(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
センス鎖ＲＮＡ配列と、
センス鎖ＲＮＡ配列に相補的なアンチセンス鎖ＲＮＡ配列と、
センス鎖とアンチセンス鎖の間に両鎖を結合する同じかまたは異なる２つのループ部分
を含む環状１本鎖核酸複合体であって、
センス鎖とアンチセンス鎖が対合してステムを形成し、
ループ部分がＤＮＡ、ＲＮＡを除くＤＮＡの誘導体、およびそれらの組合せからなる群から選択され、その長さが７〜１１塩基である
ことを特徴とする、環状１本鎖核酸複合体。
【請求項２】
細胞内でＲＮＡ干渉作用を有する２本鎖ＲＮＡに変換される、請求項１に記載の環状１本鎖核酸複合体。
【請求項３】
ステムを形成するＲＮＡ配列が、標的ＲＮＡ配列と８０〜１００％の同一性を有する、請求項１または２に記載の環状１本鎖核酸複合体。
【請求項４】
ステムの長さが１９〜３１塩基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の環状１本鎖核酸複合体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の環状１本鎖核酸複合体の製造方法であって、以下の工程：
（１）センス鎖の一部とループ部分とアンチセンス鎖の一部を含む線状１本鎖核酸複合体、およびセンス鎖の残部とループ部分とアンチセンス鎖の残部を含む線状１本鎖核酸複合体を作製する工程、および
（２）センス鎖の一部とセンス鎖の残部、およびアンチセンス鎖の一部とアンチセンス鎖の残部を連結する工程
を含む製造方法。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の環状１本鎖核酸複合体の製造方法であって、以下の工程：
（１）センス鎖とアンチセンス鎖を作製する工程、および
（２）センス鎖とアンチセンス鎖で形成された２本鎖ＲＮＡの両端に、ループ部分を連結する工程
を含む製造方法。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれかに記載の環状１本鎖核酸複合体を真核細胞に導入し、標的ＲＮＡを不能にしてタンパク質への翻訳を阻害することを含む、該タンパク質をコードする遺伝子の発現をｉｎ  ｖｉｔｒｏで抑制する方法。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれかに記載の環状１本鎖核酸複合体を非ヒト動物、植物、またはそれらの細胞に導入し、標的ＲＮＡを不能にしてタンパク質への翻訳を阻害することを含む、該タンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する方法。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれかに記載の環状１本鎖核酸複合体を有効成分として含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環状１本鎖核酸複合体、その製造方法、および環状１本鎖核酸複合体を用いた医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉法は、化学合成された２本鎖ＲＮＡを用いる方法と、プラスミドベクターを用いる方法に大別される。このＲＮＡ干渉法を用いた医薬品開発が現在進められているが、後者のプラスミドベクターを用いた場合、人体への安全性が問題となることから、前者の化学合成された２本鎖ＲＮＡを用いる医薬品の開発が期待されている。
【０００３】
しかしながら、２本鎖ＲＮＡは、生体に投与すると細胞内のヌクレアーゼで容易に分解されてしまい、生体内で不安定であるという問題があった。
【０００４】
２本鎖ＲＮＡの生体内での安定性を高めるため、非天然ヌクレオシドを導入したＲＮＡ鎖が開発された。しかし、安定性は高くなるが生物活性は下がってしまうことが問題となっていた。さらに、非天然ヌクレオシドが生体に与える毒性も未知であり、医薬品への応用は難しかった。
【０００５】
２本鎖ＲＮＡの生体内での安定性を向上させる別のアプローチから、環状１本鎖ＲＮＡ（ダンベル型ＲＮＡ）が開発された。ダンベル型ＲＮＡは２本鎖ＲＮＡの両端がループ状に閉じているために、ＲＮＡ末端がなくなり、細胞内においてダイサーなどの特異的酵素以外は、分解酵素エキソヌクレアーゼなどの基質となりにくく、分解されにくいという特徴を持つ。そのようなダンベル型ＲＮＡとして、例えば非特許文献１に記載されているダンベル型ＲＮＡが挙げられる。該ダンベル型ＲＮＡは２本鎖ＲＮＡと比較してヒト血清を加えたバッファー中で安定であることが非特許文献１に記載されている。
【０００６】
また、特許文献１には、抗インフルエンザウイルス剤としてのダンベル型ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ核酸が記載されている。該ダンベル型核酸は、インフルエンザウイルス遺伝子を直接攻撃するアンチセンス法に用いられるものである。該ダンベル型核酸のステム部分はＤＮＡとそれに相補的なＲＮＡが対合してなり、ループ部分はオリゴヌクレオチドまたはエチレングリコール化合物残基からなる。該ダンベル型核酸が細胞内に入ると、リボヌクレアーゼＨにより分解または切断されて、アンチセンスＤＮＡ部分が遊離すると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】  特開平１１−１３７２６０号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】  Abe, N., Abe, H., ＆ Ito, Y. Dumbbell-Shaped Nanocircular RNAs for RNA Interference. Journal of the American Chemical Society 129, 15108-15109 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ＲＮＡ干渉法に用いられる環状１本鎖核酸複合体、その製造方法、および該環状１本鎖核酸複合体を用いた医薬組成物を提供することを課題とする。
【００１０】
本発明者らは、環状１本鎖核酸複合体のステム部分を連結する２つのループ部分を、ポリアルキレングリコール、ＤＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡのキメラ、これらの誘導体、またはこれらの組合せにすることにより、生体内安定性が向上し、かつ細胞内でＲＮＡ干渉作用を示し、ならびに環状１本鎖核酸複合体を簡易に効率よく製造できること等を見出し、本発明を完成した。
【００１１】
本発明の特徴は要約すると以下の通りである。
［１］センス鎖ＲＮＡ配列と、センス鎖ＲＮＡ配列に相補的なアンチセンス鎖ＲＮＡ配列と、センス鎖とアンチセンス鎖の間に両鎖を結合する同じかまたは異なる２つのループ部分を含む環状１本鎖核酸複合体であって、センス鎖とアンチセンス鎖が対合してステムを形成し、ループ部分がポリアルキレングリコール、ＤＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡのキメラ、これらの誘導体、およびこれらの組合せからなる群から選択されることを特徴とする、環状１本鎖核酸複合体。
［２］細胞内でＲＮＡ干渉作用を有する２本鎖ＲＮＡに変換される、［１］に記載の環状１本鎖核酸複合体。
［３］ステムを形成するＲＮＡ配列が、標的ＲＮＡ配列と８０〜１００％の同一性を有する、［１］または［２］に記載の環状１本鎖核酸複合体。
［４］ポリアルキレングリコールがポリエチレングリコールである、［１］〜［３］のいずれかに記載の環状１本鎖核酸複合体。
［５］ステムの長さが１９〜３１塩基である、［１］〜［４］のいずれかに記載の環状１本鎖核酸複合体。
【００１２】
［６］［１］〜［５］のいずれかに記載の環状１本鎖核酸複合体の製造方法であって、以下の工程：
（１）センス鎖の一部とループ部分とアンチセンス鎖の一部を含む線状１本鎖核酸複合体、およびセンス鎖の残部とループ部分とアンチセンス鎖の残部を含む線状１本鎖核酸複合体を作製する工程、および
（２）センス鎖の一部とセンス鎖の残部、およびアンチセンス鎖の一部とアンチセンス鎖の残部を連結する工程
を含む製造方法。
【００１３】
［７］［１］〜［５］のいずれかに記載の環状１本鎖核酸複合体の製造方法であって、以下の工程：
（１）センス鎖とアンチセンス鎖を作製する工程、および
（２）センス鎖とアンチセンス鎖で形成された２本鎖ＲＮＡの両端に、ループ部分を連結する工程
を含む製造方法。
【００１４】
［８］［１］〜［５］のいずれかに記載の環状１本鎖核酸複合体を真核細胞に導入し、標的ＲＮＡを不能にしてタンパク質への翻訳を阻害することを含む、該タンパク質をコードする遺伝子の発現をin vitroで抑制する方法。
［９］［１］〜［５］のいずれかに記載の環状１本鎖核酸複合体を非ヒト動物、植物、またはそれらの細胞に導入し、標的ＲＮＡを不能にしてタンパク質への翻訳を阻害することを含む、該タンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制する方法。
［１０］［１］〜［５］のいずれかに記載の環状１本鎖核酸複合体を有効成分として含む、医薬組成物。
【発明の効果】
【００１５】
本明細書において「環状１本鎖核酸複合体」は、「ダンベル型核酸複合体」ともいう。「ダンベル型核酸複合体」とは、センス鎖とアンチセンス鎖が相補的に対合してステムを形成し、ステムの両端のそれぞれに、センス鎖とアンチセンス鎖を連結するループが形成され、環状１本鎖核酸複合体の全体の形状としてダンベル状になっているものをいう。また、「核酸複合体」とは、ＤＮＡとＲＮＡの複合体、ポリアルキレングリコールとＲＮＡの複合体、またはＤＮＡとポリアルキレングリコールとＲＮＡの複合体をいう。
【００１６】
本明細書において「ＤＮＡとＲＮＡのキメラ」とは、ＤＮＡ配列とＲＮＡ配列の任意の組合せからなるハイブリッドをいい、その組合せはどのような形でもよく、例えば、ＤＮＡが連続しているブロックとＲＮＡが連続しているブロックが連結されていてもよく、双方の複数のブロックがランダムに混ざって連結されていてもよく、ＤＮＡとＲＮＡが１つずつ交互に連結されてもよい。
【００１７】
本明細書において「標的ＲＮＡ」とは、ＲＮＡ干渉法において発現を抑制したい遺伝子のｍＲＮＡまたはその前駆体ＲＮＡをいう。
【００１８】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2008-035310号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明のダンベル型核酸複合体を模式的に示す。
【図２】本発明のダンベル型核酸複合体の製造方法の概略を示す。
【図３】本発明のダンベル型核酸複合体の製造方法の概略を示す。
【図４】本発明のダンベル型核酸複合体等の電気泳動像を示す。
【図５】本発明のダンベル型核酸複合体および２本鎖ＲＮＡの構造を示す。
【図６】血清を用いた生物学的安定性試験における本発明のダンベル型核酸複合体、ダンベル型ＲＮＡおよび２本鎖ＲＮＡの電気泳動像を示す。
【図７】血清を用いた生物学的安定性試験における本発明のダンベル型核酸複合体、ダンベル型ＲＮＡおよび２本鎖ＲＮＡの電気泳動像のバンドによる定量結果の経時的変化（残存率）を示す。
【図８】細胞抽出液を用いた生物学的安定性試験における本発明のダンベル型核酸複合体、ダンベル型ＲＮＡおよび２本鎖ＲＮＡの電気泳動像を示す。
【図９】細胞抽出液を用いた生物学的安定性試験における本発明のダンベル型核酸複合体、ダンベル型ＲＮＡおよび２本鎖ＲＮＡの電気泳動像のバンドによる定量結果の経時的変化（残存率）を示す。
【図１０】哺乳動物培養細胞における本発明のダンベル型核酸複合体および２本鎖ＲＮＡのＲＮＡ干渉効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
１．環状１本鎖核酸複合体
本発明の環状１本鎖核酸複合体（以下「ダンベル型核酸複合体」ともいう）は、ＲＮＡ干渉作用を提供し得るものである。ＲＮＡ干渉作用は、細胞内または生体内で、標的ＲＮＡと相補的な配列を持つ小ＲＮＡ分子が標的ＲＮＡに結合し、それを分解するか、または翻訳を抑制する作用である。
【００２１】
本発明のダンベル型核酸複合体は、センス鎖ＲＮＡ配列と、センス鎖ＲＮＡ配列に実質的に相補的なアンチセンス鎖ＲＮＡ配列と、センス鎖とアンチセンス鎖の間に両鎖を結合する同じかまたは異なる２つのループ部分を含む環状１本鎖核酸複合体である。
【００２２】
アンチセンス鎖ＲＮＡ配列は、センス鎖ＲＮＡ配列に実質的に相補的であって、ＲＮＡ干渉において標的ＲＮＡと特異的に結合する配列である。センス鎖とアンチセンス鎖は対合してステムを形成する。センス鎖ＲＮＡ配列とアンチセンス鎖ＲＮＡ配列は、具体的には、標的ＲＮＡ配列およびそれに相補的な配列、あるいは標的ＲＮＡ配列と８０〜１００％の同一性を有するＲＮＡ配列およびそれに相補的な配列を有する。ここで「同一性」は、２つの塩基配列にギャップを導入するかまたはギャップを導入しないで整列したときに、総塩基数に対する同一塩基数の割合（％）を表す。ステムの長さは、ＲＮＡ干渉作用を付与する限り、特に限定されないが、例えば１９〜３１塩基対、好ましくは２０〜２５塩基対、より好ましくは２０〜２４塩基対、さらに好ましくは２０〜２３塩基対からなる。
【００２３】
センス鎖および／またはアンチセンス鎖のＲＮＡは、修飾ヌクレオシドを含む誘導体でもよい。修飾ヌクレオシドは、塩基および糖部分の修飾体であり、アルキル化体、アルコキシル化体、イノシン、リボースの２’−Ｏ−アルキルまたは２’−ハロゲン化体、２’，４’−ＢＮＡ化体などが挙げられる。また、ヌクレオチドのリン酸基部が修飾されてもよく、リン酸基部の修飾体として、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド、メチルホスホネートなどが挙げられる。また、センス鎖および／またはアンチセンス鎖の塩基配列は、ＲＮＡ干渉作用を有する限り、ＲＮＡのみならず、ＲＮＡとＤＮＡのキメラであってもよい。さらに、センス鎖に、１〜６個の塩基のミスマッチ、好ましくは１〜３個の塩基のミスマッチ、さらに好ましくは１〜２個の塩基のミスマッチが含まれていてもよい。塩基のミスマッチが含まれると、２本鎖ＲＮＡがヘリケースにより１本鎖ＲＮＡに解離しやすくなると考えられる（Schwarz, D.S., et al. Asymmetry in the Assembly of the RNAi Enzyme Complex. Cell 115, 199-208 (2003））。ループ部分は、ステムの両端に位置し、センス鎖の５’末端のＲＮＡとアンチセンス鎖の３’末端のＲＮＡを連結し、またセンス鎖の３’末端のＲＮＡとアンチセンス鎖のＲＮＡの５’末端を連結する。ループ部分は、ポリアルキレングリコール、ＤＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡのキメラ、これらの誘導体、またはこれらの組合せで構成される。これにより、例えば２本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ループ部分がＲＮＡのみからなる環状１本鎖ＲＮＡ、またはヘアピン構造を有する２本鎖ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）と比較して、より細胞内または生体内安定性が向上し、ＲＮＡ干渉においてより持続的および徐放的な効果を発揮することができる。ループの長さは特に限定されず、ステムの両端を連結できる長さであればよい。たとえループが長くてもダイサーによるＲＮＡの切断は阻害されない。
【００２４】
ループ部分のポリアルキレングリコールは特に限定されないが、生体安全性が高いことが好ましい。これらは、そのアルキレン部分が、ハロゲン、アルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、アシル、アルキルチオなどの非限定的置換基で置換されていてもよい誘導体を含む。またモノマーの単位の炭素数が１〜４のものが好ましいが、炭素数５以上のもの、例えば５〜８のものでもよい。ポリアルキレングリコールとしては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、ポリオキシエチレンオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンオキシブチレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシブチレングリコールなどが挙げられる。本発明においてはポリエチレングリコールが特に好ましい。
【００２５】
ポリエチレングリコールは、式：−Ｏ−［（ＣＨ２）２−Ｏ−］ｎ−（式中、ｎは特に限定されないが、好ましくはｎ＝1〜１０００、より好ましくはｎ＝２〜５０、さらに好ましくは３〜２０、特に好ましくは３〜１０である。）で表される。ポリアルキレングリコールの一方または両方の水酸基はリン酸エステル化されていてもよい。
【００２６】
ループ部分のＤＮＡ、またはＤＮＡとＲＮＡのキメラは、ループの長さとして１塩基以上であればよく、好ましくは２〜２０塩基、より好ましくは６〜１２塩基、さらに好ましくは７〜１１である。ループ部分の核酸配列は、実質的に相補鎖を形成しない配列を含んでいれば特に限定されない。相補鎖を形成しないＤＮＡ配列の例としては、ＧＡＴＴＡＧＴＣＡＣＴ（配列番号１４）、ＡＧＡＧＡＡＣＴＴ（配列番号１５）、ＴＴＣＡＡＧＡＧＡ（配列番号１６）、ＴＧＴＧＣＴＧＴＣ（配列番号１７）などが挙げられる。該ＤＮＡ配列の一部は、各ＤＮＡに対応するＲＮＡに置換されていてもよい。ＤＮＡまたはＲＮＡは修飾ヌクレオシドを含む誘導体でもよい。修飾ヌクレオシドは、塩基および糖部分の修飾体であり、アルキル化体、アルコキシル化体、イノシン、リボースの２’−Ｏ−アルキルまたは２’−ハロゲン化体、２’，４’−ＢＮＡ化体などが挙げられる。また、ヌクレオチドのリン酸基部が修飾されてもよく、リン酸基部の修飾体として、ホスホロチオエート修飾ヌクレオチド、メチルホスホネートなどが挙げられる。さらに、ループ部分の核酸配列中の任意の位置にポリアルキレングリコールが含まれていてもよい。さらにまた、ループ部分にペプチドが含まれてもよい。
【００２７】
２．環状１本鎖核酸複合体の製造方法
本発明の環状１本鎖核酸複合体（ダンベル型核酸複合体）は、以下の工程：
（１）センス鎖の一部とループ部分とアンチセンス鎖の一部を含む線状１本鎖核酸複合体、およびセンス鎖の残部とループ部分とアンチセンス鎖の残部を含む線状１本鎖核酸複合体を作製する工程、および
（２）センス鎖の一部とセンス鎖の残部、およびアンチセンス鎖の一部とアンチセンス鎖の残部を連結する工程、
を含む製造方法で作製することができる。
【００２８】
あるいは、以下の工程：
（１）センス鎖とアンチセンス鎖を作製する工程、および
（２）センス鎖とアンチセンス鎖で形成された２本鎖ＲＮＡの両端に、ループ部分を連結する工程、
を含む製造方法で作製することができる。
【００２９】
ダンベル型核酸複合体のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、標的となる遺伝子の発現を抑制できるように、標的遺伝子の塩基配列から設計する。標的遺伝子は、一般に真核生物由来の遺伝子であり、好ましくは動物や植物由来の遺伝子である。設計は、複数のセンス鎖およびアンチセンス鎖を作製してそれぞれ抑制効率を確認してもよいが、例えばｓｉＲＮＡ設計用アルゴリズムなどによる設計を利用してもよい（参照文献：J.A.Jaeger et al., Methods in Enzymology(1989) 183:281-306;D.H.Mathews et al., J. Mol. Biol.(1999) 288:911-940）。設計時には、標的遺伝子と類似した配列を持つ標的遺伝子以外の遺伝子の発現を抑制すること（Off target効果）がないようにすることが望ましい。また、ダンベル型核酸複合体が細胞内または生体内でダイサーにより切断されたときに、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む生じた２本鎖ＲＮＡの３’末端が、１〜３個のＵ（ウラシル）の突出末端となるように配列を設計してもよい。センス鎖およびアンチセンス鎖の長さは特に限定されないが、例えば１９〜３１塩基、好ましくは２０〜２５塩基、より好ましくは２０〜２４塩基、さらに好ましくは２０〜２３塩基の長さで設計する。具体的な標的遺伝子は特に限定されないが、例えば過剰発現される疾患関連遺伝子、ウイルス性遺伝子など、具体的には、白血病のａｂｌ/ｂｃｒ遺伝子、加齢性黄斑変性症のＶＥＧＦ遺伝子、肝炎のＨＣＶ遺伝子などが挙げられる。
【００３０】
ループ部分は、ポリアルキレングリコール、ＤＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡのキメラ、これらの誘導体、あるいはこれらの組合せとし、ループ部分の塩基配列は、上記に示したように、実質的に相補鎖を形成しない配列を含む。
【００３１】
センス鎖の一部とループ部分とアンチセンス鎖の一部を含む線状１本鎖核酸複合体、およびセンス鎖の残部とループ部分とアンチセンス鎖の残部を含む線状１本鎖核酸複合体の作製は、市販の核酸合成機および試薬を用いて行うことができる。合成した線状１本鎖核酸複合体の５’末端をリン酸化する。これらの線状１本鎖核酸複合体を混合すると、センス鎖とアンチセンス鎖が部分的に対合し、かつセンス鎖の一部とセンス鎖の残部の間およびアンチセンス鎖の一部とアンチセンス鎖の残部の間に切れ目があるステムが形成される。この切れ目を酵素的または化学的に連結し、ダンベル型核酸複合体を製造する。酵素的に連結するには、リガーゼを用いればよく、リガーゼはＴ４ ＲＮＡリガーゼが好ましい。化学的に連結するには、縮合剤を用いればよく、縮合剤はジシクロヘキシルカルボジイミドなどが好ましく、リン酸エステルとして連結することができる。
【００３２】
あるいは、センス鎖とアンチセンス鎖をそれぞれ合成し、センス鎖とアンチセンス鎖を混合して２本鎖ＲＮＡを形成させ、この２本鎖ＲＮＡの両端にループ部分を連結して、ダンベル型核酸複合体を製造してもよい。ループ部分がポリアルキレングリコールを含む場合は、核酸の５’末端をリン酸化し、核酸にポリアルキレングリコールをリン酸化エステルにより連結するか、ポリアルキレングリコールの両端をリン酸エステル化し、核酸の３’末端および５’末端と連結することができる。あるいは、ループ部分がＤＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡのキメラの場合は、合成したセンス鎖、アンチセンス鎖およびループ部分の５’末端をリン酸化し、ループ部分と２本鎖ＲＮＡの各末端を上記酵素的または化学的に連結することができる。
【００３３】
以下、図２を参照しながら、ダンベル型核酸複合体（Ｄｂ−２３ＰＥＧ；２３塩基対からなるステムとポリエチレングリコールを含むループ部分からなるダンベル型核酸複合体）の製造方法の例を具体的に説明する。図中、ステムにおいて上段のＲＮＡ鎖はセンス鎖であり、下段のＲＮＡ鎖はアンチセンス鎖である。
【００３４】
（１）センス鎖ＲＮＡ配列の任意の切れ目部位から５’末端まで、例えばホスホロアミダイト法に基づく核酸合成機でＲＮＡ鎖を合成し、５’末端をリン酸化する。図２でいえば、３’が付されているセンス鎖の端（３’ＡＡＣ・・・）からセンス鎖の５’末端（・・・ＵＧＡ）まで合成する。
【００３５】
次に、ポリエチレングリコールを含むループ部分を合成する。ポリエチレングリコールは特に限定されないが、例えば分子量約６０〜６００００、より好ましくは約１２０〜３０００、さらに好ましくは約１８０〜１２００、特に好ましくは約１８０〜６００のポリエチレングリコールを用いることが好ましい。また、核酸合成機で用いられるスペーサー用の試薬を用いることが好ましい。図２でいえば、センス鎖の５’末端に、Ａ（アデニン）、ポリエチレングリコールのリンカー、Ｕ（ウラシル）を含むループ部分を結合する。
【００３６】
さらに、アンチセンス鎖の３’末端から任意の切れ目部位までＲＮＡ鎖を合成する。図２でいえば、アンチセンス鎖の３’末端（ＵＣＡ）から５’が付されているアンチセンス鎖の端まで合成し、リン酸化試薬で５’末端をリン酸化する。この工程により、線状１本鎖核酸複合体が作製できる。
【００３７】
なお、この工程で作製されるセンス鎖とアンチセンス鎖の塩基の数は、少なくとも１つの塩基の対合が生じるように、同じでないことが好ましい。塩基の数の違いは、１〜２５塩基であることがより好ましく、５〜１５塩基であることが更に好ましい。
【００３８】
（２）上記（１）で合成したアンチセンス鎖配列の残部のＲＮＡ鎖を合成する。図２でいえば、３’が付されているアンチセンス鎖の端（３’ＧＣＧ・・・）からアンチセンス鎖の５’末端（・・・ＧＧＡ）まで合成する。
【００３８】
次に、ポリエチレングリコールを含むループ部分を合成する。図２でいえば、アンチセンス鎖の５’末端に、Ａ（アデニン）、ポリエチレングリコールのリンカー、Ｕ（ウラシル）を含むループ部分を結合する。
【００３９】
さらに、センス鎖の残部のＲＮＡ鎖を合成する。図２でいえば、アンチセンス鎖ＲＮＡの３’末端（ＵＣＣ）から５’が付されているアンチセンス鎖の端まで合成し、リン酸化試薬で５’末端をリン酸化する。この工程により、線状１本鎖核酸複合体が作製できる。
【００４０】
（３）上記（１）で作製した線状１本鎖核酸複合体と、（２）で作製した線状１本鎖核酸複合体を混合する。（１）で作製した線状１本鎖核酸複合体に含まれるセンス鎖と、（２）で作製した線状１本鎖核酸複合体に含まれるアンチセンス鎖が対合して、ステムを形成し、図２に示すように、ステムに２つの切れ目があるダンベル型核酸複合体が形成される。
【００４１】
縮合剤またはＲＮＡリガーゼ、例えばＴ４ ＲＮＡリガーゼを添加して、この２つの切れ目を連結する。即ち、（１）で作製した線状１本鎖核酸複合体のセンス鎖の一部と（２）で作製した線状１本鎖核酸複合体のセンス鎖の残部、および、（１）で作製した線状１本鎖核酸複合体のアンチセンス鎖の一部と（２）で作製した線状１本鎖核酸複合体のアンチセンス鎖の残部を連結する。図２でいえば、センス鎖の３’が付されているＡと５’が付されているＣを連結し、アンチセンス鎖の５’が付されているＣと３’が付されているＧを連結する。
【００４２】
リガーゼの反応条件は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＢＳＡなどを含む緩衝液中で低温〜室温下で約２０時間のインキュベーションが好ましい。ポリエチレングリコールを加えることによりダンベル型核酸複合体の収率が向上し、ＢＳＡを加えることによりリガーゼの失活を防ぐことができる。ダンベル型核酸複合体の抽出は、特に限定されないが、クロロホルムを用いてダンベル型核酸複合体を抽出し、反応液に含まれる余分なポリエチレングリコールを除去することが好ましい。
【００４３】
ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡキメラのループ部分を有するダンベル型核酸複合体も、上記（１）〜（３）と同様にして作製し、回収、精製することができる。そのようなダンベル型核酸複合体（Ｄｂ−２３Ｄ７；２３塩基対からなるステムとＤＮＡを含むループ部分からなるダンベル型核酸複合体）の作製の例を図３に示す。
【００４４】
作製したダンベル型核酸複合体は、高速液体クロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、エキソヌクレアーゼによる分解を調べる試験等で、ダンベル型核酸複合体が作製されたかどうかを確認し、回収、精製することが好ましい。上記方法で作製したダンベル型核酸複合体を変性ポリアクリルアミドゲルで分析した例を図４に示す。図４の短い矢印は、Ｔ４ ＲＮＡリガーゼで１ヶ所のみ連結した生成物のバンドを示し、長い矢印は、２ヶ所とも連結した目的生成物（ダンベル型核酸複合体）のバンドを示す。破線の矢印は、ダンベル型核酸複合体の原料として用いた、上記（１）および（２）で合成した線状１本鎖核酸複合体のバンドを示す。
【００４５】
３．遺伝子の発現を抑制する方法
本発明のダンベル型核酸複合体を真核細胞または真核生物に導入し、標的ＲＮＡを不能にしてタンパク質への翻訳を阻害することができる。該細胞は、ヒト細胞を含む動物細胞、植物細胞などを含む。本発明のダンベル型核酸複合体は、生体内安定性（例えば血中安定性）が高く、持続的、徐放的に効果を発揮することができる。また、生体に対する安全性も高いと考えられる。
【００４６】
in vitroでＲＮＡ干渉法を行う場合、ダンベル型核酸複合体を、例えばエレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法などで細胞に導入することができる。
【００４７】
in vivoでＲＮＡ干渉法を行う場合、ダンベル型核酸複合体を、例えば局所投与、静脈内投与、遺伝子銃を用いる方法などで、動物または植物に導入することができる。
細胞内に導入されたダンベル型核酸複合体は、細胞内のダイサーにより切断を受け、ＲＮＡ干渉作用のある２本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）が細胞内で生じる（図１）。ｓｉＲＮＡが１本鎖となり、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（RNA induced silencing complex（ＲＩＳＣ））を形成し、１本鎖ＲＮＡと相補的な配列の標的ｍＲＮＡを認識して、ｍＲＮＡを分解し、結果として標的遺伝子の発現が抑制される。
【００４８】
４．環状１本鎖核酸複合体を含む医薬組成物
本発明の医薬組成物は、環状１本鎖核酸複合体（ダンベル型核酸複合体）を有効成分として含む。ダンベル型核酸複合体の医薬組成物への配合量は、組成物の全量に対して、例えば０．１重量％、０．５重量％、１重量％、３重量％、５重量％、１０重量％、２０重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、１００重量％であるが、これらに限定されない。
【００４９】
本発明の医薬組成物の剤形としては、例えば液体製剤（溶液剤、懸濁剤、乳濁剤など）、固体製剤（用時調製の凍結乾燥剤など）、リポソーム（カチオン性リポソームが好ましい）封入製剤などが挙げられる。投与は全身投与、局所投与を問わない。全身投与に関しては、最近、マウスとハムスターに合成ｓｉＲＮＡを全身投与したところ、標的遺伝子の効果的なサイレンシングが起き、しかも内在性マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の量や活性に影響が認められなかったことが確認されている（John, M. et al. Effective RNAi-mediated gene silencing without interruption of the endogenous microRNApathway. Nature 449, 745-747 (2007)）。投与経路としては、非経口投与が好ましく、例えば皮内または皮下投与、直腸内投与、経粘膜投与、静脈内投与などが挙げられる。
【００５０】
本発明の医薬組成物は、製剤化、剤形等に応じて、製薬上許容される賦形剤または希釈剤（生理食塩水、滅菌水、リンゲル液など）、添加剤、例えば医薬上許容される緩衝剤、等張化剤、安定化剤などを含めてもよい。
【００５１】
また、本発明の医薬組成物の投与量は、患者の性別、体重、年齢、重篤度、症状などに応じて変更し得る。
【００５２】
本発明の医薬組成物の適用は特に限定されないが、癌、遺伝子疾患、ウイルス等による感染症などの治療が挙げられる。例えば癌の治療では、本発明の医薬組成物を用いて癌細胞で特異的に発現する遺伝子やタンパク質の機能を抑制することができる。
【００５３】
以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００５４】
［実施例１］
（Ａ）ダンベル型核酸複合体等の設計
２３塩基対のステムを有する本発明のダンベル型核酸複合体（配列番号７〜１３）、および本発明のダンベル型核酸複合体の対照として２本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、配列番号５および６）を設計した（図５）。図中、対照のｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ−１と記載する。また、設計された各ダンベル型の名前において、「Ｄｂ」はダンベル型を意味し、「２３」はダンベル型核酸複合体が２３塩基対のステムを有することを意味し、「ＰＥＧ」はループ部分にポリエチレングリコールを含むことを意味する。「ＰＥＧｕｕ」はループ部分にポリエチレングリコールを含み、かつダイサーで切断されたときに生じる２本鎖ＲＮＡにＵＵ（連続した２つのウラシル）の突出末端を形成するＲＮＡを含むことを意味し、「Ｄ３」、「Ｄ５」および「Ｄ７」は、ループ部分にＤＮＡをそれぞれ３つ、５つ、７つ含むことを意味する。対照のｓｉＲＮＡ−１と各ダンベル型核酸複合体のステムにおいて、上段の配列はセンス鎖配列、下段の配列はアンチセンス鎖を示す。太字で示された配列は、標的ＲＮＡに対する相補配列を示す。四角で囲まれた部分は、対照のｓｉＲＮＡ−１と各ダンベル型核酸複合体の全てに共通な２本鎖ＲＮＡ部分を示す。ダンベル型核酸複合体のループ部分のＡ（アデニン）、Ｃ（シトシン）、Ｇ（グアニン）およびＴ（チミン）は、２’−デオキシヌクレオチドであることを示す。ダンベル型核酸複合体のループ部分に示された太線は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のリンカーを示す。ここでポリエチレングリコールの式：−［（ＣＨ２）２−Ｏ］ｎ−のｎは４である。また、比較として、Ｄｂ−２３Ｄ３のループ部分のＤＮＡが対応するＲＮＡに置換されている以外は同じ配列を持つ、ＲＮＡのみからなるダンベル型ＲＮＡ（Ｄｂ−２３）を設計した。
【００５５】
なお、本実施例では、ホタルルシフェラーゼ発現ベクターｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌの配列を標的として、上記ダンベル型核酸複合体、２本鎖ＲＮＡおよびダンベル型ＲＮＡを設計した。
【００５６】
（Ｂ）ダンベル型核酸複合体等の作製
(a)線状１本鎖核酸複合体等の合成
ダンベル型核酸複合体の原料となる線状１本鎖核酸複合体は、全てホスホロアミダイト法に基づき核酸合成機（GeneWorld H8-SE）により合成した。例えば、図５に示すＤｂ−２３ＰＥＧおよびＤｂ−２３Ｄ７は、図２（配列番号１および２）および図３（配列番号３および４）にそれぞれ示すように、センス鎖の切れ目の３’末端のＲＮＡからループ部分、アンチセンス鎖の切れ目の５’末端のＲＮＡまで、核酸合成機で線状１本鎖核酸複合体を合成し、５’末端をリン酸化した。また、アンチセンス鎖の切れ目の３’末端のＲＮＡからループ部分、センス鎖の切れ目の５’末端のＲＮＡまで、核酸合成機で線状１本鎖核酸複合体を合成し、５’末端をリン酸化した。図５に示す他のダンベル型複合体の原料の線状１本鎖核酸複合体も同様にして合成した。
【００５７】
アミダイト試薬としては、ＲＮＡは２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ保護体(Proligo)または２’−Ｏ−ＴＯＭ保護体(Glen Research)のどちらかを使用し、５’末端リン酸化にはChemical Phosphorylation Reagent (Glen Research)を用いた。また、ループ部分のＰＥＧにはSpacer Phosphoramidite 18 (Glen Research)を使用した。ＲＮＡの脱保護は定法に従い、変性ポリアクリルアミドゲルにより完全鎖長の生成物を精製した。
【００５８】
対照のｓｉＲＮＡ−１の原料となる線状１本鎖ＲＮＡについては、上記核酸合成機を用いて合成し、精製した。比較のＤｂ−２３の原料となる線状１本鎖ＲＮＡについては、センス鎖の両末端にそれぞれ、ループ部分の一部が４または５塩基連結された線状１本鎖ＲＮＡ、およびアンチセンス鎖の両末端にそれぞれ、ループ部分の残部が５または４塩基連結された線状１本鎖ＲＮＡを、上記核酸合成機を用いて合成し、精製した。
【００５９】
(b)Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを用いたライゲーション反応によるダンベル型核酸複合体の作製
Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを用いた反応液は、最終的に以下の組成となるようにした。
２μＭ  線状１本鎖核酸複合体
０．２〜０．４ユニット／μＬ  Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ
０．００６％  ＢＳＡ
２５％  ＰＥＧ６０００
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）
１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１０ｍＭ  ＤＴＴ
１ｍＭ  ＡＴＰ
（反応スケール２．５ｍＬ）
【００６０】
具体的には、上記(a)で合成、精製した２つの５’リン酸化線状１本鎖核酸複合体を、２つで４μＭとなるよう、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  ＤＴＴ、２ｍＭ  ＡＴＰ緩衝液（２ｘ緩衝液、最終的な反応液量の半分量）に溶解し、９０℃で３分間加熱後、その後室温まで徐冷した。その後、ＢＳＡ水溶液、ＰＥＧ６０００水溶液、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを上記反応液の組成になるように加え、室温で約２０時間インキュベートした。反応液（２．５ｍＬ）を、クロロホルム（２．５ｍＬ）で２回抽出し（ＰＥＧ６０００の除去）、アルコール沈殿してＲＮＡを回収し、変性ＰＡＧＥを用いて環化体を単離した（１０％ＰＡＧＥ、７Ｍ尿素、２５％ホルムアミド、１ｘＴＢＥ、１ｍｍ厚）。図４に電気泳動像を示す。図４において、長い矢印が示すバンドが環化体（ダンベル型核酸複合体）である。ここでのダンベル型核酸複合体の収率は、ダンベル型核酸複合体の原料として用いた２つの線状１本鎖核酸複合体の量を１００％とすると、Ｄｂ−２３ＰＥＧおよびＤｂ−２３Ｄ７のいずれも約５０％であった。UV shadowing法で目的物を含むバンドを可視化して切り出し、細かく粉砕した後、溶出バッファー（０．２Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０））４ｍＬで３回抽出した。Sep-Pakカートリッジを用いて脱塩（５０％アセトニトリル水６ｍＬで溶出）し、遠心エバポレーターを用いて濃縮し、さらに酢酸ナトリウム塩存在下でアルコール沈殿した。得られた核酸複合体は超純水に溶解し、適宜希釈後ＵＶ吸収スペクトルを測定し、溶液濃度を定量した。収率は、ダンベル型核酸複合体の原料として用いた２つの線状１本鎖核酸複合体の量を１００％とすると、Ｄｂ−２３ＰＥＧおよびＤｂ−２３Ｄ７で約１０〜２５％であった。他のダンベル型核酸複合体の収率も同程度であった。
【００６１】
（c)ｓｉＲＮＡおよびＤｂ−２３の作製
対照のｓｉＲＮＡ−１は、上記(a)で作製したセンス鎖およびアンチセンス鎖を混合してアニーリングさせて作製し、エタノール沈殿によりｓｉＲＮＡ−１を回収し、ＰＡＧＥで精製した。
【００６２】
比較のＤｂ−２３は、上記(a)で作製したセンス鎖を含む線状１本鎖ＲＮＡおよびアンチセンス鎖を含む線状１本鎖ＲＮＡを混合してアニーリングさせ、ループ部分をＴ４ ＲＮＡリガーゼで連結して作製した。Ｔ４ ＲＮＡリガーゼの反応条件は、上記反応スケール２．５ｍＬから２５μＬにし、上記Ｔ４ ＲＮＡリガーゼの濃度０．２〜０．４ユニット／μＬから２．０ユニット／μＬにし、上記９０℃で３分間加熱から６５℃で５分間加熱にし、上記室温で約２０時間インキュベートから１１℃で２０時間インキュベートにした以外は、上記と同様とした。エタノール沈殿によりＤｂ−２３を回収し、ＰＡＧＥで精製した。
【００６３】
（Ｃ）血清中のダンベル型核酸複合体の生物学的安定性試験
５μＭの各ダンベル型核酸複合体、または対照のｓｉＲＮＡ−１、比較のＤｂ−２３を、１ｘアニーリングバッファー（１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、２ｍＭ酢酸マグネシウム）中で９０℃、３分間加熱後、徐冷した。この核酸溶液４μＬとウシ血清（Gibco）１６μＬを混合し、３７℃でインキュベートした。２、４、６、８時間後に反応液の一部をサンプリングし、１５％未変性ＰＡＧＥで分析した。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを用いてゲルを染色し、バンドを可視化、定量した。
【００６４】
バンドによる定量結果の経時的変化をみると、対照のｓｉＲＮＡ−１、比較のＤｂ−２３は、２時間後、それぞれ約３０％、約４０％になるのに対して、本発明のダンベル型核酸複合体は、いずれも安定であった（図６および図７）。特に、Ｄｂ−２３ＰＥＧとＤｂ−２３Ｄ７は、８時間以降も７０％以上が残存しており、高い血中安定性を示すことが明らかとなった。
【００６５】
（Ｄ）細胞抽出液中のダンベル型核酸複合体の生物学的安定性試験
ＨＬ６０細胞（RIKEN CELL BANK）を培養し、細胞抽出液を調製した。終濃度がタンパク質１０ｍｇ／ｍＬ、各ダンベル型核酸複合体または対照のｓｉＲＮＡ−１、比較のＤｂ−２３が２．５μＭとなるよう混合し、３７℃でインキュベートし、０．５、１、２、４時間後に反応液の一部をサンプリングした。これを１５％未変性ＰＡＧＥで分析し、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉを用いてゲルを染色し、バンドを可視化、定量した。
【００６６】
バンドによる定量結果の経時的変化をみると、対照のｓｉＲＮＡ−１は、１時間ですでに４０％以下に分解されるのに対して、本発明のダンベル型核酸複合体は極めて安定であり、特にＤｂ−２３Ｄ７は最も安定であった（図８および図９）。Ｄｂ−２３Ｄ７は、４時間後もほとんど分解されずに残っていた。
【００６７】
（Ｅ）哺乳動物培養細胞系を用いたダンベル型核酸複合体のＲＮＡ干渉効果の測定
デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（promega）を用い、ダンベル型核酸複合体の哺乳動物培養細胞におけるＲＮＡ干渉効果を測定した。
【００６８】
ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（RIKEN CELL BANK）を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、Invitrogen/Gibco）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、GIBCO）培地中で３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。９６穴プレートに、１００μＬずつ、１．６ｘ１０４ｃｅｌｌ／ウェルとなるよう分注した。さらに３７℃、５％ＣＯ２下で２４時間培養し、約７０％コンフルエントの状態で２種のプラスミドベクター（ｐＧＬ３−ＣｏｎｔｒｏｌおよびｐＲＬ−ＴＫ（内部標準）、いずれもpromega）と各ダンベル型核酸複合体および対照のｓｉＲＮＡ−１を、トランスフェクション試薬GeneSilencer (Genlantis)を用い、トランスフェクション試薬添付のプロトコールに従い、コトランスフェクションした。トランスフェクション時の濃度条件は、０．２μｇ  ｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ／０．０２μｇ  ｐＲＬ−ＴＫ／２５ｎＭ各ダンベル型核酸複合体または対照のｓｉＲＮＡ−１（最終量１００μＬ）とした。
【００６９】
具体的には、上記細胞に血清を含まないＤＭＥＭ培地５５．６μＬを加えた状態とし、下記の組成のトランスフェクション用混合溶液を添加することで行った。
GeneSilencer                                    １μＬ
ＤＭＥＭ培地                                  ２５μＬ
ｓｉＲＮＡ希釈液                            ２．５μＬ
ＤＭＥＭ培地                                  １５μＬ
ＲＮＡ（５ｐｍｏｌ／μＬ）                  ０．５μＬ
ｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ（１μｇ／μＬ）    ０．２μＬ
ｐＲＬ−ＴＫ（０．１μｇ／μＬ）            ０．２μＬ
４４．４μＬ
【００７０】
トランスフェクション後、３７℃、５％ＣＯ２下で４時間インキュベートし、２０％血清入りＤＭＥＭ培地１００μＬをそれぞれのウェルに加えた。３７℃でさらに２０時間インキュベート後、Dual-luciferase Reporter Assay System (promega)を用い、添付のプロトコールに従いルシフェラーゼ発現量を定量した（条件：試薬量３０μＬ、delay time２秒、read time１０秒。機器 Wallac ARVO SX 1420 MultilabelCounter）。比較として、バッファーのみ（対照）の条件も同様に評価した。ホタルルシフェラーゼの発光強度は、内部標準であるレニラルシフェラーゼの発光強度により補正した。
【００７１】
結果を図１０に示す。ｓｉＲＮＡ−１とＤｂ−２３Ｄ３は、ほぼ同等の活性を有していることが明らかとなった。さらに、Ｄｂ−２３Ｄ７やＤｂ−２３ＰＥＧなど、ｓｉＲＮＡほどではないが十分な阻害活性が観察された。
【００７２】
以上の実施例から、ダンベル型核酸複合体は、血清中、細胞抽出液中で十分な安定性を有し、また哺乳動物細胞において十分なＲＮＡ干渉効果を発揮することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明の環状１本鎖核酸複合体は、細胞または生体内に投与されるとダイサーに特異的に認識され、両側のループ部分が切断されて２本鎖ＲＮＡになり（図１）、この２本鎖ＲＮＡがＲＮＡ干渉作用を持ち得る。本発明の環状１本鎖核酸複合体は、従来の２本鎖ＲＮＡよりも優れた生体内安定性（例えば血中安定性）を有し、かつＲＮＡ干渉において持続的、徐放的な効果を発揮し得るという格別優れた作用効果を奏する。従って、持続性および徐放性を有し、かつＲＮＡ干渉作用を付与し得る環状１本鎖核酸複合体含有医薬品を提供することが可能となる。この医薬品は、全身投与することも患部に直接投与することもでき、かつその投与量を減らすことが可能となる。
【００７４】
さらにまた、本発明の製造方法により、生体内安定性の高い環状１本鎖核酸複合体を簡易に効率よく製造することができる。
【００７３】
本発明のダンベル型核酸複合体は、医学、農学分野などでの広範な応用が期待される。例えば、医薬品開発、農薬開発、植物又は動物あるいはそれらの細胞での特定の遺伝子やタンパク質の機能の解明、例えばノックアウト法による機能の解明など、種々の目的のために本発明のダンベル型核酸複合体を使用することができる。
【００７５】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図４】
0005540312.tif 000009
【図６】
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【図８】
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【配列表】
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