(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性であり、０．１を超えるＴｒｐ／ＬＮＡＡ比を有する、ペプチド結合トリプトファン組成物、および／または遊離トリプトファン；および
水溶性であり、０．１５を超えるＴｒｐ／ＬＮＡＡ比を有するポリペプチド結合トリプトファン組成物
を一緒にするステップを含んでなる、気分又は覚醒状態に対する予防剤又は治療剤を製造する方法であって、
前記予防剤又は治療剤がＡＷまたはＧＮＷを含んでなる、方法。
【請求項２】
前記ペプチド結合トリプトファン組成物が、リゾチームまたはαラクトアルブミンを加水分解して５〜４５のＤＨを有する加水分解産物を調製し、加水分解産物を分画、濃縮または精製することにより得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ポリペプチド結合トリプトファンがリゾチームである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
１０〜９０％のトリプトファンがペプチド結合トリプトファンおよび／または遊離トリプトファンとして存在し、１０〜９０％のトリプトファンがポリペプチド結合トリプトファンとして存在し、
ＡＷまたはＧＮＷを含んでなる、気分又は覚醒状態に対する予防剤又は治療剤。
【請求項５】
３０モル％を超えるペプチド結合トリプトファンが、ジペプチドまたはトリペプチドの形態で存在する、請求項４に記載の予防剤又は治療剤。
【請求項６】
３０モル％を超えるポリペプチド結合トリプトファンが、リゾチームである未変化タンパク質として存在する、請求項４または５に記載の予防剤又は治療剤。
【請求項７】
水溶性である少なくとも１つのトリプトファン含有ペプチドを含んでなり、または水溶性であるペプチド結合トリプトファン画分が少なくとも０．１０のＴｒｐ／ＬＮＡＡ比を有する、請求項４〜６のいずれか一項に記載の予防剤又は治療剤。
【請求項８】
ジペプチドまたはトリペプチドから選択される、少なくとも１つのトリプトファン含有ペプチドを含んでなり、ジペプチドまたはトリペプチドから選択されるトリプトファン含有ペプチドが、（それぞれ）少なくともジペプチドおよびトリペプチドの総量の５モル％の量で存在する、請求項４〜７のいずれか一項に記載の予防剤又は治療剤。
【請求項９】
リゾチーム加水分解産物の水溶性画分を含んでなる、請求項４〜８のいずれか一項に記載の予防剤又は治療剤。
【請求項１０】
請求項１または２の方法によって得られる、請求項４〜９のいずれか一項に記載の予防剤又は治療剤。
【請求項１１】
１０〜９０％のトリプトファンがペプチド結合トリプトファンおよび／または遊離トリプトファンとして存在し、１０〜９０％のトリプトファンがポリペプチド結合トリプトファンとして存在し、
ＡＷまたはＧＮＷを含んでなる、組成物の使用であって、
気分又は覚醒状態に対する予防剤または治療剤の調製における、使用。
【請求項１２】
請求項４〜１０のいずれか一項に記載の予防剤又は治療剤摂取直前の、または請求項４〜１０のいずれか一項に記載の予防剤又は治療剤摂取なしの血漿Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比と比べて、１５〜２４０分間にわたり血漿Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比を増大させるように用いられる、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の予防剤又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、トリプトファンを含んでなる組成物に関する。
【０００２】
［背景技術］
脳内セロトニンレベルは、気分、俊敏さ、覚醒状態、入眠と睡眠の質、抗不安効果、うつ病、情動反応制御、食欲、および性行動と関連付けられている。脳内セロトニンレベルの変化と天然アミノ酸Ｌ−トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）の可用性とを関連付ける、多数の出版物が存在する。この相関のために血漿トリプトファンレベルを増大させる方法が注目されている。１人あたり１グラム／日前後のトリプトファン量は、臨床的に有意な効果を生じることが報告されている（Ｍａｒｋｕｓら，Ａｍ．ＪＣｌｉｎ．Ｎｕｔｒ２００５年；８１，１０２６〜１０３３頁）。血漿トリプトファンレベルを増大させる一方法は、乳清タンパク質αラクトアルブミンに富んだタンパク質製剤を摂取することを伴う。αラクトアルブミン製剤は容易に入手でき、トリプトファン濃度が比較的高い。しかし例えばＤＥ  ４１３０２８４およびＪＰ  ２２７９７００のようなαラクトアルブミンそのものを提供するアプローチでは、脳のトリプトファンおよびセロトニンレベルの主要決定因子が血漿トリプトファン濃度だけではなく、いわゆるＴｒｐ／ＬＮＡＡ比（ＦｅｒｎｓｔｒｏｍおよびＷｕｒｔｍａｎ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９７１年，１７３，１４９〜１５２頁）であることを考慮していない。このＴｒｐ／ＬＮＡＡ比は、血漿中の大型中性アミノ酸（ＬＮＡＡ：すなわちチロシン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、およびバリンの和）レベルに対するトリプトファンのモル比に相当する。これらのＬＮＡＡは、恐らく血液脳関門を超える同一輸送機序を使用することから、脳への取り込みに関してトリプトファンと競合する。したがって脳トリプトファン濃度を増大させる最も効果的なやり方は、Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比の高い製剤を供給することである。いくつかの公報、特に国際公開第０２／４６２１０号パンフレットは、改善されたＴｒｐ／ＬＮＡＡ比を有するαラクトアルブミンからのペプチド画分製剤に言及する。
【０００３】
遊離トリプトファン、すなわち遊離アミノ酸の使用は、Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比の高い製剤を提供する最も簡単で安価なアプローチを提供する。しかし多くの国々で遊離トリプトファンの供給を厳密に規制する法律が存在する。その様々な応用形態における最大許容遊離トリプトファンのレベルは、国によって異なる。より自然なやり方で追加的な食餌性トリプトファンを供給するために、より最近のアプローチではトリプトファンに富むタンパク質を提供することをを目指す。前述のようにαラクトアルブミンならびにその加水分解産物は、血漿トリプトファンレベルを増強する安全な選択肢として人気が高まっている。しかしトリプトファンに富む製剤の出発点としてのαラクトアルブミンの使用は、最大Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比および経費の観点から不利である。αラクトアルブミンおよびβラクトグロブリンは、乳清の主要タンパク質構成物を形成する。工業規模ではαラクトアルブミンとβラクトグロブリンの完全な分離は困難であるため、費用効率が高いαラクトアルブミン製剤はβラクトグロブリンもまた含有するようである。αラクトアルブミンが５．３％のモル濃度トリプトファン含量を有するのに対し、βラクトグロブリンのトリプトファン含量はわずか２％である。αラクトアルブミンが０．１１のモル濃度Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比を有するのに対し、βラクトグロブリンは０．０４以下のモル濃度Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比を有する。したがって明らかにβラクトグロブリンによるαラクトアルブミン製剤のあらゆる汚染は、最終製品のＴｒｐ／ＬＮＡＡ比を劇的に低下させるであろう。
【０００４】
脳セロトニンレベルを調節し得る製剤に対する広範な関心を考慮して、様々な食品および栄養補助食品で広く応用できる、Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比の高いタンパク質およびペプチド製剤の改善された製造方法に対する必要性がある。
【０００５】
［発明の簡単な説明］
本発明は、
好ましくは水溶性であり０．１を超え、好ましくは０．１５を超えるＴｒｐ／ＬＮＡＡ比を有する、ペプチド結合トリプトファン組成物、および／または遊離トリプトファン；および
好ましくは水溶性であり０．１５を超えるＴｒｐ／ＬＮＡＡ比を有するポリペプチド結合トリプトファン組成物
を一緒にし、好ましくは混合するステップを含んでなるトリプトファン含有組成物を製造する方法に関する。
【０００６】
好ましくはペプチド結合トリプトファン組成物は、リゾチーム、好ましくは鶏卵リゾチームを加水分解してＤＨが５〜４５の加水分解産物を調製し、任意に例えばアルギニンまたはリジン含有ペプチド部分を除去することにより、加水分解産物を分画、濃縮または精製することによって得られる。好ましくはポリペプチド結合トリプトファン組成物は、未変化リゾチーム、好ましくは鶏卵リゾチームである。
【０００７】
本発明はまたトリプトファンを含んでなる組成物にも関し、１０〜９０％、好ましくは２０〜８０％のトリプトファンは遊離トリプトファンまたはペプチド結合トリプトファンとして存在し、１０〜９０％、好ましくは２０〜８０％のトリプトファンはポリペプチド結合トリプトファンとして存在する。任意に組成物は、ペプチド結合トリプトファンに加えて遊離トリプトファンを含んでなる。一般に、存在するトリプトファンの１０％未満が遊離トリプトファンの形態であり、ペプチド結合トリプトファンもまた存在する場合、本発明の組成物中に存在するトリプトファンの好ましくは０〜５％、より好ましくは０〜２％、最も好ましくは０〜１％は遊離トリプトファンである。一般に０．１〜２０ｇの本発明の組成物が摂取用量で使用される。
【０００８】
好ましくは３０モル％を超え、好ましくは４０モル％を超え、より好ましくは５０モル％を超え、なおもより好ましくは６０モル％を超え、さらにより好ましくは７０モル％を超え、最も好ましくは８０モル％を超えるペプチド結合トリプトファンが、ジペプチドまたはトリペプチドの形態で存在する。また好ましくは４０モル％を超え、より好ましくは５０モル％を超え、なおもより好ましくは６０モル％を超え、さらにより好ましくは７０モル％を超え、最も好ましくは８０モル％を超えるポリペプチド結合トリプトファンが、好ましくはリゾチームである未変化タンパク質として存在する。
【０００９】
本発明の別の態様は、好ましくは薬剤である栄養補助食品としての本発明の組成物またはリゾチーム、または好ましくは薬剤である栄養補助食品としての本発明の組成物の使用、または好ましくは薬剤である栄養補助食品の調製における本発明の組成物の使用に関し、好ましくは薬剤である栄養補助食品が、好ましくは気分、認知力、食欲、俊敏さ、覚醒状態、入眠と睡眠の質、抗不安効果、うつ病、情動反応制御または性行動を予防または治療し改善するために使用され、または食品、飼料、健康補助食品の調製において成分として使用される。
【００１０】
さらに本発明は、摂取後１５〜２４０分間、好ましくは３０〜２４０分間にわたり血漿Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比を増大させるために摂取される、リゾチームまたは本発明の組成物の使用に関する。この増大は、本発明の組成物またはリゾチーム摂取直前の、または本発明の組成物またはリゾチーム摂取なしの血漿Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比との比較である。
【００１１】
有利には、本発明の組成物は炭水化物もまた含んでなる。
【００１２】
［発明の詳細な説明］
本トリプトファン含有組成物は２つの明確に区別できる画分を含んでなり、それは経口摂取されると長期間にわたり血漿中の高Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比を可能にする。１つの画分はペプチド結合トリプトファン、ひいては易吸収性の低分子量ペプチドまたは遊離トリプトファンの形態のトリプトファン含有ペプチドを含んでなる。トリプトファン含有ペプチドの場合、この画分はトリプトファン包含ジペプチドおよびトリペプチドを高比率で含む。他方の画分は、ポリペプチド結合トリプトファン、ひいては好ましくは未変化タンパク質形態のトリプトファン含有ポリペプチドを含んでなり、それは経口摂取後にそのペプチド結合トリプトファンを非常に緩慢にしか放出しない。したがって本明細書は、経口摂取時に、トリプトファン含有ペプチド画分のみを使用した場合と比べて、高い血中Ｔｒｐ／ＬＮＡＡレベルを迅速に引き起こし長期間にわたって維持する、これらの２つのトリプトファンに富む画分の新しい組み合わせについて記載する。低分子量画分中に存在するペプチド結合トリプトファンは好ましくは鶏卵リゾチームに由来し、ポリペプチド結合トリプトファン画分またはより大きな分子量画分は好ましくはリゾチームであり、例えば未変化鶏卵リゾチーム、またはＴｒｐ／ＬＮＡＡ比の高い未変化タンパク質などの別のポリペプチド結合トリプトファン源である。好ましくはトリプトファン含有ポリペプチドは、胃条件下でタンパク質分解に抵抗し得るタンパク質である。有利にはプロテアーゼ抵抗性試験（材料と方法を参照されたい）で記載されるように、未変化リゾチームのような未変化タンパク質などのポリペプチド結合トリプトファンは、胃条件下でタンパク質分解に抵抗し得る。
【００１３】
易吸収性のトリプトファン含有ペプチド画分は好ましくは水溶性であり、好ましくは１５よりも高いＤＨ、より好ましくは２０よりも高いＤＨを有し、０．１０を超え、好ましくは０．１５を超えるＴｒｐ／ＬＮＡＡ比を有し、好ましくは（ジペプチドとして）ＡＷまたは（トリペプチドとして）ＧＮＷ、より好ましくはＡＷおよびＧＮＷペプチドを含んでなる。適切なトリプトファン含有ペプチド画分の例は、リゾチームおよびαラクトアルブミンの加水分解産物であり、リゾチーム加水分解産物が好ましいトリプトファン含有ペプチド画分である。
【００１４】
トリプトファンをより緩慢に供給するポリペプチド結合トリプトファン画分は、典型的に１０未満、好ましくは５未満のＤＨを有する。未変化タンパク質は０のＤＨを有する。ポリペプチド結合トリプトファン画分は、好ましくは水溶性である。さらにポリペプチド結合トリプトファン画分は０．１５を超えるＴｒｐ／ＬＮＡＡ比を有し、ヒト胃に一般的な条件下でタンパク質分解に抵抗する。後者の要件の生体外試験については、本明細書の材料と方法セクションで明記されている。
【００１５】
前述のように、本発明の組成物は好ましくは炭水化物を含んで、例えばインシュリン産生を刺激する。
【００１６】
本発明は、遊離トリプトファンまたはペプチド結合トリプトファン画分ならびにポリペプチド結合トリプトファン画分を含んでなる組成物に関する。ペプチド結合トリプトファン画分は少なくとも０．１、好ましくは少なくとも０．１５、より好ましくは０．１５〜１．８のモル濃度Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比を有し、好ましくは少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つの異なる好ましくは水溶性であるペプチドを含んでなる。好ましくはこれは（ジペプチドとして）ＡＷまたは（トリペプチドとして）ＧＮＷ、好ましくはＡＷおよびＧＮＷ、最も好ましくはＡＷおよびＧＮＷ組成物を含んでなり、ＡＷとＧＮＷのモル比は１：２と１０：１の間、好ましくは１：２と５：１の間である。さらにトリプトファン含有ペプチドはトリプトファンに富み、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つの異なるジペプチドまたはトリペプチドを含んでなり、ジペプチドまたはトリペプチドから選択されるペプチドはジペプチドおよびトリペプチドの総量の少なくとも５モル％の量で存在し、組成物中で３０モル％を超え、好ましくは４０モル％を超え、より好ましくは５０モル％を超え、なおもより好ましくは６０モル％を超え、さらにより好ましくは７０モル％を超え、最も好ましくは８０モル％を超えるペプチド結合トリプトファンは、ジペプチドまたはトリペプチドの形態で存在する。ペプチド結合トリプトファン画分は、好ましくはリゾチーム加水分解産物、または精製または分画されたリゾチーム加水分解産物である。本出願人は本発明に従ったこの加水分解産物が、生体内で高い血漿Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比を迅速に生じさせることを発見した。かなり意外にも血漿中で検出されるＴｒｐ／ＬＮＡＡ比は、十分に高用量で投与した場合、加水分解産物のＴｒｐ／ＬＮＡＡ比よりも高いことが分かった。十分に高用量とは、好ましくは１０グラムを超え、１２グラムを超えまたは１４グラムを超えるリゾチーム加水分解産物の用量である。この画分のさらに別の利点は、Ｔｒｐ含有ペプチドが非常に小型であり、Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比が好ましくないタンパク質に富む製品との組み合わせにおいてさえも、加水分解産物が高血漿Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比を即座に生じさせ得ることである。本発明の組成物は遊離トリプトファンをさらに含んでなってもよく、例えば遊離トリプトファンを組成物に添加してもよい。好ましくはこの組成物は、ペプチド結合トリプトファンが存在する場合、（乾燥物質基準で）１重量％を超える遊離トリプトファンを含有しない。
【００１７】
好ましくはポリペプチド結合トリプトファン画分は０．１５を超え、好ましくは０．１５〜０．５のモル濃度Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比を有し、未変化リゾチームは０．２３のＴｒｐ／ＬＮＡＡ比を有する。摂取されると、ポリペプチド結合トリプトファン画分はペプチド結合トリプトファンもまた提供するが、このポリペプチド結合トリプトファン画分から生体内で遊離するペプチド結合トリプトファンは、ペプチド結合トリプトファン画分からのペプチド結合トリプトファンよりもかなり後に、腸管吸収できるようになる。双方の画分が同時に摂取された場合、有利なことにポリペプチド結合トリプトファン画分からのペプチド結合トリプトファンの腸管吸収は、ペプチド結合トリプトファン画分からの遊離トリプトファンまたはペプチド結合トリプトファンの腸管吸収よりも後に起きる。本出願人は、ヒト胃内での酵素的加水分解に抵抗する未変化タンパク質の経口摂取によって、このような遅延トリプトファン遊離を達成し得ることを発見した。好ましくはこのような未変化タンパク質は、高Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比を有する。
【００１８】
本発明の別の態様に従って、加水分解リゾチームおよび（未変化）リゾチーム混合物の組成物の味は、（未変化）リゾチームなしの加水分解リゾチームを含んでなる組成物と比べて改善される。
【００１９】
本発明の別の態様は、気分、月経前症候群（ＰＭＳ）、認知力、俊敏さ、覚醒状態、入眠と睡眠の質、抗不安効果、うつ病、情動反応制御または性行動を改善するための、または気分、認知力、食欲、俊敏さ、覚醒状態、入眠と睡眠の質、抗不安効果、うつ病、情動反応制御または性行動のための食品、ペットフード、飼料、健康補助食品または栄養補助組成物の調製において成分として使用するための、ポリペプチド結合トリプトファンおよび任意に炭水化物と組み合わされた、遊離トリプトファンまたはペプチド結合トリプトファン画分を含んでなるリゾチームまたは組成物の使用である。遊離トリプトファンまたはペプチド結合トリプトファン、ポリペプチド結合トリプトファン、および任意に炭水化物の他に、組成物は、「脳」栄養のため、ストレスまたはうつ病を軽減するため、または俊敏さ、気分、認知力または睡眠パターンを改善するために推奨される化合物もまた含んでなってもよい。
【００２０】
本発明の組成物を含んでなり、または本発明の方法に従って製造され、または好ましくは未変化鶏卵リゾチームと組み合わされた（トリペプチドとして）ＧＮＷ、（ジペプチドとして）ＳＷまたは（ジペプチドとして）ＡＷペプチドを含んでなる本発明に従った組成物を含んでなる、食品（乳児用調製粉乳をはじめとする）、ペットフード、飼料、健康補助食品または栄養補助組成物が開示される。
【００２１】
さらなる実施態様に従って、ペプチドまたは組成物摂取後９０分、好ましくは６０分、より好ましくは３０分、最も好ましくは１５分以内に、血漿中のＴｒｐ／ＬＮＡＡ比を増大させるための、または組成物摂取後９０分、好ましくは６０分、より好ましくは３０分、最も好ましくは１５分以内に、血漿中のＴｒｐ／ＬＮＡＡ比を増大させる栄養補助組成物を調製するための、本発明のトリプトファン含有組成物の使用が開示される。さらに別の実施態様に従って、組成物摂取後９０分を超えて、好ましくは１２０〜２４０分間、より好ましくは１５０分を超えて、血漿Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比の増大を維持するための本発明のトリプトファン含有組成物の使用が開示される。なおもさらなる実施態様に従って、組成物摂取後９０分を超えて、好ましくは１２０〜２４０分間、より好ましくは１５０分を超えて、血漿Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比の増大を維持するための栄養補助組成物を調製するためのリゾチームまたは本発明のトリプトファン含有組成物の使用が開示される。
【００２２】
本発明は、非常に短い時間間隔の後に血漿中のＴｒｐ／ＬＮＡＡ比に効果的な増大を与えるのに非常に良く適した、遊離トリプトファンとしておよび／またはペプチド結合形態で存在するトリプトファンと、組成物中にポリペプチド結合トリプトファンが存在しない状況と比べて、高血漿Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比を長期間にわたり維持するポリペプチド結合トリプトファンとを含んでなる組成物を提供する。この効果は特に、本発明の組成物摂取の９０〜２４０分後に顕著である。本出願人は、炭水化物と組み合わされたトリプトファンを含んでなる２つの画分が、迅速かつ長期のＴｒｐ／ＬＮＡＡ増大に貢献することに気がついた。
【００２３】
本発明の一態様に従って、易吸収性ペプチド結合トリプトファンは、産業工程において酵素的（前）加水分解により、リゾチーム、好ましくは鶏卵リゾチームから入手し得て、すなわち（鶏卵）リゾチームは好ましくは加水分解産物の形態で提供される。加水分解産物の形態で提供されると、トリプトファン含有ペプチドの胃腸吸収は大幅に促進される。ポリペプチド結合トリプトファン画分は、好ましくは、ヒト胃内で分解されないまたはわずかにしか分解されない高Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比の未変化タンパク質である。好ましくはこの未変化タンパク質は、鶏卵リゾチームである。Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ血液比を上昇させるのに使用されることが多い牛乳からのαラクトアルブミンはリゾチームよりも低いＴｒｐ／ＬＮＡＡ比を有するので、この分子は適切なポリペプチド結合トリプトファン源として適格でない。本発明に従った組成物は、リゾチーム加水分解産物などの易吸収性遊離トリプトファンおよび／またはペプチド結合トリプトファンと、好ましくはリゾチームである未変化タンパク質などのプロテアーゼ抵抗性ポリペプチド結合トリプトファンとの混合物によって特徴付けられる。任意に組成物は、炭水化物または遊離トリプトファンを含んでなってもよい。好ましくは本発明の組成物は、好ましくは加水分解産物としての遊離トリプトファンおよび／またはペプチド結合トリプトファンと、好ましくはリゾチームなどの未変化タンパク質としてのポリペプチド結合トリプトファンとを１：３〜１：０．２の範囲の重量比（タンパク質乾燥重量として測定）で混合することで生成される。より好ましくは組成物は、１：１〜１：０．４のタンパク質乾燥重量比で加水分解産物および未変化タンパク質を含んでなる。易吸収性およびプロテアーゼ抵抗性タンパク質画分の双方は、０．１０よりも高く、好ましくは０．１５を超える分子Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比によって特徴付けられる。組成物は、粉末、液体またはペーストとして提供されてもよい。これらの液体またはペーストは、中性または酸性ｐＨ値を有してもよい。好ましくは混合物は５未満、より好ましくは４未満のｐＨ値を有する。
【００２４】
さらに本明細書の別の実施態様では、鶏卵リゾチームは、５０モル濃度％を超え、好ましくは６０モル濃度％を超え、より好ましくは７５モル濃度％を超える存在するペプチドが５００Ｄａ未満の分子量を有する、ペプチド組成物を含んでなる、加水分解産物に変換される。ただし加水分解産物中に存在するペプチドの分子量分布は、本明細書の材料と方法セクションに記載されるように実施される。
【００２５】
易吸収性画分の重要な利点は、遊離トリプトファンまたはジペプチドおよびトリペプチド内に包含されるトリプトファンが、経口摂取直後に腸壁を越えて血流内に輸送されることである。結果として、脳セロトニンレベルに対する直接効果を有し、血漿トリプトファンレベルがほとんど即座に増大する。本明細書の実施例６および１１で提供されるデータは、このようなジペプチドおよびトリペプチドの形態で提供されるトリプトファン残基が非常に迅速に高Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比をもたらすことを示す。この点に関してジペプチドおよびトリペプチドの形態で提供されるトリプトファン残基は、遊離トリプトファンよりもさらに有効なようである。本方法に従って、少なくとも０．１０、好ましくは少なくとも０．１５の分子Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比を有する水溶性ペプチド画分が得られるが、ただし加水分解産物のアミノ酸分析は、本明細書の材料と方法セクションに記載されるように実施される。
【００２６】
ジペプチドおよびトリペプチドの形態のトリプトファンを提供することのさらに別の重要な利点は、これらのペプチドの胃腸取り込みが非常に早いために、天然ではＴｒｐ／ＬＮＡＡ比が好ましくないが、摂取後９０分、好ましくは６０分、より好ましくは３０分以内に効果的な血漿中のＴｒｐ／ＬＮＡＡ比の増大をもたらす乳製品などのタンパク質含有食品と組み合わせて、それらを摂取し得ることである。
【００２７】
したがって本発明は、ペプチド摂取後９０分、好ましくは６０分、最も好ましくは３０分以内に血漿中のＴｒｐ／ＬＮＡＡ比増大を得る用途のための、またはペプチド摂取後９０分、好ましくは６０分、最も好ましくは３０分以内に血漿中のＴｒｐ／ＬＮＡＡ比増大を得るための栄養補助組成物の調製のための、リゾチームおよび／または本発明の組成物の使用を提供する。本明細書中でＴｒｐ／ＬＮＡＡ比増大とは、本発明の組成物の消費または摂取前の状況と比較したＴｒｐ／ＬＮＡＡ比の増大を意味する。
【００２８】
「タンパク質」または「ポリペプチド」は、本明細書で３０を超えるアミノ酸残基を含んでなる鎖として定義される。
【００２９】
「未変化タンパク質」または「未変化ポリペプチド」は、本明細書で、材料と方法セクションに記載されるＳＤＳ−ＰＡＧＥ法を使用して比較すると、天然タンパク質と同一の分子量があるタンパク質として定義される。
【００３０】
未変化タンパク質の「プロテアーゼ抵抗性」は、材料と方法セクションで明記されるようにして測定される。
【００３１】
「ペプチド」または「オリゴペプチド」は、本明細書でペプチド結合を通じて連結された少なくとも２つのアミノ酸鎖として定義される。「ペプチド」および「オリゴペプチド」という用語は（一般に認識されるように）同義と見なされ、各用語は文脈の必要に応じて同義的に使用し得る。
【００３２】
トリプトファン含有ペプチドまたはトリプトファン含有ペプチド組成物または画分（画分および組成物はこの文脈で互換性に使用される）とは、少なくとも１つのトリプトファン含有ペプチドを含んでなる組成物を意味する。本明細書中で、トリプトファン含有ペプチドまたはトリプトファン含有ペプチド組成物は１つのペプチドのみを含んでなってもよく、好ましくはこの組成物は１つを超えるペプチドを含んでなる。トリプトファン含有ポリペプチドまたはトリプトファン含有ポリペプチド組成物または画分（画分および組成物はこの文脈で互換性に使用される）とは、少なくとも１つのトリプトファン含有ポリペプチドを含んでなる組成物を意味する。本明細書中でトリプトファン含有ポリペプチドまたはトリプトファン含有ポリペプチド組成物は、１つのポリペプチドのみを含んでなってもよい。
【００３３】
トリプトファン含有ペプチドとは、少なくとも１つのトリプトファンアミノ酸残基を含んでなるペプチドを意味する。トリプトファン含有ポリペプチドとは、少なくとも１つのトリプトファンアミノ酸残基を含んでなるポリペプチドを意味する。
【００３４】
ペプチド結合トリプトファンとは、ペプチド中にアミノ酸として存在するトリプトファンを意味する。ポリペプチド結合トリプトファンとは、アミノ酸中にポリペプチドとして存在するトリプトファンを意味する。
【００３５】
本発明のトリプトファン含有組成物は、トリプトファン含有ペプチド組成物およびトリプトファン含有ポリペプチド組成物を含んでなり、したがって少なくとも１つのトリプトファン含有ペプチドおよび少なくとも１つのトリプトファン含有ポリペプチドを含んでなる。
【００３６】
遊離トリプトファンとは遊離アミノ酸としてのトリプトファンを意味し、したがってペプチドまたはポリペプチドの一部ではない。
【００３７】
「水溶性」ペプチドとは、ｐＨ５．０で水溶性のペプチドである。
【００３８】
本明細書では、全ての（オリゴ）ペプチドおよびポリペプチド式または配列は、慣行に従ってアミノ末端からカルボキシ末端の方向で左から右に記述される。本明細書で使用されるアミノ酸一文字コードは一般に当該技術分野で知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９年）にある。
【００３９】
タンパク質加水分解産物、加水分解産物または加水分解タンパク質とは、タンパク質の酵素的加水分解によって形成される生成物を意味し、濃縮または分画された加水分解産物は、例えば選択されたペプチドが濃縮されている、またはペプチドまたはポリペプチドが加水分解産物から除去されているような、タンパク質加水分解産物の画分である。したがって濃縮加水分解産物は、好ましくはペプチドの混合物（またはペプチド混合物）である。したがって本発明のペプチドの混合物は、少なくとも２種、好ましくは少なくとも３種、より好ましくは少なくとも４種のトリプトファン含有ペプチドの混合物である。より好ましくは混合物は、５０モル濃度％を超え、好ましくは６０モル濃度％を超え、より好ましくは７５モル濃度％を超える存在するペプチドが５００Ｄａ未満の分子量を有する、ペプチド組成物を含んでなる。Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比は、その他の大型中性アミノ酸（ＬＮＡＡ：すなわちチロシン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、およびバリンの和）のレベルに対するトリプトファンのモル比を表す。血漿Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比を別にして、Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比はペプチド結合および／またはポリペプチド結合アミノ酸のみに関わる。血漿Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比では、Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比は遊離アミノ酸に関わる。したがってＴｒｐ／ＬＮＡＡ比では、遊離トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、およびバリンを考慮に入れない。
【００４０】
ペプチド結合アミノ酸はペプチドの一部をなすアミノ酸であり、遊離アミノ酸でない。
【００４１】
Ｔｙｒ／ＢＣＡＡ比は、分枝鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ；すなわちロイシン、イソロイシン、およびバリンの和）のレベルに対するチロシンのモル比を表す。好ましくはＴｙｒ／ＢＣＡＡ比は０．１よりも高く、好ましくは０．１２よりも高い。
【００４２】
好ましい入眠と睡眠の質は、就寝の４５分以内に入る穏やかな睡眠と定義される。
【００４３】
気分は精神の情動状態と定義され、好ましくは気分状態のプロフィール質問票を用いて測定される（本明細書の実施例６参照）。
【００４４】
認知力は、問題解決、学習、記憶および言語などの分野に関わる、組み合わさった技能と定義される。
【００４５】
食欲は空腹感によって刺激される摂食欲求と定義される。
【００４６】
俊敏さは精神の注意または覚醒状態と定義され、好ましくはＭａｃｋｗｏｒｔｈ時計試験およびクリティカルトラッキング課題を用いて測定される（本明細書の実施例９参照）。
【００４７】
抗不安効果は、恐怖、不安または心配の感情の軽減をもたらす効果である。
【００４８】
うつ病は、重度で持続する喜びの喪失感によって特徴付けられる精神状態と定義される。
【００４９】
性行動という用語は、本明細書で性欲の同義語として使用される。
【００５０】
国際公開第０２／４６２１０号パンフレットでは、乳清タンパク質加水分解産物中のトリプトファンレベルを増大させる方法について記載される。使用される方法では、乳清は最初に酸性ｐＨにおいて１つ以上の酸プロテアーゼによって、好ましくはペプシン、レンニン、酸真菌プロテアーゼ、キモシン、パパイン、ブロメライン、キモパパインまたはフィシンによって加水分解される。好ましいインキュベーション条件はｐＨ１．５〜３．５であり、疎水性のペプチドを生成するように選択される。加水分解はトリプトファン残基が大型疎水性ペプチドに組み込まれるように、意図的に実施される。小型でより水溶性の高いペプチド中には、はるかにより少ないトリプトファン残基が存在する。引き続く処理ステップでは、ｐＨを４．０〜６．０に上昇させてこれらの大型トリプトファン含有ペプチドの沈殿を促進し、それによって乳清加水分解産物からのそれらの選択的回収を容易にする。トリプトファンは比較的大型のペプチド中のみに存在し、それにより血中へのトリプトファン取り込みが遅延されることは、特にその他のタンパク質と組み合わせた食品または飲料成分としての調製物の応用可能性を制限する。材料と方法セクションで明記される試験によれば、未変化αラクトアルブミンはプロテアーゼ抵抗性でないため、本発明に従った未変化タンパク質画分として適格でないことを強調することは有意義である。
【００５１】
本発明は、工業的に入手できて高Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比を特徴とするタンパク質から出発する、単純な加水分解工程を開示する。本加水分解工程は、タンパク質トリプトファンベースで３０％を超えるトリプトファン収率を有し、トリプトファンを含んでなる水溶性ペプチド組成物を生じる。トリプトファン残基の大部分がジペプチドおよびトリペプチド中に包含されるという事実は、血流内への即時の取り込みを暗示する。以下で開示されるようにこの特質は、より多様な食品または栄養補助食品製品への加水分解産物の組み込みを可能にする。かなり意外にも本発明は、経口摂取時に、本発明に従った加水分解産物が、実際の加水分解産物のＴｒｐ／ＬＮＡＡ比よりも高い血漿Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比を生じ得ることもまた開示する。
【００５２】
本発明に従って、鶏卵リゾチームは、経口摂取時に血中に迅速かつ持続的なＴｒｐ／ＬＮＡＡ比増大をもたらす、高Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比がある本発明の組成物のための都合よい出発原料として使用される。リゾチームは、３〜４％の濃度で卵白中に存在する。そのひときわ高い等電点を生かして、単純なカチオンクロマトグラフィーの精製工程とそれに任意に続く結晶化工程を使用して、リゾチームを卵白から工業的に単離する。得られる生成物はほぼ純粋であり、この工業的に入手できる製品は７．８％の分子トリプトファン含量および少なくとも０．１５の分子Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比を有する。したがってリゾチーム、すなわち未変化タンパク質は、純粋なαラクトアルブミンおよび／またはβラクトグロブリンよりも顕著に高いＴｒｐ／ＬＮＡＡ比を有する。したがって本発明に従ったリゾチーム加水分解産物は、好ましくは０．１５よりも高いモル濃度Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比を有し、より好ましくはＴｒｐ／ＬＮＡＡ比は０．２０よりも高く、なおもより好ましくはＴｒｐ／ＬＮＡＡ比は０．２３よりも高く、さらにより好ましくはＴｒｐ／ＬＮＡＡ比は０．２５よりも高く、最も好ましくはＴｒｐ／ＬＮＡＡ比は０．３０よりも高い。一般にモル濃度Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比は３．０未満である。このようなリゾチームはトリプトファン含有ペプチドまたは組成物のための好ましい出発点であるので、ポリペプチド結合トリプトファン組成物として使用し得る。リゾチーム（ＥＣ３．２．１．１７）は、細菌細胞壁中の特異的ペプチドグリカン結合を加水分解して、細胞溶解をもたらすことができる酵素である。リゾチームはその殺菌効果のために、感染を予防することで宿主防御において重要な役割を果たす。生理学的条件下では、リゾチーム分子はタンパク質分解作用に対して非常に抵抗性である。この並外れた抵抗性は、進化に基づいて説明し得る。侵入細菌は多岐にわたるプロテアーゼを排出できるので、このようなプロテアーゼに感受性のリゾチーム分子は迅速に不活性化する。そのプロテアーゼ抵抗性は例えば反芻動物の胃リゾチームで例証されている（Ｄｏｂｓｏｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９８４年，２５９（１８）１１６０７〜１１６１６頁）。構造的な観点から、分子中の４つのジスルフィド結合の存在はリゾチームプロテアーゼ抵抗性をもたらすことが予期され得る。本明細書の実施例１に提示されるデータに基づいて、鶏卵リゾチームはタンパク質分解作用に対して非常に抵抗性であると見なし得るので、ヒト腸管の近位部においては分子は効率的に消化されそうにない。このプロテアーゼ抵抗性のため、未変化リゾチームはその非常に興味をそそるＴｒｐ／ＬＮＡＡ比にも関わらず、単に胃腸管内に存在する生理学的条件下でトリプトファン残基が容易に遊離されないという理由から、血漿トリプトファンレベルを迅速に上昇させるには適切な供給源でないと結論される。しかし未変化鶏卵リゾチームは、ほぼ中性のｐＨ条件下で酵素的に加水分解し得る（Ｐｏｒｔｅｒら，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．１９８４年，３２，３３４〜３３９頁）。この論文は、未変化鶏卵リゾチームがヒト腸のより遠位部でペプチド結合トリプトファンを遊離できるという、本出願人の観察に一致する。上���の易吸収性「前消化」リゾチーム加水分解産物と共に、これは、経口摂取時に血漿内Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比の即座の急上昇と、それに続く緩慢で持続性のペプチド結合Ｔｒｐの放出をもたらす製剤を創出する、意外な可能性を与える。これらの動態は血漿内のＴｒｐ／ＬＮＡＡレベルで再現され、脳内セロトニンならびにドーパミンに対して新しい驚くべき効果をもたらす。
【００５３】
食餌摂取時に、食物中に存在するタンパク質は徐々により小さな断片に加水分解され、次に小腸壁を越えて輸送されて血液に取り込まれる。胃腸管内では、胃、膵臓、および小腸起源のいくつかの異なるプロテアーゼが活性であり、食餌性タンパク質を加水分解する。ペプシン、トリプシン、およびキモトリプシンなどのエンドプロテアーゼは、食餌性タンパク質をより小さなオリゴペプチドに切断する。これらのエンドプロテアーゼの内、ペプシンのみが胃の酸性環境内で活性である。トリプシンおよびキモトリプシンは、十二指腸、空腸、および腸のより遠位部で一般的なほぼ中性の環境内で活性化する。次にこれらのエンドプロテアーゼによって形成されるオリゴペプチドは、ジペプチドおよびトリペプチドを生じるジペプチジルペプチダーゼおよびトリペプチジルペプチダーゼ、そして遊離アミノ酸を生じるアミノペプチダーゼおよびカルボキシペプチダーゼなどのいくつかのその他の酵素によってさらに加水分解される。遊離アミノ酸またはジペプチドおよびトリペプチド輸送に対して特異的なキャリア系が、腸壁を越えて血流内に入る効率的な輸送役割を担う。食餌摂取時に、遊離アミノ酸、ジペプチド、およびトリペプチドは、血流に即座に組み込まれる。トリペプチドよりも大きいペプチドは、取り込み可能にするための追加的な酵素的切断を要する。
【００５４】
本出願人は、本発明のトリプトファン含有組成物が、例えば乳製品によって提供される高タンパク質含有食品マトリックスに組み込まれた場合にも効果的であることを発見した。タンパク質含有食品マトリックスは高ＬＮＡＡ負荷の典型であり、ひいては高Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比の製品の効果を低下させることが予期され得るので、これはかなり意外である。この意外な現象の可能な説明としては、通常の食品は高度に加水分解されたタンパク質でなく、むしろ未変化タンパク質を包含していることが挙げられる。本発明に従った加水分解産物の典型的な粒度分布を図３に提示する。この図によれば、トリプトファンおよびチロシン組み込みペプチドの大部分は、５００Ｄａ未満の分子量を有する。トリプトファン（ＭＷ＝１８６）およびチロシン（ＭＷ＝１６３）の非常に高い分子量、および非常に低レベルの遊離トリプトファンのみが存在するという事実を鑑みて、これらのペプチドの大部分はトリペプチドまたはジペプチドであることが暗示される。使用される波長では、トリプトファンはチロシンよりもはるかに高いモル濃度吸光係数を有するので、ピーク値は主にトリプトファン包含ペプチドに由来する。
【００５５】
本発明に従ったトリプトファン含有組成物中に存在するトリプトファン含有ジペプチドおよびトリペプチドは、例えば非加水分解マトリックスタンパク質により提供される大量のＬＮＡＡよりもはるかに早く吸収されるので、本出願人はこれが大量のマトリックスタンパク質の存在下であっても、高血漿Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比が得られる理由であると想定する。
【００５６】
特定の状況では、高血漿Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比が長期間にわたり必要とされる。例えば睡眠時間を改善して延長する、または改善された認知能力が長期にわたり必要とされる状況など。また月経前症候群または閉経期後の女性の例で記載されたような気分改善を必要とする状況では、本発明に従った組成物が特に適切である。リゾチーム加水分解産物などのペプチド結合トリプトファンが、ほぼ即時の血漿Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比増大を生じるのに対し、Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比が高いペプシン抵抗性タンパク質などのポリペプチド結合トリプトファンの緩慢な消化は、ヒト腸のより終端の部分におけるペプチド結合トリプトファンの継続的放出を保証して、本発明の組成物の摂取後１２０〜２４０分間以内に、血漿内のＴｒｐ／ＬＮＡＡ比の増大をもたらす。
【００５７】
興味深いことに本出願人の本実験データは、本発明に従った加水分解産物が十分に高用量で投与された場合、ヒトボランティアの血液中に、加水分解産物のＴｒｐ／ＬＮＡＡ比よりも高いＴｒｐ／ＬＮＡＡ比を生じさせ得ることもまた示唆するようである。十分に高用量とは、好ましくは１０グラムを超え、１２グラムを超えまたは１４グラムを超えるリゾチーム加水分解産物用量である。このような現象については未知であり、本出願人の知る限りではこの効果に対する一般に認められた説明はないが、本出願人はこれがリゾチーム分子の極めて高いアルギニン含量によって引き起こされるかもしれない考える。ここで立てられた作業仮説は、実施例に示す実験データを説明するために本明細書で開示される。この仮説は発明者らの現在の洞察を与えるために使用されるが、本発明はこの仮説にどのようにも関連付けられずまたはそれに限定されない。したがって本発明は仮説の正しさからは独立している。血液インシュリンの増大は、血液から末梢組織、特に筋肉内へのアミノ酸の取り込みを刺激する。しかしトリプトファンは血液中では血漿タンパク質アルブミンに結合するという事実のために、トリプトファンはこの経路からほとんどはずれている。結果としてインシュリンレベル増大は、ＬＮＡＡ濃度を低下させるがトリプトファン濃度は低下させず、ひいては血液中のＴｒｐ／ＬＮＡＡ比を増大させる。炭水化物摂取は末梢組織、とりわけ筋肉内のインシュリン分泌を引き起こしＬＮＡＡ取り込みを刺激するので、血漿Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比は炭水化物摂取によって増大される（ＦｅｒｎｓｔｒｏｍおよびＷｕｒｔｍａｎ，１９７２年，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，第２１巻，第４号，３３７〜３４２頁）。炭水化物摂取の他にもインシュリン分泌は、また特定のアミノ酸によって刺激されることが知られている。個々のアミノ酸輸液に起因する血漿アミノ窒素レベルが非常に良く似ている場合、インシュリン応答はかなり変動する。Ｆｌｏｙｄら（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ４５（９）：１４８７〜５０２頁）は、アミノ酸に対するインシュリン応答が低下する順に、アルギニン＞リジン＞ロイシン＞フェニルアラニン＞バリン＞メチオニンであることを確立した。リゾチームが特にアミノ酸アルギニンに富むという事実を考慮して、アルギニンによってもたらされるインシュリン刺激効果が高Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比をもたらすと推測することは難くない。
【００５８】
炭水化物は、それらのインシュリン刺激効果が知られているので、本発明に従った加水分解産物は好ましくは炭水化物と組み合わせて調合される。速吸収性ペプチド結合トリプトファンおよび遅吸収性ポリペプチド結合トリプトファンの存在と併せて、本発明に従った好ましい組成物は、炭水化物を含んでなる。
【００５９】
本発明の一実施態様では、リゾチーム、好ましくは鶏卵リゾチームが工業的方法で酵素的に（前）加水分解され、すなわち（鶏卵）トリプトファン含有ペプチド組成物は、好ましくは加水分解産物または濃縮形態で提供される。このような（濃縮）加水分解産物の形態で提供されると、トリプトファン含有ペプチドの腸管吸収は大幅に促進される。本明細書の別の実施態様では、鶏卵リゾチームは、５０モル濃度％を超え、好ましくは６０モル濃度％を超え、より好ましくは７５モル濃度％を超える存在するペプチドが５００Ｄａ未満の分子量を有する、トリプトファンを含んでなるペプチド集団を含んでなる、加水分解産物または濃縮加水分解産物に変換される。好ましくはこのような（濃縮）加水分解産物は、（乾燥物質基準で）１重量％を超える遊離トリプトファンを含有しない。加水分解産物中に存在するトリプトファンを含んでなるペプチドの分子量分析は、本明細書の材料と方法セクションに記載されるように実施され、図３に示される。後者の実施態様の重要な利点は、ジペプチドおよびトリペプチドに包含されるトリプトファンが、経口摂取直後に腸管壁を越えて血流内に輸送されることである。結果として脳セロトニンレベルに対する直接的効果をもって、ほぼ即座に血漿トリプトファンレベルが増大する。かなり意外にも、本明細書の実施例６で提示されるデータは、ジペプチドおよびトリペプチドの形態で与えられたトリプトファン残基の有効性が、遊離トリプトファンよりもさらに有効であることを示す。この観察は本発明によって供される利点を強調する。
【００６０】
国際公開第２００６／００９４４８号パンフレットは、抗高血圧作用を有する鶏卵タンパク質から得られるタンパク質加水分解産物、ならびにこれらの加水分解産物を含んでなる食品および栄養補助食品を提供する。この文献は、鶏卵リゾチームから得られるものをはじめとする多数の加水分解産物の調製について開示する。これらの加水分解産物は全て、ヒトにおいて経口摂取時に血圧を低下させまたは血圧上昇を予防することを図る。国際公開第２００６／００９４４８号パンフレットはまた、サブチリシン（ＥＣ３．４．２１．６２；取引名ＡｌｃａｌａｓｅまたはＰｒｏｔｅｘ）を使用して、アルカリ性条件下で得られるリゾチーム加水分解産物の調製についても記載する。得られる高度な加水分解と比例して、これらのリゾチーム加水分解産物が含有するペプチドの大部分は５００Ｄａ未満である。しかし国際公開第２００６／００９４４８号パンフレットは、リゾチームが脳セロトニンレベルに良い影響を与え得る高トリプトファン含量のタンパク質源であるという事実に、本文のどこでも言及していない。多量のトリプトファンおよび比較的少量のＬＮＡＡを組み込んだ水溶性ペプチドを含んでなる、リゾチーム加水分解産物についてもまた言及されていない。国際公開第２００６／００９４４８号パンフレットはまた、リゾチームまたはリゾチーム加水分解産物のどちらの高アルギニンおよびリジン含量についても言及していない。本出願人は本明細書で提示されるデータに基づいて、アルギニンおよびリジンの遍在的存在と組み合わさったリゾチーム分子の高トリプトファン含量が、リゾチームを生体内で高Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比を発生させるための完璧な出発原料にすることを発見した。さらに国際公開第２００６／００９４４８号パンフレットの本文は、その他のタンパク質含有食品との同時摂取に際し、本発明で使用される加水分解産物が提供する利点について、言及していない。薄膜フィルターの使用を別として、国際公開第２００６／００９４４８号パンフレットの本文はまた、選択されるアミノ酸組成を有する加水分解産物からペプチド画分を得る方法、または特定の方法を使用してトリプトファン含量を増大させまたはＴｒｐ／ＬＮＡＡ比を増大させる方法についても言及していない。さらに高度に分解されたリゾチーム加水分解産物を、非分解未変化リゾチームと組み合わせて提供することの利点についても記録されていない。
【００６１】
本明細書の実施例４で提示されるデータは、アルカリ性ｐＨでリゾチームをサブチリシンと共にインキュベートして得られるリゾチーム加水分解産物が、特にＡｌａ−Ｔｒｐ（ＡＷ）ジペプチドに富むことを示唆する。この発見は化学的に合成されるＡＷジペプチドが、本リゾチーム加水分解産物の適切な代替え物を提供できることを示唆する。合成ジペプチドの使用には明らかな法的欠点があるが、重要な利点はその費用効率およびその理想的Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比である。理論的には２０種の異なるトリプトファンを含有するジペプチドを入手できるが、本出願人の研究はジペプチドＡｌａ−Ｔｒｐ（ＡＷ）およびＳｅｒ−Ｔｒｐ（ＳＷ）が、合成ジペプチドを通じて血漿Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比を増強する特に好ましい選択肢であることを示した。化学合成を通じたＡＷおよびＳＷジペプチドの製造は、例えば「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｎ．ＳｅｗａｌｄおよびＨ．Ｄ．Ｊａｋｕｂｋｅ編，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ，２００２年，第４章に記載されるような従来の技術を使用して可能である。大量生産に適した、化学ペプチド合成の対費用効果の高い特定の方法は、Ｃ末端保護のためのメチルエステル、およびＮ−保護のためのベンジルオキシカルボニル（Ｚ）またはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル基の使用と組み合わせた、カルボン酸基を活性化するためのアルキルクロロギ酸または塩化ピバロイルの使用に基づく。ジペプチドＳＷの費用効率が高い合成の詳細な手順は、実施例５に提供される。好ましくは未変化リゾチームである、高Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比があるペプシン抵抗性タンパク質などのポリペプチド結合トリプトファンと組み合わされた、このような化学的に合成されるトリプトファン含有ジペプチドの組み合わせは、新規である。
【００６２】
本発明に従った組成物を利用することで、技術的および経済的利点を有するその他の新しい意外な応用が考えられる。
【００６３】
新しい用途は、様々な乳児用調製粉乳製品へのリゾチームおよび／または本発明の組成物の組み込みである。牛乳は２０％の、人乳は４０〜６０％の乳清タンパク質を含有する。結果的に牛乳は人乳よりもαラクトアルブミンが少なく、ひいてはトリプトファンがより少ない。正常な満期出産乳児は、通常、母乳と等しいアミノ酸プロフィールを提供しない製品である、牛乳ベースの調製乳を与えられる。不十分なトリプトファン供給の帰結は完全に知られていないが、トリプトファンを多く含む乳児用調製粉乳製品は、乳児に対して意識的行動および入眠と睡眠の質に有益な効果を有するかもしれない。高血漿トリプトファンレベルが、健康な新生児において安静な睡眠の迅速な開始を促進するという強力な示唆が、ＹｏｇｍａｎおよびＺｅｉｓｅｌによってＮ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．１９８３年１１月１０日；３０９（１９）：１１４７〜１１４９頁で提供された。したがって本発明は、その中でトリプトファンレベルが上昇されている乳児用調製粉乳製品のための組成物を提供する。
【００６４】
本発明の別の態様に従って、本発明に従った組成物は、食事代替品製品中で使用し得る。例えば国際公開第２００５／０２３０１７号パンフレットは、食事代替品製品中の適切な構成要素としての高用量のゼラチンの利点について記載する。優れた官能的特性を提供する一方で、ゼラチンは必要とされるアミノ酸バランスを提供せず、例えばそれは必須アミノ酸トリプトファンを包含しない。したがってＥＣ指令９６／８／ＥＣで要求される適切なアミノ酸バランスを有する組成物を得るために、このようなゼラチンを含んでなる組成物にはトリプトファンを添加しなくてはならない。国際公開第２００５／０２３０１７号パンフレットでは、好ましくは、トリプトファンは例えば卵白粉末または全卵粉末などのトリプトファンに富むタンパク質の形態で添加される。本出願人は今や、本発明に従ったトリプトファン含有組成物が、トリプトファンをはるかにより濃縮された形態で供給するので、これらの加水分解産物がこの問題に対する改善された解決法を提供することを発見した。さらにリゾチームはそれ自体が全ての必須アミノ酸を必要とされる量で含有し、それ自体栄養的に完全なタンパク質であり、理想的に食事代替え物に適合する。
【００６５】
本発明のさらに別の態様に従って、リゾチームおよび／または本発明に従った組成物を使用して乳児、小児、および成人における入眠と睡眠の質を改善する。睡眠障害は様々な年齢群に属する個人で非常に一般的であり、医学的障害と関連付けられている。本発明に従ったトリプトファン含有組成物は睡眠障害全般を治療するのに有用であるが、それらは認知性、心理学的、社会的および行動障害に関連した問題を克服する有用なツールである。実例は、良好な睡眠衛生の確立、入眠時関連障害または日周期睡眠障害の克服である。製品はまた例えば線維筋痛症患者の入眠と睡眠の質および精神状態を改善するのに、有用であり得る。線維筋痛症候群は慢性疼痛症候群であり、激しく乱された入眠と睡眠の質および情動ストレスと結び付いている。本出願人は本発明に従った組成物および／またはリゾチームの定期的な摂取が、睡眠障害全般を患っている個人の入眠と睡眠の質を改善することを発見した。
【００６６】
本発明に従った組成物は、（半）必須アミノ酸供給などの追加的利点を提供する。リゾチームは高トリプトファンレベルを有するだけでなく、かなりの数のチロシン残基もまた包含する。チロシンは神経伝達物質ドーパミンの前駆物質であり、血漿チロシンレベル脳内のドーパミンレベルに影響することが知られている。リゾチーム加水分解産物はその他の既知の高トリプトファンペプチドよりもＬＮＡＡが少ないだけでなく、それはまたその他の既知の高トリプトファンペプチドよりも分枝鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）が少ない。ＢＣＡＡはドーパミン前駆物質チロシンの血漿可用性を低下させることが知られているので、これは重要である。したがってその高Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比と組み合わさったその高Ｔｙｒ／ＢＣＡＡ比は、リゾチームをユニークな分子にする。したがって本発明に従ったリゾチーム加水分解産物と未変化リゾチームとを含んでなる組成物は、「頭脳食」として、すなわち適切な神経伝達物質レベルに必要とされる必須アミノ酸の供給のために非常に適格である。ドーパミン系は、報酬および動機を仲介するその重要な役割、および集中力、記憶、俊敏さ、注意力、問題解決、および精神運動協調に対するその効果で知られている。本明細書の実施例９で例証されるように、本発明に従ったリゾチーム加水分解産物の摂取は、覚醒状態、俊敏さ、集中力、および精神運動協調に対して有意な有益効果を有する。この発見は本発明に従った組成物が、セロトニン系だけでなく、ドーパミン系もまた刺激することが期待し得ることを実証する。
【００６７】
いくつかの個人のグループは、この発見から利益を受け得る。例えば更年期にある女性は、彼女らが集中力欠如と関連付ける問題解決能力低下に対する一般的愁訴を有する。したがって本発明に従った組成物は、この年齢群の女性におけるこれらの問題を対処するのに特に適している。若年および中年女性のカテゴリーでは、月経前症候群が極めて一般的である。症候群は多種多様な症状によって特徴付けられるが、愁訴抑うつおよび情緒不安定が起きることが多い。このような愁訴を対処するために、フルオキセチンなどの選択的セロトニン再取り込み阻害剤が処方されることが多く、より症状が軽い女性では食餌の適応およびストレスの予防が推奨される。本明細書の実施例６および９に記載される実験結果に基づいて、本発明に従った組成物は特にこのような軽症例で優れた治療を提供する。さらに不十分なドーパミンは注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）と関連付けられているので、本発明に従った組成物によってこの障害の症状が緩和されることが予期され得る。ストレス後能力に対する有益な効果が、ストレス抵抗性被験者で特に顕著である本出願人の発見は驚くべきである。可能な説明では、セロトニン系が（過）活性であるストレスを受けた人々は、彼らのセロトニンの蓄えを補給するために飲料からのトリプトファンを必要とし、したがって彼らは課題において彼らの能力を改善するためにこのトリプトファンを使用し得ないかもしれない。この論理の道筋に従って、セロトニン作動系が過活性でないストレス抵抗性の人々は、彼らのセロトニンの蓄えを補給するためにトリプトファンを必要とせず、それを彼らのストレス後能力を改善するために使用し得る。代案の説明では、これらの効果は実のところドーパミン作動性過程の刺激性効果に起因するかもしれない。ドーパミン合成は、チロシンに富んだ食品成分によって、特に低レベルの分枝鎖アミノ酸（ＢＣＡＡｓ）と組み合わさせると増進し得る。これらの作業仮説は、実施例に示す実験データを説明するために本明細書で開示され、発明者らの現在の洞察を与えるために使用される。しかし本発明はこの仮説にどのようにも関連付けられず、またはそれに限定されない。したがって本発明は仮説の正しさからは独立している。他でも述べたように、リゾチームは高トリプトファンレベルを有するだけでなく、かなりの数のチロシン残基もまた包含する。
【００６８】
本発明に従ったリゾチームおよび／または組成物はまた、食品中のシステイン含量を増大させる。必須アミノ酸ではないが、システイン濃度は多数の食品で限定されている。システインの内因性合成はメチオニンの存在を必要とし、システイン同様メチオニン濃度は多数の食品で限定されている。食品のシステイン含量増大の利点は、特にメチオニンの血清ホモシステイン上昇効果に対する拮抗作用と関連がある。この発見については、国際公開第０３／０５５３３５号パンフレットで記載されている。本発明に従った組成物はまた、高システインレベルによっても特徴付けられる。実のところ、リゾチーム分子はトリプトファン残基（６）よりさらに多くのシステイン残基（８）を含有する。この点において本発明に従った組成物は、特定製品のシステイン含量を増大させる優れた原料になる。システイン含量の増大は、乳児用調製粉乳などの製品にとって重要であることが分かった。カゼインベースの、またはカゼインおよび乳清タンパク質混合物ベースの乳児用調製粉乳だけでなく、ダイズベースの製品もまた、そして実のところ主要タンパク質源が比較的少量のトリプトファンまたはシステインを含有するタンパク質によって提供される、全てのタンパク質に富む製品。牛乳およびゼラチンからのタンパク質構成要素の他に、トウモロコシタンパク質、酵母タンパク質、エンドウマメタンパク質、ダイズタンパク質、および米タンパク質が、このようなタンパク質の例を代表する。さらに高用量のゼラチンを含有する前述の食事代替品製品は、システインの量が不十分である。
【００６９】
例えばトリプトファン、特に（ジペプチドとして）ＳＷまたは（ジペプチドとして）ＡＷを含んでなる、ジペプチドまたはトリペプチドを含んでなる、リゾチームおよび／または本発明に従った組成物は、食品または飲料、特定保健用食品、健康補助食品、栄養補助食品などのあらゆる適切な形態で使用し得て、または飼料またはペットフード中においてさえも使用し得る。リゾチーム含有組成物は、これらの製品の通常の加工中のあらゆる段階で添加してもよい。食品または飲料で使用する場合、本発明に従った製品の摂取後に血液中の高いＴｒｐ／ＬＮＡＡ比を維持するため、タンパク質含量の比較的低い製品が好ましい。適切な食品としては、例えばシリアルバー、チョコレートおよびチョコレート含有飲料、ケーキやクッキーなどのベーカリー製品、またスープなどの液体食品またはスープ粉末が挙げられる。ミルクおよびヨーグルトなどの乳製品の他に、その他の適切な飲料は、非アルコールおよびアルコール飲料、ならびに飲用水や液体食品に添加される液体製剤を包含する。非アルコール飲料は、好ましくはミネラルウォーター、スポーツドリンク、果汁、レモネード、茶、コーヒー、カフェイン抜きコーヒー、ショットやエナジードリンクなどの濃縮飲料（例えばグルクロノラクトン、カフェインまたはタウリンを含有する飲料）、および炭酸飲料（例えばポップ、ソーダ、およびコーラ飲料）である。
【００７０】
リゾチームおよび／または本発明に従った組成物との好ましい組み合わせは、鉄、亜鉛、マグネシウム、ビタミン（特にＢ２、Ｂ６、葉酸、およびＣ）、ω３およびＤＨＡ脂肪または脂肪酸、グルコース、ＧＡＢＡ、コリン、ホスファチジルセリン、補酵素Ｑ１０、クレアチン、タウリンおよび５−ＨＴＰなどの「脳栄養」のために推奨される化合物；またはカノコソウ、チョコレート、セイヨウオトギリソウ、５−ＨＴＰ、ホスファチジルセリン、アルコール、レモンバーム、緑茶または緑茶抽出物、カモミールまたはＳ−アデノシルメチオニンなどのストレスまたは抑うつを軽減するために推奨される化合物；またはカフェイン、ガラナ、朝鮮人参、イチョウ（Ｇｉｎｋｇｏ  ｂｉｌｏｂａ）、セイヨウオトギリソウ、および５−ＨＴＰなどの俊敏さを改善するために推奨される化合物；またはＧＡＢＡ、５−ＨＴＰ、ＰＥＡ、チョコレート、緑茶または緑茶抽出物、イチョウ（Ｇｉｎｋｇｏ  ｂｉｌｏｂａ）、サルビアまたはＳ−アデノシルメチオニンなどの気分改善のために推奨される化合物；または乳ペプチド、遊離トリプトファン、オピオイドペプチドまたはメラトニンなどの睡眠を改善するために推奨される化合物である。特定保健用食品の例としては、スポーツフード、痩身食品、乳児用調製粉乳、および臨床食品のカテゴリーが挙げられる。健康補助食品という用語は、本明細書での用法では、食餌に栄養補給することが意図されること化合物または化合物混合物を含有する経口摂取される製品を指す。これらの製品中の化合物または化合物混合物は、ビタミン、ミネラル、ハーブまたはその他の植物性薬品およびアミノ酸を含んでもよい。健康補助食品はまた、抽出物または濃縮物であり得て、錠剤、カプセル、軟質ゲル、ジェルキャップ、液体、または粉末などの多くの形態であってもよい。
【００７１】
本発明のトリプトファン含有組成物および／またはリゾチームは、また栄養補助食品組成物としても使用され得て、またはその中で使用し得て、または栄養補助食品の調製において使用し得る。栄養補助食品という用語は、本明細書での用法では栄養および医薬分野双方における有用性を指す。本発明に従ったリゾチームおよび／または栄養補助組成物は、例えば食品または飼料（のための添加剤／栄養補給剤）、食品または飼料プレミクス、錠剤、丸薬、顆粒、糖衣丸、カプセル、粉末や錠剤のような発泡性調合物などの固形形態、または例えば飲料やペーストや油性懸濁液のような溶液、エマルジョンまたは懸濁液などの液体形態など、特に経口投与に常例のあらゆる形態である、人体をはじめとする動物体に投与するのに適したあらゆる形態であってもよい。本発明に従った加水分解産物を組み込んだ制御（遅延）放出製剤もまた、本発明の一部を構成する。さらにマルチビタミンおよびミネラル補給剤を本発明の栄養補助組成物に添加して、食生活によっては欠如している適量の必須栄養素を得てもよい。マルチビタミンおよびミネラル補給剤はまた、疾患予防、および生活習慣パターンに起因する栄養損失および欠乏症からの保護に役立つかもしれない。
【００７２】
本発明の好ましい態様では、リゾチームおよび／または組成物は、例えば高齢者において、そして試験準備中の学生などの若年者でも、および例えばコンピュータまたはインターネットゲームで遊ぶ人々において、例えば気分改善のため、または学習、記憶、覚醒状態、および俊敏さなどの認知機能改善のために、栄養補助食品または栄養補給剤として使用されてもよい。前述のように、閉経期前後の女性にとって、リゾチームおよび／または本発明に従った組成物は特に適している。リゾチームおよび／または本発明に従った組成物はまた、要求の厳しい訓練計画をこなすプロスポーツ選手、ならびにテニスやゴルフなどをする娯楽運動愛好家の双方の運動家に特に適している。これは本発明が、上述の本発明に従った加水分解産物の使用、および「状態改善剤」としての、すなわち過敏性および倦怠感を低下させる（最終的に過剰訓練リスクを低下させる）手段としての使用に関することを意味し、病人または健常人において、肉体および精神疲労を低下させまたは予防または軽減し、平穏な睡眠に有利に働き、すなわち不眠症および睡眠障害に対抗して睡眠を改善し、エネルギー全般を増大させ、特に脳エネルギー生成を増大させることを意味する。さらに認知力全般の改善のために、特に注意力および集中力の、記憶のおよび想起能力の、学習能力の、言語処理の、問題解決の、および知的機能の維持または改善のために；短期ならびに長期記憶の改善のために；精神的敏捷性を増大させるために；精神的覚醒状態を増強するために；精神疲労を低下させるために；良好な認知性をサポートするために、バランスの取れた認知機能を維持するために。高いＴｒｐ／ＬＮＡＡ比がある費用効率の高い製剤を得るのに必要であれば、本発明に従った加水分解産物は任意に遊離トリプトファンを含んでなる。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】実施例６に詳述する製品摂取後の時間の関数としての、血漿中のモル濃度Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比である。ＲＥＦ＝カゼイン加水分解産物、ＡＬＡＣ＝未変化α−ラクトアルブミン、Ｔｒｐ＝遊離トリプトファン、ＷＥＰＳ＝トリプトファン濃縮リゾチーム加水分解産物、ＳＹＮ＝合成ジペプチドＳｅｒ−Ｔｒｐ。
【図２】実施例６に詳述する製品摂取後の時間の関数としての、抑うつ気分である（気分状態のプロフィール試験（ＰＯＭＳ）で測定される）。ＲＥＦ＝カゼイン加水分解産物、ＡＬＡＣ＝未変化α−ラクトアルブミンＴｒｐ＝遊離トリプトファン、ＷＥＰＳ＝トリプトファン濃縮リゾチーム加水分解産物、ＳＹＮ＝合成ジペプチドＳｅｒ−Ｔｒｐ。
【図３】リゾチーム加水分解産物の水溶性ペプチド画分の粒度分布である。材料および方法セクションで詳述される、加水分解産物中に存在するペプチドおよびタンパク質の分子量分布を測定する方法を使用して、実施例３に記載される方法に従って調製されたリゾチーム加水分解産物を分析した。２１４ｎｍにおける吸光度測定は、ペプチド結合の存在を記録する。２８０ｎｍにおける吸光度測定は、トリプトファンおよびチロシンの芳香族側鎖の存在を記録する。トリプトファンはこの波長でチロシンよりもはるかに高いモル濃度吸光係数を有するので、ピーク値は主にトリプトファン包含ペプチドに由来する。
【図４】実施例９に記載される実験の研究デザインの流れ図である。高：ストレスを受けやすいボランティア；低：ストレス抵抗性ボランティア；ｈｙｄｒ：Ｔｒｐに富むリゾチーム加水分解産物；プラセボ：カゼイン加水分解産物。
【図５】実施例９に記載される実験の典型的な試験日の流れ図である。飲用：Ｔｒｐに富む加水分解産物またはプラセボを含有する飲料の摂取；血液：血漿アミノ酸レベルアセスメントのための血液試料採取；能力：抑制できないストレス前後の能力試験；ストレス：算術課題。
【図６】実施例９に記載される実験のプラセボ（ｐｌｃ）またはリゾチーム加水分解産物（Ｔｒｐ−ｈｙｄｒ）の摂取に続く血漿Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比（μｍｏｌ／ｌ）である。塗りつぶしシンボル：ストレスを受けやすい被験者；白抜きシンボル：ストレス抵抗性被験者。
【図７】実施例９に記載されるように実施したＭａｃｋｗｏｒｔｈ時計試験の結果である。算術課題前（ストレス前）または後（ストレス後）における、プラセボ（ｐｌｃ；左側パネル）またはＴｒｐに富む加水分解産物（Ｔｒｐ−ｈｙｄｒ；右側パネル）摂取後の正解数（垂直軸）。塗りつぶしシンボル：ストレスを受けやすい被験者；白抜きシンボル：ストレス抵抗性被験者。異なる介入製品が別々の日に与えられたため、意味のある比較は、同一日の同一処置内のストレス前とストレス後の条件間でのみで可能である。
【図８】実施例９に記載されるようにして実施したクリティカルトラッキング課題の結果である。プラセボ（ｐｌｃ）またはＴｒｐに富む加水分解産物（Ｔｒｐ−ｈｙｄｒ）摂取後のλＣＴ（被験者が達成した複雑さの最終レベルを示す）が示される。塗りつぶしシンボル：ストレスを受けやすい被験者；白抜きシンボル：ストレス抵抗性被験者。
【図９】酸性ｐＨ条件下でペプシンと共にインキュベートされたリゾチームおよび乳清タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥである。レーン１：リゾチームそれ自体；レーン２：ペプシン消化後のリゾチーム；レーン３：乳清タンパク質それ自体；レーン４：ペプシン消化後の乳清タンパク質；レーン５：ペプシンそれ自体。
【図１０】加水分解リゾチーム製品（Ｐ２Ｂ＝ダイヤモンド）、未変化リゾチーム（Ｌｙｓ＝四角）、未変化および加水分解リゾチーム混合物（Ｍｉｘ＝三角）摂取時の血漿Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比動態である。３種の処置は、全て同一のＴｒｐ含量を有する。注目に値するのは、３種の製品が全て、全く同一の「曲線下面積」値を生じることであり、リゾチーム加水分解産物ならびに未変化リゾチーム分子が完全に消化されて、血液に取り込まれることが示唆される。
【００７４】
［材料と方法］
［材料］
取引名「Ｐｒｏｔｅｘ  ６Ｌ」のサブチリシンはオランダ国ライデンのジェネンコア（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ（Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））から、ペプシンはシグマ（Ｓｉｇｍａ）から、およびトリプシン／キモトリプシンの混合物（Ｐｏｒｃｉｎｅ  ＰＥＭ）はデンマーク国バウスベアのノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）から得た。リゾチームは、Ｄｅｌｖｏｚｙｍｅ  Ｌ（２２％乾燥物質）または乾燥Ｄｅｌｖｏｚｙｍｅ  Ｇ顆粒のどちらかとして、オランダ国デルフト（Ｄｅｌｆｔ）のＤＳＭ  Ｆｏｏｄ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｉｅｓから得た。
【００７５】
カゼイン加水分解産物（「ＲＥＦ」）は、本質的にＥｄｅｎｓら（Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ，５３（２０）７９５０〜７９５７頁，２００５年）に記載されるようにして得た。カゼイン酸ナトリウムをＰｒｏｔｅｘ  ６Ｌによって、そしてｐＨを４．５に低下させた後にプロリン特異的エンドプロテアーゼによって、徹底的に加水分解してＤＨを＞２０％にした。限外濾過に続き透過水を加熱処理して残留酵素活性を不活性化し、最後に噴霧乾燥した。未変化αラクトアルブミン（「ＡＬＡＣ」）は、「Ｂｉｏｐｕｒｅ」（＞９０％αラクトアルブミン）としてミネソタ州ル・シュールのダビスコフーズインターナショナル（Ｄａｖｉｓｃｏ  Ｆｏｏｄｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｌｅ  Ｓｕｅｕｒ，ＭＮ））から得た。トリプトファン濃縮リゾチーム加水分解産物（「ＷＥＰＳ」）は実施例４に記載されるようにして得た。合成Ｓｅｒ−Ｔｒｐジペプチド（「ＳＹＮ」）は実施例５に記載されるようにして得た。純粋Ｌ−トリプトファン（「ＴＲＰ」）はＬ−トリプトファン−４００としてオランダ国アルメレ（Ａｌｍｅｒｅ）のＯｒｔｈｉｃａから得た。
【００７６】
［トリプトファン含有ポリペプチド、特に未変化タンパク質のプロテアーゼ抵抗性の試験］
ヒト胃内で、その消化吸収率を試験するためにＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（０．２Ｍクエン酸＋Ｎａ２ＨＰＯ４）ｐＨ４．０の中で、５％（ｗ／ｗ）未変化タンパク質溶液をペプシン（シグマ；未変化タンパク質に対して１％ｗ／ｗペプシン）と共に３７℃で２時間インキュベートした。プロテアーゼ抵抗性の程度は、ペプシンインキュベーションによる影響を受けないタンパク質の百分率と定義される。「影響なし」はペプシンインキュベーションの結果としてタンパク質の分子量が変化しないことを意味し；「タンパク質百分率」は消化時間後の曲線下面積を１００倍して消化前曲線下面積で除したものを意味し；「曲線下面積」は使用した定量分析法（以下参照）によって提供される初期分子量を有するタンパク質の面積である。分子量は、下文に明記するプロトコルに従ったＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続く染色によって比較される。ゲル染色後、イソジェン・ライフ・サイエンス（Ｉｓｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；
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）からのＯｐｔｉＧｏイメージングシステムを使用してデジタル画像を作成し、Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＸＰ上で作動するＮｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｌｔｄ（ｗｗｗ．ｎｏｎｌｉｎｅａｒ．ｃｏｍ）からのＴｏｔａｌｌａｂ  ＴＬ  １００、バージョン２００６ソフトウェアを使用した、選択されるタンパク質バンドの定量分析がそれに続く。ペプシンインキュベーション後に、元の分子量のタンパク質が依然として５０％を超えれば、タンパク質は本明細書に従ってプロテアーゼ抵抗性である。
【００７７】
［ＳＤＳ−ＰＡＧＥ］
使用するリゾチーム製剤の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥによってチェックした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび染色のための使用材料は全て、米国カリフォルニア州カールスバッドのインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳ））から購入した。サンプルは製造業者の説明書に従ってＳＤＳ緩衝液を使用して調製し、製造業者の説明書に従ってＭＥＳ−ＳＤＳ緩衝系を使用して１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上で分離した。染色は、Ｓｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎ（コロイドクーマシーＧ２５０）を使用して実施した。加水分解前、リゾチームは分子量約１４ｋＤａの単一バンドとしてゲル上に出現した。
【００７８】
［ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析］
オランダ国ブレダ（Ｂｒｅｄａ）のＴｈｅｒｍｏ  ＥｌｅｃｔｒｏｎからのＰ４０００ポンプに連結している、オランダ国ブレダのＴｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎからのイオントラップ質量分光計を使用したＨＰＬＣを使用して、本発明に従った方法により生成される酵素的タンパク質加水分解産物中のトリプトファン含有ペプチド（主にジペプチドおよびトリペプチド）の存在を判定した。米国マサチューセッツ州ベッドフォードのミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）からのミリＱ水（溶液Ａ）中の０．１％ギ酸およびアセトニトリル中の０．１％ギ酸（溶液Ｂ）の溶出勾配と組み合わせた、ベルギーのＶａｒｉａｎ  ＢｅｌｇｉｕｍからのＩｎｅｒｔｓｉｌ  ３  ＯＤＳ  ３．３μｍ、１５０×２．１ｍｍカラムを使用して、形成したペプチドを分離した。勾配は１００％の溶液Ａで始めてそのまま１０分間保ち、２５分間で２０％のＢに直線的に増大させ、即座に開始条件にして、安定化のためにそのまま１５分間保った。使用した注入量は５０μＬであり、流速は２００μＬ／分であり、カラム温度は５５℃に保った。注入サンプルのタンパク質濃度は、約５０μｇ／ミリリットルであった。関心のあるペプチドの同定は、約３０％の最適衝突エネルギーを使用して関心のあるペプチド専用のＭＳ／ＭＳを使用した、滞留時間およびプロトン化分子に基づいた。特定のトリプトファン含有ペプチドの定量化は、外部標準法を使用して実施した。
【００７９】
テトラペプチドＶＶＰＰ（Ｍ＝４１０．２）を使用して、ＭＳモードの最適感度のため、およびＭＳ／ＭＳモードの最適分解のために調節し、５μｇ／ｍｌの持続輸注を実施してＭＳモードのプロトン化分子、およびＭＳ／ＭＳモードの約３０％最適衝突エネルギーをもたらして、Ｂ−イオンおよびＹイオンシリーズを生じさせた。
【００８０】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ前に、酵素的タンパク質加水分解産物を周囲温度、１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を脱塩水で１：１００に希釈して、ミリポア水濾過装置（ミリＱ水）を通して濾過した。
【００８１】
［アミノ酸分析］
実施例６または実施例１１に記載されるようにして、ｖａｎ  Ｅｉｊｋら（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１９９３年：６２０：１４３〜１４８頁）に従って、血漿中のアミノ酸プロフィールをＨＰＬＣによって分析した。
【００８２】
米国マサチューセッツ州ミルフォード（Ｍｉｌｆｏｒｄ）のＷａｔｅｒｓからのアミノ酸分析システム操作マニュアルに明記されるＰｉｃｏＴａｇ法に従って、その他のアミノ酸分析を実施した。そのためにサンプルを乾燥させ、フェニルイソチオシアネートを使用して直接に誘導体化した。記載されるようなＨＰＬＣ法を使用して、存在する誘導体化アミノ酸を定量化した。ＴｒｐおよびＣｙｓは通常の酸加水分解中に破壊されるので、特別な方法を使用してこれら２つのアミノ酸を定量化した。加水分解中のＣｙｓ分解を防止するために、最初に過酸化水素を使用してこのアミノ酸をシステイン酸に酸化してから定量化する。トリプトファンの分析は、若干修正したＷａｔｅｒｓの手順に基づいた。この手順では、ペプチド溶液のアリコートを真空下で乾燥させた、次に窒素下において０．２％トリプタミンを含有する４Ｍメタンスルホン酸中で１時間かけて１５０℃で加水分解する。反応生成物は、Ａｌｌｔｅｃｈ  Ａｌｔｉｍａ  Ｃ１８カラムと蛍光検出を装着したＨＰＬＣを使用して、直接定量化する。
【００８３】
［加水分解度］
様々なタンパク質分解混合物とのインキュベーション中に得られる加水分解度（ＤＨ）は、迅速なＯＰＡ試験（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｍ．；Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｄ．；Ｄａｍｂｍａｎｎ，Ｃ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｆｏｏｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｇｒｅｅ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００１年，６６，６４２〜６４６頁）を使用してモニターした。
【００８４】
［ケルダール窒素］
総ケルダール窒素は、フローインジェクション分析によって測定した。ＴＫＮ法カセット５０００−０４０を装着したＴｅｃａｔｏｒ  ＦＩＡＳＴＡＲ  ５０００フローインジェクションシステム、ＳＯＦＩＡソフトウェアを実行するペンティアム４コンピュータ、およびＴｅｃａｔｏｒ  ５０２７オートサンプラーを使用して、タンパク質含有溶液から放出されたアンモニアを５９０ｎｍで定量化した。方法のダイナミックレンジ（０．５〜２０ｍｇＮ／ｌ）に対応するサンプル量を９５〜９７％硫酸およびＫｊｅｌｔａｂと共に消化管に入れ、２００℃で３０分間と、それに続く３６０℃で９０分間の消化プログラムの対象とした。ＦＩＡＳＴＡＲ  ５０００システム中への注入後に窒素ピークを測定し、それから測定タンパク質量を推測し得る。
【００８５】
［加水分解産物中に存在するペプチドおよびタンパク質の分子量分布］
プロテアーゼ処理タンパク質サンプルのペプチド粒度分布の分析は、高圧ポンプ、１０〜１００μＬのサンプルを注入できる注射器、および２１４ｎｍでカラム溶出物をモニターできるＵＶ検出器を装着した自動化ＨＰＬＣシステム上で行った。
【００８６】
この分析で使用したカラムは、２０ｍＭリン酸ナトリウム／２５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０緩衝液で平衡化した、マシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）からのＳｕｐｅｒｄｅｘペプチドＨＲ１０／３００ＧＬであった。サンプル（典型的に５０μＬ）を注入した後、９０分以内に流速０．５ｍｌ／分で緩衝液によってカラムから様々な構成要素を溶出した。システムは分子量マーカーとしてチトクロームＣ（分子量１３５００Ｄａ）、アプロチニン（分子量６５１０Ｄａ）、およびテトラグリシン（分子量２４６Ｄａ）の混合物を使用して較正した。
【００８７】
以下の実施例によって本発明をさらに例証する。
【００８８】
［実施例］
［実施例１］
［鶏卵リゾチームはペプシンまたはトリプシン／キモトリプシンのどちらによっても切断されない］
ヒト胃腸管内における消化吸収率を試験するために、鶏卵リゾチームをペプシンならびにトリプシンおよびキモトリプシン混合物と共に、生体外でインキュベートした。双方のインキュベーションは、胃（ペプシン）および十二指腸（トリプシン／キモトリプシン）に一般的なｐＨ条件下で実施した。このために５％（ｗ／ｗ）リゾチーム溶液を酵素（リゾチームタンパク質に対して１％ｗ／ｗの酵素）と共に、３７℃で２時間インキュベートした。進行中のタンパク質加水分解の結果としての大きなｐＨ変化を防止するために、インキュベーションはＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（添加０．２Ｍクエン酸＋Ｎａ２ＨＰＯ４）中で実施した。成功裡のタンパク質分解は少なくとも１０％のＤＨ値をもたらすことが予期され得るので、３７℃で２時間の加水分解後に得られる低ＤＨ値は（表１参照）、リゾチーム分子が胃および十二指腸および空腸内の消化条件を模倣する条件下で分解され得ないことを実証する。したがって未変化鶏卵リゾチーム分子内に存在するトリプトファン残基は胃腸管内で遊離せず、未変化鶏卵リゾチーム中に存在するトリプトファン分子が、摂取直後の血漿トリプトファンレベルに寄与し得ないことが暗示される。
【００８９】
【表１】
0005626807.tif 000002
【００９０】
［実施例２］
［鶏卵リゾチームは上昇したｐＨ値でサブチリシンによって効率的に切断される］
非生理学的ｐＨおよび酵素条件下における、酵素加水分解に対するリゾチームの感受性を試験するために、アルカリ性ｐＨ条件下でリゾチーム溶液を微生物サブチリシン（ＥＣ  ３．４．２１．６２）と共に生体外でインキュベートした。このために、１グラムのリゾチームタンパク質あたり１２．５μＬのＰｒｏｔｅｘ  ６Ｌ存在下で、５％（ｗ／ｗ）リゾチーム溶液をｐＨ７．０、８．０および９．０でインキュベートした。インキュベーションは１Ｍ  ＮａＯＨを使用してｐＨを絶えず調節しながら、６０℃で３時間にわたり実施した。インキュベーションからは、いかなる顕著な沈殿物もないわずかに濁った溶液が生じた。サブチリシン活性を不活性化する加熱工程後に、材料と方法セクションに記載されるプロトコルに従って様々なインキュベーションのＤＨ値を測定した。生理学的条件下で得られる結果（実施例１参照）とは対照的に、サブチリシンを使用したアルカリ性インキュベーション条件は完全なリゾチーム加水分解をもたらす。ｐＨ７．０のインキュベーションからは６．３のＤＨ、ｐＨ８．０のインキュベーションからは１１．２のＤＨ、およびｐＨ９．０のインキュベーションからは１６．４のＤＨが得られた。引き続く反応生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、リゾチーム分子全体が分解したこと、すなわち大型分子量断片がサブチリシンインキュベーションを乗り切らなかったことを示唆した。さらにダイセル（Ｄａｉｃｅｌ）からのＣｒｏｗｎｐａｋ  ＣＲ＋カラム上での加水分解産物のＨＰＬＣ分析は、ｐＨ９．０での長時間の加熱後でさえ、トリプトファン含有ペプチドの顕著なラセミ化が起きなかったことを明らかにした。
【００９１】
［実施例３］
［Ｐｒｏｔｅｘを使用したリゾチーム加水分解および形成ペプチドのアイデンティティ］
１０％（ｗ／ｗ）純粋リゾチームを含有する溶液をＮａＯＨを使用してｐＨ８．２に調節し、５２℃に加熱した。存在するタンパク質１ｇあたり２５μＬのＰｒｏｔｅｘを添加することで、加水分解を開始した。絶え間なく撹拌してｐＨを８．２に保ったまま加水分解を５．５時間にわたって継続し、目に見える沈殿物のないほぼ透明な溶液を得た。Ｐｒｏｔｅｘ活性を不活性化する加熱工程後、ＤＨ分析のためにサンプルを採取した。溶液のＤＨはほぼ３０％と判明した。加熱処理溶液を１０ｋＤａフィルター上で限外濾過膜して、完全に透明な液体を得た。この透明液体をＬＣ／ＭＳ分析のため、存在するペプチドおよびタンパク質の分子量分布のため、ならびにイオン交換クロマトグラフィーのために使用した。
【００９２】
存在するペプチドおよびタンパク質分子量分布の所見を得るために、材料と方法セクションに記載されるようにして、透明液体に分子粒径分析を行った。得られた結果（図３参照）は、明らかにほぼ全てのペプチドが、５００ｋＤａ未満の分子量を有する芳香族側鎖のあるアミノ酸（すなわちトリプトファン、チロシン、およびフェニルアラニン）を包含することを示唆する。これらのアミノ酸の高分子量を鑑みて、これらの小型ペプチドのほとんどはトリジプチドまたはジペプチドのどちらかのようである。
【００９３】
材料と方法セクションに記載される手順に従って、ＬＣ／ＭＳ分析を実施した。トリプトファン（「Ｗ」）を含有するペプチドを選択することにより、ペプチドＡＷ、ＧＮＷ、ＷＩＲ、ＮＡＷ、ＷＶＡ、ＶＡＷ、ＡＷＲ、ＳＬＧＮＷ、および少量のＷＷおよびＳＲＷＷを検出し得た。インキュベーション後の加水分解産物中の遊離トリプトファンのレベルは、存在する総（リゾチーム）トリプトファンの１％未満であることが確立された。
【００９４】
ジペプチドおよびトリペプチドは腸管壁に存在するペプチド輸送体によって容易に吸収されるので、本リゾチーム加水分解産物の経口摂取時に、このようなペプチド中に存在するトリプトファン残基が迅速に吸収されて血漿トリプトファンレベル増大をもたらすであろうことは、ほとんど疑念がない。
【００９５】
［実施例４］
［加水分解産物のトリプトファン含量を増大させる］
リゾチームは、驚くほど多量の塩基性アルギニンおよびリジン残基を包含する。さらにリゾチーム分子は、かなりの数の酸グルタメートおよびアスパラギン酸残基を包含する。このデータを使用して、高Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比を特色とする加水分解産物に向けた革新的で簡潔な精製経路を考案した。しかしこの精製経路の必須要件は、アルギニンまたはリジン残基またはグルタメートまたはアスパラギン酸残基のいずれかもまた含有するペプチド中に、非常にわずかなトリプトファン残基のみが出現することである。実施例３に示すように、本明細書で使用される特定の加水分解経路は、アルギニン残基を含有するわずかなトリプトファン含有ペプチドのみを生じ、リジン、グルタメートまたはアスパラギン酸残基を含有するペプチドは生じない。
【００９６】
理論はグルタメートまたはアスパラギン酸残基あり、またはなしのペプチド間の最大の電荷の差がおよそｐＨ３に達し得ることを予測する。アルギニンまたはリジン残基あり、またはなしのペプチド間の最大の電荷の差はおよそｐＨ５に達し得る。
【００９７】
このアプローチの選択力を例証するために、実施例３で明記される手順に従ってリゾチーム加水分解産物を調製した。次に酢酸を使用して加水分解産物のｐＨをｐＨ３．１に調節し、２０ｍｍのクエン酸ナトリウムｐＨ３．１で平衡化されたベルギー国ディーゲムのＧＥヘルスケア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｄｉｅｇｅｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍ））からの１５ｍｌカラム床体積のＳＰセファロースＦＦカラムに、およそ０．５グラムのタンパク質を注入した。グルタメートまたはアスパラギン酸包含ペプチドの大部分を除去するための１カラム体積のクエン酸ナトリウム緩衝液でのカラム洗浄後、溶出緩衝液を２０ｍｍクエン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ５．１に変更した。３カラム体積の後者の緩衝液によるカラム洗浄中に、様々なトリプトファン含有ペプチドが溶出された。ＬＣ／ＭＳ分析によればジペプチドＡＷが大量に存在し、ならびにトリペプチドＧＮＷ、ＮＡＷ、ＷＶＡ、ＶＡＷ、および少量のペンタペプチドＳＬＧＮＷも存在した。様々なｐＨ５．１画分のアミノ酸分析は、選択的貯留が１．７５の分子Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比およびほぼ３０％のトリプトファン収率を有する溶液を生じることを示した。選択性がより低い貯留は、０．４の分子Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比および７０％のトリプトファン収率がある溶液を生じる。引き続いてカラムを３×カラム体積の２０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ７．１で洗浄した。ＬＣ／ＭＳデータによれば、この工程はアルギニン含有ペプチドＷＩＲ、ＡＷＩＲ、そして意外にもペプチドＷＷを溶出した。１Ｍ  ＮａＯＨ、水および１Ｍ酢酸を用いたカラムの最終洗浄により、カラムを次の操作のために準備した。
【００９８】
［実施例５］
［ジペプチドＳｅｒ−Ｔｒｐの化学合成］
標準ペプチド技術に従ってジペプチドＳｅｒ−Ｔｒｐを合成した。最初の工程では、無水炭酸法（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６７年，５０１２頁）を通じてＺ−Ｓｅｒ−ＯＨおよびＴｒｐ−ＯＭｅをカップリングし、保護されたジペプチドＺ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−ＯＭｅを得た。このためにはＴｒｐ−ＯＭｅ・ＨＣｌをテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）に懸濁し、引き続いてＮ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）を添加した。混合物を１時間撹拌し、引き続いてテトラヒドロフラン／ジメチルホルムアミド（ＴＨＦ／ＤＭＦ）中のＺ−Ｓｅｒ溶液に添加した。ＮＭＭの第２の化学当量を添加して混合物を−１５℃に冷却した。初期温度が−１５℃を超えないような速度で、イソブチルクロロギ酸を添加した。引き続いて混合物を３時間撹拌し、周囲温度になるまで放置して沈殿したＮＭＭ・ＨＣｌを濾過により除去した。濾液を４℃で一晩保持した後、あらゆる追加的沈殿物を濾過して濾液を真空内で濃縮した。残基をカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２、酢酸エチル／ヘプタン）によって精製した。合わせた画分を濃縮して水洗して、あらゆる残りのＤＭＦを除去して真空内で濃縮した。
【００９９】
第２の工程では、Ａｌｃａｌａｓｅ  ２．５Ｌ  ＤＸ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．１９９０年，５２頁）を使用してＺ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−ＯＭｅの酵素的加水分解を達成し、引き続く触媒性水素化分解により、灰色がかった固体として所望のペプチドを得た。このためには精製Ｚ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−ＯＭｅをｔＢｕＯＨおよび水に溶解し、デンマーク国バウスベアのノボザイムズからのＡｌｃａｌａｓｅ  ２．５Ｌ  ＤＸを添加した。（ほぼ）全ての出発原料が消費されるまで混合物を撹拌した。次に混合物を真空内で濃縮し、残留物をｐＨ７の水に取り込んだ。酢酸エチルを用いて水性混合物を抽出してあらゆる残留出発原料を除去し、引き続いて水相を酸性化した。酢酸エチルを用いて所望の生成物、すなわちＺ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−ＯＨを単離し、抽出物を硫酸ナトリウム上で乾燥させて真空内で濃縮した。
【０１００】
第３の工程では、ジペプチドＳｅｒ−Ｔｒｐ−ＯＨを得た。このためには濃縮Ｚ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−ＯＨをＭｅＯＨおよびｗａｔｅｒ（１：１）に溶解し、Ｐｄ／Ｃを添加して混合物を陽圧水素雰囲気（５バール）下で撹拌した。反応完了時に触媒と生成物の大部分を濾過によって除去し、濾液を廃棄した。フィルターをミリＱ水で徹底的に洗浄して濾液を真空内で濃縮し、白色から灰色がかった固体としてジペプチドＳｅｒ−Ｔｒｐ−ＯＨを得た。生成物をアセトンと水の混合物中で撹拌し、濾過によってペプチドを単離して、追加的精製を達成した。これにより経口摂取に適した製品を得た。
【０１０１】
［実施例６］
［健康なボランティアにおける血漿Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比および気分に対する異なるトリプトファン源の効果］
本研究の目的は、健康なボランティアにおいて、異なるトリプトファン含有製剤の摂取後に、血漿Ｔｒｐ／ＬＮＡＡプロフィールおよび気分について調査することであった。
以下の製剤を試験した。
未変化αラクトアルブミン（材料と方法参照）
加水分解カゼイネート（ＤＨ＞２０％；材料と方法参照）
高Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比のＴｒｐ−濃縮リゾチーム加水分解産物（実施例４参照）
合成ＳＷジペプチド（実施例５）
遊離Ｌ−トリプトファン（材料と方法参照）
【０１０２】
１８人の健康な学生（９人の男性および９人の女性：年齢１８〜３０歳）が研究に参加した。参加者の排除基準は、慢性疾患および現在の疾患、精神医学的または医学的疾患の既往、医薬品または薬物の使用、アルコール摂取（＞２単位／日）、代謝疾患、ホルモン疾患または腸管疾患、および不規則な食生活または逸脱摂食習慣（健康および生活スタイル質問票により評価）であった。実験に参加した被験者は肥満度指数の正常範囲内（２０〜２５ｋｇ／ｍ２のＢＭＩ）にあり、女性被験者は避妊について整合させた。女性は中後期卵胞期（４〜１０日目）に参加し、一方避妊法を使用している女性は実際に避妊ピルを使用した時に参加した。参加者は非喫煙者であり、実験前および実験中にいかなるアルコールも使用していなかった。実験に参加した全ての被験者は、インフォームド・コンセント書に署名した。この研究は２０００年１０月にスコットランドのエディンバラの第５２回世界医師会全体会議（５２ｎｄ  ＷＭＡ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ）で採択された、ＥＣ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ＧＣＰ）（医薬品の臨床試験の実施に関する基準）に従って行った。
【０１０３】
被験者は一晩絶食するように指示され、水または砂糖抜きの茶のみが許された。５回の午前中の実験セッション中、被験者は研究室を訪れて異なるＴｒｐまたはＬＮＡＡ濃度を含有する飲料の摂取に続き、血漿Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ濃度および気分がモニターされた。様々な飲料が提示される順序を均衡させて、４日間の実験日は１週間の間隔で隔てられた。午前中の各実験日に異なるトリプトファン（Ｔｒｐ）またはＬＮＡＡ濃度を含有する３１２ｍｌの飲料が提供された（表２）。 飲料は全て０．１０ｇ甘味料（アセスルファム）を含有し、３１２ｍＬになるまで淡水が添加された。食餌条件を知らない研究助手が、異なる飲料の投与を実施した。
【０１０４】
【表２】
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【０１０５】
摂取前および摂取の１５、３０、６０、９０、１２０、１８０、および２１０分後に、ヘパリンナトリウムを含有する５ｍｌの真空採血管内に血液サンプルを二連で採取して、次に４℃において５０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。得られた上清をイオウサリチル酸（４ｍｇ／１００μＬ）と混合し、分析するまで直ちに−８０℃で保存した。ｖａｎ  Ｅｉｊｋら（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１９９３年：６２０：１４３〜１４８頁）に記載されるようにして、２〜３μｍのＢｉｓｃｈｏｆ  Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ  ＯＤＳ  ＩＩカラムを使用して、ＨＰＬＣを用いて血漿アミノ酸分析を実施した。大型中性アミノ酸バリン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、およびフェニルアラニンの血漿モル濃度濃度の和で血漿モル濃度トリプトファン濃度を除して、血漿Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比を計算した。統計学的分析は一般線形モデル（ＧＬＭ：ＳＰＳＳ  １２．０  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ）を使用して、反復測定多変量および一変量分散分析（ＭＡＮＯＶＡおよびＡＮＯＶＡ）の手段により行った。統計は全て有意水準Ｐ＝０．０５で評価した。
【０１０６】
［血漿Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ値］
血漿Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比に対する被験者内因子としての条件および時間の最初の反復測定分散分析からは、時間および条件の主要な著しい効果、および条件×時間の著しい相互作用が明らかになった。血漿Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比の最大の著しい増大は、「ＳＹＮ」（６０分後に２６３％の増大）および「ＷＥＰＳ」（９０分後に２５５％の増大）を提供した後に見られた（図１参照）。これらの２つの製品の後のＴｒｐ／ＬＮＡＡの増大は「ＴＲＰ」（１２０分後に１９１％の増大）または「ＡＬＡＣ」（１２０分後に６７％の増大）どちらの摂取後よりも、顕著により早くより高かった。「ＲＥＦ」の摂取後、６０分から始まって２１０分（−２７％）までＴｒｐ／ＬＮＡＡに著しい低下があった。
【０１０７】
「ＷＥＰＳ」で見られたＴｒｐ／ＬＮＡＡの２５５％の上昇は、未変化αラクトアルブミンで以前に見られた５０〜７０％の増大（Ｍａｒｋｕｓら，２０００年；Ｂｏｏｉｊら，２００６年）、および炭水化物などのその他の食品で以前報告された２０〜４５％の増大（Ｍａｒｋｕｓ，２００３年）のいずれをもかなり上回る。血漿Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ中の４０〜５０％の変動は、Ｔｒｐのレベルおよび５−ＨＴの合成および脳内放出（Ｍａｒｋｕｓら，２０００年）を変化させるのに十分であると考えられるが、この２５５％の上昇は、利用できる脳Ｔｒｐおよび５−ＨＴにより大きな上昇を引き起こすことが予期され、したがって機能的に活性な脳５−ＨＴの放出増大もまたもたらすかもしれない。
【０１０８】
［気分状態のプロフィール（ＰＯＭＳ）］
「非常にそう思わない」から「非常にそう思う」に及ぶ視覚的アナログ尺度として、気分状態のプロフィール質問票オランダ語短縮版の筆記バージョン（ＷａｌｄおよびＭｅｌｌｅｎｂｅｒｇｈ，Ｎｅｄ  Ｔｉｊｄｓｃｈｒ  Ｐｓｙｃｈｏｌ  １９９０年：４５：８６〜９０頁）を使用して、様々な参加者の気分変化を測定した。ＰＯＭＳは、落ち込んだ気分状態を指す、怒り、抑うつ、疲労、および緊張から前向きな気分に関わる活気に及ぶ、気分のための５つの異なる下位尺度を含んでなる。
【０１０９】
総気分スコアに対する、被験者内因子としての条件および時間の反復測定分散分析からは、時間の有意な効果および条件×時間の有意な相互作用が明らかにされ、経時的気分変化が条件間で顕著に異なることが示唆された。「ＷＥＰＳ」および「ＴＲＰ」摂取の６０分後に比較できる気分改善が見られたが、「ＷＥＰＳ」のみが摂取の２１０分後まで「ＴＲＰ」と比較して気分をさらに改善した。対照的に「ＲＥＦ」および「ＡＬＡＣ」摂取後には、気分変化は見られなかった。未変化αラクトアルブミン後の気分効果の不在は、急性ストレス曝露下のストレスを受けやすい被験者のみにおいて、未変化αラクトアルブミン後に気分に対する軽度の有益な効果が示された以前の研究と比較できる（Ｍａｒｋｕｓら，２０００年；Ｍａｒｋｕｓら，２０００年，Ｍａｒｋｕｓ，２００３年）。気分は「ＳＹＮ」摂取後にもまた改善するように見えたが、この効果はこの実験的設定では有意でなかった。
【０１１０】
本結果は、正常なストレスを受けにくい被験者では、血漿Ｔｒｐ／ＬＮＡＡの２５５％の大きな増大が改善された気分には十分かもしれないことを示唆する。以前の研究結果に基づいて、気分に対するこれらのＴｒｐ強化リゾチーム加水分解産物の有益な効果は、高い精神的ストレス条件下にあるストレスを受けやすい被験者において、さらに大きいことが予期される（Ｍａｒｋｕｓ，２００３年）。本出願人の予期に反して、合成ジペプチドの摂取後に気分の顕著な改善はなかった。この意外な結果は、現行の実験的設定に、またはこれらの様々な原料からのトリプトファンの生物学的利用能の違いに起因するかもしれない。
【０１１１】
【表３】
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【０１１２】
【表４】
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【０１１３】
［実施例７］
［大規模なリゾチーム加水分解］
大規模リゾチーム加水分解手順は、小さな修正を加えて本質的に実施例３で記載される手順に従った。７．３％（ｗ／ｗ）の純粋リゾチームを含有する溶液を６５℃に加熱した後、ＮａＯＨを使用してｐＨをｐＨ８．２に調節した。乾燥物質１ｇあたり２５μＬのＰｒｏｔｅｘ  ６Ｌを添加することにより、加水分解を開始した。連続撹拌しながらｐＨを８．２に温度を５３℃に保ちながら、加水分解を２時間継続した。次にｐＨ値を９．０に増大させてインキュベーションをさらに３．５時間続行し、いくらかの沈殿物がある溶液を得た。次に溶液のｐＨを４．５に低下させて、溶液を４℃未満に冷却した。完全に透明な製品を得るために、液体をＺ  ２０００フィルター（Ｐａｌｌ）上で濾過し、引き続いてナノ濾過を通じて過剰な水と塩を除去した。次に得られた濃縮物に１２０℃で７秒間のＵＨＴ処理を施し、蒸発させて最後に噴霧乾燥し、乾燥形態のリゾチーム加水分解産物を得た。このようにして得られた製品は約０．１９のモル濃度Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比を有する。
【０１１４】
［実施例８］
［リゾチーム加水分解産物を組み込んだ飲料を調製する］
以下のレシピは、無脂肪リゾチーム加水分解産物含有イチゴ飲料の調製を例証する。１０グラムのリゾチーム加水分解産物粉末（実施例７に従って調製した）に、４０グラムのグルコース、２．４グラムのクエン酸、０．３８グラムのリンゴ酸、０．１５グラムのスクラロース、およびオランダ国ザーンダム（Ｚａａｎｄａｍ）のＢｕｔｅｒｅｓｓｅｎｃｅからの０．５グラムのイチゴ香料を添加した。この粉末混合物は１Ｌの水に容易に溶解して、高Ｔｒｐ／ＬＮＡＡおよび高Ｔｙｒ／ＢＣＡＡ比の即席飲料が得られる。粉末混合物は、例えば小袋充填に適する。様々な既知の技術を使用した、包装された液体製品も製造し得る。
【０１１５】
［実施例９］
［ストレスを受けやすいおよびストレス抵抗性の健康なボランティアにおけるストレス後能力に対するリゾチーム加水分解産物の効果］
本研究の目的は、血漿Ｔｒｐ／ＬＮＡＡレベルおよびストレス能力後課題に対するその帰結の観点から、実施例７に記載される手順に従って調製されたリゾチーム加水分解産物の効果をプラセボ（カゼインタンパク質加水分解産物；実施例６参照）と比較することであった。使用された能力試験は、個人の「覚醒状態」および「眼・運動制御」の側面に対処することが知られている。
【０１１６】
内２０人が男性で２０人が女性である４０人の個人が、本研究に参加した。予備試験質問票に基づいて、このグループの半数をストレス抵抗性に、残りの半分をストレス感受性に分類した。個人の算入および排除基準ならびに一般研究法は、実施例６に記載したのと同じであった。研究デザインの流れ図を図４に示し、典型的な実験日の概略を図５に示す。
【０１１７】
実験日の午前中に、絶食した被験者が研究室に到着した。到着時に、彼らはリゾチーム加水分解産物含有飲料、またはプラセボ、すなわちカゼイン加水分解産物含有飲料のどちらかの飲料を与えられた。試験飲料およびプラセボ飲料の組成を表５に概説する。
【０１１８】
【表５】
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【０１１９】
３００ｍｌの飲料摂取の９０分後、血液サンプルを採取してＴｒｐ／ＬＮＡＡ比を評価した（実施例６参照）。引き続いてストレス抵抗性群またはストレス感受性被験者群のどちらかに能力試験を実施して、引き続いてストレスに曝した。このストレスは騒音刺激下で実施されなくてはならない算術課題からなった。被験者は騒音の存在または不在が、試験における彼らの能力に左右されると信じ込まされた。実際には算術課題は、全ての被験者が各試行で失敗するように操作された。この設定は心理学的ストレスを誘発することが知られており、高度に抑制不能であることが認識されている（Ｐｅｔｅｒｓ，Ｍ．Ｌ．，Ｇｏｄａｅｒｔ，Ｇ．Ｌ．Ｒ．，Ｂａｌｌｉｅｕｘ，Ｒ．Ｅ．ら  （１９９８年）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃａｔｅｃｈｏｌａｍｉｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ストレス：ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｍｅｎｔａｌ  ｅｆｆｏｒｔ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｉｌｉｔｙ．Ｐｓｙｃｈｏｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．２３，１〜１７頁）。算術課題の後、最初の能力試験を反復し、作用中の血液Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比の影響下における能力に対するストレスの効果を定量化した。
【０１２０】
実施された能力試験は、Ｍａｃｋｗｏｒｔｈ時計試験（Ｍａｃｋｗｏｒｔｈ，Ｎ（１９４８年）Ｔｈｅ  ｂｒｅａｋｄｏｗｎ  ｏｆ  ｖｉｇｉｌａｎｃｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｖｉｓｕａｌ  ｓｅａｒｃｈ．Ｑｕａｒｔ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｐｓｙｃｈ．１，６〜２１頁））およびクリティカルトラッキング課題（Ｊｅｘ  ＨＲら，（１９６６年）  Ａ  “ｃｒｉｔｉｃａｌ”ｔｒａｃｋｉｎｇ  ｔａｓｋ  ｆｏｒ  ｍａｎ−ｍａｃｈｉｎｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｏｐｅｒａｔｏｒ’ｓ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｅｌａｙ  ｔｉｍｅ．ＮＡＳＡ  Ｃｏｎｔｒａｃｔ  Ｒｅｐ  ＮＡＳＡ  ＣＲ．：１〜１０５年）であった。
【０１２１】
Ｍａｃｋｗｏｒｔｈ時計試験は長時間にわたる「覚醒状態」、俊敏さ、および集中力を測定するために広く使用される試験である。被験者は、時計の秒符号をシミュレートする６０個のドットの円形配置を表示するコンピュータスクリーンの前に座る。ドットは時計回りに、５００ｍｓあたり１回の速度で一時的に明るくなる。通常、回転は単一（１ドット）ジャンプで進む。被験者は、まれに不規則な間隔で、通常の順序のドットの１つを飛ばすことにより、標的がダブル（２ドット）ジャンプして進むと知らされる。この際被験者は、できるだけ迅速にボタンを押すように促される。４５分間の試験中に、合計３０回のこのような機会が提示される。連続する１５分毎に、８秒間から７．２分間に及ぶ間隔で１０回の機会が生じる。
【０１２２】
クリティカルトラッキング課題は、一次代償性知覚・運動協調課題において、表示されるエラーシグナルを制御する能力を測定する知覚・運動能力課題として使用される。この課題中、被験者は敏感なジョイスティックを使用して、コンピュータスクリーン上の不安定なカーソルを制御しなくてはならない。エラーは、水平な均等目盛上の中点からカーソルの水平の逸脱として出現する。被験者は継続してジョイスティックを代償的に動かすことで、不安定なカーソルを軸の中央に保ち、逸脱を低下させてそれがゼロになるよう試みなくてはならない。カーソル逸脱の頻度は、時間の一次関数として確率論的に増大し、したがって被験者は次第に高頻度に代償的な動きを要求される。また被験者の代償性応答は、位相遅れの増大と共に頻度が増大し（応答はエラーを減少せずむしろエラーを増大させ）、必然的に制御は失われる。被験者が制御を失う頻度が、クリティカル頻度である。試験を５回実施して、この試験の従属変数として、最低および最高スコアなしで平均クリティカル頻度を計算した。
【０１２３】
飲料摂取の９０分後に測定された血漿Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比からは、適用される実験条件における血漿Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比変化に対する有意な影響（Ｐ＜０．０００１）が明らかになった。リゾチーム加水分解産物（「Ｔｒｐ−ｈｙｄｒ」）摂取は血漿Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ値を０．２５μｍｏｌ／ｌに増大させた。カゼイン加水分解産物（「ｐｌｃ」）の摂取は、Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比を０．０８μｍｏｌ／ｌ（図６）に増大させた。関連アミノ酸の各値を表６に提供する。
【０１２４】
【表６】
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【０１２５】
カゼイン加水分解産物の摂取後、Ｍａｃｋｗｏｒｔｈ時計試験を受けた双方の被験者群の能力は、ストレスに曝されることにより顕著に損なわれた。しかしＴｒｐに富むリゾチーム加水分解産物の摂取は、ストレス抵抗性群においてこのような能力低下を予防した。かなり意外なことにＴｒｐに富む加水分解産物は、ストレス感受性群においてこのような能力低下を予防しなかった。得られたデータを図７に示す。
【０１２６】
クリティカルトラキング課題では、λＣＴ値は被験者が到達した複雑さの最終レベルを示す。λＣＴ値が高いほど制御がより良い。本実験で得られるデータは、ストレスへの曝露後Ｔｒｐに富む加水分解産物を摂取した場合、λＣＴ値が顕著により高かったことを示す。ストレス抵抗性個人では、プラセボ処置と比較して１６％の増大が記録できた。かなり意外にも、この試験でもまたストレス感受性群のλＣＴ値は、Ｔｒｐに富む加水分解産物とプラセボの間で有意差を示さなかった。
【０１２７】
［実施例１０］
［リゾチームおよびαラクトアルブミンのプロテアーゼ抵抗性］
βラクトグロブリンと共に、αラクトアルブミンは乳清の主要タンパク質構成物を形成する。その高Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比のために、単離されたαラクトアルブミン画分ならびにαラクトアルブミン加水分解産物は、血漿トリプトファンレベルを高めるために人気が高まっている。αラクトアルブミンおよび鶏卵リゾチームはどちらも極めて高いＴｒｐ／ＬＮＡＡ比を有するが、その他の点ではこれらの２つの分子はかなり異なる。本明細書によれば、高Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比があるペプシン抵抗性分子は、高血漿Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比を長期にわたり維持するために必須である。ここで本出願人は、鶏卵リゾチームとは異なり、αラクトアルブミンがペプシン抵抗性でないことを実証する。これは以下の実験で例証された。ヒト胃内の条件を模倣するために、５％（ｗ／ｗ）のリゾチームおよびダビスコ（Ｄａｖｉｓｃｏ）からの乳清タンパク質（Ｂｉｐｒｏ）の溶液をペプシン（リゾチームまたは乳清タンパク質に対して１重量％のペプシン（シグマ））と共に、ＭｃＩｌｖａｉｎｅ緩衝液（０．２Ｍクエン酸＋Ｎａ２ＨＰＯ４）中においてｐＨ４、３７℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、双方の溶液を８０℃で５分間加熱して反応を終結させ、少量のサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて（材料と方法参照）、様々なペプシン処理分子の完全性を試験した。
【０１２８】
図９は、酸性ｐＨ条件下において未変化鶏卵リゾチームの量が、ペプシンとのインキュベーションによって顕著に減少しないことを明らかに示す。乳清タンパク質βラクトグロブリンおよびαラクトグロブリンの内、βラクトグロブリンはほとんど未変化のままであるが、αラクトアルブミンはほぼ完全に分解される。材料と方法セクションで明記される試験に従って、リゾチームならびにβラクトグロブリンが「プロテアーゼ抵抗性」であり、αラクトグロブリンが「プロテアーゼ抵抗性」でないことが暗示される。この研究結果は、リゾチームとは異なりαラクトアルブミンが適切なポリペプチド結合トリプトファン源として適格でないことを例証する。βラクトグロブリンはペプシン分解に対してかなり抵抗性であるという事実にもかかわらず、その非常に低いＴｒｐ／ＬＮＡＡ比（０．０４）のために分子は適切なトリプトファン供与体でない。
【０１２９】
［実施例１１］
［リゾチーム加水分解産物と未変化分子を組み合わせることで高Ｔｒｐ／ＬＮＡＡレベルを延長させる］
ペプチド結合およびポリペプチド結合トリプトファン組成物併用の利点を実証するために、１５人の健常人が参加する研究を実施した。排除基準は次のとおりであった。研究者の自由裁量で慢性および現在の病気；精神障害の既往；選択的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）の使用；トリプトファン、エフェドリン、またはセイヨウオトギリソウを含有する栄養補給剤などの中枢神経系を標的とする栄養補給剤の使用；卵アレルギー；薬物濫用；同時に治験薬または市販品が関与するあらゆるその他の研究への参加；人工甘味料不耐性；研究者の自由裁量で胃腸の機能を妨げるあらゆる（既往）胃腸疾患；制酸薬などの胃腸管標的とする医薬品の使用。最後に女性では妊娠または医学的に認められない避妊法の使用もまた排除基準である。
【０１３０】
全ての実験参加被験者は、インフォームド・コンセント書に署名した。
【０１３１】
［手順］
異なる処置の受け入れ間に少なくとも３日間の休薬期間を設けて、無作為化二重盲検交叉デザインに従って実研究を施した。
【０１３２】
３日間の実験日の午前中のセッション中に、被験者は研究室を訪ねて、６グラムの未変化リゾチーム、６グラムのリゾチーム加水分解産物または６グラム加水分解産物および未変化製品混合物を含有する飲料の摂取に続いて、血漿Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ濃度がモニターされた。飲料はストロー付きボトル内の無菌製品として提供された。未変化リゾチームはＤｅｌｖｏｚｙｍｅ  Ｇとして得た。実施例７に記載されるようにして加水分解産物を調製し、混合物は加水分解産物として３０モル％のＴｒｐ、未変化リゾチームとして７０モル％のＴｒｐを包含した。全ての飲料は６グラムのリゾチーム由来タンパク質、０．１０ｇの甘味料（アセスルファム）を含有して、３００ｍＬの飲料になるまで淡水が添加された。食餌条件を知らない研究助手が、異なる飲料の投与を行った。
【０１３３】
被験者は少なくとも８時間絶食して、午前８〜９時の間に研究施設を訪れた。採血のための可撓性のカニューレを被験者の利き手でない方の前腕に挿入した。３種の実験的飲料の１種の摂取後、血液サンプルを摂取前（ｔ＝０）およびｔ＝１５、３０、６０、９０、１２０、１８０、２１０、および２４０分後に採取して、血漿Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比を測定した。この２４０分間は、水以外のいかなる食品または飲料の摂取も禁止された。
【０１３４】
［血漿測定］
リチウムヘパリン血液管内におよそ５ｍｌの血液を採取し、振って即座に氷上にのせた。サンプルを引き続いて遠心分離し、７５０μｌの血漿を５−ＳＳＡ（４ｍｇ／１００ｍｌ血漿）と混合した。
【０１３５】
これらの溶液を１３．０００ＲＰＭで５分間遠心分離して、２０μｌの上清に４０μｌの内部基準を添加した（２Ｌの１．２ｍＭ  ＨＣｌ中の１６０ｍｇのαアミノアジピン酸）。５０μｌのホウ酸塩緩衝液（Ｗａｔｅｒｓ  ＡｃｃＱ．Ｔａｇキット商品番号１８６００３８３６に含まれる）、４０μｌの０．４Ｍ  ＮａＯＨ、および２０μｌの試薬（ＷａｔｅｒｓＡｃｃＱ．Ｔａｇキット商品番号１８６００３８３６に含まれる）を添加して混合し、５５℃で１０分間加熱した。引き続いてカラムに１μｌを注入し、ｖａｎ  Ｅｉｊｋら（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１９９３：６２０：１４３〜１４８頁）に記載されるようにして分析を進めた。
【０１３６】
［結果］
３種の異なる処置における時間の変数としての血漿Ｔｒｐ／ＬＮＡＡ比を図１０に示す。３種の処置は全てＴｒｐ／ＬＮＡＡ比の増大を生じた。リゾチーム加水分解産物の摂取に続いて、最速（１５分以内）および最も急激な増大が観察された。未変化リゾチームははるかにより緩慢なＴｒｐ／ＬＮＡＡ比の増大を生じたが、経時的なＴｒｐ／ＬＮＡＡ比の低下もまた、はるかにより緩慢であった。未変化および加水分解リゾチームの混合物からは、中間の結果が生じた。
【０１３７】
「反復測定」分析では、３種の処置は時間相互作用で全て顕著に異なる処置を示し（Ｐ＜０．００１）、３つの曲線が全て顕著に異なる形を有することが示唆される。３種の製品が全て全く同じ「曲線下面積」値を生じることは注目に値し、リゾチーム加水分解産物および未変化リゾチームのどちらも完全に消化されて、血液に取り込まれることが示唆される。
【０１３８】
［実施例１２］
［リゾチーム加水分解産物と未変化リゾチームとを合わせると最終製品の味を改善する］
リゾチーム加水分解産物と未変化分子を混合すると、最終製品の味覚の印象にかなりの変化が起きることが気付かれた。以下の加水分解産物と未変化分子との比は、２００ｍｌの水あたり４グラムの最終濃度で調製された。
１００％リゾチーム加水分解産物
７０％リゾチーム加水分解産物  ３０％リゾチーム
５０％リゾチーム加水分解産物  ５０％リゾチーム
３０％リゾチーム加水分解産物  ７０％リゾチーム。
【０１３９】
これらの全ての組み合わせで、トリプトファンのモル最終濃度は全く同じであった。実施例７に記載されるようにして加水分解産物を調製し、未変化リゾチームはＤｅｌｖｏｚｙｍｅ  Ｇ顆粒製品を使用した。
【０１４０】
加水分解産物それ自体の味がわずかに苦い一方、非加水分解製品を添加することでこの苦味を次第にマスクして、長引くわずかな甘味の印象でそれを相殺する。味覚に関して熟練した試験パネルは、純粋加水分解産物よりも加水分解産物／未変化リゾチーム混合物を好んだ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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