(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リガンドを、前記リガンドで標識化されるポリペプチド分子に間接的に結合させるための方法であって、
単一混合物中で、骨格分子であって、少なくとも一つのリガンド分子が付着しているものを、標識化されるポリペプチド分子、およびチオール生成剤であって、少なくとも一つのチオール基が前記チオール生成剤の作用によって前記ポリペプチド分子上にその場で形成されるチオール生成剤に接触させるステップを含み、前記骨格分子が、前記骨格分子と前記標識化されるポリペプチド分子間の結合を形成するために、前記標識化されるポリペプチド分子上に形成されるチオール基と反応する少なくとも一つ以上の基を有し、その結果、前記リガンド分子を前記標識化されるポリペプチド分子に間接的に結合させ、
（ａ）前記チオール生成剤は少なくとも一つの硫黄原子を含み、前記標識化されるポリペプチドと反応して前記標識化されるポリペプチド分子上に共有結合チオール基を形成する分子であって、前記チオール基は前記チオール生成剤によって供与される硫黄原子を含み、
（ｂ）前記骨格分子がポリペプチド、アミノ化デキストラン、チオール化ポリマー、活性化ポリエチレングリコール、デンドリマー、および活性化ビーズよりなる群から選択されるポリマーまたはナノ粒子ポリマーを含み、
（ｃ）前記リガンド分子は前記骨格分子よりも小さい、
方法。
【請求項２】
前記骨格分子と前記標識化されるポリペプチド分子との反応前に、少なくとも一つのリガンド分子を前記骨格分子に付着させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リガンド分子が前記骨格分子に共有結合的に付着している、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記リガンド分子が化学量論的に過剰な骨格分子に接触している、請求項２または請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記リガンド分子が前記骨格分子と反応する能力に関して一価である、請求項２，３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記リガンド分子が前記骨格分子上に存在するアミン基と反応する、請求項２〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記リガンド分子がＮ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体、イソチオチアネート誘導体、トリアジン、スルホニルクロリド、アシルアジド、ハロゲン化アリール、およびアルデヒド、テトラフルオロフェニルエステルまたはイミドエステルを含む、請求項２〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記リガンド分子が蛍光色素分子、発色団、ビオチン、アビジン、金属イオンキレート剤、光反応性基、ヨウ素化可能部分、光増感剤、消光剤、ペプチドおよび低分子量薬剤よりなる群から選択される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記リガンド分子が、前記骨格への付着前に、１ｋＤ未満の分子量を有する、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記リガンド分子が、前記骨格への付着前に、０．６ｋＤ未満の分子量を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記骨格分子が、前記方法の実施前に、複数の求核基を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記骨格分子が、前記方法の実施前に、複数の遊離アミン基を含む、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記骨格分子が、前記リガンド分子の付着前に、少なくとも５ｋＤの分子量を有する、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記骨格分子が、前記リガンド分子の付着前に、少なくとも１０ｋＤの分子量を有する、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記骨格分子が、前記リガンド分子の付着前に、少なくとも２０ｋＤの分子量を有する、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記骨格分子がオボアルブミン、デキストランまたは誘導化デキストランを含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記チオール生成剤が２−イミノチオラン塩酸塩を含む、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
前記標識化されるポリペプチド分子が酵素、抗体または抗原結合断片または抗体の変異体を含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも一つのリガンド分子の付着の前または後に、前記骨格分子を１つ以上の活性化試薬に接触させるステップを含み、前記活性化試薬は前記骨格分子と反応して、前記標識化されるポリペプチド分子上のチオール基に対して反応性を有する１つ以上の基を形成する、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記活性化試薬がヘテロ二官能性である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記活性化試薬が前記骨格分子上に存在するアミン基と反応する、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記活性化試薬がＮ−ヒドロキシスクシンイミド誘導体を含む、請求項１９〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記活性化試薬が、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン
−１−カルボン酸塩（“ＳＭＣＣ”）、ｍ−マレイミドベンゾイル−ヒドロキシスクシンイミドエステル（“ＭＢＳ”）、スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノ安息香酸塩（“ＳＩＡＢ”）、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、スクシンイミジル６−（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサン酸塩（“ＳＩＡＸ”）、スクシンイミジル４−（（（ヨードアセチル）アミノ）メチルシクロヘキサン−１−カルボン酸塩（“ＳＩＡＣ”）、およびこれらのスルホン酸化誘導体を含む群から選択される、請求項１９〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記リガンド分子が、前記リガンド分子を前記骨格分子に付着させるために、前記骨格分子上に存在する部分と反応する求核基を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記リガンド分子がアミン基を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記骨格分子が前記リガンド分子と反応する１つ以上のアルデヒド基を含む、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記間接的結合反応を終止させるために、グリシンとチオールを前記反応混合物に加えるステップをさらに含む、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記グリシンと前記チオールが、２５から１００ｍＭでｐＨが２．０〜２．６のグリシンと、５から２５ｍＭのチオールとを含む混合物として加えられる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれかに記載の方法の実施において使用するためのキットであって、前記キットは骨格分子と、本発明に係る方法を実施するための説明書とを含み、
前記骨格分子は少なくとも一つのリガンド分子が付着し、前記骨格分子と標識化されるポリペプチド間の結合を形成するために、前記標識化されるポリペプチド分子上に形成されるチオール基と反応する少なくとも一つ以上の基を有し、ポリペプチド、アミノ化デキストラン、チオール化ポリマー、活性化ポリエチレングリコール、デンドリマー、および活性化ビーズよりなる群から選択されるポリマーまたはナノ粒子ポリマー含む、キット。
【請求項３０】
チオール生成剤をさらに含む、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
前記チオール生成剤が２−イミノチオラン塩酸塩を含む、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
緩衝剤、１つ以上のリガンド分子、１つ以上の活性化試薬および１つ以上の標識化されるポリペプチド分子のうち、１つ以上をさらに含む、請求項２９〜３１のいずれかに記載のキット。
【請求項３３】
前記キットの少なくとも一つの試薬成分が、凍結乾燥形態および／または複数の一定分量として存在する、請求項２９〜３２のいずれかに記載のキット。
【請求項３４】
骨格分子組成物を含み、前記組成物が前記組成物中のそれぞれの骨格分子に付着した公知の平均数のリガンド分子を有する、請求項２９〜３３のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は分子を間接的に標識化する方法、前記方法において有用な試薬およびキット、ならびに前記方法で製造される共役物に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体分子をラベルと共役させる必要性が、生物科学の研究、診断および医薬の領域において存在する。生体分子に付着するラベルは、蛋白質（たとえば、酵素、蛍光性蛋白質、ストレプトアビジン）、オリゴヌクレオチドおよび小分子リガンド（ＳＭＬｓ；ｓｉｎｇｕｌａｒ  ＳＭＬ）で通常分子量が１０００未満のもの（たとえば、ビオチン、蛍光顔料、金属イオンキレート、光反応性基、ヨウ素化可能分子、感光性物質、消光剤、短ペプチドおよび医薬）を含む。常にではないが、通常共役反応に用いられるＳＭＬｓは、ＳＭＬが生体分子に付着するのを促進する反応（しばしばアミン反応［ＡＲ］）基を有する。たとえば、フルオロセインは通常イソチオシアネート誘導体（ＦＩＴＣ；フルオロセインイソチオシアネート（fluorescein  isothiocyanate））またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）誘導体を用いて導入される。
【０００３】
共役反応で用いられる活性化ＳＭＬｓの大半はＮＨＳエステルであり、それはたとえば生物学的ｐＨにおいて容易にアミンに結合するという、多くの魅力的な特性を有する。これは強力で不可逆的なアミド結合を生じる。不利なことに、ＮＨＳエステルは保存中に分解しやすく、これは特に水分が製品に入ったときに起こりやすく、そして水溶液中では加水分解しやすい。ＳＭＬは反応性部分に関して一価であるため、いずれかの反応性基の欠如は共役反応に関与できるＳＭＬの割合を減少させる。保存時の分解の可能性のため、および両立しない加水分解反応のために、一般的に相当に過剰なモル濃度のＳＭＬが用いられている。多数の生体分子が複数のアミン官能基を有しているため、試験的実験は通常、条件を最適化し過剰な標識化を避けるために、モル濃度割合を変化させて、および／または反応時間を変化させて小規模で実施される。最終的には、相当に過剰なＳＭＬを使用する必要性から、多量の非共役ＳＭＬおよび／または加水分解物が最終製品を不純物化することが避けられず、共役物の精製が必要となるだろう。
【０００４】
ＮＨＳエステルが直面するいくつかの問題を回避する代替的な化学反応は、チオール介在型の分子共役を含む。チオール反応性（ＴＲ）ＳＭＬｓは比較的安定であるが、商業的な入手可能性がより制限されており、多数の生体分子が固有の遊離チオールを欠如しているため、ＴＲ−ＳＭＬｓは共役反応において使用される頻度がより少ない。チオールを生体分子に導入する方法は知られているが、チオール基を付加する操作は通常共役プロセスを技術的により複雑にする。商業的に入手可能なＳＭＬｓに見られる、チオール基と反応する官能基は、マレイミド、ヨードアセチル、ブロモアセチル、アジリジン、エポキシド、アクリロイル、およびチオールジスルフィド交換試薬（たとえば、ピリジルジスルフィド）を含む。
【０００５】
本発明は特に、反応性ＳＭＬｓ、特にＮＨＳエステル、および反応性官能基に関して一価である他のＳＭＬｓに関連する少なくともいくつかの問題を巧みに回避する共役物の製造方法に関する。これらの方法は、以下により十分に記載される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
典型的には、本発明において、一つ、二つまたはそれ以上の反応性ＳＭＬｓでそれぞれ限定された容量のものが、複数の求核基を有する大きな骨格分子の溶液と好適な条件下で接触する。これらの基は同じタイプまたは多種のタイプであり得る。モル濃度の点からは、求核基はＳＭＬｓよりかなり過剰に存在し、求核基のある割合のみが反応する。残りの基は、したがって、複数の場所で、多数のチオール反応性（ＴＲ）官能基を骨格に付着させる他の分子（“活性化剤”）と接触する。得られた活性化ＳＭＬ-骨格分子共役物は、平均０−ｎ個のＳＭＬｓ（ｎは＞０の数字）を含み、ＴＲ官能基に関しては多価である。ポリ−ＴＲ骨格分子は脱塩または分離によって精製し、その後生体ｐＨに近いｐＨにおいて２−イミノチオラン塩酸塩の存在下で、アミン官能基を有する分子または生体分子（たとえば抗体）と架橋される。２−−イミノチオラン塩酸塩はその場で、骨格分子に共役をもたらすのに必要なチオール基を生体分子上に作る（国際公開第２００７／０６８９０６号パンフレット参照)。
【０００７】
第一の観点において、本発明は小分子リガンドを、前記リガンドで標識化される分子に間接的に結合させるための方法であって、
骨格分子であって、少なくとも一つの小分子リガンドが付着しているものを、標識化される分子に接触させるステップを含み、前記骨格分子と前記標識化される分子との間の結合を形成するために、前記骨格分子が前記標識化される分子上に存在するレシーバー部分、またはその場で形成されるレシーバー部分と反応性を有し、その結果、前記小分子リガンドが前記標識化される分子に間接的に結合する、方法を提供する。一つ（または複数の）小分子リガンド、骨格分子および標識化される分子の結合された組み合わせは、一般的に“共役物”と示される。
【０００８】
好ましくは、骨格分子が標識化される分子上に存在するレシーバー部分、またはその場で形成されるレシーバー部分と反応性を有する複数の基を含む。好ましい実施の形態において、骨格分子が、標識化される分子上に存在するチオールレシーバー部分、またはその場で形成されるチオールレシーバー部分と反応する１つ以上（好ましくは複数の）のチオール反応性（“ＴＲ”）基を含む。
【０００９】
好ましい一実施の形態において、レシーバー部分は、少なくとも一つの硫黄原子を含み、標的化される分子上に共有結合スルフヒドリル、またはチオール基を形成するために標識化される分子と反応するチオール生成剤（“ＴＧ”）の作用によって形成される標識化される分子として形成され、前記スルフヒドリル基はチオール生成剤によって供与された硫黄原子を含む。チオール化反応は、典型的にはアミン（特に一級アミン）またはヒドロキシル基のような求核基のチオール化を含む。標識化される分子のチオール化は、その場で国際公開第２００７／０６８９０６号パンフレットに記載された技術を用いて実施するのがもっとも便利である。好ましいＴＧは、２−イミノチオラン塩酸塩（２−ＩＴ）（Ｔｒａｕｔ‘ｓ社の試薬として知られている）であり、これはたとえばポリペプチド（間接的に標識化される分子が通常含む）に存在するアミン基と反応できる。２−ＩＴは完全な可溶性であり、一級アミンとｐＨ７から１０の範囲で反応する。従来の共役物形成反応においては、２−ＩＴは約ｐＨ８で使用され、この条件下では２−ＩＴは効率的かつ迅速に一級アミン、たとえばペプチド、ポリペプチドおよび蛋白質に存在するリジン残基、と反応する。一級アミンとの反応のために、２−ＩＴは従来の値であるｐＨ８よりも低いｐＨで反応するのが好ましいことが現在分かっている。したがって、２−ＩＴを使用する際は、共役反応は好ましくはｐＨ８よりも低いｐＨ、好ましくはｐＨ７．８、より好ましくはｐＨ７．７未満で行われることが好ましい。好ましいｐＨの範囲は７．０−７．５である。チオールと、様々な種類のチオール反応性基との反応は、ｐＨ６．５から７．５の間で効率的に行われることから、競合する加水分解反応が望ましくない遊離チオールを産生する高ｐＨで２−ＩＴを使用するのは望ましくない。さらに、チオール反応性基は、一般的なマレイミド官能基の場合のように、塩基性ｐＨで加水分解反応を受けやすく、またはチオールへの選択性の減少を示すだろう。
【００１０】
チオール化ステップで使用する好適な緩衝液はリン酸緩衝液であり、特にリン酸ナトリウム、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、重炭酸塩および他の緩衝液であってチオール生成剤と反応しないもの、またはＴＧと標識化される分子上の官能基との反応速度に比べて相対的に遅い速度で反応するものが好適である。したがって、リストは適切に遅い速度で反応するアミン含有緩衝液を含むことができる。
【００１１】
最終的な共役反応混合物は、塩（たとえばＮａＣｌ）および他の無機または有機成分であって、直接的に反応に関与しないが、成分を安定化する好適な環境を提供したり、または他の方法で所望の反応を促進したり、たとえば容器の表面での損失を最小化するものを含むことができる。
【００１２】
ＴＧは反応性であるため、共役混合物中の他の求核基と反応可能である。水は弱い求核基であるが、高濃度で典型的に存在し、特にｐＨ７を超えたｐＨ値では、標識化される分子と共有結合しないチオール濃度を上昇させる。
【００１３】
好ましくはＴＧはほとんど、または全く遊離チオール基を含まず、好適な水準はモル濃度の観点から５％未満、好ましくはモル濃度の観点から３％未満、より好ましくはモル濃度の観点から１％未満である。
【００１４】
商業的供給源から得られる２−ＩＴはかなりの量の遊離チオールを含み、遊離チオールは保存期間にわたっても産生される。遊離チオールは、標識化される分子上に骨格分子上のチオール反応性基のために形成されたものと競合し、そのため共役効率を低下させる。２−イミノチラン塩酸塩の場合は、ある供給者は遊離チオールの混入は’最大５％まで’と述べている。本明細書で記載される実施に用いられるバッチは、モル濃度の観点から約１％のチオール含有率と測定された。
【００１５】
反応物のモル比率は、ＴＧ中に存在する可能性のある少量の遊離チオールが共役効率に大きな影響を与えないように、慎重に選択することが好ましい。
【００１６】
２−ＩＴは、チオールまたは保護化チオールを導入するために使用されるほとんどの分子よりも好適であり、大きな過剰モル濃度を使用する必要がない。ＮＨＳ基を有するいくつかのアミン反応性ヘテロ二官能性試薬は、水溶液中での半減期が短く、迅速な加水分解を補うために大きな過剰モル濃度で使用される。典型的には、ＴＧは適度な過剰量で用いられ、たとえば、標識化される分子中の全ての分子がチオール化されるように、標識化される分子上に存在する、たとえばアミンのような関連する化学官能基よりも１０倍量である。しかしながら、好適なＴＧ濃度を選択するにあたっては、使用者は溶液のｐＨに影響される、可能性のある反応速度について考慮しなければならない。固定されたｐＨでの好ましいＴＧ濃度は、各種ＴＧ濃度の得られる共役物の性能に対する影響を調べることによって、予め決定されている。反応条件は間接的に標識化される分子を十分にチオール化することができるものであるが、分子の生物学的活性を害さないように、過剰なチオール化は回避されることが好ましい。同様に、過剰量の骨格分子が間接的に標識化される分子に付着してはならず、そうでない場合はこれは共役物の準最適な性能を導く。骨格分子は典型的には、間接的に標識化される分子との関係において、中程度、たとえば約５倍のモル濃度過剰量で存在するが、最適なモル比率は共役物が置かれる適用に依存するだろう。どんな特定な共役物の、任意の反応物の最適な比率は、最初の試験的反応を、たとえば低、中、高比率で行い、次に試行錯誤によって”微調整”して予め決定され得る。
【００１７】
骨格分子は好ましくは、標識化される分子上に存在または形成されたレシーバー部分に対して反応性のある複数の反応性基を含む。このような基は最初から存在するか、または本発明に係る方法の一部として骨格分子に導入され得る。好都合なことに、骨格分子は小分子リガンド上に存在する官能基に対して反応性のある、複数の反応性基を含む。小分子リガンドに対して反応性のある反応性基は、標識化される分子上に存在または形成されるレシーバー部分に対して反応性のある反応性基と同種、または異なる種類であり得る。
【００１８】
好ましい一実施の形態において、骨格分子は複数の求核基を含む。好ましい一実施の形態において、骨格分子はアミン基を含み、これは”活性化”剤と反応し、下記に詳細に説明するとおり、チオール反応性基を導入する。好ましい一実施の形態において、骨格分子は、小分子リガンドのいずれの結合の前に、少なくとも５ｋＤ、より好ましくは少なくとも１０ｋＤ、およびもっとも好ましくは少なくとも２０ｋＤの分子量を有する。
【００１９】
好ましい一実施の形態において、骨格分子は、天然または人工のポリマーを含む。好ましい一実施の形態において、ポリマーは複数の求核基を有する（または必要な求核基の数および種類を含むように変性され得る）。骨格分子は１種類の求核基を有することができ、また、蛋白質のようないくつかの天然生体分子に典型的に見られるような多種の求核基を有することができる。
【００２０】
好ましいポリマーは、ポリペプチド、アミノ化デキストランまたは誘導化（たとえば、アミノ化）デキストラン、チオール化ポリマー、活性化ポリエチレングリコール、デンドリマー、活性化ビーズ、ナノ粒子または他の粒子を含む。特に好ましいポリマーはポリペプチド（たとえば、アミノ酸のポリマー）であり、それは多数及び多種の官能基（アミン、カルボキシル、フェノラート）を有し、ＳＭＬｓおよび他の分子に付着するための複数の選択肢を提供することから魅力的である。いくつかの実施の形態において、オボアルブミンは（ｉ）ＤＭＳＯへの溶解性が非常に高く、疎水性ＳＭＬｓのＮＨＳエステルとの反応が、水性／有機混合物中でＳＭＬまたはオボアルブミンの沈殿物なしで行われることを可能とすること、（ｉｉ）最適または最適に近い数の、反応に利用可能な遊離オンライン基（free online group）を有していること、から好ましい。他の好ましい骨格はデキストランまたは誘導化デキストラン（たとえば、アミノ化デキストラン）であり、これは適切な官能基を導入するのが容易で、大きさも広範囲にわたって入手可能だからである。目下の目的のために、“誘導化デキストラン”はデキストラン分子で、通常すべてではないものの、いくつかのポリマーの側鎖が代替的な部分、たとえばアミン基、アルコキシ基またはそのようなものに置換されている。
【００２１】
小分子リガンドは好都合なことに、蛍光色素分子、発色団、ビオチン、アビジン、金属イオンキレート剤、光反応性基、ヨウ素化可能部分、光増感剤、消光剤、ペプチドおよび低分子量薬剤よりなる群から選択することができる。特に、使用され得るＳＭＬｓの反応性形態はＮＨＳエステル、イソチオシアネート、トリアジン、スルホニル、クロリド、アジ化アシル、ハロゲン化アリル、アルデヒド、テトラフルオロフェニルエステル、イミドエステル、マレイミド、ハロアセチル誘導体およびヒドラジドを含む。上記リストは限定を意図するものではなく、他の官能基（たとえば一級アミン）を有するいずれのＳＭＬで、適切な骨格分子に結合できるものを採用できる。好ましくは、ＳＭＬは蛍光顔料を含む。適切な蛍光顔料および他の分子の選択を以下に示すが、これも限定を意図するものではない：５−（および−６）−カルボキシフルオロセイン、５−（および−６）−カルボキシローダミン１１０、５−（および−６）−カルボキシローダミン６Ｇ、５−（および−６）−カルボキシテトラメチルローダミン、５−（および−６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、５−カルボキシフルオロセイン（５−ＦＡＭ）、５−カルボキシローダミン１１０、５−カルボキシローダミン６Ｇ、５−カルボキシテトラメチルローダミン、５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、６−（（７−アミノ−４−メチルクマリン−３−アセチル）アミノ）ヘキサン酸、６−（フルオロセイン−５−カルボキシアミド）ヘキサン酸、６−カルボキシ−２”,４,４”，５”，７，７”−ヘキサクロロフルオロセイン、６−カルボキシ−４”,５”−ジクロロ−２”,７”−ジメチオキシフルオロセイン（ＪＯＥ）、６−カルボキシフルオロセイン（６−ＦＡＭ）、６−カルボキシローダミン１１０、６−カルボキシローダミン６Ｇ、６−カルボキシテトラメチルローダミン、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸、７−メチオキシクマリン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５１４、Ａ
、ｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７９０、ＡＭＣＡ（７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸）、ＡＴＴＯ  ３９０、ＡＴＴＯ  ４２５、ＡＴＴＯ  ４６５、ＡＴＴＯ  ４８８、ＡＴＴＯ  ４９５、ＡＴＴＯ  ５２０、ＡＴＴＯ  ５３２、ＡＴＴＯ  ５５０、ＡＴＴＯ  ５６５、ＡＴＴＯ  ５９０、ＡＴＴＯ  ５９４、ＡＴＴＯ  ６１０、ＡＴＴＯ  ６１１Ｘ、ＡＴＴＯ  ６２０、ＡＴＴＯ  ６３３、ＡＴＴＯ  ６３５、ＡＴＴＯ  ６３７、ＡＴＴＯ  ６４７、ＡＴＴＯ  ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ  ６５５、ＡＴＴＯ  ６８０、ＡＴＴＯ  ７００、ＡＴＴＯ  ７２５、ＡＴＴＯ  ７４０、Ｂｏｄｉｐｙ色素、カスケードブルー、カスケードイエロー、Ｃｈｒｏｍｅｏ  ４８８、Ｃｈｒｏｍｅｏ  ４９４、Ｃｈｒｏｍｅｏ  ５４６、Ｃｈｒｏｍｅｏ  ６４２、Ｃｙ２  ｂｉｓ、Ｃｙ３  ｍｏｎｏ、Ｃｙ３．５  ｍｏｎｏ、Ｃｙ５  ｍｏｎｏ、Ｃｙ５．５  ｍｏｎｏ、Ｃｙ７  ｍｏｎｏ、ＤｙＬｉｇｈｔ  ４８８、ＤｙＬｉｇｈｔ  ５４９、ＤｙＬｉｇｈｔ  ５４９、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６８０、ＤｙＬｉｇｈｔ  ８００、フルオロセイン、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、ＩＲＤｙｅ  ７００ＤＸ、ＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷ、ＩＲＤｙｅ  ８００ＲＳ、ルシファーイエロー、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、オレゴングリーン４８８、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ、ＰＦ−４１５、ＰＦ−４８８、ＰＦ−４８８−ＬＳＳ、ＰＦ−５００−ＬＳＳ、ＰＦ−５０５、ＰＦ−５１０−ＬＳＳ、ＰＦ−５１４−ＬＳＳ、ＰＦ−５２０−ＬＳＳ、ＰＦ−５４６、ＰＦ−５５５、ＰＦ−５９０、ＰＦ−６１０、ＰＦ−６３３、ＰＦ−６４７、ＰＦ−６８０、ＰＦ−７００、ＰＦ−７５０、ＰＦ−７８０、ＰＵＲＥＴＩＭＥ  １４、ＰＵＲＥＴＩＭＥ  ２０、ＰＵＲＥＴＩＭＥ  ２２、ＰＵＲＥＴＩＭＥ  ３２５、ピレン（および関連アナログ）、ローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミンＢ（リサミンローダミン）、テトラメチルローダミン。他の有用なＳＭＬｓは、ビオチン、ビオチンの長鎖アナログ、イミノビオチンおよび、Ｎ1−（ｐ−イソチオシアネートベンジル）−ジエチレントリアミン−Ｎ1，Ｎ2，Ｎ3，Ｎ3−四酢酸（ＤＴＴＡ）のようなキレート剤を含む。
【００２２】
ＳＭＬを骨格に付着させることは、実質的にＳＭＬの有効分子量を増加させる（典型的に１００倍以上）が、共役反応を大きな生体分子で行うことは一般的でない。たとえば、免疫診断分野においてもっとも頻繁に使用されるラベルは西洋わさび由来の（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ）ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）であり、オボアルブミン骨格（４０，０００対４６，０００）と同様の大きさである。他の通常使用される高分子量ラベルはアロフィコシアニン（allo-phycocyanin)（Ｍｒ  １０５，０００）、アルカリ性リン酸塩（Ｍｒ＝１６０，０００）および、フィコエリトリン（Ｍｒ＝２４０，０００）を含む。チオールの化学的性質は、特にこれらの反応に有用であることが分かった；ラベルがはじめにＴＲ基（通常はマレイミド）で修飾され、他の生体分子が遊離チオールを導入するために修飾される。
【００２３】
“チオール反応性”および“アミン反応性”という用語は本明細書中で適切な条件下で、それぞれチオール基（−ＳＨ)またはアミン基（特に一級アミン基  −ＮＨ2）と反応する部分または、より特定的には化学基を指定することを意図する。”チオール反応性”基は必ずしもチオール基のみとだけ反応するのではなく、“アミン反応性”基は必ずしもアミン基のみとだけ反応するのではないことに留意すべきである。特に、たとえば、ｐＨや他のその時点で優位な環境因子に依存して、“チオール反応性”または“アミン反応性”のいずれかの傾向が他より現れていたとしても、化学基は“チオール反応性”および”アミン反応性”の両方であり得る。
【００２４】
好ましい一実施の形態において、ヘテロ二官能性活性化試薬がチオール反応性基を骨格分子に導入するのに用いられる。好都合なことに、骨格分子は活性化試薬と反応可能な複数のアミン基を含む。アミン−およびチオール−反応性ヘテロ二官能性試薬の例は、Ｎ−スクシンイミジル３−（２ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ)、水溶液溶解性を高めるための延長スペーサーを有するＳＰＤＰ変異体（ＬＣ−ＳＰＤＰ；ＬＣ＝‘ｌｏｎｇ  ｃｈａｉｎ’）および延長スペーサーおよびスルホ基を有するＳＰＤＰ変異体（スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ）、スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピリジルジチオ）トルエン（ＳＭＰＴ）、スルホ−ＬＣ−ＳＭＰＴ、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（ＳＭＣＣ）、スルホ−ＳＭＣＣ、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、スルホ−ＭＢＳ、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノ安息香酸塩（ＳＩＡＢ）、スルホ−ＳＩＡＢ、スクシンイミジル−４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＢＰ）、スルホ−ＳＭＢＰ、Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ）、スルホ−ＧＭＢＳ、スクシンイミジル−６−（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサン酸塩（ＳＩＡＸ）、およびこの延長スペーサー形態ＳＩＡＸＸ、スクシンイミジル４−（（（ヨードアセチル）アミノ）メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（ＳＩＡＣ）、およびこの延長スペーサー形態（ＳＩＡＣＸ）、ｐ−ニトロフェニルヨード酢酸塩（ＮＰＩＡ）を含む。
【００２５】
間接的に標識化される分子は、興味のあるいずれの分子でもあり得るが、典型的にはからなり大きいだろう（分子量が少なくとも２５ｋＤ、より典型的には少なくとも３５ｋＤ、もっとも典型的には４５ｋＤ）。特に、間接的に標識化される分子は、しばしば酵素のようなポリペプチド、または構造プロテイン、レセプターまたは細胞表面マーカー、または抗体または抗原結合断片またはこれらの変異体（Ｆv、Ｆab、ｓｃＦv、単一ドメイン抗体、二重特異性抗体またはキメラ抗体またはこのようなもの）を含む。
【００２６】
本発明の方法の一つ、二つまたはそれ以上の工程（典型的にはすべて）は、溶液中の一つ、二つまたはそれ以上（典型的にはすべて）の試薬を用いて行われる。溶液は完全な水性（つまり、溶液中で水が基本的に唯一の溶媒である）であり得、または一部が水性（つまり、溶液中に一つ以上の他の溶媒が存在し得る）であり得、またはすべて有機性（つまり、溶液中で基本的に唯一の溶媒が水ではない）であり得る。好ましくは、溶液は完全に、または一部が水性である。特に都合のよいものは、水とＤＭＳＯを任意の好ましい割合で含む溶液である。特に、リガンド、間接的に標識化される分子および骨格分子のそれぞれは、好ましくは溶液中で固相ではなく遊離しており、または支持体に固定されている。これは最適な反応速度論を与える。
【００２７】
第二の観点から、本発明は第一の観点の方法のために使用する骨格分子を提供し、該骨格分子は一つ以上の付着した分子リガンドおよび、標識化される分子に存在し、またはその場で形成されるレシーバー部分に対して反応性のある一つ以上の基を含む。
【００２８】
小分子は骨格に共有結合的（これは一般的に好ましい）または非共有結合的に結合できる。必要であれば、骨格分子に付着する二つ以上の異なる種類の小分子リガンドがあり得る（たとえば、二つの異なる蛍光色素分子、または一種類の蛍光色素分子およびビオチンおよび／またはストレプトアビジンなど）。
【００２９】
骨格分子は好都合なことにレシーバー部分（それ自体が、好ましくは標識化される分子上に複数存在し、または形成され得る）に対して反応性の良い複数の基を含むことができる。
【００３０】
典型的に、骨格分子は所望の反応性基を導入するために、たとえば活性化剤と接触した“活性化”状態であり得、該骨格分子はそのため典型的にＳＭＣＣのような活性化剤との反応の結果導入された基を含むことができる。
【００３１】
一つ以上の小分子リガンドの付着および／または活性化の後に、骨格分子は未反応のＳＭＬｓまたはそれらの加水分解物を含む低分子量物質から分離でき、必要であれば、後続の共役反応または骨格分子の一時的または長期の保存により適した緩衝液中に置換できる。この交換および／または分離工程は当業者に公知のいずれの技術でも達成することができ、もっとも適切なものは、少なくとも一部は、合成スケールに通常依存するであろう。本発明者は商業的に入手可能な脱塩カラム（たとえば、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製のＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５“ＮＡＰ−５”カラムまたは“ＰＤ１０”カラム）を用いた分離が適当であることを発見した。より大きなスケール（＞１００ｍｇ骨格）では、より大きな最大容量の空のガラスまたはポリプロピレンカラムを、乾燥粉末として別個に入手可能な、水和Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５を用いて充填することができる。
【００３２】
ＳＭＬｓの付着および／または活性化の後に、骨格分子は保存目的のために、典型的には約５０μｌから約５ｍｌまで、好ましくは約１００μｌから２ｍｌまでの一定分量の凍結または凍結乾燥で便利に提供できる。好都合なことに、骨格分子はキットの一部として提供でき、該キットは本発明の方法の実施のために適用され、指定されている。
【００３３】
好ましい骨格分子はオボアルブミンを含む。骨格分子は、好ましくは公知の、予め定められた平均数の付着した小分子リガンドを含む。骨格分子は追加的または代替的に、一分子当たり、公知の、予め定められた平均数の反応性基（好ましくはチオール反応性基）を含み、これは標識化される分子上のレシーバー部分との反応に用いられ得る。
【００３４】
他の好ましい骨格分子はデキストランであり、これは容易にＡＲ−ＳＭＬｓと反応可能なアミノ化誘導体に変換され得る。さらに、分子サイズを必要に応じて変更でき（１０００−２，０００，０００ダルトンの範囲のデキストランは商業的に入手可能である）、標識密度を変える必要なしに、骨格分子あたりのＳＭＬｓの数を変化するかなりの余地を提供する。これはある蛍光性ＳＭＬｓにおいてかなりの価値を有し、これらの蛍光体は近接させられると消光を示す可能性がある（以下参照）。
【００３５】
本発明で用いるデキストランは、典型的に４０，０００ダルトンまたはそれ以上である。仮にデキストランが球形であると考えられる場合は、容積（分子サイズ）の変化を伴う半径／表面積の変化は、標準の数学的方程式を用いて容易に決定することができる。たとえば、表面積の２倍の増加は、デキストランを１５０ｋＤから４５０ｋＤに変えることによって達成でき、４０ｋＤから５００ｋＤへ変化させることによる表面積の増加は５倍である。標識化される生体分子への一箇所の付着が望ましい場合は、より大きなデキストランを、より多くのＳＭＬを導入するために使用できることが、上記の判断から明らかである。
【００３６】
本発明の方法で使用するために、骨格分子は好ましくは溶液中に存在し、溶液は全部または一部が水性であり、通常は適切な緩衝液を含む。ＳＭＬとの反応では、溶液は好ましくは比較的濃縮されており、少なくとも１０ｍｇｓ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも２０ｍｇｓ／ｍｌ、もっとも好ましくは４０ｍｇｓ／ｍｌまたはそれ以上である。
【００３７】
第三の観点から、本発明は本発明の方法の実施に使用するキットを提供する。該キットは前記で規定および／または記述した骨格分子および本発明の方法を実施するための使用説明書を含む。キットは好ましくは、２−イミノチオラン塩酸塩のようなチオール生成剤、および／または１つ以上の緩衝液を含む。キットの一つ以上の試薬成分は凍結乾燥形態で提供され得る。キットは選択的に１つ以上の以下のものを含む：１つ以上の小分子リガンド、１つ以上の骨格分子を活性化する活性化試薬、および１つ以上の標識化される分子。
【００３８】
第四の観点から、本発明は共役物を提供し、該共役物は、間接的に標識化された分子と、前記間接的に標識化された分子に付着した少なくとも一つの骨格分子と、前記骨格分子に付着した少なくとも一つの小分子リガンドとを含む。有利なことに、共役物は本発明の第一の観点の方法で調製される。
【００３９】
好ましくは、必須ではないが、少なくとも一つの小分子リガンドは骨格分子に共有結合的に付着している。好ましくは、必須ではないが、骨格分子は間接的に標識化された分子に共有結合的に付着している。好ましくは単数または複数の小分子リガンドと、骨格分子と、間接的に標識化される分子は、すべてこれまで定義および記述したものである。特に骨格分子は好ましくはオボアルブミンまたはアミノ化デキストランを含む。
【００４０】
一実施の形態において、本発明は間接的に標識化された分子を含む共役物を提供し、前記分子は複数の骨格分子に付着し、それぞれの骨格分子は同様に少なくとも一つの小分子リガンドに付着している。
【００４１】
他の一実施の形態において、本発明は間接的に標識化された分子を含む共役物を提供し、前記分子は一つの骨格分子に付着し、骨格分子に複数の小分子リガンド（同じでも異なっていてもよい）が付着している。
【００４２】
好ましい実施の形態において、小分子リガンドは骨格分子への結合能力に関して一価である。
【００４３】
本発明の一つの特徴は、骨格分子（特にチオール反応性骨格分子）が予め規定し、予め最適化された量の付着したＳＭＬを有して合成され、その後標識化される生体分子にかたまって付着できることである。このようにして、本発明の方法は、ラベル（またはリガンド）の標識化される分子に対する割合、ラベルの正確な量、標識化の密度および分布を正確に制御することができる。有利なことに、ＳＭＬｓの骨格媒介物を介しての組み込みは、一価の反応性ＳＭＬで直接生体分子を標識化するよりも、より簡単である。なぜなら（ｉ）骨格分子の生体分子に対するモル割合が比較的低く、（ｉｉ）立体因子が物理的に接着可能な骨格分子の数を制限するように機能するからである。この生物学的共役物へのアプローチは、ラベル密度が予想以上に大きいこと、蛍光性ＳＭＬｓの場合に過剰ラベルまたは消光を簡単に回避することを確実にする（“消光”とは複数の蛍光部分が近接して存在し、お互いが蛍光発光するのを妨げる現象をいう）。ほとんどの場合、最終共役物を精製する必要はない。なぜならＴＲ基は典型的なＮＨＳエステルよりもより安定しており、余剰な官能基はＴＲ基の加水分解は、必ずしも骨格分子の接着を妨げることを意味しないため、ｐｏｌｙ−ＴＲ骨格は相当な過剰量を使用する必要がないからである。
【００４４】
骨格分子アプローチは、共役物の設計と最適化に相当な柔軟性を与えることも可能にする。たとえば、それぞれ１つのＳＭＬを有する３つの骨格分子の抗体への付着は、合計３つのＳＭＬを導入する。同等に、３つのＳＭＬ分子を有する１つの骨格分子の付着は、同等数のＳＭＬを導入する。しかし、共役物は分子の観点からは明らかに同等でなく、共役物の特定の型の性能の優位性は、ある分析状況で明らかになるだろう。特定の適用に対しての最適化は、たとえば低、中および高密度のＳＭＬを準備し、３つの濃度の標識化される分子と共役させ、９つの型の共役物を結果として生じさせることを含む。その後、最良の共役物を、特定の免疫測定法での成績に基づいて選択する。
【００４５】
抗原の結合に続く洗浄工程を有する免疫測定法では、抗体共役物中に、未共役の骨格分子が少量存在することは、ほとんど重要でない。なぜなら過剰量は洗い流されるからである。しかし、未共役の骨格分子の存在が問題であると分かった時は、抗体／骨格分子のモル比率を遊離骨格分子の濃度が最小になるように選択できる。適用し得るラベル密度への何らかの制約に従って（たとえば、密度は消光効果、または骨格分子にその後結合する他の分子の場所をあける必要性によって制限される）、骨格分子当たりのＳＭＬ密度が比較的大きいことも、これらの状況では好ましいであろう。
【００４６】
しばしば共役反応に使用されるＳＭＬであるビオチンに結合した骨格分子の場合、２つの選択肢の可能性がある。第一に、ビオチン化した骨格は結合構成要素（たとえば抗体）に共役され、その後抗原に非共有的に結合する。過剰のビオチン−骨格分子−抗体共役物を洗い流した後、ビオチンリガンドは、測定の容易な、ラベルを組み入れたストレプトアビジン共役物を採用する（たとえば、ＨＲＰ）。ビオチンとストレプトアビジン分子は通常このように、分子同士を非共有的に結合する架橋を形成する。この種類の測定では、いずれの非共役ビオチン−骨格分子は洗浄工程で除去され、最終測定になんら及ぼすことはできない。
【００４７】
第二の適用では、ビオチン化共役物のビオチン成分が、代わりに表面の共役物をストレプトアビジンが付着している場所へ向かわせるために用いられる。この種類の適用では、少量の非共役ビオチン骨格分子が、固定化ストレプトアビジンのためにビオチン−骨格分子−抗体共役物と競合することができ、したがって表面に補足される共役物を減少させることができる。これは検出感度の減少につながると予想されるかもしれない。しかし、本発明の方法は共役物を迅速に準備し、一般的に洗浄工程の必要なしに特定の適用に調整することができる。
【００４８】
骨格分子アプローチは商業的に入手可能なすべての範囲のＡＲ−ＳＭＬｓ、ほとんどはＮＨＳ−活性化ＳＭＬｓを、１種類（または１を超える種類）のＳＭＬが付着している大量のｐｏｌｙ−ＴＲ骨格分子の製造を通じて有効に使用できる。反応性ＳＭＬ（たとえばＮＨＳエステル種）のいずれの種類内の構成要素も、本質的には同様の反応性を示すため、本発明の方法はその種類内のいずれの構成要素にも適用できる。多くのＡＲ−ＳＭＬｓとは異なり、ＳＭＬ−変性骨格分子上のＴＲ基は比較的安定で、活性機能の損失への不安なしに、凍結乾燥形態で長期間保存可能である。
【００４９】
本発明の一実施の形態において好ましくは、ＡＲ−ＳＭＬははじめにアミン含有骨格分子と反応する。特に好ましい実施の形態において、ＳＭＬのＮＨＳエステル誘導体が使用される。骨格分子に組み込まれ得る反応性ＳＭＬの割合は、限定した量のＳＭＬを骨格分子の濃縮溶液と反応させ、脱塩または透析によって骨格分子−結合および遊離形態に分離することによって、便宜的に予測することができる。保存中のＳＭＬの分解の割合や、溶液中での加水分解の割合が通常知られていないという事実は、どれくらいのＳＭＬが、比較的安価な骨格分子を用いてリガンドの特定濃度を達成するために必要か決定できるときは、ほとんど問題でない。
【００５０】
好ましくは、骨格分子とＮＨＳエステルとの反応の場合、約７．２のｐＨが加水分解を最小化するために用いられ、骨格分子は、競合する加水分解反応に逆らって、アミンを有するＮＨＳエステルとの反応を促進するため比較的高濃度で用いられる。たとえば、骨格分子の濃度は、＞１０ｍｇ／ｍｌが好ましく、＞２０ｍｇ／ｍｌがより好ましく、＞４０ｍｇ／ｍｌがさらにより好ましい。高濃度の骨格分子（たとえば、小容積）は、続いて行われる、興味のある生体分子に骨格分子を付着する前の脱塩または透析工程を促進する点でも有利である。
【００５１】
当業者には、他のアミン反応性誘導体（たとえば、イソチオシアネート、トリアジン、スルホニルクロリド、アシルアジド、ハロゲン化アリール、アルデヒド、テトラフルオロフェニルエステルおよびイミドエステル）も、適切な条件下で、ＮＨＳ誘導体の代わりに、ＳＭＬｓをアミノ化骨格分子に結合させるために使用できる。ＴＲ−ＳＭＬｓ（マレイミド、ハロアセチル誘導体）もチオール化骨格分子と採用でき、たとえばデキストランまたはグリコプロテイン骨格の過ヨード酸塩処理から生じるものとして、ＳＭＬｓまたはアミン含有ＳＭＬｓのヒドラジド誘導体もアルデヒドに共役可能であることも明らかである。
【００５２】
骨格分子上の接近可能なアミン官能基の総数が、付着可能なＡＲ−ＳＭＬｓ上限数を設定する。励起および発光スペクトルが実質的に重なる蛍光性ＳＭＬｓは、消光を受けやすく、より大きなストークシフトのものに比べてより小さな密度で組み込む必要があるだろう。より大量の蛍光性ＳＭＬｓは、骨格分子のサイズを大きくする、またはアミン基の配置を最適化することによって消光効果なく適合させることができる。なぜなら蛍光発光の消光の程度は、分子間距離に関係しているからである（たとえば、より近い蛍光体は、より消光が生じやすいだろう）。より小さい骨格分子は、より大きな骨格分子に比べてより少ない蛍光体のスペースしかないが、生物学的活性を妥協せずにより多くの数のより小さな骨格分子を付着することができる。
【００５３】
アミン（または他の可能性のある接着点）の割合のみが、ＳＭＬｓとの反応において、ＴＲ官能基の付着を可能にする十分な基が残存することを確実にする。したがって、利用できるアミンの総数が骨格分子の選択または設計に重要な考慮点である。もし骨格分子上のアミンの総数が特定の適用に不十分な時は、異なる骨格分子を選択することができ、または反応中心の数または種類を変化させるために、骨格分子上の化学修飾反応を行うことができる。デキストランの場合は、すでに明らかにされた化学構造のものを、単純により大きな分子に適用できる。
【００５４】
新規な官能基の導入方法は、化学文献に包括的に記載されている。カルボキシル基が骨格分子上に存在している場合、カルボジイミドの存在下でアミン含有分子と共役できる。ジアミン（またはポリアミド）との縮合は、新規の表面アミンを導入し、ＡＲ−ＳＭＬｓに共役する可能性のある場所を提供する。適切なジアミンは、限定されるものではないが、エチレンジアミンおよび２，２−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）［ＥＤＢＡ］を含む。
【００５５】
カルボキシメチルデキストランはジアミンを使用してアミン官能性を導入するための便利な開始点を提供する。ジアミンとモノアミンの組み合わせは、同時に表面アミンを導入し、デキストランの特性を変更させる便利な方法である。モノアミンはアミンの総数を制御し、および／または他の表面特性（たとえば、極性、疎水性または荷電群）を提供するために有効に使用できる。たとえば、カルボジイミド−介在性のエタノールアミンとの縮合物は、極性で、比較的非反応性のヒドロキシル基を導入し、付着したそれぞれの分子の一つの負電荷を除去する。同様に、グリシンアミド、アグマチンおよびタウリンもアミド（中性）、グアニジノ（正電荷を有する）およびスルホン酸（負電荷を有する）部分を、それぞれ、カルボジイミド−介在性縮合を通じて導入するのに使用できる。同様に、グリシンアミド、アグマチンおよびタウリンは、アミド（中性）、グアニジン（正電荷を有する）、およびスルホン酸（負電荷を有する）部分を、それぞれ、カルボジイミド−介在性縮合を通じて導入するのに使用できる。このような導入は共役物の非特異的結合を減らし、または、たとえば、蛍光性ＳＭＬｓの蛍光特性に影響し／蛍光特性を向上するために、固定化されたＳＭＬが存在する環境を変化させるのに使用できる。
【００５６】
カルボン酸官能基は、ＴＲ−ＳＭＬｓ（たとえば、ヨードアセトアミド誘導体）との後続の反応のために、チオール基を導入するのに利用できる。カルボジイミド−介在性の過剰シスタミンの骨格分子との反応は、ＤＴＴまたは他の還元剤との処理によって放出され得る保護チオールを導入する。このようなカルボキシルの利用の利点の一つの可能性は、骨格分子上のアミン官能基が他の反応でもまだ利用可能なことである。この接近は、アミンの総数が限られている場合、および／または反応性ＳＭＬがＴＲ誘導体としてのみ利用可能な場合に便利である。いずれの過剰チオールもモノマレイミドでキャップされ、またはホモ二官能性ＴＲ架橋剤（たとえば、ビスマレイミドヘキサン）（ＢＭＨ）を用いてＴＲ官能基を導入するのに利用される。
【００５７】
この操作が、たとえばＴＲ官能基をその後導入することを通じて、骨格分子の合成を完成させるのに十分な量のアミン基を残すと仮定すると、アミン基はまたはチオールを導入するのに利用できる。たとえば、アミンは、２−イミノチオラン塩酸塩と反応して遊離チオールを産生でき、またはＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）またはＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＰ）と反応して、ヒドロキシルアミンと、またはジチオスレイトールのような還元剤での処理でチオールを放出するＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピネート（ＳＰＤＰ）と放出される保護化チオールを産生できる。骨格分子がアルデヒド官能基を有する場合、２−アセトアミド−４−メルカプト酪酸ヒドラジドが、必要なチオールを導入するのに使用できる。
【００５８】
骨格分子が有するアミンが多すぎる場合、限定量の無水酢酸またはＮＨＳ−アセテートをこれらの基の割合を不可逆的にブロックするのに使用できる。スクシン酸無水物およびグルタル酸無水物もアミン官能基を除去し、それぞれの修飾アミンに一つのカルボキシル官能基を導入する。過剰アミンの可逆的なブロックはマレイン酸無水物または無水シトラコン酸で達成できる。
【００５９】
したがって、化学修飾反応は新規の反応中心を導入するため、および／または骨格分子およびこれらから調製される共役物の物理化学的特性を、たとえば、検出シグナルの向上および非特異的相互作用を最小限にするために、変化するために使用できる。
【００６０】
一度ＳＭＬが骨格分子と反応すると、好ましくは精製されていないそのままの混合物は、標識化される分子上に存在するレシーバー部分に反応性のある一つの基、または複数の基（たとえば、チオール反応性基）を導入する他の分子（“活性化剤”）と反応できる。ＮＨＳの化学的性質を、ＳＭＬを導入するのに使用する一つの利点は、同様の緩衝液条件を、その後、一端が（ＮＨＳエステルを介して）アミンと、他の一端がチオールと反応できるヘテロ二官能性基を用いて、チオール反応性基を導入するのに用いることができることである。多くのこのような試薬はＮＨＳ部分を有しており、たとえばスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシ塩酸塩［ＳＭＣＣ］は、マレイミド官能基が隣接脂肪族環で安定化されているため、特に好ましい。同様の化学反応性を有する他の試薬は、ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）；ＳＩＡＢ［スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノ安息香酸］；ＧＭＢＳ［Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドエステル］；ＳＩＡＸ［スクシンイミジル６−（（ヨードアセチル）アミノ）ヘキサン酸塩；およびＳＩＡＣ［スクシンイミジル４−（（（ヨードアセチル）アミノ）メチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩を含む。いくつかの場合では、スルホン化アナログも使用可能であり（たとえば、スルホ−ＳＭＣＣ）、水溶液に非スルホン化形態のものより良好な溶解性を示す。
【００６１】
骨格分子の調製に採用され、チオールが不存在の条件下では、ヘテロ二官能性試薬のＮＨＳ部位は選択的にアミンと反応し、ＴＲ官能基は骨格分子の表面に生じるようになる。得られたポリ−ＴＲ  ＳＭＬ−骨格分子の組み合わせは、好ましくは脱塩または透析で精製され、即時に使用され、または、高効率の生体分子との単一ステップの共役反応を、国際公開第２００７／０６８９０６号パンフレットに詳細に記載されている方法にしたがって行なうために、好ましくは２−ＩＴおよび他の適切な添加剤と任意に組み合わせて凍結乾燥される。
【００６２】
ＳＭＬの付着がＮＨＳエステルの使用を含まない場合、チオール反応性官能基の付着の前にＳＭＬ−骨格分子を脱塩または透析する必要があるだろう。これは高ｐＨがほとんどの他のアミン反応性基との反応に必要であるからである。たとえば、イソチオシアネートは約ｐＨ９でもっとも効率的に反応する。これは、ほとんどのヘテロ二官能性試薬を用いてＴＲ官能基を導入することにとって、理想的ではない。なぜなら‘チオール反応性’基は高ｐＨ値でアミンとも反応し、または非常に迅速に減少するからである。しかし、本発明の利点は、脱塩および透析工程が、サンプルの高濃度／小容量のために単純で、したがって異なる化学反応を、サンプルがそれぞれの工程で適切な緩衝液に置換される限り、ＳＭＬおよびＴＲ官能基の付着に用いることができる。
【００６３】
ポリ−ＴＲ  ＳＭＬ骨格分子がどのように構築されるかに関わらず、最終適用に依存して、共役物が使用される前に過剰の反応性基を消す必要があるだろう。国際公開第２００７／０６８９０６号パンフレットには、ポリペプチドラベル（たとえば、ＨＲＰ、フィコエリトリン）に用いることができるいくつかの消失戦略が記載されている。たとえば、グリシンは２−イミノチオラン塩酸塩を攻撃するのに用いられ、したがって標識化される生物学的分子または、共役物が使用されるときに存在する他の生物学的分子のさらなるチオール化を止める。第二の効果として、低分子量チオールでこのように放出されたものは、ＴＲ官能基を不活性化することもできる。本発明において、二つの予測外の観察結果が、顔料標識化デキストラン骨格の場合、異なるやり方が好ましいであろうことを示唆した。第一に、国際公開第２００７／０６８９０６号パンフレットに記載されているその場のチオール化アプローチにとって非常に好ましい高水準のＳＭＣＣ修飾は、フルオロセイン化デキストラン骨格の蛍光発光の大きな減少に関係していることが分かった。第二に、ポリマレイミドフルオロセイン化デキストラン／抗体共役物と、チオール化表面との望ましくない反応を阻害するために、メルカプトエタノールを使用することは、抗体とその抗原への特定の結合に関係して蛍光発光を増大させることが分かった。蛍光発光の向上におけるチオールの阻害作用は、別の試験で骨格分子への直接的な効果として示され、チオールはＳＭＣＣから誘導されたマレイミドの蛍光性顔料の消光作用を明らかに示す。消光作用は溶液のイオン強度の減少（たとえば、水への希釈）、および１０％ＤＭＳＯの添加によって減少され、これは消光は、少なくとも一部が、疎水性相互作用に起因していることを示唆している。
【００６４】
本発明において、グリシンとチオールの組み合わせは、共役反応を停止するために好ましい。特に好ましい一実施の形態において、組み合わされた試薬のｐＨは、チオールを保存するのに十分に低く（たとえば、ジスルフィドへの酸化を防ぐことによって）、緩衝能が十分に低く、そのため溶液が共役物混合物に添加されたとき、共役物混合物のもともとのｐＨ近くが維持され、したがってＴＲ官能基をブロックし、過剰な２−イミノチオラン塩酸塩を不活性化するのに好ましい条件を提供する。特に好ましい処方は、５０ｍＭグリシンでｐＨ２．３であり、１０ｍＭチオールを含み、これは最終濃度としてグリシンおよびチオールをそれぞれ約５ｍＭおよび１ｍＭとなるように添加される。大量のチオールは、ジチオスレイトール、メルカプトエチルアミン、メルカプトエタノール、メルカプトプロピオン酸、Ｌ−システインおよびメルカプトコハク酸を含むポリマレイミドフルオロセイン化骨格分子の蛍光発光を、６０−１００％増強することがわかった。カルボン酸基にも組み入れられるチオールは、特に有効であり、メルカプトコハク酸は優れた増強を示す。
【００６５】
本発明は説明に役立つ実例、および以下の図を参照してさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１】図１は本発明の方法の主要工程を示す模式図である。第１段階（ｉ）では、複数の官能基（Ｘおよび、任意的に、Ｗ）を有する骨格分子が限定量のＳＭＬと接触し、いくつかのＸ官能基およびＳＭＬ間に共有結合を形成する。典型的に、Ｘはアミン基である。Ｗは必要であればＸに変換され得る基であり、または他の方法で使用され得る基であり、または全く利用されない基である。工程（ｉｉ）では、骨格分子−ＳＭＬは二官能性試薬（ＢＦＲ）、典型的には、Ｘ−反応性およびチオール反応性（ＴＲ）官能基を有し、Ｘ官能基をＴＲ官能基に変換するヘテロ二官能性試薬に接触させる。最終工程（ｉｉｉ）では、ポリ−ＴＲ  骨格分子−ＳＭＬ、チオール生成剤（典型的には２−イミノチオラン塩酸塩；２−ＩＴ）および標識化される生物学的分子（たとえば、抗体；Ａｂ）がお互い同時に接触される。チオール生成剤は標識化される生物学的分子に作用し、アミン官能基を高疎水性チオールに変換し、それは単一工程の共役反応によって迅速にポリ−ＴＲ骨格と反応し抗体および骨格分子間の結合（したがって抗体とＳＭＬの間接的結合）を生成する。過剰の反応性基は自動的に減少するが、これは国際公開第２００７／０６８９０６号パンフレットに従った、適切な失活剤を用いて促進することができる。
【図２】図２は様々な量の”チオール生成剤”である２−イミノチオラン塩酸塩を用いて調製された共役物を用いた分析で検出された蛍光発光量（任意の蛍光発光単位）を示す棒グラフである。
【図３】図３は４つの棒グラフ（Ａ−Ｄ）を示す。パネルＡおよびＢは、ウサギＩｇＧ−被覆マイクロタイタープレートと、オボアルブミン骨格の介在を通じて結合した、ビオチンで間接的に標識化されたヤギ抗ウサギＩｇＧとを用いて、ＥＬＩＳＡで測定された吸光度（４０５ｎｍ）を示す。パネルＣおよびＤは、ストレプトアビジン−被覆プレートで補足された同様の共役物を用いた分析で測定された吸光度（４０５ｎｍ）を示す。パネルＡおよびＣでは、分析は一定の抗体濃度を用いて行われ、パネルＢおよびＤでは、分析は一定の骨格分子濃度を用いて行われた。Ｃ６−Ｃ８はＩｇＧ、オボアルブミンを異なる比率で用いて形成された共役物を示し、Ｃ５はコントロール共役物（ＩｇＧなし）を示す。
【図４】図４はウサギＩｇＧ−被覆プレートと、オボアルブミン骨格分子の介在を通じて結合した、ビオチンで間接的に標識化されたヤギ抗ウサギＩｇＧとを用いて、ＥＬＩＳＡで測定された吸光度（４０５ｎｍ）を示す。共役物は、異なるビオチン濃度を用いて調製され（白丸−１ｍＭ；三角−３ｍＭ；黒丸−６ｍＭ；黒四角；ビオチンなし）、希釈範囲で試験された。
【図５】図５は図４で示されたのと同様の実験での吸光度（４０５ｎｍ）を示し、ここでは試験共役物は異なる活性化剤濃度を用いて調製された（ゼロ−黒四角；三角−５ｍＭ；白丸−１０ｍＭ、黒丸−２０ｍＭ）。
【図６】図６は固定量（１００μｇ）の２つのポリ−マレイミドフルオロセイン化デキストラン（１５０ｋＤａおよび４００−５００ｋＤａ）を用いて調製された、様々なヤギ抗ウサギ共役物を、ウサギＩｇＧで被覆された（Ａ−Ｄ）、またはウサギＩｇＧなしの（Ｅ−Ｆ）ブラックポリスチレンプレートを使用して分析した時に得られた蛍光発光を示すグラフである。Ａ、Ｃ、ＥおよびＧは、１５０ｋＤａデキストラン骨格分子のデータを示し、Ｂ、Ｄ、ＦおよびＨは、４００−５００ｋＤａのデキストラン骨格分子のデータを示す。ＡおよびＢ（およびこれらに関係するコントロールＥおよびＦ）はデキストラン：抗体のモル比が１：１に固定され、ＢおよびＤ（およびこれらに関係するコントロールＧおよびＨ）はデキストラン：抗体のモル比が３：１に固定されている。
【図７】図７は、凍結乾燥物質を水（コントロール；黒丸）に溶解、または２００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．０に溶解し、様々な試薬；１．４３ｍＭメルカプトエタノール／５ｍＭグリシン（黒丸）、０．１４３ｍＭメルカプトエタノール／５ｍＭグリシン（白四角）、５ｍＭグリシン（三角）または水（白丸）で処理した、固定量のポリマレイミドフルオロセイン化４００−５００ｋＤａデキストラン骨格分子からの蛍光発光出力の経時変化を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００６７】
実施例
実施例１．ポリ−マレイミド−フルオロセイン化−ＯＶＡの調製
ｐＨ７．２の１００ｍＭリン酸ナトリウム中の４０ｍｇ／ｍｌ（約０．８７ｍＭ；１ｍｌ）のオボアルブミン（ＯＶＡ）（Ａ５５０５；ロット  ０７６Ｋ７０４５）を、限定量（オボアルブミンアミンに関して；１分子あたり２０リジン、そのうち１６は通常接近可能である；Ｂａｔｔａ  ＰＰ，Ｉｎｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，２３，１３７５−８４，１９９１）である１００μｌのＤＭＳＯに溶解した２２．５ｍＭ  ５−（および６−）カルボキシフルオロセインスクシンイミジルエステル（分子プローブ  Ｃ１３１１；ロット  ２５５４７Ｗ）と反応させた。２５℃の暗所で３０分経過後、さらに５０μｌのスルホ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（ｓＳＭＣＣ）を、ＤＭＳＯ中の２００ｍＭストックから添加して、ｓＳＭＣＣおよびオボアルブミンのそれぞれの最終濃度である８．７ｍＭおよび約０．７６ｍＭを得た。さらに暗所で３０分間インキュベーションした後、ポリ−マレイミド−フルオロセイン化−ＯＶＡのサンプルをＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（ＰＤ１０カラム；ＧＥ  Ｈｅａｒｌｔｈｃａｒｅ社製）で脱塩し、ｐＨ５．８のリン酸ナトリウム１０ｍＭの中に入れた。１２５μｌの一定量を、７７５μｌのｐＨ５．８リン酸ナトリウム緩衝液および１００μｌの３３％トレハロースストック（トレハロース１ｇと水２ｍｌから調製）で希釈した。一定量（１００μｌ；２５０μｌ）のトレハロース／ポリ−マレイミド−フルオロセイン化−ＯＶＡ混合物は、液体窒素上でパキッと凍り、国際公開第２００７／０６８９０６号パンフレットに記載の方法に従って、凍結乾燥された。
【００６８】
実施例２．被覆プレートの準備
９６ウェル  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ社製）を５０μｌ／ウェルの精製ＩｇＧ（２０μｇ／ｍｌ）またはストレプトアビジン（５μｇ／ｍｌ）で４℃で少なくとも１６時間被覆した。使用前に被覆プレートをｐＨ８．０の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／１５０Ｍ  ＮａＣｌ（ＴＢＳ）で５回洗浄して、ＴＢＳ中で０．１％ＢＳＡ（ブロッカー）を用いて３０−６０分間ブロックした。ブロックされたプレートを、必要であればブロッカー中に希釈された共役物とともにインキュベーションする前に、ＴＢＳを用いて５回洗浄した。
【００６９】
実施例３．ヤギ抗ウサギＩｇＧのポリ−マレイミド−フルオロセイン化−オボアルブミンとの共役
ｐＨ７．５の２００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ中の、５０μｌのヤギ抗ウサギＩｇＧ（１ｍｌ／ｍｌ）を、５μｌの１０ｍｇ／ｍｌ  ポリ−マレイミド−フルオロセイン化−ＯＶＡと混合した（実施例１からの物質を２５μｌの水で再懸濁した後）。４つの１１μｌの混合物を、１μｌの２−イミノチオラン塩酸塩とインキュベートし（濃度変化：８ｍＭ、４ｍＭ、２ｍＭおよび０ｍＭ）、最終濃度６６７μＭ、３３３μＭ、１６７μＭおよび０μＭを得た。２５℃で一晩インキュベーションした後、サンプルを５０ｍＭ  トリス／１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／０．１％  ＢＳＡ（ブロッカー）中で１／１００に希釈され、ウサギＩｇＧで被覆されたＭａｚｉｓｏｒｐ  マイクロタイタンプレート上で、２５℃で１時間インキュベートした（実施例２）。ＴＢＳで５回洗浄した後、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｏｔｒ上で励起／発光設定を４８５／５３５ｎｍ、およびＣＷランプエネルギーの設定を１１７２０にして読み込む（ウェル当たり１秒）前に、１００μｌのＴＢＳをそれぞれのウェルに添加した。
【００７０】
データを表２に示す。表２から分かるように、試験されたもっとも低濃度の２−ＩＴはもっとも高濃度のものと同等に効果的であった。別の試験では、非常に高濃度の２−ＩＴ（最終濃度８ｍＭ）も、８００μＭ  ２−ＩＴ（データは示していない）に比べると、２−ＩＴの調製中のチオールのコンタミおよび／または過剰のアミン修飾が原因の可能性がある共役効率のわずかな減少がみられるものの、なお効果的であった。したがって、２−ＩＴは広範囲の濃度で使用可能である。２−ＩＴが存在しないと、共役効率は低く、これはチオールが存在しないと、抗体は骨格分子上のＴＲ官能基と遅い速度のみでしか（アミンを介して）反応しないからである。
【００７１】
実施例４．ポリ−マレイミド−ビオチン−オボアルブミン骨格の製造
ｐＨ７．２の１００ｍＭリン酸ナトリウム中の４０ｍｇ／ｍｌ（約０．８７ｍＭ；１２５μｌ；５ｍｇ）のオボアルブミン（Ａ５５０５；ロット  ０７６Ｋ７０４５）を、６．２５μｌのＤＭＳＯ中の６０ｍＭ  ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンと反応させた。２５℃で１時間経過後に、１４μｌのスルホ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（ｓＳＭＣＣ）をＤＭＳＯ中の２００ｍＭストックから添加して、ｓＳＭＣＣおよびオボアルブミンの最終濃度１９．３ｍＭおよび約０．７５ｍＭをそれぞれ得た。２５℃で１時間経過後、ポリ−マレイミド−ビオチン化−オボアルブミンを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（ＮＡＰ−５カラム；ＧＥ  Ｈｅａｒｌｔｈｃａｒｅ社製）で脱塩して、ｐＨ５．８のリン酸ナトリウム３００ｍＭの中に入れた。サンプルを６０μｌのｐＨ５．８のリン酸ナトリウム緩衝液および４０μｌの３３％トレハロースストック（トレハロース１ｇと水２ｍｌから調製）で希釈した。一定量（１００μｌ；２５０μｌ）のトレハロース／ポリ−マレイミド−フルオロセイン化−ＯＶＡ混合物は、液体窒素上でパキッと凍った。
【００７２】
実施例５．抗体の骨格に対する比率の最適化
一定量（１０μｌ）のポリ−マレイミド−ビオチン−オボアルブミン骨格（実施例４）を、５μｌのｐＨ２．５の２Ｍ  Ｈｅｐｅｓ／１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５μｌの１．１ｍｇ／ｍｌ  ２−ＩＴ（８ｍＭストック）および、変量（５μｌ、１０μｌまたは２０μｌ；５５μｇ、１１０μｇまたは２２０μｇ）のヤギ抗ウサギＩｇＧ（１１ｍｇ／ｍｌ）であって、モル比（骨格分子：抗体）（抗体のモル重量を１５０，０００、骨格分子のモル重量を〜５０，０００と想定）を６．８：１（共役物６；Ｃ６）、２．４３：１（Ｃ７）および１．７：１（Ｃ８）とするもの、とともに最終容量５０μｌ（必要であれば水で埋め合わせる）で２５℃で一晩インキュベートした。抗体のないコントロールの共役物も準備した（Ｃ５）。それぞれの共役物の一部をブロッカー中に１／１０，０００で希釈し（たとえば、一定の骨格細胞濃度を得るため）、他の一組の希釈物を０．１μｌ／ｍｌに固定化された抗体濃度（共役物に依存して、１／１０，０００希釈またはそれ以上）を得るように調製した。サンプルを２つの分析で試験した。（ｉ）ウサギＩｇＧプレート使用のＥＬＩＳＡ。２５℃で１時間インキュベートした後、プレートをＴＢＳで洗浄して、ウェルを１／２，５００ストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＃８５７−０００５）で２５℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ＨＲＰをＡＢＴＳ試薬（ｐＨ５．０の５０ｍＭ酢酸ナトリウム中の１ｍＭ  ＡＢＴＳ、試薬１ｍｌあたり１μｌのＨ2Ｏ2を含む）を用いて検出した。（ｉｉ）ストレプトアビジンプレートを用いた捕捉分析。２５℃で1時間インキュベートした後、プレートをＴＢＳで洗浄し、ウェルをプロテインＡ  ＨＲＰとともに２５℃で１時間インキュベートした。洗浄後、捕捉化ヤギ抗体−骨格共役物に結合したプロテインＡ−ＨＲＰを、ＡＢＴＳ基板を用いて検出した。結果を図３に示す。
【００７３】
パネルＡに示されるように、ウサギＩｇＧ  ＥＬＩＳＡでは、共役物が固定濃度の抗体中に希釈された時は、骨格の抗体に対する比率が最も高いものが、最大シグナルを示す。ウサギＩｇＧ被覆ウェル上の共役物８（Ｃ８）への比較的中程度のシグナルは、抗体分子当たり、骨格単位の付着がより少ないことに起因すると思われる。コントロールウェル（被覆されていないＩｇＧ）への結合は全てのケースで低い。パネルＢでは、固定された骨格分子濃度において、Ｃ７およびＣ６に比べて、Ｃ８でのより高い抗体濃度は、抗体分子当たりの骨格分子の数の少なさを補うだけではなく、全ての３つの共役物は、比較的高い吸光度を与える。固定抗体濃度を用いたストレプトアビジン分析（パネルＣ）は、パネルＡで見られたのと逆の傾向であった。この観察結果は、（ｉ）固定化ストレプトアビジンとの結合において、抗体共役物と競合する、遊離骨格の量が増大したこと、および（ｉｉ）Ｆｃ抗体ドメインのプロテインＡ−ＨＲＰとの結合相互作用を阻害する、抗体あたりの骨格単位の数が増大したこと、による共役物Ｃ８からＣ６への、一つの向上として説明するのがもっともふさわしい。しかし、Ｃ６は固定化ウサギＩｇＧに効率的に結合するため（パネルＡ）（Ｆｃ領域を介さない）、遊離ビオチン化骨格の水準が、Ｃ６のストレプトアビジンプレートへの結合の低さを説明するのによりふさわいしい。実際、３つの共役物のＳＤＳゲル（データは示していない）は、Ｃ６中の遊離骨格の優位な水準を明らかにし、その水準では骨格分子の抗体に対する比率は比較的高かった。ストレプトアビジン表面での骨格−抗体共役物の捕捉は、ただ一つの骨格と、一つの好ましい位置に置かれたビオチン分子を必要とするため、骨格分子の抗体に対する低いモル比率は、この種類の適用には好ましい。一方、ビオチン化骨格がストレプトアビジン系検出試薬の捕捉に使用された場合、骨格分子の抗体に対する比較的高いモル比率が、分析感度を高めるため好ましく、そしてこの状況下で、いずれの共役していない骨格を簡単に洗浄できる。これらのデータは、共役性能は分析形態に依存し、モル比率の単純な変化を、性能を最適化し、更なる精製の必要性なく共役物を作製するために使用できることを示している。
【００７４】
実施例６．オボアルブミン骨格上のビオチン密度の最適化
ｐＨ７．２の１００ｍＭリン酸ナトリウム中の４０ｍｇ／ｍｌ（約０．８７ｍＭ；１２５μｌ；５ｍｇ）のオボアルブミン（Ａ５５０５；ロット  ０７６Ｋ７０４５）の一定量を、１．２５μｌのＤＭＳＯ中のＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ  ２１３３５）（１０ｍＭ、３０ｍＭまたは６０ｍＭ）の３つの溶液のうちの一つ、またはＤＭＳＯ溶液のみ（コントロール骨格）と反応させた。２５℃で１時間経過後に、１３．５μｌのスルホ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（ｓＳＭＣＣ）をＤＭＳＯ中の２００ｍＭストックから添加して、ｓＳＭＣＣおよびオボアルブミンの最終濃度１７．９ｍＭおよび約０．７２ｍＭをそれぞれ得た。２５℃で１時間後、サンプル（１５１μｌ）を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（ＮＡＰ−５カラム；ＧＥ  Ｈｅａｒｌｔｈｃａｒｅ社製）で脱塩して、４００μｌのｐＨ５．８の１０ｍＭリン酸ナトリウムの中に入れ、５０μｌのｐＨ５．８のリン酸ナトリウム緩衝液および、５０μｌの３３％トレハロースストック（トレハロース１ｇと水２ｍｌから調製）を加えて、５００μｌとした。骨格分子のそれぞれの種類の５μｌの一定量を、５μｌのヤギ抗ウサギＩｇＧ（１０ｍｇ／ｍｌ）、２μｌのｐＨ７．５の２Ｍ  Ｈｅｐｅｓ／１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、６μｌの水、および最後に２μｌの２−ＩＴ（８ｍＭ）と混合した。２５℃で一晩インキュベートした後、共役物をウサギＩｇＧプレート上で、２５℃で１時間インキュベートした（実施例２）。洗浄後、ウェルを１／１０，０００ストレプトアビジンＨＲＰで２５℃で１時間インキュベートして、実施例５に従ってＡＢＴＳ基板でＨＲＰ検出をする前に洗浄した。
【００７５】
図４に見られるように、骨格分子上にビオチンが存在しない時は（四角）、バックグラウンド結合のみが見られた。１ｍＭ（白丸）、３ｍＭ（三角）または６ｍＭ（黒丸）のビオチンＮＨＳエステルと調製された骨格分子から調整された共役物は、すべて１／１０，０００の共役物希釈において、かなりの結合を示したが、６ｍＭビオチンと調製された共役物がもっとも大きな吸光度を示し、これはこの共役物が他の共役物より、より多くのストレプトアビジンＨＲＰを捕捉できたからであろう。
【００７６】
実施例７．ｓＳＭＣＣ量の最適化
ｐＨ７．２の１００ｍＭリン酸ナトリウム中の４０ｍｇ／ｍｌ（約０．８７ｍＭ；１２５μｌ；５ｍｇ）のオボアルブミン（Ａ５５０５；ロット  ０７６Ｋ７０４５）の４つの一定量を、それぞれ１．２５μｌのＤＭＳＯ中の６０ｍＭのＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ  ２１３３５）と反応させた。２５℃で１時間経過後に、サンプルを１３．５μｌのスルホ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（ｓＳＭＣＣ）の３種類の濃度（２００ｍＭ、１００ｍＭまたは５０ｍＭ）のうちの一つ、またはＤＭＳＯのみと反応させて、ｓＳＭＣＣの最終濃度１７．９ｍＭ、８．９ｍＭ、４．５ｍＭおよび０ｍＭをそれぞれ得た。２５℃で１時間経過後、サンプル（１５１μｌ）を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（ＮＡＰ−５カラム；ＧＥ  Ｈｅａｒｌｔｈｃａｒｅ社製）で脱塩して、４００μｌのｐＨ５．８の１０ｍＭリン酸ナトリウムの中に入れ、５０μｌのｐＨ５．８のリン酸ナトリウム緩衝液および、５０μｌの３３％トレハロースストック（トレハロース１ｇと水２ｍｌから調製）を加えて、５００μｌとした。共役物が配置され、実施例６に記載されたとおりに、ＥＬＩＳＡで分析された。
【００７７】
図５に見られるように、ｓＳＭＣＣを欠如した骨格から調製された抗体共役物は、比較的低い吸光度を示した（四角）。少なくとも１０ｍＭのｓＳＭＣＣ濃度（白丸）が、最大吸光度値付近に到達するために必要であった。この吸光度は５ｍＭ  ｓＳＭＣＣ（三角）よりもかなり高い値であって、２０ｍＭ  ｓＳＭＣＣ（黒丸）から得られたのと同等の値を示した。
【００７８】
実施例８．イソチオシアネートＳＭＬｓを有する骨格分子の調製
ｐＨ９．２のリン酸ナトリウム中の４０ｍｇ／ｍｌオボアルブミンを、２．５ｍＭ  フルオロセインイソチオシアネート（２５ｍＭ  ＤＭＳＯストックから）と、暗所で２５℃で３時間反応させた。サンプルを脱塩してｐＨ７．２の１００ｍＭリン酸ナトリウムに入れ緩衝液を交換し、２０ｍｇ／ｍｌに調製した。ｓＳＭＣＣを、ＤＭＳＯ中の２００ｍＭストックから、最終濃度が１０ｍＭとなるように添加した。さらに２５℃で１時間インキュベートした後、サンプルを脱塩して、ｐＨ５．８のリン酸ナトリウムに入れた。
【００７９】
実施例９．アミノ化デキストラン骨格の製造
９Ａ．アルデヒド誘導体を介して、デキストラン（水中８０ｍｇ／ｍｌ；０．５ｍｌ）で分子量８０，０００（たとえば、１ｍＭ濃度）のものを、１００μｌの５００ｍＭ  過ヨウ素酸ナトリウムと暗所で２５℃で１時間反応させた。活性化デキストラン（０．６ｍｌ）を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５（ＮＡＰ−５カラム；ＧＥ  Ｈｅａｒｌｔｈｃａｒｅ社製）で脱塩して、０．１５Ｍ塩化ナトリウムに入れた（最終容量１．３ｍｌ）。ｐＨ９．２の１５０μｌの重炭酸ナトリウム／１０％（ｖ／ｖ）２，２−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）［ＥＤＴＡ］を添加して、２５℃で３０分経過後、得られたシッフ塩基を５０ｍＭのホウ素化水素ナトリウム（１Ｍ  ＮａＯＨからの５Ｍストック）で減少させた。３０分後、アミノ化デキストランをＰＤ１０カラムを用いて脱塩して、０．１５Ｍ  ＮａＣｌに入れて、０．５ｍｌ分を採取した。アミン陽性の早期に溶出する高分子量物質（ＴＮＢＳテストを使用；Bioconjugates techniques, GT Hermanson ISBN 0-12-342336-8,p112）を貯蔵した。貯蔵液中のアミン顔料は、１モルのデキストランあたり〜２５モルであった。
【００８０】
９Ｂ．カルボキシメチル（ＣＭ）誘導体を介して、５ｇのデキストラン（１５０ｋＤまたは４００−５００ｋＤａ）に、新たに調製された５０ｍｌの１Ｍ  ブロモ酢酸／２Ｍ  ＮａＯＨを添加し、１分間しっかりと振動させ、２５℃で２４時間穏やかに混合した。ＣＭデキストランをＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム上で脱塩して、ｐＨ６．０（ＮａＯＨで調整）の５０ｍＭ  ＭＥＳに入れた。ｐＨ６．０の５０ｍＭ  ＭＥＳ中の１０ｍｌのＣＭ−デキストラン（〜６７ｍｇ／ｍｌ）に、ｐＨ６．０の２ｍｌの０．５Ｍ  ＭＥＳ／２Ｍ  エチレンジアミン、および１．３ｍｌの１Ｍ  ＥＤＣ［１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩］を添加した。反応を２５℃で１６時間進め、得られたアミノ化デキストランをＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラム上で脱塩して、ｐＨ７．２の０．１Ｍ  リン酸ナトリウムに入れた。アミン置換は、１５０ｋＤａデキストラン１モル当たり〜１７モルであり、４００−５００ｋＤａデキストラン１モル当たり＞６１モルであった。
【００８１】
実施例１０．追加のアミンをオボアルブミン骨格に導入するためのカルボキシル官能基の修飾
ｐＨ６．０の５０ｍＭ  ＭＥＳ中の３７５μｌのオボアルブミンを、ｐＨ６の５０ｍＭ  ＭＥＳ中の３００μｌの１Ｍ  ＥＤＢＡに添加した。７５μｌのＥＤＣを、ｐＨ６の５０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝液に添加した。オボアルブミンの架橋を防止するために過剰ジアミン（ＥＤＢＡ）を使用することで、カルボキシル（および、ひいてはアミンの導入）の転換度をＥＤＣ量を制限して調節する。１００ｍＭ、２０ｍＭおよび４ｍＭ  ＥＤＣ（およびコントロール用の０ｍＭ）のストック濃度（最終濃度が、それぞれ１０、２、０．４および０ｍＭ）を使用した。より大きなストック濃度は（５００ｍＭまたは１ｍＭ  ＥＤＣ）、より多くの数のアミンを導入したが、さらにｓＳＭＣＣと反応したときに、沈殿したアミノ化骨格分子をもたらした。アミノ化骨格分子は、過剰ジアミン、ＥＤＣおよび反応副産物を除去するために、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ中で平衡化されたＰＤ１０上で脱塩された。脱塩化サンプルの最終量は１．２５ｍｌであった。ＴＮＢＳ試薬を用いたアミン含量の評価は、過剰ジアミン存在下の１０、２および０．４ｍＭ  ＥＤＣによる処理は、それぞれ、一つの骨格分子当たり、６、１および０個の新規アミン基を導入したことを示した。
【００８２】
実施例１１．ヨードアセトアミドとの反応のためのチオール化オボアルブミン骨格分子の製造
ジアミンＥＤＢＡをシスタミンに代えた以外は、実施例１０に記載されているとおりに反応を開始した。２５℃で一晩インキュベーションした後、サンプルをＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５で脱塩して、ｐＨ８の１００ｍＭのリン酸ナトリウム中に入れた。１２５μｌの４０ｍｇ／ｍｌ  ＤＴＴを添加して、室温で３０分間インキュベートした後に、サンプルを脱塩して、ｐＨ７．２の１００ｍＭのリン酸ナトリウムに入れた。チオール化サンプルを、迅速に２−３倍の過剰モル（チオールに対して）のヨードアセチル−ＬＣビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ  ２１３３３、ロットＤＧ５６０２８）と、暗所で２５℃で３時間反応させて、脱塩してｐＨ７．２の１００ｍＭリン酸ナトリウムに入れ、その後、他の骨格−ＳＭＬ分子で記載されたように（たとえば、実施例７）、さらなる工程を行なった。
【００８３】
実施例１２．ポリ−ヨードアセチル  フルオロセイン化デキストラン（４０ｋＤ）骨格分子の製造
ｐＨ７．２の１００ｍＭのリン酸ナトリウム中の、アミノデキストランで分子量４０，０００（１モル当たり、９．３モルのアミン）（分子プローブ、Ｄ１８６１）（４０ｍｇ／ｍｌ；１ｍＭ）を、ＤＭＳＯ中の１００μｌの５−（および６−）カルボキシフルオロセインスクシンイミジルエステル（分子プローブＣ１３１１；ロット２５５４７Ｗ）と、暗所で２５℃で１６時間反応させた。２００μｌの骨格分子を、さらにＤＭＳＯ中の２０μｌの２００ｍＭのヨード酢酸ＮＨＳエステルと、暗所で２５℃で１時間反応させた。２２０μｌのサンプルをＮＡＰ−５カラム上で脱塩して、４５０μｌのｐＨ５．８の１０ｍＭのリン酸ナトリウム中に入れ、３３％トレハロースストック（トレハロース１ｇと水２ｍｌから調製）を加えて、５００μｌとした。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（５ｍｇ／ｍｌ）との共役を、以下の順で混合して、８μｌの水、６μｌの骨格／緩衝液混合物［４μｌの骨格＋２μｌのｐＨ７．５の２Ｍ  Ｈｅｐｅｓ／１０ｍＭ  ＥＤＴＡ］、４μｌのＩｇＧおよび２μｌの８ｍＭの２−イミノチオラン塩酸塩、暗所で２５℃で一晩反応させて行われた。
【００８４】
実施例１３．１５０ｋＤおよび４００−５００ｋＤ  ポリ−マレイミドフルオロセイン化デキストランで調製された共役物の比較。コントロールウェルの蛍光発光シグナルは、全ての４つの共役物（Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈの棒）で低かった。
【００８５】
アミノ化デキストラン（実施例２Ｂの記載に従って調製）（０．２５ｍｌ）を、５−（および６−）カルボキシフルオロセインスクシンイミジルエステル（４．５μｌのＤＭＳＯ中の１００ｍＭストック）（最終濃度〜１．８ｍＭ）と反応させた。２５℃で１時間後、スルホ−ＳＭＣＣ（７．５μｌのＤＭＳＯ中の２００ｍＭストック）（最終濃度＝６ｍＭ）を添加した。ポリ−マレイミドフルオロセン化デキストラン（１５０ｋＤａおよび４００−５００ｋＤａ）をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５カラム（ＰＤ１０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）上で脱塩して、ｐＨ５．６の１０ｍＭリン酸ナトリウムに入れた（溶出量  １．５ｍｌ）。さらに、２．５５ｍｌの水、０．４５ｍｌのトレハロース（１ｇ＋２ｍｌの水）および２２．５μｌの２−イミノチオラン塩酸塩（８０ｍＭストック；最終濃度〜４００μＭ）を添加した。それぞれのポリ−マレイミドフルオロセン化デキストラン（〜２．５ｍｇ  デキストラン／ｍｌ）の一定量（４０μｌ）を凍結乾燥した。
【００８６】
ヤギ抗ウサギＩｇＧ（２１．６ｍｇ／ｍｌ）を、１部のｐＨ７．５の２Ｍ  Ｈｅｐｅｓ／１０ｍＭ  ＥＤＴＡと、９部の水を混合して調製された希釈液を使用して、２．５ｍｇ／ｍｌに希釈した（ストックＸ）。さらに、ストックＸの１／３希釈を、０．８３２５ｍｇ／ｍｌ（ストックＹ）および０．２７７ｍｇ／ｍｌ（ストックＺ）の溶液を得るために調製した。凍結乾燥ポリ−マレイミドフルオロセイン化  １５０ｋＤａ  デキストランのバイアルを、４０μｌの抗体ストックＸ（たとえば、１００μｇ抗体；１：１  抗体：デキストラン比）またはストックＹ（たとえば、３３．３μｇ抗体；１：３  抗体：デキストラン比）で再構成された。凍結乾燥ポリ−マレイミド  フルオロセイン化  ４００−５００ｋＤａ  デキストランのバイアルが、４０μｌの抗体ストックＹ（たとえば、３３．３μｇ抗体；１：３  抗体：デキストラン比）またはストックＺ（たとえば、１１．１μｇ抗体；１：３  抗体：デキストラン比）で再構成した。５時間後に、共役物を、抗体に関して濃度を正常にするために、ＴＢＳ／０．１％  ＢＳＡを適切量を用いて、４μｇ／ｍｌとなるように希釈した。
【００８７】
共役物を、実施例３の記載に従って、ウサギＩｇＧ−被覆プレート（実施例２）で試験した。図６に見られるように、抗体：デキストランのモル比が１：１では、４００−５００ｋＤａデキストラン共役物（棒Ｂ）から得られたシグナルは、１５０ｋＤａデキストラン共役物（棒Ａ）のシグナルの２倍以上であり、これはデキストラン１分子当たりの、より大きな表面積とより多くの数の付着顔料分子を反映している。この違いは、デキストラン骨格が３：１モル以上の場合は顕著さが減少するが、４００−５００ｋＤａデキストランの蛍光発光シグナル（棒Ｄ）は、それでも、１５０ｋＤａデキストラン（棒Ｃ）よりも非常に高い。小骨格分子の複数の接着（棒Ｃ；３：１  デキストラン：抗体比）は、４００−５００ｋＤａ骨格分子を、１：１  デキストラン：抗体比で調製したのと同様に大きなシグナルを有する共役物を与える。コントロールウェル上の蛍光発光シグナルは、全ての共役物で低かった（棒Ｅ，Ｆ，ＧおよびＨ）。
【００８８】
実施例１４．ＳＭＣＣの消光効果
ポリアミド−フルオロセイン化デキストラン骨格分子（実施例１３）のサンプルが、４０μｌのｐＨ７．０の２００ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ／１ｍＭ  ＥＤＴＡまたは水（コントロール、ｐＨ５．８）に取り込まれた。Ｈｅｐｅｓ緩衝液中に取り込まれたサンプルは、４μｌの様々な試薬で処理された：ｐＨ２．３の１．４３ｍＭメルカプトエタノール／５０ｍＭグリシン；ｐＨ２．３の１．４３ｍＭメルカプトエタノール／５０ｍＭグリシン；ｐＨ７．５の５０ｍＭグリシン、または水。サンプルを、蛍光発光プレートリーダーの直線範囲に入るシグナルを示すように希釈した。結果を図６に示す。蛍光発光はメルカプトエタノールによって優位に増加し、プロセスは３０分以内に完了した（最終濃度１．４３ｍＭ）。より高い濃度は、さらに蛍光発光を上昇させなかった（図示なし）。最終濃度０．１４３ｍＭは最大蛍光発光を示すのに不十分であり、安定したシグナルに達するまでに、少なくとも１２０分間かかった。低分子量チオールを放出する２−イミノチオラン塩酸塩の分解を促進するグリシンの添加も、蛍光発光を促進した。この促進は３０分以内に完了したが、高濃度のメルカプトエタノールに比べて優位に顕著でなかった。ｐＨ５．８での蛍光発光の経時的変化はなく、中和ｐＨ値で、グリシンまたはメルカプトエタノールの不存在下では、蛍光発光のわずかな増加が５時間後に示され、これはマレイミド官能基のゆっくりとした分解によって説明されるであろう。なぜＳＭＣＣがポリマレイミド−フルオロセイン化骨格を消光するのか明らかでないが、消光効果は、２−イミノチオラン塩酸塩を不活性化させるメルカプトエタノール／グリシンの混合物を使用すること、および迅速に過剰のマレイミド官能基の消光効果を緩和させるチオールを用いた付加反応を通じて、容易に逆になる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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