(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質その他の生体高分子を結晶化させるための結晶化装置であって、
結晶化溶液と、該結晶化溶液に印加する導電体電極とを備え、
該導電体電極は透明導電体電極であり、
該透明導電体電極は前記結晶化溶液に直に接し、
更に、電気絶縁部材を備え、
前記透明導電体電極は面状に形成し、
前記電気絶縁部材により、面状に形成した前記透明導電体電極を内接して保持し、
面状に形成した前記透明導電体電極により、前記結晶化溶液に対してほぼ一様な電界が印加される
ことを特徴とする生体高分子の結晶化装置。
【請求項２】
前記透明導電体電極は、透明基板上に形成した透明導電体薄膜であり、
前記透明導電体薄膜と前記透明基板とを通して、前記生体高分子の結晶が光学的に観察可能である
ことを特徴とする請求項１に記載の生体高分子の結晶化装置。
【請求項３】
更に、前記透明導電体電極に電圧を印加するための電圧発生器を備え、
前記透明導電体電極に印加される前記電圧が、直流低電圧及び／又は交流低電圧である  ことを特徴とする請求項１又は２に記載の生体高分子の結晶化装置。
【請求項４】
前記電圧は、前記生体高分子の配向を制御するように印加される
ことを特徴とする請求項３に記載の生体高分子の結晶化装置。
【請求項５】
前記結晶化溶液は、バッチ法、蒸気拡散法、又は透析法のいずれかを基に、準安定状態になるよう調製される
ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の生体高分子の結晶化装置。
【請求項６】
前記透明導電体薄膜は、無機酸化物及び／又は導電性高分子の透明導電体を用いて形成する
ことを特徴とする請求項２乃至５のいずれか１項に記載の生体高分子の結晶化装置。
【請求項７】
結晶化溶液に内部電界印加するための透明導電体電極を備え、
前記透明導電体電極の間に結晶化溶液を保持するように構成され、
更に、電気絶縁部材を備え、
前記透明導電体電極は面状に形成し、
前記電気絶縁部材により、面状に形成した前記透明導電体電極を内接して保持し、
面状に形成した前記透明導電体電極により、前記結晶化溶液に対してほぼ一様な電界が
印加される
ことを特徴とする生体高分子の結晶化溶液セル。
【請求項８】
透明導電体電極を電気絶縁部材によって電気絶縁し、
前記透明導電体電極に接して生体高分子を含む溶液を保持し、
前記透明導電体電極は面状に形成し、
前記電気絶縁部材により、面状に形成した前記透明導電体電極を内接して保持し、
面状に形成した前記透明導電体電極により、前記溶液に対してほぼ一様な電界を印加し、
前記電界の印加によって前記生体高分子を配向制御する
ことを特徴とする生体高分子の配向制御方法。
【請求項９】
前記透明導電体電極は、透明基板上に形成した透明導電体薄膜を用いる
ことを特徴とする請求項８に記載の生体高分子の配向制御方法。
【請求項１０】
前記透明導電体電極に印加する電圧が、直流低電圧及び／又は交流低電圧である
ことを特徴とする請求項８又は９に記載の生体高分子の配向制御方法。
【請求項１１】
前記溶液は、バッチ法、蒸気拡散法、又は透析法のいずれかを基に調製される
ことを特徴とする請求項８乃至１０のいずれか１項に記載の生体高分子の配向制御方法。
【請求項１２】
透明導電体電極を電気絶縁部材によって電気絶縁し、
前記透明導電体電極に接して生体高分子を含む溶液を保持し、
前記透明導電体電極は面状に形成し、
前記電気絶縁部材により、面状に形成した前記透明導電体電極を内接して保持し、
面状に形成した前記透明導電体電極により、前記溶液に対してほぼ一様な電界を印加し、
前記電界の印加によって前記生体高分子を結晶化する
ことを特徴とする生体高分子の結晶化方法。
【請求項１３】
前記透明導電体電極は、透明基板上に形成した透明導電体薄膜を用いる
ことを特徴とする請求項１２に記載の生体高分子の結晶化方法。
【請求項１４】
前記透明導電体電極に印加する電圧が、直流低電圧及び／又は交流低電圧である
ことを特徴とする請求項１２又は１３に記載の生体高分子の結晶化方法。
【請求項１５】
前記溶液は、バッチ法、蒸気拡散法、又は透析法のいずれかを基に調製する
ことを特徴とする請求項１２乃至１４のいずれか１項に記載の生体高分子の結晶化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体高分子の結晶化装置、生体高分子の結晶化溶液セル、生体高分子の配向制御方法、生体高分子の結晶化方法、及び生体高分子の結晶に係り、特に結晶構造解析に用いる高品質な結晶を得ることができる生体高分子の結晶化装置、生体高分子の結晶化溶液セル、生体高分子の配向制御方法、生体高分子の結晶化方法、及び生体高分子の結晶に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来から、タンパク質に代表される生体高分子の機能を解明するために、結晶構造解析の技術が必要不可欠となっている。生体高分子の結晶構造は、核磁気共鳴（ＮＭＲ）測定、Ｘ線回折測定、また中性子線回折測定等を用いて解析される。解析された結晶構造のデータを用いて、生体高分子の高次構造や機能の解析を行うことができる。
このような生体高分子の結晶構造解析と評価のためには、良質の結晶を作製することが必要である。【０００３】
近年、結晶化条件の判明している生体高分子は急激に増加している。しかしながら、結晶核の形成と結晶成長に関する統一的な理論は分かっていなかった。
ここで、生体高分子を結晶化するための要因としては、例えば、生体高分子の溶液濃度、沈殿剤の種類や濃度、緩衝液の種類やｐＨ値、溶液の温度等の様々な要因が考えられている。従来、個々の生体高分子毎に、このような結晶化の要因について、試行錯誤で実験されていた。このため、結晶化条件の探索は、非能率的であった。
また、従来、溶液中における生体高分子の結晶成長速度は、大変遅かった。従って、最適な結晶化条件下でも、光学顕微鏡などで結晶の生成が確認できるまでには、少なくとも数日から数週間、場合によっては、数ヶ月以上の時間が必要であった。
このように、生体高分子結晶の作製は、多大な時間と労力を要していた。【０００４】
また、結晶構造解析に適する良質の生体高分子結晶を作製するには、高純度の生体高分子原料を使用していた。
このため、コスト面から、結晶作製で用いる溶液量としては、微量であること、例えば数十μＬ以下であることが好ましかった。
しかしながら、非効率的で網羅的な結晶化条件の探索を行って結晶を作成すると、それ以上の容量が必要になっていた。【０００５】
このため、上記のような非効率的で網羅的な結晶化条件の探索に依らない、生体高分子の結晶化の促進方法が求められていた。
従来、このような結晶化の促進方法として、光照射法、強磁界印加法、及び電界印加法等が提案されている。【０００６】
この中で特に、光照射や電界印加による結晶化は、比較的簡単に実施できる方法であった。
まず、特許文献１を参照すると、従来の光照射、特に紫外線によるタンパク質等の生体高分子結晶の作製方法、及びその作製装置について開示されている。
特許文献１に記載されたような従来の光照射による結晶化方法においては、多くの場合、生体高分子の光吸収が生じる波長約２００〜約３５０ｎｍの紫外線が利用されていた。
しかし、エネルギーの高い紫外線の照射は、生体高分子自身の分子構造を変化させ、生体高分子へ直接ダメージを与えるという問題があった。よって、光照射による結晶化方法は、良質な生体高分子の結晶を得る上で好ましくなかった。【０００７】
一方、従来の電界印加による結晶化方法には、大きく分類すると、主に内部電界印加法と外部電界印加法の２種類の方法が存在していた。
内部電界印加法は、電圧印加の電極を直接、結晶化溶液に接触させ電界を印加する結晶化方法である。また、外部電界印加法は、電極付近に絶縁物を導入して間接的に結晶化溶液に電界を印加する結晶化方法である。
これら、内部電界印加法と外部電界印加法のように、電界印加による結晶化方法は、低電界の印加であれば、紫外線照射と異なり、生体高分子へのダメージは、ほとんどなかった。【０００８】
ここで、上述のように、内部電界印加法は、直接、電極を結晶化溶液に接触させる電圧印加方法である。
従来、内部電界印加法において、結晶化溶液に電界を印加するための電極として、例えば銅、銀、金及び白金などの導電性金属が用いられていた。
しかしながら、これらの金属材料は、一般に金属表面が生体高分子の結晶核となることが多いという問題があった。
すなわち、金属電極付近に、結晶化溶液への電界印加の有無に関係なく一度に多数の微結晶が形成される場合があった。これにより、良質な結晶形成の妨げになることがあった。
したがって、従来の内部電界印加法では、結晶成長の制御が困難であるという問題があった。【０００９】
このため、従来から、電界印加による結晶化方法としては、外部電界印加法が頻繁に用いられている。
こういった従来の外部電界印加法では、金属電極付近への絶縁物の挿入、あるいは金属電極上の絶縁膜形成によって、電極自身が結晶形成の妨げにならないように工夫されている。【００１０】
たとえば非特許文献１を参照すると、従来の外部電界印加法によるタンパク質結晶生成の試験方法について述べられている。
また、例えば非特許文献２を参照すると、従来の外部電界印加法によるタンパク質の結晶化装置が報告されている。
非特許文献１及び非特許文献２の技術においては、いずれも、絶縁物で覆われた金属電極に、数百Ｖから数十ｋＶという直流の高電圧が電極間に印加される。これにより、生体高分子を結晶化させやすくしている。【００１１】
さらにまた、特許文献２には、従来の外部電界印加法の一種として、マイクロ流体デバイスにおいてタンパク質結晶化溶液に交流電圧を印加して結晶化する装置が開示されている。
特許文献２の技術では、タンパク質に働く電界の誘電泳動力によって結晶生成し、結晶を運搬する方法である。この技術においても、マイクロ流路における電極の配置の都合により、電極間には高い交流電圧を印加する必要があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００３−３０６４９７
【特許文献２】特開２００７−０６１６７２
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｍ．Ｔａｌｅｂ，Ｃ．Ｄｉｄｉｅｒｊｅａｎ，Ｃ．Ｊｅｌｓｃｈ，Ｊ．Ｐ．Ｍａｎｇｅｏｔ  ａｎｄ  Ａ．Ａｕｂｒｙ，"Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｌｙｓｏｚｙｍｅ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｕｎｄｅｒ  ａｎ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｆｉｅｌｄ"，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ，ｖｏｌ．２３２，ｐｐ．２５０−２５５（２００１）．
【非特許文献２】Ｍｕｈａｍｍａｄ  Ｉｍｒａｎ  Ａｌ−Ｈａｑ，Ｅｒｉｃ  Ｌｅｂｒａｓｓｅｕｒ，Ｗａｎ−Ｋｙｕ  Ｃｈｏｉ，Ｈｉｄｅｎｏｒｉ  Ｔｓｕｃｈｉｙａ，Ｔｏｒｕ  Ｔｏｒｉｉ，Ｈｉｒｏｋｉ  Ｙａｍａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｅｔｓｕｏ  Ｓｈｉｎｏｈａｒａ，"Ａｎ  ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  ｅｌｅｃｔｒｉｃ−ｆｉｅｌｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ"，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，ｖｏｌ．４０，ｐｐ．１９９−２０１（２００７）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
しかしながら、生体高分子の結晶化溶液は、電解イオンを含み電気導電性を示していた。このため、外部電界印加法では、電極の絶縁物により、結晶化溶液に形成される電界が弱められるという問題があった。
したがって、外部電界印加法において、効率的な結晶化を行うために必要な電界を得るためには、通常、数百Ｖから数十ｋＶ程度の高電圧を電極間に印加する必要があった。そのため、結晶化溶液セルの構成として、使用する溶液セル材料の電気絶縁性や電気的短絡時の対応等に十分な配慮が必要であった。これが、高電圧の印加が結晶化溶液セルの小型化を妨げる原因となっていた。
また、結晶化溶液セルに金属電極を用いた場合、金属の光透過率が著しく低いために、金属電極を通して光学的に結晶成長を観察することが難しいという問題があった。そのため、結晶成長の状態を観察できるように、結晶化溶液セルにおける電極の配置について配慮しなければならなかった。さらにまた、結晶化溶液セルに観察用の光学窓を確保するのに、電極間距離を十分大きくとる必要があった。
従って、金属電極を使用した場合には、印加電圧の低電圧化と結晶化溶液セルの小型化を同時に満たすことは困難となるという問題があった。【００１５】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、上述の課題を解消することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
上記目的を達成するために、本発明は次の手段を講じた。すなわち、
本発明の生体高分子の結晶化装置は、タンパク質その他の生体高分子を結晶化させるための結晶化装置であって、結晶化溶液と、該結晶化溶液に印加する導電体電極とを備え、該導電体電極は透明導電体電極であり、該透明導電体電極は前記結晶化溶液に直に接し、更に、電気絶縁部材を備え、前記透明導電体電極は面状に形成し、前記電気絶縁部材により、面状に形成した前記透明導電体電極を内接して保持し、面状に形成した前記透明導電体電極により、前記結晶化溶液に対してほぼ一様な電界が印加されることを特徴とする。  本発明の生体高分子の結晶化装置は、前記透明導電体電極は、透明基板上に形成した透明導電体薄膜であり、前記透明導電体薄膜と前記透明基板とを通して、前記生体高分子の結晶が光学的に観察可能であることを特徴とする。
本発明の生体高分子の結晶化装置は、更に、前記透明導電体電極に電圧を印加するための電圧発生器を備え、前記透明導電体電極に印加される前記電圧が、直流低電圧及び／又は交流低電圧であることを特徴とする。
本発明の生体高分子の結晶化装置は、前記電圧は、前記生体高分子の配向を制御するように印加されることを特徴とする。
本発明の生体高分子の結晶化装置は、前記結晶化溶液は、バッチ法、蒸気拡散法、又は透析法のいずれかを基に、準安定状態になるよう調製されることを特徴とする。
本発明の生体高分子の結晶化装置は、前記透明導電体薄膜は、無機酸化物及び／又は導電性高分子の透明導電体を用いて形成することを特徴とする。
本発明の生体高分子の結晶化溶液セルは、結晶化溶液に内部電界印加するための透明導電体電極を備え、前記透明導電体電極の間に結晶化溶液を保持するように構成され、更に、電気絶縁部材を備え、前記透明導電体電極は面状に形成し、前記電気絶縁部材により、面状に形成した前記透明導電体電極を内接して保持し、面状に形成した前記透明導電体電極により、前記結晶化溶液に対してほぼ一様な電界が印加されることを特徴とする。
本発明の生体高分子の配向制御方法は、透明導電体電極を電気絶縁部材によって電気絶縁し、前記透明導電体電極に接して生体高分子を含む溶液を保持し、前記透明導電体電極は面状に形成し、前記電気絶縁部材により、面状に形成した前記透明導電体電極を内接して保持し、面状に形成した前記透明導電体電極により、前記溶液に対してほぼ一様な電界を印加し、前記電界の印加によって前記生体高分子を配向制御することを特徴とする。
本発明の生体高分子の配向制御方法は、前記透明導電体電極は、透明基板上に形成した透明導電体薄膜を用いることを特徴とする。
本発明の生体高分子の配向制御方法は、前記透明導電体電極に印加する電圧が、直流低電圧及び／又は交流低電圧であることを特徴とする。
本発明の生体高分子の配向制御方法は、前記溶液は、バッチ法、蒸気拡散法、又は透析法のいずれかを基に調製されることを特徴とする。
本発明の生体高分子の結晶化方法は、透明導電体電極を電気絶縁部材によって電気絶縁し、前記透明導電体電極に接して生体高分子を含む溶液を保持し、前記透明導電体電極は面状に形成し、前記電気絶縁部材により、面状に形成した前記透明導電体電極を内接して保持し、面状に形成した前記透明導電体電極により、前記溶液に対してほぼ一様な電界を印加し、前記電界の印加によって前記生体高分子を結晶化することを特徴とする。
本発明の生体高分子の結晶化方法は、前記透明導電体電極は、透明基板上に形成した透明導電体薄膜を用いることを特徴とする。
本発明の生体高分子の結晶化方法は、前記透明導電体電極に印加する電圧が、直流低電圧及び／又は交流低電圧であることを特徴とする。
本発明の生体高分子の結晶化方法は、前記溶液は、バッチ法、蒸気拡散法、又は透析法のいずれかを基に調製することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、電極を結晶化溶液に直接、接触させて低電圧を印加するために、電気絶縁に対する特別な配慮を施す必要がなく、透明導電体薄膜により、ジュール熱による結晶化溶液の温度上昇を大幅に抑制でき、光学的に結晶成長を観察することができる、小型の生体高分子の結晶化装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の実施の形態に係る結晶化装置の構成を示す概略断面図である。
【図２】本発明の実施の形態に係る生体高分子の結晶化方法のフローチャートである。
【図３Ａ】本発明の実施例に係る結晶化の結果を示す写真である。
【図３Ｂ】本発明の実施例に係る結晶化の結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
＜実施の形態＞
〔生体高分子結晶化装置１００の構成〕
図１を参照して、本発明の実施の形態に係る生体高分子結晶化装置１００の構成について説明する。
生体高分子結晶化装置１００は、結晶化溶液セル１０と、電圧発生器５とから構成される。このうち、結晶化溶液セル１０は、透明導電体電極２と、透明基板３と、電気絶縁部材４とから構成される。
結晶化溶液セル１０は、具体的に生体高分子の結晶を作成するための電極を含めた容器である。本発明の実施の形態に係る結晶化溶液セル１０は、溶液から結晶生成させる、種々の生体高分子の結晶化に適用できる。この結晶化溶液セル１０に、生体高分子の結晶化溶液１を導入して、結晶化を行う。
電圧発生器５は、生体高分子の結晶化溶液へ印加する電圧を供給する電圧発生器である、例えば正弦波電圧等を発生させられるファンクションジェネレータである。
【００２０】
（結晶化溶液セル１０の構成）
本発明の実施の形態に係る結晶化溶液セル１０は、好ましくは、透明導電体薄膜の透明導電体電極２を形成した２つの平板状電極基板である透明基板３によって、電気絶縁部材として所定の厚さで平板状（面状）の絶縁スペーサーである電気絶縁部材４を挟む。そして、電気絶縁部材４内に、結晶化溶液１を注入し保持する。結晶化溶液セル１０は、このように、いわゆる「サンドイッチ型」電極構造にて製造することができる。
透明基板３に平板状の電極を用いることで、結晶化溶液中に、ほぼ一様な電界が形成される。これにより、溶液中の生体高分子全体に、効率よく電界を印加できるという効果が得られる。よって、透明導電体電極２の周囲に微少結晶が析出し、大きな結晶を製造するのを妨げることがないという効果が得られる。
また、透明基板３に平板状の電極を用いることで、溶液中の電界や電位分布が予想でき、結晶化における電界印加の効果を解析しやすいという効果が得られる。
【００２１】
透明導電体電極２は、透明基板３の上に形成した透明導電体の薄膜である。透明導電体電極２は、電圧発生器５に電気的に接続され、電圧発生器から供給される所定の直流あるいは交流の電圧を結晶化溶液に印加される。すなわち、透明導電体電極２は、生体高分子の結晶化溶液へ印加する電圧の電極として機能する。
また、透明導電体電極２は、薄膜の電極を結晶化溶液に直接接触させ、印加電圧によって溶液中に効率良く電界を形成させる。従って、透明導電体電極２として用いる透明導電体薄膜は、結晶生成の妨げにならないこと、電解質を含む結晶化溶液に対して化学的に安定であることが必要である。
透明導電体電極２は、透明導電体として、例えば、無機酸化物である、スズ含有の酸化インジウム（Ｉｎ２Ｏ３：Ｓｎ，ＩＴＯ）、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、酸化錫（ＳｎＯ２）、酸化チタン（ＴｉＯ２）等を用いることができる。たとえば、スズを添加した酸化インジウム（ＩＴＯ）の薄膜を用いることが好適である。
なお、透明導電体として、透明性のあるポリチオフェン系やポリピロール系などの導電性高分子も利用できる。
また、透明導電体電極２は、結晶形成の光学的観察が可能な程度の透過率があればよく、所定の波長を透過しなくてもよい。
【００２２】
透明基板３は、透明導電体電極２の薄膜を形成した平板状の透明な基板である。透明基板３は、透明導電体薄膜を形成した光透過性に優れているガラス基板を用いることができる。このため、例えば実体顕微鏡などの光学顕微鏡やルーペ等により、結晶形成状態の光学的観察が可能になる。
なお、透明基板３としては、ガラス基板の他にも、耐熱性の樹脂（高分子、プラスチック）等であっても構わない。
また、透明基板３は、所定の波長を透過しないようなフィルターやコーティング等を形成したり貼り付けたりすることもできる。また、偏光板等を形成することもでき、これにより位相差等により、結晶を観察しやすくなるという効果が得られる。
【００２３】
電気絶縁部材４は、透明導電体電極２の透明導電体電極に印加する電圧を絶縁するための電気絶縁スペーサー（以下、単に絶縁スペーサーと称す）である。電気絶縁部材４の絶縁スペーサーは、透明導電体電極に印加する際の電気絶縁体として働き、また結晶化溶液を保持するシール材として働く。この絶縁スペーサー内に溝孔等を形成し、透明導電体基板と絶縁スペーサーとで囲んだ空間が、結晶化溶液を収容する容器として機能する。
電気絶縁部材４として、例えばシリコンゴムの絶縁スペーサーを用いることができる。シリコンゴムは、電気的絶縁性が良好で、容易に溝孔を加工形成でき、ガラス基板等の密着性も良好である。このため、電気絶縁部材４の絶縁スペーサーとして適切である。
また、結晶成長させる期間が比較的短期間、例えば数週間程度であれば、シリコンゴム製の絶縁スペーサーは、結晶成長に問題にならない程度の範囲で、結晶化溶液からの蒸発を防止できる。
【００２４】
〔結晶化溶液セル１０の製造方法〕
上述したように、本発明の実施の形態に係る生体高分子結晶化装置１００は、電界印加法としては、内部電界印加法により、生体高分子の結晶を作成する。
以下において、この生体高分子の結晶を作成するための結晶化溶液セル１０の各部位の構造を詳細に説明し、結晶化溶液セル１０の製造方法を記述する。
【００２５】
（透明導電体電極２の構成）
本発明の実施の形態に係る結晶化溶液セル１０においては、結晶化溶液へ電界を印加するための電極として、結晶核の生成や結晶成長を妨げない透明導電体電極２を用いる。
透明導電体電極２にて低電圧の印加を行うことで、簡便で効率的に生体高分子の結晶生成を行うことができる。これに加え、結晶成長の状態を外部から電極を通して光学的に観察できる。
本発明の実施の形態に係る透明導電体電極２は、電界印加に用いるための、導電性が良く、かつ光透過性が良好な材料である。また、電極を含め結晶化溶液セルを構成する材料は、生体高分子の結晶形成を妨げない。
ここで、透明導電体電極２の構成について詳しく説明する。
【００２６】
まず、従来、電極材料として、バルク（通常）の金属、例えば銅、銀、金及び白金等が頻繁に使用されてきた。しかし、これらの通常の金属材料は、上述のように、生体高分子の結晶生成に活性である場合が多く、内部電界印加法で使用する電極としては適さないことが多かった。
また、通常の金属材料は、可視光の透過を遮るので、金属電極を通して結晶形成を光学的に観測するには困難であるという問題があった。
このため、本発明の実施の形態に係る結晶化溶液セル１０に用いる電極材料としては、可視光を透過しない通常の金属材料は好ましくない。
【００２７】
ここで、従来、金属を光が透過する程度まで薄膜化した、極めて薄い金属薄膜、例えば厚さ３０ｎｍ〜４０ｎｍの銀、金、銅等の真空蒸着膜、スパッタ膜等が存在する。
本発明の実施の形態に係る結晶化溶液セル１０においては、このような極めて薄い金属薄膜等を用いることも可能である。
しかし、このような非常に薄い金属薄膜は、基板から剥離しやすく、またバルクの金属に比べて力学的強度が著しく低下している。このため、このような金属薄膜を結晶化溶液セル１０における透明導電体電極２のような電極として用いるには、金属薄膜上に保護膜を形成する必要がある。
しかし、多くの保護膜は誘電体であるために、電気絶縁体として働く。従って、印加した電界は、この保護膜によって弱められる。
【００２８】
よって、導電性が高く、かつ光透過性の良い透明導電体が、本発明の実施の形態に係る生体高分子の結晶化方法に用いる結晶化溶液セル１０の透明導電体電極２として適切である。
この好ましい透明導電体としては、例えば、無機酸化物である、スズ含有の酸化インジウム（Ｉｎ２Ｏ３：Ｓｎ，ＩＴＯ）、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、酸化錫（ＳｎＯ２）、酸化チタン（ＴｉＯ２）などが挙げられる。また、透明性のあるポリチオフェン系やポリピロール系などの導電性高分子も利用できる。
また、このような無機酸化物や導電性高分子の透明導電体は、従来の金属電極と異なり、生体高分子の結晶核形成や結晶成長の妨げにならないという効果を備えている。このため、本発明の実施の形態に係る透明導電体電極２として、特に好ましい。
【００２９】
これらの透明導電体は、電極として単体の厚い金属板のような状態でも用いることも可能である。しかしながら、多くの透明導電体は薄膜で作製することができる。このため、本実施形態では、基板上に形成された透明導電体の薄膜を、電圧印加の電極である透明導電体電極２として使用する。
無機酸化物の透明導電薄体薄膜は、抵抗加熱や電子ビーム照射による真空蒸着法、スパッタリング法等のドライプロセス、ゾルゲル法等のウェットプロセス等によって作製される。また、導電性高分子の薄膜は、高分子を溶媒に溶解させて溶液から作製するスピンコート法やスプレー法等によって作製される。
【００３０】
特に、スパッタリング法によって作製されたＩＴＯ膜は、導電性と光透過性が高く、膜の緻密性が良く、表面形状が滑らかで良質な透明導電性を示す。このため、本発明の実施の形態に係る透明導電体電極２に用いる透明導電体薄膜として、スパッタリング法によって作製されたＩＴＯ膜は、特に好ましい。
たとえば、透明導電体電極２として、膜厚数百ｎｍで表面粗さ３０ｎｍ程度以下の、面抵抗数１０Ω/ｃｍ2以下を示す、可視光領域の透過率８０％程度以上である、良質のＩＴＯ膜を用いることができる。
なお、電極表面の形状が粗い場合、その表面が結晶成長の核となることがある。このため、電極の表面は、できるだけ表面の粗さが小さいことが好ましい。
【００３１】
（透明基板３の構成）
本発明の実施の形態に係る結晶化溶液セル１０においては、上述したように、透明基板３の上に、電極となる透明導電体薄膜である透明導電体電極２が形成される。
この透明基板３は、透明導電体薄膜との密着性が良く、光透過性が良好な材料であればよい。特に、各種の透明ガラスや透明プラスチック等が透明導電体薄膜の形成用の透明基板３として適切である。この透明基板３は、透明であるため、結晶成長の状態を光学的に観察できるという効果が得られる。
透明基板３を、ガラス基板を用いて形成する場合は、可視光領域で透過性が良く、均質性に優れ、化学的に安定している、ＢＫ７やパイレックス（登録商標）等のホウ珪酸ガラス、紫外線領域にも透過性のある石英ガラス等が特に好ましい。
透明基板３を、プラスチック基板を用いて形成する場合は、光透過性に優れ、化学的にも安定なプラスチック基板として、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）等のポリエステル樹脂やポリイミド樹脂等が好ましく使用できる。このようなプラスチック基板は、硬いガラス基板と異なり、容易に曲げられるフレキシブル基板として使用できる。
【００３２】
透明基板３の形状は、特に制限はなく、平板、円柱、円筒及び球状など様々な形状の基板が使用できる。
この中で平板状基板が最も使用しやすく、比較的簡単な構造で本発明の実施の形態に係る結晶化溶液セル１０を構成できるために、特に好ましい。
【００３３】
（電気絶縁部材４の構成）
結晶化溶液セルがサンドイッチ型電極構造である場合、溶液中に形成される電界の大きさは、印加する電圧の大きさと、透明導電体電極２の間に挟む絶縁スペーサーである電気絶縁部材４の厚さに依存する。
絶縁スペーサーの電気絶縁性が劣化しない範囲であれば、電気絶縁部材４の厚さに制限はなく、可能な限り絶縁スペーサーの厚さを薄くするように構成するのが好適である。
より薄い絶縁スペーサーを使用すると、より低い電圧の印加で、より高い電界を結晶化溶液１に印加し、生体高分子の結晶化を促進させることが可能である。また、使用する結晶化溶液の容量を少量化できるという効果が得られる。
【００３４】
電気絶縁部材４は、電極間に印加する電圧を電気的に絶縁し、結晶化溶液を保持する機能を備える。
この電気絶縁部材４の素材としては、電気絶縁性に優れ、化学的に安定なものが好ましい。特に好ましい電気絶縁部材４の素材としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、アクリル、フッ素ゴム、シリコンゴム等が挙げられる。
その中で電気絶縁部材４の素材として、シリコンゴムが特に好ましい。これは、耐熱性、耐寒性、耐薬品性に優れており、加工が容易であり、また基板と容易に密着するので使用しやすいためである。
【００３５】
（結晶化溶液セル１０による結晶化方法）
サンドイッチ型構造の結晶化溶液セル１０において、電気絶縁部材４にシリコンゴムの絶縁スペーサーを用いる場合、シリコンゴムのシートやフイルムを用いることが特に好ましい。この場合、シリコンゴムのシートやフイルムは、ガラス基板等の密着性も比較的良好であり、簡単に結晶化溶液セル１０を構成する材料とすることができる。
すなわち、電気絶縁部材４であるシリコンゴムのシートやフィルム内に、例えば円形や楕円形、及び長方形等の任意形状の溝孔を形成し、２つの透明基板３でこの絶縁スペーサーを挟むことによって形成される溝孔の空間を、結晶化溶液セル１０の容器として用いることができる。これにより、電気絶縁部材４と透明基板３とは、結晶化溶液１を保持する容器として機能する。
【００３６】
上述したように、結晶化溶液１は、結晶化溶液セル１０の溝孔の空間の容器に注入されて保持される。
たとえば、生体高分子溶液と沈殿剤溶液とを混合させ、溶液セル内に混合溶液を封じ込めるバッチ法で結晶化させる場合には、溝孔を絶縁スペーサー内に形成し、２つの電極基板で内接させて封止する。
また、例えば、蒸気拡散法による結晶作製の場合も、バッチ法と同様に溶液セルの中に必要な溶液を離した状態で封止する。
【００３７】
結晶化溶液セル１０に注入・保持できる結晶化溶液１の容量には、特に制限はない。しかしながら、高純度の生体高分子は高価、貴重であるため、溶液の使用量は可能な限り、少ないことが望ましい。
結晶化溶液セルに収容可能な結晶化溶液の最大容量は、絶縁スペーサー内に形成した溝孔の面積と絶縁スペーサーの厚さによって決定される。例えば、絶縁スペーサーの厚さが１ｍｍで溝孔の面積が１０ｍｍ2の円筒形の溶液セルの空間には、最大１０μＬの結晶化溶液を収容できる。
【００３８】
なお、結晶化溶液セル１０に注入口を設け、この注入口から結晶化で使用する各溶液を注入して使用してもよい。
この場合、結晶化溶液が空気と触れて酸化するのを防ぐため、また結晶化溶液からの蒸発を防止するために、例えばパラフィンオイル等で結晶化溶液をシールする。
また、結晶化溶液セルから溶液が漏れ出ないように、絶縁スペーサーと電極基板とを強く密着させ、結晶化溶液をシールすることもできる。
さらにまた、好ましくは、溶液漏れを防止するために、例えばグリース等でシールすることも可能である。
漏れ防止用グリースとしては、シリコングリース等が使用できる。
【００３９】
また、本発明の実施の形態に係る結晶化溶液セル１０をマイクロ流路（デバイス）と接続することも可能である。
この場合、結晶化させる生体高分子溶液とその結晶化用沈殿剤溶液を、電界印加用の結晶化溶液セル１０へ注入して使用することもできる。この場合も、結晶化溶液セル１０に溶液の注入口を設けて使用する。
また、バッファー（緩衝液）等を加えて電界印加用の結晶化溶液セル１０内で結晶化溶液１を調製するように構成してもよい。
【００４０】
〔本発明の実施の形態に係る生体高分子の結晶化方法〕
（結晶化溶液１の構成）
ここで、本発明の実施の形態に係る生体高分子結晶化装置１００を用いて、生体高分子を結晶化する方法について、さらに詳しく説明する。
以下で、図２のフローチャートを参照して、この結晶化溶液１を用いて、生体高分子の結晶化を行う具体的な方法について説明する。
【００４１】
（ステップＳ１０１）
まず、生体高分子の結晶化溶液１の具体的な調製を行う。
タンパク質のような生体高分子の結晶は、過飽和溶液から析出させ、作製される。すなわち、一般に、生体高分子を含む溶液に塩類、有機溶媒、及び水溶性高分子などの沈殿剤を加え、溶液を過飽和状態にすることで、結晶化が行われる。
【００４２】
本発明の実施の形態に係る生体高分子の結晶化溶液１は、結晶生成の対象である生体高分子と、生体高分子を結晶化するための沈殿剤とを含む溶液、或いは、それらを含む各溶液の組み合わせを用いることができる。その際に、これらの溶液には、ｐＨ値を制御するために、結晶化に適切な緩衝液（バッファー）を使用できる。
また、結晶化溶液１は、結晶を作成したい生体高分子毎に用意する。この生体高分子としては、例えばタンパク質を用いることができる。たとえば、後述の実施例では、ニワトリ卵白リゾチームとその沈殿剤である塩化ナトリウムを含む水溶液を用いている。
なお、タンパク質やペプチドなどに代表される生体高分子に限らず、極性を有する低分子や高分子の有機分子を対象とすることもできる。
【００４３】
ここで、タンパク質等の生体高分子を含む溶液から結晶を生成させる代表的な手法には、蒸気拡散法、バッチ法、及び透析法などがある。
これらの結晶化方法では、いずれも、高純度に精製された生体高分子を含む溶液とその結晶化沈殿剤とを含む溶液等を適宜、混合させ、生体高分子の結晶化を行う。
例えば、タンパク質の結晶化方法で最もよく行われる蒸気拡散法では、タンパク質と沈殿剤を含む溶液と、沈殿剤のみを含む溶液とを組み合わせて、同じ溶器内において離した状態で入れて密閉し、その空間を介した蒸気平衡の条件下で結晶化される。
【００４４】
タンパク質のような生体高分子の結晶作製は、沈殿剤を用いて結晶化溶液を過飽和状態にして行う。
しかし、沈殿剤や生体高分子の濃度等を必要以上に上げ過ぎるなど、結晶化溶液が過度に過飽和状態になる。すると、多くの場合、一度に多数の微結晶が生成され、結晶構造解析に適した良質の大型結晶を得ることが難しくなる。
従って、極く少数の結晶核を生成させ、結晶化溶液中において、できる限りゆっくり結晶を成長させることが好ましい。
【００４５】
ここで、良質で大型の生体高分子結晶を作製するには、準安定状態にある結晶化溶液において、結晶の作製を行うことが望ましい。本実施形態では、結晶化溶液の濃度などが変化したり、光、振動、圧力、磁界や電界などの何らかの刺激が無ければ、そのまま結晶化溶液を静置しても、結晶生成が生じ難いような溶液の状態を準安定状態とよぶ。
本発明の実施の形態に係る電界印加による生体高分子の結晶化方法においても、好ましくは、このような準安定状態の結晶化溶液１を用いる。
【００４６】
（ステップＳ１０２）
次に、結晶化溶液１への電圧の印加を行う。
ここで、タンパク質のような多くの生体高分子は、極性側鎖を持ち、それらの側鎖間で水素結合し、立体構造（高次構造）を保持している。
また、たとえば、タンパク質は、水溶液中でアミノ基やカルボキシル基による極性電荷を持っている。このため、タンパク質は、グルタミン酸やアスパラギン酸、及びリジン等、アミノ酸側鎖によって、部分的に電荷を帯びている。
生体高分子の立体構造は、このような極性側鎖間の水素結合に大きく依存する。また、生体高分子の表面に現れる正味の電荷の種類（正負）や電荷量は、生体高分子の極性側鎖の種類や配置、及びその立体構造と、その溶液のｐＨ値等に依存する。
【００４７】
タンパク質の総電荷の指標としてよく用いられる等電点ｐＨ（あるいは単に等電点）は、水溶液中でタンパク質の全体の表面電荷量が０となるｐＨ値である。
等電点が７以下のタンパク質は酸性タンパク質と呼ばれ、反対に７以上では塩基性タンパク質と呼ばれている。
タンパク質の総電荷は、等電点より高いｐＨの溶液では負になり、逆に低いｐＨでは正となる。
このようにタンパク質のような生体高分子は、溶液中で溶液のｐＨ値に依存した正味の電荷を帯びている。
【００４８】
従って、溶液中で全体的に帯電した生体高分子に電界を印加した場合には、電界から静電気力を受け、熱エネルギー以外に生体高分子を運動させる駆動力となる。
帯電した生体高分子は、電界からの静電気力を受ける。それと同時に、帯電した生体高分子は、速度とともに増大する抵抗力を周囲媒質から受ける。よって、帯電した生体高分子は、両者の力の平衡状態において、所定の速度で運動する。
【００４９】
生体高分子の結晶化は、主として、極性を持った生体高分子間の相互作用に起因した配向によって生じ、結晶の核形成から成長へと結晶生成の過程をたどる。
溶液中では生体高分子は、極性を持った側鎖により部分的に帯電した状態にあるので、外部から電界を印加すれば、生体高分子を配向させ、その配向を制御できる。
したがって、本発明の実施の形態に係る電界印加によって、溶液中で帯電した生体高分子を配向制御する配向制御方法を提供する。
【００５０】
ここで、帯電した生体高分子を静的電界によって運動させる現象は、従来から、電気泳動と知られている。この電気泳動は、生体高分子の分離や解析に広く利用されている。
たとえば、ニワトリ卵白リゾチームは、等電点ｐＨ１０．５〜１１．０であり、すなわち、塩基性タンパク質である。
ニワトリ卵白リゾチームは、例えばｐＨ４．６の酢酸緩衝液中では、そのタンパク質は総電荷量として、正に帯電している。
上述のような電気泳動を行うためには、通常、直流電圧を印加して形成される静的電界をかける。
このような静的電界により、ニワトリ卵白リゾチームは、電界と同じ方向に電気泳動力を受けて運動する。
【００５１】
これに対し、時間的に変化する電圧の印加、すなわち非定常電界による帯電した生体高分子に働く電気泳動力は、印加電圧の周波数、及び周囲媒質との相互作用による緩和時間に依存する。
たとえば、非定常電界として正弦波交流電圧を印加した場合、電気泳動力は、時間平均するとゼロとなる。このため、遠距離スケールにおいては、電圧印加にも関わらず、生体高分子には正味の電気泳動力は作用しない。
しかし、時間変化する電圧印加で形成される非定常電界は、短時間であっても、帯電した生体高分子、及び溶液に含まれる電解質イオン等に対し局所的な駆動力を与える。よって、これらを揺動させることができる。
また、電極が直接、結晶化溶液に接触する内部電界印加法では、交流電圧の印加は、電気分解等の電極における化学反応を抑制する効果がある。
【００５２】
ここで、本発明の実施の形態に係る結晶化溶液１内に形成する電界は、電圧発生器５から透明導電体電極２に印加される電圧によって形成される。
この印加される電圧の種類には、特に制限はなく、結晶化する生体高分子の性質や結晶化溶液の特性（濃度、ｐＨ値、温度等）等に応じて設定する。
また、この印加される電圧としては、例えば直流および／あるいは交流電圧が利用できる。交流電圧の種類としては、代表的な正弦波の他に、三角波や方形波などが挙げられ、本発明で用いることができる。
また、連続的に変化する交流電圧の他に、単発的なパルス波などの電圧も使用できる。
さらにまた、直流電圧に交流電圧を重畳させて、結晶化溶液１に電界を印加しても良い。
【００５３】
電界印加による結晶化における設定パラメーターとしては、従来の直流電圧印加では電極間の印加電圧の大きさを用いていた。
これに対して、本発明の実施の形態に係る結晶化方法における交流電圧を印加する場合には、実効値と周波数もパラメーターとして設定する。
【００５４】
また、本実施形態に係る結晶化方法において、結晶化溶液１へ印加する電圧は、結晶化溶液の導電性や誘電性等の特性、生体高分子の結晶化条件、電極として用いる透明導電体の導電性等の特性、溶液セルの構造などに応じて、最適な印加電圧の種類を決定する。
この際、結晶化溶液１へ印加する電圧は、可能な限り低くすることが好ましい。ｐＨ値調整用の緩衝溶液を含む結晶化溶液１には、電解イオンが含まれることが多く、結晶化溶液は導電性を示す。そのために、ある程度以上高い電圧印加による高電界は、結晶化溶液１の中に大きな伝導電流を生じさせる。これにより、ジュール熱が発生し、結晶化溶液１の温度を上昇させるなどの影響が現れる場合がある。よって、低い電圧を印加することが好ましい。
【００５５】
なお、本発明の実施の形態に係る生体高分子の結晶化方法において、「直流低電圧」とは、電圧の大きさが５０Ｖ程度以下の直流電圧、特に１０Ｖ以下であることを指す。
また、「交流低電圧」とは、実効値が上記同様に５０Ｖ程度以下の交流電圧、特に１０Ｖ以下であることを指す。
【００５６】
また、溶液中の伝導電流は、電極表面で電子授受に伴う化学反応を促進させる。
このような電極表面の化学反応は、結晶化溶液の電解質濃度やｐＨ値などを変化させるため、生体高分子の結晶生成の環境を大きく変化させる。よって、電極表面の化学反応は、良質な結晶作製として好ましくない。
従って、結晶化溶液中にある程度以上高い電界を形成することは、生体高分子の結晶成長に対して好ましくない。
また、高電界は、生体高分子自身の構造や周囲の溶媒との相互作用等を大きく変化させる要因にもなるので、できるだけ低電圧印加が好ましい。
結晶化に適した溶液中での電界の大きさと分布は、生体高分子や沈殿剤の種類や濃度、使用する緩衝溶液の種類やｐＨ値、および溶液の温度などに依存する。このため、これらの特性を踏まえ、電極間の距離や電極の配置を考慮して印加する電圧を決定する。
【００５７】
結晶化溶液１へ印加する電圧を発生させる電圧発生器５には、低電力供給用の直流電源、あるいは正弦波や三角波等の交流電圧を発生できる低電力供給用の交流電源が使用できる。
本発明の実施の形態に係る好ましい電圧発生器５としては、数ｍＨｚ〜数十ＭＨｚの広い周波数範囲で、最大出力電圧１０Ｖ程度の正弦波や三角波、及び矩形波などの様々な形状の交流電圧を発生させることができ、また１０Ｖ程度以下の直流電圧を発生できる、低電力供給用のファンクションジェネレータを用いることができる。
また、電圧発生器５として、連続的に電圧を発生する他に、トリガ発振、ゲート発振で電圧発生を制御動作できる機能、さらにスイープや変調、電圧発生のプログラム機能を搭載したファンクションジェネレータを用いることもできる。
【００５８】
結晶化溶液１へ印加する時間としては、電界により生体高分子を配向させるための十分な時間、印加する。この時間は、数時間〜数日程度が好適である。あまり短い時間の印加では生体高分子を十分配向できず、逆に、長い時間印加しすぎると結晶の品質に影響することが考えられる。また、生体高分子の種類により、例えば膜タンパクのように結晶化しずらい生体高分子の場合は、長めに低電圧の電界を印加する／又は強めの電界をパルス的に印加する等の条件を設定することができる。
そして、電圧印加を中止した後、数日〜数十日程度放置することで、結晶を生成することができる。ここで、結晶ができない場合、品質が十分でなかった場合には、上述のステップに戻り、条件を検討しなおすことが可能である。
この際に、本実施形態の結晶化溶液セル１０は、光学的に結晶を観察できるため、好適である。
【００５９】
（ステップＳ１０３）
次に、生体高分子結晶の回収を行う。
本発明の実施の形態に係る結晶化溶液セル１０において、生成（製造）された生体高分子の結晶は、溶液セルから容易に回収することが可能である。
生成させた結晶の回収方法としては、結晶化溶液セル１０を分解し、溶液ごと結晶を取り出す、又は溶液の注入口から溶液中の結晶を取り出す等の方法を用いることができる。
また、結晶化溶液セル１０に予め回収用取出し口を設けておき、溶液セルを分解せずに生成された結晶を回収することもできる。
【００６０】
また、Ｘ線や中性子線の回折測定等で構造解析を行うために、場合によっては、電界印加によって生成した生体高分子結晶をさらに育成する。
これには、本発明の実施の形態に係る結晶化溶液セル１０から回収した生体高分子結晶を、結晶成長用溶液セル（図示せず）へ移し、その中で生体高分子原料等を補給して、結晶を大型化させることもできる。
【００６１】
さらにまた、結晶化溶液セル１０から、生成した生体高分子の結晶を回収せずに、結晶化溶液セル１０自体をＸ線や中性子線の回折測定装置等の測定部に取り付け、生成結晶を溶液中で構造評価することも可能である。
これにより、乾燥によりタンパク質等の生体高分子の高次構造が損なわれることを防ぐことができる。また、より正確な高次構造を解析可能である。
【００６２】
以上のように構成することで、以下のような効果を得ることができる。
まず、従来の電界印加法の為の結晶化装置では、バルクの金属を用いた電極を用いており、結晶核形成や結晶成長の妨げになるという問題があった。このため、結晶核形成や結晶成長の妨げにならない電極材料や構造の構成が求められていた。
これに対して、本発明の実施の形態に係る生体高分子結晶化装置１００は、結晶化セル１０における電界を印加するための透明導電体電極２として、通常の金属電極ではない透明導電体電極を用いた。この透明導電体電極２は、バルクの金属の電極と異なり、多数の微結晶が生じない。このため、結晶生成の妨げにはならないという特徴を備える。
すなわち、透明導電体電極２を用いることで、結晶化する生体高分子が結晶生成において金属に対して活性であっても、良好な結晶を作成できる。
【００６３】
また、上述したように、本発明の実施の形態に係る結晶化溶液セル１０は、透明導電体電極２を薄膜状に形成し、電気絶縁部材４にて透明導電体電極２を挟んで保持するように構成することができる。
これにより、結晶化溶液１に対して、ほぼ一様な電界を印加することができる。すなわち、均一、平等な電界により、生体高分子を好適に配向をすることができ、良質（高品質）な生体高分子の結晶を製造可能である。
【００６４】
また、本発明の実施の形態に係る生体高分子結晶化装置１００は、電極を結晶化溶液に直接、接触させて低電圧を印加する。このため、電気絶縁に対する特別な配慮を施す必要がないという特徴を備える。
また、生体高分子結晶化装置１００を用いた低電圧の印加により、微量の生体高分子溶液であっても、生体高分子を配向制御することができる。
【００６５】
また、従来、生体高分子の結晶化溶液の温度は、結晶生成や成長に重大な影響を与える要因であった。
これに対して、本発明の実施の形態に係る結晶化溶液セル１０には、低電圧による低電力の投入を行う。このため、ジュール熱による結晶化溶液の温度上昇を大幅に抑制できる。また、低電圧であるため電気分解等も起こりにくく、結晶化溶液１のｐＨ等の変化による劣化を抑えることができる。
よって、従来の電界印加による生体高分子の結晶化方法、及び結晶化装置より、良好な生体高分子の結晶を得ることができる。
【００６６】
さらに、光透過性の著しく低いバルクの金属電極に比べ、透明導電体電極２は、可視光領域における光透過性が十分高いという特徴を備える。また、本実施形態においては、透明基板３も、光透過性が高いように構成している。
このため、本発明の実施の形態に係る結晶化溶液セル１０は、結晶成長の状態を外部から光学的に観察できる。
よって、外部からの光学的観察が妨げられない。すなわち、生体高分子の結晶成長の観察を容易に行うことができる。これにより、より適切な条件にて生体高分子の結晶を成長させることができる。
また、観察用光学窓を結晶化溶液セル１０に設ける必要がないため、結晶化溶液セルを小型化できる。これにより、結晶化溶液１が微量であっても、効率的に生体高分子の結晶を製造（作成、生成）することができる。
【００６７】
また、結晶化溶液セル１０は、密封することができ、水分等の蒸発を抑えることができ、埃や細菌や異物等の混入を防ぐことができる。このため、結晶化溶液１の劣化を抑えることができ、従来よりも高品質の生体高分子の結晶を得ることができる。
また、短期間に結晶を生成することができるため、結晶化溶液１の組成の差等の影響を受けにくく、容易に結晶化が可能である。
【００６８】
以上のように、本実施形態に係る生体高分子結晶化装置１００は、結晶化用の溶液に電界を印加するための電極として、結晶生成の妨げにならない透明導電体を用い、微量の生体高分子溶液に対して低電圧の印加で結晶生成が効率良くできるように電極の配置を考慮した構造の結晶化溶液セルを構成し、電極側からの結晶形成の状態を光学的に観察できることを特徴とする。
生体高分子結晶化装置１００により、微量の結晶化溶液で効率的に結晶を作製する方法、及びその作製装置（結晶化装置）を提供することができる。
【００６９】
作製された生体高分子の結晶は、ＮＭＲ測定やＸ線回折測定、さらにまた中性子線回折測定によって結晶構造の解析が可能である。特に、中性子線回折測定による構造解析から、生体高分子の機能や生化学反応に関わる水素や水分子の配置についての詳細な情報を得ることができる。
そのための実験研究施設として、例えば、大強度陽子加速器施設（Ｊ−ＰＡＲＣ）内に設置されている物質・生命科学実験施設などが利用できる。
なお、このような結晶解析の際に、結晶を静置したままの結晶化溶液セル１０を解析装置に搭載可能である。
【００７０】
なお、本発明の実施の形態に係る生体高分子としては、タンパク質を用いることが好適であるが、これに限られない。たとえば、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の核酸、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、脂質、糖、その他の高分子の有機化合物を用いることができる。
また、タンパク質としても、通常のアミノ酸のみが結合したタンパク質の他に、糖タンパク、脂質とタンパクの混合物等も扱うことができる。さらに、タンパク質を所定の酵素等で消化したペプチド、ユニット、あるいはタンパク質のコンプレックス等も、そのまま結晶化可能である。さらに、生体の代謝産物、低分子〜高分子の薬物等の結晶を作成することも可能である。さらに、生体高分子以外の液晶材料等も結晶化可能である。
また、タンパク質に多少の不純物が残っている場合でも、均一に電圧がかかるため、良質の単結晶を得て選択することができる。
さらに、結晶化の対象を生体高分子に限定することもなく、低分子や高分子の有機材料に対し、溶液からの最適な結晶化条件の探索、及び結晶作製にも利用できる。
【００７１】
なお、他の構造の結晶化溶液セルの構成としては、透明導電体電極と透明基板とを、一方の面にのみ備えるように構成することもできる。また、例えば、他方の面の電極や基板を鏡面状に構成することもできる。これにより、透明な面を通して反射した光により、生体高分子の結晶を観察することができる。
【００７２】
また、他の構造の結晶化溶液セルの構成としては、いわゆるコプレナー型電極構造で構成することもできる。すなわち、同一基板上に、例えば平行に適宜間隔で透明導電体薄膜を形成し、この透明薄膜電極間に結晶化溶液を静置し、基板に平行に電圧を印加する。この際に、多数組の電極を基板上に並んで配置して構成しても良く、例えば、くし型電極の配置とすることができる。
このコプレナー型電極構造の場合、基板が誘電体材料であって電気絶縁性を有するように構成する。このため、基板自体が電極間の電気絶縁部材として機能し、特に他の電気絶縁部材で両電極間を絶縁する必要もない。しかしながら、この場合でも電気絶縁部材を薄膜電極間に配置して、その電気絶縁部材内に結晶化溶液を注入し保持することができる。
コプレナー型電極構造の結晶化溶液セルでは、電極をお互いに対向して平行に配置したサンドイッチ型電極構造と異なり、結晶化溶液の電界分布は一様ではない。このため、結晶生成の促進効果を高めるためには、より高い電圧の印加が必要となる。
【実施例】
【００７３】
次に図面に基づき本発明を実施例によりさらに説明するが、以下の具体例は本発明を限定するものではない。【００７４】
ここで、図３Ａと図３Ｂとを参照して、ニワトリ卵白リゾチームの作成の一結果例を示す（実施例１）。
まず、実施例１では、結晶化溶液セル１０として、透明導電体電極２として、厚さ約１４０ｎｍのＩＴＯ膜（面抵抗約１０Ω/ｃｍ２、透過率８３％以上）を、透明基板３である平板状ガラス基板上に形成した。
また、直径約７ｍｍの円形の溝孔を加工形成した厚さ１ｍｍのシリコンゴムを、電気絶縁部材４の絶縁スペーサーに使用した。
そして、透明基板３を１対、透明導電体電極２を対面するように配置し、電気絶縁部材４で分離し、結晶化溶液セル１０として構成した。【００７５】
ここで、実施例１においては、ｐＨ値４．６の酢酸緩衝液において、濃度３０ｍｇ／ｍＬのニワトリ卵白リゾチームと、沈殿剤として濃度３％の塩化ナトリウムを混合した溶液を、結晶化溶液１として使用した。したがって、この場合、結晶化溶液は、いわゆるバッチ法に基づき作製された。この際、電圧印加による結晶化試験の比較のために、同じ条件下で作製した結晶化溶液１を使用した。上記条件におけるニワトリ卵白リゾチームの結晶化溶液１は、温度２０℃で、結晶核形成の原因となる埃などの混入や結晶化に影響を及ぼす外部からの何らかの刺激などがなければ、結晶化が起こらないような準安定状態にあった。
この上で、結晶化溶液セル１０の溝孔に、調製したニワトリ卵白リゾチームの結晶化溶液である結晶化溶液１を、約３０μＬを封入した。  【００７６】
なお、ニワトリ卵白リゾチームは、結晶化の諸条件がよく調べられている代表的なタンパク質であり、高純度の良質結晶体が容易に入手できる。このため、本発明の実施例として適切な生体高分子である。
また、塩化ナトリウム等の塩は、タンパク質溶液を過飽和状態にして結晶化させるための沈殿剤としてよく用いられる。
また、酢酸緩衝液やリン酸緩衝液は、ｐＨ値を安定させる緩衝液（バッファー）にとして、一般的に使用されている。【００７７】
次に、電圧発生器５から、透明導電体電極２のＩＴＯ膜の電極間に、ニワトリ卵白リゾチームの結晶化溶液１に最適な所定時間、交流電圧を印加した。
実施例１においては、ニワトリ卵白リゾチームの結晶化溶液１を封入した結晶化溶液セル１０において、電圧発生器５のファンクションジェネレータで発生させた周波数２０Ｈｚ、実効値０．７１Ｖの正弦波交流電圧を透明導電体薄膜の透明導電体電極２へ、９時間印加した。その後、電圧印加を中止して２日間放置した。電圧の印加中、及びその後の経過の観察中は、室温２０℃で結晶化溶液セルを静置した。
また、透明導電体電極で構成した結晶化溶液セル１０は、電圧を印加せずに同期間、同一条件下で静置した（比較例１）。
そして、電圧印加を中止した後、数日後に結晶化溶液セル１０内の結晶形成状態を観察した。【００７８】
透明導電体電極に電圧を印加しなかった比較例１の結晶化溶液セル１０（図示せず）においては、ニワトリ卵白リゾチームの結晶形成は確認されなかった。従って、準安定状態にある結晶化溶液において、室温２０℃でこの静置期間では、ニワトリ卵白リゾチームの結晶が生成されないことが分かった。
また、透明導電体が結晶化溶液に直接触れているにも関わらず、結晶生成が見られないことから、ＩＴＯ透明導電体薄膜は、ニワトリ卵白リゾチームの結晶核形成や結晶成長の妨げにならないこと、さらにまた、絶縁スペーサーに使用したシリコンゴムも結晶形成の妨げにはならないことを示している。【００７９】
これに対して、結晶化溶液に電圧を印加した場合について、図３Ａと図３Ｂを参照して説明する。図３Ａと図３Ｂは、透明導電体電極２を通して撮影した実施例１の結晶化溶液内１の光学顕微鏡による写真である。
図３Ａ（×１２倍）、及びその拡大写真である図３Ｂ（×２４倍）に示すように、１個の立方体形状（一辺サイズ約０．５ｍｍ）のニワトリ卵白リゾチーム結晶である結晶Ｃが形成された。
この実施例において、結晶化溶液に印加された電界が、約７．１×１０2Ｖ／ｍという低値であったにも関わらず、準安定状態にある結晶化溶液に対して結晶化を促進する効果が認められた。
また、結晶化溶液セル１０は十分透明であるため、顕微鏡の光照射部からの光を通して、結晶の状態を観察可能であった。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明の生体高分子の結晶化方法、及び結晶化装置は、タンパク質のような生体高分子の結晶化条件の探索、並びにＸ線や中性子線回折測定による結晶構造解析に適応する高品質な生体高分子結晶の作製に利用することができる。
【符号の説明】
【００８１】
１  結晶化溶液
２  透明導電体電極
３  透明基板
４  電気絶縁部材
５  電圧発生器
１０  結晶化溶液セル
１００  生体高分子結晶化装置
Ｃ  結晶
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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