法が挙げられる。【００３４】
本反応においては、上記ピルベートオキシダーゼ活性の低下に加えて、ラクテートデヒドロゲナーゼ（以下LDHと呼ぶことがある）活性が低下するように改変された細菌株を用いるとより有効である。ラクテートデヒドロゲナーゼ活性とは、NADHを補酵素として、ピルビン酸を還元して乳酸を生成する反応を触媒する活性を意味する。「ラクテートデヒドロゲナーゼ活性が低下された」とは、LDH非改変株と比較してLDH活性が低下していることをいう。LDH活性は、LDH非改変株や野生株と比較して低下していればよいが、菌体当たり50％以下に低下していることが好ましく、30%以下に低下していることがより好ましく、菌体当たり10％以下に低下していることが特に好ましい。また、LDH活性は完全に欠損していてもよい。LDH活性が低下したことはL.Kanarekらの方法（L.Kanarek and R.Ｌ.Hill, J. Biol. Chem.239, 4202 (1964)）によりLDH活性を測定することによって確認することができる。本発明のコリネ型細菌は、LDH活性が低下したコリネ型細菌を作製し、さらに、ピルベートオキシダーゼ活性が低下するように改変することにより得ることができる。ただし、LDH活性を低下させるための改変と、ピルベートオキシダーゼ活性を低下させるための改変はいずれを先に行ってもよい。ldh遺伝子としては、例えば配列番号４３に示す配列を有する遺伝子を使用することができ、上記poxB遺伝子と同様の方法により遺伝子破壊等を行うことができる。【００３５】
本発明においては、ピルベートオキシダーゼ活性の低下に加えて、ホスホトランスアセチラーゼ(以下PTA)、アセテートキナーゼ(以下ACK)、アセチルCoAハイドロラーゼ（ACH）のいずれかの活性が低下するように改変された細菌株を用いるとより有効であり、これらの２以上の酵素活性が低下するように改変された細菌株を用いると更に有効であり、これらの活性が全て低下するように改変された細菌株を用いると特に有効であり、さらにアシルフォスァターゼを欠損させた細菌株を用いると更に有効である。【００３６】
本発明で、ホスホトランスアセチラーゼ（PTA）活性とは、アセチルCoA にリン酸を転移し、アセチルリン酸を生成する反応を触媒する活性をを意味し、アセテートキナーゼ(ACK)とは、アセチルリン酸とＡＤＰから酢酸を生成反応を触媒する活性を意味し、アセチルCoAハイドロラーゼ（ACH）とはアセチルCoAと水から酢酸を生成する反応を触媒する活性を意味し、アシルフォスファターゼ（ACP）は、アセチルリン酸からリン酸と酢酸、またはカルボン酸とリン酸を生成する反応を触媒する活性を意味する。【００３７】
これらの活性を低下させるには、上述の各酵素をコードする遺伝子を破壊することにより、または、各酵素をコードする遺伝子のプロモーターや、シャインダルガルノ（SD）配列等発現調節配列を改変することによって達成される。遺伝子破壊方法は上述のpoxB遺伝子破壊方法と同様の方法で行うことが出来る。【００３８】
各酵素をコードする遺伝子は、例えばGenBankに登録されているコリネバクテリウム・グルタミカムの以下の遺伝子が利用できる。
pta遺伝子（ホスホアセチルトランスフェラーゼ）GenBank Accession No. NC_003450 のNCgl2657（NC_003450 の2936506-2937891番目の相補鎖）(配列番号４５の塩基番号956〜1942)
ack遺伝子（アセテートキナーゼ）、GenBank Accession No. NC_003450 のNCgl2656
（NC_003450の2935313-2936506番目の相補鎖） （配列番号４５の塩基番号1945〜3135）
ach遺伝子（アセチル-CoA ハイドロラーゼ）（GenBank Accession No.NC_003450のNCgl2480（NC_003450の2729376-2730884番目の相補鎖）(配列番号５０)
acp遺伝子（アシルフォスファターゼ）GENEBANK accession No.NC_003450のNCgl1987 
(NC_003450の2183107-2183391番目の相補鎖)   （配列番号５２）【００３９】
「ホスホトランスアセチラーゼ(以下PTA)活性が低下した」とは、PTA非改変株と比較してPTA活性が低下していることをいう。PTA活性は、PTA非改変株や野生株と比較して低下していればよいが、菌体当たり50％以下に低下していることが好ましく、30%以下に低下していることがより好ましく、菌体当たり10％以下に低下していることが特に好ましい。また、PTA活性は完全に欠損していてもよい。PTA活性が低下したことは、Klotzschらの方法（Klotzsch, H. R., Meth Enzymol. 12, 381-386(1969)）により、PTA活性を測定することによって確認することができる。POXB及びPTA活性が低下したコリネ型細菌は、POXB活性が低下したコリネ型細菌を作製し、さらに、PTA活性が低下するように改変することにより得ることができる。ただし、PTA活性低下のための改変とPOXB活性低下のための改変は、いずれを先に行ってもよい。【００４０】
「アセテートキナーゼ(以下ACK)活性が低下した」とは、野生株または、ACK非改変株と比較してACK活性が低下していることをいう。ACK活性は、ACK非改変株や野生株と比較して低下していればよいが、ACK非改変株と比較して、菌体当たり50％以下に低下していることが好ましく、30%以下に低下していることがより好ましく、菌体当たり10％以下に低下していることが特に好ましい。また、ACK活性は完全に欠損していてもよい。ACK活性が低下したことは、Ramponiらの方法（Ramponi G., Meth. Enzymol. 42,409-426(1975)）により、ACK活性を測定することによって確認することができる。POXB及びACK活性が低下したコリネ型細菌はPOXB活性が低下したコリネ型細菌を構築し、さらにACK活性が低下するように改変することより得ることができる。ただし、ACK活性低下のための改変と、POXB活性低下のための改変は、いずれを先に行ってもよい。【００４１】
「アセチルCoAハイドロラーゼ（以下ACH）活性が低下した」は、ACH非改変株や野生株と比較して低下していればよいが, ACH非改変株と比較して、菌体あたり50％以下に低下していることが好ましく、30%以下に低下していることがより好ましく、菌体当たり10％以下に低下していることが特に好ましい。また、ACH活性は完全に欠損していてもよい。ACH活性が低下したことは、Gergely,J.,らの方法（Gergely,J., Hele,P. & Ramkrishnan,C.V. (1952) J.Biol.Chem. 198 p323-334）により、ACH活性を測定することによって確認することができる。ACH及びPOXB活性が低下したコリネ型細菌は、ACH活性が低下したコリネ型細菌を構築し、さらに、POXB活性が低下するように改変することにより得ることができる。ただし、POXB活性低下のための改変と、ACH活性低下のための改変はいずれを先に行ってもよい。【００４２】
また、「アシルホスファターゼ(以下ACP)活性が低下した」とは、野生株又は、ACP非改変株と比較してACP活性が低下していることをいう。ACP活性は、野生株又はACP非改変株と比べて低下していればよいが、ACP非改変株と比較して、菌体当たり50％以下さらに望ましくは菌体あたり10％以下に低減化されていることが好ましい。また、ACP活性は完全に欠損していてもよい。ACP活性が低減化されたことは、上記ACK活性と同様の方法（Ramponi G., Meth. Enzymol. 42,409-426(1975)）により、ACP活性を測定することによって確認することができる。POXB及びACP活性が低下したコリネ型細菌は、POXB活性が低下したコリネ型細菌を構築し、さらにACP活性が低下するように改変することにより得ることができる。ただし、ACP活性低下のための改変とPOXB活性低下のための改変はいずれを先に行ってもよい。
【００４３】
また、本反応においては、POXBの活性の低下に加えて、ピルベートカルボキシラーゼ（以下PCと呼ぶ）の活性が上昇するように改変された細菌を用いてもよい。「ピルベートカルボキシラーゼの活性が増強される」とは、PCの活性が野生株又は親株等の非改変株に対して上昇していることをいう。PCの活性はPeters-Wendisch P.Gらの方法（Peters-Wendisch P.G. et al.  Microbiology 143, 1095-1103(1997)）により測定することができる。【００４４】
本発明の方法に使用されるPCタンパク質をコードするpc遺伝子は、既にその塩基配列が決定されている遺伝子、もしくは、下記に示すような方法によりPC活性を有するタンパク質をコードするDNA断片を微生物、動植物等の染色体より単離し、塩基配列を決定したものを使用することができる。また、塩基配列が決定された後には、その配列にしたがって合成した遺伝子を使用することもできる。例えばコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032のピルベートカルボキシラーゼ遺伝子GenBank Accession No. NCgl0659遺伝子（配列番号６０）を使用することが出来る。その他にも以下の生物由来のPC遺伝子を使用することもできる。
ヒト  ［Biochem.Biophys.Res.Comm., 202, 1009-1014, (1994)］
マウス［Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 90, 1766-1779, (1993)］
ラット［GENE, 165, 331-332, (1995)］
酵母；サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）
[Mol.Gen.Genet., 229, 307-315, (1991)]
シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）
［DDBJ Accession No.; D78170］
バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus）
［GENE, 191, 47-50, (1997)］
リゾビウム・エトリ（Rhizobium etli）
［J.Bacteriol., 178, 5960-5970, (1996)］【００４５】
pc遺伝子を含むDNA断片は、適当な発現プラスミド、例えばpUC118（宝バイオ社製）へ挿入し、適当な宿主微生物、例えばエシェリヒア・コリJM109（宝バイオ社製）へ導入することにより発現させることができる。発現したpc遺伝子産物であるピルビン酸カルボキシラーゼの確認は、該形質転換体から上記の公知の方法によりPC活性を測定し、非形質転換株から抽出した粗酵素液のPC活性と比較することにより、確認することができる。pc遺伝子を含むDNA断片を、適当なプラスミド、例えばコリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むプラスミドベクターに導入することにより、コリネ型細菌内でpcの高発現可能な組換えプラスミドを得ることができる。ここで、上記組み換えプラスミドにおいて、pc遺伝子を発現させるためのプロモーターはコリネ型細菌が保有するプロモーターであることができるが、それに限られるものではなく、pc遺伝子の転写を開始させるための塩基配列であればいかなるプロモーターであっても良い。【００４６】
pc遺伝子を導入することができるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内での複製増殖機能を司る遺伝子を少なくとも含むものであれば特に制限されない。その具体例としては、例えば、特開平３−２１０１８４号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ３０；特開平２−７２８７６号公報及び米国特許５，１８５，２６２号明細書公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ及びｐＣＲＹ３ＫＸ；特開平１−１９１６８６号公報に記載のプラスミドｐＣＲＹ２およびｐＣＲＹ３；特開昭５８−６７６７９号公報に記載のｐＡＭ３３０；特開昭５８−７７８９５号公報に記載のｐＨＭ１５１９；特開昭５８−１９２９００号公報に記載のｐＡＪ６５５、ｐＡＪ６１１及びｐＡＪ１８４４；特開昭５７−１３４５００号公報に記載のｐＣＧ１；特開昭５８−３５１９７号公報に記載のｐＣＧ２；特開昭５７−１８３７９９号公報に記載のｐＣＧ４およびｐＣＧ１１等を挙げることができる。【００４７】
それらの中でもコリネ型細菌の宿主−ベクター系で用いられるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌内でプラスミドの複製増殖機能を司る遺伝子とコリネ型細菌内でプラスミドの安定化機能を司る遺伝子とを有するものが好ましく、例えば、プラスミドｐＣＲＹ３０、ｐＣＲＹ２１、ｐＣＲＹ２ＫＥ、ｐＣＲＹ２ＫＸ、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥおよびｐＣＲＹ３ＫＸ等が好適に使用される。【００４８】
pc遺伝子を、上記したような好気性コリネ型細菌内で複製可能なプラスミドベクターの適当な部位に挿入して得られる組み換えベクターで、コリネ型細菌、例えばブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)2256株（ATCC13869）を形質転換することにより、pc遺伝子の発現が増強されたコリネ型細菌が得られる。形質転換は、例えば、電気パルス法（Res. Microbiol., Vol.144, p.181-185, 1993）等によって行うことができる。なお、PC活性の増強は、公知の相同組換え法によって染色体上でpc遺伝子を導入、置換、増幅等によって高発現化させることによっても行うことができる。このようにして得られるPC遺伝子高発現株においてpox遺伝子を破壊することにより、PC活性が増強され、且つピルベートオキシダーゼ活性が低減化された細菌株を得ることが出来る。なお、ピルベートオキシダーゼ活性の低減化とPC活性の増強はどちらを先に行っても良い。【００４９】
さらに、本発明においては、ピルベートオキシダーゼ活性、ACH活性、PTA活性、及びACK活性が低下するように改変され、さらにLDH活性が低下するように改変され、さらにPC活性が増強するように改変された細菌を用いると、物質生産、特にコハク酸の製造に特に有効である。【００５０】
＜３＞本発明の微生物を用いたコハク酸の生産  
上記のようにして得られるコリネ型細菌を培地で培養し、該培地中にコハク酸を生成蓄積させ、該培地からコハク酸を採取することにより、コハク酸を効率よく製造することができる。【００５１】
コハク酸の製造反応に上記細菌を用いるに当たっては、寒天培地等の固体培地で斜面培養したものを直接反応に用いても良いが、上記細菌を予め液体培地で培養（種培養）したものを用いるのが好ましい。このように種培養した細菌を、有機原料を含む培地で増殖させながら、有機原料と反応させることによって製造することができる。また、増殖させて得られた菌体を回収し、該菌体を、有機原料を含む反応液中で有機原料と反応させることによっても製造することができる。なお、好気性コリネ型細菌を本発明の方法に用いるためには、細菌を通常の好気的な条件で培養した後、反応に用いることが好ましい。培養に用いる培地は、通常微生物の培養に用いられる培地を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム等の無機塩からなる組成物に、肉エキス、酵母エキス、ペプトン等の天然栄養源を添加した一般的な培地を用いることができる。培養後の菌体を回収して用いる場合、菌体は遠心分離、膜分離等によって回収され、反応に用いられる。【００５２】
本発明では細菌の菌体の処理物を使用することもできる。菌体の処理物としては、例えば、菌体をアクリルアミド、カラギーナン等で固定化した固定化菌体、菌体を破砕した破砕物、その遠心分離上清、又はその上清を硫安処理等で部分精製した画分等が挙げられる。【００５３】
本発明の製造方法に用いる有機原料としては、本微生物が資化してコハク酸を生成させうる炭素源であれば特に限定されないが、通常、ガラクトース、ラクトース、グルコース、フルクトース、グリセロール、シュークロース、サッカロース、デンプン、セルロース等の炭水化物；グリセリン、マンニトール、キシリトール、リビトール等のポリアルコール類等の発酵性糖質が用いられ、このうちグルコース、フルクトース、グリセロールが好ましく、特にグルコースが好ましい。【００５４】
また、上記発酵性糖質を含有する澱粉糖化液、糖蜜なども使用される。これらの発酵性糖質は、単独でも組み合わせても使用できる。上記有機原料の使用濃度は特に限定されないが、コハク酸の生成を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利であり、通常、５〜３０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは１０〜２０％（Ｗ／Ｖ）の範囲内で反応が行われる。また、反応の進行に伴う上記有機原料の減少にあわせ、有機原料の追加添加を行っても良い。【００５５】
上記有機原料を含む反応液としては特に限定されず、水、緩衝液、培地等が用いられるが、培地が最も好ましい。反応液は、窒素源や無機塩などを含む反応液であることが好ましい。ここで、窒素源としては、本微生物が資化してコハク酸を生成させうる窒素源であれば特に限定されないが、具体的には、アンモニウム塩、硝酸塩、尿素、大豆加水分解物、カゼイン分解物、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカーなどの各種の有機、無機の窒素化合物が挙げられる。無機塩としては各種リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛等の金属塩が用いられる。また、ビオチン、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等のビタミン類、ヌクレオチド、アミノ酸などの生育を促進する因子を必要に応じて添加する。また、反応時の発泡を抑えるために、反応液には市販の消泡剤を適量添加しておくことが望ましい。【００５６】
反応液のｐＨは、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム等を添加することによって調整することができる。本反応におけるｐＨは、通常、ｐＨ５〜１０、好ましくはｐＨ６〜９．５であることが好ましいので、反応中も必要に応じて反応液のｐＨはアルカリ性物質、炭酸塩、尿素などによって上記範囲内に調節する。【００５７】
培地には、炭酸イオン、重炭酸イオン又は炭酸ガス（二酸化炭素）を含有させることが好ましい。炭酸イオン又は重炭酸イオンは、中和剤としても用いることのできる炭酸マグネシウム、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウムから供給されるが、必要に応じて、炭酸若しくは重炭酸又はこれらの塩或いは炭酸ガスから供給することもできる。炭酸又は重炭酸の塩の具体例としては、例えば炭酸マグネシウム、炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム等が挙げられる。そして、炭酸イオン、重炭酸イオンは、０．００１〜５Ｍ、好ましくは０．１〜３Ｍ、さらに好ましくは１〜２Ｍの濃度で添加する。炭酸ガスを含有させる場合は、溶液１Ｌ当たり５０ｍｇ〜２５ｇ、好ましくは１００ｍｇ〜１５ｇ、さらに好ましくは１５０ｍｇ〜１０ｇの炭酸ガスを含有させる。【００５８】
本反応に用いる細菌の生育至適温度は、通常、２５℃〜３５℃である。反応時の温度は、通常、２５℃〜４０℃、好ましくは３０℃〜３７℃である。反応に用いる菌体の量は、特に規定されないが、１〜７００ｇ／Ｌ、好ましくは１０〜５００ｇ／Ｌ、さらに好ましくは２０〜４００ｇ／Ｌが用いられる。反応時間は１時間〜１６８時間が好ましく、３時間〜７２時間がより好ましい。【００５９】
細菌の培養時は、通気、攪拌し酸素を供給することが必要である。一方、コハク酸の生成反応は、通気、攪拌して行ってもよいが、通気せず、酸素を供給しない嫌気的条件下で行ってもよい。ここで言う嫌気的条件とは、溶液中の溶存酸素濃度を低く抑えて反応することを意味する。この場合、溶存酸素濃度として０〜２ｐｐｍ、好ましくは０〜１ｐｐｍ、さらに好ましくは０〜０．５ｐｐｍで反応させることが望ましい。そのための方法としては、例えば容器を密閉して無通気で反応させる、亜硫酸塩を添加する、窒素ガス等の不活性ガスを供給して反応させる、炭酸ガス含有の不活性ガスを通気する等の方法を用いることができる。【００６０】
反応液（培養液）中に蓄積したコハク酸は、常法に従って、反応液より分離・精製することができる。具体的には、遠心分離、ろ過等により菌体等の固形物を除去した後、イオン交換樹脂等で脱塩し、その溶液から結晶化あるいはカラムクロマトグラフィーによりコハク酸を分離・精製することができる。【００６１】
さらに本発明においては、上記した本発明の方法によりコハク酸を製造した後に、得られたコハク酸を原料として重合反応を行うことによりコハク酸含有ポリマーを製造することができる。コハク酸含有ポリマーはホモポリマーであってもよいし、他のポリマー原料との共重合ポリマーであってもよい。近年、環境に配慮した工業製品が数を増す中、植物由来の原料を用いたポリマーに注目が集まってきており、本発明において製造されるコハク酸は、ポリエステルやポリアミドといったポリマーに加工されて用いる事が出来る。コハク酸含有ポリマーとして具体的には、ブタンジオールやエチレングリコールなどのジオールとコハク酸を重合させて得られるコハク酸ポリエステル、ヘキサメチレンジアミンなどのジアミンとコハク酸を重合させて得られるコハク酸ポリアミドなどが挙げられる。
また、本発明の製造法により得られるコハク酸または該コハク酸を含有する組成物は食品添加物や医薬品、化粧品などに用いることができる。【００６２】
［実施例］
以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明する.
【実施例１】
【００６３】
＜１＞sacB搭載遺伝子破壊用ベクターの構築
（A）pBS3の構築
sacB遺伝子をバチルス・ズブチリスの染色体DNAを鋳型として配列番号１と２をプライマーとして用いて、PCRにより取得した。PCR反応は、LA taq(TaKaRa)を用い、94 ℃で5分保温を1サイクル行った後、変性94℃ 30秒、会合49℃ 30秒、伸長72℃ 2分からなるサイクルを25回繰り返した。生成したPCR産物を常法により精製後BglIIとBamHIで消化し、平滑化した。この断片をpHSG299のAvaIIで消化後、平滑化した部位に挿入した。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝バイオ社製）を用いて形質転換を行い、カナマイシン（以下、Kmと略す）25μg/mlを含むLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現したコロニーを釣り上げ、単コロニーを分離し形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS3と命名した。pBS3の構築過程を図1に示す。【００６４】
（B）pBS4Sの構築
pBS3上に存在するカナマイシン耐性遺伝子配列中のSmaI部位をアミノ基置換を伴わない塩基置換によりカナマイシン耐性遺伝子を破壊したプラスミドをクロスオーバーPCRで取得した。まず、pBS3を鋳型として配列番号3，4の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、カナマイシン耐性遺伝子のN末端側の増幅産物を得る。一方Km耐性遺伝子のC末端側の増幅産物を得るためにpBS3を鋳型として配列番号5，6の合成DNAをプライマーとしてPCRを行った。PCR反応はPyrobest DNA Polymerase(宝バイオ社製)を用い、98 ℃で5分保温を1サイクル行った後、変性98℃ 10秒、会合57℃ 30秒、伸長72℃ 1分からなるサイクルを25回繰り返すことにより目的のPCR産物を得ることができる。配列番号4と5は部分的に相補的であり、またこの配列内に存在するSmaI部位はアミノ酸置換を伴わない塩基置換を施すことにより破壊されている。次にSmaI部位が破壊された変異型カナマイシン耐性遺伝子断片を得るために、上記カナマイシン耐性遺伝子N末端側及びC末端側の遺伝子産物を、それぞれほぼ等モルとなるように混合し、これを鋳型として配列番号3，6の合成DNAをプライマーと
してPCRを行い変異導入されたKm耐性遺伝子増幅産物を得た。PCR反応はPyrobest DNA Polymerase(宝バイオ社)を用い、98 ℃で5分保温を1サイクル行った後、変性98℃ 10秒、会合57℃ 30秒、伸長72℃ 1.5分からなるサイクルを25回繰り返すことにより目的のPCR産物を得ることができる。
【００６５】
PCR産物を常法により精製後BanIIで消化し、上記のpBS3のBanII部位に挿入した。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝バイオ社製宝バイオ社製）を用いて形質転換を行い、カナマイシン25μg/mlを含むLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現したコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4Sと命名した。pBS4Sの構築過程を図2に示す。
【実施例２】
【００６６】
＜LDH遺伝子破壊株の構築＞
(A) ラクテートデヒドロゲナーゼ遺伝子破壊用断片のクローニング
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256株由来のラクテートデヒドロゲナーゼ（以下、ldh遺伝子と略す）のORFを欠失した遺伝子断片は、既に公開されているコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032の該遺伝子の塩基配列（GenBank Database Accession No.NC_003450のNCgl2810）を参考に設計した合成DNAをプライマーとして用いたクロスオーバーPCRで取得した。具体的にはブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256株の染色体DNAを鋳型として、配列番号7、8の合成DNAをプライマーとして常法によりPCRを行いldh遺伝子N末端側の増幅産物を得た。一方、ldh遺伝子C末端側の増幅産物を得るために、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256株ゲノムDNAを鋳型とし、配列番号9、10の合成DNAをプライマーとして常法によりPCRを行った。配列番号8と9は互いに相補的であり、ldhのORFの全配列を欠損させた構造となっている。
なお、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC）より分譲を受けることができる（住所ATCC, P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）。【００６７】
次に内部配列を欠失したldh遺伝子断片を得るために、上記ldhのN末側およびC末側の遺伝子産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、これを鋳型として配列番号11と12の合成DNAをプライマーとして常法によりPCRを行い変異導入されたldh遺伝子増幅産物を得た。生成したPCR産物を常法により精製後SalIで消化した後、上記pBS4SのSalI部位に挿入した。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝バイオ社製）を用いて形質転換を行い、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mlおよびKm 25μg/mlを含むLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpΔldh56-1と命名した。該プラスミドの構築図を図3に示す。【００６８】
（B）ldh遺伝子破壊株の作成
上記（A）で得られたpΔldh56-1はコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えにより染色体に組み込まれた株が形質転換体として出現する。ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256株を電気パルス法により高濃度のプラスミドpΔldh56-1を用いて形質転換し、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dex培地（グルコース 5g/L、ポリペプトン 10g/L、イーストエキストラクト 10g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4・7H2O 0.4g/L、FeSO4・7H2O 0.01g/L、MnSO4・7H2O 0.01g/L、尿素 3g/L、大豆加水分解物 1.2g/L、pH7.5(KOH)）に塗布し、31.5℃で約30時間培養した。この培地上に生育した株は該プラスミドのldh遺伝子断片とブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノムに該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびSacB遺伝子が挿入されている株である。【００６９】
次にこれらの一回目の組換え体をカナマイシンを含まないCM-Dex液体培地にて31.5℃で一晩培養し、適当に希釈した後、カナマイシンを含まない10%ショ糖含有Dex-S10培地（ショ糖 100g/L、ポリペプトン 10g/L、イーストエキストラクト 10g/L、KH2PO4 1g/L、MgSO4・7H2O 0.4g/L、FeSO4・7H2O 0.01g/L、MnSO4・4H2O 0.01g/L、尿素 3g/L、大豆加水分解物 1.2g/L、ビオチン 10μg/L、pH7.5(KOH)）に塗布にし、31.5℃にて約30時間培養した。その結果、2回目の相同組み換えによりSacB遺伝子が脱落しシュークロース非感受性となったと考えられる株約50個得た。
【００７０】
この様にして得られた株の中には、そのldh遺伝子がpΔldh56-1に由来する変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。ldh遺伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、Dex-S10寒天培地にて培養して得られた菌体を直接PCR反応に供し、ldh遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。ldh遺伝子をPCR増幅するためのプライマー（配列番号7および配列番号10）を用いて分析した際、2256株の染色体DNAを鋳型にしたものよりもPCR産物の大きさが小さいものをldh破壊株として以降の実験に使用した。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変異型ldh遺伝子のみを有する株を選抜し、該株を2256Δ(ldh)株と命名した。この株を親株としてさらに以下の実施例に示すような改変を行った。
【実施例３】
【００７１】
＜ピルベートオキシダーゼ遺伝子破壊株の構築＞
（A）ピルベートオキシダーゼ遺伝子破壊用断片のクローニング
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256株のピルベートオキシダーゼ遺伝子（以下、該遺伝子をpoxBとする）のORFを欠失した遺伝子断片の取得は、既に公開されているコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032の該遺伝子の塩基配列（GenBank Accession No. NC003450のNCgl2521）を参考に設計した合成DNAをプライマーとして用いたクロスオーバーPCRで取得した。具体的には、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256株ゲノムDNAを鋳型とし、配列番号２９と３０の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、poxB遺伝子N末端側の増幅産物を得た。【００７２】
一方、poxB遺伝子C末端側の増幅産物を得るために、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256株ゲノムDNAを鋳型として、配列番号３１と３２の合成DNAをプライマーとしてPCRを行う。配列番号３０と３１は互いに相補的である。PCR反応は、KOD -plus-(TOYOBO)を用い、N末端側、C末端側ともに、94℃で2分保温を1サイクル行った後、変性94℃ 10秒、会合55℃ 30秒、伸長68℃ 40秒からなるサイクルを30回繰り返した。次に、内部配列を欠失したpoxB遺伝子断片を得るために、上記poxB N末端側およびC末端側の遺伝子産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、これを鋳型として配列番号３３と３４の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い変異導入されたpoxB遺伝子増幅産物を得た。PCR反応は、KOD -plus-(TOYOBO)を用い、94℃で2分保温を1サイクル行った後、変性94℃ 10秒、会合55℃ 30秒、伸長68℃ 70秒からなるサイクルを30回繰り返し、目的の変異導入されたpoxB遺伝子増幅産物を得た。【００７３】
生成したPCR産物を常法により精製後XbaIで消化し、上記実施例１（B）で構築したpBS4SのXbaI部位に挿入した。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝バイオ社製）を用いて形質転換を行い、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mlおよびカナマイシン25μg/mlを含むLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4S::ΔpoxBと命名した。pBS4S::ΔpoxBの構築過程を図4に示した。【００７４】
（B）poxB破壊株の作成
上記（A）で得られたpBS4S::ΔpoxBはコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えにより染色体に組み込まれた株が形質転換体として出現する。実施例２で構築された、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256Δ(ldh)株を電気パルス法により高濃度のプラスミドpBS4S::ΔpoxBを用いて形質転換し、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dex培地に塗布し、31.5℃で約30時間培養した。この培地上に生育した株は該プラスミドのpoxB遺伝子断片とブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256Δ(ldh)株のゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノムに該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびSacB遺伝子が挿入されている。【００７５】
次にこれらの一回目の組換え体をカナマイシンを含まないCM-Dex液体培地にて31.5℃で一晩培養し、適当に希釈した後、カナマイシンを含まない10%ショ糖含有Dex-S10培地に塗布にし、31.5℃にて約30時間培養した。
結果、2回目の相同組み換えによりSacB遺伝子が脱落しシュークロース糖非感受性となったと考えられる株約30個得た。【００７６】
この様にして得られた株の中には、そのpoxB遺伝子がpBS4S::ΔpoxBに由来する変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。poxB遺伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、Dex-S10寒天培地にて培養して得られた菌体を直接PCR反応に供し、poxB遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。poxB遺伝子をPCR増幅するためのプライマー（配列番号２９および配列番号３２）を用いて分析すると、野生型では2.4kb、欠失領域を持つ変異型では1.2kbのDNA断片を認めるはずである。
上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変異型遺伝子のみを有する株を選抜し、該株を2256Δ(ldh, poxB)株と命名した。なお、この株をpoxB破壊株とも呼ぶ。
【実施例４】
【００７７】
＜poxB破壊株によるコハク酸生産＞
（A）poxB破壊株の培養評価
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256Δ(ldh)株及び2256Δ(ldh, poxB)株を用いてコハク酸生産のための培養を以下のように行った。CM-Dexプレート培地にて培養して得た2256Δ(ldh)株及び2256Δ(ldh, poxB)株の菌体をシードA培地 3ml（グルコース 20g/L、Urea 4g/L、(NH4) 2SO4 14g/L、KH2PO4 0.5g/L、K2HPO4 0.5g/L、MgSO4・7H2O 0.5g/L、FeSO4・7H2O 0.02g/L、MnSO4・7H2O 0.02g/L、ビオチン200μg/L、VB1・HCl 200μg/L、イーストエキストラクト 1g/L、カザミノ酸 1g/L、：pH無調整、グルコースのみ別に殺菌したのち添加）に接種し、好気条件にて31.5℃にて試験管で約16時間振とう培養を行った。【００７８】
その後、その試験管にメインA培地 3ml（グルコース 100g/L、亜硫酸ナトリウム 15g/L、MgCO3 71.4g/L）を接種し、通気を防ぐため、シリコン栓で密栓してコハク酸生産培養を行った。培養は31.5℃で約48時間振とうして培地中の糖がなくなる前に培養を終了した。【００７９】
培養終了後、培養液中のコハク酸や副生酢酸の蓄積量は、培養液を適当に希釈した後、液体クロマトグラフィーにより分析した。カラムはShim-pack SCR-102H（Simazu）を二本直列接続したものを用い、サンプルは5mM p-トルエンスルホン酸を用いて40℃で溶出した。溶出液を５mM ｐ-トルエンスルホン酸および100μM EDTAを含む20mM Bis-Tris水溶液を用いて中和し、CDD-10AD(Simazu)にて電気伝導度を測定することによりコハク酸や酢酸を測定した。このときの結果を表１、図５に示した。【００８０】
2256Δ(ldh, poxB)株では、その親株の2256Δ(ldh)株に比べて、コハク酸生産に関しては親株である2256Δ(ldh)株と同等であったが、コハク酸あたりの酢酸は2256Δ(ldh,poxB)株の約1/3〜2/3となり大幅に酢酸が副生した。この結果より、嫌気条件下における酢酸低減に関しては、poxB活性の消失または低下が有効であることが示された。【００８１】
【表１】
0005572279.tif 000002
【実施例５】
【００８２】
＜poxB、pta、ack破壊株、poxB、pta、ack、ach破壊株の構築＞
（５−１）
＜アセテートキナーゼ遺伝子破壊株の構築＞
（A）アセテートキナーゼ遺伝子破壊用断片のクローニング
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256株のアセテートキナーゼ遺伝子（以下、該遺伝子をackとする）のORFを欠失した遺伝子断片の取得は、既に公開されているコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032の該遺伝子の塩基配列（GenBank Database Accession No.NC_003450のNCgl2656；配列番号４５）を参考に設計した合成DNAをプライマーとして用いたクロスオーバーPCRで取得した。具体的には、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256株ゲノムDNAを鋳型とし、配列番号13と14の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、ack遺伝子N末端側の増幅産物を得た。一方、ack遺伝子C末端側の増幅産物を得るために、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256株ゲノムDNAを鋳型として、配列番号15と16の合成DNAをプライマーとしてPCRを行った。配列番号14と15は部分的に相補的である。PCR反応は、KOD -plus-(TOYOBO)を用い、94℃で2分保温を1サイクル行った後、N末端側に関しては、変性94℃ 10秒、会合55℃ 30秒、伸長68℃ 30秒からなるサイクルを、C末端側に関しては変性94℃ 10秒、会合55℃ 30秒、伸長68℃ 2分からなるサイクルをそれぞれ30回繰り返した。次に、内部配列を欠失したack遺伝子断片を得るために、上記ack N末側およびC末側の遺伝子産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、これを鋳型として配列番号17と18の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い変異導入されたack遺伝子増幅産物を得た。PCR反応は、KOD -plus-(東洋紡社製)を用い、94℃で2分保温を1サイクル行った後、変性94℃ 10秒、会合55℃ 30秒、伸長68℃ 2.5分からなるサイクルを30回繰り返し、目的の変異導入されたack遺伝子増幅産物を得た。【００８３】
生成したPCR産物を常法により精製後XbaIで消化し、上記の実施例１（C）で構築したpBS5TのXbaI部位に挿入した。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝バイオ社製）を用いて形質転換を行い、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mlおよびカナマイシン25μg/mlを含むLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS5T::Δackと命名した。pBS5T::Δackの構築過程を図６に示した。【００８４】
（B）ack破壊株の作成
上記（A）で得られたpBS5T::Δackにおけるコリネ型細菌の複製起点は温度感受性である。具体的には、該プラスミドは25℃ではコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能であるが、31.5℃（あるいは34℃）では自律複製不可能となる。該プラスミドを用いてブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256Δ(ldh)株を電気パルス法により形質転換し、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dex培地に塗布し、25℃にて2晩培養し、出現したコロニーを単離して形質転換体とした。この形質転換体は該プラスミドを保有している。これらの形質転換体をカナマイシンを含まない上記CM-Dex培地にて34℃で一晩培養し、適当に希釈した後、カナマイシンを25μg/ml含むCM-Dex培地に塗布し、34℃で約30時間培養した。この培地上に生育した株は該プラスミドのack遺伝子断片とブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256Δ(ldh)株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノムに該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびSacB遺伝子が挿入されている。【００８５】
次にこれらの一回目の組換え体をカナマイシンを含まないCM-Dex液体培地にて31.5℃で一晩培養し、適当に希釈した後、カナマイシンを含まない10%ショ糖含有Dex-S10培地に塗布にし、31.5℃にて約30時間培養した。その結果、2回目の相同組み換えによりSacB遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株約50個得た。【００８６】
この様にして得られた株の中には、そのack遺伝子がpBS5T::Δackに由来する変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。ack遺伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、Dex-S10寒天培地にて培養して得られた菌体を直接PCR反応に供し、ack遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。ack遺伝子をPCR増幅するためのプライマー（配列番号13および配列番号16）を用いて分析すると、野生型では3.7kb、欠失領域を持つ変異型では2.5kbのDNA断片を認めるはずである。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変異型遺伝子のみを有する株を選抜し、該株を2256Δ(ldh, ack)と命名した。【００８７】
（５−２）
＜アセテートキナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子破壊株の構築＞
（A）アセテートキナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子破壊用断片のクローニング
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256株のアセテートキナーゼ(ack)とホスホトランスアセチラーゼ遺伝子（以下、該遺伝子をptaとする）のORFはオペロン構造をとっており、これらのORFを同時に欠失させることが可能である。これらの遺伝子断片の取得は、既に公開されているコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032の該遺伝子の塩基配列（GenBank Database Accession No. NC_003450のNCgl2656及び2657；配列番号４５）を参考に設計した合成DNAをプライマーとして用いたクロスオーバーPCRで取得した。具体的には、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256株ゲノムDNAを鋳型とし、配列番号19と20の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、pta遺伝子N末端側の増幅産物を得た。一方、ack遺伝子C末端側の増幅産物を得るために、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256株ゲノムDNAを鋳型として、配列番号21と16の合成DNAをプライマーとしてPCRを行った。配列番号20と21は部分的に相補的である。PCR反応は、KOD -plus-(TOYOBO)を用い、94℃で2分保温を1サイクル行った後、N末端側に関しては、変性94℃ 10秒、会合55℃ 30秒、伸長68℃ 30秒からなるサイクルを、C末端側に関しては変性94℃ 10秒、会合55℃ 30秒、伸長68℃ 2分からなるサイクルをそれぞれ30回繰り返した。【００８８】
次に、ptaとackの内部配列を欠失したpta-ack遺伝子断片を得るために、上記pta N末側およびackC末側の遺伝子産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、これを鋳型として配列番号22と18の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い変異導入されたpta-ack遺伝子増幅産物を得た。PCR反応は、KOD -plus-(TOYOBO)を用い、94℃で2分保温を1サイクル行った後、変性94℃ 10秒、会合55℃ 30秒、伸長68℃ 2.5分からなるサイクルを30回繰り返し、目的の変異導入されたpta-ack遺伝子増幅産物を得た。生成したPCR産物を常法により精製後XbaIで消化し、pBS5TのXbaI部位に挿入した。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝バイオ社製）を用いて形質転換を行い、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mlおよびカナマイシン25μg/mlを含むLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS5T::Δpta-ackと命名した。pBS5T::Δpta-ackの構築過程を図７に示した。【００８９】
（B）pta-ack破壊株の作成
上記（A）で得られたpBS5T::Δpta-ackにおけるコリネ型細菌の複製起点は温度感受性である。具体的には、該プラスミドは25℃ではコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能であるが、31.5℃（あるいは34℃）では自律複製不可能となる。該プラスミドを用いてブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256Δ(ldh)株を電気パルス法により形質転換し、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dex培地に塗布し、25℃にて2晩培養し、出現したコロニーを単離して形質転換体とした。この形質転換体は該プラスミドを保有している。これらの形質転換体をカナマイシンを含まないCM-Dex液体培地にて34℃で一晩培養し、適当に希釈した後、カナマイシンを25μg/ml含むCM-Dex培地に塗布し、34℃で約30時間培養した。この培地上に生育した株は該プラスミドのpta-ack遺伝子断片とブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256Δ(ldh)株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノムに該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびSacB遺伝子が挿入されている。【００９０】
次にこれらの一回目の組換え体をカナマイシンを含まないCM-Dex液体培地にて31.5℃で一晩培養し、適当に希釈した後、カナマイシンを含まない10%シュークロース含有Dex-S10培地に塗布し、31.5℃にて約30時間培養した。その結果、2回目の相同組み換えによりSacB遺伝子が脱落しシュークロース非感受性となったと考えられる株約50個得た。【００９１】
この様にして得られた株の中には、そのptaとack遺伝子がpBS5T::Δpta-ackに由来する変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。pta-ack遺伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、Dex-S10寒天培地にて培養して得られた菌体を直接PCR反応に供し、ptaとack遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。pta-ack遺伝子をPCR増幅するためのプライマー（配列番号19および配列番号16）を用いて分析すると、野生型では5.0kb、欠失領域を持つ変異型では2.7kbのDNA断片を認めるはずである。
上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変異型遺伝子のみを有する株を選抜し、該株を2256Δ(ldh, pta, ack)と命名した。
【００９２】
（５−３）
＜アセテートキナーゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、ピルベートオキシダーゼ遺伝子破壊株の構築＞
（A）ピルベートオキシダーゼ遺伝子破壊用断片のクローニング
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256株のピルベートオキシダーゼ遺伝子（以下、該遺伝子をpoxBとする）のORFを欠失した遺伝子断片の取得は、既に公開されているコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032の該遺伝子の塩基配列（GenBank Database Accession No. NC_003450のNCgl2521；配列番号４８）を参考に設計した合成DNAをプライマーとして用いたクロスオーバーPCRで取得した。具体的には、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256株ゲノムDNAを鋳型とし、配列番号23と24の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、poxB遺伝子N末端側の増幅産物を得た。【００９３】
一方、poxB遺伝子C末端側の増幅産物を得るために、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256株ゲノムDNAを鋳型として、配列番号25と26の合成DNAをプライマーとしてPCRを行う。配列番号24と25は互いに相補的である。PCR反応は、KOD -plus-(TOYOBO)を用い、N末端側、C末端側ともに、94℃で2分保温を1サイクル行った後、変性94℃ 10秒、会合55℃ 30秒、伸長68℃ 40秒からなるサイクルを30回繰り返した。次に、内部配列を欠失したpoxB遺伝子断片を得るために、上記poxB N末端側およびC末端側の遺伝子産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、これを鋳型として配列番号27と28の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い変異導入されたpoxB遺伝子増幅産物を得た。PCR反応は、KOD -plus-(TOYOBO)を用い、94℃で2分保温を1サイクル行った後、変性94℃ 10秒、会合55℃ 30秒、伸長68℃ 70秒からなるサイクルを30回繰り返し、目的の変異導入されたpoxB遺伝子増幅産物を得た。【００９４】
生成したPCR産物を常法により精製後XbaIで消化し、上記実施例１（C）で構築したpBS5TのXbaI部位に挿入した。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝バイオ社製）を用いて形質転換を行い、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mlおよびカナマイシン25μg/mlを含むLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS5T::ΔpoxBと命名した。pBS5T::ΔpoxBの構築過程を図８に示した。【００９５】
（B）poxB破壊株の作成
上記（A）で得られたpBS5T::ΔpoxBにおけるコリネ型細菌の複製起点は温度感受性である。具体的には、該プラスミドは25℃ではコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能であるが、31.5℃（あるいは34℃）では自律複製不可能となる。該プラスミドを用いてブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256Δ(ldh, pta, ack)株を電気パルス法により形質転換し、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dex培地に塗布し、25℃にて2晩培養し、出現したコロニーを単離して形質転換体とした。この形質転換体は該プラスミドを保有しているはずである。【００９６】
これらの形質転換体をカナマイシンを含まないCM-Dex液体培地にて34℃で一晩培養し、適当に希釈した後、カナマイシンを25μg/ml含むCM-Dex培地に塗布し、34℃で約30時間培養した。この培地上に生育した株は該プラスミドのpoxB遺伝子断片とブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256Δ(ldh, pta, ack)株株ゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノムに該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびSacB遺伝子が挿入されている。次にこれらの一回目の組換え体をカナマイシンを含まないCM-Dex液体培地にて31.5℃で一晩培養し、適当に希釈した後、カナマイシンを含まない10%シュークロース含有Dex-S10培地に塗布にし、31.5℃にて約30時間培養した。その結果、2回目の相同組み換えによりSacB遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株約50個得た。【００９７】
この様にして得られた株の中には、そのpoxB遺伝子がpBS5T::ΔpoxBに由来する変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。poxB遺伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、Dex-S10寒天培地にて培養して得られた菌体を直接PCR反応に供し、poxB遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。poxB遺伝子をPCR増幅するためのプライマー（配列番号23および配列番号26）を用いて分析すると、野生型では2.4kb、欠失領域を持つ変異型では1.2kbのDNA断片を検出出来る。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変異型遺伝子のみを有する株を選抜し、該株を2256Δ(ldh, pta, ack, poxB)と命名した。なお、この株をpta,ack,poxB破壊株とも呼ぶ。
【００９８】
（５−４）
＜poxB、pta、ack、ach遺伝子破壊株の構築＞
（A）アセチルCoAハイドロラーゼ遺伝子破壊用断片のクローニング
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256株のアセチルCoAハイドロラーゼ遺伝子（以下、該遺伝子をachとする）のORFを欠失した遺伝子断片の取得は、既に公開されているコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032の該遺伝子の塩基配列（GenBank Database Accession No. NC_003450のNCgl2480；配列番号５０）を参考に設計した合成DNAをプライマーとして用いたクロスオーバーPCRで取得した。具体的には、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256株ゲノムDNAを鋳型とし、配列番号35と36の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、ach遺伝子C末端側の増幅産物を得る。一方、ach遺伝子N末端側の増幅産物を得るために、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256株ゲノムDNAを鋳型として、配列番号37と38の合成DNAをプライマーとしてPCRを行う。配列番号36と37は互いに相補的である。PCR反応は、KOD -plus-(東洋紡社製)を用い、N末端側、C末端側ともに、94℃で2分保温を1サイクル行った後、変性94℃ 10秒、会合55℃ 30秒、伸長68℃ 50秒からなるサイクルを30回繰り返した。次に、内部配列を欠失したach遺伝子断片を得るために、上記achのN末側およびC末側の遺伝子産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、これを鋳型として配列番号39と40の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い変異導入されたach遺伝子増幅産物を得た。PCR反応は、KOD -plus-(TOYOBO)を用い、94℃で2分保温を1サイクル行った後、変性94℃ 10秒、会合55℃ 30秒、伸長68℃ 90秒からなるサイクルを30回繰り返し、目的の変異導入されたach遺伝子増幅産物を得た。生成したPCR産物を常法により精製後XbaIで消化し、上記実施例１（B）で構築したpBS4SのXbaI部位に挿入した。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝バイオ社製）を用いて形質転換を行い、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mlおよびカナマイシン25μg/mlを含むLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS4S::Δachと命名した。pBS4S::Δachの構築過程を図9に示した。【００９９】
（B）ach破壊株の作成
上記（A）で得られたpBS4S::Δachはコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えにより染色体に組み込まれた株が形質転換体として出現する。ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム、2256Δ(ldh, pta, ack, poxB)株、及び2256株を電気パルス法により高濃度のプラスミドpBS4S::Δachを用いて形質転換し、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dex培地に塗布し、31.5℃で約30時間培養した。この培地上に生育した株は該プラスミドのach遺伝子断片とブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256Δ(ldh)株、2256Δ(ldh, pta, ack)株、2256Δ(ldh, pta, ack, poxB)株、及び2256Δ(ldh, pta, ack, poxB, ach)株のそれぞれのゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノムに該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびSacB遺伝子が挿入されている。【０１００】
次にこれらの一回目の組換え体をカナマイシンを含まないCM-Dex液体培地にて31.5℃で一晩培養し、適当に希釈した後、カナマイシンを含まない10%ショ糖含有Dex-S10培地に塗布にし、31.5℃にて約30時間培養した。その結果、2回目の相同組み換えによりSacB遺伝子が脱落しシュークロース糖非感受性となったと考えられる株約50個得た。【０１０１】
この様にして得られた株の中には、そのach遺伝子がpBS4S::Δachに由来する変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。ach遺伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、Dex-S10寒天培地にて培養して得られた菌体を直接PCR反応に供し、ach遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。ach遺伝子をPCR増幅するためのプライマー（配列番号35および配列番号38）を用いて分析すると、野生型では2.9kb、欠失領域を持つ変異型では1.4kbのDNA断片を認めるはずである。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変異型遺伝子のみを有する株を選抜し2256Δ(ldh, pta, ack, poxB)株から得られた該株を2256Δ(ldh, pta, ack, poxB, ach)株と名づけた。なお、この株をach、pta、ack、poxB破壊株とも呼ぶ。
【実施例６】
【０１０２】
＜アシルホスファターゼ遺伝子破壊株の構築＞
（A）アシルホスファターゼ遺伝子破壊用断片のクローニング
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256株のアシルホスファターゼ遺伝子（以下、該遺伝子をacpとする）のORFを欠失した遺伝子断片の取得は、マイコバクテリウム・ツベルクロシスのacp遺伝子の配列と相同性の高い配列をゲノム解析により明らかになったブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムATCC13869 株の配列から検索し、該遺伝子の塩基配列（配列番号５２）を基に設計した合成DNAをプライマーとして用いたクロスオーバーPCRで取得した。具体的には、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256株ゲノムDNAを鋳型とし、配列番号５４と５５の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、acp遺伝子C末端側の増幅産物を得る。一方、acp遺伝子N末端側の増幅産物を得るために、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256株ゲノムDNAを鋳型として、配列番号５６と５７の合成DNAをプライマーとしてPCRを行う。配列番号５５と５６は互いに相補的である。PCR反応は、KOD -plus-(東洋紡社製)を用い、N末端側、C末端側ともに、94℃で2分保温を1サイクル行った後、変性94℃ 10秒、会合55℃ 30秒、伸長68℃ 35秒からなるサイクルを30回繰り返した。次に、内部配列を欠失したacp遺伝子断片を得るために、上記acp N末側およびC末側の遺伝子産物をそれぞれほぼ等モルとなるように混合し、これを鋳型として配列番号５８と５９の合成DNAをプライマーとしてPCRを行い変異導入されたacp遺伝子増幅産物を得た。PCR反応は、KOD -plus-(TOYOBO)を用い、94℃で2分保温を1サイクル行った後、変性94℃ 10秒、会合55℃ 30秒、伸長68℃ 60秒からなるサイクルを30回繰り返し、目的の変異導入されたacp遺伝子増幅産物を得た。
【０１０３】
生成したPCR産物を常法により精製後XbaIで消化し、上記実施例１（C）で構築したpBS5TのXbaI部位に挿入した。このDNAを用いて、エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル（宝バイオ社製）を用いて形質転換を行い、IPTG 100μM、X-Gal 40μg/mlおよびカナマイシン25μg/mlを含むLB培地に塗布し、一晩培養した。その後、出現した白色のコロニーを釣り上げ、単コロニー分離し、形質転換体を得た。得られた形質転換体よりプラスミドを抽出し、目的のPCR産物が挿入されていたものをpBS5T::Δacpと命名した。pBS5T::Δacpの構築過程を図10に示した。【０１０４】
（B）acp破壊株の作成
上記（A）で得られたpBS5T::Δacpはコリネ型細菌の細胞内で自律複製可能とする領域を含まないため、本プラスミドでコリネ型細菌を形質転換した場合、極めて低頻度であるが本プラスミドが相同組換えにより染色体に組み込まれた株が形質転換体として出現する。ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256Δ(ldh, pta, ack, poxB)株を電気パルス法により高濃度のプラスミドpBS5T::Δacpを用いて形質転換し、カナマイシン25μg/mlを含むCM-Dex培地に塗布し、31.5℃で約30時間培養した。この培地上に生育した株は該プラスミドのacp遺伝子断片とブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256Δ(ldh, pta, ack, poxB)株のそれぞれのゲノム上の同遺伝子との間で相同組み換えを起こした結果、同ゲノムに該プラスミドに由来するカナマイシン耐性遺伝子およびSacB遺伝子が挿入されている。【０１０５】
次にこれらの一回目の組換え体をカナマイシンを含まないCM-Dex液体培地にて31.5℃で一晩培養し、適当に希釈した後、カナマイシンを含まない10%シュークロース含有Dex-S10培地に塗布にし、31.5℃にて約30時間培養した。その結果、2回目の相同組み換えによりSacB遺伝子が脱落しショ糖非感受性となったと考えられる株約50個得た。【０１０６】
この様にして得られた株の中には、そのacp遺伝子がpBS5T::Δacpに由来する変異型に置き換わったものと野生型に戻ったものが含まれる。acp遺伝子が変異型であるか野生型であるかの確認は、Dex-S10寒天培地にて培養して得られた菌体を直接PCR反応に供し、acp遺伝子の検出を行うことによって容易に確認できる。acp遺伝子をPCR増幅するためのプライマー（配列番号５４および配列番号５７）を用いて分析すると、野生型では1.3kb、欠失領域を持つ変異型では1.0kbのDNA断片を認めるはずである。上記方法にてショ糖非感受性となった菌株を分析した結果、変異型遺伝子のみを有する株を選抜し、該株を2256Δ(ldh, pta, ack, poxB, acp)株と命名した。
【実施例７】
【０１０７】
＜７−１＞ach、pta、ack、poxB破壊株、pta,ack,poxB破壊株の培養評価
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256Δ(ldh)株、2256Δ(ldh, pta-ack, poxB)株、及び2256Δ(ldh, pta-ack, poxB, ach)株を用いてコハク酸生産のための培養を以下のように行った。CM-Dexプレート培地にて培養して得た2256Δ(ldh)株、2256Δ(ldh, pta-ack, poxB)株、2256Δ(ldh, pta-ack, poxB, ach)株の菌体をシードB培地（グルコース 10g/L、(NH4) 2SO4 2.5g/L、KH2PO4 0.5g/L、MgSO4・7H2O 0.25g/L、尿素 2g/L、FeSO4・7H2O 0.01g/L、MnSO4・7H2O 0.01g/L、ビオチン 50μg/L、VB1・HCl 100μg/L、プロトカテク酸 15mg/L、CuSO40.02mg/L、CaCl210mg/L、pH7.0(KOH)） 3mlに接種し、好気条件にて31.5℃にて試験管で約15時間振とう培養を行った。【０１０８】
その後、その試験管にメインB培地 3ml（グルコース 70g/L、(NH4) 2SO4 5g/L、KH2PO42g/L、尿素 3g/L、FeSO4・7H2O 0.01g/L、MnSO4・7H2O 0.01g/L、ビオチン 200μg/L、VB1・HCl 200μg/L、MOPS 40g/L、MgCO350g/L、pH6.8(NaOH)）を接種し、通気を防ぐため、シリコン栓で密栓してコハク酸生産培養を行った。培養は31.5℃で約24時間振とうして培地中の糖がなくなる前に培養を終了した。培養終了後、培養液中のコハク酸や副生酢酸の蓄積量は、培養液を適当に希釈した後、液体クロマトグラフィーにより分析した。カラムはShim-pack SCR-102H（Simazu）を二本直列接続したものを用い、サンプルは5mM p-トルエンスルホン酸を用いて40℃で溶出した。溶出液を５mM p-トルエンスルホン酸および100μM EDTAを含む20mM Bis-Tris水溶液を用いて中和し、CDD-10AD(Simazu)にて電気伝導度を測定することによりコハク酸や副生酢酸測定した。そのときの結果を表２に示した。【０１０９】
対照の2256Δldh株に比べ、2256Δ(ldh, pta-ack, poxB)株の酢酸低減は大幅に低下し、2256Δ(ldh, pta, ack, ach, poxB) 株の酢酸は更に低減し、2256Δ(ldh, pta, ack, poxB) 株の約40%低減した。このことより、poxBと、pta-ack、achの全てまたはいずれかの活性が同時に消失または低下することにより、酢酸低減に有効であることが示された。
【０１１０】
【表２】
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【０１１１】
＜７−２＞pta、ack、poxB、acp破壊株の培養評価
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム2256Δ(ldh)株、2256Δ(ldh, pta, ack, poxB)株、2256Δ(ldh, pta-ack, poxB, acp)株を用いてコハク酸生産のための培養を以下のように行った。  CM-Dexプレート培地にて培養して得た2256Δ(ldh)株、2256Δ(ldh, pta, ack, poxB)株、2256Δ(ldh, pta-ack, poxB, acp)株の菌体を上述のシードB培地 3mlに接種し、好気条件にて31.5℃にて試験管で約15時間振とう培養を行った。
その後、その試験管に上述のメインB培地 3mlを接種し、通気を防ぐため、シリコン栓で密栓してコハク酸生産培養を行った。培養は31.5℃で約24時間振とうして培地中の糖がなくなる前に培養を終了した。
培養終了後、培養液中のコハク酸や副生酢酸の蓄積量は、培養液を適当に希釈した後、液体クロマトグラフィーにより分析した。カラムはShim-pack SCR-102H（Simazu）を二本直列接続したものを用い、サンプルは5mM p-トルエンスルホン酸を用いて40℃で溶出した。溶出液を５mM p-トルエンスルホン酸および100μM EDTAを含む20mM Bis-Tris水溶液を用いて中和し、CDD-10AD(Simazu)にて電気伝導度を測定することによりコハク酸や副生酢酸測定した。そのときの結果を表３に示した。【０１１２】
【表３】
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【０１１３】
その結果、上記（C）で述べたようにACH活性を低下あるいは消失させなくとも、PTA, ACK, POXB活性全てを低下あるいは消失することにより、コハク酸あたりの酢酸は若干低減するが、更にACP活性の低下或は消失させることによる、酢酸あるいはコハク酸生産への影響はほとんど見られなかった。
【産業上の利用の可能性】
【０１１４】
本発明は、コハク酸の発酵生産に有用である。コハク酸は生分解性ポリマーの原料、または、食品、医薬品、及び化粧品などの原料として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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