(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象とする少なくとも１つの異種タンパク質を発現するのに最適なＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）宿主細胞集団を同定する方法であって、
ａ）４以上のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主細胞集団を同じアレイに提供するステップであって、前記Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主細胞集団が物理的に相互に離れており、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主細胞の各集団が、
i）プロテアーゼをコードする少なくとも１つの標的遺伝子の発現が低減するように遺伝子改変されている少なくとも１つのＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主細胞集団、
ii）タンパク質のプロセシング、フォールディングまたは移行を調節するタンパク質をコードする少なくとも１つの標的遺伝子の発現が増大するように遺伝子改変されている少なくとも１つのＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主細胞集団、ならびに
iii）プロテアーゼをコードする少なくとも１つの標的遺伝子の発現が低減するように、かつ、タンパク質プロセシング、フォールディングまたは移行を調節するタンパク質をコードする少なくとも１つの標的遺伝子の発現が増大するように遺伝子改変されている少なくとも１つのＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主細胞集団
からなる群から選択されるステップ（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主細胞の各選択された集団は同一でない）と、
ｂ）対象とする少なくとも１つの異種タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む発現カセットを、前記アレイのＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主細胞の各集団に導入するステップと、
ｃ）前記対象とする少なくとも１つの異種タンパク質の発現に十分な条件下で前記アレイの前記Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主細胞集団を維持するステップであって、前記細胞集団はステップ（ｂ）で前記発現カセットを導入されたものであるステップと、
ｄ）前記対象とする少なくとも１つの異種タンパク質を発現するための前記アレイの最適なＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主細胞を選択するステップと
を含み、前記最適なＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主細胞集団で発現された前記対象とする異種タンパク質が、前記アレイにおける他のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主細胞集団で発現されたものと比較して改善された発現、改善された活性、改善された溶解性、改善された移行、または低減したタンパク分解のうち１つまたは複数を示す方法。
【請求項２】
前記発現カセットが、前記対象とする異種タンパク質に作動可能に連結したシグナリングペプチドをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記シグナリングペプチドが分泌シグナルペプチドである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記発現カセットが、前記発現カセットが導入されるＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主細胞集団に由来するシグナリングペプチドを含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記アレイが、前記アレイのハイスループットスクリーニングを可能にするフォーマットである、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記フォーマットが９６ウェルフォーマットである、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質生産(production)の分野に属し、詳細には、適切にプロセシングされた異種タンパク質の大規模生産に最適な宿主細胞の同定に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオテクノロジー薬物およびワクチンとしての使用について、１５０種を超える、組換えにより産生されたタンパク質およびポリペプチドが米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されており、さらに３７０種が臨床試験中である。化学合成を介して生産される小分子治療薬と異なり、タンパク質およびポリペプチドは、生細胞内で最も効率的に産生される。しかし、細菌内における組換えタンパク質産生の現在の方法はしばしば、不適切にフォールディングされたタンパク質、凝集したタンパク質または不活性なタンパク質を産生し、そして多くのタイプのタンパク質が二次修飾を必要とするが、それらの修飾は、既知の方法を用いて行うと非効率的である。
【０００３】
組換え系における、適切にフォールディングされたタンパク質の産生を増大させるために、多数の試みが開発されている。例えば、研究者たちは、発酵条件を変えるか（Ｓｃｈｅｉｎ（１９８９）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、７：１１４１〜１１４９）、プロモーター強度を変えるか、または過剰発現させたシャペロンタンパク質を使用しており（Ｈｏｃｋｎｅｙ（１９９４）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：４５６〜４６３）、これらは、封入体の形成を防止するのに役立ち得る。
【０００４】
細胞から上清中にタンパク質を排出させるために、複数の方法(strategies)が開発されている。例えば、米国特許第５，３４８，８６７号、米国特許第６，３２９，１７２号、ＷＯ９６／１７９４３、ＷＯ０２／４０６９６および米国特許出願公開第２００３／００１３１５０号を参照。増大した発現を得るための他の方法は、タンパク質をペリプラズム(periplasm、周辺質)にターゲティングすることに向けられている。一部の研究は、非Ｓｅｃ型の分泌に焦点をおいている（例えば、ＷＯ０３／０７９００７、米国特許出願公開第２００３／０１８０９３７号、米国特許出願公開第２００３／００６４４３５号およびＷＯ００／５９５３７を参照）。しかし、大部分の研究は、Ｓｅｃ型分泌系を用いた外因性タンパク質の分泌に焦点をおいてきた。
【０００５】
組換えポリペプチドまたはタンパク質の発現に使用するために、多くの分泌シグナルが記載されている。例えば、米国特許第５，９１４，２５４号、米国特許第４，９６３，４９５号、欧州特許第０  １７７  ３４３号、米国特許第５，０８２，７８３号、ＷＯ８９／１０９７１、米国特許第６，１５６，５５２号、米国特許第６，４９５，３５７号、第６，５０９，１８１号、第６，５２４，８２７号、第６，５２８，２９８号、第６，５５８，９３９号、第６，６０８，０１８号、第６，６１７，１４３号、米国特許第５，５９５，８９８号、第５，６９８，４３５号および第６，２０４，０２３号、米国特許第６，２５８，５６０号、ＷＯ０１／２１６６２、ＷＯ０２／０６８６６０および米国特許出願公開第２００３／００４４９０６号、米国特許第５，６４１，６７１号ならびに欧州特許第０  １２１  ３５２号を参照。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
異種タンパク質産生はしばしば、不溶性タンパク質または不適切にフォールディングされたタンパク質の形成をもたらし、それらは、回収が困難であり、かつ不活性であり得る。さらに、特定の宿主細胞プロテアーゼの存在によって、対象とするタンパク質(protein of interest)が分解され、それによって最終収率が低下し得る。全ての異種タンパク質の産生を改善する単一の因子は存在しない。結果として、当技術分野では、組換えポリペプチドを分泌し、その適切なプロセシングを行って、適切にプロセシングされた形態でトランスジェニックタンパク質を産生することができる、改善された大規模発現系を同定する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、収率および／または質が改善された望ましい仕様(desired specification)に従って、少なくとも１種の異種ポリペプチドを産生できる宿主細胞集団を迅速に同定するための組成物および方法を提供する。組成物は、タンパク質産生(production)に関与する１つまたは複数の標的遺伝子の発現が増大するように、タンパク質分解(degradation)に関与する１つまたは複数の標的遺伝子の発現が低下するように、またはタンパク質産物に影響を与える異種遺伝子を発現するように、またはその組合せとなるように遺伝子改変されている２つ以上の宿主細胞集団を含む。対象とするポリペプチドを様々な改変宿主細胞で発現する能力は、対象とするポリペプチドに最適な宿主細胞を決定するための迅速かつ効率的な手段を提供する。望ましい仕様は、対象とするポリペプチドに応じて異なるが、それには、収率、質および活性などが含まれる。
【０００８】
対象とするポリペプチドの発現を促進する内因性配列および／または外因性配列の発現レベルに影響を与える核酸配列の多数の組合せを発現するように宿主細胞集団を改変できることが認識されている。一実施形態では、２つ以上の宿主細胞集団が、対象とする異種タンパク質の適切な発現、プロセシングおよび／または移行のうち１つまたは複数に関与する１つまたは複数の標的遺伝子の発現が増大するように遺伝子改変されている。別の実施形態では、標的遺伝子はタンパク質フォールディング調節因子である。別の実施形態では、タンパク質フォールディング調節因子は表１のリストから選択される。
【０００９】
別の実施形態では、１つまたは複数の宿主細胞集団が、タンパク質分解に関与する１つまたは複数の標的遺伝子の発現が低下するように遺伝子改変されている。別の実施形態では、標的遺伝子はプロテアーゼである。別の実施形態では、プロテアーゼは表２のリストから選択される。
【００１０】
一実施形態では、対象とするタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、本明細書に記載の、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのＳｅｃ系分泌シグナルに作動可能に連結(operably linked)されている。アレイ内の株のうち１つまたは複数が、対象とする異種タンパク質をペリプラズム区画に発現し得る。特定の実施形態では、１つまたは複数の株が、外側細胞壁を通して細胞外に異種タンパク質を分泌し得る。
【００１１】
宿主細胞には、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞および植物細胞などを含めた真核細胞、ならびにＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓおよびＥ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞を含めた原核細胞が含まれる。
【００１２】
示されているように、異種発現されたタンパク質の、改善された収率および／または質を有する（１つまたは複数の）特定の株を同定するために、宿主細胞集団のライブラリーを迅速にスクリーニングできる。株アレイは、治療用タンパク質、ホルモン、成長因子、細胞外受容体またはリガンド、プロテアーゼ、キナーゼ、血液タンパク質、ケモカイン、サイトカインおよび抗体などを含めた、対象とするいかなるタンパク質の発現改善のスクリーニングにも有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】図１Ａは、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓにおけるゲノム欠失を遺伝子工学処理するために使用したプラスミドｐＤＯＷ１２６１−２を示す図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、遺伝子Ｘ欠失の構築の概略図である。
【図２】図２は、Δｐｒｃ１、ΔｄｅｇＰ２、ΔＬａ２およびｇｒｐＥｄｎａＫＪ同時発現菌株（実施例６）において誘導後０および２４時間で調製した可溶性細胞分画（それぞれＩ０およびＩ２４）のウエスタンブロット分析の図である。上部矢印は、対照（ＤＣ４４０）ではなく同時発現菌株において完全に構築されたモノクローナル抗体を指す。ｒ＝組換え体(recombinant)；ｎ−ｒ＝非組換え体(nonreconbinant)。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
これより、本発明の全ての実施形態ではなく、それらの一部が示されている添付図面を参照して、以下に本発明をより完全に説明する。実際、これらの発明は、多くの異なった形態で具体化でき、本明細書に示す実施形態に限定して解釈するべきではなく、これらの実施形態は、この開示が適用される(applicable)法的必要条件を満たすように提示されている。
【００１５】
以上の説明と添付図面とに提示されている教示の恩恵により、これらの発明が属する分野の当業者ならば、本明細書に示す本発明の多くの変更形態および他の実施形態が想起されよう。
【００１６】
したがって、本発明は、開示されている特定の実施形態に限定されるものではなく、変更形態および他の実施形態も本発明の範囲に含まれるものであることを理解されたい。本明細書では特定の用語が用いられているが、それらは包括的および説明的な意味でのみで用いられており、限定を目的としたものではない。
【００１７】
概要(Overview)
宿主細胞内で適切にプロセシングされた高レベルの異種ポリペプチドを産生するのに最適な宿主株(optimal host strain)、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主株を同定するための組成物および方法を提供する。詳細には、ライブラリー内の各株（または「宿主細胞の集団」）が、宿主細胞内の１つまたは複数の標的遺伝子の発現を調節するように遺伝子改変されている宿主株のライブラリー（または「アレイ」）を提供する。「最適な宿主株」は、アレイ内の、表現型が異なる宿主細胞の他の集団と比較した、対象とする発現タンパク質の量、質および／または位置に基づいて同定または選択できる。したがって、最適な宿主株は、対象とするポリペプチドを望ましい仕様に従って産生する株である。望ましい仕様は、産生されるポリペプチドに応じて異なるであろうが、仕様には、タンパク質の質および／または量、そのタンパク質が隔離(sequestered)されるか、または分泌されるか、ならびにタンパク質フォールディングが含まれる。
【００１８】
「異種(heterologous)」、「異種発現された(heterologously expressed)」または「組換え(recombinant)」は通常、宿主細胞で内因的に生じたのではないか、または、それがその中に存在している天然ゲノムにおける位置で内因的に生じたのではなく、感染、形質移入、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、マイクロプロジェクション、または同様の方法によって細胞に添加された遺伝子またはタンパク質を指す。
【００１９】
アレイ内の宿主細胞集団のうち１つまたは複数は、宿主細胞内の１つまたは複数の標的遺伝子の発現を調節するように改変されている。「標的遺伝子(target gene)」とは、宿主細胞内の異種タンパク質産生に影響を与える遺伝子を意味する。異種タンパク質産生に影響を与える標的遺伝子には、異種タンパク質の発現、活性、溶解性、移行、タンパク質分解および／または切断を調節するタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。例えば、標的遺伝子は、宿主細胞プロテアーゼ、タンパク質フォールディング調節因子、転写因子、翻訳因子および分泌調節因子のうち少なくとも１つをコードするものでもよく、または対象とする異種タンパク質の適切な転写、翻訳、プロセシングおよび／または移行に関与する他の任意のタンパク質でもよい。「標的タンパク質(target protein)」は、標的遺伝子の発現の結果として生じるタンパク質またはポリペプチドを指す。１つまたは複数の標的遺伝子の発現および／または活性は、標的遺伝子またはタンパク質の機能に応じて、増大または低下する。例えば、１つまたは複数の宿主細胞プロテアーゼの発現が低下し、一方、１つまたは複数のタンパク質フォールディング調節因子の発現が増大してもよい。
【００２０】
本明細書に記載のアレイは、異種タンパク質または対象とするペプチドの産生に最適な宿主細胞を迅速に同定するのに有用である。異種タンパク質産生はしばしば、不溶性タンパク質または不適切にフォールディングされたタンパク質の形成をもたらし、それらは、回収が困難であり、かつ不活性であり得る。さらに、特定の宿主細胞プロテアーゼの存在によって、対象とするタンパク質が分解され、それによって最終収率が低下し得る。対象とする全てのポリペプチドまたはタンパク質を最適に産生する単一の宿主細胞集団は存在しない。したがって、本発明の組成物および方法を用いて、改変細胞集団のライブラリーから、最適な宿主細胞を迅速かつ効率的に同定できる。その後、対象とするタンパク質を十分な量で産生するために、または商業的生産のために、その最適な宿主株を使用できる。同様に、最適な宿主株に基づいて、対象とするタンパク質の発現用に宿主株を改変できる。
【００２１】
一実施形態では、この方法は、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ細胞の少なくとも第１および第２の集団を含むアレイであって、各集団が、（ｉ）タンパク質分解に関与する少なくとも標的遺伝子の発現が低減するように遺伝子改変されているＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ細胞集団、（ｉｉ）タンパク質産生に関与する少なくとも１つの標的遺伝子の発現が増大するように遺伝子改変されているＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ細胞集団、ならびに（ｉｉｉ）タンパク質分解に関与する少なくとも１つの標的遺伝子の発現が低減するように、かつタンパク質産生に関与する少なくとも標的遺伝子の発現が増大するように遺伝子改変されている少なくとも１つのＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ細胞集団からなる群から選択されるアレイを得るステップと、対象とする少なくとも１つの異種タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む発現コンストラクトを、各集団の少なくとも１つの細胞に導入するステップと；少なくとも１つの細胞集団における前記対象とするタンパク質の発現に十分な条件下で前記細胞を維持するステップと、対象とする異種タンパク質が産生される最適な細胞集団を選択するステップとを含み、アレイ内の各集団が同一でなく、かつ各集団が物理的に相互に離れており、最適な細胞集団では、アレイ内の他の集団と比較して、対象とする異種タンパク質が、改善された発現、改善された活性、改善された溶解性、改善された移行、または低減したタンパク質分解もしくは切断のうち１つまたは複数を示す。
【００２２】
アレイは、宿主細胞プロテアーゼまたはタンパク質フォールディング調節因子の発現を改変するように遺伝子改変されていない宿主細胞（例えばＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主細胞）の集団をさらに含んでもよい。この集団は、野生型株でもよく、または、タンパク質産生、プロセシングまたは移行に関与しない、またはもしくは複数の遺伝子(or or more genes)の発現を変えるように遺伝子改変されている株でもよい（例えば、選択マーカー遺伝子を発現するように遺伝子改変されたものでもよい）。
【００２３】
一実施形態では、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主細胞の各集団は、相互に表現型が異なる(phenotypically distinct)（すなわち「同一でない(non-identical)」）。「表現型が異なる」とは、各集団が、１つまたは複数の標的遺伝子を測定可能に異なった量で産生することを意味する。この実施形態では、１つまたは複数の異なった標的遺伝子の発現を変えるように各株が遺伝子改変されている。宿主細胞の一集団内で複数の標的遺伝子の発現が調節される場合、標的遺伝子の組合せが、ライブラリー内の他の集団とは表現型上異なる。本発明による、表現型が異なる複数の宿主細胞集団を含むアレイは、異種タンパク質または対象とするペプチドを産生するのに有用な１つまたは複数の株をそれから選択する多様な集団を提供するものである。当業者ならば、そのようなアレイが、宿主細胞の任意の１つまたは複数の集団の複製(replicates)（例えば二つ組(duplicates)、三つ組(triplicates)など）も含むことを理解するであろう。
【００２４】
アレイ(Arrays)
迅速にスクリーニングして、異種タンパク質の収率および／または質が改善されている（１つまたは複数の）特定の株を同定できる宿主細胞集団のアレイ（すなわち「株アレイ(strain array)」）をここに提供する。本明細書で使用される場合、「株アレイ」という用語は、アドレス特定されているか、アドレス特定可能な複数の位置を指す（例えば、ディープウェルまたはマイクロウェルなどのウェル）。通常、アレイ内のマイクロウェルまたはマイクロウェル群のそれぞれの位置は既知であり、それによって、対象とする異種タンパク質の発現に最適な宿主細胞の同定が可能となっている。
【００２５】
株アレイは、表現型が異なる複数の宿主株を含む。アレイは、低密度アレイでも、高密度アレイでもよく、約２以上、約４以上、約８以上、約１２以上、約１６以上、約２０以上、約２４以上、約３２以上、約４０以上、約４８以上、約６４以上、約７２以上、約８０以上、約９６以上、約１９２または約３８４以上の宿主細胞集団を含有し得る。
【００２６】
本発明の宿主細胞集団は、マルチウェルまたはディープウェル容器内で維持および／またはスクリーニングできる。この容器は、任意の望ましい数のウェルを含有し得るが、最小限の試薬と比較的少ない数の細胞とを用いて、宿主細胞の各集団を個別かつ同時にスクリーニングするには、小型化された細胞培養マイクロアレイプラットフォームが有用である。このアッセイで有用な典型的なマルチウェルマイクロタイター容器は、限定されるものではないが、１０ウェルプレート、２８ウェルプレート、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、および３８４超のウェルを有するプレートを含めたマルチウェルプレートである。代替として、所望の容積に応じて、チューブ、ホルダー、カートリッジ、ミニチューブ、微量遠心チューブ、クライオバイアル、角型ウェルプレートチューブ、プレート、スラントまたは培養フラスコのアレイを用いてもよい。
【００２７】
容器(vessel)は、対象とする宿主細胞、例えば、シュードモナスを培養および／またはスクリーニングするのに適したいかなる材質で作製されたものでもよい。例えば、容器は、その材質が生体適合性である限り、プラスチックまたは他の人工高分子材料など、容易に殺菌できる材質であり得る。限定されるものではないが、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリビニル化合物（例えばポリ塩化ビニル）、ポリカーボネート（ポリ塩化ビニル）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、セルロース、ガラス、フッ素重合体、フッ素化エチレンプロピレン、ポリビニリデン、ポリジメチルシロキサンおよびシリコンなどを含めた多くの物質が使用できる。
【００２８】
細胞の自動形質転換および自動コロニーピッカーは、所望の細胞の迅速なスクリーニングを容易にする。アレイは、当技術分野で知られているスポッター装置（例えば自動ロボット装置）を用いて作製および／またはスクリーニングできる。
【００２９】
標的遺伝子(Target genes)
本発明の株アレイは、表現型および遺伝子型が異なる複数の宿主細胞集団を含み、アレイ内の各集団は、宿主細胞内の１つまたは複数の標的遺伝子の発現を調節するように遺伝子改変されている。「標的遺伝子」とは、宿主細胞内の異種タンパク質産生に影響を与える遺伝子を意味する。標的遺伝子は、宿主細胞プロテアーゼまたは内因性もしくは外因性タンパク質フォールディング調節因子、転写因子、翻訳因子、分泌調節因子、または対象とする異種タンパク質の適切な転写、翻訳、プロセシングおよび／または移行に関与する他の任意のタンパク質でもよい。「標的タンパク質」は、標的遺伝子の発現の結果として生じるタンパク質またはポリペプチドを指す。１つまたは複数の標的遺伝子の発現および／または活性は、標的遺伝子またはタンパク質の機能に応じて、増大または低下する。標的遺伝子は、宿主細胞で内因的に生じたものでもよく、またはアレイ内の宿主細胞集団のそれぞれで異種発現された遺伝子でもよい。
【００３０】
一実施形態では、１つまたは複数の標的遺伝子が、タンパク質フォールディング調節因子、推定上のタンパク質フォールディング調節因子、またはフォールディング調節因子の補因子もしくはサブユニットのうち少なくとも１つである。一部の実施形態では、１つまたは複数の標的遺伝子が、シャペロンタンパク質、フォルダーゼ、ペプチジルプロリルイソメラーゼおよびジスルフィド結合イソメラーゼから選択できる。一部の実施形態では、１つまたは複数の標的遺伝子が、ｈｔｐＧ、ｃｂｐＡ、ｄｎａＪ、ｄｎａＫおよびｆｋｂＰから選択できる。Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来の例示的タンパク質フォールディング調節因子を表１に列挙する。
【００３１】
他の実施形態では、標的遺伝子が、推定上のプロテアーゼ、プロテアーゼ様タンパク質、プロテアーゼの補因子またはサブユニットのうち少なくとも１つを含む。例えば、上記１つまたは複数の標的遺伝子が、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン酸またはメタロペプチダーゼであり得る。一実施形態では、１つまたは複数の標的遺伝子が、ｈｓｌＶ、ｈｓｌＵ、ｃｌｐＡ、ｃｌｐＢおよびｃｌｐＸから選択できる。標的遺伝子はプロテアーゼの補因子でもあり得る。Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来の例示的プロテアーゼを表２に列挙する。様々な生物由来のプロテアーゼは、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫによって維持されているＭＥＲＯＰＳペプチダーゼデータベースに見出すことができる（ウェブサイトアドレスｍｅｒｏｐｓ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／を参照）。
【００３２】
タンパク質フォールディング調節因子(Protein folding modulators)
宿主細胞での異種タンパク質産生における別の重大な障害は、しばしば細胞が、可溶性または活性のタンパク質を産生するように適切に装備されていないことである。タンパク質の一次構造はアミノ酸配列によって規定(defined)されるが、二次構造はαへリックスまたはβシートの存在によって規定され、三次構造はジスルフィド結合などの隣接するタンパク質ストレッチ間の共有結合によって規定される。異種タンパク質を発現する場合、とりわけ大規模産生では、そのタンパク質それ自体の二次構造および三次構造が極めて重要である。タンパク質構造におけるいかなる有意な(significant)変化も機能的に不活性な分子または生物活性が有意に低下したタンパク質を生じ得る。多くの場合、宿主細胞は、活性な異種タンパク質の適切な産生に必要なタンパク質フォールディング調節因子(protein folding modulators)（ＰＦＭs）を発現している。しかし、使用可能かつ経済的に満足できるバイオテクノロジー製品を生産するのに通常必要な高レベルでの発現では、細胞は、しばしば、異種発現されたタンパク質をプロセシングするのに十分な天然の１つまたは複数のタンパク質フォールディング調節因子を産生できない。
【００３３】
特定の発現系では、異種タンパク質の過剰産生に、それらのミスフォールディングおよび不溶性凝集体への隔離(segregation)が伴い得る。細菌細胞では、これらの凝集体は封入体として知られている。Ｅ．ｃｏｌｉでは、フォールディング調節因子／シャペロンのネットワークに、Ｈｓｐ７０ファミリーが含まれる。主要なＨｓｐ７０シャペロンであるＤｎａＫは、タンパク質凝集を効率的に防止し、損傷タンパク質のリフォールディングを補助する。タンパク質凝集体への熱ショックタンパク質の取込みによって脱凝集が促進され得る。しかし、特定の場合には、不溶性画分の追加プロセシングを介して、封入体内にプロセシングされたタンパク質が回収され得る。封入体内に見出されたタンパク質は通常、変性(denaturation)および復元(renaturation)を含めた複数のステップを経て精製されなければならない。封入体にターゲティングされたタンパク質の典型的な復元方法は、高濃度の変成剤中に凝集体を溶解する試みと、それに続く、希釈による変成剤の除去とを含む。しばしばこの段階で、凝集体が再形成される。追加の処理はコストを増大させ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏのリフォールディングが生理的に活性のある生成物を産生するであろうという保証がなく、回収されるタンパク質は大量の断片不純物を含み得る。
【００３４】
分子シャペロンおよびフォルダーゼによって、ｉｎ  ｖｉｖｏでのタンパク質フォールディングが補助されており、分子シャペロンはフォールディング中間体と一時的に相互作用することによって他のポリペプチドの適切な異性化および細胞ターゲッティングを促進し、フォルダーゼはフォールディング経路における律速段階を加速するという最近の認識によって、封入体形成の問題と戦うための追加アプローチが提示されている（例えば、Ｔｈｏｍａｓ  Ｊ  Ｇら（１９９７）、Ａｐｐｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６６：１９７〜２３８を参照）。
【００３５】
特定の場合には、シャペロンの過剰発現が、凝集しやすいタンパク質(aggregation-prone proteins)の可溶性収率を増大させることが見出されている（Ｂａｎｅｙｘ，Ｆ．（１９９９）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ、１０：４１１−４２１およびその中の参考文献を参照）。これらのシャペロンの細胞内濃度の増大に伴う有益効果は、過剰産生されるタンパク質の性質に強く依存しているようであり、同じ（１つまたは複数の）タンパク質フォールディング調節因子の過剰発現が全ての異種タンパク質に必要であるとは限らない。
【００３６】
シャペロン、ジスルフィド結合イソメラーゼ、およびペプチジルプロリルシス−トランスイソメラーゼ（ＰＰＩａｓｅ）を含めたタンパク質フォールディング調節因子は、新生ポリペプチドのフォールディング、アンフォールディングおよび分解を補助する、全ての細胞に存在する１クラスのタンパク質である。
【００３７】
シャペロンは、新生ポリペプチドに結合し、それらを安定化し、それらが適切にフォールディングするのを可能にすることによって作用する。タンパク質は、疎水性残基および親水性残基の両方を有し、前者は通常表面に露出しており、一方、後者は構造内に埋められており、それらは構造内で、その分子を取り囲んでいる水ではなく、他の親水性残基と相互作用している。しかし、フォールディング中のポリペプチド鎖では、タンパク質が部分的にフォールディングされた状態またはミスフォールディングされた状態で存在しているので、しばしば、親水性残基がしばらくの間露出する。この間に、生成中のポリペプチドが恒久的にミスフォールディングされた状態になるか、または他のミスフォールディングされたタンパク質と相互作用して、細胞内に大きな凝集体または封入体を形成し得る。シャペロンは通常、部分的にフォールディングされた鎖の疎水性領域に結合し、それらが完全にミスフォールディングするか、他のタンパク質と凝集するのを防止することによって作用する。シャペロンは、封入体内のタンパク質にも結合し、それらが脱凝集するのを可能にできる（Ｒａｎｓｏｎら、１９９８）。フォールディング調節因子のＧｒｏＥＳ／ＥＬ、ＤｎａＫＪ、Ｃｌｐ、Ｈｓｐ９０およびＳｅｃＢファミリーは全てシャペロン様活性を有するタンパク質の例である。
【００３８】
フォールディング調節因子の別の重要なタイプはジスルフィド結合イソメラーゼである。これらのタンパク質は、フォールディングポリペプチドが適切なタンパク質内ジスルフィド結合を形成するのを助ける極めて特殊な１セットの反応を触媒する。２残基以上のシステインを有するいかなるタンパク質も、誤った残基間でジスルフィド結合を形成する危険性がある。ジスルフィド結合生成ファミリーは、Ｄｓｂタンパク質からなり、Ｄｓｂタンパク質は、ペリプラズムの非還元環境におけるジスルフィド結合の形成を触媒する。ペリプラズムポリペプチドがミスフォールディングした場合、ジスルフィド結合イソメラーゼであるＤｓｂＣは、ジスルフィド結合を再編成して、そのタンパク質が正しい結合を再形成するのを可能にできる。
【００３９】
プロリン残基は、そのすぐ前のペプチジル結合がシス配置(conformation)またはトランス配置をとり得るという点で、アミノ酸のなかで独特である。他の全てのアミノ酸について、これは、立体障害のために好ましくない。ペプチジルプロリルシスートランスイソメラーゼ（ＰＰＩａｓｅ）は、この結合の一方の形態からもう一方への変換を触媒する。この異性化は、細胞内におけるタンパク質のフォールディング、リフォールディング、サブユニット集合および輸送の補助となり得る（Ｄｏｌｉｎｓｋｉら、１９９７）。
【００４０】
一般的なシャペロンは非特異的な様式でタンパク質と相互作用するように見えるが、それに加えて、特定の標的のフォールディングを補助するシャペロンも存在する。これらのタンパク質特異的なシャペロンは、それらの標的と複合体を形成し、凝集および分解を防止し、それらが集合して、多重サブユニット構造になるための時間を与える。ＰａｐＤシャペロンは、このタイプのよく知られている一例である（Ｌｏｍｂａｒｄｏら、１９９７）。
【００４１】
フォールディング調節因子には、例えばＨＳＰ７０タンパク質、ＨＳＰ１１０／ＳＳＥタンパク質、ＨＳＰ４０（ＤＮＡＪ関連）のタンパク質、ＧＲＰＥ様タンパク質、ＨＳＰ９０タンパク質、ＣＰＮ６０およびＣＰＮ１０タンパク質、サイトゾルシャペロン、ＨＳＰ１００タンパク質、低分子量ＨＳＰ、カルネキシンおよびカルレティキュリン、ＰＤＩおよびチオレドキシン関連タンパク質、ペプチジルプロリルイソメラーゼ、シクロフィリンＰＰＩａｓｅ、ＦＫ−５０６結合タンパク質、パルブリンＰＰＩａｓｅ、個別のシャペロニング、タンパク質特異的シャペロンまたは分子内シャペロンも含まれる。フォールディング調節因子については、概ね、「Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｆｏｌｄｉｎｇ  Ｃａｔａｌｙｓｔｓ」（１９９７）、Ｍ．Ｇｅｔｈｉｎｇ編集、Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａに記載されている。
【００４２】
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞質中で最も詳細に特徴付けられている分子シャペロンは、ＡＴＰ依存性のＤｎａＫ−ＤｎａＪ−ＧｒｐＥ系およびＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳ系である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究および相同性考察に基づいて、多くの追加の細胞質タンパク質が、Ｅ．ｃｏｌｉで分子シャペロンとして機能していると提唱されている。これらには、ＣｌｐＢ、ＨｔｐＧおよびＩｂｐＡ／Ｂが含まれ、それらは、ＤｎａＫ−ＤｎａＪ−ＧｒｐＥおよびＧｒｏＥＬ−ＧｒｏＥＳのように、ストレスレギュロンに属する熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）である。新生タンパク質鎖では、Ｘ−Ｐｒｏ結合のトランス配座がエネルギー的に支持されるが、天然タンパク質では、全てのプロリルペプチド結合の約５％がシス配座で見出されている。Ｘ−Ｐｒｏ結合のトランスからシスへの異性化は、多くのポリペプチドのフォールディングで律速となっており、ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ペプチジルプロリルシス／トランスイソメラーゼ（ＰＰＩａｓｅ）によって触媒されている。ＳｌｙＤ、ＳｌｐＡおよびトリガーファクター（ＴＦ）という３種の細胞質ＰＰＩａｓｅがこれまでにＥ．ｃｏｌｉで同定されている。ＴＦは、５０Ｓリボソームサブユニットに随伴する４８ｋＤａタンパク質であり、Ｅ．ｃｏｌｉでシャペロンと協力して、新規合成タンパク質の適切なフォールディングを保証すると仮定(postulated)されている。少なくとも５種のタンパク質（それぞれｔｒｘＡ、ｔｒｘＣ、ｇｒｘＡ、ｇｒｘＢおよびｇｒｘＣ遺伝子の産物である、チオレドキシン１および２、ならびにグルタレドキシン１、２および３）が、細胞質酵素内に一時的に生じるジスルフィド架橋の還元(reduction)に関与している。したがって、標的遺伝子は、適切なジスルフィド結合形成を可能にするジスルフィド結合形成タンパク質またはシャペロンであり得る。
【００４３】
【表１】
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【００４４】
プロテアーゼ(Protease)
異種発現されたタンパク質の好ましくない分解は、特定の発現系の効率的な使用に障害を与える。多量の標的タンパク質を産生するように細胞が改変されている場合、細胞はストレス下に置かれ、しばしば他のタンパク質を誘導または抑制することによって反応する。異種タンパク質産生中に宿主細胞が経験するストレスは、例えば、過剰発現した異種タンパク質の分解を引き起こす特定のタンパク質または補因子の発現を増大し得る。代償性の(compensatory)タンパク質の発現増大は、高レベルの活性かつ完全長の異種タンパク質を発現するという目標にとって反生産的であり得る。他のタンパク質の発現低下または適切な発現の不足は、異種発現されたタンパク質のミスフォールディングおよび凝集を引き起こし得る。ストレス下の細胞はタンパク質発現のプロファイルを変えることが知られているが、異種発現された全てのタンパク質が特定の宿主細胞内で同じタンパク質の発現を調節するわけではない。
【００４５】
したがって、１つまたは複数のプロテアーゼ酵素の発現が低下するように遺伝子操作された複数の宿主細胞集団を含むアレイを用いて、最適な宿主株、例えばＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主株を同定できる。一実施形態では、そのゲノムから、少なくとも１つのプロテアーゼの発現を低下させること、阻害すること、または除去することによって、１つまたは複数の宿主細胞集団が改変される。改変は、複数のプロテアーゼに施すこともできる。関連の実施形態では、プロテアーゼ補因子またはプロテアーゼタンパク質の発現を低下させることによって、細胞が改変されている。別の実施形態では、プロテアーゼまたは関連タンパク質のプロモーターの阻害によって、宿主細胞が改変されており、プロモーターは天然のプロモーターであり得る。代替として、遺伝子改変は、標的遺伝子に相同なタンパク質を調節するためのものでもあり得る。
【００４６】
改変宿主株を含むアレイは、下記に論じる通り、対象とする（１つまたは複数の）異種タンパク質を発現させ、タンパク質産生の質および／または量を評価することによってスクリーニングできる。代替として、対象とする異種タンパク質の単離株は、プロテアーゼ欠失宿主細胞集団それぞれから収集された溶解物と共に、独立にインキュベートすることもでき、タンパク分解のレベルを、最適な宿主細胞を同定するのに用いることができる。この実施形態では、最適な宿主細胞集団は、最小量の異種タンパク質分解をもたらすものである。したがって、一実施形態では、最適な宿主細胞集団の溶解物が、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満の異種タンパク質、またはさらに少ないタンパク質によって分解され得る。
【００４７】
例示的な標的プロテアーゼ遺伝子には、アミノペプチダーゼ、ジペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼおよびトリペプチジルペプチダーゼ、ペプチジルジペプチダーゼ、セリン型カルボキシペプチダーゼ、メタロカルボキシペプチダーゼ、システイン型カルボキシペプチダーゼ、オメガペプチダーゼ、セリンプロテイナーゼ、システインプロテイナーゼ、アスパラギン酸プロテイナーゼ、メタロプロテイナーゼまたは作用機序未知のプロテイナーゼと分類されるプロテアーゼが含まれる。
【００４８】
アミノペプチダーゼには、サイトゾルアミノペプチダーゼ（ロイシルアミノペプチダーゼ）、膜アラニルアミノペプチダーゼ、シスチニルアミノペプチダーゼ、トリペプチドアミノペプチダーゼ、プロリルアミノペプチダーゼ、アルギニルアミノペプチダーゼ、グルタミルアミノペプチダーゼ、ｘ−ｐｒｏアミノペプチダーゼ、細菌性ロイシルアミノペプチダーゼ、好熱性アミノペプチダーゼ、クロストリジウムアミノペプチダーゼ、サイトゾルアラニルアミノペプチダーゼ、リジルアミノペプチダーゼ、ｘ−ｔｒｐアミノペプチダーゼ、トリプトファニルアミノペプチダーゼ、メチオニルアミノペプチダーゼ、ｄ−立体特異的アミノペプチダーゼ、アミノペプチダーゼＥｙが含まれる。ジペプチダーゼには、ｘ−ｈｉｓ、ｘ−ａｒｇジペプチダーゼ、ｘ−メチル−ｈｉｓジペプチダーゼ、ｃｙｓ−ｇｌｙジペプチダーゼ、ｇｌｕ−ｇｌｕジペプチダーゼ、ｐｒｏ−ｘジペプチダーゼ、ｘ−ｐｒｏジペプチダーゼ、ｍｅｔ−ｘジペプチダーゼ、非立体特異的ジペプチダーゼ、サイトゾル非特異的ジペプチダーゼ、膜ジペプチダーゼ、β−ａｌａ−ｈｉｓジペプチダーゼが含まれる。ジペプチジルペプチダーゼおよびトリペプチジルペプチダーゼには、ジペプチジルペプチダーゼｉ、ジペプチジルペプチダーゼｉｉ、ジペプチジルペプチダーゼｉｉｉ、ジペプチジルペプチダーゼｉｖ、ジペプチジル−ジペプチダーゼ、トリペプチジルペプチダーゼＩ、トリペプチジルペプチダーゼＩＩが含まれる。ペプチジルジペプチダーゼには、ペプチジルジペプチダーゼａおよびペプチジルジペプチダーゼｂが含まれる。セリンカルボキシペプチダーゼには、リソソームｐｒｏ−ｘカルボキシペプチダーゼ、セリン型Ｄ−ａｌａ−Ｄ−ａｌａカルボキシペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＣ、カルボキシペプチダーゼＤが含まれる。メタロカルボキシペプチダーゼには、カルボキシペプチダーゼａ、カルボキシペプチダーゼＢ、リジン（アルギニン）カルボキシペプチダーゼ、ｇｌｙ−Ｘカルボキシペプチダーゼ、アラニンカルボキシペプチダーゼ、ムラモイルペンタペプチドカルボキシペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼｈ、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＭ、ムラモイルテトラペプチドカルボキシペプチダーゼ、亜鉛ｄ−ａｌａ−ｄ−ａｌａカルボキシペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼＡ２、膜ｐｒｏ−ｘカルボキシペプチダーゼ、チューブリン−ｔｙｒカルボキシペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼｔが含まれる。オメガペプチダーゼには、アシルアミノアシルペプチダーゼ、ペプチジルグリシンアミダーゼ、ピログルタミルペプチダーゼＩ、βアスパラチルペプチダーゼ、ピログルタミルペプチダーゼＩＩ、ｎホルミルメチオニルペプチダーゼ、プテロイルポリ−γ−グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ、γ−ｇｌｕ−Ｘカルボキシペプチダーゼ、アシルムラモイル−ａｌａペプチダーゼが含まれる。セリンプロテイナーゼには、キモトリプシン、キモトリプシンｃ、メトリジン、トリプシン、トロンビン、凝固因子Ｘａ、プラスミン、エンテロペプチダーゼ、アクロシン、α分解プロテアーゼ、グルタミル、エンドペプチダーゼ、カテプシンＧ、凝血因子ｖｉｉａ、凝固因子ｉｘａ、��クミシ(cucumisi)、プロリルオリゴペプチダーゼ、凝固因子ｘｉａ、ブラキウリン、血漿カリクレイン、組織カリクレイン、膵臓エラスターゼ、白血球エラスターゼ、凝固因子ｘｉｉａ、キマーゼ、補体成分ｃ１ｒ５５、補体成分ｃ１ｓ５５、古典的補体経路ｃ３／ｃ５コンバターゼ、補体因子Ｉ、補体因子Ｄ、第二補体経路ｃ３／ｃ５コンバターゼ、セレビシン、ヒポデルミンＣ、リジルエンドペプチダーゼ、エンドペプチダーゼ１ａ、γ−レニ(gamma-reni)、ベノムビンａｂ、ロイシルエンドペプチダーゼ、トリプターゼ、スクテラリン、ケキシン、ズブチリシン、オリジン（ｏｒｙｚｉｎ）、エンドペプチダーゼｋ、サーモミコリン、テルミターゼ、エンドペプチダーゼＳＯ、Ｔ−プラスミノーゲンアクチベータ、プロテインＣ、膵臓エンドペプチダーゼＥ、膵臓エラスターゼｉｉ、ＩＧＡ特異的セリンエンドペプチダーゼ、Ｕ−プラスミノーゲン, 活性化因子(U-plasminogen, activator)、ベノムビンＡ、フリン、ミエロブラスチン、セメノゲラーゼ、グランザイムＡすなわち傷害性Ｔリンパ細胞プロテイナーゼ１、グランザイムＢすなわち傷害性Ｔリンパ細胞プロテイナーゼ２、ストレプトグリシンＡ、トレプトグリシンＢ(trestgrisin B)、グルタミルエンドペプチダーゼＩＩ、オリゴペプチダーゼＢ、リムルス凝固因子ｃ、リムルス凝固因子、リムルス凝血酵素、オンプチン、レプレッサーｌｅｘａ、細菌リーダーペプチダーゼＩ、トガビリン、フラビリンが含まれる。システインプロテイナーゼには、カテプシンＢ、パパイン、フィシン、キモパパイン、アスクレパイン、クロストリパイン、ストレプトパイン、アクチニド、カテプシン１、カテプシンＨ、カルパイン、カテプシンｔ、グリシル, エンドペプチダーゼ(glycyl, endopeptidase)、癌凝血原、カテプシンＳ、ピコルナイン３Ｃ、ピコルナイン２Ａ、カリカイン、アナナイン、幹ブロメライン、果実ブロメライン、レグミン、ヒストリサイン、インターロイキン１−β変換酵素が含まれる。アスパラギン酸プロテイナーゼには、ペプシンＡ、ペプシンＢ、ガストリクシン、キモシン、カテプシンＤ、ネオペンテシン、レニン、レトロペプシン、プロオピオメラノコルチン変換酵素、アスペルギロペプシンＩ、アスペルギロペプシンＩＩ、ペニシロペプシン、リゾプスペプシン、エンドチアペプシン、ムコロペプシン、カンジダペプシン、サッカロペプシン、ロドトルラペプシン、フィサロペプシン、アクロシリンドロペプシン、ポリポロペプシン、ピクノポロペプシン、シタリドペプシンａ、シタリドペプシンｂ、キサントモノナペプシン、カテプシンｅ、バリヤーペプシン、細菌性リーダーペプチダーゼＩ、シュードモナペプシン、プラスメプシンが含まれる。メタロプロテイナーゼには、アトロリシンａ、微生物コラゲナーゼ、ロイコリシン、間質コラゲナーゼ、ネプリリシン、エンベリシン、ｉｇａ特異的メタロエンドペプチダーゼ、プロコラーゲンＮ−エンドペプチダーゼ、チメットオリゴペプチダーゼ、神経溶解素、ストロメライシン１、メプリンＡ、プロコラーゲンＣ−エンドペプチダーゼ、ペプチジル−Ｌｙｓメタロエンドペプチダーゼ、アスタシン、ストロメライシン, ２(stromelysin, 2)、マトリリジンゼラチナーゼ、エアロモノリシン、プソイドリシン、サーモリシン、バシ���リシン、アウレオリシン、ココリシン、ミコリシン、β−分解メタロエンドペプチダーゼ、ペプチジル−Ａｓｐメタロエンドペプチダーゼ、好中球コラゲナーゼ、ゲラチナーゼＢ、リーシュマノリシン、サッカロリシン、自己溶菌酵素、デウテロリシン、セラリシン、アトロリシンＢ、アトロリシンＣ、アトロキサーゼ、アトロリシンＥ、アトロリシンＦ、アダマリシン、ホリリシン、ラバリシン、ボソロパシン、ボソロリシン、オフィオリシン、トリメレリシンＩ、トリメレリシンＩＩ、ムクロリシン、ピトリリシン、インスリシン、Ｏ−シアロ糖タンパク質エンドペプチダーゼ、ルスセリリシン、ミトコンドリア, 間質性, ペプチダーゼ(mitochondrial intermediate peptidase)、ダクチリシン、ナルジリシン、マグノリシン、メプリンＢ、ミトコンドリアプロセシングペプチダーゼ、マクロファージエラスターゼ、コリオリシン、トキシリシンが含まれる。作用機序未知のプロテイナーゼには、サーモプシンおよび多触媒エンドペプチダーゼ複合体が含まれる。
【００４９】
【表２】
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【００５０】
その他のタンパク質修飾酵素(Additional protein modification enzymes)
別の実施形態では、標的遺伝子が、適切なタンパク質プロセシングおよび／または修飾に関与する遺伝子を含む。一般的な修飾には、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、アセチル化、アシル化、リン酸化およびγ−カルボキシ化が含まれ、これらは全て、タンパク質フォールディングおよび生物活性を調節し得る。タンパク質プロセシングに関与する酵素のいくつかのクラスの網羅的ではないリストが表３に示されている。当業者ならば、アレイ用に選択された宿主細胞内で有用であるか、または対象とする異種タンパク質と併用して有用である標的遺伝子を、どのようにして表３に列挙したタンパク質修飾酵素のクラスの中から同定するか認識するであろう。標的遺伝子は、使用される宿主細胞に内因的なものでもよく、または対象とする異種タンパク質が由来する生物に内因的なものもよく、または対象とする異種発現タンパク質の適切なプロセシングを促進することが知られているものでもよい。タンパク質産生に関与するいかなる遺伝子も、対象とする異種タンパク質の望ましい仕様に従ってターゲッティングできることも認識されている。
【００５１】
【表３】
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【００５２】
標的遺伝子の発現を調節する方法(Methods for modulating the expression of target genes)
当技術分野で知られている任意の技法によって、アレイ内の１つまたは複数の宿主細胞集団を改変でき、例えば、ゲノム内の少なくとも１つの標的遺伝子がノックアウトされる技法によって、または少なくとも１つの標的遺伝子の発現が低下するように、遺伝子に変異導入することによって、または少なくとも１つの標的遺伝子の発現が低下するように、標的遺伝子の少なくとも１つのプロモーターを改変することによって、または宿主ゲノム内の標的遺伝子または標的遺伝子の阻害因子を（対象とする異種タンパク質またはポリペプチドと共に）同時発現させることによって改変できる。上記に論じたように、標的遺伝子はアレイ内の宿主細胞集団に内因的なものでもよく、または宿主細胞集団それぞれで異種発現されるものでもよい。
【００５３】
標的遺伝子の発現は、例えば、タンパク質産生に関与する１つまたは複数の標的遺伝子を含む発現ベクターを、宿主集団内の少なくとも１つの細胞に導入することによって増大できる。標的遺伝子発現は、例えば、標的遺伝子のプロモーターに変異導入することによっても増大できる。異種タンパク質を発現する宿主細胞または生物は、タンパク質産生に関与する少なくとも１つの標的遺伝子の発現が増大し、かつタンパク質分解に関与する少なくとも１つの標的遺伝子の発現が低下するように、遺伝子改変することもできる。
【００５４】
ゲノムは、外因性遺伝子またはプロモーターエレメントをゲノム内に、もしくは発現ベクターで宿主内に含めることによって、または特定の標的遺伝子の、ｍＲＮＡもしくはタンパク質産生能力を高めることによって、または標的遺伝子もしくはプロモーターエレメントを除去もしくは破壊することによって、または標的遺伝子の、ｍＲＮＡもしくはタンパク質産生能力を低下させることによって、１つまたは複数の標的遺伝子の発現を調節するように改変できる。例えば、置換、欠失（「ノックアウト」）、同時発現または挿入（「ノックイン」）技法によって、遺伝暗号を改変し、それによって、標的遺伝子の転写および／または翻訳に影響を与えることができる。既存の標的配列の転写を調節する所望のタンパク質または調節配列の追加遺伝子を挿入することもできる。
【００５５】
ゲノム改変(Genome modification)
宿主細胞のゲノムは、遺伝的ターゲッティング事象を介して改変することができ、それは、挿入または組換え、例えば相同組換えによるものであり得る。相同組換えは、配列相同性に基づいたＤＮＡ組換え過程を指す。相同組換えは、内因性遺伝子内における部位特異的な改変を可能にし、それゆえ、ゲノム内の新規な改変が構築できる（例えば、Ｒａｄｄｉｎｇ（１９８２）、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１６：４０５；米国特許第４，８８８，２７４号参照）。
【００５６】
標的遺伝子座の相同組換え用には、様々なコンストラクトが調製できる。通常、コンストラクトは、同定された遺伝子座と相同な少なくとも１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、７０ｂｐ、１００ｂｐ、５００ｂｐ、１ｋｂｐ、２ｋｂｐ、４ｋｂｐ、５ｋｂｐ、１０ｋｂｐ、１５ｋｂｐ、２０ｋｂｐまたは５０ｋｂｐの配列を含み得る。標的遺伝子配列の相同性の程度を決定するには、例えば、標的遺伝子座のサイズ、配列の利用可能性、標的遺伝子座における二重交差事象の相対効率および他の配列との標的配列の類似性など、様々な要件が関与し得る。
【００５７】
改変遺伝子には、改変されるべきゲノム内の、対応する標的配列と実質的に同質遺伝子的なＤＮＡによって、所望の配列改変が挟まれている配列が含まれ得る。「改変遺伝子(modified gene)」は、ゲノム内に導入されて、宿主細胞内のプロテアーゼまたはタンパク質フォールディング調節因子の発現を改変する配列である。「標的遺伝子(target gene)」は、改変遺伝子によって置換される配列である。実質的に同質遺伝子的な配列は、対応する標的配列に、（所望の配列改変を除いて）少なくとも約９５％、９７〜９８％、９９．０〜９９．５％、９９．６〜９９．９％または１００％同一であり得る。改変遺伝子および標的遺伝子は、１００％同一である少なくとも約１０、２０、３０、５０、７５、１５０または５００塩基対のＤＮＡストレッチを共有し得る。
【００５８】
ヌクレオチドコンストラクトは、内因性の標的遺伝子産物を改変するように設計できる。改変遺伝子配列は、結果として生じる遺伝子産物の機能を破壊するように設計された１つまたは複数の欠失、挿入、置換またはこれらの組合せを有し得る。一実施形態では、上記改変が、標的遺伝子の上流配列と、リーディングフレーム内で融合している選択マーカー遺伝子の挿入であり得る。
【００５９】
ゲノムは、挿入不活化を用いて改変することもできる。この実施形態では、遺伝子産物の生成を阻害する遺伝子内の配列の組換えによってゲノムが改変される。この挿入は、別個のエレメントを挿入することによって遺伝子を破壊するか、遺伝子の必須部分を除去することができる。一実施形態では、抗生物質などの特定のストレッサーに対する耐性、または特定の培地中での増殖、例えば必須アミノ酸の産生をコードする遺伝子の挿入も挿入欠失に含まれる。
【００６０】
ゲノムは、トランスポゾンの使用によって改変することもできる。トランスポゾンは、相同組換えとは独立した作用機序によって、原核生物ゲノム内の複数の部位に挿入され得る遺伝的エレメントである。トランスポゾンには、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＴｎ７、Ｔｎ５またはＴｎ１０、Ｓ．ａｕｒｅｕｓにおけるＴｎ５５４、Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のＩＳ９００、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｔｌａｎｔｉｃａ由来のＩＳ４９２、ストレプトミセス由来のＩＳ１１６ならびにＭ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のＩＳ９００が含まれ得る。遺伝子転位に関与すると考えられているステップには、３’ＯＨを生じる、トランスポゾン末端の切断と、トランスポザーゼによってトランスポゾンの３’ＯＨ露出末端と同定された配列とが引き合わされる鎖転移と、同定されたＤＮＡへのトランスポゾンの共有結合を生じる１ステップエステル交換反応とが含まれる。トランスポザーゼによって行われる、鍵となる反応は、ニック形成または鎖交換であり、残りの過程は宿主酵素によって行われると一般的に考えられている。
【００６１】
一実施形態では、標的タンパク質またはその相同体をコードする遺伝子の配列を、組換えによってゲノム内に組込むことによって、標的遺伝子またはタンパク質の発現または活性を増大させる。別の実施形態では、ゲノム内にプロモーターを挿入して、標的遺伝子または相同体の発現を亢進する。別の実施形態では、不活性遺伝子を用いた組換えによって、標的遺伝子またはその相同体の発現または活性を低下させる。別の実施形態では、細胞内で別個の機能を有し得る、または耐性マーカーなどのレポーター遺伝子であるか、もしくは他の方法で検出可能なマーカー遺伝子であり得る異なった遺伝子をコードする配列を、組換えによってゲノム内に挿入できる。さらに別の実施形態では、１つまたは複数の位置で変異導入されている標的遺伝子の少なくとも一部の１コピーを、組換えによってゲノム内に挿入する。この変異バージョンの標的遺伝子は、タンパク質をコードしていなくてもよく、または変異遺伝子によってコードされているタンパク質が不活性でもよく、活性が調節（増大または低下）されていてもよく、または天然タンパク質と比較した際に、変異体タンパクが異なった活性を有することもできる。
【００６２】
細菌で遺伝子をノックアウトするための戦略があり、それらは概ね、Ｅ．ｃｏｌｉで例示されている。１つの経路は、抗生物質耐性の遺伝子（例えばアンピシリン）を含有するベクターに遺伝子内ＤＮＡ断片をクローニングするものである。接合伝達、化学的形質転換またはエレクトロポレーション（Ｐｕｅｈｌｅｒら（１９８４）、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｔｏｋｙｏ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ）を介して細胞を形質転換する前に、栄養プラスミド複製（ｏｒｉＶ遺伝子座）などの複製開始点を切除し、残りのＤＮＡ断片を再連結および精製する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２０００）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）。代替として、ＤＮＡ複製開始点を有する抗生物質抵抗性のプラスミドを用いることもできる。形質転換後に、適切な抗生物質（例えば２００μｇ／ｍＬのアンピシリン）を含有する、例えばＬＢアガープレート上に細胞をプレーティングする。抗生物質を含有するプレート上で増殖するコロニーは、おそらく、相同遺伝子座における、ゲノム内への全ＤＮＡ断片の組込みをもたらす単一の組換え事象を経たものである（Ｓｎｙｄｅｒ，Ｌ．、Ｗ．Ｃｈａｍｐｎｅｓｓら（１９９７）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ、ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ）。所望の遺伝子ノックアウトが所望の遺伝子座で起こったことを確かめる抗生物質耐性細胞のさらなる分析は、例えばＰＣＲ診断による（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｊ．、Ｐ．Ｑｕｉｒｋｅら（１９９１）、ＰＣＲ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）。ここでは、少なくとも２通りのＰＣＲプライマーが設計される。ひとつは、遺伝子ノックアウトの構築に使用されるＤＮＡ領域の外側でハイブリッド形成するものであり、ひとつは、残りのプラスミドバックボーン内でハイブリッド形成するものである。正しいサイズを有するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅に成功して、それに続いてＤＮＡ配列分析を行うことによって、細菌染色体内の正しい位置で遺伝子ノックアウトが起こったことが確認されるであろう。新規に構築された変異体株の表現型は、その後、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分析できる（Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｒ．Ｊ．（２００３）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）。
【００６３】
遺伝子ノックアウトを生成する代替の経路は、ｐＳＣ１０１レプリコンなどの温度感受性レプリコンを使用して、遺伝子置換を促進するものである（Ｈａｍｉｌｔｏｎら（１９８９）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７１（９）：４６１７〜２２）。この過程は、染色体上の遺伝子と、ＤＮＡ複製が温度感受性であるプラスミド上に保持されている相同配列との間の相同組換えによって進行する。このプラスミドを適切な宿主内に導入して形質転換した後、プラスミドが染色体内に組込まれているものを４４℃で選択することが可能である。それに続いてこれらの共組換え体を３０℃で増殖させることによって、第２の組換え事象がもたらされ、その結果、それらの解離が起こる。第２の組換え事象がどこで起こるかに応じて、その染色体が、遺伝子置換を経たものになるか、またはその遺伝子の元のコピーを保持することになる。
【００６４】
特定の遺伝子産物の発現を阻害する他の戦略も開発されている。例えば、特定遺伝子産物の発現の低下または消失さえもたらすために、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、とりわけ低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いたものが、広範に開発されている。ｓｉＲＮＡは、相補的なｍＲＮＡを、分解するためにターゲッティングできる短い二本鎖ＲＮＡ分子である。ＲＮＡｉは、二本鎖ＲＮＡの導入によって相同遺伝子の発現が抑制される現象である。ｄｓＲＮＡ分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、ＲＮＡｉ効果の媒介因子である２１〜２３ｎｔのｓｉＲＮＡにされる。２本鎖ＲＮＡは、導入された際に、Ｄｉｃｅｒと呼ばれるＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素によって、２０〜２５ヌクレオチドのｓｉＲＮＡにプロセシングされる（開始段階）。その後、ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として知られる、エンドリボヌクレアーゼを含有する複合体の中に組み込まれ、この過程で巻き戻される。続いて、ｓｉＲＮＡ鎖は、ＲＩＳＣを相補的なＲＮＡ分子へと導き、そこで、それらは同族のＲＮＡを切断して、破壊する（エフェクター段階）。同族のＲＮＡの切断は、ｓｉＲＮＡ鎖が結合した領域の中央近くで行われる。ＲＮＡｉは、ゼブラフィッシュ、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、昆虫（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、プラナリア、刺胞動物、トリパノソーマ、マウス、および哺乳動物細胞を含めた様々な生物で、遺伝子発現を低減するのに使用され、成功している。
【００６５】
標的遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム内の１または複数ヌクレオチドを変異させることによっても、ゲノムを改変できる。遺伝的変異のため技法、例えば部位特異的変異誘発は、当技術分野でよく知られている。一部のアプローチは、Ｘ線および化学物質によって誘導されるものなど、染色体ＤＮＡにおけるランダム変異の生成に焦点をおいている。
【００６６】
同時発現(Coexpression)
一実施形態では、（１つまたは複数の）標的遺伝子をコードする１または複数種のベクターを含めて、異種タンパク質またはペプチドとの標的遺伝子の同時発現を促進することによって、宿主細胞内の１つまたは複数の標的遺伝子を改変できる。別の実施形態では、宿主細胞ゲノムへの外因性プロモーターの付加を含めた、標的遺伝子のプロモーターの亢進によって、宿主細胞を改変する。
【００６７】
別の実施形態では、プロテアーゼ阻害物質など、標的遺伝子の阻害物質をコードする１または複数種のベクターを含めて、標的プロテアーゼの活性を阻害することによって、宿主細胞内の１つまたは複数の標的遺伝子を改変する。そのような阻害物質は、標的遺伝子、標的遺伝子の補因子または標的遺伝子の相同体の発現を制限するアンチセンス分子であり得る。通常、アンチセンスは、標的遺伝子の少なくとも一部に相補的な配列を有する核酸分子を指すのに使用される。加えて、阻害物質は、干渉(interfering)ＲＮＡまたは干渉ＲＮＡをコードする遺伝子であり得る。例えば、Ｆｉｒｅ，Ａ．ら（１９９８）、Ｎａｔｕｒｅ  ３９１：８０６〜１１、Ｅｌｂａｓｈｉｒら（２００１）、Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １５（２）：１８８〜２００、Ｅｌｂａｓｈｉｒら（２００１）、Ｎａｔｕｒｅ  ４１１（６８３６）：４９４〜８、Ｃａｒｎｅｇｉｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの米国特許第６，５０６，５５９号、Ｂｅｎｉｔｅｃの第６，５７３，０９９号、ｔｈｅ  Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ  Ｉｎｓｔ．の米国特許出願第２００３／０１０８９２３号、ならびに米国特許出願第２００３／０１１４４０９号、ＷＯ０３／００６４７７、ＷＯ０３／０１２０５２、ＷＯ０３／０２３０１５、ＷＯ０３／０５６０２２、ＷＯ０３／０６４６２１およびＷＯ０３／０７０９６６に記載されている通り、真核生物では、そのような干渉ＲＮＡが、低分子干渉(small interfering)ＲＮＡまたはリボザイムであり得る。
【００６８】
阻害物質は、別のタンパク質またはペプチドであり得る。阻害物質は、例えば、標的タンパク質のコンセンサス配列を有するペプチドであり得る。阻害物質は、標的タンパク質の直接的または間接的阻害分子を宿主で産生できるタンパク質またはペプチドであり得る。例えば、プロテアーゼ阻害物質には、アマスタチン、Ｅ−６４、アンチパイン、エラスタチナール、ＡＰＭＳＦ、ロイペプチン、ベスタチン、ペプスタチン、ベンズアミジン、１，１０−フェナントロリン、キモスタチン、ホスホラミドン、３，４−ジクロロイソクマリン、ＴＬＣＫ、ＤＦＰ、ＴＰＣＫが含まれ得る。これまでに、１００を超える天然存在タンパク質プロテアーゼ阻害物質が同定されている。それらは、細菌から動植物までの様々な生物で単離されている。それらは、立体障害を介して活性部位への基質接近を防止する、プロテアーゼの強結合可逆阻害物質または疑似不可逆阻害物質として働く。それらのサイズも、５０残基（例えばＢＰＴＩ：ウシ膵臓トリプシン阻害物質）から、最大４００残基（例えばα−１ＰＩ：α−１プロテイナーゼ阻害物質）まで極めて可変的である。それらは、α−マクログロブリンファミリーのタンパク質（例えばα−２マクログロブリン）を除いて、厳密にクラス特異的である。α−マクログロブリンファミリーのタンパク質は、分子トラップ作用機序を介して、ほとんどのプロテアーゼに結合し、それらを阻害する。
【００６９】
外因性のベクターまたはＤＮＡコンストラクトを宿主細胞内に導入して、形質移入(transfected)または形質転換(transformed)することができる。外因性の核酸で真核細胞および原核細胞をそれぞれ形質移入および形質転換する技法は、当技術分野でよく知られている。これらには、脂質小胞媒介の取り込み、リン酸カルシウム媒介の形質移入（リン酸カルシウム／ＤＮＡ共沈）、ウイルス感染、とりわけ、例えば改変アデノウイルスなどの改変ウイルスを用いたもの、微量注入およびエレクトロポレーションが含まれ得る。原核細胞の形質転換には、熱ショック媒介の取り込み、無傷細胞を用いた細菌プロトプラスト融合、微量注入およびエレクトロポレーションが技法に含まれ得る。植物を形質転換する技法には、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓなどのアグロバクテリウム媒介の導入、高速推進のタングステンまたは金マイクロプロジェクタイル、エレクトロポレーション、微量注入、およびポリエチレングリコール媒介の取り込みが含まれる。ＤＮＡは、１本鎖または２本鎖、直鎖状または環状、リラックス型またはスーパーコイルド型のＤＮＡであり得る。哺乳動物細胞に形質移入する様々な技法に関しては、例えば、Ｋｅｏｗｎら（１９９０）、Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８５巻、５２７〜５３７ページを参照のこと。
【００７０】
下記の通り、対象とする異種タンパク質またはポリペプチドを含む発現コンストラクト用に、標的遺伝子またはそのエンハンサーもしくは阻害物質をコードする発現コンストラクトを構築できる。例えば、コンストラクトは、１箇所または複数箇所の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含有できる。コンストラクトは、標的遺伝子の少なくとも一部、または標的遺伝子の補因子、変異体バージョンの標的遺伝子の少なくとも一部、もしくは一部の実施形態では標的遺伝子の阻害物質をコードする核酸配列に作用可能に連結したプロモーターをも含有できる。代替として、コンストラクトは、プロモーターの無いものであり得る。コンストラクトが細胞ＤＮＡ／ゲノムに組み込まれるように設計されていない場合には、ベクターは通常、少なくとも１つのプロモーターエレメントを含有する。上記核酸配列に加えて、発現ベクターは、選択マーカー配列を含有し得る。発現コンストラクトは、転写開始、終止および／または、リボソーム結合部位のための部位をさらに含有し得る。特定されたコンストラクトは、限定されるものではないが、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓもしくはＥ．ｃｏｌｉなどの細菌細胞、酵母細胞、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞または植物細胞を含めた、いかなる原核細胞または真核細胞にも挿入でき、発現させることができる。
【００７１】
コンストラクトは、当技術分野で知られている方法に従って調製できる。望ましいコンストラクトが得られるまで、様々な断片を集め、適切なベクター内に導入し、クローニングし、分析し、その後さらに操作することができる。制限分析、切断、プローブの同定などを可能にする様々な改変を配列に加えることができる。必要に応じて、サイレント突然変異を導入できる。様々な段階で、制限分析、配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応を用いた増幅、プライマー修復、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発などを利用できる。抗生物質耐性遺伝子およびネガティブ選択因子を組込む方法は、当業者ならばよく知っているであろう（例えば、国際公開第９９／１５６５０号、米国特許第６，０８０，５７６号、米国特許第６，１３６，５６６号、Ｎｉｗａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１３：３４３〜３４９（１９９３）；およびＹｏｓｈｉｄａら、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４：２７７〜２８７（１９９５）を参照）。
【００７２】
原核細胞複製系、例えばＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓまたはＥ．ｃｏｌｉなどの原核細胞によって認識可能なオリジンを含有する細菌ベクターを用いて、コンストラクトを調製できる。マーカーを利用することができ、それは挿入に使用されるべきマーカーと同じか、または異なっており、宿主細胞に導入する前に除去できる。ひとたびコンストラクトを含有するベクターが完成したならば、特定の配列を除去するか、直線化するか、相同配列中に変異、欠失または他の配列を導入することなどによって、それをさらに操作できる。一実施形態では、標的遺伝子コンストラクトおよび異種タンパク質コンストラクトが同じ発現ベクターの一部であり、かつ同じプロモーターエレメントの制御下でも、そうでなくてもよい。別の実施形態では、それは別々の発現ベクター上にある。最終操作の後、コンストラクトを細胞に導入することができる。
【００７３】
細胞増殖条件(Cell growth conditions)
本明細書に記載の宿主細胞の細胞増殖条件には、対象とするタンパク質の発現をアレイ内の少なくとも１つの株（または少なくともそれらの細胞の一部）で促進する条件および／または発現された、対象とするタンパク質の発酵を促進する条件が含まれる。本明細書で使用される場合、「発酵」という用語には、文字通りの発酵が用いられる実施形態と、他の、非発酵性の培養モードが用いられる実施形態との両方が含まれる。アレイ内の宿主細胞集団の増殖、維持および／または発酵は、いかなるスケールで行ってもよい。しかし、宿主細胞の複数集団が同時にスクリーニングされる場合には、異なった集団の数ならびに宿主細胞の複数集団を増殖および試験する能力によってスケールが限定されるであろう。一実施形態では、発酵培地が、富栄養培地、最小培地および無機塩培地の中から選択され得る。別の実施形態では、最少培地または無機塩培地のいずれかが選択される。さらに別の実施形態では、最少培地が選択される。さらに別の実施形態では、無機塩培地が選択される。
【００７４】
無機塩培地は、無機塩と、例えば、グルコース、ショ糖またはグリセロールなどの炭素源とからなる。無機塩培地の例には、例えば、Ｍ９培地、シュードモナス培地（ＡＴＣＣ１７９）、ならびにＤａｖｉｓおよびＭｉｎｇｉｏｌｉ培地（ＢＤ  ＤａｖｉｓおよびＥＳ  Ｍｉｎｇｉｏｌｉ（１９５０）、Ｊ．Ｂａｃｔ．６０：１７〜２８を参照）が含まれる。無機塩培地を作製するのに使用される無機塩には、例えば、リン酸カリウム、硫酸もしくは塩化アンモニウム、硫酸もしくは塩化マグネシウム、ならびに微量無機塩、すなわち鉄、銅、マンガンおよび亜鉛の塩化カルシウム塩、ホウ酸塩および硫酸塩などの中から選択されたものが含まれる。有機窒素源、すなわち、ペプトン、トリプトン、アミノ酸または酵母抽出物などは、無機塩培地に含まれていない。代わりに、無機窒素源が使用され、これは、例えば、アンモニウム塩、アンモニア水および気体アンモニアの中から選択され得る。好ましい無機塩培地は、炭素源としてグルコースを含有する。無機塩培地と比較すると、最小培地も、無機質塩および炭素源を含有し得るが、例えば、低レベルのアミノ酸、ビタミン、ペプトンまたは他の成分が捕捉されていてもよい。但し、これらは極めて最小レベルで添加される。
【００７５】
一実施形態では、下記表４に示す成分を用いて、培地を調製できる。それらの成分は、以下の順序で添加できる。すなわち、最初に、約３０リットルの蒸留水に（ＮＨ４）ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４およびクエン酸を溶解することができる。その後、微量元素の溶液を添加し、それに続いて、Ｕｃｏｌｕｂ  Ｎ１１５などの消泡剤を添加することができる。次に、乾熱滅菌（約１２１℃など）の後、グルコース、ＭｇＳＯ４およびチアミン−ＨＣＬの無菌液を添加できる。約６．８のｐＨ調節は、アンモニア水を用いて実現できる。その後、滅菌蒸留水を添加して、３７１からグリセロールストック（１２３ｍＬ）を引いた容積に、初期容積を調整することができる。これらの化学物質は、Ｍｅｒｃｋなどの様々な供給業者から市販されている。
【００７６】
【表４】
0005444553.tif 000009
【００７７】
本発明では、形質転換された宿主細胞の増殖、培養および／または発酵を、宿主細胞の生存を許容する温度範囲内、好ましくは、包括的に、約４℃から約５５℃の範囲内の温度で行う。したがって、例えば、「増殖」（および「増殖する」、「増殖すること」）、「培養すること」（および「培養」）」ならびに「発酵」（および「発酵させる」、「発酵させること」）という用語は、本明細書で使用される場合、本発明の宿主細胞に関して、本質的に、包括的に約４℃から約５５℃の温度範囲内での「増殖」、「培養すること」および「発酵」を意味する。加えて、「増殖」は、活動的な細胞分裂および／または拡大の生物学的状態、ならびに無分裂および／または無拡大の細胞が代謝によって維持されている生物学的状態の両方を示すのに使用され、「増殖」という用語の後者の使用は、「維持」という用語と同義である。
【００７８】
アレイの宿主細胞は、その細胞型の正常な増殖に適した温度で培養および維持するべきである。そのような正常増殖温度は、選択された宿主細胞の既知の増殖必要条件に基づいて容易に選択できる。培養を確立している間、とりわけスクリーニングの過程の間は、対象とする異種タンパク質またはポリペプチドで形質転換させる前後に、選択された細胞の増殖に適したＣＯ２／Ｎ２湿度に制御された中で、細胞培養物をインキュベートすることが好ましい。インキュベーションの湿度は、培養器からの蒸発を最小限にし、より小さい容積の使用が可能となるように制御する。湿度の制御の代替として、またはそれに加えて、蒸発を最小限にするために、容器をフタで覆ってもよい。培養温度の選択は、主として、使用される宿主細胞のアイデンティティによる。蒸発を制御する湿度（パーセント）の選択は、選択された容器容積、ならびに容器内の細胞培養物の濃度および容積、ならびに培養温度に基づく。したがって、湿度は、約１０％から約８０％まで変動し得る。適した状態の選択は、十分に当技術分野の技術範囲内であることを理解するべきである。
【００７９】
スクリーニング(Screening)
対象とする異種タンパク質を発現するのに最適な宿主細胞集団を求めて、本明細書に記載の株アレイをスクリーニングすることができる。最適な宿主細胞集団は、発現された、対象とするタンパク質の量、質および／または局在に基づいて同定または選択できる。一実施形態では、最適な宿主細胞集団は、アレイ内の、表現型が異なる宿主細胞の他の集団と比較して、宿主細胞内における、対象とするタンパク質またはポリペプチドの収率増大をもたらすものである。
【００８０】
産生の増大は、代替として、産生されたタンパク質１グラムあたり、または宿主タンパク質１グラムあたりの、適切にプロセシングされたタンパク質またはポリペプチドのレベルの増大であり得る。産生の増大は、異種タンパク質１グラムあたり、または宿主細胞タンパク質１グラムあたりに産生された、回収可能なタンパク質またはポリペプチドのレベルの増大でもあり得る。産生の増大は、総タンパク質レベルの増大、適切にプロセシングされたタンパク質もしくは適切にフォールディングされたタンパク質のレベルの増大、または、活性もしくは可溶性タンパク質のレベルの増大の任意な組合せであり得る。この実施形態では、「増大」または「改善」という用語は、対象とするタンパク質またはポリペプチドを、アレイ内の、宿主細胞の他の１つまたは複数の集団で発現させた場合に、産生される、適切にプロセシングされる、可溶性である、かつ／または回収可能であるタンパク質またはポリペプチドのレベルに対して相対的なものである。産生の増大は、例えば、エネルギー消費量を低下させることによって、利用可能資源の使用を増大させることによって、または増殖培地中の増殖補助物質の必要性を低下させることによって、細胞または生物の効率を最適化し得る。産生の増大は、発現されたタンパク質のタンパク質分解の低下の結果であってもよい。
【００８１】
一実施形態では、アレイ内の少なくとも１つの株が、少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌの正しくプロセシングされたタンパク質を産生する。正しくプロセシングされたタンパク質は、天然タンパク質のアミノ末端を有する。別の実施形態では、少なくとも１つの株が、０．１〜１０ｍｇ／ｍｌの正しくプロセシングされたタンパク質を細胞内に産生し、これには、少なくとも約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９または少なくとも約１．０ｍｇ／ｍｌの正しくプロセシングされたタンパク質が含まれる。別の実施形態では、アレイ内の少なくとも１つの株によって産生される、正しくプロセシングされた、対象とするタンパク質またはポリペプチドの総タンパク質量が、少なくとも１．０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約２ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約３ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ、約６ｍｇ／ｍｌ、約７ｍｇ／ｍｌ、約８ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、約１５ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌ、約３０ｍｇ／ｍｌ、約３５ｍｇ／ｍｌ、約４０ｍｇ／ｍｌ、約４５ｍｇ／ｍｌもしくは少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌであるか、またはそれより多い。一部の実施形態では、産生される、正しくプロセシングされたタンパク質の量が、正しくプロセシングされた形態の異種タンパク質の総タンパク質量の少なくとも約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは少なくとも約９９％であるか、またはそれより多い。
【００８２】
対象とするタンパク質またはポリペプチドの改善された発現は、タンパク質の溶解性の増大も指し得る。対象とするタンパク質またはポリペプチドを宿主細胞の細胞質、ペリプラズムまたは細胞外の培地中に産生させて、そこから回収することができる。タンパク質またはポリペプチドは、不溶性または可溶性であり得る。タンパク質またはポリペプチドは、上記に論じた通り、１つまたは複数の標的（例えばシグナルまたはリーダー）配列または精製に役立つ配列を含有し得る。
【００８３】
「可溶性(soluble)」という用語は、本明細書で使用される場合、生理的条件下にある緩衝液中で１０〜３０分間遠心処理された場合に、約５０００〜２００００×重力の遠心処理によって、そのタンパク質が沈殿しないことを意味する。可溶性タンパク質は、封入体または他の沈殿物質塊の一部でない。同様に、「不溶性(insoluble)」は、生理的条件下にある緩衝液中で１０〜３０分間遠心処理された場合に、５０００〜２００００×重力の遠心処理によって、そのタンパク質またはポリペプチドが沈殿し得ることを意味する。不溶性タンパク質またはポリペプチドは、封入体または他の沈殿物質塊の一部であり得る。「封入体(inclusion body)」という用語には、細胞内に含有されている、タンパク質またはポリペプチドの凝集体が隔離されている任意の細胞内物体が含まれるものとする。
【００８４】
別の実施形態では、最適な宿主細胞集団は、ペリプラズムに輸送されるか、または宿主細胞の細胞外空間に分泌される、対象とするタンパク質を、増大した量で産生する。一実施形態では、アレイ内の少なくとも１つの株が、少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌのタンパク質をペリプラズム区画に産生する。別の実施形態では、少なくとも１つの株が、０．１〜１０ｍｇ／ｍｌのペリプラズムタンパク質、または少なくとも０．２ｍｌ、約０．３ｍｌ、約０．４ｍｌ、約０．５ｍｌ、約０．６ｍｌ、約０．７ｍｌ、約０．８ｍｌ、約０．９ｍｌもしくは少なくとも約１．０ｍｇ／ｍｌのペリプラズムタンパク質を細胞内で産生する。一実施形態では、アレイ内の少なくとも１つの株によって産生される、対象とするタンパク質またはポリペプチドの総タンパク質量が、少なくとも１．０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約２ｍｇ／ｍｌ、少なくとも約３ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ、約５ｍｇ／ｍｌ、約６ｍｇ／ｍｌ、約７ｍｇ／ｍｌ、約８ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、約１５ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌもしくは少なくとも約２５ｍｇ／ｍｌであるか、またはそれより多い。一部の実施形態では、産生されるペリプラズムタンパク質の量が、産生される対象とするタンパク質またはポリペプチドの少なくとも約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％もしくは約９９％であるか、またはそれより多い。
【００８５】
本発明のアレイの少なくとも１つの株は、対象とするタンパク質またはポリペプチドの収率の増大ももたらし得る。一実施形態では、少なくと１つの株が、対象とするタンパク質またはポリペプチドを、全細胞タンパク質(total cell protein)（ｔｃｐ）の少なくとも約５％、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％もしくは約７５％、またはそれより多い量で産生する。「パーセント全細胞タンパク質(percent total cell protein)」は、総計細胞タンパク質のパーセントとしての、宿主細胞内のタンパク質またはポリペプチドの量である。パーセント全細胞タンパク質を測定する方法は、当技術分野でよく知られている。
【００８６】
特定の実施形態では、無機塩培地中で増殖（すなわち、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃、約４５℃および約５０℃を含めた、約４℃〜約５５℃の温度範囲内で増殖）させた場合、アレイ内の少なくとも１つの宿主細胞集団が、少なくとも１％ｔｃｐの異種タンパク質産生レベルおよび少なくとも４０ｍｇ／ｍｌの細胞密度を有し得る。特に好ましい実施形態では、無機塩培地中で増殖（すなわち、包括的に約４℃〜約５５℃の温度範囲内で増殖）させた場合、発現系が、少なくとも５％ｔｃｐのタンパク質またはポリペプチド発現レベルおよび少なくとも４０ｇ／Ｌの細胞密度を有するであろう。
【００８７】
実際、ペリプラズムにターゲッティングされた異種タンパク質は、おそらく外側細胞膜への損傷、またはその流動性の増大から、しばしば、ブロス(broth)中に見出される（欧州特許第ＥＰ０  ２８８  ４５１号を参照）。この「受動的な」分泌の速度は、コリシン（Ｍｉｋｓｃｈら（１９９７）、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６７：１４３〜１５０）、増殖速度（Ｓｈｏｋｒｉら（２００２）、Ａｐｐ  Ｍｉｏｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ５８：３８６〜３９２）、ＴｏｌＩＩＩ過剰発現（ＷａｎおよびＢａｎｅｙｘ（１９９８）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｕｒｉｆ．１４：１３〜２２）、バクテリオシン放出タンパク質（Ｈｓｉｕｎｇら（１９８９）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ７：２６７〜７１）、コリシンＡ溶解タンパク質（Ｌｌｏｕｂｅｓら（１９９３）、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ７５：４５１〜８）、周辺質(periplasmic)タンパク質を漏出する変異体（ＦｕｒｌｏｎｇおよびＳｕｎｄｓｔｒｏｍ（１９８９）、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｉｎｄｕｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．３０：１４１〜８）、融合パートナー（ＪｅｏｎｇおよびＬｅｅ（２００２）、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．６８：４９７９〜４９８５）または浸透圧ショックによる回収（Ｔａｇｕｃｈｉら（１９９０）、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １０４９：２７８〜８５）を含めた、外側細胞膜を透過処理する様々な作用機序を用いることによって増大し得る。Ｅ．ｃｏｌｉで適切にフォールディングされた活性タンパク質を産生するのに、周辺腔(periplasmic space)への改変タンパク質の輸送、およびそれに続くブロス中への局在化が使用されている（ＷａｎおよびＢａｎｅｙｘ（１９９８）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｕｒｉｆ．１４：１３〜２２；Ｓｉｍｍｏｎｓら（２００２）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．Ｍｅｔｈ．２６３：１３３〜１４７；Ｌｕｎｄｅｌｌら（１９９０）、Ｊ．Ｉｎｄｕｓｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ．５：２１５〜２７）。
【００８８】
この方法は、対象とするタンパク質またはポリペプチドをペリプラズムから、または細胞外の培地から精製するステップも含み得る。異種タンパク質またはポリペプチドがタグタンパク質に連結されるような方法で、それを発現させることができ、「タグ付き」のタンパク質を細胞または細胞外の培地から精製することができる。
【００８９】
一部の実施形態では、対象とするタンパク質またはポリペプチドを、活性形態でアレイの少なくとも１つの株によって産生することもできる。「活性」という用語は、生物活性の存在を意味し、生物活性は、対応する天然タンパク質またはポリペプチドの生物活性に匹敵するか、それに実質的に相当する。タンパク質に関する文脈では、通常これは、標準的なパラメータを用いて、対応する天然タンパク質またはポリペプチドと比較した場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、少なくとも約２０％、約５０％、好ましくは少なくとも約６０〜８０％、そして最も好ましくは少なくとも約９０〜９５％の活性を有する生物学的機能または作用を含むことを意味する。しかし、一部の実施形態では、天然タンパク質と比較して、改変または改善された活性を有するポリペプチド（例えば免疫応答性および基質の特異性などを改変または改善したもの）を産生することが望ましい可能性がある。改変または改善されたポリペプチドは、アレイ内の１つまたは複数の宿主細胞集団によって生成された特定の立体配座の結果として生じたものであり得る。
【００９０】
タンパク質またはポリペプチドの活性の測定は、特定のタンパク質またはポリペプチドを標的とした、対応する標準的な生物学的比較アッセイを用いて行うことができ、それらのアッセイを用いて、生物活性を評価することができる。
【００９１】
対象とする活性なタンパク質またはポリペプチドの回収も、本発明のアレイ内の１つまたは複数の他の株と比較して、最適な宿主株で改善されている可能性がある。活性タンパク質は、その配列が由来する天然タンパク質またはポリペプチドの活性の少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、約５０％、約６０％、少なくとも約７０％、約８０％、約９０％、または少なくとも９５約％の比活性を有し得る。さらに、基質特異性（ｋｃａｔ／Ｋｍ）が天然タンパク質またはポリペプチドと実質的に同様であってもよい。通常、ｋｃａｔ／Ｋｍは、少なくとも約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、少なくとも約９０％もしくは少なくとも約９５％、またはそれより大きいであろう。タンパク質およびポリペプチドの活性および基質特異性（ｋｃａｔ／Ｋｍ）の尺度をアッセイおよび定量化する方法は、当業者によく知られている。
【００９２】
タンパク質活性の測定(Measurement of protein activity)
対象とする異種発現タンパク質またはポリペプチドの活性は、事前に確立されている天然タンパク質またはポリペプチドの標準的な活性と比較できる。代替として、対象のタンパク質またはポリペプチドの活性は、同時または実質的に同時に行われる、天然タンパク質またはポリペプチドを用いた比較アッセイで測定できる。例えば、発現された酵素と基質との間、発現されたホルモンとホルモン受容体との間、および発現された抗体と抗原との間の相互作用など、例えば、対象とするタンパク質またはポリペプチドと標的との間の検出可能な相互作用を測定するのに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いることができる。そのような検出には、熱量変化の測定、増殖変化、細胞死、細胞忌避（ｃｅｌｌ  ｒｅｐｅｌｌｉｎｇ）、放射能の変化、溶解性の変化、ゲル電気泳動および／またはゲル濾過法で測定した分子量の変化、リン酸化能、ＥＬＩＳＡアッセイなどの抗体特異性アッセイなどが含まれ得る。加えて、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイには、天然タンパク質またはポリペプチドの生理作用と比較して、異種発現されたタンパク質またはポリペプチドの生理作用を検出するアッセイ、例えば、質量増大、電解質バランスの変化、血液凝固時間の変化、血餅融解の変化、および抗原性反応の誘導を検出するアッセイが含まれるが、これらに限定されない。通常、対象とするタンパク質またはポリペプチドの活性特性を、そのような活性がアッセイ可能である限り、天然タンパク質またはポリペプチドとの比較分析を可能にする任意のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを用いて決定できる。代替として、本発明のアレイ内の少なくとも１つの株で産生されたタンパク質またはポリペプチドを、そのタンパク質またはポリペプチドと、通常、そのタンパク質またはポリペプチドと相互作用する分子、例えば天然タンパク質が通常相互作用するシグナル経路の基質または構成要素との間の相互作用を刺激または抑制する能力についてアッセイできる。そのようなアッセイは、通常、タンパク質またはポリペプチドが標的分子と相互作用するのを可能にする条件下で、タンパク質を基質分子と混合し、上記タンパク質と標的分子との相互作用の生化学的帰結を検出するステップを含み得る。
【００９３】
タンパク質またはポリペプチドの活性を測定するのに利用できるアッセイは、例えば、Ｒａｌｐｈ，Ｐ．Ｊ．ら（１９８４）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３２：１８５８もしくはＳａｉｋｉら（１９８１）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：１０４４、Ｓｔｅｗａｒｄ，Ｗ．Ｅ．ＩＩ（１９８０）、「Ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＶｉｅｎｎａおよびＮｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ，Ｈ．Ｅ．ら（１９８２）、Ｂｌｏｏｄ  ６０：５９５、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａ」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈおよびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ編集、１９８９、および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．Ｌ．およびＡ．Ｒ．Ｋｉｍｍｅｌ編集、１９８７、Ａ  Ｋ  Ｐａｔｒａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ，１８（２）：１８２〜９２ページ（２０００）、Ｋｏｄａｍａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９：１４６５〜１４７２（１９８６）、Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５２０９〜５２１３（１９９３）、（Ｌｏｍｂｉｌｌｏら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２８：１０７〜１１５（１９９５）；（Ｖａｌｅら、Ｃｅｌｌ  ４２：３９〜５０（１９８５）に記載されている。アレイ内の１つまたは複数の他の宿主細胞集団に由来する、異種発現されたタンパク質の試料間で活性を比較することも、天然タンパク質の活性と比較することも、またはそれらを両方行うこともできる。活性測定は、単離されたタンパク質で行うこともでき、または宿主細胞内でｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うこともできる。
【００９４】
別の実施形態では、例えば、従来の顕微鏡、ルミノメーターまたはプレートリーダーにおける蛍光測定または分光測定によって、タンパク質産生および／または活性を培養物中で直接モニターすることができる。対象とするタンパク質が、その基質が既知の酵素である場合、基質を培地に添加することができ、基質が酵素によって産物に変換された際に蛍光シグナルが放出される。一実施形態では、対象とする異種タンパク質またはポリペプチドをコードする発現コンストラクトが、レポータータンパク質をさらにコードする。「レポータータンパク質」は、細胞内または細胞表面にそれが存在することによって、または培地中に分泌された場合に、レポータータンパク質を含有しない細胞からその細胞を識別するのを可能にするタンパク質を意味する。対象とする異種タンパク質の産生は、宿主細胞集団の検出可能な変化をもたらす。レポーター分子は、ホタルルシフェラーゼおよびＧＦＰ、または他の任意の蛍光分子でもよく、β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｂｅｔａ．ｇａｌ）、クロラムフェニコールおよびアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ＣＡＴ）でもよい。これらのレポーター遺伝子エレメントそれぞれと連動して産生される発現のアッセイは、当業者によく知られている。
【００９５】
レポーター遺伝子は、検出可能なタンパク質もしくは間接的に検出可能なタンパク質をコードするものであり得、またはレポーター遺伝子が生存遺伝子であり得る。好ましい実施形態では、レポータータンパク質が検出可能なタンパク質である。（検出可能な遺伝子または検出遺伝子によってコードされている）「検出可能なタンパク質」または「検出タンパク質」は、直接標識として使用できるタンパク質であり、すなわち、このタンパク質は、さらなる操作なしに検出可能（好ましくは、上記検出可能なタンパク質を含む細胞が検出可能）である。したがって、この実施形態では、レポーター遺伝子のタンパク質産物それ自体が、検出可能な遺伝子を発現している細胞を識別するのに役立ち得る。この実施形態では、適した検出可能遺伝子に、自己蛍光タンパク質をコードするものが含まれる。
【００９６】
当技術分野で知られている通り、様々な既知の自己蛍光タンパク質が存在しており、これらは通常、Ａｅｑｕｏｒｅａの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびその変種をベースにしており、これらには、ＧＦＰ（Ｃｈａｌｆｉｅら（１９９４）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３（５１４８）：８０２〜８０５）、高感度ＧＦＰ（ＥＧＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ−Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ５５７６２）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ；Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）；Ｓｔａｕｂｅｒ（１９９８）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４（３）：４６２〜４７１；ＨｅｉｍおよびＴｓｉｅｎ（１９９６）、Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７８〜１８２）、高感度黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）、および赤色蛍光タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。加えて、ＲｅｎｉｌｌａおよびＰｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ種由来の自己蛍光タンパク質が最近報告されている。全てが参照により明示的に本明細書に組み込まれている、ＷＯ９２／１５６７３、ＷＯ９５／０７４６３、ＷＯ９８／１４６０５、ＷＯ９８／２６２７７、ＷＯ９９／４９０１９、米国特許第５，２９２，６５８号、米国特許第５，４１８，１５５号、米国特許第５，６８３，８８８号、米国特許第５，７４１，６６８号、米国特許第５，７７７，０７９号、米国特許第５，８０４，３８７号、米国特許第５，８７４，３０４号、米国特許第５，８７６，９９５号および米国特許第５，９２５，５５８を参照のこと。
【００９７】
対象とするタンパク質またはポリペプチドの単離(Isolation of Protein or Polypeptide of Interest)
対象とするタンパク質の収率、溶解性、立体配座および／または活性を測定するために、アレイ内の１つまたは複数の株からタンパク質を単離することが望ましい可能性がある。適切な測定を行うのに用いたアッセイの必要条件に応じて、単離は、粗単離でも、準粗単離でも、純粋単離でもよい。タンパク質は、細胞質で産生されるものでも、ペリプラズムにターゲッティングされるものでも、または培養もしくは発酵培地中に分泌されるものでもよい。ペリプラズムにターゲッティングされたタンパク質を遊離させるには、クロロホルム（Ａｍｅｓら（１９８４）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１６０：１１８１〜１１８３）、グアニジン−ＨＣｌおよびトリトンＸ−１００（ＮａｇｌａｋおよびＷａｎｇ（１９９０）、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、１２：６０３〜６１１）などの化学物質を用いた処置が使用されている。しかし、これらの化学物質は不活性ではなく、多くの異種タンパク質産物またはその後の精製方法に対する有害効果を有し得る。Ｅ．ｃｏｌｉのグリシン処理は、外膜の透過化を引き起こし、ペリプラズム内容物を放出させることも報告されている（Ａｒｉｇａら（１９８９）、Ｊ．Ｆｅｒｍ．Ｂｉｏｅｎｇ．６８：２４３〜２４６）。異種タンパク質をペリプラズムから放出させる最も広範に使用されている方法は、浸透圧ショック（ＮｏｓａｌおよびＨｅｐｐｅｌ（１９６６）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４１：３０５５〜３０６２；ＮｅｕおよびＨｅｐｐｅｌ（１９６５）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４０：３６８５〜３６９２）、雌鳥卵白（ＨＥＷ）−リゾチーム／エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）処理（ＮｅｕおよびＨｅｐｐｅｌ（１９６４）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２３９：３８９３〜３９００；Ｗｉｔｈｏｌｔら（１９７６）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，４４３：５３４〜５４４；Ｐｉｅｒｃｅら（１９９５）、ＩＣｈｅｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｅｖｅｎｔ，２：９９５〜９９７）、およびＨＥＷ−リゾチーム／浸透圧ショック併用処理（Ｆｒｅｎｃｈら（１９９６）、Ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈ．１９：３３２〜３３８）である。Ｆｒｅｎｃｈ法は、分画緩衝液中の細胞の再懸濁、およびそれに続くペリプラズム画分の回収を行ものであり、その際、浸透圧ショックはリゾチーム処理のすぐ後に行う。
【００９８】
通常、これらの手順は、浸透圧的に安定化されている培地中での初期破壊と、それに続く、非安定化培地中における選択的放出とを含む。これらの培地の組成（ｐＨ、保護剤）および使用される破壊方法（クロロホルム、ＨＥＷ−リゾチーム、ＥＤＴＡ、超音波処理）は、報告されている特定な手順相互で異なっている。ＥＤＴＡの代わりに双極性イオン界面活性剤を用いるＨＥＷ−リゾチーム／ＥＤＴＡ処理の変法が、Ｓｔａｂｅｌら（１９９４）、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３８：３０７〜３１４に論じられている。Ｅ．ｃｏｌｉを破壊するための細胞内溶菌酵素系の使用に関する一般的概説には、ＤａｂｏｒａおよびＣｏｏｎｅｙ（１９９０）、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第４３巻、Ａ．Ｆｉｅｃｈｔｅｒ編集（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｂｅｒｌｉｎ）、１１〜３０ページを参照のこと。
【００９９】
対象とするタンパク質またはポリペプチドを、可溶性タンパク質または屈折性粒子として細胞質から回収する従来の方法は、機械的な切断による細菌細胞の崩壊を用いる。機械的破壊には、通常、液体懸濁液中に局所的なキャビテーションの産生、強固なビーズを用いた高速撹拌、超音波処理または細胞懸濁液のグラインディングを用いる（「Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｈａｎｃｏｃｋ  ａｎｄ  Ｐｏｘｔｏｎ」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ，１９８８）、第３章、５５ページ）。
【０１００】
ＨＥＷ−リゾチームは、細胞壁のペプチドグリカンバックボーンを加水分解するように生化学的に作用する。この方法は、最初、ＺｉｎｄｅｒおよびＡｒｎｄｔ（１９５６）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、４２：５８６〜５９０によって開発されたが、ＺｉｎｄｅｒおよびＡｒｎｄｔは、卵アルブミン（ＨＥＷ−リゾチームを含有する）でＥ．ｃｏｌｉを処理して、後にスフェロプラストとして知られる丸い細胞球を産生させた。これらの構造は、一部の細胞壁成分を保持していたが、細胞質膜が露出した大きな表面積を有していた。米国特許第５，１６９，７７２号は、浸透圧的に安定化された培地中、例えば２０％ショ糖液中で、例えば、ＥＤＴＡ、リゾチーム、または有機化合物を用いて細菌のエンベロープを破壊するステップと、細菌を低イオン強度緩衝液に暴露することによって、破壊した細菌の周辺腔から非ヘパリナーゼ様タンパク質を遊離させるステップと、低イオン強度で洗浄された細菌を緩衝化塩溶液に暴露することによって、ヘパリナーゼ様タンパク質を遊離させるステップとを含む、細菌からヘパリナーゼを精製する方法を開示する。
【０１０１】
これらの方法の多くの異なった変法が、広範な発現系で使用されており、様々な程度に成功している（Ｊｏｓｅｐｈ−Ｌｉａｚｕｎら（１９９０）、Ｇｅｎｅ、８６：２９１〜２９５；Ｃａｒｔｅｒら（１９９２）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：１６３〜１６７）。組換え細胞培養物を誘導して、リゾチームを産生させる試みが報告されている。ＥＰ０  １５５  １８９は、組換え細胞培養物を誘導して、リゾチームを産生させる手段を開示し、この手段は、通常、細胞壁構造を破壊または溶解することによって、そのような宿主細胞を死滅させると予測される。
【０１０２】
米国特許第４，５９５，６５８号は、細菌の周辺腔に輸送されたタンパク質の外在化を促進する方法を開示する。この方法は、細胞のリゾチーム処理、機械的粉砕または浸透圧ショック処理を必要とせずに、ペリプラズム中に局在するタンパク質の選択的単離を可能にする。米国特許第４，６３７，９８０号は、産物を直接的または間接的にコードするＤＮＡ分子で温度感受性溶原菌を形質転換させ、形質転換体を許容条件下で培養して、細胞内で遺伝子産物を発現させ、温度を上げることによって産物を外在化させ、ファージにコードされている機能を誘導することによって、細菌産物を産生させる方法を開示する。Ａｓａｍｉら（１９９７）、Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇ、８３：５１１〜５１６は、Ｔ４ファージ感染によるＥ．ｃｏｌｉ細胞の同調破壊を開示し、Ｔａｎｊｉら（１９９８）、Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇ，８５：７４〜７８は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を穏やかに破壊するための、Ｔ４ファージコードされている溶菌遺伝子の調節発現を開示する。
【０１０３】
細胞溶解の際には、ゲノムＤＮＡが細胞質から培地中に漏出し、その結果、流体粘度の著しい増大がもたらされる。これは、遠心力場内における固形物の沈降を妨害し得る。ＤＮＡ重合体を破壊するための機械的な破壊の間に作用するものなどのせん断力の不在下では、粘性流体を通る固形物の沈降速度が遅延する結果、遠心処理中の固形物と液体との分離が悪くなる。機械的せん断力の他に、ＤＮＡ重合体を分解する核酸分解酵素が存在する。Ｅ．ｃｏｌｉでは、内因性遺伝子であるｅｎｄＡが、エンドヌクレアーゼ（成熟タンパク質の分子量は約２４．５ｋＤ）をコードしている。エンドヌクレアーゼは、通常、ペリプラズムに分泌され、ヌクレオチド鎖切断の様式でＤＮＡをオリゴデオキシリボヌクレオチドへと切断する。Ｅ．ｃｏｌｉによって、ｅｎｄＡが比較的弱く発現されると示唆されている（Ｗａｃｋｅｍａｇｅｌら（１９９５）、Ｇｅｎｅ  １５４：５５〜５９）。
【０１０４】
望ましい場合には、本発明のアレイ内の１つまたは複数の株を用いて産生されたタンパク質を、当技術分野でよく知られている標準的な技法によって、実質的な純度にまで単離および精製することができ、これらの技法には、硫酸アンモニウムもしくはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ニッケルクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、分取電気泳動、界面活性剤可溶化、カラムクロマトグラフィーのような物質を用いた選択的沈殿、および免疫精製法などが含まれるが、これらに限定されない。例えば、確立された分子付着特性を有するタンパク質をリガンドに可逆的に融合させることができる。適切なリガンドを用いて、タンパク質を精製カラムに選択的に吸着させ、その後、比較的純粋な形態でカラムから遊離させることができる。融合タンパク質は、その後、酵素活性によって除去する。加えて、イムノアフィニティーカラムまたはＮｉ−ＮＴＡカラムを用いて、タンパク質を精製することができる。一般技法については、例えば、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｎ．Ｙ．（１９８２）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）；米国特許第４，５１１，５０３号；Ｓ．Ｒｏｅ、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ）」、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ（２００１）；Ｄ．Ｂｏｌｌａｇら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓａ，Ｉｎｃ．（１９９６）；ＡＫ  Ｐａｔｒａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ；１８（２）、１８２〜９２ページ（２０００）；およびＲ．Ｍｕｋｈｉｊａら、Ｇｅｎｅ  １６５（２）：３０３〜６ページ（１９９５）にさらに記載されている。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９８７年および定期増補）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ（１９９０）、「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８２巻およびこのシリーズの他の巻；Ｃｏｌｉｇａｎら（１９９６年および定期増補）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」、Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ，ＮＹ；ならびにタンパク質精製製品の使用に関する製造会社、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．またはＢｉｏ−Ｒａｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｃａｌｉｆ．の文献も参照のこと。組換え技法との併用によって、プロテアーゼで除去可能な配列を介して融合させることのできる、例えばＦＬＡＧ配列またはその等価物に、適したセグメントを融合させることが可能となる。例えば、Ｈｏｃｈｕｌｉ（１９８９）、Ｃｈｅｍｉｓｃｈｅ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅ  １２：６９〜７０；Ｈｏｃｈｕｌｉ（１９９０）、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｍｅｔａｌ  Ｃｈｅｌａｔｅ  Ａｂｓｏｒｂｅｎｔ」、Ｓｅｔｌｏｗ（編集）、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２：８７−９８、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；およびＣｒｏｗｅら（１９９２）、ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ：Ｔｈｅ  Ｈｉｇｈ  Ｌｅｖｅｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ＆Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＱＵＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，Ｃａｌｉｆ．も参照のこと。
【０１０５】
発現されたタンパク質の検出は、当技術分野で知られている方法で行われ、それには、例えば、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロット技法または免疫沈降反応が含まれる。
【０１０６】
本発明のアレイ内の株によって発現される特定のタンパク質は、不溶性の凝集体（「封入体」）を形成し得る。いくつかのプロトコールが、封入体からタンパク質を精製するのに適している。例えば、封入体の精製は通常、例えば、５０ｍＭ  ＴＲＩＳ／ＨＣＬ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍＭ  ＡＴＰおよび１ｍＭ  ＰＭＳＦという緩衝液中でのインキュベーションによって、宿主細胞を破壊することによる、封入体の抽出、分離および／または精製を要する。細胞懸濁液は、通常、フレンチプレスに通した２〜３回の通過を用いて溶解する。細胞懸濁液は、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ（Ｂｒｉｎｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてホモジナイズすることも、氷上で超音波処理することもできる。細菌を溶解する代替法は、当業者には明らかである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、同上；Ａｕｓｕｂｅｌら、同上を参照）。
【０１０７】
必要な場合には、封入体は可溶化させることができ、通常は、好ましくない不溶物を除去するために、溶解細胞懸濁液を遠心処理することができる。封入体を形成したタンパク質は、適合した緩衝液で希釈または透析することによって再生させることができる。適した溶剤には、尿素（約４Ｍ〜約８Ｍ）、ホルムアミド（少なくとも約８０％、容積／容積ベース）および塩酸グアニジン（約４Ｍ〜約８Ｍ）が含まれるが、これらに限定されない。塩酸グアニジンおよび類似の薬剤は、変性剤であるが、この変性は不可逆的でなく、変成剤を除去（例えば透析によって）または希釈した際に、再生(renaturation)が起こり得る。これにより、免疫学的および／または生物学的に活性なタンパク質の再形成(re-formation)が可能となる。他の適した緩衝液も、当業者に知られている。
【０１０８】
当業者によく知られている標準的な分離技法によって、上清中に存在する異種発現タンパク質を宿主タンパク質から分離することができる。例えば、最初の塩分画によって、多くの好ましくない宿主細胞タンパク質（細胞培地由来のタンパク質）を、対象とするタンパク質またはポリペプチドから分離し得る。その一例が硫酸アンモニウムであり得る。硫酸アンモニウムは、タンパク質混合物中の水の量を効果的に低下させることによって、タンパク質を沈殿させる。その際、タンパク質は、それらの溶解性に基づいて沈殿する。タンパク質が疎水性であるほど、より低い濃度の硫酸アンモニウムで沈殿する可能性が大きい。典型的なプロトコールは、その結果の硫酸アンモニウム濃度が２０〜３０％となるように、飽和硫酸アンモニウムをタンパク質溶液に添加するステップを含む。この濃度は、ほとんどの疎水性タンパク質を沈殿させるであろう。その後、（対象とするタンパク質が疎水性でない限り）沈殿を廃棄し、対象とするタンパク質を沈殿させることが既知の濃度まで上清に硫酸アンモニウムを添加する。その後、緩衝液中で沈殿を可溶化し、必要に応じて、透析(dialysis)またはダイアフィルトレーション(diafiltration)を介して、過剰な塩を除去する。冷エタノール沈殿など、タンパク質の溶解性に依存した他の方法も、当業者にはよく知られており、複雑なタンパク質混合物を分画するのに使用できる。
【０１０９】
対象とするタンパク質またはポリペプチドの分子量を用いて、それを、より大きなサイズのタンパク質およびより小さなサイズのタンパク質から、異なった孔径の膜（例えばＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ膜）を通す限外濾過を用いて単離することができる。最初のステップとして、対象とするタンパク質の分子量より小さい分子量のカットオフを有する孔径を備えた膜を通して、タンパク質混合物を限外濾過にかけることができる。その後、対象とするタンパク質の分子量より大きな分子カットオフを有する膜に対して、保持液の限外濾過を行うことができる。対象とするタンパク質またはポリペプチドは、膜を通り抜けて、濾液中に入る。その後、以下に記載の通り、濾液をクロマトグラフィーにかけることができる。
【０１１０】
発現された、対象とするタンパク質またはポリペプチドを、そのサイズ、正味の表面電荷、疎水性度、およびリガンドへのアフィニティーに基づいて、他のタンパク質から分離することができる。加えて、タンパク質に対して産生された抗体をカラムマトリクスに結合させ、そのタンパク質を免疫精製することができる。これらの方法は全て、当技術分野でよく知られている。任意のスケールで、かつ多くの異なった製造会社（例えばＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）の機器を用いて、クロマトグラフィー技法を実施できることは、当業者には明らかであろう。
【０１１１】
再生およびリフォールディング(Renaturation and Refolding)
異種発現されたタンパク質が変性形態で産生される場合、二次および三次タンパク質構造を生成するように、不溶性タンパク質を再生またはリフォールディングさせることができる。異種産物の立体配座を完成させるのに、タンパク質リフォールディングステップを、必要に応じて用いることができる。当技術分野で知られている、タンパク質の解離／会合を促進する薬剤を用いて、リフォールディングおよび再生を実現できる。例えば、タンパク質をジチオスレイトールと共にインキュベートし、それに続いて、酸化グルタチオン二ナトリウム塩と共にインキュベートし、それに続いて、尿素などのリフォールディング剤を含有する緩衝液と共にインキュベートすることができる。
【０１１２】
例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）または５０ｍＭ  Ｎａ−酢酸、ｐＨ６緩衝液に２００ｍＭ  ＮａＣｌを加えたものに対して、対象とするタンパク質またはポリペプチドを透析することによって、それを再生させることもできる。代替として、プロテアーゼ阻害物質を含有する、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０％グリセロール、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．４中における直線的な６Ｍから１Ｍの尿素勾配を用いることによって、Ｎｉ  ＮＴＡカラムなどのカラムに固定化しながら、タンパク質をリフォールディングさせることができる。１．５時間を超える時間にわたって、再生を行うことができる。再生の後、２５０ｍＭイミダゾールを添加することによって、タンパク質を溶出できる。イミダゾールは、ＰＢＳまたは５０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ６緩衝液に２００ｍＭ  ＮａＣｌを加えたものに対する最終の透析ステップによって除去できる。精製されたタンパク質は、４℃で保存するか、または−８０℃で冷凍できる。
【０１１３】
他の方法には、例えば、Ｍ  Ｈ  Ｌｅｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ、２５（１）：１６６〜７３ページ（２００２）、Ｗ．Ｋ．Ｃｈｏら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，７７（２〜３）：１６９〜７８ページ（２０００）、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９８７年および定期的な増補）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ（１９９０）「Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１８２巻、およびこのシリーズの他の巻、Ｃｏｌｉｇａｎら（１９９６年および定期的な増補）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」、Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ，ＮＹ、Ｓ．Ｒｏｅ、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ）」、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｐｒｅｓｓ（２００１年）；Ｄ．Ｂｏｌｌａｇら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓａ，Ｉｎｃ．（１９９６）に記載されている可能性のあるものが含まれる。
【０１１４】
発現ベクター(Expression vectors)
対象とする異種タンパク質は、それぞれの菌株に対象とする異種タンパク質をコードする発現ベクターを導入することによって、本明細書に開示する１つまたは複数の宿主細胞において産生することができる。一実施形態では、ベクターは、選択した宿主細胞において働くことができるプロモーター、ならびに全ての他の必要とされる転写および翻訳調節エレメントと作用可能に連結した対象とするタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。
【０１１５】
用語「作用可能に連結した(Operably linked)」は、転写および任意の翻訳調節エレメントが、コード配列に対して、宿主細胞中またはその作用によって、調節エレメントがコード配列の発現を誘導することができるような配置で、コード配列と共有結合した任意の形態を指す。
【０１１６】
対象とする異種タンパク質は、異種ポリペプチドコード配列が転写および翻訳調節エレメントと作用可能に連結して、宿主細胞がそこからタンパク質またはポリペプチドを発現することができる機能遺伝子を形成する、ポリヌクレオチドから発現させることが可能である。コード配列は異種ポリペプチドの天然コード配列であってよく、あるいは、例えば、宿主種のコドン使用の偏向を反映するために遺伝子を合成することによって、選択した発現宿主細胞中で使用するために選択、改良、または最適化されたコード配列であってよい。本発明の一実施形態では、宿主種はＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓであり、ポリペプチドコード配列の設計時には、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのコドンの偏向を考慮に入れる。（１つまたは複数の）遺伝子を１つまたは複数のベクター内に構築し、または１つまたは複数のベクターに挿入し、次いで発現宿主細胞に形質転換することができる。
【０１１７】
他の調節エレメントを、（「発現コンストラクト(expression construct)」とも呼ばれる）ベクター中に含めることができる。ベクターは典型的には、１つまたは複数の表現型選択可能マーカーおよび１つの複製起点を含んで、ベクターの維持を確実にし、および望ましい場合、宿主内の増幅をもたらす。追加のエレメントには、発現したポリペプチドの同定、分離、精製、および／または単離を容易にする、例えば転写エンハンサー配列、翻訳エンハンサー配列、他のプロモーター、アクチベーター、翻訳開始および停止シグナル、転写ターミネーター、シストロン性レギュレーター、ポリシストロン性レギュレーター、またはヌクレオチド配列「タグ」および「タグ」ポリペプチドコード配列などのタグ配列があるが、これらだけには限られない。
【０１１８】
別の実施形態では、発現ベクターは、対象とするタンパク質またはポリペプチドのコード配列と隣接したタグ配列をさらに含む。一実施形態では、このタグ配列はタンパク質の精製を可能にする。タグ配列は、ヘキサ−ヒスチジン親和性タグなどの親和性タグであってよい。別の実施形態では、親和性タグはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ分子であってよい。タグは、ＹＦＰまたはＧＦＰなどの蛍光分子、またはこのような蛍光タンパク質の類似体であってもよい。タグは、抗体分子、または既知の抗原もしくは精製に有用な既知の結合パートナーのリガンドの一部分であってもよい。
【０１１９】
本発明によるタンパク質コード遺伝子は、タンパク質コード配列に加えて、そこに作用可能に連結した以下の調節エレメント：プロモーター、リボソーム結合部位(ribosome binding site)（ＲＢＳ）、転写ターミネーター、翻訳開始および停止シグナルを含むことができる。有用なＲＢＳは、本発明による発現系中で宿主細胞として有用な任意の種から、好ましくは選択した宿主細胞から得ることができる。多くの特異的および様々なコンセンサスＲＢＳ、例えばＤ．Ｆｒｉｓｈｍａｎら、Ｇｅｎｅ２３４（２）：２５７〜６５ページ（１９９９年７月８日）；およびＢ．Ｅ．Ｓｕｚｅｋら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ１７（１２）：１１２３〜３０（２００１年１２月）中に記載されそれらによって言及されたＲＢＳが知られている。さらに、天然または合成ＲＢＳのいずれか、例えばＥＰ０２０７４５９（合成ＲＢＳ）；Ｏ．Ｉｋｅｈａｔａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８１（３）：５６３〜７０ページ（１９８９）（ＡＡＧＧＡＡＧの天然ＲＢＳ配列）中に記載されたＲＢＳを使用することができる。本発明中で有用な方法、ベクター、および翻訳および転写エレメント、および他のエレメントのさらなる例は、例えばＧｉｌｒｏｙへの米国特許第５，０５５，２９４号、およびＧｉｌｒｏｙらへの米国特許第５，１２８，１３０号、Ｒａｍｍｌｅｒらへの米国特許第５，２８１，５３２号、Ｂａｒｎｅｓらへの米国特許第４，６９５，４５５号および米国特許第４，８６１，５９５号、Ｇｒａｙらへの米国特許第４，７５５，４６５号、およびＷｉｌｃｏｘへの米国特許第５，１６９，７６０号中に記載されている。
【０１２０】
対象とする異種タンパク質をコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベクターまたはプラスミドに挿入することによって増大する。典型的なエンハンサーは、プロモーターに作用してその転写を増大させる、通常約１０〜３００ｂｐの大きさのＤＮＡのシス作用性エレメントである。例には様々なシュードモナスのエンハンサーがある。
【０１２１】
一般に、異種発現ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能にする複製起点および選択可能マーカー、および下流構造配列の転写を誘導するための高発現遺伝子由来のプロモーターを含む。このようなプロモーターは、特に３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、酸性ホスファターゼ、または熱ショックタンパク質などの酵素をコードするオペロンから誘導することができる。シグナル配列を使用する場合、異種コード配列は翻訳開始および停止配列と適切に一致して構築され、かつシグナル配列は翻訳されるタンパク質の部分的蓄積または分泌を誘導することができる。場合によっては異種配列は、望ましい性質、例えば発現される異種産物の安定性または精製の単純化をもたらすＮ末端同定ポリペプチドを含む融合酵素をコードすることができる。前に論じたように、融合ポリペプチドは、１つまたは複数の標的タンパク質またはその阻害剤もしくはエンハンサーも含むことができる。
【０１２２】
宿主細胞中で異種タンパク質を発現させるためのベクターが当技術分野で知られており、任意のこれらのベクターは、本発明による遺伝子を発現させるために使用することができる。このようなベクターには、例えばプラスミド、コスミド、およびファージ発現ベクターがある。有用なプラスミドベクターの例には、発現プラスミドｐＢＢＲ１ＭＣＳ、ｐＤＳＫ５１９、ｐＫＴ２４０、ｐＭＬ１２２、ｐＰＳ１０、ＲＫ２、ＲＫ６、ｐＲＯ１６００、およびＲＳＦ１０１０があるが、これらだけには限られない。このような有用なベクターの他の例には、例えば：Ｎ．Ｈａｙａｓｅ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６０（９）：３３３６〜４２ページ（１９９４年９月）中、Ａ．Ａ．Ｌｕｓｈｎｉｋｏｖら、Ｂａｓｉｃ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．３０：６５７〜６２ページ（１９８５）中、Ｓ．Ｇｒａｕｐｎｅｒ  ＆  Ｗ．Ｗａｃｋｅｍａｇｅｌ、Ｂｉｏｍｏｌｅｃ．Ｅｎｇ．１７（１）：１１〜１６ページ（２０００年１０月）中、Ｈ．Ｐ．Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２（５）：４３９〜４５ページ（２００１年１０月）中、Ｍ．Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ  ＆  Ｋ．Ｎ．Ｔｉｍｍｉｓ、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９６：４７〜６７ページ（１９８２）中、Ｔ．Ｉｓｈｉｉら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１１６（３）：３０７〜１３ページ（１９９４年３月１日）中、Ｉ．Ｎ．Ｏｌｅｋｈｎｏｖｉｃｈ  ＆  Ｙ．Ｋ．Ｆｏｍｉｃｈｅｖ、Ｇｅｎｅ１４０（１）：６３〜６５ページ（１９９４年３月１１日）中、Ｍ．Ｔｓｕｄａ  ＆  Ｔ．Ｎａｋａｚａｗａ、Ｇｅｎｅ１３６（１〜２）：２５７〜６２ページ（１９９３年１２月２２日）中、Ｃ．Ｎｉｅｔｏら、Ｇｅｎｅ８７（１）：１４５〜４９ページ（１９９０年３月１日）中、Ｊ．Ｄ．Ｊｏｎｅｓ  ＆  Ｎ．Ｇｕｔｔｅｒｓｏｎ、Ｇｅｎｅ６１（３）：２９９〜３０６ページ（１９８７）中、Ｍ．Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎら、Ｇｅｎｅ１６（１〜３）：２３７〜４７ページ（１９８１年１２月）中、Ｈ．Ｐ．Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒら、Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．（ＮＹ）２３：６９〜８１ページ（２００１年）中、Ｐ．Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙら、Ｊ．Ｂａｃｔ．１７２（１）：４７７〜８０ページ（１９９０年１月）中、Ｄ．Ｏ．Ｗｏｏｄら、Ｊ．Ｂａｃｔ．１４５（３）：１４４８〜５１ページ（１９８１年３月）中、およびＲ．Ｈｏｌｔｗｉｃｋら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１４７（Ｐｔ２）：３３７〜４４ページ（２００１年２月）中によって記載されたベクターがある。
【０１２３】
本発明の宿主細胞において有用であり得る発現ベクターのさらなる例には、示したレプリコン由来の表５中に挙げたベクターがある。
【０１２４】
【表５】
0005444553.tif 000010
【０１２５】
発現プラスミド、ＲＳＦ１０１０は、例えばＦ．Ｈｅｆｆｒｏｎらによって、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７２（９）：３６２３〜２７ページ（１９７５年９月）中、およびＫ．Ｎａｇａｈａｒｉ  ＆  Ｋ．Ｓａｋａｇｕｃｈｉによって、Ｊ．Ｂａｃｔ．１３３（３）：１５２７〜２９ページ（１９７８年３月）中に記載されている。プラスミドＲＳＦ１０１０およびその誘導体は、本発明中で特に有用なベクターである。当技術分野で知られているＲＳＦ１０１０の例示的で有用な誘導体には、例えばｐＫＴ２１２、ｐＫＴ２１４、ｐＫＴ２３１および関連プラスミド、およびｐＭＹＣ１０５０および関連プラスミド（例えば、Ｔｈｏｍｐｓｏｎらへの米国特許第５，５２７，８８３号および米国特許第５，８４０，５５４号を参照）、例えばｐＭＹＣ１８０３などがある。プラスミドｐＭＹＣ１８０３は、調節型テトラサイクリン耐性マーカーならびにＲＳＦ１０１０プラスミド由来の複製および可動性遺伝子座を有する、ＲＳＦ１０１０系プラスミドｐＴＪＳ２６０に由来する（Ｗｉｌｃｏｘへの米国特許第５，１６９，７６０号を参照）。他の例示的で有用なベクターには、Ｐｕｈｌｅｒらへ米国特許第４，６８０，２６４号の中に記載されたベクターがある。
【０１２６】
一実施形態では、発現プラスミドは発現ベクターとして使用する。別の実施形態では、ＲＳＦ１０１０またはその誘導体を発現ベクターとして使用する。さらに別の実施形態では、ｐＭＹＣ１０５０またはその誘導体、またはｐＭＹＣ４８０３またはその誘導体を発現ベクターとして使用する。
【０１２７】
プラスミド中に選択マーカー遺伝子を封入することによって、プラスミドを宿主細胞中に維持することができる。これは（１つまたは複数の）抗生物質耐性遺伝子であってよく、この場合対応する（１つまたは複数の）抗生物質、または当技術分野で知られている任意の他型の選択マーカー遺伝子、例えば原栄養体復元遺伝子を発酵培地に加え、この場合プラスミドは、対応する形質、例えばアミノ酸生合成またはヌクレオチド生合成形質、または炭素源利用形質などの生体触媒形質の栄養要求性である宿主細胞において使用する。
【０１２８】
本発明に従って使用するプロモーターは、構成的プロモーター(constitutive promoters)または調節型プロモーター(regulated promoters)であってよい。有用な調節型プロモーターの一般例には、ｌａｃプロモーター由来のファミリーのプロモーター（すなわち、ｌａｃＺプロモーター）、特にＤｅＢｏｅｒへの米国特許第４，５５１，４３３号中に記載されたｔａｃおよびｔｒｃプロモーター、ならびにＰｔａｃ１６、Ｐｔａｃ１７、ＰｔａｃＩＩ、ＰｌａｃＵＶ５、およびＴ７１ａｃプロモーターがある。一実施形態では、プロモーターは宿主細胞生物に由来しない。特定の実施形態では、プロモーターはＥ．ｃｏｌｉ生物に由来する。
【０１２９】
本発明による発現系中で有用な非ｌａｃ型プロモーターの一般例には、例えば表６中に挙げたプロモーターがある。
【０１３０】
【表６】
0005444553.tif 000011
【０１３１】
例えば、Ｊ．Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒｏｍｅｒｏ  ＆  Ｖ．Ｄｅ  Ｌｏｒｅｎｚｏ（１９９９）Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ａ．Ｄｅｍａｉｎ  ＆  Ｊ．Ｄａｖｉｅｓ、ｅｄｓ．）４６０〜７４ページ（ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、Ｄ．Ｃ．）；Ｈ．Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ（２００１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２：４３９〜４４５ページ；およびＲ．Ｓｌａｔｅｒ  ＆  Ｒ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ（２０００  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｗａｌｋｅｒ  ＆  Ｒ．Ｒａｐｌｅｙ、ｅｄｓ．）１２５〜５４ページ（Ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ））を参照。選択した細菌宿主細胞に由来するプロモーターのヌクレオチド配列を有するプロモーター、例えばＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓアントラニル酸塩または安息香酸オペロンプロモーター（Ｐａｎｔ、Ｐｂｅｎ）を使用して、標的ポリペプチドをコードするトランス遺伝子の発現を制御することもできる。配列が同じであろうと異なろうと複数のプロモーターが互いに共有結合しているタンデムプロモーター、または同じ生物または異なる生物のいずれに由来しようと、例えばＰａｎｔ−Ｐｂｅｎタンデムプロモーター（プロモーター間ハイブリッド）またはＰｌａｃ−Ｐｌａｃタンデムプロモーターを使用することもできる。
【０１３２】
調節型プロモーターはプロモーター調節タンパク質を利用して、プロモーターがその一部分である遺伝子の転写を制御する。調節型プロモーターを本明細書において使用する場合、対応するプロモーター調節タンパク質も本発明による発現系の一部分であり得る。プロモーター調節タンパク質の例には、活性化タンパク質、例えばＥ．ｃｏｌｉカタボライト活性化タンパク質、ＭａｌＴタンパク質、ＡｒａＣファミリー転写活性化因子、リプレッサータンパク質、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉＬａｃＩタンパク質、および二重機能調節タンパク質、例えばＥ．ｃｏｌｉＮａｇＣタンパク質がある。多くの調節型プロモーター／プロモーター調節タンパク質のペアが当技術分野で知られている。一実施形態では、（１つまたは複数の）標的タンパク質の発現コンストラクトと対象とする異種タンパク質は、同じ調節エレメントの制御下にある。
【０１３３】
プロモーター調節タンパク質は、エフェクター化合物、すなわち可逆的または不可逆的に調節タンパク質と会合して、タンパク質の放出、またはプロモーターの制御下にある遺伝子の少なくとも１つのＤＮＡ転写調節領域との結合のいずれかを可能にし、それによって遺伝子の転写を開始する際のトランスクリプターゼ酵素の作用を許容または阻害する化合物と相互作用する。エフェクター化合物はインデューサーまたはコリプレッサーのいずれかとして分類され、かつこれらの化合物は、天然エフェクター化合物および余分なインデューサー化合物を含む。多くの調節型プロモーター／プロモーター調節タンパク質／エフェクター化合物のトリオが当技術分野で知られている。エフェクター化合物は細胞培養または発酵中を通して使用することができるが、調節型プロモーターを使用する好ましい実施形態では、望ましい量または密度の宿主細胞バイオマスの増殖後、適切なエフェクター化合物を培養物に直接的または間接的に加え、対象とするタンパク質またはポリペプチドをコードする（１つまたは複数の）望ましい遺伝子の発現をもたらす。
【０１３４】
例えば、ｌａｃファミリーのプロモーターを利用する場合、ｌａｃＩ遺伝子が系中に存在してもよい。（通常）構成的に発現される遺伝子であるｌａｃＩ遺伝子は、これらのプロモーターのｌａｃオペレーターと結合するＬａｃリプレッサータンパク質（ＬａｃＤタンパク質）をコードする。したがって、ｌａｃファミリーのプロモーターを利用する場合、ｌａｃＩ遺伝子を発現系中に含め発現させることが可能である。ｌａｃプロモーターファミリーのメンバー、例えばｔａｃプロモーターの場合、エフェクター化合物はインデューサー、好ましくはＩＰＴＧ（「イソプロピルチオガラクトシド」とも呼ばれるイソプロピル−Ｄ−１−チオガラクトピラノシドなどの余分なインデューサーである。
【０１３５】
対象とするタンパク質またはポリペプチドの発現用に、任意の植物プロモーターを使用することもできる。プロモーターは植物ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターであってよい。植物プロモーター中に含まれるエレメントは、転写開始部位の約２５〜３５塩基対上流（５’）に典型的に位置するＴＡＴＡボックスまたはＧｏｌｄｂｅｒｇ−Ｈｏｇｎｅｓｓボックス、および７０と１００塩基対上流の間に位置するＣＣＡＡＴボックスであってよい。植物において、ＣＣＡＡＴボックスは、哺乳動物プロモーターの機能的に類似した配列と異なるコンセンサス配列を有し得る（Ｍｅｓｓｉｎｇら、（１９８３）Ｉｎ：Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔｓ、Ｋｏｓｕｇｅら、ｅｄｓ．、２１１〜２２７ページ）。さらに、ほぼ全てのプロモーターは、転写開始部位の約−１００ｂｐ〜−１，０００ｂｐ以上上流に広がる追加の上流活性化配列またはエンハンサーを含む（Ｂｅｎｏｉｓｔ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｏｎ（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ２９０：３０４〜３１０ページ；Ｇｒｕｓｓら（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：９４３〜９４７ページ；およびＫｈｏｕｒｙ  ａｎｄ  Ｇｒｕｓｓ（１９８３）Ｃｅｌｌ２７：３１３〜３１４ページ）。
【０１３６】
発現系(Expression Systems)
対象とするタンパク質またはポリペプチドを、アレイ内の１つまたは複数の宿主細胞集団のペリプラズム、または細胞外空間に標的化することは望ましい可能性がある。一実施形態では、発現ベクターは、対象とするタンパク質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と作用可能に連結した、分泌シグナル配列ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、シグナル配列と対象とするタンパク質またはポリペプチドの間に修飾を施さない。しかしながら、特定の実施形態では、追加の切断シグナルを取り込んでポリペプチドのアミノ末端の正確なプロセシングを促進する。
【０１３７】
ベクターは、前に記載した特性のいずれかを有し得る。一実施形態では、対象とするタンパク質またはポリペプチドのコード配列を含むベクターは、シグナル配列、例えば分泌シグナル配列をさらに含む。
【０１３８】
したがって一実施形態では、この単離したポリペプチドは、分泌シグナルと対象とするタンパク質またはポリペプチドの融合タンパク質である。しかしながら、タンパク質がペリプラズムを標的化するとき、分泌シグナルをタンパク質から切断することもできる。一実施形態では、Ｓｅｃ系分泌シグナルとタンパク質またはポリペプチドの間の結合を修飾して分泌シグナルの切断を増大する。
【０１３９】
ＣＨＡＭＰＩＯＮ（商標）ｐＥＴ発現系は高レベルのタンパク質産生をもたらす。発現は強力なＴ７ｌａｃプロモーターから誘導される。この系は、対象とする遺伝子の高レベルの転写に関するバクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼの高い活性および特異性を利用する。プロモーター領域に位置するｌａｃオペレーターは伝統的なＴ７系ベクターより強い調節をもたらし、プラスミドの安定性および細胞の生存を改善する（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ａｎｄ  Ｍｏｆｆａｔｔ（１９８６）Ｊ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ１８９（１）：１１３〜３０ページ；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら（１９８７）Ｇｅｎｅ５６（１）：１２５〜３５ページ）。Ｔ７発現系は、対象とする遺伝子の高レベルの転写にＴ７プロモーターおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ＲＮＡＰ）を使用する。Ｔ７ＲＮＡＰは天然Ｅ．ｃｏｌｉＲＮＡＰよりプロセシングされやすく、対象とする遺伝子の転写に限られるので、高レベルの発現がＴ７発現系において得られる。同定した遺伝子の発現は、宿主細胞中にＴ７ＲＮＡＰの供給源を提供することによって誘導する。これはＴ７ＲＮＡＰ遺伝子の染色体コピーを含有するＢＬ２１Ｅ．ｃｏｌｉ宿主を使用することによって実施する。Ｔ７ＲＮＡＰ遺伝子は、ＩＰＴＧによって誘導することができるｌａｃＵＶ５プロモーターの制御下にある。Ｔ７ＲＮＡＰは誘導によって発現され、対象とする遺伝子を転写する。
【０１４０】
ｐＢＡＤ発現系は、グルコース、グリセロールおよびアラビノースなどの特異的炭素源の存在によって、対象とするタンパク質またはポリペプチドの厳重に制御された、滴定可能な発現を可能にする（Ｇｕｚｍａｎら、（１９９５）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７７（１４）：４１２１〜３０ページ）。ｐＢＡＤベクターは独自に設計して発現レベルに対する正確な制御をもたらす。ｐＢＡＤベクターからの異種遺伝子の発現はａｒａＢＡＤプロモーターで始まる。このプロモーターは、ａｒａＣ遺伝子の産物によって正と負の両方に制御される。ＡｒａＣは、Ｌ−アラビノースと複合体を形成する転写レギュレーターである。Ｌ−アラビノースの不在下では、ＡｒａＣ二量体は転写を阻害する。最大の転写活性化のためには、２つの事象、（ｉ）Ｌ−アラビノースがＡｒａＣと結合して転写の開始を可能にすること、および（ｉｉ）ｃＡＭＰ活性化タンパク質（ＣＡＰ）−ｃＡＭＰ複合体がＤＮＡと結合してプロモーター領域の正確な位置へのＡｒａＣの結合を刺激することが必要とされる。
【０１４１】
ｔｒｃ発現系は、Ｅ．ｃｏｌｉ中でのｔｒｃプロモーターからの、高レベルの制御された発現を可能にする。ｔｒｃ発現ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ中での真核生物遺伝子の発現用に最適化されている。ｔｒｃプロモーターは、トリプトファン（ｔｒｐ）およびラクトース（ｌａｃ）プロモーター由来の強力なハイブリッドプロモーターである。それはｌａｃＯオペレーターおよびｌａｃＩＱ遺伝子の産物によって調節される（Ｂｒｏｓｉｕｓ、Ｊ．（１９８４）Ｇｅｎｅ２７（２）：１６１〜７２ページ）。
【０１４２】
本明細書に開示する（１つまたは複数の）ベクターを用いた宿主細胞の形質転換は、当技術分野で知られている任意の形質転換法を使用して実施することができ、かつ細菌宿主細胞は無傷細胞(intact cells)として、またはプロトプラスト（すなわち、サイトプラスト含む）として形質転換することができる。例示的な形質転換法にはポレーション法、例えばエレクトロポレーション、プロトプラスト融合、細菌接合、および二価カチオン処理、例えば塩化カルシウム処理またはＣａＣｌ／Ｍｇ２＋処理、または当技術分野でよく知られている他の方法がある。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｊ  Ｂａｃｔ．、１３２：３４９〜３５１ページ（１９７７年）；Ｃｌａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ  ＆  Ｃｕｒｔｉｓｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０１：３４７〜３６２ページ（Ｗｕら、ｅｄｓ、１９８３年）、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９年第２版）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０年）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．、１９９４年））を参照。
【０１４３】
対象とするタンパク質(Proteins of interst)
本発明の方法および組成物は、高レベルの適切にプロセシングされた対象とするタンパク質またはポリペプチドを産生するのに最適であるＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ菌株を同定するのに有用である。任意の種および任意の大きさの対象とするタンパク質またはポリペプチドの産生をスクリーニングするのに、アレイは有用である。しかしながら、特定の実施形態では、対象とするタンパク質またはポリペプチドは、治療上有用なタンパク質またはポリペプチドである。いくつかの実施形態では、タンパク質は哺乳動物タンパク質、例えばヒトタンパク質であってよく、かつ例えば成長因子、サイトイン、ケモカインまたは血中タンパク質であってよい。対象とするタンパク質またはポリペプチドは、天然タンパク質またはポリペプチドと同様の方法でプロセシングすることができる。特定の実施形態では、対象とするタンパク質またはポリペプチドは、１００ｋＤ未満、５０ｋＤ未満、または３０ｋＤ未満の大きさである。特定の実施形態では、対象とするタンパク質またはポリペプチドは、少なくとも約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０または１００またはそれより多くのアミノ酸のポリペプチドである。
【０１４４】
対象とするタンパク質またはポリペプチドのコード配列は、ポリペプチドの天然コード配列であってよく、利用可能である場合、但し、例えば、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓなどのシュードモナス種または他の適切な生物のコドン使用の偏向を反映するために遺伝子を最適化することによって、アレイの菌株において発現可能な形で使用するために選択、改良、または最適化されたコード配列であることがより好ましい。遺伝子最適化のために、１つまたは複数の稀なコドンを除去してリボゾーム消失を避け、アミノ酸の取り込み違いを最小にすることができる。１つまたは複数の遺伝子内リボソーム結合部位を除去して、切断型タンパク質産物を避けることもできる。ＣおよびＧヌクレオチドの長い延長部分を除去して、フレームシフトをもたらす可能性があるＲＮＡポリメラーゼのスリップを避けることができる。強力な遺伝子内ステムループ構造、特にリボソーム結合部位を覆う構造を除去することもできる。
【０１４５】
他の実施形態では、タンパク質は産生時に、追加の標的配列、例えばタンパク質をペリプラズムまたは細胞外培地に標的化する配列も含む。一実施形態では、その追加の標的配列は、タンパク質のカルボキシ末端と作用可能に連結する。別の実施形態では、タンパク質は、オートトランスポーターの分泌シグナル、２つのパートナー分泌系、主要末端分岐系または線毛外膜ポーリンを含む。
【０１４６】
生成する（１つまたは複数の）遺伝子は１つまたは複数のベクター内で構築されるか、またはその中に挿入され、次いでアレイ内の宿主細胞集団のそれぞれに形質転換される。「発現可能な形」で提供されると言われる核酸またはポリヌクレオチドは、本発明の１つまたは複数の宿主細胞集団によって発現され得る少なくとも１つの遺伝子を含有する、核酸またはポリヌクレオチドを意味する。
【０１４７】
分子遺伝学および遺伝子工学技法に必要とされる広範囲の配列情報が、広く公に利用されている。哺乳動物の完全なヌクレオチド配列、ならびにヒト、遺伝子、ｃＤＮＡ配列、アミノ酸配列およびゲノムへのアクセスは、ウェブサイトｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＥｎｔｒｅｚでＧｅｎＢａｎｋから得ることができる。追加の情報はＧｅｎｅＣａｒｄｓ、遺伝子およびそれらの産物に関する情報を統合した電子百科事典、およびＷｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｗｅｉｚｍａｎｎ．ａｃ．ｉｌ／ｃａｒｄｓ）からの生物医学的応用から得ることもでき、ヌクレオチド配列情報は、ＥＭＢＬヌクレオチド配列データベース（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｅｍｂｌ／）またはＤＮＡデータバンクまたは日本(the DNA Databank or Japan)（ＤＤＢＪ、ｗｗｗ．ｄｄｂｉ．ｎｉｇ．ａｃ．ｉｉ／；アミノ酸配列に関する情報の追加のサイトには、Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎのタンパク質情報リソースウェブサイト（ｗｗｗ−ｎｂｒｆ．Ｒｅｏｒｇｅｔｏｗｎ．ｅｄｕ／ｐｉｒｌ）およびＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ（ａｕ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｓｐｒｏｔ／ｓｐｒｏｔ−ｔｏｐ．ｈｔｍｌ）がある）から得ることもできる。
【０１４８】
本発明において発現させることが可能であるタンパク質の例には、例えばレニン、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、成長ホルモン放出因子を含めた成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、リポタンパク質、α−１−アンチトリプシン、インシュリンＡ鎖、インシュリンＢ鎖、プロインシュリン、トロンボポエチン、卵胞刺激ホルモン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、グルカゴン、因子ＶＩＩＩＣ、因子ＩＸ、組織因子、およびフォンウィルブランド因子などの凝固因子、プロテインＣなどの抗凝固因子、心房性ナトリウム利尿因子、肺表面活性剤、ウロキナーゼまたはヒト尿または組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）などのプラスミノーゲン活性化因子、ボムベシン、トロンビン、造血成長因子、腫瘍壊死因子−αおよび−β、エンケファリナーゼ、ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン、ミュラー管抑制物質、レラキシンＡ鎖、レラキシンＢ鎖、プロレラキシン、マウスゴナドトロピン関連ポリペプチド、β−ラクタマーゼなどの微生物タンパク質、デオキシリボヌクレアーゼ、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ホルモンまたは増殖因子に対する受容体、インテグリン、プロテインＡまたはＤ、リウマチ因子、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５、または−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５、またはＮＴ−６）、またはＮＧＦ−βなどの神経成長因子などの神経栄養因子、カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）などのカルジオトロフィン（心肥大因子）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ａＦＧＦおよびｂＦＧＦなどの線維芽細胞成長因子、表皮成長因子（ＥＧＦ）、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４、またはＴＧＦ−β５を含めたＴＧＦ−βなどの形質転換成長因子（ＴＧＦ）、インシュリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；ｄｅｓ（１〜３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インシュリン様成長因子結合タンパク質、ＣＤ−３、ＣＤ−４、ＣＤ−８、およびＣＤ−１９などのＣＤタンパク質、エリスロポエチン、骨誘導因子、免疫毒素、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、インターフェロン−α、−β、および−γなどのインターフェロン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦ、インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１〜ＩＬ−１０、抗ＨＥＲ−２抗体、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｔ細胞受容体、表面膜タンパク質、分解促進因子、例えばＡＩＤＳエンベロープの一部分などのウイルス抗原、輸送タンパク質、ホーミング受容体、アドレシン、調節タンパク質、抗体、および前に挙げたポリペプチドのいずれかの断片などの分子がある。
【０１４９】
特定の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドは、ＩＬ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１２ｅｌａｓｔｉ、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１８、ＩＬ−１８ＢＰａ、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＶＩＰ、エリスロポエチン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＭＳＦ、ＦＬＴ−３リガンド、ＥＧＦ、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ；例えば、α−ＦＧＦ（ＦＧＦ−１）、β−ＦＧＦ（ＦＧＦ−２）、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、またはＦＧＦ−７）、インシュリン様成長因子（例えば、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ、リンホトキシン）、神経成長因子（例えば、ＮＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、絨毛神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、オンコスタチンＭ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、形質転換成長因子（例えば、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３）、ＴＮＦスーパーファミリー（例えば、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、ＳＴＡＬＬ−ｌ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ（ＢＬｙ５、ＢＡＦＦ、ＴＨＡＮＫ）、ＴＮＦα／ＴＮＦＳＦ２およびＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２）、またはケモカイン（ＢＣＡ−１／ＢＬＣ−１、ＢＲＡＫ／Ｋｅｃ、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＲ３、ＥＮＡ−７８／ＬＩＸ、エオタキシン−１、エオタキシン−２／ＭＰＩＦ−２、エクソダス（Ｅｘｏｄｕｓ）−２／ＳＬＣ、フラクタルカイン／ニューロタクチン、ＧＲＯα／ＭＧＳＡ、ＨＣＣ−１、Ｉ−ＴＡＣ、リンホタクチン／ＡＴＡＣ／ＳＣＭ、ＭＣＰ−１／ＭＣＡＦ、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＤＣ／ＳＴＣＰ−１／ＡＢＣＤ−１、ＭＩＰ−１．クアドラチュア（ｑｕａｄｒａｔｕｒｅ）、ＭＩＰ−１．クアドラチュア、ＭＩＰ−２．クアドラチュア／ＧＲＯ．クアドラチュア、ＭＩＰ−３．クアドラチュア．／エクソダス／ＬＡＲＣ、ＭＩＰ−３／エクソダス−３／ＥＬＣ、ＭＩＰ−４／ＰＡＲＣ／ＤＣ−ＣＫ１、ＰＦ−４、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ１、ＴＡＲＣ、ＴＥＣＫ、微生物毒素、ＡＤＰリボシル化毒素、微生物またはウイルス抗原）から選択することができる。
【０１５０】
本発明の一実施形態では、対象とするタンパク質はマルチサブユニットタンパク質またはポリペプチドであってよい。発現させることが可能であるマルチサブユニットタンパク質には、同種および異種タンパク質がある。マルチサブユニットタンパク質は、同じであるかまたは異なってよい２個以上のサブユニットを含むことができる。例えばタンパク質は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個またはそれより多くのサブユニットを含む同種タンパク質であってよい。タンパク質は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、またはそれより多くのサブユニットを含む異種タンパク質であってもよい。例示的なマルチサブユニットタンパク質には、イオンチャネル受容体を含めた受容体、コンドロイチン、コラーゲンを含めた細胞外マトリクスタンパク質、ＭＨＣタンパク質、完全鎖抗体、および抗体断片を含めた免疫修飾物質、ＲＮＡポリメラーゼ、およびＤＮＡポリメラーゼを含めた酵素、および膜タンパク質がある。
【０１５１】
別の実施形態では、対象とするタンパク質は血中タンパク質であってよい。この実施形態において発現される血中タンパク質には、担体タンパク質、ヒトおよびウシアルブミンを含めたアルブミンなど、トランスフェリン、組換え体トランスフェリン半分子、ハプトグロビン、フィブリノゲンおよび他の凝固因子、補体成分、免疫グロブリン、酵素阻害剤、アンギオテンシンおよびブラジキニン、インシュリン、エンドセリン、およびα、β、およびγ−グロブリンを含めたグロブリンなどの物質の前駆体、および哺乳動物の血液中で主に見られる他の型のタンパク質、ポリペプチド、およびそれらの断片があるが、これらだけには限られない。ヒト血清アルブミンに関するアミノ酸配列（Ｌａｗｎ、Ｌ．Ｍら、（１９８１年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、９：６１０３〜６１１４ページ）およびヒト血清トランスフェリンに関するアミノ酸配列（Ｙａｎｇ、Ｆら、（１９８４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：２７５２〜２７５６ページ）を含めた、多数の血中タンパク質に関するアミノ酸配列が報告されてきている（Ｓ．Ｓ．Ｂａｌｄｗｉｎ（１９９３年）Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０６ｂ：２０３〜２１８ページ参照）。
【０１５２】
別の実施形態では、対象とするタンパク質は酵素または補因子であってよい。この実施形態において発現される酵素および補因子には、アルドラーゼ、アミンオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、アスパルターゼ、Ｂ１２依存性酵素、カルボキシペプチダーゼ、カルボキシエステラーゼ、カルボキシリアーゼ、ケモトリプシン、ＣｏＡ要求酵素、シアノヒドリンシンテターゼ、シスタチオンシンターゼ、デカルボキシラーゼ、デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、デヒドラターゼ、ジアホラーゼ、ジオキシゲナーゼ、エノアートリダクターゼ、エポキシドヒドラーゼ、フメラーゼ、ガラクトースオキシダ−ゼ、グルコースイソメラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ニトリルヒドラーゼ、ヌクレオシドホスホリラーゼ、オキシドリダクターゼ、オキシニチラーゼ、ペプチダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ペロキシダーゼ、治療活性ポリペプチドと融合した酵素、組織型プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、レプチラーゼ、ストレプトキナーゼ、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、アミノ酸加水分解酵素（例えば、アスパラギナーゼ、アミド加水分解酵素）、カルボキシペプチダーゼ、プロテアーゼ、トリプシン、ペプシン、キモトリプシン、パパイン、ブロメライン、コラゲナーゼ、ノイラミニダーゼ、ラクターゼ、マルターゼ、スクラーゼ、およびアラビノフラノシダーゼがあるが、これらだけには限られない。
【０１５３】
別の実施形態では、対象とするタンパク質は単鎖、Ｆａｂ断片および／または完全鎖抗体、またはその断片もしくは一部分であってよい。単鎖抗体は、１つの安定的にフォールディングしたポリペプチド鎖上の抗体の抗原結合領域を含むことができる。Ｆａｂ断片は特定の抗体の一片であってよい。Ｆａｂ断片は抗原結合部位を含有することができる。Ｆａｂ断片は２本の鎖、軽鎖および重鎖断片を含有することができる。これらの断片は、リンカーまたはジスルフィド結合によって連結させることが可能である。
【０１５４】
他の実施形態では、対象とするタンパク質は、約２０〜約４２℃の温度で活性があるタンパク質である。一実施形態では、タンパク質は生理的温度で活性があり、高温または極温(high or extreme temperatures)、６５℃を超える温度に加熱すると不活性である。
【０１５５】
一実施形態では、対象とするタンパク質は約２０〜約４２℃の温度で活性があるタンパク質であり、および／または高温または極温、６５℃を超える温度に加熱すると不活性であり、あるいは天然哺乳動物またはヒトタンパク質などの天然タンパク質と実質的に相同的であり、コンカタマー型の核酸から発現されず、この場合プロモーターはアレイ内で使用する宿主細胞における天然プロモーターではなく、Ｅ．ｃｏｌｉなどの他の生物に由来する。
【０１５６】
宿主細胞(Host cell)
一実施形態では本発明は、そこから対象とする異種タンパク質またはペプチドを場合によっては産生するための、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主細胞のアレイを提供する。Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓは様々なタンパク質を産生するための改良された基盤であることが実証されており、いくつかの有効な分泌シグナルがこの生物から同定されている（その全容が参照によって本明細書に組み込まれる、米国出願公開第２００６／０００８８７７号を参照）。
【０１５７】
シュードモナス系は、他の細菌発現系と比較して、ポリペプチドおよび酵素の工業的発現に関して利点をもたらす。特に、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓは有利な発現系として同定されている。Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓは、土壌、水および植物表面環境にコロニー形成する、一群の一般的な、非病原性の腐生菌を含む。洗浄添加剤として、および立体選択的加水分解用に、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来の市販の酵素が使用されて、環境汚染物質が減らされている。Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓは病原体を制御するために農業用にも使用されている。米国特許第４，６９５，４６２号は、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓにおける組換え体細菌タンパク質の発現を記載している。
【０１５８】
しかしながら、代替宿主細胞、またはさらに多様な異なる宿主細胞を使用して、前に論じたように１つまたは複数の標的遺伝子の発現を調節するために遺伝子改変された複数の表現型が異なる宿主細胞を含む、アレイを作製することができることは企図(comtemplated)される。宿主細胞は、その中で標的遺伝子を改変することができる任意の生物であってよい。表１および２中に挙げた標的遺伝子と相同的な標的遺伝子を同定する方法は、当技術分野で知られている。さらに、当業者は、対象とする宿主細胞に由来するかまたはその中で有用である標的遺伝子の同定の仕方を理解しているはずである。これらのタンパク質の多くは当技術分野でよく知られている。例えば、米国特許出願公開第２００６／０１１０７４７号）を参照。
【０１５９】
宿主細胞は「グラム陰性プロテオバクテリア亜群１８」から選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリア亜群１８」は、例えば以下の（丸括弧中に示すＡＴＣＣまたは他の寄託番号の（１つまたは複数の）例示的菌株）：次亜種１または次亜種Ｉとも呼ばれる、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓバイオタイプＡ（ＡＴＣＣ１３５２５）；次亜種２または次亜種ＩＩとも呼ばれる、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓバイオタイプＢ（ＡＴＣＣ１７８１６）；次亜種３または次亜種ＩＩＩとも呼ばれる、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓバイオタイプＣ（ＡＴＣＣ１７４００）；次亜種４または次亜種ＩＶとも呼ばれる、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓバイオタイプＦ（ＡＴＣＣ１２９８３）；次亜種５または次亜種Ｖとも呼ばれる、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓバイオタイプＧ（ＡＴＣＣ１７５１８）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓバイオタイプＶＩ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓＰｆ０−１；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓＰｆ−５（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−４７７）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓＳＢＷ２５；およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ亜種ｃｅｌｌｕｌｏｓａ（ＮＣＩＭＢ１０４６２）に属するものを含めた、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ種の全ての亜種、変種、菌株、および他の下位専門単位の群として定義する。
【０１６０】
宿主細胞は「グラム陰性プロテオバクテリア亜群１９」から選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリア亜群１９」は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓバイオタイプＡの全ての菌株の群として定義する。このバイオタイプの特に好ましい菌株は、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ菌株ＭＢ１０１（Ｗｉｌｃｏｘへの米国特許第５，１６９，７６０号を参照）、およびその誘導体である。その好ましい誘導体の一例は、ＭＢ１０１染色体ａｓｄ（アスパラギン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子）遺伝子座に挿入することによって構築されたＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ菌株ＭＢ２１４、天然Ｅ．ｃｏｌｉＰｌａｃＩ−ｌａｃＩ−ｌａｃＺＹＡコンストラクト（すなわち、その中でＰｌａｃＺが欠失した）である。
【０１６１】
本発明において使用することができる追加のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ菌株には、以下のＡＴＣＣ指定を有する、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＭｉｇｕｌａおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  Ｌｏｉｔｏｋｉｔｏｋがある：［ＮＣＩＢ  ８２８６］；ＮＲＲＬ  Ｂ−１２４４；ＮＣＩＢ  ８８６５株ＣＯ１；ＮＣＩＢ  ８８６６株ＣＯ２；１２９１［ＡＴＣＣ  １７４５８；ＩＦＯ  １５８３７；ＮＣＩＢ  ８９１７；ＬＡ；ＮＲＲＬ  Ｂ−１８６４；ピロリジン；ＰＷ２［ＩＣＭＰ  ３９６６；ＮＣＰＰＢ  ９６７；ＮＲＲＬ  Ｂ−８９９］；１３４７５；ＮＣＴＣ  １００３８；ＮＲＲＬ  Ｂ−１６０３［６；ＩＦＯ  １５８４０］；５２−１Ｃ；ＣＣＥＢ  ４８８−Ａ［ＢＵ  １４０］；ＣＣＥＢ  ５５３［ＥＭ  １５／４７］；ＩＡＭ  １００８［ＡＨＨ−２７］；ＩＡＭ  １０５５［ＡＨＨ−２３］；Ｉ［ＩＦＯ  １５８４２］；１２［ＡＴＣＣ  ２５３２３；ＮＩＨ  １１；ｄｅｎ  Ｄｏｏｒｅｎ  ｄｅ  Ｊｏｎｇ  ２１６］；１８［ＩＦＯ  １５８３３；ＷＲＲＬ  Ｐ−７］；９３［ＴＲ−１０］；１０８［５２−２２；ＩＦＯ  １５８３２］；１４３［ＩＦＯ  １５８３６；ＰＬ］；１４９［２−４０−４０；ＩＦＯ  １５８３８］；１８２［ＩＦＯ  ３０８１；ＰＪ  ７３］；１８４［ＩＦＯ  １５８３０］；１８５［Ｗ２  Ｌ−１］；１８６［ＩＦＯ  １５８２９；ＰＪ  ７９］；１８７［ＮＣＰＰＢ  ２６３］；１８８［ＮＣＰＰＢ  ３１６］；１８９［ＰＪ２２７；１２０８］；１９１［ＩＦＯ  １５８３４；ＰＪ  ２３６；２２／１］；１９４［Ｋｌｉｎｇｅ  Ｒ−６０；ＰＪ  ２５３］；１９６［ＰＪ  ２８８］；１９７［ＰＪ  ２９０］；１９８［ＰＪ  ３０２］；２０１［ＰＪ  ３６８］；２０２［ＰＪ  ３７２］；２０３［ＰＪ  ３７６］；２０４［ＩＦＯ  １５８３５；ＰＪ  ６８２］；２０５［ＰＪ  ６８６］；２０６［ＰＪ  ６９２］；２０７［ＰＪ  ６９３］；２０８［ＰＪ  ７２２］；２１２．［ＰＪ  ８３２］；２１５［ＰＪ  ８４９］；２１６［ＰＪ  ８８５］；２６７［Ｂ−９］；２７１［Ｂ−１６１２］；４０１［Ｃ７１Ａ；ＩＦＯ  １５８３１；ＰＪ  １８７］；ＮＲＲＬ  Ｂ−３１７８［４；ＩＦＯ．１５８４１］；ＫＹ  ８５２１；３０８１；３０−２１；［ＩＦＯ  ３０８１］；Ｎ；ＰＹＲ；ＰＷ；Ｄ９４６−Ｂ８３［ＢＵ  ２１８３；ＦＥＲＭ−Ｐ  ３３２８］；Ｐ−２５６３［ＦＥＲＭ−Ｐ  ２８９４；ＩＦＯ  １３６５８］；ＩＡＭ−１１２６［４３Ｆ］；Ｍ−１；Ａ５０６［Ａ５−０６］；Ａ５０５［Ａ５−０５−１］；Ａ５２６［Ａ５−２６］；Ｂ６９；７２；ＮＲＲＬ  Ｂ−４２９０；ＰＭＷ６［ＮＣＩＢ  １１６１５］；ＳＣ  １２９３６；Ａｌ［ＩＦＯ  １５８３９］；Ｆ  １８４７［ＣＤＣ−ＥＢ］；Ｆ  １８４８［ＣＤＣ  ９３］；ＮＣＩＢ  １０５８６；Ｐ１７；Ｆ−１２；ＡｍＭＳ  ２５７；ＰＲＡ２５；６１３３Ｄ０２；６５１９Ｅ０１；Ｎｉ；ＳＣ１５２０８；ＢＮＬ−ＷＶＣ；ＮＣＴＣ  ２５８３［ＮＣＩＢ  ８１９４］；Ｈ１３；１０１３［ＡＴＣＣ  １１２５１；ＣＣＥＢ  ２９５］；ＩＦＯ  ３９０３；１０６２；またはＰｆ−５。
【０１６２】
一実施形態では、宿主細胞は、前に記載したＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ細胞を含めた、対象とするタンパク質またはポリペプチドを産生することができる任意の細胞であってよい。対象とするタンパク質またはポリペプチドを産生するために最も一般的に使用される系は、大規模なバッチ式培養においてタンパク質を産生するための、それらの比較的安価な増殖要件および潜在能力のために、特定の細菌細胞、特にＥ．ｃｏｌｉを含む。酵母菌をさらに使用して、特に研究目的で、生物学的関連があるタンパク質およびポリペプチドを発現させる。系にはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓがある。これらの系は十分特徴付けられており、一般に認められるレベルの全タンパク質産生をもたらし、比較的迅速および安価である。昆虫細胞発現系も、生物活性型の組換えタンパク質を発現させるための代替として浮上している。いくつかの場合、翻訳後修飾された、正確にフォールディングされたタンパク質を産生することができる。チャイニーズハムスター卵巣細胞などの哺乳動物細胞発現系も、対象とするタンパク質またはポリペプチドの発現用に使用されている。小規模では、これらの発現系は有効であることが多い。特定の生物製剤は、特に動物またはヒトの健康用途で、タンパク質から誘導することができる。別の実施形態では、宿主細胞は、これらだけには限られないが、タバコ細胞、コーン細胞、シロイヌナズナ種由来の細胞、ジャガイモまたはコメ細胞を含めた植物細胞である。
【０１６３】
別の実施形態では、宿主細胞は、これらだけには限られないが、エシェリキアまたはシュードモナス種を含めた細菌細胞などの原核細胞であってよい。典型的な細菌細胞は、ウェブサイトｗｗｗ．ｅｍｃ．ｍａｒｉｃｏｔｐａ．ｅｄｕ／ｆａｃｕｌｔｙ／ｆａｒａｂｅｅ／ＢＩＯＢＫ／ＢｉｏＢｏｏｋＤｉｖｅｒｓｉｔｙで、Ｅｓｔｒｅｌｌａ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  Ｃｏｌｌｅｇｅ、Ａｒｉｚｏｎａ、ＵＳＡのＤｒ  Ｍ  Ｊ  Ｆａｒａｂｅｅによって提供された、例えば「Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ：Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ａｒｃｈａｅａｎｓ」、ｔｈｅ  Ｏｎ−Ｌｉｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｂｏｏｋの一章中に記載されている。特定の実施形態では、宿主細胞はシュードモナス細胞であってよく、かつ典型的にはＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ細胞であってよい。他の実施形態では、宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉ細胞であってもよい。別の実施形態では、宿主細胞は真核細胞、例えばこれらだけには限られないがスポドプテラ、トリコプルシア、ショウジョウバエまたはエスティグメン種由来の細胞を含めた昆虫細胞、またはこれらだけには限られないがネズミ細胞、ハムスター細胞、サル、霊長類またはヒト細胞を含めた哺乳動物細胞であってよい。
【０１６４】
一実施形態では、宿主細胞は細菌分類群のいずれかのメンバーであってよい。細胞は例えば、真正細菌の任意の種のメンバーであってよい。宿主は、分類群：アシドバクテリア、アクチノバクテリア、アクイフェックス、バクテロイデス、クロロビウム、クラミジア、コロフレキシ、クリシオジェネス、シアノバクテリア、デフェリバクター、デイノコッカス、ディクチオグロムス、フィブロバクター、ファーミキューテス、フソバクテリア、ゲマティモナス、レンチスファエラ、ニトロスピラ、プランクトミセス、プロテオバクテリア、スピロヘータ、サーモデスルフォバクテリア、サーモミクロビア、サーモトガ、サーマス（サーマレス）、またはベルコミクロビアのいずれか１つのメンバーであってよい。真正細菌宿主細胞の一実施形態では、細胞は、シアノバクテリアを除く真正細菌の任意の種のメンバーであってよい。
【０１６５】
細菌宿主は、プロテオバクテリアの任意の種のメンバーであってもよい。プロテオバクテリア宿主細胞は、分類群アルファプロテオバクテリア、ベータプロテオバクテリア、ガンマプロテオバクテリア、デルタプロテオバクテリア、またはイプシロンプロテオバクテリアのいずれか１つのメンバーであってよい。さらに宿主は、分類群アルファプロテオバクテリア、ベータプロテオバクテリア、またはガンマプロテオバクテリアのいずれか１つのメンバー、およびガンマプロテオバクテリアの任意の種のメンバーであってよい。
【０１６６】
ガンマプロテオバクテリア宿主の一実施形態では、宿主は、分類群エロモナス目、アルテロモナス目、腸内細菌目、シュードモナス目、またはキサントモナス目のいずれか１つのメンバー、または腸内細菌目もしくはシュードモナスの目の任意の種のメンバーであり得る。一実施形態では、宿主細胞は腸内細菌の目であってよく、宿主細胞は腸内細菌科のメンバーであり得る、またはエルビニア、エシェリキア、またはセラチア属のいずれか１つのメンバー、またはエシェリキア属のメンバーであってよい。宿主細胞がシュードモナスの目である場合、宿主細胞は、シュードモナス属を含めたシュードモナス科のメンバーであってよい。ガンマプロテオバクテリア宿主には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈａｉａ．ｃｏｌｉ種のメンバーおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ種のメンバーがある。
【０１６７】
他のシュードモナス生物も有用である可能性がある。シュードモナスおよび近縁の種には、Ｒ．Ｅ．Ｂｕｃｈａｎａｎ  ａｎｄ  Ｎ．Ｅ．Ｇｉｂｂｏｎｓ（ｅｄｓ．）、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、２１７〜２８９ページ（第８版、１９７４年）（Ｔｈｅ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｃｏ．、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ．、ＵＳＡ）（本明細書では以後「Ｂｅｒｇｅｙ（１９７４）」）によって「Ｇｒａｍ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ａｅｒｏｂｉｃ  Ｒｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｃｃｉ」として記載された、科および／または属に属するプロテオバクテリアの群を含む、グラム陰性プロテオバクテリア亜群１がある。表７は、これらの生物の科および属を表す。
【０１６８】
【表７】
0005444553.tif 000012
【０１６９】
「グラム陰性プロテオバクテリア亜群１」は、分類において使用する基準に従ってこの表題に分類され得るプロテオバクテリアも含む。この表題は、この項で前に分類したがそれ以上は分類されない群、アシドボラックス、ブレブンジモナス、バークホルデアリア、好気性水素酸化細菌、オーシャンイモナス、ラルストニア、およびステノトロフォモナス属、（以前に命名された種の）キサントモナス属に属する生物を再グループ化することによって生成したスフィンゴモナス属（およびそれに由来するブラストモナス属）、Ｂｅｒｇｅｙ（１９７４）において定義されたアセトバクター属に属する生物を再グループ化することによって生成したアシドモナス属なども含む。さらに宿主は、それぞれＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｎｉｇｒｉｆａｃｉｅｎｓ、およびＡｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓとして再分類された、シュードモナス属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｎａｌｉａ（ＡＴＣＣ１４３９３）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｎｉｇｒｉｆａｃｉｅｎｓｉ（ＡＴＣＣ１９３７５）、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ（ＡＴＣＣ８０７１）由来の細胞を含むことができる。同様に、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓ（ＡＴＣＣ１５６６８）およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ（ＡＴＣＣ１１９９６）が、それぞれＣｏｍａｍｏｎａｓ  ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓおよびＣｏｍａｍｏｎａｓ  ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉとして以後再分類されており、かつＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｎｉｇｒｉｆａｃｉｅｎｓ（ＡＴＣＣ１９３７５）およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｉｓｃｉｃｉｄａ（ＡＴＣＣ１５０５７）が、それぞれＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｎｉｇｒｉｆａｃｉｅｎｓおよびＰｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ  ｐｉｓｃｉｃｉｄａとして再分類されている。「グラム陰性プロテオバクテリア亜群１」は、科：シュードモナス科、アゾトバクター科（現在、同義語、「シュードモナス科のアゾトバクター族」によって呼ばれることが多い）、リゾビウム科、およびメチロモナス科（現在、同義語、「メチロコッカス科」によって呼ばれることが多い）のいずれかに属するとして分類されたプロテオバクテリアも含む。したがって、本明細書で他に記載する属に加えて、「グラム陰性プロテオバクテリア亜群１」の範疇のさらなるプロテオバクテリア属には、１）アゾリゾフィルス属のアゾトバクター群の細菌、２）セルビブリオ、オリゲラ、およびテレジニバクター属のシュードモナス科の細菌、３）ケラトバクター、エンシファー、リベリバクター（「カンジダタスリベリバクター」とも呼ばれる）、およびシノリゾビウム属のリゾビウム科の細菌、および４）メチロバクター、メチロカルダム、メチロミクロビウム、メチロサルシナ、およびメチロスファエラ属のメチロコッカス科の細菌がある。
【０１７０】
別の実施形態では、宿主細胞は「グラム陰性プロテオバクテリア亜群２」から選択される。「グラム陰性プロテオバクテリア亜群２」は、以下の属（および全数のカタログに挙げられ、公に入手可能な、他に示した場合を除きいずれもＡＴＣＣで寄託された、丸括弧中に示すその寄託菌株）：アシドモナス（２）；アセトバクター（９３）；グルコノバクター（３７）；ブレブンジモナス（２３）；ベイエリンキア（１３）；デルキシア（２）；ブルセラ（４）；アグロバクテリウム（７９）；ケラトバクター（２）；エンシファー（３）；リゾビウム（１４４）；シノリゾビウム（２４）；ブラストモナス（１）；スフィンゴモナス（２７）；アルカリゲネス（８８）；ボルデテラ（４３）；バークホルデアリア（７３）；ラルストニア（３３）；アシドボラックス（２０）；好気性水素酸化細菌（９）；ズーグレア（９）；メチロバクター（２）；メチロカルダム（ＮＣＩＭＢで１）；メチロコッカス（２）；メチロミクロビウム（２）；メチロモナス（９）；メチロサルシナ（１）；メチロスファエラ、アゾモナス（９）；アゾリゾフィルス（５）；アゾトバクター（６４）；セルビブリオ（３）；オリゲラ（５）；シュードモナス（１１３９）；フランシセラ（４）；キサントモナス（２２９）；ステノトロフォモナス（５０）；およびオーシャンイモナス（４）のプロテオバクテリアの群として定義する。
【０１７１】
「グラム陰性プロテオバクテリア亜群２」の例示的な宿主細胞種には、以下の細菌（および丸括弧中に示すＡＴＣＣまたは他の寄託番号の（１つまたは複数の）例示的菌株）があるが、これらだけには限られない：Ａｃｉｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ（ＡＴＣＣ  ４３５８１）；Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ａｃｅｔｉ（ＡＴＣＣ  １５９７３）；Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｏｘｙｄａｎｓ（ＡＴＣＣ  １９３５７）；Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ（ＡＴＣＣ  １１５６８）；Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ  ｉｎｄｉｃａ（ＡＴＣＣ  ９０３９  およびＡＴＣＣ  １９３６１）；Ｄｅｒｘｉａ  ｇｕｍｍｏｓａ（ＡＴＣＣ  １５９９４）；Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ（ＡＴＣＣ  ２３４５６），Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ（ＡＴＣＣ  ２３４４８）；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（ＡＴＣＣ  ２３３０８），Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ（ＡＴＣＣ  １９３５８），Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ  １１３２５）；Ｃｈｅｌａｔｏｂａｃｔｅｒ  ｈｅｉｎｔｚｉｉ（ＡＴＣＣ  ２９６００）；Ｅｎｓｉｆｅｒ  ａｄｈａｅｒｅｎｓ（ＡＴＣＣ  ３３２１２）；Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ（ＡＴＣＣ  １０００４）；Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｆｒｅｄｉｉｉ（ＡＴＣＣ  ３５４２３）；Ｂｌａｓｔｏｍｏｎａｓ  ｎａｔａｔｏｒｉａ（ＡＴＣＣ  ３５９５１）；Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ  ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ  ２９８３７）；Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ（ＡＴＣＣ  ８７５０）；Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（ＡＴＣＣ  ９７９７）；Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ（ＡＴＣＣ  ２５４１６）；Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｐｉｃｋｅｔｔｉｉ（ＡＴＣＣ  ２７５１１）；Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ  １１２２８）；Ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｐｈａｇａｆｌａｖａ（ＡＴＣＣ  ３３６６７）；Ｚｏｏｇｌｏｅａ  ｒａｍｉｇｅｒａ（ＡＴＣＣ  １９５４４）；Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌｕｔｅｕｓ（ＡＴＣＣ  ４９８７８）；Ｍｅｔｈｙｌｏｃａｌｄｕｍ  ｇｒａｃｉｌｅ（ＮＣＩＭＢ  １１９１２）；Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ＡＴＣＣ  １９０６９）；Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ａｇｉｌｅ（ＡＴＣＣ  ３５０６８）；Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ  ｍｅｔｈａｎｉｃａ（ＡＴＣＣ  ３５０６７）；Ｍｅｔｈｙｌｏｓａｒｃｉｎａ  ｆｉｂｒａｔａ（ＡＴＣＣ  ７００９０９）；Ｍｅｔｈｙｌｏｓｐｈａｅｒａ  ｈａｎｓｏｎｉｉ（ＡＣＡＭ  ５４９）；Ａｚｏｍｏｎａｓ  ａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ  ７４９４）；Ａｚｏｒｈｉｚｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｓｐａｌｉ（ＡＴＣＣ  ２３８３３）；Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｍ（ＡＴＣＣ  ９０４３）；Ｃｅｌｌｖｉｂｒｉｏ  ｍｉｘｔｕｓ（ＵＱＭ  ２６０１）；Ｏｌｉｇｅｌｌａ  ｕｒｅｔｈｒａｌｉｓ（ＡＴＣＣ  １７９６０）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＡＴＣＣ  １０１４５），Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（ＡＴＣＣ  ３５８５８）；Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ（ＡＴＣＣ  ６２２３）；Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｔｏｐｈｉｌｉａ（ＡＴＣＣ  １３６３７）；Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ（ＡＴＣＣ  ３３９１３）；およびＯｃｅａｎｉｍｏｎａｓ  ｄｏｕｄｏｒｏｆｆｉｉ（ＡＴＣＣ  ２７１２３）。
【０１７２】
別の実施形態では、宿主細胞は「グラム陰性プロテオバクテリア亜群３」から選択される。「グラム陰性プロテオバクテリア亜群３」は、以下の属：ブレブンジモナス、アグロバクテリウム、リゾビウム、シノリゾビウム、ブラストモナス、スフィンゴモナス、アルカリゲネス、バークホルデアリア、ラルストニア、アシドボラックス、好気性水素酸化細菌、メチロバクター、メチロカルダム、メチロコッカス、メチロミクロビウム、メチロモナス、メチロサルシナ、メチロスファエラ、アゾモナス、アゾリゾフィルス、アゾトバクター、セルビブリオ、オリゲラ、シュードモナス、テレジニバクター、フランシセラ、ステノトロフォモナス、キサントモナス、およびオーシャンイモナスのプロテオバクテリアの群として定義する。
【０１７３】
別の実施形態では、宿主細胞は「グラム陰性プロテオバクテリア亜群４」から選択される。「グラム陰性プロテオバクテリア亜群４」は、以下の属：ブレブンジモナス、ブラストモナス、スフィンゴモナス、バークホルデアリア、ラルストニア、アシドボラックス、好気性水素酸化細菌、メチロバクター、メチロカルダム、メチロコッカス、メチロミクロビウム、メチロモナス、メチロサルシナ、メチロスファエラ、アゾモナス、アゾリゾフィルス、アゾトバクター、セルビブリオ、オリゲラ、シュードモナス、テレジニバクター、フランシセラ、ステノトロフォモナス、キサントモナス、およびオーシャンイモナスのプロテオバクテリアの群として定義する。
【０１７４】
別の実施形態では、宿主細胞は「グラム陰性プロテオバクテリア亜群５」から選択される。「グラム陰性プロテオバクテリア亜群５」は、以下の属：メチロバクター、メチロカルダム、メチロコッカス、メチロミクロビウム、メチロモナス、メチロサルシナ、メチロスファエラ、アゾモナス、アゾリゾフィルス、アゾトバクター、セルビブリオ、オリゲラ、シュードモナス、テレジニバクター、フランシセラ、ステノトロフォモナス、キサントモナス、およびオーシャンイモナスのプロテオバクテリアの群として定義する。
【０１７５】
宿主細胞は、「グラム陰性プロテオバクテリア亜群６」から選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリア亜群６」は、以下の属：ブレブンジモナス、ブラストモナス、スフィンゴモナス、バークホルデアリア、ラルストニア、アシドボラックス、好気性水素酸化細菌、アゾモナス、アゾリゾフィルス、アゾトバクター、セルビブリオ、オリゲラ、シュードモナス、テレジニバクター、ステノトロフォモナス、キサントモナス、およびオーシャンイモナスのプロテオバクテリアの群として定義する。
【０１７６】
宿主細胞は、「グラム陰性プロテオバクテリア亜群７」から選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリア亜群７」は、以下の属：アゾモナス、アゾリゾフィルス、アゾトバクター、セルビブリオ、オリゲラ、シュードモナス、テレジニバクター、ステノトロフォモナス、キサントモナス、およびオーシャンイモナスのプロテオバクテリアの群として定義する。
【０１７７】
宿主細胞は、「グラム陰性プロテオバクテリア亜群８」から選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリア亜群８」は、以下の属：ブレブンジモナス、ブラストモナス、スフィンゴモナス、バークホルデアリア、ラルストニア、アシドボラックス、好気性水素酸化細菌、シュードモナス、ステノトロフォモナス、キサントモナス、およびオーシャンイモナスのプロテオバクテリアの群として定義する。
【０１７８】
宿主細胞は、「グラム陰性プロテオバクテリア亜群９」から選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリア亜群９」は、以下の属：ブレブンジモナス、バークホルデアリア、ラルストニア、アシドボラックス、好気性水素酸化細菌、シュードモナス、ステノトロフォモナス、およびオーシャンイモナスのプロテオバクテリアの群として定義する。
【０１７９】
宿主細胞は、「グラム陰性プロテオバクテリア亜群１０」から選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリア亜群１０」は、以下の属：バークホルデアリア、ラルストニア、シュードモナス、ステノトロフォモナス、およびキサントモナスのプロテオバクテリアの群として定義する。
【０１８０】
宿主細胞は、「グラム陰性プロテオバクテリア亜群１１」から選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリア亜群１１」は、シュードモナス、ステノトロフォモナス、およびキサントモナス属のプロテオバクテリアの群として定義する。
【０１８１】
宿主細胞は、「グラム陰性プロテオバクテリア亜群１２」から選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリア亜群１２」は、以下の属：バークホルデアリア、ラルストニア、シュードモナスのプロテオバクテリアの群として定義する。宿主細胞は、「グラム陰性プロテオバクテリア亜群１３」から選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリア亜群１３」は、以下の属：バークホルデアリア、ラルストニア、シュードモナス、およびキサントモナスのプロテオバクテリアの群として定義する。宿主細胞は、「グラム陰性プロテオバクテリア亜群１４」から選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリア亜群１４」は、以下の属：シュードモナスおよびキサントモナスのプロテオバクテリアの群として定義する。宿主細胞は、「グラム陰性プロテオバクテリア亜群１５」から選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリア亜群１５」は、シュードモナス属のプロテオバクテリアの群として定義する。
【０１８２】
宿主細胞は、「グラム陰性プロテオバクテリア亜群１６」から選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリア亜群１６」は、以下のシュードモナス種（および丸括弧中に示すＡＴＣＣまたは他の寄託番号の（１つまたは複数の）例示的菌株）のプロテオバクテリアの群として定義する：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｂｉｅｔａｎｉｐｈｉｌａ（ＡＴＣＣ  ７００６８９）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＡＴＣＣ  １０１４５）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ  １４９０９）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｎｇｕｉｌｌｉｓｅｐｔｉｃａ（ＡＴＣＣ  ３３６６０）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌｉｓ（ＡＴＣＣ  １３６７４）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ（ＡＴＣＣ  ５１５５５）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｎｄｏｃｉｎａ（ＡＴＣＣ  ２５４１１）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｅｎｓ（ＡＴＣＣ  ３３６３４）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ（ＡＴＣＣ  ８０６２）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ（ＡＴＣＣ  １７４４０）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ（ＡＴＣＣ  １４２３５）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｒａｍｉｎｅａ（ＡＴＣＣ  ３３６３６）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｇａｒｉｃｉ（ＡＴＣＣ  ２５９４１）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｌｃａｌｉｐｈｉｌａ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｌｇｉｎｏｖｏｒａ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｓｐｌｅｎｉｉ（ＡＴＣＣ  ２３８３５）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｚｅｌａｉｃａ（ＡＴＣＣ  ２７１６２）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｂｅｙｅｒｉｎｃｋｉｉ（ＡＴＣＣ  １９３７２）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｂｏｒｅａｌｉｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ（ＡＴＣＣ  ３３６６２）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｒｕｍ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｂｕｔａｎｏｖｏｒａ（ＡＴＣＣ  ４３６５５）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｌｌｕｌｏｓａ（ＡＴＣＣ  ５５７０３）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｕｒａｎｔｉａｃａ（ＡＴＣＣ  ３３６６３）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ（ＡＴＣＣ  ９４４６，ＡＴＣＣ  １３９８５，ＡＴＣＣ  １７４１８，ＡＴＣＣ  １７４６１）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｒａｇｉ（ＡＴＣＣ  ４９７３）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｌｕｎｄｅｎｓｉｓ（ＡＴＣＣ  ４９９６８）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ（ＡＴＣＣ  ４６８３）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｓｓｉｃｏｌａ（ＡＴＣＣ  ３３６１６）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｄｉｔｅｒｐｅｎｉｐｈｉｌａ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｌｏｎｇａｔａ（ＡＴＣＣ  １０１４４）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｆｌｅｃｔｅｎｓ（ＡＴＣＣ  １２７７５）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｂｒｅｎｎｅｒｉ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｄｒｅｌｌａ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｒｕｇａｔａ（ＡＴＣＣ  ２９７３６）；Ｐｓ��ｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｔｒｅｍｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（ＡＴＣＣ  ３５８５８）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｇｅｓｓａｒｄｉｉ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｌｉｂａｎｅｎｓｉｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｎｄｅｌｉｉ（ＡＴＣＣ  ７００８７１）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｒｇｉｎａｌｉｓ（ＡＴＣＣ  １０８４４）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｉｇｕｌａｅ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｕｃｉｄｏｌｅｎｓ（ＡＴＣＣ  ４６８５）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｈｏｄｅｓｉａｅ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｎｘａｎｔｈａ（ＡＴＣＣ  ９８９０）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｏｌａａｓｉｉ（ＡＴＣＣ  ３３６１８）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｖｅｒｏｎｉｉ（ＡＴＣＣ  ７００４７４）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｇｅｎｉｃｕｌａｔａ（ＡＴＣＣ  １９３７４）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｅｒｉ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｇｒａｍｉｎｉｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｇｒｉｍｏｎｔｉｉ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌａ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｈｉｂｉｓｃｉｃｏｌａ（ＡＴＣＣ  １９８６７）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｈｕｔｔｉｅｎｓｉｓ（ＡＴＣＣ  １４６７０）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｈｙｄｒｏｇｅｎｏｖｏｒａ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｊｅｓｓｅｎｉｉ（ＡＴＣＣ  ７００８７０）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｋｉｌｏｎｅｎｓｉｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｌａｎｃｅｏｌａｔａ（ＡＴＣＣ  １４６６９）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｌｉｎｉ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｒｇｉｎａｔａ（ＡＴＣＣ  ２５４１７）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｐｈｉｔｉｃａ（ＡＴＣＣ  ３３６６５）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ（ＡＴＣＣ  １９２４４）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｅｒｔｕｃｉｎｏｇｅｎａ（ＡＴＣＣ  １９０）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｉｃｔｏｒｕｍ（ＡＴＣＣ  ２３３２８）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｓｙｃｈｒｏｐｈｉｌａ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｉｌｖａ（ＡＴＣＣ  ３１４１８）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｏｎｔｅｉｌｉｉ（ＡＴＣＣ  ７００４７６）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｏｓｓｅｌｉｉ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓ（ＡＴＣＣ  ４３２７２）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｌｅｃｏｇｌｏｓｓｉｃｉｄａ（ＡＴＣＣ  ７００３８３）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ（ＡＴＣＣ  １２６３３）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅａｃｔａｎｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｉｎｏｓａ（ＡＴＣＣ  １４６０６）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｂａｌｅａｒｉｃａ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｌｕｔｅｏｌａ（ＡＴＣＣ  ４３２７３）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ（ＡＴＣＣ  １７５８８）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｍｙｇｄａｌｉ（ＡＴＣＣ  ３３６１４）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｖｅｌｌａｎａｅ（ＡＴＣＣ  ７００３３１）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃａｒｉｃａｐａｐａｙａ���（ＡＴＣＣ  ３３６１５）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｉｃｈｏｒｉｉ（ＡＴＣＣ  １０８５７）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｉｃｕｓｅｒｅｃｔａｅ（ＡＴＣＣ  ３５１０４）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｕｓｃｏｖａｇｉｎａｅ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｅｌｉａｅ（ＡＴＣＣ  ３３０５０）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ（ＡＴＣＣ  １９３１０）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｖｉｒｉｄｉｆｌａｖａ（ＡＴＣＣ  １３２２３）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｈｅｒｍｏｃａｒｂｏｘｙｄｏｖｏｒａｎｓ（ＡＴＣＣ  ３５９６１）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｈｉｖｅｒｖａｌｅｎｓｉｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｖａｎｃｏｕｖｅｒｅｎｓｉｓ（ＡＴＣＣ  ７００６８８）；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ；およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｘｉａｍｅｎｅｎｓｉｓ。
【０１８３】
宿主細胞は、「グラム陰性プロテオバクテリア亜群１７」から選択することができる。「グラム陰性プロテオバクテリア亜群１７」は、例えば以下のシュードモナス種に属する種を含めた「ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ」として当技術分野で知られているプロテオバクテリアの群として定義する：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｂｒｅｎｎｅｒｉ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｄｒｅｌｌａ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｏｒｒｕｇａｔａ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｅｘｔｒｅｍｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｇｅｓｓａｒｄｉｉ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｌｉｂａｎｅｎｓｉｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｎｄｅｌｉｉ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｒｇｉｎａｌｉｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｉｇｕｌａｅ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍｕｃｉｄｏｌｅｎｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｒｈｏｄｅｓｉａｅ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｎｘａｎｔｈａ；Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｔｏｌａａｓｉｉ；およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｖｅｒｏｎｉｉ。
【０１８４】
他の適切な宿主には、グラム（＋）プロテオバクテリアなどの参照の他の部分で分類した宿主がある。一実施形態では、宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉである。Ｅ．ｃｏｌｉに関するゲノム配列は、Ｅ．ｃｏｌｉＭＧ１６５５に関して確定している（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、（１９９７年）。Ｅ．ｃｏｌｉＫ−１２の完全なゲノム配列、Ｓｃｉｅｎｃｅ２７７（５３３１）：１４５３〜７４ページ）およびＤＮＡマイクロアレイが、Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２に関して市販されている（ＭＷＧ  Ｉｎｃ、Ｈｉｇｈ  Ｐｏｉｎｔ、Ｎ．Ｃ．）。Ｅ．ｃｏｌｉは、１％グルコースなどの適切な炭素源と共に、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／ＬのＮａＣｌ、５ｇ／Ｌの酵母エキス）などの富栄養培地中、またはＭ９（６ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４、３ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌ、０．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）などの定義した最小培地中のいずれかで培養することができる。通常、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の一晩培養物を希釈し、振とうフラスコまたは発酵槽中のいずれかの新たな富栄養または最小培地に接種し、３７℃で増殖する。
【０１８５】
宿主細胞は、任意のヒトを含めた哺乳動物または非ヒト哺乳動物由来の細胞などの、哺乳動物起源の細胞であってもよい。哺乳動物は、霊長類、サル、ブタ、ヒツジ類、ウシ、げっ歯類、有蹄動物、家畜ブタ、ブタ類、ヒツジ、ラム、ヤギ、畜牛、シカ、ラバ、ウマ、サル、類人猿、イヌ、ネコ、ラット、およびマウスを含み得るが、これらだけには限られない。
【０１８６】
宿主細胞は、植物起源の細胞であってもよい。対象とする異種タンパク質の産生を求めてスクリーニングするために任意の植物由来の細胞を選択することができる。適切な植物の例には、アルファルファ、リンゴ、アプリコット、シロイヌナズナ、チョウセンアザミ、ルッコラ、アスパラガス、アボカド、バナナ、オオムギ、マメ、ビート、ブラックチェリー、ブルーベリー、ブロッコリ、芽キャベツ、キャベツ、キャノーラ、マスクメロン、ニンジン、キャッサバ、トウゴマの実、カリフラワー、セロリ、チェリー、チコリ、シラントロ、シトラス、クレメンタイン、クローバー、ココナッツ、コーヒー、コーン、コットン、クランベリー、キュウリ、ダグラスファー、ナス、エンダイブ、キクチシャ、ユーカリ、フェンネル、イチジク、ニンニク、ウリ類、グレープ、グレープフルーツ、甘露、クズイモ、キウィフルーツ、レタス、リーキ、レモン、ライム、テーダマツ、リンシード、マンゴー、メロン、マッシュルーム、ネクタリン、ナッツ、オートムギ、油ヤシ、ナタネ、オクラ、オリーブ、オニオン、オレンジ、観賞植物、ヤシ、パパイヤ、パセリ、パースニップ、エンドウマメ、モモ、ピーナッツ、ナシ、コショウ、カキ、パイン、パインアップル、プランテイン、プラム、ザクロ、ポプラ、ジャガイモ、パンプキン、マルメロ、ラジアタパイン、ラディッキオ、ラディッシュ、ナタネ、ラズベリー、コメ、ライムギ、ソルガム、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、カボチャ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、モミジバフウ、タンジェリン、茶、タバコ、トマト、ライコムギ、シバ、カブ、ブドウの木、スイカ、コムギ、ヤムイモ、およびズッキーニがあるが、これらだけには限られない。いくつかの実施形態では、方法中で有用な植物は、シロイヌナズナ、コーン、コムギ、ダイズ、およびコットンである。
【０１８７】
キット(Kits)
本発明は、対象とする異種タンパク質またはポリペプチドの産生に最適な宿主菌株、例えばＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主菌株を同定するのに有用なキットも提供する。キットは複数の表現型が異なる宿主細胞を含み、各集団は、タンパク質産生に関与する１つもしくは複数の標的遺伝子の発現が増大するように、タンパク質分解に関与する１つもしくは複数の標的遺伝子の発現が低下するように、またはそれらの両方となるように遺伝子改変されている。アレイは、タンパク質産生に関与する遺伝子またはタンパク質分解に関与する遺伝子のいずれかの発現を調節するように遺伝子改変されていない１つまたは複数の細胞集団をさらに含むことができる。これらのキットは、細胞集団の増殖および維持を容易にするのに十分な試薬、ならびに対象とする異種タンパク質またはポリペプチドの発現用の試薬および／またはコンストラクトも含むことができる。宿主細胞の集団は、細胞集団の保存、輸送、および再構築に適した任意の方法でキットにおいて提供することができる。細胞集団はチューブ中、プレート上、またはスラント上に生きた状態で提供することができ、あるいはチューブまたはバイアル中に凍結乾燥または乾燥のいずれかの状態で保存することができる。細胞集団は、グリセロール、スクロース、アルブミン、または他の適切な保護剤もしくは保存剤などの追加の構成要素を保存培地中に含有することができる。
【０１８８】
以下の実施例は、限定の目的ではなく例示の目的で提供される。
【０１８９】
実験例(EXPERIMENTAL EXAMPLES)
概説(Overview)
異種タンパク質産生はしばしば、不溶性タンパク質または不適切にフォールディングされたタンパク質の形成をもたらし、それらは、回収が困難であり、かつ不活性であり得る。さらに、特定の宿主細胞プロテアーゼの存在によって、対象とするタンパク質が分解され、それによって最終収率が低下し得る。全ての異種タンパク質の産生を改善する単一の因子は存在しない。したがって、考えられる候補の集合由来の特定の異種タンパク質に特異的な因子を同定するための方法を探究した。
【０１９０】
Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙのツールを使用して、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのゲノムを調べて、宿主細胞のタンパク質フォールディング調節因子およびプロテアーゼ遺伝子を同定した。次いで、全体的な遺伝子発現分析を実施して上方制御された標的を優先し、およびその後、新規なタンパク質産生菌株を構築した。結果として、宿主細胞プロテアーゼが欠損しているかまたはタンパク質フォールディング調節因子の同時過剰発現を可能にする、複数の表現型が異なるＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主菌株からなる、「Ｐｆｅｎｅｘ菌株アレイ」を構築した。この菌株アレイを使用して、特定の異種タンパク質の収率または質を特異的に高める因子を求めてスクリーニングすることができる。複数の表現型が異なる宿主菌株を提供することによって、対象とする任意の個々の異種タンパク質の産生を増大させ得る宿主菌株を同定する成功の機会が増大する。
【０１９１】
本発明は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓにおける異種タンパク質の産生の改善をもたらす。同じ遺伝的背景の宿主菌株の利用可能なライブラリーを有することによって、異種発現したタンパク質の収率および／または質を高める因子の、迅速なスクリーニングおよび同定が可能である。Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのゲノム配列には注釈付けしており、標的宿主細胞のフォールディング調節因子およびプロテアーゼを同定している。フォールディング調節因子はタンパク質の適切なフォールディングを手助けし、シャペロン、シャペロニン、ペプチジル−プロリンイソメラーゼ（ＰＰＩａｓｅ）、およびジスルフィド結合形成タンパク質を含む。プロテアーゼは対象とするタンパク質を分解し、したがって異種タンパク質の収率および質に影響を与える可能性がある。考えられる標的を同定するために文献からの背景知識およびＤＮＡマイクロアレイ分析を使用して、約８０の標的遺伝子の一覧を構築した。同じ遺伝的背景を有する宿主細胞において、これらの遺伝子をゲノムから除去、またはプラスミドにクローニングして、異種タンパク質との同時過剰発現を可能にした。生成した菌株は９６ウェルフォーマットに並べ、および、対象とする異種タンパク質を発現するプラスミドの形質転換後、改善されたタンパク質の収率および／または質を求めてスクリーニングした。
【実施例１】
【０１９２】
Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ菌株ＭＢ２１４のゲノム中のフォールディング調節因子遺伝子の同定
フォールディング調節因子は、新生および異種ポリペプチドのフォールディング、アンフォールディングおよび分解を助長する、全ての細胞中に存在するクラスのタンパク質である。フォールディング調節因子には、シャペロン、シャペロニン、ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼ、およびタンパク質ジスルフィド結合形成に関与するタンパク質がある。異種タンパク質のフォールディングに助力する能力を有する新規な産生菌株を構築するための第一ステップとして、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのゲノムを調べて、宿主細胞のフォールディング調節因子遺伝子を同定した。
【０１９３】
Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＭＢ２１４のゲノムの６，４３３の予想ＯＲＦのそれぞれを、以下の方法を使用して、それらがフォールディング調節因子をコードしていた確率に関して分析した。対象とするいくつかのフォールディング調節因子は、ゲノム注釈の分析によってＤｏｗの研究者により既に同定されている（Ｒａｍｓｅｉｅｒら、２００１）。これらの出発タンパク質の相同体は、クエリーとして出発タンパク質およびサブジェクトとして全てのＭＢ２１４翻訳ＯＲＦのデータベースを用いて、タンパク質／タンパク質ＢＬＡＳＴを使用して同定した。有意な相同性でクエリータンパク質と適合した翻訳ＯＲＦを、さらなる分析用のリストに加えた。有意な相同性は、アラインメントの長さおよび質に基づく人間による判断を考慮に入れてｌｅ−３０以下のｅ−値を有するものとしてここでは定義する。この試験の目的は、全ての考えられるフォールディング調節因子を同定し得る機会を最大にすることを全体に含めることであった。
【０１９４】
より多くのＯＲＦを、キーワード「シャペロン」を含有する前の注釈からの、それらの管理された機能に基づいてリストに加えた。最終的に、ＩｎｔｅｒＰｒｏデータベースバージョン７．０（Ｍｕｌｄｅｒら、２００５年）に対するタンパク質シグネチャーファミリー検索プログラムＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ（Ｑｕｅｖｉｌｌｏｎら、２００５年）によってＯＲＦを分析した。これらのＯＲＦは、ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎソフトウェアおよびこれらのファミリーと関係があるＧｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）カテゴリー（Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．２００４年）によって割り当てられたタンパク質ファミリーであった。これらの自動ＧＯ割り当てを使用して、ＧＯ用語「ＧＯ：０００６４５７生物学的過程：タンパク質フォールディング」または「ＧＯ：０００３７５４分子機能：シャペロン活性」を割り当てた全てのＯＲＦを、さらなる分析用のリストに加えた。
【０１９５】
次いでリストを分析して、フォールディング調節因子をコードする低い確率を有していたＯＲＦを除去した。再度、この試験の目的は非常に包括的であることであったが、これらの半自動的方法によってリストに割り当てたＯＲＦの多くは、限られた基準および人間による判断に基づいて、フォールディング調節因子をコードしていないとして容易に同定することができた。
【０１９６】
特定のＯＲＦを除外した最も一般的な理由は、このＯＲＦが実際にフォールディング調節因子である根拠が乏しいため、すなわち、フォールディング調節因子としてのＯＲＦの注釈付けの理由が不明確または矛盾のいずれかであった、前の注釈に基づいてリストに割り当てたＯＲＦであるためであった。ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎは実際に異なるプログラムの集合体であり、これらのプログラムのいくつかは他のプログラムより信頼できると考えられる。ＳｃａｎＲｅｇＥｘｐまたはＰｒｏｆｉｌｅＳｃａｎコンポーネントのアウトプットのみに基づいてＯＲＦをリストに割り当てた場合、したがってそれは除去した。Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのフォールディング調節因子の最終的なリストは４３のメンバーを有し、それは表１中に示す。
【実施例２】
【０１９７】
Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ菌株ＭＢ２１４のゲノム中のプロテアーゼ遺伝子の同定
プロテアーゼは、ペプチド結合を加水分解し全ての生物の生存に必要な酵素である。しかしながら、細胞中でのそれらの役割は、Ｐｆｅｎｅｘ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商標）も含めた任意の異種タンパク質発現系中で、プロテアーゼは組換えタンパク質の収率および／または質に弊害をもたらす可能性があることを意味する。ゲノムから除去されたプロテアーゼ遺伝子を有する新規な産生菌株を構築するための第一ステップとして、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのゲノムを調べて、宿主細胞のプロテアーゼ遺伝子を同定した。
【０１９８】
Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＭＢ２１４のゲノムの６，４３３の予想ＯＲＦのそれぞれを、以下の方法を使用して、それらがプロテアーゼをコードしていた確率に関して分析した。ＭＥＲＯＰＳデータベースは、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ（Ｒａｗｌｉｎｇｓら、２００６年、ｈｔｔｐ：／／ｍｅｒｏｐｓ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ）で研究者によって手作業で管理されている。それは、研究室での実験と既知のプロテアーゼファミリーとの相同性の両方によって発見された、プロテアーゼの総合目録である。データベースの長所の１つは、ＭＥＲＯＰＳ階層的分類スキームである。このシステムでは、同じ機能を共有する相同体を複数のファミリーに一緒にグループ分けする。複数のファミリーは、ここでも類似の構造特性に基づく進化的関係に基づいて複数の仲間にグループ分けする。この方法はこのデータベースを大いに利用して、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓゲノム内のプロテアーゼ相同体を同定する。
【０１９９】
ＭＥＲＯＰＳデータベースとの相同体は、クエリーとしてそれぞれのＭＢ２１４翻訳ＯＲＦおよびサブジェクトとして全てのＭＥＲＯＰＳタンパク質のデータベースを用いて、タンパク質／タンパク質ＢＬＡＳＴを使用して同定した。有意な相同性でクエリータンパク質と適合した翻訳ＯＲＦを、さらなる分析用のリストに加えた。この場合の有意な相同性は、アラインメントの長さおよび質に基づく人間による判断を考慮に入れてｌｅ−−６０以下のｅ−値を有するものとしてここでは定義する。このステップによって、リスト用の１０９の考えられるプロテアーゼを得た。
【０２００】
ＩｎｔｅｒＰｒｏデータベースバージョン７．０（Ｍｕｌｄｅｒら、２００５年）に対するタンパク質シグネチャーファミリー検索プログラムＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ（Ｑｕｅｖｉｌｌｏｎら、２００５年）によってもＯＲＦを分析した。これらのＯＲＦは、ＩｎｔｅｒＰｒｏＳｃａｎソフトウェアおよびこれらのファミリーと関係があるＧｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ（ＧＯ）カテゴリー（Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．２００４年）によって割り当てられたタンパク質ファミリーであった。これらの自動ＧＯ割り当てを使用して、文字列「ペプチダーゼ」、「プロテアーゼ」または「タンパク質分解」を含有したＧＯ名を割り当てた全てのＯＲＦを、さらなる分析用のリストに加えた。このステップによって、前のステップで同定されなかった追加の７０の考えられるプロテアーゼを得た。
【０２０１】
より多くのＯＲＦを、キーワード「ペプチダーゼ」または「プロテアーゼ」を含有する前の注釈(annotation)（Ｒａｍｓｅｉｅｒら、２００１年）からの、それらの管理された機能に基づいてリストに加えた。このステップによって、前のステップで再度同定しなかった３２の考えられるプロテアーゼを得た。
【０２０２】
次いでリストを分析して、プロテアーゼをコードする低い確率を有していたＯＲＦを除去した。再度、この試験の目的は非常に包括的であることであったが、これらの半自動的方法によってリストに割り当てたＯＲＦの多くは、限られた基準および人間による判断に基づいて、プロテアーゼをコードしていないとして容易に同定することができた。複数の遺伝子を除外した２つの一般的な理由は、特定のＯＲＦが実際にプロテアーゼであることの根拠が乏しいため、または特定の遺伝子が、プロテアーゼ自体ではなくプロテアーゼ相同体であることが知られている他のタンパク質と最大の相同性を示したことであった。Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのプロテアーゼの最終的なリストは９０のメンバーを有し、それは表２中に示す。
【実施例３】
【０２０３】
ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでのフォールディング調節因子およびプロテアーゼタンパク質の細胞内位置の予想
Ｐｆｅｎｅｘ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商標）の長所の１つは、特定の異種タンパク質を分離することができる細胞内区画(cellular compartment)を制御するその能力である。したがって、同定した宿主細胞のフォールディング調節因子およびプロテアーゼタンパク質が位置する細胞内区画を予想した。これらの予想を行うために、２つのプログラムを選択した。ＰｓｏｒｔＢ２．０は、所与のペプチドの細胞内位置を予想する１２の別個のアルゴリズムの結果を組み合わせる。大部分のこれらのアルゴリズムは、クエリータンパク質と既知の細胞内位置のタンパク質の間の相同性の検出に依存する。ＰｓｏｒｔＢは、Ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  Ｍｏｄｅｌｓ（ＨＭＭ）を使用して膜貫通フォールディングドメインまたはＩ型分泌シグナル配列の存在をそれぞれ検出する、ＨＭＭＴＯＰおよびＳｉｇｎａｌＰなどのアルゴリズムも含む。ＰｓｏｒｔＢの結果に加えて、ＳｉｇｎａｌＰ  ＨＭＭを使用して、Ｉ型分泌シグナル配列の存在を予想した。シグナル配列を検出するが細胞内位置を示す他の具体的情報が得られないとき、ＰｓｏｒｔＢのアウトプットは曖昧である可能性があるので、これは必要であった。これらの場合、ＰｓｏｒｔＢはタンパク質の細胞内局在が知られていないことを示す、何故ならそれは実際、細胞質膜、ペリプラズム、外膜または細胞外区画のいずれか１つに分離する可能性があったからである。しかしながら、タンパク質はおそらく細胞質中に位置しないことを知り、表中においてそれに注目することは十分有益である。したがって表２は、その結果が知られていない場合以外のＰｓｏｒｔＢアルゴリズムの結果を挙げる。これらの場合、ＳｉｇｎａｌＰ  ＨＭＭ単独の結果は、シグナルペプチドが検出されたことを示す「シグナルペプチド(Signal Peptide)」、およびシグナルペプチドが検出されなかったことを示す「非分泌性(Non Secretory)」を用いて示す。
【実施例４】
【０２０４】
フォールディング調節因子の同時過剰発現を可能にするプラスミドの構築
フォールディング調節因子遺伝子を、対象とする異種タンパク質を発現させるために通常使用される別のプラスミドと適合性がある、ｐＣＮのプラスミド誘導体（Ｎｉｅｔｏら、１９９０年）にクローニングした（Ｓｑｕｉｒｅｓら、２００４年；Ｃｈｅｗら、２００５年）。マンニトール誘導性ｇｒｐＥ−ｄｎａＫＪ含有プラスミドの構築を例示する。他のフォールディング調節因子を、１つの遺伝子または多数の遺伝子としてオペロンで編成されるとき、以下に概説したのと同様にクローニングした。
【０２０５】
鋳型およびプライマーＲＣ１９９（５−ＡＴＡＴＡＣＴＡＧＴＡＧＧＡＧＧＴＡＡＣＴＴＡＴＧＧＣＴＧＡＣＧＡＡＣＡＧＡＣＧＣＡ−３’）（配列番号：１）およびＲＣ２００（５’ＡＴＡＴＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＡＧＧＴＣＧＣＣＧＡＡＧＡＡＧＣ−３’）（配列番号：２）として、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＭＢ２１４（ＤＮｅａｓｙ；Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）から単離したゲノムＤＮＡを利用して、ｇｒｐＥ−ｄｎａＫＪ遺伝子を、製造者の推奨に従いＰｆｕＴｕｒｂｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して増幅した。生成した４ｋｂのＰＣＲ産物はＳｐｅＩおよびＸｂａＩ（前述のプライマー中で下線を引いた制限部位）で消化し、ｐＤＯＷ１３０６−６（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、２００５ｂ）の誘導体であるｐＤＯＷ２２３６に連結させて、ｔａｃプロモーターの制御下でｇｒｐＥ−ｄｎａＫＪオペロンを含有するｐＤＯＷ２２４０を作製した。次いでプラスミドｐＤＯＷ２２４０をＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、生成したｇｒｐＥ−ｄｎａＫＪ含有４．０ｋｂのＤＮＡ断片はＱｉａｑｕｉｃｋ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用してゲル精製し、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓマンニトール調節型プロモーター（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、２００５ａ）を有するｐＣＮの誘導体であるｐＤＯＷ２２４７に連結させ、それをさらにＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。生成したプラスミド、ｐＤＯＷ３５０１は、マンニトールプロモーターの制御下でｇｒｐＥ−ｄｎａＫＪオペロンを含有していた。次いでプラスミドｐＤＯＷ３５０１を、２５０ｕｇ／ｍｌのウラシルを補ったＭ９グルコースプレート上での選択によって、ＤＣ３８８および他のウラシル要求性菌株に形質転換した。
【実施例５】
【０２０６】
プロテアーゼ遺伝子のゲノムが欠失したＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ菌株の構築
ゲノム欠失の生成を可能にしたプラスミドは、欠失する遺伝子の５’と３’の両方の５００〜１０００ｂｐのＤＮＡ断片の増幅によって構築した。生成する５’ＰＣＲ産物は典型的には欠失する遺伝子の翻訳開始コドン（ＡＴＧまたはＧＴＧまたはＴＧＴ）で終わり、一方３’ＰＣＲ産物は典型的には欠失する遺伝子の停止コドン（ＴＡＡまたはＴＧＡまたはＴＡＧ）で始まる。これら２つのＰＣＲ産物は追加の増幅ステップによって１つに融合し、次いでＳＯＥ  ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎら、１９９０年）を使用してｐＤＯＷ１２６１（図１）（Ｃｈｅｗら、２００５年）にクローニングした。
【実施例６】
【０２０７】
Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ菌株におけるハイスループット増殖および異種タンパク質発現の分析
プラスミドｐＤＯＷ２７８７はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ｇａｌ２をコードし、その重鎖はＰｂｐ分泌リーダーおよびｔａｃプロモーターの制御下で発現する。その軽鎖はＯｐｒＦ分泌リーダーおよびマンニトールプロモーターの制御下で発現する。プラスミドは、対象遺伝子の欠失または同時発現用のフォールディング調節因子を有するｐＤＯＷ２２４７のいずれかを有する６３菌株、および野生型菌株を含有する５つの対照菌株のコンピテント細胞にエレクトロポレーションした。３００ｒｐｍで振とうすることによって、グリセロールを含む増殖培地を含有する同一の深さのウェル単位で、細胞を培養した。０．１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）および１％マンニトールを用いて、２４時間でタンパク質発現を誘導した。誘導後２４時間で、アリコートを溶かし、抗原の抗原結合を測定して活性抗体の量を定量化した。その値をＯＤ６００で割って細胞特異的活性を測定した。菌株Δｐｒｃ１、ΔｄｅｇＰ２、ΔＬａ２、ΔｃｌｐＰ、およびΔｐｒｃ２、Δｐｒｃ２、ｇｒｐＥｄｎａＫＪ同時発現菌株、Δｔｉｇ、ΔｃｌｐＸ、およびΔｌｏｎはいずれも対照菌株より２．４倍以上高く、これは統計上有意であった（ｐ＜０．５）。可溶性細胞分画をΔｐｒｃ１、ΔｄｅｇＰ２、ΔＬａ２およびｇｒｐＥｄｎａＫＪ同時発現菌株から調製し、ウエスタン分析にかけた（図２）。完全構築抗体と一致した大きさを有するバンドを４つの試験菌株において検出したが、対照においては検出しなかった。
（参考文献）
【表８】
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【０２０８】
【表９】
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【０２０９】
本明細書中に述べる全ての刊行物および特許出願は、本発明が関係する技術分野の当業者のレベルを示す。全ての刊行物および特許出願は、それぞれ個々の刊行物または特許出願が参照によって組み込まれることが具体的および個々に示されるのと同じ程度で、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２１０】
前述の本発明を、理解を明確にする目的で例示および実施例によってある程度詳細に説明してきたが、特定の変化および変更形態を添付の特許請求の範囲内で実施することができることは明らかであろう。
本発明は以下の態様を含み得る。
[１］  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）細胞の少なくとも第１および第２の集団を含むアレイであって、各集団が、
ａ）タンパク質分解に関与する少なくとも１つの標的遺伝子の発現が低減するように遺伝子改変されている少なくとも１つのＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ細胞集団、
ｂ）タンパク質産生に関与する少なくとも１つの標的遺伝子の発現が増大するように遺伝子改変されている少なくとも１つのＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ細胞集団、ならびに
ｃ）（ａ）および（ｂ）に従って遺伝子改変されている少なくとも１つのＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ細胞集団
からなる群から選択され、アレイ内の各集団が同一でなく、各集団が物理的に相互に離れているアレイ。
[２］  前記タンパク質分解に関与する少なくとも１つの標的遺伝子がプロテアーゼである、上記［１］に記載のアレイ。
[３］  前記少なくとも１つのプロテアーゼが表２に記載のプロテアーゼから選択される、上記［２］に記載のアレイ。
[４］  前記タンパク質産生に関与する少なくとも１つの標的遺伝子が異種タンパク質の適切なタンパク質転写、翻訳、プロセシングまたは移行に関与する遺伝子である、上記［１］に記載のアレイ。
[５］  前記少なくとも１つの標的遺伝子がタンパク質フォールディング調節因子である、上記［４］に記載のアレイ。
[６］  前記タンパク質フォールディング調節因子が表１に記載のタンパク質フォールディング調節因子から選択される、上記［５］に記載のアレイ。
[７］  前記タンパク質産生に関与する標的遺伝子または前記タンパク質分解に関与する標的遺伝子の発現が増大するように遺伝子改変されていない少なくとも１つのＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ細胞集団をさらに含む、上記［１］から［６］のいずれか一項に記載のアレイ。
[８］  少なくとも１つの集団が、タンパク質産生に関与する２つ以上の標的遺伝子の発現が増大するように遺伝子改変されている、上記［１］から［７］のいずれか一項に記載のアレイ。
[９］  少なくとも１つの集団が、タンパク質分解に関与する２つ以上の標的遺伝子の発現が低減するように遺伝子改変されている、上記［１］から［７］のいずれか一項に記載のアレイ。
[１０］  前記アレイが、前記アレイのハイスループットスクリーニングに役立つフォーマットである、上記［１］から［９］のいずれか一項に記載のアレイ。
[１１］  前記フォーマットが９６ウェルフォーマットである、上記［１０］に記載のアレイ。
[１２］  対象とする少なくとも１つの異種タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む発現コンストラクトで形質転換された場合、少なくとも１つの集団が、前記対象とする少なくとも１つの異種タンパク質を発現できる、上記［１］から［１１］のいずれか一項に記載のアレイ。
[１３］  上記［１］から［１２］のいずれか一項に記載のアレイを含むキット。
[１４］  対象とする少なくとも１つの異種タンパク質を発現するのに最適なＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）宿主細胞を同定する方法であって、
ａ）Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ細胞の少なくとも第１および第２の集団を含むアレイであって、各集団が、
ｉ）タンパク質分解に関与する少なくとも１つの標的遺伝子の発現が低減するように遺伝子改変されている少なくとも１つのＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ細胞集団、
ｉｉ）タンパク質産生に関与する少なくとも１つの標的遺伝子の発現が増大するように遺伝子改変されている少なくとも１つのＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ細胞集団、ならびに
ｉｉｉ）（ｉ）および（ｉｉ）に従って遺伝子改変されている少なくとも１つのＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ細胞集団
からなる群から選択され、アレイ内の各集団が同一でなく、各集団が物理的に相互に離れているアレイを得るステップと、
ｂ）対象とする少なくとも１つの異種タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む発現カセットを、各集団の少なくとも１つの細胞に導入するステップと、
ｃ）少なくとも１つの細胞集団における前記対象とするタンパク質の発現に十分な条件下で前記細胞を維持するステップと、
ｄ）前記対象とする異種タンパク質がその中で産生される最適な細胞集団を選択するステップと
を含み、前記対象とする異種タンパク質が、前記最適な細胞集団で、アレイにおける他の集団と比較して改善された発現、改善された活性、改善された溶解性、改善された移行、または低減したタンパク分解のうち１つまたは複数を示す方法。
[１５］  前記タンパク質分解に関与する少なくとも１つの標的遺伝子がプロテアーゼである、上記［１４］に記載の方法。
[１６］  前記プロテアーゼが表２に記載のプロテアーゼから選択される、上記［１５］に記載の方法。
[１７］  前記タンパク質産生に関与する少なくとも１つの標的遺伝子が、異種タンパク質の適切なタンパク質転写、翻訳、プロセシングまたは移行に関与する遺伝子である、上記［１４］に記載の方法。
[１８］  前記少なくとも１つの標的遺伝子がタンパク質フォールディング調節因子である、上記［１７］に記載の方法。
[１９］  前記タンパク質フォールディング調節因子が表１に記載のタンパク質フォールディング調節因子から選択される、上記［１８］に記載の方法。
[２０］  アレイが、前記タンパク質産生に関与する標的遺伝子または前記タンパク質分解に関与する標的遺伝子の発現が増大するように遺伝子改変されていない少なくとも１つのＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ細胞集団をさらに含む、上記［１４］から［１９］のいずれか一項に記載の方法。
[２１］  少なくとも１つの集団が、タンパク質産生に関与する２つ以上の標的遺伝子の発現が増大するように遺伝子改変されている、上記［１４］から［２０］のいずれか一項に記載の方法。
[２２］  少なくとも１つの集団が、タンパク質分解に関与する２つ以上の標的遺伝子の発現が低下するように遺伝子改変されている、上記［１４］から［２０］のいずれか一項に記載の方法。
[２３］  前記アレイが、前記アレイのハイスループットスクリーニングに役立つフォーマットである、上記［１４］から［２２］のいずれか一項に記載の方法。
[２４］  前記フォーマットが９６ウェルフォーマットである、上記［２３］に記載の方法。
[２５］  前記発現カセットが、前記対象とする異種タンパク質に作動可能に連結したシグナリングペプチドをさらに含む、上記［１４］に記載の方法。
[２６］  前記シグナリングペプチドが分泌シグナルペプチドである、上記［１９］に記載の方法。
[２７］  前記シグナリングペプチドがＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ宿主細胞に由来する、上記［１９］に記載の方法。
[２８］  対象とする異種タンパク質の発現に最適なＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）宿主細胞を同定する方法であって、
ａ）Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ細胞の少なくとも第１および第２の集団を含むアレイであって、各集団が、タンパク質分解に関与する少なくとも１つのタンパク質の発現が低減するように遺伝子改変されており、アレイ内の各集団が同一でなく、各集団が物理的に相互に離れているアレイを得るステップと、
ｂ）細胞を溶解するステップと、
ｃ）各集団の細胞の溶解物を、対象とする異種タンパク質と接触させるステップと、
ｄ）最適な細胞集団を選択するステップと
を含み、前記最適な細胞集団が、アレイにおける他の集団と比較して、ステップ（ｃ）において対象とする異種タンパク質の分解レベルが低下した集団である方法。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【配列表】
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