(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光を検出する蛍光検出装置であって、
強度変調したレーザ光を前記測定対象物に照射するレーザ光源部と、
前記レーザ光を強度変調するための変調周波数を有する変調信号を用いたバイアス信号で誘導放出を行うことにより、前記測定対象物に前記レーザ光を照射したときに前記測定対象物で散乱する前記レーザ光の散乱光の光信号を増幅する第１の光増幅部と、第１の光増幅部によって増幅された前記散乱光の光信号を受光し、前記散乱光の電気信号を出力する第１の受光素子と、前記変調信号を用いたバイアス信号で誘導放出を行うことにより、前記測定対象物に前記レーザ光を照射したときに発せられる蛍光の光信号を増幅する第２の光増幅部と、第２の光増幅部によって増幅された前記蛍光の光信号を受光し、前記蛍光の電気信号を出力する第２の受光素子とを含む受光部と、
前記受光部から出力された前記散乱光の電気信号と前記蛍光の電気信号とを用いて、前記変調信号に対する前記蛍光の位相差を算出し、前記位相差から前記蛍光の蛍光緩和時間を求める処理部と、を有する、
ことを特徴とする蛍光検出装置。
【請求項２】
前記バイアス信号は、前記変調信号と同相の信号と、前記変調信号に対して９０度位相シフトした信号とを含む、請求項１に記載の蛍光検出装置。
【請求項３】
前記第１の光増幅器は、前記変調信号に対する前記散乱光の位相差の情報を含む光信号を出力する、請求項１または２に記載の蛍光検出装置。
【請求項４】
前記第２の光増幅器は、前記変調信号に対する前記蛍光の位相差の情報を含む光信号を出力する、請求項１〜３の何れか１項に記載の蛍光検出装置。
【請求項５】
測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光を検出する蛍光検出方法であって、
強度変調したレーザ光を前記測定対象物に照射するステップと、
前記レーザ光を強度変調するための変調周波数を有する変調信号を用いたバイアス信号で誘導放出を行うことにより、前記測定対象物に前記レーザ光を照射したときに前記測定対象物で散乱する前記レーザ光の散乱光の光信号を増幅するステップと、
増幅された前記散乱光の光信号を受光し、前記散乱光の電気信号を出力するステップと、
前記変調信号を用いたバイアス信号で誘導放出を行うことにより、前記測定対象物に前記レーザ光を照射したときに発せられる蛍光の光信号を増幅するステップと、
増幅された前記蛍光の光信号を受光し、前記蛍光の電気信号を出力するステップと、
出力された前記散乱光の電気信号と前記蛍光の電気信号とを用いて、前記変調信号に対する前記蛍光の位相差を算出し、前記位相差から前記蛍光の蛍光緩和時間を求めるステップと、を有する、
ことを特徴とする蛍光検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光を検出する蛍光検出装置及び蛍光検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
測定対象物にレーザ光を照射し、測定対象物が発する蛍光を受光して、測定対象物の情報を取得する蛍光検出装置及び蛍光検出方法が知られている。
蛍光検出装置及び蛍光検出方法を用いたフローサイトメータは、蛍光試薬でラベル化された細胞、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、蛋白等の測定対象物をシース液に流す。この測定対象物にレーザ光を照射することにより、測定対象物に付与された蛍光色素が蛍光を発する。フローサイトメータは、この蛍光を検出することにより、測定対象物の情報を取得することができる。
【０００３】
また、所定の周波数で強度変調したレーザ光を測定対象物に照射し、測定対象物が発する蛍光を受光することにより蛍光緩和時間（蛍光寿命）を算出する蛍光検出装置及び蛍光検出方法が知られている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００６−２２６６９８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
従来の蛍光検出装置では、測定対象物が発した蛍光は、光電変換素子に入射されることにより電気信号に変換された後に、増幅及び復調される。光電変換素子としては、増幅率が優れているという点から、光電子増倍管が多く用いられている。ところで、一般的な光電子増倍管は、電子の増幅率が優れている一方で量子効率が低い（例えば、約２５％以下）ため、光電子増倍管に入射する光子の数が少ない場合、電子に変換可能な光子の数がさらに減少する。この場合、電気信号に変換された蛍光の強度が微弱になるため、蛍光の電気信号が他の電気信号に埋もれて抽出が困難となり、またノイズとして除去されるおそれがある。したがって、蛍光の強度が低い場合、蛍光検出装置によって求められた蛍光緩和時間の測定精度が低下する可能性がある。
【０００６】
そこで、本発明は、精度の高い蛍光緩和時間を取得することができる蛍光検出装置及び蛍光検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の一態様は、測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光を検出する蛍光検出装置である。
当該蛍光検出装置は、
強度変調したレーザ光を前記測定対象物に照射するレーザ光源部と、
前記レーザ光を強度変調するための変調周波数を有する変調信号を用いたバイアス信号で誘導放出を行うことにより、前記測定対象物に前記レーザ光を照射したときに前記測定対象物で散乱する前記レーザ光の散乱光の光信号を増幅する第１の光増幅部と、第１の光増幅部によって増幅された前記散乱光の光信号を受光し、前記散乱光の電気信号を出力する第１の受光素子と、前記変調信号を用いたバイアス信号で誘導放出を行うことにより、前記測定対象物に前記レーザ光を照射したときに発せられる蛍光の光信号を増幅する第２の光増幅部と、第２の光増幅部によって増幅された前記蛍光の光信号を受光し、前記蛍光の電気信号を出力する第２の受光素子とを含む受光部と、
前記受光部から出力された前記散乱光の電気信号と前記蛍光の電気信号とを用いて、前記変調信号に対する前記蛍光の位相差を算出し、前記位相差から前記蛍光の蛍光緩和時間を求める処理部と、を有する。
【０００８】
前記バイアス信号は、前記変調信号と同相の信号と、前記変調信号に対して９０度位相シフトした信号とを含む、ことが好ましい。
また、前記第１の光増幅器は、前記変調信号に対する前記散乱光の位相差の情報を含む光信号を出力する、ことが好ましい。
さらに、前記第２の光増幅器は、前記変調信号に対する前記蛍光の位相差の情報を含む光信号を出力する、ことが好ましい。
【０００９】
本発明の他の態様は、測定対象物にレーザ光を照射したときに発せられる蛍光を検出する蛍光検出方法である。
当該蛍光検出方法は、
強度変調したレーザ光を前記測定対象物に照射するステップと、
前記レーザ光を強度変調するための変調周波数を有する変調信号を用いたバイアス信号で誘導放出を行うことにより、前記測定対象物に前記レーザ光を照射したときに前記測定対象物で散乱する前記レーザ光の散乱光の光信号を増幅するステップと、
増幅された前記散乱光の光信号を受光し、前記散乱光の電気信号を出力するステップと、
前記変調信号を用いたバイアス信号で誘導放出を行うことにより、前記測定対象物に前記レーザ光を照射したときに発せられる蛍光の光信号を増幅するステップと、
増幅された前記蛍光の光信号を受光し、前記蛍光の電気信号を出力するステップと、
出力された前記散乱光の電気信号と前記蛍光の電気信号とを用いて、前記変調信号に対する前記蛍光の位相差を算出し、前記位相差から前記蛍光の蛍光緩和時間を求めるステップと、を有する。
【発明の効果】
【００１０】
上述の蛍光検出装置及び蛍光検出方法によれば、精度の高い蛍光緩和時間を取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】第１実施形態の蛍光検出装置を用いたフローサイトメータの一例を示す概略構成図である。
【図２】レーザ光源部の構成の一例を示す図である。
【図３】第２受光部の構成の一例を示す図である。
【図４】信号処理部の構成の一例を示す図である。
【図５】制御部の構成の一例を示す図である。
【図６】分析装置の構成の一例を示す図である。
【図７】本実施形態の蛍光検出方法のフローの一例を説明する図である。
【図８】図３に示した第２受光部の変形例を説明する図である。
【図９】第２実施形態の蛍光検出装置を用いたフローサイトメータに含まれる発振器の構成の一例を説明する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の蛍光検出装置及び蛍光検出方法を適用したフローサイトメータについて、詳細に説明する。
＜第１実施形態＞
（フローサイトメータの構成）
まず、図１を参照して、第１実施形態のフローサイトメータの構成について説明する。図１は、本実施形態のフローサイトメータの一例を示す概略構成図である。フローサイトメータは、測定対象物１２にレーザ光を照射し、レーザ光が照射された測定対象物１２から発せられる蛍光を受光することにより、測定対象物１２の情報を取得することができる。
フローサイトメータは、フローセル１０と、レーザ光源部２０と、第１受光部３０と、第２受光部４０と、制御部５０と、分析装置６０と、出力部７０と、を備える。また、フローセル１０の下流には、測定対象物１２を回収するための容器１６が配置される。以下、各構成について詳細に説明する。
【００１３】
細胞、ＤＮＡ（Deoxyribonucleic Acid）、ＲＮＡ（Ribonucleic Acid）、酵素、蛋白等の測定対象物１２は、シース液に囲まれてフローセル１０の内部を流れる。後述するように、レーザ光源部２０が測定対象物１２にレーザ光を照射し、その際に発せられる蛍光から測定対象物１２の情報を取得するため、測定対象物１２には、蛍光色素１４が予め付与されている。蛍光色素１４は、例えば、ＣＦＰ（Cyan Fluorescent Protein）、ＹＦＰ（Yellow Fluorescent Protein）等が用いられる。フローセル１０の内部では、シース液に囲まれた測定対象物１２が、流体力学的絞り込みを受けることにより細い液流となって、フローセル１０の内部を流れる。
【００１４】
レーザ光源部２０は、例えば、３５０ｎｍ〜８００ｎｍの可視光帯域の波長を有し、所定の変調信号を用いて強度変調されたレーザ光を測定対象物１２に照射する。
図２に示すように、レーザ光源部２０は、レーザ光源２１と、レンズ系２２と、レーザドライバ２３とを有している。
レーザ光源２１は、強度が一定のＣＷ（連続波）レーザ光を強度変調して出射する。
レンズ系２２は、レーザ光源２１から出射されたレーザ光を、フローセル１０中の所定の測定点（測定場）に集束させる。
レーザドライバ２３は、後述する制御部５０と電気的に接続されており、制御部５０から供給された変調信号の周波数（変調周波数）でレーザ光の強度を変調するように構成されている。
なお、レーザ光源部２０は、１つのレーザ光源を用いてもよいし、複数のレーザ光源を用いてもよい。複数のレーザ光源が用いられる場合には、複数のレーザ光源からのレーザ光がダイクロイックミラー等を用いて合成されることにより、測定場に向けて出射されるレーザ光が形成されることが好ましい。
【００１５】
レーザ光を出射する光源として、例えば、半導体レーザを用いることができる。レーザ光の出力は、例えば、５ｍＷ〜１００ｍＷである。また、変調周波数は、その周期が蛍光緩和時間に比べてやや長く、例えば、１０ＭＨｚ〜２００ＭＨｚである。
【００１６】
第１受光部３０は、フローセル１０の測定場を基準として、レーザ光源部２０と反対側に配置される。第１受光部３０は、フローセル１０の測定場を通過する測定対象物１２にレーザ光が照射されたときに、測定対象物１２で散乱するレーザ光の前方散乱光を受光する。
第１受光部３０は、例えば、フォトダイオード等の光電変換器を備える。光電変換器は、受光した前方散乱光を電気信号に変換する。
第１受光部３０の光電変換器によって変換された電気信号は分析装置６０へ出力され、当該電気信号は、測定対象物１２がフローセル１０の測定場を通過するタイミングを知らせるためのトリガ信号として用いられる。
また、第１受光部３０は、例えば、前方散乱光を光電変換器に集束させるレンズ系（図示省略）と、レーザ光が光電変換器に直接入射しないようにレンズ系の測定対象物１２側前面に設けられた遮蔽板（図示省略）とを有してもよい。
【００１７】
第２受光部４０は、レーザ光源部２０から出射されるレーザ光の出射方向に対して垂直方向であって、且つ、フローセル１０中の測定対象物１２の移動方向に対して垂直方向に配置されている。第２受光部４０は、フローセル１０の測定場を通過する測定対象物１２にレーザ光が照射されたときに測定対象物１２から発せられる蛍光と、レーザ光の側方散乱光とを、光増幅器で増幅して受光する。
図３に示すように、第２受光部４０は、レンズ系４１と、ダイクロイックミラー４２と、ハーフミラー４３ａ，４３ｂと、バンドパスフィルタ（ＢＰＦ）４４ａ，４４ｂ，４４ｃ，４４ｄと、光増幅器４５ａ，４５ｂ，４５ｃ，４５ｄと、信号処理部４６ａ，４６ｂ，４６ｃ，４６ｄと、パワースプリッタ４７ａ，４７ｂと、９０度位相シフタ４８ａ，４８ｂと、を有する。
レンズ系４１は、第２受光部４０に入射した光を集光する。
ダイクロイックミラー４２は、レンズ系４１を透過した光のうち、レーザ光の側方散乱光の波長領域の光を反射し、蛍光の波長領域を含む波長領域の光を透過させるミラーである。
ハーフミラー４３ａは、ダイクロイックミラー４２で反射した側方散乱光の一部を透過させるとともに、残りの側方散乱光を反射することにより、側方散乱光を２方向に分配するミラーである。また、ハーフミラー４３ｂは、ダイクロイックミラー４２を透過した蛍光の一部を透過させるとともに、残りの蛍光を反射することにより、蛍光を２方向に分配するミラーである。なお、ハーフミラー４３ａ，４３ｂの代わりに、ビームスプリッタを用いてもよい。
ＢＰＦ４４ａ，４４ｂ，４４ｃ，４４ｄは、光増幅器４５ａ，４５ｂ，４５ｃ，４５ｄそれぞれの前面に設けられ、所定の波長帯域の蛍光あるいは側方散乱光のみを透過させるフィルタである。なお、透過させる側方散乱光あるいは蛍光の波長帯域は、側方散乱光の波長帯域、あるいは蛍光色素１４が発する蛍光の波長帯域に対応して設定されている。また、ＢＰＦ４４ａ，４４ｂ，４４ｃ，４４ｄの代わりに、バンドリジェクトフィルタを用いてもよい。
【００１８】
光増幅器４５ａ，４５ｂ，４５ｃ，４５ｄは、例えば半導体光増幅器であり、後述するように、変調信号を誘導放出のためのシフト信号として用いて、入射した側方散乱光あるいは蛍光の光信号を増幅する。また、光増幅器４５ａ，４５ｂ，４５ｃ，４５ｄは、レンズ系４１から入射口までの光の光路長が互いに同一になるように配置されている。これは、後述するように、光増幅器４５ａ，４５ｂ，４５ｃ，４５ｄのそれぞれで光増幅したとき、光増幅器４５ａ，４５ｂ，４５ｃ，４５ｄが、変調信号を用いたバイアス信号で誘導放出を行うことにより、変調信号に対する側方散乱光の位相差の情報、あるいは変調信号に対する蛍光の位相差の情報を含む光信号を出力するためである。
光増幅器４５ａ，４５ｂは、側方散乱光の光信号を増幅するために設けられており、パワースプリッタ４７ａを介して制御部５０と電気的に接続され、制御部５０から送信された変調信号でバイアスされている。また、光増幅器４５ｂは、９０度位相シフタ４８ａを介してパワースプリッタ４７ａと接続されている。制御部５０から送信された変調信号は、パワースプリッタ４７ａにより分配される。そして、光増幅器４５ａには、制御部５０から送信された変調信号と同相の信号が供給される。一方、光増幅器４５ｂに供給される信号は、９０度位相シフタ４８ａによって、制御部５０から送信された変調信号に対して９０度位相がシフトしている。これにより、光増幅器４５ａ，４５ｂのそれぞれを構成するレーザ媒質の原子あるいは分子は、変調信号により励起される。そして、側方散乱光が入射すると、レーザ媒質の原子あるいは分子の誘導放出により、光増幅器４５ａ，４５ｂに入射した側方散乱光は増幅される。なお、光増幅器４５ａ，４５ｂは、本発明における第１の光増幅部の一例である。
光増幅器４５ａ，４５ｂを用いることにより、側方散乱光の光信号が電気信号に変換される前に、側方散乱光の光信号を増幅することができる。
【００１９】
また、光増幅器４５ｃ，４５ｄは、蛍光の光信号を増幅するために設けられており、パワースプリッタ４７ｂを介して制御部５０と電気的に接続され、制御部５０から送信された変調信号でバイアスされている。また、光増幅器４５ｄは、９０度位相シフタ４８ｂを介してパワースプリッタ４７ｂと接続されている。制御部５０から送信された変調信号は、パワースプリッタ４７ｂにより分配される。そして、光増幅器４５ｃには、制御部５０から送信された変調信号と同相の信号が供給される。一方、光増幅器４５ｄに供給される信号は、９０度位相シフタ４８ｂによって、制御部５０から送信された変調信号に対して９０度位相がシフトしている。これにより、光増幅器４５ｃ，４５ｄのそれぞれを構成するレーザ媒質の原子あるいは分子は、変調信号により励起される。そして、蛍光が入射すると、レーザ媒質の原子あるいは分子の誘導放出により、光増幅器４５ｃ，４５ｄに入射した蛍光は増幅される。なお、光増幅器４５ｃ，４５ｄは、本発明における第２の光増幅部の一例である。
光増幅器４５ｃ，４５ｄを用いることにより、蛍光の光信号が電気信号に変換される前に、蛍光の光信号を増幅することができる。
【００２０】
次に、光信号の増幅について詳細に説明する。光信号の増幅は、変調信号あるいは変調信号を９０度位相シフトした信号をバイアス信号として用いて、光増幅器４５ａ，４５ｂ，４５ｃ，４５ｄに光の誘導放出を行わせることにより、行われる。これにより、蛍光及び側方散乱光の光信号は、変調信号を参照信号としてミキシングされる。以降では、光増幅器４５ｃを用いて蛍光の光信号を増幅する場合について、代表して説明する。
光増幅器４５ｃを構成するレーザ媒質の原子あるいは分子は、変調信号のエネルギーを吸収すると、基底状態から励起状態に遷移し、一定時間後に光を放出（自然放出）して、再び基底状態に戻る。また、励起状態の原子あるいは分子は、変調信号と同じ周波数の光信号（蛍光信号）が入射されると、同一方向に向けて連鎖反応的に光を放出（誘導放出）する。レーザ媒質の原子あるいは分子が単位時間あたりに自然放出、吸収または誘導放出する確率は、それぞれＡ、Ｂ１２Ｗ、Ｂ２１Ｗで表される。ここで、Ｗは入射光のエネルギー密度であり、Ａ，Ｂ１２，Ｂ２１は状態が遷移する確率である。また、原子あるいは分子の集団が熱平衡状態にある場合、Ｂ１２＝Ｂ２１であることから、以降ではＢ１２及びＢ２１のそれぞれを単にＢと表す。
基底状態の原子あるいは分子の密度（占位数）をＮ１、励起状態の原子あるいは分子の密度（占位数）をＮ２としたとき、Ｎ１，Ｎ２の時間変化を表す微分方程式（レート方程式）は、以下の式（１）のように示される。下記の式（１）では、励起状態の原子あるいは分子の密度の時間変化（式（１）の左辺）は、励起状態の原子あるいは分子の自然放出の発生頻度（式（１）の右辺第１項）と、誘導放出の発生頻度（式（１）の右辺第２項）に応じて低減することを示している。
【００２１】
【数１】
0005461510.tif 000002
また、Ｎ１＋Ｎ２＝Ｎとすると、式（１）は、以下の式（２）のように示される。
【００２２】
【数２】
0005461510.tif 000003
【００２３】
ここで、光増幅器４５ｃのバイアス信号の電圧を、変調信号と同じ角周波数ωで変化させた場合には、確率Ａ，ＢはそれぞれＡ＝ａｃｏｓωｔ、Ｂ＝ｂｃｏｓωｔで表される。なお、ａ，ｂは確率値であるため、ａ，ｂ≦１である。また、蛍光は変調信号で強度変調されたレーザ光により発するので、光増幅器４５ｃに入射する入射光（蛍光）も角周波数ωで変調されていることから、変調信号に対する蛍光の位相差をθとすると、入射光のエネルギー密度Ｗは、Ｗ＝ｗｃｏｓ（ωｔ＋θ）で表される。なお、ｗは入射光の強度である。Ａ、Ｂ及びＷの値を式（２）に代入し、三角関数の加法定理を用いると、式（２）は以下の式（３）のように示される。
【００２４】
【数３】
0005461510.tif 000004
【００２５】
式（３）において、ｔは入射光が光増幅器４５ｃを通過する時間である。また、
【００２６】
【数４】
0005461510.tif 000005
【００２７】
【数５】
0005461510.tif 000006
としたとき、式（３）の一般解は、定数変化法を用いることにより、以下の式（６）のように示される。
【００２８】
【数６】
0005461510.tif 000007
なお、式（６）において、∫ｐ（ｔ）ｄｔは、式（４）より以下の式（７）のように示される。
【００２９】
【数７】
0005461510.tif 000008
ここで、変調信号の変調周波数は、例えば、１０８Ｈｚ程度であることから、角周波数ω＞＞１となる。また、入射光の強度ｗは、例えば、数ｍＷ〜数十ｍＷ程度である。これにより、（ａ／ω）・ｓｉｎωｔの値と、（ｂｗ／２ω）・ｓｉｎ（２ωｔ＋θ）の値は、極めて小さくなることから、ほぼ影響が無いと考えられる。したがって、式（７）は、以下の式（８）のように近似することができる。
【００３０】
【数８】
0005461510.tif 000009
【００３１】
また、式（６）の∫ｄｔ´ｑ（ｔ´）ｅｘｐ（∫ｐ（ｔ）ｄｔ）は、以下の式（９）のように示される。
【００３２】
【数９】
0005461510.tif 000010
ここで、入射光が進行する方向の光増幅器４５ｃの長さは、数ｃｍ〜数十ｃｍ程度であることから、ｔ＜＜１とすることができる。したがって、式（９）のｅｘｐ｛（ｂｗｃｏｓθ）ｔ｝は、以下の式（１０）のように近似することができる。
【００３３】
【数１０】
0005461510.tif 000011
さらに、Ｎの値はアボガドロ数程度の大きさと考えられることから、式（９）は、以下の式（１１）のように近似することができる。
【００３４】
【数１１】
0005461510.tif 000012
したがって、式（６）の右辺第２項は、以下の式（１２）のように示される。
【００３５】
【数１２】
0005461510.tif 000013
【００３６】
よって、式（６）は、式（１２）を用いて以下の式（１３）のように示される。
【００３７】
【数１３】
0005461510.tif 000014
そして、光増幅器４５ｃから出力される蛍光は、Ｎ２の時間微分で表すことができることから、式（１３）を用いて以下の式（１４）のように示される。
【００３８】
【数１４】
0005461510.tif 000015
式（１４）より、光増幅器４５ｃから出力される蛍光の光信号には、入射光（蛍光）の周波数と変調信号の周波数との加算周波数を成分とする高周波成分と、入射光の周波数と変調信号の周波数との差分周波数を成分とする低周波成分とが含まれていることがわかる。すなわち、変調信号を用いたバイアス信号で誘導放出が行われることにより、光増幅器４５ｃは、入射光すなわち蛍光の光信号と、変調信号とをミキシングした結果を得ることができる。また、蛍光の光信号と、蛍光の光信号と同じ周波数を有する変調信号とをミキシングした結果が得られることによって、レーザ光によって変調された蛍光を復調することができる。さらに、蛍光の光信号は、Ｎｂ／２（＞１）倍に増幅されている。
【００３９】
このようにして、光増幅器４５ｃは、変調信号を用いたバイアス信号で誘導放出を行うことにより、蛍光の光信号を増幅することができるとともに、蛍光の光信号と変調信号とをミキシングした結果を得ることができる。なお、光増幅器４５ｃから出力された蛍光の光信号の低周波成分は、後述する信号処理部４６ｃにおいて、変調信号に対する蛍光の位相差の情報である実数部成分（Ｒｅ成分）として得られる。
また、光増幅器４５ｄは、制御部５０から送信された変調信号に対して９０度位相シフトした信号を用いたバイアス信号で誘導放出を行うことにより、光増幅器４５ｃと同様に、蛍光の光信号を増幅する。このとき、光増幅器４５ｄは、蛍光の光信号とバイアス信号とをミキシングした結果を得ることができる。なお、光増幅器４５ｄから出力された蛍光の光信号の低周波成分は、後述する信号処理部４６ｄにおいて、変調信号に対する蛍光の位相差の情報である虚数部成分（Ｉｍ成分）として得られる。
さらに、光増幅器４５ａは、変調信号を用いたバイアス信号で誘導放出を行うことにより、側方散乱光の光信号を増幅することができるとともに、側方散乱光の光信号と変調信号とをミキシングした結果を得ることができる。なお、光増幅器４５ａから出力された側方散乱光の光信号の低周波成分は、後述する信号処理部４６ａにおいて、変調信号に対する側方散乱光の位相差の情報である実数部成分（Ｒｅ成分）として得られる。
さらにまた、光増幅器４５ｂは、制御部５０から送信された変調信号に対して９０度位相シフトした信号を用いたバイアス信号で誘導放出を行うことにより、光増幅器４５ａと同様に、側方散乱光の光信号を増幅する。このとき、光増幅器４５ｂは、側方散乱光の光信号とバイアス信号とをミキシングした結果を得ることができる。なお、光増幅器４５ｂから出力された側方散乱光の光信号の低周波成分は、後述する信号処理部４６ｂにおいて、変調信号に対する側方散乱光の位相差の情報である虚数部成分（Ｉｍ成分）として得られる。
【００４０】
次に、図４を参照して、信号処理部４６ａ，４６ｂ，４６ｃ，４６ｄの構成について説明する。図４は、信号処理部４６ａ，４６ｂ，４６ｃ，４６ｄの構成の一例を示す図である。信号処理部４６ａは、光増幅器４５ａから出力された側方散乱光の光信号を電気信号に変換し、信号処理部４６ｂは、光増幅器４５ｂから出力された側方散乱光の光信号を電気信号に変換する。また、信号処理部４６ｃは、光増幅器４５ｃから出力された蛍光の光信号を電気信号に変換し、信号処理部４６ｄは、光増幅器４５ｄから出力された蛍光の光信号を電気信号に変換する。図４に示すように、信号処理部４６ａ，４６ｂ，４６ｃ，４６ｄは、ＢＰＦ４６１と、光電変換器４６２と、ローパスフィルタ（ＬＰＦ）４６３と、Ａ／Ｄ変換器４６４と、を有している。
【００４１】
ＢＰＦ４６１は、光電変換器４６２の前面に設けられ、所定の波長帯域の蛍光の光信号を透過させるフィルタである。これにより、迷光を抑制することができる。なお、ＢＰＦ４６１の代わりに、バンドリジェクトフィルタを用いてもよい。
光電変換器４６２は、例えばフォトダイオードや光電子増倍管等であり、蛍光あるいは側方散乱光の光信号を受光し、光信号を電気信号に変換して出力する受光素子を有している。ここで、フォトダイオードは、光電子増倍管と比べて、量子効率が優れている一方で、増幅率が劣るという特性を有している。このため、蛍光の光信号を増幅する光電変換器を用いて蛍光を検出する従来技術の構成では、フォトダイオードを光電変換器に用いることが困難であった。一方、本実施形態では、蛍光の光信号が光増幅器４５ｃ，４５ｄによって増幅されていることから、光電変換器で蛍光の光信号を増幅させなくてもよい。これにより、本実施形態では、従来技術において光電変換器に用いることが困難であったフォトダイオードを、光電変換器４６２に用いることができる。なお、信号処理部４６ａ，４６ｂの光電変換器４６２に含まれる受光素子は、本発明における第１の受光素子の一例であり、信号処理部４６ｃ，４６ｄの光電変換器４６２に含まれる受光素子は、本発明における第２の受光素子の一例である。
ＬＰＦ４６３は、光電変換器４６２から出力された蛍光あるいは側方散乱光の電気信号のうち、変調信号の周波数と蛍光信号の周波数との加算周波数を成分とする高周波成分を除去し、変調信号の周波数と蛍光信号の周波数との差分周波数を成分とする低周波成分を通過させるためのフィルタである。これにより、側方散乱光の電気信号の実数部成分（Ｒｅ成分）が、信号処理部４６ａのＬＰＦ４６３から出力され、側方散乱光の電気信号の虚数部成分（Ｉｍ成分）が、信号処理部４６ｂのＬＰＦ４６３から出力される。また、蛍光の電気信号の実数部成分（Ｒｅ成分）が、信号処理部４６ｃのＬＰＦ４６３から出力され、蛍光の電気信号の虚数部成分（Ｉｍ成分）が、信号処理部４６ｄのＬＰＦ４６３から出力される。ＬＰＦ４６３から低周波信号が出力されることにより、ＬＰＦ４６３以降の信号処理において、高周波回路よりも製作するのが容易な低周波回路を用いてフローサイトメータを構成することができる。
なお、光電変換器４６２に低速な受光素子を用いた場合、電気信号の高周波成分が受光素子において自ずと除去されるので、例えば、光電変換処理後に、電気信号用のフィルタを用いて電気信号の高周波成分を除去する処理を行なくてもよい。これにより、信号処理部４６ａ，４６ｂ，４６ｃ，４６ｄの部品点数を低減することができるので、結果として、フローサイトメータの製造コストを低減することができる。
信号処理部４６ａのＡ／Ｄ変換器４６４は、ＬＰＦ４６３から出力された側方散乱光の電気信号のＲｅ成分をデジタルデータに変換する。信号処理部４６ｂのＡ／Ｄ変換器４６４は、ＬＰＦ４６３から出力された側方散乱光の電気信号のＩｍ成分をデジタルデータに変換する。信号処理部４６ｃのＡ／Ｄ変換器４６４は、ＬＰＦ４６３から出力された蛍光の電気信号のＲｅ成分をデジタルデータに変換する。信号処理部４６ｄのＡ／Ｄ変換器４６４は、ＬＰＦ４６３から出力された蛍光の電気信号のＩｍ成分をデジタルデータに変換する。変換されたデジタルデータのそれぞれは、分析装置６０に供給される。
【００４２】
次に、図５を参照して、制御部５０の構成について説明する。図５は、制御部５０の構成の一例を示す図である。制御部５０は、変調信号の変調周波数を制御する。図５に示すように、制御部５０は、発振器５１と、パワースプリッタ５２と、アンプ（ＡＭＰ）５３，５４と、を有している。
【００４３】
発振器５１は、所定の周波数の信号、例えば正弦波信号やパルス信号等を生成し、出力する。発振器５１から出力される信号は変調信号として用いられる。上記信号の周波数は、例えば、１〜５０ＭＨｚである。
発振器５１から出力された所定の周波数の信号（変調信号）は、パワースプリッタ５２により、２つのアンプ５３，５４に分配される。アンプ５３で増幅された変調信号
は、レーザ光源部２０へ出力される。また、アンプ５４で増幅された変調信号は、第２受光部４０へ出力される。アンプ５４で増幅された変調信号を第２受光部４０へ出力するのは、前述したように、変調信号を、第２受光部４０の光増幅器４５ａ，４５ｂ，４５ｃ，４５ｄのバイアス信号として用いるためである。
【００４４】
次に、図６を参照して、分析装置６０の構成について説明する。図６は、分析装置６０の構成の一例を示す図である。分析装置６０は、ＣＰＵを主体として構成されたコンピュータであり、第２受光部４０の信号処理部４６ａ，４６ｂ，４６ｃ，４６ｄのそれぞれから出力された電気信号を用いて、変調信号に対する蛍光の位相差を算出する。また、分析装置６０は、蛍光の位相差から蛍光の蛍光緩和時間を求める。分析装置６０は、位相差算出部６１と、蛍光緩和時間算出部６２とを有している。位相差算出部６１及び蛍光緩和時間算出部６２は、コンピュータが実行可能なプログラムを実行することで形成されるモジュールである。
なお、分析装置６０は、本発明における処理部の一例である。
【００４５】
位相差算出部６１は、第２受光部４０の信号処理部４６ａから受信した側方散乱光の電気信号のＲｅ成分のデータと、第２受光部４０の信号処理部４６ｂから受信した側方散乱光の電気信号のＩｍ成分のデータとを用いてｔａｎ−１（Ｉｍ／Ｒｅ）（ＩｍはＩｍ成分のデータの値、ＲｅはＲｅ成分のデータの値である）を算出することにより、変調信号に対する側方散乱光の位相差θ´を算出する。
また、位相差算出部６１は、第２受光部４０の信号処理部４６ｃから受信した蛍光の電気信号のＲｅ成分のデータと、第２受光部４０の信号処理部４６ｄから受信した蛍光の電気信号のＩｍ成分のデータとを用いてｔａｎ−１（Ｉｍ／Ｒｅ）（ＩｍはＩｍ成分のデータの値、ＲｅはＲｅ成分のデータの値である）を算出することにより、変調信号に対する蛍光の位相差θを算出する。
さらに、位相差算出部６１は、θ−θ´を算出することにより、変調信号に対する蛍光の位相差θを補正する。このように補正が行われるのは、変調信号の伝送線路と、蛍光や側方散乱光の光信号の伝送経路による位相のずれを補正するためである。
そして、位相差算出部６１は、補正された位相差θを蛍光緩和時間算出部６２に送信する。
蛍光緩和時間算出部６２は、位相差算出部６１から受信した位相差θを用いて、蛍光緩和時間τをτ＝ｔａｎθ／（２πｆ）（ｆは変調信号の周波数の値である）に従って求める。蛍光緩和時間τを、上記式に従って求めることができるのは、蛍光は、略１次遅れの緩和応答に従うからである。
【００４６】
出力部７０は、例えば、表示装置やプリンタ等であり、分析装置６０が算出した結果、具体的には蛍光緩和時間等を出力する。
以上が本実施形態のフローサイトメータの概略構成である。
【００４７】
（蛍光検出方法）
図７は、本実施形態の蛍光検出方法のフローの一例を説明する図である。本実施形態の蛍光検出方法は、測定対象物１２にレーザ光を照射し、レーザ光が照射された測定対象物１２から発せられる蛍光を受光することにより、測定対象物１２の情報を取得することができる。
まず、制御部５０の発振器５１は、所定の周波数の信号、例えば正弦波信号やパルス信号等を変調信号として生成し（ステップＳ１）、生成された変調信号をレーザ光源部２０及び第２受光部４０に供給する（ステップＳ２）。
【００４８】
次に、レーザ光源部２０のレーザドライバ２３は、制御部５０から変調信号が供給されると、変調信号の変調周波数でレーザ光の強度を変調する。強度変調されたレーザ光は、レーザ光源２１から出射され、フローセル１０中の測定場を通過する測定対象物１２にレーザ光が照射される（ステップＳ３）。
一方、第２受光部４０の光増幅器４５ａ，４５ｂ，４５ｃ，４５ｄは、発振器５１から供給された変調信号を用いたバイアス信号でバイアスされている。測定場を通過する測定対象物１２にレーザ光が照射された際に発せられる蛍光が第２受光部４０に受光されると、光増幅器４５ｃ，４５ｄは、蛍光の光信号の増幅を行う（ステップＳ４）。これにより、変調信号に対する蛍光の位相差の情報であるＲｅ成分を含む光信号と、変調信号に対する蛍光の位相差の情報であるＩｍ成分を含む光信号とがそれぞれ増幅される。また、レーザ光が照射された際に測定対象物１２で散乱したレーザ光の側方散乱光が第２受光部４０に受光されると、光増幅器４５ａ，４５ｂは、側方散乱光の光信号の増幅を行う。これにより、変調信号に対する側方散乱光の位相差の情報であるＲｅ成分を含む光信号と、変調信号に対する側方散乱光の位相差の情報であるＩｍ成分を含む光信号とがそれぞれ増幅される。光増幅器４５ａ，４５ｂ，４５ｃ，４５ｄにて増幅された光信号は、信号処理部４６ａ，４６ｂ，４６ｃ，４６ｄにおいて電気信号に変換される。このとき、蛍光の電気信号のＲｅ成分及びＩｍ成分のデジタルデータと、側方散乱光の電気信号のＲｅ成分及びＩｍ成分のデジタルデータとが、信号処理部４６ａ，４６ｂ，４６ｃ，４６ｄから出力される。
【００４９】
次に、分析装置６０の位相差算出部６１は、第２受光部４０から受信した蛍光の電気信号のＲｅ成分及びＩｍ成分のデジタルデータと、側方散乱光の電気信号のＲｅ成分及びＩｍ成分のデジタルデータとを用いて、変調信号に対する蛍光の位相差θを算出する（ステップＳ５）。
そして、蛍光緩和時間算出部６２は、位相差算出部６１が算出した位相差θを用いて、蛍光緩和時間τを求める（ステップＳ６）。
出力部７０は、求められた蛍光緩和時間τ等の情報を出力する。
【００５０】
このように、本実施形態によれば、光増幅部４５ｃ，４５ｄを用いて蛍光の光信号を増幅しているので、蛍光の光信号が電気信号に変換される前に蛍光の光信号を増幅することができる。これにより、入射する蛍光の光子数が少ない場合であっても、蛍光の強度を高めることができるので、蛍光の光信号が電気信号に変換された後に、蛍光の電気信号が他の電気信号に埋もれて抽出困難となる可能性、さらに蛍光の電気信号がノイズとして除去される可能性を低減することができる。したがって、蛍光の強度が低い場合であっても、蛍光を検出することができ、ひいては精度の高い蛍光緩和時間を取得することができる。
また、側方散乱光の電気信号と蛍光の電気信号とを用いて、変調信号に対する蛍光の位相差θを算出しているので、変調信号の伝送線路と、蛍光や側方散乱光の光信号の伝送経路とによる位相を含まない位相差θを算出することができる。したがって、精度の高い位相差θを用いて蛍光緩和時間を求めることができるので、精度の高い蛍光緩和時間を取得することができる。
さらに、変調信号を用いたバイアス信号でバイアスされた光増幅部４５ａ，４５ｂ，４５ｃ，４５ｄが、蛍光あるいは側方散乱光の光信号を増幅することにより、蛍光あるいは側方散乱光の光信号と、バイアス信号とがミキシングされる。このため、例えば、電気信号を混合するためのミキサー等の混合器を設ける必要がない。したがって、光信号を増幅するための装置と、混合器とを個別に設ける必要がないので、部品点数を低減することができ、フローサイトメータの製造コストを低減することができる。
【００５１】
（変形例）
図８を参照して、上記実施形態の変形例について説明する。図８は、図３に示した第２受光部の変形例を説明する図である。
上記実施形態では、側方散乱光の光信号を２つに分配して光増幅器４５ａ，４５ｂに入射するとともに、蛍光の光信号を２つに分配して光増幅器４５ｃ，４５ｄに入射するように構成されている。本変形例では、図８に示すように、側方散乱光の光信号を１つの光増幅器４５ａに入射するとともに、蛍光の光信号を１つの光増幅器４５ｃに入射するように構成した点において上記実施形態と異なる。
本変形例の光増幅器４５ａ，４５ｃは、パワースプリッタ４７ａを介して制御部５０と電気的に接続されている。また、光増幅器４５ｃは、９０度位相シフタ４８ａを介してパワースプリッタ４７ａと接続されている。制御部５０から送信された変調信号は、パワースプリッタ４７ａにより分配される。そして、光増幅器４５ａには、制御部５０から送信された変調信号と同相の信号が供給される。一方、光増幅器４５ｃに供給される信号は、９０度位相シフタ４８ａによって、制御部５０から送信された変調信号に対して９０度位相がシフトしている。また、制御部５０は、所定時間（例えば数マイクロ秒）経過する毎に、変調信号の位相を切替えて第２受光部４０に送信する。具体的には、制御部５０は、発振器５１から出力された変調信号と同相の信号、例えば正弦波信号を第２受光部４０に送信し、所定時間経過すると、発振器５１から出力された変調信号に対して９０度位相シフトした信号、例えば余弦信号を第２受光部４０に送信する。そして、制御部５０は、所定時間経過すると、第２受光部４０に送信する信号を、発振器５１から出力された変調信号と同相の信号に切替える。このような処理が繰り返されることにより、制御部５０から送信される変調信号の位相が切替えられる。
これにより、側方散乱光の位相差のＲｅ成分を含む光信号と、側方散乱光の位相差のＩｍ成分を含む光信号とを、１つの光増幅器４５ａから時間的に前後して出力するとともに、蛍光の位相差のＲｅ成分を含む光信号と、蛍光の位相差のＩｍ成分を含む光信号とを、１つの光増幅器４５ｃから出力することができる。
このように、本変形例によれば、上記実施形態と同様に、光増幅部４５ｃを用いて蛍光の光信号を増幅しているので、蛍光の光信号が電気信号に変換される前に蛍光の光信号を増幅することができる。これにより、入射する蛍光の光子数が少ない場合であっても、蛍光の強度を高めることができるので、蛍光の光信号が電気信号に変換された後に、蛍光の電気信号が他の電気信号に埋もれて抽出困難となる可能性、さらに蛍光の電気信号がノイズとして除去される可能性を低減することができる。したがって、蛍光の強度が低い場合であっても、蛍光を検出することができ、ひいては精度の高い蛍光緩和時間を取得することができる。
また、側方散乱光の電気信号と蛍光の電気信号とを用いて、変調信号に対する蛍光の位相差θを算出しているので、変調信号の伝送線路と、蛍光や側方散乱光の光信号の伝送経路とによる位相を含まない位相差θを算出することができる。したがって、精度の高い位相差θを用いて蛍光緩和時間を求めることができるので、精度の高い蛍光緩和時間を取得することができる。
さらに、変調信号を用いたバイアス信号でバイアスされた光増幅部４５ａ，４５ｃが、蛍光あるいは側方散乱光の光信号を増幅することにより、蛍光あるいは側方散乱光の光信号と、バイアス信号とがミキシングされる。このため、例えば、電気信号を混合するためのミキサー等の混合器を設ける必要がない。したがって、光信号を増幅するための装置と、混合器とを個別に設ける必要がないので、部品点数を低減することができ、フローサイトメータの製造コストを低減することができる。
また、本変形例では、蛍光の光信号を２つに分配する必要がないので、上記実施形態のハーフミラー４３ａ，４３ｂ、ＢＰＦ４４ｂ，４４ｄ、光増幅器４５ｂ，４５ｄ、信号処理部４６ｂ，４６ｄを設ける必要がない。このため、部品点数を低減して、フローサイトメータの製造コストを低減することができる。
【００５２】
（第２実施形態）
以下に、第２実施形態の蛍光検出装置及び蛍光検出方法を適用したフローサイトメータについて説明する。第２実施形態のフローサイトメータの構成は、第１実施形態のフローサイトメータの構成とほぼ同じである。第２実施形態のフローサイトメータが第１実施形態のフローサイトメータと異なる点は、信号値が符号化された信号（符号化系列信号）を、レーザ光を強度変調するための変調信号及びバイアス信号として用いる点にある。具体的には、本実施形態の発振器５１の構成が、第１実形態の発振器５１の構成と異なっている。
【００５３】
図９を参照して、本実施形態の発振器５１の構成について説明する。図９は、第２実施形態のフローサイトメータに含まれる発振器５１の構成の一例を説明する図である。
発振器５１は、所定の符号化系列信号を生成し、この符号化系列信号を、アンプ５３，５４に供給する。発振器５１は、変調信号としてレーザ光源部２０に供給される符号化系列信号の生成と、光増幅器４５ａ，４５ｂのバイアス信号として第２受光部４０に供給される符号化系列信号の生成を繰り返し行う。
なお、符号化系列信号として、信号値が所定長さで符号化された信号であって、ビット方向にビット単位でシフトすることにより、シフト前の信号とシフト後の信号とが互いに略直交するように構成された信号が用いられる。ビット方向とは、信号値の配列方向をいう。このような符号化系列信号として、例えば、ＰＮ符号化系列信号が好適に用いられる。ＰＮ符号化系列信号は、Ｍ系列あるいはＧｏｌｄ系列の符号を用いた信号であることが好ましく、特に、Ｍ系列が後述する相関特性の点で好ましい。
なお、Ｍ系列とは、発振器２０が、シフトレジスタ符号発生器を有し、このシフトレジスタ符号発生器は、ｍ段（ｍは自然数）のシフトレジスタと、シフトレジスタの各段の状態の論理結合をシフトレジスタの入力へフィードバックする論理回路とで構成されるとき、信号長さＬが２ｍ−１で表されたものをいう。Ｇｏｌｄ系列は、２つのＭ系列を、同期してビットごとに加算したものである。従って２つの符号発生器の位相関係は不変であり、生成される系列の長さはもとになる系列の長さと同じ長さであるが、Ｍ系列にはならないものである。
【００５４】
ＰＮ符号化系列信号は、値が０および１からなる１ビット信号で、ビット方向にビット単位でシフトすることによってできる自己相関関数の値が０又は−１／ｎ（ｎは後述する系列符号の長さ）となる信号である。
ＰＮ符号化系列信号は、一例を挙げると以下のように作成されるＰＮ系列符号のデータを用いて信号化したものである。
次数ｋ＝５、符号系列の長さｎ＝３１とし、係数ｈ１＝１，ｈ２＝１，ｈ３＝０，ｈ４＝１，ｈ５＝１とし、初期値ａ０＝１，ａ１＝１,ａ２＝０,ａ３＝１，ａ４＝０としたとき下記式（１５）に示す漸化式で一意的にＰＮ系列符号Ｃ＝｛ａｋ｝(ｋは自然数)を求めることができる。
【００５５】
【数１５】
0005461510.tif 000016
【００５６】
さらに、系列符号Ｃ＝｛ａ０，ａ１，ａ２，………，ａｎ−１｝を用いて基準となる符号化系列信号を生成するとともに、さらにこの系列符号Ｃをｑ１ビット、ビット方向にビットシフトさせた系列符号Ｔｑ１・Ｃ（Ｔｑ１は、ビット方向にｑ１ビット、ビットシフトする作用素である）を用いて符号化系列信号を生成する。ここで、系列符号Ｔｑ１・Ｃは、{ａｑ１，ａｑ１＋１，ａｑ１＋２，………，ａｑ１＋Ｎ−１｝である。さらに、系列符号Ｃをｑ２ビット（例えば、ｑ２＝２×ｑ１）、ビット方向にビットシフトさせた系列符号Ｔｑ２・Ｃを用いて符号化系列信号を生成する。
この符号化系列信号を生成するために用いられる系列符号Ｃ，Ｔｑ１・Ｃ，Ｔｑ２・Ｃは、互いに直交する特性を有するので、生成される符号化系列信号も互いに直交する性質を有する。
【００５７】
具体的に説明すると、長さｎの系列符号をＣ＝｛ｂ０，ｂ１，ｂ２，………,ｂｎ−１｝とし、上記作用素Ｔｑを系列符号Ｃに作用させた系列符号をＣ´＝Ｔｑ・Ｃ、すなわちＣ´＝｛ｂｑ，ｂｑ＋１，ｂｑ＋２，………,ｂｑ＋ｎ−１}としたとき、系列符号ＣとＣ´との間の相関関数Ｒｃｃ´（q）は下記式（１６）のように定義される。ここで、ＮＡは系列符号における項ｂｉと項ｂｑ＋ｉ（ｉは０以上ｎ−１以下の整数）の値が一致する数であり、ＮＤは系列符号における項ｂｉと項ｂｑ＋ｉの値の不一致の数である。また、ＮＡとＮＤの和は系列符号長さｎとなる（ＮＡ＋ＮＤ＝ｎ）。ここで、ｉとｑ＋ｉはｍｏｄ（ｎ）で考える。
【００５８】
【数１６】
0005461510.tif 000017
【００５９】
上記ＰＮ符号化系列において２つの系列を項毎にｍｏｄ（２）で加算した結果はもとのＰＮ系列符号を巡回シフトしたＰＮ系列符号になる性質があり、ＰＮ系列符号の値が０となる個数は値が１となる個数より１つだけ少ないので、ＮＡ−ＮＤ＝−１となる。これより、ＰＮ系列符号において下記式（１７）および（１８）に示す値となる。
【００６０】
【数１７】
0005461510.tif 000018
【００６１】
【数１８】
0005461510.tif 000019
【００６２】
上記式（１７）より、ビットシフト量が０、すなわちｑ＝０（ｍｏｄ（ｎ））の場合、式（１７）に示すようにＲｃｃ´（q）の値は１となり自己相関性を有する。一方、ビットシフト量が０でない、すなわちｑ≠０（ｍｏｄ（ｎ））の場合、式（１８）に示すようにＲｃｃ´（q）の値は−１／ｎとなる。ここで系列符号長さｎを大きくすることにより、Ｒｃｃ´（q）（ｑ≠０）の値は０に近づく。
すなわち、系列符号ＣとＣ´は自己相関性を持ち、かつ略直交性を有するといえる。
このようなＰＮ系列符号の値を０，１として時系列信号としたのがＰＮ符号化系列信号である。
発振器５１は、このようなＰＮ符号化系列信号を生成する。
【００６３】
次に、本実施形態の発振器５１の構成について、図９を参照して説明する。変調信号に対する蛍光の位相差θの分解能を高めるためには、符号化系列信号のデータ間の時間間隔Δｔを極めて狭くする必要がある。すなわち、上記ＰＮ符号化系列信号の１ビットシフトする時間幅が小さくなるようにする必要がある。このため、発振器５１は、高速の符号化系列信号を発振させる必要があることから、図９に示すように、ＦＰＧＡ（Field Programmable Gate Array）５１ａ、パラレル・シリアル（Ｐ／Ｓ）変換器５１ｂ，５１ｃ、同期信号分割器５１ｄ，５１ｅ、クロック信号発生器５１ｆを用いて構成することが好ましい。
パラレル・シリアル変換器５１ｂ，５１ｃを用いるのは、符号化系列信号を高速化させるためである。また、クロック信号発生器５１ｆを用いるのは、パラレル・シリアル変換器５１ｂ，５１ｃのシリアル信号として生成され、アンプ５３及びアンプ５４に送られる２つの符号化系列信号を同期あるいは遅延時間を制御するためである。同期あるいは遅延時間を制御するのは、例えば、光増幅器４５ｃ，４５ｄを用いて蛍光の増幅処理を行うとき、アンプ５４に送られる符号化系列信号が、光増幅器４５ｃ，４５ｄにて蛍光の光信号とミキシングされることにより、光増幅器４５ｃ，４５ｄに入射する蛍光の光信号との間で相関関数を作成するためである。なお、光増幅器４５ｃ，４５ｄに入射する蛍光の光信号は、アンプ５３に送られる符号化系列信号によって変調されている。
発振器５１は、分析装置６０からのパルス信号、あるいは図示されない制御装置からのパルス信号、に応じて、符号化系列信号を繰り返し生成する。
【００６４】
バイアス信号として光増幅器４５ａ，４５ｂ，４５ｃ，４５ｄに供給される符号化系列信号は、発振器５１で繰り返し生成され、しかも、生成されるタイミングが、符号化系列信号のデータ間の時間間隔Δｔずつ、すなわち、符号化系列信号の１ビットずつ、ビット方向にシフトしている。このときのシフトによる遅延は、変調信号としてレーザ光源部２０に供給される符号化系列信号の生成のタイミングを基準とした遅延である。
光増幅器４５ａ，４５ｂ，４５ｃ，４５ｄでの増幅時におけるミキシングでは、遅延した符号化系列信号をａ（ｔ＋Δ）とし、入射光（蛍光）の光信号をｂ（ｔ）としたとき、ａ（ｔ＋Δ）×ｂ（ｔ）の演算を行う。ここでΔは、遅延時間であり、Δ＝ｋ・Δｔ（ｋは自然数であり、データポイント上の１ビットのシフト量を表す）である。
【００６５】
信号処理部４６ａ，４６ｂ，４６ｃ，４６ｄそれぞれのＬＰＦ４６３は、光増幅器４５ａ，４５ｂ，４５ｃ，４５ｄにてミキシングされた蛍光あるいは側方散乱光の信号のうち、符号化系列信号に応じて設定される周波数をカットオフ周波数として高周波成分の信号成分を除去して、低周波成分の信号を通過させる。
【００６６】
分析装置６０の位相差算出部６１は、発振器５１で繰り返し生成される符号化系列信号の生成のタイミングに同期して、上記低周波成分の信号を、符号化系列信号の１周期の時間、積算する。これにより、遅延時間Δにおける相関関数の値を求めることができる。この遅延時間Δが順次変更されることにより、相関関数を求めることができる。
また、位相差算出部６１は、符号化系列信号の１周期の時間のうち相関関数の値が最大となる遅延時間Δ１を求め、求められた遅延時間Δ１を用いて２πｆ・Δ１（ｆは変調周波数の値である）を算出することにより、変調信号に対する蛍光の位相差θと、変調信号に対する側方散乱光の位相差θ´とを算出する。なお、位相差算出部６１において求められる相関関数は、回路の帯域が無限大である場合、自己相関関数となる。
さらに、位相差算出部６１は、θ−θ´を算出することにより、変調信号に対する蛍光の位相差θを補正する。
蛍光緩和時間算出部６２は、位相差算出部６１から受信した位相差θを用いて、蛍光緩和時間τをτ＝ｔａｎθ／（２πｆ）に従って求める。
【００６７】
このように、本実施形態によれば、変調信号が、信号値が符号化された信号であって、ビット方向にビット単位でシフトすることにより、シフト前の信号とシフト後の信号とが互いに略直交するように構成された信号である。このため、位相差算出部６１にて相関関数が求められるとき、相関がない状態では、近似的に値が０になる。このため、蛍光の遅延時間を示す相関関数のピーク位置が明確に形成される。したがって、蛍光の位相差θを精度良く求めることができ、精度の高い蛍光緩和時間を取得することができる。
【００６８】
なお、相関関数のＳＮ比を高めることにより、遅延時間Δ１を求めやすくするためには、相関関数の最大値以外の値（＝−１／ｎ）が０に近くなる、すなわち近似的に直交性を実現する（略直交する）ことが必要である。このためには、符号化系列信号の１周期のデータ数ｎを大きくする必要がある。しかし、データ数ｎを大きくすることにより、１周期に対応する時間Ｔ（＝ｎ・Δｔ）が増大し、相関関数を０〜Ｔの遅延時間の範囲で算出するには多くの計算時間を要する。
したがって、符号化系列信号を用いて蛍光検出を行う場合、測定場における測定対象物１２の滞在時間を長くすることが好ましく、例えば、蛍光顕微鏡に本実施形態の蛍光検出装置及び蛍光検出方法を適用することが好ましい。
【００６９】
以上、本発明の蛍光検出装置及び蛍光検出方法について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態および変形例に限定されず、本発明の主旨を逸脱しない範囲において、種々の改良や変更をしてもよいのはもちろんである。
【符号の説明】
【００７０】
１０  フローセル
１２  測定対象物
２０  レーザ光源部
３０  第１受光部
４０  第２受光部
４５ａ，４５ｂ，４５ｃ，４５ｄ  光増幅器
５０  制御部
５１  発振器
６０  分析装置
６１  位相差算出部
６２  蛍光緩和時間算出部
７０  出力部
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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