(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物から採取した単球を、in vitroで以下のREICタンパク質の存在下で培養することを含む、CD14陽性単球より樹状細胞様細胞を分化誘導する方法：
(a)  配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；又は
(b)  配列番号２に表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸を置換、欠失、または付加してなるアミノ酸配列からなり、かつ単球からの樹状細胞様細胞分化誘導活性を有するタンパク質。
【請求項２】
単球が末梢血単球である請求項１記載の方法。
【請求項３】
請求項１又は２記載の方法により、REICタンパク質により活性化された単球より分化誘導された樹状細胞様に分化した細胞。
【請求項４】
CD11c、CD40、CD80、CD86、HLA-DR、及びCD14が陽性であり、CD1aが陰性である、請求項３記載の樹状細胞様に分化した細胞。
【請求項５】
フローサイトメトリーにより細胞表面の抗原を解析した場合に、GM-CSF及びIL-4を用いて単球から誘導された樹状細胞に比べて、CD14が多く発現しており、CD1aがほとんど発現していない請求項３記載の樹状細胞様に分化した細胞。
【請求項６】
請求項３〜５のいずれか１項に記載の樹状細胞様に分化した細胞を含む、癌の治療又は予防のための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗癌免疫活性を高める癌の治療又は予防のための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ：ＤＣ）は生体内で最も強力な抗原提示細胞であり、Ｔ細胞に抗原を提示することにより免疫応答を誘導することが知られている。また、ＤＣはＴ細胞のみでなくＢ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞などとも直接作用し、免疫反応における中枢的役割を担う細胞であることが知られている。未成熟ＤＣは抗原刺激を受けることによって、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６などの発現上昇を伴い高いＴ細胞刺激能を獲得すると共に末梢リンパ組織に移行して、取り込んだ抗原に特異的なＴ細胞を活性化することによって免疫応答を誘導する。
一般に、血液前駆細胞より樹状細胞（様）の分化を誘導できると認められている物質は、文献的にも、数えるほどしか無く、そのほとんどが著名なサイトカインである。例えば、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ−４の併用による分化誘導について多くの報告が成され、樹状細胞分化のゴールデンスタンダードとされている。その他に、単剤もしくは併用により樹状細胞を分化誘導できる物質として、ＴＮＦ−ａｌｐｈａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＣＤ４０  ｌｉｇａｎｄ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｆｌｔ３  ｌｉｇａｎｄ、ＴＧＦ−ｂｅｔａが報告されている。これらのタンパク質のうち、単剤のみでその前駆細胞から樹状（様）細胞を分化誘導できる物質としては、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＨＧＦ、ＣＤ４０  ｌｉｇａｎｄが挙げられる。このうち抗癌効果がｉｎ  ｖｉｖｏにおいて認められるのは、ＩＬ−２のみである（非特許文献１を参照）。
一方、細胞の不死化に関連した遺伝子として、ＲＥＩＣ遺伝子が知られており、がん細胞ではこの遺伝子の発現が抑制されていることが報告されている（特許文献１及び非特許文献２から５を参照）。
ＲＥＩＣ遺伝子はＤｋｋファミリーのメンバーであり、そのうちＤｋｋ−１がＷｎｔ受容体を介してＷｎｔシグナル伝達を阻害することが示唆されている（非特許文献６及び７を参照）。Ｗｎｔ遺伝子は、細胞の成長、分化、がん化などの重要な生物学的状況に多面的な役割を果たすことが報告されている（非特許文献８を参照）。従って、Ｄｋｋファミリー（ヒトでは現在４つの遺伝子が知られている）は恐らく同様に細胞の成長、分化、がん化において重要な機能を担うと考えられるが、大部分は未解明のままである。
【特許文献１】国際公開第ＷＯ０１／０３８５２３号パンフレット
【非特許文献１】Ｚｏｕ  ＧＭ．Ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｎｅｔｗ．２００２  Ａｐｒ−Ｊｕｎ；１３（２）：１８６−９９．
【非特許文献２】Ｔｓｕｊｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２６８，２０−４（２０００）
【非特許文献３】Ｔｓｕｊｉ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２８９，２５７−６３（２００１）
【非特許文献４】Ｎｏｚａｋｉ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  １９，１１７−２１（２００１）
【非特許文献５】Ｋｕｒｏｓｅ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｕｒｏｌ  １７１，１３１４−８（２００４）
【非特許文献６】Ｂａｆｉｃｏ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３，６８３−６（２００１）
【非特許文献７】Ｈｏａｎｇ，Ｂ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４，２７３４−９（２００４）
【非特許文献８】Ｍｏｏｎ，Ｒ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６，１６４４−６（２００２）
【発明の開示】
【０００３】
本発明は、樹状細胞様細胞を誘導・活性化し、癌を免疫療法により治療又は予防することを目的とする。
上記のように、免疫学的な癌治療剤としてのＩＬ−２タンパク質は、腎細胞癌などの特殊な癌種において治療効果を有することある。しかしながら、その投与適応のある癌種及びその効果は限定的なものであることも、臨床的には周知の事実である。
本発明者らは、先に本発明者等が単離したＲＥＩＣ（ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３）タンパク質の癌免疫治療における効果について鋭意検討を行った。その結果、本発明者等はＲＥＩＣタンパク質が単球より樹状細胞様細胞を分化誘導させ、該樹状細胞様細胞が癌抗原に対する免疫反応を惹起し、癌を治療又は予防し得ることを見出し、ＲＥＩＣタンパク質を樹状細胞分化誘導剤、癌免疫活性化剤及び癌の治療又は予防剤として用いることに関する本発明を完成させた。本発明者らは、ほとんどすべての癌種において発現・分泌低下の認められるＲＥＩＣタンパク質は、それらの様々な癌種において癌免疫活性化作用を有する癌治療剤として使用できる可能性があること、またその治療効果についてもＩＬ−２と比べて優位性を持つ可能性があることを見出した。本発明者らは、ＲＥＩＣタンパク質自身が抗癌免疫を誘導し得ることを証明し、生体内での免疫・炎症現象におけるＲＥＩＣタンパク質の有用性を確認した。発癌の観点から考えると、癌化の進む組織内ではＲＥＩＣタンパク質の濃度が低いと考えられ（多くの種類の癌細胞では、ＲＥＩＣタンパク質の発現、分泌が欠如、低下しているため）、その為、抗癌免疫活性が癌組織内では誘導されにくく、生体免疫が癌を見逃して（癌細胞の免疫学的寛容）、癌が増殖、悪化すると考えられる。ＲＥＩＣタンパク質は、このような状況下、抗癌免疫活性化による癌化・発癌予防剤としても有用である。
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］  以下のＲＥＩＣタンパク質を有効成分として含む、単球からの樹状細胞様細胞分化誘導剤：
（ａ）  配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；又は
（ｂ）  配列番号２に表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸を置換、欠失、または付加してなるアミノ酸配列からなり、かつ単球からの樹状細胞様細胞分化誘導活性を有するタンパク質。
［２］  単球が末梢血単球である［１］の単球からの樹状細胞様細胞分化誘導剤。
［３］  以下のＲＥＩＣタンパク質を有効成分として含む、癌免疫活性化剤：
（ａ）  配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；又は
（ｂ）  配列番号２に表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸を置換、欠失、または付加してなるアミノ酸配列からなり、かつ単球からの樹状細胞様細胞分化誘導活性を有するタンパク質。
［４］  単球が末梢血単球である［３］の癌免疫活性化剤。
［５］  ［３］又は［４］に記載の癌免疫活性化剤を含む、癌免疫活性化作用を有する、癌の治療又は予防のための医薬組成物。
［６］  以下のＲＥＩＣ  ＤＮＡを有効成分として含む、単球からの樹状細胞様細胞分化誘導剤：
（ａ）  配列番号１に表される塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｂ）  配列番号１に表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、単球からの樹状細胞様細胞分化誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
［７］  単球が末梢血単球である［６］の単球からの樹状細胞様細胞分化誘導剤。
［８］  以下のＲＥＩＣ  ＤＮＡを有効成分として含む、癌免疫活性化剤：
（ａ）  配列番号１に表される塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｂ）  配列番号１に表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、単球からの樹状細胞様細胞分化誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
［９］  単球が末梢血単球である［８］の癌免疫活性化剤。
［１０］  ［８］又は［９］の癌免疫活性化剤を含む、癌免疫活性化作用を有する、癌の治療又は予防のための医薬組成物。
［１１］  以下のＲＥＩＣ  ＤＮＡを含むベクターを有効成分として含む単球からの樹状細胞様細胞分化誘導剤：
（ａ）  配列番号１に表される塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｂ）  配列番号１に表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、単球からの樹状細胞若しくは樹状細胞様細胞分化誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
［１２］  ベクターがアデノウイルスベクターである［１１］の単球からの樹状細胞様細胞分化誘導剤。
［１３］  単球が末梢血単球である［１１］又は［１２］の単球からの樹状細胞様細胞分化誘導剤。
［１４］  以下のＲＥＩＣ  ＤＮＡを含むベクターを有効成分として含む癌免疫活性化剤：
（ａ）  配列番号１に表される塩基配列からなるＤＮＡ；又は
（ｂ）  配列番号１に表される塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡにストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡであって、単球からの樹状細胞若しくは樹状細胞様細胞分化誘導活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
［１５］  単球が末梢血単球である［１４］の癌免疫活性化剤。
［１６］  ベクターがアデノウイルスベクターである［１４］又は［１５］の癌免疫活性化剤。
［１７］  ［１４］〜［１６］のいずれかの癌免疫活性化剤を含む、癌免疫活性化作用を有する、癌の治療又は予防のための医薬組成物。
［１８］  ベクターがアデノウイルスベクターである［１７］の癌免疫活性化作用を有する、癌の治療又は予防のための医薬組成物。
［１９］  動物から採取した単球を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで以下のＲＥＩＣタンパク質の存在下で培養することを含む、ＣＤ１４陽性単球より樹状細胞様細胞を分化誘導する方法：
（ａ）  配列番号２に表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；又は
（ｂ）  配列番号２に表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸を置換、欠失、または付加してなるアミノ酸配列からなり、かつ単球からの樹状細胞様細胞分化誘導活性を有するタンパク質。
［２０］  単球が末梢血単球である［１９］の方法。
［２１］  ［１９］又は［２０］の方法により、ＲＥＩＣタンパク質により活性化された単球より分化誘導された樹状細胞様に分化した細胞。
［２２］  ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲ、及びＣＤ１４が陽性であり、ＣＤ１ａが陰性である、［２１］の樹状細胞様に分化した細胞。
［２３］  フローサイトメトリーにより細胞表面の抗原を解析した場合に、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４を用いて単球から誘導された樹状細胞に比べて、ＣＤ１４が多く発現しており、ＣＤ１ａがほとんど発現していない［２１］の樹状細胞様に分化した細胞。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００８−０８６５１６号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、精製したヒトＲＥＩＣタンパク質のウエスタンブロット分析の結果を示す写真である。
図２は、ヒトＲＥＩＣタンパク質添加による末梢血単球からの樹状細胞様分化誘導を示す位相差顕微鏡像を示す写真である。
図３は、ヒトＲＥＩＣタンパク質添加により分化誘導される樹状細胞様細胞の全細胞に占める割合を示す図である。
図４は、ヒトＲＥＩＣタンパク質添加による末梢血単球（ＣＤ１４陽性細胞）からの樹状細胞様分化誘導を示す写真である。
図５は、ヒトＲＥＩＣタンパク質添加による末梢血単球のＳＴＡＴ活性化を示す写真である。
図６Ａは、ヒトＲＥＩＣタンパク質添加により分化誘導された樹状細胞様細胞のフローサイトメトリーによる解析の結果を示す図である。
図６Ｂは、ヒトＲＥＩＣタンパク質添加により分化誘導された樹状細胞様細胞のフローサイトメトリーによる解析の結果を示す図である。
図７は、ヒトＲＥＩＣタンパク質の腫瘍内投与実験のプロトコールを示す図である。
図８Ａは、ヒトＲＥＩＣタンパク質の腫瘍内投与による腫瘍増殖抑制効果（腫瘍体積の経時的変化）を示す図である。
図８Ｂは、ヒトＲＥＩＣタンパク質の腫瘍内投与による腫瘍増殖抑制効果（腫瘍重量）を示す図である。
図８Ｃは、ヒトＲＥＩＣタンパク質の腫瘍内投与による腫瘍増殖抑制効果（腫瘍の写真）を示す写真である。
図９は、ヒトＲＥＩＣタンパク質の腫瘍内投与による抗癌免疫活性の上昇を示す図である。
図１０は、ヒトＲＥＩＣタンパク質添加による末梢血単核球からの樹状細胞様分化誘導を示す図である。
図１１は、ヒトＲＥＩＣタンパク質添加により誘導された樹状様細胞におけるＣＤ４＋Ｔ細胞（リンパ球）を用いたアロ（異系同種）反応誘導活性を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の単球からの樹状細胞様細胞分化誘導剤、癌免疫活性化剤及び癌免疫活性化作用を有する、癌の治療又は予防のための医薬組成物は、ＲＥＩＣ  ＤＮＡ又は該ＤＮＡがコードするＲＥＩＣタンパク質を有効成分として含む。
ＲＥＩＣ  ＤＮＡの塩基配列は、配列番号１に表される。また、ＲＥＩＣ  ＤＮＡがコードするＲＥＩＣタンパク質のアミノ酸配列は配列番号２に表される。
本発明の単球からの樹状細胞様細胞分化誘導剤、癌免疫活性化剤及び癌免疫活性化作用を有する、癌の治療又は予防のための医薬組成物に含まれるＲＥＩＣ  ＤＮＡをコードするタンパク質は、配列番号２に表されるアミノ酸配列又は配列番号２に表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、単球からの樹状細胞様細胞分化誘導活性を有するタンパク質である。ここで、実質的に同一のアミノ酸配列としては、当該アミノ酸配列に対して１又は複数若しくは数個（１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１個若しくは２個）のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の同一性を有しているものが挙げられる。
ＲＥＩＣ  ＤＮＡをコードするタンパク質は、配列番号１又は配列番号２の配列情報に基づいて、化学合成により得ることができる。また、遺伝子工学的手法により組換えＲＥＩＣタンパク質として得ることができる。さらに、ＷＯ０１／０３８５２３号公報の記載に従って得ることも可能である。
本発明の単球からの樹状細胞様細胞分化誘導剤、癌免疫活性化剤及び癌免疫活性化作用を有する、癌の治療又は予防のための医薬組成物に含まれるＲＥＩＣ  ＤＮＡは、配列番号１に表される塩基配列に相補的な塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、配列番号１に表される塩基配列と、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも８５％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９７％以上の同一性を有しているＤＮＡ、又は前記ＤＮＡによりコードされるタンパク質のアミノ酸配列に対して１又は複数若しくは数個（１〜１０個、好ましくは１〜５個、さらに好ましくは１個若しくは２個）のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡなどのうち、単球からの樹状細胞様細胞分化誘導活性を有するタンパクをコードするものである。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、「１ＸＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、３７℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「０．５ＸＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、４２℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「０．２ＸＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ、６５℃」程度の条件である。さらに、本発明の単球からの樹状細胞様細胞分化誘導剤、癌免疫活性化剤及び癌免疫活性化作用を有する、癌の治療又は予防のための医薬組成物に含まれるＲＥＩＣ  ＤＮＡは、配列番号２に表されるタンパク質をコードするＤＮＡである。
ここで、単球からの樹状細胞様細胞分化誘導活性とは、単球に作用して樹状細胞様細胞に分化させる活性をいう。ＲＥＩＣタンパク質添加により樹状細胞様細胞が分化誘導されたか否かは、形態的特徴及び表面抗原により検出することができる。すなわち、この樹状細胞様細胞の特徴としては、形態学的に樹状突起を有するということと、さらにフローサイトメトリーによる解析により、表面抗原として、樹状細胞のマーカーであるＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲが陽性であることが挙げられる。
ＲＥＩＣ  ＤＮＡは、配列番号１の配列情報に基づいて、ヒト細胞、ヒト組織等から得ることができる。また、ＷＯ０１／０３８５２３号公報の記載に従って得ることも可能である。
さらに、本発明はＲＥＩＣ  ＤＮＡを含むベクターをも包含する。該ベクターを被験体に導入することにより、被験体体内でＲＥＩＣタンパク質が発現し単球からの樹状細胞様細胞分化誘導効果、癌免疫活性化効果及び癌免疫活性化作用による癌の治療又は予防効果を発揮し得る。
遺伝子治療における目的の遺伝子（ＤＮＡ）の被験体への導入は公知の方法により行うことができる。遺伝子を被験体へ導入する方法として、ウイルスベクターを用いる方法及び非ウイルスベクターを用いる方法があり、種々の方法が公知である（別冊実験医学、遺伝子治療の基礎技術、羊土社、１９９６；別冊実験医学、遺伝子導入＆発現解析実験法、羊土社、１９９７；日本遺伝子治療学会編、遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス、１９９９）。
遺伝子導入のためのウイルスベクターとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス等のウイルスベクターを用いた方法が代表的なものである。無毒化したレトロウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０、免疫不全症ウイルス（ＨＩＶ）等のＤＮＡウイルス又はＲＮＡウイルスに目的とする遺伝子を導入し、細胞に組換えウイルスを感染させることによって、細胞内に遺伝子を導入することが可能である。
本発明に係る遺伝子をウイルスを用いた遺伝子治療に使用するとき、アデノウイルスベクターが好ましく用いられる。アデノウイルスベクターの特徴として、（１）多くの種類の細胞に遺伝子導入ができる、（２）増殖停止期の細胞に対しても効率よく遺伝子導入ができる、（３）遠心により濃縮が可能であり、高タイター（１０〜１１ＰＦＵ／ｍｌ以上）のウイルスが得られる、（４）ｉｎ  ｖｉｖｏの組織細胞への直接の遺伝子導入に適している、といった点が挙げられる。遺伝子治療用のアデノウイルスとしては、Ｅ１／Ｅ３領域を欠失させた第１世代のアデノウイルスベクター（Ｍｉｙａｋｅ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９３，１３２０，１９９６）から、Ｅ１／Ｅ３領域に加え、Ｅ２若しくはＥ４領域を欠失させた第２世代のアデノウイルスベクター（Ｌｉｅｂｅｒ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０，８９４４，１９９６；Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ，Ｈ．＆Ｋａｙ，Ｍ．Ａ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１０，２０１３，１９９９）、アデノウイルスゲノムをほぼ完全に欠失させた（ＧＵＴＬＥＳＳ）第３世代のアデノウイルスベクター（Ｓｔｅｉｎｗａｅｒｄｅｒ，Ｄ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３，９３０３，１９９９）が開発されているが、本発明に係る遺伝子を導入するには、特に限定されず、いずれのアデノウイルスベクターでも使用可能である。さらに、ＡＡＶの染色体に組み込み能を付与したアデノ−ＡＡＶハイブリッドベクター（Ｒｅｃｃｈｉａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９６，２６１５，１９９９）や、トランスポゾンの遺伝子を用いることにより染色体に組み込む能力を有したアデノウイルスベクターなどを利用すれば、長期的な遺伝子発現にも応用が可能である。また、アデノウイルスファイバーのＨ１ループに組織特異的な移行性を示すペプチド配列を挿入することにより、アデノウイルスベクターに組織特異性を付与することも可能である（Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ，Ｈ．＆Ｈａｙａｋａｗａ，Ｔ．，Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ，７，１５４４，２０００）。
本発明において、ＲＥＩＣ  ＤＮＡを含むアデノウイルスベクターをＡｄ−ＲＥＩＣと呼ぶ。
また、上記ウイルスを用いることなく、プラスミドベクター等の遺伝子発現ベクターが組み込まれた組換え発現ベクターを用いて、目的遺伝子を細胞や組織に導入することができる。例えば、リポフェクション法、リン酸−カルシウム共沈法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、微小ガラス管を用いたＤＮＡの直接注入法などにより細胞内へ遺伝子を導入することができる。また、内包型リポソーム（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）による遺伝子導入法、静電気型リポソーム（ｅｌｅｃｔｏｒｏｓｔａｔｉｃ  ｔｙｐｅ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）による遺伝子導入法、ＨＶＪ−リポソーム法、改良型ＨＶＪ−リポソーム法（ＨＶＪ−ＡＶＥリポソーム法）、ＨＶＪ−Ｅ（エンベロープ）ベクターを用いた方法、レセプター介在性遺伝子導入法、パーティクル銃で担体（金属粒子）とともにＤＮＡ分子を細胞に移入する方法、ｎａｋｅｄ−ＤＮＡの直接導入法、種々のポリマーによる導入法等によっても、組換え発現ベクターを細胞内に取り込ませることが可能である。この場合に用いる発現ベクターとしては、生体内で目的遺伝子を発現させることのできるベクターであれば如何なる発現ベクターも用いることができるが、例えばｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ  １０８，１９３−２００（１９９１））や、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３、１、ｐＺｅｏＳＶ（インビトロゲン社、ストラタジーン社）、ｐＶＡＸ１などの発現ベクターが挙げられる。
ＲＥＩＣ  ＤＮＡを含むベクターは、適宜遺伝子を転写するためのプロモーターやエンハンサー、ポリＡシグナル、遺伝子が導入された細胞の標識及び／又は選別のためのマーカー遺伝子等を含んでいてもよい。この際のプロモーターとしては、公知のプロモーターを用いることができる。
本発明のＲＥＩＣ  ＤＮＡを含むベクターを被験体へ導入するには、遺伝子治療剤を直接体内に導入するｉｎ  ｖｉｖｏ法、及び、ヒトからある種の細胞を取り出して体外で遺伝子治療剤を該細胞に導入し、その細胞を体内に戻すｅｘ  ｖｉｖｏ法等を用いればよい（日経サイエンス、１９９４年４月号、２０−４５頁；月刊薬事、３６（１），２３−４８（１９９４）；実験医学増刊、１２（１５）、（１９９４）；日本遺伝子治療学会編、遺伝子治療開発研究ハンドブック、エヌ・ティー・エス、１９９９）。
本発明において、単球は末梢血由来単球、骨髄由来単球、脾臓細胞由来単球、臍帯血由来単球が含まれ、この中でも末梢血由来の単球が好ましい。単球は、ＣＤ１４陽性を特徴とし、生体から単球を採取し、ＲＥＩＣタンパク質で樹状細胞様細胞に誘導させる場合、ＣＤ１４の存在を指標にＦＡＣＳ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒ）またはフローサイトメーター等により採取することができる。単球の由来動物種は限定されず、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒト等の哺乳動物を用いることができる。ＦＡＣＳによる特定の細胞集団の単離は公知の方法により行なえばよい。ＦＡＣＳ、フローサイトメーターとしては例えばＦＡＣＳ  ｖａｎｔａｇｅ（ベクトン・ディッキンソン社製）、ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（ベクトン・ディッキンソン社製）等を用いることができる。
単球の培養は、周知のヒトリンパ系細胞の培養技術により行なうことができる。培養液としては例えばＲＰＭＩ１６４０やＤＭＥＭの公知の基本培地を用いればよい。これらの基本培地に適当な抗生物質や動物血清等を添加して培養すればよい。培養容器は限定されず、培養規模に応じて市販のプレート、ディッシュ、フラスコを適宜選択して用いることができる。
本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで単球をＲＥＩＣタンパク質の存在下で培養し、単球を樹状細胞様細胞に分化誘導させる方法を含む。該方法においては、例えば単球を１０４〜１０７細胞／ｍｌの濃度で用い、ＲＥＩＣタンパク質を１〜２０μｇ／ｍｌの濃度で添加して培養すればよい。
樹状細胞は、生体内において、癌免疫、炎症などの機構に極めて重要な役割を果たしている。本発明の方法によりＲＥＩＣタンパク質により分化誘導された樹状細胞様細胞は、ＩＬ−４＋ＧＭ−ＣＳＦで誘導される樹状細胞に形態学的に似ているが、厳密には異なる新規な樹状細胞様細胞である。ＲＥＩＣタンパク質により誘導される樹状細胞様細胞は、樹状の形態を有している。また、樹状細胞のマーカーである、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＬＡ−ＤＲが陽性である。この点、本発明の新規な樹状細胞様細胞は樹状細胞として分類することができる。しかしながら、樹状細胞のマーカーであるＣＤ１ａは陰性であり、一般的に樹状細胞では陰性化するとされるＣＤ１４は陽性である。
ＲＥＩＣタンパク質の刺激によりＣＤ１４陽性単球から誘導される場合は、「ＲＥＩＣタンパク質により活性化された、樹状細胞様に分化した細胞（ＲＥＩＣ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｗｉｔｈ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ）」と呼ぶ。
本発明は、ＲＥＩＣタンパク質によりＣＤ１４陽性単球から誘導された樹状細胞様細胞を包含する。
ＲＥＩＣタンパク質に誘導され得られた樹状細胞様細胞は、癌免疫療法に用いることができる。すなわち、被験体より単球を採取し、該単球をＲＥＩＣタンパク質と共に培養し、樹状細胞様細胞を誘導し、得られた樹状細胞様細胞を被験体に戻すことにより、樹状細胞様細胞自体を癌治療又は予防等に用いることができる。この際、ＲＥＩＣタンパク質により誘導された樹状細胞様細胞は、癌種非特異的に作用し、癌免疫治療効果を発揮し得るが、樹状細胞様細胞を誘導する際に癌種特異的な腫瘍抗原を添加してもよい。また、誘導した樹状細胞様細胞を特定の腫瘍抗原と共に培養してもよい。樹状細胞様細胞を癌種特異的な腫瘍抗原で刺激することにより、腫瘍特異的に癌細胞を攻撃することが可能になる。また、本発明のＲＥＩＣタンパク質により誘導された樹状細胞様細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を増殖させる能力を有し、被験体の抗癌免疫活性を増大させることができる。
樹状細胞様細胞は、皮内投与、皮下投与、静脈内投与又はリンパ節内投与により投与することができる。
また、ＲＥＩＣタンパク質は、細胞外から細胞に作用して細胞の分化を司るサイトカイン様作用を有すると考えられ、生体内において広く、免疫性、炎症性に関する機能を有すると考えられる。従って、ＲＥＩＣタンパク質又はそれをコードするＤＮＡを、被験体に投与し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの樹状細胞様細胞分化誘導剤、又は樹状細胞様細胞活性化剤として用いることができる。ＲＥＩＣタンパク質は被験体内で樹状細胞様細胞を誘導し、その結果、樹状細胞様細胞により被験体内で抗癌性をもつリンパ球が全身性に活性化され癌免疫作用を発揮する。従って、ＲＥＩＣタンパク質又はそれをコードするＤＮＡを癌免疫活性化剤として用いることができる。さらに、ＲＥＩＣタンパク質により誘導された樹状細胞様細胞は癌免疫作用を有しているので、ＲＥＩＣタンパク質又はそれをコードするＤＮＡを癌の治療又は予防のための医薬組成物（癌免疫治療剤）として用いることができる。この際、ＲＥＩＣタンパク質又はそれをコードするＤＮＡを単独で投与してもよく、この場合、癌種非特異的に効果を発揮する。あるいは、特定の腫瘍抗原と共に投与してもよい。この場合は、癌種特異的に効果を発揮し得る。
本発明の治療又は予防対象となる癌としては、脳・神経腫瘍、皮膚癌、胃癌、肺癌、肝癌、リンパ腫・白血病、結腸癌、膵癌、肛門・直腸癌、食道癌、子宮癌、乳癌、副腎癌、腎癌、腎盂尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、尿道癌、陰茎癌、精巣癌、骨・骨肉腫、平滑筋腫、横紋筋腫、中皮腫等が挙げられる。特に、乳癌、膀胱癌が好ましい。
本発明の単球からの樹状細胞様細胞分化誘導剤、癌免疫活性化剤及び癌免疫活性化作用を有する、癌の治療又は予防のための医薬組成物は、ＲＥＩＣ  ＤＮＡ、該ＤＮＡを含むベクター、若しくは該ＤＮＡがコードするタンパク質並びに薬理学的に許容され得る担体、希釈剤若しくは賦形剤を含む。
本発明の単球からの樹状細胞様細胞分化誘導剤、癌免疫活性化剤及び癌免疫活性化作用を有する、癌の治療又は予防のための医薬組成物は、種々の形態で投与することができ、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与、あるいは注射剤、点滴剤、座薬、スプレー剤、点眼剤、経鼻投与剤、貼付剤などによる非経口投与を挙げることができる。
本発明の単球からの樹状細胞様細胞分化誘導剤、癌免疫活性化剤及び癌免疫活性化作用を有する、癌の治療又は予防のための医薬組成物は、局所投与することも可能であり、例えば癌部位に注射により投与することによりその効果を発揮し得る。
好ましくは、癌病変局所に１回又は複数回、癌病変全体に本剤が行き渡るように直接注入を行う。
本発明の単球からの樹状細胞様細胞分化誘導剤、癌免疫活性化剤及び癌免疫活性化作用を有する、癌の治療又は予防のための医薬組成物は、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含む。たとえば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用してもよい。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。
その投与量は、症状、年齢、体重などによって異なるが、数日又は数週間又は数ヶ月おきに１回あたり、０．００１ｍｇ〜１００ｍｇを皮下注射、筋肉注射、又は静脈注射によって投与すればよい。
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
組換えヒトＲＥＩＣタンパク質の調製
組換えヒトＲＥＩＣタンパク質は以下の方法で調製した。
１．  全長ヒトＲＥＩＣの遺伝子をコードするプラスミドをエレクトロポレーションによりＣＨＯ細胞に導入し、ヒトＲＥＩＣ安定発現クローンを確立した。トータル１０７細胞を２ｍＭ  Ｌ−グルタミン及び８μＭピューロマイシン含有無タンパク質培地（Ｃ５４６７、Ｓｉｇｍａ）を用いて５％ＣＯ２、３７℃で１週間穏やかにシェーキングして培養した。５分間、２，０００ｒｐｍの遠心分離でＣＨＯ細胞培養を回収し、上清を集めた（１Ｌ）。
２．  ４０分間、４℃、１５０００ｒｐｍで上清を遠心分離した。
３．  ０．２２μｍのフィルタ（ＴＰ９９５０５、ＴＰＰ、Ｔｒａｓａｄｉｎｇｅｎ、スイス）を用いて上清をろ過した。
４．  上清（１Ｌ）へＴＡＬＯＮ  Ｒｅｓｉｎ（＃６３５５０１  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ベッドボリュームに対して３ｍｌのＲｅｓｉｎ）を添加した。
５．  ４℃でオーバーナイトで穏やかに回転させた。
６．  ４℃、７００ｇ、５分間遠心分離を行い、Ｒｅｓｉｎを集めた。
７．  上清を除去した。
８．  ４０ｍｌの洗浄バッファ（５０ｍｌのリン酸ナトリウム、６００ｍＭ  ＮａＣｌ）でＴＡＬＯＮ  Ｒｅｓｉｎを洗浄した。
９．  ４℃、７００ｇ、５分間遠心分離を行った。
１０．  上清を除去した。
１１．  上記８〜１０のステップを３回繰り返した。
１２．  ＴＡＬＯＮ  Ｒｅｓｉｎと１５ｍｌの洗浄バッファを添加し、再懸濁した。
１３．  ３ｍｌのＴＡＬＯＮ  Ｒｅｓｉｎを重力流カラムに移した。
１４．  カラムに１５ｍｌの溶出バッファを添加し、ＨＩＳタグ付きタンパク質を溶出し、ヒトＲＥＩＣタンパク質を回収した。
１５．  ＦＰＬＣ（Ｆａｓｔ  Ｐｒｔｅｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）に供するために、溶出液を２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１Ｍ  ＮａＣｌを用いて透析した。
１６．  ＦＰＬＣ（ＭｏｎｏＱ５／５０ＧＬカラム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、以下の条件でヒトＲＥＩＣタンパク質を精製した。
バッファ
ＭｏｎｏＱバッファＡ：２０ｍｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１Ｍ  ＮａＣｌ
ＭｏｎｏＱバッファＢ：２０ｍｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．５Ｍ  ＮａＣｌ
流速：１ｍｌ／分
流量：７０ｍｌ
フラクションサイズ：１ｍｌ
１７．  フラクションを抗ヒトＲＥＩＣ抗体を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットで分析した。最終調製物はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度９５％を超えていることを確認した（図１）。
１８．  適切なフラクションを回収した。
１９．  ＰＢＳを用いて透析し、ストック又は使用した。
２０．  Ｃｅｎｔｒｉｐｌｕｓ  ＹＭ−５０（＃４４２３、ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮した。
２１．  ブラッドフォード法により、タンパク質濃度を検定した。
２２．  タンパク質のストック溶液は使用するまで−８０℃に保存した。
ヒト単球の調製
ヒトＰＢＭＣ（末梢血単球）は健康なドナーの血液からＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ遠心分離を用いた標準的方法で行った。細胞の回収率をトリパンブルー排除法で計測し、９９％以上の生存率であることを確認した。単球の調製のために、ＰＢＭＣをＬＧＭ−３培地（リンパ球増殖培地−３、血清非含有、Ｌｏｎｚａ）に再懸濁し、プラスチックに付着した細胞（２時間、３７℃、１０ｃｍディッシュでインキュベート）を単球として使用した。いくつかの実験では、ＣＤ１４＋単球をＣＤ１４＋磁気活性化セルソーティングマイクロビーズ（ＭＡＣＳ；ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ）を用いて分離した。精製したＣＤ１４＋単球をＬＧＭ−３培地に再懸濁した。フローサイトメトリーによると、純度は常に、９５％より高かった。
ヒト単球の処理
ＰＢＭＣは単独、又は組換えヒトＲＥＩＣタンパク質（１０μｇ／ｍｌ）若しくはＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）＋ＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（それぞれ、２ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養した。細胞は位相差顕微鏡で観察した。
図２に単独、組換えヒトＲＥＩＣタンパク質又はＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４存在下で培養したＰＢＭＣの０、２及び７日目の位相差顕微鏡像を示す。単独の０日目、ＲＥＩＣタンパク質存在下での培養の７日目、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４存在下での培養の７日目の像の四角い点線部の拡大像を右のパネルに示す。図に示すように、ＰＢＭＣをＲＥＩＣタンパク質の存在下で培養することにより、樹状細胞様細胞の分化が認められた。
それぞれの培養の７日目において、樹状細胞様細胞の全細胞に占める割合を測定した。ヒトＲＥＩＣタンパク質添加により分化誘導される樹状細胞様細胞の全細胞に占める割合は、以下のように測定した。すなわち、３回の独立した実験において、それぞれの群（（−）群、ヒトＲＥＩＣタンパク質、ＩＬ−４＋ＧＭ−ＣＳＦ群）の樹状細胞様細胞（形態学的に大きく、かつ樹状突起が確認できる細胞）を、それぞれの添加後７日目に、顕微鏡下のランダムな計５視野においてそれぞれ１００個づつの細胞を目視し、計測した。結果を図３に示す。ＰＢＭＣ単独で培養した場合の樹状細胞様細胞の割合は数％であったが、ＲＥＩＣタンパク質存在下で培養した場合は約４０％、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４存在下で培養した場合は約６０％であった。また、ＲＥＩＣタンパク質により誘導される樹状細胞様細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４により誘導される樹状細胞と形態学的に類似していた。
ＣＤ１４＋細胞及びＣＤ１４陰性細胞は単独、又は組換えヒトＲＥＩＣタンパク質（１μｇ／ｍｌ又は１０μｇ／ｍｌ）若しくはＧＮ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４（それぞれ、２ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養した。細胞は位相差顕微鏡で観察した。末梢血単核球は、単球とリンパ球から構成されており、これらのどちらの細胞から樹状細胞様細胞が分化誘導されたのかを明らかにするため、市販の抗ＣＤ１４抗体の付着したビーズを用いて、ＣＤ１４陽性の単球とＣＤ１４陰性のリンパ球について、それぞれヒトＲＥＩＣタンパク質添加による樹状細胞様分化誘導を試みた。図４にＣＤ１４＋細胞からの樹状細胞様分化誘導の結果を示す。図４に示すように、ＣＤ１４陽性の単球においてのみ樹状細胞様の分化誘導が観察され、図に示されるように、分化誘導された細胞の頻度は、添加したＲＥＩＣタンパク質の濃度に依存して増加した。以上のことより、ヒトＲＥＩＣタンパク質について、末梢血単球（ＣＤ１４陽性）を樹状細胞様に分化誘導する作用が明らかとなった。また、この作用には、用量依存性が認められた。
ウエスタンブロット分析
ヒトＲＥＩＣタンパク質（１０μｇ／ｍｌ）又はＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−４（それぞれ２ｎｇ／ｍｌ）で処理した後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２度洗浄し、溶解バッファ（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，２５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１％ＮＰ−４０，１ｍＭ  ＤＴＴ，１ｍＭ  ＰＭＳＦ，５μｇ／ｍｌ  ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，２ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４，１ｍＭ  ＮａＦ及び１０ｍＭ  β−ＧＰ）で溶解し、タンパク質を抽出した。遠心の後に、上清中のタンパク質を各実験で等しくなるように調整し、等量の２×ＳＤＳサンプルバッファで希釈し、５分間、９５℃で加熱処理した。サンプル（１０μｇタンパク質）を７．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに供し、ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｉｎｅ  ｆｌｕｏｒｏｄｉｄｅ（ＰＶＤＦ）膜にエレクトロブロットした。ブロットは１０％脱脂乳粉、６％  Ｇｌｙｃｉｎｅ及び０．１％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＴＢＳを用いて、室温で１時間行った。タンパク質は１０００倍稀釈のウサギポリクローナル抗ヒトＲＥＩＣ抗体（Ａｂａｒｚｕａ  Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００５  Ｎｏｖ  １；６５（２１）：９６１７−２２）、抗リン酸化Ｓｔａｔ１（Ｔｒｙ７０１）抗体（＃９１７１、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、抗リン酸化Ｓｔａｔ３（Ｔｒｙ７０５）抗体（＃９１３１）及び抗リン酸化Ｓｔａｔ５（Ｔｒｙ６９４）抗体（＃９３５１）を用いて同定した。０．１％のＴｗｅｅｎ−２０添加ＴＢＳ（Ｔ−ＴＢＳ）で十分洗浄した後に、ブロットを西洋わさびペルオキシダーゼ結合２次抗体で処理し、Ｔ−ＴＢＳで充分洗浄した後、ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｅｈｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ法（ＥＣＬキット、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて発色させた。
図５に、ヒトＲＥＩＣタンパク質添加により末梢血単核球のＳＴＡＴが活性化された結果を示す。リン酸化ＳＴＡＴ−１（Ｔｙｒ）、リン酸化ＳＴＡＴ−３（Ｔｙｒ）、リン酸化ＳＴＡＴ−５（Ｔｙｒ）の発現の上昇は、これらのタンパク質の活性化を意味し、血球の分化の際に重要であるとされている。すなわち、このウエスタンブロット法の所見は、ＲＥＩＣタンパク質が細胞内ＳＴＡＴシグナルを介した血球分化能を有することを、強く示唆する。加えて、ＲＥＩＣタンパク質のＳＴＡＴ活性化（リン酸化）におよぼす作用パターンは、樹状細胞−ポジティブコントロールのＩＬ−４＋ＧＭ−ＣＳＦ添加によるものと異なっていた。このことは、フローサイトメトリーでの結果も併せて、ＲＥＩＣタンパク質添加により、ポジティブコントロールの樹状細胞とは異なる樹状細胞様細胞が誘導されていることを示唆する。
フローサイトメトリー分析
細胞培養を冷ＰＢＳの添加により、終了させ、その後１０分間氷冷しインキュベートした。次いで、パスツールピペットにより細胞を再懸濁し、回収した。付着した細胞は、トリプシン処理により回収し、浮遊細胞と混ぜた。おおよそ５×１０５細胞を１００μｌのＰＢＳで５倍稀釈したＰＥ結合抗体を用いて６０分間氷上でインキュベートした。用いたＰＥ結合抗体は、ＣＤ１１ｃ（１２−０１１６、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＣＤ１４（１２−０１４９）、ＣＤ１ａ（１２−００１９）、ＣＤ４０（１２−０４０９）、ＣＤ８０（１２−０８０９）、ＣＤ８３（１２−０８３９）、ＣＤ８６（１２−０８６９）、ＨＬＡ−ＤＲ（１２−９９５６）であった。アイソタイプが同じＰＥ結合免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）（１２−４７１４、１２−４７３２）を陰性コントロールとして用いた。インキュベーション後、細胞を１ｍｌのＰＢＳで一度洗浄し、５００μｌのＰＢＳに再懸濁した。その後、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて１０４個の細胞を採取し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて分析した。これらの細胞の特徴的なｆｏｒｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒパターンに基づいて適当なゲートを設定し、ゲート内の細胞のみを分析した。アイソタイプが同じコントロール抗体とともにインキュベートしたコントロール細胞よりも高い平均蛍光インデックス（ＭＦＩ）を示した細胞を陽性とみなした。死細胞はヨウ化プロピジウム（ＰＩ）による染色及び／又はｓｃａｔｔｅｒ特性により除去した。ＰＩ染色により、９９％より多い細胞が生存していることがわかった。
ＦＩＴＣ標識粒子のエンドサイトーシス
細胞を回収後、細胞を５×１０６細胞／ｍｌの濃度で冷ＰＢＳに再懸濁した。５０μｇのＦＩＴＣ結合デキストラン（ＤＸ  ＦＩＴＣ；ＦＤ４０、Ｓｉｇｍａ）をサスペンション０．５ｍｌに添加し、次いで細胞を１時間４℃又は３７℃でインキュベートした。１ｍｌの冷ＰＢＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで取得した１０４細胞をＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いた分析した。
図６Ａ及びＢに、ヒトＲＥＩＣタンパク質添加により分化誘導された樹状細胞様細胞をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す。
図６Ａの、囲った部分の細胞を用いて、フローサイトメトリーを行った。その囲いの根拠は、検体中の細胞の残骸を外し、かつ、ポジティブコントロールであるＩＬ−４＋ＧＭ−ＣＳＦ添加群において樹状細胞がきれいにモニターできるということの、２点である。
図６Ａの右の図において、ＣＤ１１ｃは、骨髄系白血球のマーカー（リンパ球ではない）である。また、ＣＤ１４は、単球やマクロファージのマーカーである。さらに、ＤＸ  ＦＩＴＣは、ＦＩＴＣのタグのついたデキストランを意味する。この物質は、白血球系細胞の貪食能（エンドサイトーシス）の評価によく用いられる。
従って、ＲＥＩＣタンパク質添加により分化誘導された細胞は骨髄系白血球由来で、ＩＬ−４＋ＧＭ−ＣＳＦ添加により誘導された樹状細胞に比べ単球系細胞に近く、また、樹状細胞とほぼ同等の異物・抗原貪食能を持つ樹状細胞様細胞である。
また、図６Ｂにおいて、ＣＤ１ａは、樹状細胞のマーカーの一つで、非ペプチド性の抗原（脂質抗原など）の提示に関与するとされる。また、ＣＤ４０は、樹状細胞のマーカーの一つで、ＣＤ４０  ｌｉｇａｎｄ（樹状細胞誘導能を単剤でも持つ）のレセプターである。ＣＤ８０は、樹状細胞のマーカーの一つで、ＣＤ８６と共に、Ｔリンパ球に対する抗原提示に関与するとされる。ＣＤ８３は、樹状細胞のマーカーの一つで、成熟樹状細胞のマーカーとして使われる。ＣＤ８６は、樹状細胞のマーカーの一つで、未熟樹状細胞のマーカーとして使われる。ＨＬＡ−ＤＲは、樹状細胞のマーカーの一つで、樹状細胞の分化に従って強発現する。
従って、ＲＥＩＣタンパク質添加により分化誘導された細胞は、ＩＬ−４＋ＧＭ−ＣＳＦ添加により誘導された樹状細胞に類似した（同じではない）マーカー発現パターンを示す。
他のｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験の結果も合わせて結論すると、ＲＥＩＣタンパク質添加により、末梢血ＣＤ１４陽性単球から、樹状細胞様の細胞が分化誘導される。この細胞は、形態学的に末梢血単球と異なり、また、ＩＬ−４＋ＧＭ−ＣＳＦ添加により誘導される樹状細胞とも異なる。
図６に示す結果は、ヒトＲＥＩＣタンパク質およびＲＥＩＣタンパク質により誘導された樹状様細胞が、（ＩＬ−４＋ＧＭ−ＣＳＦによる治療やＩＬ−４＋ＧＭ−ＣＳＦＤＣと同様に、）生体内における抗原貪食・抗原提示能をより高めることにより、抗癌免疫を活性化させることを示す。
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験によるＲＥＩＣタンパク質の腫瘍抑制効果の検定
ＲＭ９細胞（１×１０６個）をマウス（Ｃ５７ＢＬ６、オス）の皮下に注入した。注入後７、９、１１、１３、１５、１７及び１９日目（注入後７日目をＲＥＩＣタンパク質の投与開始とする）にＲＥＩＣタンパク質（１００μｇ（３００μｌ））又はコントロールとしてＰＢＳ（３００μｌ）を、形成された腫瘍全体に注入した。２１日目にマウスを犠牲にし、皮下腫瘍における治療効果を判定し、抗癌免疫活性の測定を行った。ｉｎ  ｖｉｖｏ実験のプロトコールを図７に示す。腫瘍のサイズは処理の後数日後に測定した。腫瘍ボリュームは、１／２×（最小直径）２×（最大直径）により求めた。
図８Ａに治療後の腫瘍体積の経時的変化を示す。また、図８Ｂにマウスから採取した腫瘍の重量を示す。さらに、図８Ｃにマウスから採取した腫瘍の写真を示す。図８Ａ〜８Ｃに示すようにヒトＲＥＩＣタンパク質の投与により腫瘍増殖を抑制することができた。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞溶解アッセイによるＲＥＩＣタンパク質の抗癌免疫活性上昇効果の検定
図７に示す方法により処理したマウス又はコントロールマウス（ＲＥＩＣタンパク質の投与開始後１４日目）から脾細胞を採取し、該脾細胞をエフェクターとしてＲＭ９細胞（ターゲット）と共に９６ウェル丸底プレートで培養した。エフェクター／ターゲット比（Ｅ／Ｔ比）は１００：１、５０：１、２５：１又は１２．５：１であった。５×１０３のターゲット細胞を１つのウェルに添加した。上清を回収し、溶解したＲＭ９細胞から放出された乳酸脱水素酵素を、非放射性細胞毒性アッセイ（ＣｙｔｏＴｏｘ９６、Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。溶解細胞の比率は、以下の式により計算した。
（実験における放出−エフェクターの自発的放出）／（ターゲットの最大放出−ターゲットの自発的な放出）×１００（％）
図９にマウス脾細胞のＲＭ９細胞に対する抗癌細胞免疫活性の解析の結果を示す。図９に示すように、ＲＥＩＣタンパク質を投与した場合、エフェクター比依存的に溶解細胞の割合が上昇しており、ＲＥＩＣタンパク質に抗癌細胞免疫活性を上昇させる効果があることが判明した。
本実施例において、データは平均±ＳＥＭで示した。Ｕｎｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔ−テストを２群の間の統計分析のために用いた。ｐ値が＜０．０５である場合に有意差があるとした。
ヒトＲＥＩＣタンパク質添加による末梢血単核球からの樹状細胞様分化誘導
ＲＥＩＣタンパク質の添加群、ＩＬ−４単独の添加群、ＧＭ−ＣＳＦ単独の添加群、ＩＬ−４＋ＧＭ−ＣＳＦの添加群との間で、分化誘導される樹状細胞様細胞の全細胞に占める割合について比較を行った。図１０は縦軸にＰｅｒｃｅｎｔａｇｅ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ−ｌｉｋｅ  ｆｅａｔｕｒｅ（形態学的に大きく、かつ突起が確認できる樹状細胞様細胞の全細胞に占める割合）を示しており、それぞれの添加後７日目に、顕微鏡下に目視にて、ランダムに計測した。
図１０に示すように、ヒトＲＥＩＣタンパク質を添加した群では、ＩＬ−４単独の添加群およびＧＭ−ＣＳＦ単独の添加群に比べて、樹状細胞様細胞への分化誘導が統計学的に有意に多かった（＊にて示す）。
これらのことから、図１０に示すような濃度においてヒトＲＥＩＣタンパク質がヒトの末梢血単球から樹状細胞様の細胞を分化誘導する能力は、サイトカインとして知られるＩＬ−４やＧＭ−ＣＳＦそれぞれ単独の場合と比べて、有意に高い。すなわちヒトＲＥＩＣタンパク質は、ＩＬ−４やＧＭ−ＣＳＦといった各サイトインと比べて、樹状細胞様細胞の分化誘導という点においての優位性、より高い有用性を持つ。
ヒトＲＥＩＣタンパク質添加により誘導された樹状様細胞におけるＣＤ４＋Ｔ細胞（リンパ球）を用いたアロ（異系同種）反応誘導活性
ＲＥＩＣタンパク質により誘導された樹状様細胞の抗癌免疫機能を評価するために、ＣＤ４＋Ｔ細胞（リンパ球）を用いたアロ（同種異系）反応誘導活性の評価を行った。０日目に、ＣＤ１４＋単球を回収するためのＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、末梢血単核球からＣＤ１４＋単球を回収し、ヒトＲＥＩＣタンパク質及びＩＬ−４＋ＧＭ−ＣＳＦをそれぞれ添加した。７日目にそれぞれの細胞を回収し、ＲＥＩＣタンパク質により誘導された樹状様細胞及びＩＬ−４＋ＧＭ−ＣＳＦにより誘導された樹状細胞（ポジティブコントロール用）とした。また、７日目に、ＣＤ４＋Ｔ細胞を回収するためのＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、樹状細胞のドナーとＨＬＡ−ＤＲが共通していないドナーの末梢血単核球よりＣＤ４＋Ｔ細胞を選択・回収した。このＣＤ４＋Ｔ細胞において、蛍光を発する化学物質ＣＦＳＥを濃度０．０５μＭで添加して５分間室温で培養することにより細胞ラベリングを行い、アロのｎａｉｖｅＣＤ４＋Ｔ細胞として用いた。同じく、７日目に、９６穴丸底プレートの１ウェルにつき、ＲＥＩＣタンパク質により誘導された樹状様細胞（６．２５×１０３個）、またはポジティブコントロールとしてのＩＬ−４＋ＧＭ−ＣＳＦにより誘導された樹状細胞（６．２５×１０３個）を、ＣＤ４＋Ｔ細胞（１×１０５個）と共培養した。ネガティブコントロールとして、ＣＦＳＥラベリングしたＣＤ４＋Ｔ細胞のみの培養も行った。培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２、９５％大気下にてインキュベーター内で４日間共培養した。１１日目に、蛍光顕微鏡下のランダムな視野において、ＣＦＳＥが陽性のリンパ球の数を計測した。結果を図１１に示す。
図１１は、ＲＥＩＣタンパク質により誘導された樹状様細胞（ＲＥＩＣ／Ｄｋｋ−３Ｍｏ）が、共培養により、コントロール群と比べて統計学的に有意に多くの（＊にて示す）ＣＤ４＋Ｔ細胞を増殖させる能力があることを示している。また、その能力は、ポジティブコントロールであるＩＬ−４＋ＧＭ−ＣＳＦにより誘導された樹状細胞と統計学的に同等であることが示された。すなわち、本実施例により、ヒトＲＥＩＣタンパク質及びＲＥＩＣタンパク質により誘導された樹状様細胞が、ＩＬ−４＋ＧＭ−ＣＳＦによる治療やＩＬ−４＋ＧＭ−ＣＳＦＤＣと同様に、臨床の場で抗癌免疫を高め、癌を治療するという点において、非常に有用な手段になることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０００６】
ＲＥＩＣタンパク質は、ＩＬ−２や従来から数多く知られている免疫活性作用を持つサイトカイン群と比べて、
（１）単剤でも抗癌免疫活性化による抗腫瘍効果を有する、
（２）ＲＥＩＣ遺伝子発現が多くの癌種において欠如・低下しているというＲＥＩＣタンパク質そのものの特性により、ＲＥＩＣタンパク質製剤は、広い範囲の癌種に対して有効である、
（３）ＲＥＩＣタンパク質による抗癌免疫活性化により、投与した癌局所のみならず、癌転移巣の改善や予防といった作用が期待できる、並びに
（４）既存の様々な癌抗原タンパク質と本剤を同時に投与することにより、樹状（様）細胞などの分化誘導を介して抗癌免疫を系統的に活性化させ、発癌そのものを予防することが可能となる、
という効果を有する。
ＲＥＩＣタンパク質は、癌免疫療法剤として用いることができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
［配列表］
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【図３】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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