(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコース、またはグルコースを含むオリゴマーもしくはポリマーからの無細胞酵素系によるピルビン酸由来の有機化合物の製造方法であって、該方法は、
（ｉ）グルコースを、中間生成物であるグルコノラクトン、グルコン酸、２−ケト−デオキシグルコン酸、及びグリセリン酸を介してピルビン酸へと変換すること、ここで正味のＡＴＰ生産は生じず、また、１モルのグルコース当たり２モルのピルビン酸が生じる、及び
（ｉｉ）前記ピルビン酸を、前記ピルビン酸由来の有機化合物へと変換すること、
を含む上記方法。
【請求項２】
前記ピルビン酸由来の有機化合物が、エタノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、または２−ブタノールである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
グリセリン酸が、中間生成物であるグリセリン酸−２−リン酸およびホスホエノールピルビン酸を介してピルビン酸へと反応する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
酵素であるグリセリン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．１）、エノラーゼ（ＥＣ４．２．１．１１）、及びピルビン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．１．４０）が、グリセリン酸からグリセリン酸−２−リン酸への反応、グリセリン酸−２−リン酸からホスホエノールピルビン酸への反応、及びホスホエノールピルビン酸からピルビン酸への反応にそれぞれ用いられる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
グルコースからピルビン酸への変換が、補因子としてＡＴＰおよび／またはＡＤＰなしでも完全に機能する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
グリセリン酸が、中間生成物であるヒドロキシピルビン酸を介してピルビン酸へと反応し、ピルビン酸が、セリン−ピルビン酸トランスアミナーゼに触媒されてアラニンと反応してセリンおよびピルビン酸を提供し、セリンが、ピルビン酸およびアンモニアへと変換されて、次いで、アラニンへと変換される、請求項１または５に記載の方法。
【請求項７】
酵素であるグリセリン酸脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．２９）、セリン−ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＥＣ２．６．１．５１）、Ｌ−セリンアンモニアリアーゼ（ＥＣ４．３．１．１７）、及びアラニン脱水素酵素（ＥＣ１．４．１．１）が、グリセリン酸からヒドロキシピルビン酸への反応、ヒドロキシピルビン酸からヒドロキシピルビン酸＋アラニンを介してセリン＋ピルビン酸への反応、セリンからピルビン酸＋アンモニアへの反応、及びピルビン酸＋アンモニアからアラニンへの反応にそれぞれ用いられる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
グリセリン酸が直接にピルビン酸へと変換される、請求項１または５に記載の方法。
【請求項９】
酵素であるグリセリン酸デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１）がグリセリン酸からピルビン酸への直接の反応に用いられる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記製造方法が、２つに分離した相を含む液体系中で行われ、前記ピルビン酸由来の有機化合物は、主として分離した相の一方に存在しているか、または、分離した相の一方を形成しており、前記ピルビン酸由来の有機化合物はその分離した相から回収される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
２つの別の相を形成するために、有機溶媒が添加される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
グルコース、またはグルコースを含むオリゴマーもしくはポリマーが前記方法に連続的に供給され、前記ピルビン酸由来の有機化合物が連続的に取り出される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ＡＴＰアーゼが用いられない、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
炭素源から化学物質を生産する酵素を用いた方法を説明する。具体的には、一形態によれば、無細胞酵素系による炭素源からの標的有機化合物の製造方法を開示する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、酵素を用いた方法によって、好ましくは生産力のある生きた細胞の非存在下で、炭素源を標的有機化合物に生物学的に変換する方法を対象とし、ここでこのような炭素源は、好ましくは炭水化物またはその他の炭素を含む化合物である。標的有機化合物は、好ましくは、疎水性化学物質、親水性化学物質、または、その中間の化学物質である。
【０００３】
本発明に係る疎水性化学物質としては、これらに限定されないが、例えばｎ−ブタノール、２−ブタノール、および、イソブタノールのようなＣ４アルコール、ならびに水との混和性が限定的なそれ以外の化学物質が挙げられる。限定的な混和性とは、室温で相分離を起こさずに２０％（ｗ／ｗ）以下で水と混合が可能なことを意味する。本発明に係る親水性化学物質および中間的な化学物質としては、これらに限定されないが、エタノールおよびそれ以外の化学物質が挙げられる。
【０００４】
ｎ−ブタノールは、水との混和性が限定的な（室温で約７〜８％）中程度の揮発性を有する無色の中性の液体である。ｎ−ブタノールは、化学物質生産における中間体として、溶媒として、および、例えば化粧品のような配合製品における成分として用いられる。ｎ−ブタノールは、アクリル酸／メタクリル酸エステル、グリコールエーテル、酢酸ｎ−ブチル、アミノ樹脂およびｎ−ブチルアミンの合成で用いられる。またｎ−ブタノールは、低い蒸気圧、高いエネルギー含量、および、高濃度でガソリンとブレンドできる可能性のために、燃焼機関における燃料としても使用することができる。
【０００５】
２−ブタノールは、水との混和性が限定的な（室温で約１２％）中程度の揮発性を有する無色の中性の液体である。２−ブタノールは、塗料および塗装のための、加えて食品成分のための溶媒として、または、１−ブテン生産において用いられる。
【０００６】
イソブタノールは、水との混和性が限定的な（室温で約９〜１０％）中程度の揮発性を有する無色の中性の液体である。イソブタノールは、溶媒として、または、可塑剤として用いられる。これはまた、ＭＴＢＥまたはＥＴＢＥ生産の前駆体であるイソブテン生産でも用いられる。
【０００７】
ｎ−ブタノールは、例えば、典型的にはｎ−ブタノール、アセトンおよびエタノールの混合物を生産するＣ．アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｙｌｉｃｕｍ）、または、Ｃ．ベイジェリンキ（Ｃ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）のようなソルベントジェニック（ｓｏｌｖｅｎｔｏｇｅｎｉｃ）クロストリジウム属を用いて生産することができる。溶媒生成性クロストリジウム属を用いたブタノール生産にはいくつかの欠点がある：（ｉ）薄い水溶液から生成物を単離することは、手の込んだ方法（例えばメンブレンを用いた方法を使用）、または、エネルギーを消費する方法（例えば蒸留を使用）のいずれかであるため、極めて高コストである。（ｉｉ）基質のかなりの部分が、例えばアセトン、エタノール、水素およびバイオマスなどの副産物の形成に使われてしまうため、収量が低い。（ｉｉｉ）細胞のタイターが限られているため、ブタノールの生産性が低い。（ｉｖ）複雑な代謝のため、より高い生産性および収量のための代謝工学が限定される。（ｖ）プロセス安定性が限られているため、生産量の損失が起こることが多く、さらに無菌状態を保つことが難しい。（ｖｉ）クロストリジウムの増殖には二相性があることから、方法の柔軟性および生産性が限定される。
【０００８】
典型的な発酵によるブタノール生産の限定を克服するいくつかのアプローチがある。例えばＷＯ２００８／０５２５９６は、収量を改善するためのクロストリジウム属の組換えによる改変を説明している。例えばＷＯ２００８／００６０３８では、ブタノール耐性をより高くするための変異体の選択または処理が説明されている。
【０００９】
無細胞による化学物質生産は、１８９７年もの早い時期にＥｄｕａｒｄ  Ｂｕｃｈｎｅｒがグルコースをエタノールに変換するために酵母細胞の溶解産物を用いた際に登場している。その後、ＷｅｌｃｈおよびＳｃｏｐｅｓが、１９８５年にエタノールの無細胞生産を実証したが、この方法は技術的に有用ではなかった。この系は特異性に欠けており（酵素の副反応、溶解産物における不要な活性）、最大９％のエタノールしか得られなかった。
【００１０】
化学物質生産のために単離した酵素を使用した技術的な方法が多数説明されている。例えばアルコール脱水素酵素は、ケトンからのキラルアルコールの生産で用いられる。このような方法は補因子（ＮＡＤ）の再生を必要とするが、これは、例えばグルコースおよびグルコース脱水素酵素を添加することによって達成できる。このような方法は、価値の高い化学物質を生産するように設計されており、炭水化物を高いエネルギーおよび炭素利用率を有する化学物質に変換する複数の酵素反応を含む酵素系を提供するようには設計されていなかった。
【００１１】
Ｚｈａｎｇ等（２００８）は、無細胞の酵素によるグルコースからｎ−ブタノールへの変換に関する概念を説明している。この概念は、少なくとも１８種の酵素、数種の異なる補因子および補酵素（例えば、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤ、フェレドキシンおよびコエンザイムＡ）を含む。加えてこの想定上の方法は、ＡＴＰの正味の生産を引き起こし、ＡＴＰアーゼ酵素を添加してＡＴＰを除去する必要が生じる。実用的な期間、バランスの取れたＡＴＰレベルを維持しながらＡＴＰアーゼ添加をコントロールすることは、極めて難しい。まとめると、説明されている方法は、高コストであり、技術的に不安定であると予想され、さらに低いブタノール収量しか得られないと予想される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】ＷＯ２００８／０５２５９６
【特許文献２】ＷＯ２００８／００６０３８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
まとめると、再生可能な資源からの、具体的にはエタノール、および、Ｃ４アルコール、例えばｎ−ブタノールならびにその異性体からの、費用効率が高い化学物質生産方法への必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
一形態によれば、本発明は、限られた種類の酵素と限られた補因子群とだけを用いた無細胞の酵素系によって、この必要性を解決するものである。具体的に言えば、好ましい形態によれば、本発明の方法は、正味のＡＴＰ生産が生じない、および／または、リン酸化酵素反応を使用しない、および／または、生産された化学物質の存在下での不活性化に耐える酵素だけを使用する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明のコンセプトの好ましい実施態様に従った可能な実施を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
定義
疎水性化学物質とは、水にほとんど溶解せず、周囲大気圧および温度で固体または液体状態で存在する化学物質である。疎水性化学物質が水と相分離を起こさず混和される濃度は限られており、２０％（ｗ／ｗ）以下である。本発明に係る疎水性化学物質の具体的な例としては、ｎ−ブタノール、２−ブタノール、および、イソブタノールが挙げられる。
【００１７】
炭素源は、増殖または化学物質生産のために微生物が利用することができるあらゆる材料が可能である。このような材料としては、炭水化物および誘導体：ポリオース（ｐｏｌｙｏｓｅ）、例えばセルロース、ヘミセルロース、スターチ；ビオース、例えばスクロース、マルトース、ラクトース；ヘキソース、例えばグルコース、マンノース、ガラクトース；ペントース、例えばキシロース、アラビノース；ウロン酸、グルコサミンなど；ポリオール、例えばソルビトール、グリセロール；脂質および誘導体、リグニンおよび誘導体が挙げられる。特に好ましい炭素源は、グルコース、グルコースを含むオリゴマーもしくはポリマー、グルコースではない単量体ヘキソース、または、高分子糖誘導体、またはそれらの混合物である。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、炭素源からの、具体的には、疎水性化学物質、例えばｎ−ブタノール、イソブタノールまたは２−ブタノールなどのＣ４アルコールからの、および、親水性および中間的な化学物質、例えばエタノールからの、バイオテクノロジーによる化学物質生産のための無細胞方法を対象とする。
【００１９】
好ましい形態によれば、本発明は、炭素源からの無細胞酵素系による標的有機化合物の製造方法を開示し、特許請求するものであり、本方法は、グルコースの中間生成物としてのピルビン酸への変換を含み、正味のＡＴＰ生産は生じない。好ましくは、グルコースの中間生成物としてのピルビン酸への変換において、正味のＡＴＰ生産は生じない。より好ましくは、炭素源の標的有機化合物への全体的な変換において、正味のＡＴＰ生産は生じない。
【００２０】
好ましい形態によれば、炭素源の化合物は、グルコース、グルコースを含むオリゴマーもしくはポリマー、グルコースではない単量体ヘキソース、または、高分子糖誘導体である。
【００２１】
さらなる好ましい形態によれば、標的有機化合物は、エタノール、４個の炭素を有するモノアルコール、具体的にはｎ−ブタノール、イソブタノール、２−ブタノール、または、好ましくは酵素系経路によってピルビン酸から誘導されるそれ以外の有機化合物である。
【００２２】
本発明の好ましい実施態様によれば、グルコースの中間生成物としてのピルビン酸への変換は、補因子としてＡＴＰおよび／またはＡＤＰなしでも十分に作動する。より好ましくは、炭素源の標的有機化合物への全体的な変換（反応経路）は、補因子としてＡＴＰおよび／またはＡＤＰなしでも十分に作動する。
【００２３】
本発明のさらに好ましい実施態様によれば、本明細書においてさらに説明されるように、本製造方法は、２つに分離した相を含む液体系中で行われ、標的有機化合物は、主として分離した相の一方に存在しているか、または、分離した相の一方を形成しており、標的有機化合物はその分離した相から回収される。
【００２４】
本発明のさらに好ましい実施態様によれば、本明細書においてさらに説明されるように、２つに分離した相を形成するために、有機溶媒が添加される。
本発明のさらに好ましい実施態様によれば、本明細書においてさらに説明されるように、炭素源の化合物はプロセスに連続的に供給され、標的有機化合物は連続的に取り出される。
【００２５】
本発明のさらに好ましい実施態様によれば、本明細書においてさらに説明されるように、酵素系は、好ましくは、以下のグルコースからピルビン酸に変換するための酵素または酵素活性を含む：
・グルコース脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．４７）、
・グルコノラクトナーゼ（ＥＣ３．１．１．１７）、
・グルコン酸デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．３９）、
・２−ケト−３−デオキシグルコン酸アルドラーゼ（ＥＣ４．１．２．１４）、
・アルデヒド脱水素酵素（ＥＣ１．２．１．３）、
・グリセリン酸脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．２９）、または、ヒドロキシピルビン酸還元酵素（ＥＣ１．１．１．８１）、
・セリン−ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＥＣ２．６．１．５１）、
・Ｌ−セリンアンモニア−リアーゼ（ＥＣ４．３．１．１７）、および、
・アラニン脱水素酵素（ＥＣ１．４．１．１）。
【００２６】
本発明のさらに好ましい実施態様によれば、本明細書においてさらに説明されるように、酵素系は、好ましくは、以下のグルコースからピルビン酸に変換するための酵素または酵素活性を含む：
・グルコース脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．４７）、
・グルコノラクトナーゼ（ＥＣ３．１．１．１７）、
・グルコン酸デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．３９）
・２−ケト−３−デオキシグルコン酸アルドラーゼ（ＥＣ４．１．２．１４）
・アルデヒド脱水素酵素（ＥＣ１．２．１．３）、および、
・グリセリン酸デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．）。
【００２７】
本発明のさらに好ましい実施態様によれば、本明細書においてさらに説明されるように、エタノールは、１１、１０、９、８、７種またはそれ未満の酵素を含む酵素系によってグルコースから生産される。
【００２８】
本発明のさらに好ましい実施態様によれば、本明細書においてさらに説明されるように、ｎ−ブタノールは、１７、１６、１５種またはそれ未満の酵素を含む酵素系によってグルコースから生産される。
【００２９】
本発明のさらに好ましい実施態様によれば、本明細書においてさらに説明されるように、イソブタノールは、１４、１３種またはそれ未満の酵素を含む酵素系によって生産される。
【００３０】
本発明のさらに好ましい実施態様によれば、本明細書においてさらに説明されるように、２−ブタノールは、１３種またはそれ未満の酵素を含む酵素系によって生産される。
好ましい一つの形態によれば、本発明の製造方法は、以下の４つの工程を含む：
Ｉ．炭素源を化学物質（本明細書においては「標的化学物質」または「標的有機化合物」とも称される）に変換するための酵素（「標的酵素」）を微生物細胞を用いて生産する工程；
ＩＩ．工程Ｉで用いられる微生物細胞から、標的酵素を放出させる工程（ここで好ましくは、補因子の放出、および、非標的酵素の余分な活性の不活性化も共に行う）；
ＩＩＩ．工程ＩＩの標的酵素を、炭素源を標的化学物質に変換するのに適した条件下で炭素源と接触させる工程；
ＩＶ．標的化学物質を反応混合物から分離する工程。
【００３１】
図１はさらに、好ましい実施態様に係る本発明の概念の可能性のある実施を説明する。
工程Ｉ：
工程Ｉにおいて、標的酵素は、微生物細胞を用いて生産される。
【００３２】
本発明の一実施態様において、酵素生産は、全体の生産経路やその主要な部分が１種の微生物では再構築されないように、２種またはそれより多くの異なる微生物細胞系で行われる。それにより、不必要な基質の化学物質の変換の開始は回避され、より効率的な酵素生産が得られる。酵素生産は、細胞内でもまたは細胞外でもよいし、組換えでもまたは非組換えでもよい。酵素生産が組換えによる場合、組換えは、相同組換えでもよいし、また、非相同組換えでもよい。
【００３３】
本発明のさらなる実施態様において、標的酵素は、１種の基質および１種の反応に関して選択的である。好ましくは、標的酵素は、その他のあらゆる自然に存在する物質と比較して少なくとも１０倍の基質選択性（ｋｃａｔ／ｋＭ）、および、少なくとも９０％の反応選択性を有する。より好ましくは、標的酵素は、少なくとも２０倍の基質選択性、および、少なくとも９５％の反応選択性を有する。さらにより好ましくは、標的酵素は、少なくとも１００倍の基質選択性、および、少なくとも９９％の反応選択性を有する。
【００３４】
本発明のさらなる実施態様において、標的酵素は、基質、または、多段階反応の生成物またはそれ以外の中間体によって阻害されないか、わずかな阻害しか示さない（フィードバック阻害がないか、または、低い）。好ましくは、多段階反応のあらゆる基質、生成物または中間体に関する阻害定数（Ｋｉ）は、酵素および基質それぞれに関するＫＭ値よりも少なくとも１０倍高い。より好ましくは、このような阻害定数は、それぞれのＫＭよりも１００倍高い。さらなる特に好ましい実施態様において、多段階反応のあらゆる基質、中間体または生成物の濃度が１００ｍＭまたはそれより高くて、標的酵素はそれでもなおそれらの最大活性の５０％を有する。
【００３５】
標的酵素は、好ましくは、酵素経路の多段階の状態にあわせて調節されたｋｃａｔおよびＫＭ値を有する。
本発明の方法の一実施態様によれば、標的酵素は、高レベルの標的化学物質に対する耐性を有し、任意に、標的化学物質の分離を促進するために分離した相に任意に添加される可能性があるその他の有機溶媒に対する耐性を有していてもよい。標的酵素は、好ましくは２質量％より高い、より好ましくは６質量％より高い、最も好ましくは１２質量％より高い標的化学物質濃度に対する耐性を有する。特に好ましい実施態様において、標的酵素は、水に溶解する最大濃度までの標的化学物質濃度に対する耐性を有する。
【００３６】
本発明の好ましい実施態様において、標的酵素は、高レベルのカオトロピック物質に対する耐性、および、高温に対する耐性を有する。標的酵素は、好ましくは１Ｍより高い、より好ましくは、３Ｍより高い、最も好ましくは６Ｍより高い塩化グアニジニウムの濃度に対する耐性を有する。その代わりに、または、それと組み合わせて、標的酵素は、好ましくは５０℃より高い、より好ましくは７０℃より高い、最も好ましくは９０℃より高い温度に対する耐性を有する。このような好ましい実施態様において、標的酵素生産は、高レベルのカオトロピック物質の存在下で、および／または、高温で、内因性の酵素活性の大部分が不活性化されている宿主生物中でなされる。好ましくは、標的酵素生産は、以下の微生物種を用いてなされる：エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）；シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）；バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）；ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）；ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）；クルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｙｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）；トリコデルマ・リーゼイ（ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）；アスぺルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）。より好ましくは、標的酵素生産は、宿主生物としてエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を用いてなされる。
【００３７】
本発明のさらに好ましい実施態様において、標的酵素は、高レベルの酸素に対する耐性を有する。好ましくは、標的酵素は、１ｐｐｍより高い酸素濃度、より好ましくは７ｐｐｍより高い酸素濃度に対する耐性を有する。最も好ましくは、標的酵素は、好気条件下で活性であり、かつ安定である。好ましくは、多段階反応は酸素を必要とせず、酸素によって阻害されない。そのために酸素除去のための特殊な予防措置を取り入れる必要はなく、生産環境および／または器具に関してより少ない努力で本方法をより安定にすることができる。
【００３８】
好ましくは、酵素生産と細胞増殖とは、分離した相に分けられる。それによって、全体の代謝活性のために基質は使用されない。
工程ＩＩ：
工程ＩＩにおいて、標的酵素を細胞から放出させる。
【００３９】
好ましい実施態様において、標的酵素は、高温およびカオトロピック条件に対する耐性を有するが、それに対して生産中の微生物から生じるバックグラウンドの酵素は、これらの条件に対する耐性を有していない。この実施態様によれば、標的酵素は微生物細胞の細胞内に生産され、これらの細胞は、高温および／またはカオトロピック条件を用いて溶解され、それによって任意に補因子と共に活性型の標的酵素が放出され、同時に、不要なバックグラウンドの酵素活性は不活性化される。
【００４０】
その他の好ましい実施態様において、酵素生産は細胞外であり、標的酵素は、高温およびカオトロピック条件に対する耐性を有するが、バックグラウンドの酵素活性（非標的酵素）はこれらの条件に対する耐性を有さない。この実施態様によれば、細胞外生産によって生じた上清は、例えば高温および／またはカオトロピック条件のような条件下で処理される。それにより不要なバックグラウンドの酵素活性（非標的酵素）の不活性化が起こるが、同時に、標的酵素は活性を維持する。
【００４１】
本発明の一実施態様において、１種またはそれより多くの複数の酵素による変換工程には補因子が必要である。本発明の一形態において、このような補因子は、酵素混合物に添加される。この実施態様のその他の特に好ましい形態において、このような補因子はまた微生物細胞によって細胞内に生産され、標的酵素を放出させるのと同じ処理によって放出される。その他の本発明の好ましい実施態様において、微生物細胞は、生産された補因子のレベルを最適化するために加工される。
【００４２】
好ましくは、微生物細胞は、工程ＩＩの間に不活性化される。それによりプロセスにおいて細胞増殖と酵素活性とは分離されるので、望ましくない細胞増殖によって炭素源が消費されることはない。
【００４３】
工程ＩＩＩ：
工程ＩＩＩにおいて、炭素源は、多段階の酵素反応において酵素混合物によって標的化学物質に変換される。
【００４４】
本発明の方法によれば、酵素は、標的化学物質の変性作用がある条件下で活性である。好ましくは、工程Ｉで用いられる微生物細胞は、工程ＩＩＩの反応条件下で不活性であるか、および／または、不活性化される。
【００４５】
好ましくは、標的酵素混合物中の各酵素の濃度は、処理条件下で最適なレベルに調節される。特に好ましい実施態様において、本方法の収量を改善するために、１種またはそれより多くの酵素の濃度を典型的な細胞内濃度よりも高くする（典型的な方法と同様に、微生物の最大密度による限定はない）。その他の特に好ましい実施態様において、１種またはそれより多くの酵素は、最大の触媒効率が得られるように加工される（それにより、典型的な方法と比較して、反応装置のサイズおよび運転費を低くすることができる）。
【００４６】
さらに好ましい実施態様において、標的化学物質は、工程ＩＩＩにおいて、処理条件下で一つの相中で水と混合することができる最大レベルよりもやや高い濃度で反応混合物に加えられる。この実施態様によれば、標的化学物質は、処理中に連続的に第二の相に分離する。この実施態様の具体的な形態において、水溶性物質を反応混合物に添加すると、添加された物質が存在しない場合の濃度よりも低い濃度で標的化学物質の相分離が生じる。このような物質の例は塩であり、これらは当業者によく知られている。この実施態様の特に好ましい形態において、水相における標的化学物質の溶解性を低くするために、塩化ナトリウムが添加される。
【００４７】
その他の好ましい実施態様において、本方法に、それ自身が相を形成する有機溶媒を追加で添加して、水相から生成した疎水性化学物質を抽出する。このような追加の溶媒の好ましい例としては、ｎ−ヘキサン、シクロヘキサン、オクタノール、酢酸エチル、メチルブチルケトン、または、それらの組み合わせが挙げられる。
【００４８】
その他の好ましい実施態様において、望ましい反応に特異的な標的酵素を用いることにより副産物の形成が減少するので、収量が改善される。その他の好ましい実施態様において、副反応を触媒すると予想される宿主の酵素は工程ＩＩ中に不活性化されるか、および／または、反応条件下で不活性である。
【００４９】
さらにその他の本発明の好ましい実施態様において、本方法の微生物による汚染は、工程ＩＩＩにおける反応条件を典型的な微生物（汚染物質）にとって毒性に調節することによって回避される。このような条件は、高温、極端なｐＨ、有機化合物の添加を含む。特に本発明の好ましい実施態様において、標的化学物質それ自身が、本方法中に到達する濃度において毒性である（生産環境および／または器具に対する尽力がより少ない、より安定な方法）。
【００５０】
本発明のその他の好ましい実施態様によれば、反応混合物に追加の補因子は添加されない（ただし、工程Ｉで用いられる微生物によって生産され、工程ＩＩで生産された細胞溶解産物中に含まれる補因子を除く）。このような補因子の例は、ＮＡＤ／ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨ、ＡＴＰ／ＡＤＰである。この実施態様によれば、必要な補因子は工程Ｉで微生物細胞によって生産され、本方法中に再生する（ＮＡＤＨからＮＡＤへ、逆もまた同様；ＮＡＤＰＨからＮＡＤＰに、逆もまた同様、ＡＤＰからＡＴＰに、逆もまた同様）。本発明の一実施態様において、余分な還元等価体（ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ）またはエネルギー等価体（ＡＴＰ）は、追加の酵素（ＮＡＤＨの場合はＮＡＤＨオキシダーゼ；ＮＡＤＰＨの場合はＮＡＤＰＨオキシダーゼ；ＡＴＰの場合はＡＴＰアーゼ）によって再生される。
【００５１】
特に本発明の好ましい実施態様において、少なくとも多段階反応工程の実質的な部分において、補因子としてＡＴＰまたはＡＤＰが含まれない。多段階反応経路の実質的な部分は、好ましくは少なくとも２０％の酵素活性を含み、より好ましくは少なくとも５０％の酵素活性を含む。最も好ましくは、標的酵素混合物（工程Ｉで生産された酵素混合物）の酵素活性は、リン酸化工程を含まない（非リン酸化反応経路）。特に本発明の好ましい実施態様において、このような反応経路は、グルコースからピルビン酸への変換を含み、この変換に関与する標的酵素は、リン酸化工程を含まない（非リン酸化ピルビン酸生産）。
【００５２】
工程ＩＶ：
工程ＩＶにおいて、１種またはそれより多くの標的化学物質が、反応混合物から分離される。
【００５３】
本発明の好ましい実施態様において、１種またはそれより多くの標的化学物質は疎水性であり、好ましくは、生産された化学物質を少なくとも実質的な割合で含む分離した相が形成される。特に好ましい実施態様において、１種またはそれより多くの標的化学物質は、反応混合物から連続的に取り出される。
【００５４】
本発明のさらに好ましい実施態様において、炭素源は、標的化学物質に変換される反応混合物に連続的に供給される。同様に、標的化学物質は、好ましくは分離した相として連続的に取り出され、当業界公知の方法でさらに精製される。それによって生成物の単離は、生成物が分離した相中で回収されるために簡易化され、それをさらに精製することができる。それによって、収量は改善され、生成物の精製は簡易化される。
【００５５】
説明されている無細胞の酵素を用いた方法（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｗｅｌｃｈ  ａｎｄ  Ｓｃｏｐｅｓ  １９８５）の主要な問題は、ＡＴＰの蓄積である。説明されている方法において、これは、ＡＴＰアーゼの添加によって回避される。しかしながら、基質や様々な中間体の濃度、加えて酵素活性に依存するので、ＡＴＰアーゼの適正な濃度を見出すことは難しい。ＡＴＰアーゼが多すぎても、または、ＡＴＰアーゼが少なすぎても、変換が完全に止まる（Ｗｅｌｃｈ  ａｎｄ  Ｓｃｏｐｅｓ，１９８５）。それに対して、特に好ましい形態によれば、本発明の無細胞方法は、正味のＡＴＰ生産を生じさせず、さらにＡＴＰアーゼを用いることなく、グルコースおよびそのポリマーのような炭素源を、エタノール、ブタノールおよび／またはイソブタノールのような標的化学物質に変換する。
【００５６】
さらに好ましい実施態様において、本発明の方法は、補因子としてＡＤＰまたはＡＴＰを必要としない。その他の方法（Ｗｅｌｃｈ  ａｎｄ  Ｓｃｏｐｅｓ，１９８５；Ａｌｇａｒ  ａｎｄ  Ｓｃｏｐｅｓ，１９８５）は、ＡＤＰ／ＡＴＰ、および、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨのような補因子を必要とする。提唱されているグルコースからブタノールへの変換（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，２００８）は、補因子のＡＤＰ／ＡＴＰ、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ、フェレドキシンとコエンザイムＡとを必要とする。
【００５７】
本明細書で用いられる用語「酵素」は、用語「酵素活性」も包含しており、同じ意味で用いることができる。
以下で、ｎ−ブタノール、イソブタノール、エタノール、および、２−ブタノールの生産に関するいくつかの好ましい実施態様を説明する。
【００５８】
ｎ−ブタノールの生産
本発明の一実施態様において、標的化学物質はｎ−ブタノールであり、ｎ−ブタノールを生成する標的酵素混合物は、１９種未満の異なる酵素活性を含む。標的酵素混合物は、好ましくは１７種またはそれ未満の異なる酵素活性、より好ましくは、１６種またはそれ未満の酵素活性、さらにより好ましくは、１５種またはそれ未満の酵素活性、最も好ましくは１２種のみの異なる酵素活性を含む。酵素の生産は、本方法における主なコスト要因であるため、これは、その他の方法を超える主要な利点を与える。
【００５９】
特に好ましい実施態様を介して生産されるにおいて、ｎ−ブタノールは、グルコースから中間体のピルビン酸およびアセチルＣｏＡを介して生産される。グルコースからのｎ−ブタノールの生産は、任意にさらに以下の３つの工程：（Ａ）１分子のグルコースの２分子のピルビン酸への変換、（Ｂ）２分子のピルビン酸の２分子のアセチルＣｏＡへの変換、（Ｃ）２分子のアセチルＣｏＡの１分子のｎ−ブタノールへの変換、に細分化することができる。
【００６０】
工程（Ａ）：グルコースのピルビン酸への変換。
この工程は、全てではないがほとんどの生物において、異なる代謝経路（例えば、エムデン−マイエルホーフ−パルナス経路、エントナー−ドウドロフ経路）が存在したとしても、ほとんどの場合において共通である。工程（Ａ）の具体的な形態は、表１（酵素の組み合わせＡ．１）で列挙したように１０種の酵素活性を含む、エムデン−マイエルホーフ−パルナス経路からの酵素を使用している。この酵素の組み合わせによって触媒される反応経路はリン酸化酵素を含み、それにより正味のＡＴＰ生産が生じる（グルコース１分子あたり２分子のＡＴＰが生成する）。
【００６１】
【表１】
0005461582.tif 000002
【００６２】
工程（Ａ）のその他の具体的な形態は、エントナー−ドウドロフ経路の酵素活性を使用する。本発明の好ましい実施態様によれば、工程（Ａ）において、古細菌から知られている非リン酸化エントナー−ドウドロフ経路からの酵素が用いられる。これは、表２（酵素の組み合わせＡ．２）で列挙した８種の酵素活性を含む。この酵素の組み合わせはリン酸化酵素を含むため、補因子としてＡＴＰおよび／またはＡＤＰを必要とするが、グルコースのピルビン酸への変換により、正味のＡＴＰ生産は生じない。
【００６３】
【表２】
0005461582.tif 000003
【００６４】
工程（Ａ）のその他の特に好ましい形態は、正味のＡＴＰ生産が生じないだけでなく、補因子としてＡＴＰまたはＡＤＰも必要としない酵素の組み合わせを使用する。それぞれの酵素の組み合わせは、表３（酵素の組み合わせＡ．３）で列挙したように９種の異なる酵素活性を含む。
【００６５】
【表３】
0005461582.tif 000004
【００６６】
さらに工程（Ａ）の特に好ましい形態も、正味のＡＴＰ生産が生じないだけでなく、補因子としてＡＴＰまたはＡＤＰも必要としないその他の酵素の組み合わせを使用する。それぞれの酵素の組み合わせは、表４（酵素の組み合わせＡ．４）で列挙したように５種の異なる酵素活性を含む。
【００６７】
【表４】
0005461582.tif 000005
【００６８】
工程（Ｂ）：ピルビン酸のアセチルＣｏＡへの変換
ピルビン酸のアセチルＣｏＡへの変換のための様々な選択肢が存在する。
本発明の一実施態様において、以下の酵素のうち１種またはそれより多くが変換に用いられる：（ｉ）補因子としてフェレドキシンを用いたピルビン酸オキシド還元酵素；（ｉｉ）補因子としてＮＡＤ（Ｐ）Ｈを用いたピルビン酸脱水素酵素；（ｉｉｉ）ピルビン酸ギ酸リアーゼ；（ｉｖ）ピルビン酸脱水素酵素複合体。
【００６９】
好ましい実施態様において、ピルビン酸脱水素酵素は、この変換のための、補因子としてＮＡＤＨを利用する酵素として用いられる（表５で列挙した通り）。
【００７０】
【表５】
0005461582.tif 000006
【００７１】
ピルビン酸脱水素酵素は通常、３種の酵素活性からなる複数の酵素の複合体（ピルビン酸脱水素酵素複合体、ＰＤＣ）の一部であり、約１００万Ｄａ（１ Ｍｉｏ Ｄａ）の分子量を有する。無細胞反応系で適用するためには、小さく強健な錯体化されていない酵素を含むことが有利である。ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）由来のピルビン酸脱水素酵素が酵素混合物Ｂ．１で用いることができることが見出された。この酵素は単独であり複合体を含まない。さらにこの酵素は、より適切な補因子であるＮＡＤＰＨに匹敵する補因子としてＮＡＤＨを使用する（より多くの量で利用可能であり、再生がより簡単である）。
【００７２】
あるいは、ピルビン酸ギ酸リアーゼは、補因子としてＮＡＤＨを用いるギ酸脱水素酵素と組み合わせることができる。
工程（Ｃ）：アセチルＣｏＡのｎ−ブタノールへの変換
アセチルＣｏＡをｎ−ブタノールに変換するための様々な選択肢が存在するが、これは、数種の微生物がこの経路を介してｎ−ブタノールを生産するためである（例えば、Ｃ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、Ｃ．ベイジェリンキ）。
【００７３】
工程（Ｃ）の好ましい形態において、この変換には表６で列挙したような酵素が用いられる。酵素（源の生物）に応じて様々な補因子が用いられる。
【００７４】
【表６】
0005461582.tif 000007
【００７５】
その他の好ましい形態において、中間体ブチリルＣｏＡからブタノールへの反応経路は、酪酸を含まないが、リン酸ブチリルを含む。ただし列挙した経路および酵素に限定されない。また、当業界でよく知られている代替の酵素および経路も使用できる。
【００７６】
上述したような全ての反応工程が組み合わされる場合（酵素の組み合わせＡ．１、Ａ．２、Ａ．３またはＡ．４；それに加えて、酵素の組み合わせＢ．１およびＣ．１）１分子のグルコースの、２分子のＣＯ２、１分子の水、および、１分子のｎ−ブタノールへの正味の変換が成される。このような酵素の組み合わせによって、正味の還元等価体の生産は起こらない（４分子のＨ２が放出され、その後再利用される）。グルコースからピルビン酸への経路に従って、ＡＤＰおよびリン酸から、ＡＴＰは生成しないか（Ａ．２、Ａ．３またはＡ．４）、または、２分子以下のＡＴＰが生成される（Ａ．１）。
【００７７】
特に本発明の好ましい実施態様において、酵素の組み合わせＡ.４、Ｂ．１およびＣ.１が組み合わされる。この標的酵素混合物は、１２種の異なる酵素活性しか含まず、補因子としてＡＤＰ/ＡＴＰを必要とせず、その結果として正味のＡＴＰ生産は生じない。
【００７８】
本発明の特に好ましいその他の実施態様において、酵素の組み合わせＡ．３、Ｂ．１およびＣ．１が組み合わされる。この標的酵素混合物は１６種の異なる酵素活性を含み、補因子としてＡＤＰ／ＡＴＰを必要とせず、その結果として正味のＡＴＰ生産は生じない。
【００７９】
本発明の好ましいその他の実施態様において、酵素の組み合わせＡ.２、Ｂ.１およびＣ.１が組み合わされる。この標的酵素混合物は、１５種の異なる酵素活性を含み、補因子としてＡＤＰ/ＡＴＰを必要とするが、それにより正味のＡＴＰ生産は生じない。
【００８０】
イソブタノールの生産
本発明のその他の実施態様において、標的化学物質は、イソブタノールである。
特に好ましい実施態様において、イソブタノールは、グルコースから中間体のピルビン酸を介して生産される。グルコースからのイソブタノールの生産は、任意に、さらに二段階：（Ａ）１分子のグルコースの２分子のピルビン酸への変換；および、（Ｄ）２分子のピルビン酸の１分子のイソブタノールへの変換、に細分化することができる。
【００８１】
工程（Ａ）：グルコースのピルビン酸への変換
この工程はｎ−ブタノールの生産における工程（Ａ）と同じである（上記参照）。
工程（Ｄ）：ピルビン酸のイソブタノールへの変換
本発明の好ましい実施態様において、表７で列挙したような酵素活性は、イソブタノールの無細胞生産のための工程（Ｄ）で用いられる。
【００８２】
【表７】
0005461582.tif 000008
【００８３】
上述したような全ての反応が組み合わされる場合（酵素の組み合わせＡ．１、Ａ．２、Ａ．３またはＡ．４；それに加えて、酵素の組み合わせＤ．１）、１分子のグルコースの、２分子のＣＯ２、１分子の水、および、１分子のイソブタノールへの正味の変換が達成される。この酵素の組み合わせにより、正味の還元等価体の生産は起こらない（２分子のピルビン酸が形成されると４分子のＨ２が形成され、その後イソブタノールの形成で消費される）。グルコースからピルビン酸への経路に従って、ＡＤＰおよびリン酸から、ＡＴＰは生成しないか（Ａ．２、Ａ．３またはＡ．４）、または、２分子以下のＡＴＰが生成される（Ａ．１）。
【００８４】
特に本発明の好ましい実施態様において、酵素の組み合わせＡ．４およびＤ．１が組み合わされる。この標的酵素混合物は、１０種の異なる酵素活性しか含まず、補因子としてＡＤＰ／ＡＴＰを必要とせず、その結果として正味のＡＴＰ生産は生じない。
【００８５】
本発明の特に好ましいその他の実施態様において、酵素の組み合わせＡ．３およびＤ．１が組み合わされる。この標的酵素混合物は１４種の異なる酵素活性を含み、補因子としてＡＤＰ／ＡＴＰを必要とせず、その結果として正味のＡＴＰ生産は生じない。
【００８６】
本発明の好ましいその他の実施態様において、酵素の組み合わせＡ．２およびＤ．１が組み合わされる。この標的酵素混合物は１３種の異なる酵素活性を含み、補因子としてＡＤＰ／ＡＴＰを必要とするが、それにより正味のＡＴＰ生産は生じない。
【００８７】
エタノールの生産
本発明のその他の実施態様において、標的化学物質は、エタノールである。エタノールはどのような比率でも完全に水に溶解し、分離した有機相の形成による簡単な精製ができない。それにもかかわらず、無細胞生産のための本発明の方法は、再生可能な炭素源からエタノールを生産するコスト効率の高い方法を提供する。
【００８８】
特に好ましい実施態様において、エタノールは、グルコースから中間体のピルビン酸を介して生産される。グルコースからのエタノールの生産は、任意に、さらに二段階：（Ａ）１分子のグルコースの２分子のピルビン酸への変換；および、（Ｅ）２分子のピルビン酸の２分子のエタノールへの変換、に細分化することができる。
【００８９】
工程（Ａ）：グルコースのピルビン酸への変換
この工程は、ｎ−ブタノールの生産における工程（Ａ）と同じである（上記参照）。
工程（Ｅ）：ピルビン酸のエタノールへの変換
本発明の好ましい実施態様において、表８で列挙したような酵素活性は、ピルビン酸のエタノールへの変換に用いられる。
【００９０】
【表８】
0005461582.tif 000009
【００９１】
上述したような全ての反応が組み合わされる場合（酵素の組み合わせＡ．１、Ａ．２、Ａ．３またはＡ．４；それに加えて、酵素の組み合わせＥ．１）、１分子のグルコースの、２分子のＣＯ２、および、２分子のエタノールへの正味の変換が達成される。この酵素の組み合わせにより、正味の還元等価体の生産は起こらない。グルコースからピルビン酸への経路に従って、ＡＤＰおよびリン酸から、ＡＴＰは生成しないか（Ａ．２、Ａ．３またはＡ．４）、または、２分子以下のＡＴＰが生成される（Ａ．１）。
【００９２】
特に本発明の好ましい実施態様において、酵素の組み合わせＡ．４およびＥ．１が組み合わされる。この標的酵素混合物は、７種の異なる酵素活性しか含まず、補因子としてＡＤＰ／ＡＴＰを必要とせず、その結果として正味のＡＴＰ生産は生じない。
【００９３】
本発明の特に好ましいその他の実施態様において、酵素の組み合わせＡ．３およびＥ．１が組み合わされる。この標的酵素混合物は１１種の異なる酵素活性を含み、補因子としてＡＤＰ／ＡＴＰを必要せず、それにより、正味のＡＴＰ生産は生じない。
【００９４】
本発明の好ましいその他の実施態様において、酵素の組み合わせＡ．２およびＥ．１が組み合わされる。この標的酵素混合物は１０種の異なる酵素活性を含み、補因子としてＡＤＰ／ＡＴＰを必要とするが、それにより、正味のＡＴＰ生産は生じない。
【００９５】
２−ブタノールの生産
本発明のその他の実施態様において、標的化学物質は、２−ブタノールである。
特に好ましい実施態様において、２−ブタノールは、グルコースから中間体のピルビン酸を介して生産される。グルコースからの２−ブタノールの生産は、任意にさらに二段階：（Ａ）１分子のグルコースの２分子のピルビン酸への変換；および、（Ｆ）２分子のピルビン酸の１分子の２−ブタノールへの変換、に細分化することができる。
【００９６】
工程（Ａ）：グルコースのピルビン酸への変換
この工程は、ｎ−ブタノールの生産における工程（Ａ）と同じである（上記参照）。
工程（Ｆ）：ピルビン酸の２−ブタノールへの変換
本発明の好ましい実施態様において、表９で列挙したような酵素活性は、２−ブタノールの無細胞生産のための工程（Ｆ）で用いられる。好ましい実施態様において、基質としてアセトイン、加えて２−ブタノンを使用するアルコール脱水素酵素が用いられる。
【００９７】
【表９】
0005461582.tif 000010
【００９８】
上述したような全ての反応が組み合わされる場合（酵素の組み合わせＡ．１、Ａ．２、Ａ．３またはＡ．４；それに加えて、酵素の組み合わせＦ．１）、１分子のグルコースの、２分子のＣＯ２、１分子の水、および、１分子の２−ブタノールへの正味の変換が達成される。この酵素の組み合わせにより、正味の還元等価体の生産は起こらない（２分子のピルビン酸が形成されると４分子のＨ２が形成され、その後２−ブタノールの形成で消費される）。グルコースからピルビン酸への経路に従って、ＡＤＰおよびリン酸から、ＡＴＰは生成しないか（Ａ．２、Ａ．３またはＡ．４）、または、２分子以下のＡＴＰが生成される（Ａ．１）。
【００９９】
特に本発明の好ましい実施態様において、酵素の組み合わせＡ．４およびＦ．１が組み合わされる。この標的酵素混合物は９種の異なる酵素しか含まず、補因子としてＡＤＰ／ＡＴＰを必要とせず、その結果として正味のＡＴＰ生産は生じない。
【０１００】
本発明の特に好ましいその他の実施態様において、酵素の組み合わせＡ．３およびＦ．１が組み合わされる。この標的酵素混合物は１４種の異なる酵素活性を含み、補因子としてＡＤＰ／ＡＴＰを必要とせず、その結果として正味のＡＴＰ生産は生じない。
【０１０１】
本発明の好ましいその他の実施態様において、酵素の組み合わせＡ．２およびＦ．１が組み合わされる。この標的酵素混合物は１３種の異なる酵素活性を含み、補因子としてＡＤＰ／ＡＴＰを必要とするが、それにより、正味のＡＴＰ生産は生じない。
【０１０２】
グルコース以外のその他の基質
上述したエタノール、ｎ−ブタノール、イソブタノール、２−ブタノールまたはその他の化学物質を生産するための本発明の経路は、基質としてのグルコースの使用に限定されない。本方法に適用されるグルコース脱水素酵素の選択性に応じて、例えばその他のＣ６糖も基質として用いることができる。加えてスターチは、アミラーゼ／グルコアミラーゼ活性の組み合わせと共に、基質として用いることができる。セルロース系材料は、エンドセルラーゼ（ｅｎｄｏｃｅｌｌｕｌａｓｅ）／エキソセルラーゼ（ｅｘｏｃｅｌｌｕｌａｓｅ）／グルコシダーゼ活性と共に、基質として用いることができる。またラクトース、スクロースおよびその他のオリゴマーまたは高分子糖誘導体も、それに対応する、これらを単体のヘキソースに変換する酵素と共に用いることができる。
【０１０３】
本発明の一実施態様に関して、リグノセルロース系材料は、合計で１０種の酵素（酵素の組み合わせＡ．４およびＥ．１、エンドセルラーゼ（ｅｎｄｏｃｅｌｌｕｌａｓｅ）、エキソセルラーゼ（ｅｘｏｃｅｌｌｕｌａｓｅ）、ベータ−グルコシダーゼ）だけを用いてエタノールに変換される。
【０１０４】
以下の実施例で、本発明をさらに定義する。当然のことながら、これらの実施例は、単に例証として示されただけであり、本発明の範囲を限定するものではない。上記の考察およびこれらの実施例に関して、当業者であれば本発明の本質的な特徴を確認することができ、それらの本質および範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更および改変を施して、それらを様々な用途および条件に適合させることができる。
【実施例】
【０１０５】
実施例１：Ｃ．サッカロブチリカム（Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、Ｓ．セレビジエおよびＺ．モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）の細胞溶解産物からの酵素混合物を用いたグルコースのｎ−ブタノールへの変換
Ｓ．セレビジエを１２％グルコースを含むＹＰＤ培地で３０℃で嫌気的に増殖させる。エタノールの形成は、１時間ごとのサンプリングとガスクロマトグラフィーでの解析によってモニターする。エタノール生成が最大の相で細胞を回収し、４倍量の反応緩衝液（２０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６．５；５ｍＭのメルカプトエタノール、１０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、５００μＭのＺｎＳＯ４、５００μＭのＣｏＣｌ２、２００μＭのＭｎＣｌ２）で懸濁する。続いて細胞をフレンチプレスで破壊することによって溶解させ、細胞上清を遠心分離で精製し、ろ過滅菌して全ての残存した細胞を除去する。
【０１０６】
Ｚ．モビリス（ＡＴＣＣ１０９９８）を１２％グルコースを含むＬＢ培地で３５℃で増殖させる。エタノールの形成は、１時間ごとのサンプリングとガスクロマトグラフィーでの解析によってモニターする。エタノール生成が最大の相で細胞を回収し、４倍量の反応緩衝液（２０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６．５；５ｍＭのメルカプトエタノール、１０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、５００μＭのＺｎＳＯ４、５００μＭのＣｏＣｌ２、２００μＭのＭｎＣｌ２）で懸濁する。続いて細胞をフレンチプレスで破壊することによって溶解させ、細胞上清を遠心分離で精製し、ろ過滅菌して全ての残存した細胞を除去する。
【０１０７】
クロストリジウム・サッカロブチリカムＤＳＭＺ１３８６４を、６％のグルコース濃度を有するＴＹＡ培地（６ｇ／ｌのトリプトンペプトン、２ｇ／ｌの酵母抽出物、３ｇ／ｌのＮＨ４ＣＨ３ＣＯＯ、０．３ｇ／ｌのＭｇＳＯ４、０．５ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、１ｍｇ／ｌのリザズリン、１０ｍｇ／ｌのＭｎＳＯ４、１ｍｇ／ｌのｐ−アミノ安息香酸、１ｍｇ／ｌのチアミンクロリド塩酸塩、０．２ｍｇ／ｌのビオチン）で３５℃で増殖させる。ブタノールが形成されたら、２時間毎にサンプリングし、ＧＣで解析する。４０時間後、細胞は、溶媒生産相（ｓｏｌｖｅｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｐｈａｓｅ）中に存在する。細胞を回収し、溶解させ、溶解産物をろ過滅菌する。
【０１０８】
Ｃ．サッカロブチリカムからの１ミリリットルの細胞溶解産物を、Ｓ．セレビジエまたはＺ．モビリスからの等量の溶解産物と共に、または、それらを含まないで、１００ｍＭのグルコースとインキュベートする。全ての反応において、ピルビン酸脱炭酸酵素の阻害剤として作用する１０ｍＭのケトマロン酸（７１７４０，フルカ（Ｆｌｕｋａ））を添加する。嫌気性条件化で３０℃で２時間インキュベートした後、全ての反応において生産されたｎ−ブタノールを定量する。
【０１０９】
実施例２：単離した酵素およびＣ．サッカロブチリカムの細胞溶解産物からの酵素を用いたグルコースのｎ−ブタノールへの変換
実施例１からのＣ．サッカロブチリカムの細胞溶解産物を以下の酵素とインキュベートする：ヘキソキナーゼ（２０μ／ｍｌ）、ホスホヘキソイソメラーゼ（１５μ／ｍｌ）、ホスホフルクトキナーゼ（４μ／ｍｌ）、アルドラーゼ（１６μ／ｍｌ）、ホスホトリオースイソメラーゼ（３００μ／ｍｌ）、グリセリンアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（６０μ／ｍｌ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（１２０μ／ｍｌ）、ホスホグリセリン酸ムターゼ（６０μ／ｍｌ）、エノラーゼ（１１μ／ｍｌ）、ピルビン酸キナーゼ（１５μ／ｍｌ）、ピルビン酸脱水素酵素（２０μ／ｍｌ）、リン酸トランスアセチラーゼ（１５μ／ｍｌ）（全ての酵素はシグマ（Ｓｉｇｍａ）から得た；以下の表を参照；ホスホグリセリン酸ムターゼのみ、ＵＳＢ（２６１１１マイルズロード，オハイオ州クリーブランド）から得たものであり（製品番号２６１１８  １００ＵＧ）、これは、組換えによってＥ．コリで発現されたヒト酵素である）。２０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ６．５）；５ｍＭのメルカプトエタノール、１０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、５００μＭのＺｎＳＯ４、５００μＭのＣｏＣｌ２、２００μＭのＭｎＣｌ２、４ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭのＡＤＰ、１ｍＭのＮＡＤＨ、１ｍＭのＮＡＤ、１ｍＭのコエンザイムＡ、および、２００ｍＭのグルコース中で嫌気性条件下で３０℃でインキュベートする。用いる全ての試薬は、標準的な方法によって脱酸素する。１０分後、ＡＴＰアーゼ（０．５μ／ｍｌ）を添加して、初期でのＡＴＰ形成を回避する。３時間後、生産されたｎ−ブタノールを定量する。
【０１１０】
【表１０】
0005461582.tif 000011
【０１１１】
実施例３：単離した酵素を用いたグルコースのｎ−ブタノールへの変換
酵素チオラーゼ（ＥＣ２．３．１．１６、クロストリジウム・アセトブチリカム、ＮＣＢＩ遺伝子番号：ＮＰ＿３４９４７６．１）、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．１５７、ＮＰ＿３４９３１４．１）、クロトナーゼ（ＥＣ４．２．１．５５、クロストリジウム・アセトブチリカム、ＮＰ＿３４９３１８．１）、ブチリル−ＣｏＡ脱水素酵素（ＥＣ１．３．９９．２、クロストリジウム・アセトブチリカム、ＮＣＢＩ遺伝子番号：ＮＰ＿３４９３１７．１）、アルデヒド脱水素酵素をアシル化するコエンザイムＡ（ＥＣ１．２．１．５７、クロストリジウム・ベイジェリンキ、ＮＣＢＩ遺伝子番号：ＡＦ１３２７５４＿１）、ＮＡＤＨ依存性ブタノール脱水素酵素Ｂ（ＢＤＨ  ＩＩ）（ＥＣ１．１．１．−、クロストリジウム・アセトブチリカム、ＮＣＢＩ遺伝子番号：ＮＰ＿３４９８９１．１）、および、電子移動フラビンタンパク質（ｅｔｆＡおよびＢ、クロストリジウム・アセトブチリカム、ＮＣＢＩ遺伝子番号：ＮＰ＿３４９３１５．１、および、ＮＰ＿３４９３１６．１）を合成し、説明されているようにして組換えによってＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させる。５ｍｌの反応溶液（２０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６．５；５ｍＭのメルカプトエタノール、１０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、５００μＭのＺｎＳＯ４、５００μＭのＣｏＣｌ２、２００μＭのＭｎＣｌ２、４ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭのＡＤＰ、１ｍＭのＮＡＤＨ、１ｍＭのＮＡＤ、１ｍＭのコエンザイムＡ）中で全ての酵素を合わせる（各１ｍｇ）。上記の表９（グルコースのアセチルＣｏＡへの変換）で列挙した等しい体積の酵素混合物を添加する：ヘキソキナーゼ（２００μ／ｍｌ）、ホスホヘキソイソメラーゼ（１５０μ／ｍｌ）、ホスホフルクトキナーゼ（４０μ／ｍｌ）、アルドラーゼ（１６０μ／ｍｌ）、ホスホトリオースイソメラーゼ（３０００μ／ｍｌ）、グリセリンアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（６００μ／ｍｌ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（１２００μ／ｍｌ）、ホスホグリセリン酸ムターゼ（６００μ／ｍｌ）、エノラーゼ（１１０μ／ｍｌ）、ピルビン酸キナーゼ（１５０μ／ｍｌ）、ピルビン酸脱水素酵素（２００μ／ｍｌ）、リン酸トランスアセチラーゼ（１５０μ／ｍｌ）、ＡＴＰアーゼ（４，５μ／ｍｌ）を、５００ｍＭのグルコースを含む２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）中で合わせる。この反応液を３０℃で嫌気性条件下で撹拌する。３時間後、生産されたｎ−ブタノールを定量する。
【０１１２】
あるいは、この反応をグルコースを１２０ｍｇ／時間の速度で連続的に添加しながら行う（反応開始後２時間から、手動で３０分のインターバルで６０ｍｇを添加する）。合計反応時間が２０時間に達したら、生産されたｎ−ブタノールを定量する。
【０１１３】
実施例４：単離した酵素およびＴ．マリティマからの細胞溶解産物を用いたグルコースのイソブタノールへの変換
Ｔ．マリティマを８０℃で５％グルコースで増殖させる。グルコースが全て消費される前に、細胞を回収し、４倍量の反応緩衝液（２０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６．５；５ｍＭのメルカプトエタノール、１０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、５００μＭのＺｎＳＯ４、５００μＭのＣｏＣｌ２、２００μＭのＭｎＣｌ２）に再懸濁し、フレンチプレスで破壊することによって溶解させる。細胞上清を遠心分離で精製し、ろ過滅菌する。バリン生合成に関する遺伝子ｉｌｖＩＣＤ（アセト乳酸合成酵素、ＥＣ：２．２．１．６、ＮＣＢＩ遺伝子番号：ＮＰ＿２２８３５８．１；ケトール酸レダクトイソメラーゼ、ＥＣ．１．１．１．８６、ＮＣＢＩ遺伝子番号：ＮＰ＿２２８３６０．１、および、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ、ＥＣ：４．２．１．９、ＮＣＢＩ遺伝子番号：ＮＰ＿２２８３６１．１）を、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍｅ）からクローニングし、標準的な方法で組換えによってＥ．コリで発現させる。ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（ＥＣ４．１．１．−、ＮＣＢＩ遺伝子番号：ＣＡＧ３４２２６．１）由来のα−ケトイソ吉草酸脱炭酸酵素をクローニングし、標準的な方法で組換えによってＥ．コリで発現させる。Ｓ．セレビジエ由来のアルコール脱水素酵素（ＥＣ：１．１．１．１）はシグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（Ａ３２６３）から購入する。
【０１１４】
全ての酵素を、５ｍｌの反応溶液（２０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６．５；５ｍＭのメルカプトエタノール、１０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、５００μＭのＺｎＳＯ４、５００μＭのＣｏＣｌ２、２００μＭのＭｎＣｌ２、４ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭのＡＤＰ、１ｍＭのＮＡＤＨ、１ｍＭのＮＡＤ）中で１００μ／ｍｌの濃度で合わせる。
【０１１５】
等しい体積のＴ．マリティマからの細胞溶解産物を添加し、合わせたサンプルを２５０ｍＭのグルコースと共に５０℃でインキュベートする。１時間後、生産されたイソブタノールを定量する。
【０１１６】
実施例５：単離した酵素を用いたグルコースのエタノールへの変換
以下の酵素に関する遺伝子：グルコース脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．４７、Ｓ．ソルファタリカス（Ｓ．ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）、ＮＣＢＩ遺伝子番号：ＮＰ＿３４４３１６．１）、グルコノラクトナーゼ（ＥＣ３．１．１．１７、ピクロフィルス・トリダス（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ  ｔｏｒｒｉｄｕｓ）、ＮＣＢＩ遺伝子番号：ＹＰ＿０２３６８５．１）、グルコン酸デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．３９、スルフォロブス・ソルファタリカス、ＮＣＢＩ遺伝子番号：ＮＰ＿３４４５０５、突然変異株Ｉ９Ｌ）、２−ケト−３−デオキシグルコン酸アルドラーゼ（ＥＣ４．１．２．１４、スルフォロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）、ＮＣＢＩ遺伝子番号：ＮＰ＿３４４５０４．１）、アルデヒド脱水素酵素（ＥＣ１．２．１．３、フラボバクテリウム・フリギディマリス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｉｇｉｄｉｍａｒｉｓ）、ＮＣＢＩ遺伝子番号：ＢＡＢ９６５７７．１）、グリセリン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．１．−、スルフォロブス・ソルファタリカス、ＮＣＢＩ遺伝子番号：ＮＰ＿３４２１８０．１）、エノラーゼ（ＥＣ４．２．１．１１、スルフォロブス・ソルファタリカス、ＮＣＢＩ遺伝子番号：ＮＰ＿３４２４０５．１）、および、ピルビン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．１．４０、スルフォロブス・ソルファタリカス、ＮＣＢＩ遺伝子番号：ＮＰ＿３４２４６５．１）を合成し、クローニングのためにＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて標準的な方法で発現ベクターｐＥＴ３ｂにクローニングする。細胞増殖、タンパク質発現および部分的な精製は、Ｌａｍｂｌｅ等（２００３）によって説明されている通りに行なうが、それに加えて、全ての緩衝液に５ｍＭのメルカプトエタノールを供給し、加熱沈殿の一般的な温度として８０℃を用いる（アルデヒド脱水素酵素の場合、６０℃を用いる）。タンパク質生産は通常、５〜５０ｍｇ／ｌであった。Ｓ．セレビジエ由来のピルビン酸脱炭酸酵素およびアルデヒド脱水素酵素は、シグマ−アルドリッチ（製品番号２９１６３および８２８８４）から得る。
【０１１７】
全ての酵素を、２５０ｍＭのグルコースを含む５ｍｌの反応溶液（２０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６．５；５ｍＭのメルカプトエタノール、１０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、５００μＭのＺｎＳＯ４、５００μＭのＣｏＣｌ２、２００μＭのＭｎＣｌ２、４ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭのＡＤＰ、１ｍＭのＮＡＤＨ、１ｍＭのＮＡＤ）中で合わせ（それぞれ１ｍｇの組換え生産された酵素、および、２μの購入した酵素）、４７℃でインキュベートする。この溶液に、熱による不活性化を補うために３０分毎に２種の酵母の酵素を添加する。６時間後、生産されたエタノールを定量する。１０種の酵素を用いただけで、グルコースからエタノールが生産される。加えて正味のＡＴＰは生じない。
【０１１８】
実施例６：単離した酵素を用いたグルコースのエタノールへの変換
正味のＡＴＰ生産またはその他のあらゆる補因子なしで、グルコースからエタノールまたは化学物質および燃料を生産することは有利ではあるが、本方法から補因子としてのＡＴＰまたはＡＤＰが完全に除去されることがより有益である。それゆえに、実施例５で説明した酵素群、ただしグリセリン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．１．−）、エノラーゼ（ＥＣ４．２．１．１１）、および、ピルビン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．１．４０）を除く、を用いる。グリセリン酸脱水素酵素（別名ヒドロキシピルビン酸還元酵素（ＥＣ１．１．１．２９／１．１．１．８１））、セリン−ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＥＣ２．６．１．５１）、Ｌ−セリンアンモニア−リアーゼ（ＥＣ４．３．１．１７）、および、アラニン脱水素酵素（ＥＣ１．４．１．１）を用いて、グリセリン酸のピルビン酸への変換が達成される。以下の酵素に関する遺伝子：グリセリン酸脱水素酵素／ヒドロキシピルビン酸還元酵素（ＥＣ１．１．１．２９／１．１．１．８１、ピクロフィルス・トリダス、ＮＣＢＩ遺伝子番号：ＹＰ＿０２３８９４．１）、セリン−ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＥＣ２．６．１．５１、スルフォロブス・ソルファタリカス、ＮＣＢＩ遺伝子番号：ＮＰ＿３４３９２９．１）、Ｌ−セリンアンモニア−リアーゼ（ＥＣ４．３．１．１７、サーマス・サーモフィルス、ＹＰ＿１４４２９５．１、および、ＹＰ＿１４４００５．１）、および、アラニン脱水素酵素（ＥＣ１．４．１．１、サーマス・サーモフィルス、ＮＣＢＩ遺伝子番号：ＹＰ＿００５７３９．１）を合成し（Ｅ．コリにおける生産に最適化したコドン）、ＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて発現ベクター  ｐＥＴ３ｂにクローニングする。タンパク質発現はＥ．コリで行なう。
【０１１９】
全ての酵素を、２５０ｍＭのグルコースを含む５ｍｌの反応溶液（２０ｍＭのリン酸カリウム、１０ｍＭの硫酸アンモニウム、ｐＨ６．５；５ｍＭのメルカプトエタノール、１０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、５００μＭのＺｎＳＯ４、５００μＭのＣｏＣｌ２、２００μＭのＭｎＣｌ２、１ｍＭのＮＡＤＨ、１ｍＭのＮＡＤ、１ｍＭのセリン、１ｍＭのアラニン）中で合わせ（それぞれ１ｍｇの組換え生産された酵素、および、２μの購入した酵素）、４７℃でインキュベートする。この溶液に、熱による不活性化を補うために３０分毎に２種の酵母の酵素を再度添加する。インキュベート６時間後に生産されたエタノールを定量する。リン酸化を行わず、および、補因子としてＡＴＰまたはＡＤＰを必要とすることなく、グルコースからエタノールが生産される。
【０１２０】
実施例７：単離した酵素を用いたグルコースのエタノールへの変換
グリセリン酸からのピルビン酸の形成は、エタノールまたはその他のピルビン酸誘導体の生産における重要な工程である。Ｓ．ソルファタリカス由来のジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．９）は、異なる基質を受け入れることが示されている（Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，２００６）。ジヒドロキシ酸デヒドラターゼに関する遺伝子（ＥＣ４．２．１．９、Ｓ．ソルファタリカス、ＮＰ＿３４４４１９．１）は、ＫｉｍおよびＬｅｅ（２００６）によって説明されているように発現される。これらの酵素は、グリセリン酸をピルビン酸に変換することができる（しかしながら、天然基質と比較してより低い活性である）。またこれらの酵素は、グルコン酸に対しても活性である（しかしながら、天然基質と比較してより低い活性である）。
【０１２１】
実施例９の酵素グルコース脱水素酵素、グルコノラクトナーゼ、２−ケト−３−デオキシグルコン酸アルドラーゼおよびアルデヒド脱水素酵素を、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（上述の通り）、ならびにシグマからのピルビン酸脱炭酸酵素およびアルデヒド脱水素酵素（実施例５を参照）（それぞれ１ｍｇの組換え生産された酵素、および、２μの購入した酵素）と、２５０ｍＭのグルコースを含む５ｍｌの反応溶液（２０ｍＭのリン酸カリウム、１０ｍＭの硫酸アンモニウム、ｐＨ６．５；５ｍＭのメルカプトエタノール、１０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、５００μＭのＺｎＳＯ４、５００μＭのＣｏＣｌ２、２００μＭのＭｎＣｌ２１ｍＭのＮＡＤＨ、１ｍＭのＮＡＤ）中で合わせ、４７℃でインキュベートする。この溶液に、熱による不活性化を補うために３０分毎に２種の酵母の酵素を再度添加する。インキュベート６時間後に生産されたエタノールを定量する。
【０１２２】
実施例８：正味のＡＴＰ生産が生じない単離した酵素を用いたグルコースのｎ−ブタノールへの変換
ピルビン酸シンターゼ４単位の遺伝子（ＥＣ１．２．７．１．、スルフォロブス・ソルファタリカス、ＮＣＢＩ遺伝子番号：ＮＰ＿３４２６６４．１、ＮＰ＿３４２６６３．１、ＮＰ＿３４２６６６．１、ＮＰ＿３４３５１７．１）、および、ＮＡＤＨ  フェレドキシン還元酵素の遺伝子（ＥＣ１．１８．１．３、ＮＣＢＩ遺伝子番号：ＮＰ＿３４２６８２．１）を合成し、ｐＥＴ３ｂでＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位を用いてクローニングする。これらの遺伝子を、説明されているようにして、Ｅ．コリ中で嫌気的に発現させ、一部精製する。グルコース脱水素酵素、グルコノラクトナーゼ、グルコン酸デヒドラターゼ、２−ケト−３−デオキシグルコン酸アルドラーゼ、アルデヒド脱水素酵素、グリセリン酸キナーゼ、エノラーゼ、および、ピルビン酸キナーゼを実施例５で説明されているように得た。実施例３で説明されているように、チオラーゼ、β−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水素酵素、ブチリルＣｏＡ脱水素酵素、ＣｏＡアシル化ブタナール脱水素酵素、および、ブタノール脱水素酵素（ｅｔｆＡおよびｅｔｆＢ含む）が得られる。
【０１２３】
全ての酵素を、２５０ｍＭのグルコースを含む１０ｍｌの反応溶液（２０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６．５；５ｍＭのメルカプトエタノール、１０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、５００μＭのＺｎＳＯ４、５００μＭのＣｏＣｌ２、２００μＭのＭｎＣｌ２４ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭのＡＤＰ、１ｍＭのＮＡＤＨ、１ｍＭのＮＡＤ、１ｍＭのコエンザイムＡ、１ｍＭのＦＡＤ、１ｍＭのＦＡＤＨ２）中で合わせる（それぞれ１ｍｇ）。この溶液を４５℃でインキュベートする。１時間後、生産されたブタノールを定量する。
【０１２４】
実施例９：正味のＡＴＰ生産が生じない単離した酵素を用いたグルコースのｎ−ブタノールへの変換
グルコース脱水素酵素、グルコノラクトナーゼ、２−ケト−３−デオキシグルコン酸アルドラーゼ、および、アルデヒド脱水素酵素を実施例５で説明したようにして得る。ジヒドロキシ酸デヒドラターゼを実施例９で説明したようにして得る。ＮＡＤＨ  フェレドキシン還元酵素およびピルビン酸シンターゼを実施例１０で説明したようにして得る。チオラーゼ、β−ヒドロキシブチリルＣｏＡ脱水素酵素、ブチリルＣｏＡ脱水素酵素、ＣｏＡアシル化ブタナール脱水素酵素、および、ブタノール脱水素酵素（ｅｔｆＡおよびｅｔｆＢを含む）を実施例３で説明したようにして得る。
【０１２５】
全ての酵素を、２５０ｍＭのグルコースを含む１０ｍｌの反応溶液（２０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６．５；５ｍＭのメルカプトエタノール、１０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、５００μＭのＺｎＳＯ４、５００μＭのＣｏＣｌ２、２００μＭのＭｎＣｌ２１ｍＭのＮＡＤＨ、１ｍＭのＮＡＤ、１ｍＭのコエンザイムＡ、１ｍＭのＦＡＤ、１ｍＭのＦＡＤＨ２）中で合わせる（それぞれ１ｍｇ）。この溶液を４５℃でインキュベートする。１時間後、生産されたｎ−ブタノールを定量する。
【０１２６】
実施例１０：正味のＡＴＰ生産が生じない単離した酵素を用いたグルコースのイソブタノールへの変換
アセト乳酸合成酵素（ＥＣ２．２．１．６、スルフォロブス・ソルファタリカス、ＮＣＢＩ遺伝子番号：ＮＰ＿３４２１０２．１）、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＥＣ１．１．１．８６、スルフォロブス・ソルファタリカス、ＮＣＢＩ遺伝子番号：ＮＰ＿３４２１００．１）、分枝２−オキソ酸脱炭酸酵素（ＥＣ４．１．１．７２、ラクトコッカス・ラクティス、ＮＣＢＩ遺伝子番号）、および、アルコール脱水素酵素（ＥＣ１．１．１．１、フラボバクテリウム・フリギディマリス、ＮＣＢＩ遺伝子番号：ＢＡＢ９１４１１．１）の触媒単位を、ｐＥＴ３ｂ中でＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ部位を用いてクローニングする。この遺伝子をＥ．コリで発現させる。これらの酵素は、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（実施例７を参照）と共に、ピルビン酸からイソブタノールへの経路を構成する。グルコース脱水素酵素、グルコノラクトナーゼ、グルコン酸デヒドラターゼ、２−ケト−３−デオキシグルコン酸アルドラーゼ、アルデヒド脱水素酵素、グリセリン酸キナーゼ、エノラーゼ、および、ピルビン酸キナーゼを実施例５で説明したようにして得る。ジヒドロキシ酸デヒドラターゼを実施例５で説明したようにして得る。
【０１２７】
全ての酵素を、２５０ｍＭのグルコースを含む１０ｍｌの反応溶液（２０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６．５；５ｍＭのメルカプトエタノール、１０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＭｇＳＯ４、５００μＭのＺｎＳＯ４、５００μＭのＣｏＣｌ２、２００μＭのＭｎＣｌ２、４ｍＭのＡＴＰ、１ｍＭのＡＤＰ、１ｍＭのＮＡＤＨ、１ｍＭのＮＡＤ）中で合わせる（それぞれ１ｍｇ）。この溶液を５３℃で１時間インキュベートする。熱による不活性化を補うために、１０分毎に新しい分枝２−オキソ酸脱炭酸酵素を添加する。１時間後、生産されたイソブタノールを定量する。
【０１２８】
参考文献
・Algar, E.M. and Scopes, R.K. (1985) Journal of Biotechnology 2(5) 275-287.
・Lamble, H.J.; Heyer, N.I.; Bull, S.D.; Hough, D.W. and Danson M.J. (2003) J. Biol.Chem. 36 (5) 34066-72.
・Welch, P und Scopes R.K: (1985) Journal of Biotechnology 2(5) 257-273.
・Zhang Y.-H.P., Evans B.R., Mielenz J.R., Hopkins R.C., Adams M.W.W. (2007) PLoS ONE 2(5): e456.
・Zhang Y.H.P., Ye, X. And Wang, Y. (2008) Biotechnology: Research, Technology and Applications。
【０１２９】
以下に、本発明の様々な実施態様において有用な典型的な配列を示す（ただしこれらに限定されない）：
【０１３０】
【化１】
0005461582.tif 000012
【０１３１】
【化２】
0005461582.tif 000013
【０１３２】
【化３】
0005461582.tif 000014
【０１３３】
【化４】
0005461582.tif 000015
【０１３４】
【化５】
0005461582.tif 000016
【０１３５】
【化６】
0005461582.tif 000017
【０１３６】
【化７】
0005461582.tif 000018
【０１３７】
【化８】
0005461582.tif 000019
【図１】
0005461582.tif 000020