(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
圧電基板と、
該圧電基板上に形成された電極を有する弾性波素子と、
該弾性波素子上に形成され、被測定物質と一体化した酵素に起因する化学反応により質量が減少する反応膜と、
を備え、
前記弾性波素子への前記反応膜による質量変化を周波数変化により検出することにより、該被測定物質を検出する弾性波センサであって、
前記反応膜は、前記酵素の反応により発生する反応物質との化学反応により質量が減少し、
前記第１の標識抗体は、前記被測定物質を捕獲し、前記反応膜の周囲に形成されている抗体と一体化していることを特徴とする、弾性波センサ。
【請求項２】
前記反応膜が有機膜であることを特徴とする、請求項１に記載の弾性波センサ。
【請求項３】
前記反応膜が生分解性プラスチックであることを特徴とする、請求項２に記載の弾性波センサ。
【請求項４】
前記反応膜が無機膜であることを特徴とする、請求項１に記載の弾性波センサ。
【請求項５】
前記無機膜がＺｎＯ膜であることを特徴とする、請求項４に記載の弾性波センサ。
【請求項６】
圧電基板と、
該圧電基板上に形成された電極を有する弾性波素子と、
該弾性波素子上に形成され、被測定物質と一体化した酵素に起因する化学反応により質量が減少する反応膜と、
を備え、
前記弾性波素子への前記反応膜による質量変化を周波数変化により検出することにより、該被測定物質を検出する弾性波センサであって、
前記反応膜が生分解性プラスチックからなる有機膜であることを特徴とする、弾性波センサ。
【請求項７】
前記反応膜は、前記酵素との化学反応により質量が減少することを特徴とする、請求項６に記載の弾性波センサ。
【請求項８】
前記第１の標識抗体は、前記被測定物質を捕獲する第２の抗体と媒体とを含む第２の標識抗体と一体化していることを特徴とする、請求項７に記載の弾性波センサ。
【請求項９】
前記媒体は、磁気ビーズであることを特徴とする、請求項８に記載の弾性波センサ。
【請求項１０】
前記反応膜は、前記酵素の反応により発生する反応物質との化学反応により質量が減少することを特徴とする、請求項６に記載の弾性波センサ。
【請求項１１】
前記反応物質が酸であることを特徴とする、請求項１０に記載の弾性波センサ。
【請求項１２】
前記酵素が、前記被測定物質を捕獲する第１の抗体を含む第１の標識抗体の一部であることを特徴とする、請求項１乃至１１のいずれか一つに記載の弾性波センサ。
【請求項１３】
前記電極がＩＤＴ電極であることを特徴とする、請求項１乃至１２のいずれか一つに記載の弾性波センサ。
【請求項１４】
前記弾性波素子が弾性表面波素子であることを特徴とする、請求項１乃至１３のいずれか一つに記載の弾性波センサ。
【請求項１５】
圧電基板と、該圧電基板上に形成された電極を有する弾性波素子と、該弾性波素子上に形成され、酵素との化学反応により質量が減少する反応膜と、を備える弾性波センサを用意する工程と、
検体と、被測定物質を捕獲する第１の抗体と前記酵素とを含む第１の標識抗体とを混ぜる工程と、
前記被測定物質と一体化した前記第１の標識抗体を前記反応膜の近傍に移動させる工程と、
前記弾性波センサの周波数を測定する工程と、
を備えることを特徴とする、弾性波センサを用いた検出方法。
【請求項１６】
前記被測定物質を捕獲する第２の抗体と媒体とを含む第２の標識抗体を、前記検体と前記第１の標識抗体と混ぜることを特徴とする、請求項１６に記載の弾性波センサを用いた検出方法。
【請求項１７】
前記被測定物質を介して前記第２の標識抗体と一体化した前記第１の標識抗体を前記反応膜の近傍に移動させることを特徴とする、請求項１７に記載の弾性波センサを用いた検出方法。
【請求項１８】
圧電基板と、該圧電基板上に形成された電極を有する弾性波素子と、該弾性波素子上に形成され、酵素の反応により発生する反応物質との化学反応により質量が減少する反応膜と、を備える弾性波センサを用意する工程と、
検体と、被測定物質を捕獲する第１の抗体と前記酵素とを含む第１の標識抗体とを混ぜる工程と、
前記被測定物質と一体化した前記第１の標識抗体を、前記酵素と反応する物質が存在する前記反応膜の近傍に移動させる工程と、
前記弾性波センサの周波数を測定する工程と、
を備えることを特徴とする、弾性波センサを用いた検出方法。
【請求項１９】
前記被測定物質と一体化した前記第１の標識抗体を、前記酵素と反応する物質が存在する前記反応膜の近傍に移動させる際に、前記被測定物質と一体化した前記第１の標識抗体を、前記被測定物質を捕獲し、前記反応膜の周囲に形成されている抗体と一体化させることを特徴とする、請求項１８に記載の弾性波センサを用いた検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は弾性波センサ及び弾性波センサを用いた検出方法に関し、詳しくは、弾性波素子の周波数が変化することを利用した弾性波センサ及び弾性波センサを用いた検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、弾性波素子の表面に形成された抗体などの反応性物質が反応することによって、弾性波素子の周波数特性が変化することを利用した弾性波センサが提案されている。この弾性波センサは、抗体などの受容体もしくはリガンドを弾性波素子上に固相化しておき、それらと検体に含まれる抗原との反応によって周波数が変化することでセンシングする。【０００３】
例えば図１２の概念図に示す弾性波センサは、弾性波素子である水晶発振子１１の表面の電極１２にオリゴヌクレチオド（−ＯＮ'）が固定される。試薬は、電極１２に固定されたオリゴヌクレチオドと特異的に結合する相補的な塩基配列（−ＯＮ）と、抗原１４と結合するＦａｂ'部分１６やＩｇＧ部分１８を有する。抗原１４は、試薬を介して水晶発振子１１に結合される（例えば、特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平９−２９２３９７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、抗体などの受容体もしくはリガンドを弾性波素子上に固相化する構成では、弾性波センサの感度は、予め弾性波素子上に固相化された受容体もしくはリガンドの数量に依存する。予め弾性波素子上に固相化された受容体もしくはリガンドの数量を増やそうとしても限界があるため、弾性波センサの高感度化は困難である。【０００６】
また、立体障害などにより反応が阻害されることによって、あるいは、検体を含む液体中の他の物質の取り込みなどによって、センシングの再現性、安定性が悪くなる可能性がある。【０００７】
本発明は、かかる実情に鑑み、高感度化が可能であり、センシングの再現性、安定性が優れている弾性波センサ及び弾性波センサを用いた検出方法を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、上記課題を解決するために、以下のように構成した弾性波センサを提供する。【０００９】
弾性波センサは、（ａ）圧電基板と、（ｂ）該圧電基板上に形成された電極を有する弾性波素子と、（ｃ）該弾性波素子上に形成され、被測定物質と一体化した酵素に起因する化学反応により質量が減少する反応膜とを備える。前記弾性波素子への前記反応膜による質量変化を周波数変化により検出することにより、該被測定物質を検出する。
【００１０】
上記構成において、被測定物質と一体化した酵素に起因する化学反応により反応膜の質量が減少すると、反応膜による弾性波素子への質量負荷が変化し、弾性波素子の周波数が変化することから、被測定物質を検出することができる。
【００１１】
反応膜の質量の増加により被測定物質を検出する場合には、抗体などの受容体もしくはリガンドの固相化による限界があり、高感度化が困難であるのに対して、本発明の上記構成では、反応膜がなくなるまで被測定物質を検出することができ、より大きな周波数変化量が得られる。その結果、弾性波センサの高感度化が可能である。また、立体障害等による影響を受けないため、センシングの再現性、安定性がよい。
第１の態様において、前記反応膜は、前記酵素の反応により発生する反応物質との化学反応により質量が減少し、前記第１の標識抗体は、前記被測定物質を捕獲し、前記反応膜の周囲に形成されている抗体と一体化している。
好ましくは、前記反応膜が有機膜である。
この場合、反応膜を安価で形成することができる。
より好ましくは、前記反応膜が生分解性プラスチックである。
この場合、生物学的な被測定物質に好適である。
好ましくは、前記反応膜が無機膜である。
この場合、反応膜を安定して形成することができるため、弾性波センサのばらつきを小さくすることができる。
より好ましくは、前記無機膜がＺｎＯ膜である。
この場合、反応膜を安価で形成することができる。
第２の態様において、前記反応膜が生分解性プラスチックからなる有機膜である。
好ましくは、前記反応膜は、前記酵素との化学反応により質量が減少する。
より好ましくは、前記第１の標識抗体は、前記被測定物質を捕獲する第２の抗体と媒体とを含む第２の標識抗体と一体化している。
より好ましくは、前記媒体は、磁気ビーズである。
好ましくは、前記反応膜は、前記酵素の反応により発生する反応物質との化学反応により質量が減少する。
より好ましくは、前記反応物質が酸である。
【００１２】
前記第１及び第２の態様において、好ましくは、前記酵素が、前記被測定物質を捕獲する第１の抗体を含む第１の標識抗体の一部である。
【００１３】
この場合、抗原と一体化した酵素に起因する化学反応により反応膜の質量が減少すると、反応膜による弾性波素子への質量負荷が変化し、弾性波素子の周波数が変化することから、抗原を検出することができる。
【００１４】
酵素は触媒として機能するため、反応膜の化学反応は反応膜がなくなるまで起り、従来のように抗体を弾性波素子の上に形成する場合と比べ、より大きな周波数変化量が得られる。その結果、弾性波センサの高感度化が可能である。【００１５】
また、例えば検体に含まれる抗原を捕獲した酵素標識抗体の酵素に起因する化学反応により、弾性波センサの反応膜の質量を減少させることで、検体に含まれる抗原の数量を正確に検出することができる。また、検体に含まれる抗原に応じて酵素標識抗体を選択することにより、検体に含まれる抗原の種類を正確に判定することができる。つまり、センシングの再現性、安定性が優れている。
【００１６】
好ましくは、前記電極がＩＤＴ電極である。【００１７】
この場合、高周波化により検出感度を高めることができる。【００１８】
好ましくは、前記弾性波素子が弾性表面波素子である。【００１９】
この場合、弾性波センサのより小型化、より高感度化が可能になる。【００２８】
また、本発明は、上記課題を解決するために、以下のように構成した弾性波センサを用いた検出方法を提供する。【００２９】
弾性波センサを用いた検出方法は、（ａ）圧電基板と、該圧電基板上に形成された電極を有する弾性波素子と、該弾性波素子上に形成され、酵素との化学反応により質量が減少する反応膜と、を備える弾性波センサを用意する工程と、（ｂ）検体と、被測定物質を捕獲する第１の抗体と前記酵素とを含む第１の標識抗体とを混ぜる工程と、（ｃ）前記被測定物質と一体化した前記第１の標識抗体を前記反応膜の近傍に移動させる工程と、（ｄ）前記弾性波センサの周波数を測定する工程とを備える。
【００３０】
好ましくは、前記被測定物質を捕獲する第２の抗体と媒体とを含む第２の標識抗体を、前記検体と前記第１の標識抗体と混ぜる。
【００３１】
好ましくは、前記被測定物質を介して前記第２の標識抗体と一体化した前記第１の標識抗体を前記反応膜の近傍に移動させる。
【００３２】
また、本発明は、上記課題を解決するために、以下のように構成した他の弾性波センサを用いた検出方法を提供する。【００３３】
弾性波センサを用いた検出方法は、（ａ）圧電基板と、該圧電基板上に形成された電極を有する弾性波素子と、該弾性波素子上に形成され、酵素の反応により発生する反応物質との化学反応により質量が減少する反応膜と、を備える弾性波センサを用意する工程と、（ｂ）検体と、被測定物質を捕獲する第１の抗体と前記酵素とを含む第１の標識抗体とを混ぜる工程と、（ｃ）前記被測定物質と一体化した前記第１の標識抗体を、前記酵素と反応する物質が存在する前記反応膜の近傍に移動させる工程と、（ｄ）前記弾性波センサの周波数を測定する工程とを備える。
【００３４】
好ましくは、前記被測定物質と一体化した前記第１の標識抗体を、前記酵素と反応する物質が存在する前記反応膜の近傍に移動させる際に、前記被測定物質と一体化した前記第１の標識抗体を、前記被測定物質を捕獲し、前記反応膜の周囲に形成されている抗体と一体化させる。
【発明の効果】
【００３６】
本発明によれば、弾性波センサは、高感度化が可能であり、センシングの再現性、安定性が優れている。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】弾性波センサの要部断面図である。（実施例１）
【図２】弾性波センサの要部平面図である。（実施例１）
【図３】弾性波センサを用いた検出方法を示す概念図である。（実施例２）
【図４】弾性波センサを用いた検出方法を示す概念図である。（実施例２）
【図５】弾性波センサを用いた検出方法を示す概念図である。（実施例３）
【図６】弾性波センサの要部断面図である。（実施例４）
【図７】弾性波センサを用いた検出方法を示す概念図である。（実施例５）
【図８】発振周波数の変化を示すグラフ図である。（実施例５）
【図９】発振周波数の最大変化速度と酵素濃度との関係を示すグラフである。（実施例５）
【図１０】反応前後の周波数特性を示すグラフである。（実施例５）
【図１１】弾性波センサの要部断面図である。（実施例６）
【図１２】弾性波センサを用いた検出方法を示す概念図である。（従来例）
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下、本発明の実施の形態について、図１〜図１１を参照しながら説明する。
【００３９】
＜実施例１＞  実施例１の弾性波センサ１の構成について、図１及び図２を参照しながら説明する。図１は弾性波センサ１の要部断面図、図２は弾性波素子２の要部平面図である。
【００４０】
図１に示すように、弾性波センサ１は、圧電基板６の一方主面６ａ上に、図２に示す弾性波素子２が形成され、弾性波素子２を覆うように反応膜８が形成されている。
【００４１】
圧電基板６は、ＬｉＴａＯ３、ＬｉＮｂＯ３、水晶などの圧電単結晶により形成される。
【００４２】
弾性波素子２は、図２に示すように、表面波励振用電極としての櫛型のＩＤＴ（interdigital transducer）電極３Ａ，３Ｂと，ＩＤＴ電極３Ａ，３Ｂが設けられている領域の表面波伝搬方向両側に配置された反射器４，５とを有する。ＩＤＴ電極３Ａ，３Ｂの一方に信号が入力され、他方から信号が出力される、共振子型の弾性表面波フィルタが構成されている。ＩＤＴ電極３Ａ，３Ｂ及び反射器４，５は、Ａｌ、Ａｕ、Ｐｔ、Ｃｕ、Ａｇ、又はこれらを主成分とする合金などにより形成される。
【００４３】
弾性波素子２は、弾性表面波を利用するものに限らず、例えば、バルク弾性波を利用する素子などであってもよい。弾性波素子２が弾性表面波を利用するものである場合には、弾性波センサのより小型化、より高感度化が可能になる。
【００４４】
なお、弾性波素子２の電極は、ＩＤＴ電極であれば高周波化により検出感度を高めることができるので好ましいが、ＩＤＴ電極以外の電極形状であってもよい。
【００４５】
反応膜８は、弾性波素子２のＩＤＴ電極３Ａ，３Ｂと反射器４，５とを覆うように形成されている。反応膜８は、抗原と一体化した酵素との直接的あるいは間接的な化学反応により質量が変化するように、酵素に応じて選択された材料を用いて形成される。例えば、酵素がプロテアーゼの場合には、反応膜８としてプロテイン膜が形成される。酵素がアルデヒド分解酵素の場合には、反応膜８としてＺｎＯ膜が形成される。
【００４６】
反応膜８として、無機膜を形成すると、反応膜８を安定して形成することができるため、弾性波センサ１のばらつきを小さくすることができる。特にＺｎＯ膜は、安価で形成することができる。反応膜８として有機膜を形成しても、反応膜８を安価で形成することができる。
【００４７】
反応膜８が酵素と化学反応を起こし、化学反応による反応膜８の質量の変化にともない変化する弾性波センサ１の周波数を測定する。この周波数の変化により、酵素と一体化した抗原の有無を検出する。すなわち、ＩＤＴ電極３Ａ，３Ｂや反射器４，５を含む振動伝搬領域には、反応膜８により質量が付加される。反応膜８の化学反応によって質量が変化すると、振動伝搬領域を伝搬する表面波の振動特性が変化する。この振動特性の変化を、ＩＤＴ電極３Ａ，３Ｂの一方に入力、他方を出力とし、周波数ごとのゲインを測定することによって、化学反応による反応膜８の質量の変化、すなわち、抗原の有無や抗原の量を検出することができる。
【００４８】
弾性波センサ１は、従来のように抗体を弾性波素子２の上に形成していないため、酵素と反応膜８との化学反応は反応膜８がなくなるまで起り、より大きな周波数変化量が得られる。その結果、高感度の弾性波センサ１を提供できる。
【００４９】
また、弾性波素子２の負荷となる反応膜８を予め形成しておくことができるため、負荷質量は均一かつ形状ばらつきも少なくできる。そのため、センシング時のばらつきを減らすことができる。
【００５０】
＜実施例２＞  実施例１の構成の弾性波センサを用いた検出方法について、図３及び図４を参照しながら説明する。
【００５１】
図３及び図４は、検出方法を示す概念図である。図３は抗原２０がある場合、図４は抗原２０がない場合を示す。
【００５２】
図３（ｃ）及び図４（ｃ）に示すように、実施例２で用いる弾性波センサ１ａは、圧電基板６及び弾性波素子（図示せず）上に、タンパク質の反応膜であるプロテイン膜８ａが形成されている。
【００５３】
実施例２の検出方法は、次の工程を含む。
【００５４】
まず、図３（ａ）及び図４（ａ）に示すように、抗原２０を含む可能性のある検体と、プロテインと化学反応を起こす酵素であるプロテアーゼ３１と抗原２０を捕獲する抗体３２とからなるプロテアーゼ標識抗体３０と、媒体である磁気ビーズ４１と抗原２０を捕獲する抗体４２とからなる磁気ビーズ標識抗体４０とを混ぜて、抗原２０を介してプロテアーゼ標識抗体３０と磁気ビーズ標識抗体４０とを一体化させる。
【００５５】
次いで、図３（ｂ）及び図４（ｂ）に示すように、磁石５０を用いて磁気ビーズ標識抗体４０を凝集させ、磁気ビーズ標識抗体４０を磁石５０で保持したまま洗浄する。
【００５６】
このとき、検体中に抗原２０がある場合には、図３（ｂ）に示すように、抗原２０を介してプロテアーゼ標識抗体３０と磁気ビーズ標識抗体４０とが一体化するため、プロテアーゼ標識抗体３０と抗原２０と磁気ビーズ標識抗体４０とが一体化した状態で、磁石５０に吸着され、保持される。一方、検体中に抗原２０がない場合には、図４（ｂ）に示すように、プロテアーゼ標識抗体３０は磁気ビーズ標識抗体４０と一体化することができないため、磁石５０には磁気ビーズ標識抗体４０のみが吸着され、保持される。
【００５７】
次いで、磁石５０を弾性波センサ１ａのプロテイン膜８ａ上に移動させ、弾性波センサ１ａの周波数を測定する。
【００５８】
このとき、抗原２０がある場合には、図３（ｃ）に示すように、抗原２０を捕獲した抗体３２を有するプロテアーゼ標識抗体３０のプロテアーゼ３１が、弾性波センサ１ａのプロテイン膜８ａと化学反応を起こし、それにより弾性波センサ１ａの周波数が変化する。
【００５９】
一方、抗原２０がない場合には、図４（ｃ）に示すように、プロテイン膜８ａと化学反応を起こす酵素３１を有するプロテアーゼ標識抗体３０がないため、弾性波センサ１ａの周波数が変化しない。
【００６０】
したがって、弾性波センサ１ａの周波数の変化量を検出して、抗原２０の量を求めることができる。
【００６１】
以上の検出方法によれば、酵素であるプロテアーゼ３１との反応によりタンパク質のプロテイン膜８ａが除去されることにより周波数が変化するため、弾性波センサ１ａに発生する負荷の変化量は、予め形成しておくプロテイン膜８ａのタンパク質の量に依存することになり、大きな感度が得られる。
【００６２】
磁気ビーズ標識抗体４０は、抗原２０を捕獲したプロテアーゼ標識抗体３０のみと一体化するので、磁気ビーズ標識抗体４０により、抗原２０を捕獲したプロテアーゼ標識抗体３０のみを弾性波センサ１ａのプロテイン膜８ａ上に移動させることができる。すなわち、抗原２０を捕獲していないプロテアーゼ標識抗体３０が弾性波センサ１ａのプロテイン膜８ａ上に来ることはない。そのため、立体障害などにより反応が阻害されることがなく、液中の他の物質の取り込みなどが発生せず、センシングの安定性、再現性に優れる。
【００６３】
＜実施例３＞  実施例１の弾性波センサを用いた別の検出方法について、図５の概念図を参照しながら説明する。図５（ａ−１）及び（ｂ−１）は抗原２２がある場合、図５（ａ−２）及び（ｂ−２）は抗原２２がない場合を示す。
【００６４】
図５（ｂ−１）及び（ｂ−２）に示すように、実施例３で用いる弾性波センサ１ｂは、圧電基板６及び弾性波素子（図示せず）上に、反応膜としてＺｎＯ膜８ｂが形成されている。
【００６５】
弾性波センサ１ｂは、検体中の抗原２２を、抗原２２がアルデヒド分解酵素標識抗体３４をなす抗体３６に捕獲された状態で固定する抗体４４が、媒体であるＺｎＯ膜８ｂの周囲の蓋７の内面７ａや側壁の内面（図示せず）などに、予め形成されている。
【００６６】
実施例３の検出方法は、次の工程を含む。
【００６７】
まず、図５（ａ−１）及び（ａ−２）に示すように、抗原２２を含む可能性のある検体と、ＺｎＯ膜８ｂと化学反応を起こす反応物資である酸を発生させる酵素であるアルデヒド分解酵素３５と抗原２２を捕獲する抗体３６とからなるアルデヒド分解酵素標識抗体３４とを混ぜる。これによって、検体中に抗原２２がある場合には、抗原２２とアルデヒド分解酵素標識抗体３４とを一体化させる。
【００６８】
次いで、図５（ｂ−１）及び（ｂ−２）に示すように、検体とアルデヒド分解酵素標識抗体３４との混合物を、弾性波センサ１ｂの反応膜８の近傍に流し込み、弾性波センサ１ｂの蓋７の内側や側壁の内側などに固相化することにより形成された抗体４４と、抗原２２を捕獲したアルデヒド分解酵素標識抗体３４のみとを一体化させる。そして、弾性波センサ１ｂの周波数変化を検出する。
【００６９】
検体中に抗原２２がある場合には、図５（ｂ−１）に示すように、アルデヒド分解酵素標識抗体３４は、抗原２２を介して抗体４４に固定される。抗体４４によって固定されたアルデヒド分解酵素標識抗体３４のアルデヒド分解酵素３５と弾性波センサ１ｂの反応膜８ｂの近傍に予め流し込ませておいたアルデヒドとの反応により反応物質である酸が発生し、この酸によって弾性波センサ１ｂのＺｎＯ膜８ｂと化学反応を起こし、これにより弾性波センサ１ｂの周波数が変化する。
【００７０】
一方、検体中に抗原２２がない場合には、図５（ｂ−２）に示すように、アルデヒド分解酵素標識抗体３４は、抗体４４に固定されずに流れ去るため、弾性波センサ１ｂの周波数は変化しない。
【００７１】
したがって、弾性波センサ１ｂの周波数変化を検出して、抗原２２の量を求めることができる。
【００７２】
以上の検出方法によれば、アルデヒド分解酵素標識抗体３２により酸が発生し、この酸によってＺｎＯ膜８ｂが除去されることにより周波数が変化するため、弾性波センサ１ｂに発生する負荷の変化量は、予め形成しておくＺｎＯ膜８ｂの量に依存することになり、大きな感度が得られる。
【００７３】
抗体４４は、抗原２２を捕獲したアルデヒド分解酵素標識抗体３４のみと一体化するので、抗体４４により、抗原２２を捕獲したアルデヒド分解酵素標識抗体３４のみを、弾性波センサ１ｂのＺｎＯ膜８ｂの近傍に保持することができる。すなわち、抗原２２を捕獲していないアルデヒド分解酵素標識抗体３２が弾性波センサ１ｂのＺｎＯ膜８ｂの近傍に保持されることはない。そのため、立体障害などにより反応が阻害されることがなく、液中の他の物質の取り込みなどが発生せず、センシングの安定性、再現性に優れる。
【００７４】
＜実施例４＞  実施例４の弾性波センサ１ｓの構成について、図６を参照しながら説明する。
【００７５】
実施例４の弾性波センサ１ｓは、実施例１の弾性波センサ１と略同様に構成されており、以下では、同じ構成部分には同じ符号を用い、相違点を中心に説明する。
【００７６】
図６は弾性波センサ１ｓの要部断面図である。図６に示すように、実施例４の弾性波センサ１ｓは、実施例１の弾性波センサ１と同様に、圧電基板６の一方主面６ａ上に、弾性波素子２が形成されている。
【００７７】
実施例４の弾性波センサ１ｓは、実施例１の弾性波センサ１と異なり、圧電基板６の一方主面６ａ上に、弾性波素子２を覆うように絶縁膜７ｓが形成され、絶縁膜７ｓの上に反応膜８ｓが形成されている。
【００７８】
実施例４の弾性波センサ１ｓは、実施例１の弾性波センサ１と同様に、化学反応による反応膜８ｓの質量の変化にともない変化する周波数を測定する。
【００７９】
実施例４の弾性波センサ１ｓは、従来のように抗体を弾性波素子２の上に形成していないため、酵素と反応膜８ｓとの化学反応は反応膜８ｓがなくなるまで起り、より大きな周波数変化が得られる。その結果、高感度の弾性波センサ１ｓを提供できる。
【００８０】
また、弾性波素子２の負荷となる反応膜８ｓを予め形成しておくことができるため、負荷質量は均一かつ形状ばらつきも少なくできる。そのため、センシング時のばらつきを減らすことができる。
【００８１】
さらに、反応膜８ｓがなくなっても、弾性波素子２は絶縁膜７ｓで保護されるため、最後まで安定した測定が可能となる。また、絶縁膜７ｓ上に再び反応膜８ｓを形成して、弾性波センサ１ｓを繰り返し使用することも可能である。
【００８２】
＜実施例５＞  実施例４の構成の弾性波センサ１ｓを用いた検出方法について、図７〜図１０を参照しながら説明する。
【００８３】
図７は、検出方法を示す概念図である。図７に示すように、実施例５の検出方法は、弾性波センサ１ｓの反応膜８ｓ上に、反応膜８ｓと反応する酵素３１ｓを含む複合体６０を移動させて、弾性波センサ１ｓの周波数を測定する。
【００８４】
詳しくは、実施例５の検出方法は、次の工程を含む。
【００８５】
まず、（ａ）抗原２０ｓを含む可能性のある検体と、（ｂ）抗原２０ｓを捕獲する抗体３２ｓに、反応膜８ｓと化学反応を起こす酵素３１ｓが固定された酵素付き標識抗体３０ｓと、（ｃ）抗原２０ｓを捕獲する抗体４２ｓが磁気ビーズ４１ｓに固定された磁気ビーズ標識抗体４０ｓとを混ぜて、抗原２０ｓを介して酵素付き標識抗体３０ｓと磁気ビーズ標識抗体４０ｓとを一体化させた複合体６０を形成する。
【００８６】
次いで、磁石を用いて、複合体６０中の磁気ビーズ標識抗体４０ｓも含め、磁気ビーズ標識抗体４０ｓを凝集させ、磁石で保持したまま洗浄する。
【００８７】
このとき、検体中に抗原２０ｓがある場合には、抗原２０ｓを介して酵素付き標識抗体３０ｓと磁気ビーズ標識抗体４０ｓとが一体化するため、酵素付き標識抗体３０ｓと抗原２０ｓと磁気ビーズ標識抗体４０ｓとが一体化した複合体６０が磁石に吸着され、保持される。一方、検体中に抗原２０ｓがない場合には、酵素付き標識抗体３０ｓは磁気ビーズ標識抗体４０ｓと一体化することができないため、磁石には磁気ビーズ標識抗体４０ｓのみが吸着され、保持される。
【００８８】
次いで、磁石を用いて、複合体６０中の磁気ビーズ標識抗体４０ｓも含め、磁気ビーズ標識抗体４０ｓを弾性波センサ１ｓの反応膜８ｓ上に移動させ、弾性波センサ１ｓの周波数を測定する。
【００８９】
このとき、検体中に抗原２０ｓがある場合には、抗原２０ｓを捕獲した抗体３２ｓを有する酵素付き標識抗体３０ｓの酵素３１ｓが、弾性波センサ１ｓの反応膜８ｓと化学反応を起こし、それにより弾性波センサ１ｓの周波数が変化する。
【００９０】
一方、検体中に抗原２０がない場合には、反応膜８ｓと化学反応を起こす酵素３１ｓを有する酵素付き標識抗体３０ｓが存在しないため、弾性波センサ１ｓの周波数は変化しない。
【００９１】
したがって、弾性波センサ１ｓの周波数の変化量を検出して、抗原２０ｓの有無や量を求めることができる。
【００９２】
以上の検出方法によれば、酵素３１ｓとの反応により反応膜８ｓが除去されることにより周波数が変化するため、弾性波センサ１ｓに発生する負荷の変化量は、予め形成しておく反応膜８ｓの量に依存することになり、大きな感度が得られる。
【００９３】
磁気ビーズ標識抗体４０ｓは、抗原２０ｓを捕獲した酵素付き標識抗体３０ｓのみと一体化するので、磁気ビーズ標識抗体４０ｓにより、抗原２０ｓを捕獲した酵素付き標識抗体３０ｓのみを弾性波センサ１ｓの反応膜８ｓ上に移動させることができる。すなわち、抗原２０ｓを捕獲していない酵素付き標識抗体３０ｓが弾性波センサ１ｓの反応膜８ｓ上に来ることはない。そのため、立体障害などにより反応が阻害されることがなく、液中の他の物質の取り込みなどが発生せず、センシングの安定性、再現性に優れる。
【００９４】
次に、具体例について説明する。
【００９５】
弾性波センサ１ｓは、弾性表面波デバイスと同様に、圧電基板６上に弾性波素子２を形成した後、絶縁膜７ｓとしてＳｉＯ２膜を成膜する。次いで、絶縁膜７ｓ上に、生分解性プラスチックをクロロホルム等の溶媒で溶かした溶液をスピンコートすることで、反応膜８ｓを成膜する。
【００９６】
酵素３１ｓには、生分解性プラスチックと化学反応を起こさせる酵素を用いる。抗体３２ｓ，４２ｓにはＣＲＰ抗体を用い、抗原２０ｓにはＣＲＰ抗原を用いる。
【００９７】
詳しい手順は、次の通りである。
【００９８】
まず、ＣＲＰ抗体を修飾した直径１μｍ程度の磁性ビーズ溶液にマイクロチューブ内でＣＲＰ抗原（濃度：１μｇ／ｍｌ）と、生分解プラスチック分解酵素を標識したＣＲＰ抗体と、ブロッカー溶液とを混ぜ、１０分間攪拌して反応させる。
【００９９】
その後、磁性ビーズを磁石で集め、上澄みの液をピペットで回収し、残った磁性ビーズを、ＴＢＳＴ溶液で複数回、よく洗浄する。
【０１００】
次いで、ＴＢＳＴ溶液で洗浄した磁性ビーズをＴＢＳで希釈し、適量を、弾性波センサ上にピペットで滴下し、生分解プラスチック分解酵素による生分解性プラスチック膜の分解反応の様子を、弾性波センサの発振周波数の変化によってモニタリングする。
【０１０１】
図８は、発振周波数の変化を示すグラフである。横軸は経過時間であり、縦軸は発振周波数の変化率であり、初期周波数をｆ０、測定周波数をｆ１とすると、｜ｆ１−ｆ０｜／ｆ０である。ＣＲＰの濃度が０μｇ／ｍｌ、すなわち反応膜８ｓが除去されない場合と、ＣＲＰの濃度が１μｇ／ｍｌ、すなわち反応膜８ｓが除去される場合とを示している。
【０１０２】
図８から、反応膜が除去されるにつれて発振周波数は変化し、反応膜が完全に除去された後は発振周波数が一定になることが分かる。
【０１０３】
図９のグラフは、発振周波数の最大変化速度と酵素濃度との関係を示すグラフである。横軸は酵素濃度である。縦軸は発振周波数の最大変化速度（すなわち、周波数が変化したときの変化曲線の傾きに相当する変化速度の最大値）である。
【０１０４】
図９から、酵素濃度が高いほど、反応速度が大きくなることが分かる。
【０１０５】
図１０は、弾性波センサの周波数特性（Ｓ２１）を示すグラフである。反応膜８ｓの成膜後、反応前、すなわち反応膜８ｓが除去される前の周波数特性と、反応膜８ｓの成膜後、反応膜８ｓが完全に除去された後の周波数特性とを示している。
【０１０６】
図１０から、大きなロスなく、５ＭＨｚ（約８０００ｐｐｍ）の周波数変化が得られることが分かる。
【０１０７】
＜比較例１＞  従来の弾性波センサを用いて、酵素と基質との反応によって生成した沈殿物を弾性波センサのセンサ面（弾性波が伝搬する振動伝搬領域）に堆積させることで、弾性波センサの発振周波数の変化を観察する。この場合、沈殿物は、弾性波の伝搬する状況等の影響でセンサ面に均一に堆積しない上、堆積物の密度も小さくなる。その結果、弾性波の減衰が大きくなり、発振を持続する周波数範囲が狭い。
【０１０８】
実施例５のように、生分解性プラスチックをスピンコートにより成膜すると、生分解性プラスチック膜は均一な膜厚で、かつ大きな密度で弾性波共振子上に堆積させることができるので、成膜時の弾性波の減衰を、比較例１よりも小さくすることができる。
【０１０９】
発振を持続する周波数範囲は、生分解性プラスチック膜の膜厚で決まるが、この膜厚を比較例１の沈殿物を堆積させる方法において発振が持続する限界となる沈殿物の膜厚に比べて大きくしても、弾性波の減衰が小さく抑えられ、発振させることが可能である。結果として、発振を持続する周波数範囲を、従来の沈殿物を堆積させる比較例１のような方法と比べ、広くできる。
【０１１０】
＜実施例６＞  実施例６の弾性波センサ１ｔについて、図１１を参照しながら説明する。
【０１１１】
図１１は、実施例６の弾性波センサ１ｔの要部断面図である。図１１に示すように、弾性波センサ１ｔは、水晶基板６ｔの両面に電極９ａ，９ｂが形成された水晶共振子であり、一方の電極９ａの上に反応膜８ｔが形成されている。
【０１１２】
実施例６の弾性波センサ１ｔは、実施例１の弾性波センサ１と同様に、化学反応による反応膜８ｔの質量変化に伴い変化する発振周波数を測定することにより、検出対象の存在及びその量を測定することができる。
【０１１３】
＜まとめ＞  以上のように、弾性波センサは、酵素との直接的あるいは間接的な化学反応により反応膜の質量が減少すると、反応膜による弾性波素子への質量負荷が変化し、弾性波素子の周波数が変化することから、抗原を検出することができる。
【０１１４】
酵素は触媒として機能するため、反応膜の化学反応は反応膜がなくなるまで起り、従来のように抗体を弾性波素子の上に形成する場合と比べ、より大きな周波数変化量が得られる。その結果、弾性波センサの高感度化を図ることができる。
【０１１５】
また、検体に含まれる抗原を捕獲した酵素標識抗体の酵素との化学反応により、弾性波センサの反応膜の質量を減少させることができるため、検体に含まれる抗原の数量を正確に検出することができる。検体に含まれる抗原に応じて酵素標識抗体を選択することにより、検体に含まれる抗原の種類を正確に判定することができる。そのため、センシングの安定性、再現性に優れる。
【０１１６】
なお、本発明は、上記実施の形態に限定されるものではなく、種々変更を加えて実施することが可能である。
【０１１７】
例えば、弾性波素子上に形成される反応膜は、被測定物質と直接的あるいは間接的な化学反応により質量が減少するものであればよく、酵素の直接的あるいは間接的な化学反応によって質量が減少するもの以外であってもよい。
【符号の説明】
【０１１８】
１，１ａ，１ｂ  弾性波センサ
２  弾性波素子
３Ａ，３Ｂ  ＩＤＴ電極
４，５  反射器
６  圧電基板
７  蓋（媒体）
８  反応膜
８ａ  プロテイン膜（反応膜）
８ｂ  ＺｎＯ膜（反応膜）
２０，２２  抗原（被測定物質）
３０  プロテアーゼ標識抗体（酵素標識抗体）
３１  プロテアーゼ（酵素）
３２  抗体
３４  アルデヒド分解酵素標識抗体（酵素標識抗体）
３５  アルデヒド分解酵素（酵素）
３６  抗体
４０  磁気ビーズ標識抗体（媒体標識抗体）
４１  磁気ビーズ（媒体）
４２，４４  抗体
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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