(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的試料において、薬剤耐性に関連する突然変異を含むかもしれないＨＩＶ−１標的配列を増幅する方法であって：
（ａ）ｇａｇ遺伝子内に含有されるＧａｇ１と呼ばれるＨＩＶ−１標的配列を特異的に増幅する、増幅オリゴマーと、試料とを混合し、
ここで増幅オリゴマーは、配列番号１７の増幅オリゴマーおよび配列番号５の増幅オリゴマーを含む；そして
（ｂ）Ｇａｇ１標的配列を増幅して、Ｇａｇ１標的配列の増幅産物を産生する
工程を含んでなる、方法。
【請求項２】
工程（ｂ）が、実質的に等温条件下で行う転写仲介増幅法を用いる、請求項１の方法。
【請求項３】
増幅されたＧａｇ１標的配列の部分に特異的にハイブリダイズする核酸プローブへの、Ｇａｇ１標的配列の増幅産物のハイブリダイゼーションを検出することをさらに含む、請求項１または２の方法。
【請求項４】
配列番号２３のプローブを用いてＧａｇ１標的配列の増幅産物を検出することをさらに含む、請求項１または２の方法。
【請求項５】
配列番号２４のプローブを用いてＨＩＶ−１サブタイプＡのテンプレートからＧａｇ１標的配列の増幅産物を検出することをさらに含む、請求項１または２の方法。
【請求項６】
プローブが標識を含む、請求項４または５の方法。
【請求項７】
標識が、均質検出系で検出可能な発光シグナルを生じる化合物である、請求項６の方法。
【請求項８】
請求項４〜７のいずれか一項の方法であって、プローブの核酸主鎖が１以上の２'−メトキシ連結、ペプチド核酸連結、ホスホロチオエート連結、メチルホスホネート連結またはそれらのいずれかの組み合わせを含む、方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項の方法であって、標的配列を含むＨＩＶ−１核酸に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの捕捉オリゴヌクレオチドと試料とを接触させ、こうしてＨＩＶ−１核酸が含まれるハイブリダイゼーション複合体を形成し、そして他の試料構成要素から該ハイブリダイゼーション複合体を分離する工程をさらに含んでなる、方法。
【請求項１０】
生物学的試料において、薬剤耐性に関連する突然変異を含むかもしれないＨＩＶ−１標的配列を増幅することに使用するための、オリゴマーのセットであって、ここでセットは、配列番号１７の増幅オリゴマーと配列番号５の増幅オリゴマーとの増幅オリゴマーの組み合わせを含む、セット。
【請求項１１】
配列番号２３のプローブオリゴマーをさらに含む、請求項１０のセット。
【請求項１２】
配列番号２４のプローブオリゴマーをさらに含む、請求項１０のセット。
【請求項１３】
プローブオリゴマーが標識を含む、請求項１１または１２のセット。
【請求項１４】
標識が、均質検出系で検出可能な発光シグナルを生じる化合物である、請求項１３のセット。
【請求項１５】
請求項１１〜１４のいずれか一項のセットであって、プローブオリゴマーの核酸主鎖が１以上の２'−メトキシ連結、ペプチド核酸連結、ホスホロチオエート連結、メチルホスホネート連結またはそれらのいずれかの組み合わせを含む、セット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１）の診断的検出に関し、そしてより具体的には、核酸増幅、および増幅された配列、特にＨＩＶ−１薬剤耐性の発展に関連する配列の検出を用いて、ＨＩＶ−１核酸配列を検出するための組成物およびアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ＨＩＶ−１は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因病原体である。感染した個体が症状を明らかにする前であっても、感染の有効な治療を決定し、そして体液中の感染性ウイルスの伝播を避けるため、ＨＩＶ−１感染の早期検出が重要である。感染した組織または体液においてＨＩＶ−１核酸配列の存在を早期に検出すれば、他へのウイルスの伝播を予防するため、より早い治療および工程につなげることが可能である。早期診断に有効であるためには、ＨＩＶ−１核酸配列を検出する試薬および方法は、試験する試料中の、比較的少数のウイルスコピー（例えば血漿ｍｌあたり、数百コピー）を検出可能でなければならない。さらに、ＨＩＶ−１サブタイプおよび／またはウイルス薬剤耐性に関連する突然変異的変化などの、感染した個体に存在するＨＩＶ−１に関するさらなる情報を提供する診断法が、予後のために有用である。
【０００３】
薬剤で治療され、そしてＨＩＶ−１増殖および症状の再燃を経験しているＨＩＶ−１患者において、薬剤耐性突然変異（１以上の核酸塩基の置換、欠失または挿入）が発見されてきている。表現型の変化を生じ、それによってウイルスが抗レトロウイルス薬剤に耐性になる、こうした突然変異は、ｇａｇ遺伝子で発見され、これはしばしば、プロテアーゼ切断部位に影響を与え、そしてプロテアーゼおよび逆転写酵素（ＲＴ）コード領域両方において、ｐｏｌ遺伝子で発見されている（Ｇｉｎｇｅｒａｓら，  １９９１，  Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  １６４（６）：１０６６−１０７４；Ｒｉｃｈｍａｎら，  １９９１，  Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．  １６４（６）：１０７５−１０８１；Ｓｃｈｉｎａｚｉら，  １９９３，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ３７（４）：８７５−８８１；Ｎａｊｅｒａら，  １９９４，  ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．  Ｈｕｍ．  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １０（１１）：１４７９−１４８８；Ｅａｓｔｍａｎら，  １９９５，  Ｊ．  ＡＩＤＳ  Ｈｕｍ．  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌ．  ９（３）：２６４−２７３；Ｆｒｅｎｋｅｌら，  １９９５，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３３（２）：３４２−３４７；Ｓｈｉｒａｓａｋａら，  １９９５，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２（６）：２３９８−２４０２；Ｌｅａｌら，  １９９６，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２６（６）：４７６−４８０；Ｃｌｅｌａｎｄら，  １９９６，  Ｊ．  ＡＩＤＳ  Ｈｕｍ．  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌ．  １２（１）：６−１８；Ｓｃｈｍｉｔら，  １９９６，  ＡＩＤＳ  １０（９）：９９５−９９９；Ｖａｓｕｄｅｖｅｃｈａｒｉら，  １９９６，  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ４０（１１）：２５３５−２５４１；Ｗｉｎｓｌｏｗら，  １９９６，  ＡＩＤＳ  １０（１１）：１２０５−１２０９；Ｆｏｎｔｅｎｏｔら，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９０（１）：１−１０；Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎら，  １９９７，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７１（９）：６３４８−６３５８；Ｉｖｅｓら，  １９９７，  Ｊ．  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．  ３９（６）：７７１−７７９）。
【０００４】
ＨＩＶ−１に感染した患者に存在するウイルス突然変異に関する情報は、臨床家が使用して、特定の抗レトロウイルス療法を患者で開始するかまたは持続するかどうかなど、適切な治療を決定することが可能である。さらに、治療中、ＨＩＶ−１の性質決定を可能にする、患者試料の試験を継続すれば、薬剤耐性ウイルスの出現を示すことが可能であり、それによって、臨床家が、療法をより有効なものに改変することが可能になる。薬剤耐性試験が臨床的に有用であることを示唆する証拠は、遡及的および前向き介入に基づく研究から得られる（Ｄｕｒａｎｔら，  １９９９，  Ｌａｎｃｅｔ  ３５３：２１９５−２１９９；Ｃｌｅｖｅｎｂｅｒｇｈら，  １９９９，  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｔｈｅｒ．  ４：抄録６０；Ｂａｘｔｅｒら，  １９９９，  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｔｈｅｒ．  ４：抄録６１；Ｃｏｈｅｎら，  ２０００，  第７回レトロウイルスおよび日和見感染に関する会議（カリフォルニア州サンフランシスコ）、抄録２３７）。薬剤耐性を与えることが知られるいくつかの突然変異は、プロテアーゼコード配列の２０のコドンおよび逆転写酵素（ＲＴ）コード配列の２７のコドンに影響を及ぼす（Ｈｉｒｓｃｈら，  ２０００，  ＪＡＭＡ  １８：２４１７−２４２６）。ｐｏｌにおける１９０の突然変異の包括的リストが、Ｓｃｈｉｎａｚｉら（Ｉｎｔ’ｌ  Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｎｅｗｓ  ８：６５−９１（２０００））に報告された。ｇａｇ切断部位に影響を及ぼす突然変異は、プロテアーゼにおける耐性突然変異による酵素活性の損失を補償することが示されている。したがって、適切なコドンに関する配列情報を提供する遺伝子型アッセイに対する必要性があり、これは、こうしたアッセイが、患者のウイルス集団のより少数の構成要素であったとしても薬剤失敗に寄与しうるウイルス突然変異体を検出可能であるためである。
【０００５】
ＨＩＶ−１ゲノムは非常に可変性であり、その遺伝的関連性に基づいて、３群（Ｍ、ＯおよびＮ）が記載される。最も蔓延している群、Ｍは、サブタイプ（ＡからＪ）を含有し、サブタイプＡ、ＢおよびＣが、世界中で発見されるウイルスサブタイプの約９５％を占める。アジアで頻繁に見られるサブタイプＥは、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子中にサブタイプＡ配列を含む組換えウイルスである。したがって、有効な診断アッセイは、Ａ、ＢおよびＣサブタイプの少なくとも１つを、そして好ましくはすべてを検出可能でなければならない。
【０００６】
多様なアッセイおよび試薬を用いたＨＩＶ−１の検出が、先に記載されてきている。例えば米国特許第５，５９４，１２３号、第５，１７６，９９５号および第５，００８，１８２号（Ｓｎｉｎｓｋｙら）は、ＨＩＶ−１核酸を増幅するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく検出を開示する。米国特許第５，６８８，６３７号（Ｍｏｎｃａｎｙら）は、ＨＩＶ−１遺伝子の選択された領域のオリゴヌクレオチドプライマー配列、および該プライマーを用いて、ウイルス配列を増幅し、そして増幅された産物を検出する方法を開示する。米国特許第５，７１２，３８５号（ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら）および第５，８５６，０８８号（ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら）は、ＨＩＶ−１配列を検出するための増幅オリゴヌクレオチド、プローブおよび方法を開示する。米国特許第５，７８６，１７７号（Ｍｏｎｃａｎｙら）は、遺伝子発現のため、ＨＩＶ−１ヌクレオチド配列を増幅する方法、および産生したポリペプチドを精製する方法を開示する。ＨＩＶ−１の存在を検出するのに有用なＨＩＶ−１核酸配列は、米国特許第５，７７３，６０２号およびＥＰ  ０  １７８  ９７８（Ａｌｉｚｏｎら）、米国特許第５，８４３，６３８号（Ｍｏｎｔａｇｎｉｅｒら）、第６，００１，９７７号（Ｃｈａｎｇら）、第５，４２０，０３０号（Ｒｅｉｔｚら）および第５，８６９，３１３号（Ｒｅｉｔｚら）、およびＥＰ  ０  １８１  １５０（Ｌｕｃｉｗら）に開示されてきている。ＰＣＴ第ＷＯ９９６１６６６号は、ＨＩＶ遺伝子配列における多型突然変異を検出する方法を開示し、該方法は、切迫したウイルス薬剤耐性突然変異のリスクが増加している指標を提供する。
【０００７】
核酸を増幅して、標的配列の、より多くのコピーを産生する方法が、先に記載されている。例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、および第４，８００，１５９号（Ｍｕｌｌｉｓら）は、変性および重合反応の一連の熱周期を用いて、多コピーの標的配列を産生する、ＰＣＲ増幅を開示する。ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写に頼る増幅法は、米国特許第５，３９９，４９１号および第５，５５４，５１６号（Ｋａｃｉａｎら）、米国特許第５，４３７，９９０号（Ｂｕｒｇら）、ＰＣＴ第ＷＯ８８０１３０２号および第ＷＯ８８１０３１５号（Ｇｉｎｇｅｒａｓら）、米国特許第５，１３０，２３８号（Ｍａｌｅｋら）；並びに米国特許第４，８６８，１０５号および第５，１２４，２４６号（Ｕｒｄｅａら）に開示されている。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、４つの異なるオリゴヌクレオチドを用いて、ハイブリダイゼーション、連結、および変性の周期を用いることによって、標的およびその相補鎖を増幅する（ＥＰ第０  ３２０  ３０８号）。鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、半修飾ＤＮＡ標的二重鎖の一方の鎖にニックを形成する制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含有するプライマーを用い、その後、プライマー伸長および鎖置換工程が続く（米国特許第５，４２２，２５２号（Ｗａｌｋｅｒら））。
【０００８】
核酸配列は、相補配列（例えばオリゴヌクレオチドプローブ）とのハイブリダイゼーションを用いることによって、検出可能である（米国特許第５，５０３，９８０号（Ｃａｎｔｏｒ）、第５，２０２，２３１号（Ｄｒｍａｎａｃら）、第５，１４９，６２５号（Ｃｈｕｒｃｈら）、第５，１１２，７３６号（Ｃａｌｄｗｅｌｌら）、第５，０６８，１７６号（Ｖｉｊｇら）、および第５，００２，８６７号（Ｍａｃｅｖｉｃｚ）を参照されたい）。ハイブリダイゼーション検出法は、ＤＮＡチップ上のプローブアレイを用いて、１ヌクレオチドが異なる、４つの関連プローブ配列の組において、正確に相補的なプローブ配列に選択的にハイブリダイズする、標的核酸に関する配列情報を提供することが可能である（米国特許第５，８３７，８３２号および第５，８６１，２４２号（Ｃｈｅｅら）を参照されたい）。
【発明の概要】
【０００９】
発明の概要
本発明の１つの側面にしたがって、ＨＩＶ−１のｇａｇまたはｐｏｌ遺伝子の一部を増幅するための核酸オリゴマーであって、配列番号５から配列番号２２および配列番号３３から配列番号６８からなる群より選択される配列を含み、所望により、核酸主鎖中に、１以上の２’−Ｏ−メトキシ連結、ペプチド核酸連結、ホスホロチオエート連結、メチルホスホネート連結またはそれらのいずれかの組み合わせが含まれることが可能である、前記核酸オリゴマーを提供する。１つの態様において、オリゴマーは、配列番号５から配列番号１０および配列番号３３から配列番号４５からなる群より選択される配列を有するプロモーター−プライマーであり、該配列の５’部分にＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーター配列が含まれる。別の態様において、核酸オリゴマーは：第一のｇａｇ配列を増幅するための、配列番号５、配列番号１１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号４６、または配列番号４７および配列番号１７または配列番号５９；第二のｇａｇ配列を増幅するための、配列番号６、配列番号１２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号４８または配列番号４９および配列番号１８または配列番号６０；ｐｏｌ遺伝子のプロテアーゼ配列を増幅するための、配列番号７、配列番号１３、配列番号３７、配列番号３８、配列番号５０または配列番号５１および配列番号１９、配列番号６１または配列番号６２；ｐｏｌ遺伝子の第一の逆転写酵素（ＲＴ）配列を増幅するための、配列番号８、配列番号１４、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号５２、配列番号５３または配列番号５４および配列番号２０、配列番号６３、配列番号６４または配列番号６５；ｐｏｌ遺伝子の第二のＲＴ配列を増幅するための、配列番号９、配列番号１５、配列番号４２、配列番号４３、配列番号５５または配列番号５６および配列番号２１または配列番号６６；並びにｐｏｌ遺伝子の第三のＲＴ配列を増幅するための、配列番号１０、配列番号１６、配列番号４４、配列番号４５、配列番号５７または配列番号５８および配列番号２２、配列番号６７または配列番号６８からなる群より選択されるオリゴマーの混合物である。
【００１０】
本発明の別の側面にしたがって、ｇａｇまたはｐｏｌ配列由来のＨＩＶ−１配列に特異的にハイブリダイズし、配列番号２３から配列番号２９からなる群より選択される塩基配列および検出可能シグナルを生じる標識を有する、標識オリゴヌクレオチドを提供する。該オリゴヌクレオチドには、所望により、核酸主鎖中に、１以上の２’−Ｏ−メトキシ連結、ペプチド核酸連結、ホスホロチオエート連結、メチルホスホネート連結またはそれらのいずれかの組み合わせが含まれることが可能である。１つの態様において、標識オリゴヌクレオチドには、発光シグナルを生じる化合物である、標識が含まれ、そして好ましくは、該標識は、均質検出系で検出可能な化学発光シグナルを生じる。１つの態様において、標識オリゴヌクレオチドは、アクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物で標識され、そして：第一のｇａｇ配列に特異的にハイブリダイズする配列番号２３；第二のｇａｇ配列に特異的にハイブリダイズする配列番号２４；第三のｇａｇ配列に特異的にハイブリダイズする配列番号２５；プロテアーゼ配列に特異的にハイブリダイズする配列番号２６；第一のＲＴ配列に特異的にハイブリダイズする配列番号２７；第二のＲＴ配列に特異的にハイブリダイズする配列番号２８；および第三のＲＴ配列に特異的にハイブリダイズする配列番号２９からなる群より選択される配列を含有する。
【００１１】
本発明の別の側面にしたがって、生物学的試料におけるＨＩＶ−１を検出する方法であって：ＨＩＶ−１核酸を含有する試料を提供し；ｇａｇおよびｐｏｌ配列内に含有される、少なくとも１つのＨＩＶ−１標的配列を特異的に増幅する、２以上の増幅オリゴマーと、試料とを、核酸の増幅を可能にする条件下で混合し、ここで増幅オリゴマーは：
第一のｇａｇ配列を増幅するための、配列番号５、配列番号１１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号４６、または配列番号４７および配列番号１７または配列番号５９；
第二のｇａｇ配列を増幅するための、配列番号６、配列番号１２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号４８または配列番号４９および配列番号１８または配列番号６０；
プロテアーゼ配列である第一のｐｏｌ配列を増幅するための、配列番号７、配列番号１３、配列番号３７、配列番号３８、配列番号５０または配列番号５１および配列番号１９、配列番号６１または配列番号６２；
第一の逆転写酵素（ＲＴ）配列である第二のｐｏｌ配列を増幅するための、配列番号８、配列番号１４、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号５２、配列番号５３または配列番号５４および配列番号２０、配列番号６３、配列番号６４または配列番号６５；
第二のＲＴ配列である第三のｐｏｌ配列を増幅するための、配列番号９、配列番号１５、配列番号４２、配列番号４３、配列番号５５または配列番号５６および配列番号２１または配列番号６６；並びに
第三のＲＴ配列である第四のｐｏｌ配列を増幅するための、配列番号１０、配列番号１６、配列番号４４、配列番号４５、配列番号５７または配列番号５８および配列番号２２、配列番号６７または配列番号６８；あるいは
少なくとも１つのｇａｇ配列および少なくとも１つのｐｏｌ配列の増幅を可能にする、それらの組み合わせ
からなる群より選択される配列を有し、
標的配列を増幅して、増幅された核酸産物を産生し；そして増幅された核酸産物の存在を検出する工程を含んでなる、前記方法を提供する。１つの態様において、増幅工程は、実質的に等温条件下で行う転写仲介増幅法を用いる。別の態様において、検出工程は：ｇａｇ配列から産生される増幅された核酸にハイブリダイズするための、配列番号２３、配列番号２４もしくは配列番号２５の配列を有する標識オリゴマー、またはそれらのいずれかの組み合わせを有するオリゴマーの混合物；ｐｏｌ配列から産生される増幅された核酸にハイブリダイズするための、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８もしくは配列番号２９の配列を有する標識オリゴマー、またはそれらのいずれかの組み合わせを有するオリゴマーの混合物；あるいは２以上の標的配列から産生される増幅された核酸にハイブリダイズするための、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８または配列番号２９の配列を有する、少なくとも２つの標識オリゴマーの混合物を用いる。別の態様において、検出工程は、核酸プローブアレイへの増幅された核酸のハイブリダイゼーションを検出する。１つの態様には、ＨＩＶ−１核酸を含有する試料と、ＨＩＶ−１核酸に特異的にハイブリダイズする配列を有する、少なくとも１つの捕捉オリゴマーとを接触させ、こうしてＨＩＶ−１核酸が含まれるハイブリダイゼーション複合体を形成し、そして他の試料構成要素から該ハイブリダイゼーション複合体を分離する工程がさらに含まれる。
【００１２】
付随する図は、本発明のいくつかの態様を例示する。図は、説明と合わせ、本発明の原理を説明し、そして例示するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ＨＩＶ−１  ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子領域（上部に、左から右へ、５’から３’方向に示す）の模式図であり、本発明の増幅オリゴヌクレオチドおよび方法を用いて産生される、増幅される配列（ｇａｇおよびｐｏｌ領域の下に示す、Ｇａｇ１、Ｇａｇ２、Ｐｒｔ、ＲＴ１、ＲＴ３およびＲＴ４）の相対的な位置およびサイズを示す。１つの態様において、上のＧａｇ１、Ｇａｇ２およびＲＴ３領域の群が、１つの多重反応中で増幅され、そして下のＰｒｔ、ＲＴ１およびＲＴ４領域の群が、別の多重反応中で増幅される。
【図２】図２は、図１に記載するような、ＨＩＶ−１  ｇａｇおよびｐｏｌ領域、並びに増幅される配列の模式図であるが、この態様では、上のＧａｇ１、ＰｒｔおよびＲＴ３領域の群が、１つの多重反応中で共に増幅され、そして下のＧａｇ２、ＲＴ１およびＲＴ４領域の群が、別の多重反応中で増幅される。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明には、１以上のＨＩＶ−１標的領域を増幅し、そして増幅された配列を検出することによって、生物学的試料におけるＨＩＶ−１核酸を検出する方法およびオリゴヌクレオチドが含まれる。増幅される標的領域は、ＨＩＶ−１ウイルスが薬剤耐性になる際に、潜在的に突然変異される可能性がある多くのコドンが含まれるものである。検出工程は、増幅産物を、標識プローブとハイブリダイズさせ、そして標識プローブから生じるシグナルを検出することによるなど、増幅された標的配列と特異的に関連するシグナルを検出する、既知の多様な方法のいずれかを用いて行うことが可能である。検出工程はまた、核酸塩基配列のすべてまたは一部などの、増幅された配列に関するさらなる情報を提供することも可能である。本発明の組成物および方法は、ＨＩＶ−１配列の存在を検出し、そして検出可能配列情報に基づく遺伝的下位群または薬剤耐性表現型などの、感染性病原体に関するさらなる情報を提供するのに有用である。したがって、本発明は、医療従事者および患者に、ＨＩＶ−１感染に関する有用な診断および予後情報を提供する。好ましい態様において、ＨＩＶ−１ゲノムの多数の異なる部分を多重反応中で増幅して、単一反応容器中で異なるＨＩＶ−１配列の多数のコピーを産生する。その後、異なる領域から増幅された産物を検出し、そして／またはさらに解析する。多重反応は、試料に関して行う個々の反応数を最小限にし、そして多数の領域が増幅されるため、１つの領域が十分に増幅されていなくても、偽陰性結果の可能性を回避する。１つの態様において、該方法は、２つの異なる多重反応中で、増幅オリゴヌクレオチドを用いて、ＨＩＶ−１ゲノムの多数の異なる部分を増幅し、累積して約２．５ｋｂのＨＩＶ−１配列を増幅する。
【００１５】
本発明の方法には、好ましくは、先に、米国特許第５，３９９，４９１号および第５，５５４，５１６号（Ｋａｃｉａｎら）に詳細に開示されたような、等温転写仲介核酸増幅法を用いた増幅が含まれる。該方法には、プローブオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによって、核酸の存在を検出する、既知の多様な方法のいずれを用いることも可能な検出工程が含まれる。好ましくは、検出工程は、先に、Ａｒｎｏｌｄら  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１５８８−１５９４（１９８９）、並びに米国特許第５，６５８，７３７号（Ｎｅｌｓｏｎら）、および第５，１１８，８０１号および第５，３１２，７２８号（Ｌｉｚａｒｄｉら）に詳細に記載されるような、均質検出法を用いる。本発明の方法にはまた、既知の多様な精製法のいずれかを用いて、増幅前に他の試料構成要素から標的ＨＩＶ−１を精製する、所望による工程が含まれることも可能である。核酸を精製する方法は、当該技術分野に公知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー，  １９８９）§§１．２３−１．４０、２．７３−２．８０、４．２６−４．３２および７．３−７．３５）。好ましい態様は、ＰＣＴ第ＷＯ９８５０５８３号（Ｗｅｉｓｂｕｒｇら）に詳細に開示される溶液相ハイブリダイゼーションなどの、最小限の工程を伴う、比較的迅速な精製工程を用いる。簡潔には、精製は、標的に、そして磁気粒子（Ｗｈｉｔｅｈｅａｄら、米国特許第４，５５４，０８８号および第４，６９５，３９２号）などの除去可能固体支持体上の固定オリゴヌクレオチドにハイブリダイズして、他の試料構成要素から標的核酸を分離する、オリゴヌクレオチドを用いる。
【００１６】
本発明は、組織または体液試料などのヒト生物学的試料に存在するＨＩＶ−１核酸を検出する方法を提供する。「生物学的試料」には、ＨＩＶ−１核酸を含有する可能性がある、生存しているまたは死亡したヒト由来のいずれかの組織、体液または材料が含まれ、例えば、末梢血、血漿、血清、リンパ液、骨髄、子宮頚スワブ試料、リンパ節組織、呼吸組織または滲出物、胃腸組織、尿、糞便、精液または他の体液、組織または材料が含まれる。標準法を用いて、生物学的試料を処理して、物理的または機械的に組織または細胞構造を破壊し、水性または有機溶液中に、細胞内構成要素を遊離させて、さらなる解析のため、核酸を調製することが可能である。
【００１７】
「核酸」は、窒素性複素環塩基類、または塩基類似体（ａｎａｌｏｇ）類を有し、ホスホジエステル結合によって共に連結されて、ポリヌクレオチドを形成する、ヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を含んでなる多量体化合物を指す。核酸には、慣用的なＲＮＡおよびＤＮＡ、並びにその類似体が含まれる。核酸の「主鎖」は、既知の多様な連結で構成されることが可能であり、該連結には、１以上の糖−ホスホジエステル連結、ペプチド核酸結合（米国特許第５，５３９，０８２号（Ｎｉｅｌｓｅｎら）に記載されるような「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」に見られるもの）、ホスホロチオエート連結、メチルホスホネート連結またはそれらの組み合わせが含まれる。糖部分は、リボースまたはデオキシリボース、あるいは、２’メトキシおよび２’ハロゲン化物置換物（例えば２’−Ｆ）など、こうした糖の既知の置換物であることが可能である。窒素性塩基は、慣用的な塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、その類似体、例えばイノシン（「Ｉ」）またはネブラリン（「Ｎ」）あるいは合成類似体（Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ５−３６，  Ａｄａｍｓら監修，  第１１版，  １９９２；Ｌｉｎ  ＆  Ｂｒｏｗｎ，  １９８９，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １７：１０３７３−８３；Ｌｉｎ  ＆  Ｂｒｏｗｎ，  １９９２，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０：５１４９−５２）、プリンまたはピリミジン塩基類の誘導体（例えば、Ｎ４−メチルデオキシグアノシン、デアザ−またはアザ−プリン類、およびデアザ−またはアザ−ピリミジン類、５または６位に置換基を有するピリミジン塩基類、２、６または８位に置換基を有するプリン塩基類、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン類、４−アミノ−ピリミジン類、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン類、およびＯ４−アルキル−ピリミジン類；ＰＣＴ第ＷＯ９３１３１２１号（Ｃｏｏｋ）を参照されたい）およびその位でポリマー主鎖に窒素性塩基が含まれない、「無塩基性（ａｂａｓｉｃ）」残基（米国特許第５，５８５，４８１号（Ａｒｎｏｌｄら））であることが可能である。核酸は、天然存在ＲＮＡまたはＤＮＡに見られるような慣用的な糖、塩基および連結のみを含んでなることが可能であるし、または慣用的な構成要素および置換の組み合わせ（例えば２’メトキシ主鎖を介して連結される慣用的塩基、または慣用的塩基および１以上の塩基類似体を含むポリマー）が含まれることが可能である。
【００１８】
オリゴマーの主鎖組成は、オリゴマーおよび相補核酸鎖間に形成される、ハイブリダイゼーション複合体の安定性に影響を与える可能性がある。本発明のオリゴマーの態様には、ＰＮＡ、糖−ホスホジエステル連結、オリゴマーの一部またはすべてにおける２’メトキシ連結、またはその誘導体が含まれることが可能である。改変されたオリゴマー主鎖は、標準的ＤＮＡまたはＲＮＡに相対して、ハイブリダイゼーション複合体安定性を増進することが可能である。例えば、ＰＮＡであるか、あるいは２’−メトキシ連結（２’−Ｏ−メチルリボフラノシル部分を含有する；ＰＣＴ第ＷＯ９８／０２５８２号）または２’−Ｆ置換ＲＮＡ基を有するオリゴマーは、相補的２’ＯＨ  ＲＮＡと安定したハイブリダイゼーション複合体を形成する。２つの糖基を連結する連結は、全体の電荷または電荷密度、あるいは立体相互作用に影響を与えることによって、ハイブリダイゼーション複合体安定性に影響を与えることが可能である。オリゴマーの態様には、複合体安定性に影響を与える荷電（例えばホスホロチオエート）または中性（例えばメチルホスホネート）基を用いた連結が含まれることが可能である。
【００１９】
本発明には、ＨＩＶ−１標的配列を特異的に増幅する増幅オリゴヌクレオチドまたはオリゴマー、およびＨＩＶ−１標的配列またはその増幅産物を検出するプローブオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーが含まれる。「オリゴヌクレオチド」および「オリゴマー」は、一般的に１，０００残基未満を有するポリマー核酸を指し、約２から５残基の下限および約５００から９００残基の上限を有するサイズ範囲にあるポリマーが含まれる。好ましい態様において、オリゴマーは、約５から約１５残基の下限および約１００から２００残基の上限を有するサイズ範囲にある。より好ましくは、本発明のオリゴマーは、約１０から約１５残基の下限および約１７から１００残基の上限を有するサイズ範囲にある。オリゴマーは、天然に存在する核酸から精製することが可能であるが、一般的には、多様な公知の酵素的または化学的方法のいずれかを用いて、合成する。
【００２０】
「増幅オリゴヌクレオチド」または「増幅オリゴマー」は、標的核酸またはその相補体にハイブリダイズし、そして核酸増幅反応に関与するオリゴヌクレオチドである。増幅オリゴマーには、テンプレートとして別の核酸鎖を用いて、オリゴマーの３’端が酵素的に伸長される、プライマーおよびプロモーター−プライマーが含まれる。いくつかの態様において、増幅オリゴヌクレオチドは、標的配列（またはその相補鎖）の領域に相補的である、少なくとも約１０の隣接する塩基、そしてより好ましくは約１２の隣接する塩基を含有し、そして所望により、標的配列またはその相補体に結合しない他の塩基を含有することが可能である。例えば、プロモーター−プライマーは、標的結合塩基、および標的配列にハイブリダイズしないプロモーター配列が含まれる、さらなる５’塩基を含有することが可能である。隣接する標的結合塩基は、該塩基が結合する配列に、好ましくは少なくとも約８０％、そしてより好ましくは約９０％から１００％相補的である。増幅オリゴマーは、好ましくは、約１０から約６０塩基長であり、そして修飾ヌクレオチドまたは塩基類似体が含まれることが可能である。
【００２１】
本発明の態様は、ＨＩＶ−１ゲノムの領域、特にｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子配列の領域を特異的に増幅する、増幅オリゴマーを用いる。これらの増幅オリゴヌクレオチドには、配列番号５から配列番号２２および配列番号３３から配列番号６８の配列が含まれる。プロモーター−プライマーである、いくつかの増幅オリゴマーには、プロモーター配列が含まれる（配列番号５から配列番号１０および配列番号３３から配列番号４５）。プロモーター−プライマーに含まれる、好ましいＴ７プロモーター配列は、配列番号１から配列番号４に示す。当業者は、プライマーとして機能可能なオリゴマー（すなわち標的配列に特異的にハイブリダイズし、そして３’ポリメラーゼ伸長可能端を有するもの）を修飾して、５’プロモーター配列を含ませ、そしてこうしてプロモーター−プライマーにすることが可能であると認識するであろう。同様に、いかなるプロモーター−プライマー配列も、そのプロモーター配列と独立にプライマーとして機能可能である（配列番号１１から配列番号１６および配列番号４６から配列番号５８における、プロモーターを含まずに示す配列など）。
【００２２】
「増幅する」または「増幅」により、多コピーの標的核酸配列あるいはその相補体または断片を生じるための方法を意味する（すなわち増幅された産物は、完全標的配列より少ない配列を含有することが可能である）。例えば、断片は、標的核酸の内部位にハイブリダイズし、そして該位から重合を開始する増幅オリゴヌクレオチドを用いることにより、標的核酸の一部を増幅することによって、産生可能である。既知の増幅法には、例えば、レプリカーゼ仲介増幅、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）増幅、鎖置換増幅（ＳＤＡ）および転写関連または転写仲介増幅（ＴＭＡ）が含まれる。レプリカーゼ仲介増幅は、ＱＢレプリカーゼを用いて、ＲＮＡ配列を増幅する（米国特許第４，７８６，６００号（Ｋｒａｍｅｒら）；ＰＣＴ第ＷＯ９０１４４３９号）。ＰＣＲ増幅は、ＤＮＡポリメラーゼ、向かい合う鎖のプライマーおよび熱反復を用いて、多コピーのＤＮＡまたはｃＤＮＡを合成する（米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、および第４，８００，１５９号（Ｍｕｌｌｉｓら）；Ｍｕｌｌｉｓら，  １９８７，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １５５：３３５−３５０）。ＬＣＲ増幅は、少なくとも４つの異なるオリゴヌクレオチドを用いて、ハイブリダイゼーション、連結、および変性の周期を用いることにより、標的の相補鎖を増幅する（ＥＰ第０  ３２０  ３０８号）。ＳＤＡは、標的配列が含まれる半修飾ＤＮＡ二重鎖の一方の鎖にニックを形成する制限エンドヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼの認識部位を含有するプライマーを用い、その後、プライマー伸長および鎖置換工程が続く（米国特許第５，４２２，２５２号および第５，４７０，７２３号（Ｗａｌｋｅｒら））。エンドヌクレアーゼニック形成に頼らない等温鎖置換増幅法もまた知られる（米国特許第６，０８７，１３３号（Ｄａｔｔａｇｕｐｔａら））。転写関連または転写仲介増幅は、プロモーター配列が含まれるプライマー、および該プロモーターに特異的なＲＮＡポリメラーゼを用いて、標的配列から多数の転写物を産生し、こうして標的配列を増幅する（米国特許第５，３９９，４９１号、第５，４８０，７８４号、第５，８２４，５１８号および第５，８８８，７７９号（Ｋａｃｉａｎら）、第５，４３７，９９０号（Ｂｕｒｇら）、第５，４０９，８１８号（Ｄａｖｅｙら）、第５，５５４，５１６号および第５，７６６，８４９号（ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら）、第５，１３０，２３８号（Ｍａｌｅｋら）、第４，８６８，１０５号および第５，１２４，２４６号（Ｕｒｄｅａら）、および第５，７８６，１８３号（Ｒｙｄｅｒら）、ＰＣＴ第ＷＯ８８０１３０２号および第ＷＯ８８１０３１５号（Ｇｉｎｇｅｒａｓら））。
【００２３】
本発明の好ましい態様は、転写仲介増幅（ＴＭＡ）反応において、本増幅オリゴマーを用いて、ＨＩＶ−１標的配列を増幅する。当業者は、ポリメラーゼ仲介プライマー伸長を用いる核酸増幅の他の方法において、これらの増幅オリゴヌクレオチドが容易に使用可能であることを認識するであろう。
【００２４】
「転写仲介増幅」は、ＲＮＡポリメラーゼを用いて、核酸テンプレートから多数のＲＮＡ転写物を産生する核酸増幅を指す。増幅反応は、ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮアーゼＨ活性、リボヌクレオシド三リン酸、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、およびプロモーター−プライマーを使用し、そして１以上のさらなる増幅オリゴヌクレオチドが含まれることが可能である。好ましい態様は、米国特許第５，３９９，４９１号、第５，４８０，７８４号、第５，８２４，５１８号および第５，８８８，７７９号（Ｋａｃｉａｎら）、第５，５５４，５１６号および第５，７６６，８４９号（ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら）、および第５，７８６，１８３号（Ｒｙｄｅｒら）に詳細に開示される方法を用いる。
【００２５】
ＨＩＶ−１標的配列の増幅後、増幅された配列およびプローブオリゴヌクレオチド配列間に形成されるハイブリダイゼーション複合体の検出を可能にするプローブへのハイブリダイゼーションを用いて、増幅された産物を検出する。いくつかの態様において、プローブを標識し、そしてハイブリダイゼーション複合体から検出されるシグナルは、標識プローブから生じる。他の態様において、増幅された産物を標識し、そしてプローブにハイブリダイズさせ、そして検出されるシグナルは、ハイブリダイゼーション複合体中の標識産物から生じる。検出工程で、配列情報を提供する態様において、増幅された核酸を、オリゴヌクレオチドプローブのアレイ（米国特許第５，８３７，８３２号および第５，８６１，２４２号（Ｃｈｅｅら））にハイブリダイズさせ、そしてコンピューター化システムを用いて、検出されたシグナルを解析し（米国特許第５，７３３，７２９号および第６，０６６，４５４号（Ｌｉｐｓｈｕｔｚら））、システムによって、「塩基コール」から核酸配列を生じる。
【００２６】
「プローブ」は、ハイブリダイゼーションを促進する条件下で、核酸標的配列に特異的にハイブリダイズし、それにより、標的配列の検出を可能にする核酸オリゴマーを指す。検出は、直接（すなわち標的配列に直接ハイブリダイズするプローブから生じる）であっても、または間接的（すなわちプローブおよび標的配列を連結する中間分子構造にハイブリダイズするプローブから生じる）であってもよい。プローブの「標的配列」は、プローブオリゴマーの少なくとも一部に特異的にハイブリダイズする、核酸内、好ましくは増幅された核酸中の配列を指す。プローブは、標的特異的配列およびプローブの三次元コンホメーションに貢献する他の配列（米国特許第５，１１８，８０１号および第５，３１２，７２８号（Ｌｉｚａｒｄｉら）を参照されたい）を含んでなることが可能である。「十分に相補的な」配列は、プローブおよび標的配列が、標準的塩基対形成（Ｇ：Ｃ、Ａ：ＴまたはＡ：Ｕ対形成）により完全に相補的でなくても、ハイブリダイゼーション条件下で、標的配列へのプローブオリゴマーの安定なハイブリダイゼーションを可能にする。「十分に相補的な」プローブ配列は、１００％相補的ではないが、プローブの全塩基配列によって、ハイブリダイゼーション条件において、別の配列と特異的にハイブリダイズすることが可能である、１以上の残基（無塩基性残基が含まれる）を含有することが可能である。適切なハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野に公知であり、塩基配列組成に基づいて、容易に予測可能であるか、または日常的な試験を用いることによって、実験的に決定することが可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー，  １９８９）§§１．９０−１．９１、７．３７−７．５７、９．４７−９．５１および１１．４７−１１．５７、特に§§９．５０−９．５１、１１．１２−１１．１３、１１．４５−１１．４７および１１．５５−１１．５７を参照されたい）。好ましい態様において、プローブには、標的配列に、少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは約１００％相補的である、隣接塩基が含まれる。
【００２７】
検出のため、プローブは、標識されることが可能であり、すなわち、検出可能分子部分または検出可能シグナルを導く化合物に、直接または間接的に連結することが可能である。直接標識は、共有結合および非共有相互作用（例えば水素結合、疎水性およびイオン性相互作用）を含む、標識をプローブに連結する結合または相互作用を通じて、あるいはキレートまたは配位複合体の形成を通じて、生じることが可能である。間接的標識は、標識をプローブに連結し、そして検出可能シグナルを増幅することが可能な、架橋部分（「リンカー」）の使用を通じて、生じる（例えば、ＰＣＴ第ＷＯ９５／１６０５５号（Ｕｒｄｅａら）を参照されたい）。標識は公知であり、そして例えば、放射性核種、リガンド（例えばビオチン、アビジン）、酵素および／または酵素基質、反応性基、遷移金属などの酸化還元活性部分（例えばＲｕ）、発色団（例えば検出可能な色を与える部分）、発光化合物（例えば、生物発光、燐光または化学発光標識）および蛍光化合物が含まれる。当業者は、標識プローブが、検出のため、プローブ試薬の比活性を最適化するのに、標的配列に特異的にハイブリダイズする、標識および非標識オリゴヌクレオチドの混合物であることが可能であると認識するであろう。いくつかの態様において、プローブ上の標識は、均質アッセイ系で検出可能であり、すなわち、混合物において、非結合標識プローブに比較して、結合した標識プローブが、安定性または差別的分解などの検出可能な変化を示す。均質アッセイで使用するのに好ましい標識は、化学発光化合物（米国特許第５，６５６，２０７号（Ｗｏｏｄｈｅａｄら）、第５，６５８，７３７号（Ｎｅｌｓｏｎら）、および第５，６３９，６０４号（Ａｒｎｏｌｄ，  Ｊｒ．ら））である。好ましい化学発光標識にはアクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物が含まれ、これは標準的ＡＥまたはその誘導体（例えば、ナフチル−ＡＥ、オルト−ＡＥ、１−または３−メチル−ＡＥ、２，７−ジメチル−ＡＥ、４，５−ジメチル−ＡＥ、オルト−ジブロモ−ＡＥ、オルト−ジメチル−ＡＥ、メタ−ジメチル−ＡＥ、オルト−メトキシ−ＡＥ、オルト−メトキシ（シンナミル）−ＡＥ、オルト−メチル−ＡＥ、オルト−フルオロ−ＡＥ、１−または３−メチル−オルト−フルオロ−ＡＥ、１−または３−メチル−メタ−ジフルオロ−ＡＥ、および２−メチル−ＡＥ）であることが可能である。核酸に標識を付着させ、そして標識を検出する方法は、当該技術分野に公知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ニューヨーク州コールドスプリングハーバー，  １９８９），  第１０章；米国特許第５，６５８，７３７号（Ｎｅｌｓｏｎら）、第５，６５６，２０７号（Ｗｏｏｄｈｅａｄら）、第５，５４７，８４２号（Ｈｏｇａｎら）、および第５，２８３，１７４号（Ａｒｎｏｌｄ，  Ｊｒ．ら）、並びにＰＣＴ第ＷＯ９８０２５８２号（Ｂｅｃｋｅｒ）を参照されたい）。
【００２８】
本発明の方法は、所望により、増幅前に他の試料構成要素からＨＩＶ−１標的核酸を精製する工程を含むことが可能である。「精製」によって、標的が生物学的試料の１以上の構成要素（例えば他の核酸、タンパク質、炭水化物または脂質）から分離されていることを意味する。好ましくは、精製工程は、少なくとも約７０％、そしてより好ましくは約９０％以上の他の試料構成要素を除去する。こうした精製工程が含まれる態様において、ＨＩＶ−１標的核酸は、先に詳細に記載されるように（ＰＣＴ第ＷＯ９８／５０５８３号）、核酸ハイブリダイゼーションに基づいて、ＨＩＶ−１標的配列を固定（すなわち固体支持体に付着した）オリゴマーに特異的に連結する、「捕捉オリゴマー」にハイブリダイズされる。この工程は、他の試料構成要素からの標的の迅速な分離を可能にする、２溶液相ハイブリダイゼーション（捕捉オリゴマーおよび標的のハイブリダイゼーション、その後、固定オリゴマーへの標的：捕捉オリゴマー複合体のハイブリダイゼーション、標的：捕捉オリゴマー：固定オリゴマー複合体を生じる）を伴うため、好適である。
【００２９】
「本質的にからなる」によって、本発明の基本的なそして新規の特性を実質的に変化させない、さらなる単数または複数の構成要素、単数または複数の組成物あるいは単数または複数の方法工程が、本発明の組成物または方法に含まれていてもよいことを意味する。こうした特性には、試料に存在するＨＩＶ−１配列を増幅し、そして検出する能力が含まれる。
【００３０】
別に定義しない限り、本明細書に用いるすべての科学的および技術的用語は、相当する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同一の意味を有する。本明細書に用いる多くの用語の一般的な定義は、例えば、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  第２版（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら，  １９９４，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  ニューヨーク州ニューヨーク）に提供される。別に言及しない限り、本明細書に使用されるかまたは意図される技術は、一般の当業者の１人に公知の標準的方法である。実施例は、好ましい態様のいくつかを例示する。
【００３１】
本発明には、ヒト生物学的試料に存在するＨＩＶ−１核酸を検出するための核酸オリゴマーおよび方法が含まれる。増幅オリゴマーとして使用するのに適したＤＮＡ配列を決定するため、同一または同様の配列領域をマッチングすることによって、一般的には既知のサブタイプのものであり、そして公的にアクセス可能なデータベース（例えばＧｅｎＢａｎｋ）から入手可能な部分的または相補的配列が含まれる、既知のＨＩＶ−１配列を並列させ、そして公知の分子生物学的技術を用いて比較した。アルゴリズムの使用は、配列比較を容易にすることが可能であるが、当業者は、アルゴリズムの助けを借りず、容易にこうした比較を行うことが可能である。オリゴマー配列が既知の薬剤耐性突然変異を含有せず、オリゴマーの組み合わせが各々、約３００から６００ｎｔを増幅し、オリゴマーが、核酸構造を予測する公知の方法に基づいて予測される二次構造を最小限しか含有せず、配列が既知の多型塩基（サブタイプ内またはサブタイプ間多型）をほとんど含有せず、そして多型が生じる残基に関しては、比較される配列の大部分において、その位で見出される塩基または塩基類似体（例えばネブラリン）をその位で用いることを条件として、ＨＩＶ−１  ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子の一部を増幅するであろう、増幅オリゴマーを設計した（ＨＩＶ−１  ＨＸＢ２、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＫＯ３４５５に基づく）。増幅オリゴマーを設計する際に用いた配列比較は、一般的に：ｇａｇ領域に関しては、２２のサブタイプＡ、４１のサブタイプＢ、１２のサブタイプＣ、１１のサブタイプＤ、６のサブタイプＦ、４のサブタイプＧ、３のサブタイプＨ、および２のサブタイプＪ配列；プロテアーゼ領域に関しては、２２−３４のサブタイプＡ、３６−４１のサブタイプＢ、１５のサブタイプＤ、２６のサブタイプＦ、および８のサブタイプＧ配列；そしてＲＴ領域に関しては、３２−４４のサブタイプＡ、３８−４６のサブタイプＢ、２４のサブタイプＣ、９−１５のサブタイプＤ、５−２６のサブタイプＦ、および８のサブタイプＧ配列であった。
【００３２】
増幅された配列内に生じるものに相補的な配列に関して選択して、プローブオリゴマーを同様に設計した。公知の合成法を用いて、ＤＮＡオリゴマーを合成し、そして増幅またはプローブオリゴマーとしての有効性に関して試験した。標識プローブは、実質的に米国特許第５，６３９，６０４号（１０欄６行から１１欄３行、および実施例８を参照されたい）に詳細に記載されるように、リンカーを介して付着させたＡＥ化合物で標識した。オリゴマーの有効性を、本明細書に記載する増幅および検出系で試験し、そしていくつかの場合、例えば１以上の残基を変化させるか、塩基類似体を置換するか、あるいはオリゴマー主鎖の一部またはすべてを修飾する（例えばＤＮＡに対して２’−Ｏ−メチルＲＮＡを置換する）ことによって、オリゴマー配列を修飾して、増幅または検出を最適にした。
【００３３】
これらの解析に基づいて、本明細書に記載する増幅オリゴヌクレオチドを同定した。増幅オリゴヌクレオチドには、所望により、増幅された標的配列から転写物を産生するためのプロモーター配列が含まれることが可能であり、そして好ましいＴ７プロモーター配列を配列番号１から配列番号４に示す。Ｔ７プロモーター配列が含まれる増幅オリゴマーに関しては、プライマー配列は、Ｔ７プロモーター配列を含み（配列番号５から配列番号１０および配列番号３３から配列番号４５）、そしてＴ７プロモーター配列を含まず（配列番号１１から配列番号１６および配列番号４６から配列番号５８）示している。当業者は、プロモーター配列を含むまたは含まない、ＨＩＶ−１に特異的な増幅オリゴマーが、適切な増幅条件下で、プライマーとして有用である可能性があると認識するであろう。
【００３４】
図１および２を参照すると、上部は、ＨＩＶ−１ゲノムのｇａｇおよびｐｏｌ領域（ｇａｇおよびｐｏｌと標示する、重複する斜線領域）を例示し、そして下部は、増幅プライマーを用いて増幅される領域（Ｇａｇ１、Ｇａｇ２、Ｐｒｔ、ＲＴ１、ＲＴ３およびＲＴ４と下に標示する二重線）のおよそのサイズおよび位置を示す。これらの増幅される領域には特徴が含まれ：Ｇａｇ１はＧａｇ  Ｐ２４およびＧａｇ  Ｐ１７間の切断部位を含有し；Ｇａｇ２は他のＧａｇ切断部位を含有し；ＰｒｔはＧａｇの３’端の２つの切断部位、プロテアーゼ領域、並びにプロテアーゼおよび逆転写酵素（ＲＴ）間の切断部位を含有し；ＲＴ１はＲＴの４１および１９０間のコドンを含有し；ＲＴ３はＲＴの２００および３５０間のコドンを含有し；そしてＲＴ４はＲＴの３’端のコドン、並びにＲＴおよびＲＮアーゼＨ間の切断部位を含有する。図１および２は、増幅される領域の相対サイズおよび位置を例示するが、増幅される領域の絶対サイズは、用いる増幅オリゴマーの特定の組み合わせに応じて、わずかに変化する可能性がある。例えば、配列番号５および配列番号１７の配列を有するプライマーを用いて増幅されるＧａｇ配列は、２６０ｎｔ増幅産物（Ｇａｇ１）を産生し、そして配列番号６および配列番号１８は、４１５ｎｔ増幅産物（Ｇａｇ２）を産生する。配列番号７および配列番号１９の配列を有するプライマーを用いて増幅されるプロテアーゼ（Ｐｒｔ）領域は、５７４ｎｔ増幅産物を産生する。ｐｏｌ遺伝子の３つの逆転写酵素（ＲＴ）配列は：５３２ｎｔ産物（ＲＴ１）を産生する配列番号８および配列番号２０、４６４ｎｔ産物（ＲＴ３）を産生する配列番号９および配列番号２１、並びに３８４ｎｔ産物（ＲＴ４）を産生する配列番号１０および配列番号２２の配列を有するプライマーを用いる増幅から生じる。関連増幅オリゴマー配列の他の組み合わせを同様に用いて、例えば：Ｇａｇ１に関して（配列番号３３および配列番号１７または配列番号５９）、Ｇａｇ２に関して（配列番号３４または配列番号３６および配列番号６０）、Ｐｒｔに関して（配列番号３７または配列番号３８および配列番号１９、配列番号６１または配列番号６２）、ＲＴ１に関して（配列番号３９、配列番号４０または配列番号４１および配列番号２０、配列番号６３、配列番号６４または配列番号６５）、ＲＴ３に関して（配列番号４２または配列番号４３および配列番号６６）、そしてＲＴ４に関して（配列番号４４または配列番号４５および配列番号６７または配列番号６８）、これらの領域を増幅することが可能である。好ましい態様において、配列番号１８から配列番号２２、および配列番号３５の増幅オリゴマーには、１以上の５’残基の主鎖に関して、好ましくは残基１から４に関して、２’−Ｏ−メトキシ連結が含まれる。
【００３５】
増幅される標的配列の検出のため、増幅される配列に相補的なプローブ配列を設計し、そしてこうしたプローブの好ましい態様は、配列番号２３から配列番号２９、配列番号６９および配列番号７０の配列を有する。より具体的には、配列番号２３のプローブは、Ｇａｇ１増幅産物または単位複製配列（ａｍｐｌｉｃｏｎ）にハイブリダイズし、配列番号２４のプローブは、ＨＩＶ−１サブタイプＡテンプレートから産生されるＧａｇ１単位複製配列にハイブリダイズし、配列番号２５および配列番号６９のプローブはＧａｇ２単位複製配列にハイブリダイズし、配列番号２６のプローブはＰｒｔ単位複製配列にハイブリダイズし、配列番号２７および配列番号７０のプローブはＲＴ１単位複製配列にハイブリダイズし、配列番号２８のプローブはＲＴ３単位複製配列にハイブリダイズし、そして配列番号２９のプローブはＲＴ４単位複製配列にハイブリダイズする。いかなる主鎖を用いて、プローブオリゴマーの塩基配列を連結することも可能であり、そしていくつかの態様には、例えば配列番号２４から配列番号２９、配列番号６９および配列番号７０に関して、１以上の２’−Ｏ−メトキシ連結が含まれる。標識プローブとして用いる際、プローブオリゴマーには、いかなる既知の検出可能標識または検出可能シグナルの産生を導く標識が含まれることも可能である。いくつかの態様において、プローブオリゴマーは、先に記載されるように（米国特許第５，６３９，６０４号（Ａｒｎｏｌｄ，  Ｊｒ．ら））、リンカーを介してアクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物で標識する。例えば、プローブのいくつかの態様は、以下のように標識する：配列番号２３、残基９および１０の間、配列番号２４、残基１０および１１の間、配列番号２５、残基１７および１８の間、配列番号２６、残基９および１０の間、配列番号２７、残基１６および１７の間、配列番号２８、残基９および１０の間、配列番号２９、残基１０および１１の間、配列番号６９、残基１１および１２の間、並びに配列番号７０、残基１１および１２の間。
【００３６】
捕捉オリゴマーを用いて、他の試料構成要素からＨＩＶ−１標的を精製する態様では、捕捉オリゴマー配列は、配列番号３０、配列番号３１および配列番号３２の組み合わせであった。これらの捕捉プローブには、ＨＩＶ−１配列（ｐｏｌまたはＬＴＲ配列）と特異的にハイブリダイズする配列の５’部分および固体支持体（例えば常磁性粒子）上の相補的固定オリゴマー（ｄＴ１４）とハイブリダイズする３’ポリＡ「テール」部分が含まれる。当業者は、ポリ−ｄＡテールの代わりに、相補的固定配列に結合する、いかなる３’部分を用いてもよく、そしてハイブリダイゼーションを可能にするいかなる主鎖を用いて、捕捉オリゴマーの塩基配列を連結してもよいことを認識するであろう。
【００３７】
これらの構成要素を用いて、生物学的試料におけるＨＩＶ−１配列を検出するアッセイには、所望により、１以上の捕捉オリゴマーを用いて、試料から標的ＨＩＶ−１核酸を精製し、少なくとも２つのプライマーを用いて、好ましくは転写仲介増幅反応を用いることによって、標的ＨＩＶ−１領域を増幅し、そして増幅された核酸に特異的にハイブリダイズする１以上のプローブと、増幅された核酸とをハイブリダイズさせることによって、増幅された核酸を検出する工程が含まれる。検出工程が標識プローブを用いるならば、結合した標識プローブから生じるシグナルを検出する。検出工程が固体支持体に付着したプローブアレイ（「ＤＮＡチップ」）へのハイブリダイゼーションを用いるならば、増幅された産物に特異的に結合するプローブ位置を検出するため、増幅産物を、ＤＮＡチップにハイブリダイズさせる前に、標識することが可能である。単位複製配列は、増幅工程の一部として、または増幅後に標識可能である。増幅後に単位複製配列を標識するのに好ましい方法はまた、ＤＮＡチップ上での検出のため、産物をより小さい部分に寸断する（詳細に関しては、ＰＣＴ第ＷＯ００／６５９２６号およびＰＣＴ第ＰＣＴ／ＩＢ９９／０２０７３号を参照されたい）。
【００３８】
増幅前に、所望による精製工程を用いる場合、好ましくは、ＰＣＴ第ＷＯ９８／５０５８３号に記載される２工程ハイブリダイゼーション法を用いることによるなど、最小限の取り扱い工程を用いて、単一反応容器中で行う。簡潔には、第一のハイブリダイズ条件下で、ＨＩＶ−１標的核酸を含有する試料に捕捉オリゴマーを添加し、ここで捕捉オリゴマーの１つの部分がＨＩＶ−１標的配列に特異的にハイブリダイズし、捕捉オリゴマー：ＨＩＶ−１  ＲＮＡ複合体を生じる。その後、第二のハイブリダイズ条件下で、捕捉プローブの第二の部分が、磁気ビーズなどの固体支持体上に固定した相補的オリゴマー配列にハイブリダイズし、固定オリゴマー：捕捉オリゴマー：ＨＩＶ−１  ＲＮＡ複合体を生じる。どちらのハイブリダイゼーション条件でも、試料は、塩、界面活性剤および緩衝剤（例えば４００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１−１０％ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、２４０−８３２ｍＭ  ＬｉＯＨ、０−７８３ｍＭ  ＬｉＣｌ、ｐＨ７．６−８．０）、捕捉オリゴマー（類）、および固体粒子上の固定オリゴマーの混合物中にあり、そして２つの異なるハイブリダイゼーション条件は、第一および第二の温度でインキュベーションすることによって得られる。その後、付着した固定オリゴマー：捕捉オリゴマー：ＨＩＶ−１  ＲＮＡ複合体を含む固体支持体を、他の試料構成要素から物理的に分離して、標的ＨＩＶ−１  ＲＮＡを精製する。付着した核酸複合体を含む固体支持体は、標準的方法を用いて洗浄し（例えば核酸複合体がハイブリダイズしたままであることを可能にする条件下で、緩衝水性溶液でリンスして）、ＨＩＶ−１  ＲＮＡをさらに精製することが可能である。磁気粒子が固体支持体である場合、物理的分離は、容器に磁場を適用することによって、容易に達成可能である。精製後、支持体に付着したＨＩＶ−１  ＲＮＡ含有複合体は、増幅に直接使用可能である。
【００３９】
２以上の増幅オリゴマーを用いたＨＩＶ−１標的の増幅は、多コピーの標的配列またはその相補体を産生するプライマー伸長に頼る、既知の多様な核酸増幅反応を用いて、達成可能である。１つの態様は、実質的に先に詳細に記載されるような、転写仲介増幅を用いる（米国特許第５，３９９，４９１号、第５，４８０，７８４号、第５，５５４，５１６号、第５，７６６，８４９号、第５，７８６，１８３号、第５，８２４，５１８号、および第５，８８８，７７９号）。簡潔には、転写仲介増幅は、２つのプライマー（１つはＲＮＡポリメラーゼ用のプロモーター配列を含有するプロモーター−プライマー）、ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）、ＲＮＡポリメラーゼ、およびヌクレオシド（デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸）を、適切な塩および緩衝剤と共に、溶液中で用いて、核酸テンプレートから多数のＲＮＡ転写物を産生する。まず、プロモーター−プライマー（Ｐ１プライマーとも称される）が標的配列に特異的にハイブリダイズし、そして逆転写酵素が、プロモーター−プライマーの３’端の伸長によって、第一鎖ｃＤＮＡを生成し、そしてそのＲＮアーゼＨ活性がＲＮＡ：ｃＤＮＡ複合体中のＲＮＡ標的鎖を消化する。第一鎖ｃＤＮＡは、プロモーター−プライマー配列の３’の位置で第二のプライマー（Ｐ２プライマーとも称される）とハイブリダイズし、そして逆転写酵素が、Ｐ２プライマーの３’端の伸長によって新規ＤＮＡコピーを生成し、それにより一端に機能するプロモーター配列を有する二本鎖ＤＮＡを生成する。ＲＮＡポリメラーゼが機能するプロモーター配列に結合し、そして転写して、多数の転写物（増幅産物または単位複製配列）を産生する。各転写物は、別の周期の複製のテンプレートとして働くことが可能であり、すなわちＰ２プライマーが単位複製配列に結合し、そして逆転写酵素がｃＤＮＡを生成し、このｃＤＮＡにＰ１プロモーターが結合し、そして逆転写酵素が、一端に機能するプロモーターを持つ二本鎖ＤＮＡを作成し、このプロモーターがＲＮＡポリメラーゼに結合してより多くの転写物を産生する。したがって、実質的に等温の条件下で、転写仲介増幅は多くの単位複製配列、すなわち単一のテンプレートから約１００から約３，０００のＲＮＡ転写物を産生する。実施例に記載する態様は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼに認識されるプロモーター配列が含まれるＰ１プロモーター−プライマーを用いるが、当業者は、プロモーター配列およびその対応するＲＮＡポリメラーゼのいかなる組み合わせも使用可能であることを認識するであろう（例えばＴ３ポリメラーゼ）。
【００４０】
転写仲介増幅のための増幅反応混合物は、一般的に、１−２．５ｍＭ  Ｍｇ＋２、１８−４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、０．５−３．５ｍＭ  ＡＴＰ、１．７５−７．０ｍＭ  ＵＴＰ、５−１６ｍＭ  ＧＴＰ、１．７５−５．６ｍＭ  ＣＴＰ、０．７５ｍＭ  ｄＮＴＰ、２５−３７．５ｍＭ  ＫＣｌ、最適な量の各プライマー、２６００−３０００Ｕ逆転写酵素および２６００−３６００Ｕ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを含有する。典型的な反応混合物には、１ｍＭ  Ｍｇ＋２、３２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、０．５−１．０ｍＭ  ＡＴＰ、５．０ｍＭ  ＵＴＰ、５−９ｍＭ  ＧＴＰ、５ｍＭ  ＣＴＰ、０．７５ｍＭ  ｄＮＴＰ、３７．５ｍＭ  ＫＣｌ、プライマー、並びに各３０００Ｕの逆転写酵素およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼが含まれる。
【００４１】
増幅産物の検出は、１以上のプローブ配列への単位複製配列の特異的ハイブリダイゼーションを検出する、いかなる工程も使用可能である。標識プローブが単位複製配列にハイブリダイズするならば、標識は、好ましくは、均質系で検出可能なもの（すなわち、結合したプローブの検出のため、未結合プローブが単位複製配列：プローブ複合体から分離されることを要しないもの）である。いくつかの態様において、標識はＡＥ化合物であり、該化合物から、先に詳細に記載されるように検出される、化学発光シグナルが生じる（米国特許第５，２８３，１７４号、第５，６５６，７４４号および第５，６５８，７３７号）。あるいは、単位複製配列またはその断片は、ＤＮＡチップ上のようなプローブアレイにハイブリダイズさせることが可能であり、そして単位複製配列に特異的にハイブリダイズするプローブを検出して、単位複製配列を産生するＨＩＶ−１標的に関する配列情報を提供する。当業者は、１より多い方法を用いて、単一の増幅反応から生じる増幅産物を検出可能であることを認識するであろう。例えば、増幅反応の一部を、陽性または陰性反応を提供する標識プローブハイブリダイゼーション法に供して、反応中のＨＩＶ−１特異的増幅産物の存在または非存在を示し、それによって、試料がＨＩＶ−１に関して陽性であるかまたは陰性であるかを示すことが可能である。陽性に試験された反応に関しては、ＤＮＡプローブアレイへのハイブリダイゼーションを用いて、増幅反応の別の一部をさらにアッセイして、試料に存在するＨＩＶ−１に関する配列情報を提供し、それによってさらにより詳細な診断情報を提供することが可能である。
【００４２】
開示する増幅オリゴマーを用いることによって増幅されるｇａｇおよびｐｏｌ領域のいずれか１つを検出して、試料に関する診断情報を提供することが可能であるが、１より多い領域の増幅および検出は、例えば薬剤耐性に関連する多数の遺伝子マーカーを検出することによって、潜在的に、より多くの診断情報を提供する。個々のｇａｇおよびｐｏｌ領域は別個に増幅し、そしてその後、検出のため、単位複製配列をプールすることが可能であるが、アッセイを単純にするため、多重反応で、多数の領域を増幅した。すなわち、各多重反応は、多数の増幅オリゴマーを含み、単一反応容器中で多数のＨＩＶ−１標的領域を増幅する。
【００４３】
多重反応は、それぞれの標的配列へのハイブリダイゼーションに関する増幅オリゴマー間の潜在的な干渉または比較的小さい単位複製配列の産生を回避しながら、多数の標的配列を増幅するように設計した。例えば、図１を参照すると、ＲＴ１およびＲＴ３と標識した標的領域は重複し、ＲＴ３およびＲＴ４標的領域も同様である。したがって、多重反応が、重複する標的用の増幅オリゴマーを含む場合、例えば配列番号９または配列番号１５（ＲＴ３のＰ１プライマー）および配列番号２２（ＲＴ４のＰ２プライマー）の組み合わせの使用から、比較的小さい標的領域が増幅される可能性がある。したがって、多重反応は、多くの診断情報を提供しないが増幅中に基質を消費する、小さい単位複製配列を産生しないであろうプライマーの組み合わせを含むように設計した。（１）１つの容器において、Ｇａｇ１、ＲＴ１およびＲＴ４標的領域を増幅する増幅オリゴマー、並びに別の容器において、Ｇａｇ２、ＰｒｔおよびＲＴ３標的領域を増幅する増幅オリゴマー、（２）１つの容器において、Ｇａｇ１、Ｇａｇ２およびＲＴ３標的領域を増幅する増幅オリゴマー、並びに別の容器において、Ｐｒｔ、ＲＴ１およびＲＴ４標的領域を増幅する増幅オリゴマー（図１に例示される）、並びに（３）１つの容器において、Ｇａｇ２、ＲＴ１およびＲＴ４標的領域を増幅する増幅オリゴマー、並びに別の容器において、Ｇａｇ１、ＰｒｔおよびＲＴ３標的領域を増幅する増幅オリゴマー（図２に例示される）を含む、異なる組み合わせの増幅オリゴマーを多重反応で試験した。これらの多重組み合わせの反応各々は、１ｋｂを超えるＨＩＶ−１標的核酸を増幅し、そして各組み合わせに関して２つの多重反応を組み合わせると、累積して２．５ｋｂを超えるＨＩＶ−１配列が増幅される。
【００４４】
本発明のいくつかの態様は、以下の実施例によって例示される。これらの実施例において、核酸増幅に用いるＨＩＶ−１  ＲＮＡは、ウイルスサブタイプＡ、ＢまたはＣに感染したリンパ球培養の上清に存在するウイルス、培養上清から単離した精製ＨＩＶ−１  ＲＮＡ、クローニングしたＨＩＶ−１配列から産生した転写物、またはＨＩＶ−１感染患者から得た血漿由来であり、血漿由来の場合、ウイルスサブタイプは、配列決定によって、または血漿中のウイルスのウイルスエンベロープに存在する抗原によって決定した。
【実施例】
【００４５】
実施例１
ＨＩＶ−１の異なるサブタイプからのＧａｇ標的配列の増幅および検出
３つの異なるサブタイプ（Ａ、ＢおよびＣ）由来のＨＩＶ−１  ＲＮＡの既知の量を含有する試料を調製し、その後、転写仲介増幅反応において、Ｇａｇ１標的領域に特異的なプライマーを用いて増幅した。増幅後、Ｇａｇ１単位複製配列の２つの異なる標識プローブ、および２つの異なる標識プローブの混合物を用いることによって、増幅産物を検出した。
【００４６】
第一の試験では、ＨＩＶ−１サブタイプＢ  ＲＮＡを水と混合して、反応試験管あたり５００コピーを達成し、そしてＨＩＶ−１サブタイプＡウイルス上清を緩衝液（４００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、１０％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、３５０ｍＭ  ＬｉＯＨ、７８３ｍＭ  ＬｉＣｌ）と混合して、反応試験管あたり５００コピーを達成した。増幅のため、各反応は、反応混合物（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１７．５ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５％ポリビニルピロリドン、各１ｍＭ  ｄＮＴＰ、各４ｍＭ  ｒＮＴＰ）中に、試料、並びに配列番号５（Ｔ７プライマー−プロモーターまたはＰ１プライマー）および配列番号１７（Ｐ２プライマー）を有する増幅オリゴマー各々７．５ｐｍｏｌを含有した。反応混合物を不活性油の層（２００μｌ）で覆って蒸発を防ぎ、そして６０℃で１０−１５分間、そしてその後、４１．５−４２℃で５分間、インキュベーションした。各反応混合物に関して、各々約３０００Ｕの逆転写酵素およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを添加し、混合し、そして標的ＨＩＶ−１核酸は、４１．５−４２℃で２時間増幅した。
【００４７】
増幅後、増幅されたＧａｇ標的領域は、配列番号２３、配列番号２４を有するＡＥ標識プローブ、またはこれらのプローブの混合物（各０．０５−０．１ｐｍｏｌ）を用いることによって検出し、そして先に記載される方法（米国特許第５，６５８，７３７号、第２５欄、２７−４６行；Ｎｅｌｓｏｎら，  １９９６，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３５：８４２９−８４３８の８４３２）を用いて、結合したプローブからの化学発光を検出した。検出した化学発光は、相対光単位（ＲＬＵ）で表した。陰性対照は同様に処理したが、ＨＩＶ−１標的核酸をまったく含有しなかった。
【００４８】
表１は、各プローブに関して検出されたＲＬＵ結果を示す（「プローブ混合物」に関して、陰性対照アッセイが１回であったのを例外として、三つ組アッセイの平均）。これらの結果は、Ｇａｇ１標的領域用の増幅オリゴマーを用いて、ＨＩＶ−１の両方のサブタイプが増幅されたが、配列番号２３のプローブは、サブタイプＢから増幅されたＧａｇ１産物のみを検出し、一方、配列番号２４のプローブは、サブタイプＡおよびＢから増幅された産物両方を検出したことを示す。プローブ混合物を用いて得た結果は、２つのサブタイプ用の個々のプローブで得た結果を付加したものに見える。
【００４９】
表１：ＨＩＶ−１サブタイプＡおよびサブタイプＢ  Ｇａｇ１標的領域の増幅および検出（ＲＬＵ）
【００５０】
【表１】
0005461460.tif 000002
【００５１】
別の試験において、反応あたり２５０、５０または２５コピーのウイルスＲＮＡのＨＩＶ−１サブタイプＡ、ＢおよびＣを用いて、そしてプローブ混合物（配列番号２３および配列番号２４）を用いて、同様のアッセイを行った。サブタイプＢおよびＣに関しては、ＨＩＶ−１  ＲＮＡが標的であり、そしてサブタイプＡに関してはウイルス上清が標的核酸を含有した。表２は、この試験の結果を示す（各条件に関して６試料の平均ＲＬＵ）。陰性対照、すなわちＨＩＶ−１標的が存在しないものは、１．３７ｘ１０４ＲＬＵを生じた（二つ組アッセイの平均）。
【００５２】
表２：標識プローブ混合物を用いることによる、増幅されたＧａｇ１標的領域の検出
【００５３】
【表２】
0005461460.tif 000003
【００５４】
これらの結果は、増幅オリゴヌクレオチドが、ＨＩＶ−１サブタイプＡ、ＢおよびＣに関してＧａｇ１標的領域を増幅し、そして増幅された配列をプローブが検出したことを示す。アッセイ系は、すべてのサブタイプに関して、少なくとも標的５０コピーの感度を有した。反応あたり２５コピーの標的では、反応の少なくとも半数で、すべてのサブタイプが増幅され、そして検出された（陰性対照より、少なくとも１０倍多いＲＬＵを生じた）（データ未提示）。これらの結果は、本発明の方法を用い、生物学的試料において、ＨＩＶ−１が容易に検出可能であることを示す。
【００５５】
増幅される他の個々の標的配列（Ｇａｇ２、Ｐｒｔ、ＲＴ１、ＲＴ３およびＲＴ４）各々の増幅オリゴマーの組み合わせを用いて、同様の実験を行った。プローブオリゴマーはまた、同様の均質検出アッセイで、それぞれの標的各々に特異的にハイブリダイズして、増幅反応で生じる増幅された産物の量に比例した、検出可能発光シグナルを生じた。
【００５６】
実施例２
サブタイプＡ、ＢおよびＣのＨＩＶ−１標的配列検出の感度
本実施例は、増幅オリゴマーが、世界中で最も蔓延しているＨＩＶ−１の３つのサブタイプである、サブタイプＡ、Ｂ、およびＣから、標的配列を効率的に増幅可能であることを示す。これらの実験において、ウイルスＲＮＡ、クローニングしたＨＩＶ−１配列からのＲＮＡ転写物または血漿に存在するウイルスから得たＨＩＶ−１標的ＲＮＡを、反応あたり２５、５０、１００、２５０、５００または１０００コピーで、転写仲介増幅反応に用いた。個々の標的配列（Ｇａｇ１、Ｇａｇ２、Ｐｒｔ、ＲＴ１、ＲＴ３およびＲＴ４）を別個の反応で増幅し、そして実質的に実施例１に記載した条件を用いて、ＡＥ標識プローブとのハイブリダイゼーションによって検出した。これらの実験のいくつかの結果（各サブタイプに関するＲＬＵ）を表３に示す（１回の試験からの結果である、血漿ウイルス検出に関して報告したＰｒｔ結果を例外として、少なくとも三つ組反応から得た平均ＲＬＵを報告する）。感度は、増幅した試料に存在する標的（ウイルス（「Ｖ」）、転写物（「Ｔ」）または感染血漿（「Ｐ」）の異なる供給源に関する）のコピー数によって示す。
【００５７】
表３：ＡＥ標識プローブを用いて増幅されたＨＩＶ−１標的領域検出の感度
【００５８】
【表３】
0005461460.tif 000004
【００５９】
これらの結果は、３つのサブタイプすべてで、検出感度が少なくとも標的１００コピーであり、そしてしばしば１００コピー未満であったことを示す（例えば、３つのサブタイプすべてのＧａｇ１に関してウイルス２５−５０コピー）。他のＨＩＶ−１標的領域に関して同様の結果が得られ（データ未提示）、本発明の増幅オリゴマーおよび検出プローブを用いて行ったアッセイの大部分で、３つのサブタイプに関して、すべて、少なくとも標的２００コピーの検出感度を有した。
【００６０】
実施例３
多重反応中のＨＩＶ−１標的配列の検出
この実験では、各々３つのＨＩＶ−１標的領域を増幅する、２つの別個の多重反応を用いて、個々の標的領域を増幅して検出可能単位複製配列を産生可能であることを示した。各増幅試験管は、２００コピーのＨＩＶ−１サブタイプＢ  ＲＮＡおよび実質的に実施例１に記載するような増幅試薬を含有した。増幅試験管１は、Ｇａｇ２、ＲＴ１およびＲＴ４領域を増幅するプライマー（配列番号６および配列番号１８、配列番号８の３’遮断オリゴマーを含む、配列番号８および配列番号２０、並びに配列番号１０および配列番号２２）を含有した。増幅試験管２は、Ｇａｇ１、ＰｒｔおよびＲＴ３領域を増幅するプライマー（配列番号５および配列番号１７、配列番号７および配列番号１９、並びに配列番号９および配列番号２１）を含有した。これらのプライマー各々の反応あたりの量は、以下のとおりであった：試験管１において、各４ｐｍｏｌの配列番号６、配列番号１０、配列番号１８および配列番号２２、２．４ｐｍｏｌの配列番号８、１２ｐｍｏｌの配列番号２０および９．６ｐｍｏｌの３’遮断配列番号８；そして試験管２において、１ｐｍｏｌの配列番号５、４ｐｍｏｌの配列番号１７、４．５ｐｍｏｌの配列番号７、各５ｐｍｏｌの配列番号９および配列番号１９、並びに９．８５ｐｍｏｌの配列番号２１。反応各組に関して、５つの個別の試験管を調製し、そして増幅した。増幅反応は、実質的に実施例１に記載したように行い、そしてその後、反応の半量（すなわち標的ＨＩＶ−１  ＲＮＡ１００コピーから産生される単位複製配列と同等なもの）を検出工程に用いた。
【００６１】
検出は、実質的に先に記載されるような（米国特許第５，６５８，７３７号、第２５欄、２７−４６行；Ｎｅｌｓｏｎら，  １９９６，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ３５：８４２９−８４３８の８４３２）均質検出アッセイを用い、ＡＥ標識プローブを用いて行い、そして化学発光は、較正した発光測定装置（ＬＥＡＤＥＲ（登録商標）ＨＣ４５０、Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて、各増幅反応に関して、そして各プローブに関して、ＲＬＵとして検出した。用いた標識プローブ（０．１ｐｍｏｌ／反応）は：Ｇａｇ１を検出する配列番号２４、Ｇａｇ２を検出する配列番号６９、Ｐｒｔを検出する配列番号２６、ＲＴ１を検出する配列番号７０、ＲＴ３を検出する配列番号２８、およびＲＴ４を検出する配列番号２９であった。検出用のプローブの比活性を最適化するため、プローブ試薬は、一般的に、プローブオリゴマー各々に関して、標識および未標識プローブの混合物であった。
【００６２】
各条件に関して５つの反応の平均として報告する、これらの試験の結果は、表４に示す（陰性対照は示さない）。これらの結果は、３つの標的配列すべてが、多重反応各々で増幅され、増幅された配列に特異的な、対応するプローブによって特異的に検出される単位複製配列を生じたことを示す。
【００６３】
表４：標識プローブハイブリダイゼーションによって検出された、多重増幅反応産物（ＲＬＵ）
【００６４】
【表４】
0005461460.tif 000005
【００６５】
他の実験において、上で試験したのと同一の多重の組み合わせで、異なる比率の増幅オリゴマーを用いて、同様の増幅結果を提供した。例えば、別の多重の組み合わせは、反応試験管１あたり、以下の量のプライマーを用いた：各４ｐｍｏｌの配列番号６、配列番号１０、および配列番号２２、３ｐｍｏｌの配列番号１８、２．４ｐｍｏｌの配列番号８、各９．６ｐｍｏｌの配列番号２０および３’遮断配列番号８．
実施例４
臨床試料からのＨＩＶ−１標的配列の検出
本実施例は、症状によって、感染が薬剤耐性になったことが示される（薬剤治療中のウイルスリバウンド）ＨＩＶ−１患者から採取した生物学的試料に存在するＨＩＶ−１標的配列の検出を記載する。多重増幅反応を用いて、検出のための単一反応試験管において、多数の標的から増幅された核酸を産生する。該方法は、ＤＮＡプローブのアレイにハイブリダイズした、増幅された産物を検出して、Ｇａｇ、プロテアーゼおよびＲＴ領域中のＨＩＶ−１薬剤耐性に共通して関連する残基のアミノ酸情報を提供した。
【００６６】
ウイルス負荷の増加を経験している、薬剤併用治療中の３人のＨＩＶ陽性患者から血漿を収集した。患者１および２は、どちらも、１種類の薬剤併用（ｄ４Ｔ、３ＴＣおよびネルフィナビルＴＭ）で治療され、そしてそれぞれ６，１３０および１０，０００コピー／ｍｌのウイルス負荷を有し；患者３は、別の薬剤併用（アバカビルＴＭ、エファビレンツＴＭおよびネルフィナビルＴＭ）で治療され、そして１０，０００コピー／ｍｌのウイルス負荷を有した。各患者から、０．５ｍｌの血漿を２つの別個の試験管に分配し、そして０．５ｍｌの溶解緩衝液（０．４Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．６、０．３５Ｍ  ＬｉＯＨ、０．２２Ｍ  ＬＬＳ）と混合し、そして６０℃で２０分間インキュベーションした。混合に添加した３つの捕捉オリゴヌクレオチド（各３．５ｐｍｏｌ／試験の配列番号３０および配列番号３２、並びに１０ｐｍｏｌ／試験の配列番号３１）および磁気粒子上に固定したｄＴ１４オリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせることによって、他の試料構成要素から遊離したウイルスＲＮＡを精製し；混合物を５５−６０℃で１５−２０分間、そしてその後、１８−２５℃で１０−１５分間インキュベーションした。磁場を用いて磁気粒子をペレット化し、そして未結合試料構成要素を吸引し；結合したＨＩＶ−１  ＲＮＡを含む磁気粒子を２回洗浄した（１．５ｍｌの洗浄緩衝液）。洗浄した粒子を７５μｌの増幅緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、グリセロール、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰおよび増幅オリゴヌクレオチド）に懸濁した。各標的領域用の増幅オリゴヌクレオチドは：Ｇａｇ１用の配列番号３３および配列番号１７；Ｇａｇ２用の配列番号３４および配列番号６０；プロテアーゼ用の配列番号４１および配列番号１９；ＲＴ１用の配列番号４１および配列番号２０；ＲＴ３用の配列番号９および配列番号２１；並びにＲＴ４用の配列番号１０および配列番号２２であった。増幅反応試験管１は、Ｇａｇ１、プロテアーゼおよびＲＴ３標的を増幅するプライマーを含有し；そして増幅反応試験管２は、Ｇａｇ２、ＲＴ１およびＲＴ４標的を増幅するプライマーを含有した。増幅反応混合物は、６０℃で１０分間インキュベーションし、そしてその後、各々約３０００Ｕの逆転写酵素およびＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを添加し（２５μｌ中、８ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１７０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、７０ｍＭ  ＫＣｌ、０．０１％フェノールレッド、１０％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００、０．０８％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１０２、２０％グリセロール、０．０４ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  Ｎ−アセチルＬ−システイン、０．０４ｍＭ  酢酸亜鉛、０．０８％トレハロース）、そして混合物を４２℃で１時間インキュベーションした。
【００６７】
増幅反応を各患者に関してプールし（試験管１および２各々から５０μｌ）、そして先に記載された方法を用いて、増幅された産物を標識した（ＰＣＴ第ＷＯ９９／６５９２６号および第ＰＣＴ／ＩＢ９９／０２０７３号）。簡潔には、増幅産物を標識試薬と混合し（１５０μｌの総体積中、６０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、６ｍＭイミダゾール、２ｍＭブロモフルオレセインの最終濃度）、そして６０℃で３０分間インキュベーションし、そしてその後、１５μｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを添加した。標準的カラムクロマトグラフィー（ＱＩＡＶＡＣＴＭ、Ｑｉａｇｅｎ、ＳＡ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、フランス）を用いて標識核酸を精製し、そして１００μｌ体積中で溶出し、これを４００μｌのハイブリダイゼーション緩衝液（０．０６Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．９Ｍ  ＮａＣｌ、３Ｍベタイン、５ｍＭ  ＤＴＡＢ、５００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ、０．０６％消泡剤、５ｘ１０−４ｎｍｏｌ／試験の対照オリゴヌクレオチド）と混合した。混合物を固定ＤＮＡプローブのアレイと３５℃で３０分間インキュベーションした（流体状態のＤＮＡ−ＣｈｉｐＴＭ（ＤＮＡ−ＣｈｉｐＴＭ  ｉｎ  ａ  Ｆｌｕｉｄｉｃ  Ｓｔａｔｉｏｎ）、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンタクララ；Ｌｉｐｓｈｕｔｚら，  ＢｉｏＦｅａｔｕｒｅ  ３：４４２−４４７（１９９５）；米国特許第５，７４４，３０５号）。未結合材料をアレイから２回洗い流し（ＨＥＰＥＳ、ＮａＣｌ、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１０２溶液を用いる）、そしてアレイ上のハイブリダイゼーション結果を検出して、患者試料に問題のＨＩＶ−１配列が存在するかどうかを決定した（Ｌｉｐｓｈｕｔｚら，  ＢｉｏＦｅａｔｕｒｅ  ３：４４２−４４７（１９９５）；ＰＣＴ第ＷＯ９５／１１９９５号）。この系は、薬剤耐性と関連する１８０の突然変異を含む、１００５の多型ＨＩＶ−１  ｇａｇおよびｐｏｌ配列を検出可能である（フランス政府機関Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  ｌａ  Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ  ｓｕｒ  ｌｅ  ＳＩＤＡに決定された薬剤耐性コドン）。検出工程には、アレイ上の各プローブ部位に関して、蛍光強度を測定し（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ共焦点レーザー読み取り装置を用いる）、そしてアルゴリズム（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐソフトウェア）を用いて、最も強いシグナルに対応する塩基を決定し、これを用いて、該コドンに関して存在する可能性があるアミノ酸（類）を決定した。３人の患者試料各々に関して、この方法を用いて得た、選択した位の予測されるアミノ酸を、ＲＴコドンに関して表５に、そしてプロテアーゼコドンに関して表６に、一文字アミノ酸暗号を用いて示す（「チップ」列）。比較のため、各患者試料のＨＩＶ−１配列を独立に決定し（米国特許第５，７９５，７２２号に記載されるようなＲＴ−ＰＣＲ後の標準的配列決定法を用いて）、そしてハイブリダイゼーション解析によって決定されるものに対応するコドン各々に関して予測されるアミノ酸を表に示す（「配列」列）。報告される位各々で、第一列（「ＷＴおよび位」）に、野生型（非薬剤耐性）アミノ酸を示し；「ｎｄ」は、未測定を意味する。
【００６８】
これらの結果は、ＤＮＡプローブにハイブリダイズした、増幅されたＨＩＶ−１配列が、薬剤耐性と関連するアミノ酸に影響を与える突然変異（太字で示す突然変異）に関する情報を提供し、そしてハイブリダイゼーション結果が、１３５の解析したコドンの配列決定によって決定した予測されるアミノ酸と、概して一致する（９８．５％）ことを示す。２つの場合で、プローブハイブリダイゼーションが突然変異配列を検出する一方、ＤＮＡ配列決定が野生型および突然変異配列の混合を検出した。しかし、突然変異体の検出は、診断のため、臨床的に重要である。
【００６９】
表５：３人の患者由来の増幅されたＨＩＶ−１  ＲＮＡから予測されるＲＴコドン
【００７０】
【表５】
0005461460.tif 000006
【００７１】
表６：３人の患者由来の増幅されたＨＩＶ−１  ＲＮＡから予測されるプロテアーゼコドン
【００７２】
【表６】
0005461460.tif 000007
【００７３】
他の実験において、以下の組み合わせの増幅オリゴマーを用い、ＨＩＶ−１標的配列の増幅を同様に行って、検出可能産物を産生した：Ｇａｇ１に関して（配列番号３３および配列番号５９）、Ｇａｇ２に関して（配列番号３６および配列番号６０）、Ｐｒｔに関して（配列番号３７または配列番号３８および配列番号１９、配列番号６１または配列番号６２）、ＲＴ１に関して（配列番号３９または配列番号４０および配列番号２０、配列番号６３、配列番号６４または配列番号６５）、ＲＴ３に関して（配列番号４２または配列番号４３および配列番号６６）、およびＲＴ４に関して（配列番号４４または配列番号４５および配列番号６７または配列番号６８）。
【００７４】
実施例５
ＰＣＲ増幅および増幅されたＨＩＶ−１プロテアーゼおよびＲＴ１標的配列の検出
本実施例では、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて、ＨＩＶ−１標的配列（ＰｒｔおよびＲＴ１）を増幅し、そして増幅された配列をその後、標準的ＤＮＡ配列決定と比較して、先の実施例に記載するようなＤＮＡチップ解析を用いることによって、検出した。ウイルスＲＮＡは、９２ＢＲ０２０単離体（米国国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダから）の組織培養上清から、標準的ＲＮＡ精製法（ＱＩＡＭＰＴＭウイルスＲＮＡミニキット、Ｑｉａｇｅｎ、ＳＡ、Ｃｏｕｒｔａｂｏｅｕｆ、フランス）を用いて精製して、５ｘ１０５コピー／ｍｌを含有する溶出液を産生した。ＲＴ−ＰＣＲは、標準法（ＡＣＣＥＳＳＴＭ  ＲＴ−ＰＣＲキット、Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）を用い、別個の試験管中で行うＰｒｔおよびＲＴ１標的配列の増幅に関して、先の実施例に記載するプライマー（Ｐｒｔに関して、配列番号３７および配列番号１９；ＲＴ１に関して、配列番号４１および配列番号２０）を用いて行った。増幅後、１．５％アガロースゲルを通過させ、エチジウムブロミド染色した電気泳動を用い、標準分子サイズマーカーと比較して結果をチェックした。期待されるサイズを持つ増幅された核酸のバンドは、ＲＴ１に関して、５コピー／ｍｌの標的を含有する試験管で、そしてプロテアーゼに関して、５００コピー／ｍｌの標的を含有する試験管で見られた。
【００７５】
増幅後、標準的ＤＮＡ配列決定法を用いて、各試験管由来のアリコットを配列決定した。チップ上のＤＮＡプローブアレイへのハイブリダイゼーションのため、標準法でＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写（ＡＭＢＩＯＮ  ＭＥＧＡＳＣＲＩＰＴＴＭ  Ｔ７キット、Ｃｌｉｎｉｓｃｉｅｎｃｅｓ、フランス・モンルージュ）に、増幅された材料１０μｌをテンプレートとして用いた。転写後、実質的に先の実施例に記載するように、８μｌのＲＮＡ産物をブロモフルオレセインで標識した。先の実施例に記載するように示した、ＰｒｔおよびＲＴ１増幅配列の多様な位に関して予測されるアミノ酸結果を表７に示す。
【００７６】
これらの結果は、別の増幅法（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いることによって、増幅オリゴマーが単位複製配列を産生可能であり、そして産物、または増幅産物から産生される転写物が、プローブアレイへのハイブリダイゼーションによって、そして配列決定によって、突然変異に該当する配列情報を提供することを示す。結果は、解析した４５のコドンに関して、概して一致した（９１．１％）。
【００７７】
表７：プロテアーゼおよびＲＴ１の増幅された配列から予測されるアミノ酸
【００７８】
【表７】
0005461460.tif 000008
【図１】
0005461460.tif 000009
【図２】
0005461460.tif 000010
【配列表】
0005461460000001.app