(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
敗血症の処置のための有効量のアネキシンＡ５又はその変異体を含む治療用薬学的組成物であって、該アネキシンＡ５又はその変異体は、ＴＬＲ４受容体と相互作用する、組成物。
【請求項２】
前記組成物は、血液凝固障害を有しない被験体において使用するためのものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記敗血症は、頻脈、低体温、発熱、頻呼吸、白血球減少、白血球増加、および帯状核細胞増加のうちの少なくとも２つによって特徴づけられ、感染が疑われるか又は証明されている、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記敗血症は、さらに、全身性低潅流によって特徴づけられる、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記敗血症はさらに、輸液蘇生後の低血圧によって特徴づけられる、請求項３又は４に記載の組成物。
【請求項６】
前記アネキシンＡ５又はその変異体の量が炎症促進性サイトカインを阻害するのに有効である、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記炎症促進性サイトカインがＴＮＦ−α及びＩＬ−１βから選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記アネキシンＡ５がアネキシンＡ５ポリペプチド、アネキシンＡ５核酸及びアネキシンＡ５を含む組換え細胞からなる群より選択される、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記アネキシンＡ５は、全長の天然に存在するポリペプチドである、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
敗血症の処置用の薬剤を調製するためのアネキシンＡ５又はその変異体の使用であって、該アネキシンＡ５又はその変異体は、ＴＬＲ４受容体と相互作用する、使用。
【請求項１１】
前記薬剤は、血液凝固障害を有しない被験体において使用するためのものである、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記敗血症は、頻脈、低体温、発熱、頻呼吸、白血球減少、白血球増加、および帯状核細胞増加のうちの少なくとも２つによって特徴づけられ、感染が疑われるか又は証明されている、請求項１０又は１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記敗血症は、さらに、全身性低潅流によって特徴づけられる、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記敗血症はさらに、輸液蘇生後の低血圧によって特徴づけられる、請求項１２又は１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記アネキシンＡ５又はその変異体の量がＴＮＦ−α及びＩＬ−１βから選択される炎症促進性サイトカインを阻害するのに有効である、請求項１０乃至１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
前記アネキシンＡ５がアネキシンＡ５ポリペプチド、アネキシンＡ５核酸及びアネキシンＡ５を含む組換え細胞からなる群より選択される、請求項１０乃至１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
前記アネキシンＡ５は、全長の天然に存在するポリペプチドである、請求項１０乃至１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
前記アネキシンＡ５又はその変異体の量がマウス、ブタ、イヌ、ラット及びヒトからなる群より選択される哺乳動物の処置に有効である、請求項１０乃至１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
被験体において敗血症を処置するための組成物であって、有効量のアネキシンＡ５又はその変異体を含む、組成物であって、該アネキシンＡ５又はその変異体は、ＴＬＲ４受容体と相互作用する、組成物。
【請求項２０】
前記組成物は、血液凝固障害を有しない被験体において使用するためのものである、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記敗血症は、頻脈、低体温、発熱、頻呼吸、白血球減少、白血球増加、および帯状核細胞増加のうちの少なくとも２つによって特徴づけられ、感染が疑われるか又は証明されている、請求項１９又は２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記敗血症は、さらに、全身性低潅流によって特徴づけられる、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記敗血症はさらに、輸液蘇生後の低血圧によって特徴づけられる、請求項２１又は２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記アネキシンＡ５又はその変異体の量がＴＮＦ−α及びＩＬ−１βから選択される炎症促進性サイトカインを阻害するのに有効である、請求項１９乃至２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記アネキシンＡ５がアネキシンＡ５ポリペプチド、アネキシンＡ５核酸及びアネキシンＡ５を含む組換え細胞からなる群より選択される、請求項１９乃至２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記アネキシンＡ５は、全長の天然に存在するポリペプチドである、請求項１９乃至２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記被験体がマウス、ブタ、イヌ、ラット及びヒトからなる群より選択される哺乳動物である、請求項１９乃至２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
アネキシンＡ５又はその変異体及び薬学的に受容可能な担体及びアネキシンＡ５又はその変異体を含む薬剤を調製するための使用説明書及び／又は敗血症を処置するためにアネキシンＡ５又はその変異体を投与するための使用説明書を含む、キットであって、該アネキシンＡ５又はその変異体は、ＴＬＲ４受容体と相互作用する、キット。
【請求項２９】
前記薬剤は、血液凝固障害を有しない被験体において使用するためのものである、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
前記敗血症は、頻脈、低体温、発熱、頻呼吸、白血球減少、白血球増加、および帯状核細胞増加のうちの少なくとも２つによって特徴づけられ、感染が疑われるか又は証明されている、請求項２８又は２９に記載のキット。
【請求項３１】
前記敗血症は、さらに、全身性低潅流によって特徴づけられる、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
前記敗血症はさらに、輸液蘇生後の低血圧によって特徴づけられる、請求項３０又は３１に記載のキット。
【請求項３３】
被験体における敗血症の処置することによって播種性血管内凝固（ＤＩＣ）の発症を予防するための治療的薬学的組成物であって、該組成物は、アネキシンＡ５又はその変異体を含み、該アネキシンＡ５又はその変異体は、ＴＬＲ４受容体と相互作用する、組成物。
【請求項３４】
前記アネキシンＡ５又はその変異体は、血液凝固障害を有しない被験体において使用するためのものである、請求項３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記アネキシンＡ５又はその変異体は、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βからなる群より選択される炎症促進性サイトカインを阻害するのに有効である、請求項３３又は３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記アネキシンＡ５がアネキシンＡ５ポリペプチド、アネキシンＡ５核酸及びアネキシンＡ５を含む組換え細胞からなる群より選択される、請求項３３乃至３５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
前記アネキシンＡ５又はその変異体の量がマウス、ブタ、イヌ、ラット及びヒトからなる群より選択される哺乳動物の処置に有効である、請求項３３乃至３６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
前記アネキシンＡ５は、全長の天然に存在するポリペプチドである、請求項３３乃至３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記敗血症は、頻脈、低体温、発熱、頻呼吸、白血球減少、白血球増加、および帯状核細胞増加のうちの少なくとも２つによって特徴づけられ、感染が疑われるか又は証明されている、請求項３３乃至３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
前記敗血症は、さらに、全身性低潅流によって特徴づけられる、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
前記敗血症はさらに、輸液蘇生後の低血圧によって特徴づけられる、請求項３９又は４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記変異体は、全長の天然に存在するアネキシンに対して少なくとも８０％同一である配列を有する、請求項１、１９又は３３に記載の組成物。
【請求項４３】
前記変異体は、全長の天然に存在するアネキシンに対して少なくとも８０％同一である配列を有する、請求項１０に記載の使用。
【請求項４４】
前記変異体は、全長の天然に存在するアネキシンに対して少なくとも８０％同一である配列を有する、請求項２８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は炎症性障害の処置に関する。更に特定すれば、本発明は炎症性障害の処置、特に敗血症の処置のためのアネキシンＡ５の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願を通して、本発明が属する技術分野の水準をより十分に説明するために各種の文献が括弧内に引用されている。各引用に関する十分な書誌的情報がこの明細書の最後、特許請求の範囲の直前に記載されている。これらの文献の開示内容は全体として参照により本開示内容に組み込まれている。
【０００３】
炎症と関連づけられる異常は、種々のヒトの疾患の根底にある多くの障害を構成している。免疫系はアレルギー反応及び一部の筋障害で明らかにされている炎症性障害にかかわっている場合が多く、その際、多くの免疫系障害は異常な炎症をもたらす。炎症過程に病因を有する非免疫疾患と考えられるものには、敗血症、癌、アテローム性動脈硬化症及び虚血性心疾患が挙げられる。
【０００４】
様々な蛋白質が炎症に関与しており、これらの蛋白質の１種以上の発現及び／又は活性の変化は正常な免疫機能を阻害するか、それともその調節障害を生じ得る。
【０００５】
脊椎動物は、炎症促進性（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）及び抗炎症性経路の活性を均衡させることで感染又は傷害時の体内環境維持を達成する。しかしながら、多くの疾患状態では、この体内環境維持は不均衡になる。例えば、全てのグラム陽性細菌により産生されるエンドトキシン（リポ多糖体、ＬＰＳ：ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）は、致死的となる可能性のあるサイトカインを放出するようにマクロファージを活性化する（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。
【０００６】
（エンドトキシンの作用が原因である敗血症性ショックなどの）炎症性障害は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ：ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ；ＴＮＦα又はカケクチンと呼ばれることもある）、インターロイキン（ＩＬ：ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）−１ａ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１８、インターフェロンγ、血小板活性化因子（ＰＡＦ：ｐｌａｔｅｌｅｔ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ：ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｆａｃｔｏｒ）及び他の化合物などの炎症促進性サイトカインによって誘発されることが多い。炎症促進性サイトカインは、炎症性サイトカインカスケードの過程でのその放出を介して種々の障害の一因となっている。
【０００７】
従って、炎症性障害の処置が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｔｒａｃｅｙ，Ｋ．Ｊ．ほか、Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９８６年）２３４：４７０−７４
【非特許文献２】Ｄｉｎａｒｅｌｌｏ，Ｃ．Ａ．、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９４年）８：１３１４−２５
【非特許文献３】Ｗａｎｇ，  Ｈ．ほか、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９９年）２８５：２４８−５１
【非特許文献４】Ｎａｔｈａｎ，Ｃ．Ｆ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（１９８７年）７９：３１９−２６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一態様として、炎症性障害の処置に用いるための有効量のアネキシンＡ５を含む組成物を提供する。
【００１０】
本発明の一態様によるものは、炎症性障害の処置のための有効量のアネキシンＡ５を含む治療用薬学的組成物である。
【００１１】
別の態様として、臓器機能不全の処置に用いるための有効量のアネキシンＡ５を含む組成物を提供する。
【００１２】
別の態様として、敗血症の処置に用いるための有効量のアネキシンＡ５を含む処置用薬学的組成物を提供する。
【００１３】
別の態様として、内毒素血症時の心機能の改善に用いるための有効量のアネキシンＡ５を含む組成物を提供する。
【００１４】
本発明の組成物又は薬剤に関する態様のいずれにおいても、本組成物は１種以上の医薬をさらに含むことができる。
【００１５】
さらに別の態様として、薬剤の調製のためのアネキシンＡ５の使用がある。
【００１６】
別の態様として、炎症性障害処置用の薬剤の調製のためのアネキシンＡ５の使用を提供する。
【００１７】
さらに別の態様として、臓器機能不全、特に心機能不全処置用の薬剤の調製のためのアネキシンＡ５の使用を提供する。
【００１８】
別の態様として、被験体における敗血症処置用の薬剤の調製のためのアネキシンＡ５の使用を提供する。
【００１９】
さらに別の態様として、被験体において炎症性障害を処置する方法であって、この被験体に有効量のアネキシンＡ５を投与することを含む方法を提供する。
【００２０】
別の態様として、被験体において臓器機能不全を処置する方法であって、この被験体に有効量のアネキシンＡ５を投与することを含む方法を提供する。
【００２１】
本発明の別の態様において、被験体において敗血症を処置する方法であって、この哺乳動物に有効量のアネキシンを投与することを含む方法を提供する。特に、このアネキシンはアネキシンＡ５である。
【００２２】
さらに別の態様として、被験体における臓器機能改善用の薬剤を調製するためのアネキシンＡ５の使用を提供する。
【００２３】
さらに別の態様として、臓器機能改善のための有効量のアネキシンＡ５を含む組成物を提供する。
【００２４】
さらに別の態様として、被験体において臓器機能不全を改善する方法であって、この被験体に有効量のアネキシンＡ５を投与することを含む方法を提供する。
【００２５】
別の態様として、アネキシンＡ５及び薬学的に受容可能な担体及びアネキシンＡ５を含む薬剤を調製するための使用説明書及び／又は炎症性障害を処置するためにアネキシンＡ５を投与するための使用説明書を含むキットを提供する。
【００２６】
さらに別の態様として、アネキシンＡ５及び薬学的に受容可能な担体及びアネキシンＡ５を含む薬剤を調製するための使用説明書及び／又は被験体における臓器機能不全を処置するためにアネキシンＡ５を投与するための使用説明書を含むキットを提供する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
炎症性障害の処置のための有効量のアネキシンＡ５を含む治療用薬学的組成物。
（項目２）
前記アネキシンＡ５の量が炎症促進性サイトカインを阻害するのに有効である、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記炎症促進性サイトカインがＴＮＦ−α及びＩＬ−１βから選択される、項目２に記載の組成物。
（項目４）
前記アネキシンＡ５の量が炎症性障害における臓器機能不全の処置に有効である、項目１乃至３のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５）
前記臓器が心臓、肺、肝臓、腎臓及び脳からなる群より選択される、項目４に記載の組成物。
（項目６）
敗血症の処置に用いるための項目１に記載の組成物。
（項目７）
前記アネキシンＡ５の量がＴＮＦ−α及びＩＬ−１βから選択される炎症促進性サイトカインを阻害するのに有効である、項目６に記載の組成物。
（項目８）
前記アネキシンＡ５がアネキシンＡ５ポリペプチド、アネキシンＡ５核酸及びアネキシンＡ５を含む組換え細胞からなる群より選択される、項目１乃至７のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９）
敗血症の処置用の薬剤を調製するためのアネキシンＡ５の使用。
（項目１０）
炎症性障害の処置用の薬剤を調製するためのアネキシンＡ５の使用。
（項目１１）
前記アネキシンＡ５の量がＴＮＦ−α及びＩＬ−１βから選択される炎症促進性サイトカインを阻害するのに有効である、項目９又は１０に記載の使用。
（項目１２）
心機能不全の処置用の薬剤を調製するためのアネキシンＡ５の使用。
（項目１３）
前記アネキシンＡ５がアネキシンＡ５ポリペプチド、アネキシンＡ５核酸及びアネキシンＡ５を含む組換え細胞からなる群より選択される、項目９乃至１２のいずれか一項に記載の使用。
（項目１４）
前記アネキシンＡ５の量がマウス、ブタ、イヌ、ラット及びヒトからなる群より選択される哺乳動物の処置に有効である、項目１３に記載の使用。
（項目１５）
被験体において炎症性障害を処置する方法であって、該被験体に有効量のアネキシンＡ５を投与することを含む、方法。
（項目１６）
前記アネキシンＡ５の量が炎症促進性サイトカインを阻害するのに有効である、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記炎症促進性サイトカインがＴＮＦ−αである、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記炎症促進性サイトカインがＩＬ−１βである、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記アネキシンＡ５の量が前記炎症性障害における臓器機能不全の処置に有効である、項目１５乃至１８のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記臓器が心臓、肺、肝臓、腎臓及び脳からなる群より選択される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
被験体において敗血症を処置するための方法であって、該被験体に有効量のアネキシンＡ５を投与することを含む方法。
（項目２２）
前記アネキシンＡ５の量がＴＮＦ−α及びＩＬ−１βから選択される炎症促進性サイトカインを阻害するのに有効である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記臓器が心臓、肺、肝臓、腎臓及び脳からなる群より選択される、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
前記アネキシンＡ５がアネキシンＡ５ポリペプチド、アネキシンＡ５核酸及びアネキシンＡ５を含む組換え細胞からなる群より選択される、項目２１乃至２３のいずれか一項に記載の方法。
（項目２５）
前記被験体がマウス、ブタ、イヌ、ラット及びヒトからなる群より選択される哺乳動物である、項目２１乃至２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
アネキシンＡ５及び薬学的に受容可能な担体及びアネキシンＡ５を含む薬剤を調製するための使用説明書及び／又は炎症性障害を処置するためにアネキシンＡ５を投与するための使用説明書を含む、キット。
（項目２７）
前記障害が敗血症である、項目２６に記載のキット。
（項目２８）
アネキシンＡ５及び薬学的に受容可能な担体及びアネキシンＡ５を含む薬剤を調製するための使用説明書及び／又は被験体における臓器機能不全を処置するためにアネキシンＡ５を投与するための使用説明書を含む、キット。
【００２７】
次に、実施態様を添付の図を参照してほんの一例として説明する。図中、
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、内毒素血症を有するマウスの心機能に対するアネキシンＡ５投与の効果を示す。
【図２】図２は、内毒素血症を有するマウスの心筋ＴＮＦ−α  ｍＲＮＡ発現に対するアネキシンＡ５投与の効果を示す。
【図３】図３は、内毒素血症を有するマウスの心筋ＴＮＦ−α蛋白質発現に対するアネキシンＡ５投与の効果を示す。
【図４】図４は、アネキシンＡ５（Ａ５）が内毒素血症を有するマウスの心機能をインビボで改善するという図１の実験結果を確認するものである。マウスは生理食塩水（対照、１００μＬ、ｉ．ｐ）、Ａ５（５μｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．）、ＬＰＳ（４ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）又はＬＰＳプラスＡ５で４時間処置した。Ａ５処置により内毒素血症マウスのＬＶ＋ｄＰ／ｄｔ及び−ｄＰ／ｄｔは有意に増加した。データは平均値±ＳＥＭであり、二元ＡＮＯＶＡに続いてボンフェローニ補正した対応のないスチューデントのｔ検定を行って解析した。＊  対照に対してＰ＜０．０１、†  ＬＰＳに対してＰ＜０．０５、ｎ＝９〜１１（群当たり）。
【図５】図５は、アネキシンＡ５（Ａ５）が内毒素血症マウスの心機能をエクスビボで改善することを示す。マウスは食塩水（対照、１００μＬ、ｉ．ｐ）、Ａ５（５μｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．）、ＬＰＳ（４ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）又はＬＰＳプラスＡ５で４時間処置した。Ａ５処置により内毒素血症マウスの＋ｄＦ／ｄｔ、−ｄＦ／ｄｔ及び心仕事量は有意に増加した。データは平均値±ＳＥＭであり、二元ＡＮＯＶＡに続いてボンフェローニ補正した対応のないスチューデントのｔ検定を行って解析した。＊  対照に対してＰ＜０．０１、†  ＬＰＳに対してＰ＜０．０５、ｎ＝４〜７（群当たり）。
【図６】図６Ａ−Ｄは、内毒素血症マウスのＴＮＦ−α産生およびＩＬ−１β産生に対するアネキシンＡ５（Ａ５）の効果を示す。マウスは食塩水（対照、１００μＬ、ｉ．ｐ）、Ａ５（５μｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．）、ＬＰＳ（４ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）又はＬＰＳプラスＡ５で４時間処置した。ＡおよびＢ。Ａ５（５μｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．）処置により内毒素血症時の心筋のＴＮＦ−α  ｍＲＮＡ発現およびＴＮＦ−α蛋白質発現は有意に減少した。ＣおよびＤ。内毒素血症時のＡ５処置によってＴＮＦ−αの血漿レベルおよびＩＬ−１βの血漿レベルは有意に減少した。データは平均値±ＳＥＭであり、二元ＡＮＯＶＡに続いてボンフェローニ補正した対応のないスチューデントのｔ検定を行って解析した。＊  対照に対してＰ＜０．０１、†  ＬＰＳに対してＰ＜０．０５、ｎ＝８〜１２（群当たり）。
【図７】図７ＡおよびＢは、アネキシンＡ５（Ａ５）が内毒素血症時における心筋ｐ３８  ＭＡＰＫおよびＥＲＫ１／２  ＭＡＰＫのリン酸化を低下させることを示す。マウスは食塩水（対照、１００μＬ、ｉ．ｐ）、Ａ５（５μｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．）、ＬＰＳ（４ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）又はＬＰＳプラスＡ５で３０分処置した。Ａ．心筋ｐ３８リン酸化。Ｂ．ＥＲＫ１／２リン酸化。ｐ３８およびＥＲＫ１／２のリン酸化はウエスタンブロット分析によって測定した。データは平均値±ＳＥＭであり、二元ＡＮＯＶＡに続いてボンフェローニ補正した対応のないスチューデントのｔ検定を行って解析した。＊  対照に対してＰ＜０．０５、†  ＬＰＳに対してＰ＜０．０５、ｎ＝４〜６（群当たり）。
【図８】図８ＡおよびＢは、アネキシンＡ５（Ａ５）が成体心筋細胞におけるＴＮＦ−α  ｍＲＮＡおよびＩＬ−１β  ｍＲＮＡの発現を阻害することを示す。成体心筋細胞は３５ｍｍ皿で培養した。細胞はＡ５（１μｇ／ｍｌ）の存在又は非存在下にＬＰＳ（２．５μｇ／ｍｌ）で６時間処置した。ＴＮＦ−α（Ａ）およびＩＬ−１β（Ｂ）のｍＲＮＡレベルは、２８Ｓを負荷対照としたリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析により測定した。データは平均値±ＳＥＭであり、二元ＡＮＯＶＡに続いてボンフェローニ補正した対応のないスチューデントのｔ検定を行って解析した。＊  対照に対してＰ＜０．０１、†  ＬＰＳに対してＰ＜０．０５  、独立実験回数（群当たり）ｎ＝３〜４。
【図９】図９は、免疫共沈降分析により測定した場合、アネキシンＡ５が心筋組織中のＴＬＲ４と相互作用することを示す。心筋組織はホモゲナイズして０．５μｇのアネキシンＡ５と共にインキュベートした。ＴＬＲ４蛋白質は抗ＴＬＲ４抗体で被覆した磁気ビーズを用いて沈降させた。この後にアネキシンＡ５のウエスタンブロット分析を行った。レーン１：食塩水で処置したマウスからの対照心筋サンプル。レーン２：ＬＰＳ処置（４ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．４時間）マウスからの心筋サンプル。レーン３：組換えアネキシンＡ５陽性対照。図に示されているブロットは３回の実験からの代表的な例である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
炎症性障害の処置のための方法及び組成物が本明細書に記載されている。より詳細には、炎症性障害の処置のためのアネキシンＡ５の使用を含む方法及び組成物が本明細書に記載されている。特に、その障害は敗血症である。
【００３０】
本発明に用いている「処置」は予防的及び治療的処置を含む。「予防的処置」とは、炎症状態の発症前に被験体を処置してその発生を阻止、抑制又は低減することをいう。治療的処置は、炎症性障害にすでに罹患している被験体を処置することである。
【００３１】
「被験体」とは、任意の脊椎動物とすることができるが、通常は哺乳動物、例えば、ヒト患者、（イヌもしくはネコなどの）飼い慣らされた動物、（ウマ、ウシもしくはヒツジなどの）家畜又は（ラット、マウス、非ヒト霊長類もしくはモルモットなどの）実験動物に属する。特定の例ではこの被験体はヒトである。
【００３２】
炎症性障害」は通常、被験体における少なくとも１種の炎症促進性サイトカインの細胞からのインビボ放出と本明細書で定義される炎症性サイトカインカスケードによって媒介され、この場合、サイトカインの放出はこの被験体の生理的状態に影響を及ぼすものとする。炎症促進性サイトカインを産生する細胞の例としては、単球、マクロファージ、好中球、上皮細胞、骨芽細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞及びニューロンがあるが、これらに限定されるものではない。
【００３３】
「サイトカイン」とは、自然界で哺乳動物の細胞により産生され、インビボでマイクロモル乃至ピコモルの濃度で体液性調節因子として作用する可溶性蛋白質又はペプチドである。サイトカインは、正常又は病的状態の下で、個々の細胞及び組織の機能的活動を調節することができる。炎症促進性サイトカインとは、炎症に伴う生理的反応、即ち、血管拡張、充血、浮腫に伴う血管透過性の増大、顆粒球及び単核食細胞の蓄積又はフィブリンの沈着のいずれかを引き起こすことができるサイトカインである。炎症促進性サイトカインの例としては、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ）、インターロイキン（ＩＬ）−１ａ、ＩＬ−１−ベータ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１８、インターフェロン−ガンマ、ＨＭＧ−１、血小板活性化因子（ＰＡＦ）及びマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）があるが、これらに限定されるものではない。炎症促進性サイトカインは、多くの炎症性障害の有害な状態、例えば、内毒素性ショック、喘息、関節リウマチ、炎症性胆汁疾患、心不全及び同種移植の拒絶反応を媒介することができる。
【００３４】
炎症促進性サイトカインは、炎症のメディエータではないＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３などの抗炎症性サイトカインから区別されるべきである。特定の例では、抗炎症性サイトカインの放出は、本明細書に記載したアネキシンＡ５処置によって阻害されない。
【００３５】
特定の例では、本明細書に記載したアネキシンＡ５処置によってＴＮＦの炎症誘発作用は阻害される。ＴＮＦは、各種炎症性障害においてメディエータとしての機能を果たす。少数のそのような例としては、敗血症性ショック、癌、ＡＩＤＳ、移植拒絶、多発性硬化症、糖尿病、関節リウマチ、外傷、マラリア、髄膜炎、虚血−再潅流傷害及び成人呼吸窮迫症候群が挙げられる。
【００３６】
ＴＮＦは、いくつかの炎症性障害に関係しており、このため、ＴＮＦ療法及び抗ＴＮＦ療法に関する研究が行われている。研究の中心は、関節リウマチ、クローン病、ＡＩＤＳ、（特定のグラム陰性細菌により引き起こされる）細菌性敗血症性ショック、（超抗原によって引き起こされる）細菌性毒素ショックなどの炎症性障害並びに同種反応性及び移植片拒絶の阻止におけるＴＮＦ活性の阻害にあった。ＴＮＦを欠損する突然変異体マウスはグラム陰性細菌誘発敗血症に抵抗性であり（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃ、Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｐ．、Ｗａｌｐｏｒｔ，Ｍ．，  Ｃａｐｒａ、Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ：Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ．  １９９９年）、抗ＴＮＦモノクロナール抗体はＴＮＦ活性を阻害して内毒素血症を処置するのに用いられてきた（Ｂｅｕｔｌｅｒ，Ｂ．、Ｍｉｌｓａｒｋ，Ｌ．、Ｃｅｒａｍｉ，Ａ．１９８５年．  Ｐａｓｓｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｃａｃｈｅｃｔｉｎ／Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｐｒｏｔｅｃｔｓ  Ｍｉｃｅ  ｆｒｏｍ  Ｌｅｔｈａｌ  Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９；８６７−８７１）。ＴＮＦ活性を制御するための処置の利点の一つは、多くの種類の炎症におけるその役割からくる。例えば、熱傷及び外傷の患者の炎症の原因が感染であり、抗生物質による処置が正当化されると判定することは困難な場合が多く、このため、ＴＮＦ活性を阻害するための処置が有益な場合がある。ＴＮＦ活性を阻害する方法としては、抗ＴＮＦ抗体、可溶性受容体もしくは受容体融合蛋白質によるこのサイトカインの中和；シクロスポリンＡ、グルココルチコイド又はサイトカインＩＬ−１０などの薬物によるＴＮＦ−Ａ合成の抑制；低用量の繰り返し刺激によるＴＮＦに対する反応性の緩和；又はＩＬ−１、ＩＬ−６、一酸化窒素などの二次メディエータの阻害によるものが挙げられる。本明細書に記載したアネキシンＡ５処置はＴＮＦ活性を阻害するために用いることができる。
【００３７】
炎症性障害に対するアネキシンＡ５の効果を見る場合、「処置」、「阻害」、「緩和」又は「減弱」という用語の使用は、アネキシンＡ５投与の結果としての、処置対象障害に伴う諸症状の少なくとも僅かではあるが測定可能な減退をカバーするものである。
【００３８】
炎症性障害は、炎症性サイトカインカスケードが全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ：ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）又は敗血症性ショックのような全身反応を引き起こす障害であるとすることもできる。或いは、この障害は、関節リウマチの場合のように、局所的な炎症性サイトカインカスケードによって媒介され得る。本明細書に記載したアネキシンＡ５処置を利用して有効に処置することができる状態の例としては、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵炎、潰瘍性大腸炎、偽膜性大腸炎、急性大腸炎、虚血性大腸炎、憩室炎、喉頭蓋炎、アカラシア、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、クローン病、腸炎、ウィップル病、アレルギー、アナフィラキシー性ショック、免疫複合体病、多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ：ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｏｒｇａｎ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、臓器虚血、再灌流障害、臓器壊死、枯草熱、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、敗血症、毒血症、内毒素性ショック、悪液質、超高熱、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、敗血性流産、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、肺気腫、鼻炎、肺炎、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、胸膜炎、静脈洞炎、インフルエンザ、呼吸合包体ウイルス感染症、ＨＩＶ感染、ＡＩＤＳ、Ｂ型肝炎ウイルス感染、Ｃ型肝炎ウイルス感染、ヘルペスウイルス感染、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、包虫嚢胞、熱傷、皮膚炎、皮膚筋炎、日焼け、蕁麻疹、いぼ、膨疹、バスリティス（ｖａｓｕｌｉｔｉｓ）、脈管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム性動脈硬化症、心膜炎、心筋炎、心筋虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、アルツハイマー病、小児脂肪便症、うっ血性心不全、成人呼吸窮迫症候群、髄膜炎、脳炎、多発性硬化症、脳梗塞、脳塞栓症、ギラムバレー症候群（Ｇｕｉｌｌａｍｅ−Ｂａｒｒｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、ブドウ膜炎、関節炎、鉛関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、関節リウマチ、滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、同種移植の拒絶反応、移植片対宿主病、Ｉ型糖尿病、肥満症、強直性脊椎炎、ベルガー病、ライター症候群及びホジキン病が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
特定の例では、炎症性障害は、喘息、アレルギー、アナフィラキシー性ショック、多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）、臓器虚血、虚血−再灌流障害、臓器虚血、ＳＩＲＳ、敗血症、毒血症、内毒素性ショック、悪液質、敗血性流産、播種性菌血症、熱傷、小児脂肪便症、うっ血性心不全、心筋炎、心筋虚血成人呼吸窮迫症候群、脳梗塞、脳塞栓症、脊髄損傷、麻痺、同種移植の拒絶反応又は移植片対宿主病から選択されるがこれらに限定されるものではない。
【００４０】
一例において、炎症性障害は内毒素性ショックである。別の例では、炎症性障害はＳＩＲＳである。さらに別の例では、炎症性障害は敗血症である。さらに別の例では、炎症性障害は多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）である。
【００４１】
アネキシンＡ５は、敗血症時の臓器（例えば、心臓、肝臓、肺、腎臓又は脳）の機能を改善するのに用いることができる。また、アネキシンＡ５は、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）及び外傷時の全身性臓器障害又は虚血及び再潅流を伴う障害を処置するのにも用いることができる。
【００４２】
敗血症は、感染に対する全身性の応答であり、集中治療室における最も多い死因である。死亡率は敗血症で２０乃至３０％、敗血症性ショックで４０乃至８０％である［１］。心筋機能不全は敗血症性ショックの一般的な合併症である［２］。この全身性の炎症性障害は感染に対する無調節な宿主反応の結果であり、過剰な炎症促進性サイトカイン産生を特徴としている。宿主の先天性免疫応答の誘導は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ：ｐａｔｈｏｇｅｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｔｅｒｎ）の認識時に細胞膜トール様受容体−４（ＴＬＲ４：ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−４）の活性化によって媒介される。リポ多糖体（ＬＰＳ）は、グラム陰性細菌の外膜中の最もよく知られたＰＡＭＰであり、ＣＤ−１４及びＬＰＳ結合蛋白質（ＬＢＰ：ＬＰＳ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）依存性にＴＬＲ４に結合する。ＬＰＳ結合時にＴＬＲ４が活性化されると、シグナル伝達経路が始動し、マイトジェン活性化蛋白質キナーゼ（ＭＡＰＫ：ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）の活性化、及び敗血症時の臓器機能不全（例えば、心機能不全）における主要な原因因子であるよく知られたサイトカインＴＮＦの産生をもたらす［３、４］。
【００４３】
敗血症が存在するとみなされるのは、感染が高度に疑われるか証明されていて下記の全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）基準のうちの２つ以上が満たされる場合である（Ｂｏｎｅ  ＲＣ、Ｂａｌｋ  ＲＡ、Ｃｅｒｒａ  ＦＢほか、（１９９２年６月）  ”Ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｓｅｐｓｉｓ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎ  ｆａｉｌｕｒｅ  ａｎｄ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｉｎ  ｓｅｐｓｉｓ．  Ｔｈｅ  ＡＣＣＰ／ＳＣＣＭ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ．  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃｈｅｓｔ  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ／Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ”、Ｃｈｅｓｔ  １０１（６）：１６４４−５５．）：
・心拍数：毎分９０拍超（頻脈）
・体温：３６℃（９６．８°Ｆ）未満又は３８℃（１００．４°Ｆ）超（低体温又は発熱）
・呼吸数：毎分２０回超、又は血液ガスではＰａＣＯ２として３２ｍｍＨｇ（４．３ｋＰａ）未満（頻呼吸又は過呼吸による低炭酸ガス血）
・白血球数：４，０００個／ｍｍ３未満又は１２，０００個／ｍｍ３超（＜４×１０９又は＞１２×１０９個／Ｌ）或いは１０％超の帯状体（未熟な白血球）；（白血球減少、白血球増加、又は帯状核細胞増加）
発熱及び白血球増加は急性期応答の特徴であるが、頻脈は血行動態悪化の初期徴候である場合が多い。頻呼吸は感染及び炎症による代謝ストレスの増大と関係づけることができるが、嫌気性細胞代謝の発現をもたらす灌流不良の徴候であるとすることもできる。
【００４４】
小児では、上記ＳＩＲＳ基準は以下のように修正されている（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  Ｂ、Ｇｉｒｏｉｒ  Ｂ、Ｒａｎｄｏｌｐｈ  Ａ（２００５年）．  ”Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｓｅｐｓｉｓ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ：  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｓｅｐｓｉｓ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ”．  Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ６（１）：２−８）：
・心拍数：痛み及び薬剤投与などの刺激の無い場合において年齢的に正常値よりも上の２標準偏差超、又は３０分超乃至４時間の説明のつかない持続性上昇。乳児では、迷走神経の刺激、ベータ遮断剤もしくは先天性心疾患の無い場合において年齢的に第１０パーセンタイル未満、又は３０分超の説明のつかない持続性低下も含む。
【００４５】
・口内、直腸、フォーリーカテーテルプローブ又は中心静脈カテーテルプローブから得られる体温：３８．５℃超又は３６℃未満。小児患者ではＳＩＲＳとみなすには体温が異常でなければならない。
【００４６】
・呼吸数：年齢的に正常値よりも上の２標準偏差超、又は神経筋疾患もしくは麻酔の施行と関連づけられない機械換気の必要。
【００４７】
・白血球数：化学療法と関連づけられない年齢的に高いか低い、或いは１０％超の帯状体＋他の未熟形態
当業者なら認めるであろうが、ＳＩＲＳ基準は臨床的文脈内で注意深く解釈されなければならない。これらの基準は主として、今後の臨床研究がより厳密でより容易に再現可能となるように重症患者をより客観的に分類することを目的として存在する。
【００４８】
統一的な定義は、臨床のベッドサイド経験を反映する敗血症の徴候及び症状の最新リストを備えて進歩し続けている。
【００４９】
敗血症とみなすことができるためには、感染の（培養、染色もしくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による）疑い又は証明、或いは感染に特徴的な臨床症候群が存在しなければならない。感染の具体的な証拠には、（尿、脳脊髄液（ＣＳＦ：ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ）などの）正常では無菌の体液中のＷＢＣの存在、内腔臓器の穿孔（腹部Ｘ線もしくはＣＴスキャン上におけるフリーエア、急性腹膜炎の徴候）の証拠、（局所の不透明化を伴う）肺炎に一致した異常な胸部Ｘ線（ＣＸＲ：ｃｈｅｓｔ  ｘ−ｒａｙ）又は点状出血、紫斑もしくは電撃性紫斑病がある。
【００５０】
敗血症のより重篤なサブセットは重症敗血症（急性臓器機能不全を伴う敗血症）及び敗血症性ショック（難治性動脈性低血圧を伴う敗血症）である。或いは、上記の全身性炎症反応症候群の基準のうちの２つ以上が感染症の証拠なしに満たされる場合、患者は単に「ＳＩＲＳ」と診断することができる。ＳＩＲＳ及び急性臓器機能不全を有する患者は「重症ＳＩＲＳ」と呼ばれることがある。
【００５１】
患者は、敗血症プラス全身性低潅流の徴候、即ち、臓器機能不全又は４ｍｍｏｌ／ｄＬ超の血清乳酸値を有する場合、「重症敗血症」に罹患していると定義される。他の徴候としては乏尿及び精神状態の変化が挙げられる。また、患者は、敗血症プラス積極的急速輸液蘇生後の低血圧（通常６リットルもしくは４０ｍｌ／ｋｇ以上の晶質）を有する場合、敗血症性ショックに罹患していると定義されている。
【００５２】
末期臓器機能不全の例としては以下のものが挙げられる（Ａｂｒａｈａｍ  Ｅ、Ｓｉｎｇｅｒ  Ｍ（２００７年）．  ”Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｓｅｐｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｏｒｇａｎ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ”．  Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．  ３５（１０）：２４０８−１６）：
・肺−急性肺損傷（ＡＬＩ：ａｃｕｔｅ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ）（ＰａＯ２／ＦｉＯ２＜３００）又は急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ：ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｔｒｅｓｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＰａＯ２／ＦｉＯ２＜２００）
・脳−脳障害−（症状：興奮、錯乱、昏睡）；（病因：虚血、出血、微小血栓、微小膿瘍、多発性壊死性白質脳症）
・肝臓−蛋白質合成機能の破壊：凝固因子合成不能による進行性凝固障害として急性に現れる；代謝機能の破壊、非抱合型血清ビリルビン（間接ビリルビン）レベルの上昇をもたらすビリルビン代謝の停止として現れる。
【００５３】
・腎臓−乏尿及び無尿；電解質異常；体液量過剰
・心臓−少なくとも部分的に筋細胞機能を抑制するサイトカインによる収縮期及び拡張期心不全；細胞損傷、が（本来、必ずしも虚血性ではないが）トロポニン漏出として現れる。
【００５４】
本明細書に記載したアネキシンＡ５処置は、播種性血管内凝固（ＤＩＣ：ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ）などの血液凝固障害の処置を目的としたものではない。特定の例では、アネキシンＡ５を用いて初期段階で敗血症などの炎症性障害を処置することによって播種性血管内凝固（ＤＩＣ）などの血液凝固障害の発症を予防する。
【００５５】
本明細書に記載した組成物及び方法は、アネキシン分子、より一般的にはアネキシンポリペプチドを含む。
【００５６】
一例において、アネキシンＡ５分子を含む組成物を提供する。
【００５７】
アネキシンＡ５は、１３メンバーからなる蛋白質ファミリーの一部である３５ｋＤａのリン脂質結合性蛋白質である（表１、Ｇｅｒｋｅほか、Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ２００２年；８２：３３１−３７１）。これは、形質膜の陰イオン性リン脂質（例えば、ホスファチジルセリン）にカルシウム依存性に結合し、ホスファチジルセリンが露出されている細胞の表面の上方に保護的な２Ｄの結晶化シールドを形成することで抗アポトーシス及び抗凝固特性を示す［Ｒｅｕｔｅｌｉｎｇｓｐｅｒｇｅｒほか、Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  １９９７年；５３：５２７−５３２］。この保護シールドは、細胞外因子が複合体を形成するリン脂質諸部位を隔離し、これらが食作用又は血栓形成を開始する能力を減少させる。
【００５８】
アネキシンＡ５はいくつかの診断法及び製品に用いられており、その際、いくつかの例が下記の会社によって提供されている：
・Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＵＫ；アネキシンＡ５−死滅しつつある細胞の同定
・Ｂｅｎｄｅｒ  ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ  ＧｍｂＨ、Ｄ；Ｂｅｎｄｅｒ  ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ  ＧｍｂＨはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍを介してアネキシンＡ５の製造権を保持し、アネキシンＡ５製品の広範囲な各種フォーマット及びコンジュゲートを提供している。
【００５９】
・Ｃａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＵＳＡ；ヒト組換えアネキシンＡ５
・Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ；ＡｐｏＡｌｅｒｔアネキシンＡ５プロトコル
・ＩＱ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ、ＮＬ；ホスファチジルセリン検出用アネキシンＡ５
・Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ；ＡｎｘＡ５−Ｂｉｏｔｉｎ、ＡｎｘＡ５−ＦＩＴＣアポトーシス検出キット
・Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；ＡｎｘＡ５−Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、ＡｎｘＡ５−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ
・Ｔａｕ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＢＶ、ＮＬ；抗アネキシンＡ５抗体
・Ｔｒｅｖｉｇｅｎ、ＭＤ、ＵＳＡ；アネキシンＡ５アポトーシス用製品；ＴＡＣＳ  ＡｎｘＡ５−ＦＩＴＣ、ＴＡＣＳ  ＡｎｘＡ５−Ｂｉｏｔｉｎ
アネキシンＡ５の遺伝子配列の初期の公表文献は、１９８７年におけるエンドネキシンＩＩの開示文献である（Ｓｃｈａｅｐｆｅｒほか、１９８７年、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｎｅｘｉｎ  ＩＩ，  ａ  ｃａｌｃｉｕｍ−ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８４：６０７８−６０８２）。この蛋白質の初期の公表文献は１９７９年における開示文献である（Ｂｏｎｎ，  Ｈ及びＫｒａｕｓ  Ｗ．  １９７９年、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＰＰ１０）．  Ａｒｃｈ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．２２７：１２５−１３４）。
【００６０】
アネキシンＡ５は、胎盤抗凝固蛋白質Ｉ（Ｔａｉｔほか、Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｉ，  ａ  ｍｅｍｂｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｐｏｃｏｒｔｉｎ  ｆａｍｉｌｙ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  １９８９年５月１５号；２６４（１４）７９４４−９；Ｇｒｕｎｄｍａｎｎほか、Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＰＰ４）：ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｌｉｐｏｃｏｒｔｉｎ  ｆａｍｉｌｙ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ．  １９８８年６月号；８５（１１）：３７０８−１２）、血管抗凝結素アルファ（Ａｎｄｒｅｅほか、１９９０年、Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ  ａｌｐｈａ  （ＶＡＣ  ａｌｐｈａ）  ｔｏ  ｐｌａｎａｒ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｂｉｌａｙｅｒｓ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  １９９０年３月２５日号；２６５（９）：４９２３−８）、エンドネキシンＩＩ（Ｓｃｈａｅｐｆｅｒほか、１９８７年、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｎｅｘｉｎ  ＩＩ，  ａ  ｃａｌｃｉｕｍ−ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ．  ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８４：６０７８−６０８２）、リポコルチンＶ（Ｒｏｔｈｈｕｔほか、Ａ  ３２  ｋＤａ  ｌｉｐｏｃｏｒｔｉｎ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｐｐｅａｒｓ  ｔｏ  ｂｅ  ｉｄｅｎｔｉｃａｌ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．  １９８９年１１月１日号、２６３（３）：９２９−３５）、胎盤蛋白質４（Ｉｎａｂａほか、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｌａｃｅｎｔａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ４  （ＰＰ４）  ｉｎ  ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．  Ｎｉｐｐｏｎ  Ｓａｎｋａ  Ｆｕｊｉｎｋａ  Ｇａｋｋａｉ  Ｚａｓｓｈｉ．  １９８６年２月号、３８（２）：２６５−６）及びアンコリンＣＩＩ（Ｍｏｌｌｅｎｈａｕｅｒほか、Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ａｎｃｈｏｒｉｎ  ＣＩＩ，  ａ  ３１，０００−ｍｏｌ−ｗｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ．  Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．  １９８４年４月号、９８（４）：１５７２−９；ｖｏｎ  ｄｅｒ  Ｍａｒｋほか、Ａｎｃｈｏｒｉｎ  ＣＩＩ，  ａ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｏｍ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．  Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  １９８５年；４６０：２１４−２３；  Ｍａｕｃｈほか、Ａ  ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｄｅｒｍａｔｏｓｐａｒａｃｔｉｃ  ｓｈｅｅｐ  ｆｉ��ｒｏｂｌａｓｔｓ．  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １９８８年１月号；１０６（ｌ）：２０５−１１；  Ｐｉｌａｒほか、Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎｃｈｏｒｉｎ  ＣＩＩ，  ａ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ．  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  １９８８年４月２５日号；２６３（１２）：５９２１−５）とも呼ばれている。
【００６１】
理論にとらわれることは望まないが、本明細書に記載したアネキシンＡ５処置はＴＮＦαなどの炎症促進性サイトカインを阻害することで炎症性障害を処置することを明らかにした。本明細書に記載したアネキシンＡ５処置は抗凝固を意図したものではない。従って、特定の例では、アネキシンＡ５を用いて、抗凝固効果とは無関係に炎症性障害における臓器機能不全を処置する。
【００６２】
アネキシンＡ５分子を含む組成物は、炎症性障害を処置するのに有用と考えられる。アネキシンＡ５分子を含む組成物は、炎症性障害に罹患している被験体の臓器（例えば、心臓、肝臓、肺、腎臓又は脳）機能を改善するのに有用と考えられる。また、アネキシンＡ５分子を含む組成物は、サイトカイン（例えば、ＴＮＦα）の産生に伴う炎症性障害を処置するのにも有用と考えられる。また、アネキシンＡ５分子を含む組成物は、ＳＩＲＳ又は敗血症時の臓器（例えば、心臓、肝臓、肺、腎臓又は脳）機能不全又は障害の処置にも有用と考えられる。さらに、アネキシンＡ５分子を含む組成物は、虚血又は再潅流時における臓器（例えば、心臓、肝臓、肺、腎臓又は脳）の機能不全又は障害を処置するのにも有用と考えられる。
【００６３】
また、アネキシンＡ５分子を含む組成物は、ＤＩＣの発症を予防するために敗血症を処置するのにも有用と考えられる。
【００６４】
アネキシンＡ５分子を含む組成物は、炎症促進性サイトカインの阻害が予防的及び／又は治療的有用性をもたらす任意の障害の処置に用いることができる。従って、被験体の炎症性障害を処置する方法は、炎症促進性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α）の活性を阻害するのに有効な量のアネキシンＡ５分子を投与することを含む。
【００６５】
上記アネキシンＡ５分子は、完全長の天然ポリペプチド又はその変異体とすることができ、或いはアネキシンＡ５ポリペプチドをコードしている核酸分子又はその変異体とすることができるが、これらに限定されるものではない。さらに、このアネキシンＡ５分子を産生する組換え細胞も提供する。
【００６６】
アネキシンＡ５ポリペプチドは、任意の供給源又は方法、例えば、天然分離物又は組換えもしくは合成起源或いはこれらの適切な組合せによって供給することができる。アネキシンＡ５ポリペプチドの被験体への投与は、炎症性障害の処置、より詳細には炎症性障害における臓器機能不全の処置のために行うことができる。アネキシンＡ５ポリペプチドは、ＴＮＦαなどの炎症促進性サイトカインを阻害するのに有効な量で投与する。アネキシンＡ５ポリペプチドは、その抗炎症活性が維持される限り、任意の長さとすることができる。アネキシンＡ５ポリペプチドの配列は、完全な、又は部分的な天然アミノ酸配列に基づいたものとすることができる。アネキシンＡ５ポリペプチドは、単独、又は炎症性障害を処置し、もしくは炎症性障害における臓器機能不全を処置する組成物の調製において抗炎症性もしくは非抗炎症性の他のポリペプチドと組み合わせて用いることができる。ポリペプチドとは、アミノ酸の鎖、例えば、生物学的機能を有するペプチド、オリゴペプチド又は蛋白質のことをいうのであって、特定の長さのその鎖のことを指すのではない。
【００６７】
アネキシンＡ５ポリペプチドの単離体は、自然環境の少なくとも１成分から同定され、分離及び／又は回収されたポリペプチドである。このポリペプチド単離体は通常少なくとも１段の精製工程で精製されたものであり、一部の実施態様では、精製は、（１）シークエネーターを用いてＮ末端又は内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度に、或いは（２）クマシー・ブルー又は好ましくは銀染色を用いて非還元又は還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一となるように、達成される。アネキシンＡ５ポリペプチドの自然環境の少なくとも１成分が存在しないため、ポリペプチド単離体には組換え細胞内のインサイツのポリペプチドが含まれる。ポリペプチド単離体は、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｂｏｏｋｓ  １−３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに記載されているように、合成又は組換え技術により製造することができる。組換え技術の結果として製造されたポリペプチド単離体は組換えポリペプチドと称することができる。
【００６８】
アネキシンＡ５ポリペプチドをコードしている核酸は、例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡもしくはＲＮＡ起源又はこれらの適切な組合せのいずれかの核酸分子とすることができる。このアネキシンＡ５ポリペプチドをコードしている核酸は、炎症性障害の処置、より詳細には炎症性障害における臓器機能不全の処置、のために被験体に投与することができる。アネキシンＡ５核酸は、ＴＮＦなどの炎症促進性サイトカインを阻害するのに効果的な量で投与する。この核酸はコードされているアネキシンＡ５ポリペプチドによって抗炎症活性が維持されている限り、任意の長さとすることができる。このアネキシンＡ５ポリペプチドをコードしている核酸の配列は、完全な、又は部分的な天然核酸配列に基づいたものとすることができる。アネキシンＡ５ポリペプチドをコードしている核酸配列は、単独、又は炎症性障害を処置し、もしくは炎症性障害における臓器機能不全を処置する組成物の調製において抗炎症性ポリペプチドをコードし、もしくは任意の他の所望のポリペプチドをコードしている他の核酸配列との組合せで用いることができる。
【００６９】
アネキシンＡ５ポリペプチドをコードしている核酸分子単離体は、この核酸の天然源中で通常結合している少なくとも１種の挟雑核酸分子から同定、分離された核酸分子である。そのような核酸分子単離体は、それが自然界に存在するのとは異なる形態及びセッティングにある。従って、核酸分子単離体は、それが自然細胞中に存在する場合の核酸分子とは区別される。アネキシンＡ５ポリペプチドをコードしている核酸分子単離体には、通常アネキシンＡ５ポリペプチドを発現する細胞に含まれるこのアネキシンＡ５ポリペプチドをコードしている核酸分子であって、例えば、自然細胞の場合とは異なる染色体内又は染色体外の位置にある核酸分子がある。この核酸分子単離体は、例えば、Ｊ．  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｅ．Ｆ．  Ｆｒｉｔｓｃｈ及びＴ．  Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｂｏｏｋｓ  １−３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓに記載されているようにして組換え技術を用い、操作されたものである場合、組換え核酸分子と称することができる。
【００７０】
変異体としては、アナログ、誘導体、断片、短縮体、スプライス変異体、突然変異体、欠失体、置換体、挿入体、融合体などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７１】
アネキシンＡ５ポリペプチド又はアネキシンＡ５ポリペプチドをコードしている核酸を  （例えば、欠失、挿入もしくは置換の数もしくは組合せにおいて）所望の任意の仕方で突然変異、変更又は誘導体化させることにより対応する変異体を製造することができる。このような変異体は炎症性障害の処置又は炎症性障害における臓器機能不全の処置に用いることが想定されており、このような変異体核酸又は変異体ポリペプチドは、抗炎症活性が維持される限り、それぞれ、天然の核酸又はポリペプチド配列と比較して任意の仕方で突然変異又は変更又は誘導体化させることができる。同様に、対応する天然の核酸又はポリペプチド配列に対して種々の程度の配列同一性を有する核酸又はポリペプチドも、抗炎症活性を消失させることがなければ容認することができる。例えば、組成物は、天然型アネキシンＡ５ポリペプチドと同一の配列を有するアネキシンＡ５ポリペプチド又は天然型アネキシンＡ５ポリペプチドに対して少なくとも８０％同一である配列を有するその変異体を含むことができる。別の例として、組成物は、天然型のコード配列と同一のコード配列を有する核酸分子又は天然型のコード配列に対して少なくとも７０％同一である配列を有するその変異体を含むことができる。コンピュータ利用の方法及び高い（例えば、少なくとも７０％の）配列同一性を共有する核酸配列を決定又は同定するための高緊縮条件を用いる核酸ハイブリダイゼーション技術による蛋白質及び核酸の配列同一性の測定については当業者には公知である。
【００７２】
ハイブリダイゼーション反応の緊縮性は当業者が容易に決定することができ、通常プローブの長さ、洗浄温度及び塩濃度によって決まる経験的な計算値である。一般に、プローブが長いほど、適切なアニーリングには高い温度が必要となり、プローブが短いほど、低い温度が必要になる。ハイブリダイゼーションは一般に、相補鎖がそれらの融解温度より低い環境中に存在する場合、変性ＤＮＡの再アニーリング能に依存している。プローブとハイブリダイゼーション可能な配列との配列同一性が高いほど、使用できる相対温度は高くなる。高緊縮条件は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを５０℃で使用する、（２）ハイブリダイゼーション時にホルムアミド、例えば５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド等の変性剤を、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファーに７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを添加したものと共に４２℃で使用する、又は（３）４２℃において５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸を用い、４２℃において０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中で、５５℃において５０％ホルムアミド中で洗浄した後、５５℃においてＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高緊縮性洗浄を行うことよって特定することができる。ハイブリダイゼーション及び洗浄時間は平衡を達成するのに十分なものとする必要がある。
【００７３】
アネキシンＡ５ポリペプチド及びアネキシンＡ５ポリペプチドをコードしている核酸配列に対するアミノ酸又は核酸配列の配列同一性百分率（％）は、場合によっては配列をアラインメントさせ、必要ならば最大の配列同一性百分率を得るために間隙を導入した後の、アネキシンＡ５ポリペプチドアミノ酸配列又はアネキシンＡ５ポリペプチドをコードしている核酸配列と同一である、候補配列中の残基の割合である。アミノ酸配列同一性百分率又は核酸配列同一性百分率を求めるためのアラインメントは、当該分野の技術の範囲内にある種々の方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを用いて、達成することができる。当業者であれば、所望の長さの配列、例えば比較対象の配列の少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０もしくは２００残基又は完全長にもわたって最大アラインメントを得るのに必要な全てのアルゴリズムを含む、アラインメント測定のための適切なパラメータを決定することができる。
【００７４】
アネキシンＡ５ポリペプチド又はその変異体を考慮する場合、この変異体アネキシンＡ５ポリペプチドは通常、その対応するアネキシンＡ５ポリペプチドに対して少なくとも８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６又は９８％同一であるアミノ酸配列を有することになる。
【００７５】
アネキシンＡ５ポリペプチドをコードしている核酸配列又はその変異体を考慮する場合、この変異体核酸配列は通常、その対応するアネキシンＡ５ポリペプチドをコードしている核酸配列に対して少なくとも７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６又は９８％同一であることになる。
【００７６】
変異体を製造する技術及び方法については当該分野では公知である。一例において、ポリペプチドに関しては、アネキシンＡ５ポリペプチドを、抗炎症活性を消失させることなくグリコシル化、アミド化、リン酸化、カルボキシル化、短縮化、断片化、置換などによりインビボ又はインビトロで修飾することができる。別の例では、核酸に関して、特定のコドンが異なるアミノ酸をコードするコドンへ変更されるようにアネキシンＡ５ポリペプチドをコードしている核酸において置換突然変異を行うことができる。この種の置換突然変異は、得られる蛋白質中のアミノ酸を非保存的様式で（即ち、特定の大きさもしくは特性を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸から別のグループに属するアミノ酸へとコドンを変更することによって）又は保存的様式で（即ち、特定の大きさもしくは特性を有するアミノ酸のグループに属するアミノ酸から同じグループに属するアミノ酸へとコドンを変更することによって）行うことができる。そのような保存的変更は通常、得られる蛋白質の構造及び機能に余り変化をもたらさない。非保存的変更は、得られる蛋白質の構造、活性又は機能を変化させる可能性が高い。アミノ酸のグループ分けについては当業者には周知である。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としてアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが挙げられる。芳香環構造を有するアミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンである。極性中性アミノ酸としてはグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが挙げられる。正電荷を有する（塩基性）アミノ酸としてはアルギニン、リジン及びヒスチジンが挙げられる。負電荷を有する（酸性）アミノ酸としてはアスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。そのような置換又はその他の種類の変更（例えば、欠失もしくは挿入）もしくは修飾のどれも、抗炎症効果が消失しない限り、許容することができる。
【００７７】
アネキシンＡ５ポリペプチド又はアネキシンＡ５ポリペプチドをコードしている核酸配列を含む組換え細胞は、炎症性障害の処置又は炎症性障害における臓器機能不全の処置に用いることができる。組換え細胞型としては、処置のために選ばれた予定された被験体の生理に適合する任意の細胞型が挙げられる。
【００７８】
細胞はその細胞内で自然には生じない核酸配列を含むように改変又は修飾することができ、このため、この細胞は組換え体とみなされることになる。他の例では、細胞はその細胞内で自然には生じない核酸配列の別のコピーを含むように改変又は修飾することができ、このため、この細胞は組換え体とみなされることになる。当業者であれば理解されようが、アネキシンＡ５ポリペプチドをコードしている核酸は、任意の既知の技術、例えば、微量注入、電気穿孔、ウイルストランスフェクション、リポフェクタミントランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿などを用いて細胞内に導入することができる。特定の例では、幹細胞をアネキシンＡ５ポリペプチドをコードしている核酸分子の導入によって修飾し、次いで、この修飾細胞を被験体に投与することができるが、これに限定されるものではない。特定の他の例では、アネキシンＡ５ポリペプチドをコードしている核酸分子を適切な構築体又は運搬体、例えばウイルス構築体中に組み込み、このアネキシンＡ５ポリペプチドをコードしている核酸分子が被験体の細胞の少なくとも一部において導入されて発現されるようにこの被験体に投与することができる。
【００７９】
アネキシンＡ５ポリペプチドをコードしている核酸は、通常適切なベクターとの関係において、制御配列に動作可能なように連結させることができる。有用な制御配列は、核酸配列のコード配列の発現に必要又は有利である任意の核酸エレメントとすることができる。各制御配列は、アネキシンＡ５ポリペプチドをコードしている核酸配列に固有のものであるか、異種のものとすることができる。そのような制御配列としては、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモータ、シグナル配列又は転写ターミネータが挙げられるが、これらに限定されるものではない。制御配列を組み込むための別の方法も当業者には容易に利用可能である。例えば、アネキシンＡ５ポリペプチドをコードしている核酸を内因性の上流プロモータの制御下に、又は異種の上流プロモータの制御下におくことができる。アネキシンＡ５ヌクレオチド配列の細菌宿主における転写を誘導する好適なプロモータの例としては、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃオペロンのプロモータ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子ｄａｇＡプロモータ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）のプロモータ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトース生成型アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）のプロモータ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓアルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）のプロモータ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのｘｙｌＡ及びｘｙｌＢ遺伝子のプロモータ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓのａｐｒＥ遺伝子のプロモータ並びにＰ１７０プロモータを含むＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．由来プロモータに由来するプロモータが挙げられる。アネキシンＡ５ポリペプチドをコードしている核酸をＥ．ｃｏｌｉなどの細菌種において発現させる場合、好適なプロモータは、例えば、Ｔ７プロモータ及びファージラムダプロモータを含むバクテリオファージのプロモータから選ぶことができる。
【００８０】
真菌種における転写の場合、有用なプロモータの例には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉのアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒの中性アルファ−アミラーゼ、Ａ．  ｎｉｇｅｒの酸安定性アルファ−アミラーゼ、Ａ．ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉのリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのアルカリ性プロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのトリオースリン酸イソメラーゼ又はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓのアセトアミダーゼをコードしている遺伝子に由来するものがある。
【００８１】
酵母種における発現のための好適なプロモータの例としては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＧａｌ１及びＧａｌ１０プロモータ及びＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓのＡＯＸ１又はＡＯＸ２プロモータが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８２】
さらに別の好適なプロモータ、例えば、サイトメガロウイルス、ラウス肉腫ウイルス、合成ポックスウイルスプロモータ、ポックス合成後期プロモータ１、ポックス合成後期プロモータ２早期プロモータ２、ポックス０１Ｌプロモータ、ポックス１４Ｌプロモータ、ポックス１３Ｌプロモータ、ポックス１２Ｌプロモータ、ポックスＩＩＬプロモータ、ポックスＤＩＯＲプロモータ、ＰＲＶ  ｇＸ、ＨＳＶ−１アルファ４、ニワトリベータ−アクチンプロモータ、ＨＣＭＶ前初期、ＭＤＶ  ｇＡ、ＭＤＶ  ｇＢ、ＭＤＶ  ｇＤ、ＩＬＴ  ｇＢ、ＢＨＶ−１．１  ＶＰ８及びＩＬＴ  ｇＤ及び内部リボソーム侵入部位プロモータが当業者には利用可能である。
【００８３】
好適なベクターは、アネキシンＡ５ポリペプチドをコードしている核酸配列及び全ての所望の制御配列を組み込むことができる任意のベクター（例えば、プラスミド又はウイルス）とすることができ、この核酸配列の発現をもたらすことができる。上記ベクターの選択は、このベクターが導入されることになる宿主細胞とのこのベクターの相性によって決まる。特定の例では、このベクターは、複製が染色体の複製とは無関係である染色体外のもの、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体又は人工染色体として存在することができる。他の例では、上記ベクターは、宿主細胞に導入された時、ゲノム中に取り込まれ、取り込まれた染色体（単数又は複数）と共に複製されるベクターである。ベクター及びベクターを操作する技術のさらに別の例については当業者には周知で、明らかであろう。
【００８４】
組換え細胞は、アネキシンＡ５ポリペプチド又はアネキシンＡ５ポリペプチドをコードしている核酸配列を単独で、又は、例えば効果を最適化もしくは増強するために、それぞれ他の所望のポリペプチドもしくは核酸分子との組合せで含むことができる。さらに、例えば特定の細胞型における発現のためのコドン最適化のために、核酸配列を所望の細胞内に導入する前に突然変異又は改変を施すことができる。さらに、アネキシンＡ５ポリペプチドとある用途において所望される１種以上の他のポリペプチド（単数又は複数）との融合体、例えば標的ポリペプチド又は担体ポリペプチドとの融合体をコードするように核酸配列を改変することができる。
【００８５】
アネキシンＡ５分子及びアネキシンＡ５分子を含む細胞について本明細書に記載した変異体がアネキシンＡ５分子及びアネキシンＡ５分子を含む細胞との組合せで用いられる他のポリペプチド、核酸分子及び細胞にも同様に当てはめることができることは当業者によって認められよう。特定の例では、抗炎症性ポリペプチド、抗炎症性ポリペプチドをコードしている核酸分子又は抗炎症性ポリペプチドを産生する細胞をアネキシンＡ５分子又はアネキシンＡ５分子を産生する細胞と組み合わせて使用することができる。特定の例では、アネキシンＡ５分子はアネキシン１分子と組み合わせて使用する。
【００８６】
当業者であれば理解されようが、ポリペプチド、核酸分子又は細胞の投与は種々の仕方で行うことができる。例えば、投与は、筋肉内、皮下、静脈内、鼻腔内、皮内、滑液嚢内、胚内、点眼、経口、気管内又は気管支内及びこれらの様式の組合せで行うことができる。用量は予定されている被験体の大きさによって変えることができる。投与の方法は当業者には公知であり、例えば、米国特許第５，６９３，６２２号、同５，５８９，４６６号、同５，５８０，８５９号及び同５，５６６，０６４号を参照されたい。組成物の調製に必要なポリペプチド、核酸配列又は組換え細胞の量については当業者に十分理解される。
【００８７】
また、治療効果のある量は動物研究で求めることもできる。アネキシンＡ５の適用用量は、使用する補助薬を含む投与化合物の相対的な生物学的利用能及び効力に基づいて調整することができる。上記の方法及び他の方法に基づいて最大の効力を達成するために上記用量を調整することについては、十分当業者の能力の範囲内にある。本明細書に記載したアネキシンＡ５の被験体毎の用量は一般的に約０．１μｇ乃至１０，０００ｍｇ、より一般的には約１μｇ／日乃至８，０００ｍｇ、さらにより一般的には約１０μｇ乃至５ｍｇ、最も一般的には約１０μｇ乃至１００ｐｇの範囲にあるとすることができる。被験体の体重に換算すると、日用量として２０ｍｇ／ｋｇ／日超又は０．１μｇ／ｋｇ／日未満とすることもできるが、一般的な投与量は、約０．１μｇ乃至２０ｍｇ／ｋｇ／日、より一般的には約１乃至１０ｍｇ／ｋｇ／日、最も一般的には約１乃至５ｍｇ／ｋｇ／日である。例えば、一部の実施態様では、アネキシンＡ５は１日当たり１．０ｍｇ／ｋｇ以下の量で投与することができる。これは、１日当たり０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１ｍｇ／ｋｇ以下の量を含む。また、アネキシンＡ５は、１日当たり０．１ｍｇ／ｋｇ以下（例えば、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．５、０．０４、０．０３、０．０２又は０．０１ｍｇ／ｋｇ／日以下）の量で投与することもできる。一部の実施態様では、こうした薬剤は１日当たり約０．００５ｍｇ／ｋｇ乃至１日当たり１．０ｍｇ／ｋｇ未満（又は１日当たり約０．００５ｍｇ／ｋｇ乃至１日当たり０．１ｍｇ／ｋｇ以下）の範囲で投与する。一部の実施態様では、２０ｍｇ／ｋｇ／日  一部の実施態様では（例えば、特に、炎症性障害を発症するリスクのある被験体をターゲットとした方法において）、アネキシンＡ５及び／又は機能的に同等のものを含む薬剤の投与のタイミングが重要とすることができる。例えば、被験体は定期的に投与することができる。本明細書に用いている「定期（ｒｏｕｔｉｎｅ  ｓｃｈｅｄｕｌｅ）」とは、所定の指定された期間のことをいう。定期は、日程があらかじめ定められている限り、長さが同一又は異なる期間を包含することができる。例えば、定期は、毎日、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、毎週、毎月又は任意の設定日数もしくは週数毎、２ヶ月毎、３ヶ月毎、４ヶ月毎、５ヶ月毎、６ヶ月毎、７ヶ月毎、８ヶ月毎、９ヶ月毎、１０ヶ月毎、１１ヶ月毎、１２ヶ月毎などの投与を含むことができる。或いは、このあらかじめ定められた定期は、最初の週は毎日、その後数ヶ月は毎月、その後は３ヶ月毎の投与を含むことができる。適切な日程が特定の日の投与を含むことが前もって決定されている限り、上記定期によって任意の特定の組合せがカバーされることになる。
【００８８】
本明細書に記載したポリペプチド、核酸又は組換え細胞は、炎症性障害の処置又は炎症性障害における臓器機能不全の処置のための組成物の調製用の薬学的に受容可能な担体と組み合わせて用いることができる。薬学的に受容可能な担体については当業者に公知であり、蛋白質、糖などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。好適なそのような担体の一例は、加水分解蛋白質、乳頭などの安定化剤を１種以上含む生理的平衡培養培地である。許容可能な担体の別の例は０．０１乃至０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍリン酸緩衝液又は０．８％食塩水である。許容可能な担体は、水性又は非水性溶液、懸濁液及び乳液とすることができる。非水性溶媒の例にはプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどの植物油及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルがある。水性担体の例には水、食塩水及び緩衝メジウムを含むアルコール性／水性溶液、乳液又は懸濁液がある。薬学的組成物用の保存剤及び他の添加剤についても当業者には公知であり、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、不活性ガス、有機酸などが挙げられる。好適なそのような担体の別の例には天然又は合成細胞外基質物質を含む生体適合物質がある。
【００８９】
アネキシンＡ５を含む本発明の組成物は、炎症性障害の処置のために所望される他の医薬を含むこともできる。例えば、敗血症の処置では、アネキシンＡ５組成物は、敗血症の処置に用いられる１種以上の抗生物質又は昇圧剤及び／又はコルチコステロイドをさらに含むことができるが、これらに限定されるものではない。このように、追加的な医薬は処置被験体の基礎症状に基づいて選択される。
【００９０】
本明細書に記載したポリペプチド、核酸又は組換え細胞を薬学的に受容可能な担体との組合せで含むキットが想定されている。キットは通常、アネキシンＡ５を含む薬剤を調製するための使用説明書及び／又は炎症性障害を罹患している被験体の臓器機能改善用のアネキシンＡ５を投与するための使用説明書を含む。
【００９１】
本明細書に開示される要素を紹介する際、本明細書の原文における冠詞の「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、及び「該」は、文脈で別に指示されない限り、１または複数の要素が存在することを意味するものである。例えば、用語「化合物」及び「少なくとも１種類の化合物」には、その混合物を含む複数の化合物を含め得る。用語「含む」、「有する」、「含める」は、制約のないことが意図されており、列挙される要素以外にさらなる要素が存在し得ることを意味する。「のみから実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という句は、特定のエレメントと特定エレメントの組合せの基本的及び新規な特徴に大して影響を与えない別のエレメントとに限定するものである。例えば、句「のみから実質的になる」を用いて定義される組成物は任意の既知の薬学的に受容可能な添加剤、賦形剤、希釈剤、担体などを含む。
【００９２】
上記の詳細な説明は、単に説明を目的としたものであり、特許請求の範囲を限定するものではない。以下の特定の実施例を参照することにより、より一層の理解が得られよう。これらの実施例も、もっぱら例証のために記載されたものであり、特許請求の範囲を限定するものではない。状況により方策が示唆または提供されることがあるので、形態の変更と等価物の代用が想定されている。本明細書で特定の用語を使用したが、そのような用語は、説明的な意味であり、限定するためのものではない。
【実施例】
【００９３】
実施例１：実施例２及び３において用いた方法
動物  この研究は米国国立衛生研究所により公表された「Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ」（ＮＩＨ冊子第８５−２３号、１９９６年改訂）に準拠している。動物の使用は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｏｎｔａｒｉｏ  （Ｃａｎａｄａ）  のＡｎｉｍａｌ  Ｕｓｅ  Ｓｕｂｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。Ｃ５７ＢＬ／６マウスはＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。繁殖プログラムをＬａｗｓｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの動物飼育施設で行って子孫を生ませた。体重２１乃至２６ｇの成体（３乃至４ヶ月令）雄マウスについて研究を行った。
【００９４】
実験プロトコル  マウスを以下の群、即ち、食塩水（偽対照、ｎ＝５）、リポ多糖（ＬＰＳ、ｎ＝７）及びＬＰＳプラス組換えヒトアネキシンＡ５（ｎ＝６）処置群に無作為に割り付けた。ＬＰＳ（４ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）は敗血症をシミュレートするために用いた。マウスは、ＬＰＳ投与の直後及び２時間後の２回の組換えヒトアネキシンＡ５（５μｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．）注射により処置した。ＬＰＳ投与の４時間後に、マウスを屠殺し、心臓を摘出した。心機能はＬａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ心臓標本を用いて測定した。心機能測定の終了後、心臓は、心筋ＴＮＦ発現の分析のために−８０℃の冷凍庫に貯蔵した。
【００９５】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによるＴＮＦ  ｍＲＮＡの測定  以前に報告された［７、８］ようにしてＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、Ｏｎｔａｒｉｏ）を用い、ＬＶ心筋から全ＲＮＡを分離した。Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素及びランダムプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｃＤＮＡを合成した。リアルタイムＰＣＲは、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘをメーカー（Ａｂｍ、Ｖｅｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ）の使用説明書に従って用い、実施した。ＴＮＦのオリゴヌクレオチドプライマーはセンス５’  ＣＣＧ  ＡＴＧ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＡＣＣ  ＴＴＧ  ＴＣ  ３’及びアンチセンス５’  ＧＧＧ  ＣＴＧ  ＧＧＴ  ＡＧＡ  ＧＡＡ  ＴＧＧ  ＡＴ  ３’とした。センス５’  ＴＴＧ  ＡＡＡ  ＡＴＣ  ＣＧＧ  ＧＧＧ  ＡＧＡ  Ｇ  ３’及びアンチセンス５’  ＡＣＡ  ＴＴＧ  ＴＴＣ  ＣＡＡ  ＣＡＴ  ＧＣＣ  ＡＧ  ３’のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる負荷対照として２８ＳｒＲＮＡを使用した。サンプルはＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｐｔｉｃｏｎ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ装置を用いて３５サイクル増幅した。以前の報告［９］と同様な２８ＳｒＲＮＡに対するＴＮＦ  ｍＲＮＡのレベルが得られた。
【００９６】
ＴＮＦ蛋白質レベルの測定  以前の報告［７、１０］に記載されているようにして、マウスＴＮＦ  ＥＬＩＳＡキット（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｍｉｓｓｉｓａｕｇａ、Ｏｎｔａｒｉｏ）を用いて左心室（ＬＶ：ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ）心筋ＴＮＦ蛋白質レベルを測定した。このＬＶ心筋組織をＰＢＳ中にホモゲナイズした。遠心分離後、上清を採集して蛋白質濃度及びＴＮＦ  ＥＬＩＳＡの測定を行った。ＴＮＦの測定値は各サンプルの蛋白質濃度で標準化し、ｐｇ／ｍｇ蛋白質で表した。
【００９７】
摘出マウス心臓標本  食塩水、ＬＰＳ又はＬＰＳプラスアネキシンＡ５処置の４時間後に、マウスを屠殺した。マウスの心臓を摘出し、以前報告された［１０］ようにしてＬａｎｇｅｎｄｏｒｆｆシステムで潅流して心機能を測定した。つまり、心臓を２ｍＬ／分の一定流量のＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液で潅流した。潅流緩衝液は３７℃に維持し、９５％Ｏ２及び５％ＣＯ２の混合気体で連続的に泡立たせた。６−０絹製縫合糸を左心室尖を介して置き、力−変位変換器（ＦＴ０３、Ｇｒａｓｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．）に接続されている軽量剛性の連結棒を通した。収縮力及び心拍数をＰｏｗｅｒＬａｂ  Ｃｈａｒｔプログラム（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によって測定した。心仕事量を上記力（ｇ）に上記心拍数（拍／分）を乗じることで算出し、心重量に対して標準化した。
【００９８】
統計解析  結果は全て平均値±ＳＥＭで表した。一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ：ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｖａｒｉａｎｃｅ）に続いてＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌのポストホックテストを行い、処置群間の差を検出した。Ｐ値が０．０５未満である場合に統計的有意性を付与した。
【００９９】
実施例２：敗血症モデルの心機能に対するアネキシンＡ５の効果
敗血症は、全ての病院又は集中治療室入院の２乃至１１％において生じる一般的な臨床問題である［１１、１２］。過去２０年にわたる多大な研究努力にもかかわらず、敗血症は、依然として集中治療室における主要な死因である。心筋機能不全は重症敗血症の患者でよくみられ、敗血症患者を高死亡率に関連づけられる多臓器不全発症の高いリスク状態にする［１３］。エンドトキシン又はＬＰＳは、敗血症時の心筋抑制に関与する重要な病原体である［３、４］。ＬＰＳの心機能に対する抑制作用は炎症促進性サイトカインの産生によって媒介される［１４］。こうしたサイトカインの中で、ＴＮＦ−αは敗血症時の心機能不全の主な要因の一つであると提唱されている［４、１５］。心筋細胞はＬＰＳ投与後にＴＮＦ−αを合成し［１５乃至１７］、心筋内に産生された高レベルのＴＮＦ−αが心機能不全発症の一因となる［１７］。
【０１００】
ヒトにおける重症敗血症をシミュレートするために、ＬＰＳによって誘発された内毒素血症の齧歯動物モデルが敗血症研究のツールとして広く用いられている［８、１０］。ＬＰＳによる処置は、敗血症患者と同様な血液学的変化を伴う敗血症様症状と関連づけられる［１８］。さらに、内毒素血症ではＴＮＦ−αを含むサイトカインの発現が著しく増大する［８、１０］。さらに、これまでの研究から、ＬＰＳはマウスにおいて収縮及び拡張機能の低下並びに平均動脈圧の減少によって示されるような著しい心機能不全を誘発することが分かっている（Ｘｉａｎｇほか、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００９年：１２０：１０６５−１０７４）。総合すると、以上の研究から内毒素血症はヒト敗血症の優れたモデルであることが示唆される。
【０１０１】
図１はアネキシンＡ５が内毒素血症マウスにおいて心機能を改善することを示している。マウスをＬＰＳで４時間処置して（４ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．、ｎ＝７）心機能不全をもたらす内毒素血症を誘発させた。アネキシンＡ５（５μｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．、ｎ＝６）で処置すると、ＬＰＳ単独の場合に比し、有意に心機能が改善した。食塩水（１００μＬ、ｉ．ｐ．）処置を偽対照とした（ｎ＝４）。データは平均値±ＳＥＭであり、一元ＡＮＯＶＡに続いてＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌテストを行い解析した。＊  偽対照に対してＰ＜０．０１、＃  ＬＰＳに対してＰ＜０．０５。
【０１０２】
食塩水、ＬＰＳ又はＬＰＳプラスアネキシンＡ５処置の４時間後に、動物を屠殺し、心機能をＬａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ心臓標本を用いて測定した。心拍数及び収縮力を記録した。心仕事量並びに収縮（＋ｄＦ／ｄｔｍａｘ）及び弛緩（−ｄＦ／ｄｔｍｉｎ）速度を解析した。その結果、収縮及び弛緩速度、収縮力並びに心仕事量は、偽対照群に比しＬＰＳ処置群では有意に減少することが分かった（図１、＊  Ｐ＜０．００１）。組換えヒトアネキシンＡ５で処置すると、ＬＰＳ群に比し、４種の心臓パラメータの全てが有意に改善した（図１、＃  Ｐ＜０．０１）。
【０１０３】
実施例３：心筋ＴＮＦ発現に対するアネキシンＡ５の効果
図２は、内毒素血症マウスにおける心筋ＴＮＦ  ｍＲＮＡの発現に対するアネキシンＡ５の効果を示している。マウスをＬＰＳで４時間処置して（４ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．、ｎ＝７）内毒素血症及び偽対照に比し有意な心筋ＴＮＦ  ｍＲＮＡ発現を誘発させた。アネキシンＡ５（５μｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．、ｎ＝６）で処置すると、ＬＰＳ単独の場合に比し、有意に心筋ＴＮＦ  ｍＲＮＡ発現が低下した。食塩水（１００μＬ、ｉ．ｐ．）処置を偽対照とした（ｎ＝５）。ＴＮＦ  ｍＲＮＡレベルはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定した。データは平均値±ＳＥＭであり、一元ＡＮＯＶＡに続いてＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌテストを行って解析されている。＊  偽対照に対してＰ＜０．０１、＃  ＬＰＳに対してＰ＜０．０５。
【０１０４】
図３は、内毒素血症マウスにおける心筋ＴＮＦ蛋白質の発現に対するアネキシンＡ５の効果を示している。マウスをＬＰＳで４時間処置して（４ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．、ｎ＝５）内毒素血症及び偽対照に比し有意な心筋ＴＮＦ蛋白質発現を誘発させた。アネキシンＡ５（５μｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．、ｎ＝６）で処置すると、ＬＰＳ単独の場合に比し、有意に心筋ＴＮＦ蛋白質発現が低下した。食塩水（１００μＬ、ｉ．ｐ．）処置を偽対照とした（ｎ＝４）。ＴＮＦ蛋白質レベルはＥＬＩＳＡにより測定した。データは平均値±ＳＥＭであり、一元ＡＮＯＶＡに続いてＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌテストを行って解析されている。＊  偽対照に対してＰ＜０．０１、＃  ＬＰＳに対してＰ＜０．０５。
【０１０５】
食塩水、ＬＰＳ又はＬＰＳプラスアネキシンＡ５処置の４時間後に、心筋ＴＮＦ  ｍＲＮＡ及び蛋白質発現をそれぞれ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ及びＥＬＩＳＡにより測定した。ＴＮＦ  ｍＲＮＡ及び蛋白質レベルはいずれも、食塩水処置の偽対照に比し、ＬＰＳ処置マウスのＬＶ心筋において有意に増大した（Ｐ＜０．０１）。アネキシンＡ５により処置すると、ＬＰＳにより誘発されるＴＮＦ発現は有意に低下した（Ｐ＜０．０５）。
【０１０６】
本研究では、敗血症のマウスモデルであるマウス内毒素血症を用いて、ＬＰＳ投与時の心機能に対する組換えヒトアネキシンＡ５の効果を調べた。心機能測定値に対して示す虞のある心臓の心血管系反射及び負荷条件の影響を避けるために、摘出Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ心臓標本を使用した。ＬＰＳは心機能不全を誘発したが、アネキシンＡ５処置によりある程度回復した。以上の結果は、アネキシンＡ５がマウスの内毒素血症時の心機能を改善することを初めて示すものである。アネキシンＡ５はアネキシンＡ１と同じアネキシンスーパーファミリーに属するが、これらは別個の遺伝子によりコードされている異なる蛋白質である（［５］）。アネキシンＡ５が抗炎症効果を有するかどうかを判定するために、心筋ＴＮＦ−α発現を測定した。図２及び図３に示した結果から分かるように、アネキシンＡ５で処置することにより内毒素血症時のＬＶ心筋におけるＴＮＦ−αのｍＲＮＡ及び蛋白質レベルは有意に減少し、抗炎症効果が示唆される。ＴＮＦ−αの産生が敗血症時の心機能不全の大きな要因であるので、心筋ＴＮＦ−α発現の低下はアネキシンＡ５が内毒素血症モデルの心機能を改善する重要なメカニズムとなる。
【０１０７】
実施例４−実施例５乃至１０の実験プロトコル
マウスを以下の群、即ち、食塩水（偽対照、ｎ＝１５）、組換えヒトアネキシンＡ５（ｎ＝１１）、リポ多糖（ＬＰＳ、ｎ＝１６）及びＬＰＳプラス組換えヒトアネキシンＡ５（ｎ＝１７）処置群に無作為に割り付けた。ＬＰＳ（４ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）は敗血症をシミュレートするために投与した。マウスは、ＬＰＳ投与の直後及び２時間後の２回の組換えヒトアネキシンＡ５（５μｇ／ｋｇ  ｉ．ｖ．）注射により処置した。ＬＰＳ投与の４時間後に、マウスをケタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１２．５ｍｇ／ｋｇ）混液のＩＰ注射で麻酔し、Ｍｉｌｌａｒ圧伝導カテーテルを用いてインビボ心機能を測定した。一部のマウスを屠殺し、採血し、心臓を摘出した。エクスビボでの心機能はＬａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ心臓標本を用いて測定した。心機能測定の終了後、血漿及び心臓を、更なる分析のために−８０℃の冷凍庫に貯蔵した。
【０１０８】
血行動態測定
ＬＰＳ及び／又はアネキシンＡ５処置の４時間後に、マウスをケタミン及びキシラジンで麻酔した。Ｍｉｌｌａｒ圧伝導カテーテル（型式ＳＰＲ−８３９、サイズ１．４Ｆ）を右頸動脈に挿入し、ＬＶ中へ進めた。１０分間安定させた後、ＰｏｗｅｒＬａｂ  Ｃｈａｒｔプログラム（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用い、シグナルを連続的に記録した。血行動態パラメータは、心臓圧−容量分析プログラム（ＰＶＡＮ  ３．２、Ｍｉｌｌａｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＴＸ）により以前に報告されたようにして（Ｘｉａｎｇほか、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．  ２００９年、１２０：１０６５−１０７４）分析した。
【０１０９】
摘出マウス心臓標本
ＬＰＳ及び／又はアネキシンＡ５処置の４時間後に、マウスを屠殺した。マウスの心臓を摘出し、以前報告された（Ｐｅｎｇほか、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．  ２００５年、１１１：１６３７−１６４４）ようにしてＬａｎｇｅｎｄｏｒｆｆシステムで潅流して心機能を測定した。つまり、心臓を２ｍＬ／分の一定流量のＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ緩衝液で潅流した。潅流緩衝液は３７℃に維持し、９５％Ｏ２及び５％ＣＯ２の混合気体で連続的に泡立たせた。６−０絹製縫合糸を左心室尖を介して置き、力−変位変換器（ＦＴ０３、Ｇｒａｓｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ．）に接続されている軽量剛性の連結棒を通した。収縮力及び心拍数をＰｏｗｅｒＬａｂ  Ｃｈａｒｔプログラム（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によって測定した。心仕事量を上記力（ｇ）に上記心拍数（拍／分）を乗じることで算出し、心重量に対して標準化した。
【０１１０】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによるＴＮＦ−α及びインターロイキン（ＩＬ）−１β  ｍＲＮＡの測定
以前に報告された（Ｐｅｎｇほか、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．  ２００３年；５９：８９３−９００及びＧｅｏｇｈｅｇａｎ−Ｍｏｒｐｈｅｔほか、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ．  ２００７年；７５：４０８−４１６）ようにしてＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、Ｏｎｔａｒｉｏ）を用い、ＬＶ心筋及び心筋細胞から全ＲＮＡを分離した。Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素及びランダムプライマー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、Ｏｎｔａｒｉｏ）を用いてｃＤＮＡを合成した。リアルタイムＰＣＲは、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘをメーカー（Ａｂｍ、Ｖｅｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ）の使用説明書に従って用い、実施した。ＴＮＦ−？のオリゴヌクレオチドプライマーはセンス５’  ＣＣＧ  ＡＴＧ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＡＣＣ  ＴＴＧ  ＴＣ  ３’及びアンチセンス５’  ＧＧＧ  ＣＴＧ  ＧＧＴ  ＡＧＡ  ＧＡＡ  ＴＧＧ  ＡＴ  ３’とした。ＩＬ−１βのプライマーはセンス５’  ＡＣＡＡＧＧＡＧＡＡＣＣＡＡＧＣＡＡＣＧＡＣ  ３’及びアンチセンス５’  ＧＣＴＧＡＴＧＴＡＣＣＡＧＴＴＧＧＧＧＡＡＣ  ３’とした。センス５’  ＴＴＧ  ＡＡＡ  ＡＴＣ  ＣＧＧ  ＧＧＧ  ＡＧＡ  Ｇ  ３’及びアンチセンス５’  ＡＣＡ  ＴＴＧ  ＴＴＣ  ＣＡＡ  ＣＡＴ  ＧＣＣ  ＡＧ  ３’のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる負荷対照として２８ＳｒＲＮＡを使用した。サンプルはＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｏｐｔｉｃｏｎ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ装置を用いて３５サイクル増幅した。
【０１１１】
ＴＮＦ−α及びＩＬ−１β蛋白質レベルの測定
本出願者の以前の報告８、９に記載されているようにして、マウスＴＮＦ−α  ＥＬＩＳＡキット（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｍｉｓｓｉｓａｕｇａ、Ｏｎｔａｒｉｏ）を用いて心筋及び血漿ＴＮＦ−α蛋白質レベルを測定した。この左心室（ＬＶ）心筋組織をＰＢＳ中にホモゲナイズした。遠心分離後、上清を採集して蛋白質濃度及びＴＮＦ−α  ＥＬＩＳＡの測定を行った。心筋ＴＮＦ−αの測定値は各サンプルの蛋白質濃度で標準化した。血漿ＩＬ−１β蛋白質レベルは、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ、ＣＡからのＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。
【０１１２】
ｐ３８及びＥＲＫ１／２  ＭＡＰＫのリン酸化
心臓組織中のリン酸化／全ｐ３８及びＥＲＫ１／２蛋白質レベルをウエスタンブロット分析により分析した。つまり、４０μｇの蛋白質をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。次に、蛋白質をポリビニリデンジフルオリド膜に移し、ブロットをｐ３８（１：８００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）、リン酸化ｐ３８（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２、１：８００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＥＲＫ１／２（１：８００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）又はリン酸化ＥＲＫ１／２（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４、１：８００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）に対する抗体でプローブした。ブロットを西洋ワサビペルオキシダーゼ−結合二次抗体（１：２，０００、ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）でプローブし、ＥＣＬ化学発光法を用いて検出を行った。
【０１１３】
成体心筋細胞の培養
成体ＷＴ及びｎＮＯＳ−／−マウスの心臓から心筋細胞を分離した。心臓をＬａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ装置に取り付け、４５μｇ／ｍＬのリベラーゼブレンザイムＩＶ（Ｒｏｃｈｅ）を含む消化用緩衝液で潅流した。消化後、細胞を再懸濁し、漸増濃度（１２．５μＭ乃至１．０ｍＭ）のＣａ２＋を含有する緩衝液中の一連の沈殿及び再懸濁工程にかけた。次いで、棒状筋細胞をラミニン被覆３５ｍｍ皿に５０個／ｍｍ２の密度でプレートし、２％ＣＯ２中３７℃で６時間培養した。この後に、アネキシンＡ５（１．０μｇ／ｍｌ）を添加するか、添加せずにＬＰＳ（２．５μｇ／ｍｌ）で４時間処置した。
【０１１４】
同時免疫沈降
Ｄｙｎａｂｅａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ｌｍｍｕｎｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＣＡ）を用いてＴＬＲ４及びアネキシンＡ５の同時免疫沈降を実施した。つまり、磁気ダイナビーズを２０μｇのＴＬＲ４抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）含有抗体結合性緩衝液中に１時間懸濁した。心筋組織をＮＰ４０細胞溶解緩衝液にホモゲナイズし、超音波処理した。Ｌｏｗｒｙ蛋白分析法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、ＯＮ）を用いて蛋白質濃度を測定した。濃度を測定することによってチューブ当たり１ｍｇの蛋白質と、使用量を等しくすることを可能とした。ヒト組換えアネキシンＡ５（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ、ＣＡ）５００ｎｇを組織サンプルに添加し、ＴＬＲ４被覆ビーズと共に２時間インキュベートした。こうしたサンプルをダイナビーズから溶離させ、１２％ポリアクリルアミドゲルに等しく負荷した。ウェスタンブロッティングを行い、抗アネキシンＡ５抗体（１：２，０００、Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ、ＣＡ）を用いてアネキシンＡ５を検出した。膜を取り除き、抗ＴＬＲ４抗体（１：２，０００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）を用いてＴＬＲ４について再プローブした。
【０１１５】
統計解析
結果は全て平均値±ＳＥＭで表した。二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いてボンフェローニ補正した対応のないスチューデントのｔ検定を行い、処置群間の差を検出した。Ｐ値が０．０５未満である場合に統計的有意性を付与した。
【０１１６】
実施例５−インビボの心機能に対するアネキシンＡ５の効果
食塩水、アネキシンＡ５、ＬＰＳ又はＬＰＳプラスアネキシンＡ５処置の４時間後に、マウスを麻酔し、心機能をＭｉｌｌａｒ圧伝導カテーテルにより測定した。得られる血行動態パラメータとしては、平均動脈圧（ＭＡＰ：ｍｅａｎ  ａｒｔｅｒｙ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）、心拍数、左心室駆出率（ＬＶＥＦ：ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｌｅ  ｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）、心拍出量、左心室圧微分値（ＬＶ  ｄＰ／ｄｔｍａｘ及びｄＰ／ｄｔｍｉｎ）、最大ｄＰ／ｄｔ時の圧（Ｐ＠ｄＰ／ｄｔｍａｘ）、ＬＶ収縮終期圧（ＬＶＥＳＰ：ＬＶ  ｅｎｄ  ｓｙｓｔｏｌｉｃ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）、ＬＶ拡張終期圧（ＬＶＥＤＰ：ＬＶ  ｅｎｄ  ｄｉａｓｔｏｌｉｃ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）、ＬＶ拡張終期容積（ＬＶＥＤＶ：ＬＶ  ｅｎｄ  ｄｉａｓｔｏｌｉｃ  ｖｏｌｕｍｅ）、等容性弛緩の時定数（Ｔａｕ）及び最大パワーが挙げられる（表２、図４）。ＬＰＳ処置後、ＭＡＰ、ＬＶＥＦ、ＬＶ＋ｄＰ／ｄｔｍａｘ及び−ｄＰ／ｄｔｍｉｎ、Ｐ＠ｄＰ／ｄｔｍａｘ、ＬＶＥＳＰ、ＬＶＥＤＰ及び最大パワーは有意に（Ｐ＜０．０１）減少したが、ＬＶＥＤＶは有意に（Ｐ＜０．０１）増加した。アネキシンＡ５を処置すると、内毒素血症マウスのＬＶＥＳＰ及びＰ＠ｄＰ／ｄｔｍａｘは有意に増加した（Ｐ＜０．０５、表２）。重要なことは、ＬＶ  ＋ｄＰ／ｄｔｍａｘ及び−ｄＰ／ｄｔｍｉｎが、ＬＰＳ群に比し、ＬＰＳ及びアネキシンＡ５処置群において有意に増加したことである（Ｐ＜０．０５、図４）。
【０１１７】
実施例６−エクスビボにおける心機能に対するアネキシンＡ５の効果
食塩水、アネキシンＡ５、ＬＰＳ又はＬＰＳプラスアネキシンＡ５処置の４時間後に、動物を屠殺し、心機能をＬａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ心臓標本を用いて測定した。心拍数及び収縮力を記録した。心仕事量並びに収縮（＋ｄＦ／ｄｔｍａｘ）及び弛緩（−ｄＦ／ｄｔｍｉｎ）速度を解析した。その結果、収縮及び弛緩速度、収縮力並びに心仕事量は、偽対照に比しＬＰＳ処置群では有意に減少することが分かった（図５、Ｐ＜０．００１）。組換えヒトアネキシンＡ５で処置すると、ＬＰＳ群に比し、４種の心臓パラメータの全てが有意に改善した（図６、Ｐ＜０．０１）。
【０１１８】
実施例７−心筋及び血漿ＴＮＦ−αレベルに対するアネキシンＡ５の効果
食塩水、アネキシンＡ５、ＬＰＳ又はＬＰＳプラスアネキシンＡ５処置の４時間後に、心筋ＴＮＦ  ｍＲＮＡ及び蛋白質発現をそれぞれ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ及びＥＬＩＳＡにより測定した。ＴＮＦ−α  ｍＲＮＡ及び蛋白質レベルはいずれも、食塩水処置の偽対照に比し、ＬＰＳ処置マウスのＬＶ心筋において有意に増大した（Ｐ＜０．０１、図６Ａ及び図６Ｂ）。アネキシンＡ５により処置すると、ＬＰＳにより誘発されるＴＮＦ−α発現は有意に低下した（Ｐ＜０．０５、図６Ａ及び図６Ｂ）。同様に、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１βの血漿レベルは、ＬＰＳ処置マウスでは有意に増大し（Ｐ＜０．０１）、これはアネキシンＡ５処置により有意に低下した（Ｐ＜０．０５、図６Ｃ及び図６Ｄ）。
【０１１９】
実施例８−心筋ｐ３８及びＥＲＫ１／２リン酸化に対するアネキシンＡ５の効果
本発明者らは、ｐ３８及びＥＲＫ１／２  ＭＡＲＫをＬＰＳにより活性化することにより心筋ＴＮＦ−αの発現がもたらされることを証明した。ｐ３８及びＥＲＫ１／２はＬＰＳ誘発ＴＮＦ−α発現において重要な役割を果たしていることから、心筋ｐ３８及びＥＲＫ１／２のリン酸化に対するアネキシンＡ５の効果をウエスタンブロット分析法により検討した。ＬＰＳ（４ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）処置の３０分後、心筋ｐ３８及びＥＲＫ１／２のリン酸化は有意に増大した（Ｐ＜０．０５、図４）。アネキシンＡ５をＬＰＳと共に処置すると、ｐ３８及びＥＲＫ１／２のリン酸化は対照レベルまで戻った（Ｐ＜０．０５、図７）。
【０１２０】
実施例９−心筋細胞におけるＴＮＦ−α及びＩＬ−１β発現に対するアネキシンＡ５の効果
心筋細胞におけるＴＮＦ−α及びＩＬ−１βの発現に対するアネキシンＡ５の直接的効果を明らかにするために、成体心筋細胞を摘出して培養した。上記に報告したインビボデータと一致して、ＬＰＳは、この培養成体心筋細胞においてリアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより測定したＴＮＦ−α及びＩＬ−１β  ｍＲＮＡレベルを有意に増大させ、この反応はアネキシンＡ５処置により抑止された（Ｐ＜０．０５、図８Ａ及び図８Ｂ）。
【０１２１】
実施例１０−アネキシンＡ５及びＴＬＲ４受容体間の相互作用
アネキシンＡ５がＬＰＳ誘発ＴＬＲ４シグナル伝達を阻害するメカニズムをさらに明らかにするために、同時免疫沈降法を用いてアネキシンＡ５及びＴＬＲ４受容体間の相互作用を検討した。食塩水及びＬＰＳ処置マウスからの心筋組織をホモゲナイズし、アネキシンＡ５と共にインキュベートした。磁気ダイナビーズを抗ＴＬＲ４抗体で被覆してＴＬＲ４受容体を沈降させ、アネキシンＡ５についてブロットした。陽性対照として組換えヒトアネキシンＡ５を使用した。データから、食塩水及びＬＰＳ処置マウスの両方からの心筋サンプルにおけるアネキシンＡ５特異的バンド、これがアネキシンＡ５及びＴＬＲ４受容体間の相互作用を示していることが分かった（図９）。
【０１２２】
内毒素血症のマウスモデルによって、ＬＰＳ投与時の心機能に対するアネキシンＡ５の効果が明らかとなった。Ｍｉｌｌａｒ圧伝導カテーテルを用いてインビボでの心機能を測定した。データから、ＬＰＳによって誘発される心機能不全はアネキシンＡ５処置後に有意に改善されることが分かった。心機能測定値に対して示す虞のある心臓の心血管系反射及び負荷条件の影響を避けるために、摘出Ｌａｎｇｅｎｄｏｒｆｆ心臓標本を使用した。インビボでのデータと一致して、ＬＰＳ誘発心機能不全はアネキシンＡ５処置によりある程度回復した。従って、以上の結果は、アネキシンＡ５がマウスの内毒素血症時の心機能を改善することを本明細書で初めて示すものである。
【０１２３】
また、以上の結果から、アネキシンＡ５で処置することにより内毒素血症時のＬＶ心筋においてＴＮＦ−αのｍＲＮＡ及び蛋白質レベルのいずれも有意に減少したことが分かる。心筋ＴＮＦ−αの発現が減少したことの他に、内毒素血症マウスにおけるアネキシンＡ５処置によってＴＮＦ−α及びＩＬ−１βの血漿レベルも減少した。さらに、アネキシンＡ５で処置することにより培養成体心筋細胞におけるＴＮＦ−α及びＩＬ−βの発現が阻害された。これらのデータから、アネキシンＡ５は抗炎症効果を有することが分かる。また、心筋のｐ３８及びＥＲＫ１／２リン酸化がＬＰＳ処置後に増大することも分かった。このｐ３８及びＥＲＫ１／２リン酸化の増大はアネキシンＡ５の処置により完全に抑止され、このことからアネキシンＡ５はＴＬＲ４／ＭＡＰＫシグナル伝達経路を妨げることが分かった。アネキシンＡ５はＴＬＲ４受容体のロイシンに富んだ繰り返し配列と相互作用してＬＰＳ誘発シグナル伝達を阻害すると考えられる。アネキシンＡ５とＴＬＲ４との間の相互作用の可能性を確認するために同時免疫沈降を行い、そのデータからアネキシンＡ５はＴＬＲ４と同時免疫沈降することが分かり、アネキシンＡ５及びＴＬＲ４受容体間の相互作用が示唆された。アネキシンＡ５によるロイシンに富んだ繰り返し配列への結合が受容体機能を阻害することが示されたので、アネキシンＡ５はそのＴＬＲ４受容体との相互作用を介してＬＰＳ誘発ＴＬＲ４／ＭＡＰＫシグナル伝達を阻害する可能性が高い。
【０１２４】
要約すると、本明細書に示したデータは内毒素血症のマウスモデルにおいてアネキシンＡ５の新規な効果を示したものである。アネキシンＡ５で処置すると、心筋のＴＮＦ−α発現が低下し、内毒素血症時の心機能が改善される。アネキシンＡ５のこうした有益な効果は、そのＴＬＲ４受容体との相互作用を介してＴＬＲ４／ＭＡＰＫシグナル伝達を阻害することによって達成される。従って、アネキシンＡ５は、敗血症の処置における重要な治療的用途を有する。
【０１２５】
表１：ヒトアネキシンＡ５のｍＲＮＡ及びアミノ酸配列を示す。ｍＲＮＡのコード配列は太字で示されている。
【０１２６】
【表１】
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表２：内毒素血症マウスにおけるインビボ血行動態測定値
【０１２７】
【表２】
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データは平均値±ＳＥＭであり、二元ＡＮＯＶＡに続いてボンフェローニ補正した対応のないスチューデントのｔ検定を行って解析した。＊＊  食塩水に対してＰ＜０．０１、†  ＬＰＳに対してＰ＜０．０５。ＭＡＰ：平均動脈圧、ＳＷ：一回仕事量、Ｐ＠ｄＰ／ｄｔｍａｘ：最大ｄＰ／ｄｔ時のＬＶ圧、ＬＶＥＳＰ：ＬＶ収縮終期圧、ＬＶＥＤＰ：ＬＶ拡張終期圧、ＬＶＥＤＶ：ＬＶ拡張終期容積、Ｔａｕ：等容性弛緩の時定数。
【０１２８】
【化１】
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【０１２９】
【化２】
0005590621.tif 000005
【０１３０】
【化３】
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上記の実施態様は例であることを意味し、当業者は、これに対して、本明細書に添付の特許請求の範囲で定義されている本発明の範囲を逸脱することなく変更又は修正を加えることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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