(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
主流路と、該主流路に開口する複数の微小憩室と、該微小憩室に連絡する房室と、該房室に設けられた脈動防止手段と、該房室に圧力を加える手段と、剪断手段とを含む構造体を複数含むことを特徴とする、両親媒性分子による二分子膜ベシクルの生成装置。
【請求項２】
前記脈動防止手段は、前記微小憩室と前記房室とを連絡する連通細路であることを特徴とする、請求項１に記載の二分子膜ベシクルの生成装置。
【請求項３】
前記微小憩室の壁面には相分離流体リザーバーが設けられ、該相分離流体リザーバーは相分離流体の層を懸架し、該相分離流体の層は、前記微小憩室の開口と前記房室との間で前記微小憩室を封止することを特徴とする、請求項１又は２に記載の二分子膜ベシクルの生成装置。
【請求項４】
前記相分離流体リザーバーは前記微小憩室の側壁面から該微小憩室内に伸びる張出部であることを特徴とする、請求項３に記載の二分子膜ベシクルの生成装置。
【請求項５】
前記房室には圧力発生部が設けられることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれかに記載の二分子膜ベシクルの生成装置。
【請求項６】
前記圧力発生部はレーザ光、電気分解若しくは電気ヒーターで発生させた微小気泡の膨張によって又はマイクロアクチュエータによって圧力を発生させることを特徴とする、請求項５に記載の二分子膜ベシクルの生成装置。
【請求項７】
前記房室は外部圧力源に接続されることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれかに記載の二分子膜ベシクルの生成装置。
【請求項８】
前記外部圧力源はシリンジポンプ又は高圧ガスボンベであることを特徴とする、請求項７に記載の二分子膜ベシクルの生成装置。
【請求項９】
前記主流路を通過する流体は１つの向きに流れ、前記剪断手段は前記微小憩室の開口の下流側に設けられることを特徴とする、請求項３ないし８のいずれかに記載の二分子膜ベシクルの生成装置。
【請求項１０】
前記主流路を通過する流体は順逆２つの向きに流れ、前記剪断手段は前記２つの向きの流れのそれぞれの下流側に設けられることを特徴とする、請求項１ないし８のいずれかに記載の二分子膜ベシクルの生成装置。
【請求項１１】
前記房室は水性溶液の外部供給源に接続され、該水性溶液は前記連通細路を介して前記微小憩室に供給されることを特徴とする、請求項２ないし１０のいずれかに記載の二分子膜ベシクルの生成装置。
【請求項１２】
前記構造体は副流路を含み、該副流路は相分離流体の外部供給源に接続され、該相分離流体は前記副流路を介して前記相分離流体リザーバーに供給されることを特徴とする、請求項３ないし１１のいずれかに記載の二分子膜ベシクルの生成装置。
【請求項１３】
前記微小憩室は２次元的又は３次元的に配置されることを特徴とする、請求項１ないし１２のいずれかに記載の二分子膜ベシクルの生成装置。
【請求項１４】
前記相分離流体の層は水性溶液との間で界面を形成することを特徴とする、請求項３ないし１３のいずれかに記載の二分子膜ベシクルの生成装置。
【請求項１５】
前記相分離流体は両親媒性分子を含む有機溶液であることを特徴とする、請求項３ないし１４のいずれかに記載の二分子膜ベシクルの生成装置。
【請求項１６】
前記相分離流体は、気体か、両親媒性分子を含まない有機溶液かであり、前記水性溶液は両親媒性分子を含むことを特徴とする、請求項１４に記載の二分子膜ベシクルの生成装置。
【請求項１７】
前記構造体はポリジメチルシロキサンでできており、前記有機溶液はポリジメチルシロキサンを膨潤変形させることを特徴とする、請求項１５又は１６に記載の二分子膜ベシクルの生成装置。
【請求項１８】
二分子膜ベシクルの生成方法であって、
主流路と、該主流路に開口する複数の微小憩室と、該微小憩室に連絡する房室と、該房室に設けられた脈動防止手段と、該房室に圧力を加える手段と、剪断手段とを含む構造体と、第１及び第２の水性溶液と、相分離流体とを用意するステップと、
前記構造体の主流路に第１の水性溶液を流して、第１の水性溶液を前記微小憩室に導入するステップと、
前記構造体の主流路に前記相分離流体を流して、該相分離流体を前記微小憩室の少なくとも一部に導入するステップと、
前記構造体の主流路に第２の水性溶液を流して、前記主流路内の前記相分離流体を除去し、前記相分離流体が相分離流体層を形成し、該相分離流体層は前記微小憩室の側壁面に懸架されるステップと、
前記相分離流体層が前記微小憩室の側壁面に懸架された状態で、前記房室に圧力を加える手段で前記房室に圧力を加えることにより、前記房室を経て前記微小憩室に第１の水性溶液が押し流されて、前記相分離流体層の先端が前記微小憩室の開口から前記主流路に入るように前記相分離流体層を伸張させるステップと、
前記主流路内の第２の水性溶液の液流が前記剪断手段で前記相分離流体層を剪断することによって、前記相分離流体層と、該相分離流体層に包囲された第１の水性溶液とが括れてベシクルとして切断されるステップとを含むことを特徴とする、二分子膜ベシクルの生成方法。
【請求項１９】
二分子膜ベシクルの生成方法であって、
主流路と、該主流路に開口する複数の微小憩室と、該微小憩室に連絡する房室と、該房室に設けられた脈動防止手段と、該房室に圧力を加える手段と、剪断手段とを含む構造体と、疎水性溶媒と、第１及び第２の水性溶液と、相分離流体とを用意するステップと、
前記構造体の主流路に前記疎水性溶媒を流して、該疎水性溶媒を前記微小憩室に導入するステップと、
前記構造体の主流路に第１の水性溶液を流して、第１の水性溶液を前記微小憩室に導入するステップと、
前記構造体の主流路に前記相分離流体を流して、該相分離流体を前記微小憩室の少なくとも一部に導入するステップと、
前記構造体の主流路に第２の水性溶液を流して、前記主流路内の前記相分離流体を除去し、前記相分離流体が相分離流体層を形成し、該相分離流体層は前記微小憩室の側壁面に懸架されるステップと、
前記相分離流体層が前記微小憩室の側壁面に懸架された状態で、前記房室の前記疎水性溶媒を加熱して微小気泡の発生、膨張により圧力を加えることにより、前記房室を経て前記微小憩室に第１の水性溶液が押し流されて、前記相分離流体層の先端が前記微小憩室の開口から前記主流路に入るように前記相分離流体層を伸張させるステップと、
前記主流路内の第２の水性溶液の液流が前記剪断手段で前記相分離流体層を剪断することによって、前記相分離流体層と、該相分離流体層に包囲された第１の水性溶液とが括れてベシクルとして切断されるステップとを含むことを特徴とする、二分子膜ベシクルの生成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、二分子膜ベシクルの生成装置及び生成方法に関し、より具体的には、１μｍないし１００μｍの平均サイズで変動係数が５％未満の二分子膜ベシクルのマイクロ流路を用いた生成装置及び生成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
所望の高分子化合物を含む所望の体積が完全に封入された、単一層の両親媒性分子膜からなるベシクルは、顕微鏡スケールの化学リアクタとして、医薬品の送達ビークルとして、あるいは、さまざまな環境刺激に応答するバイオセンサーとしての用途が期待される。特に１μｍないし１００μｍの範囲でサイズが均一な単一層のリン脂質ベシクルは、実際の生体細胞とほぼ同じ寸法を有し、生体膜の複雑な機能のモデル系として需要が大きい。そして生体細胞を構成している要素の機能を一つ一つ組み合わせて人工細胞を作成することによって、さらに高度な生命現象及びその分子機序を理解し応用することが可能になる。【０００３】
しかし、基質上で乾燥させた脂質フィルムに水性溶液を添加するやり方では、凍結溶融、超音波処理その他の処理を行わないと均一な単一層ベシクルを生成することはできない。そして前記処理は封入される液体の特性に応じて選択しなければならず、封入の効率が低いため、普遍的な生成方法ではない。また、逆エマルジョン法はこれらの課題を克服しているが、ベシクルのサイズを直接制御することができず、大量生産は困難である。例えば、非特許文献１に報告される方法では、平均サイズが４．１２μｍないし６２．４μｍのベシクルが生成されたが、そのサイズの変動はベシクルのサイズの約１０％ないし約２０％であった。非特許文献２に報告される方法では、平均サイズが４．０μｍのベシクルが生成されたが、そのサイズの変動は５０％もあった。
【非特許文献１】Tan, Y.C.ら、J. Am. Chem. Soc., 128: 5656-5658 (2006).
【非特許文献２】Dittrich, P.S.ら、Lab Chip, 6: 488-493 (2006)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、１μｍないし１００μｍの範囲のサイズで均一な単一層の二分子膜ベシクルを大量に生成する方法であって、封入効率の高い方法を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は二分子膜ベシクルの生成装置を提供する。本発明の二分子膜ベシクルの生成装置は、主流路と、該主流路に開口する複数の微小憩室と、該微小憩室に連絡する房室と、該房室に設けられた脈動防止手段とを含む構造体を複数含む。【０００６】
本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記脈動防止手段は、前記微小憩室と前記房室とを連絡する連通細路の場合がある。【０００７】
本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記構造体は剪断手段を含む場合がある。【０００８】
本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記微小憩室の壁面には相分離流体リザーバーが設けられ、該相分離流体リザーバーは相分離流体の層を懸架し、該相分離流体の層は、前記微小憩室の開口と前記房室との間で前記微小憩室を封止する場合がある。【０００９】
本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記微小憩室の壁面には複数の相分離流体リザーバーが設けられ、該複数の相分離流体リザーバーは複数の相分離流体の層を懸架し、該複数の相分離流体の層は、前記微小憩室の開口と前記房室との間で前記微小憩室を封止する場合がある。【００１０】
本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記相分離流体リザーバーは前記微小憩室の側壁面から該微小憩室内に伸びる張出部の場合がある。【００１１】
本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記房室には圧力発生部が設けられる場合がある。【００１２】
本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記圧力発生部はレーザ光で発生させた微小気泡の膨張によって圧力を発生させる場合がある。【００１３】
本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記圧力発生部は電気分解で発生させた微小気泡の膨張によって圧力を発生させる場合がある。【００１４】
本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記圧力発生部は電気ヒーターで発生させた微小気泡の膨張によって圧力を発生させる場合がある。【００１５】
本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記圧力発生部はマイクロアクチュエータによって圧力を発生させる場合がある。【００１６】
本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記房室は外部圧力源に接続される場合がある。【００１７】
本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記外部圧力源はシリンジポンプの場合がある。【００１８】
本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記外部圧力源は高圧ガスボンベの場合がある。【００１９】
本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記主流路を通過する相分離流体は１つの向きに流れ、前記剪断手段は前記微小憩室の開口の下流側に設けられる場合がある。【００２０】
本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記主流路を通過する液体は順逆２つの向きに流れ、前記剪断手段は前記２つの向きの流れのそれぞれの下流側に設けられる場合がある。【００２１】
本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記房室は水性溶液の外部供給源に接続され、該水性溶液は前記連通細路を介して前記微小憩室に供給される場合がある。【００２２】
本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記構造体は１個又は２個以上の水性溶液の流路を含み、該水性溶液の流路は、前記複数の相分離流体リザーバーのうち少なくとも２個の間に設けられた前記微小憩室の壁面の開口と、前記複数の水性溶液のそれぞれの外部供給源とを連絡する場合がある。【００２３】
本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記構造体は副流路を含み、該副流路は相分離流体の外部供給源に接続され、該相分離流体は前記副流路を介して前記相分離流体リザーバーに供給される場合がある。【００２４】
本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記微小憩室は２次元的に配置される場合がある。【００２５】
本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記微小憩室は３次元的に配置される場合がある。【００２６】
本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記相分離流体の層は水性溶液との間で界面を形成する場合がある。【００２７】
本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記相分離流体は両親媒性分子を含む有機溶液の場合がある。【００２８】
本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記相分離流体は気体か、両親媒性分子を含まない有機溶液かであり、前記水性溶液は両親媒性分子を含む場合がある。【００２９】
本発明の二分子膜ベシクルの生成装置において、前記構造体はポリジメチルシロキサンでできており、前記有機溶液はポリジメチルシロキサンを膨潤変形させる場合がある。【００３０】
本発明は二分子膜ベシクルの生成方法を提供する。本発明の二分子膜ベシクルの生成方法は、主流路と、該主流路に開口する複数の微小憩室と、該微小憩室に連絡する房室と、該房室に設けられた脈動防止手段とを含む構造体と、第１及び第２の水性溶液と、相分離流体とを用意するステップと、前記構造体の主流路に第１の水性溶液を流して、第１の水性溶液を前記微小憩室に導入するステップと、前記構造体の主流路に前記相分離流体を流して、該相分離流体を前記微小憩室の少なくとも一部に導入するステップと、前記構造体の主流路に第２の水性溶液を流して、前記主流路内の前記相分離流体を除去し、前記相分離流体が相分離流体層を形成し、該相分離流体層は前記微小憩室の側壁面に懸架されるステップと、前記相分離流体層が前記微小憩室の側壁面に懸架された状態で、前記房室に圧力を加えることにより、前記房室を経て前記微小憩室に第１の水性溶液が押し流されて、前記相分離流体層の先端が前記微小憩室の開口から前記主流路に入るように前記相分離流体層を伸張させるステップと、前記主流路内の第２の水性溶液の液流が前記相分離流体層を剪断することによって、前記相分離流体層と、該相分離流体層に包囲された第１の水性溶液とが括れてベシクルとして切断されるステップとを含む。【００３１】
本発明は二分子膜ベシクルの生成方法を提供する。本発明の二分子膜ベシクルの生成方法は、主流路と、該主流路に開口する複数の微小憩室と、該微小憩室に連絡する房室と、該房室に設けられた脈動防止手段とを含む構造体と、疎水性溶媒と、第１及び第２の水性溶液と、相分離流体とを用意するステップと、前記構造体の主流路に前記疎水性溶媒を流して、該疎水性溶媒を前記微小憩室に導入するステップと、前記構造体の主流路に第１の水性溶液を流して、第１の水性溶液を前記微小憩室に導入するステップと、前記構造体の主流路に前記相分離流体を流して、該相分離流体を前記微小憩室の少なくとも一部に導入するステップと、前記構造体の主流路に第２の水性溶液を流して、前記主流路内の前記相分離流体を除去し、前記相分離流体が相分離流体層を形成し、該相分離流体層は前記微小憩室の側壁面に懸架されるステップと、前記相分離流体層が前記微小憩室の側壁面に懸架された状態で、前記房室の前記疎水性溶媒を加熱して微小気泡の発生、膨張により圧力を加えることにより、前記房室を経て前記微小憩室に第１の水性溶液が押し流されて、前記相分離流体層の先端が前記微小憩室の開口から前記主流路に入るように前記相分離流体層を伸張させるステップと、前記主流路内の第２の水性溶液の液流が前記相分離流体層を剪断することによって、前記相分離流体層と、該相分離流体層に包囲された第１の水性溶液とが括れてベシクルとして切断されるステップとを含む。【００３２】
本発明の二分子膜ベシクルの生成方法において、前記相分離流体は両親媒性分子を含む有機溶液の場合がある。【００３３】
本発明の二分子膜ベシクルの生成方法において、第１及び第２の水性溶液は両親媒性分子を含み、前記相分離流体は気体か、両親媒性分子を含まない有機溶液かの場合がある。【００３４】
本発明の二分子膜ベシクルの生成方法において、第１の水性溶液が含む両親媒性分子は第２の水性溶液が含む両親媒性分子と異なる組成の場合がある。【００３５】
本発明の二分子膜ベシクルの生成方法において、前記脈動防止手段は、前記微小憩室と前記房室とを連絡する連通細路の場合がある。【００３６】
本発明の二分子膜ベシクルの生成方法において、前記構造体は剪断手段を含み、該剪断手段は前記主流路内の第２の水性溶液の液流とともに前記相分離流体層を剪断する場合がある。【００３７】
本発明の二分子膜ベシクルの生成方法において、前記微小憩室の壁面には相分離流体リザーバーが設けられ、前記相分離流体リザーバーは相分離流体の層を懸架し、該相分離流体の層は、前記微小憩室の開口と前記連通細路との間で前記微小憩室を封止する場合がある。【００３８】
本発明の二分子膜ベシクルの生成方法において、前記相分離流体リザーバーは前記微小憩室の側壁面から該微小憩室内に伸びる張出部の場合がある。【００３９】
本発明の二分子膜ベシクルの生成方法において、前記房室に圧力を加えることは、レーザ光で発生させた微小気泡の膨張によって実行される場合がある。【００４０】
本発明の二分子膜ベシクルの生成方法において、前記房室に圧力を加えることは、電気分解で発生させた微小気泡の膨張によって実行される場合がある。【００４１】
本発明の二分子膜ベシクルの生成方法において、前記房室に圧力を加えることは、電気ヒーターで発生させた微小気泡の膨張によって実行される場合がある。【００４２】
本発明の二分子膜ベシクルの生成方法において、前記房室に圧力を加えることは、マイクロアクチュエータによって実行される場合がある。【００４３】
本発明の二分子膜ベシクルの生成方法において、前記房室に圧力を加えることは、外部圧力源に接続されることによって実行される場合がある。【００４４】
本発明の二分子膜ベシクルの生成方法において、前記外部圧力源はシリンジポンプの場合がある。【００４５】
本発明の二分子膜ベシクルの生成方法において、前記外部圧力源は高圧ガスボンベの場合がある。【００４６】
本発明の二分子膜ベシクルの生成方法において、前記主流路を通過する液体は１つの向きに流れ、前記剪断手段は前記微小憩室の開口の下流側に設けられる場合がある。【００４７】
本発明の二分子膜ベシクルの生成方法において、前記主流路を通過する液体は順逆２つの向きに流れ、前記剪断手段は前記２つの向きの流れのそれぞれの下流側に設けられる場合がある。【００４８】
本発明の二分子膜ベシクルの生成方法において、前記房室は水性溶液の外部供給源に接続され、該水性溶液は前記連通細路を介して前記微小憩室に供給される場合がある。【００４９】
本発明の二分子膜ベシクルの生成方法において、前記構造体は副流路を含み、該副流路は相分離流体の外部供給源に接続され、該相分離流体は前記副流路を介して前記相分離流体リザーバーに供給される場合がある。【００５０】
本発明はＮ層（Ｎは２又は３以上の整数）の二分子膜ベシクルの生成方法を提供する。本発明のＮ層の二分子膜ベシクルの生成方法において、主流路と、該主流路に開口する複数の微小憩室と、該微小憩室に連絡する房室と、該房室に設けられた脈動防止手段と含む構造体と、第１ないし第Ｎ＋１番目の水性溶液と、第１ないし第Ｎ番目の相分離流体とを用意するステップと、前記構造体の主流路に第１の水性溶液を流して、第１の水性溶液を前記微小憩室に導入するステップと、前記構造体の主流路に第１の相分離流体を流して、第１の相分離流体を前記微小憩室の少なくとも一部に導入するステップと、前記構造体の主流路に第２の水性溶液を流して、前記主流路内の第１の相分離流体を除去し、第１の相分離流体が第１及び第２の水性溶液で挟まれた第１の相分離流体層を形成し、第１の相分離流体層は前記微小憩室の側壁面に懸架されるステップと、前記構造体の主流路に第ｍ番目（ｍは２からＮ−１までの整数）の相分離流体を流して、第ｍ番目の相分離流体を前記微小憩室の少なくとも一部に導入するステップと、前記構造体の主流路に第ｍ＋１番目の水性溶液を流して、前記主流路内の第ｍ番目の相分離流体を除去し、第ｍ番目の相分離流体が第ｍ番目及び第ｍ＋１番目の水性溶液で挟まれた第ｍ番目の相分離流体層を形成し、第ｍ番目の相分離流体層は前記微小憩室の側壁面に懸架されるステップと、前記構造体の主流路に第Ｎ番目の相分離流体を流して、第Ｎ番目の相分離流体を前記微小憩室の少なくとも一部に導入するステップと、前記構造体の主流路に第Ｎ＋１番目の水性溶液を流して、前記主流路内の第Ｎ番目の相分離流体を除去し、前記相分離流体が第Ｎ番目及び第Ｎ＋１番目の水性溶液で挟まれた第Ｎ番目の相分離流体層を形成し、第Ｎ番目の相分離流体層は前記微小憩室の側壁面に懸架されるステップと、前記Ｎ個の相分離流体層が前記微小憩室の側壁面に懸架された状態で、前記房室に圧力を加えることにより、前記房室を経て前記微小憩室に第１の水性溶液が押し流されて、前記Ｎ個の相分離流体層の先端が前記微小憩室の開口から前記主流路に入るように前記Ｎ個の相分離流体層を伸張させるステップと、前記主流路内の第Ｎ＋１番目の水性溶液の液流が前記Ｎ個の相分離流体層を剪断することによって、前記Ｎ個の相分離流体層と、該Ｎ個の相分離流体層に包囲された第１ないし第Ｎ番目の水性溶液とが括れてベシクルとして切断されるステップとを含む。ここで、前記構造体の主流路に第ｍ番目（ｍは２からＮ−１までの整数）の相分離流体を流して、第ｍ番目の相分離流体を前記微小憩室の少なくとも一部に導入するステップと、前記構造体の主流路に第ｍ＋１番目の水性溶液を流して、前記主流路内の第ｍ番目の相分離流体を除去し、第ｍ番目の相分離流体が第ｍ番目及び第ｍ＋１番目の水性溶液で挟まれた第ｍ番目の相分離流体層を形成し、第ｍ番目の相分離流体層は前記微小憩室の側壁面に懸架されるステップとは、ｍの値を２、３、４、・・・、Ｎ−１としてＮ−２回繰り返して実施される。【００５１】
本発明は、平均サイズが１μｍないし１００μｍの範囲で、変動係数が５％未満であり、膜及びベシクル内液の組成が同一である、単一層の二分子膜ベシクルを提供する。【００５２】
本発明は、本発明の二分子膜ベシクルの生成装置によって生成される、二分子膜ベシクルを提供する。【００５３】
本発明は、本発明の二分子膜ベシクルの生成方法によって生成される単一層の二分子膜ベシクルを提供する。【００５４】
本発明は、本発明のＮ層の二分子膜ベシクルの生成方法によって生成されるＮ層の二分子膜ベシクルを提供する。【００５５】
本発明の二分子膜ベシクルは、同一の膜タンパク質が埋め込まれている場合がある。【００５６】
本発明は、本発明の二分子膜ベシクルを含む医薬品組成物を提供する。【００５７】
本発明は、本発明の二分子膜ベシクルを含む化粧料組成物を提供する。【００５８】
本発明は、本発明の二分子膜ベシクルを含む食品組成物を提供する。【００５９】
本発明において、ベシクルとは、流体を内封した二分子膜をいう。二分子膜とは両親媒性分子２個からなる膜をいう。二分子膜ベシクルは光学顕微鏡で観察することができ、マイクロ流路技術によって取り扱うことができることを条件にいかなる形状及び大きさのベシクルであってもかまわないが、球形又はパンケーキ状の形状をとり、直径が１μｍないし１００μｍで、内部が完全に封入されたベシクルであることが好ましく、直径が５μｍないし４０μｍのベシクルであることがより好ましい。【００６０】
本発明においてベシクルのサイズとは、ほぼ球形のベシクルについては、マイクロメータで較正された光学顕微鏡で測定されたベシクルの表面の１点からもっとも離れた別の点までの距離をいう。パンケーキ状のベシクルについては顕微鏡下で撮影された画像の蛍光標識された面積の平方根をいう。【００６１】
本発明において相分離流体は、有機溶液又は気体である。本発明の相分離流体が有機溶液のとき、該有機溶液は二分子膜の構成成分である両親媒性分子を含む。本発明の相分離流体が気体の場合には、本発明の第１及び第２の水性溶液は両親媒性分子を含む。本発明の第１及び第２の水性溶液に含まれる両親媒性分子は同じ組成の場合と、異なる組成の場合がある。本発明の両親媒性分子は、水と油のいずれにも溶解することができる分子であって、分子内に親水性原子団と疎水性原子団とが共存する分子をいう。本発明の両親媒性分子は、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン等のリン脂質と、セレブロシド、ガングリオシド等の糖脂質と、長鎖アルコールと、長鎖カルボン酸と、石鹸と、合成洗剤とを含むがこれらに限られない。【００６２】
本発明において疎水性溶媒は、第１の水性溶液に先立って主流路に流されて、微小憩室から房室内に入れられるか、該房室に接続された前記疎水性溶媒の供給源から直接前記房室内に入れられる場合がある。前記疎水性溶媒は、水より沸点の低い溶媒、例えば、フルオロカーボンの場合がある。【００６３】
本発明において第１の水性溶液は、以下の実施例に説明されるとおり、非常に高い効率でベシクル内に封入される。したがって、第１の水性溶液は所望のベシクル内液と同じ組成の溶液を選択できる。例えば、転写、翻訳、呼吸、同化、異化、情報伝達その他の反応系を構成する酵素、補酵素、基質、高エネルギーリン酸化合物、電子供与体等を単独又は任意の組み合わせで選択することができる。以下の実施例に示すとおり、転写及び翻訳に必要なＲＮＡポリメラーゼ及び転写因子と、アミノアシルｔＲＮＡ及びリボソームとを含む無細胞発現系と、プロモーター及び構造遺伝子を含む転写ユニットをコーディングしたＤＮＡとが第１液に含まれる場合がある。生成されたベシクルを識別するために蛍光標識を行うことが好ましい。【００６４】
第１の水性溶液にポリビニルピロリドンやアルギン酸ナトリウムのような粘稠性ポリマーを添加する場合もある。前記ポリマーがアルギン酸ナトリウムのような可逆的にゲル化するポリマーの場合もある。アルギン酸ナトリウムはカルシウムイオン存在下でゲル化する。カルシウムのようにポリマーを可逆的にゲル化させる因子を、第２の水性溶液か、生成されたベシクルを回収した後のベシクル外液かに添加することにより、ベシクル内部をゲル化させることができる。ベシクル外液から前記ゲル化させる因子を除去することによって、自在にベシクル内液を可逆的にゲル化することができる。前記ゲル化させる因子の除去は、例えば、希釈か、カルシウムイオンに対する特異的キレート剤であるＥＤＴＡやＧＥＤＴＡ（ＥＧＴＡ）の添加かによって行うことができる。ベシクル内部に粘稠なポリマー又はゲルが存在すると、ベシクル内での化学反応系が分子クラウディング又は排除体積効果によって効率よく進行する。また、ベシクルの形状を安定に保持するため、生成したベシクルを輸送したり、長期保存する際に有用である。【００６５】
本発明において有機溶液は、二分子膜の構成成分である、リン脂質、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン等と、糖脂質、例えば、セレブロシド、ガングリオシド等と、コレステロールその他の化合物と、膜タンパク質と、これらを溶解させることのできる有機溶媒、例えば、ヘキサデカセン、スクアレン等を含むのが好ましい。本発明の構造体がポリジメチルシロキサンでできている場合には、ポリジメチルシロキサンに吸収され、膨潤変形させることができるヘキサデカセンを溶媒として用いることが好ましい。【００６６】
本発明の第２の水性溶液は、ベシクルの外液であるから、ベシクルの形状を安定に保持するためにはベシクル内液、すなわち、第１の水性溶液と等張性の溶液組成を有することが好ましい。また静電気的に容器にベシクルが吸着することを防いだり、ベシクルを安定化するために、ウシ血清アルブミン、ポリビニルピロリドンを添加する場合がある。【００６７】
本発明のベシクルの生成装置の構造体に含まれる、主流路、微小憩室、脈動防止手段、連通細路、房室、剪断手段、剪断部、流体リザーバー、張出部及び副流路と、水性溶液の外部供給源及び／又は外部圧力源と前記構造体との接続は添付する図面に示された形状に限定されず、いかなる形状のものであってもかまわない。本発明のベシクル生成方法は、本明細書に開示された２分子膜の形成方法だけでなく、特願２００５−２２０００２号明細書をはじめとする他の方法で形成された２分子膜を用いて形成される場合がある。【００６８】
本発明の構造体の主流路は、構造体の外部から供給される水性溶液、有機溶液及び／又は気体を、構造体内部の全ての微小憩室に導入するように流す。最終的には構造体の外部に接続されたドレンに排出される。構造体を流れた水性溶液、有機溶液及び／又は気体は、主流路を流れた順に前記微小憩室内で層を形成する。【００６９】
本発明の構造体の脈動防止手段は、微小憩室内に形成された水性溶液、有機溶液及び／又は気体の層が、その後に主流路を流れる水性溶液、有機溶液及び／又は気体によって乱されて層状構造が破壊されることがないように設けられる。本発明の脈動防止手段は、微小憩室と房室との連絡部分が微小憩室の開口寸法に比べて細くなっている連通細路の場合がある。あるいは、房室又は房室から外部への接続経路に設けられた弁であって、主流路から房室への向きにのみ液体が流入可能で、かつ、房室内の圧力が上がると、変形して微小憩室内の液体を主流路に向けて押すことのできる弁の場合がある。さらに、オリフィスその他当業者に周知のいずれかの脈動防止手段の場合がある。【００７０】
本発明のベシクルの生成装置の構造体に含まれる剪断手段は、主流路の液流よって変形した有機溶液層と第１の水性溶液とを含む舌状の断面形状の物体（以下、「舌状体」という。）が接触することが可能なことを条件として、微小憩室の開口から離れた位置に設けてもかまわない。剪断手段は、主流路の流れとともに舌状体を括る剪断力を集中させる手段をいう。剪断手段は、本発明の構造体の物理的構造である剪断部の他、超音波、電気等によって剪断力を集中させるものであってもかまわない。剪断部の寸法及び開口からの距離は、開口の形状及び大きさ、用いる水性溶液及び有機溶液の粘弾性、表面張力等の物性や、有機溶液層を懸架する微小憩室の側壁面及び剪断部の濡れ特性等に応じて当業者が適切に設計することができる。剪断部は、主流路の壁面と連続した凸条、突起又は台の場合がある。剪断部が微小憩室の開口と連続した構造、例えば、微小憩室の開口の狭窄又はノズルや、主流路の下流側の開口が主流路内に伸びて、主流路に侵入した舌状体の下流側を支持する構造の場合がある。あるいは、１個又は２個以上の前記主流路の壁面からの突起、脚又は柱によって支持される橋、梁又は棒のような構造であってもかまわない。本発明の剪断部は主流路の液流に関して微小憩室の開口の下流側に設けられる場合がある。本発明の剪断部は微小憩室の開口と同側の主流路の壁面に設けられる場合があるが、微小憩室の開口に向き合う主流路の壁面に設けられる場合がある。本発明において、主流路を通過する液体は１つの向き（順方向）のみに流れる場合があるが、順方向と反対の向き（逆方向）にも流れる場合がある。その場合には本発明の剪断部は主流路の長手方向に沿って微小憩室の開口の両側に１個ずつ設けられる。２個の剪断部は位置及び／又は形状が異なる場合があり、主流路の液流の向きを切り替えることによって異なるサイズのベシクルを生成することができる。【００７１】
本発明の相分離流体、有機溶液又は気体は第１の水性溶液の次に主流路に流され、その後、第２の水性溶液を主流路に流すことによって、微小憩室のそれぞれに導入される。微小憩室に張出部その他の相分離流体リザーバーを微小憩室の開口付近に設けることによって、より大きい体積の有機溶液を懸架することが可能になる。本発明の相分離流体リザーバーは、より大きい体積の有機溶液又は気体が微小憩室の側壁面に付着することができることを条件としていかなる構造又は形状のものであってもかまわない。例えば、微小憩室の側壁面に有機溶液又は気体との親和性の高い化学的な表面処理を施す場合があり、あるいは、前記側壁面に凹部及び／又は凸部を設けて表面積を増大させるものであってもよく、図３に示される張出部に限定されない。本発明の相分離流体リザーバーは、光学的、電気的その他の手法によって本発明の相分離流体の微小憩室の側壁面との親和性を遠隔制御して、相分離流体リザーバーの機能の状態を切り替え可能であることが好ましい。【００７２】
本発明の別の実施態様では、第１の水性溶液を主流路に流す前に、疎水性溶媒が流される。該疎水性溶媒は、主流路から微小憩室を経て房室に侵入する。前記疎水性溶媒はフルオロカーボンのような沸点が低い液体であることが好ましい。房室内の圧力発生部で微小気泡を発生、膨張させる際に必要な熱発生を最小限に抑えることができるからである。【００７３】
本発明のベシクルの生成は前記舌状体の先端が剪断手段に押しつけられて括れて切断されることによって起こる。以下の実施例で説明するとおり本発明のベシクルは単一層の二分子膜ベシクルであるから、舌状体からベシクルが分離してもすぐには有機溶液はなくならない。しかし、大量のベシクルが生成すると有機溶液は消費される。そこで、本発明では有機溶液を補給するために副流路を設ける場合がある。副流路は、主流路の壁面の一部を表面処理して第２の水性溶液を流した後でも主流路の壁面に沿って有機溶液の流路が形成される場合があり、あるいは、主流路とは別に立体的な流路を微細加工技術によって設ける場合がある。有機溶液の補給のための副流路を備えたベシクル生成装置は、長期安定的に同一品質のベシクルを生成しつづけることができる。同様に、本発明の第１の水性溶液も大量のベシクルが生成すると消費される。そこで、本発明では第１の水性溶液を外部供給源から補給する場合がある。Ｎ個の相分離流体リザーバーを備えたＮ層の二分子膜ベシクルの生成装置では、第ｍ番目の相分離流体リザーバーと第ｍ＋１番目の相分離流体リザーバーとの間に第ｍ＋１番目の水性溶液を外部供給源から補給するための開口を設ける場合がある。各相分離流体リザーバーの機能状態を遠隔的に切り替えることによって、どの層がどの相分離流体リザーバーによって懸架されるかを制御することができる。すると、特定の層の間の水性溶液を外部から補給することができる。これにより、Ｎ層の二分子膜ベシクルの各層の中間の水性溶液の組成を制御することができる。【００７４】
本発明のベシクル生成装置と、構造体と、相分離流体と、空気と、有機溶液と、水性溶液とは、必要に応じて、無菌処理を施したり、生体毒性のない素材及び製造方法で製作又は調製される。【００７５】
本発明のベシクル生成装置は、レーザ光を操作したり、ベシクル生成過程を観察するための光学顕微鏡と、主流路を通過する液体を送液するためのポンプ、例えば、シリンジポンプと、流路を切り替えるためのバルブと、本発明の構造体のアクチュエータを駆動又は制御するための電気回路の制御装置と、温度制御装置とを含むが、これらに限られない付属設備を伴う場合がある。【００７６】
本発明の構造体は、例えば、光リソグラフィ、エッチング等の従来の微細加工技術を組合せて、犠牲層の除去により立体的な構造とすることができる（ＥＥ  Ｔｅｘｔ  センサ・マイクロマシン工学、藤田博之編著、オーム社（２００５））。代替策として、押印転写法（特願２００７−１０８６７号明細書及びOnoe, H.ら、Journal of Micromechanics and Microengineering, 17: 1818-1827 (2007)）を利用する場合がある。また、従来の微細加工技術と前記押印転写法とを組み合わせて立体的な形状を有する構造体を作成することもできる。【００７７】
本発明の構造体は、従来の微細加工技術及び／又は前記押印転写法を、単独で、あるいは、組み合わせて作成された立体的な形状を有する鋳型を使って作成される成形品の場合がある。前記成形品は、プラスチック、セラミック及びハイドロゲルと、これらの複合材料とを含むが、これらに限定されない材料を用いて作成される場合がある。【００７８】
本発明において「微小憩室が２次元的に配置される」とは、主流路と微小憩室とが単一の平面上に配置されることをいう。例えば、単一のガラス基板上に作成され、主流路を挟んで相対するように複数の微小憩室が配置される場合をいう。【００７９】
本発明において「微小憩室が３次元的に配置される」とは、主流路と微小憩室とが配置される平面が２個又は３個以上あることをいう。例えば、微小憩室が主流路の流体の流れる方向軸に回転対称となるように配置される場合をいう。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】本発明のベシクル生成装置の１つの実施態様の構造体の模式図。
【図２】本発明のベシクル生成方法の１つの実施態様を示す模式図。
【図３】本発明のベシクル生成装置の構造体の１つの実施態様における微小憩室の開口付近での有機溶液層の変形の様子を示す部分拡大模式図。
【図４】蛍光標識したベシクルの生成を蛍光顕微鏡下で連続撮影した顕微鏡写真。
【図５】本発明のベシクル生成装置の１つの実施態様で生成された球状ベシクルの蛍光顕微鏡写真。
【図６】本発明のベシクル生成装置の１つの実施態様で生成された球状ベシクルのサイズのヒストグラム。
【図７】本発明のベシクル生成装置の１つの実施態様で生成されたパンケーキ状ベシクルの蛍光顕微鏡写真。
【図８】本発明のベシクル生成装置の１つの実施態様で生成されたパンケーキ状ベシクルのサイズのヒストグラム。
【図９】第１の水性溶液の流速Ｑとベシクルのサイズとの関係を示すグラフ。
【図１０】ベシクルの生成順とベシクルのサイズとの関係を示すグラフ
【図１１】有機溶液の外部供給源に接続された副流路を含む本発明のベシクル生成装置の１つの実施態様の構造体の模式図。
【図１２Ａ】α−ヘモリシンが埋め込まれたベシクルの蛍光強度の経時変化を示す顕微鏡写真。
【図１２Ｂ】α−ヘモリシンが埋め込まれたベシクルの蛍光強度の経時変化を示すグラフ。
【図１３Ａ】ベシクルのサイズの浸透圧ショック後の経時変化を示す顕微鏡写真。
【図１３Ｂ】ベシクルのサイズの浸透圧ショック後の経時変化を示すグラフ。
【図１４】蛍光標識されたビーズ玉のベシクルへの封入前後の共焦点顕微鏡写真。
【図１５Ａ】ベシクルでのＧＦＰによる蛍光発光強度の経時変化を示す顕微鏡写真。
【図１５Ｂ】ベシクルでのＧＦＰによる蛍光発光強度の経時変化を示すグラフ。
【図１６】相分離流体として気体を用いて第１及び第２の水性溶液の間に両親媒性分子膜を形成させる本発明のベシクル生成装置の１つの実施態様の構造体の模式図。
【符号の説明】
【００８１】
１    主流路
２    微小憩室
３    連通細路
４    房室
５    圧力発生部
６    アルミニウム薄膜
７    レーザ光束
８    微細気泡
９    剪断部
１０    張出部
１１    副流路
１２    第１の水性溶液の表面に配向した両親媒性分子
１３    気体の層
１４    第２の水性溶液の表面に配向した両親媒性分子
【発明を実施するための形態】
【００８２】
以下に実施例を示すが、これらは実施態様の例示を意図しており本発明の範囲を限定することは意図しない。
【実施例１】
【００８３】
１．ベシクルの生成
本発明の１つの実施態様のベシクル生成装置はマイクロ流体デバイスを含み、該マイクロ流体デバイスは１個又は２個以上の本発明の構造体を含む。前記構造体は、ガラス面にマウントされたポリジメチルシロキサン（PDMS）でできており、主流路と、該主流路に開口する複数の微小憩室とを含む微細構造が微細加工により設けられる。前記マイクロ流体デバイスには、ポンプ及び流路スイッチが連結され、前記主流路に流す液体の種類と、流速と、均一流か、脈流その他の不均一流かのような流し方とを自由に設定することができる。図１は本発明の１つの実施態様のベシクル生成装置の構造体の模式図である。主流路１に面して微小憩室２が開口し、微小憩室２は連通細路３を介して房室４と連絡する。房室４には圧力発生部５が設けられる。本発明の１つの実施態様では、圧力発生部５は、房室４の底面にパターン状に配置されたアルミニウム薄膜６に合焦したレーザ光７によって発生した微細気泡８の膨張のために圧力を発生する。前記圧力によって房室４から連通細路３に液体が押し出される。しかし、連通細路３は狭く長いため流動抵抗を生じさせる。そのため、連通細路３は、房室４から微小憩室２に向かう液流を緩徐化する。主流路１の液流に関して微小憩室２の開口の下流側の主流路の壁面には剪断部９が設けられる。本発明の１つの実施態様では、主流路、微小憩室、その他全てのポリジメチルシロキサン構造のガラス面にマウントされた深さ（図１の平面と垂直な方向の寸法）は１７μｍである。微小憩室２の主流路１の壁面への開口の幅は２０μｍである。連通細路３の幅は６μｍで、連通細路３の微小憩室２への開口面と、連通細路３の房室４への開口面との距離、すなわち、連通細路３の長さは１００μｍである。剪断部９の主流路壁面からの高さは１０μｍである。【００８４】
図２は本発明のベシクル生成方法の１つの実施態様を示す模式図である。まず、第１の水性溶液と、ベシクル膜を構成する両親媒性分子を含む水不溶性の有機溶液と、第２の水性溶液とをこの順序で本発明のベシクル生成装置に通過させる（図２ＡないしＨ）。第１の水性溶液はベシクル内液となる。主流路を流れる第１の水性溶液は、本発明の構造体のそれぞれの微小憩室の開口から微小憩室に侵入し、連通細路を通って房室を満たす（図２Ａ）。つぎに、有機溶液を主流路に流す。ここで有機溶液として、例えば、ヘキサデカン１７で脂質を溶解した有機溶液を用いる場合には、ポリジメチルシロキサンを溶解しないが、ポリジメチルシロキサン表面で濡れる性質を有し、ポリジメチルシロキサン樹脂に当該有機溶液が吸収され、ポリジメチルシロキサン樹脂が膨潤変形する。これにより、本発明の構造体の微小憩室２の内部に、前記有機溶液が侵入する（図２Ｂ）。前記有機溶液はポリジメチルシロキサン表面で濡れるので、有機溶液層は微小憩室２の相対する側壁面に懸架されて微小憩室を封止する。なお、ポリジメチルシロキサンが膨潤変形するため、連通細路もさらに狭くなるので、前記有機溶液は連通細路内には侵入しない。最後に、第２の水性溶液を主流路に流すことによって主流路内の有機溶液を押し流して除去する。前記有機溶液は、第１及び第２の水性溶液との間で相分離し界面で隔てられた有機溶液層を形成する（図２Ｃ）。その後、房室内の圧力発生部で圧力を発生させて、微小憩室内の第１の水性溶液が有機溶液層を微小憩室の開口に向けて押す。房室内の圧力発生部で発生した圧力は連通細路によって緩徐化されているので有機溶液層は微小憩室の側壁面に懸架されたまま微小憩室の開口の外に向けて断面が凸状に変形する（図２Ｄ）。このとき凸状に変形した有機溶液層の先端部では層が薄くなる。主流路では第２の水性溶液が一定速度で流れている（図２では左から右への向き）ので、有機溶液層の先端がさらに伸張して微小憩室の開口から主流路に入ると、該先端部が主流路の液流に押されて主流路の下流（図２では右）向きに屈曲する（図２Ｅ）。第１の水性溶液によって押された有機溶液層の先端が剪断手段を越えて伸張すると、主流路の液流により前記有機溶液層が前記剪断手段に押しつけられる（図２Ｆ）。そして、有機溶液層の先端が括れて切断される（図２Ｇ）。その後も第１の水性溶液によって前記有機溶液層の先端が前記剪断手段を越えて伸張して、順次前記先端が括れてベシクルとして切断される（図２Ｈ）。その結果、第１の水性溶液を内部に含むベシクルが第２の水性溶液を主流路の下流に向かって流れる。【００８５】
図３の（Ａ）は本発明のベシクル生成装置の主流路に第１の水性溶液（薄いハッチングの「Ｗａｔｅｒ」と表記）と、有機溶液（「Ｏｉｌ」と表記）と、第２の水性溶液（濃いハッチングの「Ｗａｔｅｒ」と表記）とを順次流す様子を示す斜視図であり、（Ｂ）ないし（Ｈ）は本発明のベシクル生成装置の構造体の１つの実施態様における微小憩室の開口付近での有機溶液層の変形の様子を示す部分拡大模式図である。第１の水性溶液は空気を押し出して微細憩室の中に侵入し、導入される（図３Ｂ）。有機溶液が前記微細憩室の中に導入された後（図Ｃ）、第２の水性溶液が前記微細憩室の中に侵入し、該微細憩室の中に前記有機溶液の層が形成される（図３Ｄ）。前記有機溶液層に溶けた両親媒性分子の分子は棒状の疎水性原子団と球状の親水性原子団とからなり、第１及び第２の水性溶液と前記有機溶液層との界面では親水性原子団が水性溶液に接するように配向する（図３Ｃ、Ｄ）。主流路の液流に関して微小憩室の開口の下流側の主流路の壁面には剪断部９が設けられる。微小憩室が主流路に面する開口周縁には憩室の壁面が張り出して内径を狭くする張出部１０が設けられる場合がある。張出部１０は憩室の内面の表面積を局所的に増大させるため、より大きい体積の有機溶液の層を微小憩室の開口に懸架することができる。有機溶液層は伸張に伴って微小憩室の壁面及び／又は張出部の周辺から伸張の先端に向かって薄くなり、最終的には全ての両親媒性分子が第１又は第２の水性溶液に接するように配向した二分子膜が形成される（図３Ｅ）。図４は第１の水性溶液に蛍光色素を添加してベシクルを蛍光標識し、ベシクルの生成を蛍光顕微鏡下で上のフレームから下のフレームへと連続撮影した顕微鏡写真である。図４に示すとおり、上向きに伸びた舌状体が主流路の左向きの流れにより剪断手段に押しつけられて、ベシクルが括れて生成する。生成したベシクルの膜内で単一層の二分子膜が実際に形成されていることは以下の実施例３に説明する。
【実施例２】
【００８６】
２．生成したベシクルの特徴付け
２−１．ベシクルのサイズ
生成したベシクルのサイズは、第１の水性溶液に蛍光色素を溶解させ、主流路を流れるベシクルをマイクロメーターで較正した蛍光顕微鏡で観察して測定した。実施例１に説明した本発明の１つの実施態様のベシクル生成装置において、光ピンセットによって発生する第１の水性溶液の圧力と、主流路を流れる第２の水性溶液の流速とを調整することにより、５μｍから４０μｍまでのサイズのベシクルが得られた。図５は生成した球状ベシクルの蛍光顕微鏡写真の１つの例である。図６は、２４個の球状ベシクルのサイズのヒストグラムで、横軸はベシクルサイズ（単位：μｍ）、縦軸は約０．５μｍごとのサイズの各区間のベシクルの個数を表す。図６に示すとおり、生成したベシクルのサイズは、ほぼ対称的に分布し、ベシクルのサイズの平均は１６．５μｍ、変動係数（ｃｖ）は３．７％であった。生成したベシクルは安定で、数日間は球状の形態を保った。主流路の流速を上げると、変形した有機溶液層に作用する剪断力が強くなるため、より小さなサイズの球状のベシクルが生成した。主流路の流速を下げると、パンケーキあるいは回転楕円体状のベシクルが生成した（図７）。図８はかかるパンケーキ状のベシクル３１個のサイズのヒストグラムで、生成したベシクルのサイズは、ほぼ対称的に分布し、ベシクルのサイズの平均は２８．０μｍ、変動係数（ｃｖ）は４．４％であった。パンケーキ状のベシクルを広い体積寸法の溶液中に移すと球形になった。連通細路から微小憩室に流入する第１の水性溶液の流速を変化させてベシクルのサイズへの影響を調べた結果を図９に示す。図９は、横軸に流速Ｑ（単位：ｐＬ／秒）、縦軸にベシクルのサイズ（単位：μｍ）をプロットしたグラフである。流速Ｑは個々のベシクルの体積を当該ベシクルの生成に要した時間で割って求めた。図９に示すとおり、流速Ｑとベシクルのサイズとの相関係数は−０．０５８と小さいことから、ベシクルのサイズは流速Ｑを変化させても影響が小さいとの結論が得られた。本実施例は、本発明の方法及び装置が一般的な細胞と同様のサイズの均一なベシクルを大量に生成可能であることを証明した。
【実施例３】
【００８７】
図１０は、横軸に何個目に生成したベシクルかというベシクルの生成順の番号を、縦軸に当該ベシクルのサイズをプロットしたグラフである。図１０から、後から生成したベシクルほどサイズが大きく、また、サイズのばらつきが大きくなる傾向が認められた。これは、ベシクルが生成するにつれて有機溶液中の両親媒性分子濃度が下がるため、舌状体の先端の表面張力が変化すること、及び、舌状体の先端への両親媒性分子の輸送及び／又は配向が不均一になることを示す。
【実施例４】
【００８８】
図１１に示す実施態様では、有機溶液の外部供給源に接続された副流路１１が微小憩室に沿って設けられる。この実施態様では副流路１１を介して有機溶液を補給するので、より大量のベシクルを均一に生成することができる。副流路への有機溶液の充填は主流路に有機溶液を流す前に行うことが好ましい。また、主流路に有機溶液が流れるときに副流路から有機溶液を押し出して、副流路の有機溶液が主流路から流入した有機溶液と連続することが好ましい。なお、後に説明するとおり、有機溶液を用いないで第１及び第２の水性溶液を気体の層で隔てる実施態様では、両親媒性分子は水性溶液に添加され、前記気体を副流路１１を通じて補給する。
【実施例５】
【００８９】
２−２．生成したベシクルの膜構造
黄色ブドウ球菌由来のα−ヘモリシンは単一層の二分子膜に埋め込まれて膜の内外を連絡する貫通孔を形成する。生成したベシクルが単一層の二分子膜でできているとすると、α−ヘモリシンが膜の内外を貫通するナノポアを形成するため膜の内外で物質の拡散が起こり、ベシクル内液に蛍光色素が添加されている場合には、当該蛍光色素がベシクル外に流出し、蛍光が消えるはずである（図１２Ａ）。そこで、生成したベシクルがα−ヘモリシンによって膜の内外で物質の拡散を起こすかどうかを検討した。ベシクル内液となる第１の水性溶液に蛍光色素カルセインを溶かし、ベシクル膜となる有機溶液に脂質とともにα−ヘモリシンを溶かしてベシクルを生成させた。図１２Ｂは生成したベシクルの蛍光強度の経時変化を示すグラフである。図１２Ｂに示すとおり、ベシクルの蛍光強度は、生成後約４秒間は変化がなかったが、その後５秒間で急激に低下した。このことは、最初の４秒間に膜内でα−ヘモリシンが自己集合し膜の内外を貫通するナノポアが形成され、その後ベシクル内のカルセインが当該ナノポアを通ってベシクルの外に流出したことを意味する。すなわち、この実験結果から、本発明の方法及び装置で生成されたベシクルは単一層の二分子膜でできていることが示唆された。また本実施例は、本発明の方法及び装置が膜タンパク質を再構成したベシクルを作成可能であることを証明した。
【実施例６】
【００９０】
２−３．ベシクルの膜透過性及び安定性
生体膜の特徴のひとつは、水は透過するが、糖や塩類は透過しない半透性を有することである。そこで、本発明の方法及び装置で生成されたベシクルの膜透過性を検討した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を第１の水性溶液として生成したベシクルを１００ｍＭグルコース添加ＰＢＳ中に移してベシクルのサイズの経時変化を測定した。図１３Ａは１個のベシクルのサイズの変化の連続写真である。図１３Ｂは、ベシクル内液がＰＢＳで、サイズがそれぞれ約１５μｍ、約２０μｍ及び約２５μｍのベシクルを、１００ｍＭグルコース添加ＰＢＳに移して浸透圧ショックに曝露した後のベシクルのサイズの経時変化を示すグラフである。図６に示すとおり、ベシクルのサイズは、測定開始後直ちに減少し、１５００秒（２５分）後以降は変化がみられなかった。ベシクルは非常に安定で、生成してから１週間経過後でもサイズは変わらなかった（図示されない）。また、ベシクルのサイズの減少は直線的で、ベシクルのサイズに関係なく直線の傾きがほぼ同じであった。このことから、ベシクルのサイズに関係なく同じ膜組成のベシクルは同じ膜透過特性を示すことが示唆される。本実施例は、本発明の方法及び装置で生成されたベシクルが生体膜と同様に水は透過するがグルコースを透過しない半透性を有することを証明した。また本実施例は、二分子膜の特性をベシクル状態で測定可能であることを証明した。
【実施例７】
【００９１】
２−４．ベシクル内液組成の制御
本実施例では、第１の水性溶液と、ベシクル内液との組成、特に高分子の濃度が同じかどうかを検討した。粒径２００ｎｍの蛍光標識されたビーズ玉の高濃度溶液を第１の水性溶液として用いて作成したベシクルを共焦点顕微鏡で観察した（図１４）。１００ミリ秒間隔で撮影した２０枚のフレーム中の５μｍ平方の視野あたりのビーズ玉の平均個数を比較した結果、２０個のベシクルの内部で観察されたビーズ玉の視野あたりの個数は、第１の水性溶液として本発明の装置に適用した溶液におけるビーズ玉の視野あたりの個数とほぼ同じであった。本実施例は、本発明の方法及び装置によるベシクル生成では、ベシクルへの封入の効率が非常に高い、すなわち、ベシクルが生成する際に、ベシクル内液が封入されずにベシクル外に漏出したり、ベシクル外液が流入する可能性が非常に低いことを証明した。
【実施例８】
【００９２】
２−５．ベシクルでの化学反応
本実施例では、ベシクル内に封入された基質及び酵素によってベシクル内で化学反応が進行するかどうかを検討した。図１５Ａは、大腸菌の無細胞発現系と、ＧＦＰ発現コンストラクトとを含む混合液（RTS100、E. coli HY kit、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社、カタログ番号：3186148）を第１の水性溶液、リボヌクレオチド及びアミノ酸を含む反応補給液を第２の水性溶液として用いて生成したベシクルでのＧＦＰによる蛍光顕微鏡写真（それぞれ左からベシクル生成後０、１、２、５及び１５時間経過後に撮影）で、図１５Ｂは発光強度の経時変化を示すグラフである。横軸は時間（単位：時間）、縦軸は相対的な蛍光強度である。図１５Ｂに示すとおり、ＧＦＰによる蛍光はベシクル生成直後から増大し、５時間後にはプラトーに達した。なお、対照実験として、ＤＮＡを添加しない場合にはベシクルの蛍光発光は全く認められなかった。本実施例は、本発明の方法及び装置によって生成されたベシクルの中で、ＤＮＡからの転写と、ＧＦＰの翻訳というＡＴＰを消費してｍＲＮＡ及びタンパク質を合成する複雑な化学反応を実行可能であること、すなわち、本発明のベシクルが人工細胞を作出するためのバイオリアクタとして有用であることを証明した。
【実施例９】
【００９３】
ベシクルの用途によっては有機溶液を用いないことが望ましい場合がある。かかる場合には、有機溶液を気体で置き換えるとともに、両親媒性分子は第１及び／又は第２の水性溶液に溶解して供給する本発明の別の実施態様が採用される。この実施態様では、図１６の左側の模式図に示すとおり、第１の水性溶液の表面に配向した両親媒性分子１２が、気体の層１３を隔てて第２の水性溶液の表面に配向した両親媒性分子１４と向き合っている。第１及び第２の水性溶液の表面は先端で接するが、その際に、それぞれの水性溶液の外側に配向した両親媒性分子の疎水性部分どうしが結合するので、第１及び第２の水性溶液の表面は二分子膜で封止される。そのため、本実施態様でも、有機溶液を用いる実施態様と同様の舌状体が形成される（図１６、右側）。【００９４】
以上のとおり、本発明の二分子膜ベシクルは、生体細胞と同様の寸法で非常に均一なサイズのベシクルであって、ベシクル内で転写及び翻訳のような複雑な化学反応を進行させたり、生体膜と同様の選択的透過性を再現することができる。したがって本発明の二分子膜ベシクル生成装置及び生成方法は、将来の人工細胞作成の重要な橋頭堡として大きな意義を有するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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