(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
６．６６±０．２０、９．８±０．２０、および１８．１２±０．２０の２θ値で回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンによって特徴づけられる、４’−｛２−エトキシ−４−エチル−５−［（（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］イミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸の結晶性遊離塩基。
【請求項２】
１２．６８±０．２０、１３．５４±０．２０、１５．０２±０．２０、１９．３２±０．２０、２１．２０±０．２０、２２．６２±０．２０、２４．５６±０．２０、２５．３０±０．２０、２５．９６±０．２０、および２７．３２±０．２０から選択される２θ値で１つまたは複数の追加の回折ピークを有することによって特徴づけられる、請求項１に記載の結晶性遊離塩基。
【請求項３】
ピーク位置が以下の図：
【化１】
0005495396.tif 000015
に示すパターンのピーク位置に実質的に従う粉末Ｘ線回折パターンによって特徴づけられる、請求項１に記載の結晶性遊離塩基。
【請求項４】
１４４℃〜１４８℃の範囲の融点を有する示差走査熱量のトレースによって特徴づけられる、請求項１に記載の結晶性遊離塩基。
【請求項５】
以下の図：
【化２】
0005495396.tif 000016
に示すものに実質的に従う示差走査熱量のトレースによって特徴づけられる、請求項１に記載の結晶性遊離塩基。
【請求項６】
３３２４±１、２９５８±１、２８７２±１、２５２７±１、１７０９±１、１６４３±１、１５５１±１、１５００±１、１３５７±１、１２５４±１、１１３３±１、１０６２±１、８６９±１、７９９±１、７５９±１、および６９５±１ｃｍ−１で有意な吸収バンドを有する赤外線吸収スペクトルによって特徴づけられる、請求項１に記載の結晶性遊離塩基。
【請求項７】
製薬上許容される担体と請求項１に記載の結晶性遊離塩基とを含む医薬組成物。
【請求項８】
利尿剤、β１アドレナリン作動性受容体遮断剤、カルシウムチャネル遮断剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、ＡＴ１受容体拮抗剤、ネプリライシン阻害剤、非ステロイド性抗炎症剤、プロスタグランジン、抗脂質剤、抗糖尿病剤、抗血栓剤、レニン阻害剤、エンドセリン受容体拮抗剤、エンドセリン変換酵素阻害剤、アルドステロン拮抗剤、アンジオテンシン変換酵素／ネプリライシン阻害剤、およびその組合せから選択される第二治療剤をさらに含む、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
ａ）４’−｛２−エトキシ−４−エチル−５−［（（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］イミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸をアセトンで処理して完全に溶解させることと、
ｂ）冷却して結晶化をもたらすことと、
ｃ）生じる固体を単離して、請求項１に記載の結晶性遊離塩基を得ることと
を含む、請求項１に記載の結晶性遊離塩基を調製するプロセス。
【請求項１０】
ａ）４’−｛２−エトキシ−４−エチル−５−［（（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］イミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸をアセトニトリルで処理して完全に溶解させることと、
ｂ）冷却して結晶化をもたらすことと、
ｃ）生じる固体を単離して、請求項１に記載の結晶性遊離塩基を得ることと
を含む、請求項１に記載の結晶性遊離塩基を調製するプロセス。
【請求項１１】
ａ）４’−｛５−［（（Ｓ）−２−アセチルスルファニル−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］−２−エトキシ−４−エチルイミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸をメタノール中で脱保護し、水を加えて完全に溶解させることと、
ｂ）冷却して結晶化をもたらすことと、
ｃ）生じる固体を単離して、請求項１に記載の結晶性遊離塩基を得ることと
を含む、請求項１に記載の結晶性遊離塩基を調製するプロセス。
【請求項１２】
請求項９または１０に記載の４’−｛２−エトキシ−４−エチル−５−［（（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］イミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸の結晶性遊離塩基を形成することを含む、４’−｛２−エトキシ−４−エチル−５−［（（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］イミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸を精製するプロセス。
【請求項１３】
医薬品を製造するための請求項１に記載の結晶性遊離塩基の使用。
【請求項１４】
前記医薬品が高血圧または心不全の処置に有用である、請求項１３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンジオテンシンＩＩ  １型受容体拮抗活性およびネプリライシン阻害活性を有する、アルコキシイミダゾール−１−イルメチルビフェニルカルボン酸の新規結晶形に関する。また、本発明は、結晶性化合物を含むまたはそのような化合物から調製した医薬組成物、結晶性化合物を調製するためのプロセスおよび中間体、ならびに高血圧などの疾患を処置するためのそのような化合物の使用方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
２００８年４月２３日に出願の、どちらもＡｌｌｅｇｒｅｔｔｉらの同一出願人による特許文献１および特許文献２は、ＡＴ１受容体拮抗活性およびネプリライシン（ＮＥＰ）酵素阻害活性を保有する新規化合物を開示しており、その開示は本明細書中に参考として組み込まれている。特に、化合物４’−｛２−エトキシ−４−エチル−５−［（（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］イミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸がこれらの出願中で具体的に開示されている。
【０００３】
４’−｛２−エトキシ−４−エチル−５−［（（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］イミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸の化学構造は式Ｉによって表される。
【０００４】
【化１】
0005495396.tif 000002
【０００５】
長期保管用の化合物を調製する場合ならびに医薬組成物および配合物を調製する場合、多くの場合、吸湿性でも潮解性でもない治療剤の結晶形を有することが望ましい。また、顕著に分解せずに材料を加工、たとえば微粒子化することを可能にする、比較的高い融点（すなわち約１５０℃より高い）を有する結晶形を有することも有利である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許公開第２００８／０２６９３０５号明細書
【特許文献２】米国特許公開第２００９／００２３２２８号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
式Ｉの化合物の結晶形はこれまでに報告されていない。したがって、許容されるレベルの吸湿性および比較的高い融点を有する、式Ｉの化合物の安定な非潮解性の形態の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、４’−｛２−エトキシ−４−エチル−５−［（（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］イミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸の結晶形に関する。
【０００９】
本発明の一態様は、式Ｉの化合物の結晶形を調製するプロセスに関する。一実施形態では、４’−｛２−エトキシ−４−エチル−５−［（（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］イミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸の結晶形を調製するプロセスは、４’−｛２−エトキシ−４−エチル−５−［（（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］イミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸を不活性希釈剤と接触させて混合物を形成することと、混合物を約２５℃〜約５０℃まで加熱することと、混合物を冷却して結晶形を形成することとを含む。
【００１０】
本発明の別の態様は、４’−｛２−エトキシ−４−エチル−５−［（（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］イミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸を精製するプロセスに関する。一実施形態では、このプロセスは、４’−｛２−エトキシ−４−エチル−５−［（（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイルアミノ）−メチル］イミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸の結晶形を形成することを含む。また、本発明は、本明細書中に記載のプロセスによって調製した生成物にも関する。
【００１１】
本発明の一態様は、製薬上許容される担体と４’−｛２−エトキシ−４−エチル−５−［（（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］イミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸の結晶形とを含む医薬組成物に関する。
【００１２】
本発明の別の態様は、式Ｉの化合物の結晶形を、１つまたは複数の他の治療剤と組み合わせて含む組成物に関する。したがって、一実施形態では、本発明は、（ａ）製薬上許容される担体および治療上有効な量の式Ｉの化合物の結晶形、ならびに（ｂ）治療上有効な量の、利尿剤、β１アドレナリン作動性受容体遮断剤、カルシウムチャネル遮断剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、ＡＴ１受容体拮抗剤、ネプリライシン阻害剤、非ステロイド性抗炎症剤、プロスタグランジン、抗脂質剤、抗糖尿病剤、抗血栓剤、レニン阻害剤、エンドセリン受容体拮抗剤、エンドセリン変換酵素阻害剤、アルドステロン拮抗剤、アンジオテンシン変換酵素／ネプリライシン阻害剤、バソプレシン受容体拮抗剤、およびその組合せから選択される薬剤を含み、結晶形および薬剤を一緒にまたは別々に配合する組成物に関する。薬剤を別々に配合する場合、製薬上許容される担体を含め得る。
【００１３】
本発明のさらに別の態様は、処置を必要としている患者に、治療上有効な量の４’−｛２−エトキシ−４−エチル−５−［（（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］イミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸の結晶形を投与することを含む、高血圧または心不全を処置する方法に関する。
【００１４】
また、本発明は、医薬品を製造するための４’−｛２−エトキシ−４−エチル−５−［（（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］イミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸の結晶形の使用にも関する。さらに、本発明は、医薬品を製造するため、特に高血圧または心不全を処置する医薬品を製造するための４’−｛２−エトキシ−４−エチル−５−［（（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］イミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸の結晶形の使用に関する。本発明は以下をも提供する。
（１）６．６６±０．２０、９．８±０．２０、および１８．１２±０．２０の２θ値で回折ピークを含む粉末Ｘ線回折パターンによって特徴づけられる、４’−｛２−エトキシ−４−エチル−５−［（（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］イミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸の結晶性遊離塩基。
（２）１２．６８±０．２０、１３．５４±０．２０、１５．０２±０．２０、１９．３２±０．２０、２１．２０±０．２０、２２．６２±０．２０、２４．５６±０．２０、２５．３０±０．２０、２５．９６±０．２０、および２７．３２±０．２０から選択される２θ値で１つまたは複数の追加の回折ピークを有することによって特徴づけられる、項目１に記載の化合物。
（３）ピーク位置が図１に示すパターンのピーク位置に実質的に従う粉末Ｘ線回折パターンによって特徴づけられる、項目１に記載の化合物。
（４）約１４４℃〜約１４８℃の範囲の融点を有する示差走査熱量のトレースによって特徴づけられる、項目１に記載の化合物。
（５）図２に示すものに実質的に従う示差走査熱量のトレースによって特徴づけられる、項目１に記載の化合物。
（６）３３２４±１、２９５８±１、２８７２±１、２５２７±１、１７０９±１、１６４３±１、１５５１±１、１５００±１、１３５７±１、１２５４±１、１１３３±１、１０６２±１、８６９±１、７９９±１、７５９±１、および６９５±１ｃｍ−１で有意な吸収バンドを有する赤外線吸収スペクトルによって特徴づけられる、項目１に記載の化合物。
（７）製薬上許容される担体と項目１に記載の結晶性化合物とを含む医薬組成物。
（８）利尿剤、β１アドレナリン作動性受容体遮断剤、カルシウムチャネル遮断剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、ＡＴ１受容体拮抗剤、ネプリライシン阻害剤、非ステロイド性抗炎症剤、プロスタグランジン、抗脂質剤、抗糖尿病剤、抗血栓剤、レニン阻害剤、エンドセリン受容体拮抗剤、エンドセリン変換酵素阻害剤、アルドステロン拮抗剤、アンジオテンシン変換酵素／ネプリライシン阻害剤、およびその組合せから選択される第二治療剤をさらに含む、項目７に記載の医薬組成物。
（９）ａ）（ｉ）４’−｛２−エトキシ−４−エチル−５−［（（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］イミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸をアセトンで処理して完全に溶解させること、または（ｉｉ）４’−｛２−エトキシ−４−エチル−５−［（（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］イミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸をアセトニトリルで処理して完全に溶解させること、または（ｉｉｉ）４’−｛５−［（（Ｓ）−２−アセチルスルファニル−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］−２−エトキシ−４−エチルイミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸をメタノール中で脱保護し、水を加えて完全に溶解させることと、
ｂ）冷却して結晶化をもたらすことと、
ｃ）生じる固体を単離して、項目１に記載の結晶性遊離塩基を得ることと
を含む、項目１に記載の結晶性遊離塩基を調製するプロセス。
（１０）項目９に記載のプロセスによって調製した生成物。
（１１）項目１に記載の結晶性遊離塩基を形成することを含む、４’−｛２−エトキシ−４−エチル−５−［（（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］イミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸を精製するプロセス。
（１２）項目１１に記載のプロセスによって調製した生成物。
（１３）医薬品を製造するための項目１に記載の結晶性遊離塩基の使用。
（１４）前記医薬品が高血圧または心不全の処置に有用である、項目１３に記載の使用。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
添付の図面を参照して本発明の様々な態様を例示する。
【図１】図１は、式Ｉの化合物の結晶形の粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）パターンを示す図である。
【図２】図２は、式Ｉの化合物の結晶形の示差走査熱量（ＤＳＣ）温度記録計を示す図である。
【図３】図３は、式Ｉの化合物の結晶形の熱重量分析（ＴＧＡ）のトレースを示す図である。
【図４】図４は、式Ｉの化合物の結晶形の動的水分収着（ＤＭＳ）プロフィールを示す図である。
【図５】図５は、式Ｉの化合物の結晶形の赤外線（ＩＲ）吸収スペクトルを示す図である。
【図６】図６は、式Ｉの化合物の結晶形の顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、４’−｛２−エトキシ−４−エチル−５−［（（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］イミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸の結晶形を提供する。この結晶形はどの対イオンとも会合しておらず、本明細書中で遊離塩基結晶形と呼ぶ。
【００１７】
活性薬剤（すなわち式Ｉの化合物）は１つのキラル中心を含有し、（Ｓ）立体配置を有する。しかし、当業者には、別段に指定しない限りは、全体としての組成物の有用性がそのような異性体の存在によって排除されない限りは、少量の（Ｒ）立体異性体が本発明の組成物中に存在し得ることが理解されよう。さらに、式Ｉの化合物は塩基性部分（イミダゾール）および酸性部分（カルボン酸）をどちらも含有するため、これは双性イオンとして存在し得る。
【００１８】
本発明は、４’−｛２−エトキシ−４−エチル−５−［（（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］イミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸の結晶形を提供する。驚くべきことに、この結晶形は、大気の水分に曝された場合にも潮解性でないことが判明した。さらに、本発明の結晶性化合物は許容されるレベルの吸湿性および高い融点を有する。
【００１９】
式Ｉの化合物はＡＴ１受容体拮抗活性およびＮＥＰ阻害活性を有する。式Ｉの化合物の結晶形は、同じ活性、したがって高血圧および心不全などの疾患の処置において同じ有用性を有することが予想される。したがって、他の使用のなかでとりわけ、式Ｉの化合物の結晶形は、高血圧または心不全を処置するための医薬組成物の調製に有用である。
【００２０】
式Ｉの化合物は市販のＡｕｔｏＮｏｍソフトウェア（ＭＤＬ、Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて命名した。
【００２１】
定義
本発明の化合物、組成物、方法およびプロセスを説明する場合、別段に指定しない限りは、以下の用語は以下の意味を有する。さらに、本明細書中で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、使用する文脈により明らかにそうでないと指示される場合以外は、対応する複数形が含まれる。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含める（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」は包括的であることを意図し、記載した要素以外の追加の要素が存在し得ることを意味する。本明細書中で使用する成分の量および分子量、反応条件などの特性等を表すすべての数値は、別段に指定しない限りは、すべての場合で用語「約」によって修飾されると理解されたい。したがって、本明細書中に記載する数値は、本明細書によって得ようとする所望の特性に応じて変動し得る近似である。少なくとも、特許請求の範囲の均等物の教義の適用を限定する試みとしてではなく、それぞれの数値は、少なくとも報告した有効桁に鑑みて、かつ通常の四捨五入の技術を適用することによって解釈されるべきである。
【００２２】
本明細書中で使用する場合、語句「式を有する」または「構造を有する」とは、限定することを意図せず、用語「含む」が一般的に使用される様式と同じように使用する。
【００２３】
本明細書中で使用する場合、用語「融点」とは、固体から液体への相変化に対応する熱転移の、示差走査熱量によって最大の吸熱熱流が観察される温度を意味する。
【００２４】
用語「製薬上許容される」とは、本発明中で使用した場合に生物学的または他の様式で許容されないものではない材料をいう。たとえば、用語「製薬上許容される担体」とは、許容されない生物学的効果を引き起こさずに、または組成物の他の構成要素と許容されない様式で相互作用せずに、組成物内に取り込ませて患者に投与することができる材料をいう。そのような製薬上許容される材料は、典型的には毒性および製造の試験の必須の基準を満たし、米国食品医薬品局によって適切な不活性成分として同定された材料が含まれる。
【００２５】
用語「治療上有効な量」とは、それを必要としている患者に投与した場合に処置をもたらすために十分な量、すなわち、所望の治療効果を得るために必要な薬物の量を意味する。たとえば、高血圧を処置するために治療上有効な量とは、たとえば、高血圧の症状を低下、抑制、排除もしくは予防する、または高血圧の根底にある原因を処置するために必要な化合物の量である。一実施形態では、治療上有効な量とは、血圧を低下させるために必要な量、または正常な血圧を維持するために必要な薬物の量である。他方で、用語「有効量」とは、所望の結果を得るために十分な量を意味し、これは必ずしも治療的な結果でなくてもよい。たとえば、ＡＴ１受容体を含む系を研究する場合、「有効量」とは受容体を拮抗するために必要な量であり得る。
【００２６】
本明細書中で使用する場合、用語「処置すること」または「処置」とは、哺乳動物（特にヒト）などの患者において疾患または病状（高血圧など）を処置することまたはその処置を意味し、（ａ）疾患もしくは病状を未然に予防すること、すなわち、患者の予防的処置を行なうこと、（ｂ）患者において疾患もしくは病状を排除するもしくはその回帰を引き起こすことなどによって、疾患もしくは病状を寛解させること、（ｃ）患者において疾患もしくは病状の発生を遅らせるもしくは停止させることなどによって、疾患もしくは病状を抑制すること、または（ｄ）患者において疾患もしくは病状の症状を軽減させることが含まれる。たとえば、用語「高血圧の処置」には、高血圧を未然に予防すること、高血圧を寛解させること、高血圧を抑制すること、および高血圧の症状を軽減させること（たとえば血圧を下げること）が含まれる。用語「患者」には、処置または疾患の予防を必要としている、あるいは疾患の予防または具体的な疾患もしくは病状の処置ついて現在処置されている、ヒトなどの哺乳動物が含まれることを意図する。また、用語「患者」には、本発明の化合物を評価中の試験対象またはアッセイで使用中の試験対象、たとえば動物モデルも含まれる。
【００２７】
一般合成手順
本発明の結晶性化合物は、以下および実施例中に記載のように、容易に入手可能な出発物質から合成することができる。本発明の結晶性化合物を生成するために使用できる方法はいくつか存在する。しかし、結晶含有量ならびに結晶の晶癖（大きさおよび形状）は、調製方法および溶媒組成に部分的に基づいて変動し得ることに注意されたい。結晶は、板および針の形態学を有するものとして観察されている。
【００２８】
具体的なプロセス条件（すなわち、結晶化の温度、時間、反応物質のモル比、溶媒、圧力など）を与えるが、別段に記述しない限りは他のプロセス条件も使用できることを理解されたい。一部の例では、反応または結晶化を室温で実施し、実際の温度測定は行なわなかった。室温とは、実験室環境における周囲温度に一般的に関連する範囲内の温度を意味するととることができ、典型的には約２５℃〜約５０℃の範囲であることを理解されたい。他の例では、反応または結晶化を室温で実施し、温度を実際に測定および記録した。
【００２９】
一般に、結晶化は適切な不活性希釈剤または溶媒の系中で実施し、その例には、それだけには限定されないが、メタノール、エタノール、イソプロパノール、イソブタノール、酢酸エチル、アセトニトリル、ジクロロメタン、メチルｔ−ブチルエーテルなど、およびその混合物が含まれ、任意選択で水を含有する。前述の結晶化のうちの任意のものが完了した後、沈殿、濃縮、遠心分離などの任意の慣用の手段によって結晶性化合物を反応混合物から単離することができる。
【００３０】
本発明で用いる４’−｛２−エトキシ−４−エチル−５−［（（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］−イミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸は、市販の出発物質および試薬から、実施例に記載の手順を用いて、または本出願の背景技術のセクションに記載した同一出願人による米国出願に記載の手順を用いて、容易に調製することができる。本発明の方法に記載のモル比は、当業者が利用可能な様々な方法によって容易に決定することができる。たとえば、そのようなモル比は１Ｈ  ＮＭＲによって容易に決定することができる。あるいは、元素分析およびＨＰＬＣ方法を用いてモル比を決定することができる。
【００３１】
一般に、式Ｉの化合物の結晶形は、４’−｛２−エトキシ−４−エチル−５−［（（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］−イミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸を不活性希釈剤で処理して完全に溶解させることによって、調製することができる。適切な不活性希釈剤には、例として示しそれに限定するものではないが、アセトン、アセトニトリル、酢酸エチル、メチルエチルケトン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、水などが含まれる。他の適切な不活性希釈剤には、例として示しそれに限定するものではないが、アセトンと水、アセトニトリルと水、およびメタノールと水などの、不活性希釈剤の組合せが含まれる。具体的な一実施形態では、不活性希釈剤は、アセトン、アセトニトリルまたはアセトンと水との組合せである。一般に、溶解は、約２０℃〜約５０℃の範囲の温度、一実施形態では約３０〜４５℃の範囲の温度、別の実施形態では約１５〜２５℃の温度で実施する。その後、溶液を冷却して本発明の結晶性化合物を形成させる。具体的な一実施形態では、溶液を２５℃などの約２０〜３０℃まで、別の実施形態では４℃などの約０〜８℃まで冷却する。適切な時間の後、結晶が観察される。一実施形態では、結晶は、約２０〜２４時間の期間の後、別の実施形態では約４時間の期間の後に観察される。結晶が観察された後、母液の体積を減らし、結晶を単離および乾燥させることができる。
【００３２】
一実施形態では、本発明の結晶性化合物は、４’−｛２−エトキシ−４−エチル−５−［（（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］−イミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸をアセトンで処理して完全に溶解させ、冷却して結晶化をもたらすことによって調製する。その後、生じる固体を単離および乾燥させて、本発明の結晶性化合物を得ることができる。典型的には、このプロセスは、前述の温度範囲のうちの任意のもので実施することができる。一実施形態では、溶解ステップを約３０〜４５℃、たとえば約３５〜４０℃で実施し、冷却ステップを約０〜８℃、たとえば約４℃で実施する。
【００３３】
別の実施形態では、本発明の結晶性化合物は、４’−｛２−エトキシ−４−エチル−５−［（（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］−イミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸をアセトニトリルで処理して完全に溶解させ、冷却して結晶化をもたらすことによって調製する。その後、生じる固体を単離および乾燥させて、本発明の結晶性化合物を得ることができる。典型的には、このプロセスは、前述の温度範囲のうちの任意のもので実施することができる。一実施形態では、溶解ステップを約３０〜４５℃、たとえば約３５℃で実施し、冷却ステップを約０〜８℃、たとえば約４℃で実施する。
【００３４】
別の実施形態では、本発明の結晶性化合物は、４’−｛２−エトキシ−４−エチル−５−［（（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイル−アミノ）メチル］イミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸のチオールで保護された形態を用いて調製する。この方法は、４’−｛５−［（（Ｓ）−２−アセチルスルファニル−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］−２−エトキシ−４−エチルイミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸をメタノール中で脱保護し、水を加えて完全に溶解させ、冷却して結晶化をもたらすことを含む。標準の脱保護の技術ならびにＮａＯＨ、ナトリウムメトキシド、第一級アルキルアミン、およびヒドラジンなどの試薬を使用してチオール保護基を除去し得る。脱保護ステップには、１，４−ジチオスレイトールなどの還元剤が含まれ得る。その後、生じる固体を単離および乾燥させて、本発明の結晶性化合物を得ることができる。典型的には、このプロセスは、前述の温度範囲のうちの任意のもので実施することができる。一実施形態では、脱保護ステップを約−５℃〜５℃、たとえば約０℃で実施し、溶解ステップを約１５〜２５℃、たとえば約２０℃で実施し、冷却ステップを約０〜８℃、たとえば約４℃で実施する。
【００３５】
結晶特性
他の利点のなかでとりわけ、式Ｉの化合物の結晶形の形成は、化合物自体の精製に有用であることが発見されている。たとえば、本発明の結晶性化合物は９８．５％の純度を有する。
【００３６】
粉末Ｘ線回折の分野では周知のように、ＰＸＲＤスペクトルの相対的なピーク高さは試料の調製および機器の形状に関連するいくつかの要因に依存する一方で、ピークの位置は実験の詳細に比較的鈍感である。ＰＸＲＤパターンを実施例３に記載のように得た。したがって、一実施形態では、本発明の結晶性化合物は、特定のピーク位置を有するＰＸＲＤパターンによって特徴づけられる。
【００３７】
式Ｉの化合物の結晶形は、ピーク位置が図１に示すものに実質的に従うＰＸＲＤパターンによって特徴づけられている。これらのピークを、相対強度の降順で以下に記載する。
【００３８】
【表１】
0005495396.tif 000003
【００３９】
したがって、一実施形態では、本発明の結晶性化合物は、６．６６±０．２０、９．８±０．２０、および１８．１２±０．２０の２θ値で回折ピークを含む粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）パターンによって特徴づけられており、１２．６８±０．２０、１３．５４±０．２０、１５．０２±０．２０、１９．３２±０．２０、２１．２０±０．２０、２２．６２±０．２０、２４．５６±０．２０、２５．３０±０．２０、２５．９６±０．２０、および２７．３２±０．２０から選択される２θ値で１つまたは複数の追加の回折ピークを有することによってさらに特徴づけられている。
【００４０】
示差走査熱量（ＤＳＣ）のトレースを実施例４に記載のように得た。したがって、一実施形態では、本発明の結晶性化合物は、そのＤＳＣ温度記録計によって特徴づけられている。一実施形態では、図２に示されるように、本発明の結晶性化合物は、約１４４℃の融点を示し、約１５０℃未満で著しい熱分解がないＤＳＣ温度記録計によって特徴づけられている。
【００４１】
実施例４に記載のように熱重量分析（ＴＧＡ）を本発明の結晶性化合物で行なった。したがって、一実施形態では、本発明の結晶性化合物は、そのＴＧＡのトレースによって特徴づけられている。一実施形態では、図３に示されるように、本発明の結晶性化合物は、約２００℃未満の温度（これは融点よりも著しく高い）で溶媒および／または水の損失（１．８％）を示すＴＧＡのトレースによって特徴づけられている。
【００４２】
本発明の結晶性化合物は、許容されるレベルの吸湿性を有する可逆的な収着／脱離プロフィールを有することが実証されている。たとえば、図４に示されるように、式Ｉの化合物の結晶形は吸湿性の性向を有さないまたは最小限しか有さず、７５％までの相対湿度に曝された際に約１％未満の重量増加しか示さなかった。
【００４３】
本発明の結晶性化合物の赤外線（ＩＲ）吸収スペクトルを実施例１０に記載のように得た。したがって、一実施形態では、図５に示されるように、本発明の結晶性化合物は、３３２４±１、２９５８±１、２８７２±１、２５２７±１、１７０９±１、１６４３±１、１５５１±１、１５００±１、１３５７±１、１２５４±１、１１３３±１、１０６２±１、８６９±１、７９９±１、７５９±１、および６９５±１ｃｍ−１で有意な吸収バンドを有するＩＲ吸収スペクトルによって特徴づけられている。
【００４４】
さらに、本発明の結晶性化合物は、高温に曝された際に安定であることが判明している。たとえば、４０℃で２８日間保管した後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による結晶性遊離塩基の分析では最小限の化学分解しか示されなかった。
【００４５】
本発明の結晶性化合物のこれらの特性を、以下の実施例中にさらに例示する。
【００４６】
有用性
式Ｉの化合物はアンジオテンシンＩＩ  １型（ＡＴ１）受容体拮抗活性およびネプリライシン（ＮＥＰ）阻害活性を保有する、すなわち、化合物は酵素−基質の活性を阻害することができる。ＡＴ１受容体に対する化合物の親和性の１つの測度は、ＡＴ１受容体との結合の阻害定数（Ｋｉ）である。ｐＫｉ値とは、Ｋｉの１０を底とする負の対数である。化合物がＮＥＰ活性を阻害する能力の１つの測度は阻害濃度（ＩＣ５０）であり、これは、ＮＥＰ酵素による基質変換の最大半量阻害をもたらす化合物の濃度である。ｐＩＣ５０値とは、ＩＣ５０の１０を底とする負の対数である。式Ｉの化合物は、約７．０以上のＡＴ１受容体でのｐＫｉを示し、約７．０以上のＮＥＰに対するｐＩＣ５０を示す。
【００４７】
ＡＴ１受容体結合および／またはＮＥＰ阻害活性などの、式Ｉの化合物および本発明の結晶性化合物の特性を決定するための例示的なアッセイを実施例に記載し、例として示しそれに限定するものではないが、ＡＴ１およびＡＴ２の結合（アッセイ１に記載）、ならびにＮＥＰ阻害（アッセイ２に記載）を測定するためのアッセイが含まれる。有用な第二アッセイには、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害（やはりアッセイ２に記載）およびアミノペプチダーゼＰ（ＡＰＰ）阻害（Ｓｕｌｐｉｚｉｏら、（２００５）ＪＰＥＴ、３１５：１３０６−１３１３に記載）を測定するためのアッセイが含まれる。麻酔下のラットにおいてＡＣＥ、ＡＴ１、およびＮＥＰに対するｉｎ  ｖｉｖｏ阻害効力を評価するための薬力学的アッセイは、どちらもＡｌｌｅｇｒｅｔｔｉらの米国公開第２００８／０２６９３０５号および第２００９／００２３２２８号に記載されており（Ｓｅｙｍｏｕｒら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、７（補遺Ｉ）：Ｉ−３５−Ｉ−４２、１９８５およびＷｉｇｌｅら、Ｃａｎ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、７０：１５２５−１５２８、１９９２も参照）、ＡＴ１阻害はアンジオテンシンＩＩ昇圧応答のパーセント阻害として測定し、ＡＣＥ阻害はアンジオテンシンＩ昇圧応答のパーセント阻害として測定し、ＮＥＰ阻害は尿中の環状グアノシン３’，５’−一リン酸（ｃＧＭＰ）排出量の増加として測定する。有用なｉｎ  ｖｉｖｏアッセイには、意識のある自然発症高血圧ラット（ＳＨＲ）モデル、すなわちＡＴ１受容体遮断の測定に有用なレニン依存性高血圧モデル（どちらもＡｌｌｅｇｒｅｔｔｉらの米国公開第２００８／０２６９３０５号および第２００９／００２３２２８号に記載、Ｉｎｔｅｎｇａｎら、（１９９９）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １００（２２）：２２６７−２２７５およびＢａｄｙａｌら、（２００３）Ｉｎｄｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、３５：３４９−３６２も参照）、ならびに意識のあるデスオキシコルチコステロン酢酸塩（ＤＯＣＡ塩）ラットモデル、すなわちＮＥＰ活性の測定に有用な体積依存性高血圧モデル（どちらもＡｌｌｅｇｒｅｔｔｉらの米国公開第２００８／０２６９３０５号および第２００９／００２３２２８号に記載、Ｔｒａｐａｎｉら、（１９８９）Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１４：４１９−４２４、Ｉｎｔｅｎｇａｎら、（１９９９）Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ、３４（４）：９０７−９１３、およびＢａｄｙａｌら、（２００３）上記も参照）が含まれる。ＳＨＲおよびＤＯＣＡ塩モデルはどちらも、血圧を低下させる試験化合物の能力を評価するために有用である。また、ＤＯＣＡ塩モデルは、血圧の上昇を予防または遅延させる試験化合物の能力を測定するためにも有用である。式Ｉの化合物および本発明の結晶性化合物は、上記のアッセイのうちの任意のもの、または同様の性質のアッセイにおいて、ＡＴ１受容体を拮抗し、ＮＥＰ酵素を阻害すると予想される。したがって、前述のアッセイは、本発明の結晶性化合物の治療的有用性、たとえば降圧剤としてのその有用性を決定するために有用である。結晶性化合物の他の特性および利用性は、当業者に周知の他のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを用いて実証することができる。
【００４８】
したがって、式Ｉの化合物の結晶形は、ＡＴ１受容体拮抗およびＮＥＰ阻害に応答性の病状の処置および／または予防において、有用性が見つかると予想される。たとえば、ＡＴ１受容体を拮抗し、したがってアンジオテンシンＩＩのその受容体に対する作用を妨害することによって、本発明の結晶性化合物は、強力な昇圧剤であるアンジオテンシンＩＩによって生じる血圧の増加の予防において、有用性が見つかると予想される。さらに、ＮＥＰを阻害することによって、結晶性化合物は、ナトリウム利尿ペプチド、ボンベシン、ブラジキニン、カルシトニン、エンドセリン、エンケファリン、ニューロテンシン、サブスタンスＰおよび血管作動性腸管ペプチドなどの、ＮＥＰによって代謝される内在性ペプチドの生物学的効果を増強させるとも予想される。たとえば、ナトリウム利尿ペプチドの効果を増強することによって、結晶性化合物は、緑内障の処置に有用であることが予想される。また、この結晶性化合物は、他の生理的作用、たとえば、腎臓系、中枢神経系、生殖器系および胃腸管系に対する作用を有することも予想される。
【００４９】
本発明の結晶性化合物は、心血管病および腎臓病などの病状を処置および／または予防することにおいて、有用性が見つかると予想される。特に興味深い心血管病には、鬱血性心不全、急性心不全、慢性心不全、ならびに急性および慢性の非代償性心不全などの心不全が含まれる。特に興味深い腎臓病には糖尿病性腎症および慢性腎臓病が含まれる。本発明の一実施形態は、患者に治療上有効な量の本発明の結晶性化合物を投与すること含む、高血圧を処置する方法に向けられている。典型的には、治療上有効な量とは、患者の血圧を下げるために十分な量である。一実施形態では、結晶性化合物は経口剤形として投与する。
【００５０】
本発明の別の実施形態は、患者に治療上有効な量の本発明の結晶性化合物を投与することを含む、心不全を処置する方法に向けられている。典型的には、治療上有効な量とは、血圧を下げるおよび／または腎機能を向上させるために十分な量である。一実施形態では、結晶性化合物は静脈内剤形として投与する。心不全を処置するために使用する場合、結晶性化合物は、利尿剤、ナトリウム利尿ペプチド、およびアデノシン受容体拮抗剤などの他の治療剤と組み合わせて投与し得る。
【００５１】
また、本発明の結晶性化合物は、予防的治療、たとえば、心筋梗塞後の心不全の進行の予防、血管形成術後の動脈再狭窄の予防、血管手術後の血管壁の肥厚の予防、アテローム性動脈硬化症の予防、および糖尿病性血管障害の予防においても有用であると予想される。
【００５２】
さらに、ＮＥＰ阻害剤としては、本発明の結晶性化合物はエンケファリナーゼを阻害すると予想され、これは内在性エンケファリンの分解を阻害し、したがって、そのような化合物は鎮痛剤としても有用性が見つかり得る。また、そのＮＥＰ阻害特性が原因で、結晶性化合物は、鎮咳剤および止痢剤（たとえば水様下痢を処置するため）としても有用であると予想され、また、月経障害、早産、子癇前症、子宮内膜症、生殖障害（たとえば、男性および女性の不妊症、多嚢胞性卵巣症候群、着床不全）、ならびに男性勃起不全および女性性的興奮障害を含めた、男性および女性の性機能不全の処置においても有用性が見つかる。より具体的には、結晶性化合物は、女性患者が性的表現において満足を見い出すことが困難またはできないこととして多くの場合定義される、女性性機能不全の処置において有用であると予想される。これは、例として示しそれに限定するものではないが、性的欲求低下障害、性的興奮障害、オルガスム障害および性交痛障害を含めた様々な多様な女性性的障害に及ぶ。そのような障害、特に女性性機能不全を処置するために使用した場合、結晶性化合物は、以下の第二薬剤、すなわち、ＰＤＥ５阻害剤、ドーパミン作用剤、エストロゲン受容体作用剤および／または拮抗剤、アンドロゲン、ならびにエストロゲンのうちの１つまたは複数と組み合わせ得る。
【００５３】
１回の投薬あたり投与する本発明の結晶性化合物の量または１日あたり投与する合計量は、事前に決定し得るか、または、患者の状態の性質および重篤度、処置する状態、患者の年齢、重量、および全体的な健康、活性薬剤に対する患者の寛容、投与経路、ならびに化合物および投与する任意の第二薬剤の活性、有効性、薬物動態学および毒性学プロフィールなどの薬理学的考慮等を含めた数々の要因を考慮して個々の患者に基づいて決定し得る。疾患または病状（高血圧など）を患っている患者の処置は、事前に決定された投薬量または処置する医師によって決定された投薬量から開始することができ、疾患または病状の症状を予防、寛解、抑制、または緩和させるために必要な期間の間続ける。そのような処置を受けている患者は、典型的には、治療の有効性を決定するためにルーチンに基づいて監視する。たとえば、高血圧の処置において、血圧の測定を使用して処置の有効性を決定し得る。本明細書中に記載の他の疾患および状態の同様の指標は周知であり、処置する医師が容易に利用可能である。医師による連続的な監視は、任意の所定の時点で最適な量の結晶性化合物が投与されることを保証し、また、処置の期間の決定を容易にする。これは、第二薬剤も投与する場合、その選択、投薬量、および治療期間も調整を必要とし得るため、特に貴重である。このようにして、所望の有効性を示す最小量の活性薬剤が投与され、さらに、疾患または病状の処置が成功するために必要な長さだけ投与を続けられるように、処置レジメンおよび投薬スケジュールを治療の経過にわたって調整することができる。
【００５４】
本発明の結晶性化合物はＡＴ１受容体拮抗活性およびＮＥＰ酵素阻害活性を保有するため、ＡＴ１受容体またはＮＥＰ酵素を有する生物系または試料を調査または研究するため、たとえば、ＡＴ１受容体またはＮＥＰ酵素が役割を果たす疾患を研究するための研究ツールとしても有用である。ＡＴ１受容体および／またはＮＥＰ酵素を有する任意の適切な生物系または試料をそのような研究で用いてよく、これはｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのどちらで実施してもよい。そのような研究に適した代表的な生物系または試料には、それだけには限定されないが、細胞、細胞抽出物、形質膜、組織試料、単離した器官、哺乳動物（マウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ブタ、ヒトなど）等が含まれ、哺乳動物が特に興味深い。本発明の具体的な一実施形態では、哺乳動物中のＡＴ１受容体は、ＡＴ１を拮抗する量の結晶性化合物を投与することによって拮抗する。別の特定の実施形態では、哺乳動物中のＮＥＰ酵素活性は、ＮＥＰを阻害する量の結晶性化合物を投与することによって阻害する。また、結晶性化合物は、そのような化合物を用いた生物学的アッセイを実施することによって研究ツールとして使用することもできる。
【００５５】
研究ツールとして使用する場合、ＡＴ１受容体および／またはＮＥＰ酵素を含む生物系または試料を、典型的には、ＡＴ１受容体を拮抗するまたはＮＥＰ酵素を阻害する量の結晶性化合物と接触させる。生物系または試料を結晶性化合物に曝露した後、ＡＴ１受容体を拮抗するおよび／またはＮＥＰ酵素を阻害する効果を、慣用の手順および機材を用いて、たとえば、結合アッセイにおいて受容体結合を測定することまたは機能的アッセイにおいてリガンドに媒介される変化を測定することよって決定する。曝露には、細胞または組織を化合物と接触させること、化合物を哺乳動物に、たとえば腹腔内、静脈内または皮下投与によって投与することなどが包含される。この決定ステップは、応答を測定すること（定量分析）を含むことができるか、または観察を行なうこと（定性分析）を含むことができる。応答の測定は、たとえば、放射性リガンド結合アッセイおよび機能的アッセイにおけるリガンドに媒介される変化の測定などの慣用の手順および機材を用いて、生物系または試料に対する結晶性化合物の効果を決定することを含む。アッセイの結果を用いて、活性レベルならびに所望の結果を達成するために必要な化合物の量、すなわち、ＡＴ１受容体を拮抗するおよび／またはＮＥＰ酵素を阻害する量を決定することができる。典型的には、決定ステップは、ＡＴ１受容体リガンドに媒介される効果を決定することおよび／またはＮＥＰ酵素を阻害する効果を決定することを含む。
【００５６】
さらに、本発明の結晶性化合物は、他の化学物質を評価するための研究ツールとして使用することができ、したがって、たとえば、ＡＴ１受容体拮抗活性および／またはＮＥＰ阻害活性を有する新しい化合物を発見するためのスクリーニングアッセイにも有用である。このようにして、結晶性化合物は、試験化合物および結晶性化合物で得られた結果を比較して、ほぼ同等または優れた活性を有する試験化合物が存在する場合はそれを同定することを可能にするアッセイにおいて、標準として使用する。たとえば、試験化合物または試験化合物の群のＫｉデータ（たとえば結合アッセイによって決定）を本発明の結晶性化合物のＫｉデータと比較して、所望の特性を有する試験化合物、たとえば、本発明の化合物とほぼ同等または優れたＫｉ値を有する試験化合物が存在する場合はそれを同定する。本発明のこの態様には、別々の実施形態として、比較データを作成すること（適切なアッセイを使用）および試験データを分析して目的の試験化合物を同定することがどちらも含まれる。したがって、試験化合物は、生物学的アッセイにおいて、（ａ）試験化合物を用いて生物学的アッセイを実施して第１のアッセイ値を提供するステップと、（ｂ）本発明の化合物を用いて生物学的アッセイを実施して第２のアッセイ値を提供するステップであって、ステップ（ａ）をステップ（ｂ）の前、その後、またはそれと同時に実施するステップと、（ｃ）ステップ（ａ）からの第１のアッセイ値をステップ（ｂ）からの第２のアッセイ値と比較するステップとを含む方法によって評価することができる。例示的な生物学的アッセイにはＡＴ１受容体結合アッセイおよびＮＥＰ酵素阻害アッセイが含まれる。
【００５７】
医薬組成物および配合物
式Ｉの結晶性化合物は、典型的には医薬組成物または配合物の形態で患者に投与する。そのような医薬組成物は、それだけには限定されないが、経口、直腸、経膣、経鼻、吸入、局所（経皮が含まれる）、眼球、および非経口の投与様式を含めた、任意の許容される投与経路によって患者に投与し得る。さらに、本発明の化合物は、たとえば経口で、１日に複数の用量（たとえば、１日に２回、３回、もしくは４回）、単一の１日用量または単一の１週用量で投与し得る。当業者には、本発明の結晶性化合物を配合した後は、もはや結晶形でない場合がある、すなわち、結晶性化合物を適切な担体に溶かし得ることが理解されよう。
【００５８】
したがって、一実施形態では、本発明は、製薬上許容される担体と４’−｛２−エトキシ−４−エチル−５−［（（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］イミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸の結晶形とを含む医薬組成物に関する。また、そのような医薬組成物は、所望する場合は他の治療剤および／または配合剤も含有し得る。組成物を記述する場合、「本発明の結晶性化合物」は、担体などの配合物の他の構成要素と識別するために本明細書中で「活性薬剤」とも呼び得る。
【００５９】
本発明の医薬組成物は、典型的には治療上有効な量の本発明の結晶性化合物を含有する。しかし、当業者には、医薬組成物が、バルク組成物などの治療上有効な量より多く、または治療上有効な量より少なく、すなわち、治療上有効な量を達成するために複数投与用に設計された個々の単位用量を含有し得ることを理解されよう。典型的には、組成物は、約０．０１〜３０ｗｔ％、たとえば約０．０１〜１０ｗｔ％を含めた、約０．０１〜９５ｗｔ％の活性薬剤を含有し、実際の量は、配合物自体、投与経路、投薬頻度などに依存する。一実施形態では、たとえば、経口剤形に適した組成物は、約５〜７０ｗｔ％、または約１０〜６０ｗｔ％の活性薬剤を含有し得る。
【００６０】
任意の慣用の担体または賦形剤は本発明の医薬組成物で使用し得る。特定の担体もしくは賦形剤、または担体もしくは賦形剤の組合せの選択は、特定の患者または病状もしくは病状の種類を処置するために使用する投与様式に依存する。この点で、特定の投与様式用の適切な組成物の調製は、製薬分野の当業者の技術範囲内に十分ある。さらに、そのような組成物中で使用される担体または賦形剤は市販されている。さらなる例示として、慣用の配合の技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｈｉｔｅ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（２０００）およびＨ．Ｃ．Ａｎｓｅｌら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、第７版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｈｉｔｅ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９９９）に記載されている。
【００６１】
製薬上許容される担体として役割を果たすことができる材料の代表的な例には、それだけには限定されないが、ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖、コーンスターチおよびジャガイモデンプンなどのデンプン、微結晶セルロース、およびカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースや酢酸セルロースなどのその誘導体等のセルロース、粉末トラガカント、麦芽、ゼラチン、タルク、カカオ脂および坐薬ワックスなどの賦形剤、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油などの油、プロピレングリコールなどのグリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなどのポリオール、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル、寒天、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、アルギン酸、発熱物質を含まない水、等張生理食塩水、リンゲル液、エチルアルコール、リン酸緩衝液、クロロフルオロカーボンおよびヒドロフルオロカーボンなどの圧縮噴霧剤ガス、ならびに医薬組成物中で用いられる他の無毒性の適合性物質が含まれる。
【００６２】
医薬組成物は、典型的には、活性薬剤を製薬上許容される担体および１つまたは複数の任意選択の成分と徹底的かつ密に混合または混和することによって調製する。その後、慣用の手順および機材を用いて、生じた均一に混和した混合物を錠剤、カプセル、丸薬、缶、カートリッジ、分注器などに成形または充填し得る。
【００６３】
本発明の結晶性化合物はチオール基を含有するため、チオールが酸化してジスルフィドを形成することを最小限にするまたは排除するために追加の考慮を与え得る。固体配合物では、これは、乾燥時間を短縮すること、配合物の水分含有量を減少すること、ならびにアスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムや亜硫酸水素ナトリウムなどの材料、およびラクトースと微結晶セルロースとの混合物などの材料を含めることによって達成し得る。液体配合物では、チオールの安定性は、アミノ酸、抗酸化剤、またはエデト酸二ナトリウムとアスコルビン酸との組合せを加えることによって向上させ得る。
【００６４】
一実施形態では、医薬組成物は経口投与に適している。経口投与用の適切な組成物は、それぞれが事前に決定した量の活性薬剤を含有する、カプセル、錠剤、丸薬、ロゼンジ、カシェ剤、糖衣錠、散剤、顆粒、水性もしくは非水性の液体中の液剤もしくは懸濁液、水中油もしくは油中水の液体乳濁液、エリキシルまたはシロップなどの形態であり得る。
【００６５】
固体剤形（カプセル、錠剤、丸薬など）での経口投与を意図する場合、組成物は、典型的には、活性薬剤とクエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなどの１つまたは複数の製薬上許容される担体とを含む。また、固体剤形は、デンプン、微結晶セルロース、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸などの充填剤または増量剤、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアカシアなどの結合剤、グリセロールなどの湿潤剤、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のシリケート、および／または炭酸ナトリウムなどの崩壊剤、パラフィンなどの溶液緩染剤、第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤、セチルアルコールおよび／またはモノステアリン酸グリセロールなどの湿潤剤、カオリンおよび／またはベントナイト粘土などの吸収剤、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、および／またはその混合物などの潤滑剤、着色料、ならびに緩衝剤も含み得る。
【００６６】
剥離剤、湿潤剤、コーティング剤、甘味料、香味料および香料、保存料ならびに抗酸化剤も医薬組成物中に存在し得る。錠剤、カプセル、丸薬などの例示的なコーティング剤には、酢酸フタル酸セルロース、酢酸フタル酸ポリビニル、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メタクリル酸−メタクリル酸エステルコポリマー、酢酸セルローストリメリテート、カルボキシメチルエチルセルロース、酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの、腸溶コーティングに使用されるものが含まれる。製薬上許容される抗酸化剤の例には、アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、メタ硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤、およびクエン酸、エチレンジアミン四酢酸、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート化剤等が含まれる。
【００６７】
また、組成物は、例として様々な割合のヒドロキシプロピルメチルセルロース、または他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／もしくはミクロスフェアを用いて、活性薬剤の遅放または徐放性を提供するようにも配合し得る。さらに、本発明の医薬組成物には乳白剤を含有させてもよく、胃腸管の特定の部分において、任意選択で遅延様式で、活性薬剤のみ、またはそれを優先的に放出するように配合し得る。使用できる包埋組成物の例には、ポリマー物質およびワックスが含まれる。また、活性薬剤は、任意選択で上述の賦形剤のうちの１つまたは複数と共に、微小カプセル封入形態であることもできる。
【００６８】
経口投与用の適切な液体剤形には、例示として、製薬上許容される乳濁液、マイクロエマルジョン、液剤、懸濁液、シロップおよびエリキシルが含まれる。液体剤形は、典型的には、活性薬剤と、不活性希釈剤、たとえば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、たとえば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（たとえば、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにその混合物などとを含む。懸濁液は、たとえば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、ならびにその混合物などの懸濁剤を含有し得る。
【００６９】
経口投与を意図する場合、本発明の医薬組成物は単位剤形で梱包し得る。用語「単位剤形」とは、患者への投薬に適切な物理的に区別された単位をいい、すなわち、それぞれの単位は、単独でまたは１つもしくは複数の追加の単位と組み合わせて所望の治療効果を生じるように計算された、事前に決定された量の活性薬剤を含有する。たとえば、そのような単位剤形は、カプセル、錠剤、丸薬などであり得る。
【００７０】
別の実施形態では、本発明の組成物は吸入投与に適しており、典型的にはエアロゾルまたは粉末の形態である。そのような組成物は、一般に、噴霧器、乾燥粉末、または定量吸入器などの周知の送達装置を用いて投与する。噴霧器装置は、組成物が患者の気道内へと運ばれる霧として噴霧されることを引き起こす、高速の空気の流れを生じる。例示的な噴霧器配合物は、担体に溶かして溶液を形成した活性薬剤、または微粒子化して担体と組み合わせて呼吸に適した大きさの微粒子化した粒子の懸濁液を形成する活性薬剤を含む。乾燥粉末吸入器は、活性薬剤を、吸気中に患者の空気流中に分散される易流動性の粉末として投与する。例示的な乾燥粉末配合物は、ラクトース、デンプン、マンニトール、デキストロース、ポリ乳酸、ポリ乳酸−コ−グリコリド、およびその組合せなどの賦形剤と乾式混和した活性薬剤を含む。定量吸入器は、圧縮噴霧剤ガスを用いて測定した量の活性薬剤を放出する。例示的な定量配合物は、クロロフルオロカーボンまたはヒドロフルオロアルカンなどの液化した噴霧剤中の活性薬剤の溶液または懸濁液を含む。そのような配合物の任意選択の構成要素には、エタノールまたはペンタンなどの共溶媒、ならびにトリオレイン酸ソルビタン、オレイン酸、レシチン、グリセリン、およびラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤が含まれる。そのような組成物は、典型的には、冷却または加圧したヒドロフルオロアルカンを、活性薬剤、エタノール（存在する場合）および界面活性剤（存在する場合）を含有する適切な容器に加えることによって調製する。懸濁液を調製するためには、活性薬剤を微粒子化し、その後、噴霧剤と組み合わせる。あるいは、懸濁液配合物は、界面活性剤のコーティングを活性薬剤の微粒子化した粒子上に噴霧乾燥させることによって調製することができる。その後、配合物を吸入器の一部分を形成するエアロゾル缶内に装填する。
【００７１】
また、本発明の結晶性化合物は、非経口的に（たとえば、皮下、静脈内、筋肉内、または腹腔内注射によって）投与することもできる。そのような投与には、活性薬剤を無菌的な溶液、懸濁液、または乳濁液中で提供する。そのような配合物を調製するための例示的な溶媒には、水、生理食塩水、プロピレングリコールなどの低分子量アルコール、ポリエチレングリコール、油、ゼラチン、オレイン酸エチルなどの脂肪酸エステル等が含まれる。また、非経口配合物は、１つまたは複数の抗酸化剤、可溶化剤、安定化剤、保存料、湿潤剤、乳化剤、および分散剤も含有し得る。界面活性剤、追加の安定化剤またはｐＨ調整剤（酸、塩基もしくは緩衝液）および抗酸化剤は、配合物に安定性をもたらすため、たとえば、エステルおよびアミド結合の加水分解、または化合物中に存在するチオールの二量体化を最小限にするまたは回避するために、特に有用である。これらの配合物は、無菌的な注射用媒体、滅菌剤、濾過、放射線照射、または熱を使用することによって無菌的にし得る。具体的な一実施形態では、非経口配合物は、製薬上許容される担体としてシクロデキストリン水溶液を含む。適切なシクロデキストリンには、アミラーゼ、β−シクロデキストリンまたはシクロヘプタアミロースなどのように、１，４位置で連結された６個以上のα−Ｄ−グルコピラノース単位を含有する環状分子が含まれる。例示的なシクロデキストリンには、ヒドロキシプロピルなどのシクロデキストリン誘導体ならびにヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンおよびスルホブチルエーテルβ−シクロデキストリンなどのスルホブチルエーテルシクロデキストリンが含まれる。そのような配合物の例示的な緩衝液には、シトレート、ラクテートおよびマレエート緩衝溶液などのカルボン酸系の緩衝液が含まれる。
【００７２】
また、本発明の結晶性化合物は、既知の経皮送達系および賦形剤を用いて経皮投与することもできる。たとえば、化合物を、プロピレングリコール、モノラウリン酸ポリエチレングリコール、アザシクロアルカン−２−オンなどの浸透増強剤と混ぜ、パッチまたは同様の送達系内に取り込ませることができる。所望する場合は、ゲル化剤、乳化剤および緩衝液を含めたさらなる賦形剤をそのような経皮組成物中で使用し得る。
【００７３】
所望する場合は、本発明の結晶性化合物を１つまたは複数の他の治療剤と組み合わせて投与し得る。したがって、一実施形態では、本発明の医薬組成物は、本発明の結晶性化合物と同時投与する他の薬物を含有する。たとえば、組成物は、利尿剤、β１アドレナリン作動性受容体遮断剤、カルシウムチャネル遮断剤、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、ＡＴ１受容体拮抗剤、ネプリライシン阻害剤、非ステロイド性抗炎症剤、プロスタグランジン、抗脂質剤、抗糖尿病剤、抗血栓剤、レニン阻害剤、エンドセリン受容体拮抗剤、エンドセリン変換酵素阻害剤、アルドステロン拮抗剤、アンジオテンシン変換酵素／ネプリライシン阻害剤、およびその組合せの群から選択される１つまたは複数の治療剤（「第二薬剤（複数可）とも呼ばれる」）をさらに含み得る。そのような治療剤は当分野で周知であり、例を以下に記載する。本発明の結晶性化合物を第二薬剤と組み合わせることによって、三重治療を達成することができる。すなわち、２つの活性構成要素のみを使用することで、ＡＴ１受容体拮抗活性、ＮＥＰ阻害活性、および第二薬剤（たとえばβ１アドレナリン作動性受容体遮断剤）に関連する活性を達成することができる。２つの活性構成要素を含有する組成物は、典型的には、３つの活性構成要素を含有する組成物よりも配合が容易なため、そのような二構成要素の組成物は、３つの活性構成要素を含有する組成物を超える顕著な利点を提供する。したがって、本発明のさらに別の実施形態では、医薬組成物は、本発明の結晶性化合物、第２の活性薬剤、および製薬上許容される担体を含む。第３、第４などの活性薬剤も組成物中に含め得る。組合せ療法では、投与する本発明の結晶性化合物の量、および第二薬剤の量は、単独療法で典型的に投与する量よりも少ない場合がある。
【００７４】
本発明の結晶性化合物は、第２の活性薬剤と物理的に混合して両方の薬剤を含有する組成物を形成してもよく、または、それぞれの薬剤を別々かつ別個の組成物中に存在させ、同時にもしくは別々の時点で患者に投与してもよい。たとえば、結晶性化合物は、慣用の手順および機材を用いて第２の活性薬剤と組み合わせて、本発明の化合物および第２の活性薬剤を含む活性薬剤の組合せを形成することができる。さらに、活性薬剤は、製薬上許容される担体と組み合わせて、本発明の化合物、第２の活性薬剤、および製薬上許容される担体を含む医薬組成物を形成し得る。本実施形態では、典型的には、組成物の構成要素を混合または混和して物理的な混合物を作製する。その後、本明細書中に記載の経路のうちの任意のものを用いて、物理的な混合物を治療上有効な量で投与する。
【００７５】
あるいは、活性薬剤は、患者に投与する前は別々かつ別個ままであり得る。本実施形態では、薬剤は投与前に物理的に一緒に混合せず、同時にまたは別々の時点で別々の組成物として投与する。そのような組成物は、別々に梱包することができ、またはキット中で一緒に梱包し得る。別々の時点で投与する場合、第二薬剤は、典型的には、結晶性化合物の投与の２４時間未満以内、結晶性化合物の投与と同時から投薬の約２４時間後のいずれかの範囲で投与する。これは連続投与とも呼ぶ。したがって、本発明の結晶性化合物は、２つの錠剤、すなわちそれぞれの活性薬剤に１つの錠剤を用いて、別の活性薬剤と共に同時にまたは連続的に経口投与することができ、連続とは、結晶性化合物を投与した直後または事前に決定された一定の時間後（たとえば１時間後もしくは３時間後）に投与することを意味し得る。あるいは、組合せを異なる投与経路によって投与し得る、すなわち、一方を経口によって、他方を吸入によって投与する。
【００７６】
本発明の一実施形態では、キットは、本発明の結晶性化合物を含む第１の剤形と、本明細書中に記載の第二薬剤のうちの１つまたは複数を含む少なくとも１つの追加の剤形とを、本発明の方法を実施するために十分な量で含む。第１の剤形および第２（または第３など）の剤形は、患者において疾患または病状を処置または予防するために治療上有効な量の活性薬剤を一緒になって含む。
【００７７】
含まれる場合、第二薬剤（複数可）は、典型的には、本発明の結晶性化合物と同時投与した場合に治療上有益な効果を生じる量で投与されるように、治療上有効な量で存在する。本発明の結晶性化合物と組み合わせて投与するこれらの第二薬剤の適切な用量の範囲は、約０．０５μｇ／日〜約１００ｍｇ／日である。第二薬剤は、製薬上許容される塩、溶媒和物、光学的に純粋な立体異性体などの形態であることができる。また、第二薬剤は、プロドラッグ、たとえばエステル化されたカルボン酸基を有する化合物の形態であってもよい。したがって、以下に記載の第二薬剤には、そのような形態がすべて含まれることを意図し、市販されている、または慣用の手順および試薬を用いて調製することができる。
【００７８】
一実施形態では、本発明の結晶性化合物を利尿剤と組み合わせて投与する。代表的な利尿剤には、それだけには限定されないが、アセタゾラミドおよびジクロルフェナミドなどの炭酸脱水酵素阻害剤、アセタゾラミド、アンブシド、アゾセミド（ａｚｏｓｅｒｎｉｄｅ）、ブメタニド、ブタゾラミド、クロラミノフェナミド、クロフェナミド、クロパミド、クロレキソロン、ジスルファミド、エトキソラミド、フロセミド、メフルシド、メタゾラミド、ピレタニド、トルセミド、トリパミド、およびキシパミドなどのスルホンアミド誘導体を含めたループ利尿剤、エタクリン酸などの非スルホンアミド利尿剤およびチエニル酸、インダクリノンやキンカルベート（ｑｕｉｎｃａｒｂａｔｅ）などの他のフェノキシ酢酸化合物、マンニトールなどの浸透圧利尿剤、スピロノラクトンなどのアルドステロン拮抗剤を含めたカリウム保持性利尿剤、およびアミロライドやトリアムテレンなどのＮａ＋チャネル阻害剤、アルチアジド、ベンドロフルメチアジド、ベンジルヒドロクロロチアジド、ベンズチアジド、ブチアジド、クロルタリドン、クロロチアジド、シクロペンチアジド、シクロチアジド、エピチアジド、エチアジド、フェンキゾン、フルメチアジド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、インダパミド、メチルクロチアジド、メチクラン、メトラゾン、パラフルチジド、ポリチアジド、キネタゾン、テクロチアジド、およびトリクロロメチアジドなどのチアジドおよびチアジド様利尿剤、ならびにその組合せが含まれる。特定の実施形態では、利尿剤は、アミロライド、ブメタニド、クロロチアジド、クロルタリドン、ジクロルフェナミド、エタクリン酸、フロセミド、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、インダパミド、メチルクロチアジド、メトラゾン、トルセミド、トリアムテレン、およびその組合せから選択される。利尿剤は、約５〜５０ｍｇ／日、より典型的には６〜２５ｍｇ／日を提供するために十分な量で投与し、一般的な投薬量は６．２５ｍｇ、１２．５ｍｇまたは２５ｍｇ／日である。
【００７９】
また、本発明の結晶性化合物はβ１アドレナリン作動性受容体遮断剤と組み合わせて投与してもよい。代表的なβ１アドレナリン作動性受容体遮断剤には、それだけには限定されないが、アセブトロール、アルプレノロール、アモスラロール、アロチノロール、アテノロール、ベフノロール、ベタキソロール、ベバントロール、ビソプロロール、ボピンドロール、ブシンドロール、ブクモロール、ブフェトロール、ブフラロール、ブニトロロール、ブプラノロール、ブブリジン、ブトフィロロール、カラゾロール、カルテオロール、カルベジロール、セリプロロール、セタモロール、クロラノロール、ジレバロール、エパノロール、エスモロール、インデノロール、ラベトロール、レボブノロール、メピンドロール、メチプラノロール、コハク酸メトプロロールおよび酒石酸メトプロロールなどのメトプロロール、モプロロール、ナドロール、ナドキソロール、ネビバロール、ニプラジロール、オキシプレノロール、ペンブトロール、ペルブトロール、ピンドロール、プラクトロール、プロネタロール、プロプラノロール、ソタロール、スフィナロール、タリンドール、テルタトロール、チリソロール、チモロール、トリプロロール、キシベノロール、ならびにその組合せが含まれる。具体的な一実施形態では、β１アドレナリン作動性受容体遮断剤は、アテノロール、ビソプロロール、メトプロロール、プロプラノロール、ソタロール、およびその組合せから選択される。
【００８０】
一実施形態では、本発明の結晶性化合物をカルシウムチャネル遮断剤と組み合わせて投与する。代表的なカルシウムチャネル遮断剤には、それだけには限定されないが、アムロジピン、アニパミル、アラニピン、バルニジピン、ベンシクラン、ベニジピン、ベプリジル、クレンチアゼム、シルニジピン、シンナリジン、ジルチアゼム、エホニジピン、エルゴジピン、エタフェノン、フェロジピン、フェンジリン、フルナリジン、ガロパミル、イスラジピン、ラシジピン、レルカニジピン、リドフラジン、ロメリジン、マニジピン、ミベフラジル、ニカルジピン、ニフェジピン、ニグルジピン、ニルジピン、ニルバジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、ニバルジピン、ペルヘキシリン、プレニラミン、リョシジン、セモチアジル、テロジリン、チアパミル、ベラパミル、およびその組合せが含まれる。特定の実施形態では、カルシウムチャネル遮断剤は、アムロジピン、ベプリジル、ジルチアゼム、フェロジピン、イスラジピン、ラシジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニグルジピン、ニルジピン、ニモジピン、ニソルジピン、リョシジン、ベラパミル、およびその組合せから選択される。
【００８１】
また、本発明の結晶性化合物はアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤と組み合わせて投与することもできる。代表的なＡＣＥ阻害剤には、それだけには限定されないが、アキュプリル、アラセプリル、ベナゼプリル、ベナゼプリラート、カプトプリル、セラナプリル、シラザプリル、デラプリル、エナラプリル、エナラプリラート、フォシノプリル、フォシノプリラート、イミダプリル、リシノプリル、モエキシプリル、モノプリル、モベルトプリル、ペントプリル、ペリンドプリル、キナプリル、キナプリラート、ラミプリル、ラミプリラート、酢酸サララシン、スピラプリル、テモカプリル、トランドラプリル、ゾフェノプリル、およびその組合せが含まれる。特定の実施形態では、ＡＣＥ阻害剤は、ベナゼプリル、エナラプリル、リシノプリル、ラミプリル、およびその組合せから選択される。
【００８２】
一実施形態では、本発明の結晶性化合物を、アンジオテンシンＩＩ  １型受容体遮断剤（ＡＲＢ）としても知られるＡＴ１受容体拮抗剤と組み合わせて投与する。代表的なＡＲＢには、それだけには限定されないが、アビテサルタン、ベンジルロサルタン（ｂｅｎｚｙｌｌｏｓａｒｔａｎ）、カンデサルタン、カンデサルタンシレキセチル、エリサルタン、エムブサルタン、エノルタソサルタン、エプロサルタン、フォンサルタン、フォラサルタン、グリシルロサルタン、イルベサルタン、イソテオリン、ロサルタン、メドキシミル、ミルファサルタン、オルメサルタン、オポミサルタン、プラトサルタン、リピサルタン、サプリサルタン、サララシン、サルメシン、タソサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、ゾラサルタン、およびその組合せが含まれる。特定の実施形態では、ＡＲＢは、カンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、オルメサルタン、イルベサルタン、サプリサルタン、タソサルタン、テルミサルタン、およびその組合せから選択される。例示的な塩には、メシル酸エプロサルタン、ロサルタンカリウム塩、およびオルメサルタンメドキソミルが含まれる。典型的には、ＡＲＢは、約４〜６００ｍｇ／用量を提供するために十分な量で投与し、例示的な１日投薬量の範囲は２０〜３２０ｍｇ／日である。
【００８３】
別の実施形態では、本発明の結晶性化合物をネプリライシン（ＮＥＰ）阻害剤と組み合わせて投与する。代表的なＮＥＰ阻害剤には、それだけには限定されないが：カンドキサトリル、カンドキサトリラート、ドキセカドトリル（ｄｅｘｅｃａｄｏｔｒｉｌ）（（＋）−Ｎ−［２（Ｒ）−（アセチルチオメチル）−３−フェニルプロピオニル］グリシンベンジルエステル）、ＣＧＳ−２４１２８（３−［３−（ビフェニル−４−イル）−２−（ホスホノメチルアミノ）プロピオンアミド］プロピオン酸）、ＣＧＳ−２４５９２（（Ｓ）−３−［３−（ビフェニル−４−イル）−２−（ホスホノメチルアミノ）プロピオンアミド］プロピオン酸）、ＣＧＳ−２５１５５（Ｎ−［９（Ｒ）−（アセチルチオメチル）−１０−オキソ−１−アザシクロデカン−２（Ｓ）−イルカルボニル］−４（Ｒ）−ヒドロキシ−Ｌ−プロリンベンジルエステル）、Ｈｅｐｗｏｒｔｈら（Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．）のＷＯ２００６／０２７６８０号に記載の３−（ｌ−カルバモイルシクロヘキシル）プロピオン酸誘導体、ＪＭＶ−３９０−１（２（Ｒ）−ベンジル−３−（Ｎ−ヒドロキシカルバモイル）プロピオニル−Ｌ−イソロイシル−Ｌ−ロイシン）、エカドトリル、ホスホラミドン、レトロチオルファン、ＲＵ−４２８２７（２−（メルカプトメチル）−Ｎ−（４−ピリジニル）ベンゼンプロピオンアミド）、ＲＵ−４４００４（Ｎ−（４−モルホリニル）−３−フェニル−２−（スルファニルメチル）プロピオンアミド）、ＳＣＨ−３２６１５（（Ｓ）−Ｎ−［Ｎ−（１−カルボキシ−２−フェニルエチル）−Ｌ−フェニルアラニル］−β−アラニン）およびそのプロドラッグＳＣＨ−３４８２６（（Ｓ）−Ｎ−［Ｎ−［１−［［（２，２−ジメチル−１，３−ジオキソラン−４−イル）メトキシ］カルボニル］−２−フェニルエチル］−Ｌ−フェニルアラニル］−β−アラニン）、シアロルフィン、ＳＣＨ−４２４９５（Ｎ−［２（Ｓ）−（アセチルスルファニルメチル）−３−（２−メチルフェニル）プロピオニル］−Ｌ−メチオニンエチルエステル）、スピノルフィン、ＳＱ−２８１３２（Ｎ−［２−（メルカプトメチル）−１−オキソ−３−フェニルプロピル］ロイシン）、ＳＱ−２８６０３（Ｎ−［２−（メルカプトメチル）−１−オキソ−３−フェニルプロピル］−β−アラニン）、ＳＱ−２９０７２（７−［［２−（メルカプトメチル）−１−オキソ−３−フェニルプロピル］アミノ］ヘプタン酸）、チオルファンおよびそのプロドラッグラセカドトリル、ＵＫ−６９５７８（シス−４−［［［１−［２−カルボキシ−３−（２−メトキシエトキシ）プロピル］シクロペンチル］カルボニル］アミノ］シクロヘキサンカルボン酸）、ＵＫ−４４７，８４１（２−｛１−［３−（４−クロロフェニル）プロピルカルバモイル］−シクロペンチルメチル｝−４−メトキシ酪酸）、ＵＫ−５０５，７４９（（Ｒ）−２−メチル−３−｛１−［３−（２−メチルベンゾチアゾール−６−イル）プロピルカルバモイル］シクロペンチル｝プロピオン酸）、５−ビフェニル−４−イル−４−（３−カルボキシプロピオニルアミノ）−２−メチルペンタン酸および５−ビフェニル−４−イル−４−（３−カルボキシプロピオニルアミノ）−２−メチル���ンタン酸エチルエステル（ＷＯ２００７／０５６５４６号）、Ｋｈｄｅｒら（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  ＡＧ）のＷＯ２００７／１０６７０８号に記載のダグルトリル［（３Ｓ，２’Ｒ）−３−｛１−［２’−（エトキシカルボニル）−４’−フェニルブチル］−シクロペンタン−１−カルボニルアミノ｝−２，３，４，５−テトラヒドロ−２−オキソ−１Ｈ−１−ベンズアゼピン−１−酢酸］、ならびにその組合せが含まれる。特定の実施形態では、ＮＥＰ阻害剤は、カンドキサトリル、カンドキサトリラート、ＣＧＳ−２４１２８、ホスホラミドン、ＳＣＨ−３２６１５、ＳＣＨ−３４８２６、ＳＱ−２８６０３、チオルファン、およびその組合せから選択される。ＮＥＰ阻害剤は、約２０〜８００ｍｇ／日を提供するために十分な量で投与し、典型的な１日投薬量の範囲は５０〜７００ｍｇ／日であり、より一般的には１００〜６００または１００〜３００ｍｇ／日である。
【００８４】
さらに別の実施形態では、本発明の結晶性化合物を非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）と組み合わせて投与する。代表的なＮＳＡＩＤには、それだけには限定されないが、アセメタシン、アセチルサリチル酸、アルクロフェナク、アルミノプロフェン、アンフェナク、アミプリロース、アモキシプリン、アニロラク、アパゾン、アザプロパゾン、ベノリラート、ベノキサプロフェン、ベズピペリロン、ブロペラモール、ブクロキシン酸、カルプロフェン、クリダナク、ジクロフェナク、ジフルニサル、ジフタロン、エノリカム、エトドラク、エトリコキシブ、フェンブフェン、フェンクロフェナク、フェンクロジン酸、フェノプロフェン、フェンチアザク、フェプラゾン、フルフェナム酸、フルフェニサル、フルプロフェン、フルルビプロフェン、フロフェナク、イブフェナック、イブプロフェン、インドメタシン、インドプロフェン、イソキセパク、イソキシカム、ケトプロフェン、ケトロラック、ロフェミゾール、ロルノキシカム、メクロフェナメート、メクロフェナム酸、メフェナム酸、メロキシカム、メサラミン、ミロプロフェン、モフェブタゾン、ナブメトン、ナプロキセン、ニフルム酸、オキサプロジン、オクスピナク、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、ピルプロフェン、プラノプロフェン、サルサレート、スドキシカム、スルファサラジン、スリンダク、スプロフェン、テノキシカム、チオピナク、チアプロフェン酸、チオキサプロフェン、トルフェナム酸、トルメチン、トリフルミデート、ジドメタシン、ゾメピラック、およびその組合せが含まれる。特定の実施形態では、ＮＳＡＩＤは、エトドラク、フルルビプロフェン、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラック、メロキシカム、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、およびその組合せから選択される。
【００８５】
さらに別の実施形態では、本発明の結晶性化合物を抗脂質剤と組み合わせて投与する。代表的な抗脂質剤には、それだけには限定されないが、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンおよびシンバスタチンなどのスタチン、コレステリルエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）、ならびにその組合せが含まれる。
【００８６】
さらに別の実施形態では、本発明の結晶性化合物を抗糖尿病剤と組み合わせて投与する。代表的な抗糖尿病剤には、それだけには限定されないが、インスリンおよびインスリン誘導体などの注射用薬物、メトホルミンなどのビグアニド、グルカゴン拮抗剤、アカルボースおよびミグリトールなどのα−グルコシダーゼ阻害剤、レパグリニドなどのメグリチニド、オキサジアゾリジンジオン、クロルプロパミド、グリメピリド、グリピジド、グリブリド、およびトラザミドなどのスルホニル尿素、ピオグリタゾンおよびロシグリタゾンなどのチアゾリジンジオンを含めた経口で有効な薬物、ならびにその組合せが含まれる。
【００８７】
一実施形態では、本発明の結晶性化合物を抗血栓剤と組み合わせて投与する。代表的な抗血栓剤には、それだけには限定されないが、アスピリン、抗血小板剤、ヘパリン、およびその組合せが含まれる。また、本発明の化合物は、レニン阻害剤と組み合わせて投与してもよく、その例には、それだけには限定されないが、アリスキレン、エナルキレン、レミキレン、およびその組合せが含まれる。別の実施形態では、本発明の化合物は、エンドセリン受容体拮抗剤と組み合わせて投与し、その代表的な例には、それだけには限定されないが、ボセンタン、ダルセンタン、テゾセンタン、およびその組合せが含まれる。また、本発明の化合物は、エンドセリン変換酵素阻害剤と組み合わせて投与してもよく、その例には、それだけには限定されないが、ホスホラミドン、ＣＧＳ２６３０３、およびその組合せが含まれる。さらに別の実施形態では、本発明の化合物は、アルドステロン拮抗剤と組み合わせて投与し、その代表的な例には、それだけには限定されないが、エプレレノン、スピロノラクトン、およびその組合せが含まれる。
【００８８】
また、組み合わせた治療剤も、本発明の化合物のさらなる組合せ療法に役立ち得る。たとえば、Ｖａｓｅｒｅｔｉｃ（登録商標）の商標で販売されているＡＣＥ阻害剤エナラプリル（マレイン酸塩形態）と利尿剤ヒドロクロロチアジドとの組合せ、またはカルシウムチャネル遮断剤アムロジピン（ベシル酸塩形態）とＡＲＢオルメサルタン（メドキソミルプロドラッグ形態）との組合せ、またはカルシウムチャネル遮断剤とスタチンとの組合せを、すべて本発明の化合物と共に使用し得る。また、二重作用薬剤も本発明の結晶性化合物との組合せ療法に役立ち得る。たとえば、ＡＶＥ−０８４８（（４Ｓ，７Ｓ，１２ｂＲ）−７−［３−メチル−２（Ｓ）−スルファニルブチラミド］−６−オキソ−１，２，３，４，６，７，８，１２ｂ−オクタヒドロピリド［２，１−ａ］［２］ベンズアゼピン−４−カルボン酸）、ＡＶＥ−７６８８（イレパトリル）およびその親化合物、ＢＭＳ−１８２６５７（２−［２−オキソ−３（Ｓ）−［３−フェニル−２（Ｓ）−スルファニルプロピオンアミド］−２，３，４，５−テトラヒドロ−１Ｈ−１−ベンズアゼピン−１−イル］酢酸）、ＣＧＳ−２６３０３（［Ｎ−［２−（ビフェニル−４−イル）−１（Ｓ）−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）エチル］アミノ］メチルホスホン酸）、ＣＧＳ−３５６０１（Ｎ−［１−［４−メチル−２（Ｓ）−スルファニルペンタンアミド］シクロペンチルカルボニル］−Ｌ−トリプトファン）、ファシドトリル、ファシドトリラート、エナラプリラート、ＥＲ−３２９３５（（３Ｒ，６Ｓ，９ａＲ）−６−［３（Ｓ）−メチル−２（Ｓ）−スルファニルペンタンアミド］−５−オキソペルヒドロチアゾロ［３，２−ａ］アゼピン−３−カルボン酸）、ジェムパトリラト（ｇｅｍｐａｔｒｉｌａｔ）、ＭＤＬ−１０１２６４（（４Ｓ，７Ｓ，１２ｂＲ）−７−［２（Ｓ）−（２−モルホリノアセチルチオ）−３−フェニルプロピオンアミド］−６−オキソ−１，２，３，４，６，７，８，１２ｂ−オクタヒドロピリド［２，１−ａ］［２］ベンズアゼピン−４−カルボン酸）、ＭＤＬ−１０１２８７（［４Ｓ−［４α，７α（Ｒ＊），１２ｂβ］］−７−［２−（カルボキシメチル）−３−フェニルプロピオンアミド］−６−オキソ−１，２，３，４，６，７，８，１２ｂ−オクタヒドロピリド［２，１−ａ］［２］ベンズアゼピン−４−カルボン酸）、オマパトリラト、ＲＢ−１０５（Ｎ−［２（Ｓ）−（メルカプトメチル）−３（Ｒ）−フェニルブチル］−Ｌ−アラニン）、サムパトリラト、ＳＡ−８９８（（２Ｒ，４Ｒ）−Ｎ−［２−（２−ヒドロキシフェニル）−３−（３−メルカプトプロピオニル）チアゾリジン−４−イルカルボニル］−Ｌ−フェニルアラニン）、Ｓｃｈ−５０６９０（Ｎ−［１（Ｓ）−カルボキシ−２−［Ｎ２−（メタンスルホニル）−Ｌ−リジルアミノ］エチル］−Ｌ−バリル−Ｌ−チロシン）、ならびにその組合せなどのアンジオテンシン変換酵素／ネプリライシン（ＡＣＥ／ＮＥＰ）阻害剤も含め得る。具体的な一実施形態では、ＡＣＥ／ＮＥＰ阻害剤は、ＡＶＥ−７６８８、エナラプリラート、ファシドトリル、ファシドトリラート、オマパトリラト、サムパトリラト、およびその組合せから選択される。
【００８９】
また、α２−アドレナリン作動性受容体作用剤およびバソプレシン受容体拮抗剤などの他の治療剤も組合せ療法に役立ち得る。例示的なα２−アドレナリン作動性受容体作用剤には、クロニジン、デクスメデトミジン、およびグアンファシンが含まれる。例示的なバソプレシン受容体拮抗剤にはトルバプタンが含まれる。
【００９０】
以下の配合物は、本発明の代表的な医薬組成物を例示する。
【００９１】
経口投与用の例示的な硬ゼラチンカプセル
本発明の結晶性化合物（５０ｇ）、噴霧乾燥したラクトース（４４０ｇ）およびステアリン酸マグネシウム（１０ｇ）を徹底的に混和する。その後、生じる組成物を硬ゼラチンカプセル内に装填する（５００ｍｇの組成物／カプセル）。あるいは、結晶性化合物（２０ｍｇ）をデンプン（８９ｍｇ）、微結晶セルロース（８９ｍｇ）およびステアリン酸マグネシウム（２ｍｇ）と共に徹底的に混和する。その後、混合物を４５番メッシュの米国標準篩（Ｕ．Ｓ．ｓｉｅｖｅ）に通し、硬ゼラチンカプセル内に装填する（２００ｍｇの組成物／カプセル）。
【００９２】
経口投与用の例示的なゼラチンカプセル配合物
本発明の結晶性化合物（１００ｍｇ）をモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン（５０ｍｇ）およびデンプン粉末（２５０ｍｇ）と共に徹底的に混和する。その後、混合物をゼラチンカプセル内に装填する（４００ｍｇの組成物／カプセル）。
【００９３】
あるいは、結晶性化合物（４０ｍｇ）を微結晶セルロース（Ａｖｉｃｅｌ  ＰＨ  １０３、２５９．２ｍｇ）およびステアリン酸マグネシウム（０．８ｍｇ）と共に徹底的に混和する。その後、混合物をゼラチンカプセル（サイズ＃１、白色、不透明）内に装填する（３００ｍｇの組成物／カプセル）。
【００９４】
経口投与用の例示的な錠剤配合物
本発明の結晶性化合物（１０ｍｇ）、デンプン（４５ｍｇ）および微結晶セルロース（３５ｍｇ）を２０番メッシュの米国標準篩に通し、徹底的に混合する。このようにして生成された顆粒を５０〜６０℃で乾燥させ、１６番メッシュの米国標準篩に通す。ポリビニルピロリドンの溶液（滅菌水中の１０％溶液として４ｍｇ）をカルボキシメチルナトリウムデンプン（４．５ｍｇ）、ステアリン酸マグネシウム（０．５ｍｇ）、およびタルク（１ｍｇ）と共に混合し、その後、この混合物を１６番メッシュの米国標準篩に通す。その後、カルボキシメチルナトリウムデンプン、ステアリン酸マグネシウムおよびタルクを顆粒に加える。混合後、混合物を錠剤機で圧縮して、１００ｍｇの重量の錠剤が得られる。
【００９５】
あるいは、結晶性化合物（２５０ｍｇ）を微結晶セルロース（４００ｍｇ）、ヒュームド二酸化ケイ素（１０ｍｇ）、およびステアリン酸（５ｍｇ）と共に徹底的に混和する。その後、混合物を圧縮して錠剤を形成する（６６５ｍｇの組成物／錠剤）。
【００９６】
あるいは、結晶性化合物（４００ｍｇ）をコーンスターチ（５０ｍｇ）、クロスカルメロースナトリウム（２５ｍｇ）、ラクトース（１２０ｍｇ）、およびステアリン酸マグネシウム（５ｍｇ）と共に徹底的に混和する。その後、混合物を圧縮して１割線を有する錠剤を形成する（６００ｍｇの組成物／錠剤）。
【００９７】
あるいは、結晶性化合物（１００ｍｇ）を、ゼラチン水溶液（２０ｍｇ）を用いてコーンスターチ（１００ｍｇ）と共に徹底的に混和する。混合物を乾燥させ、微粉末へと粉砕する。微結晶セルロース（５０ｍｇ）およびステアリン酸マグネシウム（５ｍｇ）をゼラチン配合物と混ぜ、顆粒化し、生じる混合物を圧縮して錠剤を形成する（１００ｍｇの活性物／錠剤）。
【００９８】
経口投与用の例示的な懸濁液配合物
以下の成分を混合して、１０ｍＬの懸濁液あたり１００ｍｇの活性薬剤を含有する懸濁液を形成する。
【００９９】
【表２】
0005495396.tif 000004
【０１００】
経口投与用の例示的な液体配合物
適切な液体配合物は、シトレート、ラクテートおよびマレエート緩衝溶液などのカルボン酸系緩衝液を用いたものである。たとえば、本発明の結晶性化合物（ＤＭＳＯと事前に混合し得る）を１００ｍＭのクエン酸アンモニウム緩衝液と混和し、ｐＨをｐＨ５に調整するか、または、１００ｍＭのクエン酸溶液と混和し、ｐＨをｐＨ２に調整する。また、そのような溶液には、シクロデキストリンなどの可溶化賦形剤が含まれる場合もあり、たとえば、溶液には１０ｗｔ％のヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンが含まれ得る。
【０１０１】
他の適切な配合物には、シクロデキストリンを含むまたは含まない５％のＮａＨＣＯ３溶液が含まれる。
【０１０２】
注射による投与用の例示的な注射用配合物
本発明の結晶性化合物（０．２ｇ）を０．４Ｍの酢酸ナトリウム緩衝溶液（２．０ｍＬ）と混和する。生じる溶液のｐＨを、必要に応じて０．５Ｎの塩酸水溶液または０．５Ｎの水酸化ナトリウム水溶液を用いてｐＨ４に調整し、その後、十分な注射用水を加えて合計体積２０ｍＬをもたらす。その後、混合物を、無菌的なフィルター（０．２２ミクロン）を通して濾過して、注射による投与に適した無菌的な溶液が得られる。
【０１０３】
吸入による投与用の例示的な組成物
本発明の結晶性化合物（０．２ｍｇ）を微粒子化し、その後、ラクトース（２５ｍｇ）と混和する。その後、この混和した混合物をゼラチン吸入カートリッジ内に装填する。たとえば乾燥粉末吸入器を用いてカートリッジの含有物を投与する。
【０１０４】
あるいは、微粒子化した結晶性化合物（１０ｇ）を、レシチン（０．２ｇ）を脱塩水（２００ｍＬ）に溶かすことによって調製した溶液中に分散させる。生じる懸濁液を噴霧乾燥させ、その後、微粒子化して、約１．５μｍ未満の平均直径を有する粒子を含む微粒子化した組成物を形成する。その後、微粒子化した組成物を、吸入器によって投与した場合に約１０μｇ〜約５００μｇの本発明の化合物／用量を提供するために十分な量で、加圧した１，１，１，２−テトラフルオロエタンを含有する定量吸入器カートリッジ内に装填する。
【０１０５】
あるいは、結晶性化合物（２５ｍｇ）をシトレート緩衝（ｐＨ５）等張生理食塩水（１２５ｍＬ）に溶かす。化合物が溶けるまで混合物を撹拌および超音波処理する。溶液のｐＨを検査し、必要な場合は１Ｎの水酸化ナトリウム水溶液をゆっくりと加えることによってｐＨ５に調整する。溶液は、約１０μｇ〜約５００μｇの活性薬剤／用量を提供する噴霧器装置を用いて投与する。
【実施例】
【０１０６】
本発明の具体的な実施形態を例示するために以下の調製物および実施例を提供する。しかし、これらの具体的な実施形態は、具体的に指定した場合以外は、いかなる様式でも本発明の範囲を限定することを意図しない。
【０１０７】
別段に指定しない限りは以下の略記は以下の意味を有し、本明細書中で使用するが定義されていないすべての他の略記は、その標準の一般に認識されている意味を有する。
ＡｃＯＨ  酢酸
ＡＴ１  アンジオテンシンＩＩ  １型（受容体）
ＡＴ２  アンジオテンシンＩＩ  ２型（受容体）
ＢＳＡ  ウシ血清アルブミン
Ｂｕ４ＮＢｒ  臭化テトラブチルアンモニウム
ＤＣＣ  １，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＣＭ  ジクロロメタンまたは塩化メチレン
ＤＩＰＥＡ  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡＰ  ４−ジメチルアミノピリジン
ＤＭＦ  Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ  ジメチルスルホキシド
Ｄｎｐ  ２，４−ジニトロフェニル
ＤＯＣＡ  酢酸デオキシコルチコステロン
ＤＴＴ  １，４−ジチオスレイトール
ＥＤＣ  Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド
ＥＤＴＡ  エチレンジアミン四酢酸
ＥＧＴＡ  エチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−四酢酸
ＥｔＯＡｃ  酢酸エチル
ＥｔＯＨ  エタノール
ＨＡＴＵ  Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート
ＨＣＴＵ  （２−（６−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート）
ＩＰＡｃ  酢酸イソプロピル
Ｍｃａ  （７−メトキシクマリン−４−イル）アシル
ＭｅＣＮ  アセトニトリル
ＭｅＯＨ  メタノール
ＭＴＢＥ  メチルｔ−ブチルエーテル
ＮａＯＭｅ  ナトリウムメトキシド
ＮＢＳ  Ｎ−ブロモスクシンイミド
ＮＥＰ  ネプリライシン（ＥＣ３．４．２４．１１）
ＰＢＳ  リン酸緩衝生理食塩水
ＳＨＲ  自然発症高血圧ラット
ＴＦＡ  トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ  テトラヒドロフラン
トリス  トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
Ｔｗｅｅｎ−２０  モノラウリン酸ポリエチレングリコールソルビタン
別段に注記しない限りは、試薬、出発物質および溶媒などのすべての材料は商業的供給者（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｆｌｕｋａ  Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ、Ｓｔｒｅｍ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．など）から購入し、さらに精製せずに使用した。
【０１０８】
別段に注記しない限りは、反応は窒素雰囲気下で実行した。反応の進行は薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、分析用高速液体クロマトグラフィー（分析用ＨＰＬＣ）、および質量分析によって監視し、特定の実施例ではその詳細を記載する。分析用ＨＰＬＣで使用した溶媒は、溶媒Ａが９８％の水／２％のＭｅＣＮ／１．０ｍＬ／ＬのＴＦＡであり、溶媒Ｂが９０％のＭｅＣＮ／１０％の水／１．０ｍＬ／ＬのＴＦＡであった。
【０１０９】
それぞれの調製物または実施例で具体的に記載したように反応を後処理した。一般的に、抽出および温度や溶媒依存性の結晶化などの他の精製方法ならびに沈殿によって反応混合物を精製した。さらに、反応混合物は、分取ＨＰＬＣによって、典型的にはＭｉｃｒｏｓｏｒｂ  Ｃ１８およびＭｉｃｒｏｓｏｒｂ  ＢＤＳカラムパッキングならびに慣用の溶出液を用いて、ルーチン的に精製した。反応生成物の特徴づけは、質量および１Ｈ−ＮＭＲ分光測定によってルーチン的に実施した。ＮＭＲ測定には、試料を重水素化溶媒（ＣＤ３ＯＤ、ＣＤＣｌ３、またはＤＭＳＯ−ｄ６）に溶かし、Ｖａｒｉａｎ  Ｇｅｍｉｎｉ２０００機器（４００ＭＨｚ）を用いて、標準の観察条件下で１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを得た。化合物の質量分析同定は、典型的には、エレクトロスプレーイオン化方法（ＥＳＭＳ）を使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）モデルＡＰＩ  １５０ＥＸ機器またはＡｇｉｌｅｎｔ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）モデル１２００ＬＣ／ＭＳＤ機器を用いて実施した。
【０１１０】
調製物１
５−ブロモ−２−エトキシ−３Ｈ−イミダゾール−４−カルボアルデヒド
【０１１１】
【化２】
0005495396.tif 000005
【０１１２】
２，４，５−トリブロモ−１Ｈ−イミダゾール（１ａ）（９８．７ｇ、３２４ｍｍｏｌ、１．０当量）を１．２０ＬのＤＣＭに溶かし、０℃まで冷却した。これにＤＩＰＥＡ（６２ｍＬ、３６０ｍｍｏｌ、１．１当量）を加え、次いで［β−（トリメチルシリル）エトキシ］メチルクロライド（６０．２ｍＬ、３４０ｍｍｏｌ、１．０５当量）をゆっくりと加えた。溶液を室温までゆっくりと温めた。２時間後、混合物を１ＭのＨ３ＰＯ４／飽和ＮａＣｌ水溶液（１：１０；２×６００ｍＬ）で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、蒸発乾固して、中間体（１ｂ）が静置した際に固化したかすかな黄色液体として得られた（１３７ｇ）。
【０１１３】
中間体（１ｂ）（１３０ｇ、２９０ｍｍｏｌ、１．０当量）を無水ＥｔＯＨ（６５０ｍＬ）に溶かした。これにカリウムｔ−ブトキシド（９８．６ｇ、８７９ｍｍｏｌ、３．０当量）をゆっくりと加え、混合物を１６時間加熱還流した。その後、混合物を室温まで冷却し、濾過し、濃縮した。生じた油状物をＥｔＯＡｃ（８００ｍＬ）に溶かし、飽和ＮａＨＣＯ３（４００ｍＬ）で洗浄した。層を分離し、有機物を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮して、中間体（１ｃ）が茶色油状物として得られた（１１５．３ｇ）。ＭＳ  ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ＋］、Ｃ１１Ｈ２０Ｂｒ２Ｎ２Ｏ２Ｓｉの計算値４０１．９、実測値４０１．２。
【０１１４】
中間体（１ｃ）（６９．５ｇ、１７４ｍｍｏｌ、１．０当量）を無水ＴＨＦ（６００ｍＬ）に溶かし、窒素下で−７８℃まで冷却した。ヘキサン中のｎ−ブチルリチウムの２．５Ｍの溶液（７２．９ｍＬ、１８０ｍｍｏｌ、１．０５当量）を滴下し、混合物を−７８℃で１０分間撹拌した。その後、ＤＭＦ（４０ｍＬ、５２０ｍｍｏｌ、３．０当量）を加え、混合物を−７８℃で１５分間撹拌し、その後、室温まで温めた。反応を水（１０ｍＬ）で反応停止させ、ＥｔＯＡｃ（６００ｍＬ）で希釈し、水（１００ｍＬ）、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮した。回収した材料をシリカゲルクロマトグラフィー（１５〜３０％のＥｔＯＡｃ：ヘキサン）によって精製して、中間体（１ｄ）が淡黄色油状物として得られた（４５ｇ）。
【０１１５】
中間体（１ｄ）（１０５．８ｇ、３０３ｍｍｏｌ、１．０当量）を氷中、０℃で冷却した。ＴＦＡ（３００ｍＬ）を加え、混合物を０℃で１５分間撹拌し、その後、室温まで温めた。９０分後、混合物を減圧下で濃縮し、ＥｔＯＡｃ（７００ｍＬ）に再度溶かした。有機物を飽和バイカーボネート（２×６００ｍＬ）、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下で濃縮して、黄色固形物が得られた。材料をヘキサン（３００ｍＬ）に懸濁させ、０℃で３０分間撹拌した。材料を濾過し、固形物を冷ヘキサン（１５０ｍＬ）で洗浄して、表題化合物が淡い白色固形物として得られた（６１．２ｇ）。1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.4(m、3H)、4.5(m、2H)、5.2(s、1H)、9.2(d、1H)。
【０１１６】
調製物２
４’−ブロモメチル−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸ｔ−ブチルエステル
【０１１７】
【化３】
0005495396.tif 000006
【０１１８】
０℃で冷却したＤＣＭ中の１．０ＭのＤＣＣ（８００ｍＬ、８００ｍｏｌ）の溶液に、２−ブロモ安息香酸（２ａ）（１６１ｇ、８００ｍｍｏｌ）を加え、次いでＤＭＡＰ（９．０ｇ、７４０ｍｍｏｌ）およびｔ−ブチルアルコール（８２．４ｍＬ、８８０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で１０分間撹拌し、その後、室温まで温め、撹拌した。１６時間後、その後、混合物を濾過した。有機物を飽和ＮａＨＣＯ３（４００ｍＬ）、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、粗中間体（２ｂ）が油状物として得られた（２２８．８ｇ）。
【０１１９】
粗中間体（２ｂ）（１０９．６ｇ、４２６ｍｍｏｌ）および３−フルオロ−４−メチルフェニル−ボロン酸（７２．２ｇ、４４９ｍｍｏｌ）をイソプロピルアルコール（３６０ｍＬ、４．７ｍｍｏｌ）に懸濁させた。水中の炭酸ナトリウムの２．０Ｍの溶液（３６０ｍＬ、７２０ｍｍｏｌ）を加え、混合物を窒素下で脱気した。その後、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（４．９ｇ、４．３ｍｍｏｌ）を加え、混合物を９０℃で４６時間撹拌した。混合物を室温まで冷却し、ＥｔＯＡｃ（８００ｍＬ）で希釈し、層を分離した。有機物を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、減圧下で濃縮した。回収した油状物をシリカゲルクロマトグラフィー（３×４〜６％のＥｔＯＡｃ：ヘキサン）によって精製して、中間体（２ｃ）が透明な油状物として得られた（９３．３ｇ）。
【０１２０】
中間体（２ｃ）（８９．８ｇ、３１４ｍｍｏｌ、１．０当量）をＣＣｌ４（６２０ｍＬ、６．４ｍｏｌ）に溶かし、窒素下で脱気した。ＮＢＳ（５５．８ｇ、３１４ｍｍｏｌ）を加え、次いで過酸化ベンゾイル（１．５ｇ、６．３ｍｍｏｌ）を加え、混合物を９０℃、窒素下で７時間加熱した。反応を氷浴中で冷却し、濾過し、減圧下で濃縮した。回収した油状物を１５０ｍＬの３％のＥｔＯＡｃ：ヘキサンで粉砕した。溶液を−２０℃で２時間冷却し、その後、濾過し、冷３％のＥｔＯＡｃ：ヘキサン溶液（２００ｍＬ）で洗浄して、表題化合物がオフホワイト色固形物として得られた（８８．９ｇ）。1H-NMR(CDCl3)δ(ppm):1.3(m、9H)、4.6(s、2H)、7.0-7.1(m、2H)、7.3(dd、1H)、7.4(m、1H)、7.5(m、1H)、7.8(dd、1H)。
【０１２１】
調製物３
４’−（５−アミノメチル−２−エトキシ−４−エチルイミダゾール−１−イルメチル）−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸ｔ−ブチルエステル
【０１２２】
【化４】
0005495396.tif 000007
【０１２３】
５−ブロモ−２−エトキシ−３Ｈ−イミダゾール−４−カルボアルデヒド（４２．０ｇ、１９２ｍｍｏｌ）および４’−ブロモメチル−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸ｔ−ブチルエステル（７０．０ｇ、１９２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（８９０ｍＬ、１２ｍｏｌ）に溶かし、溶液を０℃で冷却した。炭酸カリウム（２６．５ｇ、１９２ｍｍｏｌ）をゆっくりと加え、混合物を０℃で終夜撹拌した。その後、反応を水で反応停止させた。混合物をＥｔＯＡｃ（３×３００ｍＬ）で抽出し、飽和ＮａＣｌ水溶液（５００ｍＬ）で洗浄し、減圧下で濃縮した。回収した油状物をＭｅＯＨ（４５０ｍＬ）に溶かした。撹拌しながら水（１１２ｍＬ）をゆっくりと加えて、生成物を沈殿させた。沈殿物をさらに１時間撹拌した後、濾過によって収集した。固形物をＥｔＯＡｃに溶かし、減圧下で濃縮した。残渣を終夜静置し、その後、３％のＥｔＯＡｃ：ヘキサン中で撹拌し、濾過によって収集した。濾液を減圧下で濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィーによって精製して、中間体（３ａ）（８．４ｇ）が得られた。
【０１２４】
中間体（３ａ）（５４．２ｇ、１０８ｍｍｏｌ）を１，２−ジメトキシエタン（６７０ｍＬ、６．５ｍｏｌ）に溶かした。テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（１２４０ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）を加えた。１５分後、水（２４０ｍＬ、１３ｍｏｌ）および炭酸カリウム（１４．９ｇ、１０８ｍｍｏｌ）を加え、混合物を８５℃、窒素下で加熱した。この温度で１０分間撹拌した後、２，４，６−トリビニルシクロトリボロキサンピリジン錯体（１１．７ｇ、４８．４ｍｍｏｌ）を加え、混合物を２時間撹拌した。その後、混合物をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で希釈し、水および飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、減圧下で濃縮した。混合物を別のロットと合わせ、シリカゲルクロマトグラフィー（０〜５０％のＥｔＯＡｃ：ヘキサン）によって精製して、中間体（３ｂ）（４７．１ｇ）が得られた。
【０１２５】
中間体（３ｂ）（１９．０ｇ、４２．２ｍｍｏｌ）をピリジン（２５０ｍＬ、３．１ｍｏｌ）に溶かした。塩酸ヒドロキシルアミン（８．８ｇ、１２６ｍｍｏｌ）を加え、次いで水（７５ｍＬ、４．２ｍｏｌ）を加え、混合物を室温で終夜撹拌した。その後、水（３００ｍＬ）を加え、混合物を３０分間撹拌した。沈殿剤を濾取し、真空下で乾燥させて、中間体（３ｃ）（１７．３ｇ）が得られた。
【０１２６】
中間体（３ｃ）（５．１ｇ、１１ｍｍｏｌ）を酢酸（１００ｍＬ、１．８ｍｏｌ）および硫酸（６４０μＬ、１２ｍｍｏｌ）に溶かした。混合物を窒素下で脱気し、１０％のＰｄ／Ｃ、Ｄｅｇｕｓｓａ型、湿５０％（０．０５：０．４５：０．５、パラジウム：カーボンブラック：水、１．５ｇ、７２３μｍｏｌ）を加えた。その後、混合物を水素下（５０ｐｓｉ）、Ｐａｒｒ揺動器上で脱気し、室温で揺動した。１２時間後、混合物を濾過し、減圧下で濃縮した。回収した材料をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）に溶かし、飽和ＮａＨＣＯ３（５０ｍＬ）および飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、その後、液体を蒸発させた。材料をシリカゲルクロマトグラフィー（０〜１０％のＭｅＯＨ：ＤＣＭ）によって精製して、表題化合物が透明な油状物として得られた（４．６ｇ、９６％の純度）。ＭＳ  ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ＋］、Ｃ２６Ｈ３２ＦＮ３Ｏ３の計算値４５４．３、実測値４５４．２。1H  NMR(CDCl3)  7.82(1H、d)、7.50(1H、t)、7.42(1H、t)  7.35(1H、d)、7.27(1H、d)、7.12(1H、s)、7.04(1H、d)、5.34(1H、b)、4.65(2H、s)、4.40(2H、q)、4.12(2H、q)、2.70(1H、b)、1.50(3H、t)、1.28(9H、s)、1.17(3H、t)。
【０１２７】
調製物４
（Ｓ）−２−アセチルスルファニル−４−メチルペンタン酸
【０１２８】
【化５】
0005495396.tif 000008
【０１２９】
Ｄ−ロイシン（８．２ｇ、６２．７ｍｍｏｌ）を水中の３．０ＭのＨＢｒ（９９ｍＬ、０．３ｍｏｌ）に溶かし、０℃まで冷却した。水中のＮａＮＯ２（６．９ｇ、１００ｍｍｏｌ）の溶液（１１．３ｍＬ、６２７ｍｍｏｌ）を２０分間かけてゆっくりと加えた。混合物を０℃で３時間撹拌し、その後、エチルエーテルで２回抽出し、水、その後飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮して、（Ｒ）−２−ブロモ−４−メチルペンタン酸（１１．５ｇ）がオフイエロー色の油状物として得られた。これをさらに精製せずに次のステップに持ち越した。
【０１３０】
チオ酢酸（４．２ｇ、５４．４ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（１００ｍＬ、１．０ｍｏｌ）を合わせ、混合物を氷浴中で冷却した。炭酸ナトリウム（５．８ｇ、５４．４ｍｍｏｌ）を加えた。３０分後、ＤＭＦ（２０ｍＬ）中の（Ｒ）−２−ブロモ−４−メチルペンタン酸（１０．１ｇ、５１．８ｍｍｏｌ）を滴下し、混合物を０℃〜室温で６時間かけて撹拌した。混合物を１００ｍＬのＥｔＯＡｃで希釈し、１００ｍＬの１：１の１ＮのＨＣｌ：飽和ＮａＣｌ水溶液で抽出した。層を分離し、水相を追加のＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で抽出した。有機物を合わせ、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。回収した油状物をジイソプロピルエーテル（４５ｍＬ、３２０ｍｍｏｌ）に溶かし、０℃で冷却した。ジシクロヘキシルアミン（１０．１ｍＬ、５０．７ｍｍｏｌ）を滴下し、固形物を溶液から出させた。さらに３０分間撹拌した後、材料を濾過し、７５ｍＬの冷ジイソプロピルエーテルで洗浄した。回収した固形物（１４ｇ）を１００ｍＬのＥｔＯＡｃに懸濁させた。１５０ｍＬの５％のＫＨＳＯ４を加え、層を分離した。有機物を飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。その後、回収した油状物を共沸させて（３×２５ｍＬのトルエン）、表題化合物（６．１ｇ）がジシクロヘキシルアミン塩として得られた。
【０１３１】
実施例１
４’−｛２−エトキシ−４−エチル−５−［（（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］イミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸
【０１３２】
【化６】
0005495396.tif 000009
【０１３３】
ＴＦＡ塩の調製
４’−（５−アミノメチル−２−エトキシ−４−エチルイミダゾール−１−イルメチル）−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸ｔ−ブチルエステル（５．０ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）、（Ｓ）−２−アセチルスルファニル−４−メチルペンタン酸（ジシクロヘキシルアミン塩；２．１ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）、４−メチルモルホリン（１．２ｍＬ、１１．０ｍｍｏｌ）、および１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（１．５ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）を合わせ、ＤＭＦ（１２０ｍＬ、１．６ｍｏｌ）に溶かし、その後、０℃で１０分間冷却した。ＥＤＣ（２ｍＬ、１１．０ｍｍｏｌ）を加え、混合物を０℃で１時間撹拌し、その後、室温で２時間撹拌した。反応を水（１００ｍＬ）で反応停止させ、生成物をＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）で抽出し、その後、濃縮した。混合物をカラムクロマトグラフィー（０〜５０％のＥｔＯＡｃ：ヘキサン）によって精製して、アセチルスルファニルエステル中間体、４’−｛５−［（（Ｓ）−２−アセチルスルファニル−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］−２−エトキシ−４−エチルイミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸ｔ−ブチルエステルが得られた。
【０１３４】
このエステル中間体をＤＣＭ：ＴＦＡ（それぞれ１０ｍＬ）に溶かし、混合物を室温で３時間撹拌し、その後、濃縮した。残渣をＥｔＯＡｃ中に取り、飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮して、５．３ｇのアセチルスルファニル酸中間体、４’−｛５−［（（Ｓ）−２−アセチルスルファニル−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］−２−エトキシ−４−エチルイミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸が得られた。
【０１３５】
この酸中間体をＭｅＯＨ（３０ｍＬ）に溶かした。溶液を脱気し、窒素下で撹拌し、０℃で冷却した。ＭｅＯＨ中の０．５ＭのＮａＯＭｅ（２５ｍＬ、２当量）を加え、混合物を０℃、窒素下で２０分間撹拌した。その後、混合物を１ＮのＨＣｌ（１５ｍＬ）で酸性化した。混合物を濃縮し、ＥｔＯＡｃに溶かし、水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、その後、濃縮した。生成物を分取ＨＰＬＣ、０．５％のＴＦＡを含む１０〜７０％のＭｅＣＮ：水（７０分方法）によって精製して、２．３ｇのＴＦＡ塩が得られた。
【０１３６】
ＨＣｌ塩の調製
Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ  ＩＲＡ−９００樹脂（８０ｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を１ＭのＨＣｌ（６００ｍＬ）に懸濁させた。混合物を６０分間かけて時折揺動した。上清のバルクを傾瀉して湿樹脂が得られた、その後、これを１００ｍＬのプラスチックカラムに移した。通過した溶出液のｐＨが約５となるまで、水（２００ｍＬ）および５０％のＭｅＣＮ水溶液（２００ｍＬ）を用いた溶出によってカラムを洗浄した。４’−｛２−エトキシ−４−エチル−５−［（（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイル−アミノ）メチル］イミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸のＴＦＡ塩（２．３ｇ、３．５ｍｍｏｌ）を５０％のＭｅＣＮ水溶液（８ｍＬ）に溶かし、準備したカラムに装填した。化合物を重力下で５０％のＭｅＣＮ水溶液を用いて溶出させた。画分を５ｍＬの体積で収集し、ＨＰＬＣによって分析した。所望の質量を有する画分を合わせ、凍結乾燥して、表題化合物がＨＣｌ塩として得られた（１．５ｇ、９７％の純度）。
【０１３７】
表題化合物の調製
このＨＣｌ塩をＭｅＯＨ（５ｍＬ）および水（５ｍＬ）に溶かし、混合物はｐＨ２．２を有していた。一連の１００μＬの１ＮのＮａＯＨの注入を用いて材料のｐＨを４．２までゆっくりと上げ、その後、１ＮのＨＣｌ（２５μＬ）、ＮａＯＨ（２×２５μＬ）、その後、ＨＣｌ（２５μＬ）で調整して、等電点に到達した。溶液は曇っていることが観察された。材料は油分離していた（ｏｉｌｉｎｇ  ｏｕｔ）。ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）を加えて固形物を抽出し、その後、これを水層から除去し、濃縮して、表題化合物（１．３ｇ、９８％の純度）が得られた。イオンクロマトグラフィーを用いたこの材料のイオン含有量の分析により、０．０６％のＮａ、０．１％のＣｌ、および＜０．１％のＴＦＡ（ｗ／ｗ）が得られた。
【０１３８】
実施例２
４’−｛２−エトキシ−４−エチル−５−［（（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］イミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸の結晶性遊離塩基
実施例１に記載のように調製した４’−｛２−エトキシ−４−エチル−５−［（（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］−イミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸は、粉末Ｘ線回折によって非結晶性であることが決定された。
【０１３９】
この非晶形（３５．７ｍｇ）をアセトン（１ｍＬ）に加えて、約３６ｍｇ／ｍＬの溶液が得られた。溶液を３５〜４０℃まで約３０分間加熱し、その後、徐々に室温まで冷却した。その後、溶液を約４４時間冷蔵した（４℃）。沈殿物が観察され、室温の穏やかな窒素流下で体積が半分に減った。固形物を単離し、窒素下で乾燥させて、表題結晶性化合物（２２．３ｍｇ）が得られた。生成物の結晶性性質はＸＲＰＤパターン、ＤＳＣ温度記録計、およびＴＧＡのトレース分析によって確認した。
【０１４０】
実施例３
粉末Ｘ線回折
粉末Ｘ線回折パターンは、Ｒｉｇａｋｕ  Ｍｉｎｉｆｌｅｘ  ＰＸＲＤ回折計を用いて、Ｃｕ  Ｋα（３０．０ｋＶ、１５．０ｍＡ）の照射を使用して得た。分析は、２〜４０°の２シータの角度の範囲にわたって０．０３°のステップサイズを用いた、２°（２θ）／分の連続走査モードで実行する角度計で行なった。試料は、粉末材料の薄層として石英検体ホルダー上で調製した。機器は、ケイ素金属標準を用いて、±０．０２°の２シータの角度以内に較正した。実施例２の結晶形の試料の代表的なＰＸＲＤパターンを図１に示す。
【０１４１】
図１に示される、数々の強い粉末回折ピークおよび比較的平らなベースラインは、実施例２の結晶形が良好な結晶化度を保有していたことを強く示す。それとは正反対に、結晶化前の出発物質である実施例１の非晶質化合物はどの回折ピークも示さなかった。
【０１４２】
実施例４
熱分析
示差走査熱量（ＤＳＣ）は、熱分析コントローラを備えたＴＡ  ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓモデルＱ−１００モジュールを用いて行なった。データを収集し、ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ熱溶液ソフトウェアを用いて分析した。覆ったアルミニウムパン内に実施例２の結晶形の１．６４ｍｇの試料を正確に秤量した。２２℃で５分の等温平衡期間の後、２２℃から２５０℃までの１０℃／分の直線加熱勾配を用いて試料を加熱した。代表的なＤＳＣ温度記録計を図２に示す。
【０１４３】
ＤＳＣ温度記録計は、本発明の結晶性化合物が約１４４℃の融点を有し、１５０℃未満で熱分解がなく、優れた熱安定性を有することを実証している。この複雑でない熱プロフィールは、１４４℃での融解吸熱より前に望ましくない吸熱または発熱ピークを全く示さず、これは、この結晶性固形物が無水結晶形である可能性が最も高いことを示唆している。
【０１４４】
代表的なＴＧＡのトレースを図３に示し、これは実施例２の結晶形の試料が室温から２００℃までに少量（約１．８％）の重量を失ったことを示しており、これは、残留の水分または溶媒の損失と一致している。
【０１４５】
実施例５
動的水分収着評価
ＶＴＩ大気微量天秤（ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ  ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ）、ＳＧＡ−１００システム（ＶＴＩ  Ｃｏｒｐ．、Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＬ、３３０１６）を用いて、実施例２の結晶形の試料について動的水分収着（ＤＭＳ）評価（水分収着−脱離プロフィールとしても知られる）を行なった。約４．２７ｍｇの試料サイズを使用し、湿度は分析の開始時に周囲値に設定した。ＤＭＳ分析は、２％の相対湿度（ＲＨ）から９０％のＲＨの全湿度範囲にわたって５％のＲＨ／ステップの走査測度からなっていた。ＤＭＳの実行は２５℃の等温で行なった。代表的なＤＭＳプロフィールを図４に示す。
【０１４６】
ＤＭＳプロフィールは、本発明の結晶性化合物が重要でない吸湿性を有する可逆的な収着／脱離プロフィールを有することを実証している。結晶性化合物は、２％のＲＨから９０％のＲＨまでの広範囲の湿度に曝した際に少しの重量増加しか有さず、７５％までのＲＨに曝された際に約１％未満の重量増加しか有さず、これは、結晶形は周囲条件下において最小限の吸湿性の危険性しか保有しないことを示している。
【０１４７】
実施例６
４’−｛２−エトキシ−４−エチル−５−［（（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］イミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸の結晶性遊離塩基
実施例２に記載の様式と同様であるが、アセトンの代わりにＭｅＣＮを使用して、表題結晶性化合物を調製した。
【０１４８】
非晶質４’−｛２−エトキシ−４−エチル−５−［（（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイルアミノ）−メチル］イミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸（９８．８ｍｇ）をＭｅＣＮ（４ｍＬ）に加えて、約２４．７ｍｇ／ｍＬの溶液が得られた。溶液を３５℃まで約３０分間加熱し、その後、徐々に室温まで冷却した。その後、溶液を約４２時間冷蔵した（４℃）。沈殿物が観察され、室温の穏やかな窒素流下で体積が半分に減った。固形物を単離し、窒素下で乾燥させて、表題結晶性化合物（７３．８ｍｇ）が得られた。
【０１４９】
同様のＰＸＲＤパターン、ＤＳＣ温度記録計、およびＴＧＡのトレースによって証明されるように、同じ結晶性物質が実施例２と同様に得られた。しかし、この物質は、約１５１℃のわずかに高い融点によって証明されるように、実施例２の物質と比較して向上した結晶化度の特性を示した。
【０１５０】
調製物５
結晶性遊離塩基４’−（５−アミノメチル−２−エトキシ−４−エチルイミダゾール−１−イルメチル）−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸ｔ−ブチルエステル
【０１５１】
【化７】
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【０１５２】
５−ブロモ−２−エトキシ−３Ｈ−イミダゾール−４−カルボアルデヒド（２２．０ｇ、１００ｍｍｏｌ、１．１当量）、４’−ブロモメチル−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸ｔ−ブチルエステル（３３．０ｇ、９０ｍｍｏｌ、１当量）、およびＢｕ４ＮＢｒ（１．６ｇ、５ｍｍｏｌ、０．０５当量）を、トルエン（４００ｍＬ）および１ＮのＮａＯＨ（１２０ｍＬ、１２０ｍｍｏｌ、１．２当量）に溶かした。生じた混合物を２７℃で４８〜６０時間撹拌した。トルエン層を分離し、水（２×２００ｍＬ）で洗浄し、その後、蒸留によって除去した。ＥｔＯＨ（３５０ｍＬ）を残渣に加え、固体が溶けるまで混合物を５０〜６０℃まで加熱した。混合物を４時間かけて室温まで冷却し、その後、４℃まで冷却し、４℃で４時間撹拌した。固形物を濾取し、冷ＥｔＯＨ（６０ｍＬ）で洗浄し、室温、真空下で２４時間乾燥させて、中間体（５ａ）（約３９ｇ）が得られた。
【０１５３】
中間体（５ａ）（２０．０ｇ、４０ｍｍｏｌ、１当量）、カリウムエチルトリフルオロボレート（７．１ｇ、５２ｍｍｏｌ、１．３当量）、酢酸パラジウム（ＩＩ）（２２４ｍｇ、１ｍｍｏｌ、０．０２５当量）、ｃａｔａＣＸｉｕｍ（登録商標）Ａ（ブチルジ−１−アダマンチルホスフィン、ＣＡＳ＃３２１９２１−７１−５、５３８ｍｇ、１．４５ｍｍｏｌ、０．０４当量）、およびＣｓ２ＣＯ３（４５ｇ、１３８ｍｍｏｌ、３．４５当量）を、トルエン（２４０ｍＬ）および水（８０ｍＬ）に溶かした。混合物を真空下で窒素（３×）を用いてフラッシュし、その後、９０℃まで１６時間加熱した。その後、混合物を室温まで冷却し、層を分離した。有機層を水（２×２００ｍＬ）で洗浄し、その後、減圧下で蒸留して、油状物が得られた。油状物をＥｔＯＨ（２４０ｍＬ）に溶かした。水（８０ｍＬ）を加え、混合物を３０分間撹拌した。混合物を濾過して固体を除去し、固形物を７５％のＥｔＯＨ（１３０ｍＬ）で洗浄し、濾液を収集して、ＥｔＯＨ溶液中の中間体（５ｂ）が得られ、これを次のステップで直接使用した。
【０１５４】
中間体（５ｂ）（１０ｍｍｏｌ、１当量）のＥｔＯＨ溶液を、塩酸ヒドロキシルアミン（２７．２ｇ、５２ｍｍｏｌ、１．３当量）およびＮａＨＣＯ３（３５．２ｇ、３．４５当量）と合わせた。混合物を４０℃で２４時間撹拌し、その後、室温まで冷却した。沈殿剤を濾取し、７５％のＥｔＯＨ（１００ｍＬ）および５０％のＥｔＯＨ（２００ｍＬ）で洗浄し、その後、減圧下、３０℃で２４時間乾燥させて、中間体（５ｃ）（１５ｇ）が得られた。
【０１５５】
中間体（５ｃ）（５ｇ）を、ＥｔＯＨ（１００ｍＬ）、ＮＨ４ＯＨ（２８％、６ｍＬ）、およびレイニーＮｉ（湿１０ｇ）と合わせて、スラリーを形成した。混合物を窒素下で脱気し（３×）、水素下（３×）で脱気し、その後、水素下（１ａｔｍ）で３時間撹拌した。混合物を濾過して触媒を除去し、固形物をＥｔＯＨ（２０ｍＬ）で洗浄した。その後、濾液を木炭（０．５ｇ）で処理し、再度濾過した。その後、濾液を真空下で蒸留して、油状物が得られた。ヘプタン（５０ｍＬ）を加え、混合物を蒸留して、油状物を形成した（２×）。混合物を加熱し、４℃で２４時間撹拌することによって残った油状物をヘプタン（６０ｍＬ）に溶かした。その後、固形物を濾過し、冷ヘプタン（１０ｍＬ）で洗浄し、室温で２４時間乾燥させて、表題化合物が結晶性物質として得られた（３．８ｇ）。
【０１５６】
調製物６
結晶性遊離塩基４’−｛５−［（（Ｓ）−２−アセチルスルファニル−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］−２−エトキシ−４−エチルイミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸
【０１５７】
【化８】
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【０１５８】
結晶性４’−（５−アミノメチル−２−エトキシ−４−エチルイミダゾール−１−イルメチル）−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸ｔ−ブチルエステル（ジシクロヘキシルアミン塩、１８ｇ、４０ｍｍｏｌ、１当量）、（Ｓ）−２−アセチルスルファニル−４−メチルペンタン酸（１８ｇ、４８ｍｍｏｌ、１．２当量）、およびＨＣＴＵ（１９ｇ、４８ｍｍｏｌ、１．２当量）を、事前に冷却した容器（０℃で１０分間）中で合わせ、冷ＤＣＭ（２４０ｍＬ）を加えた。混合物を１±２℃で５〜１５時間撹拌した。４％のＮａＨＣＯ３（２００ｍＬ）を加え、混合物を１５分間撹拌した。ＤＣＭ層を分離し、約１００ｍＬまで蒸留した。ＩＰＡｃ（１５０ｍＬ）を加え、１５０ｍＬまで蒸留した。さらなるＩＰＡｃ（２００ｍＬ）を加え、混合物を４％のＮａＨＣＯ３（２×２００ｍＬ）および水（２００ｍＬ）で洗浄した。溶液を１５％のＮＨ４Ｃｌ（３００ｍＬ）と共に１５分間撹拌し、１ＮのＨＣｌを用いてｐＨを５．５に調整し、その後、１時間撹拌した。固形物を濾取した。濾液をＩＰＡｃ（５０ｍＬ）で洗浄し、ＩＰＡｃ層を分離した。ＩＰＡｃ層を１５％のＮＨ４Ｃｌ（２００ｍＬ）と共に３時間撹拌し、すべての固体を濾取した。濾液を飽和ＮａＣｌ水溶液（１５０ｍＬ）で洗浄し、真空下で約６０ｍＬまで蒸留した。ＤＣＭ（５０ｍＬ）を加え、留去した。ＤＣＭ（２００ｍＬ）を加え、混合物を０〜５℃で冷却した。ＴＦＡ（７０ｍＬ）を１５℃未満でゆっくりと加え（わずかに発熱性）、混合物を２０℃で１６時間撹拌した。混合物を約１５０ｍｌまで濃縮し、ＩＰＡｃ（１５０ｍＬ）を加えた。混合物を約１５０ｍＬまで蒸留した。さらなるＩＰＡｃ（１５０ｍＬ）を加え、約１５０ｍＬまで再度蒸留した。ＩＰＡｃ（２００ｍＬ）を加え、生じた溶液を、１０℃未満の事前に冷却した水（２５０ｍＬ）中のＫ２ＣＯ３（５２ｇ）に１５分間かけてゆっくりと加えた（穏やかに発熱性、ｐＨ＞７、反応停止中は＞６でなければならない）。移行中にｐＨを監視し、ｐＨが６未満に下がった場合はさらなる塩基（８ｇ）を加えた。ＩＰＡｃ層を分離し、飽和ＮａＣｌ水溶液（１５０ｍＬ）で洗浄した。ＩＰＡｃ溶液を約５０ｍＬまで蒸留した。ＭＴＢＥ（１００ｍＬ）を加え、混合物を約５０ｍＬまで蒸留した。さらなるＭＴＢＥ（１００ｍＬ）を加え、混合物を室温で３時間撹拌してスラリーを形成し、その後、これを４℃で１６時間撹拌した。固形物を濾取し、ＭＴＢＥ／ジイソプロピルエーテル（１：１；１００ｍＬ）で洗浄した。その後、固形物を室温で６０時間、窒素下で乾燥させて、表題化合物が結晶性物質として得られた（１８．２ｇ）。
【０１５９】
実施例７
４’−｛２−エトキシ−４−エチル−５−［（（Ｓ）−２−メルカプト−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］イミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸の結晶性遊離塩基
結晶性４’−｛５−［（（Ｓ）−２−アセチルスルファニル−４−メチルペンタノイルアミノ）メチル］−２−エトキシ−４−エチルイミダゾール−１−イルメチル｝−３’−フルオロビフェニル−２−カルボン酸（２．３ｇ、４ｍｍｏｌ、１当量）およびＤＴＴ（６２ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ、０．１当量）をＭｅＯＨ（３０ｍＬ）に溶かした。生じた溶液を窒素で脱気し（３回）、０℃で冷却した。ＮａＯＭｅ（ＭｅＯＨ中に２５％、１．７ｍＬ）を加え、混合物を０℃で３０分間撹拌した。ＡｃＯＨ（３ｇ、５０ｍｍｏｌ、４当量）を加えて反応を０℃で反応停止させた。混合物を２０℃まで温めた。脱イオン水（１０ｍＬ）をゆっくりと加えた。混合物を２０℃で３時間撹拌し、その後、沈殿物が形成されるまで４℃で１時間撹拌した。固形物を濾過し、ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（２：１；３０ｍＬ）で洗浄し、その後、窒素下、２０℃で４８時間乾燥させて、表題結晶性化合物（１．２ｇ）が得られた。
【０１６０】
同様のＰＸＲＤパターン、ＤＳＣ温度記録計、およびＴＧＡのトレースによって証明されるように、同じ物質が実施例２と同様に得られた。
【０１６１】
実施例８
熱安定性
実施例６のように調製した結晶形の試料を６０℃で５日間加熱した。試料はその純度の２％のみを失い、したがって、本発明の結晶性化合物は優れた熱安定性を有する。他方で、実施例１の非晶質化合物の試料は６０℃で１日間加熱した後にその純度の約５０％を失った。
【０１６２】
実施例９
微粒子化
実施例７のように調製した結晶性遊離塩基の試料をジェットミルで微粒子化して、易流動性の白色粉末が得られた。微粒子化プロセス中に問題には遭遇しなかった。粒子径の分布は以下のとおりであった。
【０１６３】
【表３】
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【０１６４】
微粒子化したしていない材料と比較して、微粒子化した材料において粉末Ｘ線回折パターン、ＴＧＡ、ＤＳＣ、ＤＭＳ、化学純度、キラル純度および水分含有量の顕著な変化は観察されなかった。たとえば、実施例５に注記されているように、実施例２の結晶性遊離塩基の試料の代表的なＤＭＳのトレースでは、４０〜７５％のＲＨの湿度範囲で１％未満の重量増加が示された一方で、実施例７のように調製した微粒子化した結晶性遊離塩基はこの湿度範囲内で０．７％の重量増加を示した。
【０１６５】
実施例１０
赤外線分析
赤外線（ＩＲ）吸収スペクトルは、Ｎｉｃｏｌｅｔ減衰全反射（ＡＴＲ）試料ホルダーを備えたＡｖａｔａｒ３６０ＦＴ−ＩＲ分光計を用いて、４０００〜６７５ｃｍ−１の周波数範囲にわたって決定した。実施例６のように調製した結晶性遊離塩基の試料の代表的なＩＲ吸収スペクトルを図５に示し、ピークのリストを以下に提供する。
【０１６６】
【表４】
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【０１６７】
有意な吸収バンドが３３２４±１、２９５８±１、２８７２±１、２５２７±１、１７０９±１、１６４３±１、１５５１±１、１５００±１、１３５７±１、１２５４±１、１１３３±１、１０６２±１、８６９±１、７９９±１、７５９±１、および６９５±１ｃｍ−１で観察された。
【０１６８】
実施例１１
固体状態の安定性評価
それぞれの約１００ｍｇの、実施例７のように調製した結晶性遊離塩基の試料を、複数のバイアル中、５℃（密閉容器）、２５℃（密閉容器）、および４０℃（密閉容器）で保管した。指定した間隔で、代表的なバイアルの内容物全体を以下のＨＰＬＣ方法によって分析した。
【０１６９】
カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂｏｘ  ＳＢ−Ｃ１８、４．６×２５０ｍｍ、５μｍ（部品番号８８０９７５−９０２）。移動相Ａ：８０％のＨ２Ｏ、２０％のＭｅＣＮ、０．０１％のＴＦＡ。移動相Ｂ：８０％のＭｅＣＮ、２０％のＨ２Ｏ、０．０１％のＴＦＡ。流速：１ｍＬ／分。注入体積：２０μＬ。検出器：２５０ｎｍ。
【０１７０】
試料は、ＨＰＬＣ上に注射するために、溶解度に応じて１００％のＭｅＣＮ中に０．２〜０．５ｍｇ／ｍＬのストック溶液として調製した。
【０１７１】
試料の純度はＨＰＬＣの面積のパーセンテージ（％ＡＵＣ）として決定した。２８日間保管した後、すべての条件下で保持した結晶性遊離塩基試料について、化学的純度に検出可能な変化はなく、物質の外見に観察可能な変化はなかった。
【０１７２】
たとえば、以下に示すように、４０℃で２８日間保管した後、結晶性遊離塩基の化学的純度に検出可能な変化はなかった一方で、非晶質遊離塩基およびＴＦＡ塩（どちらも実施例１に記載のように調製した）は純度の低下を示した。
【０１７３】
【表５】
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【０１７４】
アッセイ１
ＡＴ１およびＡＴ２の放射性リガンド結合アッセイ
これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いて、ＡＴ１およびＡＴ２受容体と結合する試験化合物の能力を評価した。
【０１７５】
ヒトＡＴ１またはＡＴ２受容体を発現する細胞からの膜調製物
クローニングしたヒトＡＴ１またはＡＴ２受容体を安定して発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ−Ｋ１）由来の細胞系を、それぞれ、１０％のウシ胎児血清、１０μｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、および５００μｇ／ｍｌのジェネティシンを添加したＨＡＭ−Ｆ１２培地中、５％のＣＯ２加湿インキュベーター内、３７℃で成長させた。ＡＴ２受容体を発現する細胞は、１００ｎＭのＰＤ１２３，３１９（ＡＴ２拮抗剤）をさらに存在させて成長させた。培養物が８０〜９５％のコンフルエンスに達した際、細胞をＰＢＳで徹底的に洗浄し、５ｍＭのＥＤＴＡで持ち上げた。細胞を遠心分離によってペレット化し、ＭｅＯＨ−ドライアイス中でスナップ凍結し、さらに使用するまで−８０℃で保管した。
【０１７６】
膜調製物には、細胞ペレットを溶解緩衝液（２５ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、４℃、１ｍＭのＥＤＴＡ、および１錠剤の完全プロテアーゼ阻害剤カクテル錠＋５０ｍＬの緩衝液あたり２ｍＭのＥＤＴＡ（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１６９７４９８、Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ））中に再懸濁させ、氷上でタイトフィットのＤｏｕｎｃｅガラスホモジナイザー（１０回のストローク）を用いてホモジナイズした。ホモジネートを１０００×ｇで遠心分離し、上清を収集し、２０，０００×ｇで遠心分離した。最終ペレットを膜緩衝液（７５ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．３ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、２５０ｍＭのスクロース、４℃）中に再懸濁させ、２０Ｇゲージの針を通して押し出すことによってホモジナイズした。膜懸濁液のタンパク質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ、（１９７６）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、７２：２４８−５４に記載の方法によって決定した。膜をＭｅＯＨ−ドライアイス中でスナップ凍結し、さらに使用するまで−８０℃で保管した。
【０１７７】
ヒトＡＴ１およびＡＴ２アンジオテンシン受容体に対する化合物の親和性を決定するためのリガンド結合アッセイ
結合アッセイは、９６ウェルのＡｃｒｏｗｅｌｌフィルタープレート（Ｐａｌｌ  Ｉｎｃ．、カタログ番号５０２０）中、１００μＬの全アッセイ体積で、アッセイ緩衝液（５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２０℃、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２５μＭのＥＤＴＡ、０．０２５％のＢＳＡ）中、ヒトＡＴ１受容体を含有する膜には０．２μｇの膜タンパク質、またはヒトＡＴ２受容体を含有する膜には２μｇの膜タンパク質を用いて行なった。リガンドのＫｄ値を決定するための飽和結合研究は、Ｎ末端をユーロピウムで標識したアンジオテンシン−ＩＩ（［Ｅｕ］ＡｎｇＩＩ、Ｈ−（Ｅｕ−Ｎ１）−Ａｈｘ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＯＨ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を、０．１ｎＭ〜３０ｎＭの範囲の８個の異なる濃度で用いて行なった。試験化合物のｐＫｉ値を決定するための置換アッセイは、２ｎＭの［Ｅｕ］ＡｎｇＩＩおよび１ｐＭ〜１０μＭの範囲の１１個の異なる濃度の薬物を用いて行なった。薬物をＤＭＳＯ中に１ｍＭの濃度で溶かし、そこから、アッセイ緩衝液で連続希釈した。非特異的結合は、１０μＭの非標識のアンジオテンシン−ＩＩの存在下で決定した。アッセイは、１２０分間、暗所、室温または３７℃でインキュベーションし、Ａｃｒｏｗｅｌｌフィルタープレートを通して迅速に濾過することによって結合反応を停止させ、次いで、Ｗａｔｅｒｓ濾過マニフォールドを用いて２００μＬの氷冷洗浄バッファー（５０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、４℃、５ｍＭのＭｇＣｌ２）で３回洗浄した。プレートを軽く叩いて乾燥させ、５０μｌのＤＥＬＦＩＡ増強溶液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒカタログ番号４００１−００１０）と共に、室温で５分間、揺動器上でインキュベーションした。フィルターと結合した［Ｅｕ］ＡｎｇＩＩを、Ｆｕｓｉｏｎプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）上で時間分解蛍光（ＴＲＦ）を用いてすぐに定量した。結合データは、１部位競合の３−パラメータモデルを使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアパッケージ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて、非直線回帰分析によって分析した。ＢＯＴＴＯＭ（曲線最小値）は、１０μＭのアンジオテンシンＩＩの存在下で決定される、非特異的結合の値に固定されていた。薬物のＫｉ値を、観察されたＩＣ５０値およびＣｈｅｎｇら、（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２２（２３）：３０９９−１０８に記載のＣｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ方程式に従った［Ｅｕ］ＡｎｇＩＩのＫｄ値から計算した。ＡＴ２受容体よりもＡＴ１受容体に対する試験化合物の選択性を、ＡＴ２Ｋｉ／ＡＴ１Ｋｉの比として計算した。試験化合物の結合親和性はＫｉ値の負の１０を底とする対数（ｐＫｉ）として表した。
【０１７８】
このアッセイでは、より高いｐＫｉ値は、試験化合物が試験した受容体に対してより高い結合親和性を有することを示す。実施例１の化合物は、約７．０を超えるｐＫｉ値を有することが判明した。
【０１７９】
アッセイ２
ヒトおよびラットＮＥＰならびにヒトＡＣＥでの阻害効力（ＩＣ５０）を定量するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
ヒトおよびラットＮＥＰならびにヒトアンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）での化合物の阻害活性は、以下に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いて決定した。
【０１８０】
ラット腎臓からのＮＥＰ活性の抽出
ラットＮＥＰを成体スプラーグドーリーラットの腎臓から調製した。腎臓全体を冷ＰＢＳで洗浄し、腎臓１ｇあたり５ｍＬの緩衝液の比の氷冷溶解緩衝液（１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、Ｂｏｒｄｉｅｒ、（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５６：１６０４−１６０７）中にとった。ｐｏｌｙｔｒｏｎ手持ち組織粉砕器を用いて試料を氷上でホモジナイズした。ホモジネートを、スイングバケツローター内で５分間、３℃で、１０００×ｇで遠心分離した。ペレットを２０ｍＬの氷冷溶解緩衝液中に再懸濁させ、氷上で３０分間インキュベーションした。その後、試料（１５〜２０ｍＬ）を２５ｍＬの氷冷クッション緩衝液（６％ｗ／ｖのスクロース、５０ｍＭのｐＨ７．５、トリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０６％、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４）上に層状に重ね、３７℃まで３〜５分間加熱し、スイングバケツローター内で室温で３分間、１０００×ｇで遠心分離した。上部の２層を吸引除去し、濃縮された膜画分を含有する粘稠の油性沈殿物が残った。グリセロールを５０％の濃度まで加え、試料を−２０℃で保管した。タンパク質濃度は、ＢＳＡを標準として用いたＢＣＡ検出システムを使用して定量した。
【０１８１】
酵素阻害アッセイ
組換えヒトＮＥＰおよび組換えヒトＡＣＥを購入した（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ、カタログ番号それぞれ１１８２−ＺＮおよび９２９−ＺＮ）。蛍光発生ペプチド基質Ｍｃａ−ＢＫ２（Ｍｃａ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｄｎｐ）−ＯＨ、Ｊｏｈｎｓｏｎら、（２０００）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２８６：１１２−１１８）をヒトＮＥＰおよびＡＣＥアッセイに使用し、Ｍｃａ−ＲＲＬ（Ｍｃａ−ＤＡｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−（Ｄｎｐ）−ＯＨ、Ｍｅｄｅｉｒｏｓら、（１９９７）Ｂｒａｚ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓ．、３０：１１５７−１１６２）をラットＮＥＰアッセイに使用した（どちらもＡｎａｓｐｅｃ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡからのもの）。
【０１８２】
試験化合物をアッセイ緩衝液で１０μＭ〜２０ｐＭの１２個の濃度まで希釈した。アッセイは、２５μＬの酵素を１２個の濃度のそれぞれの１２．５μＬの試験化合物に加えることによって開始させた。試験化合物を酵素と１０分間平衡させた後、１２．５μＬの蛍光原基質を加えて反応を開始させた。２０分間のインキュベーション後に１０μＬの３．６％の氷酢酸を加えることによって反応を停止させた。
【０１８３】
スルフヒドリル含有試験化合物では、試験化合物を４００μＭの濃度のトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）（ＴＣＥＰ）を含有するアッセイ緩衝液で希釈し得る。その後、試験化合物を４０分間、室温で還元させた後、酵素を加える。その後、試験化合物を酵素と２０分間平衡させた後、蛍光原基質を加える。反応は上記のように停止させる。
【０１８４】
プレートは、励起および発光波長をそれぞれ３２０ｎｍおよび４０５ｎｍに設定し、蛍光光度計で読み取った。生データ（相対蛍光単位）を、それぞれ３個の標準のＮＥＰおよびＡＣＥ阻害剤を用いた平均の高い読取り（阻害なし、１００％の酵素活性）および平均の低い読取り（完全阻害、最高の阻害剤濃度、０％の酵素活性）からの％活性に対して正規化した。正規化したデータの非直線回帰を１部位競合モデル（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いて行なった。データはｐＩＣ５０値として報告した。実施例１の化合物は約７．０以上のｐＩＣ５０値を有することが判明した。
【０１８５】
本発明は、その具体的な態様または実施形態を参照しながら記載したが、当業者には、本発明の真の精神および範囲から逸脱せずに、様々な変化を行なうことができる、または均等物を置換することができることが理解されよう。さらに、適用される特許法および規定によって許可される程度に、本明細書中で引用するすべての出版物、特許および特許出願は、それぞれの文書が本明細書中に個々に参考として組み込まれている場合と同じ程度に、その全体で本明細書中に参考として組み込まれている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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