(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造（Ｉ）
【化９】
0005512533.tif 000015
（式中、
Ｒ１は、低級アルキル、ジ（低級アルキル）アミノ又はフェニルであり、
Ｒ２は、低級アルキル、単環式アリールメチル又は単環式（アリールオキシ）メチルであり、
Ｒ３は、トリアリールメチル又は水素であり、そして
Ｙは、保護又は非保護ヒドロキシル基、保護又は非保護アミノ基、クロロホスホルアミダート基、モルホリノサブユニットモノマーのモルホリノ環窒素へのホスホロジアミダート結合、モルホリノオリゴマー中のモルホリノサブユニットのモルホリノ環窒素へのホスホロジアミダート結合、又は固体支持体への結合であり、
低級アルキルが、１から６個の炭素原子を含むアルキル基を示す）
を有するモルホリノ化合物。
【請求項２】
Ｙが、保護又は非保護ヒドロキシル基、あるいはクロロホスホルアミダート基である、請求項１に記載のモルホリノ化合物。
【請求項３】
Ｙが、トリアルキルシリルで保護されたヒドロキシル基又は非保護ヒドロキシル基である、請求項２に記載のモルホリノ化合物。
【請求項４】
Ｙが、以下の構造：
【化１０】
0005512533.tif 000016
を有するクロロホスホルアミダート基である、請求項２に記載のモルホリノ化合物。
【請求項５】
Ｒ３が、トリチル、４−メトキシトリチル、４−メチルトリチル、４，４’−ジメチルトリチル、又は４，４’，４”−トリメチルトリチルである、請求項１に記載のモルホリノ化合物。
【請求項６】
Ｒ１が１から６個の炭素原子を含むアルキルである、請求項１に記載のモルホリノ化合物。
【請求項７】
Ｒ１が−Ｃ（ＣＨ３）３である、請求項６に記載のモルホリノ化合物。
【請求項８】
Ｒ２がベンジル又は−ＣＨ（ＣＨ３）２である、請求項１に記載のモルホリノ化合物。
【請求項９】
モルホリノオリゴマーを合成する方法であって、該方法は、
（ａ）非保護モルホリノ環窒素を含む固相に支持されたモルホリノサブユニットモノマーを、第一のモルホリノサブユニットモノマーと反応させる工程であって、該第一のモルホリノサブユニットモノマーは、トリアリールメチルで保護されたモルホリノ環窒素及び活性化ホスホルアミダート基を５’環外炭素上に含み、該反応によって該第一のモルホリノサブユニットモノマーの該５’環外炭素と、該固相に支持されたモルホリノサブユニットモノマーの該非保護モルホリノ環窒素との間にホスホロジアミダート結合を形成する工程、
（ｂ）該トリアリールメチルで保護されたモルホリノ環窒素を脱保護して、非保護モルホリノ環窒素を含む生成物を形成する工程、
（ｃ）工程（ｂ）からの生成物を、さらなるモルホリノサブユニットモノマーと、必要に応じて反応させる工程であって、該さらなるモルホリノサブユニットモノマーは、トリアリールメチルで保護されたモルホリノ環窒素及び活性化ホスホルアミダート基を５’環外炭素上に含み、該反応によって該さらなるモルホリノサブユニットモノマーの該５’環外炭素と、工程（ｂ）からの生成物の非保護モルホリノ環窒素との間にホスホロジアミダート結合を形成する工程、および
（ｄ）工程（ｂ）及び（ｃ）を、必要に応じて１回以上繰り返す工程
を含み、
該第一のモルホリノサブユニットモノマー、該さらなるモルホリノサブユニットモノマー、又は該固相に支持されたモルホリノサブユニットモノマーのうちの少なくとも一つは、以下の構造（Ｉ）：
【化１１】
0005512533.tif 000017
（式中、
Ｒ１は、低級アルキル、ジ（低級アルキル）アミノ又はフェニルであり、
Ｒ２は、低級アルキル、単環式アリールメチル又は単環式（アリールオキシ）メチルであり、
Ｒ３は、トリアリールメチル又は水素であり、該固相に支持されたモルホリノサブユニットモノマーについて、Ｒ３は、水素であり、
Ｙはクロロホスホルアミダート基、又は固体支持体への結合であり、
低級アルキルが、１から６個の炭素原子を含むアルキル基を示す）
を有する二重に保護されたグアニンモルホリノ化合物である、方法。
【請求項１０】
Ｙが、以下の構造：
【化１２】
0005512533.tif 000018
を有するクロロホスホルアミダート基である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
Ｒ３が、トリチル、４−メトキシトリチル、４−メチルトリチル、４，４’−ジメチルトリチル、又は４，４’，４”−トリメチルトリチルである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
Ｒ１が１から６個の炭素原子を含むアルキルである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
Ｒ１が−Ｃ（ＣＨ３）３である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｒ２がベンジル又は−ＣＨ（ＣＨ３）２である、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｂ）の前記脱保護が、トリフルオロエタノール含有溶媒中の複素環式アミン塩を含む試薬溶液に前記トリアリールメチルで保護された環窒素を曝露する工程を含み、該塩が、複素環式アミンと、スルホン酸、トリフルオロ酢酸又は塩酸との塩であり、そしてそのプロトン化された形態のｐＫａが１〜４の範囲である、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記塩が、３−クロロピリジニウムメタンスルホナート（ＣＰＭ）又は４−シアノピリジニウムトリフルオロアセタート（ＣＹＴＦＡ）である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記溶媒が、９０：１０から２５：７５の範囲の体積比のジクロロメタンとトリフルオロエタノールとを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記体積比が８０：２０である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記化合物は、以下の構造：
【化１３】
0005512533.tif 000019
を有し、ここで、Ｙは、固体支持体への結合、又は以下の構造：
【化１４】
0005512533.tif 000020
を有するクロロホスホルアミダート基である、請求項１に記載のモルホリノ化合物。
【請求項２０】
前記第一のモルホリノサブユニットモノマー、又は前記さらなるモルホリノサブユニットモノマーのうちの少なくとも一つは、以下の構造：
【化１５】
0005512533.tif 000021
を有し、ここで、Ｙは、固体支持体への結合、又は以下の構造：
【化１６】
0005512533.tif 000022
を有するクロロホスホルアミダート基である、請求項９に記載の方法。
【請求項２１】
前記固相に支持されたモルホリノサブユニットは、以下の構造：
【化１７】
0005512533.tif 000023
を有し、ここで、Ｙは、固体支持体への結合、又は以下の構造：
【化１８】
0005512533.tif 000024
を有するクロロホスホルアミダート基である、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、モルホリノサブユニットモノマーのカップリングによって、ホスホロジアミダートで連結されたモルホリノオリゴマーを合成する方法、特に各カップリングステップにおける保護されたモルホリノ環窒素の脱保護のための改善された手順、及びグアニン塩基のＮ２とＯ６／Ｎ１基の両方において保護されたグアニンモルホリノ（ＭｏＧ）サブユニットの使用に関する。これらの改変を使用して合成されたモルホリノオリゴマーは、モノ保護グアニンサブユニット及び／又は従来の環窒素脱保護手順を使用して合成されたモルホリノオリゴマーよりも高い純度及び収率で得られる。
【０００２】
【数１】
0005512533.tif 000002
【背景技術】
【０００３】
背景
ホスホロジアミダートで連結されたモルホリノオリゴマー、すなわちＰＭＯは、相補ＲＮＡに堅固にかつ配列特異的に結合する核酸類似体であって、タンパク質合成、したがって遺伝子発現の調節に有用である核酸類似体である。これらのオリゴマーは、モルホリノ骨格系によって支持された塩基対合認識部分（複素環式塩基）で構成される。かかるオリゴマーの合成に使用されるモルホリノサブユニットは、容易に入手可能な安価な前駆体である対応するリボヌクレオシドから容易に調製することができる（例えば、Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｅｒ，１９９３，１９９７参照）。
【０００４】
従来のオリゴヌクレオチド合成同様、かかる合成中に、複素環式塩基上の官能基は、典型的には、合成変換における干渉を防止するためにマスクされる。例えば、Ｎ−トリチル化モルホリノモノマー（１ａ−ｆ、図１）の活性化は、活性化サブユニット２ａ−ｆを形成する、５’−ヒドロキシルと適切なホスホルアミドジクロリダートとの反応を必要とする。大きな規模（５０〜１００ガロン反応器）では、粗製活性化サブユニットは、一般に、高レベルの副生物で汚染される。クロマトグラフィー精製後に、活性化サブユニットは、Ａ、Ｃ、Ｉ、Ｔ、Ｕ及びその保護体については収率約５０％で単離されるが、活性化された単一保護Ｇサブユニットについては収率約５％でしか単離されない。これは、非保護のＯ６酸素の存在のためと考えられる。
【０００５】
Ｏ６非保護グアニンサブユニットは、オリゴマー段階において副反応も生じる。例えば、Ｏ６酸素は、カップリングステップ中に活性化サブユニットと反応して、Ｏ６リン酸化又は誘導体種を形成し、アンモニアを用いた塩基保護基の最終切断中に、アンモニアはＣ６において反応してこれらの種を置換し、ジアミノプリン誘導体を与え得る。かかる不純物は、クロマトグラフィーによって除去することが困難であり、収率を大きく低下させる。
【０００６】
従来のオリゴヌクレオチド合成における非保護グアニンＯ６位の副反応を抑制するために種々の保護スキームが当分野では提案されてきた（例えば、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５参照）。しかし、これらのプロトコルは、ＰＭＯ合成に適用すると大部分は失敗であった。したがって、ＰＭＯ合成において、特にＧモルホリノサブユニットの使用において、収率及び純度を増加させる改善された方法が求められている。
【０００７】
モルホリノサブユニットのモルホリノ窒素は、使用前に、典型的にはトリチル又は置換トリチル種でも保護される。オリゴマー合成中には、次のサブユニットの組み入れを可能にするために、この基を各サイクル中に除去しなければならない。保護基を完全に除去することができないと、所望のオリゴマー生成物を汚染するＮ−１欠失配列をもたらす。
【０００８】
トリチル基は、従来、酸を用いて除去され、ＰＭＯ合成に使用される脱保護試薬は、伝統的にカルボン酸である（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９３，１９９７）。しかし、ホスホロジアミダート基は、酸にも感受性であり、図１に示すように、脱トリチル化に有用であるカルボン酸は、アミダート種とのホスホロジアミダート結合の加水分解を促進する能力もあり、より大規模な骨格分解の可能性を有する。例えば、シアノ酢酸の２０％アセトニトリル／ＤＣＭ溶液は、有効な脱保護試薬であるが、ＰＭＯ生成物中のホスホロジアミダート結合のかなりの（５〜１０％）加水分解を起こすことが判明した。
【０００９】
カルボン酸は、カップリング反応前に合成支持樹脂（ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｓｕｐｐｏｒｔ  ｒｅｓｉｎ）からも完全に除去しなければならない。さもないと、３’−アシル化種を含む切断型オリゴマーからなる副生物が形成される。
【００１０】
これらの理由のために、ＰＭＯ合成におけるモルホリノ窒素脱保護のための改善された試薬が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｇｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７：１９５５−１９６４
【非特許文献２】Ｒｅｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２２：４７５５−４７５８
【非特許文献３】Ｒｅｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．Ｉ  １２６３−１２７０
【非特許文献４】Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２Ａ）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２３：２２５３−２２５６
【非特許文献５】Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２Ｂ）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２３：２２５７−２２６０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
一態様においては、本発明は、構造Ｉを含むモルホリノ化合物を提供する。
【００１３】
【化１】
0005512533.tif 000003
式中、
Ｒ１は、低級アルキル、ジ（低級アルキル）アミノ及びフェニルからなる群から選択され、
Ｒ２は、低級アルキル、単環式アリールメチル及び単環式（アリールオキシ）メチルからなる群から選択され、
Ｒ３は、トリアリールメチル及び水素からなる群から選択され、
Ｙは、保護又は非保護ヒドロキシル又はアミノ基、クロロホスホルアミダート基、及び更なるモルホリノ化合物又はモルホリノオリゴマーの前記環窒素とのホスホロジアミダート結合からなる群から選択される。
【００１４】
選択された実施形態においては、Ｙは、保護又は非保護ヒドロキシル基及びクロロホスホルアミダート基からなる群から選択され、例えば、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）２Ｃｌの形のクロロホスホルアミダート基である。Ｙが保護ヒドロキシル基であるときには、Ｙは、好ましくは、トリアルキルシリルで保護されたヒドロキシル基である。
【００１５】
Ｒ３基は、好ましくは、トリチル（トリフェニルメチル）、４−メトキシトリチル、４−メチルトリチル、４，４’−ジメチルトリチル及び４，４’，４”−トリメチルトリチルから選択される。Ｒ１基は、好ましくは、低級アルキル、特にＣ１−Ｃ４アルキル、最も具体的には−Ｃ（ＣＨ３）３（ｔｅｒｔ−ブチル）である。Ｒ２基は、好ましくは、ベンジル及び−ＣＨ（ＣＨ３）２（イソプロピル）から選択される。
【００１６】
関連した一態様においては、本発明は、モルホリノオリゴマーを合成する改善された方法を提供する。この方法は、
（ａ）非保護環窒素を有する、固相に支持されたモルホリノサブユニットを、トリアリールメチルで保護された環窒素及び活性化ホスホルアミダート基を５’環外炭素上に有する、塩基で保護されたモルホリノサブユニットモノマーと反応させ、それによって５’環外炭素と非保護環窒素との間にホスホロジアミダート結合を形成すること、
（ｂ）保護環窒素を脱保護して、非保護環窒素を形成すること、及び
（ｃ）更なる塩基保護モルホリノサブユニットモノマーを用いて、ステップ（ａ）及び（ｂ）を１回以上繰り返すこと
を含み、
塩基保護モルホリノサブユニットモノマーの少なくとも１種類が、構造Ｉを有する二重に保護されたグアニンモルホリノ化合物である。
【００１７】
【化２】
0005512533.tif 000004
式中、
Ｒ１は、低級アルキル、ジ（低級アルキル）アミノ及びフェニルからなる群から選択され、
Ｒ２は、低級アルキル、単環式アリールメチル及び単環式（アリールオキシ）メチルからなる群から選択され、
Ｒ３は、トリアリールメチル及び水素からなる群から選択され、
Ｙはクロロホスホルアミダート基である。
【００１８】
上記構造中で示される変数の選択実施形態としては、上記のものが挙げられる。
【００１９】
更に別の一態様においては、本発明は、モルホリノオリゴマーを合成する改善された方法を提供する。この方法は、
（ａ）非保護環窒素を有する、固相に支持されたモルホリノサブユニットを、トリアリールメチルで保護された環窒素及び活性化ホスホルアミダート基を５’環外炭素上に有する、塩基で保護されたモルホリノサブユニットモノマーと反応させ、それによって５’環外炭素と非保護環窒素との間にホスホロジアミダート結合を形成すること、
（ｂ）保護環窒素を脱保護して、非保護環窒素を形成すること、及び
（ｃ）更なる塩基保護モルホリノサブユニットモノマーを用いて、ステップ（ａ）及び（ｂ）を１回以上繰り返すこと
を含み、
前記脱保護が、トリフルオロエタノール含有溶媒中の複素環式アミン塩を含む試薬溶液にトリアリールメチル保護環窒素を曝露することを含み、塩が、そのプロトン化された形で１〜４のｐＫａを有する複素環式アミンとスルホン酸、トリフルオロ酢酸及び塩酸から選択される酸との塩である。
【００２０】
複素環式アミンは、好ましくは、電子求引性基で置換されたピリジン、チアゾール、ピリダジン、ピラゾール、トリアゾール及び電子求引性基で置換されたこれらの置換誘導体からなる群から選択される。かかる電子求引性基（ＥＷＧ）としては、ハロゲン、シアノ、アルデヒド、ケト、カルボキシエステル及びカルボキサミドが挙げられる。
【００２１】
好ましくは、複素環式アミンは、クロロ又はシアノで置換されたピリジンなどの電子求引性基で置換されたピリジンである。アミン塩は、好ましくは、アルキルスルホナート、（フルオロアルキル）スルホナート、ｐ−トルエンスルホナートなどのスルホン酸塩又はトリフルオロアセタートである。選択された実施形態においては、塩は、３−クロロピリジニウムメタンスルホナート（ＣＰＭ）及び４−シアノピリジニウムトリフルオロアセタート（ＣＹＴＦＡ）から選択される。
【００２２】
ＴＦＥ含有溶媒は、好ましくは、約９０：１０から２５：７５の体積比のジクロロメタンとトリフルオロエタノール、より好ましくは体積比約８０：２０のＤＣＭ：ＴＦＥを含む。
【００２３】
トリアリールメチル保護基は、トリチル（トリフェニルメチル）、４−メトキシトリチル、４−メチルトリチル、４，４’−ジメチルトリチル及び４，４’，４”−トリメチルトリチルからなる群から選択される。
【００２４】
本明細書に記載の改変及び改善は、上記ステップ（ａ）から（ｃ）が実施されるように組み合わせることができ、
（ｉ）塩基保護モルホリノサブユニットモノマーの少なくとも１種類は、上記構造Ｉを有する二重に保護されたグアニンモルホリノ化合物であり、
（ｉｉ）保護環窒素の脱保護は、トリフルオロエタノール含有溶媒中の複素環式アミン塩を含む試薬溶液にトリアリールメチル保護環窒素を曝露することを含み、塩は、そのプロトン化された形で１〜４のｐＫａを有する複素環式アミンとスルホン酸、トリフルオロ酢酸及び塩酸から選択される酸との塩である。
【００２５】
典型的には、合成は、標準手順に従って、固相からのモルホリノオリゴマーの切断及び塩基の脱保護を更に含む。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
下記構造を含むモルホリノ化合物。
【化９−１】
0005512533.tif 000005
（式中、
Ｒ１は、低級アルキル、ジ（低級アルキル）アミノ及びフェニルからなる群から選択され、
Ｒ２は、低級アルキル、単環式アリールメチル及び単環式（アリールオキシ）メチルからなる群から選択され、
Ｒ３は、トリアリールメチル及び水素からなる群から選択され、
Ｙは、保護又は非保護ヒドロキシル基又はアミノ基、クロロホスホルアミダート基、及び更なるモルホリノ化合物又はモルホリノオリゴマーの環窒素とのホスホロジアミダート結合からなる群から選択される。）
（項目２）
Ｙが、保護又は非保護ヒドロキシル基及びクロロホスホルアミダート基からなる群から選択される、項目１に記載の化合物。
（項目３）
Ｙが、トリアルキルシリルで保護されたヒドロキシル基又は非保護ヒドロキシル基である、項目２に記載の化合物。
（項目４）
Ｙが、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）２Ｃｌの形のクロロホスホルアミダート基である、項目２に記載の化合物。
（項目５）
Ｒ３が、トリチル（トリフェニルメチル）、４−メトキシトリチル、４−メチルトリチル、４，４’−ジメチルトリチル及び４，４’，４”−トリメチルトリチルから選択される、項目１に記載の化合物。
（項目６）
Ｒ１が低級アルキルである、項目１に記載の化合物。
（項目７）
Ｒ１が−Ｃ（ＣＨ３）３（ｔｅｒｔ−ブチル）である、項目６に記載の化合物。
（項目８）
Ｒ２がベンジル又は−ＣＨ（ＣＨ３）２である、項目１に記載の化合物。
（項目９）
モルホリノオリゴマーを合成する方法であって、該方法は、
（ａ）非保護環窒素を有する、固相に支持されたモルホリノサブユニットを、トリアリールメチルで保護された環窒素及び活性化ホスホルアミダート基を５’環外炭素上に有する、塩基で保護されたモルホリノサブユニットモノマーと反応させ、それによって該５’環外炭素と該非保護環窒素との間にホスホロジアミダート結合を形成する工程、
（ｂ）該保護環窒素を脱保護して、非保護環窒素を形成する工程、及び
（ｃ）更なる塩基保護モルホリノサブユニットモノマーを用いて、工程（ａ）及び（ｂ）を１回以上繰り返す工程
を含み、
該塩基保護モルホリノサブユニットモノマーの少なくとも１種類が、下記構造を有する二重に保護されたグアニンモルホリノ化合物である、方法。
【化１０−１】
0005512533.tif 000006
（式中、
Ｒ１は、低級アルキル、ジ（低級アルキル）アミノ及びフェニルからなる群から選択され、
Ｒ２は、低級アルキル、単環式アリールメチル及び単環式（アリールオキシ）メチルからなる群から選択され、
Ｒ３は、トリアリールメチル及び水素からなる群から選択され、
Ｙはクロロホスホルアミダート基である。）
（項目１０）
Ｙが、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）−Ｎ（ＣＨ３）２Ｃｌの形のクロロホスホルアミダート基である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
Ｒ３が、トリチル（トリフェニルメチル）、４−メトキシトリチル、４−メチルトリチル、４，４’−ジメチルトリチル及び４，４’，４”−トリメチルトリチルから選択される、項目９に記載の方法。
（項目１２）
Ｒ１が低級アルキルである、項目９に記載の方法。
（項目１３）
Ｒ１が−Ｃ（ＣＨ３）３（ｔｅｒｔ−ブチル）である、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
Ｒ２がベンジル又は−ＣＨ（ＣＨ３）２である、項目９に記載の方法。
（項目１５）
工程（ｂ）の前記脱保護が、トリフルオロエタノール含有溶媒中の複素環式アミン塩を含む試薬溶液に前記トリアリールメチルで保護された環窒素を曝露する工程を含み、該塩が、そのプロトン化された形で１〜４の範囲のｐＫａを有する複素環式アミンと、スルホン酸、トリフルオロ酢酸及び塩酸から選択される酸との塩である、項目９に記載の方法。
（項目１６）
前記塩が、３−クロロピリジニウムメタンスルホナート（ＣＰＭ）及び４−シアノピリジニウムトリフルオロアセタート（ＣＹＴＦＡ）から選択される、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記溶媒が、約９０：１０から２５：７５の範囲の体積比のジクロロメタンとトリフルオロエタノールとを含む、項目１５に記載の方法。
（項目１８）
前記体積比が約８０：２０である、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
モルホリノオリゴマーを合成する方法であって、該方法は、
（ａ）非保護環窒素を有する、固相に支持されたモルホリノサブユニットを、トリアリールメチルで保護された環窒素及び活性化ホスホルアミダート基を５’環外炭素上に有する、塩基で保護されたモルホリノサブユニットモノマーと反応させ、それによって該５’環外炭素と該非保護環窒素との間にホスホロジアミダート結合を形成する工程、
（ｂ）該保護環窒素を脱保護して、非保護環窒素を形成する工程、及び
（ｃ）更なる塩基保護モルホリノサブユニットモノマーを用いて、工程（ａ）及び（ｂ）を１回以上繰り返す工程
を含み、
該脱保護が、トリフルオロエタノール含有溶媒中の複素環式アミン塩を含む試薬溶液に該トリアリールメチルで保護された環窒素を曝露する工程を含み、該塩が、そのプロトン化された形で１〜４の範囲のｐＫａを有する複素環式アミンと、スルホン酸、トリフルオロ酢酸及び塩酸から選択される酸との塩である、方法。
（項目２０）
前記複素環式アミンが、電子求引性基で置換されたピリジン、チアゾール、ピリダジン、ピラゾール、トリアゾール及び電子求引性基で置換されたその置換誘導体からなる群から選択される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記複素環式アミンが、電子求引性基で置換されたピリジンである、項目２０に記載の方法。
（項目２２）
前記電子求引性基が、ハロゲン、シアノ、アルデヒド、ケト、カルボキシエステル及びカルボキサミドからなる群から選択される、項目２０に記載の方法。
（項目２３）
前記複素環式アミンが、クロロ又はシアノで置換されたピリジンである、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記塩が、アルキルスルホナート、（フルオロアルキル）スルホナート及びｐ−トルエンスルホナートから選択されるスルホン酸塩、又はトリフルオロアセタートである、項目１９に記載の方法。
（項目２５）
前記塩が、３−クロロピリジニウムメタンスルホナート（ＣＰＭ）及び４−シアノピリジニウムトリフルオロアセタート（ＣＹＴＦＡ）から選択される、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
前記溶媒が、約９０：１０から２５：７５の体積比のジクロロメタンとトリフルオロエタノールとを含む、項目１９に記載の方法。
（項目２７）
前記体積比が約８０：２０である、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記トリアリールメチルが、トリチル（トリフェニルメチル）、４−メトキシトリチル、４−メチルトリチル、４，４’−ジメチルトリチル及び４，４’，４”−トリメチルトリチルからなる群から選択される、項目１９に記載の方法。
【００２６】
本発明のこれら及び他の目的及び特徴は、本発明の以下の詳細な説明を添付図面と併せて読むとより十分に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】活性化モルホリノサブユニットの形成を示した図である。
【図２】Ｎ２位がフェニルアセチル化され、Ｏ６位が４−ニトロフェネチル（ＮＰＥ）基で保護された、二重に保護されたモルホリノＧサブユニット（ＤＰＧ）誘導体の形成経路を示した図である。
【図３】Ｎ２位がフェニルアセチル化され、Ｏ６位が４−ニトロフェネチル（ＮＰＥ）基で保護された、二重に保護されたモルホリノＧサブユニット（ＤＰＧ）誘導体の代替形成経路を示した図である。
【図４】Ｎ２位がフェニルアセチル化され、Ｏ６位がフェニルスルホニルエチル（ＰＳＥ）又はメチルスルホニルエチル（ＭＳＥ）基で保護された、ＤＰＧ誘導体の形成を示した図である。
【図５】Ｎ２位がフェニルアセチル化され、Ｏ６位がトリメチルシリルエチル（ＴＭＳＥ）基で保護された、ＤＰＧ誘導体の形成を示した図である。
【図６】Ｎ２位がフェニルアセチル化され、Ｏ６位が一連のアリール誘導体で保護された、ＤＰＧ誘導体の形成を示した図である。
【図７】Ｎ２位がフェニルアセチル化され、Ｏ６位が一連のカルバモイル誘導体で保護された、ＤＰＧ誘導体の形成を示した図である。
【図８】Ｎ２位がフェニルアセチル化され、Ｏ６位が４−（ピバロイルオキシ）ベンジルオキシ（ＰＯＢ）基で保護された、ＤＰＧ誘導体の形成を示した図である。
【図９】ホスホロジアミダートで連結されたモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）をカルボン酸で処理すると起こり得る副反応における、ホスホロジアミダート（ＰＤＡ）結合からホスホルアミダート（アミダート）結合への変換を示した図である。
【図１０】モルホリノオリゴマーの段階的調製に用いられる合成樹脂の改変に使用され、チオール処理によるオリゴマーの容易な放出を可能にする、ジスルフィドアンカーの調製を示した図である。
【図１１】合成アンチセンスオリゴマーの水溶解度を増加させる部分（「末端部」）を含むトリエチレングリコールの調製を示した図である。
【図１２】モルホリノオリゴマーの固相合成に有用である樹脂の調製を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
Ｉ．定義
本明細書では以下の用語は、別段の記載がない限り以下の意味を有する。
【００２９】
「モルホリノオリゴマー」とは、典型的なポリヌクレオチドに水素結合可能な塩基を支持する骨格を有するポリマー分子を指し、ポリマーは、五炭糖の糖骨格部分、より具体的にはヌクレオチド及びヌクレオシドの典型であるリン酸ジエステル結合によって連結されたリボース骨格を欠くが、代わりに環窒素を含み、環窒素を介してカップリングする。好ましいモルホリノオリゴマーは、オリゴマー中で、好ましくは、一サブユニットのモルホリノ窒素を隣接サブユニットの５’環外炭素に連結する（チオ）ホスホロジアミダート結合によって結合された、下に示すものなどの「モルホリノサブユニット」構造で構成される。各サブユニットは、ポリヌクレオチド中の塩基に塩基特異的水素結合によって結合するのに有効であるプリン又はピリミジン塩基対合部分Ｐｉを含む。
【００３０】
【化３】
0005512533.tif 000007
モルホリノオリゴマーは、そのすべてが参照により本明細書に明確に援用される、例えば、共同所有された米国特許第５，６９８，６８５号、同５，２１７，８６６号、同５，１４２，０４７号、同５，０３４，５０６号、同５，１６６，３１５号、同５，１８５，４４４号、同５，５２１，０６３号及び同５，５０６，３３７号に詳述されている。
【００３１】
「ホスホロジアミダート」基は、２個の結合酸素原子と２個の結合窒素原子とを有するリンを含み、本明細書では１個の結合酸素原子と３個の結合窒素原子とを有するリンも指し得る。本明細書に記載のオリゴマーのサブユニット間結合においては、下式ＩＩに示すように、１個の窒素は典型的には骨格鎖に懸垂し、第２の窒素はモルホリノ環構造中の環窒素である。その代わりに、又はそれに加えて、窒素は、下式ＩＩＩ及びＩＶに示すように、５’環外炭素位に存在し得る。
【００３２】
【化４】
0005512533.tif 000008
チオホスホロジアミダート結合においては、１個の酸素原子、典型的には、本明細書に記載のオリゴマー中の骨格に懸垂した酸素は、硫黄で置換されている。
【００３３】
「固相に支持されたモルホリノサブユニット」は、本明細書に記載の固相段階的合成によってモルホリノオリゴマーに組み入れられた第１又は任意のそれに続くモルホリノサブユニットモノマーであり得る。サブユニットは、その５’環外炭素を介して、固体支持体に付着し、又は固体支持体上の成長オリゴマー鎖と結合する。「塩基で保護された」とは、段階的オリゴマー合成中の反応又は塩基対合基の干渉を防止するのに適切な保護基を用いた、モルホリノサブユニット上の塩基対合基、例えば、プリン又はピリミジン塩基の保護を指す。
【００３４】
「活性化ホスホルアミダート基」は、典型的には、オリゴマー中の最終的なホスホルアミダート結合において要求される窒素位の置換を有するクロロホスホルアミダート基である。一例は、（ジメチルアミノ）クロロホスホルアミダート、すなわち−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＮＭｅ２）Ｃｌである。
【００３５】
本明細書では「荷電」、「無電荷」、「陽イオン性」及び「陰イオン性」という用語は、中性付近のｐＨ、例えば約６から８における化学部分の支配的な状態を指す。好ましくは、この用語は、生理的ｐＨ、すなわち約７．４における化学部分の支配的な状態を指す。
【００３６】
「低級アルキル」とは、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、イソアミル、ｎ−ペンチル及びイソペンチルによって例示される、１から６個の炭素原子のアルキル基を指す。選択された実施形態においては、「低級アルキル」基は、１から４個の炭素原子、又は１から２個の炭素原子（すなわち、メチル又はエチル）を有する。同様に、「低級アルケニル」とは、アリル及びブテニルによって例示される、２から６個、好ましくは３又は４個の炭素原子のアルケニル基を指す。
【００３７】
「非干渉」置換基は、その意図された標的に結合する本明細書に記載のアンチセンスオリゴマーの能力に悪影響を及ぼさない置換基である。かかる置換基としては、メチル、エチル、メトキシ、エトキシ、ヒドロキシ、フルオロなどの小さい、好ましくは非極性の、基が挙げられる。
【００３８】
ＩＩ．ＰＭＯ合成における塩基保護
モルホリノケミストリー特有の難題のために、塩基保護基は、幾つかの要件を満たさなければならない。保護基は、複素環式部分上に容易に導入されるべきであり、その後、サブユニット活性化及び精製条件並びに固相合成に安定であるべきである。保護基は、成長鎖のモルホリノアミン部分と反応性であるべきではなく、活性化モルホリノサブユニットが成長オリゴマー鎖ときれいにカップリングするようにすべきである。保護基は、新しい不純物を持ち込むことなく、好ましくはアンモニアによって、切断されるべきである。最後に、保護基は、活性化前のクロマトグラフィー精製を不要にするために、結晶性サブユニット誘導体をもたらすべきである。
【００３９】
以下及び比較例に示すように、核酸合成に使用され、二重に保護されたグアノシンに対して文献に報告された保護基は、これらの判定基準を十分満たさなかった。したがって、新しい保護戦略がモルホリノＧサブユニットには必要であった。以下に示すように、Ｏ６位における４−（ピバロイルオキシ）ベンジルオキシ基の使用は、上記判定基準のすべてを満たすことが見いだされた。
【００４０】
Ａ．Ｏ６保護基：比較データ
Ａ１．４−ニトロフェネチルエーテル（ＮＰＥ）
この誘導体を図２（Ｍｉｔｓｕｎｏｂｕ  １９８１）又は図３（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９８２Ｂ）に示したように調製した。粗製Ｏ６保護サブユニットは妥当な収率で調製することができたが、化合物は容易に結晶性ではなく、シリカゲルクロマトグラフィーでしか十分に精製することができず、大規模生産には望ましくない。広範な再スラリー及び／又は再結晶条件を試験した後、ブトキシエタノール含有溶媒の組合せが、ある程度の困難を伴って、材料を結晶化できることが見いだされた。しかし、過剰のブトキシエタノールを最終生成物から除去することができず、化合物は溶媒和化合物として結晶化する可能性があった。過剰のアルコール溶媒の存在は、活性化反応においては許容されないであろう。
【００４１】
ＮＰＥ基は、強塩基を用いてβ脱離機構によって切断される。これらの条件は、反応性副生物４−ニトロスチレンを生成する傾向にあり、４−ニトロスチレンは次いでオリゴマー上の反応部位と反応し得る。オリゴマーによる副生物の捕捉を防止しようてして種々の捕捉剤（例えば、チオール及び１，３−ジカルボニル化合物）が脱保護混合物に導入されたが、この内部帰還問題を解消するのに完全に成功したものはなかった。精製後でも、このサブユニットを用いて調製されたオリゴマーは、黄色みがかった色であった。
【００４２】
Ａ２．フェニルスルホニルエチル（ＰＳＥ）及びメチルスルホニルエチル（ＭＳＥ）
図４に示すように、これらの基を対応する２−チオエタノール誘導体を介して導入した（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９８２Ａ，１９８２Ｂ）。しかし、生成したサブユニットに対して好結果の結晶化手順を見いだすことはできなかった。
【００４３】
上記ＮＰＥ基同様、これらの基は、β脱離機構によって切断される。オリゴマーへの組み入れ後、これらの誘導体は、ＮＰＥ基で見られた同じ問題、すなわち、脱保護中に形成された反応性アルケン副生物の内部帰環を生じた。
【００４４】
Ａ３．トリメチルシリルエチルエーテル
Ｊｏｎｅｓによって報告されたように（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９８２Ｂ）、Ｏ６−ＴＭＳＥ修飾モルホリノグアニンサブユニットを図５に示すように調製したが、それはオリゴマー合成中安定ではなかった。このサブユニットを用いて作製されたオリゴマーは、Ｏ６非保護Ｇサブユニットでできたオリゴマーに類似したある範囲の副生物を示した。
【００４５】
Ａ４．フェニルエーテル
Ｏ６フェニル置換を有するモルホリノグアニンサブユニット（図６）をＲｅｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１，１９８４）の手順に従って調製した。誘導体は、非置換フェニル、２，５−ジクロロフェニル、ペンタフルオロフェニル及び３−フルオロフェニルを含んだ。かかるサブユニットをＰＭＯに組み入れることはできたが、２−ニトロベンズアルデヒドオキシム、強塩基などの通常の試薬を用いた脱保護は、オリゴマーの分解なしには終了できなかった。
【００４６】
Ａ５．カルバマート
幾つかのＯ６−カルバマート誘導体をＨａｔａ  ｅｔ  ａｌ．１９８３の手順に従って合成した（図７）。オリゴマー合成におけるこれらの誘導体の使用は、使用する誘導体に応じて結果が変わった。ジフェニルカルバモイル類似体などのより不安定な種では、成長鎖の３’窒素への保護基の移動が固相合成のカップリングステップ中に認められ、３’−ジフェニルカルバモイル部分を含む切断型オリゴマーが生成した。さらに、Ｏ６−カルバマートは、アンモニアと反応可能な２個の部位を有する。ジフェニルカルバモイル基などのより反応性の部分は、カルボニルにおける比較的選択的な攻撃を生じ、より安定なジメチル及びピロリジニルカルバマートは、Ｃ６位においてアンモニアの重要な競争反応を示し、ジアミノプリンに転化された。
【００４７】
Ｂ．４−（ピバロイルオキシ）ベンジルオキシ保護基
４−（ピバロイルオキシ）ベンジルオキシアルコール（４ａ、図８）を効率的高収率合成によってモルホリノグアニンサブユニットに導入した。活性化前のサブユニット（図１及び８における化合物１ｆ）は、合成することができ、クロマトグラフィー精製なしに大規模に再現性良く単離することができ、種々の溶媒（例えば、ＴＨＦ／水、ＴＨＦ／ヘプタン、アセトニトリル、種々のエステル／炭化水素混合物）から結晶化することができる。５０〜２００ガロン規模（バッチサイズ：化合物１ｃ８〜２７ｋｇ）で製造された１０バッチのこのサブユニットは、（ＨＰＬＣによる）純度９７．６％から９９．２％を有する生成物の平均収率が６５％であった。
【００４８】
このサブユニットは、モノ保護Ｇよりもはるかにきれいに活性化サブユニットに転化され（すなわち、５’−クロロホスホルアミダート化合物への転化）、シリカゲルクロマトグラフィーによってより容易に精製することができる。規模で、化合物１ｆから化合物２ｆ（図１）への全収率は約５０％である。
【００４９】
ＰＯＢ保護基は、Ｎ２及びモルホリノ環窒素に対する保護基の別の組合せを用いて使用することができる。適切なＮ２保護基としては、（図８に示す）フェニルアセチル、並びにアセチル、プロピオニル、イソブチリル及びフェノキシアセチルが挙げられる。カップリングステップ間のモルホリノ環窒素保護に適切なトリチル種としては、非置換トリチル、４−メチル−、４，４’−ジメチル−及び４，４’，４”−トリメチルトリチル並びに４−メトキシトリチルが挙げられる。
【００５０】
別のアシル保護基を、ＰＯＢ基のフェノール部分に対するピバロイルの代わりに使用することもできる。適切な代替物としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルカルバモイル及びベンゾイルが挙げられる。
【００５１】
ＰＭＯ合成中に、上で考察したＯ６−カルバマートに共通した副反応である、完全長ＰＭＯのより小さい断片の３’末端にピバロイル基が結合した生成物は見られない。検出された唯一の注目すべき副生物は、脱保護副生物キノンメチドとの反応に起因する、フェノール残基を含むＰＭＯであった。しかし、この副生物は、アンモニア性脱保護溶液の十分な希釈によって、微量レベルに減少させることができた。さらに、この副生物は、強力な陰イオン交換クロマトグラフィーに使用される重合体樹脂とフェノール残基との強い結合のために容易に除去される。一般に、精製ＰＭＯの全収率は、表１に見られるように大きく増加する。
【００５２】
ＰＯＢで保護されたグアニン基によって促進されるＰＭＯ生成の改善は、ＰＭＯ固相合成に続く精製において最も明白である。ジアミノプリン及び関連副生物を除去する難しさは、強力な陰イオン交換（ＳＡＸ）クロマトグラフィー中の重大な損失を招き得る。例えば、ＣＰＭ及びＭＰＧ（モノ保護グアニンサブユニット、２ｃ）を用いて調製されたＡＶＩ−４１２６の粗純度は、６８〜７３％の範囲であり、ＰＭＯの約５８％粗収率に計算する。トリチルＯｎ及びトリチルＯｆｆ精製中に、純粋な生成物を得るためにかなりの材料が失われ、クロマトグラフィーからの全回収率は５２％である。ＣＹＴＦＡ及びＤＰＧ（二重保護グアニンサブユニット）を用いて製造されたＡＶＩ−４１２６の場合、粗純度は７０〜７５％であり、質量分析法によるＮ−１レベルが類似し（ＣＹＴＦＡとＣＰＭ試薬の各脱トリチル化効率がほぼ同等であることを示す。）、粗収率は約６１％である。しかし、通常の精製方法を適用すると、粗製混合物からＰＭＯの８０％が回収される。
【００５３】
【表１】
0005512533.tif 000009
共同所有された米国特許出願第１１／８０１，８８５号に記載の方法に従い、表に示した修飾を用いて、合成を実施した。下記実施例３〜６参照。すべてのＰＭＯは、５’「末端部」を有し、３’末端が非置換である。
１ＣＡＡ＝２０％アセトニトリル／ＤＣＭ（ｖ／ｖ）混合物中の１１％シアノ酢酸（ｗ／ｗ）、ＣＰＭ＝２０％トリフルオロエタノール／ＤＣＭ（ｖ／ｖ）中の２％３−クロロピリジナム（Ｃｈｌｏｒｏｐｙｒｉｄｉｎｕｍ）メタンスルホナート（ｗ／ｖ）及び０．９％エタノール（ｖ／ｖ）、ＣＹＴＦＡ＝２０％トリフルオロエタノール／ＤＣＭ（ｖ／ｖ）中の２％３−シアノピリジナム（Ｃｙａｎｏｐｙｒｉｄｉｎｕｍ）トリフルオロアセタート（ｗ／ｖ）及び０．９％エタノール（ｖ／ｖ）。
２規模は、グラム単位の出発樹脂重量である。樹脂使用量は４８０〜５２０マイクロモル／ｇである。
３４×１２ｇと１×８ｇ運転の総生成量
４２×１２ｇ運転の総生成量
５４×１２ｇ運転の総生成量
６最終Ｃサブユニットの付加は、モルホリノ窒素上の４−メトキシトリチル保護を有する活性化モルホリノＣサブユニットを用いて実施された。
【００５４】
したがって、本発明の二重に保護されたＭｏＧモノマーの使用は、従来技術方法よりも、特にモノ保護ＭｏＧモノマー又は本発明のものではない別の保護ＭｏＧモノマーを使用したときに認められた精製収率よりも、高い精製収率でモルホリノオリゴマーを合成する方法を提供する。特に、この方法は、好ましくは、本発明のものではないＭｏＧモノマーを使用して得られるよりも低レベルのジアミノプリン種を生成する。
【００５５】
ＩＩＩ．二重に保護されたグアニンモルホリノサブユニット
本発明の二重に保護されたグアニン（ＤＰＧ）モルホリノサブユニットは、以下の構造を有する。
【００５６】
【化５】
0005512533.tif 000010
式中、
Ｒ１は、低級アルキル、ジ（低級アルキル）アミノ及びフェニルからなる群から選択され、
Ｒ２は、低級アルキル、単環式アリールメチル及び単環式（アリールオキシ）メチルからなる群から選択され、
Ｒ３は、トリアリールメチル及び水素からなる群から選択され、
Ｙは、保護又は非保護ヒドロキシル又はアミノ基、クロロホスホルアミダート基、及び更なるモルホリノ化合物又はモルホリノオリゴマーの環窒素とのホスホロジアミダート結合からなる群から選択される。
【００５７】
選択された実施形態においては、Ｙは、（前もって活性化されたモノマーにおけるような）保護若しくは非保護ヒドロキシル基、又は（活性化モノマーにおけるような）クロロホスホルアミダート基である。ヒドロキシル基の好ましい保護基としては、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）などのトリアルキルシリル基が挙げられる。
【００５８】
Ｙが更なるモルホリノ化合物の環窒素とのホスホロジアミダート結合又はモルホリノオリゴマーとのホスホロジアミダート結合である実施形態とは、塩基脱保護前のモルホリノオリゴマー合成中に形成された種を指す。
【００５９】
以下に考察するように、（活性化モノマー中の）クロロホスホルアミダート基上の置換基は、所望の特定のホスホロジアミダート結合に応じて変わり得る。
【００６０】
それに応じて、本発明は、モルホリノオリゴマーを合成する方法であって、
（ａ）非保護環窒素を有する、固相に支持されたモルホリノサブユニットを、トリアリールメチルで保護された環窒素及び活性化ホスホルアミダート基を５’環外炭素上に有する、塩基で保護されたモルホリノサブユニットモノマーと反応させ、それによって前記５’環外炭素と前記非保護環窒素の間のホスホロジアミダート結合を形成すること、
（ｂ）前記保護環窒素を脱保護して、非保護環窒素を形成すること、及び
（ｃ）更なる塩基保護モルホリノサブユニットモノマーを用いて、ステップ（ａ）及び（ｂ）を１回以上繰り返すこと
を含み、前記塩基保護モルホリノサブユニットモノマーの少なくとも１種類が、下記構造を有する二重に保護されたグアニンモルホリノ化合物である、方法も提供する。
【００６１】
【化６】
0005512533.tif 000011
式中、
Ｒ１は、低級アルキル、ジ（低級アルキル）アミノ及びフェニルからなる群から選択され、
Ｒ２は、低級アルキル、単環式アリールメチル及び単環式（アリールオキシ）メチルからなる群から選択され、
Ｒ３は、トリアリールメチル及び水素からなる群から選択され、
Ｙはクロロホスホルアミダート基である。
【００６２】
モルホリノ環窒素の好ましいトリアリールメチル保護基（Ｒ３）としては、トリチル（トリフェニルメチル）、４−メトキシトリチル、４−メチルトリチル、４，４’−ジメチルトリチル及び４，４’，４”−トリメチルトリチルが挙げられる。
【００６３】
Ｏ６保護基上のＲ１置換基は、好ましくは、Ｃ１からＣ４アルキル、特に４−（ピバロイルオキシ）ベンジルオキシ（ＰＯＢ）基におけるような−Ｃ（ＣＨ３）３（ｔｅｒｔ−ブチル）である。しかし、Ｒ１は、ジメチルアミノなどのジ（低級アルキル）アミノ、又はフェニルとすることもできる。
【００６４】
上述したように、「活性化」モノマーにおけるクロロホスホルアミダート基Ｙの置換は、所望のホスホロジアミダート結合の構造に応じて変わる。（Ｒがメチルである上式ＩＩに示したように）「標準」無電荷ＰＭＯ結合５’−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（−Ｎ（ＣＨ３）２）−３’の調製の場合、クロロホスホルアミダート基Ｙは５’−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）Ｃｌ−ＮＲ２である（例えば、化合物２ｆ、図８参照）。
【００６５】
参照により本明細書に援用する、２００７年５月１０日に出願された米国特許出願第１１／８０１，８８５号の共同所有出願に記載のように、陽イオン性及び中性のサブユニット間結合を有するＰＭＯを調製することによって、有利な諸性質を得ることができる。かかるオリゴマーにおいては、２個の連続モルホリノ環構造間の少なくとも１個のサブユニット間結合は、懸垂陽イオン性基を含む。懸垂基は、中性又はほぼ中性（例えば、生理的）ｐＨにおいて陽電荷を有し得る末端窒素原子を有する。
【００６６】
かかる結合の調製では、本発明のサブユニットモノマー中のクロロホスホルアミダート基Ｙは、以下の構造の１つを有し得る。
【００６７】
【化７】
0005512533.tif 000012
式中、Ｒは、メチル、エチルなどの低級アルキルであり、
Ｘ＝−Ｒ４−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒｆ（式中、Ｒ４は二価のアルキル又はオリゴＰＥＧであり、Ｒｆは完全又は部分的にフッ素化されたメチル、エチル又はイソプロピルである。）、及び
Ｚ＝上で定義したＸ、又は低級アルキル。Ｚ含有基は５’−アミン含有結合をもたらすことに留意されたい。
【００６８】
「オリゴＰＥＧ」という用語は、ｎが典型的には１から３である−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｎ−ＣＨ２−ＣＨ２−などの基を指し、「二価のアルキル」は典型的にはＣ２からＣ８アルキルである。
【００６９】
かかる活性化クロロホスホルアミダート基を有するモノマーを用いたオリゴマーの調製後に、Ｃ（＝Ｏ）Ｒｆ保護基を末端窒素原子から除去する。それを更に改変して、例えば、共同所有された米国特許出願第１１／８０１，８８５号に記載のように、末端グアニジニル基を形成することができる。
【００７０】
ＩＶ．ＰＭＯ合成におけるモルホリノ環窒素の脱保護のための改善された条件
上述したように、ＰＭＯ合成におけるトリチルなどのトリアリールメチル基によって典型的には保護されたモルホリノ環窒素の脱保護は、Ｎ−１欠失種を最少化するために、各ステップにおいて十分完全でなければならない。しかし、本発明を支持する研究によれば、この目的のために従来技術に使用される試薬は、望ましくない量の骨格加水分解（図１参照）及び分解を起こした。したがって、かかる加水分解を同時に最小化する効率的脱保護試薬が求められた。
【００７１】
簡単なアッセイを使用して、Ｎで保護されたモルホリノサブユニットの脱保護（典型的には脱トリチル化）における種々の試薬の効率を試験した。モデル化合物である下記トリチル化ｍｏＣＢｚ（すなわち、ベンゾイルで保護されたシトシンモルホリノ）サブユニットを、調べようとする脱トリチル化溶液に溶解させる。種々の時点（例えば、１、２、４分）で一定分量をクエンチし、モルホリノ窒素脱保護の終了をＴＬＣ又はＨＰＬＣによって分析する。一般に、固相ＰＭＯ合成中の有効な脱トリチル化を予測するために、このモデル反応は室温で約２分以内に終了すべきである。
【００７２】
【化８】
0005512533.tif 000013
このアッセイ及び更なる実験法を用いて、トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）とジクロロメタン（ＤＣＭ）の混合物中の強酸の種々のピリジニウム塩が、トリアリールメチル保護基、例えばトリチル基を、固相ＰＭＯ合成中にモルホリノ窒素から除去するための優れた触媒であることが判明した。
【００７３】
最小量のＴＦＥ（約１０％ｖ／ｖ以上）は、ピリジニウム塩の妥当な反応速度及び可溶化に好ましい。ＴＦＥ単体は、裸のポリスチレンを膨潤させないので、ＤＣＭ（ジクロロメタン）との混合物は、特にＰＭＯ合成の初期サイクルにおいて好ましい。好ましい溶媒組成物は、１０から７５％ＴＦＥを含む。
【００７４】
ＴＦＥ溶媒の使用は、ＰＤＡ切断及び脱トリチル化の異なる機序を扱うことによって、上記アミダート形成（加水分解）及びホスホロジアミダート（ＰＤＡ）切断よりも脱トリチル化反応の選択性を高めると考えられる。ＴＦＥは、強力な水素結合性溶媒であり、溶液中の求核剤の反応性を減少させ、したがって、Ｐ−Ｎ結合切断に必要なリン攻撃を遅延させると考えられる。ＴＦＥは、ＳＮ１型加溶媒分解反応も促進する。ＴＦＥを用いたアミン脱トリチル化反応の加溶媒分解性は、脱トリチル化反応混合物の黄色及び脱メトキシトリチル化反応混合物のオレンジがかった色によって明示される。したがって、ＴＦＥ濃度の上昇は、ＰＤＡ結合に対する求核攻撃を抑制し、脱トリチル化を促進すると考えられる。
【００７５】
非置換ピリジニウム塩は、最適な脱保護には十分な酸性ではないが、電子求引性基（ＥＷＧ）（例えば、ハロゲン、カルボニル、シアノ）を含むピリジニウム種の使用は、保護基の急速な切断を可能にする。一般に、ＴＦＥ：ＤＣＭ溶媒中の少なくとも２％（ｗ／ｖ）のかかる塩が、急速な脱トリチル化に十分である。ピリジニウム塩の好ましいレベルは２から１０％（ｗ／ｖ）である。
【００７６】
ピリジニウム塩の形成に有用である酸としては、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、及びｐ−トルエンスルホン酸などのスルホン酸、トリフルオロ酢酸並びに塩酸が挙げられる。カルボン酸、トリフルオロ酢酸は、カップリング反応中に成長ＰＭＯ鎖（存在する場合）をキャッピングしないが、そのカルボキシラートは、アミダート形成を促進するには求核性が不十分である。特に好ましいのは、トリフルオロ酢酸、特にメタンスルホン酸である。
【００７７】
ピリジニウム塩の形成に有用であるピリジンとしては、ハロゲン置換ピリジン、特により安価なクロロピリジン（中でも３−クロロピリジンが好ましい。）、及びシアノピリジン（中でも４−シアノピリジンが好ましい。）が挙げられる。３−及び４−シアノピリジンは容易に入手可能な安価なバルク化学物質である。一般に、塩の効力は、ピリジニウム種のｐＫａと逆の相関がある。電子求引性基を有するピリジンは、ｐＫａが約１から４の範囲である（Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９６４、Ｒｏｇｎｅ  １９７０）。
【００７８】
ニコチン酸誘導体（すなわち、ニコチン酸エチルなどのエステル、及びニコチンアミド）、並びにそのケトン及びアルデヒド同族体も有用である。しかし、これらは、一般に、シアノピリジニウム塩より弱い試薬である。
【００７９】
ピリジン以外の複素環の塩は、プロトン化体のｐＫａが本発明の置換ピリジンのｐＫａに類似しているという前提で、上記条件下で選択的脱トリチル化試薬として機能し得ることが理解されるであろう。例は、文献に記載された複素環のｐＫａの多数の表に見いだすことができる（例えば、Ａｌｂｅｒｔ  １９６３）。例としては、チアゾール（ｐＫａ２．５３）、ピリダジン（ｐＫａ２．３３）、ピラゾール（ｐＫａ２．４７）、トリアゾール（ｐＫａ２．３０）及びその置換誘導体、特に上述したようにＥＷＧで置換された誘導体が挙げられる。
【００８０】
２種類の特に好ましい塩は、３−クロロピリジニウムメタンスルホナート（ＣＰＭ）及び４−シアノピリジニウムトリフルオロアセタート（ＣＹＴＦＡ）であり、脱トリチル化試薬の特に好ましい実施形態としては、０．９％エタノール（ｖ／ｖ）を含む２０％トリフルオロエタノール／ＤＣＭ（ｖ／ｖ）中の２％（ｗ／ｖ）ＣＰＭ又はＣＹＴＦＡの溶液が挙げられる。上表１に示すように、これらの試薬を使用すると、収率が従来のシアノ酢酸試薬よりもかなり増加した。
【００８１】
より酸性なＣＹＴＦＡは、ＣＰＭよりわずかに効率的であることがわかる。しかし、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｄｏｕｂｌｙ  Ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  Ｇｕａｎｉｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ  Ｓｕｂｕｎｉｔｓ」と題する共同所有され、同時出願された仮出願に開示されているように、表中のＣＰＭとＣＹＴＦＡ試薬の間の収率の増加の多くは、Ｏ６位が４−（ピバロイルオキシ）ベンジルオキシ基で保護された二重保護グアニンモノマー（ＤＰＧ）の使用に帰することができる。一般に、ＤＰＧモノマーを使用するとジアミノプリン含有副生物量が減少し、改善された脱トリチル化試薬を使用すると骨格加水分解量又は切断型副生物量が減少する。
【００８２】
したがって、この修飾は、従来技術の方法と比較して、骨格中のホスホロジアミダート結合の加水分解が少ない、好ましくはＮ−１欠失種レベルが低い又は同等である、モルホリノオリゴマーを合成する方法を提供する。別の一態様においては、本発明は、シアノ酢酸を脱保護試薬として使用したときに認められるよりもモルホリノオリゴマー骨格中のホスホロジアミダート結合の加水分解が少ない、トリアリールメチルで保護されたモルホリノ環窒素をモルホリノオリゴマー合成中に脱保護する方法を提供する。好ましくは、この方法は、シアノ酢酸を脱保護試薬として使用したときに認められるよりも低い又は同等であるＮ−１欠失種レベルも与える。
【００８３】
有用である更なる改変は、反応平衡を生成物の方向に移動させるチオールなどのトリチル捕捉剤の使用である。チオール捕捉剤の使用は、核酸合成に採用されてきた（Ｒａｖｉｋｕｍａｒ他、米国特許第５，５１０，４７６号）。メルカプトエタノールは、この目的に有用である容易に入手可能な安価な薬剤である。ベンジルメルカプタンなどの簡単なチオールも同様に十分機能するので、ヒドロキシル基の存在は捕捉には重要でない。エタノール、及びブタノールなどのアルコール、さらには水でさえ、トリチル陽イオンの捕捉剤として役立つ。
【実施例】
【００８４】
（実施例１）
Ｎ２−ＰｈＡｃ，Ｏ６−ＰＯＢ二重保護モルホリノＧ（ＤＰＧ）サブユニットの合成（図８参照）
（１ｃ  ３５ｋｇから出発する）３の調製：１００Ｇ反応器に１ｃ（３５ｋｇ、１．０当量）、イミダゾール（５．０ｋｇ、１．３当量）及びジクロロメタン（２７９ｋｇ）を充填する。バッチを３℃に冷却する。５０Ｇ反応器を３℃に冷却し、ｔ−ブチルクロロジメチルシラン（１０．１ｋｇ、１．２当量）及びジクロロメタン（９３ｋｇ）を充填する。５０Ｇ反応器中の溶液を１００Ｇ反応器に移し、バッチを２０℃に調節する。反応終了（１〜３時間）後、メタノール（１．８ｋｇ、１．０当量）を１００Ｇ反応器に充填する。３０分後、１００Ｇ反応器中の溶液をｐＨ３クエン酸緩衝剤（固体ＮａＯＨでｐＨ３に調節された１Ｍクエン酸３７６ｋｇ）を含む２００Ｇ反応器に充填する。バッチを３０分間撹拌し、層を分離させる。下層の有機層をｐＨ３クエン酸緩衝剤でもう１回洗浄し、塩水溶液（２．５％ＮａＣｌ／水（ｗ：ｗ）２８７ｋｇ）で１回洗浄する。バッチのカールフィッシャー分析が＜０．０５％水を示すまで、生成した有機溶液を＜３５℃で蒸留する。この溶液を１００Ｇ反応器中で３℃に冷却し、化合物４の調製に直接使用する。
【００８５】
４の調製：化合物３の溶液を含む１００Ｇ反応器にトリエチルアミン（６．８ｋｇ、１．２当量）、４−ジメチルアミノピリジン（０．６８ｋｇ、０．１当量）及び塩化トリイソプロピルベンゼンスルホニル（１８．６ｋｇ、１．１当量）を充填する。バッチを２０℃に加温する。反応終了（３〜９時間）後、ｐＨ４．５リン酸緩衝剤（１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４  ２２８ｋｇ）を含む２００Ｇ反応器に溶液を充填する。バッチを３０分間撹拌し、層を分離させる。下層の有機層を塩水（２．５％ＮａＣｌ／水（ｗ：ｗ）２１２ｋｇ）で洗浄する。バッチのカールフィッシャー分析が＜０．０１％水を示すまで、生成した有機溶液を＜３５℃で蒸留する。この溶液を１００Ｇ反応器中で３℃に冷却し、化合物５の調製に直接使用する。
【００８６】
（４−ヒドロキシベンズアルデヒド６０ｋｇから出発する）４ａの調製：７５０Ｇ反応器に４−ヒドロキシベンズアルデヒド（６０ｋｇ、１．０当量）、トルエン（２６０ｋｇ）及び１−メチルイミダゾール（８．１ｋｇ、０．２当量）を充填する。この溶液に炭酸水素カリウム（１００ｋｇ、２．０当量）水溶液（４００ｋｇ）、続いて塩化トリメチルアセチル（８３ｋｇ、１．４当量）を充填する。この２相混合物を２０℃で撹拌する。反応終了（１〜５時間）後、メタノール（１５．７ｋｇ、１．０当量）をバッチに充填する。バッチを２０℃で１時間撹拌する。層を分離させる。上層の有機層に水（２００ｋｇ）を充填する。バッチを３０分間撹拌し、層を分離させる。上層の有機層にｐＨ４．５リン酸緩衝剤（水２４２ｋｇ中ＫＨ２ＰＯ４  １６．５ｋｇ）を充填する。バッチを３０分間撹拌し、層を分離させる。上層の有機層に水（２００ｋｇ）を充填する。バッチを３０分間撹拌し、層を分離させる。上層の有機層を＜３０℃で減圧蒸留して、バッチ体積２００Ｌにする。ＴＨＦ（７０ｋｇ）をバッチに充填し、Ｐｄ／Ｃ（９．６ｋｇ、０．００４当量、５％Ｐｄ／Ｃ、５０％ウェットＪｏｈｎｓｏｎ  ＭａｔｔｈｅｙタイプＡ４０５０２８−５又はＡ５７０１２９−５）を含む５００Ｇ反応器にバッチを移す。撹拌を５０ｒｐｍに設定して、反応器を最初に５ｐｓｉ  Ｈ２に加圧する。反応の進行と伴に圧力と撹拌速度の両方を徐々に増加させ、最大２５ｐｓｉ  Ｈ２及び９０ｒｐｍにする。反応終了（８〜４８時間）後、バッチをＣｅｌｉｔｅパッド、続いて０．１ミクロンインラインフィルターに通してろ過する。Ｃｅｌｉｔｅをトルエン（２０ｋｇ）でリンスする。バッチにｐＨ６．５リン酸緩衝液（水２００ｋｇ中ＫＨ２ＰＯ４  ２．７ｋｇ及び二塩基性リン酸カリウム三水和物２．３ｋｇ）を充填する。バッチを３０分間撹拌し、層を分離させる。上層の有機層を＜３０℃で減圧蒸留して、バッチ体積１４０Ｌにする。トルエン（１２６ｋｇ）をバッチに充填し、バッチを＜３０℃で減圧蒸留して、バッチ体積１４０Ｌにする。バッチを２０℃に調節し、０℃で保持されたｎ−ヘプタン（８２１ｋｇ）及び化合物４ａの種晶（１００グラム）を含む５００Ｇ反応器に移す。バッチを０℃で１〜２時間保持する。追加の種晶（１００グラム）を添加し、バッチを０℃で１〜２時間保持する。化合物４ａをろ過によって単離する。収率＝４−ヒドロキシベンズアルデヒドから７０〜８０％。
【００８７】
フェノール部分がピバル酸エステルの代わりにそのＮ，Ｎ−ジメチルカルバマートとして保護された誘導体を４ａに類似の条件下で調製する。４−ヒドロキシベンズアルデヒドとジメチルカルバモイルクロリドの反応を終了させるために、還流ジクロロメタン中で塩基としてＮ−メチルイミダゾール及び触媒として０．２当量ＤＭＡＰの存在下で反応を行う。
【００８８】
５の調製：化合物４の溶液を含む１００Ｇ反応器にＮ−メチルピロリジン（９．５ｋｇ、ジクロロメタン２３ｋｇに溶解した２．０当量）を充填する。１０分後、化合物４ａ（１４．０ｋｇ、１．２当量）を添加し、続いて１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（１０．２ｋｇ、ジクロロメタン２３ｋｇ中の１．２当量）を添加する。バッチを２０℃に加温する。反応終了（１〜９時間）後、溶液をジクロロメタン３２７ｋｇで希釈し、ｐＨ４．５リン酸緩衝剤（１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４  ３３４ｋｇ）を含む２００Ｇ反応器に充填する。バッチを３０分間撹拌し、層を分離させる。下層の有機層をｐＨ４．５リン酸緩衝剤（１Ｍ  ＫＨ２ＰＯ４  １１１ｋｇ）でもう１回洗浄し、次いで塩水（２．５％ＮａＣｌ／水（ｗ：ｗ）２１２ｋｇ）で１回洗浄する。バッチのカールフィッシャー分析が＜０．０５％水を示すまで、生成した有機溶液を＜３５℃で蒸留する。この溶液を化合物１ｆの調製に直接使用する。
【００８９】
１ｆの調製：化合物５の溶液を含む１００Ｇ反応器にトリエチルアミン三フッ化水素酸塩（１８．０ｋｇ、２．０当量）を充填する。バッチを２０℃で撹拌する。反応終了（４〜２０時間）後、バッチを２００Ｇ反応器に充填する。２００Ｇ反応器にＮａＨＣＯ３溶液（５％（ｗ：ｗ）溶液２３０ｋｇ）を充填する。バッチを３０分間撹拌し、層を分離させる。下層の有機層をＮａＨＣＯ３溶液（５％（ｗ：ｗ）溶液２３０ｋｇ）でもう１回洗浄し、次いでｐＨ６．５リン酸緩衝剤（水２１５ｋｇ中ＫＨ２ＰＯ４  ９．３ｋｇ及びＫ２ＨＰＯ４  １４．０ｋｇ）で１回洗浄する。生成した有機溶液をＴＨＦに溶媒交換する（バッチ中重量で＜１％ＤＣＭにする）。溶液をＴＨＦ（１２４ｋｇ）で希釈し、６０℃に加熱する。（６０℃に予熱された）水（ＬＯＥ分析に基づいて溶液中の化合物１ｆ  １ｋｇ当たり８ｋｇ）をＴＨＦ溶液に徐々に充填する。溶液を３℃に徐々に冷却し、＞４時間保持する。粗製化合物１ｆをろ過によって単離する。粗製材料をＴＨＦ（３４２ｋｇ）に再溶解させ、６０℃に加熱する。（６０℃に予熱された）水（３１５ｋｇ）をＴＨＦ溶液に徐々に充填する。溶液を３℃に冷却し、＞４時間保持する。化合物１ｆをろ過によって単離する。必要に応じて、第２の再結晶を実施して化合物１ｆを更に精製することができる。収率＝１ｃから５３〜７３％。
【００９０】
（１ｆ  １２ｋｇから出発する）２ｆの調製：５０Ｇ反応器に化合物１ｆ（１２ｋｇ、１．０当量）、ジクロロメタン（１５９ｋｇ）、２，６−ルチジン（２．５ｋｇ、１．６当量）及び１−メチルイミダゾール（０．３６ｋｇ、０．３当量）を充填する。この溶液を蒸留してバッチ体積６９Ｌとし、５℃に冷却する。Ｎ，Ｎ−ジメチルホスホルアミドジクロリダート（３．８ｋｇ、１．６当量）をバッチに充填する。バッチを２０℃に調節する。反応終了（６〜１６時間）後、トルエン（７８ｋｇ）をバッチに充填する。生成した混合物を２５℃で蒸留してバッチ体積１２６Ｌとし（バッチのＧＣ分析は、重量で３０〜４５％ＤＣＭを示さなければならない。）、ｐＨ３クエン酸緩衝剤（クエン酸一水和物１５．４ｋｇ、ＮａＯＨ１．４ｋｇ、水８０ｋｇ）を含む１００Ｇ反応器に移す。バッチを１０分間撹拌し、層を分離させる。下層の水層を廃棄する。上層の有機層を、硫酸ナトリウム（８．０ｋｇ）を含む５０Ｇ反応器に移す。バッチを３０分間撹拌し、硫酸ナトリウム廃棄ケーキをろ過除去する。硫酸ナトリウムケーキをジクロロメタン（１６ｋｇ）でリンスする。得られた生成物溶液を５０Ｇ反応器中で蒸留して、バッチ体積５３Ｌにする（バッチのＧＣ分析は、重量で１１〜１５％ＤＣＭを示さなければならない。）。１００Ｇ反応器にヘプタン（２３８ｋｇ）を充填する。５０Ｇ反応器中のバッチを１００Ｇ反応器に２時間かけて移す。移送の最後に、バッチを２０℃で４〜１６時間保持する。粗製化合物６をろ過収集する。粗製材料を１００Ｇ反応器に充填する。粗製固体にトルエン（１６ｋｇ）及びヘプタン（５０ｋｇ）の溶液を添加する。この混合物を３時間撹拌し、ろ過する。再スラリーを１回以上繰り返す。粗製２ｆの収率＝１ｆから８０％。
【００９１】
（粗製化合物２ｆ約６．５ｋｇから出発する）シリカゲルクロマトグラフィーによる化合物２ｆの精製：粗製材料重量をＨＰＬＣ純度及び揮発性物質について補正することによって粗製化合物２ｆの「濃度（ｓｔｒｅｎｇｔｈ）」を計算する。この精製ステップでは、５０ｃｍクロマトグラフィーカラムへの注入１回当たり材料５．７５ｋｇ（濃度補正済み）を使用する。５０ｃｍクロマトグラフィーカラムにヘプタン／シリカゲル（シリカゲル５１．８ｋｇ）のスラリーを詰める。粗製材料をジクロロメタン／２，６−ルチジン（ジクロロメタン１５ｋｇ、２，６−ルチジン０．１６ｋｇ）溶液としてカラムに充填する。生成物を４−メチル−２−ペンタノン（ＭＩＢＫ）／ヘプタン／２，６−ルチジンの二段階勾配で溶出させる（第１段階は、０．０６％２，６−ルチジン（ｗ：ｗ）を含む３９：６１ＭＩＢＫ：ヘプタン（ｗ：ｗ）８２７Ｌであり、第２段階は０．０６％２，６−ルチジン（ｗ：ｗ）を含む７３：２７ＭＩＢＫ：ヘプタン（ｗ：ｗ）１３４３Ｌである。）。承認された画分プールを薄膜蒸発によって濃度１５０ｇ／Ｌに濃縮する。この濃縮プールを６体積のヘプタン上に沈殿させる。精製２ｆをろ過によって単離する。精製２ｆの収率＝１ｆから５０％、粗製２ｆから６５％。
【００９２】
（実施例２）
ＣＹＴＦＡピリジニウム塩脱トリチル化溶液の調製
４−シアノピリジン（１０．１ｇ、１．０５５当量）のジクロロメタン（７９０ｍＬ）溶液に、トリフルオロ酢酸（１０．５ｇ、１．０当量）、続いて２，２，２−トリフルオロエタノール（１９８ｍＬ）及びエタノール（１０ｍＬ）を添加し、溶液を１０〜３０分間撹拌する。
【００９３】
（実施例３）
ジスルフィドアンカーの調製（図１０参照）
Ｎ−トリチルピペラジンコハク酸塩（ＮＴＰ）の調製：ピペラジン（１０当量）のトルエン／メタノール冷却溶液（５：１トルエン／メタノール（ｖ：ｖ）、５ｍＬ／ｇピペラジン）に、塩化トリフェニルメチル（トリチル）（１．０当量）のトルエン溶液（５ｍＬ／ｇ塩化トリチル）を徐々に添加した。反応終了（１〜２時間）後、この溶液を水で４回洗浄した。生成した有機溶液にコハク酸水溶液（１．１当量、水１３ｍＬ／ｇコハク酸）を添加した。この混合物を９０分間撹拌し、固体生成物をろ過収集した。粗製ＮＴＰをアセトン中での２回の再スラリーによって精製した。収率＝７０％。
【００９４】
対称ジスルフィド７の調製：１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）（１２．４０２ｇ、２．２当量）をジクロロメタン（５．２５ｍＬ／ｇ）に懸濁させ、氷浴で冷却した。ヒドロキシエチルジスルフィド６（５．３６ｇ、１当量）をジクロロメタン（１０ｍＬ／ｇ）及びテトラヒドロフラン（１ｍＬ／ｇ）に溶解させた。混合物の温度が反応期間中４℃未満にとどまるように、ジオール溶液をＣＤＩに徐々に添加した。反応終了後（添加終了後）、脱イオン水（９３．８μＬ、０．１５当量）を添加して、反応をクエンチした。独立に、Ｎ−トリチルピペラジンコハク酸塩（ＮＴＰ）（３２．５９ｇ、２．１当量）をトルエン（８ｍＬ／ｇ  ＮＴＰ）、ジクロロメタン（２ｍＬ／ｇ  ＮＴＰ）及びメタノール（２ｍＬ／ｇ  ＮＴＰ）に溶解させた。Ｋ２ＣＯ３（２２．０９ｇ、４．６当量）を脱イオン水に溶解させた（１０ｍＬ／ｇ）。ＮＴＰ溶液に添加されたＫ２ＣＯ３溶液；混合物を撹拌し、次いで２層に分離させた。濁った有機層を蒸留して９０グラムを除去した。生成した水滴を分離し、アセトン（８ｍＬ／ｇ  ＮＴＰ）を有機層に添加した。ＣＤＩ活性化ジスルフィドジオール溶液を遊離塩基溶液に添加し、２２５ｍＬに濃縮した。アセトン（１０ｍＬ／ｇ  ＮＴＰ）を添加し、混合物を２２５ｍＬに濃縮した。混合物を加熱還流させると、固体は溶液から晶出し始めた。終了後、反応混合物を冷却し、固体（７）をろ過によって単離した。収率：２７．９２ｇ、（重量基準のアッセイに基づいて）９３．１％。
【００９５】
ジスルフィドアルコール８の調製：７（３６．００ｇ、３２．１ｍｍｏｌ、１当量）をアセトン（２．８ｍＬ／ｇ  ７）に懸濁させた。ヒドロキシエチルジスルフィド（７８．５１ｍＬ、２０当量）を添加し、続いてアセトン（１．７ｍＬ／ｇ  ７）を添加した。５％ＮａＯＨ／メタノール（２．８５ｍＬ、０．１当量）を添加した。混合物のｐＨはｐＨ紙で１０であった。トリフェニルホスフィン（８．４２ｇ、１当量）を添加し、続いてアセトン（１．１ｍＬ／ｇ  ７）を添加した。全固体を溶液に入れると、生成物が晶出し始めた。１６時間後、反応混合物を酢酸（２．４ｇ、０．２当量）で中和した。粗生成物をろ過によって単離した。粗製固体８を２回の還流アセトン再スラリー（５ｍＬ／ｇ  ７）に供した。
【００９６】
ろ過後、粗生成物をジクロロメタン（７．２５ｍＬ／ｇ  ７）に懸濁させた。混合物を透明溶液が形成されるまで加熱した（３５℃）。溶液を等体積の脱イオン水で５回抽出し、最終有機層を１５５ｍＬに濃縮した。ジクロロメタン（４．３ｍＬ／ｇ  ７）を添加し、溶液を再度１５５ｍＬに濃縮した。ＣＤＩ（９．１７ｇ、１．１当量）を添加し、混合物を室温で撹拌した。反応終了（約２０分間）後、反応混合物を等体積の脱イオン水で２回洗浄し、次いでエチルベンゼン（２．１ｍＬ／ｇ  ７）を添加した。溶液を６５．２ｇに濃縮し、溶液中のジクロロメタンを０．１７％に減少させ、氷浴上で撹拌して、生成物を結晶化させた。生成物９をろ過によって単離した。収率：４４％。
【００９７】
（実施例４）
トリエチレングリコール末端部（図１１参照）
トリチルピペラジンフェニルカルバマート１０の調製：ＮＴＰのジクロロメタン（６ｍＬ／ｇ  ＮＴＰ）冷却懸濁液に炭酸カリウム（３．２当量）水（４ｍＬ／ｇ炭酸カリウム）溶液を添加した。この２相混合物にクロロギ酸フェニル（１．０３当量）のジクロロメタン（２ｇ／ｇクロロギ酸フェニル）溶液を徐々に添加した。反応混合物を２０℃に加温した。反応終了（１〜２時間）後、層を分離させた。有機層を水で洗浄し、無水炭酸カリウムを用いて脱水した。生成物１０をアセトニトリルからの結晶化によって単離した。収率＝８０％
カルバマートアルコール１１の調製：水素化ナトリウム（１．２当量）を１−メチル−２−ピロリジノン（３２ｍＬ／ｇ水素化ナトリウム）に懸濁させた。この懸濁液にトリエチレングリコール（１０．０当量）及び化合物１０（１．０当量）を添加した。生成したスラリーを９５℃に加熱した。反応終了（１〜２時間）後、混合物を２０℃に冷却した。この混合物に３０％ジクロロメタン／メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ｖ：ｖ）及び水を添加した。生成物を含有する有機層をＮａＯＨ水溶液、コハク酸水溶液及び塩化ナトリウム飽和水溶液で連続的に洗浄した。生成物１１をジクロロメタン／メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル／ヘプタンからの結晶化によって単離した。収率＝９０％。
【００９８】
末端部酸１２の調製：化合物１１のテトラヒドロフラン（７ｍＬ／ｇ  １１）溶液に無水コハク酸（２．０当量）及びＤＭＡＰ（０．５当量）を添加した。混合物を５０℃に加熱した。反応終了（５時間）後、混合物を２０℃に冷却し、ＮａＨＣＯ３水溶液でｐＨ８．５に調節した。メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを添加し、生成物を水層に抽出した。ジクロロメタンを添加し、混合物をクエン酸水溶液でｐＨ３に調節した。生成物を含有する有機層をｐＨ＝３クエン酸緩衝剤と塩化ナトリウム飽和水溶液の混合物で洗浄した。この１２のＤＣＭ溶液を単離せずに化合物１３の調製に使用した。
【００９９】
１３の調製：化合物１２の溶液にＮ−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボン酸イミド（ＨＯＮＢ）（１．０２当量）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（０．３４当量）、次いで１−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（１．１当量）を添加した。混合物を５５℃に加熱した。反応終了（４〜５時間）後、混合物を２０℃に冷却し、１：１  ０．２Ｍクエン酸／塩水及び塩水で連続的に洗浄した。ジクロロメタン溶液をアセトン、次いでＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶媒交換し、アセトン／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドから塩化ナトリウム飽和水溶液中への沈殿によって生成物を単離した。粗生成物を水で数回再スラリーして、残留Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及び塩を除去した。収率＝化合物１１からの１３の７０％。ジスルフィドアンカー樹脂上への活性化「末端部」の導入を、固相合成中のサブユニットの組み入れに使用される手順によってＮＭＰ中で実施した。
【０１００】
（実施例５）
モルホリノオリゴマー合成用固体支持体の調製
実施例５ａ：アミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂の調製
この手順は、フリットを通したＮ２バブリング又は減圧抽出が可能な粗大空隙率（４０〜６０μｍ）のガラスフリット、頭上式撹拌機及び３方テフロン（登録商標）コックを備え、シラン処理されたジャケット付きペプチド容器（ＣｈｅｍＧｌａｓｓ，ＮＪ，ＵＳＡによる特注）において実施された。温度制御を反応器中で循環水浴によって行った。
【０１０１】
以下の手順における樹脂の処理／洗浄ステップは、２つの基本操作、すなわち樹脂流動化及び溶媒／溶液抽出からなる。樹脂流動化では、フリットを通したＮ２流入が可能なようにコックを回し、指定の樹脂処理／洗浄剤を反応器に添加し、樹脂に浸透させ、樹脂を完全に湿らせた。次いで、混合を開始し、樹脂スラリーを指定時間混合した。溶媒／溶液抽出では、混合及びＮ２流入を停止し、真空ポンプを作動させ、次いで樹脂処理／洗浄剤が廃棄物に排除されるようにコックを回した。全樹脂処理／洗浄剤体積は、別段の記載がない限り、１５ｍＬ／ｇ樹脂であった。
【０１０２】
シラン処理されたジャケット付きペプチド容器中のアミノメチルポリスチレン樹脂（１００〜２００メッシュ、約１．０ｍｍｏｌ／ｇ  Ｎ２置換、７５ｇ、１当量、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｓ，ＵＫ、部品＃１４６４−Ｘ７９９）に１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ、２０ｍｌ／ｇ樹脂）を添加し、１〜２時間混合しながら樹脂を膨潤させた。膨潤溶媒排除後、樹脂をジクロロメタン（２×１〜２分間）、２５％イソプロパノール／ジクロロメタン中の５％ジイソプロピルエチルアミン（２×３〜４分間）、及びジクロロメタン（２×１〜２分間）で洗浄した。最終洗浄剤の排除後、樹脂をジスルフィドアンカー９の１−メチル−２−ピロリジノン溶液（０．１７Ｍ、１５ｍＬ／ｇ樹脂、約２．５当量）と一緒に流動化し、樹脂／試薬混合物を４５℃で６０時間加熱した。反応終了後、加熱を停止し、アンカー溶液を排除し、樹脂を１−メチル−２−ピロリジノン（４×３〜４分間）及びジクロロメタン（６×１〜２分間）で洗浄した。樹脂を１０％（ｖ／ｖ）ジエチルジカルボナートのジクロロメタン溶液（１６ｍＬ／ｇ；２×５〜６分間）で処理し、次いでジクロロメタン（６×１〜２分間）で洗浄した。樹脂１４をＮ２気流下で１〜３時間、次いで減圧下で乾燥させて、一定重量（±２％）にした。収率：初期樹脂重量の１１０〜１５０％。
【０１０３】
実施例５ｂ：アミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂の使用量の決定
樹脂使用量（潜在的に利用可能な反応部位数）は、樹脂１グラム当たりのトリフェニルメチル（トリチル）基数の分光測定アッセイによって決定される。
【０１０４】
既知重量の乾燥樹脂（２５±３ｍｇ）をシラン処理された２５ｍｌメスフラスコに移し、２％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸のジクロロメタン溶液約５ｍＬを添加する。内容物を静かに旋回させて混合し、次いで３０分間静置する。追加の２％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸のジクロロメタン溶液で２５ｍＬに増量し、内容物を徹底的に混合する。容積式置換ピペットを使用して、一定分量のトリチル含有溶液（５００μＬ）を１０ｍＬメスフラスコに移し、メタンスルホン酸で１０ｍＬに増量する。
【０１０５】
最終溶液中のトリチル陽イオン含有量を４３１．７ｎｍにおけるＵＶ吸光度によって測定し、適切な体積、希釈度、消衰係数（ε：４１μｍｏｌ−１ｃｍ−１）及び樹脂重量を用いて、樹脂使用量を樹脂１グラム当たりのトリチル基（μｍｏｌ／ｇ）として計算する。アッセイを３回行い、平均使用量を計算する。
【０１０６】
この実施例における樹脂充填手順は、約５００μｍｏｌ／ｇの樹脂使用量となる。３００〜４００μｍｏｌ／ｇの使用量は、ジスルフィドアンカー組み入れステップを室温で２４時間実施する場合に得られた。
【０１０７】
実施例５ｃ：末端部付加（図１２参照）
アミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂の調製と同じ構成及び体積を用いて、末端部を分子に導入することができる。カップリングステップでは、４−エチルモルホリン（ＮＥＭ、０．４Ｍ）を含むＮＭＰ中の１３（０．２Ｍ）の溶液をジスルフィドアンカー溶液の代わりに使用した。４５℃で２時間後、樹脂１５を２５％イソプロパノール／ジクロロメタン中の５％ジイソプロピルエチルアミンで２回、ＤＣＭで１回洗浄した。樹脂に無水安息香酸（０．４Ｍ）及びＮＥＭ（０．４Ｍ）の溶液を添加した。２５分後、反応器ジャケットを室温に冷却し、樹脂を２５％イソプロパノール／ジクロロメタン中の５％ジイソプロピルエチルアミンで２回、ＤＣＭで８回洗浄した。樹脂１５をろ過し、高真空下で乾燥させた。樹脂１５の使用量は、末端部付加に使用される最初のアミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂１４の使用量であると定義される。
【０１０８】
（実施例６）
モルホリノオリゴマーの合成
実施例６ａ：固相合成
保護されたオリゴマーをアミノメチルポリスチレン−ジスルフィド樹脂上に固相オリゴマー合成によって手作業で１０ｇ規模（出発樹脂重量）で調製した（約５００μｍｏｌ／ｇ使用量）。使用した溶液は以下のとおりであった。
【０１０９】
脱トリチル化溶液：ＣＡＡ＝２０％アセトニトリル／ＤＣＭ（ｖ／ｖ）の混合物中の１１％シアノ酢酸（ｗ／ｗ）、
ＣＰＭ＝２０％トリフルオロエタノール／ＤＣＭ（ｖ／ｖ）中の２％３−クロロピリジナムメタンスルホナート（ｗ／ｖ）及び０．９％エタノール（ｖ／ｖ）、
ＣＹＴＦＡ＝２０％トリフルオロエタノール／ＤＣＭ（ｖ／ｖ）中の２％３−シアノピリジナムトリフルオロアセタート（ｗ／ｖ）及び０．９％エタノール（ｖ／ｖ）。
【０１１０】
中和溶液：２５％イソプロパノール／ジクロロメタン中の５％ジイソプロピルエチルアミン、
カップリング溶液：１，３−ジメチルイミダゾリジノン（ＤＭＩ）中の（２ｆ（ＤＰＧ）、２ｃ及び２ｄ又は別のＴサブユニットの場合）０．１６５Ｍ又は（２ａ及び２ｂ又は別のＡ／Ｃサブユニットの場合）０．１８Ｍ活性化モルホリノサブユニット及び０．４Ｍ  Ｎ−エチルモルホリン。
【０１１１】
活性化ＭＰＧ（２ｃ）をＳｕｍｍｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）のように調製した。
【０１１２】
樹脂を合成反応器に移した後、合成サイクルを開始する前に、１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ、２０ｍＬ／ｇ樹脂）を添加し、１〜２時間静置した。ジクロロメタン（１０ｍＬ／ｇ樹脂）で２回洗浄した後、各サイクルにおいて所望の塩基及び所望の結合タイプの活性化モルホリノサブユニットの適切なカップリング溶液を添加して以下の合成サイクルを使用して、適切な配列を与えた。
【０１１３】
【表２】
0005512533.tif 000014
最終サブユニットの組み入れ後、ＤＭＩ中の０．３２Ｍ  ４−メトキシトリフェニルメチルクロリド及び０．４Ｍ  Ｎ−エチルモルホリンを用いて最終サイクル（メトキシトリチル化）を実施した。メトキシトリチル化後、樹脂をＮＭＰで８回洗浄し、次いでＮＭＰ中の０．１Ｍ  １，４−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）及び０．７３Ｍトリエチルアミンからなる切断溶液（２７ｍＬ／ｇ出発樹脂）で３０分間処理した。保護オリゴマー溶液を収集後、（体積がかなり減少した）樹脂を、２回の追加の切断溶液で洗浄し（各１３ｍＬ／ｇ出発樹脂で１５分間）、洗浄液をバルク溶液と混合した。テフロン（登録商標）栓の付いた適切なサイズの耐圧瓶（Ａｃｅ  Ｇｌａｓｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）中の保護オリゴマー溶液に、（−２０℃に前もって冷却した）濃アンモニア水（１０６ｍＬ／ｇ出発樹脂）を添加し、瓶を密閉し、内容物を旋回させて混合した。瓶を４５℃乾燥器中に１６〜２０時間置いて、塩基及び骨格保護基を除去した。
【０１１４】
アンモノリシス後、粗製オリゴマー溶液を室温に冷却し、次いでイオン交換クロマトグラフィー前にＰＬＢＣ３ｋｄ再生セルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して０．２８％アンモニア水に対して透析ろ過して、溶媒及び小分子を除去する。
【０１１５】
実施例６ｂ：陰イオン交換クロマトグラフィーによるモルホリノオリゴマーの精製
透析ろ過から得られた粗製オリゴマー溶液をｐＨ１１〜１１．５に調節し、ＴｏｙｏＰｅａｒｌ  Ｓｕｐｅｒ−Ｑ６５０Ｓ陰イオン交換樹脂（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のカラムに充填する。メトキシトリチル化オリゴマーを５〜３５％Ｂ勾配で１７カラム体積（緩衝剤Ａ：１０ｍＭ水酸化ナトリウム、緩衝剤Ｂ：１０ｍＭ水酸化ナトリウム中の１Ｍ塩化ナトリウム）で溶出させ、許容純度（陰イオン交換ＨＰＬＣ及び質量分析）の画分をプールする。
【０１１６】
実施例６ｃ：モルホリノオリゴマーの脱メトキシトリチル化
陰イオン交換クロマトグラフィーからのプール画分にアセトニトリル（１０体積％）、続いて２Ｍ  Ｈ３ＰＯ４を添加して、ｐＨを３に調節する。溶液を４５分間混合し、次いで濃アンモニア水でｐＨ７に中和する。陽イオン交換クロマトグラフィー前にＰＬＢＣ３ｋｄ再生セルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して２０ｍＭ酢酸ナトリウムに対してオリゴマー溶液を透析ろ過して、緩衝剤を交換する。
【０１１７】
実施例６ｄ：陽イオン交換クロマトグラフィーによるモルホリノオリゴマーの精製
オリゴマー溶液を酢酸でｐＨ４．５に調節し、Ｓｏｕｒｃｅ  ３０Ｓ陽イオン交換樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムに充填する。オリゴマーを０〜３５％Ｂ勾配で１７カラム体積（緩衝剤Ａ：２０ｍＭ酢酸ナトリウム、２５％アセトニトリル、ｐＨ４．５；緩衝剤Ｂ：０．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、２５％アセトニトリル、ｐＨ４．５）で溶出させ、許容純度（陽イオン交換ＨＰＬＣ及び質量分析）の画分をプールする。
【図１】
0005512533.tif 000025
【図２】
0005512533.tif 000026
【図３】
0005512533.tif 000027
【図４】
0005512533.tif 000028
【図５】
0005512533.tif 000029
【図６】
0005512533.tif 000030
【図７】
0005512533.tif 000031
【図８】
0005512533.tif 000032
【図９】
0005512533.tif 000033
【図１０】
0005512533.tif 000034
【図１１】
0005512533.tif 000035
【図１２】
0005512533.tif 000036
【配列表】
0005512533000001.app