(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号10のアミノ酸17からアミノ酸153までの範囲内から選ばれる癌療法増感活性を有する単離されたポリペプチドであって、配列番号3、5、8、9から選ばれるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むポリペプチド。
【請求項２】
配列番号8のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
配列番号9のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
請求項1〜3のいずれかのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる単離されたポリヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号3のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む請求項1記載のポリペプチドおよび医薬的に許容される担体または賦形剤を含む組成物。
【請求項６】
配列番号5のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む請求項1記載のポリペプチドおよび医薬的に許容される担体または賦形剤を含む組成物。
【請求項７】
配列番号8のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む請求項1記載のポリペプチドおよび医薬的に許容される担体または賦形剤を含む組成物。
【請求項８】
配列番号9のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む請求項1記載のポリペプチドおよび医薬的に許容される担体または賦形剤を含む組成物。
【請求項９】
請求項2〜3中の2またはそれ以上のポリペプチド、および/または請求項5〜8中の2またはそれ以上の組成物を含む組成物。
【請求項１０】
さらに癌療法剤を含む請求項5〜9のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
請求項2〜3中の少なくとも1のポリペプチドおよび医薬的に許容される担体または賦形剤を含む組成物。
【請求項１２】
癌療法剤が、1またはそれ以上の化学療法剤、1またはそれ以上の放射線療法剤、1またはそれ以上の代替療法剤、およびその組み合わせからなる群から選ばれる請求項10記載の組成物。
【請求項１３】
癌療法増感活性を有する、配列番号3、5、8、または9のアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【請求項１４】
請求項13記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる単離されたポリヌクレオチド。
【請求項１５】
癌療法増感活性を有する、配列番号3、5、8、または9のアミノ酸配列からなるポリペプチドおよび医薬的に許容される担体または賦形剤を含む組成物。
【請求項１６】
さらに、1またはそれ以上の化学療法剤、1またはそれ以上の放射線療法剤、1またはそれ以上の代替療法剤、およびその組み合わせからなる群から選ばれる癌療法剤を含む請求項15に記載の組成物。
【請求項１７】
癌性細胞を癌療法剤で治療する前に、該細胞を癌療法剤に増感させるための、
配列番号3、配列番号5、配列番号8、および配列番号9のアミノ酸配列からなるポリペプチドの1またはそれ以上から選ばれるポリペプチドの使用であって、該細胞の増感がin vitroまたはex vivoでなされる、使用。
【請求項１８】
配列番号2、配列番号4、配列番号11、および配列番号12のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの1またはそれ以上から選ばれるポリヌクレオチドを含むベクターの使用であって、
癌性細胞を癌療法剤で処置する前に、
該細胞で該ベクターによって運ばれた該配列を発現させるための使用であって、該細胞における該ベクターによって運ばれた該配列の発現がin vitroまたはex vivoでなされる、使用。
【請求項１９】
癌療法剤が、1またはそれ以上の化学療法剤、1またはそれ以上の放射線療法剤、1またはそれ以上の代替療法剤、およびその組み合わせからなる群から選ばれる請求項17または18に記載の使用。
【請求項２０】
該ポリペプチドが配列番号3のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む請求項17記載の使用。
【請求項２１】
該ポリペプチドが配列番号5のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む請求項17記載の使用。
【請求項２２】
該ポリペプチドが配列番号8のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む請求項17記載の使用。
【請求項２３】
該ポリペプチドが配列番号9のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む請求項17記載の使用。
【請求項２４】
該ポリヌクレオチドが配列番号2のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含む請求項18記載の使用。
【請求項２５】
該ポリヌクレオチドが配列番号4のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含む請求項18記載の使用。
【請求項２６】
該ポリヌクレオチドが配列番号11のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含む請求項18記載の使用。
【請求項２７】
該ポリヌクレオチドが配列番号12のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドを含む請求項18記載の使用。
【請求項２８】
癌性細胞が治療法に抵抗性である請求項17〜27のいずれかに記載の使用。
【請求項２９】
配列番号2；配列番号4；配列番号11；および配列番号12のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの1またはそれ以上から選ばれる単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３０】
配列番号3；配列番号5；配列番号8；および配列番号9のアミノ酸配列からなるポリペプチドの1またはそれ以上から選ばれる単離されたポリペプチド。
【請求項３１】
配列番号2；配列番号4；配列番号11；および配列番号12のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドの1またはそれ以上から選ばれる単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３２】
該単離されたポリヌクレオチドが発現制御配列と操作可能に連結している請求項31記載のベクター。
【請求項３３】
遺伝子療法に適している請求項31または32記載のベクター。
【請求項３４】
該ヌクレオチドが発現制御配列と操作可能に連結している請求項29記載のポリヌクレオチドを含む細胞。
【請求項３５】
請求項31〜33のいずれかに記載のベクターでトランスフェクトした細胞またはその子孫。
【請求項３６】
請求項30記載のポリペプチドを発現する宿主細胞。
【請求項３７】
配列番号3；配列番号5；配列番号8；および配列番号9のアミノ酸配列からなるポリペプチドの1またはそれ以上から選ばれるポリペプチドをコードする発現ベクターの使用であって、
該ベクターを細胞に導入し、
発現を可能にする条件下で該細胞を維持するための、該ベクターの細胞への導入がex vivoでなされる、使用。
【請求項３８】
配列番号3；配列番号5；配列番号8；および配列番号9のアミノ酸配列からなるポリペプチドの1またはそれ以上から選ばれるポリペプチドをコードする発現ベクターの使用であって、
該ベクターを細胞に導入し、
発現を可能にする条件下で該細胞を維持するための、該ベクターの細胞への導入がin vitroでなされる、使用。
【請求項３９】
ポリペプチドを発現させる方法であって、
(a) 配列番号3；配列番号5；配列番号8；および配列番号9のアミノ酸配列からなるポリペプチドの1またはそれ以上から選ばれるポリペプチドをコードする発現ベクターを得、
(b) 該ベクターを細胞に導入し、
(c) 発現を可能にする条件下で該細胞を維持することを含む、該ベクターの細胞への導入がex vivoでなされる方法。
【請求項４０】
ポリペプチドを発現させる方法であって、
(a) 配列番号3；配列番号5；配列番号8；および配列番号9のアミノ酸配列からなるポリペプチドの1またはそれ以上から選ばれるポリペプチドをコードする発現ベクターを得、
(b) 該ベクターを細胞に導入し、
(c) 発現を可能にする条件下で該細胞を維持することを含む、該ベクターの細胞への導入がin vitroでなされる方法。
【請求項４１】
配列番号3のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４２】
配列番号5のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌療法を増感する組成物および方法、詳細にはSPARCタンパク質およびSPARC遺伝子に関連するポリペプチドおよびポリヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
癌はヒトの死をもたらす主な原因の1つであり、標準的化学療法、放射線療法、および外科的介入は多くの症例で腫瘍の負荷をうまく減少させるが、化学療法的介入に対する耐性が特に固形腫瘍では希ではない。耐性は、化学療法に曝露した後に発生し、さらに腫瘍の退縮や治癒を妨げる。この化学療法耐性が、癌の高死亡率を説明する治療の失敗をもたらす。
【０００３】
化学療法耐性の分子的原理は主として遺伝子的であり、多くの形を取りうる。腫瘍の初期発生に関与する多くの突然変異も薬剤耐性の一因となりうる。例えば、DNAミスマッチ修復(MMR)遺伝子機能の損失は、ある種の癌における臨床的薬剤耐性のより急速な発生と関連があり(de las Alas M.M.、et al.、1997. J Natl Canc Inst 89:1537-41；Lin X. and Howell、S.B. 1999. Mol Pharmacol 56:390-5)、K-ras遺伝子の突然変異(腺腫様ポリープおよび腺癌の約40%にみられる)は、再発率の増加、死亡率、および化学療法に対する反応が悪いことと関連がある(Arber N. et al. 2000. Gastroenterology 118:1045-1050)。通常は厳重に制御されている細胞の複製周期に関与するタンパク質の異常発現と調節異常も腫瘍を保護しうるし、これらタンパク質は、論文ではおおまかに「発癌遺伝子」と呼ばれることがある。例えば、遺伝子産物p21およびp27は、種々の抗癌剤により促進されるアポトーシスから腫瘍を保護することが示されている(Waldman T. et al.、1996. Uncoupling of S phase and mistosis induced by anticancer agents in cells lacking p21. Nature 381:713 716；St. Croix B. et al.、1996. Nature Med 1996、2:1204-1210)。付着分子(例えばE-カドヘリン)も化学療法剤に曝露した細胞に耐性を付与することがある(Skoudy A、et al.、1996. Biochem J 317: 279-84.)。治療に対する耐性に関与するメカニズムは多様であり、非常に複雑なことがある。
【０００４】
化学療法増感剤は、化学療法剤と協力して作用しうるか、または細胞の耐性メカニズムに対抗する役割を果たしうる。既存の化学療法増感剤には、低分子薬、例えば光増感剤、または薬物排出ポンプ阻害剤、より最近ではアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれる。化学療法増感活性を有する新規化合物は、療法剤の細胞毒性を増強する新規化合物の例を示すUS5776925およびWO 02/00164を包含する。
【０００５】
US6001563は、化学療法増感活性を有しうる化合物を同定する方法を提供する。
【０００６】
化学療法増感活性を有する(しばしば発癌遺伝子を特異的に標的化する)アンチセンス配列は多様であり、ほぼあらゆる標的にみいだすことができよう。例えば、サバイビンは、アポトーシスを調節するタンパク質であり、しばしば癌細胞に過剰発現する(Krajewska、M. et al. 2003. Clin Cancer Res 9:4914；Kaur、P. et al. 2004. Arch Pathol Lab Med 128:39；Shariat、S.F. et al.、2004. Urine detection of surviving is a sensitive marker for the noninvasive diagnosis of bladder cancer. J Urol 171：626)。アンチセンスサバイビンオリゴヌクレオチドは、サバイビンの発現を下方調節し、化学療法剤、例えばドセタキセルおよびエトポチドに対して細胞を増感する(Hayashi、N. et al.、2005. Prostate 15:10-19)。
【０００７】
同様に、癌療法増感剤は、癌療法剤、例えば放射線療法と共同して作用しうるか、または癌療法剤に対する細胞の耐性メカニズムに対抗する役割を果たしうる。
【０００８】
システインに富む酸性分泌タンパク質(SPARC)は、腫瘍抑制因子の役割を果たしうる、in vitro多剤耐性細胞系における発現が顕著に低下した遺伝子の一例である(Tai、I.T. et al. 2005. J. Clin Invest. 115:1492-1502)。オステオネクチンとしても知られるSPARCは、細胞マトリックス相互作用を破壊する反付着特性を有するマトリックス細胞タンパク質のファミリーに属する(Bornstein P. 1995. J.Cell Biol 130:503-6；Sage E. H. and Bornstein P. 1991. J Biol Chem；266:14831-4)。
【０００９】
SPARCは、骨石灰化、組織の再構築、内皮細胞の移動、形態形成、および血管形成に役割を果たすことがわかってきた(Latvala T. et al.、1996. Exp Eye Res. 63:579-84；Hasselaar P. and Sage EH.1992. J Cell Biochem. 49:272-83；Mason I.J. et al. 1986. EMBO J. 5:1831-7；Strandjord T.P. et al. 1995. Am J Respir Cell Mol Biol. 13:279-87；Kupprion C、et al.、1998. J Biol Chem. 273:29635-40；Lane T.F. et al. 1994. J Cell Biol. 125:929-43)。
【００１０】
培養中のウシ大動脈内皮細胞のSPARC介在抗拡散活性を阻害するネズミSPARCのN末端およびC末端ペプチドのいくつかが記載されている(Lane TF and Sage、EH 1990. J. Cell Biol 111:3065-3076)。
【００１１】
ホリスタチンドメインの1断片に相当するペプチドは、in vitroの内皮細胞移動、およびラット角膜アッセイモデルにおける血管形成を阻害する(Chlenski et al 2004. Cancer Res. 64:7420-7425)。
【００１２】
ネズミSPARCのカチオン領域に相当するあるペプチドは、in vitroおよびin vivoの毛細血管成長の刺激因子として作用する。しかしながら、Cu2+結合活性のみではペプチドが血管形成を刺激するのに十分ではないようである(Lane et al 1994. J Cell Biol 125:929-943)。
【００１３】
さらなる研究は、MMP-3によるSPARCの開裂が血管形成に影響を及ぼすペプチドを生じることを示唆する(Sage et al. 2003 J. Biol Chem 287: 37849-37857)。
【００１４】
SPARCは、可変遺伝子として悪性度にも役割を有し、SPARCのタンパク質発現は多くの腫瘍における癌の進行と関連がある(Yiu、G.K.et al.、2001. Am J.Pathol 159:609-622；Rempel S.A. et al.、2001. J Neurooncol 53:149-60；Schultz C. et al.、2002. Cancer Res 62:6270-7；Porter P.L. et al.、1995. J Histochem Cytochem 43:791-800)。SPARCノックアウト動物における研究は、SPARCの損失は膵臓癌および肺癌の腫瘍異種移植片の増殖を増強する(Puolakkainen P.A. et al.2004. Mol Cancer Res 2:215-24；Brekken R.A. et al. 2003. J Clin Invest111:487-95)。
【００１５】
単離された完全なSPARCタンパク質の化学療法増感剤としての使用はWO 2004/064785に記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
(発明の要約)
本発明のある態様は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号11、もしくは配列番号12の配列を含む単離されたポリペプチド、または配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号8、もしくは配列番号9の配列を含む単離されたポリペプチドを提供することである。関連する態様において、本発明は、配列番号3、5、もしくは7〜10のいずれかのアミノ酸配列、およびアミノ末端もしくはカルボキシル末端または両末端に位置するさらに50個以下のアミノ酸、好ましくはさらに25個以下のアミノ酸、より好ましくはさらに15個以下のアミノ酸、最も好ましくはさらに10個以下のアミノ酸を有する単離されたポリペプチドを提供する。本発明により得られたポリペプチドは、全長が50個以下のアミノ酸であるポリペプチドを含む。さらに関連する態様において、本発明は、配列番号3、5、および7〜10のアミノ酸配列ならびにさらにアミノ末端もしくはカルボキシル末端または両末端に位置するアミノ酸を有するポリペプチドをコードする単離されたポリペプチドも提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の別の態様は、癌療法増感活性を有する、配列番号10のアミノ酸17〜153から選ばれる単離されたポリペプチドを提供することである。本発明の別の態様は、発現すると癌療法増感活性を有する配列番号10のアミノ酸157〜56から選ばれる単離されたポリヌクレオチドを提供することである。
【００１８】
本発明の別の態様は、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、または配列番号12を含む医薬を提供することである。本発明は、さらに、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号8もしくは配列番号9、および化学療法剤を含む医薬を含みうる。本発明は、さらに配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号8、または配列番号9を、限定されるものではないが、1またはそれ以上の化学療法剤、1またはそれ以上の放射線療法剤、1またはそれ以上の代替療法剤、およびその組み合わせからなる群から選ばれる癌療法剤とともに含む医薬も含みうる。
【００１９】
本発明の別の態様は、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号11、もしくは配列番号12を含むベクター、または配列番号2、配列番号4、配列番号11、もしくは配列番号12を含むベクターを発現する宿主細胞を提供することである。
【００２０】
本発明の別の態様は、癌性細胞を癌療法に増感させる方法であって、配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号11、または配列番号12を含むベクターを細胞に送達し、該ベクターによって運ばれた配列を発現させ、次いで細胞を化学療法剤で処置することを含む方法を提供する。本発明の関連する態様は、癌性細胞を癌療法に増感させる方法であって、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号8、もしくは配列番号9を含むポリペプチドを細胞に送達し、次いで細胞を癌療法剤で処置することを含む方法を提供する。この癌性細胞の増感方法は、癌療法剤が1またはそれ以上の化学療法剤、1またはそれ以上の放射線療法剤、1またはそれ以上の代替療法剤、およびその組み合わせからなる群から選ばれる本発明に従って実施することができる。
【００２１】
本発明の別の局面では、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号8、もしくは配列番号9の少なくとも5連続アミノ酸を含むポリペプチドを提供する。該ポリペプチドはさらに化学療法剤を含む医薬と組み合わせるか、または該医薬と組み合わせて投与することができる。
【００２２】
本発明の別の局面では、配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号8、および配列番号9の少なくとも5連続アミノ酸を含むポリペプチドと化学療法剤を含む医薬を提供する。
【００２３】
本発明の別の局面では、配列番号8または配列番号9の少なくとも5連続アミノ酸を含むポリペプチドと化学療法剤を含む医薬を提供する。本発明は、さらに配列番号8および配列番号9と化学療法剤を含む医薬も含みうる。
【００２４】
別の局面において、本発明は、1またはそれ以上のアミノ酸が保存的突然変異を受けている配列番号3、5、および7〜10の配列からなる単離された増感ペプチドを提供する。本発明は、該保存的突然変異ポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドも提供する。
【００２５】
本発明の別の態様では、癌性細胞を癌療法剤に増感させる方法であって、(a)配列番号3、配列番号5、配列番号7、配列番号8、および配列番号9の1またはそれ以上から選ばれるポリペプチドを細胞に送達し、(b)該細胞を癌療法剤で処置する方法を提供する。
【００２６】
本発明の別の態様では、癌性細胞を癌療法剤に増感させる方法であって、(a)配列番号2、配列番号4、配列番号6、配列番号11、および配列番号12の1またはそれ以上から選ばれるポリヌクレオチドを含むベクターを細胞に送達し、(b)該ベクターによって運ばれる配列を発現させ、(c)該細胞を癌療法剤で処置することを含む方法を提供する。
【００２７】
本発明の別の態様では、配列番号2；配列番号4；配列番号6；配列番号11；配列番号12；およびその断片、変異体、または類似体(ここで、その断片、変異体、または類似体は発現すると癌療法増感活性を保持する。)の1またはそれ以上から選ばれる単離されたポリペプチドを含むベクターを提供する。
【００２８】
本発明の別の態様では、発現制御配列と操作可能に連結した本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。
【００２９】
本発明の別の態様では、本明細書に記載のベクターで形質転換した細胞またはその子孫を提供する。
【００３０】
本発明の別の態様では、(a)配列番号3；配列番号5；配列番号7；配列番号8；配列番号9；およびその断片、変異体、類似体、または保存的突然変異ポリペプチド(ここで、その断片、変異体、類似体、または保存的突然変異ポリペプチドは癌療法増感活性を保持する)の1またはそれ以上から選ばれるポリペプチドをコードする発現ベクターを提供し、(b)該ベクターを細胞に導入し、次いで(c)発現を可能にする条件下で細胞を維持する
ことを含むポリペプチドの発現方法を提供する。
【００３１】
該その断片、変異体、類似体、または保存的突然変異ポリペプチドは、同一性%、類似性%、および本明細書に記載の保存度の1またはそれ以上により決定することができる。
【００３２】
該そのポリヌクレオチド断片、ポリヌクレオチド変異体、またはポリヌクレオチド類似体は、同一性%、類似性%、および本明細書に記載の高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする能力の1またはそれ以上により決定される。
【００３３】
送達および処置は同時であってよい。送達は処置に先立つか、または処置が送達に先立ってよい。
【００３４】
癌療法剤は、1またはそれ以上の化学療法剤、1またはそれ以上の放射線療法剤、1またはそれ以上の代替療法剤、およびその組み合わせからなる群から選ばれうる。
【００３５】
ポリペプチドは、配列番号3；配列番号5；配列番号7；配列番号8；および配列番号9の1またはそれ以上から選ばれうる。
【００３６】
ポリヌクレオチドは、配列番号2；配列番号4；配列番号6；配列番号11；および配列番号12の1またはそれ以上から選ばれる。癌性細胞は、治療法に耐性であることに基づいて選択することができる。本明細書に記載の方法は、治療法に耐性である癌性細胞の選択工程も含みうる。
【００３７】
単離されたポリヌクレオチドは、配列番号2；配列番号4；配列番号6；配列番号11；配列番号12；およびその断片、変異体、または類似体(ここで、その断片、変異体、または類似体は発現したときに癌療法増感活性を保持する。)の1またはそれ以上から選ばれうる。
【００３８】
単離されたポリペプチドは、配列番号3；配列番号5；配列番号7；配列番号8；配列番号9；およびその断片、変異体、または類似体(ここで、その断片、変異体、または類似体は癌療法増感活性を保持する)の1またはそれ以上から選ばれうる。単離されたポリペプチドは、配列番号3；配列番号5；配列番号7；配列番号8；配列番号9；および癌療法増感活性を保持するその保存的置換ポリペプチドの1またはそれ以上から選ばれうる。
【００３９】
単離されたポリヌクレオチドは、発現制御配列と操作可能に連結しうる。ベクターは遺伝子療法に適しているかもしれない。
【００４０】
細胞は本明細書に記載のポリペプチドを発現するために操作可能でありうる。
【００４１】
ベクターの細胞への導入はin vivoで行うことができる。ベクターの細胞への導入はex vivoで行うことができる。ベクターの細胞への導入は、in vitroで行うことができる。
【００４２】
本発明の他の局面および特徴は、以下の発明の具体的態様の説明および添付した図面に照らして当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】完全長SPARC(配列番号1)、配列番号2(N末端ドメイン)、配列番号4(フォリスタチン様ドメイン)、または配列番号6(ECドメイン)のみを発現するベクターで一次的にトランスフェクトするか(黒バー)、または上記のごとくトランスフェクトし、次いでイリノテカン(500μM)で処理した(白バー)MIP101細胞から得られた細胞生存率アッセイを示す。
【図２】完全長SPARC(配列番号1)、配列番号2(N末端ドメイン)、配列番号4(フォリスタチン様ドメイン)、または配列番号6(ECドメイン)のみを発現するベクターで一次的にトランスフェクトするか(黒バー)、または上記のごとくトランスフェクトし、次いでイリノテカン(500μM)で処理した(白バー)MIP/CPT(CPT-11耐性)細胞から得られた細胞生存率アッセイを示す。
【図３】低(96μg/ml)および高(200μg/ml)濃度のB8ペプチドに単独または5FU(500μM)と組み合わせて曝露したMIP(5FU感受性)およびMIP/5FU(5FU耐性)細胞から得た細胞生存率を示す。
【図４】低(96μg/ml)および高(200μg/ml)濃度のB14ペプチドに単独または5FU(500μM)と組み合わせて曝露したMIP(5FU感受性)およびMIP/5FU(5FU耐性)細胞から得た細胞生存率を示す。
【図５】高(200μg/ml)濃度のA、A1、A2、およびA3ペプチドに単独または5FU(500μM)と組み合わせて曝露したMIP(5FU感受性)およびMIP/5FU(5FU耐性)細胞から得た細胞生存率を示す。
【図６】高(200μg/ml)濃度のB8-スクランブルおよびB14-スクランブルペプチドに単独または5FU(500μM)と組み合わせて曝露したMIP(5FU感受性)およびMIP/5FU(5FU耐性)細胞から得た細胞生存率を示す。
【図７】移植コントロール腫瘍細胞(5-FUの存在下および非存在下で増殖)を含む異種移植系における腫瘍増殖により測定した化学療法剤5-FUに対するin vivo増感の結果を示す。
【図８】配列番号2/NT-断片発現移植腫瘍細胞(5-FUの存在下および非存在下で増殖)を含む異種移植系における腫瘍増殖により測定した化学療法剤5-FUに対するin vivo増感の結果を示す。
【図９】配列番号4/FS-断片発現移植腫瘍細胞(5-FUの存在下および非存在下で増殖)を含む異種移植系における腫瘍増殖により測定した化学療法剤5-FUに対するin vivo増感の結果を示す。
【図１０】配列番号6/EC-断片発現移植腫瘍細胞(5-FUの存在下および非存在下で増殖)を含む異種移植系における腫瘍増殖により測定した化学療法剤5-FUに対するin vivo増感の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
(詳細な説明)
以下の説明では多くの用語を広範囲に用いており、下記定義は本発明の理解を促すために記載する。
【００４５】
現在の化学療法は、患者の薬剤に対する耐容能と細胞の薬剤の毒性作用に耐える能力により制限される。正常細胞における腫瘍抑制的役割を有するタンパク質の発現増強または発現増強の模倣(mimicking)は、小分子の毒性の問題を避け、患者に投与したときの有効半減期が長く、癌性細胞を化学療法剤により感受性にしながら用量の減少を可能にするかもしれない。
【００４６】
本明細書で用いている「医薬」は、患者または被検対象に投与することができる、効果をもたらすことができる組成物である。効果は、化学的、生物学的、または物理的であってよく、患者もしくは被検対象はヒトまたは非ヒト動物、例えば齧歯類またはトランスジェニックマウスであってよい。組成物は、合成、天然、または部分的合成起源の異なる分子組成の小有機または無機分子を含みうる。この群にはヌクレオチド、核酸、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド核酸、またはこれら部分の少なくとも1つを含む複合体が含まれる。医薬は、有効組成物のみ、または医薬的に許容される賦形剤との組み合わせからなりうる。
【００４７】
本明細書で用いている「医薬的に許容される賦形剤」は、生理学的に適合性のあらゆるすべての溶媒、分散媒質、コーティング剤、抗菌剤、抗微生物薬、または抗真菌剤、等張吸収遅延剤などを含む。該賦形剤は、静脈内、腹腔内、筋肉内、髄腔内、または経口投与に適するであろう。該賦形剤は、無菌注射可能溶液剤または分散剤を即時調製するための無菌水性溶液剤または分散剤を含みうる。医薬を製造するためのそのような媒質の使用は当該分野で知られている。
【００４８】
本明細書で用いている医薬の「医薬的有効量」は、薬剤を用いる期間中、送達される薬剤が治療レベルを生じる濃度で存在する医薬の量を用いることを表す。これは、送達方法、投与期間、医薬を投与される対象の年齢、体重、一般健康状態、性別、および食事に依存しうる。どの用量が「医薬的に許容される量」であるかの決定は日常的最適化が必要であり、これは当業者の能力内である。
【００４９】
本明細書で用いている用語「癌」は、正常な成長制御に対する感受性を失った細胞の増殖により生じるかまたは特徴づけられる増殖性疾患を表す。本願で用いている用語癌には、腫瘍およびあらゆる他の増殖性疾患が含まれる。同じ組織型の癌は、通常同じ組織に由来し、生物学的特性に基づいて種々の亜型に分けることができる。癌の4つの一般的カテゴリーは、カルチノーマ(癌)(上皮組織由来)、肉腫(結合組織または中胚葉由来)、白血病(造血組織由来)、およびリンパ腫(リンパ組織由来)である。200種以上の異なる癌が知られており、身体のすべての器官および組織を侵しうる。癌の定義に限定されない癌の具体例には、メラノーマ、白血病、星状細胞腫、膠芽腫、網膜芽腫、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、および慢性リンパ球性白血病が含まれよう。種々の癌に侵される器官および組織の例には、膵臓、乳房、甲状腺、卵巣、子宮、精巣、前立腺、甲状腺、下垂体、副腎、腎臓、胃、食道、結腸もしくは直腸、頭および首、骨、神経系、皮膚、血液、鼻咽頭組織、肺、尿道、頸部、膣、外分泌腺、および内分泌腺が含まれる。あるいはまた、癌は多中心性または未知の原発部位(CUPS)のものでありうる。
【００５０】
本明細書で用いている「癌性細胞」とは、形質転換事象を受けた、その成長がもはや形質転換事象前と同程度には制御されない細胞をいう。腫瘍とは、組織または患者もしくは被検対象にしばしば固体または半固体の塊としてみられる癌性細胞の集合体をいう。
【００５１】
癌または癌性細胞は、癌細胞を殺すか腫瘍サイズを減少させ、全体的癌増殖を減少させ(すなわち、血管新生の減少を介して)、および/または転移を阻害するその能力に基づいて特定の治療レジメンまたは化学療法剤に「感受性」または「耐性(抵抗性)」と説明することができる。治療レジメンに耐性の癌細胞は、該レジメンに反応せず、増殖し続けるであろう。治療レジメンに感受性の癌細胞は、該レジメンに反応して細胞死、腫瘍サイズの減少、全体的増殖(腫瘍負荷)の減少、または転移の阻害をもたらす。例えば、これは、望ましくは腫瘍サイズ、全体的成長/腫瘍負荷、または転移発生率の、約10%またはそれ以上、例えば、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、またはそれ以上、または約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約10倍、約15倍、約20倍、またはそれ以上の減少を示す。反応のモニタリングは、本明細書に記載され、当業者に知られた多くの病理学的、臨床的、および画像化方法により達成することができよう。
【００５２】
化学療法剤または薬剤の組み合わせに共通の主題は癌性細胞の死を誘導することである。例えば、DNA付加物、例えばニトロソウレア、ブスルファン、チオテパ、クロラムブシル、シスプラチン、マイトマイシン、プロカルバジン、またはデカカルバジンは、複製細胞の細胞周期のM期前に損傷DNAを修復させることにより癌性細胞の増殖を遅くするか、またはそれ自身で癌性細胞のアポトーシスを引き起こすのに十分な損傷を生じうる。他の事象、例えば遺伝子発現もしくは転写、タンパク質の翻訳、または複製DNAのメチル化は、臨床医が利用可能な化学療法剤の蓄積変化により干渉し、癌性細胞内のアポトーシスプロセスを引き起こすのを助けるかもしれない。あるいはまた、化学療法剤は、患者または被検対象の液性または獲得免疫系、例えば補体カスケードもしくはリンパ球攻撃の態様により癌性細胞の殺滅を可能にするかもしれない。
【００５３】
いかなる特定の理論に縛られることも望まないが、化学療法剤または薬剤の組み合わせに耐性の癌性細胞は、生存するために、例えばABCトランスポーターMDR1 p-糖タンパク質の過剰発現により細胞から薬剤を積極的に輸送する(FORD et al 1993. Cytotechnol. 12:171-212)か、または該薬剤に対抗する「カウンター突然変異」を獲得することにより戦うことができよう。例えば細胞のDNAの損傷を検出する能力に影響を及ぼすDNA修復酵素の突然変異は、損傷DNAの複製を可能にし、癌性細胞が複製し続けるのを可能にし、腫瘍を肥大させうる。突然変異は蓄積するので、本来なら正常細胞周期において作用する他の調節点は機能を停止し、無制御な増殖周期につながる。化学療法耐性の別の態様は、腫瘍細胞のアポトーシス回避を含む。無制御な細胞増殖に対する宿主生物の正常反応は、アポトーシスを起こさせ、無制御の複製のカスケードが始まる前に欠陥細胞を排除する。しかしながら、これは、例えば、情報伝達事象の破壊、癌性細胞における付着依存性の損失もしくは接触阻害、またはしばしば「腫瘍抑制因子」(例えばp53、BRCA1、またはRB)と考えられるアポトーシス促進因子の損失により癌性細胞により妨害される。癌治療におけるこのアポトーシスに対する感受性の重要性は、今までに薬剤のみによって治癒した腫瘍が比較的少ない化学療法の選択性は大部分そのアポトーシスの受けやすさに依存することを示唆する最近の証拠により裏付けられる(JOHNSTONE et al.、2002. Cell. 108(2):153-64)。
【００５４】
本明細書で用いている「治療レジメン(therapeutic regimen)」または「療法(治療)」とは、癌性細胞に有害な少なくとも1の物質を投与することをいう。本発明に従って用いる適切な治療レジメンには、限定されるものではないが、「化学療法レジメン」、「放射線療法レジメン」、「代替治療法レジメン」、およびその組み合わせが含まれる。
【００５５】
本明細書で用いている「化学療法レジメン」または「化学療法」とは、癌性細胞を破壊する有害な少なくとも1の化学療法剤を投与することをいう。臨床家に利用可能なそのような化学療法剤は無数にある。化学療法剤は対象に単回ボーラス用量で投与するか、またはゆっくり時間をかけてより小用量で投与することができよう。1つの化学療法剤を用いるか(単剤療法)、または2以上の薬剤を組み合わせて用いることができよう(組み合わせ療法)。ある種の癌は化学療法を単独使用して治療することができよう。あるいはまた、化学療法を他の種類の治療、例えば本明細書に記載の放射線療法または代替療法(例えば免疫療法)と組み合わせて用いることができよう。さらに、化学療法増感剤は、化学療法剤との組み合わせ療法として投与することができよう。
【００５６】
本明細書で用いている「化学療法剤」は、癌の治療に用いうる医薬をいい、一般的には、癌性細胞を直接殺す能力を有する。化学療法剤の例には、アルキル化剤、抗代謝薬、天然生成物、ホルモンおよびアンタゴニスト、および種々の薬剤が含まれる。別名の例は括弧で示す。アルキル化剤の例には、ナイトロジェンマスタード、例えばメクロレタミン、シクロホスファミド、イフォスファミド、メルファラン(L-サルコリシン)、およびクロラムブシル；エチレンイミンおよびメチルメラミン、例えばヘキサメチルメラミンおよびチオテパ；アルキルスルホン酸、例えばブスルファン；ニトロソウレア、例えばカルムスチン(BCNU)、セムスチン(メチル-CCNU)、ロムスチン(CCNU)およびストレプトゾシン(ストレプトゾトン)；DNA合成アンタゴニスト、例えばリン酸エストラムスチン；およびトリアジン、例えばデカルバジン(DTIC、デメチル-トリアゼノイミダゾールカルボキサミド)、およびテモゾロミドが含まれる。抗代謝薬の例には、葉酸アンタゴニスト、例えばメトトレキセート(アメトプテリン)；ピリミジン類似体、例えばフルオロウラシン(5-フルオロウラシル、5-FU、5FU)、フロクスウリジン(フルオロデオキシウリジン、FUdR)、シタラビン(シトシンアラビノシド)、およびゲムシタビン；プリン類似体、例えばメルカプトプリン(6-メルカプトプリン、6-MP)、チオグアニン(6-チオグアニン、TG)、およびペントスタチン(2’-デオキシコホルマイシン、デオキシコホルマイシン)、クラドリビン、およびフルダラビン；およびトポイソメラーゼ阻害剤、例えばアムサクリンが含まれる。天然生成物の例には、ビンカアルカロイド、例えばビンブラスチン(VLB)およびビンクリスチン；タキサン、例えばパクリタキセルおよびドセタキセル(Taxotere)；エピポドフィロトキシン、例えばエトポシドおよびテニポシド；カムプトテシン、例えばトポテカンおよびイリノテカン；抗生物質、例えばダクチノマイシン(アクチノマイシンD)、ダウノルビシン(ダウノマイシン、ルビドマイシン)、ドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシン(マイトマイシンC)、イダルビシン、エピルビシン；酵素、例えばL-アスパラギナーゼ：および生物反応修飾物質、例えばインターフェロンαおよびインターロイキン2が含まれる。ホルモンおよびアンタゴニストの例には、黄体形成ホルモン放出ホルモンアゴニスト、例えばブセレリン；アドレノコルチコステロイド、例えばプレドニゾンおよび関連調製物；プロゲスチン、例えばヒドロキシプロゲステロンカプロエート、メドロキシプロゲステロンアセテートおよびメゲストロールアセテート；エストロゲン、例えばジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオールおよび関連調製物；エストロゲンアンタゴニスト、例えばタモキシフェンおよびアナストロゾール；アンドロゲン、例えばプロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロンおよび関連調製物；アンドロゲンアンタゴニスト、例えばフルタミドおよびビカルバミド；およびゴナドトロピン放出ホルモン類似体、例えばロイプロリドが含まれる。種々の薬剤の例には、タリドミド；プラチナ配位錯体、例えばシスプラチン(cis-DDP)、オキサリプラチンおよびカルボプラチン；アントラセンジオン、例えばマイトキサントロン；置換ウレア、例えばヒドロキシウレア；メチルヒドラジン誘導体、例えばプロカルバジン(N-メチルヒドラジン、MIH)；副腎皮質抑制剤、例えばマイトタン(o，p’-DDD)およびアミノグルテチミド；RXRアゴニスト、例えばベキサロテン；およびチロシンキナーゼ阻害剤、例えばイマチニブが含まれる。これらの別名および商標名、および化学療法剤のさらなる例、ならびに投薬および投与レジメンを含むそれらの使用方法は当業者に知られているし、例えば「The Pharmacological basis of therapeutics」、10版、HARDMAN HG.、LIMBIRD LE.編 McGraw-Hill、New York、および「Clinical Oncology」、3版、Churchill Livingstone/ Elsevier Press、2004、ABELOFF、MD.編に記載されている。特に、本発明に従って用いるのに適した化学療法剤には、限定されるものではないが、ナノ粒子アルブミン結合パクリタキセルが含まれる。
【００５７】
本明細書で用いている用語「放射線療法レジメン」または「放射線療法」は、癌性細胞を殺すための放射線の投与を表す。放射線は、細胞内の種々の分子と相互作用するが、細胞死をもたらす主な標的はデオキシリボ核酸(DNA)である。しかしながら、放射線療法は、しばしば細胞膜や核膜、および他のオルガネラにも損傷をもたらす。DNA損傷は、通常、糖-リン酸骨格の一本鎖および二本鎖の破壊を含む。さらに、細胞機能を破壊しうるDNAおよびタンパク質の架橋がありうる。放射線の種類に応じて、DNA損傷のメカニズムは、相対的生物学的効果同様に変化することがある。例えば、重粒子(すなわち、プロトン、ニュートロン)はDNAを直接損傷し、より大きな相対的生物学的効果を有する。電磁波は、主として細胞水のイオン化により生じる短寿命のヒドロキシルフリーラジカルを通して作用する間接イオン化をもたらす。放射線の臨床応用は、外照射(外部供給源からの)および小線源療法(患者体内に移植または挿入した放射線源を用いる)からなる。外照射は、X線および/またはガンマ線からなり、小線源療法は崩壊してガンマ線とともにアルファ粒子またはベータ粒子を放射する放射性核種を使用する。
【００５８】
さらに放射線療法は、組み合わせ化学療法において、放射線療法増感剤として作用する化学療法剤とともに用いることもできよう。個々の患者に適した放射線療法の具体的選択は、治療時に当業者が癌の組織および病期を考慮して決定することができよう。種々の癌に対する放射線療法のアプローチの例は、例えば「Clinical Oncology」3版. Churchill Livingstone/Elsevier Press、2004. ABELOFF、MD.編に記載されている。
【００５９】
本明細書で用いている用語「代替治療レジメン」または「代替療法」は、例えば、生物反応修飾物質(ポリペプチド-、炭化水素-、および脂質-生物反応修飾物質を含む)、毒素、レクチン、血管新生阻害剤、レセプターチロシンキナーゼ阻害剤(例えば、Iressa(登録商標)(ゲフィチニブ)、Tarceva(登録商標)(エルロチニブ)、Erbitux(登録商標)(セツキシマブ)、イマチニブメシレート(Gleevec(登録商標))、プロテオソーム阻害剤(例えば、ボルテゾミブ、Velcade(登録商標)；VEGFR2阻害剤、例えばPTK787(ZK222584)、オーロラキナーゼ阻害剤(例えばZM447439)；哺乳類のラパマイシン標的(mTOR)阻害剤、シクロオキシゲナーゼ-2(COX-2)阻害剤、ラパマイシン阻害剤(例えばシロリムス、Rapamune(登録商標)；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤(例えばチピファルニブ、Zarnestra)；マトリックスメタロプロテナーゼ阻害剤(例えばBAY 12-9566；硫酸化多糖テコガラン)；血管新生阻害剤(例えばAvastin(登録商標)(ベバシズマブ)；フマギリン類似体、例えばTNP-4；カルボキシアミノトリアゾール；BB-94およびBB-2516；タリドミド；インターロイキン-12；リノミド；ペプチド断片；および血管成長因子に対する抗体、および血管成長因子レセプター)；血小板由来成長因子レセプター阻害剤、タンパク質キナーゼC阻害剤、マイトジェン活性化キナーゼ阻害剤、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ阻害剤、ラウス肉腫ウイルス形質転換発癌遺伝子(SRC)阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、小低酸素誘導因子阻害剤、ヘッジホッグ阻害剤、およびTGF-β情報伝達阻害剤が含まれる。さらに、免疫療法剤も代替療法レジメンと考えられる。例には、ケモカイン、ケモタキシン、サイトカイン、インターロイキン、または組織因子が含まれる。適切な免疫療法剤には、予め形成された抗体を含む血清またはガンマグロブリン；非特異的免疫刺激アジュバント；能動特異免疫療法；および養子免疫療法が含まれる。さらに、代替療法は、ポリペプチドのような他の生物学に基づく化学物質(アンチセンス分子、ポリペプチド、抗体、遺伝子療法ベクターなどを含む)を含みうる。そのような代替療法剤は、単独または組み合わせて、または本明細書に記載の他の治療レジメンと組み合わせて投与することができよう。代替療法レジメンに用いるこれら薬剤の別名および商標名、および代替療法レジメンに用いる薬剤のさらなる例、および投薬および投与レジメンを含むその使用方法は当業者に知られているであろう。さらに、投薬および投与レジメンを含む組み合わせ療法において代替療法レジメンに用いる化学療法剤および他の薬剤の使用方法も当業者に知られているであろう。
【００６０】
特に、適切な代替療法レジメンには、限定されるものではないが、癌細胞の表面分子に対する抗体、例えばHer2に対する抗体(例えばTrastuzumab)、EGFもしくはEGFレセプターに対する抗体、VEGF(例えばBevacizumab)もしくはVEGFレセプター、CD20に対する抗体などが含まれる。治療剤には、さらに補体活性化、細胞性細胞毒性(アポトーシス(細胞死を含む)を含む)、およびオプソニン化の1またはそれ以上を仲介するあらゆる抗体または抗体断片を含みうる。例えば、そのような抗体断片は完全または部分Fcドメインであってよい。
【００６１】
「抗体」は、限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ダイマー、マルチマー、多特異性抗体(例えば二特異性抗体)を意味する。抗体は、ネズミ、ヒト、ヒト化、キメラ、または他の種由来であってよい。抗体は、特異抗原を認識し、それと結合することができる免疫系により生じるタンパク質である。一般的に、標的抗原は、複数の抗体上のCDRにより認識される多くの結合部位(エピトープとも呼ばれる)を有する。異なるエピトープと特異的に結合する各抗体は異なる構造を有する。すなわち、1つの抗原は1以上の対応する抗体を有することがある。
【００６２】
抗体は、完全長免疫グロブリン分子または完全長免疫グロブリン分子の免疫的活性部分、すなわち、目的とする標的の抗原またはその部分と免疫学的に特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を含む。標的には、癌細胞、または自己免疫疾患と関連する自己免疫抗体を産生する他の細胞が含まれる。
【００６３】
本明細書に記載の免疫グロブリンは、免疫グロブリン分子のあらゆるクラス(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、およびIgA)またはサブクラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2)でありうる。該免疫グロブリンはあらゆる種由来でありうる。
【００６４】
「抗体断片」は、望む生物活性を維持する完全長抗体の部分を含む。「抗体断片」は、一般的には抗原結合領域またはその可変領域である。抗体断片の例には、Fab、Fab'、F(ab')2、およびFv断片；ディアボディ(diabody)；直鎖抗体；Fab発現ライブラリーにより生じる断片、抗イデオタイプ(抗Id)抗体、CDR(相補性決定領域)、および癌細胞抗原、ウイルス抗原もしくは細菌抗原と免疫特異的に結合する上記のあらゆるエピトープ結合断片、一本鎖抗体分子；および抗体断片から形成される多特異性抗体が含まれる。
【００６５】
本明細書に記載のモノクローナル抗体には、重鎖および/または軽鎖の部分が特定種由来の抗体の対応する配列と同一またはホモローガスであるかまたは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属するが、鎖の残りの部分は別の種由来の抗体の対応する配列と同一またはホモローガスであるか別の抗体のクラスまたはサブクラスに属する「キメラ」抗体、または望む生物活性を有する限りそのような抗体の断片が含まれる(米国特許No.4,816,567)。本明細書に記載のキメラ抗体には、非ヒト霊長類(例えば旧世界ザルまたは類人猿)由来の可変ドメイン抗体結合配列、およびヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体が含まれる。
【００６６】
「抗体依存性細胞介在性細胞毒性」および「ADCC」は、Fcレセプター(FcR)を発現する非特異的細胞毒性細胞(例えば、ナチュラルキラー(NK)細胞、好中球、およびマクロファージ)が標的細胞上の結合抗体を認識し、次いで標的細胞の溶解をもたらす細胞介在性反応を表す。ADCCに介在する一次細胞、NK細胞はFc.γ.RIIIのみを発現するが、単球はFcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIを発現する。目的とする分子のADCC活性を評価するには、in vitro ADCCアッセイを行うことができる(米国特許No.5,003,621；米国特許No. 5,821,337)。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血液単核細胞(PBMC)およびナチュラルキラー(NK)細胞が含まれる。あるいはまたはさらに、目的とする分子のADCC活性は、in vivo、例えばClynes et al PNAS(USA)、95:652-656(1998)に開示されているような動物モデル中で評価することができよう。
【００６７】
「細胞死を誘導する」抗体は、生存細胞を生存できなくなるようにする抗体である。in vitroの細胞死は、抗体依存性細胞介在性細胞毒性(ADCC)または補体依存性細胞毒性(CDC)により誘導される細胞死と区別するために補体および免疫エフェクター細胞の非存在下で決定することができよう。すなわち、細胞死のアッセイは、加熱不活化血清(すなわち補体非存在下)を用い、免疫エフェクター細胞の非存在下で行うことができよう。抗体が細胞死を誘導することができるか否かを決定するため、プロピジウムアイオダイド(PI)、トリパンブルー、または7AADの取り込みにより評価される膜の完全性の損失を、非処理細胞との比較により評価することができる。細胞死誘導抗体は、BT474細胞を用いるPI取り込みアッセイにおけるPI取り込みを誘導する抗体である。
【００６８】
「アポトーシスを誘導する」抗体は、アネキシンVの結合、DNAの断片化、細胞収縮、小胞体の拡張、細胞の断片化、および/または膜小胞(アポトーシス小体と呼ばれる)の形成により決定されるプログラムされた細胞死を誘導する抗体である。
【００６９】
本明細書で用いている「化学療法増感剤」または「増感剤」は、化学療法剤、放射線療法処置、または代替治療レジメンの治療効果を増強し、そのような処置または薬剤の効果を改善しうる医薬である。腫瘍または癌性細胞の処置に対する感受性または耐性は、動物、例えばヒトまたは齧歯類において例えばある期間にわたり転移の発生率、腫瘍サイズ、または腫瘍の負荷を測定することにより測定してもよい。例えばヒトでは約2、約3、約4、または約6カ月であり、マウスでは約2〜4、約3〜5、または約4〜6週間である。組成物または治療方法は、治療に対する感受性の増加または耐性の減少が、そのような組成物または方法の非存在下の治療に対する感受性または耐性と比較して約10%またはそれ以上、例えば約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%またはそれ以上、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約10倍、約15倍、約20倍またはそれ以上であれば、治療的処置に対する腫瘍または癌性細胞の反応を増感するかもしれない。治療的処置に対する感受性または耐性の測定は、当該分野では日常的であり、当業者の技術内である。
【００７０】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」は互換性に用い、半減期の増加のようなペプチドにさらなる望ましい特性をもたらすかもしれないペプチド結合または修飾ペプチド結合、例えばペプチドイソスター(isosteres)(修飾ペプチド結合)で共有結合した少なくとも2のアミノ酸残基からなる化合物を表す。ペプチドは少なくとも2のアミノ酸を含むであろう。本明細書に記載のペプチドまたはタンパク質を含むアミノ酸を、天然の過程(例えば翻訳後プロセシング)や当業者によく知られている化学修飾技術により修飾してもよい。修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、およびアミノもしくはカルボキシル末端を含むペプチドのどこにも生じうる。同じ種類の修飾はあるペプチドの種々の部位に同程度または異なる程度に存在しうると理解される。
【００７１】
ペプチドに対する修飾の例には、アセチル化、アシル化、ADP-リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有結合架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク分解プロセシング、ホスホリル化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、タンパク質へのアミノ酸のトランスファーRNA介在付加、例えばアルギニル化、およびユビキチン化が含まれる。例えば、Proteins-Structure and Molecular Properties、2版、T. E. Creighton、W. H. Freeman and Company、New York、1993、およびWold F、Posttranslational Protein Modifications：Perspectives and Prospects、pgs. 1-12、Posttranslational Covalent Modification of Proteins、B. C. Johnson編、Academic Press、New York、1983中、Seifter et al.、Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors、Meth. Enzymol.(1990) 182: 626-646、およびRattan et al.(1992)、Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging、Ann NY Acad Sci 663: 48-62参照。
【００７２】
実質的に同様な配列とは、基準配列と本明細書に記載の1またはそれ以上の保存的置換のみが異なるアミノ酸配列をいう。そのような配列は、例えば別の実質的に同様な配列と機能的にホモローガスであるかもしれない。当業者は置換されうる本発明のペプチド中の個々のアミノ酸の態様を認識するであろう。
【００７３】
アミノ酸配列の類似性および同一性は、例えばBLAST(基本的局所アラインメント検索ツール)2.0アルゴリズムを用いるBLASTPおよびTBLASTNプログラムを用いて計算することができよう。アミノ酸配列の類似性または同一性の計算技術は当業者によく知られており、BLASTアルゴリズムの使用は、ALTSCHUL et al. 1990、J Mol. Biol. 215: 403-410、およびALTSCHUL et al.(1997)、Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402に記載されている。
【００７４】
アラインメントを行う配列は多くのデータベースから収集することができよう。タンパク質データベースの例には、タンパク質機能、そのドメイン構造、翻訳後修飾、変異体に関連する高レベルの注釈も提供するSWISS-PROT(Bairoch A. and Apweiler R.(2000) Nucleic Acids Res. 28(1):45-48；Bairoch A. and Apweiler R.(1997) J. Mol. Med. 75(5):312-316；Junker V.L. et al.(1999) Bioinformatics 15(12):1066-1007)、EMBLヌクレオチド配列入力のすべての翻訳を含むSWISS-PROTのコンピューター注釈補足であるTrEMBL(Bairoch A. and Apweiler R.(2000) Nucleic Acids Res. 28(1):45-48)が含まれ、nrデータベースは、すべての非冗長GenBank CDS翻訳、ならびにPDB、SwissProt、PIR、およびPRFのような他のデータベース由来のタンパク質配列を比較する。
【００７５】
タンパク質配列のアラインメントは、クエリー配列と同様の配列についてデータベースを検索する既存のアルゴリズムを用いて行うことができよう。あるアラインメント法はSmith-Watermanアルゴリズムであり(Smith、T. F. and Waterman、M.S. 1981. Journal of Molecular Biology 147(1):195-197)、これはクエリー配列とデータベース配列の間の最適アラインメントをいかに作成することができるかを決定するのに有用である。そのようなアラインメントは、データベース配列と一致させるためにクエリー配列がどんな変換を受ける必要があるかを決定することにより得られる。変換には、1文字の別のものへの置換、および一連の文字の挿入もしくは置換が含まれる。スコアは、正確な一致およびある置換については各文字対文字比較の正のスコア、他の置換および挿入/欠失については負のスコアを割り当てる。スコアは統計的コアリングマトリックスから得られる。最高スコアを生じる変換の組み合わせを用いて、クエリー配列とデータベース配列の間のアラインメントを作成する。Needleman-Wunsch(Needleman、S. B. and Wunsch、C.D. 1970. Journal of Molecular Biology 48(3):443-453)アルゴリズムは、Smith-Watermanアルゴリズムと同様であるが、配列の比較は部分的ではなく全体的である。全体比較は、全データベース配列に対して全クエリー配列をアラインメントさせる。常に部分的アラインメントは一致で開始し終了するが、全体アラインメントは挿入または欠失(indel)で開始または終了する。あるクエリー配列とデータベース配列については、全体スコアは、末端のindelにより部分スコア以下であるか同じであろう。上記アルゴリズムの代わりに、Hidden Markov Model(HMM)検索(Eddy、S. R. 1996. Current Opinion in Structural Biology 6(3):361-365)を用いてタンパク質配列のアラインメントを作成しうる。HMMスコアリングは、一致の確率、次いで挿入/欠失(その逆もある)を検討する。さらに、HMMは、挿入-欠失転移(その逆もある)、および開始および終了段階のスコアリングを可能にし、検索が全体的か部分的かを制御する。
【００７６】
上記アルゴリズムの1またはそれ以上をアラインメントプログラムに用いてタンパク質配列アラインメントを作成することができよう。当業者には、種々の異なるアルゴリズムを含む、選択すべき多くの配列アラインメントプログラムがある。アラインメントプログラムの一例はBLASTPである(Altschul、S.F. et al.(1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402)。他のアラインメントプログラムは、CLUSTAL WおよびPILEUPがある。BLASTP操作からの標準的出力は、さらに下記のindel分析を行うのに十分な情報を含む。
【００７７】
アミノ酸は、例えば極性、非極性、酸性、塩基性、芳香族、または中性と表現することができる。極性アミノ酸は、生物学的またはほぼ中性のpHでの水素結合により水と相互作用しうるアミノ酸である。アミノ酸の極性は、生物学的またはほぼ中性のpHでの水素結合の程度の指標である。極性アミノ酸の例には、セリン、プロリン、トレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン、リジン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸(aspartate)、チロシン、およびグルタミン酸(glutamate)が含まれる。非極性アミノ酸の例には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、およびトリプトファンが含まれる。酸性アミノ酸は、中性pHで正味の負の荷電を有する。酸性アミノ酸の例には、アスパラギン酸(aspartate)およびグルタミン酸(glutamate)が含まれる。塩基性アミノ酸は、中性pHで正味の正の荷電を有する。塩基性アミノ酸の例には、アルギニン、リジン、およびヒスチジンが含まれる。芳香族アミノ酸は、一般的には非極性であり、疎水性相互作用に参加しうる。芳香族アミノ酸の例には、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンが含まれる。チロシンは、芳香族側鎖上のヒドロキシル基を介して水素結合に参加することもある。中性、脂肪族アミノ酸は、一般的には非極性および疎水性である。中性アミノ酸の例には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、およびメチオニンが含まれる。アミノ酸は、2以上の記述的カテゴリーにより説明することができよう。一般的記述的カテゴリーを共有するアミノ酸はペプチド中で互いに置換可能かもしれない。
【００７８】
本発明のペプチド化合物を説明するのに用いる用語は、各アミノ酸残基の左にアミノ基が、右にカルボキシ基が存在する通常の慣行に従う。本発明の選択した特定の態様を示す配列において、アミノおよびカルボキシ末端基は、具体的には示さないが特記しないかぎり生理学的pH値であると推測される形であると理解されよう。アミノ酸の構造式において、各残基は一般的に下記表1に従ってアミノ酸の慣用名に対応する1文字または3文字表示により示すことができる。
表1：天然ペプチドに共通してみられる20の標準L-アミノ酸の用語と略号
0005590882.tif 000002
【００７９】
アミノ酸のヒドロパシー指標は、水性環境(負値)または疎水性環境(正値)を求めるアミノ酸の傾向を示す尺度である(KYTE & DOOLITTLE 1982. J Mol Biol 157:105-132)。標準的アミノ酸のヒドロパシー指標は、アラニン(1.8)、アルギニン(-4.5)、アスパラギン(-3.5)、アスパラギン酸(-3.5)、システイン(2.5)、グルタミン(-3.5)、グルタミン酸(-3.5)、グリシン(-0.4)、ヒスチジン(-3.2)、イソロイシン(4.5)、ロイシン(3.8)、リジン(-3.9)、メチオニン(1.9)、フェニルアラニン(2.8)、プロリン(-1.6)、セリン(-0.8)、トレオニン(-0.7)、トリプトファン(-0.9)、チロシン(-1.3)、およびバリン(4.2)を含む。同様のヒドロパシー指標を有するアミノ酸は、ペプチド中で互いに置換することができよう。
【００８０】
本明細書に記載のペプチドを含むアミノ酸は、L-またはD-配置にあると理解される。本発明のペプチドおよびペプチド模倣物は、L-アミノ酸がD-アミノ酸で置換されていることがある。
【００８１】
本発明のペプチド内、特にカルボキシ-またはアミノ-末端に含まれるアミノ酸は、メチル化、アミド化、アセチル化、またはその生物活性に有害な影響を及ぼすことなくペプチドの循環半減期を変化させうる他の化学基による置換により修飾されることもある。さらに、ジスルフィド結合は本発明のペプチド中に存在しても存在しなくてもよい。
【００８２】
非標準的アミノ酸は天然に生じることもあり、遺伝的にコードされていることもいないこともある。遺伝的にコードされた非標準的アミノ酸の例には、通常終止コドンであるUGAコドンでタンパク質中に組み込まれることがあるセレノシステイン、または通常終止コドンであるUAGコドンでタンパク質中に組み込まれることがあるピロリジンが含まれる。遺伝的にコードされていない非標準的アミノ酸は、ペプチド中にすでに組み込まれた標準的アミノ酸の修飾から生じるか、または例えば代謝中間体または前駆体であることもある。非標準的アミノ酸の例には、4-ヒドロキシプロリン、5-ヒドロキシリジン、6-N-メチルリジン、γ-カルボキシグルタメート、デスモシン、セレノシステイン、オルニチン、シトルリン、ランチオニン、1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸、γ-アミノ酪酸、カルニチン、サルコシン、またはN-ホルミルメチオニンが含まれる。標準的および非標準的アミノ酸の合成変異体も知られており、これには化学的に誘導体化されたアミノ酸、同定もしくは追跡のために標識されたアミノ酸、またはα炭素に種々の側基を有するアミノ酸が含まれる。そのような側基の例は当該分野で知られており、脂肪族、単芳香族、多環状芳香族、複素環、異核、アミノ、アルキルアミノ、カルボキシル、カルボキシアミド、カルボキシルエステル、グアニジン、アミジン、ヒドロキシル、アルコキシ、メルカプト-、アルキルメルカプト-、もしくは他の異種原子-含有側鎖が含まれうる。他の合成アミノ酸は、α-イミノ酸、非α-アミノ酸、例えばβ-アミノ酸、des-カルボキシ、またはdes-アミノ酸が含まれうる。アミノ酸の合成変異体は、当該分野で知られた一般的方法を用いて合成するか、民間業者、例えばRSP Amino Acids LLC(Shirley、MA)から購入することができる。
【００８３】
保存的アミノ酸置換が何を意味するかをさらに例示するため、以下にグループA〜Fを示す。以下のグループのあるメンバーを同じグループの別のメンバーで置換することが保存的置換であると考えられる。
【００８４】
グループAは、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、セリン、システイン、トレオニン、および以下の側鎖：エチル、イソブチル、-CH2CH2OH、-CH2CH2CH2OH、-CH2CHOHCH3、およびCH2SCH3、を有する修飾アミノ酸を含む。
【００８５】
グループBは、グリシン、アラニン、バリン、セリン、システイン、トレオニン、およびエチル側鎖を有する修飾アミノ酸を含む。
【００８６】
グループCは、フェニルアラニン、フェニルグリシン、チロシン、トリプトファン、シクロヘキシルメチル、および置換ベンジルまたはフェニル側鎖を有する修飾アミノ残基を含む。
【００８７】
グループDは、グルタミン酸、アスパラギン酸；グルタミン酸またはアスパラギン酸の置換もしくは非置換の脂肪族、芳香族、もしくはベンジルエステル(例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソ-プロピル、シクロヘキシル、ベンジル、もしくは置換ベンジル)；グルタミン、アスパラギン、CO-NH-アルキル化グルタミン、もしくはアスパラギン(例えば、メチル、エチル、n-プロピル、およびイソ-プロピル)、および側鎖-(CH2)3COOHを有する修飾アミノ酸、そのエステル(置換もしくは非置換の、脂肪族、芳香族、もしくはベンジルエステル)、そのアミド、およびその置換もしくは非置換のN-アルキル化アミドを含む。
【００８８】
グループEは、ヒスチジン、リジン、アルギニン、N-ニトロアルギニン、p-シクロアルギニン、g-ヒドロキシアルギニン、N-アミジノシトルリン、2-アミノグアニジノブタン酸、リジンの類似体、アルギニンの類似体、およびオルニチンを含む。
【００８９】
グループFは、セリン、トレオニン、システイン、ならびに-OHまたは-SHで置換されたCl-C5直鎖もしくは分岐鎖アルキル側鎖を有する修飾アミノ酸を含む。
【００９０】
グループA〜Fは例示であり、本発明を制限するものではない。
【００９１】
ペプチド模倣物は、親ペプチドの生物活性を模倣した非ペプチド構造要素を含む化合物である。ペプチド模倣物は、伝統的ペプチドの特性、例えば酵素的に切断できるペプチド結合を持たないかもしれない。親ペプチドは、目的とするタンパク質上の結合配列またはホスホリル化部位として最初に同定されるか、または天然ペプチド、例えばペプチドホルモンであるかもしれない。ペプチド模倣物を同定するための活性には、ライブラリー、例えばペプチド模倣物ライブラリーをスクリーニングする時に比較のための陽性対照として親ペプチドを含むかもしれない。ペプチド模倣物ライブラリーは、親ペプチドと同様の生物活性を有する化合物のライブラリーである。
【００９２】
本明細書で用いている用語「ポリヌクレオチド」は、当業者が容易に認識するように、RNA、cDNA、ゲノムDNA、合成型、および混合ポリマー(センスおよびアンチセンス鎖両方)を含み、化学的または生化学的に修飾されるかまたは非天然もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含みうる。そのような修飾には、例えば標識、メチル化；天然ヌクレオチドの類似体による1またはそれ以上の置換；ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電結合(例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど)、荷電結合(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど)、懸垂部分(例えばペプチド)、および修飾結合(例えば、α-アノマーペプチドなど)が含まれる。水素結合および他の化学的相互作用により特定の配列と結合する能力がポリペプチドとよく似た合成分子も含む。
【００９３】
本明細書で用いている「ペプチド核酸」(PNA)とは、核酸の糖リン酸骨格がN-(2-アミノエチル)-グリシン骨格に変換されている修飾核酸をいう。DNA/RNAの糖リン酸骨格は、相補鎖間に静電反発力を生じる中性条件下で負の荷電を受けるが、PNAの骨格構造は本質的に荷電をもたない。したがって、静電反発力はない。したがって、PNAは通常の核酸に比べて高い二本鎖形成能力を有し、高い塩基配列認識能力を有する。さらに、PNAは一般的に核酸より強固である。PNAは、アレイ、および上記およびオリゴヌクレオチドについて本明細書に記載の他のハイブリダイゼーションもしくは他の反応に用いることもできる。
【００９４】
本明細書で用いている用語「ベクター」は、外来性もしくは内在性ペプチドを宿主細胞に導入するのに用いるポリヌクレオチド化合物を表す。ベクターは、1またはそれ以上のポリペプチド分子をコードするヌクレオチド配列を含む。天然状態もしくは組換え操作を受けたプラスミド、コスミド、ウイルス、およびバクテリオファージは、少なくとも1の望ましい単離されたポリペプチド分子を含む組換えベクターを提供するための一般に用いられるベクターの非限定的例である。
【００９５】
本明細書で用いている「腫瘍抑制因子」は、細胞の無制御な増殖を抑制する正常な生物学的役割を有する遺伝子または遺伝子産物である。腫瘍抑制因子の機能を失うと、無制御な細胞増殖が生じる。腫瘍抑制因子に対する機能的対応物は、発癌遺伝子-「癌原遺伝子」として知られる正常細胞増殖を促進する遺伝子である。そのような遺伝子または遺伝子産物を活性化する突然変異は、さらにそれを無調節に細胞増殖活性が持続する「発癌遺伝子」に変換する。腫瘍抑制因子遺伝子および遺伝子産物の例は、文献でよく知られており、これにはPTC、BRCA1、BRCA2、p16、APC、RB、WT1、EXT1、p53、NF1、TSC2、NF2、VHL、またはSPARCが含まれよう。腫瘍抑制因子遺伝子、遺伝子産物、またはそれらの機能のさらなる例は、McKusick、V.A.: Mendelian Inheritance in Man. A Catalog of Human Genes and Genetic Disorders. Baltimore: Johns Hopkins University Press、1998(12版)、およびオンライン関連サイト：Online Mendelian Inheritance in Man、OMIM(登録商標). McKusick-Nathans Institute for Genetic Medicine、Johns Hopkins University(Baltimore、MD)、およびNational Center for Biotechnology Information、National Library of Medicine(Bethesda、MD)、2000. World Wide Web URL：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim/.に記載されている。
【００９６】
本発明は、さらに、ポリペプチドもしくは本明細書に記載のポリペプチドを発現するための調節エレメント(例えば適切なプロモーター)と操作可能に連結した本明細書に記載の調節エレメントおよび核酸分子を含む核酸構築物を提供する。タンパク質の発現は、RNAの転写レベルに依存し、DNAシグナルにより制御される。同様に、mRNAの翻訳には少なくともAUG開始コドンが必要であり、このコドンは通常、伝達内容の5’末端の約10〜約100内に位置する。AUG開始コドンと隣接する配列は、真核性リボソームによるその認識に影響し、完全Kozakコンセンサス配列との適合は最適な翻訳をもたらすことがわかっている(例えば、Kozak、J. Molec. Biol. 196: 947-950(1987)参照)。また、細胞中の外来性核酸の発現が成功するには得られるタンパク質の翻訳後修飾が必要なことがある。したがって、本発明は、ベクターが例えばpCDNA3.1またはその誘導体であるポリペプチドをコードするプラスミドを提供する。
【００９７】
本明細書に記載の核酸分子は、好ましくは適切なプロモーター(ここで、該プロモーターは好ましくは真核性細胞中で機能的である)と操作可能に連結したコーディング領域を含む。ウイルスプロモーター、例えば、限定されるものではないが、RSVプロモーターおよびアデノウイルス主要後期プロモーターを本発明に用いることができる。適切な非ウイルスプロモーターには、限定されるものではないが、ホスホグリセロキナーゼ(PGK)プロモーターおよび延長因子1αプロモーターが含まれる。非ウイルスプロモーターは望ましくはヒトプロモーターである。多くが当該分野で知られているさらなる適切な遺伝要素を、本発明の核酸および構築物と連結もしくは結合するかまたはそれらに挿入し、さらなる機能、発現レベル、または発現パターンをもたらすこともできる。SPARCファミリー遺伝子を発現させるための天然プロモーターも用いることができ、その場合は、染色体を実質的に変化させる工程により修飾されない限り、それらを天然にコードする染色体中で用いないことが好ましい。そのような実質的に変化した染色体は、レトロウイルスベクターまたは同様の工程によりトランスフェクトされて変化した染色体を含むことができる。あるいはまた、そのような実質的に変化した染色体は、人工的染色体、例えばHAC、YAC、またはBACを含むことができる。
【００９８】
さらに、本明細書に記載の核酸分子は、転写を促進するためのエンハンサーと操作可能に連結することができる。エンハンサーは、隣接遺伝子の転写を促すDNAのシス作用エレメントである。多くの種由来の多くの異なる細胞種中の連結遺伝子の高レベルの転写をもたらすエンハンサーの例には、限定されるものではないが、SV40およびRSV-LTR由来のエンハンサーが含まれる。そのようなエンハンサーは、細胞種特異的効果を有する他のエンハンサーと組み合わせることができるか、あらゆるエンハンサーを単独で用いてもよい。
【００９９】
タンパク質生成を最適化するため、本発明の核酸分子は、さらに該核酸分子のコーディング領域の後にポリアデニル化部位を含むことができる。また、好ましくは全ての適切な転写シグナル(および適切な場合には翻訳シグナル)は、外来核酸が導入される細胞中で適切に発現するように正しく配置される。必要に応じて、外来核酸をスプライス部位(すなわち、スプライスアクセプターおよびスプライスドナー部位)と結合し、インフレームな完全長転写を維持しながらmRNA生成を促進することができる。さらに、本発明の核酸分子は、さらにプロセシング、分泌、細胞内局在化などのための適切な配列を含むことができる。
【０１００】
該核酸分子は、あらゆる適切なベクター内に挿入することができる。適切なベクターには、限定されるものではないがウイルスベクターが含まれる。適切なウイルスベクターには、限定されるものではないが、レトロウイルスベクター、ならびにアルファウイルス、ワクシニア、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、および鶏痘ウイルス-ベクターが含まれる。該ベクターは、好ましくは真核性細胞(例えばCHO-K1細胞)を形質転換する天然または人工の能力を有する。さらに、本発明に関連して有用なベクターは、「裸の(naked)」核酸ベクター(すなわち、それを被包するタンパク質、糖、および/または脂質をほとんどもしくは全く持たないベクター)、例えばプラスミドもしくはエピソームでありうるか、または該ベクターは他の分子と複合化しうる。本発明の核酸と適切に結合することができる他の分子には、限定されるものではないが、ウイルスコート、カチオン性脂質、リポソーム、ポリアミン、金粒子、および標的部分、例えばリガンド、レセプター、または細胞分子を標的にする抗体を含みうる。
【０１０１】
上記核酸およびタンパク質に関連して本明細書で用いている核酸、ペプチド、またはタンパク質の「対応(一致)」の尺度は、配列間の相対的「同一性」である。ペプチドもしくはタンパク質の場合、またはコードされたペプチドまたはタンパク質に従って定義された核酸の場合、対応には、少なくとも約50%の同一性、もしくは少なくとも約70%の同一性、もしくは少なくとも約90%の同一性、または約95%を有するペプチドを含み、特定のペプチドまたはタンパク質と少なくとも約98-99%の同一性があることもある。核酸間の同一性の好ましい尺度は、ペプチドについて上記したものと同じであり、少なくとも約90%もしくは少なくとも約98-99%の同一性が最も好ましい。
【０１０２】
本明細書で用いている用語「同一性」は、2つのペプチド間、または2つの核酸分子間の配列の同一性の尺度を表す。同一性は、比較のために直線になっている各配列中の位置を比較することにより決定することができる。2つのアミノ酸または核酸配列は、それらが少なくとも約75%の配列同一性、好ましくは少なくとも約90%の配列同一性、より好ましくは少なくとも95%の配列同一性、および最も好ましくは少なくとも約98-99%の同一性を有する場合は実質的に同一と考えられる。
【０１０３】
配列同一性は、現在用いられている、Altschul et al.(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410が最初に記載したBLASTアルゴリズムにより決定することができる。BLASTアルゴリズムは、公表されたデフォルト設定で用いることができる。比較した配列中の位置を同じ塩基またはアミノ酸が占めるときは、該分子は、その位置で同一性があると考えられる。配列間の同一性度は、配列が共有する一致する位置の数の関数である。
【０１０４】
核酸配列の同一性の別の尺度は、2つ配列が互いに低ストリンジェンシー、好ましくは高ストリンジェンシー下でハイブリダイズするか否かを決定することである。そのような配列は高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするとき実質的に同一である。低ストリンジェンシー条件下でのフィルター結合配列とのハイブリダイゼーションは、例えば、65℃の0.5 M NaHPO4、7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、1mM EDTA中で行い、42℃の0.2 x SSC/0.1SDSで洗浄することができる(Ausubel et al.(eds.) 1989、Current Protocols in Molecular Biology、Vol.1、Green Publishing Associates、Inc.、and John Wiley & sons、Inc.、New York、p.2.10.3参照)。あるいはまた、高ストリンジェンシー条件下でのフィルター結合配列とのハイブリダイゼーションは、例えば65℃の0.5M NaHPO4、7%(SDS)、1mM EDTA中で行い、68℃の0.2 x SSC/0.1% SDSで洗浄することができる(Ausubel et al.(編) 1989、上記参照)。ハイブリダイゼーション条件は、目的とする配列に応じて既知の方法に従って修飾されることがある(Tijssen、1993、Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology -- Hybridization with Nucleic Acid Probes、Part I、第2章 「Overview of Principles in Hybridization and the Strategy of Nucleic Acid Probe Assays」、Elsevier、New York参照)。一般的には、ストリンジェント条件は、限定したイオン強度およびpHで特定配列について熱融解温度より約5℃低く選択する。
【０１０５】
完全長SPARCタンパク質は、N-末端酸性ドメイン、細胞増殖を阻害しうるフォリスタチン様ドメイン、および高親和性にカルシウムイオンを結合し、細胞増殖を阻害するC-末端細胞外ドメインを含む複数の機能的ドメインを有する。完全長SPARCタンパク質をマウス腫瘍モデルに投与すると、化学療法増感活性が認められ、化学療法剤、例えば5-フルオロウラシル、イリノテカン、シスプラチン、またはエトポシドに対する耐性腫瘍の反応率が改善された。
【０１０６】
これらドメイン、もしくはこれらドメイン内の領域のどれがSPARCのアポトーシス介在もしくは化学療法増感作用に関与するかは以前には検討されていない。
【０１０７】
配列内の突然変異の位置の数字的表示は特定配列に対するものであると当業者に理解される。また、同じ位置に、該配列が番号付けされ、配列が選ばれる方法に応じて異なる番号表示を割り当てられることがある。さらに、配列変異体、例えば挿入または欠失は、突然変異部位およびその周辺の特定ヌクレオチドの相対位置、次いで番号表示を変化させることがある。
【０１０８】
配列番号1(NM_003118)は、SPARCタンパク質をコードする完全長cDNA配列である。翻訳すると、303アミノ酸のSPARCタンパク質が生成される(配列番号10)。配列番号2はSPARC cDNAのヌクレオチド157〜309からなる。これらヌクレオチドは、SPARCタンパク質(NT)のN-末端酸性ドメイン - アミノ酸17〜68(配列番号3)に対応する。配列番号4は、SPARC cDNAのヌクレオチド310〜565からなる。これらヌクレオチドは、SPARCタンパク質(FS)のフォリスタチン様ドメイン - アミノ酸69〜153(配列番号5)に対応する。配列番号6は、PARC cDNAのヌクレオチド566〜1015からなる。これらヌクレオチドは、SPARCタンパク質(EC)の細胞外ドメイン - アミノ酸154〜303(配列番号7)に対応する。配列番号11はSPARC cDNAのヌクレオチド157〜225からなる。これらヌクレオチドは、B8ペプチド(配列番号8)に対応する。配列番号12は、SPARC cDNAのヌクレオチド319〜411からなる。これらヌクレオチドはB14ペプチド(配列番号9)に対応する。完全長SPARCタンパク質の最初の17アミノ酸もしくはペプチドのN-末端にさらなるアミノ酸残基を有する最初の17アミノ酸に対応するさらなるペプチド配列は以下の通り同一である：A(配列番号13)；A1(配列番号14)；A2(配列番号15)；およびA3(配列番号16)。さらに、ペプチドB8およびB14をスクランブルにし、陰性コントロールペプチドB8-SCR(配列番号17)およびB14-SCR(配列番号18)を作成した。
【０１０９】
感受性および耐性腫瘍細胞系へのSPARCのポリヌクレオチド断片(配列番号2および配列番号4)発現ベクターのトランスフェクションは、同様に、ホリスタチン様領域(ポリペプチド配列、配列番号5に翻訳されるポリヌクレオチド、配列番号4によりコードされる)、および非開裂シグナル配列を含む即N-末端領域(ポリペプチド配列、配列番号3に翻訳されるポリヌクレオチド配列、配列番号2によりコードされる)は、化学療法剤と同時に処理するとin vitroでアポトーシスを誘導することができることを示唆した(図1および2)。ホリスタチン様領域は、カルシウムと結合するECドメインと相互作用し、アポトーシス制御の重要因子であるカルシウム恒常性を調節しうる。これらポリペプチドの過剰発現は、非癌性細胞においてSPARCと相互作用してアポトーシスを促す細胞タンパク質を含むタンパク質-タンパク質相互作用と干渉するかもしれない。
【０１１０】
遺伝子療法は、疾患と戦う生細胞の遺伝物質を修飾することを含む医薬的介入である。遺伝子療法は、多くの異なる種類の癌および他の疾患に対する臨床試験(ヒトを用いる調査研究)において試験中である。したがって、本発明は、さらに「癌療法」に用いるのに適したSPARCポリペプチドをコードする単離された核酸分子を提供する(例えば、Patil et al.、AAPS J. 7(1):E61-77(2005)参照)。
【０１１１】
一般に、遺伝子は、本明細書に開示しているような「ベクター」を用いて細胞に送達される。遺伝子療法に用いる最も一般的なタイプのベクターはウイルスである。遺伝子療法においてベクターとして用いるウイルスは遺伝子的に無能であり、自身で複製することはできない。ほとんどの遺伝子療法の臨床試験は、望む遺伝子を送達するためにマウスレトロウイルスに頼っている。ベクターとして用いる他のウイルスには、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ポックスウイルス、およびヘルペスウイルスが含まれる。適切なウイルス遺伝子療法ベクターおよびそのin vivoおよびex vivo投与法は当該分野で知られている。
【０１１２】
遺伝子療法はex vivoおよびin vivoの両方で行うことができる。典型的には、ex vivo遺伝子療法の臨床試験において、患者の血液または骨髄由来の細胞を取り出し、実験室で増殖させる。細胞を、望む遺伝子を保持するウイルスに曝露する。該ウイルスが細胞に入り、望む遺伝子は細胞DNAの一部になる。細胞を実験室で増殖させ、次いで静脈注射により患者に戻す。in vivo遺伝子療法を用い、例えばウイルスやリポソームのようなベクターを用いて患者の身体内部の細胞に望む遺伝子を送達することができよう。
【０１１３】
アポトーシスの調節に関与する重要なSPARCポリペプチド配列を同定し、次いで化学療法剤と組み合わせて用いるペプチドベースの化学療法増感療法を開発する。未成熟SPARCにおける開裂分泌シグナル配列を含むSPARCのN-末端1/3の少なくとも5連続アミノ酸に及ぶ個々の合成ポリペプチドは、化学療法剤と組み合わせて、耐性腫瘍中の癌性細胞を増感する役目をはたし得る。適切な合成ポリペプチドを同定するためのアッセイは、耐性癌性細胞をin vitroまたはin vivoで少なくとも1の単離されたポリペプチドおよび化学療法剤(単独または組み合わせて)に曝露し、次いで本明細書に記載のごとく化学療法剤に曝露し続けることにより行うことができよう。細胞の生存およびアポトーシスは本明細書に記載の方法を用いて評価することができよう。
【０１１４】
本発明のある態様のペプチドは、表2に示すアミノ酸配列を含むペプチドを含みうる。本発明の他の態様の他のペプチドは、表2に記載のものと実質的に同様な配列を有するペプチドを含みうる。そのようなペプチドは、単離されているか、または当業者に明らかな様に、トレーサー化合物、タンパク質翻訳配列、リポソーム、炭化水素担体、重合担体もしくは他の物質、または賦形剤と結合または混合することができる。別の態様において、薬理学的有効量で存在するそのようなペプチドには医薬が含まれよう。
【０１１５】
本発明は、癌療法的処置を増感するための組成物および方法を提供する。そのような増感組成物および方法は、処置に耐性な患者の反応を増強するのに特に有用である。それらは、例えば該処置の同様の強さ(すなわち用量)に対する患者の反応を増強することにより癌療法の副作用を減少させるのにも有用である。本発明の組成物は、治療薬の用量を少なくとも約10%、例えば少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%減少させうる。
表3．ペプチド配列
【０１１６】
【表１】
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【０１１７】
当業者は、遺伝子コードの普遍性により、あらゆる特定のアミノ酸配列の知識は当業者が該アミノ酸配列のペプチドをコードすることができる限定された数の特定のポリヌクレオチド配列を容易に予想することを可能にすると認識する。さらに、当業者は、当該分野でよく知られている「コドン最適化」のプロセスを介してあらゆる特定の種において発現させるための該アミノ酸配列のポリペプチドをコードする最適ポリヌクレオチド配列を容易に決定することができる(例えば、VILLALOBOS et al.: Gene Designer: a synthetic biology tool for constructing artificial DNA segments. BMC Bioinformatics. 2006 Jun 6;7:285参照)。
【０１１８】
本発明は、ある態様において、SPARCポリペプチドおよび化学療法に耐性な細胞を含む組成物を提供する。試料または哺乳動物を癌療法に増感するのに加えて、本発明の対象組成物の使用は療法の用量を減らし、癌療法により生じる副作用を減らすことができる。上記組成物は、さらに医薬的に許容される担体または賦形剤を含む医薬組成物を含みうる。
【０１１９】
本明細書で用いている「担体」とは、活性医薬成分(API)を適切なin vitroまたはin vivo作用部位に送達するためのビークルとして適したあらゆる物質をいう。したがって、担体は、活性医薬成分を含む治療用または実験用試薬を製造するための賦形剤として働くことができる。好ましい担体は、活性医薬成分をT細胞と相互作用することができる形に維持することができる。そのような担体の例には、限定されるものではないが、水、リン酸緩衝生理食塩水、生理食塩水、リンゲル溶液、ブドウ糖溶液、血清含有溶液、ハンクス溶液、および他の水性生理学的平衡溶液もしくは細胞培養液が含まれる。水性担体は、レシピエントの生理学的状態に近づける(例えば化学的安定性および等張性の増大)のに必要な適切な補助物質も含みうる。適切な補助物質には、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、およびリン酸緩衝液、Tris緩衝液、および重炭酸緩衝液を作製するのに用いる他の物質が含まれる。
方  法
クローニングおよびプラスミドの構築
【０１２０】
配列番号2、配列番号4、もしくは配列番号6に対応するポリヌクレオチド断片をPCRにより増幅し、pSecTagベクター(Invitrogen)に挿入し、次いでシーケンシングにより確認した。
細胞培養および維持
【０１２１】
結腸直腸細胞系MIP101およびMIP/CPT細胞を、37℃および5% CO2で10%ウシ胎児血清(FBS)(Invitrogen)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen)を添加したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)(Invitrogen)中で維持した。
耐性細胞系の作製
【０１２２】
耐性MIP101細胞を、増加する量の5-フルオロウラシル(5-FU)(10-500uM)、イリノテカン(CPT)(1-50uM；Pharmacia)、シスプラチン(CIS)(1-100uM)、またはエトポシド(ETO)(0.1-5uM：Sigma-Aldrich)で長期培養後に作製した。各薬剤の濃度は6カ月間、2週間毎に10%増加させた。
一時的トランスフェクション
【０１２３】
一時的トランスフェクションを以前に記載されているように行った(Tai TC et al.、2001. J Neurochem;76:1851-9)。簡単には、96ウェル組織培養プレート中で50〜60%コンフルエントに増殖したMIP101結腸直腸癌細胞および耐性MIP/CPT細胞を、1.0μgのベクター(コントロール)またはベクター + SPARC断片でPEIトランスフェクション法にてトランスフェクションした(Tai、T.C. et al.、2002. Mol Pharmacol 61:1385-92)。トランスフェクション後、細胞をDMEM培地(10% FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン添加)で洗浄し、48時間新鮮培地中で培養し、次いで化学療法剤(5-FU 1000μMまたはCPT-11 500μM)と24時間インキュベーションした。細胞増殖をMTSアッセイ(Promega)により評価した。
ペプチドアッセイ
【０１２４】
感受性MIP101および耐性MIP/5FU細胞を、10% FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン添加DMEM中、8,000細胞/ウェル(96ウェルプレート)の密度で播種した。37℃、5% CO2で48時間培養後、培地を除去し、500μM 5-FUの存在下または非存在下、目的のペプチドを含む新鮮無血清順化培地(VP-SFM、Invitrogen)でさらに48時間培養した。細胞の生存性をMTSアッセイで評価した。
【０１２５】
ペプチドはSigmaにより注文合成された。ペプチドA、A1、A2、A3は0.1% DMSOに溶解した。ペプチドB8、B14、B8-スクランブル、およびB14-スクランブルはPBSに溶解した。MTS細胞生存性アッセイでは、用量反応曲線を「高」ペプチド濃度200μg/mlおよび「低」ペプチド濃度96μg/mlを用いて得た。
細胞生存性(MTSアッセイ)
【０１２６】
MTSアッセイでは、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシ-メトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム内塩(MTS)、およびフェナジンメトサルフェート(PMS)(Promega(Madison、WI)から購入)を比2：0.92μg/mlで混合し、25μlの混合物を各ウェルに加えた。37℃、5% CO2で2時間インキュベーションした後、各ウェルの490nmの吸光度を96ウェルプレートリーダー(Versa Max、version 4.8、Molecular Devices Co.)を使用説明書に従って用い測定した。細胞生存性はコントロールのパーセントで表した。
【０１２７】
グループ間の統計学的差は、分散分析、次いでStudent t-検定とのpost hoc比較により求めた。P-値<0.05を統計的に有意と考えた。
【実施例】
【０１２８】
実施例1
感受性(MIP101-図1)および多剤耐性(MIP/CPT-図2)細胞を一時的にトランスフェクトし、イリノテカン(CPT)に曝露したときの生存率をアッセイした。細胞の生存性をMTSアッセイにより定量した。配列番号2および配列番号4両方のトランスフェクションは、完全長SPARCベクターに比べて耐性MIP/CPT細胞の細胞生存性の低下により同様の効果を示した。コントロール(エンプティベクター)でトランスフェクトした耐性MIP/CPT細胞は、500 uM CPT-11に曝露したにも関わらず生存性であった。
実施例2
in vitroでのSPARCペプチド化学療法増感剤の使用
【０１２９】
本実施例は、in vitroモデル系における本発明のSPARCペプチド化学療法増感剤の有用性を証明する。
【０１３０】
N-末端酸性領域またはホリスタチンドメインの種々の領域に対応する短ペプチドを、化学療法増感活性を示すペプチド配列をさらに絞り込むために合成した。
【０１３１】
5-FUに耐性(MIP/5FU)または感受性のMIP101細胞を記載のごとくB14ペプチド(配列番号9)に曝露した。耐性細胞および感受性細胞の両方において、試験した濃度のいずれでも該ペプチド単独では生存性に有意な影響を及ぼさなかった(図4)。予期したように耐性細胞は、5-FUのみの存在下でより高い生存性を示し、96または200μg/mlのB14 ペプチドの添加により5-FU単独に比べて細胞生存性は低下し、該ペプチドの存在は化学療法剤に対する耐性細胞の感受性を増大させることを示唆する。
【０１３２】
5-FUに耐性(MIP/5FU)または感受性のMIP101細胞をB8ペプチド(配列番号8)に曝露したときにも同様の傾向がみられる(図3)。いずれの濃度でもペプチド単独では細胞生存性に影響はなかった。耐性細胞(MIP/5FU)では、薬剤それ自体では細胞生存性に影響はなかったが、増加する濃度のペプチドの存在下では、化学療法剤に対する耐性細胞の感受性の増加がみられた。
【０１３３】
コントロールとして、5-FUに耐性(MIP/5FU)および感受性のMIP101細胞を、図5に示すようにペプチドA(配列番号13)；A1(配列番号14)；A2(配列番号15)；およびA3(配列番号16)、ならびに図6に示すようにB8-SCR(配列番号17)；およびB14-SCR(配列番号18)に曝露した。耐性および感受性両細胞において、ペプチド(高濃度)単独または5-FUとの組み合わせは%細胞生存性に有意な影響はなかった(図5および6)。
実施例3
in vivoでのSPARCペプチド化学療法増感剤の使用
【０１３４】
本実施例は、腫瘍異種移植モデル系における本発明のSPARCペプチド化学療法増感剤の有用性を示す。
【０１３５】
腫瘍異種移植動物モデルを用いてin vivoの腫瘍増殖に対する種々のSPARC断片の過剰発現の効果を評価した。SPARC(MIP/SP)、またはSPARCのN-末端(MIP/NT)、ホリスタチン(MIP/FS)、および細胞外(MIP/EC)ドメインに相当する種々の生物学的断片を安定にトランスフェクションし、発現するMIP101細胞を腫瘍異種移植モデルに用いた。NIHヌードマウス(6週齢、Taconic Laboratories、Germantown、NY)の左脇腹に1 x 106個の細胞を移植した。平均腫瘍サイズが容積75〜100mm3に達した時に治療計画を開始した。試験終了まで体重測定と同時に、携帯型キャリパー(Fisher Scientific International、Inc. Hampton、NH)を用いて腫瘍を測定した。化学療法は、3週間周期の処置計画(合計x6周期)：5-FU 25mg/kg体重の腹腔内(IP)注射を各サイクルの第1週に3回、次いで2週間の無治療期間を用いて行った。コントロール動物は生理食塩水の注射を受けた。各グループは動物6〜8匹を含んだ。
【０１３６】
結果を図7〜10に示す。SPARCのN-末端(NT-断片；配列番号2)および細胞外(EC-断片；配列番号6)ドメインを安定に発現するMIP101細胞は、この異種移植系において5-FUに対する有意な増感を示した。具体的には、NT-断片は、最高のin vivo感受性をもたらし、次いでEC-断片、最後がFS-断片であった。EC-ドメインは、本アッセイの約44日間処置後に生じる遅延した中等度の化学療法増感作用を示す。
【０１３７】
本発明の特定の態様を記載し、例示したが、そのような態様は単に本発明の例示であって本発明を限定するものではないとみなすべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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