(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸の増幅に応じて発する蛍光が変化するＰＣＲ試料を用い、該試料中の核酸を増幅し、かつ、増幅反応液の蛍光を検出するための容器であって、
少なくとも、（Ａ）高分子材料からなり前記核酸の増幅反応を行なうための反応部と、（Ｂ）該反応部と同一の材料からなり前記試料を受け入れるための導入部と、（Ｃ）ピペットチップの吸入吐出口部位を嵌合する形態で収納できる収納部とを有し、該（Ａ）（Ｂ）および（Ｃ）が一体的に形成されており、
前記反応部は、
底面の形状が正方形であり、
前記反応部の容積に対する表面積の比は４ｍｍ−１以上であり、該容積は０．１ｍｌ以下であり、
前記反応部の側面における平面状または曲面状の側面の部分の肉厚が０．５ｍｍ以下であり、
前記導入部は、
前記反応部と流動性連通を有し、
前記導入部の容積に対する表面積の比は４ｍｍ−１未満であり、該容積は前記反応部の容積より大きいことを特徴とする容器。
【請求項２】
高分子材料が熱可塑性樹脂であることを特徴とする請求項１に記載の容器。
【請求項３】
ピペットチップがフィルター付きピペットチップであることを特徴とする請求項１または２に記載の容器。
【請求項４】
フィルターが疎水性フィルターであることを特徴とする請求項３に記載の容器。
【請求項５】
核酸の増幅に応じて発する蛍光が変化するＰＣＲ試料を用い、該試料中の核酸を増幅し、かつ、増幅反応液の蛍光を検出するための方法であって、容器として、
少なくとも、（Ａ）高分子材料からなり前記核酸の増幅反応を行なうための反応部と、（Ｂ）該反応部と同一の材料からなり前記試料を受け入れるための導入部と、（Ｃ）ピペットチップの吸入吐出口部位を嵌合する形態で収納できる収納部とを有し、該（Ａ）（Ｂ）および（Ｃ）が一体的に形成されており、
前記反応部は、
底面の形状が正方形であり、
前記反応部の容積に対する表面積の比は４ｍｍ−１以上であり、該容積は０．１ｍｌ以下であり、
前記反応部の側面における平面状または曲面状の側面の部分の肉厚が０．５ｍｍ以下であり、
前記導入部は、
前記反応部と流動性連通を有し、
前記導入部の容積に対する表面積の比は４ｍｍ−１未満であり、該容積は前記反応部の容積より大きい容器を使用することを特徴とする核酸増幅方法。
【請求項６】
少なくとも下記（ａ）および（ｂ）の工程を含むことを特徴とする請求項５に記載の核酸増幅方法。
（ａ）着脱可能なチップに、核酸増幅反応のための溶液を保持させる
（ｂ）前記溶液を保持したチップを核酸増幅容器に装着する
【請求項７】
（ａ）の工程において、着脱可能なチップへの溶液の保持が、該チップを介して溶液を吸引および吐出することが可能な分注機構を用いて、該チップに該溶液を吸引することにより行なわれることを特徴とする請求項６に記載の核酸増幅方法。
【請求項８】
（ｂ）の工程において、溶液を保持したチップの核酸増幅容器への装着が、該チップを分注機構から取り外すことなく行なわれることを特徴とする請求項７に記載の核酸増幅方法。
【請求項９】
チップがフィルターを内蔵してなり、該フィルターは、該チップにおいて溶液を保持する部分と、分注機構に装着される際に該分注機構に接する部分との間に位置することを特徴とする請求項６から８のいずれかに記載の核酸増幅方法。
【請求項１０】
さらに、下記（ｃ）および（ｄ）の工程を含むことを特徴とする請求項６から９のいずれかに記載の核酸増幅方法。
（ｃ）前記チップを分注機構から取り外す
（ｄ）前記チップに保持した溶液を核酸増幅容器の底部に移動させる
【請求項１１】
さらに、下記（ｃ）および（ｄ）の工程を含むことを特徴とする請求項６から１０のいずれかに記載の核酸増幅方法。
（ｃ）前記チップに保持された溶液に空気圧を与え、核酸増幅反応のための溶液を該核酸増幅容器の底部に移動させる
（ｄ）前記チップを分注機構から取り外す
【請求項１２】
試料が蛍光体または発光体を含有することを特徴とする請求項５から１１のいずれかに記載の核酸増幅方法。
【請求項１３】
さらに試料から発せられる光を検出することを特徴とする請求項５から１２のいずれかに記載の核酸増幅方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸増幅容器に関するものである。より詳しくは、破損しにくく取り扱いが簡便であり、さらに簡易な構造で安価に大量生産することが可能な核酸増幅容器に関するものである。
本発明はまた、コンタミネーションの原因となる廃棄物を減らすことが可能な反応容器に関するものである。
また、本発明は、核酸増幅方法に関するものである。より詳しくは、自動化が容易であり、さらにコンタミネーションの原因となる廃棄物を減らすことが可能な核酸増幅方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
例えば医薬品や医薬品原料など有用物質は、一般に、化合物の酸化、還元、修飾など様々な化学反応を組み合わせることにより生産され、また、例えば健康診断などの際には、酸化、還元、呈色など様々な化学反応を用いて試薬などの性状を変化させ、尿や血液などの生体物質を分析するなど、バイオテクノロジーにおける様々な分野で化学反応が利用されている。
【０００３】
中でも、近年特に、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）などの核酸増幅反応はバイオテクノロジーにおける様々な分野で応用されている。
例えば、医学分野では、特定臓器で発現または機能するタンパク質の核酸分子レベルでの解析や、神経、脳あるいは免疫系での情報伝達におけるタンパク質の発現制御の研究などにおいて重要であるのみならず、遺伝的疾患の変異遺伝子の検出、癌の診断、ウイルス関連遺伝子の検出など遺伝子診断においても極めて重要である。特に、遺伝子診断などでは核酸増幅反応が確定診断として用いられるため誤りが許されず、また患者から採取できる検体の量が限られているため失敗が許されず、さらに迅速性も要求されるために、迅速性を保ちながら高い精度を有していなければならない。
【０００４】
（１）
ＰＣＲは、一般に、二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離する反応（以下、「変性反応」と表記する）、解離して生じた一本鎖ＤＮＡとプライマーとのアニーリング反応（以下、「アニーリング反応」と表記する）、アニーリングした一本鎖ＤＮＡを鋳型とするプライマーの伸長反応（以下、「伸長反応」と表記する）を繰り返すことにより行なう。具体的には、従来、ＰＣＲ反応液を個々のマイクロチューブに入れて、昇温または冷却を繰り返すことで、上記各反応に必要な反応温度に調整する方法が主に用いられてきた。しかし、ＰＣＲを行なうためには、この温度の調整の繰り返しや、微量のサンプルを扱うことなどにより、煩雑な作業や多大な時間を要し、上記温度の調整の繰り返しを行なうために、約２〜３時間を要する。そこで、近年、より簡便かつ短時間のうちにＰＣＲを行なうための技術が提案されている（特許文献１〜６）。
【０００５】
特許文献１および２には、空気などの気体を熱媒とすることで、変性反応などのための温度調整を行なう装置が開示されている。具体的には、ヒーターで加熱した空気をＰＣＲ反応液の周囲に送り込むことで、それぞれの反応温度に調整している。これにより、ヒートブロック等を用いるより迅速に温度調整が可能になるとされている。核酸増幅容器としては、キャピラリーサンプルチューブが用いられている。キャピラリーサンプルチューブは、ＰＣＲ反応液の貯留部位が極めて細く形成されているため、温度調整の時間を短縮することができる。また、当該装置では、キャピラリーサンプルチューブなどに含まれるＰＣＲ反応液の蛍光を検出する手段も備えている。つまり、核酸の増幅に応じて発する蛍光が変化するＰＣＲ試料を用いれば、リアルタイムにＰＣＲの結果を確認することができる。
【０００６】
特許文献１および２に開示の装置のように、核酸増幅容器としてキャピラリチューブを用いる場合は、別途、遠心機によって試料などを充填する工程が必要となる。つまり、キャピラリチューブは液溜部が細いため、試料などを当該液溜部すなわち核酸増幅反応を行なうための反応部に充填するためには、注入口すなわち試料などを受け入れるための導入部に注いだ上で遠心機にかける工程が必要になり、当該工程を行なった上で、装置に搭載する必要がある。このとき、特許文献１および２に開示の核酸増幅容器では反応部の材質としてガラスを使用しているため、当該導入部に注いだ試料などを当該反応部に充填するための遠心の際に生じる遠心力によって核酸増幅容器が破損する可能性がある。遠心時の他にも、持ち運びなど通常の実験操作においても核酸増幅容器が破損する可能性がある。当該充填操作の際に核酸増幅容器が破損すると試料などを失うことになるため、例えば、患者から採取できる検体の量が限られている遺伝子診断の場合には、診断結果を得ることができない。また、特許文献１および２に開示の核酸増幅容器は、プラスチック製の導入部とガラス製の反応部を組み合わせた複雑な構造であるため、大量生産することが困難であり安価に供給することができない。
【０００７】
特許文献３および４には、ＰＣＲによって得られる二本鎖核酸に結合して蛍光を発する蛍光染料を用いて、当該蛍光を検出することで、迅速にＰＣＲの結果を確認する技術が開示されている。
【０００８】
特許文献５には、ＰＣＲによって得られる二本鎖核酸に結合する化合物と、当該化合物が当該二本鎖核酸に結合したときに発する蛍光が変化する反応分子で標識したプライマーとを用いるＩＦＰ法が開示されている。当該蛍光の変化を検出することで、ＰＣＲの結果を簡便に確認することができるとされている。
【０００９】
特許文献６には、３’末端にＣ（シトシン）を有し、Ｃ（シトシン）とＧ（グアニン）とが水素結合したときに蛍光が消える蛍光色素で標識したプライマーを用いてＰＣＲを行なうＱ−Ｐｒｏｂｅ法が開示されている。これにより、当該蛍光の変化を確認することで、ＰＣＲの結果を簡便に確認することができるとされている。
【００１０】
特許文献３〜６に開示の技術は、核酸増幅反応の結果を簡便に確認するための技術であり、核酸増幅容器としては光学的に透明であれば良く、破損しにくく取り扱いが簡便な核酸増幅容器を安価に供給するために資する技術ではない。
【特許文献１】特表２０００−５１１４３５号公報
【特許文献２】特表２０００−５１２１３８号公報
【特許文献３】特開平５−１８４３９７号公報
【特許文献４】特開平１０−２１０４６４号公報
【特許文献５】特表２００３−５００００１号公報
【特許文献６】特開２００１−２８６３００号公報
【００１１】
（２）
ＰＣＲは、一般に、二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離する反応（以下、「変性反応」と表記する）、解離して生じた一本鎖ＤＮＡとプライマーとのアニーリング反応（以下、「アニーリング反応」と表記する）、アニーリングした一本鎖ＤＮＡを鋳型とするプライマーの伸長反応（以下、「伸長反応」と表記する）を繰り返すことにより、任意のＤＮＡ断片を指数関数的に増幅させる方法である。この１サイクルにより、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。したがって、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上、増幅の対象となるＤＮＡ断片が２のｎ乗倍に増幅される。増幅されたＤＮＡ断片は大量に存在するため、電気泳動など従来公知の方法により容易に検出できる。このように、ＰＣＲによれば、従来では検出不可能であった、極めて微量（１分子でも可）の核酸をも検出することが可能である（非特許文献１）。
【００１２】
このように、ＰＣＲに代表される核酸増幅技術を用いれば、増幅の対象となるＤＮＡ断片を非常に高感度に検出できる。一方で、高感度であるがゆえに非特異的な増幅反応、すなわち増幅の対象となるＤＮＡの有無とは無関係な増幅が起こりやすいことが、本技術の大きな問題である。例えば、核酸増幅反応が確定診断として用いられる遺伝子診断において、本来増幅の対象となる核酸が存在しない、すなわち陰性と判断されるべき検体で、非特異的な増幅反応が起こった場合は、当該検体は陽性と診断されることになる。このような偽陽性は、例えば、増幅の対象がウイルス由来の核酸の場合には、健常者を誤って感染患者として扱う原因となり、無意味な治療行為により健常者の健康を害する危険があるだけでなく、入院や隔離などの行動制限や風評被害などの社会的な問題を引き起こす可能性もあり、非常に大きな問題に発展する。
【００１３】
核酸増幅においては、核酸増幅反応液へ鋳型核酸が混入することによる汚染、すなわちコンタミネーションが、上述のような偽陽性の主要な原因となり得る。混入する鋳型核酸としては、例えば、他の患者などに由来する検体や、一旦増幅させた同種の核酸、すなわち増幅核酸断片などが挙げられる。特に、上述のように核酸増幅反応では、少量の核酸から大量の増幅核酸断片が生じるために、例えば、増幅核酸断片が、目に見える飛沫のような形態だけでなく、目には見えないエアゾールのような形態で核酸増幅反応液へ混入しただけでも、偽陽性の原因となり得るため、増幅反応後の反応液の取り扱いには細心の注意を要する。
【００１４】
ＰＣＲは、具体的には、従来、ＰＣＲ反応液を個々のマイクロチューブに入れて、昇温または冷却を繰り返すことで、上記各反応に必要な反応温度に調整する方法が主に用いられてきた。しかし、ＰＣＲを行なうためには、この温度の調整の繰り返しや、微量のサンプルを扱うことなどにより、煩雑な作業や多大な時間を要し、上記温度の調整の繰り返しを行なうために、約２〜３時間を要する。そこで、近年、より簡便かつ短時間のうちにＰＣＲを行なうための技術が提案されている。
【００１５】
特許文献１および２には、空気などの気体を熱媒とすることで、変性反応などのための温度調整を行なう装置が開示されている。具体的には、ヒーターで加熱した空気をＰＣＲ反応液の周囲に送り込むことで、それぞれの反応温度に調整している。これにより、ヒートブロック等を用いるより迅速に温度調整が可能になるとされている。
特許文献１および２には、核酸増幅容器としてキャピラリチューブを用いて、ＰＣＲに必要な温度サイクルを行なう手段と、サンプルチューブに含まれるＰＣＲ反応液の蛍光を検出する手段とを備えた装置が開示されている。核酸増幅容器としては、キャピラリーサンプルチューブが用いられている。キャピラリーサンプルチューブは、ＰＣＲ反応液の貯留部位が極めて細く形成されているため、温度調整の時間を短縮することができる。また、当該装置では、キャピラリーサンプルチューブなどに含まれるＰＣＲ反応液の蛍光を検出する手段も備えている。つまり、当該装置では、核酸の増幅に応じて発する蛍光が変化するＰＣＲ試料を用いれば、リアルタイムにＰＣＲの結果を確認することができ、反応後にサンプルチューブの蓋を開けることによる核酸増幅反応液の飛散を防ぎ、コンタミネーションの危険を低減させることができる。
【００１６】
特許文献１および２に開示の装置のように、核酸増幅容器としてキャピラリチューブを用いる場合は、別途、遠心機によって試料などを充填する工程が必要となる。つまり、キャピラリチューブは液溜部が細いため、試料などを当該液溜部すなわち核酸増幅反応を行なうための反応部に充填するためには、注入口すなわち試料などを受け入れるための導入部に注いだ上で遠心機にかける工程が必要になり、当該工程を行なった上で、装置に搭載する必要がある。このとき、特許文献１および２に開示の核酸増幅容器では反応部の材質としてガラスを使用しているため、当該導入部に注いだ試料などを当該反応部に充填するための遠心の際に生じる遠心力によって核酸増幅容器が破損する可能性がある。遠心時の他にも、持ち運びなど通常の実験操作においても核酸増幅容器が破損する可能性がある。当該充填操作の際に核酸増幅容器が破損すると試料などを失うことになるため、例えば、患者から採取できる検体の量が限られている遺伝子診断の場合には、診断結果を得ることができない。また、特許文献１および２に開示の核酸増幅容器は、プラスチック製の導入部とガラス製の反応部を組み合わせた複雑な構造であるため、大量生産することが困難であり安価に供給することができない。
【００１７】
特許文献１および２に開示の装置では、核酸増幅反応の前に、別途、核酸増幅容器であるキャピラリチューブにキャップを装着する必要がある。これは、一旦増幅させた同種の核酸、すなわち増幅核酸断片のコンタミネーションを防止するために、従来、一般的に行なわれている対策であるが、それぞれのキャピラリチューブへのキャップの装着は、特にＰＣＲを行なうサンプルの数が多い場合には、大変煩雑な作業となる。また、特許文献１および２に開示の装置では、他の患者などに由来する検体のコンタミネーションを防止するための対策は開示されていない、すなわち、核酸増幅反応のための溶液を核酸増幅容器に充填する際に、上記検体中に含まれる核酸が飛散する問題が解決されていない。さらに、特許文献１および２に開示の核酸増幅容器では、反応部の材質としてガラスを使用しているため、キャップを装着する際に核酸増幅容器が破損する可能性がある。当該操作の際に核酸増幅容器が破損すると試料などを失うことになるため、例えば、患者から採取できる検体の量が限られている遺伝子診断の場合には、診断結果を得ることができない。
【００１８】
特許文献７には、蓋が一体的に設けられた検出容器に、試薬と、標的核酸を含むことが疑われる試料とを分注する分注手段と、検出容器への試薬および試料の分注が終了した後に、検出容器の蓋を閉める蓋閉手段と、蓋が閉められた検出容器内の標的核酸を増幅する増幅手段と、蓋が閉められた検出容器内の標的核酸の存在を検出する検出手段とを備えた装置が開示されている。つまり、当該装置では、自動的に、核酸増幅容器へ蓋を装着することができる。
【００１９】
特許文献７に開示の装置では、核酸増幅容器へ蓋を装着する作業を自動的に行なうための手段として、当該装置に、検出容器の蓋を蓋閉位置まで移動させる回動部材と、回動部材を上方向から下方向に押圧することにより蓋に上方向からの押圧力を加えて蓋の蓋閉動作を完了させる押圧部材とを含んでおり、押圧部材による上方向からの押圧力による蓋閉め動作により、検出容器の蓋閉め動作を行う。これは、コンタミネーションを防止するために、従来、一般的に行なわれている対策を自動化したものであるが、装置が大型化、複雑化するという問題を有する。また、特許文献７に開示の装置においても、特許文献１および２に開示の装置と同様に、他の患者などに由来する検体のコンタミネーションを防止するための対策は開示されていない、すなわち、核酸増幅反応のための溶液を核酸増幅容器に充填する際に、上記検体中に含まれる核酸が飛散する問題が解決されていない。
【特許文献７】特開２００５−９５１３４号公報
【非特許文献１】Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、第８章、第８．１〜８．１２６頁、２００１年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
核酸増幅容器としてキャピラリーサンプルチューブを用い、また核酸の増幅に応じて発する蛍光が変化するＰＣＲ試料を用い、さらに核酸増幅装置がキャピラリーサンプルチューブなどに含まれるＰＣＲ反応液の蛍光を検出する手段を備えていれば、短時間のうちにＰＣＲを行ない、その結果を確認することができる。しかしながら、上記従来の構成では、キャピラリーサンプルチューブなど極めて細く形成された核酸増幅容器を使用するため、ＰＣＲ反応液の調製および当該容器への充填に細心の注意が必要であり、その作業に長時間を要するという問題を有する。また、上記従来の構成では、キャピラリーサンプルチューブなど核酸増幅容器が破損しやすいため、特に失敗が許されない遺伝子診断などに用いることは困難であるという問題をも有する。
【００２１】
さらに、上記従来の構成、すなわち、核酸の増幅に応じて発する蛍光が変化するＰＣＲ試料を用い、さらに核酸増幅装置がキャピラリチューブなどに含まれるＰＣＲ反応液の蛍光を検出する手段を備えていれば、反応後にサンプルチューブの蓋を開けることによる核酸増幅反応液の飛散を防ぎ、コンタミネーションの危険を低減させることができる。
また、核酸増幅装置が、核酸増幅容器へ蓋を装着する作業を自動的に行なうための手段を備えていれば、蓋の装着という煩雑な作業を省略することができる。
しかしながら、上記従来の構成では、装置が大型化、複雑化するという問題を有する。また、上記従来の構成では、核酸増幅反応のための溶液を核酸増幅容器に充填する際に、上記検体中に含まれる核酸が飛散し、他の患者などに由来する検体のコンタミネーションが起こるという問題をも有する。
【００２２】
本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、破損しにくく取り扱いが簡便であり、また簡易な構造で安価に大量生産することができ、さらにコンタミネーションの原因となる廃棄物を減らすことが可能な反応容器（核酸増幅容器）を提供することにある。
【００２３】
また、本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、自動化が容易であり、装置が大型化、複雑化することなくコンタミネーションを予防することができ、さらにコンタミネーションの原因となる廃棄物を減らすことが可能な核酸増幅方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意検討を重ねた結果、核酸増幅容器の材質と形状を工夫することによって、破損を抑え、安価に大量生産できることを見出し、本発明に至った。
【００２５】
また、本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意検討を重ねた結果、化学反応のための溶液を反応容器に充填する方法（核酸増幅反応のための溶液を核酸増幅容器に充填する方法）を工夫し、さらに反応容器の材質と形状を工夫することによって、破損を抑え、安価に大量生産でき、簡易な操作で確実に反応液の飛散を防ぐことができ、さらにコンタミネーションの原因となる廃棄物を減らすことができることを見出し、本発明に至った。
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
【００２６】
１Ａ．試料中の核酸を増幅するための容器であって、
少なくとも、高分子材料からなり前記核酸の増幅反応を行なうための反応部と、該反応部と同一の材料からなり前記試料を受け入れるための導入部とを有し、
前記反応部は、
少なくとも２つの角を有する形状の底面と、該底面を構成する直線または曲線をそれぞれ一辺とする平面状または曲面状の側面とを有し、
前記反応部の容積に対する表面積の比は４ｍｍ−１以上であり、該容積は０．１ｍｌ以下であり、
前記導入部は、
前記反応部と流動性連通を有し、
前記導入部の容積に対する表面積の比は４ｍｍ−１未満であり、該容積は前記反応部の容積より大きいことを特徴とする容器。
２Ａ．核酸の増幅反応を行なうための反応部と試料を受け入れるための導入部とが一体的に形成されてなることを特徴とする１Ａの容器。
３Ａ．反応部の側面における平面状または曲面状の側面の部分の肉厚が０．５ｍｍ以下であることを特徴とする１Ａまたは２Ａの容器。
４Ａ．反応部の底面の形状が三角形であることを特徴とする１Ａから３Ａのいずれかの容器。
５Ａ．反応部の底面の形状が四角形であることを特徴とする１Ａから３Ａのいずれかの容器。
６Ａ．反応部の底面の形状が長方形であり、該長方形を構成する辺において、長辺の長さが短辺の長さの２倍以上であることを特徴とする５Ａの容器。
７Ａ．高分子材料が熱可塑性樹脂であることを特徴とする１Ａ〜６Ａのいずれかの容器。
８Ａ．熱可塑性樹脂が、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリメチルペンテン、環状ポリオレフィン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリアセタール、ポリアミド、ポリイミド、ポリアミドイミド、液晶ポリマー、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルサルホン、ポリエチレンテレフタレート、ポリフェニレンエーテル、ポリサルフォン、ポリフェニレンサルファイド、ポリブチレンテレフタレート、メタクリル樹脂、ＡＢＳ樹脂及びポリ塩化ビニルからなる群より選ばれた１種の樹脂又は２種以上のポリマーアロイまたは２種以上のポリマーブレンドであることを特徴とする７Ａの容器。
９Ａ．熱可塑性樹脂が、ポリプロピレンであることを特徴とする７Ａの容器。
１０Ａ．核酸の増幅反応を行なうための反応部の少なくとも一部が、光学的に透明であることを特徴とする１Ａ〜９Ａのいずれかの容器。
１１Ａ．さらに複数の容器が連結されてなることを特徴とする１Ａ〜１０Ａのいずれかの容器。
１２Ａ．複数の容器の連結が、試料を受け入れるための導入部を連結することによってなることを特徴とする１１Ａの容器。
１Ｂ’．ピペットチップの少なくとも吸入吐出口部位を収納できる収納部を含むことを特徴とする１Ａの容器。
２Ｂ’．化学反応が、核酸増幅反応であることを特徴とする１Ｂ’の容器。
３Ｂ’．前記反応部の容積が、０．１ｍｌ以下であることを特徴とする１Ｂ’または２Ｂ’の容器。
４Ｂ’．前記反応部の容積に対する表面積の比が、４ｍｍ−１以上であることを特徴とする３Ｂ’の容器。
５Ｂ’．前記反応部の側面の部分の肉厚が０．５ｍｍ以下であることを特徴とする１Ｂ’〜４Ｂ’のいずれかの容器。
６Ｂ’．前記反応部の底面の形状が三角形であることを特徴とする１Ｂ’〜５Ｂ’のいずれかの容器。
７Ｂ’．前記反応部の底面の形状が四角形であることを特徴とする１Ｂ’〜５Ｂ’のいずれかの容器。
８Ｂ’．前記反応部の底面の形状が長方形であり、該長方形を構成する辺において、長辺の長さが短辺の長さの２倍以上であることを特徴とする７Ｂ’の容器。
９Ｂ’．容器が熱可塑性樹脂からなることを特徴とする１Ｂ’〜８Ｂ’のいずれかの容器。
１０Ｂ’．熱可塑性樹脂が、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリメチルペンテン、環状ポリオレフィン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリアセタール、ポリアミド、ポリイミド、ポリアミドイミド、液晶ポリマー、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルサルホン、ポリエチレンテレフタレート、ポリフェニレンエーテル、ポリサルフォン、ポリフェニレンサルファイド、ポリブチレンテレフタレート、メタクリル樹脂、ＡＢＳ樹脂及びポリ塩化ビニルからなる群より選ばれた１種の樹脂又は２種以上のポリマーアロイ又は２種以上のポリマーブレンドであることを特徴とする９Ｂ’の容器。
１１Ｂ’．熱可塑性樹脂が、ポリプロピレンであることを特徴とする９Ｂ’の容器。
１２Ｂ’．化学反応を行なうための反応部の少なくとも一部が、光学的に透明であることを特徴とする１Ｂ’〜１１Ｂ’のいずれかの容器。
１３Ｂ’．さらに複数の容器が連結されてなることを特徴とする１Ｂ’〜１２Ｂ’のいずれかの容器。
１４Ｂ’．複数の容器の連結が、収納部を連結することによってなることを特徴とする１３Ｂ’の容器。
１５Ｂ’．ピペットチップがフィルター付きピペットチップであることを特徴とする１Ｂ’〜１４Ｂ’のいずれかの容器。
１６Ｂ’．フィルターが疎水性フィルターであることを特徴とする１５Ｂ’の容器。
１３Ａ．試料中の核酸を増幅するための方法であって、容器として、
少なくとも、高分子材料からなり前記核酸の増幅反応を行なうための反応部と、該反応部と同一の材料からなり前記試料を受け入れるための導入部とを有し、
前記反応部は、
少なくとも２つの角を有する形状の底面と、該底面を構成する直線または曲線をそれぞれ一辺とする平面状または曲面状の側面とを有し、
前記反応部の容積に対する表面積の比は４ｍｍ−１以上であり、該容積は０．１ｍｌ以下であり、
前記導入部は、
前記反応部と流動性連通を有し、
前記導入部の容積に対する表面積の比は４ｍｍ−１未満であり、該容積は前記反応部の容積より大きい容器を使用することを特徴とする核酸増幅方法。
１Ｃ’．少なくとも下記（ａ）および（ｂ）の工程を含むことを特徴とする１３Ａの核酸増幅方法。
（ａ）着脱可能なチップに、核酸増幅反応のための溶液を保持させる
（ｂ）前記溶液を保持したチップを核酸増幅容器に装着する
２Ｃ’．（ａ）の工程において、着脱可能なチップへの溶液の保持が、該チップを介して溶液を吸引および吐出することが可能な分注機構を用いて、該チップに該溶液を吸引することにより行なわれることを特徴とする１Ｃ’の核酸増幅方法。
３Ｃ’．（ｂ）の工程において、溶液を保持したチップの核酸増幅容器への装着が、該チップを分注機構から取り外すことなく行なわれることを特徴とする２Ｃ’の核酸増幅方法。
４Ｃ’．チップがフィルターを内蔵してなり、該フィルターは、該チップにおいて溶液を保持する部分と、分注機構に装着される際に該分注機構に接する部分との間に位置することを特徴とする１Ｃ’から３Ｃ’のいずれかの核酸増幅方法。
５Ｃ’．フィルターが疎水性フィルターであることを特徴とする４Ｃ’の核酸増幅方法。
６Ｃ’．チップと核酸増幅容器が、装着により互いに密着することを特徴とする１Ｃ’から５Ｃ’のいずれかの核酸増幅方法。
７Ｃ’．さらに、下記（ｃ）および（ｄ）の工程を含むことを特徴とする１Ｃ’から６Ｃ’のいずれかの核酸増幅方法。
（ｃ）前記チップを分注機構から取り外す
（ｄ）前記チップに保持した溶液を核酸増幅容器の底部に移動させる
８Ｃ’．（ｄ）の工程において、溶液の移動が、チップを装着した核酸増幅容器を遠心することにより行なわれることを特徴とする７Ｃ’の核酸増幅方法。
９Ｃ’．（ｄ）の工程において、溶液の移動が、チップに保持された溶液に空気圧を与えることにより行なわれることを特徴とする７Ｃ’の核酸増幅方法。
１０．（ｃ）の工程において、チップの取り外しが、分注機構から空気を吐出しながら行なわれることを特徴とする７Ｃ’から９Ｃ’のいずれかの核酸増幅方法。
１１．さらに、下記（ｃ）および（ｄ）の工程を含むことを特徴とする１Ｃ’から６Ｃ’のいずれかの核酸増幅方法。
（ｃ）前記チップに保持された溶液に空気圧を与え、核酸増幅反応のための溶液を該核酸増幅容器の底部に移動させる
（ｄ）前記チップを分注機構から取り外す
１４Ａ．核酸の増幅反応を行なうための反応部と試料を受け入れるための導入部とが一体的に形成されてなることを特徴とする１３Ａの核酸増幅方法。
１５Ａ．反応部の側面における平面状または曲面状の側面の部分の肉厚が０．５ｍｍ以下であることを特徴とする１３Ａまたは１４Ａの核酸増幅方法。
１６Ａ．反応部の底面の形状が三角形であることを特徴とする１３Ａから１５Ａのいずれかの核酸増幅方法。
１７Ａ．反応部の底面の形状が四角形であることを特徴とする１３Ａから１５Ａのいずれかの核酸増幅方法。
１８Ａ．反応部の底面の形状が長方形であり、該長方形を構成する辺において、長辺の長さが短辺の長さの２倍以上であることを特徴とする１７Ａの核酸増幅方法。
１９Ａ．高分子材料が熱可塑性樹脂であることを特徴とする１３Ａ〜１８Ａのいずれかの核酸増幅方法。
２０Ａ．熱可塑性樹脂が、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリメチルペンテン、環状ポリオレフィン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリアセタール、ポリアミド、ポリイミド、ポリアミドイミド、液晶ポリマー、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルサルホン、ポリエチレンテレフタレート、ポリフェニレンエーテル、ポリサルフォン、ポリフェニレンサルファイド、ポリブチレンテレフタレート、メタクリル樹脂、ＡＢＳ樹脂及びポリ塩化ビニルからなる群より選ばれた１種の樹脂又は２種以上のポリマーアロイ又は２種以上のポリマーブレンドであることを特徴とする１９Ａの核酸増幅方法。
２１Ａ．熱可塑性樹脂が、ポリプロピレンであることを特徴とする１９Ａの核酸増幅方法。
２２Ａ．核酸の増幅反応を行なうための反応部の少なくとも一部が、光学的に透明であることを特徴とする１３Ａ〜２１Ａのいずれかの核酸増幅方法。
２３Ａ．試料が蛍光体または発光体を含有することを特徴とする１３Ａから２２Ａのいずれかの核酸増幅方法。
２４Ａ．さらに試料から発せられる光を検出することを特徴とする１３Ａから２３Ａのいずれかの核酸増幅方法。
２５Ａ．試料から発せられる光の検出が核酸増幅反応と同時に行なわれることを特徴とする２４Ａの核酸増幅方法。
２６Ａ．試料から発せられる光の検出が核酸増幅反応の後に行なわれることを特徴とする２４Ａの核酸増幅方法。 
１Ｂ．ピペットチップの少なくとも吸入吐出口部位を収納できる収納部と、化学反応を行なう反応部を含むことを特徴とする容器。
２Ｂ．化学反応が、核酸増幅反応であることを特徴とする請求項３２に記載の容器。
３Ｂ．前記反応部の容積が、０．１ｍｌ以下であることを特徴とする１Ｂまたは２Ｂの容器。
４Ｂ．前記反応部の容積に対する表面積の比が、４ｍｍ−１以上であることを特徴とする３Ｂの容器。
５Ｂ．前記反応部の側面の部分の肉厚が０．５ｍｍ以下であることを特徴とする１Ｂ〜４Ｂのいずれかの容器。
６Ｂ．前記反応部の底面の形状が三角形であることを特徴とする１Ｂ〜５Ｂのいずれかの容器。
７Ｂ．前記反応部の底面の形状が四角形であることを特徴とする１Ｂ〜５Ｂのいずれかの容器。
８Ｂ．前記反応部の底面の形状が長方形であり、該長方形を構成する辺において、長辺の長さが短辺の長さの２倍以上であることを特徴とする７Ｂの容器。
９Ｂ．容器が熱可塑性樹脂からなることを特徴とする１Ｂ〜８Ｂのいずれかの容器。
１０Ｂ．熱可塑性樹脂が、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリメチルペンテン、環状ポリオレフィン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリアセタール、ポリアミド、ポリイミド、ポリアミドイミド、液晶ポリマー、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルサルホン、ポリエチレンテレフタレート、ポリフェニレンエーテル、ポリサルフォン、ポリフェニレンサルファイド、ポリブチレンテレフタレート、メタクリル樹脂、ＡＢＳ樹脂及びポリ塩化ビニルからなる群より選ばれた１種の樹脂又は２種以上のポリマーアロイ又は２種以上のポリマーブレンドであることを特徴とする９Ｂの容器。
１１Ｂ．熱可塑性樹脂が、ポリプロピレンであることを特徴とする９Ｂの容器。
１２Ｂ．化学反応を行なうための反応部の少なくとも一部が、光学的に透明であることを特徴とする１Ｂ〜１１Ｂのいずれかの容器。
１３Ｂ．さらに複数の容器が連結されてなることを特徴とする１Ｂ〜１２Ｂのいずれかの容器。
１４Ｂ．複数の容器の連結が、収納部を連結することによってなることを特徴とする１３Ｂの容器。
１５Ｂ．ピペットチップがフィルター付きピペットチップであることを特徴とする１Ｂ〜１４Ｂのいずれかの容器。
１６Ｂ．フィルターが疎水性フィルターであることを特徴とする１５Ｂの容器。
１Ｃ．少なくとも下記（ａ）および（ｂ）の工程を含むことを特徴とする核酸増幅方法。
（ａ）着脱可能なチップに、核酸増幅反応のための溶液を保持させる
（ｂ）前記溶液を保持したチップを核酸増幅容器に装着する
２Ｃ．（ａ）の工程において、着脱可能なチップへの溶液の保持が、該チップを介して溶液を吸引および吐出することが可能な分注機構を用いて、該チップに該溶液を吸引することにより行なわれることを特徴とする１Ｃの核酸増幅方法。
３Ｃ．（ｂ）の工程において、溶液を保持したチップの核酸増幅容器への装着が、該チップを分注機構から取り外すことなく行なわれることを特徴とする２Ｃの核酸増幅方法。
４Ｃ．チップがフィルターを内蔵してなり、該フィルターは、該チップにおいて溶液を保持する部分と、分注機構に装着される際に該分注機構に接する部分との間に位置することを特徴とする１Ｃから３Ｃのいずれかの核酸増幅方法。
５Ｃ．フィルターが疎水性フィルターであることを特徴とする４Ｃの核酸増幅方法。
６Ｃ．チップと核酸増幅容器が、装着により互いに密着することを特徴とする１Ｃから５Ｃのいずれかの核酸増幅方法。
７Ｃ．さらに、下記（ｃ）および（ｄ）の工程を含むことを特徴とする１Ｃから６Ｃのいずれかの核酸増幅方法。
（ｃ）前記チップを分注機構から取り外す
（ｄ）前記チップに保持した溶液を核酸増幅容器の底部に移動させる
８Ｃ．（ｄ）の工程において、溶液の移動が、チップを装着した核酸増幅容器を遠心することにより行なわれることを特徴とする７Ｃの核酸増幅方法。
９Ｃ．（ｄ）の工程において、溶液の移動が、チップに保持された溶液に空気圧を与えることにより行なわれることを特徴とする７Ｃの核酸増幅方法。
１０Ｃ．（ｃ）の工程において、チップの取り外しが、分注機構から空気を吐出しながら行なわれることを特徴とする７Ｃから９Ｃのいずれかの核酸増幅方法。
１１Ｃ．さらに、下記（ｃ）および（ｄ）の工程を含むことを特徴とする１Ｃから６Ｃのいずれかの核酸増幅方法。
（ｃ）前記チップに保持された溶液に空気圧を与え、核酸増幅反応のための溶液を該核酸増幅容器の底部に移動させる
（ｄ）前記チップを分注機構から取り外す
【発明の効果】
【００２７】
本発明により、破損しにくく取り扱いが簡便であり、さらに簡易な構造で安価に大量生産することが可能な核酸増幅容器、ならびに当該核酸増幅容器を用いた迅速かつ簡便な核酸増幅検出方法が提供される。本発明の核酸増幅容器は、特に、これまでの核酸増幅容器とは異なり破損する可能性が極めて低いため、例えば、遺伝子検査のように、患者から採取できる検体の量が限られているため失敗が許されず、さらに迅速性も要求される場合にも、効果的に使用することができる。
【００２８】
本発明により、破損しにくく取り扱いが簡便であり、簡易な構造で安価に大量生産することが可能な反応容器が提供される。また、本発明により、簡易な操作で確実に核酸増幅反応液の飛散を防ぐことができるため、自動化が容易であり、簡易な構造の核酸増幅装置でコンタミネーションを予防することが可能な核酸増幅方法が提供される。
さらに、本発明の反応容器（核酸増幅容器）・核酸増幅方法を用いれば、特に、これまでの反応容器（核酸増幅容器）・核酸増幅方法とは異なり、コンタミネーションの原因となる物質の、廃棄物からの飛散または漏出を減らすことができるため、例えば、遺伝子検査のように、患者から採取できる検体の量が限られているため失敗が許されず、さらに感染性の検体を取り扱う可能性がある場合にも、効果的に使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
以下、本発明の一実施形態について詳細に説明する。
（Ａ）
本発明において、増幅の対象となる核酸としては、標的核酸配列すなわち解析の対象となる核酸配列を含む染色体又はその断片に相補的な配列を有する核酸、増幅した核酸またはその断片に相補的な配列を有する核酸、などが挙げられる。
【００３０】
上記染色体又はその断片に相補的な配列を有する核酸は、例えば、バクテリア、動物または植物組織、個体細胞由来の溶解物などのあらゆる材料から調製することができる。該染色体又はその断片に相補的な配列を有する核酸の調製法は特に限定されないが、例えば、患者の血液、組織から、既知の方法により調製してもよい。代表的なものとして、フェノール／クロロホルム抽出法（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  第７２巻、第６１９〜６２９頁、１９６３年）、アルカリＳＤＳ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  第７巻、第１５１３〜１５２３頁、１９７９年）等の液相で行なう方法がある。また、核酸の単離に核酸結合用担体を用いる系としては、ガラス粒子とヨウ化ナトリウム溶液を使用する方法（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  第７６−２巻、第６１５〜６１９頁、１９７９年）、ハイドロキシアパタイトを用いる方法（特開昭６３−２６３０９３号公報）等がある。その他の方法としてはシリカ粒子とカオトロピックイオンを用いた方法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  第２８−３巻、第４９５〜５０３頁、１９９０年、特開平２−２８９５９６号公報）が挙げられる。なお、例えば、バクテリア、動物、植物などに由来する細胞を含む溶液を、当該細胞を破壊することなく試料として用いたり、あるいはバクテリア、動物、植物などに由来する細胞を直接、核酸増幅反応を行なうための反応液に添加して、上記のような方法による核酸の調製を省略し、核酸増幅反応を行なうこともできる。
【００３１】
本発明において、核酸の増幅方法としては、上記ＰＣＲの他に、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ；Ｎａｔｕｒｅ  第３５０巻、第９１頁（１９９１年））、ＬＣＲ（国際公開８９／１２６９６号公報、特開平２−２９３４号公報）、ＳＤＡ（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  第２０巻、第１６９１頁（１９９２年））、ＲＣＡ（国際公開９０／１０６９号公報）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  第３１巻、第３２７０頁（１９９３年））、ＬＡＭＰ（ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ：Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  第４２巻：第１，９５６頁（２００４年））、ＩＣＡＮ（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｎｄ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ：Ｋｅｋｋａｋｕ．  第７８巻、第５３３頁（２００３年））など既知の核酸増幅方法が挙げられる。本発明において、核酸増幅方法はＰＣＲに限定されるものではないが、以下、説明の簡便化のため、核酸の増幅方法をＰＣＲに代表させ、核酸増幅（核酸増幅反応）を行なうための反応液を「ＰＣＲ反応液」と称することがある。
【００３２】
本発明の核酸増幅容器は、材料として高分子材料を用いることにより、核酸増幅容器が破損する可能性を極めて低くすることができる。高分子材料としては、破損しにくい性質を有していれば特に限定されないが、成型が容易であるという観点から熱可塑性樹脂であることがより好ましい。例えば、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリオレフィン（ＰＯ）、ポリメチルペンテン（ＴＰＸ）、環状ポリオレフィン（ＣＯＣ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリアセタール（ＰＯＭ）、ポリアミド（ＰＡ）、ポリイミド（ＰＩ）、ポリアミドイミド（ＰＡＩ）、液晶ポリマー（ＬＣＰ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエーテルサルホン（ＰＥＳ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリフェニレンエーテル（ＰＰＥ）、ポリサルフォン（ＰＳＦ）、ポリフェニレンサルファイド（ＰＰＳ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、メタクリル樹脂（ＰＭＭＡ）、ＡＢＳ樹脂（ＡＢＳ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）などを使用することができる。またはこれら２種以上のポリマーアロイを使用することができる。好ましくはポリプロピレン（ＰＰ）、環状ポリオレフィン（ＣＯＣ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、またはこれら２種以上のポリマーアロイ又は２種以上のポリマーブレンドであり、より好ましくはポリプロピレン（ＰＰ）である。
【００３３】
また、本発明の核酸増幅容器において、核酸の増幅反応を行なうための反応部の少なくとも一部が、光学的に透明であることにより、核酸の増幅に応じて発する蛍光が変化するＰＣＲ試料を用い、さらに核酸増幅装置がＰＣＲ反応液の蛍光を検出する手段を備えている場合に、短時間のうちにＰＣＲを行ない、その結果を確認することができる。一般に、物体に入射した光は、一部は物体表面で反射され、他の一部は物体内で吸収され、残りが透過光となるため、光学的な透明度は、入射光に対する透過光の比率として表すことができる。当該反応部の少なくとも一部の透明度としては、核酸の増幅に応じて発する蛍光が検出できれば特に限定されない。１ｍｍ厚の成形板にしたときの可視光線透過率が、５０％以上であることが好ましく、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上であればよい。
【００３４】
高分子材料は、従来公知のキャピラリーサンプルチューブの材質として知られるガラスに比べて割れにくい、すなわち破損しにくいメリットを有する一方で、熱などの影響により変形しやすいデメリットを有する材料である。特に、ＰＣＲ反応液の蛍光を検出することにより短時間のうちにＰＣＲの結果を確認する検出方法を用いる場合、核酸増幅容器が変形すると、ＰＣＲ反応液から発せられた蛍光が核酸増幅装置の検出器に届かないことが大きな問題となる。
【００３５】
前述のように、ＰＣＲにおいては核酸増幅容器を介してＰＣＲ反応液の昇温または冷却を繰り返し、それぞれ変性反応、アニーリング反応、伸長反応に適した温度に調整することにより、試料中の核酸が増幅する。一般に、ＰＣＲの変性反応に用いられる温度は９５℃程度であるため、当該温度において高分子材料からなる核酸増幅容器が変形しないようにするためには、該核酸増幅容器の肉厚を厚くする必要がある。しかしながら、肉厚を厚くすると核酸増幅容器を介した熱エネルギーの伝達が遅くなるため、ＰＣＲ反応液の昇温または冷却に時間がかかり、核酸増幅を迅速に行なうことができない。したがって、従来公知のキャピラリーサンプルチューブの材質を単純に高分子材料と置き換えるだけでは、迅速性を犠牲にすることなく、破損しにくい核酸増幅容器を提供することはできない。すなわち、本発明では、様々な材質および形状を検討し、破損しにくい性質と変形しにくい性質を両立できる核酸増幅容器を確立したものである。
【００３６】
本発明の核酸増幅容器は、底面と、該底面を構成する直線または曲線をそれぞれ一辺とする平面状または曲面状の側面とを有する。該底面の形状としては、核酸増幅容器の強度を確保するために、少なくとも２つの角を有していれば特に限定されないが、例えば、図１の（Ａ）〜（Ｏ）に示すような形状が挙げられる。（Ａ）〜（Ｅ）に示すような正多角形、（Ｆ）のような長方形、（Ｇ）のような平行四辺形、（Ｈ）のような十字型、（Ｉ）または（Ｊ）のような星型など、直線のみで構成される形状の他に、（Ｋ）〜（Ｎ）のように直線と曲線とを組み合わせた形状、（Ｏ）のように曲線のみで構成される形状など、適宜選択することができる。
【００３７】
核酸増幅容器の強度を確保し、かつＰＣＲ反応液から発せられる蛍光を容易に検出するという観点からは、該底面の形状は（Ａ）のような三角形、または（Ｂ）、（Ｆ）、（Ｇ）のような四角形が好ましい。一般に、蛍光検出においては、光源すなわちＰＣＲ反応液と検出器とを結ぶ直線に平行な軸線上にある蛍光分子の量が、測定されるシグナルの強度に反映されるため、該底面の形状は（Ｆ）のような長方形であることがより好ましく、該長方形を構成する辺において、長辺の長さが短辺の長さの２倍以上であることがさらに好ましい。
【００３８】
核酸増幅容器の成型方法としては、従来公知の方法を使用することができるが、短い時間で同じ品質の成型品を大量に生産できる、原料の投入から成型品の取り出しまでを全自動で行うことができる、高い寸法精度と複雑な構造の成型品を作ることができる、などの観点から、射出成型法がより好適に使用し得る。
【００３９】
蛍光検出において、当該ＰＣＲ反応液へ入射した励起光が核酸増幅容器により反射される現象が蛍光測定の障害となる場合は、例えば、（Ｋ）〜（Ｎ）のように直線と曲線を組み合わせた形状、または（Ｏ）のように曲線のみで構成される形状を選択することで、反射光の影響を低減させることができる。この場合、上述したように、光源すなわちＰＣＲ反応液と検出器とを結ぶ直線に平行な軸線上にある蛍光分子の量が、測定されるシグナルの強度に反映されることから、（Ｋ）のような形状であることがより好ましい。
【００４０】
本発明の核酸増幅容器は、上記のような形状の底面を構成する直線または曲線をそれぞれ一辺とする平面状または曲面状の側面とを有する。すなわち核酸増幅容器において、核酸の増幅反応を行なうための反応部は、上記のような形状の底面を、該底面に垂直な軸線方向に掃引したような外観を有する。当該核酸増幅容器を側面から見た場合の形状は特に限定されず、該反応部を、該底面に平行な平面で切断した場合の切り口の大きさは、該底面からの距離によらず一定の形状（すなわち、柱状）でも良いし、該底面からの距離が離れるほど大きくなる形状（すなわち、底面に向かって細くなる形状）でも良い。本発明の実施形態の一例として、図２に、底面の形状を正方形、側面の形状を柱状（すなわち、該底面に平行な平面で切断した場合の切り口の大きさが該底面からの距離によらず一定）とした場合の核酸増幅容器の外観を示す。
【００４１】
一般に、柱状または底面に向かって細くなる形状の構造物の変形に対する抵抗性、すなわち強度は、該構造物の断面形状が三角形や四角形などの多角形の方が、円形より強いことが知られている。したがって、本発明の核酸増幅容器の外観は、三角形や四角形など多角形の断面形状を有する柱状または底面に向かって細くなる形状が好ましく、三角形または四角形の断面形状を有することがより好ましい。
【００４２】
本発明では、核酸増幅容器の反応部、すなわちＰＣＲ反応液の貯留部位を極めて細く形成することにより、該ＰＣＲ反応液の容積に対する表面積が大きくなる、すなわち該ＰＣＲ溶液と核酸増幅装置の間での熱エネルギーの伝達速度が向上し、ＰＣＲにおいて繰り返される変性反応、アニーリング反応、伸長反応の各工程間での温度調整の時間を短縮することができる。該反応部において、容積に対する表面積の比は４ｍｍ−１以上であることが好ましく、６ｍｍ−１以上であることがより好ましく、８ｍｍ−１以上であることがさらに好ましい。
【００４３】
また、ＰＣＲにおいて繰り返される変性反応、アニーリング反応、伸長反応の各工程間での温度調整の時間を短縮するためには、ＰＣＲ反応液の容積を小さくすることも効果的である。迅速にＰＣＲを行なうためには、該ＰＣＲ反応液の容積は０．１ｍｌ以下であることが好ましく、０．０２ｍｌ以下であることがより好ましい。しかしながら、ＰＣＲ反応液の容積が小さすぎると、該ＰＣＲ反応液の蛍光を検出することにより短時間のうちにＰＣＲの結果を確認する検出方法を用いる場合に、検出可能な蛍光分子の量が不足し、シグナルとして測定できない可能性があるため、該ＰＣＲ反応液の容積は０．００５ｍｌ以上であることが好ましく、０．０１ｍｌ以上であることがより好ましい。
【００４４】
さらに、上述のように、核酸増幅容器の肉厚を厚くすると、該核酸増幅容器を介した熱エネルギーの伝達が遅くなるため、ＰＣＲ反応液の昇温または冷却に時間がかかり、核酸増幅を迅速に行なうことができない。核酸増幅容器の反応部の側面における平面状または曲面状の部分の肉厚は０．５ｍｍ以下であることが好ましく、０．４ｍｍ以下であることがより好ましく、０．３ｍｍ以下であることがさらに好ましい。しかしながら、当該反応部の側面における平面状または曲面状の部分の肉厚が薄すぎると、例え、核酸増幅容器の形状について前述のような工夫を施していたとしても、強度不足によりＰＣＲ中に該核酸増幅容器の反応部が変形する可能性があるため、該肉厚は０．１ｍｍ以上であることが好ましく、０．２ｍｍ以上であることがより好ましい。
【００４５】
上述のように、本発明の核酸増幅容器において、反応部、すなわちＰＣＲ反応液の貯留部位を極めて細く形成することが好ましい。しかしながら、極めて細い反応部に試料またはＰＣＲ反応液などを充填するためには、導入部、すなわち試料などを受け入れるための注入口に注いだ上で遠心機にかける工程が必要になる。核酸増幅容器の導入部へ試料またはＰＣＲ反応液などを注入する際には、例えば、マイクロピペットなど手動式の分注器または自動式の分注装置を使用するため、該導入部は当該分注器または分注装置により容易に試料またはＰＣＲ反応液などを注入し得る形状であることが好ましい。具体的には、該導入部の容積に対する表面積の比が４ｍｍ−１未満であり、該容積は前記反応部の容積より大きいことが好ましい。さらには、該導入部の容積に対する表面積の比が２ｍｍ−１未満であり、該容積は前記反応部の容積より大きいことがより好ましい。
【００４６】
また、試料またはＰＣＲ反応液などを核酸増幅容器の導入部に注入し、遠心により該核酸増幅容器の反応部に充填するためには、該反応部と該導入部は流動性連通を有していることが好ましい。「流動性連通」とは、該導入部に注入した溶液が遠心力、圧力、重力などの外力により該反応部へ移動できることを指し、該溶液が約１０００ｘｇ以上の遠心力により該反応部へ移動できることが好ましい。さらに、該反応部と該導入部とが同一の材料からなり、一体的に形成されていれば、従来公知の高分子材料の成型技術を用いて、当該核酸増幅容器を安価に大量生産することが可能となるため、より好ましい。
【００４７】
多数の反応を同時に行なう場合などにおいては、複数の核酸増幅容器を連結することで取り扱いを簡便にすることができる。核酸増幅容器の連結方法としては、生産する際に、複数の核酸増幅容器をあらかじめ連結した構造で成型しても良いし、使用する際に、単体の核酸増幅容器を当業者により用意に想到し得る冶具などを用いて連結しても良い。前述のように、ＰＣＲにおいて繰り返される変性反応、アニーリング反応、伸長反応の各工程間での温度調整の時間を短縮するためには、核酸増幅容器の反応部を介した熱エネルギーの伝達を速くすることが効果的であるから、上記複数の核酸増幅容器の連結は、該核酸増幅容器の導入部を連結することによってなることが好ましい。本発明の実施形態の一例として、図３に、底面の形状を正方形、側面の形状を柱状とした核酸増幅容器を、８個連結した場合の外観を示す。
【００４８】
本発明の核酸増幅容器は、核酸を増幅および／または検出するための容器として、例えば、核酸の増幅のみの場合、核酸の増幅と同時に検出する場合、核酸の増幅後に検出する場合、核酸の検出のみの場合などの用途で適宜使用することができる。
【００４９】
（Ｂ）
本発明の反応容器を、バイオテクノロジーにおける様々な分野で応用されている化学反応である核酸増幅反応に適用する場合、増幅の対象となる核酸としては、標的核酸配列すなわち解析の対象となる核酸配列を含む染色体又はその断片に相補的な配列を有する核酸、増幅した核酸またはその断片に相補的な配列を有する核酸、などが挙げられる。
【００５０】
本発明は、簡易な操作で確実に反応液の飛散を防ぐことができ、コンタミネーションを予防することが可能な反応容器を提供することを目的の一つとする。
したがって、本発明において、核酸増幅方法とは、前述のような、核酸の増幅に応じて発する蛍光が変化するＰＣＲ試料を用い、さらに核酸増幅装置がキャピラリチューブなどに含まれるＰＣＲ反応液の蛍光を検出する手段を備えていることによって、核酸の増幅と同時に、あるいは核酸の増幅後に連続して、増幅した核酸を検出する方法をも包含する。
【００５１】
本発明の反応容器は、化学反応のための溶液を保持させたピペットチップの少なくとも吸入吐出口部位を収納することにより、例えば、遺伝子検査においては、従来のピペット操作など核酸増幅反応のための溶液を核酸増幅容器に充填する際に、検体中に含まれる核
酸が飛散し、他の患者などに由来する検体のコンタミネーションが起こる可能性を極めて低くすることができる。
【００５２】
ピペットチップとしては、化学反応のための溶液を保持させることが可能な性質を有していれば特に限定されないが、入手が容易であるという観点から、ピペットチップを介して溶液を吸引および吐出することが可能な分注機構を有する手動分注器または自動分注装置に使用するために、市販されているピペットチップであることが好ましい。例えば、レイニン・インスツルメント社、ギルソン社、エッペンドルフ社、イナ・オプティカ社などから市販されているマイクロピペット用のチップを使用することができる。また、従来公知の成型技術を用いれば、任意の形状のピペットチップを設計および作製することができ、上記ピペットチップとして使用することができる。
【００５３】
ピペットチップが吸引することができる溶液の量は、ピペットチップに化学反応のための溶液を保持させることができれば特に限定されないが、例えば、核酸増幅反応では、０．５マイクロリットル以上１００マイクロリットル以下であることが好ましく、１マイクロリットル以上５０マイクロリットル以下であることがより好ましく、５マイクロリットル以上２０マイクロリットル以下であることがさらに好ましい。また、溶液の量は、ピペットチップが反応容器に収納された際に、当該ピペットチップの先端、すなわち吸入吐出口部位に溶液が接触しない量であることが好ましい。
【００５４】
ピペットチップに、化学反応のための溶液を保持させるための手段も特に制限されないが、ピペットチップを介して溶液を吸引および吐出することが可能な分注機構を用いて、ピペットチップに化学反応のための溶液を吸引することにより、行なうことができる。例えば、ピペットチップを手動式または電動式のマイクロピペット装着して、化学反応のための溶液を吸引し、プランジャーを停止することにより、ピペットチップに溶液を保持させることができる。このとき、マイクロピペットの吸引量を、化学反応のための溶液より多く設定しておけば、チップの先端、すなわち吸引吐出口部位より奥の位置で溶液を保持させることもできる。例えば、自動分注装置の使用は、これら一連の操作をより簡便に行なうことができるため好ましい。また、例えば、核酸増幅機構と分注機構とを有する装置の使用は、さらに好ましい。
【００５５】
ピペットチップを反応容器に収納する手段は、収納後にピペットチップと反応容器を一体的に取り扱うことができる形態であれば特に制限されないが、ピペットチップと反応容器が嵌合する形態であることが好ましく、ピペットチップが反応容器に嵌入する形態であることがより好ましい。このような形態でピペットチップを反応容器に収納することにより、反応後、ピペットチップおよび反応容器を廃棄する際においても、ピペットチップと反応容器が分離することなく一体的に廃棄することができる。一例として、核酸増幅反応において、ピペットチップと核酸増幅容器が分離することなく一体的に廃棄することができることにより、廃棄の際に、ピペットチップに付着した核酸が飛散する可能性を極めて低くし、さらに、核酸増幅容器から増幅核酸断片が漏出する可能性を極めて低くすることで、コンタミネーションの可能性をさらに低減させることができる。
【００５６】
ピペットチップの反応容器への収納は、ピペットチップを上記分注機構から取り外すことなく行なわれても良いし、ピペットチップを上記分注機構から取り外した後に行なわれても良い。手動で装着する場合の操作、あるいは自動で装着する場合の動作を、ともに簡易にするためには、チップを上記分注機構から取り外すことなく、反応容器へ収納することがより好ましい。
【００５７】
本発明の反応容器は、反応液の飛散を厳密に防ぐため、ピペットチップがフィルターを内蔵してなる、フィルター付きピペットチップであることが好ましい。化学反応中および
化学反応後の反応液の飛散を防ぐ観点から、フィルターは、ピペットチップにおいて溶液を保持する部分と、上記分注機構に装着される際に分注機構に接する部分との間に位置することが好ましい。また、フィルターは疎水性フィルターであることが好ましく、飛沫だけでなく、エアゾールの通過をも阻止し得る疎水性フィルターであることがより好ましい。このようなフィルターはとしては、従来公知の方法にて作製することが可能であるが、例えば、ポリエチレン製の基材からなる、フィルター孔の大きさが平均約２０ミクロンのフィルターを用いれば、エアゾールの通過によるコンタミネーションを好適に防止し得る。
【００５８】
フィルター付きピペットチップとしては、例えば、レイニン・インスツルメント社、ギルソン社、エッペンドルフ社、イナ・オプティカ社などから市販されているマイクロピペット用のフィルターチップあるいはエアゾール耐性チップを使用することができる。このような市販品の使用は、入手が容易であるという観点から好ましい。
【００５９】
チップを反応容器に装着する際には、反応液の飛散を厳密に防ぐため、ピペットチップと反応容器が密着していることが好ましい。このような形状のピペットチップおよび反応容器の組み合わせを市販品より選抜して用いることが好ましいが、ピペットチップと反応容器の形状が合わず、反応容器にピペットチップを装着した際に隙間が生じる場合には、例えば、ピペットチップとして市販のフィルターチップあるいはエアゾール耐性チップを使用し、当該ピペットチップの形状に合わせて反応容器を作製すればよい。また、反応容器にピペットチップを装着した際に生じた隙間をシール材などを充填することにより塞ぐ、あるいは、反応容器とピペットチップの間に装着するアダプターなどを作製する、などによりピペットチップと反応容器を密着させればよい。
【００６０】
本発明の重要な開示について、核酸増幅反応をその一例として、ピペットチップにフィルター付きピペットチップを用い、反応容器に核酸増幅容器であるキャピラリチューブを用いる場合について、図７を用いて、より詳しく説明する。図７において、まず、（Ａ）に示すような、フィルター付きピペットチップに、手動分注器または自動分注装置を用いて、（Ｂ）に示すように、核酸増幅反応のための溶液を吸引し、溶液を保持する。当該ピペットチップを、手動または自動にて、（Ｃ）に示すように、核酸増幅容器まで移動させ、（Ｄ）に示すように、ピペットチップを核酸増幅容器に収納する。次に、ピペットチップを手動分注器または自動分注装置から取り外す。このとき、手動分注器または自動分注装置の分注機構から空気を吐出しながら、当該ピペットチップを取り外す動作を行なうことにより、当該動作の際に生じる圧力によってピペットチップに保持された溶液の位置が変化する現象を回避することもできる。
【００６１】
続いて、ピペットチップを装着した核酸増幅容器を遠心することにより、（Ｅ）に示すように、核酸増幅反応のための溶液を核酸増幅容器の底部に移動させる。このとき、遠心の代わりに空気圧を用いることにより、当該溶液を移動させることもできる。空気圧を用いる場合には、例えば、手動分注器または自動分注装置の分注機構を再度ピペットチップに装着し、空気を吐出することにより、ピペットチップに保持された溶液を押し出すことができる。
【００６２】
次に、（Ｅ）の状態のままで核酸増幅反応および増幅核酸断片の検出を行い、（Ｅ）の状態のままでピペットチップおよび核酸増幅容器を廃棄する。
【００６３】
また、本発明の別の重要な開示について、核酸増幅反応をその一例として、ピペットチップにフィルター付きピペットチップを用い、反応容器に核酸増幅容器であるキャピラリチューブを用いる場合について、図７を用いて説明する。図７において、まず、（Ａ）に示すような、フィルター付きピペットチップに、手動分注器または自動分注装置を用いて、（Ｂ）に示すように、核酸増幅反応のための溶液を吸引し、溶液を保持する。当該ピペットチップを、手動または自動にて、（Ｃ）に示すように、核酸増幅容器まで移動させ、（Ｄ）に示すように、ピペットチップを核酸増幅容器に収納する。
【００６４】
次に、手動分注器または自動分注装置の分注機構から空気を吐出することにより、ピペットチップに保持された溶液に空気圧を与え、（Ｅ）に示すように、当該溶液を核酸増幅容器の底部に移動させる。
【００６５】
続いて、（Ｅ）の状態のままで核酸増幅反応および増幅核酸断片の検出を行い、（Ｅ）の状態のままでピペットチップおよび核酸増幅容器を廃棄する。
【００６６】
本発明の反応容器は、材料として熱可塑性樹脂を用いることにより、成型が容易であるとともに、核酸増幅容器が破損する可能性を極めて低くすることができる。熱可塑性樹脂としては、破損しにくい性質を有していれば特に限定されないが、例えば、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリオレフィン（ＰＯ）、ポリメチルペンテン（ＴＰＸ）、環状ポリオレフィン（ＣＯＣ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリアセタール（ＰＯＭ）、ポリアミド（ＰＡ）、ポリイミド（ＰＩ）、ポリアミドイミド（ＰＡＩ）、液晶ポリマー（ＬＣＰ）、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエーテルサルホン（ＰＥＳ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリフェニレンエーテル（ＰＰＥ）、ポリサルフォン（ＰＳＦ）、ポリフェニレンサルファイド（ＰＰＳ）、ポリブチレンテレフタレート（ＰＢＴ）、メタクリル樹脂（ＰＭＭＡ）、ＡＢＳ樹脂（ＡＢＳ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）などを使用することができる。またはこれら２種以上のポリマーアロイを使用することができる。好ましくはポリプロピレン（ＰＰ）、環状ポリオレフィン（ＣＯＣ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、またはこれら２種以上のポリマーアロイ又は２種以上のポリマーブレンドであり、より好ましくはポリプロピレン（ＰＰ）である。
【００６７】
また、本発明の反応容器において、化学反応を行なうための反応部の少なくとも一部が、光学的に透明であることにより、化学反応中あるいは化学反応後に、当該反応の結果を確認することができる。一例として、核酸増幅反応においては、核酸の増幅に応じて発する蛍光が変化するＰＣＲ試料を用い、さらに核酸増幅装置がＰＣＲ反応液の蛍光を検出する手段を備えている場合に、短時間のうちにＰＣＲを行ない、その結果を確認することができる。一般に、物体に入射した光は、一部は物体表面で反射され、他の一部は物体内で吸収され、残りが透過光となるため、光学的な透明度は、入射光に対する透過光の比率として表すことができる。当該反応部の少なくとも一部の透明度としては、核酸の増幅に応じて発する蛍光が検出できれば特に限定されない。１ｍｍ厚の成形板にしたときの可視光線透過率が、５０％以上であることが好ましく、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上であればよい。
【００６８】
熱可塑性樹脂は、従来公知のキャピラリーサンプルチューブの材質として知られるガラスに比べて割れにくい、すなわち破損しにくいメリットを有する一方で、熱などの影響により変形しやすいデメリットを有する材料である。例えば、核酸増幅反応において、ＰＣＲ反応液の蛍光を検出することにより短時間のうちにＰＣＲの結果を確認する検出方法を用いる場合、核酸増幅容器が変形すると、ＰＣＲ反応液から発せられた蛍光が核酸増幅装置の検出器に届かないことが大きな問題となる。
【００６９】
前述のように、ＰＣＲにおいては核酸増幅容器を介してＰＣＲ反応液の昇温または冷却を繰り返し、それぞれ変性反応、アニーリング反応、伸長反応に適した温度に調整することにより、試料中の核酸が増幅する。一般に、ＰＣＲの変性反応に用いられる温度は９５℃程度であるため、当該温度において高分子材料からなる核酸増幅容器が変形しないようにするためには、該核酸増幅容器の肉厚を厚くする必要がある。しかしながら、肉厚を厚くすると核酸増幅容器を介した熱エネルギーの伝達が遅くなるため、ＰＣＲ反応液の昇温または冷却に時間がかかり、核酸増幅を迅速に行なうことができない。したがって、従来公知のキャピラリーサンプルチューブの材質を単純に高分子材料と置き換えるだけでは、迅速性を犠牲にすることなく、破損しにくい核酸増幅容器を提供することはできない。すなわち、本発明では、様々な材質および形状を検討し、破損しにくい性質と変形しにくい性質を両立できる反応容器を確立したものである。
【００７０】
本発明の反応容器は、底面と、該底面を構成する直線または曲線をそれぞれ一辺とする平面状または曲面状の側面とを有する。該底面の形状としては、反応容器の強度を確保するために、少なくとも２つの角を有していれば特に限定されないが、例えば、図８の（Ａ）〜（Ｏ）に示すような形状が挙げられる。（Ａ）〜（Ｅ）に示すような正多角形、（Ｆ）のような長方形、（Ｇ）のような平行四辺形、（Ｈ）のような十字型、（Ｉ）または（Ｊ）のような星型など、直線のみで構成される形状の他に、（Ｋ）〜（Ｎ）のように直線と曲線とを組み合わせた形状、（Ｏ）のように曲線のみで構成される形状など、適宜選択することができる。
【００７１】
反応容器の強度を確保し、かつ反応液から発せられる蛍光などの光学的な信号を容易に検出するという観点からは、該底面の形状は（Ａ）のような三角形、または（Ｂ）、（Ｆ）、（Ｇ）のような四角形が好ましい。一般に、蛍光検出においては、光源すなわちＰＣＲ反応液と検出器とを結ぶ直線に平行な軸線上にある蛍光分子の量が、測定されるシグナルの強度に反映されるため、該底面の形状は（Ｆ）のような長方形であることがより好ましく、該長方形を構成する辺において、長辺の長さが短辺の長さの２倍以上であることがさらに好ましい。
【００７２】
本発明において、ピペットチップの少なくとも吸入吐出口部位を収納できる収納部と、化学反応を行なう反応部とが、同一の材料からなり、一体的に形成されていれば、従来公知の高分子材料の成型技術を用いて、当該核酸増幅容器を安価に大量生産することが可能となるため、より好ましい。
【００７３】
反応容器の成型方法としては、従来公知の方法を使用することができるが、短い時間で同じ品質の成型品を大量に生産できる、原料の投入から成型品の取り出しまでを全自動で行うことができる、高い寸法精度と複雑な構造の成型品を作ることができる、などの観点から、射出成型法がより好適に使用し得る。
【００７４】
蛍光検出において、当該反応液へ入射した励起光が反応容器により反射される現象が蛍光測定の障害となる場合は、例えば、（Ｋ）〜（Ｎ）のように直線と曲線を組み合わせた形状、または（Ｏ）のように曲線のみで構成される形状を選択することで、反射光の影響を低減させることができる。この場合、上述したように、光源すなわちＰＣＲ反応液と検出器とを結ぶ直線に平行な軸線上にある蛍光分子の量が、測定されるシグナルの強度に反映されることから、（Ｋ）のような形状であることがより好ましい。
【００７５】
本発明の反応容器は、上記のような形状の底面を構成する直線または曲線をそれぞれ一辺とする平面状または曲面状の側面とを有する。すなわち反応容器において、化学反応を行なうための反応部は、上記のような形状の底面を、該底面に垂直な軸線方向に掃引したような外観を有する。当該反応容器を側面から見た場合の形状は特に限定されず、該反応部を、該底面に平行な平面で切断した場合の切り口の大きさは、該底面からの距離によらず一定の形状（すなわち、柱状）でも良いし、該底面からの距離が離れるほど大きくなる形状（すなわち、底面に向かって細くなる形状）でも良い。本発明の実施形態の一例として、図９に、底面の形状を正方形、側面の形状を柱状（すなわち、該底面に平行な平面で
切断した場合の切り口の大きさが該底面からの距離によらず一定）とした場合の反応容器の外観を示す。
【００７６】
一般に、柱状または底面に向かって細くなる形状の構造物の変形に対する抵抗性、すなわち強度は、該構造物の断面形状が三角形や四角形などの多角形の方が、円形より強いことが知られている。したがって、本発明の反応容器の外観は、三角形や四角形など多角形の断面形状を有する柱状または底面に向かって細くなる形状が好ましく、三角形または四角形の断面形状を有することがより好ましい。
【００７７】
本発明では、反応容器の反応部、すなわち反応液の貯留部位を極めて細く形成することにより、該反応液の容積に対する表面積が大きくなる、すなわち、反応液と反応装置の間での熱エネルギーの伝達速度が向上し、特に温度変化を伴う化学反応において、反応時間を短縮することができる。一例として、ＰＣＲを用いた核酸増幅反応においては、ＰＣＲ溶液と核酸増幅装置の間での熱エネルギーの伝達速度が向上し、ＰＣＲにおいて繰り返される変性反応、アニーリング反応、伸長反応の各工程間での温度調整の時間を短縮することができる。該反応部において、容積に対する表面積の比は４ｍｍ−１以上であることが好ましく、６ｍｍ−１以上であることがより好ましく、８ｍｍ−１以上であることがさらに好ましい。
【００７８】
また、特に温度変化を伴う化学反応において、反応時間を短縮するためには、反応液の容積を小さくすることも効果的である。一例として、ＰＣＲにおいて繰り返される変性反応、アニーリング反応、伸長反応の各工程間での温度調整の時間を短縮するためには、ＰＣＲ反応液の容積を小さくすることも効果的である。迅速にＰＣＲを行なうためには、該ＰＣＲ反応液の容積は０．１ｍｌ以下であることが好ましく、０．０２ｍｌ以下であることがより好ましい。しかしながら、ＰＣＲ反応液の容積が小さすぎると、該ＰＣＲ反応液の蛍光を検出することにより短時間のうちにＰＣＲの結果を確認する検出方法を用いる場合に、検出可能な蛍光分子の量が不足し、シグナルとして測定できない可能性があるため、該ＰＣＲ反応液の容積は０．００５ｍｌ以上であることが好ましく、０．０１ｍｌ以上であることがより好ましい。
【００７９】
さらに、上述のように、反応容器の肉厚を厚くすると、該反応容器を介した熱エネルギーの伝達が遅くなるため、反応液の昇温または冷却に時間がかかり、温度変化を伴う化学反応を迅速に行なうことができない。例えば、核酸増幅反応において、核酸増幅容器の反応部の側面における平面状または曲面状の部分の肉厚は０．５ｍｍ以下であることが好ましく、０．４ｍｍ以下であることがより好ましく、０．３ｍｍ以下であることがさらに好ましい。しかしながら、当該反応部の側面における平面状または曲面状の部分の肉厚が薄すぎると、例え、核酸増幅容器の形状について前述のような工夫を施していたとしても、強度不足によりＰＣＲ中に該核酸増幅容器の反応部が変形する可能性があるため、該肉厚は０．１ｍｍ以上であることが好ましく、０．２ｍｍ以上であることがより好ましい。
【００８０】
多数の反応を同時に行なう場合などにおいては、複数の反応容器を連結することで取り扱いを簡便にすることができる。反応容器の連結方法としては、生産する際に、複数の反応容器をあらかじめ連結した構造で成型しても良いし、使用する際に、単体の反応容器を当業者により用意に想到し得る冶具などを用いて連結しても良い。例えば、核酸増幅反応においては、前述のように、ＰＣＲにおいて繰り返される変性反応、アニーリング反応、伸長反応の各工程間での温度調整の時間を短縮するためには、核酸増幅容器の反応部を介した熱エネルギーの伝達を速くすることが効果的であるから、上記複数の核酸増幅容器の連結は、該核酸増幅容器の収納部を連結することによってなることが好ましい。本発明の実施形態の一例として、図１０に、底面の形状を正方形、側面の形状を柱状とした反応容器を、８個連結した場合の外観を示す。
【００８１】
本発明の反応容器を核酸増幅反応に用いる場合は、核酸を増幅および／または検出するための容器として、例えば、核酸の増幅のみの場合、核酸の増幅と同時に検出する場合、核酸の増幅後に検出する場合、核酸の検出のみの場合などの用途で適宜使用することができる。
【００８２】
本発明において、化学反応としては、加水分解、脱水反応、付加重合、縮合重合、酸化反応、還元反応、中和反応など、原子間の結合または切断によって異なる物質を生成する反応の他に、抗原−抗体反応、リガンド結合反応、蛍光エネルギー転移反応など、分子間の相互作用に由来する反応をも包含する。
本発明の反応容器はこれらの化学反応に用いることもできる。
【００８３】
（ｃ）
本発明は、簡易な操作で確実に核酸増幅反応液の飛散を防ぐことができ、自動化が容易であり、簡易な構造の核酸増幅装置でコンタミネーションを予防することが可能な核酸増幅方法を提供することを目的の一つとする。したがって、本発明において、核酸増幅方法とは、前述のような、核酸の増幅に応じて発する蛍光が変化するＰＣＲ試料を用い、さらに核酸増幅装置がキャピラリチューブなどに含まれるＰＣＲ反応液の蛍光を検出する手段を備えていることによって、核酸の増幅と同時に、あるいは核酸の増幅後に連続して、増幅した核酸を検出する方法をも包含する。
【００８４】
本発明の核酸増幅方法は、核酸増幅反応のための溶液を保持させた着脱可能なチップを核酸増幅容器に装着することにより、例えば、従来のピペット操作など核酸増幅反応のための溶液を核酸増幅容器に充填する際に、検体中に含まれる核酸が飛散し、他の患者などに由来する検体のコンタミネーションが起こる可能性を極めて低くすることができる。
【００８５】
着脱可能なチップとしては、核酸増幅反応のための溶液を保持させることが可能な性質を有していれば特に限定されないが、入手が容易であるという観点から、チップを介して溶液を吸引および吐出することが可能な分注機構を有する手動分注器または自動分注装置に使用するために、市販されているチップであることが好ましい。例えば、レイニン・インスツルメント社、ギルソン社、エッペンドルフ社、イナ・オプティカ社などから市販されているマイクロピペット用のチップを使用することができる。また、従来公知の成型技術を用いれば、任意の形状のチップを設計および作製することができ、上記着脱可能なチップとして使用することができる。
【００８６】
着脱可能なチップが吸引することができる溶液の量は、チップに核酸増幅反応のための溶液を保持させることができれば特に限定されないが、０．５マイクロリットル以上１００マイクロリットル以下であることが好ましく、１マイクロリットル以上５０マイクロリットル以下であることがより好ましく、５マイクロリットル以上２０マイクロリットル以下であることがさらに好ましい。
【００８７】
着脱可能なチップに、核酸増幅反応のための溶液を保持させるための手段も特に制限されないが、チップを介して溶液を吸引および吐出することが可能な分注機構を用いて、チップに核酸増幅反応のための溶液を吸引することにより、行なうことができる。例えば、チップを手動式または電動式のマイクロピペット装着して、核酸増幅反応のための溶液を吸引し、プランジャーを停止することにより、チップに溶液を保持させることができる。このとき、マイクロピペットの吸引量を、核酸増幅反応のための溶液より多く設定しておけば、チップの先端開口部より奥の位置で溶液を保持させることもできる。例えば、自動分注装置の使用は、これら一連の操作をより簡便に行なうことができるため好ましい。また、例えば、核酸増幅機構と分注機構とを有する装置の使用は、さらに好ましい。
【００８８】
チップを核酸増幅容器に装着する手段は、装着後にチップと核酸増幅容器を一体的に取り扱うことができる形態であれば特に制限されないが、チップと核酸増幅容器が嵌合する形態であることが好ましく、チップが核酸増幅容器に嵌入する形態であることがより好ましい。このような形態でチップを核酸増幅容器に装着することにより、核酸増幅反応後、チップおよび核酸増幅容器を廃棄する際においても、チップと核酸増幅容器が分離することなく一体的に廃棄することができる。つまり、廃棄の際に、チップに付着した核酸が飛散する可能性を極めて低くし、さらに、核酸増幅容器から増幅核酸断片が漏出する可能性を極めて低くすることで、コンタミネーションの可能性をさらに低減させることができる。
【００８９】
溶液を保持したチップの核酸増幅容器への装着は、チップを上記分注機構から取り外すことなく行なわれても良いし、チップを上記分注機構から取り外した後に行なわれても良い。手動で装着する場合の操作、あるいは自動で装着する場合の動作を、ともに簡易にするためには、チップを上記分注機構から取り外すことなく、核酸増幅容器へ装着することがより好ましい。
【００９０】
本発明の核酸増幅方法は、検体中に含まれる核酸または増幅核酸断片の飛散を厳密に防ぐため、チップがフィルターを内蔵してなることが好ましい。核酸増幅反応中および核酸増幅反応後の当該核酸断片の飛散を防ぐ観点から、フィルターは、フィルターは、チップにおいて溶液を保持する部分と、上記分注機構に装着される際に分注機構に接する部分との間に位置することが好ましい。また、フィルターは疎水性フィルターであることが好ましく、飛沫だけでなく、エアゾールの通過をも阻止し得る疎水性フィルターであることがより好ましい。このようなフィルターはとしては、従来公知の方法にて作製することが可能であるが、例えば、ポリエチレン製の基材からなる、フィルター孔の大きさが平均約２０ミクロンのフィルターを用いれば、エアゾールの通過によるコンタミネーションを好適に防止し得る。
【００９１】
フィルターを内臓したチップとしては、例えば、レイニン・インスツルメント社、ギルソン社、エッペンドルフ社、イナ・オプティカ社などから市販されているマイクロピペット用のフィルターチップあるいはエアゾール耐性チップを使用することができる。このような市販品の使用は、入手が容易であるという観点から好ましい。
【００９２】
チップを核酸増幅容器に装着する際には、検体中に含まれる核酸または増幅核酸断片の飛散を厳密に防ぐため、チップと核酸増幅容器が密着していることが好ましい。このような形状のチップおよび核酸増幅容器の組み合わせを市販品より選抜して用いることが好ましいが、チップと核酸増幅容器の形状が合わず、核酸増幅容器にチップを装着した際に隙間が生じる場合には、例えば、チップとして市販のフィルターチップあるいはエアゾール耐性チップを使用し、当該チップの形状に合わせて核酸増幅容器を作製することも、当業者により容易に想到し得る。また、核酸増幅容器にチップを装着した際に生じた隙間をシール材などを充填することにより塞ぐ、あるいは、核酸増幅容器とチップの間に装着するアダプターなどを作製する、などによりチップと核酸増幅容器を密着させることも、当業者により容易に想到し得る。
【００９３】
本発明の重要な開示について、チップにフィルター内臓チップを用い、核酸増幅容器にキャピラリチューブを用いる場合を例として、図１５を用いて、より詳しく説明する。図１５において、まず、（Ａ）に示すような、フィルターを内蔵したチップに、手動分注器または自動分注装置を用いて、（Ｂ）に示すように、核酸増幅反応のための溶液を吸引し、溶液を保持する。当該チップを、手動または自動にて、（Ｃ）に示すように、核酸増幅容器まで移動させ、（Ｄ）に示すように、チップを核酸増幅容器に装着する。次に、チップを手動分注器または自動分注装置から取り外す。このとき、手動分注器または自動分注装置の分注機構から空気を吐出しながら、当該チップを取り外す動作を行なうことにより、当該動作の際に生じる圧力によってチップに保持された溶液の位置が変化する現象を回避することもできる。
【００９４】
続いて、チップを装着した核酸増幅容器を遠心することにより、（Ｅ）に示すように、核酸増幅反応のための溶液を核酸増幅容器の底部に移動させる。このとき、遠心の代わりに空気圧を用いることにより、当該溶液を移動させることもできる。空気圧を用いる場合には、例えば、手動分注器または自動分注装置の分注機構を再度チップに装着し、空気を吐出することにより、チップに保持された溶液を押し出すことができる。
【００９５】
次に、（Ｅ）の状態のままで核酸増幅反応および増幅核酸断片の検出を行い、（Ｅ）の状態のままでチップおよび核酸増幅容器を廃棄する。
【００９６】
また、本発明の別の重要な開示について、チップにフィルター内臓チップを用い、核酸増幅容器にキャピラリチューブを用いる場合を例として、図１５を用いて説明する。図１５において、まず、（Ａ）に示すような、フィルターを内蔵したチップに、手動分注器または自動分注装置を用いて、（Ｂ）に示すように、核酸増幅反応のための溶液を吸引し、溶液を保持する。当該チップを、手動または自動にて、（Ｃ）に示すように、核酸増幅容器まで移動させ、（Ｄ）に示すように、チップを核酸増幅容器に装着する。
【００９７】
次に、手動分注器または自動分注装置の分注機構から空気を吐出することにより、チップに保持された溶液に空気圧を与え、（Ｅ）に示すように、当該溶液を核酸増幅容器の底部に移動させる。
【００９８】
続いて、（Ｅ）の状態のままで核酸増幅反応および増幅核酸断片の検出を行い、（Ｅ）の状態のままでチップおよび核酸増幅容器を廃棄する。
【実施例】
【００９９】
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【０１００】
（実施例１−３に用いた核酸増幅容器の作製）
図４は実施例１−３で用いた核酸増幅容器の一例を示している。図４（Ａ）は核酸増幅容器を側面から見た図、図４（Ｂ）は核酸増幅容器を導入部の上方より見た図、図４（Ｃ）は核酸増幅容器を反応部の底から見た図である。反応部の内部の形状は四角柱をしており、その四角柱の底面の形状は正方形である。この内部の四角柱の長さをＬ、底面の正方形の一辺の長さをａとする。また反応部の外側の形状も四角柱の形状をなし、その外側の四角柱の底面の形状も正方形である。この外側の四角柱の底面の一辺の長さをｂとする。これらにより容積（Ｖ）、表面積（Ｓ）、容積に対する表面積の比（Ｓ／Ｖ）、肉厚を求めることができる。例えば、Ｌ＝２０．００ｍｍ、ａ＝１．００ｍｍ、ｂ＝１．８ｍｍであれば、下記のように算出される。
容積（Ｖ）＝ａ×ａ×Ｌ＝２０．００ｍｍ３
表面積（Ｓ）＝ａ×ａ＋ａ×Ｌ×４＝８１．００ｍｍ２
容積に対する表面積の比（Ｓ／Ｖ）＝Ｓ／Ｖ＝８１．００／２０．００＝４．０５ｍｍ−１
肉厚＝（ｂ−ａ）／２＝（１．８−１．００）／２＝０．４０ｍｍ
【０１０１】
表１に示すように、高分子材料としてポリプロピレン（ＰＰ）を用いて、容器１〜１９の様々な容器の金型を作製し、射出成形を行った。なお、ここで用いたポリプロピレン（ＰＰ）は、１ｍｍ厚の成形板にしたときの可視光線透過率が７５％であった。
【０１０２】
【表１】
0005444632.tif 000002
【０１０３】
〔実施例１：ＰＣＲ反応容器内の溶液温度変化の測定〕
（温度データの測定）
ＰＣＲ反応容器には、上記実施の形態で説明した核酸増幅容器（以下、「本発明の核酸増幅容器」と表記する）と、比較のため、従来品であるガラス製キャピラリー（ロシュ・ダイアグノスティクス社製、品番１１９０９３３９００１）を用いた。なお、本発明の核酸増幅容器については、容器１６を用いた。
【０１０４】
まず、本発明の核酸増幅容器の導入部およびガラス製キャピラリーの注入口に、水１０μｌをそれぞれ注入した。次に、３０００ｒｐｍで５秒間遠心することで、水を本発明の核酸増幅容器の反応部およびガラス製キャピラリーの底にそれぞれ移動させた。
【０１０５】
水が充填された反応容器をそれぞれ核酸増幅装置ＲａｐｉｄＣｙｃｌｅｒ２（アイダホ・テクノロジーズ社製）に装着し、温度測定記録装置（東亜電波工業株式会社製、ＩＮＲ−９０００インテリジェントレコーダ）に接続された温度センサーの先端部を、反応容器内の水にそれぞれ浸漬した。
【０１０６】
ＰＣＲの温度条件は、９４℃で２分間静置した後、９４℃で０秒、６５℃で０秒を３５サイクル行なう設定とし、ＰＣＲサイクル中の温度変化を、温度測定記録装置によりリアルタイムに記録した。また、比較のため、上記核酸増幅装置の熱媒（空気）のＰＣＲサイクル中の温度変化も同時に記録した。
【０１０７】
（温度データの解析）
記録した温度変化のデータを、温度測定記録装置専用の解析ソフトウェア（東亜電波工業株式会社製、ＪＵＬＩＬＯＧ２）を用いて解析した。その結果を図５に示す。図５は本実施例におけるＰＣＲサイクル中の温度変化を示す図であり、（Ａ）は本発明の核酸増幅容器内の溶液温度の測定結果を示し、（Ｂ）はガラス製キャピラリー内の溶液温度の測定結果を示し、（Ｃ）は核酸増幅装置の熱媒（空気）温度の測定結果を示す。
【０１０８】
図５（Ａ）に示すように、本発明の核酸増幅容器内の溶液温度は、おおよそ６５０秒の間に約９８℃から約６０℃にわたる温度変化が３５回繰り返されており、図５（Ｂ）に示すように、ガラス製キャピラリー内の溶液温度は、おおよそ６５０秒の間に約９４℃から約６５℃にわたる温度変化が３５回繰り返されている。また、図５（Ｃ）に示すように、核酸増幅装置の熱媒（空気）温度は、おおよそ６５０秒の間に約９９℃から約５６℃にわたる温度変化が３５回繰り返されている。つまり、ＰＣＲの温度下降工程においては、核酸増幅装置の熱媒温度が約５６℃まで下降したときに、本発明の核酸増幅容器内の溶液温度は約６０℃まで下降し、ガラス製キャピラリー内の溶液温度は約６５℃まで下降したことを示し、また、ＰＣＲの温度上昇工程においては、核酸増幅装置の熱媒温度が約９９℃まで上昇したときに、本発明の核酸増幅容器内の溶液温度は約９８℃まで上昇し、ガラス製キャピラリー内の溶液温度は約９４℃まで上昇した。これは、本発明の一実施形態である核酸増幅容器を用いた核酸増幅方法では、従来品のガラス製キャピラリーを用いた場合に比べて、核酸増幅装置の熱媒の温度変化に対する溶液温度の追随性が優れ、より迅速に核酸増幅を行なうことができることを示している。
【０１０９】
〔実施例２：Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ２Ｃ１９（ＣＹＰ２Ｃ１９）遺伝子の
検出〕
（ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子を検出するプライマーの合成）
まず、正鎖プライマー及び逆鎖プライマーを合成した。
【０１１０】
正鎖プライマー及び逆鎖プライマーは、ＤＮＡシンセサイザー（パーキンエルマー社製；３９２型）を用いて、添付のマニュアルに従い、ホスホアミダイト法により合成した。合成した正鎖プライマー及び逆鎖プライマーを、アンモニア水に溶解して、５５℃の環境下で、一晩静置することによって脱保護した。その後、ＯＰＣカラム（パーキンエルマー社製）にて精製した。なお、プライマーの合成は、ＤＮＡ合成受託会社（（株）日本バイオサービス、シグマアルドリッチジャパン（株）、オペロンバイオテクノロジー（株）等）に依頼してもよい。
【０１１１】
（ＰＣＲによるＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の解析）
ＰＣＲに供するサンプルとして、ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法によって得たＤＮＡ溶液（以下、「サンプル」と表記する）を用いた。
【０１１２】
次に、ＰＣＲ反応液を調製した。ＰＣＲ反応液は、全量を２５μｌとして、正鎖プライマー  ２０ｐｍｏｌ、逆鎖プライマー  ２０ｐｍｏｌ、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製、品番ＫＯＤ−２０１）、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼに添付の×１０緩衝液  ２．５μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ  ２．５μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２２μｌ、５ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）  ０．５μｌ及びサンプルを、溶解しているＤＮＡが１００ｎｇ、１０ｎｇ又は１ｎｇとなるように混合し、残部は水とした。
【０１１３】
ＰＣＲを行なう反応容器には、本発明の核酸増幅容器と、比較のため、従来品であるガラス製キャピラリー（ロシュ・ダイアグノスティクス社製、品番１１９０９３３９００１）を用いた。なお、本発明の核酸増幅容器については、容器１６を用いた。
【０１１４】
まず、本発明の核酸増幅容器の導入部およびガラス製キャピラリーの注入口に、調製したＰＣＲ反応液のうち１０μｌをそれぞれ注入した。次に、３０００ｒｐｍで５秒間遠心することで、ＰＣＲ反応液を本発明の核酸増幅容器の反応部およびガラス製キャピラリーの底にそれぞれ移動させた。
【０１１５】
核酸増幅装置には、ＲａｐｉｄＣｙｃｌｅｒ２（アイダホ・テクノロジーズ社製）を用いた。ＰＣＲの温度条件は、９４℃で２分間静置した後、９４℃で０秒、６５℃で０秒を３５サイクル行なった。
【０１１６】
（アガロースゲル電気泳動による核酸増幅の確認）
ＰＣＲ反応後、それぞれの反応容器からＰＣＲ反応液５μｌを回収した。次に、回収したＰＣＲ反応液を、３％アガロースゲルによる電気泳動に供した。電気泳動では、１００Ｖの電圧を印加して、６０分間行なった。その結果を図６に示す。図６は本実施例における電気泳動の結果を示す図であり、レーン１〜４は本発明の核酸増幅容器を用いたＰＣＲの結果を示し、レーン５〜８はガラス製キャピラリーを用いたＰＣＲの結果を示す。また、レーン１及び５は、調製したＰＣＲ反応液２５μｌ当たりのＤＮＡの溶解量が１００ｎｇとしたＰＣＲ反応液を用いた結果を示し、レーン２及び６は、調製したＰＣＲ反応液２５μｌ当たりのＤＮＡの溶解量が１０ｎｇとしたＰＣＲ反応液を用いた結果を示し、レーン３及び７は、調製したＰＣＲ反応液２５μｌ当たりのＤＮＡの溶解量が１ｎｇとしたＰＣＲ反応液を用いた結果を示す。また、レーン４及び８は比較のためサンプルの代わりに水を混合したＰＣＲ反応液を用いた結果を示す。
【０１１７】
図６に示すように、本発明の核酸増幅容器を用いたＰＣＲでは従来品のガラス製キャピラリーを用いたＰＣＲより、高感度にＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子を検出することができた。これは、本発明の一実施形態である核酸増幅容器を用いれば、従来品のガラス製キャピラリーとは異なり破損する可能性が極めて低いため、採取できる量が限られている患者検体に対して特に効果的でありながら、該ガラス製キャピラリーを用いたＰＣＲ以上の感度でＰＣＲを行なうことができたことを示している。
【０１１８】
容器１６を除く他の容器についても、実施例１〜２を行った。その結果を下記の評価基準を用いて検討したところ、容器１〜１９の全てにおいて、◎又は○の評価であった。
◎  ：  ガラス製キャピラリーより非常に良好
○  ：  ガラス製キャピラリーより良好
△  ：  ガラス製キャピラリーと同等の性能
×  ：  ガラス製キャピラリーより不良  
【０１１９】
〔実施例３：核酸増幅容器の強度の比較〕
容器には、上記実施の形態で説明した核酸増幅容器（以下、「本発明の核酸増幅容器」と表記する）と、比較のため、従来品であるガラス製キャピラリー（ロシュ・ダイアグノスティクス社製、品番１１９０９３３９００１）を用いた。なお、本発明の核酸増幅容器については、容器１６を用いた。
【０１２０】
まず、本発明の核酸増幅容器およびガラス製キャピラリーを水平な木製台の上に置き、それぞれの上に、重さが１ｋｇであり各辺の長さが１０ｃｍの立方体を静かに乗せた。本発明の核酸増幅容器およびガラス製キャピラリーのそれぞれ１０本について上記の操作を行い、破損の有無を目視で判定した。表２は本発明の核酸増幅容器およびガラス製キャピラリーの強度を比較した結果を示す。
【０１２１】
【表２】
0005444632.tif 000003
【０１２２】
表２に示すように、本発明の核酸増幅容器では１０本すべてが破損しなかったが、ガラス製キャピラリーでは１０本すべてが破損した。これは、本発明の核酸増幅容器では、従来品であるガラス製キャピラリーに比べて強度が優れていることを示しており、実験操作において核酸増幅容器が破損する危険性が極めて低いことを示している。
【０１２３】
（実施例４−７に用いた反応容器の作製）
図１１は実施例４−７で用いた反応容器の一例を示している。図１１（ＡＩ）は反応容器を側面から見た図、図１１（ＡＩＩ）は反応容器にピペットチップを収納したところを側面から見た図、図１１（Ｂ）は反応容器を収納部の上方より見た図、図１１（Ｃ）は反応容器を反応部の底から見た図である。収納部の開口部の形状は、実施例４−７でフィルター付きピペットチップとして用いたＬＴＳエアゾール耐性チップ（レイニン・インスツルメント社製、品番ＲＴ−Ｌ１０Ｆ）の形状に合わせ、開口部の内径ｃ＝５．６ｍｍとした。また、反応部の内部の形状は四角柱をしており、その四角柱の底面の形状は正方形である。この内部の四角柱において、反応容器にピペットチップが収納され、溶液が充填された場合に、反応の前後あるいは反応中に、当該ピペットチップに溶液が接触しないような、最高位の液面位置から上記底面までの長さをＬとする。また、内部の四角柱において、底面の正方形の一辺の長さをａとする。また反応部の外側の形状も四角柱の形状をなし、その外側の四角柱の底面の形状も正方形である。この外側の四角柱の底面の一辺の長さをｂとする。これらにより、溶液をピペットチップに接触しない状態で充填可能な最大の溶液量、すなわち容積（Ｖ）、表面積（Ｓ）、容積に対する表面積の比（Ｓ／Ｖ）、肉厚を求めることができる。例えば、Ｌ＝２０．００ｍｍ、ａ＝１．００ｍｍ、ｂ＝１．８ｍｍであれば、下記のように算出される。
容積（Ｖ）＝ａ×ａ×Ｌ＝２０．００ｍｍ３
表面積（Ｓ）＝ａ×ａ＋ａ×Ｌ×４＝８１．００ｍｍ２
容積に対する表面積の比（Ｓ／Ｖ）＝Ｓ／Ｖ＝８１．００／２０．００＝４．０５ｍｍ−１
肉厚＝（ｂ−ａ）／２＝（１．８−１．００）／２＝０．４０ｍｍ
なお、液面とピペットチップ間の距離は、前述のように接触しなければいいので特に限定はしないが、１ｍｍ以上であればよく、好ましくは２ｍｍ以上であり、特に好ましくは３ｍｍ以上である。液面とピペットチップ間の距離の上限については、ピペットチップに溶液が接触しなければいいので、特に上限を設ける必要はなく、下限の説明だけで十分である。
【０１２４】
表３に示すように、熱可塑性樹脂としてポリプロピレン（ＰＰ）を用いて、容器１〜１９の様々な容器の金型を作製し、射出成形を行った。なお、ここで用いたポリプロピレン（ＰＰ）は、１ｍｍ厚の成形板にしたときの可視光線透過率が７５％であった。
【０１２５】
【表３】
0005444632.tif 000004
【０１２６】
〔実施例４：反応容器内の溶液温度変化の測定〕
（温度データの測定）
反応容器には、上記実施の形態で説明した反応容器（以下、「本発明の反応容器」と表記する）と、比較のため、従来品であるガラス製キャピラリー（ロシュ・ダイアグノスティクス社製、品番１１９０９３３９００１）を用いた。なお、本発明の反応容器については、容器１６を用いた。
【０１２７】
まず、本発明の反応容器の導入部およびガラス製キャピラリーの注入口に、水１０μｌをそれぞれ注入した。次に、３０００ｒｐｍで５秒間遠心することで、水を本発明の反応容器の反応部およびガラス製キャピラリーの底にそれぞれ移動させた。
【０１２８】
水が充填された反応容器をそれぞれ核酸増幅装置ＲａｐｉｄＣｙｃｌｅｒ２（アイダホ・テクノロジーズ社製）に装着し、温度測定記録装置（東亜電波工業株式会社製、ＩＮＲ−９０００インテリジェントレコーダ）に接続された温度センサーの先端部を、反応容器内の水にそれぞれ浸漬した。
【０１２９】
温度条件は、９４℃で２分間静置した後、９４℃で０秒、６５℃で０秒を３５サイクル行なう設定とし、当該サイクル中の温度変化を、温度測定記録装置によりリアルタイムに記録した。また、比較のため、上記核酸増幅装置の熱媒（空気）の当該サイクル中の温度変化も同時に記録した。
【０１３０】
（温度データの解析）
記録した温度変化のデータを、温度測定記録装置専用の解析ソフトウェア（東亜電波工業株式会社製、ＪＵＬＩＬＯＧ２）を用いて解析した。その結果を図１２に示す。図１２は本実施例における当該サイクル中の温度変化を示す図であり、（Ａ）は本発明の反応容器内の溶液温度の測定結果を示し、（Ｂ）はガラス製キャピラリー内の溶液温度の測定結果を示し、（Ｃ）は核酸増幅装置の熱媒（空気）温度の測定結果を示す。
【０１３１】
図１２（Ａ）に示すように、本発明の反応容器内の溶液温度は、おおよそ６５０秒の間に約９８℃から約６０℃にわたる温度変化が３５回繰り返されており、図１２（Ｂ）に示すように、ガラス製キャピラリー内の溶液温度は、おおよそ６５０秒の間に約９４℃から約６５℃にわたる温度変化が３５回繰り返されている。また、図１２（Ｃ）に示すように、核酸増幅装置の熱媒（空気）温度は、おおよそ６５０秒の間に約９９℃から約５６℃にわたる温度変化が３５回繰り返されている。つまり、温度下降工程においては、核酸増幅装置の熱媒温度が約５６℃まで下降したときに、本発明の反応容器内の溶液温度は約６０℃まで下降し、ガラス製キャピラリー内の溶液温度は約６５℃まで下降したことを示し、また、温度上昇工程においては、核酸増幅装置の熱媒温度が約９９℃まで上昇したときに、本発明の反応容器内の溶液温度は約９８℃まで上昇し、ガラス製キャピラリー内の溶液温度は約９４℃まで上昇した。これは、本発明の一実施形態である反応容器では、従来品のガラス製キャピラリーを用いた場合に比べて、核酸増幅装置の熱媒の温度変化に対する溶液温度の追随性が優れ、より迅速に化学反応を行なうことができることを示している。
【０１３２】
〔実施例５：Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ２Ｃ１９（ＣＹＰ２Ｃ１９）遺伝子の
検出〕
（ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子を検出するプライマーの合成）
まず、正鎖プライマー及び逆鎖プライマーを合成した。
【０１３３】
正鎖プライマー及び逆鎖プライマーは、ＤＮＡシンセサイザー（パーキンエルマー社製；３９２型）を用いて、添付のマニュアルに従い、ホスホアミダイト法により合成した。合成した正鎖プライマー及び逆鎖プライマーを、アンモニア水に溶解して、５５℃の環境下で、一晩静置することによって脱保護した。その後、ＯＰＣカラム（パーキンエルマー社製）にて精製した。なお、プライマーの合成は、ＤＮＡ合成受託会社（（株）日本バイオサービス、シグマアルドリッチジャパン（株）、オペロンバイオテクノロジー（株）等）に依頼してもよい。
【０１３４】
（ＰＣＲによるＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の解析）
ＰＣＲに供するサンプルとして、ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法によって得たＤＮＡ溶液（以下、「サンプル」と表記する）を用いた。
【０１３５】
次に、ＰＣＲ反応液を調製した。ＰＣＲ反応液は、全量を２５μｌとして、正鎖プライマー  ２０ｐｍｏｌ、逆鎖プライマー  ２０ｐｍｏｌ、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製、品番ＫＯＤ−２０１）、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼに添付の×１０緩衝液  ２．５μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ  ２．５μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ２μｌ、５ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）  ０．５μｌ及びサンプルを、溶解しているＤＮＡが１００ｎｇ、１０ｎｇ又は１ｎｇとなるように混合し、残部は水とした。
【０１３６】
ＰＣＲを行なう反応容器には、本発明の核酸増幅容器と、比較のため、従来品であるガラス製キャピラリー（ロシュ・ダイアグノスティクス社製、品番１１９０９３３９００１）を用いた。なお、本発明の反応容器については、容器１６を用いた。
【０１３７】
ピペットチップには、ＬＴＳエアゾール耐性チップ（レイニン・インスツルメント社製、品番ＲＴ−Ｌ１０Ｆ）を用いた。また、ピペットチップを介して溶液を吸引および吐出することが可能な分注機構を有する手動分注器として、Ｐｉｐｅｔ−Ｌｉｔｅ（ＴＭ）（レイニン・インスツルメント社製、品番Ｌ−２０）を用いた。
【０１３８】
まず、Ｐｉｐｅｔ−Ｌｉｔｅ（ＴＭ）にＬＴＳエアゾール耐性チップを装着し、調製したＰＣＲ反応液のうち１０μｌを吸引し、溶液を保持した。この状態で、ＬＴＳエアゾール耐性チップの先端を、本発明の反応容器の収納部に押し付け、当該ピペットチップを本発明の反応容器に装着した。次に、Ｐｉｐｅｔ−Ｌｉｔｅ（ＴＭ）に装備されているチップ・イジェクターを用いて、本発明の反応容器に収納されたチップを取り外し、当該収納物を３０００ｒｐｍで５秒間遠心することで、ＰＣＲ反応液を本発明の反応容器の底に移動させた。
【０１３９】
比較のため、従来の方法、すなわち、ガラス製キャピラリー（ロシュ・ダイアグノスティクス社製、品番１１９０９３３９００１）に添付のキャップを蓋として使用するＰＣＲを行なった。具体的には、ガラス製キャピラリーの注入口に、調製したＰＣＲ反応液のうち１０μｌをそれぞれ注入し、ガラス製キャピラリーに添付のキャップを装着した。次に、３０００ｒｐｍで５秒間遠心することで、ＰＣＲ反応液をガラス製キャピラリーの底にそれぞれ移動させた。
【０１４０】
核酸増幅装置には、ＲａｐｉｄＣｙｃｌｅｒ２（アイダホ・テクノロジーズ社製）を用いた。ＰＣＲの温度条件は、９４℃で２分間静置した後、９４℃で０秒、６５℃で０秒を３５サイクル行なった。
【０１４１】
（アガロースゲル電気泳動による核酸増幅の確認）
ＰＣＲ反応後、それぞれの反応容器からＰＣＲ反応液５μｌを回収した。次に、回収したＰＣＲ反応液を、３％アガロースゲルによる電気泳動に供した。電気泳動では、１００Ｖの電圧を印加して、６０分間行なった。その結果を図１３に示す。図１３は本実施例における電気泳動の結果を示す図であり、レーン１〜４は本発明の核酸増幅容器を用いたＰＣＲの結果を示し、レーン５〜８はガラス製キャピラリーを用いたＰＣＲの結果を示す。また、レーン１及び５は、調製したＰＣＲ反応液２５μｌ当たりのＤＮＡの溶解量が１００ｎｇとしたＰＣＲ反応液を用いた結果を示し、レーン２及び６は、調製したＰＣＲ反応液２５μｌ当たりのＤＮＡの溶解量が１０ｎｇとしたＰＣＲ反応液を用いた結果を示し、レーン３及び７は、調製したＰＣＲ反応液２５μｌ当たりのＤＮＡの溶解量が１ｎｇとしたＰＣＲ反応液を用いた結果を示す。また、レーン４及び８は比較のためサンプルの代わりに水を混合したＰＣＲ反応液を用いた結果を示す。
【０１４２】
図１３に示すように、本発明の反応容器を用いたＰＣＲでは従来品のガラス製キャピラリーを用いたＰＣＲより、高感度にＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子を検出することができた。これは、本発明の一実施形態である反応容器を用いれば、従来品のガラス製キャピラリーとは異なり破損する可能性が極めて低いため、採取できる量が限られている患者検体に対して特に効果的でありながら、該ガラス製キャピラリーを用いたＰＣＲ以上の感度でＰＣＲを行なうことができたことを示している。
【０１４３】
容器１６を除く他の容器についても、実施例４〜５を行った。その結果を下記の評価基準を用いて検討したところ、容器１〜１９の全てにおいて、◎又は○の評価であった。
◎  ：  ガラス製キャピラリーより非常に良好
○  ：  ガラス製キャピラリーより良好
△  ：  ガラス製キャピラリーと同等の性能
×  ：  ガラス製キャピラリーより不良  
【０１４４】
〔実施例６：反応容器の強度の比較〕
容器には、上記実施の形態で説明した反応容器（以下、「本発明の反応容器」と表記する）と、比較のため、従来品であるガラス製キャピラリー（ロシュ・ダイアグノスティクス社製、品番１１９０９３３９００１）を用いた。なお、本発明の反応容器については、容器１６を用いた。
【０１４５】
まず、本発明の反応容器およびガラス製キャピラリーを水平な木製台の上に置き、それぞれの上に、重さが１ｋｇであり各辺の長さが１０ｃｍの立方体を静かに乗せた。本発明の反応容器およびガラス製キャピラリーのそれぞれ１０本について上記の操作を行い、破損の有無を目視で判定した。表４は本発明の反応容器およびガラス製キャピラリーの強度を比較した結果を示す。
【０１４６】
【表４】
0005444632.tif 000005
【０１４７】
表４に示すように、本発明の反応容器では１０本すべてが破損しなかったが、ガラス製キャピラリーでは１０本すべてが破損した。これは、本発明の反応容器では、従来品であるガラス製キャピラリーに比べて強度が優れていることを示しており、実験操作において反応容器が破損する危険性が極めて低いことを示している。
【０１４８】
〔実施例７：核酸増幅反応、および、増幅核酸断片が容器外に放出される可能性の検討〕
本発明における化学反応の一例として、ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子を対象とするＰＣＲにおいて、核酸増幅反応が十分に行われた場合に、核酸増幅反応中または核酸増幅反応後に、増幅核酸断片がピペットチップに内蔵されたフィルターを通過して容器外に放出され、コンタミネーションの原因となる可能性があるかを検討した。
（ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子を検出するプライマーの合成）
実施例５に記載のプライマーを使用した。
【０１４９】
（ＰＣＲによるＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の増幅）
ＰＣＲに供するサンプルとして、ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法によって得たＤＮＡ溶液を用いた。ヒト白血球として、４種類の個体から得たものを用い、ＤＮＡ溶液を４種類調製した（以下、「サンプルＡ」、「サンプルＢ」、「サンプルＣ」、「サンプルＤ」と表記する）。
【０１５０】
次に、ＰＣＲ反応液を調製した。ＰＣＲ反応液は、全量を２５μｌとして、正鎖プライマー  ２０ｐｍｏｌ、逆鎖プライマー  ２０ｐｍｏｌ、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製、品番ＫＯＤ−２０１）、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼに添付の×１０緩衝液  ２．５μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ  ２．５μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ２μｌ、５ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）  ０．５μｌおよびサンプルＡ、Ｂ、Ｃ、またはＤを、溶解しているＤＮＡが１００ｎｇとなるように混合し、残部は水とした。
【０１５１】
ピペットチップには、ＬＴＳエアゾール耐性チップ（レイニン・インスツルメント社製、品番ＲＴ−Ｌ１０Ｆ）を用いた。また、ピペットチップを介して溶液を吸引および吐出することが可能な分注機構を有する手動分注器として、Ｐｉｐｅｔ−Ｌｉｔｅ（ＴＭ）（レイニン・インスツルメント社製、品番Ｌ−２０）を用いた。
【０１５２】
ＰＣＲを行なう核酸増幅容器には、本発明の反応容器、容器１６を用いた。
【０１５３】
まず、Ｐｉｐｅｔ−Ｌｉｔｅ（ＴＭ）にＬＴＳエアゾール耐性チップを装着し、調製したＰＣＲ反応液のうち１０μｌを吸引し、溶液を保持した。この状態で、ＬＴＳエアゾール耐性チップの先端を、本発明の反応容器の収納部に押し付け、当該ピペットチップを本発明の反応容器に装着した。次に、Ｐｉｐｅｔ−Ｌｉｔｅ（ＴＭ）に装備されているチップ・イジェクターを用いて、本発明の反応容器に収納されたチップを取り外し、当該装着物を３０００ｒｐｍで５秒間遠心することで、ＰＣＲ反応液を本発明の反応容器の底に移動させた。
【０１５４】
さらに、本発明の反応容器に装着されたＬＴＳエアゾール耐性チップに内蔵されたフィルターの上部、すなわち、Ｐｉｐｅｔ−Ｌｉｔｅ（ＴＭ）が装着されていた面の上側に、水２５μｌを置き、核酸増幅装置にセットした。
【０１５５】
核酸増幅装置には、ＲａｐｉｄＣｙｃｌｅｒ２（アイダホ・テクノロジーズ社製）を用
いた。ＰＣＲの温度条件は、９４℃で２分間静置した後、９４℃で０秒、６５℃で０秒を５０サイクル行なった。
【０１５６】
（ＰＣＲによるフィルターを通過した増幅核酸断片の確認）
ＲａｐｉｄＣｙｃｌｅｒ２による増幅反応の終了後、上記フィルターの上部に置いた水の全量を採取し、それぞれサンプルとして、ＰＣＲを行なった。ＰＣＲ反応液は、全量を５０μｌとして、正鎖プライマー  １０ｐｍｏｌ、逆鎖プライマー  １０ｐｍｏｌ、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製、品番ＫＯＤ−２０１）、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼに添付の×１０緩衝液  ５μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ  ５μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ２μｌおよび各サンプルを混合し、残部は水とした。
【０１５７】
核酸増幅装置には、ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（アプライドバイオシステムズ社製）を用いた。ＰＣＲの温度条件は、９４℃で２分間静置した後、９４℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で３０秒を５０サイクル行なった。
【０１５８】
（アガロースゲル電気泳動による核酸増幅の確認）
ＰＣＲ反応後、それぞれの反応容器からＰＣＲ反応液５μｌを回収した。次に、回収したＰＣＲ反応液を、３％アガロースゲルによる電気泳動に供した。電気泳動では、１００Ｖの電圧を印加して、６０分間行なった。その結果を図１４に示す。図１４は本実施例における電気泳動の結果を示す図であり、レーン１、３、５、７はＲａｐｉｄＣｙｃｌｅｒ２を用いた増幅、すなわちガラス製キャピラリーの内部で増幅したＰＣＲの結果を示し、レーン２、４、６、８はＧｅｎｅＡｍｐ９７００を用いた増幅、すなわちＲａｐｉｄＣｙｃｌｅｒ２を用いた増幅の際にフィルターの上部に置いた水をサンプルとしたＰＣＲの結果を示す。また、レーン１および２はサンプルＡを用いたＰＣＲの結果を示し、レーン３および４はサンプルＢを用いたＰＣＲの結果を示し、レーン５および６はサンプルＣを用いたＰＣＲの結果を示し、レーン７および８はサンプルＤを用いたＰＣＲの結果を示す。
【０１５９】
図１４に示すように、本発明の反応容器の内部では大量の増幅核酸断片が生成しているが、フィルターの上部に置いた水からは増幅核酸断片が検出できなかった。これは、本発明の一実施形態である反応容器を用いれば、核酸増幅反応が十分に行われ、大量の増幅核酸断片が生成した場合でも、核酸増幅反応中または核酸増幅反応後に、増幅核酸断片がチップに内蔵されたフィルターを通過して容器外に放出されることはないことを示している。すなわち、本発明の一実施形態である反応容器を用いれば、簡易な構造のため核酸増幅装置の自動化が容易である長所を有していながら、確実にコンタミネーションを予防することができることを示している。
【０１６０】
〔実施例８：Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ２Ｃ１９（ＣＹＰ２Ｃ１９）遺伝子の
検出〕
（ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子を検出するプライマーの合成）
まず、正鎖プライマー及び逆鎖プライマーを合成した。
【０１６１】
正鎖プライマー及び逆鎖プライマーは、ＤＮＡシンセサイザー（パーキンエルマー社製；３９２型）を用いて、添付のマニュアルに従い、ホスホアミダイト法により合成した。合成した正鎖プライマー及び逆鎖プライマーを、アンモニア水に溶解して、５５℃の環境下で、一晩静置することによって脱保護した。その後、ＯＰＣカラム（パーキンエルマー社製）にて精製した。なお、プライマーの合成は、ＤＮＡ合成受託会社（（株）日本バイオサービス、シグマアルドリッチジャパン（株）、オペロンバイオテクノロジー（株）等）に依頼してもよい。
【０１６２】
（ＰＣＲによるＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の解析）
ＰＣＲに供するサンプルとして、ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法によって得たＤＮＡ溶液（以下、「サンプル」と表記する）を用いた。
【０１６３】
次に、ＰＣＲ反応液を調製した。ＰＣＲ反応液は、全量を２５μｌとして、正鎖プライマー  ２０ｐｍｏｌ、逆鎖プライマー  ２０ｐｍｏｌ、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製、品番ＫＯＤ−２０１）、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼに添付の×１０緩衝液  ２．５μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ  ２．５μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ２μｌ、５ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）  ０．５μｌ及びサンプルを、溶解しているＤＮＡが１００ｎｇ、１０ｎｇ又は１ｎｇとなるように混合し、残部は水とした。
【０１６４】
チップには、ＬＴＳエアゾール耐性チップ（レイニン・インスツルメント社製、品番ＲＴ−Ｌ１０Ｆ）を用いた。また、チップを介して溶液を吸引および吐出することが可能な分注機構を有する手動分注器として、Ｐｉｐｅｔ−Ｌｉｔｅ（ＴＭ）（レイニン・インスツルメント社製、品番Ｌ−２０）を用いた。
【０１６５】
ＰＣＲを行なう核酸増幅容器には、ガラス製キャピラリー（ロシュ・ダイアグノスティクス社製、品番１１９０９３３９００１）を用いた。
【０１６６】
まず、Ｐｉｐｅｔ−Ｌｉｔｅ（ＴＭ）にＬＴＳエアゾール耐性チップを装着し、調製したＰＣＲ反応液のうち１０μｌを吸引し、溶液を保持した。この状態で、ＬＴＳエアゾール耐性チップの先端を、ガラス製キャピラリーの注入口に押し付け、当該チップをガラス製キャピラリーに装着した。次に、Ｐｉｐｅｔ−Ｌｉｔｅ（ＴＭ）に装備されているチップ・イジェクターを用いて、ガラス製キャピラリーに装着されたチップを取り外し、当該
装着物を３０００ｒｐｍで５秒間遠心することで、ＰＣＲ反応液をガラス製キャピラリーの底に移動させた。
【０１６７】
比較のため、従来の方法、すなわち、上記ガラス製キャピラリーに添付のキャップを蓋として使用するＰＣＲを行なった。具体的には、ガラス製キャピラリーの注入口に、調製したＰＣＲ反応液のうち１０μｌをそれぞれ注入し、ガラス製キャピラリーに添付のキャップを装着した。次に、３０００ｒｐｍで５秒間遠心することで、ＰＣＲ反応液を本発明の核酸増幅容器の反応部およびガラス製キャピラリーの底にそれぞれ移動させた。
【０１６８】
核酸増幅装置には、ＲａｐｉｄＣｙｃｌｅｒ２（アイダホ・テクノロジーズ社製）を用いた。ＰＣＲの温度条件は、９４℃で２分間静置した後、９４℃で０秒、６５℃で０秒を３５サイクル行なった。
【０１６９】
（アガロースゲル電気泳動による核酸増幅の確認）
ＰＣＲ反応後、それぞれの反応容器からＰＣＲ反応液５μｌを回収した。次に、回収したＰＣＲ反応液を、３％アガロースゲルによる電気泳動に供した。電気泳動では、１００Ｖの電圧を印加して、６０分間行なった。その結果を図１６に示す。図１６は本実施例における電気泳動の結果を示す図であり、レーン１〜４は本発明の核酸増幅方法の結果を示し、レーン５〜８はガラス製キャピラリーに添付のキャップを用いたＰＣＲの結果を示す。また、レーン１及び５は、調製したＰＣＲ反応液２５μｌ当たりのＤＮＡの溶解量が１００ｎｇとしたＰＣＲ反応液を用いた結果を示し、レーン２及び６は、調製したＰＣＲ反応液２５μｌ当たりのＤＮＡの溶解量が１０ｎｇとしたＰＣＲ反応液を用いた結果を示し、レーン３及び７は、調製したＰＣＲ反応液２５μｌ当たりのＤＮＡの溶解量が１ｎｇとしたＰＣＲ反応液を用いた結果を示す。また、レーン４及び８は比較のためサンプルの代わりに水を混合したＰＣＲ反応液を用いた結果を示す。
【０１７０】
図１６に示すように、本発明の核酸増幅方法では、従来の核酸増幅方法、すなわちガラス製キャピラリーに添付のキャップを用いたＰＣＲと同等の感度でＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子を検出することができた。これは、本発明の一実施形態である核酸増幅方法を用いれば、核酸増幅反応のための溶液を保持させた着脱可能なチップを核酸増幅容器に装着することにより、例えば、従来のピペット操作など核酸増幅反応のための溶液を核酸増幅容器に充填する際に、検体中に含まれる核酸が飛散し、他の患者などに由来する検体のコンタミネーションが起こる可能性を極めて低くすることができる効果がありながら、従来の方法と同等の感度でＰＣＲを行なうことができたことを示している。さらに、本発明の一実施形態である核酸増幅方法を用いれば、チップを核酸増幅容器に装着することにより、核酸増幅反応後、チップおよび核酸増幅容器を廃棄する際においても、チップと核酸増幅容器が分離することなく一体的に廃棄することができるため、コンタミネーションの原因となる核酸が廃棄物から飛散または漏出する可能性を極めて低くすることができる効果がありながら、従来の方法と同等の感度でＰＣＲを行なうことができたことをも示している。
【０１７１】
〔実施例９：核酸増幅反応、および、増幅核酸断片が容器外に放出される可能性の検討〕
ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子を対象とするＰＣＲを例として、本発明において核酸増幅反応が十分に行われた場合に、核酸増幅反応中または核酸増幅反応後に、増幅核酸断片がチップに内蔵されたフィルターを通過して容器外に放出され、コンタミネーションの原因となる可能性があるかを検討した。
（ＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子を検出するプライマーの合成）
実施例８に記載のプライマーを使用した。
【０１７２】
（ＰＣＲによるＣＹＰ２Ｃ１９遺伝子の増幅）
ＰＣＲに供するサンプルとして、ヒト白血球からフェノール・クロロフォルム法によって得たＤＮＡ溶液を用いた。ヒト白血球として、２種類の個体から得たものを用い、ＤＮＡ溶液を４種類調製した（以下、「サンプルＡ」、「サンプルＢ」、「サンプルＣ」、「サンプルＤ」と表記する）。
【０１７３】
次に、ＰＣＲ反応液を調製した。ＰＣＲ反応液は、全量を２５μｌとして、正鎖プライマー  ２０ｐｍｏｌ、逆鎖プライマー  ２０ｐｍｏｌ、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製、品番ＫＯＤ−２０１）、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼに添付の×１０緩衝液  ２．５μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ  ２．５μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ２μｌ、５ｍｇ／ｍｌ  ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）  ０．５μｌおよびサンプルＡ、Ｂ、Ｃ、またはＤを、溶解しているＤＮＡが１００ｎｇとなるように混合し、残部は水とした。
【０１７４】
チップには、ＬＴＳエアゾール耐性チップ（レイニン・インスツルメント社製、品番ＲＴ−Ｌ１０Ｆ）を用いた。また、チップを介して溶液を吸引および吐出することが可能な分注機構を有する手動分注器として、Ｐｉｐｅｔ−Ｌｉｔｅ（ＴＭ）（レイニン・インスツルメント社製、品番Ｌ−２０）を用いた。
【０１７５】
ＰＣＲを行なう核酸増幅容器には、ガラス製キャピラリー（ロシュ・ダイアグノスティクス社製、品番１１９０９３３９００１）を用いた。
【０１７６】
まず、Ｐｉｐｅｔ−Ｌｉｔｅ（ＴＭ）にＬＴＳエアゾール耐性チップを装着し、調製したＰＣＲ反応液のうち１０μｌを吸引し、溶液を保持した。この状態で、ＬＴＳエアゾール耐性チップの先端を、ガラス製キャピラリーの注入口に押し付け、当該チップをガラス製キャピラリーに装着した。次に、Ｐｉｐｅｔ−Ｌｉｔｅ（ＴＭ）に装備されているチップ・イジェクターを用いて、ガラス製キャピラリーに装着されたチップを取り外し、当該装着物を３０００ｒｐｍで５秒間遠心することで、ＰＣＲ反応液をガラス製キャピラリーの底に移動させた。
【０１７７】
さらに、ガラス製キャピラリーに装着されたＬＴＳエアゾール耐性チップに内蔵されたフィルターの上部、すなわち、Ｐｉｐｅｔ−Ｌｉｔｅ（ＴＭ）が装着されていた面の上側に、水２５μｌを置き、核酸増幅装置にセットした。
【０１７８】
核酸増幅装置には、ＲａｐｉｄＣｙｃｌｅｒ２（アイダホ・テクノロジーズ社製）を用いた。ＰＣＲの温度条件は、９４℃で２分間静置した後、９４℃で０秒、６５℃で０秒を５０サイクル行なった。
【０１７９】
（ＰＣＲによるフィルターを通過した増幅核酸断片の確認）
ＲａｐｉｄＣｙｃｌｅｒ２による増幅反応の終了後、上記フィルターの上部に置いた水の全量を採取し、それぞれサンプルとして、ＰＣＲを行なった。ＰＣＲ反応液は、全量を５０μｌとして、正鎖プライマー  １０ｐｍｏｌ、逆鎖プライマー  １０ｐｍｏｌ、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製、品番ＫＯＤ−２０１）、ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼに添付の×１０緩衝液  ５μｌ、２ｍＭ  ｄＮＴＰ  ５μｌ、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２  ２μｌおよび各サンプルを混合し、残部は水とした。
【０１８０】
核酸増幅装置には、ＧｅｎｅＡｍｐ９７００（アプライドバイオシステムズ社製）を用いた。ＰＣＲの温度条件は、９４℃で２分間静置した後、９４℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で３０秒を５０サイクル行なった。
【０１８１】
（アガロースゲル電気泳動による核酸増幅の確認）
ＰＣＲ反応後、それぞれの反応容器からＰＣＲ反応液５μｌを回収した。次に、回収したＰＣＲ反応液を、３％アガロースゲルによる電気泳動に供した。電気泳動では、１００Ｖの電圧を印加して、６０分間行なった。その結果を図１７に示す。図１７は本実施例における電気泳動の結果を示す図であり、レーン１、３、５、７はＲａｐｉｄＣｙｃｌｅｒ２を用いた増幅、すなわちガラス製キャピラリーの内部で増幅したＰＣＲの結果を示し、レーン２、４、６、８はＧｅｎｅＡｍｐ９７００を用いた増幅、すなわちＲａｐｉｄＣｙｃｌｅｒ２を用いた増幅の際にフィルターの上部に置いた水をサンプルとしたＰＣＲの結果を示す。また、レーン１および２はサンプルＡを用いたＰＣＲの結果を示し、レーン３および４はサンプルＢを用いたＰＣＲの結果を示し、レーン５および６はサンプルＣを用いたＰＣＲの結果を示し、レーン７および８はサンプルＤを用いたＰＣＲの結果を示す。
【０１８２】
図１７に示すように、ガラス製キャピラリーの内部では大量の増幅核酸断片が生成しているが、フィルターの上部に置いた水からは増幅核酸断片が検出できなかった。これは、本発明の一実施形態である核酸増幅方法において、核酸増幅反応が十分に行われ、大量の増幅核酸断片が生成した場合でも、核酸増幅反応中または核酸増幅反応後に、増幅核酸断片がチップに内蔵されたフィルターを通過して容器外に放出されることはないことを示している。すなわち、本発明の一実施形態である核酸増幅方法は、簡易な構造のため核酸増幅装置の自動化が容易である長所を有していながら、確実にコンタミネーションを予防することができることを示している。
【産業上の利用可能性】
【０１８３】
本発明に係る核酸増幅容器は、破損する可能性が極めて低く、また極めて迅速かつ簡便に核酸増幅反応を行なうことができる。遺伝子解析や、遺伝子をモニタリングすることにより行なわれるバイオアッセイなど、ＰＣＲ等の核酸増幅反応を用いるあらゆる産業で利用可能である。特に、核酸増幅反応が確定診断として用いられるため誤りが許されず、また患者から採取できる検体の量が限られているため失敗が許されず、さらに迅速性も要求されるために、迅速性を保ちながら高い精度を有していなければならない遺伝子診断において極めて有用である。
【０１８４】
本発明に係る反応容器は、破損する可能性が極めて低く、また極めて迅速かつ簡便に化学反応を行なうことができる。また、本発明に係る反応容器を用いれば、あるいは、本発明に係る核酸増幅方法を行えば、簡易な操作で確実に反応液（核酸増幅反応液）の飛散を防ぐことができるため、自動化が容易であり、簡易な構造の反応装置でコンタミネーションを予防することができる。特に、本発明に係る反応容器を核酸増幅反応に用いれば、あるいは、本発明に係る核酸増幅方法を行えば、これまでの核酸増幅方法とは異なり、コンタミネーションの原因となる核酸の、廃棄物からの飛散または漏出を減らすことができるため、例えば、患者から採取できる検体の量が限られているため失敗が許されず、感染性の検体を取り扱う可能性があり、さらに迅速性も要求されるために、迅速性を保ちながら高い精度を有していなければならない遺伝子診断において極めて有用である。
【０１８５】
本発明は上述した実施形態および実施例のそれぞれに限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態および実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１８６】
【図１】本発明の実施形態に係る核酸増幅容器の底面の形状を示す模式図である。
【図２】本発明の実施形態に係る核酸増幅容器の外観を示す模式図である。
【図３】本発明の実施形態に係る核酸増幅容器を８個連結した外観を示す模式図である。
【図４】本発明の実施形態の一例を説明する図である。
【図５】本発明の実施例１における溶液温度測定の結果を示す図である。
【図６】本発明の実施例２における電気泳動の結果を示す図である。
【図７】本発明の実施形態の一例を説明する図である。
【図８】本発明の実施形態に係る反応容器の底面の形状を示す模式図である。
【図９】本発明の実施形態に係る反応容器の外観を示す模式図である。
【図１０】本発明の実施形態に係る反応容器を８個連結した外観を示す模式図である。
【図１１】本発明の実施形態の一例を説明する図である。
【図１２】本発明の実施例４における溶液温度測定の結果を示す図である。
【図１３】本発明の実施例５における電気泳動の結果を示す図である。
【図１４】本発明の実施例７における電気泳動の結果を示す図である。
【図１５】本発明の実施形態に係る核酸増幅方法を示す模式図である。
【図１６】本発明の実施例８における電気泳動の結果を示す図である。
【図１７】本発明の実施例９における電気泳動の結果を示す図である。
【符号の説明】
【０１８７】
１００    図４においては「核酸増幅容器」、図１１においては「反応容器」
１０１    図２および図４においては「導入部」、図９および図１１においては「収納部」
１０２    図２および図４においては「反応部」、図９および図１１においては「反応部」
１０３    図２および図４においては「反応部底面」、図９および図１１においては「反応部底面」
２００    図１１において「ピペットチップ」
２０１    図１１において「フィルター」
【図１】
0005444632.tif 000006
【図４】
0005444632.tif 000007
【図５】
0005444632.tif 000008
【図７】
0005444632.tif 000009
【図８】
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【図１１】
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【図１２】
0005444632.tif 000012
【図１５】
0005444632.tif 000013
【図２】
0005444632.tif 000014
【図３】
0005444632.tif 000015
【図６】
0005444632.tif 000016
【図９】
0005444632.tif 000017
【図１０】
0005444632.tif 000018
【図１３】
0005444632.tif 000019
【図１４】
0005444632.tif 000020
【図１６】
0005444632.tif 000021
【図１７】
0005444632.tif 000022