(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キャリアタンパク質に結合された改変された血清群Ｗ１３５髄膜炎菌の莢膜糖類であって、ここで（ａ）該糖類中のシアリン酸残基の２〜９％は、７位においてＯ−アセチル化され；および／または（ｂ）該糖類中のシアリン酸残基の３５〜５５％は、９位においてＯ−アセチル化されている、糖類。
【請求項２】
キャリアタンパク質に結合された改変された血清群Ｙ髄膜炎菌の莢膜糖類であって、ここで（ａ）該糖類中のシアリン酸残基の２〜９％は、７位においてＯ−アセチル化され；および／または（ｂ）該糖類中のシアリン酸残基の３５〜５５％は、９位においてＯ−アセチル化されている、糖類。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の改変された髄膜炎菌の莢膜糖類であって、該糖類中の４〜８％のシアリン酸残基は、７位においてＯ−アセチル化されている、糖類。
【請求項４】
請求項１または請求項２に記載の改変された髄膜炎菌の莢膜糖類であって、該糖類中の４０〜５０％のシアリン酸残基は、９位においてＯ−アセチル化されている、糖類。
【請求項５】
キャリアタンパク質に結合された改変された髄膜炎菌の莢膜糖類であって、該糖類は、二糖類単位のｎ個以上の繰り返し単位：
［シアリン酸］−［ヘキソース］
を含有し、ここで該ヘキソースは、ガラクトースまたはグルコースのいずれかであり、ｎは、１〜１００の整数であり、そして
（ａ）該ｎ個以上の繰り返し単位におけるシアリン酸残基のｘ％は、７位においてＯ−アセチル化され；および／または、
（ｂ）ヘキソースがガラクトースである場合、該ｎ個以上の繰り返し単位におけるシアリン酸残基のｙ％は、９位においてＯ−アセチル化され、そしてヘキソースがグルコースである場合、該ｎ個以上の繰り返し単位におけるシアリン酸残基のｙ％は、９位においてＯ−アセチル化され、
ヘキソースがガラクトースである場合、ｘは２〜９であり、かつｙは３５〜５５であり；そして、ヘキソースがグルコースである場合、ｘは２〜９であり、かつｙは３５〜５５である、糖類。
【請求項６】
請求項５に記載の糖類であって、ヘキソースがガラクトースであり、前記ｎ個以上の繰り返し単位におけるシアリン酸残基の６±０．６％は、７位においてＯ−アセチル化され、かつ該ｎ個以上の繰り返し単位におけるシアリン酸残基の４３±４．３％は、９位においてＯ−アセチル化されている、糖類。
【請求項７】
請求項５に記載の糖類であって、ヘキソースがグルコースであり、前記ｎ個以上の繰り返し単位におけるシアリン酸残基の６±０．６％は、７位においてＯ−アセチル化され、かつ該ｎ個以上の繰り返し単位におけるシアリン酸残基の４５±４．５％は、９位においてＯ−アセチル化されている、糖類。
【請求項８】
血清群Ｗ１３５髄膜炎菌の莢膜糖類のａ個の分子を含有する薬学的組成物であって、
（ｉ）莢膜糖類分子あたりのシアリン酸残基の平均数は、ｂであり、そしてここで：
（ａ）該組成物中のａ・ｂ血清群Ｗ１３５シアリン酸残基の２〜９％は、７位においてＯ−アセチル化され；および／または
（ｂ）該組成物中のａ・ｂ血清群Ｗ１３５シアリン酸残基の３５〜５５％は、９位においてＯ−アセチル化されており、
（ｉｉ）該糖類はキャリアタンパク質に結合されており、そして、
ａ・ｂは、該組成物中の血清群Ｗ１３５シアリン酸残基の総数を指す、組成物。
【請求項９】
血清群Ｙ髄膜炎菌の莢膜糖類のａ個の分子を含有する薬学的組成物であって、
（ｉ）莢膜糖類分子あたりのシアリン酸残基の平均数は、ｂであり、そしてここで、
（ａ）該組成物中のａ・ｂ血清群Ｙシアリン酸残基の２〜９％は、７位においてＯ−アセチル化され；および／または
（ｂ）該組成物中のａ・ｂ血清群Ｙシアリン酸残基の３５〜５５％は、９位においてＯ−アセチル化されており、
（ｉｉ）該糖類はキャリアタンパク質に結合されており、そして、
ａ・ｂは、該組成物中の血清群Ｙシアリン酸残基の総数を指す、組成物。
【請求項１０】
以下の二糖単位：
【化１】
0005590760.tif 000014
のｎ個以上の繰り返しを含む糖類であって、ここで
ｎは１〜１００の整数であり、
ＸおよびＹは、−Ｈおよび−ＯＨから選択される別個の基であり、
Ｒ１は、−Ｈおよび−ＣＯＣＨ３から独立して選択され、そして各々の二糖単位において等しくても異なっていてもよく、
Ｒ２は、−Ｈおよび−ＣＯＣＨ３から独立して選択され、そして各々の二糖単位において等しくても異なっていてもよく、
Ｘが−ＯＨであり、かつＹが−Ｈである場合、（ａ）Ｒ１の２〜１０％は、−ＣＯＣＨ３であり、および／または（ｂ）Ｒ２の３５〜５５％は、−ＣＯＣＨ３であり、
Ｘが−Ｈであり、かつＹが−ＯＨである場合、（ａ）Ｒ１の２〜９％は、−ＣＯＣＨ３であり、および／または（ｂ）Ｒ２の３５〜５５％は、−ＣＯＣＨ３であり、そして
該糖類はキャリアタンパク質に結合されている、糖類。
【請求項１１】
請求項１〜７および１０のいずれか１項に記載の糖類であって、該糖類は、３０未満の平均重合度を有する、糖類。
【請求項１２】
以下：
（ｉ）請求項１〜７および１０〜１１のいずれか１項に記載の糖類であって、前記キャリアタンパク質が、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）タンパク質Ｄ、およびＣＲＭ１９７からなる群から選択される、糖類。
【請求項１３】
以下：
（ａ）請求項１〜７および１０〜１２のいずれか１項に記載の糖類、および
（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、
を含有する、免疫原性組成物。
【請求項１４】
水性形態である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
凍結乾燥形態である、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の血清群Ｃ由来の莢膜糖類抗原をさらに含有する、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の血清群Ａ由来の莢膜糖類抗原をさらに含有する、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
血清群Ａ抗原が、天然の糖類上の１つ以上のヒドロキシル基が保護基により置換された改変された糖類である、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）の血清群Ｂ由来の抗原をさらに含有する、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）Ｂ型由来の糖類抗原をさらに含有する、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）由来の抗原をさらに含有する、請求項１３〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
Ａ型肝炎ウイルス由来の抗原；Ｂ型肝炎ウイルス由来の抗原；百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）由来の抗原；ジフテリアトキソイド；破傷風トキソイド；および／またはポリオウイルス抗原の１つ以上をさらに含有する請求項１３〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
医薬としての使用のための、請求項１３〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
哺乳動物において抗体の応答を惹起するための、請求項１３〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
髄膜炎菌性髄膜炎を防御するための医薬の製造における、請求項１〜７および１０〜１２のいずれか１項に記載の、改変された血清群Ｗ１３５髄膜炎菌の莢膜糖類および／または改変された血清群Ｙ髄膜炎菌の莢膜糖類の使用。
【請求項２６】
以下の工程：
（１）出発血清群Ｗ１３５または血清群Ｙの髄膜炎菌の莢膜糖類、およびキャリアタンパク質を提供する工程であって、ここで該糖類およびキャリアタンパク質の一方または両方は、必要に応じてその他方に対して反応性であるように改変されている、工程、
（２）該糖類と該キャリアタンパク質との間で共有結合を形成する工程、および
（３）得られたグリコ結合体を精製する工程、
を包含する、免疫原性結合体を調製するためのプロセスであって、ここで工程（１）と工程（３）との間で、出発糖類におけるシアリン酸残基の９位におけるＯ−アセチル化の程度が３５〜５５％まで増加する、プロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書中で引用される全ての文献は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、髄膜炎菌の莢膜糖類およびその結合誘導体の分野におけるものである。
【背景技術】
【０００３】
多糖は、重要な生物学的分子であり、これらは、疾患の予防および処置のために製薬産業において広く使用されている。例えば、莢膜多糖は、長年にわたって莢膜細菌（例えば、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびＨｉｂ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｅｕｅｎｚａｅＢ型））に対するワクチンにおいて使用されている。
【０００４】
莢膜多糖の免疫原性を（主に子供において）増強するために、結合ワクチンが開発された。これらは、キャリアタンパク質に結合した莢膜糖類を含有する（例えば、参考文献１〜３（特許文献１〜３））。結合は、Ｔ−非依存性抗原をＴ−依存性抗原へと転換する。
【０００５】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｗ１３５（「ＭｅｎＷ１３５」）の莢膜糖類は、シアリン酸−ガラクトース二糖単位のポリマー：
→４）−Ｄ−Ｎｅｕｐ５Ａｃ（７／９ＯＡｃ）−α−（２→６）−Ｄ−Ｇａｌ−α−（１→
を含有し、ここで「Ｎｅｕ」は、一般にシアリン酸として公知のノイラミン酸を指す。
【０００６】
同様に、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｙ（ＭｅｎＹ）の莢膜糖類は、シアリン酸−グルコース二糖単位のポリマー：
→４）−Ｄ−Ｎｅｕｐ５Ａｃ（７／９ＯＡｃ）−α−（２→６）−Ｄ−Ｇｌｃ−α−（１→
を含有する。
【０００７】
天然においては、これらの莢膜糖類は、シアリン酸残基のいくつかの７位および９位のいくつかにおいて、Ｏ−アセチル化されることが見出されている。Ｗ１３５糖類のＯ−アセチル化は、参考文献４（非特許文献１）において「最初に報告され」、Ｏ−７位およびＯ−９位におけるＯ−アセチル化が報告された。Ｏ−７位およびＯ−９位におけるアセチル化はまた、血清群Ｙ糖類においても見出されたが、著者らは、以前の研究により、Ｏ−７位、Ｏ’−３位またはＯ’−４位においてＯ−アセチル化を示したことを報告した。糖類のＯ−アセチルの量に対するさらなる研究が、参考文献５（非特許文献２）に報告された。
【０００８】
参考文献５（非特許文献２）は、血清群Ｗ１３５について、「Ｏ−アセチル化は、防御抗体応答を誘発するために重要でないという根拠が増加しつつある」ことを報告する。対照的に、参考文献６（非特許文献３）は、「Ｏ−アセチル化は、多糖ワクチンの免疫原性に影響を及ぼす根拠がある」ことを報告する。しかし、「ＣＰＳ（莢膜多糖）のＯ−アセチル化は、防御免疫の誘発に重要でないかもしれない」という記述に対して、参考文献５（非特許文献２）の著者らは、血清群１３５およびＹにおけるアセチル化を調査した。その結果では、基本的な条件にて室温で９日間保存した後、これらの２つの血清群について、Ｏ−アセチル化における変化は見出されなかった。
【０００９】
参考文献７（非特許文献４）は、四価の多糖ワクチンにおいて使用される「Ｗ１３５およびＹ株のＯ−アセチル化状態」は、以前には「報告されなかった」ことを報告した。著者らは、参考文献８（非特許文献５）において続けて、「血清群Ｗ１３５およびＹのＯ−アセチル化状態について、ほとんど知られていない」ことを報告し、そして著者らは、さらなる研究は、「最適なワクチン処方への有用な視点を提供し得る」ことを提示したが、このようなさらなる研究および可能な視点の性質（ｎａｔｕｒｅ）は、詳細には記載されなかった。参考文献９（非特許文献６）は、血清群Ｗ１３５について「ワクチン開発に対するＯ−アセチル化の関連性は、未特定のままである」ことを報告する。参考文献６（非特許文献３）は、血清群Ｗ１３５または血清群Ｙの免疫原性に対するＯ−アセチル化の影響について、多糖は、まだ利用できない」というデータに符合する（２００４年、１月）。
【００１０】
血清群Ｗ１３５およびＹについてのこの困惑および情報の不足は、糖類ワクチンが現在使用される２つの他の血清群と対照的である。Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｃ莢膜多糖のＯ−アセチル化におけるバリエーションは、広く報告されている（１０、１１）が、ＭｅｎｊｕｇａｔｅＴＭおよびＮｅｉｓＶａｃ−ＣＴＭプロダクトは、両方とも有効であることから、免疫原性に対していかなる負の影響も有するようには見られない。対照的に、血清群Ａ多糖の脱Ｏ−アセチル化は、「免疫原性の大幅な低下」に関連している（１２）。
【特許文献１】米国特許第４，７１１，７７９号明細書
【特許文献２】米国特許第４，７６１，２８３号明細書
【特許文献３】米国特許第４，８８２，３１７号明細書
【非特許文献１】Ｌｅｍｅｒｃｉｎｉｅｒら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ  Ｒｅｓ（１９９６）２９６：８３−９６
【非特許文献２】ＪｏｎｅｓおよびＬｅｍｅｒｃｉｎｉｅｒ、Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｍｅｄ（２００２）３０：１２３３−４７
【非特許文献３】Ｃｌａｕｓら、Ｍｐｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２００４）５１：２２７−３９
【非特許文献４】Ｌｏｎｇｗｏｒｔｈら、１３ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  Ａｂｓｔｒａｃｔ（２００２）２７２
【非特許文献５】Ｌｏｎｇｗｏｒｔｈら、ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（２００２）３２：１１９−２３
【非特許文献６】Ｐｏｌｌａｒｄら、Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（２００３）９：１５０３−４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、莢膜糖類誘導体を提供することである。この誘導体は、詳細には、キャリアタンパク質と結合する場合に、そして詳細には、髄膜炎菌の血清群Ｗ１３５およびＹについて免疫原性組成物を作製するのに使用され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
髄膜炎菌の血清群Ｗ１３５およびＹについてのワクチンにおけるＯ−アセチル化の役割への不確かな関与にもかかわらず、本発明者らは、Ｏ−アセチル化が、詳細には結合ワクチンの調製の間に実際に関与し得ることを見出した。本発明は、シアリン酸残基の７位および９位における改変されたレベルのＯ−アセチル化を有するＭｅｎＷ１３５およびＭｅｎＹ由来の改変された莢膜糖類は、免疫原性組成物を作製するのに使用することができるという発見に基づいている。未改変の天然の糖類に対して、本発明の誘導体は、キャリアタンパク質への結合の間、優先的に選択される。さらに、これらの誘導体の結合体は、天然の多糖と比較して改善された免疫原性を示す。
【００１３】
（改変された糖類）
従って、本発明は、改変された血清群Ｗ１３５の髄膜炎菌の莢膜糖類を提供し、ここで：（ａ）糖類中のシアリン酸残基のｘ％以下は、７位においてＯ−アセチル化される；および／または（ｂ）糖類中のシアリン酸残基のｙ％以上は、９位においてＯ−アセチル化される。
【００１４】
同様に、本発明は、改変された血清群Ｙの髄膜炎菌の莢膜糖類を提供し、ここで：（ａ）糖類中のシアリン酸残基のｘ％以下は、７位においてＯ−アセチル化される；および／または（ｂ）糖類中のシアリン酸残基のｙ％以上またはｚ％以下は、９位においてＯ−アセチル化される。
【００１５】
ｘの値は、血清群に依存する：血清群Ｗ１３５について、ｘは、２９以下である（例えば、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５または０）であり；血清群Ｙについて、ｘは、９以下である（例えば、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５または０）。
【００１６】
ｙの値もまた血清群に依存する：血清群Ｗ１３５について、ｙは２６以上である（例えば、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００）；血清群Ｙについて、ｙは、２９以上である（例えば、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００）。
【００１７】
ｚの値は２７以下である（例えば、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５または０）。
【００１８】
好ましくは、ｘ＞ｍであり、ここで、ｍは、０、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０から選択される。
【００１９】
好ましくは、ｚ＞ｐであり、ここで、ｐは０、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０から選択される。
【００２０】
（本発明の糖類）
より一般には、本発明は、必要に応じてキャリアタンパク質に結合された、改変された髄膜炎菌の莢膜糖類を提供し、ここで、この糖類は、二糖単位｛［シアリン酸］−［ヘキソース］｝のｎ個以上の繰り返し単位を含有し、ここで、このヘキソースは、ガラクトースまたはグルコースのいずれかであり、そしてｎは１〜１００の整数であり、そしてここで、（ａ）上記ｎ個以上の繰り返し単位におけるシアリン酸残基のｘ％以下は、７位においてＯ−アセチル化され；および／または（ｂ）ヘキソースがガラクトースである場合、上記ｎ個以上の繰り返し単位におけるシアリン酸残基のｙ％以上は、９位においてＯ−アセチル化され、およびヘキソースがグルコースである場合、上記ｎ個以上の繰り返し単位におけるシアリン酸残基のｙ％以上またはｚ％以下は、９位においてＯ−アセチル化される。
【００２１】
ｘの値はヘキソースに依存する：ヘキソースがガラクトースである場合、ｘは２９以下である（例えば、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５または０）；ヘキソースがグルコースである場合、ｘは、９以下である（例えば、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５または０）。
【００２２】
ｙの値は、ヘキソースに依存する：ヘキソースがガラクトースである場合、ｙは、２６以上である（例えば、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００）；ヘキソースがグルコースである場合、ｙは２９以上である（例えば、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００）。
【００２３】
ｚの値は、２７以下である（例えば、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５または０）。
【００２４】
好ましくは、上に規定されるとおりにｘ＞ｍである。好ましくは、上に規定されるとおりにｚ＞ｐである。
【００２５】
好ましくは、シアリン酸は、Ｎ−アセチルノイラミン酸である。
【００２６】
ヘキソースがガラクトースである場合、｛［シアリン酸］−［ヘキソース］｝二糖単位は、好ましくは：
→４）−Ｄ−Ｎｅｕｐ５Ａｃ（７／９ＯＡｃ）−α−（２→６）−Ｄ−Ｇｌｃ−α−（１→
である。
【００２７】
ヘキソースがグルコースである場合、｛［シアリン酸］−［ヘキソース］｝二糖単位は、好ましくは：
→４）−Ｄ−Ｎｅｕｐ５Ａｃ（７／９ＯＡｃ）−α−（２→６）−Ｄ−Ｇｌｃ−α−（１→
好ましくは、改変された髄膜炎菌の莢膜糖類は、キャリアタンパク質に結合される。このような結合体において：（ｉ）好ましくは２〜９％の間の、より好ましくは４〜８％の間の、より好ましくは５〜７％の間の、さらにより好ましくは約６％の、シアリン酸残基は、７位においてＯ−アセチル化され；（ｉｉ）好ましくは３５〜５５％の間の、より好ましくは４０〜５０％の間の、より好ましくは４２〜４６％の間の、さらにより好ましくは約４３％（ヘキソースが、Ｇａｌである場合）の、または約４５％（ヘキソースが、Ｇｌｃである場合）の、シアリン酸残基は、９位においてＯ−アセチル化される。
【００２８】
本発明はまた、血清群Ｗ１３５髄膜炎菌の莢膜糖類のａ分子を含有する組成物を提供し、ここで莢膜糖類分子あたりのシアリン酸残基の平均数は、ｂであり、そしてここで：（ａ）組成物中のａ・ｂ血清群Ｗ１３５シアリン酸残基のｘ％以下は、７位においてＯ−アセチル化され；および／または（ｂ）組成物中のａ・ｂ血清群Ｗ１３５シアリン酸残基のｙ％以上は、９位においてＯ−アセチル化され、そしてここで、ｘおよびｙは、上に規定されたとおりである。
【００２９】
本発明はまた、血清群Ｙ髄膜炎菌莢膜糖類のａ分子を含有する組成物を提供し、ここで莢膜糖類分子あたりのシアリン酸残基の平均数は、ｂであり、そしてここで：（ａ）組成物中のａ・ｂ血清群Ｙシアリン酸残基のｘ％以下は、７位においてＯ−アセチル化され；および／または（ｂ）組成物中のａ・ｂ血清群Ｙシアリン酸残基のｙ％以上またはｚ％以下は、９位においてＯ−アセチル化され、そしてここで、ｘ、ｙおよびｚは、上に規定されたとおりである。
【００３０】
上記集合における糖類は、タンパク質キャリアに結合され得、そして／または溶液中で遊離であり得る。
【００３１】
好ましくは本発明の糖類または結合体は、精製された形態（例えば、実質的に天然の多糖が存在しない）である。
【００３２】
（構造の描写）
本発明はまた、必要に応じてキャリアタンパク質に結合された糖類を提供し、この糖類は、以下の二糖単位：
【００３３】
【化２】
0005590760.tif 000002
のｎ個以上の繰り返しを含有し、ここで：
ｎは１〜１００の整数であり、
ＸおよびＹは、−Ｈおよび−ＯＨから選択される異なる基であり、
Ｒ１は、−Ｈおよび−ＣＯＣＨ３から独立して選択され、および各々の二糖単位において等しくても異なっていてもよく、
Ｒ２は、−Ｈおよび−ＣＯＣＨ３から独立して選択され、および各々の二糖単位において等しくても異なっていてもよく、そして
Ｘが−ＯＨであり、かつＹが−Ｈである場合、（ａ）Ｒ１のｘ％以下は、−ＣＯＣＨ３であり、および／または（ｂ）Ｒ２のｙ％以上は、−ＣＯＣＨ３であり、
Ｘが−Ｈであり、かつＹが−ＯＨである場合、（ａ）Ｒ１のｘ％以下は、−ＣＯＣＨ３であり、および／または（ｂ）Ｒ２のｙ％以上またはｚ％以下は、−ＣＯＣＨ３である。
【００３４】
Ｘが−ＯＨであり、かつＹが−Ｈである場合、ｘは２９以下であり（例えば、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５または０）、およびｙは、２６以上である（例えば２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００）。
【００３５】
Ｘが−Ｈであり、Ｙが−ＯＨである場合、ｘは９以下であり（例えば、８、７、６、５、４、３、２、１または０．５）、ｙは２９以上であり（例えば、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００）、そしてｚは、２７以下である（例えば、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、０．５または０）。
【００３６】
好ましくは、ｘ＞ｍであり、ここで、ｍは上に規定されたとおりである。好ましくは、ｚ＞ｐであり、ここで、ｐは上に規定されたとおりである。
【００３７】
好ましくは、糖類は、キャリアタンパク質に結合される。
【００３８】
糖類がキャリアタンパク質に結合され、かつＸは−ＯＨであり、かつＹが−Ｈである場合、（ａ）好ましくは約２〜１０％、より好ましくは約４〜８％、より好ましくは約５〜７％、さらにより好ましくは約６％のＲ１は、−ＣＯＣＨ３であり；および／または（ｂ）好ましくは約３５〜５５％、より好ましくは約４０〜５０％、より好ましくは約４２〜４４％、さらにより好ましくは約４３％のＲ２は、−ＣＯＣＨ３である。
【００３９】
糖類がキャリアタンパク質に結合され、かつＸは−Ｈであり、かつＹが−ＯＨである場合、（ａ）好ましくは約２〜９％、より好ましくは約４〜８％、より好ましくは５〜７％、さらにより好ましくは約６％のＲ１は、−ＣＯＣＨ３であり；および／または（ｂ）好ましくは約３５〜５５％、より好ましくは約４０〜５０％、より好ましくは約４２〜４６％、さらにより好ましくは約４５％のＲ２は、−ＣＯＣＨ３である。
【００４０】
本発明の糖類および結合体の７位および９位におけるシアリン酸残基のＯ−アセチル化状態は、以下に記載されるとおりに１Ｄおよび２ＤプロトンＮＭＲを使用して計測され得る。ＨＰＡＥＣが使用されて、全体のＯ−アセチル化を計測し得るが、異なる位置の間を見分けることはできない（２３４）。イオンスプレーＭＳは、ＭｅｎＡにおけるＯ−アセチル化を分析するために使用されている（２３５）。
【００４１】
（改変された糖類を調製するためのプロセス）
本発明はまた、免疫原性結合体を調製するためのプロセスを提供する。このプロセスは、（１）出発髄膜炎菌莢膜糖類およびキャリアタンパク質を提供する工程であって、上記糖類およびキャリアタンパク質の一方または両方は、必要に応じて他方に対して反応性であるように、改変されている工程；（２）上記糖類と上記キャリアタンパク質との間に共有結合を形成する工程；（３）得られたグリコ結合体を精製する工程、を包含し、ここで工程（１）と工程（３）との間（例えば、工程（２）の間）、出発糖類におけるシアリン酸残基の９位におけるＯ−アセチル化の程度は、増加する。
【００４２】
髄膜炎菌莢膜糖類は、好ましくは、血清群Ｗ１３５または血清群Ｙ由来である。
【００４３】
（莢膜糖類の出発物質）
本発明の改変された莢膜糖類は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｗ１３５またはＹの莢膜において見出される糖類から得ることができる。従って、本発明の糖類は、好ましくは改変されたＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｗ１３５糖類と、改変されたＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｙ糖類である。
【００４４】
髄膜炎菌莢膜多糖は、代表的には、多糖の沈降（例えば、カチオン界面活性剤を使用する）、エタノール分画、（タンパク質を除去するための）冷フェノール抽出および（ＬＰＳを除去するための）超遠心の工程を包含するプロセスにより調製される（例えば、参考文献１３）。
【００４５】
より好ましいプロセス（１４）は、多糖の沈降、次に低級アルコールを使用する沈降した多糖の可溶化を包含する。沈降は、カチオン性界面活性剤（例えば、テトラブチルアンモニウム塩およびセチルトリメチルアンモニウム塩（例えば、臭化物塩）、または臭化ヘキサジメトリンおよびミリスチルトリメチルアンモニウム塩）を使用して達成され得る。臭化セチルトリメチルアンモニウム（「ＣＴＡＢ」）は、特に好ましい（１５）。沈降した物質の可溶化は、低級アルコール（例えば、メタノール、プロパン−１−オール、プロパン−２−オール、ブタン−１−オール、ブタン−２−オール、２−メチル−プロパン−１−オール、２−メチル−プロパン−２−オール、ジオールなど）を使用して達成され得るが、ＣＴＡＢ−多糖複合体の可溶化のためには、エタノールが特に適切である。エタノールは、好ましくは、沈降した多糖に添加されて、５０％と９５％との間の（エタノールと水との全容量に基づく）最終濃度を得る。
【００４６】
再可溶化後、多糖は、さらに処理されて、不純物を除去され得る。これは、わずかな汚染も受け入れられない状況（例えば、ヒトワクチンの作製）において、特に重要である。これは、代表的には、１回以上の濾過工程（例えば、デプス濾過（ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、活性化炭素が使用され得る濾過、サイズ濾過（ｓｉｚｅ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、および／または限外濾過）を包含する。一旦濾過されて、不純物を除去すると、多糖は、さらなる処理および／またはプロセスのために沈降され得る。これは、都合のよいことに、カチオンを交換することにより（例えば、カルシウム塩またはナトリウム塩の添加により）達成され得る。
【００４７】
本発明の糖類は、多糖またはオリゴ糖であり得る。オリゴ糖は、細菌中に存在する天然の莢膜多糖で見出されるよりも低い重合度を有する。
【００４８】
本発明は、好ましくはオリゴ糖を使用する。これらは、好ましくは、３０未満（例えば、１５と２５との間、好ましくは１５〜２０あたり）の平均重合度を有する。重合度は、都合のよいことにイオン交換クロマトグラフィーまたは比色定量アッセイにより計測され得る（１６）。
【００４９】
オリゴ糖は、都合のよいことに、精製した莢膜多糖のフラグメント化により（例えば、加水分解、マイルドな酸での処理、加熱などにより）形成される。このフラグメント化は、通常、所望のサイズの断片の精製に続く。加水分解が実施された場合、加水分解物は一般に短い長さのオリゴ糖を除去するための大きさにされる。これは、イオン交換クロマトグラフィーが続く限外濾過のような種々の手段で達成され得る。約４未満の重合度を有するオリゴ糖は、好ましくは、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙについて除去される。
【００５０】
天然の供給源からの精製の代替として、莢膜糖類（および特にオリゴ糖）は、全合成または部分合成（例えば、参考文献１７に開示されるＨｉｂ合成、および参考文献１８に開示されるＭｅｎＡ合成）により得ることが出来る。
【００５１】
（共有結合）
本発明の改変された糖類は、糖類に適用される任意の通常の下流プロセス（例えば、誘導、結合、フラグメント化など）に供され得る。免疫原性を増強するために、本発明の改変された糖類は、好ましくはキャリアタンパク質に結合される：キャリアタンパク質への結合は、少児ワクチンについて特に有用であり（１９）、および周知の技術である（例えば、参考文献２０〜２８などに概説される）。
【００５２】
従って、本発明は、キャリアタンパク質と本発明の糖類との結合体を提供する。
【００５３】
好ましいキャリアタンパク質は、ジフテリアトキソイドまたは破傷風類トキソイドのような細菌性毒素またはトキソイドである。ジフテリア毒素のＣＲＭ１９７誘導体（２９〜３１）が特に好ましい。他の適切なキャリアタンパク質としては、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜タンパク質（３２）、合成ペプチド（３３、３４）、熱ショックタンパク質（３５、３６）、百日咳タンパク質（３７、３８）、サイトカイン（３９）、リンホカイン（３９）、ホルモン（３９）、成長因子（３９）、種々の病原体由来抗原に由来する多数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質（４０）（例えば、Ｎ１９タンパク質（４１））、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅに由来するタンパク質Ｄ（４２、４３）、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ（４４）、ニューモリシン（ｐｎｅｕｍｏｌｙｓｉｎ）（４５）、鉄摂取タンパク質（４６）、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅに由来する毒素ＡまたはＢ（４７）、変異体細菌毒素（例えば、Ｇｌｕ−２９（４８）において置換されているコレラ毒素のようなコレラ毒素「ＣＴ」、またはＥ．ｃｏｌｉ非耐熱性毒素「ＬＴ」）などが挙げられる。好ましいキャリアは、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタンパク質Ｄ、およびＣＲＭ１９７がある。
【００５４】
本発明の組成物内において、例えば、キャリアの抑制のリスクを軽減するために１個を超えるキャリアタンパク質を使用することが可能である。従って、種々のキャリアタンパク質が、種々の血清群について使用され得る。例えば、血清群Ｗ１３５糖類は、ＣＲＭ１９７に結合され得、一方血清群Ｙ糖類は、破傷風トキソイドに結合され得る。また、特定の糖類抗原について１種より多いキャリアタンパク質を使用することが可能である。例えば、血清群Ｙ糖類は、２種の群で存在し得、いくつかはＣＲＭ１９７に結合され、残りは破傷風トキソイドに結合される。しかし、一般に、全ての血清群について同じキャリアタンパク質を使用することが好ましく、ＣＲＭ１９７は、好ましい選択である。
【００５５】
１種類のキャリアタンパク質は、１種を超える糖類抗原を送達し得る（４９）。例えば、１種類のキャリアタンパク質は、血清群Ｗ１３５およびＹ由来の糖類に結合し得る。しかし、一般に、各々の血清群について別個の結合体を有することが好ましい。
【００５６】
１：５（すなわち、過剰なタンパク質）と５：１（すなわち過剰な糖類）との間の糖：キャリア比（ｗ／ｗ）を有する結合体が好ましい。１：２と５：１との間の比が好ましい。同様に、１：１．２５と１：２．５との間の比がより好ましい。この比は、ＭｅｎＷ１３５結合体については約１．１であり得、ＭｅｎＹ結合体については０．７であり得る。１０μｇ量のＭｅｎＷ１３５糖類、またはＭｅｎＹ糖類に基づいて、好ましい結合体は、６．６〜２０μｇのＣＲＭ１９７キャリアを含有する。
【００５７】
遊離キャリアタンパク質と結合して、結合体は使用され得る（５０）。所与のキャリアタンパク質が、本発明の組成物中に遊離形態と結合形態の両方で存在する場合、非結合形態は、好ましくは、全体として組成物中のキャリアタンパク質の総量の５重量％以下であり、より好ましくは、２重量％未満で存在する。
【００５８】
任意の適切な結合反応は、必要な場合、任意の適切なリンカーとともに使用され得る。
【００５９】
上記糖類は、代表的に、結合前に活性化されるかまたは官能基化される。活性化は、例えば、シアン化試薬（例えば、ＣＤＡＰ（例えば、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（５１、５２など）））を含み得る。他の適切な技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを使用する；参考文献２６のイントロダクションもまた  参照のこと。
【００６０】
リンカー基を介した結合が、任意の公知の手順（例えば、参考文献３および参考文献５３に記載の手順）を用いて作製され得る。結合の１種のタイプは、多糖の還元的アミノ化、結果として生じるアミノ基とアジピン酸リンカー基の一端とのカップリング、そして、次いで、タンパク質とアジピン酸リンカー基の他端とのカップリングを包含する（２４、５４、５５）。結合の好ましい型は、カルボニルリンカーであり、この結合は、改変された糖類の遊離ヒドロキシル基と、ＣＤＩとの反応（５６、５７）、次にタンパク質との反応により形成され得、カルバメート結合を形成する。結合の別の好ましいタイプは、アジピン酸リンカーであり、この結合は、改変された糖類上の遊離−ＮＨ２基とアジピン酸とを（例えば、ジイミド活性化を使用して）結合し、次いで、タンパク質を得られた糖類−アジピン酸中間体と結合することにより形成され得る（２４、５４、５８）。結合の別の好ましい型は、糖類の遊離したヒドロキシル基とシアン化試薬（例えば、ｐ−ニトロフェニルシアネート、１−シアノ−４−（ジメチルアミノ）ピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）、Ｎ−シアノトリエチルアンモニウムテトラフルオロボレート（ＣＴＥＡ））との反応、次にタンパク質上のアミン基と（必要に応じてスペーサー（例えば、ヒドラジン）を解して）反応することにより形成され得る（５９、６０）。他のリンカーとしては、Ｂ−プロピオンアミド（６１）、ニトロフェニル−エチルアミン（６２）、ハロアシルハライド（６３）、グリコシド結合（２、６４）、６−アミノカプロン酸（６５）、ＡＤＨ（６６）、Ｃ４〜Ｃ１２部分（６７）などが挙げられる。リンカーの使用に対する代替として、直接的な結合が使用され得る。タンパク質に対する直接的な結合は、例えば、参考文献２および６８に記載されるように、多糖の酸化、次にタンパク質の還元的アミノ化を包含し得る。
【００６１】
結合は、一級ヒドロキシル基のアノマー末端の還元、一級ヒドロキシル基の任意の保護／脱保護；一級ヒドロキシル基とＣＤＩとの反応によるＣＤＩカルバメート中間体の形成；およびＣＤＩカルバメート中間体とタンパク質上のアミノ基との結合、に関し得る。
【００６２】
アミノ基を糖類へ導入し（例えば、末端＝Ｏ基を−ＮＨ２で置換する工程）、次にアジピン酸ジエステル（例えば、アジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステル）による誘導体化、およびキャリアタンパク質との反応を包含するプロセスが、好ましい。別の好ましい反応は、プロテインＤキャリアを使用するＣＤＡＰ活性化を使用する。
【００６３】
結合後、遊離した糖類および結合した糖類は、分離され得る。多くの適切な方法（疎水性クロマトグラフィー、接線（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ）限外濾過、ダイアフィルトレーションなどが挙げられる）が存在する（参考文献６９、および７０などを参照のこと）。
【００６４】
本発明の組成物は、結合オリゴ糖を含有するという点において、オリゴ糖調製は、結合の前に行われることが好ましい。
【００６５】
（薬学的組成物）
本発明は、（ａ）本発明の改変された莢膜糖類および／または本発明の結合体、および（ｂ）薬学的に受容可能なキャリア、を含有する免疫原性組成物（例えば、ワクチン）を提供する。糖類、または糖類タンパク質結合体に基づくワクチンは、当該分野で周知であり、脱Ｏ−アセチル化糖類に基づく結合体（ＮｅｉｓＶａｃ−ＣＴＭ）が挙げられる。本発明のワクチンは、予防薬（すなわち、感染を予防する）か、または治療薬（すなわち、感染を処置する）のいずれでもよいが、代表的には、予防薬である。
【００６６】
「薬学的に受容可能なキャリア」としては、それ自体は薬学的組成物を受容する個体に有害な抗体の産生を誘導しない、任意のキャリアが挙げられる。適切なキャリアは、代表的には、大きく、ゆっくりと代謝される高分子（例えば、タンパク質、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、トレハロース（７１）、脂質凝集物（例えば、油小滴またはリポソーム）および不活性ウイルス粒子）である。このようなキャリアは、当業者に周知である。上記ワクチンはまた、希釈剤（例えば、水、生理食塩水、グリセロールなど）を含有し得る。さらに、補助的な物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）が、存在し得る。薬学的に受容可能な賦刑剤の詳細な議論は、参考文献７２において入手可能である。
【００６７】
代表的には、薬学的組成物は、注射可能物（溶液または懸濁液）として調製される；注射前に液状ビヒクル中に溶解または懸濁するのに適切な固体形態もまた、調製され得る。調製物はまた、アジュバントの効果を高めるためにリポソーム中で乳化、またはカプセル化され得る。薬学的組成物の直接的な送達は、一般に、非経口である（例えば、経皮的にか、腹腔内か、静脈内かまたは筋肉内か、あるいは組織の間隙の空間に送達されるかのいずれかで注射されることよる）。薬学的組成物はまた、病巣に投与され得る。投与の他の形態としては、経口投与および肺投与、直腸（座剤）、および経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）適用、または経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）適用（例えば、参考文献７３）、針およびハイポスプレー（ｈｙｐｏｓｐｒａｙ）が挙げられる。
【００６８】
この組成物のｐＨは、好ましくは６と８との間であり、好ましくは約７である。安定なｐＨは、緩衝液の使用により維持され得る。組成物が、水酸化アルミニウム塩を含む場合、ヒスチジン緩衝液を使用することが好ましい（７４）。この組成物は、滅菌性であり得、および／または発熱因子を含まない。本発明の組成物は、ヒトに関して等張性であり得る。
【００６９】
本発明の組成物は、水性形態（すなわち、溶液または懸濁液）でも乾燥形態（例えば、凍結乾燥粉末）でもよい。液体処方物は、この組成物が、この水性媒体から再構成する必要なく、そのパッケージされた形態から直接投与されることを可能にし、従って、注射のために理想的である。このような組成物は、バイアル中に存在し得るか、またはすでに充填されたシリンジ中に存在し得る。このシリンジは、針付きで供給されても、針なしで供給されてもよい。シリンジは、１回用量の組成物を含有するが、バイアルは、１回用量または複数回用量を含有し得る。
【００７０】
本発明の液体組成物はまた、凍結乾燥形態から他のワクチンを再構成する（例えば、凍結乾燥Ｈｉｂ抗原、またはＤＴＰ抗原を再構成する）のに適切である。本発明の組成物が、このような即時的再構成に使用される点について、本発明はキットを提供する。このキットは、２つのバイアルを含み得るか、または１つのすでに充填されたシリンジと１つのバイアルとを含み得、このシリンジの内容物は、注射前にバイアルの内容物を反応性にするのに使用され得る。
【００７１】
本発明の乾燥組成物は、貯蔵安定性を提供するが、投与前に液体形態に再構成されるなければならない。本発明は、本発明の乾燥組成物を含有する第１のコンテナと、第１のコンテナの内容物を再構成する水性組成物を含有する第２のコンテナとを備えるキットを提供する。第２のコンテナ中の水性組成物は、抗原（例えば、非髄膜炎菌性）を含み得るか、または賦形剤のみを含み得る。第１のコンテナは、一般にはバイアルであり；第２のコンテナもまた、バイアルであり得るか、またはすでに充填されたシリンジであり得る。
【００７２】
乾燥組成物を調製するために、安定化剤（ｓｔａｂｉｌｉｓｅｒ）（例えば、トレハロースおよびスクロースのような二糖、またはマンニトールのような糖アルコール）が使用され得る。これらの成分は、凍結乾燥前に添加され、再構成された組成物中において現れる。
【００７３】
組成物のさらなる成分としては：例えば、約９ｍｇ／ｍｌにおける塩化ナトリウム（張度のため）；一般に、０．０１％未満の低レベルにおける界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ８０のようなＴｗｅｅｎ（ポリソルベート））；および塩類緩衝液（例えば、リン酸緩衝液）が挙げられる。この組成物は、抗生物質を含み得る。
【００７４】
本発明の組成物は、単位用量形態または複数用量形態でパッケージングされ得る。複数用量形態のために、事前に充填されているシリンジよりも、バイアルが好ましい。有効な投薬容量は、慣用的に確立され得るが、注射のための上記組成物の代表的なヒト用量は、０．５ｍｌの容量を有する。
【００７５】
ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的に有効量の抗原、ならびに必要とされる場合、任意の他の成分を含有する。「免疫学的有効量」とは、単回用量または連続の一部としてのどちらかにおける個体への投与量が、処置または予防に有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康条件および身体的条件、年齢、処置される個体の分類学上の群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、その個体の免疫系が抗体を合成する能力、所望される予防の程度、そのワクチンの処方、処置する医師による医学的状態の評価および他の関連因子に依存して変化する。上記量は、慣習的な試験を通して決定され得る比較的広範な範囲にわたることが期待される。
【００７６】
用量あたりの各々の髄膜炎糖類抗原の代表的な量は、１μｇと２０μｇとの間である（例えば、約１μｇ、約２．５μｇ、約４μｇ、約５μｇ、または約１０μｇ（糖類として示される））。
【００７７】
各々の糖類は、用量あたり実質的に同じ量で存在し得る。しかし、過剰なＭｅｎＹ糖類が好適であり得る（例えば、１．５：１以上のＭｅｎＹ：ＭｅｎＷ１３５比（ｗ／ｗ））。
【００７８】
結合体が存在する場合、組成物はまた、遊離キャリアタンパク質を含有し得る（５０）。好ましくは、遊離キャリアタンパク質は、組成物の５重量％未満で存在し；より好ましくは、２重量％未満で存在する。
【００７９】
本発明の組成物は、一般に１つ以上のアジュバントを含有する。このようなアジュバントとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８０】
（Ａ．無機質含有組成物）
本発明におけるアジュバントとしての使用のために適切な無機質含有組成物としては、無機塩（例えば、アルミニウム塩およびカルシウム塩）が挙げられる。本発明は、無機塩（例えば、水酸化物（例えば、オキシヒドロキシド）、ホスフェート（例えば、ヒドロキシホスフェート、オルトホスフェート）、スルフェートなど）（例えば、参考文献７５の第８章および第９章を参照のこと）、または異なる無機化合物の混合物を含み、上記化合物は、任意の適切な形態（例えば、ゲル、結晶、非晶質など）をとり、そして、吸着が好ましい。上記無機質含有組成物はまた、無機塩の粒子として処方され得る（７６）。
【００８１】
（Ｂ．油エマルジョン）
本発明におけるアジュバントとしての使用のために適切な油エマルジョン組成物としては、スクアレン−水エマルジョン（例えば、ＭＦ５９）が挙げられる（参考文献７５の第１０章；参考文献７７もまた参照のこと）。（５％スクアレン、０．５％Ｔｗｅｅｎ  ８０および０．５％Ｓｐａｎ  ８５、マイクロフルイダイザー（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）を用いて、サブミクロン粒子に処方される）。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）もまた、使用され得る。
【００８２】
（Ｃ．サポニン処方物［参考文献７５の第２２章］）
サポニン処方物はまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。サポニンは、広範な植物種の樹皮、葉、茎、根および花においてさえ見られる、ステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの不均一な群である。Ｑｕｉｌｌａｉａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ（モリナの木（Ｍｏｌｉｎａ  ｔｒｅｅ））の樹皮由来のサポニンは、アジュバントとして広範に研究されている。サポニンはまた、Ｓｍｉｌａｘ  ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ））、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライドベール（ｂｒｉｄｅｓ  ｖｅｉｌ））およびＳａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（サボンソウ（ｓｏａｐ  ｒｏｏｔ））から市販品として得られ得る。サポニンアジュバント処方物としては、精製された処方物（例えば、ＱＳ２１）および液体処方物（例えば、ＩＳＣＯＭ）が挙げられる。ＱＳ２１は、ＳｔｉｍｕｌｏｎＴＭとして市販される。
【００８３】
サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製されている。これらの技術を用いて、特定の精製フラクションが同定され、これらのフラクションとしては、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃが挙げられる。好ましくは、上記サポニンは、ＱＳ２１である。ＱＳ２１の生成方法は、参考文献７８に開示されている。サポニン処方物はまた、ステロール（例えば、コレステロール）を含有し得る（７９）。
【００８４】
サポニンとコレステロールとの組み合わせが、使用され、免疫刺激複合体（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる独特な粒子を形成し得る（参考文献７５の第２３章）。ＩＳＣＯＭとしてはまた、代表的に、リン脂質（例えば、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリン）が挙げられる。任意の公知のサポニンが、ＩＳＣＯＭにおいて使用され得る。好ましくは、上記ＩＳＣＯＭは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣのうちの１つ以上を含む。ＩＳＣＯＭは、参考文献７９〜８１にさらに記載されている。必要に応じて、上記ＩＳＣＯＭは、さらなる洗剤を含まなくてもよい（８２）。
【００８５】
サポニンベースのアジュバントの開発の概説は、参考文献８３および８４に見られ得る。
【００８６】
（Ｄ．ビロソームおよびウイルス様粒子）
ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）はまた、本発明においてアジュバントとして使用され得る。これらの構造は、一般的に、必要に応じてリン脂質と組み合わされるかまたはリン脂質とともに処方されたウイルス由来の１つ以上のタンパク質を含む。それらは、一般的に、非病原性、非複製性であり、そして、一般的に、あらゆる天然ウイルスゲノムを含まない。上記ウイルスタンパク質は、ウイルス全体から、組換え的に生成されるかまたは単離され得る。ビロソームまたはＶＬＰにおける使用のために適切なこれらのウイルスタンパク質としては、インフルエンザウイルス由来のタンパク質（例えば、ＨＡまたはＮＡ）、Ｂ型肝炎ウイルス由来のタンパク質（例えば、コアタンパク質またはカプシドタンパク質）、Ｅ型肝炎ウイルス由来のタンパク質、麻疹ウイルス由来のタンパク質、シンドビスウイルス由来のタンパク質、ロタウイルス由来のタンパク質、口蹄疫ウイルス由来のタンパク質、レトロウイルス由来のタンパク質、ノーウォークウイルス由来のタンパク質、ヒトパピローマウイルス由来のタンパク質、ＨＩＶ由来のタンパク質、ＲＮＡファージ由来のタンパク質、Ｑβファージ由来のタンパク質（例えば、コートタンパク質）、ＧＡファージ由来のタンパク質、ｆｒファージ由来のタンパク質、ＡＰ２０５ファージ由来のタンパク質およびＴｙ由来のタンパク質（例えば、レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１）が挙げられる。ＶＬＰは、参考文献８５〜９０においてさらに議論されている。ビロソームは、例えば、参考文献９１においてさらに議論されている。
【００８７】
（Ｅ．細菌誘導体または微生物誘導体）
本発明における使用のために適切なアジュバントは、細菌誘導体または微生物誘導体（例えば、腸内細菌リポ多糖類（ＬＰＳ）の無毒性誘導体、リピドＡ誘導体、免疫刺激オリゴヌクレオチドならびにＡＤＰリボシル化トキシンおよびそれらの無毒性誘導体）を含む。
【００８８】
ＬＰＳの無毒性誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）が挙げられる。３ｄＭＰＬは、３つの脱Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡと、４つ、５つまたは６つのアシル化鎖との混合物である。３脱Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの好ましい「小さい粒子」形態は、参考文献９２に開示されている。このような３ｄＭＰＬの「小さい粒子」は、０．２２μｍメンブレンを通って滅菌濾過されるために充分小さい（９２）。他の無毒性ＬＰＳ誘導体としては、モノホスホリルリピドＡ模倣物（例えば、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体（例えば、  ＲＣ−５２９））が挙げられる（９３、９４）。
【００８９】
リピドＡ誘導体としては、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ由来のリピドＡ誘導体（例えば、ＯＭ−１７４）が挙げられる。ＯＭ−１７４は、例えば、参考文献９５および９６に記載されている。
【００９０】
本発明におけるアジュバントとしての使用のために適切な免疫刺激オリゴヌクレオチドとしては、ＣｐＧモチーフ（グアノシンへのホスフェート結合により連結された非メチル化シトシンを含むジヌクレオチド配列）を含むヌクレオチド配列が挙げられる。二本鎖ＲＮＡおよびパリンドローム配列またはポリ（ｄＧ）配列を含むオリゴヌクレオチドもまた、免疫刺激性であることが示されている。
【００９１】
ＣｐＧは、ヌクレオチド改変体／アナログ（例えば、ホスホロチオエート改変体）を含み得、そして、二本鎖または一本鎖であり得る。参考文献９７、９８および９９は、可能なアナログ置換（例えば、グアノシンの２’−デオキシ−７−デアザグアノシンによる置換）を開示している。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献１００〜１０５において、さらに議論されている。
【００９２】
上記ＣｐＧ配列（例えば、ＧＴＣＧＴＴモチーフまたはＴＴＣＧＴＴモチーフ）は、ＴＬＲ９に関与し得る（１０６）。上記ＣｐＧ配列（例えば、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮ）は、Ｔｈ１免疫応答誘導に対して特異的であり得るか、または、上記ＣｐＧ配列（例えば、ＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮ）は、Ｂ細胞応答誘導に対して、より特異的であり得る。ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮは、参考文献１０７〜１０９において議論されている。好ましくは、上記ＣｐＧは、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮである。
【００９３】
好ましくは、上記ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端がレセプター認識のために利用可能であるように構築される。必要に応じて、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列が、それらの３’末端に結合され、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成し得る。例えば、参考文献１０６および１１０〜１１２を参照のこと。
【００９４】
細菌ＡＤＰ−リボシル化トキシンおよびその無毒化誘導体が、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。好ましくは、上記タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来（Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラ由来（「ＣＴ」）または百日咳由来（「ＰＴ」）である。粘膜アジュバントとしての無毒化ＡＤＰ−リボシル化トキシンの使用は、参考文献１１３に記載されており、そして、非経口的アジュバントとしての無毒化ＡＤＰ−リボシル化トキシンの使用は、参考文献１１４に記載されている。上記トキシンまたはトキソイドは、好ましくは、ＡサブユニットおよびＢサブユニットの両方を含むホロトキシン（ｈｏｌｏｔｏｘｉｎ）の形態である。好ましくは、上記Ａサブユニットは、無毒化変異を含み；好ましくは、上記Ｂサブユニットは、変異していない。好ましくは、上記アジュバントは、無毒化ＬＴ変異体（例えば、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２およびＬＴ−Ｇ１９２）である。アジュバントとしてのＡＤＰ−リボシル化トキシンおよびその無毒性誘導体（特に、ＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２）の使用は、参考文献１１５〜１２２において見られ得る。アミノ酸置換についての多くの参考文献は、好ましくは、参考文献１２３に記載のＡＤＰ−リボシル化トキシンのＡサブユニットおよびＢサブユニットの整列に基づき、特に、本明細書中で、その全体が参考として援用される。
【００９５】
（Ｆ．ヒト免疫調節因子）
本発明におけるアジュバントとしての使用のために適切なヒト免疫刺激因子としては、サイトカイン（例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２など）（１２４）、インターフェロン（例えば、インターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子および腫瘍壊死因子）が挙げられる。
【００９６】
（Ｇ．生体接着因子および粘膜接着因子）
生体接着因子および粘膜接着因子はまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。適切な生体接着因子としては、エステル化ヒアルロン酸マイクロスフェア（１２５）または粘膜接着因子（例えば、ポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリサッカリドおよびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体）が挙げられる。キトサンおよびその誘導体はまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る（１２６）。
【００９７】
（Ｈ．微粒子）
微粒子はまた、本発明におけるアジュバントとして使用され得る。生分解性かつ無毒性の材料（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）と、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）とから形成される微粒子（すなわち、直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、より好ましくは、直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、そして、最も好ましくは、直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）が、好ましく、必要に応じて、処理されて、（例えば、ＳＤＳによる）負に荷電した表面または（例えば、カチオン性洗剤（例えば、ＣＴＡＢ）による）正に荷電した表面を有する。
【００９８】
（Ｉ．リポソーム（参考文献７５の第１３章および第１４章））
アジュバントとしての使用のために適切なリポソーム処方物の例は、参考文献１２７〜１２９に記載されている。
【００９９】
（Ｊ．ポリオキシエチレンエーテル処方物およびポリオキシエチレンエステル処方物）
本発明における使用のために適切なアジュバントとしては、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルが挙げられる（１３０）。このような処方物としては、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（１３１）および少なくとも１つのさらなる非イオン性界面活性剤（例えば、オクトキシノール）と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤またはポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性剤（１３２）が、さらに挙げられる。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群より選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ｌａｕｒｅｔｈ  ９）、ポリオキシエチレン−９−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテルおよびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【０１００】
（Ｋ．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ））
ＰＣＰＰ処方物は、例えば、参考文献１３３および１３４において記載されている。
【０１０１】
（Ｌ．ムラミルペプチド）
本発明におけるアジュバントとしての使用のために適切なムラミルペプチドの例としては、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’，２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）が挙げられる。
【０１０２】
（Ｍ．イミダゾキノロン化合物）
本発明におけるアジュバントとしての使用のために適切なイミダゾキノロン化合物の例としては、参考文献１３５および１３６にさらに記載される、Ｉｍｉｑｕａｍｏｄおよびその相同体（例えば、「Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ  ３Ｍ」）が挙げられる。
【０１０３】
本発明はまた、上に定義されるアジュバントの１つ以上の局面の組み合わせを含み得る。例えば、以下のアジュバント組成物が、本発明において使用され得る：（１）サポニンおよび水中油エマルジョン（１３７）；（２）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋無毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）（１３８）：（３）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋無毒性ＬＰＳ誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；（４）サポニン（例えば、ＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（必要に応じて、＋ステロール）（１３９）；（５）３ｄＭＰＬと、例えば、ＱＳ２１および／または水中油エマルジョンとの組み合わせ（１４０）；（６）マイクロフルイダイズされてサブミクロンエマルジョンにされるか、またはボルテックスされてより大きい粒子サイズのエマルジョンを生じるかのいずれかの、１０％  スクアレン、０．４％  Ｔｗｅｅｎ  ８０ＴＭ、５％  プルロニックブロック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ−ｂｌｏｃｋ）ポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ；（７）２％  スクアレン、０．２％  Ｔｗｅｅｎ  ８０、ならびにモノホスホリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群由来の１つ以上の細菌細胞壁構成要素を含むＲｉｂｉＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）（好ましくは、ＭＰＬ＋ＣＷＳ（ＤｅｔｏｘＴＭ））；ならびに（８）１つ以上の無機塩（例えば、アルミニウム塩）＋ＬＰＳの無毒性誘導体（例えば、３ｄＭＰＬ）。
【０１０４】
免疫刺激因子として作用する他の物質は、参考文献７５の第７章に開示されている。
【０１０５】
アルミニウム塩およびリン酸カルシウムは、好ましい非経口アジュバントである。変異毒素は、好ましい経粘膜アジュバントである。
【０１０６】
リン酸アルミニウムアジュバントを含む本発明の組成物が好ましい。水酸化アルミニウムは、好ましくは、存在しない。リン酸アルミニウムアジュバントは、１ｍｌあたり約０．６ｍｇ  Ａｌ３＋で含まれ得る。
【０１０７】
（免疫原の組み合わせ）
本発明の組成物は、本発明の改変された血清群Ｗ１３５髄膜炎菌莢膜糖類および本発明の改変された血清群Ｙ髄膜炎菌莢膜糖類の両方を含有し得る。
【０１０８】
他の抗原はまた、本発明の組成物に含まれ得る。従って、本発明は、本発明の改変された血清群Ｗ１３５髄膜炎菌莢膜糖類および／または本発明の改変された血清群Ｙ髄膜炎菌莢膜糖類を含み、そして以下のリストから選択される１つ以上の抗原を含む組成物を提供する：
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ由来の莢膜糖類抗原
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｃ由来の莢膜糖類抗原
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂ由来のタンパク質抗原（例えば、参考文献１４１〜１５０に記載される）
Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｂの微小水疱（１５１）、「天然のＯＭＶ」（１５２）、ブレブ、または外膜水疱（例えば、参考文献１５３〜１５８など）。これらは、細菌から調製され得、この細菌は、例えば、免疫原性を増加するため（例えば、免疫原を多量に発現する）、毒性を軽減するため、莢膜多糖の合成を阻害するため、ＰｏｒＡ発現をダウンレギュレートするためなどで、遺伝的に操作されている（１５９〜１６２）。これらは、過剰水疱化（ｈｙｐｅｒｂｌｅｂｂｉｎｇ）株から調製され得る（１６３〜１６６）。非病原性のＮｅｉｓｓｅｒｉａ由来の小庖が、含まれ得る（１６７）。ＯＭＶは、界面活性剤を使用することなく調製され得る（１６８、１６９）。これらは、その表面上に非ナイセリアタンパク質を発現し得る（１７０）。これらは、ＬＰＳを除去され得る。これらは、組み換え抗原と混合され得る（１５３、１７１）。種々のクラスＩ外膜タンパク質サブタイプを有する、細菌由来の小庖が、使用され得る（例えば、各々３種のサブタイプを示す２種の異なる遺伝的に操作された小胞集団を使用する６種の異なるサブタイプ（１７２、１７３）、または各々３種のサブタイプを示す３種の異なる遺伝的に操作された小胞集団を使用する９種の異なるサブタイプなど）。有用なサブタイプとしては、以下が挙げられる：Ｐ１．７，１６；Ｐ１．５−１，２−２；Ｐ１．１９，１５−１；Ｐ１．５−２，１０；Ｐ１．１２−１，１３；Ｐ１．７−２，４；Ｐ１．２２，１４；Ｐ１．７−１，１；Ｐ１．１８−１，３，６。
【０１０９】
Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ由来の糖類抗原（例えば、１７４）
Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原（例えば、２０８、２０９、２１０）
Ａ型肝炎由来の抗原（例えば、不活性化されたウイルス）（例えば、１７５、１７６）
Ｂ型肝炎由来の抗原（例えば、表面抗原および／または中心抗原（ｃｏｒｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）（例えば、１７６、１７７）。
【０１１０】
Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の抗原（例えば、百日咳ホロトキシン（ＰＴ）、およびＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の糸状赤血球凝集素（ＦＨＡ））であって、必要に応じてペルタクチンおよび／または凝集体２および３と組み合わされる（例えば、参考文献１７８および１７９）。細胞百日咳抗原が、使用され得る。
【０１１１】
ジフテリア抗原（例えば、ジフテリアトキソイド（例えば、参考文献１８０の第３章）（例えば、ＣＲＭ１９７変異体）（例えば１８１）。
【０１１２】
破傷風抗原（例えば、破傷風トキソイド）（例えば、参考文献１８０の第４章）。
【０１１３】
ポリオ抗原（例えば、１８２、１８３）（例えば、ＩＰＶ）。
【０１１４】
毒性タンパク質抗原は、必要な場合解毒され得る（例えば、化学的手段および／または遺伝的手段による百日咳毒素の解毒）（１７９）。
【０１１５】
ジフテリア抗原が、薬学的組成物中に含まれる場合、破傷風抗原および百日咳抗原もまた含むことが好ましい。同様に、破傷風抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および百日咳抗原を含むことが好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原および破傷風抗原を含むことが好ましい。
【０１１６】
薬学的組成物中の抗原は、代表的には、それぞれ少なくとも１μｇ／ｍｌの濃度で存在する。一般に、任意の所与の抗原の濃度は、その抗原に対する免疫応答を誘導するのに十分である。
【０１１７】
抗原は、好ましくは、アルミニウム塩アジュバントに吸着される。
【０１１８】
本発明の薬学的組成物中のタンパク質抗原の使用の代替として、抗原をコードする核酸が使用され得る（例えば、参考文献１８４〜１９２）。従って、本発明の薬学的組成物のタンパク質成分は、タンパク質をコードする核酸（好ましくは、例えば、プラスミド形態のＤＮＡ）により、置き換えられ得る。同様に、本発明の組成物は、糖類抗原を模倣するタンパク質（例えば、ミモトープ（ｍｉｍｏｔｏｐｅ）（１９３）または抗イディオタイプ抗体）を含有する。これらは、個体の糖類成分を置換し得るか、またはそれらを補充し得る。例として、ワクチンは、糖類自体の代わりに、ＭｅｎＧ（１９４）またはＭｅｎＡ（１９５）の莢膜多糖のペプチド模倣物を含有し得る。
【０１１９】
（合わされた髄膜炎菌性ワクチン）
本発明の好ましい組成物は、本発明の改変された血清群Ｗ１３５髄膜炎菌莢膜糖類、本発明の改変された血清群Ｙ髄膜炎菌莢膜糖類、および血清群Ｃ莢膜糖類を含有し、ここで、莢膜糖類は、キャリアタンパク質に結合される。この組成物はまた、好ましくは、キャリアタンパク質に結合した、血清群Ａの莢膜糖類を含有し得る。これらの組成物中の糖類は、好ましくはオリゴ糖である。オリゴ糖結合体は、参考文献１４に開示されるように調製され得る。
【０１２０】
血清群Ａ糖類は、Ｏ−アセチル化されるか、または脱Ｏ−アセチル化され得る。血清群Ｃ糖類は、Ｏ−アセチル化されるか、または脱Ｏ−アセチル化され得る。
【０１２１】
好ましいＭｅｎＣ結合体は、１０μｇの糖類に基づき、１２．５〜２５μｇのＣＲＭ１９７キャリアを含む。好ましいＭｅｎＡ結合体は、１０μｇの糖類に基づき、１２．５〜３３μｇのＣＲＭ１９７キャリアを含む。
【０１２２】
ＭｅｎＣおよびＭｅｎＡ結合体についての代表的な用量は、ＭｅｎＷ１３５およびＭｅｎＹと等しく、すなわち、１μｇと２０μｇの間（例えば、約１μｇ、約２．５μｇ、約４μｇ、約５μｇ、または約１０μｇ）である。
【０１２３】
血清群Ｃ：Ｗ１３５：Ｙ由来の糖類についての好ましい比（ｗ／ｗ）は、１：１：１；１：１：２；１：１：１；２：１：１；４：２：１；２：１：２；４：１：２；２：２：１；および２：１：１である。血清群Ａ：Ｃ：Ｗ１３５：Ｙ由来の糖類についての好ましい比は、１：１：１：１；１：１：１：２；２：１：１：１；４：２：１：１；８：４：２：１；４：２：１：２；８：４：１：２；４：２：２：１；２：２：１：１；４：４：２：１；２：２：１：２；４：４：１：２；および２：２：２：１である。単回用量あたり各々の糖類の実質的に等しい量を使用することが、好ましい。
【０１２４】
組成物が、血清群Ａの糖類を含む場合、この組成物は、１つ以上の血清群Ｃ、Ｗ１３５、および／またはＹ糖類を含む水性の組成物を使用して、凍結乾燥形態から血清群Ａ糖類を再構成することにより調製され得る。
【０１２５】
組成物が、血清群Ａの糖類を含む場合、この組成物は、改変された糖類であり得、この糖類は、天然の糖類上の１つ以上のヒドロキシル基が、保護基により置換されている（１９６）。この改変は、加水分解への耐性を改善する。全てのまたは実質的に全ての単糖ユニットが保護基置換を有し得ることが好ましい。
【０１２６】
血清群Ｙ、Ｗ１３５およびＣ（ならびに、必要に応じてＡ）由来の糖類抗原を含むことと同様に、本発明の組成物は、血清群Ｂ由来の１つ以上の抗原を含み得る。血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹとは別に、ＭｅｎＢの莢膜糖類は、その自己抗原の類似性により、ヒトの免疫としての使用に適切でない。それゆえに、糖類抗原が、ＭｅｎＢについて使用される場合、改変された糖類を使用することが必要とされ、例えば、糖類のシアリン酸残基中のＮ−アセチル基は、Ｎ−アシル基で置換される。適切なＮ−アシル基は、Ｃ１〜Ｃ８のアシル基（例えば、Ｎ−プロピオニル）である（１９７）。しかし、糖類抗原を使用するよりも、ポリペプチド抗原を使用することが、好ましい。
【０１２７】
従って、上記組成物は、ＭｅｎＢ感染を防ぐ免疫応答を誘導する１つ以上のポリペプチド抗原を含み得る。より一般的には、上記組成物は、被験体への投与後に、その被験体において抗体応答を誘導し得る。この抗体応答は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ血清群Ｂの超毒性系統Ａ４、超毒性系統ＥＴ−５および系統３のうちの２種以上（例えば、２種または３種）に対して殺菌性である。
【０１２８】
血清群ＢのＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｌｉｓのゲノム配列は、公開されており（１４８）、および適切な抗原は、コードポリペプチドから選択され得る（１５０）。抗原の例は、参考文献１４１〜１５０に開示されている。好ましい組成物は、１つ以上の以下の５つの抗原を含む（１９８）：（１）好ましくは、オリゴマー形態（例えば、三量体形態）の「ＮａｄＡ」タンパク質；（２）「７４１」タンパク質；（３）「９３６」タンパク質；（４）「９５３」タンパク質；および（５）「２８７」タンパク質。
【０１２９】
これらの５つのタンパク質についての初期配列は、以下のとおりに参考文献１４３に見られる。
【０１３０】
【化３】
0005590760.tif 000003
本発明の組成物中で使用される場合、血清群Ｂタンパク質は、これらの初期配列の１つのアミノ酸配列を含有し得るか、または以下のアミノ酸配列を含有し得る：（ａ）初期配列に対して５０％以上（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上）の同一性を有する配列；および／または（ｂ）初期配列の少なくともｎ個の連続アミノ酸のフラグメントを含み、ここでｎは、７以上である配列（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）。（ｂ）についての好ましいフラグメントは、初期配列のＣ末端および／またはＮ末端から１個以上のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を欠く。他の好ましいフラグメントは、この配列からのエピトープを含む。
【０１３１】
これらの５つのＭｅｎＢ抗原は、５種類の別個のタンパク質として組成物中に存在し得るが、少なくとも２種類の抗原は、一本のポリペプチド鎖（「ハイブリッド」タンパク質（参考文献１４５〜１４７））として発現される（すなわち、５種類の抗原が５種類未満のポリペプチドを形成する）ことが好ましい。ハイブリッドタンパク質は、２つの主要な利点を提供する：第１に、単独では不安定に発現され得るか、あまり発現し得ないタンパク質は、その問題を克服する適切なハイブリッドパートナーを添加することにより、補助され得る；第２に、２つの別個の有用なタンパク質を産生するために、使用されることが必要とされるのは、たった１回の発現工程および精製工程であることから、商業的な製造工程が、単純化される。本発明の組成物に含まれるハイブリッドタンパク質は、５種類の基本的な抗原の２つ以上（すなわち、２、３、４または５）を含有し得る。５種類の抗原の２つからなるハイブリッドは、例えば、以下が好ましい：ＮａｄＡおよび７４１；ＮａｄＡおよび９３６；ＮａｄＡおよび９５３；ＮａｄＡおよび２８７；７４１および９３６；７４１および９５３；７４１および２８７；９３６および９５３；９３６および２８７；９５３および２８７。
【０１３２】
本発明の組成物中に合わせて含む３つの好ましいＭｅｎＢ抗原は、以下：
Ｃ−末端が欠失し、リーダーペプチドがプロセシングされた２９９６株由来のＮａｄＡ
【０１３３】
【化４】
0005590760.tif 000004
２８７−９５３ハイブリッド
【０１３４】
【化５】
0005590760.tif 000005
９３６−７４１ハイブリッド
【０１３５】
【化６】
0005590760.tif 000006
上記のとおりに、ＭｅｎＢ抗原を含む本発明の組成物は、好ましくは血清殺菌性抗体応答を誘導し、この応答は、２つまたは３つの超毒性系統Ａ４、超毒性系統ＥＴ−５、および系統３に対して有効である。それらは、超毒性系統のサブグループＩ、サブグループＩＩＩ、サブグループＩＶ−１またはＥＴ−３７複合体の１種以上に対する殺菌性抗体応答および他の系統（例えば、超侵襲性系統）に対する殺菌性抗体応答をさらに誘導し得る。これらの抗体応答は、マウスにおいて都合よく測定され、そしてワクチン効力の標準的な指標である（例えば、参考文献１５０の巻末の注１４を参照のこと）。上記組成物は、これらの超毒性系統内の各々および全てのＭｅｎＢ株に対して殺菌性抗体応答を誘導する必要はない；むしろ、特定の超毒素系統内の血清群Ｂ髄膜炎菌の４種のさらなる株の任意の所与の群に対して、上記組成物により誘導される抗体は、上記群のうちの少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％以上）に対して殺菌性である。好ましい株群は、以下の国のうちの少なくとも４つにおいて単離された株を含む：ＧＢ、ＡＵ、ＣＡ、ＮＯ、ＩＴ、ＵＳ、ＮＺ、ＮＬ、ＢＲおよびＣＵ。上記血清は、好ましくは、少なくとも１０２４（例えば、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８以上、好ましくは、少なくとも２１４）の殺菌性力価を有する。すなわち、上記血清は、参考文献１５０に記載されるように、１／１０２４に希釈される場合、特定の株の試験細菌の少なくとも５０％を殺傷可能である。好ましい組成物は、血清群Ｂ髄膜炎菌の以下の株に対する殺菌応答を誘導し得る：（ｉ）クラスターＡ４由来、９６１−５９４５株（Ｂ：２ｂ：Ｐ１．２１，１６）および／またはＧ２１３６株（Ｂ：−）；（ｉｉ）ＥＴ−５複合体由来、ＭＣ５８株（Ｂ：１５：Ｐ１．７，１６ｂ）および／または４４／７６株（Ｂ：１５：Ｐ１．７，１６）；（ｉｉｉ）系統３由来、３９４／９８株（Ｂ：４：Ｐ１．４）および／またはＢＺ１９８株（Ｂ：ＮＴ：−）。より好ましい組成物は、９６１−５９４５株、４４／７６株および３９４／９８株に対する殺菌応答を誘導し得る。９６１−５９４５株およびＧ２１３６株は、ともにＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ＭＬＳＴ基準株である（参考文献１９９におけるｉｄｓ  ６３８および１００２）。ＭＣ５８株は、広範に利用可能であり（例えば、ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−３３５）、そして参考文献１４８において配列決定された株であった。４４／７６株は、広範に使用され、そして特徴付けられており（例えば、参考文献２００）、そしてＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ＭＬＳＴ基準株の１つである（参考文献１９９におけるｉｄ  ２３７；参考文献２０１における表２の３２行目）。３９４／９８株は、元々、ニュージーランドにおいて１９９８年に単離され、そしてこの株を用いたいくつかの研究が公開されている（例えば、参考文献２０２および２０３）。ＢＺ１９８株は、別のＭＬＳＴ基準株である（参考文献１９９におけるｉｄ  ４０９；参考文献２０１における表２の４１行目）。上記組成物は、ＥＴ−３７複合体由来の血清群Ｗ１３５のＬＮＰ１７５９２株（Ｗ１３５：２ａ：Ｐ１．５，２）に対する殺菌性応答を、さらに誘導し得る。これは、フランスにおいて２０００年に単離されたＨａｊｉ株である。
【０１３６】
本発明の組成物中に含まれ得る他のＭｅｎＢポリペプチドとしては、以下のアミノ酸、またはポリペプチド配列の１つを含むポリペプチドが挙げられる：参考文献１４１からの配列番号６５０；参考文献１４１からの配列番号８７８；参考文献１４１からの配列番号８８４；参考文献１４２からの配列番号４；参考文献１４３からの配列番号５９８；参考文献１４３からの配列番号８１８；参考文献１４３からの配列番号８６４；参考文献１４３からの配列番号８６６；参考文献１４３からの配列番号１１９６；参考文献１４３からの配列番号１２７２；参考文献１４３からの配列番号１２７４；参考文献１４３からの配列番号１６４０；参考文献１４３からの配列番号１７８８；参考文献１４３からの配列番号２２８８；参考文献１４３からの配列番号２４６６；参考文献１４３からの配列番号２５５４；参考文献１４３からの配列番号２５７６；参考文献１４３からの配列番号２６０６；参考文献１４３からの配列番号２６０８；参考文献１４３からの配列番号２６１６；参考文献１４３からの配列番号２６６８；参考文献１４３からの配列番号２７８０；参考文献１４３からの配列番号２９３２；参考文献１４３からの配列番号２９５８；参考文献１４３からの配列番号２９７０；参考文献１４３からの配列番号２９８８、あるいは（ａ）上記配列に対して５０％以上（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％以上）の同一性を有する配列；および／または（ｂ）上記配列の少なくともｎ個の連続アミノ酸のフラグメントを含み得、ここでｎは、７以上である（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０以上）のアミノ酸配列を含有する、ポリペプチド。（ｂ）についての好ましいフラグメントは、関係する配列由来のエピトープを含有する。これらのポリペプチドの１つを超えたもの（例えば、２、３、４、５、６）が含まれ得る。
【０１３７】
（Ｈｉｂ糖類との組み合わせ）
この組成物が、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ型抗原を含む場合、代表的にはＨｉｂ莢膜糖類抗原である。Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ｂ由来の糖類抗原は、周知である。
【０１３８】
有利には、上記Ｈｉｂ糖類は、特に子供においてその免疫原性を亢進するために、キャリアタンパク質に共有結合される。一般に、多糖の結合体および詳細にはＨｉｂ莢膜多糖の調製は、十分に考証されている。本発明は、任意の適切なＨｉｂ結合体を使用し得る。適切なキャリアタンパク質は、上に記載され、Ｈｉｂ糖類についての好ましいキャリアは、ＣＲＭ１９７（「ＨｂＯＣ」）、破傷風トキソイド（「ＰＲＰ−Ｔ」）、およびＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの外膜複合体（「ＰＲＰ−ＯＭＰ」）である。
【０１３９】
上記結合体の糖類部分は、多糖（例えば、全長ポリリボシルリビトールホスフェート（ＰＲＰ）、であり得るが、これは、オリゴ糖（例えば、約１〜約５ｋＤａのＭＷ）を形成するために多糖を加水分解するのに好ましい。
【０１４０】
好ましい結合体は、ＣＲＭ１９７にアジピン酸リンカーを介して共有結合したＨｉｂオリゴ糖を含有する（１６，２０４）。破傷風トキソイドもまた、好ましいキャリアである。
【０１４１】
Ｈｉｂ抗原の投与は、好ましくは、０．１５μｇ／ｍｌ以上（好ましくは、１μｇ／以上）の抗ＰＲＰ抗体の濃度をもたらす。
【０１４２】
組成物が、Ｈｉｂ糖類抗原を含有する場合、水酸化アルミニウムアジュバントを含有しないことが好ましい。この組成物が、リン酸アルミニウムアジュバントを含有する場合、Ｈｉｂ抗原は、アジュバントに吸着されても（２０５）、されなくてもよい（２０６）。吸着の防止は、抗原／アジュバントの混合の間の正確なｐＨ、適切なゼロ電荷の点を有するアジュバント、および組成物中の種々の異なる抗原を混合する適切な順序（２０７）を選択することにより、達成され得る。
【０１４３】
本発明の組成物は、１種類を超えるＨｉｂ抗原を含み得る。Ｈｉｂ抗原は、例えば、本発明の髄膜菌炎の組成物を再形成するために凍結乾燥され得る。
【０１４４】
（肺炎球菌抗原との組み合わせ）
この組成物が、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原を含有する場合、代表的には、好ましくはキャリアタンパク質に結合された莢膜糖類抗原である（例えば、参考文献２０８〜２１０）。１種を超えるＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの血清群由来の糖類を含有することが好ましい。例えば、２３種類の異なる血清群由来の多糖の混合物は、広範に使用されており、５種と１１種との間の異なる血清群由来の多糖を有する結合体ワクチンも同様である（２１１）。例えば、ＰｒｅｖＮａｒＴＭ（２１２）は、７種の血清群（４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆ）由来の抗原を含有し、各々の糖類は、還元アミノ化により独立してＣＲＭ１９７に結合され、０．５ｍｌ用量あたり２μｇの各々の糖類を添加しており（血清群６Ｂは４μｇ）、結合体をリン酸アルミニウムアジュバントに吸着されている。本発明の組成物は、好ましくは、少なくとも血清群６Ｂ、１４、１９Ｆ、および２３Ｆを含有する。結合体は、リン酸アルミニウム上に吸着され得る。
【０１４５】
肺炎球菌由来の糖類抗原の使用の代替として、上記組成物は、１つ以上のポリペプチド抗原を含有し得る。いくつかの肺炎球菌株についてのゲノム配列は入手可能であり（２１３、２１４）、そして逆ワクチン学に供されて（２１５−２１８）、適切なポリペプチド抗原を提供し得る（２１９、２２０）。例えば、上記組成物は、参考文献２２１に規定されるように１種以上の以下の抗原を含有し得る：ＰｈｔＡ、ＰｈｔＤ、ＰｈｔＢ、ＰｈｔＥ、ＳｐｓＡ、ＬｙｔＢ、ＬｙｔＣ、ＬｙｔＡ、Ｓｐ１２５、Ｓｐ１０１、Ｓｐ１２８、Ｓｐｌ３０およびＳｐｌ３０。上記組成物は、これらの抗原の１種以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４）を含有し得る。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、上記組成物は、肺炎球菌由来の糖類およびポリペプチド抗原の両方を含有し得る。これらは、単一の混合物として使用され得るか、または肺炎球菌糖類抗原は、肺炎球菌タンパク質に結合され得る。このような実施形態についての適切なキャリアタンパク質は、前述の段落に列挙された抗原を含有する（２２１）。
【０１４７】
肺炎球菌抗原は、例えば、Ｈｉｂ抗原とともに凍結乾燥され得る。
【０１４８】
（処置方法）
本発明はまた、哺乳動物における抗体応答を惹起する方法を提供し、この方法は、本発明の薬学的組成物を哺乳動物に投与する工程を包含する。
【０１４９】
本発明は、哺乳動物において免疫応答を惹起する方法を提供し、この方法は、有効量の本発明の組成物を投与する工程を包含する。上記免疫応答は、好ましくは、保護的であり、好ましくは抗体に関する。上記方法は、追加応答（ｂｏｏｓｔｅｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を惹起し得る。
【０１５０】
哺乳動物は、好ましくはヒトである。ワクチンが、予防用途である場合、ヒトは、好ましくは子供（例えば、幼児または乳児）、またはティーンエージャーである；ワクチンが、治療用途の場合、ヒトは、好ましくは成人である。子供のために企図されるワクチンはまた、例えば、安全性、投薬量、免疫原性などを評価するために成人に投与され得る。
【０１５１】
本発明はまた、医薬としての使用のための本発明の組成物を提供する。医薬は、好ましくは哺乳動物における免疫応答を惹起することができ（すなわち、免疫原性組成物である）、そしてより好ましくはワクチンである。
【０１５２】
本発明はまた、哺乳動物における免疫応答を惹起するための医薬の製造において、本発明の改変された血清群Ｗ１３５の髄膜炎菌莢膜糖類、および／または本発明の改変された血清群Ｙの髄膜炎菌莢膜糖類の使用を提供する。上記糖類は、好ましくは結合されている。上記医薬は、好ましくはワクチンである。
【０１５３】
これらの使用および方法は、好ましくはＮｅｉｓｓｅｒｉａにより引き起こされる疾患（例えば、髄膜炎、敗血症、菌血、淋病など）の予防および／または処置のためである。細菌性および／または髄膜炎菌性髄膜炎の予防および／または処置が、好ましい。
【０１５４】
治療処置の効力を確認する１つの手段は、本発明の組成物の投与後にナイセリアの感染をモニタリングする工程を包含する。予防処置の効力を確認する１つの手段は、上記組成物の投与後に５種類のベーシックな抗原に対する免疫応答をモニタリングする工程を包含する。本発明の組成物の免疫原性は、被験体を試験するためにこの組成物を投与し、（１２月齢〜１６月齢の子供、または動物モデル（２２２））、次いで血清の殺菌性活性（ＳＢＡ）および抗莢膜ＩｇＧの総結合力および高結合力のＥＬＩＳＡ力価（ＧＭＴ）を含む標準的なパラメーターを決定することによって決定され得る。これらの免疫応答は一般に、組成物の投与後およそ４週間で決定され、組成物の投与前に決定された値と比較される。ＳＢＡは、補体により媒介される細菌殺傷を測定し、そしてヒトまたはウサギ乳仔の補体を用いてアッセイされ得る。ＷＨＯ基準は、ワクチンが、レシピエントの９０％より多くにおいて、少なくとも４倍のＳＢＡ上昇を誘導することを要求している。少なくとも４倍または８倍のＳＢＡ増加が好ましい。一よりも多い用量の組成物が、投与される場合、一回よりも多い投与後の判定がなされ得る。
【０１５５】
本発明の好ましい組成物は、患者において、ヒト被験体の受容可能なパーセンテージに対して各々の抗原成分についての血清防御基準より優れた抗体力価を与え得る。宿主がその力価より上ではその抗原に対してセロコンバージョンされると考えられる関連する抗体力価を有する抗原は、周知であり、そして、このような力価は、ＷＨＯのような機関により公開されている。好ましくは、被験体の統計学的に有意なサンプルのうちの８０％より多く、より好ましくは、９０％より多く、さらにより好ましくは、９３％より多く、そして最も好ましくは、９６〜１００％が、セロコンバージョンされる。
【０１５６】
本発明の組成物は、一般に患者に直接投与される。直接の送達は、経皮注射（例えば、皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内、または組織の間質空間（ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｓｐａｃｅ））、あるいは直腸、経口、膣内、局所、経皮内、鼻内、目、耳、肺、または他の粘膜投与により、達成され得る。太股または上腕への筋肉内投与は、好ましい。注射は、針（例えば、皮下針）を介するものであり得るが、針を使用しない注射が、代替的に使用され得る。代表的な筋肉内用量は、０．５ｍｌである。
【０１５７】
本発明は、全身免疫および／または粘膜免疫を誘発するのに使用され得る。
【０１５８】
投薬処置は、単一用量スケジュールでも複数用量スケジュールでもよい。複数用量は、初回免疫スケジュールおよび／または追加免疫スケジュールにおいて使用され得る。初回用量スケジュールの後、追加用量スケジュールが行われ得る。初回用量の間（例えば、４〜１６週の間）および初回免疫（ｐｒｉｍｉｎｇ）と追加免疫（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）との間の適切なタイミングは、慣用的に決定され得る。
【０１５９】
ナイセリア感染症は、身体の種々の領域に影響を及ぼすので、本発明の組成物は、種々の形態で調製され得る。例えば、本発明の組成物は、注射可能物（溶液または懸濁液のどちらか）として調製され得る。注射前に、液状ビヒクル中に溶解または懸濁するのに適切な固体形態もまた、調製され得る（例えば、凍結乾燥組成物）。上記組成物は、局所投与（例えば、軟膏、クリームまたは散剤）のために調製され得る。上記組成物は、経口投与（例えば、錠剤、またはカプセル、あるいは（必要に応じて味付けされた）シロップ）のために調製され得る。上記組成物は、微小粉末またはスプレーを使用する、肺投与（例えば、吸入器）のために調製され得る。上記組成物は、座薬またはペッサリーとして調製され得る。上記組成物は、鼻、耳、または目への投与（例えば、スプレー、小滴、ゲルまたは散剤）のために調製され得る（例えば、参考文献２２３および２２４）。肺炎球菌糖類（２２５、２２６）、肺炎球菌菌ポリペプチド（２２７）、Ｈｉｂ糖類（２２８）、ＭｅｎＧ糖類（２２９）、ならびにＨｉｂおよびＭｅｎＣ糖類結合体の混合物（２３０）の鼻投与を用いた結果が、報告されている。
【０１６０】
（概論）
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「なる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を意味する（例えば、Ｘを「含む」組成物は、Ｘのみからなり得るか、またはさらなる何かを含み得る（例えば、Ｘ＋Ｙ））。
【０１６１】
単語「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」は、「完全に（ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ）」を除外しない（例えば、「実質的に」Ｙを含まない組成物は、完全にＹを含まなくてよい）。必要な場合、単語「実質的に」は、本発明の定義から除外され得る。
【０１６２】
数値ｘに関する用語「約（ａｂｏｕｔ）」とは、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【０１６３】
「シアリン酸残基のｘ％以下は、７位においてＯ−アセチル化されている」のような表現は、組成物中の各々の糖類分子が、７位において必ず同程度のアセチル化を有するべきであるということを意味しない。また、組成物中の各々の糖類分子が、その７位において必ずｘ％以下のＯ−アセチル化を有するということも意味しない。むしろ、いくつかは、ｘ％より多くを有し、他はｘ％未満を有するが、糖類の全ての集合における全てのシアリン酸残基の全ての７位にわたるアセチル化の平均の程度は、ｘ％以下である。「シアリン酸残基のｙ％以上が、９位においてＯ−アセチル化される」などのような表現に対しても、同じものを適用する。
【０１６４】
糖環は、開いた形態か、または閉じた形態であり得、閉じた形態が、本明細書中の構造式で示されるが、開いた形態もまた、本発明に含まれることが理解される。
【０１６５】
シアリン酸はまた、ノイラミン酸としても公知である。
【０１６６】
（本発明を実施するための形態）
（Ａ．髄膜炎菌性多糖の産生および精製）
参考文献１４に記載されるとおりに、莢膜多糖を、ＭｅｎＷ１３５およびＭｅｎＹから精製した。
【０１６７】
（Ｂ．改変された血清群Ｗ１３５Ｇ多糖結合体および血清群Ｙ多糖結合体の調製）
精製した多糖を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液中ｐＨ４．７で、３時間８０℃にて加水分解した。これにより、シアリン酸（ＳＡ）と還元末端ＳＡとの間の比により決定されるように、約１５〜２０の平均ＤＰのオリゴ糖を得た。
【０１６８】
この加水分解物３０ｋＤａのカットオフ膜を通して限外濾過した（５ｍＭ酢酸緩衝液／１５〜３０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．５の１２〜２０ダイアフィルトレーション容量）。その残留物（高ＭＷ種を含有する）を、除去し、その透過物を、５ｍＭ酢酸緩衝液／１５ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．５で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラムに充填した。次いで、そのカラムを、１０ＣＶ平衡化緩衝液で洗浄し、３〜４以下のＤＰを有するオリゴ糖を取り除き、そして３ＣＶ  ５ｍＭ酢酸緩衝液／５００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ６．５で溶出させた。
【０１６９】
塩化アンモニウムまたは酢酸アンモニウムを、同じ大きさの（ｓｉｚｅｄ）オリゴ糖溶液に添加して、３００ｇ／Ｌの最終濃度にし、次いで、ナトリウムシアノ−ボロヒドリドを添加して、４９ｇ／Ｌまたは７３ｇ／Ｌの最終濃度にした。この混合物を、５０℃で３日間インキュベートし、アミノ−オリゴ糖を生成し、次いで、この糖を、０．５Ｍ  ＮａＣｌの１３のダイアフィルトレーション容量、次に２０ｍＭ  ＮａＣｌの７のダイアフィルトレーション容量を使用して１ｋＤａまたは３ｋＤａのカットオフ膜を使用する接線限外濾過により、精製した。次いで、精製したオリゴ糖を、回転エバポレーターで遠心して水を除去した。
【０１７０】
乾燥したアミノオリゴ糖を、希釈用の水に、４０ｍＭのアミノ基濃度で可溶化し、次いで、９容量のＤＭＳＯを添加し、次にトリエチルアミンを２００ｍＭの最終濃度で添加した。得られた溶液に、アジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステルを、４８０ｍＭの最終濃度で添加した。この反応物を、室温で２時間攪拌しつづけ、次いで、活性化オリゴ糖を、アセトンで沈殿させた（最終濃度８０％  ｖ／ｖ）。この沈殿物を、遠心により回収し、アセトンで数回洗浄して未反応のアジピン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドジエステルおよび副生成物を取り除いた。最終的に、活性化したオリゴ糖を、真空化で乾燥した。オリゴ糖構造に導入された活性エステル基の量を、参考文献２３１に記載されるとおりに、比色法により決定した。
【０１７１】
乾燥した活性化オリゴ糖を、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）中の４５ｍｇ／ｍｌ  ＣＲＭ１９７溶液に、１２：１の活性エステル／タンパク質（モル／モル）比で添加した。この反応物を、室温で一晩攪拌し続けた。この期間の後に、この結合体を、３０ｋＤａ膜を用いたダイアフィルトレーション（１０ｍＭリン酸緩衝液  ｐＨ７．２の５０のダイアフィルとレーション容量）により精製した。精製した結合体を、滅菌濾過し、そしてワクチン処方まで−２０℃または−６０℃にて貯蔵した。
【０１７２】
（Ｃ．結合の間の多糖のＯ−アセチル化状態）
ＭｅｎＷ１３５およびＭｅｎＹ由来の改変された糖類の集団においてシアリン酸残基のＣ７位およびＣ９位のＯ−アセチル化状態を、ＮＭＲ分析により測定した。
【０１７３】
結合プロセス（天然の多糖、加水分解後、アミノ化する前、活性化後、および結合後）中の多糖およびオリゴ糖の中間体を、１ＤプロトンＮＭＲ実験および２ＤプロトンＮＭＲ実験を使用して特徴付けた。凍結乾燥したオリゴ糖を０．７５ｍＬの９９．９％の重水素を含む２Ｈ２Ｏ（ＡｌｄｒｉｃｈＴＭ）に溶解し、１０〜１５ｍＭの濃縮溶液を得ることで、１Ｈ  ＮＭＲサンプルを調製した。全ての実験において、５ｍｍ  Ｗｉｌｍａｄ  ＮＭＲチューブを使用した。
【０１７４】
ＢＧＵユニットを備えたＢｒｕｋｅｒ  ＮＭＲ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＤＲＸ  ６００ＭＨｚで、標準的なＢｒｕｋｅｒ  ｐｕｌｓｅ  ｐｒｏｇｒａｍを使用して、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを記録した。ｚ軸グラジエントでセルフシールド化（ｓｅｌｆ−ｓｈｉｅｌｄ）された５ｍｍ  ＴＢＩトリプル共鳴プローブ（ｔｒｉｐｌｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｐｒｏｂｅ）を、使用した。データの加工のために、Ｂｒｕｋｅｒ  ＸＷＩＮＮＭＲ  ３．０ソフトウェアを使用した。
【０１７５】
プロトン標準スペクトルの獲得条件は、４回のスキャンで６０００Ｈｚのスペクトルウインドウ上で３２ｋのデータ点を回収することである。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを、０．１Ｈｚ線広域化（ｌｉｎｅ  ｂｒｏａｒｄｉｎｇ）関数を適用後、フーリエ解析を行い、４．７２ｐｐｍにおいて１個の重水素を含む水（ＨＤＯ）に対して参照した。
【０１７６】
共鳴の割り当て、そして分子構造の決定を、文献のデータに基づいておこなった（２３２、４）。
【０１７７】
ピークの割り当てを示すために、加水分解したＭｅｎＷ１３５および加水分解したＭｅｎＹの注釈付きのＮＭＲデータを、それぞれ図１および図２に示す。
【０１７８】
以下の表は、結合体調製の間にＯ−アセチル化されたことが見出されたＭｅｎＷ１３５由来の糖類の集合において、全てのシアリン酸（Ｎ−アセチル−ノイラミン酸）のＣ７位およびＣ９位の比率を提供する。
【０１７９】
【化７】
0005590760.tif 000007
従って、結合体の調製の間、７位におけるシアリン酸のＯ−アセチル化の全体のパーセンテージは、約３０％から約６％に低下した。同時に、９位におけるＯ−アセチル化のパーセンテージは、約２５％から約４３％に増加した（図３）。最終工程において９位に見られる劇的な変化は、結合が、９位においてＯ−アセチル化された結合糖類を優先的に選択することを示す。
【０１８０】
同様に、結合プロセスの各々の工程後に、ＭｅｎＹ由来の改変された糖類の集団において、シアリン酸残基のＯ−アセチル化状態を、以下の表に提供する。
【０１８１】
【化８】
0005590760.tif 000008
従って、７位におけるシアリン酸のＯ−アセチル化のパーセンテージは、本発明の結合体の調製の間に約１０％から約２％に低下し、その後、結合反応の間、最終的に約６％に増加した。同時に、９位におけるＯ−アセチル化のパーセンテージは、約２８％から約２１％に低下し、その後、結合反応の間、最終的に約４５％に増加した（図４）。最終工程において９位において見られる劇的な変化は、結合は、９位においてＯ−アセチル化される結合糖類を優先的に選択することを示す。
【０１８２】
（Ｄ．結合体の免疫原性）
凍結した大量の結合体を融解した。各々を、攪拌しながら希釈して、２０μｇ  糖類／ｍｌ、５ｍＭリン酸、９ｍｇ／ｍｌ  ＮａＣｌ、リン酸アルミニウム（０．６ｍｇ／ｍｌのＡl３＋濃度を提供する）、ｐＨ７．２の最終濃度にした。次いで、この混合物を２〜８℃で一晩攪拌せずに静地し、マウスの免疫化のために、生理食塩水を用いて４μｇ  糖類／ｍｌにさらに希釈した。
【０１８３】
ワクチンの第２のセットを同じ手段で両方の血清群について調製したが、リン酸アルミニウムの添加を、等量の水で置き換えた。
【０１８４】
各々の免疫化群について１０匹のＢａｌｂ／ｃマウスに、０週および４週において０．５ｍｌのワクチンを２回ｓ．ｃ．注射した。免疫化前（２回目の投薬前、および２回目の投薬後２週間）に、瀉血した。（ａ）アラムを有するかまたは有さない、結合体ワクチン、（ｂ）生理食塩水コントロール、（ｃ）結合していない多糖コントロールを使用して、免疫化を実施した。
【０１８５】
本質的に参考文献２３３に記載されるとおりに、特定の抗多糖ＩｇＧ抗体を、免疫化動物の血清において定量した。各々個別のマウスの血清を、滴定曲線により二連で分析し、各々の免疫化群についてＧＭＴを計算した。「Ｔｉｔｅｒｕｎ］ソフトウェア（ＦＤＡ）を使用して、Ｍｏｕｓｅ  Ｅｌｉｓａ  Ｕｎｉｔｓ（ＭＥＴ）における力価を計算した。抗多糖の力価の特異性を、関連する多糖を競合剤として使用する競合ＥＬＩＳＡ（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ＥＬＩＳＡ）により決定した。
【０１８６】
図５に示すように、ＭｅｎＷ１３５結合体は、動物において、高い抗体力価を誘導した。予測どおりに、結合しない多糖は、免疫原性ではなかった。アジュバントとしてのリン酸アルミニウムとの結合体の処方は、結合体のみにより得られた力価と比較して、より高いレベルの抗体を誘導した。同様の結果が、ＭｅｎＹについても見られた（図６）。
【０１８７】
補体に媒介される細菌溶解を測定するために、ポスト−ＩＩ血清を、インビトロアッセイを使用して殺菌活性について試験した。アッセイにおいて使用する前に、ポスト−ＩＩ（ｐｏｓｔ−ＩＩ）血清を、３０分間５６℃にて不活性化し、２５％ウサギ胎仔補体を、補体の供給源として使用した。殺菌力価を、相反血清希釈（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ  ｓｅｒｕｍ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）として表し、以下の株に対して５０％細菌殺傷を得た：ＭｅｎＷｌ３５，５５５４（ＯＡｃ＋）；ＭｅｎＹ，２４２９７５（ＯＡｃ＋）。
【０１８８】
ＭｅｎＷ１３５由来の莢膜多糖は、ＧＭＴ値を得られず、わずか４の細菌活性を提供した。対照的に、脱Ｏ−アセチル化した本発明の結合体は、１４と５６５との間のＧＭＴ値、６４と２０４８との間の殺菌力価を示した。
【０１８９】
ＭｅｎＹ由来の莢膜多糖は、ＧＭＴ値を得られず、わずか２５６の殺菌活性を提供した。対照的に、脱Ｏ−アセチル化した本発明の結合体は、２５３と１６１８との間のＧＭＴ値、２５６と１６３８４との間の殺菌力価を提供した。
【０１９０】
本発明は、単なる例として記載し、かつ本発明の精神および範囲内に維持された改変がなされ得ることが理解される。特に、本発明の莢膜糖類の免疫原性に影響を及ぼさないわずかな改変もまた、包含される。
【０１９１】
【化９】
0005590760.tif 000009
【０１９２】
【化１０】
0005590760.tif 000010
【０１９３】
【化１１】
0005590760.tif 000011
【０１９４】
【化１２】
0005590760.tif 000012
【０１９５】
【化１３】
0005590760.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【０１９６】
【図１】図１は、加水分解したＭｅｎＷ１３５の注釈をつけたＮＭＲスペクトルを示す。
【図２】図２は、加水分解したＭｅｎＹの注釈をつけたＮＭＲスペクトルを示す。
【図３】図３は、ＭｅｎＷ１３５−ＣＲＭ１９７結合体の調製の間、７位および９位におけるシアリン酸残基のＯ−アセチル化状態を示す。
【図４】図４は、ＭｅｎＹ−ＣＲＭ１９７結合体の調製の間、７位および９位におけるシアリン酸残基のＯ−アセチル化状態を示す。
【図５】図５は、ＭｅｎＷ１３５を使用して、マウスにおいてオリゴ糖に対して得られたＩｇＧ力価を示す。
【図６】図６は、ＭｅｎＹを使用して、マウスにおいてオリゴ糖に対して得られたＩｇＧ力価を示す。
【図１】
0005590760.tif 000015
【図２】
0005590760.tif 000016
【図３】
0005590760.tif 000017
【図４】
0005590760.tif 000018
【図５】
0005590760.tif 000019
【図６】
0005590760.tif 000020
【配列表】
0005590760000001.app