(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクテート単量体単位及び４−ヒドロキシブチレート単量体単位含有共重合体の製造方法であって、
（ａ）ラクテートをラクチル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに、それぞれ転換する酵素の遺伝子、
（ｂ）ホスホトランスブチラーゼ遺伝子、
（ｃ）ブチレートキナーゼ遺伝子、及び
（ｄ）ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）合成酵素遺伝子、
を同時に有する微生物を培養する工程を含み、
上記培養が、４−ヒドロキシブチレートを含有する、又は、４−ヒドロキシブチレートと３−ヒドロキシプロピオネート及び３−ヒドロキシブチレートよりなる群から選択される少なくとも一つ以上とを含有する培地で遂行し、
上記ラクテートをラクチル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに、それぞれ転換する酵素の遺伝子が、クロストリジウム・プロピオニカム（Clostridium propionicum）由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（ｐｃｔ）であり、
上記ホスホトランスブチラーゼ遺伝子が、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutyricum）由来であり、
上記ブチレートキナーゼ遺伝子が、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutyricum）由来であり、
上記ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）合成酵素遺伝子が、シュードモナス属（Pseudomonas sp.）６−１９由来のｐｈａＣ１ｐｓ６−１９である
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
上記微生物は、
上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）遺伝子中で一つ以上の遺伝子を有しない微生物を、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）遺伝子中で上記微生物に存在しない遺伝子で形質転換することによって、
得られたものであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記ＰＨＡ合成酵素遺伝子が、
ａ）Ｓ３２５Ｔ及びＱ４８１Ｍ；
ｂ）Ｅ１３０Ｄ及びＱ４８１Ｋ；
ｃ）Ｓ３２５Ｔ及びＱ４８１Ｋ；
ｄ）Ｅ１３０Ｄ及びＱ４８１Ｍ；
ｅ）Ｅ１３０Ｄ及びＱ４８１Ｒ；
ｆ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ及びＱ４８１Ｍ；
ｇ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ及びＱ４８１Ｋ；
ｈ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｋ；
ｉ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｍ；
ｊ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｒ；
ｋ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｈ及びＱ４８１Ｋ；
ｌ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｈ及びＱ４８１Ｍ；
ｍ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｈ及びＱ４８１Ｒ；
ｎ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｋ；
ｏ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｍ；
ｐ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｒ；
ｑ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｙ及びＱ４８１Ｋ；
ｒ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｙ及びＱ４８１Ｍ；
ｓ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｙ及びＱ４８１Ｒ；
ｔ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ，Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｍ；
ｕ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｋ；
ｖ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｍ；
ｗ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｇ及びＱ４８１Ｍ；又は
ｘ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｋ；
の変異体を有する配列番号８のアミノ酸配列をコードする遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
上記微生物が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、４−ヒドロキシブチレート単量体単位及びラクテート単量体単位を含有する共重合体又は４−ヒドロキシブチレート単量体単位、ラクテート単量体単位及び３−ヒドロキシアルカノエートを含有する共重合体、及びその共重合体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリラクテート（ＰＬＡ）は、ラクテート由来の代表的な生分解性高分子であり、汎用高分子又は医療用高分子としての応用性の高い高分子である。現在、ＰＬＡは微生物発酵により生産されたラクテートを重合して製造されているが、ラクテートの直接重合によっては、低い分子量（１０００〜５０００ダルトン）のＰＬＡだけが生成される。高分子量（１００，０００ダルトン以上 ）のＰＬＡを合成するためには、鎖カップリング剤（chain coupling agent）でラクテートを直接重合することにより得られた低分子量のＰＬＡを重合する方法を使用できる。しかし、溶剤やカップリング剤の添加によって高分子量のＰＬＡを製造する工程が複雑になり、またそれを除去することが容易ではないとういう短所がある。現在、商用化されている高分子量のＰＬＡの生産工程は、ラクテートをラクチドに転換してラクチド環の開環縮合反応によってＰＬＡを合成する方法が使用されている。
【０００３】
一方、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）は、過度な炭素源が存在しながら、リン、窒素、マグネシウム、酸素などの他の営養分が不足する時、微生物がエネルギー及び炭素源貯蔵物質として、その内部に蓄積されるポリエステルである。ＰＨＡは、既存の石油から由来された合成高分子に似た物性を有しながら、完全な生分解性を示すので、既存の合成プラスチックの代替物質として認識されている。
【０００４】
従来のＰＨＡは短い炭素数を有するＳＣＬ−ＰＨＡ（短鎖長ＰＨＡ）と長い炭素数を有するＭＣＬ−ＰＨＡ（中鎖長ＰＨＡ）とに分けられる。ＰＨＡを合成する酵素の遺伝子は、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha ）、シュードモナスエスピー（Pseudomonas sp.）の微生物からクローニングされ、上記ＰＨＡを合成する酵素遺伝子が形質転換された組換え微生物を通して様々な種類の単量体からなるＰＨＡが合成された（非特許文献１、２、３；特許文献１、２、３，４）。
【０００５】
微生物でＰＨＡを生産するためには、微生物の代謝産物をＰＨＡモノマーに転換する酵素と、ＰＨＡモノマーを用いてＰＨＡ高分子を合成するＰＨＡ合成酵素とが必要とされる。ＰＨＡ合成酵素は、ヒドロキシアシル−ＣｏＡを基質として用いてＰＨＡを合成し、ＰＨＡの基質であるヒドロキシアシル−ＣｏＡを提供しうる酵素としては、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropha）などから由来されたα−ケトチオラーゼ（ＰｈａＡ）、アセトアセチル−ＣｏＡレダクターゼ（ＰｈａＢ）、シュードモナススピー（Pseudomonas sp.）から由来された３−ヒドロキシデカノイル−ＡＣＰ：ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＰｈａＧ）、アエロモナス・キャビエ（Aeromonas caviae）とシュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）から由来された（Ｒ）特異的エノイル−ＣｏＡヒドラターゼ（ＰｈａＪ）（非特許文献４、５）、大腸菌とシュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）などから由来された３−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＦａｂＧ）（非特許文献６、７、８）など、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutyricum）から由来されたホスホトランスブチラーゼ（Ｐｔｂ；phosphotransbutylase）とブチレートキナーゼ（Ｂｕｋ；butyrate kinase）（特許文献９）など、クロストリジウム・クルイベリ（Clostridium kluyveri）から由来されたＣａｔ２（非特許文献１０）などが知られている。このような酵素を利用して様々な炭素位置（主に３、４、５、６位）にヒドロキシル化されたヒドロキシアルカノエートを用いて様々な種類のＰＨＡを合成してきた。
【０００６】
しかし、２位がヒドロキシル化されたヒドロキシアルカノエートに対するＰＨＡ合成酵素の反応性はほとんど有していないことが報告された（非特許文献１１、１２）。今までは、ラクチル−ＣｏＡに対するＰＨＡポリメラーゼのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性測定を通してＰＨＡ合成酵素のラクチル−ＣｏＡに対する反応性を分析した報告があったが、ラクチル−ＣｏＡに対するＰＨＡ合成酵素の反応性は非常に弱い（非特許文献１１、１２）。即ち、２位−炭素位置がヒドロキシル化されたラクテートのようなヒドロキシアルカノエートはＰＨＡ合成酵素の基質特異性に適していないため、自然的に又は組換え細胞を用いてＰＨＡ及びその共重合体を製造した例はない。
【０００７】
特許文献５には、グルコースからラクテートを合成し、ラクテートをラクチル−ＣｏＡから生合成し、及びラクチル−ＣｏＡからヒドロキシアルカノエート−ＣｏＡを合成する方法が開示さいれている。しかし、ラクチル−ＣｏＡと３−ヒドロキシアルカノエート−ＣｏＡを用いて共重合体を製造する方法は開示されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００１／５５４３６号パンフレット
【特許文献２】米国特許第６，１４３，９５２号公報
【特許文献３】国際公開第１９９８／５４３２９号パンフレット
【特許文献４】国際公開第１９９９／６１６２４号パンフレット
【特許文献５】米国公開特許第２００４００７６９８２号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Qi et al., FEMS Microbiol. Lett., 157:155, 1997
【非特許文献２】Qi et al., FEMS Microbiol. Lett., 167:89, 1998
【非特許文献３】Langenbach et al., FEMS Microbiol. Lett., 150:303, 1997
【非特許文献４】Fukui et al., J. Bacteriol., 180:667, 1998
【非特許文献５】Tsage et al., FEMS Microbiol. Lett., 184:193, 2000
【非特許文献６】Taguchi et al., FEMS Microbiol. Lett., 176:183, 1999
【非特許文献７】Ren et al., J. Bacteriol., 182:2978, 2000
【非特許文献８】Park et al., FEMS Microbiol. Lett., 214:217, 2002
【非特許文献９】Liu and Steinbuchel, Appl Environ Microbiol, 66:739, 2000
【非特許文献１０】Hein et al. FEMS Microbiol. Lett., 15:411, 1997
【非特許文献１１】Zhang et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 56:131, 2001
【非特許文献１２】Valentin and Steinbuchel, Appl. Microbiol. Biotechnol., 40:699, 1994
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本発明の目的は、４−ヒドロキシブチレート単量体単位及びラクテート単量体単位を含む共重合体又は４−ヒドロキシブチレート単量体単位、ラクテート単量体単位及び３−ヒドロキシアルカノエート単量体単位を含む共重合体を提供することにある。
【００１１】
本発明の別の目的は上記共重合体の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記目的を達成するために、本発明は、ラクテート単量体単位及び４−ヒドロキシブチレート単量体単位を含むことを特徴とする共重合体を提供する。
【００１３】
また、本発明は、ラクテート単量体単位、４−ヒドロキシブチレート単量体及び３−ヒドロキシアルカノエート単量体単位を含むことを特徴とする共重合体を提供する。
【００１４】
より好ましくは、本発明の上記共重合体は、４−ヒドロキシブチレート−ラクテート共重合体（poly(4-hydroxybutyrate-co-lactate)）、４−ヒドロキシブチレート−３−ヒドロキシプロピオネート−ラクテート三重合体（poly(4-hydroxybutyrate-co-3-hydroxypropionate-co-lactate)）、３−ヒドロキシブチレート−４−ヒドロキシブチレート−ラクテート三重合体（poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutylate-co-lactate)）、又は３−ヒドロキシブチレート−３−ヒドロキシプロピオネート−４−ヒドロキシブチレート−ラクテート四重合体（poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxypropionate-co-4-hydroxybutylate-co-lactate)）である。
【００１５】
本発明は、（ａ）ラクテートをラクチル−ＣｏＡに転換し、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子、（ｂ）ホスホトランスブチラーゼ（phosphotransbutylase）遺伝子、（ｃ）ブチレートキナーゼ（butyrate kinase）遺伝子及び（ｄ）ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）合成酵素遺伝子、を同時に有する細胞又は植物を培養することを特徴とするラクテート単量体単位及び４−ヒドロキシブチレート単量体単位含有共重合体の製造方法を提供する。
【００１６】
本発明において、上記細胞又は植物は、上記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）遺伝子中で一つ以上の遺伝子を有しない細胞又は植物を、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）遺伝子中で存在しない遺伝子で形質転換して得ることができる。また、上記細胞又は植物は、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）遺伝子中で一つ以上の発現が微弱であるか、又は存在しない細胞又は植物を（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）遺伝子中の発現が微弱であるか、又は存在しない遺伝子で形質転換して得ることができる。
【００１７】
即ち、上記４−ヒドロキシブチレート単量体単位及びラクテート単量体単位を含む共重合体生成能を有する細胞又は植物は、（ｉ）上記遺伝子を全部有しない細胞又は植物を、ラクテートをラクチル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに、それぞれ転換する酵素の遺伝子、ホスホトランスブチラーゼ遺伝子、ブチレートキナーゼ遺伝子及びＰＨＡ合成酵素遺伝子で形質転換し、（ｉｉ）ラクチル−ＣｏＡを基質として使用するＰＨＡ合成酵素の遺伝子を有する細胞又は植物を、ラクテートをラクチル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに、それぞれ転換する酵素の遺伝子、ホスホトランスブチラーゼ遺伝子及びブチレートキナーゼ遺伝子で形質転換し、（ｉｉｉ）ラクテートをラクチル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子を有する細胞又は植物をホスホトランスブチラーゼ遺伝子、ブチレートキナーゼ遺伝子及びＰＨＡ合成酵素遺伝子で形質転換し、（ｉｖ）ホスホトランスブチラーゼ遺伝子を有する細胞又は植物を、ラクテートをラクチル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに、それぞれ転換する酵素の遺伝子、ブチレートキナーゼ遺伝子及びＰＨＡ合成酵素遺伝子で形質転換し、（ｖ）ブチレートキナーゼ遺伝子を有する細胞又は植物を、ラクテートをラクチル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに、それぞれ転換する酵素の遺伝子、ホスホトランスブチラーゼ及びＰＨＡ合成酵素遺伝子で形質転換し、（ｖｉ）ラクチル−ＣｏＡを基質として使用するＰＨＡ合成酵素の遺伝子及びラクテートをラクチル−ＣｏＡに 、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに、それぞれ転換する酵素の遺伝子を有する細胞又は植物をホスホトランスブチラーゼ遺伝子及びブチレートキナーゼ遺伝子で形質転換し、（ｖｉｉ）ラクテートをラクチル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに、それぞれ転換する酵素の遺伝子及びホスホトランスブチラーゼ遺伝子を有する細胞又は植物をラクチル−ＣｏＡを基質として使用するＰＨＡ合成酵素の遺伝子及びブチレートキナーゼ遺伝子で形質転換し、（ｖｉｉｉ）３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子及びブチレートキナーゼ遺伝子を有する細胞又は植物をＰＨＡ合成酵素の遺伝子及びホスホトランスブチラーゼ遺伝子で形質転換し、（ｉｘ）ラクチル−ＣｏＡを基質として使用するＰＨＡ合成酵素の遺伝子及びブチレートキナーゼ遺伝子を有する細胞又は植物を、ラクテートをラクチル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに、それぞれ転換する酵素の遺伝子及びホスホトランスブチラーゼ遺伝子で形質転換し、（ｘ）ＰＨＡ合成酵素の遺伝子及びホスホトランスブチラーゼ遺伝子を有する細胞又は植物を、ラクテートをラクチル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに、それぞれ転換する酵素の遺伝子及びブチレートキナーゼ遺伝子で形質転換し、（ｘｉ）ホスホトランスブ��ラーゼ遺伝子及びブチレートキナーゼ遺伝子を有する細胞又は植物を、ラクチル−ＣｏＡを基質として使用するＰＨＡ合成酵素の遺伝子及びラクテートをラクチル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに、それぞれ転換する酵素の遺伝子で形質転換し、（ｘｉｉ）ラクテートをラクチル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに、それぞれ転換する酵素の遺伝子、ホスホトランスブチラーゼ遺伝子及びブチレートキナーゼ遺伝子を有する細胞又は植物をラクチル−ＣｏＡを基質として使用するＰＨＡ合成酵素の遺伝子で形質転換し、（ｘｉｉｉ）ホスホトランスブチラーゼ遺伝子、ブチレートキナーゼ遺伝子及びＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する細胞又は植物を、遺伝子ラクテートをラクチル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子で形質転換し、（ｘｉｖ）ラクテートをラクチル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに、それぞれ転換する酵素の遺伝子、ブチレートキナーゼ遺伝子及びＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する細胞又は植物を遺伝子ホスホトランスブチラーゼ遺伝子で形質転換し、又は（ｘｖ）ラクテートをラクチル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに、それぞれ転換する酵素の遺伝子、ホスホトランスブチラーゼ及びＰＨＡ合成酵素遺伝子を有する細胞又は植物を遺伝子ブチレートキナーゼ遺伝子で形質転換する、ことによって得ることができる。しかし、本発明の範囲は上記で説明された具体例に制限されない。
【００１８】
好ましくは、本発明において、上記ラクテートをラクチル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに、それぞれ転換する酵素の遺伝子はプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子（ｐｃｔ）である。
【００１９】
好ましくは、本発明において、上記ホスホトランスブチラーゼ（Ｐｔｂ）遺伝子は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutyricum）由来である。
【００２０】
好ましくは、本発明において、上記ブチレートキナーゼ（Ｂｕｋ）遺伝子は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutyricum）由来である。
【００２１】
本発明において、上記Ｐｔｂ遺伝子とｂｕｋ遺伝子の代りにクロストリジウム・クルイベリ（Clostridium kluyveri）由来のＣａｔ２遺伝子を使用することができる。このＣａｔ２遺伝子はＰｔｂ遺伝子及びｂｕｋ遺伝子のように４−ヒドロキシブチレートを４−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに転換する酵素である。好ましくは、Ｃａｔ２遺伝子は配列番号３０の塩基配列を有する。
【００２２】
また、ラクチル−ＣｏＡを基質として使用するＰＨＡ合成酵素の遺伝子がｐｈａＣの場合、ｐｃｔ、ｐｔｂ及びｂｕｋ遺伝子を含む組換えベクターで形質転換される。同時にｐｈａＣを含むベクターで形質転換されるか、又はｐｈａＣが染色体上に挿入されていることを特徴とする。また、ラクチル−ＣｏＡを基質として使用するＰＨＡ合成酵素の遺伝子がｐｈａＣの場合、ｐｃｔ遺伝子を含む組換えベクターで形質転換される。同時にｐｈａＣを含むベクターで形質転換されるか、又はｐｈａＣが染色体上に挿入されていることを特徴とする。
【００２３】
当技術分野に知られたように、上記ＰＨＡ合成酵素の遺伝子を有する細胞としては様々な微生物が知られている（韓国特許第１０−２５０８３０号）。例えば、 Achromobacter sp.、 Achromobacter xylosoxidansなどを含むAchromobacter属微生物、Acidovorax delafieldii、Acidovax facilis、Acinetobacter sp., Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacter lwoffiiなどを含むAcinetobacter属微生物、 Actinomyces sp.、Aeromonas caviae、Aeromonas hydrophila、Aeromonas salmonicidaなどを含むAeromonas属微生物、Alcaligenes aestus、Alcaligenes denitrificans、Alcaligenes eutrophus（Ralstonia eutrophaとして再命名された後、再びWautersia eutrophaとして再命名される）、Alcaligenes faecalis、Alcaligenes latus、Alcaligenes pacificus Alcaligenes paradoxus、Alcaligenes venestusなどを含むAlcaligenes属微生物、Alteromonas macleodii、Amoebobacter roseu、Amoebobacter pendensなどを含むAmoebobacter属微生物、Aphanocapa sp.、Aphanothece sp. Aquaspirillum autotrophicum、Azorhizobium caulinodans、Azospirillum sp.、Azospirillum brasilense、Azospirillum lipoferumなどを含むAzospirillum属微生物、Azotobacter sp.、Azotobacter agilis、Azotobacter chroococcum、Azotobacter macrocytogenes、Azotobacter vinelandiiなどを含むAzotobacter属微生物、Bacillus anthracis、Bacillus cereus、Bacillus megaterium、Bacillus subtillus、Bacillus thuringiensisなどを含むBacillus属微生物、Beggiatoa sp.、Beggiatoa albaなどを含むBeggiatoa属微生物、Beijerinckia indicus、Beijerinckia mobilisなどを含むBeijerinckia属微生物、Beneckia natrigens、Beneckea pelagiaなどを含むBeneckea属微生物, Bordetella pertussis、Bradyrhizobium japonicum、Caryophamon latum、Caulobacter bacteroides、Caulobacter crescentusなどを含むCaulobacter属微生物、Chloroflexus aurantiacus、Chlorogloea fritschiiなどを含むChlorogloea属微生物、Chromatium minutissimum、Chromatium okenii, Chromatium tepidum などを含むChromatium 属微生物, Chromobacterium violaceumなどを含むChromobacterium属微生物、Clostridium botulinum、Clostridium sphenoidesなどを含むClostridium属微生物、Comamonas acidovorans、Comamonas testosteroniなどを含むComamonas属微生物、Corynebacterium autotrophicum、Corynebacterium hydrocarboxydansなどを含むCorynebacterium属微生物、Cyanobacteria、Derxia gummosaを含むDerxia属微生物、Desulfococcus multivorans、Desulfonema limicola、Desulfonema magnumなどを含むDesulfonema属微生物、Desulfosacina variabilis、Desulfovibrio sapovorans、 Ectothiorhodospira halochloris、Ectothiorhodospira mobilis、Ectothiorhodospira vacuolataなどを含むEctothiorhodospira属微生物、Ferrobacillus ferroxidans、Flavobacterium sp.、Haemophilus influenzae、Halobacterium gibbonsii、Halobacterium volcaniiなどを含むHalobacterium属微生物、Haloferax mediterranei、Hydroclathratus clathratus、Hydrogenomonas facilis、Hydrogenophaga flava、Hydrogenophaga pseudoflava、Hydrogenophaga taeniospiralisなどを含むHydrogenophaga属微生物、Hyphomicrobium vulgareを含むHyphomicrobium属微生物、Ilyobacter delafieldii、Labrys monachus、Lamprocystis reseopersicina、Lampropedia hyalina、Legionella sp.、Leptothrix discophorus、Methylobacterium AM1、Methylobacterium extorquensなどを含むMethylobacterium属微生物、Methylococcus thermophilus、Methlocystis parvus、Methylomonas methanica、Methylosinus sporium、Methylosinus trichosporiumなどを含むMethylosinus属微生物、Methylovibrio soehngenii、Micrococcus denitrificans、Micrococcus halodenitrificansなどを含むMicrococcus属微生物、Mycobacterium album、 Mycobacterium vacaeなどを含むMycobacterium 属微生物、Nitrobacter agilis, Nitrobacter winogradskyiなどを含むNitrobacter属微生物、Nocardia alba、 Nocardia asteroides、Nocardia lucida、Nocardia rubraなどを含むNocardia属微生物、Paracoccus dentrificans、scillatoria limosa、Penicillium cyclopium、Photobacterium mandapamensis、Photobacterium phosphoreumなどを含むPhotobacterium属微生物、Physarum ploycephalumとPseudomonas glathei、Pseudomonas indigofera、Pseudomonas lemonieri、Pseudomonas mallei、Pseudomonas marina、Pseudomonas mixta、Pseudomonas oleovorans、Pseudomonas oxalaticus、Pseudomonas pseudoalcaligenes、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas alcaligenes、Pseudomonas asplenii、Pseudomonas butanovora、Pseudomonas cepacia、Pseudomonas coronafaciens、Pseudomonas dacunhae、Pseudomonas denitrificans、Pseudomonas diminuta、Pseudomonas echinoides、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas putida、Pseudomonas rubrilineas、Pseudomonas saccharophila、Pseudomonas stutzeri、Pseudomonas syringae、Pseudomonas thermophilus、Pseudomonas viridiflavaなどを含むPseudomonas属微生物、Ralstonia 属微生物、Rhizobium hedysarum、Rhizobium lupini、Rhizobium meliloti、Rhizobium phaseoli、 Rhizobium trifoliなどを含むRhizobium属微生物、Rhodobacillus属微生物、Rhodobacter capsulatus、Rhodobacter sphaeroidesなどを含むRhodobacter属微生物、Rhodococcus rhodochrousを含むRhodococcus属微生物、Rhodocyclus gelatinosus、 Rhodocyclus tenuis などを含むRhodocyclus 属微生物, Rhodomicrobium vannieliiとRhodopseudomonas acidophila、Rhodopseudomonas capsulataなどを含むRhodopseudomonas属微生物、Rhodospirillum molischianum、Rhodospirillum rubrum などを含むRhodospirillum属微生物、Sphingomonas paucimobilis、Spirillum itersomii、Spirillum serpensなどを含むSpirillum属微生物、Spirulina jenneri、Spirulina maxima、Spirulina subsaksaなどを含むSpirulina属微生物、Staphylococcus aureus、 Staphylococcus epidermidis、Staphylococcus xylosusなどを含むStaphylococcus属微生物、Stella humosa、Stella vacuolataなどを含むStella属微生物、Streptomyces antibioticus、Streptomyces coelicolorなどを含むStreptomyces属微生物、Syntrophomonas wolfei、Thermophilic cyanobacteria、Thermus thermophilus、Thiobacillus A2、Thiobacillus acidophilus、Thiobacillus versutusなどを含むThiobacillus属微生物、Thiocapsa pfennigiiなどを含むThiocapsa属微生物、Thiocystis violacea、Vibrio parahaemolyticus、Xanthobacter autotrophicus、Xanthomonas maltophilia、Zoogloea ramigeraなどを含むZoogloea属微生物などがある。
【００２４】
好ましくは、本発明の上記ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）合成酵素遺伝子は、シュードモナスエスピー（Pseudomonas sp.）６−１９由来のｐｈａＣ1ｐｓ６−１９である。より好ましくは、上記ＰＨＡ合成酵素遺伝子は、配列番号８のアミノ酸配列で、ａ）Ｓ３２５Ｔ及びＱ４８１Ｍ；ｂ）Ｅ１３０Ｄ及びＱ４８１Ｋ；ｃ）Ｓ３２５Ｔ及びＱ４８１Ｋ；ｄ）Ｅ１３０Ｄ及びＱ４８１Ｍ；ｅ）Ｅ１３０Ｄ及びＱ４８１Ｒ；ｆ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ及びＱ４８１Ｍ；ｇ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ及びＱ４８１Ｋ；ｈ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｋ；ｉ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｍ；ｊ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｒ；ｋ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｈ及びＱ４８１Ｋ；ｌ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｈ及びＱ４８１Ｍ；ｍ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｈ及びＱ４８１Ｒ；ｎ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｋ；ｏ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｍ；ｐ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｒ；ｑ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｙ及びＱ４８１Ｋ；ｒ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｙ及びＱ４８１Ｍ；ｓ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｙ及びＱ４８１Ｒ；ｔ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｍ；ｕ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｒ及びＱ４８１Ｋ；v）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｍ；ｗ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｇ及びＱ４８１Ｍ；又はｘ）Ｅ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｋが変異されたアミノ酸配列をコードする遺伝子である。このようなＰＨＡ合成酵素変異体を用いることがラクチル−ＣｏＡの基質利用性の側面からより好ましい。
【００２５】
本発明において、上記細胞は好ましくは微生物である。さらに好ましくは、上記微生物は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
【００２６】
本発明において、ラクテートをラクチル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに、それぞれ転換する酵素の遺伝子、ホスホトランスブチラーゼ遺伝子、ブチレートキナーゼ遺伝子及びポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）合成酵素遺伝子を、同時に有する細胞又は植物は、４−ヒドロキシブチレート−３−ヒドロキシプロピオネート及び３−ヒドロキシブチレートよりなる群から選択される一つ以上を含む培地で培養して４−ヒドロキシブチレート単量体単位、ラクテート単量体単位及び選択的に３−ヒドロキシアルカノエートを含有する共重合体を製造することができる。もしグルコースやクエン酸などの他の炭素源からラクテート、４−ヒドロキシブチレート及び３−ヒドロキシアルカノエートを生合成しうる細胞又は植物であれば、培地に４−ヒドロキシブチレート、ラクテートなどをさらに加えなくてもよい。
【００２７】
例えば、ポリ（４−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−３−ヒドロキシプロピオネート−ｃｏ−ラクテート）の場合、上記細胞又は植物を４−ヒドロキシブチレート（４−ＨＢ）及び３−ヒドロキシプロピオネート（３−ＨＰ）をさらに含有する培地で培養して取得できる。
【００２８】
例えば、３−ヒドロキシブチレート−３−ヒドロキシプロピオネート−４−ヒドロキシブチレート−ラクテート四重合体の場合、上記細胞又は植物を４−ヒドロキシブチレート（３−ＨＰ）、３−ヒドロキシプロピオネート（３−ＨＰ）及び３−ヒドロキシブチレート（３−ＨＢ）を含有する培地で培養又は栽培して収得できる。
【００２９】
本発明の転換酵素の遺伝子及び合成酵素の遺伝子を含有する植物体を製造するための植物体の形質転換は、アグロバクテリウム又はウイルスベクターなどを用いる常法により達成できる。例えば、本発明に係る遺伝子を含有する組換えベクターでアグロバクテリウム中の微生物を形質転換させた後、上記形質転換されたアグロバクテリウム中の微生物を対象植物の組織などに感染させ、形質感染された植物を得ることができる。より具体的に、対象植物の外植体（explant）を前培養（pre-culture）した後、これを上記形質転換されたアグロバクテリウムと共同培養して形質転換させる工程；形質転換された外植体をカルス誘導培地で培養し、カルスを収得する工程；及び得られたカルスを切断し、これをシュート誘導培地で培養して芽を形成させる工程；を経て形質転換された植物を製造できる。
【００３０】
本発明で、用語“外植体（explant）”とは、植物体から切断した組織の断片を意味し、子葉（cotyledon）又は胚軸（hypocotyl）を含む。子葉又は胚軸は本発明の外植体として使用できる。植物の種子を消毒・洗浄した後、ＭＳ培地で発芽させることによって得られた子葉を使用することがより好ましい。
【００３１】
本発明で利用可能な形質転換された植物は、タバコ、トマト、唐辛子、豆、稲、トウモロコシなどが挙げられるが、これらに制限されない。また、たとえ形質転換された植物が有性繁殖する植物でも、組織培養などにより無性的に繰返生殖させることができることは当業者にとって自明である。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ＰＨＡ合成酵素とＣＰ−ＰＣＴが共に発現されるオペロン形態の構造的発現されるシステムを示す模式図である。
【図２】本発明に係るＰＨＡ合成酵素遺伝子とＣＰ−ＰＣＴ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴの遺伝子地図である。
【図３】本発明に係るＰＨＡ合成酵素遺伝子とＣＰ−ＰＣＴ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＴａｃＣｐＰｃｔＮＣｖＥＣの遺伝子地図である。
【図４】本発明に係るＰｔｂとＢｕｋ遺伝子を含む組換えプラスミドｐＭＣＳＰｔｂＢｕｋの遺伝子地図である。
【図５】ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ／ｐＭＣＳＰｔｂＢｕｋプラスミドで形質転換された組換え大腸菌により生合成された共重合体である４−ヒドロキシブチレート−ラクテート共重合体の成分を分析したＮＭＲ結果である。
【図６】ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ／ｐＭＣＳＰｔｂＢｕｋプラスミドで形質転換された組換え大腸菌により生合成された共重合体である３−ヒドロキシプロピオネート−４−ヒドロキシブチレート−ラクテート三重合体及び３−ヒドロキシブチレート−３−ヒドロキシプロピオネート−４−ヒドロキシブチレート−ラクテート四重合体の成分を分析したＮＭＲ結果である。
【図７】ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ／ｐＭＣＳＰｔｂＢｕｋプラスミドで形質転換された組換え大腸菌により生合成された共重合体である３−ヒドロキシプロピオネート−４−ヒドロキシブチレート−ラクテート三重合体及び３−ヒドロキシブチレート−３−ヒドロキシプロピオネート−４−ヒドロキシブチレート−ラクテート四重合体の成分を分析したＧＣ−ＭＳＤ結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。下記実施例は当業者が本発明に対する理解を助けるために実例として提供されており、本発明の範囲が制限することを意図としない。
【実施例１】
【００３４】
ｐｃｔ遺伝子及びＰＨＡ合成酵素遺伝子を含有する組換えプラスミドの構築
４−ヒドロキシブチレート単量体単位及びラクテート単量体単位を含む共重合体を製造するために、ｐｃｔ遺伝子とＰＨＡ合成酵素遺伝子を含有する組換えプラスミドｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ及びｐＴａｃＣｐＰｃｔＮＣｖＥＣなどを構築した。
【００３５】
（１）ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴプラスミドの構築
ｐｃｔ遺伝子としてはクロストリジウム・プロピオニカム（Clostridium propionicum）由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＣＰ−ＰＣＴ）遺伝子が使用され、ＰＨＡ合成酵素遺伝子としてはシュードモナスエスピー６−１９（Pseudomonas sp. 6-19）のＰＨＡ合成酵素遺伝子が使用された。
【００３６】
図１のように合成酵素（synthase）とＣＰ−ＰＣＴが共に発現されるオペロン形態の構造的発現されるシステムを構築した。ＣＰ−ＰＣＴの場合、発現時に宿主微生物に対して強い毒性を有していることがよくしられている。即ち、ＩＰＴＧによって誘導されたｔａｃプロモーター又はＴ７プロモーター発現誘導システム（このシステムは組換えタンパク質の発現に広く使用されている）において、発現誘導物質添加直後に微生物は全て死滅する。この理由のために、弱く発現されるが、微生物成長によって持続的に発現されるシステムを使用することは、適当と考えられる。ＣＰ−ＰＣＴ遺伝子はクロストリジウム・プロピオニカム（Chostridium propionicum）（ＤＳＭＺ１６８２）の染色体ＤＮＡを鋳型として、ｐｃｔ遺伝子配列（Selmer et al., Eur J Biochem., 269:372, 2002）に基づいて構築された配列番号１及び配列番号２の塩基配列を有するプライマーを用いるＰＣＲによって得られた。その塩基配列を配列番号２９に示した。
【００３７】
配列番号１：５−ｇｇａａｔｔｃＡＴＧＡＧＡＡＡＧＧＴＴＣＣＣＡＴＴＡＴＴＡＣＣＧＣＡＧＡＴＧＡ
配列番号２：５−ｇｃｔｃｔａｇａｔｔａｇｇａｃｔｔｃａｔｔｔｃｃｔｔｃａｇａｃｃｃａｔｔａａｇｃｃｔｔｃｔｇ
【００３８】
このとき、野生型のＣＰ−ＰＣＴに存在するＮｄｅＩ制限酵素部位をクローニングの容易性のためにＳＤＭ方法で除去した。さらに、ＳｂｆＩ／ＮｄｅＩ認識部位を添加するために、配列番号３と４の塩基配列を有するプライマーでオーバーラップＰＣＲを遂行した。
【００３９】
配列番号３：５−ａｇｇ ｃｃｔ ｇｃａ ｇｇｃ ｇｇａ ｔａａ ｃａａ ｔｔｔ ｃａｃ ａｃａ ｇｇ− ３
配列番号４：５−ｇｃｃ ｃａｔ ａｔｇ ｔｃｔ ａｇａ ｔｔａ ｇｇａ ｃｔｔ ｃａｔ ｔｔｃ ｃ− ３
【００４０】
シュードモナスエスピー（Pseudomonas sp.）６−１９（ＫＣＴＣ  １１０２７ＢＰ）由来ＰＨＡ合成酵素（ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９）遺伝子を分離するために、シュードモナスエスピー（Pseudomonas sp.）６−１９の全体ＤＮＡを抽出し、ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９遺伝子配列（Ae-jin Song, Master's Thesis, Department of Chemical and Biomolecular Engineering, KAIST, 2004）に基づいた配列番号５と６の塩基配列を有するプライマーを構築し、ＰＣＲを遂行してｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９遺伝子を得た。ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９遺伝子の塩基配列を配列番号７に示し、これから計算されたアミノ酸配列を配列番号８に示した。
【００４１】
配列番号５：５− ＧＡＧ ＡＧＡ ＣＡＡ ＴＣＡ ＡＡＴ ＣＡＴ ＧＡＧ ＴＡＡ ＣＡＡ ＧＡＧ ＴＡＡ ＣＧ −３
配列番号６：５− ＣＡＣ ＴＣＡ ＴＧＣ ＡＡＧ ＣＧＴ ＣＡＣ ＣＧＴ ＴＣＧ ＴＧＣ ＡＣＧ ＴＡＣ −３
【００４２】
上記得られたｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９遺伝子をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Stratagene Co., USA）のＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩ認識部位に挿入することによって、ｐＰｓ６１９Ｃ１組換えベクターを製造した。ＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩ認識部位がそれぞれ両端に一つずつだけが含まれたｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素遺伝子断片を作るために、まず、内在しているＢｓｔＢＩ位置をＳＤＭ（site directed mutagenesis）方法で、アミノ酸を変換することなく除去し、ＢｓｔＢＩ／ＳｂｆＩ認識部位を添加するために、配列番号９と１０、配列番号１１と１２、配列番号１３と１４の塩基配列を有するプライマーを利用してオーバーラップＰＣＲを遂行した。
【００４３】
配列番号９：５− ａｔｇ ｃｃｃ ｇｇａ ｇｃｃ ｇｇｔ ｔｃｇ ａａ −３
配列番号１０：５− ＣＧＴ ＴＡＣ ＴＣＴ ＴＧＴ ＴＡＣ ＴＣＡ ＴＧＡ ＴＴＴ ＧＡＴ ＴＧＴ ＣＴＣ ＴＣ −３
配列番号１１：５− ＧＡＧ ＡＧＡ ＣＡＡ ＴＣＡ ＡＡＴ ＣＡＴ ＧＡＧ ＴＡＡ ＣＡＡ ＧＡＧ ＴＡＡ ＣＧ −３
配列番号１２：５− ＣＡＣ ＴＣＡ ＴＧＣ ＡＡＧ ＣＧＴ ＣＡＣ ＣＧＴ ＴＣＧ ＴＧＣ ＡＣＧ ＴＡＣ −３
配列番号１３：５− ＧＴＡ ＣＧＴ ＧＣＡ ＣＧＡ ＡＣＧ ＧＴＧ ＡＣＧ ＣＴＴ ＧＣＡ ＴＧＡ ＧＴＧ −３
配列番号１４：５− ａａｃ ｇｇｇ ａｇｇ ｇａａ ｃｃｔ ｇｃａ ｇｇ −３
【００４４】
アミノ酸配列分析を通してｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素のＳＣＬ（short-chain-length PHA）合成活性に影響を及ぼすアミノ酸位置３箇所（１３０、３２５、４８１）を見つけた後、ＳＤＭ方法でｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素のアミノ酸配列中のＥ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ及びＱ４８１Ｍが変異された変異体をコードする遺伝子を含有するｐＰｓ６１９Ｃ１３００を構築した。構築されたｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９合成酵素変異体を下記表１に示した。
【００４５】
【表１】
0005565938.tif 000002
【００４６】
配列番号１５：５− ａｔｃ ａａｃ ｃｔｃ ａｔｇ ａｃｃ ｇａｔ ｇｃｇ ａｔｇ ｇｃｇ ｃｃｇ ａｃｃ− ３
配列番号１６：５− ｇｇｔ ｃｇｇ ｃｇｃ ｃａｔ ｃｇｃ ａｔｃ ｇｇｔ ｃａｔ ｇａｇ ｇｔｔ ｇａｔ− ３
配列番号１７：５− ＣＴＧ ＡＣＣ ＴＴＧ ＣＴＧ ＧＴＧ ＡＣＣ ＧＴＧ ＣＴＴ ＧＡＴ ＡＣＣ ＡＣＣ− ３
配列番号１８：５− ＧＧＴ ＧＧＴ ＡＴＣ ＡＡＧ ＣＡＣ ＧＧＴ ＣＡＣ ＣＡＧ ＣＡＡ ＧＧＴ ＣＡＧ− ３
配列番号１９：５− ＣＧＡ ＧＣＡ ＧＣＧ ＧＧＣ ＡＴＡ ＴＣ Ａ ＴＧＡ ＧＣＡ ＴＣＣ ＴＧＡ ＡＣＣ ＣＧＣ− ３
配列番号２０：５− ＧＣＧ ＧＧＴ ＴＣＡ ＧＧＡ ＴＧＣ ＴＣＡ ＴＧＡ ＴＡＴ ＧＣＣ ＣＧＣ ＴＧＣ ＴＣＧ− ３
【００４７】
上記構築されたｐＰｓ６１９Ｃ１３００ベクターをＳｂｆＩ／ＮｄｅＩで切断し、上記クローニングしたＣＰ−ＰＣＴ遺伝子をＳｂｆＩ／ＮｄｅＩ認識部位に挿入することによって、ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ組換えベクターを構築した（図２）。
【００４８】
（２）ｐＴａｃＣｐＰｃｔＮＣｖＥＣプラスミドの構築
ｐＴａｃ９９Ａ（Park and Lee, J. Bacteriol. 185, 5391-5397, 2003）ベクターをＳｓｐＩで切断して得たＴａｃプロモーターと転写タミネータを含む遺伝子断片を制限酵素ＳｓｐＩで切断したｐＴｒｃ９９Ａ（Pharmacia Biotech, Sweden）に挿入してｐＴａｃｌａｃベクターを構築した。クロマチウム・ビノサム（Chromatium vinosum）（ＤＳＭＺ１８０）染色体ＤＮＡを鋳型として配列番号２１及び２２のプライマーを利用してｐｈａＥＣ遺伝子を増幅した。
【００４９】
配列番号２１：ｇｇａａａｔｃ ｃａｔ ＡＴＧＡＣＧＡＴＧＴＴＣＴＣＧＣＴＣＡＴＧＧＣＧ
配列番号２２：ｇｇａａａｔｃ ｃａｔａｔｇ ａｔｃ ｃａｇ ｇｇｃ ｃａｃ ｔａｔ ｃｔｃ ｃａａ ｃｔｇ
【００５０】
増幅されたｐｈａＥＣ遺伝子を上記製造されたｐＴａｃｌａｃベクターのＮｄｅＩ切断部位に挿入し、ｐＴａｃｌａｃＮＣｖＥＣを構築した。また順次にｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴをＥＣＯＲＩ／ＸｂａＩで切断して得たｐｃｔ遺伝子をＥＣＯＲＩ／ＸｂａＩで切断したｐＴａｃｌａｃＮＣｖＥＣに挿入してｐＴａｃＣｐＰｃｔＮＣｖＥＣを構築した（図３）。
【００５１】
（３）ｐＭＣＳＰｔｂＢｕｋプラスミドの構築
ｐｔｂとｂｕｋ遺伝子はクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutyricum）菌株に一つのオペロンで構成され、これらの塩基配列を配列番号２７及び２８に示した。ｐｔｂ／ｂｕｋ遺伝子を配列番号２３及び配列番号２４のプライマーを利用してクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutyricum）（ＡＴＣＣ８２４）の染色体ＤＮＡから増幅した。
【００５２】
配列番号２３：ＧＧＣＡＧＡＧＡＧ ＡＣＡＡＴＣＡＡＡＴ Ｃ ＡＴＧＡＴＴＡＡＧＡＧＴＴＴＴＡＡＴＧ
配列番号２４：ｇｇａａｔｔｃ ｃａｔａｔｇ ｔｔａ ｔｔｔ ｇｔａ ｔｔｃ ｃｔｔ ａｇｃ ｔｔｔ ｔｔｃ ｔｔｃ ｔｃｃ
【００５３】
また、ｐＣ１３００−ＣＰＰＣＴのＳｂｆＩ認識部分の遺伝子を増幅するために、配列番号２５及び配列番号２６のプライマーを利用してｐＣ１３００−ＣＰＰＣＴを鋳型としてＰＣＲを遂行した。
【００５４】
配列番号２５：ＧＧＧＣＡＧＡＴＧＴ ＧＣＣＧＧＣＡＧＡＣ
配列番号２６：ｇａｔ ｔｔｇ ａｔｔ ｇｔｃ ｔｃｔ ｃｔｇ ｃｃｇ
【００５５】
上記配列番号２３及び２４のプライマーを利用して得た遺伝子断片と配列番号２５及び２５のプライマーを利用して得た遺伝子断片を鋳型として用いて、配列番号２４、２５のプライマーを利用してオーバーラップＰＣＲを遂行し、最終的にＳｂｆＩ／ＮｄｅＩ認識部位を有するｐｔｂ／ｂｕｋ遺伝子断片を得た。得られたｐｔｂ／ｂｕｋ遺伝子断片をＳｂｆＩ／ＮｄｅＩで切断した後、同じ酵素で切断したｐＣ１３００−ＣＰＰＣＴに挿入してｐＰｔｂＢｕｋプラスミドを構築した。ｐＰｔｂＢｕｋプラスミドをＸｍａＩ／ＸｈｏＩで切断し、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＡ生合成遺伝子のプロモーターとｐｔｂ／ｂｕｋ遺伝子を含有する遺伝子断片を得て、上記得られた遺伝子をＸｍａＩ／ＸｈｏＩで切断したｐＢＢＲ１ＭＣＳ（ＮＣＣＢ  ３４３３）プラスミドに挿入して、ｐＭＣＳＰｔｂＢｕｋプラスミドを構築した（図４）。
【００５６】
［実施例２］
４−ヒドロキシブチレート−ラクテート共重合体の製造
実施例１で構築したｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴをｐＭＣＳＰｔｂＢｕｋのように、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０（Invitrogen）に形質転換し、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０／ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ／ｐＭＣＳＰｔｂＢｕｋを得た。
【００５７】
上記形質転換体を下記のように２段階培養して、４−ヒドロキシブチレート−ラクテート共重合体を得た。まず、上記形質転換組換え大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０／ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ／ｐＭＣＳＰｔｂＢｕｋを１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンと３０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコール（Chloramphenicol）が含有されている１００ｍＬのＬＢ培地（バクトＴＭトリプトン（BD）１０ｇ／Ｌ、バクトＴＭイースト抽出物（BD）５ｇ／Ｌ；ＮａＣｌ（amresco）１０ｇ／Ｌ）で２４時間培養した後、４℃、１０００ｇで１５分間遠心分離して菌体を回収した。
【００５８】
回収した菌体を２ｇ／Ｌの４−ヒドロキシブチレート（４−ＨＢ）と１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンと３０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールがさらに含有されたＭＲ培地（１Ｌ当たり、グルコース１０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ６．６７ｇ、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４  ４ｇ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．８ｇ、クエン酸０．８ｇ及び微量金属溶液５ｍＬ；微量金属溶液の組成：１Ｌ当たり、５Ｍ  ＨＣｌ  ５ｍＬ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １０ｇ、ＣａＣｌ２  ２ｇ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２．２ｇ、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ  ０．５ｇ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  １ｇ、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２・４Ｈ２Ｏ  ０．１ｇ、及びＮａ２Ｂ４ｏ２・１０Ｈ２Ｏ  ０．０２ｇ）で３日間嫌気的に培養した。
【００５９】
上記培養液を４℃、１０００ｇで１５分間遠心分離して菌体を回収し、十分な量の蒸留水で４回洗浄した後、８０℃で１２時間乾燥した。湿気が完全に除去された菌体を定量した後、１００℃で、クロロホルムを溶媒として用いて硫酸触媒下でメタノールと反応した。これを室温でクロロホルムの半分に該当する体積の蒸留水を加えて混合した後、二つの層に分離されるまで静置した。二つの層において、メチル化された高分子の単量体が溶けているクロロホルム層を採取し、ガスクロマトグラフィーで高分子の成分を分析した。内部標準物質としてはベンゾエートを使用した。
【００６０】
分析結果、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０／ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ／ｐＭＣＳＰｔｂＢｕｋ菌体でメチル−４−ヒドロキシブチレート及びメチル−ラクテートが検出され、組換え大腸菌により新規な４−ヒドロキシブチレート−ラクテート共重合体［(poly(4-hydroxybutyrate-co-lactate))］が生成されたことを確認することができた。生成されたポリ（４−ヒドロキシブチレート−ｃｏ−ラクテート）共重合体のＮＭＲ測定結果を図５に示した。
【００６１】
［実施例３］
４−ヒドロキシブチレート−３−ヒドロキシプロピオネート−ラクテート三重合体の製造
回収した菌体を２ｇ／Ｌの４−ヒドロキシブチレート（４−ＨＢ）と１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンと３０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールがさらに含有されたＭＲ培地で３日間嫌気的に培養する代わりに、２ｇ／Ｌの４−ヒドロキシブチレート（４−ＨＢ）及び２ｇ／Ｌの３−ヒドロキシプロピオネート（３−ＨＰ）と１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンと３０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールがさらに含有されたＭＲ培地で３日間嫌気的に培養したことを除いては、実施例２と同様にして、４−ヒドロキシブチレート−３−ヒドロキシプロピオネート−ラクテート三重合体を製造した。
【００６２】
分析結果、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０／ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ／ｐＭＣＳＰｔｂＢｕｋ菌体でメチル−４−ヒドロキシブチレート、メチル−３−ヒドロキシプロピオネート、及びメチル-ラクテートが検出され、組換え大腸菌により４−ヒドロキシブチレート−３−ヒドロキシプロピオネート−ラクテート三重合体［poly(4-hydroxybutyrate-co-３−hydroxypropionate-co-lactate)］が生成されたことを確認することができた。生成された４−ヒドロキシブチレート−３−ヒドロキシプロピオネート−ラクテート三重合体の１Ｈ−ＮＭＲ結果及びＧＣ−ＭＳＤ結果を、それぞれ図６及び７に示した。
【００６３】
［実施例４］
３−ヒドロキシブチレート−４−ヒドロキシブチレート−ラクテート共重合体の製造
回収した菌体を２ｇ／Ｌの４−ヒドロキシブチレート（４−ＨＢ）と１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンと３０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールがさらに含有されたＭＲ培地で３日間嫌気的に培養する代わりに、２ｇ／Ｌの４−ヒドロキシブチレート（４−ＨＢ）及び１ｇ／Ｌの３−ヒドロキシブチレート（３−ＨＢ）と１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンと３０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールがさらに含有されたＭＲ培地で３日間嫌気的に培養したことを除いては、実施例２と同様にして、３−ヒドロキシブチレート−４−ヒドロキシブチレート−ラクテート三重合体を製造した。
【００６４】
分析結果、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０／ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ／ｐＭＣＳＰｔｂＢｕｋ菌体でメチル−４−ヒドロキシブチレート、メチル−３−ヒドロキシブチレート及びメチル−ラクテートが検出され、組換え大腸菌により３−ヒドロキシブチレート−４−ヒドロキシブチレート−ラクテート三重合体［poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate-co-lactate)］が生成されたことを確認することができた。
【００６５】
［実施例５］
３−ヒドロキシブチレート−３−ヒドロキシプロピオネート−４−ヒドロキシブチレート−ラクテート四重合体の製造
回収した菌体を２ｇ／Ｌの４−ヒドロキシブチレート（４−ＨＢ）と１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンと３０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールがさらに含有されたＭＲ培地で３日間嫌気的に培養する代わりに、２ｇ／Ｌの３−ヒドロキシブチレート（３−ＨＢ）、２ｇ／Ｌの３−ヒドロキシプロピオネート（３−ＨＰ）、１ｇ／Ｌの４−ヒドロキシブチレート（４−ＨＢ）及び１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンがさらに含有されたＭＲ培地で３日間嫌気的に培養したことを除いては、実施例２と同様にして、３−ヒドロキシブチレート−３−ヒドロキシプロピオネート−４−ヒドロキシブチレート−ラクテート四重合体を製造した。
【００６６】
分析結果、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｔｏｐ１０／ｐＰｓ６１９Ｃ１３００−ＣＰＰＣＴ／ｐＭＣＳＰｔｂＢｕｋ菌体でメチル−４−ヒドロキシブチレート、メチル−３−ヒドロキシブチレート、メチル−３−ヒドロキシプロピオネート及びメチル−ラクテートが検出され、組換え大腸菌により３−ヒドロキシブチレート−３−ヒドロキシプロピオネート−４−ヒドロキシブチレート−ラクテート四重合体が生成されたことを確認することができた。生成された３−ヒドロキシブチレート−３−ヒドロキシプロピオネート−４−ヒドロキシブチレート−ラクテート四重合体の１Ｈ−ＮＭＲ結果及びＧＣ−ＭＳＤ結果を、それぞれ図６及び７に示した。
【００６７】
［実施例６］
様々な変異体の構築
上記ｐＰｓ６１９Ｃ１３００構築と同様にし、下記プライマーを用いて様々なＰＨＡ合成酵素変異体を構築した。構築された変異体を下記表２、３、４及び５にまとめて示した。
【００６８】
Ｅ１３０Ｄ
配列番号１５：５’−ａｔｃ ａａｃ ｃｔｃ ａｔｇ ａｃｃ ｇａｔ ｇｃｇ ａｔｇ ｇｃｇ ｃｃｇ ａｃｃ− ３'
配列番号１６：５' −ｇｇｔ ｃｇｇ ｃｇｃ ｃａｔ ｃｇｃ ａｔｃ ｇｇｔ ｃａｔ ｇａｇ ｇｔｔ ｇａｔ− ３'
【００６９】
Ｓ３２５Ｔ
配列番号１７：５'−ＣＴＧ ＡＣＣ ＴＴＧ ＣＴＧ ＧＴＧ ＡＣＣ ＧＴＧ ＣＴＴ ＧＡＴ ＡＣＣ ＡＣＣ− ３'
配列番号１８：５'− ＧＧＴ ＧＧＴ ＡＴＣ ＡＡＧ ＣＡＣ ＧＧＴ ＣＡＣ ＣＡＧ ＣＡＡ ＧＧＴ ＣＡＧ− ３'
【００７０】
Ｓ４７７Ｒ
配列番号３１：５'−ｇａａ ｔｔｃ ｇｔｇ ｃｔｇ ｔｃｇ ａｇｃ ｃｇｃ ｇｇｇ ｃａｔ ａｔｃ− ３'
配列番号３２：５'−ｇａｔ ａｔｇ ｃｃｃ ｇｃｇ ｇｃｔ ｃｇａ ｃａｇ ｃａｃ ｇａａ ｔｔｃ− ３'
【００７１】
Ｓ４７７Ｈ
配列番号３３：５'−ｇａａ ｔｔｃ ｇｔｇ ｃｔｇ ｔｃｇ ａｇｃ ｃａｔ ｇｇｇ ｃａｔ ａｔｃ− ３'
配列番号３４：５'−ｇａｔ ａｔｇ ｃｃｃ ａｔｇ ｇｃｔ ｃｇａ ｃａｇ ｃａｃ ｇａａ ｔｔｃ− ３'
【００７２】
Ｓ４７７Ｆ
配列番号３５：５'− ｇａａ ｔｔｃ ｇｔｇ ｃｔｇ ｔｃｇ ａｇｃ ｔｔｔ ｇｇｇ ｃａｔ ａｔｃ− ３'
配列番号３６：５’− ｇａｔ ａｔｇ ｃｃｃ ａａａ ｇｃｔ ｃｇａ ｃａｇ ｃａｃ ｇａａ ｔｔｃ− ３'
【００７３】
Ｓ４７７Ｙ
配列番号３７：５'−ｇａａ ｔｔｃ ｇｔｇ ｃｔｇ ｔｃｇ ａｇｃ ｔａｔ ｇｇｇ ｃａｔ ａｔｃ− ３'
配列番号３８：５'−ｇａｔ ａｔｇ ｃｃｃ ａｔａ ｇｃｔ ｃｇａ ｃａｇ ｃａｃ ｇａａ ｔｔｃ− ３'
【００７４】
Ｓ４７７Ｇ
配列番号３９：５'−ｇａａ ｔｔｃ ｇｔｇ ｃｔｇ ｔｃｇ ａｇｃ ｇｇｃ ｇｇｇ ｃａｔ ａｔｃ− ３'
配列番号４０：５'−ｇａｔ ａｔｇ ｃｃｃ ｇｃｃ ｇｃｔ ｃｇａ ｃａｇ ｃａｃ ｇａａ ｔｔｃ− ３'
【００７５】
Ｑ４８１Ｋ
配列番号４１：５'−ｇｇｇ ｃａｔ ａｔｃ ａａａ ａｇｃ ａｔｃ ｃｔｇ ａａｃ ｃｃｇ ｃ− ３'
配列番号４２：５'−ｇｃｇ ｇｇｔ ｔｃａ ｇｇａ ｔｇｃ ｔｔｔ ｔｇａ ｔａｔ ｇｃｃ ｃ− ３'
【００７６】
Ｑ４８１Ｍ
配列番号４３：５'−ｇｇｇ ｃａｔ ａｔｃ ａｔｇ ａｇｃ ａｔｃ ｃｔｇ ａａｃ ｃｃｇ ｃ− ３'
配列番号４４：５'−ｇｃｇ ｇｇｔ ｔｃａ ｇｇａ ｔｇｃ ｔｃａ ｔｇａ ｔａｔ ｇｃｃ ｃ− ３'
【００７７】
Ｑ４８１Ｒ
配列番号４５：５'−ｇｇｇ ｃａｔ ａｔｃ ｃｇｃ ａｇｃ ａｔｃ ｃｔｇ ａａｃ ｃｃｇ ｃ− ３'
配列番号４６：５'−ｇｃｇ ｇｇｔ ｔｃａ ｇｇａ ｔｇｃ ｔｇｃ ｇｇａ ｔａｔ ｇｃｃ ｃ− ３'
【００７８】
【表２】
0005565938.tif 000003
【００７９】
【表３】
0005565938.tif 000004
【００８０】
【表４】
0005565938.tif 000005
【００８１】
【表５】
0005565938.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【００８２】
以上で詳細に説明して立証されたように、本発明は、４−ヒドロキシブチレート単量体単位及びラクテート単量体単位を含む共重合体又は４−ヒドロキシブチレート単量体単位、ラクテート単量体単位及び３−ヒドロキシアルカノエートを含む共重合体を提供する効果がある。本発明は、ラクテートをラクチル−ＣｏＡに、３−ヒドロキシアルカノエートを３−ヒドロキシアルカノイル−ＣｏＡに、それぞれ転換する酵素の遺伝子、ホスホトランスブチラーゼ遺伝子、ブチレートキナーゼ遺伝子及びポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）合成酵素遺伝子を、同時に有する細胞又は植物を培養することを特徴とする上記共重合体の製造方法を提供する効果がある。本発明の共重合体は生分解性高分子であり、従来合成プラスチックの用途を代替することができ、医療用にも使用可能である。
【図２】
0005565938.tif 000007
【図３】
0005565938.tif 000008
【図４】
0005565938.tif 000009
【図６】
0005565938.tif 000010
【図１】
0005565938.tif 000011
【図５】
0005565938.tif 000012
【図７】
0005565938.tif 000013
【配列表】
0005565938000001.app