(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
互いに異なる波長のストークス光、ポンプ光及び探針光を選択的に照射して複合レーザービームを発生させる近赤外線パルスレーザーユニット；
前記近赤外線パルスレーザーユニットから伝達された複合レーザービームが照射される試料が装着されたプラットホーム；
前記試料で発生したＣＡＲＳ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ａｎｔｉ−ｓｔｏｋｅｓ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）信号を収集してスペクトルを検出する広帯域マルチフレックスＣＡＲＳ顕微分光ユニット；
前記試料で発生したＣＡＲＳ信号を収集して立体映像を提供するＥｎ ｆａｃｅ ＣＡＲＳイメージモード検出ユニット；及び
前記ストークス光、前記ポンプ光および前記探針光の照射により前記試料で発生したＣＡＲＳ信号を前記広帯域マルチフレックスＣＡＲＳ顕微分光ユニットに伝達するスペクトルモード位置と、前記ストークス光と前記ポンプ光の照射により前記試料で発生したＣＡＲＳ信号を前記Ｅｎ ｆａｃｅ ＣＡＲＳイメージモード検出ユニットに伝達するイメージモード位置との間で選択的に移動可能な２色性ミラーを含む、血管内脂質の病理的変化診断システムにおいて、
前記近赤外線パルスレーザーユニットが、ピコ秒の狭帯域ストークス光とフェムト秒の広帯域ポンプ光を心血管組織試料に照射して散乱されるＣＡＲＳ脂質信号を前記Ｅｎ ｆａｃｅ ＣＡＲＳイメージモード検出ユニットに伝達するイメージモード位置に前記２色性ミラーを移動する段階；
前記ＣＡＲＳ脂質信号の総強度を測定する段階；
前記ＣＡＲＳ脂質信号の総強度を利用して、３次元イメージとして検出する段階；及び
前記イメージから脂質の構造を分析する段階；をコンピュータに実行させる、血管内脂質の非破壊的病理的変化診断プログラム。
【請求項２】
血管内脂質の病理的変化が動脈硬化病斑である、請求項１に記載の血管内脂質の非破壊的病理的変化診断プログラム。
【請求項３】
互いに異なる波長のストークス光、ポンプ光及び探針光を選択的に照射して複合レーザービームを発生させる近赤外線パルスレーザーユニット；
前記近赤外線パルスレーザーユニットから伝達された複合レーザービームが照射される試料が装着されたプラットホーム；
前記試料で発生したＣＡＲＳ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ａｎｔｉ−ｓｔｏｋｅｓ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）信号を収集してスペクトルを検出する広帯域マルチフレックスＣＡＲＳ顕微分光ユニット；
前記試料で発生したＣＡＲＳ信号を収集して立体映像を提供するＥｎ ｆａｃｅ ＣＡＲＳイメージモード検出ユニット；及び
前記ストークス光、前記ポンプ光および前記探針光の照射により前記試料で発生したＣＡＲＳ信号を前記広帯域マルチフレックスＣＡＲＳ顕微分光ユニットに伝達するスペクトルモード位置と、前記ストークス光と前記ポンプ光の照射により前記試料で発生したＣＡＲＳ信号を前記Ｅｎ ｆａｃｅ ＣＡＲＳイメージモード検出ユニットに伝達するイメージモード位置との間で選択的に移動可能な２色性ミラーを含む、血管内脂質の病理的変化診断システムにおいて、
前記近赤外線パルスレーザーユニットが、ピコ秒の狭帯域ストークス光、フェムト秒の広帯域ポンプ光及びピコ秒の狭帯域探針光を心血管組織試料に照射して散乱されるＣＡＲＳ脂質信号を前記広帯域マルチフレックスＣＡＲＳ顕微分光ユニットに伝達するスペクトルモード位置に前記２色性ミラーを移動する段階；
前記ＣＡＲＳ脂質信号の波長及び強度を測定する段階；
前記ＣＡＲＳ脂質信号をスペクトルとして検出する段階；及び
前記スペクトルから脂質構造のスペクトルピークを分析する段階；をコンピュータに実行させる、血管内脂質の非破壊的病理的変化診断プログラム。
【請求項４】
血管内脂質の病理的変化が動脈硬化病斑である、請求項３に記載の血管内脂質の非破壊的病理的変化診断プログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は非線形光学顕微鏡を用いた血管内脂質の病理的変化診断システムに係り、より詳しくは非線形光学顕微鏡を用いて血管のいかなる標識や破壊もなしに血管内壁に非正常的に沈着した微細脂質をイメージ化するとともにイメージ化した脂質の成分を分析して血管の微細な病理学的変化を診断することで脂質関連疾病の進行段階を判断することができる非線形光学顕微鏡を用いた血管内脂質の病理的変化診断システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
脂質は動脈硬化の進行段階に連関されている。動脈硬化の初期段階で、脂質の滞留は主要な開始事象であると思われている。いわゆる“内膜滞留による現象（ｒｅｓｐｏｎｓｅ−ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）”仮説に対する具体的な事項は明かされていないが、動脈硬化性脂蛋白が内膜に蓄積し、粥腫発生（ａｔｈｅｒｏｇｅｎｅｓｉｓ）が誘導されると強調している。このモデルによれば、浸透した脂蛋白は細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｍａｔｒｉｘ、ＥＣＭ）、特にプロテオグリカン（ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）と結合し、これら脂蛋白−プロテオグリカン複合体は分泌されたサイトカインと脂質を含む泡沫細胞（ｆｏａｍ ｃｅｌｌ）の分化によるマクロファージの募集のような動脈硬化現象を誘導する。一方、脂質含量は進行段階で動脈硬化病斑脆弱性を決める決定的な役目をする。傷つきやすい病斑はコラーゲンが多い中心部の代わりに脂質が多い中心部のソフトグルーアル（ｓｏｆｔ ｇｒｕｅｌ）段階を含む。事実上、病巣の脂質成分は病斑破裂と血栓症に直接連関されているといういくつかの研究が報告されている。進行されたアテローム性中心部（ａｔｈｅｒｏｍａｔｏｕｓ ｃｏｒｅ）にはコレステロール（遊離型及びエステル化した型の両者）、リン脂質、トリアシルグリセロール、及び脂肪酸を含む。主要構成成分であるコレステロールは、板型、針型そして時々ヘリックス型などの多様な外形を持つ結晶の形態として存在することができる。細胞膜コレステロールとは異なり、進行した病斑で観察されるコレステロール結晶構造は細胞外脂質であり、活性がない。最近、Ｖｉｒｍａｎｉらは破裂した病斑は切断された冠状動脈で浸食または安定した病斑よりは壊疽中心部でコレステロールクレフトまたは結晶を含み潜在的に病斑脆弱性を示すものであると報告したことがある。
【０００３】
一般に、動脈硬化病巣は適切なイメージ化様式がないため、個々の動脈硬化病巣の形態的及び化学的組成物よりは狭くなった動脈内腔を評価して測定している。従来には、血管造影剤などを投与して内腔充填欠陥（ｌｕｍｉｎａｌ ｆｉｌｌｉｎｇ ｄｅｆｅｃｔ）を判読し、全身性イメージ化（ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｍａｇｉｎｇ）で動脈硬化を診断したが、最近には各病変個体の異質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ）が認められるため、血管壁そのもののイメージ化が非常に必要な実情である。しかし、血管壁の微細病理学的判読のためには、組織の損傷をもたらす染色を行わなければならない。また、横断面積（ｃｒｏｓｓ−ｓｅｃｔｉｏｎａｌ）イメージのみを得ることができるので、組織に存在する状態で判読を行うことは非常に難しいことである。また、どんな染色の場合でも各脂質の成分をイメージ上で分析することは不可能なことであった。
【０００４】
動脈硬化の診断において重要な尺度は次のようである。本格的な脂質の沈着はマクロファージ（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）と言う特定の兔疫細胞によって進み、活性化したマクロファージは過量の脂質を含み、泡沫細胞（ｆｏａｍ ｃｅｌｌ）に分化することになる。このような泡沫細胞の登場は動脈硬化の重要な尺度として認識されているが、現在のイメージ化技術によって組織内にある泡沫細胞をイメージ化することは不可能なことであった。また、非常に深化した段階の動脈硬化においてはコレステロールが結晶状態（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｃｒｙｓｔａｌｓ）で存在し、深化した程度によってコレステロール結晶の量が違うことになる。コレステロール結晶も組織の破壊なしにイメージ化することは現在のイメージ化技術によっては不可能である。
【０００５】
一方、非線形光学顕微鏡（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ａｎｔｉ−ｓｔｏｋｅｓ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ（ＣＡＲＳ） ｍｉｃｒｏｃｏｐｙ）は最近標的分子の標識及び標本固定なしに生体内分子振動を追跡して生体内組織の３次元化学的イメージ化のための最も実用的な手段として台頭した。ＣＡＲＳ顕微鏡は、蛍光標識技術の好ましくないバイアスが立証されたため、生きている生物体において脂質代謝に対する実物大きさの生物学的研究に用いられてきた。近年、生体内皮膚組織をイメージ化するためのビデオレートＣＡＲＳ顕微鏡が開発された。ＣＡＲＳプロセスの非線形特徴のため、標本に対する緻密な焦点の早いスキャニングは従来のラマン顕微鏡とは異なり、３次元超微細分割による振動差によるイメージの実時間収集が可能である。周辺組織と比較し、２７００〜３０００ｃｍ−１のＣＡＲＳスペクトルで強くて特徴的な振動サインを示しながら炭化水素結合が豊かであるため、ＣＡＲＳ顕微鏡は特に脂質の選択的イメージ化に適している。しかし、脂質組成物を超えて単純な振動組織学の細密な化学的分析は依然としてＣＡＲＳ測定によっては限界がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】韓国公開特許第１０−２００９−００２４９６５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、血管壁の内部をいかなる標識や破壊なしにｅｎ−ｆａｃｅマイクロイメージ化し各構造体の化学的成分を直接分析して微細な病理学的変化を診断するシステムを提供することである。
【０００８】
本発明の他の目的は、前記システムを用いて血管内脂質の病理的変化を診断する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記目的を達成するために、本発明は、互いに異なる波長のストークス光、ポンプ光及び探針光を選択的に照射して複合レーザービームを発生させる近赤外線パルスレーザーユニット；前記近赤外線パルスレーザーユニットから伝達された複合レーザービームが照射される試料が装着されたプラットホーム；前記試料で発生したＣＡＲＳ信号を収集してスペクトルを検出する広帯域マルチフレックスＣＡＲＳ顕微分光ユニット；前記試料で発生したＣＡＲＳ信号を収集して立体映像を提供するＥｎ ｆａｃｅ ＣＡＲＳイメージモード検出ユニット；及び前記ストークス光、前記ポンプ光および前記探針光の照射により前記試料で発生したＣＡＲＳ信号を前記広帯域マルチフレックスＣＡＲＳ顕微分光ユニットに伝達するスペクトルモード位置と、前記ストークス光と前記ポンプ光の照射により前記試料で発生したＣＡＲＳ信号を前記Ｅｎ ｆａｃｅ ＣＡＲＳイメージモード検出ユニットに伝達するイメージモード位置との間で選択的に移動可能な２色性ミラーを含む、血管内脂質の病理的変化診断システムを提供する。
【００１０】
また、本発明は、上記病理的変化診断システムにおいて、前記近赤外線パルスレーザーユニットが、ピコ秒の狭帯域ストークス光とフェムト秒の広帯域ポンプ光を心血管組織試料に照射して散乱されるＣＡＲＳ脂質信号を前記Ｅｎ ｆａｃｅ ＣＡＲＳイメージモード検出ユニットに伝達するイメージモード位置に前記２色性ミラーを移動する段階；前記ＣＡＲＳ脂質信号の総強度を測定する段階；前記ＣＡＲＳ脂質信号の総強度を利用して、３次元イメージとして検出する段階；及び前記イメージから脂質の構造を分析する段階をコンピュータに実行させる、血管内脂質の非破壊的病理的変化診断プログラムを提供する。
【００１１】
また、本発明は、上記病理的変化診断システムにおいて、前記近赤外線パルスレーザーユニットが、ピコ秒の狭帯域ストークス光、フェムト秒の広帯域ポンプ光及びピコ秒の狭帯域探針光を心血管組織試料に照射して散乱されるＣＡＲＳ脂質信号を前記広帯域マルチフレックスＣＡＲＳ顕微分光ユニットに伝達するスペクトルモード位置に前記２色性ミラーを移動する段階；前記ＣＡＲＳ脂質信号の波長及び強度を測定する段階；前記ＣＡＲＳ脂質信号をスペクトルとして検出する段階；及び前記スペクトルから脂質構造のスペクトルピークを分析する段階をコンピュータに実行させる、血管内脂質の非破壊的病理的変化診断プログラムを提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は染色または切断による組織損傷なしにかつ標識なしに３次元的に血管内脂質を選択的にイメージ化することで動脈硬化の進行段階を診断することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の脂質選択的３次元イメージ化及び点スペクトル分析が可能なＣＡＲＳ顕微鏡測定プラットホームを示す図である。
【図２】（ａ）は広帯域ポンプレーザー励起を含む三原色マルチフレックスＣＡＲＳのエネルギー図表を示すもので、（ｂ）は探針レーザービームなしに、早い脂質−ウィンドウイメージ化のための多数の脂質関連ラマン（Ｒａｍａｎ）共鳴によって発生した２原色励起反ストークス信号の広帯域統合検出を示すものであり、（ｃ）はそれぞれの分離された探針レーザーを追加して実施したマルチフレックスＣＡＲＳスペクトル分析を示すものである。
【図３】動脈硬化病斑に対する標識がない脂質選択的ＣＡＲＳイメージ化結果を示すもので、（ａ）はＣＡＲＳによる動脈硬化病斑のｓｅｒｉａｌ ｅｎ ｆａｃｅイメージの３次元復元結果を示すものであり、（ｂ）は（ａ）イメージを４６倍に示すものである。
【図４】単一動脈硬化病斑に対する標識がない脂質選択的ＣＡＲＳイメージ化結果を示すもので、（ａ）はＣＡＲＳイメージの３次元表現を示すものであり、（ｂ）は表面層で泡沫細胞、及び深層内膜（ｄｅｅｐ ｉｎｔｉｍａ）から板状脂質結晶と細胞外脂質沈着物を含み具体的な脂質構造を観察するために動脈硬化病斑の３次元イメージ化を２次元形態に示すものであり、挿入されたインデックスはＣＨ結合振動に係わるＣＡＲＳ強度を示すものであり、白色枠は３次元ＣＡＲＳイメージにおいて動脈硬化病斑の半球状形態を示すものである。
【図５】ヒトの動脈硬化の頸動脈のＣＡＲＳイメージを示すもので、（ａ）は核にあたる濃い内部空間を持つ表面領域で脂質が豊かな泡沫細胞であり、（ｂ）は壊疽中心部において板状及び針状脂質結晶を示すものである。
【図６】ＣＡＲＳによって特性が究明されたアポリポタンパク質Ｅ発現抑制（ＡｐｏＥ−／−）マウスにおいて動脈硬化の進行段階を示すものである。
【図７】ＣＡＲＳによる動脈硬化の進行段階による体積分析を示すもので、脂質蓄積及び各脂質構造の大きさに対し、初期（ａ）、中期（ｂ）、及び深化（ｃ）段階別に示すものである。
【図８】ＣＡＲＳによる動脈硬化脂質のｏｎ−ｓｉｔｅスペクトル分析を示すもので、（ａ）〜（ｆ）は動脈硬化脂質を形態的な差によって分類したもので、細胞内（ａ）、細胞外（ｂ）、板状（ｃ）、針状（ｄ）、連結組織から非動脈（ｅ）、及びマトリックスから非脂質（ｆ）を示すものであり、挿入されたイメージはスペクトル分析のために使用された一般的な形態を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の構成を具体的に説明する。
【００１５】
本発明は、
互いに異なる波長のストークス光、ポンプ光及び探針光を選択的に照射して複合レーザービームを発生させる近赤外線パルスレーザーユニット；
前記近赤外線パルスレーザーユニットから伝達された複合レーザービームが照射される試料が装着されたプラットホーム；
前記試料で発生したＣＡＲＳ信号を収集してスペクトルを検出する広帯域マルチフレックスＣＡＲＳ顕微分光ユニット；
前記試料で発生したＣＡＲＳ信号を収集して立体映像を提供するＥｎ ｆａｃｅ ＣＡＲＳイメージモード検出ユニット；及び
前記広帯域マルチフレックスＣＡＲＳ顕微分光ユニットとＥｎ ｆａｃｅ ＣＡＲＳイメージモード検出ユニットの間に配置され、前記試料で発生したＣＡＲＳ信号を選択的に各ユニットに伝達する２色性ミラーを含む血管内脂質の病理的変化診断システムに関するものである。
【００１６】
本発明の血管内脂質の病理的変化診断システムは、脂質の炭化水素の振動によってイメージが明らかに区別される脂質選択的３次元イメージ化と点スペクトル分析が可能であることを特徴とする。
【００１７】
本発明の血管内脂質の病理的変化診断システムを図１に基づいて具体的に説明すれば以下のとおりである。
【００１８】
前記近赤外線パルスレーザーユニットは、互いに異なる波長のストークス光、ポンプ光及び探針光を選択的に照射して複合レーザービームを発生することができ、前記ビームは脂質の炭化水素部分を振動させることで、３次元イメージだけではなく、これによるラマンシフトを同時に評価することができる。
【００１９】
具体的に、脂質の３次元イメージ化のためにストークス光とポンプ光を試料に照射し、探針光は脂質のスペクトル分析のために使うことができるので、３次元イメージ化の際に機械的シャッターによって遮断されることができる。
【００２０】
脂質の３次元イメージ化のために、前記近赤外線パルスレーザーユニットの励起ビームによって得た脂質のＣＡＲＳ信号が全体炭化水素の振動部分を含むように帯域幅は２７００〜３０５０ｃｍ−１であることが好ましい。
【００２１】
また、前記ＣＡＲＳ信号収集時間は１．０ｓ／ｆｒａｍｅであり、空間的密度は左右側面が０．４μｍ、軸方向が１．３μｍであることが好ましい。
【００２２】
また、前記広帯域マルチフレックスＣＡＲＳ顕微分光ユニットは、試料で発生したＣＡＲＳ信号を収集してスペクトルを検出することができ、大韓民国公開特許第１０−２００９−００２４９６５号に開示されたものを使うことができるが、これに特に制限されるものではない。
【００２３】
また、本発明の血管内脂質の病理的変化診断システムは、前記広帯域マルチフレックスＣＡＲＳ顕微分光ユニットとＥｎ ｆａｃｅ ＣＡＲＳイメージモード検出ユニットの間に配置され、前記試料で発生したＣＡＲＳ信号を選択的に各ユニットに伝達する２色性ミラーを含む。
【００２４】
前記２色性ミラーは、１０００ｎｍ未満の波長を反射させるが、それ以上の波長を透過させる特徴を持っている。
【００２５】
前記２色性ミラーを用いて、脂質の３次元イメージ化のためにはストークス光とポンプ光を試料に照射し、６４５〜６７５ｎｍの範囲のＣＡＲＳ脂質信号を帯域透過フィルターを通じて分離し、Ｅｎ ｆａｃｅ ＣＡＲＳイメージモード検出ユニットで検出して３次元イメージを得ることができる。
【００２６】
また、脂質のスペクトル分析のためには、広帯域マルチフレックスＣＡＲＳ顕微分光ユニットをセットアップ転換し、ポイント−スキャンモードでレーザー−スキャナを調整し、試料に探針光を５０〜１５０ｍｓ間照射してマルチフレックスＣＡＲＳ信号を発生させ、前記信号は格子型モノクロメーターを透過してスペクトル分析可能にすることができる。この際、前記探針光は３．５ｃｍ−１以下の狭帯域波長を有することが好ましく、これから発生する反ストークス信号は６２０〜６４０ｎｍ範囲で現れる。
【００２７】
また、本発明の血管内脂質の病理的変化診断システムに使用する試料は何ら固定や染色処理がされていないもので、動物から摘出された組織であれば特に制限されず、例えば動物の心血管組織でもよい。
【００２８】
また、本発明の血管内脂質の病理的変化診断システムによって分析することができる試料の厚さは１００〜１５０μｍの範囲で３次元イメージ化が可能である。
【００２９】
また、本発明の血管内脂質の病理的変化診断システムで診断することができる血管内脂質の病理的変化は動脈硬化病斑であり得る。
【００３０】
一具体例において、本発明の血管内脂質の病理的変化診断システムによって得た脂質の３次元イメージにおいて、初期段階にあたる試料の場合、脂質液滴（泡沫細胞）が表面内膜で観察され、中期段階にあたる試料の場合、脂質液滴の数が著しく増加し、細胞外脂質液滴が血管壁に深く沈着し、脂質液滴が深層内膜で多層板状として観察される。深化段階にあたる試料の場合には、壊疽中心部が内腔側に大きくなっており、コレステロール結晶層が支配的に観察され、泡沫細胞が著しく減少し、繊維の肥厚が観察される。
【００３１】
また、本発明は、
ストークス光とポンプ光を試料に照射して散乱されるＣＡＲＳ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ａｎｔｉ−ｓｔｏｋｅｓ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）脂質信号の波長及び強度を測定する段階；
前記信号を３次元イメージとして検出する段階；及び
前記イメージから脂質の構造を分析する段階を含む血管内脂質の非破壊的病理的変化診断方法に関するものである。
【００３２】
前記試料は何ら固定や染色処理もなされていないもので、動物から摘出された組織であれば特に制限されず、例えば動物の心血管組織でもよい。
【００３３】
前記信号は帯域透過フィルターによって収集され、Ｅｎ ｆａｃｅ ＣＡＲＳイメージモード検出ユニットによって検出されて３次元イメージとして得ることができる。
【００３４】
前記脂質の３次元イメージは、脂質の構造、例えば、脂質液滴、板状、針状として観察され、動物の動脈硬化性血管をイメージ化する場合、動脈硬化の進行段階による特異的な脂質構造を観察することができるだけでなく、脂質の体積及び大きさを分析することができるので、動脈硬化の進行段階を診断することができる。
【００３５】
また、本発明は、
探針光を試料に照射して散乱されるＣＡＲＳ（Ｃｏｈｅｒｅｎｔ Ａｎｔｉ−ｓｔｏｋｅｓ Ｒａｍａｎ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）脂質信号の波長及び強度を測定する段階；
前記信号をスペクトルで検出する段階；及び
前記スペクトルから脂質構造のスペクトルピークを分析する段階を含む血管内脂質の非破壊的病理的変化診断方法に関するものである。
【００３６】
前記試料は何ら固定や染色処理もなされていないもので、動物から摘出された組織であれば特に制限されず、例えば動物の心血管組織でもよい。
【００３７】
前記信号は格子型モノクロメーターを透過して広帯域マルチフレックスＣＡＲＳ顕微分光ユニットによってスペクトルとして検出できる。
【００３８】
前記スペクトルの分析において、一具体例によれば、細胞外及び細胞内脂質液滴のスペクトルは、２８４５ｃｍ−１で一つの主要ピークを示し、板状脂質の場合、四つの主要ピーク、つまり２８８０、２９０５、２９２０、２９５０ｃｍ−１を示し、針状脂質の場合、２９０５、２９２０、２９５０ｃｍ−１で弱いピークを示すので、前記ピークによって脂質の病理的変化を診断することができる。
【００３９】
したがって、脂質の化学的プロファイルは動脈硬化の進行段階を診断するのに適用することができる。
【００４０】
以下、本発明による実施例及び本発明によらない比較例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲が下記に開示する実施例によって制限されるものではない。
【実施例】
【００４１】
＜実施例１＞ＣＡＲＳイメージ化プラットホームの準備
動脈硬化病巣を持つ心血管組織の脂質選択的３次元顕微鏡イメージ化及び点スペクトル分析のために、同じプラットホーム上に広帯域マルチフレックスＣＡＲＳ顕微分光計とレーザー−スキャニングＣＡＲＳ顕微鏡を同時に設置した。
【００４２】
図１に示すように、レーザー−スキャニングＣＡＲＳ顕微鏡は格子型モノクロメーター（ｇｒａｔｉｎｇ ｍｏｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｒ， Ｔｒｉａｘ３２０；Ｈｏｒｉｂａ Ｊｏｂｉｎ Ｙｖｏｎ）が装着されている変形レーザー−スキャニング共焦点顕微鏡（ＩＸ８１／ＦＶ３００；Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｊａｐａｎ）と３色を同時に発生することができるＣＡＲＳ励起ビームを発生する近赤外線（ｎｅａｒ−ＩＲ）パルスレーザーシステムで構成されている。出力電力の１０％を分割し、これをパルス伝送ライン（ｄｅｌａｙ ｌｉｎｅ）を通じて顕微鏡に伝達してＣＡＲＳストークスビームを発生させるために、７６ＭＨｚの反復率で１０Ｗの平均電力で７ｐｓのパルストレーンを伝達する１０６４ｎｍモードロックネオジウムバナデート（Ｎｄ：ＹＶＯ４）レーザー（ｐｉｃｏ Ｔｒａｉｎ；Ｈｉｇｈ Ｑ Ｌａｓｅｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ＧｍｂＨ， Ｈｏｈｅｎｅｍｓ， Ａｕｓｔｒｉａ）を使った。吸収線量（ｉｎｔｒａｃａｖｉｔｙ）二重光学パラメトリックオシレーター（Ｌｅｖａｎｔｅ；ＡＰＥ ＧｍｂＨ， Ｂｅｒｌｉｎ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を同時にポンピングするために、メインポーション（９Ｗ）を使って７７６．７ｎｍの波長で６ｐｓ、７６ＭＨｚのパルストレーンで１．３Ｗ ＣＡＲＳ探針ビームを発生させた。８００ｍＷの平均電力と約３５ｎｍに調整されたパルス帯域幅、７６ＭＨｚで一般の反復率を維持するための１０６４ｎｍ ＣＡＲＳストークスビームとともに活性的に発生する出力パルストレーン及び共振器安定化フィードバックサーボ（ＳｙｎｃｈｒｏＬｏｃｋ−ＡＰ；Ｃｏｈｅｒｅｎｔ，Ｉｎｃ．）を用いて同一パルスタイミングを提供する広帯域フェムト秒モードロックチタン−サファイアレーザーから８１７ｎｍの波長に集中しているマルチフレックスＣＡＲＳポンプビームを発生させた。各ビーム経路（ｐａｔｈ）に位置する望遠鏡のビーム拡大器（ｂｅａｍ ｅｘｐａｎｄｅｒ）が互いにマッチするように各レーザーのビーム直径及びディバージェンス（ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ）を調整した。その後、三つのＣＡＲＳ励起ビームは二つのビーム結合オプティックス（ｂｅａｍ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｏｐｔｉｃｓ）を順次用いて空中で同一線上に重なるようにした。すなわち、ポンプ及び探針ビームは５０：５０の広帯域ビームスプリッタ（ＣＶＩ Ｍｅｌｌｅｓ Ｇｒｉｏｔ， Ａｌｂｕｑｕｅｒｑｕｅ， ＮＭ）に連結され、ストークスビームは７３０〜９６０ｎｍの範囲の近赤外線波長に対して高反射率を有し、１０６４ｎｍでストークスビームに対して高透過率を有する２色性ミラー（ｄｉｃｈｒｏｉｃ  ｍｉｒｒｏｒ， Ｃｈｒｏｍａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ．， Ｒｏｃｋｉｎｇｈａｍ，ＶＴ）に連結した。複合レーザービームは６００ｎｍ以上の波長に対して約９５％の透過率を持つ一対のガルバノメーター−マウントゴールドミラーで構成された二つの軸を持つビームスキャニングユニット（ＦＶ３００）を通じて１．２ＮＡ ６０Ｘ ｗａｔｅｒ−ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ（ＵＰｌａｎＳＡｐｏ ＵＩＳ２；Ｏｌｙｍｐｕｓ）に伝達した。組織試料のレーザーによる損傷を避けるために、ＮＤフィルター（ｎｅｕｔｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｆ��ｌｔｅｒ）で各レーザー出力の電力を減殺して試料を照明する複合レーザービームの平均電力を総４０ｍＷ以下に制限した。
【００４３】
要約すれば、ＣＡＲＳプラットホームを使って標識なしに脂質選択的に化学的イメージ化を遂行するため、ビームの帯域幅を全ＣＨ振動部分を含むようにラマンシフトで２７００〜３０５０ｃｍ−１の範囲に拡張し、多様な変形を受けている動脈硬化性脂質をイメージ化して化学的に分析した。二番目で、標識のないバイオイメージ化のための通常のラマン顕微鏡と比較し、収集時間が１．０ｓ／ｆｒａｍｅであり、空間的密度（ｓｐａｔｉａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）は左右側面で（ｘ−ｙ）０．４μｍであり、軸方向（ｚ−ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）は１．３μｍにすることで、２５０×２５０μｍ２のマキシマムフィールド（ｍａｘｉｍｕｍ ｆｉｅｌｄ）を持つ２次元イメージ化を改善した。三番目で、ＣＡＲＳ顕微鏡は動脈硬化性脂質のスペクトル分析のための広帯域マルチフレックスＣＡＲＳセットアップで易しく転換できるようにした。３次元脂質選択的イメージ化の後、ＣＡＲＳスペクトル分析のための地点を選択し、５０〜１５０ｍｓの間に露出して分析した。
【００４４】
（試料準備）
試料として使うための標本を準備するため、三星ソウル病院（Ｓａｍｓｕｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ，ＳＭＣ）で手術を受けた頸動脈狭窄症患者（６３〜８１歳）から頸動脈内膜切除（ｃａｒｏｔｉｄ ｅｎｄａｒｔｅｒｅｃｔｏｍｙ）標本を得た。ＣＡＲＳ分析のための標本はリン酸塩緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ，ＰＢＳ）に直ちに浸漬させて移動した。また、比較基準として使うために、冠状動脈バイパスグラフト患者から二つの内胸動脈（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｍａｍｍａｒｙ ａｒｔｅｒｙ）標本を得た。本発明はヘルシンキガイドライン宣言によるＳＭＣの臨床試験審査委員会の承認を受け、告知による患者の同意はすべての被検体から得た（ＩＲＢ ２００６−０２−１１）。
【００４５】
（動物実験）
アポリポタンパク質（Ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）Ｅの発現機能が除去された遺伝子組み換え実験用鼠（ＡｐｏＥ−／−）はジャクソン実験室（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＢａｒＨａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入し、三星生命科学研究所の実験動物研究センターで特定病原菌のない無菌環境で一週間適応させた。８週齢の雄ＡｐｏＥ−／−マウス２２匹に２〜２０週の間に０．１５％の高脂肪高コレステロール食餌（ＨＦＨＣ）を摂取させた。２週後に毎週ごとにＣＯ２を吸入させて４〜６匹のマウスを犠牲にさせた。ＣＡＲＳイメージ化のために心臓と大動脈に１０分間ＰＢＳを撒布してから速かに除去した。すべての動物実験は三星生命科学研究所の実験動物研究センターの動物実験倫理委員会の規定を守った。
【００４６】
（ｅｘ ｖｉｖｏ ＣＡＲＳイメージ化のための試料準備）
心臓と大動脈を取り去った後、ＣＡＲＳイメージ化のために試料を準備した。結合組織を注意深く除去し、脂質の化学的プロファイルを分析するためにｃｏｌｄ ＰＢＳに保存した。大動脈は上行大動脈から胸管の下行大動脈方向に垂直に切開した後、４片に切開した。すなわち、一片は大動脈弓の小湾部、二つの片は左右動脈を含み、残りの胸管下行大動脈は鎖骨下動脈を含む。大動脈から分岐した動脈はマイクロ鋏で慎重に切開した。Ｅｎ ｆａｃｅ ＣＡＲＳイメージ化のための化学的設置溶液または何ら固定液なしにＰＢＳを用いて準備された片を内腔側（ｌｕｍｅｎ−ｓｉｄｅ）を下にしてカバースリップ上に設置した。
【００４７】
（統計分析）
イメージはＩｍａｇｅ−Ｐｒｏソフトウェア（ＭｅｄｉａＣｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を用いて分析した。それぞれの変異を最小化するため、すべての吸光度測定は各動脈硬化病斑に対して３回繰り返し遂行した。Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ（ｔｗｏ−ｓｉｄｅｄ）ですべての確率を実験した。０．０５未満のＰ−値は有意なものと見なした。
【００４８】
＜実験例１＞動脈硬化病巣のＥｎ ｆａｃｅ ＣＡＲＳ ３次元イメージ化
実施例１のＣＡＲＳ顕微鏡を用いてマウス及び人間の動脈硬化病斑に対するｅｎ ｆａｃｅ化学的イメージ化を実施した。動脈硬化ＡｐｏＥ−／−マウス（２８匹）から全ての大動脈を収集した後、大動脈弓と頸動脈の小湾部を垂直に切開し、ＣＡＲＳイメージ化のために固定なしに準備した。
【００４９】
図３は内腔から深層内膜（ｄｅｅｐ ｉｎｔｉｍａ）に至る動脈硬化病斑のｅｎ ｆａｃｅイメージスライスの３次元復元を示すもので、ＣＡＲＳイメージにおいて、明るいスポットは２７００〜３０５０ｃｍ−１の範囲の特徴的なＣＨ分子振動を持つ高濃度の脂質を示すものである。これは病巣の深さに依存する動脈硬化性脂質の典型的な３次元顕微鏡的特徴を立証したものである。表面層で（内腔から５〜１０μｍ）、細胞内脂質液滴を含む泡沫細胞が明らかにイメージ化される一方、脂質結晶はその体積構造を邪魔しないながらも深層内膜（ｄｅｅｐ ｉｎｔｉｍａ）部分（＞２５μｍの深さ）でイメージ化された。動脈硬化病斑での脂質構造は形態学的に、１）細胞内液滴、２）細胞外液滴、３）多層の結晶板、及び４）針状の結晶構造に分類できる。泡沫細胞は表面内膜の浅い部分（３〜４μｍの深さ）でばかり発見された。一方、多層板脂質は泡沫細胞でうまく分離された深層内膜（ｄｅｅｐ ｉｎｔｉｍａ）で観察された。あらゆる種類の多層脂質結晶は平行に配列されるか、内膜表面に傾いた板として広範囲にかけていた。また、針状の脂質構造は板状脂質結晶とともに深層内膜（ｄｅｅｐ ｉｎｔｉｍａ）で沈着されていた。
【００５０】
また、図４の単一動脈硬化病斑の半球状の３次元ＣＡＲＳイメージで示すように、脂質液滴（泡沫細胞）、表面層と細胞外脂質沈着物及び深層内膜（ｄｅｅｐ ｉｎｔｉｍａ）でコレステロール結晶が豊かな拡張細胞（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｃｅｌｌ）を含み微細解剖学的な成分が観察された。
【００５１】
医療的な応用の可能性を調査するため、同一イメージ化プロトコルを使い、ＣＡＲＳ顕微鏡を人間の動脈硬化性頸動脈に適用した（図５）。泡沫細胞は表面から深さ４０μｍまで成功的にイメージ化され、マウスのように、脂質結晶は深層内膜（ｄｅｅｐ ｉｎｔｉｍａ）で発見された（＞８０μｍ）。人間組織に対するＣＡＲＳイメージ化の最大深さは１００〜１５０μｍであった。
【００５２】
＜実験例２＞ＣＡＲＳイメージ化による動脈硬化進行段階確認実験
前記実施例１のＣＡＲＳイメージ化プラットホームを用いて動脈硬化の進行段階を実験するため、高脂肪食餌を投与したＡｐｏＥ−／−マウス（２８匹）から２〜２０週後に動脈硬化病斑の多様な水準を得た。正常食餌を投与したＡｐｏＥ−／−マウスを対照群として同時に評価した。毎週ごとにマウスの大動脈のｓｅｒｉａｌ ｅｎ ｆａｃｅ ＣＡＲＳイメージ化を実施した。大動脈壁を通じた脂質の垂直的浸透水準及び動脈硬化進行による脂質構造の形態的変化に対するＣＡＲＳイメージ化に対する動脈硬化の進行段階を分析した。
【００５３】
２週齢の動脈硬化マウスモデルにおいて、ＥＣＭに結合された脂質液滴はほとんど観察されなかった（図６（ａ））。４週齢の動脈硬化マウスモデルにおいて、脂質液滴は表面内膜（血管壁への浸透深さが＜１０μｍ）でばかり観察され、ＥＣＭの下側は培地側にクレーター（ｃｒａｔｅｒ）状に再編成されていた（図６（ｂ））。６週齢の動脈硬化マウスモデルにおいて、脂質液滴の数は２週齢のマウスに比べて著しく増加した（図６（ｃ））。特に、ＥＣＭに詰まって細胞外脂質液滴は血管壁から３０μｍの浸透深さに沈着されていた。ある種類の脂質液滴は核にあたる濃い内部空間を持つ細胞の典型的な形態に分布されており、これは脂質を含む泡沫細胞の形態を提示するものである。８週齢の動脈硬化マウスモデルにおいて、動脈硬化病巣は深層内膜（ｄｅｅｐ ｉｎｔｉｍａ）で結晶形態の脂質構造のような深化した病原性特徴を示した（図６（ｄ））。泡沫細胞は表面部分でばかり依然として観察された。しかし、泡沫細胞の構造は６週齢の動脈硬化マウスモデルより明らかであった（図６（ｄ）の白色矢印）。また、壊疽中心部の全体積は３次元ＣＡＲＳイメージ化で測定することができた（１００〜１２０μｍ）。１０週齢の動脈硬化マウスモデルにおいて、動脈硬化病斑の半球状形態は泡沫細胞と細胞外脂質沈着物で編成されていた（図６（ｅ））。１２週齢の動脈硬化マウスモデルにおいて、結晶形態の脂質構造は血管壁に６０μｍ以上浸透されていた（図６（ｆ））。あらゆる種類の脂質液滴が深層内膜（ｄｅｅｐ ｉｎｔｉｍａ）（青色矢印）に結晶形態の脂質のよく規定された多層板状で沈着されていた。しかし、泡沫細胞は依然として元気な形態（白色矢印）として観察された。１６週齢の動脈硬化マウスモデルにおいて、壊疽中心部は内腔側に大きくなっており、大きさは直径がおよそ２５０μｍまで大きくなっていた（図６（ｇ））。これは８週齢の動脈硬化マウスで観察されるものに比べ、ほぼ二倍に相当するものである。興味深いことは、コレステロール結晶層が支配的に観察されたが、泡沫細胞は著しく減少したことである。これは泡沫細胞から細胞外脂質に転移される時点であることを言うものである。２０週齢の動脈硬化マウスモデルにおいて、繊維の肥厚が観察された（図６（ｈ））。
【００５４】
＜実験例３＞ＣＡＲＳによる動脈硬化病斑の特性究明
３次元ＣＡＲＳイメージ化において、脂質分布は主要な３段階で定量的に分析した（初期、中期及び深化の段階、図７）。動脈硬化の進行段階の典型的な特徴は脂質分画の体積（ｚ−ｓｔａｃｋにおいて２次元適用範囲で計算）及び脂質構造の大きさで分析する。初期段階の間（２〜６週：図７（ａ）：ｉ−ｉｖ）、ほんの少量の脂質が小さな大きさで明示されている。中期段階で（８〜１２週、図７（ｂ）：ｉ−ｉｖ）、脂質沈着物はｚ−ｓｔａｃｋに深く移動した。興味深いことに、脂質の大きさまたは深層内膜（ｄｅｅｐ ｉｎｔｉｍａ）で増加して板状脂質結晶を形成した。深化段階で（１６週、図７（ｃ）：ｉ−ｉｖ）、脂質適用範囲（ｃｏｖｅｒａｇｅ）及び大きさ共に増加した。動脈硬化性脂質は３０μｍの深さまで浸透し、甚だしくは９０μｍ２の大きさの単一脂質構造が直接検出され、これは深刻な動脈硬化病斑として見なされる特徴である。
【００５５】
また、単一動脈硬化病巣に対する３次元イメージに対するＣＡＲＳ能力を用いて、図７（ａ）〜図７（ｃ）のｉ−ｉｖの脂質分布を比較してそれぞれの動脈硬化病斑の異質性を認識した。
【００５６】
＜実験例４＞マルチフレックスＣＡＲＳによる動脈硬化脂質の化学的プロファイルのｏｎ−ｓｉｔｅ分析
マルチフレックスＣＡＲＳを用いてスペクトル形態に基づく多様な形態の動脈硬化性脂質での化学的差を分析することができた。分析した脂質はｅｎ ｆａｃｅイメージから検出された形態的差に基づいて４種類の主要タイプ、つまり細胞外及び細胞内脂質液滴、板状及び針状の脂質に分類した。
【００５７】
細胞外及び細胞内脂質液滴のスペクトルは対称的なＣＨ２振動において一つの主ピーク（２８４５ｃｍ−１）を示した（図８）。しかし、板状脂質の化学的プロファイルは脂質液滴とは著しく違った。すなわち、深層内膜（ｄｅｅｐ ｉｎｔｉｍａ）において板状脂質のスペクトルは、脂質液滴に比べ、そのスペクトルプロファイルで四つのエキストラピーク（２８８０、２９０５、２９２０、２９５０ｃｍ−１）を示した。エキストラピークはそれぞれＣＨ２非対称、炭化水素、ＣＨ３対称、及びＣＨ３非対称振動に相当する。反対に、結晶形態の脂質の針状は、多層板状脂質のスペクトルと比較して、２９０５、２９２０、２９５０ｃｍ−１でより低いピークを示した。脂質−結晶構造は広範囲な浸透深さで分析した。しかし、スペクトルは肉眼で見る深さとは関わらず、形態依存的に非常に高く再生した（ｎ＝１８７）。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明は染色または切断による組織損傷なしにかつ標識なしに３次元的に血管内脂質を選択的にイメージ化することで、動脈硬化の進行段階を診断することができるので、医療機器産業に非常に有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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