(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分子の細胞内濃度を決定する方法であって、該標的分子のナノ粒子との会合を可能とする条件下で、該標的分子を該ナノ粒子と接触させるステップを含み、該ナノ粒子が該標的分子に特異的なポリヌクレオチドである結合部を含み、該結合部がマーカーで標識されており、該標的分子および該ナノ粒子の会合が、該マーカーの検出可能な変化をもたらし、該検出可能マーカーの変化が、該標的分子の細胞内濃度に比例し、ポリヌクレオチドである前記結合部が前記ナノ粒子に共有結合しており、前記マーカーが、ポリヌクレオチドである前記結合部とハイブリッド形成しているポリヌクレオチドに結合した標識であって、前記結合部の前記標的分子との会合が、前記ハイブリッド形成しているポリヌクレオチドを放出し、前記マーカーが前記放出後に検出可能である、前記方法。
【請求項２】
前記結合部がＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記結合部がＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドに結合した前記標識は、該標識を有する該ポリヌクレオチドが前記結合部とハイブリッド形成している場合に、消光される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記結合部が、検出可能な標識であるマーカーを含むポリヌクレオチドであり、該マーカーは、ポリヌクレオチドである結合部が前記標的分子と会合している場合にのみ、検出可能である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記マーカーは、前記結合部が前記標的分子と会合していない場合、消光される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ナノ粒子が、多数の結合部を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記結合部が、１つの標的分子と特異的に会合する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記結合部が、複数の標的分子と特異的に会合する、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（政府資金の開示）
本発明は、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｅｘｃｅｌｌｅｎｃｅ（ＮＣＩ／ＣＣＮＥ）により授与された助成金番号ＩＵ５４−ＣＡ１１９３４１、およびＮＩＨ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒ’ｓ  Ｐｉｏｎｅｅｒ  Ａｗａｒｄにより授与された５ＤＰＩＯＤ０００２８５、およびＮＳＣＥにより授与された助成金番号ＥＥＣ−０６４７５６０の下、政府支援によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、ナノ粒子を用いて標的分子の細胞内濃度を検出する方法であって、該ナノ粒子が、標的分子と特異的に会合できる結合部を含み、前記会合が、標的分子との会合後に測定できる、検出可能マーカーの変化を起こす方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
標識オリゴヌクレオチドは、核酸、タンパク質などの特定の高分子標的を検出するための使用広範なプローブである。高い特異性で標的に結合する能力のために、それらは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手順などのインビトロアッセイにおいて有用なものとなっている。しかし、細胞は、核酸の取込みに当然ながら抵抗し、また、こうした外来性の遺伝物質を除去する多様な経路を含有してもいるので、こうしたタイプの標的特異的プローブを生細胞中に送達することは、依然として主要な難題である。したがって、特異的な結合性、蛍光性のシグナル伝達能の双方を保持するように、こうした物質を細胞中に送達する方法は、大変興味深い。
【０００４】
オリゴヌクレオチド−ナノ粒子コンジュゲートの発見およびその後の開発は、分子診断（Ｅｌｇｈａｎｉａｎら、１９９７年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７巻、１０７８〜１０８１頁；Ｎａｍら、２００３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０８巻、１８８４〜１８８６頁）および材料設計（Ｍｉｒｋｉｎら、１９９６年、Ｎａｔｕｒｅ  ３８２巻、６０７〜６０９頁；Ａｌｉｖｉｓａｔｏｓら、１９９６年、Ｎａｔｕｒｅ  ３８２巻、６０９〜６１１頁；Ｄｅｍｅｒｓら、２００３年、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ４０巻、３０７１〜３０７３頁）において、多様な新たな機会を生み出してきた。最近になって、オリゴヌクレオチド官能化ナノ粒子は、細胞に進入し、遺伝子発現を抑制するためのアンチセンス剤として作用することが実証された（Ｒｏｓｉら、２００６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１２巻、１０２７〜１０３０頁）。こうした「アンチセンス粒子」は、単なる送達媒体ではなく（Ｓａｎｄｈｕら、２００２年、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  １３巻、３〜６頁；Ｔｋａｃｈｅｎｋｏら、２００３年、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２５巻、４７００〜４７０１頁）、むしろ、細胞内取込みを受け、酵素分解に抵抗し、遊離オリゴヌクレオチドより２桁も大きい親和性定数で細胞内標的に結合する、単一構成の調節・トランスフェクション剤である（Ｌｙｔｔｏｎ−Ｊｅａｎ  ａｎｄ  Ｍｉｒｋｉｎ、２００５年、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２７巻、１２７５４〜１２７５５頁）。その上、それらの粒子は、ロックド核酸などの強力な、即ち非常に安定な設計物質で容易に修飾することができ（Ｓｅｆｅｒｏｓら、２００７年、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ８巻、１２３０〜１２３２頁）、遺伝子調節に必要な条件下で無毒である。実際に、溶液中に遊離しているオリゴヌクレオチドとは異なり、オリゴヌクレオチド修飾金ナノ粒子は、細胞により容易に多数が取り込まれることが示された。この性質から、オリゴヌクレオチド修飾金ナノ粒子は、ＤＮＡの細胞内送達を迅速に行い、更に、協調性に基づいて細胞におけるオリゴヌクレオチドの効力を高める、細胞内遺伝子抑制剤として使用できるという発見に至った。こうしたオリゴヌクレオチド官能化ナノ粒子は、各種の細胞型に進入することが示されており、高い局所濃度のオリゴヌクレオチドを導入するために使用することができる。
【０００５】
ＤＮＡで高密度に官能化されている金ナノ粒子は、高度に協調的に相補ＤＮＡと結合する結果、金ナノ粒子に付けられていない類似のＤＮＡ鎖に対して決定した結合強度より、２桁大きい結合強度を生じることも既に示されていた。この性質から、ナノ粒子は、上記の用途以外に、ＤＮＡおよびタンパク質の診断アッセイにも特に有用となっている。
【０００６】
注目すべきオリゴヌクレオチドの１部類は、認識配列で特定の標的を検出できるものである。こうしたタイプの構造は、生細胞中に導入された場合、医療診断、創薬、および発生・分子生物学用途にとって特に注目すべきである。しかし、現在の送達／トランスフェクション戦略は、それらの使用に必要とされる１）低毒性、２）高い細胞取込み量、および３）擬陽性シグナルを生む酵素に対する耐性の獲得、などの特質を欠いている。
【０００７】
細胞内ＲＮＡを可視化し、検出するプローブは、その場染色（Ｆｅｍｉｎｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０巻、５８５〜５９０頁、１９９８年；Ｋｌｏｏｓｔｅｒｍａｎら、Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３巻、２７〜２９頁、２００６年）、分子ビーコン（Ｔｙａｇｉら、１９９６年、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １４巻、３０３〜３０８頁；Ｓｏｋｏｌら、１９９８年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５巻、１１５３８〜１１５４３頁；Ｐｅｎｇら、２００５年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６５巻、１９０９〜１９１７頁；Ｐｅｒｌｅｔｔｅら、２００１年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．  ７３巻、５５４４〜５５５０頁；Ｎｉｔｉｎら、２００４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３２巻、ｅ５８頁）、およびＦＲＥＴ対（Ｓａｎｔａｎｇｅｌｏら、２００４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３２巻、ｅ５７頁；Ｂｒａｔｕら、２００３年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  １００巻、１３３０８〜１３３１３頁）に使用するプローブを含め、各々、外部刺激に応答する生体系における活性を測定し、定量する重要な生物学的ツールである（Ｓａｎｔａｎｇｅｌｏら、２００６年、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ３４巻、３９〜５０頁）。しかし、オリゴヌクレオチド系レポーターを細胞媒体および細胞中へ送達することは、細胞内検出にとって主要な難題であることが判明した。オリゴヌクレオチド系プローブの細胞内取込みには、脂質（Ｚａｂｎｅｒら、１９９５年、Ｊ．  Ｂｉｏ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０巻、１８９９７〜１９００７頁）、または有毒なこともあり、もしくは細胞過程を変えるデンドリマー（Ｋｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏら、１９９６年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３巻、４８９７〜４９０２頁）などのトランスフェクション剤が通常必要である。更に、オリゴヌクレオチドは、細胞内で分解を受け易く（Ｏｐａｌｉｎｓｋａ  ａｎｄ  Ｇｅｗｉｒｔｚ、２００２年、Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．  １巻、５０３〜５１４頁）、蛍光団標識プローブの場合には、これが、真の認識事象と識別不能である高いバックグランドシグナルを生む恐れがある（Ｌｉら、２００４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２８巻、ｅ５２頁；Ｒｉｚｚｏら、２００２年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  １６巻、２７７〜２８３頁）。
【０００８】
したがって、高度な特異性で標的を認識できるナノ粒子が設計されてきたが、特異的相互作用から生じる陽性効果を検出すること、特に、単一細胞レベルでそのような相互作用を検出する感度で陽性効果を検出することは困難である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、当技術分野には、特定の標的と会合するために細胞に進入できる物質、およびその結果起こる細胞内相互作用を検出し、定量化する方法を開発する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明では、標的分子の細胞内濃度を決定する方法であって、標的分子のナノ粒子との会合を可能とする条件下で、標的分子をナノ粒子と接触させるステップを含み、ナノ粒子が前記標的分子に特異的な結合部を含み、該結合部がマーカーで標識されており、標的分子およびナノ粒子の会合が、マーカーの検出可能な変化を起こし、検出可能マーカーの変化が、前記標的分子の細胞内濃度に比例する、方法が提供される。
【００１１】
該方法の一実施形態では、結合部はポリヌクレオチドであり、別の態様では、結合部がポリペプチドである。結合部がポリヌクレオチドである実施形態では、代替的な態様には、結合部がＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である態様が含まれる。該方法の他の実施形態では、標的分子はポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。標的分子がポリヌクレオチドである実施形態では、代替的な態様には、結合部がＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である態様が含まれる。
【００１２】
一実施形態では、結合部が、ナノ粒子に共有結合したポリヌクレオチドであり、マーカーが、結合部ポリヌクレオチドとハイブリッド形成しているポリヌクレオチドに結合した標識であって、結合部ポリヌクレオチドの標的分子との会合が、ハイブリッド形成しているポリヌクレオチドを放出し、マーカーが、放出後に検出可能である方法が提供される。一態様では、マーカーが、ハイブリッド形成しているポリヌクレオチドに付いており、マーカー付きのハイブリッド形成しているポリヌクレオチドが、該結合部とハイブリッド形成している場合に、マーカーが消光される。
【００１３】
別の実施形態では、結合部が、ナノ粒子に共有結合したポリペプチドであり、マーカーが、結合部ポリペプチドと会合している作用剤に結合した標識であって、結合部ポリペプチドの標的分子との会合が、会合している作用剤を転位させ、マーカーが、放出後に検出可能である方法が提供される。一態様では、マーカーが、作用剤に付いており、作用剤が、結合部ポリペプチドと会合している場合に、マーカーが消光される。
【００１４】
別の実施形態では、結合部がマーカーで標識されており、結合部が標的分子と会合している場合にだけ、マーカーが検出可能である方法が提供される。結合部がポリヌクレオチドである実施形態では、代替的な態様には、結合部がＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である態様が含まれる。該方法の他の実施形態では、標的分子はポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。標的分子がポリヌクレオチドである実施形態では、代替的な態様には、結合部がＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である態様が含まれる。
【００１５】
一態様では、結合部がポリヌクレオチドであり、ポリヌクレオチド結合部が標的分子と会合していない場合にはマーカーが消光されるように、マーカーが、ポリヌクレオチド結合部に結合している。したがって、ポリヌクレオチド結合部に結合しているマーカーは、ポリヌクレオチド結合部が標的分子と会合している場合にだけ、検出可能である。
【００１６】
別の態様では、結合部がポリペプチドであり、ポリペプチド結合部が標的分子と会合していない場合にはマーカーが消光されるように、マーカーが、ポリペプチド結合部に結合している。したがって、ポリペプチド結合部に結合しているマーカーは、ポリペプチド結合部が標的分子と会合している場合にだけ、検出可能である。
【００１７】
前記ナノ粒子が、多数の結合部を含む方法も提供される。一態様では、多数の該結合部が１つの標的分子と特異的に会合する方法が提供される。別の態様では、多数の該結合部が複数の標的分子と特異的に会合する。
【００１８】
本発明の更なる態様は、以下に示す詳細な説明から明らかになろう。しかし、本発明の趣旨および範囲内における様々な変更および改変が、この詳細な説明から当業者には明らかになると見込まれるので、本発明の好ましい実施形態を示しながらの以下の詳細な説明および実施例は、例示だけのために示していることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】細胞内標的を検出できる蛍光団含有オリゴヌクレオチドで修飾された金ナノ粒子の概略図である。
【図２】ｍＲＮＡの検出および定量化用のナノフレアを示す図である。
【図３】サバイビンノックダウンのナノフレアを用いた定量化を表示する図である。（ａ）ｓｉＲＮＡ処理ＳＫＢＲ３細胞に関して集めたフローサイトメトリーデータ。（ｂ）ｓｉＲＮＡ濃度の関数としての平均蛍光量（黒色円）およびサバイビン発現（灰色棒グラフ）のプロット。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本明細書に示す方法は、１つまたは複数の特定の標的部を特異的に認識し、それと会合する、１つまたは複数の結合部を含むように修飾されたナノ粒子の物理的性質および適用を活用する。本明細書では、標的分子の細胞内濃度は、標的分子に特異的である結合部を含むナノ粒子を用いて決定できることが示される。本発明では、該結合部がマーカーで標識され、標的分子とナノ粒子との会合が、マーカーの検出可能な変化を生じ、検出可能マーカーの変化が、前記標的分子の細胞内濃度に比例する。細胞内標的には、標的細胞中に自然に出現するもの、天然の標的であって、細胞中に導入された（しかし、その細胞型には通常見出されない）もの、または自然には出現しないが、標的細胞中に導入された合成標的が含まれることは理解されよう。
【００２１】
本発明の別の態様では、所望する標的の細胞内局在化も、本明細書に概説する方法を用いて決定し得る。
【００２２】
本明細書で使用する場合、用語「結合部」は、ポリヌクレオチドもしくはポリペプチド、または対象とする標的と会合できる前記分子のいずれかの他の任意の断片もしくはセグメントを包含するものと理解される。この用語には、対象とする小分子も含まれるが、それだけに限らない。当技術分野で理解されているように、用語「小分子」には、天然化合物、天然化合物の修飾体、または合成化合物のいずれかである、有機および無機の化合物が含まれる。
【００２３】
提示した方法は、細胞内標的分子を認識し、それと会合する結合部の使用に特に馴染むが、この場合、結合部はポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドであり、標的分子はポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドである。単純な態様では、ポリヌクレオチド結合部はポリヌクレオチド標的分子と特異的に会合し、またはポリペプチド結合部はポリペプチド標的分子と特異的に会合する。しかし、ポリヌクレオチド結合部がポリペプチド標的分子と特異的に会合し、またはポリペプチド結合部がポリヌクレオチド標的分子と特異的に会合する方法も、想定している。
【００２４】
本明細書で使用する場合、用語「特異的に認識する」または「特異的に会合する」とは、他種の全ての標的分子と比較して、結合部が、高い親和性および／またはアビディティで１種の標的分子を識別し、および／またはそれと相互作用することができることを意味する。
【００２５】
提示した方法は、結合部が、マーカーで直接的または間接的に標識され、結合部の標的分子との会合の結果、マーカーが検出可能になる、または検出し易くなるという原理の下で機能する。したがって、結合部が標的分子と会合していないとき、マーカーは相対的に検出不可能であるか、または消光される。用語「消光する」または「消光」が蛍光マーカーにしばしば関連していることは、当技術分野で理解されているが、本明細書では、任意のマーカーのシグナルは、相対的に検出不可能であるとき消光されていると想定している。したがって、本説明を通して例示され、蛍光マーカーを使用する方法は、想定する方法の単一の実施形態として示されており、消光できる任意のマーカーを、例示の蛍光マーカーの代用とすることができることを理解されたい。
【００２６】
一態様では、マーカーは結合部に直接結合した標識であり、別の態様では、マーカーは、結合部と会合している作用剤に結合した標識であるが、この作用剤は、標的分子と結合部との会合が、作用剤を結合部との会合から転位させるように、結合部に対してより低い結合親和性または結合アビディティを有している。
【００２７】
マーカーを結合部に直接結合している場合、マーカーは、結合部が標的分子と会合していないときに相対的に検出不可能であるか、または消光されるように、配置される。例えば、標的分子と会合していないポリヌクレオチド結合部の場合、マーカーは、ポリヌクレオチド結合部内に形成されるいずれかの二次構造を介して、ナノ粒子自体の近傍に位置取りすることができる、または、マーカーが所与の任意の時間にナノ粒子に近接していることができ、しかもそのシグナルは、シグナルが消光されていないナノ粒子から隔たった水性環境中で、消光しもしくは自由に揺動できる（ナノ粒子に依然繋がっているが）ように、マーカーは、水性環境中で自由に揺動することができる。ポリヌクレオチド結合部が標的分子と会合していないときに、ナノ粒子近傍の消光位置にマーカーを保持する二次構造が全くないこの実施形態では、あるレベルのバックグランドシグナルが必然的に検出され、ポリヌクレオチド結合部の標的分子との会合は、消光作用を付与するのに十分なナノ粒子近傍から転位するマーカーが増加するという事実の結果、バックグランドに対してシグナルを強化することになろう。
【００２８】
同様に結合部がポリペプチドである場合、結合部上のマーカーは、ポリペプチド結合部が標的分子と会合しているときに起こる高次構造変化が、シグナルが相対的に消光されないように十分にナノ粒子からマーカーを移動させるように、位置取りし得る。
【００２９】
マーカーが結合部と間接的に会合している方法の態様では、結合部の標的分子との会合は、ナノ粒子がマーカーに対して消光作用をもはや行使できないように、マーカーの物理的放出を起こす。例えば、ポリヌクレオチド結合部の場合、ナノ粒子が消光作用を行使するのに十分にナノ粒子近傍にマーカーがあるような位置において、ポリヌクレオチド結合部とハイブリッド形成できる第２のポリヌクレオチド上に、マーカーを標識し得る。ポリヌクレオチド結合部が、標的分子を認識し、それと会合すると、ハイブリッド形成され、標識されたポリヌクレオチドは転位され、ナノ粒子の消光作用がなくなる。
【００３０】
したがって、例えば一態様では、ポリヌクレオチド結合部を含み、それが順に、蛍光団マーカーで標識された相補ポリヌクレオチドとハイブリッド形成するように修飾された金ナノ粒子を、生細胞中のＲＮＡを可視化し、定量化するためのトランスフェクション剤兼細胞「ナノフレア」として使用できる方法が提供される。ナノフレアは、金の高効率の蛍光消光性（Ｄｕｂｅｒｔｒｅｔら、２００１年、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９巻、３６５〜３７０頁）、トランスフェクション剤を使用しないオリゴヌクレオチドナノ粒子コンジュゲートの細胞内取込み、およびこのようなコンジュゲートの酵素安定性（Ｒｏｓｉら、２００６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１２巻、１０２７〜１０３０頁）を利用し、その結果、感度良く、有効な細胞内プローブの創製に対する難題の多くを克服している。具体的には、ナノフレアは、高いシグナル伝達を示し、低いバックグランド蛍光を有し、細胞中に存在するＲＮＡ転写物の個数変化に敏感である。したがって、本明細書に記載のナノフレアは、特定の細胞内ＲＮＡの相対量と直接または間接に相関する細胞内蛍光シグナルを与えるように設計された、オリゴヌクレオチド官能化ナノ粒子コンジュゲートである。開示した方法で検出することを想定しているＲＮＡは、ｍＲＮＡおよびｈｎＲＮＡを包含するが、それだけに限らない。
【００３１】
類似の機構がポリペプチド結合部にも作動しているが、この場合、作用剤がマーカーで標識されており、作用剤はポリペプチド結合部と会合することができ、その会合の仕方は、会合によって、作用剤およびマーカーが、マーカーを相対的に消光させるのに十分にナノ粒子に接近するようなものである。ポリペプチド結合部が特定の標識分子と会合すると、作用剤は、上記のナノフレア同様に放出または転位され、ナノ粒子の消光作用は軽減される。
【００３２】
結合部の特定の性質に関わらず、蛍光団標識オリゴヌクレオチドまたはポリペプチドで高密度に官能化したナノ粒子を利用することにより、細胞内分子検出に通常伴う幾つかの困難が緩和される。こうした結合部は、細胞に進入するためにマイクロインジェクションまたはトランスフェクション補助試薬を必要とせず、酵素分解に対して高度に耐性であり、試験する条件下で無毒である。
【００３３】
ポリヌクレオチド
本明細書で使用する場合、ナノ粒子上で官能化される、または標的分子としての「ポリヌクレオチド」という用語は、オリゴヌクレオチドという用語と互換的に使用される。
【００３４】
本明細書で使用する場合の用語「ヌクレオチド」またはその複数形は、本明細書で考察するような修飾型、そうでなければ当技術分野で公知の修飾型と互換可能である。ある種の事例では、当技術分野では、天然ヌクレオチドならびに重合できるヌクレオチド修飾体を包含する用語「核酸塩基」が使用される。
【００３５】
配列所定のポリヌクレオチドを作製する方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（第２版、１９８９年）およびＦ．  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（編）「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ」、第１版（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１年）を参照されたい。固相合成法は、オリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド双方にとって好ましい（ＤＮＡを合成する周知の方法は、ＲＮＡの合成にも有用である）。オリゴリボヌクレオチドおよびオリゴデオキシリボヌクレオチドは、酵素的に調製することもできる。
【００３６】
様々な態様では、提示した方法は、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、またはこの２種の組合せであるポリヌクレオチドの使用を含む。オリゴヌクレオチドの修飾型も想定されており、それには、少なくとも１つのヌクレオチド間修飾連結部を有するものが含まれる。修飾されたポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、本明細書の以下に詳細に説明する。
【００３７】
修飾オリゴヌクレオチド
オリゴヌクレオチドの具体例には、修飾された骨格または非天然ヌクレオシド間連結部を含有するものが含まれる。修飾された骨格を有するオリゴヌクレオチドは、骨格中にリン原子を保持するもの、および骨格中にリン原子を有していないものを包含する。ヌクレオシド間骨格中にリン原子を有していない修飾オリゴヌクレオチドは、「オリゴヌクレオチド」の意味内に入ると見なされる。
【００３８】
リン原子を含有する修飾オリゴヌクレオチド骨格は、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含めたメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホラミデートおよびアミノアルキルホスホラミデートを含めたホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、３’−５’連結部を有するセレノホスフェートおよびボラノホスフェート、これらの２’−５’連結類縁体、ならびに１つまたは複数のヌクレオチド間連結部が、３’から３’、５’から５’、または２’から２’への連結部である、反転極性を有するものを包含する。末端３’ヌクレオチド間連結部に３’から３’への単一連結部、即ち非塩基性の場合もある単一の反転ヌクレオシド残基（ヌクレオチドが消失しているか、その代わりにヒドロキシ基を有する）を含む、反転極性を有するオリゴヌクレオチドも想定されている。塩、混合塩および遊離酸型も想定されている。上記の含リン連結部の調製を教示する代表的米国特許には、開示内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第３６８７８０８号、第４４６９８６３号、第４４７６３０１号、第５０２３２４３号、第５１７７１９６号、第５１８８８９７号、第５２６４４２３号、第５２７６０１９号、第５２７８３０２号、第５２８６７１７号、第５３２１１３１号、第５３９９６７６号、第５４０５９３９号、第５４５３４９６号、第５４５５２３３号、第５４６６６７７号、第５４７６９２５号、第５５１９１２６号、第５５３６８２１号、第５５４１３０６号、第５５５０１１１号、第５５６３２５３号、第５５７１７９９号、第５５８７３６１号、第５１９４５９９号、第５５６５５５５号、第５５２７８９９号、第５７２１２１８号、第５６７２６９７号および第５６２５０５０号が含まれる。
【００３９】
リン原子をその中に含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖のアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結部、ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルの混合ヌクレオシド間連結部、または１つもしくは複数の短鎖のヘテロ原子性もしくはヘテロ環性ヌクレオシド間連結部により形成される骨格を有する。こうした骨格には、モルホリノ連結部を有するもの；シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシドおよびスルホンの骨格；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有骨格；スルファメート骨格；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格；スルホネートおよびスルホンアミド骨格；アミド骨格；ならびにＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２の混合構成要素部を有する他の骨格が含まれる。例えば、開示内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５０３４５０６号、第５１６６３１５号、第５１８５４４４号、第５２１４１３４号、第５２１６１４１号、第５２３５０３３号、第５２６４５６２号、第５２６４５６４号、第５４０５９３８号、第５４３４２５７号、第５４６６６７７号、第５４７０９６７号、第５４８９６７７号、第５５４１３０７号、第５５６１２２５号、第５５９６０８６号、第５６０２２４０号、第５６１０２８９号、第５６０２２４０号、第５６０８０４６号、第５６１０２８９号、第５６１８７０４号、第５６２３０７０号、第５６６３３１２号、第５６３３３６０号、第５６７７４３７号、  第５７９２６０８号、第５６４６２６９号および第５６７７４３９号を参照されたい。
【００４０】
更に他の実施形態では、ヌクレオチド単位の１つもしくは複数の糖および／または１つもしくは複数のヌクレオチド間連結部が共に、「非天然」基で代替されているオリゴヌクレオチド模倣物質。一態様では、この実施形態はペプチド核酸（ＰＮＡ）を想定している。ＰＮＡ化合物では、オリゴヌクレオチドの糖骨格がアミド含有骨格で代替されている。例えば、開示内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５５３９０８２号、第５７１４３３１号および第５７１９２６２号、ならびにＮｉｅｌｓｅｎら、１９９１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５４巻、１４９７〜１５００頁を参照されたい。
【００４１】
更に他の実施形態では、オリゴヌクレオチドがホスホロチオエート骨格を備え、オリゴヌクレオシドがヘテロ原子骨格を備えており、米国特許第５４８９６７７号および第５６０２２４０号に記載の
【００４２】
【化１−１】
0005512285.tif 000002
を含む。米国特許第５０３４５０６号に記載のモルホリノ骨格構造を有するオリゴヌクレオチドも、想定されている。
【００４３】
様々な形態では、オリゴ中の連続する２モノマー間の連結部は、
【００４４】
【化１−２】
0005512285.tif 000003
から選択される２〜４個、望ましくは３個の基／原子からなり、式中ＲＨは、水素およびＣ１−４アルキルから選択され、Ｒ”はＣ１−６アルキルおよびフェニルから選択される。このような連結基の例示的な例は、
【００４５】
【化１−３】
0005512285.tif 000004
【００４６】
【化２】
0005512285.tif 000005
（式中ＲＨは、水素およびＣ１−４アルキルから選択され、Ｒ”はＣ１−６アルキルおよびフェニルから選択される）が想定されている。更なる例示的な例は、Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら、１９９５年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、５巻、３４３〜３５５頁、およびＳｕｓａｎ  Ｍ．  Ｆｒｅｉｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ  Ａｌｔｍａｎｎ、１９９７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２５巻、４４２９〜４４４３頁に示されている。
【００４７】
オリゴヌクレオチドの他の更なる修飾型は、開示内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２００４０２１９５６５号に詳細に記載されている。
【００４８】
修飾オリゴヌクレオチドは、１個または複数の置換糖部も含有し得る。ある種の態様では、オリゴヌクレオチドは、２’位に以下のものの１つを含む。即ち、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルであり、式中アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルでもよい。他の実施形態では、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２が含まれ、式中ｎおよびｍは１から約１０である。他のオリゴヌクレオチドは、２’位に以下のものの１つを含む。即ち、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリール、アラルキル、Ｏ−アルカリールまたはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、挿入基、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基、オリゴヌクレオチドの薬物動力学特性を改善する基、および類似の性質を有する他の置換基である。一態様では、修飾部には２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、別名２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥ）（Ｍａｒｔｉｎら、１９９５年、Ｈｅｌｖ．  Ｃｈｉｍ．  Ａｃｔａ、７８巻、４８６〜５０４頁）、即ちアルコキシアルコキシ基が含まれる。他の修飾部には、本明細書の以下の実施例に記載する、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、即ちＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、別名２’−ＤＭＡＯＥ、および本明細書の以下の実施例にやはり記載する、２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野での別名２’−Ｏ−ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥ）、即ち２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２が含まれる。
【００４９】
更に他の修飾部には、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−アミノプロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、２’−アリル（２’−ＣＨ２  −ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−Ｏ−アリル（２’−Ｏ−ＣＨ２  −ＣＨ＝ＣＨ２）および２’−フルオロ（２’−Ｆ）が含まれる。２’−修飾部は、アラビノ（上向き）位またはリボ（下向き）位にあってもよい。一態様では、２’−  アラビノ修飾部は２’−Ｆである。類似の修飾部をオリゴヌクレオチド上の他の位置、例えば、３’末端ヌクレオチド上または２’−５’連結オリゴヌクレオチド中の糖の３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位に作製してもよい。オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部などの糖模倣部を有してもよい。例えば、開示内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４９８１９５７号、第５１１８８００号、第５３１９０８０号、第５３５９０４４号、第５３９３８７８号、第５４４６１３７号、第５４６６７８６号、第５５１４７８５号、第５５１９１３４号、第５５６７８１１号、第５５７６４２７号、第５５９１７２２号、第５５９７９０９号、第５６１０３００号、第５６２７０５３号、第５６３９８７３号、第５６４６２６５号、第５６５８８７３号、第５６７０６３３号、第５７９２７４７号および第５７００９２０号を参照されたい。
【００５０】
一態様では、糖の修飾部には、２’−ヒドロキシ基が、糖環の３’または４’炭素原子に連結され、それにより二環性糖部を形成するロックド核酸（ＬＮＡ）が含まれる。ある種の態様における連結部は、２’酸素原子および４’炭素原子を架橋するメチレン（−ＣＨ２−）ｎ基であり、式中ｎは１または２である。ＬＮＡおよびその調製は、国際公開第９８／３９３５２号および国際公開第９９／１４２２６号に記載されている。
【００５１】
オリゴヌクレオチドは、塩基の修飾または置換も含み得る。本明細書で使用する場合、「非修飾」または「天然」塩基には、プリン塩基のアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が含まれる。修飾塩基には、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシンならびにピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンなどの他の合成および天然塩基が含まれる。更なる修飾塩基には、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）などのＧクランプ、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）などの三環性ピリミジンが挙げられる。修飾塩基は、プリンまたはピリミジン塩基が他のヘテロ環で代替された塩基、例えば、７−デアザアデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドンも包含し得る。更なる塩基には、米国特許第３６８７８０８号に開示されたもの、「Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、８５８〜８５９頁、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，  Ｊ．  Ｉ．編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９０年に開示されたもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、１９９１年、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、３０巻、６１３頁で開示されたもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，  Ｙ．  Ｓ．、１５章、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、２８９〜３０２頁、Ｃｒｏｏｋｅ，  Ｓ．  Ｔ．  ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，  Ｂ．編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３年で開示されたものが含まれる。こうした塩基のうち特定のものは、結合親和性の増加に有用であり、２−アミノプロ��ルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含め、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンを包含する。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃高めることが示されており、ある種の態様では、２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせられる。開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第３６８７８０８号、米国特許第４８４５２０５号、第５１３０３０２号、第５１３４０６６号、第５１７５２７３号、第５３６７０６６号、第５４３２２７２号、第５４５７１８７号、第５４５９２５５号、第５４８４９０８号、第５５０２１７７号、第５５２５７１１号、第５５５２５４０号、第５５８７４６９号、第５５９４１２１号、第５５９６０９１号、第５６１４６１７号、第５６４５９８５号、第５８３０６５３号、第５７６３５８８号、第６００５０９６号、第５７５０６９２号および第５６８１９４１号を参照されたい。
【００５２】
「修飾塩基」または類似の他の用語は、天然塩基（例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシルおよび／またはチミン）と対を形成できる、および／または非天然塩基と対を形成できる構成物を指す。ある種の態様では、修飾塩基は、１５、１２、１０、８、６、４もしくは２℃、またはそれ未満のＴｍ差を示す。例示的な修飾塩基は、欧州特許第１０７２６７９号および国際公開第９７／１２８９６号に記載されている。
【００５３】
「核酸塩基」とは、天然核酸塩基のアデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）、ならびに非天然核酸塩基を意味し、非天然核酸塩基は、キサンチン、ジアミノプリン、８−オキソ−Ｎ６−メチルアデニン、７−デアザキサンチン、７−デアザグアニン、Ｎ４，Ｎ４−エタノシトシン、Ｎ’，Ｎ’−エタノ−２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン（ｍＣ）、５−（Ｃ３−Ｃ６）−アルキニルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、プソイドイソシトシン、２−ヒドロキシ−５−メチル−４−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシン、ならびにＢｅｎｎｅｒらの米国特許第５４３２２７２号およびＳｕｓａｎ  Ｍ．  Ｆｒｅｉｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｒｌ−Ｈｅｉｎｚ  Ａｌｔｍａｎｎ、１９９７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２５巻、４４２９〜４４４３頁に記載の「非天然」核酸塩基などである。したがって、用語「核酸塩基」は、既知のプリンおよびピリミジンヘテロ環だけでなく、それらのヘテロ環類縁体および互変異性体も包含する。更なる天然および非天然核酸塩基は、米国特許第３６８７８０８号（Ｍｅｒｉｇａｎら）、Ｓａｎｇｈｖｉ、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、Ｓ．  Ｔ．  Ｃｒｏｏｋｅ  ａｎｄ  Ｂ．  Ｌｅｂｌｅｕ編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３年の１５章、Ｅｎｇｌｉｓｃｈら、１９９１年、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、３０巻、６１３〜７２２頁（特に６２２および６２３頁、ならびに各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、「Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、Ｊ．  Ｉ．  Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９９０年、８５８〜８５９頁、Ｃｏｏｋ、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ、１９９１年、６巻、５８５〜６０７頁を参照されたい）に開示されたものを包含する。更に、用語「ヌクレオシド塩基」または「塩基単位」は、最も古典的な意味ではヌクレオシド塩基でないが、ヌクレオシド塩基として働くことができる一定の「ユニバーサル塩基」を含め、核酸塩基のように働くことができる、ヘテロ環化合物などの化合物を包含することを意図している。ユニバーサル塩基として特に挙げられるものは、３−ニトロピロール、場合により置換されているインドール（例えば、５−ニトロインドール）および場合により置換されているヒポキサンチンである。望ましい他のユニバーサル塩基には、当技術分野で公知のユニバーサル塩基を含めた、ピロール、ジアゾールまたはトリアゾール誘導体が挙げられる。
【００５４】
ポリペプチド
本明細書で使用する場合、用語「ポリペプチド」とは、天然に由来する、合成で生成される、または組換えで産生される、ペプチド、タンパク質、アミノ酸のポリマー、ホルモン、ウィルスおよび抗体を指す。ポリペプチドは、リポタンパク質、および例えばグリコシル化タンパク質などの翻訳後修飾タンパク質、ならびに、構造の一部として、Ｄ−アミノ酸、ＤもしくはＬ立体配置の修飾した、誘導体化した、もしくは非天然のアミノ酸、および／またはペプト模倣（ｐｅｐｔｏｍｉｍｅｔｉｃ）単位を有するタンパク質またはタンパク質性物質も包含する。
【００５５】
提示した方法での使用を想定したペプチドは、商業的入手源に由来するものを包含する。ライブラリーには、サイズが６〜１２アミノ酸に亘る小さなジスルフィド束縛環状ペプチド化合物を含む、構造別ペプチドライブラリーであって、各ライブラリー中の異なるペプチド構造の個数が通常１０億個を超えるライブラリー、（ｉｉ）２０量体ペプチド中の各位置にある１９アミノ酸（システインはない）が、ペプチド１００億種のライブラリーを創出することを可能にする直鎖ペプチドライブラリー、（ｉｉｉ）１３量体ペプチド中の各位置にある１９アミノ酸（システインはない）全てが、ペプチド約１億種のライブラリーを創出することを可能にする基質ファージペプチドライブラリーが含まれる。
【００５６】
市販のペプチドライブラリーには、Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ  ｓ．ａ．（Ｂｅｌｇｉｕｍ）、Ｄｙａｘ  Ｃｏｒｐ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ）およびＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＵＫ）のペプチドライブラリーのものが含まれる。
【００５７】
本法の実施に有用なペプチドライブラリーの調製は、当技術分野で周知であり、Ｊｕｎｇ編、「Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｎｏｎｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ：  Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」およびＤｅｖｌｉｎら、１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻、４９６７号、４０４〜４０６頁に記載の通りであり、市販の合成キット、例えばＳｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓキットの使用でもなし得る。
【００５８】
提示した方法での使用を想定したタンパク質は、Ｍａｔｓｕｕｒａら、２００２年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１１巻、２６３１〜２６４３頁、Ｏｈｕｃｈｉら、１９９８年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １０月１日、２６巻（１９号）、４３３９〜４３４６頁、国際公開第１９９９／０１１６５５号、国際公開第１９９８／０４７３４３号、米国特許第６８４４１６１号および米国特許第６４０３３１２号に記載されるような合成タンパク質ライブラリー由来のものを包含する。タンパク質ライブラリーの作製用市販キットも、当技術分野で公知であり、例えばＢｉｏＣａｔ  ＧｍｂＨ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）から入手できる。
【００５９】
本法の実施に有用なタンパク質ライブラリーは、例えばＤｙａｘ  Ｃｏｒｐ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ）から商業的に入手することもできる。
【００６０】
検出可能マーカー／標識
本明細書で使用する場合の「マーカー」は、「標識」と互換的であり、特定される相互作用化合物の種類に関わりなく、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの複合体形成を観察可能な変化で検出する方法が提供される。一態様では、複合体形成は、裸眼または分光法で観察される色変化を起こす。金ナノ粒子を用いた場合、ナノ粒子の凝集に伴って赤から青への色変化が起こり、しばしば裸眼で検出される。本発明では、凝集は、標的分子の特異的だが異なる部分に対する結合部を各々含有する個別のナノ粒子が、同じ標的分子に結合する結果、起こると想定している。
【００６１】
別の態様では、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの複合体形成は、電子顕微鏡または比濁法で観察される凝集形成を生じる。ナノ粒子の凝集一般は、プラズモン共鳴の減少を起こす。更に別の態様では、複合体形成は、裸眼または顕微鏡で観察される凝集ナノ粒子の析出を生じる。
【００６２】
裸眼による色変化の観察は、一態様では、対照色のバックグランドに対してなされる。例えば、金ナノ粒子を用いた場合、色変化の観察は、固体白色表面（制限はないが、シリカもしくはアルミナのＴＬＣプレート、ろ紙、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、またはＣ−１８シリカＴＬＣプレート）上にハイブリッド形成溶液の試料をスポットし、そのスポットを乾燥させることにより、促進される。当初のスポットは、ハイブリッド形成していない場合の桃／赤色から、ハイブリッド形成した場合の紫赤／紫色に亘る、ハイブリッド形成溶液の色を保持している。室温または８０℃（温度は肝要ではない）で乾燥すると、ナノ粒子−オリゴヌクレオチドコンジュゲートが、スポット前のハイブリッド形成により連結されていた場合、青色のスポットが発現する。ハイブリッド形成していない場合は、スポットが桃色である。青色および桃色のスポットは、安定であり、その後の冷却もしくは加熱時、または経時的に変化せず、便利な恒久的試験記録となる。色変化の観察に他のステップ（ナノ粒子−オリゴヌクレオチドコンジュゲートのハイブリッド形成部およびハイブリッド未形成部の分離など）は不要である。
【００６３】
本法の実施結果を可視化する代替法は、ガラス繊維フィルター（例えば、サイズ１３ｎｍの金ナノ粒子に使用する、ホウケイ酸マイクロファイバーフィルター、０．７μ孔径、グレードＦＧ７５）上にナノ粒子プローブの試料をスポットし、同時にフィルターを通してその液を抜き取ることである。その後の濯ぎで、フィルターを通して過剰の非ハイブリッド形成プローブを洗い出すと、ナノ粒子プローブのハイブリッド形成により生成した凝集体（こうした凝集体は、フィルターの孔径より大きいため保持されている）を含む観察可能なスポットが残る。この技法では、過剰のナノ粒子プローブを使用できるので感度の向上が可能である。
【００６４】
想定しているマーカーが、本明細書に記載の任意の蛍光団ならびに当技術分野で公知の他の検出可能マーカーを包含すると見込まれることは、理解されよう。例えば、マーカーには、それだけに限らないが、レドックス活性プローブ、他のナノ粒子、および量子ドット、ならびに、分光手段を用いて検出できる任意のマーカー、即ち顕微鏡およびサイトメトリーを用いて検出可能なマーカーも含まれる。
【００６５】
オリゴヌクレオチドの標識法
蛍光分子でオリゴヌクレオチドを標識し、蛍光を測定する方法は、当技術分野で周知である。適切な蛍光分子も、当技術分野で周知であり、制限はないが、１，８−ＡＮＳ（１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸）、１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸（１，８−ＡＮＳ）、５（および６）−カルボキシ−２’，７’−ジクロロフルオレッセインｐＨ９．０、５−ＦＡＭ  ｐＨ９．０、５−ＲＯＸ（５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、トリエチルアンモニウム塩）、５−ＲＯＸ  ｐＨ７．０、５−ＴＡＭＲＡ、５−ＴＡＭＲＡ  ｐＨ７．０、５−ＴＡＭＲＡ−ＭｅＯＨ、６ＪＯＥ、６，８−ジフルオロ−７−ヒドロキシ−４−メチルクマリンｐＨ９．０、６−カルボキシローダミン６Ｇ  ｐＨ７．０、６−カルボキシローダミン６Ｇ塩酸塩、６−ＨＥＸ，ＳＥ  ｐＨ９．０、６−ＴＥＴ，ＳＥ  ｐＨ９．０、７−アミノ−４−メチルクマリンｐＨ７．０、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリンｐＨ９．０、Ａｌｘａ  ３５０、Ａｌｘａ  ４０５、Ａｌｘａ  ４３０、Ａｌｘａ  ４８８、Ａｌｘａ  ５３２、Ａｌｘａ  ５４６、Ａｌｘａ  ５５５、Ａｌｘａ  ５６８、Ａｌｘａ  ５９４、Ａｌｘａ  ６４７、Ａｌｘａ  ６６０、Ａｌｘａ  ６８０、Ａｌｘａ  ７００、Ａｌｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０抗体コンジュゲートｐＨ７．２、Ａｌｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８抗体コンジュゲートｐＨ８．０、Ａｌｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８ヒドラジド−水、Ａｌｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２抗体コンジュゲートｐＨ７．２、Ａｌｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５抗体コンジュゲートｐＨ７．２、Ａｌｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８抗体コンジュゲートｐＨ７．２、Ａｌｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０  Ｒ−フィコエリトリンストレプトアビジンｐＨ７．２、Ａｌｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７抗体コンジュゲートｐＨ７．２、Ａｌｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  Ｒ−フィコエリトリンストレプトアビジンｐＨ７．２、Ａｌｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０抗体コンジュゲートｐＨ７．２、Ａｌｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０抗体コンジュゲートｐＨ７．２、Ａｌｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００抗体コンジュゲートｐＨ７．２、アロフィコシアニンｐＨ７．５、ＡＭＣＡコンジュゲート、アミノクマリン、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）、Ａｔｔｏ  ６４７、ＢＣＥＣＦｐＨ５．５、ＢＣＥＣＦｐＨ９．０、ＢＦＰ（青色蛍光タンパク質）、ＢＯ−ＰＲＯ−１−ＤＮＡ、ＢＯ−ＰＲＯ−３−ＤＮＡ、ＢＯＢＯ−１−ＤＮＡ、ＢＯＢＯ−３−ＤＮＡ、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６５５−Ｘ，ＭｅＯＨ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬコンジュゲート、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ，ＭｅＯＨ、Ｂｏｄｉｐｙ  Ｒ６Ｇ  ＳＥ、ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ，ＭｅＯＨ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ−Ｘ抗体コンジュゲートｐＨ７．２、Ｂｏｄｉｐｙ  ＴＭＲ−Ｘコンジュゲート、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ−Ｘ，ＭｅＯＨ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ−Ｘ，ＳＥ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−ＸファラシジンｐＨ７．０、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−Ｘ，ＭｅＯＨ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＲ−Ｘ，ＳＥ、ＢＯＰＲＯ−１、ＢＯＰＲＯ−３、カルセイン、カルセインｐＨ９．０、カルシウムクリムゾン、カルシウムクリムゾンＣａ２＋、カルシウムグリーン、カルシウムグリーン−１Ｃａ２＋、カルシウムオレンジ、カルシウムオレンジＣａ２＋、カル���キシナフトフルオレッセインｐＨ１０．０、カスケードブルー、カスケードブルーＢＳＡｐＨ７．０、カスケードイエロー、カスケードイエロー抗体コンジュゲートｐＨ８．０、ＣＦＤＡ、ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）、ＣＩ−ＮＥＲＦｐＨ２．５、ＣＩ−ＮＥＲＦｐＨ６．０、シトリン、クマリン、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＣｙＱＵＡＮＴ  ＧＲ−ＤＮＡ、ダンシルカダベリン、ダンシルカダベリン，ＭｅＯＨ、ＤＡＰＩ、ＤＡＰＩ−ＤＮＡ、ダポキシル（２−アミノエチル）スルホンアミド、ＤＤＡＯｐＨ９．０、Ｄｉ−８  ＡＮＥＰＰＳ、Ｄｉ−８−ＡＮＥＰＰＳ−脂質、ＤｉＩ、ＤｉＯ、ＤＭ−ＮＥＲＦｐＨ４．０、ＤＭ−ＮＥＲＦｐＨ７．０、ＤｓＲｅｄ、ＤＴＡＦ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｅＣＦＰ（強化シアン蛍光タンパク質）、ｅＧＦＰ（強化緑色蛍光タンパク質）、エオシン、エオシン抗体コンジュゲートｐＨ８．０、エリスロシン−５−イソチオシアネートｐＨ９．０、臭化エチジウム、エチジウムホモ二量体、エチジウムホモ二量体−１−ＤＮＡ、ｅＹＦＰ（強化黄色蛍光タンパク質）、ＦＤＡ、ＦＩＴＣ、ＦＩＴＣ抗体コンジュゲートｐＨ８．０、ＦｌＡｓｈ、Ｆｌｕｏ−３、Ｆｌｕｏ−３Ｃａ２＋、Ｆｌｕｏ−４、フルオルルビー、フルオレッセイン、フルオレッセイン０．１Ｍ  ＮａＯＨ、フルオレッセイン抗体コンジュゲートｐＨ８．０、フルオレッセインデキストランｐＨ８．０、フルオレッセインｐＨ９．０、フルオロエメラルド、ＦＭ１−４３、ＦＭ１−４３脂質、ＦＭ４−６４、ＦＭ４−６４，２％ＣＨＡＰＳ、ＦｕｒａレッドＣａ２＋、Ｆｕｒａレッド高Ｃａ、Ｆｕｒａレッド低Ｃａ、Ｆｕｒａ−２Ｃａ２＋、Ｆｕｒａ−２高Ｃａ、Ｆｕｒａ−２無Ｃａ、ＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）、ＨｃＲｅｄ、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８−ＤＮＡ、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２、Ｉｎｄｏ−１Ｃａ２＋、Ｉｎｄｏ−１無Ｃａ、Ｉｎｄｏ−１飽和Ｃａ、ＪＣ−１、ＪＣ−１ｐＨ８．２、リッサミンローダミン、ＬＯＬＯ−１−ＤＮＡ、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ，  ＣＨ、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ  Ｂｌｕｅ、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ  Ｂｌｕｅ  ｐＨ５．０  、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ  Ｇｒｅｅｎ、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ  Ｇｒｅｅｎ  ｐＨ５．０、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ  Ｙｅｌｌｏｗ  ｐＨ３．０、ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ  Ｙｅｌｌｏｗ  ｐＨ９．０、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｂｌｕｅ、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ、マグネシウムグリーン、マグネシウムグリーンＭｇ２＋、マグネシウムオレンジ、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＦＭ，  ＭｅＯＨ、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅ、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｏｒａｎｇｅ，  ＭｅＯＨ、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ，  ＭｅＯＨ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＰｌｕｍ、ｍＲＦＰ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ＮＢＤ−Ｘ、ＮＢＤ−Ｘ，ＭｅＯＨ、ＮｅｕｒｏＴｒａｃｅ  ５００／５２５、緑色蛍光ニッスル染色ＲＮＡ、ナイルブルーＥｔＯＨ、ナイルレッド、ナイルレ��ド脂質、ニッスル、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン４８８抗体コンジュゲートｐＨ８．０、オレゴングリーン５１４、オレゴングリーン５１４抗体コンジュゲートｐＨ８．０、パシフィックブルー、パシフィックブルー抗体コンジュゲートｐＨ８．０、フィコエリトリン、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ定量試薬、ＰＯ−ＰＲＯ−１、ＰＯ−ＰＲＯ−１−ＤＮＡ、ＰＯ−ＰＲＯ−３、ＰＯ−ＰＲＯ−３−ＤＮＡ、ＰＯＰＯ−１、ＰＯＰＯ−１−ＤＮＡ、ＰＯＰＯ−３、ヨウ化プロピジウム、ヨウ化プロピジウム−ＤＮＡ、Ｒ−フィコエリトリンｐＨ７．５、ＲｅＡｓＨ、レゾルフィン、レゾルフィンｐＨ９．０、Ｒｈｏｄ−２、Ｒｈｏｄ−２Ｃａ２＋、ローダミン、ローダミン１１０、ローダミン１１０ｐＨ７．０、ローダミン１２３，ＭｅＯＨ、ローダミングリーン、ローダミンファロイジンｐＨ７．０、ローダミンレッド−Ｘ抗体コンジュゲートｐＨ８．０、ローダミングリーンｐＨ７．０、ロドールグリーン抗体コンジュゲートｐＨ８．０、サファイア、ＳＢＦＩ−Ｎａ＋、ナトリウムグリーンＮａ＋、スルホローダミン１０１，ＥｔＯＨ、ＳＹＢＲグリーンＩ、ＳＹＰＲＯルビー、ＳＹＴＯ１３−ＤＮＡ、ＳＹＴＯ４５−ＤＮＡ、ＳＹＴＯＸブルー−ＤＮＡ、テトラメチルローダミン抗体コンジュゲートｐＨ８．０、テトラメチルローダミンデキストランｐＨ７．０、テキサスレッド−Ｘ抗体コンジュゲートｐＨ７．２、ＴＯ−ＰＲＯ−１−ＤＮＡ、ＴＯ−ＰＲＯ−３−ＤＮＡ、ＴＯＴＯ−１−ＤＮＡ、ＴＯＴＯ−３−ＤＮＡ、ＴＲＩＴＣ、Ｘ−Ｒｈｏｄ−１Ｃａ２＋、ＹＯ−ＰＲＯ−１−ＤＮＡ、ＹＯ−ＰＲＯ−３−ＤＮＡ、ＹＯＹＯ−１−ＤＮＡおよびＹＯＹＯ−３−ＤＮＡを包含する。
【００６６】
更に別の実施形態では、異なる２つの粒子に結合した２種の蛍光標識オリゴヌクレオチドは、ナノ粒子が、利用している検出可能マーカーを消光する能力を有する限り、使用することができる。適切な粒子には、ポリマー粒子（制限はないが、ポリスチレン粒子、ポリビニル粒子、アクリレートおよびメタクリレート粒子など）、ガラス粒子、ラテックス粒子、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ、および当技術分野で周知の他の類似粒子が挙げられる。オリゴヌクレオチドをこのような粒子に結合させる方法は、当技術分野で周知のことであり、常套的に実施されている。Ｃｈｒｉｓｅｙら、１９９６年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２４巻、３０３１〜３０３９頁（ガラス）ならびにＣｈａｒｒｅｙｒｅら、１９９７年、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、１３巻、３１０３〜３１１０頁、Ｆａｈｙら、１９９３年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２１巻、１８１９〜１８２６頁、Ｅｌａｉｓｓａｒｉら、１９９８年、Ｊ．  Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．、２０２巻、２５１〜２６０頁、Ｋｏｌａｒｏｖａら、１９９６年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２０巻、１９６〜１９８頁およびＷｏｌｆら、１９８７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１５巻、２９１１〜２９２６頁（ポリマー／ラテックス）を参照されたい。
【００６７】
ハイブリッド形成時に検出可能シグナルまたは検出可能シグナルの変化を示すと見込まれる、化学発光分子などの蛍光分子以外の他の標識も、使用することができる。
【００６８】
ナノ粒子
本明細書で使用する場合、「ナノ粒子」とは、任意の１つの寸法が１０μｍ未満、好ましくは５μｍ未満の小さな構造体を指す。一般に、想定しているナノ粒子は、本明細書に記載するようなオリゴヌクレオチドに対して、高い担持能を有する任意の化合物または物質を包含する。本発明の実施に有用なナノ粒子には、ナノ粒子が他の方法で検出可能なマーカーを消光する能力を有する限り、金属（例えば、金、銀、銅および白金）、半導体（例えば、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、およびＺｎＳで被覆したＣｄＳまたはＣｄＳｅ）、および磁性（例えば、フェロマグネタイト）コロイド状物質が含まれる。本発明の実施に有用な他のナノ粒子には、ＺｎＳ、ＺｎＯ、ＴｉＯ２、ＡｇＩ、ＡｇＢｒ、ＨｇＩ２、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＴｅ、Ｉｎ２Ｓ３、Ｉｎ２Ｓｅ３、Ｃｄ３Ｐ２、Ｃｄ３Ａｓ２、ＩｎＡｓおよびＧａＡｓが挙げられる。ナノ粒子のサイズは、好ましくは約５ｎｍ〜約１５０ｎｍ（平均直径）、より好ましくは約５ｎｍ〜約５０ｎｍ、最も好ましくは約１０ｎｍ〜約３０ｎｍである。ナノ粒子のサイズは、約５〜約１０ｎｍ、または約５〜約２０ｎｍ、または約５〜約３０ｎｍ、または約５〜約４０ｎｍ、または約５〜約６０ｎｍ、または約５〜約７０ｎｍ、または約５〜約８０ｎｍ、または約５〜約９０ｎｍ、または約５〜約１００ｎｍ、または約５〜約１１０ｎｍ、または約５〜約１２０ｎｍ、または約５〜約１３０ｎｍ、または約５〜約１４０ｎｍ、または約１０〜約２０ｎｍ、または約１０〜約４０ｎｍ、または約１０〜約５０ｎｍ、または約１０〜約６０ｎｍ、または約１０〜約７０ｎｍ、または約１０〜約８０ｎｍ、または約１０〜約９０ｎｍ、または約１０〜約１００ｎｍ、または約１０〜約１１０ｎｍ、または約１０〜約１２０ｎｍ、または約１０〜約１３０ｎｍ、または約１０〜約１４０ｎｍ、または約１０〜約１５０ｎｍであると想定されている。ナノ粒子はまた、棒状、角柱、または四面体でもよい。
【００６９】
したがって、それだけに限らないが、米国特許出願第２００３０１４７９６６号に記載されるような金属、半導体材料またはセラミックスを含めた、多様な無機材料を含むナノ粒子が、本法での使用に想定されている。例えば、金属系ナノ粒子には本明細書に記載のものが含まれる。セラミックナノ粒子材料には、それだけに限らないが、ブラッシュ石、リン酸三カルシウム、アルミナ、シリカおよびジルコニアが挙げられる。ナノ粒子を作製する有機材料には、カーボンが含まれる。ナノ粒子ポリマーには、ポリスチレン、シリコーンゴム、ポリカーボネート、ポリウレタン、ポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリエステル、ポリエーテルおよびポリエチレンが挙げられる。生分解性の生体高分子（例えば、ＢＳＡなどのポリペプチド、多糖類など）、他の生体物質（例えば、炭水化物）、および／またはポリマー化合物も、ナノ粒子の作製に使用することを想定している。
【００７０】
実際には、当技術分野で公知の検出アッセイにおける使用に一般にその程度に適しており、ポリヌクレオチドの複合体形成、即ち２本鎖または３本鎖複合体を形成するハイブリッド形成を妨害しない分子をそれに付けた、適切な任意のナノ粒子を用いる方法が提供される。該粒子のサイズ、形状および化学組成は、生成するオリゴヌクレオチド官能化ナノ粒子の性質に寄与する。こうした性質には、例えば、光学的性質、光電子的性質、電気化学的性質、電子的性質、各種溶液中での安定性、磁気的性質、ならびに孔径および流路径の変化が含まれる。サイズ、形状および化学組成が均一なナノ粒子の使用だけでなく、サイズ、形状および／または化学組成が異なる粒子混合物の使用も想定されている。適切な粒子の例には、制限はないが、ナノ粒子、凝集粒子、等方性（球形粒子など）および異方性粒子（非球形の棒、四面体、角柱など）、ならびにコア−シェル粒子であって、開示内容の全体が参照により組み込まれる、２００２年１２月２８日出願の米国特許出願第１０／０３４４５１号および２００２年１２月２８日出願の国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ０１／５０８２５号に記載のものなどが含まれる。
【００７１】
金属、半導体および磁性のナノ粒子を作製する方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｓｃｈｍｉｄ，  Ｇ．編、「Ｃｌｕｓｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｏｉｄｓ」（ＶＣＨ，  Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、１９９４年）；Ｈａｙａｔ，  Ｍ．  Ａ．編、「Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｇｏｌｄ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、１９９１年）；Ｍａｓｓａｒｔ，  Ｒ．、ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  Ｏｎ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、１７巻、１２４７頁（１９８１年）；Ａｈｍａｄｉ，  Ｔ．  Ｓ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７２巻、１９２４頁（１９９６年）；Ｈｅｎｇｌｅｉｎ，  Ａ．ら、Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．、９９巻、１４１２９頁（１９９５年）；Ｃｕｒｔｉｓ，  Ａ．  Ｃ．ら、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．、２７巻、１５３０頁（１９８８年）を参照されたい。調製されたポリアルキルシアノアクリレートナノ粒子の調製は、Ｆａｔｔａｌら、Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ（１９９８年）５３巻、１３７〜１４３頁および米国特許第４４８９０５５号に記載されている。ポリ（Ｄ−グルカルアミドアミン）を含むナノ粒子を作製する方法は、Ｌｉｕら、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．（２００４年）１２６巻、７４２２〜７４２３頁に記載されている。メチルメタクリレート（ＭＭＡ）重合体を含むナノ粒子の調製は、Ｔｏｎｄｅｌｌｉら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９８年）２６巻、５４２５〜５４３１頁に記載されており、デンドリマーナノ粒子の調製は、例えばＫｕｋｏｗｓｋａ−Ｌａｔａｌｌｏら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ（１９９６年）９３巻、４８９７〜４９０２頁（星形ポリアミドアミンデンドリマー）に記載されている。
【００７２】
適切なナノ粒子は、例えば、Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ，  Ｉｎｃ．（金）、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（金）およびＮａｎｏｐｒｏｂｅｓ，  Ｉｎｃ．（金）から商業的にも入手できる。
【００７３】
米国特許出願第２００３０１４７９６６号にも記載されているように、本明細書に記載の材料を含むナノ粒子は、商業的に入手できる、または溶液中での漸進的核形成（例えば、コロイド反応による）から、もしくはスパッタ堆積などの各種の物理的および化学的気相堆積法により、生成することができる。例えば、ＨａＶａｓｈｉ（１９８７年）Ｖａｃ．  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９８７年７／８月、Ａ５巻（４号）、１３７５〜８４頁；Ｈａｙａｓｈｉ（１９８７年）Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｔｏｄａｙ、１９８７年１２月、４４〜６０頁；ＭＲＳ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、１９９０年１月、１６〜４７頁を参照されたい。
【００７４】
米国特許出願第２００３０１４７９６６号に更に記載されているように、想定されるナノ粒子は、当技術分野で公知の方法を用いて、ＨＡｕＣｌ４およびクエン酸塩還元剤を用いて作製される。例えば、Ｍａｒｉｎａｋｏｓら、（１９９９年）Ａｄｖ．  Ｍａｔｅｒ．１１巻、３４〜３７頁；Ｍａｒｉｎａｋｏｓら、（１９９８年）Ｃｈｅｍ．  Ｍａｔｅｒ．１０巻、１２１４〜１９頁；Ｅｎｕｓｔｕｎ  ＆  Ｔｕｒｋｅｖｉｃｈ、（１９６３年）Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．８５巻、３３１７頁を参照されたい。約１４０ｎｍの分散凝集体粒径を有する酸化スズナノ粒子は、日本・千葉の真空冶金株式会社から商業的に入手できる。組成およびサイズ範囲が様々な他の市販ナノ粒子は、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．  ｏｆ  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，  Ｃａｌｉｆ．から入手できる。
【００７５】
構造スイッチング認識配列で官能化されたナノ粒子
他の実施形態では、検出可能変化は、ナノ粒子上でのオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成時に検出可能変化を生じる分子（例えば、制限はないが、蛍光性の分子および色素）で、オリゴヌクレオチドを標識することにより創出される。例えば一態様では、ナノ粒子上に官能化されたオリゴヌクレオチドまたはポリペプチドは、ナノ粒子取付末端に対して遠位にある末端に結合したマーカーを有しており、標的と会合していない状態では、マーカーのある遠位末端は、マーカーの蛍光を消光するのに十分に近くナノ粒子近傍に配置している。一態様では、金属および半導体ナノ粒子は、既知の蛍光消光剤であり、その消光作用の大きさは、ナノ粒子と蛍光分子との距離に依存する。したがって、１本鎖状態では、ナノ粒子に結合したオリゴヌクレオチドは、二次構造折畳みを介してオリゴヌクレオチドにより形成される、例えばヘアピン構造によってナノ粒子と相互作用するが、その折畳みのために、蛍光分子は、相当な消光が観察されるようにナノ粒子に近接する。同様に、非結合状態では、ナノ粒子に結合したポリペプチドは、マーカーをナノ粒子に近接させる立体構造を取り、マーカーが消光されることになろう。認識配列を介した標的分子の結合によるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの複合体形成時には、蛍光分子がナノ粒子から遠ざかり、蛍光の消光が減衰することになろう（図１）。オリゴヌクレオチドの有用な長さは、実験的に決定することができる。したがって、様々な態様では、蛍光標識したオリゴヌクレオチドまたはポリペプチドを結合させた金属および半導体ナノ粒子は、本明細書に記載するアッセイ方式のいずれにおいても使用される。
【００７６】
オリゴヌクレオチドのナノ粒子への取付け
提示した方法に使用するナノ粒子は、長さが約５〜約１００ヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドまたはその修飾型で官能化される。オリゴヌクレオチドが、長さ約５〜約９０ヌクレオチド、長さ約５〜約８０ヌクレオチド、長さ約５〜約７０ヌクレオチド、長さ約５〜約６０ヌクレオチド、長さ約５〜約５０ヌクレオチド、長さ約５〜約４５ヌクレオチド、長さ約５〜約４０ヌクレオチド、長さ約５〜約３５ヌクレオチド、長さ約５〜約３０ヌクレオチド、長さ約５〜約２５ヌクレオチド、長さ約５〜約２０ヌクレオチド、長さ約５〜約１５ヌクレオチド、長さ約５〜約１０ヌクレオチドである方法も想定しており、サイズ長さが中間的な全てのオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドが所望の結果を実現できる程度にまで、明確に開示されている。したがって、長さがヌクレオチド個数にして５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９および１００のオリゴヌクレオチドが想定されている。
【００７７】
更に他の態様では、オリゴヌクレオチドは約８〜約８０ヌクレオチド（即ち、連結されるヌクレオシドが約８〜約８０個）を含む。当業者であれば、長さがヌクレオチド個数にして８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９または８０の化合物を方法が利用することを理解されよう。
【００７８】
ナノ粒子、オリゴヌクレオチドまたは両者は、オリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合させるために官能化される。このような方法は当技術分野で公知である。例えば、３’末端または５’末端でアルカンチオールにより官能化されたオリゴヌクレオチドは、金ナノ粒子に容易に結合する。Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓ、１９９５年、「Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｗｅｌｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ３９ｔｈ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  Ｏｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｎａｎｏｐｈａｓｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｈｏｕｓｔｏｎ，  Ｔｅｘ．、１０９〜１２１頁を参照されたい。Ｍｕｃｉｃら、１９９６年、Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ５５５〜５５７頁も参照されたい（３’チオールＤＮＡを平坦な金表面に結合させる方法を記載しており、この方法は、オリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合させるために使用することができる）。このアルカンチオール法は、オリゴヌクレオチドを他の金属、半導体および磁性コロイドに、ならびに前掲した他のナノ粒子に結合させるために使用することもできる。オリゴヌクレオチドを固体表面に結合させるための他の官能基には、ホスホロチオエート基（例えば、オリゴヌクレオチドホスホロチオエートの金表面への結合については米国特許第５４７２８８１号を参照されたい）、置換アルキルシロキサン（例えば、オリゴヌクレオチドをシリカおよびガラス表面に結合させるためにはＢｕｒｗｅｌｌ、１９７４年、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４巻、３７０〜３７７頁およびＭａｔｔｅｕｃｃｉ  ａｎｄ  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、１９８１年、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１０３巻、３１８５〜３１９１頁、ならびにアミノアルキルシロキサンの結合およびメルカプトアルキルシロキサンの同様な結合についてはＧｒａｂａｒら、１９９５年、Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．、６７巻、７３５〜７４３頁を参照されたい）が挙げられる。５’チオヌクレオシドまたは３’チオヌクレオシドを末端とするオリゴヌクレオチドも、オリゴヌクレオチドを固体表面に結合させるために使用し得る。以下の参考文献は、オリゴヌクレオチドをナノ粒子に結合させるために使用し得る他の方法を記載している。即ち、Ｎｕｚｚｏら、１９８７年、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１０９巻、２３５８頁（金上のジスルフィド）；Ａｌｌａｒａ  ａｎｄ  Ｎｕｚｚｏ、１９８５年、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、１巻、４５頁（アルミニウム上のカルボン酸）；Ａｌｌａｒａ  ａｎｄ  Ｔｏｍｐｋｉｎｓ、１９７４年、Ｊ．  Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．、４９巻、４１０〜４２１頁（銅上のカルボン酸）；ｌｌｅｒ、「Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｏｆ  Ｓｉｌｉｃａ」、６章、（Ｗｉｌｅｙ  １９７９年）（シリカ上のカルボン酸）；Ｔｉｍｍｏｎｓ  ａｎｄ  Ｚｉｓｍａｎ、１９６５年、Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．、６９巻、９８４〜９９０頁（白金上のカルボン酸）；Ｓｏｒｉａｇａ  ａｎｄ  Ｈｕｂｂａｒｄ、１９８２年、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１４０巻、３９３７頁（白金上の芳香環化合物）；Ｈｕｂｂａｒｄ、１９８０年、Ａｃｃ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．、１３巻、１７７頁（白金上のスルホラン、スルホキシドおよび他の官能化溶媒）；Ｈｉｃｋｍａｎら、１９８９年、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．、１１１巻、７２７１頁（白金上のイソニトリル）；Ｍａｏｚ  ａｎｄ  Ｓａｇｉｖ、１９８７年、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、３巻、１０４５頁（シリカ上のシラン）；Ｍａｏｚ  ａｎｄ  Ｓａｇｉｖ、１９８７年、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、３巻、１０３４頁（シリカ上のシラン）；Ｗａｓｓｅｒｍａｎら、１９８９年、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、５巻、１０７４頁（シリカ上のシラン）；Ｅｌｔｅｋｏｖａ  ａｎｄ  Ｅｌｔｅｋｏｖ、１９８７年、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、３巻、９５１頁（二酸化チタンおよびシリカ上の芳香族のカルボン酸、アルデヒド、アルコール、およびメトキシ基）；Ｌｅｅら、１９８８年、Ｊ．  Ｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．、９２巻、２５９７頁（金属上の剛直なホスフェート）である。それに加え、オリゴヌクレオチドをナノ粒子表面上に結合させる適切な任意の方法を使用し得る。オリゴヌクレオチドを表面上に結合させる特に好ましい方法は、米国出願第０９／３４４６６７号（１９９９年６月２５日出願）、第０９／６０３８３０号（２０００年６月２６日出願）、第０９／７６０５００号（２００１年１月１２日出願）、第０９／８２０２７９号（２００１年３月２８日出願）、第０９／９２７７７７号（２００１年８月１０日出願）、および国際公開第ＰＣＴ／ＵＳ９７／１２７８３号（１９９７年７月２１日）、第ＰＣＴ／ＵＳ００／１７５０７号（２０００年６月２６日）、第ＰＣＴ／ＵＳ０１／０１１９０号（２００１年１月１２日）、第ＰＣＴ／ＵＳ０１／１００７１号（２００１年３月２８日）に記載のエージング法に基づくが、以上の開示内容の全体は参照により組み込まれる。このエージング法は、ナノ粒子−オリゴヌクレオチドコンジュゲートに予想外に増強された安定性および選択性を付与する。この方法は、ナノ粒子に結合できる官能基を含む部分を、好ましくは共有結合したオリゴヌクレオチドをもたらすことを含む。そうした部分および官能基は、オリゴヌクレオチドのナノ粒子への結合（即ち、化学吸着または共有結合による）を可能とするものである。例えば、アルカンチオール、アルカンジスルフィドまたは環状スルフィドを５’または３’末端に結合したオリゴヌクレオチドは、金ナノ粒子を含めた多様なナノ粒子へオリゴヌクレオチドを結合するために、使用することができる。
【００７９】
オリゴヌクレオチドは、官能基によってオリゴヌクレオチドの少なくとも一部をナノ粒子へ結合させるに十分な時間、水中でナノ粒子と接触させる。このような時間は、実験的に決定することができる。例えば、約１２〜２４時間の時間で良い結果が得られることが判明した。オリゴヌクレオチドの結合にとって適切な他の条件も、実験的に決定することができる。例えば、ナノ粒子約１０〜２０ｎＭの濃度および室温でのインキュベーションで、良い結果が得られる。
【００８０】
次に、少なくとも１種の塩を水に添加して塩溶液を形成する。その塩は適切な任意の水溶塩でよい。例えば、その塩は、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、酢酸ナトリウム、酢酸アンモニウム、これらの塩の２種以上の組合せ、またはリン酸緩衝液中のこれらの塩の１種でもよい。好ましくはその塩を濃厚溶液として添加するが、固体として添加することもできよう。この塩は、一度に水へ添加することができる、または徐々に時間をかけて添加される。「徐々に時間をかけて」とは、ある時間を隔てて時々、少なくとも２回に分けてその塩を添加することを意味する。適切な時間間隔は、実験的に決定することができる。
【００８１】
塩溶液のイオン強度は、オリゴヌクレオチド相互の静電反発、および負荷電オリゴヌクレオチドの正荷電ナノ粒子に対する静電引力、または負荷電オリゴヌクレオチドの負荷電ナノ粒子に対する静電反発のいずれかを、少なくとも部分的に克服するだけ十分でなければならない。徐々に時間をかけて塩を添加することにより、静電的な引力および反発を漸減させると、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの表面密度が最高になることが判明した。適切なイオン強度は、各塩または塩の組合せについて実験的に決定することができる。リン酸緩衝液中、約０．１Ｍ〜約１．０Ｍの塩化ナトリウムの最終濃度で、好ましくは塩化ナトリウムの濃度を徐々に時間をかけて上げると、良い結果が得られることが判明した。
【００８２】
塩の添加後、オリゴヌクレオチドおよびナノ粒子は、十分な追加のオリゴヌクレオチドが、ナノ粒子に結合し、安定なナノ粒子−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの生成を可能とするに十分な追加の時間の間、塩溶液中でインキュベートする。以下に詳細に述べるように、ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドの表面密度が増加することにより、コンジュゲートが安定化することが判明した。このインキュベーション時間は、実験的に決定することができる。約２４〜４８時間、好ましくは４０時間の全インキュベーション時間で、良い結果が得られることが判明した（これはインキュベーションの全時間であり、前に触れた通り、塩濃度は、この全時間に亘って徐々に増加させることができる）。塩溶液中でのこの第２のインキュベーション期間を、本明細書では「エージング」ステップと称する。この「エージング」ステップに対する適切な他の条件も、実験的に決定することができる。例えば、室温でのインキュベーションおよびｐＨ７．０で、良い結果が得られる。
【００８３】
「エージング」ステップの使用で生成するコンジュゲートは、「エージング」ステップなしに生成したものより相当に安定であることが判明した。前に触れた通り、この安定性の増加は、「エージング」ステップにより実現される、ナノ粒子表面上のオリゴヌクレオチドの密度増加による。代替的な「迅速塩エージング」法も、同等のＤＮＡ密度および安定性を有する粒子を生成した。界面活性剤、例えば約０．０１％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）Ｔｗｅｅｎ、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在下で塩添加を行うことにより、この塩エージング法は約１時間で行うことができる。
【００８４】
「エージング」ステップにより実現される表面密度は、ナノ粒子のサイズおよび種類、ならびにオリゴヌクレオチドの長さ、配列および濃度に依存することになろう。ナノ粒子を安定化させるに十分な表面密度、およびナノ粒子とオリゴヌクレオチドとの所望の組合せに対してその密度を得るに必要な条件は、実験的に決定することができる。一般に、少なくとも１０ピコモル／ｃｍ２の表面密度が、安定なナノ粒子−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを得るのに十分となろう。好ましくは、表面密度が少なくとも１５ピコモル／ｃｍ２である。表面密度が高過ぎる場合、コンジュゲートのオリゴヌクレオチドが、核酸およびオリゴヌクレオチドの標的とハイブリッド形成する能力を減退させる恐れがあるので、表面密度は、好ましくは約３５〜４０ピコモル／ｃｍ２以下である。オリゴヌクレオチドが、少なくとも１０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも１５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも２０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも２５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも３０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも３５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも４０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも４５ｐｍｏｌ／ｃｍ２、少なくとも５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２、または５０ｐｍｏｌ／ｃｍ２以上の表面密度でナノ粒子に結合している方法も提供される。
【００８５】
本明細書において用語「複合体形成」と互換的に使用される「ハイブリッド形成」とは、ワトソン・クリックのＤＮＡ相補性、フーグスティーン結合、または当技術分野で公知である他の配列特異的結合の規則に従う、水素結合による核酸の２本鎖または３本鎖間の相互作用を意味する。あるいは、それは、当技術分野で公知の配列特異的結合性に従った、本明細書に規定するようなポリペプチド間の相互作用を意味することができる。ハイブリッド形成は、当技術分野で公知の異なる厳密性（ｓｔｒｉｎｇｅｎｃｙ）条件下で行うことができる。適当な厳密度条件下では、２本の相補鎖間または２種のポリペプチド間のハイブリッド形成は、反応において約６０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、または約９９％以上に達することができよう。
【００８６】
様々な態様では、該方法は、相互に１００％相補的、即ち完全な適合である、２種または３種のオリゴヌクレオチドまたはポリペプチドの使用を含むが、他の態様では、個々のオリゴヌクレオチドは、各オリゴヌクレオチドの全長または部分長に亘って相互に少なくとも（それ以上を意味する）約９５％相補的であり、少なくとも約９０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２０％相互に相補的である。
【００８７】
該方法に使用されるオリゴヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリッド形成が可能であるために、相互に１００％相補的である必要はないことが、当技術分野では理解されている。その上、オリゴヌクレオチドは、介在または隣接セグメントがハイブリッド形成事象に関与しない（例えば、ループ構造またはヘアピン構造）ように、１個または複数のセグメントに亘り相互にハイブリッド形成してもよい。任意の所与のオリゴヌクレオチド間における相補率（％）は、当技術分野で公知のＢＬＡＳＴプログラム（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌｓ）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラムを用いて常套的に決定することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０年、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２１５巻、４０３〜４１０頁；Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ、１９９７年、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、７巻、６４９〜６５６頁）。
【００８８】
一態様では、ナノ粒子表面上のオリゴヌクレオチドの充填密度が、ナノ粒子間および単一ナノ粒子上でのポリヌクレオチド鎖間に、協調的挙動を生むに十分である方法が提供される。別の態様では、ナノ粒子間の協調的挙動が、オリゴヌクレオチドの耐分解性を増加させる。
【００８９】
本明細書で使用する場合、「安定な」とは、コンジュゲートを作製してから少なくとも６ヶ月の期間、大多数のオリゴヌクレオチドがナノ粒子に結合した状態にあり、オリゴヌクレオチドが、核酸を検出する方法およびナノファブリケーションの方法において認められる標準的な条件下で、核酸およびオリゴヌクレオチドの標的とハイブリッド形成することができることを意味する。
【００９０】
提示した方法で利用される各ナノ粒子は、複数のオリゴヌクレオチドを結合させている。その結果、各ナノ粒子−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、第１のナノ粒子−オリゴヌクレオチドコンジュゲート上に存在する蛍光団と検出上異なり、第２のナノ粒子上で官能化された蛍光団にコンジュゲートしている第２のオリゴヌクレオチド、および存在する場合、十分に相補的な配列を有する遊離オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成する能力を有する。一態様では、各ナノ粒子が同一のオリゴヌクレオチドで官能化されている、即ち、ナノ粒子に結合した各オリゴヌクレオチドが、同じ長さおよび同じ配列を有する方法が提供される。他の態様では、各ナノ粒子は、同一でない２種以上のオリゴヌクレオチドで官能化されている、即ち、結合しているオリゴヌクレオチドの少なくとも１個は、異なる長さおよび／または異なる配列を有するため、結合している他の少なくとも１個のオリゴヌクレオチドと異なる。
【００９１】
用語「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、単一配列がナノ粒子に結合している、または単一配列の複数コピーが結合しているものを包含する。例えば、様々な態様では、オリゴヌクレオチドは、縦列をなす、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれを超える縦列反復をなす、複数コピーとなって存在する。
【００９２】
あるいは、ナノ粒子は、配列の異なる少なくとも２個のオリゴヌクレオチドを含むように官能化されているが、但し、各オリゴヌクレオチドは、検出上異なるマーカーで標識されている。上記の通り、異なるオリゴヌクレオチド配列は、様々な態様では、縦列および／または複数コピーをなして配置されている。あるいは、配列の異なるオリゴヌクレオチドは、ナノ粒子に直接結合されている。配列の異なるオリゴヌクレオチドがナノ粒子に結合している方法では、該方法の態様には、異なるオリゴヌクレオチド配列が、同じポリヌクレオチド上の異なる領域にハイブリッド形成する態様が含まれる。
【００９３】
ナノ粒子上のオリゴヌクレオチドは、全て同じ配列を有することもあり、または別のナノ粒子に結合したポリヌクレオチドの異なる部分とハイブリッド形成する、異なる配列を有することもある。異なる配列を有するオリゴヌクレオチドを使用する場合、各ナノ粒子が異なるオリゴヌクレオチド全てを結合させていることもあり、または異なるオリゴヌクレオチドは異なるナノ粒子に結合している。あるいは、ナノ粒子各々上にあるオリゴヌクレオチドは、複数の異なる配列を有することもあるが、該配列の少なくとも１つは、第２のナノ粒子上にあるポリヌクレオチドの一部分とハイブリッド形成しなければならない。
【００９４】
ナノフレア技術
本発明の一態様では、結合部中に認識配列を含有するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、本明細書に記載するようにナノ粒子に結合している。本明細書で使用する場合の「認識配列」とは、対象とする標的分子に部分的または完全に相補的である配列を意味すると理解される。
【００９５】
結合しているオリゴヌクレオチドに、認識配列を含有する結合部を有するナノ粒子は、始めにレポーター配列と会合する。本明細書で使用する場合、「レポーター配列」とは、結合部およびその認識配列に部分的または完全に相補的であり、したがってそれらにハイブリッド形成できる配列を意味すると理解される。レポーター配列は、本明細書の上記で考察したように標識され、ナノフレアとも呼称される。更に、レポーター配列が、様々な態様において、認識配列より少ない、同数、または多い塩基からなる結果、結合部中にある認識配列の標的分子との結合は、ハイブリッド形成しているレポーター配列の放出を起こし、それによりレポーター配列に結合している標識に検出可能であり、測定可能である変化が起きる（図２）。
【００９６】
特定の一態様では、特定の標的ｍＲＮＡに対する認識配列で官能化されたナノ粒子は、レポーター配列を有する短いＣｙ５標識相補性レポーターポリヌクレオチドとハイブリッド形成しており、Ｃｙ５部分の蛍光は、ナノ粒子上の認識配列とハイブリッド形成している際には消光される。このレポーター配列は、標的ｍＲＮＡにより転位されることもできる。転位すると、Ｃｙ５部分は、もはや消光されずに蛍光を発し、蛍光シグナルの検出および定量を可能にするが、このシグナルは、レポーター配列の転位と同時に認識配列にハイブリッド形成する標的配列の量と相関している。
【００９７】
ナノフレアは、金ナノ粒子（ＡｕＮＰ）の独特な光学的性質を利用する。ＡｕＮＰは、分子消光剤より、高い効率で（Ｄｕｂｅｒｔｒｅｔら、２００１年、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９巻、３６５〜３７０頁）、および長い距離に亘って（Ｄｕｌｋｅｉｔｈら、２００５年、Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．、５巻、５８５〜５８９頁）蛍光を消光する。同様に、本明細書に記載する他の全種のナノ粒子は、結合している結合部の検出可能マーカーを消光できる限り、使用し得る。
【００９８】
当業者は、標的分子の非存在下では認識配列へのレポーター結合を促進する一方、前記標的分子の存在下では前記レポーター配列の転位を起こすと見込まれる、インビトロ試験の場合の相対的融解温度および／またはハイブリッド形成条件を過度の実験をせずに決定することができる。
【００９９】
本発明は、以下の実施例によって例示されるが、それらは決して限定することを意図してはいない。
【実施例】
【０１００】
（実施例１）
この実施例は、蛍光標識オリゴヌクレオチドで修飾した金ナノ粒子剤が、細胞内分子標的の検出に使用できると実証することを意図している。概念実証として、蛍光標識オリゴヌクレオチドで修飾した金ナノ粒子を用いた、２種の細胞型におけるｍＲＮＡ標的の細胞内検出は、非常に有効であることが示されている。こうした作用剤は、細胞に容易に進入し、蛍光顕微鏡、フローサイトメトリーの双方を用いて容易に読み取ることができる蛍光シグナルを生じる、
具体的には、１３ｎｍの金ナノ粒子を、一端はチオール部、他端は蛍光色素を末端とし、構造スイッチング認識配列を含有する異なる数配列で修飾した。標的のない状態では、色素分子は、金ナノ粒子表面に近接しているため、消光され、蛍光シグナルを発しない。標的のある状態では、色素分子は、金ナノ粒子表面から離れており、蛍光シグナルが観察される（図１）。
【０１０１】
ＡｕＮＰは、特定のＲＮＡ転写物に対する１８塩基認識要素を含有するチオール化オリゴヌクレオチド（図１）で、金チオール結合形成により官能化した（Ｌｏｖｅら、２００５年、Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  １０５巻、１１０３〜１１６９頁）。次いで、オリゴヌクレオチド官能化ＡｕＮＰを、より長い標的または標的領域により転位された場合には「フレア」として作用できる、短いシアニン（Ｃｙ５）色素末端レポーター配列とハイブリッド形成させた（図１）。結合状態では、レポーター鎖のＣｙ５蛍光は、ＡｕＮＰ表面に近接しているために消光される。標的のある状態では、フレア鎖は、標的とオリゴヌクレオチド修飾ＡｕＮＰとの間でより長く、より安定な二重鎖を形成することにより、ＡｕＮＰから転位され、遊離される。
【０１０２】
（実施例２）
細胞に進入し、細胞内標的分子を検出する金ナノ粒子の能力の使用を更に例示するために、インビトロ細胞培養実験を実施した。
【０１０３】
強化緑色蛍光タンパク質を安定に発現するＣ１６６哺乳動物細胞を、１０％血清入りダルベッコ改良イーグル培地中、３７℃および５％ＣＯ２で維持し、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）ｍＲＮＡを標的とする、蛍光標識オリゴヌクレオチドで修飾した金ナノ粒子剤を投与した。ＳＫＢＲ３ヒト乳癌（下記参照）およびＣ１６６マウス内皮細胞をアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手し、１０％熱不活化ウシ胎児血清入りのそれぞれマッコイ（ＭｃＣｏｙ）５Ａ培地およびダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で増殖させ、３７℃、５％ＣＯ２中で維持した。細胞を６または２４ウェルのプレート中に播種し、１〜２日間増殖させた後に処置した。処置当日に、細胞はおよそ５０％集密していた。培地は、官能化ＡｕＮＰを含有する新鮮培地で入れ替えた。
【０１０４】
哺乳動物細胞中には存在しない炭疽病ＲＮＡに対するターゲティング領域を含有する粒子を用いて、対照実験を行った。１６時間トランスフェクションした後、ＥＧＦＰターゲティングプローブで処置したこれらのＥＧＦＰ発現細胞は、対照粒子で認めたシグナルより遥かに大きい、明るい蛍光シグナルを示した。更なる対照実験として、ＥＧＦＰを発現しない、そのためＥＧＦＰのｍＲＮＡ標的を含有していないＣ１６６細胞において、粒子を試験した。これらの実験では、いずれのプローブも、細胞内で１度もシグナル伝達をしないことが判明し、したがって蛍光標識オリゴヌクレオチドで修飾した金ナノ粒子剤は、特定の細胞内分子標的の検出に使用できることが確認された。
【０１０５】
細胞内へのプローブ進入は、その取込みを定量し、何らかの配列依存性取込み効果を除外するためにも、誘導結合プラズマ質量分析法を用いて確認した。これらのデータは、通常の実験後、細胞が、金ナノ粒子およそ１０万個を含有すること、およびＣ１６６細胞は、オリゴヌクレオチド中に含まれる認識配列に関係なく、類似数の金ナノ粒子を取り込むことを確認している。
【０１０６】
（実施例３）
蛍光標識オリゴヌクレオチドで修飾した金ナノ粒子剤を、オリゴヌクレオチド担持量および蛍光シグナル伝達能について更に調べた。これらの実験の結果から、各金ナノ粒子は、認識配列を含有するおよそ６０個の蛍光オリゴヌクレオチドで官能化されていることが確認される。更に、各種のオリゴヌクレオチド修飾金ナノ粒子剤の１ｎＭ溶液をＫＣＮ溶液中で分解すると、いずれもほぼ同じ蛍光を示した。まとめると、この特性決定データは、標的のない状態では、蛍光標識オリゴヌクレオチドで修飾した金ナノ粒子剤が、同じ蛍光シグナルを表すことを示しており、したがって、観察された細胞内シグナル伝達が、特定の細胞内結合事象により起こされたことが確認される。
【０１０７】
内因性遺伝子の検出は、創薬および遺伝子研究にとって特に重要である。そこで、癌遺伝子のサバイビンの存在を感知するために使用できる、金ナノ粒子を調製した。これらの粒子は、対照配列と比較すると、サバイビン発現Ａ５４９肺癌細胞の内部から明るい蛍光シグナルをやはり表す。こうした結果から、上記の蛍光標識オリゴヌクレオチドで修飾した金ナノ粒子剤は、自然なｍＲＮＡ標的の存在を直接読み取るために、使用できることが示される。
【０１０８】
観察した蛍光シグナルは、別法として、単純な卓上フローサイトメーター計器を用いて、大きな処置細胞集団において検出することができる。これらの実験からも、蛍光標識オリゴヌクレオチドで修飾した金ナノ粒子剤について観察される非常に効率的な取込み効率、および、所与の試料中のほぼ全細胞が強いシグナルを示し、細胞内ｍＲＮＡ標的の存在が示されることが、目立っている。ここでは、Ｇｕａｖａ  Ｅａｓｙ  Ｃｙｔｅフローサイトメーターおよびその計器用ソフトウェアを用いて、１０００細胞カウントを蛍光強度の関数としてプロットした。これらの実験では、サバイビン発現Ａ５４９細胞集団の蛍光の劇的変化が、該細胞をサバイビンターゲティング用の蛍光標識オリゴヌクレオチドで修飾した金ナノ粒子剤で処置したとき、対照の炭疽病ターゲティング剤で処置した細胞に比して、見られることが観察された。この結果は、フローサイトメリーと共用すると、蛍光標識オリゴヌクレオチドで修飾した金ナノ粒子剤は、大きな細胞集団の分取に良く適合することを示している。
【０１０９】
該粒子の効率は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００製剤で細胞中にトランスフェクトした従来型消光剤−蛍光団オリゴヌクレオチド配列とも比較した。本発明粒子が劇的なシグナル伝達能を示した類似の条件下で、これらの製剤は、無視し得るシグナル伝達能を示す。濃度を１０倍上げた場合でも、該製剤は、僅かしかまたは全くシグナルを示さず、したがって、これらの条件下で、該ナノ粒子は、従来型消光剤−蛍光団オリゴヌクレオチドプローブより高性能であることが立証された。
【０１１０】
要約すると、以上の実施例から次のことが示される。
【０１１１】
１）金ナノ粒子は、標的を検出できる蛍光団含有オリゴヌクレオチドの細胞内送達を補助する。
【０１１２】
２）蛍光標識オリゴヌクレオチドで修飾したこうした金ナノ粒子剤は、内因性、外因性双方の細胞内標的を検出するために使用することができる。
【０１１３】
３）特定のｍＲＮＡ標的の存在を示す蛍光シグナルは、蛍光顕微鏡、フローサイトメーターのいずれかで読み取ることができる。
【０１１４】
４）効率的な取込みおよび高いシグナル伝達能により、こうした作用剤は、大きな細胞集団の分取に良く適している。
【０１１５】
５）こうした作用剤の効率的な取込みおよび高いシグナル伝達能は、試験した条件下で従来型消光剤−蛍光団オリゴヌクレオチドプローブより高性能である。
【０１１６】
６）当該原理は、核酸アプタマーおよびペプチドなどの他の構造スイッチング認識配列に拡張することができる。
【０１１７】
アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）分子を標的とする、追加の蛍光標識アプタマー含有粒子プローブも、本発明により想定されている。
【０１１８】
本発明は、複数の細胞内標的を同時に検出し、それらの細胞内濃度をリアルタイムで定量する能力も想定している。その原理は、高等生物における細胞機能のリアルタイムモニタリングに適用することができる。
【０１１９】
（実施例４）
１３ｎｍのＡｕＮＰを用いて、ナノフレアを調製した。このサイズの粒子は、効率的な消光剤であり、オリゴヌクレオチドで高密度に官能化することができ（Ｍｉｒｋｉｎら、１９９６年、Ｎａｔｕｒｅ  ３８２巻、６０７〜６０９頁）、しかも可視光を効率的に散乱せず、これが、干渉が最小限の光学プローブの設計に重要なためである。
【０１２０】
ＡｕＮＰは、特定のＲＮＡ転写物に対する認識要素を含有するチオール化オリゴヌクレオチド（図２）で、金チオール結合形成により官能化した（Ｌｏｖｅら、２００５年、Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｖ．  １０５巻、１１０３〜１１６９頁）。オリゴヌクレオチドは、標準的な固相ホスホロアミダイト法を用いてＥｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９ヌクレオチド合成システム（ＡＢＩ）上で合成した。塩基および試薬は、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入した。オリゴヌクレオチドは、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で精製した。ナノフレアプローブを調製するために、公表済み手順（Ｆｒｅｎｓ，  Ｇ．、１９７３年、Ｎａｔｕｒｅ−Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１巻、２０〜２２頁）を用いて、クエン酸塩安定化金ナノ粒子（１３±１ｎｍ）を調製した。チオール修飾オリゴヌクレオチドを、１３±１ｎｍの金コロイドに、１０ｎＭコロイド１ｍＬ当たりオリゴヌクレオチド３ｎｍｏｌの濃度で添加し、終夜振とうした。１２時間後、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液（１０％）を混合物に添加し、０．１％ＳＤＳ濃度を実現した。リン酸緩衝液（０．１Ｍ；ｐＨ７．４）を混合物に添加し、０．０１Ｍリン酸濃度を実現した後、塩化ナトリウム溶液（２．０Ｍ）の６等分量を８時間の期間に亘って混合物に添加し、０．１５Ｍの最終塩化ナトリウム濃度を実現した。混合物を終夜振とうして官能化工程を完了した。官能化粒子を含有する溶液を遠心し（１３０００ｒｐｍ、２０分）、リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ；１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４、Ｈｙｃｌｏｎｅ）中に３回再懸濁して、その後の全実験に使用する精製ＡｕＮＰを作製した。粒子の濃度は、５２４ｎｍの吸光量（ε＝２．７×１０８Ｌｍｏｌ−１ｃｍ−１）を測定することにより決定した。精製したオリゴヌクレオチド官能化ＡｕＮＰは、相補的なＣｙ５標識レポーター配列１００ｎＭを含有するＰＢＳ（ＰＢＳ；１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、ｐＨ７．４、Ｈｙｃｌｏｎｅ）中で、１０ｎＭの濃度に懸濁した。混合物を７０℃に加熱し、緩やかに室温に冷却し、暗中で少なくとも１２時間保存することにより、ハイブリッド形成を行った。粒子を、０．２μｍのアセテートシリンジフィルター（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて滅菌ろ過した。使用したオリゴヌクレオチド配列は、以下の通りである。
【０１２１】
【化３】
0005512285.tif 000006
ナノフレアプローブまたは分子ビーコンを、０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳ中で１ｎＭの濃度に希釈し、相補的な標的（標的濃度１μＭ）で処理した。蛍光スペクトルは、６３３ｎｍで励起し、６５０〜７５０ｎｍの発光を増分１ｎｍで測定するＪｏｂｉｎ  Ｙｖｏｎ  Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ  ＦＬ３−２２上で記録した。次いで、オリゴヌクレオチド官能化ＡｕＮＰを、より長い標的または標的領域により転位された場合には「フレア」として作用できる、短いシアニン（Ｃｙ５）色素末端レポーター配列とハイブリッド形成させた。結合状態では、レポーター鎖のＣｙ５蛍光は、ＡｕＮＰ表面に近接しているために消光される。標的のある状態では、フレア鎖は、標的とオリゴヌクレオチド修飾ＡｕＮＰとの間でより長く、より安定な二重鎖を形成することにより、ＡｕＮＰから転位され、遊離される。
【０１２２】
相補的な合成標的を用いてナノフレア設計を試験することにより、該プローブは、標的の認識および結合時に、蛍光シグナルの３．８倍の増加で応答することが示される。対照的に、非相補的な標的の存在下では、シグナルは変化せず、バックグランド蛍光と大きさが同等である。したがって、以上の結果は、ナノフレアが、特定の標的の存在をシグナル伝達する上で効率的であることを示す。
【０１２３】
（実施例５）
合成標的でナノフレアプローブのシグナル伝達能を確立した後、生細胞に進入し、可視化し、ＲＮＡ標的を検出するプローブの能力を調べた。サバイビン転写物に対する相補領域を組み込むように、ナノフレアを設計したが、この転写物は、癌の治療剤および診断剤における潜在的な使用のために相当な関心を受けている標的である（Ａｌｔｉｅｒｉら、２００３年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２２巻、８５８１〜８５８９頁）。多数のサバイビン転写物を発現する（Ｐｅｎｇら、２００５年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６５巻、１９０９〜１９１７頁）ＳＫＢＲ３細胞系（ヒト乳癌）をモデルとして使用して、サバイビンターゲティングナノフレアを試験した。サバイビンの認識およびレポーター配列は、上記に示す通りである（配列番号１および配列番号２）。対照として、非相補配列を含有する第２のプローブを調製した。この非相補的プローブは、サバイビンプローブと類似のバックグランド蛍光、融解性およびシグナル伝達能を有するように設計され、その通り有すると決定された。サバイビン対照プローブのオリゴヌクレオチド配列は、以下の通りであった。
【０１２４】
【化４】
0005512285.tif 000007
細胞を、顕微鏡用ガラス製カバースリップ上で培養し、ナノフレアと共にインキュベートし、走査共焦点顕微鏡を用いて結像させた。具体的には、細胞を、６ウェル組織培養プレートの底部に置いたガラス製カバースリップ上で増殖させた。１日後、ナノフレアを含有する培地（粒子濃度１２５ｐＭ）で、培地を入れ替えた。処置から６時間後、培地を入れ替え、細胞を更に１２時間培養した。カバースリップを取り出し、ＰＢＳで洗浄し、スライドガラス上に載せたＰＢＳ充填チャンバーに固定した。全ての画像は、６３３ｎｍのＨｅＮｅレーザー励起源を用いて倍率６３倍のＺｅｉｓｓ  ５１０  ＬＳＭで得た。
【０１２５】
サバイビンナノフレアで処置したＳＫＢＲ３細胞は、非相補的対照で処置した該細胞と比較して、強い蛍光を示した。このシグナル伝達がサバイビンの存在と合致することを更に確認するために、Ｃ１６６細胞系（マウス内皮）がヒトサバイビン転写物を含有していないので、この細胞系を対照として用いた。Ｃ１６６細胞を、サバイビン、対照の両プローブで処置した。この場合には、処置後の細胞の蛍光に、識別可能な差が認められなかった。こうした画像形成の結果は、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）の測定（下記参照）と一致していた。
【０１２６】
ナノフレアの細胞内シグナル伝達を定量するために、プローブで処置した細胞を、分析フローサイトメトリーを用いて調べた。それ以外に、フローサイトメトリーによって、大きな細胞集団の蛍光データを収集することが可能になる。この結果、小さな細胞試料の検査しかできない、蛍光画像形成などの技法を用いて観察する恐れのあるばらつきおよび人為的実験結果が除外される。細胞を上記のようにナノフレアで処置した（粒子濃度１０ｎＭ）。分子ビーコンプローブ（配列番号６および配列番号７）は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞に送達された。処置後、トリプシンを用いて、細胞を培養フラスコから剥がした。フローサイトメトリーは、６３５ｎｍで励起したＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ  ＣｙＡｎを用いて行った。
【０１２７】
ナノフレアをトランスフェクトした細胞系は、蛍光細胞の均一な単一集団を示したが、これは、アンチセンス粒子をトランスフェクトした際に観察される９９％超の細胞透過と合致していた（Ｒｏｓｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１２巻、１０２７〜１０３０頁）。フローサイトメトリーの結果、サバイビンナノフレアで処置したＳＫＢＲ３細胞は、強い蛍光を示し、非相補的対照で処置した集団より２．５倍強い蛍光を示すことが明らかとなった。比較のために、Ｃ１６６細胞モデルでは、両プローブとも同様な低い蛍光シグナルを生じた。こうしたフローサイトメトリー実験は、共焦点蛍光画像形成と優れた一致を示し、ナノフレアの均一な細胞内取込みおよび細胞内シグナル伝達を実証している。
【０１２８】
次いで、細胞内検出実験に関するこれらのプローブの独特な性質を理解するために、実験を計画した。先ず、ナノフレアの細胞内性能を、市販トランスフェクション剤のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを用いて送達した分子ビーコンレポーターと比較した（Ｐｅｎｇら、２００５年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６５巻、１９０９〜１９１７頁；Ｎｉｔｉｎら、２００４年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３２巻、ｅ５８頁）。分子ビーコンおよびナノフレアをＳＫＢＲ３細胞に導入し（トランスフェクション濃度１０ｐＭ）、それらのシグナル能力を、フローサイトメトリーを用いて調べた。サバイビンナノフレアで処置した細胞は、同濃度でトランスフェクトしたサバイビン分子ビーコンプローブで処置した細胞より、５５倍大きい蛍光シグナルを生じた。細胞培養物外部における蛍光測定から、各ナノフレアプローブは、およそ１０個の蛍光団を含有しており、したがって等しいプローブ濃度で、分子ビーコンより１０倍大きいシグナルを潜在的に有すると予想できたことを示している。予想より大きな細胞内蛍光は、ナノフレアが、分子ビーコンプローブより迅速に、または多量に取り込まれることを示唆している。
【０１２９】
次に、ナノフレアで観察された細胞内蛍光シグナルまでそのシグナルを達成するために、分子ビーコンを高濃度（０．５ｎＭ）でトランスフェクトした。非相補的プローブが寄与するバックグランド蛍光を比較した（分子ビーコン、ナノフレア共）。非相補的な分子ビーコンプローブの蛍光は、非相補的ナノフレアの蛍光より有意に大きい。バックグランドとシグナルとの差は、正確な標的検出にとって決定的に重要であるので、ナノフレアのより低いバックグランドは、細胞内標的を検出する際に重要な利点となる。
【０１３０】
酵素的分解が非特異的なシグナル伝達を起こす次第を探るために、ナノフレアをエンドヌクレアーゼＤＮＡｓｅＩ（０．３８ｍｇ／Ｌ、細胞環境中で見出されると思われる濃度より有意に高い濃度）と共にインキュベートし、分解速度を、時間の関数としての蛍光シグナルの増加をモニターすることにより、測定した。ナノフレアプローブを、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）、０．２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５０ｍｇ／Ｌのウシ血清アルブミン（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、２．５ｎＭの濃度に希釈した。ウシ膵臓ＤＮａｓｅＩ（Ｕｎｉｔｅｓ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を添加後、直ちに読み取った（濃度０．３８ｍｇ／Ｌ）。全ての実験は、６２０ｎｍでの励起および６６５ｎｍでの発光を用いて、Ｐｈｏｔａｌ  Ｏｔｓｕｋａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ＦｌｕｏＤｉａ  Ｔ７０上で行った。分子ビーコンを２５ｎＭの濃度で同様に試験した。こうした実験条件下での近似的な分解速度を、分解曲線の直線領域の勾配から決定した（Ｒｉｚｚｏら、２００２年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  １６巻、２７７〜２８３頁）。
【０１３１】
このアッセイの結果から、ナノフレアは、こうした条件下で０．２７５ｎｍｏｌ／分の正規化速度で分解する。それに対し、分子ビーコンは、１．２５ｎｍｏｌ／分の正規化速度、ナノフレアよりおよそ４．５倍速やかに分解する。ヌクレアーゼ活性は、従来型プローブのバックグランド蛍光を増加させるので、ナノフレアのヌクレアーゼ活性減少は、より低いバックグランドシグナルのシステムを生じる。
【０１３２】
（実施例６）
ナノフレアの細胞進入、向上したシグナル伝達および低いバックグランドが、細胞内ＲＮＡ量の変化に対する高い感度となる適用例を示すために、ｓｉＲＮＡノックダウン実験を行って、ＳＫＢＲ３細胞モデルにおけるサバイビンＲＮＡ転写物の量を減少させた。細胞がおよそ５０％集密していたとき、ヒトサバイビンに対するｓｉＲＮＡ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて細胞に送達した（ｓｉＲＮＡ濃度は、２０、４０および８０ｎＭ）。２４時間後、培地を、ナノフレアプローブを含有する培地（粒子濃度５０ｐＭ）と交換した。６時間後、細胞を洗浄し、新鮮な培地を添加した。細胞を更に１２時間培養し、フローサイトメトリーを用いて分析した。
【０１３３】
細胞は、先ず、サバイビンに対するｓｉＲＮＡで処置し、細胞内ＲＮＡ量を、ナノフレアおよびフローサイトメトリーを用いて定量した。細胞集団の蛍光のｓｉＲＮＡ濃度依存的変化が、細胞培養物に添加したｓｉＲＮＡの濃度の関数として観察された（図３ａ）。ｓｉＲＮＡ濃度は、ヒストグラムの左側のグラフに示してある。非処置試料では、平均以上の蛍光を示す集団の半分に、灰色の陰影を付けている。処置試料では、平均蛍光を示す細胞集団の分率が縮小していることが示される（灰色の減少、黒色の増加）。この変化が、サバイビン転写物の個数減少に相応していることを確認するために、同濃度のｓｉＲＮＡで処置した試料に関してＲＴ−ＰＣＲ測定を行った。細胞は、Ｇｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅ  Ｍｉｎｉ（Ｇｕａｖａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてカウントした。総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、製造業者の手順に従って細胞から単離した。細胞溶解ステップ中に、単離および精製中のＲＮＡ損失量を明らかにするために、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）ＲＮＡを５×１０７コピー各試料に添加した。ｑＲＴ−ＰＣＲ用ＲＮＡ標準曲線を生成するために、定量すべきＲＮＡの断片を適当な細胞ＲＮＡから生成した。ＰＣＲとＴ７プロモーター部位を含有するプライマーとを用いて、その各断片を転写適合性配列に変換した（ＤＮＡ→ＲＮＡ）。転写物は、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ  ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ）用いて製造業者の手順に従って精製した。ＲＮＡ濃度は、Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ  ＲＮＡ定量キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて測定し、ストックＲＮＡの希釈系列を用いて、標準曲線を生成した。プライマーは以下の通りであった。
【０１３４】
【化５】
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定量ＰＣＲおよび分析は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＲＮＡ  ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、製造業者の推奨に従って行った。逆転写は、６１℃、２０分間の後、増幅サイクル（９５℃、５秒；５４℃、１５秒；７２℃、２０秒）４５回で進行させ、標的遺伝子ＲＮＡは、生成した標準曲線に従って正規化した。全ての反応は３回行った。
【０１３５】
細胞集団内の蛍光シグナルの直線的減少は、ＲＴ−ＰＣＲ測定で決定したサバイビンＲＮＡのコピー数の減少と一致していた（図３ｂ）。まとめると、以上の結果は、ナノフレアが、細胞内転写物の個数変化に敏感であることを示す。ＲＴ−ＰＣＲは３回行っており、上記に示す誤差棒は、測定値の標準偏差である。
【０１３６】
「ナノフレア」と呼ぶ細胞内プローブの新たな１部類を開発した。ナノフレアは、細胞トランスフェクション、酵素的保護、ＲＮＡ検出および定量と、ｍＲＮＡの可視化とを組み合わせる唯一のプローブであるので、新規であり、潜在的に非常に有用である。ｓｉＲＮＡノックダウン実験に関して示した用途以外に、ナノフレアは、細胞分取、遺伝子像作成およびリアルタイム薬物試験などの他の領域でも有用であると想定される。最後に、こうした材料に遺伝子調節剤（Ｒｏｓｉら、２００６年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１２巻、１０２７〜１０３０頁；Ｓｅｆｅｒｏｓら、２００７年、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ８巻、１２３０〜１２３２頁）として作用する能力もあれば、これらのプローブは、同時にトランスフェクトし、遺伝子発現を抑制し、リアルタイムでそれを可視化するように、容易に適合されると想定される。
【０１３７】
要約すると、以上の結果から次のことが示される。
【０１３８】
１）金ナノ粒子は、標的を検出できる蛍光団含有オリゴヌクレオチドの細胞内送達を補助する。
【０１３９】
２）こうした蛍光標識オリゴヌクレオチドで修飾した金ナノ粒子剤は、細胞内標的を検出し、可視化し、定量するために使用することができる。
【０１４０】
３）特定のｍＲＮＡ標的の存在および量を示す蛍光シグナルは、読取り可能な尺度に変換することができる。
【０１４１】
４）効率的な取込み、ならびに高いシグナル伝達能および低い毒性のために、こうした作用剤は、細胞集団の識別に良く適合している。
【０１４２】
５）こうした作用剤の効率的な取込みおよび高いシグナル伝達能は、試験した条件下で、従来の消光剤−蛍光団オリゴヌクレオチドプローブを凌いでいる。
【０１４３】
６）当該原理は、核酸アプタマーおよびペプチドなどの他の構造スイッチング認識配列に拡張することができる。
【０１４４】
本発明は、該プローブの使用が、複数の細胞内標的を同時に検出し、それらの細胞内濃度をリアルタイムで定量する能力を生むものと想定している。該原理は、高等生物における細胞機能のリアルタイムモニタリングに適用され、治療剤を同時に送達する一方で、それらの効力を同時にモニターするために使用されるとも想定している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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