(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳癌を再発することなく長期生存する可能性を予測する方法であって、
患者の乳房の原発性腺管腫瘍または小葉腫瘍から得られた組織サンプルにおけるＳＵＲＶのＲＮＡ転写物のレベルをアッセイする工程、
前記組織サンプルにおける少なくとも一の参照ＲＮＡ転写物のレベルに対して前記レベルを正規化し、正規化したＳＵＲＶのＲＮＡレベルを求める工程、および、
参照乳癌サンプルから求めたＳＵＲＶ発現データと、前記の正規化したＳＵＲＶのＲＮＡレベルとを比較することによって、前記患者の乳癌を再発することなく長期生存する可能性を予測する工程を含み、
このとき、前記の正規化したＳＵＲＶ ＲＮＡレベルの増加が、前記乳癌患者の乳癌を再発せずに長期生存する可能性の増加と負の相関がある方法。
【請求項２】
さらに、
前記組織サンプルにおけるＳＴＫ１５、Ｂｃｌ２、Ｋｉ−６７、ＧＳＴＭ１、ＰＲ、ＥｓｔＲ１、ＣＣＮＢ１およびＢＡＧ１からなる群から選択される一または複数の遺伝子のＲＮＡ転写物のレベルをアッセイする工程、
前記組織サンプルにおける少なくとも一の参照ＲＮＡ転写物のレベルに対して前記一または複数の遺伝子のＲＮＡ転写物のレベルを正規化して、前記一または複数の遺伝子の正規化したレベルを求める工程、および、
参照乳癌サンプルから求めた前記一または複数の遺伝子からの遺伝子発現データと、前記の一または複数の遺伝子の正規化したＲＮＡレベルとを比較する工程を含み、
このとき、前記のＳＴＫ１５、Ｋｉ−６７およびＣＣＮＢ１の一または複数の正規化したＲＮＡレベルの増加が、乳癌を再発せずに長期生存する可能性の増加と負の相関があり、そして、前記のＢｃｌ２、ＧＳＴＭ１、ＰＲ、ＥｓｔＲ１およびＢＡＧ１の一または複数の正規化したＲＮＡレベルの増加が、乳癌を再発せずに長期生存する可能性の増加と正の相関がある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記腫瘍が侵襲性であり、前記方法が、さらに、前記組織サンプルにおいてＦＯＸＭ１、ＰＲＡＭＥ、Ｂｃｌ２、ＳＴＫ１５、ＣＥＧＰ１、Ｋｉ−６７、ＧＳＴＭ１、ＰＲ、ＢＢＣ３、ＮＭＥ１、ＧＡＴＡ３、ＴＦＲＣ、ＹＢ−１、ＤＰＹＤ、ＣＡ９、Ｃｏｎｔｉｇ５１０３７およびＲＰＳ６Ｋ１からなる群から選択される一または複数の遺伝子のＲＮＡ転写物のレベルをアッセイする工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記腫瘍がエストロゲンレセプター（ＥＲ）陽性である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
さらに、前記組織サンプルにおいてＰＲＡＭＥ、Ｂｃｌ２、ＦＯＸＭ１、ＤＩＡＢＬＯ、ＥＰＨＸ１、ＨＩＦ１Ａ、ＶＥＧＦＣ、Ｋｉ−６７、ＩＧＦ１Ｒ、ＶＤＲ、ＮＭＥ１、ＧＳＴＭ３、Ｃｏｎｔｉｇ５１０３７、ＣＤＣ２５Ｂ、ＣＴＳＢ、ｐ２７、ＣＤＨ１およびＩＧＦＢＰ３からなる群から選択される一または複数の遺伝子のＲＮＡ転写物のレベルをアッセイする工程を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
２以上の前記遺伝子のＲＮＡ転写物のレベルを測定する、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記組織サンプルが、前記患者の、固定された、蝋包埋された乳癌組織標本である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記組織サンプルが、微細な針生検サンプル由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
さらに、正規化したＳＵＲＶのＲＮＡレベルに基づいてレポートを作成する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記レポートが、前記患者の乳癌を再発することなく長期生存する可能性の予測を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記レポートが、前記患者の治療様式の推奨に関する情報を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＳＵＲＶ発現データが、コックス比例ハザードモデルを用いた多変量分析により求められている、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記アッセイが、ホルマリン固定された、パラフィン包埋組織サンプルから得られたＲＮＡを用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記アッセイが、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記腫瘍が原発性腺管癌であり、前記アッセイが、患者の乳房から原発性腺管癌が外科的に除去された後に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記原発性腺管癌が侵襲性である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記腫瘍が原発性小葉癌であり、前記アッセイが、患者の乳房から原発性小葉癌が外科的に除去された後に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記原発性小葉癌が侵襲性である、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
（引用）
本願は、米国特許法第１１９条（ｈ）項の下で２００２年９月１８日出願の仮出願番号６０／４１２，０４９および２００２年３月１３日出願の６０／３６４，８９０の利益を張する。これらの全開示は、本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、生検腫瘍組織での遺伝子発現プロファイリングに関する。特に、本発明は、生検腫瘍組織（保存されたパラフィン包埋生検材料が挙げられる）でのｍＲＮＡレベルを測定するための感受性な方法に関する。加えて、本発明は、発現が乳癌の診断および治療で重要な遺伝子のセットを提供する。
【背景技術】
【０００３】
癌専門医は、多くの処置の選択肢（「治療の基準（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｏｆ  ｃａｒｅ）」と特徴づけられている化学療法薬と、特定の癌についてラベルクレイムを持たないが、その癌における効力の証明が存在する多くの薬物との様々な組み合わせが挙げられる）が利用可能である。最も高い可能性で良い処置結果を得るには、患者が利用できる最適の癌処置を指定されることおよび、診断後に出来るだけ早くこの指定が行われることが必要である。
【０００４】
現在、臨床診療で使用される診断試験は、単独の分析物である。従って、多くの異なるマーカー間の関係を知るという潜在的な価値を捕らえない。さらに、診断テストは、頻繁に定量的でなく、免疫組織化学に頼っている。この方法は、異なる研究室でしばしば異なる結果を与える。これは、試薬が安定化されていないから、および部分的には解釈が主観的であり、簡単に定量化できないためである。経時的なＲＮＡ分解の問題および分析のために患者から新しい組織サンプルを入手することが困難であるという事実に起因して、ＲＮＡに基づいた試験はあまり使用されなかった。固定されたパラフィン包埋組織は、より簡単に利用でき、固定された組織からＲＮＡを検出するための方法は、確立されている。しかし、これらの方法は、一般的には少量の材料からの多数の遺伝子（ＤＮＡまたはＲＮＡ）の研究を可能にしない。従って、伝統的に固定組織は、免疫組織化学的なタンパク質の検出以外ではほとんど使用されなかった。
【０００５】
最近、いくつかのグループが、様々な癌の型のマイクロアレイ遺伝子発現分析による分類に関する研究を公開した（例えば、Ｇｏｌｕｂら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２８６：５３１〜５３７（１９９９）；Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊａｅら，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：１３７９０〜１３７９５（２００１）；Ｃｈｅｎ−Ｈｓｉａｎｇら，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １７（補遺１）：Ｓ３１６〜Ｓ３２２（２００１）；Ｒａｍａｓｗａｍｙら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１５１４９〜１５１５４（２００１）を参照のこと）。遺伝子発現パタ−ンに基づいたヒト乳癌の特定の分類もまた、報告されている（Ｍａｒｔｉｎら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０：２２３２〜２２３８（２０００）；Ｗｅｓｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９８：１１４６２〜１１４６７（２００１）；Ｓｏｒｌｉｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ／ＵＳＡ９８：１０８６９〜１０８７４（２００１）；Ｙａｎら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：８３７５〜８３８０（２００１））。しかし、これら研究は主に、癌（乳癌が挙げられる）の様々なタイプで既に確立されている分類の改善および洗練することを重視していて、異なって発現される遺伝子の関係への新しい見解を一般的には提供しない。また、これら研究は、その知見を癌処置の臨床結果を改善するために処置戦略と関連付けるということをしない。
【０００６】
現代の分子生物学および生化学が、腫瘍細胞の挙動、腫瘍細胞の分化の状態、および特定の治療薬に対する腫瘍細胞の感受性または耐性にそれらの活性が影響する１００より多くのの遺伝子を明らかにしたにも関わらず、少しの例外を除いて、これら遺伝子の状態は、薬物処置について日常的に下される臨床判断の目的に利用されていない。１つの注目すべき例外は、抗エストロゲン薬物（例えば、タモキシフェン）での処置に対する患者を選ぶため、乳癌でのエストロゲンレセプター（ＥＲ）タンパク質の発現の使用である。他の例外は、Ｈｅｒ２アンタゴニスト薬物Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）での患者を選ぶための、乳癌でのＥｒｂＢ２（Ｈｅｒ２）タンパク質の発現の使用である。
【０００７】
最近の発達にもかかわらず、特定の処置レジメンを病原性が異なる腫瘍タイプに対して標的化し、最終的には、結果を最大限にするために、腫瘍治療を個人化するという癌処置の問題が残っている。従って、様々な処置選択肢への患者の反応についての予測的な情報を同時提供する試験に対する必要性がある。その生物学があまり理解されていない乳癌に対して特にこれは、事実である。少数の亜群（例えば、ＥｒｂＢ２＋亜群、およびエストロゲンレセプター（ＥＲ）の遺伝子の低い発現〜発言の損失により特徴付けられている亜群、および少数のさらなる転写因子（Ｐｅｒｏｕら、Ｎａｔｕｒｅ４０６：７４７〜７５２（２０００）））への乳癌の分類は、乳癌の細胞異質性および分子異質性を反映せず、患者の反応を最大化する処置戦略の設計をも認めない。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、（１）生検腫瘍組織でのｍＲＮＡレベルを測定するための感受性な方法、（２）その発現が乳癌の診断において重要な約１９０遺伝子のセット、および（３）生化学的調節経路の活性化または破壊を介して乳癌の治療に使用されるまたは潜在的に有効な薬剤に対する患者の反応に影響を及ぼす遺伝子セットに含まれる遺伝子および同定された遺伝子の異常に低い発現、もしくは高い発現の重要性を提供する。これらの結果は、１ダースより多くの関連薬物の効力のゲノム的証拠の評価を可能にする。
【０００９】
本発明は、集団における全てのマーカーのアッセイのために保存され、パラフィン包埋した生検材料の使用を適応する。従って、最も広く利用されている生検材料の種類と適合する。本発明は、蝋包埋された固定組織からのＲＮＡ抽出のための効率的な方法を提供する。この方法は、分析の質を犠牲にすることなく、この情報獲得のための大量生産プロセスの費用を低下させる。さらに、本発明は、ｍＲＮＡのコピー数を増幅させるための大変効果的な新しい方法を記載する。この方法は、アッセイの感度および生検材料の限定された量での多数の異なる遺伝子の発現をモニターする能力を上昇させる。本発明はまた、乳癌マーカーセットにおける特定のマーカーの発現間での関連性の予言的な重要性を捕らえる。最後に、本発明は、遺伝子セットのそれぞれのメンバーについて、試験において使用されるオリゴヌクレオチド配列を特定する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、遺伝子発現の測定のための、本発明のプロセスの全体の作業流れを示す図である。この図において、ＦＰＥＴとは、「固定パラフィンに包埋された組織」を表し、そして「ＲＴ−ＰＣＲ」とは、「逆転写酵素ＰＣＲ」を表す。ＲＮＡ濃度は、市販のＲｉｂｏＧｒｅｅｎＴＭ  ＲＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌを使用することによって、決定される。
【図２】図２は、代表的な市販の方法の流れ図と並べた、本発明に従うＲＮＡ抽出方法の工程を示す流れ図である。
【図３】図３は、発現プロファイリング分析のために断片化ｍＲＮＡを調製するための、改善された方法の工程を示すスキームである。
【図４】図４は、ＲＴ−ＰＣＲの前のＲＮＡの増幅のための方法を示す。
【図５】図５は、断片化ｍＲＮＡの修復および増幅のための、代替のスキームを示す。
【図６】図６は、ＲＴ−ＰＣＲによる、４０ＦＰＥ乳癌標本におけるエストロゲンレセプターｍＲＮＡレベルの測定を示す。３つの１０ミクロンの切片を、各測定のために使用した。各データ点は、三連測定の平均を表す。
【図７】図７は、上記図６の凡例に記載されるように実施されたＲＴ−ＰＣＲによる、４０ＦＰＥ乳癌標本におけるプロゲステロンレセプターｍＲＮＡレベルの測定の結果を示す。
【図８】図８は、ＩＶＴ／ＲＴ−ＰＣＲ実験からの結果を示す。
【図９】図９は、７０ＦＰＥ乳癌標本にわたる９２の遺伝子の発現の表現である。ｙ軸は、サイクル閾値時間としての表現を示す。これらの遺伝子は、表１に列挙される遺伝子のサブセットである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
１つの局面において、本発明は、癌と診断された患者の臨床結果を予測するための方法に関する。この方法は、患者から得られた癌組織における１つ以上の遺伝子の発現レベルの決定、もしくはそれらの発現産物の発現レベルの決定を含む。その遺伝子は、ｐ５３ＢＰ２、カテプシンＢまたはカテプシンＬ、Ｋｉ６７／ＭｉＢ１、およびチミジンキナーゼから成る群から選択される。その発現レベルは、コントロールの遺伝子（単数または複数）に対して正規化され、参照となる癌組織セットにおいて検出される量と比較され、ここで、
（ａ）ｐ５３ＢＰ２の発現レベルが、下位１０の百分位数である場合；または
（ｂ）カテプシンＢまたはカテプシンＬのいずれかの発現レベルが、上位１０の百分位数である場合；または
（ｃ）Ｋｉ６７／ＭｉＢ１またはチミジンキナーゼのいずれかの発現レベルが、上位１０の百分位数％である場合、不良な結果が予想される。
不良な臨床結果は、例えば、生存期間の短縮または癌再発の危険性の増加の点で測定され得る（例えば、癌の外科的手術での除去の後）。
【００１２】
別の実施形態において、本発明者は、癌患者における処置後の癌再発の可能性を予想する方法を考慮している。この方法は、癌患者から得られた癌細胞におけるｐ２７の発現レベルの決定またはその発現産物の発現レベルの決定を含み、この発現レベルは、コントロール遺伝子（単数または複数）に対して正規化され、参照される癌組織セットにおいて見られる量と比較され、ここで上位１０の百分位数の発現レベルは、処置後の再発の危険性の低下を示す。
【００１３】
別の局面において、本発明は，Ｂｃｌ２、肝細胞核因子３、ＥＲ、ＥｒｂＢ２およびＧｒｂ７、またはそれらの発現産物からなる群から選択した２種類以上の遺伝子の癌組織での発現レベルの決定を含む癌分類の方法に関する。癌組織でのこれら遺伝子の発現レベルは、コントロール遺伝子（単数または複数）に対して正規化されており、参照癌組織セットで見られる量と比べられ、ここで、（ｉ）Ｂｃｌ２，肝細胞核因子３、およびＥＲ、またはそれらの発現産物のうち少なくとも１種類を発現している腫瘍で、参照癌組織セットでの平均発現レベルより上のものは、処置後の疾患がない、全体的な患者の生存に対して、良好な予後を持つと分類される；および（ｉｉ）高いレベルのＥｒｂＢ２およびＧｒｂ７またはそれらの発現産物を発現している腫瘍が、参照癌組織セットでの平均発現レベルより１０倍以上のものは、処置後の疾患がない全体的な患者の生存に対して、不良な予後を持つと分類される。
【００１４】
全てのタイプの癌（例えば、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎臓癌、腺癌、黒色腫、および脳腫瘍）が挙げられる。前記の方法は、乳癌の予後診断／分類に特に適切である。
【００１５】
これまでの全ての局面において、特定の実施形態で、発現レベルは、ホルマリン固定された、パラフィン包埋組織サンプルから入手したＲＮＡの使用により決定される。遺伝子発現プロファイリングの全ての技術とプロテオミクスの技術は共に、本発明の前記した局面の実行における使用に適切である。一方、遺伝子発現レベルは逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、しばしば決定される。
【００１６】
組織源が、ホルマリン固定された、パラフィン包埋組織サンプルである場合、ＲＮＡはしばしばフラグメント化されている。
【００１７】
発現データはさらに、多変量の分析（例えば、Ｃｏｘ  Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  Ｈａｚａｒｄｓモデルを用いる）にかけられ得る。
【００１８】
さらなる局面において、本発明は固定された、蝋包埋標本から核酸を調製するための方法に関する。この方法は以下を含む：
（ａ）固定された、蝋包埋組織標本の切片を、事前の脱蝋なしで、タンパク質分解酵素存在下、溶解緩衝液中約５６℃〜７０℃の温度でインキュベートし、溶解溶液を形成する工程；
（ｂ）溶解溶液を蝋が凝固する温度まで冷却する工程；および
（ｃ）溶解溶液から核酸を単離する工程。
【００１９】
溶解緩衝液は、尿素（例えば、４Ｍ  尿素）を含み得る。
【００２０】
特定の実施形態において、前記した方法の工程（ａ）におけるインキュベーションは、約６５℃で実行される。
【００２１】
別の特定の実施形態において、前記方法において使用されるタンパク質分解酵素は、タンパク質分解酵素Ｋである。
【００２２】
別の実施形態において、工程（ｂ）における冷却は、室温で実行される。
【００２３】
さらなる実施形態において、タンパク質除去後に核酸は２．５Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃで単離される。
【００２４】
例えば、核酸は、固定された蝋包埋組織標本中に存在する核酸の総量であり得る。
【００２５】
さらなる別の実施形態において、総核酸は、タンパク質除去の後、２．５Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃで溶解溶液から沈殿することによって単離される。例えば、沈殿は、イソプロパノールで実行され得る。
【００２６】
以上で記述した方法は、総核酸からＤＮＡを除く工程（例えば、ＤＮＡａｓｅ処理によって）をさらに含み得る。
【００２７】
例えば、組織標本は、腫瘍から入手され得る。さらに、ＲＮＡは、腫瘍が濃縮され組織標本の顕微鏡解剖された部分から入手され得る。
【００２８】
全てのタイプの癌（例えば、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺がん、腎臓癌、腺癌、黒色腫、および脳腫瘍、特に乳癌）が制限なしに挙げられる。
【００２９】
以上で記述した方法は、ＲＮＡを遺伝子発現プロファイルに供する工程をさらに含み得る。従って、表１に列挙した遺伝子の少なくとも２つを含む遺伝子セットについて、遺伝子発現プロファイルが、完了され得る。
【００３０】
遺伝子発現プロファイリングの全ての方法が意図されるが、特定の実施形態において、遺伝子発現プロファイリングは、増幅工程が先に行われ得る、ＲＴ−ＰＣＲにより実行される。
【００３１】
別の局面において、本発明は、遺伝子発現分析のためのフラグメント化されたＲＮＡを調製するための方法に関する。この方法は以下の工程を含む：
（ａ）少なくとも１つの遺伝子特異的な一本鎖ＤＮＡの足場に対してＲＮＡのフラグメントが相補的なそのＤＮＡの足場とハイブリダイズする条件で、ＲＮＡと混合する工程；
（ｂ）ハイブリダイズしたＲＮＡフラグメントを、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長してＤＮＡ−ＤＮＡ二重鎖を形成する工程；および
（ｃ）二重鎖からＤＮＡの足場を除去する工程。
【００３２】
特定の実施形態において、この方法の工程（ｂ）で、ＲＮＡは、目的の遺伝子それぞれに特異的な一本鎖テンプレートＤＮＡの混合物と混ぜられ得る。
【００３３】
本方法は、熱変性および二重鎖ＤＮＡのＤＮＡの足場（さらなる足場の重複があってもよいし、なくてもよい）への再アニールの工程をさらに含み得る。本方法はまた、過程（ｃ）における足場の除去の工程の前に、ＤＮＡポリメラーゼで二重鎖のセンス鎖をさらに伸長する工程を含み得る。
【００３４】
ＤＮＡテンプレートは、目的遺伝子に対して完全に相補的であり得るが、そうである必要はない。
【００３５】
特定の実施形態において、少なくとも１つのＤＮＡテンプレートは、目的の遺伝子の特定の区域に対して相補的である。
【００３６】
他の実施形態において、ＤＮＡテンプレートは、同じ遺伝子の多形性改変体に対し相補的な配列を含んでいる。
【００３７】
テンプレートＤＮＡは、１つ以上のｄＵＴＰまたはｒＮＴＰ部位を含み得る。この件において、工程（ｃ）では、工程（ｂ）で形成されたＤＮＡ−ＤＮＡ二重鎖中に存在するＤＮＡテンプレートをｄＵＴＰまたはｒＮＴＰ部位で断片化することによりＤＮＡテンプレートは除去され得る。
【００３８】
重要な実施形態において、ＲＮＡは、固定された蝋包埋組織標本から抽出され、酵素アッセイでの基質として働くのに十分な程度に精製される。ＲＮＡ精製には、オリゴｄＴに基づく工程がふくまれ得るが、含む必要はない。
【００３９】
さらなる局面では、本発明は、目的遺伝子の少なくとも１つを代表しているフラグメント化されたＲＮＡを含むサンプルにおけるＲＮＡフラグメント増幅の方法に関する。この方法は、以下の工程を含む：
（ａ）５’末端にＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含む１本鎖ＤＮＡの足場と相補的なＲＮＡフラグメントがこのＤＮＡの足場とハイブリダイズする条件下でＤＮＡの足場のプールとサンプルを接触させる工程；
（ｂ）ＤＮＡの足場に沿って、ＤＮＡポリメラーゼで、ハイブリダイズしたＲＮＡフラグメントを伸長し、ＤＮＡ−ＤＮＡ二重鎖形成する工程；
（ｃ）インビトロ転写によって目的の遺伝子（単数または複数）を増幅する工程；および
（ｄ）二重鎖からＤＮＡの足場を除去する工程。
【００４０】
代表的なプロモーターは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーターであり、代表的なＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼＩである。
【００４１】
工程（ｄ）において、ＤＮＡの足場は、例えば、ＤＮａｓｅＩでの処理によって除去され得る。
【００４２】
さらなる実施形態において、一本鎖ＤＮＡの足場のプールは、部分的なまたは完全な目的遺伝子の配列（例えば、ｃＤＮＡクローンのライブラリ）を含む。
【００４３】
特定の実施形態において、サンプルは、全ゲノムまたはそれらの一部分を代表する。好ましい実施形態において、ゲノムは、ヒトゲノムである。
【００４４】
別の局面において、本発明は、患者のための個人化したゲノム化学のプロファイル調整の方法に関する。この方法は、以下の工程を含む：
（ａ）患者から得られた組織から抽出したＲＮＡを遺伝子発現分析に供する工程；
（ｂ）このような組織における、表１で列挙した遺伝子セットから選択した少なくとも２つの遺伝子の発現レベルを決定する工程であって、この発現レベルは、コントロール遺伝子（単数または複数）に対して正規化され、癌組織の参照セットで観察される量と比較される、工程。；
（ｃ）ならびに、遺伝子発現分析により得たデータを要約するレポートを作成する工程。
【００４５】
患者から得られた組織は、癌細胞を含み得るが、含まなくても良い。以前と同じように、癌は、例えば、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎臓癌、腺癌、黒色腫、または脳腫瘍であり得る。特に、乳癌が好まれる。
【００４６】
特定の実施形態において、ＲＮＡは、癌細胞を濃縮された乳癌組織の顕微鏡解剖された一部分から入手される。コントロール遺伝子セットは、例えば、Ｓ−アクチンおよびリボソームタンパク質ＬＰＯを含み得る。
【００４７】
患者の利用または患者の医師の利用のために準備されるレポートは、患者の治療において潜在的に有益な、少なくとも１種類の薬剤の同定を含み得る。
【００４８】
前述の方法の工程（ｂ）は、薬物に対する細胞の感受性に特異的に影響する遺伝子の発現レベル決定の工程を含み得る。例えば、遺伝子は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ３、アンフィリレグリン（ａｍｐｈｉｌｉｒｅｇｕｌｉｎ）、ＡＲＧ、ＢＲＫ、ＢＣＲＰ、ＣＤ９、ＣＤ３１、ＣＤ８２／ＫＡＩ−１、ＣＯＸ２、ｃ−ａｂｌ、ｃ−ｋｉｔ、ｃ−ｋｉｔ  Ｌ、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２Ｃ９、ＤＨＦＲ、ジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ、ＥＧＦ，エピレグリン、ＥＲ−α、ＥｒｂＢ−１、ＥｒｂＢ−２、ＥｒｂＢ−３、ＥｒｂＢ−４、ＥＲ−β、ファルネシルピロリン酸シンターゼ、γ−ＧＣＳ（グルタミルシステインシンターゼ）、ＧＡＴＡ３、グラニルグラニルピロリン酸シンターゼ、Ｇｒｂ７、ＧＳＴ−α、ＧＳＴ−π、ＨＢ−ＥＧＦ、ｈｓｐ  ２７、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン／ＣＧＡ、ＩＧＦ−１，ＩＧＦ−２，ＩＧＦ１Ｒ、ＫＤＲ、ＬＩＶ１、肺耐性タンパク質／ＭＶＰ、Ｌｏｔ１、ＭＤＲ−１、ミクロソームエポキシド加水分解酵素、ＭＭＰ９、ＭＲＰ１、ＭＲＰ２、ＭＲＰ３、ＭＲＰ４、ＰＡＩ１、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−ｃ、ＰＤＧＦ−Ｄ、ＰＤＧＦＲ−α、ＰＤＧＦＲ−β、ＰＬＡＧａ（多形腺腫１）、ＰＲＥＰプロリルエンドペプチダーゼ、プロゲステロンレセプター、ｐＳ２／トレフォイル（ｔｒｅｆｏｉｌ）因子、ＰＴＥＮ、ＰＴＢ１ｂ、ＲＡＲ−α、ＲＡＲ−β２、還元型葉酸塩キャリア、ＳＸＲ、ＴＧＦ−α、チミジンホスホリラーゼ、チミジンシンターゼ、トポイソメラーゼＩＩ−α、トポイソメラーゼＩＩ−β、ＶＥＧＦ、ＸＩＳＴ、およびＹＢ−１からなる群より選択され得る。
【００４９】
別の実施形態において、前記のプロセスの工程（ｂ）は、多種薬剤耐性因子（例えば、γグルタミルシステインシンターゼ（ＧＣＳ），ＧＳＴ−α、ＧＳＴ−π、ＭＤＲ−１、ＭＲＰ１−４、乳癌耐性タンパク質（ＢＣＲＰ）、肺癌耐性タンパク質（ＭＶＰ）、ＳＸＲまたはＹＢ−１）の発現レベルを決定する工程を含む。
【００５０】
別の実施形態において、前記プロセスの工程（ｂ）は、真核生物の翻訳開始因子４Ｅ（ＥＩＦ４Ｅ）の発現レベルの決定を含む。
【００５１】
なお別の実施形態において、前記プロセスの工程（ｂ）は、ＤＮＡ修復酵素の発現レベル決定を含む。
【００５２】
さらなる実施形態において、前記プロセスの工程（ｂ）は、細胞周期調節因子（例えば、ｃ−ＭＹＣ、ｃ−Ｓｒｃ、サイクリン  Ｄ１、Ｈａ−Ｒａｓ、ｍｄｍ２、ｐ１４ＡＲＦ、ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩ、ｐ１６ＩＮＫ４ａ／ｐ１４、ｐ２３、ｐ２７、ｐ５３、Ｐ１３Ｋ、ＰＫＣ−ε、またはＰＫＣ−δ）の発現レベル決定を含む。
【００５３】
またさらなる実施形態において、前記プロセスの工程（ｂ）は、腫瘍サプレッサまたは関連タンパク質（例えば、ＡＰＣまたはＥ−カドヘリン）の発現レベル決定を含む。
【００５４】
別の実施形態において、前記方法の工程（ｂ）は、アポトーシスを調節する遺伝子（例えば、ｐ５３、ＢＣ１２、Ｂｃｌ−ｘ１、Ｂａｋ、Ｂａｘ、および関連因子、ＮＦκ−Ｂ、ＣＩＡＰ１、ＣＩＡＰ２、ｓｕｒｖｉｖｉｎ、および関連因子、ｐ５３ＢＰ１／ＡＳＰＰ１またはｐ５３ＢＰ２／ＡＳＰＰ２）の発現レベル決定を含む。
【００５５】
さらなる別の実施形態において、前記プロセスの過程（ｂ）は、細胞侵襲または血管形成を制御する因子（例えば、ｕＰＡ、ＰＡＩ１、カテプシンＢ、カテプシンＣ、およびカテプシンＬ、散乱因子（ＨＧＦ）、ｃ−ｍｅｔ、ＫＤＲ、ＶＥＧＦ、またはＣＤ３１）の発現レベル決定を含む。
【００５６】
異なる実施形態において、前記方法の工程（ｂ）は、免疫細胞もしくは免疫プロセスまたは炎症細胞もしくは炎症プロセスに対するマーカー（例えば、Ｉｇ軽鎖λ、ＣＤ１８、ＣＤ３、ＣＤ６８、Ｆａｓ（ＣＤ９５）、Ｆａｓ  リガンド）の発現レベル決定を含む。
【００５７】
さらなる実施形態において、前記プロセスの工程（ｂ）は、細胞増殖マーカー（例えば、Ｋｉ６７／ＭｉＢ１、ＰＣＮＡ、Ｐｉｎ１、またはチミジンキナーゼ）の発現レベル決定を含む。
【００５８】
なおさらなる実施形態において、上記プロセスの工程（ｂ）は、増殖因子（例えば、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＦＧＦ２、ＣＳＦ−１、ＣＳＦ−ｌＲ／ｆｍｓ、ＳＣＦ−１、ＩＬ６またはＩＬ８のような）または増殖因子レセプターの発現レベルの決定を包含する。
【００５９】
別の実施形態において、上記プロセスの工程（ｂ）は、乳癌のサブクラスを規定する遺伝子マーカーの発現レベルの決定を包含し、ここでこの遺伝子マーカーは、例えば、ＧＲＯ１オンコジーンα、Ｇｒｂ７、サイトケラチン５およびサイトケラチン１７、レチノール結合タンパク質４、肝細胞核因子３、インテグリンサブユニットα７、またはリポプロテインリパーゼであり得る。
【００６０】
なおさらなる局面において、本発明は、乳癌と診断された患者の、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）またはそのアナログに対する応答を予測するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）患者から得られた乳癌組織から抽出したＲＮＡを遺伝子発現分析に供する工程；
（ｂ）チミジル酸シンターゼｍＲＮＡの、組織における発現レベルを決定する工程であって、ここで発現レベルは、コントロール遺伝子に対して正規化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較される、工程、および
（ｃ）この正規化したチミジル酸シンターゼｍＲＮＡレベルに基づいて患者の応答を予測する工程。
【００６１】
上記方法の工程（ｄ）は、さらに、ジヒドロピリミジンホスホリラーゼの発現レベルを決定する工程を包含し得る。
【００６２】
別の実施形態において、本方法の工程（ｂ）はさらに、チミジンホスホリラーゼの発現レベルを決定する工程を包含し得る。
【００６３】
さらに別の実施形態において、以下の場合に５−ＦＵまたはそのアナログに対する正の応答が予測される：（ｉ）工程（ｂ）において決定された正規化されたチミジル酸シンターゼｍＲＮＡレベルが、１５百分位数を下回る場合；または（ｉｉ）工程（ｂ）において決定されたチミジル酸シンターゼの正規化した発現レベルおよびジヒドロピリミジンホスホリラーゼの発現レベルの合計が、２５百分位数を下回る場合、または（ｉｉｉ）工程（ｂ）において決定されたチミジンシンターゼの正規化された発現レベル、ジヒドロピリミジンホスホリラーゼの発現レベル、およびチミジンホスホリラーゼの発現レベルの合計が、２０百分位数を下回る場合。
【００６４】
さらなる実施形態において、上記方法の工程（ｂ）において、ｃ−ｍｙｃおよび野生型ｐ５３の発現レベルが決定される。この場合において、５−ＦＵまたはそのアナログに対する正の応答は、野生型ｐ５３の正規化された発現レベルに対するｃ−ｍｙｃの正規化された発現レベルが１５百分位数を上回る場合に予測される。
【００６５】
なおさらなる実施形態において、上記方法の工程（ｂ）において、ＮＦκＢおよびｃＩＡＰ２の発現レベルが決定される。特定の実施形態において、５−ＦＵまたはそのアナログに対する抵抗性は、代表的に、ＮＦκＢおよびｃＩＡＰ２の正規化された発現レベルが１０百分位数以上である場合に予測される。
【００６６】
別の局面において、本発明は、乳癌と診断された患者のメトトレキサートまたはそのアナログに対する応答を予測するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）患者から得られた乳癌組織から抽出したＲＮＡを遺伝子発現分析に供する工程であって、ここで、遺伝子発現レベルは、コントロール遺伝子に対して正規化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較される、工程；ならびに
（ｂ）以下の場合に、メトトレキサートもしくはそのアナログに対する患者の感受性の減少を予測する工程：（ｉ）ＤＨＦＲレベルが、コントロール遺伝子セットにおけるＤＨＦＲの平均発現レベルよりも１０倍以上高い場合、または（ｉｉ）還元葉酸キャリア（ＲＦＣ）ファミリーのメンバーの正規化された発現レベルが、１０百分位数を下回る場合。
【００６７】
なお別の局面において、本発明は、乳癌と診断された患者のアントラサイクリンまたはそのアナログに対する応答を予測するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）患者から得られた乳癌組織から抽出したＲＮＡを遺伝子発現分析に供する工程であって、ここで、遺伝子発現レベルは、コントロール遺伝子に対して正規化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較される、工程；ならびに
（ｂ）以下の場合に、アントラサイクリンもしくはそのアナログに対する患者の抵抗性もしくは減少した感受性を予測する工程：（ｉ）トポイソメラーゼＩＩαの正規化された発現レベルが、１０百分位数を下回る場合、または（ｉｉ）トポイソメラーゼＩＩβの正規化された発現レベルが、１０百分位数を下回る場合、または（ｉｉｉ）トポイソメラーゼＩＩαもしくはトポイソメラーゼＩＩβの、組み合わせた正規化された発現レベルが、１０百分位数を下回る場合。
【００６８】
異なる局面において、本発明は、乳癌と診断された患者のドセタキソール（ｄｏｃｅｔａｘｏｌ）に対する応答を予測するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）患者から得られた乳癌組織から抽出したＲＮＡを遺伝子発現分析に供する工程であって、ここで、遺伝子発現レベルは、コントロール遺伝子に対して正規化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較される、工程；ならびに
（ｂ）ＣＹＰ１Ｂ１の正規化された発現レベルが、１０百分位数を上回る場合、ドセタキソールに対する減少した感受性を予測する、工程。
【００６９】
本発明は、さらに、乳癌と診断された患者のシクロホスファミドまたはそのアナログに対する応答を予測するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）患者から得られた乳癌組織から抽出したＲＮＡを遺伝子発現分析に供する工程であって、ここで、遺伝子発現レベルは、コントロール遺伝子に対して正規化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較される、工程；ならびに
（ｂ）アルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１および１Ａ３の発現レベルの合計が、参照組織セットにおけるそれらの組み合わせた発現レベルの平均より１０倍高い場合に、シクロホスファミドもしくはそのアナログに対する患者の減少した感受性を予測する、工程。
【００７０】
さらなる局面において、本発明は、乳癌と診断された患者の抗エストロゲン治療に対する応答を予測するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）患者から得られた乳癌組織から抽出したＲＮＡを遺伝子発現分析に供する工程であって、ここで、遺伝子発現レベルは、コントロール遺伝子に対して正規化され、そして参照乳癌組織セット（エストロゲンレセプターα（ＥＲα）およびプロゲステロンレセプターα（ＰＲα）に対して陰性および陽性の両方の標本を含む）において見出される量と比較される、工程；ならびに
（ｂ）ＥＲαもしくはＰＲαの正規化された発現レベル、およびミクロソームエポキシドヒドロラーゼ、ｐＳ２／トレフォイル因子１、ＧＡＴＡ３およびヒト絨毛性ゴナドトロピンの少なくとも１つの正規化された発現レベルに基づいて患者の応答を予測する、工程。
【００７１】
特定の実施形態において、以下の場合に、患者から得られた乳癌組織におけるＥＲαまたはＰＲαの発現レベルに関係なく、応答の欠如または感応性の減少が予測される：（ｉ）ミクロソームエポキシドヒドロラーゼの正規化された発現レベルが１０百分位数を上回る場合；あるいは（ｉｉ）ｐＳ２／トレフォイル因子１、またはＧＡＴＡ３もしくはヒト絨毛性ゴナドトロピンの正規化された発現レベルが、上記乳癌組織セットにおける対応する平均発現レベルを下回る場合。
【００７２】
別の局面において、本発明は、乳癌と診断された患者のタキサンに対する応答を予測するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）患者から得られた乳癌組織から抽出したＲＮＡを遺伝子発現分析に供する工程であって、ここで、遺伝子発現レベルは、コントロール遺伝子に対して正規化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較される、工程；ならびに
（ｂ）以下の場合に、タキサンに対する減少した感受性を予測する工程：（ｉ）ＸＩＳＴの発現が、全く検出されないか、もしくはわずかに検出される場合、または（ｉｉ）ＧＳＴ−πもしくはプロピルエンドペプチダーゼ（ＰＲＥＰ）の正規化された発現レベルが、１０百分位数を上回る場合；または（ｉｉｉ）ＰＬＡＧ１の正規化された発現レベルが、１０百分位数を上回る場合。
【００７３】
本発明はまた、乳癌と診断された患者のシスプラチンまたはそのアナログに対する応答を予測するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）患者から得られた乳癌組織から抽出したＲＮＡを遺伝子発現分析に供する工程であって、ここで、遺伝子発現レベルは、コントロール遺伝子に対して正規化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較される、工程；ならびに
（ｂ）ＥＲＣＣ１の正規化された発現レベルが、１０百分位数を上回る場合、抵抗性または感受性の減少を予測する、工程。
【００７４】
本発明はさらに、乳癌と診断された患者のＥｒｂＢ２またはＥＧＦＲアンタゴニストに対する応答を予測するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）患者から得られた乳癌組織から抽出したＲＮＡを遺伝子発現分析に供する工程であって、ここで、遺伝子発現レベルは、コントロール遺伝子に対して正規化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較される、工程；ならびに
（ｂ）Ｇｒｂ７、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ１およびＩＧＦ２の少なくとも１つの正規化された発現レベルに基づいて患者の応答を予測する、工程。
【００７５】
特定の実施形態において、正の応答は、Ｇｒｂ７の正規化された発現レベルが１０百分位数を上回り、かつＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ１およびＩＧＦ２の発現レベルが９０百分位数より高く上昇していない場合に予測される。
【００７６】
さらに特定の実施形態において、減少した応答性は、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ１およびＩＧＦ２のうちの少なくとも１つの発現レベルが上昇する場合に予測される。
【００７７】
別の局面において、本発明は、ビスホスホネート薬物に対する、乳癌と診断された患者の応答を予測するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）患者から得られた乳癌組織から抽出したＲＮＡを遺伝子発現分析に供する工程であって、ここで、遺伝子発現レベルは、コントロール遺伝子に対して正規化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較される、工程；ならびに
（ｂ）患者から得られた乳癌組織が変異体Ｈａ−Ｒａｓを発現し、さらに、９０百分位数以上の正規化された発現レベルでファルネシルピロホスフェートシンターゼまたはゲラニルピロホスフォンシンターゼを発現する場合に、正の応答を予測する工程。
【００７８】
さらに別の局面において、本発明は、シクロオキシゲナーゼ２インヒビターによる処置に対する、乳癌と診断された患者の応答を予測するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）患者から得られた乳癌組織から抽出したＲＮＡを遺伝子発現分析に供する工程であって、ここで、遺伝子発現レベルは、コントロール遺伝子に対して正規化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較される、工程；ならびに
（ｂ）患者から得られた乳癌組織におけるＣＯＸ２の正規化された発現レベルが９０百分位数以上である場合に正の応答を予測する工程。
【００７９】
本発明はさらに、ＥＧＦレセプター（ＥＧＦＲ）アンタゴニストに対する、乳癌と診断された患者の応答を予測するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）患者から得られた乳癌組織から抽出したＲＮＡを遺伝子発現分析に供する工程であって、ここで、遺伝子発現レベルは、コントロール遺伝子に対して正規化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較される、工程；ならびに
（ｂ）以下の場合にＥＧＦＲアンタゴニストに対する正の応答を予測する工程：（ｉ）ＥＧＦＲの正規化された発現レベルが１０百分位数以上である場合で、かつ（ｉｉ）エピレグリン、ＴＧＦ−α、アンフィレグリン、ＥｒｂＢ３、ＢＲＫ、ＣＤ９、ＭＭＰ９、ＣＤ８２、およびＬｏｔ１のうちの少なくとも１つの正規化された発現レベルが９０百分位数より高い場合。
【００８０】
別の局面において、本発明は、ＥＧＦＲアンタゴニストによる処置に対する、乳癌と診断された患者の応答をモニタリングするための方法に関し、この方法は、処置の間に、患者におけるエピレグリン、ＴＧＦ−α、アンフィレグリン、ＥｒｂＢ３、ＢＲＫ、ＣＤ９、ＭＭＰ９、ＣＤ８２、およびＬｏｔ１からなる群より選択される遺伝子の発現レベルをモニタリングする工程を包含し、ここで、発現レベルの減少は、このような処置に対する正の応答を示す。
【００８１】
さらに別の局面において、本発明は、ａｂｌ、ｃ−ｋｉｔ、ＰＤＧＦＲ−α、ＰＤＧＦＲ−βおよびＡＲＧからなる群より選択される薬物標的化チロシンキナーゼに対する、乳癌と診断された患者の応答を予測するための方法に関し、この方法は、以下の工程：
（ａ）患者から得られた乳癌組織から抽出したＲＮＡを遺伝子発現分析に供する工程であって、ここで、遺伝子発現レベルは、コントロール遺伝子に対して正規化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較される、工程；
（ｂ）ａｂｌ、ｃ−ｋｉｔ、ＰＤＧＦＲ−α、ＰＤＧＦＲ−βおよびＡＲＧ、ならびにチロシンキナーゼの同族リガンドからなる群より選択されるチロシンキナーゼの正規化された発現レベルを決定する工程、ならびに
チロシンキナーゼの正規化された発現レベルが、１０百分位数を上回る場合に、
（ｃ）チロシンキナーゼの配列が任意の変異を含むか否かを決定する工程、
を包含し、ここで、以下の場合に正の応答が予測される：（ｉ）チロシンキナーゼの正規化された発現レベルが１０百分位数を上回る場合、（ｉｉ）チロシンキナーゼの配列が活性化変異を含む場合、または（ｉｉｉ）チロシンキナーゼの正規化された発現レベルが正常であり、かつリガンドの発現レベルが１０百分位数を上回る場合。
【００８２】
本発明の別の局面は、抗血管形成薬による処置に対する、乳癌と診断された患者の応答を予測するための方法であり、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）患者から得られた乳癌組織から抽出したＲＮＡを遺伝子発現分析に供する工程であって、ここで、遺伝子発現レベルは、コントロール遺伝子に対して正規化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較される、工程；ならびに
（ｂ）以下の場合に正の応答を予測する工程：（ｉ）ＶＥＧＦの正規化された発現レベルが１０百分位数を上回り、かつ（ｉｉ）ＫＤＲまたはＣＤ３１の正規化された発現レベルが２０百分位数を上回る場合。
【００８３】
本発明のさらなる局面は、乳癌と診断された患者が、多重薬物抵抗性タンパク質Ｐ−糖タンパク質をコードするＭＲＰ−１遺伝子と相互作用する薬物に対する抵抗性を発生する可能性を予測するための方法であり、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）患者から得られた乳癌組織から抽出したＲＮＡを遺伝子発現分析に供して、ＰＴＰ１ｂの発現レベルを決定する工程であって、ここで、発現レベルは、コントロール遺伝子に対して正規化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較される、工程；ならびに
（ｂ）ＭＲＰ−１遺伝子の正規化された発現レベルが９０百分位数より高い場合に、患者が上記薬物に対する抵抗性を生じる可能性があると結論付ける工程。
【００８４】
本発明はさらに、乳癌と診断された患者が、癌処置において使用される化学療法剤または毒素に対する抵抗性を生じる可能性を予測するための方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）患者から得られた乳癌組織から抽出したＲＮＡを遺伝子発現分析に供する工程であって、ここで、遺伝子発現レベルは、コントロール遺伝子に対して正規化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較される、工程；ならびに
（ｂ）以下の遺伝子：ＭＤＲ１、ＳＧＴα、ＧＳＴπ、ＳＸＲ、ＢＣＲＰ  ＹＢ−１、およびＬＲＰ／ＭＶＰのうちの少なくとも１つの正規化された発現レベルを決定する工程であって、ここで、４百分位数を上回る正規化された発現レベルの知見は、患者が薬物に対する抵抗性を生じる可能性があることを示す、工程。
【００８５】
乳癌組織サンプルにおけるＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの翻訳効率を測定する方法もまた、本明細書中に含まれ、この方法は、サンプルにおけるＶＥＧＦおよびＥＩＦ４Ｅ  ｍＲＮＡの発現レベルを決定し、コントロール遺伝子に対して正規化し、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較する工程を包含し、ここで、同じＶＥＧＦ発現レベルに対してより高い正規化されたＥＩＦ４Ｅ発現レベルは、ＶＥＧＦに対する比較的により高い翻訳効率の指標である。
【００８６】
別の局面において、本発明は、ＶＥＧＦアンタゴニストに対して乳癌と診断された患者の応答を予測するための方法を提供し、この方法は、コントロール遺伝子に対して正規化された、ＶＥＧＦおよびＥＩＦ４Ｅ  ｍＲＮＡの発現レベルを決定して、参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較する工程を包含し、ここで、９０百分位数より高いＶＥＧＦ発現レベルおよび５０百分位数より高いＥＩＦ４Ｅ発現レベルは、患者の応答の良好な予測因子である。
【００８７】
本発明はさらに、乳癌と診断された患者における乳癌の再発率を予測するための方法を提供し、この方法は、患者から得られた乳癌組織における、ｐ５３  ｍＲＮＡ発現：ｐ２１  ｍＲＮＡ発現の比またはｐ５３  ｍＲＮＡ発現：ｍｄｍ２  ｍＲＮＡ発現の比を決定し、コントロール遺伝子に対して正規化し、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較する工程を包含し、ここで、上記正常比は、再発の危険性がより高いことを示す。代表的に、より高い再発の危険性は、この比が１０百分位数を上回る場合に示される。
【００８８】
さらに別の局面において、本発明は、外科手術後に、乳癌患者における乳癌の再発率を予測するための方法を提供し、この方法は、患者から得られた乳癌組織におけるサイクリンＤ１の発現レベルを決定し、コントロール遺伝子に対して正規化し、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較する工程を包含し、ここで、１０百分位数を上回る発現レベルは、外科手術後に再発の危険性が増加したことを示す。この方法の特定の実施形態において、発現レベルが１０百分位数を上回る場合に、患者はアジュバント化学療法に供される。
【００８９】
本発明の別の局面は、外科手術後に、乳癌患者における乳癌の再発率を予測するための方法であり、この方法は、患者から得られた乳癌組織におけるＡＰＣまたはＥ−カドヘリンの発現レベルを決定、コントロール遺伝子に対して正規化し、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較する工程を包含し、ここで、５百分位数を上回る発現レベルは、外科手術後に再発の危険性が増加し、高まった危険性は、生存期間が短くなることを示す。
【００９０】
本発明のさらなる局面は、乳癌と診断された患者の応答を予測して、アポトーシス促進性薬物により処置するための方法であり、この方法は、患者から得られた乳癌組織におけるＢＣｌ２およびｃ−ＭＹＣの発現レベルを決定し、コントロール遺伝子に対して正規化し、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較する工程を包含し、ここで、（ｉ）ｃ−ＭＹＣの発現レベルが上昇していない、１０百分位数を上回るＢＣｌ２発現レベルは、良好な応答を示し、そして（ｉｉ）良好な応答は、ＢＣｌ２の発現レベルにも関わらず、ｃ−ＭＹＣの発現レベルが上昇した場合には、示されない。
【００９１】
本発明のなおさらなる局面は、乳癌と診断された患者についての処置結果を予測するための方法であり、この方法は、以下の工程：
（ａ）患者から得られた乳癌組織から抽出したＲＮＡを遺伝子発現分析に供する工程であって、ここで、遺伝子発現レベルは、コントロール遺伝子に対して正規化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較される、工程；ならびに
（ｂ）ＮＦκＢ、ならびにｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２、ＸＩＡＰ、およびＳｕｒｖｉｖｉｎからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の正規化された発現レベルを決定する工程、
を包含し、ここで、予後不良は、ＮＦκＢ、ならびにｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２、ＸＩＡＰ、およびＳｕｒｖｉｖｉｎからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子についての発現レベルが５百分位数を上回る場合に示される。
【００９２】
本発明はさらに、乳癌と診断された患者に対する処置結果を予測するための方法に関し、この方法は、患者から得られた乳癌組織におけるｐ５３ＢＰ１およびｐ５３ＢＰ２の発現レベルを決定し、コントロール遺伝子に対して正規化し、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較する工程を包含し、ここで、予後不良は、ｐ５３ＢＰ１またはｐ５３ＢＰ２の発現レベルが１０百分位数を下回る場合に予測される。
【００９３】
本発明はさらに、乳癌と診断された患者に対する処置結果を予測するための方法に関し、この方法は、患者から得られた乳癌組織におけるｕＰＡおよびＰＡＩ１の発現レベルを決定し、コントロール遺伝子に対して正規化し、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較する工程を包含し、ここで、（ｉ）不良の結果は、ｕＰＡおよびＰＡＩ１の発現レベルが２０百分位数を上回る場合に予測され、そして（ｉｉ）再発の危険性の減少は、ｕＰＡおよびＰＡＩ１の発現レベルが乳癌参照セットにおいて観察された平均より高く上昇しない場合に予測される。特定の実施形態において、不良の結果は、外科手術後の短い生存期間または癌再発の危険性の増加の観点で測定される。別の特定の実施形態において、ｕＰＡおよびＰＡＩ１は、正常なレベルで発現され、そして患者は、外科手術後にアジュバント化学療法に供される。
【００９４】
本発明の別の局面は、乳癌と診断された患者における処置結果を予測するための方法であり、この方法は、患者から得られた乳癌組織におけるカテプシンＢおよびカテプシンＬの発現レベルを決定し、コントロール遺伝子に対して正規化し、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較する工程を包含し、ここで、不良の結果は、カテプシンＢまたはカテプシンＬのいずれかの発現レベルが１０百分位数を上回る場合に予測される。直前にあるように、不良な処置結果は、例えば、短い生存期間または癌再発の危険性の増加の観点で測定され得る。
【００９５】
本発明のさらなる局面は、乳癌と診断された患者の処置を考察するための方法であり、この方法は、以下の工程を包含する：
（ａ）患者から得られた乳癌組織における散乱因子およびｃ−ｍｅｔの発現レベルを決定し、コントロール遺伝子に対して正規化し、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較する工程、および
（ｂ）散乱因子およびｃ−ｍｅｔ、または両方の組み合わせの発現レベルが９０百分位数より高い場合に、正確で積極的な化学療法処置を示唆する工程。
【００９６】
本発明のなおさらなる局面は、乳癌と診断された患者についての処置の結果を予測する方法であって、この方法は、患者から得られた乳癌組織におけるＶＥＧＦ、ＣＤ３１およびＫＤＲの発現レベルを決定する工程を包含し、この発現レベルは、対照遺伝子に対して規格化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較され、ここで、ＶＥＧＦ、ＣＤ３１およびＫＤＲのいずれかの発現レベルが上位１０の百分位数である場合、不良な処置結果が予測される。
【００９７】
本発明のなお別の局面は、乳癌と診断された患者についての処置の結果を予測する方法であって、この方法は、患者から得られた乳癌組織におけるＫｉ６７／ＭｉＢ１、ＰＣＮＡ、Ｐｉｎ１およびチミジンキナーゼの発現レベルを決定する工程を包含し、この発現レベルは、対照遺伝子に対して規格化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較され、ここで、Ｋｉ６７／ＭｉＢ１、ＰＣＮＡ、Ｐｉｎ１およびチミジンキナーゼのいずれかの発現レベルが上位１０の百分位数である場合、不良な処置結果が予測される。
【００９８】
本発明はさらに、乳癌と診断された患者についての処置の結果を予測する方法に関し、この方法は、患者から得られた乳癌組織における可溶性ＣＤ９５および全長ＣＤ９５の発現レベルを決定し、対照遺伝子に対して規格化し、そして、参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較する工程を包含し、ここで、可溶性ＣＤ９５の存在は、不良な患者の生存に相関する。
【００９９】
本発明はまた、乳癌と診断された患者についての処置の結果を予測する方法に関し、この方法は、患者から得られた乳癌組織におけるＩＧＦ１、ＩＧＦ１ＲおよびＩＧＦＢＰ３の発現レベルを決定する工程を包含し、この発現レベルは、対照遺伝子に対して規格化され、そして、参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較され、ここで、ＩＧＦ１、ＩＧＦ１ＲおよびＩＧＦＢＰ３の発現レベルの合計が上位１０の百分位数である場合、不良な処置結果が予測される。
【０１００】
本発明はさらに、乳癌を分類する方法に関し、この方法は、乳癌組織における、Ｂｃｌ１２、肝細胞核因子３、ＬＩＶ１、ＥＲ、リポタンパク質リパーゼ、レチノール結合タンパク質４、インテグリンα７、サイトケラチン５、サイトケラチン１７、ＧＲＯオンコジーン（ｏｎｃｏｇｅｎ）、ＥｒｂＢ２およびＧｒｂ７からなる群から選択される２つ以上の遺伝子の発現レベルを決定する工程を包含し、この発現レベルは、対照遺伝子に対して規格化され、そして参照乳癌組織セットにおいて見出される量と比較され、ここで、（ｉ）参照組織セットにおける平均発現レベルよりも上のＢｃｌ１、肝細胞核因子３、ＬＩＶ１およびＥＲのうちの少なくとも１つを発現している腫瘍は、外科的切除の後に、疾患を有さず、全般的な患者の生存についての良好な予後を有していると分類され；（ｉｉ）参照組織セットと比較して、リポタンパク質リパーゼ、レチノール結合タンパク質４、インテグリンα７のうちの少なくとも１つの発現の上昇によって特徴付けられる腫瘍は、外科的切除の後に、疾患を有さず、そして、全般的な患者の生存の中程度の予後を有していると分類され；そして、（ｉｉｉ）参照組織セットにおける平均発現レベルよりも４倍以上のレベルのサイトケラチン５および１７ならびにＧＲＯオンコジーン、または、参照組織セットにおける平均発現レベルよりも１０倍以上のレベルのＥｒｂＢおよびＧｒｂ７のレベルの上昇を示す腫瘍は、外科的切除の後に、疾患を有さず、全般的な患者の生存の不良な予後を有していると分類される。
【０１０１】
本発明の別の局面は、表２に列挙される順方向プライマーおよび逆方向プライマーからなる群から選択される２つ以上の遺伝子特異的なプライマーのパネルである。
【０１０２】
本発明のなお別の局面は、ＰＴ−ＰＣＲ増幅における断片化されたＲＮＡ集団の逆転写のための方法であり、この方法は、増幅反応において、逆方向プライマーとして複数の遺伝子特異的なプライマーを使用する工程を包含する。特定の実施形態において、この方法は、同じ増幅反応中に２〜約４０，０００個の遺伝子特異的プライマーを用いる。別の実施形態において、遺伝子特異的プライマーは、約１８〜２４塩基（例えば、約２０塩基長）である。別の実施形態において、プライマーのＴｍは約５８〜６０℃である。このプライマーは、例えば、表２に列挙される順方向プライマーおよび逆方向プライマーからなる群から選択され得る。
【０１０３】
本発明はまた、逆転写酵素駆動式の第１鎖ｃＤＮＡ合成の方法に関し、この方法は、約１８〜２４塩基長で、約５８℃〜約６０℃の最適Ｔｍを有する遺伝子特異的プライマーを用いる工程を包含する。特定の実施形態において、第１鎖ｃＤＮＡ合成の後にＰＣＲ  ＤＮＡ増幅が行われ、そして、プライマーは、ＰＣＲ増幅を駆動する逆方向プライマーとして機能する。別の実施形態において、この方法は、同じ第１鎖ｃＤＮＡ合成反応混合物中に複数の遺伝子特異的プライマーを用いる。遺伝子特異的プライマーの数は、例えば、２〜約４０，０００の間であり得る。
【０１０４】
異なる局面において、本発明は、原発性腫瘍の外科的切除の後に、乳癌を再発することがない、乳癌患者の長期生存の可能性を予測する方法に関し、この方法は、上記患者から得られた乳癌組織サンプルにおける１つ以上の診断的ＲＮＡ転写物またはその生成物の発現レベルを決定する工程を包含し、この発現レベルは、上記乳癌組織サンプルにおける全てのＲＮＡ転写物もしくはその生成物、またはＲＮＡ転写物もしくはその生成物の参照セットの発現レベルに対して規格化され、ここで、診断的転写物は、以下からなる群から選択される１つ以上の遺伝子の転写物であり：
【０１０５】
【化１】
0005461730.tif 000002
ここで、
【０１０６】
【化２】
0005461730.tif 000003
のうちの１つ以上の過剰発現は、乳癌を再発することがない長期生存の減少した可能性を示し、
【０１０７】
【化３】
0005461730.tif 000004
のうちの１つ以上の過剰発現は、乳癌を再発することがない長期生存の増加した可能性を示す。
【０１０８】
本発明の方法の特定の実施形態において、少なくとも２、好ましくは少なくとも５、より好ましくは少なくとも１０、最も好ましくは少なくとも１５の診断的転写物またはその発現生成物の発現レベルが決定される。
【０１０９】
乳癌が侵襲性乳癌（エストロゲンレセプター（ＥＲ）過剰発現（ＥＲ陽性）腫瘍およびＥＲ陰性腫瘍の両方を含む）である場合、分析は、以下の遺伝子のうちの少なくとも２つの転写物、またはその発現生成物の発現レベルの決定を含む：
【０１１０】
【化４】
0005461730.tif 000005
乳癌がＥＲ陽性侵襲性乳癌である場合、分析は、以下の遺伝子のうちの少なくとも２つの転写物またはその発現生成物の発現レベルの決定を含む：
【０１１１】
【化５】
0005461730.tif 000006
前と全く同じように、少なくとも５、より好ましくは少なくとも１０、最も好ましくは少なくとも１５の遺伝子またはそのそれぞれの発現生成物の発現レベルを決定することが好ましい。
【０１１２】
特定の実施形態において、少なくとも１つ以上の診断的ＲＮＡ転写物の発現レベルが決定され、ここで、ＲＮＡは、例えば、患者の固定化され、蝋で包埋した乳癌組織検体から得られ得る。ＲＮＡの単離は、例えば、上記もしくは本願を通じて記載される手順のいずれかに従って、または当該分野で公知の任意の他の方法によって実行され得る。
【０１１３】
なお別の局面において、本発明は、固相表面上に固定化された以下の遺伝子にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むアレイに関する：
【０１１４】
【化６】
0005461730.tif 000007
特定の実施形態において、アレイは、以下の遺伝子にハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む：
【０１１５】
【化７】
0005461730.tif 000008
さらなる局面において、本発明は、原発性腫瘍の外科的切除の後に、乳癌を再発することがない、侵襲性乳癌と診断された患者の長期生存の可能性を予測する方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する：
（１）以下からなる群から選択される遺伝子セットの遺伝子のＲＮＡ転写物または発現生成物の、上記患者から得られた乳癌組織サンプルにおける発現レベルを決定する工程であって：
【０１１６】
【化８】
0005461730.tif 000009
この発現レベルは、上記乳癌組織サンプルにおける全てのＲＮＡ転写物もしくはその生成物の発現レベル、または、ＲＮＡ転写物もしくはその生成物の参照セットに対して規格化される、工程；
（２）  工程（ａ）で得られたデータを統計分析にかける工程；そして
（３）  上記長期間の生存の可能性が増加したかまたは減少したかを決定する工程。
【０１１７】
なおさらなる局面において、本発明は、原発性腫瘍の外科的切除の後に、乳癌を再発することがない、エストロゲンレセプター（ＥＲ）陽性の侵襲性乳癌と診断された患者の長期生存の可能性を予測する方法に関し、この方法は、以下の工程を包含する：
（１）  以下からなる群から選択される遺伝子セットの遺伝子のＲＮＡ転写物または発現生成物の発現レベルを決定する工程：
【０１１８】
【化９】
0005461730.tif 000010
【０１１９】
【化１０】
0005461730.tif 000011
（２）  工程（１）で得られたデータを統計分析にかける工程；そして
（３）  上記長期生存の可能性が増加したかまたは減少したかを決定する工程。
【０１２０】
異なる局面において、本発明は、固相表面上に固定化された、以下からなる群から選択される遺伝子セットにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むアレイに関する：
【０１２１】
【化１１】
0005461730.tif 000012
【０１２２】
【化１２】
0005461730.tif 000013
さらなる局面において、本発明は、固相表面上に固定化された、以下からなる群から選択される遺伝子セットにハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むアレイに関する：
【０１２３】
【化１３】
0005461730.tif 000014
【０１２４】
【化１４】
0005461730.tif 000015
全ての局面において、ポリヌクレオチドは、代表的に約５００〜５０００塩基長のｃＤＮＡ（「ｃＤＮＡアレイ」）であり得るが、より短いかまたはより長いｃＤＮＡもまた使用され得、そして本発明の範囲内である。あるいは、ポリヌクレオチドは、代表的に約２０〜８０塩基長のオリゴヌクレオチド（ＤＡＮマイクロアレイ）であり得るが、より短いオリゴヌクレオチドおよびより長いオリゴヌクレオチドもまた適切であり、そして本発明の範囲内である。固体表面は、例えば、ガラスまたはナイロン、あるいはマイクロアレイのようなアレイを調製する際に代表的に使用される任意の他の固体表面であり得、そして代表的に、ガラスである。
【０１２５】
表１は、乳癌遺伝子の列挙を示す。
【０１２６】
表２は、断片化ｍＲＮＡの増幅のために使用されるアンプリコン配列およびプライマー配列を示す。
【０１２７】
表３は、試験した乳癌遺伝子の受託番号および配列番号を示す。
【０１２８】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
（Ａ．定義）
他に定義されない限り、本明細書中で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ第２版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９４）およびＭａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ第４版Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９２）は、当業者に、本発明において使用される用語の多くの一般的案内を提供する。
【０１２９】
当業者は、本明細書中に開示される方法および材料と類似または等価な、多くの方法および材料を認識し、これらは、本発明の実施において使用され得る。実際に、本発明は、記載される方法および材料に、いかなる様式でも限定されない。本発明の目的で、以下の用語が以下に定義される。
【０１３０】
用語「マイクロアレイ」とは、基板上の、ハイブリダイズ可能なアレイエレメント（好ましくは、ポリヌクレオチドプローブ）の順序立った配置をいう。
【０１３１】
用語「ポリヌクレオチド」とは、単数形または複数形で使用される場合、一般に、改変されていないＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいは改変されたＲＮＡまたはＤＮＡであり得る、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドをいう。従って、例えば、本明細書中で定義されるポリヌクレオチドとしては、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域および二本鎖領域を含むＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本領域および二本鎖領域を含むＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡ（これらは、一本鎖であっても、より代表的には二本鎖であってもよく、あるいは一本鎖領域および二本鎖領域を含み得る）を含むハイブリッド分子が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、用語「ポリヌクレオチド」とは、本明細書中において使用される場合、ＲＮＡまたはＤＮＡ、あるいはＲＮＡとＤＮＡとの両方を含む、三重鎖領域をいう。このような領域における鎖は、同じ分子を形成しても異なる分子を形成してもよい。領域は、１つ以上の分子の全てを含み得るが、より代表的には、いくつかの分子の領域のみを含む。三重螺旋領域の分子の１つは、しばしば、オリゴヌクレオチドである。用語「ポリヌクレオチド」としては、具体的に、１つ以上の改変された塩基を含むＤＮＡおよびＲＮＡが挙げられる。従って、安定性または他の理由で改変された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、この用語が本明細書中で意図されるような「ポリヌクレオチド」である。さらに、通常でない塩基（例えば、イノシン）または修飾塩基（例えば、トリチウム化塩基）を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書中で定義される場合の用語「ポリヌクレオチド」に含まれる。一般に、用語「ポリヌクレオチド」は、改変されていないポリヌクレオチドの全ての化学的改変形態、酵素的改変形態、および／または代謝的改変形態、ならびにウイルスおよび細胞（単純な細胞および複雑な細胞を含む）に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的形態を包含する。
【０１３２】
用語「オリゴヌクレオチド」とは、比較的短いポリヌクレオチドをいい、一本鎖デオキシリボヌクレオチド、一本鎖リボヌクレオチドまたは二本鎖リボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、ならびに二本鎖ＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。オリゴヌクレオチド（例えば、一本鎖ＤＮＡプローブオリゴヌクレオチド）は、しばしば、化学的方法によって、例えば、市販の自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して合成される。しかし、オリゴヌクレオチドは、種々の他の方法によって作製され得、この方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ媒介技術、ならびに細胞および生物内でのＤＮＡの発現が挙げられる。
【０１３３】
用語「差示的に発現される遺伝子」、「差示的遺伝子発現」およびこれらの同義語（これらは、交換可能に使用される）とは、正常またはコントロール被験体における発現と比較して、疾患（特に、乳癌のような癌）を罹患する被験体において発現がより高レベルまたはより低レベルに活性化される遺伝子をいう。この用語はまた、同じ疾患の異なる段階において、発現がより高レベルまたはより低レベルに活性化される遺伝子を包含する。差示的に発現される遺伝子は、核酸レベルまたはタンパク質レベルにおいて、活性化されるかまたは阻害されるかのいずれかでありうるか、あるいは選択的スプライシングに供されて異なるポリペプチド産物を生じ得ることもまた、理解される。このような差異は、例えば、ｍＲＮＡレベル、表面発現、分泌またはポリペプチドの他の関与の変化によって、証拠付けられ得る。差示的遺伝子発現は、２つ以上の遺伝子の間での発現の比較、または２つ以上の遺伝子の間での発現の比の比較、またはさらに、同じ遺伝子の差示的にプロセスされた２つの産物の比較を包含し得、これらは、正常な被験体と疾患（特に、癌）に罹患する被験体との間で異なるか、または同じ疾患の種々の段階の間で異なる。差示的発現としては、遺伝子、または例えば、正常細胞と疾患細胞との間、または異なる疾患事象もしくは疾患段階を受けた細胞の間でのその遺伝子の発現産物における、一時的発現パターンまたは細胞発現パターンの、定量的差異と定性的差異との両方を含む。本発明の目的で、「差示的遺伝子発現」は、少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約４倍、より好ましくは少なくとも約６倍、最も好ましくは少なくとも約１０倍の差異が、正常な被験体および疾患被験体における所定の遺伝子の発現の間、または疾患被験体における様々な段階の疾患発達において存在する場合に、存在するとみなされる。
【０１３４】
語句「遺伝子増幅」とは、遺伝子または遺伝子フラグメントの複数のコピーが、特定の細胞または細胞株において形成されるプロセスをいう。複製された領域（増幅されたＤＮＡの伸長）は、しばしば、「アンプリコン」と称される。通常、産生されるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の量（すなわち、遺伝子発現のレベル）はまた、発現される特定の遺伝子から作製されるコピーの数に比例して増加する。
【０１３５】
用語「予後」とは、本明細書中で、癌に起因する死または進行（新生物疾患（例えば、乳癌）の再発、転移拡散、および薬物耐性が挙げられる）の可能性の予測をいうように使用される。用語「予測」とは、本明細書中で、患者が薬物または薬物のセットに対して、好ましくかまたは好ましくなくかのいずれかで応答する可能性、およびこれらの応答の程度をいうように使用される。本発明の予測方法を臨床的に使用して、任意の特定の患者に対して最も適切な処置形態を選択することによって、処置の決定をなし得る。もし患者が治療法（例えば、外科的処置、所定の薬剤および薬剤の組み合わせでの化学療法、および／または放射線療法）に対して好意的に反応する可能性がある場合、本発明の予測方法は、予測において価値ある手段である。
【０１３６】
特定の薬剤または治療の選択肢に対する用語「耐性上昇（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）」は、本発明に従って使用された場合、標準的な薬剤の投与量または標準的な処置プロトコルに対する反応の減少を意味する。
【０１３７】
特定の薬剤または治療の選択肢に対する用語「感受性の減少」、本発明に従って使用された場合、標準的な薬剤の投与量または標準的な処置プロトコルに対する反応の減少を意味する。一方、反応の減少は、薬剤の用量または治療の強度を高めることによって補われ得る（少なくとも一部）。
【０１３８】
「患者の反応」は、患者に対する利点を示す任意の指標を使用して評価され得る。その最終段階には、（１）ある程度の腫瘍の成長の抑制（遅延および完全な成長の停止を含む）；（２）腫瘍細胞の数の減少；（３）腫瘍の大きさの減少；（４）腫瘍細胞の隣接する周辺器官および／または組織への浸潤の抑制（すなわち、減少、遅延または完全な停止）；（５）転移の抑制（すなわち、減少、遅延または完全な停止）；（６）腫瘍の退行または腫瘍の拒絶に帰し（しかし必ずしもそうではない）抗腫瘍免疫応答の増強；（７）腫瘍に関した１つ以上の症状のある程度の除去；（８）処置後の生存の長さの上昇；および／または（９）処置後の所定の時点での死亡率の減少が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３９】
用語「処置」は治療的処置および予防的な（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）または予防的な（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）測定の両方を意味し、ここでの対象は、標的となる病理学的状態または障害を予防または遅らせる（減らす）事である。治療を必要とするものは、既に障害を持つもの、および障害を持つ傾向があるものまたは障害が予防されるべきものとの両方を含む。腫瘍（例えば癌）の処置において、処置因子は腫瘍細胞の病理を直接減少させ得るかまたは腫瘍細胞を他の治療因子（例えば、放射線および／または化学療法）による処置に対してより感受性になるようにし得る。
【０１４０】
本明細書中で使用される用語「腫瘍」は、すべての新生物形成の細胞成長および細胞増殖を指す。「腫瘍」は悪性または両性であり得るし、全ての前癌性細胞および組織ならびに癌性細胞および組織であり得る。
【０１４１】
用語「癌」および「癌性」は、制御されていない細胞成長によって代表的に特徴付けられる哺乳動物における生理学的な状態を指すかまたは記載する。癌の例としては、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎臓癌、腺癌、黒色腫、および脳腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４２】
癌の「病理学」は患者の健康を損なう全ての現象を含む。これには、異常なまたは制御不可能な細胞の成長、転移、近隣細胞の通常の機能への干渉、異常なレベルでのサイトカインまたは他の分泌産物の放出、炎症応答または免疫学的応答の抑制または悪化、腫瘍形成、前癌状態、腺癌、周囲のまたは離れた組織または器官（例えばリンパ節など）への浸潤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４３】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定されて、一般的にプローブの長さ、洗いの温度、および塩濃度に依存する経験的訂算である。一般的に、長いプローブは、適切なアニーリングのために高い温度を必要とし、一方短いプローブは、低い温度を必要とする。相補的な鎖がそれらの融解温度以下の環境において存在する場合、ハイブリダイゼーションは一般的に、変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリダイゼーションし得る配列との間の所望する相同性の程度が高いほど、使用される相対的な温度も高くなる。結果として、相対的により高い温度は、反応状態をより厳密にする傾向があり、より低い温度は厳密性を低めるということになる。ハイブリダイゼーション反応の厳密性のさらなる詳細の説明には、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，（１９９５）を参照のこと。
【０１４４】
本明細書中で定義されるような、「ストリンジェントな状態」または「高度にストリンジェントな状態」は代表的に：（１）低いイオン強度および洗浄のための高い温度（例えば、５０℃で０．０１５Ｍ  塩化ナトリウム／０．００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム／０．１％  ドデシル硫酸ナトリウム）を使用する；（２）ハイブリダイゼーションの間に変性因子（ホルムアミド（例えば、４２℃にて、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／ｐＨ６．５で７５０ｍＭ  塩化ナトリウム５０  ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を有する５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、７５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）を使用する；または（３）４２℃で５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０７５Ｍ  クエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％  ピロリン酸ナトリウム、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔの溶液、超音波処理した鮭精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％  ＳＤＳ、および１０％  硫酸デキストランを使用し、４２℃で０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）そして５５℃で５０％ホルムアミドにおいて洗い、続いて５５℃にて、ＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣよりなる高度のストリンジェンシーで洗う。と共に使用する。
【０１４５】
「適度にストリンジェントな状態」はＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９によって記載されるように同定され得、上で記載したものより低いストリンジェントの洗浄の溶液およびハイブリダイゼーションの条件（例えば、温度、イオン強度、および％  ＳＤＳ）の使用を含む。適当にストリンジェントな状態の１つの例は、溶液中（２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１５ｍＭ  クエン酸３ナトリウム）、５０ｍＭ  リン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔの溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０ｍｇ／ｍｌ変性剪断鮭精子ＤＮＡを含む）３７℃で一晩インキュベートし、続いて約３７〜５０℃での１×ＳＳＣにおいてフィルターを洗う。当業者は、どのように温度、イオン強度などをプローブの長さなどのような適応因子の必要に応じて調節するかを認識する。
【０１４６】
本発明に関して、ある特定の遺伝子セット中に列挙されている遺伝子の「少なくとも１つ」、「少なくとも２つ」、「少なくとも５つ」の言及は、列挙された遺伝子の任意の１つ、または任意の組み合わせおよび全ての組み合わせを意味する。
【０１４７】
用語「スプライシング」および「ＲＮＡスプライシング」は交換可能に使用され、真核細胞の細胞質へと移動することをコードする連続したコード配列を持つ成熟ｍＲＮＡを産生するためにイントロンを除去しエキソンを繋ぐＲＮＡプロセッシングを指す。
【０１４８】
理論上は、用語「エキソン」は、成熟ＲＮＡ産物中において表現されている中断された遺伝子の任意の断片を指す（Ｂ．Ｌｅｗｉｎ．Ｇｅｎｅｓ  ＩＶ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｍａｓｓ．１９９０）。仮説では、用語「イントロン」は、転写されるが転写産物からスプライシングにより除去され、そのいずれかの端にエキソンがあるＤＮＡの任意の断片を指す。操作的に、エキソン配列は、Ｒｅｆ．配列番号により定義されている遺伝子のｍＲＮＡ配列内で生じる。操作的に、イントロン配列は、遺伝子のゲノムＤＮＡ内の介在する配列であり、エキソン配列によってひとまとめにくくられており、ＧＴおよびＡＧスプライスコンセンサス配列を５｀および３｀境界に持つ。
【０１４９】
（Ｂ．詳細な説明）
本発明の実施は、他に示されない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、および生化学の当該技術分野の範囲内である従来の技術を使用する。このような技術は、文献内で完全に説明されている。例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，編，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，編，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．）；“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，第４版（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ＆  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，編，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．，１９８７）；“Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ”（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  および  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，編，１９８７）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌら，  ｅｄｓ．，１９８７）  ；  および“ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓら，編，  １９９４）。
【０１５０】
（１．遺伝子発現プロファイリング）
一般的に、遺伝子発現プロファイリングの方法は以下の２つの大きな群に分類し得る：ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション分析に基づく方法、およびポリヌクレオチドの配列決定に基づく方法。当該分野で公知であるサンプル中のｍＲＮＡ発現を定量化するための最も一般的に使用されている方法は、ノーザンブロッティングおよびインサイチュ・ハイブリダイゼーション（Ｐａｒｋｅｒ  および  Ｂａｒｎｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０６：２４７−２８３（１９９９））；ＲＮＡｓｅ保護アッセイ（Ｈｏｄ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：８５２−８５４（１９９２））；および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｗｅｉｓら，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８：２６３−２６４（１９９２））を含む。代わりに、特定の２重鎖（例えば、ＤＮＡ２重鎖、ＲＮＡ２重鎖、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド２重鎖またはＤＮＡ−タンパク質２重鎖）を認識し得る抗体が使用され得る。配列決定に基づく遺伝子発現分析の代表的な方法としては、遺伝子発現の連続分析（Ｓｅｒｉａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ）（ＳＡＧＥ）および大量並列痕跡配列決定（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現分析が挙げられる。
【０１５１】
（２．逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ））
上で列挙した技術で、最も感受性で最も適応性のある定量方法はＲＴ−ＰＣＲである。このＲＴ−ＰＣＲは、異なるサンプル集団、通常の組織および腫瘍組織、薬剤処置するまたは薬剤処置なし、でのｍＲＮＡのレベルを比較するために使用されて、遺伝子発現のパターンを特徴づけ得、密接に関連するｍＲＮＡ間を区別し得、そしてＲＮＡ構造を分析し得る。
【０１５２】
最初の工程は標的サンプルからのｍＲＮＡの単離である。出発物質は、代表的に、ヒト腫瘍または腫瘍細胞株、およびそれぞれ対応する通常の組織または細胞株から単離された総ＲＮＡである。このように、ＲＮＡは種々原発腫瘍（例えば、乳、肺、結腸、前立腺、脳、肝臓、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、精巣、卵巣、子宮など）、腫瘍、または腫瘍細胞株から、健康的なドナーからのプールされたＤＮＡと共に単離され得る。ｍＲＮＡの源が原発腫瘍である場合、例えば、ｍＲＮＡは、凍結または保存された、パラフィン包埋された、かつ固定された（例えば、ホルマリン固定された）組織サンプルから抽出され得る。
【０１５３】
ｍＲＮＡ抽出のための一般的な方法は、当該分野で周知であり、分子生物学の標準的な参考書（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９７）．）に開示されている。パラフィン包埋された組織からのＲＮＡ抽出の方法は、例えば、ＲｕｐｐおよびＬｏｃｋｅｒ，  Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ５６：  Ａ６７  （１９８７），  およびＤｅＡｎｄｒｅｓら，  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １８：  ４２０４４  （１９９５）  において開示されている。特に、ＲＮＡの単離は、営業的製造業者から（例えば、Ｑｉａｇｅｎ）の精製キット、緩衝液のセットおよびタンパク質分解酵素を使用し，製造業者の指示に従って実行され得る。例えば、培養中の細胞からの総ＲＮＡはＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミニカラムを使用して単離され得る。他の市販されているＲＮＡ単離キットとしては、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅＴＭ  完全ＤＮＡおよびＲＮＡ精製キット（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）およびパラフィンブロックＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。組織サンプルからの総ＲＮＡは、ＲＮＡ  Ｓｔａｔ−６０（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ）を使用して単離され得る。腫瘍から調製されたＲＮＡは、例えば、塩化セシウム濃度勾配遠心によって単離され得る。
【０１５４】
ＰＣＲでＲＮＡはテンプレートとして働かないので、ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現プロファイリングでの最初の工程は、ＲＮＡテンプレートのｃＤＮＡへの逆転写であり、続いてＰＣＲ反応におけるその指数関数的増幅が起こる。最も一般的に使用される２つの逆転写酵素は、アビロ（ａｖｉｌｏ）骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素（ＡＭＶ−ＲＴ）およびＭｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）である。逆転写酵素の工程は代表的に、状況および発現プロファイリングの目的に依存して特異的なプライマー、ランダムヘキサマーまたはオリゴｄＴプライマーを使用して準備される。例えば、抽出されたＲＮＡは、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用し、製造業者の指示に従って逆転写され得る。誘導されたｃＤＮＡはそれに続くＰＣＲ反応におけるテンプレートとして使用され得る。
【０１５５】
ＰＣＲの工程で種々の耐熱性のＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用し得るが、代表的に５’−３’ヌクレアーゼ活性を有するが、３’−５’校正エンドヌクレアーゼ活性を欠いているＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼが使用される。従って、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲは、代表的に、標的のアプリコンに結合しているハイブリダイゼーションプローブを加水分解するためにＴａｑまたはＴｔｈポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性を使用するが、同様の  ５’ヌクレアーゼ活性を持つ任意の酵素が使用され得る。２つのオリゴヌクレオチドプライマーが、ＰＣＲ反応独特のアプリコンを産生するのに使用される。３番目のオリゴヌクレオチドまたはプローブは、２つのＰＣＲプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出するように設計されている。プローブは、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素により伸長されず、レポーター蛍光色素およびクエンチャー蛍光色素で標識されている。２つの色素がプローブ上にあるように近くに共に位置する場合、レポーター色素からの任意のレーザー誘発発光は、クエンチャー蛍光染色により消光される。増幅反応の間、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素はテンプレート依存性の様式でプローブを切断する。結果として生じるプローブフラグメントは、溶液中に解離し、放出されたレポーター色素からの信号は、第２の発蛍光団の消光効果から影響を受けない。レポーター色素の１分子が合成された新しい分子それぞれに対して遊離し、消光されないレポーター色素の検出は、データの定量的な解釈のための基礎を提供する。
【０１５６】
ＴａｑＭａｎ（登録商標）は、市販されている道具（例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７７００ＴＭ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍＴＭ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）、またはＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して実施され得る。好ましい実施形態において、５’ヌクレアーゼの手順は、同時定量的ＰＣＲ装置（例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７７００ＴＭ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＳｙｓｔｅｍＴＭ）で行われる。このシステムは、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラおよびコンピュータからなる。このシステムは、サーモサイクラー上で９６−ウェルフォーマットでサンプルを増幅する。増幅の間、レーザー誘導の蛍光信号は、すべての９６ウェルに対して光ファイバーケーブルを介して同時に収集され、ＣＣＤで検出される。このシステムは、装置を動かし、かつデータを分析するためのソフトウェアを含む。
【０１５７】
５’ヌクレアーゼアッセイデータは、最初にＣｔ（または閾値サイクル）として表現される。上で議論されるように、蛍光値は、サイクル毎に記録され、増幅反応におけるその点に増幅される産物の量を表す。蛍光シグナルが統計的に有意であるとして最初に記録される点が、閾値サイクル（Ｃｔ）である。
【０１５８】
誤差およびサンプル間の変動の影響を最小にするために、通常、ＲＴ−ＰＣＲを、内部標準を使用して実施する。理想的な内部標準は、異なる組織間で一定レベルで発現され、そして実験処理によって影響しない。遺伝子発現のパターンを正規化するために最も頻繁に使用されるＲＮＡは、ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド−３−ホスフェート−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）およびβ−アクチンに対するｍＲＮＡである。
【０１５９】
ＲＴ−ＰＣＲ技術のより最近の変化は、実時間定量的ＰＣＲであり、これは、２重標識蛍光発生（ｆｌｕｏｒｉｇｅｎｉｃ）プローブ（すなわち、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ）によりＰＣＲ産物蓄積を測定する。実時間ＰＣＲは、定量的競合的ＰＣＲ（各標的配列に対して内部の競合物が正規化のために使用される）およびサンプル中に含まれる正規化遺伝子またはＲＴ−ＰＣＲのためのハウスキーピング遺伝子を使用する定量的比較ＰＣＲの両方に匹敵する。さらなる詳細について、例えば、Ｈｅｌｄら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６：９８６−９９４（１９９６）を参照のこと。
【０１６０】
（３．マイクロアレイ）
差示的遺伝子発現が、マイクロアレイ技術を使用して、同定され得るかまたは確認され得る。従って、乳癌関連遺伝子の発現プロフィールを、マイクロアレイ技術を使用して、新鮮な腫瘍組織またはパラフィンに埋め込んだ腫瘍組織のいずれかで測定し得る。この方法において、目的のポリヌクレオチド配列を、マイクロチップ基板上に、プレートするかまたはアレイする。次いで、アレイされた配列を、目的の細胞または組織由来の特異的ＤＮＡプローブとハイブリダイズする。ＲＴ−ＰＣＲ法と同様に、ｍＲＮＡの供給源は、代表的に、ヒト腫瘍または腫瘍細胞株、および対応する製造組織または細胞株から単離された全ＲＮＡである。従って、ＲＮＡは、種々の原発腫瘍または腫瘍細胞株から単離され得る。ｍＲＮＡの供給源が原発腫瘍である場合、ｍＲＮＡは、例えば、凍結またはアーカイブされたパラフィン包埋および固定（例えば、ホルマリン固定）組織サンプルから抽出され得、これは、毎日、臨床的な実施において慣用的に調製および保存される。
【０１６１】
マイクロアレイ技術の特定の実施形態において、ｃＤＮＡクローンのＰＣＲ増幅挿入物を、密なアレイで基板に適用する。好ましくは、少なくとも１０，０００個のヌクレオチド配列が基板に適用される。マイクロアレイ化遺伝子（各々１０，０００エレメントでマイクロチップ上に固定される）は、ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションに適切である。蛍光標識されたｃＤＮＡプローブを、目的の組織から抽出したＲＮＡの逆転写によって、蛍光ヌクレオチドの組み込みによって作製し得る。チップに適用された標識ｃＤＮＡプローブは、アレイ上のＤＮＡの各スポットに特異的にハイブリダイズする。非特異的な結合プローブを除去するためのストリンジェントな洗浄後、チップを共焦点レーザーマイクロスコピーによってまたは別の検出方法（例えば、ＣＣＤカメラ）によって走査する。各アレイ化エレメントのハイブリダイゼーションの定量によって、対応するｍＲＮＡの存在量の評価が可能である。二重色蛍光を用いて、ＲＮＡの２つの供給源から作製した別々に標識されたｃＤＮＡプローブを、アレイに対でハイブリダイズする。従って、各特定された遺伝子に対応する２つの供給源由来の転写物の相対的存在量は、同時に決定される。ハイブリダイゼーションの小型スケールは、多数の遺伝子についての発現パターンの簡便で迅速な評価を与える。このような方法は、まれな転写物（細胞当たり数コピーで発現される）を検出するため、および発現レベルで少なくとも約２倍の差異を再現可能に検出するために必要とされる感度を有することが示されている（Ｓｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３（２）：１０６−１４９（１９９６））。マイクロアレイ分析を、市販の機器によって、製造業者のプロトコルに従って（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎＣｈｉｐ技術、またはＩｎｃｙｔｅのマイクロアレイ技術を使用することによって）、実施し得る。
【０１６２】
遺伝子発現の大規模分析のためのマイクロアレイ方法の開発によって、癌分類および種々の腫瘍型における結果の予測の分子マーカーを体系的に調査することが可能になる。
【０１６３】
（４．遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ））
遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）は、各転写物についての個々のハイブリダイゼーションプローブを提供する必要なしに、多数の遺伝子転写物の同時かつ定量的な分析を可能にする方法である。最初に、転写物をただ一つ同定するのに十分な情報を含む短い配列タグ（約１０〜１４ｂｐ）を作製するが、但し、このタグは、各転写物内の独特の位置から得られている。次いで、多くの転写物を一緒に連結して、長い一連の分子を形成し、これは、配列決定され得、複数のタグの同一性を同時に明らかにする。転写物の任意の集団の発現パターンは、個々のタグの存在量を決定し、そして各タグに対応する遺伝子を同定することによって定量的に評価され得る。さらなる詳細について、例えば、Ｖｅｌｃｕｌｅｓｃｕら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４８４−４８７（１９９５）；およびＶｅｌｃｕｌｅｓｃｕら，Ｃｅｌｌ  ８８：２４３−５１（１９９７）を参照のこと。
【０１６４】
（５．大規模並列サイン配列決定（Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現分析）
この方法（Ｂｒｅｎｎｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：６３０−６３４（２０００）によって記載される）は、非ゲルベースのサイン配列決定と、別々の５μｍ直径マイクロビーズ上での数百万のテンプレートのインビトロクローニングとを組み合わせる配列決定アプローチである。最初に、ＤＮＡテンプレートのマイクロビーズライブラリーを、インビトロクローニングによって構築する。これに続いて、高い密度（代表的に、３×１０６マイクロビーズ／ｃｍ２）でフローセルにおいて、テンプレート含有マイクロビーズの平面アレイのアセンブリがなされる。各マイクロビーズ上のクローン化テンプレートの自由末端が、ＤＮＡフラグメント分離を必要としない蛍光ベースのサイン配列決定法を使用して、同時に分析される。この方法は、酵母ｃＤＮＡライブラリーから数十万の遺伝子サイン配列を単一操作で同時にかつ正確に提供することが示されている。
【０１６５】
（６．本発明のｍＲＮＡ単離方法、精製方法および増幅方法の一般的説明）
本発明の代表的なプロトコルの工程（ｍＲＮＡ単離、精製、プライマー伸長および増幅を含む）を、図１に示す。図１に示されるように、この代表的なプロセスは、パラフィン包埋腫瘍組織サンプルの約１０μｍの厚みの切片を切断することで開始する。次いで、以下に記載される本発明の方法に従って、ＲＮＡを抽出し、そしてタンパク質およびＤＮＡを取り出す。ＲＮＡ濃度の分析の後、ＲＮＡ修復および／または増幅工程が、必要な場合、含まれ得、そしてＲＮＡが、遺伝子特異的プロモーターを使用して逆転写され、続いてＲＴ−ＰＣＲが行われる。最後に、調べられた腫瘍サンプル中で同定された特徴的な遺伝子発現パターンに基づいて、患者に利用可能な最良の処置選択肢を同定するためにデータが分析される。このプロトコルの個々の工程を、以下にさらに詳細に考察する。
【０１６６】
（７．アーカイブされた組織試料からの核酸の単離のための改善された方法）
上に考察されるように、本発明の方法の最初の工程において、全ＲＮＡを、目的の供給源材料（固定されたパラフィン包埋組織試料を含む）から抽出し、そして酵素アッセイにおいて基質として作用するように十分に精製する。市販の産物の入手可能性および組織からの核酸（例えば、ＲＮＡ）の単離に関して入手可能な広範囲な知識にもかかわらず、固定されたパラフィン包埋組織試料（ＦＰＥＴ）からの核酸（ＲＮＡ）の単離は、困難が無いわけではない。
【０１６７】
１つの局面において、本発明は、アーカイブされた（例えば、ＦＰＥＴ）組織試料からの核酸の単離のための改善された方法に関する。ｍＲＮＡ種の測定レベルは、細胞および組織の生理学的状態または病理学的状態を規定するために有用である。ＲＴ−ＰＣＲ（上で考察される）は、この「遺伝子発現プロファイリング」について、最も感度が高く再現可能な定量的方法の１つである。パラフィン包埋、ホルマリン固定組織は、このような研究について最も幅広く入手可能な材料である。いくつかの研究所が、ＲＴ−ＰＣＲについてのＲＮＡ供給源として固定パラフィン包埋組織（ＦＰＥＴ）を首尾良く使用することが可能であることを実証した（Ｓｔａｎｔａら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １１：３０４−３０８（１９９１）；Ｓｔａｎｔａら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８６：２３−２６（１９９８）；Ｊａｃｋｓｏｎら，Ｌａｎｃｅｔ  １：１３９１（１９８９）；Ｊａｃｋｓｏｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．４３：４９９−５０４（１９９９）；Ｆｉｎｋｅら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １４：４４８−４５３（１９９３）；Ｇｏｌｄｓｗｏｒｔｈｙら，Ｍｏｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇ．２５：８６−９１（１９９９）；Ｓｔａｎｔａ  ａｎｄ  Ｂｏｎｉｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４：２７１−２７６（１９９８）；Ｇｏｄｆｒｅｙら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ２：８４（２０００）；Ｓｐｅｃｈｔら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７８：Ｂ２７（２０００）；Ｓｐｅｃｈｔら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１５８：４１９−４２９（２００１））。これによって、遺伝子発現プロファイリングを、ヒト生検試料の最も通常に入手可能な供給源で実施し得、従って、潜在的に新たな価値のある診断情報および治療情報を作成し得る。
【０１６８】
最も幅広く使用されるプロトコルは、有害な有機溶媒（例えば、キシレン、またはオクタン（Ｆｉｎｋｅら、上出））を利用して、核酸（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）抽出の前に、パラフィンブロック中の組織を脱蝋する。必須の有機溶媒除去（例えば、エタノールを用いる）および再水和工程（これは、複数の操作を必要とする）が続き、プロトコルに実質的な合計時間を追加し、これは、数日かかり得る。ＦＰＥＴからのＲＮＡ抽出のための市販のキットおよびプロトコル［ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅＴＴＭ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；Ｐａｒａｆｆｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）およびＲＮｅａｓｙＴＭ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ）］は、代表的に、複数の遠心分離およびエタノール緩衝液交換、およびキシレンでのインキュベーション後のインキュベーションを必要とする手順で、脱パラフィン化のためのキシレンを使用する。
【０１６９】
本発明は、遺伝子発現測定のための十分にインタクトな核酸（特にＲＮＡ）を産生する、改善された核酸抽出プロトコルを提供する。本明細書中における核酸抽出プロトコルにおける重要な工程は、いずれの有機溶媒も使用しない脱蝋の性能であり、これによって、有機溶媒の除去に関連する複数の手順の必要性を排除し、そしてプロトコルに対する合計の時間を実質的に減少する。本発明に従って、蝋（例えば、パラフィン）を、溶解緩衝液中で６５〜７５℃でのインキュベーションによって蝋に埋め込まれた組織サンプルから除去され、この溶解緩衝液は、組織を可溶化し、そして蝋を凝固させるために冷却することに続いて、タンパク質を加水分解する。
【０１７０】
図２は、蝋を除去するためのキシレンを使用する、代表的な商業的方法と比較した、本発明のＲＮＡ抽出プロトコルのフローチャートを示す。プロセスの個々の工程および全体のプロセスについて必要とされる時間を、チャートに示す。示されるように、商業的プロセスは、本発明のプロセスよりも約５０％多い時間を必要とする。
【０１７１】
溶解緩衝液は、細胞溶解物について公知の任意の緩衝液であり得る。しかし、ｍＲＮＡ分子のバルクが、フラグメント化することが予期され、従って、インタクトなポリアデニル化テールを有さず、引き続く分析アッセイについて回収されず利用可能でもないので、本発明のためのＲＮＡを単離するために、ポリアデニル化ｍＲＮＡを選択的に精製するオリゴ−ｄＴ−ベースの方法は、使用されないことが好ましい。そうでなければ、多くの標準的な核酸精製スキームが使用され得る。これらとしては、カオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）および有機溶媒抽出、ガラスビーズまたはフィルターを使用する抽出、塩析および沈殿ベースの方法、または生物学的供給源から全ＲＮＡまたは全核酸を回収するための当該分野で公知の精製方法のいずれかが挙げられる。
【０１７２】
溶解緩衝液は、例えば、Ｑｉａｇｅｎ，Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，またはＡｍｂｉｏｎから市販される。溶解緩衝液の好ましい群としては、代表的に、尿素、およびプロテインキナーゼＫまたは他のプロテアーゼが挙げられる。プロテアーゼＫは、大部分の哺乳動物ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅが、特に０．５〜１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の存在下で迅速に不活化されるので、高い品質の非損傷ＤＮＡまたはＲＮＡの単離に非常に有用である。これは、ＲＮＡの場合に特に重要であり、ＲＮＡは、ＤＮＡよりも分解に対してより感受性である。ＤＮａｓｅが活性のために金属イオンを必要とし、従って、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）によって容易に不活化され得るものの、ＲＮａｓｅについて類似の補因子要件がない。
【０１７３】
蝋の冷却および得られる凝固によって、核酸全体からの蝋の容易な分離が可能になり、この核酸全体は、例えば、イソプロパノールによって簡便に沈殿され得る。さらなる処理は、意図される目的に依存する。ＲＮＡ分析の提案される方法が抽出物中の混入するＤＮＡによる偏り（ｂｉａｓ）に供される場合、ＲＮＡ抽出物は、例えば、ＤＮａｓｅ（ＲＮＡを保存しながらＤＮＡを特異的に除去するための後精製）によってさらに処理され得る。例えば、引き続くＲＴ−ＰＣＲ増幅のために高い品質のＲＮＡを単離することが目的である場合、核酸沈殿に続いて、通常、ＤＮａｓｅ処理によって、ＤＮＡが除去される。しかし、ＤＮＡは、ＤＮａｓｅまたは当該分野で周知の他の技術によって種々の段階の核酸単離で除去され得る。
【０１７４】
本発明の核酸抽出プロトコルの利点は、アーカイブされたパラフィン包埋組織サンプルからのＲＮＡの単離のために最も明らかであるものの、本発明の蝋除去工程（これは、有機溶媒の使用を包含しない）もまた、核酸全体（ＲＮＡおよびＤＮＡ）またはＤＮＡのみの抽出のための任意の従来のプロトコルに包含され得る。これらの局面全てが、特に、本発明の範囲内である。
【０１７５】
パラフィンを除去するための加熱、引き続く冷却を使用することによって、本発明のプロセスは、貴重な処理時間を省き、一連の操作を排除し、それによって、核酸の収率を潜在的に増加させる。実際、以下の実施例に提示される実験的証拠は、本発明の方法がＲＮＡ収率を損なわないことを実証する。
【０１７６】
（８．逆転写の５’多重化遺伝子特異的プライミング）
ＲＴ−ＰＣＲは、最初の工程として試験ＲＮＡ集団の逆転写を必要とする。逆転写のために最も一般的に使用されるプライマーは、オリゴ−ｄＴであり、これは、ＲＮＡがインタクトである場合、良好に働く。しかし、このプライマーは、ＦＰＥ組織における場合のように、ＲＮＡが高度にフラグメント化する場合、有効ではない。
【０１７７】
本発明は、遺伝子特異的プライマーの使用を含み、このプライマーは、約５８℃と６０℃との間で最適なＴｍを有する長さのおよそ２０塩基である。これらのプライマーはまた、ＰＣＲ  ＤＮＡ増幅を駆動する逆プライマーとして役立つ。
【０１７８】
本発明の別の局面は、同じ反応混合物中の多重遺伝子特異的プライマーを含むことである。このような異なるプライマーの数は、非常に変動し得、２個という少なさおよび４０，０００以上という多さであり得る。表２は、本発明の方法を実施する際に首尾良く使用され得る逆プライマーの例を示す。図９は、この多重化遺伝子特異的プライミングストラテジーを使用して得られた発現データを示す。詳細には、図９は、７０個のＦＰＥ乳癌試料にわたる９２個の遺伝子の発現の表示である（表１に列挙される遺伝子のサブセット）。ｙ軸は、サイクル閾値時間として発現を示す。
【０１７９】
代替的アプローチは、ｃＤＮＡ合成のためのプライマーとしてランダムへキサマーの使用に基づく。しかし、本発明者らは、遺伝子特異的プライマーの多重度を使用する方法が、ランダムへキサマーを使用する公知のアプローチよりも優れることを実験的に実証している。
【０１８０】
（９．発現プロファイリングアッセイのためのフラグメント化ｍＲＮＡの調製）
生物学的サンプル中の特異的ｍＲＮＡ種の存在量を分析することが目的である。なぜなら、この発現プロフィールが、そのサンプルの生理学的状態の指数を提供するからである。ｍＲＮＡは、抽出し、そのネイティブな状態を維持することが困難であることがよく知られており、結果として、生物学的供給源から回収されたｍＲＮＡは、しばしば、フラグメント化されるかまたは少し分解される。これは、特に、化学的に固定され、長期間保存されたヒト組織試料において当てはまる。
【０１８１】
１つの局面において、本発明は、相対的な存在量が保存され、そして目的のｍＲＮＡが首尾良く測定され得る方式で、発現をプロファイリングするために、種々の供給源（アーカイブされた組織試料を含む）から抽出されるｍＲＮＡを調製する手段を提供する。この方法は、レポータープローブ（ＴａｑＭａｎ（登録商標）型アレイ）の５’エキソヌクレアーゼと連結されたＲＴ−ＰＣＲ（上で考察される）、フラップエンドヌクレアーゼアッセイ（Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標）およびＩｎｖａｄｅｒ（登録商標）型アッセイ）、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイ、ｃＤＮＡハイブリダイゼーションアレイ、オリゴヌクレオチド連結アッセイ、３’単一ヌクレオチド発現アッセイおよび生物学的サンプル中の特定のｍＲＮＡ配列の存在量を評価するために設計された他のアッセイを含む、公知の発現プロファイリング方法のいずれかによる分析のためのｍＲＮＡを調製する手段として有用である。
【０１８２】
本発明の方法に従って、ＲＮＡ全体が、供給源材料から抽出され、酵素アッセイにおける基質として作用するように十分に精製される。抽出手順（組織サンプルを埋め込むために使用される蝋（例えば、パラフィン）を除去する新規で改善された方法を含む）が、上で考察されている。ｍＲＮＡのバルクがフラグメント化されることが予期され、ポリアデニル化されず、従って、回収されず、オリゴ−ｄＴに基づく方法が使用される場合、引き続く分析アッセイに利用可能であるので、ポリアデニル化ｍＲＮＡを選択的に精製するオリゴ−ｄＴに基づく方法が、本発明のためのＲＮＡを単離するために使用されないことが好ましいことも注目された。
【０１８３】
フラグメント化ＲＮＡを修復するための改善された方法の図を、図３に示す。組織サンプルから精製されたフラグメント化ＲＮＡを、目的の各々のｍＲＮＡ種に対して、ユニバーサルまたは遺伝子特異的一本鎖ＤＮＡと混合する。これらのテンプレートは、クローン化遺伝子供給源由来のｍＲＮＡの全長ＤＮＡコピーであり得、これらは、アッセイされる遺伝子のセグメントのみを表す遺伝子のフラグメントであり得、これらは、目的の全長遺伝子または特定のセグメントのいずれかを表す一連の長さのオリゴヌクレオチドであり得る。テンプレートは、単一のコンセンサス配列を表し得るか、またはその遺伝子の多型改変体の混合物であり得るかのいずれかである。このＤＮＡテンプレートまたは足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）は、好ましくは、その長さに１つ以上のｄＵＴＰまたはｒＮＴＰを含む。これは、後の分析アッセイにおいて基質または標的として作用することをさけるために、引き続く分析工程を実施する前にテンプレートを除去する手段を提供する。この除去は、サンプルをウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）で処理し、それを加熱して、ＵＤＧが無塩基（ａｂａｓｉｃ）部位を生成する場所で鎖を切断することによって、達成される。ｒＮＴＰの場合、サンプルは、塩基性緩衝液（ｐＨ約１０）の存在下で加熱されて、ｒＮＴＰがテンプレートに配置される場所で鎖の切断を誘導し得る。
【０１８４】
一本鎖ＤＮＡテンプレートを、生成ＲＮＡと混合し、この混合物を変性し、ＤＮＡテンプレートに相補的なＲＮＡフラグメントが効果的に一本鎖ＤＮＡテンプレートに沿って伸長され得るプライマーとなるようにアニーリングする。ＤＮＡポリメラーゼＩは、伸長のためのプライマーを必要とするが、ＤＮＡプライマーまたはＲＮＡプライマーのいずれかを効果的に使用する。従って、ＤＮＡポリメラーゼＩおよびｄＮＴＰの存在下で、フラグメント化ＲＮＡは、相補的なＤＮＡテンプレートに沿って伸長され得る。伸長の効率を増大させるために、この反応は、熱サイクルされ得、フラグメント化ＲＮＡの集団全体がＲＮＡフラグメントプライマーから抽出される二本鎖ＤＮＡとして表されるまで、重複するテンプレートおよび伸長産物がハイブリダイズし得そして伸長し得る。
【０１８５】
この「修復された」ＲＮＡの作製に続いて、サンプルは、ＤＮＡテンプレート（足場）をフラグメント化し、そして引き続く分析反応で沈殿することを妨げるために、ＵＤＧで処理されるか、または中程度に塩基性の溶液で熱処理される。
【０１８６】
次いで、この酵素伸長から得られる産物は、酵素に基づくアッセイからの蛍光、化学発光、比色または他の共通読みだしのような増幅および検出可能なシグナル生成を含む標準的な酵素プロファイリングアッセイでテンプレートとして使用され得る。例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）型アッセイについて、この二本鎖ＤＮＡ産物は、標準的なアッセイでテンプレートとして添加され；そしてアレイハイブリダイゼーションについて、この産物は、アレイハイブリダイゼーションのための一本鎖標識ＲＮＡを作製するために代表的に使用されるｃＲＮＡ標識反応のためのｃＤＮＡテンプレートとして作用する。
【０１８７】
テンプレートを調製するこの方法は、短すぎて標準的なｃＤＮＡ生成スキームでテンプレートとして有効に作用しないｍＲＮＡフラグメントから情報を回収する利点を有する。さらに、この方法は、特異的な分析アッセイによって標的化されるｍＲＮＡ配列で特定の位置を保存するように作用する。例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイは、標識化されたレポータープローブによって標的化されるＰＣＲ増幅テンプレートとして作用するように、ｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーで単一の連続配列に依存する。ｍＲＮＡ鎖切断がこの配列で起こる場合、アッセイは、そのテンプレートを検出せず、元のサンプル中のそのｍＲＮＡの量を過小評価する。この標的調製方法は、ＲＮＡフラグメント化からのその効果を最小化する。
【０１８８】
ＲＮＡプライマー伸長アッセイで形成される伸長産物は、一本鎖ＤＮＡテンプレートの入力量を制御し、そして伸長反応の制限サイクリングを行うことによって、制御され得る。これは、分析のために標的化されるｍＲＮＡ配列の相対的存在量を保存する際に重要である。
【０１８９】
この方法は、容易に多重化されるので、各標的配列について並行調製を必要としないさらなる利点を有する。標的化遺伝子特異的分析よりも、発現されたゲノム分析全体に対して、サンプル抽出物中のｍＲＮＡ配列の集団全体を伸長するために、ランダム配列長オリゴヌクレオチドの大プールまたはクローン化配列の全ライブラリーを使用することもまた可能である。
【０１９０】
（１０．ＲＴ−ＰＣＲの前のｍＲＮＡ種の増幅）
ＦＰＥＴから単離され得るｍＲＮＡの制限された量および乏しい量に起因して、目的のｍＲＮＡを正確に増幅し得る新規な手順が、特に、遺伝子発現のリアルタイム定量（ＴａｑＭａｎ（登録商標））に、特に定量的に多くの数（＞５０）の遺伝子（＞５０〜１０，０００）に非常に有用である。
【０１９１】
現在のプロトコル（例えば、Ｅｂｅｒｗｉｎｅ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２０：５８４−９１（１９９６））は、主に、マイクロアレイ分析のために少量の全ＲＮＡまたはポリＡ＋ＲＮＡからのｍＲＮＡ増幅のために最適化される。本発明は、図４に示されるように、プライマーとして遺伝子特異的配列を使用して、少量のフラグメント化された全ＲＮＡ（平均サイズ約６０〜１５０ｂｐ）の増幅のために最適化されるプロトコルを提供する。
【０１９２】
本発明の増幅手順は、１回の逆転写の実施において非常に多くの数（代表的に１００〜１９０，０００もの多さ）の遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ）を使用する。各々のＧＳＰは、続くＲＮＡ増幅についての５’末端でのＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えば、Ｔ７ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター）を含む。ＧＳＰは、このＲＮＡの小さなサイズのためにプライマーとして好ましい。現在のプロトコルは、ｄＴプライマーを使用し、このプライマーは、ＦＰＥＴ  ＲＮＡの小さなサイズに起因するｍＲＮＡの全ての逆転写を適切には表さない。ＧＳＰは、長さ、Ｔｍなどのような通例のパラメーターを最適化することにより、設計され得る。例えば、ＧＳＰは、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはＰｒｉｍｅｒ  ３（ＭＩＴ）ソフトウェアプログラムを使用して設計され得る。代表的には、遺伝子当たり少なくとも３つのセットが設計され、そしてＦＰＥＴ  ＲＮＡ上で最も低いＣｔを与えるセット（最良の実験品）が、選択される。
【０１９３】
第２鎖ｃＤＮＡ合成が、標準的手段（図４、方法１を参照のこと）、またはＰＣＲ条件（例えば、９５℃、１０分（Ｔａｑ活性化）続いて６０℃、４５秒）下のＧＳＰｆプライマーおよびＴａｑ  ｐｏｌにより実施される。後者の方法の利点は、第２の遺伝子特異的プライマー、ＳＧＦｆは、より多くの開始ＤＮＡがＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ増幅のために必要な場合、さらなる特異性（および潜在的により効率的な第２鎖の合成）ならびにいくつかのＰＣＲサイクルを実施する選択肢を与えることである。次いで、ＲＮＡ増幅は、標準的条件下で実施され、多数のｃＲＮＡの複製を産生し、この複製は続いて、標準的ＴａｑＭａｎ（登録商標）反応において使用される。
【０１９４】
このプロセスは、Ｔ７に基づくＲＮＡ増幅を使用することにより例示されるが、当業者は、Ｔ３またはＳｐ６のようなプライマーを必要としない他のＲＮＡポリメラーゼプロモーターがまた使用され得、本発明の範囲内にあることを理解する。
【０１９５】
（１１．フラグメント化したＲＮＡの伸長および続く増幅の方法）
上記セクション９および１０に記載される本発明を組み合わせ、そして改変する本方法は、図５に例示される。この手順は、フラグメント化したｍＲＮＡの伸長で始まる。この手順は、骨格ＤＮＡが、５’末端にてＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列でタグ化され、ＲＮＡフラグメントから伸長される二本鎖ＤＮＡを誘導することを除いて、上記のように生じる。このテンプレート配列は、インビトロでの転写の後で除去される必要がある。これらのテンプレートは、ｄＵＴＰまたはｒＮＴＰヌクレオチドを含み得、セクション９に記載されるようなテンプレートの酵素的除去を可能にし、またはこれらのテンプレートは、ＤＮａｓｅＩ処理により除去され得る。
【０１９６】
テンプレートＤＮＡは、任意の数の異なるｍＲＮＡを表す集団であり得る。ＤＮＡテンレート（骨格）の高度な配列複雑性源が、種々の細胞または組織からＲＮＡをプールすることにより作製され得る。１つの実施形態において、これらのＲＮＡが、二本鎖ＤＮＡに変換され、ファージミドにクローニングされる。次いで、一本鎖ＤＮＡは、ファージミド増殖および精製ファージミドからの一本鎖ＤＮＡ単離により回収される。
【０１９７】
本発明は、本発明が遺伝子発現プロファイルシグナルを、以下による２つの異なる方法において増大させるので有用である：試験ｍＲＮＡポリヌクレオチド配列長を増大させることおよびインビトロにおける転写増大の両方。さらなる利点は、本発明がＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列でタグ化された遺伝子特異的プライマーで逆転写最適化を実行する必要を除外し、従って、比較的早く、経済的であることである。
【０１９８】
本発明は、種々の異なる方法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲまたは種々のＤＮＡアレイ方法）で使用されて、遺伝子発現をプロファイリングし得る。以前のプロトコルと全く同じように、このアプローチは、Ｔ７プロモーターを使用することにより例示されるが、本発明はそれに限定されない。しかし、当業者は、Ｔ３またはＳｐ６のような他のＲＮＡポリメラーゼプロモーターがまた、使用され得ることを理解する。
【０１９９】
（１２．乳癌遺伝子セット、アッセイされた遺伝子部分配列および遺伝子配列データの臨床的適用）
本発明の重要な局面は、乳癌組織による特定の遺伝子の測定された発現を使用して、患者を最良の薬物および薬物の組み合わせに適合させ、かつ予後情報を提供することである。この目的のために、アッセイされるＲＮＡの量および使用されるＲＮＡの質における変動における両方の差を、補正する（除いて正規化する）ことが必要である。従って、このアッセイは特定の正規化遺伝子の発現を測定かつ組み込み、この遺伝子としては、ＧＡＰＤＨおよびＣｙｐ１のような、周知のハウスキーピング遺伝子が挙げられる。あるいは、正規化は、全てのアッセイされる遺伝子またはその大きなサブセットの平均または中間シグナル（Ｃｔ）に基づき得る（全体的正規化アプローチ）。遺伝子ごとの基準に基づいて、患者腫瘍ｍＲＮＡの測定された正規化量は、乳癌組織参照セットに見出される量と比較される。この参照セットにおいて、乳癌組織の数（Ｎ）は、異なる参照セットが（全体として）本質的に同様に作用することが確実なほど十分に多いべきである。この条件が適合する場合、特定のセットにおいて存在する個々の乳癌組織の同定は、アッセイされる遺伝子の相対量に有意な影響を与えない。通常、乳癌組織参照セットは、少なくとも約３０、好ましくは少なくとも約４０の異なるＦＰＥ乳癌組織試料からなる。他に特筆されることがなければ、各々のｍＲＮＡ／試験される腫瘍／患者についての正規化発現レベルが、参照セットにおいて測定される発現レベルのパーセンテージとして表される。より詳細には、十分に高い数（例えば、４０）の腫瘍の参照セットは、各々のｍＲＮＡ種の正規化レベルの分布を生じる。分析されるべき特定の腫瘍サンプルにおいて測定されるレベルは、この範囲内のあるパーセンタイルまで減少し、このパーセンタイルは、当該分野で周知の方法により決定され得る。以下、他に特筆されることがなければ、遺伝子の発現レベルに対する参照は、参照セットに対する正規化した発現とみなされるが、これは常に明確に述べられるわけではない。
【０２００】
乳癌遺伝子セットが、表１に示される。遺伝子受託番号ならびに順方向のプライマー、逆方向プライマーおよび遺伝子増幅のために使用され得るアンプリコン配列についての配列番号が、表２に列挙される。マーカーの封入のための基板および参照セットに対するｍＲＮＡレベル変動の臨床的意義が、以下に示される。遺伝子は、その発現レベルにより適応される臨床的重要性の型に基づいて、以下のサブセット中に分類される：Ａ．乳癌処置に使用される薬物または他の適応について認可され、かつ乳癌の処置においてオフラベルで使用され得る薬物に対する患者の応答の予測。Ｂ．生存についての予後または癌の再発。
【０２０１】
（Ｃ．治療薬物に対する患者応答の予測）
（１．薬物に対する細胞感受性に特異的に影響する分子）
表１は、有力な薬物（これもまた列挙される）に対する細胞感受性に特異的に影響する７４個の遺伝子（イタリック体で示される）を列挙する。示される薬物のほとんどは、乳癌を処置するために認可され、かつ既に使用されている（例えば、アントラサイクリン；シクロホスファミド；メトトレキサート；５−ＦＵおよびアナログ）。いくつかの薬物が、オフラベルで乳癌を処置するために使用され、または臨床的開発段階にある（例えば、ビスホスホネ−トおよび抗ＶＥＧＦ  ｍＡｂ）。いくつかの薬物は、乳癌を処置するほど広範に使用されていないが、適応される標的が発現される他の癌において使用される（例えば、Ｃｅｌｅｂｒｅｘは、家族性結腸癌を処置するために使用される；シスプラチンは、卵巣癌および他の癌を処置するために使用される）。
【０２０２】
正規化チミジレートシンターゼｍＲＮＡ量が、１５パーセンタイル順位以下であるか、またはチミジレートシンターゼに加えてジヒドロピリミジンホスホリラーゼの発現の総量が、２５パーセンタイル順位以下であるか、またはこれらのｍＲＮＡに加えてチミジンホスホリラーゼの発現の総量が２０パーセンタイル順位以下である場合、５ＦＵに対する患者の応答が、適応される。５パーセンタイル順位以下のジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼは、５ＦＵ、またはＸｅｌｏｄａのようなアナログに対する有害応答の危険がある。
【０２０３】
チミジレートシンターゼおよびジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼのレベルが、先行する段落に規定されるような、受容可能な範囲内である場合、野生型ｐ５３（以下に規定されるような）のバックグラウンドに対する上位１５％におけるｃ−ｍｙｃ  ｍＲＮＡの増幅は、５ＦＵに対する有益な応答を予測する（Ｄ．Ａｒａｎｇｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：４９１０−４９１５（２００１））。チミジレートシンターゼおよびジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼの標準レベルの存在下で、上位１０％におけるＮＦκＢおよびｃＩＡＰ２のレベルは、化学療法薬物５ＦＵに対する乳腫瘍の抵抗性を示す。
【０２０４】
トポイソメラーゼＩＩαの正規化ｍＲＮＡのレベルが１０パーセンタイル順位未満である場合、またはトポイソメラーゼＩＩβの正規化ｍＲＮＡのレベルが１０パーセンタイル順位未満である場合、または組み合わせられた正規化トポイソメラーゼＩＩαシグナルおよび正規化トポイソメラーゼＩＩβシグナルが１０パーセンタイル順位未満である場合、アントラサイクリンに対する患者の耐性が、示される。
【０２０５】
ＤＨＦＲレベルがこのｍＲＮＡ種についての平均参照セットレベルよりも十倍以上高い場合、または減少した葉酸キャリヤレベルが１０パーセンタイル未満である場合、メトトレキサートに対する患者の感受性が、弱められる。
【０２０６】
腫瘍が上位１０％においてＣＹＰ１Ｂ１を発現する患者が、ドセタキソールに反応する可能性を減少している。
【０２０７】
アルデヒドデヒドロゲナーゼ１Ａ１および１Ａ３に対するシグナルの合計が、参照セット平均の１０倍以上である場合、シクロホスファミドに対する応答の減少した可能性を示す。
【０２０８】
現在、免疫組織化学により測定されるようなエストロゲンレセプター発現およびプロゲステロンレセプター発現を使用して、抗エストロゲン療法についての患者を選択する。発明者らは、高い程度の一致で、標準的臨床的診断試験により決定されるような、これらのタンパク質のレベルを予測するエストロゲンおよびプロゲステロンレセプターｍＲＮＡレベルについてのＲＴ−ＰＣＲアッセイを示した（図６および７）。
【０２０９】
腫瘍が上位７０％においてＥＲαまたはＰＲ  ｍＲＮＡを発現する患者が、タモキシフェンまたは他の抗エストロゲンに応答する可能性がある（従って、操作上、これより低いレベルのＥＲαは、ＥＲα−ネガティブを規定すべきである）。しかし、ミクロソームのエポキシドヒドラーゼについてのシグナルが上位１０％にあるか、またはｐＳ２／三葉型因子、ＧＡＴＡ３もしくはヒト絨毛膜性腺刺激ホルモンについてのｍＲＮＡが、ＥＲα−ネガティブ腫瘍において見出される平均レベル以下である場合、抗エストロゲン療法は、有益ではない。
【０２１０】
ＸＩＳＴシグナルの欠失は、上位１０％におけるＧＳＴ−πまたはプロリルエンドペプチダーゼ［ＰＲＥＰ］シグナルの増加も弱めるので、タキサンに対する応答の可能性を弱める。上位１０％におけるＰＬＡＧ１の増加は、タキサンに対する感受性を減少する。
【０２１１】
上位１０％におけるＥＲＣＣ１  ｍＲＮＡの発現は、シスプラチンまたはアナログに対する耐性の有意な危険を示す。
【０２１２】
Ｈｅｒ２  ｍＲＮＡ発現のＲＴ−ＰＣＲアッセイは、高い程度の一致を有する、標準的診断試験により測定されるようにＨｅｒ２過剰発現を予測する（データは示さず）。腫瘍が上位１０％においてＨｅｒ２（ｃｙｐ．１に対して正規化される）を発現する患者が、Ｈｅｒｃｅｐｉｎまたは他のＥｒｂＢ２アンタゴニストでの処置に対する有益な応答の増大した可能性を有する。Ｇｒｂ７  ｍＲＮＡの発現の測定は、ＨＥＲ２遺伝子増幅についての試験として役立つ。なぜなら、Ｇｒｂ７遺伝子が、Ｈｅｒ２に密接に関連しているためである。Ｈｅｒ２の発現がこの段落において上で規定されるように高いならば、同様に増加したＧｒｂ７は、Ｈｅｒ２遺伝子増幅を指示する。ＩＧＦ１Ｒおよび／またはＩＧＦ１もしくはＩＧＦ２の過剰発現がＨｅｒｃｅｐｔｉｎに対する、およびまたＥＧＦＲアンタゴニストに対する有益な応答の可能性を減少させる。
【０２１３】
腫瘍が変異体Ｈａ−Ｒａｓおよびまた１０パーセンタイル順位を超えるレベルにてファルネシルピロリン酸シンセターゼｍＲＮＡまたはゲラニルピロホスホン酸シンセターゼｍＲＮＡを発現する患者は、ビス−ホスホネート薬物に対する有益な応答を特に示す可能性のある群を含む。
【０２１４】
Ｃｏｘ２は、プロスタグランジンの合成における重要な制御酵素である。これは、乳癌を含む癌の種々の型のサブセットにおいて増加したレベルでしばしば発現される。この遺伝子の発現は、転写レベルにて制御され、その結果ＲＴ−ＰＣＲは、細胞酵素活性の有効なインジケーターとして働く。非臨床的研究が、ｃｏｘ２が腫瘍脈管形成を促進することを示し、これはこの酵素が固形腫瘍における見込みのある薬物標的であることを示唆する。いくつかのＣｏｘ２アンタゴニストは、抗炎症性状態における使用のために市販される産物である。ｃｏｘ２抑制因子Ｃｅｌｅｂｒｅｘを有する家族性腺腫性ポリポーシス患者の処置は、腫瘍性ポリープの数および大きさを有意に減少させた。ｃｏｘ２抑制因子は、乳癌の処置のためにまだ認可されていないが、一般にこのクラスの薬物は、安全でかつｃｏｘ２が過剰増幅である乳癌においてオフラベルで処方され得る。上位１０パーセンタイル単位におけるレベルにてＣＯＸ２を発現する腫瘍は、Ｃｅｌｅｂｒｅｘまたは他のシクロオキシゲナーゼ２抑制因子の有益な応答の増加した機会を有する。
【０２１５】
チロシンキナーゼＥｒｂＢ１［ＥＧＦＲ］、ＥｒｂＢ３［Ｈｅｒ３］およびＥｒｂＢ４［Ｈｅｒ４］；またリガンドＴＧＦα、アンフィレグリン、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子、およびエピレグリン；またＢＲＫ、非レセプターキナーゼ。臨床的開発におけるいくつかの薬物は、ＥＧＦレセプターを阻害する。ＥｒｂＢ２−４、指示されるリガンドおよびＢＲＫはまた、ＥＧＦＲ経路の活性を増大する。腫瘍が高いレベルのＥＧＦＲまたはＥＧＦＲおよびＥＧＦＲ経路の異常に高いレベルの他に指示される活性化因子を発現する乳癌患者は、ＥＧＦＲアンタゴニストを用いる処置のための可能性のある候補である。
【０２１６】
腫瘍が参照パネルで観察される平均レベルの１０％未満のＥＧＦＲ  ｍＲＮＡを発現する患者は、ＥＧＦＲアンタゴニストに応答する可能性が比較的低い［例えば、Ｉｒｅｓｓａ、またはＩｍＣｌｏｎｅ２２５］。ＥＧＦＲがこの低い範囲を超える場合、９０パーセンタイル順位を超えるレベルでのエピレグリン、ＴＧＦα、アンフィレグリン、もしくはＥｒｂＢ３、もしくはＢＲＫ、ＣＤ９、ＭＭＰ９またはＬｏｔ１のさらなる存在が、ＥＧＦＲアンタゴニストに応答する素因となる。エピレグリン遺伝子発現は、特に、ＥＧＦＲ活性化のための良好な代理マーカーであり、ＥＧＦＲアンタゴニストへの応答を予測するだけではなく、ＥＧＦＲアンタゴニストへの応答をもモニタリングするために使用し得る［細い針生検を使用して処置の間の腫瘍組織を提供する］。９０パーセンタイル順位を超えるＣＤ８２のレベルは、ＥＧＦＲアンタゴニストからのより低い効力を示唆する。
【０２１７】
チロシンキナーゼａｂｌ、ｃ−ｋｉｔ、ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦβ、およびＡＲＧ；また、シグナル伝達リガンドｃ−ｋｉｔリガンド、ＰＤＧＦＡ、Ｂ、ＣおよびＤ。この列挙されるチロシンキナーゼは、薬物ＧｌｅｅｖｅｃＴＭ（イマチニブメシレート、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）の全ての標的であり、そして列挙されるリガンドは、列挙されるチロシンキナーゼの１つ以上を刺激する。ＧｌｅｅｖｅｃＴＭが認可されている２つの適用において、チロシンキナーゼ標的（ｂｃｒ−ａｂｌおよびｃｋｉｔ）は過剰発現され、また活性化変異を含む。ＧｌｅｅｖｅＴＭ標的チロシンキナーゼ標的の１つが乳癌組織中で発現されることの発見が、遺伝子が配列決定されて変異されるか否かを決定する分析の第２段階を促す。変異が見出されることは、当該分野で公知の方法により（例えば、対応する野生型のキナーゼに対する、特定のキナーゼのキナーゼ酵素活性を測定することによりまたはリン酸化状態を測定することにより）立証され得る活性化変異である。腫瘍がＧｌｅｅｖｅＴＭ標的チロシンキナーゼをコードする高レベルのｍＲＮＡ（特に、上位１０パーセンタイル順位において）、または平均的範囲でＧｌｅｅｖｅＴＭ標的チロシンキナーゼについてのｍＲＮＡ、および上位１０パーセンタイル順位における同族成長刺激リガンドについてのｍＲＮＡを発現する、乳癌患者が、ＧｌｅｅｖｅＴＭでの処置のための特に良好な候補である。
【０２１８】
ＶＥＧＦは、有効かつ病理学的に重要な脈管形成因子である。（以下の予後指標を参照のこと。）ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡレベルが、上位１０パーセンタイル順位内にある場合、強度の処置が正当化される。このようなレベルは特に、抗脈管形成薬物での処置の重要性を示唆し、この薬物としては、抗ＶＥＧＦ抗体のような、ＶＥＧＦアンタゴニストが挙げられる。さらに、上位２０パーセンタイル順位におけるＫＤＲまたはＣＤ３１  ｍＲＮＡレベルは、ＶＥＧＦアンタゴニストからの利益の可能性をさらに増大する。
【０２１９】
ファルネシルピロホスファターゼシンテターゼおよびゲラニルゲラニルピロホスファターゼシンテターゼ。これらの酵素は、市販されるビスホスホネート薬物の標的であり、この薬物は、骨粗しょう症の処置のために元々開発されたが、最近乳癌においてオフラベルで患者に処方され始めている。９０パーセンタイル順位以上で、乳癌組織においてこれらの酵素をコードする増加したレベルのｍＲＮＡが、処置の選択肢としてビスホスホネートの使用を示唆する。
【０２２０】
（２．多剤耐性因子）
これらの因子は、以下の１０個の遺伝子を含む：γグルタミルシステインシンテターゼ［ＧＣＳ］；ＧＳＴ−α；ＧＳＴ−π；ＭＤＲ−１；ＭＲＰ１−４；乳癌耐性タンパク質［ＢＣＲＰ］；肺耐性タンパク質［ＭＶＰ］；ＳＸＲ；ＹＢ−１。
【０２２１】
ＧＣＳならびにＧＳＴ−αおよびＧＳＴ−πの両方は、グルタチオンレベルを制御し、これは化学療法薬物および減少誘導によるほかの毒に対する細胞性感受性を減少させる。グルタチオンは、多剤耐性ポンプ、ＭＤＲ−１およびＭＲＰについての必要な補因子である。ＭＤＲ１およびＭＲＰは、乳癌において使用されるいくつかの重要な化学療法薬物を細胞外に能動的に輸送するように機能する。
【０２２２】
ＧＳＴ、ＭＤＲ−１、およびＭＲＰ−１は、ヒトの癌における予後的意義または予測的意義を有する可能性を決定するために、広範囲に研究されてきた。しかし、大きな不一致が、この質問に関する文献中に存在している。最近、ＭＲＰファミリーの新しいメンバーが同定された：ＭＲＰ−２、ＭＲＰ−３、ＭＲＰ−４、ＢＣＲＰ、および肺耐性タンパク質［主要円蓋タンパク質（ｍａｊｏｒ  ｖａｕｌｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ）］。これらは、ＭＤＲ−１およびＭＲＰ−１の基質特異性と共通する基質特異性を有する。これら全ての関連のあるＡＢＣファミリーメンバーおよびグルタチオン合成酵素の本発明への組み込みは、単一のまたは二重の被検体アッセイが不可能である方法において、薬物耐性に対するこのファミリーの寄与を獲得する。
【０２２３】
ＭＲＰ−１、多剤耐性タンパク質についての遺伝子コーディング
Ｐ−糖タンパク質は、転写レベルにおいて主に調節されない。しかし、ｐ−糖タンパク質は、ＰＴＰ１ｂの転写を刺激する。本発明の実施形態は、ＭＲＰ−１／ｐ−糖タンパク質活性の代理測定としてのホスファターゼＰＴＰ１ｂについてのｍＲＮＡのレベルの使用である。
【０２２４】
遺伝子ＳＸＲはまた、これが特定の多剤耐性因子の転写を刺激するために、多剤耐性の活性化因子である。
【０２２５】
乳癌において使用される化学療法剤に関する多剤耐性因子の重要性は、以下の様である。ＭＤＲ１、ＧＳＴα、ＧＳＴπ、ＳＸＲ、ＢＣＲＰ  ＹＢ−１、またはＬＲＰ／ＭＶＰのいずれかのｍＲＮＡレベルが、上位４パーセンタイル順位である場合、ドキソルビシンに対する有益な応答は、弱められる。任意のＭＲＰ１、ＭＲＰ２、ＭＲＰ３、もしくはＭＲＰ４またはγ−グルタミルシステインシンテターゼのｍＲＮＡレベルが上位４パーセンタイル順位である場合、メトトレキサートに対する有益な応答は、阻害される。
【０２２６】
（３．真核生物翻訳開始因子４Ｅ［ＥＩＦ４Ｅ］）
ＥＩＦ４Ｅ  ｍＲＮＡレベルは、タンパク質発現の証拠を提供し、その結果ＲＴ−ＰＣＲの能力を大きくして遺伝子発現におけるバリエーションを指示する。従って、本発明の１つの特許請求の範囲が、特定の遺伝子［例えば、サイクリンＤ１、ｍｄｍ２、ＶＥＧＦ、およびその他］の遺伝子発現の付加されたインジケーターとしてのＥＩＦ４Ｅの使用である。例えば、同量の正規化されたＶＥＧＦ  ｍＲＮＡを含む２つの組織検体において、より高い正規化レベルのＥＩＦ４Ｅを含む組織が、より高いレベルのＶＥＧＦ遺伝子発現を示す可能性がある。
【０２２７】
バックグラウンドは、以下のようである。ｍＲＮＡ翻訳の調節における重要な点は、４３Ｓリボソームサブユニットへ結合するＥＩＦ４Ｇ複合体によるｍＲＮＡの選択である。タンパク質ＥＩＦ４Ｅ［ｍ７Ｇ  ＣＡＰ結合タンパク質］は、ＥＩＦ４Ｅコピーよりも多いｍＲＮＡが細胞中に存在しているために、制限的である。高度に構築化された５’ＵＴＲまたは高度にＧＣリッチなｍＲＮＡは、非効率的に翻訳され、これらはしばしば癌に関連する機能を実行する遺伝子［例えば、サイクリンＤ１、ｍｄｍ２、およびＶＥＧＦ］をコードする。ＥＩＦ４Ｅは、転写／ｍＲＮＡレベルにおいてそれ自体調節される。従って、ＥＩＦ４Ｅの発現は、タンパク質の数の増加した活性の付加された適応を提供する。
【０２２８】
ＥＩＦ４Ｅの過剰発現が培養された細胞を形質転換し、従ってオンコジーンであることがまた、注目すべきである。ＥＩＦ４Ｅの過剰発現は、いくつかの異なる型の癌において起こるが、乳癌において特に重要である。ＥＩＦ４Ｅは代表的に、通常の胸の組織において非常に低いレベルで発現される。
【０２２９】
（Ｄ．予後指標）
（１．ＤＮＡ修復酵素）
変異を介するＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２の欠失は、家族性乳癌のほとんどの一般的な型において重要なオンコジーン段階を示す。これらの重要な酵素のｍＲＮＡのレベルは、散発性乳癌のサブセットにおいて同様に異常である。いずれかからのシグナルの欠失［１０パーセンタイル順位以下まで］は、短い生存の危険を高める。
【０２３０】
（２．細胞周期調節因子）
細胞周期調節因子は、以下の１４個の遺伝子を含む：ｃ−ＭＹＣ；ｃ−Ｓｒｃ；サイクリンＤ１；Ｈａ−Ｒａｓ；ｍｄｍ２；ｐ１４ＡＲＦ；ｐ２１ＷＡＦ１／ＣＩＰ；ｐ１６ＩＮＫ４ａ／ｐ１４；ｐ２３；ｐ２７；ｐ５３；ＰＩ３Ｋ；ＰＫＣ−ε；ＰＫＣ−δ。
【０２３１】
ｐ５３［ＴＰ５３］についての遺伝子は、乳癌の大きなフラクションにおいて変異される。頻繁にｐ５３レベルは、機能変異の欠失が起こる場合に高められる。変異がドミナントネガティブである場合、変異は、増殖が促進され、アポトーシスが阻害されるので、癌細胞に対する生存価値（ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｖａｌｕｅ）を作り出す。何千もの異なるｐ５３変異が、ヒト癌の中で見出され、その多くの機能的結果は、明らかになっていない。学術的な文献の大きな集まりは、変異したｐ５３の予後的意義および予測的意義に取り組み、その結果は非常に対立している。本発明は、以下のようなｐ５３活性の機能的ゲノム測定を提供する。活性化された野生型ｐ５３分子は、細胞周期抑制因子ｐ２１の転写を誘発する。従って、ｐ２１に対するｐ５３の割合は、ｐ５３が野生型であり活性化される場合、低いはずである。ｐ５３が検出可能であり、ｐ２１に対するｐ５３の割合が正常な胸に対して腫瘍において高められる場合、このｐ５３は、非機能的またはドミナントネガティブのｐ５３である。癌の文献は、貧弱な予後によって証明されるような、これについての証拠を提供する。
【０２３２】
ｍｄｍ２は、重要なｐ５３調節因子である。活性化された野生型ｐ５３は、ｍｄｍ２の転写を刺激する。ｍｄｍ２タンパク質は、ｐ５３に結合し、タンパク質分解による破壊を促進する。従って、通常のレベルのｐ５３または高いレベルのｐ５３の存在において、ｍｄｍ２の異常に低いレベルは、ｐ５３が変異され、不活性化されることを指示する。
【０２３３】
本発明の１つの局面は、ｐ５３状態の姿を提供するｍＲＮＡレベルの比ｐ５３：ｐ２１およびｐ５３：ｍｄｍ２の使用である。ｐ５３のドミナントネガティブの変異についての証拠（高いｐ５３：ｐ２１および／または高いｐ５３：ｍｄｍ２  ｍＲＮＡ比によって指示されるように、特に上位１０パーセンタイル順位において）は、乳癌における再発のより高い危険を予測し、従って、乳癌手術後の負の結節における化学療法を使用する決定に対して、重点を置く。
【０２３４】
別の重要な細胞周期調節因子はｐ２７であり、これは、活性化された形態で、ｃｄｋ４のレベルで細胞周期進行をブロックする。このタンパク質は、転写レベルにおけるよりもむしろ、主にリン酸化／脱リン酸化を経由して調節される。しかし、ｐ２７  ｍＲＮＡのレベルは、まさに変動する。従って、上位１０の百分位数におけるｐ２７  ｍＲＮＡのレベルは、手術後の乳癌の再発の低下したリスクを示す。
【０２３５】
サイクリンＤ１は、細胞周期のＳ期に入る主要なポジティブ調節因子である。サイクリンＤ１の遺伝子は、約２０％の乳癌患者で増幅されており、そしてそれ故、これらの事例における腫瘍増殖を促進している。本発明の１つの局面は、乳癌患者における診断目的のためのサイクリンＤ１  ｍＲＮＡレベルの使用である。上位１０の百分位数におけるサイクリンＤ１  ｍＲＮＡのレベルの使用は、手術後の乳癌における再発の高リスクを示唆し、そしてアジュバント化学療法の特定の利益を示唆している。
【０２３６】
（３．その他の腫瘍サプレッサおよび関連タンパク質）
これらは、ＡＰＣおよびＥ−カドヘリンを含む。腫瘍サプレッサＡＰＣは、結腸癌の約５０％中で失われ、重要な細胞接着分子および成長サプレッサであるＥ−カドヘリンの同時転写アップレギュレーションをともなうことが長く知られている。最近、このＡＰＣ遺伝子が、１５〜４０％の乳癌中でサイレンス化されていることが見出された。同様に、Ｅ−カドヘリン遺伝子は、約３０％の乳癌でサイレンス化（ＣｐＧアイランドメチル化を経由して）されている。下位５の百分位数におけるＡＰＣおよび／またはＥ−カドヘリンの異常に低いレベルは、手術後の乳癌の再発の高リスク、および強調された短縮化生存のリスクを示唆する。
【０２３７】
（４．アポトーシスの調節因子）
これらは、ＢＣｌ／ＢＡＸファミリーメンバーＢＣｌ２、Ｂｃｌ−ｘｌ、Ｂａｋ、Ｂａｘおよび関連因子、ＮＦκ−Ｂおよび関連因子、ならびにまた、ｐ５３ＢＰ１／ＡＳＰＰ１およびｐ５３ＢＰ２／ＡＳＰＰ２を含む。
【０２３８】
ＢａｘおよびＢａｋはプロ−アポトーシス、そしてＢＣｌ２およびＢｃｌ−ｘｌはアンチ−アポトーシスである。従って、これら因子の比率は、細胞傷害性（プロ−アポトーシス性）薬物への細胞の抵抗性または感受性に影響する。乳癌においては、その他の癌とは異なり、ＢＣｌ２の増加したレベル（上位１０の百分位数における）は、良好な成果と相関している。これは、ＢＣｌ２が成長阻害活性およびアンチ−アポトーシス活性を有し、そして乳癌においては、前者の活性の重要性が後者の重要性に勝るという事実を反映している。次に、ＢＣｌ２の影響は、成長刺激転写因子ｃ−ＭＹＣの状況に依存する。ｃ−ＭＹＣの遺伝子は、乳癌で２０％増幅されている。ｃ−ＭＹＣメッセージレベルがＢＣｌ２に対して異常に高められるとき（この比が上位１０の百分位数にあるように）、そのときは、ＢＣｌ２  ｍＲＮＡの高められたレベルはもはやボジティブな指標ではない。
【０２３９】
ＮＦκ−Ｂは、別の重要なアンチ−アポトーシス因子である。当初は、炎症誘発性転写因子として認識され、今や、それは、いくつかの細胞外毒性因子［腫瘍壊死因子のような］に応答してプログラムされた細胞死を防ぐことが明確である。この転写因子の活性は、主に、リン酸化／脱リン酸化事象を経由して調節される。しかし、ＮＦκ−Ｂのレベルは、細胞によりまさに変動し、そして高められたレベルは、アポトーシスに対する増加した抵抗性と相関し得る。重要なことは、現在の目的には、ＮＦκ−Ｂは、タンパク質のＩＡＰ［アポトーシスのインヒビター］ファミリーの特定のメンバー、詳細には、ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２、ＸＩＡＰ、およびＳｕｒｖｉｖｉｎをコードするｍＲＮＡの転写のその刺激を通じてアンチ−アポトーシス活性を多いに奏する。従って、［上位５の百分位数のいずれかにおける］これらのＩＡＰおよびＮＦκ−ＢのｍＲＮＡレベルの異常に増加したレベルは、ＮＦκ−Ｂアンチ−アポトーシス経路の活性化を意味する。これは、化学療法後の乳癌の再発の高リスク、そしてそれ故、不良な予後を示唆する。本発明の１つの実施形態は、乳癌における予後のための、上記のアポトーシス調節因子の遺伝子セット、ならびに上記で概説した組み合わせの使用およびそれらのｍＲＮＡのレベルの比の包含である。
【０２４０】
タンパク質ｐ５３ＢＰ１および２はｐ５３に結合し、そしてプロ−アポトーシス性遺伝子の転写活性化を促進する。ｐ５３ＢＰ１および２のレベルは、乳癌の有意なフラクションで抑制され、不良な予後と相関する。いずれかが１／１０より低い百分位数で発現されるとき、不良な予後が示される。
【０２４１】
（５．細胞侵襲および血管形成を制御する因子）
これらは、ｕＰＡ、ＰＡＩ１、カテプシンＢ、ＧおよびＬ、散乱因子［ＨＧＦ］、ｃ−ｍｅｔ、ＫＤＲ、ＶＥＧＦ、およびＣＤ３１を含む。プラスミノゲンアクチベータｕＰＡおよびそのセルピン調節因子ＰＡＩ１は、細胞外マトリックスの破壊および腫瘍細胞侵襲を促進する。悪性乳癌における両者のｍＲＮＡの異常に高められたレベル（上位２０の百分位数における）は、短縮化した生存の増加したリスク、手術後の乳癌における増加した再発、およびアジュバント化学療法を受ける増加した重要性を意味する。その一方、それらの腫瘍が、増加したレベルのこれらのｍＲＮＡ種を発現しないノードネガティブの患者は、この癌の再発を有する可能性がより少なく、そして標準的な化学療法の利益が、ともなう毒性を正当化するか否かをより重篤に考慮し得る。
【０２４２】
カテプシンＢまたはＬは、上位１０の百分位数で発現されるとき、不良な疾患フリーおよび全体の生存を予見する。特に、カテプシンＬは、ノードポジティブ患者における短い生存を予見する。
【０２４３】
散乱因子およびその同族レセプターｃ−ｍｅｔは、細胞運動性および侵襲、細胞成長、および血管形成を促進する。乳癌において、これら因子をコードするｍＲＮＡの高められたレベルは、いずれか、またはその組み合わせの発現が、第９０百分位数の上であるとき、積極的な化学療法薬物による処置を促進すべきである。
【０２４４】
ＶＥＧＦは、血管形成の中心的なポジティブ調節因子であり、そして固形腫瘍における高められたレベルは、短い生存を予見する［多くの文献が、ＶＥＧＦの高められたレベルが短い生存を予見することを示していることに注目のこと］。ＶＥＧＦのインヒビターは、それ故、動物およびヒトにおける固形腫瘍の成長を遅延する。ＶＥＧＦ活性は、転写レベルで制御される。上位１０の百分位数におけるＶＥＧＦｍＲＮＡレベルは、平均予後よりも有意に不良であることを示す。血管形成のその他のマーカーは、ＣＤ３１［ＰＥＣＡＭ］であり、そしてＫＤＲは、腫瘍における高い血管密度を、しかも腫瘍が特に悪性かつ攻撃的であり、そしてそれ故、積極的な治療戦略が召還されることを示す。
【０２４５】
（６．免疫および炎症性細胞およびプロセスのためのマーカー）
これらのマーカーは、免疫グロブリン軽鎖λ、ＣＤ１８、ＣＤ３、ＣＤ６８、Ｆａｓ［ＣＤ９５］、およびＦａｓリガンドを含む。
【０２４６】
いくつかの系統の証拠は、乳癌で用いられる特定薬物の作用の機構は、宿主免疫／炎症応答の活性化をもたらすことであることを示唆している（例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））。本発明の１つの局面は、炎症性および免疫細胞のためのマーカーの遺伝子セット、および免疫監視に対する腫瘍抵抗性を予見するマーカーにおける-包含である。免疫グロブリン軽鎖λは、免疫グロブリン産生細胞のマーカーである。ＣＤ１８はすべての白血球細胞のマーカーである。ＣＤ３はＴ細胞のマーカーである。ＣＤ６８はマクロファージのマーカーである。
【０２４７】
ＣＤ９５およびＦａｓリガンドは、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞が標的細胞を殺傷する２つの主要経路の１つを媒介するレセプター：リガンドペアである。ＣＤ９５の減少した発現、およびＦａｓリガンドの増加した発現は、乳癌における不良な予後を示す。ＣＤ９５およびＦａｓリガンドもの両方は、膜貫通タンパク質であり、そして細胞死の引き金となるために膜に係留される必要がある。特定の腫瘍細胞は、ＣＤ９５ｍＲＮＡの代替スプライシングの結果として作製される、ＣＤ９５の短縮化可溶性改変体を産生する。これは、腫瘍細胞のＮＫ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞Ｆａｓリガンド媒介殺傷をブロックする。可溶性ＣＤ９５の存在は、乳癌における不良な生存と相関している。この遺伝子セットは、ＣＤ９５の可溶性および完全長改変体を含む。
【０２４８】
（７．細胞増殖マーカー）
この遺伝子セットは、細胞増殖マーカーＫｉ６７／ＭｉＢ１、ＰＣＮＡ、Ｐｉｎ１、およびチミジンキナーゼを含む。増殖マーカーの高レベル発現は、高組織学グレード、および短い生存をともなう。上位１０の百分位数における高レベルのチミジンキナーゼは、短い生存の増加したリスクを示唆する。Ｐｉｎ１は、一部サイクリンＤ１遺伝子の転写活性化による細胞成長を刺激するプロピルイソメラーゼであり、そして上位１０の百分位数におけるレベルは、ネガティブ予後プロフィールに寄与する。
【０２４９】
（８．その他の成長因子およびレセプター）
この遺伝子セットは、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦ１Ｒ、ＦＧＦ２、ＦＧＦＲ１、ＣＳＦ−１Ｒ／ｆｍｓ、ＣＳＦ−１、ＩＬ６およびＩＬ８を含む。これらタンパク質のすべては乳癌で発現される。大部分は腫瘍増殖を刺激する。しかし、成長因子ＦＧＦ２の発現は、良好な結果と相関する。いくつかはアンチ−アポトーシス活性を有する。ＩＧＦ１は有望である。増加したＩＧＦ−１、ＩＧＦ１Ｒ、またはＩＧＦＢＰ３（上位１０の百分位数におけるこれらシグナルの合計により示されるように）を経由するＩＧＦ１の活性化は、腫瘍細胞死を阻害し、そして不良な予後プロフィールに強く寄与する。
【０２５０】
（９．乳癌のサブクラスを規定する遺伝子発現マーカー）
これらは：ＧＲＯ１発癌遺伝子α、Ｇｒｂ７、サイトケラチン５および１７、網膜結合タンパク質４、肝細胞核因子３、インテグリンα７、およびリポタンパク質リパーゼを含む。これらのマーカーは、乳癌を、遺伝子発現のレベルで表現型が異なる細胞タイプのサブセットに分ける。Ｂｃｌ２、肝細胞核因子３、ＬＩＶ１およびＥＲの平均を超える腫瘍発現シグナルは、疾患フリーの最良の予後、および癌の外科的除去後の全体の生存を有する。リポタンパク質リパーゼ、網膜結合タンパク質４、およびインテグリンα７の上昇した発現により特徴付けられる乳癌腫瘍タイプの別のカテゴリーは、中間の予後を保持する。平均を超えて４倍以上のレベルのサイトケラチン５および１７、ＧＲＯ発癌遺伝子、または平均を超えて１０倍以上のＥｒｂＢ２およびＧｒｂ７のいずれかの上昇したレベルを発現する腫瘍は、最も不良な予後を有する。
【０２５１】
以下の実施例を含む、本明細書を通じて、遺伝発現研究を参照して本発明の種々の局面が説明されるが、本発明は、類似の様式で実施され得、そして類似の結果が、当該分野で周知のプロテオミクス技法を適用することにより到達され得る。プロテオームは、特定の時点におけるサンプル中に存在するタンパク質の全体である（例えば、組織、生物または細胞培養）。プロテオミクスは、とりわけ、サンプル中のタンパク質発現の全体の変化の研究である（「発現プロテオミクス」とも称される）。プロテオミクスは、代表的には、以下の工程：（１）２−Ｄゲル電気泳動（２−Ｄ  ＰＡＧＥ）によるサンプル中の個々のタンパク質の分離；（２）ゲルから回収された個々のタンパク質の同定、例えば、ｍｙ質量スペクトル分析法および／またはＮ末端配列決定、および（３）バイオインフォーマティクスを用いるデータの分析を含む。プロテオミクス法は、遺伝子発現プロファイリングのその他の方法の価値ある補足であり、そして単独または本発明のその他の方法と組合せて用いられ得、本発明の遺伝子マーカーの産物を検出する。
【０２５２】
本発明のさらなる詳細は、以下の非制限的な実施例に記載される。
【実施例】
【０２５３】
（実施例１）
（ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＰＥＴ）組織標本からのＲＮＡの単離）
（Ａ．プロトコル）
（Ｉ．ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）キシレンプロトコール）
（ＲＮＡ単離）
（１）清澄なミクロトームブレードを用いてサンプルあたり１〜６の切片（各１０μｍ厚さ）のパラフィン包埋組織を切断し、そして１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中に配置する。
【０２５４】
（２）パラフィンを抽出し、そして１ｍｌのキシレンを添加し、そしてチューブを１０分間、旋回装置上で振動することにより転置する。
【０２５５】
（３）切片を、エッペンドルフ微量遠心分離機中、１４，０００×ｇで１０分間の遠心分離によりペレット化する。
【０２５６】
（４）ペレットが取れるのを避けるために底にいくらかを残し、キシレンを除去する。
【０２５７】
（５）ステップ２〜４を繰り返す。
【０２５８】
（６）１ｍｌの１００％エタノールを添加し、そして３分間、旋回装置上で振動することによって転置する。
【０２５９】
（７）残渣を、エッペンドルフ微量遠心分離機中、１４，０００×ｇで１０分間の遠心分離によりペレット化する。
【０２６０】
（８）ペレットが取れるのを避けるために底にいくらかを残してエタノールを除去する。
【０２６１】
（９）ステップ６〜８を２回繰り返す。
【０２６２】
（１０）残りのエタノールのすべてを除去する。
【０２６３】
（１１）各サンプルについて、２μｌの５０μｇ／μｌプロテイナーゼＫを３００μｌの組織および細胞溶解溶液に添加する。
【０２６４】
（１２）各サンプルに、３００μｌの、プロテイナーゼＫを含む組織および細胞溶解溶液を添加し、十分に混合する。
【０２６５】
（１３）６５℃で９０分間インキュベートする（５分毎にボルテックス混合）。残りの組織フラグメントを肉眼によりモニターする。３０分後に見えるのであれば、さらなる２μｌの５０μｇ／μｌプロテイナーゼＫを添加し、そしてフラグメントが溶解するまでインキュベートすることを継続する。
【０２６６】
（１４）サンプルを氷上に３〜５分置き、そしてタンパク質除去、および総核酸沈殿を進行する。
【０２６７】
（タンパク質除去および総核酸の沈殿）
（１）各溶解サンプルに１５０μｌのＭＰＣタンパク質沈殿試薬を添加し、そして１０秒間激しくボルテックスする。
【０２６８】
（２）残渣を、エッペンドルフ微量遠心分離機中、１４，０００×ｇで１０分間の遠心分離によりペレット化する。
【０２６９】
（３）上清液を清澄なエッペンドルフチューブ中に移し、そしてペレットを捨てる。
【０２７０】
（４）回収された上清液中に５００μｌのイソプロパノールを添加し、そしてチューブを３分間、旋回装置上で振動することにより完全に混合する。
【０２７１】
（５）エッペンドルフ微量遠心分離機中、１４，０００×ｇで１０分間４℃の遠心分離によりＲＮＡ／ＤＮＡをペレット化する。
【０２７２】
（６）ペレットを取り除かないように注意して、ピペットでイソプロパノールのすべてを除去する。
【０２７３】
（ＲＮＡ調整物からの汚染ＤＮＡの除去）
（１）１９５μｌの１×ＤＮａｓｅ緩衝液に、５μｌのＲＮａｓｅフリーのＤＮａｓｅＩ（１Ｕ／μｌ）を添加することにより、各サンプルについて２００μｌのＤＮａｓｅＩ溶液を調製する。
【０２７４】
（２）２００μｌのＤＮａｓｅＩ溶液中で、ボルテックスすることにより、ペレット化したＲＮＡを完全に再懸濁する。
【０２７５】
（３）サンプルを３７℃で６０分間インキュベートする。
【０２７６】
（４）各サンプルに２００μｌの２×ＴおよびＣ溶解溶液を添加し、そして５秒間ボルテックスする。
【０２７７】
（５）２００μｌのＭＰＣタンパク質沈殿試薬を添加し、１０秒間ボルテックスすることにより混合し、そして氷上に３〜５分間置く。
【０２７８】
（６）エッペンドルフ微量遠心分離機中、１４，０００×ｇで１０分間の遠心分離により残渣をペレット化する。
【０２７９】
（７）ＲＮＡを含む上清液を清澄なエッペンドルフチューブに移し、そしてペレットを棄てる。（ペレットが移ることを避けるように注意のこと）
（８）各上清液に５００μｌのイソプロパノールを添加し、そして旋回装置上でサンプルを３分間振動する。
【０２８０】
（９）エッペンドルフ微量遠心分離機中、１４，０００×ｇで４℃１０分間の遠心分離によりＲＮＡをペレット化する。
【０２８１】
（１０）ペレットが取れるのを避けるために底にいくらかを残してイソプロパノールを除去する。
【０２８２】
（１１）１ｍｌの７５％エタノールで２回すすぐ。ＲＮＡペレットがとれる場合、少し遠心分離する。
【０２８３】
（１２）エタノールを注意深く除去する。
【０２８４】
（１３）残存エタノールを除去するために約３分間ヒュームフード下にセットする。
【０２８５】
（１４）このＲＮＡを、３０μｌのＴＥ緩衝液中に再懸濁し、そして−３０℃に貯蔵する。
【０２８６】
（ＩＩ．本発明の熱蝋／尿素プロトコル）
（ＲＮＡ単離）
（１）清澄なミクロトームブレードを用いて３つの切片（各１０μｍ厚さ）のパラフィン包埋組織を切断し、そして１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中に配置する。
【０２８７】
（２）３３０μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（５０μｇ／μｌのストック溶液から新たに添加される）を含む、３００μｌの溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ７．５、０．５％サルコシンラウロイルナトリウム、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．５、４Ｍ尿素）を添加し、そして簡単にボルテックスする。
【０２８８】
（３）６５℃で９０分間インキュベートする（５分毎にボルテックス混合）。組織フラグメントを肉眼によりモニターする。３０分後になお見えるのであれば、さらなる２μｌの５０μｇ／μｌプロテイナーゼＫを添加し、そしてフラグメントが溶解するまで６５℃でインキュベートすることを継続する。
【０２８９】
（４）１４，０００×ｇで５分間遠心分離し、そして上部水相を、パラフィンシールを乱さないように注意して新たなチューブに移す。
【０２９０】
（５）サンプルを氷上に３〜５分置き、そしてタンパク質除去、および総核酸沈殿を進行する。
【０２９１】
（タンパク質除去および総核酸の沈殿）
（１）各溶解サンプルに１５０μｌの７．５Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃを添加し、そして１０秒間激しくボルテックスする。
【０２９２】
（２）残渣を、エッペンドルフ微量遠心分離機中、１４，０００×ｇで１０分間の遠心分離によりペレット化する。
【０２９３】
（３）上清液を清澄なエッペンドルフチューブ中に移し、そしてペレットを捨てる。
【０２９４】
（４）回収された上清液中に５００μｌのイソプロパノールを添加し、そしてチューブを３分間、旋回装置上で振動することにより完全に混合する。
【０２９５】
（５）エッペンドルフ微量遠心分離機中、１４，０００×ｇで１０分間４℃での遠心分離によりＲＮＡ／ＤＮＡをペレット化する。
【０２９６】
（６）ペレットを取り除かないように注意して、ピペットでイソプロパノールのすべてを除去する。
【０２９７】
（ＲＮＡ調製物からの汚染ＤＮＡの除去）
（１）各サンプルに、４５μｌの１×ＤＮａｓｅＩ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ  ＣａＣｌ２）および５μｌのＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅＩ（２Ｕ／μｌ、Ａｍｂｉｏｎ）を添加する。
【０２９８】
（２）サンプルを３７℃で６０分間インキュベートする。
【０２９９】
７０℃で５分間加熱することにより、ＤＮａｓｅＩを不活性化する。
【０３００】
（Ｂ．結果）
実験による証拠は、本発明の熱ＲＮＡ抽出プロトコルがＲＮＡ収率を損なわないことを示す。１９のＦＰＥ乳癌標本を用い、同じ標本中の３つの隣接する切片からＲＮＡを抽出し、ＲＮＡ収率を、蛍光検出（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ）を用いるキャピラリー電気泳動により測定した。本発明の方法および市販方法のナノグラムでの平均ＲＮＡ収率および標準偏差は、それぞれ：１３９＋／−２１対１４１＋／−３４であった。
【０３０１】
また、本発明の尿素含有溶解緩衝液は、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）Ｔ＆Ｃ溶解緩衝液を置換し得、そして本発明に従ってタンパク質沈殿のために用いられる７．５Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃ試薬は、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ（登録商標）ＭＰＣタンパク質沈殿溶液を置換し得、ＲＮＡ収率もＴａｑＭａｎ（登録商標）効率のいずれをも損なわないことが見出された。
【０３０２】
（実施例２）
（ＲＴ−ＰＣＲの前のｍＲＮＡ種の増幅）
上記のセクション１０に記載の方法を、固定され、パラフィン包埋された乳癌組織から単離されたＲＮＡとともに用いた。ＴａｑＭａｎ（登録商標）分析は、Ｔ７−ＧＳＰプライマー（非増幅（Ｔ７−ＧＳＰｒ））、Ｔ７増幅ＲＮＡ（増幅（Ｔ７−ＧＳＰｒ））で生成された第１鎖ｃＤＮＡで実施された。ＲＮＡは、図４のステップ２に従って増幅した。コントロールとして、ＴａｑＭａｎ（登録商標）をまた、非改変ＧｓＰｒ（増幅（ＧｓＰｒ））で生成したｃＤＮＡで実施した。等価な量の初期テンプレート（１ｎｇ／ウェル）を各ＴａｑＭａｎ（登録商標）反応で用いた。
【０３０３】
結果を図８に示す。インビトロ転写は、ＲＴ−ＰＣＲシグナル強度を１０倍より多く、そして特定の遺伝子では、コントロールに対して１００倍を超えて増加し、ここで、ＲＴ−ＰＣＲプライマーは、インビトロ転写のために二本鎖ＤＮＡの生成に用いた方法２で用いたのと同じプライマーであった（ＧＳＰ−Ｔ７ｒおよびＧＳＰｒ）。図８にまた示されるのは、標準的な最適化ＲＴ−ＰＣＲプライマー（すなわち、Ｔ７テイルを欠いている）が用いられたとき生成されたＲＴ−ＰＣＲである。示されるように、このコントロールと比較して、新たな方法は、ＲＴ−ＰＣＲシグナルにおいて実質的な増加を生じた（この実験では４〜６４倍）。
【０３０４】
新たな方法は、各Ｔ７−ＧＳＰ配列が、ＲＴ−ＰＣＲシグナルにおける増加が、標準的な最適化ＲＴ−ＰＣＲ（非Ｔ７テールプライマー）に対して各遺伝子について同じであるように最適化されることを要求する。
【０３０５】
（実施例３）
（前癌状態および悪性乳癌における遺伝子発現の研究）
遺伝子発現研究は、侵襲性乳腺管癌のパラフィン包埋された固定組織サンプル中の遺伝子発現を分子的に特徴付け、およびこのような分子プロフィールと疾患フリーの生存との間の相関を探る主要目的で設計および実施された。本研究のさらなる目的は、侵襲性乳癌の組織サンプルにおける分子プロフィールを、インサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）の乳腺管癌で得られた分子プロフィールと比較することであった。この研究はさらに、インサイチュの小葉癌腫中、および侵襲性小葉癌腫のパラフィン包埋固定組織サンプル中の分子プロフィールに関するデータを得るために設計された。
【０３０６】
分子アッセイを、乳癌と診断された２０２人の個々の患者から得られた、パラフィンに包埋しホルマリン固定した原発胸部腫瘍組織に対して実施した。全ての患者は、胸部の侵襲性腺管癌、原位置純粋腺管癌（ｐｕｒｅ  ｄｕｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｓｉｔｕ）（ＤＣＩＳ）、胸部の小葉癌、または原位置純粋小葉癌（ＬＣＩＳ）の診断に伴い手術を受けていた。患者は、材料および方法の節で記載したとおりに実行された組織病理学的評価が適切な量の腫瘍組織および均一な病理を示した場合にのみ研究に含めた。
【０３０７】
この研究に参加する個体を、以下のグループに分けた：
グループ１：原位置純粋腺管癌（ＤＣＩＳ）；ｎ＝１８
グループ２：侵襲性腺管癌  ｎ＝１３０
グループ３：原位置純粋小葉癌（ＬＣＩＳ）；ｎ＝７
グループ４：侵襲性小葉癌  ｎ＝１６。
【０３０８】
（材料および方法）
それぞれの代表的な腫瘍塊を、診断用の標準的組織病理学、腫瘍の量の半定量的評価、および腫瘍等級により特徴付けした。合計６つの切片（それぞれ厚さ１０ミクロン）を調製し、そして２つのＣｏｓｔａｒ  Ｂｒａｎｄ微量遠心管（ポリプロピレン、１．７ｍＬ管、透明；各管に３つの切片）に入れた。その腫瘍が全標本面積の３０％未満を構成する場合、そのサンプルは、肉眼顕微解剖を使用して、その腫瘍組織を直接Ｃｏｓｔａｒ管に押しつけて、病理学者により、粗く切開されていてもよい。
【０３０９】
１つより多くの腫瘍塊が外科手順の一部として得られた場合、全ての腫瘍塊を、上記のように同じ特徴付けに供し、そしてその病理に最も代表的な塊を分析に使用した。
【０３１０】
（遺伝子発現分析）
ｍＲＮＡを抽出し、そして固定したパラフィン埋包組織サンプルから精製し、そして上記の７〜１１章に記載されるような遺伝子発現分析のために調製した。
【０３１１】
定量的遺伝子発現の分子アッセイを、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＴＭ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  （Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ＲＴ−ＰＣＲにより実行した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７９００ＴＭは、サーモサイクラー、レーザー、電荷結合素子（ＣＣＤ）、カメラおよびコンピュータから構成される。このシステムは、サーモサイクラー上の３８４ウェル形式でサンプルを増幅する。増幅の間、レーザー誘導蛍光シグナルを、３８４個のウェル全てについて光ファイバーケーブルを通して実時間で収集し、そしてＣＣＤで検出する。このシステムは、この機器を作動させ、そしてデータを分析するためのソフトウェアを含む。
【０３１２】
（分析および結果）
腫瘍組織を、１８５の癌関連遺伝子および７つの参照遺伝子について分析した。各患者についての閾値サイクル（ＣＴ）値を、その特定の患者についての全ての遺伝子の中央値に基づいて正規化した。臨床的結果データは、登録データおよび選択された患者のチャートの検討から全ての患者について利用可能であった。
【０３１３】
結果を以下のように分類した：
０  乳癌に起因するかもしくは未知の原因に起因して死亡したか、または乳癌の再発を伴って生存している；
１  乳癌の再発なしで生存しているか、または乳癌以外の原因に起因して死亡した。
【０３１４】
分析を、以下により実施した：
１．  正規化した遺伝子発現と０もしくは１の二元結果との間の関係の分析。
【０３１５】
２．正規化した遺伝子発現と、乳癌の再発なしで生存している患者または乳癌以外の原因に起因して死亡した患者を検閲した場合の結果までの時間（上で定義した０または１）との間の関係の分析。このアプローチを、個々の遺伝子および複数の遺伝子のセットの予後の影響を評価するために使用した。
【０３１６】
（侵襲性乳癌を有する１４７人の患者の二元アプローチによる分析）
第１の（二元）アプローチにおいて、侵襲性乳癌を有する１４６人の全ての患者に対して分析を行った。ｔ検定を、０または１に分類される患者のグループに対して行い、そして各遺伝子についてグループ間の差異についてのｐ値を計算した。
【０３１７】
以下の表４は、４５の遺伝子を列挙しており、グループ間の差異についてのｐ値は＜０．０５であった。
【０３１８】
【表４−１】
0005461730.tif 000016
【０３１９】
【表４−２】
0005461730.tif 000017
前述の表４において、より低い（ネガティブ）ｔ値は、より良好な結果を伴うより高い発現（またはより低いＣＴ）を示し、そして反対に、より高い（ポジティブ）ｔ値は、より不良な結果を伴うより高い発現（より低いＣＴ）を示す。従って、例えば、ＦＯＸＭ１遺伝子の上昇した発現（ｔ値＝３．９２、ＣＴ平均値（生存）＞ＣＴ平均値（死亡））は、無疾患生存の減少した傾向を示す。同様に、ＣＥＧＰ１遺伝子の上昇した発現（ｔ値＝−３．３９；ＣＴ平均値（生存）＜ＣＴ平均値（死亡））は、無疾患生存の増加した傾向を示す。
【０３２０】
表４に示されるデータに基づいて、乳癌における以下の遺伝子のいずれかの過剰発現は、術後の癌再発のない生存の減少した傾向を示す：ＦＯＸＭ１；ＰＲＡＭＥ；ＳＫＴ１５，Ｋｉ−６７；ＣＡ９；ＮＭＥ１；ＳＵＲＶ；ＴＦＲＣ；ＹＢ−１；ＲＰＳ６ＫＢ１；Ｓｒｃ；Ｃｈｋｌ；ＣＣＮＢ１；Ｃｈｋ２；ＣＤＣ２５Ｂ；ＣＹＰ３Ａ４；ＥｐＣＡＭ；ＶＥＧＦＣ；ｈＥＮＴ１；ＢＲＣＡ２；ＥＧＦＲ；ＴＫ１；ＶＤＲ。
【０３２１】
表４に示されるデータに基づいて、乳癌における以下の遺伝子のいずれかの過剰発現は、術後の癌再発のない生存のより良好な予後を示す：Ｂｌｃ１２；ＣＥＧＰ１；ＧＳＴＭ１；ＰＲ；ＢＢＣ３；ＧＡＴＡ３；ＤＰＹＤ；ＧＳＴＭ３；ＩＤ１；ＥｓｔＲ１；ｐ２７；ＸＩＡＰ；ＩＧＦ１Ｒ；ＡＫ０５５６９９；Ｐ１３ＫＣ２Ａ；ＴＧＦＢ３；ＢＡＧＩ１；ｐＳ２；ＷＩＳＰ１；ＨＮＦ３Ａ；ＮＦＫＢｐ６５。
【０３２２】
（１０８人のＥＲポジティブ患者の二元アプローチによる分析）
エストロゲンレセプター（ＥＲ）についての正規化されたＣＴが＜２５．２を有する１０８人の患者（すなわち、ＥＲポジティブ患者）を、別々の分析に供した。ｔ検定を、０または１に分類される患者のグループに対して実行し、そして各々の遺伝子についてのグループ間の差異のｐ値を計算した。以下の表５は、グループ間の差異のｐ値が＜０．０５である場合の１２の遺伝子を列挙する。
【０３２３】
【表５】
0005461730.tif 000018
各遺伝子について、分類アルゴリズムを利用して、臨床的結果を推定する際に各遺伝子単独を使用するために最良な閾値（ＣＴ）を同定した。
【０３２４】
表５に示されるデータに基づいて、ＥＲポジティブ癌における以下の遺伝子の過剰発現は、術後の癌再発のない生存の減少した傾向の指標である：ＰＲＡＭＥ；ＦＯＸＭ１；ＥＰＨＸ１；ＨＩＦ１Ａ；ＶＥＧＦＣ；Ｋｉ−６７；ＶＤＲ；ＮＭＥ１。これらの遺伝子のいくつか（ＰＲＡＭＥ；ＦＯＸＭ１；ＶＥＧＦＣ；Ｋｉ−６７；ＶＤＲ；およびＮＭＥ１）はまた、ＥＲポジティブ乳癌に限らず、以前の分析における不良な予後の指標として同定された。残りの遺伝子（ＥＰＨＸ１およびＨＩＦ１Ａ）の過剰発現は、ＥＲポジティブ乳癌のみにおける無疾患生存のネガティブな指標であるようである。表５に示されるデータに基づいて、ＥＲポジティブ癌における以下の遺伝子の過剰発現は、術後の癌再発のない生存についてのより良好な予後の指標である：Ｂｃｌ−２；ＤＩＡＢＬＯ；ＩＧＦ１Ｒ；ＧＳＴＭ３。後者の遺伝子のうち、Ｂｃｌ−２；ＩＧＦＲ１；およびＧＳＴＭ３はまた、ＥＲポジティブ乳癌に限らず、以前の分析における良好な予後の指標として同定された。ＤＩＡＢＬＯの過剰発現は、ＥＲポジティブ癌のみにおける無疾患生存のポジティブな指標であるようである。
【０３２５】
（複数の遺伝子および結果の指標の分析）
２つのアプローチを、複数の遺伝子を使用することが、結果間のより良好な弁別を提供するか否かを決定するために採用した。
【０３２６】
第１に、弁別分析を、変数増加ステップワイズ（ｆｏｒｗａｒｄ  ｓｔｅｐｗｉｓｅ）アプローチを使用して実行した。任意の単一の遺伝子のみで得られるモデルよりも、より大きな弁別で結果を分類したモデルを作成した。
【０３２７】
第２のアプローチ（事象発生までの時間（ｔｉｍｅ−ｔｏ−ｅｖｅｎｔ）のアプローチ）に従って、各遺伝子について、コックス比例ハザードモデル（例えば、Ｃｏｘ，Ｄ．  Ｒ．およびＯａｋｅｓ，Ｄ．（１９８４），Ａｎａｌｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｕｒｖｉｖａｌ  Ｄａｔａ，Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）を、従属変数として再発または死亡までの時間、および独立変数として遺伝子の発現レベルで定義した。Ｃｏｘモデルにおいて＜０．０５のｐ値を有する遺伝子を同定した。各遺伝子について、Ｃｏｘモデルは、その遺伝子の発現における単位変化について再発または死亡の相対的危険性（ＲＲ）を提供する。測定された発現（ＣＴスケール）の任意の閾値において患者をサブグループに分割するように選択する事ができ、ここで閾値より上の発現値を有する全ての患者は、より高い危険性を有し、そして閾値より下の発現値を有する全ての患者は、より低い危険性を有するか、あるいはその逆もまた同様であり、その遺伝子が良好な（ＲＲ＞１．０１）予後もしくは不良な（ＲＲ＜１．０１）予後のどちらの指標であるかに依存する。従って、任意の閾値は、それぞれ増加した危険性または減少した危険性を有する患者のサブグループを規定する。結果を以下の表６および７にまとめる。
【０３２８】
【表６−１】
0005461730.tif 000019
【０３２９】
【表６−２】
0005461730.tif 000020
【０３３０】
【表７】
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バイナリー時間対事象（ｔｉｍｅ−ｔｏ−ｅｖｅｎｔ）分析は、わずかな例外を伴って、予後マーカーと同じ遺伝子を同定した。例えば、表４と表６の比較により、１つの遺伝子を除いて、２つの分析が上位１５のマーカーの同じリストを作製したことが示される（最小のｐ値によって定義される）。さらに、両方の分析は、同じ遺伝子を同定し、これらは、生存期間／再発との相関の方向（プラス徴候またはマイナス徴候）について一致した。全体として、これらの結果は、これらの同定されたマーカーが有意な予後値を有するという結論を強める。
【０３３１】
２つより多い遺伝子を有するＣｏｘモデル（多変量モデル）について、各個の遺伝子がこのモデルに段階的に組み込まれ、ここで組み込まれた第１の遺伝子は、有意な単変量ｐ値を有する遺伝子の中から予め選択され、そして各次の工程におけるモデルへの組み込みのために選択された遺伝子は、このモデルのデータへのフィッティングを最も良く改善する遺伝子である。この分析は、任意の総数の遺伝子を用いて実施され得る。以下に結果が示されるこの分析において、段階的組み込みを、１０個までの遺伝子について実施した。
【０３３２】
多変量分析を、以下の式を用いて実施する：
ＲＲ＝ｅｘｐ［係数（遺伝子Ａ）×Ｃｔ（遺伝子Ａ）＋係数（遺伝子Ｂ）×Ｃｔ（遺伝子Ｂ）＋係数（遺伝子Ｃ）×Ｃｔ（遺伝子Ｃ）＋．．．．．］。
【０３３３】
この式において、有益な結果の予測指数である遺伝子の係数は、正の数であり、不良な結果の予測指数である遺伝子の係数は、負の数である。この式中の「Ｃｔ」値は、ΔＣｔである。すなわち、集団の正規化された平均Ｃｔ値と、研究中の患者について測定された正規化Ｃｔとの間の差異を示す。現在の分析で用いられる規約は、集団平均より下のΔＣＴは、正の符号を有し、集団平均より上のΔＣｔは、負の符号を有するということである（より多いかまたはより少ないｍＲＮＡ存在量を示す）。この式を解くことにより算出される相対危険度（ＲＲ）は、患者が癌を再発することなく長期生存する可能性が高いか低いかを示す。
【０３３４】
（侵襲性乳癌を有する１４７人の患者の多変量遺伝子分析）
（ａ）Ｃｏｘ  Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  Ｈａｚａｒｄｓ  Ｍｏｄｅｌを使用する多変量段階的分析を、侵襲性乳癌を有する１４７人全ての患者について得られた遺伝子発現データを用いて実施した。遺伝子ＣＥＧＰ１、ＦＯＸＭ１、ＳＴＫ１５およびＰＲＡＭＥを、この分析から除外した。以下の１０遺伝子セットを、この分析によって、原発性腫瘍の外科的除去後に癌を再発することなく患者が生存する特に強い推定値を有するとして同定した。
１．Ｂｃｌ２、サイクリンＧｌ、ＮＦＫＢｐ６５、ＮＭＥ１、ＥＰＨＸ１、ＴＯＰ２Ｂ、ＤＲ５、ＴＥＲＣ、Ｓｒｃ、ＤＩＡＢＬＯ；
２．Ｋｉ６７、ＸＩＡＰ、ｈＥＮＴｌ、ＴＳ、ＣＤ９、ｐ２７、サイクリンＧ１、ｐＳ２、ＮＦＫＢｐ６５、ＣＹＰ３Ａ４；
３．ＧＳＴＭ１、ＸＩＡＰ、Ｋｉ６７、ＴＳ、サイクリンＧ１、ｐ２７、ＣＹＰ３Ａ４、ｐＳ２、ＮＦＫＢｐ６５、ＥｒｂＢ３；
４．ＰＲ、ＮＭＥ１、ＸＩＡＰ、ｕｐａ、サイクリンＧｌ、Ｃｏｎｔｉｇ５１０３７、ＴＥＲＣ、ＥＰＨＸ１、ＡＬＤＨ１Ａ３、ＣＴＳＬ；
５．ＣＡ９、ＮＭＥ１、ＴＥＲＣ、サイクリンＧ１、ＥＰＨＸ１、ＤＰＹＤ、Ｓｒｃ、ＴＯＰ２Ｂ、ＮＦＫＢｐ６５、ＶＥＧＦＣ；
６．ＴＦＲＣ、ＸＩＡＰ、Ｋｉ６７、ＴＳ、サイクリンＧ１、ｐ２７、ＣＹＰ３Ａ４、ｐＳ２、ＥｒｂＢ３、ＮＦＫＢｐ６５。
【０３３５】
（ｂ）Ｃｏｘ  Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  Ｈａｚａｒｄｓ  Ｍｏｄｅｌを使用する多変量段階的分析を、侵襲性乳癌を有する１４７人全ての患者について得られた遺伝子発現データを用い、少数の遺伝子を含むインテロゲーションセットを使用して実施した。以下の１０遺伝子セットを、この分析によって、原発性腫瘍の外科的除去後に癌を再発することなく患者が生存する特に強い推定値を有するとして同定した。
１．Ｂｃｌ２、ＰＲＡＭＥ、サイクリンＧ１、ＦＯＸＭ１、ＮＦＫＢｐ６５、ＴＳ、ＸＩＡＰ、Ｋｉ６７、ＣＹＰ３Ａ４、ｐ２７；
２．ＦＯＸＭ１、サイクリンＧ１、ＸＩＡＰ、Ｃｏｎｔｉｇ５１０３７、ＰＲＡＭＥ、ＴＳ、Ｋｉ６７、ＰＤＧＦＲａ、ｐ２７、ＮＦＫＢｐ６５；
３．ＰＲＡＭＥ、ＦＯＸＭ１、サイクリンＧＩ、ＸＩＡＰ、Ｃｏｎｔｉｇ５１０３７、ＴＳ、Ｋｉ６、ＰＤＧＦＲａ、ｐ２７、ＮＦＫＢｐ６５；
４．Ｋｉ６７、ＸＩＡＰ、ＰＲＡＭＥ、ｈＥＮＴＩ、ｃｏｎｔｉｇ５１０３７、ＴＳ、ＣＤ９、ｐ２７、ＥｒｂＢ３、サイクリンＧｌ；
５．ＳＴＫ１５、ＸＩＡＰ、ＰＲＡＭＥ、ＰＬＡＵＲ、ｐ２７、ＣＴＳＬ、ＣＤ１８、ＰＲＥＰ、ｐ５３、ＲＰＳ６ＫＢ１；
６．ＧＳＴＭ１、ＸＩＡＰ、ＰＲＡＭＥ、ｐ２７、Ｃｏｎｔｉｇ５１０３７、ＥｒｂＢ３、ＧＳＴｐ、ＥＲＥＧ、ＩＤ１、ＰＬＡＵＲ；  
７．ＰＲ、ＰＲＡＭＥ、ＮＭＥ１、ＸＩＡＰ、ＰＬＡＵＲ、サイクリンＧＩ、Ｃｏｎｔｉｇ５１０３７、ＴＥＲＣ、ＥＰＨＸ１、ＤＲ５；  
８．ＣＡ９、ＦＯＸＭ１、サイクリンＧ１、ＸＩＡＰ、ＴＳ、Ｋｉ６７、ＮＦＫＢｐ６５、ＣＹＰ３Ａ４、ＧＳＴＭ３、ｐ２７；
９．ＴＦＲＣ、ＸＩＡＰ、ＰＲＡＭＥ、ｐ２７、Ｃｏｎｔｉｇ５１０３７、ＥｒｂＢ３、ＤＰＹＤ、ＴＥＲＣ、ＮＭＥ１、ＶＥＧＦＣ；
１０．ＣＥＧＰ１、ＰＲＡＭＥ、ｈＥＮＴｌ、ＸＩＡＰ、Ｃｏｎｔｉｇ５１０３７、ＥｒｂＢ３、ＤＰＹＤ、ＮＦＫＢｐ６５、ＩＤ１、ＴＳ。
【０３３６】
（ＥＲ陽性侵襲性乳癌を有する患者の多変量分析）
Ｃｏｘ  Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ  Ｈａｚａｒｄｓ  Ｍｏｄｅｌを使用する多変量段階的分析を、ＥＲ陽性侵襲性乳癌を有する患者について得られた遺伝子発現データを用いて実施した。以下の１０遺伝子セットを、この分析によって、原発性腫瘍の外科的除去後に癌を再発することなく患者が生存する特に強い推定値を有するとして同定した。
１．ＰＲＡＭＥ、ｐ２７、ＩＧＦＢＰ２、ＨＩＦ１Ａ、ＴＩＭＰ２、ＩＬＴ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＩＤ１、ＥｓｔＲｌ、ＤＩＡＢＬＯ；
２．Ｃｏｎｔｉｇ５１０３７、ＥＰＨＸ１、Ｋｉ６７、ＴＩＭＰ２、サイクリンＧｌ、ＤＰＹＤ、ＣＹＰ３Ａ４、ＴＰ、ＡＩＢ１、ＣＹＰ２Ｃ８；  
３．Ｂｃｌ２、ｈＥＮＴ１、ＦＯＸＭ１、Ｃｏｎｔｉｇ５１０３７、サイクリンＧｌ、Ｃｏｎｔｉｇ４６６５３、ＰＴＥＮ、ＣＹＰ３Ａ４、ＴＩＭＰ２、ＡＲＥＧ；
４．ＨＩＦ１Ａ、ＰＲＡＭＥ、ｐ２７、ＩＧＦＢＰ２、ＴＩＭＰ２、ＩＬＴ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＩＤ１、ＥｓｔＲｌ、ＤＩＡＢＬＯ；
５．  ＩＧＦ１Ｒ、ＰＲＡＭＥ、ＥＰＨＸ１、Ｃｏｎｔｉｇ５１０３７、サイクリンＧｌ、Ｂｃｌ２、ＮＭＥ１、ＰＴＥＮ、ＴＢＰ、ＴＩＭＰ２；
６．ＦＯＸＭ１、Ｃｏｎｔｉｇ５１０３７、ＶＥＧＦＣ、ＴＢＰ、ＨＩＦ１Ａ、ＤＰＹＤ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＤＣＲ３、サイクリンＧ１、ＢＡＧ１；
７．ＥＰＨＸ１、Ｃｏｎｔｉｇ５１０３７、Ｋｉ６７、ＴＩＭＰ２、サイクリンＧｌ、ＤＰＹＤ、ＣＹＰ３Ａ４、ＴＰ、ＡＩＢ１、ＣＹＰ２Ｃ８；
８．Ｋｉ６７、ＶＥＧＦＣ、ＶＤＲ、ＧＳＴＭ３、ｐ２７、ｕｐａ、ＩＴＧＡ７、ｒｈｏＣ、ＴＥＲＣ、Ｐｉｎｌ；
９．ＣＤＣ２５Ｂ、Ｃｏｎｔｉｇ５１０３７、ｈＥＮＴｌ、Ｂｃｌ２、ＨＬＡＧ、ＴＥＲＣ、ＮＭＥ１、ｕｐａ、ＩＤ１、ＣＹＰ；
１０．ＶＥＧＦＣ、Ｋｉ６７、ＶＤＲ、ＧＳＴＭ３、ｐ２７、ｕｐａ、ＩＴＧＡ７、ｒｈｏＣ、ＴＥＲＣ、Ｐｉｎｌ；
１１．ＣＴＳＢ、ＰＲＡＭＥ、ｐ２７、ＩＧＦＢＰ２、ＥＰＨＸ１、ＣＴＳＬ、ＢＡＤ、ＤＲ５、ＤＣＲ３、ＸＩＡＰ；
１２．ＤＩＡＢＬＯ、Ｋｉ６７、ｈＥＮＴ１、ＴＩＭＰ２、ＩＤｌ、ｐ２７、ＫＲＴ１９、ＩＧＦＢＰ２、ＴＳ、ＰＤＧＦＢ；
１３．ｐ２７、ＰＲＡＭＥ、ＩＧＦＢＰ２、ＨＩＦ１Ａ、ＴＩＭＰ２、ＩＬＴ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＩＤ１、ＥｓｔＲｌ、ＤＩＡＢＬＯ；
１４．ＣＤＨ１；ＦＲＡＭＥ、ＶＥＧＦＣ；ＨＩＦ１Ａ；ＤＰＹＤ、ＴＩＭＰ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＥｓｔＲｌ、ＲＢＰ４、ｐ２７；
１５．ＩＧＦＢＰ３、ＰＲＡＭＥ、ｐ２７、Ｂｃｌ２、ＸＩＡＰ、ＥｓｔＲｌ、Ｋｉ６７、ＴＳ、Ｓｒｃ、ＶＥＧＦ；
１６．ＧＳＴＭ３、ＰＲＡＭＥ、ｐ２７、ＩＧＦＢＰ３、ＸＩＡＰ、ＦＧＦ２、ｈＥＮＴｌ、ＰＴＥＮ、ＥｓｔＲｌ、ＡＰＣ；
１７．ｈＥＮＴｌ、Ｂｃｌ２、ＦＯＸＭ１、Ｃｏｎｔｉｇ５１０３７、サイクリンＧＩ、Ｃｏｎｔｉｇ４６６５３、ＰＴＥＮ、ＣＹＰ３Ａ４、ＴＩＭＰ２、ＡＲＥＧ；
１８．ＳＴＫ１５、ＶＥＧＦＣ、ＰＲＡＭＥ、ｐ２７、ＧＣＬＣ、ｈＥＮＴＩ、ＩＤ１、ＴＩＭＰ２、ＥｓｔＲｌ、ＭＣＰ１；
１９．ＮＭＥ１、ＰＲＡＭ、ｐ２７、ＩＧＦＢＰ３、ＸＩＡＰ、ＰＴＥＮ、ｈＥＮＴ１、Ｂｃｌ２、ＣＹＰ３Ａ４、ＨＬＡＧ；
２０．ＶＤＲ、Ｂｃｌ２、ｐ２７、ｈＥＮＴ１、ｐ５３、ＰＩ３ＫＣ２Ａ、ＥＩＦ４Ｅ、ＴＦＲＣ、ＭＣＭ３、ＩＤ１；
２１．ＥＩＦ４Ｅ、Ｃｏｎｔｉｇ５１０３７、ＥＰＨＸ１、サイクリンＧｌ、Ｂｃｌ２、ＤＲ５、ＴＢＰ、ＰＴＥＮ、ＮＭＥ１、ＨＥＲ２；
２２．ＣＣＮＢ１、ＰＲＡＭＥ、ＶＥＧＦＣ、ＨＩＦ１Ａ、ｈＥＮＴ１、ＧＣＬＣ、ＴＩＭＰ２、ＩＤ１、ｐ２７、ｕｐａ；
２３．ＩＤ  １、ＰＲＡＭＥ、ＤＩＡＢＬＯ、ｈＥＮＴ１、ｐ２７、ＰＤＧＦＲａ、ＮＭＥ  １、ＢＩＮ  １、ＢＲＣＡ  １、ＴＰ；
２４．ＦＢＸＯ５、ＰＲＡＭＥ、ＩＧＦＢＰ３、ｐ２７、ＧＳＴＭ３、ｈＥＮＴ１、ＸＩＡＰ、ＦＧＦ２、ＴＳ、ＰＴＥＮ；
２５．ＧＵＳ、ＨＩＡ１Ａ、ＶＥＧＦＣ、ＧＳＴＭ３、ＤＰＹＤ、ｈＥＮＴｌ、ＦＢＸＯ５、ＣＡ９、ＣＹＰ、ＫＲＴ１８；
２６．Ｂｃｌｘ、Ｂｃｌ２、ｈＥＮＴｌ、Ｃｏｎｔｉｇ５１０３７、ＨＬＡＧ、ＣＤ９、ＩＤ１、ＢＲＣＡ１、ＢＩＮ１、ＨＢＥＧＦ。
【０３３７】
上記の遺伝子セットの多くは、上で考察された標準条件下で予後マーカーとみなすのに十分な予測値を単独では有さないが、他の遺伝子と組み合わされた場合、その存在が、癌の再発を伴わない患者の長期生存の可能性についての価値ある情報を提供する遺伝子を含む。
【０３３８】
本開示全体にわたって引用される全ての参考文献は、本明細書中に参考として明確に援用される。
【０３３９】
本発明は、特定の実施形態とみなされるものに関して記載されてきたが、本発明はこのような実施形態に限定されないことが理解されるべきである。逆に、本発明は、添付の特許請求の範囲の精神および範囲内に含まれる種々の改変物および等価物を網羅することを意図する。例えば、本開示は、種々の乳癌関連遺伝子および遺伝子セットの同定、ならびに乳癌の診断および処置に焦点を合わせているが、特に、他のタイプの癌についての類似の遺伝子、遺伝子セットおよび方法が、本明細書の範囲に含まれる。
【図１】
0005461730.tif 000022
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
0005461730.tif 000027
【図７】
0005461730.tif 000028
【図８】
0005461730.tif 000029
【図９】
0005461730.tif 000030
【配列表】
0005461730000001.app