(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料をエバネッセント照明するための装置であって、補正光学部品（３）を有する照明光学部品と、少なくとも二つの異なる波長を有する光放射（Ｓ１、Ｓ２）を含む供給された光束（１５）を用いて試料をエバネッセント照明するために、該補正光学部品の下流に配置された対物レンズ（４）とを備え、該補正光学部品（３）が横色収差を有し、該横色収差により、前記光放射（Ｓ１、Ｓ２）が、照明中に前記対物レンズ（４）の瞳（１４）を波長に応じて異なる高さで横切ることになり、該横色収差は、エバネッセント照明中の、前記試料（１１）内への前記放射の透過深度の波長に関連した差が縮小するように選択される、試料をエバネッセント照明するための装置。
【請求項２】
前記補正光学部品（３）は、少なくとも一つの屈折素子（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記補正光学部品（３）は、少なくとも１つの、斜めに配置された平板（１７）、および斜めに配置されたレンズの少なくとも一方を含む、請求項１または２に記載の装置。
【請求項４】
前記補正光学部品（３）は、前記対物レンズの瞳（１４）と共役の面（１６）を含み、前記供給された光束（１５）が前記面を通過する、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項５】
前記光束（１５）を前記補正光学部品（３）に軸から外して供給する供給ユニットを備える、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６】
少なくとも二つの異なる波長を有する光放射を含む光束を用いて試料をエバネッセント照明するための方法であって、前記光束は補正光学部品を介して試料へ向けられ、対物レンズは、試料がエバネッセント照明されるように、前記補正光学部品の下流に配置され、
前記補正光学部品は横色収差を有し、該横色収差により、前記光放射が照明中に前記対物レンズの瞳を波長に応じて異なる高さで横切ることになり、該横色収差は、エバネッセント照明中の、前記試料内への前記放射の透過深度の波長に関連した差が縮小するように選択される、試料をエバネッセント照明するための方法。
【請求項７】
前記補正光学部品は、少なくとも１つの屈折素子を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記補正光学部品は、少なくとも１つの、斜めに配置された平板、および斜めに配置されたレンズの少なくとも一方を含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記補正光学部品は、前記対物レンズの瞳と共役の面を有し、前記供給された光束が前記面を通過する、請求項６乃至８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記光束は、同軸光束として該光束が前記共役の面を通過するように、前記光放射を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料は、少なくとも二つの波長を有する光放射で同時に照明される、請求項６乃至１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記光束は、前記補正光学部品に軸から外れて供給される、請求項６乃至１１のいずれ
か一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記補正光学部品（３）は、少なくとも一つの回折素子（２０、２５）を含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１４】
前記補正光学部品は、少なくとも一つの回折素子（２０、２５）を有する、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料をエバネッセント照明する装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料のエバネッセント照明では、試料を照明する光束は、全反射が試料との境界面で起こるように供給される。こうして定在エバネッセント波が試料中に形成され、その強度は、境界面との距離と共に指数関数的に減少する。
【０００３】
強度がｅ分の１に低下した距離は、エバネッセント波の透過深度を示す距離として定義することができる。典型的な値は、１００〜２００ｎｍの範囲にある。
エバネッセント放射は、例えば試料中に蛍光を励起するために用いられる。その場合、励起された蛍光放射は顕微鏡を用いて検出することができる。
【０００４】
異なる波長を有するいくつかの蛍光が励起されることがますます増える。これは、当然ながら、可能な限り高い程度まで同じ条件下で行なわれるべきであり、その結果、個々の蛍光像は有意であり、互いに組み合わせること、または互いに定量的に比較することができる。これに関連して、透過深度が波長および入射角に依存するという難点が生じる。透過深度は、同じ入射角の異なる波長に対し大きさが異なる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このことに基づいて、本発明の目的は、波長に関連した透過深度の差が縮小される、試料をエバネッセント照明する装置を提供することである。さらに、試料のエバネッセント照明のそれぞれの方法が提供されるべきである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
この目的は、試料をエバネッセント照明する装置によって達成され、この装置は、補正光学部品を備えた照明光学部品と、該補正光学部品の下流に配置され、少なくとも二つの異なる波長を有する光放射を含む供給された光束で試料をエバネッセント照明する対物レンズとからなり、補正光学部品は横色収差を有し、この横色収差により、照明の間、光放射が波長に応じて異なる高さで対物レンズの瞳を横切ることになり、またこの横色収差は、エバネッセント照明の間、試料中への放射の透過深度の、波長に関連した差が縮小するように選択される。
【０００７】
この結果、本発明による装置は、例えば蛍光検査の場合に有利である少なくとも二つの異なる波長を有する光放射、または二つの異なる波長を有する光線束を用いて同時に試料を照明するために使用することができる。透過深度の差を大幅に縮小することが可能であり、それによって、例えば同時または順次に実施された周波数励起によるマルチスペクトル像を評価することができる。
【０００８】
すなわち、エバネッセント照明時のスペクトル透過深度は、本発明による装置によって一様になる。したがって、有利なことには装置内にスペクトル透過深度を整合させるための調整オプションを用意する必要がもはやない。
【０００９】
本発明による装置では、対物レンズ瞳の高さが照明角度に影響を及ぼし、それによってエバネッセント照明時の透過深度に影響を及ぼすことが有利に利用される。これは、本発明によれば、エバネッセント照明中に同じ透過深度を得るために、必要とされる対物レンズ瞳の波長依存高さが存在するように、補正光学部品の意図的な倍率色収差により利用される。
【００１０】
本発明による装置の結果として、例えばそれぞれ異なる蛍光色素分子または染料が、異なる波長で同時または順次に励起されるべき実験の場合、測定または検査は、かなり高頻度で実施することができるようになる。というのは、同じ透過深度または同じ励起量に到達するのに、以前に必要であったように機械要素を２つの検査（またはスナップショット）の間で移動させる必要がもはやないからである。
【００１１】
補正光学部品は、回折素子、および屈折素子の少なくとも一方を備えることができる。具体的には、これは、斜めに配置された平板、ウェッジ、プリズム、回折素子、および斜めに配置できるレンズの少なくとも一つ、およびこれらの素子の組合せとすることができる。補正光学部品によって引き起こされる横色収差は特にまた、対物レンズの倍率を考慮して選択することもできる。もしも対物レンズに照明時の色収差がある場合には、これは、補正光学部品の横色収差または倍率色収差の選択の際に考慮に入れることができる。
【００１２】
補正光学部品は、対物レンズ瞳と共役の面を有することができ、供給された光束がこの面を通って進む。具体的には、供給された光束は、補正光学部品の光軸と平行に共役面を通って進む。この場合、光学部品の配置は簡単に実現可能である。
【００１３】
さらに、光束は、対物レンズ瞳内の主光線の必要な進路に一致するように、ある距離の、ある角度で光軸から外れてこの面を通過することができる。波長の異なる光は、この面に例えば光ファイバ内部で供給することができ、この光は、本発明によれば、規定された横色収差により対物レンズ瞳内に結像され、それによって透過深度のスペクトル差を意図的に縮小することができる。
【００１４】
具体的には、試料をエバネッセント照明する本発明による装置は供給ユニットを備えることができ、このユニットは、補正光学部品の光束を軸から外れて、かつ／または光束が補正光学部品の光軸に平行に延びないようにして供給する。供給ユニットは光ファイバを備えることもあり、そのファイバ端は、所望の光束供給が実現されるように配置される。供給ユニットはまた、ビーム・スプリッタ、レンズ、格子など他の光学素子を含むこともできることを理解されたい。
【００１５】
供給される光束には、異なる波長を有する複数の線束が、互いに特に同軸上で含まれる。これにより、補正光学部品の構成が簡単になる。
試料をエバネッセント照明する本発明による装置は、さらに駆動素子を有することができ、この素子は、例えば供給ユニットの一部とすることができ、この素子を用いて、光束が共役面を通過する位置、および光束が共役面を通過する光束の角度の少なくとも一方を設定することができる。具体的には、光束から補正光学部品の光軸までの距離を変更することができる。したがって、すべての波長に対し透過深度を同時に変更することが可能である。
【００１６】
駆動素子はまた、対物レンズ瞳における、すべての波長依存高さを同時に変更することが可能なように配置することもできる。この変更は、透過深度を波長に依存しないで変更するように行われることが好ましい。わずかに波長に依存するスペクトル透過深度の変化が、駆動素子によって透過深度を変更する場合には生じうる。残った差は、非補正の場合と比較して少なくとも１桁だけ小さい。
【００１７】
供給された光束が異なる波長を有する２つ以上の光線束を含むとき、透過深度の波長に依存する差を最小にすることができる。特に、２つ、３つ、またはそれより多い波長に対し各透過深度が同じになることが実現可能である。中間にある波長の場合には、何らの透過深度の補正も実施されない場合と比較して大幅な縮小が可能である。残った差は、非補正の場合と比較して１桁または数桁だけ小さくなりうる。
【００１８】
２つまたは３つを超える異なる波長の場合では、補正光学素子は、例えばスペクトル差がすべての波長に対し最小化されるように配置することができる。例えば、スペクトル差がどの波長でも既定の限度値を超えないことが求められることがある。他の任意の種類の最小化もまた実現可能である。
【００１９】
光放射または光線束は特に、本明細書では光学法則に従って挙動する電磁放射と理解されたい。具体的には、これは可視波長領域の放射にかかわる。赤外線領域または紫外線領域の放射もまた可能性がある。
【００２０】
試料をエバネッセント照明する本発明による装置は顕微鏡の構成要素になりうる。この場合、試料中の放射透過深度の波長に関連した差が縮小されるように試料をエバネッセント照明することができる顕微鏡が実現される。
【００２１】
この場合には、補正光学部品は、顕微鏡の照明光学部品の一部を利用することができる。この補正光学部品は、対物レンズの下流に配置された入射垂直照明の一部を含むことができる。この場合、補正光学部品は、例えば補正モジュールを含み、これは顕微鏡に付加することができ、照明光学部品の一部と共に本発明による補正光学部品を実現する。この場合には、補正光学部品は、利用される照明光学部品の一部と共に補正光学部品の所望の横色収差が実現されるように配置されることが好ましい。
【００２２】
このような顕微鏡を用いて蛍光放射が検出されるとき、これはＴＩＲＦ（全反射照明蛍光）顕微鏡と呼ばれることも多い。ＴＩＲＦ顕微鏡では、落射蛍光で知られる背景蛍光が大幅に低減され、像コントラストが大幅に改善される。その結果、それぞれ高いｚ解像度が得られる。エバネッセント場は、１００〜２００ｎｍの典型的な厚さを有する。
【００２３】
本発明による装置は、ＴＩＲＦ顕微鏡においてスペクトル励起量を最適化することを可能にし、またいくつかの波長を利用することによってより鮮明でより良質のＴＩＲＦカラー画像を得るためにいくつか異なる波長を用いる方法を可能にする。
【００２４】
結像原理のために、本発明による装置を照明する方法は特に、細胞膜の環境中の動的過程を調べるのに、また無細胞系において分子間の相互作用を調べるのに適している。さらに、ＴＩＲＦ顕微鏡法では、以前には間接的な測定しか可能でなかった場合でも像を提示することができるので、電気生理学と薬理学の実験（試料の操作）の組合せもまた、重要な役割を果たす。
【００２５】
試料をエバネッセント照明する本発明による装置はさらに、光束の発生源を含むことができる。その放射は、特にレーザ放射と関係がありうる。
試料をエバネッセント照明する本発明による装置、およびそのような装置を備えた顕微鏡は、当業者に知られた制御装置を含むことができる。この顕微鏡は特に、従来の方法で構成することができる。
【００２６】
この目的はさらに、少なくとも２つの異なる波長を有する光放射を含む光束からなり、この光束が補正光学部品と、試料がエバネッセント照明されるように補正光学部品の下流に配置された対物レンズとを介して試料に向けられ、補正光学部品が横色収差を有し、この横色収差により、照明中に光放射が対物レンズの瞳を波長に応じて異なる高さで横切ることになり、またこの横色収差が、エバネッセント照明中に試料中への放射の透過深度の波長に関連した差が縮小するように選択される、試料をエバネッセント照明する方法によって達成される。
【００２７】
本発明による方法は、試料を異なる波長で同時にエバネッセント照明すること、および透過深度がわずかしか違わないように保証することを可能にする。透過深度は特に同じにすることができる。
【００２８】
同じ照明状態を異なる波長で、このような方法を用いて優れた方法で実現することができる。
補正光学部品は、少なくとも１つの屈折素子および／または少なくとも１つの回折素子を備えることができる。
【００２９】
具体的には、補正光学部品は、対物レンズの瞳と共役の面を備えることができ、供給された光束がこの面を通過する。光束は、この共役面をそれぞれ異なる波長で同軸光ビームとして通過することが好ましい。
【００３０】
この方法では、試料は、異なる波長を有する光放射で同時に照明されることが好ましい。
この方法を用いて、光束を補正光学部品に軸から外れて、かつ／または光束が補正光学部品の光軸に平行に延びないようにして供給することができる。こうして補正光学部品の横色収差を意図的に、それぞれ異なる波長が対物レンズの瞳を所望の異なる高さで通過するように利用することができる。
【００３１】
本発明による照明方法は、顕微鏡検査で用いることができる。こうしてそれぞれの顕微鏡法、例えばＴＩＲＦ顕微鏡法が提供される。この顕微鏡法は、当業者に知られた方法でさらに発展させることができる。
【００３２】
上記および以下でさらに説明する特徴は、提示した組合せで使用できるだけでなく、本発明の範囲から逸脱することなく他の組合せでも単独でも使用できることを理解されたい。
【００３３】
本発明を以下で、本発明に関連する特徴の開示もする添付の図面を参照して、より詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】試料をエバネッセント照明する本発明による装置の一実施形態の概略図である。
【図２】図１の試料１１を伴った対物レンズ４の拡大図である。
【図３】試料をエバネッセント照明する本発明による装置の別の一実施形態の図である。
【図４】図１乃至３の実施形態における現在の透過深度を説明するグラフである。
【図５】回折光学部品を使用することにより試料をエバネッセント照明する、本発明による装置の別の一実施形態の図である。
【図６】回折を生じるように作用する格子を使用することにより試料をエバネッセント照明する、本発明による装置の別の一実施形態の図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
図１および図２に示された実施形態では、試料をエバネッセント照明する本発明による装置１は、顕微鏡２に組み込まれ、補正光学部品３と、補正光学部品３の下流に配置された対物レンズ４とを備える。
【００３６】
補正光学部品３は、３つのレンズＬ１、Ｌ２およびＬ３を有する補正ユニット５、下流偏向プリズム６、２つのレンズＬ４およびＬ５を有する入射光光学部品７、ならびに反射鏡８を備える。
【００３７】
入射光光学部品７は、顕微鏡２の従来の入射垂直照明の構成要素とすることができる。入射垂直照明の他の要素は、図を簡単にするためにここでは示されていない。入射垂直照明用の光は、プリズム６が除去されたとすれば、矢印Ｐ１で示された方向から入射光光学部品７に当たり、次に、反射鏡８を介して顕微鏡ビーム経路に送り込まれる。反射鏡８は、ある程度透明の反射鏡、およびダイクロイック反射鏡の少なくとも一方として（用途に応じて）構成することができる。
【００３８】
顕微鏡２はさらに、管光学部品９およびイメージ・センサ１０を備えることができる。
図１および図２による実施形態では、試料１１のエバネッセント照明が、波長４５０ｎｍおよび５７５ｎｍの放射１５を用いて、２つの波長にかかわらず、それぞれの場合で透過深度が９３ｎｍになるように実施される。供給される光束１５は、図１に矢印で示されている。矢印の先端は面１６にあり、例えばファイバ端とすることができ、そこから放射１５が出射される。
【００３９】
この場合、補正光学部品３は、面１６が、対物レンズ４の、図１に矢印１４で位置が示されている出口瞳１４に共役の面になるように配置される。さらに、補正光学部品３は横色収差を含み、検査されるべき試料１１のエバネッセント照明時の透過深度ｄ（図２）の波長に依存する差がこのようにして、２つの波長４５０ｎｍおよび５７５ｎｍに対して補償されるように構成される。
【００４０】
２つの波長４５０ｎｍおよび５７５ｎｍに対して同じ既定の９３ｎｍの透過深度ｄを得るために、補正光学部品３の補正ユニット５は、それが強い横色収差を有するように構成される。この横色収差は、図２に概略的に示されるように、検出側において、波長４５０ｎｍを有する光放射または光線束Ｓ１が、５７５ｎｍの波長を有する光放射Ｓ２よりも低い高さｈ１（光軸ＯＡまでの距離）で、対物レンズ４の瞳１４を通過するように選択される。異なる高さｈ１、ｈ２（光軸ＯＡまでの距離）は、従って得られる試料１１上の放射Ｓ１、Ｓ２の異なる入射角の結果として、透過深度ｄが両方の波長に対しそれぞれ９３ｎｍになるように、補正ユニット５によってあらかじめ設定される。
【００４１】
補正ユニット５は、高さｈに応じて構成され、この高さは、所望の透過深度ｄに基づいて以下のように計算することができる。
透過深度ｄは、次の式１により表すことができる。
【００４２】
【数１】
0005461527.tif 000002
λは使用される光放射の波長、αは現在のビーム入射角、αｇは全反射に移行する臨界ビーム入射角、またｎ２は試料（すなわち、エバネッセント照明される媒体）の屈折率を表す。
【００４３】
全反射の臨界角αｇは、次の式２により表すことができる。
【００４４】
【数２】
0005461527.tif 000003
ここで、ｎ１はカバーガラス１２の屈折率である。
【００４５】
式１と２を一緒に組み合わせると、試料１１に入るエバネッセント波の透過深度は以下のように表すことができる。
【００４６】
【数３】
0005461527.tif 000004
異なる波長に対し、透過深度ｄが同じであるべき場合、以下の数式が一定でなければならないことが式３から必要とされる。
【００４７】
【数４】
0005461527.tif 000005
値ｎ１・ｓｉｎαは、対物レンズ４の対物側の開口数に相当する。これにより、無限大の像距離での正弦条件を含む状態で次式が導かれる。
【００４８】
【数５】
0005461527.tif 000006
ここで、ｈは対物レンズ４の出口瞳１４内のそれぞれの開口ビームの高さ、ｆは対物レンズ４の焦点距離である。
【００４９】
決められた、または所望の透過深度に対する対物側の必要な開口数（ｎ１・ｓｉｎα）は、式３により個々の波長について計算することができる。式５により、対物レンズ４の出口瞳１４に入射する光について、波長に依存する高さｈが得られる。波長に依存する高さｈが既知の場合、補正ユニット５により生じる色倍率収差は、補正ユニット５に供給される光束１５のそれぞれ異なる波長を有する光線Ｓ１、Ｓ２が、計算された高さｈで出口瞳１４を通過するように設計することができる。
【００５０】
さらに、光束１５の補正光学部品３の光軸からの軸方向距離は、図１の装置内で、双方向矢印Ｐ２で示されているように変更することができる。透過深度は、この距離の変更によって変えることができる。距離の変更は、特にアクチュエータ（図示せず）によって行うことができる。
【００５１】
透過深度がこのようにして、ここで想定された９３ｎｍ以外の値に設定された場合でも、波長に依存する透過深度の差を縮小することがやはり、補正ユニット５を用いて実現される。しかし、透過深度がもはや全く同じにならないことも起こりうる。しかし、透過深度の差は、本発明による補正ユニット５を用いない場合と比較して、大幅に小さくなる。
【００５２】
次の表１は、レンズＬ１〜Ｌ５の個々の領域の半径および間隔と、使用されたレンズ材料のそれぞれの屈折率とを示す。
【００５３】
【表１】
0005461527.tif 000007
別の実現可能な補正ユニット５が図３に示されている。この場合、補正ユニットは、傾斜した平板１７を備え、４２５ｎｍと５７５ｎｍでの透過ｄの色収差を補償する。
【００５４】
さらに別の実現可能な補正ユニットが図５および図６に示されている。図５で、補正光学部品に供給される光束は、回折光学部品（２０）を通過し、そのため波長に依存して放射が分割されることになる。この光は、回折光学部品上の、供給された光束の衝突点に焦点がある下流レンズ２１によって平行にされる。
【００５５】
図６で、補正光学部品に供給された光束は、回折作用をする格子２５に当たって、波長に依存して放射が分割されることになる。この光は、回折格子上の、供給された光束の衝突点に焦点がある下流レンズ２６によって平行にされる。
【００５６】
波長４２５ｎｍと５７５ｎｍで得られるべき高さの差Δｈ（λ）は、対物レンズ４を使用する場合、９３ｎｍの透過深度で０．０９８９ｍｍになる。このような高さの差は、光放射を有する光束１５が、これら２つの波長を有して３７．１４９°の角度γで平板１７に当たる場合に得られる。光放射が、その波長に応じて様々に屈折されるので、様々な波長を有する光線では、平行オフセットのようにそれぞれ異なる高さｈ（λ）で平板１７から出射される。ここで必要な高さの差には、１７．７７５ｍｍの平板１７の厚さＤで到達する。
【００５７】
図４は、様々な場合でのエバネッセント照明時の透過深度を示す。曲線Ｋ１は、本発明による補正なしでの、波長に依存する透過深度を示す。曲線Ｋ２は、図１の実施形態の透過深度を示す。破線の曲線Ｋ３は、瞳高さの最適化が４００から６５０ｎｍの間の８つの波長で実施された補正光学部品（図示せず）での透過深度を示す。このような補正光学部品は、図１の補正光学部品３と比較して追加のレンズを備える。最後に、波長に依存しない９３ｎｍの透過深度が曲線Ｋ４で示されている。
【００５８】
透過深度の調整の実現が透過深度の図から明白に理解される。
【図１】
0005461527.tif 000008
【図２】
0005461527.tif 000009
【図３】
0005461527.tif 000010
【図４】
0005461527.tif 000011
【図５】
0005461527.tif 000012
【図６】
0005461527.tif 000013