(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
trans-2-デセン酸エチルエステル、trans-2-デセン酸メチルエステル、trans-2-デセン酸-trans-2-デセニルエステル、trans-2-デセン酸シクロヘキシルエステル及びtrans-2-デセン酸イソプロピルエステルから選ばれるtrans-2-デセン酸エステルを有効成分として含有する神経障害の予防又は治療剤。
【請求項２】
trans-2-デセン酸エステルがtrans-2-デセン酸エチルエステルである請求項１に記載の神経障害の予防又は治療剤。
【請求項３】
神経障害が神経変性疾患である請求項１又は２に記載の神経障害の予防又は治療剤。
【請求項４】
神経変性疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性脊髄側索硬化症（ALS）、ハンチントン病、進行性核上性麻痺（PSP）又は糖尿病性ニューロパシーである請求項３に記載の神経障害の予防又は治療剤。
【請求項５】
神経障害が精神疾患である請求項１又は２に記載の神経障害の予防又は治療剤。
【請求項６】
精神疾患がうつ病である請求項５に記載の神経障害の予防又は治療剤。
【請求項７】
精神疾患が不安障害（神経症）である請求項５に記載の神経障害の予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経成長因子（NGF）や脳由来神経栄養因子（BDNF）などの神経栄養因子様の作用でシグナル伝達を活性化し、神経細胞の活性化の促進により神経変性疾患やうつ病などの神経障害に有用な神経栄養因子様作用剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経細胞は、情報伝達機能を有する細胞であり、その損傷は重大な脳神経機能の喪失となって顕れる。脳、脊髄の中枢神経では軸索の再生はほとんど期待できないので、神経細胞に損傷、変性がある場合、神経細胞の活性化が必要である。神経細胞の分化、生存維持、シナプスの機能亢進、神経細胞の損傷時の再生、修復など中枢神経や末梢神経の神経細胞の活性化には神経栄養因子が不可欠である。神経栄養因子の中でも、神経成長因子（NGF）、脳由来神経栄養因子（BDNF）、ニューロトロフィン−３（NT-3）、ニューロトロフィン−４／５（NT-4/5)などは神経成長因子（NGF）をプロトタイプとして50%以上の配列ホモロジーをもつニューロトロフィンファミリーを構成する。神経細胞の活性化は、細胞外に分泌された神経栄養因子が高親和性受容体（Trks）と結合し、神経細胞内でMAPキナーゼ（mitogen-activated protein(MAP)kinases）を活性化（リン酸化）するMAPキナーゼ情報伝達経路を介してシグナル伝達を活性化し、転写因子のCREB（c-AMP-response element binding protein）の活性化などを通して数多くの遺伝子発現を制御することにより行われる。【０００３】
従ってMAPキナーゼ情報伝達経路を介するシグナル伝達を活性化できれば、神経細胞の変性や細胞死が成因となる神経障害への臨床応用の可能性がある。また、脳由来神経栄養因子（BDNF）といくつかの疾患との関連についての報告がある。脳由来神経栄養因子（BDNF）の多型を用いた研究に基づくものとして、脳由来神経栄養因子（BDNF）がパーキンソン病と関連するとの報告（非特許文献１参照）、脳由来神経栄養因子（BDNF）がアルツハイマー病と関連するとの報告（非特許文献２参照）、脳由来神経栄養因子（BDNF）がうつ病と関連するとの報告（非特許文献３参照）、脳由来神経栄養因子（BDNF）が双極性うつ病と関連するとの報告（非特許文献４参照）、脳由来神経栄養因子（BDNF）が不安症と関連するとの報告（非特許文献５参照）がある。また、ハンチントン病の遺伝子変異マウスのシナプス機能低下が脳由来神経栄養因子（BDNF）の投与で回復するとの報告（非特許文献６参照）やMAPキナーゼリン酸化阻害剤の投与により抑うつ状態を惹起するとの報告（非特許文献７参照）がある。したがって、神経栄養因子は、神経障害の治療剤としての効果が期待される。しかし、神経栄養因子は高分子蛋白質であるため、末梢から投与をしても血液脳関門を通過できず脳に到達するのが困難という問題がある。そこで、低分子化合物で神経細胞を活性化させる神経栄養因子様の作用を有する医薬や神経栄養因子の産生・分泌を促進する医薬を探索する試みがなされている。【０００４】
従来、所定の一般式を有する化合物を含有する神経栄養因子様作用剤についての提案（特許文献１、特許文献２）がある。所定の一般式を有する化合物を含有する神経栄養因子の産生・分泌促進剤の提案（特許文献３〜特許文献５参照、）や脂肪酸化合物、その塩またはそれらのプロドラッグを含有する神経再生促進剤の提案（特許文献６参照）がある。
また、所定の一般式を有する化合物を含有し、アストロサイトのGABAA受容体応答の低下を改善して神経変性疾患などを予防・治療する薬剤の提案（特許文献７参照）がある。【０００５】
【非特許文献１】Ann Neurol.2002 Jan; 51(1):133-6
【非特許文献２】J Neural Transm.2005 May;112(5):703-11.Epub 2004 Sep14
【非特許文献３】Neuropsychopharmacology.2003 Feb; 28(2):397-401.Epub 2002 Aug29
【非特許文献４】Br J Psychiatry. 2006 Oct; 189:317-23
【非特許文献５】Psychopharmacology(Berl).2005 Jun; 180(1):95-9.Epub 2005 Jan 26
【非特許文献６】J Neurosci. 2007 Apr 18; 27(16): 4424-34
【非特許文献７】BIOL PSYCHIATRY 2007 ; 61: 661-670
【特許文献１】特開２０００−７５６８号公報
【特許文献２】特開２００３−１１３０８５号公報
【特許文献３】特開２００２−８０４６７号公報
【特許文献４】特開２００３−２６１５４５号公報
【特許文献５】ＷＯ２００３／０８４５４２号公報
【特許文献６】ＷＯ２００５／０３２５３５号公報
【特許文献７】特開平７−３１６０９２号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、特許文献１〜特許文献５に記載の神経栄養因子様作用剤又は神経栄養因子の産生・分泌促進剤は、脂肪酸又は脂肪酸エステルを有効成分とするものではない。特許文献６に記載の神経再生促進剤において、神経再生の薬理活性が開示される有効成分は、（2R）-2-プロピルオクタン酸である。特許文献７に記載の神経変性疾患などを予防・治療する薬剤は、炭素数10（C10）以下の飽和脂肪酸、炭素数5（C5）の不飽和脂肪酸又は飽和脂肪酸エステルなどを有効成分とするものである。【０００７】
本発明は、所定の脂肪酸又は脂肪酸エステルを有効成分として含有し、安全性の高い神経栄養因子様の作用を有する医薬を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、炭素数8（C8）又は炭素数10（C10）〜炭素数12（C12）のいずれかの脂肪酸又はこれらの脂肪酸エステルに包含される、炭素数8(C8)のn-オクタン酸メチルエステル、n-オクタン酸エチルエステル、3,7-ジメチルオクタン酸エチルエステル又はゲラン酸エチルエステル、炭素数10（C10）のデカン酸メチルエステル、デカン酸エチルエステル、trans-2-デセン酸、trans-2-デセン酸メチルエステル、trans-2-デセン酸エチルエステル、trans-2-デセン酸-2-デセニルエステル、trans-2-デセン酸シクロヘキシルエステル、trans-2-デセン酸-オクチルエステル、trans-2-デセン酸イソプロピルエステル、trans-3-デセン酸メチルエステル、trans-3-デセン酸エチルエステル、trans-9-デセン酸、rans-9-デセン酸メチルエステル又はtrans-9-デセン酸エチルエステル、炭素数11（C11）のtrans-10-ウンデセン酸メチルエステル又はtrans-10-ウンデセン酸エチルエステル、炭素数12（C12）のドデカン酸、ドデカン酸メチルエステル又はドデカン酸エチルエステルのいずれかの化合物、その塩又はそのプロドラッグを有効成分として含有してなる神経栄養因子様作用剤を要旨とする。【０００９】
本発明は、上記の神経障害の予防・治療剤である神経栄養因子様作用剤を要旨とする。神経障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性脊髄側索硬化症（ALS）、ハンチントン病、進行性核上性麻痺（PSP）又は糖尿病性ニューロパシーの神経変性疾患でもよい。神経障害は、精神疾患でもよく、精神疾患はうつ病又は不安障害（神経症）でもよい。【００１０】
本発明は、神経栄養因子様作用を有するtrans-2-デセン酸-2-デセニルエステルを要旨とする。本発明は、神経栄養因子様作用を有するtrans-2-デセン酸シクロヘキシルエステルを要旨とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の神経栄養因子様作用剤は、MAPキナーゼ情報伝達経路を介するシグナル伝達を活性化し、安全性の高い神経障害の予防・治療剤として有用である。また、神経障害の中でアルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性脊髄側索硬化症（ALS）、ハンチントン病、進行性核上性麻痺（PSP）又は糖尿病性ニューロパシーの神経変性疾患の予防・改善剤として有用である。神経障害の中で精神疾患の予防・改善剤として有用である。さらに、精神疾患の中でうつ病や不安障害（神経症）の予防・改善剤として有用である。特にうつ病や不安障害（神経症）の予防・改善剤として、即効性の抗うつ効果・抗不安効果を期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例１の化合物１、２、３、６、７、８、１１、１２、１３のMAPキナーゼに対するリン酸化MAPキナーゼの比率を示すグラフである。
【図２】実施例１の化合物１６、１７、１８、２１、２２、２３、３６、３７、３８のMAPキナーゼに対するリン酸化MAPキナーゼの比率を示すグラフである。
【図３】実施例１の化合物４７、４８、５３、５４、６２、６３、７７、７８のMAPキナーゼに対するリン酸化MAPキナーゼの比率を示すグラフである。
【図４】実施例２の「ストレス負荷3週間投与群」のストレス負荷例と非ストレス負荷例のガラス玉を隠した数を対比したガラス玉覆い隠し試験のグラフである。
【図５】実施例２の「ストレス負荷1週間投与群」のストレス負荷例と非ストレス負荷例のガラス玉を隠した数を対比したガラス玉覆い隠し試験のグラフである。
【図６】実施例２の「ストレス負荷3週間投与群」のストレス負荷例と非ストレス負荷例の不動時間を対比した尾懸垂試験のグラフである。
【図７】実施例２の「ストレス負荷1週間投与群」のストレス負荷例と非ストレス負荷例の不動時間を対比した尾懸垂試験のグラフである。
【図８】実施例２の「ストレス負荷3週間投与群」のストレス負荷例と非ストレス負荷例のオープンアームにいた時間を対比した高架式十字型迷路試験のグラフである。
【図９】実施例２の「ストレス負荷3週間投与群」のストレス負荷例と非ストレス負荷例のクローズドアームに入った回数を対比した高架式十字型迷路試験のグラフである。
【図１０】実施例２の「ストレス負荷1週間投与群」のストレス負荷例と非ストレス負荷例のオープンアームにいた時間を対比した高架式十字型迷路試験のグラフである。
【図１１】実施例２の「ストレス負荷1週間投与群」のストレス負荷例と非ストレス負荷例のクローズドアームに入った回数を対比した高架式十字型迷路試験のグラフである。
【図１２】実施例３の化合物８の投与とストレスの負荷を３週間に亘り行ったストレス負荷例と非ストレス負荷例の体重差を対比したグラフである。
【図１３】実施例４の化合物８の投与とストレスの負荷を３週間に亘り行った前頭葉皮質におけるストレス負荷例と非ストレス負荷例のリン酸化MAPキナーゼ量を対比したグラフである。
【図１４】実施例４の化合物８の投与とストレスの負荷を３週間に亘り行った海馬におけるストレス負荷例と非ストレス負荷例のリン酸化MAPキナーゼ量を対比したグラフである。
【図１５】実施例５の化合物８の投与とストレスの負荷を３週間に亘り行った前頭葉皮質におけるストレス負荷例と非ストレス負荷例のBDNF、NT-3、NGF及びGRのmRNAの発現量を対比したグラフである。
【図１６】実施例５の化合物８の投与とストレスの負荷を３週間に亘り行った海馬におけるストレス負荷例と非ストレス負荷例のBDNF、NT-3、NGF及びGRのmRNAの発現量を対比したグラフである。
【図１７】実施例６の「ストレス負荷終了後非投与群」のストレス負荷例と非ストレス負荷例のガラス玉を隠した数を対比したガラス玉覆い隠し試験のグラフである。
【図１８】実施例６の「ストレス負荷終了後1週間投与群」のストレス負荷例と非ストレス負荷例のガラス玉を隠した数を対比したガラス玉覆い隠し試験のグラフである。
【図１９】実施例６の「ストレス負荷終了後2週間投与群」のストレス負荷例と非ストレス負荷例のガラス玉を隠した数を対比したガラス玉覆い隠し試験のグラフである。
【図２０】実施例６の「ストレス負荷終了後非投与群」のストレス負荷例と非ストレス負荷例の不動時間を対比した尾懸垂試験のグラフである。
【図２１】実施例６の「ストレス負荷終了後1週間投与群」のストレス負荷例と非ストレス負荷例の不動時間を対比した尾懸垂試験のグラフである。
【図２２】実施例６の「ストレス負荷終了後2週間投与群」のストレス負荷例と非ストレス負荷例の不動時間を対比した尾懸垂試験のグラフである。
【図２３】実施例６の「ストレス負荷終了後非投与群」のストレス負荷例と非ストレス負荷例のオープンアームにいた時間を対比した高架式十字型迷路試験のグラフである。
【図２４】実施例６の「ストレス負荷終了後非投与群」のストレス負荷例と非ストレス負荷例のクローズドアームに入った回数を対比した高架式十字型迷路試験のグラフである。
【図２５】実施例６の「ストレス負荷終了後1週間投与群」のストレス負荷例と非ストレス負荷例のオープンアームにいた時間を対比した高架式十字型迷路試験のグラフである。
【図２６】実施例６の「ストレス負荷終了後1週間投与群」のストレス負荷例と非ストレス負荷例のクローズドアームに入った回数を対比した高架式十字型迷路試験のグラフである。
【図２７】実施例６の「ストレス負荷終了後2週間投与群」のストレス負荷例と非ストレス負荷例のオープンアームにいた時間を対比した高架式十字型迷路試験のグラフである。
【図２８】実施例６の「ストレス負荷終了後2週間投与群」のストレス負荷例と非ストレス負荷例のクローズドアームに入った回数を対比した高架式十字型迷路試験のグラフである。
【図２９】実施例７のストレスの負荷を３週間に亘り行った直後のストレス負荷例と非ストレス負荷例の体重差を対比したグラフである。
【図３０】実施例７のストレスの負荷を３週間に亘り行った後１週間に亘り化合物８を投与したストレス負荷例と非ストレス負荷例の体重差を対比したグラフである。
【図３１】実施例８の行動試験の評価方法（Behavior assessment）（Ａ）と、化合物８とフルボキサミン（fluvoxamine）の抑うつ症状に対する効果を対比した尾懸垂試験(tail suspension test）（Ｂ）のグラフである。
【図３２】実施例９のトリメチルスズが投与されたマウスの自発的交替行動試験（Y-maze test）のグラフである。Ａは、各試験群の交替行動率（alternation behavior (%)を示すグラフで、Ｂは各試験群の総アーム選択数（total arm entries）を示すグラフである。
【図３３】実施例１０のマウスの新規物質確認試験（novel object recognition test）のグラフである。Ａは、マウスの「以前に見て知っているはずの物体」（familiar object）と「見慣れない新規な物体」（novel  object）を探索する時間（探索時間(Exploration time))を示すグラフで、Ｂは認識率（Recognition index）を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の神経栄養因子様作用剤の有効成分である脂肪酸は市販品を用いることができ、また市販品と同様の公知の方法で製造することができる。また、本発明の神経栄養因子様作用剤の有効成分である脂肪酸エステルは、公知の方法で製造することができる。例えば、酸触媒下、脂肪酸とアルコールを反応させるフィシャーエステル合成法やエステル交換法により製造することができる。また、塩化チオニル、塩化スルフィリル、三塩化リン、五塩化リン、塩化オキサリル、リン酸トリクロリド等で脂肪酸の水酸基をハロゲンに置換してハロゲン化アシルを得、該ハロゲン化アシルとアルコールを反応させて製造することができる。製造された脂肪酸エステルは、反応終了後に抽出、分配、カラムクロマトグラフィー等の公知の分離、精製手段を用いて単離することができる。【００１４】
脂肪酸又は脂肪酸エステルは、炭素数8（C8）又は炭素数10（C10）〜炭素数12（C12）のいずれかの脂肪酸又はこれらの脂肪酸エステルに包含される、炭素数8(C8)のn-オクタン酸メチルエステル、n-オクタン酸エチルエステル、3,7-ジメチルオクタン酸エチルエステル又はゲラン酸エチルエステル、炭素数10（C10）のデカン酸メチルエステル、デカン酸エチルエステル、trans-2-デセン酸、trans-2-デセン酸メチルエステル、trans-2-デセン酸エチルエステル、trans-2-デセン酸-2-デセニルエステル、trans-2-デセン酸シクロヘキシルエステル、trans-2-デセン酸-オクチルエステル、trans-2-デセン酸イソプロピルエステル、trans-3-デセン酸メチルエステル、trans-3-デセン酸エチルエステル、trans-9-デセン酸、rans-9-デセン酸メチルエステル又はtrans-9-デセン酸エチルエステル、炭素数11（C11）のtrans-10-ウンデセン酸メチルエステル又はtrans-10-ウンデセン酸エチルエステル、炭素数12（C12）のドデカン酸、ドデカン酸メチルエステル又はドデカン酸エチルエステルのいずれかの化合物である。また、これらの１種又は２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。【００１５】
脂肪酸又は脂肪酸エステルは、遊離のものでも、また薬学的に許容される塩、プロドラッグとすることもできる。塩の例としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などのアルカリ土類金属塩、塩酸、硫酸、リン酸、臭化水素酸などの無機酸、アンモニウム塩、トリエタノールアミンなどのアルカノールアミン、酢酸、ギ酸、フマル酸、シュウ酸などの有機酸の酸付加塩などが挙げられる。また、脂肪酸又は脂肪酸エステルは、脂肪酸又は脂肪酸エステルの溶媒和物とすることができる。このような溶媒和物としては、水和物、アルコール和物などが挙げられる。【００１６】
神経栄養因子様作用剤は、神経障害の予防・治療に有用である。神経障害とは、神経細胞の変性・細胞死に起因しその機能が損なわれる病態をいい、神経変性疾患、精神疾患を含む。神経変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性脊髄側索硬化症（ALS）、ハンチントン病、進行性核上性麻痺（PSP）、糖尿病性ニューロパシーなどをいう。精神疾患は、うつ病（双極性うつ病を含む）、不安障害（神経症）、総合失調症等をいう。うつ病に用いる場合、従来既存のうつ病治療剤の三環系抗うつ薬、四環系抗うつ薬、選択的セロトニン再取り込み阻害薬（SSRI）、セロトニン・ノルアドレナリン再取り込み阻害薬（SNRI）などは効果が現れるまでに少なくとも3〜4週間を要し、この間定期的に服薬しなければならなかったが、本発明の神経栄養因子様作用剤は既存の医薬より即効性を期待できる。【００１７】
神経栄養因子様作用剤の医薬としての投与形態は特に限定されず、経口又は非経口のいずれの投与形態でもよい。また、投与形態に応じて適当な剤形とすることができ、例えば注射剤、あるいはカプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤、丸剤、細粒剤などの経口剤、直腸投与剤、油脂性坐剤、水性坐剤などの各種製剤に調製することができる。【００１８】
各種製剤は、薬学的に許容され通常用いられる賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、界面活性剤、流動性促進剤などを添加して調製できる。賦形剤として、例えば、乳糖、果糖、ブドウ糖、コーンスターチ、ソルビット、結晶セルロースなどが、結合剤として、例えば、メチルセルロース、エチルセルロース、アラビアゴム、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが、滑沢剤として、例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、硬化植物油などが、崩壊剤として、例えば、澱粉、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム、デキストリン、炭酸マグネシウム、合成ケイ酸マグネシウムなどが、界面活性剤として、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリソルベート８０などが、流動性促進剤として、例えば、軽質無水ケイ酸、乾燥水酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウムなどが、その他の添加剤としては、シロップ、ワセリン、グリセリン、エタノール、プロピレングリコール、クエン酸、塩化ナトリウム、亜硝酸ソーダ、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。【００１９】
神経栄養因子様作用剤の投与量は、用法、患者の年齢、性別、症状の程度などを考慮して適宜増減できるが、通常成人1日当り1〜1000mg好ましくは5〜300mgで、これを1日1回又は数回に分けて投与できる。
【実施例】
【００２０】
次いで本発明を実施例を挙げて説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００２１】
〔製造例１〕（デカン酸メチルエステル、化合物２）  
デカン酸を塩化チオニル（10ml）に溶解し、水浴上で3時間処理して、過剰な塩化チオニルを留去した。デカン酸のクロリドにメタノール（30ml）を加え、水浴上で2時間還流した。冷後、1NHCl(80ml)に加え酸性とし、酢酸エチル（以下、「EtOAc」と記す）で分配した。分配液は濃縮後、カラムクロマトグラフィー（展開溶媒：n-ヘキサン（C6H14）-EtOAc（3:1））で精製し、次に示すデカン酸メチルエステルを単離した。【００２２】
無色油状物、C11H22O2 MW 186, EIMS m/z (%): 186 (M+, 7), 143 (21), 101 (10), 87 (55), 74 (100)【００２３】
〔製造例２〕（デカン酸エチルエステル、化合物３）  
デカン酸を塩化チオニル（10ml）に溶解し、水浴上で3時間処理して、過剰な塩化チオニルを留去した。デカン酸のクロリドにエタノール（30ml）を加え、水浴上で2時間還流した。冷後、1NHCl(80ml)に加え酸性とし、EtOAcで分配した。分配液は濃縮後、カラムクロマトグラフィー（展開溶媒：C6H14-EtOAc（3:1））で精製し、次に示すデカン酸エチルエステルを単離した。【００２４】
無色油状物、C12H24O2 MW 200, EIMS m/z (%): 200 (M+, 10), 155 (26), 101 (44), 88 (100), 73 (19)【００２５】
〔製造例３〕（trans-2-デセン酸メチルエステル、化合物７）  
trans-2-デセン酸を塩化チオニル（10ml）に溶解し、水浴上で3時間処理して、過剰な塩化チオニルを留去した。trans-2-デセン酸のクロリドにメタノール（30ml）を加え、水浴上で2時間還流した。冷後、1NHCl(80ml)に加え酸性とし、EtOAcで分配した。分配液は濃縮後、カラムクロマトグラフィー（展開溶媒：C6H14-EtOAc（3:1））で精製し、次に示すtrans-2-デセン酸メチルエステルを単離した。【００２６】
無色油状物、C11H20O2 MW 184, EIMS m/z (%): 184 (M+, 5), 167 (6), 153 (43), 123 (16), 113 (41), 87 (90), 69 (39), 43 (100)【００２７】
〔製造例４〕（trans-2-デセン酸エチルエステル、化合物８）  
trans-2-デセン酸を塩化チオニル（10ml）に溶解し、水浴上で3時間処理して、過剰な塩化チオニルを留去した。trans-2-デセン酸のクロリドにエタノール（30ml）を加え、水浴上で2時間還流した。冷後、1NHCl(80ml)に加え酸性とし、EtOAcで分配した。分配液は濃縮後、カラムクロマトグラフィー（展開溶媒：C6H14-EtOAc（3:1））で精製し、次に示すtrans-2-デセン酸エチルエステルを単離した。【００２８】
無色油状物、C12H22O2 MW 198, EIMS m/z (%): 198 (M+, 9), 171 (27), 153 (56), 110 (11), 91 (100), 71 (44)【００２９】
〔製造例５〕（trans-9-デセン酸メチルエステル、化合物１２）  
trans-9-デセン酸を塩化チオニル（10ml）に溶解し、水浴上で3時間処理して、過剰な塩化チオニルを留去した。trans-9-デセン酸のクロリドにメタノール（30ml）を加え、水浴上で2時間還流した。冷後、1NHCl(80ml)に加え酸性とし、EtOAcで分配した。分配液は濃縮後、カラムクロマトグラフィー（展開溶媒：C6H14-EtOAc（3:1））で精製し、次に示すtrans-9-デセン酸メチルエステルを単離した。【００３０】
無色油状物、C11H20O2 MW 184, EIMS m/z (%): 184 (M+, 0), 166 (M+ - CH3OH, 37), 135 (28), 110 (38), 91 (80), 74 (100)【００３１】
〔製造例６〕（trans-9-デセン酸エチルエステル、化合物１３）  
trans-9-デセン酸を塩化チオニル（10ml）に溶解し、水浴上で3時間処理して、過剰な塩化チオニルを留去した。trans-9-デセン酸のクロリドにエタノール（30ml）を加え、水浴上で2時間還流した。冷後、1NHCl(80ml)に加え酸性とし、EtOAcで分配した。分配液は濃縮後、カラムクロマトグラフィー（展開溶媒：C6H14-EtOAc（3:1））で精製し、次に示すtrans-9-デセン酸エチルエステルを単離した。【００３２】
無色油状物、C12H22O2 MW 198, EIMS m/z (%): 198 (M+, 0), 152 (M+ - C2H5OH, 13), 135 (17), 101 (17), 91 (100)【００３３】
〔製造例７〕（ドデカン酸メチルエステル、化合物１７）  
ドデカン酸を塩化チオニル（10ml）に溶解し、水浴上で3時間処理して、過剰な塩化チオニルを留去した。ドデカン酸のクロリドにメタノール（30ml）を加え、水浴上で2時間還流した。冷後、1NHCl(80ml)に加え酸性とし、EtOAcで分配した。分配液は濃縮後、カラムクロマトグラフィー（展開溶媒：C6H14-EtOAc（3:1））で精製し、次に示すドデカン酸メチルエステルを単離した。【００３４】
無色油状物、C13H26O2 MW 214, EIMS m/z (%): 214 (M+, 13), 185 (15), 171 (15), 143 (17), 87 (64), 74 (100)【００３５】
〔製造例８〕（ドデカン酸エチルエステル、化合物１８）  
ドデカン酸を塩化チオニル（10ml）に溶解し、水浴上で3時間処理して、過剰な塩化チオニルを留去した。ドデカン酸のクロリドにエタノール（30ml）を加え、水浴上で2時間還流した。冷後、1NHCl(80ml)に加え酸性とし、EtOAcで分配した。分配液は濃縮後、カラムクロマトグラフィー（展開溶媒：C6H14-EtOAc（3:1））で精製し、次に示すドデカン酸エチルエステルを単離した。【００３６】
無色油状物、C14H28O2 MW 228, EIMS m/z (%): 228 (M+, 17), 183 (28), 157 (15), 101 (50), 88 (100)
7 (64), 74 (100)【００３７】
〔製造例９〕（trans-10-ウンデセン酸メチルエステル、化合物２２）  
trans-10-ウンデセン酸を塩化チオニル（10ml）に溶解し、水浴上で3時間処理して、過剰な塩化チオニルを留去した。trans-10-ウンデセン酸のクロリドにメタノール（30ml）を加え、水浴上で2時間還流した。冷後、1NHCl(80ml)に加え酸性とし、EtOAcで分配した。分配液は濃縮後、カラムクロマトグラフィー（展開溶媒：C6H14-EtOAc（3:1））で精製し、次に示すtrans-10-ウンデセン酸メチルエステルを単離した。【００３８】
無色油状物、C12H22O2 MW 198, EIMS m/z (%): 198 (M+, 0), 166 (M+ - CH3OH, 22), 149 (13), 124 (36), 87 (53), 74 (100)【００３９】
〔製造例１０〕（trans-10-ウンデセン酸エチルエステル、化合物２３）  
trans-10-ウンデセン酸を塩化チオニル（10ml）に溶解し、水浴上で3時間処理して、過剰な塩化チオニルを留去した。trans-10-ウンデセン酸のクロリドにエタノール（30ml）を加え、水浴上で2時間還流した。冷後、1NHCl(80ml)に加え酸性とし、EtOAcで分配した。分配液は濃縮後、カラムクロマトグラフィー（展開溶媒：C6H14-EtOAc（3:1））で精製し、次に示すtrans-10-ウンデセン酸エチルエステルを単離した。【００４０】
無色油状物、C13H24O2 MW 212, EIMS m/z (%): 212 (M+, 2), 166 (M+ - CH3OH, 32), 149 (20), 124 (38), 101 (44), 88 (84), 69 (34), 41 (100)【００４１】
〔製造例１１〕（n-オクタン酸メチルエステル、化合物３７）  
n-オクタン酸を塩化チオニル（10ml）に溶解し、水浴上で3時間処理して、過剰な塩化チオニルを留去した。n-オクタン酸のクロリドにメタノール（30ml）を加え、水浴上で2時間還流した。冷後、1NHCl(80ml)に加え酸性とし、EtOAcで分配した。分配液は濃縮後、カラムクロマトグラフィー（展開溶媒：C6H14-EtOAc（3:1））で精製し、次に示すn-オクタン酸メチルエステルを単離した。【００４２】
無色油状物、C9H18O2 MW 158, EIMS m/z (%): 158 (M+, 4), 127 (27), 115 (11), 88 (43), 74 (100)【００４３】
〔製造例１２〕（n-オクタン酸エチルエステル、化合物３８）  
n-オクタン酸を塩化チオニル（10ml）に溶解し、水浴上で3時間処理して、過剰な塩化チオニルを留去した。n-オクタン酸のクロリドにエタノール（30ml）を加え、水浴上で2時間還流した。冷後、1NHCl(80ml)に加え酸性とし、EtOAcで分配した。分配液は濃縮後、カラムクロマトグラフィー（展開溶媒：C6H14-EtOAc（3:1））で精製し、次に示すn-オクタン酸エチルエステルを単離した。【００４４】
無色油状物、C10H20O2 MW 172, EIMS m/z (%): 172 (M+, 6), 127 (42), 115 (11), 101 (39), 88 (100)【００４５】
〔製造例１３〕（trans-2-デセン酸-trans-2-デセニルエステル、化合物４７）  
trans-2-デセン酸を塩化チオニル（10ml）に溶解し、水浴上で3時間処理して、過剰な塩化チオニルを留去した。trans-2-デセン酸のクロリドにtrans-2-デセン-1-オール（30ml）を加え、水浴上で2時間還流した。冷後、1NHCl(80ml)に加え酸性とし、EtOAcで分配した。分配液は濃縮後、カラムクロマトグラフィー（展開溶媒：C6H14-EtOAc（3:1））で精製し、次に示すtrans-2-デセン酸-trans-2-デセニルエステルを単離した。【００４６】
無色油状物、C20H36O2 MW 308, EIMS m/z (%): 308 (M+, 8), 153 (100), 138 (12), 110 (10), 91 (36), 69 (24), 55 (35)【００４７】
〔製造例１４〕（trans-2-デセン酸-シクロヘキシルエステル、化合物４８）  
trans-2-デセン酸を塩化チオニル（10ml）に溶解し、水浴上で3時間処理して、過剰な塩化チオニルを留去した。trans-2-デセン酸のクロリドにシクロヘキサノール（30ml）を加え、水浴上で2時間還流した。冷後、1NHCl(80ml)に加え酸性とし、EtOAcで分配した。  分配液は濃縮後、カラムクロマトグラフィー（展開溶媒：C6H14-EtOAc（3:1））で精製し、次に示すtrans-2-デセン酸シクロヘキシルエステルを単離した。【００４８】
無色油状物、C16H28O2 MW 252, EIMS m/z (%): 252 (M+, 0), 171 (100), 153 (30), 82 (16), 67 (10), 55 (13)【００４９】
〔製造例１５〕（trans-2-デセン酸オクチルエステル、化合物５３）  
trans-2-デセン酸を塩化チオニル（10ml）に溶解し、水浴上で3時間処理して、過剰な塩化チオニルを留去した。trans-2-デセン酸のクロリドに1-オクタノール（30ml）を加え、水浴上で2時間還流した。冷後、1NHCl(80ml)に加え酸性とし、EtOAcで分配した。分配液は濃縮後、カラムクロマトグラフィー（展開溶媒：C6H14-EtOAc（3:1））で精製し、次に示すtrans-2-デセン酸オクチルエステルを単離した。【００５０】
無色油状物、C18H34O2 MW 282, EIMS m/z (%): 282 (M+, 1.6), 171 (100), 153 (18), 112 (14), 83 (25), 69 (22), 57(26)【００５１】
〔製造例１６〕（trans-2-デセン酸イソプロピルエステル、化合物５４）  
trans-2-デセン酸を塩化チオニル（10ml）に溶解し、水浴上で3時間処理して、過剰な塩化チオニルを留去した。trans-2-デセン酸のクロリドにイソプロピルアルコール（30ml）を加え、水浴上で2時間還流した。冷後、1NHCl(80ml)に加え酸性とし、EtOAcで分配した。分配液は濃縮後、カラムクロマトグラフィー（展開溶媒：C6H14-EtOAc（3:1））で精製し、次に示すtrans-2-デセン酸イソプロピルエステルを単離した。【００５２】
無色油状物、C13H24O2 MW 212, EIMS m/z (%): 212 (M+, 1.6), 171 (38), 153 (54), 110 (11), 99 (11), 57 (26), 43(100)【００５３】
〔製造例１７〕（trans-3-デセン酸メチルエステル、化合物６２）  
trans-3-デセン酸（和光純薬株工業（株））を塩化チオニル（10ml）に溶解し、水浴上で3時間処理して、過剰な塩化チオニルを留去した。trans-3-デセン酸のクロリドにメタノール（30ml）を加え、水浴上で2時間還流した。冷後、1NHCl(80ml)に加え酸性とし、EtOAcで分配した。分配液は濃縮後、カラムクロマトグラフィー（展開溶媒：C6H14-EtOAc（3:1））で精製し、次に示すtrans-3-デセン酸メチルエステルを単離した。【００５４】
無色油状物、C11H20O2 MW 184, EIMS m/z (%): 183 (M+-1, 14), 171 (30), 151 (8), 139 (25), 123 (46), 97 (25), 87 (62), 55 (47), 41 (100)【００５５】
〔製造例１８〕（trans-3-デセン酸エチルエステル、化合物６３）  
trans-3-デセン酸（和光純薬株工業（株））を塩化チオニル（10ml）に溶解し、水浴上で3時間処理して、過剰な塩化チオニルを留去した。trans-3-デセン酸のクロリドにエタノール（30ml）を加え、水浴上で2時間還流した。冷後、1NHCl(80ml)に加え酸性とし、EtOAcで分配した。分配液は濃縮後、カラムクロマトグラフィー（展開溶媒：C6H14-EtOAc（3:1））で精製し、次に示すtrans-3-デセン酸エチルエステルを単離した。【００５６】
無色油状物、C12H22O2 MW 198, EIMS m/z (%): 197 (M+-1, 23), 185 (31), 157(20), 139 (52), 123 (100), 101 (85), 73 (56)【００５７】
〔製造例１９〕（ゲラン酸エチルエステル、化合物７７）  
ゲラン酸（和光純薬株工業（株））を塩化チオニル（10ml）に溶解し、水浴上で3時間処理して、過剰な塩化チオニルを留去した。ゲラン酸のクロリドにエタノール（30ml）を加え、水浴上で2時間還流した。冷後、1NHCl(80ml)に加え酸性とし、EtOAcで分配した。分配液は濃縮後、カラムクロマトグラフィー（展開溶媒：C6H14-EtOAc（3:1））で精製し、次に示すゲラン酸エチルエステルを単離した。【００５８】
無色油状物、C12H20O2 MW 196, EIMS m/z (%): 195 (M+-1, 17), 181 (10), 151 (15), 121 (74), 107 (100), 79 (40), 69 (30)【００５９】
〔製造例２０〕（3,7-ジメチルオクタン酸エチルエステル、化合物７８）  
3,7-ジメチルオクタン酸を塩化チオニル（10ml）に溶解し、水浴上で3時間処理して、過剰な塩化チオニルを留去した。3,7-ジメチルオクタン酸のクロリドにエタノール（30ml）を加え、水浴上で2時間還流した。冷後、1NHCl(80ml)に加え酸性とし、EtOAcで分配した。分配液は濃縮後、カラムクロマトグラフィー（展開溶媒：C6H14-EtOAc（3:1））で精製し、次に示す3,7-ジメチルオクタン酸エチルエステルを単離した。3,7-ジメチルオクタン酸は、ゲラン酸を接触還元することにより得た。【００６０】
無色油状物、C12H24O2 MW 200, EIMS m/z (%): 200 (M+, 6), 198 (10), 185 (6), 153 (22), 128 (24), 115 (68), 88 (100), 69 (45)【００６１】
〔実施例１〕（MAPキナーゼの活性化の測定）
製造例で得た化合物を含む表１の各化合物について、ウエスタンイムノブロッティングによりMAPキナーゼの活性化を以下のように測定した。胎児17日齢のラット大脳皮質から神経細胞を分散し、該神経細胞を5%牛胎仔血清を含むダルベコ改変イーグル培地（DMEM）で1日培養した。無血清培地（B27supplement添加Neurobasal、インビトロジェン（株）社）に培養液を交換し、ポリオルニチンコートした培養シャーレにて2-4万個/cm2の密度で神経細胞を培養した。3日後、表１の各化合物をそれぞれ添加して30分間培養を継続した。その後、氷上でTris-HCl緩衝液をベースとする脱リン酸化酵素阻害剤を含む液で細胞を回収した。得られた細胞抽出液のタンパク質濃度をBCA Protein Assay Kit（タカラバイオ（株）社）を用いて定量し、一定量のタンパク質（MAPキナーゼ測定用には3μg、リン酸化MAPキナーゼ測定用には5μg）をポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。泳動後のゲルからPVDF膜へタンパク質を転写し、1次抗体の抗MAPキナーゼ抗体（セルシグナリングテクノロジー社）と抗リン酸化MAPキナーゼ抗体（セルシグナリングテクノロジー社）をそれぞれ用いてウエスタンイムノブロッティングを実施した。次いで、2次抗体のアルカリフォスファターゼ標識抗ウサギIgG抗体（プロメガ（株）社）と反応させて酵素活性を発色させ、MAPキナーゼ及びリン酸化MAPキナーゼを測定した。なお、各化合物は0.1%DMSOに溶解し、500μg/mlの濃度に調整した。対照は、0.1%DMSOを含むリン酸緩衝液を化合物の添加量と同量を添加した。【００６２】
上記で得られた電気泳動ゲルのバンドの濃度測定をImage J（(株)バイオアーツ社）を用いて強度を算出し数値化した。対照のMAPキナーゼの数値で各化合物のMAPキナーゼの数値を割り、また対照のリン酸化MAPキナーゼの数値で各化合物のリン酸化MAPキナーゼの数値を割って、対照に対する各化合物のMAPキナーゼの比率及び対照に対する各化合物のリン酸化MAPキナーゼの比率を求めた。次いで、得られた対照に対するリン酸化MAPキナーゼの比率を得られた対照に対するMAPキナーゼの比率で割り、MAPキナーゼに対するリン酸化MAPキナーゼの比率を求めグラフを作成し図１〜図３に示した。表１中、化合物１、化合物６、化合物１１、化合物１６、化合物２１及び化合物３６は、和光純薬株工業株式会社の製品を使用した。【００６３】
【表１】
0005447954.tif 000002
【００６４】
図１〜図３より、表１に示す化合物は１倍以上の数値を示し（化合物２１を除く）、MAPキナーゼが活性化（リン酸化）されていた。中でも、trans-2-デセン酸エステルは、アルコキシ基の異なる化合物（化合物番号７、８、４７、４８、５３、５４）のいずれも２倍以上の数値を示し、高いMAPキナーゼの活性化（リン酸化）作用を示した。特に、trans-2-デセン酸エチルエステルが１１倍と最も高く、次いでtrans-2-デセン酸メチルエステルが６倍であった。また、デカン酸メチルエステル、デカン酸エチルエステル、trans-2-デセン酸、trans-9-デセン酸メチルエステル、trans-9-デセン酸エチルエステル、trans-10-ウンデセン酸メチルエステル、trans-10-ウンデセン酸エチルエステル、ゲラン酸エチルエステル及び3,7-ジメチルオクタン酸エチルエステルも高い活性を示した。【００６５】
〔実施例２〕（ストレス負荷時のマウスの行動試験） 
（１）ストレスの負荷(stress)
うつ病、不安病様モデル動物は、確立された慢性マイルドストレス(Chronic Mi1d Stress、以下、「ストレス」という)が負荷されたマウスを用いた。ストレスの負荷は以下のように行った。１ケージ４匹で飼った７週齢ddY系雄性マウスを用い、最初に15分間の強制水泳（Forced swimming）を行った。次いで、傾斜ケージで2日間飼い、その後1日間は通常のケージで飼って休ませた。次いで、200mLの水で濡らした汚物ケージで1日間飼い、その後1日間通常のケージで飼って休ませた。次いで、180rpmで回転する回転ケージで1日間飼い、その後1日間は通常のケージで飼って休ませた。この3種類のケージを用いる1週間に亘るストレスの負荷を1クールとして3クール（3週間）に亘り行った。また、ストレスの負荷と同時にそれぞれ0、20、100、500μg/kgの各用量となるよう0.1%DMSOに溶解して濃度を調整した化合物８を3週間に亘り1日に1回0.25mLずつ腹腔内注射した。ストレスを負荷しなかった例についても、化合物８を同様に3週間に亘り投与した。対照の0μg/kg投与例は、ストレスを負荷した例とストレスを負荷しなかった例についてそれぞれ0.1%DMSOを含むリン酸緩衝液（対照は、以下の図中で「PBS」又は「0μg/kg」と表示する）0.25mLを投与した。マウスの行動試験は、上記の3週間に亘るストレスの負荷と同時に化合物８を投与した投与群とストレスを負荷することなく3週間に亘り化合物８を投与した投与群（以下、「ストレス負荷3週間投与群」という）と、1週間に亘るストレスの負荷と同時に化合物８を投与した投与群とストレスを負荷することなく1週間に亘り化合物８を投与した投与群（以下、「ストレス負荷1週間投与群」という）のそれぞれについて行った。なお、以下において、マウスにストレスを負荷した例をストレス負荷例、マウスにストレスを負荷しなかった例を非ストレス負荷例ということがある。また、実施例１〜実施例７の結果は、Students't-testで有意差検定を行った。【００６６】
（２）行動試験(behavior test)
１．ガラス玉覆い隠し試験(burying the glass-marbles test）
30平方メートルの箱に高さ5センチになるようにチップを敷き詰め、その上に5センチ間隔に25個のガラス玉（直径1.6センチ）を置き、マウスの行動を観察した。隠されたガラス玉の数は、15分後にそれぞれ真上からの目視により2/3以上隠されたガラス玉を1カウントとした。試験は3時間に亘り行った。ストレスで不安症状（状態）のマウスはガラス玉を隠す行動をとるので、隠されたガラス玉の数の多少で不安症状のレベルを評価できる。
結果は、図４と図５に示した。【００６７】
マウスにより隠されたガラス玉の数は、「ストレス負荷3週間投与群」と「ストレス負荷1週間投与群」のいずれにおいても、対照（PBS）のストレス負荷例と非ストレス負荷例との間に有意差があるのに対し、化合物８の投与群の各投与例におけるストレス負荷例と非ストレス負荷例との間に有意差がなく（図４、図５参照）、化合物８は不安症状を抑制していた。また、「ストレス負荷１週間投与群」の結果により、化合物８は不安症状に即効的に作用するものと思われる。【００６８】
２．尾懸垂試験(tail suspension test）
マウスの尻尾の先端から1センチの部位を手でつかみ、床から10センチ離れるようにして、6分間の懸垂での不動時間（Immobility time）を2時間に亘り計測した。マウスが抑うつ症状（状態）にあると不動時間が長くなるので、不動時間の長短で抑うつ症状（状態）のレベルを評価できる。結果は、図６と図７に示した。【００６９】
マウスの不動時間は、「ストレス負荷3週間投与群」と「ストレス負荷1週間投与群」のいずれにおいても、対照（PBS）のストレス負荷例と非ストレス負荷例との間に有意差があるのに対し、化合物８の投与群は各投与例のストレス負荷例と非ストレス負荷例との間に有意差がなく（図６、図７参照）、化合物８は抑うつ症状を抑制していた。また、「ストレス負荷１週間投与群」の結果により、化合物８は抑うつ症状に即効的に作用するものと思われる。【００７０】
３．高架式十字型迷路試験(elevated plus maze test）
床より50センチ離れたところに十字型に交差した高架迷路をX軸には10センチの壁を設け(closed arm、30cmX10cm)、Y軸には壁を設けない(open arm、30cmX10cm)装置を用いて、マウスの5分間における行動を観察して、オープンアームにいる時間とクローズドアームに入った回数を計測した。この試験ではオープンアームにいる時間から不安レベルを、クローズドアームに入った回数から行動量を評価できる。これにより、マウスが不安症状（状態）にあるとオープンアームにいる時間が長くなるので、この時間の長短で不安症状（状態）のレベルを評価できる。結果は、図８〜図１１に示した。【００７１】
マウスのクローズドアームに入る回数は、対照（PBS）と化合物８の投与群との間及びストレス負荷例と非ストレス負荷例との間に有意差がないので（図９、図１１参照）、化合物８の投与はマウスの行動量に影響を与えず、マウスがオープンアームにいる時間は行動量に依らない。マウスがオープンアームにいる時間は、「ストレス負荷3週間投与群」と「ストレス負荷1週間投与群」のいずれにおいても、対照（PBS）のストレス負荷例と非ストレス負荷例との間に有意差があり、化合物８の投与群は各投与例のストレス負荷例と非ストレス負荷例との間に有意差がなく（図８、図１０参照）、化合物８はマウスの不安症状を抑制していた。また、「ストレス負荷１週間投与群」の結果により、化合物８は不安症状に即効的に作用するものと思われる。【００７２】
〔実施例３〕（ストレス負荷前後におけるマウスの体重の測定）  
ストレスの負荷前のマウスの体重を、3週間に亘るストレスの負荷と同時に化合物８を投与をした直後のマウスの体重から差し引いて体重差（g)を求めた。結果は図１２に示した。【００７３】
図１２により、対照（PBS）の非ストレス負荷例の体重が増加しているのに対し、ストレス負荷例の体重が抑うつ・不安症状により著しく減少していた。一方、化合物８の投与群のストレス負荷例における体重の減少の割合は化合物８の抑うつ・不安症状の抑制作用により対照（PBS）に比べて少なく、500μg/kgの投与例ではストレス負荷例と非ストレス負荷例との間に有意差がなく体重への影響が認められなかった。【００７４】
〔実施例４〕（化合物８によるMAPキナーゼの活性化の測定）
実施例２に記載と同様の方法による3週間に亘るストレスの負荷終了の24時間後、ストレスの負荷と同時に化合物８をそれぞれ0、20、100、500μg/kgを投与したマウスと0.1%DMSOを含むリン酸緩衝液のみ投与をしストレスが負荷されなかったマウスをそれぞれ屠殺し、前頭葉皮質と海馬をそれぞれ摘出し、各湿重量の19倍量のRIPAバッファーを加えた。
次いで、超音波破砕機で組織が見えなくなるまでソニケーションを行い、12000rpmで15分間遠心し、上清を回収して組織タンパク抽出溶液とした。抽出溶液のタンパク質濃度をBCA Protein Assay Kit（タカラバイオ（株））を用いて測定し、MAPキナーゼ用には3μg、リン酸化MAPキナーゼ用には5μgを含む抽出溶液に4倍濃の電気泳動用サンプルバッファーを1/3量、2-メルカプトエタノール(2-Mercaptoethano1)を1/10量加え、95℃5分加熱処理し、10%SDSポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行った。その後ゲルからPVDF膜ヘタンパク質を転写し、転写後のメンブランはブロック液(5%スキムミルクを含むTBS)に1時間浸し、1次抗体の抗MAPキナーゼ抗体（セルシグナリングテクノロジー社）と抗リン酸化MAPキナーゼ抗体（セルシグナリングテクノロジー社）と1晩中反応させ、さらに2次抗体のアルカリフォスファターゼ標識抗ウサギIgG抗体（プロメガ（株）社）と1時間反応させた。最後にD1G3バッファーをアルカリホスファターゼの基質としニトロブルーテトラゾリウム(nitrob1ue tetrazo1ium(NBT))と5-ブロム-4-クロロ-3-インドリルフォスフェート p-トルイジンソルト(5-bromo-4-ch1oro-3-indo1y1phosphate p-to1uidine sa1t(BCIP))を加えた液で数分間インキュベーションして発色させた。バンドの濃度測定は、Image J（(株)バイオアーツ社）を用いて強度を算出し、非ストレス負荷例のリン酸化MAPキナーゼに対する化合物８の各投与群のリン酸化MAPキナーゼ量を求めた。結果は、図１３と図１４に示した。【００７５】
図１３と図１４より、対照（0μg/kg）のリン酸化MAPキナーゼ量は、非ストレス負荷例に比し前頭葉皮質と海馬のいずれにおいても有意に減少していた。これに対し、化合物８の投与群は、対照（0μg/kg）に比し、リン酸MAPキナーゼ量が有意に増加する投与例があり、化合物８はMAPキナーゼの活性化（リン酸化）を促進していた。【００７６】
〔実施例５〕（マウスの前頭葉皮質と海馬における神経栄養因子及びグルココチコイドリセプターのmRNAの発現）
ストレスの負荷後のマウスの前頭葉皮質と海馬における脳由来神経栄養因子（以下、「BDNF」と表示）、ニューロトロフィン−３（以下、「NT-3」と表示）、神経成長因子（以下、「NGF」と表示）及びグルココルチコイドレセプター（以下、「GR」と表示）のmRNAの発現を以下のように調べた。実施例２に記載と同様の方法による3週間に亘るストレスの負荷終了の24時間後、ストレスの負荷と同時に化合物８をそれぞれ0、20、100、500μg/kgを投与したマウスと0.1%DMSOを含むリン酸緩衝液のみ投与しストレスが負荷されなかったマウスをそれぞれ屠殺し、前頭葉皮質と海馬をそれぞれ摘出しTriZo1を加えた。ホモゲナイザーで両組織をそれぞれ破砕した後クロロホルムを加え15000rpmで15分間遠心して水相を取り出した。この水相にイソプロパノールを加え、15000rpmで15分間遠心した。
得られた沈殿は70%エタノールで洗い、乾燥した後TEに溶解しtota1 RNAサンプルとした。RNAの逆転写は、0.5μg tota1 RNAサンプルにCDSプライマー（オリゴdtプライマー）溶液を加え、72℃2分間反応してアニーリングを行った。次いで、5×first strand buffer、DTT、dNTP、逆転写酵素を加え、42℃で60分間反応を行った。TEを加え、72℃で7分間反応させてcDNAサンプルとした。PCR反応は、cDNA、Taq po1ymerase及びプライマー（BDNF、NGF、NT-3、GRに特異的な配列（10〜20個）を有する各プライマー）を含む混合溶液を加えて行った。PCR反応は、開始時に94℃、5分間処理を行い、変性94℃、45秒、アニーリング61℃、45秒、伸長72℃、30秒を１サイクルとして、BDNFは28サイクル、NT-3は30サイクル、NGFは34-37サイクル、GRは37サイクル繰り返した。最後に、72℃、7分間の伸長反応を行った。PCR反応後、2%アガロースゲルで電気泳動し、増幅されたDNA断片をエチジウムブロマイドでバンドを蛍光発色させた。バンドの蛍光強度をデンシトメーターで読み取って数値化し、得られた値を別に求めた内部標準のβアクチンmRNAのRT-PCRのバンドの蛍光強度で割り、非ストレス負荷のマウスのバンド値／βアクチンバンド値を1.0としてグラフを作成した。結果は、図１５と図１６に示した。【００７７】
前頭葉皮質におけるBDNF、NT-3、GRのmRNAの発現は、非ストレス負荷例に比し対照（0μg/kg）が有意に低下し（図１５参照）、海馬におけるBDNF、NGF、GRのmRNAの発現は非ストレス負荷例に比し対照（0μg/kg）が有意に低下していた（図１６参照）。GRやBDNFのmRNAがストレスの負荷により発現が低下することはすでに知られているので、前記のBDNFやGRのmRNAの発現の低下を惹起した本試験のストレスの負荷は従来報告されているストレスの負荷と同質であると判断される。図１５と図１６において、化合物８の投与例によってはBDNF、NT-3、NGF、GRのmRNAが非ストレス負荷例のレベルに戻ったことから、ストレスの負荷に伴う神経栄養因子関連遺伝子の発現の低下が化合物８によって抑制され、非ストレス負荷例の状態に改善したものと思われる。【００７８】
〔実施例６〕（ストレス負荷終了後のマウスの行動試験） 
実施例２は、マウスにストレスを負荷しながら同時に化合物８を投与し、マウスの抑うつ・不安症状に対する化合物８の抑制効果を検討する行動試験である。一方、本実施例は、化合物８を投与することなくストレスの負荷のみを3週間行い、ストレスの負荷が終了し、ストレスが取り除かれた後のマウスの抑うつ・不安症状に対する化合物８の治療効果を検討するマウスの行動試験である。マウスに対するストレスの負荷は、実施例２と同様の方法で行った。また、マウスの行動試験は、3週間に亘るストレスの負荷の終了直後の化合物８を投与しない群と最初からストレスを負荷することなく化合物８を投与しない群（以下、「ストレス負荷終了後非投与群」という）、ストレスの負荷の終了後に1週間に亘り化合物８を投与した投与群と最初からストレスを負荷することなく前者と同様に1週間に亘り化合物８を投与した投与群（以下、「ストレス負荷終了後1週間投与群」という）及びストレスの負荷の終了後に2週間に亘り化合物８を投与した投与群と最初からストレスを負荷することなく前者と同様に2週間に亘り化合物８を投与した投与群（以下、「ストレス負荷終了後2週間投与群」という）について、それぞれ実施例２と同様の方法でガラス玉覆い隠し試験(burying the glass-marbles test）、尾懸垂試験(tail suspension test）及び高架式十字型迷路試験(elevated plus maze test）を行った。以下のいずれのマウスの行動試験においても、「ストレス負荷終了後非投与群」の対照（0μg/kg）のストレス負荷例と非ストレス負荷例との間、化合物８の投与群のストレス負荷例と非ストレス負荷例との間にそれぞれ有意差があった（図１７、図２０、図２３参照）。なお、「ストレス負荷終了後非投与群」を示す図１７、図２０、図２３、図２４に用量の記載があるが、いずれも上記のように化合物８が投与されるのではなく、「ストレス負荷終了後1週間投与群」と「ストレス負荷終了後2週間投与群」の各投与例に対応するマウスを示すだけのものである。【００７９】
１．ガラス玉覆い隠し試験(burying the glass-marbles test）
マウスにより隠されたガラス玉の数は、「ストレス負荷終了後1週間投与群」と「ストレス負荷終了後2週間投与群」のいずれにおいても、対照（0μg/kg）のストレス負荷例と非ストレス負荷例との間に有意差があったが、20μg/kgと100μg/kgの各投与例のストレス負荷例と非ストレス負荷例との間に有意差がなく（図１８、図１９参照）、化合物８はストレスが取り除かれてからの不安症状に治療効果を示した。また、「ストレス負荷終了後１週間投与群」の結果により、化合物８は不安症状に即効的な治療効果を有すると思われる。【００８０】
２．尾懸垂試験(tail suspension test）
マウスの不動時間は、「ストレス負荷終了後1週間投与群」において、対照（0μg/kg）のストレス負荷例と非ストレス負荷例との間に有意差があったが、500μg/kgの投与例のストレス負荷例と非ストレス負荷例との間に有意差がなく（図２１参照）、化合物８はストレスが取り除かれてからの抑うつ症状に即効的な治療効果を示した。また、「ストレス負荷終了後2週間投与群」において、対照（0μg/kg）のストレス負荷例と非ストレス負荷例との間に有意差があったが、すべての投与例のストレス負荷例と非ストレス負荷例との間に有意差がなく（図２２参照）、化合物８はストレスが取り除かれてからの抑うつ症状に高い治療効果を示した。【００８１】
３．高架式十字型迷路試験(elevated plus maze test）
マウスのクローズドアームに入る回数は、「ストレス負荷終了後非投与群」、「ストレス負荷終了後1週間投与群」及び「ストレス負荷終了後2週間投与群」のいずれにおいても、対照（0μg/kg）と化合物８の投与群との間及びストレス負荷例と非ストレス負荷例との間に有意差がないので（図２４、図２６、図２８参照）、化合物８の投与はマウスの行動量に影響を与えず、マウスがオープンアームにいる時間は行動量に依らない。マウスがオープンアームにいる時間は、「ストレス負荷終了後1週間投与群」において、対照（0μg/kg）のストレス負荷例と非ストレス負荷例との間に有意差があったが、500μg/kgの投与例のストレス負荷例と非ストレス負荷例との間に有意差がなく（図２５参照）、化合物８はストレスが取り除かれてからの不安症状に即効的な治療効果を示した。また、「ストレス負荷終了後2週間投与群」において、対照（0μg/kg）のストレス負荷例と非ストレス負荷例との間に有意差があったが、すべての投与例のストレス負荷例と非ストレス負荷例との間に有意差がなく（図２７参照）、化合物８はストレスが取り除かれてからの不安症状に高い治療効果を示した。【００８２】
〔実施例７〕（ストレス負荷終了後におけるマウスの体重の測定）  
ストレスの負荷前のマウスの体重を、化合物８を投与することなく3週間に亘るストレスの負荷の終了直後におけるマウスの体重とストレスの負荷の終了後1週間に亘る化合物８の投与後におけるマウスの体重からそれぞれ差し引いて体重差（g)を求めた。結果は図２９と図３０に示した。なお、図２９に用量の記載があるが、上記のように化合物８が投与されるのではなく、ストレスの負荷の終了後1週間に亘り化合物８が投与される各投与例に対応するマウスを示すだけのものである。【００８３】
図２９より、ストレスの負荷の終了直後におけるマウスの体重差は、対照（0μg/kg）のストレス負荷例と非ストレス負荷例の間及び各投与例に対応するストレス負荷例と非ストレス負荷例との間に有意差があったが、ストレスの負荷の終了後の1週間に亘る化合物８の投与後における500μg/kg投与例では化合物８の抑うつ・不安症状の治療効果によりストレス負荷例と非ストレス負荷例との間に有意差がなかった。【００８４】
〔実施例８〕（尾懸垂試験(tail suspension test）による化合物８とフルボキサミン（fluvoxamine）の抑うつ症状に対する効果の比較）
本願明細書の段落〔００６３〕実施例２（ストレス負荷時のマウスの行動試験）（１）ストレスの負荷（stress）と同様に、１ケージ４匹で飼った７週齢ddY形雄性マウスに、最初に15分間の強制水泳（Forced swimming）を行い、次いで3種類のケージを用いる1週間に亘るストレスの負荷を1クールとして3クール（3週間）に亘り行い、慢性マイルドストレス(Chronic Mi1d Stress、CMS）を負荷した。Exp.1は、ストレス負荷直後、Exp.2はストレス負荷後１週間後、Exp.3はストレス負荷後２週間後にそれぞれ化合物８とフルボキサミン（fluvoxamine）をマウスに投与し、各試験群について尾懸垂試験(tail suspension test）を行った。各試験群は、化合物８を20、100、500μg/kg、フルボキサミン（fluvoxamine）を1000μg/kgの各用量となるように0.1%DMSOに溶解して濃度を調整し、ストレス負荷直後から１回／日マウスに腹腔内投与した。また、ストレスを負荷しない１ケージ４匹で飼った７週齢ddY系雄性マウスについても、ストレスを負荷したマウスと同様に化合物８とフルボキサミン（fluvoxamine）を投与して尾懸垂試験(tail suspension test）を行った。結果は、図３１に示した。有意差検定は、Student's t-test(*)により行った。なお、図３１のＡは、上記の行動試験の評価方法（Behavior assessment）を示す。図３１のＢは、マウスの不動時間（Immobility time）を示す。また「DAEE」は化合物８を表し、「Flu」はフルボキサミン（fluvoxamine）を表す。【００８５】
図３１のＢより、抑うつ症状に対し、化合物８は、Exp. 2（ストレス負荷後の１週間）の500 ug/kgで効果があったが、フルボキサミン（fluvoxamine）では効果が認められなかった。フルボキサミン（fluvoxamine）は、Exp.3（ストレス負荷後の２週間）でのみ効果が認められた。この結果より、化合物８は抑うつ症状に対する効果に優れていた。【００８６】
〔実施例９〕（トリメチルスズが投与されたマウスの自発的交替行動試験（Y-maze test））
自発的交替行動試験（Y-maze test）は、３つのアームからなるYの形をした迷路を使う行動試験の一種である。まず３つあるアームのうちの1つのアームの先端にマウスを置き、8分間に亘って迷路内を自由に探索させて、マウスが移動したアームを順番通りに記録する。次に、各アームへの移動回数（総アーム選択数（total arm entries））と、連続して異なる3本のアームを選択した数（交替行動数（numbers of spontaneous behavior））を数える。正常なマウスは、異なる３本のアームを選択して移動するという行動を示す確率が高く、記憶・学習能が低下したマウスはこのような行動を取る確率が低いので、交替行動数÷（総アーム選択数−2）×100＝交替行動率（alternation behavior (%)）とし、これを自発的交替行動の指標とする。
トリメチルスズ（trimethyltin 、以下「TMT」という)は, 神経毒性を持つ有機金属化合物で、特に海馬歯状回の顆粒神経細胞に対して急性の神経細胞死を起こすので、マウスの記憶・学習能を障害する。そのため、マウスにTMTを投与すると、交替行動率（alternation behavior (%)が顕著に低下する。【００８７】
１）化合物８が単独投与される試験群、２）TMTと化合物８が投与される試験群について、それぞれ自発的交替行動試験（Y-maze test）を行った。化合物８が単独投与される試験群は、化合物８を100、500μg/kgの各用量となるよう0.1%DMSOに溶解して濃度を調整し、各投与例毎に６匹のマウスに0.25mLずつ腹腔内投与した。対照の0μg/kg体重の投与例は、0.1%DMSOを含むリン酸緩衝液0.25mLを腹腔内投与した。各投与例は、腹腔内投与してから２時間経過後に自発的交替行動試験（Y-maze test）を行った。また、TMTと化合物８が投与される試験群は、マウスにTMT（2mg/kg体重）を腹腔内投与し、２日経過後、化合物８が単独投与される試験群と同様に化合物８を腹腔内投与し、２時間経過後に自発的交替行動試験（Y-maze test）を行った。結果は、図３２に示した。有意差検定は、Turkey's test(*、##)及びStudent's t-test(++)により行った。「DAEE」は、化合物８を表す。【００８８】
図３２のＢから、総アーム選択数（total arm entries）は各試験群で差がなく、このことにより各試験群の運動機能に差がないことが分かる。図３２のＡから、TMT処理によって顕著に低下した自発的交替行動率は、TMTと化合物８が同時に投与される試験群において、化合物８を投与することにより低下が抑制されていた。一方、化合物８が単独投与される試験群においても、化合物８の投与によって自発的交替行動率が有意に上昇していることから、化合物８はTMTの神経毒性に対して抵抗性を付与し、記憶・学習能の低下を抑制できるばかりか、マウスの記憶・学習能を亢進することが分かった。以上の点から、化合物８は、海馬の通常機能をさらに上昇させることにより、記憶・学習能力を向上させる作用があると考えられる。このような作用は、アルツハイマー病におけるアミロイドβペプチドによる神経機能低下に対しても抑制的に作用すると考えられる。【００８９】
〔実施例１０〕（マウスの新規物質確認試験（novel object recognition test））
新規物質認識試験を用いて化合物８による脳機能の亢進作用について調べた。新規物質確認試験とは、マウスが「見慣れない新規な物体」（novel object）を見つけると探索行動を取る（そばに寄ったり、においをかいだりする動作）ことを利用し、「以前に見て知っているはずの物体」（familiar object）と「見慣れない新規な物体」（novel  object）を見せてその行動から、記憶・学習能力を評価する方法である。【００９０】
化合物８を100、500μg/kgの各用量となるよう0.1%DMSOに溶解して濃度を調整し、各投与例毎に６匹のマウスに0.25mLずつ腹腔内注射した。対照の0μg/kg体重の投与例は、0.1%DMSOを含むリン酸緩衝液0.25mLを腹腔内注射した。マウスに化合物８を投与し、２時間後に新規物質確認試験を行った。すなわち、マウスを２つの同じ物体のあるところに１５分間に亘り置き、２つの物体を記憶させた（この２つの物体は、「以前に見て知っているはずの物体」（familiar object）となる）。１日経過後、マウスを「以前に見て知っているはずの物体」（familiar object）と「見慣れない新規の物体」（novel  object）のあるところに置く探索行動試験を１０分間に亘り行った。結果は図３３に示した。有意差検定は、Student's t-test(*)及びTurkey's test(##)により行った。なお、「DAEE」は、化合物８を表す。【００９１】
図３３のＡは、マウスの「以前に見て知っているはずの物体」（familiar object）と「見慣れない新規な物体」（novel  object）を探索する時間（探索時間(Exploration time))を示す。図３３のＢは、認識率（Recognition index）を示す。認識率（Recognition index）は、「以前に見て知っているはずの物体」（familiar object）の探索時間をＸとし、「見慣れない新規な物体」（novel  object）の探索時間をＹとすると、Ｙ／Ｘ＋Ｙで示される。図３３のＢより、化合物８を投与する方が「見慣れない新規な物体」（novel  object）の認識率が高くなることから、化合物８は健常動物の記憶・学習能を高める作用を持つことが分かった。このような作用は、アルツハイマー病におけるアミロイドβペプチドによる神経機能低下に対しても抑制的に作用すると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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