(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セロトニンを含む試料を第一の前処理カラムに吸着させる工程、
前記第一の前処理カラムに吸着したセロトニンを溶出させ第二の前処理カラムに吸着させる工程、
前記第二の前処理カラムに吸着したセロトニンを溶出させる工程、
溶出したセロトニンを分離カラムに導入し分離する工程、および
分離したセロトニンを検出する工程、
からなるセロトニンの測定方法において、
前記第一の前処理カラムがゲル濾過カラムからなり、前記第二の前処理カラムがイオン交換カラムからなる、前記測定方法。
【請求項２】
イオン交換カラムが陽イオン交換カラムである、請求項１に記載の測定方法。
【請求項３】
セロトニンを含む試料を吸着するゲル濾過カラムからなる第一の前処理カラムと、
前記第一の前処理カラムから導入されたセロトニンを吸着するイオン交換カラムからなる第二の前処理カラムと、
前記第二の前処理カラムから導入されたセロトニンを分離する分離カラムと、
セロトニンを含む試料を導入するための試料注入手段と、
前記第一または第二の前処理カラムにセロトニンを吸着させる溶離液が流れる流路と前記第一または第二の前処理カラムとを接続可能で、セロトニンを溶出させる溶離液が流れる流路と前記第二の前処理カラムまたは前記分離カラムとを接続可能な流路切り替え手段と、
前記分離カラムで分離したセロトニンを検出する手段と、
を備えたセロトニンの測定装置。
【請求項４】
セロトニンを含む試料を吸着するゲル濾過カラムからなる第一の前処理カラムと、
前記第一の前処理カラムから導入されたセロトニンを吸着するイオン交換カラムからなる第二の前処理カラムと、
前記第二の前処理カラムから導入されたセロトニンを分離する分離カラムと、
セロトニンを含む試料を導入するための試料注入手段と、
前記第一または第二の前処理カラムにセロトニンを吸着させる溶離液が流れる流路と、前記第一の前処理カラムまたは前記第二の前処理カラムとを接続可能な第一の流路切り替え手段と、
前記第一の前処理カラムと前記第二の前処理カラムとを接続可能な第二の流路切り替え手段と、
前記第二の前処理カラムと、前記第一の前処理カラムまたは前記分離カラムとを接続可能な第三の流路切り替え手段と、
前記分離カラムで分離したセロトニンを蛍光誘導体化するための試薬と、
前記試薬と前記分離したセロトニンとを反応させるための手段と、
蛍光誘導体化したセロトニンを検出するための蛍光検出器と、
を備えたセロトニンの測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中のセロトニンの測定方法および前記方法を利用した装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
セロトニンは、神経伝達物質および消化管の蠕動運動に関連した物質として知られている。また、セロトニンは血小板に含まれており、血液凝固に関連した物質として体内で重要な働きを担っている。
【０００３】
生体液などの試料中に含まれるセロトニン量の測定は、その量が微量であり、また夾雑物の含有量が多い。そのため当業者の多くは通常、試料の前処理方法として、あらかじめセロトニン以外の物質を除去してから、分離カラムに供して試料中に含まれるセロトニンを分離するカラムスイッチング法を採用している。また、分離カラムで分離した試料中のセロトニンの検出には、ポストカラム蛍光検出、プレカラム蛍光検出、ポストカラム発光検出、電気化学検出を採用することで特異性および感度の高い測定系を実現している。これまで公知となっている代表的な測定方法を下記に示す。
【０００４】
特許文献１：セロトニン標準品を測定試料として検討している。逆相カラムで分離後、アミノメチルフタルヒドラジドと反応させ誘導体化し、発光検出する（ポストカラム発光検出）。
【０００５】
特許文献２：ラットの脳内透析液を測定試料として検討している。ベンジルアミンにより、試料中のセロトニンを蛍光誘導体化させてから（プレカラム蛍光検出）、逆相カラムにより分離後、セロトニンの蛍光誘導体を蛍光検出する。
【０００６】
特許文献３：血漿および尿を測定試料として検討している。逆相カラムを用いた自動前処理（カラムスイッチング）を採用し、分離カラムとして逆相カラムを用いて、試料中のセロトニンを分離している。検出方法は、ベンジルアミンを用いたポストカラム蛍光検出により実施している。
【０００７】
非特許文献１：血清および血漿を測定試料として検討している。過塩素酸による前処理を実施し、逆相カラムを用いた自動前処理（カラムスイッチング）を採用し、分離カラムとして逆相カラムを用いて、試料中のセロトニンを分離後、セロトニン分子のもつ自然蛍光により蛍光検出する。
【０００８】
非特許文献２：尿を測定試料として検討している。逆相カラムを用いた自動前処理（カラムスイッチング）を採用し、分離カラムとして逆相カラムを用いて、試料中のセロトニンを分離している。電気化学検出器により検出する。
【０００９】
非特許文献３：乏血小板血漿を測定試料として検討している。ジメトキシベンジルアミン、ベンジルアミンなどにより、試料中のセロトニンを蛍光誘導体化させてから（プレカラム蛍光検出）、逆相カラムにより分離後、セロトニンの蛍光誘導体を蛍光検出する。
【００１０】
非特許文献４：尿を測定試料として検討している。逆相カラムを用いた自動前処理（カラムスイッチング）を採用し、分離カラムとして逆相カラムを用いて、試料中のセロトニンを分離している。検出方法は、ジフェニルエチレンジアミンを用いたポストカラム蛍光検出を採用している。
【００１１】
前記セロトニン測定方法のうち、自然蛍光検出（非特許文献１）や電気化学検出（非特許文献２）による測定方法は、特異性が十分でない。よって、患者由来の血漿や尿といった種々の薬物が含まれた試料に対し前記検出系を採用した場合、精度の良い測定が困難、という問題がある。プレカラム蛍光検出（特許文献２、非特許文献３）も、試料が前記種々の薬物が含まれた試料の場合、前記薬物が蛍光誘導体化反応を妨害する可能性があり、その場合精度が低下する問題点がある。また、ポストカラム発光検出（特許文献１）は、発光検出試薬が高価であるため、多くの検体を測定するには不向きである。
【００１２】
以上より、試料中の不純物質を除去する工程、さらに分離カラムで分離する工程、不純物質が含まれない試料中のセロトニンをベンジルアミンなどの安価な試薬と反応させる工程、蛍光誘導体化し蛍光検出（ポストカラム蛍光検出）する工程、からなるカラムスイッチング法が、患者由来の血漿や尿といった種々の薬物が含まれた試料の分析には好ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】特開平９−００５３１６号公報
【特許文献２】特開平１１−０５１９３４号公報
【特許文献３】特開２００１−０５６３２６号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｐｅｔｅｒ  Ｎｅｂｉｎｇｅｒら、Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、４２７、３２６（１９８８）
【非特許文献２】Ｍａｒｌｉｅｓ  Ｋｏｅｌら、Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、４９５、２６３（１９８９）
【非特許文献３】Ｊｕｎｉｃｈｉ  Ｉｓｈｉｄａら、Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ、６９２、３１（１９９７）
【非特許文献４】Ｔｏｒｓｔｅｎ  Ｊら、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ、４５、２６２（１９９９）
【非特許文献５】Ｙ  Ｈｉｒｏｗａｔａｒｉら、Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、３７、１９１（２００４）
【非特許文献６】Ｈｉｔｏｓｈｉ  Ｎｏｈｔａら、Ａｎａｌｙｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、３４４、２３３（１９９７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明者は以前より、前処理カラムおよび分離カラムとして、オクタデシル基を有したシリカ系のゲルを充填したカラムを用いて試料中に含まれるセロトニンを分離した後、ベンジルアミンを用いたポストカラム蛍光検出により、乏血小板血漿中セロトニンを測定する方法を構築し、検討を進めてきた（特許文献３、非特許文献５）。
【００１６】
しかしながら一部の試料で、試料中に含まれる不純物の影響で測定不能となる現象が確認された。一般に血液中のセロトニンは、その大部分が５−ヒドロキシインドール酢酸に代謝され、尿中に排泄される。しかしながら、腎臓障害を持つ患者では、５−ヒドロキシインドール酢酸の排泄が効率よく実施されない。よって、当該患者では５−ヒドロキシインドール酢酸の血中濃度が高まり、５−ヒドロキシインドール酢酸に由来するセロトニンに類似した分解産物が増加するため、セロトニンの測定を妨害するのではないかと推測された。
【００１７】
そこで本発明は、前記試料も含めた、あらゆる試料中に含まれるセロトニンを精度よく測定する方法を提供することが課題である。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
上記課題を鑑みてなされた本発明は、以下の発明を包含する。
【００１９】
第一の発明は、
セロトニンを含む試料を前処理カラムに吸着させる工程、
前記前処理カラムに吸着したセロトニンを溶出させる工程、
溶出したセロトニンを分離カラムに導入し分離する工程、および
分離したセロトニンを検出する工程、
からなるセロトニンの測定方法において、
前記前処理カラムがゲル濾過カラムおよびイオン交換カラムからなる、前記測定方法である。
【００２０】
第二の発明は、イオン交換カラムが陽イオン交換カラムである、第一の発明に記載の測定方法である。
【００２１】
第三の発明は、
セロトニンを含む試料を吸着するゲル濾過カラムおよびイオン交換カラムからなる前処理カラムと、
前記前処理カラムから導入されたセロトニンを分離する分離カラムと、
セロトニンを含む試料を導入するための試料注入手段と、
前記前処理カラムに吸着させる溶離液が流れる流路と前記前処理カラムとを接続可能で、前記セロトニンを溶出させる溶離液が流れる流路と前記前処理カラムまたは前記分離カラムとを接続可能な流路切り替え手段と、
前記分離カラムで分離したセロトニンを検出する手段と、
を備えたセロトニンの測定装置である。
【００２２】
第四の発明は、
セロトニンを含む試料を吸着するゲル濾過カラムからなる第一の前処理カラムと、
セロトニンを含む試料を吸着するイオン交換カラムからなる第二の前処理カラムと、
前記前処理カラムから導入されたセロトニンを分離する分離カラムと、
セロトニンを含む試料を導入するための試料注入手段と、
前記前処理カラムに吸着させる溶離液が流れる流路と、前記第一の前処理カラムまたは前記第二の前処理カラムとを接続可能な第一の流路切り替え手段と、
前記第一の前処理カラムと前記第二の前処理カラムとを接続可能な第二の流路切り替え手段と、
前記第二の前処理カラムと、前記第一の前処理カラムまたは前記分離カラムとを接続可能な第三の流路切り替え手段と、
前記分離カラムで分離したセロトニンを蛍光誘導体化するための試薬と、
前記試薬と前記分離したセロトニンとを反応させるための手段と、
蛍光誘導体化したセロトニンを検出するための蛍光検出器と、
を備えたセロトニンの測定装置である。
【００２３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２４】
試料中に含まれるセロトニンは、
セロトニンを含む試料を前処理カラムに吸着させる工程、
前処理カラムに吸着したセロトニンを溶出させる工程、
溶出したセロトニンを分離カラムに導入し分離する工程、および
分離したセロトニンを検出する工程、
により測定することができる。従来の測定方法では、前記前処理カラムとして１本の逆相カラムを、前記分離カラムとして１本の逆相カラムをそれぞれ用いていた（非特許文献１、２、４および５、ならびに特許文献３）。また、分離したセロトニンを分離する工程では、自然蛍光による蛍光検出（非特許文献１）、電気化学検出（非特許文献２）、ジフェニルエチレンジアミンを用いたポストカラム蛍光検出（非特許文献４）、ベンジルアミンを用いたポストカラム蛍光検出（特許文献３、非特許文献５）など、種々の方法を用いている。
【００２５】
本発明の測定方法では、前記前処理カラムとしてゲル濾過カラムとイオン交換カラムの２種類のカラムを用いることを特徴としている。２種類の前処理カラムを用いることにより、薬物投与を受けている患者検体といった、一般的な試料と比較してセロトニン以外の不純物の種類や量が多い試料であっても、前記不純物を除去することが可能となり、結果として試料中に含まれるセロトニン量を精度よく測定することができる。
【００２６】
本発明の測定方法で使用する前処理カラムのうち、ゲル濾過カラムは、血清や尿といった不純物を多く含んだ試料が流れることから、耐久性に優れたポリマー系の基材からなるカラムが好ましい。特に好ましいゲル濾過カラムは、デキストランによる排除限界分子量が２０万程度の交換基を有しないポリマー系の基材を充填したカラムであり、一例としてＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＰＷ（東ソー製）があげられる。
【００２７】
本発明の測定方法で使用する前処理カラムのうち、イオン交換カラムは、シリカ系またはポリマー系の基材にイオン交換基を導入したゲルからなるカラムであればよいが、陽イオン交換基を導入したゲルからなるカラムが、本発明で使用する前処理カラムとして好ましい。陽イオン交換基としては、スルホプロピル基、スルホン基、カルボキシルメチル基が例示できる。特に好ましいイオン交換カラムは、デキストランによる排除限界分子量が１０万程度のシリカ系の基材にスルホプロピル基を導入したゲルを充填したカラムであり、一例としてＴＳＫｇｅｌ  ＳＰ−２ＳＷ（東ソ−製）があげられる。
【００２８】
なお、前記２種類の前処理カラムの順番に特に限定はないものの、カラムの耐久性が高いゲル濾過カラムを１番目の前処理カラムとして用いたほうが好ましい。
【００２９】
本発明の測定方法では、セロトニンを含む試料を、ゲル濾過カラムおよびイオン交換カラムからなる前処理カラムに吸着後、セロトニンを溶出させる溶離液により、前記前処理カラムに吸着したセロトニンを溶出し、分離カラムに導入させるが、前記工程をカラムスイッチングシステム（自動的に液体クロマトグラフィーの流路を変更できるバルブにより自動的に前処理工程が実施されるシステム）を用いて実施すると、前記工程が効率的に行なえる点で好ましい。
【００３０】
本発明の測定方法で使用する分離カラムは、逆相カラムまたはイオン交換カラムの中から適宜選択することが可能であるが、分離カラムで分離する試料が、前処理カラムに吸着後溶出したセロトニンであることを考慮すると、分離能力すなわち理論段数の高いカラムを用いるのが好ましい。一般的に、逆相カラムはイオン交換カラムより理論段数が高いことから、逆相カラムを分離カラムとして用いたほうが好ましいといえる。逆相カラムとしては、シリカ系またはポリマー系の基材にオクタデシル基、オクチル基またはフェニル基を導入したゲルからなるカラムをあげることができる。特に好ましい分離カラムは、ゲルの孔径が８ｎｍ程度のシリカ系のゲルにオクタデシル基を導入したものを充填したカラムであり、一例としてＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ（東ソー製）があげられる。
【００３１】
本発明の測定方法のうち、分離したセロトニンを検出する工程は、前述した、自然蛍光による蛍光検出（非特許文献１）、電気化学検出（非特許文献２）、ポストカラム蛍光検出（非特許文献４）、ポストカラム蛍光検出（特許文献３、非特許文献５）などの公知の検出方法を用いればよいが、特に安価で精度良くセロトニン検出が可能なポストカラム蛍光検出が好ましい。ポストカラム蛍光検出を用いたセロトニン検出工程の一態様として、分離カラムより分離したセロトニンを含む溶離液に、セロトニンを蛍光誘導体化させるための試薬をオンラインで混合後、配管中に流しつつ反応させ、反応液中のセロトニン由来の蛍光誘導体を蛍光検出器で検出する態様が例示できる。前記蛍光誘導体化させるための試薬としては、セロトニンと特異性の高い反応性を示す芳香族グリシノニトリルや芳香族メチルアミンを例示できる（非特許文献６）。特にベンジルアミンはセロトニン検出において、特異性および感度を十分示し、かつ試薬のコストも安価であることから、前記蛍光誘導体化させるための試薬として好ましい。
【００３２】
本発明のセロトニン測定装置は、
セロトニンを含む試料を吸着するゲル濾過カラムおよびイオン交換カラムからなる前処理カラムと、
前記前処理カラムから導入されたセロトニンを分離する分離カラムと、
セロトニンを含む試料を導入するための試料注入手段と、
前記前処理カラムに吸着させる溶離液が流れる流路と前記前処理カラムとを接続可能で、前記セロトニンを溶出させる溶離液が流れる流路と前記前処理カラムまたは前記分離カラムとを接続可能な流路切り替え手段と、
前記分離カラムで分離したセロトニンを検出する手段と、
を備えていることを特徴としている。前記２種類の前処理カラムは、直列した流路上に配置されており、試料注入手段により注入されたセロトニンを含む試料は、前記２種類の前処理カラムにより前処理が実施され、前処理された試料は分離カラムでセロトニンが分離される。前記分離カラムで分離したセロトニンを検出する手段としては、蛍光検出器、電気化学検出器が例示できるが、好ましくは、セロトニンを特異的に検出できる、セロトニンを誘導体化するための試薬と、前記試薬とセロトニンとを反応させるための手段と、誘導体化したセロトニンを検出する手段と、を備えた手段である。
【００３３】
本発明の装置において、前記前処理カラムに吸着させる溶離液が流れる流路と前記前処理カラムとを接続可能で、前記セロトニンを溶出させる溶離液が流れる流路と前記前処理カラムまたは前記分離カラムとを接続可能な流路切り替え手段を用いた流路切り替え操作（カラムスイッチング操作）は手動で行なってもよいが、コンピューター制御により自動的に指定した時間に流路が切り替えられる流路切り替えバルブを用いて行なうのが好ましい。なお、前記流路切り替え手段としては、通常用いられる六方バルブが例示できる。また、本発明のセロトニン測定装置に、溶離液の種類を切り替えるための手段、溶離液中に溶存する気体成分を除去する脱気手段などをさらに備えると好ましく、かつ測定装置の各構成がコンピューターにより自動制御可能な装置であると、より好ましい。
【００３４】
本発明の測定装置の一態様を図２に示す。図２の装置は、
ゲル濾過カラムからなる前処理カラム８１と、
陽イオン交換カラムからなる前処理カラム８２と、
前処理カラム８２から導入されたセロトニンを分離する分離カラム８３と、
前処理カラム８１と８２にセロトニンを吸着させるための溶離液１１と、
セロトニンを分離カラム８３で分離するための溶離液１３と、
前処理カラム８１と８２、および分離カラム８３を洗浄するための溶離液１２と、
セロトニンを蛍光誘導体化するための試薬２１と２２と、
溶離液を切り換える３方電磁弁４１と４２と、
溶液または反応液を送液するポンプ５１から５４と、
溶離液１１から１３ならびに反応液２１と２２を脱気するための脱気装置３０と、
測定試料を注入するための試料注入装置（オートサンプラー）６０と、
溶離液１１が流れる流路と、前処理カラム８１または前処理カラム８２とを接続可能な流路切り替え手段７１と、
前処理カラム８１と前処理カラム８２とを接続可能な流路切り替え手段７２と、
前処理カラム８２と、前処理カラム８１または分離カラム８３とを接続可能な流路切り替え手段７３と、
分離カラム８３で分離したセロトニンと試薬２１と２２とを反応させるための反応器（反応オーブン）９０と、
蛍光誘導体化したセロトニンを検出するための蛍光検出器１００と、
を備えている。本発明の測定装置を用いたセロトニン測定操作を以下に示す。
（１）セロトニンを含む測定試料を試料注入装置（オートサンプラー）６０により測定装置に注入する。
（２）注入された試料はポンプ５１により前処理カラム８１に導入される。このとき、流路切り換えバルブ７１（六方バルブ）はＯＦＦの状態であり、流路切り替えバルブ７２（六方バルブ）はＯＮの状態であり、前処理カラム８１に吸着しない親水性物質は廃棄される。
（３）前処理カラム８１から溶出されるセロトニンは流路切り換えバルブ７２（六方バルブ）をＯＮからＯＦＦにすることで流路を切り替え、前処理カラム８２に導入される。このとき、流路切り換えバルブ７３（六方バルブ）はＯＦＦの状態であり、前処理カラム８２に吸着しないアニオン性物質は廃棄される。
（４）流路切り換えバルブ７３（六方バルブ）をＯＦＦからＯＮにすることで流路を切り替え、溶離液１３により前処理カラム８２に吸着していたセロトニンを溶出させる。
（５）（４）で溶出したセロトニン成分が分離カラム８３に導入され、セロトニンを分離する。
（６）分離カラム８３で分離されたセロトニンはポンプ５３と５４で送液される試薬２１と２２と混合後、反応器（反応オーブン）９０に導入し、蛍光誘導体化される。
（７）蛍光誘導体化されたセロトニンを蛍光検出器１００で検出する。
【００３５】
なお、１回の測定が終了するごとに、溶離液を切り換える３方電磁弁４１と４２を用いて、前処理カラム８１と８２、および分離カラム８３に、一定時間溶離液１２を流すことでカラムを洗浄している。なお、図２において前処理カラムは、陽イオン交換カラムを前処理カラム８１に、ゲル濾過カラムを前処理カラム８２にしてもよい。また、溶液および誘導体化試薬２１と２２の流量、反応オーブン９０の温度、流路切り換えバルブ（六方バルブ）７１から７３ならびに３方電磁弁４１と４２の制御、検出ピークの定量などをマイクロコンピュータにより自動制御することにより、自動的に信頼性の高い分析結果を得ることが可能である。
【発明の効果】
【００３６】
本発明のセロトニン測定方法は、
セロトニンを含む試料を前処理カラムに吸着させる工程、
前記前処理カラムに吸着したセロトニンを溶出させる工程、
溶出したセロトニンを分離カラムに導入し分離する工程、および
分離したセロトニンを検出する工程、
からなるセロトニンの測定方法において、
前記前処理カラムとして、ゲル濾過カラムおよびイオン交換カラムの２種類のカラムを用いることを特徴としている。本発明の測定方法および前記方法を用いた測定装置により、腎臓障害を持つ患者の試料といった、従来から知られているセロトニン測定方法では測定困難な試料であっても、精度よく測定することができる。また従来の測定方法では、試料中の不純物質に由来するクロマトグラムのピークとセロトニンのピークとが重なることにより、セロトニンが高値に乖離する現象が見られたが、本発明の測定方法では前記２種類の前処理カラムにより、試料中に含まれた前記不純物質が除去されるため、前記乖離現象の発生を抑えることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】比較例で使用した装置の概略図。
【図２】実施例で使用した装置の概略図。
【図３】比較例の方法で測定したときの標準試料のクロマトグラム。
【図４】比較例の方法で測定したときの血漿試料１のクロマトグラム。
【図５】比較例の方法で測定したときの血漿試料２のクロマトグラム。
【図６】比較例の方法で測定したときの血漿試料３のクロマトグラム。
【図７】比較例の方法で測定したときの血漿試料４のクロマトグラム。
【図８】比較例の方法で測定したときの血漿試料５のクロマトグラム。
【図９】比較例の方法で測定したときの全血試料１のクロマトグラム。
【図１０】比較例の方法で測定したときの全血試料２のクロマトグラム。
【図１１】比較例の方法で測定したときの全血試料３のクロマトグラム。
【図１２】比較例の方法で測定したときの全血試料４のクロマトグラム。
【図１３】比較例の方法で測定したときの全血試料５のクロマトグラム。
【図１４】比較例の方法で測定したときの代謝物１（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｈｙｄｒｏｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）のクロマトグラム。
【図１５】比較例の方法で測定したときの代謝物２（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）のクロマトグラム。
【図１６】比較例の方法で測定したときの代謝物３（５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）のクロマトグラム。
【図１７】比較例の方法で測定したときの代謝物４（４−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）のクロマトグラム。
【図１８】比較例の方法で測定したときの代謝物５（Ｉｓｏｐｒｏｔｅｌｅｎｏｌ）のクロマトグラム。
【図１９】比較例の方法で測定したときの代謝物６（３−ｍｅｔｈｏｘｙｔｙｒａｍｉｎｅ）のクロマトグラム。
【図２０】実施例の方法で測定したときの標準試料のクロマトグラム。
【図２１】実施例の方法で測定したときの血漿試料１のクロマトグラム。
【図２２】実施例の方法で測定したときの血漿試料２のクロマトグラム。
【図２３】実施例の方法で測定したときの血漿試料３のクロマトグラム。
【図２４】実施例の方法で測定したときの血漿試料４のクロマトグラム。
【図２５】実施例の方法で測定したときの血漿試料５のクロマトグラム。
【図２６】実施例の方法で測定したときの全血試料１のクロマトグラム。
【図２７】実施例の方法で測定したときの全血試料２のクロマトグラム。
【図２８】実施例の方法で測定したときの全血試料３のクロマトグラム。
【図２９】実施例の方法で測定したときの全血試料４のクロマトグラム。
【図３０】実施例の方法で測定したときの全血試料５のクロマトグラム。
【図３１】実施例の方法で測定したときの代謝物１（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｈｙｄｒｏｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）のクロマトグラム。
【図３２】実施例の方法で測定したときの代謝物２（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）のクロマトグラム。
【図３３】実施例の方法で測定したときの代謝物３（５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）のクロマトグラム。
【図３４】実施例の方法で測定したときの代謝物４（４−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）のクロマトグラム。
【図３５】実施例の方法で測定したときの代謝物５（Ｉｓｏｐｒｏｔｅｌｅｎｏｌ）のクロマトグラム。
【図３６】実施例の方法で測定したときの代謝物６（３−ｍｅｔｈｏｘｙｔｙｒａｍｉｎｅ）のクロマトグラム。
【図３７】実施例の方法におけるセロトニン濃度に対する希釈直線性を確認した結果。
【図３８】比較例および実施例で測定した血漿試料（乏血小板血漿試料）中のセロトニン濃度の相関図。
【図３９】比較例および実施例で測定した全血試料中のセロトニン濃度の相関図。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下、本発明を比較例および実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００３９】
比較例
比較例として、本発明者がこれまで検討してきた測定方法（特許文献３、非特許文献５）の条件を一部変更した測定方法でセロトニンを測定した。すなわち、前処理カラムおよび分離カラムとして、オクタデシル基を有したシリカ系のゲルを充填したカラムを用いて、試料中のセロトニンを分離した後、ベンジルアミンを用いたポストカラム蛍光検出する方法である。なお、前処理カラムおよび分離カラムとして、それぞれ１本の逆相カラムを用いるカラムスイッチング法は、前述した非特許文献１、２および４でも採用されている。また、ベンジルアミンを用いたポストカラム蛍光検出は、前述した非特許文献３でも採用されている。比較例での測定条件を以下に示す。また、測定に使用した装置の概略を図１に示す。
【００４０】
１．装置構成
前処理カラム８１：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ（東ソー製）、４．６ｍｍＩＤ×３５ｍｍ
分離カラム８３：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ（東ソー製）、４．６ｍｍＩＤ×１２０ｍｍ
溶離液１１：１０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｇｌｙｃｉｎｅ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌＯ４、３ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ２Ｎａ、０．０５％  ＮａＮ３、ｐＨ３．０
溶離液１２：３０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮＨ４ＮＯ３、５０％  ＣＨ３ＣＮ、ｐＨ４．５
溶離液１３：１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣＨ３ＣＯＯＮａ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮＨ４ＮＯ３、０．３ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ２Ｎａ、ｐＨ５．４
試薬２１：５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ベンジルアミン、５０％  エタノ−ル
試薬２２：５．０ｍｍｏｌ／Ｌ  フェリシアン化カリウム、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ホウ酸、５０％  エタノ−ル、ｐＨ８．０
ポンプ流速：ポンプ５１  １．０ｍＬ／ｍｉｎ、ポンプ５２  ０．７ｍＬ／ｍｉｎ、ポンプ５３  ０．２５ｍＬ／ｍｉｎ、ポンプ５４  ０．２５ｍＬ／ｍｉｎ
試料注入装置（オートサンプラー）６０の試料注入量：５００μＬ
反応器中９０中の反応オ−ブン温度：６０℃
反応器中９０中の反応コイル（ＰＴＦＥ製）サイズ：０．４ｍｍＩＤ×２０ｍ
測定サイクル：１９分／テスト
流路切り替えバルブ制御：六方バルブ７１  測定開始７分後にＯＮ−測定開始１０分後にＯＦＦ、三方電磁弁４１  測定開始１０分後にＯＮ−測定開始１１分後にＯＦＦ、三方電磁弁４２  測定開始４分後にＯＮ−測定開始５分後にＯＦＦ
蛍光検出器１００：励起波長  ３４０から３６０ｎｍ、蛍光波長  ４７０ｎｍ以上
２．試料の前処理方法
測定試料の前処理方法を以下に示す。
【００４１】
２−１  乏血小板血漿試料（以下、単に血漿試料とする）
（１）採血した血液に抗凝固剤としてＥＤＴＡ２Ｋ（２水和物）を３から６ｍｇ／ｍＬ容量添加後、冷却遠心分離により乏血小板血漿を調製した。
【００４２】
（２）血漿用除蛋白液（２４０ｍｍｏｌ／Ｌ  過塩素酸＋５０ｍｍｏｌ／Ｌ  アスコルビン酸）４００μＬと前記乏血小板血漿１００μＬを混合後、冷却遠心分離を実施し、得られた上清と中和溶液（２００ｍｍｏｌ／Ｌ  過塩素酸ナトリウム＋１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ２Ｎａ＋５０ｍｍｏｌ／Ｌ  酢酸ナトリウム）と１：１で混合したものを試料として用いた。
【００４３】
２−２  全血試料
（１）採血した血液に抗凝固剤としてＥＤＴＡ２Ｋ（２水和物）を１から８ｍｇ／ｍＬ容量入れ、全血試料を調製した。
【００４４】
（２）全血用希釈液（０．９％  塩化ナトリウム＋７ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ２Ｎａ）により全血試料を５倍希釈し、希釈した全血１００μＬと血漿用除蛋白液（２００ｍｍｏｌ／Ｌ  過塩素酸＋５０ｍｍｏｌ／Ｌ  アスコルビン酸）１ｍＬを混合した。
【００４５】
（３）冷却遠心分離を実施し、得られた上清と中和溶液（２００ｍｍｏｌ／Ｌ  過塩素酸ナトリウム＋１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ２Ｎａ＋５０ｍｍｏｌ／Ｌ  酢酸ナトリウム）と１：１で混合したものを試料として用いた。
【００４６】
２−３  標準試料（セロトニン  １０ｎｍｏｌ／Ｌ）
セロトニン（クレアチニン硫酸塩）を０．１Ｎ塩酸溶液に１０ｍｍｏｌ／Ｌの濃度に溶解後、標準試料用希釈液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ  過塩素酸＋１００ｍｍｏｌ／Ｌ  過塩素酸ナトリウム＋３ｍｍｏｌ／Ｌ  アスコルビン酸）で１０ｎｍｏｌ／Ｌの濃度に希釈して調製した。
【００４７】
３．測定方法
標準試料を測定後、続けて血漿試料または全血試料を測定し、標準試料のセロトニンのピーク高さから試料中のセロトニン濃度を算出した。
【００４８】
図３に標準試料（１０ｎｍｎｏｌ／Ｌ）のクロマトグラムを示した。約２３分の位置にセロトニンのピークが見られた。約２９分の位置に見られるピークは溶離液１２（カラムの洗浄用溶離液）に由来するピークである。
【００４９】
５つの血漿試料のクロマトグラムを図４から８に示し、セロトニン濃度の測定結果を表１に示す。血漿試料１、２および４は、セロトニンに相当するピークが確認された（図４、５および７で示したピーク）が、血漿試料３および５は不純物質に由来するピークが多いため、セロトニンのピークが確認困難であり、測定不能であった（図６および８）。
【００５０】
５つの全血試料のクロマトグラムを図９から１３に示し、セロトニン濃度の測定結果を表１に示す。５つの全血試料全てにおいてセロトニンに相当するピークが確認できた（図９から１３の矢印で示したピーク）。しかしながら、全血試料３および５（図１１および１３）は、全血試料１、２および４（図９、１０および１２）に比べて、不純物質に由来するピークが多く確認された。
【００５１】
【表１】
0005471287.tif 000002
次に、代謝物１（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｈｙｄｒｏｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、代謝物２（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、代謝物３（５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）、代謝物４（４−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、代謝物５（Ｉｓｏｐｒｏｔｅｌｅｎｏｌ）、代謝物６（３−ｍｅｔｈｏｘｙｔｙｒａｍｉｎｅ）を測定した。代謝物の濃度はすべて１００ｎｍｏｌ／Ｌとした。クロマトグラムに代謝物のピークは確認され、すべてにおいてセロトニンのピークと重なることはなかった（代謝物のピークは図１４から１９の矢印で示したピークである）。代謝物のピークの溶出時間（検出時間）を表２に示した。
【００５２】
【表２】
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実施例
実施例として、本発明の測定方法でセロトニンを測定した。実施例での測定条件を以下に示す。また、測定に使用した装置の概略を図２に示す。
【００５３】
１．装置構成
前処理カラム８１：ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＰＷ（東ソー製）、４．６ｍｍＩＤ×３５ｍｍ
前処理カラム８２：ＴＳＫｇｅｌ  ＳＰ−２ＳＷ（東ソー製），３．０ｍｍＩＤ×６０ｍｍ
分離カラム８３：ＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−８０Ｔｓ（東ソー製）、４．６ｍｍＩＤ×１２０ｍｍ
溶離液１１：５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣＨ３ＣＯＯＮａ、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮＨ４ＮＯ３、３ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ２Ｎａ、０．０５％  ＮａＮ３、ｐＨ５．０
溶離液１２：６０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮＨ４ＮＯ３、７０％  ＣＨ３ＯＨ、ｐＨ４．５
溶離液１３：１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣＨ３ＣＯＯＮａ、４００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮＨ４ＮＯ３、０．３ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ２Ｎａ、１２％  ＣＨ３ＯＨ、ｐＨ５．０
試薬２１：５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ベンジルアミン、５０％  エタノ−ル
試薬２２：５．０ｍｍｏｌ／Ｌ  フェリシアン化カリウム、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ホウ酸、５０％  エタノ−ル、ｐＨ８．０
ポンプ流速：ポンプ５１  １．０ｍＬ／ｍｉｎ、ポンプ５２  ０．７ｍＬ／ｍｉｎ、ポンプ５３  ０．２５ｍＬ／ｍｉｎ、ポンプ５４  ０．２５ｍＬ／ｍｉｎ
試料注入装置（オ−トサンプラー）６０の試料注入量：５００μＬ
反応器中９０中の反応オ−ブン温度：６０℃
反応器中９０中の反応コイル（ＰＴＦＥ製）サイズ：０．４ｍｍＩＤ×２０ｍ
測定サイクル：３０分／テスト
流路切り換えバルブ制御：六方バルブ７１  測定開始７分後にＯＮ−測定開始１８．１分後にＯＦＦ、六方バルブ７２  測定開始０．０２分後にＯＮ−測定開始２分後にＯＦＦ、六方バルブ７３  測定開始１８分後にＯＮ−測定開始２４分後にＯＦＦ、三方電磁弁４１  測定開始１９分後にＯＮ−測定開始２０分後にＯＦＦ、三方電磁弁４２  測定開始５分後にＯＮ−測定開始６分後にＯＦＦ
蛍光検出器１００：励起波長３４０から３６０ｎｍ、蛍光波長４７０ｎｍ以上
２．試料の前処理方法
比較例と同様に調製した。
【００５４】
３．測定方法
比較例と同様に測定した。
【００５５】
図２０に標準試料（１０ｎｍｎｏｌ／Ｌ）のクロマトグラムを示した。約３１分の位置にセロトニンのピークが見られた。約４１分の位置に見られるピークは溶離液１２（カラムの洗浄用溶離液）に由来するピークである。
【００５６】
比較例で測定した試料と同じ５つの血漿試料のクロマトグラムを図２１から２５に示す。セロトニンのピークは５つの血漿試料全てにおいてセロトニンに相当するピークが確認できた（図２１から２５の矢印で示したピーク）。また、比較例で測定した試料と同じ５つの全血試料のクロマトグラムを図２６から３０に示す。セロトニンのピークは５つの全血試料全てにおいてセロトニンに相当するピークが確認できた（図２６から３０の矢印で示したピーク）。血漿試料および全血試料のセロトニン濃度測定結果を表１に示す。
【００５７】
次に、代謝物１（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｈｙｄｒｏｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、代謝物２（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、代謝物３（５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）、代謝物４（４−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、代謝物５（Ｉｓｏｐｒｏｔｅｌｅｎｏｌ）、代謝物６（３−ｍｅｔｈｏｘｙｔｙｒａｍｉｎｅ）を測定した。代謝物の濃度はすべて１００ｎｍｏｌ／Ｌとした。クロマトグラム上に代謝物のピークは確認されなかった（図３１から３６、および表２）。
【００５８】
本実施例の測定方法における、セロトニン濃度に対する希釈直線性を確認した結果を図３７に示す。濃度の異なるセロトニン標準試料（０、０．１、１．０、５．０、１０、２０、２５、３０、３５ｎｍｏｌ／Ｌ）を測定し、標準試料のセロトニン濃度とクロマトグラム上のピーク高さの関係を確認した。図３７に示すように良好な直線性を示した。
【００５９】
本実施例の測定方法における、同時再現性（ｎ＝１０）試験の結果を表３に示す。測定試料はセロトニン標準試料（０．１、１０ｎｍｏｌ／Ｌ）とした。再現性のＣＶ値は、５％以下と良好な結果を示した。
【００６０】
【表３】
0005471287.tif 000004
比較例および実施例で測定した血漿試料および全血試料中のセロトニン濃度の相関図を、図３８（血漿試料１０検体）および図３９（全血試料９検体）に示す。ただし比較例の測定で、クロマトグラム上に不純物質に由来すると考えられるピークが多く確認された試料は相関関係を検討するデータから予め除外している。
【００６１】
前記結果から以下のことが確認され、実施例に示す本発明の測定方法は比較例に比べて、試料中の不純物質の影響を受けずに、試料中のセロトニンを精度よく測定できることが明らかとなった。
（１）試料として血漿試料を用いた場合、比較例の測定方法では一部の試料（血漿試料３および５）においてクロマトグラム上での不純物質に由来するピークが多く発生したため、セロトニンのピークが確認困難となり、測定不能となった。一方、実施例に示す本発明の測定方法では、不純物質に由来するピークが比較例よりも減少したため、セロトニンのピークが確認可能となり、良好に測定できた（表１）。なお、一部の試料（血漿試料４）において、セロトニン濃度の測定値が比較例と比較し実施例では半分以下となっている（表１）。これは、比較例の測定方法では血漿試料４のクロマトグラム上でのセロトニンのピークの位置と不純物由来のピークとが重なることにより、セロトニン濃度が高値に乖離しているためと推測される。
（２）試料として全血試料を用いた場合、一部の試料（全血試料３および５）において、
セロトニン濃度の測定値が比較例と比較し実施例では低くなっている（表１）。（１）と同様、比較例の測定方法では、前記全血試料のクロマトグラム上でのセロトニンのピークの位置と不純物由来のピークとが重なることにより、セロトニン濃度が高値に乖離しているためと推測される。
（３）カラムから溶出したセロトニンとベンジルアミンとの蛍光誘導体化反応で生じることが判明している６つの代謝物（代謝物１から６）を試料として用いた場合、比較例の方法ではデータを取り込む区間（測定開始後１３分から３０分までの間）のクロマトグラムに代謝物由来のピークが確認されたが、実施例の方法では、データを取り込む区間（測定開始後２５分から４５分までの間）のクロマトグラムに代謝物由来のピークは確認されなかった。当該結果より、試料中に含まれる不純物由来のピークについても、比較例に比べて実施例の方が、クロマトグラム上に確認される確率が低く、セロトニンのピークに重なる確率も低くなることが推測される。
（４）実施例の測定方法におけるセロトニン濃度の希釈直線性（図３７）、同時再現性（表３）および比較例の測定方法とのセロトニン濃度相関試験（図３８および３９）の結果、すべてにおいて良好な成績が得られ、実施例に示す本発明の測定方法により、セロトニンを精度よく測定できることが明らかとなった。
【符号の説明】
【００６２】
１１、１２、１３：溶離液
２１、２２：試薬
３０：脱気装置
４１、４２：三方電磁弁
５１、５２、５３、５４：ポンプ
６０：試料注入装置
７１、７２、７３：六方バルブ
８１、８２：前処理カラム
８３：分離カラム
９０：反応器
１００：蛍光検出器
【図１】
0005471287.tif 000005
【図２】
0005471287.tif 000006
【図３】
0005471287.tif 000007
【図４】
0005471287.tif 000008
【図５】
0005471287.tif 000009
【図６】
0005471287.tif 000010
【図７】
0005471287.tif 000011
【図８】
0005471287.tif 000012
【図９】
0005471287.tif 000013
【図１０】
0005471287.tif 000014
【図１１】
0005471287.tif 000015
【図１２】
0005471287.tif 000016
【図１３】
0005471287.tif 000017
【図１４】
0005471287.tif 000018
【図１５】
0005471287.tif 000019
【図１６】
0005471287.tif 000020
【図１７】
0005471287.tif 000021
【図１８】
0005471287.tif 000022
【図１９】
0005471287.tif 000023
【図２０】
0005471287.tif 000024
【図２１】
0005471287.tif 000025
【図２２】
0005471287.tif 000026
【図２３】
0005471287.tif 000027
【図２４】
0005471287.tif 000028
【図２５】
0005471287.tif 000029
【図２６】
0005471287.tif 000030
【図２７】
0005471287.tif 000031
【図２８】
0005471287.tif 000032
【図２９】
0005471287.tif 000033
【図３０】
0005471287.tif 000034
【図３１】
0005471287.tif 000035
【図３２】
0005471287.tif 000036
【図３３】
0005471287.tif 000037
【図３４】
0005471287.tif 000038
【図３５】
0005471287.tif 000039
【図３６】
0005471287.tif 000040
【図３７】
0005471287.tif 000041
【図３８】
0005471287.tif 000042
【図３９】
0005471287.tif 000043