(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における自己免疫性疾患又は障害の重症度又は発症リスクを評価することを補助する方法であり、
該被験体から得られた試料中の可溶性Ｂ７−Ｈ４のレベルを決定するステップと、
前記試料中の前記可溶性Ｂ７−Ｈ４のレベルを、正常コントロールあるいは自己免疫性疾患または障害の重症度又は発症リスクを示すことが分かっているレベルを伴うコントロールにおけるレベルと比較するステップ
を含み、ここで、
該自己免疫性疾患または障害は、関節リウマチまたは全身性エリテマトーデスである、方法。
【請求項２】
被験体における自己免疫性疾患又は障害の診断を補助するか、または被験体における自己免疫性疾患又は障害の発症についての性向を検出することを補助するための方法であり、
該被験体から得られた生物学的試料における可溶性Ｂ７−Ｈ４のレベルを決定するステップを含み、
コントロールにおける可溶性Ｂ７−Ｈ４のレベルに対する該生物学的試料中の可溶性Ｂ７−Ｈ４のレベルの上昇は、自己免疫性疾患又は障害の指標であるか、または自己免疫性疾患又は障害を発症する性向が増加していることの指標であり、ここで、該自己免疫性疾患または障害は、関節リウマチまたは全身性エリテマトーデスである、方法。
【請求項３】
自己免疫性疾患又は障害の処置について被験体を選択することを補助するための方法であって、（ａ）該被験体から得られた生物学的試料における可溶性Ｂ７−Ｈ４のレベルを決定するステップ；および（ｂ）コントロールにおける可溶性Ｂ７−Ｈ４のレベルに対して、該生物学的試料における可溶性Ｂ７−Ｈ４のレベルを比較するステップを包含し、（ｃ）該生物学的試料における可溶性Ｂ７−Ｈ４のレベルが該コントロールにおける可溶性Ｂ７−Ｈ４のレベルより高い場合は、処置についての該被験体の選択の指標となり、ここで、該自己免疫性疾患または障害は、関節リウマチまたは全身性エリテマトーデスである、
方法。
【請求項４】
前記試料が、血液、血漿、唾液、リンパ、脳脊髄液、および痰からなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
関節リウマチまたは全身性エリテマトーデスを治療又は阻害するためのシステムであって、
個体から生物流体を除去するための手段；
処置された生物流体を得るために、前記生物流体から可溶性Ｂ７−Ｈ４を除去するための手段、
を含むシステムであり、そして、該処置された生物流体は、該個体に投与して戻されることが意図される、システム。
【請求項６】
前記生物流体が、全血液又は血漿を含む、請求項５に記載のシステム。
【請求項７】
可溶性Ｂ７−Ｈ４を除去するための手段が、限外濾過、アフェレーシス、又は透析により行われる、請求項５に記載のシステム。
【請求項８】
前記可溶性Ｂ７−Ｈ４を除去するための手段が、免疫吸着技術を用いることにより行われる、請求項５に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する出願への相互参照
本願は、２００６年１２月２７日に出願された米国特許出願第６０／８７７，３１９号および２００７年７月１３日に出願された米国特許出願第６０／９４９，７４２号の利益と米国特許出願第６０／８７７，３１９号および米国特許出願第６０／９４９，７４２号に対する優先権を主張する。米国特許出願第６０／８７７，３１９号および米国特許出願第６０／９４９，７４２号の両方は、その許される全体が参考として援用される。
【０００２】
政府の支援
本発明は、国立衛生研究所により与えられた補助金番号第Ｒ０１  ＣＡ９８７３１のもと、政府の支援でなされた。政府は、本発明における一定の権利を有す。
【０００３】
本発明は、一般に、炎症反応を調節する組成物及び方法に関し、特に、自己免疫性障害に関係する炎症反応を治療又は阻害するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
免疫応答を調節することは、多くの疾患及び障害の処置において重要である。例えば、癌又は感染症に罹患している患者の免疫応答を増強することは有益であると考えられる。あるいは、炎症状態を患う患者における免疫反応を阻害又は減少することが、有益である。
【０００５】
慢性的及び持続的炎症は、関節リウマチ（ＲＡ：ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）及び全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ：ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）等の全身性自己免疫疾患の発病及び進行の主な原因である。ＲＡは、関節破壊、変形及び機能喪失につながることの多い、炎症性の高い多発性関節炎である。末梢関節の付加的な対称性の腫れが、病気の特徴である。関節外特徴及び全身症状が一般に生じ得、関節症状の開始に先立ちうる。慢性的痛み、能力障害及び超過死亡率が、残念な後遺症である。ＲＡの進行の間には、滑膜過形成及びＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞及び好中球による滑膜間質への浸潤の結果、炎症関節の滑膜表層が厚みを増す（非特許文献１；非特許文献２）。ＳＬＥにおいては、自己抗体の産生が、糸球体、皮膚、肺及び滑膜を含む多くの組織及び臓器における免疫複合体の蓄積をもたらし、これにより特徴的な慢性炎症及び組織損傷を伴うリウマチ性病変を生成する。
【０００６】
いくつかの関節炎モデルにおいては、好中球の枯渇が、関節炎の重症度の低下をもたらした。最も一般的なＲＡの動物モデルは、ニワトリコラーゲンＩＩ型（ＣＩＩ）による曝露によりＤＢＡ／１ｊマウスの全主要関節における持続的な慢性炎症が誘導される、コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ：ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）である（非特許文献３）。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＲＡの病因において中心的役割を果たすと長いあいだ考えられていたが、ＲＡの開始、進行及び維持における好中球の重要な役割の検討への新たな関心がある。損傷における好中球の大量の浸潤により、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１及びＩＬ−６を含む炎症誘発性サイトカインが放出され、これが好中球及び他の炎症細胞の機能に影響を与えうる。
【０００７】
広範囲に研究されるＳＬＥのネズミモデルは、Ｆａｓアポトーシス遺伝子の突然変異が、ヒトＳＬＥに類似した自発的自己免疫性障害をもたらすｌｐｒ系統である。この系統における研究は、ヒトＳＬＥ症状の多くの面を反復する。例えば、ｌｐｒマウスは、全免疫グロブリンの多クローン性の増加だけでなく、抗クロマチン、抗ＤＮＡ、及び抗ＩｇＧ血清自己抗体を産生する。病気の重症度は、遺伝的背景に強く依存する。例えば、ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスは、ＤＮＡに対する高レベルのＩｇＧ自己抗体を産生し、免疫複合体の蓄積による重度の糸球体腎炎を発症し、他方でＣ５７ＢＬ／６（Ｂ６）−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスは、はるかに軽度の免疫病理を伴って、低レベルの自己抗体を産出する。
【０００８】
共刺激及び共阻害機能を有するものを含む補助シグナル分子は、有効な免疫反応の誘導、及び不要な自己免疫の防止のために重要である。Ｂ７−ＣＤ２８ファミリーを通じたシグナルが、このバランスの主なレギュレータであり、自己免疫の制御において重要な役割を果たすことが明らかになっている。全身性自己免疫疾患における炎症反応の持続は、共阻害機能の障害又は共刺激機能の増強によるバランスの喪失を意味する。この点に関しては、その受容体ＰＤ−１に結合後の主な共阻害分子Ｂ７−Ｈ１に対する自己抗体が、ＲＡ患者の有意な割合において見られ、自己抗体の存在がＲＡ症状の進行に関与していることが、特に興味深い。
【０００９】
Ｂ７−ＣＤ２８ファミリー分子の可溶性形態も、リウマチ様疾患の進行に関与している。最近の研究は、可溶性ＰＤ−１がＲＡ患者において検出でき、可溶性ＰＤ−１のレベルが滑液のＴＮＦ−アルファ濃度と相関づけられることを示す。Ｂ７−Ｈ４は、より最近Ｂ７ファミリーメンバーに加えられた。Ｂ７−Ｈ４は、推定受容体に結合することにより、Ｔ細胞に対して強力な阻害作用を有する。その表面発現は、ＩＬ−１０及びＩＬ−６を含む炎症性サイトカインにより、マクロファージ及び腫瘍細胞において上方制御されうると考えられるが、細胞表面Ｂ７−Ｈ４は正常組織において通常は検出されない。Ｂ７−Ｈ４が、抗原刺激の存在下でＴ細胞反応を抑制しうることが報告されている。可溶性Ｂ７−Ｈ４（ｓＨ４）は、可能性のあるバイオマーカーとして卵巣癌患者においても検出されているが、ｓＨ４の産生及び機能の機序は知られない。Ｂ７−Ｈ４欠損マウスは、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａの主な感染に対するＴヘルパー１型Ｔ細胞反応がやや増強されることが分かった。独立して産生されたＢ７−Ｈ４ノックアウトマウスを用いて、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ菌感染に対する抵抗につながるＢ７−Ｈ４の欠如は、好中球前駆体の増殖の直接制御により生じることが示された。まとめると、Ｂ７−Ｈ４が免疫、特に自己免疫及び感染に対する抵抗に関与することは明らかだが、機序は不明である。
【００１０】
したがって、自己免疫性障害の治療のための組成物及び方法を提供することが、本発明の目的である。
【００１１】
炎症反応の治療のための組成物及び方法を提供することが、本発明の別の目的である。
【００１２】
可溶性Ｂ７−Ｈ４の生物活性を阻害、減少、又は遮断するための組成物及び方法を提供することが、本発明のさらに別の目的である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｆｅｌｄｍａｎｎ，Ｍ．ほか、Ｃｅｌｌ，８５：３０７−１０（１９９６）
【非特許文献２】Ｍｏｒｅｌａｎｄ，Ｌ．Ｗ．ほか、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，３３７：１４１−７（１９９７）
【非特許文献３】Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．Ｏ，ほか、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９１：２７６２−６（１９９４）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
個体における炎症反応を減少、阻害、又は軽減するために有効な量の可溶性Ｂ７−Ｈ４（ｓＨ４）アンタゴニストを含む組成物、及び、炎症性障害及び自己免疫性疾患又は障害の治療又は予防の方法が開発されている。Ｔ細胞性免疫のＢ７−Ｈ４阻害を含めて、可溶性Ｈ４（「ｓＨ４」）がＢ７−Ｈ４活性を妨げることが発見されている。したがって、ｓＨ４生物活性の干渉は、Ｂ７−Ｈ４活性を回復する有効な方法であり、したがって、自己免疫性疾患又は障害を含む炎症性疾患又は障害を治療するための有効な方法を提供すると考えられる。
【００１５】
好適なｓＨ４アンタゴニストには、ｓＨ４結合剤、例えばｓＨ４の抗体及び天然リガンド、ｓＨ４アンタゴニストをコードする核酸、プロテアーゼ阻害剤、Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド、Ｂ７−Ｈ４融合蛋白質、及び核酸をコードするｓＨ４に特異的な阻害核酸が挙げられるが、これらに限定されるものではない。炎症性反応又は自己免疫性疾患又は障害を治療する別の方法は、ｓＨ４の発現を下方制御又は阻害する薬剤、インビボでｓＨ４を不活性化する薬剤、インビボでｓＨ４の天然リガンドと競合する薬剤、又はその組み合わせを、必要な個体に投与することによる。
【００１６】
ある実施態様では、好中球媒介性炎症が減少又は阻害される。一つ以上の症状を減少、阻害、又は軽減するために、ｓＨ４アンタゴニストの一つ以上で治療できる代表的な炎症性疾患又は障害には、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円形脱毛症、強直性脊椎炎（ａｎｋｌｏｓｉｎｇ  ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）、抗リン脂質症候群、自己免疫アジソン病、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫内耳疾患、自己免疫リンパ球増殖性症候群（ＡＬＰＳ：ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、自己免疫血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ：ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ）、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、脂肪便症−皮膚炎、慢性疲労症候群免疫不全症候群（ＣＦＩＤＳ：ｃｈｒｏｎｉｃ  ｆａｔｉｇｕｅ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、良性粘膜類天疱瘡、寒冷凝集素症、クレスト症候群、クローン病、ドゴー病、皮膚筋炎、皮膚筋炎−若年性、円板状ループス、混合型クリオグロブリン血症、線維症−繊維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ：ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ  ｐｕｒｐｕｒａ）、Ｉｇａ腎症、インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型）、若年性関節炎、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群（ｐｏｌｙｇｌａｎｃｕｌａｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ）、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎及び皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆管萎縮症、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、全身強直性症候群、高安動脈炎、巨細胞性動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、脈管炎、白斑、及びヴェーゲナー肉芽腫症を含む自己免疫性疾患又は障害が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１７】
炎症反応又は自己免疫性疾患又は障害を治療するさらに別の方法は、個体の血液又は血漿からｓＨ４を選択的に除去することによる。血液又は血漿からｓＨ４を選択的に除去するために、血液又は血漿が、ｓＨ４に特異的な結合剤によりエクスビボで処置されうる。処置された血液又は血漿が、個体に戻されうる。
【００１８】
炎症反応又は自己免疫性疾患又は障害の重症度は、個体の生体試料におけるｓＨ４のレベルを測定し、試料中のｓＨ４のレベルを、病気又は障害の進行における様々な時点で個体から得たｓＨ４の所定の量に相関させることにより評価できる。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
必要な個体における炎症反応の一つ以上の症状を減少又は阻害するために有効な量の可溶性Ｂ７−Ｈ４アンタゴニストと、前記アンタゴニストの投与のための薬理学上許容可能な担体とを含む、医薬組成物用量単位。
（項目２）
前記Ｂ７−Ｈ４アンタゴニストが、（ｉ）直接第二ポリペプチドに、又は（ｉｉ）選択的に前記第二ポリペプチドに融合されたリンカーペプチド配列に融合されたＢ７−Ｈ４細胞外ドメインの全部又は一部を含む第一融合パートナーを含む、融合蛋白質である、項目１に記載の医薬組成物。
（項目３）
前記第一融合パートナーが、Ｂ７−Ｈ４の前記膜遠位ＩｇＶドメインと前記膜近位ＩｇＣドメインとを含む、項目２に記載の医薬組成物。
（項目４）
第一ユニット内の前記アンタゴニストと、第二ユニット内の前記薬理学上許容可能な担体とを含むキット内の、項目１に記載の医薬組成物であり、前記ユニットが、投与のために組み合わせられる、項目１に記載の医薬組成物。
（項目５）
前記炎症反応が、自己免疫性疾患又は障害と関連する、項目１に記載の医薬組成物。
（項目６）
前記炎症反応が、好中球媒介性である、項目１に記載の医薬組成物。
（項目７）
前記自己免疫性疾患又は障害が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円形脱毛症、強直性脊椎炎（ａｎｋｌｏｓｉｎｇ  ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）、抗リン脂質症候群、自己免疫アジソン病、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫内耳疾患、自己免疫リンパ球増殖性症候群（ＡＬＰＳ）、自己免疫血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、脂肪便症−皮膚炎、慢性疲労症候群免疫不全、症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、良性粘膜類天疱瘡、寒冷凝集素症、クレスト症候群、クローン病、ドゴー病、皮膚筋炎、皮膚筋炎−若年性、円板状ループス、混合型クリオグロブリン血症、線維症−繊維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、Ｉｇａ腎症、インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型）、若年性関節炎、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群（ｐｏｌｙｇｌａｎｃｕｌａｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ）、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎及び皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆管萎縮症、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、全身強直性症候群、高安動脈炎、巨細胞性動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、脈管炎、白斑、及びヴェーゲナー肉芽腫症からなる群より選択される、項目５に記載の医薬組成物。
（項目８）
必要な個体における炎症反応の一つ以上の症状を治療又は阻害する方法であり、前記個体における前記炎症反応の前記一つ以上の症状を減少又は阻害するために有効な量の可溶性Ｂ７−Ｈ４のアンタゴニストを、前記個体に投与するステップを含む、方法。
（項目９）
前記炎症反応が、自己免疫性疾患又は障害と関連する、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記個体が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円形脱毛症、強直性脊椎炎（ａｎｋｌｏｓｉｎｇ  ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）、抗リン脂質症候群、自己免疫アジソン病、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫内耳疾患、自己免疫リンパ球増殖性症候群（ａｌｐｓ）、自己免疫血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、脂肪便症−皮膚炎、慢性疲労症候群免疫不全、症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、良性粘膜類天疱瘡、寒冷凝集素症、クレスト症候群、クローン病、ドゴー病、皮膚筋炎、皮膚筋炎−若年性、円板状ループス、混合型クリオグロブリン血症、線維症−繊維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、Ｉｇａ腎症、インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型）、若年性関節炎、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群（ｐｏｌｙｇｌａｎｃｕｌａｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ）、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎及び皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆管萎縮症、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、全身強直性症候群、高安動脈炎、巨細胞性動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、脈管炎、白斑、及びヴェーゲナー肉芽腫症からなる群より選択される自己免疫性疾患を有する、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記可溶性Ｂ７−Ｈ４アンタゴニストが、Ｂ７−Ｈ４細胞外ドメインに対して少なくとも８０％の配列同一性を含むＢ７−Ｈ４ポリペプチドを含み、液性免疫、細胞性免疫、または両方を抑制又は阻害できる、項目８に記載の方法。
（項目１２）
前記可溶性Ｂ７−Ｈ４アンタゴニストが、イムノグロビン又はその断片を含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記イムノグロビン又はその断片が、イムノグロビンＦｃ領域を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
Ｂ７−Ｈ４細胞外ドメインに対して少なくとも８０％の配列同一性を含むＢ７−Ｈ４ポリペプチドをコードする核酸を、前記個体において発現するステップを含む、項目８に記載の方法。
（項目１５）
前記Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドが、イムノグロビンＦｃ領域をさらに含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
自己免疫性疾患又は障害の重症度又は発症リスクを評価する方法であり、
個体から生体試料を得るステップと；
前記試料中の可溶性Ｂ７−Ｈ４のレベルを決定するステップと、
前記試料中の前記可溶性Ｂ７−Ｈ４のレベルを、正常コントロールあるいは自己免疫性疾患または障害の重症度又もしくは発症リスクを示すことが分かっているレベルを伴うコントロールにおけるレベルと比較するステップ
を含む、方法。
（項目１７）
前記自己免疫性疾患又は障害が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円形脱毛症、強直性脊椎炎（ａｎｋｌｏｓｉｎｇ  ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）、抗リン脂質症候群、自己免疫アジソン病、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫内耳疾患、自己免疫リンパ球増殖性症候群（ａｌｐｓ）、自己免疫血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、脂肪便症−皮膚炎、慢性疲労症候群免疫不全、症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、良性粘膜類天疱瘡、寒冷凝集素症、クレスト症候群、クローン病、ドゴー病、皮膚筋炎、皮膚筋炎−若年性、円板状ループス、混合型クリオグロブリン血症、線維症−繊維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、Ｉｇａ腎症、インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型）、若年性関節炎、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群（ｐｏｌｙｇｌａｎｃｕｌａｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ）、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎及び皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆管萎縮症、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、全身強直性症候群、高安動脈炎、巨細胞性動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、脈管炎、白斑、及びヴェーゲナー肉芽腫症からなる群より選択される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
炎症反応を治療又は阻害する方法であり、
ａ）個体から生物流体を除去するステップと；
ｂ）処置された生物流体を得るために、前記生物流体から可溶性Ｂ７−Ｈ４を除去するステップと；
ｃ）前記処置された生物流体を、前記個体に戻すステップと
を含む、方法。
（項目１９）
前記生物流体が、全血液又は血漿を含む、項目１８に記載の方法。
（項目２０）
可溶性Ｂ７−Ｈ４を除去するステップが、限外濾過、アフェレーシス、又は透析により生じる、項目１８に記載の方法。
（項目２１）
可溶性Ｂ７−Ｈ４が、免疫吸着技術を用いて、前記生物流体から選択的に除去される、項目１８に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】Ｂ７−Ｈ４遺伝子の破壊を示す概略図である。マウスＢ７−Ｈ４遺伝子のＩｇＶ及びＩｇＣドメインをコードするエクソンを含有する４．７ｋｂ  ＤＮＡ断片がネオマイシン耐性（Ｎｅｏ）遺伝子をコードする１．７ｋｂ断片によって置換されている。閉四角形はＢ７−Ｈ４をコードするエクソンを表す。エクソン間の線はイントロン配列を表す。開四角は非翻訳エクソンを表す。Ｎｅｏは斜線を施した四角により表されている。
【図２ａ】野生型マウス（◆）又はＢ７−Ｈ４ＫＯマウス（□）におけるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（ＬＭ）感染後日数に対する生残百分率を示す折れ線グラフである。
【図２ｂ】ＬＭを感染させた野生型マウス（○）又はＢ７−Ｈ４ＫＯマウス（▲）の２又は３日目における脾臓１ｇ当たりのＣＦＵ（×１０８）を示すグラフである。
【図２ｃ】ＬＭを感染させた野生型マウス（◆）又はＢ７−Ｈ４ＫＯマウス（□）におけるＬＭ感染後日数に対する脾臓顆粒球百分率を示す折れ線グラフである。
【図２ｄ】リステリア菌感染の２４時間前に１５０ｐｇのＧｒ−１  ｍＡｂ又は対照ラットＩｇＧ（ＬＰＳ不含）をｉ．ｐ．注射した３匹のＢ７−Ｈ４ＫＯマウス又は同腹仔対照における肝臓１ｇ当たりのＣＦＵ×１０４を示す棒グラフである。次いで、マウスに３×１０６ＣＦＵのリステリア菌をｉ．ｐ．注射した。感染後２４時間に、マウスを屠殺し、肝臓中のリステリア菌を計数した。
【図３】野生型マウス（◆）又はＢ７−Ｈ４ＫＯマウス（□）におけるＬＭ感染後の時間に対する顆粒球当たりのＬＭ  ＣＦＵを示す棒グラフである。
【図４】ＲＫＯマウス（◆）又はＢ７−Ｈ４ＫＯマウス（□）におけるＬＭ感染後の日数に対する生存百分率を示す折れ線グラフである。
【図５ａ】図に示した濃度の組換えＧ−ＣＳＦと３日間平板培養した野生型マウス（◆）又はＢ７−Ｈ４ＫＯマウス（□）の２×１０６個の骨髄細胞におけるＧ−ＣＳＦ（ｎｇ／ｍｌ）に対するＣＰＭを示す折れ線グラフである。培養液は、培養終了前１８時間３ＨＴｄＲでパルスし、収集してシンチレーションカウンターにより計数した。
【図５ｂ】フローサイトメトリーにより分析したゲートされたＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋顆粒球中のＣＦＳＥの希釈度の線グラフのパネルである。そこに示したマウスからの２×１０６個の骨髄細胞をＣＦＳＥで標識し、５日間培養した。細胞は収集してＧｒ−１／ＣＤ１１ｂ  ｍＡｂで二重に染色した。
【図６】日数に対するＣＰＭの折れ線グラフである。正常Ｂ６マウスからの２×１０６個の骨髄細胞を、組換えマウスＧ−ＣＳＦの非存在下（Ａ）、０．１ｎｇ／ｍｌの存在下（Ｂ）又は１ｎｇ／ｍｌの存在下（Ｃ）に２０μｇ／ｍｌの組換えマウスＢ７−Ｈ４Ｉｇ（△）又はマウスＩｇ対照蛋白（▲）で被覆した９６−穴プレート中で平板培養した。図に示したように、２乃至５日目に細胞を収集した。培養液は培養終了前１８時間３ＨＴｄＲでパルスし、収集してシンチレーションカウンターにより計数した。＊Ｐ＜０．０５。
【図７ａ】健常ドナー（ＨＡ）（◆）、ＲＡ（▲）、及びＳＬＥ（□）患者の血清中の、ｓＨ４を示すグラフである。
【図７ｂ】ｓＨ４がＲＡ患者に存在し、健常ドナー存在しないことを示すウェスタンブロットである。
【図７ｃ】ｓＨ４の濃度と、ＲＡの重症度群０（▲）、１（Ｘ）、２（◆）、及び３（■）との間の相関関係を示すグラフである。
【図８ａ】Ｂ７−Ｈ４Ｖ、Ｂ７−Ｈ４ＶＣ及びＢ７−Ｈ４Ｉｇの概略図である。ＩｇＶドメイン；ＩｇＶ、ＩｇＣドメイン；ＩｇＣ。ＴＭ；膜貫通ドメイン、ＣＹ；細胞質ドメイン。
【図８ｂ】ＣＦＡにおける、ニワトリコラーゲンＩＩ型で０日目及び２１日目に免疫したマウスの、コラーゲン注射後の日数に対する％発病率のグラフである。−１日目及び２０日目に、三つのマウス群が、コントロールベクター（□）、Ｂ７−Ｈ４Ｖ（▲）、又はＢ７−Ｈ４ＶＣ（■）での水圧注射であった；平均値±ｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝５）。
【図８ｃ】ＣＦＡにおける、ニワトリコラーゲンＩＩ型で０日目及び２１日目に免疫したマウスの、コラーゲン注射後の日数に対する臨床スコアのグラフである。−１日目及び２０日目に、三つのマウス群に、コントロール（□）、Ｂ７−Ｈ４Ｖ（▲）、又はＢ７−Ｈ４ＶＣ（■）ベクターが水圧注射された；平均値±ｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝５）。
【図８ｄ】抗ＣＩＩ全ＩｇＧ血清レベルを示す棒グラフである。白；コントロールベクター、灰色；Ｂ７−Ｈ４Ｖ、黒；Ｂ７−Ｈ４ＶＣ；平均値±ｓ．ｄ．
【図８ｅ】ＣＩＩμｇ／ｍｌに対する毎分カウント数の線グラフである。コントロールベクター（□）、Ｂ７−Ｈ４Ｖ（▲）、又はＢ７−Ｈ４ＶＣ（■）が注射されたＣＩＡマウスからの３０日目の全脾細胞が、指定の量のＣＩＩの存在下で７２時間培養された；平均値±ｓ．ｄ．
【図８ｆ】ＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γ及びＩＬ−１７産生につき評価された、７２時間培養後の全脾細胞の上清の棒グラフである；平均値±ｓ．ｄ．
【図８ｇ】ＣＦＡにおける、ニワトリコラーゲンＩＩ型で０日目及び２１日目に免疫したマウスの、コラーゲン注射後の日数に対する発病率の線グラフである。ＷＴマウス（□）、Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウス（■）；平均値±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝５）。
【図８ｈ】ＣＦＡにおける、ニワトリコラーゲンＩＩ型で０日目及び２１日目に免疫したマウスの、臨床スコアの線グラフである。ＷＴマウス（□）、Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウス（■）；平均値±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝５）。
【図９ａ】ｓＨ４が、そのドミナントネガティブ活性により好中球を活性化することを示す、空気嚢アッセイの棒グラフである。皮下空気嚢に、ＬＰＳ（５０μｇ）が注射された。５時間後、Ｇｒ−１＋好中球が、滅菌生食水で嚢からすすがれた細胞のフローサイトメトリにより定量された。各棒は、各群における６〜８匹のマウスの平均を表す；平均値±ｓ．ｄ．
【図９ｂ】コラーゲン曝露後の日数に対する発病率の線グラフである。六つのマウス群が、コントロールベクター及びコントロールラットＩｇＧ（▲）、コントロールベクター及び抗Ｇｒ−１  Ａｂ（□）、Ｂ７−Ｈ４Ｖ及びコントロールラットＩｇＧ（●）、ならびに、Ｂ７−Ｈ４Ｖ及び抗Ｇｒ−１  Ａｂ（○）、Ｂ７−Ｈ４ＶＣ及びコントロールラットＩｇＧ（■）、ならびに、Ｂ７−Ｈ４ＶＣ及び抗Ｇｒ−１  Ａｂ（■）で処置された；平均値±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝５）
【図９ｃ】コラーゲン曝露後の日数に対するＣＩＡマウスの臨床スコアの線グラフである。六つのマウス群が、コントロールベクター及びコントロールラットＩｇＧ（▲）、コントロールベクター及び抗Ｇｒ−１  Ａｂ（□）、Ｂ７−Ｈ４Ｖ及びコントロールラットＩｇＧ（●）、ならびに、Ｂ７−Ｈ４Ｖ及び抗Ｇｒ−１  Ａｂ（○）、Ｂ７−Ｈ４ＶＣ及びコントロールラットＩｇＧ（■）、ならびに、Ｂ７−Ｈ４ＶＣ及び抗Ｇｒ−１  Ａｂ（■）で処置された；平均値±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝５）
【図１０ａ】ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおける、抗二本鎖ＤＮＡ自己抗体の血清レベルの線グラフである。四つのマウス群が、コントロールベクター及びコントロールラットＩｇＧ（▲）、コントロールベクター及び抗Ｇｒ−１  Ａｂ（□）、Ｂ７−Ｈ４ＶＣ及びコントロールラットＩｇＧ（■）、ならびに、Ｂ７−Ｈ４ＶＣ及び抗Ｇｒ−１  Ａｂ（□）で処置された；平均値±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝５）。
【図１０ｂ】Ｂ６−ｌｐｒ／ｌｐｒマウス（□）又はＢ６−ｌｐｒ／ｌｐｒ×Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウス（■）における、抗二本鎖ＤＮＡ自己抗体の血清レベルの線グラフである；平均値±ｓ．ｅ．ｍ．
【図１０ｃ】生後２４週目のＢ６−ｌｐｒ／ｌｐｒマウス（□）又はＢ６−ｌｐｒ／ｌｐｒ×Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウス（□）の、脾臓及び末梢リンパ節における重量及び全細胞数を示すグラフのパネルである。（ｎ＝５）
【図１０ｄ】生後２４週目のＢ６−ｌｐｒ／ｌｐｒマウス（□）又はＢ６−ｌｐｒ／ｌｐｒ×Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウス（□）の、蛋白尿グレードを示すグラフである。（ｎ＝５）
【図１１ａ】ＣＦＡにおける、ニワトリコラーゲンＩＩ型で０日目及び２１日目に免疫したマウスの、発病率の線グラフである。−１日目及び２０日目に、三つのマウス群は、コントロールベクター（□）又はＢ７−Ｈ４Ｉｇ（■）と水圧注射であった；平均値±ｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝５）
【図１１ｂ】ＣＦＡにおける、ニワトリコラーゲンＩＩ型で０日目及び２１日目に免疫したマウスの、臨床スコアの線グラフである。−１日目および２０日目に、三つのマウス群は、コントロールベクター（□）又はＢ７−Ｈ４Ｉｇ（■）での水圧注射であった；平均値±ｓ．ｅ．ｍ（ｎ＝５）
【図１１ｃ】抗ＣＩＩ全ＩｇＧの血清レベルの棒グラフである。白；コントロールベクター、黒；Ｂ７−Ｈ４Ｉｇ；平均値±ｓ．ｄ．
【図１１ｄ】コントロールベクター（□）又はＢ７−Ｈ４Ｉｇ（■）が注射されたＣＩＡマウスからの、３０日目の全脾細胞のＣＩＩμｇ／ｍｌに対する毎分カウント数の線グラフである。指定の量のＣＩＩの存在又は非存在下で７２時間培養された；平均値±ｓ．ｄ．
【図１１ｅ】ＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γ及びＩＬ−１７産生につき評価された、７２時間培養後の全脾細胞の上清を示す棒グラフである；平均値±ｓ．ｄ．
【図１２】コントロールベクター、Ｂ７−Ｈ４Ｖ、Ｂ７−Ｈ４ＶＣ又はＢ７−Ｈ４Ｉｇで処置されたＣＩＡマウスにおける、抗ＣＩＩ  ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂの血清レベルの棒グラフである。３０日目にＥＬＩＳＡで測定された；平均値±ｓ．ｄ．
【図１３】コントロールベクター（□）、Ｂ７−Ｈ４Ｖ（▲）、Ｂ７−Ｈ４ＶＣ（■）又はＢ７−Ｈ４Ｉｇ（●）が注射されたＣＩＡマウスにおける３０日目の脾臓ＣＤ４Ｔ細胞の、指定の量のＣＩＩの存在下における７２時間の増殖を示す、ＣＩＩμｇ／ｍｌに対する毎分カウント数の線グラフである；平均値±ｓ．ｄ．
【図１４】生後６、８、１０及び１２週の、コントロールｍＩｇＧプラスミド（□）又はＢ７−Ｈ４Ｉｇプラスミド（■）が注射されたＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおける、年齢（週）に対する％累積的生存率の線グラフである。全ての表現型が、生後１９週目で分析された。
【図１５】コントロールｍＩｇＧプラスミド（□）又はＢ７−Ｈ４Ｉｇプラスミド（■）が注射されたＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおける、年齢（週）に対するＩｇＧ自己抗体力価（Ａ４５０ｎｍ）の線グラフである。
【図１６】コントロールｍＩｇＧプラスミド（□）又はＢ７−Ｈ４Ｉｇプラスミド（□）が注射されたＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおける、蛋白尿グレードのグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
Ｉ．定義
本明細書に用いている科学技術用語は全て、別に定義しない限り、本発明が属する分野の当業者によって通常理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載した刊行物、特許出願、特許その他の文献は全て、許容される場合その全体が参照として本明細書に援用される。係争の場合には、定義を含めて、本明細書が制限するであろう。なお、これらの材料、方法および実施例は、単に例示的なものであり、それに限定することを意図するものではない。
【００２１】
「有効量」又は「治療的有効量」という用語は、炎症反応もしくは処置されている自己免疫疾患状態の処置をもたらすか、そうでない場合は所望の薬理学的及び／又は生理学的効果をもたらすのに十分な投与量を意味する。正確な投与量は、対象に依存する変数（例えば、年齢、免疫系の健全性など）、疾患及び実施される処置などの種々の要因によって異なることになる。
【００２２】
Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドの「断片」とは完全長のポリペプチドよりも短いポリペプチドの断片である。一般に、断片は長さがアミノ酸５個以上である。抗原断片は抗体によって認識され、結合される能力を有する。
【００２３】
「個体」、「個体」、「対象」及び「患者」という用語は、本明細書では互換可能に用いており、げっ歯類、サル、ヒト、家畜用哺乳動物、スポーツ用哺乳動物及びペット用哺乳動物を含む哺乳動物を意味するが、それに限定するものではない。
本明細書に用いている、核酸に関して「動作可能なように連結された」とは、発現制御配列が所望のコーディング配列の発現を効果的に制御するように遺伝子構築物に組み込まれることを意味する。
【００２４】
「ポリペプチド」及び「蛋白」という用語は互換可能に用いており、長さ又は翻訳後修飾の有無とは関係なく、アミノ酸の任意のペプチド結合鎖のことを意味する。実施態様としては、保存的置換を有するＢ７−Ｈ４ポリペプチドが挙げられる。保存的置換としては、通常、以下のグループ内での置換が挙げられる：グリシン及びアラニン；バリン、イソロイシン及びロイシン；アスパラギン酸及びグルタミン酸；アスパラギン、グルタミン、セリン及びスレオニン；リジン、ヒスチジン及びアルギニン；並びにフェニルアラニン及びチロシン。
【００２５】
「ｓＨ４」という用語は、Ｂ７−Ｈ４の細胞外ドメインの生物活性断片を含む可溶性Ｂ７−Ｈ４を意味する。
【００２６】
「可溶性Ｂ７−Ｈ４アンタゴニスト」又は「ｓＨ４アンタゴニスト」という用語は、可溶性Ｂ７−Ｈ４の生物活性又は発現を阻害、減少、又は遮断する化合物をさす。適切な可溶性Ｂ７−Ｈ４アンタゴニストには、ｓＨ４をコードする核酸に特異的な、可溶性Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ４融合蛋白質、プロテアーゼ阻害剤、小有機化合物、アンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及びマイクロＲＮＡを拮抗できる、可溶性Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ４又はその断片に結合する抗体及び抗体断片が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一実施態様においては、可溶性Ｂ７−Ｈ４アンタゴニストは、好中球媒介性の炎症を減少又は阻害する。
【００２７】
本明細書で使用されるところの、「治療」という用語には、炎症反応又は自己免疫性疾患と関係する一つ以上の症状の、軽減、防止及び／又は除去が含まれる。
【００２８】
ＩＩ．抗炎症組成物
可溶性Ｂ７−Ｈ４（「ｓＨ４」とも呼ばれる）の生物活性又は発現を阻害、減少、又は遮断するための組成物が、提供される。ある実施態様では、組成物は、炎症反応を阻害、減少又は、低下させるために有効な量のｓＨ４アンタゴニストを、活性薬剤として含む。例示的な炎症反応には、好中球媒介性の炎症反応が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２９】
Ａ．ｓＨ４アンタゴニスト
可溶性Ｂ７−Ｈ４アンタゴニストには、ｓＨ４の発現又は生物活性を阻害する化合物が含まれる。可溶性Ｂ７−Ｈ４は、ウェスタンブロット分析により約５０ｋＤａであり、変性状態における単量体Ｂ７−Ｈ４分子の全細胞外ドメインに等しいサイズである（図１ｂ）。
【００３０】
１．プロテアーゼ阻害剤
Ｂ７−Ｈ４の全細胞外部分の酵素的切断により、ｓＨ４が生成されると考えられる。完全長Ｂ７−Ｈ４ｃＤＮＡによりトランスフェクションされた２９３Ｔ細胞は、培養上清にｓＨ４を放出し、この分泌は、様々なプロテアーゼ阻害剤を伴ったインキュベーションにより阻害されうる。したがって、ある実施態様では、ｓＨ４アンタゴニストには、プロテアーゼ阻害剤が含まれる。例示的なプロテアーゼ阻害剤には、セリンプロテアーゼ阻害剤、システインプロテアーゼ阻害剤、アスパラギン酸プロテアーゼ阻害剤、及びメタロプロテアーゼ阻害剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。特異的プロテアーゼ阻害剤には、ロイペプチン、ＰＭＳＦ、ＡＥＢＳＦ、アプロチニン、キモスタチン、抗トロンビンＩＩＩ、３，４−ジクロロイソクマリン、ＴＬＣＫ、ＴＰＣＫ、ＤＩＦＰ、アンチパイン、α２−マクログロブリン、Ｎ−エチルマレイミド、Ｅ−６４、キモスタチン、ペプスタチンＡ、１，１０−フェナントロリン、ホスホラミドン、及びベスタチンが含まれる。
【００３１】
２．阻害核酸
細胞外ドメインのＩｇＶ（図２ａ）部分だけを含むｓＨ４は、自己免疫性疾患を悪化させるのに十分である。実際、Ｂ７−Ｈ４Ｖ及びＢ７−Ｈ４ＶＣ（図２ａ）は、動物モデルにおいて類似の効果を有し、その推定受容体の結合部位がＩｇＶドメインに位置することを示唆する。結果は、コンピュータ生成モデルに基づくＢ７−Ｈ４  ＩｇＶ構造を用いた過去の研究により支持される。過去の報告は、Ｂ７−Ｈ４が、アンカリング部分から離れることにより可溶性形態になりうる、ＧＰＩ−アンカリング蛋白質であることを示唆する。しかし、最近の研究は、Ｂ７−Ｈ４が膜貫通蛋白質であることを示す。免疫グロブリンスーパーファミリーのいくつかの分子が、可溶性形態を示すことが明らかにされている。ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＰＤ−１を含むこれらの可溶性分子は、変異体をスプライシングすることにより作製される。したがって、ｓＨ４は、Ｂ７−Ｈ４の交互スプライシングにより生成されうる。
【００３２】
阻害核酸は、ｓＨ４をコードする転写産物を生成するＲＮＡスプライシングを特異的に阻害し、又はｓＨ４をコードするＲＮＡの発現を特異的に阻害又は減少できる。阻害核酸には、アンチセンスＤＮＡ、三重鎖形成性オリゴヌクレオチド、外部ガイド配列、ｓｉＲＮＡ、及びマイクロＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されるものではない。有用な阻害核酸には、ｓＨ４をコードするＲＮＡの発現を、コントロールと比較して少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は９５％減少するものが含まれる。阻害核酸及びそれらを作製する方法は、公知技術である。ｓｉＲＮＡ設計ソフトウェアは、例えばｈｔｔｐ：／／ｉ．ｃｓ．ｈｋｕ．ｈｋ／〜ｓｉｒｎａ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｓｉｒｎａ．ｐｈｐ．で利用可能である。核酸の合成は周知であり、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌ編、第３版）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）を参照。
【００３３】
３．抗ｓＨ４抗体
ｓＨ４に特異的に結合する抗体又は抗体断片を用いて、ｓＨ４の生物活性を拮抗しうる。例示的な抗体は、ｍＡｂ  ｈＨ４．３である（Ｃｈｏｉ，Ｉ．Ｈ．ほか、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１７１：４６５０−４（２００３））。抗体を作製する方法は、従来技術において周知であり、当業者の能力の範囲内である。
【００３４】
例えば、単クローン抗体（ｍＡｂ）及びそれらの産生及び使用の方法が、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）；米国特許第４，３７６，１１０号；Ｈａｒｔｌｏｗ，Ｅ．ほか、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ，１９８８）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８０）；Ｈ．Ｚｏｌａほか、ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９８２））の中に記載される。
【００３５】
抗イディオタイプ抗体は、例えば、Ｉｄｉｏｔｙｐｙ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８４；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  ７９，１９８４；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  ９０，１９８６；Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｖｏｌｕｍｅ  １１９，１９８５；Ｂｏｎａ  Ｃ．ほか、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｐｐ．３３−８１（１９８１）；Ｊｅｒｍｅ，Ｎ  Ｋ，Ａｎｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２５Ｃ：３７３−３８９（１９７４）；Ｊｅｒｎｅ，Ｎ  Ｋ，：Ｉｄｉｏｔｙｐｅｓ−Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｉｎｓｉｄｅ，Ｗｅｓｔｅｎ−Ｓｃｈｎｕｒｒ，Ｉ．編、Ｅｄｉｔｉｏｎｅｓ  Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，１９８２，Ｕｒｂａｉｎ，Ｊ．ほか、Ａｎｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３Ｄ：１７９−（１９８２）；Ｒａｊｅｗｓｋｙ，Ｋ．ほか、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：５６９−６０７（１９８３）の中に記載される。
【００３６】
一定の実施態様は、Ｂ７−Ｈ４では存在しないか遮蔽されるｓＨ４の新規なエピトープと反応する、多クローン性の及び単クローンの抗体を提供する。抗体は、異種、同種、同系、又はヒト化、一本鎖もしくはキメラ抗体などのこれらの修飾体とすることができる。抗体は、抗ｓＨ４抗体のイディオタイプに特異的な、抗イディオタイプ抗体とすることもできる。「抗体」という用語は、抗原結合部位を含み、ｓＨ４エピトープに結合可能な、完全分子ならびにその断片の両方が含まれる意味でもある。これらには、完全抗体のＦｃ断片を欠く、したがって循環からより速やかに除去され、完全抗体より少ない非特異的組織結合を有しうる、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片が含まれる（Ｗａｈｌほか、Ｊ．Ｎｕｃ．Ｍｅｄ  ２４：３１６−３２５（１９８３））。Ｆｖ断片も含まれる（Ｈｏｃｈｍａｎ，Ｊ．ほか、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１２：１１３０−１１３５（１９７３）；Ｓｈａｒｏｎ，Ｊ．ほか、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１５：１５９１−１５９４（１９７６））。これらの様々な断片は、プロテアーゼ開裂又は化学開裂等の従来技術を用いて作製できる（例えば、Ｒｏｕｓｓｅａｕｘほか、Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１２１：６６３−６９（１９８６）を参照）。
【００３７】
多クローン抗体は、ウサギ、ヤギ、齧歯類等の免疫動物からの血清として得られ、さらなる処置なしで直接使用され、又は硫安沈殿、イオン交換クロマトグラフィ、及びアフィニティークロマトグラフィ等、従来の濃縮又は精製法が行われうる。
【００３８】
免疫原は、ｓＨ４の任意の免疫原性部分とすることができる。好ましい免疫原としては、ヒトＢ７−Ｈ４の細胞外ドメインの全部又は一部が挙げられ、この場合、その残基群は、天然のＢ７−Ｈ４に存在するグリコシル化などの翻訳後修飾を含む。細胞外ドメインを含む免疫原は、当該分野で周知の各種方法、例えば、従来の組換え法を使用したクローン化遺伝子の発現、元の細胞、高レベルのＢ７−Ｈ４を発現する細胞集団からの単離によって作製する。
【００３９】
ｍＡｂは、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−９７（１９７５）に紹介される手順、従来のハイブリドーマ技術及びその変更形態等（上記参考文献を参照）を用いて作製できる。抗原刺激された動物における所望の抗体反応を誘導するために、動物、好ましくはマウスが、上述のような免疫原による免疫化により抗原刺激される。
【００４０】
抗原刺激された動物のリンパ節、脾臓又は末梢血からのＢリンパ球が、通常はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の融合促進剤の存在下で骨髄腫細胞と融合される。多数のネズミ骨髄腫細胞系統の任意のものが、このような用途のために入手可能である：Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−ｋ０Ａｇ８．６５３、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４、又はＨＬ１−６５３骨髄腫系統（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．から入手可能）。後のステップには、融合していない親骨髄腫細胞及びドナーリンパ球細胞が最終的に死に、ハイブリドーマ細胞だけが生存するような、選択培地における増殖が含まれる。これらがクローニングされ増殖させられ、その上清が、例えばＢ７−Ｈ４−Ｉｇ融合蛋白質を用いたイムノアッセイ技術により、所望の特異性の抗体の存在につきスクリーニングされる。陽性クローンが、例えば限界希釈によりサブクローニングされ、ｍＡｂが単離される。
【００４１】
これらの方法により作製されたハイブリドーマが、公知技術を用いて、インビトロ又はインビボで（腹水液中で）増殖させられうる（一般的にＦｉｎｋほか、Ｐｒｏｇ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ，９：１２１−３３（１９８４）を参照）。一般に、個々の細胞系統が培養において増殖させられ、高濃度の単一のｍＡｂを含む培地が、デカンテーション、濾過、又は遠心分離により採取されうる。
【００４２】
抗体は、正常の多量体構造ではなく一本鎖抗体又はｓｃＦｖとして作製されうる。一本鎖抗体は、目的のＩｇからの高頻度可変領域を含み、完全なＩｇの一部の大きさでありながら、天然Ｉｇの抗原結合部位を再現する（Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．ほか、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１０３８−１０４１（１９８８）；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．ほか、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，１７８：４９７−５１５（１９８９）；Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．ほか、Ｎａｔｕｒｅ，３４９：２９３−２９９（１９９１）；Ｂｉｒｄほか、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３（１９８８）；Ｈｕｓｔｏｎほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：５８７９（１９８８）；Ｊｏｓｔ  Ｃ  Ｒほか、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６９：２６２６７−２６２７３（１９９４）；米国特許第４，７０４，６９２号、第４，８５３，８７１号、第４，９４，６７７８号、第５，２６０，２０３号。好ましい実施態様においては、従来の分子生物学技術を用いて抗体が作製される。
【００４３】
エピトープの存在を検出するための抗体の使用方法が、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．ほか編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９１（又は現行版）；Ｂｕｔｔ，Ｗ．Ｒ．（編）Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：Ｔｈｅ  Ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｒｔ，Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８４；Ｂｉｚｏｌｌｏｎ，Ｃｈ．Ａ．編、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ，１９８４；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．，ＥＬＩＳＡ（２９章），ｖａｎ  Ｏｓｓ，Ｃ．Ｊ．ほか、（編），ＩＭＭＵＮＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４，ｐｐ．７５９−８０３；Ｂｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．（編），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９１；Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｍａｒｃｈ，１９８６；Ｗｏｒｋ，Ｔ．Ｓ．ほか、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｏｒｔｈ  Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ＮＹ，（１９７８）（Ｃｈａｒｄ，Ｔ．による章、“Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｅ  Ａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”）に記載される。
【００４４】
Ｂ．Ｂ７−Ｈ４融合蛋白質
Ｂ７−Ｈ４融合ポリペプチドは、（ｉ）第二ポリペプチドに直接融合された、又は、（ｉｉ）選択的に、第二ポリペプチドに融合されたリンカーペプチド配列に融合された、Ｂ７−Ｈ４蛋白質の全部又は一部を含む、第一融合パートナーを有する。例示的な融合蛋白質は、Ｓｉｃａ、Ｇ．Ｌほか、Ｂ７−Ｈ４，ａ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂ７  ｆａｍｉｌｙ，ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１８，８４９−６１（２００３）に記載される。
【００４５】
Ｂ７−Ｈ４融合蛋白質は、好ましくはヒト免疫グロブリンＣγ１鎖のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域に相当するアミノ酸配列を有する、第二ポリペプチド、好ましくはＩｇ重鎖定常領域の一種以上のドメインに融合されうる。
【００４６】
Ｂ７−Ｈ４融合蛋白質は、完全長Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドを含むか、完全長Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドの断片を含みうる。一実施態様においては、融合蛋白質は、Ｂ７−Ｈ４の断片を含む。本明細書において使用されるところの、Ｂ７−Ｈ４の断片とは、完全長蛋白質より短いポリペプチドである、ポリペプチドの任意のサブセットを指す。有用な断片は、その天然リガンドと結合する能力を保持するものである。完全長Ｂ７−Ｈ４の断片であるＢ７−Ｈ４ポリペプチドは、典型的に、完全長Ｂ７−Ｈ４と比較して、その天然リガンド（単数または複数）を結合する能力の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％、１００％以上をも有する。
【００４７】
一実施態様は、第一融合パートナーがＢ７−Ｈ４蛋白質の細胞外ドメインである、融合蛋白質を提供する。Ｂ７−Ｈ４ヌクレオチド及び蛋白質配列は、ＧＥＮＢＡＮＫにおいて、アクセス番号ＡＹ２８０９７２の下に見られる。さらに、Ｂ７−Ｈ４は米国特許第６，８９１，０３０号に記載され、可能な限りで参照により全体として本明細書に組み込まれる。融合蛋白質は、Ｂ７−Ｈ４の細胞外ドメイン全体又はＢ７−Ｈ４の生物活性を保持するその断片を含みうる。
【００４８】
融合蛋白質の第一融合パートナーは、Ｂ７−Ｈ４の膜遠位ＩｇＶドメイン及び膜近位ＩｇＣドメインを含む。構造物は、Ｂ７−Ｈ４ＶＣとも呼ばれる：
ｍａｓｌｇｑｉｉｆｗ  ｓｉｉｎｉｉｉｉｌａ  ｇａｉａｌｉｉｇｆｇ  ｉｓｇｋｈｆｉｔｖｔ  ｔｆｔｓａｇｎｉｇｅ  ｄｇｔｌｓｃｔｆｅｐ  ｄｉｋｌｎｇｉｖｉｑ  ｗｌｋｅｇｉｋｇｌｖ  ｈｅｆｋｅｇｋｄｄｌ  ｓｑｑｈｅｍｆｒｇｒ  ｔａｖｆａｄｑｖｖｖ  ｇｎａｓｌｒｌｋｎｖ  ｑｌｔｄａｇｔｙｔｃ  ｙｉｒｔｓｋｇｋｇｎ  ａｎｌｅｙｋｔｇａｆ  ｓｍｐｅｉｎｖｄｙｎ  ａｓｓｅｓｌｒｃｅａ  ｐｒｗｆｐｑｐｔｖａ  ｗａｓｑｖｄｑｇａｎ  ｆｓｅｖｓｎｔｓｆｅ  ｌｎｓｅｎｖｔｍｋｖ  ｖｓｖｌｙｎｖｔｉｎ  ｎｔｙｓｃｍｉｅｎｄ  ｉａｋａｔｇｄｉｋｖ  ｔｄｓｅｖｋｒｒｓｑ  ｌｑｌｌｎｓ
（配列番号１）に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性を有しうる。
【００４９】
別の実施態様においては、融合蛋白質の第一融合パートナーは、Ｂ７−Ｈ４のＩｇＶドメインを含む。構造物は、Ｂ７−Ｈ４Ｖとも呼ばれる：
ｍａｓｌｇｑｉｉｆｗ  ｓｉｉｎｉｉｉｉｌａ  ｇａｉａｌｉｉｇｆｇ  ｉｓｇｋｈｆｉｔｖｔ  ｔｆｔｓａｇｎｉｇｅ  ｄｇｔｌｓｃｔｆｅｐ  ｄｉｋｌｎｇｉｖｉｑ  ｗｌｋｅｇｉｋｇｌｖ  ｈｅｆｋｅｇｋｄｄｌ  ｓｑｑｈｅｍｆｒｇｒ  ｔａｖｆａｄｑｖｖｖ  ｇｎａｓｌｒｌｋｎｖ  ｑｌｔｄａｇｔｙｔｃ  ｙｉｒｔｓｋｇｋｇｎ  ａｎｌｅｙｋｔｇａｆ  ｓｍｐｅｉｎ
（配列番号２）に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有しうる。
【００５０】
好ましい実施態様においては、融合蛋白質は、ＩｇＦｃ定常領域に融合されたＢ７−Ｈ４の細胞外ドメイン又はその断片を含む。前述のように、Ｂ７−Ｈ４の細胞外ドメインのコード領域をマウスＩｇＧ２ａのＦｃ定常領域に融合させることにより、組換え型Ｂ７−Ｈ４Ｉｇ融合蛋白質が調製されうる（Ｃｈａｐｏｖａｌほか、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．４５：２４７−２５５（２０００））。
【００５１】
開示された融合蛋白質は、標準的な分子生物学技術を用いて単離されうる。例えば、Ｂ７−Ｈ４ＩｇをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターが、リン酸カルシウム沈殿により２９３細胞にトランスフェクションされ、無血清ＤＭＥＭにおいて培養される。上清が７２時間後に集められ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）カラムにより融合蛋白質が精製される。
【００５２】
ｓＨ４の生物学的機能を減少、阻害、又は遮断する融合蛋白質を作製するために、Ｂ７−Ｈ４の変異体も使用されうる。本明細書で使用されるところの、「変異体」Ｂ７−Ｈ４ポリペプチドは、対応する野生型Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド（例えばアクセス番号ＡＹ２８０９７２のアミノ酸配列を有するポリペプチド）のアミノ酸配列と比較して、少なくとも一つのアミノ酸配列変異を含有する。アミノ酸配列変異は、例えば、一つ以上のアミノ酸の置換、欠失又は挿入でありうる。
【００５３】
Ｂ７−Ｈ４の変異体は、野生型Ｂ７−Ｈ４と同じ活性、ほぼ同じ活性、又は異なる活性を有しうる。ほぼ同じ活性とは、変異体がＴ細胞活性化を抑制しうることを意味する。
【００５４】
当然のことながら、Ｂ７−Ｈ４の細胞外ドメインの変異体は、野生型Ｂ７−Ｈ４（すなわちアクセス番号ＡＹ２８０９７２）の細胞外ドメインに対して少なくとも８０％の配列同一性を有し得、典型的に少なくとも８５％、より典型的には少なくとも９０％、さらに典型的には少なくとも９５％の、Ｂ７−Ｈ４の細胞外ドメインに対する配列同一性を有しうる。一実施態様においては、融合蛋白質は、アクセス番号ＡＹ２８０９７２におけるＢ７−Ｈ４の細胞外ドメインと同一である、Ｂ７−Ｈ４の細胞外ドメインを含む。
【００５５】
配列同一性百分率はコンピュータプログラム又は直接配列比較法を用いて算出することができる。２つの配列間の同一性を測定するための好ましいコンピュータプログラムによる方法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＰ及びＴＢＬＡＳＴＮ（例えば、Ｄ．  Ｗ．  Ｍｏｕｎｔ、２００１年、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．  Ｙ．参照）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＢＬＡＳＴＰ及びＴＢＬＡＳＴＮプログラムはＮＣＢＩ及び他の供給源から公に入手可能である。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性測定に用いることができる。
【００５６】
アミノ酸配列比較のための例示的なパラメータとしては、以下のものが挙げられる：１）Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、４８：ｐ．４４３−４５３  （１９７０年））；２）Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｔｉｋｏｆｆのＢＬＯＳＳＵＭ６２比較マトリックス（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９：ｐ．１０９１５−１０９１９  （１９９２年））；３）ギャップペナルティ＝１２；及び４）ギャップ長ペナルティ＝４。これらのパラメータを用いる有用なプログラムが「ギャップ」プログラムとして公に入手可能である（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）。上記のパラメータ類は、（末端ギャップに対するペナルティのない）ポリペプチド比較のためのデフォルトパラメータ類である。
【００５７】
或いは、ポリペプチド配列の同一性は、式：同一性％＝（同一残基数）／（アミノ酸残基のアラインメント長）＊１００を用いて算出することができる。この計算において、アラインメント長には内部ギャップを含めるが、末端ギャップは含めない。
【００５８】
アミノ酸置換は、任意のアミノ酸又はアミノ酸アナログを使用して行われうる。例えば、天然アミノ酸（例えばアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、アルギニン、システイン、グリシン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、ロイシン、バリン、イソロイシン、リシン、メチオニン、プロリン、スレオニン、セリン、フェニルアラニン、トリプトファン、又はチロシン）のいずれかにより、置換が行われうる。
【００５９】
Ｂ７−Ｈ４融合蛋白質ポリペプチドにおけるアミノ酸置換は、保存的置換でありうる。本明細書に用いている「保存的」アミノ酸置換とは、置換アミノ酸が同様な構造的又は化学的性質を有する置換である。「非保存的」アミノ酸置換とは置換アミノ酸の電荷、疎水性又は嵩が著しく変化する置換である。非保存的置換は、（ａ）置換領域のペプチド主鎖の、例えばシートもしくはヘリカル構造としての構造、（ｂ）標的部位におけるその分子の電荷もしくは疎水性、又は（ｃ）その側鎖の嵩、の維持に及ぼす影響がさらにいちじるしく異なる。保存的置換は、以下の群の中での置換を典型的に含む：グリシン及びアラニン；バリン、イソロイシン、及びロイシン；アスパラギン酸及びグルタミン酸；アスパラギン、グルタミン、セリン及びスレオニン；リシン、ヒスチジン及びアルギニン；ならびにフェニルアラニン及びチロシン。
【００６０】
開示の融合蛋白質及びその変異体は、ｓＨ４と競合して、例えば共通の受容体に結合することによりｓＨ４の生物活性を阻害するのが好ましい。受容体は典型的に、ｓＨ４及びＢ７−Ｈ４の両方に結合する免疫細胞上の受容体である。Ｂ７−Ｈ４の細胞外ドメインの変異体は、ｓＨ４と競合してｓＨ４の生物活性を減少させる融合蛋白質の能力を高める保存的変異体及び非保存的変異体を含む。
【００６１】
上記の融合蛋白質の二量体又は三量体である、二量体又は三量体融合蛋白質も提供される。鎖が、ジスルフィド結合又は他の鎖間共有結合を介してタンデム的に連結されるのが好ましい。
【００６２】
好ましい二量体融合蛋白質においては、二量体化された通常のＩｇＨ鎖においてジスルフィド結合されるものと同じＣｙｓ残基である、Ｉｇ重鎖の二つのＣＨ領域におけるＣｙｓ残基の共有結合形成から、二量体が生じる。
【００６３】
適切な融合蛋白質には、直接又は一つ以上のモノマーの間のリンカー配列により、末端と末端で連結された、第一融合パートナーの二以上のリピートの多量体が含まれうる。
【００６４】
Ｃ．  医薬組成物
ｓＨ４アンタゴニスト及びこれを含有するベクターを含む医薬組成物を提供する。こうした医薬組成物は、経口、非経口（筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）又は皮下注射）、経皮（受動的に、又はイオン電気導入もしくは電気穿孔法により）、経粘膜（経鼻、膣内、直腸内又は舌下）経路によって、或いは生体内分解性挿入物を用いて投与することができ、各投与経路に適した剤型に製剤化することができる。
【００６５】
１．  非経口投与用製剤
好ましい実施態様において、上記ペプチドは水溶液として非経口注射により投与する。この製剤は懸濁剤又は乳剤の形態をとることもできる。一般には、有効量のｓＨ４アンタゴニスト又は誘導体生成物を含む医薬組成物が提供され、これは、任意選択的に、医薬用として許容可能な希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、佐剤及び／又は担体を含む。このような組成物は、希釈滅菌水、各種緩衝剤含有量（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、ｐＨおよびイオン強度の緩衝生理食塩水；並びに任意選択的に、界面活性剤、可溶化剤（例えば、ＴＷＥＥＮ２０、ＴＷＥＥＮ８０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）及び保存剤（例えば、Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ、ベンジルアルコール）及び増量物質（例えば、乳糖、マンニトール）等の添加剤を含む。非水溶媒又はビヒクルの例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油、とうもろこし油などの植物油、ゼラチン及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルがある。これら製剤は、凍結乾燥し、使用直前に再溶解／再懸濁することができる。上記製剤は、例えば、細菌保定フィルターを通して濾過し、又は滅菌剤を上記製剤に添合し、上記組成物に放射線照射し、又は上記組成物を加熱することによって滅菌することができる。
【００６６】
２．  経腸内投与用製剤
ｓＨ４アンタゴニストは経口送達用に製剤化することができる。経口用固形剤型については、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、１９９０年（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．１８０４２）の第８９章に概ね記載されている。固形剤型としては、錠剤、カプセル剤、丸剤、トローチ剤もしくは薬用キャンデー、カシェ剤、ペレット剤、散剤又は顆粒剤、或いは原料をポリ乳酸、ポリグリコール酸などの高分子化合物の微粒子調製物もしくはリポソームに取り込ませたものが挙げられる。このような組成物は本発明の蛋白質及び誘導体の物理的状態、安定性、インビボ放出速度及びインビボクリアランス速度に影響を与えると考えられる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版（１９９０年、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．１８０４２）１４３５−１７１２頁を参照されたい。組成物は液状に調製することができ、又は乾燥粉末（例えば、凍結乾燥）状にすることができる。また、リポソームまたはプロテイノイド封入を行うことにより（例えば、米国特許第４，９２５，６７３号で報告されているプロテイノイドミクロスフェアとして）組成物を製剤化することができる。リポソーム封入を利用することができ、リポソームを各種ポリマーで誘導体化することができる（例えば、米国特許第５，０１３，５５６号）。Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｋ．Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ、Ｇ．Ｓ．Ｂａｎｋｅｒ及びＣ．Ｔ．Ｒｈｏｄｅｓ編、第１０章、１９７９年をも参照されたい。概して、製剤は、ペプチド（又はその化学的修飾体）並びに胃の環境におけるペプチド、および腸における生物学的に活性の材料の放出を保護する不活性成分を含むことになる。
【００６７】
ポリペプチドアンタゴニストは、化学的に修飾して誘導体の経口的送達が有効なものであるようにすることができる。概して、想定されている化学的修飾とは、（ａ）蛋白質分解の阻害；及び（ｂ）胃又は腸から血流中への取り込みを可能にする、少なくとも一つの部分の上記成分分子自体に対する結合である。成分（単数または複数）の総合的安定性が高まり、体内における循環時間が長くなることも望まれる。ＰＥＧ化は、製薬学的用途に好ましい化学的修飾である。用いることができる他の部分としては、プロピレングリコール、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリプロリン、ポリ−１，３−ジオキソラン及びポリ−１，３，６−チオキソカンが挙げられる［例えばＡｂｕｃｈｏｗｓｋｉ及びＤａｖｉｓ（１９８１）“Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｅｎｚｙｍｅ  Ａｄｄｕｃｔｓ，”ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇｓ．Ｈｏｃｅｎｂｅｒｇ及びＲｏｂｅｒｔｓ編、（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）ｐｐ．３６７−３８３；及びＮｅｗｍａｒｋほか、（１９８２）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４：１８５−１８９を参照］。
【００６８】
別の実施態様は、不活性希釈剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤などの佐剤；及び甘味剤、矯味矯臭剤及び芳香剤を含む他の成分を含みうる、医薬用として許容可能な乳剤、液剤、懸濁剤及びシロップ剤を含む、経口投与用液状剤型を提供する。
【００６９】
徐放性経口製剤が望ましいと考えられる。ｓＨ４アンタゴニストを、拡散又は浸出機構による放出を可能にする不活性マトリックス、例えばガムに取り込ませることができる。ゆっくりと変性するマトリックスを製剤に取り込ませることもできる。別の徐放製剤はＯｒｏｓ治療系（Ａｌｚａ  Ｃｏｒｐ．）を利用したものであり、即ち薬剤が、水の侵入を許容し、浸透圧効果により単一の小開口から薬剤を押し出す半透膜に封入される。経口製剤の場合、放出場所は胃、小腸（十二指腸、空腸（ｊｅｊｕｎｅｍ）または回腸）または大腸とすることができる。この放出は、ペプチド（または誘導体）を保護するか、腸など胃環境を超えた場所でペプチド（または誘導体）を放出することによって、胃環境の有害な影響を避けることが好ましい。胃における抵抗性を完全にするためには、少なくともｐＨ５．０に対して不浸透性のコーティングが不可欠である。腸溶コーティングとして用いられるより一般的な不活性成分の例には、トリメリト酸酢酸セルロース（ＣＡＴ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣＰ）、ＨＰＭＣＰ５０、ＨＰＭＣＰ５５、ポリビニルアセテートフタレート（ＰＶＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ３０Ｄ、Ａｑｕａｔｅｒｉｃ、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｓ及びＳｈｅｌｌａｃが挙げられる。これらのコーティングは混合膜として用いることができる。
【００７０】
３．  局所送達製剤
組成物は局所に適用することができる。これは多くのペプチド製剤ではうまくいかないが、特に肺、鼻、口内（舌下、頬）、膣又は直腸粘膜に適用された場合には有効である場合がある。ｓＨ４アンタゴニストは、空気動力学的直径が約５ミクロン未満のエアロゾル又は噴霧乾燥粒子として送達させる場合、息を吸い込みながら肺に送達され得、肺の上皮層を超えて血流まで横断する。
【００７１】
噴霧器、計量吸入器及び粉末吸入器を含むがこれに限られない、治療薬を肺に送達するために設計された様々な機械的装置を用いることができ、それらは全て当業者に周知である。市販のデバイスの具体例は、Ｕｌｔｒａｖｅｎｔ噴霧器（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）；Ａｃｏｒｎ  ＩＩ噴霧器（Ｍａｒｑｕｅｓｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ、Ｃｏｌｏ．）；Ｖｅｎｔｏｌｉｎ計量吸入器（Ｇｌａｘｏ  Ｉｎｃ．，Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，Ｎ．Ｃ．）；及びＳｐｉｎｈａｌｅｒ粉末吸入器（Ｆｉｓｏｎｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ、Ｍａｓｓ）である。Ｎｅｋｔａｒ、Ａｌｋｅｒｍｅｓ及びＭａｎｎｋｉｎｄの各社は、いずれも技術が本明細書に説明される製剤に適用されうる承認済み又は臨床試験中の吸入用インスリン粉末製剤を有する。
【００７２】
粘膜への投与用製剤は通常、噴霧乾燥薬物粒子となるが、これらは錠剤、ゲル剤、カプセル剤、懸濁剤又は乳剤に取り込ませることができる。標準的な医薬用賦形剤はどの製剤者からでも入手可能である。経口製剤は、チューインガム、ゲルストリップ、錠剤又は薬用キャンデーの形をとることができる。
【００７３】
経皮製剤を調製することもできる。これらは通常、軟膏剤、ローション剤、噴霧剤又はパッチとなるが、これらは全て標準的な技術を用いて調製することができる。経皮製剤には浸透促進剤を含ませることが必要になる。
【００７４】
４．  送達制御用ポリマーマトリックス
ポリマーデバイス（ロッド、シリンダ、フィルム、ディスク）の移植又は注射（微粒子）後に全身的に長期放出させるための、放出制御用ポリマーデバイスを作製することができる。マトリックスはミクロスフェアなどの微粒子の形をとることができ、この場合、ペプチドが固体のポリマーマトリックス又はマイクロカプセル内に分散され、コアはポリマーシェルと異なる材質のものとし、ペプチドが液体又は固体の性質とすることができるコアに分散又は懸濁される。本明細書において明確に定義していない限り、微粒子、ミクロスフェア及びマイクロカプセルは同じ意味で用いている。あるいは、ポリマーは、数ナノメートルから四センチメートルの範囲の薄いスラブもしくはフィルム、磨砕その他の標準的な方法で作製した粉末、又はヒドロゲルなどのゲルとしても成型することができる。
【００７５】
生分解性マトリックスが好ましいが非生分解性及び生分解性マトリックスのいずれもｓＨ４アンタゴニストの送達に用いることができる。分解及び放出プロフィールがより十分に特徴付けられているため、合成ポリマーが好ましいがこれらは天然又は合成ポリマーとすることができる。このポリマーは、所望の放出期間に基づいて選択される。ある場合には線形放出が最も有用でありうるが、別の場合にはパルス放出又は「バルク放出」がより効果的な結果をもたらしうる。ポリマーは、（通常、最大約９０重量％の水を吸収する）ヒドロゲルの形をとることができ、多価イオン又はポリマーと選択的に架橋させることができる。
【００７６】
マトリックスは、溶媒蒸発、噴霧乾燥、溶媒抽出及び当業者に周知の他の方法によって形成できる。生体内分解性ミクロスフェアは、例えば、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ及びＬａｎｇｅｒ，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ５，１３−２２（１９８７）；Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚほか、Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ６，２７５−２８３（１９８７）；及びＭａｔｈｉｏｗｉｔｚほか、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉ．３５，７５５−７７４（１９８８）に記載されている、薬物送達用ミクロスフェアを作製するために開発された方法のいずれかを用いて調製することができる。
【００７７】
デバイスは、埋設もしくは注入−通常は全身治療のための投与量よりもはるかに少ない投与量を送達する−部位を治療するための局所放出又は全身送達用に製剤化することができる。これらは皮下、筋肉内、脂肪内に埋設又は注入し、又は飲み込むことができる。
【００７８】
ＩＩＩ．  製造方法
上記及び実施例に記載されるように、ポリペプチドｓＨ４アンタゴニスト、ｓＨ４アンタゴニストをコードする核酸コンストラクト、Ｂ７−Ｈ４又はその変異体は、公知技術の標準的な分子生物学プロトコルを使用して作製されうる。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌ編、第３版）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）を参照。あるいは、Ｂ７−Ｈ４、ｓＨ４、そのアンタゴニスト又はアゴニスト、又はその変異体が、従来の生化学的技術を用いて、それらを発現する個体から単離及び精製されうる。
【００７９】
ＩＶ．  炎症反応治療及び検出
Ａ．  診断法
可溶性Ｂ７−Ｈ４は、サンプルとされるＲＡの約三分の二及びＳＬＥ患者の三分の一の血清にみられ、ｓＨ４の濃度はＲＡの重症度と密接に相関する。ＲＡ及びＳＬＥの実験モデルにおいてｓＨ４の効果が反復され、ｓＨ４が、内因性Ｂ７−Ｈ４の抑制機能を遮断するためのデコイとしての役割を果たし、全身性自己免疫疾患の増悪をもたらすことが示された（実施例を参照）。結果は、全身性自己免疫疾患の病因論におけるｓＨ４の役割を示す。
【００８０】
個体の生体試料のｓＨ４の量を定量することにより、個体における炎症反応を検出でき、コントロール（同じアッセイにおける正常な個体の単一又はより好ましくはプール又は平均値）と比較して個体の生体試料のｓＨ４の量が高いことは、炎症反応を表す。生体試料には、例えば組織又は個体からの流体、例えば血液、血漿、唾液、リンパ、脳脊髄液、又は痰等の生物流体が含まれる。コントロールは、自己免疫性疾患等の炎症反応のない個体からの生体試料を意味する。
【００８１】
試料のｓＨ４の量は、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ、質量分析、分光測光、又はそれらの組み合わせ等の従来技術を用いて測定されうる。
【００８２】
炎症反応又は自己免疫性疾患の重症度は、個体の生体試料のｓＨ４のレベルを定量し、個体の生体試料のｓＨ４の量を、炎症反応又は自己免疫性疾患の異なるステージを示すｓＨ４の量（単数または複数）と相関させることにより、検出又は評価されうる。様々なステージの炎症性疾患又は様々なレベルの重症度のｓＨ４の量は、炎症性疾患の様々なステージ又は病気の様々な重症度の患者におけるｓＨ４を定量することにより予め決定されうる。例えば、ＲＡについては、以下の重症度の分類が典型的に用いられる：クラスＩ：通常の活動を行う能力の制限がない；クラスＩＩ：中程度の制限があるが、日常生活動作の大半を行う能力がある；クラスＩＩＩ：顕著な制限があり、日常生活及び仕事の動作の大半ができない；及びクラスＩＶ：活動不能であり、ベッド又は車椅子に拘束される。各クラスからの患者においてｓＨ４のレベルが決定され、特定の重症度レベルと相関づけられるｓＨ４の参照レベルが作成されうる。
【００８３】
あるいは、ｓＨ４の量が、好中球のレベルと相関づけられうる。炎症反応又は自己免疫性疾患を有する個体においては、ｓＨ４が好中球のレベルと同じように上昇する。したがって、個体のｓＨ４レベルは好中球レベルの指標となりうる。
【００８４】
重症度が検出又は評価できる代表的な炎症反応又は自己免疫性疾患には、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、円形脱毛症、強直性脊椎炎（ａｎｋｌｏｓｉｎｇ  ｓｐｏｎｄｙｌｉｔｉｓ）、抗リン脂質症候群、自己免疫アジソン病、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫内耳疾患、自己免疫リンパ球増殖性症候群（ａｌｐｓ）、自己免疫血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、脂肪便症−皮膚炎、慢性疲労症候群免疫不全、症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、良性粘膜類天疱瘡、寒冷凝集素症、クレスト症候群、クローン病、ドゴー病、皮膚筋炎、皮膚筋炎−若年性、円板状ループス、混合型クリオグロブリン血症、線維症−繊維筋炎、グレーブス病、ギラン・バレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、Ｉｇａ腎症、インシュリン依存性糖尿病（Ｉ型）、若年性関節炎、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群（ｐｏｌｙｇｌａｎｃｕｌａｒ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ）、リウマチ性多発性筋痛、多発性筋炎及び皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆管萎縮症、乾癬、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ熱、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、全身強直性症候群、高安動脈炎、巨細胞性動脈炎／巨細胞性動脈炎、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、脈管炎、白斑、及びヴェーゲナー肉芽腫症が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８５】
Ｂ．炎症反応を治療する方法
慢性的及び持続的炎症は、関節リウマチ（ＲＡ）及び全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）等の全身性自己免疫疾患の病因及び進行の主要な原因である。ｓＨ４は、内因性Ｂ７−Ｈ４を遮断するためのデコイ分子として働く。Ｂ７−Ｈ４は、抗原刺激の存在下で、Ｔ細胞の細胞周期進行を阻害する。Ｂ７−Ｈ４は、好中球前駆体の増殖を抑制することにより、先天免疫を阻害できる。高いレベルのｓＨ４が内因性Ｂ７−Ｈ４の阻害作用を遮断すると考えられる。
【００８６】
したがって、例えば病気の一つ以上の症状を阻害又は低下させるために有効な量のｓＨ４アンタゴニストを必要な個体に投与することにより、インビボでｓＨ４の生物活性を妨げることで、炎症反応を治療できる。病気の一つ以上の症状を阻害又は低下は、好中球レベルの低下により示されうる。ｓＨ４の発現の下方制御、ｓＨ４の除去、インビボでのｓＨ４の結合剤、例えば抗体との結合、Ｂ７−Ｈ４の内因性レベルの増加、Ｂ７−Ｈ４融合蛋白質の投与、又はこれらの組み合わせにより、ｓＨ４生物活性の干渉が達成されうる。
【００８７】
１．  ｓＨ４発現の下方制御
炎症反応又は自己免疫性疾患を治療する一つの方法は、炎症反応を減少又は阻害するために有効な量の、ｓＨ４をコードする核酸に特異的な阻害核酸を、必要な個体に投与することによる。阻害核酸は、アンチセンスＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、又はその組み合わせでありうる。あるいは、阻害核酸は、Ｂ７−Ｈ４を切断してｓＨ４を生成するプロテアーゼに特異的でありえる。好ましい実施態様においては、阻害核酸は、Ｂ７−Ｈ４発現に統計学的に有意な影響を与えずに、ｓＨ４発現を下方制御する。ある側面においては、ｓＨ４の下方制御が、好中球集団を減少させる。
【００８８】
２．  ｓＨ４の除去
個体の炎症反応又は自己免疫性障害を治療する別の方法は、個体の血液又は血漿からｓＨ４を除去することによる。可溶性Ｂ７−Ｈ４は、ウルトラフェレーシス、アフェレーシス、又は透析等の周知の技術を用いて除去されうる。一実施態様においては、個体から血液又は血漿が除去される。可溶性Ｂ７−Ｈ４が、エクスビボで血液又は血漿から選択的に除去される。ｓＨ４を通しながら、他の成分を保持する特定の分子量カットオフを有するフィルターを使用して、ｓＨ４の選択的除去が達成されうる。
【００８９】
あるいは、血液又は血漿が、ｓＨ４に特異的な結合剤と接触させられうる。結合剤は、基質に固定されうる。適切な結合剤には、ｓＨ４又はｓＨ４の天然リガンドに特異的な抗体又は抗原結合性抗体断片が挙げられるが、これらに限定されるものではない。結合剤は、ｓＨ４と特異的に結合してｓＨ４を捕え、これにより血液又は血漿から除去する。そして、処置された血液又は血漿が個体に戻される。
【００９０】
３．  ｓＨ４の不活性化
炎症反応又は自己免疫性疾患を治療する別の方法は、炎症反応を減少又は阻害するために有効な量のｓＨ４結合剤を、必要な個体に投与することによる。代表的な結合剤には、ｓＨ４の生物活性を阻害又は減少する抗体又はその抗原結合性断片が挙げられるが、これらに限定されるものではない。代表的な抗体は、ｍＡｂ  ｈＨ４．３である。小分子を用いて、インビボでｓＨ４を結合及び不活性にしうることはいうまでもない。
【００９１】
４．  Ｂ７−Ｈ４の過剰発現
Ｂ７−Ｈ４の過剰発現は、内因性ｓＨ４と競合させるために使用でき、したがって、炎症性反応及び自己免疫性疾患又は障害を治療するための有効な手段となりうる。Ｂ７−Ｈ４の過剰発現は、内因性Ｂ７−Ｈ４を刺激して発現を増加させることにより達成しうる。あるいは、Ｂ７−Ｈ４の血清レベルを一時的に高めるために、Ｂ７−Ｈ４が必要な個体にボーラスとして投与されうる。
【００９２】
炎症反応又は自己免疫性疾患を治療するための別の方法は、Ｂ７−Ｈ４又はその機能的断片をコードする核酸コンストラクトを、必要な個体に投与することによる。機能的断片とは、ｓＨ４生物活性を妨げ、阻害し、又は減少させるＢ７−Ｈ４断片を意味する。
【００９３】
別の実施態様においては、Ｂ７−Ｈ４融合蛋白質が、ｓＨ４媒介性炎症又はその症状を減少又は阻害するために有効な量、必要な個体に投与されうる。Ｂ７−Ｈ４融合蛋白質は、上述される。あるいは、Ｂ７−Ｈ４融合をコードする核酸コンストラクトが、必要な個体に投与されればよく、核酸コンストラクトが個体に発現されて、ｓＨ４の生物学的機能を減少又は阻害するために有効な量のＢ７−Ｈ４融合蛋白質を生成する。
【００９４】
５．  遺伝子送達
ｓＨ４アンタゴニストをコードする核酸は、これを必要とする個体に対して炎症反応又は自己免疫疾患を処置するのに有効な量で投与することができる。ＤＮＡの送達では「外来」ＤＮＡを細胞内に、最終的には生きている動物体内に導入することが含まれる。遺伝子の送達はウイルスベクター又は非ウイルスベクターを用いて達成することができる。１つの方法は、培養一次細胞中に核酸を移入した後、この生体外で形質転換された細胞を個体に、全身性又は特定の器官又は組織中へ自家移植することを含む。
【００９５】
核酸による治療は、哺乳動物の体細胞組織又は器官中にインビボで機能的に活性なＤＮＡを直接移入することにより達成することができる。ＤＮＡの移入は以下に記載するいくつかの方法を用いて実現することができる。こうした系について選択可能なマーカー（例えば、Ｇ４１８抵抗性）を用いてインビトロでの発現に成功するかどうかを試験し、そのＤＮＡを発現する形質移入された（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）クローンを選択した後、（誘導系の場合は誘導剤で処理した後）  Ｂ７−Ｈ４発現産物の存在を適切なイムノアッセイでその産物に対する抗体を用いて検出することができる。ＤＮＡの取り込み、プラスミドの組込み及び組込みプラスミドの安定性を含むこの方法の効率性は、既知の方法を用いてプラスミドＤＮＡを線状化し、「担体」として高分子量哺乳動物ＤＮＡを用いて同時形質移入することにより改善することができる。
【００９６】
レトロウイルス媒介ヒト治療では両栄養性複製欠損性レトロウイルス系が利用される（Ｗｅｉｓｓ及びＴａｙｌｏｒ、Ｃｅｌｌ、８２：ｐ．５３１−５３３  （１９９５年））。このようなベクターは、機能性ＤＮＡをヒトの細胞又は組織に、例えば、アデノシンデアミナーゼ遺伝子をリンパ球に、ＮＰＴ−ＩＩ遺伝子及び腫瘍壊死因子遺伝子を腫瘍浸潤リンパ球に導入するのに用いられてきた。一般に、レトロウイルス媒介遺伝子送達では遺伝子移入（ｔｒａｎｓｆｅｒ）のために標的細胞の増殖が必要となる（Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎほか、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：ｐ．４７０−４７５  （１９９５年））。この条件は今回のＤＮＡ分子が導入されることになる好ましい細胞の一部、即ち、活発に増殖している腫瘍細胞によって満たされる。いくつかの方法のいずれかを利用するプラスミド及びレトロウイルスベクターによる形質移入を用いた嚢胞性線維症の遺伝子治療がＣｏｌｌｉｎｓほかにより米国特許第５，２４０，８４６号に記載されている。
【００９７】
Ｂ７−Ｈ４ポリペプチド又は融合蛋白をコードするＤＮＡ分子は、当該分野でよく知られているように、複製欠損性レトロウイルスをもたらすパッケージング細胞株を用いてレトロウイルスベクターに詰め込むことができる（例えば、Ｓｔｏｎｅ，Ｄ．ほか、Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１６４：ｐ．１０３−１１８  （２０００年）参照）。遺伝子送達のための追加のウイルスがＲｅｙｎｏｌｄｓほか、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｔｏｄａｙ、５：ｐ．２５−３１（１９９９年）に記載されている。
【００９８】
また、組換えアデノウイルス（Ｍｕｒｐｈｙほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９４：ｐ．１３９２１−１３９２６  （１９９７年））、神経細胞特異的に送達させ存続させるための単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）（Ｌｏｗｅｎｓｔｅｉｎほか、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．、３０：ｐ．１６９−１７５（１９９５年））を含む他のウイルスベクターを用いることもできる。ヒト遺伝子処置におけるアデノウイルスベクターの利点としては、組換えがまれであり、このようなウイルスとヒトの悪性腫瘍とに関連がなく、アデノウイルスのゲノムが最大７．５ｋｂの大きさの外来遺伝子を受け入れさせるように操作することができる二本鎖ＤＮＡであり、生アデノウイルスが安全なヒトワクチン有機体であるという事実が挙げられる。また、アデノ関連ウイルスもまたヒトの治療用に有用である（Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．ほか、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：ｐ．３９４１（１９９１年））。
【００９９】
上記の開示されたＤＮＡ分子を発現することができ、特にヒトにおける今回の治療設定に有用である別のベクターは、複製しないようにすることができるワクシニアウイルスである（Ｐｅｐｌｉｎｋｓｋｉ，Ｇ．Ｒ．ほか、Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｃｌｉｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ、ｐ．７５７５−５８８  １９９８年））。組換えワクシニアウイルス及び異種ＤＮＡを含有する他のウイルス並びに免疫化及びＤＮＡ治療におけるそれらの使用に関する記載については、Ｍｏｓｓ，Ｂ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．  ３：ｐ．８６−９０（１９９３年）；Ｍｏｓｓ，Ｂ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０：ｐ．３４５−３６２  （１９９２年）；Ｍｏｓｓ，Ｂ．、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５８：ｐ．２５−３８（１９９２年）；Ｍｏｓｓ，Ｂ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：ｐ．１６６２−１６６７（１９９１年）；Ｐｉｃｃｉｎｉ，Ａほか、Ａｄｖ．Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．３４：ｐ．４３−６４（１９８８年）；Ｍｏｓｓ，Ｂ．ほか、Ｇｅｎｅ  Ａｍｐｌｉｆ  Ａｎａｌ  ３：ｐ．２０１−２１３（１９８３年）に概説されている。
【０１００】
裸のＤＮＡもしくはＲＮＡ又はウイルスベクターの他に、設計された細菌をベクターとして使用することができる。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、ＢＣＧ及びＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（ＬＭ）を含む多くの細菌株（Ｈｏｉｓｅｔｈ  ＆  Ｓｔｏｃｋｅｒ、Ｎａｔｕｒｅ  ２９１：ｐ．２３８−２３９（１９８１年）；Ｐｏｉｒｉｅｒ，Ｔ  Ｐほか、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８：ｐ．２５−３２（１９８８年）；（Ｓａｄｏｆｆ，Ｊ．Ｃ．ほか、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０，ｐ．３３６−３３８（１９８８年）；Ｓｔｏｖｅｒ，Ｃ．Ｋ．ほか、Ｎａｔｕｒｅ  ３５１，ｐ．４５６−４６０（１９９１年）；Ａｌｄｏｖｉｎｉ，Ａ．ほか、Ｎａｔｕｒｅ  ３５１，ｐ．４７９−４８２（１９９１年）；Ｓｃｈａｆｅｒ，Ｒ．ほか、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９，ｐ．５３−５９（１９９２年）；Ｉｋｏｎｏｍｉｄｉｓ，Ｇ．ほか、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０，ｐ．２２０９−２２１８（１９９４年））。これらの微生物はワクチンベクターとして用いるための２つの有望な特性を示す：（１）経口的にワクチンを送達させる能力をもたらす腸内感染経路；及び（２）単球／マクロフェージの感染により抗原がフェッショナルＡＰＣの標的となる、というものである。
【０１０１】
インビボでのウイルス媒介遺伝子移入の他に、ＤＮＡを直接的に移入するために、プラスミドＤＮＡの投与（Ｗｏｌｆｆほか、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：ｐ．１４６５−１４６８  （１９９０年）；Ｈｉｃｋｍａｎ，Ｍ．Ａ．ほか、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、５：ｐ．１４７７−１４８３（１９９４年））及び微粒子銃（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）媒介遺伝子移入（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｊ．ほか、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｐｒｏｔｃｏ、１０：ｐ．１２−１５（２００２年））を含む、当該分野で周知の物理的手段を用いることができる。さらに、インビトロで遺伝子を細胞中に移入するための周知の手段である電気穿孔法を用いてＤＮＡ分子をインビボで組織に移入することができる（Ｔｉｔｏｍｉｒｏｖ，Ａ．Ｖ．ほか、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １０８８：ｐ．１３１（（１９９１年））。
【０１０２】
「担体媒介遺伝子移入」についても記載がある（Ｗｕ，Ｃ．Ｈ．ほか、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：ｐ．１６９８５（１９８９年）；Ｗｕ，Ｇ．Ｙ．ほか、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３：ｐ．１４６２１（１９８８年）；Ｓｏｒｉａｎｏ，  Ｐ．  ほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：ｐ．７１２８（１９８３年）；Ｗａｎｇ，Ｃ−Ｙ．ほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：ｐ．７８５１（１９８２年）；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．ほか、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：ｐ．９６３（１９９２年））。好ましい担体は、アシル化ｍＡｂを脂質二重層に取り込むことができる免疫リポソームなどの標的化リポソーム（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ、１０：ｐ．１３０７−１３１５（２００３年））である。アシアログリコプロテイン／ポリリジン（Ｗｕほか、１９８９年、上掲）などのポリカチオンを用いることができ、この場合、この結合体は標的組織を認識する分子（例えば、肝臓用のアシアロオロソムコイド）及びＤＮＡに結合して形質移入されるＤＮＡ結合性化合物を含む。ポリリジンは、ＤＮＡに損傷を与えることなくそれに結合するＤＮＡ結合性分子の１例である。次に、この結合体はプラスミドＤＮＡと複合体を形成して移入される。
【０１０３】
形質移入又は微量注入のために用いるプラスミドＤＮＡは、当該分野で周知の方法を用いて、例えば、Ｑｕｉａｇｅｎ法（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いた後、本明細書に例示した方法などの既知の方法を用いてＤＮＡを精製することにより調製することができる。
【０１０４】
６．  併用療法
開示の組成物は、単独で、又は、免疫抑制因子、例えば他のリンパ球表面マーカー（例えばＣＤ４０）又はサイトカインに対する抗体、他の融合蛋白質、例えばＣＴＬＡ４１ｇ、又は他の免疫抑制薬（例えばサイクロスポリンＡ、ＦＫ５０６−様化合物、ラパマイシン化合物、又はステロイド）、抗増殖剤、細胞毒性剤、又は免疫抑制を補助しうる他の化合物を含むがこれに限られない一つ以上の追加的治療剤と組み合わせて、必要な対象に投与されうる。
【０１０５】
本明細書で使用されるところの、「ラパマイシン化合物」という用語は、中性の三環式化合物ラパマイシン、ラパマイシン誘導体、ラパマイシンアナログ、及びラパマイシンと同じ作用機序（例えばサイトカイン機能の阻害）を有すると考えられる他のマクロライド系化合物を含む。「ラパマイシン化合物」という語は、ラパマイシンと構造的な類似性を有する化合物、例えば治療効果を増強するために改変されている、類似の大環状構造を有する化合物を含む。例示的なラパマイシン化合物は、従来技術において周知である（例えば国際公開第９５１２２９７２号、第９５１１６６９１号、第９５１０４７３８号、米国特許第６，０１５，８０９号；第５，９８９，５９１号；米国特許第５，５６７，７０９号；第５，５５９，１１２号；第５，５３０，００６号；第５，４８４，７９０号；第５，３８５，９０８号；第５，２０２，３３２号；第５，１６２，３３３号；第５，７８０，４６２号；第５，１２０，７２７号を参照）。
【０１０６】
「ＦＫ５０６−様化合物」という語は、ＦＫ５０６、及びＦＫ５０６誘導体及びアナログ、例えばＦＫ５０６と構造的類似性をもつ化合物、例えば、治療効果を高めるために改変されている、類似の大環状構造をもつ化合物を含む。ＦＫ５０６−様化合物の例には、例えば国際公開第００１０１３８５号において記載されるものが含まれる。本明細書で用いられるところの「ラパマイシン化合物」という語には、ＦＫ５０６−様化合物が含まれないのが好ましい。
【０１０７】
別の適切な治療薬には、抗炎症剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。抗炎症剤は、非ステロイド性、ステロイド性、又はその組み合わせでありうる。一実施態様は、約１％（ｗ／ｗ）〜約５％（ｗ／ｗ）、典型的に約２．５％（ｗ／ｗ）又は抗炎症剤を含む経口組成物を提供する。非ステロイド系消炎薬の代表例には、ピロキシカム、イソキシカム、テノキシカム、スドキシカム等のオキシカム；アスピリン、ジサルシド、ベノリレート、トリリセート、サファプリン、ソルプリン、ジフルニサル、及びフェンドサル等のサリチル酸塩；ジクロフェナク、フェンクロフェナク、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、イソキセパック、フロフェナック、チオピナク、ジドメタシン、アセマタシン、フェンチアザク、ゾメピラク、クリダナク、オクキセピナク、フェルビナク、及びケトロラック等の酢酸誘導体；メフェナミック、メクロフェナミック、フルフェナミック、ニフルミック、及びトルフェナミック酸等のフェナム酸；イブプロフェン、ナプロキセン、ベノキサプロフェン、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、フェノプロフェン、フェンブフェン、インドプロフェン（ｉｎｄｏｐｒｏｐｆｅｎ）、ピルプロフェン、カルプロフェン、オキサプロジン、プラノプロフェン、ミロプロフェン、チオキサプロフェン、スプロフェン、アルミノプロフェン、及びチアプロフェン等のプロピオン酸誘導体；フェニルブタゾン、オキシフェンブタゾン、フェプラゾン、アザプロパゾン、及びトリメタゾン等のピラゾールが挙げられるが、これらに限定されるものではない。これらの非ステロイド系消炎薬の混合物が用いられてもよい。
【０１０８】
ステロイド性抗炎症薬の代表例には、ハイドロコルチゾン、ヒドロキシル−トリアムシノロン、アルファ−メチルデキサメサゾン、デキサメサゾン−フォスフェート、ベクロメタゾンジプロピオネート、吉草酸クロベタゾール、デソニド、デソキシメタゾン、酢酸デゾキシコルチコステロン、デキサメサゾン、ジクロリゾン、ジフロラゾンジアセテート、吉草酸ジフルコルトロン、フルアドレノロン、フルクロロロンアセトニド、フルドロコルチゾン、ピバリン酸フルメタゾン、フルオシノロンアセトニド、フルオシノニド、フルコルチンブチルエステル、フルオコルトロン、酢酸フルプレドニデン（フルプレドニリデン）、フルランドレノロン、ハルシノニド、酢酸ヒドロコルチゾン、酪酸ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロンアセトニド、コルチゾン、コルトドキソン、フルセトニド、フルドロコルチゾン、ジフルオロゾンジアセテート、フルラドレノロン、フルドロコルチゾン、ジフルロゾンジアセテート、フルラドレノロンアセトニド、メドリゾン、アムシナフェル、アムシナフィド、ベタメタゾン及びそのエステルの平衡物、クロロプレドニゾン、酢酸クロロプレドニゾン、クロコルテロン、クレシノロン、ジクロリゾン、ジフルルプレドネート、フルクロロニド、フルニゾリド、フルオロメタロン、フルペロロン、フルプレドニゾロン、吉草酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾンシクロペンチルプロピオネート、ヒドロコルタメート、メプレドニゾン、パラメタゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、ベクロメタゾンジプロピオネート、トリアムシノロン、及びその混合物等のコルチコステロイドが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１０９】
Ｖ．  トランスジェニック動物
Ｂ７−Ｈ４を発現しないか発現が減少したトランスジェニック非ヒト動物が、スクリーニング及びテストにおいて有用である。内因性Ｂ７−Ｈ４遺伝子及び対立遺伝子が、遺伝子に遺伝因子を挿入して発現を妨げることにより妨げられうる。内因性Ｂ７−Ｈ４遺伝子が、相同的組み換えを使用して欠失されるのが好ましい。代表的な非ヒトトランスジェニック動物には、マウス又は他の齧歯類、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、及び非ヒト霊長類が含まれる。
【０１１０】
トランスジェニック動物が、Ｂ７−Ｈ４がいかに免疫系を調節するか、特にＢ７−Ｈ４がいかに免疫反応を抑制するかを研究するための研究ツールとして用いられうる。例えば、トランスジェニック動物を用いて、内因性Ｂ７−Ｈ４生物活性を模倣する化合物、又は、可溶性Ｂ７−Ｈ４と相互作用する化合物をスクリーニングできる。
【０１１１】
本発明は、以下の限定されない実施例を参照することによってさらに理解されよう。
【実施例】
【０１１２】
（実施例１）
Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスの作製
マウス
６乃至８週令のＣ５７ＢＬ１６（Ｂ６）マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。ＲＡＧ−１  ＫＯマウスはＴａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓから購入した。実験には雌雄マウスとも使用した。全てのマウスは、Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｆａｃｉｌｉｔｙにおいて施設内動物管理使用委員会により承認された全てのプロトコルを用いて特定病原体感染防止条件下で飼育した。相同組換えによって遺伝子ＫＯマウスを作製する一般的な方法については、Ｄｏｎｇ，  Ｈ．ほか、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２０：ｐ．３２７−３３６  （２００４年）；Ｔａｍａｄａ，  Ｋ．ほか、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６８：ｐ．４８３２−４８３５  （２００２年）により記載された。Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスを作製するために、１２９ＳｖＪ細菌人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）からマウスＢ７−Ｈ４ゲノムＤＮＡのＩｇＶドメイン（エクソン３）の上流の５．０９ｋｂＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅し、ｐＫＯスクランブラーベクターＮＴＫＶ−１９０７（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）の５’アーム位中にクローニングした。同じライブラリからＢ７−Ｈ４ゲノムＤＮＡのＩｇＣドメイン（エクソン４）の下流の５．５７ｋｂＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅し、同じベクターの３’アーム位中にクローニングしてＢ７−Ｈ４遺伝子からのＩｇＶ及びＩｇＣドメインの除去をもたらす標的プラスミドを作製した（図１Ａ）。Ｂ７−Ｈ４遺伝子の５’アーム及び３’アーム配列、ポジティブ選択マーカーＮＥＯ及びネガティブ選択マーカーＴＫを含有する標的断片を１２９ＳｖＩＥ胚幹（ＥＳ）細胞中に形質移入した。ＥＳ細胞形質移入体をネオマイシン薬剤選択にかけた。標的とするクローンは、３’外部プローブを用いるサザンブロット分析によって同定した。個々のＢ６の胚盤胞中に標的ＥＳ細胞を注入することによりキメラマウスを作製した。キメラマウスをＢ６マウスと交配してヘテロ接合体Ｂ７−Ｈ４（＋Ｉ−）マウスを得た。野生型及びＢ７−Ｈ４対立遺伝子欠失を識別するためにＰＣＲ分析を行った。３種のＰＣＲプライマーの配列は以下の通りとした。
【０１１３】
【化１】
0005481199.tif 000002
１０世代超の間Ｂ６へ戻し交配することによりホモ接合体マウスを作製した後、更なる分析に用いた。Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスとＲＡＧ−１ＫＯマウスとを戻し交配することによりＢ７−Ｈ４ＫＯ／ＲＡＧ−１ＫＯマウスを得た。
【０１１４】
Ｂ７−Ｈ４遺伝子のＩｇＶ及びＩｇＣ領域全体を欠損させてその潜在的な受容体とのこれらの相互作用を完全になくすことで１２９ＥＳ細胞における相同組換えを行ってＢ７−Ｈ４ＫＯマウスを作製した。Ｂ７−Ｈ４遺伝子のＩｇＶ及びＩｇＣドメインをコードするエクソンはＮｅｏ遺伝子カセットで置換した（図１）。ＥＳ細胞の標的組換えはサザンブロット分析によって確認し、４つの独立したＥＳクローンからのデータを図に示した。
【０１１５】
Ｂ７−Ｈ４＋対立遺伝子は１２．２５ｋｂ  Ｓｐｅ１断片を有し、Ｂ７−Ｈ４−対立遺伝子は８．９ｋｂ  Ｓｐｅ１断片を有すると予測される。両断片を有するクローン（２及び３）は組換えが生じたことを示す。これらのＥＳクローンから標準的な手順によりキメラ雄性マウスを得た。こうしたマウスをＣ５７ＢＬ１６（Ｂ６）雌へ戻し交配し、２つの独立した標的ＥＳクローンからヘテロ接合体改変マウスを確立した。次いで、Ｂ７−Ｈ４改変マウスがヘテロ接合体であるかホモ接合体であるかについて、尾部生検試料から単離したゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析により確認した。サザンブロット分析によってゲノムＤＮＡが置換されていることを確認した。ＲＴ−ＰＣＲ分析によってＢ７−Ｈ４欠損マウスの肝臓ではＢ７−Ｈ４ｍＲＮＡが発現されていないことが明らかとなった。Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスは正常に成長し、正常な同腹仔数が得られた。こうしたマウスを１０世代の間、Ｂ６バックグラウンドへ戻し交配した後、下記の実験に用いた。
（実施例２）
Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスにおけるリステリア菌感染に対する顆粒球媒介抵抗性の増強
抗体、組換え蛋白及びフローサイトメトリー分析
ＦＩＴＣ、ＰＥ又はＡＰＣと直接結合体を形成する、マウスＧｒ−１及びＣＤ１１ｂに対する一次及び二次抗体はＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）又はｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から購入した。結合体を形成していない一次抗体をハイブリドーマ培養上清から精製した。Ｂ７−Ｈ４Ｉｇ融合蛋白はＳｉｃａ，Ｇ．Ｌ．ほか、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１８：ｐ．８４９−８６１（２００３年）に記載されているのと同様にして調製した。細胞は全て先に記載したように標準的なプロトコルを用いて染色し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメトリーで分析した（同上文献）。そのデータはＳｏｆｔｗａｒｅ  ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ  （ＢＤ）又はＦｌｏｗＪｏ  （Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ．、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を用いて解析した。インビボ実験の場合、ｍＡｂは、以前に記載された様に（同上文献）調製し、精製した。抗ＮＫ１．１ハイブリドーマ（ＰＫｌ３６）及び抗ＩＦＮ−γハイブリドーマ（Ｒ４−６Ａ２）はＡＴＣＣから購入した。抗Ｇｒ−１ハイブリドーマ（ＲＢ６−８Ｃ５）はシカゴ大学のＨａｎｓ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ博士から親切な提供を受けた。対照マウスＩｇＧ、ラットＩｇＧ及びハムスターＩｇＧはＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入し、さらに、以前に記載された様に（同上文献）精製した。カラゲナンはＳｉｇｍａから購入した。全ての細胞培養培地及び抗体はＣｅｌｌｇｒｏ（Ｈｅｒｎｄｏｎ、ＶＡ）から購入した。ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）はＨｙｃｌｏｎｅ（Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）  から購入した。
【０１１６】
リステリア菌感染及びコロニー計数
Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株ＤＰ−Ｌ４０５６はＣｅｒｕｓ  Ｃｏｒｐ．のＴｈｏｍａｓ  Ｗ．Ｄｕｂｅｎｓｋｙ  Ｊｒ．博士から親切な提供を受けた。リステリア菌のストックを調製するため、リステリア菌細胞をＤｌＦＣＯ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈ  （Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏ．、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ）中、ＯＤ６００ｎｍで０．８乃至１となるまで増殖させた。培養物を遠心分離により採集しＰＢＳで２度洗浄した。次いで、ペレットをストック用溶液（１５乃至２０％グリセロール含有ＰＢＳ）に再懸濁し、マイクロチューブ当たり２００μｌのアリコートにして−８０℃で貯蔵した。リステリア菌ストックのコロニー形成単位（ＣＦＵ）は、ＢＢＬ  ＣＨＲＯＭａｇａｒ  Ｌｉｓｔｅｒｉａプレート（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｃｏ．、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ）上で増殖する上記アリコートの希釈系列液のコロニーを計測することにより求めた。感染させる前に、リステリア菌ストックを解凍してＰＢＳで適切なＣＦＵ／ｍｌ濃度に希釈し、示したようにしてマウス又は細胞に適用した。６乃至８週令のマウスに対して、示したＣＦＵのリステリア菌を腹腔内（ｉ．ｐ．）又は静脈内（ｉ．ｖ．）注射して感染させた。感染後の示した時点で、マウスの肝臓又は膵臓の一片を切り取り、重量を計ってＰＢＳ中ですり潰した。得られた肝臓懸濁液はＢＢＬ  ＣＨＲＯＭａｇａｒ  Ｌｉｓｔｅｒｉａプレート又はＬｉｓｔｅｒｉａ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈの寒天プレート上で平板培養した。平板培養後２日にコロニーを計数し、肝臓又は脾臓のＣＦＵＩｇに調整した。
【０１１７】
インビトロにおける顆粒球のリステリア菌感染
顆粒球は、Ｃｈｅｎ，  Ｌ．  Ｙ．ほか、Ｈｕｍ．  ＭｏＬ．  Ｇｅｎｅｔ、１２：ｐ．２５４７−２５５８  （２００３年）に記載の方法と同様にして単離した。つまり、マウスに３％チオグリコレート培地をｉ．ｐ．注射した。注射後４乃至５時間に、各マウスの腹膜腔を５ｍｌのＰＢＳで洗浄し、遠心分離により細胞を収集した。この方法では、採集細胞の９０％より多くが、Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋顆粒球であった。１×１０６個の顆粒球を１×１０８ＣＦＵのＬＭと３７℃で１０分間インキュベートした。培養は、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）の添加によって終結した。次いで、遠心分離によって細胞を収集し、これを９６穴プレートで平板培養した。プレートを３７℃でインキュベートし、示した時点で採集した。細胞は、１ｍｌの滅菌水中に再懸濁して直ちに溶解させた。細胞溶解液又は希釈細胞溶解液をＬｉｓｔｅｒｉａ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｂｒｏｔｈの寒天プレート上に平板培養してコロニーを計数した。
【０１１８】
顆粒球の呼吸バースト及び貪食
Ｒａｄｓａｋ，Ｍ．Ｐ．ほか、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７２：ｐ．４９５６−４９６３  （２００４年）；Ｒａｄｓａｋ，Ｍ．Ｐ．ほか、Ｂｌｏｏｄ、１０１：ｐ．２８１０−２８１５（２００３年）に記載の方法と同様にして、顆粒球の貪食活性及び酸化的バースト活性を測定した。つまり、１×１０６個の顆粒球を５×１０７個の赤色蛍光マイクロビーズ（ＦＬＵＯＲＥＳＢＲＩＴＥ（登録商標）  Ｐｏｌｙｃｈｒｏｍａｔｉｃ  Ｒｅｄ  １．０  Ｍｉｃｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、ＰＡ）及び２５μＭのＤＣＦＨ−ＤＡ（２’，７’−ジヒドロクロロフルオレセイン二酢酸、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と共に３７℃で３０乃至６０分間インキュベートした。次いで、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（１％ＦＢＳを含むＰＢＳ）で２度洗浄し、１％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで固定した。分析はフローサイトメトリーによって行った。
【０１１９】
病理学
組織の処理及び染色の方法についてはＤｏｎｇ，Ｈ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．  ８：ｐ．７９３−８００（２００２年）に記載されている。簡単に言えば、６乃至８週令のマウスの脾臓試料をＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ  ＵＳＡ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）で包埋し、−８０℃で凍結した。凍結組織はスライスにし、固定して５μｇ／ｍｌのＧｒ−１−ビオチン抗体で染色した。次いで、ＡＢＣペルオキシダーゼ（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）及びＤＡＢペルオキシダーゼ基質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をメーカーのプロトコルに従ってスライドに適用した。最後に、ヘマトキシリン液を用いてＧｒ−１ネガティブ細胞を染色した。
【０１２０】
結果
Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスは正常な数及び率のＴ、Ｂ、ＮＫ、ＮＫＴ細胞及びマクロファージを示す。ＣＤ３架橋による精製Ｔ細胞のインビトロ増殖、同種抗原刺激又は同種抗原に対する細胞傷害性Ｔ細胞の応答により判断して、Ｔ細胞応答に明白な変化は認められない。これらの結果から、抗原に対する多クローン性Ｔ細胞の応答はＢ７−Ｈ４ＫＯマウスでは損なわれないことが示される。こうしたインビトロの知見と符合して、Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスはＣｏｎ−Ａ誘導肝炎（Ｄｏｎｇ，Ｈ．ほか、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２０３２７−３３６（２００４年））、ハプテン誘導過敏症（Ｔｓｕｓｈｉｍａ，Ｆ．ほか、Ｅｕｒ．Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３３：ｐ．２７７３−２７８２（２００３年））及びＯＶＡ誘導気道炎症（Ｋａｍａｔａ，Ｔ．、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ、１１１：ｐ．１０９−１１９（２００３年））に対して正常な応答を示すことも見出した。また、Ｂ７−Ｈ４欠損マウスはＯＶＡ蛋白に対するＯＴ−Ｉ及びＯＴ−ＩＩ細胞の増殖（Ｓｉｃａ，Ｇ．Ｌ．、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１８８４９−８６１（２００３年））、超抗原に対するＣＤ４−Ｖβ８．１１８．２Ｔ細胞の増殖（Ｔａｍａｄａ，Ｋ．ほか、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６８：ｐ．４８３２−４８３５（２００２年））並びにインビボにおける同種抗原に対するＣＴＬ活性（Ｔａｍａｄａ，Ｋ．、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．、６：ｐ．２８３−２８９（２０００年））において野生型マウスと同等であることも見出した。また、正常なＢ細胞応答がＴＮＰ−ＫＬＨによる免疫化（Ｔａｍｕｒａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．、Ｂｌｏｏｄ９７：ｐ．１８０９−１８１６（２００１年））後に認められた。Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスは、ＳＰＦ条件で最長１．５年、自然発生の自己免疫疾患を発症しない。
【０１２１】
これらのデータからＢ７−Ｈ４はアッセイにおける抗原駆動Ｔ及びＢ細胞応答に最小の関与であることが分かるが、これらの応答は、活動性感染の非存在下に行われたものであり、活動性感染が存在すれば、通常、自然免疫と適応免疫との精巧な協調を必要とする。この可能性を検証するために、Ｂ７−Ｈ４を除いた場合の影響をＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  （ＬＭ）に感染させたマウスで評価してＢ７−Ｈ４が感染に対する免疫に寄与するかどうかを調べた。マウスに、致死性を誘導するのに十分な腹腔内（ｉ．ｐ．）用量（２×１０６ＣＦＵ）のＬＭを感染させた。次に、こうしたマウスの生残について評価した。Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスはＬＭ感染に対して有意により抵抗性であった。即ち、Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスは野生型（ＷＴ）同腹仔よりもはるかに長く生残し、マウスの最大４０％が細菌を除去し、いつまでも生存したのに対して、全ての同腹仔は９日目前後で死亡した（図２ａ）。この効果は、Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスの脾臓（図２ｂ）及び肝臓中のリステリア菌数の減少と相関性がある。興味深いことに、大部分のマウスは、適応免疫が通常まだ発達していない時点である３乃至４日以内に死んでいた。従って、これらの結果から、Ｂ７−Ｈ４は自然免疫応答の状況を変えることに関与することが示唆される。
【０１２２】
この抵抗性のメカニズムに取り組むために、自然免疫及び適応免疫の細胞組成を調べた。マウスをリステリア菌に感染させ、末梢血及びリンパ系器官中のＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ及び顆粒球を特異的ｍＡｂによって調べた。ＬＭ感染後最初の３日以内ではＮＫ、マクロファージ、Ｔ細胞及びＢ細胞に有意な差違は見られなかったが、脾臓中の顆粒球は、感染３日目で、同一に感染させたＷＴ同腹仔よりもＬＭ感染Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスから有意により多く見出された（図２ｃ）。同様な結果は、感染後の肝臓から単離される顆粒球及び末梢血の顆粒球においても得られた。しかしながら、未感染のＢ７−Ｈ４ＫＯマウスでは、顆粒球数はＷＴ対照の正常範囲内にあった。これらの結果から、Ｂ７−Ｈ４の役割はＬＭ感染時の顆粒球応答を阻害することにあることが分かる。
【０１２３】
Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスにおけるＬＭ感染の抵抗性に顆粒球が必要とされるかどうかを明らかにするために、Ｇｒ−１ｍＡｂを接種することにより顆粒球を枯渇させた。Ｇｒ−ＩｍＡｂを注射すると、２日目の脾臓において顆粒球が検出不可能なレベルにまで急速に減少した。Ｇｒ−Ｉおよび顆粒球を枯渇させると、ＰＢＳ又はアイソタイプ適合対照ｍＡｂで処置したマウスと比較して、Ｂ７−ＫＯマウスからの肝臓におけるＬＭ負荷は有意に増大した（図２ｄ）。ＮＫ細胞をＮＫＩ．ＩｍＡｂによって枯渇させても肝臓におけるＬＭのコロニー形成に影響を及ぼさなかったが、マクロファージをカラゲナンにより枯渇させると、ＬＭコロニーは中等度に増殖したが、Ｇｒ−Ｉ細胞枯渇の場合に比し、より重要性の低いレベルであった。従って、これらの結果は、Ｇｒ−Ｉおよび顆粒球が、Ｂ７−Ｈ４非存在下におけるＬＭ感染に対する抵抗性に重要な役割を果たしていることを示すものである。
【０１２４】
Ｂ７−Ｈ４欠乏顆粒球では機能性が改変されているかどうかについて精製顆粒球とＬＭとの共培養により明らかにした。Ｂ７−Ｈ４欠乏顆粒球は培養系中のＬＭの正常な取り込み及び増殖阻害を示した（図３）。さらに、Ｂ７−Ｈ４ＫＯ顆粒球による呼吸バースト及び貪食も正常であり、Ｂ７−Ｈ４ＫＯ顆粒球はＷＴ顆粒球と機能的に異ならないことが示された。従って、Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスにおいてＬＭ感染に対する抵抗性が増大するのは、顆粒球の機能的能力の増大によるのでなく、顆粒球数の増加による可能性が高い。
（実施例３）
Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスの顆粒球媒介自然抵抗性は適応免疫と無関係である。
【０１２５】
活性化及び記憶Ｔ細胞はＬＭに対する免疫における重要な構成要素である（Ｎａｔｈａｎ，Ｃ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．ＩｍｍｕｎｏＬ、６：ｐ．１７３−１８２（２００６年））。データはＬＭ感染に対するＢ７−Ｈ４ＫＯマウスの抵抗性が顆粒球を必要とすることを支持しているが、適応免疫もこの抵抗性に寄与しているかどうかは不明である。ＬＭ感染後の顆粒球数の増加はＢ７−Ｈ４ＫＯマウスに見出される主要な表現型であるので、ＬＭ感染に対するＢ７−Ｈ４ＫＯマウスの反応を適応免疫の非存在下に調べた。Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスは、ＲＡＧ−１ＫＯバックグラウンドへ戻し交配してＴ及びＢ細胞を除去した。
【０１２６】
結果
小さな脾臓を有するＲＡＧ−１ＫＯ（ＲＫＯ）マウスと異なって、Ｂ７−Ｈ４／ＲＡＧ−１二重ＫＯ（ＤＫＯ）マウスは脾臓の拡大を呈する。ＤＫＯマウスの脾臓サイズはＢ６バックグラウンドにおけるＷＴ及びＢ７−Ｈ４ＫＯマウスと同様である。脾臓、末梢血、肝臓及び骨髄の細胞成分をさらに分析すると、Ｇｒ１＋ＣＤ１１ｂ＋顆粒球が劇的に増加することが明らかとなった。
【０１２７】
ＲＫＯ及びＤＫＯマウスに対して、その後、致死量のＬＭを投与して感染させ、これらの自然抵抗性を検討した。ＬＭによりＲＫＯマウスを感染させることによって肝臓のＬＭは指数関数的に増殖し、４日目には死亡率１００％となった（図４）。これとは際立って対照的に、ＤＫＯマウスは２日目の肝臓における細菌負荷が有意に少なく、大部分のマウスはＬＭ感染後１０日を超えて生残することができた（図４）。脾臓を含む他の器官でも同様なＬＭの指数関数的増殖が認められ、ＬＭ感染の播種が示された。感染Ｂ６バックグラウンドＢ７−Ｈ４ＫＯマウスのかなりの割合が長期間生残した（図２ａ）のとは対照的に、ＤＫＯマウスは全て最終的に１５日目に感染死したことは、適応免疫の重要な役割を確認するものである（図４）。ＬＭが２日目という早期にＤＫＯマウスの肝臓その他の器官から速やかに除去されたことと合せ、その結果は、Ｂ７−Ｈ４の欠乏によってＬＭ感染に対する自然免疫が増強され、これは主として顆粒球の増加によって媒介されることを示す。
（実施例４）
Ｂ７−Ｈ４は顆粒球の増殖を直接阻害する。
【０１２８】
骨髄細胞の培養並びに顆粒球の増殖及び阻害試験
骨髄細胞を吸引し、Ｗｉｌｃｏｘ，Ｒ．Ａ．ほか、Ｂｌｏｏｄ、１０３：ｐ．１７７−１８４（２００４年）に記載されている方法と同様にして調製した。Ｂ７−Ｈ４媒介増殖阻害の場合、９６穴プレート中でＢ７−Ｈ４Ｉｇ又は対照マウスＩｇを一夜コーティングした。十分洗浄した後、組換えマウスＧ−ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、ＮＪ）を示した濃度で含み、又は含まない２４穴プレート中でＢＭ細胞を２×１０６個／穴平板培養した。示した時点で細胞を採集し、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ）で細胞数を計数した。細胞増殖を調べるために、２×１０５／穴のＢＭ細胞をＧ−ＣＳＦを含む９６穴プレート中で平板培養した。３ＨＴｄＲでパルスした後、細胞を３ＨＴｄＲパルス後１６時間にＦｉｌｔｅｒＭａｔｅセルハーベスタ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｓｈｅｌｔｏｎ、ＣＴ）で収集した。取り込まれた３ＨＴｄＲはＴｒｉｌｕｘ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ及びＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｗａｌｌａｃ、Ｔｕｒｋｕ、Ｆｉｎｌａｎｄ）によって検出した。細胞分裂試験の場合、まず、ＢＭ細胞を２μＭのカルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステル（ｃａｒｂｏｘｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ）（ＣＦＳＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で標識し、次いで９６穴又は２４穴プレートにおける培養物に添加した。示した時点で細胞を収集し、ｍＡｂ  Ｇｒ−１及びＣＤ１１ｂで染色し、種々の時点のＣＦＳＥ含量（２）についてフローサイトメトリー分析を行った。
【０１２９】
結果
Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスにおいて顆粒球が増加したことから、Ｂ７−Ｈ４は顆粒球に増殖阻害シグナルを送達することに関与していることが示唆される。Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスからの顆粒球について、これがＷＴ顆粒球よりも増殖能に優れているかどうかを明らかにするための検討を行った。これを行うために、多数の顆粒球前駆体を含有する骨髄（ＢＭ）細胞をＷＴ又はＢ７−Ｈ４ＫＯマウスから調製し、Ｇ−ＣＳＦの存在又は非存在下に３日間培養して顆粒球／好中球の分化を促進した。次いで、ＢＭ細胞の増殖を  ３ＨＴｄＲの取り込みにより測定した。図５ａに示したように、ＢＭ細胞は用量依存性に増殖することでＧ−ＣＳＦに反応するが、Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスからのＢＭ細胞の増殖はＷＴ細胞からの場合よりも有意に高かった。培養の最後においてＧ−ＣＳＦに反応するＢＭ細胞のフローサイトメトリー分析を行った結果から、生残細胞の９５％超はＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ−１＋顆粒球であることを示している。
【０１３０】
このデータは顆粒球におけるＢ７−Ｈ４の阻害効果と一致しているが、ＢＭ細胞中の他の細胞成分が増殖に寄与することも考えられる。この可能性を明確に排除するために、ＢＭ細胞をＣＦＳＥで標識し、Ｇ−ＣＳＦで３日間刺激した後、この細胞を抗Ｇｒ−１＋／ＣＤ１１ｂ＋ｍＡｂで染色することにより細胞分裂に関して顆粒球を観察した。図５ｂは、Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウス（Ｂ６）からの７０％のＧｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋顆粒球が少なくとも１回分裂するのに対し、ＷＴＢ６マウスからのわずか５６％の顆粒球がＣＳＦＥの希釈を示した。同様ではあるがより大きな有意差がＲＡＧ−１ＫＯバックグラウンドを有するマウスで見出された。即ち、ＤＫＯマウスの８６％の顆粒球が分裂を始めたのに対し、ＲＫＯマウスからのわずか６４．８％の顆粒球がＣＳＦＥの希釈を示した。従って、これらの結果から、ＢＭ細胞においてＢ７−Ｈ４が欠乏すると、ＢＭ由来顆粒球の増殖が増大することが示唆される。
【０１３１】
Ｂ７−Ｈ４の欠乏がＢＭ由来顆粒球の増殖増大をもたらし得ることを考慮して、Ｂ７−Ｈ４がその増殖を直接阻害することができるかどうかを調べた。これを検証するために、組換えＢ７−Ｈ４Ｉｇ融合蛋白の存在下にＷＴ  ＢＭ由来顆粒球を培養し、顆粒球の増殖について調べた。ＷＴ  ＢＭ細胞の増殖は、Ｂ７−Ｈ４の細胞外部分と免疫グロブリンＦｃとの融合蛋白であるＢ７−Ｈ４Ｉｇによって有意に阻害された。この阻害は培養３日目で明らかであり、４及び５日目でより著しくなった（図６ａ）。培養液に０．１ｎｇ／ｍｌのＧ−ＣＳＦを添加すると、ＢＭ細胞の増殖が中等度に増大したにもかかわらず、Ｂ７−Ｈ４Ｉｇ媒介の抑制は有意には覆されなかった（図６ｂ）。しかしながら、培養液中のＧ−ＣＳＦを１ｎｇ／ｍｌに増加させると、ＢＭ細胞のＢ７−Ｈ４Ｉｇ媒介増殖阻害を大きく回復させることができた（図６ｃ）。同様な阻害はＢ７−Ｈ４欠乏顆粒球でも認められた。集約すると、これらの結果から、さらに、Ｂ７−Ｈ４は顆粒球の増殖に対して阻害的であるが、これをＧ−ＣＳＦが逆転させ得るという証拠が得られる。
【０１３２】
Ｂ７−Ｈ４がリステリア菌感染に対する自然免疫を負に調節し得ることを発見した。Ｂ７−Ｈ４の効果は顆粒球の増殖抑制によって媒介されると考えられる。末梢組織におけるＢ７−Ｈ４の広範な発現パターンとの関連で、これまでに記載したＴ細胞応答の阻害におけるＢ７−Ｈ４の役割の他に、Ｂ７−Ｈ４が末梢組織の自然免疫の制御において重要な調節分子であることをデータは裏付けている。
【０１３３】
Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスでは、Ｂ７−Ｈ４蛋白の細胞外部分の大部分が欠損することにより内因性Ｂ７−Ｈ４とその推定上の受容体との相互作用が完全に排除される。しかしながら、この遺伝子を除去すると、インビトロにおける多クローン性及び異種抗原刺激に対するＴ細胞応答に強い影響はない。Ｓｕｈ，Ｗ．Ｋ．ほか、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、２６：ｐ．６４０３−６４１１（２００６年）により報告された最近の研究でも同様な観察がなされている。これらの知見からＢ７−Ｈ４はＣＤ３架橋又は異種抗原に対する強い多クローン性Ｔ細胞応答の阻害に実質的には影響を及ぼさないことが示唆されるが、Ｂ７−Ｈ４がＴ細胞応答のカスケードにおけるより選択的な段階に影響する可能性がある。例えば、最近の研究では、Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスは数種の気道炎症反応並びにＬＣＭＶ及びインフルエンザ感染に対して正常に反応するが、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ感染に対してはこのマウスはＴ細胞免疫応答の軽度の増強を示すことが分かっている。しかしながら、このノックアウト系では顆粒球の応答については検討されていない。今回の実験から、リステリア菌感染におけるＢ７−Ｈ４の主要な役割は顆粒球媒介自然免疫を抑制することであり、この効果は適応免疫系の非存在下のＲＡＧ−１  ＫＯマウスでも認め得ることが示唆される。従って、これまでに報告されたＴ細胞免疫の阻害の他に、Ｂ７−Ｈ４は細菌感染に対する自然免疫の負の調節に重要な役割を果たし得る。
【０１３４】
Ｂ６１Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスの脾臓では顆粒球が軽度に増加するが、ＬＭ感染時には顆粒球は劇的に増加する（図２）。しかしながら、この増加は、単にＬＭ誘導性炎症による動員の増大によるものではない。Ｂ６バックグラウンドのＢ７−Ｈ４ＫＯマウスは感染のない血液、骨髄及び脾臓において顆粒球のわずかな増加を示す。ＲＡＧ−１  ＫＯバックグラウンドではより劇的な顆粒球増加が認められる。さらに、Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスからの骨髄細胞はＧ−ＣＳＦ刺激存在下により多くの顆粒球を産生する。最後に、培養液にＢ７−Ｈ４蛋白を含めると骨髄由来顆粒球の増殖が有意に阻害される。顆粒球の阻害におけるＢ７−Ｈ４の役割は、培養液により高濃度のＧ−ＣＳＦを添加することで少なくともある程度逆転し得る。Ｇ−ＣＳＦはインビボにおける顆粒球の増殖及び恒常性のための重要な因子である。この結果から、Ｂ７−Ｈ４はインビボにおけるＧ−ＣＳＦの役割に拮抗する負の調節因子として働き得ることが示唆される。集約すると、これらの結果から、Ｂ７−Ｈ４は、顆粒球の第一位の増殖因子であるＧ−ＣＳＦに対する顆粒球の反応性の阻害シグナルを供給することにより、顆粒球の恒常性を調節できることが確認される。
【０１３５】
Ｂ７−Ｈ４は、その推定上の受容体に結合すると、Ｔ細胞の細胞周期の進行を阻害することが示されている（Ｓｉｃａ，Ｇ．Ｌ．ほか、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １８：ｐ．８４９−８６１（２００３年）；Ｋｒｙｃｚｅｋ，Ｉ．、Ｊ．Ｅｉｃｐ．Ｍｅｄ．、２０３：ｐ．８７１−８８１（２００６年））。この細胞培養系では、ＣＦＳＥの希釈及び３ＨＴｄＲの取り込みが明らかに阻害される（図６ａ）。骨髄細胞は、顆粒球の重要な増殖因子であるＧ−ＣＳＦを外因的に供給しなくても増殖（図６ａ）及び細胞分裂（図５ｇ）が観察された。内因性Ｇ−ＣＳＦが骨髄細胞によって産生され、インビトロにおける基底レベルの増殖を維持している可能性がある。この抑制はＧ−ＣＳＦを添加することで大きく逆転し得た（図６ｃ）。培養中、細胞アポトーシスの有意な増加は最長５日間認められなかった。従って、Ｂ７−Ｈ４結合による顆粒球において増殖阻害が主要なメカニズムであり得る。Ｂ７−Ｈ４ｍＲＮＡは種々の細胞によって広く発現されるが、その細胞表面発現は、卵巣癌及び浸潤性マクロファージにおいて観察されたように（Ｋｒｙｃｚｅｋ，Ｉ．ほか、Ｊ．Ｅｉｃｐ．Ｍｅｄ．、２０３：ｐ．８７１−８８１（２００６年））、大部分は細胞質内に含み得る。Ｂ７−Ｈ４の表面発現が骨髄微小環境内のサイトカインによって調節されて顆粒球の増殖を阻害し得る。
【０１３６】
好中球を含む顆粒球は感染部位に最も早期に達する細胞の一つであり、貪食能を介した個々のの感染防御の最前線である（Ｎａｔｈａｎ，Ｃ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．、Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６：ｐ．１７３−１８２（２００６年））。Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスにおいてリステリア菌感染に対する抵抗性が増大することを示す上記知見は、リステリア菌及び恐らく他の病原体による感染に対する自然免疫を増強する新たなアプローチを包含する。また、ＲＡＧ−１バックグラウンドのＢ７−Ｈ４ＫＯマウスが、Ｂ６バックグラウンドのＢ７−Ｈ４ＫＯマウスと比較して顆粒球数のより顕著な増加を示し、初期相のＬＭ感染に対してより抵抗性であることも興味深い。こうしたデータは、顆粒球の恒常性及びリステリア菌感染に対する応答におけるＴ及びＢ細胞を含む適応免疫の構成要素の抑制的な役割の可能性を包含している。従って、アンタゴニスト活性を有する中和ｍＡｂ又は適切に設計されたＢ７−Ｈ４蛋白のような、Ｂ７−Ｈ４発現を選択的に遮断する方法は、顆粒球を増加させ、病原体感染に対する自然免疫を増強する新しいアプローチを示す。
（実施例５）
関節リウマチ患者の血清中の可溶性Ｂ７−Ｈ４は重症度と相関する。
【０１３７】
患者及び健常ドナー：
Ｍａｙｏ  ＣｌｉｎｉｃのＩｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄの承認の下、ＲＡと診断された６８人の患者、ＳＬＥと診断された３５人の患者、及び２４人の正常な健常ドナーから、血清試料が得られた。ＲＡ患者は、以下の４群に分類された。０：活動性疾患なし、１：１〜４の能動関節、２：５〜９の能動関節、３：１０以上の能動関節で、関節外病変を伴うか伴わない。
【０１３８】
可溶性Ｂ７−Ｈ４、コラーゲン特異的自己抗体及び抗ｄｓＤＮＡ自己抗体の検出：
ヒトｓＨ４の検出のために、ヒトＢ７−Ｈ４に対する特異的ｍＡｂ  ｈＨ４．３（２μｇ／ｍｌ）及びｈＨ４．１（２μｇ／ｍｌ）が、ＥＬＩＳＡにおいてそれぞれ捕捉及び検出として使用された。リウマチ因子を除去するために、ＥＬＩＳＡでの検出の前に、ヒトＩｇＧアガロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）で血清が処置された。コラーゲン特異的自己抗体の測定のために、ニワトリコラーゲン（ｌμｇ／ｍｌ）が、プレートに一晩４℃でコートされ、検出抗体としてはビオチン結合抗マウスＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ  Ａｂ（ＢＤ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）である。抗ｄｓＤＮＡ自己抗体レベルを測定するために、ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌのサケ精巣からのｄｓＤＮＡが、プレートに一晩４℃でコートされ、ＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ（ＢＤ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）である。
【０１３９】
ウェスタンブロット：
血清が、２Ｘサンプルバッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝食塩水中４％ＳＤＳ、０．２％ブロムフェノールブルー、２０％グリセロール）と混合され、５分間沸騰された。試料は、１０％Ｒｅａｄｙゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）上の還元条件下で電気泳動され、蛋白質がＰｒｏｔｒａｎ  ＢＡ８５（Ｗｈａｔｍａｎ、Ｆｌｏｒｈａｍ  Ｐａｒｋ、ＮＪ）上にエレクトロブロットされた。イモビロン−Ｐシートが、ＰＢＳ中５％の脱脂粉ミルクで１時間ブロックされ、一晩４℃で抗体とインキュベートされた。反復洗浄（５分５回）の後、結合性抗体が、ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識により検出された。
【０１４０】
結果
ｓＨ４を検出するために、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ規準にもとづいて関節リウマチと診断された個々の患者からの血清が、ヒトＢ７−Ｈ４の異なるエピトープに結合する二つの特異的単クローン抗体（ｍＡｂ）を用いた酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により分析された。このアッセイにおいては、ＲＡ患者からの６５％（６８中４４）の試料及びＳＬＥ患者からの４３％（１５／３５）が、バックグラウンドを上回り、したがって陽性だった。健常ドナー（ＨＤ）におけるｓＨ４の評価では、わずか１３％（３／２４）が陽性であった（図７ａ）。ｓＨ４は、ＲＡ及びＳＬＥ患者において健常ドナーより有意に高い（Ｐ＜０．０５）。さらに、ＲＡ（９６．１ｎｇ／ｍｌ）及びＳＬＥ（３６．９ｎｇ／ｍｌ）におけるｓＨ４の平均濃度は、健常ドナー（３．８ｎｇ／ｍｌ）のものより有意に高かった。結果は、ＲＡ及びＳＬＥ患者の有意な部分においてｓＨ４が上昇することを示す。
【０１４１】
ウェスタンブロット分析を用いて、３人の関節リウマチ患者からの血清におけるｓＨ４の存在が確認された。Ｂ７−Ｈ４に対する特異的ｍＡｂを用いて、ＥＬＩＳＡにおいて検出可能なｓＨ４を有する３人のＲＡ患者からの血清が、単一の５０ｋＤａのバンドを示した。これは、ヒトＢ７−Ｈ４の細胞外ドメインの予測サイズにマッチした。これに対して、三人の健常ドナーからの血清においてはハンドが観察されなかった（図７ｂ）。データは、ＲＡ患者の血清におけるｓＨ４の存在を支持する。
【０１４２】
ｓＨ４の濃度上昇とＲＡの重症度との関連が調査された。病気の重症度に基づいて、６８人のＲＡ患者が、方法に記載されるように、群３を最も重度として４群（０−３）に分類された。群３におけるｓＨ４の平均濃度（２６０．７ｎｇ／ｍｌ）は、群０（２２．０ｎｇ／ｍｌ）又は群１（１８．８ｎｇ／ｍｌ）のものより有意に高かった。しかし、Ｓｃｈｅｆｆｅテストによると、群０−２の間には有意差がなかった（図７ｃ）。したがってデータは、群３のＲＡ患者が最も高いレベルのｓＨ４を有することを示し、ｓＨ４が重度のＲＡの進行に関与する可能性があることを示唆する。
（実施例６）
可溶性Ｂ７−Ｈ４がマウスモデルにおいてコラーゲン誘導性関節炎を悪化させる。
【０１４３】
マウス
雄ＤＢＡ／１ｊマウス、ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウス及びＣ５７ＢＬ／６−ｌｐｒ／ｌｐｒ（Ｂ６−ｌｐｒ／ｌｐｒ）が、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から得られた。生後４〜１０週目の年齢がマッチしたマウスが、全ての実験に用いられた。このラボにおいて、Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスが上述の通りに生成され、Ｂ６バックグラウンドに１０世代戻し交配されている。ＤＢＡ／１ｊバックグラウンドに５世代戻し交配されたＢ７−Ｈ４ＫＯマウスにより、ＤＢＡ／１ｊ×Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスが作製された。Ｂ６−ｌｐｒ／ｌｐｒとＢ７−Ｈ４ＫＯマウスの間で戻し交配することにより、Ｂ６−ｌｐｒ／ｌｐｒ×Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスが得られた。全てのマウスは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによる承認プロトコルの下で、Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  ＨｏｓｐｉｔａｌのＡｎｉｍａｌ  Ｆａｃｉｌｉｔｙで維持された。
【０１４４】
コラージュ（ｃｏｌｌａｇｅ）誘導性関節炎の誘導：
完全フロイントアジュバントにおいて乳化された４．０ｍｇ／ｍｌのｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ＤＩＦＣＯ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）を添加した０．０５Ｍ酢酸中の０．２ｍｇのニワトリコラーゲン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）の尾基底皮内注射により、生後８〜１０週目の雄ＤＢＡ／１ｊマウスにおいてＣＩＡが誘導された。最初の一次免疫の十四日後に、マウスが同じように一回ブーストされた。病気の重症度が、足の外観検査により評価された。各足が、炎症の程度につき０〜４のスケールで採点された：０、紅斑及び腫れの所見なし；１、中足（足根部）又は足関節に限定された紅斑及び軽度の腫れ；２、足関節から中足まで広がる紅斑及び軽度の腫れ；３、足関節から中足関節まで広がる紅斑及び軽度の腫れ；４、足首、足及び指趾を含む紅斑及び重度の腫れ。四つの足全てからのスコアが加算されて、各動物についての合計が得られた。
【０１４５】
ネズミＢ７−Ｈ４コンストラクト
Ｓｉｃａ，Ｇ．Ｌ．ほか、Ｂ７−Ｈ４，ａ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂ７  ｆａｍｉｌｙ，ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １８，８４９−６１（２００３））に記載されるように、Ｂ７−Ｈ４Ｉｇコンストラクトが準備された。Ｂ７−Ｈ４Ｖ及びＢ７−Ｈ４ＶＣプラスミドを生成するために、２つの隣接５’及び３’プライマがＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩ制限部位をそれぞれ伴って設計された（５’プライマ；５’−ｃｃｇｃｔｃｇａｇｃｃａｃｃａｔｇｇｃｔｔｃｃｔｔｇｇｇｇｃａｇ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、Ｂ７−Ｈ４Ｖの３’プライマ；５’−ｃｇｇａａｔｔｃｃｇｃｔａａｔｔｔａｔｃｔｃｔｇｇｃａｔａｃｔ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、Ｂ７−Ｈ４ＶＣの３’プライマ；５’−ｃｇｇａａｔｔｃｃｇｃｔａａｇａｇｔｔｃａｇｃａａｃｔｇｃａｇ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ０：８））。プライマを使用して、ｃＤＮＡの適切な領域が増幅された。ＰＣＲ産物が、ＸｈｏＩ及びＥｃｒｏＲＩで消化され、及びＸｈｏＩ／ＥｃｒｏＲＩ−消化ｐｃＤＮＡ３．１ベクターにライゲートされた（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）。
【０１４６】
コラーゲン特異的Ｔ細胞増殖及びサイトカイン産生。
【０１４７】
最後の免疫化の後、１４日目に脾臓が除去された。磁性ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）を用いて、ＣＤ４＋Ｔ細胞が精製された。全脾細胞又は精製ＣＤ４＋Ｔ細胞が、９６ウェル平底マイクロタイタープレートにおいて、変性（６０℃、３０分）ニワトリコラーゲンＩＩ型（ＣＩＩ）により７２時間刺激され、［３Ｈ］チミジン（１μＣｉ／ウェル）で（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）最後の１２時間パルスされた。精製ＣＤ４＋Ｔ細胞の培養に、同系マウスからの照射（５０Ｇｙ）脾細胞が、抗原提供細胞として加えられた。４８時間後に培養からの上清が集められ、製造者により推奨されるプロトコルに従ってＥＬＩＳＡキットを使用して、マウスＩＦＮ−γ（ＢＤ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）及びＩＬ−１７Ａ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）につき検定された。
【０１４８】
結果
ＲＡの病因におけるｓＨ４の考えうる役割を反復し、調査するために、コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）のマウスモデルが用いられた。ＣＩＡは、良く特徴付けされたヒト関節炎のマウスモデルであり、ＤＢＡ／１ｊマウスへのコラーゲン注射が大きな関節の腫れ及び進行性炎症を誘導し、関節炎をもたらす。インビボでｓＨ４を発現するために、マウスＢ７−Ｈ４  ｃＤＮＡの膜貫通及び細胞内ドメインを欠失させた発現ベクターＢ７−Ｈ４ＶＣが構築され、ＩｇＶ及びＩｇＣドメインの両方をコードする切断遺伝子がＣＭＶ最初期プロモータの制御下におかれた。Ｂ７−Ｈ４のＩｇＶドメインだけを含む別のベクター、Ｂ７−Ｈ４Ｖも作製された（図８ａ）。発現時には、これらの切断蛋白質／ポリペプチドが、細胞表面上の内因性Ｂ７−Ｈ４と競合して、その推定受容体と結合することが期待される。親ベクターが、コントロールとして含まれる。公知技術の流体力学的発現方法により、これらのプラスミドの注射が、二つの抗ネズミＢ７−Ｈ４  ｍＡｂを用いた特異的捕捉サンドイッチＥＬＩＳＡに基づいて、血清中最大２μｇ／ｍｌのｓＨ４の発現をもたらした。
【０１４９】
ＣＩＡモデルにおいて、コラーゲンによるＤＢＡ／１ｊマウスの免疫化は、２８日目頃から関節炎症状の外観をもたらした。コントロールベクターで処置したマウスは３２日目から関節炎を発症し、８０％のマウスが第一免疫化の後６０日で病気を発症した。Ｂ７−Ｈ４ＶＣの注射は、より早期の病気の発現（１７日）をもたらし、１００％のマウスが３０日頃に関節炎を発症した。Ｂ７−Ｈ４Ｖが注射されたマウスにおいても、類似の結果が見られた（図８ｂ）。さらに、Ｂ７−Ｈ４Ｖ又はＢ７−Ｈ４ＶＣのいずれかによる処置は、臨床スコアの増加（図８ｃ）、足蹠の腫れの増加及び組織病理学分析で示される炎症細胞の関節浸潤の増加により示されるように、関節炎の重症度を有意に増加させる。
【０１５０】
細胞及び液性免疫反応の評価から、免疫化及びＢ７−Ｈ４ＶＣ又はＢ７−Ｈ４Ｖ処置から３０日後に、関節炎の発病率及び重症度の増加が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂを含む他のサブタイプだけでなく、コラーゲンＣＩＩに対する全ＩｇＧ自己抗体の上昇（８ｄ図）を伴うことが明らかになった（図１２）。Ｂ７−Ｈ４ＶＣ又はＢ７−Ｈ４Ｖで処置されたマウスからの全脾臓細胞又は精製ＣＤ４＋Ｔ細胞のＣＩＩによる刺激から、コントロールベクターで処置されたマウスと比較してはるかに高い増殖レベルも誘導された（図８ｅ及び図１３）。重要なことに、ＣＩＡ進行の原因となる二つの主要サイトカインＩＦＮ−γ及びＩＬ−１７も、培養において有意に増加する（図８ｆ）。合わせて考えると、データは、ｓＨ４がＣＩＩに対する自己免疫反応を増強し、自己免疫ＣＩＡを悪化させることを示す。
【０１５１】
Ｂ７−Ｈ４ＶＣ及びＢ７−Ｈ４Ｖが、細胞表面上における内因性Ｂ７−Ｈ４の効果をブロックするデコイとして作用するならば、Ｂ７−Ｈ４欠損マウス（Ｂ７−Ｈ４ＫＯ）においても類似の増悪効果が観察されるはずである。これをテストするために、Ｂ７−Ｈ４ＫＯ表現型マウスが、ＤＢＡ／１ｊバックグラウンドに５世代戻し交配された。Ｂ７−Ｈ４ＫＯ−ＤＢＡ／１Ｊマウスは普通に成長し、全体的外観及び免疫系の発達において明らかな異常を有しない。しかしこれらのマウスは、はるかに深刻なＣＩＡを発症し、Ｂ７−Ｈ４＋／＋コントロールマウスより高い形態論（図８ｇ）及び臨床スコア（図８ｈ）を示し、Ｂ７−Ｈ４ＶＣ又はＢ７−Ｈ４Ｖ処置マウスと類似の結果となった。したがって、データは、ｓＨ４がデコイ分子として機能して、自己免疫反応を増加させ、ＣＩＡを悪化させることを支持する。
（実施例７）
好中球増加がｓＨ４によるＣＩＡの増悪の原因となる。
【０１５２】
好中球の空気嚢アッセイ
Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｊ．Ｃ．ほか、Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ，１３４：１４７−５６（１９８１）に記載されるように、空気嚢アッセイが行われた。簡単にいうと、２，２，２−トリブロモエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）でマウスが麻酔され、５ｍｌの無菌空気の注射により皮下胸椎嚢がつくられた。３日後に３ｍｌの空気が嚢に再注射された。最初の注射の６日後に、１ｍｌＰＢＳ中の５０μｇＬＰＳが嚢に注射された。５時間後にマウスが麻酔され、嚢が３ｍｌのＰＢＳで洗浄されて浸潤細胞が集められた。
【０１５３】
結果
Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスは、好中球の迅速な増加によりＬｉｓｔｅｒｉａ感染に抵抗をもつ。さらなる実験は、Ｂ７−Ｈ４が好中球前駆体の増殖を直接阻害できることを示した。したがって、ＲＡの進行性炎症の解釈を提供しうる仮説として、ｓＨ４は、内因性Ｂ７−Ｈ４を遮断し、これにより、好中球媒介性炎症を介してＣＩＡを悪化させうる。ｓＨ４の発現がネズミの末梢組織における好中球を増加させるかが調査された。マウスのＲＡ損傷における好中球数に直接アクセスするのが困難なため、炎症誘発後に好中球を皮下空気嚢から集められる空気嚢アッセイが用いられた。図９ａに示されるように、Ｂ７−Ｈ４Ｖ又はＢ７−Ｈ４ＶＣが注射されたマウスは、各空気嚢の好中球がコントロールベクターのものより有意に多かった。Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスにおける前の研究と合わせて、結果は、ｓＨ４がインビボで末梢組織における好中球の迅速な増加を誘導することを示す。
【０１５４】
好中球を枯渇させて、ＣＩＡ増悪におけるｓＨ４の効果を除去できるかが調査された。ＣＩＡ−マウスを、Ｂ７−Ｈ４ＶＣ又はＢ７−Ｈ４Ｖで処置し、その後一日おきに抗Ｇｒ−１抗体で処置して好中球を枯渇させた。ＣＩＡ発病率（図９ｂ）及び臨床スコア（図９ｃ）の両方における、Ｂ７−Ｈ４Ｖ又はＢ７−Ｈ４ＶＣの効果の増強が、抗Ｇｒ−１抗体処置により完全に除去された。したがって結果は、好中球がＣＩＡの進行におけるｓＨ４の効果の原因となることを支持する。
（実施例８）
可溶性Ｂ７−Ｈ４がｌｐｒマウスにおけるＳＬＥ−様疾患を悪化させ、自己免疫反応を高める。
【０１５５】
尿蛋白質排泄
計量棒分析（ＧＥＲＭＡＩＮＥ、Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ、ＴＸ）により、尿蛋白質排泄が測定された。蛋白尿グレードが、以下のように０〜４で採点された：グレード０、正常；グレード１、３０ｍｇ／ｄｌ；グレード２、１００ｍｇ／ｄｌ；グレード３、３００ｍｇ／ｄｌ；グレード４、２０００ｍｇ／ｄｌ。
【０１５６】
関節炎及び腎炎の組織評価
ＣＩＡマウスは、３５日で屠殺された。後足が除去され、ホルマリン固定され、１０％ＥＤＴＡで脱灰され、パラフィンに包埋され、切断され、Ｈ＆Ｅで染色された。腎臟病の組織評価では、マウスが生後６ヵ月で屠殺された。腎臓が、ホルマリン固定されるか、冷凍切断のためにＴｉｓｓｕｅ  Ｔｅｋ（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）でスナップ冷凍された。ホルマリン固定組織は、パラフィンに包埋され、切断され、過沃素酸−Ｓｃｈｉｆｆ（ＰＡＳ）法により染色された。凍結切片は、アセトン及び１％パラホルムアルデヒドに固定され、ＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ  Ａｂ又はＣ３  Ａｂ（ＩＣＮ／Ｃａｐｐｅｌ、Ａｕｒｏｒａ、ＯＨ）で染色された。
【０１５７】
有意な割合のＳＬＥ患者も、血清中に検出可能なｓＨ４を有する（図７ａ）。ｓＨ４がＳＬＥの進行にも関与している可能性がある。これをテストするために、マウスが、主に自己抗体及びリンパ増殖の効果により進行性ＳＬＥ−様症状を自発的に発症するＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおいて、自己免疫を促進できるかを決定するためにｓＨ４が調査された。ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスが、Ｂ７−Ｈ４ＶＣプラスミドで処置され、血清中の抗ｄｓＤＮＡ自己抗体が評価された。図１０ａに示されるように、Ｂ７−Ｈ４ＶＣで処置すると、１０週目で、血清中の抗ｄｓＤＮＡ自己抗体の濃度が、コントロールプラスミドで処置されたマウスよりも有意に高く上昇した。抗Ｇｒ−１抗体の注射による好中球の枯渇は、この効果を完全に除去し、ＣＩＡモデルにおける観察と同様の結果であった。この最初の研究は、ｓＨ４が、このＳＬＥモデルにおける自己免疫反応の促進にも関与することを示唆する。
【０１５８】
ＳＬＥの発病学における免疫反応及びｓＨ４の役割の分析を促進するために、Ｂ７−Ｈ４−／−表現型マウスが、ＭＲＬ−ｌｐｒ系統と類似するがＳＬＥ−様症状が弱い系統Ｂ６−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスに戻し交配された。予想通り、Ｂ６−ｌｐｒ／ｌｐｒ×Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスにおいては、コントロールＢ６−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスよりも、抗ｄｓＤＮＡ  ＩｇＧ自己抗体がはるかに早く、はるかに高い力価で生成された（図１０ｂ）。重要なことに、Ｂ６−ｌｐｒ／ｌｐｒ×Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスは、コントロールＢ６−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスと比較して、有意な重量増加（図１０ｃ）を伴って重度の脾腫及びリンパ腺症を速やかに発症した。Ｂ６−ｌｐｒ／ｌｐｒ×Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスにおいては、コントロールよりも脾臓及びリンパ節がずっと大きく、これらの臓器の細胞充実度が有意に増加した（図１０ｃ）。ｓＨ４処置によりこれらの臓器において有意に増加される主な細胞成分は、好中球（Ｇｒ−１＋ＣＤ１１ｂ＋）及びＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ８＋、ＣＤ３＋ＣＤ４＋及びＣＤ３＋ＣＤ４−ＣＤ８−Ｂ２２０＋）である。Ｂ６−ｌｐｒ／ｌｐｒ×Ｂ７−Ｈ４ＫＯマウスは、間質炎症細胞浸潤、糸球体過形成及び糸球体間質細胞増加を伴って重度の糸球体腎炎を発症した。さらに、マウスは、３０週以内に血管周囲の細胞浸潤、全ＩｇＧの糸球体沈着）及びＣ３ならびに蛋白尿増加（図１０ｄ）を伴って脈管炎も発症した。これに対して、コントロールＢ６−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスは、２４ヶ月まで可視症状の一切ない正常な腎臓を有する。合わせて考えると、結果は、ｓＨ４が、抗体及び細胞媒介自己免疫反応及び症状を増強することにより、ｌｐｒマウスにおいてＳＬＥ−様疾患を悪化させることを示す。
（実施例９）
Ｂ７−Ｈ４ＩｇによるＣＩＡ進行の阻害
データが、ＲＡ及びＳＬＥネズミモデルにおけるｓＨ４が病気の進行を促進することを示す一方で、これらのデータは、内因性Ｂ７−Ｈ４が自己免疫反応の抑制におけるチェックポイント分子であることも支持する。したがって、これらの自己免疫性疾患を抑制するための潜在的アプローチは、推定受容体を結合するために、アゴニスト形態のＢ７−Ｈ４の発現を増加させることである。Ｂ７−Ｈ４細胞外ドメインがネズミＩｇＧ２ａ  Ｆｃ部分に融合されたＢ７−Ｈ４Ｉｇ融合蛋白質の効果は、Ｓｉｃａ，Ｇ．Ｌ．ほか、Ｂ７−Ｈ４，ａ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂ７  ｆａｍｉｌｙ，ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １８，８４９−６１（２００３）；Ｃｈａｐｏｖａｌ，Ａ．Ｉ．，Ｚｈｕ，Ｇ．＆  Ｃｈｅｎ，Ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｓ  ａ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１，２５９−６４（２００２）により記載された。Ｂ７−Ｈ４ＩｇのＦｃ部分は、Ｆｃ受容体を結合して、インビボでアゴニストの効果を促進できた。その後、ＣＩＡの進行におけるＢ７−Ｈ４Ｉｇの効果がテストされた。コントロールプラスミドと比較して、ＣＩＩ曝露の１日前のＢ７−Ｈ４Ｉｇプラスミド処置は、関節炎発病率及び臨床スコアを有意に低下させるとともに、ＣＩＡの発症を遅延させた（図１１ａおよびｂ）。さらに、Ｂ７−Ｈ４Ｉｇプラスミド処置は、ＣＩＩに対する全ＩｇＧ（図１１ｃ）及びＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ自己抗体の産生を抑制した（図１２）。ＣＩＩに応答した脾細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖（図１１ｄ及び図１３）、ならびにＩＦＮ−γ及びＩＬ−１７産生も、Ｂ７−Ｈ４Ｉｇ処置により有意に抑制された（図１１ｅ）。集合的に、結果は、Ｂ７−Ｈ４Ｉｇが液性及び細胞自己免疫の両方を抑制するアゴニストとして作用し得たことを示す。さらに、この方法は、ＣＩＡの発病抑制においても有効なはずである。
（実施例１０）
ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおけるＢ７−Ｈ４Ｉｇの発現が生存率を高める。
【０１５９】
ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスに、生後６、８、１０及び１２週目でコントロールｍＩｇＧプラスミド又はＢ７−Ｈ４Ｉｇプラスミドが注射された。全ての表現型が、生後１９週目で分析された。各群は５〜１０匹のマウスを含み、各実験組が少なくとも二回繰り返された。図１４は、生後６、８、１０及び１２週目でコントロールｍＩｇＧプラスミド（□）又はＢ７−Ｈ４Ｉｇプラスミド（■）を注射されたＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおける、年齢（週）に対する％累積生存率の線グラフである。図１４は、Ｂ７−Ｈ４Ｉｇ（ネズミ）ベクターによる処置が、ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスの生存率を高めることを示す。全ての表現型が、生後１９週目で分析された。
【０１６０】
図１５は、コントロールｍＩｇＧプラスミド（□）又はＢ７−Ｈ４Ｉｇプラスミド（■）を注射されたＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおける、年齢（週）に対するＩｇＧ自己抗体力価（Ａ４５０ｎｍ）の線グラフである。図１５は、Ｂ７−Ｈ４Ｉｇ（ネズミ）ベクターによる処置が、ＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおいて自己抗体（抗ＤＮＡ）を阻害することを示す。図１６は、コントロールｍＩｇＧプラスミド（□）又はＢ７−Ｈ４Ｉｇプラスミド（□）を注射されたＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウスにおける蛋白尿グレードのグラフである。図１６は、Ｂ７−Ｈ４Ｉｇ（ネズミ）ベクターによる処置がＭＲＬ−ｌｐｒ／ｌｐｒマウス（１）において腎臓損傷を阻害することを示す。
【０１６１】
統計的分析。
【０１６２】
単一比較のためのＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕテスト及びＡＮＯＶＡ、その後多重比較のためのＳｃｈｅｆｆｅテストにより、統計的分析が行われた。全ての統計的分析において、Ｐ＜０．０５で有意性が認められた。
【０１６３】
当業者は、本明細書に記載されている特定の実施態様に対する多くの均等物を、通常の実験作業を超えることなくして、認識し、確認できる。このような均等物は、以下の特許請求の範囲に包含されるものである。
【図１】
0005481199.tif 000003
【図２ａ】
0005481199.tif 000004
【図２ｂ】
0005481199.tif 000005
【図２ｃ】
0005481199.tif 000006
【図２ｄ】
0005481199.tif 000007
【図３】
0005481199.tif 000008
【図４】
0005481199.tif 000009
【図５ａ】
0005481199.tif 000010
【図５ｂ】
0005481199.tif 000011
【図６】
0005481199.tif 000012
【図７ａ】
0005481199.tif 000013
【図７ｂ】
0005481199.tif 000014
【図７ｃ】
0005481199.tif 000015
【図８ａ】
0005481199.tif 000016
【図８ｂ】
0005481199.tif 000017
【図８ｃ】
0005481199.tif 000018
【図８ｄ】
0005481199.tif 000019
【図８ｅ】
0005481199.tif 000020
【図８ｆ】
0005481199.tif 000021
【図８ｇ】
0005481199.tif 000022
【図８ｈ】
0005481199.tif 000023
【図９ａ】
0005481199.tif 000024
【図９ｂ】
0005481199.tif 000025
【図９ｃ】
0005481199.tif 000026
【図１０ａ】
0005481199.tif 000027
【図１０ｂ】
0005481199.tif 000028
【図１０ｃ】
0005481199.tif 000029
【図１０ｄ】
0005481199.tif 000030
【図１１ａ】
0005481199.tif 000031
【図１１ｂ】
0005481199.tif 000032
【図１１ｃ】
0005481199.tif 000033
【図１１ｄ】
0005481199.tif 000034
【図１１ｅ】
0005481199.tif 000035
【図１２】
0005481199.tif 000036
【図１３】
0005481199.tif 000037
【図１４】
0005481199.tif 000038
【図１５】
0005481199.tif 000039
【図１６】
0005481199.tif 000040
【配列表】
0005481199000001.app