(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖類と、
前記糖類と反応してオイルを生成する、中国普通微生物菌株保存管理センター(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)に受託番号「ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ.  ４９６８」として寄託されている酵母と、を備え、
前記酵母は、シストフィロバシジウム（Cystofilobasidium）属であることを特徴とするオイル発生システム。
【請求項２】
前記オイル発生システムは、更に前記酵母によって利用される窒素源を含み、
前記窒素源は、アンモニアナトリウム（Na(NH4)）であることを特徴とする請求項１に記載のオイル発生システム。
【請求項３】
前記オイルは、C14-C20の脂肪酸を含み、バイオディーゼルとして使用されることを特徴とする請求項１に記載のオイル発生システム。
【請求項４】
前記酵母は、配列番号7の18S rDNA配列、配列番号8の26S rDNA配列及び配列番号9のITS rDNA配列を有することを特徴とする請求項１に記載のオイル発生システム。
【請求項５】
炭素源と、
前記炭素源と反応してオイルを生成する、中国普通微生物菌株保存管理センター(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)に受託番号「ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ.  ４９６８」として寄託されている酵母と、を備え、
前記酵母は、シストフィロバシジウム（Cystofilobasidium）属であることを特徴とするオイル発生システム。
【請求項６】
前記酵母は、前記炭素源を前記オイルに分解することを特徴とする請求項5に記載のオイル発生システム。
【請求項７】
中国普通微生物菌株保存管理センター(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)に受託番号「ＣＧＭＣＣ  Ｎｏ.  ４９６８」として寄託されている酵母によってオイルを生成し、
前記酵母は、シストフィロバシジウム（Cystofilobasidium）属であることを特徴とするオイル発生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オイルを生成する微生物に関し、特に、シストフィロバシジウム（Cystofilobasidium）属の微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
今まで、バイオマスエネルギーとしては、概略的に2つの種類に分けることができ、一つはバイオエタノールであり、もう一つはバイオディーゼルである。バイオエタノールは、穀物を原料として製造されるものであるが、最近では、徐々に微生物によって生成されるバイオエタノールの研究になっている。多くの研究おいて、嫌気性生物がアルコールを生成する高い潜在能力を有することが指摘された。バイオディーゼルとしては、植物原料、廃棄食用油又は動物性脂肪から製造される。植物原料は、主に油糧種子であり、大豆、トウモロコシ、菜種、パーム、ナンヨウアブラギリ（学名：Jatropha curcushas）の種子、ヒマワリなどを含む。廃棄食用油や精製された動物性脂肪を精製して、バイオディーゼルを取り出す。両方のバイオディーゼルは、使用上の要件を満たすことができなく、それぞれの欠点を持っている。油料作物は、大規模な範囲の土地を必要とし、季節的な要素があり、作物の単位面積あたりのバイオエネルギーは、経済効率が低下し、食物との競合問題が発生し、更に、その抽出手順は、非常に複雑であり、そのコストが高くなる。従って、油料作物は、継続的に石油に代わるバイオディーゼルとして提供することはできない。廃棄食用油と動物性脂肪は、産量、繁殖、環境汚染などの問題を有している。よって、最近の傾向は、微生物によるバイオディーゼルを生成することである。研究報告によれば、1〜3％の穀物栽培面積があれば、微生物は運輸業が必要とされる代替エネルギーの40％の生産ができ、これはかなり大きな潜在能力であり、優位に立てるものである。
【０００３】
オイルを生産する微生物を利用することは、最近からの考えではない。微細藻類及び細菌類のほかに、真菌類にもオイルを生成する微生物があり、ほとんどの微生物は、酵母、カビであり、又、いくつかの微生物（例えば酵母）は、長鎖の飽和脂肪酸、一価不飽和脂肪酸及び多価不飽和脂肪酸を生成することができる。これらのオイルを生成する微生物は、バイオマスの40％以上を占める脂肪酸を生成し、培養基の限界と配分を介して70％まで蓄積することができ、かなり高い潜在能力を有する。表1は、普通のオイルを生成する真菌類及びそのオイル産量を示す(Beopoulos, et al., 2009; Gill, Hall, & Ratledge, 1977; Ratledge, 1993, 2002, 2004; Sergeeva Ia, Galanina, Andrianova, & Feofilova, 2008; Zhao, et al., 2010)。
【表１】
0005512613.tif 000002
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の主な目的は、Cystofilobasidium属の酵母によってオイルを生産する方法を提供することにより、石油の代わりに、バイオディーゼルを代替エネルギーとして利用することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
上述の目的を達成するために、本発明のオイル発生システムは、糖類と、前記糖類と反応してオイルを生成する作業微生物と、を備え、前記作業微生物は、シストフィロバシジウム（Cystofilobasidium）属であることを特徴とする。
【０００６】
上記構成の本発明に係るオイル発生システムにおいて、前記オイル発生システムは、更に前記作業微生物によって利用される窒素源を含み、前記窒素源は、アンモニアナトリウム（Na(NH4)）である。
【０００７】
上記構成の本発明に係るオイル発生システムにおいて、前記オイルは、不飽和脂肪酸又はC14-C20の脂肪酸であり、バイオディーゼルとして使用される。
【０００８】
上記構成の本発明に係るオイル発生システムにおいて、前記作業微生物は、配列番号7の18S rDNA配列、配列番号8の26S rDNA配列及び配列番号9のITS rDNA配列を有する。
【０００９】
本発明のオイル発生システムは、炭素源と、前記炭素源と反応してオイルを生成する作業微生物と、を備え、前記作業微生物は、シストフィロバシジウム（Cystofilobasidium）属であることを特徴とする。
上記構成の本発明に係るオイル発生システムにおいて、前記作業微生物は、前記炭素源を前記オイルに分解する。
本発明のオイル発生方法は、産油菌によってオイルを生成し、前記産油菌は、シストフィロバシジウム（Cystofilobasidium）属であることを特徴とする。
【００１０】
上記工程の本発明に係るオイル発生方法において、前記産油菌は、シストフィロバシディウム・ビスポリディ（Cystofilobasidium bisporidii）、シストフィロバシディウム・キャピタタム（Cystofilobasidium capitatum）、シストフィロバシディウム・インファモミニアタム（Cystofilobasidium infirmominiatum）及び他のシストフィロバシジウム（Cystofilobasidium）属からなる群より選ぶ。
【発明の効果】
【００１１】
本発明は、Cystofilobasidium属の酵母によってオイルを生産する方法を提供することにより、石油の代わりに、バイオディーゼルを代替エネルギーとして利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の実施例による光学及び蛍光顕微鏡でTN01菌株の形態とオイルの染色結果（1000倍）を示す図である。
【図２】本発明の実施例による走査型電子顕微鏡でTN01菌株の形態を示す図である。
【図３】本発明の実施例による18S rDNA配列の進化系統樹を示す図である。
【図４】本発明の実施例による26S rDNA D1/D2配列の進化系統樹を示す図である。
【図５】本発明の実施例によるITS配列の進化系統樹を示す図である。
【図６】本発明の実施例による各塩濃度の条件下でTN01の増殖曲線を示す図である。
【図７】本発明の実施例によるTN01に対する最適な塩濃度試験での結果を示す図である。
【図８】本発明の実施例によるTN01に対する最適な温度試験での結果を示す図である。
【図９】本発明の実施例によるTN01に対する培養液の簡素化での結果を示す図である。
【図１０】本発明の実施例によるTN01に対する最適なpH値試験での結果を示す図である。
【図１１】本発明の実施例によるTN01に対する炭素源の利用試験での結果を示す図である。
【図１２】本発明の実施例によるTN01に対する窒素源の利用試験での結果を示す図である。
【図１３】本発明の実施例によるTN01に対する糖類濃度試験での結果を示す図  である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下のように、本発明を実施例に基づいて詳述するが、あくまでも例示であって、本発明の範囲はこれらの実施形態に限定されない。本発明の範囲は、特許請求の範囲に記載されており、さらに特許請求の範囲の記載と均等な意味及び範囲内での全ての変更を含んでいる。
【００１４】
形状観察
実験菌株の出処は、台湾台南の沿岸域からサンプリングされたサンプルである。前記サンプルは、抗LgYPG培養基によって最初に篩選し、そうして、光学顕微鏡で異なる外観を有する群体を観察する。観察結果は、図1のA、Bのように示す。前記群体の外観が円であり、その表面がワックスの輝きのように、滑らかに整い、ピンク色を呈す。最初に篩選したサンプルは、7日間に20℃でLgYPG培養基によって培養される。これは二番目の篩選であり、篩選したサンプルは、ナイルレッドで染色され、蛍光顕微鏡で観察される。観察結果は、図1のC、Dのように示し、オイルを有する部分が黄金色に表示される。前記観察した後、オイルを有する菌株が、7日間に20℃でGYPG培養基によって培養され、3回繰り返し精製された後、実験菌株が得られる。
【表Ａ】
0005512613.tif 000003
【００１５】
B.LgYPG培養基の処方は、抗LgYPG培養基と同じようなものであるが、ストレプトマイシンを添加しない。
【００１６】
C.GYPG固体培養基の処方は、LgYPG培養基と同じようなものであるが、グルコース濃度が5％に調整される。
【００１７】
D.GYPG液体培養基の処方は、GYPG培養基と同じようなものであるが、寒天を添加しない。
【００１８】
何回も浄化して分離する後、オイルを生成する微生物が篩選され、前記微生物にTN01-TN09という番号が付けられ、精製菌株として確認されている。篩選されたTNシリーズとは非常に似ているため、以下の実験では、TN01を無作為に選択して培養最適化の研究対象とする。
【００１９】
TN01は、さらに走査型電子顕微鏡で観察される。図2に示すように、TN01は、楕円形菌体であり、菌体の表面は、滑らかであり、しわや突起がなく、菌糸体を持っていない。又、TN01は、出芽のような形態を有するため、酵母として推測できる。
【００２０】
序列識別と菌株の系統樹
DNA抽出
A. 1 mlのTN01を含む培地を取って、遠心分離を行って菌体を収集し、その後、1MのNaClを3回繰り返し洗う。
【００２１】
B. 200μlの溶解バッファー及び20μlのプロテアーゼKを加えて、55℃で一晩中放置する。
【００２２】
C. 臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（CTAB）抽出溶液を加えて1 mlに達し、65℃で30分間反応させる。
【００２３】
D. 400μlクロロホルムを加えて、30秒間よく混ぜる。
【００２４】
E. 14000rpmで遠心分離して、懸濁液を取る。
【００２５】
F. 2倍容積のCTABを加えて60分間放置する。
【００２６】
G. 14000rpmで遠心分離した後、沈殿物を収集して、350μl、1.2MのNaClで前記沈殿物を再溶解する。
【００２７】
H. 350μlのクロロホルムを加え、30秒間よく混ぜて、遠心分離して懸濁液を取る。
【００２８】
I. 0.8倍容積のイソプロパノールを加え、−20℃でDNAを30分間放置して沈殿させる。
【００２９】
J. 14000rpmで遠心分離して懸濁液を除去し、500μl、70％のアルコールを加えてDNA沈殿を洗浄して遠心分離し、そうして室温でDNAを乾燥する。
【００３０】
K. 滅菌した後の20μlの二重蒸留水は、そのpH値が8になれ、37℃で再溶解する。
【００３１】
L. ゲル電気泳動を行って、DNAのサイズを確認する。又、使用されるマーカーは、Bio-1 kb  DNAラダー（プロテック）である。
【表Ｂ】
0005512613.tif 000004
【００３２】
処方は蒸留水によって溶解して、HClやNaOHでそのpH値を8.2に調整し、加圧滅菌器で滅菌する。
【表Ｃ】
0005512613.tif 000005
【００３３】
処方は蒸留水によって溶解して、HClやNaOHにより、そのpH値を8.0に調整し、加圧滅菌器で滅菌する。
【表Ｄ】
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【００３４】
処方は蒸留水によって溶解して、加圧滅菌器で滅菌する。
【００３５】
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）
この実験は、株識別ための配列増幅であり、3つの組のプライマー（primer）が使用される。配列及び条件は次のとおりである。
【表Ｅ】
0005512613.tif 000007
【表Ｆ】
0005512613.tif 000008
【表Ｇ】
0005512613.tif 000009
【表Ｈ】
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【表Ｉ】
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【００３６】
i.それぞれの条件を増幅する後、DNAのサイズを確認するために、1％のゲル電気泳動を行う。
【００３７】
ii. 使用されるマーカーは、Bio-1 kb  DNAラダー（プロテック）である。
【００３８】
配列の比較分析
18S rDNA、26S rDNA D1/D2及びITSのPCR増幅の後、それらのすべてのサイズが約1200塩基対である。BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）を行った後、TN01の配列は、Cystofilobasidiumに最も似ている。
【００３９】
それぞれの配列は、ClustalWモジュールによって整理され、生物学の解析ソフトウェアMEGA4により分析される。又、ブートストラップ法（bootstrap）及び近隣結合法（neighbor-joining method）の分類方法を使って、TN系列と標準菌株の間に進化系統樹を確立する。図3は、18S rDNA配列の進化系統樹を示し、図4は、26S rDNA D1/D2配列の進化系統樹を示し、図5は、ITS配列の進化系統樹を示す。そこで、Rhodotorula lamellibrachiaeは、他の種類の石油生成菌であり、対照群として提供される。それらの図から見ると、TN系列と標準菌株Cystofilobasidiumとは最も似ているが、いくつかの相違点を有している。
【００４０】
生化学品質試験
炭素源の生化学品質試験を行うために、実験菌株と標準菌株を分離して、酵母識別システムID 32C （REF 32 200、bioMerieux（登録商標）から購入した）を使用する。
【００４１】
A. 分離された実験菌株と標準菌株は、3 mlのGYPG液体培養基（培養液）で20℃に150 rpmで2日間培養する。
【００４２】
B. キット操作説明書に基ついて実験手順を実行する。
【００４３】
C. 前記二つの菌株を有する培養液は、20℃の培養器内で3日間培養し、ウェルプレートから培養液を取って二重蒸留水を加えて、1 mlに達し、O.D.600により濃度を測定する。O.D.値は、0.2未満になると無反応（−）を示し、0.2から0.3になると弱い信号（W）を示し、0.4から0.6になると強い信号（+）を示し、0.6以上になると最高信号（++）を示す。
【００４４】
前記O.D.値の結果は、表2のように示す。炭素源の分類は、表3のように示す。炭素源を利用することには、TN01と標準菌株を比較すると、C. bisporidiiに最も似ている。異なる炭素源のそれぞれは、グルクロン酸乳酸（LAT）、メチル- D -グルコピラノシド（MDGs）、パラチノース（PLE）及びナトリウム（GRT）である。
【表２】
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【表３】
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【００４５】
最適培養条件
菌株を固体培養基から選び取って、3 mlのGYPG液体培養基（培養液）を有する試験管に配置し、20℃に150 rpmで2日間振り動かす。そうして、500 μlの前記菌株を有する培養液を取って、50 mlのGYPG液体培養基を含んでいるフラスコ（125 ml）に配置し、20℃に150 rpmで2日間振り動かして最終接種菌液を得る。前記最終接種菌液から500 μlを取ってそれぞれの培養条件の培養液に入れる。すべての培養条件は、3回繰り返し、培養日数は、成長曲線によって決定され、TN01を含む培養液は、菌株成長の定常期に収集し、遠心分離を実行して凍結乾燥を行う。
【００４６】
脂肪酸の抽出
各実験群から収集された菌液をそれぞれ凍結乾燥して乾燥菌粉末を得り、脂肪酸を抽出するために、前記乾燥菌粉末を使う。生体内で脂肪酸は、トリグリセリドという形で存在し、エステル化によってグリセロールと組み合わせる三つの遊離脂肪酸であるため、エステル転移反応を必要とする。エステル転移反応は、メタノール及びトリグリセリドによって単一のメチルエステルを形成して、それを分析することができる。
【化１】
0005512613.tif 000014
【００４７】
トリグリセリドのエステル転移反応（Chisti, 2007）
抽出工程には、定量的な方法で微生物が含む脂肪酸の量を決定するため、ガスクロマトグラフ（GC）を使用する必要があるが、実際には、サンプルがGCに接続される検出器によって検出される。検出器自体は、GCの特徴により、安定な検出結果を提供できないため、内部標試料を追加して定量化の基礎を提供するすることができる。内部標試料に対し分析物の比（RRF、相対感度係数）は、サンプルの量を決定するように使用される。サンプルと内部標試料は、検出プロセスに比例した増加量と減少量を提出するため、より正確に定量することができる。内部標試料の選択については、サンプルに現われなく、且つサンプルと同様の構造、化学的性質、沸点を有するものではない。有機体内に存在する脂肪酸の殆どが、偶数炭素鎖であり、奇数炭素鎖が非常に珍しい。したがって、ノナデカン酸（nonadecanoic acid）は内部標試料として使用されている。抽出工程は次のとおりである。
【００４８】
A. 0.05 gの乾燥菌粉末を10 mlの試験管に入れ、5 mlのクロロホルムとメタノールを2：1で加えてよく混ぜる。
【００４９】
B. 菌体は、超音波により、2分間振って粉々になる（5秒間振り、5秒間停止し、総計は4分になる）。
【００５０】
C. 室温で1時間に置かれた後、100 μl、10 mg/mlの内部標試料を加える。
【００５１】
D. 0.5 mlの水を加え、2500rpmで5分間に遠心分離をして、上層の懸濁液（上清）を取り除く。
【００５２】
E. 揺れないように、2.5 mlのTUP（theoretical upper phase、クロロホルム：二重蒸留水：メタノール＝47:48:3）を加え、2500rpmで5分間に遠心分離をし、上層の懸濁液を取り除く。
【００５３】
F. 工程DとEを繰り返して行って、室温下で窒素ガスによって沈殿物を乾燥させる。
【００５４】
G. 2.5 mLのメタノールとベンゼンを4:1（V / V）の比で加えて、エステル転移反応の触媒として250μlの塩化アセチルを徐々に追加して、よく混ぜる。
【００５５】
H. 密閉するようにポリテトラフルオロエチレン製の蓋をし、80℃のオーブンに4時間置いておく。
【００５６】
I. 室温下で冷却した後、1.5 ml、7％の炭酸カリウムをゆっくりと加えて反応を停止し、2500rpmで10分間に遠心分離をする。
【００５７】
J. 上ベンゼン層を使い捨て遠心管に置き、室温で窒素ガスによって沈殿物を乾燥させる。
【００５８】
K. 管壁に沿って0.5 mlのヘキサンを加えてよく混ぜる。
【００５９】
L. 窒素ガスで乾燥した後、250μlのヘキサンを加え、揺らして混ぜ、挿入管を有する標本ビンに注入する。開口部を密封した後、GCによって分析する。
【００６０】
ガスクロマトグラフィー（GC）によって脂肪酸を分析する
カラム・クロマトグラフィで使用されるガラス管が低極性であり、ガラス管の仕様はDB-1である。前記ガラス管は、60mの長さ、0.25 mmの内径を有し、又、その内側にある膜が0.25μmの厚さを有するポリジメチルシロキサン[-O-ジメチルシリコン-]である。オーブンの初期温度が60℃であり、280℃に加熱できる。注射器の加熱温度が250℃である。窒素ガスの流量は、1.2 ml/minであり、水素ガスの流量は、30 ml/minであり、空気の流量は、300 ml/minである。サンプルの注入量は、1μlである。火災イオン検出器（FID）によってサンプルを検出することには、温度が300℃に設定されている。結果は、GCのパッケージソフトウェアによって積分し、標試料で脂肪酸の内容物を推算する。推算式は以下の通りである。
【００６１】
単一脂肪酸％＝（単一脂肪酸の積分面積×標試料の濃度×100）÷内部標試料の積分面積
総脂肪酸％＝[（総脂肪酸の積分面積−内部標試料の積分面積）×標試料の濃度×100]÷内部標試料の積分面積
最適な塩濃度試験
0％、1％、25％及び50％の希釈海水のそれぞれを培養基に加え、5Lの発酵タンクにより培養する。24時間ごとに50mlの菌液を収集し、凍結乾燥した後、乾燥重量を測定して総菌体数及び培養日数を推定する。図6は、本発明の実施例による各塩濃度の条件下でTN01の増殖曲線を示す。第一日から第五日までは、TN01の対数増殖期である。第六日目は、TN01の成長率が穏やかになる。第七日から第十日までは、TN01の成長率が遅くなるが、上昇傾向を示している。従って、第六日目は、菌体を収集して培養する最適な時間である。1％の希釈海水は、菌体を増殖するための最適な塩濃度を有する。最悪は25％であり、次善は0％と50％である。10日間に培養した後、1％の希釈海水の条件下での菌体の乾燥重量は、13.09 g/Lに達し、又、0％、25％及び50％のそれぞれは、11.84 g/L、10.73 g/L 及び11.31 g/Lに対応する。
【００６２】
第六日目で収集された菌体に対し、乾燥重量を測定し、且つ脂肪酸を分析する結果は、図7のように示す。0％、1％、25％及び50％の希釈海水により培養された菌体（50 ml）は、それぞれに対応する乾燥重量が0.31 g、0.39 g、0.266 g及び0.297 gであり、それぞれに対応する総脂肪酸含量が50.91%、51.24%、44.31%及び41.76%である。脂肪酸の分析結果と増殖曲線の結果を比較してみると、後続の最適化実験には、1％の塩濃度を有する希釈海水を採用する。
【００６３】
培養温度の範囲試験
3つの異なる温度条件下でTN01を50 mlのGYPG培養液に培養し、六日後に菌体を収集し、乾燥重量を測定し、且つ脂肪酸を分析する結果は、図8のように示す。20℃で培養すると、最も好ましいバイオマスと脂肪酸の割合があり、28℃で培養すると増殖状況が悪くなり、37℃で培養すると、20℃とはかなり異なり、TN01はほとんど増殖しない。は、20℃、28℃及び37℃で培養された菌体は、それぞれに対応する乾燥重量が0.317 g、0.027 g及び0.023 gであり、それぞれに対応する総脂肪酸含量が53.1%、4.40%及び0.63%である。
【００６４】
培養液の簡素化
未来では、工業的規模で発酵・培養を実行する時、最も単純な培養液によりコストを削減する効果に達することが望まれる。したがって、元のGYPG培養液は、次のように改善される。
【表Ｊ】
0005512613.tif 000015
【００６５】
最適なpH値試験
菌体に対するpH値の影響及び最適な培養条件を議論するために、pH値の範囲は、3〜11に設定されている。生物体が生成する代謝物によりpH値に影響を及ぼすため、以下の緩衝剤は、前記影響を減少するために、GYPG培養液をベースとして、各条件に応じて追加される。
【表Ｋ】
0005512613.tif 000016
【００６６】
酢酸を使用してpH値を3〜4に調整し、NaOHまたはHClを用いてpH値を5〜11に調整する。TN01は、各pH値、最適な温及び150rpmの条件で6日間に培養される。六日後に50 mlの菌液を収集して乾燥した後、乾燥重量を測定する結果は、図10のように示す。pH値は3〜11になると、TN01菌体の乾燥重量のそれぞれは0.0423 g、0.025 g、0.412 g、0.45 g、0.479 g、0.596 g、0.369 g、0.168 g及び0.1gであり、従って、菌体成長のための最適なpH値は8である。
【００６７】
炭素源の利用試験
従属栄養体が成長するため、炭素源を必要とする。炭素源の種類については、微生物の成長とオイルの蓄積に影響を及ぼす。酵母の代謝経路に基づき、炭素源は、単糖（ヘキソースとペントース）、二糖、多糖、及び三炭素鎖の長さを有する炭素源を含む。更に、微生物の成長とオイルの蓄積に対し、最適な炭素源を探すために、グリセリンは、オイルの炭素源として使用される。培養液の処方は次のとおりである。
【００６８】
5％の炭素源＋0.1％酵母抽出物＋0.1％ペプトン＋0.1％ゼラチン
炭素源の種類：グルコース、フルクトース、乳糖、マルトース、蔗糖、グリセロール、ソルビトール、澱粉、酢酸
結果としての乾燥重量と総脂肪酸含量は、図11のように示す。TN01が培養されて、最も好ましいバイオマスを生成させる炭素源としては、澱粉であり、その乾燥重量は、0.382 gである。次善の炭素源としては、蔗糖であり、その乾燥重量は、0.364 gである。TN01が培養されて、最も好ましい総脂肪酸含量を生成させる炭素源としては、蔗糖であり、総脂肪酸含量は、70％である。次善の炭素源としては、グルコースであり、総脂肪酸含量は、56％である。乳糖と酢酸によってTN01を培養して生成するバイオマスが最も好ましくなく、その総脂肪酸含量も最も少ない。
【００６９】
窒素源の利用試験
微生物が成長するため、窒素源を必要とする。研究によると、微生物は異なる窒素源により、オイルの蓄積に影響を与えることができる。従って、最適な窒素源を発見するため、有機窒素源、無機窒素源により、微生物の成長及びオイルの蓄積を観察する。培養液の処方は次のとおりである。
【００７０】
5％グルコース＋0.1％酵母エキス＋0.1％窒素源＋0.1％ゼラチン
窒素源の種類：尿素、ペプトン、トリプトン、ソイトン、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、ナトリウムアンモニウム、チオ硫酸ナトリウム。チオ硫酸ナトリウムは、窒素源を持っていないため、対照群として提供する。
【００７１】
結果としての乾燥重量と総脂肪酸含量は、図12のように示す。TN01が培養されて、最も好ましいバイオマスを生成させる窒素源としては、尿素であり、その乾燥重量は、0.318 gである。次善の窒素源としては、順番的にはソイトン、ペプトン及びトリプトンであり、その乾燥重量は、0.304 g, 0.296 g及び0.293 gである。TN01が培養されて、最も好ましい総脂肪酸含量を生成させる窒素源としては、対照群のチオ硫酸ナトリウムであり、その総脂肪酸含量は、66.6％である。次善の窒素源としては、順番的には塩化アンモニウム、トリプトンであり、それらの総脂肪酸含量は、52.3％、51.9％である。
【００７２】
糖類濃度試験
炭素は、脂肪酸を形成する基本単位である。発酵培養は、通常、流加培養法（fed-batch)）によってオイルの蓄積を調整する。従って、炭素源とする高濃度の糖類で微生物の成長とオイルの蓄積に与えた影響を観察する。実験群は、GYPG培養液をベースとして、添加されたグルコースのそれぞれは、50 g/L、100 g/L、150 g/L及び200 g/Lである。
【００７３】
結果としては、図13のように示す。グルコースの濃度が、50 g/L、100 g/L、150 g/L 及び200 g/Lであることに対し、TN01菌体の乾燥重量のそれぞれは、0.2680 g、0.2580 g、0.2900 g及び0.2960 gであり、総脂肪酸含量は47.5%、43.5%、30.5%及び24.3%である。グルコースの濃度は150 g/Lになる時、最も好ましいバイオマスを有し、グルコースの濃度は50 g/Lになる時、最も好ましい総脂肪酸含量を有する。
【００７４】
TN01の脂肪酸の分類
TN01は、GYPG培養液で培養され、乾燥された後、TN01の菌体が収集され、脂肪酸が抽出される。TN01の脂肪酸についての詳細な分類を知るため、抽出されたサンプルに対し、GC/MS分析をし、表4に示すように、ほとんどの脂肪酸は、C14の、C16及びC18シリーズの低飽和脂肪酸である。それらの低飽和脂肪酸は、酸化されにくく、飽和脂肪酸よりもバイオディーゼルの製造に適している。バイオディーゼルの製造における熱と酸化剤は、飽和脂肪酸をクラッキングさせる可能性があり、酸化防止剤を添加するため、余分な費用を負担する必要がある。また、TN01を最適化する前に、50％の総脂肪酸に達するので、バイオディーゼルの原料として高い潜在能力を有する。
【表４】
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【００７５】
TN01と他のCystofilobasidiumの脂肪酸含量の試験
TN01、Cystofilobasidium bisporidii BCRC22462、Cystofilobasidium  capitatum  BCRC22464及びCystofilobasidium infirmominiatum BCRC  2246（BCRC：生物資源の収集と研究センター(Bioresource Collection and Research Center)）を、次の培養基で培養する。
【表Ｌ】
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【００７６】
液体培養基を20℃、150 rpmで7日間に揺らし続けて培養を行う。脂肪酸含量を分析し、その結果は表5にように示す。他のCystofilobasidiumは、確かに、オイルを生成する能力を持っているが、TN01よりも良い生成能力を持っていない。
【表Ｍ】
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【００７７】
以上の説明によると、当業者であれば本発明の技術思想を逸脱しない範囲で、多様な変更及び修正が可能であることが分かる。従って、本発明の技術的な範囲は、明細書の詳細な説明に記載された内容に限らず、特許請求の範囲によって定めなければならない。
以下に、本願出願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］糖類と、
前記糖類と反応してオイルを生成する作業微生物と、を備え、
前記作業微生物は、シストフィロバシジウム（Cystofilobasidium）属であることを特徴とするオイル発生システム。
［２］前記オイル発生システムは、更に前記作業微生物によって利用される窒素源を含み、
前記窒素源は、アンモニアナトリウム（Na(NH4)）であることを特徴とする上記［１］に記載のオイル発生システム。
［３］前記オイルは、不飽和脂肪酸又はC14-C20の脂肪酸であり、バイオディーゼルとして使用されることを特徴とする上記［１］に記載のオイル発生システム。
［４］前記作業微生物は、配列番号7の18S rDNA配列、配列番号8の26S rDNA配列及び配列番号9のITS rDNA配列を有することを特徴とする上記［１］に記載のオイル発生システム。
［５］炭素源と、
前記炭素源と反応してオイルを生成する作業微生物と、を備え、
前記作業微生物は、シストフィロバシジウム（Cystofilobasidium）属であることを特徴とするオイル発生システム。
［６］前記作業微生物は、前記炭素源を前記オイルに分解することを特徴とする上記［５］に記載のオイル発生システム。
［７］産油菌によってオイルを生成し、
前記産油菌は、シストフィロバシジウム（Cystofilobasidium）属であることを特徴とするオイル発生方法。
［８］前記産油菌は、シストフィロバシディウム・ビスポリディ（Cystofilobasidium bisporidii）、シストフィロバシディウム・キャピタタム（Cystofilobasidium capitatum）、シストフィロバシディウム・インファモミニアタム（Cystofilobasidium infirmominiatum）及び他のシストフィロバシジウム（Cystofilobasidium）属からなる群より選ぶことを特徴とする上記［７］に記載のオイル発生システム。
【寄託番号】
【００７８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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