(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトラミニンα５β１γ１のＥ８フラグメントまたはヒトラミニンα３β３γ２のＥ８フラグメントがコーティングされていることを特徴とするヒト多能性幹細胞培養用培養基材。
【請求項２】
ヒトラミニンα５β１γ１のＥ８フラグメントまたはヒトラミニンα３β３γ２のＥ８フラグメントが０．５μｇ／ｃｍ２〜２５μｇ／ｃｍ２の濃度でコーティングされていることを特徴とする請求項１に記載の培養基材。
【請求項３】
ヒト多能性幹細胞が、ヒトＥＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞である請求項１または２に記載の培養基材。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の培養基材を使用することを特徴とするヒト多能性幹細胞の培養方法。
【請求項５】
単一細胞に分散されたヒト多能性幹細胞を培養する方法であって、
ヒト多能性幹細胞を単一細胞に分散する工程と、
単一細胞に分散されたヒト多能性幹細胞を、請求項１〜３のいずれかに記載の培養基材を用いて培養する工程とを含むことを特徴とするヒト多能性幹細胞の培養方法。
【請求項６】
ヒト多能性幹細胞を単一細胞に分散する工程と、
単一細胞に分散されたヒト多能性幹細胞を、請求項１〜３のいずれかに記載の培養基材を用いて培養する工程とを含み、
単一細胞に分散されたヒト多能性幹細胞を２×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２〜２０×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２の密度で播種することを特徴とするヒト多能性幹細胞の急速拡大方法。
【請求項７】
ヒト多能性幹細胞を単一細胞に分散する工程と、
単一細胞に分散されたヒト多能性幹細胞を、請求項１〜３のいずれかに記載の培養基材を用いて培養する工程とを含み、
単一細胞由来のコロニーを形成させることを特徴とするヒト多能性幹細胞の単一細胞由来クローン分離方法。
【請求項８】
ヒト多能性幹細胞を単一細胞に分散する工程と、
単一細胞に分散されたヒト多能性幹細胞を、請求項１〜３のいずれかに記載の培養基材を用いて培養する工程とを含み、
単一細胞の状態で維持することを特徴とするヒト多能性幹細胞の単一細胞培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト多能性幹細胞用培養基材およびその利用に関するものであり、詳細には、ヒト多能性幹細胞用培養基材、ならびに当該培養基材を用いるヒト多能性幹細胞の培養方法、ヒト多能性幹細胞の急速拡大方法およびヒト多能性幹細胞の単一細胞由来クローン分離方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトＥＳ細胞やヒトｉＰＳ細胞などのヒト多能性幹細胞は、その再生医療への応用が世界的に注目されている。しかし、分化多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を保持したままヒト多能性幹細胞を培養、維持するためには、通常、マウスやヒト由来の線維芽細胞をフィーダー細胞として用いて共培養する方法が一般的であり、フィーダー細胞の使用がヒト多能性幹細胞を臨床応用する上での大きな制約となっている。この問題を解決するために、これまでにフィーダー細胞に代えて様々な接着タンパク質がヒトＥＳ細胞の細胞外基質として試みられており、中でも基底膜を過剰産生するマウスＥＨＳ肉腫から抽出、精製した基底膜成分であるマトリゲル（商品名）が、最も分化多能性維持の活性が高いと報告されている。しかし、マトリゲルはマウス由来であり、異種のタンパク質や多糖類が混在した複雑な混合物であることから、再生医療に用いるためのヒト多能性幹細胞の培養に適したものではない。
【０００３】
ヒト多能性幹細胞を再生医療に応用するためには、培養系から異種由来の成分を排除するゼノフリー（Ｘｅｎｏ−Ｆｒｅｅ）条件と、フィーダー細胞を使用しないフィーダーフリー条件を満たす培養環境が求められる。そこで、同種由来の細胞外基質として、ヒトビトロネクチンやヒトフィブロネクチンの使用が試みられているが、これらはマトリゲルに比べてヒトＥＳ細胞の未分化維持効果や接着効率が劣り、品質、材料源確保、安全性等の面で問題が生じる。このように、ヒト多能性幹細胞の維持培養に適した細胞外基質の開発は進んでいないのが現状であり、化学的組成が均一なヒト由来の細胞外基質を用いる新たなヒト多能性幹細胞培養技術の開発が強く求められている。
【０００４】
ラミニンは基底膜の主要な細胞接着タンパク質であり、α、β、γ鎖の３本のサブユニット鎖からなるヘテロ３量体で、分子量８０万Ｄａの巨大な糖タンパク質である。３本のサブユニット鎖がＣ末端側で結合してコイルドコイル構造を作りジスルフィド結合によって安定化したヘテロ３量体分子を形成している。本発明者らは、ヒトＥＳ細胞が発現するインテグリンのタイプを解析した結果、α６β１インテグリンがヒトＥＳ細胞の主要な接着受容体であること、および、ヒトラミニン（特に、α３β３γ２からなるラミニン３３２およびα５β１γ１からなるラミニン５１１）の組換えタンパク質が、ヒトＥＳ細胞の分化多能性維持に有効であることを報告している（非特許文献１参照）。また、本発明者らは、ラミニン５１１はα６β１インテグリンに対して非常に高い親和性を持つこと、および、ラミニン５１１のＥ８フラグメントは、全長のラミニン５１１と同等のα６β１インテグリン結合活性を有することを報告している（非特許文献２参照）。
【０００５】
しかし、ラミニンは様々な細胞表面分子や細胞外マトリックス分子と結合するため、不純物を含まない均一な精製ラミニンを取得するためには、多くの技術的問題を克服する必要がある。また、ラミニンを構成する３本のサブユニット鎖は、分子量がいずれも２０万〜４０万Ｄａと巨大で、これらが会合したヘテロ３量体分子をそのまま組換えタンパク質として発現させること自体が容易でなく、収量も少ないという問題がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Miyazaki T, Futaki S, Hasegawa K, Kawasaki M, Sanzen N, Hayashi M, Kawase E, Sekiguchi K, Nakatsuji N, Suemori H. Recombinant human laminin isoforms can support the undifferentiated growth of human embryonic stem cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 375:27-35, 2008.
【非特許文献２】Taniguchi Y, Ido H, Sanzen N, Hayashi M, Sato-Nishiuchi R, Futaki S, Sekiguchi K. The C-terminal region of laminin beta chains modulates the integrin binding affinities of laminins. J Biol Chem. 284:7820-7831, 2009.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、フィーダーフリーの培養環境で、分化多能性を保持したままヒト多能性幹細胞を維持培養可能な培養基材および当該培養基材を用いたヒト多能性幹細胞の培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の発明を包含する。
［１］ヒトラミニンα５β１γ１のＥ８フラグメントまたはヒトラミニンα３β３γ２のＥ８フラグメントがコーティングされていることを特徴とするヒト多能性幹細胞培養用培養基材。
［２］ヒトラミニンα５β１γ１のＥ８フラグメントまたはヒトラミニンα３β３γ２のＥ８フラグメントが０．５μｇ／ｃｍ２〜２５μｇ／ｃｍ２の濃度でコーティングされていることを特徴とする前記［１］に記載の培養基材。
［３］ヒト多能性幹細胞が、ヒトＥＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞である前記［１］または［２］に記載の培養基材。
［４］前記［１］〜［３］のいずれかに記載の培養基材を使用することを特徴とするヒト多能性幹細胞の培養方法。
［５］単一細胞に分散されたヒト多能性幹細胞を培養する方法であって、ヒト多能性幹細胞を単一細胞に分散する工程と、単一細胞に分散されたヒト多能性幹細胞を、前記［１］〜［３］のいずれかに記載の培養基材を用いて培養する工程とを含むことを特徴とするヒト多能性幹細胞の培養方法。
［６］ヒト多能性幹細胞を単一細胞に分散する工程と、単一細胞に分散されたヒト多能性幹細胞を、前記［１］〜［３］のいずれかに記載の培養基材を用いて培養する工程とを含み、単一細胞に分散されたヒト多能性幹細胞を２×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２〜２０×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２の密度で播種することを特徴とするヒト多能性幹細胞の急速拡大方法。
［７］ヒト多能性幹細胞を単一細胞に分散する工程と、単一細胞に分散されたヒト多能性幹細胞を、前記［１］〜［３］のいずれかに記載の培養基材を用いて培養する工程とを含み、単一細胞由来のコロニーを形成させることを特徴とするヒト多能性幹細胞の単一細胞由来クローン分離方法。
［８］ヒト多能性幹細胞を単一細胞に分散する工程と、単一細胞に分散されたヒト多能性幹細胞を、請求項１〜３のいずれかに記載の培養基材を用いて培養する工程とを含み、単一細胞の状態で維持することを特徴とするヒト多能性幹細胞の単一細胞培養方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、フィーダーフリーの培養環境で、分化多能性を保持したままヒト多能性幹細胞を維持培養可能な培養基材および当該培養基材を用いたヒト多能性幹細胞の培養方法を提供することができる。さらに、ゼノフリーの培地を併用すれば、ゼノフリーかつフィーダーフリー条件下でヒト多能性幹細胞を培養でき、安全性の高いヒト多能性幹細胞を提供することができる。また、本発明の培養基材を用いれば、単一細胞に分散したヒト多能性幹細胞を急速拡大増殖させることができるとともに、単一細胞由来のクローンを分離することや単一細胞の状態で維持することが可能となる。さらに、本発明の培養基材にコーティングするヒトラミニンα５β１γ１Ｅ８フラグメントまたはヒトラミニンα３β３γ２のＥ８フラグメントは、組換えタンパク質として高収量で製造できるので、高純度かつ均一なヒト由来タンパク質をコーティングした高品質の培養基材を低コストで製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ヒトＥＳ細胞の各種細胞外基質への濃度依存的接着効率を比較した結果を示す図である。
【図２】ヒトラミニンα５β１γ１のＥ８フラグメントまたはマトリゲルをコーティングした培養器における播種密度依存的な単一ヒトＥＳ細胞の接着効率を検討した結果を示す図である。
【図３】ヒトラミニンα３β３γ２のＥ８フラグメントをコーティングした培養器におけるヒトＥＳ細胞の形態を示す図である。
【図４】ヒトラミニンα５β１γ１のＥ８フラグメントをコーティングした培養器におけるヒトＥＳ細胞の形態を示す図である。
【図５】ヒトラミニンα３β３γ２のＥ８フラグメント、ヒトラミニンα５β１γ１のＥ８フラグメントまたはマトリゲルをコーティングした培養器を用いて培養したヒトＥＳ細胞の表面抗原解析の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
〔ヒト多能性幹細胞用培養基材〕
本発明は、ヒトラミニンα５β１γ１のＥ８フラグメントまたはヒトラミニンα３β３γ２のＥ８フラグメントがコーティングされているヒト多能性幹細胞培養用培養基材を提供する。多能性幹細胞としては、ＥＳ細胞（胚性幹細胞）、ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）、ｍＧＳ細胞（多能性生殖幹細胞）、ヒトＥＳ細胞と体細胞との融合細胞などが挙げられる。
【００１２】
ヒトラミニンα５β１γ１のＥ８フラグメント（以下、「ヒトラミニン５１１Ｅ８」と記す。）は、マウスラミニンα１β１γ１のＥ８フラグメント（以下、「マウスラミニン１１１Ｅ８」と記す。）に相当するヒトラミニンα５β１γ１（以下、「ヒトラミニン５１１」と記す。）のフラグメントを意味し、ヒトラミニンα３β３γ２のＥ８フラグメント（以下、「ヒトラミニン３３２Ｅ８」と記す。）は、マウスラミニン１１１Ｅ８に相当するヒトラミニンα３β３γ２（以下、「ヒトラミニン３３２」と記す。）のフラグメントを意味する。
【００１３】
ラミニンのＥ８フラグメントは、マウスラミニンα１β１γ１（以下、「マウスラミニン１１１」と記す。）をエラスターゼで消化して得られたフラグメントの中で、強い細胞接着活性をもつフラグメントとして同定されたものである（Edgar D., Timpl R., Thoenen H.The heparin-binding domain of laminin is responsible for its effects on neurite outgrowth and neuronal survival. EMBO J., 3:1463-1468, 1984.、Goodman SL., Deutzmann R., von der Mark K.Two distinct cell-binding domains in laminin can independently promote nonneuronal cell adhesion and spreading. J. Cell Biol., 105:589-598, 1987.）。ヒトラミニン５１１およびヒトラミニン３３２についてもエラスターゼで消化した際にマウスラミニン１１１Ｅ８に相当するフラグメントの存在が推定されるが、これらを分離・同定したことは報告されていない。したがって、本発明に用いられるヒトラミニン５１１Ｅ８またはヒトラミニン３３２Ｅ８は、ヒトラミニン５１１またはヒトラミニン３３２のエラスターゼ消化産物であることを要するものではなく、マウスラミニン１１１Ｅ８と同様の細胞接着活性を有し、同様の構造を有し、同程度の分子量を有するヒトラミニン５１１またはヒトラミニン３３２のフラグメントであればよい。
【００１４】
ヒトラミニン５１１Ｅ８またはヒトラミニン３３２Ｅ８の製造方法は特に限定されず、例えば、全長のヒトラミニン５１１またはヒトラミニン３３２をエラスターゼ等のタンパク質分解酵素で消化し、目的のフラグメントを分取、精製する方法や、組換えタンパク質として製造する方法などが挙げられる。製造量、品質の均一性、製造コスト等の観点から、組換えタンパク質として製造することが好ましい。
【００１５】
組換えヒトラミニン５１１Ｅ８または組換えヒトラミニン３３２Ｅ８は、公知の遺伝子組換え技術を適宜用いることにより製造することができる。組換えヒトラミニン５１１Ｅ８の製造方法としては、例えば、ヒトラミニン５１１Ｅ８のα鎖、β鎖およびγ鎖の各タンパク質をコードするＤＮＡをそれぞれ取得し、これをそれぞれ発現ベクターに挿入し、得られた３種類の発現ベクターを適切な宿主細胞に共導入して発現させ、３量体を形成しているタンパク質を公知の方法で精製することにより製造できる。本願発明者らは、Ｉｄｏら（Hiroyuki Ido, Aya Nakamura, Reiko Kobayashi, Shunsuke Ito, Shaoliang Li, Sugiko Futaki, and Kiyotoshi Sekiguchi, “The requirement of the glutamic acid residue at the third position from the carboxyl termini of the laminin γ chains in integrin binding by laminins” The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154, 2007.）に記載の方法に従って作製しているが（実施例参照）、これに限定されるものではない。組換えヒトラミニン３３２Ｅ８についても同様の方法で製造することができる（実施例参照）。なお、ヒトラミニン５１１を構成するα５鎖、β１鎖、γ１鎖、ならびにヒトラミニン３３２を構成するα３鎖、β３鎖、γ２鎖をそれぞれコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）の塩基配列情報および各鎖のアミノ酸配列情報は、表１に記載したアクセッション番号で公知のデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ等）から取得することができる。
【００１６】
【表１】
0005590646.tif 000002
【００１７】
得られたヒトラミニン５１１Ｅ８またはヒトラミニン３３２Ｅ８を適当な溶媒、例えばＰＢＳ、生理食塩水、トリスヒドロキシメチルアミノメタンあるいは４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルフォン酸で中性ｐＨとした生理的食塩水などで希釈し、この溶液を適当な培養器に添加して、室温〜３７℃程度で約１〜約１２時間程度静置することにより、ヒトラミニン５１１Ｅ８またはヒトラミニン３３２Ｅ８が培養器表面にコーティングされ、本発明の培養基材が製造できる。培養器としては、ヒト多能性幹細胞の培養に使用できるものであれば限定されず、例えば、ガラス製またはプラスチック製のシャーレ、フラスコ、マルチウェルプレート、カルチャースライド、マイクロキャリア、ポリビニリデンフルオリド膜等のポリマー膜などが挙げられる。
【００１８】
ヒトラミニン５１１Ｅ８またはヒトラミニン３３２Ｅ８のコーティング濃度は、約０．５μｇ／ｃｍ２〜約２５μｇ／ｃｍ２が好ましく、約１．５μｇ／ｃｍ２〜約１０μｇ／ｃｍ２がより好ましい。従来用いられているマトリゲルや、ヒトラミニン５１１またはヒトラミニン３３２をコーティングする場合と比較して、低いコーティング濃度でも多数のヒト多能性幹細胞が接着し、増殖することができる。
【００１９】
本発明の培養基材は、ヒトラミニン５１１Ｅ８のみ、またはヒトラミニン３３２Ｅ８のみがそれぞれ単独でコーティングされていてもよく、両者がコーティングされていてもよい。また、ヒトラミニン５１１Ｅ８またはヒトラミニン３３２Ｅ８以外のヒト由来成分がコーティングされていてもよい。例えば血清成分、細胞外マトリックス分子、成長因子、分化誘導因子、形態形成因子（モルフォゲン）などが挙げられる。また、合成高分子ゲル（合成ポリマー）などの非生物成分がコーティングされていてもよい。
【００２０】
本発明の培養基材は、ヒトラミニン５１１Ｅ８またはヒトラミニン３３２Ｅ８がコーティングされていることにより、幹細胞の培養に通常用いられるフィーダー細胞を使用しない培養環境（フィーダーフリー）で、分化多能性を保持したままヒト多能性幹細胞を維持培養することが可能となる。通常、多能性幹細胞の培養には、クローナルな増殖と未分化性を維持させるために、Ｘ線照射やマイトマイシンＣ処理により増殖を停止させたマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）等のフィーダー細胞上で多能性幹細胞を共培養する培養系が用いられるが、このようなフィーダー細胞を使用しない培養系がフィーダーフリーである。
さらに、異種由来の成分が排除されている培地を使用すれば、完全に異種由来の成分を含まない培養条件（ゼノフリー：Ｘｅｎｏ−Ｆｒｅｅ）でヒト多能性幹細胞を培養することができ、ヒトに対して免疫原性を発現する可能性が非常に低い、高安全性のヒト多能性幹細胞を提供することができる。
また、本発明の培養基材を用いれば、従来の培養系では不可能であった単一細胞に分散されたヒト多能性幹細胞を培養することができる。したがって、従来の培養系と比較して、ヒト多能性幹細胞を顕著に急速拡大増殖させることができる。また、ヒト多能性幹細胞を単一細胞由来クローンを容易に分離することができ、単一細胞の状態で維持することができる。
【００２１】
〔ヒト多能性幹細胞の培養方法〕
本発明は、上記本発明の培養基材を用いてヒト多能性幹細胞を培養する方法を提供する。本発明の培養方法は、フィーダーフリーの培養条件でヒト多能性幹細胞を培養する場合に使用することが好ましく、フィーダーフリーかつゼノフリーの培養条件でヒト多能性幹細胞を培養する場合に使用することが特に好ましい。
【００２２】
本発明の培養方法で使用する培地は、特に限定されないが、合成培地が好ましく、異種成分を含まない（ゼノフリー）合成培地が特に好ましい。市販または市販予定の合成培地としては、ｍＴｅＳＲ１（商品名、StemCell Technologies）、ＴｅＳＲ２（商品名、StemCell Technologies）、ＳｔｅｍＰｒｏ ｈＥＳＣ ＳＦＭ（商品名、Invitrogen）、ｈＥＳＦ−ＧＲＯ（商品名、株式会社細胞科学研究所）等が挙げられる。このうちＴｅＳＲ２が異種成分を含まない培地である。また、以下の文献(1)〜(5)に記載された培地も好適に用いることができる。
(1) Liu, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 346:131-139, 2006.
(2) Vallier, L. et al., J. Cell Sci. 118:4495-4509, 2005.
(3) Li, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 91:688-698, 2005.
(4) Yao, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103:6907-6912, 2006.
(5) Lu, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103:5688-5693, 2006.
【００２３】
本発明の培養方法を用いてヒトＥＳ細胞を培養する場合の一実施形態を以下に示す。なお、本発明の培養方法は上記本発明の培養基材を用いるヒト多能性幹細胞の培養方法であればよく、これに限定されるものではない。
【００２４】
（１）フィーダー細胞との共培養系からヒトＥＳ細胞を回収
以下の方法１または方法２のいずれかの方法で、フィーダー細胞との共培養系からヒトＥＳ細胞を回収する。
方法１：
フィーダー細胞（例えばＭＥＦ）と共培養しているヒトＥＳ細胞の培養ディッシュ（３〜５日目）に０．２５％トリプシン／ＤＭＥＭ−Ｆ１２を添加して（例えば１ｍｌ／６０ｍｍディッシュ）、３７℃で２〜３分間恒温処理し、培養ディッシュをＤＭＥＭ−Ｆ１２で洗浄してフィーダー細胞を除去する。培養液を加えて全体細胞を物理的に剥離した細胞懸濁液をＢＤ Ｆａｌｃｏｎセルストレーナー１００μｍ（BD Falcon #352460）に通した後、ストレーナーを洗浄することでヒトＥＳ細胞のコロニーのみを分離し、回収する。
【００２５】
方法２：
フィーダー細胞（例えばＭＥＦ）と共培養しているヒトＥＳ細胞の培養ディッシュ（３〜５日目）にヒトＥＳ細胞剥離液（例えば、霊長類ＥＳ細胞用細胞剥離液（リプロセル ＲＣＨＥＴＰ００２、１ｍｇ/ｍｌ ｄｉｓｐａｓｅ/ＤＭＥＭ−Ｆ１２、１０ｍｇ/ｍｌ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅＩＶ／ＤＭＥＭ−Ｆ１２など）を添加して（例えば１ｍｌ／６０ｍｍディッシュ）、３７℃で５分間恒温処理し、ヒトＥＳ細胞とＭＥＦを剥離する。細胞を１５ｍｌ遠心チューブに移し、培養液を約１０ｍｌ入れて細胞を懸濁した後、５分間チューブを静置してコロニーのみを沈降させる。上清を除去し、同様の操作を２回以上繰り返して、ヒトＥＳ細胞のコロニーのみを沈降させ、回収する。
【００２６】
（２）ヒトＥＳ細胞を本発明の培養基材への移行
回収したヒトＥＳ細胞のコロニーを単一細胞に分散させる。単一細胞に分散させる方法は特に限定されないが、例えばＰ−１０００ピペットマン等を用いて培養液を数回フラッシングすることによりコロニーを砕く方法等が挙げられる。単一細胞に分散させた後、適切な培養液（例えばＴｅＳＲ２など）に懸濁し、本発明の培養基材（例えばヒトラミニン５１１Ｅ８をコーティング（１．５μｇ／ｃｍ２）した培養ディッシュ）に播種する。培養は、用いた培養液に適合するＣＯ２濃度条件で行い、培養液の交換は毎日行う。
【００２７】
（３）継代培養
拡大エリアの不足あるいはコロニー内に死細胞の出現が目立つようになるのを目安に、継代操作を行う。本発明の培養方法では、従来の方法と同様にヒトＥＳ細胞を適度な大きさのコロニー形態を維持した状態で播種する方法で継代培養を行ってもよく、ヒトＥＳ細胞を単一細胞に分散させて播種する方法で継代培養を行ってもよい。ここで、単一細胞に分散された状態は、細胞懸濁液中の全細胞が単一細胞に分散されていることを要するものではなく、単一細胞に分散された細胞以外に数個〜十数個程度が接着した状態の細胞が細胞懸濁液中に含まれている状態も単一細胞に分散された状態に包含される。
【００２８】
単一細胞に分散する場合：
ヒトＥＳ細胞を培養している本発明の培養基材（培養ディッシュ）に、ＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（商品名、Invitrogen #12563011）を添加して（例えば１ｍｌ／６０ｍｍディッシュ）、３７℃で５分間恒温処理する。例えばＰ−１０００ピペットマン等を用いて培養液を数回フラッシングすることによりヒトＥＳ細胞のコロニーを砕き、単一細胞に分散させる。培養液を加えて細胞を懸濁し、遠心チューブに回収する。遠心（２００×ｇ、３分）と同培養液による洗浄操作を２度繰り返した後、新鮮な培養液に細胞を懸濁し、本発明の培養基材（例えばヒトラミニン５１１Ｅ８をコーティング（１．５μｇ／ｃｍ２）した培養ディッシュ）に、例えば約４００００細胞／ｃｍ２の播種密度で単一細胞に分散したヒトＥＳ細胞を播種する。培養は、用いた培養液に適合するＣＯ２濃度条件で行い、培養液の交換は毎日行う。
【００２９】
単一細胞に分散しない場合：
ヒトＥＳ細胞を単一細胞に分散しない場合は、細胞の剥離にＣｏｌｌａｇｅｎａｓｅＩＶ、Ｄｉｓｐａｓｅ、Ａｃｃｕｔａｓｅ等の酵素を用いる。ヒトＥＳ細胞を培養している本発明の培養基材に、１０ｍｇ／ｍｌ ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ／ＤＭＥＭ−Ｆ１２、または２ｍｇ／ｍｌ ｄｉｓｐａｓｅ／ＤＭＥＭ−Ｆ１２、またはＡｃｃｕｔａｓｅ（Millipore #SCR005）を添加して（例えば１ｍｌ／６０ｍｍディッシュ）、３７℃で５分間恒温処理する。酵素液を除いて培養液を加え、例えばＰ−１０００のピペットマン等を用いて培養液を数回フラッシングすることによりヒトＥＳ細胞が約５０〜約１００個のコロニー状を維持する程度に小さく砕く。細胞懸濁液を遠心チューブに回収し、遠心（２００×ｇ、３分）と同培養液による洗浄操作を２度繰り返した後、新鮮な培養液に細胞を懸濁し、本発明の培養基材（例えばヒトラミニン５１１Ｅ８をコーティング（１．５μｇ／ｃｍ２）した培養ディッシュ）に２分の１〜４分の１希釈量を播種する。培養は、用いた培養液に適合するＣＯ２濃度条件で行い、培養液の交換は毎日行う。
【００３０】
〔ヒト多能性幹細胞の急速拡大方法〕
本発明は、ヒト多能性幹細胞の急速拡大方法を提供する。本発明の急速拡大方法は、ヒト多能性幹細胞を単一細胞に分散する工程と、単一細胞に分散されたヒト多能性幹細胞を、上記本発明の培養基材を用いて培養する工程とを含み、単一細胞に分散されたヒト多能性幹細胞を約２×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２〜約２０×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２の密度で播種するものであればよい。播種密度は、約３×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２〜約１０×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２がより好ましく、約４×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２〜約５×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２がさらに好ましい。従来の培養系では、単一に分散されたヒトＥＳ細胞を上記細胞密度で播種したときの接着効率が１０％未満であるところ、本発明の急速拡大方法によれば、顕著に高い接着効率が得られ、その後旺盛に増殖するので、従来法と比較して格段の速度でヒト多能性幹細胞を増殖させることができる。
【００３１】
ヒト多能性幹細胞を単一細胞に分散する工程では、上述の「単一細胞に分散する場合」と同様に、培養ディッシュから剥離、回収したヒト多能性幹細胞のコロニーを例えばＰ−１０００ピペットマン等を用いて培養液を数回フラッシングすることにより単一細胞に分散する。続いて、公知の細胞計数方法で細胞数をカウントし、上記播種密度となるように、適宜細胞懸濁液の細胞濃度を調整する。培養方法については、上記本発明の培養方法に記載に準じて行うことができる。
【００３２】
〔ヒト多能性幹細胞の単一細胞由来クローン分離方法〕
本発明は、ヒト多能性幹細胞の単一細胞由来クローン分離方法を提供する。本発明の単一細胞由来クローン分離方法は、ヒト多能性幹細胞を単一細胞に分散する工程と、単一細胞に分散されたヒト多能性幹細胞を、上記本発明の培養基材を用いて培養する工程とを含み、単一細胞由来のコロニーを形成させるものであればよい。本発明の単一細胞由来クローン分離方法によれば、従来の培養系では困難であったヒト多能性幹細胞の単一細胞由来クローンを形成させ、分離することができ、均一なヒト多能性幹細胞を容易に取得することが可能となる。
【００３３】
単一細胞由来のコロニーを形成させ単一細胞由来クローンを分離する方法は特に限定されない。例えば公知の限界希釈法等を好適に用いることができる。用いる方法に応じて適宜細胞密度および使用する本発明の培養基材を選択して、単一細胞に分散されたヒト多能性幹細胞を播種し、培養すればよい。培養方法については、上記本発明の培養方法に記載に準じて行うことができる。
【００３４】
〔ヒト多能性幹細胞の単一細胞培養方法〕
本発明は、ヒト多能性幹細胞の単一細胞培養方法を提供する。本発明の単一細胞培養方
法は、ヒト多能性幹細胞を単一細胞に分散する工程と、単一細胞に分散されたヒト多能性幹細胞を、上記本発明の培養基材を用いて培養する工程とを含み、細胞を増殖させることなく単一細胞の状態で維持するものであればよい。コロニーを形成したヒト多能性幹細胞は、コロニー周辺部とコロニー内部とで細胞の状態が異なる場合があるが、本発明の単一細胞培養方法によれば、細胞はコロニーを形成しないので、状態の均一なヒト多能性幹細胞を得ることができ、分化誘導効率の向上が期待できる。
【００３５】
細胞を増殖させることなく単一細胞の状態で維持する方法としては、使用する本発明の培養基材に応じて適宜細胞密度を選択して単一細胞に分散されたヒト多能性幹細胞を播種し、細胞が増殖する前に細胞を他の用途に使用することが好ましい。また、例えば、増殖因子を含まない培養液、または増殖因子を減量した培養液を用いることにより、単一細胞の状態で維持できる時間を延長してもよい。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３７】
〔実験材料〕
（１）細胞外基質
組換えヒトラミニン５１１Ｅ８（以下「ｒｈＬＭ５１１Ｅ８」と記す。）、組換えヒトラミニン３３２Ｅ８（以下「ｒｈＬＭ３３２Ｅ８」と記す。）、組換えヒトラミニン５１１（以下「ｒｈＬＭ５１１」と記す。）、組換えヒトラミニン３３２（以下「ｒｈＬＭ３３２」と記す。）、組換えヒトラミニン１１１（以下「ｒｈＬＭ１１１」と記す。）、マトリゲル（BD Bioscience #354230）、ヒトフィブロネクチン（Sekiguchiらの方法（Sekiguchi K. and Hakomori S: Domain structure of human plasma fibronectin. Differences and similarities between human and hamster fibronectins. The Journal of Biological Chemistry, 258, 3967-3973, 2003.）に従い、ゼラチン不溶化アフィニティーカラムを用いて精製したもの）、およびビトロネクチン（Yatohgoらの方法（Yatohgo T., Izumi, M., Kashiwagi, H., and Hayashi, M. Novel purification of vitronectin from human plasma by heparin affinity chromatograhy. Cell Structure and Function, 13, 281-292, 1988 ）に従いヘパリン不溶化アフィニティーカラムを用いて精製したもの）を使用した。
【００３８】
（２）使用細胞
ヒトＥＳ細胞は、京都大学再生医科学研究所樹立株（ＫｈＥＳ−１、ＫｈＥＳ−２、ＫｈＥＳ−３）およびＮａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋより購入した株（Ｈ１、Ｈ９）を使用した。ヒトｉＰＳ細胞はＮａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋより購入した株（クローン名：ｉＰＳ（ＩＭＲ９０）−１−ＤＬ−１、ｉＰＳ（ＩＭＲ９０）−４−ＭＣＢ−１、ｉＰＳ（ｆｏｒｅｓｋｉｎ）−１−ＤＬ−１）を使用した。
【００３９】
各細胞は、各機関が推奨する培養方法に従って、維持培養した。例えば、ヒトＥＳ細胞Ｈ９は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋが推奨する方法に従い、マウスフィーダー細胞との共培養で維持した。共培養ディッシュに、０．２５％トリプシン／ＤＭＥＭ−Ｆ１２を添加し、マウスフィーダー細胞を除去した後、ＢＤ Ｆａｌｃｏｎセルストレーナー１００μｍ（BD Falcon #352460）を通し、ストレーナーを洗浄することでヒトＥＳ細胞Ｈ９のコロニーを分離した。残留したコロニーをヒトＥＳ細胞培養液で回収し、Ｐ−１０００ピペットマンで細かく砕いた後、ｍＴｅＳＲ１（StemCell Technologies）に懸濁し、マトリゲルコーティング培養器に播種した。播種直後を継代数（Ｐ１）とし、５％ＣＯ２／９５％Ａｉｒ条件下、マウスフィーダー細胞の混入がないことを確認しながら毎日培養液交換を行い、４日まで拡大培養を行った。マウスフィーダー細胞の混入がないことが確認できた細胞を実験に供した。他の細胞についても同様の方法で維持培養および拡大培養を行い、実験に供した。なお、以下の実施例においてヒトＥＳ細胞Ｈ９の結果のみを示したが、他の細胞についても同様の結果が得られた。
【００４０】
（３）ｒｈＬＭ５１１Ｅ８の作製方法
ｒｈＬＭ５１１Ｅ８は、Ｉｄｏら（Hiroyuki Ido, Aya Nakamura, Reiko Kobayashi, Shunsuke Ito, Shaoliang Li, Sugiko Futaki, and Kiyotoshi Sekiguchi, “The requirement of the glutamic acid residue at the third position from the carboxyl termini of the laminin γ chains in integrin binding by laminins” The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154, 2007.）に記載の方法に従い、以下のように作製した。
【００４１】
最初に、クローニング用プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）（Stratagene社）を鋳型として、以下の３種類のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、プラスミドのマルチクローニング部位内のＥｃｏＲＶの５’側に６×Ｈｉｓタグ（HHHHHH）をコードするＤＮＡ、ＨＡ（ヘマグルチニン）タグ（YPYDVPDYA）をコードするＤＮＡ、またはＦＬＡＧタグ（DYKDDDDK）をコードするＤＮＡが挿入された３種類のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）をそれぞれ作製した。
(i) ６×Ｈｉｓタグ導入用プライマー
5’-ATGATGATGAAGCTTATCGATACCGT-3’（forward、配列番号１）
5’-CATCATCATGATATCGAATTCCTGCA-3’（reverse、配列番号２）
(ii) ＨＡタグ導入用プライマー
5’-ATCATATGGATAAAGCTTATCGATACCGT-3’（forward、配列番号３）
5’-GTGCCAGATTATGCAGATATCGAATTCCT-3’（reverse、配列番号４）
(iii) ＦＬＡＧタグ導入用プライマー
5’-ATCCTTGTAATCAAGCTTATCGATACCGT-3’（forward、配列番号５）
5’-GTGCCAGATTATGCAGATATCGAATTCCT-3’（reverse、配列番号４）
【００４２】
次に、α５鎖、β１鎖、γ１鎖の全長塩基配列を含むプラスミド（Ido et al., J. Biol. Chem., 279, 10946-10954, 2004.）を鋳型として、以下のプライマーを用いたＰＣＲを行い、各鎖のα５（Ａｌａ2534−Ａｌａ3327）、β１（Ｌｅｕ1561−Ｌｅｕ1786）、γ１（Ａｓｎ1362−Ｐｒｏ1608）に相当する領域を増幅した。
(iv) α５鎖Ｅ８フラグメント増幅用プライマー
5’-GCTGCCGAGGATGCTGCTGGCCAGG-3’（forward、配列番号６）
5’-CTAGGCAGGATGCCGGGCGGGCTGA-3’（reverse、配列番号７）
(v) β１鎖Ｅ８フラグメント増幅用プライマー
5’-CTTCAGCATAGTGCTGCTGACATTG-3’（forward、配列番号８）
5’-TTACAAGCATGTGCTATACACAGCAAC-3’（reverse、配列番号９）
(vi) γ１鎖Ｅ８フラグメント増幅用プライマー
5’-AATGACATTCTCAACAACCTGAAAG-3’（forward、配列番号１０）
5’-CTAGGGCTTTTCAATGGACGGGGTG-3’（reverse、配列番号１１）
【００４３】
増幅したｃＤＮＡを、タグ配列を付加したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）のマルチクローニング部位のＥｃｏＲＶ部位に挿入した後、５’側のタグをコードする配列を含めて増幅したｃＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩで切り出し、哺乳細胞用発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ（インビトロジェン）の当該部位に挿入し、ヒトα５鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側に６ＸＨｉｓタグを含む）、ヒトβ１鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側にＨＡタグを含む）、ヒトγ１鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側にＦＬＡＧタグを含む）の発現ベクターをそれぞれ作製した。
【００４４】
ｒｈＬＭ５１１Ｅ８の発現は、作製した各鎖の発現ベクターをヒト腎臓由来２９３Ｆ細胞（インビトロジェン社より購入）に導入して行った。３００ｍｌの２９３Ｆ細胞（1.0×106個/ml）にトランスフェクション試薬２９３ｆｅｃｔｉｎ（商品名、インビトロジェン）およびＯｐｔｉ−ＭＥＭ（商品名、インビトロジェン）を用いて各鎖発現ベクターを１８０μｇずつ同時にトランスフェクトし、７２時間培養を行ったのち、培養液を回収した。培養液は１０００×ｇで１０分間遠心し、その上清をさらに１５，０００×ｇで３０分間遠心し、細胞や不溶物を除去した。培養上清に５ｍｌのＮｉ−ＮＴＡ ａｇａｒｏｓｅ（キアゲン）を添加し一晩インキュベートして目的タンパク質を吸着させた。Ｎｉ−ＮＴＡ ａｇａｒｏｓｅを回収し、ＴＢＳ（−）（Ca、Mgを含まないトリス緩衝生理的食塩水）および１０ｍＭイミダゾ−ル／ＴＢＳ（−）で洗浄したのち２００ｍＭイミダゾール／ＴＢＳ（−）で溶出した。溶出画分はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色により確認し、ｒｈＬＭ５１１Ｅ８が溶出された画分に２ｍｌのＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ Ｍ２ ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ（シグマ）を添加し、４℃で一晩旋回させた。ゲルをエコノカラムに移し１ｍＭ ＰＭＳＦを含むＴＢＳ（−）で洗浄後、１００μｇ／ｍｌ ＦＬＡＧ ｐｅｐｔｉｄｅ（シグマ）を含むＴＢＳ（−）で溶出した。溶出フラクションを銀染色で確認し、ｒｈＬＭ５１１Ｅ８の溶出された画分を合わせてＴＢＳ（−）に対して透析を行った。
【００４５】
（４）ｒｈＬＭ３３２Ｅ８の作製方法
（4-1）ヒトラミニンα３鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターの作製
クローニング用プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）（Stratagene社）を鋳型として、以下のプライマーセットを用いてＰＣＲを行い、プラスミドのマルチクローニング部位内のＥｃｏＲＶの５’側に制限酵素ＡｓｃＩ認識配列（GGCGCGCC）と６×Ｈｉｓタグ（HHHHHH）をコードするＤＮＡが挿入されたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）を作製した。
(vii) ６×Ｈｉｓタグ導入用プライマー
5’-ATGATGATGGGCGCGCCAAGCTTATCGATACCGT-3’（forward、配列番号１２）
5’-CATCATCATGATATCGAATTCCTGC-3’（reverse、配列番号１３）
【００４６】
次に、ヒトラミニンα３鎖（ラミニン球状ドメインの４番目と５番目を除く）のｃＤＮＡ配列を含むプラスミド（Ido et al., J. Biol. Chem., 282, 11144-11154, 2007）を鋳型として、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、α３鎖（Ａｌａ579−Ａｌａ1364）に相当する領域を増幅した。なお、リバース（reverse）プライマーの５’側にはＸｂａＩ認識配列（TCTAGA）が付加されている。
(viii) α３鎖Ｅ８フラグメント増幅用プライマー
5’-GCGGCCGAGGACGCAGCCAACAGG-3’（forward、配列番号１４）
5’-GGTCTAGACTAAGCATCTTGCCACACC-3’（reverse、配列番号１５）
【００４７】
増幅したｃＤＮＡを、ＡｓｃＩ認識配列と６×Ｈｉｓタグ配列を付加したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ（＋）のマルチクローニング部位のＥｃｏＲＶとＸｂａＩ部位に挿入した。この後、５’側の６×Ｈｉｓタグとα３鎖Ｅ８フラグメントをコードする配列を含むｃＤＮＡを制限酵素ＡｓｃＩとＮｏｔＩとで切り出し、哺乳細胞用発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ａ（インビトロジェン）の当該部位に挿入し、ヒトα３鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側に６ＸＨｉｓタグを含む）の発現ベクターを作製した。
【００４８】
（4-2）ヒトラミニンβ３鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターの作製
５’側から、マウスＩｇ−κ鎖Ｖ−Ｊ２−Ｃシグナルペプチド・ＨＡタグ・β３鎖Ｅ８フラグメントを順にコードするｃＤＮＡ断片を獲得するために、マウスＩｇ−κ鎖Ｖ−Ｊ２−Ｃシグナルペプチド・ＨＡタグをコードするｃＤＮＡ断片とβ３鎖Ｅ８をコードするｃＤＮＡ断片をそれぞれ取得し、エクステンションＰＣＲによってそれら２種類の断片を連結・増幅した。
【００４９】
まず、ヒトラミニンβ１鎖Ｅ８発現ベクター（Ido et al., J. Biol. Chem., 282, 11144-11154, 2007）を鋳型として、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、マウスＩｇ−κ鎖Ｖ−Ｊ２−Ｃシグナルペプチド・ＨＡタグに相当する領域を増幅した。なお、リバース（reverse）プライマーの５’側にはエクステンションＰＣＲに使用する配列が付加されている。
(ix) シグナルペプチド配列・ＨＡタグ配列増幅用プライマー
5’-TGGGCGTGGATAGCGGTTTG-3’（forward、配列番号１６）
5’-TCTGGGACAGATCTGCATAATCTGGCAC-3’（reverse、配列番号１７）
【００５０】
次に、ヒトラミニンβ３鎖のｃＤＮＡ配列を含むプラスミド（Ido et al., J. Biol. Chem., 282, 11144-11154, 2007）を鋳型として、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、β３鎖（Ｌｅｕ949−Ｌｙｓ1172）に相当する領域を増幅した。なお、フォワード（forward）プライマーの５’側にはエクステンションＰＣＲに使用する配列が、リバース（reverse）プライマーの５’側にはＥｃｏＲＩ認識配列（GAATTC）がそれぞれ付加されている。
(x) β3鎖Ｅ８フラグメント増幅用プライマー
5’-AGATTATGCAGATCTGTCCCAGACCAAG-3’（forward、配列番号１８）
5’-GCGAATTCTCACTTGCAGGTGGCATA-3’（reverse、配列番号１９）
【００５１】
得られた２種類のｃＤＮＡ断片を、以下のプライマーを用いたエクステンションＰＣＲにより連結・増幅させ、マウスＩｇ−κ鎖Ｖ−Ｊ２−Ｃシグナルペプチド・ＨＡタグ・β３鎖Ｅ８をコードするｃＤＮＡ断片を得た。増幅したｃＤＮＡを、制限酵素ＮｈｅＩとＥｃｏＲＩで消化し、哺乳細胞用発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ（インビトロジェン）の当該部位に挿入し、ヒトβ３鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側にＨＡタグを含む）の発現ベクターを作製した。なお、ＮｈｅＩ認識配列（GCTAGC）は、開始コドンから５’側直前に存在している。
(xi) マウスＩｇ−κ鎖Ｖ−Ｊ２−Ｃシグナルペプチド・ＨＡタグ・β３鎖Ｅ８増幅用プライマー
5’-TGGGCGTGGATAGCGGTTTG-3’（forward、配列番号１６）
5’-GCGAATTCTCACTTGCAGGTGGCATA-3’（reverse、配列番号１９）
【００５２】
（4-3）ヒトラミニンγ２鎖Ｅ８フラグメント発現ベクターの作製
５’側から、マウスＩｇ−κ鎖Ｖ−Ｊ２−Ｃシグナルペプチド・ＦＬＡＧタグ・γ２鎖Ｅ８フラグメントを順にコードするｃＤＮＡ断片を獲得するために、マウスＩｇ−κ鎖Ｖ−Ｊ２−Ｃシグナルペプチド・ＦＬＡＧタグをコードするｃＤＮＡ断片とγ２鎖Ｅ８をコードするｃＤＮＡ断片をそれぞれ取得し、エクステンションＰＣＲによってそれら２種類の断片を連結・増幅した。
【００５３】
まず、ヒトラミニンγ１鎖Ｅ８発現ベクター（Ido et al., J. Biol. Chem., 282, 11144-11154, 2007）を鋳型として、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、マウスＩｇ−κ鎖Ｖ−Ｊ２−Ｃシグナルペプチド・ＨＡタグに相当する領域を増幅した。なお、リバース（reverse）プライマーの５’側にはエクステンションＰＣＲに使用する配列が付加されている。
(xii) シグナルペプチド配列・ＦＬＡＧタグ配列増幅用プライマー
5’-TGGGCGTGGATAGCGGTTTG-3’（forward、配列番号１６）
5’-GGATGCTCTCATCCTTATCATCATCATCC-3’（reverse、配列番号２０）
【００５４】
次に、ヒトラミニンγ２鎖のｃＤＮＡ配列を含むプラスミド（Ido et al., J. Biol. Chem., 282, 11144-11154, 2007）を鋳型として、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、γ２鎖（Ｇｌｕ949−Ｇｌｎ1172）に相当する領域を増幅した。なお、フォワード（forward）プライマーの５’側にはエクステンションＰＣＲに使用する配列が、リバース（reverse）プライマーの５’側にはＥｃｏＲＩ認識配列（GAATTC）がそれぞれ付加されている。
(xiii) γ２鎖Ｅ８フラグメント増幅用プライマー
5’-GATGATGATAAGGATGAGAGCATCCTTAAAAAC-3’（forward、配列番号２１）
5’-GCGAATTCTCACTGTTGCTCAAGAGCCTG-3’（reverse、配列番号２２）
【００５５】
得られた２種類のｃＤＮＡ断片を、以下のプライマーを用いたエクステンションＰＣＲにより連結・増幅させ、マウスＩｇ−κ鎖Ｖ−Ｊ２−Ｃシグナルペプチド・ＦＬＡＧタグ・γ２鎖Ｅ８をコードするｃＤＮＡ断片を得た。増幅したｃＤＮＡを、制限酵素ＮｈｅＩとＥｃｏＲＩで消化し、哺乳細胞用発現ベクターｐＳｅｃＴａｇ２Ｂ（インビトロジェン）の当該部位に挿入し、ヒトγ２鎖Ｅ８フラグメント（Ｎ末端側にＦＬＡＧタグを含む）の発現ベクターを作製した。
(xiv) マウスＩｇ−κ鎖Ｖ−Ｊ２−Ｃシグナルペプチド・ＦＬＡＧタグ・γ２鎖Ｅ８増幅用プライマー
5’-TGGGCGTGGATAGCGGTTTG-3’（forward、配列番号１６）
5’-GCGAATTCTCACTGTTGCTCAAGAGCCTG-3’（reverse、配列番号２２）
【００５６】
（4-4）ｒｈＬＭ３３２Ｅ８の発現と精製
ｒｈＬＭ３３２Ｅ８の発現は、作製した各鎖の発現ベクターをヒト腎臓由来２９３Ｆ細胞（インビトロジェン）に導入して行った。３００ｍｌの２９３Ｆ細胞（1.0×106個/ml）にトランスフェクション試薬２９３ｆｅｃｔｉｎ（商品名、インビトロジェン）およびＯｐｔｉ−ＭＥＭ（商品名、インビトロジェン）を用いて各鎖発現ベクターを７０μｇずつ同時にトランスフェクトし、７２時間培養を行ったのち、培養液を回収した。培養液は１０００×ｇで１０分間遠心し、その上清をさらに１５，０００×ｇで３０分間遠心し、細胞や不溶物を除去した。培養上清にイミダゾールを終濃度１０ｍＭとなるよう加え、よく撹拌した。その後、５０％（v/v）Ｎｉ−ＮＴＡ ａｇａｒｏｓｅ（キアゲン社）を４０ｍｌ添加し、４℃、一晩のバッチ法で目的タンパク質を吸着させた。Ｎｉ−ＮＴＡ ａｇａｒｏｓｅを回収し、ＴＢＳ（−）で洗浄したのち２００ｍＭイミダゾール／ＴＢＳ（−）で溶出した。２８０ｎｍの吸光度を指標にしてｒｈＬＭ３３２Ｅ８溶出画分を確認した。溶出された画分に２ｍｌのＡＮＴＩ−ＦＬＡＧ Ｍ２ ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ（シグマ）を添加し、４℃、一晩のバッチ法で目的タンパク質を吸着させた。ゲルをエコノカラム（バイオラッド社製）に移し、ＴＢＳ（−）で洗浄後、１００μｇ／ｍｌ ＦＬＡＧ ｐｅｐｔｉｄｅ（シグマ）を含むＴＢＳ（−）で溶出した。溶出フラクションを銀染色で確認し、ｒｈＬＭ３３２Ｅ８の溶出された画分をＴＢＳ（−）に対して透析（２０ｋＤａ ｃｕｔ）を行った。
【００５７】
（５）組換えヒトラミニン（ｒｈＬＭ５１１、ｒｈＬＭ３３２、ｒｈＬＭ１１１）の作製方法
ｒｈＬＭ５１１は、Ｉｄｏら（Hiroyuki Ido, Kenji Harada, Sugiko Futaki, Yoshitaka Hayashi, Ryoko Nishiuchi, Yuko Natsuka, Shaoliang Li, Yoshinao Wada, Ariana C. Combs, James M. Ervasti, and Kiyotoshi Sekiguchi, “Molecular dissection of the α-dystroglycan- and integrin-binding sites within the globular domain of human laminin-10” Jhe Journal of Biological Chemistry, 279, 10946-10954, 2004.）に記載の方法に従って作製した。
ｒｈＬＭ３３２は、Ｉｄｏら（Hiroyuki Ido, Aya Nakamura, Reiko Kobayashi, Shunsuke Ito, Shaoliang Li, Sugiko Futaki, and Kiyotoshi Sekiguchi, “The requirement of the glutamic acid residue at the third position from the carboxyl termini of the laminin γ chains in integrin binding by laminins” The Journal of Biological Chemistry, 282, 11144-11154, 2007.）に記載の方法に従って作製した。
ｒｈＬＭ１１１は、Ｉｄｏら（Hiroyuki Ido, Kenji Harada, Yoshiki Yagi, and Kiyotoshi Sekiguchi, “Probing the integrin-binding site within the globular domain of laminin-511 with the function-blocking monoclonal antibody 4C7” Matrix Biology, 25, 112-117, 2006.）およびＴａｎｉｇｕｃｈｉら（Yukimasa Taniguchi, Hiroyuki Ido, Noriko Sanzen, Maria Hayashi, Ryoko Sato-Nishiuchi, Sugiko Futaki, and Kiyotoshi Sekiguchi, “The C-terminal region of laminin β chains modulates the integrin binding affinities of laminins” The Journal of Biological Chemistry, 284, 7820-7831, 2009.）に記載の方法に従って作製した。
【００５８】
〔実施例１：ヒトＥＳ細胞の各種細胞外基質への濃度依存的接着効率の比較〕
９６ウェルマイクロプレート（BD Bioscience #351172）に、ｒｈＬＭ５１１Ｅ８、ｒｈＬＭ３３２Ｅ８、ｒｈＬＭ５１１、ｒｈＬＭ３３２、ｒｈＬＭ１１１、マトリゲル、フィブロネクチン、ビトロネクチンをＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳ（和光純薬 #045-29795）またはＤＭＥＭ−Ｆ１２（シグマ #D6241）で希釈し、各細胞外基質溶液を最終濃度が０〜２５μｇ／ｃｍ２の範囲になるように加え、室温で２時間静置してコーティングを行った。
ｍＴｅＳＲ１培養細胞（Ｐ１）にＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（インビトロジェン #12563011）を加えて３分間３７℃で恒温処理し、細胞を単一細胞に分散させた。細胞数をカウントした後、プレートに５×１０４ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌの密度で細胞を播種した。細胞播種から６時間経過後、上清を除いてＤＭＥＭ−Ｆ１２で１度ウェルを洗浄し、１０％中性ホルマリン緩衝液を加えて１０分間細胞を固定した。１００％エタノールに置換して５分経過した後、４％クリスタルバイオレット／１００％メタノール溶液を加え、細胞を５分間染色した。プレートを大量の蒸留水に浸して過剰な染色液を除去した後、風乾させた。１％ＳＤＳを加えて細胞を可溶化し、マルチプレートリーダーを用いて波長５７０ｎｍの吸光度を測定した。
【００５９】
結果を図１に示した。図１から明らかなように、ｒｈＬＭ５１１Ｅ８およびｒｈＬＭ３３２Ｅ８は低濃度のコーティングでも顕著に高い接着細胞数を示した。既知の細胞外基質のうち、ヒトＥＳ細胞の接着が最も高いとされるマトリゲルの接着細胞数の最大値より、ｒｈＬＭ５１１Ｅ８の接着細胞数はいずれの濃度においても高いことが明らかとなった。また、全長のｒｈＬＭ５１１またはｒｈＬＭ３３２のコーティング量より少ないコーティング量で、多数の細胞が接着することが明らかとなった。この結果から、ｒｈＬＭ５１１Ｅ８およびｒｈＬＭ３３２Ｅ８の至適コーティング濃度は約１．０μｇ／ｃｍ２〜約２０μｇ／ｃｍ２と考えられた。
【００６０】
〔実施例２：ｒｈＬＭ５１１Ｅ８をコーティングした培養器における播種密度依存的な単一ヒトＥＳ細胞の接着効率の検討〕
ヒトＥＳ細胞の継代は、トリプシン／ＥＤＴＡ等を用いて単一細胞に分散すると細胞の生存率が極端に低下するため、コロニー形状を維持しながら植え継ぐのが一般的である。そこで、ｒｈＬＭ５１１Ｅ８をコーティングした場合の単一ヒトＥＳ細胞の接着効率を、マトリゲルをコーティングした場合と比較した。
【００６１】
ｒｈＬＭ５１１Ｅ８を最終濃度が１．５μｇ／ｃｍ２になるようにＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳで希釈した。マトリゲルを最終濃度が２５μｇ／ｃｍ２になるようにＤＭＥＭ−Ｆ１２で希釈した。各希釈液を４８ウェルマルチウェルプレート（BD Bioscience #351178）に添加し、室温で２時間静置してコーティングを行った。
ｍＴｅＳＲ１培養細胞（Ｐ１）にＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを加えて３分間３７℃で恒温処理し、細胞を単一細胞に分散させた。ｒｈＬＭ５１１Ｅ８またはマトリゲルをコーティングした４８ウェルマルチウェルプレートに、細胞密度１×１０３ｃｅｌｌ／ｃｍ２〜５×１０５ｃｅｌｌ／ｃｍ２の範囲で３ウェルずつ播種した。細胞播種から６時間後、上清を除いてＰＢＳで洗浄し、０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡで細胞を剥離した。細胞数をカウントし、各細胞密度における播種細胞数に対する接着細胞数の比を求めた。
【００６２】
結果を図２に示した。図２から明らかのように、マトリゲルをコーティングした場合の単一ヒトＥＳ細胞の接着効率は従来通り極端に低いが、ｒｈＬＭ５１１Ｅ８をコーティングした場合は、５×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２の播種密度で約５０％が接着、生存することが明らかとなった。この結果から、ｒｈＬＭ５１１Ｅ８をコーティングした培養器における細胞播種密度の適正値は約５×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２〜約１０×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２と考えられた。
【００６３】
〔実施例３：ｒｈＬＭ５１１Ｅ８またはｒｈＬＭ３３２Ｅ８をコーティングした培養器におけるヒトＥＳ細胞の形態観察および表面抗原解析〕
ｒｈＬＭ５１１Ｅ８またはｒｈＬＭ３３２Ｅ８を最終濃度が１．５μｇ／ｃｍ２になるようにＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ＰＢＳで希釈した。マトリゲルを最終濃度が２５μｇ／ｃｍ２になるようにＤＭＥＭ−Ｆ１２で希釈した。各希釈液を３５ｍｍイージーグリップセルカルチャーディッシュ（BD Falcon #353001）に添加し、室温で２時間静置してコーティングを行った。
ｍＴｅＳＲ１培養細胞（Ｐ１）にＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔを加えて３分間３７℃で恒温処理し、細胞を単一細胞に分散させた。ｒｈＬＭ５１１Ｅ８、ｒｈＬＭ３３２Ｅ８またはマトリゲルをコーティングした３５ｍｍイージーグリップセルカルチャーディッシュに、細胞密度５×１０４ｃｅｌｌ／ｃｍ２で播種した。細胞播種から毎日観察を行い、形態変化を撮影記録した。
細胞播種から５日後、表面抗原解析を行うために細胞をＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔで３分間処理して細胞を単一細胞に分散し、Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（0.1％BSA/PBS）で洗浄処理した。一次抗体として抗ＳＳＥＡ−１抗体、抗ＳＳＥＡ−４抗体、抗Ｔｒａ−１−６０抗体、抗Ｔｒａ−１−８１抗体、抗Ｔｒａ−２−５４抗体（以上、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ Ｂａｎｋ、アイオワ大学）または抗ＧＣＴＭ−２抗体（インビトロジェン）を添加して４℃で３０分間染色した後、Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで洗浄した。次に二次抗体（Beckman Coulter #731735）を添加して４℃で３０分間染色した。細胞をＷｏｒｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎで２度洗浄し、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ ＨＧを用いて蛍光強度を測定した。
【００６４】
ｒｈＬＭ３３２Ｅ８をコーティングしたディッシュで培養したヒトＥＳ細胞の形態観察の結果を図３に示した。また、ｒｈＬＭ５１１Ｅ８をコーティングしたディッシュで培養したヒトＥＳ細胞の形態観察の結果を図４に示した。図３および図４から明らかなように、単一細胞に分散したヒトＥＳ細胞は、ｒｈＬＭ３３２Ｅ８またはｒｈＬＭ５１１Ｅ８をコーティングしたディッシュに単独で接着、あるいは近接した細胞とコロニー形状を再構築して接着し（図３、図４の各上段のｄａｙ１参照）、その後、旺盛な増殖を示した（図３、図４の各下段のｄａｙ３参照）。この結果から、ｒｈＬＭ３３２Ｅ８またはｒｈＬＭ５１１Ｅ８をコーティングした培養基材を用いれば、従来不可能であった単一分散によるヒトＥＳ細胞の培養方法を提供できることが示された。
【００６５】
表面抗原解析の結果を図５に示した。図５において、左列がマトリゲルをコーティングしたディッシュで培養した細胞の結果であり、中央列がｒｈＬＭ３３２Ｅ８をコーティングしたディッシュで培養した細胞の結果であり、右列がｒｈＬＭ５１１Ｅ８をコーティングしたディッシュで培養した細胞の結果である。図５から明らかなように、表面抗原解析の結果は三者に違いがなく、いずれも未分化マーカー（ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、Ｔｒａ−２−５４、ＧＣＴＭ２）は高い陽性率を示し、分化マーカー（ＳＳＥＡ−１）は陽性を示さなかった。この結果から、ｒｈＬＭ３３２Ｅ８またはｒｈＬＭ５１１Ｅ８をコーティングした培養基材を用いても、従来法と比べて遜色なく、ヒトＥＳ細胞の未分化状態を維持ができることが示された。
【００６６】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図５】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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