(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体において、所望の抗原への免疫応答を増強するための組成物であって、
特異的に阻害されたクラスＡマクロファージスカベンジャー受容体(SR-A)を有する樹状細胞を含むこと、および
前記所望の抗原が腫瘍抗原であり、前記クラスＡマクロファージスカベンジャー受容体がshRNAによって特異的に阻害されていること
を特徴とする組成物。
【請求項２】
前記樹状細胞が前記所望の抗原に曝露されたものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記所望の抗原を発現する腫瘍の増殖を抑制するために投与される、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記樹状細胞が、前記個体から単離されたものであり、且つ、前記所望の抗原に曝露されたものである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
個体において、所望の抗原への免疫応答を増強するための組成物であって、
前記所望の抗原と、クラスＡマクロファージスカベンジャー受容体(SR-A)を特異的に阻害する能力を有する薬剤とを含むこと、および、
前記所望の抗原が腫瘍抗原であり、前記薬剤がshRNAを含むこと
を特徴とする組成物。
【請求項６】
腫瘍と診断された個体において、前記腫瘍によって発現された抗原への免疫応答を増強することによって、前記腫瘍の増殖を抑制する組成物であって、
クラスＡマクロファージスカベンジャー受容体(SR-A)を阻害する能力を有する薬剤と、前記腫瘍抗原とを含むこと、および
前記薬剤がshRNAを含むこと
を特徴とする組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫療法の一般分野に関し、より詳しくは、抗原への免疫応答を増大するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
クラスＡマクロファージスカベンジャー受容体(SR-A)は、抗菌防御の第一線の中で、マクロファージ(Mφ)によって一次的に発現される(非特許文献１)。SR-Aは、まとめてスカベンジャー受容体と呼ばれる、構造的に多様な膜受容体の拡大ファミリーのプロトタイプメンバーである(非特許文献２および３)。このグループの受容体は、化学的に修飾または改変された分子、小胞体(ER)常在性シャペロン、および、血管性疾患の発生に関連する変性リポ蛋白を含む、複数のリガンドを認識する(非特許文献３〜５)。SR-Aは、最初はアセチル化低密度リポ蛋白質(acLDL)のためのクリアランス受容体として同定され(非特許文献３および６)、アテローム性動脈硬化におけるその関与の研究が、この疾患との関連性のため主要となっている。しかしながら、グラム陰性のリポ多糖(LPS)およびグラム陽性菌のリポタイコ酸が、他の既知のSR-Aリガンドの結合と競合し、SR-Aがパターン認識受容体として機能することを示すことも、明らかになった(非特許文献２)。この関連で、スズキらは、最初はSR-A-/-マウスが、リステリア菌および単純ヘルペスウイルスによる感染に対する保護を損なうことを報告した(非特許文献７)。他人による独立した研究も、SR-Aの発現が、細菌感染に対する免疫応答の開始において重要かもしれないことを示している(非特許文献８〜１０)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Hughes, et al. Eur J Immunol 1995;25:466-73.
【非特許文献２】Pearson et al. Chem Biol 1998;5:R193-203.
【非特許文献４】Krieger et al. Curr Opin Lipidol 1997;8:275-80.
【非特許文献５】Berwin et al. Embo J 2003;22:6127-36.
【非特許文献６】Kodama et al. Proc Natl Acad Sci U S A 1988;85:9238-42.
【非特許文献７】Suzuki et al. Nature 1997;386:292-6.
【非特許文献８】Thomas et al. J Exp Med 2000;191:147-56.
【非特許文献９】Ishiguro et a.. Am J Pathol 2001;158:179-88.
【非特許文献１０】Peiser et al. Infect Immun 2002;70:5346-54.
【非特許文献１１】Kunjathoor et al. J Biol Chem 2002;277:49982-8.
【非特許文献１２】Wang et al. Cancer Res 2003;63:2553-60.
【非特許文献１３】Bloom et al. J Exp Med 1997;185:453-9.
【非特許文献１４】Overwijk et al. J Exp Med 1998;188:277-86.
【非特許文献１５】Udono et al. Proc Natl Acad Sci U S A 1994;91:3077-81.
【非特許文献１６】Sugiura et al. Cancer Res 1955;15:38-51.
【非特許文献１７】Popovic et al. Clin Exp Metastasis 1998;16:623-32.
【非特許文献１８】Engelhard et al. Immunological Reviews 2002;188:136-46.
【非特許文献１９】Bondanza et al. J Exp Med 2004;200:1157-65.
【非特許文献２０】Asano et al. J Exp Med 2004;200:459-67.
【非特許文献２１】Cohen et al. J Exp Med 2002;196:135-40.
【非特許文献２２】Platt et al. Proc Natl Acad Sci U S A 1996;93:12456-60.
【非特許文献２３】Platt et all. J Immunol 2000;164:4861-7.
【非特許文献２４】Rubinson et al. Nat Genet 2003;33:401-6.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、アテローム性動脈硬化における、及び病原体認識におけるSR-Aについての情報が利用できるにもかかわらず、その獲得免疫における役割はほとんど知られておらず、したがって、免疫応答を向上させるためにSR-Aの調節を伴う技術を開発する必要がなお存在している。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、個体における所望の抗原への免疫応答を増強するための方法を提供する。前記方法は、個体に所望の抗原およびクラスＡマクロファージスカベンジャー受容体(SR-A)を阻害（抑制）する能力を有する薬剤を投与することを含む。前記薬剤および抗原を個体に投与することによって、個体内での抗原に対する免疫応答が増強される。
【０００６】
別の実施形態では、個体における腫瘍への免疫応答を増強するための方法が提供される。前記方法は、個体に、腫瘍への免疫応答を増強するのに有効な量にて、クラスＡマクロファージスカベンジャー受容体(SR-A)を阻害する能力を有する薬剤を投与することを含み、この際、腫瘍の増殖は、前記薬剤の投与後に抑制される。前記方法はさらに、前記腫瘍によって発現される抗原を個体に投与することを含んでもよい。
【０００７】
前記薬剤は、SR-Aを特異的に阻害できる物質の任意の組成物であればよい。このような薬剤の例には、SR-A mRNAの転写および／または翻訳に干渉するポリヌクレオチドが含まれるがこれに限定されない。前記薬剤は、SR-Aに結合して拮抗する抗体でもよい。前記薬剤は、SR-A拮抗物質として使用できる様々な既知のスルホンアミドベンズアニリド化合物のいずれかでもよい。
【０００８】
個体に樹状細胞を含む組成物を投与することを含む、所望の抗原への免疫応答を増強するための方法も提供される。ここで、前記樹状細胞は特異的に阻害されたSR-Aを特徴とする。前記方法はさらに、前記個体への投与前にインビトロで所望の抗原に前記樹状細胞を曝露する(さらす；接触させる)ことを含んでもよい。
【０００９】
本発明は、実質的に精製された哺乳類の樹状細胞の集団を含む組成物も提供する。ここで、前記樹状細胞は特異的に阻害されたSR-A活性によって特徴付けられる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、SR-A-/-マウス(SR-A欠損マウス)において低免疫原性腫瘍の拒絶という結果をもたした、イオン化照射(IR)処理D121ルイス肺癌細胞によるワクチン接種から得られたデータのグラフ表示である。マウス(n=5)は、137Cs照射D121細胞で免疫され、一週間後に生存D121腫瘍細胞(4×105細胞)を接種(チャレンジ)された。各曲線は個々のマウスそれぞれにおける腫瘍増殖を示す(p<0.05、免疫SR-A-/- vs 非免疫SR-A-/-または免疫野生型(WT)マウス)。示される結果は、実施された３つの代表的な実験に基づく。
【図２】図２は、UV照射されたB16メラノーマ細胞がSR-A-/-マウスにおいて腫瘍防御効果を与えることを実証するデータのグラフ表示である。マウス(n=5)は、UV照射B16細胞で免疫されるか、B16細胞に由来する細胞溶解物で免疫されるか、または未処理とされた。一週間後、マウスは生存B16腫瘍細胞(2×105細胞)を接種され、腫瘍増殖の追跡調査が行われた(p<0.05、免疫SR-A-/- vs 非免疫SR-A-/-または免疫野生型(WT)マウス)。示される結果は、実施された３つの独立した実験を表す。
【図３】図３は、CD8+Ｔ細胞がSR-A-/-マウスにおける防御的な抗腫瘍免疫にとって重要であることを示すデータのグラフ表示である。Ｔ細胞のサブセットの欠乏は、ワクチン接種の前にインビボの抗体注射によって行われた。マウス(n=10)はその後照射D121細胞で免疫され、その後生存D121細胞を用いて腫瘍の誘発(チャレンジ)を行った。腫瘍の発生は、一日おきにモニターされた(P=0.002［ログランク検定による］、CD8+Ｔ細胞欠乏グループ vs IgGグループ；P=0.002、カラゲナングループ vs IgGグループ；P>0.05、CD4+欠乏グループ vs IgGグループ)。
【図４】図４は、照射腫瘍細胞を用いたワクチン接種がSR-A-/-マウスにおいて、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)応答を誘発することを示すデータのグラフ表示である。照射B16細胞による免疫化(ワクチン接種)の一週間後、WTマウスまたはSR-A-/-マウス(n=3)から単離された脾細胞(1×106細胞)は、一晩、20U/mlのIL-2の存在下にて、5μg/mlのCTLエピトープgp10025-32，TRP2180-188有りまたは無しで一晩刺激されるか、あるいは照射B16細胞もしくはD121細胞のどちらかで刺激された。INF-γ産生は、エリスポット(ELISPOT)アッセイを用いて測定された。３つの独立した実験から得られた代表的なデータを示す。
【図５】図５は、WTおよびSR-A-/-マウスの両方から得られたMφがアポトーシス細胞を効率的に貪食することを実証するデータのグラフ表示である。UV処理D121腫瘍細胞はCFSEで標識された。非結合の色素は、等体積のウシ胎児血清とのインキュベーションによって消光された。細胞は洗浄され、チオグリコール酸-誘発Mφとともに、2：1の比率で、４時間共培養された。接着Mφは収集され、CD11b-PE抗体で染色された。Mφによる食作用は、B-D FACScaliberを用いた蛍光標識細胞分取器(FACS)によって、二重陽性染色細胞の割合として計数された(p>0.05、SR-A-/-由来のMφ vs WT由来のMφ)。示された結果は、代表的な３つの独立した実験を表す。
【図６】図６は、照射腫瘍細胞による処置が、SR-A-/-マウスにおいて、樹立腫瘍細胞を根絶することを実証するデータのグラフ表示である。マウス(n=8)は、0日目に、D121ルイス肺癌またはB16メラノーマ(2×105細胞)で樹立された。照射D121細胞またはB16細胞は、２，４，６，８日目に投与された。それぞれの曲線は、各マウスにおける腫瘍の増殖を表す(p<0.05、免疫されたSR-A-/- vs 免疫されていないSR-A-/-)。示された結果は、実施された３つの代表的な実験に基づく。
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、SR-A欠損DCsが、抗原特異的腫瘍免疫をより効率的に刺激することを実証するデータのグラフ表示である。図７Ａ：７日目：WTまたはSR-A-/- C57BL6マウスから得られた骨髄由来の樹状細胞(BM-DCs)は６時間OVAプロテイン(10μg/ml)でパルスされ、その後LPS(10ng/ml)で一晩刺激された。WT C57BL/6マウス(n=6)は、１週間間隔で２度、抗原負荷されたWTまたはSR-A-/DCs(マウス当たり1×106細胞)をワクチン接種され、その後、1×105のB16-OVAメラノーマ細胞で腫瘍チャレンジされた。図７Ｂ：WT C57BL/6マウスは、１週間間隔で２度、OVAプロテイン-パルスWTまたはSR-A-/-BM-DCsで免疫された。二度目のワクチン接種後１週間目に、脾細胞は収集され、IL-2の存在下で、OVA-特異的 MHC I-制限CTLエピトープ OVA257-264(1μg/ml)で刺激された。IFN-γ産生細胞の数はELISPOTアッセイを用いて測定された。
【図８】図８Ａおよび８Ｂは、SR-A発現停止DCsが抗原特異的抗腫瘍免疫の刺激において極めて強力であることを実証するデータを表す。図８Ａ：DC1.2細胞(ウェル当たり1×106細胞)は、MOI 10でLV-SRA-shRNA、LV-スクランブル-shRNAを形質移入されるか、未処理のままとされた。細胞は２日後に収集され、免疫ブロットにかけられた。β-アクチンは対照として使用された。図８Ｂ：DC細胞は感染の２日後に収集され、３時間OVAプロテイン(10μg/ml)でパルスされた。LPS(10ng/ml)での一晩の刺激後、DCsは充分に洗浄され、マウスの皮下に注射された。ワクチン接種は、一週間後に繰り返された。マウスは２度目の免疫化の一週間後、B16-OVAでチャレンジされた。
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、SR-A発現停止DCsが抗原特異的CTL応答を誘発するのに非常に効果的であることを実証するデータのグラフ表示である。図９Ａ：C57BL/6マウスはLV-スクランブル-shRNAまたはLV-SRA-shRNA感染DC1.2細胞で免疫された。脾細胞はその後収集され、OVA-特異的 MHC I-制限CTLエピトープ OVA257-264で刺激された。IFN-γ産生は、ELISPOTアッセイを用いて測定された。図９Ｂ：免疫された動物由来の脾細胞は、IL-2の存在下で５日間OVA257-264で刺激され、51Cr-標識B16-OVA腫瘍細胞と、様々な比率で共培養された。T-エフェクター細胞の細胞傷害性は、クロムリリースアッセイを使用して測定された。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、個体において所望の抗原への免疫応答を増強するための方法を提供する。当該方法は、前記個体にクラスＡマクロファージスカベンジャー受容体(SR-A)を特異的に阻害する能力を有する薬剤を投与することを含む。前記薬剤は、前記個体において前記抗原への免疫応答を増強するために有効な量にて投与される。それ故に、本発明の方法は、個体における所望の抗原への免疫応答であって、前記薬剤が投与されなかった場合より大きな免疫応答を誘発する。ある実施形態では、前記所望の抗原が前記個体に投与されてもよい。
【００１２】
「所望の抗原」とは、前記個体において、その抗原への増強された免疫応答が治療的有用性をもたらすことが期待される抗原である。前記の増強された免疫応答は、前記抗原への増強された液性の応答、前記抗原への増強された細胞性の応答、またはそれらの組合せであってもよい。
【００１３】
SR-Aを特異的に阻害する能力を有する薬剤は、SR-Aタンパクへ結合することによって、またはSR-AをコードしているDNAおよび／またはRNAにハイブリッド形成することによって、SR-Aの発現および／または機能を妨げるものである。SR-Aに結合する薬剤は、リガンド結合を減じるかブロックすることによって、それを特異的に阻害できる。SR-AをコードしているDNAおよび／またはRNAにハイブリッド形成する薬剤は、SR-A mRNA転写および／または翻訳を妨害することによって、および／またはSR-A mRNAの分解を引き起こすことによってSR-Aを特異的に阻害できる。
【００１４】
本発明は、抗原への免疫応答におけるSR-Aの予想外の役割の発見に基づく。特に、我々は、照射された腫瘍細胞を用いた野生型マウス(すなわち、実験的に変化させたSR-A発現を持たないマウス)のワクチン接種が、その腫瘍細胞への免疫応答を誘発するのに有効でないが、そのようなワクチン接種は、SR-A欠損(SR-A-/-)マウスにおいて、その腫瘍細胞を用いたその後のチャレンジに対する長期にわたる免疫をもたらすことができることを観察した。この効果は、低免疫原性腫瘍D121ルイス肺癌およびB16メラノーマに対して実証された。さらに、照射腫瘍細胞の投与は、SR-A欠損マウスにおいて樹立された腫瘍を縮小させることができたが、それらの野生型の対応物においてはできなかった。重要なことに、我々は、SR-A-/-マウスにおいて観察された抗原への増強された免疫応答が、野生型マウスではSR-Aの特異的阻害によって再現できることも実証する。このことを実証するために、我々は野生型(SR-A +/+)マウスから樹状細胞(DCs)を単離し、RNAiストラテジーを使用してそのDCs中のSR-Aを阻害し、そのDCsにモデル抗原卵白アルブミン(OVA)を負荷し、そのDCsを前記マウスに戻し、そのマウスにOVA-発現B16メラノーマ細胞を投与(チャレンジ)した。この手法を使用したところ、ネガティブコントロール群の100％のマウスがチャレンジ後18日以内に腫瘍を有したのに対し、処理したマウスでは腫瘍チャレンジ後の36日目にも腫瘍は検出されなかった。我々は、DCsにおけるSR-Aの発現減少(ダウンレギュレーション)が、抗原特異的CTL応答を、ネガティブコントロールより効果的に促進することも実証した。このように、我々は抗原提示細胞(例えば、樹状細胞)におけるSR-Aの特異的阻害が、低免疫原性抗原への無応答性または弱応答性の免疫反応を逆行させることができることを発見し、且つ、我々のデータは、マウスにおいて増強された抗原特異的CTL応答が、自然免疫と獲得免疫の両方に関してSR-Aレセプターの相互作用に重要であることを示す。このように、本発明は、所望の抗原に対する免疫を増強させる方法を提供すると考えられる。
【００１５】
SR-Aを阻害する能力を有する任意の薬剤が、本発明の方法において使用されてもよい。例えば、前記薬剤はSR-A mRNAの転写および／または翻訳に干渉するポリヌクレオチド、SR-Aに結合し、そのリガンドとの結合を阻害し、あるいはまたそのレセプターに拮抗する抗体、または特異的にSR-Aを阻害できる他の任意の化合物であってもよい。
【００１６】
様々な種に由来するSR-Aのヌクレオチドおよびアミノ酸配列は当該分野において既知である。例えば、ハツカネズミ(マウス)SR-AのmRNAおよびアミノ酸配列は、エントリーNM 031195(2006年1月28日エントリー)の下、全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)のデータベースにて提供されている。ヒト(人間)SR-AのmRNAおよびアミノ酸配列は、エントリーBC 063878(2006年8月11日エントリー)の下、NCBIデータベースにて提供されている。これらのマウスおよびヒトSR-A配列は、46%のヌクレオチド相同性および70%のアミノ酸相同性を共有する。
【００１７】
当技術分野において３つのSR-Aアイソタイプが存在することが認識されている。アイソタイプ１および２はmRNAスプライシングに由来しており、一方、アイソタイプ３は小胞体中に存在する非機能性SR-Aであると信じられている。本発明において使用されるSR-A阻害剤は、各アイソタイプを特異的に阻害できる能力を有することが好ましい。この関連で、本明細書中で記載されるSR-A欠損マウスでは３つ全てのSR-Aアイソタイプが欠けており、３つ全てのアイソタイプが、本発明の一実施形態を実証するのに使用されるRNAiストラテジーによって阻害される。
【００１８】
前記薬剤がポリヌクレオチドである場合、前記薬剤はRNAポリヌクレオチド、DNAポリヌクレオチド、あるいはDNA/RNAハイブリッドであってもよい。前記ポリヌクレオチドは、ハンマーヘッド型リボザイムなどのリボザイム、アンチセンスRNA、siRNA、DNAザイム、ヘアピンリボザイム、あるいはSR-A mRNAもしくはDNAとハイブリッド形成することを含むプロセスによってSR-Aを阻害することができる任意の修飾もしくは未修飾ポリヌクレオチドであってもよい。リボザイム、アンチセンスRNA、siRNA、およびDNAザイムをデザインする方法は、当技術分野において周知である。そのような薬剤は、SR-AをコードしているRNAもしくはDNA配列とのハイブリダイゼーションを通じて少なくとも一部作用するであろうことが理解されるであろう。したがって、本発明のポリヌクレオチド薬剤は、生理的条件の下、RNAもしくはDNAとハイブリッド形成するために、十分な長さと、SR-AをコードしているRNAもしくはDNAとの相補性を有するであろう。一般に、前記ポリヌクレオチド薬剤の少なくとも約１０個の連続するヌクレオチドが、SR-AをコードするDNAもしくはRNAと相補的であるか同一であるべきである。
【００１９】
前記ポリヌクレオチド薬剤は、ポリヌクレオチドの安定性を増すために、修飾ヌクレオチドおよび／または修飾ヌクレオチド結合を含んでもよい。それらを作製するために好適な修飾および方法は、当技術分野において周知である。本発明において使用するための修飾ポリヌクレオチド薬剤の例には、修飾されたリボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが含まれるが、これに限定されない。例えば、修飾リボヌクレオチドは、１〜６個の飽和もしくは不飽和の炭素原子を含む--O--低級アルキル基による、あるいは２〜６個の炭素原子を有する--O--アリール基による、リボース部分の2'位の置換を含んでもよく、ここで、そのようなアルキルもしくはアリール基は非置換であってもよく、あるいは置換されていてもよい(例えば、ハロ、ヒドロキシ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、カルボキシル、カルバルコキシル、もしくはアミノ基で；またはヒドロキシ、アミノもしくはハロ基で)。ヌクレオチドはホスホジエステル結合によって、または合成結合(すなわち、ホスホジエステル結合以外の結合)によって、連結されていてもよい。本発明にて使用されることができるポリヌクレオチド薬剤におけるヌクレオシド間の結合の例には、ホスホジエステル、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、リン酸エステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホロアミデート、カルバメート、カルボネート、モルホリノ、ホスフェート トリエステル、アセタミデート、カルボキシメチル エステルまたはそれらの組合せが含まれるが、これらに限定されない。 
【００２０】
一実施形態では、前記薬剤は、SR-A mRNAのRNA干渉(RNAi)介在性の発現停止(サイレンシング)もしくは発現低下(ダウンレギュレーション)において使用するためのsiRNAである。RNAi剤は、一般に、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)として細胞内に発現する。shRNAは、センス鎖、アンチセンス鎖、およびセンスとアンチセンスフラグメント間のショートループ配列を含むRNA分子である。shRNAは、細胞質内に輸送され、そこで、ダイサーによって、低分子干渉RNA(siRNA)に加工される。siRNAは、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)によって認識される２１〜２３ヌクレオチドの二本鎖のRNA分子である。RISC内に取り込まれると、siRNAは標的mRNAの切断と分解を促進する。したがって、SR-A発現のRNAi介在性サイレンシングもしくはダウンレギュレーションにおいて使用するために、前記ポリヌクレオチド薬剤は、siRNAであってもshRNAであってもよい。
【００２１】
本発明のshRNAは、２つの別個の相補的なRNA分子として、あるいは２つの相補的な領域を有する単一のRNA分子として、組換えウイルスベクターから発現させることができる。この関連で、発現させるshRNA分子(複数でもよい)のためのコード配列を受容する能力のある任意のウイルスベクターが使用できる。好適なベクターの例には、アデノウイルス(AV)、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス(例えば、レンチウイルス(LV)、ラブドウイルス、マウス白血病ウイルス)、ヘルペスウイルスなどに由来するベクターが含まれるが、これらに限定されない。好ましいウイルスはレンチウイルスである。ウイルスベクターの指向性は、別のウイルス由来のエンベロープタンパク質または他の表面抗原による、当該ウイルスのシュードタイピングによって修飾されることもできる。本発明での使用に好適なshRNA配列の一例は、配列番号１として与えられる。組換えベクターに由来する細胞内でのshRNAの発現に代わるものとして、化学的に安定化させたshRNAもしくはsiRNsを本発明の方法における薬剤として投与してもよい。
【００２２】
別の実施形態では、前記薬剤はSR-Aを認識する抗体であってもよい。本発明において使用される抗体は、前記抗体の結合が、SR-Aレセプターの活性を妨害するおよび／またはSR-Aリガンド結合を妨害するように、適宜SR-Aに結合するであろう。レセプターのＣ末端部に存在することが知られており、アミノ酸位置１２５〜４５８の、SR-Aの細胞外領域に、前記抗体が結合することが好ましい。
【００２３】
本発明において使用されるSR-Aを認識する抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナルであってもよい。前記抗体はモノクローナルであることが好ましい。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を作製する方法は、当技術分野において周知である。さらに、セロテック社(イギリス、オックスフォード)の2F8モノクローナル抗体のように、アンチ-SR-A抗体が市販されている。
【００２４】
本発明の方法において、抗体の抗原結合性フラグメントが使用され得ることが予期されている。好適な抗体フラグメントの例には、Fab、Fab'、F(ab')2、およびFvフラグメントが含まれる。様々な技術が抗体フラグメントの産生のために開発されており、当技術分野において周知である。
【００２５】
前記抗体あるいはその抗原結合性フラグメントがヒト化しうることも予期される。非ヒト抗体をヒト化するための方法も当技術分野において周知である(例えば、Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)参照)。
【００２６】
SR-Aを阻害できる他の薬剤も既知である。例えば、米国特許第6,458,845号は、SR-A拮抗物質として使用できる様々なスルホンアミドベンズアニリド化合物についての記述を提供し、そしてSR-A拮抗作用を測定する方法も記載している。これらの化合物および方法に関する記述は、参照によりここに包含される。
【００２７】
治療目的で使用するためのSR-Aを阻害できる薬剤を含んでいる組成物は、製薬的に許容される任意の好適なキャリアー、賦形剤および／または安定剤と、前記薬剤を混合することによって調製できる。前記薬剤と混合するために好適な組成物の例は、以下に見受けられる：Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2005) 21版, Philadelphia, PA. Lippincott Williams & Wilkins.。
【００２８】
前記薬剤がポリヌクレオチドである場合、それは、送達試薬との併用でネイキッドポリヌクレオチドとして、または前記ポリヌクレオチド薬剤を包含するか発現する組換えプラスミドもしくはウイルスベクターとして、個体に投与されることができる。投与のために好適な送達試薬には、Mirus社のTransit TKO親油性試薬；リポフェクチン；リポフェクタミン；セルフェクチン；またはポリカチオン(例えば、ポリリジン)、あるいはリポソームが含まれる。
【００２９】
一実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、前記ポリヌクレオチド薬剤を含む樹状細胞などの抗原提示細胞の投与を経て、個体に投与される。
【００３０】
一般に、本発明の方法にかかる治療用途のための製剤は、個体において所望の抗原に対する免疫応答を増強するのに有効な量の薬剤を含む。当業者は、その薬剤の分子構造、処置される個体の大きさおよび年齢、および疾患のタイプとステージのようなファクターを考慮に入れ、本発明の薬剤のための投与計画を策定する方法を認識するであろう。所望の抗原も前記個体に投与される場合、当該所望の抗原は、任意の上述のルート経由で前記薬剤の投与の前に、同時に、あるいは後で投与されることができる。
【００３１】
SR-Aを阻害する薬剤を含み、且つ、任意に免疫応答の増強が望まれる抗原を含む組成物は、非経口、皮下、腹腔内、肺内および鼻腔内を含む、薬物送達のために好適な、利用可能な方法およびルートを用いて個体に投与されることができる。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内および皮下の投与を含む。
【００３２】
薬剤の有無にかかわらず前記薬剤の投与は、その抗原と関連する疾患もしくは障害を治療することを目的としている通常療法と併せて実施されることができる。例えば、前記方法が腫瘍抗原への免疫応答を増強するために使用される場合、前記薬剤は、従来の抗ガン治療法の前に、同時に、もしくは後に投与されることができる。そのような治療法には、化学療法、外科的処置、および放射線療法が含まれるが、これらに限定されない。
【００３３】
任意の所望の抗原に対する増強された免疫応答が本発明の方法を使用して達成されうることが予期される。そのような抗原の例には、感染性生物上に存在する抗原および癌細胞によって発現される抗原が含まれるが、これらに限定されない。所望の抗原は、特徴がはっきりしていてもよく、未知であってもよく、例えば、腫瘍もしくはバクテリアのようなある特定の細胞型由来の溶解物中における既知の存在以外のものであってもよい。本発明に有用な抗原は、市販のものでもよく、標準的な方法によって調製されてもよい。
【００３４】
一実施形態において、前記抗原は腫瘍抗原である。腫瘍抗原は、従来技術によって、例えばロイペプチンとアプロチニンを含有するリン酸緩衝食塩水中で、腫瘍細胞／組織を繰り返し凍結し解凍することによる腫瘍細胞溶解物の調製によって得ることが出来る(新鮮腫瘍生検組織から、あるいは組織培養によってインビトロで産生された腫瘍細胞から得られる)。そのような冷凍と解凍は細胞の溶解をもたらす。腫瘍溶解物は、遠心分離および上澄液の収集によって得ることが出来る。腫瘍細胞溶解物は、直ちに使用することもでき、あるいは冷凍し、使用するまで-70℃で保管することもできる。前記抗原は精製された形で、または部分的に精製された形で、もしくは細胞溶解物として未精製の形で使用することができる。あるいは、前記抗原は、多種多様の発現系のいずれかにおける組換えDNA技術によって発現されてもよい。
【００３５】
腫瘍抗原に対する免疫応答を増強することに関連して、一実施形態では、本発明は、腫瘍を有すると診断された個体において、その腫瘍によって発現された抗原に対する免疫応答を増強する方法を提供する。当該方法は、前記個体に、前記抗原に対する免疫応答を増強するのに有効な量にて、SR-Aを阻害できる薬剤を投与することを含み、この際、腫瘍の増殖は薬剤の投与後に抑制される。任意に、前記腫瘍によって発現される抗原も前記個体に投与してもよい。
【００３６】
別の実施形態において、本発明は、個体において、所望の抗原に対する免疫応答を増強するための方法を提供する。当該方法は、前記個体に樹状細胞などの抗原提示細胞(APCs)を投与することを含む。ここで、当該細胞は前記所望の抗原に曝露されており、当該細胞においてSR-Aは特異的に阻害されている。SR-Aが特異的に阻害された樹状細胞とは、細胞の分裂、転写もしくは翻訳といった細胞プロセスの、より全般的な阻害を誘発する薬剤にのみ曝露されたものに対して、SR-Aを特異的に阻害できる薬剤を含むおよび／または当該薬剤に曝露された樹状細胞を意味する。この実施形態の実行において、前記樹状細胞は従来技術を使用してまず個体から単離されてもよい。前記樹状細胞は、所望の抗原に対する増強した免疫応答が意図される個体から単離されてもよい。前記薬剤は、単離された樹状細胞内のSR-Aを特異的に阻害するために、単離された樹状細胞に投与されてもよい。単離された樹状細胞は、例えば、前記樹状細胞に抗原蛋白を前投与することによって、または前記細胞に抗原をコードしているDNAを形質移入することによって、所望の抗原に曝露されてもよい。前記の単離された樹状細胞は、所望の抗原に対する増強された免疫応答を誘発するために、個体に投与されることもできる。前記個体に投与される樹状細胞は、従って、前記個体への投与に際し、前記薬剤および／または抗原を含んでいてもよい。
【００３７】
一実施形態において、本発明は、樹状細胞を含む組成物の有効量を個体に投与することによって、個体での腫瘍に対する免疫応答を増強するための方法を提供し、ここで、前記樹状細胞は特異的に阻害されたSR-Aを有することによって特徴付けられ、前記組成物の投与は、前記腫瘍に対する免疫応答を増強し、前記組成物の投与後、前記腫瘍の増殖が抑制される。前記方法はさらに、前記個体への投与前に、前記樹状細胞を前記腫瘍によって発現された抗原に曝露することを含んでもよく、且つ、任意の既存の抗癌療法の使用を含んでもよい。好ましい抗癌療法は、癌細胞の照射である。
【００３８】
様々なアプローチ(例えば、抗体、shRNA発現停止または抑制性分子)を使用するSR-A機能の阻害は、腫瘍の免疫介在性の拒絶もしくはコントロールを促進するために、様々な状況において利用されることができる。例えば、単離されたDCs(当該DCsにおいてSR-Aは阻害されている)は、抗原を負荷されることや、抗原をコードしているcDNAもしくはmRNAを形質移入されることができる。修飾されたDCsは抗原特異的免疫応答の産生のために、ホストにワクチンとして投与されてもよい。このアプローチはまた、感染症と関連する抗原に対する免疫応答の増大のために使用されてもよい。
【００３９】
担癌患者は、放射線療法もしくは化学療法などの他の通常療法で治療され、その後、腫瘍部位に、SR-Aが阻害されたDCsのインサイツ(in situ)投与を続けてもよい。DCsが、損傷された腫瘍からリリースされた抗原を捕獲し、腫瘍特異的免疫応答の誘導のためにホストの免疫系に抗原を提示することが予期される。
【００４０】
別の実施形態において、前記ホストは抗原もしくは腫瘍特異的ワクチンで免疫されてもよく、ワクチン有効性を改善するために、免疫されたホストに、全身的もしくは局所的なDCsにおけるSR-A阻害を達成するための戦略を適用することができる。
【００４１】
別の実施形態において、本発明は、実質的に精製された樹状細胞を含む組成物を提供し、ここで、前記樹状細胞は、特異的に阻害されたSR-A発現および／または機能によって特徴付けられる。そのような樹状細胞は、例えば、ホストから細胞を単離し、既存の技術を用いて他の細胞タイプから樹状細胞を実質的に精製し、当該樹状細胞を特異的にSR-Aを阻害する能力を有する薬剤に曝露させることによって、調製可能である。そのような細胞は、前記ホストにおいて増強された免疫応答が望まれる抗原に曝露され、前記ホストに再び導入されてもよい。
【００４２】
本発明の具体的な実施形態を以下の実施例に示すが、当該実施例は、本発明を説明することを意図し限定を意図しない。
【実施例１】
【００４３】
本実施例は、SR-A(-/-)マウスの作製および、特定の抗原への免疫応答に対する、マウスにおけるSR-Aノックアウトの効果の説明を提供する。
以下の物質および方法が、本実施例において示される結果を得るのに使用された。
【００４４】
マウスおよび細胞株
SR-A欠損マウス(非特許文献７)はC57BL/6Jマウス(非特許文献１１)と戻し交配され、Ｍ．フリーマン(ハーバード・メディカル・スクール)およびＢ．ベルヴィン(ダートマス・メディカル・スクール)によって提供された(非特許文献５および１１)。野生型(WT)C57BL/6マウスはジャクソン研究所(メイン州、バール・ハーバー)から購入した。マウスはロズウェル・パーク癌研究所の特定病原体除去施設内で維持された。動物のケアと実験は、施設および国立衛生研究所(NIH)のガイドラインに従って行われ、施設の実験動物委員会によって承認された。B16(F10)細胞(H-2b)、ATCCおよびD121細胞株(H-2b)由来の自然発症マウスメラノーマ、我々の研究所のＳ．フェルローネによって提供されたルイス肺癌の亜系統は、DMEM中で維持され、10%の熱失活ウシ胎児血清(ニューヨーク州、グランドアイランド、ライフテクノロジー社)、2mMのL-グルタミン、100U/mlのペニシリン、および100μg/mlのストレプトマイシンが追加された。
【００４５】
ワクチン接種用の腫瘍細胞の調製
腫瘍細胞は、137CS-照射器中で100Gyでイオン化照射(IR)によって処理されるか、UV光(カリフォルニア州、ラ・ホーヤ、ストラタジーン社、ストラタリンカー1800)に５分間曝された。細胞はその後洗浄され、PBS中に1×107細胞/mlにて再懸濁された。細胞溶解物の調製のために、腫瘍細胞はPBS中で懸濁され、４サイクルの急速な凍結／融解曝露に供され、細胞片(デブリ)を除去するために４℃にて１０分間12000rpmで回転された。
【００４６】
腫瘍の研究
腫瘍チャレンジ(tumor challenge)の研究のために、マウス(１グループ当たり５匹のマウス)は、1×106の照射腫瘍細胞による左側腹部の皮下注射で免疫された。いくつかのケースでは、一週間後に２度目の追加免疫が行われた。免疫化の７日後、マウスは、右側腹部への生B16(マウス当たり2×105細胞)またはD121腫瘍細胞(マウス当たり4×105細胞)の皮下注射によってチャレンジされた。治療の研究のために、マウスは、０日目に2×105のD121腫瘍細胞またはB16腫瘍細胞を接種され、その後、２，４，６および８日目に照射腫瘍細胞を用いて治療された。腫瘍の増殖は一日おきにモニターされた。腫瘍体積(腫瘍量)は式［Ｖ＝(最短径２×最長径)／２］を使用して計算された。
【００４７】
酵素結合免疫吸着スポット(ELISPOT)アッセイ
すでに記述されているようにELISPOTアッセイを用いて、腫瘍特異的もしくは抗原特異的IFN-γを分泌するＴ細胞を測定するために、免疫されたマウスまたは腫瘍のないマウスから脾細胞を単離した(非特許文献１２)。手短に説明すると、ろ過プレート(マサチューセッツ州、ベッドフォード、ミリポア社)は４℃にて一晩、10μg/mlのラット抗マウスINF-γ抗体(カリフォルニア州、サンディエゴ、ファーミンゲン社、クローンR4-6A2)でコートされた。プレートはその後洗浄され、10%のFBSを含有する培養液でブロックされた。脾細胞(1×106／ウェル)は、5μg/mlのH-2Kb制限CTLエピトープ TRP2180-188(SVYDFFVWL)(非特許文献１３)もしくは H-2Db制限CTLエピトープ gp10025-32(EGSRNQDWL)(非特許文献１４)とともに、10U/mlのIL-2の存在下で37℃にて２４時間インキュベートされた。いくつかのケースで、照射B16もしくはD121細胞(脾細胞：腫瘍細胞＝２０：１)が刺激剤として使用された。プレートはその後十分に洗浄され、5μg/mlのビオチン化INF-γ抗体(カリフォルニア州、サンディエゴ、ファーミンゲン社、クローンXMG1.2)とともに４℃にて一晩インキュベートされた。洗浄後、0.2U/mlのアビジン-アルカリホスファターゼＤ(カリフォルニア州、バーリンゲーム、ベクターラボラトリー社)が添加され、室温にて２時間インキュベートされた。スポットは、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスファターゼ／ニトロ ブルー テトラゾリウム(インディアナ州、インディアナポリス、ベーリンガー・マンハイム社)を添加することによって展開され、室温にて２０分間インキュベートされた。スポットはELISPOTカウンター(ドイツ、カールツァイス社)を用いてカウントされた。
【００４８】
インビボの抗体除去
CD4+、CD8+Ｔ細胞サブセットの除去(欠乏)は、免疫化前の６日間に一日おきにそれぞれ投与された200μgのGK1.5および2.43mAb腹腔内注射によって達成された。細胞サブセットの有効な除去は、ワクチン接種の１日前の脾細胞のFACS解析によって確認され、実験期間中、１週間に２度の抗体注射によって維持された。アイソタイプ-マッチド(isotype-matched)抗体はコントロールとして使用された。食細胞の機能阻害のために、200μlのPBS中の1mgのカラゲナン(シグマ社、typeII)が、記述されているように腹腔内注射によって投与された(非特許文献１５)。
【００４９】
貪食性解析
マウスは3%のチオグリコール酸ブロスを腹腔内に注射され、誘発されたマクロファージは４日後に腹膜灌流によって収集された。マクロファージは10%ウシ胎児血清を含有するダルベッコ変法イーグル培地中で一晩培養され、非付着性細胞は洗浄により除去された。このように調製されたマクロファージはフローサイトメトリーによりCD11b(>96%)に対しルーチン的に陽染した。UV処理された腫瘍細胞は、PBS中で37℃にて５分間、2nMの5(および6)-カルボキシフルオセイン二酢酸サクシニミジルエステル(オレゴン州、ユージーン、モレキュラー・プローブ社、CFSE)で標識された。非結合色素は、等容積のウシ胎児血清とともに37℃にて３０分間インキュベートすることによって消光された。細胞は完全培地で洗浄され、チオグリコール酸-誘発マクロファージとともに、2:1の比で４時間共培養された。浮遊細胞は洗い流され、付着マクロファージは収集され、CD11b-PE抗体(カリフォルニア州、サンディエゴ、ファーミンゲン社)で染色された。マクロファージによる貪食は、二重陽性染色細胞のパーセンテージとしてB-D FACScaliber(ベクトン・ディッキンソン社)を用いたFACSによって数量化された。
【００５０】
統計解析 
腫瘍の増殖はスチューデントｔ検定を用いて解析された。腫瘍のないマウスは、ログランク統計解析によって比較された。p<0.05の値が有意と見なされた。
前述の物質と方法を使用することによって、以下の結果が得られた。
【００５１】
照射腫瘍細胞のワクチン接種は、SR-A-/-マウスにおいて低免疫原性腫瘍の拒絶をもたらす
SR-A欠乏が腫瘍免疫原性に影響を及ぼすかどうかを判定するために、低免疫原性且つ高転移性の腫瘍である、D121ルイス肺癌細胞(非特許文献１６および１７)が使用された。野生型(WT)C57BL/6およびSR-A-/-マウスはどちらも、イオン化照射(IR)処理D121腫瘍細胞で免疫され、一週間後に生存腫瘍細胞を用いたチャレンジを続けた。予想通り、IR-D121腫瘍細胞で免疫されたまたは免疫されないWTマウスは、腫瘍チャレンジ(誘発)により急激に増殖する腫瘍を発生した(図１の上のパネル)。非免疫SR-A-/-マウスに接種されたD121腫瘍は野生型マウスにおけるのと同様に増殖するのに対し(図１の下のパネル)、単一用量の照射D121腫瘍細胞によるワクチン接種は、その後の腫瘍チャレンジに対して、SR-A-/-マウスを完全に保護することができた。腫瘍のないSR-A-/-マウスは、８ヶ月後でさえ、第二の腫瘍チャレンジに抵抗性であり、長期の免疫記憶の存在を示唆した(データは示さない)。増強された腫瘍-防御免疫の普遍性は、他の弱免疫原性腫瘍であり、異なる組織学的な起源に由来する、B16(F10)メラノーマにおいて確認された(データは示さない)。さらに、UV-処理B16腫瘍細胞による単一用量のワクチン接種は、SR-A-/-でのこの予防的な環境において腫瘍拒絶をもたらし、WTマウスではもたらさなかった(図２)。これは、放射線源が処理腫瘍細胞の免疫原性に影響しないことを示唆している。腫瘍溶解物によるSR-A-/-マウスの免疫化も、SR-A-/-マウスにおける腫瘍の増殖を有意に減少させたが、全ての動物は最終的に腫瘍が発達した(図２)。
【００５２】
CD8+Ｔ細胞がSR-A-/-マウスにおける防御的な抗腫瘍免疫に関与する
D121腫瘍細胞の拒絶における免疫エフェクター細胞の関与が、インビボにおける抗体欠乏研究によって調査された。マウスは、免疫化の前に、抗-CD4 Ab GK1.5もしくは抗-CD8 Ab 2.43による処理によって、CD4+もしくはCD8+Ｔ細胞サブセットが枯渇した。枯渇(欠乏)の完全性は98%を超えることが、脾臓およびリンパ節集団のFACS解析によって評価された(データは示さない)。マウスはその後、4×105のD121腫瘍細胞でチャレンジされた(図３)。CD8+Ｔ細胞の欠乏は、腫瘍防御免疫を完全に抑制し(p=0.002、vs IgG処置グループ)、他方、CD4+Ｔ細胞の欠乏は、D121腫瘍の拒絶に影響を与えなかった(p>0.05、vs IgG処置グループ)。カラゲナン(非特許文献１５)もプライミング期間中に食細胞を枯渇させるために使用された。食細胞の欠乏も腫瘍防御効果を減少することが観察された(p=0.002、vs IgG処置グループ)。
【００５３】
照射腫瘍細胞によるワクチン接種は、SR-A-/-マウスにおいて抗原特異的CTL応答を誘発する
B16メラノーマは、それがgp100およびTRP-2を含む、複数のメラノーマ関連抗原を発現するため(非特許文献１８)、内在性腫瘍抗原に特異的な免疫応答を評価するための関連モデルとして使用された。照射B16腫瘍細胞による免疫化後、脾細胞はWTもしくはSR-A-/-マウスから単離され、CTLエピトープ gp10025-32またはTRP2180-188で刺激された。ELISPOTアッセイは、照射B16細胞で免疫されたSR-A-/-動物の脾細胞が、非免疫マウスまたは免疫WTマウスの脾細胞と比較して、強い抗原特異的IFN-γ産生を示すことを明らかにした(図４)。さらに、免疫SR-A-/-マウスの脾細胞はまた、照射B16細胞でインビトロで刺激された際、高レベルのIFN-γを産生するが、D121細胞では産生せず、刺激を受けたCTLsの腫瘍特異性を示唆した。
【００５４】
WTおよびSR-A-/-マウスの両方に由来するMφが、瀕死の細胞を効率的に貪食する
アポトーシス細胞貪食の機能障害は、自己寛容の破綻をもたらす可能性があり(非特許文献１９〜２１)、SR-Aはアポトーシス細胞のクリアランスに関連している(非特許文献２２)。我々はSR-A-/-およびWTマウス由来のマクロファージの食作用能を比較した。貪食は、CFSEも含有したCD11b+Mφを検出することによってFACscan解析で測定された。食細胞の取り込みの定量化は、両方のマウスに由来するMφが瀕死の腫瘍細胞を効率的に貪食することを示した(p＞0.05)(図５)。結果はさらに、細胞を蛍光顕微鏡で可視化することによって確認され(データは示さない)、瀕死細胞のクリアランスに対する、APCs上の重複性のレセプターの存在を示唆している(非特許文献２３)。
【００５５】
照射腫瘍細胞による処理は、SR-A-/-マウスにおいて樹立腫瘍細胞を根絶する
予防免疫が、SR-A-/-マウスにおいて腫瘍拒絶をもたらすという事実を考慮して、我々は、担癌マウスにおけるワクチン接種の治療効果を特定した。SR-A-/-マウスは、まず０日目にD121腫瘍細胞を樹立され、その後、2，4，6，8日目に照射D121腫瘍細胞で処理された。無処理のSR-A-/-マウスでは、D121腫瘍は著しく成長した。しかしながら、照射D121細胞の投与は、腫瘍成長速度の著しい低下をもたらし、マウスの50%が腫瘍なしのままであった(図６、p<0.05 vs 無処理群)。同様の治療効果がB16メラノーマモデルでも見られた(図６)。
【００５６】
このように、上記実施例は、SR-Aが抗原特異的抗腫瘍免疫を負に調節するという最初の実証を提供する。当該実施例はさらに、SR-Aが抑制されている哺乳類へ抗原を投与することが、当該抗原に対する増強された免疫応答をもたらすことを実証する。
【実施例２】
【００５７】
本実施例は、実施例１にて示された、SR-A-/-マウスにおいて観察された抗原に対する増強された免疫応答が、野生型マウスにおける抗原提示細胞(例、樹状細胞)におけるSR-Aの阻害、および免疫応答の増強が望まれる抗原をマウスに投与することによって再現できることを実証する。
【００５８】
まず、SR-Aノックアウトマウスで観察された、SR-A欠如により増強されたワクチン効力への樹状細胞(DC)の寄与を判定するために、野生型(WT)またはSR-Aノックアウトマウスに由来する骨髄(BM)-DCsの抗原特異的抗腫瘍免疫を刺激する能力を比較した(図７Ａ)。
【００５９】
図７に示された結果を得るために、WT C57BL/6マウスは、モデル抗原卵白アルブミン(OVA)でパルスされたDCsで免疫され、その後OVA-発現B16メラノーマによる腫瘍チャレンジを行った。DCsはGM-CSFおよびIL-4の存在下で骨髄から産生された。簡潔に説明すると、マウスBM細胞は、37℃で、組換えマウスGM-CSF(20ng/ml；BDバイオサイエンス社)、および組換えマウスIL-4(5ng/ml；BDバイオサイエンス社)を含む完全RPMI1640で、5%の加湿CO2中で培養された。培養２日および４日目に、上清を除去し、GM-CSFとIL-4を含む新鮮培地と交換した。７日目の培養物から得られた非付着性細胞(浮遊細胞)をOVA(10μg/ml)とともに３時間培養し、続けて1ng/ml LPS(大腸菌 セロタイプ026:B6、ミズーリ州、セントルイス、シグマ-アルドリッチ社)で１６時間刺激した。
【００６０】
SR-A-/-DCが、低免疫原性B16腫瘍の増殖のコントロールにおいて、WT DCと比較して、はるかに強力であることが観察された。さらに、OVA-特異的細胞傷害Ｔリンパ球(CTL)応答の誘発について、両方のマウス株由来のBM-DCsの能力を比較した。SR-A-/-DC-免疫マウス由来の脾細胞は、OVA-特異的、MHC I-制限CTLエピトープ(すなわち、SIIMFEKL；配列番号２)で刺激した際、はるかに高レベルのIFN-γを産生し、SR-A-/-DCが、抗原特異的エフェクターＴ細胞応答の刺激においてWT DCと比較して、はるかに強力であることを示唆した(図７Ａ)。これらの結果は、このように、SR-Aが抗原提示細胞(APCs)、特にDCsの免疫活性機能をネガティブに制御することを実証し、それ故、DCsによって自然免疫と獲得免疫の両方をコントロールする制御メカニズムを提供する。
【００６１】
APCの免疫賦活機能にSR-Aが果たす抑制性の役割の発見をかんがみて、我々はSR-Aのブロッキングもしくはダウンレギュレーション(すなわち、阻害)が、免疫の開始に最も重要なAPCsであると一般に考えられているDCsによって仲介されるワクチンの効力を向上させるかどうかを判定した。
【００６２】
DCの成熟および同時刺激を促進することによってインビトロで免疫増強DCsを産生するために使用されるたいていの戦略と異なり、このアプローチは免疫抑制性SR-Aの効果を除去しようとする。遺伝子導入のためのレンチウイルスベクターおよびRNA干渉(RNAi)による遺伝子サイレンシングを使用して、DCs中の内在性SR-Aの発現停止がCTL活性化および抗腫瘍免疫を増強するかどうかを試験した。
【００６３】
shRNAを使用するRNA干渉は、哺乳類細胞において、遺伝子発現の効率的な配列特異的-発現停止または発現低下を仲介できる。自己不活性化レンチウイルスベクター(LV)は、分裂細胞と非分裂細胞(造血幹細胞やDCs等の高分化した細胞の子孫を含む)の両方における、その安全性と優れた導入効率のために、RNAiの送達に使用される（非特許文献２４）。
【００６４】
SR-A発現を下方制御できるshRNAを同定するために、様々なレンチウイルスをコードする低分子ヘアピン型RNA(shRNA)を設計し、選別した。スクリーニングを実施するために、非複製LV-SRA-shRNAは50:1の比率にてDCsとともに２４時間37℃でインキュベートされた。DCs中のSR-Aを特異的に減少させる低分子干渉RNA(siRNA)を同定した(図８Ａ)。免疫ブロットアッセイによって示されるように、配列番号１からなるshRNAを産生するLV-SRA-shRNAに感染したDC1.2細胞中のSR-Aプロテインのレベルは、無処理の細胞もしくは偽の感染細胞中のそれと比較して、約90%減少した。重要なことに、SR-Aを減少させたDCsは、可溶性OVA抗原を負荷した際、OVA抗原を発現している非常に活動的なB16腫瘍の根絶において、スクランブルshRNAで処理された対照DCsよりもはるかに有効であることが観察された(図８Ｂ)。さらに、OVA257-264ペプチドで刺激した際の脾細胞中のINF-γ産生のより高いレベル(図９Ａ)およびOVA-特異的エフェクターCD8+-Ｔ細胞の増強された細胞溶解活性によって示されるように(図９Ｂ)、RNA干渉によるDCs中のSR-A発現低下が、抗原特異的CTL応答を、スクランブルshRNAと比べてより効果的に促進することが明らかになった。
【００６５】
このように、総合すれば、明細書中に示されたデータは、WTおよびSR-A-/-マウスにおいて観察された免疫応答における機能差が、SR-A発現の直接的作用(例えば、SR-Aの欠如におけるDCsの発生における変化よりむしろ)による可能性が高いことを示す。
重要なことに、我々はDCsにおいてSR-Aを特異的に阻害することが、所望の抗原に対する哺乳類の免疫応答を増強できることを実証した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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