(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
過酸化水素から酸素および水への酵素的転化を触媒する能力のあるポリペプチドを産生する方法であって、トリコデルマ宿主細胞中で、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから当該ポリペプチドを発現する工程を含むとともに、当該ポリペプチドが、アスペルギルスニガー由来のカタラーゼ酵素であり、当該ポリヌクレオチドが、アスペルギルスニガーｃａｔＲ遺伝子を含み、かつ、当該トリコデルマ宿主細胞が、トリコデルマリーゼイ細胞である、方法。
【請求項２】
当該ポリヌクレオチドが、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
トリコデルマリーゼイ中での当該ポリペプチドの発現が、アスペルギルスニガー中での同じポリペプチドの発現よりも少なくとも約５０％大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
当該トリコデルマリーゼイ宿主細胞から成長媒地中に分泌される当該ポリペプチドの量が、アスペルギルスニガー宿主細胞から成長媒地中に分泌される当該ポリペプチドの量よりも少なくとも約１９０％大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
トリコデルマ宿主細胞が、エンド−Ｔ遺伝子の欠失を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
過酸化水素から酸素および水への酵素的転化を触媒する能力のあるポリペプチドを産生する方法であって、
（ａ）  当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて、トリコデルマ宿主細胞を形質転換する工程、
（ｂ）  当該ポリペプチドの発現に適した条件下の成長培地中で当該トリコデルマ宿主細胞を生育する工程、および
（ｃ）  当該成長培地から当該ポリペプチドを単離する工程
を含むとともに、当該ポリペプチドが、アスペルギルスニガー由来のカタラーゼ酵素であり、当該ポリヌクレオチドが、アスペルギルスニガーｃａｔＲ遺伝子を含み、かつ、当該トリコデルマ宿主細胞が、トリコデルマリーゼイ細胞である、方法。
【請求項７】
当該ポリヌクレオチドが、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
トリコデルマリーゼイ中での当該ポリペプチドの発現が、アスペルギルスニガー中での同じポリペプチドの発現よりも少なくとも約５０％大きい、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
当該トリコデルマリーゼイ宿主細胞から成長媒地中に分泌される当該ポリペプチドの量が、アスペルギルスニガー宿主細胞から成長媒地中に分泌される当該ポリペプチドの量よりも少なくとも約１９０％大きい、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
トリコデルマ宿主細胞が、エンド−Ｔ遺伝子の欠失を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
過酸化水素から酸素および水への酵素的転化を触媒する能力のあるポリペプチドであって、当該ポリペプチドが請求項１に記載の方法によって産生されるポリペプチド。
【請求項１２】
トリコデルマ宿主細胞が、エンド−Ｔ遺伝子の欠失を含む、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
過酸化水素から酸素および水への酵素的転化を触媒する能力のあるポリペプチドであって、当該ポリペプチドが請求項６に記載の方法によって産生されるポリペプチド。
【請求項１４】
トリコデルマ宿主細胞が、エンド−Ｔ遺伝子の欠失を含む、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
過酸化水素を酸素および水に転化する方法であって、当該過酸化水素を請求項１１に記載のポリペプチドに接触させる工程を含む方法。
【請求項１６】
請求項１３に記載のポリペプチドを含む、過酸化水素を酸素および水に転化するための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２００８年３月７日に出願された米国仮特許出願第６１／０３４，７８８号の優先権を主張し、その内容はその全体が参照によって本明細書に取り込まれる。
【０００２】
本発明は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ）宿主細胞中でのカタラーゼ酵素の発現、特にトリコデルマリーゼイ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）中でのアスペルギルスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）由来のＣａｔＲ遺伝子の発現に関する。
【背景技術】
【０００３】
カタラーゼ［過酸化水素：過酸化水素オキシドレダクターゼ（ＥＣ  １．１１．１．６）］は、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）が酸素（Ｏ２）および水（Ｈ２Ｏ）へ転化する反応、すなわち
２Ｈ２Ｏ２  →  ２Ｈ２Ｏ  ＋  Ｏ２
を触媒する酵素である。カタラーゼは、多数の動物組織、植物、および微生物から精製されている（非特許文献１および２）。これまでに特性解析されたほとんどのカタラーゼ酵素は、４のポリペプチドサブユニットを含み、各サブユニットは５０，０００〜６０，０００の分子量を有し、かつ１サブユニット当たり１のプロトヘミン補欠分子族を含んでいる（非特許文献３および４）。ウシ肝臓由来のカタラーゼは、もっとも広く研究されている酵素である（非特許文献５）。ウシ肝臓カタラーゼの全アミノ酸配列および３次元構造は公知である（非特許文献６および７）。
【０００４】
生化学および生物物理学の観点からは、ウシ肝臓カタラーゼほどにはよく研究されていないけれども、糸状菌由来のカタラーゼは哺乳類由来のカタラーゼとは区別される特性を有し、かつそれを超える利点を持つ。サブユニット数およびヘム含有量では類似しているけれども、糸状菌カタラーゼは、他の生物由来のものよりも実質的に大きい分子であり、８０，０００〜９７，０００の範囲にあるサブユニット分子量を有する（非特許文献８，９および１０）。さらに重要なことは、糸状菌種、たとえばアスペルギルスニガー由来のカタラーゼは、タンパク質分解に対しておよびグルタルアルデヒドまたはＳＤＳによる不活性化に対してウシ肝臓カタラーゼよりも安定であり、またカタラーゼ阻害因子、たとえばシアン化物、アジドおよびフッ化物とのより低い親和性を有する（上記非特許文献３）。さらに、アスペルギルスニガーカタラーゼは、極端なｐＨ、過酸化水素濃度および温度下に置かれたときにウシ肝臓カタラーゼよりも有意に安定である（非特許文献１１）。糸状菌カタラーゼは安定性の利点を提供するけれども、対応する哺乳類酵素、たとえばウシ肝臓カタラーゼは、より高い触媒活性を有するようである（非特許文献１２および１３）。しかし、酵素の安定性は、酵素の生命工学的利用における重要な因子であるから、糸状菌カタラーゼの利用、とりわけ高濃度の過酸化水素の中和に関係する用途には多大な関心が寄せられている。Ｈ２Ｏ２中での不活性化速度は、アスペルギルスニガーカタラーゼについてウシ肝臓カタラーゼよりも少なくとも１桁低いことが観察されている（非特許文献１４）。これらの２の酵素間の安定性の差は、これらのタンパク質の構造上の特徴および組成の差に帰するものであろう（上記非特許文献１４）。
【０００５】
従来、ウシ肝臓カタラーゼが、診断目的用におよび医薬品関連用途（たとえば、コンタクトレンズの洗浄、消毒、Ｈ２Ｏ２の中和）に好んで用いられる酵素であった。しかし、欧州畜牛における牛海綿状脳症への懸念および人がこの疾病にかかるかも知れないという恐怖（非特許文献１５および１６）が、カタラーゼ源の代替品への関心を引き起こした。
【０００６】
アスペルギルスニガー由来のカタラーゼ製剤は、診断酵素キット用として、グルコースからのグルコン酸ナトリウムの酵素的生産用として、Ｈ２Ｏ２廃棄物の中和用として、ならびに食品および飲料におけるＨ２Ｏ２の除去および／またはＯ２の生成用として市販されている。アスペルギルスニガーからは、２のカタラーゼ遺伝子が単離されている。アスペルギルスニガーｃａｔＡ遺伝子が、脂肪酸上での成長の間に主に誘発されペルオキシソーム内に配置されると考えられているカタラーゼ酵素をコードする。もう一つの遺伝子はｃａｔＲと呼ばれ、市販のアスペルギルスニガーカタラーゼ製剤において主要な活性を示す可溶性細胞質酵素をコードする。
【０００７】
アスペルギルスニガーｃａｔＲ遺伝子にはアスペルギルスニガーグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）遺伝子のプロモーター要素およびターミネーター要素が機能し得るように結合されており、このアスペルギルスニガーｃａｔＲ遺伝子の組換え発現は、グルコースオキシダーゼ（ｇｏｘＡ）の発現を排除するように遺伝子組換えされたアスペルギルスニガー株においてすでに開示されている（特許文献１）。しかし、この酵素の収率は最善ではない。何故ならば、発現されたカタラーゼ酵素の一部がアスペルギルスニガー宿主細胞の細胞壁中に局在して、この酵素の収率および回収率を減少させるからである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第５，３６０，９０１号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ＣｈａｎｃｅおよびＭａｅｈｌｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９５５年、第２巻、ｐ．７６４−７９１
【非特許文献２】ＪｏｎｅｓおよびＷｉｌｓｏｎ、Ｍｅｔａｌ  Ｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈ．Ｓｉｇｅｌ編）、１９７８年、第７巻、米国、ニューヨーク州、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ社
【非特許文献３】ＷａｓｓｅｒｍａｎおよびＨｕｌｔｉｎ、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、１９８１年、第２１２巻、ｐ．３８５−３９２
【非特許文献４】ＨａｒｔｉｇおよびＲｕｉｓ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９８６年、第１６０巻、ｐ．４８７−４９０
【非特許文献５】ＳｃｈｏｎｂａｕｍおよびＣｈａｎｃｅ、Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（Ｐ．Ｄ．Ｂｏｙｅｒ編）、１９７６年、第３版、第１３巻、ｐ．３６３−４０８、米国、ニューヨーク州、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社
【非特許文献６】Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、１９８３年、第２１４巻、ｐ．３９７−４１２
【非特許文献７】Ｍｕｒｐｈｙら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８１年、第１５２巻、ｐ．４６５−４９９
【非特許文献８】Ｖａｉｎｓｈｔｅｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９８６年、第１８８巻、ｐ．６３−７２
【非特許文献９】ＪａｃｏｂおよびＯｒｍｅ−Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９７９年、第１８巻、ｐ．２９６７−２９７５
【非特許文献１０】Ｊｏｎｅｓら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９８７年、第９１３巻、ｐ．３９５−３９８
【非特許文献１１】ＳｃｏｔｔおよびＨａｍｍｅｒ、Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｉａ、１９６０年、第２２巻、ｐ．２２９−２３７
【非特許文献１２】Ｇｒｕｆｔら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７８年、第５６巻、第９号、ｐ．９１６−９１９
【非特許文献１３】キクチ−トリイら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）、１９８２年、第９２巻、第５号、ｐ．１４４９−１４５６
【非特許文献１４】ＶａｓｕｄｅｖａｎおよびＷｅｉｌａｎｄ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、１９９０年、第３６巻、ｐ．７８３−７８９
【非特許文献１５】ＤｅａｌｌｅｒおよびＬａｃｅｙ、Ｎｅｕｔｒ．Ｈｅａｌｔｈ（Ｂｉｃｅｓｔｅｒ）、１９９１年、第７巻、ｐ．１１７−１３４
【非特許文献１６】ＤｅａｌｌｅｒおよびＬａｃｅｙ、Ｆｏｏｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９０年、第７巻、ｐ．２５３−２８０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、分泌される可溶性酵素の、従来よりも大きい収率をもたらす精製カタラーゼのための改善された宿主発現系の必要が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
１の側面では、本発明は、過酸化水素から酸素および水への酵素的転化を触媒する能力のあるポリペプチドを産生する方法であって、トリコデルマ宿主細胞中で、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから該ポリペプチドを発現する工程を含む方法を提供する。１の実施態様では、該ポリペプチドはアスペルギルスニガー由来のカタラーゼ酵素である。１の実施態様では、該ポリヌクレオチドはアスペルギルスニガーｃａｔＲ遺伝子を含む。１の実施態様では、ポリヌクレオチドは、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。１の実施態様では、トリコデルマ宿主細胞はトリコデルマリーゼイ細胞である。ある実施態様では、トリコデルマリーゼイ中での該ポリペプチドの発現は、アスペルギルスニガー中での同じポリペプチドの発現よりも少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％のいずれかだけ大きい。ある実施態様では、トリコデルマリーゼイ宿主細胞から成長媒地中に分泌されるポリペプチドの量は、アスペルギルスニガー宿主細胞の場合に成長媒地中に分泌されるポリペプチドの量よりも少なくとも約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００％のいずれかだけ大きい。
【００１２】
１の実施態様では、上記の方法は、（ａ）当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを用いて、トリコデルマ宿主細胞を形質転換する工程、（ｂ）当該ポリペプチドの発現に適した条件下の成長培地中で当該トリコデルマ宿主細胞を生育する工程、および（ｃ）当該成長培地から当該ポリペプチドを単離する工程を含む。
【００１３】
他の側面では、本発明は、過酸化水素から酸素および水への酵素的転化を触媒する能力のあるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含むトリコデルマ宿主細胞を提供する。１の実施態様では、該ポリペプチドはアスペルギルスニガー由来のカタラーゼ酵素である。１の実施態様では、該ポリヌクレオチドはアスペルギルスニガーｃａｔＲ遺伝子を含む。他の実施態様では、該ポリヌクレオチドは、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする。１の実施態様では、該宿主細胞はトリコデルマリーゼイ細胞である。ある実施態様では、該トリコデルマ宿主細胞はエンド−Ｔ遺伝子の欠失を有している。１の実施態様では、該宿主細胞はエンド−Ｔ遺伝子の欠失を有するトリコデルマリーゼイ細胞である。
【００１４】
他の側面では、本発明は、過酸化水素から酸素および水への酵素的転化を触媒する能力のあるポリペプチドであって、該ポリペプチドが本明細書に記載されたようにトリコデルマ宿主細胞中で発現されるポリペプチドを提供する。
【００１５】
他の側面では、本発明は、過酸化水素を酸素および水に転化する方法であって、過酸化水素から酸素および水への酵素的転化を触媒する能力のあるポリペプチドに、該過酸化水素を接触させる工程を含み、該ポリペプチドが本明細書に記載されたようにトリコデルマ宿主細胞中で発現される方法を提供する。
【００１６】
他の側面では、本発明は、過酸化水素を酸素および水に転化するための組成物であって、過酸化水素から酸素および水への酵素的転化を触媒する能力のあるポリペプチドを含み、該ポリペプチドが本明細書に記載されたようにトリコデルマ宿主細胞中で発現される組成物を提供する。
【００１７】
他の側面では、本発明は、過酸化水素から酸素および水への酵素的転化を触媒する能力のあるポリペプチドを含むキットであって、該ポリペプチドが本明細書に記載されたようにトリコデルマ宿主細胞中で発現されるキットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】アスペルギルスニガーｃａｔＲカタラーゼ酵素のアミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。分泌を指示するシグナル配列がイタリック体で示される。
【図２】イントロンを含む、アスペルギルスニガーｃａｔＲカタラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列（配列番号２）を示す図である。
【図３】ｐＴｒｅｘ３ｇＭ発現ベクターの構造を示す図である。
【図４】ｐＴｒｅｘ３ｇＭ（ＣＡＴＥ）発現ベクターの構造を示す図である。
【図５】アスペルギルスニガーまたはトリコデルマリーゼイ中で発現されたカタラーゼ酵素の融点へのｐＨの効果を示すグラフである。
【図６】アスペルギルスニガーまたはトリコデルマリーゼイ中で発現されたカタラーゼ酵素の融点へのＨ２Ｏ２の効果を示すグラフである。
【図７】実施例６に記載されたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。
【図８】実施例７に記載されたカタラーゼサンプルの活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の実施には、他様に示されない限り、分子生物学（組換え技術を含む。）、微生物学、細胞生物学および生化学の慣用の技術が用いられ、これらは当業者の技能の範囲内である。かかる技術は文献、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、１９８９年、第２版；Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）、１９８４年；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、分子生物学の現行手法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、１９９４年；Ｍｕｌｌｉｓら編、ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）、１９９４年；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ、遺伝子の導入および発現：実験マニュアル（Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、１９９０年に十分に説明されている。
【００２０】
本明細書で他様に定義されない限り、本明細書で用いられるすべての技術的および科学的用語は、本発明の属する分野の当業者によって普通に理解されるのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、微生物学および分子生物学辞典（Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、１９９４年、第２版、米国、ニューヨーク州、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ社、ならびにＨａｌｅおよびＭａｒｋｈａｍ、ハーパーコリンズ生物学辞典（Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、１９９１年、米国、ニューヨーク州、Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ社は、当業者に、本発明で用いられる用語の多くについての一般的辞書を提供する。本明細書に記載された方法および物質と類似のまたは同等の任意の方法および物質が、本発明の実施または試験に用いられることができる。
【００２１】
本明細書に示された数値範囲は、その範囲を規定する数値を包含する。
【００２２】
他様に示されない限り、核酸は左から右に５’から３’の方向に、アミノ酸配列は左から右にアミノ基からカルボキシ基の方向に、それぞれ書かれる。
定義
【００２３】
本明細書で用いられる「ポリヌクレオチド」の語は、任意の長さおよび任意の三次元構造の、ならびに一本鎖または複数鎖（たとえば、一本鎖、二本鎖、三本鎖等）のヌクレオチドのポリマー形態をいい、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドの類似体もしくは修飾型、たとえば修飾ヌクレオチドもしくは塩基またはこれらの類似体を含む。遺伝子コードは縮重性なので、特定のアミノ酸をコードするために２以上のコドンが用いられることができ、したがって本発明は、特定のアミノ酸配列をコードする複数のポリヌクレオチドを包含する。ポリヌクレオチドが所望の機能性を使用条件下に保持する限り、たとえばヌクレアーゼ耐性を増加する修飾（たとえば、デオキシ、２’−ＯＭｅ、ホスホロチオエート等）を含む、任意の種類の修飾をされたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が用いられることができる。標識、たとえば放射性もしくは非放射性標識またはアンカー、たとえばビオチンが、検出または捕捉の目的のために取り込まれることができる。ポリヌクレオチドの語はペプチド核酸（ＰＮＡ）も包含する。ポリヌクレオチドは天然由来または非天然由来であることができる。「ポリヌクレオチド」および「核酸」および「オリゴヌクレオチド」の語は、本明細書では互換的に用いられる。本発明のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡもしくは双方、ならびに／またはこれらの修飾型および／もしくは類似体を包含することができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。１以上のホスホジエステル結合が代替連結基によって置換されてもよい。これらの代替結合基は、以下に記載されたものに限定されることなく、ホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）によって置換された実施態様を含み、ここで各ＲまたはＲ’は、独立にＨ、または置換もしくは非置換のアルキル（１〜２０のＣ）であって、任意的にエーテル（−Ｏ−）結合、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルジルを含むアルキルである。ポリヌクレオチド中のすべてのホスホジエステル結合が同一である必要はない。ポリヌクレオチドは直鎖状もしくは環状であることができ、または直鎖状および環状部分の組み合わせを含むことができる。
【００２４】
本明細書で用いられる「ポリペプチド」とは、アミノ酸から成り、かつ当業者によってタンパク質と認識される任意の組成をいう。アミノ酸残基を表す慣用の一文字または三文字のコードが本明細書で用いられる。「ポリペプチド」および「タンパク質」の語は、本明細書では互換的に用いられ、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。該ポリマーは直鎖状または分枝状であることができ、これは修飾アミノ酸を含んでいてもよく、また非アミノ酸によって中断されていてもよい。これらの語は、天然にまたは人の介入によって修飾を、たとえばジスルフィド結合形成、グルコシル化、脂質化、アセチル化、ホスホリル化または任意の他の操作もしくは修飾、たとえば標識成分との接合、をされたアミノ酸ポリマーも包含する。この定義内に同様に含まれるのは、たとえばアミノ酸の１以上の類似体（たとえば、非天然のアミノ酸等を含む。）ならびに従来技術で知られた他の修飾を含むポリペプチドである。
【００２５】
本明細書で用いられる「ベクター」とは、１以上の種類の細胞中に核酸を導入するように設計されたポリヌクレオチド配列をいう。ベクターはクローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセット等を包含する。
【００２６】
本明細書で用いられる「発現」の語は、遺伝子の核酸配列に基づいてポリペプチドが産生される過程をいう。この過程は転写および翻訳の双方を含む。
【００２７】
本明細書で用いられる「発現ベクター」とは、宿主中にコード配列の発現を達成する能力のある１以上の適当な制御配列に、機能し得るように連結されたＤＮＡコード配列（たとえば、遺伝子配列）を含むＤＮＡ構成体をいう。かかる制御配列は、転写を達成するプロモーター、かかる転写を制御する任意的なオペレーター配列、適当なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の停止を制御する配列を含む。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、または単に潜在的なゲノム挿入体であることができる。適当な宿主中にいったん形質転換されると、ベクターは、宿主遺伝子とは独立に複製しおよび機能することができ、またはある場合にはゲノム自体中に組み込まれるものであってもよい。プラスミドは、発現ベクターのもっとも普通に用いられる形態である。しかし、本発明は、同等の機能を果たす発現ベクターのこのような他の形態を包含することを意図しており、このような形態は従来技術ですでに知られており、またはここで知られる。
【００２８】
「プロモーター」とは、遺伝子の転写を開始するＲＮＡポリメラーゼを結合することに関与する調節配列をいう。プロモーターは、誘導性プロモーターまたは構成性プロモーターであることができる。本発明に用いられることができる誘導性プロモーターの非限定的な例は、トリコデルマリーゼイｃｂｈ１であり、これは誘導性プロモーターである。
【００２９】
「機能し得るように連結され」の語は、複数の要素が機能的に関連することができる配置にある、このような複数の要素の併置をいう。たとえば、プロモーターがコード配列の転写を制御するならば、該プロモーターは該コード配列に機能し得るように連結されている。
【００３０】
「転写制御下に」とは、ポリヌクレオチド配列の転写が、転写の開始に寄与する、または転写の開始を促進する要素に、該ポリヌクレオチド配列が機能し得るように連結されていることに依存していることを表すと、当該技術分野においてよく理解されている用語である。
【００３１】
「翻訳制御下に」とは、ｍＲＮＡが形成された後に生じる調節過程を表すと、当該技術分野においてよく理解されている用語である。
【００３２】
「遺伝子」とは、ポリペプチドを産生することに関与するＤＮＡセグメントをいい、コード領域に先行するおよびそれに続く領域ならびに個々のコードセグメント（エキソン）の間に介在する配列（イントロン）を含む。
【００３３】
本明細書で用いられる「宿主細胞」の語は、ポリペプチドを産生するための組換え発現ベクターが、該ポリペプチドの発現のためにその中に導入されることができる細胞または細胞株をいう。宿主細胞は、１の宿主細胞の子孫を含み、該子孫は元の親細胞と、天然の、偶発的な、または意図的な変異の故に、必ずしも完全に（形態（モルフォロジー）においてまたは全ゲノムＤＮＡ相補体において）同一でなくてもよい。宿主細胞は、発現ベクターを生体内で（ｉｎ  ｖｉｖｏ）導入された、または形質転換された細胞を含む。「宿主細胞」とは、糸状菌株、とりわけトリコデルマ種の株の細胞から産生された細胞およびプロトプラストの双方をいう。
【００３４】
「組換え体」の語は、細胞、核酸、タンパク質またはベクターに関して用いられるときは、その細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、非相同の核酸もしくはタンパク質、もしくは天然の核酸もしくはタンパク質の変更物によって修飾されていることを、またはその細胞がそのように修飾された細胞に由来することを示している。したがって、たとえば、組換え細胞は、その細胞の天然（非組換え）型の中で見出されない遺伝子を発現し、またはそれとは別様に異常に発現された、不十分に発現された、もしくはまったく発現されない天然の遺伝子を発現する。
【００３５】
「シグナル配列」（「プレ配列」、「シグナルペプチド」、「リ−ダー配列」または「リ−ダーペプチド」とも呼ばれる。）とは、タンパク質のＮ末端部分に結合されたアミノ酸の配列をいい、これは細胞からの成熟型タンパク質の分泌を促進する。シグナル配列は分泌経路へのポリペプチドを標的とし、新生ポリペプチドが小胞体膜内にいったん移行してしまうとそれから分離される。成熟型の細胞外タンパク質は、分泌過程の間にシグナル配列を切り離され、それを欠いている。
【００３６】
「選択マーカー」または「選択可能マーカー」の語は、導入された核酸またはベクターを含んでいる宿主の選別を容易にすることを可能にする、宿主細胞中で発現する能力のある遺伝子をいう。選択可能マーカーの例は、以下のものに限定されることなく、抗生物質（たとえば、ハイグロマイシン、ブレオマイシンまたはクロラムフェニコール）および／または代謝上の利益、たとえば栄養的利益を宿主細胞に与える遺伝子を含む。
【００３７】
「に由来する」の語は、「を源とする」、「から得られた」、「から得られ得る」、「から単離された」および「から生成された」の語を包含する。
【００３８】
「糸状菌」とは、ユーミコチナ（Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ）亜門のすべての糸状体をいう（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．、「菌類学入門（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ）」、１９６２年、米国、ニューヨーク州、Ｗｉｌｅｙ社参照）。これらの真菌は、キチン、セルロースおよび他の複合多糖からなる細胞壁を有する栄養菌糸によって特性付けられる。本発明の糸状菌は酵母菌とは形態学的に、生理学的におよび遺伝学的にはっきり区別される。糸状菌による栄養増殖は菌糸の伸長によるものであり、炭素異化作用は偏性好気性である。本発明では、糸状菌親細胞は、トリコデルマ、たとえばトリコデルマリーゼイ（従来はトリコデルマロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）として分類され、現在はハイポクレアジェコリーナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）として知られている。）、トリコデルマビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマコニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）またはトリコデルマハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）の種の細胞であることができる。
【００３９】
本明細書で用いられる「トリコデルマ」または「トリコデルマ種」の語は、従来および現在トリコデルマとして分類された任意の糸状菌属をいう。
【００４０】
「培養」の語は、液状または固形培地中で、成長に適した条件下に微生物細胞の集団を生育することをいう。
【００４１】
ポリヌクレオチドまたはタンパク質に関する「非相同」の語は、宿主細胞中に天然には生じないポリヌクレオチドまたはタンパク質をいう。ある実施態様では、このタンパク質は商業的に重要な工業用タンパク質である。「非相同」の語は、天然遺伝子、突然変異遺伝子および／または合成遺伝子によってコードされたタンパク質を包含することが意図されている。ポリヌクレオチドまたはタンパク質に関する「相同」の語は、宿主細胞中に天然に生じるポリヌクレオチドまたはタンパク質をいう。
【００４２】
核酸配列を細胞中に挿入する文脈における「導入され」の語は、「核酸導入」、「形質転換」または「形質導入」を包含し、核酸配列を真核細胞または原核細胞中に導入することをいい、その場合、該核酸配列は該細胞のゲノム（たとえば、染色体、プラスミド、色素体またはミトコンドリアのＤＮＡ）中に導入され、自律レプリコンに転換され、または一時的に発現されることができる。
【００４３】
本明細書で用いられる「形質転換され」、「安定に形質転換され」および「トランスジェニックの」の語は、非天然（すなわち、非相同）の核酸配列を、自身のゲノム中に取り込んで、または複数世代を通して保持されているエピソームプラスミドとして、有する細胞をいう。
【００４４】
本明細書で用いられる「回収され」、「単離され」、「精製され」および「分離され」の語は、その物質が自然に結び付けられている少なくとも１の成分から分離された物質（たとえば、タンパク質、核酸または細胞）をいう。たとえば、これらの語は、その物質の自然な状態において見られる、その物質に通常付随する成分から、実質的にまたは本質的に自由になっている物質、たとえば人の手の加えられていない生体系をいうということができる。
【００４５】
本明細書で用いられる「カタラーゼ」とは、過酸化水素から水素および酸素への分解を触媒する酵素（たとえば、触媒活性を有するポリペプチド）をいう。
【００４６】
「ＡＴＣＣ」とは、米国、２０１０８、バージニア州、Ｍａｎａｓｓａｓを本拠とするアメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）をいう。
【００４７】
「ＮＲＲＬ」とは、米国、イリノイ州、Ｐｅｏｒｉａの米国立農業利用研究センター（米国農務省北部地域研究所（ＵＳＤＡ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）として従来知られていた。）、農事研究事業団カルチャーコレクション（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）をいう。
【００４８】
「１の（ａ、ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」とは、文脈が明白に他様に指示しない限り、複数のものへの言及を包含する。
トリコデルマ宿主細胞
【００４９】
本発明は、カタラーゼ酵素をコードする非相同のポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞を提供する。該宿主細胞は、トリコデルマ種、たとえばトリコデルマリーゼイ、トリコデルマビリデ、トリコデルマコニンギまたはトリコデルマハルジアナムの糸状菌細胞である。ある実施態様では、宿主細胞はトリコデルマリーゼイ菌株である。トリコデルマリーゼイの菌株は公知であり、非限定的な例はＡＴＣＣ番号１３６３１、ＡＴＣＣ番号２６９２１、ＡＴＣＣ番号５６７６４、ＡＴＣＣ番号５６７６５、ＡＴＣＣ番号５６７６７およびＮＲＲＬ番号１５７０９を含む。ある実施態様では、宿主細胞はＲＬ−Ｐ３７トリコデルマリーゼイ菌株（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９８４年、第２０巻、ｐ．４６〜５３に記載されている。）に由来する。１の実施態様では、宿主細胞はＭｏｒｐｈ  １．１（ｐｙｒ＋）トリコデルマリーゼイ菌株、すなわち４遺伝子欠失のＲＬ−Ｐ３７トリコデルマリーゼイ菌株の自然復帰変異株ｐｙｒ４である（国際公開第０５／００１０３６号に記載されている）。
【００５０】
宿主株は、遺伝子工学によってすでに遺伝子組換えされたものであってもよい。ある実施態様では、糸状菌宿主細胞の各種の天然遺伝子がこれまでに不活性化されている。これらの遺伝子は、たとえばセルロース分解酵素、たとえばエンドグルカナーゼ（ＥＧ）およびエキソセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）（たとえば、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１およびｅｇｌ３）をコードする遺伝子を含む。米国特許第５，６５０，３２２号は、ｃｂｈ１遺伝子およびｃｂｈ２遺伝子の欠失を有するＲＬ−Ｐ３７の誘導体株を開示している。ある実施態様では、トリコデルマ宿主細胞はエンド−Ｔ遺伝子の欠失を有しており、発現されたカタラーゼ酵素の脱グリコシル化（糖鎖の除去）が低減されまたは阻害される。ある実施態様では、宿主細胞は、エンド−Ｔ遺伝子の欠失を有するトリコデルマリーゼイである。
【００５１】
本発明のポリペプチドをコードする発現ベクターは、標準的な手法を用いて宿主細胞中に核酸導入されることができる。「核酸導入」または「形質転換」とは、外因性ポリヌクレオチドを宿主細胞中に挿入することをいう。外因性ポリヌクレオチドは、非組み込みベクター、たとえばプラスミドとして保持されることができ、あるいは宿主細胞ゲノム中に取り込まれてもよい。「核酸導入する」または「核酸導入」の語は、核酸を宿主細胞中に導入するためのすべての慣用の手法を包含することが意図される。核酸導入の手法の例は、以下のものに限定されることなく、リン酸カルシウム沈降法、ＤＥＡＥデキストリン媒介性核酸導入、リポフェクション、エレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションを含む。宿主細胞中に核酸導入する好適な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、１９８９年、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ刊および他の実験教科書に見出されることができる。核酸をｉｎ  ｖｉｖｏに細胞中に導入するのに適した送達機構によって、たとえばレトロウイルスベクター法（たとえば、Ｆｅｒｒｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、１９９１年、第８８巻、ｐ．８３７７〜８３８１；およびＫａｙら、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９２年、第３巻、ｐ．６４１〜６４７参照）、アデノウイルスベクター法（たとえば、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ、Ｃｅｌｌ、１９９２年、第６８巻、ｐ．１４３〜１５５；ならびにＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、１９９３年、第９０巻、ｐ．２８１３〜２８１６参照）、受容体媒介性ＤＮＡ組み込み法（たとえば、ＷｕおよびＷｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８８年、第２６３巻、ｐ．１４６２１；Ｗｉｌｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９２年、第２６７巻、ｐ．９６３−９６７；ならびに米国特許第５，１６６，３２０号参照）、ＤＮＡの直接注入法（たとえば、Ａｃｓａｄｉら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９１年、第３３２巻、ｐ．８１５−８１８；およびＷｏｌｆｆら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９０年、第２４７巻、ｐ．１４６５−１４６８参照）、または粒子ボンバードメント（微粒子銃）法（たとえば、Ｃｈｅｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、１９９３年、第９０巻、ｐ．４４５５〜４４５９；およびＺｅｌｅｎｉｎら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｓ．、１９９３年、第３１５巻、ｐ．２９〜３２参照）によって、核酸は細胞中に導入されることもできる。
【００５２】
ある種のベクターは、低い頻度で宿主細胞中に組み込まれる。これらの組み込み体を特定するために、ある実施態様では、選択可能マーカー（たとえば、薬剤耐性を与えるもの）を含む遺伝子が、関心の対象である核酸とともに宿主細胞中に導入される。選択可能マーカーの例は、ある種の薬剤に対する耐性を与えるもの、たとえばＧ４１８およびハイグロマイシンを含む。選択可能マーカーは、関心の対象である核酸とは別のベクター上に、または同じベクター上に導入されることができる。核酸導入された宿主細胞はそうすると、選択可能マーカーを用いて細胞を選別することによって、特定されることができる。たとえば、選択可能マーカーがネオマイシン耐性を与える遺伝子をコードするならば、核酸を組み込んだ宿主細胞は、Ｇ４１８の存在下においてもそれが成長することによって特定されることができる。選択可能マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生き延び、そうでない細胞は死ぬ。
【００５３】
いったん発現されると、本発明のポリペプチドは、当該技術分野の標準的方法、たとえば、以下のものに限定されることなく、親和性精製法、硫酸アンモニウム沈降法、イオン交換クロマトグラフィーまたはゲル電気泳動法（一般的に、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ、「タンパク質の精製（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、１９８２年、米国、ニューヨーク州、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ社；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８２巻：「タンパク質精製法の解説（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、１９９０年、米国、ニューヨーク州、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社を参照）を含む方法に従って精製されることができる。
カタラーゼ酵素
【００５４】
本発明の文脈では、カタラーゼは、過酸化水素から酸素および水への転化を触媒する酵素である。本明細書に記載されたトリコデルマ宿主細胞中で発現されたカタラーゼ酵素は、宿主の種とは非相同である。すなわち、これらのカタラーゼ酵素は、その中でこれらのカタラーゼ酵素が発現されたトリコデルマの種とは別の種に由来する。
【００５５】
１の実施態様では、カタラーゼは、アスペルギルスニガーのｃａｔＲカタラーゼである。ある実施態様では、カタラーゼは、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を含み、同配列からなり、または同配列から本質的になる。ある実施態様では、カタラーゼは、配列番号１に記載された配列と約７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９または９９．５％のいずれかの同一性を有するアミノ酸配列を含み、同配列からなり、または同配列から本質的になり、この酵素は過酸化水素から酸素および水への転化を触媒する能力がある。
【００５６】
ある実施態様では、カタラーゼは、配列番号１に記載されたアミノ酸配列に由来する成熟型の、処理された配列である。ある実施態様では、配列番号１に記載されたアミノ酸配列に由来する成熟型の、処理された配列は、配列番号１のＮ末端から１〜約２５個のアミノ酸残基の欠失、たとえば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５個のＮ末端アミノ酸の欠失を有する。
【００５７】
１の実施態様では、カタラーゼは、アスペルギルスニガーのｃａｔＲ遺伝子によってコードされる。ある実施態様では、カタラーゼは、配列番号２に記載されたポリヌクレオチド配列を含み、同配列からなり、または同配列から本質的になるポリヌクレオチドによってコードされる。ある実施態様では、カタラーゼは、配列番号２に記載されたポリヌクレオチド配列と約７０、７５、８０、８５、９０、９５、９７、９８、９９または９９．５％のいずれかの同一性を有するポリヌクレオチド配列によってコードされ、このポリヌクレオチドによってコードされた酵素は過酸化水素から酸素および水への転化を触媒する能力がある。
ベクター
【００５８】
本発明に従って、カタラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターは、トリコデルマ宿主細胞中に導入される。典型的には、カタラーゼ活性を含むポリペプチドは、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含みかつカタラーゼコード配列に機能し得るように連結された１または複数の調節配列を含む発現ベクターから発現される。
【００５９】
ベクターは、トリコデルマ細胞中に導入されその中で複製されることができる任意のベクターであることができる。好適なベクターの例は、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら、上記、１９８９年；Ａｕｓｕｂｅｌ、上記、１９９４年；ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌら、「真菌中でのより多くの遺伝子操作（Ｍｏｒｅ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｇｉ）（ＢｅｎｎｅｔおよびＬａｓｕｒｅ編）」、１９９１年、ｐ．３９６−４２８、米国、サンジエゴ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ社：および米国特許第５，８７４，２７６号の中に見出されることができる。有用なベクターの例は、以下のものに限定されることなく、ｐＦＢ６、ｐＢＲ３２２、ＰＵＣ１８およびｐＥＮＴＲ／Ｄを含む。
【００６０】
典型的には、カタラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドは、トリコデルマ宿主細胞中で転写活性を示す適当なプロモーターに機能し得るように連結されている。このプロモーターは、宿主細胞と相同か、あるいは非相同であるタンパク質をコードする遺伝子に由来することができる。プロモーターの好適な非限定的な例は、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１およびｅｇｌ２を含む。ある実施態様では、プロモーターは宿主細胞生来である。たとえば、トリコデルマリーゼイが宿主細胞であるときは、プロモーターは天然のトリコデルマリーゼイプロモーターであることができる。１の実施態様では、プロモーターはトリコデルマリーゼイｃｂｈ１であり、これは誘導性プロモーターであり、受託番号Ｄ８６２３５の下にジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）に寄託されている。「誘導性プロモーター」とは、環境的または発生的調節条件下に活性であるプロモーターである。他の実施態様では、プロモーターは宿主細胞と非相同である。
【００６１】
ある実施態様では、カタラーゼをコードする配列は、シグナル配列をコードするポリヌクレオチド配列と機能し得るように連結されている。ある実施態様では、シグナル配列は、発現されるべきカタラーゼ遺伝子と天然に結合されている配列である。ある実施態様では、シグナル配列は、配列番号１の１〜１６の残基に示されたアミノ酸配列を含み、同配列からなり、または同配列から本質的になる。ある実施態様では、シグナル配列は、配列番号１の１〜１６のアミノ酸残基に示されたシグナル配列と少なくとも約８０、８５、９０％、９５％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。ある実施態様では、シグナル配列は、トリコデルマリーゼイのｃｂｈ１またはｎｓｐ２４のシグナル配列である。１の実施態様では、シグナル配列は、ｃｂｈ１核酸配列ＡＴＧＴＡＴＣＧＧＡＡＧＴＴＧＧＣＣＧＴＣＡＴＣＴＣＧＧＣＣＴＴＣＴＴＧＧＣＣＡＣＡＧＣＴＣＧＴＧＣＴ（配列番号３）によってコードされたアミノ酸配列である。１の実施態様では、シグナル配列は、ｎｓｐ２４核酸配列ＡＴＧＣＡＧＡＣＣＴＴＴＧＧＡＧＣＴＴＴＴＣＴＣＧＴＴＴＣＣＴＴＣＣＴＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＣＴＧＧＣＣＧＣＧＧＣＣ（配列番号４）によってコードされたアミノ酸配列である。ある実施態様では、トリコデルマ宿主細胞中に導入されるべきベクターは、同じ源に由来するシグナル配列およびプロモーター配列を含む。ある実施態様では、シグナル配列およびプロモーター配列は異なった源に由来する。
【００６２】
ある実施態様では、ベクターは終止配列も含む。ある実施態様では、トリコデルマ宿主細胞中に導入されるべきベクターは、同じ源に由来する終止配列およびプロモーター配列を含む。ある実施態様では、終止配列およびプロモーター配列は異なった源に由来する。好適な終止配列の１の非限定的な例は、トリコデルマ株、たとえばトリコデルマリーゼイ株に由来するｃｂｈ１の終止配列である。
【００６３】
ある実施態様では、ベクターは選択可能マーカーを含む。好適な選択可能マーカーの例は、以下のものに限定されることなく、抗生物質化合物、たとえばハイグロマイシン、フレオマイシンに対する耐性を与える遺伝子を含む。栄養要求性選択可能マーカー、たとえばａｍｄＳ、ａｒｇＢ、ｐｙｒ４も用いられることができる。トリコデルマの形質転換のためのベクター系に有用なマーカーは、従来技術で知られている（たとえば、Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ、「糸状菌のバイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  Ｆｕｎｇｉ）（Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎら編）」、１９９２年、第６章、米国、マサチューセッツ州、ボストン、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ社；Ｋｉｎｇｈｏｒｎら、「糸状菌の応用分子遺伝学（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  Ｆｕｎｇｉ）」、１９９２年、英国、ロンドン、Ｃｈａｐｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ社、Ｂｌａｃｋｉｅ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  ａｎｄ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ部門参照）。１の実施態様では、選択可能マーカーはａｍｄＳ遺伝子であり、これはアセトアミダーゼ酵素をコードし、形質転換された細胞が窒素源としてのアセトアミド上で成長することを可能にする。アスペルギルスニジュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳ遺伝子の選択可能マーカーとしての使用は、Ｋｅｌｌｙら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１９８５年、第４巻、ｐ．４７５−４９７およびＰｅｎｔｔｉｌａら、Ｇｅｎｅ、１９８７年、第６１巻、ｐ．１５５−１６４に記載されている。
【００６４】
カタラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含んでいる発現ベクターは、トリコデルマ宿主細胞中で自律的に複製する能力がある、または該宿主細胞のＤＮＡ中に組み込まれる能力がある任意のベクターであることができる。ある実施態様では、発現ベクターはプラスミドである。
【００６５】
カタラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび他の配列、たとえばプロモーターおよびターミネーターを含んでいるＤＮＡ構成体を作る方法、ならびにこれらを適当なベクター中に挿入する方法は、従来技術で周知である。ポリヌクレオチド配列の連結は、一般に都合のよい制限酵素認識部位での結合によって達成される。かかる部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドリンカーが従来の慣行に従って用いられる（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記、１９８９年；ＢｅｎｎｅｔｔおよびＬａｓｕｒｅ、上記、１９９１年、ｐ．７０−７６参照）。
宿主細胞中へのベクターの導入
【００６６】
カタラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターのトリコデルマ宿主細胞中への導入は、従来技術で周知の多数の手法のいずれか、たとえば形質転換、エレクトロポレーション、核マイクロインジェクション、形質導入、核酸導入（たとえば、リポフェクション、ＤＥＡＥデキストリン媒介性核酸導入）、リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿による培養、ＤＮＡ被覆マイクロプロジェクタイルによる高速度ボンバードメントまたはプロトプラスト融合を用いて実施されることができる。
【００６７】
ある実施態様では、安定な形質転換体が生成され、それによってカタラーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、宿主細胞染色体中に安定に組み込まれる。形質転換体は次に公知の手法によって精製される。
【００６８】
１の実施態様では、ａｍｄＳマーカーを含む安定な形質転換体は、そのより急速な成長速度と、アセトアミドを含有する固形培地上に不規則でなくて滑らかな輪郭を有する円形のコロニーを形成することとによって、不安定な形質転換体から識別可能である。その上、場合によっては、固形非選択培地（すなわち、アセトアミドを含んでいない培地）上で形質転換体を成長させ、この培地から胞子を収穫し、そしてアセトアミドを含有する選択培地上でその後に発芽し成長するような胞子の割合を測定することによるさらなる安定性試験が実施される。あるいは、従来技術で知られた他の方法が、形質転換体を選別するために用いられることができる。
【００６９】
１の実施態様では、形質転換のためのトリコデルマ宿主細胞の調製は、真菌の菌糸体からのプロトプラストの調製を含む（たとえば、Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．、１９８９年、第１６巻、ｐ．５３−５６参照）。ある実施態様では、発芽した栄養胞子から菌糸体が得られる。この菌糸体は細胞壁を消化する酵素で処理されて、プロトプラストとなる。このプロトプラストは、懸濁培地中で浸透圧安定剤の存在によって保護される。かかる安定剤は、たとえばソルビトール、マンニトール、塩化カルシウムおよび硫酸マグネシウムを含む。典型的には、安定剤の濃度は約０．８Ｍ〜約１．２Ｍの範囲にある。１の実施態様では、ソルビトールは懸濁培地中に約１．２Ｍの濃度で存在する。
【００７０】
典型的には、宿主のトリコデルマ細胞中へのＤＮＡの組み込みは、組み込み溶液中のカルシウムイオン濃度に依存する。一般に、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭのＣａＣｌ２が組み込み溶液中に含まれている。その上、組み込み溶液は、典型的には緩衝系（たとえば、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）、ｐＨ７．４；１ｍＭのＥＤＴＡ））または１０ｍＭのモルホリンプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、ｐＨ６．０）およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）も含んでいる。理論に束縛されることを望むわけではないが、ＰＥＧは、細胞膜を溶解する役割を果たすことができ、このようにして培地中の内容物がトリコデルマ細胞の細胞質中に送達されること、およびプラスミドＤＮＡが核中に導入されることを可能にする。この融合は典型的には、プラスミドＤＮＡの複数のコピーが宿主染色体中に組み込まれる結果をもたらす。
【００７１】
しばしば、約１０５／ｍｌ〜約１０７／ｍｌ、典型的には約２×１０６／ｍｌの細胞密度での透過性処理に付されたトリコデルマのプロトプラストまたは細胞を含む懸濁体が形質転換に用いられる。これらのプロトプラストまたは細胞の適当な溶液（たとえば、１．２Ｍのソルビトール、５０ｍＭのＣａＣｌ２を含んでいる溶液）１００μｌの量が、ＤＮＡと混合される。一般に、高濃度のＰＥＧが組み込み溶液に添加される。たとえば、約０．１〜約１倍量の２５％ＰＥＧ  ４０００が、プロトプラスト懸濁体に添加されることができる。１の実施態様では、約０．２５倍量の２５％ＰＥＧ  ４０００が添加される。添加剤、たとえば以下のものに限定されないが、ジメチルスルホキシド、ヘパリン、スペルミジンおよび塩化カリウムが組み込み溶液に添加され、形質転換を補助する。
【００７２】
典型的には、組み込み混合物は次に０℃で約１０〜約３０分間温置される。追加のＰＥＧがそれからこの混合物に添加されて、所望の遺伝子またはポリヌクレオチド配列の組み込みを促進することができる。たとえば、約５〜約１５倍量の２５％ＰＥＧ  ４０００が添加されることができる。しかし、これよりも多いまたは少ない量が適当であることもある。添加される２５％ＰＥＧ  ４０００の量は、しばしば形質転換混合物の１０倍量である。ＰＥＧの添加後、形質転換混合物は次に室温であるいは氷上に温置され、引き続いてソルビトールおよび塩化カルシウム溶液が添加される。プロトプラスト懸濁体は、次に成長培地、たとえば溶解した成長培地のアリコートに添加され、該成長培地は形質転換体の成長のみを許す。
カタラーゼの産生
【００７３】
トリコデルマ中の非相同タンパク質の発現は、たとえば米国特許第６，０２２，７２５号および６，２６８，３２８号；Ｈａｒｋｋｉら、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９１年、第１３巻、ｐ．２２７−２３３；Ｈａｒｋｋｉら、Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．、１９８９年、第７巻、ｐ．５９６−６０３；欧州特許第２４４，２３４号；欧州特許第２１５，５９４号；およびＮｅｖａｌａｉｎｅｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ（ＬｅｏｎｇおよびＢｅｒｋａ編）中の「トリコデルマならびに相同および非相同の双方の遺伝子の発現へのその利用の分子生物学（Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｔｈ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｄ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅｓ）」、１９９２年、ｐ．１２９−１４８、米国、ニューヨーク州、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ社に記載されている。
【００７４】
一般に、トリコデルマ宿主細胞は、生理的塩類および栄養素を含む標準培地中で培養される。通常の商業的に調製された培地（たとえば、酵母・麦芽抽出物（ＹＭ）ブロス；ルリアベルタニ（ＬＢ）ブロス；サブローデキストロース（ＳＤ）ブロス）が用いられることができる。典型的には、細胞は、振とう培養機または発酵槽中約２８℃で、所望のレベルのカタラーゼの発現が達成されるまで培養される。しばしば、誘導糖、たとえばラクトースまたはグルコース／ソホロースが培地中に含められる。
【００７５】
アスペルギルスニガー中でカタラーゼが産生されるときは、シュウ酸が副生成物として約３０ｇ／ｌのレベルで生成される。カタラーゼ産物中への制御されない沈降を避けるために、ほとんどのシュウ酸を除くことが必要である。したがって、シュウ酸は、ＣａＣｌ２を用いてシュウ化カルシウムとしてアスペルギルスニガー発酵培地から沈降される。トリコデルマリーゼイ中のカタラーゼの産生は、これよりもはるかに低いレベルのシュウ酸をもたらす。４回の異なったトリコデルマリーゼイの発酵後の平均シュウ酸濃度は、わずか１．２４±０．１５ｇ／ｌであった。好都合なことに、このレベルはシュウ酸塩による沈降の必要をなくしてくれる。
使用方法
【００７６】
本発明は、過酸化水素を酸素および水に転化する方法であって、過酸化水素を、本明細書に記載されたトリコデルマ宿主細胞中で産生されたカタラーゼ酵素に接触させる工程を含む方法を提供する。本発明の方法が用いられることができる用途は、以下のものに限定されることなく、布地の漂白後、パルプもしくは紙の漂白後、または殺菌剤としての使用後に過酸化水素を除去する用途を含む。本明細書に記載されたカタラーゼ酵素のための好適なプロセス条件の非限定的な例は、ｐＨ３〜９、２０〜８０℃および５０００ｐｐｍまでの過酸化水素を含む。
組成物
【００７７】
本発明は、本明細書に記載されたトリコデルマ宿主細胞中で産生されたカタラーゼ酵素を含む酵素組成物も提供する。かかる組成物は、過酸化水素を酸素および水に転化する方法に用いられることができる。
【００７８】
様々な実施態様において、カタラーゼ酵素は、液状、固形状、全ブロス液状または全ブロス固形状の配合物で提供されることができる。
【００７９】
ある実施態様では、精製カタラーゼは、約８００〜２０，０００Ｕ／ｇの範囲の活性濃度を持ち、ｐＨ約３〜９で提供されることができる。液状配合物は、ポリオール、たとえば５〜４０％のソルビトールもしくはグリセロール、塩類、たとえば５〜２０％の塩化ナトリウム、緩衝液、たとえばクエン酸塩、リン酸塩もしくは酢酸塩、ならびに他の成分、たとえば０．０１〜２％のギ酸塩および／もしくは０．０１〜２％の亜硝酸ナトリウム、および／もしくは抗生物質、たとえばソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、パラベンおよび／もしくはプロキセル（１，２−ベンズイソチアゾリン−３−オン）を含むことができる。
キット
【００８０】
本発明はキットも提供する。１の実施態様では、キットは、本明細書に記載されたトリコデルマ宿主細胞中で産生されたカタラーゼ酵素を提供し、任意的に、カタラーゼ酵素を、たとえば布地の漂白後、パルプもしくは紙の漂白後、または殺菌剤としての使用後の過酸化水素を除去する方法または用途に使用するための説明書が添付される。好適な包装が提供される。本明細書で用いられる「包装」とは、系において習慣的に用いられ、本明細書に記載されたキットの成分、たとえばカタラーゼ酵素を一定の限度量内に保持することのできる固形の母体または物質をいう。
【００８１】
説明書は、印刷体で、または電子媒体、たとえばフロッピーディスク、ＣＤもしくはＤＶＤの形で、またはかかる説明書が取得されることができるウェブサイトアドレスの形で提供される。
【００８２】
以下の実施例は、本発明を例示することを意図しているが、限定することは意図していない。
【実施例１】
【００８３】
ｐＴｒｅｘ３ｇＭ（ＣＡＴＥ）発現ベクターの構築
プラスミドｐＴｒｅｘ３ｇＭが、（国際公開第０５／００１０３６号に記載された）ｐＴｒｅｘ３ｇの修飾によって産生され、前者はサイズが後者よりも小さい。ｐＴｒｅｘ３ｇＭは、細菌中でのプラスミドの複製に関与する配列において主としてｐＴｒｅｘ３ｇと異なる。ｐＴｒｅｘ３ｇＭは、２のプライマー対、すなわち
ｏＭＯＢ５（ＧＧＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＴＡＡＡＴＧＧＣＣＡＴＧＡＧＡＣＡＡＴＡＡＣＣＣＴＧＡＴＡＡＡＴＧＣ）（配列番号５）プラス
ｏＭＯＢ３１（ＡＡＧＧＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧＡＴＴＡＴＣ）（配列番号６）、および
ｏＭＯＢ５１（ＴＣＧＧＣＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＴＴＡＡＣＧＴＧＡＧＴＴＴＴＣＧＴＴＣＣ）（配列番号７）プラス
ｏＭＯＳ３（ＧＧＴＴＣＴＡＧＡＧＧＣＣＡＴＴＴＡＧＧＣＣＧＴＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＡＧＧ）（配列番号８）
を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ｐＵＣ１９からの複製開始遺伝子およびアンピシリン耐性遺伝子を増幅することによって構築された。
【００８４】
２の得られたＰＣＲ産物は、ＰｓｔＩおよびＸｂａＩによって消化され、ｐＴｒｅｘ３ｇの６．１７ｋｂのＸｂａＩ−ＸｂａＩ断片で結合されて、ｐＴｒｅｘ３ｇＭ発現ベクターを生成した。ｐＴｒｅｘ３ｇＭの構造が図３に示される。
【００８５】
アスペルギルスニガー株ＦＳ１（ＧＩＣＣ  ２００４７）由来のｃａｔＲ遺伝子の全体のコード領域（イントロンを含む）（配列番号２）が、プライマー対、すなわち
ｏＣＡＴ５１（ＣＡＣＣＡＡＡＣＡＡＴＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＡＴＧＣＧＴＣＡＴＴＴＣＴＧＧＣＴＴＴＴＧＣＣＡＧ）（配列番号９）および
ｏＣＡＴ３（ＣＧＴＧＡＴＡＣＣＣＴＴＡＣＴＣＡＴＣＣＡＧＣＧＣ）（配列番号１０）
とともに高忠実度ＤＮＡポリメラーゼＰｆｕＵｌｔｒａ  II（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて増幅された。
【００８６】
ｃａｔＲ遺伝子の完全なコード領域の他に、得られたＰＣＲ産物は、マイコウイルスＰｃＶに由来するＡＣの多い５’非翻訳領域を含んでいた。この領域の考えられる機能が、「翻訳エンハンサー」として提案されている（Ｊｉａｎｇら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、２００４年、第８５巻、ｐ．２１１１−２１２１）。このＰＣＲ産物は、ｐＥＮＴＲベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）中にクローニングされ、その後Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＧａｔｅｗａｙ（商標）クローニング系を用いてｐＴｒｅｘ３ｇＭに導入されて、図４に示されたｐＴｒｅｘ３ｇＭ（ＣＡＴＥ）ベクターになった。
【実施例２】
【００８７】
トリコデルマリーゼイの形質転換および該形質転換株のスクリーニング
トリコデルマリーゼイ株Ｍｏｒｐｈ  １．１（ｐｙｒ＋）は、４遺伝子欠失のＲＬ−Ｐ３７株の自然復帰変異体ｐｙｒ４である（国際公開第０５／００１０３６号に記載されている）。この株から新たに収穫された胞子が、氷冷された１．２Ｍのソルビトール中に懸濁され、同じ溶液で２回洗浄され、そしてｐＴｒｅｘ３ｇＭ（ＣＡＴＥ）プラスミド由来の精製された７．０４ｋｂのｃａｔＲ含有ＳｆｉＩ−ＳｆｉＩ断片を用いるエレクトロポレーションに付された。エレクトロポレーションのパラメーターは以下の通りであった。すなわち電圧−１６ｋＶ／ｃｍ、静電容量−２５μＦおよび抵抗値−５０Ω。
【００８８】
エレクトロポレーションに引き続いて、胞子は、１Ｍのソルビトール、０．３％グルコース、０．３％Ｂａｃｔｏペプトンおよび０．１５％酵母エキスを含む培地中でロータリーシェーカー（３０℃、２００ｒｐｍ）にかけられて一晩温置された。発芽胞子は、アセトアミドを唯一の窒素源として含有する選択培地（アセトアミド０．６ｇ／ｌ、塩化セシウム１．６８ｇ／ｌ、グルコース２０ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム１５ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム七水和物０．６ｇ／ｌ、塩化カルシウム二水和物０．６ｇ／ｌ、硫酸鉄（II）５ｍｇ／ｌ、硫酸亜鉛１．４ｍｇ／ｌ、塩化コバルト（II）１ｍｇ／ｌ、硫酸マグネシウム（II）１．６ｍｇ／ｌ、寒天２０ｇ／ｌ、ｐＨ４．２５）上で平板培養された。形質転換されたコロニーが約１週間後に出現した。個別の形質転換体が新鮮なアセトアミド選択プレート上に移され、２〜４日間放置され生育された。
【００８９】
選択培地上で安定な成長を示す分離株が、ウェルの底にマイクロフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ−ＧＶ（商標））を備えたマイクロタイタープレートのウェル中の０．１７ｍｌのラクトース規定量培地（国際公開第０５／００１０３６号、ｐ．６０）（（ＮＨ４）２ＳＯ４  ５ｇ／ｌ、ＰＩＰＰＳ緩衝液３３ｇ／ｌ、Ｂａｃｔｏカザミノ酸９ｇ／ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ４．５ｇ／ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  １．３２ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １ｇ／ｌ、Ｍａｚｕ  ＤＦ２０４  ５ｍｌ／ｌ、４００×微量元素溶液２．５ｍｌ／ｌ、ｐＨ５．５、（別途に滅菌された）ラクトース１６ｇ／ｌ。４００×微量元素溶液の組成は、クエン酸（無水）１７５ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２００ｇ／ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １６ｇ／ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ３．２ｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ  １．４ｇ／ｌ、Ｈ３ＢＯ３  ０．８ｇ／ｌであった。）に、植え付けされるのに用いられた。このプレートは、純酸素の雰囲気中２５〜２８℃で４〜５日間温置された。培地がろ過によって分離され、ドデシル硫酸ナトリウムの存在下におけるポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＤＥ）によって分析された。成熟カタラーゼポリペプチドの計算された分子量よりもわずかに高い分子量を持つ新しいタンパク質のバンドが観察された。この相違はグリコシル化によるものと考えられる。このカタラーゼのバンド中のタンパク質の量は、クローン間の大きい変動を示した。最も高いカタラーゼ発現を有するクローンが選択され、ポテト−デキストロース寒天培地上に放置されて胞子形成をさせ、そして単一胞子サブクローンの単離によって精製された。
【００９０】
形質転換されたトリコデルマリーゼイ中で産生されたカタラーゼは、触媒活性を有していた。たとえば、（上記のように生育された）クローン３２９からの培養ブロスの少量（１０μｌ）のアリコートを、２００μｌの１％Ｈ２Ｏ２と混合すると、視認できるＨ２Ｏ２の分解が直ちに生じ、分子状酸素の激しい発生（気泡として視認可能）を伴った。親株であるＭｏｒｐｈ  １．１（ｐｙｒ＋）からの培養ブロスでは、このような反応は観察されなかった。
【実施例３】
【００９１】
トリコデルマリーゼイおよびアスペルギルスニガー中で発現されたカタラーゼの発現および分布の比較
サンプルの調製
カタラーゼ（アスペルギルスニガーｃａｔＲ）が、実施例２に記載されたようにトリコデルマリーゼイ中で、ならびに米国特許第５，３６０，７３２号および５，３６０，９０１号に記載されたようにアスペルギルスニガー中で、それぞれ産生された。３０ｍｌのサンプルが４０００ｒｐｍ（３２１０×ｇ）で１５分間遠心分離された。上清がデカンテーションされ、ペレット（沈殿物）が５０ｍｌの脱イオン水で洗われた。洗われた細胞は次に４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離され、上清がデカンテーションされ、そしてペレットが５０ｍｌの脱イオン水で洗われた。洗われた細胞はもう一度４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離され、上清がデカンテーションされた。細胞ペレットはドライアイス上で冷凍された。アスペルギルスニガーの場合の平均細胞質量（乾燥細胞重量）は４３．３ｇ／ｋｇであり、トリコデルマリーゼイの場合の平均細胞質量は４３．９ｇ／ｋｇであった。
化学的抽出
【００９２】
細胞ペレットは試料瓶中に移され、４０ｍｌの脱イオン水中に懸濁された。細胞ペレットは、次に磁気スターラーで穏やかに混合されながら３０℃の水浴中で温置された。２５ｍｌの抽出ストック（５０ｇ／ｌのＮａＣｌ、６ｇ／ｌのソルビン酸カリウム、１２ｇ／ｌのギ酸ナトリウム、１２ｇ／ｌの酢酸、ｐＨを４．８〜５．０に調整するために添加された約６ｇ／ｌの水酸化ナトリウム、０．１ｇ／ｌのプロテアーゼＣ）が試料瓶に添加され、それからｐＨが４．８〜５．２に調整された。試料瓶の蓋が緩く閉じられ、それから温置が７２〜８４時間続行された。得られたサンプル溶液は１００ｍｌのビーカー中に移され、その体積が測定された。カタラーゼの活性が、次にベーカー（Ｂａｋｅｒ）カタラーゼ分析方法を用いて測定された。
ベーカーカタラーゼ分析法
【００９３】
ベーカーカタラーゼ分析法は、過酸化水素によるカタラーゼの不活性化およびカタラーゼによる過酸化水素の分解の同時発生に基づく「二重消費」分析法である。実際には、カタラーゼをｐＨ７．０および２５℃で６０分間温置した後の反応混合物中の残留過酸化水素が分析される。１ベーカー単位は、この分析法の条件下に２６４ｍｇの過酸化水素を分解するカタラーゼの量と定義される。
試薬の調製
【００９４】
０．２Ｍのリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．０の調製：１０．７６ｇのＮａＨ２ＰＯ４および１７．３２ｇのＮａ２ＨＰＯ４が８００ｍｌの蒸留水中に希釈され、十分に混合された。このｐＨが検査され、次に溶液は蒸留水で１０００ｍｌの最終量に調整された。
【００９５】
緩衝化された基質の調製：０．２Ｍのリン酸塩緩衝液５００ｍｌ、ｐＨ  ７．０が４５０ｍｌの脱イオン水と混合された。４４〜４６ｍｌの３０％過酸化水素が添加された。この溶液は４℃で１週間安定であった。
【００９６】
１Ｍ硫酸の調製：５５．６ｍｌの濃Ｈ２ＳＯ４が９００ｍｌの蒸留水中に希釈され、十分に混合され、そして放置冷却された。最終量が、蒸留水で１０００ｍｌの最終量に調整された。
【００９７】
４０（重量／体積）％ヨウ化カリウム溶液の調製：２００ｇのヨウ化カリウムが２５０ｍｌの蒸留水に加えられ、十分に混合された。量が、蒸留水で５００ｍｌに調整された。この溶液は冷蔵（４℃）下にコハク色瓶中に保存され、１週間後に廃棄された。
【００９８】
１（重量／体積）％モリブデン酸アンモニウム溶液の調製：１．０ｇの（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏが９０ｍｌの蒸留水に添加され、十分に混合された。量が、蒸留水で１００ｍｌに調整された。
【００９９】
０．２５Ｍのチオ硫酸ナトリウム溶液の調製：６２ｇのＮａ２Ｓ２Ｏ３・５Ｈ２Ｏが９００ｍｌの蒸留水に添加され、十分に混合された。量が、蒸留水で１０００ｍｌに調整された。この溶液は１週間よりも長く保存されなかった。
分析方法
【０１００】
サンプルは以下のようにして正副３回分析された。
１．  １．０Ｍ硫酸５ｍｌをピペットで採取し、１００ｍｌの三角フラスコ中に入れる。
２．  緩衝化された基質４．０ｍｌをピペットで採取し、上記硫酸中に入れ、そして４０％ヨウ化カリウム溶液５ｍｌを添加する。回転させて混合する。
３．  １％モリブデン酸アンモニウム溶液２滴を添加し、０．２５Ｍのチオ硫酸ナトリウム溶液で直ちに滴定する。
４．  遊離のヨウ素の色が完全に消失したときに、滴定終点に達する。色は数分後に戻るかもしれないが、無視する。
５．  １４〜１６ｍｌの滴定量が得られるはずである。この滴定量を得るために、緩衝化された基質溶液中の過酸化水素の濃度を必要であれば調整する。
６．  緩衝化された基質の５０ｍｌのアリコートを、軽く栓をした１００ｍｌの三角フラスコ中に分取し、２５℃に設定された水浴中で１５分間、前温置する。
７．  ０．２Ｍのリン酸塩緩衝液で５〜９ベーカー単位／ｍｌになるまで、カタラーゼサンプルを希釈する。
８．  希釈されたカタラーゼサンプル２００μｌをピペットで採取し、前温置された１００ｍｌの三角フラスコ中に３分間の間隔を空けて入れ、直ちに回転によって混合する。
９．  ２５℃で６０分間温置する。時々振って、反応混合物から酸素を放出させる。
１０．  温置期間の最後に、酸素がすべて除かれてしまうまで、反応混合物を振る。
１１．  上記の工程１〜４の方法を用いることによって、残留過酸化水素を分析する。（試験溶液４．０ｍｌをピペットで採取し、上記硫酸中に入れ、そして工程２〜４を追行する。）
１２．  工程８の希釈されたカタラーゼサンプルの代わりに０．２Ｍのリン酸塩緩衝液２００μｌを用いたブランクの基質を、同じように温置し分析しなければならない。（該ブランクは１４〜１６ｍｌの滴定量を要するはずである。）
活性の計算
【０１０１】
ベーカー単位でのカタラーゼ活性（Ｕ／ｍｌ）＝（Ｂ−Ｓ）×ＤＦ
Ｂはブランクの滴定量である（ｍｌ）。
Ｓはサンプルの滴定量である（ｍｌ）。
ＤＦはサンプルの希釈倍数である。
最大の精度を得るために、差（Ｂ−Ｓ）は５〜１０ｍｌでなければならない。
結果
【０１０２】
結果が表１に示される。
【表１】
0005435812.tif 000002
【実施例４】
【０１０３】
アスペルギルスニガーおよびトリコデルマリーゼイ中で発現されたカタラーゼのＴｍの比較
カタラーゼ（アスペルギルスニガーｃａｔＲ）が、実施例２に記載されたようにトリコデルマリーゼイ中で、ならびに米国特許第５，３６０，７３２号および５，３６０，９０１号に記載されたようにアスペルギルスニガー中で、それぞれ産生された。
融点へのｐＨの効果
【０１０４】
アスペルギルスニガーまたはトリコデルマリーゼイ中で発現されたカタラーゼが、ｐＨ３〜８に１ｐＨ単位づつ増加させて調整された緩衝液中に約０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で懸濁された。緩衝液は、２５０ｍＭのクエン酸ｐＨ３、２５０ｍＭの酢酸ナトリウム三水和物ｐＨ４、２５０ｍＭのクエン酸ナトリウムｐＨ５、２５ｍＭのビストリスプロパンｐＨ６、７および８であった。サンプルは、ＭｉｃｒｏＣａｌ  ＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＤＳＣ（米国、マサチュ−セッツ州、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭｉｃｒｏＣａｌ有限責任会社）を用いて、２００℃／時の速度で３０℃〜１２０℃の温度走査で操作される示差走査熱量計法（ＤＳＣ）によって分析された。カタラーゼタンパク質が加えられていない同じ緩衝液が、参照溶液として用いられた。Ｃｐ（ｃａｌ／℃）対温度のプロットの最大ピーク高さを観察することによって、融点（Ｔｍ）が測定された。この測定についてのＤＳＣの誤差は約±１℃であった。結果が図５に示される。
Ｈ２Ｏ２の前処理の効果
【０１０５】
アスペルギルスニガーまたはトリコデルマリーゼイ中で発現されたカタラーゼが、２５℃、５０℃または７０℃まで予熱された緩衝液（５０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７）中に約０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で懸濁された。Ｈ２Ｏ２が次に約３％の濃度で添加された。サンプルは、それぞれの温度に１５分間保持され、それから４℃まで冷却され、そしてＤＳＣによって上記と同じ方法を用いて分析された。Ｈ２Ｏ２に曝露されなかった他は同じに処理された並行する一組
のサンプルが実験対照とされた。この測定についてのＤＳＣの誤差は約±１℃であった。結果が図６に示される。
【実施例５】
【０１０６】
エンド−Ｔ欠失を有するトリコデルマリーゼイ宿主細胞中のアスペルギルスニガーカタラーゼの発現
トリコデルマリーゼイのエンド−Ｔ遺伝子の破壊用カセットの構築
国際公開第２００６／０５０５８４号中に提供された情報を用いて、トリコデルマリーゼイの遺伝子配列中のエンド−Ｔ遺伝子が同定された（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｊｇｉ−ｐｓｆ．ｏｒｇ／Ｔｒｉｒｅ２／Ｔｒｉｒｅ２．ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ）。その５’フランキング領域（１．９ｋｂ）が、プライマーＳＫ９１５（５’−ＣＴＧＡＴＡＴＣＣＴＧＧＣＡＴＧＧＴＧＡＡＴＣＴＣＣＧＴＧ−３’）（配列番号１１）およびＳＫ９１６（５’−ＣＡＴＧＧＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＣＡＧＡＴＡＧＧＣＧＧＡＣＧＡＡＧ−３’）（配列番号１２）を用いるＰＣＲによって増幅された。その３’フランキング領域（１．７ｋｂ）は、プライマーＳＫ９１７（５’−ＣＡＴＧＧＣＧＣＧＣＣＧＴＧＴＡＡＧＴＧＣＧＴＧＧＣＴＧＣＡＧ−３’）（配列番号１３）およびＳＫ９１８（５’−ＣＴＧＡＴＡＴＣＧＡＴＣＧＡＧＴＣＧＡＡＣＴＧＴＣＧＣＴＴＣ−３’）（配列番号１４）を用いるＰＣＲによって増幅された。すべてのＰＣＲ反応において、ＰｆｕII  Ｕｌｔｒａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）がポリメラーゼとして用いられた。
【０１０７】
ＰＣＲ反応の産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて、取扱説明書に示された手順に従って精製された。増幅された両方のＤＮＡ断片が、制限エンドヌクレアーゼＡｓｃＩによって消化され、引き続いてＱＩＡｑｕｉｃｋキットを用いて、消化されたＤＮＡが精製された。この２のＤＮＡ断片は混合され、プライマーＳＫ９１５およびＳＫ９１８を用いる融合ＰＣＲ反応のテンプレートとして使用された。この反応の産物である3.6ｋｂのＤＮＡ断片が、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯ  ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔII  ＴＯＰＯベクター中にクローニングされた。得られたプラスミド（ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔII−ＴＯＰＯ（５’−３’フランク））の構造は制限解析によって確認された。
【０１０８】
クロリムロンエチル（国際公開第２００８／０３９３７０号）に対する耐性を与えるトリコデルマリーゼイアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子の変異型が、ＰＣＲプライマーＳＫ９４９（５’−ＧＴＴＴＣＧＣＡＴＧＧＣＧＣＧＣＣＴＧＡＧＡＣＡＡＴＧＧ−３’）（配列番号１５）およびＳＫ９４６（５’−ＣＡＣＡＧＧＣＧＣＧＧＣＧＡＴＣＧＣＣＡＴＣＣＣＧＴＣＧＣＧＴＣ−３’）（配列番号１６）ならびにテンプレートとしてのｐＴｒｅｘグルコアミラーゼベクター（国際公開第２００８／０３９３７０号、実施例２）を用いて増幅された。ＰＣＲ反応の産物がＱＩＡｑｕｉｃｋキットを用いて精製され、ＡｓｃＩによって消化され、再び精製され、そして同じ酵素によって消化され同じように精製されたｐＣＲ−ＢｌｕｎｔII−ＴＯＰＯ（５’−３’フランク）と結合された。得られたプラスミドｐＣＲ−ＢｌｕｎｔII−ＴＯＰＯ（５’フランク−ＡＬＳマーカー−３’フランク）中の挿入断片の方向は、制限解析によって確証された。
【０１０９】
トリコデルマリーゼイ染色体配列のさらなる断片（「３’リピート」と呼ばれる。）が、同じ手法ならびにプライマーＭＣ４０（５’−ＣＴＡＴＧＡＣＡＴＧＣＣＣＴＧＡＧＧＣＧＡＴＧＣＴＧＧＣＣＡＧＧＴＡＣＧＡＧＣＴＧ−３’）（配列番号１７）およびＭＣ４１（５’−ＣＡＧＣＣＴＣＧＣＧＧＴＣＡＣＡＧＴＧＡＧＡＧＧＡＡＣＧＧＧＧＴＧＡＡＧＴＣＧＴＡＴＡＡＧ−３’）（配列番号１８）を用いて増幅された。この配列は、トリコデルマリーゼイ染色体上の、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔII−ＴＯＰＯ（５’−３’フランク）内に含まれている３’フランク領域のさらに下流に位置していた。このＰＣＲの０．４６ｋｂの産物（３’リピート）が、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ｄｒｙ−Ｄｏｗｎ  ＰＣＲクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔII−ＴＯＰＯ（５’フランク−ＡＬＳマーカー−３’フランク）中のＡＬＳ遺伝子の上流にクローニングされた。ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔII−ＴＯＰＯ（５’フランク−ＡＬＳマーカー−３’フランク）は、３’−リピート中にクローニングするためのベクターとして用いるためにＰａｓ  ＩおよびＢｓｔＥIIによって消化された。得られた構成体ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯ（５’フランク−ＡＬＳマーカー−３’リピート−３’フランク）は、プライマーＳＫ１００８（ＣＴＡＧＣＧＡＴＣＧＣＧＴＧＴＧＣＡＣＡＴＡＧＧＴＧＡＧＴＴＣＴＣＣ）（配列番号１９）およびＳＫ１００９（ＣＴＡＧＣＧＡＴＣＧＣＧＣＡＧＡＣＴＧＧＣＡＴＧＣＣＴＣＡＡＴＣＡＣ）（配列番号２０）によるＰＣＲのためのテンプレートとして用いられた。
【０１１０】
７．５ｋｂのＤＮＡ産物が、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔII−ＴＯＰＯベクター中にＩｎｔｒｏｇｅｎ社の対応するキットを用いてクローニングされた。得られたプラスミドはＡｓｉＳＩによって消化され、そして７．５ｋｂのＤＮＡ断片（エンド−Ｔ欠失カセット）が前処理アガロースゲル電気泳動法によって精製された。完全なヌクレオチド配列が以下の配列番号２１に示される。
【化１】
0005435812.tif 000003
0005435812.tif 000004
トリコデルマリーゼイ中のエンド−Ｔ遺伝子の破壊
【０１１１】
トリコデルマリーゼイの４遺伝子欠失株（Δｃｂｈ１、Δｃｂｈ２、Δｅｇｌ１、Δｅｇｌ２）は、国際公開第０５／００１０３６号に記載されている。この株が、Ｐｅｎｔｔｉｌａらによって記載された形質転換法（Ｐｅｎｔｔｉｌａ  Ｍ．ら、「セルロース分解性糸状菌トリコデルマリーゼイの多目的形質転換系（Ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌｙｔｉｃ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｕｓ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）」、Ｇｅｎｅ、１９８７年、第６１巻、ｐ．１５５−１６４）を使用して、配列番号２１として示された欠失カセットを用いて形質転換された。２００ｐｐｍのクロリムロンエチル（国際公開第２００８／０３９３７０号）を含有する、修正Ｖｏｇｅｌ培地上で、形質転換体は選別された。形質転換体は液状培地中で培養され、培養物上清がＳＤＳゲル電気泳動法によって分析された。
【０１１２】
ゲル上のほとんどのタンパク質バンドの移動度において上方移動を示す２のクローン（＃１１および＃７４）が特定された。トリコデルマリーゼイの親４遺伝子欠失株とともにこれらの２の株から、染色体ＤＮＡが単離された。これらのＤＮＡ調製物についてＭＣ４２プラスＭＣ４８（５’−ＣＴＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＣＡＡＣＣＴＡＣＡＡＡＴＣ−３’（配列番号２２）および５’−ＣＴＡＧＴＡＣＣＣＴＧＡＧＴＴＧＴＣＴＣＧＣＣＴＣＣ−３’（配列番号２３））、ならびにＭＣ４５プラスＭＣ５０（５’−ＣＣＴＣＴＡＣＣＡＴＡＡＣＡＧＧＡＴＣＣＡＴＣＴＧ−３’（配列番号２４）および５’−ＣＧＴＧＡＧＣＴＧＡＴＧＡＡＧＧＡＧＡＧＡＡＣＡＡＡＧＧ−３’（配列番号２５））の一対のプライマーを用いて、ＰＣＲ分析が実施された。
【０１１３】
クローン＃７４から単離されたＤＮＡを持つ、予想されたサイズ（２．９ｋｂおよび２．３ｋｂ）の産物が得られた。このクローンは、連続する２回の一連の（単一胞子の子孫の単離による）精製に付された。精製された形質転換体＃７４からＤＮＡが単離された。ＰＣＲ分析が繰り返されて、エンド−Ｔ遺伝子の欠失に成功したことを確認した。
カタラーゼ発現ベクターを用いるトリコデルマリーゼイのエンド−Ｔ欠失株の形質転換
【０１１４】
トリコデルマリーゼイのエンド−Ｔ欠失株の新たに収穫された胞子が、氷冷された１．２Ｍのソルビトール中に懸濁され、同じ溶液で２回洗われ、そしてプラスミドｐＴｒｅｘ３ｇＭ（ＣＡＴＥ）の精製された７．０４ｋｂのＳｆｉＩ−ＳｆｉＩ断片を用いるエレクトロポレーションに付された。形質転換および形質転換体のスクリーニングが本質的に上記の通りに行われた。高い量のカタラーゼを発現するクローン＃２６が特定され、２回の一連の胞子精製に付された。このクローンの精製された分離株によって産生されたカタラーゼが、組換え酵素の特性に対するエンド−Ｔ欠失の効果についてのすべての検討に用いられた。
【実施例６】
【０１１５】
アスペルギルスニガー、トリコデルマリーゼイ、およびエンド−Ｔ欠失を有するトリコデルマリーゼイ中で発現されたカタラーゼの比較
アスペルギルスニガーカタラーゼが、アスペルギルスニガー、トリコデルマリーゼイおよびエンド−Ｔ遺伝子欠失を有するトリコデルマリーゼイ中で発現された。各カタラーゼのサンプルが、エンドＨ酵素によって消化されて、脱グリコシル化が行われた。脱グリコシル化ありおよびなしのサンプルが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を泳動された。結果が図７に示される。
【０１１６】
脱グリコシル化（糖鎖の除去）を行うエンドＨ処理の前および後の分子量の変化は、アスペルギルスニガー、およびエンド−Ｔ欠失を有するトリコデルマリーゼイ由来のサンプルの場合に、より大きいようである。したがって、これらのカタラーゼ酵素は、エンド−Ｔ欠失のないトリコデルマリーゼイ由来のカタラーゼよりも高いレベルのグリコシル化を有するようである。
【０１１７】
アスペルギルスニガー、およびエンド−Ｔ欠失を有するトリコデルマリーゼイ由来のカタラーゼ酵素の出発分子量は、エンド−Ｔ欠失のないトリコデルマリーゼイ由来のカタラーゼの出発分子量よりもわずかに高いようである。したがって、これらのカタラーゼは、エンド−Ｔ欠失のないトリコデルマリーゼイ由来のカタラーゼよりも高い程度のグリコシル化を有するようである。この差は、あるいは、または追加的に、配列の差による可能性があるが、詳細には検討されていない。
【実施例７】
【０１１８】
アスペルギルスニガー、トリコデルマリーゼイ、およびエンド−Ｔ欠失を有するトリコデルマリーゼイ中で産生されたアスペルギルスニガーカタラーゼの活性の比較
カタラーゼの評価は、相異するカタラーゼは相異する性能を示すという観察結果に基づくものであった。この相異は、「ストレス条件」（高温度および高濃度の過酸化水素）下においてもっとも顕著であった。この評価では各カタラーゼは、同一合計量の活性単位で施量された。施量される合計活性は、過酸化水素が約２０分間で分解されるように選択された。
カタラーゼ活性の測定
【０１１９】
酵素の活性は、以下の方法を用いて測定された。
試薬
【０１２０】
基質溶液：
−  ２５ｍｌの０．２Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．０、および
−  １３０μｌの３０％Ｈ２Ｏ２
を混合し、脱イオン水で量を１００ｍｌに合わせる。
【０１２１】
基質溶液の吸光度は０．５２〜０．５５でなければならない。必要により、過酸化物の量を調整する。
【０１２２】
緩衝溶液：２５ｍｌの０．２Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．０を脱イオン水で１００ｍｌまで希釈する。
カタラーゼサンプルの調製：
【０１２３】
約１グラムのカタラーゼ産物を１０．００ｍｌの容量フラスコ中に（小数点以下４桁まで）正確な重量を秤量して入れ、体積を１００ｍｌの印に合わせ、そして混合する。この溶液から更に希釈をすることができる。
酵素活性の測定：
【０１２４】
−  ２．９ｍｌの基質溶液、および
−  １００μｌの（希釈された）カタラーゼサンプル
を石英角セルに入れそして混合する。
【０１２５】
２４０ｎｍの吸光度が０．４５０から０．４００までに下がる（秒単位の）時間を測定する。この時間は３５〜５０秒間の範囲に入らなければならない。時間がこの範囲から外れるならば、異なった希釈量を（試行錯誤で）試して、正しい希釈量を見つける。
カタラーゼ活性の計算：
【０１２６】
カタラーゼ産物の活性は、以下の式によって計算されることができる。
【数１】
0005435812.tif 000005
Ｆ＝希釈倍率
Ｖ＝容量フラスコの体積
ｔ＝時間（秒）
ｗ＝カタラーゼ産物の重量（ｇ）
カタラーゼ性能の評価
試薬
【０１２７】
基質溶液（１０００ｐｐｍＨ２Ｏ２）：
−  ２５０ｍｌの０．２Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．０、および
−  ３ｍｌの３０％Ｈ２Ｏ２
を混合し、脱イオン水で量を１リットルに合わせる。
【０１２８】
緩衝溶液：２５０ｍｌの０．２Ｍリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．０を脱イオン水で１リットルまで希釈する。
サンプルの希釈
【０１２９】
カタラーゼの希釈は緩衝液で行われることが必要である。目標は過酸化水素を約２０分間で分解することである。参照として用いられたアスペルギルスニガーカタラーゼについて約４００単位が用いられた。他のカタラーゼについても同じ単位量が施量された。
手順
【０１３０】
温置は、２５０ｍｌ容量のショット瓶（Ｓｃｈｏｔｔ  ｂｏｔｔｌｅ）中で実施された。１００ｍｌの基質がショット瓶に加えられ、これは７０℃の水浴に入れられた。基質の温度が７０℃になったときに、少量（１ｍｌ以下）の（希釈された）カタラーゼをこの瓶に添加することによって反応が開始され、同時にタイマーがスタートした。溶液は時々混合された。１〜２分間の間隔で３ｍｌが、反応を停止するための１０％硫酸溶液５００μｌを含む試験管中に瓶から採取された。サンプル採取は、１５〜３０分間までのサンプルを取るまで続けられた。ｔ＝０の測定については、１０％硫酸溶液５００μｌを含む試験管中に３ｍｌの基質が移された。（試験条件下での過酸化物溶液の安定性を試験するための）ブランク試験については、（カタラーゼの試験におけるのと同じ量の）緩衝液が、基質を含む瓶に添加され、同じ手順が追行された。溶液の吸光度は２４０ｎｍで測定された。
アスペルギルスニガーカタラーゼ、およびトリコデルマリーゼイ中で発現されたアスペルギルスニガーカタラーゼの性能の評価
サンプル
【０１３１】
アスペルギルスニガーおよびトリコデルマリーゼイ中で発現されたアスペルギルスニガーカタラーゼが、上記の活性分析の試験をされた。
サンプル調製
【０１３２】
１ｇのカタラーゼが、１００．００ｍｌ容量の容量フラスコ中に重量を秤量されて入れられ、５０ｍＭリン酸塩緩衝液を用いて１００．００ｍｌに合わされた。１．２ｍｌがアスペルギルスニガーサンプルについて用いられ、１．３９ｍｌがトリコデルマリーゼイサンプルについて用いられた。カタラーゼ分析（２４０ｎｍにおける吸光度）の結果が表２に示される。
【表２】
0005435812.tif 000006
アスペルギルスニガー、トリコデルマリーゼイ、およびエンド−Ｔ欠失を有するトリコデルマリーゼイ中で発現されたアスペルギルスニガーカタラーゼの性能の評価
【０１３３】
カタラーゼ活性が、表３に示されたサンプルについて測定された。
【表３】
0005435812.tif 000007
【０１３４】
結果が表４（２４０ｎｍにおける吸光度）および図８に示される。
【表４】
0005435812.tif 000008
【０１３５】
上述の本発明は、理解の明確さを目的として例示および実施例によってある程度詳しく記載されたけれども、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、ある程度の変化および変更が実施されることができることは当業者には明らかであろう。したがって、本明細書の記載は本発明の範囲を限定するものとみなされてはならない。
【０１３６】
本明細書に引用されたすべての刊行物、特許および特許出願は、本明細書にそれぞれの個々の刊行物、特許または特許出願が参照によって取り込まれることを具体的にかつ個別に示されているかのように、すべての目的のためにかつ同じ程度にまで、その全体が参照によって本明細書に取り込まれる。
【図１】
0005435812.tif 000009
【図２】
0005435812.tif 000010
【図３】
0005435812.tif 000011
【図４】
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【図５】
0005435812.tif 000013
【図６】
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【図７】
0005435812.tif 000015
【図８】
0005435812.tif 000016