(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
結果としてトロンボキサン合成酵素（ＴＢＸＡＳ１）のＬｅｕ４８８Ｐｒｏ突然変異体、Ｌｅｕ８３Ｐｒｏ突然変異体、Ｇｌｙ４８２Ｔｒｐ突然変異体およびＡｒｇ４１３Ｇｌｕ突然変異体になる突然変異からなる群から選択されるＴＢＸＡＳ１遺伝子の突然変異を検出することを含む、対象におけるゴサール血液骨幹異形成症候群を診断または予測することを補助する方法であって、前記突然変異の存在がゴサール血液骨幹異形成症候群の指標となり、前記対象から採取した核酸試料においてＴＢＸＡＳ１の突然変異を検出するステップを含む方法。
【請求項２】
前記突然変異が、１４６３Ｔ＞Ｃ、２４８Ｔ＞Ｃ、１４４４Ｇ＞Ｔおよび１２３８Ｇ＞Ａからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨塩密度関連の障害の治療および診断の方法に関する。より詳細には、本発明は、トロンボキサン合成酵素が骨塩密度の差異に関与しているという発見に基づく。
【背景技術】
【０００２】
椎骨の骨質は、椎骨の強度において必須である。骨質の主要な要素は、骨塩密度、および、骨全体にわたるその分布であり、いくつかの証拠から、現時点では、骨塩密度がいくつかのヒトの状態に影響することが示されている。
【０００３】
骨粗鬆症または多孔性骨は、骨塩密度が低く、結果として骨の脆弱性および骨折しやすさ（特に、寛骨、脊椎および手首の骨折）が高まることを特徴とする疾患であるが、いかなる骨も罹患する可能性がある。予防しないか、または治療しないままにしておくと、骨粗鬆症は痛みもなく進行して、骨の破損に至ることがある。骨粗鬆症が原因で年間１５０万件超の骨折が発生すると推定され、その内訳は、３００，０００件超が寛骨骨折、およそ７００，０００件が椎骨骨折、２５０，０００件が手首の骨折、３００，０００件が他の部位の骨折である。骨粗鬆症の病因において遺伝因子は重要な役割を果たしており、いくつかの研究から、骨塩密度における５０％〜８５％の間のばらつきが遺伝的に決定されることが示唆される（Ｇｕｅｇｕｅｎら、１９９５；ＡｒｄｅｎおよびＳｐｅｃｔｏｒ、１９９７）。しかし、こうした効果に関与する遺伝子は完全に定義されてはいない。骨粗鬆症の治療に使用される大部分の薬剤（エストロゲンおよびビスホスホネートなど）は、あまり有効ではない。こうした薬剤は、骨吸収を遅らせるが、結合性を改善しない。したがって、骨粗鬆症の治療のための新しい標的を提供する必要性が常に存在する。
【０００４】
反対に、いくつかの他の病態または状態においては、骨塩密度が増加することが示されている。例えば、骨塩密度の増加は、甲状腺摘出後の副甲状腺機能低下症に罹患している閉経期後の女性において示されている。さらに、いくつかの薬物が、骨塩密度の増加を誘導することが示されている。例えば、カテプシン−Ｋを選択的に阻害する治験薬であるオダナカチブ（旧ＭＫ−０８２２）を用いた第ＩＩＢ相試験の１２カ月の結果から、閉経期後の女性においては、プラセボと比較して、骨塩密度が用量依存的に増加し、骨代謝回転が低下することが実証された（第２９回Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｍｉｎｅｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＡＳＢＭＲ））。他の例としては、主要な骨幹の病変、無再生性の皮質感受性貧血および慢性の生物学的炎症を伴う、骨塩密度の増加を特徴とする稀な常染色体劣性障害であるゴサール血液骨幹異形成症候群（ＧＨＤＤ）が挙げられる（Ｇｈｏｓａｌら、１９８８）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、骨塩密度関連の疾患を診断、予測、予防および治療する方法を構想するために、骨塩密度に影響する因子を同定する必要性が従来から存在する。
【０００６】
ビタミンＤ受容体（Ｋｅｌｌｙ  ＰＪら、１９９７）およびエストロゲン受容体（Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、１９９６）など多種多様な候補遺伝子が、骨塩密度に関してこれまでに研究されている。ところが、現時点での証拠からは、これらの遺伝子における対立遺伝子の差異では骨塩密度のばらつきのごく一部しか説明されない（Ｒｕｂｉｎら、１９９９）ことが示唆されており、そのことは、骨塩密度を調節する遺伝子の大部分が未だ発見されていないことを示すものである。骨塩密度の調節に関連する多形性の同定および遺伝子型同定は、骨量、ひいては、例えば、骨塩密度関連の疾患への罹患しやすさのマーカーを明確にするために有用である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ＴＢＸＡＳ１遺伝子の突然変異を検出することを含む、対象における骨塩密度関連の疾患または骨塩密度関連の疾患のリスクを診断または予測する方法であって、前記突然変異の存在が骨塩密度関連の疾患または骨塩密度関連の疾患のリスクの指標となり、前記対象から採取した核酸試料においてＴＢＸＡＳ１の突然変異を検出するステップを含む方法に関する。
【０００８】
本発明は、さらに、骨塩密度の増加を伴う疾患（例えば、ゴサール血液骨幹異形成症候群）を治療または予防するための、トロンボキサン合成酵素（ＴＸＡＳ）をコードするポリヌクレオチド、ＴＸＡＳ、トロンボキサンＡ２またはその類似体からなる群から選択される化合物にも関する。
【０００９】
本発明は、さらに、骨塩密度の減少を伴う疾患（例えば骨粗鬆症）を治療または予防するための、ＴＢＸＡＳ１遺伝子発現阻害薬またはトロンボキサン阻害薬からなる群から選択される化合物にも関する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
定義
「コード配列」、または、発現産物（ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質または酵素など）を「コードする」配列は、発現時に、当該ＲＮＡ、ポリペプチド、タンパク質または酵素の産生を結果としてもたらすヌクレオチド配列であり、すなわち、このヌクレオチド配列は、当該ポリペプチド、タンパク質または酵素のアミノ酸配列をコードする。タンパク質のコード配列としては、開始コドン（通常はＡＴＧ）および終止コドンを挙げることができる。
【００１１】
用語「遺伝子」は、１つまたは複数のタンパク質または酵素の全てもしくは一部を含む特定のアミノ酸配列をコードするか、またはそれに相当するＤＮＡ配列を意味し、例えば、遺伝子が発現する条件を決定する調節性のＤＮＡ配列（プロモーター配列など）は含まれても含まれなくてもよい。いくつかの遺伝子（構造遺伝子ではない）は、ＤＮＡからＲＮＡへ転写されることがあるが、アミノ酸配列には翻訳されない。他の遺伝子は、構造遺伝子の調節因子として、またはＤＮＡ転写の調節因子として、機能することがある。とりわけ、遺伝子という用語は、タンパク質をコードするゲノム配列、すなわち、調節因子、プロモーター、イントロンおよびエキソンの配列を含む配列を意図することがある。
【００１２】
本明細書中で使用する場合、用語「ＴＢＸＡＳ１遺伝子」は、任意の種のトロンボキサン合成酵素の遺伝子を表し、この場合の種は、特にヒトであるが、本発明の方法を適用できる他の哺乳動物または脊椎動物でもある。ＴＢＸＡＳ１遺伝子は、６０ｋＤａの膜貫通型トロンボキサン合成酵素（「ＴＸＡＳ」）をコードする。ヒトＴＢＸＡＳ１遺伝子は、第７染色体（７ｑ３４〜ｑ３５位）上に局在しており、その配列は、ＮＣ＿０００００７．１２の受入番号で遺伝子バンクに寄託されている。
【００１３】
ＴＢＸＡＳ１遺伝子は、ＮＭ＿００１０６１の受入番号で遺伝子バンクに寄託されている転写物をコードし、配列番号１に記載されているようなオープンリーディングフレームを含有する。対応するアミノ酸配列は、受入番号ＮＰ＿００１０５２でＧｅｎＰｅｐｔデータベースに寄託され、配列番号２に記載されている。
【００１４】
核酸分子の一本鎖形態が、温度および溶液イオン強度の適切な条件下で他の核酸分子にアニールできるとき、核酸分子は別の核酸分子（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡなど）と「ハイブリダイズでき」る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照）。
【００１５】
温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。相同な核酸の予備スクリーニングの場合、５５℃のＴｍ（溶融温度）に対応する低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件、例えば、５倍ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．２５％ミルク、およびホルムアミドなし；または、３０％ホルムアミド、５倍ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳを用いることができる。中ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、より高いＴｍに対応し、例えば、４０％ホルムアミド、５倍または６倍のＳＣＣである。高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は、最も高いＴｍに対応し、例えば、５０％ホルムアミド、５倍または６倍のＳＣＣである。ＳＣＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸Ｎａである。ハイブリダイゼーションには、２つの核酸が相補的な配列を有することが必要であるが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーによっては、塩基間のミスマッチが生じる可能性がある。核酸をハイブリダイズするための適切なストリンジェンシーは、核酸の長さおよび相補性の程度、当技術分野で周知の変数によって決まる。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が大きいほど、そうした配列を有する核酸をハイブリダイズするためのＴｍの値が大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的な安定性（より高いＴｍに対応する）は、以下の順序で低下する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００ヌクレオチドを超えるハイブリッドの場合のＴｍを計算する式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、９．５０〜９．５１を参照）。比較的短い核酸、すなわち、オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの場合は、ミスマッチの位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さによりその特異性が決まる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、ＩＩ．７〜１１．８を参照）。ハイブリダイズ可能な核酸のための最短の長さは、少なくとも約１０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１５ヌクレオチド、より好ましくは、この長さは少なくとも約２０ヌクレオチドである。
【００１６】
特定の一実施形態では、用語「標準的なハイブリダイゼーション条件」は、５５℃のＴｍを指し、前述したような条件を利用する。好ましい一実施形態では、Ｔｍは６０℃である。より好ましい実施形態では、Ｔｍは６５℃である。特定の一実施形態では、「高ストリンジェンシー」は、０．２倍ＳＳＣ中で６８℃、５０％ホルムアミド、４倍ＳＳＣ中で４２℃、またはこれら２つの条件のいずれかの元で観察されるものと同等なハイブリダイゼーションのレベルを得られる条件下でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄の条件を指す。
【００１７】
本明細書中で使用する場合、増幅プライマーは、ハイブリダイゼーション後にオリゴヌクレオチドを標的配列に拡張すること、または標的配列とハイブリダイズする際に隣接する複数のオリゴヌクレオチドを連結させることによる、標的配列の増幅のためのオリゴヌクレオチドである。増幅プライマーの少なくとも一部は、標的とハイブリダイズする。この部分は標的結合配列と呼ばれ、これがプライマーの標的特異性を決定する。標的結合配列に加え、一定の増幅方法には、増幅プライマーにおける特殊化された非標的結合配列が必要である。このような特殊化された配列は、増幅反応が進み、典型的には、特殊化された配列を標的に付加するように働くために必要である。例えば、鎖置換増幅（ＳＤＡ）において使用される増幅プライマーとしては、標的結合配列への制限エンドヌクレアーゼ認識部位５’が挙げられる（米国特許第５，４５５，１６６号および米国特許第５，２７０，１８４号）。核酸ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、自律的配列複製（３ＳＲ）および転写ベース増幅プライマーには、プライマーの標的結合配列に連結したＲＮＡポリメラーゼプロモーターが必要である。そのような特殊化された配列を、選択された増幅反応において使用するための標的結合配列に連結することは、当技術分野では日常行われていることである。対照的に、特殊化された配列を標的の末端に必要としないＰＣＲなどの増幅方法は、標的結合配列のみからなる増幅プライマーを一般に用いる。
【００１８】
本明細書中で使用する場合、用語「プライマー」および「プローブ」は、オリゴヌクレオチドの機能を指す。プライマーは、典型的には、ポリメラーゼ、または標的とのハイブリダイゼーションに次ぐ連結により拡張されるが、プローブは、典型的には拡張されない。ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドは、標的配列を捕捉または検出するために使用される場合にはプローブとして機能でき、同じオリゴヌクレオチドが、増幅プライマー中で標的結合配列として用いられるときにはプライマーとして機能できる。したがって、ＴＢＸＡＳ１の増幅、検出または定量化のための本明細書中で開示する標的結合配列のいずれも、ハイブリダイゼーションプローブとして、または、検出もしくは増幅用のプライマー中の標的結合配列として、そのいずれかで使用でき、場合によっては、選択された増幅反応により必要とされるか、または検出を容易にするための、特殊化された配列に連結されてもよいと理解されよう。
【００１９】
用語「突然変異体」および「突然変異」は、遺伝物質（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ）もしくは任意の過程、機序において検出可能な任意の変化、または、そのような変化の結果を意味する。これには、遺伝子の構造（例えばＤＮＡ配列）が変化している遺伝子突然変異、任意の突然変異過程から生じる任意の遺伝子またはＤＮＡ、および、改変された遺伝子またはＤＮＡの配列により発現される任意の発現産物（例えば、タンパク質または酵素）が含まれる。一般に、突然変異は、対象において、前記対象により発現される核酸またはポリペプチドの配列を、対照集団において発現される対応する核酸またはポリペプチドと比較することにより同定される。遺伝物質の突然変異は「サイレント」である（すなわち、突然変異の結果、発現産物のアミノ酸配列の変化が生じない）場合もある。
【００２０】
本出願に関する場合、ＴＢＸＡＳ１遺伝子中で同定される突然変異は、ＤｕｎｎｅｎおよびＡｎｔｏｎａｒａｋｉｓ（２０００）の命名法に従って指定される。ＤｕｎｎｅｎおよびＡｎｔｏｎａｒａｋｉｓにより定義されるように、核酸レベルでは、置換は「＞」により指定され、例えば「１４６３Ｔ＞Ｃ」は、参照配列のヌクレオチド１４６３でＴがＣに変化することを表す。完全長のゲノム配列がわかっている場合、突然変異は、ゲノム参照のヌクレオチド番号により最もよく指定される。核酸の突然変異は、配列番号１のヌクレオチド番号を参照することにより指定される。
【００２１】
用語「配列類似性」は、その全ての文法形態において、タンパク質の核酸またはアミノ酸の配列間の同一度または一致度を指し、それらは共通の進化上の起源を共有してもしなくてもよい。好ましくは、配列同一度は、参照配列の全体と比較して計算される。
【００２２】
特定の一実施形態では、配列比較アルゴリズム（ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＤＮＡ  Ｓｔｒｉｄｅｒなど）により定量した場合にヌクレオチドの少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％または８０％または８５％または９０％または９５％または９９％がＤＮＡ配列の規定の長さを超えて一致するとき、２本のＤＮＡ配列は「実質的に相同」または「実質的に類似」である。そのような配列の例は、ＴＢＸＡＳ１遺伝子の対立遺伝子変種または種変種である。実質的に相同な配列は、配列データバンクにおいて、またはサザンハイブリダイゼーション実験において入手可能な標準的なソフトウェアを使用して、例えば、当該特定のシステムについて規定されるようなストリンジェントな条件下で配列を比較することにより同定できる。
【００２３】
同様に、特定の一実施形態では、アミノ酸の８０％超、好ましくは８５％超または９０％超または９５％超または９９％超が類似（機能的に同一）であるとき、２つのアミノ酸配列は「実質的に類似」である。「機能的に同一の」ポリペプチドは、その中の所与のアミノ酸残基が変化しているが、ポリペプチドの全体的な立体配座および機能の変質を伴わないものであり、この場合の変質とは、アミノ酸を、特性（例えば、極性、水素結合ポテンシャル、酸性、塩基性、疎水性、芳香族など）の類似したものに置換することを非限定的に含む。特性の類似したアミノ酸は、当技術分野で周知である。例えば、アルギニン、ヒスチジンおよびリシンは、親水性の塩基性アミノ酸であり、互換性がある場合がある。同様に、疎水性のアミノ酸であるイソロイシンは、ロイシン、メチオニンまたはバリンで置換できる。そのような変化は、タンパク質またはポリペプチドの見かけの分子量または等電点にほとんどまたは全く影響しないと考えられる。好ましくは、類似した配列は、例えば、ＧＣＧ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｍａｎｕａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＧＣＧ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ７、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）パイルアッププログラム、または、前述のプログラムのいずれか（ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなど）を使用する配列比較により同定される。
【００２４】
「トロンボキサン阻害薬」としては、いわゆるトロンボキサンＡ２受容体拮抗薬、トロンボキサンＡ２拮抗薬、トロンボキサンＡ２／プロスタグランジンエンドペルオキシド拮抗薬、トロンボキサン受容体（ＴＰ）拮抗薬、トロンボキサン拮抗薬、トロンボキサン合成酵素阻害薬、ならびに、二重作用性のトロンボキサン合成酵素阻害薬およびトロンボキサン受容体拮抗薬である化合物が挙げられる。
【００２５】
「トロンボキサンＡ２受容体拮抗薬」は、任意のトロンボキサンＡ２受容体の活性化を可逆的または不可逆的に遮断する任意の化合物を指す。
【００２６】
「トロンボキサン合成酵素阻害薬」は、酵素トロンボキサン合成酵素を可逆的または不可逆的に阻害することによりトロンボキサンＡ２の形成を減少させる任意の化合物を指す。
【００２７】
「二重作用性のトロンボキサン受容体拮抗薬およびトロンボキサン合成酵素阻害薬」は、トロンボキサンＡ２受容体拮抗薬およびトロンボキサン合成酵素阻害薬として同時に作用する任意の化合物を指す。
【００２８】
用語「骨塩密度関連の疾患」は、骨塩密度の差異（すなわち、対照集団と比較した場合の増減）を伴うか、またはそれにより引き起こされるか、またはその結果である全ての障害を包含する。より詳細には、「骨塩密度の減少を伴う疾患」は、骨塩密度の減少を伴うか、またはそれにより引き起こされるか、またはその結果である疾患を表す。より詳細には、「骨塩密度の増加を伴う疾患」は、骨塩密度の増加を伴うか、またはそれにより引き起こされるか、またはその結果である疾患を表す。
【００２９】
本発明における文脈では、用語「治療すること」または「治療」は、本明細書中で使用する場合、そのような用語が適用される障害もしくは状態、または、そのような障害もしくは状態の１つもしくは複数の症状の進行を反転、軽減、阻害すること、あるいは、そのような障害もしくは状態もしくは症状を予防することを意味する。「治療上有効量」は、対象に治療上の利益をもたらすのに必要な最少量の活性剤（例えば、ＴＢＸＡＳ１ポリヌクレオチドまたはトロンボキサン合成酵素阻害薬）を意図する。例えば、哺乳動物に対する「治療上有効量」は、病理学的な症状、疾患の進行、または、障害を伴う生理的な状態もしくは障害への屈服に対する抵抗性の改善を、誘導し、回復させ、または別の形でもたらすような量である。
【００３０】
用語「生体試料」は、患者に由来する任意の生体試料を意味する。そのような試料の例としては、体液、組織、細胞試料、臓器、生検などが挙げられる。好ましい生体試料は、細胞または組織の試料である。好ましい生体試料は、全血、血清、血漿または尿である。
【００３１】
本明細書中で使用する場合、用語「対象」は、齧歯動物、ネコ、イヌおよび霊長動物などの哺乳動物を表す。好ましくは、本発明による対象はヒトである。
【００３２】
「トロンボキサン合成酵素活性の低下を伴うＴＢＸＡＳ１遺伝子の突然変異」という表現は、結果としてＴＢＸＡＳ１遺伝子の発現レベルの減少をもたらす突然変異、および、結果として、酵素活性の低下、すなわち、プロスタグランジン（ＰＧ）Ｈ２のトロンボキサンＡ２（ＴＸＡ２）への転換の低下を示すＴＸＡＳの合成をもたらす突然変異を包含する。
【００３３】
「トロンボキサン合成酵素活性の増加を伴うＴＢＸＡＳ１遺伝子の突然変異」という表現は、結果としてＴＢＸＡＳ１遺伝子の発現レベルの増加をもたらす突然変異、および、結果として、酵素活性の増加、すなわち、プロスタグランジン（ＰＧ）Ｈ２のトロンボキサンＡ２（ＴＸＡ２）への転換の増加を示すＴＸＡＳの合成をもたらす突然変異を包含する。
【００３４】
ＴＢＸＡＳ１遺伝子の突然変異
本発明者らは、ＴＢＸＡＳ１遺伝子における多様な突然変異を同定した。実施例に示すように、ＴＢＸＡＳ１遺伝子の直接配列決定の結果、実施例のＧＨＤＤの４家族全てにおいて、異なるホモ接合ミスセンス突然変異が検出された：１４６３Ｔ＞Ｃ、２４８Ｔ＞Ｃ、１４４４Ｇ＞Ｔおよび１２３８Ｇ＞Ａ、配列番号１のヌクレオチド番号を参照。
【００３５】
前述のような突然変異を有するＴＢＸＡＳ１ヌクレオチド配列を含む核酸またはその断片は、本発明の一部である。
【００３６】
したがって、本発明は、１４６３Ｔ＞Ｃ、２４８Ｔ＞Ｃ、１４４４Ｇ＞Ｔおよび１２３８Ｇ＞Ａからなる群から選択される突然変異を有するＴＢＸＡＳ１遺伝子配列を含み、またはそれからなる、ＴＸＡＳをコードする単離された核酸に関する。前記核酸は、前述の突然変異の１つまたは複数を有することがある。
【００３７】
本発明は、さらに、前記核酸によりコードされるポリペプチドに関する。より具体的には、ＴＢＸＡＳ１遺伝子における突然変異１４６３Ｔ＞Ｃ、２４８Ｔ＞Ｃ、１４４４Ｇ＞Ｔおよび１２３８Ｇ＞Ａは、結果として、それぞれ、ＴＸＡＳのＬｅｕ４８８Ｐｒｏ突然変異体、Ｌｅｕ８３Ｐｒｏ突然変異体、Ｇｌｙ４８２Ｔｒｐ突然変異体およびＡｒｇ４１３Ｇｌｕ突然変異体になる。アミノ酸の位置は、配列番号２に記載の通りのポリペプチド配列を参照することにより示される。
【００３８】
したがって、本発明は、さらに、Ｌｅｕ４８８Ｐｒｏ、Ｌｅｕ８３Ｐｒｏ、Ｇｌｙ４８２ＴｒｐおよびＡｒｇ４１３Ｇｌｕからなる群から選択される突然変異を有するＴＸＡＳのポリペプチド配列を含み、またはそこに存在する、単離されたポリペプチドを提供する。前記ポリペプチドは、前述の突然変異の１つまたは複数を有してもよい。
【００３９】
本発明の診断方法：
本発明者らは、トロンボキサン合成酵素活性の低下を伴うＴＢＸＡＳ１遺伝子において見出された突然変異は、骨塩密度の増加を伴う疾患、とりわけゴサール血液骨幹異形成症候群（ＧＨＤＤ）と関連があることをさらに示した。
【００４０】
したがって、本発明は、対象におけるゴサール血液骨幹異形成症候群またはゴサール血液骨幹異形成症候群のリスクを診断または予測する方法であって、突然変異の存在がゴサール血液骨幹異形成症候群またはゴサール血液骨幹異形成症候群のリスクの指標となる、対照集団と比較してＴＢＸＡＳ１遺伝子の突然変異を検出することを含む方法を提供する。
【００４１】
いかなる理論に拘束されるものでもないが、本発明者らは、ＴＢＸＡＳ１遺伝子は骨塩密度関連の疾患の病因に関与していると考える。
【００４２】
したがって、本発明の目的は、対照集団と比較してＴＢＸＡＳ１遺伝子の突然変異を検出することを含む、対象における骨塩密度関連の疾患または骨塩密度関連の疾患のリスクを診断または予測する方法であって、突然変異の存在が骨塩密度関連の疾患または骨塩密度関連の疾患のリスクの指標となる、方法に関する。
【００４３】
特定の一実施形態では、骨塩密度関連の疾患は、ゴサール血液骨幹異形成症候群または骨粗鬆症からなる群において選択される。
【００４４】
第１の実施形態によれば、前記突然変異は、ＴＢＸＡＳ１核酸分子を分析することにより検出できる。本発明に関する場合、ＴＢＸＡＳ１核酸分子としては、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および、ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡが含まれる。ＤＮＡまたはＲＮＡは、一本鎖でも二本鎖でもよい。こうした核酸分子は、例えば、プローブを用いた増幅および／またはハイブリダイゼーションによる検出に利用してもよい。
【００４５】
したがって、本発明は、ＴＢＸＡＳ１遺伝子の突然変異を検出することを含む、対象における骨塩密度関連の疾患または骨塩密度関連の疾患のリスクを診断または予測する方法であって、突然変異の存在が骨塩密度関連の疾患または骨塩密度関連の疾患のリスクの指標となり、前記対象から採取した核酸試料におけるＴＢＸＡＳ１遺伝子の突然変異を検出するステップを含む方法を提供する。
【００４６】
核酸試料は、任意の細胞源または組織生検から採取できる。採取可能な細胞源の非限定例としては、血球、頬の細胞、上皮細胞、線維芽細胞、または生検により採取される組織中に存在する任意の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。細胞は、血液、血漿、血清、リンパなどの体液からも採取できる。ＤＮＡは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９中に記載のような、当技術分野において公知の任意の方法を用いて抽出してもよい。ＲＮＡは、グアニジンチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出など、当業者に周知の標準的な方法を用いて、例えば組織生検から単離してもよい。
【００４７】
本発明によるＴＢＸＡＳ１の突然変異は、ＴＢＸＡＳ１遺伝子の調節領域（例えば、プロモーター配列、または転写因子結合部位）中、ＴＢＸＡＳ１遺伝子のイントロン中、または、ＴＸＡＳをコードするエキソン中で見出すことができる。
【００４８】
好ましくは、本発明によるＴＢＸＡＳ１遺伝子の突然変異は、１４６３Ｔ＞Ｃ、２４８Ｔ＞Ｃ、１４４４Ｇ＞Ｔおよび１２３８Ｇ＞Ａからなる群から選択される。
【００４９】
ＴＢＸＡＳ１の突然変異は、ＲＮＡまたはＤＮＡの試料中で、好ましくは増幅後に検出してもよい。例えば、単離ＲＮＡは、変異部位に特異的であるか、または変異部位を有する領域の増幅が可能な特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）による逆転写および増幅など、対合型の逆転写および増幅に供してもよい。第１の代替手段によれば、プライマーアニーリングのための条件は、増幅産物が出現すれば特定のＴＢＸＡＳ１の突然変異の存在が診断されるように、特異的な逆転写（適切な場合）および増幅を確実にするように選択できる。それ以外には、ＲＮＡを逆転写および増幅させてもよく、またはＤＮＡを増幅させてもよく、その後、適当なプローブを用いたハイブリダイゼーションにより、または、直接配列決定もしくは当技術分野で公知の他の任意の適切な方法により、増幅された配列中で突然変異部位を検出してもよい。例えば、ＲＮＡから得られたｃＤＮＡをクローニングおよび配列決定して、ＴＢＸＡＳ１配列の突然変異を同定してもよい。
【００５０】
実際には、遺伝子型分析についての多数の戦略を用いることが可能である（Ａｎｔｏｎａｒａｋｉｓら、１９８９；Ｃｏｏｐｅｒら、１９９１；Ｇｒｏｍｐｅ、１９９３）。手短に言えば、制限部位の有無について核酸分子をテストできる。塩基置換突然変異により制限酵素の認識部位が作り出され、または消失すると、これにより、突然変異についての単純な直接ＰＣＲテストが可能になる。以下のようにさらなる戦略が挙げられるが、これらに限定されない：直接配列決定、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）分析；適切にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、完全にマッチする配列にのみハイブリダイズする短い合成プローブである対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）を用いたハイブリダイゼーション；対立遺伝子特異的なＰＣＲ；変異原性プライマーを用いたＰＣＲ；リガーゼＰＣＲ、ＨＯＴ切断；変性剤濃度勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ）、温度変性勾配ゲル電気泳動法（ＴＧＧＥ）、一本鎖の立体配座多型（ＳＳＣＰ）および変性高性能液体クロマトグラフィー（Ｋｕｋｌｉｎら、１９９７）。直接配列決定は任意の方法により達成でき、そのような方法としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法を用いた化学的配列決定；Ｓａｎｇｅｒ法を用いた酵素的配列決定による；質量分析配列決定；チップベースの技術を用いた配列決定、および、リアルタイム定量ＰＣＲ。好ましくは、対象由来のＤＮＡは、まず、特異的な増幅プライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅に供する。しかし、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、Ｉｎｖａｄｅｒ（商標）アッセイ、またはオリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）など、ＰＣＲとは独立にＤＮＡを試験することが可能ないくつかの他の方法を用いることが可能である。ＯＬＡは、塩基置換突然変異を明らかにするために使用してもよい。この方法によれば、突然変異の位置に置かれる接合箇所を有する、標的核酸中の隣接する配列とハイブリダイズする２つのオリゴヌクレオチドが構成される。ＤＮＡリガーゼは、２つのオリゴヌクレオチドを、それらが完全にハイブリダイズされる場合にのみ共有結合的に連結させることになる。
【００５１】
したがって、本発明による有用な核酸分子、とりわけオリゴヌクレオチドのプローブまたはプライマーとしては、突然変異が位置する領域と特異的にハイブリダイズするものが挙げられる。
【００５２】
オリゴヌクレオチドのプローブまたはプライマーは、少なくとも１０、１５、２０または３０ヌクレオチドを含有できる。その長さは、４００、３００、２００または１００ヌクレオチドより短くてもよい。
【００５３】
第２の実施形態によれば、ＴＢＸＡＳ１遺伝子の前記突然変異は、タンパク質レベルで検出できる。
【００５４】
したがって、本発明によるＴＸＡＳの突然変異は、好ましくは、結果としてＴＸＡＳのＬｅｕ４８８Ｐｒｏ突然変異体、Ｌｅｕ８３Ｐｒｏ突然変異体、Ｇｌｙ４８２Ｔｒｐ突然変異体およびＡｒｇ４１３Ｇｌｕ突然変異体になる突然変異からなる群から選択される。
【００５５】
前記突然変異は、当技術分野で公知の適切な任意の方法により検出できる。とりわけ、対象から採取した組織生検などの試料を、ＴＸＡＳの突然変異型に特異的な抗体、すなわち、ＴＢＸＡＳ１の突然変異型と野生型のタンパク質（または他の任意のタンパク質）との間を識別して、抗体により特定されたＴＢＸＡＳ１の有無を定量することが可能な抗体と接触させることができる。
【００５６】
突然変異型ＴＸＡＳを特異的に認識する抗体も、本発明の一部となる。こうした抗体は、突然変異型ＴＸＡＳに特異的であり、すなわち、野生型ＴＸＡＳと交差反応しない。
【００５７】
本発明の抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でも、単鎖または二本鎖のキメラ抗体、ヒト化抗体、または免疫グロブリン分子の一部（抗原結合断片Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ｖ）として当技術分野で公知の当該部分など）であってもよい。こうした抗体は、例えば、毒素または標識化抗体と共に免疫複合体化することもできる。
【００５８】
ポリクローナル抗体を使用してもよいが、長期的に見て再現性がより高いことから、モノクローナル抗体が好ましい。
【００５９】
「ポリクローナル抗体」を産生させる手順も周知である。ポリクローナル抗体は、適切な抗原に対して免疫化された動物の血清から入手でき、遺伝子工学により、例えば、当業者に周知の標準的な方法に従って作製できる。典型的には、そのような抗体は、まず出血させて免疫前の血清を採取しておいたニュージーランドシロウサギに突然変異型ＴＸＡＳを皮下投与することにより産生できる。抗原は、６つの異なる部位において、１部位当たり総量１００μｌで注射できる。各注射材料は、アジュバンドを含有してもよく、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、タンパク質またはポリペプチドを含有する微粉化されたアクリルアミドゲルを含有してもしなくてもよい。次に、１回目の注射後、ウサギを２週間出血させ、同じ抗原を用いて６週間毎に３回、定期的に追加免疫を行った。次に、各追加免疫の１０日後に血清試料を採取した。次に、抗体を捕捉するための対応する抗原を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより血清からポリクローナル抗体を回復させた。ポリクローナル抗体を産生するためのさまざまな手順がＨａｒｌｏｗら（１９８８）により開示されており、これらの文献は、参考文献の形で本明細書に組み込まれる。
【００６０】
多様な文法形態での「モノクローナル抗体」は、特定のエピトープと免疫反応することが可能な、１つの種のみの抗体結合部位を含有する抗体分子の集団を指す。したがって、モノクローナル抗体は、典型的には、この抗体が免疫反応する任意のエピトープに対する単一の結合の親和性を示す。したがって、モノクローナル抗体は、異なるエピトープに対してそれぞれが免疫特異的である複数の抗体結合部位を有する抗体分子（例えば二重特異性モノクローナル抗体）を有することがある。歴史的には、モノクローナル抗体はクローン的に純粋な免疫グロブリン分泌細胞株の不死化により産生されたが、本発明の方法によりモノクローナル的に純粋な抗体分子集団を調製することもできる。
【００６１】
モノクローナル抗体を調製するための実験室法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｈａｒｌｏｗら、１９８８を参照）。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、精製した突然変異型ＴＸＡＳを、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ヒトなどの哺乳動物の体内で免疫化することにより調製してもよい。免疫化された哺乳動物体内の抗体産生細胞は、単離され、骨髄腫細胞またはヘテロ骨髄腫細胞と融合されてハイブリッド細胞（ハイブリドーマ）が産生される。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、所望のモノクローナル抗体源として利用される。ハイブリドーマ培養のこの標準的な方法については、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）中に記載がある。
【００６２】
ｍＡｂは、ハイブリドーマ培養により産生できるが、本発明は、そのように限定されるものではない。同様に企図するのは、本発明のハイブリドーマからクローニングされた核酸を発現させることにより産生されたｍＡｂの使用である。すなわち、本発明のハイブリドーマにより分泌される分子を発現する核酸を別の細胞株中に移して形質転換体を産生させることができる。形質転換体は、遺伝子型で元のハイブリドーマと区別されるが、ハイブリドーマにより分泌されるものに相当する、抗体分子全体の免疫活性断片など、本発明の抗体分子を産生することも可能である。例えば、Ｒｅａｄｉｎｇに付与された米国特許第４，６４２，３３４号；ＰＣＴ公開第  号；Ｗｉｎｔｅｒらに付与された欧州特許公開第０２３９４００号およびＣａｂｉｌｌｙらに付与された同第０１２５０２３号を参照。
【００６３】
例えば、ファージディスプレイ技術を用いてナイーブライブラリー（非免疫化動物に由来）を調べるなど、免疫化を含まない抗体産生法も企図される；Ｂａｒｂａｓら（１９９２）およびＷａｔｅｒｈｏｕｓｅら（１９９３）を参照。
【００６４】
突然変異型ＴＸＡＳに対して産生された抗体は、野生型ＴＸＡＳと交差反応できる。したがって、突然変異型ＴＸＡＳに特異的な抗体を選択することが必要である。このことは、野生型ＴＸＡＳと反応性のものから抗体のプールを枯渇させること、例えば、産生した抗体を、野生型ＴＸＡＳに対するアフィニティークロマトグラフィーにかけることにより達成してもよい。
【００６５】
あるいは、本発明の目的のために、抗体以外の結合剤を使用してもよい。こうした結合剤は、例えば、分子認識に関する抗体の代替物を代表する分子の種類であるアプタマーであってもよい。アプタマーは、高い親和性および特異性を有する任意の種類の標的分子を実質的に認識する能力をもつオリゴヌクレオチド配列またはオリゴペプチド配列である。そのようなリガンドは、Ｔｕｅｒｋ  Ｃ．およびＧｏｌｄ  Ｌ．、１９９０に記載のような、ランダム配列ライブラリーのＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（ＳＥＬＥＸ）により単離してもよい。ランダム配列ライブラリーは、ＤＮＡのコンビナトリアル化学合成により得られる。このライブラリーにおいては、各構成要素は、最終的に化学的に修飾された、独自の配列の直鎖オリゴマーである。この種類の分子の、可能性のある修飾、使用および利点については、Ｊａｙａｓｅｎａ  Ｓ．Ｄ．、１９９９に概説されている。ペプチドアプタマーは、２つのハイブリッド法によりコンビナトリアルライブラリーから選択される大腸菌チオレドキシンＡなどのプラットフォームタンパク質により示される、立体配座的に束縛された抗体可変領域からなる（Ｃｏｌａｓら、１９９６）。
【００６６】
本発明のプローブ、プライマー、アプタマーまたは抗体は、蛍光分子、放射性分子または当技術分野で公知の任意の他の標識など、検出可能な分子または物質で標識できる。シグナルを一般にもたらす（直接的または間接的いずれかで）標識は、当技術分野で公知である。
【００６７】
用語「標識された」は、本発明のプローブ、プライマー、アプタマーまたは抗体に関する場合、本発明のプローブ、プライマー、アプタマーまたは抗体を、検出可能な物質を本発明のプローブ、プライマー、アプタマーまたは抗体と対合させること（すなわち、物理的に連結させること）により直接標識化すること、ならびに、直接標識されている別の試薬との反応性により本発明のプローブ、プライマー、アプタマーまたは抗体を間接的に標識することを包含することを意図している。検出可能な物質のその他の例としては、放射性薬剤またはフルオロフォア（例えば、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）またはフィコエリトリン（ＰＥ）またはインドシアニン（Ｃｙ５））が挙げられるが、これらに限定されない。間接標識化の例としては、蛍光標識されたストレプトアビジンで検出できるように蛍光標識された二次抗体を用いた一次抗体の検出、およびビオチンでのＤＮＡプローブの末端標識化が挙げられる。本発明の抗体またはアプタマーは、当技術分野で公知の任意の方法により、放射性分子で標識できる。例えば、放射性分子としては、ｌ１２３、ｌ１２４、ｌｎ１１１、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８などのシンチグラフ試験用の放射性原子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
本発明のキット
本発明の別の態様によれば、ＴＢＸＡＳ１突然変異は、対象のＤＮＡを核酸プローブ（標識されていてもよい）と接触させることにより検出される。
【００６９】
プライマーは、所望の突然変異位置を有するＴＢＸＡＳ１遺伝子の一部を増幅または配列決定するためにも有用な場合がある。
【００７０】
そのようなプローブまたはプライマーは、所望の突然変異位置を有するＴＢＸＡＳ１遺伝子配列の一部と特異的にハイブリダイズする能力のある核酸である。つまり、それらは、高ストリンジェンシー条件下で関係する、部分的に突然変異したＴＢＸＡＳ１核酸配列とハイブリダイズする配列であるということである。
【００７１】
本発明は、ＴＢＸＡＳ１遺伝子の突然変異の少なくとも１つを決定するのに適したキットをさらに提供する。
【００７２】
このキットには、以下の構成要素が含まれていてもよい：
（ｉ）プローブ：通常はＤＮＡからなり、予め標識されていてもよい。あるいは、このプローブは標識されていなくてもよく、別々の容器に入った形で標識用の原料がキット内に含まれていてもよい；および
（ｉｉ）ハイブリダイゼーション試薬：キットには、固相マトリックスなど特定のハイブリダイゼーションプロトコールに必要な、適切に包装された他の試薬および材料（該当する場合）ならびに標準品が入っていてもよい。
【００７３】
別の実施形態では、キットには以下が含まれていてもよい：
（ｉ）配列決定または増幅用のプライマー：配列決定用プライマーは予め標識されていてもよく、または、親和性精製部分もしくは付着部分を有していてもよい；および
（ｉｉ）配列決定または増幅用の試薬：キットには、特定の配列決定増幅プロトコールに必要な、適切に包装された他の試薬および材料が入っていてもよい。好ましい一実施形態では、キットは、配列決定または増幅プライマーのパネル（その配列は、多型位置の少なくとも１つに隣接する配列に対応する）、ならびに、各多型配列の存在を検出するための手段を備える。
【００７４】
特定の一実施形態では、本発明において同定される突然変異の少なくとも１つ、特に、１４６３位、２４８位、１４４４位および１２３８位を含むＴＢＸＡＳ１遺伝子の全てまたは一部の増幅に特異的なヌクレオチドプライマー対を備えるキットが提供される。
【００７５】
あるいは、本発明のキットは、本発明の突然変異ポリペプチドを検出する能力のある標識化された化合物または薬剤（例えば、該ポリペプチドと結合する前述のような抗体またはアプタマー）を備えてもよい。例えば、キットは以下を備えてもよい：（１）本発明の突然変異を含むポリペプチドに結合する第１の抗体（例えば、固体の支持体に付着している）；および、場合により、（２）該ポリペプチドまたは第１の抗体のいずれかに結合し、検出可能な薬剤にコンジュゲートする、異なる第２の抗体。
【００７６】
このキットは、例えば、緩衝化剤、保存剤またはタンパク質安定化剤も備えることができる。このキットは、検出可能な薬剤の検出に必要な構成要素（例えば、酵素または基質）も備えることができる。このキットには、アッセイし、入っているテスト試料と比較できる対照試料または一連の対照試料が入っていてもよい。キットの各構成要素は、個別の容器内に通常は封入されており、多様な容器は全て、テストされる対象が骨塩密度関連の疾患に罹患しているか、またはこの疾患を発症するリスクを有するかを観察するための取扱説明書と共に、単一のパッケージ内に入っている。
【００７７】
本発明の治療法：
さらなる目的では、本発明は、骨塩密度関連の疾患を治療または予防するための使用、方法および医薬組成物に関する。
【００７８】
特定の一実施形態では、骨塩密度関連の疾患は、骨塩密度の増加を伴う。そのような疾患の例としては、ゴサール血液骨幹異形成症候群（ＧＨＤＤ）が挙げられるが、これに限定されない。
【００７９】
したがって、本発明は、さらに、骨塩密度の増加を伴う疾患を治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に、ＴＢＸＡＳ１ポリヌクレオチド、すなわち、野生型ＴＸＡＳをコードする核酸配列を投与して、ＴＸＡＳが、前記ポリヌクレオチドを形質移入されている対象の細胞によりｉｎ  ｖｉｖｏで発現されるようにするステップを含む方法に関する。したがって、前記方法は、欠陥のある突然変異型ＴＸＡＳの発現を補う野生型ＴＸＡＳの過剰発現をもたらす。投与されるポリヌクレオチドは、１４６３Ｔ＞Ｃ、２４８Ｔ＞Ｃ、１４４４Ｇ＞Ｔおよび１２３８Ｇ＞Ａからなる群において選択される突然変異を有さない。
【００８０】
本発明は、さらに、骨塩密度の増加を伴う疾患の治療を意図した医薬の製造のためのＴＢＸＡＳ１ポリヌクレオチドの使用にも関する。好ましくは、前記ＴＢＸＡＳ１ポリヌクレオチドは、治療上有効量で投与される。
【００８１】
好ましくは、本発明によるＴＢＸＡＳ１ポリヌクレオチド配列は、プロモーター配列など、その発現の調節を可能にする要素を伴う。
【００８２】
そのような核酸は、ベクターの形態をしていてもよい。本明細書中で使用する場合、用語「ベクター」は、自身が連結している別の核酸を輸送する能力のある核酸分子を指す。ベクターの一種が「プラスミド」であり、これは、中に追加的なＤＮＡ区域を連結できる環状の二本鎖ＤＮＡループを指す。別の種類のベクターはウイルスベクターであり、この場合、ウイルスゲノム中に追加的なＤＮＡ区域を連結できる。ある種のベクターは、導入された宿主細胞中で自律複製する能力がある（例えば、細菌由来の複製を有する細菌ベクターおよび哺乳動物のエピソームベクター）。他のベクター（例えば、哺乳動物の非エピソームベクター）は、宿主細胞中に導入されると宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それにより、宿主のゲノムと共に複製される。さらに、ある種のベクター（発現ベクター）は、自身が操作可能に連結している遺伝子の発現を誘導する能力を有する。一般に、組換えＤＮＡ法において利用できる発現ベクターは、プラスミド（ベクター）の形態をしていることが多い。しかし、本発明は、ウイルスベクター（例えば、複製能のないレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）など、同等の機能を果たす他の形態の発現ベクターを包含することを意図している。
【００８３】
ＴＢＸＡＳ１ポリヌクレオチドは、ｅｘ  ｖｉｖｏ（培養細胞上、または、動物もしくは患者から取り出した細胞上で）またはｉｎ  ｖｉｖｏで核酸を細胞核へ送達するための公知の任意の手順により、標的細胞中に導入できる。
【００８４】
ｅｘ  ｖｉｖｏでの導入は、当業者に周知の標準的な任意の方法、例えば、形質移入、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿により、または遺伝子銃の使用により、実施できる。
【００８５】
ＴＢＸＡＳ１ポリヌクレオチドは、リポフェクションによりｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで導入することもできる。特定の実施形態では、リポソームおよび／またはナノ粒子の使用は、ドナーの核酸の標的系を宿主細胞中に導入することを企図したものである。
【００８６】
ナノカプセルは、一般に、安定で再現可能な様式で化合物を封入できる。細胞内のポリマーの過負荷による副作用を回避するために、そのような超微粒子（０．１μｍ前後のサイズ）は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの分解が可能なポリマーを使用して設計すべきである。本発明における使用には、こうした要件を満たす生分解性のポリアルキルシアノアクリレートナノ粒子が企図され、そのような粒子は容易に作製できる。
【００８７】
リポソームは、水性媒体中に分散されると自然に多層同心二重層ベシクル（多層ベシクル（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を形成するリン脂質から形成される。ＭＬＶの直径は、一般に、２５ｎｍ〜４μｍである。ＭＬＶを超音波処理する結果、直径が２００〜５００Åの範囲の、コア中に水溶液を含有する小型単層ベシクル（ＳＵＶ）が形成される。
【００８８】
リポソームが媒介する形質移入に伴って遭遇する困難および危険を制限するために設計される合成の陽イオン脂質を使用して、マーカーをコードする遺伝子のｉｎ  ｖｉｖｏでの形質移入用リポソームを調製できる。陽イオン脂質を使用すると、負に帯電した核酸の封入を促進でき、負に帯電した細胞膜との融合も促進できる（Ｆｅｌｇｎｅｒら、１９８９）。
【００８９】
あるいは、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞膜を通過してＴＢＸＡＳ１ポリヌクレオチドを送達するための最も単純で最も安全な様式の１つには、高濃度の遊離した、またはむき出しのポリヌクレオチド（典型的にはｍＲＮＡまたはＤＮＡ）の直接施用が含まれることがある。「むき出しのＤＮＡ（またはＲＮＡ）」とは、他の化学部分と予め複合体化されていないＤＮＡ（ＲＮＡ）分子の意味である。動物細胞によるむき出しのＤＮＡの取込みは、賦形剤および核酸を細胞に同時投与することにより増加させることができる。そのような賦形剤は、細胞膜を通過したＤＮＡの透過、ひいては治療剤の細胞への送達を強化または増加させる試薬である。当技術分野では、界面活性物質、例えば、以下からなる群から選択される界面活性物質など、多様な賦形剤についての記載がある：Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ドデシル硫酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ２０およびＴｗｅｅｎ  ８０；細菌毒素、例えばストレプトリジンＯ、コレラ毒素、および、組換え改変された大腸菌不安定毒素；ならびに、例えば、グルコース、ショ糖、フルクトースまたはマルトースなど、細胞膜付近における浸透圧を乱すことにより作用する多糖類。細胞外ヌクレアーゼおよび細胞内ヌクレアーゼ両方による内側または外側からの核酸分解切断を介してポリヌクレオチド不活性化を遮断するなど、遊離ポリヌクレオチドの送達を強化する他の方法についての記載がある。
【００９０】
あるいは、本発明は、さらに、骨塩密度の増加を伴う疾患を治療または予防する方法であって、それを必要とする対象に野生型ＴＸＡＳを投与するステップを含む方法を提供する。
【００９１】
投与されるＴＸＡＳポリペプチドは、野生型ＴＸＡＳの変異体であってもよいが、プロスタグランジン（ＰＧ）Ｈ２をトロンボキサンＡ２（ＴＸＡ２）に変換させる活性を保持することが条件である。したがって、このポリペプチドは、結果としてＴＸＡＳのＬｅｕ４８８Ｐｒｏ突然変異体、Ｌｅｕ８３Ｐｒｏ突然変異体、Ｇｌｙ４８２Ｔｒｐ突然変異体およびＡｒｇ４１３Ｇｌｕ突然変異体になる突然変異からなる群から選択される突然変異を含まない。
【００９２】
所望の配列のアミノ酸配列がわかれば、当業者であれば、ポリペプチド作製の標準的な手法により前記ポリペプチドを容易に作製できる。例えば、ポリペプチドは、周知の固相法を用いて、好ましくは市販のペプチド合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ製のものなど）を用いて、製造者の取扱説明書に従って合成できる。
【００９３】
あるいは、本発明のポリペプチドは、現在当技術分野で周知のもののような組換えＤＮＡ法により合成できる。例えば、所望の（ポリ）ペプチドをコードするＤＮＡ配列を発現ベクター中に組み込み、所望のポリペプチドを発現すると思われる適当な真核宿主または原核宿主中にそのようなベクターを導入した後でＤＮＡ発現産物としてこの断片を得ることができ、その後、周知の手法を用いてそうした断片を宿主から単離できる。
【００９４】
本発明のポリペプチドは、単離された（例えば精製された）形態で使用するか、または、膜ベシクルまたは脂質ベシクル（例えばリポソーム）などのベクター中に入っていてもよい。
【００９５】
あるいは、本発明は、さらに、骨塩密度の増加を伴う疾患を治療または予防する方法であって、それを必要とする対象にトロンボキサンＡ２またはその類似体を投与するステップを含む方法を提供する。トロンボキサンＡ２は、以下のような二環式のオキサンオキセタン構造を有する：
【００９６】
【化１】
0005512534.tif 000002
【００９７】
トロンボキサンＡ２の類似体は、例えば、Ｕ４６６１９（９，１１−ジデオキシ−９α，１１α−メタノエポキシＰＧＦ２α；９，１１−ジデオキシ−９α，１１α−メタノエポキシプロスタグランジンＦ２α、（ＣＡＳ５６９８５−４０−１））であってもよく、その構造は以下の通りである：
【００９８】
【化２】
0005512534.tif 000003
【００９９】
本発明は、さらに、骨塩密度の減少を伴う疾患を治療または予防する方法を提供する。そのような疾患の例としては、骨粗鬆症、アテローム性硬化症に伴う骨粗鬆症、偽性神経膠腫に伴う骨粗鬆症、骨粗鬆症および眼皮膚の低色素沈着症候群、内分泌機能障害による骨粗鬆症、骨形成不全症、骨転移および初期の骨癌、骨肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１００】
特定の実施形態では、本発明は、骨塩密度の減少を伴う疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、ＴＢＸＡＳ１遺伝子発現の発現阻害薬を投与するステップを含む方法に関する。
【０１０１】
本発明において使用するためのＴＢＸＡＳ１遺伝子発現阻害薬は、アンチセンスオリゴヌクレオチドのコンストラクトに基づくものであってもよい。アンチセンスオリゴヌクレオチド（アンチセンスＲＮＡ分子およびアンチセンスＤＮＡ分子など）は、ＴＢＸＡＳ１のｍＲＮＡの翻訳を、ｍＲＮＡに結合することによりタンパク質翻訳を妨げ、もしくはｍＲＮＡの分解を増加させ、それにより細胞中でのＴＸＡＳのレベル、ひいては活性を低下させることにより直接遮断するように作用すると考えられる。例えば、従来のリン酸ジエステル法により、および、例えば、静脈内注射または注入により投与することにより、例えば、少なくとも約１５塩基でありＴＸＡＳをコードするｍＲＮＡ転写物配列の独特の領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成できる。その配列が公知である遺伝子の遺伝子発現を特異的に阻害するためのアンチセンス法を用いる方法は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第６，５６６，１３５号、同第６，５６６，１３１号、同第６，３６５，３５４号、同第６，４１０，３２３号、同第６，１０７，０９１号、同第６，０４６，３２１号および同第５，９８１，７３２号を参照）。
【０１０２】
阻害性低分子ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）も、本発明において使用するためのＴＢＸＡＳ１遺伝子発現阻害薬として機能させることができる。ＴＢＸＡＳ１遺伝子発現は、ＴＢＸＡＳ１遺伝子発現が特異的に阻害（すなわち、ＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉ）されるように、対象または細胞を小分子の二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）と、または、小分子の二本鎖ＲＮＡを産生させるベクターもしくはコンストラクトと接触させることにより、減らすことができる。適切なｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡをコードするベクターを選択する方法は、その配列が公知である遺伝子については当技術分野で周知である（例えば、Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．ら（１９９９）；Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．ら（２００１）；Ｈａｎｎｏｎ，ＧＪ．（２００２）；ＭｃＭａｎｕｓ，ＭＴ．ら（２００２）；Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ，ＴＲ．ら（２００２）；米国特許第６，５７３，０９９号および同第６，５０６，５５９号；ならびに国際特許公開第ＷＯ０１／３６６４６号、同第ＷＯ９９／３２６１９号および同第ＷＯ０１／６８８３６号を参照）。
【０１０３】
リボザイムも、本発明において使用するためのＴＢＸＡＳ１遺伝子発現阻害薬として機能させることができる。リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒する能力のある酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイム作用の機序には、相補的な標的ＲＮＡとのリボザイム分子の配列特異的なハイブリダイゼーション、次いでエンドヌクレアーゼ分解切断が関与している。それにより、ＴＢＸＡＳ１のｍＲＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ分解切断を特異的および効率的に触媒する、操作されたヘアピンモチーフまたはハンマーヘッドモチーフのリボザイム分子は、本発明の範囲内で有用である。以下の配列：ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣを典型的に含むリボザイム切断部位について標的分子を走査することにより、可能性のある任意のＲＮＡ標的内の特異的なリボザイム切断部位をまず同定する。一旦同定したら、切断部位を有する標的遺伝子の領域に相当する約１５〜２０リボヌクレオチドの間の短鎖ＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチド配列を不適当なものにする可能性のある予測される構造上の特徴（二次構造など）について評価できる。候補標的の適合性は、例えばリボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて、相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションのしやすさをテストすることにより評価することもできる。
【０１０４】
ＴＢＸＡＳ１遺伝子発現阻害薬として有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムは両方とも、公知の方法により調製できる。こうした方法としては、例えば、固相ホスホラマダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍａｄｉｔｅ）化学合成によるなど、化学合成のための手法が挙げられる。あるいは、アンチセンスＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの転写により産生できる。そのようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなど適当なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込む多種多様なベクター中に組み込むことができる。本発明のオリゴヌクレオチドへの多様な修飾は、細胞内の安定性を高め半減期を伸ばす手段として導入できる。可能性のある修飾としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列の、当該分子の５’末端および／または３’末端への付加、または、オリゴヌクレオチドの骨格内でのホスホジエステラーゼ連結ではなくホスホロチオエートもしくは２’−Ｏ−メチルの使用。
【０１０５】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡおよびリボザイムは、単独で、またはベクターと結合した形で、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達させることができる。最も広い意味では、「ベクター」は、アンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡまたはリボザイム核酸の、細胞への、好ましくはＴＢＸＡＳ１遺伝子を発現する細胞への移動を容易にする能力のある任意の媒体である。好ましくは、ベクターは、ベクターがなければ結果としてもたらされると考えられる分解の程度と比較して低い分解度で、核酸を細胞へ輸送する。一般に、本発明において有用なベクターとしては以下が挙げられるが、これらに限定されない：プラスミド、ファージミド、ウイルス、アンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡまたはリボザイム核酸配列の挿入または組込みにより操作されているウイルス源または細菌源に由来する他の媒体。ウイルスベクターは好ましい種類のベクターであり、こうしたベクターとしては以下のウイルスに由来する核酸配列が挙げられるが、これらに限定されない：レトロウイルス（モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳癌ウイルスおよびラウス（ｒｏｕｓｅ）肉腫ウイルスなど）；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０タイプウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン・バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；およびＲＮＡウイルス（レトロウイルスなど）。名前が挙がっていなくても当技術分野にとって公知の他のベクターを容易に採用できる。
【０１０６】
好ましいウイルスベクターは、必須でない遺伝子を所望の遺伝子で置き換えてある真核生物の非細胞変性ウイルスが基になっている。非細胞変性ウイルスとしてはレトロウイルス（例えばレンチウイルス）が挙げられるが、その生活環には、ウイルスのゲノムのＲＮＡからＤＮＡへの逆転写、次いで宿主細胞のＤＮＡ中へのプロウイルスの組込みが含まれる。レトロウイルスは、ヒト遺伝子療法の試みとして認可されている。最も有用なのは、複製欠損（すなわち、所望のタンパク質の合成を誘導する能力はあるが、感染性の粒子を作る能力はない）しているようなレトロウイルスである。そうした遺伝的に変質したレトロウイルス発現ベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝子を高効率に形質導入することに一般に利用される。複製欠損レトロウイルスを作製するための標準的なプロトコール（外因性の遺伝物質をプラスミド中に組み込むステップ、パッケージング細胞株にプラスミドを形質移入するステップ、パッケージング細胞株により組換えレトロウイルスを作製するステップ、組織培養培地からウイルス粒子を回収するステップおよび標的細胞をウイルス粒子に感染させるステップを含む）は、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、１９９０およびＭｕｒｒｙ、１９９１中に記載がある。
【０１０７】
一定の用途にとって好ましいウイルスは、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスであり、遺伝子療法におけるヒトへの使用がすでに認可されている二本鎖のＤＮＡウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、複製欠損であるように操作することができ、広範な細胞の型および種に感染する能力がある。このウイルスは、熱安定性および脂質溶媒安定性；造血細胞など多様な系統の細胞における高い形質導入頻度；ならびに、重複感染が阻害されないことから複数組の形質導入が可能になるなど、さらに利点を有する。報告によれば、アデノ随伴ウイルスは、部位特異的な様式でヒト細胞のＤＮＡ中に組み込むことにより、挿入変異の可能性、およびレトロウイルス感染の特徴を示す挿入遺伝子の発現のばらつきを最小限にできる。加えて、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、選択圧がない状態では組織培養物中で１００継代超にわたり続いており、このことから、アデノ随伴ウイルスのゲノムの組込みは比較的安定な事象であることが示唆される。アデノ随伴ウイルスは、染色体外の様式でも機能できる。
【０１０８】
他のベクターとしては、プラスミドベクターが挙げられる。プラスミドベクターは、当技術分野で広範に記載されており、当業者に周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照。ここ数年では、プラスミドベクターは、抗原をコードする遺伝子をｉｎ  ｖｉｖｏで細胞に送達するためのＤＮＡワクチンとして使用されている。プラスミドベクターは、これにとってとりわけ有利であるが、その理由は、このベクターはウイルスベクターの多くほど安全上の懸念をもたないからである。しかし、宿主細胞と適合するプロモーターを有するこうしたプラスミドは、プラスミド内で操作的にコードされた遺伝子からペプチドを発現することができる。一般に使用されるいくつかのプラスミドとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣＩ９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０およびｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔが挙げられる。他のプラスミドは、当業者には周知である。加えて、プラスミドは、制限酵素および連結反応を用いて特別設計して、特異的なＤＮＡ断片を除去および付加することができる。プラスミドは、さまざまな非経口経路、粘膜経路および局所経路により送達できる。例えば、ＤＮＡプラスミドは、筋肉内、皮内、皮下または他の経路により注射できる。ＤＮＡプラスミドは、鼻腔内用の噴霧剤または点鼻薬、直腸用の坐薬により、および経口的に投与してもよい。ＤＮＡプラスミドは、遺伝子銃を用いて表皮または粘膜表面中に投与してもよい。プラスミドは、水溶液の形で、金粒子上に乾燥させて、または別のＤＮＡ送達系（リポソーム、デンドリマー、コクリエート（ｃｏｃｈｌｅａｔｅ）およびマイクロカプセル化を非限定的に含む）に連結させて、投与してもよい。
【０１０９】
あるいは、本発明は、さらに、骨塩密度の減少を伴う疾患を治療または予防する方法であって、それを必要とする対象にトロンボキサン阻害薬を投与するステップを含む方法を提供する。
【０１１０】
本発明における使用のために企図されるトロンボキサン阻害薬としては、例えば以下が挙げられる：２−（アセチルオキシ）−安息香酸、ＡＡ２４１４（セラトロダスト、（４−ヒドロキシ−（Ｚ）−（２，４，５−トリメチル−３，６−ジオキソ−１，４−シクロヘキサジエン−１−イル）ベンゼンヘプタン酸）、ＡＨ２，８４８（（１［α］（Ｚ），２［β］，５［α］）−（＋−）−７−（５−（（（１，１’−ビフェニル）−４−イル）メトキシ）−２−（４−モルホリニル）−３−オキソシクロペンチル）−４−ヘプテン酸）、ＢＡＹ  ｕ３４０５（ラマトロバン、３Ｒ−（（４−フルオロフェニル）スルホニル）アミノ）−１，２，３，４−テトラヒドロ−９Ｈ−カルバゾール−９−プロパン酸）、ＢＭ１３１７７（スロトロバン、（（４−（２−（（フェニルスルホニル）アミノ）エチル）フェノキシ）−酢酸）、ＢＭ１３５０５（ダルトロバン、（４−（２−（（（４−クロロフェニル）スルホニル）アミノ）エチル）−ベンゼン酢酸）、ＢＭＳ１８０２９１（イフェトロバン、（（＋）−１Ｓ−（１［α］，２［α］，３［α］，４［α］）−２−（（３−（４−（ｎ−ペンチルアミノ）カルボニル）−２−オキサゾリル）−７−オキサビシクロ）（２．２．１）ヘプタ−２−イル）メチル）ベンゼンプロポン酸（ｐｒｏｐｏｎｉｃ  ａｃｉｄ））、シナモルヒリン（ｃｉｎｎａｍｏｒｐｈｉｌｉｎ）（（８Ｒ，８’Ｓ）−４，４’−ジヒドロキシ−３，３’−ジメトキシ−７−オキソ−８，８’−ネオリグナン）、ＣＧＳ１２９７０（３−メチル−２−（３−ピリジル）インドール−１−オクタン酸）、ＣＧＳ１５４３５、ＣＧＳ２２６５２（４−（（（４−クロロフェニル）スルホニル）アミノ）ブチル）−３−ピリジンヘプタン酸）、ＣＶ４１５１（（Ｅ）−７−フェニル−７−（３−ピリジニル）−６−ヘプテン酸）、ダゾキシベン（４−（２−（１Ｈ−イミダゾ−ル−１−イル）エトキシ）安息香酸）、ダズメグレル、ＤＴ−ＴＸ３０（（Ｅ）−６−（４−２−（４−クロロベンゼンスルホニルアミノ）エチル）フェニル）−６−（３−ピリジル）ヘキサ−５−エノン酸）、エトフィブレート（２−（２−（４−クロロフェノキシ）−２−メチル−１−オキソプロポキシ）−３−ピリジンカルボン酸エチルエステル）、ＥＰ０４５（（１［α］，２［β］（Ｚ），３［α］，４［α］）−７−（３−（（（（フェニルアミノ）カルボニル）ヒドラゾノ）メチル）ビシクロ（２．２．１）ヘプタ−２−イル）、ＥＰ０９２（７−（（１Ｓ，２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３−（１−（３−（フェニルチオウレイドイミノ）エチル）ビシクロ（２．２．１）ヘプタン−２−イル）−５−ヘプテン酸）、Ｆ１０１７１（１−（（（５−（４−クロロフェニル）−２−フラニル）メチレン）アミノ）−３−（４−（１−ピペラジニル）ブチル）−２，４−イミダゾリジンジオン）、ＦＣＥ２７２６２（（Ｅ）−（＋−）−５−（（（１−シクロヘキシル−２−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）−３−フェニルプロピリデン）アミノ）オキシペンタン酸）、Ｆｌ２８４５（カモングレル（ｃａｍｏｎｇｒｅｌ）、２，３−ジヒドロ−５−（２−（１Ｈ−イミダゾ−ル−１−イル）エトキシ）インデン−１−カルボン酸）、ＦＫ０７���（（５Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｒ）−４−（（４−クロロフェニル）スルホニル）アミノ）−１−（３−ピリジニルメチル）−２−ピロリジニル）−５−ヘキセン酸一水和物）、フレグレレート、ＧＲ３２１９１（バピプロスト、（１Ｒ−（１［α］（Ｚ），２［β］，３［β］，５［α］））−（＋）−７−（５−（（１，１’−ビフェニル）−４−イルメトキシ）−３−ヒドロキシ−２−（１−ピペリジニル）シクロペンチル）−４−＋＋＋＋ヘプトン酸（ｈｅｐｔｏｎｏｉｃ  ａｃｉｄ））、ＧＲ８３７８３（（＋−）−（１［α］（Ｚ），２［β］，５［β］）−６−（（２−（ヘキサヒドロ−１Ｈ−アゼピン−１イル）−５−（（４−（４−プロピル−３−ピリジニル）フェニル）メトキシ）シクロペンチル）オキシ）−４−ヘキサン酸）、ＧＲ８５３０５（（５Ｅ）−６−（３−（２−（（４−ヨードフェニル）スルホニル）アミノ）エチル）フェニル）−６−（３−ピリジニル）−５−ヘキセン酸）、ＧＲ１０８７７４（（５Ｅ）−６−（３−（２−（（４−ヨードフェニル）スルホニル）アムニノ（ａｍｎｉｎｏ））−１，１−ジメチルエチル）フェニル）−６−（３−ピリジニル）−５−ヘキセン酸）、ＩＢＩ  Ｐ−０５００６（２−（６−カルボキシヘキシル）−３−ｎ−ヘキシルシクロヘキシルアミン）、イスボグレル（（Ｅ）−７−フェニル−７−（３−ピリジニル）−６−ヘプテン酸）、ＩＣＩ１８００８０（５（Ｚ）−７−（２，２−ジメチル−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−シス−５−イル）ヘプテン酸）、ＩＣＩ１９２６０５（（Ｚ）−（２［α］，４［α］５［α］）−６−（２−（２−クロロフェニル）−４−（２−ヒドロキシフェニル）−１，３−ジオキサン−５−イル）−４−ヘキセン酸）、ＫＴ２９６２（３−（４−（（（４−クロロフェニル）スルホニル）アミノ）ブチル）−６−（１−メチルエチル）−１−アズレンスルホン酸一ナトリウム塩）、ＫＹ２３４（（Ｅ）−１１−（２−（５，６−ジメチル−１Ｈ−ベンズイミダゾール−１−イル）−６，１１−ジヒドロ−ジベンズ（ｂ，ｅ）オキセピン−２−カルボン酸ナトリウム塩）、ＫＷ３６３５（ナトリウム（Ｅ）−１１−（２−（５，６−ジメチル−１−ベンズイミダゾリル）エチリデン）−６，１１−ジヒドロジベンズ（ｂ，ｅ）オキセピン−２−カルボキシレート一水和物）、リノトロバン（４−メチルベンゼンスルホネート−Ｎ−（（フェニルメトキシ）カルボニル）−セリンエチルエステル）、Ｌ６４００３５（ジベンゾ（ｂ，ｆ）チエピン−３−メタノール−５，５−ジオキシド）、Ｌ６７０５９６（（−）−６，８−ジフロロ−２，３，４，９−テトラヒドロ−９−（（４−（メチルスルホニル）フェニル）メチル）−１Ｈ−カルバゾール−１−酢酸）、Ｌ６３６４９９（（５，５−ジオキシド−ジベンゾ（ｂ，ｆ）チエピン−３−カルボン酸）、Ｌ６５５２４０（３−メチル−１−（（４−クロロフェニル）メチル）−５−フルオロ−［α］，［α］，−１Ｈ−インドール−２−プロパン酸）、ミダゾグレル、ＯＮ５７９（（４−（（２−（（（４−クロロフェニル）スルホニル）アミノ）エチル）チオ）−２，６−ジフルオロフェノキシ）酢酸）、ＯＮＯ３７０８（（１Ｓ−（１［α］，２���β］（Ｚ），３［α］（Ｓ），５［α］））−７−（３−（（シクロペンチルヒドロキシアセチル）アミノ）−６，６−ジメチルビシクロ（３．１．１ヘプタ−２−イル）−５−ヘプテン酸）、ＯＫＹ０４６（塩酸オザグレル、（Ｅ）−３−（４−（１Ｈ−イミダゾール−１−イルメチル）フェニル）−２−プロペン酸モノヒドロクロリド）、ＯＫＹ１５５５、ＯＫＹ１５８０、ＯＫＹ１５８１、（Ｅ）−２−メチル−３−（４−（３−ピリジニルメチル）フェニル）−２−プロペン酸ナトリウム塩）、Ｓ−１４５（（＋−）−（５Ｚ）−７−（３−エンド（（フェニルスルホニル）アミノ）ビシクロ（２．２．１）ヘプタ−２−エキソ−イル）ヘプテン酸）、ピコタミド（４−メトキシ−Ｎ−Ｎ’−ビス（３−ピリジニルメチル）−１，３−ベンゼンジカルボキサミド一水和物）、Ｒ６８０７０（リドグレル、（Ｅ）−５−（（（３−ピリジニル（３−（トリフルオロメチル）フェニル）メチレン）アミノ）オキシ）−ペンタン酸）、Ｓ−１４５２（ドミトロバン、（１Ｒ）−（１［α］２［α］（Ｚ），３［β］，４［α］））−７−（３−（（フェニルスルホニル）アミノ）ビシクロ（２．２．１）ヘプタ−２−イル）−５−ヘプテン酸）、ＳＫＦ８８０４６（Ｎ７−（３−クロロフェニル）−Ｎ２−（（７−（（（３−クロロフェニル）アミノ）スルホニル）−３，４−ジヒドロ−２（１Ｈ）−イソキノリニル）スルホニル）−３，４−ジヒドロ−２，７（１Ｈ）−イソキノールジスルホンアミド）、ＳＱ２７４２７（（（１Ｓ）−（１［α］，２［α］（Ｚ），３［α］（１Ｅ，３Ｒ），４［α］））−７−（３−（３−シクロヘキシル−３−ヒドロキシ−１−プロペニル）−７−オキサビシクロ（２．２．１）ヘプタ−２−イル）−５−ヘプテン酸）、ＳＱ２８６６８（（１［α］，２［α］（Ｚ），３［α］（１Ｅ，３Ｓ，４Ｒ），４［α］））−７−（３−（３−ヒドロキシ−４−フェニル−１−ペンチル）−７−オキサビシクロ（２．２．１）ヘプタ−２−イル）−５−ヘプテン酸）、ＳＱ２９５４８（（（１Ｓ）−（１［α］，２［β］（５Ｚ），３［β］，４［α］）−７−（３−（（２−（（フェニルアミノ）−カルボニル）ヒドラジノ）メチル）−７−オキサビシクロ（２．２．１）−ヘプタ−２−イル）−５−ヘプテン酸）、ＳＱ３０７４１（（（１Ｓ）−（１［α］，２［α］（Ｚ），３［α］，４［α］））−７−（３−（（（（（１−オキソヘプチル）アミノ）アセチル）アミノ）メチ（ｍｅｔｈｙ））−７−オキサビシクロ（２．２．１）ヘプタ−２−イル）−５−ヘプテン酸）、ＳＱ３３９６１（（１−エキソ，エキソ））−２−（（３−（４−（（（４−シクロヘキシルブチル）アミノ）カルボニル）−２−オキサゾリル）−７−オキサビシクロ（２．２．１）−ヘプタ−２−イル）メチル）ベンゼンプロパン酸）、ＴＥＲ９３０１８０（４−（１−（（（４−クロロフェニル）スルホニル）アミノ）メチル）−４−（３−ピリジニル）ブチル）ベンゼンプロパン酸）、ＵＫ３４７８７、ＵＰ１１６７７（ミピトロバン（［β］，［β］−ジメチル−６−クロロ−３−（（４−クロロフェニル）メチル）−３Ｈ−イミダゾ（４，５−ｂ）ピリジン−２−ブタン酸）、Ｙ２０８１１、ＹＭ１５８（（３−（（��−ｔｅｒｔ−ブチルチアゾール−２−イル）メトキシ）−５’−（３（４−クロロベンゼンスルホニル）プロピル−２’−（１−テトラゾール−５−イルメトキシ）ベンザニリド一ナトリウム塩一水和物）、Ｚ３３５（（＋−）ナトリウム（２−（４−（クロロフェニルスルホニルアミノメチル）インダン−５−イル）アセテート一水和物）、ＺＤ１５４２（４（Ｚ）−６−（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（１メチル−１−（２−ニトロ−４−トリロキシ）エチル）−４−（３−ピリジル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−酸）、ＺＤ９５８３（（４Ｚ）−６−（（２Ｓ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（１−（２−シアノ−４−メチルフェノキシ）−１−メチルエチル）−４−（３−ピリジル）−１，３−ジオキサン−５−イル）ヘキサ−４−エノイクン酸（ｅｎｏｉｃｎ  ａｃｉｄ））。
【０１１１】
前記の化合物は「トロンボキサン阻害薬」と総称されるが、当業者であれば、特定の任意の化合物が、具体的にはトロンボキサンＡ２受容体拮抗薬であるか、トロンボキサン合成酵素阻害薬であるか、または二重作用性のトロンボキサン受容体拮抗薬であるか、およびトロンボキサン合成酵素阻害薬であるかを容易に認識できるであろう。
【０１１２】
二重作用性のトロンボキサン受容体拮抗薬およびトロンボキサン合成酵素阻害薬は、以下からなる群から選択してもよい：テルボグレル、ピコタミド、ならびに、ＥＰ０８１１６２１、ＥＰ０８１６３６１および米国特許第５，９９０，３０８号中で開示されているような化合物など、オキサゾールカルボキサミドで置換された［ω］−フェニル−［ω］−（３−ピリジル）アルケン酸の誘導体。テルボグレルは、式
【０１１３】
【化３】
0005512534.tif 000004
のピリジン誘導体であり、
化学名は、（５Ｅ）−６−［３−［［（シアノアミノ）［（１，１−ジメチルエチル）アミノ］−メチレン］アミノ］フェニル］−６−（３−ピリジニル）−５−ヘキセン酸であり、例えばＥＰ５４７５１７中に記載がある。
【０１１４】
別の適当なトロンボキサン合成酵素阻害薬は、ＴＸＡＳの選択的な阻害薬として作用する１−アルキルイミダゾール誘導体であるオザグレルであり、ＩＣ５０は１１ｎＭである。オザグレルは以下の通りの式を有する：
【０１１５】
【化４】
0005512534.tif 000005
【０１１６】
適当なトロンボキサン阻害薬は、ＷＯ０１／８７３４３，ＪＰ７１７９４２５、ＪＰ６２０１００７２、ＪＰ２００４０４３３８０、ＵＳ５，４６８，７５７、ＵＳ５，５５０，１１８、ＵＳ５，６０４，２３６およびＵＳ５，２４６，９５６中にも記載があり、これらの開示内容は、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
【０１１７】
本発明の化合物は、薬学上許容される賦形剤、および場合により徐放性のマトリックス（生分解性ポリマーなど）と組み合わせて、治療用組成物を形成してもよい。
【０１１８】
経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所または経直腸での投与用の本発明の医薬組成物では、活性成分は、単独で、または別の活性成分と組み合わせて、従来の医薬担体との混合物として、動物およびヒトに単位投与形態で投与できる。適当な単位投与形態は、錠剤、ゲルカプセル、粉末、顆粒および経口用の懸濁液または溶液などの経口経路形態、舌下投与およびバッカル投与用の形態、噴霧剤、インプラント、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、真皮下、経皮、くも膜下腔内および鼻腔内の投与形態および経直腸投与形態を含む。
【０１１９】
好ましくは、この医薬組成物は、注射可能な製剤用に薬学上許容される媒体を含有する。これらは、とりわけ、等張性で滅菌済の生理食塩溶液（リン酸一ナトリウムもしくはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムもしくは塩化マグネシウムなど、またはそのような塩の混合物）、または、場合により、滅菌済の水もしくは生理食塩水を加えると注射可能な溶液が構成できる乾燥、特に凍結乾燥させた組成物であってもよい。
【０１２０】
注射剤用途に適した医薬形態としては、滅菌済の水溶液または分散系；ゴマ油、ピーナッツ油または水性プロピレングリコールを含む製剤；および注射用の滅菌済の溶液または分散系を即席調製するための滅菌済の粉末が挙げられる。全ての場合において、この形態は、滅菌済でなければならず、容易に注射できる程度に流動性でなければならない。この形態は、製造条件および保管条件下で安定でなければならず、細菌および真菌など微生物の汚染作用を受けないように維持されなければならない。
【０１２１】
遊離塩基としての本発明の化合物または薬理学上許容される塩を含む溶液は、水中で、適切には、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性物質と混合して調製できる。分散系は、グリセロール中、液体ポリエチレングリコール中およびその混合物中ならびに油中でも調製できる。普通の保管条件および使用条件下では、こうした調製品は、微生物の成長を予防するために保存剤を含有する。
【０１２２】
本発明の化合物は、中性形態または塩形態の組成物に製剤できる。薬学上許容される塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）が挙げられ、このような塩は、例えば、塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸で形成される。遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウムまたは水酸化酸化鉄などの無機塩基、および、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導することもできる。
【０１２３】
担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、適当なその混合物および植物油を含有する溶媒または分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散系の場合には必要な粒子サイズの維持により、および、界面活性物質の使用により、維持できる。微生物作用の予防は、多様な抗微生物剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどにより達成できる。多くの場合、等張性の作用剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含ませることが好ましいと考えられる。注射用組成物の吸収の持続は、吸収を遅らせる薬剤の組成物、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの中での使用により達成できる。
【０１２４】
滅菌済の注射用溶液は、活性ポリペプチドを必要な量で、必要に応じ、上に列挙した多様な他の原料と共に適切な溶媒中に組み込み、次いで濾過による滅菌により調製する。一般に、分散系は、滅菌済の多様な活性成分を、基礎となる分散媒および上に列挙したもののうち必要な他の原料を含有する滅菌済の媒体中に組み込むことにより調製する。滅菌済の注射用溶液を調製するための滅菌済粉末の場合に、好ましい調製方法は、活性成分に、予め滅菌濾過しておいたその溶液に由来する追加的な所望の任意の原料を加えた粉末を得る、真空乾燥法および凍結乾燥法である。
【０１２５】
製剤時には、溶液は、剤形と適合する様式および治療上有効であるような量で投与されることになる。この製剤は、前述した種類の注射用溶液などさまざまな剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなどを採用することもできる。
【０１２６】
水溶液の形態での非経口投与の場合は、例えば、溶液は、必要に応じ適切に緩衝化され、液体希釈剤をまず、十分な生理食塩水またはグルコースで等張性にすべきである。こうした特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内の投与に特に適している。この関係においては、採用できる滅菌済の水性媒体は、本開示に照らせば当業者にはわかるであろう。例えば、１回の用量は、等張性のＮａＣｌ溶液１ｍｌ中に溶解させることができると考えられ、皮下注入液１０００ｍｌに加えるか、または、提案される注入部位で注射するか、いずれかとする。ある程度の用量の差異は、治療される対象の状態に応じ、必ず生じるであろう。投与の責任者は、いかなる事象においても、個々の対象について適切な用量を決定することになろう。
【０１２７】
本発明の化合物は、治療用混合物内で製剤して、１回用量当たり、約０．０００１〜１．０ミリグラム、または約０．００１〜０．１ミリグラム、または約０．１〜１．０またはさらには約１０ミリグラムほどを含んでもよい。複数回用量を投与することもできる。
【０１２８】
静脈内注射または筋肉内注射など非経口投与用に製剤される本発明の化合物に加え、薬学上許容される他の形態としては、例えば、錠剤、または、経口投与用の他の固体、リポソーム製剤、時間放出カプセル、および、現在使用されている他の任意の形態が挙げられる。
【０１２９】
スクリーニング法：
本発明は、骨塩密度関連の疾患の治療に有用である可能性のある候補化合物（例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは小分子または他の薬物）をスクリーニングする方法も提供する。
【０１３０】
より詳細には、本発明は、以下からなるステップを含む、骨塩密度の増加を伴う疾患の治療に有用である可能性がある化合物をスクリーニングする方法を提供する：
ａ）候補化合物を供給するステップ、
ｂ）前記候補化合物の能力を測定してＴＸＡＳの活性を高めるステップ、
ｃ）ＴＸＡＳの活性を高めることが可能な候補化合物を選別するステップ。
【０１３１】
あるいは、本発明は、以下からなるステップを含む、骨塩密度の減少を伴う疾患の治療に有用である可能性がある化合物をスクリーニングする方法を提供する：
ａ）候補化合物を供給するステップ、
ｂ）前記候補化合物の能力を測定してＴＸＡＳの活性を阻害するステップ、
ｃ）ＴＸＡＳの活性を阻害することが可能な候補化合物を選別するステップ。
【０１３２】
次に、本発明の方法により同定される候補化合物を細胞モデル中でテストできる。例えば、候補化合物は、実施例に記載の方法により、初代培養物である骨芽細胞中で、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、および、ＮＦ−κＢの受容体アクチベーターのリガンド（ＲＡＮＫＬ）の発現を調節する能力についてテストしてもよい。
【０１３３】
本発明の候補化合物は、当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチのいずれかを用いて入手でき、そうしたライブラリー法としては以下が挙げられる：生物学的ライブラリー、空間的にアドレス可能な平行固相または液相ライブラリー、デコンボリューションが必要な合成ライブラリー法、「１ビーズ１化合物」ライブラリー法、および、親和性クロマトグラフィーによる選別を用いる合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーによるアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、化合物のペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは小分子ライブラリーに適用可能である。
【０１３４】
以下の図および実施例に照らして、本発明をさらに例証することとする。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】罹患個体の家系図および骨格Ｘ線写真である：（ａ）この試験の４家族の罹患個体は、（ｂ）にはっきりさせてある。ＧＨＤＤにおける骨密度の増加は、骨幹の病変、異常な長骨モデリングおよび皮質性過骨症を特徴とする。
【図２】ＴＸＡＳ／ＴＸＡ２は、ＲＡＮＫＬ経路を調節する：（ａ）アラキドン酸（ＡＡ）カスケードの図である。ＡＡは、３段階で動員される：ａ）ホルモンまたはストレスにより活性化されたＡＡが、ホスホリパーゼ（Ａ２およびＣ）により、細胞の脂質二重層のω−６脂肪酸から動員される、ｂ）シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）１および２により、ＡＡがプロスタグランジン（ＰＧ）Ｈ２に変換される、ｃ）個々の合成酵素により、小胞体内腔上のＰＧＨ２が、プロスタノイドと呼ばれる生物学的に活性な最終産物（すなわち、ＰＧＩ２、ＰＧＤ２、ＰＧＥ２、ＰＧＦ２αおよびＴＸＡ２）を異性化させる。抗炎症性および抗血栓性の活性を有するエイコサペンタン酸であるＴＸＡ３は、脂質二重層のω−３脂肪酸の動員から産生される。（ｂ）ＲＡＮＫＬおよびＯＰＧの発現試験のグラフである。骨芽細胞におけるリアルタイム定量ＰＣＲ試験から、オザグレルによるＴＸＡＳの阻害に次いで、ＲＡＮＫＬの減少およびＯＰＧのｍＲＮＡレベルの増大が示された。対照的に、ＴＸＡ２の類似体であるＣＴＡ２は、ＲＡＮＫＬの増大およびＯＰＧのｍＲＮＡレベルの減少をもたらした。（ｃ）破骨細胞の分化／活性化の誘導におけるＴＸＡ２の仮定される作用の概略図である。ＴＸＡ２は、ＲＡＮＫＬを増加させ、骨中のＯＰＧ発現を少なくとも自己分泌様式で減少させる。
【図３】ヒトトロンボキサン合成酵素（ＴＸＡＳ）の概略図である。（ａ）ＧＨＤＤ家族において検出された突然変異の位置を赤および緑色で示す。（ｂ）ＴＸＡＳの三次元のＳｗｉｓｓ−Ｐｄｂ  Ｖｉｅｗｅｒ図である。突然変異した４つの残基は、７つのβシートの１つ（アミノ酸８３、緑色）、ヘムおよび酵素窩の付近（アミノ酸４１３および４８２、赤）中およびαヘリックス（アミノ酸４８８、緑色）中に位置していた。（ｃ）４８２位におけるアミノ酸のファンデルワールス体積のＳｗｉｓｓ−Ｐｄｂ  Ｖｉｅｗｅｒ図である。グリシン（左）は、家族３（右）においてトリプトファンに変化した。触媒部位（ヘム、青色）付近での立体障害の変化に注目。
【図４】ＴＢＸＡＳ１の発現プロファイル：ヒト骨芽細胞（ＯＢ）、破骨細胞（ＯＣ）、軟骨細胞、筋肉、ヒトリンパ芽球腫細胞株および皮膚線維芽細胞におけるＲＴ−ＰＣＲの写真である。Ψ＝ＤＮＡラダー。
【図５】血小板試験：（ａ）対照（左）および患者（右）における血小板凝集プロファイルを示すグラフである。色は、多様な刺激に対応する。中間のアラキドン酸濃度（ＡＡ、緑色）では凝集プロファイルの障害が観察されたが、トロンボキサン受容体拮抗薬であるＵ４６６１９を使用すると、正常な血小板凝集（薄い青色）がもたらされた。（ｂ）多様な刺激下での血小板エキソサイトーシス試験を示すグラフである。ＡＡにより誘導されたＰ−セレクチン発現は劇的に減少した（ｐ＜０．００５）が、ＴＲＡＰ、ＡＤＰおよびＵ４６６１９により誘導されたＰ−セレクチン発現は、対照と同等であった。
【０１３６】
【表１】
0005512534.tif 000006
【０１３７】
【表２】
0005512534.tif 000007
【実施例】
【０１３８】
＜実施例１＞
材料および方法：
罹患個体：本発明者らは、近親交配の４家族に属する１０名の罹患個体を試験した。試験組入れのための診断基準は以下の通りであった：ｉ）輸血が必要な重度の貧血、およびｉｉ）骨密度の増加、異常な長骨モデリング、皮質性過骨症、ならびに、正常な骨幹端および骨端を有する、骨幹の異形成症など骨格の変化。ＤＮＡ試料は、署名を伴うインフォームドコンセントの後に採取した。
【０１３９】
突然変異検出：一連のイントロンプライマー１７種を設計して、ＴＢＸＡＳ１遺伝子の非コードエキソン４種およびコードエキソン１３種を増幅させた。増幅産物を精製し、蛍光ジデオキシターミネーター法を用いて自動配列決定装置（ＡＢＩ３１００）で配列決定した。
【０１４０】
ＲＴ−ＰＣＲ：ヒトの筋肉、初代培養細胞（骨芽細胞、軟骨細胞および線維芽細胞）、ならびに、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて臍帯血細胞を破骨細胞に分化転換させたものから、全ＲＮＡを抽出した。製造者のプロトコール（ＧｅｎｅＡｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｃｏｒｅ  Ｋｉｔ、Ｒｏｃｈｅ）を用いて、ＭｕＬＶ逆転写酵素の存在下でランダムヘキサマーとプライミングすることによりｃＤＮＡを合成した。６０℃のアニーリング温度でＰＣＲを合計３０サイクル実施して、スプライシングされることがわかっているエキソン１２種を含む、ＴＢＸＡＳ１に特異的な７７２−ｂｐ断片を増幅させた（要求に応じたプライマー配列を入手可能）。
【０１４１】
三次元構造：ヒトトロンボキサン合成酵素（アイソフォームＴＸＳ−Ｉ）の三次元構造を、Ｓｗｉｓｓ−Ｍｏｄｅｌプログラムを最適化された様式で用いて、比較モデリング法およびエネルギー最少化によりモデル化した（Ｓｃｈｗｅｄｅ，Ｔら、２００３）。ＴＸＡＳと５つのテンプレート（１Ｗ０Ｆ、１ＴＱＮ、２ｊ０Ｃ、１ＯＧ５および１ＢＶＹについて、それぞれ、４１．３１％、４０．０１％、３７．５２％、２７．７２％および３３．２４％）との間の同一性の程度から、これらのテンプレートのＸ線座標を用いた、ヒトＴＸＡＳの構造のモデル化が可能になった。構造モデル用のテンプレートとして、２．６５Å（ＰＤＢは１Ｗ０Ｆをコードする）、２．０５Å（１ＴＱＮ）、２．８０Å（２Ｊ０Ｃ）、２．５５Å（１ＯＧ５）および２．０３Å（１ＢＶＹ）の座標セットを使用した。全体の折畳みは、構造的に確立されたＰ４５０タンパク質にかなり類似していたが、但し、２つの領域（アミノ酸２６０〜２７７および２９５〜３３０）については、構造情報がないことから例外であった。提示された配列の残基３２〜５３４を使用して、モデルを構築した。Ｓｗｉｓｓ−Ｐｄｂ  Ｖｉｅｗｅｒ３．７を使用して、構造を可視化し、ＴＸＡＳ突然変異への構造洞察を分析した。
【０１４２】
トロンボキサンレベルおよびプロスタグランジンＥ２レベル：ＡＡ誘導前後の多血漿血小板におけるＴＸＢ２およびＰＧＥ２の産生の新規レベルを、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）（Ｃａｙｍａｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅｆ  ５１９０３１．１および５１４０１０．１、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）により、家族１の患者ＩＩ１およびＩＩ２において直接定量し、性別および年齢のマッチ対照と比較した。Ｒｅｖｅｌａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｖ４．２２（Ｄｙｎｅｃ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いてＥＬＩＳＡデータを分析した。
【０１４３】
血小板凝集テスト：測光法を用いることにより４チャネルの血小板凝集計（Ｒｅｇｕｌｅｓｔ、Ａｍｎｅｖｉｌｌｅ、フランス）で、採血の２時間以内に３７℃で凝集試験を実施した（Ｄｕｐｏｎｔ，Ａ．ら、２００３）。手短に言えば、一定分量２８０μＬの多血小板血漿を３７℃で３分間インキュベートしてから、１１００ｒｐｍで２分間撹拌した後、生理食塩水２０μＬを加えるか、または、以下の作動薬を続いて加えた：１．５、０．７５および０．３７５ｍｍｏｌ／Ｌのアラキドン酸（Ｈｅｌｅｎａ）、２、５および１０μｍｏｌ／ＬのＡＤＰ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、１．５μｍｏｌ／ＬのＵ４６６１９（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）およびコラーゲン１μｇ／ｍＬ（Ｈｏｒｍ）。作動薬を加えると血小板が凝集することにより、光透過率が増加する結果となり、これを５分間記録する。凝集は、基準（任意に１００％）として貧血小板血漿を用い、ベースラインからの光透過率の最大変化率（％）として表した。
【０１４４】
フローサイトメトリーによる血小板糖タンパク質および血小板活性化の分析：製造者の取扱説明書に従い、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ血球計数器（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用い、Ｐｌａｔｅｌｅｔ  ＧＰ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（Ｂｉｏｃｙｔｅｘ）を用いて、活性化前後にフローサイトメトリーにより多血漿血小板中での血小板糖タンパク質ＧＰＩｂ（ＣＤ４２ｂ）、ＧＰＩＩＩａ（ＣＤ６１）およびＰ−セレクチン（ＣＤ６２Ｐ）の表面発現を実施した（Ｈｅｚａｒｄ，Ｎ．ら、２００３）。ＴＲＡＰ（５０μＭ、２５μＭ、１２．５μＭ、ＮｅｏＭＰＳ）、アラキドン酸（０．５ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）、Ｕ４６６１９（５μＭ、ＶＷＲ  Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を使用して活性化を達成した。結果は、患者の血小板表面での平均蛍光強度（ＭＦＩ）の、同じ条件で試験した対照の表面でのＭＦＩと比較した比率（％）の形で表す。作動薬により誘導されたＰ−セレクチン発現の変化をＭＦＩで表す。
【０１４５】
骨芽細胞の培養およびリアルタイム定量ＰＣＲ：署名を伴うインフォームドコンセントの後、頭蓋癒合症の日常的な外科手術の間に、ヒトの正常な頭蓋縫合線を採取した。別の箇所で説明するように、ダルベッコ変法イーグル培地（１０％ウシ胎仔血清を添加）中で骨芽細胞を培養した（Ｄｅ  Ｐｏｌｌａｃｋ，Ｃ．ら、１９９６）。培養培地中に０．２５μＭ（ＩＣ５０は１１ｎＭ）でオザグレル（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を３日間毎日加え、ＣＴＡ２（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を、１日目に培養培地中に２通りの濃度（５μＭおよび１５μＭ）で加えた。細胞は３日目に回収した。各試料中のＯＰＧおよびＲＡＮＫＬのｍＲＮＡについて、Ｌｉｇｈｔ  Ｃｙｃｌｅｒ技術（Ｒｏｃｈｅ  Ｍａｎｈｅｉｍ）を用いてリアルタイム定量ＰＣＲを実施した。実験は５回実施した。各実験においては、試料を３回ずつ試験した。ＯＰＧおよびＲＡＮＫＬのｍＲＮＡの量をβ−アクチンのｍＲＮＡの量に正規化した。Ｐ値の定量にはスチューデント検定を用いた。
【０１４６】
結果：
ＧＨＤＤ（ＯＭＩＭ２３１０９５）は、主要な骨幹の病変および無再生性の皮質感受性貧血を伴う骨密度増加（ＩＢＤ）障害を特徴とする稀な常染色体劣性障害である（Ｇｈｏｓａｌら、１９８８）。アルジェリアおよびチュニジア出身の血縁のＧＨＤＤの２家族を試験して、本発明者らは、最近、染色体７ｑ３３〜ｑ３４に疾患遺伝子をマッピングした（Ｉｓｉｄｏｒ  Ｂ．ら、２００７）。ここに、本発明者らは、これらの家族、ならびに、チュニジアおよびパキスタンを起源とするさらなる２家族においては、ＧＨＤＤの原因はトロンボキサン合成酵素遺伝子（ＴＢＸＡＳ１）の突然変異であるものとする（図１）。
【０１４７】
ＩＢＤは、骨吸収と骨形成との間の不均衡が原因である。ヒトの３．８４Ｍｂ領域の３６個の遺伝子のうち、本発明者らは、まず、その機能により２５個の遺伝子について検討し、直接配列決定によりそれらを除外した。ＴＢＸＡＳ１は、ヒトにおける軽度の出血障害に関与していると考えられる（Ｍｅｓｔｅｌ  Ｆ．ら、１９８０；Ｗｅｉｓｓ  ＨＪ．ら、２００２）が、この遺伝子は、その後、破骨細胞の動員において関与が推定されることに基づき候補遺伝子とみなされた（Ｇｒｕｂｅｒ  Ｒ．ら、２００２）。ＴＢＸＡＳ１（エキソン１７種、非コードエキソン４種およびコードエキソン１３種）は、６０ｋＤＡの膜貫通型トロンボキサン合成酵素（ＴＸＡＳ）をコードするが、モノオキシゲナーゼ活性をもたないことから、チトクロムｐ４５０スーパーファミリーの非定型構成要素とみなされる。ＴＸＡＳは、アラキドン酸（ＡＡ）カスケードの終末酵素の１つであり、小胞体内腔中でプロスタグランジン（ＰＧ）Ｈ２をトロンボキサンＡ２（ＴＸＡ２）に変換する。ＴＸＡ２は、ほぼ全ての細胞により産生され、炎症、血管収縮／血管拡張、凝固、疼痛および発熱に関与するエイコサノイドの群に属する（Ｓｈｅｎ  ＲＦ．ら、１９９８）。エイコサノイドは、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ１〜２）によるＡＡの変換（脂質二重層のω−６脂肪酸から）、および個々の合成酵素による生物学的に活性な最終産物への異性化により産生される（Ｓｈｅｎ  ＲＦ．ら、１９９８）（図２ａ）。ＴＸＡ２は、血小板凝集の強力な誘導因子であり、血管／呼吸器の平滑筋の収縮因子である。
【０１４８】
ＴＢＸＡＳ１遺伝子の直接配列決定により、ＧＨＤＤの４家族全てにおいて異なるホモ接合ミスセンス突然変異が検出された（ｃ．１４６３Ｔ＞Ｃ、ｃ．２４８Ｔ＞Ｃ、ｃ．１４４４Ｇ＞Ｔおよびｃ．１２３８Ｇ＞Ａ、図１、図３および表１）。この突然変異には、種を超えて保存されたアミノ酸が含まれており、３／４は、ヘム結合領域中に含まれる残基の近くに位置していた。こうしたアミノ酸は、疾患と同時分離し、２１０個の対照染色体中では同定されなかった。ＲＴ−ＰＣＲ分析により、ヒトの骨芽細胞（ＯＢ）、破骨細胞（ＯＣ）、軟骨細胞、筋肉、リンパ芽球腫の細胞株において、また、程度は低いが皮膚の線維芽細胞においても、ＴＢＸＡＳ１転写物が検出された（図４）。
【０１４９】
ＴＸＡＳは内因性の膜タンパク質であるため、精製には界面活性剤処理が必要であり、その構造分析は、達成が難しい。したがって、突然変異の機能的な結果は、他のＰ４５０ファミリーの構成要素が有するＴＸＡＳ配列の配列比較を介した三次元構造モデリングにより調査した。得られたモデルを、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｄｂ  Ｖｉｅｗｅｒ図として示す（図３ａ）。突然変異した４つの残基は、７つのβシートの１つ（アミノ酸８３）、ヘム付近の中、酵素窩（アミノ酸４１３および４８２）中およびαヘリックス（アミノ酸４８８）中に位置していた。
【０１５０】
ＴＸＡ２は、血小板凝集において主要な役割を果たす（（Ｓｈｅｎ  ＲＦ．ら、１９９８）ことから、本発明者らは、本試験の患者における一次止血を調査した。外科手術後の突発性または過剰な出血歴は報告されず、患者ＩＩ２、ＩＩ３およびＩＩ６（それぞれ、家族１、２および３）における一次止血は正常であった（Ｉｖｙテスト）（表１）。家族１の患者ＩＩ２は、血小板凝集分析に適格であったが、その理由は、この男性は、凝集テストを妨げる恐れのある薬物適用を一切受けていなかったからである。中間のＡＡ濃度（４％）を用いて凝集プロファイルの障害を観察したが、年齢および性別のマッチした２つの対照により、それぞれ８０％および９０％の値が示された（図５ａ）。低濃度または高濃度のＡＡのいずれかおよび他の作動薬により誘導された凝集は、患者ＩＩ２および対照において同様の結果となった。とりわけ、ＴＸＡ２受容体の特異的な作動薬であるＵ４６６１９により誘導された凝集は、患者ＩＩ２（家族１）において正常であった。本発明者らは、異なる刺激下での血小板エキソサイトーシスも試験した。活性化に先立つ血小板ＧＰＩｂ、ＧＰＩＩＩａおよびＰ−セレクチンの発現は、５名のＧＨＤＤ患者において正常な範囲であった（７５〜１５６％、データは示していない）。最後に、本発明者らは、３名のＧＨＤＤ患者における多様な刺激前後のＰ−セレクチン発現を試験した。ＡＡにより誘導されるＰ−セレクチン発現は劇的に減少した（ｐ＜０．００５）が、ＴＲＡＰ、ＡＤＰおよびＵ４６６１９により誘導されるＰ−セレクチン発現は、対照と同等であった（図５ｂ）。
【０１５１】
多血漿血小板（ＰＲＰ）におけるＴＸＢ２およびＰＧＥ２のＥＬＩＳＡアッセイから、対照と比較して、ＡＡ誘導前の患者においてはＴＸＢ２レベルが低く、ＡＡ誘導後のＴＸＢ２レベルはあまり変化していない（それぞれ１００倍および２００倍低い）ことが明らかになった。対照的に、ＡＡ誘導前のＰＲＰ  ＰＧＥ２レベルは、対照と比較して患者において高く、広範なばらつきがあった（対照より５〜１８倍高かった）。興味深いことに、ＡＡ誘導への応答は、対照におけるよりＧＨＤＤ患者のＰＲＰにおけるほうが強かった（表２）。
【０１５２】
ＧＨＤＤにおけるＩＢＤの機序を解明するため、本発明者らは、正常なヒトの縫合線に由来する初代培養した骨芽細胞（ＯＢ）におけるＲＡＮＫＬ（ＮＦ−κＢの受容体アクチベーターのリガンド）およびオステオプロテゲリン（ＯＰＧ）の発現に対するＴＸＡＳおよびＴＸＡ２の役割を調査した。ＴＸＡＳの特異的な阻害薬であるオザグレルを培養培地に加えると、対照値と比較して、ＲＡＮＫＬ発現は劇的に減少したが、ＯＰＧ発現は増加した（それぞれ、−７８％、ｐ＜０．００５、および、＋５０％、ｐ＜０．００５）。ＴＸＡ２の安定類似体であるＣＴＡ２を加えると逆の効果があり、ＲＡＮＫＬは増加し（５μＭおよび１５μＭでそれぞれ、＋９４％、ｐ＜０．００５、および、＋４７１％、ｐ＜０．０３）、ＯＰＧ発現は減少した（５μＭおよび１５μＭでそれぞれ、−４０％、ｐ＜０．００５、および、−５３％、ｐ＜０．００５）（図２ｂ）。
【０１５３】
ここに、本発明者らは、骨の異常と血液学的な異常とが組み合わさったヒト障害におけるＴＢＸＡＳ１の突然変異を同定したことを報告する。４つのミスセンス突然変異には、酵素活性にとってきわめて重大なアミノ酸が含まれていた。家族３（ｐ．Ａｒｇ４１３Ｇｌｕ）にも含まれている４１３位のアルギニン（ｐ．Ａｒｇ４１３Ｌｙｓ）の変化は、酵素のヘム含有量の低下（３０％）を伴い、ＴＸＡＳ活性の低下（１％）の主な原因となることが示されている（Ｈｓｕ  ＰＹ．ら、２０００）。突然変異ｐ．Ｇｌｎ４８２Ｔｒｐ（家族４）は、触媒部位付近で、立体障害度の低い脂肪族アミノ酸を立体障害度の高い芳香族酸に変化させた。立体障害のそのような変化は、酵素／基質複合体（すなわち、ＴＸＡＳおよびＰＧＨ２）の相互作用を変化させることがある（図３ｂ）。最後に、８３位（βシート）および４８８位（αヘリックス）においてロイシンがプロリンに変化すると、ＴＸＡＳの四次構造中にコイルが導入されることがある。
【０１５４】
ＧＨＤＤ患者には出血の問題は一切ないが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験から、おそらくＴＸＡＳ酵素活性の低下およびＴＸＡ２産生欠損が原因で、ＡＡ誘導後は血小板凝集が起こらないことが明らかになり、このことから、ＴＸＡ２は血小板凝集の主要因子であることが確認された。しかし、本試験の患者において出血障害がないことから、血小板凝集についての機序は非常に豊富であることが示唆される。同様に、マウスにおいてｔｂｘａｓ１が無効化しても突発性の出血障害には至らず、特徴は、トロンビンおよびコラーゲンにより誘導される、ＴＸＡ２とは無関係の血小板凝集によるものとされる（Ｙｕ  ＩＳ．ら、２００４）。
【０１５５】
動脈高血圧症においては高いレベルのＴＸＡ２が観察される（Ｓｈｅｎ  ＲＦ．ら、１９９８）が、この試験の患者の血圧は正常であった（表１）。
【０１５６】
無再生性の皮質感受性貧血および炎症は、ＧＨＤＤ患者において観察されるまた別の特徴である。この特徴は、高いＰＧＥ２レベルに関連があると考えられる。事実、ＰＧＥ２は、炎症など多様な細胞機能に関与しており（Ｄａｖｉｅｓ  Ｐ．ら、１９８４）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験から、後の赤血球前駆体細胞の成長を抑制する能力を有することが示されている（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ  Ｓ．ら、１９８９）。しかし、貧血および炎症は、全患者において一貫して観察されるものではなく、重症度において相当なばらつきがある。このばらつきは、個体間におけるＰＧＥ２産生のばらつきに関連があると考えられる。
【０１５７】
ＩＢＤはＧＨＤＤにおける主要な特徴であることから、ＴＸＡＳ／ＴＸＡ２は、未だ明らかになっていない機能、すなわち骨のリモデリングにおいても主要な役割を果たすと仮定できる。エイコサノイドは、骨格の代謝において重要な生理的／病理学的役割を有する（Ｐｉｌｂｅａｍ  ＣＣ．ら、２００２）。その中でも、ＰＧＥ２は、骨吸収を刺激すると共に、とりわけ皮質骨量も高めることが公知であり、このことから、ＥＰ２およびＥＰ４受容体に依存している、ＰＧＥ２に誘導される骨リモデリングの複雑な機序が示唆される（Ｒａｉｓｚ  ＬＧ．ら、２００３）。加えて、ヒトにおける長期のＰＧＥ２注入は、用量依存的な過骨症の原因となる（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ  ＨＲ．ら、１９８８）。
【０１５８】
ＴＸＡ２（ＣＴＡ２）の安定な類似体は、骨芽細胞のＲＡＮＫＬ経路を介した骨髄培養物中での破骨細胞の動員および成熟にも関与している（Ｇｒｕｂｅｒ  Ｒ．ら、２００２）。本発明者らのデータから、ｉ）ＣＴＡ２は、用量応答の様式で、ＲＡＮＫＬを増加させ、ＯＰＧレベルを減少させること、および、ｉｉ）オザグレルによりＴＸＡＳを阻害すると、反対の効果がもたらされることが示される（図２ｂ）。ＲＡＮＫＬ／ＯＰＧ発現とＴＸＡＳ活性の間に直接の結び付きがあるという知見は、ＴＸＡ２が、骨芽細胞において自己分泌の様式で破骨細胞の分化／活性化の誘導を制御するという見解を支持する（図２ｃ）。骨リモデリングに及ぼすＴＸＡＳ／ＴＸＡ２の効果に加え、個体間のＰＧＥ２産生のばらつきも、ＧＨＤＤにおける骨の兆候のばらつきの原因となると考えられる。
【０１５９】
ＩＢＤの原因となる遺伝子のほとんどは、破骨細胞および骨芽細胞の機能／分化に関与している。興味深いことに、こうした遺伝子のいくつかは、骨塩密度の差異における候補遺伝子とみなされる（Ｒａｌｓｔｏｎ  ＳＨ．ら、２００６）。さらに、エストロゲンおよびプロゲステロンは、トロンボキサン受容体の発現を低下させるが、栄養法における過剰な量のω−６脂肪酸は、骨粗鬆症を引き起こすと考えられる（Ｗａｔｋｉｎｓ  ＢＡ．ら、２００１）。したがって、トロンボキサン合成酵素は、骨塩密度の差異および骨粗鬆症の病因に関与している。結論として、ＧＨＤＤにおけるＴＢＸＡＳ１の突然変異の同定により、ピーク骨量の差異に大きな影響を及ぼす、骨リモデリングにおけるＴＸＡＳ／ＴＸＡ２の未だ明らかになっていない機能が実証される。
【０１６０】
＜実施例２＞
この実施例では、骨塩密度の減少を伴う疾患を治療する能力について、多様なモデルおよびヒト患者においていくつかのトロンボキサン阻害薬をテストする。
【０１６１】
トロンボキサン阻害薬
・オザグレルは、トロンボキサン合成酵素阻害薬である（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）。これを８００ｍｇ／日の用量で成人に経口投与する。
【０１６２】
・ピコタミドは、二重作用性のトロンボキサン受容体拮抗薬であり、トロンボキサン合成酵素阻害薬である（Ｐｌａｃｔｉｄｉｌ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ製）。これを、６００ｍｇの用量で１日２回、成人に経口投与する。
【０１６３】
・セラトロダストは、トロンボキサン受容体拮抗薬である（Ｔａｋｅｄａ，Ａｂｏｔｔ）。これを、８０ｍｇ／日で成人に経口投与する。
【０１６４】
骨塩密度の減少を伴う疾患
１）ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル
ヒト骨芽細胞の初代培養物を、トロンボキサン阻害薬がある条件またはない条件で培養する。
【０１６５】
以下の変数を測定する：
・ＴＣＢ２レベルをＥＬＩＳＡによりアッセイする、
・ＲＡＮＫＬ／ＯＰＧレベルを定量ＰＣＲによりアッセイする、
・ＰＡＬレベル、
・骨芽細胞の細胞成長。
【０１６６】
２）動物モデル：卵巣切除ラット
この動物モデルは、女性の骨粗鬆症、閉経後骨粗鬆症の最も頻繁な原因をモデル化するために頻繁に使用される。
【０１６７】
最低６カ月の年齢の雌のラット（１群当たり６匹）を、卵巣切除して、異なる処置に供する：未処置群、ラロキシフェン（Ｅｖｉｓｔａ（登録商標））およびビスホスホネート、骨粗鬆症のための基準処置で処置した対照群、オザグレル処置群、ピコタミド処置群、セラトロダスト処置群。これらの群を、以下の変数について、非卵巣切除群と比較する：
・骨密度測定（ＢＤ）
○定量的コンピューター断層撮影法（ＱＣＴ）により測定する骨密度測定。このテストは、容積測定ＢＤ（１ｃｍ３当たりのヒドロキシアパタイトのグラム数で表される）、および骨形状（直径、皮質厚、皮質および骨梁部分の表面）を測定する；
○ＤＸＡタイプの密度測定（二重エネルギーＸ線吸収測定法）。このテストは、表面ＢＤ（１ｃｍ２当たりのグラム数で表される）を測定する。
【０１６８】
・骨梁の組織構造。
【０１６９】
・骨芽細胞増殖（初代培養物において）。
【０１７０】
・骨芽細胞機能（初代培養物において）。
【０１７１】
・カルシウム取込み（初代培養物において）。
【０１７２】
３）臨床試験
Ｃｏｃｈｉｎ／Ｌａｒｉｂｏｉｓｉｅｒｅ、Ｐａｒｉｓ、フランスのＢｏｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（「Ｃｅｎｔｒｅ  ｄｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｍａｌａｄｉｅ  Ｏｓｓｅｕｓｅ」）からの患者のコホートを、処置群（プラセボ、Ｅｖｉｓｔａ（登録商標）およびビスホスホネートの基準処置、オザグレル、ピコタミドまたはセラトロダスト）にランダムに割り付ける。
【０１７３】
ＤＸＡタイプの密度測定により、処置の有効性を評価する。
【０１７４】
要するに、これらの試験から、トロンボキサン合成酵素阻害薬は、骨密度の減少を伴う疾患の治療に首尾よく使用できることが実証される。
【０１７５】
参考文献：
本出願を通して各種の参考文献が本発明が関連する技術を記載している。これらの参考文献の開示は、参照により本発明の開示に組み込まれる。
【表３】
0005512534.tif 000008
【０１７６】
【表４】
0005512534.tif 000009
【０１７７】
【表５】
0005512534.tif 000010
【０１７８】
【表６】
0005512534.tif 000011
【０１７９】
【表７】
0005512534.tif 000012
【図１】
0005512534.tif 000013
【図２】
0005512534.tif 000014
【図３】
0005512534.tif 000015
【図４】
0005512534.tif 000016
【図５】
0005512534.tif 000017
【配列表】
0005512534000001.app