(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ヒト動物においてグラム陽性バクテリアにより引き起こされる腸感染症を処置し又は予防する為に、
式１
0005461432.tif 000008
に従うラクチレート又はそのＮａ、Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｚｎ、ＮＨ４、若しくはＣｕ（ＩＩ）の塩である抗バクテリア化合物を使用する方法、
ここで上記式においてＲ１がＨから選択され、ｎは１〜１０の値の整数を表し、且つ、Ｒ２は分枝していてもよく又は分枝していなくてもよいＣ１〜Ｃ３５のアルキル又はアルケニル鎖を表す。
【請求項２】
Ｒ２がＣ６〜Ｃ１８のアルキル又はアルケニル鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｎが１、２、又は３である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
動物においてグラム陽性バクテリアにより引き起こされる腸感染症を予防し又は処置する剤であって、請求項１〜３のいずれか１項に定義された抗バクテリア化合物を含む前記剤。
【請求項５】
動物においてグラム陽性バクテリアにより引き起こされる腸感染症を予防し又は処置する為の組成物の製造の為に、請求項１〜３のいずれか１項に定義された抗バクテリア化合物を使用する方法。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか１項に定義された抗バクテリア化合物を含む、動物においてグラム陽性バクテリアにより引き起こされる腸感染症を予防し又は処置する為の組成物。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に定義された抗バクテリア化合物の有効量を動物に与えることを含む、非ヒト動物においてグラム陽性バクテリアにより引き起こされる腸感染症を予防し又は処置する為の方法。
【請求項８】
該グラム陽性バクテリアがＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ属のものである、請求項１〜３、５、及び７のいずれか１項に記載された方法。
【請求項９】
該動物がウシ又は家禽から選ばれる、請求項１〜３、５、及び７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
非ヒト動物の成長を増す為の方法であって、請求項１〜３のいずれか１項に定義された抗バクテリア化合物の有効量を該動物に与えることを含む、前記方法。
【請求項１１】
請求項１〜３のいずれか１項に定義された抗バクテリア化合物の有効量を該動物に与えることによって腸内のグラム陽性バクテリアを抑制することにより、該動物の成長が増される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜３のいずれか１項に定義された抗バクテリア化合物の有効量を該動物に与えることによって腸内のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種を抑制することにより、該動物の成長が増される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
非ヒト動物における壊死性腸炎に対して、請求項１〜３のいずれか１項に定義された抗バクテリア化合物を使用する方法。
【請求項１４】
飼料対獲得比を非ヒト動物において改善する為に、請求項１〜３のいずれか１項に定義された抗バクテリア化合物を使用する方法。
【請求項１５】
動物飼料において施与されたアミノ酸の消化率を非ヒト動物において改善する為に、請求項１〜３のいずれか１項に定義された抗バクテリア化合物を使用する方法。
【請求項１６】
コムギ、デンプン、肉及び骨粉、トウモロコシ、ヒマワリ粉末、コーン、穀草類、オオムギ、大豆粉末、タピオカ、シトラスパルプ、マメ、及びビートパルプから選ばれる１又はそれより多くの化合物と一緒に、請求項１〜３のいずれか１項に定義された抗バクテリア化合物を含む動物栄養組成物。
【請求項１７】
静コクシジウム剤と一緒に請求項１〜３のいずれか１項に定義された抗バクテリア化合物を含む動物栄養組成物。
【請求項１８】
請求項１〜３のいずれか１項に定義された抗バクテリア化合物を含む動物栄養組成物であって、該抗バクテリア化合物が担体上に存在する、前記組成物。
【請求項１９】
請求項１〜３のいずれか１項に定義された抗バクテリア化合物を含む動物栄養組成物であって、該抗バクテリア化合物が植物油を有する混合物中に添加される、前記組成物。
【請求項２０】
請求項１〜３のいずれか１項に定義された抗バクテリア化合物を含む動物栄養組成物であって、該抗バクテリア化合物が、該動物に与えられるそれぞれの飼料の合計重量に対して０．００１〜１重量％の量で存在する、前記組成物。
【請求項２１】
請求項１〜３のいずれか１項に定義された抗バクテリア化合物を含む動物栄養組成物であって、解離していない乳酸の存在を増加する為の窒素、硫黄及びリン含有酸から選ばれる無機酸を含まない、前記組成物。
【請求項２２】
請求項１〜３のいずれか１項に定義された抗バクテリア化合物を含む動物栄養組成物であって、該抗バクテリア化合物が、ラウロイルラクチレート、ミリストイルラクチレート、セチルラクチレート、パルミチルラクチレート、及びそれらのナトリウム塩の１又はそれより多くから選ばれるものである、前記組成物。
【請求項２３】
該グラム陽性バクテリアがＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ属のものである、請求項４に記載された剤又は請求項６に記載された組成物。
【請求項２４】
該動物がウシ又は家禽から選ばれる、請求項４に記載された剤又は請求項６に記載された組成物。
【請求項２５】
動物の成長を増す剤であって、請求項１〜３のいずれか１項に定義された抗バクテリア化合物の有効量を含む、前記剤。
【請求項２６】
請求項１〜３のいずれか１項に定義された抗バクテリア化合物の有効量を該動物に与えることによって腸内のグラム陽性バクテリアを抑制することにより、該動物の成長が増される、請求項２５に記載の剤。
【請求項２７】
請求項１〜３のいずれか１項に定義された抗バクテリア化合物の有効量を該動物に与えることによって腸内のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種を抑制することにより、該動物の成長が増される、請求項２６に記載の剤。
【請求項２８】
請求項１〜３のいずれか１項に定義された抗バクテリア化合物を含む抗壊死性腸炎剤。
【請求項２９】
飼料対獲得比を改善する剤であって、請求項１〜３のいずれか１項に定義された抗バクテリア化合物を含む、前記剤。
【請求項３０】
動物飼料において施与されたアミノ酸の消化率を改善する剤であって、請求項１〜３のいずれか１項に定義された抗バクテリア化合物を含む剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物においてグラム陽性バクテリアにより引き起こされる腸の感染症を予防し又は処置する為の方法、動物においてグラム陽性バクテリアにより引き起こされる腸の感染症を予防し又は処置する為の特定の組成物に、動物においてグラム陽性バクテリアにより引き起こされる腸の感染症を予防し又は処置する為の特定の組成物の使用方法に、及び動物においてグラム陽性バクテリアにより引き起こされる腸の感染症を予防し又は処置する為に有効な量で特定の化合物を含む動物の為の栄養組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
グラム陽性バクテリアは、それらの細胞壁内の多量のペプチドグリカンに主に起因して、グラム染色により暗い青又は紫に染められる。該グラム陽性バクテリアのうち、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、種々のＢａｃｉｌｌｕｓ種、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓは病原性バクテリアである。これらの微生物のいくつかは食品汚染物としての主に関心事項である一方で、動物において疾患を引きおこすものもある。
【０００３】
例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａは、動物において腸の多くの広くさまざまな疾患を引きおこすことに関与する。それは、土壌、埃、排泄物、及び食物中に容易に発見されるほとんどどこにでもいるバクテリアであるので、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａがいない状態に動物を維持することは極めて困難である。
【０００４】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍに関連する腸疾患は、非常に重度でありうる。例えば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａは、鶏において壊死性腸炎を引き起こすことに関与する。ウシにおいて、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ関連腸炎が、「突然死症候群」の形をとることがあり、これは実際に、多数のウシの一晩での死を結果しうる。他の動物においても、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａに関連する疾患は重度の障害を引き起こしうる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
動物を腸感染症から守る為に動物に抗生物質を投与することが知られている。そのような抗生物質を動物の栄養物中に含めることも知られている。しかしながら、動物の飼料における抗生物質の使用に対する抵抗が増加していており、そして最近多くの国は、動物の飼料における抗生物質の使用を禁ずる法律を有する。さらに、抗生物質は非常に管理された量で与えられる必要がある。
【０００６】
従って、それゆえに動物、特には哺乳動物（反芻動物（例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、シカ）及び単胃動物（例えばブタ、ウマ、ウサギ）を含む）における；鳥（例えば家禽、ターキー、キジ、ウズラ）における；魚（海水魚（例えばサーモン、オヒョウ、マグロ）、淡水魚（例えばマス、コイ、ティラピア）を含む）における；軟体動物（例えばカキ、イガイ、クラム、巻貝）における、及び甲殻類（例えばカニ、ロブスター、エビ）における、グラム陽性バクテリアにより引き起こされる腸感染症を処置し又は予防するのに役立つであろう非抗生物質的な方法及び動物飼料のための組成物についてのニーズがある。本発明は、ヒトにおける、及び毛皮動物、例えばミンク、オコジョ、サーベル（sabre）、及びキツネなど、における適用も発見しうる。
【０００７】
さらに、動物の成長を増すことを目的として、腸において特定のグラム陽性バクテリアを抑制することが望ましくありうる。これはＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種についての関心事項でありうると考えられる。本発明は、この適用についても関心がある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、動物においてグラム陽性バクテリアにより引き起こされる腸感染症を処置し又は予防する為の方法及び動物飼料の為の組成物を提供する。本発明に従い、グラム陽性バクテリアにより引き起こされる腸感染症の予防又は処置の為に、
式１
0005461432.tif 000002
に従うラクチレート又はそのＮａ、Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｚｎ、ＮＨ４、若しくはＣｕ（ＩＩ）の塩である抗バクテリア化合物が使用され、
ここで上記式においてＲ１がＨから選択され、ｎは１〜１０の値の整数を表し、且つ、Ｒ２は分枝していてよく又は分枝していなくてもよいＣ１〜Ｃ３５のアルキル又はアルケニル鎖を表す。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、動物におけるグラム陽性バクテリアによる腸感染症の予防又は処置に関する。本発明は、嫌気性又は通性嫌気性のバクテリア、さらにより特には嫌気性バクテリアによる、腸感染症に対する使用にとって特に魅力的である。嫌気性バクテリアの群内において、芽胞形成バクテリアによる腸感染症の予防又は処置の為の方法を有することが特に望ましい。なぜなら、これらの生物は制御することが難しい傾向にあるからである。本発明は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａによる腸感染症の予防及び処置において特に興味深い。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
一つの実施態様において、本発明は、家禽、特には鶏において、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍにより、特にはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓにより引き起こされる腸感染症の予防又は処置に関する。
【００１１】
他の実施態様において、本発明は、ウシにおいて、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍにより、特にはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍのｔｅｔａｎｉｉ、ｎｏｖｙｉ（Ｂ型）、ｓｅｐｔｉｃｕｍ、ｃｈａｕｖｉｉ、ｓｏｒｄｅｌｉｉ、ｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｍ、ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、の１以上により引き起こされる腸感染症の予防又は処置に関する。
【００１２】
さらなる実施態様において、本発明は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種の腸内増殖の減少に関する。
【００１３】
国際公開第２００４／１０７８７７号パンフレットが、乳酸又はその誘導体と無機酸との混合物を含む抗微生物性組成物を記載することが注目される。該組成物は、一般に抗微生物剤として記載されている。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉに対する使用が特定されている。ラクチレートは可能な乳酸誘導体として言及されているが、それらの使用はさらに明らかにされていない。この文献は、ラクチレートの使用が動物においてグラム陽性バクテリアに対して特定の有効性を示すと発見された特定の有効性を教唆も示唆もしていない。
【００１４】
さらに、独国特許出願公開第１１５４８０号明細書が、アシル化α−ヒドロキシカルボン酸の、バクテリア及び菌類、例えばカビ、白カビ及び酵母など、に対する使用を記載することが注目される。該化合物がヒト又は他の動物による消費又はヒト又は他の動物への施与の為に用いられうることが示されているが、これは明らかにされていない。この文献は、ラクチレートの使用がグラム陽性バクテリアに対して特定の有効性を示すと発見された特定の有効性を教唆も示唆もしていない。
【００１５】
本発明において、式１に従うラクチレート又はそのＮａ、Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｚｎ、ＮＨ４、若しくはＣｕ（ＩＩ）の塩、式２のグリコリレート又はそのＮａ、Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｆｅ（ＩＩ）、Ｚｎ、ＮＨ４、若しくはＣｕ（ＩＩ）の塩、式３のラクテートエステル、及び／又は式４のグリコール酸エステルの１以上から選ばれる抗バクテリア化合物が使用されうる。
【００１６】
式１のラクチレート又はその塩の使用が好ましいと発見された。
【００１７】
本発明の好ましい実施態様において、Ｒ２は、６〜２０の炭素原子を有するアルキル又はアルケニル鎖である。より特には、Ｒ２は、６〜１８の炭素原子を有するアルキル又はアルケニル鎖である。この実施態様において、適当な置換基は、６の炭素原子を有する基（カプロニック）、８の炭素原子を有する基（カプリリック）、１０の炭素原子を有する基（カプリン酸）、１２の炭素原子を有する基（ラウリル）、１４の炭素原子を有する基（ミリスチル）、１６の炭素原子を有する基（セチル、パルミチル）、１８の炭素原子を有する基（ステアリル）を含む。２以上の化合物の混合物もまた用いられうる。塩が用いられる場合、Ｎａ、Ｋ、Ｃａ、又はＭｇの塩の使用が特に好ましい。
【００１８】
ｎについての値は好ましくは１〜５である。より特には、ｎは１、２、又は３の値を有する。
【００１９】
ラウロイルラクチレート、ミリストリルラクチレート、及びそれらのナトリウム塩の使用が特に好ましい。一つの実施態様において、５〜９５重量％のラウロイルラクチレート及び９５〜５重量％のミリストイルラクチレート、又はこれらの化合物のナトリウム塩を含む混合物が用いられ、より特には、２５〜７５重量％、より特には４０〜６０重量％のラウロイルラクチレート及び７５〜２５重量％、より特には４０〜６０重量％のミリストイルラクチレート、又はこれらの化合物のナトリウム塩を含む混合物が用いられる。
【００２０】
本発明の一つの実施態様において、抗バクテリア化合物、特には該ラクチレート又はその塩が、１以上の静コクシジウム性（coccidostatic）成分と一緒に用いられる。これは、免疫抑制期間（卵内の動物を守る免疫システムが衰退したが動物それ自身の免疫システムは完全には発達していないところの鶏の生存期間内の期間である）の間の家禽において特に興味深い。鶏にとって、これは該動物生存期間の１０〜２０日目の間である。
【００２１】
これは、腸のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ感染症に対する鶏の抵抗性を増すことにおいて特に興味深い。より特には、鶏において、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍにより引き起こされる壊死性腸炎はしばしば、Ｅｉｍｅｒｉａによる感染症によって先行されると考えられる。Ｅｉｍｅｒｉａは、腸の壁を損傷すると考えられ、これは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍによる感染症に対して、それをより抵抗性でないものにする。ラクチレートと１以上の静コクシジウム性成分との組み合わせの使用はそれ故に、壊死性腸炎に対する鶏の増加した抵抗性を与えるであろう。
【００２２】
適当な静コクシジウム性成分は当技術分野で知られており、それらが与えられるべき量も同様に知られている。適当な成分は、マデュラマイシン、ジクラズリル（ｄｉｃｌｒｚｉｌ）、ナラシン、ナイカルバジン、モネンシン、ロベニジン、ラサロシド、ハロフギノン、ナラシン、サリノマイシン、デコキネート、及びセンデュラマイシンを含む。
【００２３】
該組成物は、慣用の動物飼料組成物の成分として動物に与えられる。本発明の文脈において、語「動物栄養物」は、固体の飼料及び液体の飼料、例えば飲料水など、を含む。すなわち、該組成物は、慣用の動物飼料組成物の固体又は液体の成分として又はそれらの飲料水中において固体又は液体の成分として、動物に投与されうる。
【００２４】
該組成物は、慣用の動物飼料組成物の供給から独立して、別のステップにおいて該動物に投与されてもよい。
【００２５】
本発明の一つの実施態様において、該抗バクテリア化合物、特には該ラクチレート又はその塩は、担体に付けられる。これは、固体のパウダー状の形にある該抗微生物性組成物を得る為の簡便な方法を与える。適当な担体は、植物繊維物質、植物炭水化物、例えばセルロースなど、及び無機担体、例えばシリカなど、デンプン、石こう、及び石灰から選ばれる。
【００２６】
他の実施態様において、該抗微生物性化合物は、植物油、例えばコーン油、大豆油又はオリーブ油などを有する混合物中に添加される。
【００２７】
他の実施態様において、該抗微生物性化合物は、タブレット又は動物への医薬成分の供給の為に知られた他の形をしたものの形でもありうる。
【００２８】
該動物に投与される該抗微生物性化合物、特にはラクチレート、の量は、該化合物が投与される該動物においてグラム陽性バクテリアにより引き起こされる腸感染症を処置し又は予防する為に有効であるようなものである。そのような量は適当には、該動物に与えられるそれぞれの飼料の合計重量に対して０．０００１〜５％である。好ましい実施態様において、該量は、該動物に与えられるそれぞれの飼料の合計重量に対して０．００１〜２％でありうる。国際公開第２００４／１０７８７７号パンフレットにおいて記載されるとおりの乳酸の使用と比較して、該有効成分のより低い濃度を使用することが可能でありうることが発見された。国際公開第２００４／１０７８７７号パンフレットの実施例では１．２重量％の乳酸が用いられるのに対して、本発明に従い例えばラクチレートの使用は、活性成分の減少された量の使用を許す。従って、本発明の一つの実施態様において、該量は、該動物に与えられるそれぞれの飼料の合計重量に対して０．００１〜１重量％、より特には０．００１〜０．５重量％でありうる。必要な量を決定することは当業者の範囲内である。
【００２９】
もしそのように望まれるならば、該量は、該動物においてグラム陽性バクテリアＣｌｏｓｔｒｉｄｉａ関連腸炎により引き起こされる感染症を処置し又は予防する為に有効である為に該化合物について要求されるよりも多くてよい。これは、該化合物が、成長を促し、飼料対獲得比（feed  to  gain  ratio）を改善する為に作用もする場合、及び／又は動物飼料において施与されたアミノ酸の消化率を改善する場合にあてはまりうる。
【００３０】
上記で言及されたとおり、該抗バクテリア化合物は、動物に、慣用の動物飼料組成物の成分として投与されうる。慣用の動物飼料組成物は、コムギ、デンプン、肉及び骨粉、トウモロコシ、ヒマワリ粉末、コーン、穀草類、オオムギ、大豆粉末、タピオカ、シトラスパルプ、マメ、ビートパルプ等を含みうる。本発明に従い、グラム陽性バクテリアによる腸感染症を処置し又は予防する為の動物への抗バクテリア化合物の供給は、一般に、抗生物質の供給と一緒にされないであろう。
【００３１】
国際公開第２００４／１０７８７７号パンフレットにおいて、乳酸又は乳酸誘導体は、窒素、硫黄、及びリンを含む酸から選択される無機酸と一緒に用いられる。該無機酸は、該動物内の全通過（total  passage）の間に糜粥のｐＨを低下すると考えられ、それにより解離していない乳酸の存在を増加し、これが病原体の外膜を崩壊させると示されている。
【００３２】
対照的に、本発明は、解離していない乳酸の存在に依存しない。それ故に、本発明は、糜粥中のｐＨを低める為の無機酸の存在を要求しない。
【００３３】
従って、本発明は、グラム陽性バクテリアにより引き起こされる腸感染症の予防又は処置において、上記で記載された抗バクテリア化合物、特には式１に従うラクチレートの使用方法にも関し、ここでそのような使用方法は、解離していない乳酸の存在を増加する為の窒素、硫黄及びリン含有酸から選ばれる無機さんの使用を伴わない。
【００３４】
本発明はさらに、以下の実施例により説明され、これは、本発明がそこに又はそれにより限定されること無く、この発明の発明に関する利点を示す。
【実施例１】
【００３５】
実施例１：鶏における壊死性腸炎に対するナトリウムラウロイルラクチレートおよびナトリウムミリストイルラクチレートの混合物の有効性
【００３６】
鶏における壊死性腸炎に対するナトリウムラウロイルラクチレートとナトリウムミリストイルラクチレートとの混合物の有効性が、Ｓｃｈｏｔｈｏｒｓｔ  Ｆｅｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈにより、彼らが開発した実験的Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ感染モデル（コクシジウム感染症が、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓにとって、小腸にコロニー形成し及び壊死性腸炎を引き起こす為のプレトリガー（a  pretrigger）として用いられる）において評価された。コクシジウム感染症が、病原体のＥｉｍｅｒｉａ  ｍａｘｉｍａにより開始され、そして、コクシジウム感染症のピークで、鳥が、ブロイラー鶏に対して病原性であると判明したＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ株を接種される。Ｅ．ｍａｘｉｍａにより引き起こされるコクシジウム感染症（小腸の中央区域（middle  segment）において病変を結果する）及び続くＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ感染症は、非常に再現性の良いモデルを結果し、そして、壊死性腸炎病変についての簡単且つ正確なスコアリング方法を結果する。なぜなら、Ｅ．ｍａｘｉｍａ及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍの病変は区別するのが容易であり、同時に、両病原体の病変は、同じ小腸区域に発生しないからである。該実験は、Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（ＧＤ）と協力して実施される。
【００３７】
該実験は、１つの処置及び２つの対照処置から構成された。全ての処置は、１ケージ当たり１９のブロイラーを有する、６つの複製ケージから構成された。該処置が、表１に与えられる。
【００３８】
【表１】
0005461432.tif 000003
【００３９】
動物、管理及び手順
１日齢のオスのＲｏｓｓ  ３０８ブロイラー鶏が、Ｐｒｏｂｒｏｅｄ  ＆  Ｓｌｏｏｔ  Ｂ．Ｖ．（オランダ）により供給された。０日目で、ブロイラーが、Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（Ｄｅｖｅｎｔｅｒ、オランダ）の研究施設に到着し、そして、個別の計量後に、消化性ケージ（digestibility  cages）中に収容された。重量クラスシステムに基づき、１９の鳥が３０のＳｃｈｏｔｈｏｒｓｔわら床（litter  floor）消化性ケージに割り当てられ、１ケージ当たり同様の平均体重を結果した。ブロイラーは、これらのケージ中で、２０日目での実験の終わりまで収容された。９日目で、もし死亡が発生しなければ、鶏の数は、１７へと標準化され、そして、鳥の体重が再度測定された。第一に、明らかな視覚上の異常を有する鳥は除かれ、そして第二に、鳥は無作為に除かれて１７へと数を減少させた。実験期間を通じての照明及び温度のスケジュールは以下の通りであった、０日目〜９日目の第一の期間において、２２時間の照明に続き２時間の暗闇、続いて実験の残りを通じて１８時間の照明及び６時間の暗闇。環境温度は、開始での３２℃から、実験の終わりでの２５℃へと徐々に減少された。
【００４０】
飼料は、接種（９、１４、１５及び１６日目）及びセクション（sections）（１５、１６日目及び２０日目）の前の５時間を除き、０日目以降は不断給餌で与えられた。水は、実験を通じて不断給餌で利用可能であった。
【００４１】
飼料組成物
ブロイラーは、到着の日から９日目までコムギ／大豆粉末に基づくスターター食餌（starter  diet）を供給された。９日目以降は、コムギ／オオムギに基づくグローワー食餌（grower  diet）が、実験の終わり（２０日目）まで与えられた。グローワー飼料は、飼料製造後の試験製品における均一な混合の必要性の故に、粉末として与えられた。食餌は、抗コクシジウム剤を何も含まず、試験製品以外の抗微生物性飼料添加物を何も含まなかった。該実験食餌の栄養組成は、ブロイラーの栄養要求を満たすために、オランダの基準に従った（ＣＶＢ、２００６）。
【００４２】
接種
９日目で、ブロイラーは、５時間の飼料離脱期間後に、１ｍｌの生理食塩水又はＥ．ｍａｘｉｍａ（１ｍｌ中に、１０．０００の胞子形成オーシスト／鶏）のいずれかを接種された。１４日目から先は、ブロイラーは、１ｍｌの肝臓ブロス（ＤＩＦＣＯ）又はＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓを１日当たり１回、続く３日間、５時間の飼料脱離後に、接種された。種々の処置の詳細な概説は表１に提示されている。
【００４３】
病原性Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ株が、Ｄｅｖｅｎｔｅｒ、オランダ、のＡｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅから得られた（１ｍｌ中に１０８ｃｆｕ）。該株は、ヒツジの血液のアガー上で増殖され、そして培養物は、ＣＩＤＣ（ＬｅｌｙｓｔａｄのＣｅｎｔｒａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）により、αタイプ及びβ２タイプの毒素を生成するＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓとして分類される。日ごとに、新鮮に調製された接種材料が用いられた。
【００４４】
病変スコアリング
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ：大きな（gross）及び顕微鏡的な病変が一般に、小腸に発生し、特に近位部（the  proximal  site）に、発生する。以下のスコアリング方法が用いられた：
０：病変無し
１：１〜５の小さな病変（１ｍｍ未満の直径のスポット）
２：５超の小さな病変（１ｍｍ未満の直径のスポット）又は１〜５のより大きな病変（１〜２ｍｍの直径のスポット）
３：５超のより大きな病変（１〜２ｍｍの直径）又はびらん性領域
４：死亡した鳥、死亡後に陽性の壊死性腸炎との診断を有する
全ての鳥は、「盲検法（blind）」でスコア化された。すなわち、病変について鳥をスコア化する人は、該鳥の処置の知識を有さなかった。
【００４５】
測定
実験の間、以下のパラメーターが測定された：
・到着の日での個別の体重及び、実験の9日目及び２０日目でのケージ当たりの平均
・死体解剖の前の鳥の体重
・０〜９日目の期間のケージ当たりの飼料摂取量及び９〜２０日齢（from  9-20  days  of  age）の日ごとの飼料摂取量
・実験の１５日目、１６日目及び２０日目での処置当たりの24の鳥の小腸粘膜におけるコクシジウム症の病変及び壊死性腸炎病変（処置当たり７２の鳥の合計）
・０〜２０日齢（from  0  to  20  days  of  age）のケージ当たりの死亡率
全てのルーチンの研究活動、健康異常の日ごとの記録、及び死亡率の日ごとの記録（その最もあり得る原因を伴う）が、維持された。
【００４６】
統計的分析
生のデータが、外れ値（outliers）について分析された。有意な外れ値が該統計分析から除外された。ＮＥ−病変の発生率（感染した鳥の％）が、フィッシャーの正確確立検定（Fisher  Exact  Test）により分析され、一方で病変の重症度及び日毎の飼料摂取量測定は、Ｇｅｎｓｔａｔ統計ソフトウェアを用いて、分散分析（ＡＮＯＶＡ）により分析された。処置の平均が、最小有意差（ＬＳＤ）により比較された。Ｐ≦０．０５が、統計的に有意であるとみなされる一方で、０．０５＜Ｐ≦０．１０は有意に近いトレンドであるとみなされた。
【００４７】
結果及び考察
【００４８】
病変の発生率及び重症度
【００４９】
１５日目での病変スコアリング（感染後１日）
表２において、陽性とスコア化された鳥（ＮＥ病変を有する鳥）のパーセンテージが、すべての陽性とスコア化された鳥の平均病変スコアと同様に与えられる。すべての試験された鳥の平均病変スコア（感染した及び感染していない）が、母集団についてのより代表的な像を与えるので、統計的分析は、これらの結果にわたって実施された（表２の第５カラムを参照されたい）。陽性及び陰性とスコア化された鳥の両方における病変の重症度が、０〜４のスケールで示される（段落「病変スコアリング」を参照されたい）。
【００５０】
【表２】
0005461432.tif 000004
【００５１】
有意な処置効果が、ＮＥ発生率について観察された。予測されたとおり、最も低い発生率が、感染していない対照処置において観察されたが、結果は、該試験混合物を補われた処置及び補われていない感染した対照の結果と比較可能である。
【００５２】
ＡＮＯＶＡに基づき、１５日目での壊死性病変の重症度に対する有意な処置効果があること（Ｐ＜０．００１）が結論付けられた。病変重症度について、感染した処置（補われていない及び補われた）において、感染していない対照処置よりも、病変はより重度であることが明白であった。なぜなら、後者において陽性とスコア化された鳥は無かったからである。感染した処置のうちで、統計的差異は観察されなかった。
【００５３】
１６日目での病変スコアリング（感染後２日）
表３において、陽性とスコア化された鳥のパーセンテージ及び鳥の平均病変スコアが、１６日目について与えられる。
【００５４】
【表３】
0005461432.tif 000005
【００５５】
１６日目についてのＮＥ発生率及び病変重症度の結果と１５日目の結果とを比較すると、感染の重症度は、感染後２日でより高いことが明らかである。やはり有意な処置効果がＮＥ発生率について観察されたが、これは、感染していない対照処置及び感染した処置の間の差異に起因することが明らかであり、これは予測されるとおりであり、一方で感染した処置のあいだで、観察された有意な差異は無かった。
【００５６】
はっきりした区別が、感染後２日の病変重症度について描かれうる。該試験混合物を補われた処置は、平均病変スコアは感染していない対照よりもなお高かったが、感染した補われていない対照と比較して病変重症度において明白な減少を結果した。
【００５７】
２０日目での病変スコアリング（感染後６日）
２０日目で、有意な差異は、処置の間で観察されなかった。すべての処置が、少なくとも顕微鏡評価に基づき、０％発生率及び病変重症度について明らかに０．０を伴い、ＮＥから回復させた。
【００５８】
死亡率
死亡率は、集団におけるＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍによる感染症の重症度を測定する為のパラメーターの一つである。この実験において、死亡率は、処置間で比較された。死亡率は、感染した対照処置（処置２）において１４．６％であり、そして、感染していない対照において０％であった。試験混合物の補給は、死亡率の減少を結果した（５．１％）。
【００５９】
生産パラメーター
病変スコアリングに加えて、体重及び日毎の飼料摂取量のような生産パラメーターが、試験期間中に測定された。
【００６０】
１日齢ブロイラーの体重は、全ての処置において約４７グラムであった。０日目〜９日目の処置が同様であったので、体重増加及び飼料摂取量における差異はこの期間において観察されなかった。
【００６１】
９日目〜２０日目までの感染期間において、両方の生産パラメーターは、個々の処置によって有意に影響された。体重増加は、予想されたとおり、感染していない対照において最も高く、一方で、感染した補われていない処置におけるブロイラーは、最低の体重増加を示した。これは、２０日目で、３０％のより低い最終重量を結果した（５２３ｇ対７４９ｇ）。感染した補われた処置は、感染した補われていない対照と比較して、有意により高い飼料摂取量及び体重増加を結果した。生産パフォーマンスにおける減少は１０％で減少され、感染していない対照集団と比較したときに、約２０％の最終体重における損失を示す（約５８３ｇ対７４９ｇ）。試験混合物は、無症状のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ感染の間に、生産パフォーマンスを有意に増加した。
【実施例２】
【００６２】
実施例２：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍに対するラクチレートのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験
【００６３】
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  ＡＴＣＣ  １３１２４の液体培養物が、１０ｍｌのブレインハートインフュージョン培地（Ｏｘｏｉｄ  ＣＭ２２５、ベージングストーク、英国）を有するスクリューキャップチューブ（１００×１６ｍｍ）中で、３０℃で２４時間、増殖された。種々の量のラクチレートを有するブレインハートインフュージョン培地が調製された。該培地のｐＨは、６．０へと、９Ｍの硫酸により、Ｂｌｕｅｌｉｎｅ  １６  ｐＨ（ミクロ）プローブを備えられたＨａｎｄｙｌａｂ  ｐＨ１２ｐＨメーター（ｎｏ．２８５１２９１６３）を用いて調整された。全ての培地が、０．４５μｍセルロースアセテートフィルター（Ｍｉｎｉｓａｒｔ  ｓｙｒｉｎｇｅｆｉｌｔｅｒ、ｓｔｅｒｉｌｅ  ａｎｄ  ｎｏｎ−ｐｙｒｏｇｅｎｉｃ、ｎｏ．１６５５５、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ゲッティンゲン、ドイツ）を用いたろ過により滅菌された（９）。３００μｌの夫々の培地が、滅菌されたＢｉｏｓｃｒｅｅｎ  ｈｏｎｅｙｃｏｍｂｅ  １００  ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｏｙ、Ｖａｎｔａａ、フィンランド）のパネルへ移された。完成したウェルプレートは、さらなる使用まで、−３０℃で貯蔵された。
【００６４】
ウェルプレートは、３μｌの培養物を、滅菌Ｈａｍｉｌｔｏｎリピーティングディスペンサー（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｂｏｎａｄｕｚ、スイス）を用いて接種された。試験生物の増殖速度が、Ｂｉｏｓｃｒｅｅｎ  Ｃ培養システム（Ｏｙ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｃｕｒｖｅｓ  ＡＢ  Ｌｔｄ、ヘルシンキ、フィンランド）により、３０℃で決定された。低い酸素条件を確保する為に、該Ｂａｉｏｓｃｒｅｅｎは、タイプＭ−１２酸素センサーを備えられた嫌気的キャビネット（Ｉｎ  Ｖｉｖｏ２  ４００  低酸素ワークステーション、Ｂｉｏｔｒａｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｌｃ、Ｂｒｉｄｇｅｎｄ、英国）の内側に置かれた。酸素圧は、Ｒｕｓｋｉｎｎガスミキサーモジュール（Ｂｉｏｔｒａｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｌｃ）を用いて０％酸素に制御された。該Ｂｉｏｓｃｒｅｅｎ  Ｃは、濁度の発達を、垂直フォトメトリーにより、最大で２００ウェルにおいて同時に動力学的に測定する。該培養物の光学密度は、ワイドバンドフィルターを用いて、４２０〜５８０ｎｍで一定の時間間隔で自動的に測定された。
【００６５】
表４は、ブレインハートインフュージョン培地中で、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  ＡＴＣＣ  １３１２４について試験された種々のラクチレートについてのＭＩＣ値を示す。丸括弧内に、繰り返しの数が与えられている。ＭＩＣは、最小発育阻止濃度（Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を表し、これは培養物の吸光度の増加が閾値（これはブランクの球光度値における平均増加プラス３掛ける標準偏差として定義された）を越えなかったところの最低濃度である。
【００６６】
非常に低い濃度のラクチレートでさえ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの増殖を抑制することができることが明らかである。
【００６７】
【表４】
0005461432.tif 000006
【実施例３】
【００６８】
実施例３：鶏における壊死性腸炎に対するナトリウムラウロイルラクチレート及びナトリウムミリストイルラクチレートの混合物の用量応答研究及び予防研究
【００６９】
実施例１と同様に、該化合物の用量の影響が研究された。さらに、Ｅｍｅｒｉａ及びＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍによって先に感染されていない鶏についての該混合物の使用が研究された。
【００７０】
実施された処置が表５に要約される。
【００７１】
【表５】
0005461432.tif 000007
【００７２】
結果は以下の通りに要約されうる。
【００７３】
この実験において、Ｅ．ｍａｘｉｍａ及びＣ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓによる続く感染は、感染後最初の２日の間で、５６％の壊死性腸炎の発生率を結果し及び１．６の平均病変スコアを結果した。試験混合物により鳥の食餌を補うことは、感染した鳥の数の減少させ、そして、用量応答効果が観察され、０．６％及び０．３％処置において最高の有効性を示した。病変重症度は、試験混合物補充に起因して、有意に減少され、そして、用量応答効果も、このパラメーターについて強く存在もした。病変は、試験混合物の最高用量による処置においてより重度でなかった。純粋な形で補給された試験混合物は、シリカ担体を介して補給された試験混合物よりも、いくぶんより良い応答を結果した。０．６％での試験混合物の補給は、死亡率における有意な減少を結果し（４．６％）、そして、感染していない対照処置よりも、有意により高くなかった。０．３％試験混合物による結果は、該病変スコアリングにおいて観察された結果を支持した。
【００７４】
生産パフォーマンスに関して、効果が、試験混合物補給を有する又は有さない健康な鳥を互いに比較したときに、観察された。試験混合物の供給は、スターターフェーズ（starter  phase）及びグローワーフェーズ（grower  phase）において体重を増加する傾向にあった。感染した鳥をより高い用量の試験混合物により補うことは、全く感染していなかった鳥と同様の最終体重（３７日目）を有する鳥を結果した。
【００７５】
試験混合物、特には０．３重量％以上の用量における試験混合物が、ブロイラーにおける壊死性腸炎発達を予防することにおいて、より低い発生率及びより重度でない病変を示すことにより、有効であることが結論付けられうる。