(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析チップ外に設けられた重力方向の回転軸に対して、回転による遠心力を用いて検体および試薬を送液し、免疫学的測定を行うための分析チップであって、
抗原または抗体が結合した担体を収容可能な反応室と検体中の測定阻害物質を除去するための担体を収容するプレカラムを反応室上流に有し、
プレカラムの外周側に、第１の回転速度による回転中にプレカラムを通過した検体を保持する第１の保持槽を有し、第１の保持槽と反応室とが連通しており、
第１の保持槽と反応室との間に試薬が流入する試薬流路が接続しており、
該試薬流路の少なくとも一部が回転軸側から外周方向に延伸している、
分析チップ。
【請求項２】
第１の保持槽の重力方向に位置し、第１の回転速度よりも低速の第２の回転速度による回転もしくは回転停止時に第１の保持槽から重力の作用により移送された検体を保持する第２の保持槽をさらに有し、第１の保持槽が重力方向に延伸する流路Ａにより第２の保持槽と接続し、第２の保持槽が反応室と連通している、請求項１に記載の分析チップ。
【請求項３】
前記試薬流路が、前記第２の保持槽または流路Ａに接続していることを特徴とする、請求項２に記載の分析チップ。
【請求項４】
前記第１の保持槽が、その内壁の少なくとも一部に疎水的な壁面を有しており、前記流路Ａが、その内壁の少なくとも一部に親水的な壁面を有している、請求項１から３のいずれか一項に記載の分析チップ。
【請求項５】
前記試薬流路が、対向する主面間を連通している、請求項１から４のいずれか一項に記載の分析チップ。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか一項に記載の分析チップを用いる、検体の分析方法。
【請求項７】
前記分析チップに検体を導入した後、分析チップを回転装置に装着し、第１回転速度により回転させた後、第１回転速度よりも低速の第２回転速度による回転もしくは回転停止する工程を含む、請求項６に記載の検体の分析方法。
【請求項８】
前記分析チップに検体を導入した後、分析チップを回転装置に装着し、第１回転速度による回転で検体にプレカラムを通過させることで検体中の測定阻害物質を除去し、かつプレカラムを通過した検体を第１の保持槽で保持し、第１回転速度よりも低速の第２回転速度による回転もしくは回転停止する工程で検体を第２の保持槽に重力の作用により移送し、第２回転速度よりも高速の第３の回転速度による回転で検体を反応室に送液し、抗原抗体反応を行う工程を含む、請求項６に記載の検体の分析方法。
【請求項９】
前記第１の回転速度より、前記第３の回転速度が低いことを特徴とする、請求項８に記載の検体の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学的測定を行うための分析チップおよび分析チップを用いる検体の分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、臨床診断や食品衛生、環境分析に関わる微量分子の分析の殆どは、試料を遠心分離器やガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー等を用いて分離した後、質量分析装置を用いて高精度な分析が行われている。これらの分析装置は高価で操作に専門知識が必要であることから、分析は臨床検査会社や分析会社で行われてきた。近年、世の中の流れとしてベッドサイドでの簡便・迅速診断や、食品の加工、輸入の各現場において分析・測定を行い、事故を未然に防ぐことや、河川や廃棄物中の有害物質の分析を河川や廃棄物処理場等の現場で行うことの重要性が注目されており、簡便、迅速、安価、高精度かつ高感度に測定が可能な検出法や分析装置の開発が重要視されている。
【０００３】
特に高齢化社会に伴い、がんや生活習慣病はますます深刻化しており、健康状態や疾患の状態の変化を手軽に図ることのできる手段として、血液検査はさらに重要性となってきた。そのため、医療関係者ばかりでなく、患者自身が血液を採取し、簡便、迅速に分析することが可能な方法が望まれている。
【０００４】
そこで近年、これらの課題を解決するために微細加工技術を応用し、数ｃｍサイズのチップ上に微細な流路を形成配置して、そこに被験者の血液などの体液を極微量注入し、分析することができる新しいデバイスの開発が進められている。例えば特許文献１には、略水平面に配置された微細な流路を有するチップを回転させることにより血液から血球を分離し、回転停止後、外部吸引ポンプを用いて血漿成分を分取する手法が開示されている。また、特許文献２には、抗原又は抗体が結合した担体を収容可能な反応室を有する分析チップに、回転による遠心力を用いて血清や血漿などの検体を送液し、免疫学的分析を行うための分析チップが開示されている。また、抗原又は抗体が結合した担体を収容可能な反応室を有する分析チップを用いて、検体を送液するときの遠心力を制御することにより、高感度な測定や広範囲な測定結果を得るための分析方法が特許文献３に開示されている。
【０００５】
また、血液中の微量分子の検出・測定手段として、特異性が高く、高感度な免疫学的測定法が用いられてきたが、検体（とくに血漿）をサンプルとした場合、抗原抗体反応を速やかに行わせるために希釈等の前処理を行う必要があることが知られており、前処理技術が一体化したチップの開発が進められている。さらに、検体の前処理をチップ内で行えば、測定者が検体の前処理を別途行う必要が無いため、測定者が検体により汚染される確率を低下させるという利点もある。例えば、特許文献４には検体の前処理要素と多層乾式分析要素が一体化した分析チップが記載されており、前処理として溶血や酵素阻害剤を用いて検体中の酵素を阻害している。例えば、特許文献５には検体の前処理要素で攪拌できる手段が一体化した分析チップが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第３８０３０７８号公報
【特許文献２】特開２００８−２６８１９４号公報
【特許文献３】特開２００８−２４１６９８号公報
【特許文献４】特開２００６−５８２８０号公報
【特許文献５】特開２００７−７１７１１号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
血液中の微量分子の検出、測定手段として、特異性が高く、高感度な免疫学的測定法が用いられてきたが、血液をサンプルとした場合のバックグラウンドノイズが高いという問題点がある。バックグラウンドノイズの原因となる測定阻害物質としては生体試料溶液中の澱状の不溶物や浮遊性の凝集物、内因性ペルオキシダーゼ活性物質などの内因性酵素活性物質が吸着することが挙げられる。
【０００８】
また、なんらかの疾患に罹患した患者の血清または血漿は、健常人と比較して不溶物の量が多く、粘度も高い傾向にあり、チップ状の微細な流路に送液されにくい等の問題もあり、さらに正確な測定が難しいという課題がある。
【０００９】
特に、高感度な免疫学的測定法を行うために、微少な担体を充填した反応室内で免疫測定法を行う場合、内因性の酵素活性物質などの測定阻害物質を予め除去した検体を反応室に供給する必要がある。この時、洗浄液や酵素基質を反応室に送液する際も、検体中の測定阻害物質を反応室に持ち込ませない機構が必要となる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、このような従来の問題点に鑑み、遠心力を用いて血漿または血清中のタンパク質等を含む検体（被検物質を含む液体または溶液）および試薬を送液する分析チップにおいて、検体中の澱状の不溶物、浮遊性の凝集物および内因性ペルオキシダーゼ様活性物質等の測定阻害物質を除去するためのプレカラムを反応室上流に設け、また、特定の試薬を試薬流路を介してプレカラムを通すことなく反応室に送液することにより、再現性、測定の精度を向上させた。
【００１１】
本発明は、以下の［１］〜［１７］を提供するものである。
［１］回転による遠心力を用いて検体および試薬を送液し、免疫学的測定を行うための分析チップであって、抗原または抗体が結合した担体を収容可能な反応室と検体中の測定阻害物質を除去するための担体を収容するプレカラムを反応室上流に有し、プレカラムと反応室との間に試薬が流入する試薬流路が接続している、分析チップ。
［２］前記試薬流路の少なくとも一部が、回転軸側から外周方向に延伸して、プレカラムと反応室との間に接続していることを特徴とする、［１］に記載の分析チップ。
［３］前記試薬流路が、対向する主面間を連通していることを特徴とする、［１］または［２］のいずれかに記載の分析チップ。
［４］前記分析チップが、プレカラムの外周側に、第１の回転速度による回転中にプレカラムを通過した検体を保持する第１の保持槽を有し、第１の保持槽と反応室とが連通していることを特徴とする、［１］から［３］のいずれかに記載の分析チップ。
［５］第１の保持槽の重力方向に位置し、第１の回転速度よりも低速の第２の回転速度による回転もしくは回転停止時に第１の保持槽から重力の作用により移送された検体を保持する第２の保持槽をさらに有し、第１の保持槽が重力方向に延伸する流路Ａにより第２の保持槽と接続し、第２の保持槽が反応室と連通している、［４］に記載の分析チップ。
［６］前記試薬流路が、前記第２の保持槽または流路Ａに接続していることを特徴とする、［５］に記載の分析チップ。
［７］前記流路Ａと前記第１の保持槽との接続部は、少なくともその一部が前記分析チップの前記第１の回転速度による回転時の前記第１の保持槽内の「検体の液面を含む平面」よりも、回転の内周側に位置する、［５］または［６］に記載の分析チップ。
［８］前記流路Ａの少なくとも一部が、前記分析チップの前記第１の回転速度による回転時の前記第１の保持槽内の「検体の液面を含む平面」よりも、回転の内周側に延伸する、［５］から［７］のいずれか一項に記載の分析チップ。
［９］前記流路Ａが、前記第２の回転速度による回転時または回転停止時の第１の保持槽内の「検体の液面を含む平面」よりも下方に位置する、［５］から［８］のいずれか一項に記載の分析チップ。
［１０］前記流路Ａが、流路途中で回転の外周側に屈曲している、［５］から［９］のいずれか一項に記載の分析チップ。
［１１］前記第１の保持槽が、その内壁の少なくとも一部に疎水的な壁面を有しており、前記流路Ａが、その内壁の少なくとも一部に親水的な壁面を有している、［５］から［１０］のいずれか一項に記載の分析チップ。
［１２］前記免疫学的測定が酵素免疫測定であって、測定阻害物質が内因性酵素活性物質であることを特徴とする、［１］から［１１］のいずれか一項に記載の分析チップ。
［１３］前記試薬が前記試薬流路接続部から反応室へ送液される際の動力の少なくとも一部が重力を利用することを特徴とする、［１］から［１２］のいずれか一項に記載の分析チップ。
［１４］［１］から［１３］のいずれか一項に記載の分析チップを用いる、検体の分析方法。
［１５］前記分析チップに検体を導入した後、分析チップを回転装置に装着し、第１回転速度により回転させた後、第１回転速度よりも低速の第２回転速度による回転もしくは回転停止する工程を含む、［１４］に記載の検体の分析方法。
［１６］前記分析チップに検体を導入した後、分析チップを回転装置に装着し、第１回転速度による回転で検体にプレカラムを通過させることで検体中の測定阻害物質を除去し、かつプレカラムを通過した検体を第１の保持槽で保持し、第１回転速度よりも低速の第２回転速度による回転もしくは回転停止する工程で検体を第２の保持槽に重力の作用により移送し、第２回転速度よりも高速の第３の回転速度による回転で検体を反応室に送液し、抗原抗体反応を行う工程を含む、［１４］に記載の検体の分析方法。
［１７］前記第１の回転速度より、前記第３の回転速度が低いことを特徴とする、［１６］に記載の検体の分析方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の前処理プレカラムを有する分析チップによれば、検体（被検物質を含む液体または溶液）の免疫学的測定における再現性、精度、感度を向上させることが可能となる。
【００１３】
また、第１の保持槽を設けることで、回転による遠心力を用いてプレカラム部位にて検体中の澱状の不溶物、浮遊性の凝集物および内因性ペルオキシダーゼ様活性物質を除去したのちに、プレカラムへの送液に用いた回転速度と異なる回転速度での反応室への送液することを可能となり、反応室への検体の送液条件をプレカラムへの送液条件と独立して自在に選択可能となり、分析チップによる、より高感度な測定が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、本発明における分析チップを構成する反応室の一例を示す概略斜視図である。
【図２】図２は、本発明の分析チップの一例である、プレカラムの後段に第１の保持槽を有さない分析チップＡの平面図である。
【図３】図３は、本発明の分析チップの一例である分析チップＢの正面図である。
【図４】図４は、本発明の分析チップの一例である分析チップＢの背面図である。
【図５】図５は、本発明の分析チップの一例である分析チップＢの左側面図である。
【図６】図６は、本発明の分析チップの一例である分析チップＢの右側面図である。
【図７】図７は、本発明の分析チップの一例である分析チップＢの平面図である。
【図８】図８は、本発明の分析チップの一例である分析チップＢの底面図である。
【図９】図９は、本発明の分析チップの一例である分析チップＢを示す図である。
【図１０】図１０は、本発明の分析チップの一例である分析チップＢを用いる検体の分析方法を説明する模式図である。
【図１１】図１１は、本発明の分析チップの一例である分析チップＢを用いる検体の分析方法を説明する模式図である。
【図１２】図１２は、本発明の分析チップの一例である分析チップＢを用いる検体の分析方法を説明する模式図である。
【図１３】図１３は、本発明の分析チップの一例である分析チップＢを用いる検体の分析方法を説明する模式図である。
【図１４】図１４は、本発明の分析チップの一例である分析チップＢを用いる検体の分析方法を説明する模式図である。
【図１５】図１５は、本発明の分析チップの一例である分析チップＢを用いる検体の分析方法を説明する模式図である。
【図１６】図１６は、本発明の分析チップの一例である分析チップＢを用いる検体の分析方法を説明する模式図である。
【図１７】図１７は、本発明の分析チップの一例である分析チップＢを用いる検体の分析方法を説明する模式図である。
【図１８】図１８は、本発明の分析チップの一例である分析チップＢを用いる検体の分析方法を説明する模式図である。
【図１９】図１９は、本発明の分析チップの一例である分析チップＢを用いる検体の分析方法を説明する模式図である。
【図２０】図２０は、本発明の分析チップの一例である分析チップＢを用いる検体の分析方法を説明する模式図である。
【図２１】図２１は、本発明の分析チップにおける流路Ａの、第１の回転速度による回転中の、第１の保持槽内の「検体の液面を含む平面」に対する好ましい位置を示す説明図である。
【図２２】図２２は、本発明の分析チップにおける流路Ａの、第２の回転速度による回転中もしくは回転停止時の、第１の保持槽内の「検体の液面を含む平面」に対する好ましい位置を示す説明図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００１６】
本発明の分析チップにおいては、測定阻害物質を除去する担体を収容するプレカラムおよび抗原もしくは抗体が結合した担体（免疫学的測定要素）を収容可能な反応室を具備し、前記分析チップ外の回転軸に対して公転させることにより、検体および試薬を送液して、遠心送液という簡便な操作のみで検体中の被検物質を分析することを特徴とする。
【００１７】
本発明の分析チップにおけるプレカラムは、免疫学的測定に先立って検体の前処理を行う一つ以上の小室であって、該小室内に測定阻害物質を除去する担体が充填される。プレカラムにはリザーバがあってもかまわない。
【００１８】
本発明の分析チップにおいては、プレカラムへの検体や試薬の送液には、回転による遠心力を用いることが好ましい。遠心力を用いて送液することで検体や試薬がプレカラムを均一に流れ、プレカラム用担体に効率よく曝露される。さらに、遠心力を用いて送液することにより、検体や試薬がその溶液自体の自重によって送液されるため、ポンプによる圧力での送液や毛細管現象での送液と異なり、検体や試薬がプレカラム内に残存することを防止でき、他の送液方法よりも回収率が良い。そのため、免疫学的測定の効率がよく、ばらつきも小さくなる。プレカラム内に検体が残存すると、後段の反応室での測定時に検体が混入する場合があり、測定の阻害を引き起こすことがある。また、迅速にプレカラムを通過させることが可能となり、測定に必要な時間を短縮することができる。
【００１９】
本発明の分析チップは、抗原もしくは抗体が結合した担体を収容可能な反応室を少なくとも一つ以上有する。反応室内に担体を充填し、反応表面積もしくは反応点を増加させることにより、測定感度の向上を実現することができる。
【００２０】
本発明の分析チップにおいては、反応室への検体や試薬の送液には、回転による遠心力を用いることが好ましい。遠心力を用いて送液を行うことで検体や試薬が反応室を均一に流れ、反応室内に充填された、抗原もしくは抗体が結合した担体に効率よく曝露される。さらに、遠心力を用いることにより、検体や試薬が、その溶液自体の自重によって送液されるため、ポンプによる圧力での送液や、毛細管現象での送液と異なり、ノイズの原因となる検体や試薬が反応室内に残存するのを抑制できる。また、迅速に反応室を通過させることが可能となり、測定に必要な時間を短縮することができる。また、回転数を制御するだけで、送液速度を自在に制御することが可能になる。
【００２１】
本発明の分析チップにおいては、プレカラムが反応室の上流に位置する構成であることを特徴とする。プレカラムと反応室とは、直接接続していても、流路や槽を介して接続していてもまたは一体化していてもかまわない。プレカラムと反応室とは、流路や槽を介して接続していても良いし、直接連結していても良い、
さらに好ましくは、本発明の分析チップはプレカラムが反応室よりも内周側に位置する構造をとる。回転軸に対してプレカラムが反応室より内側に位置する構造は、省スペースであるとともに、同じ回転数のときに負荷する遠心力が内径側のプレカラムより外径側の反応室のほうが大きいため、プレカラムを通過した試料がより確実に反応室へ送液されるのでより好ましい。
【００２２】
本発明における測定阻害物質とは、免疫学的測定の際の測光分析にバックグラウンドノイズを与えるとともに、正確で再現性のある免疫学的測定を妨げるような物質を意味する。例えば、検体が生体試料の場合は、生体試料中に含まれる内因性測定阻害物質を挙げることができる。内因性測定阻害物質には、生体試料溶液中の澱状の不溶物や浮遊性の凝集物、内因性酵素活性物質などが挙げられる。
【００２３】
本発明の分析チップは、プレカラム内の担体により内因性測定阻害物質を吸着作用により除去することが可能なため、バックグラウンドノイズを抑えることが可能である。
【００２４】
内因性測定阻害物質のひとつである内因性酵素活性物質とは、免疫学的測定の中でも、酵素標識抗体を用いた酵素免疫測定法において使用される酵素標識抗体もしくは酵素標識抗原が有する酵素活性と同様の活性を持つ、検体中に内在する酵素活性物質を意味する。具体的には、ペルオキシダーゼ、フォスファターゼ、好ましくはアルカリフォスファターゼやペルオキシダーゼ、更に好ましくはペルオキシダーゼ活性を持つ酵素が挙げられる。これらの内因性酵素活性物質は、酵素免疫測定時に、分析対象物質の存在によらないシグナルを生じる可能性があるため、測定の精度が低下する。
【００２５】
内因性測定阻害物質のひとつである、生体試料溶液中の澱状の不溶物や浮遊性の凝集物は、反応室を通過する際、抗原もしくは抗体が結合した担体の閉塞や詰まりの原因となり、測定のばらつきを増大させる可能性がある。本発明の分析チップおけるプレカラムは、プレカラム内の担体によるろ過作用により、生体試料溶液中の澱状の不溶物や浮遊性の凝集物を除去し、反応室への送液時に閉塞や詰まりを防止する効果がある。生体試料溶液中の澱状の不溶物や浮遊性の凝集物の一例としては、細胞に由来する脂質成分や、変性したタンパク質を含む凝集塊が挙げられる。
【００２６】
生体試料溶液中の澱状の不溶物や浮遊性の凝集物に、内因性酵素活性物質が結合した複合体も、内因性測定阻害物質に含まれる。本発明の分析チップおけるプレカラムは、吸着やろ過により、該複合体も除去することが可能である。
【００２７】
また、検体は何らかの希釈液で希釈してから用いる場合が多く、さらに検体は検体中の分析対象物質と選択的に結合する物質を含む溶液との混合溶液を反応室に送液して反応させることが一般的である。例えば、検体と標識抗体および／または抗原の混合物を送液したり、希釈液で希釈した検体をを送液する場合がある。このとき、希釈や混合により塩が析出したり、タンパクが凝集したりすることなどにより生じる沈殿や凝集物も測定阻害物質であって、反応室への送液時に閉塞や詰まりを生じ、測定を阻害する可能性がある。本発明の分析チップおけるプレカラムは、プレカラム内の担体によるろ過作用により、希釈や混合により生じた沈殿や凝集物を除去し、反応室への送液時に閉塞や詰まりを防止する効果がある。
【００２８】
以上のように、本発明の分析チップは、測定阻害物質をプレカラムにより除去した後に反応室に送液して免疫学的測定を行うことができるため、測定値のバラツキおよびバックグラウンドノイズを抑えることが可能である。
【００２９】
本発明の分析チップは、プレカラムと反応室の間に、プレカラムを通過させずに試薬等を反応室に流入させるための、試薬流路が連結されている。この試薬流路は、複数設けられていても良い。
【００３０】
試薬流路により、洗浄液および／または試薬をプレカラムを通さずに反応室へと供給できることからノイズを抑制することが可能である。とくに酵素基質を検体や他の試薬が通過していない別ルートから反応室へと供給できることは大幅なノイズ低減を可能にする。
【００３１】
仮に試薬流路がない場合、反応室へ通す洗浄液および／または試薬は、先に検体が通過したプレカラムを通過することになるため、プレカラム内に存在する検体中から除去した測定阻害物質と接触することになり、反応室においてノイズが上昇する原因となりうる。
【００３２】
本発明の分析チップにおいて、試薬流路への試薬の送液には、少なくともその一部に回転による遠心力を用いることが好ましい。遠心力を動力として用いて送液することにより、流路内に試薬が残存することを防ぐことができる。
【００３３】
本発明の分析チップにおける試薬流路は、少なくともその一部が回転軸側から外周方向に延伸して、その延伸先においてプレカラムと反応室との間に接続していることが好ましい。これにより、遠心力によって試薬等を送液することができる。さらに、試薬流路の少なくとも一部は重力方向に延伸して位置し、試薬流路の接続部から反応室は重力方向に延伸して位置しており、動力の少なくとも一部に重力を利用して送液することができる。このように配置することにより、重力による送液が遠心力による送液の補助的な力となるとともに、回転を停止したときに重力方向に液を送液することが可能となる。このように回転と停止を繰り返すことで、回転時は遠心力方向へ、回転停止時は重力方向へと簡便な操作で送液を制御することが可能になる。
【００３４】
本発明の分析チップは、遠心力による送液で試料または試薬をプレカラムに通液させる過程で、第１の回転速度による回転中にプレカラムを通過した溶液を保持できる第１の保持槽を有することが好ましい。第１の保持槽は、第１の回転速度による回転時に第１の保持槽内に溜められた溶液を、回転停止もしくは回転時に排出し、反応室に通過させる機能を有する。第１の保持槽を有することで、プレカラムと反応室とで与える遠心力を変えて、プレカラムへの送液速度と反応室への送液速度を独立に制御して最適な送液条件（速度）で送液することが可能になる。
【００３５】
プレカラムへ検体を含む溶液を送液をする際には、澱状の不溶物や浮遊性の凝集物によるプレカラムの閉塞を防止でき、また、内因性酵素活性物質を吸着除去できる送液を行うための遠心力が好ましく選択される。
【００３６】
一方、抗原もしくは抗体が結合した担体上で抗原抗体反応が行われる反応室へ検体を含む溶液を送液するときには、抗原抗体反応の効率を高めたり、広範囲の濃度での測定を可能となるように、送液の速度を制御することが重要である。また、測定ばらつきの発生を抑えるために、検体が反応室を通過している間に回転速度を変化させたりするなど、反応室への送液に適した条件が選択される。このように、プレカラムへの送液速度と反応室への送液速度とは独立に制御されることが好ましいが、第１の保持槽を設けることでこの独立した制御が可能となる。
【００３７】
例えば、検体の粘度や懸濁物の影響により、比較的送液し難い検体の場合には、プレカラムにつまりが生じないよう、強い遠心力をかけることが好ましい。一方、反応室に通液するときの遠心力が強いほど、検出感度は低下するので、反応室での送液においてもプレカラム同じ強い遠心力をかけなければならない構造の分析チップでは、感度が低下する恐れがある。これに対し、第１の保持槽を設けることで、プレカラムを強い遠心力で送液し、プレカラムを通過した検体を第１の保持槽で一旦保持した後、次いで反応室へ送液する時に検出感度が低下しないように弱い遠心力によって送液することが可能となる。
【００３８】
また、第１の保持槽を設けることで、第１の保持槽内で保持する時間を自由に制御することが可能となるので、例えばインキュベーション時間の自由な選択が可能となり、感度向上に繋がる。また、プレカラム通過時に検体や試薬は混合されるので、反応効率が向上する。
【００３９】
第１の保持槽を設けることにより、検体や検体と試薬の混合溶液をプレカラムに通過させるときに、混合効率を上げることも可能である。プレカラム通過時に混合された検体や検体と試薬の混合溶液を、前記第１の保持槽で保持することにより、混合効率を上げ、抗原抗体反応の効率を高め、また測定のばらつきを低下させる効果が期待できる。
【００４０】
本発明の分析チップにおける第１の保持槽は、その内壁の少なくとも一部に疎水的な壁面を有していることが好ましい。これにより、第１の回転速度による回転中に、第１の保持槽内に保持された検体もしくは検体を含む溶液が、第１の回転速度よりも低速の第２の回転速度による回転時もしくは回転停止時に、疎水的な壁面の撥水性により、検体もしくは検体を含む溶液が壁面から離れやすくなり、結果として流路Ａもしくは第２の保持槽に移送されやすくなる。そのため、回収率よく、送液を短時間にかつ確実に行うことができる。
【００４１】
本発明における疎水的な表面とは、接触角が９０度より大きい表面を意味する。疎水的な表面の形成には、フルオロカーボン系樹脂、シリコーン系樹脂などの撥水剤を表面に塗布すればよい。接触角の測定は、２０℃、５０％ＲＨの条件下で、水に対する接触角を接触角計を用いて測定することで調べることができる。
【００４２】
本発明の分析チップは、第１の回転速度よりも低速の、第２の回転速度もしくは回転停止時に、第１の保持槽から重力の作用により移送された検体を含む溶液を保持することが可能な第２の保持槽を、第１の保持槽の重力方向に有することがより好ましい。これにより、装置にポンプなどを必要とせず、回転数を低下させたり回転を停止させたりするだけで、検体を含む溶液を、重力の作用により第２の保持槽まで簡便に送液することができる。第１の回転速度による遠心送液によりプレカラムを通過した試料または試薬は、第１の保持槽に保持され、第２の回転速度による回転もしくは回転停止することで重力により第２の保持槽へと移送される。その後、第３の回転速度により回転させることで第２の保持槽から溶液を反応室へ送液することができる。回転、低速回転もしくは回転停止、回転という簡便なステップでプレカラムや反応室内への送液を独立に制御することが可能である。このような第１の保持槽と第２の保持槽の構成を、直列もしくは並列に並べたり、繰り返すことで、回転速度を制御するという簡便な作業で様々な制御が可能となる。
【００４３】
本発明の分析チップにおいて、第１の保持槽と第２の保持槽とは、重力方向に延伸する流路Ａにより接続されている。流路Ａは、第１の保持槽と第２の保持槽間を連通する流路である。第１の回転速度よりも低速の第２の回転速度による回転時もしくは回転停止時に、重力の作用により流路Ａを検体を含む溶液が流れ、第１の保持槽から第２の保持槽に送液される。流路Ａは、第１の保持槽との接続部から重力方向に延伸し、第２の保持槽に接続している。これにより、分析チップの第１回転速度よりも低速の第２回転速度による回転時または回転停止時に、液体を第１の保持槽から第２の保持槽に、重力の作用により、送液することが可能となる。
【００４４】
流路Ａは、その第１の保持槽との接続部のうちの少なくとも一部が、第１回転速度における第１の保持槽内の「検体の液面を含む平面」よりも回転軸側（内周側）にあることが好ましい。第１回転速度で分析チップを回転させた際には、プレカラムを通過した検体の液体は、第１の保持槽において遠心力と重力の合力に略垂直な液面を形成する。この際に、流路Ａと第１の保持槽との接続部の少なくとも一部を、この液面よりも回転軸側に位置させることにより、第１回転速度における回転中に液体を第１の保持槽により確実に保持することができる。
【００４５】
流路Ａの形状やサイズは、流路全体が管形状であればよく、流路全体を通じて一定でなくともよい。また、流路Ａは第１の保持槽と第２の保持槽とを直接連通する開口であってもよい。すなわち、流路Ａが直接連通する開口である場合は、第１の保持槽と第２の保持槽は直接連結している。流路Ａの横断面の形状は円、多角形等特に限定されない。横断面のサイズについても、およそ一定であればよく、検体・試薬が通過可能なサイズで適宜調整することができる。流路Ａの断面積がプレカラムの断面積よりも大きいと、第１の保持槽内の液体を第２の保持槽に円滑に送液することができるので、好ましい。例えば、短径（円の場合は直径、多角形の場合は中心を通る最も短い径を意味するものとする。）は通常１０μｍ〜５ｍｍ、好ましくは１００μｍ〜３ｍｍの範囲とすることができる。
【００４６】
流路Ａは、毛細管現象を利用した送液が可能な、第１の保持槽との接続部における流路断面積より小さな流路断面積となる部位を流路途中に有することが好ましい。これにより、送液速度を上げることができる。また、流路Ａは、その全体または一部の流路断面積が下流に向かって連続的に小さくなっていてもよい。
【００４７】
また、流路Ａの断面積は、第２の保持槽に近づくほど小さくなっていることがさらに好ましい。これにより、第２の回転速度での回転時または回転停止時に、重力によって液体が第１の保持槽から第２の保持槽に送液される際に表面張力が作用し、さらに円滑に液体が第２の保持槽に向かって送液される。
【００４８】
また、流路Ａは、第１の保持槽から下方内周側に向けて延伸し、途中から下方外周側に向けて屈曲していてもよい。これにより、分析チップの第２の回転速度による回転時または回転停止時に検体が流路Ａを通過する際に、流路Ａの下部に液残りが生じても、次の第３の回転速度による回転時に、より確実に検体を反応室に送液することが可能になる。
【００４９】
本発明の分析チップにおける前記流路Ａは、その内壁の少なくとも一部に親水的な表面を有していることが好ましい。ここで、親水的な表面とは、接触角が９０度より小さい表面を意味する。これにより、第１の保持槽から第２の保持槽へ、検体もしくは検体を含む溶液を送液する際、重力に加えて毛細管現象を利用できるので、送液時間、すなわち測定時間の短縮と、測定精度の向上に繋がる。親水的な表面を形成するには、親水性樹脂を用いたり、親水性ポリマーなどを塗布、結合させてもよい。
【００５０】
本発明における「検体の液面を含む平面」とは、検体の液面が平面の場合はそのまま液面を意味し、槽が細い管状で壁面との表面張力によって形成される左右の壁面のメニスカスがつながり、検体の液面が平面以外になる場合は、槽中央での液面の接線方向に延在する面を意味する。
【００５１】
本発明において、流路Ａと第１の保持槽との接続部は、少なくともその一部が分析チップの第１の回転速度による回転時の第１の保持槽内の「検体の液面を含む平面」よりも、回転の内周側に位置することが好ましい。「検体の液面を含む平面よりも回転の内周側に位置する」とは、例えば図２１に示すように、第１の回転速度で分析チップを回転させているときに、第１の保持槽４−１中の検体１０の液面を含む平面Ｐ１よりも流路Ａと第１の保持槽４−１との接続点Ｑが少なくともその一部において内周側（Ｐ１で隔てられる２つの空間のうち回転軸側の空間）に位置することを意味する。
【００５２】
図２１を例に説明すると、第１の回転速度で分析チップを回転させた際には、プレカラムを通過した検体は、第１の保持槽４−１において遠心力と重力の合力方向に略垂直な液面Ｐ１を形成する。この際に、流路Ａと第１の保持槽との接続部Ｑのうちの少なくとも一部を、この検体の液面を含む平面よりも回転軸側に位置させることにより、第１の回転速度における回転中、検体を第１の保持槽４−１中に確実に保持し、他の槽や反応室に流出することを防止することができる。
【００５３】
本発明における第１の保持槽４−１と流路Ａとの接続部Ｑは、第１の保持槽４−１の下方（重力方向）に位置することが好ましい。これにより、第１の回転速度より低速の第２の回転速度での回転時もしくは回転停止時に、第１の保持槽４−１内で形成される検体の液面を含む平面よりも下方に位置することとなり、第１の保持槽４−１から流路Ａを介して検体を第２の保持槽４−２に排出することが可能となる。
【００５４】
本発明において、流路Ａは、少なくともその一部が分析チップの第１の回転速度による回転時の第１の保持槽内の「検体の液面を含む平面」よりも、回転の内周側に延伸することが好ましい。
【００５５】
図２１を例に説明すると、第１の回転速度で分析チップを回転させた際には、プレカラムを通過した検体は、第１の保持槽４−１において遠心力と重力の合力方向に略垂直な液面Ｐ１を形成する。この際に、流路Ａは、その前半部分において、少なくとも一部を、この検体の液面を含む平面Ｐ１よりも、回転の内周側に延伸している。これにより、第１の回転速度における回転中、検体を第１の保持槽４−１中により確実に保持し、他の槽や反応室に流出することを防止することができる。
【００５６】
本発明の分析チップにおける流路Ａは、第２の回転速度による回転時もしくは回転停止時の第１の保持槽内の「検体の液面を含む平面」よりも下方に位置することが好ましい。これにより、第２の回転速度において、第１の保持槽から第２の保持槽への送液を、滞留なく効率よく行うことができる。「「検体の液面を含む平面」よりも下方に位置する」とは、例えば図２２に示すように、第２の回転速度で分析チップを回転させているときあるいは回転を停止させているときには、第１の保持槽４−１中の検体１０の液面を含む平面Ｐ２よりも流路Ａが下方の空間（Ｐ２で隔てられる２つの空間のうち重力方向の空間）に位置することを意味する。
【００５７】
試薬流路は、反応室とプレカラムの間であれば、どこに接続していても構わないが、好ましくは、第２の保持槽または流路Ａに接続している。または、第２の保持槽と反応室との間に接続しても良い。プレカラムを通過せずに反応室内へ洗浄液や基質などの試薬を送液することにより、バックグラウンドノイズの低減を可能にする。
【００５８】
本発明のプレカラムを有する分析チップにおいては、選択的結合性物質が結合した担体を収容した反応室にて免疫学的測定を行う。前記選択的結合性物質として被検成分（被験物質）と選択的に結合する物質のなかでも抗体を利用する分析方法で、代表的なものとしてＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ  固相酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ  放射線免疫測定法）、ＦＩＡ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  蛍光免疫測定法）、ＦＬＩＳＡ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ  固相蛍光免疫検定法）等が挙げられるがこの限りではない。さらに、抗原抗体反応以外の被検成分と選択的に結合する物質を組み合わせて利用できる。被検成分と選択的に結合する物質は、抗原と抗体、糖とレクチン、リガンドやレセプター、アビジンとビオチンなどがあり、好ましくは抗原または抗体である。
【００５９】
本発明における好ましい免疫学的測定方法としては、例えば以下の（１）〜（５）の測定方法が挙げられる。
（１）標識した抗体により標的物質を直接認識して検出する直接法。
（２）標的とする物質を抗体により認識し、標的物質と結合した抗体を、標識した抗体により認識し検出する間接法。
（３）抗体と酵素で標識した一定量の標的物質を加えた試料を反応させて検出する競合法、もしくは、未標識抗体と標識抗体を競合的に標的物質に結合させて検出する競合法。
（４）標的とする物質を固相化した抗体により捕捉し、さらに別の抗体により検出するサンドイッチ法。
（５）標的とする物質を固相化した抗体により捕捉し、さらに別の抗体により標的とする物質を認識し、標的とする物質を認識した抗体を、標識した抗体により検出する三抗体サンドイッチ法。
【００６０】
標的物質の捕捉に、糖とレクチンの結合や、リガンドとレセプターの結合などを利用してもかまわない。また、ＡＢＣ法やＬＳＡＢ法など、アビジン、ストレプトアビジンなどを用いて、被検物質を検出する手法を利用しても良い。
【００６１】
本発明の分析チップは種々の免疫学的測定に用いることができるが、特にアルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼなどの酵素を利用した酵素免疫測定が好ましい。本チップは内因性ペルオキシダーゼ様活性物質を好ましく除去する効果を有するプレカラムを搭載しているため、酵素免疫測定、特に酵素としてペルオキシダーゼを利用する酵素免疫測定により好ましく用いることができる。さらに、前記ペルオキシダーゼのなかでも西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ：ＨＲＰ）を利用する酵素免疫測定に最も好ましく用いることができる。
【００６２】
反応室内に収容する、選択的結合性物質（抗原もしくは抗体）が結合した担体の材料は抗原もしくは抗体が結合するものであれば特に限定されず、例えば、ガラス、セラミック（例えばイットリウム部分安定化ジルコニア）、金属（例えば金、白金、ステンレス）、樹脂（例えばナイロンやポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリルアミド）、アガロース等を用いることができる。これらの中でも樹脂、特にポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）もしくはポリスチレンが好ましく用いられる。
【００６３】
反応室内に収容する担体の形状は不織布や繊維、網などの多孔質体でもビーズなどの微粒子であっても、それらの組み合わせであっても良い。
【００６４】
反応室内に収容する担体は、反応表面積もしくは反応点を増加させることから、球状、楕円球状の粒子（ビーズ）のほか、円柱、多角柱などのいわゆるマイクロロッド、板状のマイクロプレートであってもよい。なかでも、球状の粒子が好ましい。担体のサイズは、短径が１〜１０００μｍ、好ましくは１０〜２００μｍの範囲であることが好ましい。さらに好ましくは球状で粒径２０〜１００μｍの範囲のマイクロビーズであることが好ましい。
【００６５】
反応室に収容する担体に結合させる選択的結合性物質としては、種々の抗体、ＦａｂフラグメントやＦ（ａｂ'）２フラグメントのような抗体の抗原結合性断片、並びに種々の抗原などの中から、免疫学的測定における検体中の被検物質に特異的に結合する抗原や抗体を適宜選択することができる。反応室に収容する担体に結合させる選択的結合性物質は１種類であっても、また複数種類であってもよい。抗原や抗体の担体への結合密度、結合数、結合様式などに特に制限はない。他にも、担体に結合させる選択的結合性物質として選択的結合タンパク質であるアビジンやレクチンなどでも構わない。
【００６６】
反応室内に収容する担体に選択的結合性物質を結合させる方法としては、架橋剤を使って化学的に結合させる方法などを利用することができる。架橋剤には炭素鎖や親水性ポリマー（ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリスルホン酸ナトリウム等）を含んでも構わない。結合方法はこれらに限定されず、例えば担体と選択的結合性物質を緩衝液等の溶液中で混合し接触し結合させる方法も用いることができる。接触による結合は、通常１時間〜２４時間（日）、低温、一般には４〜３７℃の条件で、必要に応じて攪拌しながら実施することができる。得られた担体は、使用前に緩衝液、洗浄液等で洗浄してもよい。
【００６７】
また、反応室に格納する担体のすべてに選択的結合性物質結合されている必要はなく、何も結合しない担体が一部含まれていてもよい。
【００６８】
プレカラムに収容する測定阻害物質を除去する担体（プレカラム用担体）としてはマイクロビーズが好ましく用いられる。プレカラムに用いる測定阻害物質を除去する担体（以下プレカラム用ビーズともいう）の材質としては、樹脂やガラス、セラミック、金属やそれらの複合体などが含まれるが、好ましくはタンパク質の吸着性が高く、非特異的に結合するタンパク質を吸着除去しやすい樹脂が用いられる。樹脂の具体例としては、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリカーボネートなどが挙げられるが、好ましくはＰＭＭＡが用いられる。なお、担体の製造方法は特に限定されないが、ＰＭＭＡのビーズを担体として用いる場合は、「川瀬進，“ポリメチルメタクリレート粒子”，繊維学会誌，Ｖｏｌ．６０，Ｎｏ．７， ｐｐ．Ｐ３７１−Ｐ３７５（２００４）」に記載の方法によって作製することができる。
【００６９】
本発明においてプレカラム用の担体としてビーズを用いる場合、生体試料中の測定阻害物質除去能の観点からビーズの平均粒径は１００μｍ以下が好ましい。また、プレカラム用ビーズの平均粒径が小さすぎるとプレカラムに目詰まりが生じるため、２０μｍ以上が好ましい。より好ましいプレカラム用ビーズの平均粒径としては２０−８０μｍであり、さらに好ましくは２５−６０μmである。
【００７０】
プレカラム用ビーズは、反応室内に収容する担体のサイズと比較して大きくても小さくても構わないが、反応室内に収容する担体のサイズと同じもしくは小さい方が好ましい。これにより、プレカラム処理された検体は反応室に詰まることなく確実に送液される効果が得られる。
【００７１】
プレカラム用ビーズおよび反応室内に収容する抗原もしくは抗体が結合した担体としての反応室充填用ビーズの平均粒径の測定方法としては、コールターカウンター（米国コールターエレクトロニクス社製）ＣＯＵＬＴＥＲ  ＭＵＬＴＩＳＩＺＥＲ  ＩＩ型を用い、約３万個測定し、平均化することで求められる。
【００７２】
本発明の分析チップの素材としては各種有機材料、無機材料をあげることができる。例えば、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリメチルペンテン、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ＡＢＳ樹脂、ポリジメチルシロキサン、シリコン等の樹脂、それらの高分子化合物を含む共重合体あるいは複合体；石英ガラス、パイレックス（登録商標）ガラス、ソーダガラス、ホウ酸ガラス、ケイ酸ガラス、ホウケイ酸ガラス等のガラス類、セラミックスおよびその複合体などが好ましく用いられる。樹脂は、ガラスなどと比較し、量産性に優れ、コスト、加工性においても優れることから好ましい。樹脂のうち、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレンが特に好ましく用いられる。分析チップの反応室部位は光学分析を行うことや、外部から観察が容易になる観点から、少なくとも反応室の一部に透明材料を用いることが好ましい。測光分析におけるバックグラウンドノイズを抑制すべく、チップの一部に黒色の材料を用いることが好ましい。より好ましくは、自家蛍光の低い黒色材料が用いられ、黒色の着色方法は特に限定されないが、例えばカーボンブラックを添加することにより黒色に着色することができる。
【００７３】
本発明の分析チップ製造方法としては、射出成形でも切削加工でもかまわないが、射出成形が特に好ましく用いられる。本発明の分析チップの製造方法としては、射出成形もしくは切削加工したチップの表面にフィルムを貼り付けて封じることで流路を形成する方法であっても良い。フィルムの材料は特に限定されないが、ポリエチレンテレフタレートなどのポリエステルや、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリビニルアルコール、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリメチルメタクリレートおよびそれらに添加物を混入したものなどを用いることができる。また、フィルムは単層でも多層でも構わない。
【００７４】
本発明の分析チップにおけるプレカラム用担体が充填される領域の容量は、測定阻害物質を除去できるに足りる容量であればよい。測定対象となる試料やその量に応じて調整することが好ましく、例えば、血清または血漿０．１ｍＬに対してプレカラム用担体が充填される領域の容量は０．５μL程度で十分であり、血清または血漿１０ｍＬに対しては５０μＬ程度で十分である。例えば、断面の短径が０．１mm〜３０ｍｍ、流路長が０．２ｍｍ〜１００ｍｍの範囲にプレカラム用担体を充填し、プレカラムとして用いることができる。プレカラムの形状は、横断面が円、多角形など特に限定されないが、短径（円の場合は直径、多角形の場合は中心を通る最も短い径を意味する）より流路長のほうが長い方が好ましい。
【００７５】
本発明の分析チップを用いて分析する対象となる検体としては、環境分析に用いられる河川・湖沼・海水試料や土壌試料や、アレルゲンや食品衛生検査に用いられる食品試料や、臨床診断に用いられる生体試料などが挙げられる。
【００７６】
本発明の分析チップを用いて分析する生体試料としては、生体から採取されるあらゆる液体、例えば、血液、尿、唾液、汗、涙、精液、リンパ液、髄液、滑液、および細胞懸濁液などをそのまま用いることができる。また、生体試料中から細胞成分等を予め除去した試料であってもよい。
【００７７】
これらの生体試料のうち、血液が好ましく用いられる。この場合の血液は、無処理の状態のものでもよいが、予め血球成分を除去して得られる血漿もしくは血清であることが好ましい。血球成分の除去には、遠心力やフィルターを使用する方法を用いても良いが、遠心力を用いた分離方法が最も好ましい。この血球成分の遠心分離は、本発明の分析チップに供する前に予め行ってもよく、または後述するような血球成分を遠心分離して除去するための分離部を設けた本発明の分析チップを用いてもよい。分離部を設けた本発明の分析チップにおいては、回転による遠心力を利用して、不溶性成分保持槽に血球を保持し、分離液保持槽に血漿もしくは血清を回収することができる。
【００７８】
分離部を有する本発明の分析チップにおいては、分離部で遠心力により比重で分離すると、血球や比重の大きい澱状の浮遊物が除去されるだけでなく、プレカラム部位で浮遊性の凝集物や内因性ペルオキシダーゼ様活性物質などの遠心分離が困難な測定阻害物質を除去することが可能である。特に、生体試料として血漿や血清を用いた場合、内因性のミエロペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ等の内因性ペルオキシダーゼ様活性物質がＨＲＰを標識酵素として使用する酵素免疫測定法検出の精度を低下させることがしばしば問題となるが、本発明の分析チップによれば、生体試料中から内因性ペルオキシダーゼ様活性物質を好ましく取り除いた後に測定を実施することが可能である。しかも、遠心力により分離部において血球分離を行い、引き続き同じ動力である遠心力によりプレカラム、反応室に順次送液することが可能であるため、新たに別の動力を必要とせず、回転による送液のみで簡便に全血から血球分離して血漿または血清を調製し、測定目的物質の検出まで一体化した系を単一のチップ内で実施することができる。
【００７９】
本発明の分析チップの分析対象としては、生体試料中のタンパク質やペプチド、糖、コレステロール、ビタミン、ステロイド、ＤＮＡ、ＲＮＡなどをはじめとした内因性の物質および、生体に投与した化合物やその代謝物などが挙げられる。分離部を有する本発明分析チップは、免疫学的測定に先立って分離部やプレカラムにて検体を前処理できるため、界面活性剤や有機溶媒を用いた前処理と比較して被検物質への影響が小さいことを特徴としており、例えば熱や界面活性剤、有機溶媒などにより変性しやすいタンパク質を好ましく被検対象物質とすることができる。中でも、血液中のサイトカインや腫瘍マーカーなど疾患に関わるタンパク質を検出することにより好ましく用いられる。
【００８０】
本発明の分析チップは、遠心力を利用して検体中の不溶成分（細胞成分など）を除去する機能を有する分離部を有していてもよい。
【００８１】
分離部はプレカラムの上流に位置する構成であることが好ましい。分離部は、回転による遠心力を用いて懸濁液から不溶性成分を分離し、分離液を分取する機能を有する。懸濁液とは細胞などの不溶性成分を含む溶液を意味し、分離液とは懸濁液から不溶性成分が除去された成分を意味する。検体が血液である場合は、分離部において、懸濁液（全血）から不溶性成分（血球成分など）が除去され、分離液（血清、血漿）が分取される。
【００８２】
本発明の分析チップの一例である、図９に記載の分析チップＢを例に、本発明における分離部の構成と機能を説明する。
【００８３】
分離部５は、懸濁液保持槽５−１、分離液保持槽５−２、不溶性成分保持槽５−３を備え、回転時における内周側より懸濁液保持槽５−１、分離液保持槽５−２、不溶性成分保持槽５−３の順に配置されている。
【００８４】
懸濁液保持槽５−１は、懸濁液を保持可能な槽である。回転前もしくは回転停止時に、懸濁液は懸濁液保持槽５−１内に予め貯液される。
【００８５】
分離液保持槽５−２は、分析チップを回転させた時に、懸濁液保持槽５−１より送液された懸濁液が遠心分離された分離液を保持可能な槽である。分離液保持槽の形状は、分析チップを回転させた時に一時的に分離液を保持可能であれば良い。必ずしも槽構造をとる必要はなく、流路の壁面の一部分（例えば流路の湾曲部のくぼみ部分など）であっても構わない。
【００８６】
不溶性成分保持槽５−３は、チップを回転させた時に、懸濁液保持槽５−１より送液された懸濁液中の不溶性成分を保持可能な槽である。
【００８７】
プレカラムの上流に分離部を有する本発明の分析チップは、遠心力を利用する送液のみで、分離部で血球等の比重の重い測定阻害物質を除去することができ、また比重が軽い測定阻害物質はプレカラムで除去することができる。分離部を有する本発明の分析チップは、測定阻害物質の除去、検体および試薬の送液が、制御された回転による遠心力を利用する送液のみにより行うことが可能である。
【００８８】
本発明の分析チップは、洗浄液や酵素基質、標識抗体、標識抗原などの試薬を貯液する試薬リザーバを有していても良い。試薬を試薬リザーバに貯液させて保管することで、試薬の安定性に優れた条件、すなわち温度や湿度、明暗といった条件下で保管することが可能となる。試薬リザーバは、分析チップに脱着可能な試薬リザーバユニットであってもよい。分析チップの使用時もしくは製造時に、複数の試薬リザーバが設けられた試薬リザーバユニットを分析チップに勘合もしくは接合することで、分析が可能となる。
【００８９】
本発明の検体の分析方法は、本発明の分析チップを用いるものである。
【００９０】
本発明の分析チップを用いた分析方法では、本発明の分析チップを回転装置に装着し、第１回転速度により回転させた後、第１回転速度よりも低速の第２回転速度による回転もしくは回転停止する工程を含む方法が好ましく用いられる。
【００９１】
本発明の分析チップを用いた分析方法において、プレカラムに検体を通過させるための第１の回転速度は、反応室に検体を送液するための第３の回転速度と、同一の回転速度であっても、異なっていても良い。好ましくは、第１の回転速度は、第３の回転速度と比較して、速い回転速度（回転数）が選択されることが好ましい。これにより、プレカラム送液時により遠心力を大きくすることができることから、固形分や浮遊物を含有する検体であっても、プレカラムの閉塞を引き起こすことなく送液できる。また、反応室への送液時に、遠心力を小さくすることができることから、抗原抗体反応の時間が延長され、高感度な測定が可能となる。例えば、第１の回転速度より第３の回転速度が１０％以上低くすることが好ましい。また、第１の回転速度と第３の回転速度による回転のそれぞれ最後の工程において、１分間程度の短時間、回転数を急上昇させるプロトコルが採用されても良い。この短時間の回転数上昇によって、検体や試薬を完全に振り切ることが可能となり、測定のばらつきを低減させることが可能となる。
【００９２】
図９から図２０を用いて、本発明の分析チップを用いる検体の分析方法について説明する。
【００９３】
まず、図９は、本発明の分析チップの一例である分析チップＢで示す図であって、二つの対向する主面Ｘおよび主面Ｙ（主面Ｘと対向する主面）、および底面を示す図である。分析チップＢは、抗原もしくは抗体が結合した担体を収容可能な反応室２を分析チップの底面に具備し、その上流にプレカラム１を底面に具備する。プレカラム１の外周側には、第１の保持槽４−１を具備し、第１の保持槽の重力方向に位置する第２の保持槽４−２と、第１の保持槽から重力方向に延伸し、第２の保持槽に連通する流路Ａ  ４−３とを具備する。第１の保持槽４−１は、その外周側の壁面が、フッ素処理により疎水的な表面となっている。流路Ａ  ４−３は、一端回転の内周側に延伸した後、流路途中で外周側に屈曲している。分析チップＢは、分離部５をプレカラム１の上流に有しており、分離部５は、回転の内周側から、懸濁液保持槽５−１、分離液保持槽５−２、不溶性成分保持槽５−３により構成されている。分析チップＢは、多段送液部６を具備する。多段送液部６は、複数設けられた試薬リザーバ（試薬リザーバユニット）７のうちの幾つかと、勘合により連通する。分離部５および多段送液部６の少なくとも一部が、互いに対向する２つの主面、主面Ｙと主面Ｘ寄りに、それぞれ互いに離間して設けられている。多段送液部から延伸する試薬流路３は、分析チップの主面Ｙから対向する主面Ｘへと、分析チップを連通する形で延伸し、第２の保持槽４−２に、外周側に開口して接続している。試薬流路を、対向する主面間を連通させることにより、分析チップの両面（２つの対向する主面）が利用可能になることから、分析チップおよび分析装置の小型化が可能となる。試薬流路が分析チップの対向する２つの主面間を連通することにより、分析チップを小型化することができる。
【００９４】
ここで、「主面」とは、分析チップを透過的に見た時に、分析チップのソリッドな厚み内に空間として設けられている槽および流路を観察できる側の面を意味する。例えば形状が多面体の、好ましくは立方体又は直方体の薄板状の、分析チップの場合、互いに対向する２つの面が主面となりうる。
【００９５】
次に、図１０から図２０を用いて、図９に示した本発明の分析チップの一例である分析チップＢを用いる検体の分析方法について説明する。
【００９６】
標識抗体１０１、洗浄液Ａ  １０４、洗浄液Ｂ  １０５、基質Ａ  １０２、基質Ｂ  １０３を導入した試薬リザーバ（試薬リザーバユニット）７を、分析チップ本体に装着する。分離部５の懸濁液保持５−１に血液（全血）２００を注入し、回転装置（分析装置）に装着する（図１０）。
【００９７】
分析チップＢを回転させると、試薬リザーバ内の試薬は、分離部５と、多段送液部６と、反応室２にそれぞれ送液される。この時、洗浄液Ａ  １０４はプレカラム１を通過することなく、試薬流路３を介して反応室２に送液され、反応室２内をプレ洗浄する。同時に、血液から血漿成分２０２（もしくは血清成分）が分離し、分離液保持槽５−２に保持される（図１１）。
【００９８】
回転停止により、分離液保持槽５−２内の血漿成分２０２（もしくは血清成分）が、標識抗体１０１と混合されながら、重力により落下する。また、多段送液部６の試薬が重力により落下する（図１２）。
【００９９】
次いで、第１の回転速度による回転を行うと、検体（本例では血漿成分２０２もしくは血清成分）と標識抗体１０１の混合液がプレカラム１を通過し、プレカラムの外周側に位置する第１の保持槽４−１に保持される。この時、検体中の測定阻害物質がプレカラム１により除去される。また、検体（血漿２０２）と標識抗体１０１とが、プレカラム通過時に混合されることから、反応効率が高まる。このように、プレカラム１を通過する溶液は、検体と標識抗体および／または抗原の混合液であることが好ましい。この時、多段送液部６では、試薬が一段ずつ送液される（図１３）。
【０１００】
次いで、回転停止させると、第１の保持槽４−１に保持されていた検体が、重力の作用により、流路Ａ  ４−３を通じて第２の保持槽４−２に送液される。多段送液部６内では試薬が重力の作用により落下する（図１４）。
【０１０１】
次いで第３の回転速度による回転を行うと、検体（血漿２０２）と標識抗体１０１の混合液が反応室２に送液される。この時、抗原もしくは抗体が結合した担体表面上で、抗原抗体反応が行われる。多段送液部６内では、洗浄液Ｂ  １０５と基質Ａ１０２、基質Ｂ  １０３が一段ずつ送液される（図１５）。
【０１０２】
次いで、回転停止させると、多段送液部６内では洗浄液Ｂ  １０５と基質Ａ  １０２、基質Ｂ  １０３が重力の作用により落下する（図１６）。
【０１０３】
次いで、分析チップＢを回転させると、洗浄液Ｂ  １０５はプレカラム１を通過することなく、多段送液部６から試薬流路３を介して反応室２に送液され、反応室２内を洗浄する。多段送液部６内では、基質Ａ  １０２、基質Ｂ  １０３が一段ずつ送液される（図１７）。
【０１０４】
次いで、回転停止させると、多段送液部６内では基質Ａ  １０２、基質Ｂ  １０３が重力の作用により落下する（図１８）。
【０１０５】
次いで、分析チップＢを回転させると、基質Ａ  １０２、基質Ｂ  １０３はプレカラム１を通過することなく、多段送液部６から試薬流路３を介して反応室２に送液され、反応室２内で標識抗体の酵素による酵素反応が進行する（図１９）。
【０１０６】
反応室２内での酵素反応により生じる蛍光、発光または吸光度などを測定することで、検体中の被検物質（測定対象物質）の濃度を得ることができる（図２０）。
【実施例】
【０１０７】
実施例１  分析チップＡの作製
次のようにして、図２に示す分析チップ（分析チップＡ）を作製した。
【０１０８】
反応室に充填する、抗原もしくは抗体を結合させた担体として、以下の手法により調製したビーズを用いた。ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）からなるマイクロビーズ（早川ゴム株式会社製  平均粒径２８．０マイクロメートル）を加水分解することにより、マイクロビーズ表面にカルボキシル基を露出させ、マイクロビーズ表面のカルボキシル基と、固相化用抗体抗ＩＬ−８抗体（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）のアミノ基を利用した脱水縮合反応を行い、アミド結合を形成させることにより、マイクロビーズ表面に抗体を結合させ、抗体固相化担体を作製した。
【０１０９】
分析チップＡを構成する反応室（図１）は、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）を用いた射出成型品の貼りあわせにより作製し、反応室内には抗体固相化担体を充填した。
【０１１０】
分析チップＡを構成する試薬リザーバユニット７は、ポリプロピレンを用いた射出成型により作製し、内部に試薬（標識抗体、基質、洗浄液）を充填した。標識抗体として、ＨＲＰ標識抗ＩＬ−８抗体（鎌倉テクノサイエンス社製）を使用した。洗浄液として、０．０５％トゥイーン２０含有リン酸緩衝液を使用した。基質として、過酸化水素水およびＡｍｐｌｅｘＲｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）を使用した。
【０１１１】
分析チップＡの反応室以外の部分については、ポリプロピレンを用いた射出成型により作製し、必要に応じて分離液保持槽の壁面の一部をフロロサーフＦＳ１０１０−ＴＨ−２．０（フロロテクノロジー社製）を用いて疎水処理した。これにポリプロピレンフィルムを接合し、開口部８よりプレカラム用担体スラリーを注入し、５０００ｒｐｍ（プレカラム部位で約１８００Ｇの遠心力を与える回転速度）にて２分間回転させることで、プレカラム部位にプレカラム用担体を充填し、充填後に開口部８はポリプロピレンフィルムでふさいた。プレカラム用担体として、０．０５％トゥイーン２０含有リン酸緩衝液で洗浄したポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）ビーズ（早川ゴム株式会社製  平均粒径２８．０マイクロメートル）を用い、これをＰＢＳＴに分散させてプレカラム用担体スラリーとした。
【０１１２】
さらに、試薬リザーバと抗体固相化担体を充填した反応室を勘合もしくは接合し、分析チップＡを作製した。
【０１１３】
実施例２  全血中ＩＬ−８の測定
実施例１で作製した分析チップＡを用いて、全血中に含まれるＩＬ−８の測定を行った。
【０１１４】
実施例１で作製した分析チップＡの懸濁液保持槽５−１に全血を導入した。送液装置（遠心装置）にチップを装着し、５０００ｒｐｍ（不溶性成分保持槽部位で約１５００Ｇの遠心力を与える回転速度）にて２分間回転させた。この間、全血中の血球成分が不溶性成分保持槽５−３に沈降し、血漿が分離液保持槽５−２に保持された。試薬リザーバ７内の洗浄液の内、一部の洗浄液は試薬流路３を介して反応室２に送液され、反応室をプレ洗浄した。標識抗体は、分離液保持槽上部に設けられた槽にて保持された。基質および洗浄液の一部は多段送液部６に送液された。
【０１１５】
次いで回転を５分間停止させると、血漿を巻き込みながら標識抗体が重力により落下し、血漿中のＩＬ−８と標識抗体との反応が開始した。多段送液部内の試薬は重力により落下した。
【０１１６】
次いで、分析チップを５０００ｒｐｍ（反応室で約２０００Ｇの遠心力を与える回転速度）にて５分間回転させた。これにより、血漿と標識抗体の混合液がプレカラムおよび反応室を通過した。プレカラムを通過することによって、血漿中の測定阻害物質である内因性酵素活性物質や澱状の浮遊物が吸着除去された。また、プレカラム通過時に標識抗体と血漿の混合液が攪拌され、抗原抗体反応の効率が向上した。続いて、反応室通過時に、血漿と標識抗体の混合液中で形成された、標識抗体と抗原（ＩＬ−８）との複合体と、反応室内に収容された担体表面上の抗ＩＬ−８抗体とが抗原抗体反応した。基質および洗浄液の一部は多段送液部に送液された。
【０１１７】
次いで回転を３０秒間停止させると多段送液部内の試薬は、多段送液部内で重力の作用により落下した。
【０１１８】
次いで、分析チップを５０００ｒｐｍ（反応室で約２０００Ｇの遠心力を与える回転速度）にて２分間回転させた。これにより、多段送液部内の洗浄液が、プレカラムを通過することなく、試薬流路を介して反応室に送液され、反応室内を洗浄した。この間、多段送液部内の基質溶液は、多段送液部内で送液された。
【０１１９】
次いで回転を３０秒間停止させた。この間、多段送液部内の基質溶液は、多段送液部内で重力の作用により落下した。
【０１２０】
次いで、分析チップを５０００ｒｐｍ（反応室で約２０００Ｇの遠心力を与える回転速度）にて１５秒間回転させた。これにより、多段送液部内の基質溶液が、プレカラムを通過することなく、試薬流路を介して反応室に送液され、反応室内を満たした。標識抗体の酵素と、基質との酵素反応が開始された。
【０１２１】
回転停止してから５分間静置した後に反応室部位で生じた蛍光を測定した。
【０１２２】
バックグラウンドの低い、高感度な測定が可能であった。
【０１２３】
実施例３  分析チップＢの作製
次のようにして、図３から図８に示す分析チップ（分析チップＢ）を作製した。
【０１２４】
反応室に充填する、抗原もしくは抗体を結合させた担体として、以下の手法により調製したビーズを用いた。ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）からなるマイクロビーズ（早川ゴム株式会社製  平均粒径２８．０マイクロメートル）を加水分解することにより、マイクロビーズ表面にカルボキシル基を露出させ、マイクロビーズ表面のカルボキシル基と、固相化用抗体抗ＩＬ−８抗体（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）のアミノ基を利用した脱水縮合反応を行い、アミド結合を形成させることにより、マイクロビーズ表面に抗体を結合させ、抗体固相化担体を作製した。
【０１２５】
反応室は、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）を用いた射出成型品の貼りあわせにより作製し、反応室内には抗体固相化担体を充填した。
【０１２６】
プレカラム用担体として、０．０５％トゥイーン２０含有リン酸緩衝液で洗浄したポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）ビーズ（早川ゴム株式会社製  平均粒径２８．０マイクロメートル）を用いた。
【０１２７】
プレカラム部は、反応室と同様に、ＰＭＭＡ（ポリメチルメタクリレート）を用いた射出成型品の貼りあわせにより作製し、プレカラム部内にはプレカラム用担体を充填した。
【０１２８】
試薬リザーバはポリプロピレンを用いた射出成型により作製し、内部に試薬（標識抗体、基質、洗浄液）を充填した。標識抗体として、ＨＲＰ標識抗ＩＬ−８抗体（鎌倉テクノサイエンス社製）を使用した。洗浄液として、０．０５％トゥイーン２０含有リン酸緩衝液を使用した。基質として、過酸化水素水およびＡｍｐｌｅｘＲｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社製）を使用した。
【０１２９】
分析チップＢの一部分、反応室とプレカラム、試薬リザーバ以外の部分については、ポリプロピレンを用いた射出成型により作製し、必要に応じて第１の保持槽の壁面の一部をフロロサーフＦＳ１０１０−ＴＨ−２．０（フロロテクノロジー社製）を用いて疎水処理した。これにポリプロピレンフィルムを両面に接合した。さらに、抗体固相化担体を充填した反応室、プレカラム用担体を充填したプレカラム部を、接着剤により接着し、分析チップＢを作製した。
【０１３０】
実施例４  全血中ＩＬ−８の高感度測定
実施例３で作製した分析チップＢを用いて、全血中に含まれるＩＬ−８の測定を行った。
【０１３１】
実施例３で作製した分析チップＢに、試薬リザーバ７を装着し、懸濁液保持槽５−１に全血を導入した。送液装置（遠心装置）にチップを装着し、５０００ｒｐｍ（不溶性成分保持槽部位で約１５００Ｇの遠心力を与える回転速度）にて２分間回転させた。この間、全血中の血球成分が不溶性成分保持槽５−３に沈降し、血漿が分離液保持槽５−２に保持された。試薬リザーバ内の洗浄液の内、一部の洗浄液は試薬流路３を介して反応室２に送液され、反応室をプレ洗浄した。標識抗体は、分離液保持槽上部に設けられた槽にて保持された。基質および洗浄液の一部は多段送液部６に送液された。
【０１３２】
次いで回転を３０秒間停止させると、血漿を巻き込みながら標識抗体が重力により落下し、血漿中のＩＬ−８と標識抗体との反応が開始した。多段送液部内の試薬は重力により落下した。
【０１３３】
次いで、分析チップＢを第１の回転速度により回転させた。具体的には、５０００ｒｐｍ（プレカラム部位で約２０００Ｇの遠心力を与える回転速度）にて１分間回転させた。これにより、血漿中の測定阻害物質である内因性酵素活性物質や澱状の浮遊物がプレカラムにより吸着除去された。さらに、プレカラム通過時に標識抗体と血漿の混合液が攪拌され、抗原抗体反応の効率が向上した。プレカラムを通過した血漿と標識抗体の混合液は、第１の保持槽に保持された。この間、多段送液部内の試薬は、多段送液部内で送液された。
【０１３４】
次いで回転を２１０秒間停止させると、第１の保持槽内の血漿と標識抗体の混合液は、流路Ａを介して重力の作用により第２の保持槽に落下した。この間、多段送液部内の試薬は、多段送液部内で重力の作用により落下した。この落下の行程で、標識抗体と血漿の混合液が攪拌され、抗原抗体反応の効率がさらに向上した。
【０１３５】
次いで、分析チップＢを第３の回転速度により回転させた。具体的には、２０００ｒｐｍ（反応室部位で約３００Ｇの遠心力を与える回転速度）にて４分間回転させた。これにより、血漿と標識抗体の混合液中で形成された、標識抗体と抗原（ＩＬ−８）との複合体と、反応室内に収容された担体表面上の抗ＩＬ−８抗体とが抗原抗体反応した。その後、５０００ｒｐｍにて１分間回転させ、反応室内の血漿と標識抗体の混合液を完全に振り切った。この間、多段送液部内の試薬は、多段送液部内で送液された。
【０１３６】
次いで回転を３０秒間停止させた。この間、多段送液部内の試薬は、多段送液部内で重力の作用により落下した。
【０１３７】
次いで、分析チップＢを回転させた。具体的には、５０００ｒｐｍにて１分間回転させた。これにより、多段送液部内の洗浄液が、プレカラムを通過することなく、試薬流路を介して反応室に送液され、反応室内を洗浄した。この間、多段送液部内の基質溶液は、多段送液部内で送液された。
【０１３８】
次いで回転を３０秒間停止させた。この間、多段送液部内の基質溶液は、多段送液部内で重力の作用により落下した。
【０１３９】
次いで、分析チップＢを回転させた。具体的には、５０００ｒｐｍにて１５秒間回転させた。これにより、多段送液部内の基質溶液が、プレカラムを通過することなく、試薬流路を介して反応室に送液され、反応室内を満たした。標識抗体の酵素と、基質との酵素反応が開始された。
【０１４０】
次いで、５ｒｐｍで１〜１５分間低速回転させながら、反応室部位で生じた蛍光を経時的に測定した。
【０１４１】
バックグラウンドの低い、高感度な測定が可能であった。
【０１４２】
実施例５  全血中ＩＬ−８の高濃度範囲測定
実施例３で作製した分析チップＢを用いて、全血中に含まれるＩＬ−８の高濃度範囲における測定を行った。
【０１４３】
第３の回転速度として、４０００ｒｐｍを選択したこと以外は、実施例４と同様に行った。
【０１４４】
第３の回転速度を高めることで、血液中のＩＬ−８を実施例４よりも高濃度の範囲において測定可能であった。この結果から、分析チップＢを用いることで、ワイドレンジな測定が可能であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１４５】
本発明の分析チップを用いれば、バックグラウンドが低く、感度、精度、再現性の高い免疫学的測定が可能である。本発明の分析チップは、臨床検査や食品、環境検査、バイオテクノロジー分野における研究などに利用できる。
【符号の説明】
【０１４６】
１  プレカラム
２  反応室
３  試薬流路
４−１  第１の保持槽
４−２  第２の保持槽
４−３  流路Ａ
５  分離部
５−１  懸濁液保持槽
５―２  分離液保持槽
５−３  不溶性成分保持槽
６  多段送液部
７  試薬リザーバ（試薬リザーバユニット）
８  開口部
９  抗原もしくは抗体が結合した担体
１０  検体
１０１  標識抗体
１０２  基質Ａ
１０３  基質Ｂ
１０４  洗浄液Ａ
１０５  洗浄液Ｂ
２００  血液（全血）
２０１  血球成分
２０２  血漿成分（血清成分）
Ｐ１  第１の回転速度における回転中の、第１の保持槽内における検体の液面を含む平面
Ｐ２  第２の回転速度における回転中もしくは回転停止中の、第１の保持槽内における検体の液面を含む平面
Ｑ  第１の保持槽と流路Ａの接続点
Ｘ  主面Ｘ
Ｙ  主面Ｘと対向する主面Ｙ
【図１】
0005423200.tif 000002
【図２】
0005423200.tif 000003
【図３】
0005423200.tif 000004
【図４】
0005423200.tif 000005
【図５】
0005423200.tif 000006
【図６】
0005423200.tif 000007
【図７】
0005423200.tif 000008
【図８】
0005423200.tif 000009
【図９】
0005423200.tif 000010
【図１０】
0005423200.tif 000011
【図１１】
0005423200.tif 000012
【図１２】
0005423200.tif 000013
【図１３】
0005423200.tif 000014
【図１４】
0005423200.tif 000015
【図１５】
0005423200.tif 000016
【図１６】
0005423200.tif 000017
【図１７】
0005423200.tif 000018
【図１８】
0005423200.tif 000019
【図１９】
0005423200.tif 000020
【図２０】
0005423200.tif 000021
【図２１】
0005423200.tif 000022
【図２２】
0005423200.tif 000023