(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｃ）の特徴を備えたターゲティングベクターとの相同性組換えにより、エクソン２に含まれる翻訳開始点からエクソン３に含まれるインフレームのＡＴＧまでの領域が、マーカー遺伝子に置換されており、かつ、以下の（i）〜（iii）の性質を有していることを特徴とするアレルギー疾患モデルマウス。
（ａ）相同組換えの際に、フィラグリンをコードする内在性遺伝子の、エクソン２に含まれる翻訳開始点からエクソン３に含まれるインフレームのＡＴＧまでの領域が、マーカー遺伝子と置換されるように設計されていること；
（ｂ）上記（ａ）のマーカー遺伝子配列の５’側に、フィラグリンをコードする内在性遺伝子の５’非翻訳領域を含む配列と相同性のある７ｋｂ以上の遺伝子配列を含むこと；
（ｃ）上記（ａ）のマーカー遺伝子配列の３’側に、フィラグリンをコードする内在性遺伝子のエクソン３に含まれるインフレームのＡＴＧより下流側の配列と相同性のある１．５ｋｂ以下の遺伝子配列を含むこと；
（i）同種の野生型マウスと比較して角質のアミノ酸量が少ない；
（ii）同種の野生型マウスと比較して皮膚の透過性が高い；
（iii）同種の野生型マウスと比較して、ダニ抗原の感作により皮膚炎が誘導されやすい；
【請求項２】
アレルギー疾患が、アトピー性皮膚炎であることを特徴とする請求項１記載のマウス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロフィラグリン及びフィラグリンを発現する機能を喪失させたマウスを、アトピー性皮膚炎等のアレルギー疾患動物モデルや、皮膚バリア機能が低下している皮膚炎動物モデルとして使用する方法や、プロフィラグリン及びフィラグリンを発現する機能を喪失させたアレルギー疾患モデルマウスや皮膚炎モデルマウス等に関する。
【背景技術】
【０００２】
アトピー性皮膚炎（Atopic Dermatitis）は、主に外的刺激に対する炎症性皮膚病であり、遺伝的な背景によって環境刺激に対する反応が左右される「環境−遺伝的」な疾患である。また、アトピー性皮膚炎患者は気管支喘息など他のアレルギー疾患を併発する場合が多くあることが知られている。【０００３】
これまで、一般的にアトピー性皮膚炎は主に何らかの免疫異常により引き起こされると考えられており、複数の免疫関連遺伝子がアトピー性皮膚炎原因遺伝子として報告されている。そのため、現在までに報告されているアトピー性皮膚炎モデル動物はいずれも免疫機能調節に関わる遺伝子を導入又はノックアウトすることによりアトピー性皮膚炎に類似の症状を誘導したモデル動物である。このようなアトピー性皮膚炎モデル動物としては、例えば、ＧＡＴＡ−３トランスジェニックマウス（特許文献１）、ＴＮＰ−ＩｇＥトランスジェニックマウス（非特許文献１）、ＩＬ−１８トランスジェニックマウス（非特許文献２）、Ｃａｓｐａｓｅ−1トランスジェニックマウス（非特許文献３）、カテプシンＥノックアウトマウス（非特許文献４）等を挙げることができる。【０００４】
しかし最近になって、アトピー性皮膚炎発症に皮膚バリア機能障害の関与する可能性が示唆されてきている。皮膚バリア機能は、生体の水分保持や外部からの進入物や紫外線等を防ぐものであり、表皮のなかでも最も外層にある角層が特に重要な機能を果たしている。角層は、角化したケラチノサイトにより構成され、体内の他の細胞には全く見出されない特殊な被膜に囲まれたケラチンフィラメントの骨格構築からなる。このケラチンフィラメント骨格構築には表皮ケラチノサイト由来のフィラグリンが不可欠である。フィラグリンは表皮ケラチノサイトで特異的に産生されるタンパク質であり、前駆体であるプロフィラグリンタンパク質が発現した後、直ちにリン酸化し、ケラトヒアリン顆粒に蓄積され、その後脱リン酸、加水分解を経てフィラグリンへと分解される。フィラグリンは、ケラチンフィラメントを凝集させる作用を持つ他、さらに低分子のペプチドに分解され保湿因子や紫外線吸収因子としても働く。【０００５】
欧米の多くのアトピー性皮膚炎患者を対象とした研究の結果、アトピー性皮膚炎の要因となりうる遺伝子変異がフィラグリンタンパク質をコードする遺伝子（ＦＬＧ遺伝子）上に発見された。この遺伝子変異は、プロフィラグリン及びフィラグリンタンパクの完全な欠損を引き起こすものであり（非特許文献５）、アトピー性皮膚炎患者に高頻度に、喘息を併発しているアトピー性皮膚炎患者にはさらに高頻度に認められることが明らかにされた（非特許文献６）。また、日本においても、同様のＦＬＧ遺伝子変異がアトピー性皮膚炎患者に高頻度で認められることが明らかにされている（非特許文献７）。これらの結果は、フィラグリンタンパクの欠損による皮膚バリア機能の低下が、アトピー性皮膚炎や喘息の発症に関与することを示唆しているが、このような皮膚バリア機能障害とアトピー性皮膚炎等のアレルギー疾患との関連についてはこれまでほとんど注目されておらず、研究が進んでいないのが現状である。今後、アトピー性皮膚炎及び／又は喘息の予防・治療方法を確立するために、プロフィラグリン及びフィラグリンの欠損により皮膚バリア機能が低下したモデル動物は非常に有用であると考えられる。【０００６】
皮膚バリア機能の低下を特徴とする皮膚疾患モデル動物としては、テープストリッピングによって物理的に角質層を剥離する方法や、アセトン等の有機溶媒又は界面活性剤により皮膚バリア機能を構成する脂質成分を脱脂する方法が公知であるが（例えば、特許文献２、非特許文献１０、非特許文献１１）、これらのモデル動物はフィラグリン欠損による皮膚バリア機能障害を反映したものではなく、アトピー性皮膚炎発症機構解明のためのモデル動物としては適さない。また、尋常性魚鱗癬モデルマウスとして知られるFlaky Tail（ｆｔ）マウスでは、角層構成タンパク質であるロリクリン及びフィラグリンをコードする遺伝子領域の近傍に劣性突然変異が起こっており（非特許文献８）、その表皮では、正常なプロフィラグリンタンパク質（約５００ｋＤａ）が産生されず、代わりに、分子量の小さい変異プロフィラグリンタンパク質（２２０ｋＤａ）が発現していることが明らかにされている（非特許文献８、非特許文献９）。しかし、ｆｔマウスは、（１）自然発生突然変異マウスであるため、フィラグリン遺伝子以外の遺伝子にも変異が起こっている可能性が考えられること、さらに、（２）ｆｔマウスにおいて発現している異常プロフィラグリンタンパク質からもフィラグリンタンパク質やペプチドが分解生成されると考えられることから、プロフィラグリン及びフィラグリンタンパク質を完全に欠失しているアトピー性皮膚炎患者のモデルとしては不十分であると考えられる。以上のように、これまでのところ、アトピー性皮膚炎モデルとなりうるような、プロフィラグリン及びフィラグリンタンパク質が完全に欠損したモデル動物は確立されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００４−１６６６９６号公報
【特許文献２】特開２００１−３２１０１６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Matuoka et al., Int Immuno., 11: 987-994, 1999
【非特許文献２】Yoshimoto et al., Nat Immunol., 1: 132-137, 2000
【非特許文献３】Yamanaka et al., J Immunol., 165: 997-1003, 2000
【非特許文献４】Tsukuba et al., J Biochem(Tokyo)., 134: 893-902, 2003
【非特許文献５】Smith et al., Nat genet., 38: 337-342, 2006
【非特許文献６】Palmer et al., Nat genet., 38: 441-446, 2006
【非特許文献７】Nomura et al., J Allergy ClinImmunol., 119: 434-440, 2007
【非特許文献８】Rothnagel et al., Genomics, 23: 450-456, 1994
【非特許文献９】Presland et al., J Inv Dermatol., 115: 1072-1081, 2000
【非特許文献１０】Kitagaki H, et al. J Invest Dermatol 105: 749-755, 1995
【非特許文献１１】Spergel JM, et al. J Clin Invest 101: 1614-1622, 1998
【非特許文献１２】Fallon PG. et al., Nat genet 41: 602-608, 2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の課題は、アトピー性皮膚炎等のアレルギー疾患モデルマウスや、皮膚バリア機能が低下した皮膚炎モデルマウスを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明者らは、まず、尋常性魚鱗癬モデルマウスであるflaky tail（ｆｔ）マウスが、上述のようなアトピー性皮膚炎患者のモデルとしても使用することができるか検討する目的で、ｆｔマウスにおけるプロフィラグリン及びフィラグリンタンパク質の発現について調べてみることとした。フィラグリン遺伝子内の第６フィラグリンリピート上にナンセンス変異を持つｆｔマウス（非特許文献１２）の皮膚抽出物を電気泳動し、プロフィラグリンタンパク質の繰り返し領域に対する抗体（Rabbit Anti-Filaggrin Polyclonal Antibody, Unconjugated； Covance Research Products Inc社製；Cat# PRB-417P）を用いてウエスタンブロットを行った。その結果、図５−ａ、右端のレーン“ｆｔ”に示すように、正常なプロフィラグリンタンパク質の約半分程度の長さの変異プロフィラグリンタンパク質のバンドとともに、フィラグリンタンパク質への分解過程にあるいくつかのバンド、さらに、わずかな成熟型フィラグリンタンパク質のバンドが認められた。フィラグリンタンパク質は、最終的にアミノ酸レベルにまで分解されたものが天然保湿因子として働き、皮膚の保湿およびバリア機能に貢献するとされている。すなわち、ｆｔマウスでは野生型に比べて不十分ではあるものの、天然保湿因子として働きうるフィラグリンタンパク質が発現していることが確認できた。これらの結果から、フィラグリンタンパク質の機能解析や、フィラグリン欠失による皮膚バリア障害・皮膚バリア障害に起因するアトピー性皮膚炎発症メカニズムの解析のためには、ｆｔマウスでは不十分であり、プロフィラグリンタンパク質及びフィラグリンタンパク質の発現が完全に欠損したノックアウトマウスの作製が不可欠であることが分かった。【００１１】
続いて、発明者らは、プロフィラグリンタンパク質及びフィラグリンタンパク質の発現が完全に欠損したノックアウトマウスの作製を試みた。マウスフィラグリン遺伝子は、非翻訳領域である短いエクソン１、翻訳開始点を含むエクソン２、及びフィラグリンに特有な１００００ｂｐを超える巨大なエクソン３からなっており、エクソン３は長大な翻訳領域と終止コドンとを含んでいる。なお、プロフィラグリンの遺伝子の配列及び構造は既に開示されており、例えば、Zhang D et al., J Invest Dermatol., 119, 905-912 (2002)の図１及び図２には、マウスプロフィラグリンの遺伝子のエクソン２に存在する翻訳開始点の位置やエクソン３に含まれるインフレームのＡＴＧについても具体的に示されている。エクソン３に含まれる翻訳領域は、５’末端と３’末端の短い特異的配列に挟まれて、極めて相同性の高い繰り返し配列が１２個連続して存在する特殊な構造をしているため、ターゲティング時の相同組換えにより予測不能な変化が起こりやすいと考えられた。本発明者らは、このような繰り返し配列間での予測不能な変化や非特異的な組換えを避けるために、エクソン３側にshort armを、エクソン１側にlong armをそれぞれ設定してターゲティングベクター（ＴＶ１）を作製し、該ターゲティングベクターを用いてプロフィラグリンタンパク質及びフィラグリンタンパク質の発現が完全に欠損したフィラグリン遺伝子欠損マウスを作製することに成功した。
【００１２】
さらに、発明者らは、このフィラグリン遺伝子欠損マウスの表現型を詳細に検討し、（１）野生型マウスと比較して皮膚バリア機能が低下していること、（２）皮膚透過性が高く、表皮の外側に接触した物質が容易に皮膚のランゲルハンス細胞へ抗原として取り込まれること、（３）ダニ抗原により皮膚炎を誘導することができることを明らかにし、該フィラグリン遺伝子欠損マウスが皮膚炎、なかでもアトピー性皮膚炎のモデルマウスとして極めて有用であることを見い出し、本発明を完成するに至った。【００１４】
すなわち本発明は、〔１〕（ａ）相同組換えの際に、フィラグリンをコードする内在性遺伝子の、エクソン２に含まれる翻訳開始点からエクソン３に含まれるインフレームのＡＴＧまでの領域が、マーカー遺伝子と置換されるように設計されていること；（ｂ）上記（ａ）のマーカー遺伝子配列の５’側に、フィラグリンをコードする内在性遺伝子の５’非翻訳領域を含む配列と相同性のある７ｋｂ以上の遺伝子配列を含むこと；（ｃ）上記（ａ）のマーカー遺伝子配列の３’側に、フィラグリンをコードする内在性遺伝子のエクソン３に含まれるインフレームのＡＴＧより下流側の配列と相同性のある１．５ｋｂ以下の遺伝子配列を含むこと；の（ａ）〜（ｃ）の特徴を備えたターゲティングベクターとの相同性組換えにより、エクソン２に含まれる翻訳開始点からエクソン３に含まれるインフレームのＡＴＧまでの領域が、マーカー遺伝子に置換されており、かつ、以下の（i）〜（iii）の性質を有していることを特徴とするアレルギー疾患モデルマウス；（i）同種の野生型マウスと比較して角質のアミノ酸量が少ない；（ii）同種の野生型マウスと比較して皮膚の透過性が高い；（iii）同種の野生型マウスと比較して、ダニ抗原の感作により皮膚炎が誘導されやすい；や、〔２〕アレルギー疾患が、アトピー性皮膚炎であることを特徴とする上記〔１〕記載のマウスに関する。
【発明の効果】
【００１６】
上述のように、フィラグリンタンパク質は表皮のケラチンフィラメント構築に関与するだけでなく、ペプチドレベルにまで分解された後に保湿因子等としても働いており、皮膚バリア機能に重要な役割を果たしている。本発明のプロフィラグリン及びフィラグリンを発現する機能を完全に喪失させたマウスを、アレルギー疾患動物モデルや皮膚炎動物モデルとして使用することにより、皮膚バリア機能の形成及び維持におけるフィラグリンの役割を分子レベルで解析するとともに、アレルギー疾患や皮膚炎における皮膚バリア機能の関与を解明することが可能となり、皮膚バリア機能の低下により引き起こされるアレルギー疾患や皮膚炎の発症機構の解明や、その予防・治療効果を有する物質のスクリーニングが可能となる。さらに、本発明の皮膚バリア機能が低下したマウスは、アトピー性皮膚炎と喘息発症との関連を解明するための動物モデルとしても好適に用いることができる。これまでにアトピー性皮膚炎の臨床定義を満たすモデル動物は多々知られているが、抗原暴露から感作が成立するまでの疾患発症機序を正しく反映したモデルの報告は全くない。既存のモデルマウスの中でアトピー性皮膚炎の発症過程に近いと思われるものは反復抗原塗布モデル(非特許文献１０及び１１)であるが、これらはテープストリッピングなどの機械刺激やパッチによる抗原の閉鎖塗布により皮膚バリアを人為的に壊した後に、マウスに抗原を塗布して感作を成立させている。すなわち、バリアを通過して体内に入った抗原に対して、どのような反応が起こるかを解析するためのモデルである。それに対して、本発明のプロフィラグリン及びフィラグリンを発現する機能を喪失させたアトピー性皮膚炎発症モデルマウスは、皮膚のバリア障害によりそもそも何が起こるのか、特に、抗原が皮膚バリアを通過してから感作が成立するまでの、アトピー性皮膚炎の発症の最初期を解析することのできる初めてのモデルとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明のマウスフィラグリン遺伝子ターゲティングベクター（ＴＶ１）のデザインを示す図である。
【図２】野生型フィラグリン遺伝子（Wildtype allele）、ターゲティングベクター、ならびに相同組換え後の変異フィラグリン遺伝子（Targeted allele）を示す図である。本発明のターゲティングベクターを用いてフィラグリン遺伝子のエクソン２の途中からエクソン３の一部までをＰＧＫ−ｎｅｏと置換することにより、本来のスタートコドン及びフィラグリン遺伝子内に存在する全てのインフレームのＡＴＧを消失させることができる。
【図３】本発明のターゲティングベクターを用いて作製された陽性細胞（ES clone 832）のｌｏｎｇ  ａｒｍ側の遺伝子型をサザンブロット法により解析した結果を示す図である。
【図４−ａ】本発明のキメラマウスの交配によって作製されたＦ１マウスのｌｏｎｇ  ａｒｍ側の遺伝子型をサザンブロット法で解析した結果を示す図である。
【図４−ｂ】本発明のＢＡ１ハイブリッドＥＳを用いて得られたクローンのｓｈｏｒｔ  ａｒｍ側の遺伝子型をサザンブロット法で解析した結果を示す図である。
【図４−ｃ】本発明のＢＡ１ハイブリッドＥＳを用いて得られたクローンにおいて、１２９マウス由来のゲノムに相同組換えが起こった場合に得られるキメラマウス及びＦ１マウスの遺伝子型を示す図である。
【図４−ｄ】本発明のＢＡ１ハイブリッドＥＳを用いて得られたクローンにおいて、Ｂ６マウス由来のゲノムに相同組換えが起こった場合に得られるキメラマウス及びＦ１マウスの遺伝子型を示す図である。
【図５−ａ】Flaky Tailマウス及び本発明のマウスの皮膚抽出物中に存在するプロフィラグリン及びフィラグリンタンパクをウエスタンブロット法により検出した結果を示す図である。図中、＋／＋は野生型を、＋／−はヘテロ接合体（ＦＬＧ＋／−）を、−／−はホモ接合体（ＦＬＧ−／−）を、ｆｔはFlaky Tailマウスをそれぞれ示す。
【図５−ｂ】本発明のＦＬＧ＋／−及びＦＬＧ−／−マウスの皮膚抽出物中に存在するプロフィラグリン及びフィラグリンタンパクをウエスタンブロット法により検出した結果を示す図である。図中、＋／＋は野生型を、＋／−はヘテロ接合体（ＦＬＧ＋／−）を、−／−はホモ接合体（ＦＬＧ−／−）をそれぞれ示す。
【図６】本発明のＦＬＧ＋／−及びＦＬＧ−／−マウスの皮膚組織におけるプロフィラグリン及びフィラグリンタンパク発現を免疫組織染色により検出した結果を示す図である。図中、＋／＋は野生型を、＋／−はヘテロ接合体を、−／−はホモ接合体をそれぞれ示し、写真は上から、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）、フィラグリン（ＦＬＧ）、ロリクリン（ＬＯＲ）、インボルクリン（ＩＮＶ）の染色結果を示す。
【図７】本発明ＦＬＧ−／−マウスの角層に含まれるアミノ酸の量を、野生型マウスと比較した結果を示す図である。図中、ＷＴは野生型を、ＫＯはホモ接合体（ＦＬＧ−／−）をそれぞれ示す。
【図８】本発明ＦＬＧ−／−マウスの角層に含まれるアミノ酸の種類を野生型マウスと比較した結果、フィラグリンに多く含まれるアミノ酸が顕著に減少していることを示す図である。図の縦軸はＦＬＧ−／−又は野生型マウスの角層に含まれる各アミノ酸量（モル数）を、横軸はフィラグリンタンパク質に含まれる量の多い順に左から右にアミノ酸の種類を並べた結果を示している。図中、ＷＴは野生型を、ＫＯはホモ接合体（ＦＬＧ−／−）をそれぞれ示す。
【図９】野生型及びＦＬＧ−／−マウスの手を、従来の臨界点乾燥方法により処理して白金を蒸着した後、通常の走査型電子顕微鏡（低真空チャンバーを有さない）で観察した結果を示す図である。
【図１０−ａ】野生型マウスの手をグルタールアルデヒドで固定してｔ−ブチルメタノールで乾燥処理した後、−２０℃の冷却ステージを装備した低真空走査型電子顕微鏡により観察した結果を示す図である。
【図１０−ｂ】ＦＬＧ−／−マウスの手をグルタールアルデヒドで固定してｔ−ブチルメタノールで乾燥処理した後、−２０℃の冷却ステージを装備した低真空走査型電子顕微鏡により観察した結果を示す図である。
【図１０−ｃ】野生型マウスの腹部より採取した皮膚をグルタールアルデヒドで固定してｔ−ブチルメタノールで乾燥処理した後、−２０℃の冷却ステージを装備した低真空走査型電子顕微鏡により観察した結果を示す図である。下段は上段パネルの四角の部分の拡大図である。
【図１０−ｄ】ＦＬＧ−／−マウスの腹部より採取した皮膚をグルタールアルデヒドで固定してｔ−ブチルメタノールで乾燥処理した後、−２０℃の冷却ステージを装備した低真空走査型電子顕微鏡により観察した結果を示す図である。下段は上段パネルの四角の部分の拡大図である。図中、矢印は本来角質に覆われているはずの未熟な表皮層が露出している箇所を示す。
【図１１−ａ】ｉｎ  ｖｉｖｏ共焦点ラマン分光装置（Model3510;River Diagnostic社製）を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏマウス角層内分子濃度解析を行った結果を示す図である。図中、ＷＴは野生型を、ＫＯはホモ接合体（ＦＬＧ−／−）をそれぞれ示す。
【図１１−ｂ】ｉｎ  ｖｉｖｏ共焦点ラマン分光装置（Model3510;River Diagnostic社製）を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏマウス角層内分子濃度解析を行った結果を示す図である。図中、ＷＴは野生型を、ＫＯはホモ接合体（ＦＬＧ−／−）をそれぞれ示す。
【図１２】本発明のＦＬＧ−／−マウスの皮膚組織における、ランゲルハンス細胞（赤）の細胞体へのbiotin（緑）の取り込みを示す図である。図中、＋／＋は野生型を、−／−はホモ接合体（ＦＬＧ−／−）をそれぞれ示す。
【図１３】本発明のＦＬＧ−／−マウスの耳にコナヒョウヒダニ抽出粗抗原を隔日で８回塗布した結果を示す図である。野生型マウスでは皮膚炎所見を認めなかったが、本発明のフィラグリン欠損マウスでは、皮膚炎所見の特徴である痂皮・鱗屑付着・血管拡張・皮膚硬化が３匹中２匹で顕著に認められた。
【図１４】本発明のＦＬＧ−／−マウスの耳にコナヒョウヒダニ抽出粗抗原を隔日で１６回塗布した後に、組織を染色した結果を示す図である。野生型と比較してＦＬＧ−／−マウスでは耳介が腫脹し、表皮組織が海綿状態であることが明らかとなった。また、真皮の炎症細胞浸潤が認められた。図中、＋／＋は野生型を、−／−はホモ接合体（ＦＬＧ−／−）をそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の動物モデルとして使用する方法としては、フィラグリンをコードするマウスの内在性遺伝子の全部又は一部を破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化し、プロフィラグリン及びフィラグリンを発現する機能を喪失させたマウスを、アレルギー疾患動物モデルや皮膚バリア機能が低下した皮膚炎動物モデルとして使用する方法であれば特に制限されず、なかでもアトピー性皮膚炎及び／又は喘息動物モデルとして使用する方法をより具体的に例示することができる。また、動物モデルとして使用する方法には、例えば、後述するスクリーニング方法における使用形態や、アトピー性皮膚炎と喘息発症との関連を解明するためのモデルとしての使用形態を挙げることができる。次に、本発明のアレルギー疾患モデルマウスや皮膚炎モデルマウス、より具体的には、アトピー性皮膚炎モデルマウス、喘息モデルマウス、アトピー性皮膚炎・喘息モデルマウス等としては、フィラグリンをコードするマウスの内在性遺伝子の全部又は一部を破壊・欠損・置換等の遺伝子変異により不活性化し、プロフィラグリン及びフィラグリンを発現する機能を喪失させたマウスであって、皮膚バリア機能が低下したマウスであれば特に制限されるものではなく、該マウスの表現型としては、例えば、（ａ）同種の野生型マウスと比較して角質のアミノ酸量が少ない；（ｂ）同種の野生型マウスと比較して皮膚の透過性が高い；（ｃ）ダニ抗原の感作により皮膚炎が誘導される；等を具体的に挙げることができる。
【００１９】
皮膚バリア機能は、生体の水分保持や外部からの進入物や紫外線等を防ぐものであり、表皮のなかでも最も外層にある角層が特に重要な機能をはたしている。フィラグリンは、ケラチノサイトの角化にともないプロフィラグリンから分解生成され、ケラチン線維を凝集させる。その後、角層上層でフィラグリンはさらに低分子のペプチドに分解され、保湿や紫外線吸収因子となる。このため、フィラグリン発現の低下又は欠損した場合、表皮、特に角層の形成が正常に行われず、水分保持機能や外部の刺激を防ぐ皮膚バリア機能障害が起こる。本発明の皮膚バリア機能が低下した皮膚炎モデル動物は、特定の刺激を与えることにより人為的に皮膚炎を発症させることが可能であり、上記特定の刺激としては、本発明のモデルマウスに皮膚炎を発症させることができるものであれば特に制限されないが、例えば、ダニ抗原などの特定の物質の皮膚への接触や、特定の物質の投与や、紫外線曝露や、特定の温度や湿度など外的環境による刺激等を挙げることができるが、なかでも、ダニ抗原による刺激を好適に挙げることができる。
【００２０】
本発明のプロフィラグリン及びフィラグリンを発現する機能が低下又は喪失したマウスとしては、エクソン２に含まれる翻訳開始点からエクソン３に含まれるインフレームのＡＴＧまでの領域が、マーカー遺伝子と置換され、ＦＬＧ遺伝子の機能が欠損したＦＬＧ−／−マウスであれば特に制限されるものではないが、エクソン２に含まれる翻訳開始点からエクソン３に含まれるインフレームのＡＴＧまでの領域が、（ａ）相同組換えの際に、フィラグリンをコードする内在性遺伝子の、エクソン２に含まれる翻訳開始点からエクソン３に含まれるインフレームのＡＴＧまでの領域が、マーカー遺伝子と置換されるように設計されていること；（ｂ）上記（ａ）のマーカー遺伝子配列の５’側に、フィラグリンをコードする内在性遺伝子の５’非翻訳領域を含む配列と相同性のある７ｋｂ以上の遺伝子配列を含むこと；（ｃ）上記（ａ）のマーカー遺伝子配列の３’側に、フィラグリンをコードする内在性遺伝子のエクソン３に含まれるインフレームのＡＴＧより下流側の配列と相同性のある１．５ｋｂ以下の遺伝子配列を含むこと；の（ａ）〜（ｃ）の特徴を備えたターゲティングベクターとの相同性組換えにより、マーカー遺伝子に置換されているマウスであることが好ましい。かかるＦＬＧ遺伝子の機能が欠損したマウスの作製方法を、以下説明する。
【００２１】
ＦＬＧ遺伝子は、マウス遺伝子ライブラリーをＰＣＲ法等により増幅し、得られた遺伝子断片をマウスＦＬＧ遺伝子由来のプローブを用いてスクリーニングすることができる。スクリーニングされたＦＬＧ遺伝子は、プラスミドベクター等を用いてサブクローンし、制限酵素マッピング及びＤＮＡシーケンシングにより特定することができる。次に、このＦＬＧをコードする遺伝子の全部又は一部をｐＭＣ１ネオ遺伝子カセット等に置換し、３'末端側にジフテリアトキシンＡフラグメント（ＤＴ−Ａ）遺伝子や単純ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）遺伝子等の遺伝子を導入することによって、ターゲティングベクターを作製する。
【００２２】
作製されたターゲティングベクターを線状化し、エレクトロポレーション（電気穿孔）法等によってＥＳ細胞に導入し、相同的組換えを行い、その相同的組換え体の中から、Ｇ４１８やガンシクロビア（ＧＡＮＣ）等の抗生物質により相同的組換えを起こしたＥＳ細胞を選択する。また、この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかをサザンブロット法等により確認することが好ましい。その確認されたＥＳ細胞のクローンをマウスの胚盤胞中にマイクロインジェクションし、かかる胚盤胞を仮親のマウスに戻し、キメラマウスを作製する。このキメラマウスを野生型マウスと交雑させると、本発明のヘテロ接合体マウス（Ｆ１マウス；ＦＬＧ＋／−）を得ることができ、このヘテロ接合体マウスを交雑させることによって、本発明のホモ接合体ＦＬＧ−／−マウスを作製することができる。また、このＦＬＧ−／−を野生型マウスと交雑させることで、ＦＬＧ−／＋マウスを得ることも出来る。上記ＦＬＧ−／＋及びＦＬＧ−／−マウスにおける、フィラグリンの発現を確認する方法としては、例えば、上記マウスの細胞や組織における遺伝子発現をノーザンブロット法や、ＲＴ−ＰＣＲ法等より確認する方法や、タンパク発現をウエスタンブロット法や免疫染色法等により確認する方法を挙げることができるが、上記マウスの皮膚組織におけるプロフィラグリン及びフィラグリンタンパク発現をウエスタンブロット法や免疫組織染色法により確認することが好ましく、なかでも、プロフィラグリンからのフィラグリンへの段階的な分解過程にあるタンパク質を検出することができることから、プロフィラグリンタンパク質の繰り返し領域に対する抗体（Rabbit Anti-Filaggrin Polyclonal Antibody, Unconjugated； Covance Research Products Inc社製；Cat# PRB-417P）を用いたウエスタンブロット法より確認することが特に好ましい。
【００２３】
作出されたＦＬＧ−／−マウスの皮膚バリア機能の低下は、例えば、目視による外観の観察や、角質水分量や角質アミノ酸量の測定などにより非侵襲的に確認することができる他、ＦＬＧ−／−マウスの表皮組織切片をヘマトキシリン・エオジン染色した後に顕微鏡下で組織学的に調べることや、マウスの皮膚組織をｔ−ブチルメタノールで処理した後に低真空走査型電子顕微鏡により観察することでより詳細に確認することができる。さらに、作出されたＦＬＧ−／−マウスの角質バリア透過性については、下記実施例に記載のような、細胞膜非透過性のタンパク質ビオチン化試薬であるSulfo-NHS-LC-Biotinを用いた角質バリア通過性評価方法により調べることが可能である。
【００２４】
本発明の動物モデルとして使用する方法の一形態である、経皮曝露により皮膚バリア機能の低下した動物の免疫応答反応に影響を与えるアレルギー誘導又は抑制物質のスクリーニング法としては、本発明のＦＬＧ−／−マウスに被験物質を投与及び／又は曝露し、前記マウスにおける、動物個体、組織、器官若しくは細胞に現れる表現形の変化を、同種の野生型マウスに該被検物質を投与及び／又は曝露した場合と比較・評価するスクリーニング法であれば特に制限されるものではなく、スクリーニングに際しては、フィラグリンを発現する機能を喪失させたＦＬＧ−／−マウスを、同腹の野生型と比較・評価することが好ましい。上記被験物質の投与及び曝露する方法は、被験物質の性質に依存して選択することができ、例えば、経口投与、経鼻投与、皮下への注射、皮膚への塗布、皮膚への接触、スプレーでの噴霧等を挙げることができる。また、上記表現形の変化としては、動物個体、組織、器官若しくは細胞に現れる表現形の変化であれば特に制限されないが、なかでも、アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変の程度の変化や、気管支喘息病変の程度の変化等を好例として挙げることができる。上記アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変の程度は、例えば、皮膚外観の観察や、掻破行動回数の計測や、血中のＩｇＧ及び／又はＩｇＥ濃度の測定や、表皮組織中の免疫細胞浸潤の検出や、表皮細胞のサイトカイン産生量の測定等を行うことにより、また、上記気管支喘息病変の程度は、例えば、肺気管支組織における免疫細胞浸潤の検出や、気道抵抗圧の測定や、鼻腔抵抗の測定や、鼻腔容量の測定等を行うことにより比較・評価することができ、アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変の程度と、気管支喘息病変の程度の比較・評価を同時に行うこともできる。
【００２５】
また、本発明の動物モデルとして使用する方法の一形態であるアレルギー疾患の予防・治療剤のスクリーニング方法としては、本発明のＦＬＧ−／−マウスに、被検物質とアレルギー誘導物質を投与及び／又は曝露し、動物個体、組織、器官若しくは細胞に現れる表現形の変化を、被検物質を投与及び／又は曝露しない場合と比較・評価するスクリーニング法であれば特に制限されないが、スクリーニングに際しては、ＦＬＧ−／−マウスを、同腹の野生型マウスと比較・評価することが好ましい。上記被験物質とアレルギー誘導物質の投与及び／又は曝露する方法、被験物質の性質に依存して選択することができ、例えば、経口投与、経鼻投与、皮下への注射、皮膚への塗布、皮膚への接触、スプレーでの噴霧等を挙げることができ、被験物質とアレルギー誘導物質を同時に投与及び／又は曝露することも、被験物質とアレルギー誘導物質のどちらかを先に投与及び／又は曝露することもでき、また、上記アレルギー誘導物質としては、特に制限されるものではないが、ダニ抗原を例として好適に挙げることができ、アレルギー誘導により抗原刺激する方法としては、特に制限がないが、例えば、前記アレルギー誘導を適用な溶媒に溶解し、マウスの皮膚に塗布（感作）し、一定の期間（例えば、数日間）を置いて複数回の塗布を行う（誘発、チャレンジ）方法が挙げることができ、感作部位と誘発部位とは同一であっても、異なっていてもよい。上記表現形の変化としては、動物個体、組織、器官若しくは細胞に現れる表現形の変化であれば特に制限されないが、なかでも、アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変の程度の変化や、気管支喘息病変の程度の変化等を好例として挙げることができる。上記アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変の程度は、例えば、皮膚外観の観察や、掻破行動回数の計測や、血中のＩｇＧ及び／又はＩｇＥ濃度の測定や、表皮組織中の免疫細胞浸潤の検出や、表皮細胞のサイトカイン産生量の測定等を行うことにより、また、上記気管支喘息病変の程度は、例えば、肺気管支組織における免疫細胞浸潤の検出や、気道抵抗圧の測定や、鼻腔抵抗の測定や、鼻腔容量の測定等を行うことにより比較・評価することができ、アトピー性皮膚炎様の炎症性皮膚病変の程度と、気管支喘息病変の程度の比較・評価を同時に行うこともできる。
【００２６】
本発明のターゲティングベクターとしては、フィラグリンをコードする遺伝子の上流又は／及び発現領域の、少なくとも一部の配列の欠失、置換、および／または他の配列の挿入を起こすことにより、フィラグリン遺伝子の機能が喪失するように設計されたものであれば特に制限されないが、組み換えＥＳ細胞の選別のために、ポジティブ（陽性）及び／又はネガティブ（陰性）選別を行うマーカーとして機能する遺伝子の配列が挿入されるように設計されており、また、フィラグリン遺伝子の繰り返し配列による際に非特異的な組換えを防ぐように設計されたものが好ましい。具体的には、フィラグリンをコードする内在性遺伝子の、エクソン２に含まれる翻訳開始点からエクソン３に含まれるインフレームのＡＴＧまでの領域が、マーカー遺伝子と置換されるように設計されており、且つ、マーカー遺伝子配列の５’側に、フィラグリンをコードする内在性遺伝子の５’非翻訳領域を含む配列と相同性のある７ｋｂ以上の遺伝子配列を、マーカー遺伝子配列の３’側に、フィラグリンをコードする内在性遺伝子のエクソン３に含まれるインフレームのＡＴＧより下流側の配列と相同性のある１．５ｋｂ以下の遺伝子配列を含むターゲティングベクターを好例として挙げることができる。
【００２７】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２８】
［ターゲティングベクターのデザイン］
マウスフィラグリン（ｍＦＬＧ）遺伝子は、非翻訳領域である短いエクソン１、翻訳開始点を含むエクソン２、及びフィラグリンに特有な１００００ｂｐを超える巨大なエクソン３からなっている。第３エクソンは、開始直後にインフレームのＡＴＧを持ち、第３エクソンの開始点から約７００ｂｐが特異的配列であり、その下流に１スパンが約７５０ｂｐの繰り返し配列が１６回繰り返される特殊な構造を持っている。このため、第２エクソンのＡＴＧのみを破壊しても、第３エクソン開始直後にあるインフレームのＡＴＧから翻訳が開始された場合、ほぼフィラグリン遺伝子の全長が正常に翻訳されてしまうと考えられる。したがって、ターゲッティングベクターの構築にあたっては、第２エクソンのＡＴＧから第３エクソンのＡＴＧまでを全て含む、約１．９ｋｂを欠失させるように設計した（図１）。また、繰り返し配列をできる限り避けるために、ｌｏｎｇ  ａｒｍを上流側に、ｓｈｏｒｔ  ａｒｍを下流側に設定した。ｓｈｏｒｔ  ａｒｍについては、第３エクソンのＡＴＧを欠失させるために、第３エクソンのＡＴＧよりも下流に設定する必要があるが、短すぎるとターゲッティング効率が非常に落ちるため、ｓｈｏｒｔ  ａｒｍを短くしすぎることはできない。そこで、ｓｈｏｒｔ  ａｒｍは第３エクソンのＡＴＧ以降の特異的配列約７００ｂｐに、１スパンが約７５０ｂｐの繰り返し配列のうち前半の約５００ｂｐの配列を加えて、約１２００ｂｐの長さとした。
【実施例２】
【００２９】
［ターゲティングベクターの構築］
ｍＦＬＧ遺伝子座を含むＢＡＣｃｌｏｎｅｓ（ＲＰ２３−３４６Ｂ１３、及び、ＲＰ２３−３９Ｅ２２）を取得した。配列番号１及び２に示される２種類のプライマーを合成し、GeneBridges社のsRed/ETシステムを用いてＢＡＣクローンよりターゲティングベクター構築に必要なフィラグリン遺伝子を含むゲノムＤＮＡ配列（chromosome 3において上記プライマーによって挟まれた範囲のゲノムＤＮＡ）をクローニングし、さらに、Ｂａｃｋｂｏｎｅベクターにサブクローニングした。次に、ｎｅｏカセットを挿入するため、制限酵素EcoRIの認識配列（GAATTC）をエクソン２にある翻訳開始点上にin vitro mutagenesisにて作製（GATGTC>>GGATCCに変更）し、BsiWIの認識配列（CGTACG）をin vitro mutagenesisにてエクソン３の頭の領域に作製（CAAATG>>CGTACG）した。その上でEcoRI及びBsiWIにて制限酵素処理後、両端をEcoRI-BsiWIにて切断したFrt/loxP-neo配列（配列番号３）を挿入し、ターゲティングベクターＴＶ１を作製した。
【実施例３】
【００３０】
［ＥＳの作製とサザンブロット解析による陽性クローンの確認］
まず、Ｃ５７ＢＬ６のＥＳ細胞を用いて、エレクトロポレーションによるＴＶ１の導入を試みたが、陽性細胞を得ることができなかった。このため、細胞をＢＡ１ハイブリッドのＥＳ細胞（Ｂ６マウスと１２９マウスのハイブリッド）に変更し、再度エレクトロポレーションによるＴＶ１の導入を行った。
陽性クローンを確認のためには通常ＰＣＲが用いられるが、本実験においてはフィラグリン遺伝子の繰り返し配列のためにＰＣＲによる確認は不可能であった。このため、繰り返し配列直前の配列をプローブとして用いたサザンブロット解析を行い、陽性クローンを検索することとした。プローブの位置を図２に示す。上述のように、ｓｈｏｒｔ  ａｒｍにはフィラグリン遺伝子の繰り返し配列の前半の５００ｂｐの配列が含まれるが、この配列は、その下流にほぼ１００％一致する配列が１５回繰り返し出現する。このために、ｓｈｏｒｔ  ａｒｍ側は、１６回繰り返される繰り返し配列（１スパンが約７５０ｂｐ）のどこかで予期せぬ相同組換えが起こる可能性がある。ｓｈｏｒｔ  ａｒｍ側で正しく相同組換えが起こっていることを証明するためには、ｓｈｏｒｔ  ａｒｍ側のサザンブロット解析が必要となる。通常のサザンブロット解析にはｓｈｏｒｔ  ａｒｍの外側（すなわちターゲッティングベクターには含まれない配列）を用いてプローブを作製するが、このターゲッティングベクターにおいてはｓｈｏｒｔ  ａｒｍの外側は繰り返し配列となっており、ｓｈｏｒｔ  ａｒｍの外側にプローブを作製することができない。そこで、ターゲッティングベクターのｓｈｏｒｔ  ａｒｍ内部にプローブを作製した。また、サザンブロットに用いるゲノム切断制限酵素を検索した結果、唯一、ＭｓｃＩのみが使用可能であることが分かった（図２）。上述のように、フィラグリン遺伝子は１５の繰返し配列を含んでいるが、この繰返し配列は完全に同一の配列が繰り返されているのではなく、繰返し配列ごとに異なる配列が一部含まれている。ＭｓｃＩ認識配列は、そのような繰返し配列ごとに異なる配列中に存在している。このため、ＭｓｃＩによりゲノムＤＮＡを消化した後に、上記のプローブを用いたサザンブロット解析を行うことにより、相同組換えが正しい位置で起こっているクローンを検出することが可能である。また、全く予期せぬ場所で組換えが起こった場合も、検出されるバンドの高さが変化することで検出可能であると考えられた。
【００３１】
上述のサザンブロット解析によりＢＡ１ハイブリッドＥＳを用いて得られたクローンの遺伝子型を確認した結果、全く予想外のことに、１０ｋｂと６ｋｂの２本のバンドが検出された（図４−ａ、ｌａｎｅ３及び１１）。この結果は、ＥＳクローン作製に用いた細胞が、Ｂ６マウスと１２９マウスのハイブリッドＥＳ細胞であることが原因であると予想されたため、Ｂ６マウス、１２９マウスそれぞれのゲノムをＭｓｃＩにて切断し、サザンブロット解析を行った。その結果、１０ｋｂのバンドは１２９マウスゲノム由来、６ｋｂのバンドはＢ６マウスゲノム由来であることが明らかとなった。また、バンドの大きさから、フィラグリン遺伝子の繰り返し配列内にあるＭｓｃＩサイトに多型があると考えられた。このようなエクソン内部の遺伝子多型は非常にめずらしく、変異が入りやすい繰り返し配列を持つ遺伝子独特のものであると考えられた。この多型のため、以後の解析はさらに困難となった。ターゲッティングによって得られたクローンに対して、まずｌｏｎｇ  ａｒｍ側のサザンブロット解析を行い、ｌｏｎｇ  ａｒｍ側で目的の相同組換えが起こっているクローン＃８２４を得た（図３）。次に、＃８２４のゲノムをＭｓｃＩにて切断しサザンブロットを行ったところ、１０ｋｂ，  ６ｋｂのバンドが得られたことから、このクローンではｓｈｏｒｔ  ａｒｍ側も正しい場所で相同組換えが起こっている可能性が高いと考えられた。しかし、クローン＃８２４において、Ｂ６ゲノムまたは１２９ゲノムのいずれのフィラグリン遺伝子と相同組換えが起こったかは、この時点では不明であった。【００３２】
［キメラマウスの作製］
ＥＳクローン＃８２４を胚盤胞に導入して仮親に移植することによりキメラマウスを作製し、さらに、Ｂ６マウスと掛け合わせてＦ１ヘテロマウスを得た（追加図４−ｂ及びｃ）。このＦ１ヘテロマウスのゲノムをＭｓｃＩにて切断しサザンブロット解析を行ったところ、Ｆ１ヘテロマウスでは６ｋｂのバンドのみが得られた。この結果から、ＥＳクローン＃８２４において、１２９マウス由来ゲノムのフィラグリン遺伝子ではなく、Ｂ６マウス由来ゲノムのフィラグリン遺伝子において正しく相同組換えが起こっていたことが、この時点ではじめて証明された。本ターゲッティングにおける、相同組換えが正しい位置で起こったかどうかの確認方法は、フィラグリン遺伝子の繰り返し配列の非常な特殊性に対応して開発した独自性の高い方法である。
【実施例４】
【００３３】
［ＦＬＧ遺伝子欠損マウスにおけるフィラグリン発現解析］
実施例３で作製されたＦＬＧ＋／−及びＦＬＧ−／−マウスにおいて、フィラグリンタンパク質の発現が特異的に減少又は欠損しているかどうかを確認するために、ウエスタンブロット解析及び免疫組織染色を行った。
図５−ａに、Flaky Tailマウス及び本発明のマウスの皮膚抽出物中に存在するプロフィラグリン及びフィラグリンタンパクをウエスタンブロット法により検出した結果を示す。野生型マウス（+/+）、ヘテロマウス（+/-）、フィラグリンノックアウトマウス（-/-）では、フィラグリンの前駆体であるプロフィラグリンタンパク質のバンドと、プロフィラグリンタンパク質が段階的に分解されていくことを示すラダー状のバンド、および成熟型であるフィラグリンタンパク質のバンドが認められた。一方、ノックアウトマウスではこれら全てのバンドが完全に消失していた。このことから、１．使用している抗体はフィラグリン特異的な抗体であり、フィラグリン以外の蛋白を認識することはないこと、２．フィラグリンノックアウトマウスでは、プロフィラグリンおよびフィラグリンタンパク質のいずれも全く産生されていないこと、が明らかとなった。また、flaky tailマウスでは、通常のプロフィラグリンタンパク質の約半分程度の長さの変異プロフィラグリンタンパク質のバンドと、わずかな成熟型フィラグリンタンパク質のバンドを認めた。【００３４】
図５−ｂに、野生型（＋／＋）、ヘテロ（＋／−）及びホモ（−／−）欠損マウスの皮膚抽出物中の、角質局在タンパク質の発現をウエスタンブロット法により検討した結果を示す。前述のように、ＦＬＧ−／−マウスでは、プロフィラグリン及びフィラグリンタンパクはともに全く検出されなかったが、代表的な角質局在タンパクであるロリクリン及びインボルクリンは、野生型、ＦＬＧ＋／−、及びＦＬＧ−／−のいずれにも発現しており、その発現量に明らかな差は認められなかった。各レーンに同量のサンプルが泳動されていることは、コントロールであるβ−アクチンの発現量が一定であることから確認できる。【００３５】
図６に、野生型（＋／＋）、ヘテロ（＋／−）及びホモ（−／−）欠損マウスの皮膚組織におけるフィラグリンタンパク発現を免疫組織染色により検討した結果を示す。上述のウエスタンブロット法による実験結果と同様に、ＦＬＧ−／−マウスではフィラグリンタンパクは全く検出されなかった。また、ロリクリン（ＬＯＲ）及びインボルクリン（ＩＮＶ）は、野生型、ＦＬＧ＋／−、及びＦＬＧ−／−のいずれにも同様に発現していた。ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色の結果には明らかな差は認められなかった。
以上の結果から、ＦＬＧ−／−マウスの皮膚組織中においてはフィラグリンタンパクの発現が完全に欠損していることが明らかとなった。
【実施例５】
【００３６】
［ＦＬＧ遺伝子欠損マウスの表現型解析］
ＦＬＧ−／−マウス、ＦＬＧ＋／−、及び、同腹の野生型マウスを用いて、以下の比較実験を行った。
（角質のアミノ酸組成分析）
日齢４のＦＬＧ−／−及び野生型マウスを用いて、角層に含まれるアミノ酸の量及び種類を分析した。マウスの背部皮膚約１．５×２．０ｃｍ２の領域から、メンディングテープ（Ｓｃｏｔｃｈ）を用いて計６回のテープストリッピングを行い、角層サンプルを採取した後、トルエンを用いてメンディングテープより計４回にわけて角層を抽出した。抽出物をエバポレートして溶媒を除去した後、１０％スルホサリチル酸に抽出物を溶解し、アミノ酸分析装置（日立社製）によりアミノ酸分析を行った。その結果、ＦＬＧ−／−マウスにおける角質単位面積あたりのアミノ酸モル数は、野生型と比較して著明に減少していた（図７）。また、図８は、縦軸にＦＬＧ−／−又は野生型マウスの角層に含まれる各アミノ酸量（モル数）を、横軸にフィラグリンタンパク質に含まれる量の多い順に左から右にアミノ酸の種類を並べた結果を示している。この図から、フィラグリンタンパク質に多く含まれているアミノ酸ほど顕著に減少しているが、フィラグリンタンパク質にあまり含まれていないアミノ酸も減少していることが明らかとなった。以上の結果から、ＦＬＧ−／−マウスでは、角質内アミノ酸量が減少していることが明らかとなった。【００３７】
（低真空走査型電子顕微鏡による角質組織解析）
日齢５のＦＬＧ−／−及び野生型マウス皮膚を採取し、グルタールアルデヒドで固定した。ｔ−ブチルメタノールで乾燥処理した後、−２０℃の冷却ステージを装備した低真空走査型電子顕微鏡（日立Ｓ−３４００Ｎ；日立社製）により観察した。図１０−ａ〜図１０−ｄに結果を示すように、ｔ−ブチルエタノールを選択することにより皮表の形態を良好に保持することができ、また、低真空走査型電子顕微鏡を選択することにより組織の真空による破損を最小限に留め、本来の形態を観察することが可能となった。低真空走査型電子顕微鏡は反射電子、または二次電子を検出する２つの異なるモードで観察した。
【００３８】
図１０−ａ及び図１０−ｂは、生理的に角質が厚い手（paw）の観察を行った結果である。野生型マウスの手の皮表は層状の角質で鎧状に覆われているのに対し（図１０−ａ）、フィラグリン欠損型マウスでは表面が平滑、層状の角層に乏しい所見が得られた（１０−ｂ）。これらの結果から、フィラグリンを欠損することにより正常な層状の角質構造を形成できない可能性が示唆された。【００３９】
図１０−ｃ及び図１０−ｄは、体幹の皮膚（腹部）の観察を行った結果である。下段は上段パネルの四角の部分の拡大図である。野生型マウスの皮表は層状、もしくはリボン状の角層に覆われているのに比し、フィラグリン欠損型マウスではこの構造が存在しない箇所が多く認められ、下層の有核細胞層を透見して見ることができた。以上の結果より、野生型マウスでは角質が層状の構造を取りながら皮膚最外層のバリアーを形成しているのに比べ、フィラグリン欠損型マウスではこの構造が正常に形成されないか、容易に脱落してしまうため本来角質に覆われているはずの未熟な表皮層が露出していることが示唆された。【００４０】
なお、図９は上記実験の対照として、従来の臨界点乾燥を行い、白金を蒸着した後、通常の走査型電子顕微鏡（低真空チャンバーを有さない）で観察した結果を示す。試料の前処理および走査型電子顕微鏡の試料チャンバーの低真空により組織のアーティファクトが強く、表現型を判断するのが極めて困難であった。【００４１】
（角層内分子濃度解析）
ｉｎ  ｖｉｖｏ共焦点ラマン分光装置（Model3510;River Diagnostic社製）を用いて、ｉｎ  ｖｉｖｏマウス角層内分子濃度解析を行った。日齢２〜５のＦＬＧ−／−及び野生型マウスをそれぞれ各５匹ずつ用意し、その腹部皮膚表面より深さ２μｍ間隔で、マウスの角層の厚さの範囲内に収まる８μｍまでを測定した。光源として７８５ｎｍのレーザーを用い、４００〜１８００ｃｍ−１の指紋領域と呼ばれる領域を調べ、各種アミノ酸およびその代謝産物を定量化した。ＮＭＦ（Natural Moisturizing Factor）は、serine、glycine、pyrrolidone-5-carboxylic acid（ＰＣＡ）、proline、ornithine、histidine（ｐＨ４）、histidine（ｐＨ７）、alanineという主要構成要素のラマンスペクトルの総和により測定した。【００４２】
なお、図に表したＮＭＦ、各種アミノ酸等の分子濃度プロファイルは、ＦＬＧ−／−及び野生型マウスとの間で変化が最も少ないと考えられるケラチンのラマンスペクトルシグナル強度を基準値とした時の、これらの各分子の相対値として求めた。図１１−ａ及びｂに結果を示すように、ＦＬＧ−／−マウスにおいては、天然保湿因子と呼ばれる成分が著明に減少していることが明らかとなった。以上の結果から、予想されたとおり、ＦＬＧ−／−マウスの角層では野生型と比較して水分量が減少し、皮膚が乾燥していることが示唆された。【００４３】
（ＦＬＧ遺伝子欠損マウスの皮膚バリア機能解析）
ＦＬＧ遺伝子欠損マウスの皮膚バリア機能が低下しているかどうかを確認するために、表皮の抗原提示細胞であるランゲルハンス細胞への取り込み量による皮膚バリア機能評価方法を開発し、ＦＬＧ−／−及び野生型マウスにおける皮膚バリア機能について検討した。
従来の皮膚に抗原を外用してランゲルハンス細胞の抗原取り込みを評価する方法においては、ＦＩＴＣなどの角質バリアを容易に通過する試薬が用いられてきた。しかし、角質バリアを容易に通過する試薬を用いた方法では、フィラグリン欠失による角質バリア通過性の変化を観察することはできない。そこで、我々は細胞膜非透過性のタンパク質ビオチン化試薬であるSulfo-NHS-LC-Biotinを用いた角質バリア通過性評価方法を確立し、はじめて角質バリア通過性の変化を観察を可能にした。Sulfo-NHS-LC-Biotinの構造式を以下に示す。【００４４】
【化１】
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【００４５】
Sulfo-NHS-LC-Biotin（#21335；Thermo Scientific社製）を７週齢のメスのＦＬＧ−／−マウス、及び、同腹の野生型マウスの耳の内側の皮膚表面に塗布し、ランゲルハンス細胞への取り込みを蛍光顕微鏡を用いて観察した。具体的には、Sulfo-NHS-LC-Biotin[10mg/mL in PBS/0.7mM CaCl2]を皮膚表面に塗布し、２４時間後にマウスの耳を採取した。耳の皮膚を軟骨より剥離して３．８％チオシアン化アンモニウム／リン酸バッファにて３７℃、２０分間処理した後、真皮から表皮をメカニカルに剥離した。続いて、表皮を９５％エタノールにて固定し、抗MHC Class II IA + IE 抗体［M5/114.15.2］（eBioscience社製）によりランゲルハンス細胞を、avidin-Alexa488（Invitrogen社製）によりビオチン化タンパク質を染色し、Leica TCS SP5 レーザーコンフォーカル顕微鏡（ライカ社製）を用いて観察した。【００４６】
図１２に示すように、野生型マウスでは、ランゲルハンス細胞（赤）へのbiotin（緑）の取り込みは見られなかったが、ＦＬＧ−／−マウスでは、ランゲルハンス細胞（赤）の細胞体に、取り込まれたbiotin（緑）が蓄積している像（矢印）が頻繁に観察された。これらの結果から、ＦＬＧ−／−マウスでは、皮膚のバリア機能が障害されており、角質の外側に塗布された物質が、容易に皮膚バリアをつきぬけて表皮内に侵入し、ランゲルハンス細胞に抗原として取り込まれることが示された。
【実施例６】
【００４７】
［ダニ抗原感作による皮膚炎の誘導］
まず、ＦＬＧ−／−マウスにおいて、経皮的に塗布した抗原に対する感作が成立しやすいか否かについて検討した。６〜８週齢のＦＬＧ−／−マウス(ｎ＝３)と同腹の野生型マウス(ｎ＝４)のそれぞれにおいて、コナヒョウヒダニ抽出粗抗原を隔日で両耳に塗布した。図１３に、８回塗布後の写真を示す。フィラグリン欠損型マウスは、図１３に示すように、皮膚炎所見の特徴である痂皮・鱗屑付着・血管拡張・皮膚硬化が３匹中２匹で顕著に認められた。一方、同腹の野生型マウスでは、４匹とも明らかな皮膚炎所見を認めなかった。すなわちＦＬＧ−／−マウスでは経皮的な抗原感作が起こりやすいと考えられた。【００４８】
さらに、コナヒョウヒダニ抽出粗抗原を１６回塗布後のＦＬＧ−／−マウスと同腹の野生型マウスの耳を採取し、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色により組織学的な変化を検討した。図１４に結果を示すように、野生型と比較してＦＬＧ−／−マウスの耳では、耳介が腫脹（厚さが増加）しており、表皮部分（写真の色の濃い部分）では細胞の隙間が白く抜けて見えることから表皮組織が海綿状態であることが明らかとなった。また、真皮には炎症細胞浸潤が認められた。
【実施例７】
【００４９】
［フィラグリン欠損マウスにおける抗原感作亢進のメカニズムの解析］
フィラグリン欠失により、皮膚における抗原感作が成立しやすくなるメカニズムとしては、（１）フィラグリン欠失により皮膚の角層バリアが脆弱となり、抗原が皮膚を通過して免疫系に暴露されやすくなる、（２）フィラグリン欠失により皮膚と免疫系細胞との相互作用が変調して抗原に対して感作が起こりやすくなる、という大きく分けて２つの可能性が考えられる。（１）については、様々な物質の皮膚角層バリアの通過性・透過性をラマン分光顕微鏡・ツーフォトン顕微鏡・質量分析顕微鏡を用いて測定した。また、皮膚を通過して抗原提示細胞に取り込まれた抗原をＦＡＣＳ（フローサイトメトリー）を用いて定量的に解析することで、抗原の皮膚通過量の変化を測定する。一方、（２）については定常状態およびtape stripやパッチテストにおける表皮および真皮の各種抗原提示細胞の活性化度合に対して、フィラグリン欠失が及ぼす影響を測定する。
【実施例８】
【００５０】
［フィラグリン欠損による皮膚バリア障害に対するバリア機能補充薬の開発］
フィラグリンノックアウトマウスの皮膚炎モデルを用いて、バリア機能を補填することにより皮膚炎発症を予防できる薬剤のスクリーニングを行う。
【実施例９】
【００５１】
［慢性的な抗原刺激によるアトピー性皮膚炎モデルマウスの開発］
フィラグリンノックアウトマウスでは経皮的な抗原感作が起こりやすいことを示した。すなわちフィラグリン変異を持つアトピー性皮膚炎患者では、経皮的な抗原感作が生後すぐから慢性的に起こっていると考えられる。フィラグリンノックアウトマウスを用いて、慢性的な抗原刺激によるアトピー性皮膚炎モデルマウスの開発を行う。
【実施例１０】
【００５２】
［アトピー性皮膚炎モデルにおける抗原提示細胞の役割の解析］
経皮的に侵入した抗原は、表皮ランゲルハンス細胞および真皮樹状細胞により捕捉され免疫系に抗原提示されると考えられる。真皮樹状細胞には複数のサブセットが存在することが最近報告された。しかし表皮ランゲルハンス細胞および真皮樹状細胞サブセットそれぞれの抗原提示における役割分担はほとんど不明である。Langerin-DTA, Langerin-DTR, CD11c-DTRマウスとフィラグリンノックアウトマウスを掛け合わせることで、各種の皮膚抗原提示細胞を欠失したフィラグリンノックアウトマウスを作成し、アトピー性皮膚炎発症における各種の抗原提示細胞の役割分担を解明する。これらの抗原提示細胞の働きを抑制したり、免疫寛容に働く抗原提示細胞の働きを賦活化したりすることにより、アトピー性皮膚炎の発症予防・治療の新しい方法を開発する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−ａ】
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【図４−ｂ】
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【図４−ｃ】
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【図４−ｄ】
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【図５−ａ】
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【図５−ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−ａ】
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【図１０−ｂ】
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【図１０−ｃ】
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【図１０−ｄ】
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【図１１−ａ】
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【図１１−ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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