(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主DNAの置換対象領域の塩基配列に対して1〜数個の変異を導入した塩基配列から成る置換対象領域を含む供与体DNAの置換対象領域と、宿主DNAの置換対象領域との置換において、
宿主DNAの置換対象領域を一部又は全部欠失させる第１工程と、
供与体DNAと宿主DNAとの間の組換えを行う第２工程とを含み、
第２工程では、供与体DNAの置換対象領域が宿主DNAに導入されることを特徴とする、宿主DNAの置換方法。
【請求項２】
上記第２工程後に、供与体DNA及び/又は宿主DNAに存在する選択マーカー遺伝子を指標に、供与体DNAの置換対象領域を有する形質転換体を選択する工程を含むことを特徴とする、請求項１記載の宿主DNAの置換方法。
【請求項３】
上記供与体DNAがプロトプラスト中のDNAであり、且つ、上記宿主がコンピテントセルであることを特徴とする、請求項１又は２記載の宿主DNAの置換方法。
【請求項４】
上記宿主が枯草菌であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項記載の宿主DNAの置換方法。
【請求項５】
上記供与体DNAの置換対象領域が20kb以上のDNAサイズであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載の宿主DNAの置換方法。
【請求項６】
上記宿主DNAの置換対象領域は生育に必須な遺伝子を含み、且つ上記第１工程が以下の１）又は２）の方法によるものであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項記載の宿主DNAの置換方法。
１）宿主DNAの置換対象領域を少なくとも前記生育に必須な遺伝子を含むDNA断片にて置換する方法。
２）前記生育に必須な遺伝子以外の置換対象領域を欠失させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば枯草菌ゲノム等を宿主DNAとして、当該宿主DNAの所定の領域を供与体DNAの相当する領域にて置換する、宿主DNAの置換方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、形質転換方法としては、例えば、組換えプラスミドやDNA断片を大腸菌等の宿主に導入するコンピテントセル形質転換法（J. Bacterial. 93, 1925 (1967)）が挙げられる。また、宿主に応じて、例えばプロトプラスト形質転換法、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、リン酸カルシウム法及びリポフェクション法等によって、組換えプラスミドやDNA断片を宿主に形質転換することができる。
【０００３】
しかしながら、以上のような従来の形質転換方法では、例えば、100kb以上の大きなサイズのDNA断片を、宿主DNA中に導入することが困難であった。
【０００４】
そこで、大きなサイズのDNA断片を宿主DNA中に導入すべく、LP(lysis of protoplasts)形質転換方法と呼ばれる形質転換方法が開発されている(非特許文献１及び２)。LP形質転換方法では、抽出したDNA断片や組換えプラスミドに代えて、例えば枯草菌(Bacillus subtilis)の菌株の細胞壁を溶解させたプロトプラストを供与体DNAとして、レシピエント菌株のコンピテントセルに供与する。添加されたプロトプラストは浸透圧ショックにより破壊され、培養液中に放出された供与体DNAがレシピエント菌株のコンピテントセルに取り込まれるものと考えられている。また、LP形質転換方法によれば、一般的な形質転換方法に比べて、導入すべきDNAの損傷は大幅に軽減する。LP形質転換方法を用いた場合には、100kb以上のDNA断片を、宿主DNAに導入することが比較的容易である。
【０００５】
しかしながら、LP形質転換方法では、目的のDNA断片のサイズが大きくなるほど、プロトプラストの供与体DNAとレシピエント菌株の宿主DNAとの間の相同領域において、複数箇所で相同組換えが生じる可能性がある。すなわち、LP形質転換方法では、大きなサイズの目的のDNA断片を宿主DNAに正確に導入することが困難であった。
【０００６】
そこで、形質転換方法として、大きなサイズのDNA断片を宿主DNA中に正確に導入する方法が望まれている。
【０００７】
【非特許文献１】T. Akamatsu及びJ. Sekiguchi, 「Archives of Microbiology」, 1987年, 第146巻, p.353-357
【非特許文献２】T. Akamatsu及びH. Taguchi, 「Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry」, 2001年, 第65巻，第4号, p.823-829
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上述した実情に鑑み、大きなサイズのDNA断片を宿主DNA中に正確に導入する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、宿主DNAの置換対象領域を一部又は全部欠失させた後に、供与体DNAと宿主DNAとの間の組換えを行うことで、供与体DNAの置換対象領域が宿主DNAに正確に導入されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は以下を包含する。
（１）宿主DNAの置換対象領域を一部又は全部欠失させる第１工程と、供与体DNAと宿主DNAとの間の組換えを行う第２工程とを含み、第２工程では、供与体DNAの置換対象領域が宿主DNAに導入されることを特徴とする、宿主DNAの置換方法。
【００１１】
（２）上記第２工程後に、供与体DNA及び/又は宿主DNAに存在する選択マーカー遺伝子を指標に、供与体DNAの置換対象領域を有する形質転換体を選択する工程を含むことを特徴とする、（１）記載の宿主DNAの置換方法。
【００１２】
（３）上記供与体DNAがプロトプラストであり、且つ、上記宿主がコンピテントセルであることを特徴とする、（１）又は（２）記載の宿主DNAの置換方法。
【００１３】
（４）上記宿主が枯草菌であることを特徴とする、（１）〜（３）のいずれか１記載の宿主DNAの置換方法。
【００１４】
（５）上記供与体DNAの置換対象領域が20kb以上のDNAサイズであることを特徴とする、（１）〜（４）のいずれか１記載の宿主DNAの置換方法。
【００１５】
（６）上記宿主DNAの置換対象領域は生育に必須な遺伝子を含み、且つ上記第１工程が以下の１）又は２）の方法によるものであることを特徴とする、（１）〜（５）のいずれか１記載の宿主DNAの置換方法。
１）宿主DNAの置換対象領域を少なくとも前記生育に必須な遺伝子を含むDNA断片にて置換する方法。
２）前記生育に必須な遺伝子以外の置換対象領域を欠失させる方法。
【００１６】
（７）上記（１）〜（６）のいずれか１記載の宿主DNAの置換方法で置換対象領域が置換された形質転換体。
【発明の効果】
【００１７】
本発明により、大きなサイズのDNA断片を宿主DNA中に正確に、すなわち一括して導入することができる宿主DNAの置換方法が提供される。本発明に係る宿主DNAの置換方法では、置換対象領域間での相同組換えが生じることなく、供与体DNAの置換対象領域を宿主DNA中に導入することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明に係る宿主DNAの置換方法は、宿主DNAにおける置換対象領域を供与体DNAにおける置換対象領域に置換する方法である。本方法においては、先ず、宿主DNAの置換対象領域を一部又は全部欠失させる。次に、置換対象領域の一部又は全部を欠失した宿主DNAと置換対象領域を有する供与体DNAとを、相同組換えが生じうる条件下に共存させる。このとき、宿主DNAには、供与体DNAの置換対象領域に対応する領域が実質的に、あるいは全く存在しないが、供与体DNAの置換対象領域の外側の領域に対応する領域は存在している。このため、宿主DNAと供与体DNAとは、置換対象領域の外側の領域で一組の鎖間交換構造を形成することとなる。この一組の鎖間交換構造が形成されることで、宿主DNAと供与体DNAとの間の二重交差の相同組換えが生じ、供与体DNAの置換対象領域を宿主DNAに導入することができる。
【００１９】
ここで、置換対象領域とは、相同組換えによって置換される領域を意味する。従って、置換対象領域は、宿主DNA及び供与体DNAそれぞれに存在し、宿主DNAと供与体DNAとの間の相同組換え過程において一組の鎖間交換構造を形成する領域に挟まれる領域を意味する。なお、宿主DNAの置換対象領域及び供与体DNAの置換対象領域は、同一の塩基配列からなるものであっても良いし、異なる塩基配列を有するものであっても良い。例えば、供与体DNAの置換対象領域は、宿主DNAの置換対象領域の塩基配列に対して1〜数個の変異を導入した塩基配列からなるものであっても良いし、宿主DNAの置換対象領域に所定のDNA断片を導入したものであっても良い。ここでいう変異とは、例えば、1〜数個の塩基が他の塩基に置換されたもの、1〜数個の塩基が欠失されたもの、1〜数個の塩基が付加されたもの、又は1〜数個の遺伝子等の連続した塩基配列が欠失されたものを示す。
【００２０】
また、本発明に係る宿主DNAの置換方法において、宿主DNAの置換対象領域を一部欠失させる場合における、宿主DNAの置換対象領域の一部とは、宿主DNAの置換対象領域において宿主の生育に必須な遺伝子(以下、「生育必須遺伝子」という)や、宿主DNAに残存させたい遺伝子を除く領域を意味する。ここで生育必須遺伝子としては、宿主の生育に必須な遺伝子であれば特に限定されないが、例えば枯草菌においては、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 4679 (2003)に示される生育に必須な271遺伝子が挙げられ、より具体的にはdnaA等のDNA複製に関与する遺伝子、rpoBやsigA等の転写に関与する遺伝子、fusやtufA等の翻訳に関与する遺伝子、またprsA等のタンパク質分泌に関与する遺伝子等が挙げられる。また、宿主DNAに残存させたい遺伝子は、何ら限定されず、生育に必須でない遺伝子を含む意味である。
【００２１】
さらに、置換対象領域の外側の領域とは、一方の鎖を基準として、置換対象領域における3'末端側に続く領域と5'末端側に続く領域とを意味し、宿主DNAと供与体DNAとの間の相同組換え過程において一組の鎖間交換構造を形成する部位を含む領域を意味する。従って、宿主DNAにおける置換対象領域の外側の領域と供与体DNAにおける置換対象領域の外側の領域とは、鎖間交換構造を形成しうる程度に高い相同性を有していることが好ましい。
【００２２】
具体的に、宿主DNAにおける置換対象領域の外側の領域と供与体DNAにおける置換対象領域の外側の領域との相同性は、例えば、Lipman-Pearson法 (Science, 227, 1435, (1985))によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を2として解析を行うことに基づいて計算することができる。当該計算の結果によれば、宿主DNAにおける置換対象領域の外側の領域と供与体DNAにおける置換対象領域の外側の領域とは、60％以上の相同性を有していればよく、80％以上が好ましく、90％以上がさらに好ましく、95％以上が特に好ましく、99％以上の相同性を有していることが最も好ましい。
【００２３】
供与体DNAとは、宿主DNAに導入する目的の置換対象領域及び置換対象領域の外側の領域とを有するDNAを意味する。供与体DNAとしては、DNA断片、ゲノムの全体若しくはその一部、プラスミド、シャトルベクター、ヘルパープラスミド、ファージDNA、ウイルスベクター、BAC（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 8242(1990)）及びYAC（Science 236, 806 (1987)）など、更にはプラスミド、シャトルベクター、ヘルパープラスミド、ファージDNA、ウイルスベクター、BAC及びYACなどにクローニングされたDNA断片やゲノムDNAの一部等などが挙げられる。例えば、プラスミドとしては、大腸菌(Escherichia coli）由来のプラスミド（例えばpET30bなどのpET系、pBR322およびpBR325などのpBR系、pUC118、pUC119、pUC18およびpUC19などのpUC系、pBluescript等）、枯草菌(Bacillus subtilis)由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5等)、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13などのYEp系、YCp50などのYCp系等)などが挙げられる。またファージDNAとしては、λファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP等）やPBS1ファージ（J. Bacteriol. 90, 1575 (1965)）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルスベクター、カリフラワーモザイクウイルスなどの植物ウイルスベクター、またはバキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。さらに、本発明に係る宿主DNAの置換方法において、以下に説明するLP形質転換方法を用いる場合には、例えば、枯草菌等の微生物自体を供与体DNAとして使用することができる。
【００２４】
宿主DNAとは、供与体DNAの置換対象領域が導入される対象となる領域（置換対象領域）及び置換対象領域の外側の領域を有するDNAを意味する。宿主DNAとしては、所定の生物におけるゲノムDNA及びミトコンドリアDNA等を挙げることができる。宿主としては、枯草菌等のバチルス属、大腸菌等のエッシェリヒア属及びシュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)等のシュードモナス属に属する細菌、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)及びシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)等の酵母、COS細胞及びCHO細胞等の動物細胞、Sf9等の昆虫細胞、並びにイネ科(イネ(Oryza sativa)、トウモロコシ(Zea mays))、アブラナ科(シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana))、ナス科(タバコ（Nicotiana tabacum）及びマメ科(ダイズ(Glycine max))等の植物が挙げられる。特に、枯草菌が好ましい。
【００２５】
一方、本発明に係る置換方法では、従来正確に置換することが困難であった大きなサイズのDNAであっても正確に置換することが可能である。本発明に係る置換方法では、宿主DNA及び供与体DNAの置換対象領域のサイズは、特に限定されない。従来のLP形質転換法によれば、下記の比較例に示すように置換対象領域のサイズが大きくなるとドナー菌株の置換対象領域の両端の領域がレシピエント菌株に導入された場合に、間に挟まれた領域が同時にレシピエント菌株に保持される割合（同時転換率）は下がってしまう。一方、本発明に係る置換方法では、置換対象領域のサイズによらず同時転換率は100%となるので、置換対象領域のサイズが大きくなるほど改善効果は高くなる。よって、本発明では、宿主DNA及び供与体DNAの置換対象領域のサイズは、20kb以上が好ましく、30kb以上がより好ましく、60kb以上が特に好ましく、100kb以上が最も好ましい。また、例えば枯草菌のゲノムにて生育必須遺伝子を含まない連続した領域で最大の領域は、dltA遺伝子〜yycH遺伝子間の約200kbである（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 4679 (2003) ）。この観点から生育必須遺伝子を削除しないことを考慮し、宿主DNA及び供与体DNAの置換対象領域のサイズは、200kb以下が好ましく、180kb以下がより好ましく、160kb以下が特に好ましく、140kb以下が最も好ましい。さらに、宿主DNAの置換対象領域のサイズは、供与体DNAの置換対象領域と同程度か、遺伝子領域の欠失等により小さくなっている場合には何ら問題はなく、また塩基配列の挿入等により供与体DNAの置換対象領域より大きくなっている場合にも問題は生じない。例えば、当該供与体DNAと宿主DNAとの間における置換対象領域間のサイズ差は、200kb以下、好ましくは140kb以下、より好ましくは100kb以下、特に好ましくは20kb以下とすることができる。
【００２６】
本発明に係る宿主DNAの置換方法において、相同組換えが生じる条件下にて、宿主DNAは置換対象領域を有していないため、供与体DNAと宿主DNAが近接したとしても、置換対象領域の内部に鎖間交換構造を形成することがない。従って、本発明に係る宿主DNAの置換方法によれば、置換対象領域の外側の領域においてのみ相同組換えが生じ、供与体DNAの置換対象領域を確実に宿主DNAに導入することができる。また、本発明に係る宿主DNAの置換方法によれば、置換対象領域が20kbp以上、特に140kbp以上といった長さを有する場合においても、置換対象領域内部に相同組換えが生じず、一括して確実に供与体DNAの置換対象領域を宿主DNAに導入することができる。
【００２７】
さらに、本発明に係る宿主DNAの置換方法では、供与体DNA及び/又は宿主DNAに存在する選択マーカー遺伝子を指標に、供与体DNAの置換対象領域を有する形質転換体を選択することができる。当該選択マーカー遺伝子を利用することで、置換対象領域の外側の領域以外の相同部位間等の望ましくない箇所での相同組換えにより生じた形質転換体を排除し、供与体DNAの置換対象領域を有する形質転換体を確実に選択することができる。ここで、選択マーカー遺伝子としては、特に限定されるものではないが、例えば、薬剤耐性遺伝子(クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子及びブラストサイジンS耐性遺伝子等)が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することが可能である。供与体DNA又は宿主DNAにおける選択マーカー遺伝子の存在位置は、選択の方法に応じて、適宜決定することができる。
【００２８】
例えば、供与体DNAの置換対象領域内部或いは末端に薬剤耐性遺伝子が存在する場合には、当該薬剤耐性を指標に供与体DNAの置換対象領域が導入された宿主DNA(形質転換体)を選択することができる。一方、宿主DNAにおいて、置換対象領域を欠失させると同時に、又は置換対象領域を欠失させた後に、置換対象領域の部位に薬剤耐性遺伝子を導入する。次いで、本発明に係る宿主DNAの置換方法によれば、置換対象領域の外側の領域においてのみ相同組換えが生じ、宿主DNAに存在する薬剤耐性遺伝子が供与体DNAの置換対象領域に置換されることとなる。従って、当該薬剤感受性を指標に供与体DNAの置換対象領域が導入された宿主DNAを選択することができる。
【００２９】
あるいは、以下に説明するLP形質転換方法を利用する場合、供与体DNAであるプロトプラスト溶液中に完全にはプロトプラスト化していない細胞が含まれることがある。そのため、供与体DNAに含まれる選択マーカー遺伝子のみを指標として形質転換体の選択を試みると、ドナー菌株そのものが選択されてしまうことがある。そこで、宿主DNAの置換対象領域及び置換対象領域の外側の領域以外の位置に存在させた選択マーカー遺伝子による選択を組み合わせることで、宿主DNAの置換対象領域の部位に供与体DNAの置換対象領域が導入された形質転換体を確実に選択することが出来る。また宿主DNAの置換対象領域及び置換対象領域の外側の領域以外の位置に薬剤耐性遺伝子等の選択マーカー遺伝子を存在させることで、置換対象領域の外側の領域以外の箇所で相同組換えが生じていない形質転換体を選択することができる。特に、宿主DNAの置換対象領域及び置換対象領域の外側の領域以外の位置に選択マーカー遺伝子を存在させると共に供与体DNAの適切な位置に選択マーカー遺伝子を存在させることが好ましい。供与体DNAの選択マーカー遺伝子を存在させる位置は、置換対象領域の内部又は末端が好ましく、特に末端が好ましい。
【００３０】
例示として、図１に枯草菌の供与体DNA又は宿主DNAへの薬剤耐性遺伝子の導入方法を示す。図１において、枯草菌の供与体DNA又は宿主DNA上には、連続して存在する遺伝子A、遺伝子B及び遺伝子Cが存在するものとする。一方、プラスミドには、薬剤耐性遺伝子が存在するものとする。なお、供与体DNA又は宿主DNAにおいて、5’側から3’側への方向は、一方の鎖を基準として遺伝子Aから遺伝子Cへの方向であるものとする。
【００３１】
先ず、当該供与体DNA又は宿主DNAを鋳型とし、遺伝子Aの5'末端部分に基づいて設計したプライマー1と、遺伝子Aの3'末端部分及び薬剤耐性遺伝子の5'末端部分に基づいて設計したプライマー2とのプライマーセットを用いたPCRにより遺伝子A及び薬剤耐性遺伝子の5'末端部分を有するPCR産物Aを調製する。同様に、当該供与体DNA又は宿主DNAを鋳型とし、遺伝子Cの5'末端部分及び薬剤耐性遺伝子の3'末端部分に基づいて設計したプライマー5と、遺伝子Cの3'末端部分に基づいて設計したプライマー6とのプライマーセットを用いたPCRにより、遺伝子C及び薬剤耐性遺伝子の3'末端部分を有するPCR産物Cを調製する。一方、薬剤耐性遺伝子が存在するプラスミドを鋳型とし、薬剤耐性遺伝子に基づいて設計したプライマーセット(プライマー3及び4)を用いたPCRにより、薬剤耐性遺伝子のPCR産物Bを調製する。次いで、得られたPCR産物A、B及びCを混合して鋳型とし、プライマーセット(プライマー1及び6)を用いたSOE(splicing by overlap extension)-PCR(Gene, 77, 61, (1989))を行う。SOE-PCRの結果、上記3個のPCR産物がPCR産物A、B及びCの順に含まれるPCR産物Dが得られる。
【００３２】
さらに、得られたPCR産物Dを用いて枯草菌の形質転換(例えば、コンピテントセル形質転換法(J. Bacterial. 93, 1925 (1967)))を行うことで、PCR産物Dと供与体DNA又は宿主DNAとの間で、遺伝子A領域及び遺伝子C領域における二重交差の相同組換えが生じる(図１では、相同組換えの態様を実線で示す)。その結果、当該供与体DNA又は宿主DNA上に存在する遺伝子Bが欠失し、且つPCR産物Dに存在する薬剤耐性遺伝子を、当該遺伝子B領域に導入することができる。
【００３３】
一方、本発明に係る宿主DNAの置換方法に使用することができる宿主DNAの置換対象領域を全部欠失させる方法としては、例えば、上述した枯草菌の供与体DNA又は宿主DNAへの薬剤耐性遺伝子の導入方法と同様の方法等が挙げられる。
【００３４】
以下に、宿主DNAの置換対象領域を全部欠失させる方法の例示として、上述した枯草菌の供与体DNA又は宿主DNAへの薬剤耐性遺伝子の導入方法と同様の方法を図２に基づいて説明する。なお、図２において、置換対象領域の外側の領域を「隣接領域(L)」及び「隣接領域(R)」と表記する。一方、プラスミドには、薬剤耐性遺伝子が存在するものとする。また、宿主DNAにおいて、5’側から3’側への方向は、一方の鎖を基準として隣接領域(L)から隣接領域(R)への方向であるものとする。
【００３５】
当該宿主DNAを鋳型とし、隣接領域(L)の5'末端部分に基づいて設計したプライマー1と、隣接領域(L)の3'末端部分及び薬剤耐性遺伝子の5'末端部分に基づいて設計したプライマー2とのプライマーセットを用いたPCRにより隣接領域(L)及び薬剤耐性遺伝子の5'末端部分を有するPCR産物を調製する。同様に、宿主DNAを鋳型とし、薬剤耐性遺伝子の3'末端部分及び隣接領域(R)の5'末端部分に基づいて設計したプライマー5と、隣接領域(R)の3'末端部分に基づいて設計したプライマー6とのプライマーセットを用いたPCRにより、隣接領域(R)及び薬剤耐性遺伝子の3'末端部分を有するPCR産物を調製する。一方、薬剤耐性遺伝子が存在するプラスミドを鋳型とし、薬剤耐性遺伝子に基づいて設計したプライマーセット(プライマー3及び4)を用いたPCRにより、薬剤耐性遺伝子のPCR産物を調製する。次いで、得られた上記3つのPCR産物を混合して鋳型とし、プライマーセット(プライマー1及び6)を用いたSOE-PCRにより、上記3個のPCR産物が、隣接領域(L)、薬剤耐性遺伝子及び隣接領域(R)の順に連結したPCR産物を得る。
【００３６】
さらに、得られたPCR産物を用いて宿主DNAを有する宿主(例えば、枯草菌)の形質転換を行うことで、PCR産物と宿主DNAとの間で、隣接領域(L)及び隣接領域(R)における二重交差の相同組換えが生じる(図２では、相同組換えの態様を実線で示す)。その結果、宿主DNA上に存在する置換対象領域を全部欠失させ、且つ薬剤耐性遺伝子を、当該置換対象領域の部位に導入することができる。あるいは、上述のPCR産物の調製に用いる各プライマー配列中に適当な制限酵素切断配列を施しておく。次いで、得られた各PCR産物を、プライマー配列中の制限酵素切断配列に対応した制限酵素で切断し、適当なプラスミドベクターに順次挿入する。このようにして、上述の隣接領域(L)、薬剤耐性遺伝子及び隣接領域(R)の順に連結したPCR産物を用いて作製されたDNA断片を組み込んだプラスミドを構築することができる。次に、構築したプラスミドを用いて宿主DNA(宿主)を形質転換し、宿主DNAの置換対象領域を全部欠失させ、且つ薬剤耐性遺伝子を、当該置換対象領域の部位に導入することができる。
【００３７】
以上のような方法により、宿主DNAの置換対象領域を全部欠失させることができる。
あるいは、本発明に係る宿主DNAの置換方法においては、宿主DNAの置換対象領域を一部欠失させる。例えば、置換対象領域内の生育必須遺伝子を含むプラスミドを用いて宿主の形質転換を図２に示した方法に準じて行う。当該形質転換によれば、宿主DNAにおいて、置換対象領域内に存在する生育必須遺伝子が残存し、その他の置換対象領域は欠失されることとなる。
【００３８】
より具体的に、宿主DNAの置換対象領域を一部欠失させる方法の例を、図３及び４に示す。図３及び４において、置換対象領域の外側の領域を「隣接領域(L)」及び「隣接領域(R)」と表記する。一方、プラスミドには、薬剤耐性遺伝子が存在するものとする。また、宿主DNAにおいて、5’側から3’側への方向は、一方の鎖を基準として隣接領域(L)から隣接領域(R)への方向であるものとする。さらに、相同組換えの態様を実線で示す。
【００３９】
図３に示す方法では、宿主DNAの置換対象領域における生育必須遺伝子を本来の配向とは逆の配向で残存させるとともに、当該生育必須遺伝子以外のその他の置換対象領域を欠失させる。先ず、当該宿主DNAを鋳型とし、隣接領域(L)の5'末端部分に基づいて設計したプライマー1と、隣接領域(L)の3'末端部分及び生育必須遺伝子の3'末端部分に基づいて設計したプライマー2とのプライマーセットを用いたPCRにより隣接領域(L)及び生育必須遺伝子の3'末端部分を有するPCR産物を調製する。同様に、宿主DNAを鋳型とし、薬剤耐性遺伝子の3'末端部分及び隣接領域(R)の5'末端部分に基づいて設計したプライマー7と、隣接領域(R)の3'末端部分に基づいて設計したプライマー8とのプライマーセットを用いたPCRにより、隣接領域(R)及び薬剤耐性遺伝子の3'末端部分を有するPCR産物を調製する。さらに、宿主DNAを鋳型とし、生育必須遺伝子の5'末端部分及び薬剤耐性遺伝子の5'末端部分に基づいて設計したプライマー3と生育必須遺伝子の3'末端部分に基づいて設計したプライマー4とのプライマーセットを用いたPCRにより、生育必須遺伝子及び薬剤耐性遺伝子の5'末端部分を有するPCR産物を調製する。一方、薬剤耐性遺伝子が存在するプラスミドを鋳型とし、薬剤耐性遺伝子に基づいて設計したプライマーセット(プライマー5及び6)を用いたPCRにより、薬剤耐性遺伝子のPCR産物を調製する。次いで、得られた上記4つのPCR産物を混合して鋳型とし、プライマーセット(プライマー1及び8)を用いたSOE-PCRにより、上記4個のPCR産物が、隣接領域(L)、生育必須遺伝子、薬剤耐性遺伝子及び隣接領域(R)の順に連結したPCR産物を得る。なお、PCR産物では、生育必須遺伝子は隣接領域(L)及び(R)に対して本来の配向と逆の配向で存在する。次いで、得られたPCR産物を用いて宿主DNAを有する宿主(例えば、枯草菌)の形質転換を行う。当該形質転換において、隣接領域(L)及び隣接領域(R)における二重交差の相同組換えが生じる。その結果、宿主DNAにおいて、置換対象領域内に存在する生育必須遺伝子が、宿主DNA中の他の領域に対して本来の配向とは逆の配向で残存し、その他の置換対象領域は欠失されることとなる。
【００４０】
一方、図４に示す方法では、宿主DNAにおいて置換対象領域中の生育必須遺伝子の上流側と下流側の欠失を2段階に分けて行い、当該生育必須遺伝子以外のその他の置換対象領域を欠失させる。先ず、第1段階では、当該宿主DNAを鋳型とし、隣接領域(L)の5'末端部分に基づいて設計したプライマー1と、隣接領域(L)の3'末端部分及び薬剤耐性遺伝子Aの5'末端部分に基づいて設計したプライマー2とのプライマーセットを用いたPCRにより隣接領域(L)及び薬剤耐性遺伝子Aの5'末端部分を有するPCR産物を調製する。同様に、宿主DNAを鋳型とし、薬剤耐性遺伝子Aの3'末端部分及び生育必須遺伝子の5'末端部分に基づいて設計したプライマー5と、生育必須遺伝子の3'末端部分に基づいて設計したプライマー6とのプライマーセットを用いたPCRにより、生育必須遺伝子及び薬剤耐性遺伝子Aの3'末端部分を有するPCR産物を調製する。一方、薬剤耐性遺伝子Aが存在するプラスミドを鋳型とし、薬剤耐性遺伝子Aに基づいて設計したプライマーセット(プライマー3及び4)を用いたPCRにより、薬剤耐性遺伝子AのPCR産物を調製する。次いで、得られた上記3つのPCR産物を混合して鋳型とし、プライマーセット(プライマー1及び6)を用いたSOE-PCRにより、上記3個のPCR産物が、隣接領域(L)、薬剤耐性遺伝子A及び生育必須遺伝子の順に連結したPCR産物を得る。さらに、得られたPCR産物を用いて宿主DNAを有する宿主(例えば、枯草菌)の形質転換を行う。当該形質転換において、隣接領域(L)及び生育必須遺伝子における二重交差の相同組換えが生じる。その結果、宿主DNAにおいて、隣接領域(L)と生育必須遺伝子との間の領域(すなわち、生育必須遺伝子の上流に存在する置換対象領域)が欠失されることとなる。
【００４１】
第2段階では、第1段階で得られた宿主DNAを鋳型とし、生育必須遺伝子の5'末端部分に基づいて設計したプライマー7と、生育必須遺伝子の3'末端部分及び薬剤耐性遺伝子Bの5'末端部分に基づいて設計したプライマー8とのプライマーセットを用いたPCRにより生育必須遺伝子及び薬剤耐性遺伝子Bの5'末端部分を有するPCR産物を調製する。同様に、当該宿主DNAを鋳型とし、隣接領域(R)の5'末端部分及び薬剤耐性遺伝子Bの3'末端部分に基づいて設計したプライマー11と、隣接領域(R)の3'末端部分に基づいて設計したプライマー12とのプライマーセットを用いたPCRにより、隣接領域(R)及び薬剤耐性遺伝子Bの3'末端部分を有するPCR産物を調製する。一方、薬剤耐性遺伝子Bが存在するプラスミドを鋳型とし、薬剤耐性遺伝子Bに基づいて設計したプライマーセット(プライマー9及び10)を用いたPCRにより、薬剤耐性遺伝子BのPCR産物を調製する。次いで、得られた上記3つのPCR産物を混合して鋳型とし、プライマーセット(プライマー7及び12)を用いたSOE-PCRにより、上記3個のPCR産物が、生育必須遺伝子、薬剤耐性遺伝子B及び隣接領域(R)の順に連結したPCR産物を得る。さらに、得られたPCR産物を用いて第1段階で得られた宿主DNAを有する宿主(例えば、枯草菌)の形質転換を行う。当該形質転換において、生育必須遺伝子及び隣接領域(R)における二重交差の相同組換えが生じる。その結果、宿主DNAにおいて、生育必須遺伝子と隣接領域(R)との間の領域(すなわち、生育必須遺伝子の下流に存在する置換対象領域)が欠失されることとなる。以上に説明した2段階による置換対象領域中の生育必須遺伝子の上流側と下流側の欠失を行うことで、宿主DNAにおいて、置換対象領域内に存在する生育必須遺伝子が残存し、その他の置換対象領域は欠失されることとなる。なお、宿主DNAの置換対象領域において生育必須遺伝子が置換対象領域の末端に存在する場合には、当該生育必須遺伝子の上流又は下流のみの欠失を行うことで、生育必須遺伝子以外のその他の置換対象領域を欠失させることができる。
【００４２】
次いで、本発明に係る宿主DNAの置換方法では、相同組換えが生じる条件下に供与体DNAと宿主DNAとを近接させ、供与体DNAにおける置換対象領域の外側の領域と、宿主DNAにおける欠失した置換対象領域の外側の領域との間で二重交差の相同組換えを生じさせ、供与体DNAの置換対象領域を宿主DNAの欠失した置換対象領域の部位に導入する。ここで、相同組換えが生じる条件下とは、宿主が本来的に有している組換え反応に関与する酵素等の機能を失っていない状態を意味する。供与体DNAと宿主DNAとの間の組換え方法としては、例えば、一般的なコンピテントセル形質転換方法(J. Bacterial. 93, 1925 (1967))、プロトプラスト形質転換法(Mol. Gen. Genet. 168, 111 (1979))、エレクトロポレーション法（FEMS Microbiol. Lett. 55, 135 (1990)）またはLP形質転換方法(非特許文献１及び２)が挙げられる。この中でもプロトプラスト化した細胞を供与体DNAとしてコンピテントセル形質転換を行うLP形質転換方法が特に好ましい。LP形質転換方法によれば、一般的な形質転換方法に比べて、供与体DNAの損傷を大幅に軽減することができる。
【００４３】
供与体DNAを有するドナー菌株を用いた宿主DNAを有するレシピエント菌株のLP形質転換を、図５に基づいて説明する。なお、図５において、置換対象領域の外側の領域を「隣接領域(L)」及び「隣接領域(R)」と表記する。
【００４４】
図５に示すように、例えば、供与体DNAに、ネオマイシン耐性遺伝子(Ne)及びテトラサイクリン耐性遺伝子(Tc)が組み込まれていた場合には、供与体DNAには、ネオマイシン耐性遺伝子(Ne)及びテトラサイクリン耐性遺伝子(Tc)が存在する。
【００４５】
一方、図５に示すように、置換対象領域を欠失した宿主DNAには、供与体DNAに存在する薬剤耐性遺伝子とは異なる薬剤耐性遺伝子(例えば、クロラムフェニコール耐性遺伝子(Cm))を欠失した置換対象領域の部位に存在させることができる。
【００４６】
供与体DNAを有するドナー菌株を用いた宿主DNAを有するレシピエント菌株に対するLP形質転換では、まずドナー菌株からプロトプラストを調製する。ドナー菌株からのプロトプラストの調製は、Changらの方法（Mol. Gen. Genet. 168, 111 (1979)）に従って以下のように行うことができる。
【００４７】
ドナー菌株を、LB培地において37℃で、例えば生育度(OD600)の値が1程度になるまで振盪培養する。振盪培養後、培養液から遠心分離によって集めた菌体を、4mg/mLリゾチーム (Sigma)を含むSMMP(3.50% Antibiotic Medium3 (Difco)、17.15% スクロース、0.16% マレイン酸二ナトリウム、0.20% 塩化マグネシウム6水和物、0.10% ウシ血清アルブミン (pH6.5に調整))緩衝液に懸濁し、37℃で1〜2時間インキュベーションする。インキュベーション後、遠心分離によってプロトプラストを集めてSMMP緩衝液に再懸濁する。さらに、形質転換効率及び置換対象領域の外側の領域以外の箇所で相同組換えが生じる虞れを考慮して、適宜、その懸濁液を濃縮又は希釈することができる。例えば、再懸濁後の上記懸濁液をSMMP緩衝液で1〜100倍（例えば10倍）濃縮、又は1〜1,000,000倍(例えば10倍)希釈したものを、プロトプラスト懸濁液として使用することができる。一般的には、得られた再懸濁後の上記懸濁液をSMMP緩衝液で1〜100倍希釈したものをプロトプラスト懸濁液として使用することできる。
【００４８】
一方、レシピエント菌株のコンピテントセルの調製は、例えば、Anagnostopoulosらの方法（J.Bacteriol. 81, 741 (1961)）に従って以下のように行うことができる。
【００４９】
レシピエント菌株を、SPI培地（0.20% 硫酸アンモニウム、1.40% リン酸水素二カリウム、0.60% リン酸二水素カリウム、0.10% クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50% グルコース、0.02% カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.25μM 塩化マンガン、50μg/ml トリプトファン）において37℃で、例えば生育度(OD600)の値が1程度になるまで振盪培養する。振盪培養後、培養液の一部を9倍量のSPII培地（0.20% 硫酸アンモニウム、1.40% リン酸水素二カリウム、0.60% リン酸二水素カリウム、0.10% クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50% グルコース、0.01% カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.40μM 塩化マンガン、5μg/ml トリプトファン）に接種し、更に例えば生育度(OD600)の値が0.4程度になるまで振盪培養することで、レシピエント菌株のコンピテントセルを調製することができる。
【００５０】
次いで、プロトプラスト懸濁液を、レシピエント菌株のコンピテントセルに添加する。添加するプロトプラスト懸濁液量は特に限定されないが、レシピエント菌株のコンピテントセルに対して1/10000〜10倍、好ましくは1/10〜1倍とすることができる。添加されたプロトプラストは浸透圧ショックにより破壊され、培養液中に放出された供与体DNAがレシピエント菌株のコンピテントセルに取り込まれるものと考えられている。
【００５１】
以上のようにドナー菌株とレシピエント菌株との間でLP形質転換が行われると、供与体DNAと宿主DNAとが近接することとなる。また、レシピエント菌株が本来的に有している相同組換えに関与する酵素の作用によって、供与体DNA及び宿主DNAに存在する置換対象領域の外側の領域間で一組の鎖間交換構造が形成され、二重交差の相同組換えが生じる(図５では、相同組換えの態様を実線で示す)。その結果、供与体DNA中の置換対象領域が、宿主DNA中の欠失した置換対象領域の部位に導入される。形質転換体は、供与体DNAの置換対象領域に挿入した薬剤耐性遺伝子(図５では、ネオマイシン耐性遺伝子(Ne)、テトラサイクリン耐性遺伝子(Tc))に基づく薬剤耐性を指標に選択することができる。また、図５に示すように、宿主DNAにおいて、欠失した置換対象領域の部位に存在する他の薬剤耐性遺伝子(例えば、クロラムフェニコール耐性遺伝子)に基づく薬剤感受性を指標に、形質転換体を選択することができる。あるいは、形質転換体における相同組換えは、供与体DNAに由来する置換対象領域を対象としたPCRを行うことで確認することができる。
【００５２】
一方、宿主DNA又は供与体DNAにおいて、LP形質転換前に予め置換対象領域外の遺伝子を欠失させておく。次いで、LP形質転換後、形質転換体のDNAにおいて、欠失した遺伝子の存在の有無をPCRにおいて確認することで、置換対象領域の外側の領域以外の箇所で相同組換えが生じていないことを確認することができる。
【００５３】
得られた形質転換体のDNAにおいて、供与体DNA由来の置換対象領域は、本来の配向で置換されることとなる。
【００５４】
なお、図３及び４に基づいて説明した方法等を用いて宿主DNAの置換対象領域内に生育必須遺伝子を残存させた場合には、生育必須遺伝子は置換対象領域の外側の領域に比較して遥かに短いことから、本来と同じ配向で残存しても、宿主DNAと供与体DNAとの相同組換えにおいて、宿主DNAの置換対象領域内に残存させた生育必須遺伝子と供与体DNAの置換対象領域に存在する生育必須遺伝子との間で鎖間交換構造が形成され、相同組換えが起こる可能性は極めて低い。また、図３に示す方法により、宿主DNAの置換対象領域内に生育必須遺伝子を本来の配向とは逆の配向で残存させた場合には、宿主DNAと供与体DNAとの相同組換えにおいて、置換対象領域の外側の領域が互いに相同な位置関係にある場合、宿主DNAの置換対象領域内に残存させた生育必須遺伝子と供与体DNAの置換対象領域に存在する生育必須遺伝子とは非相同であるため、当該生育必須遺伝子間で相同組換えは生じない。
【００５５】
以上のように説明した本発明に係る置換方法によれば、大きなサイズのDNA断片を宿主DNA中に一括して確実に導入することができる。また、本発明に係る置換方法では、宿主DNAの置換対象領域を事前に欠失させるので、置換対象領域内部での相同組換えが生じることなく、供与体DNAの置換対象領域を宿主DNA中に導入することができる。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
【００５７】
以下の比較例及び実施例におけるDNA断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）には、GeneAmp PCR System（アプライドバイオシステムズ）を使用し、Pyrobest DNA Polymerase（タカラバイオ）と付属の試薬類を用いてDNA増幅を行った。PCRの反応液組成は、適宜希釈した鋳型DNAを1μL、センス及びアンチセンスプライマーを各々20pmol及びPyrobest DNA Polymeraseを2.5U添加して、反応液総量を50μLとした。PCRの反応条件は、98℃で10秒間、55℃で30秒間及び72℃で1〜5分間（目的増幅産物に応じて調整。目安は1kbあたり1分間）の3段階の温度変化を30回繰り返した後、72℃で5分間反応させることにより行った。なお、PCRにおいて用いたプライマーは、以下の表１に示すプライマーである。
【００５８】
【表１】
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【００５９】
また、以下の比較例及び実施例において、遺伝子の上流・下流とは、複製開始点からの位置ではなく、上流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の開始コドンの5’側に続く領域を示し、一方、下流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の終始コドンの3’側に続く領域を示す。
【００６０】
さらに、以下の比較例及び実施例における各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、Nature, 390, 249-256, (1997) で報告され、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新）された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載している。
【００６１】
〔比較例１〕 従来のLP形質転換
(1) ドナー菌株（D4-1株、D4-3株及びD4-4株）の作製
以下、図６に基づいて、ドナー菌株（D4-1株、D4-3株及びD4-4株）の作製を説明する。なお、各薬剤耐性遺伝子は、下記に示すプラスミドに由来する。クロラムフェニコール(Cm)耐性遺伝子：pC194、エリスロマイシン(Em)耐性遺伝子：pMutinT3、ネオマイシン(Ne)耐性遺伝子：pUB110、及びテトラサイクリン(Tc)耐性遺伝子：pHY300PLK。
【００６２】
1−1．D4-1株の作製
枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表１に示したDlytf(配列番号１)及びDlytcmr(配列番号２)のプライマーセットを用いて、ゲノム中のlytT遺伝子の下流に隣接する1.0kb断片（A）をPCRにより増幅した。また、上記ゲノムDNAを鋳型とし、Dlytcmf(配列番号３)及びDlytr(配列番号４)のプライマーセットを用いて、ゲノム中のlytS遺伝子の上流に隣接する1.0kb断片（B）をPCRにより増幅した。なお、枯草菌168株由来のゲノムDNAにおいて、lytT遺伝子とlytS遺伝子とは連続して存在する(図６では、lytTSと表記)。
【００６３】
さらに、プラスミドpC194 (J. Bacteriol. 150 (2) 815 (1982)) DNAを鋳型とし、表１に示したcatf(配列番号５)及びcatr(配列番号６)のプライマーセットを用いて、0.9kbのクロラムフェニコール（Cm）耐性遺伝子領域（C）をPCRにより調製した。
【００６４】
次に、得られた1.0kb断片（A）、1.0kb断片（B）及びCm耐性遺伝子領域（C）の3断片を混合して鋳型として、表１に示したDlytf(配列番号１)とDlytr(配列番号４)のプライマーセットを用いたSOE（splicing by overlap extension）-PCR法（Gene, 77, 61, (1989)）を行うことによって、3断片が1.0kb断片（A）、Cm耐性遺伝子領域（C）、1.0kb断片（B）の順に含まれる2.9kbのDNA断片を得た。
【００６５】
さらに、コンピテントセル形質転換法（J. Bacterial. 93, 1925 (1967)）によって、得られたDNA断片を用いて、枯草菌168株の形質転換を行った。形質転換後、クロラムフェニコール（10μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。
【００６６】
得られた形質転換体のゲノムDNAを抽出し、表１に示したDlytf(配列番号１)とcatr(配列番号６)及びcatf(配列番号５)とDlytr(配列番号４)の各プライマーセットを用いたPCRによって、lytT及びlytS遺伝子が欠失し、相同組換えによりlytT及びlytS遺伝子がCm耐性遺伝子（Cmマーカー）に置換していることの確認を行った。このようにして得られた菌株を168CM株と命名した。
【００６７】
次に、図６に示すように、168CM株に対して、lytT遺伝子の下流側に30kb離れたyshB及びyshA遺伝子のエリスロマイシン耐性遺伝子（Emマーカー）による置換を、上記CmマーカーによるlytT遺伝子及びlytS遺伝子の置換と同様の方法で行った。なお、168CM株のゲノムDNAにおいて、yshB遺伝子とyshA遺伝子とは連続して存在する(図６では、yshBAと表記)。同様に、図６に示すように、leuD遺伝子、leuC遺伝子、leuB遺伝子及びleuA遺伝子の4遺伝子(図６では、leuDCBAと表記)を、テトラサイクリン耐性遺伝子（Tcマーカー）にて置換し、一方、argH遺伝子及びargG遺伝子(図６では、argHGと表記)をネオマイシン耐性遺伝子（Neマーカー）にて置換して、最終的にD4-1株を作製した。
【００６８】
なお、Emマーカー領域は、pMutinT3 (Microbiology 144, 3079 (1998))を鋳型として調製した。Tcマーカー領域はpHY300PLK（ヤクルト社）を鋳型として調製した。また、Neマーカーは、表１に示したrneof(配列番号２３)とrepUr-Nm(配列番号２４)とのプライマーセット及び鋳型としてプラスミドpUB110（Plasmid 15, 93 (1986)）を用いて調製したrepU遺伝子プロモーター領域を含む0.4kb断片と、表１に示したNmUf-rep(配列番号２５)とneor(配列番号２６)とのプライマーセット及び鋳型としてプラスミドpUB110を用いて調製したネオマイシン耐性遺伝子の構造遺伝子領域を含む0.8kb断片とを混合して鋳型とし、表１に示したプライマーrneof(配列番号２３)及びneor(配列番号２６)を用いたSOE-PCRを行うことによって調製した。
【００６９】
上述したそれぞれ2又は4個の遺伝子の欠失を伴う薬剤耐性遺伝子(薬剤マーカー)のゲノム上への挿入に用いたプライマーの塩基配列を表１に示した。また、表２において、各2又は4個の遺伝子の欠失及び薬剤マーカーの挿入に使用したプライマーを、上記lytT遺伝子及びlytS遺伝子の欠失とそれに伴うCmマーカー挿入を行った際に用いたプライマーと対応させて示した。
【００７０】
【表２】
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【００７１】
1−2．D4-3株の作製
枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表１に示したysfCUf(配列番号２７)及びysfCTcｒ(配列番号２８)のプライマーセットを用いて、ゲノム中のysfC遺伝子の上流に隣接する領域とysfC遺伝子の5’側1.0kb領域とを含む2.0kb断片（A）をPCRにより増幅した。また、上記ゲノムDNAを鋳型とし、ysfCTcf(配列番号２９)及びysfCDr(配列番号３０)のプライマーセットを用いて、ゲノム中のysfC遺伝子の下流に隣接する領域とysfC遺伝子の3’側0.1kb領域とを含む2.0kb断片（B）をPCRにより増幅した。
【００７２】
さらに、プラスミドpHY300PLK DNAを鋳型とし、表１に示したtetf(配列番号１７)及びtetr(配列番号１８)のプライマーセットを用いて、1.6kbのテトラサイクリン（Tc）耐性遺伝子領域（C）をPCRにより調製した。
【００７３】
次に、得られた2.0kb断片（A）、2.0kb断片（B）及びTc耐性遺伝子領域（C）の3断片を混合して鋳型として、表１に示したysfCUf(配列番号２７)及びysfCDr(配列番号３０)のプライマーセットを用いたSOE-PCR法によって、3断片が2.0kb断片（A）、Tc耐性遺伝子領域（C）、2.0kb断片（B）の順に含まれる5.6kbのDNA断片を得た。
【００７４】
さらに、コンピテントセル形質転換法によって、得られたDNA断片を用いて、168CM株の形質転換を行った。形質転換後、テトラサイクリン（15μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。
【００７５】
得られた形質転換体のゲノムDNAを抽出し、表１に示したysfCUf(配列番号２７)とtetr(配列番号１８)及びtetf(配列番号１７)とysfCDr(配列番号３０)の各プライマーセットを用いたPCRによって、ysfC遺伝子部位にTc耐性遺伝子（Tcマーカー）が挿入していることの確認を行った。このようにして得られた菌株を168CT株と命名した。
【００７６】
次に、図６に示すように、168CT株に対して、araD遺伝子領域へのネオマイシン耐性遺伝子（Neマーカー）の挿入を、ysfC遺伝子領域へのTcマーカーの挿入と同様の方法で行い、168CTN株を構築した。さらに、168CTN株に対して、ysdC遺伝子領域へのエリスロマイシン耐性遺伝子（Emマーカー）の挿入を行い、最終的にD4-3株を作製した。
【００７７】
上述した各遺伝子領域への薬剤マーカーの挿入に用いたプライマーの塩基配列を表１に示した。また、表３において、各遺伝子領域への薬剤マーカーの挿入に用いた各プライマーを、上記ysfC遺伝子領域へのTcマーカー挿入を行った際に用いたプライマーと対応させて示した。
【００７８】
【表３】
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【００７９】
1−3．D4-4株の作製
図６に示すように、D4-1株の構築と同様に、上記168CTN株に対して、yshB遺伝子及びyshA遺伝子(図６では、yshBAと表記)のエリスロマイシン耐性遺伝子（Emマーカー）による置換を行い、D4-4株を作製した。
【００８０】
(2) レシピエント菌株の作製
図７に基づいて、レシピエント菌株168SP株の作製を説明する。
【００８１】
枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表１に示したeprUf(配列番号３９)及びeprSpr(配列番号４０)のプライマーセットを用いて、ゲノム中のepr遺伝子の上流に隣接する1.0kb断片（A）をPCRにより増幅した。また、上記ゲノムDNAを鋳型とし、eprSpf(配列番号４１)及びeprDr(配列番号４２)のプライマーセットを用いて、ゲノム中のepr遺伝子の下流に隣接する1.0kb断片（B）をPCRにより増幅した。
【００８２】
さらに、プラスミドpDG1727 DNAを鋳型とし、表１に示したspf(配列番号４３)及びspr(配列番号４４)のプライマーセットを用いて、1.2kbのスペクチノマイシン（Sp）耐性遺伝子領域（C）をPCRにより調製した。
【００８３】
次に、図７に示すように、得られた1.0kb断片（A）、1.0kb断片（B）及びSp耐性遺伝子領域（C）の3断片を混合して鋳型として、表１に示したeprUf(配列番号３９)及びeprDr(配列番号４２)のプライマーセットを用いたSOE-PCR法によって、3断片が1.0kb断片（A）、Sp耐性遺伝子領域（C）、1.0kb断片（B）の順に含まれる3.2kbのDNA断片を得た。
【００８４】
さらに、コンピテントセル形質転換法によって、得られたDNA断片を用いて、168株の形質転換を行った。形質転換後、スペクチノマイシン（100μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。
【００８５】
得られた形質転換体のゲノムDNAを抽出し、PCRによってepr遺伝子がSp耐性遺伝子（Spマーカー）に置換していることを確認した。以上のようにして、レシピエント菌株168SP株を作製した。なお、枯草菌168株のゲノムDNAにおいて、epr遺伝子は、ゲノムにおいて、図６に示すargHG遺伝子から上流に925kb離れた位置に存在する。
【００８６】
(3) ドナー菌株からのプロトプラストの調製
ドナー菌株からのプロトプラストの調製は、Changらの方法（Mol. Gen. Genet. 168, 111 (1979)）に従って以下のように行った。
【００８７】
ドナー菌株（D4-1株、D4-3株、D4-4株）を、LB培地において37℃で、生育度（OD600）の値が1になるまで振盪培養した。振盪培養後、培養液1mLから遠心分離によって菌体を回収した。菌体を4mg/mLリゾチームを含む0.5mLのSMMP（3.50% Antibiotic Medium3 (Difco)、17.15% スクロース、0.16% マレイン酸二ナトリウム、0.20% 塩化マグネシウム6水和物及び0.10% ウシ血清アルブミン (pH6.5に調整)）緩衝液に懸濁し、37℃で2時間インキュベーションした。インキュベーション後、遠心分離によってプロトプラストを回収し、0.5mLのSMMP緩衝液に再懸濁した。更にその懸濁液をSMMPにて10倍希釈して、後述のLP形質転換における供与体DNAとして使用した。
【００８８】
(4) ドナー菌株とレシピエント菌株とのゲノムDNAにおける相同領域についての説明
ドナー菌株とレシピエント菌株とのゲノムDNAでは、導入した薬剤耐性遺伝子及び薬剤耐性遺伝子導入と同時に欠失した遺伝子以外の全ての領域が同一である。
【００８９】
(5) LP形質転換
Akamatsuら（非特許文献２）の方法に従って、LP形質転換を行った。本方法は、抽出したDNAに代えて、上記(3)のようにドナー菌株より調製したプロトプラストを供与体DNAとしてレシピエント菌株のコンピテントセルに与えることを特徴とする。
【００９０】
コンピテントセル形質転換法によって作製したレシピエント菌株168SPのコンピテントセル培養液1mLに、それぞれD4-1株、D4-3株及びD4-4株のプロトプラスト溶液0.1mLを加え、以後は通常の形質転換処理を行った。なお、浸透圧ショックによって、コンピテントセル培養液中でドナー菌株のプロトプラストが破壊され、培養液中に放出されたゲノムDNAがレシピエント菌株168SPのコンピテントセルに取り込まれるものと考えられている。
【００９１】
(6) 薬剤耐性を指標とした形質転換体の選択及び同時転換率の測定
上記（5）のようにLP形質転換を行った後、薬剤耐性を指標として形質転換体を選択した。なお、通常、薬剤耐性に基づく形質転換体の選択の際には、供与体DNA中の薬剤耐性遺伝子と同時にレシピエント菌株が有する薬剤耐性遺伝子を利用する。これによって供与体DNA中の薬剤耐性遺伝子のみを指標にした場合に現れるプロトプラスト化せずに残存するドナー菌株（非形質転換体）由来のコロニー形成を抑制することができる。また以下に述べる同時転換率測定の際には、供与体DNA中の複数の薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤を同時に含む寒天培地を利用できればより簡便であるが、3種類以上の薬剤を含む培地上でのコロニー形成率は著しく低下する。そこで、形質転換体の取得の際には、レシピエント菌株とドナー菌株が有する各々１つずつの薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤を含む寒天培地を使用した。
【００９２】
ここでは、レシピエント菌株として168SP株、ドナー菌株としてD4-1株を用いた際のLP形質転換に基づいて、LP形質転換による同時転換率の測定について示す。
【００９３】
まず、168SP株に導入したSpマーカーと、ドナー菌株D4-1に導入したTcマーカーとを利用して形質転換体500個を選択した。次に、得られた形質転換体についてCmマーカーの有無をクロラムフェニコール（Cm）耐性を指標に調べたところ、98個がCm耐性であった。さらに、Tc及びCm耐性を有している形質転換体について、Emマーカーの有無をエリスロマイシン（Em）耐性を指標に調べたところ、18個がEm耐性であった。ここで、Tc及びCm耐性を有している形質転換体数に対するTc、Cm及びEm耐性を有している形質転換体数の比率（(Tc、Cm及びEm耐性)÷(Tc及びCm耐性)×100％）は18％であった。なお、図６に示すように、当該値が100％ではないということは、TcマーカーとCmマーカーとの間の領域（60kb間）でも相同組換えが生じていることを意味する。以上のように、ドナー菌株の置換対象領域の両端の領域がレシピエント菌株に導入された場合に、間に挟まれた領域が同時にレシピエント菌株に保持される割合（同時転換率）を求めた。すなわち、供与体DNA上の2つの薬剤マーカーを指標に選択した形質転換体数に対し、それら2つのマーカーに挟まれた第3の薬剤耐性マーカーも同時に保持している形質転換体数の割合を同時転換率とした。上記の結果より、60kb間の同時転換率は18％と算出された。
【００９４】
図６に示すように、同様に、D4-1株を用いて、TcマーカーからNeマーカーまでの120kb間の領域についての同時転換率を求めた。さらに、D4-1株を用いた場合と同様に、ドナー菌株としてD4-3株を用いた場合には、10kb間(NeマーカーからCmマーカーまで)と20kb間(TcマーカーからCmマーカーまで)の領域について、さらにドナー菌株としてD4-4株を用いた場合に、20kb間(TcマーカーからCmマーカーまで)と30kb間(EmマーカーからCmマーカーまで)の領域についての同時転換率を求めた。
【００９５】
(7) 同時転換率の評価及び結果
上記(6)で測定した10kbから120kbまでの各断片の同時転換率の結果を、表４に示す。
【００９６】
【表４】
0005495469.tif 000009
【００９７】
表４に示すように、20kbまでは、90％以上の同時転換率を示したが、それ以上の距離では、顕著な同時転換率の低下が確認された。すなわち、従来のLP形質転換法では、20kb以上の一括同時置換に際して、改善の余地があることが示された。
【００９８】
〔実施例１〕 本発明に係る宿主DNAの置換方法−長さの異なる置換対象領域(PBSX領域、Pro7領域及びSPβ領域)の導入
(1) ドナー菌株の作製（XNT株、7NE株及びSPT株）
1−1．XNT株の作製
枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表１に示したxNeUf(配列番号４５)及びxNeUr(配列番号４６)のプライマーセットを用いて、ゲノム中のxlyB遺伝子の上流に隣接する領域とxlyB遺伝子の5’側領域0.08kbとを含む1.5kb断片（A）をPCRにより増幅した。また、上記ゲノムDNAを鋳型とし、xNeDf(配列番号４７)及びxNeDr(配列番号４８)のプライマーセットを用いて、ゲノム中のxlyB遺伝子の下流に隣接する領域とxlyB遺伝子の3’側領域0.8kbとを含む1.5kb断片（B）をPCRにより増幅した。
【００９９】
さらに、比較例１の(1)1-1と同様に、表１に示したrneof(配列番号２３)及びneor(配列番号２６)のプライマーセットを用いて、1.3kbのネオマイシン（Ne）耐性遺伝子領域（C）をPCRにより調製した。
【０１００】
次に、得られた1.5kb断片（A）、1.5kb断片（B）及びネオマイシン（Ne）耐性遺伝子領域（C）の3断片を混合して鋳型として、表１に示したxNeUf(配列番号４５)及びxNeDr(配列番号４８)のプライマーセットを用いたSOE-PCR法によって、3断片が1.5kb断片（A）、ネオマイシン（Ne）耐性遺伝子領域（C）、1.5kb断片（B）の順に含まれる4.3kbのDNA断片を得た。
【０１０１】
さらに、コンピテントセル形質転換法によって、得られたDNA断片を用いて、枯草菌168株の形質転換を行った。形質転換後、ネオマイシン（20μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。
【０１０２】
得られた形質転換体のゲノムDNAを抽出し、表１に示したxNeUf(配列番号４５)とneor(配列番号２６)及びrneof(配列番号２３)とxNeDr(配列番号４８)の各プライマーセットを用いたPCRを行って、xlyB遺伝子領域にネオマイシン耐性遺伝子が挿入されていることを確認した。
【０１０３】
次に、Neマーカーを挿入した株に対して、Neマーカーの挿入と同様の方法で、テトラサイクリン（Tc）マーカーのxkdK遺伝子領域への挿入を行い、XNT株を構築した。なお、Tcマーカーを挿入する際に用いたプライマーの塩基配列を表１に示した。また、表５において、Tcマーカーの挿入に使用したプライマーを、Neマーカー挿入の際に用いたプライマーと対応させて示した。
【０１０４】
【表５】
0005495469.tif 000010
【０１０５】
1−2．7NE株の作製
枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表１に示した7NeUf(配列番号５３)及び7NeUr(配列番号５４)のプライマーセットを用いて、ゲノム中のprophage 7の領域内に存在するyrkM遺伝子の上流に隣接する領域とyrkM遺伝子の5’側0.04kbとを含む1.5kb断片（A）をPCRにより増幅した。また、上記ゲノムDNAを鋳型とし、7NeDf(配列番号５５)及び7NeDr(配列番号５６)のプライマーセットを用いて、ゲノム中のprophage 7の領域内に存在するyrkM遺伝子の下流に隣接する領域とyrkM遺伝子の3’側0.02kbとを含む1.5kb断片（B）をPCRにより増幅した。
【０１０６】
さらに、前述の比較例１の(1)1−1と同様に、表１に示したrneof(配列番号２３)及びneor(配列番号２６)のプライマーセットを用いて、1.3kbのネオマイシン（Ne）耐性遺伝子領域（C）をPCRにより調製した。
【０１０７】
次に、得られた1.5kb断片（A）、1.5kb断片（B）及びネオマイシン（Ne）耐性遺伝子領域（C）の3断片を混合して鋳型として、表１に示した7NeUf(配列番号５３)及び7NeDr(配列番号５６)のプライマーセットを用いたSOE-PCR法によって、3断片が1.5kb断片（A）、ネオマイシン（Ne）耐性遺伝子領域（C）、1.5kb断片（B）の順に含まれる4.3kbのDNA断片を得た。
【０１０８】
さらに、コンピテントセル形質転換法によって、得られたDNA断片を用いて、枯草菌168株の形質転換を行った。形質転換後、ネオマイシン（20μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。
【０１０９】
得られた形質転換体のゲノムDNAを抽出し、表１に示した7NeUf(配列番号５３)とneor(配列番号２６)及びrneof(配列番号２３)と7NeDr(配列番号５６)の各プライマーセットを用いたPCRによって、yrkM遺伝子領域にネオマイシン耐性遺伝子（Neマーカー）が挿入されていることを確認した。
【０１１０】
次に、Neマーカーを挿入した株に対して、Neマーカーの挿入と同様の方法で、エリスロマイシン耐性遺伝子（Emマーカー）のyraK遺伝子領域への挿入を行い、7NE株を構築した。なお、Emマーカーを挿入する際に用いたプライマーの塩基配列を表１に示した。また、表６において、Emマーカーを挿入する際に用いたプライマーを、Neマーカー挿入の際に用いたプライマーと対応させて示した。
【０１１１】
【表６】
0005495469.tif 000011
【０１１２】
1−3．SPT株の作製
枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表１に示したyokBUf(配列番号６１)及びyokBUr(配列番号６２)のプライマーセットを用いて、ゲノム中のSPβの領域内に存在するyokB遺伝子の下流に隣接する2kb断片（A）をPCRにより増幅した。また、上記ゲノムDNAを鋳型とし、表１に示したyokBDf(配列番号６３)及びyokBDr(配列番号６４)のプライマーセットを用いて、ゲノム中のSPβの領域内に存在するyokB遺伝子の上流に隣接する領域とyokB遺伝子の5’側0.1kbとを含む2kb断片（B）をPCRにより増幅した。
【０１１３】
さらに、プラスミドpHY300PLK DNAを鋳型とし、表１に示したtetf(配列番号１７)及びtetr(配列番号１８)のプライマーセットを用いて、1.6kbのテトラサイクリン（Tc）耐性遺伝子領域（C）をPCRにより調製した。
【０１１４】
次に、得られた2kb断片（A）、2kb断片（B）及びテトラサイクリン（Tc）耐性遺伝子領域（C）の3断片を混合して鋳型として、表１に示したyokBUf(配列番号６１)及びyokBDr(配列番号６４)のプライマーセットを用いたSOE-PCR法によって、3断片が2kb断片（A）、テトラサイクリン（Tc）耐性遺伝子領域（C）、2kb断片（B）の順に含まれる5.6kbのDNA断片を得た。
【０１１５】
さらに、コンピテントセル形質転換法によって、得られたDNA断片を用いて、枯草菌168株の形質転換を行った。形質転換後、テトラサイクリン（15μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。
【０１１６】
得られた形質転換体のゲノムDNAを抽出し、表１に示したyokBUf(配列番号６１)とtetr(配列番号１８)及びtetf(配列番号１７)とyokBDr(配列番号６４)の各プライマーセットを用いたPCRによって、yokB遺伝子領域にテトラサイクリン耐性遺伝子が挿入されていることを確認し、SPT株を作製した。
【０１１７】
(2) ゲノムDNA上の各置換対象領域の削除によるレシピエント菌株の作製（ΔPBSX株、ΔPro7株及びΔSPβ株）
2−1．ΔPBSX株の作製
枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表１に示したpbsxFW(配列番号６５)及びpbsx/cmr(配列番号６６)のプライマーセットを用いて、ゲノム中のxlyB遺伝子の上流に隣接する3.1kb断片（A）をPCRにより増幅した。また、上記ゲノムDNAを鋳型とし、表１に示したpbsx/cmf(配列番号６７)及びpbsxRV(配列番号６８)のプライマーセットを用いて、ゲノム中のxlyA遺伝子の下流に隣接する3.3kb断片（B）をPCRにより増幅した。なお枯草菌168株由来のゲノムDNAにおいて、xlyB遺伝子及びxlyA遺伝子は、prophage PBSX領域のそれぞれの末端に位置する遺伝子である。
【０１１８】
さらに、プラスミドpC194 DNAを鋳型とし、表１に示したcatf(配列番号５)及びcatr(配列番号６)のプライマーセットを用いて、0.9kbのクロラムフェニコール（Cm）耐性遺伝子領域（C）をPCRにより調製した。
【０１１９】
次に、得られた3.1kb断片（A）、3.3kb断片（B）及びクロラムフェニコール（Cm）耐性遺伝子領域（C）の3断片を混合して鋳型として、表１に示したpbsxFW(配列番号６５)及びpbsxRV(配列番号６８)のプライマーセットを用いたSOE-PCR法によって、3断片が3.1kb断片（A）、クロラムフェニコール（Cm）耐性遺伝子領域（C）、3.3kb断片（B）の順に含まれる7.3kbのDNA断片を得た。
【０１２０】
さらに、コンピテントセル形質転換法によって、得られたDNA断片を用いて、比較例１の(2)で作製した枯草菌168SP株の形質転換を行った。形質転換後、クロラムフェニコール（10μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。
【０１２１】
得られた形質転換体のゲノムDNAを抽出し、表１に示したpbsxFW(配列番号６５)とcatr(配列番号６)及びcatf(配列番号５)とpbsxRV(配列番号６８)の各プライマーセットを用いたPCRによって、PBSX領域が欠失し、相同組換えによりPBSX領域がクロラムフェニコール耐性遺伝子に置換していることの確認を行った。このようにして得られた菌株をΔPBSX株と命名した。
【０１２２】
2−2．ΔPro7株の作製
枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表１に示したpro7U2500F(配列番号６９)及びpro7CMUCR(配列番号７０)のプライマーセットを用いて、ゲノム中のyrkM遺伝子の上流に隣接する2.5kb断片（A）をPCRにより増幅した。また、上記ゲノムDNAを鋳型とし、表１に示したpro7CMCDF(配列番号７１)及びpro7D2500R(配列番号７２)のプライマーセットを用いて、ゲノム中のyraK遺伝子の下流に隣接する2.5kb断片（B）をPCRにより増幅した。なお、枯草菌168株由来のゲノムDNAにおいて、yrkM遺伝子及びyraK遺伝子は、prophage7（Pro7）領域のそれぞれの末端に位置する遺伝子である。
【０１２３】
さらに、プラスミドpC194 DNAを鋳型とし、表１に示したcatf(配列番号５)及びcatr(配列番号６)のプライマーセットを用いて、0.9kbのクロラムフェニコール（Cm）耐性遺伝子領域（C）をPCRにより調製した。
【０１２４】
次に、得られた2.5kb断片（A）、2.5kb断片（B）及びクロラムフェニコール（Cm）耐性遺伝子領域（C）の3断片を混合して鋳型として、表１に示したpro7U2500F(配列番号６９)及びpro7D2500R(配列番号７２)のプライマーセットを用いたSOE-PCR法によって、3断片が2.5kb断片（A）、クロラムフェニコール（Cm）耐性遺伝子領域（C）、2.5kb断片（B）の順に含まれる5.9kbのDNA断片を得た。
【０１２５】
さらに、コンピテントセル形質転換法によって、得られたDNA断片を用いて、比較例１の(2)で作製した枯草菌168SP株の形質転換を行った。形質転換後、クロラムフェニコール（10μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。
【０１２６】
得られた形質転換体のゲノムDNAを抽出し、表１に示したpro7U2500F(配列番号６９)とpro7CMCR(配列番号７３)及びpro7CMCF(配列番号７４)とpro7D2500R(配列番号７２)の各プライマーセットを用いたPCRを行い、Pro7領域の欠失及びクロラムフェニコール耐性遺伝子の挿入を確認し、ΔPro7株を作製した。
【０１２７】
2−3．ΔSPβ株の作製
枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表１に示したspbfw(配列番号７５)及びspb/cmr(配列番号７６)のプライマーセットを用いて、ゲノム中のyotN遺伝子の下流に隣接する1.0kb断片（A）をPCRにより増幅した。また、上記ゲノムDNAを鋳型とし、表１に示したspb/cmf(配列番号７７)及びspbrv(配列番号７８)のプライマーセットを用いて、ゲノム中のyokA遺伝子の下流に隣接する1.0kb断片（B）をPCRにより増幅した。なお、枯草菌168株由来のゲノムDNAにおいて、yotN遺伝子及びyokA遺伝子は、prophage SPβ（SPβ）領域のそれぞれの末端に位置する遺伝子である。yotN遺伝子及びyokA遺伝子の3’側がいずれもSPβ領域の外側に位置するため、SPβ領域の外側は当該遺伝子のそれぞれの下流に隣接する領域となる。
【０１２８】
さらに、プラスミドpC194 DNAを鋳型とし、表１に示したcatf(配列番号５)及びcatr(配列番号６)のプライマーセットを用いて、0.9kbのクロラムフェニコール（Cm）耐性遺伝子領域（C）をPCRにより調製した。
【０１２９】
次に、得られた1.0kb断片（A）、1.0kb断片（B）及びクロラムフェニコール（Cm）耐性遺伝子領域（C）の3断片を混合して鋳型として、表１に示したspbfw(配列番号７５)及びspbrv(配列番号７８)のプライマーセットを用いたSOE-PCR法によって、3断片が1.0kb断片（A）、クロラムフェニコール（Cm）耐性遺伝子領域（C）、1.0kb断片（B）の順に含まれる2.9kbのDNA断片を得た。
【０１３０】
さらに、コンピテントセル形質転換法によって、得られたDNA断片を用いて、比較例１の(2)で作製した枯草菌168SP株の形質転換を行った。形質転換後、クロラムフェニコール（10μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。
【０１３１】
得られた形質転換体のゲノムDNAを抽出し、表１に示したspbfw(配列番号７５)とcatr(配列番号６)及びcatf(配列番号５)とspbrv(配列番号７８)の各プライマーセットを用いたPCRによって、SPβ領域の欠失及びクロラムフェニコール耐性遺伝子の挿入を確認し、ΔSPβ株を作製した。
【０１３２】
(3) ドナー菌株からのプロトプラストの作製
ドナー菌株XNT株、7NE株及びSPT株を用いて、比較例１の(3)と同様の方法でプロトプラストの作製を行った。ただし、リゾチーム処理後に回収し、SMMP緩衝液に再懸濁したプロトプラスト溶液は、XNT株と7NE株についてはさらにSMMP緩衝液で100倍希釈したものを、SPT株については5倍希釈したものを、後述のLP形質転換に用いた。
【０１３３】
(4) ドナー菌株とレシピエント菌株とのゲノムDNAにおける相同領域についての説明
ドナー菌株としてXNT株を用いた場合には、レシピエント菌株としてΔPBSX株を用いた。図８は、ドナー菌株XNT株とレシピエント菌株ΔPBSX株とのゲノムDNAにおけるPBSX領域周辺の構造を示す。図８に示すように、ΔPBSX株のゲノムDNAにおいて、約30kbのPBSX領域が欠失されている。従って、XNT株とΔPBSX株とのゲノムDNA間では、当該PBSX領域中の相同領域は存在しないが、当該領域以外の全ての領域については完全に同一である。なお、PBSX領域とは、枯草菌ゲノム上のxlyB遺伝子−xlyA遺伝子間の36遺伝子から成るprophage PBSX領域を意味する。
【０１３４】
また、ドナー菌株として7NE株を用いた場合には、レシピエント菌株としてΔPro7株を用いた。図９は、ドナー菌株7NE株とレシピエント菌株ΔPro7株とのゲノムDNAにおけるPro7領域周辺の構造を示す。図９に示すように、ΔPro7株のゲノムDNAにおいて、約42kbのPro7領域が欠失されている。従って、7NE株とΔPro7株とのゲノムDNA間では、当該Pro7領域中の相同領域は存在しないが、当該領域以外の全ての領域については完全に同一である。なお、Pro7領域とは、枯草菌ゲノム上のyrkM遺伝子−yraK遺伝子間の46遺伝子から成るprophage 7領域を意味する。
【０１３５】
さらに、ドナー菌株としてSPT株を用いた場合には、レシピエント菌株としてΔSPβ株を用いた。図１０は、ドナー菌株SPT株とレシピエント菌株ΔSPβ株とのゲノムDNAにおけるSPβ領域周辺の構造を示す。図１０に示すように、ΔSPβ株のゲノムDNAにおいて、約134kbのSPβ領域が欠失されている。従って、SPT株とΔSPβ株とのゲノムDNA間では、当該SPβ領域中の相同領域は存在しないが、当該領域以外の全ての領域については完全に同一である。なお、SPβ領域とは、枯草菌ゲノム上のyotN遺伝子−yraK遺伝子間の185遺伝子から成るprophage SPβ領域を意味する。
【０１３６】
以上の各々の場合で、欠失領域(置換対象領域)の外側の領域での相同組換えは可能であるが、欠失領域内での相同組換えは起こり得ない。
【０１３７】
(5) LP形質転換
LP形質転換は、前述の比較例１の(5)と同様の方法で行った。ドナー菌株XNT株に対しレシピエント菌株ΔPBSXを用い、またドナー菌株7NE株に対しレシピエント菌株ΔPro7株、さらにドナー菌株SPT株に対しレシピエント菌株ΔSPβ株を用いて、形質転換を行った。
【０１３８】
(6) 薬剤耐性を指標とした形質転換体の選択
6−1．XNT株（ドナー菌株）を用いた際のΔPBSX株（レシピエント菌株）の形質転換体
図８に示すように、XNT株（ドナー菌株）を用いてΔPBSX株（レシピエント菌株）を形質転換した際には、XNT株が有するNeマーカー（xlyB遺伝子領域に挿入）及びΔPBSX株が有するSpマーカー（epr遺伝子領域に挿入）を指標に形質転換体の選択を行った。すなわち、スぺクチノマイシン（100μg/ml）とネオマイシン（20μg/ml）とを含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。次にXNT株が有するもう一つの薬剤耐性遺伝子であるTcマーカー（xkdK遺伝子領域に挿入）を指標に、上記で得られた形質転換体50個についてレプリカ法を用いて、全ての形質転換体がテトラサイクリン耐性であることを確認した。さらに、当該50個の形質転換体が全てクロラムフェニコール感受性であることを確認した。すなわち、ΔPBSX株のゲノムDNAのPBSX領域に挿入したCmマーカーが欠失したことを確認した。
【０１３９】
また、得られた形質転換体のゲノムDNAを抽出し、PCRによる確認を後述の(7)のように行った。
【０１４０】
6−2．7NE株（ドナー菌株）を用いた際のΔPro7株（レシピエント菌株）の形質転換体
図９に示すように、7NE株（ドナー菌株）を用いてΔPro7株（レシピエント菌株）を形質転換した際には、7NE株が有するNeマーカー（yrkM遺伝子領域に挿入）及びΔPro7株が有するSpマーカー（epr遺伝子領域に挿入）を指標に形質転換体の選択を行った。すなわち、スぺクチノマイシン（100μg/ml）とネオマイシン（20μg/ml）とを含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。次に7NE株が有するもう一つの薬剤耐性遺伝子であるEmマーカー（yraK遺伝子領域に挿入）を指標に、上記で得られた形質転換体50個についてレプリカ法を用いて、全ての形質転換体がエリスロマイシン耐性であることを確認した。さらに、当該50個の形質転換体が全てクロラムフェニコール感受性であることを確認した。すなわち、ΔPro7株のゲノムDNAのPro7領域に挿入したCmマーカーが欠失したことを確認した。
【０１４１】
また、得られた形質転換体のゲノムDNAを抽出し、PCRによる確認を後述の(7）のように行った。
【０１４２】
6−3．SPT株（ドナー菌株）を用いた際のΔSPβ株（レシピエント菌株）の形質転換体
図１０に示すように、SPT株（ドナー菌株）を用いてΔSPβ株（レシピエント菌株）を形質転換した際には、SPT株が有するTcマーカー（ykoB遺伝子領域に挿入）及びΔSPβ株が有するSpマーカー（epr遺伝子領域に挿入）を指標に形質転換体の選択を行った。すなわち、スぺクチノマイシン（100μg/ml）とネオマイシン（20μg/ml）とを含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。次に、上記で得られた形質転換体50個についてレプリカ法を用いて、クロラムフェニコール感受性であることを確認した。すなわち、ΔSPβ株のゲノムDNAのSPβ領域に挿入したCmマーカーが欠失したことを確認した。
【０１４３】
また、得られた形質転換体のゲノムDNAを抽出し、PCRによる確認を後述の(7)のように行った。
【０１４４】
(7) 形質転換体における相同組換えに関するPCR確認
上記（6）で得られた形質転換体のゲノムDNAについてPCRによる確認を行った。
7−1．XNT株（ドナー菌株）を用いた際のΔPBSX株（レシピエント菌株）の形質転換体
XNT株（ドナー菌株）を用いてΔPBSX株（レシピエント菌株）を形質転換した際に得られた形質転換体のゲノムDNAについて、rneof(配列番号２３)とxNeDr(配列番号４８)、tetf(配列番号１７)とxTcDr(配列番号５２)、及びxEmUf(配列番号７９)とxEmDr(配列番号８０)の各プライマーセットを用いてPCRを行った。なお、それぞれのプライマーセットを用いることにより増幅されるPCR産物は、図８に示す、F1(rneof(配列番号２３)とxNeDr(配列番号４８)とのプライマーセット)、F2(tetf(配列番号１７)とxTcDr(配列番号５２)とのプライマーセット)及びF3(xEmUf(配列番号７９)とxEmDr(配列番号８０)とのプライマーセット)の位置に相当する。
【０１４５】
PCRの結果(電気泳動写真)を図１１に示す。図１１に示すように、ΔPBSX株において欠失されていたPBSX領域が復帰した際に得られると予想されるそれぞれF1(2.8kb)、F2(3.1kb)及びF3(3.0kb)のDNA断片の増幅を確認した。なお、形質転換体IとIIとは、得られた異なる形質転換体である。このPCRの結果と上記薬剤耐性確認の結果より、レシピエント菌株ΔPBSXのPBSX領域が存在した位置にドナー菌株XNTのPBSX領域が完全に導入されたことが確認された。なお、ドナー菌株XNTのPBSX領域の両端の領域がレシピエント菌株ΔPBSXに導入された場合に、間に挟まれた領域が同時にレシピエント菌株ΔPBSXに保持される割合を示す同時転換率は100%であった。
【０１４６】
7−2．7NE株（ドナー菌株）を用いた際のΔPro7株（レシピエント菌株）の形質転換体
7NE株（ドナー菌株）を用いてΔPro7株（レシピエント菌株）を形質転換した際に得られた形質転換体のゲノムDNAについて、rneof(配列番号２３)と7NeDr(配列番号５６)、7TcUf(配列番号８１)と7TcDr(配列番号８２)、及び7EmUf(配列番号５７)とemr2(配列番号１２)の各プライマーセットを用いてPCRを行った。なお、それぞれのプライマーセットを用いることにより増幅されるPCR産物は、図９に示す、F1(rneof(配列番号２３)と7NeDr(配列番号５６)とのプライマーセット)、F2(7TcUf(配列番号８１)と7TcDr(配列番号８２)とのプライマーセット)及びF3(7EmUf(配列番号５７)とemr2(配列番号１２)とのプライマーセット)の位置に相当する。
【０１４７】
PCRの結果(電気泳動写真)を図１２に示す。図１２に示すように、ΔPro7株において欠失されていたPro7領域が復帰した際に得られると予想されるそれぞれF1(2.8kb)、F2(3.0kb)及びF3(2.8kb)のDNA断片の増幅を確認した。なお、形質転換体IとIIとは、得られた異なる形質転換体である。このPCRの結果と上記薬剤耐性確認の結果より、レシピエント菌株ΔPro7のPro7領域が存在した位置にドナー菌株7NEのPro7領域が完全に導入されたことが確認された。なお、ドナー菌株7NEのPro7領域の両端の領域がレシピエント菌株ΔPro7に導入された場合に、間に挟まれた領域が同時にレシピエント菌株ΔPro7に保持される割合を示す同時転換率は100%であった。
【０１４８】
7−3．SPT株（ドナー菌株）を用いた際のΔSPβ株（レシピエント菌株）の形質転換体
SPT株（ドナー菌株）を用いてΔSPβ株（レシピエント菌株）を形質転換した際に得られた形質転換体ゲノムDNAについて、tetf(配列番号１７)とtetr(配列番号１８)、yotMUf(配列番号８３)とyotMUr(配列番号８４)、yokBUf(配列番号６１)とyokBUr(配列番号６２)、35kf(配列番号８５)と35kr(配列番号８６)、70kf(配列番号８７)と70kr(配列番号８８)、及び105kf(配列番号８９)と105kr(配列番号９０)の各プライマーセットを用いてPCRを行った。なお、それぞれのプライマーセットを用いることにより増幅されるPCR産物は、図１０に示す、F1(tetf(配列番号１７)とtetr(配列番号１８)とのプライマーセット)、F2(yotMUf(配列番号８３)とyotMUr(配列番号８４)とのプライマーセット)、F3(yokBUf(配列番号６１)とyokBUr(配列番号６２)とのプライマーセット)、F4(35kf(配列番号８５)と35kr(配列番号８６)とのプライマーセット)、F5(70kf(配列番号８７)と70kr(配列番号８８)とのプライマーセット)、及びF6(105kf(配列番号８９)と105kr(配列番号９０)とのプライマーセット)の位置に相当する。
【０１４９】
PCRの結果(電気泳動写真)を図１３に示す。図１３に示すように、ΔSPβ株において欠失されていたSPβ領域が復帰した際に得られると予想されるそれぞれF1(1.6kb)、F2(2.0kb)、F3(1.8kb)、F4(2.0kb)、F5(2.0kb)及びF6(2.0kb)のDNA断片の増幅を確認した。なお、形質転換体IとIIとは、得られた異なる形質転換体である。このPCRの結果と上記薬剤耐性確認の結果より、レシピエント菌株ΔSPβのSPβ領域が存在した位置にドナー菌株SPTのSPβ領域が完全に導入されたことが確認された。なお、ドナー菌株SPTのSPβ領域の両端の領域がレシピエント菌株ΔSPβに導入された場合に、間に挟まれた領域が同時にレシピエント菌株ΔSPβに保持される割合を示す同時転換率は100%であった。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】図１は、枯草菌の供与体DNA又は宿主DNAへの薬剤耐性遺伝子の導入方法を示す。
【図２】図２は、宿主DNAの置換対象領域の欠失方法を示す。
【図３】図３は、宿主DNAの置換対象領域中の生育必須遺伝子を本来の配向とは逆の配向で残存させるとともに、当該生育必須遺伝子以外のその他の置換対象領域を欠失させる方法を示す。
【図４】図４は、宿主DNAにおいて置換対象領域中の生育必須遺伝子の上流側と下流側の欠失を2段階に分けて行い、当該生育必須遺伝子以外のその他の置換対象領域を欠失させる方法を示す。
【図５】図５は、供与体DNAを有するドナー菌株を用いた宿主DNAを有するレシピエント菌株のLP形質転換を示す。
【図６】図６は、比較例１におけるドナー菌株（D4-1株、D4-3株及びD4-4株）の作製を示す。
【図７】図７は、比較例１におけるレシピエント菌株168SP株の作製を示す。
【図８】図８は、実施例１におけるドナー菌株XNT株とレシピエント菌株ΔPBSX株とのゲノムDNAにおけるPBSX領域周辺の構造を示す。
【図９】図９は、実施例１におけるドナー菌株7NE株とレシピエント菌株ΔPro7株とのゲノムDNAにおけるPro7領域周辺の構造を示す。
【図１０】図１０は、実施例１におけるドナー菌株SPT株とレシピエント菌株ΔSPβ株とのゲノムDNAにおけるSPβ領域周辺の構造を示す。
【図１１】図１１は、XNT株（ドナー菌株）を用いてΔPBSX株（レシピエント菌株）を形質転換した際に得られた形質転換体のゲノムDNAについてのPCRの結果を示す。
【図１２】図１２は、7NE株（ドナー菌株）を用いてΔPro7株（レシピエント菌株）を形質転換した際に得られた形質転換体のゲノムDNAについてのPCRの結果を示す。
【図１３】図１３は、SPT株（ドナー菌株）を用いてΔSPβ株（レシピエント菌株）を形質転換した際に得られた形質転換体のゲノムDNAについてのPCRの結果を示す。
【配列表フリーテキスト】
【０１５１】
配列番号１〜９０は、プライマーである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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