(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナイーブＴ細胞をＴｈ２細胞に誘導する方法であって、
抗原と該抗原に結合するＩｇＥとからなりかつ細胞および基材に結合していない複合体を形成させる第１工程、
該複合体の存在下で、好塩基球を培養する第２工程、および
ナイーブＴ細胞を、第２工程にて培養した後の好塩基球とともに培養する第３工程
を包含する、方法。
【請求項２】
抗原、該抗原に結合するＩｇＥ、および好塩基球を備えている、請求項１に記載の方法においてナイーブＴ細胞をＴｈ２細胞に誘導するためのキット。
【請求項３】
ＩＬ−４を生成する方法であって、
抗原と該抗原に結合するＩｇＥとからなりかつ細胞および基材に結合していない複合体を形成させる第１工程、および
該複合体の存在下で、好塩基球を培養する第２工程
を包含する、方法。
【請求項４】
ナイーブＴ細胞を、上記第２工程にて培養した後の好塩基球とともに培養する第３工程
をさらに包含する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
抗原、該抗原に結合するＩｇＥ、および好塩基球を備えている、請求項３または４に記載の方法においてＩＬ−４を生成するためのキット。
【請求項６】
ＩｇＥを生成する方法であって、
抗原と該抗原に結合するＩｇＥとからなりかつ細胞および基材に結合していない複合体を形成させる第１工程、
該複合体の存在下で、好塩基球を培養する第２工程、
ナイーブＴ細胞を、第２工程にて培養した後の好塩基球とともに培養する第３工程、ならびに
Ｂ細胞を、該抗原および抗原提示細胞の存在下で、第３工程において誘導されたＴｈ２細胞とともに培養する第４工程
を包含する、方法。
【請求項７】
上記第４工程にて生成されたＩｇＥの存在下で、上記抗原、上記Ｔｈ２細胞およびＢ細胞を培養する第５工程
をさらに包含する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
抗原、該抗原に結合するＩｇＥ、および好塩基球を備えている、請求項６または７に記載の方法においてＩｇＥを生成するためのキット。
【請求項９】
Ｔｈ２型疾患に対する治療剤のスクリーニング方法であって、
抗原と該抗原に結合するＩｇＥとからなりかつ細胞および基材に結合していない複合体を形成させる第１工程、および
該複合体の存在下で、好塩基球を培養する第２工程
を包含する、方法。
【請求項１０】
上記第２工程を候補物質の存在下または非存在下で行い、第２工程後の好塩基球の細胞表面上に提示されているＭＨＣクラスＩＩ分子またはＣＤ８０分子の量を測定する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ナイーブＴ細胞を、上記第２工程にて培養した後の好塩基球とともに培養する第３工程をさらに包含し、
第２工程または第３工程を候補物質の存在下または非存在下で行い、第３工程において誘導されたＴｈ２細胞の量を測定する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
Ｂ細胞を、上記抗原および抗原提示細胞の存在下で、上記第３工程において誘導されたＴｈ２細胞とともに培養してＩｇＥを生成する第４工程をさらに包含し、
上記第２工程〜第４工程の少なくとも１工程を候補物質の存在下または非存在下で行い、第４工程において生成されたＩｇＥの量を測定する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
上記第４工程にて生成されたＩｇＥの存在下で、上記抗原、Ｔｈ２細胞およびＢ細胞を培養する第５工程をさらに包含し、
上記第２工程〜第５工程の少なくとも１工程を候補物質の存在下または非存在下で行い、第５工程において生成されたＩｇＥの量を測定するする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｔｈ２型疾患に対する治療剤のスクリーニング方法であって、
上記第２工程にて培養した後の好塩基球を非ヒト動物に投与して非ヒトモデル動物を作製する工程、
該非ヒトモデル動物に候補物質を投与する工程、および
該候補物質を投与した後の非ヒトモデル動物における、Ｔｈ２型疾患に対する改善効果の有無を測定する工程
をさらに包含する、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記疾患が、花粉症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性腸炎、アレルギー性結膜炎およびアレルギー性鼻炎からなる群より選択される、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
抗原、該抗原に結合するＩｇＥ、および好塩基球を備えている、請求項９〜１５のいずれか１項に記載の方法においてＴｈ２型疾患に対する治療剤をスクリーニングするためのキット。
【請求項１７】
前記疾患が、花粉症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性腸炎、アレルギー性結膜炎およびアレルギー性鼻炎からなる群より選択される、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
Ｔｈ２型疾患の非ヒトモデル動物を作製する方法であって、
抗原と該抗原に結合するＩｇＥとからなりかつ細胞および基材に結合していない複合体を形成させる第１工程、
該複合体の存在下で、好塩基球を培養する第２工程、および
該複合体の存在下で培養した後の好塩基球を、非ヒト動物に投与する工程
を包含する、方法。
【請求項１９】
前記疾患が気管支喘息であり、前記複合体の存在下での培養後の好塩基球を経鼻投与することを包含する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
抗原、該抗原に結合するＩｇＥ、および好塩基球を備えている、請求項１８または１９に記載の方法においてＴｈ２型疾患の非ヒトモデル動物を作製するためのキット。
【請求項２１】
前記疾患が、花粉症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性腸炎、アレルギー性結膜炎およびアレルギー性鼻炎からなる群より選択される、請求項２０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔｈ２細胞を誘導するための組成物およびその利用に関するものであって、特に、Ｔｈ２型の免疫応答を惹起する初期ＩＬ−４を産生するための組成物およびその利用に関するものである。また、本発明は、Ｔｈ２型疾患を治療するための組成物およびその利用に関するものであり、特に、Ｔｈ２型免疫応答を惹起する初期ＩＬ−４の産生をブロックするための組成物およびその利用に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
マクロファージや樹状細胞は、細菌の侵入の際に、Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅレセプター（ＴＬＲ）を介して樹状細胞（ＤＣ）が細菌を認識し、刺激補助分子を発現するように成熟し、Ｔｈ１型の免疫応答を誘導するＩＬ−１２およびＩＬ−１８などを産生する。これらの分子を介してマクロファージや樹状細胞と結合するとともにＩＬ−１２が作用することによって、ナイーブＴ細胞はＴｈ１細胞に分化する。このＴｈ１細胞から分泌されるＩＦＮ−γがマクロファージを活性化し、貪食、殺菌などの作用が活性化される。【０００３】
ナイーブＴ細胞は、ＩＬ−１２によってＴｈ１細胞に分化し、ＩＬ−４によってＴｈ２細胞に分化する。Ｔｈ２細胞はＴｈ１細胞とともに適応免疫系において重要な細胞といえる。しかし、Ｔｈ２型の免疫応答の発達における先天性免疫細胞の役割はほとんど理解されていない。【０００４】
好塩基球および肥満細胞は、ＩｇＥ媒介性のアレルギー性炎症における重要なエフェクター細胞である（非特許文献１〜４参照）。また、寄生虫が感染した宿主マウスにおいて、Ｔｈ２細胞、ならびに脾臓および肝臓での好塩基球の増殖が強く誘導される（非特許文献５参照）。このことは、好塩基球が、Ｔｈ２応答の誘導および／または増加に寄与することを示唆する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Galli, S. J. Curr Opin Hematol 7: 32-9 (2000)
【非特許文献２】Galli, S. J. et al. Annu Rev Immunol 23: 749-86 (2005)
【非特許文献３】Kawakami, T. & Galli, S. J. Nat Rev Immunol 2: 773-86 (2002)
【非特許文献４】Mukai, K. et al. Immunity 23: 191-202 (2005)
【非特許文献５】Min, B. et al. J Exp Med 200: 507-17 (2004)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｈ２細胞に分化させるのに必要な初期ＩＬ−４を産生する細胞の性質はまだ知られておらず、また、初期ＩＬ−４を産生させるための初期刺激が、いかなる物質によって行われるのかも知られておらず、自然免疫担当細胞がＴｈ２細胞を分化誘導するメカニズムは未だ明かされていない。【０００７】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、Ｔｈ２型の免疫応答の作用メカニズム、特に初期ＩＬ−４の産生機序を明らかにすることによって、Ｔｈ２型疾患を治療／予防する技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、好塩基球が抗原を取り込んで断片化し、表面に提示させるとともにＩＬ−４を産生し、そのＩＬ−４存在下で好塩基球の表面に提示された抗原ペプチド／ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体を認識したナイーブＴ細胞がＴｈ２細胞に誘導されることを見出した。そして、Ｔｈ２細胞が誘導されると、刺激を受けたＢ細胞を活性化して、抗原に対するＩｇＥが産生されることを確認し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明に係る組成物は、ナイーブＴ細胞をＴｈ２細胞に誘導するために、好塩基球を含有していることを特徴としている。本発明に係る組成物は、抗原をさらに含有していることが好ましく、該抗原に結合するＩｇＥをさらに含有していることがより好ましい。【０００９】
本発明に係る組成物は、ナイーブＴ細胞をＴｈ２細胞に誘導する方法に利用可能である。すなわち、本発明に係るＴｈ２細胞誘導方法は、抗原と該抗原に結合するＩｇＥとの複合体を形成させる第１工程、該複合体の存在下で、好塩基球を培養する第２工程、およびナイーブＴ細胞を、第２工程にて培養した後の好塩基球とともに培養する第３工程を包含することを特徴としている。【００１０】
本発明に係る組成物は、ＩＬ−４を生成するために、好塩基球を含有していることを特徴としている。本発明に係る組成物は、抗原をさらに含有していることが好ましく、該抗原に結合するＩｇＥをさらに含有していることがより好ましい。【００１１】
本発明に係る組成物は、ＩＬ−４を生成する方法に利用可能である。すなわち、本発明に係るＩＬ−４産生方法は、抗原と該抗原に結合するＩｇＥとの複合体を形成させる第１工程、および該複合体の存在下で、好塩基球を培養する第２工程を包含することを特徴としている。本方法を用いれば、ＩＬ−４、特に初期ＩＬ−４（primary IL-4）を産生し得る。また、本発明に係るＩＬ−４産生方法は、抗原と該抗原に結合するＩｇＥとの複合体を形成させる第１工程、該複合体の存在下で、好塩基球を培養する第２工程、およびナイーブＴ細胞を、第２工程にて培養した後の好塩基球とともに培養する第３工程を包含することを特徴としている。本方法を用いれば、ＩＬ−４、特に二次的ＩＬ−４（secondary IL-4）を産生し得る。【００１２】
本発明に係る組成物は、ＩｇＥを生成するために、好塩基球を含有していることを特徴としている。本発明に係る組成物は、抗原をさらに含有していることが好ましく、該抗原に結合するＩｇＥをさらに含有していることがより好ましい。【００１３】
本発明に係る組成物は、ＩｇＥを生成する方法に利用可能である。すなわち、本発明に係るＩｇＥ生成方法は、抗原と該抗原に結合するＩｇＥとの複合体を形成させる第１工程、該複合体の存在下で、好塩基球を培養する第２工程、ナイーブＴ細胞を、第２工程にて培養した後の好塩基球とともに培養する第３工程、ならびにＢ細胞を、該抗原および抗原提示細胞の存在下で、第３工程において誘導されたＴｈ２細胞とともに培養する第４工程を包含することを特徴としている。本方法を用いれば、ＩｇＥ、特に初期ＩｇＥ（primary IgE）を産生し得る。また、本発明に係るＩｇＥ生成方法は、抗原と該抗原に結合するＩｇＥとの複合体を形成させる第１工程、該複合体の存在下で、好塩基球を培養する第２工程、ナイーブＴ細胞を、第２工程にて培養した後の好塩基球とともに培養する第３工程、Ｂ細胞を、該抗原および抗原提示細胞の存在下で、第３工程において誘導されたＴｈ２細胞とともに培養してＩｇＥを生成する第４工程、ならびに第４工程にて生成されたＩｇＥの存在下で、該抗原、該Ｔｈ２細胞およびＢ細胞を培養する第５工程を包含することを特徴としている。本方法を用いれば、ＩｇＥ、特に二次的ＩｇＥ（secondary IgE）を産生し得る。【００１４】
本発明に係る組成物は、Ｔｈ２型疾患に対する治療剤をスクリーニングするために、好塩基球を含有していることを特徴としている。本発明に係る組成物は、抗原をさらに含有していることが好ましく、該抗原に結合するＩｇＥをさらに含有していることがより好ましい。なお、上記Ｔｈ２型疾患は、花粉症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性腸炎、アレルギー性結膜炎およびアレルギー性鼻炎からなる群より選択されることが好ましい。【００１５】
本発明に係る組成物は、Ｔｈ２型疾患に対する治療剤をスクリーニングする方法に利用可能である。すなわち、本発明に係るスクリーニング方法は、抗原と該抗原に結合するＩｇＥとの複合体を形成させる第１工程、および該複合体の存在下で、好塩基球を培養する第２工程を包含することを特徴としている。本発明に係るスクリーニング方法において、第２工程を候補物質の存在下または非存在下で行い、第２工程後の好塩基球の細胞表面上に提示されているＭＨＣクラスＩＩ分子またはＣＤ８０分子の量を測定することが好ましい。【００１６】
また、本発明に係るスクリーニング方法は、抗原と該抗原に結合するＩｇＥとの複合体を形成させる第１工程ナイーブＴ細胞を、第２工程にて培養した後の好塩基球とともに培養する第３工程をさらに包含し、第２工程または第３工程を候補物質の存在下または非存在下で行い、第３工程において誘導されたＴｈ２細胞の量を測定してもよい。【００１７】
さらに、本発明に係るスクリーニング方法は、抗原と該抗原に結合するＩｇＥとの複合体を形成させる第１工程Ｂ細胞を、上記抗原および抗原提示細胞の存在下で、第３工程において誘導されたＴｈ２細胞とともに培養してＩｇＥを生成する第４工程をさらに包含し、第２工程〜第４工程の少なくとも１工程を候補物質の存在下または非存在下で行い、第４工程において生成されたＩｇＥの量を測定してもよい。【００１８】
なおさらに、本発明に係るスクリーニング方法は、抗原と該抗原に結合するＩｇＥとの複合体を形成させる第１工程第４工程にて生成されたＩｇＥの存在下で、上記抗原、Ｔｈ２細胞およびＢ細胞を培養する第５工程を包含し、第２工程〜第５工程の少なくとも１工程を候補物質の存在下または非存在下で行い、第５工程において生成されたＩｇＥの量を測定してもよい。【００１９】
本発明に係るモデル動物作製方法は、Ｔｈ２型疾患のモデル動物を作製するために、抗原と該抗原に結合するＩｇＥとの複合体を形成させる第１工程、該複合体の存在下で、好塩基球を培養する第２工程、および該複合体の存在下で培養した後の好塩基球を、動物に投与する工程を包含することを特徴としている。なお、上記Ｔｈ２型疾患は、花粉症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性腸炎、アレルギー性結膜炎およびアレルギー性鼻炎からなる群より選択されることが好ましい。本発明に係る作製方法によって作製されるモデル動物は、気管支喘息のモデル動物であってもよく、この場合、上記複合体の存在下での培養後の好塩基球を静脈内投与した後に、当該抗原を経鼻投与することが好ましい。【００２０】
このような作製方法によって作製されたモデル動物は、Ｔｈ２型疾患に対する治療剤のスクリーニングに用いられ得る。すなわち、本発明に係るスクリーニング方法は、Ｔｈ２型疾患に対する治療剤をスクリーニングするために、第２工程にて培養した後の好塩基球を動物に投与してモデル動物を作製する工程、該モデル動物に候補物質を投与する工程、および該候補物質を投与した後のモデル動物における、Ｔｈ２型疾患に対する改善効果の有無を測定する工程を包含することを特徴としている。【００２１】
本発明に係る組成物は、Ｔｈ２型疾患を処置するために、好塩基球を枯渇させる物質またはＦｃεＲ１の機能を阻害する物質を含有していることを特徴としている。本発明に係る組成物は、ＦｃεＲ１に対する抗体を含有していることが好ましい。【００２２】
本発明に係る方法は、Ｔｈ２型疾患を処置するために、被験体から好塩基球を枯渇させる工程、または被験体にＦｃεＲ１の機能を阻害する物質を投与する工程を包含することを特徴としている。本発明に係る方法は、被験体に、ＦｃεＲ１に対する抗体を投与する工程を包含することが好ましい。【００２３】
また、本発明者らは、抗原−ＩｇＥ複合体によってパルスした好塩基球を用いることが好ましいこと、さらには、正常なマウスに移入した抗原−ＩｇＥ複合体が内因性の好塩基球に起因するＴｈ２応答を誘導することを見出した。すなわち、本発明に係る複合体は、抗原と該抗原に結合するＩｇＥとからなることを特徴としている。本発明を用いれば、末梢血、脾臓、骨髄等に存在する好塩基球を用いてＩＬ−４の産生を誘導し得る。このような好塩基球は脾臓等においてＴｈ２応答を誘導することができる。また、本発明に係る組成物は、抗原、および該抗原に結合するＩｇＥを含有していることを特徴としている。このような組成物を用いれば、本発明に係る複合体を生成することができるので、Ｔｈ２応答を誘導することができる。さらに、本発明に係るキットは、抗原、該抗原に結合するＩｇＥ、および好塩基球を備えていることを特徴としている。このようなキットを用いれば、本発明に係る複合体を生成することができるので、Ｔｈ２応答を誘導することができる。【００２４】
本発明に係る組成物は、ナイーブＴ細胞をＴｈ２細胞に誘導する技術に利用可能である。すなわち、本発明に係る組成物は、ナイーブＴ細胞をＴｈ２細胞に誘導するために、抗原、および該抗原に結合するＩｇＥを含有していることを特徴としている。また、本発明に係るキットは、ナイーブＴ細胞をＴｈ２細胞に誘導するために、抗原、該抗原に結合するＩｇＥ、および好塩基球を備えていることを特徴としている。【００２５】
本発明に係る組成物は、ＩＬ−４を生成する技術に利用可能である。すなわち、本発明に係る組成物は、ＩＬ−４を生成するために、抗原、および該抗原に結合するＩｇＥを含有していることを特徴としている。また、本発明に係るキットは、二次的ＩＬ−４を生成するために、抗原、該抗原に結合するＩｇＥ、および好塩基球を備えていることを特徴としている。【００２６】
本発明に係る組成物は、ＩｇＥを生成する技術に利用可能である。すなわち、本発明に係る組成物は、ＩｇＥを生成するために、抗原、および該抗原に結合するＩｇＥを含有していることを特徴としている。また、本発明に係るキットは、ＩｇＥを生成するために、抗原、該抗原に結合するＩｇＥ、および好塩基球を備えていることを特徴としている。【００２７】
本発明に係る組成物は、Ｔｈ２型疾患に対する治療剤をスクリーニングする技術に利用可能である。すなわち、本発明に係る組成物は、Ｔｈ２型疾患に対する治療剤をスクリーニングするために、抗原、および該抗原に結合するＩｇＥを含有していることを特徴としている。また、本発明に係るキットは、Ｔｈ２型疾患に対する治療剤をスクリーニングするために、抗原、該抗原に結合するＩｇＥ、および好塩基球を備えていることを特徴としている。【００２８】
本発明に係る組成物は、Ｔｈ２型疾患のモデル動物を作製する技術に利用可能である。すなわち、本発明に係る組成物は、Ｔｈ２型疾患のモデル動物を作製するために、抗原、および該抗原に結合するＩｇＥを含有していることを特徴としている。また、本発明に係るキットは、Ｔｈ２型疾患のモデル動物を作製するために、抗原、該抗原に結合するＩｇＥ、および好塩基球を備えていることを特徴としている。
【発明の効果】
【００２９】
本発明によれば、Ｔｈ２型の免疫応答の作用メカニズム、特に初期ＩＬ−４の産生機序を明らかにすることができる。また、本発明を用いれば、Ｔｈ２細胞誘導、ＩＬ−４生成、ＩｇＥ生成、Ｔｈ２疾患治療剤のスクリーニングが可能になる。さらに、本発明を用いれば、Ｔｈ２型疾患モデル動物を作製し得る。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１（ａ）】正常マウスまたは寄生虫感染マウスから調製した脾臓の非Ｂ非Ｔ細胞におけるＦｃεＲ１およびｃ−ｋｉｔの発現を、フローサイトメトリーによって解析した結果、ならびにＦｃεＲ１＋／ｃ−ｋｉｔ−細胞（好塩基球）を分離した結果を示す図である。
【図１（ｂ）】分離した好塩基球の培養上清中のサイトカイン含量を示す図である。
【図１（ｃ）】Ｔ細胞枯渇マウス脾細胞（ΔＴ脾臓）、または寄生虫感染マウスからの好塩基球の存在下にて、ナイーブＴ細胞を、ＯＶＡ３２３−３３９で刺激し、生成したＣＤ４＋Ｔ細胞上における細胞質ＩＬ−４およびＩＦＮ−γについてＦＡＣＳによって解析した結果を示す図である。
【図１（ｄ）】Ｔ細胞枯渇マウス脾細胞（ΔＴ脾臓）、または寄生虫感染マウスからの好塩基球の存在下にて、ナイーブＴ細胞を、ＯＶＡ３２３−３３９で刺激し、生成したＣＤ４＋Ｔ細胞上のＩＬ−３３Ｒα鎖の発現を示す図である。
【図２（ａ）】骨髄由来の、ＦＡＣＳソートされた、好塩基球および肥満細胞、ならびにＴ細胞枯渇脾細胞（ΔＴ脾臓）を、種々の表面マーカーによって染色した結果を示す図である。
【図２（ｂ）】骨髄由来の、ＦＡＣＳソートされた、好塩基球および肥満細胞を、ＭＨＣクラスＩＩ（Ｉ−Ａ）およびＦｃεＲ１の発現について、フローサイトメトリーで解析した結果を示す図である。
【図２（ｃ）】ヒトＩＬ−３の存在下にて培養したＣＤ３４＋臍帯血細胞を、ｃ−ｋｉｔおよびＣＤ２０３ｃ（左）、ならびにＣＤ２０３ｃ＋ｃ−ｋｉｔ−である細胞中のＨＬＡ−ＤＲ（右）の発現について、フローサイトメトリーによって解析した結果を示す図である。
【図３（ａ）】ナイーブＴ細胞を、Ｔ細胞枯渇マウス脾細胞（ΔＴ脾臓）、骨髄由来の精製好塩基球または肥満細胞の存在下で、ＯＶＡ３２３−３３９で刺激し、生成したＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ−４およびＩＦＮ−γの発現をＦＡＣＳによって解析した結果を示す図である。Ｔｈ２細胞の誘導のために、ＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍＬ）を培養物にさらに添加した（Ｔｈ２条件）。
【図３（ｂ）】ナイーブＴ細胞を、骨髄由来の精製好塩基球（ＷＴ；野生型マウス、Ｇ４／Ｇ４；ＩＬ−４欠損マウス）、または脾臓ＤＣの存在下で、ＯＶＡ３２３−３３９で刺激し、生成したＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ−４およびＩＦＮ−γの発現をＦＡＣＳによって解析した結果を示す図である。
【図３（ｃ）】ナイーブＴ細胞を、Ｔ細胞枯渇マウス脾細胞（ΔＴ脾臓）、骨髄由来の精製好塩基球の存在下で、ＤＮＰ−ＯＶＡで刺激し、生成したＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ−４およびＩＦＮ−γの発現をＦＡＣＳによって解析した結果を示す図である。
【図３（ｄ）】ナイーブＴ細胞を、Ｔ細胞枯渇マウス脾細胞（ΔＴ脾臓）、骨髄由来の精製好塩基球の存在下で、抗ＤＮＰ  ＩｇＥ  ｍＡｂの存在下または非存在下でのＤＮＰ−ＯＶＡ（６．２５〜１００μｇ／ｍＬ）で刺激し、生成したＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＩＬ−４およびＩＦＮ−γの発現をＦＡＣＳによって解析した結果を示す図である。
【図４（ａ）】ＤＮＰ−ＯＶＡ／抗ＤＮＰ  ＩｇＥとともに培養した好塩基球または肥満細胞を用いて正常マウスを免疫し、４日後にインタクトなＯＶＡタンパク質を用いてマウスを静脈内チャレンジし、チャレンジの２日後にこのマウスから調製した脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＯＶＡでパルスしたＡＰＣ（ΔＴ‐脾臓）で５日間刺激し、培養上清中のＩＬ−４、ＩＬ−１３およびＩＦＮ−γの量をＥＬＩＳＡによって測定した結果を示す図である。
【図４（ｂ）】ＤＮＰ−ＯＶＡ／抗ＤＮＰ  ＩｇＥとともに培養した好塩基球を用いて正常マウスを免疫し、１週間後にインタクトなＯＶＡタンパク質を用いてマウスを静脈内チャレンジし、チャレンジの日にこのマウスから回収した血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＥ抗体およびＩｇＧ１抗体を、ＥＬＩＳＡによって測定した結果を示す図である。
【図４（ｃ）】ＤＮＰ−ＯＶＡ／抗ＤＮＰ  ＩｇＥをとともに培養した好塩基球を用いて正常マウスを免疫し、１週間後にインタクトなＯＶＡタンパク質を用いてマウスを静脈内チャレンジし、チャレンジの２週間後にこのマウスから調製した脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＯＶＡでパルスしたＡＰＣ（ΔＴ‐脾臓）で５日間刺激し、培養上清中のＩＬ−４、ＩＬ−１３およびＩＦＮ−γの量をＥＬＩＳＡによって測定した結果を示す図である。
【図４（ｄ）】ＤＮＰ−ＯＶＡ／抗ＤＮＰ  ＩｇＥとともに培養した好塩基球を用いて正常マウスを免疫し、１週間後にインタクトなＯＶＡタンパク質を用いてマウスを静脈内チャレンジし、チャレンジの２週間後にこのマウスから調製した脾臓中のCD4+CD62LlowIL33Rα+Ｔｈ２細胞の割合を測定した結果を示す図である。
【図４（ｅ）】図中に示した用量のＤＮＰ−ＯＶＡ／抗ＤＮＰ  ＩｇＥの注入の前後のマウス末梢血、脾臓、骨髄におけるＩＬ−４の産生を、ＩＬ−４のレポーターとしてのＧＦＰの発現によって確認した結果を示す図である。
【図４（ｆ）】図中に示した用量のＤＮＰ−ＯＶＡ／抗ＤＮＰ  ＩｇＥの注入の前後に抗ＦｃεＲ１α（ＭＡＲ−１）を腹腔内投与したマウスから、ＤＮＰ−ＯＶＡ／抗ＤＮＰ  ＩｇＥの注入４日後に調製した脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＯＶＡでパルスしたＡＰＣ（ΔＴ‐脾臓）で５日間刺激し、培養上清中のＩＬ−４、ＩＬ−１３およびＩＦＮ−γの量をＥＬＩＳＡによって測定した結果を示す図である。
【図４（ｇ）】図中に示した用量のＤＮＰ−ＯＶＡ／抗ＤＮＰ  ＩｇＥの注入の前後に抗ＦｃεＲ１α（ＭＡＲ−１）を腹腔内投与したマウスから、ＤＮＰ−ＯＶＡ／抗ＤＮＰ  ＩｇＥの注入４日後に調製した脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＯＶＡでパルスしたＡＰＣ（ΔＴ‐脾臓）で５日間刺激し、培養上清中のＩＬ−４、ＩＬ−１３およびＩＦＮ−γの量をＥＬＩＳＡによって測定した結果を示す図である。
【図４（ｈ）】図中に示した用量のＤＮＰ−ＯＶＡ／抗ＤＮＰ  ＩｇＥを注入したマウスを、ＤＮＰ−ＯＶＡ／抗ＤＮＰ  ＩｇＥの注入４日後にインタクトなＯＶＡタンパク質を用いて静脈内チャレンジし、チャレンジの日にこのマウスから回収した血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＥ抗体およびＩｇＧ１抗体を、ＥＬＩＳＡによって測定した結果を示す図である。なお、好塩基球の数の枯渇または増加のために、マウスに、抗ＦｃεＲ１α（ＭＡＲ−１）を注入している。
【図４（ｉ）】図中に示した用量のＤＮＰ−ＯＶＡ／抗ＤＮＰ  ＩｇＥを注入したマウスを、ＤＮＰ−ＯＶＡ／抗ＤＮＰ  ＩｇＥの注入４日後にインタクトなＯＶＡタンパク質を用いて静脈内チャレンジし、チャレンジの日にこのマウスから回収した血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＥ抗体およびＩｇＧ１抗体を、ＥＬＩＳＡによって測定した結果を示す図である。なお、好塩基球の数の枯渇または増加のために、マウスに、ＩＬ−３を注入している。
【図５】好塩基球によって駆動されたＴｈ２細胞からのサイトカイン産生を示す図であり、Ｔ細胞枯渇マウス脾細胞（ΔＴ脾臓）、または寄生虫感染マウスからの好塩基球の存在下にて、ナイーブＴ細胞を、ＯＶＡ３２３−３３９で７日間刺激し、生成したＣＤ４＋Ｔ細胞を、照射したＴ細胞枯渇マウス脾細胞の存在下にて、ＩＬ−３３ありまたはなしでＯＶＡ３２３−３３９を用いて４８時間チャレンジし、回収した上清における種々のサイトカイン産生を試験した結果を示す。
【図６（ａ）】マウス骨髄細胞をＩＬ−３とともに１０日間培養し、ＦｃεＲ１およびｃ−ｋｉｔの発現について、フローサイトメトリーで解析し、次いで、ＦＡＣＳ  ＡｒｉａによってＦｃεＲ１＋／ｃ−ｋｉｔ−（好塩基球）の細胞集団とＦｃεＲ１＋／ｃ−ｋｉｔ＋（肥満細胞）の細胞集団とにソートした結果を示す図である。
【図６（ｂ）】ソートしたＦｃεＲ１＋／ｃ−ｋｉｔ−（好塩基球）およびＦｃεＲ１＋／ｃ−ｋｉｔ＋（肥満細胞）の細胞集団を、電子顕微鏡観察した結果を示す図である。
【図６（ｃ）】陰性選別によって濃縮したヒト末梢血単核細胞の、選別後すぐ（左）またはヒトＩＬ−３存在下で２４時間培養した後（右）の、ＨＬＡ−ＤＲとＣＤ２０３ｃの発現を測定した結果を示す図である。
【図６（ｄ）】ソートしたＣＤ２０３ｃ＋／ＨＬＡ−ＤＲ＋細胞集団の、ギムザ染色（左；１００×）および電子顕微鏡観察（右）の結果を示す図である。
【図７】好塩基球誘導性の抗原特異的Ｔ細胞増殖を示す図であり、ナイーブＴ細胞を、ＯＶＡ３２３−３３９（１μＭ）、あるいは抗ＤＮＰ  ＩｇＥ  ｍＡｂの存在下または非存在下でのＤＮＰ−ＯＶＡで、照射したΔＴ脾臓または好塩基球の存在下にて４日間刺激し、最終１６時間の間のＤＮＡ合成を測定した結果を示す図である。
【図８（ａ）】ナイーブＴ細胞を、ＯＶＡ３２３−３３９、あるいは抗ＤＮＰ  ＩｇＥ  ｍＡｂの存在下または非存在下でのＤＮＰ−ＯＶＡで、照射したΔＴ脾臓または好塩基球の存在下にて２４時間刺激し、上清を回収し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−４の産生を試験した結果を示す図である。
【図８（ｂ）】骨髄由来の、ＦＡＣＳソートした好塩基球または肥満細胞を、抗ＤＮＰ  ＩｇＥ  ｍＡｂの存在下または非存在下でのＤＮＰ−ＯＶＡで１６時間刺激し、上清を回収し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−４またはＩＬ−１３の産生を試験した結果を示す図である。
【図８（ｃ）】骨髄由来の、ＦＡＣＳソートした好塩基球または肥満細胞から抽出したｍＲＮＡを、ＴＬＲ遺伝子およびβアクチンの発現についてＲＴ−ＰＣＲによって解析した結果を示す図である。
【図８（ｄ）】骨髄由来の、ＦＡＣＳソートした好塩基球または肥満細胞を、ＩＬ−３、およびＩＬ−１８、ＩＬ−３３、ＬＰＳまたはＰＧＮで２４時間刺激し、上清を回収し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−４、ＩＬ−６またはＩＬ−１３の産生を試験した結果を示す図である。
【図９（ａ）】抗マウスＦｃε１α（ＭＡＲ−１（＋））またはＰＢＳ（ＭＡＲ−１（−））を腹腔内投与されたマウスから最終投与の２日後に調製した脾臓における好塩基球の数をフローサイトメトリーによって定量した結果を示す図である。
【図９（ｂ）】抗マウスＦｃε１α（ＭＡＲ−１（＋））またはＰＢＳ（ＭＡＲ−１（−））を腹腔内投与されたマウスから最終投与の２日後に調製した肝臓における好塩基球の数をフローサイトメトリーによって定量した結果を示す図である。
【図９（ｃ）】抗マウスＦｃε１α（ＭＡＲ−１（＋））またはＰＢＳ（ＭＡＲ−１（−））を腹腔内投与されたマウスにＤＮＰ−ＯＶＡ／抗ＤＮＰ  ＩｇＥをさらに３日間、ＭＡＲ−１またはＰＢＳとともに注入し、ＯＶＡでの腹腔内チャレンジの後に、ＭＡＲ−１またはＰＢＳでさらに処理し、調製した血液における好塩基球の数を定量した結果を示す図である。
【図９（ｄ）】抗マウスＦｃε１α（ＭＡＲ−１（＋））またはＰＢＳ（ＭＡＲ−１（−））を腹腔内投与されたマウスにＤＮＰ−ＯＶＡ／抗ＤＮＰ  ＩｇＥをさらに３日間、ＭＡＲ−１またはＰＢＳとともに注入し、ＯＶＡでの腹腔内チャレンジの後に、ＭＡＲ−１またはＰＢＳでさらに処理し、調製した脾臓における好塩基球の数を定量した結果を示す図である。
【図９（ｅ）】ＩＬ−３を注入したマウスからの好塩基球の頻度について、脾臓の非Ｂ非Ｔ細胞に対するＦｃεＲ１＋／ＤＸ５＋細胞の割合を示す図である。
【図１０】抗原でパルスされた好塩基球またはＩｇＥ複合体によるインビボでのＴｈ２／ＩｇＥ誘導の機序を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
〔１：好塩基球およびその利用〕
好塩基球および肥満細胞はアレルギー性炎症の効果細胞であることが、これまでによく知られている。今回、本発明者らは、好塩基球が主要組織適合性抗原クラスＩＩ分子およびＣＤ８０分子を発現することを見出し、好塩基球が抗原を細胞内に取り込み、さらに抗原由来のペプチド断片をクラスＩＩ分子に結合させた態様で細胞表面に発現するとともに、ＩＬ−４を産生することを見出した。さらに、このような好塩基球を正常なマウスに移入すると、抗原特異的Ｔｈ２細胞が誘導され、さらに、ＯＶＡ溶液を経静脈投与するとＯＶＡ特異的なＩｇＥ産生が誘導され、経鼻投与すると気管支喘息が誘導されることを見出した。このように、本発明は、当業者に容易に予測し得ない新規知見に基づいて完成された。
【００３２】
本発明に係る組成物は、好塩基球を含有していることを特徴としている。上述したように、本発明者らは、好塩基球が抗原を取り込んで断片化し、表面に提示させるとともにＩＬ−４を産生し、そのＩＬ−４存在下で好塩基球の表面に提示された抗原ペプチド／ＭＨＣクラスＩＩ分子複合体を認識したナイーブＴ細胞がＴｈ２細胞に分化することを見出した。そして、Ｔｈ２細胞が誘導されると、Ｂ細胞を活性化して、抗原に対するＩｇＥが産生されることを確認し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明に係る組成物は、ナイーブＴ細胞からＴｈ２細胞への誘導、ＩＬ−４の生成、ＩｇＥの生成などに好適に用いられ得る。
【００３３】
抗原を取り込んで断片化し、表面に提示させるために、本発明に係る組成物は、好塩基球を含有していればよいといえるが、目的の抗原をさらに含有していてもよく、目的の抗原の取り込みをより促進するためには、該抗原に結合するＩｇＥをさらに含有していることがより好ましい。さらに、好塩基球に取り込ませるべき抗原−ＩｇＥ複合体の形成を促進するために、抗原にハプテンを連結していてもよい。この場合、ＩｇＥは抗ハプテンＩｇＥであってもよく、本明細書中で使用される場合、抗ハプテンＩｇＥもまた、該抗原に結合するＩｇＥの範疇に含まれる。
【００３４】
本発明に用いられるに好ましい好塩基球は、種々の組織から調製され得るが、脾臓、脊髄などの組織由来の好塩基球が好ましい。生体内に存在する好塩基球の割合は非常に小さいので、組織から取得された好塩基球をインビトロで培養して増殖させて用いることがより好ましい。本発明に用いられるに好ましい抗原は、種々の疾患に関連する抗原（すなわち免疫原）となり得るタンパク質（ペプチドを含む。）であれば特に限定されない。当業者は、Ｔｈ２型疾患を惹起する抗原を十分認識しているので、本発明に用いられるに好ましい抗原を周知技術に基づいて容易に取得し得る。また、標的とする抗原（免疫原）を取得した当業者は、本発明に用いられるに好ましいＩｇＥを周知技術に基づいて容易に取得し得る。なお、本明細書中で使用される場合、「Ｔｈ２型疾患」は、Ｔｈ２細胞が誘導されたことに起因するアレルギー疾患が意図され、「Ｔｈ２型アレルギー疾患」と交換可能に用いられ得る。Ｔｈ２型疾患としては、花粉症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性腸炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
「組成物」は各種成分が一物質中に含有されている形態であり、「キット」は各種成分の少なくとも１つが別物質中に含有されている形態であることが意図されるが、本明細書中で使用される場合、キットもまた組成物の一態様であることが意図される。なお、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図される。好ましくは各材料を使用するための指示書を備える。本明細書中においてキットの局面において使用される場合、「備えた（備えている）」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に内包されている状態が意図されるが、複数の成分を同一の容器に混合して備えていても別々の容器に備えていてもよい。「指示書」は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ−ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよい。本発明に係るキットはまた、希釈剤、溶媒、洗浄液またはその他の試薬を内包した容器を備え得る。さらに、本発明に係るキットは、適用に必要な器具をあわせて備えていてもよい。
【００３６】
すなわち、一実施形態において、本発明に係る組成物は、好塩基球を備えているキットであることを特徴としている。本実施形態に係るキットは、抗原をさらに備えていることが好ましく、該抗原に結合するＩｇＥをさらに備えていることがより好ましい。
【００３７】
上述したように、本発明に係る組成物は、ナイーブＴ細胞をＴｈ２細胞に誘導する方法に利用可能である。すなわち、本発明に係るＴｈ２細胞誘導方法は、抗原と該抗原に結合するＩｇＥとの複合体を形成させる第１工程、該複合体の存在下で、好塩基球を培養する第２工程、およびナイーブＴ細胞を、第２工程にて培養した後の好塩基球とともに培養する第３工程を包含することを特徴としている。
【００３８】
また、本発明に係る組成物は、ＩＬ−４を生成する方法に利用可能である。すなわち、本発明に係るＩＬ−４産生方法は、抗原と該抗原に結合するＩｇＥとの複合体を形成させる第１工程、および該複合体の存在下で、好塩基球を培養する第２工程を包含することを特徴としている。本方法を用いれば、ＩＬ−４、特に初期ＩＬ−４（primary IL-4）を産生し得る。また、本発明に係るＩＬ−４産生方法は、抗原と該抗原に結合するＩｇＥとの複合体を形成させる第１工程、該複合体の存在下で、好塩基球を培養する第２工程、およびナイーブＴ細胞を、第２工程にて培養した後の好塩基球とともに培養する第３工程を包含することを特徴としている。本方法を用いれば、ＩＬ−４、特に二次的ＩＬ−４（secondary IL-4）を産生し得る。
【００３９】
さらに、本発明に係る組成物は、ＩｇＥを生成する方法に利用可能である。すなわち、本発明に係るＩｇＥ生成方法は、抗原と該抗原に結合するＩｇＥとの複合体を形成させる第１工程、該複合体の存在下で、好塩基球を培養する第２工程、ナイーブＴ細胞を、第２工程にて培養した後の好塩基球とともに培養する第３工程、ならびにＢ細胞を、該抗原およびプロフェッショナル抗原提示細胞の存在下で、第３工程において誘導されたＴｈ２細胞とともに培養する第４工程を包含することを特徴としている。本方法を用いれば、ＩｇＥ、特に初期ＩｇＥ（primary IgE）を産生し得る。また、本発明に係るＩｇＥ生成方法は、抗原と該抗原に結合するＩｇＥとの複合体を形成させる第１工程、該複合体の存在下で、好塩基球を培養する第２工程、ナイーブＴ細胞を、第２工程にて培養した後の好塩基球とともに培養する第３工程、Ｂ細胞を、該抗原およびプロフェッショナル抗原提示細胞の存在下で、第３工程において誘導されたＴｈ２細胞とともに培養してＩｇＥを生成する第４工程、ならびに第４工程にて生成されたＩｇＥの存在下で、該抗原、該Ｔｈ２細胞およびＢ細胞を培養する第５工程を包含することを特徴としている。本方法を用いれば、ＩｇＥ、特に二次的ＩｇＥ（secondary IgE）を産生し得る。
【００４０】
本発明において培養される細胞は、好塩基球、ナイーブＴ細胞、Ｔｈ２細胞、およびＢ細胞であり、これらの細胞の培養手順（培養条件）は、当該分野において周知である。よって、当業者は、本発明を実行する際に、周知の培養手順を適宜設計し得る。
【００４１】
本発明に係る組成物は、ナイーブＴ細胞からＴｈ２細胞への誘導、ＩＬ−４の生成、ＩｇＥの生成などに好適に用いられ得る。よって、本発明に係る組成物を用いた際の、ナイーブＴ細胞からＴｈ２細胞への誘導、ＩＬ−４の生成、ＩｇＥの生成が抑制または阻害されるか否かを指標にすれば、Ｔｈ２型疾患に対する治療剤をスクリーニングすることができる。また、本発明に係る組成物を用いれば、Ｔｈ２型疾患のモデル動物を作製し得るとともに、該モデル動物を用いれば、Ｔｈ２型疾患に対する治療剤をスクリーニングすることができる。
【００４２】
Ｔｈ２サイトカインによって惹起されるＴｈ２型アレルギー性疾患の治療には、現在、ＩｇＥ抗体とＴｈ２サイトカインとによって活性化されたエフェクター細胞（肥満細胞など）から産生される様々な化学伝達物質を抑制することを目的としたものが用いられている。Ｔｈ２サイトカイン自体の産生を抑制するＴｈ２型アレルギー性疾患治療薬の開発はあまり進んでいない。
【００４３】
Ｔｈ２サイトカイン自体の産生を抑制する方法として、ＩＬ−１２の大量投与や、ＩＬ−１２とＩＬ−１８との組合せ投与が、現在知られている。ＩＬ−１２とＩＬ−１８との生体内投与は様々な細胞に作用してＩＦＮ−γの産生を誘導し、産生されたＩＦＮ−γは細胞内寄生性病原体の感染防御作用や抗アレルギー作用を発揮する。しかし、ＩＬ−１２とＩＬ−１８との組合せ投与は、過剰なＩＦＮ−γの産生を誘導するため、これによる過度の炎症反応を惹起することで、肝臓毒等の副作用が強く、実際の治療には不適切である。
【００４４】
ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞からＴｈ２細胞への分化誘導を抑制すること、誘導されたＴｈ２細胞からのＴｈ２サイトカイン産生を抑制することによって、感染症やアレルギー性疾患といったＴｈ２型疾患を治療／予防する技術は、有効かつ副作用がないことが大いに期待される。しかし、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｈ２細胞に発達させるに必要な初期ＩＬ−４を産生する細胞の性質はまだ知られておらず、自然免疫担当細胞からＴｈ２細胞への作用メカニズムは未だ明かされていない。
【００４５】
本発明によって、Ｔｈ２型の免疫応答を開始するメカニズムが明らかになった。これにより、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞からＴｈ２細胞への分化誘導を抑制するための医薬を得るための手段や、誘導されたＴｈ２細胞からのＴｈ２サイトカイン産生を抑制するための医薬を得るための手段が明らかとなった。
【００４６】
本発明は、Ｔｈ２型疾患に対する治療剤をスクリーニングする方法を提供する。上述したように、好塩基球は抗原を取り込んで断片化し、表面に提示させる。よって、候補物質を存在させることによって、好塩基球における表面提示が抑制または阻害された場合は、その候補物質が、Ｔｈ２型疾患に対する治療に有効であると判定し得る。
【００４７】
すなわち、一実施形態において、本発明に係るスクリーニング方法は、抗原と該抗原に結合するＩｇＥとの複合体を形成させる第１工程、および該複合体の存在下で、好塩基球を培養する第２工程を包含し、第２工程を候補物質の存在下または非存在下で行い、第２工程後の好塩基球の細胞表面上に提示されているＭＨＣクラスＩＩ分子またはＣＤ８０分子の量を測定することを包含することを特徴としている。好塩基球の細胞表面上に提示されているＭＨＣクラスＩＩ分子またはＣＤ８０分子の量は、これらのタンパク質に対する抗体を用いれば、容易に測定され得る。
【００４８】
また、好塩基球が抗原を取り込んで断片化し、表面に提示させるとともにＩＬ−４を産生し、ナイーブＴ細胞は、そのＩＬ−４存在下で好塩基球の表面に提示されたＭＨＣクラスＩＩ分子／抗原ペプチド複合体を認識し、Ｔｈ２細胞に誘導される。よって、候補物質を存在させることによって、Ｔｈ２細胞の誘導が抑制または阻害された場合は、その候補物質が、Ｔｈ２型疾患に対する治療に有効であると判定し得る。
【００４９】
すなわち、一実施形態において、本発明に係るスクリーニング方法は、抗原と該抗原に結合するＩｇＥとの複合体を形成させる第１工程、該複合体の存在下で、好塩基球を培養する第２工程、およびナイーブＴ細胞を、第２工程にて培養した後の好塩基球とともに培養する第３工程を包含し、第２工程または第３工程を候補物質の存在下または非存在下で行い、第３工程において誘導されたＴｈ２細胞の量を測定することを包含することを特徴としている。誘導されたＴｈ２細胞の量は、表面マーカーを用いたフローサイトメトリーなどによって、容易に測定され得る。
【００５０】
さらに、好塩基球が抗原を取り込んで断片化し、表面に提示させるとともにＩＬ−４を産生し、ナイーブＴ細胞が、そのＩＬ−４存在下で好塩基球の表面に提示された複合体を認識し、Ｔｈ２細胞に誘導され、Ｔｈ２細胞が誘導されると、Ｂ細胞は、Ｔｈ２細胞の作用を受けて、抗原に対するＩｇＥを産生する。よって、候補物質を存在させることによって、ＩｇＥの産生が抑制または阻害された場合は、その候補物質が、Ｔｈ２型疾患に対する治療に有効であると判定し得る。
【００５１】
すなわち、一実施形態において、本発明に係るスクリーニング方法は、抗原と該抗原に結合するＩｇＥとの複合体を形成させる第１工程、該複合体の存在下で、好塩基球を培養する第２工程、ナイーブＴ細胞を、第２工程にて培養した後の好塩基球とともに培養する第３工程、ならびにＢ細胞を、該抗原およびプロフェッショナル抗原提示細胞の存在下で、第３工程において誘導されたＴｈ２細胞とともに培養してＩｇＥを生成する第４工程を包含し、第２工程〜第４工程の少なくとも１工程を候補物質の存在下または非存在下で行い、第４工程において生成されたＩｇＥの量を測定することを包含することを特徴としている。ＩｇＥの量は、抗ＩｇＥ抗体などによって、容易に測定され得る。
【００５２】
なお、上記実施形態において測定されるＩｇＥはいわゆる初期ＩｇＥである。上述したように、本発明は二次的ＩｇＥを生成する方法もまた提供している。よって、候補物質を存在させることによって、二次的ＩｇＥの産生が抑制または阻害された場合は、その候補物質が、Ｔｈ２型疾患に対する治療に有効であると判定し得る。
【００５３】
すなわち、一実施形態において、本発明に係るスクリーニング方法は、抗原と該抗原に結合するＩｇＥとの複合体を形成させる第１工程、該複合体の存在下で、好塩基球を培養する第２工程、ナイーブＴ細胞を、第２工程にて培養した後の好塩基球とともに培養する第３工程、Ｂ細胞を、該抗原およびプロフェッショナル抗原提示細胞の存在下で、第３工程において誘導されたＴｈ２細胞とともに培養してＩｇＥを生成する第４工程、ならびに第４工程にて生成されたＩｇＥの存在下で、該抗原、該Ｔｈ２細胞およびＢ細胞を培養する第５工程を包含し、第２工程〜第５工程の少なくとも１工程を候補物質の存在下または非存在下で行い、第５工程において生成されたＩｇＥの量を測定することを包含することを特徴としている。
【００５４】
後述するＴｈ２型疾患のモデル動物を用いて、疾患に対する改善効果の有無を測定すれば、Ｔｈ２型疾患に対する治療剤をスクリーニングし得ることを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解する。すなわち、一実施形態において、本発明に係るスクリーニング方法は、Ｔｈ２型疾患に対する治療剤をスクリーニングするために、好塩基球を、抗原と該抗原に結合するＩｇＥとの複合体の存在下で培養する工程、該複合体の存在下で培養した後の好塩基球を動物に投与してモデル動物を作製する工程、該モデル動物に候補物質を投与する工程、および該候補物質を投与した後のモデル動物における、Ｔｈ２型疾患に対する改善効果の有無を測定する工程を包含することを特徴としている。
【００５５】
上述したように、本発明に係る組成物は、Ｔｈ２型疾患のモデル動物を作製する方法に利用可能である。すなわち、本発明に係るモデル動物作製方法は、Ｔｈ２型疾患のモデル動物を作製するために、好塩基球を、抗原と該抗原に結合するＩｇＥとの複合体の存在下で培養する工程、および該複合体の存在下で培養した後の好塩基球を、動物に投与する工程を包含することを特徴としている。なお、上記Ｔｈ２型疾患は、花粉症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性腸炎、アレルギー性結膜炎およびアレルギー性鼻炎からなる群より選択されることが好ましい。本発明に係る作製方法によって作製されるモデル動物は、気管支喘息のモデル動物であってもよく、この場合、上記複合体の存在下での培養後の好塩基球を経鼻投与することが好ましい。
【００５６】
本発明に係るモデル動物の作製方法は、アジュバントを必要としない。Ｔｈ２型疾患について、これまで多くのモデル動物が作製されているが、アジュバントを用いることなく作製された例はない。
【００５７】
〔２：抗原−ＩｇＥ複合体およびその利用〕
上述したように、今回、本発明者らは、好塩基球によるＴｈ２応答の誘導を見出した。これと同時に、抗原−ＩｇＥ複合体を正常なマウスに移入することによって同様のＴｈ２応答が誘導されることを見出した。具体的には、後述する実施例に示すように、ＤＮＰ−ＯＶＡ／抗ＤＮＰ  ＩｇＥ複合体とともに培養した好塩基球を用いて免疫したマウスの脾臓において、Ｔｈ２細胞が迅速に誘導される。また、ＤＮＰ−ＯＶＡ／抗ＤＮＰ  ＩｇＥ複合体を注入したナイーブマウスでは、末梢血、脾臓、骨髄において初期ＩＬ−４の産生が誘導され、ＩｇＥ複合体を注入されたマウスの脾臓において、Ｔｈ２細胞が迅速に誘導される。一方、ＤＮＰ−ＯＶＡ／抗ＤＮＰ  ＩｇＥ複合体を注入した好塩基球枯渇マウス（ＭＡＲ−１処理マウス）の脾臓においてはＴｈ２細胞が誘導されない。これらのことは、好塩基球が初期ＩＬ−４を産生し、次いでＴｈ２応答を誘導するということだけでなく、抗原と該抗原に結合するＩｇＥとからなる複合体が、好塩基球による初期ＩＬ−４産生についての初期刺激物質であることを示している。より詳細には、本発明者らによる上記新規知見は、好塩基球によるＴｈ２応答の誘導であるとともに、ＩｇＥとその抗原との複合体によるＴｈ２応答の誘導でもある。このように、本発明は、当業者に容易に予測し得ない新規知見に基づいて完成された。
【００５８】
すなわち、本発明は、抗原と該抗原に結合するＩｇＥとからなる複合体を提供する。本発明に係る複合体を用いれば、好塩基球から初期ＩＬ−４を産生させることができ、その結果、ナイーブＴ細胞をＴｈ２細胞に誘導すること、二次的ＩＬ−４を生成させること、抗原に対するＩｇＥを生成させることができる。さらに、本発明に係る複合体を用いれば、Ｔｈ２疾患治療剤のスクリーニング、およびＴｈ２型疾患モデル動物の作製が可能になる。
【００５９】
一般に、抗原とその抗体とからなる免疫複合体は、大量の抗体が存在する条件下において形成され得るので、生体内では血中濃度が非常に高いＩｇＧまたはＩｇＭについて観察され得る。ＩｇＥは、免疫グロブリンの一種とはいえ、ＩｇＧおよびＩｇＭと比較すると、その血中濃度は極めて低い。よって、生体内にて抗原と結合するＩｇＥは、そのＦｃ領域を介して好塩基球または肥満細胞とすでに結合している。すなわち、生体内では抗原−ＩｇＥ複合体が血中に存在するのではなく、抗原−ＩｇＥ−細胞の複合体として存在し、抗原−ＩｇＥ−細胞の複合体がアレルギー反応に関与すると考えられている。
【００６０】
本発明に係る複合体は、抗原と該抗原に結合するＩｇＥとからなり、そのＩｇＥのＦｃ領域は細胞（例えば、好塩基球および肥満細胞）に結合していない。この観点から、本発明に係る複合体は遊離複合体ともいえる。
【００６１】
このように、ＩｇＥとその抗原とからなる複合体は当該分野において認識されていない。さらには、そのような複合体が、好塩基球からの初期ＩＬ−４の産生を担っているということは、これまで知られていないばかりか、当業者が全く予測し得ないことである。
【００６２】
なお、上述したように、好塩基球に取り込ませるべき抗原−ＩｇＥ複合体の形成を促進するために、抗原はハプテンが連結されていてもよい。この場合、ＩｇＥは抗ハプテンＩｇＥであり得、本明細書中で使用される場合、抗ハプテンＩｇＥもまた、抗原に結合するＩｇＥの範疇に含まれる。
【００６３】
さらに、本発明は、上記遊離複合体を形成させるための組成物およびキットを提供する。本発明に係る組成物およびキットは、上記遊離複合体を形成させることができるので、好塩基球から初期ＩＬ−４を産生させることができ、その結果、ナイーブＴ細胞をＴｈ２細胞に誘導すること、二次的ＩＬ−４を生成させること、抗原に対するＩｇＥを生成させることができる。さらに、本発明に係る組成物およびキットを用いれば、Ｔｈ２疾患治療剤のスクリーニング、およびＴｈ２型疾患モデル動物の作製が可能になる。
【００６４】
すなわち、本発明に係る組成物およびキットは、好塩基球から初期ＩＬ−４を産生させるための組成物およびキットであり得、ナイーブＴ細胞をＴｈ２細胞に誘導するための組成物およびキットであり得、二次的ＩＬ−４を生成させるための組成物およびキットであり得、抗原に対するＩｇＥを生成させるための組成物およびキットであり得、Ｔｈ２疾患治療剤をスクリーニングするための組成物およびキットであり得、そしてＴｈ２型疾患モデル動物を作製するための組成物およびキットであり得る。
【００６５】
本発明に係る組成物は、抗原および該抗原に結合するＩｇＥを含有していることを特徴としている。抗原と該抗原に結合するＩｇＥとからなる複合体を形成させることを目的としているので、本発明に係る組成物は、ＩｇＥのＦｃ領域と結合し得る細胞（例えば、好塩基球）を含有していないことが好ましい。本発明に係る組成物に含有されている抗原およびＩｇＥは複合体化していてもしていなくてもよい。複合体化していない状態であっても、組成物という限定された空間内に両者を存在させた状態で生体へ提供された際に、組成物中のＩｇＥが生体内の細胞と結合する前に組成物中の抗原と結合する機会が非常に高く、その結果、本発明の効果が有意に導かれ得る。なお、本発明に係る組成物は、抗原と該抗原に結合するＩｇＥとを独立して備えているキット形態であってもよく、限定された空間内に両者を存在させた状態で生体へ提供されればよい。すなわち、本発明に係る組成物は、生体内でＩｇＥ−細胞の結合が生じるよりも前に抗原−ＩｇＥ複合体を生じさせることができる態様であればよいといえる。
【００６６】
本発明に係るキットは、抗原、該抗原に結合するＩｇＥおよび好塩基球を備えていることを特徴としている。なお、上記遊離複合体を形成させることを目的としているので、本発明に係るキットにおいて、ＩｇＥと細胞とが独立して備えられていればよく、抗原、該抗原に結合するＩｇＥおよび好塩基球が独立して備えられている態様であっても、抗原および該抗原に結合するＩｇＥを含有している組成物と好塩基球とが独立して備えられている態様であってよい。なお、本発明に係るキットもまた、抗原と該抗原に結合するＩｇＥとを、限定された空間内に両者を存在させた状態で生体へ提供し得るものであればよく、生体内でＩｇＥ−細胞の結合が生じるよりも前に抗原−ＩｇＥ複合体を生じさせることができる態様であればよいといえる。
【００６７】
なお、上記「好塩基球およびその利用」における記載に基づけば、本発明に係る遊離複合体（抗原−ＩｇＥ複合体）を用いた、ナイーブＴ細胞をＴｈ２細胞に誘導する方法、ＩＬ−４を生成させる方法、ＩｇＥを生成させる方法、Ｔｈ２疾患に対する治療剤をスクリーニングする方法、およびＴｈ２型疾患のモデル動物を作製する方法を実施し得るということを、本明細書を読んだ当業者は容易に理解し得る。
【００６８】
〔３：さらなる利用〕
上述したように、本発明者らは、内因性の好塩基球による抗原提示が初期Ｔｈ２応答の誘導に非常に重要であるということを示した。さらに、生体内の好塩基球を枯渇させることによりＴｈ２細胞の誘導が阻害されることも実証した。すなわち、本発明は、Ｔｈ２型疾患を処置する技術を提供する。本明細書中で使用される場合、用語「処置」は、症状の軽減または排除が意図され、予防的（発症前）または治療的（発症後）に行われ得るもののいずれもが包含される。「Ｔｈ２型疾患を処置する」とは、Ｔｈ２細胞誘導を抑制または阻止することが意図される。Ｔｈ２細胞の誘導は、Ｔｈ２型疾患における症状の緩和が生じる程度まで抑制されることが好ましく、Ｔｈ２型疾患における症状が消滅する（すなわち疾患が治癒する）程度までＴｈ２細胞の誘導が抑制されることがより好ましい。
【００６９】
本発明は、Ｔｈ２型疾患を処置するための組成物を提供する。上述したように、被験体から好塩基球を枯渇させることによってＴｈ２型疾患を処置することができる。すなわち、本発明に係る組成物は、好塩基球を枯渇させる物質を含んでいればよいといえる。このような物質としては、ＦｃεＲ１に対する抗体が好ましい。また、ＦｃεＲ１に対する抗体は、ＦｃεＲ１の機能を阻害する（例えば、ＦｃεＲ１による結合を阻害する）物質であるといえる。すなわち、本発明に係る組成物は、ＦｃεＲ１の機能を阻害する物質を含んでいてもよいといえる。本発明に係る組成物の形態は、血中または末梢組織にて好塩基球を枯渇し得る形態、すなわち、注入可能な形態であることが好ましいがこれに限定されない。なお、本発明に係る組成物は、上述したようなキット形態で提供されてもよい。すなわち、本発明は、Ｔｈ２型疾患を処置するためのキットを提供する。組成物の態様であってもキットの態様であっても、当業者は、本発明における有効成分以外の成分を、適宜選択し得る。
【００７０】
本発明はまた、Ｔｈ２型疾患を処置する方法を提供する。本発明に係る方法は、上述した組成物を用いる方法であり得、すなわち、被験体から好塩基球を枯渇させる工程、または被験体にＦｃεＲ１の機能を阻害する物質を投与する工程を包含すればよいといえる。本発明に係る方法もまた、予防的に用いられても治療的に用いられてもよい。また、投与形態や投与経路についても特に限定されない。
【００７１】
本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
【００７２】
また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【実施例】
【００７３】
〔１．材料および方法〕
〔マウス〕
ＢＡＬＢ／ｃマウスをJackson Laboratoryから購入した。ＯＶＡ３２３−３３９（ＤＯ１１．１０）を認識するαβＴＣＲについてのトランスジェニックマウス、およびＢＡＬＢ／ｃ  Ｇ４ホモ接合性（ＩＬ−４欠損）マウスを、兵庫医科大学の動物施設にてＳＰＦ条件下で交配させた。全ての動物実験を、the Institutional Animal Care Committee of Hyogo College of Medicineのガイドラインに従って行った。【００７４】
〔細胞精製〕
以前の報告（Kondo, Y. et al. Int Immunol 20, 791-800 (2008)およびYoshimoto, T. et al. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 13962-6 (1999)）に従って、マウス骨髄由来の好塩基球および肥満細胞を調製した。精製した集団の純度は９６％を超えた。ヒト好塩基球およびマウスＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋休止Ｔ細胞についてのさらなる情報および精製については後述する。【００７５】
〔インビトロでの培養〕
ＤＯ１１．１０マウスからのナイーブ脾臓ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞（１×１０５個／ｍＬ）を、５×１０５個／ｍＬの慣用的なＡＰＣ（照射されたＴ細胞枯渇ＢＡＬＢ／ｃ脾細胞）、照射された脾臓樹状細胞、照射された精製好塩基球または精製肥満細胞の存在下にて、ＩＬ−２（１００ｐＭ）、ＩＬ−３（２０Ｕ／ｍＬ）およびＯＶＡ３２３−３３９（１μＭ）またはＤＮＰ−ＯＶＡ（６．２５〜１００μｇ／ｍＬ）で、４８ウェルプレート中で７日間刺激した。Ｔｈ２細胞の誘導のために、ＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍＬ）を培養物にさらに添加した。プライム開始後に、細胞を洗浄し、ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍＬ）およびイオノマイシン（５００ｎｇ／ｍＬ）とともにさらに４時間培養し、サイトゾルのＩＬ−４およびＩＦＮ−γについてＦＡＣＳ解析を行った。いくつかの実験において、プライム開始後に、ＣＤ４＋Ｔ細胞（１×１０５個／０．２ｍＬウェル）を、照射した慣用的なＡＰＣ（１×１０５個）の存在下にて、ＩＬ−２（１００ｐＭ）、ＯＶＡ３２３−３３９（１μＭ）で、９６ウェルプレート中で４８時間再度刺激した。上清を回収し、サイトカイン産生についてELISA kits (R&D Systems)またはBio-Plex system (BioRad) によって試験した。【００７６】
〔寄生虫〕
ＢＡＬＢ／ｃマウスにS. venezuelensisの３期幼虫（５０００匹）を皮下摂取して完全な感染を開始させた。【００７７】
〔統計〕
データは、平均±ＳＥＭとして示した。２つの実験群の統計学的比較を、GraphPad Instat Softwareによって実施した対応スチューデントｔ検定によって決定した。Ｐ値（＜０．０５）を顕著に差異があるとみなした。【００７８】
〔抗体および試薬〕
抗マウスＩＬ−４（１１Ｂ１１）を、本発明者らの研究室にて精製した。ＰＥ−抗マウスＣＤ４、ＦＩＴＣ−抗マウスＣＤ６２Ｌ、ＦＩＴＣ−抗マウスＩ−Ａｄ、ＦＩＴＣ−抗マウスＣＤ４０、ＦＩＴＣ−抗マウスＣＤ８０、ＦＩＴＣ−抗マウスＣＤ８６、ＦＩＴＣ−抗マウスＣＤ１１ｃ、ＰＥ−抗マウスｃ−ｋｉｔ、ＦＩＴＣ−抗マウスｃ−ｋｉｔ、ＦＩＴＣ−抗マウスＤＸ５、ＦＩＴＣ−抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ、およびＡＰＣ−抗ヒトＣＤ２０３ａを、BD Biosciencesから購入した。ＦＩＴＣ−抗マウスＴ１／ＳＴ２（ＤＪ８）、ビオチン抗マウスＦｃε１α（ＭＡＲ１）、ストレプトアビジン‐ＰＥ、およびストレプトアビジン‐ＡＰＣを、eBioscienceから購入した。以下の、ＰＥ標識化抗ヒトｍＡｂを、BD Biosciencesから購入した：抗ＣＤ３、抗ＣＤ７、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ１５、抗ＣＤ１６、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３６、抗ＣＤ４５ＲＡおよび抗ＣＤ２３５ａ。リコンビナントマウスＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４およびヒトＩＬ−３を、R&D Systemsから購入した。ＩＬ−１８をＭＢＬから購入した。リコンビナントヒトＩＬ−３３を、本発明者らの研究室にて精製した。抗ＤＮＰ  ＩｇＥ  ｍＡＢ、ＯＶＡ（クレードＶ）、Salmonella minnesota Re-595またはE.coli 055:B5からのＬＰＳ、およびStaphylococcus aureusからのＰＧＮを、Ｓｉｇｍａから購入した。ＯＶＡ−ＤＮＰを、Eisen, H. N. et al. J Immunol 73, 296-308 (1954)の方法に従って調製した。【００７９】
〔フローサイトメトリーおよび細胞精製〕
骨髄由来の好塩基球を調製するために、骨髄細胞を、１０％ＦＢＳ、２−ＭＥ（５０μＭ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）を補充したＲＰＭＩ１６４０中でＩＬ−３（１０Ｕ／ｍＬ）とともに１４日間培養し、２回洗浄した。細胞を、先ず、抗ＦｃγＲＩＩ／ＩＩＩ（１０μｇ／ｍＬ）を用いて、４度で３０分間刺激し、ビオチン抗マウスＦｃεＲ１α（５μｇ／ｍＬ）を用いて、染色緩衝液（ＰＢＳ、１％ＦＢＳ）中にて４℃で１時間処理した。２回洗浄した後、細胞を、ストレプトアビジン‐ＡＰＣおよびＰＥ−抗マウスｃ−ｋｉｔで３０分間染色した。サンプルを、FACS Calibur (BD Biosciences)で解析し、蛍光セルソーター(FACS Aria; BD Biosciences)によってＦｃεＲ１＋／ｃ−ｋｉｔ−細胞（好塩基球）とＦｃεＲ１＋／ｃ−ｋｉｔ＋細胞（肥満細胞）とに分離した。各集団の残りを、表面マーカーの分析のためにＦＩＴＣ標識化抗体でさらに染色した。脾臓好塩基球の調製のために、ＢＡＬＢ／ｃマウスからの脾細胞を、先ず、MACS system (MiltenyiBiotec)によってＴｈｙ１．２＋Ｔ細胞およびＢ２２０＋細胞を枯渇させ、次いで、残りの細胞をさらに染色し、ＦＡＣＳ  ＡｒｉａによってＦｃεＲ１＋／ｃ−ｋｉｔ−細胞とＦｃεＲ１＋／ｃ−ｋｉｔ＋細胞とに分離した。各集団の純度は９６％を超えた。脾臓ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋休止Ｔ細胞の調製のため、および細胞内サイトカイン染色のために、以下の手順を行った。【００８０】
インフォームドコンセントの後に、正常ボランティアからのヒト末梢血、および臨月の正常人の臍帯血を取得し、プロセスした。研究所の倫理委員会は、この実験プランを承認している。Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配遠心分離によって、末梢血および臍帯血から単核細胞を単離した。末梢血の単核細胞について、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ２３５ａに対する、ＰＥ標識した抗ヒトモノクローナル抗体のカクテル、ならびに抗ＰＥマイクロビーズ(MiltenyiBiotec)を用いて、Ｔ細胞、単球、好酸球、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、血小板、樹状細胞および赤血球をさらに枯渇させた。マイクロビーズを用いて、臍帯血の単核細胞をさらにＣＤ３４＋細胞に富化させた。これらのＣＤ３４＋前駆細胞を、５×１０５個／ｍＬの細胞密度で、１２ウェルプレートに播種し、１０％ＦＢＳ、２−ＭＥ（５０μＭ）、Ｌ−グルタミン（０．５ｍＭ）、ペニシリン（５０Ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（５０μｇ／ｍＬ）ならびにヒトＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍＬ）を補充したSTEM PRO-34 SFM medium (GIBCO)中で７日間培養した。【００８１】
〔電子顕微鏡〕
ソートした、マウス骨髄由来細胞（ＦｃεＲ１＋／ｃ−ｋｉｔ−細胞およびＦｃεＲ１＋／ｃ−ｋｉｔ＋細胞）およびヒト細胞（ＣＤ２０３ｃ＋ＨＬＡ−ＤＲ細胞）を、２％パラホルムアルデヒドおよび１．２５％グルタルアルデヒドで固定し、１％ＯｓＯ４で後固定し、Ｅｐｏｎ中に包埋した。超薄切片を、ウラニル酢酸およびクエン酸鉛で二重染色し、JEM 1220 transmission electron microscopy (JEOL)で観察した。【００８２】
〔増殖アッセイ〕
ＤＯ１１．１０マウスからのナイーブ脾細胞ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞（５×１０４個／０．２ｍＬウェル）を、２．５×１０５個／ｍＬの慣用的なＡＰＣまたは精製された好塩基球の存在下にて、ＤＮＰ  ＩｇＥに対するモノクローナル抗体（１０μｇ／ｍＬ）の存在下または非存在下にて、ＩＬ−２（１００ｐＭ）、ＩＬ−３（２０Ｕ／ｍＬ）およびＯＶＡ３２３−３３９（１μＭ）またはＤＮＰ−ＯＶＡ（６．２５〜１００μｇ／ｍＬ）で、９６ウェルプレート中において４日間刺激した。最後の１６時間の間、ＤＮＡ合成を、１μＣｉの［３Ｈ］チミジンの添加によって測定した。【００８３】
〔ＥＬＩＳＡアッセイ〕
ＯＶＡ特異的血清ＩｇＥを、Mouse OVA-IgE ELISA kit (Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd.)によって測定した。ＯＶＡ特異的血清ＩｇＧ１を、Mouse OVA-IgG1 ELISA kit (AKRIE-04, Shibayagi) によって測定した。【００８４】
〔マウスのインビボ処理〕
骨髄由来のまたはＦＡＣＳソートした、好塩基球および肥満細胞（各５×１０５個／ｍＬ）を、ＩＬ−３（２０Ｕ／ｍＬ）、ＤＮＰ−ＯＶＡ（１００μｇ／ｍＬ）および抗ＤＮＰ  ＩｇＥ  ｍＡｂ（１０μｇ／ｍＬ）とともに、４８ウェルプレート中で１６時間培養した。プライムした後、好塩基球または肥満細胞（２．５〜５×１０５個／マウス）を、尾静脈を介してＢＡＬＢ／ｃマウスに移した（１群あたり５匹）。再構築の４日後または１週間後に、マウスを、ＰＢＳ中のＯＶＡタンパク質（１００μｇ）で、静脈内にチャレンジした。いくつかの実験において、ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたり５匹）について、ＤＮＰ−ＯＶＡ（１００μｇ／マウス）および抗ＤＮＰ  ＩｇＥ  ｍＡｂ（２００μｇ／マウス）の混合物を、静脈内注入した。注入後、ＩＬ−４のレポーターとしてのＧＦＰの発現を、ＦＡＣＳを用いて経時的に測定することによって、好塩基球におけるＩＬ−４の発現を測定した。好塩基球のインビボ枯渇については、Ｄｅｎｚｅｌらの方法に従った。５μｇの抗マウスＦｃεＲ１α（ＭＡＲ−１）またはコントロールハムスターＩｇＧ（eBioscience）を、腹腔内投与にて１日２回で３日間注入した。マウスを２日間休息させて、次いで、ＤＮＰ−ＯＶＡおよび抗ＤＮＰ  ＩｇＥ  ｍＡｂの混合物をマウスに注入し、続いて、これらのマウスにＭＡＲ−１またはハムスターＩｇＧを１日２回でさらに３日間注入した。ＤＮＰ−ＯＶＡおよび抗ＤＮＰ  ＩｇＥの注入の４日後に、脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞（１×１０５細胞／０．２ｍＬウェル）を、照射した慣用的なＡＰＣ（１×１０５個）の存在下で、ＩＬ−２（１００ｐＭ）、ＯＶＡ（１００μｇ／ｍＬ）で、９６ウェルプレート中にて５日間刺激した。脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＰＶＡでパルスしたＡＰＣで５日間刺激した。【００８５】
〔ＴＬＲ  ｍＲＮＡの発現解析〕
ソートした好塩基球および肥満細胞から、Ｔｒｉｚｏｌ試薬を用いて総ＲＮＡを抽出し、ＤＮａｓｅＩで処理し、Superscript II RTおよびoligo (dT)12-18 primer (Invitrogen)を用いて逆転写した。全てのＴＬＲのポジティブコントロールとして、総脾臓細胞から抽出したＲＮＡを用いた。ＴＬＲ  ｍＲＮＡの発現解析のために、ｍＲＮＡを、標準的なＲＴ−ＰＣＲ増幅手順を改変して用いることにより、増幅した。特異的ＴＬＲプライマー配列およびそれぞれのアニーリング温度を設計した。ｃＤＮＡを、１サイクルあたり、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間、さらに７２℃で１０分間伸長させ、３５サイクル増幅した。３５サイクルの後、分析するまでサンプルを４℃で保存した。増幅後に、ＰＣＲ産物を、１．７％アガロースゲルにて電気泳動し、ＵＶ光照射によって可視化した。【００８６】
〔２．結果および考察〕
本発明者らは、今回、ＩＬ−４の産生、およびナイーブＣＤ４＋細胞へのＭＨＣクラスＩＩ／ペプチド複合体の提示によって、インビトロおよびインビボでのＴｈ２／ＩｇＥ応答に対する好塩基球の寄与を示した。【００８７】
先ず、Ｔｈ２サイトカインを産生し、インビトロでナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞がＴｈ２細胞に発達することについての、脾臓好塩基球の能力を試験した。ナイーブマウスからの非Ｔ細胞機能および非Ｂ細胞機能は、０．２０％のＦｃεＲ１＋／ｃ−ｋｉｔ−細胞を含んでいたが、Strongyloides venezuelensis (S. venezuelensis)が感染したマウスでは、寄生虫Nippostrrongylus brasiliensis (N. brasiliensis)が感染したマウスでの報告と同様に、この割合が顕著に増加していた（５．８４％；図１（ａ））。ＦｃεＲ１＋／ｃ−ｋｉｔ−細胞（好塩基球）を、ナイーブマウスおよび感染マウスの脾臓から精製した。ＩＬ−３存在下で２４時間培養した、感染マウスからの脾臓好塩基球は、多量のＩＬ−４、ＩＬ−６およびＩＬ−１３を産生したが、ＩＬ−１２を産生しなかった。一方、ナイーブマウスからの脾臓好塩基球は、ＩＬ−３に応答して少量のＩＬ−４、ＩＬ−６およびＩＬ−１３を産生した。これらのことは、感染マウスの脾臓好塩基球は、ＩＬ−２を含む培養においてＩＬ−４、ＩＬ−６およびＩＬ−１３を強く産生する能力を獲得したということを示唆する（図１（ｂ））。【００８８】
ＯＶＡ特異的ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞からＴｈ２細胞への発達を誘導する、感染マウスからの好塩基球の能力を、ＯＶＡペプチド（ＯＶＡ３２３−３３９）、ＩＬ−２およびＩＬ−３の存在下で試験した。また、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を慣用的なＡＰＣ（Ｔ細胞枯渇脾臓細胞）とともに、ＯＶＡ３２３−３３９およびＩＬ−２の存在下で培養した。S. venezuelensis感染マウスからの脾臓好塩基球は、ＩＬ−４非存在下でナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞からＴｈ２細胞への発達を誘導する著しい能力を有していた（図１（ｃ））。対照的に、他でも報告されているように、慣用的なＡＰＣはＴｈ０条件（ＯＶＡ３２３−３３９およびＩＬ−２のみ）の下ではＴｈ２細胞の発達を誘導しなかった（図１（ｃ））。発達したＴｈ２細胞は、Ｔｈ２マーカーであるＩＬ−３３Ｒαを発現し（図１（ｄ））、ＯＶＡチャレンジの際にＴｈ２サイトカインを産生し、抗原およびＩＬ−３３でのチャレンジの際にＩＬ−４以外の産生をさらに増加させた。【００８９】
脾臓好塩基球へのＤＣの潜在的な夾雑を避けるために、高度に精製した骨髄好塩基球の、インビトロでのＴｈ２細胞の発達を誘導する能力を試験した（図６（ａ），図６（ｂ））。先ず、ＭＨＣクラスＩＩ分子および刺激補助分子ＣＤ８０およびＣＤ８６の発現を試験した。さらに、肥満細胞および慣用的なＡＰＣによるこれらの発現を同時に試験した（図２（ａ））。骨髄由来の好塩基球および慣用的なＡＰＣは、クラスＩＩ分子、ＣＤ８０およびＣＤ８６を明らかに発現したが、ＣＤ１１ｃを発現しなかった。対照的に、肥満細胞は、これらの分子をごく軽度にしか発現しなかった（図２（ａ）、図２（ｂ））。脾臓好塩基球は、ＣＤ６２Ｌ（リンパ節ホーミング分子）を発現する。このことは、リンパ組織への侵入について優位であることが示唆される。臍帯血または末梢血由来のヒト好塩基球（ＣＤ２０３ｃ＋／ｃ−ｋｉｔ−）はまた、ＨＬＡ−ＤＲを発現している（図２（ｃ）、図６（ｃ）、図６（ｄ））。【００９０】
予期したように、S. venezuelensis感染マウスからの脾臓好塩基球と同様に、骨髄由来の好塩基球は、プロフェッショナルＡＰＣが完全に非存在であっても、Ｔｈ０条件（ＯＶＡ３２３−３３９、ＩＬ−２およびＩＬ−３の存在、かつＩＬ−４非存在）の下でナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞からＴｈ２細胞への発達を誘導する能力を有している（２０．７％）（図３（ａ））。【００９１】
どのように好塩基球がＴｈ２細胞の発達を誘導しているのかについてのメカニズムを調べた。ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＯＶＡ３２３−３３９、慣用的なＡＰＣ（ΔＴ脾臓）、ＩＬ−２およびＩＬ−４（Ｔｈ２条件下）で刺激した場合に、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞はＴｈ２細胞に発達した（１９．１％）（図３（ａ））。同様に、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＯＶＡ３２３−３３９、肥満細胞、ＩＬ−２、ＩＬ−３およびＩＬ−４（Ｔｈ２条件下）で刺激した場合に、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞はＴｈ２細胞に発達した（１７．２％）（図３（ａ））。対照的に、さらなるＩＬ−４刺激（Ｔｈ２条件下）は、この好塩基球依存的Ｔｈ２細胞の発達を中程度にのみ増強した（２５．２％；図３（ａ））。さらに、ＩＬ−４枯渇マウスからの好塩基球は、このＴｈ２発達がほぼ完全に排除され（３．１％）、野生型好塩基球は、Ｔｈ０条件下で、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞をＴｈ２細胞へ誘導したが、プロフェッショナルＡＰＣは誘導しなかった（図３（ｂ））。これらの結果は、好塩基球がＩＬ−４を産生し、ＯＶＡペプチドを提示することを示すとともに、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞からＴｈ２細胞への発達を誘導することを示す。【００９２】
次いで、ＤＮＰ−複合体化ＯＶＡ（ＤＮＰ−ＯＶＡ）を抗原としてＯＶＡペプチド（ＯＶＡ３２３−３３９）の代わりに用いた。ＩＬ−３およびＤＮＰ−ＯＶＡの存在下でありかつＩＬ−４の非存在下にて、ＯＶＡ特異的ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を好塩基球とともに培養することによって、ＯＶＡ特異的Ｔｈ２細胞を誘導し得た（図３（ｃ））。これらの結果は、好塩基球がネイティブなＯＶＡを取り込み、ＯＶＡ３２３−３３９にプロセスし、ＭＨＣクラスＩＩと共同してペプチドフラグメントを提示し、ＩＬ−４を産生する能力を有していることを示唆する。次いで、抗ＤＮＰ  ＩｇＥモノクローナル抗体の添加が、好塩基球のＡＰＣ能を上方制御するか否かを試験した（図３（ｄ））。ＯＶＡ特異的ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を、１００μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌあるいは６．２μｇ／ｍｌのＤＮＰ−結合ＯＶＡの存在下、かつ１０μｇ／ｍｌの抗ＤＮＰ−ＩｇＥモノクローナル抗体の存在下で、好塩基球とともに７日間培養した。培養終了後、細胞を良く洗浄して、ＰＭＡ＋ｉｏｎｏｍｙｃｉｎｅ存在下で４時間培養後、細胞質内のＩＬ−４とＩＦＮ−γの発現をＦＡＣＳで測定した。数字は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の中で細胞質内にＩＬ−４あるいはＩＦＮ−γを有する細胞の割合である。低用量（６．２μｇ／ｍＬ）のＤＮＰ−ＯＶＡでパルスした好塩基球は、Ｔｈ２細胞を中程度に誘導した（３．２％）。一方、高用量（１００μｇ／ｍＬ）のＤＮＰ−ＯＶＡでパルスした好塩基球は、Ｔｈ２細胞を顕著に誘導した（１１．３％）。抗ＤＮＰ  ＩｇＥモノクローナル抗体の添加は、Ｔｈ２細胞を顕著に誘導した（抗ＩｇＥなしの場合の３．２％、４．２％、１１．３％に対して、抗ＩｇＥありの場合の１０．５％、１２．５％、１６．８％；図３（ｄ））。よって、好塩基球誘導性のＴｈ２発達に対する抗ＤＮＰ−ＩｇＥモノクローナル抗体の増強効果は、最低濃度のＤＮＰ−ＯＶＡで好塩基球をパルスした場合に明らかである。さらに、プロフェッショナルＡＰＣと比較して、少数の好塩基球が、抗ＤＮＰ−ＩｇＥモノクローナル抗体を用いたＴｈ２条件下でナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞からＴｈ２細胞への発達を誘導する（図３（ｄ））。【００９３】
続いて、抗ＤＮＰ  ＩｇＥモノクローナル抗体が上述した上方制御効果をどのように示したのかを試験した。抗ＤＮＰ−ＩｇＥの存在下にてＤＮＰ−ＯＶＡでパルスした好塩基球は、特に、好塩基球が低濃度のＤＮＰ−ＯＶＡでパルスされた場合に、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞の増殖を誘導する能力を増加させた（図７）。対照的に、抗ＤＮＰ−ＩｇＥ抗体の存在下でパルスされた慣用的なＡＰＣは、Ｔ細胞の増殖を誘導する能力を増加させなかった（図７）。さらに、これまでに報告されているように、好塩基球のみが、抗ＤＮＰ−ＩｇＥ抗体の存在下でＤＮＰ−ＯＶＡでパルスされた場合に、ＩＬ−４を産生する能力を顕著に増加させた（図８（ａ），図８（ｂ））。ＤＮＰ−ＯＶＡ／抗ＤＮＰ  ＩｇＥでパルスした肥満細胞は、ＩＬ−１３を産生し得たがＩＬ−４を産生しなかった（図８（ｂ））。さらに、好塩基球のみが、ＩＬ−３、およびＩＬ−１８、ＩＬ−３３、ＰＧＮまたはＬＰＳで刺激した場合に、ＩＬ−４を産生した（図８（ｃ）、図８（ｄ））。【００９４】
ＯＶＡでパルスした好塩基球がＴｈ２応答をインビボで誘導し得るのか否かを試験するために、ＤＮＰ−ＯＶＡ／抗ＤＮＰ  ＩｇＥとともに培養することによって、ＯＶＡペプチドでの強力なパルスを好塩基球に試みた。また、この抗原／抗体複合体で肥満細胞を同時に処理した。次いで、これらの好塩基球または肥満細胞を、尾静脈を介して正常マウスに移した。４日後、ＰＢＳに溶解したインタクトなＯＶＡタンパク質を用いてマウスをチャレンジした。チャレンジの２日後、脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞を調製し、ＯＶＡでパルスしたＡＰＣ（ΔＴ‐脾臓）でこれらの細胞を刺激し、培養上清中のＩＬ−４、ＩＬ−１３およびＩＦＮ−γの含有量を測定した。この脾臓において、ＯＶＡでパルスした好塩基球のみが、迅速かつ強力にＴｈ２細胞を誘導し、Ｔｈ１細胞を中程度に誘導した（図４（ａ））。次いで、ＯＶＡでパルスした好塩基球で免疫したマウスの、ＯＶＡの静脈内チャレンジの際にＩｇＥおよびＩｇＧ１を産生する能力を試験した。アジュバントを用いないこの全身性のＯＶＡ投与は、ＩｇＥ応答をナイーブなマウスにおいて誘導しなかった。対照的に、ＯＶＡでパルスした好塩基球でプライムしたマウスは、ＯＶＡチャレンジに応答してＩｇＥおよびＩｇＧ１を産生した（図４（ｂ））。これらのマウスは、脾臓内においてCD4+CD62LlowIL33Rα+Ｔｈ２細胞を発達させた（図４（ｃ），図４（ｄ））。ＣＤ６２Ｌ分子はＴｈ２細胞の再循環に必要なマーカーであるので、ＯＶＡでパルスした好塩基球はプロフェッショナルＡＰＣ様であり、ＯＶＡ特異的Ｔｈ２細胞を誘導する。なお、このＯＶＡ特異的Ｔｈ２細胞は、ＯＶＡで活性化されたＢ細胞がインビボでＩｇＧ１およびＩｇＥを産生することを補助する。【００９５】
最後に、内因性の好塩基球による抗原提示がインビボでの初期Ｔｈ２応答の誘導に非常に重要であるという直接的な証拠を示すために、ＤＮＰ−ＯＶＡ／抗ＤＮＰ  ＩｇＥ複合体をナイーブマウスまたは好塩基球枯渇マウスに注入した。好塩基球を枯渇させるために、Ｄｅｎｚｅｌらの方法に従って、ＦｃεＲ１αに対する抗体（ＭＡＲ−１）をマウスに１日２回で３日間の腹腔内投与した。ＭＡＲ−１（コントロールのハムスターＩｇＧではない）の最終投与の２日後に、脾臓および肝臓での好塩基球の完全な枯渇を達成した（図９）。ＩＬ−４のレポーターとしてのＧＦＰの発現を、ＤＮＰ−ＯＶＡ（１００μｇ）／抗ＤＮＰ  ＩｇＥ（２００μｇ）の注入から経時的にＦＡＣＳを用いて測定することによって、好塩基球におけるＩＬ−４の発現を測定したところ、注入から１２時間後または２４時間後の好塩基球においてＩＬ−４の顕著な産生が認められた。さらに、注入から４日後に、脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞を調製し、ＯＶＡパルスしたＡＰＣでこれらの細胞を刺激し、培養上清中のＩＬ−４、ＩＬ−１３およびＩＦＮ−γの含有量を測定した。ＤＮＰ−ＯＶＡ／抗ＤＮＰ  ＩｇＥ複合体を、好塩基球枯渇マウスではなくナイーブマウスに注入した場合に、脾臓にてＴｈ２細胞が迅速に誘導されることを見出した（図４（ｃ））。【００９６】
独特なプロフェッショナルＡＰＣが、Ｔｈ２細胞をインビトロおよびインビボの両方で優先的に誘導することを実証した。慣用的なＡＰＣと同様に、好塩基球はＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０およびＣＤ８６を発現し、抗原タンパク質の取り込みおよびプロセッシングを行い、ペプチドをＭＮＨＣクラスＩＩとともに発現する（図２（ａ）、図３）。対照的に、肥満細胞はこれらの分子の発現が極めて軽度である（図２（ａ））。さらに、ＯＶＡペプチドで強くパルスした好塩基球は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞からＴｈ２細胞への発達を強く誘導し、ＯＶＡでパルスした肥満細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞からＴｈ２細胞への発達を誘導しなかった。このことは、インビボでのＴｈ２応答の誘導に大きな差異があることを示唆する（図４（ａ））。これまでに報告されているように、Ｔｈ２細胞は、脾臓およびリンパ節での好塩基球の数を顕著に増加させ、好塩基球のレベルとＴｈ２細胞のレベルとの間でポジティブフィードバック制御があるようである。【００９７】
従って、好塩基球の下方制御は、Ｔｈ２／ＩｇＥ応答の制御的処置に重要なストラテジーである。ＩｇＥはまた、重要な標的分子である。なぜなら、ＩｇＥは好塩基球とＴｈ２細胞との間のポジティブフィードバック制御を開始させるからである。好塩基球は、一般に、ＩＬ−４を生成し、抗原を、実際の抗原提示を行う樹状細胞に移すだけの細胞であると認識されている。好塩基球自身による潜在的ＡＰＣ機能の認識は、単一のアレルゲンに対する陽性反応を有する患者が同一の抗原によりどのようにして強く陽性になるのか、どのように複数のアレルゲンに対する陽性反応を発達させるのかについてのメカニズムを理解するために重要と思われる。ポリクローナル抗体で感作された好塩基球が対応アレルゲンを取り込み、複数のＴ細胞エピトープを提示することによって複数のＴｈ２細胞クローンを誘導することが予想された。ヒト臍帯血細胞も、ＩＬ−３含有培地中で増殖させた後にヒトに輸血されると、好塩基球がコン有しており、これらがＭＨＣクラスＩＩ分子を発現するため、臍帯血細胞輸血を受けた患者においてＴｈ２／ＩｇＥ応答が誘導される危険性があることを示唆する。【００９８】
以上のように、好塩基球がＴｈ２優位な免疫応答を誘導する抗原提示細胞であることを、本発明において示した。また、好塩基球を種々の方法で制御することでアレルギー疾患を制御し得る可能性を示した。【００９９】
本発明者らは、好塩基球がＭＨＣクラスＩＩ分子およびＣＤ８０／８６を発現しており、種々の刺激の下でＩＬ−４を産生することを示した。このことは、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）の非存在下でのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞からＴｈ２細胞への発達を、好塩基球が誘導することを示唆する。【０１００】
好塩基球、ＯＶＡペプチドまたはＤＮＰ−ＯＶＡとともに、ＩＬ−３存在下でＩＬ−４非存在下にて培養したオブアルブミン（ＯＶＡ）特異的ナイーブＣＤ４＋細胞が、Ｔｈ２細胞に発達した。このような好塩基球によるＴｈ２誘導作用はＩＬ−４欠損好塩基球では全く認められなかった。このことは、ＯＶＡでパルスされた好塩基球によって放出されたＩＬ−４が、Ｔｈ２細胞の発達に不可欠であることを示唆する。さらに、ＤＮＰ−ＯＶＡおよび抗ＤＮＰ−ＩｇＥとともに培養した好塩基球は、ＤＮＰ−ＯＶＡ単独とともに培養された好塩基球よりも多くＯＶＡを取り込み、より多くプロセッシングするため、ＤＮＰ−ＯＶＡ単独とともに培養した好塩基球よりも強力なＡＰＣ活性を示した。【０１０１】
さらに、ＯＶＡで強くパルスした好塩基球の静脈内投与は、強くかつ迅速にＴｈ２細胞を誘導したが、ＯＶＡでパルスした肥満細胞ではＴｈ２細胞の誘導は起こらなかった。好塩基球によるＴｈ２細胞の誘導に続いて、ＯＶＡで刺激されたＢ細胞はＯＶＡ特異的ＩｇＥ抗体を産生するようになるが、Ｔｈ２細胞がこの過程を強力に促進している。このことは、好塩基球によるＩｇＥ依存的な抗原の取り込みによってＴｈ２／ＩｇＥ応答のポジティブフィードバックが制御されていることを示唆する。【０１０２】
〔３．図面について〕
図１（ａ）〜図１（ｄ）には、寄生虫によって誘導される脾臓好塩基球による抗原提示を示した。図１（ａ）には、ＢＡＬＢ／ｃマウス、またはS. venezuelensisの３期幼虫を１０日間感染させたＢＡＬＢ／ｃマウスから、脾臓の非Ｂ非Ｔ細胞を新鮮に調製し、ＦｃεＲ１およびｃ−ｋｉｔの発現を、フローサイトメトリーによって解析した結果を示す。S. venezuelensisの感染ありまたはなしのマウスからの脾臓の非Ｂ非Ｔ細胞を、ＦＡＣＳ  ＡｒｉａによってＦｃεＲ１＋／ｃ−ｋｉｔ−細胞にさらに分離した。ＦｃεＲ１＋／ｃ−ｋｉｔ−細胞の割合を数字で示した。【０１０３】
図１（ｂ）には、図１（ａ）に示した、ソートした好塩基球（１×１０５個／０．２ｍＬウェル）を、ＩＬ−３（２０Ｕ／ｍＬ）とともに９６ウェルプレート中で２４時間培養し、その上清を回収し、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘシステムによってサイトカイン含量を試験した結果を、１群あたり３匹のマウスからの好塩基球の、２回の独立した実験によって得た平均＋ＳＥＭで示した。【０１０４】
図１（ｃ）には、ＤＯ１１．１０からのナイーブＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞（１×１０５個／ｍＬ）を、５×１０５個／ｍＬの、照射したＴ細胞枯渇ＢＡＬＢ／ｃ脾細胞（ΔＴ脾臓）、または照射した、S. venezuelensis感染マウスからの脾臓好塩基球（寄生虫誘導性好塩基球）（ＩＬ−４なし（Ｔｈ０条件））の存在下にて、ＩＬ−２（１００ｐＭ）、ＩＬ−３（２０Ｕ／ｍＬ）およびＯＶＡ３２３−３３９（１μＭ）で、４８ウェルプレート中にて７日間刺激し、プライム開始後に、細胞を洗浄し、ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍＬ）およびイオノマイシン（５００ｎｇ／ｍＬ）とともに４時間再度培養し、細胞質ＩＬ−４およびＩＦＮ−γについてＦＡＣＳによって解析した結果を示した。ＣＤ４＋Ｔ細胞について、ＩＬ−４＋細胞またはＩＦＮ−γ＋細胞の割合を数字で示した。【０１０５】
図１（ｄ）は、図１（ｃ）でフローサイトメトリーによって示した、ΔＴ脾臓または寄生虫誘導性好塩基球とともに７日間培養したＣＤ４＋Ｔ細胞上のＩＬ−３３Ｒα鎖の発現を示した。ＣＤ４＋細胞におけるＩＬ−３３Ｒα鎖＋細胞の割合を、パーセントで示した。【０１０６】
図２（ａ）〜図２（ｃ）には、好塩基球上でのＭＨＣクラスＩＩ分子の発現を示した。図２（ａ）には、骨髄由来の、ＦＡＣＳソートされた、好塩基球および肥満細胞（図６に示す）、ならびにＴ細胞枯渇脾細胞（ΔＴ脾臓）を、図中に示した表面マーカーで染色した結果を示した。図中の陰影領域はマーカー染色したものを示し、白抜き領域は未染色のものを示す。【０１０７】
図２（ｂ）には、骨髄由来の、ＦＡＣＳソートされた、好塩基球および肥満細胞を、ＭＨＣクラスＩＩ（Ｉ−Ａ）およびＦｃεＲ１の発現について、フローサイトメトリーで解析した結果を示した。ＦｃεＲ１＋Ｉ−Ａ＋細胞の割合をパーセントで示した。４回の独立した実験の代表的な結果を示す。【０１０８】
図２（ｃ）には、ヒトＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍＬ）とともに７日間培養したＣＤ３４＋臍帯血細胞を、ｃ−ｋｉｔおよびＣＤ２０３ｃ（左）、ならびにＣＤ２０３ｃ＋ｃ−ｋｉｔ−である細胞中のＨＬＡ−ＤＲ（右）の発現について、フローサイトメトリーによって解析した結果を示した。３回の独立した実験の代表的な結果を示す。【０１０９】
図３（ａ）〜図３（ｄ）には、骨髄由来の好塩基球による抗原提示の結果を示した。ＤＯ１１．１０マウスからのナイーブ脾臓ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞（１×１０５個／ｍＬ）を、照射したＴ細胞枯渇ＢＡＬＢ／ｃ脾細胞（ΔＴ脾臓）（５×１０５個／ｍＬ）、照射された、骨髄由来の精製好塩基球（ＷＴ；野生型マウス、Ｇ４／Ｇ４；ＩＬ−４欠損マウス）、肥満細胞または脾臓ＤＣの存在下で、４８ウェルプレートにて総容量１ｍＬの培地中で７日間刺激した（Ｔｈ０条件）。刺激には、ＩＬ−２（１００ｐＭ）、ＩＬ−３（２０Ｕ／ｍＬ）およびＯＶＡ３２３−３３９（１μＭ）（図３（ａ）および図３（ｂ））、ＤＮＰ−ＯＶＡ（１００μｇ／ｍＬ）（図３（ｃ））、ならびに抗ＤＮＰ  ＩｇＥ  ｍＡｂ（１０μｇ／ｍＬ）の存在下または非存在下でのＤＮＰ−ＯＶＡ（６．２５〜１００μｇ／ｍＬ）（図３（ｄ））を用いた。Ｔｈ２細胞の誘導のために、ＩＬ−４（１０００Ｕ／ｍＬ）を培養物にさらに添加した（Ｔｈ２条件）。プライム開始後に、細胞を洗浄し、ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍＬ）およびイオノマイシン（５００ｎｇ／ｍＬ）とともに４時間再度培養し、細胞質内のＩＬ−４およびＩＦＮ−γの発現をＦＡＣＳによって解析した。ＣＤ４＋Ｔ細胞について、ＩＬ−４＋細胞またはＩＦＮ−γ＋細胞の割合を数字で示した。３回の独立した実験の代表的な結果を示す。【０１１０】
図４（ａ）〜図４（ｉ）には、好塩基球に誘導された、インビボでの抗原特異的Ｔｈ２応答を示した。図４（ａ）〜図４（ｄ）について、骨髄由来の、ＦＡＣＳソートされた好塩基球または肥満細胞（各５×１０５個／ｍＬ）を、ＩＬ−３（２０Ｕ／ｍＬ）、ＤＮＰ−ＯＶＡ（１００μｇ／ｍＬ）および抗ＤＮＰ  ＩｇＥ  ｍＡｂ（１０μｇ／ｍＬ）とともに、４８ウェルプレート中にて１６時間培養した。プライム後に、好塩基球または肥満細胞を、各２．５×１０５個／マウスで、ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたり５匹）に尾静脈を介して移した。移入の４日後（図４（ａ））または１週間後（図４（ｂ）〜図４（ｄ））のマウスを、ＯＶＡタンパク質（１００μｇ／マウス）で静脈内にチャレンジした。コントロールマウスに、ＯＶＡタンパク質（１００μｇ）のみを注入した。チャレンジ（０日目）の後、血清を回収し、ＯＶＡ特異的ＩｇＥ抗体およびＩｇＧ１抗体を、ＥＬＩＳＡによって決定した（図４（ｂ））。チャレンジの２日後（図４（ａ））または２週間後（図４（ｃ））に、各マウスからの脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞（２×１０５個／０．２ｍＬウェル）を、照射したΔＴ脾臓（２×１０５個／０．２ｍＬウェル）の存在下にて、９６ウェルプレート中にてＯＶＡタンパク質（１００μｇ／ｍＬ）で再度刺激した。【０１１１】
図４（ｅ）〜図４（ｇ）について、ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたり５匹）に、ＯＶＡ−ＤＮＰおよび抗ＤＮＰ  ＩｇＥ抗体の混合物（免疫複合体Ｉ．Ｃ）を、図中に示した濃度で注入した。好塩基球の枯渇のために、マウスに５μｇの抗ＦｃεＲ１α（ＭＡＲ−１）を１日２回で３日連続して、Ｉ．Ｃ投与の前後に腹腔内に投与した。Ｉ．Ｃ投与の４日後に、各マウスからの脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞（２×１０５個／０．２ｍＬウェル）を、照射したΔＴ脾臓（２×１０５個／０．２ｍＬウェル）の存在下にて、ＯＶＡタンパク質（１００μｇ／ｍＬ）で再度刺激した。インビトロ刺激の５日後に、上清を回収し、ＩＬ−４、ＩＬ−１３およびＩＦＮ−γの産生をＥＬＩＳＡによって試験した（図４（ａ）、図４（ｃ）、図４（ｆ）、図４（ｇ））。結果は、１群あたり５匹の平均＋ＳＥＭであり、２つの独立した実験の代表例を示す。【０１１２】
図４（ａ）において、＊＊は、肥満細胞を移しＯＶＡを注入したマウスと比較したスチューデントｔ検定での結果がＰ＜０．０００１であることを示す。図４（ｂ）〜図４（ｄ）において、＊はＰ＜０．０１であり、†はＰ＜０．０５であり、‡はＰ＜０．００５であることを示す（いずれもＯＶＡのみを注入したコントロール群と比較した）。図４（ｂ）において、好塩基球を枯渇させた群と比較したスチューデントｔ検定での結果として、＊はＰ＝０．１９１であり、†はＰ＜０．００５であることを示す。【０１１３】
図４（ｈ）〜図４（ｉ）について、ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群あたり５匹）に、ＯＶＡ−ＤＮＰおよび抗ＤＮＰ  ＩｇＥ抗体の混合物（Ｉ．Ｃ）を図中に示した用量で注入した。Ｉ．Ｃ投与の４日後のマウスを、ＯＶＡタンパク質（１００μｇ／マウス）で静脈内にチャレンジし、血清を回収し、ＯＶＡ特異的ＩｇＥ抗体およびＩｇＧ１抗体をＥＬＩＳＡによって決定した。好塩基球の数の枯渇または増加のために、マウスに、抗ＦｃεＲ１α（ＭＡＲ−１）またはＩＬ−３を注入した。コントロール群と比較したスチューデントｔ検定の結果として、＊はＰ＜０．００１であり、†はＰ＜０．０５であることを示す。【０１１４】
図５には、好塩基球によって駆動されたＴｈ２細胞からのサイトカイン産生を示した。ＤＯ１１．１０からのナイーブＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞（１×１０５個／ｍＬ）を、５×１０５個／ｍＬの、照射したＴ細胞枯渇ＢＡＬＢ／ｃ脾細胞（ΔＴ脾臓）、または照射した、S. venezuelensis感染マウスからの脾臓好塩基球（寄生虫誘導性好塩基球）（ＩＬ−４なし（Ｔｈ０条件））の存在下にて、ＩＬ−２（１００ｐＭ）、ＩＬ−３（２０Ｕ／ｍＬ）およびＯＶＡ３２３−３３９（１μＭ）で、４８ウェルプレート中にて７日間刺激した。プライム開始後に、ＣＤ４＋Ｔ細胞（１×１０５個／０．２ｍＬウェル）を、照射したＴ細胞枯渇ＢＡＬＢ／ｃ脾細胞（１×１０５個）の存在下で、ＩＬ−３３（１００ｎｇ／ｍＬ）ありまたはなしで、９６ウェルプレート中にてＩＬ−２（１００ｐＭ）、ＯＶＡ３２３−３３９（１μＭ）で４８時間再度刺激した。上清を回収し、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘシステムによってサイトカイン産生を試験した。３回の独立した実験の代表的な結果を示す。【０１１５】
図６（ａ）〜図６（ｄ）には、マウス骨髄由来好塩基球およびヒト末梢血好塩基球の精製および免疫学的試験の結果を示した。図６（ａ）には、ＢＡＬＢ／ｃマウスからの骨髄細胞をＩＬ−３（１０Ｕ／ｍＬ）とともに１０日間培養し、ＦｃεＲ１およびｃ−ｋｉｔの発現について、フローサイトメトリーで解析し、次いで、ＦＡＣＳ  ＡｒｉａによってＦｃεＲ１＋／ｃ−ｋｉｔ−（好塩基球）の細胞集団とＦｃεＲ１＋／ｃ−ｋｉｔ＋（肥満細胞）の細胞集団とにソートした結果を示した。選別された集団における細胞のパーセントを示した。【０１１６】
図６（ｂ）には、ソートしたＦｃεＲ１＋／ｃ−ｋｉｔ−（好塩基球）およびＦｃεＲ１＋／ｃ−ｋｉｔ＋（肥満細胞）の細胞集団を、電子顕微鏡観察した結果を示した。スケールバーは１μｍである。【０１１７】
図６（ｃ）は、陰性選別によって濃縮したヒト末梢血単核細胞（ＣＤ３−、ＣＤ７−、ＣＤ１４−、ＣＤ１５−、ＣＤ１６−、ＣＤ１９−、ＣＤ３６−、ＣＤ４５ＲＡ−およびＣＤ２３５ａ−）の、ＨＬＡ−ＤＲとＣＤ２０３ｃの発現を選別後すぐに測定した結果（左）と、ヒトＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍＬ）存在下で２４時間培養した後のＨＬＡ−ＤＲとＣＤ２０３ｃの発現を測定した結果（右）である。ＣＤ２０３ｃ＋細胞に対するＨＬＡ−ＤＲ＋細胞の細胞集団のパーセントを示す。【０１１８】
図６（ｄ）には、ソートしたＣＤ２０３ｃ＋／ＨＬＡ−ＤＲ＋細胞集団の、ギムザ染色（左；１００×）、電子顕微鏡観察（右）の結果を示した。スケールバーは１μｍである。【０１１９】
図７には、好酸球誘導性の抗原特異的Ｔ細胞増殖を示した。ＤＯ１１．１０マウスからのナイーブ脾臓ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞（５×１０４個／ｍＬ）を、ＩＬ−２（１００ｐＭ）、ＩＬ−３（２０Ｕ／ｍＬ）およびＯＶＡ３２３−３３９（１μＭ）、あるいは抗ＤＮＰ  ＩｇＥ  ｍＡｂ（１０μｇ／ｍＬ）の存在下または非存在下でのＤＮＰ−ＯＶＡ（６．２５〜１００μｇ／ｍＬ）で、照射したΔＴ脾臓または精製した好塩基球（２．５×１０５個／ｍＬ）の存在下で、９６ウェルプレートにて４日間刺激した。１μＣｉの［３Ｈ］を添加することによって、最終１６時間の間のＤＮＡ合成を測定した。【０１２０】
図８（ａ）〜図８（ｄ）には、骨髄由来の好塩基球および肥満細胞からのＴｈ２サイトカイン産生を示した。図８（ａ）には、ＤＯ１１．１０マウスからのナイーブ脾臓ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞（１×１０５個／ｍＬ）を、ＯＶＡ３２３−３３９（１μＭ）、あるいは抗ＤＮＰ  ＩｇＥ  ｍＡｂ（１０μｇ／ｍＬ）の存在下または非存在下でのＤＮＰ−ＯＶＡ（１００μｇ／ｍＬ）で、照射したΔＴ脾臓または精製した好塩基球（５×１０５個／ｍＬ）の存在下で、４８ウェルプレートにて２４時間刺激した結果を示した。【０１２１】
図８（ｂ）には、骨髄由来の、ＦＡＣＳソートした好塩基球または肥満細胞（各１×１０５個／０．２ｍＬウェル）を、ＩＬ−３（２０Ｕ／ｍＬ）、あるいは抗ＤＮＰ  ＩｇＥ  ｍＡｂ（１０μｇ／ｍＬ）の存在下または非存在下でのＤＮＰ−ＯＶＡ（１００μｇ／ｍＬ）で、９６ウェルプレート中にて１６時間再度刺激し、上清を回収し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−４またはＩＬ−１３の産生を試験した結果を、平均＋ＳＥＭで示した。５回の独立した実験の代表例を示す。ｎｄは検出し得なかったことを示す。【０１２２】
図８（ｃ）には、骨髄由来の、ＦＡＣＳソートした好塩基球または肥満細胞から抽出したｍＲＮＡを、ＴＬＲ遺伝子およびβアクチンの発現についてＲＴ−ＰＣＲによって解析した結果を示した。ＴＬＲ  ｍＲＮＡについてのポジティブコントロール（ｐｏｓｉ．）として、マウス脾臓細胞から抽出したｍＲＮＡを使用した。【０１２３】
図８（ｄ）には、骨髄由来の、ＦＡＣＳソートした好塩基球または肥満細胞（各１×１０５個／０．２ｍＬウェルを、ＩＬ−３（２０Ｕ／ｍＬ）、およびＩＬ−１８（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−３３（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）またはＰＧＮ（１０μｇ／ｍＬ）で、それぞれ９６ウェルプレート中にて２４時間再度刺激し、上清を回収し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−４、ＩＬ−６またはＩＬ−１３の産生を試験した結果を、平均＋ＳＥＭで示した。５回の独立した実験の代表例を示す。【０１２４】
図９（ａ）〜図９（ｅ）には、抗ＦｃεＲ１αを有する好塩基球の枯渇を示した。図９（ａ）〜図９（ｄ）について、５μｇの抗マウスＦｃε１α（ＭＡＲ−１（＋））またはＰＢＳ（ＭＡＲ−１（−））を１日２回で３日間腹腔内投与されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、好塩基球（ＦｃεＲ１＋／ｃ−ｋｉｔ−細胞またはＦｃεＲ１＋／ＤＸ５＋細胞）のフローサイトメトリーおよび頻度を示す。最終投与の２日後に、好塩基球の数を定量した（図９（ａ）：脾臓、図９（ｂ）：肝臓）。次いで、マウスにＤＮＰ−ＯＶＡおよび抗ＤＮＰ  ＩｇＥの混合物を１日２回でさらなる３日間、ＭＡＲ−１またはＰＢＳとともに注入した。ＯＶＡでの腹腔内チャレンジの後、Ｉ．Ｃ投与の４日後に、マウスを、週に連続５日間で２週間にわたって、ＭＡＲ−１またはＰＢＳでさらに処理した。ＯＶＡチャレンジの１週間または２週間の後、血液（図９（ｃ））または脾臓（図９（ｄ））における好塩基球の数を定量した。【０１２５】
図９（ｅ）には、ＩＬ−３（０〜１０μｇ／体重／２週間）を浸透圧ポンプを用いて注入したＢＡＬＢ／ｃマウスからの好塩基球（ＦｃεＲ１＋／ＤＸ５＋細胞）の頻度についての、代表的な実験データを示した。５回の独立した実験の代表例を示す。脾臓の非Ｂ非Ｔ細胞に対するＦｃεＲ１＋／ｃ−ｋｉｔ−細胞またはＦｃεＲ１＋／ＤＸ５＋細胞の割合をパーセントで示す。【０１２６】
図１０には、抗原でパルスされた好塩基球によるインビボでのＴｈ２／ＩｇＥ誘導の概略図を示した。抗原Ａ（例えば、ＯＶＡ）を正常な動物に投与すると、先ず、抗原Ａが好塩基球に取り込まれる（図中１）。ＯＶＡでパルスされた好塩基球が末梢リンパ器官（例えば、脾臓）に循環され、そこでＯＶＡ特異的ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞に対してＩＬ−４刺激と抗原ペプチド／ＭＨＣクラスＩＩ刺激とを与える。次いで、ＤＣからの補助作用を必要とすることなく、好塩基球からの抗原刺激およびＩＬ−４刺激のみによって、ＯＶＡ特異的ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞はＴｈ２細胞に分化する（すなわち、好塩基球依存性のＴｈ２細胞誘導フェーズ；図中２）。同時に、生体に投与されたＯＶＡもまた末梢リンパ器官に循環されている。ここで、ＯＶＡがＯＶＡ特異的Ｂ細胞の抗原受容体に結合する。ＯＶＡでパルスされたＢ細胞はＯＶＡ特異的Ｔｈ２細胞を刺激するので、刺激されたＴｈ２細胞はＣＤ４０リガンドおよびＩＬ−４を産生する。産生されたＣＤ４０リガンドおよびＩＬ−４は、ＯＶＡでパルスされたＢ細胞を刺激してＯＶＡ特異的ＩｇＥ産生を誘導する（すなわち、Ｔｈ２依存型のＢ細胞活性化フェーズ；図中３）。一旦、ＯＶＡ特異的ＩｇＥが産生されると、ＯＶＡと抗ＯＶＡ特異的ＩｇＥ抗体とによって構成されるＩｇＥ免疫複合体が好塩基球上のＦｃεＲ１に結合する（すなわち、好塩基球がＩｇＥに感作される；図中４）。感作された好塩基球の刺激によって、メモリーＴｈ２細胞は刺激されて増殖する（図中５）。さらに、ＯＶＡで刺激されたメモリーＢ細胞は、メモリーＴｈ２細胞の刺激を受けて、ＯＶＡに対する結合親和性が高いＩｇＥ抗体を産生する（図中６）。
【産業上の利用可能性】
【０１２７】
本発明は、これまで不明であったＴｈ２型免疫応答、特に初期ＩＬ−４産生の作用メカニズムを明らかにしたので、Ｔｈ２型疾患に対する新規治療薬・治療方法の開発などに好適に用いることができる。すなわち、本発明は、医療分野、医薬品分野をはじめ、幅広い分野に利用可能である。
【図１（ａ）】
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【図１（ｂ）】
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【図１（ｃ）】
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【図１（ｄ）】
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【図２（ａ）】
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【図２（ｂ）】
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【図２（ｃ）】
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【図３（ａ）】
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【図３（ｂ）】
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【図３（ｃ）】
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【図３（ｄ）】
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【図４（ａ）】
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【図４（ｂ）】
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【図４（ｃ）】
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【図４（ｄ）】
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【図４（ｅ）】
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【図４（ｆ）】
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【図４（ｇ）】
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【図４（ｈ）】
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【図４（ｉ）】
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【図５】
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【図６（ａ）】
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【図６（ｃ）】
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【図７】
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【図８（ａ）】
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【図８（ｂ）】
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【図８（ｃ）】
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【図８（ｄ）】
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【図９（ａ）】
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【図９（ｂ）】
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【図９（ｃ）】
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【図９（ｄ）】
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【図９（ｅ）】
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【図１０】
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【図６（ｂ）】
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【図６（ｄ）】
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