(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的遺伝子の核酸の増幅反応において増幅反応が正しく行われたかどうかを判断するために使用される内部コントロール組成物であって、前記組成物が、テンプレートとしての内部コントロール核酸、及び前記内部コントロール核酸を増幅するためのプライマー対を含み、前記内部コントロール核酸及びプライマー対の塩基配列が、前記標的遺伝子が由来する生物の属する界とは異なる界に属する生物の遺伝子の塩基配列であること、及び前記内部コントロール核酸及びプライマー対の塩基配列が植物のｍａｔＫ遺伝子の塩基配列であることを特徴とする内部コントロール組成物。
【請求項２】
核酸の増幅反応がＰＣＲ法又はＲＴ−ＰＣＲ法に基づくものであることを特徴とする請求項１に記載の内部コントロール組成物。
【請求項３】
内部コントロール核酸の塩基配列のＧＣ含量が１０〜５０％であることを特徴とする請求項１又は２に記載の内部コントロール組成物。
【請求項４】
前記標的遺伝子が由来する生物が細菌又は動物であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか一項に記載の内部コントロール組成物。
【請求項５】
内部コントロール組成物が、増幅された内部コントロール核酸を検出するための蛍光標識プローブをさらに含み、前記蛍光標識プローブの発する蛍光波長が、増幅された標的遺伝子を検出するための蛍光標識プローブの発する蛍光波長とは異なるように選択されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載の内部コントロール組成物。
【請求項６】
標的遺伝子の核酸の増幅反応において増幅反応が正しく行われたかどうかを判断する方法であって、請求項１〜５のいずれか一項に記載の内部コントロール組成物を、標的遺伝子の核酸、前記標的遺伝子の核酸を増幅するためのプライマー対、及び核酸の増幅のために必要な試薬と共に核酸の増幅反応に供し、内部コントロール核酸が増幅されたかどうかを確認し、内部コントロール核酸が増幅された場合は、増幅反応が正しく行われたと判断し、内部コントロール核酸が増幅されなかった場合は、増幅反応が正しく行われなかったと判断することを特徴とする方法。
【請求項７】
内部コントロール核酸の増幅の確認が、増幅された内部コントロール核酸を蛍光標識プローブで検出することによって行われ、前記蛍光標識プローブの発する蛍光波長が、増幅された標的遺伝子を検出するための蛍光標識プローブの発する蛍光波長とは異なるように選択されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子検査の際に標的遺伝子の核酸の増幅反応において増幅反応が正しく行われたかどうかを判断するために使用される内部コントロール組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子検査は大きく分けて三つに分類される。第一は、遺伝学的検査で個体が生来的に保有する遺伝学的情報を明らかにする検査、第二は、体細胞遺伝子検査で遺伝子の構造異常を検出する検査及び病状とともに変化し得る一時的な遺伝子情報を明らかにする検査、第三は、病原体の遺伝子を検出することにより感染症の病原菌を同定するための検査である。臨床検査の分野では最近、迅速で高感度な検査として遺伝子検査が広まってきている。遺伝子検査は通常、標的とする遺伝子を増幅して、増幅された増幅産物を検出することで解析が行なわれる。この時に標的遺伝子の増幅を検出できなかった場合、つまり「陰性」の場合、標的となる遺伝子がサンプル中に存在しなかったのか、それとも臨床材料由来の成分により増幅反応が阻害されたのかは判断できない。
【０００３】
そこで陰性判定時に増幅反応が正しく行われたかどうかを確認するため、内部コントロール（ＩＣ）が用いられてきた。内部コントロールにより、様々な種類の陰性結果を見分けることができる。増幅結果が標的核酸について陰性でありかつＩＣについて陽性である場合は、標的配列がサンプル中に存在しないことを示唆し、増幅結果が標的配列について陰性でありかつＩＣについて陰性である場合は、増幅反応が阻害されたことを示唆する。
【０００４】
内部コントロールの一例として、非特許文献１には、トラコーマ病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびヒトＣ型肝炎ウイルスに関するＣＯＭＡＳ  ＡＭＰＬＩＣＯＲ（商標登録）試験に用いる内部コントロール核酸を構築したことが開示されている。
【０００５】
非特許文献２には、Ｂ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）の定量化に用いるＰＣＲアッセイのための内部コントロール配列を構築したことが開示されている。
【０００６】
非特許文献１および２では、標的遺伝子を増幅するためのプライマーの塩基配列と同じプライマーをＩＣ増幅に利用するため、標的核酸の増幅性能が低下するという問題があった。また、標的遺伝子の核酸に相補的なプライマーを共通に使用するため、標的遺伝子の種類ごとに異なる内部コントロール核酸を合成する必要があった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｒｏｓｅｎｓｔｒａｕｓ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｊ．  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３６（１）：１９１−１９７
【非特許文献２】Ｄａｎｂｉｎｇ  Ｋｅ，ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４６（３）：３２４−３３１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、かかる従来技術の現状に鑑み創案されたものであり、その目的は、標的遺伝子の増幅性能を低下させることがなく、しかも標的遺伝子の種類を問わずに広く使用することができる内部コントロールを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記目的を達成するために、核酸の増幅反応が正常に行なわれたかどうかを判断する指標として、標的遺伝子とは全く異なる遺伝子を検出することで、上記の問題点が解決することを見出した。さらに詳細には、本発明者は、標的遺伝子とは全く異なる遺伝子として植物遺伝子を用いること、及び独立した検出系にて蛍光色素の検出波長を変えて検出することが有利であり、特に、植物の遺伝子であるｍａｔＫを使用し、プラスミド、プライマーともに完全に独立した検出系を使用することで、リアルタイム定量ＰＣＲの内部コントロールとは異なり、定性での「陽性」「陰性」の判定で用いるための内部コントロールとして優れた性能を有することを見出した。
【００１０】
本発明は、上述の知見に基づいてなされたものであり、具体的には、以下の構成を採用するものである。
（１）標的遺伝子の核酸の増幅反応において増幅反応が正しく行われたかどうかを判断するために使用される内部コントロール組成物であって、前記組成物が、テンプレートとしての内部コントロール核酸、及び前記内部コントロール核酸を増幅するためのプライマー対を含み、前記内部コントロール核酸及びプライマー対の塩基配列が、前記標的遺伝子が由来する生物の属する界とは異なる界に属する生物の遺伝子の塩基配列であること、及び前記内部コントロール核酸及びプライマー対の塩基配列が植物のｍａｔＫ遺伝子の塩基配列であることを特徴とする内部コントロール組成物。
（２）核酸の増幅反応がＰＣＲ法又はＲＴ−ＰＣＲ法に基づくものであることを特徴とする（１）に記載の内部コントロール組成物。
（３）内部コントロール核酸の塩基配列のＧＣ含量が１０〜５０％であることを特徴とする（１）又は（２）に記載の内部コントロール組成物。
（４）前記標的遺伝子が由来する生物が細菌又は動物であることを特徴とする（１）〜（３）のいずれか一項に記載の内部コントロール組成物。
（５）内部コントロール組成物が、増幅された内部コントロール核酸を検出するための蛍光標識プローブをさらに含み、前記蛍光標識プローブの発する蛍光波長が、増幅された標的遺伝子を検出するための蛍光標識プローブの発する蛍光波長とは異なるように選択されることを特徴とする（１）〜（４）のいずれか一項に記載の内部コントロール組成物。
（６）標的遺伝子の核酸の増幅反応において増幅反応が正しく行われたかどうかを判断する方法であって、（１）〜（５）のいずれか一項に記載の内部コントロール組成物を、標的遺伝子の核酸、前記標的遺伝子の核酸を増幅するためのプライマー対、及び核酸の増幅のために必要な試薬と共に核酸の増幅反応に供し、内部コントロール核酸が増幅されたかどうかを確認し、内部コントロール核酸が増幅された場合は、増幅反応が正しく行われたと判断し、内部コントロール核酸が増幅されなかった場合は、増幅反応が正しく行われなかったと判断することを特徴とする方法。
（７）内部コントロール核酸の増幅の確認が、増幅された内部コントロール核酸を蛍光標識プローブで検出することによって行われ、前記蛍光標識プローブの発する蛍光波長が、増幅された標的遺伝子を検出するための蛍光標識プローブの発する蛍光波長とは異なるように選択されることを特徴とする（６）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の内部コントロール組成物は、標的遺伝子とは全く異なる遺伝子を内部コントロール核酸としているので、内部コントロール核酸を増幅するためのプライマー対の配列も標的遺伝子を増幅するためのプライマー対の配列とは異なる。このため、本発明の内部コントロール組成物では、標的遺伝子の増幅性能が低下することがなく、また、標的遺伝子の種類を問わずに広く使用することができる。従って、本発明の内部コントロール組成物は、定性での「陽性」「陰性」判定で用いるためのコントロールとして優れた性能を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、実施例２の核酸増幅の検出結果を示す。
【図２】図２は、実施例２の核酸増幅の検出結果を示す。
【図３】図３は、実施例３の核酸増幅の検出結果を示す。
【図４】図４は、実施例３の核酸増幅の検出結果を示す。
【図５】図５は、実施例４の核酸増幅の検出結果を示す。
【図６】図６は、実施例４の核酸増幅の検出結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の内部コントロール組成物は、標的遺伝子の核酸の増幅反応において増幅反応が正しく行われたかどうかを判断するために使用されるものであり、テンプレートとしての内部コントロール核酸、及び前記内部コントロール核酸を増幅するためのプライマー対として、標的遺伝子とは系統分類学的に全く異なる生物のものを使用することを特徴とする。
【００１４】
本発明の内部コントロール組成物は、臨床材料中の標的遺伝子の核酸を増幅するための方法に適用できる。臨床材料としては、例えば、ヒトまたは動物から採取した全血、血しょう、血清、組織、体液、尿、唾液、分泌物が挙げられる。さらに、培養組織、培養細胞、ヒトまたは動物に感染した細菌なども含まれる。標的遺伝子としては、例えば、特定の病原菌による感染の指標となる、この病原菌に特異的な遺伝子や、特定の疾患によって生体内で発現される、この疾患の指標となる遺伝子などが挙げられる。
【００１５】
測定用試料中の目的の核酸を増幅させる核酸増幅法としては、公知の核酸増幅法を適用することができ、例えば、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＬＡＭＰ法、ＲＴ−ＬＡＭＰ（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−  ｌｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ）法、ＴＭＡ法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、３ＳＲ法、ＳＤＡ（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ）法などが挙げられる。さらに、ＲＣＡ（Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＮＶＡＤＥＲ法、ＣＰＴ（Ｃｙｃｌｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）法、ＰＡＬＳＡＲ（Ｐｒｏｂｅ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ  ｌｉｎｋ  ｓｅｌｆ‐ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法などの核酸増幅法の一種であるシグナル増幅法も挙げられる。シグナル増幅法では、標的核酸そのものが増幅されるのではなく、標的核酸に相補的な特定の塩基配列が増幅される。好ましい核酸増幅法は、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＲＴ−ＬＡＭＰ法であり、特に核酸増幅の迅速性の観点から、ＰＣＲ法、ＲＴ−ＰＣＲ法がより好ましい。
【００１６】
臨床検査に用いられる遺伝子検査においては、核酸増幅を迅速に測定することが要求されるため、核酸を高速に増幅させることができる方法が好ましい。また、ＰＣＲを用いる増幅方法において高速増幅を可能とするＤＮＡポリメラーゼを使用することが好ましい。ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑと比較して伸長速度が速いＤＮＡポリメラーゼであれば良く、好ましくはＫＯＤ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【００１７】
増幅された核酸を検出する方法は、特に限定されず、公知の方法によって行なうことができる。例えば、アガロースゲル電気泳動法や、蛍光標識を使用したプローブを用いて蛍光を測定する方法、ＤＮＡ合成の際の副生成物（ピロリン酸マグネシウム）による濁り（濁度）を測定する濁度測定法を挙げることができ、これらの方法に加えて、必要に応じて酵素による切断パターンの確認や、直接シークエンス解析で塩基配列を決定する方法、その他多くの方法を用いることができる。特に、核酸増幅反応を阻害しない蛍光標識プローブを用いる方法で、核酸増幅反応後にエンドポイントで蛍光を検出する方法が好ましい。さらに増幅を阻害しにくい蛍光標識プローブが好ましく、一対の蛍光標識プローブを用いるＦＲＥＴシグナルを検出する方法よりも一本の蛍光標識プローブのハイブリダイゼーションにより標的核酸を検出できる消光プローブが好ましい。
【００１８】
本発明の内部コントロール核酸は、臨床材料中に含まれる成分の存在下でも特異的な増幅が可能な核酸である。このような内部コントロール核酸は、増幅反応を行った際に、生体試料に含まれる種々の核酸の増幅を伴うことなく、特異的に増幅させることが可能である。即ち、遺伝子検査方法で用いる内部コントロール核酸は、その増幅の際に、生体試料中に含まれる核酸の増幅を伴わないものが好ましい。
【００１９】
内部コントロール核酸としては、対象となる生体試料中に絶対に存在しない核酸配列を用いることが好ましい。このような核酸を内部コントロールとして用いることにより、内部コントロール核酸に特有の配列を特異的に増幅し、かつ臨床材料に含まれる種々の核酸配列は増幅しないプライマーおよび蛍光標識プローブの選択が容易となる。このような核酸配列を持つ遺伝子としては、例えば標的遺伝子が由来する生物とは界が異なる生物の遺伝子を用いることが好ましく、植物の遺伝子を用いることがより好ましく、さらには植物の光合成に関与する遺伝子を用いることが好ましい。
【００２０】
臨床材料はヒトまたは動物の細胞を含み、さらにヒトまたは動物に感染している細菌を含むこともある。植物の遺伝子、特に植物に特有の遺伝子である光合成に関与する遺伝子は臨床材料に含まれることはほとんどない。したがって臨床材料を試料とした遺伝子検査においては、植物の遺伝子は、内部コントロールとして共通で使用できる可能性が極めて高い。
【００２１】
しかし、植物の遺伝子が全て内部コントロールに適用できるわけではない。植物遺伝子の中にもヒトまたは動物に共通の遺伝子、例えばハウスキーピング遺伝子などの生物が生きていくのに必要な遺伝子がある。界が異なる生物であってもこれらの共通の遺伝子は、類似の塩基配列を持つことが多く、内部コントロールに特異的な増幅が必ずしも達成できるわけではない。
【００２２】
さらに、内部コントロールの遺伝子としては、遺伝子の塩基配列のＧＣ含量が低い遺伝子、具体的には１０％〜５０％である遺伝子が望ましい。ＧＣ含量が高い遺伝子の場合、設計した内部コントロールのプライマーまたはプローブがミスプライミングを起こし、非特異的増幅が起こり得る。ＧＣ含量は、２０％〜４０％がさらに好ましい。ＧＣ含量が１０％を下回る場合は核酸増幅反応を正常に行なうことが難しい。さらにＧＣ含量が２０％を下回る場合はプライマー設計が非常に難しく、遺伝子検査に適した迅速な増幅、検出系の構築が難しい。
【００２３】
本発明の内部コントロール組成物においては、内部コントロール核酸及びプライマー対の塩基配列は、標的遺伝子が由来する生物の属する界とは異なる界に属する生物の遺伝子の塩基配列である。つまり、本発明の内部コントロール組成物においては、テンプレートとしての内部コントロール核酸及びプライマー対（フォワードプライマーとリバースプライマーのセット）は、いずれも標的遺伝子のものとは異なる「完全独立系」である。このため、本発明では、内部コントロールに特異的な増幅及び内部コントロールに特異的な検出が可能となる。この完全に独立した内部コントロールの系は、例えばヒトと細菌、ヒトと動物のように、標的の遺伝子の生物が異なっても、さらに標的遺伝子が異なる種類であっても共通で使用することができる。
【００２４】
完全独立系の内部コントロールでは、標的遺伝子のものとは塩基配列の異なるプライマーを選択する必要がある。そのため、ヒトや感染細菌の遺伝子検査に関係する「界」（動物、細菌）のいずれにも属さない「植物」の遺伝子、特に、限定されないが植物に特有の光合成に関連する遺伝子を内部コントロールの遺伝子として選択することが好ましい。
【００２５】
植物に特有の光合成関連遺伝子としては、「ｒｂｃＬ遺伝子」が挙げられる。ｒｂｃＬ遺伝子は、リブロース二リン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子であり、植物遺伝子の代表として取り上げられることが多い。ｒｂｃＬ遺伝子は、様々な植物で遺伝子解析が進んでおり、進化速度が遅いため変異が入り難く、植物の系統解析に用いられている。また、「ｍａｔＫ遺伝子」も内部コントロールの遺伝子として選択できる。ｍａｔＫ遺伝子は、植物の葉緑体ゲノムに含まれている遺伝子の一つでイントロンを切り取る酵素をコードしている。ｍａｔＫ遺伝子は、ｒｂｃＬ遺伝子と比較して進化速度が２〜３倍速く、情報のある変異が多く、近縁種間の系統解析に非常に有効である。また、塩基配列の保存性が低いことから属種で特異的な配列になっていることが多い。従って、ｍａｔＫ遺伝子は、本発明における内部コントロールの遺伝子として完全に独立した検出が可能で、植物の中でも同じ配列を持つ属種がほとんどないため、より好ましい。さらにｍａｔＫ遺伝子のＣＧ含量は３０％〜４０％であるため、この点からも、様々な標的遺伝子に共通する内部コントロールの遺伝子として適している。
【００２６】
内部コントロール核酸の塩基配列のＧＣ含量は、１０〜５０％であること、つまり「ＡＴリッチ」であることが、増幅の特異性を保つために好ましい。また、核酸を増幅した後の検出において蛍光標識プローブとして、標的核酸配列にハイブリダイゼーションしたときにＧが存在すると消光する性質を持つ蛍光標識プローブを用いる場合、内部コントロール核酸の塩基配列のＧＣ含量がこの範囲であると、非特異反応が起こりにくい。したがって非特異的な増幅を低減するだけでなく、非特異的な検出をも低減することが可能となる。
【００２７】
本発明の内部コントロール組成物は、テンプレートとしての内部コントロール核酸、及び前記内部コントロール核酸を増幅するためのプライマー対に加えて、増幅された内部コントロール核酸を検出するためのプローブをさらに含むことができる。このプローブは、蛍光標識プローブであることが好ましく、この蛍光標識プローブの発する蛍光波長が、増幅された標的遺伝子を検出するための蛍光標識プローブの発する蛍光波長とは異なるように選択されることがさらに好ましい。本発明の内部コントロール組成物は、それ自体で使用することもできるが、公知の核酸増幅キットの構成成分に含めることもできる。
【００２８】
本発明によれば、標的遺伝子の核酸の増幅反応において増幅反応が正しく行われたかどうかを判断する方法も提供される。この方法は、本発明の内部コントロール組成物を、標的遺伝子の核酸、前記標的遺伝子の核酸を増幅するためのプライマー対、及び核酸の増幅のために必要な試薬と共に核酸の増幅反応に供し、内部コントロール核酸が増幅されたかどうかを確認し、内部コントロール核酸が増幅された場合は、増幅反応が正しく行われたと判断し、内部コントロール核酸が増幅されなかった場合は、増幅反応が正しく行われなかったと判断することを特徴とする。
【００２９】
本発明の方法においてはまず、内部コントロール核酸、及び前記内部コントロール核酸を増幅するためのプライマー対を含む内部コントロール組成物を、標的遺伝子の核酸、前記標的遺伝子の核酸を増幅するためのプライマー対、及び核酸の増幅のために必要な試薬と共に核酸の増幅反応に供する。内部コントロール核酸としては、内部コントロールの標的核酸領域を通常のＰＣＲで増幅したＰＣＲ産物を用いることができる。安定的に保存するために環状の核酸を用いることもできる。より好ましくは、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、その他のプラスミドベクターなどの市販の環状核酸に内部コントロール標的核酸領域を挿入した核酸を用いることができる。
【００３０】
核酸の増幅反応において、内部コントロール核酸の増幅は、標的遺伝子核酸の増幅と同様の方法で行えばよい。例えば、増幅にＰＣＲ法を用いる場合、反応温度、反応時間を同じにしたときに同様の増幅効率であることが好ましい。内部コントロールの増幅系は標的遺伝子を増幅する系よりも増幅効率が弱いことが好ましい。内部コントロールの増幅効率のほうが高い場合は反応阻害物質が存在しても内部コントロールの検出はできるが、標的遺伝子を検出することができない。
【００３１】
ＰＣＲ法で内部コントロールを検出する場合は、核酸の増幅のために必要な試薬として、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、マグネシウムイオンなどが必要である。この他、同業者であれば一般的にＰＣＲに用いることができる成分をさらに追加することも可能である。ジメチルスルホキシドやポリエチレングリコールのような核酸増幅反応を促進する成分を追加することができる。また、各成分量もＰＣＲに最適なものであれば良く、特に限定されないが、高速増幅可能な反応液の組成がより好ましい。
【００３２】
ＤＮＡポリメラーゼとしては、特に限定されるものではないが、例えば、以下の（ｉ）および（ｉｉ）からなる群から選ばれる１つ以上からなるものが使用できる。
（ｉ）Ｔｂｒ，Ｔｆｌ，Ｔｒｕ，Ｔｔｈ，Ｔ１ｉ，Ｔａｃ，Ｔｎｅ，Ｔｍａ，Ｔｉｈ、Ｔｆｉ，Ｐｆｕ，Ｐｆｕｔｕｂｏ，Ｐｙｒｏｂｅｓｔ（登録商標），Ｐｗｏ，ＫＯＤ，Ｂｓｔ，Ｓａｃ，Ｓｓｏ，Ｐｏｃ，Ｐａｂ，Ｍｔｈ，Ｐｈｏ，ＥＳ４，ＶＥＮＴおよびＤＥＥＰＶＥＮＴからなる群。
（ｉｉ）（ｉ）で示される群のＤＮＡポリメラーゼの変異体であり、かつ、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する変異体。
【００３３】
これらの中でも、ＤＮＡポリメラーゼとして「伸長速度」が速いＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。ＤＮＡポリメラーゼの「増幅効率」がよく、「伸長速度」が速いと、少量の核酸から増幅反応を行うことが可能になる。伸長速度の遅いＴａｑポリメラーゼでは、短時間で少量の核酸を増幅させることは難しい。ＤＮＡポリメラーゼの「伸長速度」は、１００塩基／秒以上であることが好ましい。
【００３４】
核酸の増幅反応の反応系は、至適緩衝液を含むことが、核酸を含む臨床検体残存物からの検出を容易にする上で有利である。例えば、マグネシウムイオン濃度の許容幅が広いことは、臨床検体からの検出に有利に働く。臨床検体に含まれる金属キレート作用を持つ物質によりマグネシウムイオンがキレート化されて不足すると、ＤＮＡポリメラーゼの増幅反応は起こりにくくなる。反応系中のマグネシウムイオンの濃度は特に限定されないが、１ｍＭ〜８ｍＭが好ましく、より好ましくは２ｍＭ〜８ｍＭであり、さらに好ましくは３ｍＭ〜６ｍＭである。
【００３５】
本発明では、内部コントロール核酸を、標的遺伝子の増幅とは完全に独立して増幅することで、標的遺伝子の増幅効率を基準として内部コントロールの増幅効率の調節を独立して行うことができ、様々な標的遺伝子に共通の内部コントロールとして利用しやすくなる。増幅効率の調節は、プライマー濃度を標的遺伝子のプライマー濃度よりも低くすることによって行うことが好ましい。内部コントロールのプライマー濃度が高い場合、プライマーの非特異反応により標的遺伝子の増幅に与える影響が出始めて、標的遺伝子の増幅を阻害する。内部コントロール核酸の濃度を極めて低くして調節するとＰＣＲの特性上、内部コントロールの検出がばらつく。
【００３６】
次に、内部コントロール核酸が増幅されたかどうかを確認する。内部コントロール核酸の増幅の確認方法は、特に限定されず、公知の方法を採用することができる。例えば、アガロースゲル電気泳動法や、蛍光標識を使用したプローブを用いて蛍光を測定する方法、ＤＮＡ合成の際の副生成物（ピロリン酸マグネシウム）による濁り（濁度）を測定する濁度測定法を挙げることができ、これらの方法に加えて、必要に応じて酵素による切断パターンの確認や、直接シークエンス解析で塩基配列を決定する方法、その他多くの方法を用いることができる。特に、核酸増幅反応を阻害しない蛍光標識プローブを用いる方法で、核酸増幅反応後にエンドポイントで蛍光を検出する方法が好ましい。さらに増幅を阻害しにくい蛍光標識プローブが好ましく、一対の蛍光標識プローブを用いるＦＲＥＴシグナルを検出する方法よりも一本の蛍光標識プローブのハイブリダイゼーションにより標的核酸を検出できる消光プローブが好ましい。
【００３７】
内部コントロールの蛍光標識プローブから発する蛍光波長は、標的遺伝子の蛍光標識プローブから発する蛍光波長と同じでも良いが、内部コントロールの蛍光標識プローブから発する蛍光波長と標的遺伝子の検出に利用する蛍光標識プローブから発する蛍光波長が異なることがより好ましい。標的遺伝子が検出される蛍光波長とは異なる蛍光波長で検出されることで、解析においても内部コントロールの蛍光が、標的遺伝子の蛍光に重なることなく測定され、解析が容易にできるという効果がある。蛍光標識プローブの標識としては、一本のプローブにより標的核酸へのハイブリダイゼーションを検出できる蛍光標識が好ましく、標的核酸へハイブリダイゼーションしたときに蛍光が消光する性質を持った蛍光色素がより好ましい。特に標識プローブの末端においてグアニンとシトシンの塩基対形成時に蛍光の消光を生じる蛍光色素が好ましい。具体的には、フルオロセインまたはその誘導体（例えばフルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））、ＢＯＤＩＰＹ（商標）シリーズ、ローダミンまたはその誘導体（例えば５−カルボキシローダミン６Ｇ（ＣＲ６Ｇ）やテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ））などを使用でき、これらの中でもＢＯＤＩＰＹシリーズやＣＲ６Ｇが特に好ましい。蛍光色素のオリゴヌクレオチドへの結合方法は、通常の方法に従って行うことができる。蛍光色素の消光を利用すれば、インターカレーターなどの他の二重鎖核酸構造への挿入色素を用いることなく、またＦＲＥＴ現象を起こす二種類のプローブを用いることなく、一種類の蛍光物質に標識されたプローブを用いて単純かつ特異的に標的核酸配列を検出することができる。標識プローブの塩基配列中の蛍光色素の標識位置は、末端部に標識されていることが好ましく、末端に標識されていることがより好ましい。
【００３８】
次に、増幅結果に基づいて、内部コントロール核酸の増幅が確認された場合は、増幅反応が正しく行われたと判断する。このとき、標的遺伝子が増幅されていれば問題ないが、増幅されていない場合は、増幅反応自体は正しく行われているので、サンプル中に標的遺伝子が存在していないと考えることができる。一方、増幅結果に基づいて、内部コントロール核酸の増幅が確認できなかった場合は、増幅反応が正しく行われなかったと判断する。このとき、標的遺伝子も当然増幅されていないが、この原因は、サンプル中に標的遺伝子が存在していないためではなく、何らかの理由で増幅反応が阻害されたためであると考えることができる。従って、本発明の方法によれば、標的遺伝子が増幅されなかった場合、その原因がサンプル中の標的遺伝子の非存在によるものなのか、それとも増幅反応の阻害によるものなのかを知ることができる。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
【００４０】
〔実施例１：内部コントロール組成物の調製〕
（１）内部コントロール核酸の調製
内部コントロールの標的核酸領域としては、配列番号１に示されるＬａｇａｒｏｓｉｐｈｏｎ  ｍａｄａｇａｓｃａｒｉｅｎｓｉｓ（水草、有茎草に分類、分布は主にマダガスカル）のｍａｔＫ遺伝子の配列の一部を選択した。この塩基配列を大腸菌系プラスミドベクター（ｐＵＣ１８）に連結してプラスミドＤＮＡを構築した。次に、このプラスミドＤＮＡを、大腸菌ＤＨ５αに導入して形質転換株を作成し、アンピシリン存在下で培養して増殖させた。形質転換株からＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ（商標登録）によりプラスミドを抽出した。エタノール沈殿法によって得られた沈殿をトリス緩衝液で溶解し、内部コントロール核酸を調製した。
【００４１】
（２）プライマー及び標識プローブの合成
パーキンエルマー社製ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号２〜１２に示される核酸配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ２〜１２と示す）を合成した。合成は、マニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護は、アンモニア水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製は、パーキンエルマー社ＯＰＣカラムにて実施するか、もしくはＤＮＡ合成受託会社（（株）日本バイオサービス、シグマアルドリッチジャパン（株）、オペロンバイオテクノロジー（株）など）に依頼した。オリゴ２〜８がプライマーであり、オリゴ９〜１２がプローブである。オリゴ９は、３’末端がＣＲ６Ｇにより標識されている。オリゴ１０は、３’末端がＢＯＤＩＰＹ（商標登録）−ＦＬにより標識されており、オリゴ１１、１２は、５’末端がＢＯＤＩＰＹ（商標登録）−ＦＬにより標識されている。
【００４２】
〔実施例２：ヒト型結核菌の検出のための核酸増幅反応における内部コントロールの利用〕
（１）標的遺伝子の試料の調製
Ｍ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ（ヒト型結核菌）株を小川培地で培養した。培養後の菌体よりフェノール・クロロホルム法を用いてＤＮＡを抽出し、標的遺伝子の試料とした。陰性コントロールとしては、水を試料とした。
【００４３】
（２）核酸増幅および融解曲線解析
標的遺伝子の試料（ヒト型結核菌群抽出ＤＮＡ）および陰性コントロールを使用して下記試薬を調製し、下記条件により核酸増幅および融解曲線解析を行い、ヒト型結核菌を検出した。核酸増幅および融解曲線解析には、ロシュ・ダイアグノスティック社製ライトサイクラー（登録商標）を使用した。測定モードは、５３０ｎｍ及び６１０ｎｍを利用し、ライトサイクラーソフトウェアにより結果を解析した。
【００４４】
試薬
以下の試薬を含む１０μＬ溶液を調製した。調製した反応液は、ガラスキャピラリーに充填した。その後の操作は、ライトサイクラーの取り扱い説明書にしたがって実施した。
ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ２                                １５０ｎＭ、
オリゴ３                                ７５０ｎＭ、
オリゴ４                                ２５０ｎＭ、
オリゴ５                                １５００ｎＭ、
オリゴ９                                １００ｎＭ
オリゴ１０                              ２５０ｎＭ、
×１０緩衝液                            １μＬ、
ｄＮＴＰ                                ０．２ｍＭ、
ＭｇＳＯ４                              ４ｍＭ、
ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ    ０．３Ｕ、
ジメチルスルホキシド                    ７．５％
標的遺伝子の試料又は陰性コントロール    ２０ｎｇ
内部コントロール核酸                    １０ｎｇ
【００４５】
ＰＣＲ法による核酸増幅および融解曲線解析条件
９４℃・２分
（ｉ）９８℃・０秒、
（ｉｉ）６０℃・５秒、（（ｉ）及び（ｉｉ）を５０サイクル）
９４℃・１分、
４０℃・１分、
４０℃〜７５℃（０．５℃／秒で温度上昇）。
【００４６】
（３）結果
ライトサイクラーソフトウェアの解析により、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析した。図１に５３０ｎｍの解析結果を、図２に６１０ｎｍの解析結果を示す。図１より明らかなように、ヒト型結核菌のＤＮＡを試料とした場合にのみ明瞭なピークが観察され、陰性コントロール（ＮＣ）の場合は検出ピークが認められなかった。図２ではヒト型結核菌のＤＮＡを試料とした場合に加え、陰性コントロール（ＮＣ）を試料とした場合にも明瞭な検出ピークが得られた。これは内部コントロールの検出が同時に行なわれ、ＰＣＲによる核酸増幅の成功を確認できたことを示す。また、核酸増幅検出反応は１時間以内の時間で解析可能であるため、極めて短時間で内部コントロールの検出を含めた標的遺伝子の検出が可能であった。
【００４７】
〔実施例３：トリ型結核菌の検出のための核酸増幅反応における内部コントロールの利用〕
（１）標的遺伝子の試料の調製
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｖｉｕｍ（トリ型結核菌）を７Ｈ１１寒天培地で培養した。培養後の菌体よりフェノール・クロロホルム法を用いてＤＮＡを抽出し、標的遺伝子の試料とした。陰性コントロールとしては、水を試料とした。
【００４８】
（２）核酸増幅および融解曲線解析
標的遺伝子の試料（トリ結核菌群抽出ＤＮＡ）および陰性コントロールを使用して、実施例２と同様にしてトリ結核菌を検出した。ただし、オリゴ４，５，１０の代わりにオリゴ６，７，１１をそれぞれ使用した。
【００４９】
（３）結果
ライトサイクラーソフトウェアの解析により、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析した。図３に５３０ｎｍの解析結果を、図４に６１０ｎｍの解析結果を示す。図３より明らかなように、トリ型結核菌のＤＮＡを試料とした場合にのみ明瞭なピークが観察され、陰性コントロール（ＮＣ）の場合は検出ピークが認められなかった。図４ではトリ型結核菌のＤＮＡを試料とした場合に加え、陰性コントロール（ＮＣ）を試料とした場合にも明瞭な検出ピークが得られた。これは内部コントロールの検出が同時に行なわれ、ＰＣＲによる核酸増幅の成功を確認できたことを示す。
【００５０】
〔実施例４：カンサシイの検出のための核酸増幅反応における内部コントロールの利用〕
（１）標的遺伝子の試料の調製
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ（カンサシイ）を７Ｈ１１寒天培地で培養した。培養後の菌体よりフェノール・クロロホルム法を用いてＤＮＡを抽出し、標的遺伝子の試料とした。陰性コントロールとしては、水を試料とした。
【００５１】
（２）核酸増幅および融解曲線解析
標的遺伝子の試料（カンサシイ抽出ＤＮＡ）および陰性コントロールを使用して、実施例２と同様にしてカンサシイを検出した。ただし、オリゴ４  ２５０ｎＭの代わりにオリゴ８  １５００ｎＭを、オリゴ５  １５００ｎＭの代わりにオリゴ７  ５００ｎＭを、オリゴ１０  ２５０ｎＭの代わりにオリゴ１２  ２５０ｎＭを使用した。
【００５２】
（３）結果
ライトサイクラーソフトウェアの解析により、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析した。図５に５３０ｎｍの解析結果を、図６に６１０ｎｍの解析結果を示す。図５より明らかなように、カンサシイのＤＮＡを試料とした場合にのみ明瞭なピークが観察され、陰性コントロール（ＮＣ）の場合は検出ピークが認められなかった。図６ではカンサシイのＤＮＡを試料とした場合に加え、陰性コントロール（ＮＣ）を試料とした場合にも明瞭な検出ピークが得られた。これは内部コントロールの検出が同時に行なわれ、ＰＣＲによる核酸増幅の成功を確認できたことを示す。
【００５３】
〔実施例５：トリ型結核菌の検出のための核酸増幅反応における内部コントロールの利用〕
（１）標的遺伝子の試料の調製
トリ型結核菌を小川培地で培養した。培養後の菌体よりフェノール・クロロホルム法を用いてＤＮＡを抽出し、標的遺伝子の試料とした。陰性コントロールとしては、水を試料とした。
【００５４】
（２）核酸増幅および融解曲線解析
標的遺伝子の試料（トリ結核菌群抽出ＤＮＡ）および陰性コントロールを使用して、実施例３と同様にしてトリ型結核菌を検出した。ただし、標的遺伝子の試料又は陰性コントロールの量を１０ｎｇに変更し、ＰＣＲ阻害物質として、エタノールを１％、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、又は１６％添加した。
【００５５】
（３）結果
ライトサイクラーソフトウェアの解析により解析を実施し、５３０ｎｍ及び６１０ｎｍの検出ピークの有り無しで結果を判定した。表１に判定結果を示す。検出ピークが確認できた時は「＋」、確認できない時は「−」で表示した。判定結果から、エタノール添加量を増やしていくと内部コントロールの検出系の検出ピークが先に消失することがわかった。プライマー量の調節により、内部コントロールの検出系がトリ型結核菌の検出系よりも増幅効率が低くなっており、内部コントロールとして正常に機能していることがわかった。
【００５６】
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【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明の内部コントロール組成物は、定性での「陽性」「陰性」判定で用いるためのコントロールとして優れた性能を有するため、感染症の診断など生命科学、臨床検査などの領域で極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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