(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式ＩＩＩで表される化学構造からなる化合物の合成方法であって、
ａ）ニコチンアミドリボシルキナーゼ（ＮＲＫ）酵素を用いて式Ｉ
0005540096.tif 000014
（上式中、Ｒ１はＯＨ、ＮＨ２、Ｏ−メチル又はＮ−ジメチル、メチルであり、Ｙ−は対イオンであり、ＸはＯ又はＳである）
の化合物をリン酸化し、
ｂ）ニコチンアミド モノヌクレオチドアデノシルトランスフェラーゼ（ＮＭＮ−ＡＴ）酵素を用いて工程ａ）のリン酸化生成物を式ＩＩ
0005540096.tif 000015
（上式中、Ｒ２はＮＨ２、ＯＨ、又はＮＨアルキルであり、
Ｒ３はＨ、ＯＨ又はＮＨ２である）
の化合物でアデニル化し、
よって、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｙ−及びＸが上の定義の通りである式ＩＩＩ
0005540096.tif 000016
のカルバ-ＮＡＤ又はそのアナログを得ること
を含んでなる方法。
【請求項２】
上記ＮＲＫ酵素が、サッカロマイセス・セレビシエ、シュードモナス・エルジノーサ、ストレプトコッカス・サンギニウス及びホモ・サピエンス由来のＮＲＫから選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
上記ＮＭＮ−ＡＴが、バチルス・スブチリス、エシェリキア・コリ、メタノコックス・ジャナスキ、スルホロブス・ソルファタリカス、サッカロマイセス・セレビシエ及びホモ・サピエンス由来のＮＭＮ−ＡＴからなる群から選択される請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
式Ｉの化合物において、Ｒ１がＯＨ、ＮＨ２、及びＯ−メチルからなる群から選択される請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項５】
式ＩＩの化合物において、Ｒ２がＮＨ２又はＯＨである請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項６】
式ＩＩの化合物において、Ｒ３がＨ又はＯＨである請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項７】
式Ｉの化合物において、ＸがＯである請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
Ｒ１がＮＨ２であり、Ｒ２がＮＨ２であり、Ｒ３がＨであり、ＸがＯである請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、いわゆる「カルバ−ＮＡＤ」、つまりリボースの代わりにカルバ環糖(carbacyclic sugar)を含むそれぞれＮＡＤ／ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨのアナログであるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドＮＡＤ／ＮＡＤＨ及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨの安定なアナログの酵素合成に関する。
【背景技術】
【０００２】
生化学分析のための測定系は臨床的に関連する分析法の重要な成分である。これは、酵素を用いて直接的に又は間接的に決定される例えば代謝産物又は基質のような分析物の測定に主に関する。しばしば、興味ある分析物は酵素・補酵素複合体を用いて転換され、ついでこの酵素反応を介して定量される。このプロセスにおいて、適切な反応条件下で定量される分析物は適切な酵素及び補酵素に接触せしめられ、それによって補酵素が酵素反応によって例えば酸化又は還元等、変化させられる。このプロセスは直接的に又はメディエーターによって電気化学的に又は測光的に検出されうる。通常、較正曲線が測定値と興味ある分析物の間の直接的相関をもたらし、それによって分析物濃度を決定することができる。
【０００３】
補酵素は酵素に共有的に又は非共有的に結合される有機分子であり、分析物の転換により変化せしめられる。補酵素の著名な例は、それからＮＡＤＨとＮＡＤＰＨがそれぞれ還元によって形成されるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）とニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰ）である。米国特許出願公開第２００８／０２１３８０９号に記載されているように、常套的な測定系の不具合、例えば限られた有効期間、改善された有効期間を達成するための冷却又は乾燥貯蔵のような貯蔵条件に対する特別な要求は少なくとも、そこに開示された安定なニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ／ＮＡＤＨ）及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨ）誘導体によってかなり克服できる。これらの安定なＮＡＤ（Ｐ）Ｈアナログは、例えば血糖自己測定におけるようにエンドユーザー自身によって実施される試験の場合に特に重要である、間違った看過された不完全な保管によって引き起こされる誤った結果を避けるのに適している。
【０００４】
米国特許出願公開第２００８／０２１３８０９号に記載されているように、カルバ−ＮＡＤの化学合成は、極めて困難であり、少なくとも８の合成工程を必要とし、かなり低収量で、よって全体的にかなり費用がかかる。カルバ−ＮＡＤの合成の化学的経路を図１に示す。合成の代替経路が緊急に必要とされている。
【０００５】
よって、本発明の目的は、煩わしさが少なく、高収率で、魅力的に低いコストでカルバ-ＮＡＤを提供することである。
驚いたことに、カルバ-ＮＡＤを高い費用効率かつ簡便な方法で提供するために一般化学の代わりに酵素を利用することができることが今見出された。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、カルバ−ＮＡＤ又はそのアナログを酵素的に合成する方法であって、ａ）３−カルバモイル−１−(２，３−ジヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−シクロペンチル)−ピリジニウム−メタンスルホネート又はそのアナログをＮＲＫ酵素によってリン酸化し、ｂ）工程（ａ）のリン酸化生成物を、ＮＭＮ−ＡＴ酵素を用いてアデノシン又は構造的に関連した化合物でアデニル化し、それによってカルバ−ＮＡＤ又はそのアナログを得る工程を含んでなる方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
好ましい実施態様において、本発明は、カルバ−ＮＡＤ又はそのアナログの合成方法であって、
ａ）ニコチンアミドリボシルキナーゼ（ＮＲＫ）酵素を用いて式Ｉ
0005540096.tif 000002
（上式中、Ｒ１はＯＨ、ＮＨ２、Ｏ−メチル又はＮ−ジメチル、メチルであり、Ｙ−は対イオンであり、ＸはＯ又はＳである）
の化合物をリン酸化し、
ｂ）ＮＭＮ−ＡＴ酵素を用いて工程（ａ）のリン酸化生成物を式ＩＩ
0005540096.tif 000003
（上式中、Ｒ２はＮＨ２、ＯＨ、又はＮＨアルキルであり、
Ｒ３はＨ、ＯＨ又はＮＨ２である）
の化合物でアデニル化し、
よって、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｙ−及びＸが上の定義の通りである式ＩＩＩ
0005540096.tif 000004
のカルバ−ＮＡＤ又はそのアナログを得ること
を含んでなる方法に関する。
【０００８】
上記方法はまた図２に示された反応スキームによって例証される。
「カルバ−」なる用語は、リボシル糖残基の代わりに、２，３−ジヒドロキシシクロペンタンが存在していることを示すために使用される。換言すれば、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ’）のカルバ−アナログは、２，３−ジヒドロキシシクロペンタン環がニコチンアミドリボシド部分のＤ−リボヌクレオチド環に換わることを除いて、（ＮＡＤ’）と同一である化合物である（Slama, J.T.及びSimmons, A.M., Biochemistry 27 (1988) 1831）。
【０００９】
酵素は、それが存在しない場合には厳しい条件を必要とするか又はしばしば達成するのが殆ど不可能でさえある反応が、程度の差はあれ、生理学的条件で起こることを可能にする非常に特異的な触媒として知られている。そのような特定の反応を実施することができるためには、また淘汰圧下での世代間を通した進化の結果、酵素は、基質特異性に関してと、触媒される反応に関しての双方で非常に特異的になる傾向がある。今、驚いたことに、ニコチンアミドリボシルキナーゼが、基質としてリボシル残基の代わりに２，３，ジヒドロキシシクロペンタン環を含む式Ｉのピリジニウム化合物を受容し、これらの化合物をリン酸化することができることが見出された。
【００１０】
国際酵素命名法に従ってニコチンアミドリボシルキナーゼ（ＮＲＫ）は、クラスＥＣ２．７．１．２２（ＡＴＰ：Ｎ−リボシルニコチンアミド５’−ホスホトランスフェラーゼ）にグループ化される。好ましくは、クラスＥＣ２．７．１．２２から選択される酵素が、式Ｉの化合物をリン酸化するために本発明に係る方法において使用される。好ましいＮＲＫは、サッカロマイセス・セレビシエ、シュードモナス・エルジノーサ、ストレプトコッカス・サンギニウス(sanguinius)及びホモ・サピエンスから知られているものである。また好ましくは、本発明に係る方法において使用されるＮＲＫはストレプトコッカス・サンギニウス及びホモ・サピエンスから知られているものである。好ましい一実施態様では、本発明に係る方法における第一工程を実施するためにホモ・サピエンスからとして知られているＮＲＫ１が使用される。
【００１１】
式Ｉに示されるように、Ｒ１がＮＨ２であるカルバ−ニコチンアミドばかりでなく、Ｒ１に対して与えられた別のものによって定義され、まとめられるカルバ−ニコチンアミドアナログのような他の化合物がある種のＮＲＫ酵素に対して適した基質を表す。本発明の開示を武器にすれば、ＲＮＫ酵素によって効果的にリン酸化されるその能力について式Ｉの化合物並びに関連化合物を調査することは当業者には問題がないであろう。好ましくは、式Ｉに定義されたピリジニウム化合物は本発明に係る方法において酵素的リン酸化に使用される。ニコチンアミドに対するアナログは、Ｒ１がＮＨ２ではない式Ｉに定義された化合物である。好ましくは、式ＩのＲ１は、ＯＨ、ＮＨ２及びＯ−メチルからなる群から選択される。好ましい一実施態様では、Ｒ１はＯＨであり、更に他の好ましい一実施態様では、Ｒ１はＮＨ２である。Ｒ１又はＲ２中のアルキルは好ましくはＣ１からＣ６の直鎖状又は分枝状アルキル、好ましくは直鎖状アルキルである。
【００１２】
式Ｉ中の残基ＸはＯ又はＳのいずれかであり得る。好ましい一実施態様では、式Ｉ中のＸはＯである。
対イオンＹ−は、好ましくは、メチルスルホネート、Ｃｌ−、ＰＦ６−、ＢＦ４−、及びＣｌＯ４−からなる群から選択される。また好ましくは、対イオンはＢＦ４−又はメチルスルホネートである。
【００１３】
驚いたことに、ニコチンアミドヌクレオチドアデニルイルトランスフェラーゼ（ＮＭＮ−ＡＴ）は、上述のようにして得られたリン酸化カルバ−ニコチンアミドをアクセプター分子として使用することができ、これらの化合物をアデニル化することができる。カルバ−ＮＡＤ又はそのアナログの酵素合成の第二工程では、ニコチンアミドモノヌクレオチドアデニルイルトランスフェラーゼがよってアデニル残基又はそのアナログをリン酸化カルバ−ニコチンアミド又はそのアナログに移動させるために使用され、それによってカルバ−ＮＡＤ又はそのアナログが形成される。
【００１４】
国際酵素命名法に従ってニコチンアミドヌクレオチドアデニルイルトランスフェラーゼ（ＮＭＮ−ＡＴ）はクラスＥＣ２．７．７．１（ＡＴＰ：ニコチンアミド−ヌクレオチドアデニルイルトランスフェラーゼ）に分類される。好ましくは、クラスＥＣ２．７．７．１から選択される酵素が、本発明に係る方法において、式Ｉのリン酸化化合物を式ＩＩに記載の化合物でアデニル化するために使用される。好ましいＮＭＮ−ＡＴは、バチルス・スブチリス、エシェリキア・コリ、メタノコックス・ジャナスキ、スルホロブス・ソルファタリカス、サッカロマイセス・セレビシエ及びホモ・サピエンスから知られているものである。好ましい一実施態様では、ホモ・サピエンスから知られ、例えばエシェリキア・コリ又はバチルス・スブチリスにおいて発現されるＮＭＮ−ＡＴが本発明に係る方法において第二の酵素反応を実施するために使用される。アデニル基ばかりでなくそのアナログをまた本発明において開示された方法においてＮＭＮ−ＡＴに対する基質として使用できるという事実にかかわらず、便宜上、アデニル化する、アデニル化された、又はアデニル化という用語は全てのこれらの物質に対して同等に使用される。
【００１５】
また驚いたことに、カルバＮＡＤ又はそのアナログの酵素合成における両工程を単一の反応混合物中で実施することができることが観察された。また更に好ましい実施態様では、本発明は、カルバ−ＮＡＤ又はそのアナログを酵素的に合成する方法であって、ａ）３−カルバモイル−１−(２，３−ジヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−シクロペンチル)−ピリジニウム−メタンスルホネート又はそのアナログをＮＲＫ酵素によってリン酸化し、ｂ）工程（ａ）のリン酸化生成物を、ＮＭＮ−ＡＴ酵素によってアデノシン又は構造的に関連した化合物でアデニル化し、それによってカルバ−ＮＡＤ又はそのアナログを得る工程を具備し、ここで両酵素反応が一つの反応混合物中で実施される方法に関する。
【００１６】
驚いたことに、本発明において開示された方法に基づいて、カルバモイル−１−(２，３−ジヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−シクロペンチル)ピリジニウムの１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒエナンチオマーに基づくｃＮＡＤの生物学的に関連したエナンチオマーを純粋な形態及び高収率で得ることができることが見出された。好ましい実施態様では、本発明において開示された方法は、カルバモイル−１−(２，３−ジヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−シクロペンチル)−ピリジニウムの１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒエナンチオマーを含むｃＮＡＤを合成するために使用される。
【００１７】
式ＩＩに示されるように、アデノシン−トリ−ホスフェートばかりでなく、他の構造的に関連した化合物もまた式ＩＩにおけるＲ２及びＲ３それぞれに対して与えられた定義によって特徴付けられまとめられる。式ＩＩにおいてそれぞれ様々な可能な組み合わせのＲ２及びＲ３を持つ化合物がある種のＮＭＮ−ＡＴ酵素に対して適した基質を表す。本発明の開示を武器にすれば、ＮＭＮ−ＡＴ酵素によって効果的にアデニル化されるその能力について式ＩＩの化合物並びに構造的に関連した化合物を調査することは当業者には問題がないであろう。アデノシンと構造的に関連した化合物は、それぞれＲ２がＮＨ２ではなく、Ｒ３がＨではない式ＩＩで定義される化合物である。好ましくは、式ＩＩにおいてそれぞれＲ２及びＲ３に対して与えられた基を介して定義されるプリン化合物は、リン酸化カルバ−ニコチンアミド又はそのアナログの酵素アデニル化に使用される。
【００１８】
更に好ましい実施態様では、本発明は、式ＩＩの化合物に関し、ネブラリン、ホルマイシン、アリステロマイシン、７デアザ−アデノシン、７デアザ−グアノシン、７デアザ−イノシン、７デアザ−キサントシン、７デアザ２，６−ジアミノオウリン、７デアザ８アザ−アデノシン、７デアザ８アザ−グアノシン、７デアザ８アザ−イノシン、７デアザ８アザ−キサントシン、７デアザ８アザ２，６−ジアミノオウリン、８アザ−アデノシン、８アザ−グアノシン、８アザ−イノシン及び８アザ−キサントシン及び８アザ２，６−ジアミノプリンのトリホスフェートからなる群から選択される化合物の使用に関する。これらの化合物は、本発明に係る方法においてニコチンアミドのカルバアナログを含む対応のジヌクレオチドを製造するためにまた使用できる。
【００１９】
好ましくは、式ＩＩのＲ２はＮＨ２又はＯＨからなる群から選択される。好ましい一実施態様では、Ｒ２はＯＨであり、更に他の好ましい一実施態様では、Ｒ２はＮＨ２である。好ましくは、式ＩＩのＲ３は、Ｈ又はＯＨからなる群から選択される。好ましい一実施態様では、Ｒ３はＨである。
【００２０】
好ましい一実施態様では、本発明に係る方法は、Ｒ１がＮＨ２であり、Ｒ２がＮＨ２であり、Ｒ３がＨであり、ＸがＯである式Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩに与えられた化合物で実施される。
【００２１】
当業者には明らかなように、カルバ−ＮＡＤ又はそのアナログは、それぞれ補酵素又は補因子としてＮＡＤを必要とする様々な異なった酵素と正確に同じようには作用しないであろう。しかしながら、今問題の選択肢から適切なアナログを選択するのは当業者には問題はないであろう。
【００２２】
次の実施例及び図面は本発明の理解を助けるために提供されるもので、本発明の真の範囲は添付の特許請求の範囲に記載される。本発明の精神を逸脱しないで記載された手順において変更を加えることができることは理解される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１はカルバ−ＮＡＤ（ｃＮＡＤ）を化学的に合成するために使用される標準的な経路を図で示している。与えられたパーセントで示されるように、この手順による全収率はかなり低い。
【図２】図２は本発明に開示されたカルバ−ＮＡＤの合成において使用される二つの酵素段階で模式的に例証する。
【実施例】
【００２４】
実施例１：
５-ジメチルアミノ-４-メトキシカルボニル-ペンタ-２,４-ジエニリデン-ジメチル-アンモニウムテトラフルオロボレートの合成
実施例１．１：メチル−(２Ｅ)−３−(３−ジメチルアミノ)プロパ−２−エノエートの合成
0005540096.tif 000005
７００ｍｌの無水ＴＨＦ中のメチルプロピオレート（６８．０ｍｌ，０．７６４ｍｏｌ）の溶液に同じ溶媒（３９２ｍｌ，０．７８３ｍｏｌ）中のＮ，Ｎ−ジメチルアミンの２Ｍ溶液を室温で１時間以内に添加した。溶媒の除去後、エバポレーターで１時間（３７℃、１０−２０ｍｂａｒ）乾燥させ、淡黄色の固形物を生じた。粉砕した固形物をｎ−ヘキサンで洗浄して、ＴＬＣ及び１Ｈ ＮＭＲに従って純粋であった９３．０ｇ（９４％）のメチル−(２Ｅ)−３−(３−ジメチルアミノ)プロパ−２−エノエートを得た。
【００２５】
実施例１．２：ピリジニウムテトラフルオロボレートの合成
0005540096.tif 000006
テトラフルオロホウ酸（２５０ｍｌ，２．００ｍｏｌ）を加えてピリジン（１５７．７ｍｌ，１．９５ｍｏｌ）を２５分以内に冷却し（０℃）、無色沈殿物を得た。酸を完全に添加した後、混合物を同じ温度で更に３０分攪拌した。ついで、反応混合物を濾過した。残留物を冷エタノールで洗浄し、高真空下で１２時間乾燥させて、２０１．９ｇ（６０％）のピリジニウムテトラフルオロボレートを無色の結晶として得た。
【００２６】
実施例１．３：５−ジメチルアミノ−４−メトキシカルボニル−ペンタ−２，４−ジエニリデン−ジメチル−アンモニウムテトラフルオロボレートの合成
0005540096.tif 000007
ピリジニウムテトラフルオロボレート（２８３．７ｇ，１．７０ｍｏｌ）を４４２．５ｍｌの無水酢酸／酢酸（２：１）中のメチル−(２Ｅ)−３−(３−ジメチルアミノ)プロパ−２−エノエートの溶液に加えた。得られた懸濁液を０℃に冷却し、激しく攪拌し、氷浴で冷却しながら３−ジメチルアミノアクロレイン（１６９．９ｍｌ，１．７０ｍｏｌ）をゆっくり（３時間）加え、黄褐色の沈殿物を得た。室温で２時間更に攪拌した後、反応混合物を濾過した。残りの固形物をジエチルエーテルで数回洗浄し、減圧下で乾燥させた。ｉ−プロパノール／エタノール（２：１）からの結晶化により、３２６．７ｇ（６５％）のペンタメチニウム塩が黄色結晶として得られた。
【００２７】
実施例２：
２，３−ジヒロキシ−４−ヒドロキシメチル−１−アミノシクロペンタンの合成
0005540096.tif 000008
ＥｔＯＨ中のＫＯＨの１Ｍ溶液（５４．５ｍｌ，５４．５ｍｍｏｌ）を、５４０ｍｌのＥｔＯＨに溶解した塩酸塩の冷却（０℃）溶液に加えた。室温で１５分攪拌した後、形成された無色の沈殿物を濾過によって除去した。濾液を減圧下で濃縮した。残りの油をエバポレーター（１時間、４０℃）で乾燥させて、９．０１ｇ（１１２％）のアミノカルバリボースを淡黄色の油として得た。得られた生成物は、更なる精製なしに次の工程で使用される。
この手順は、(１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ)−２，３−ジヒロキシ−４−ヒドロキシメチル−１アミノシクロペンタン及びそのエナンチオマーの合成に使用される。
【００２８】
実施例３：
１−(２，３−ジヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−シクロペンチル)−３−メトキシカルボニル−ピリジニウム−メタンスルホネートの合成
0005540096.tif 000009
ビナミジニウム塩（２９８．１ｇ，１．００ｍｏｌ）を１５００ｍｌのＤＭＦに溶解させ、１当量のメタンスルホン酸（６５．０２ｍｌ，１．００ｍｏｌ）を加えた。この混合物を、１２５０ｍｌのＭｅＯＨ中の３−アミノ−５−ヒドロキシメチル−シクロペンタン−１，２−ジオール（１６５．３ｇ，０．９０ｍｏｌ）及び３−アミノ−５−ヒドロキシメチル−シクロペエンタン−１，２−ジオール（２５．８ｇ，０．１５ｍｏｌ）の還流溶液（９０℃）に連続的に非常にゆっくりと（５時間以内）滴下した。ビナミジニウム塩溶液を完全に添加した後、反応混合物を室温まで冷却し、再び０．１５当量のメタンスルホン酸を加えた。混合物を同じ温度で１２時間攪拌した。減圧下で溶媒を除去した後、赤褐色の油を得、これを更に３時間（４５℃、４ｍｂａｒ）乾燥させた。収量：６９３．０ｇ（１９１％，塩及び多量の溶媒を含む）。
この手順は、３−メトキシカルボニル−１−((１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ)−２，３−ジヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−シクロペンチル)−ピリジニウム塩及びそのエナンチオマーの合成に使用される。
【００２９】
実施例４：
３−カルバモイル−１−(２，３−ジヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−シクロペンチル)−ピリジニウム−メタンスルホネート
実施例３からの粗１−(２，３−ジヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−シクロペンチル)−３−メトキシカルボニル−ピリジニウム−メタンスルホネート材料を更なる精製なしに対応するアミドに迅速に転換した。
0005540096.tif 000010
粗１−(２，３−ジヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−シクロペンチル)−３−メトキシカルボニル−ピリジニウム−メタンスルホネート１１８．３ｇ，１７３．７ｍｍｏｌ）を１００．０ｍｌのメタノールに溶解させた。メタノール性アンモニア（７Ｍ，３５０．０ｍｌ，２．４５ｍｏｌ）の添加後、反応混合物を２．５時間攪拌した。減圧下で溶媒を除去した後、赤褐色の油を得、これを更に３時間（４０℃、１０ｍｂａｒ）乾燥させた。この粗生成物は活性炭で前もって精製し、例えばｃＮＡＤの合成に対して（国際公開第２００７／０１２４９４号）又はここで以下に記載されるｃＮＡＤの酵素合成において直接使用される。
【００３０】
本発明に係る方法において使用するのに適した他の化合物、例えば式Ｉに定義される化合物は、上記実施例１から４に与えられた手順に類似した形で合成することができる。
この手順は、３−カルバモイル−１−((１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ)−２，３−ジヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−シクロペンチル)−ピリジニウム塩及びそのエナンチオマーの合成に使用される。
【００３１】
実施例５：
ニコチンアミド リボシルキナーゼを用いた式Ｉに係る幾つかの化合物の酵素的リン酸化
0005540096.tif 000011
１２，１４，１７の純粋な(１Ｒ,２Ｓ,３Ｒ,４Ｒ)エナンチオマー
各１００ｍｇ／ｍｌ：                                            １００μｌ
ＴＲＩＳ×ＨＣｌバッファーｐＨ７．５，１５ｍＭ ＭｇＣｌ２：      ９６０μｌ
ＡＴＰ溶液１００ｍＭ／ｌ：                                      ４０μｌ
リン酸クレアチンフォスフェート：                                １４．５ｍｇ
クレアチンキナーゼ：                                            ０．１ｍｇ
ニコチンアミドリボシルキナーゼ，０．７Ｕ／ｍｌ                  ２３０μｌ
（組換え型ＮＲＫ１，ホモ・サピエンス由来（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ＩＤ：Ｑ９ＮＷＷ６）又はＮＲＫ（ｎａｄＲ），ストレプトコッカス・サンギニウス由来（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ＩＤ：Ａ３ＣＱＶ５），エシェリキア・コリ中で異種性に発現）。
【００３２】
一般的作業手順：
クレアチンホスフェート（１４．５ｍｇ）及びクレアチンキナーゼ（０．１ｍｇ）を、ＴＲＩＳバッファー（ｐＨ７．５，１５ｍＭ ＭｇＣｌ２，９６０μｌ）及びＡＴＰ（Ｈ２Ｏ中１００ｍＭ／ｌ，４０μｌ）の混合物に溶解させた。ついで、リボシド（上記の化合物１４又はアナログ）の溶液（Ｈ２Ｏ中１００ｍｇ／ｍｌ，１００μｌ）と続いてリボシルキナーゼ（０．７Ｕ／ｍｌ，２３０μｌ）を添加した。反応混合物を３７℃で１６時間インキュベートした。８０℃で短い間温めた後、混合物を濾過し、ＨＰＬＣによって調べた。
３例（化合物１４、１２又は１７）の全てにおいて、リボシドの完全な消費と新規化合物の形成（それぞれ上に化合物１５、１６又は１８として与えた対応のリン酸化産物）をＨＰＬＣによって検出することができた。
所望のリン酸化産物の正確な質量はＬＣ／ＭＳによって見出した：（ＭＳ：ＥＳＩ：Ｍ−＝３３０．７５（化合物１５），３４５．７４（化合物１６），３５８．７９（化合物１８））。
化合物１５はカチオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘで水で溶出するクロマトグラフィーを使用して精製する。
【００３３】
実施例６：
それぞれＮＭＮ−ＡＴを用いたカルバ−ニコチンアミド及びそのアナログの酵素的転換
0005540096.tif 000012
それぞれ物質１５、１６及び１８（実施例５の酵素的リン酸化からの粗物質）
おおよそ                                                      １０．０ｍｇ
物質１９（アデノシントリホスフェート，二ナトリウム塩）        ２２．６ｍｇ
ＮＭＮ−ＡＴ：，（３２Ｕ／ｍｌ）                      ４．８μｌ（０．１５３Ｕ）
（組換え型ニコチンアミドモノヌクレオチド−アデノシルトランスフェラーゼ（ＮＭＮ−ＡＴ），ホモ・サピエンス由来（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ＩＤ：Ｑ９ＨＡＮ９）。あるいは、例えばＮＭＮ−ＡＴ、エシェリキア・コリ由来（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ０Ａ７５２）又はバチルス・スブチリス由来（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ ＩＤ：Ｐ５４４５５）、エシェリキア・コリ中で異種性に発現、を使用）
【００３４】
作業手順：
ＡＴＰ二ナトリウム塩（２２．６ｍｇ）及びニコチンアミドモノヌクレオチドアデノシルトランスフェラーゼ（ＮＭＮ−ＡＴ，４．８μｌ，０．１５３Ｕ）を、モノヌクレオチドを含む酵素的リン酸化から得られた濾過液（化合物１５又はアナログ、例えば化合物１６及び１８）に加えた。反応混合物を３７℃で１８時間インキュベートした。８０℃で短い間温めた後、混合物を濾過し、ＨＰＬＣ及びＬＣ／ＭＳによって調査した。
３例全ての実験において、モノヌクレオチド（化合物１５，１６又は１８）の完全な消費及び新規化合物の形成はＨＰＬＣによって検出することができた。
化合物２０の正確な質量を見出した（ＭＳ：ＥＳＩ：Ｍ−＝６５９．７７）。
【００３５】
実施例７：
カルバ−ニコチンアミドへの３−カルバモイル−１−（（１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−シクロペンチル）−ピリジニウム塩の転換のワンポット手順
１ｇ（２．１６ｍｍｏｌ）の３−カルバモイル−１−（（１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−シクロペンチル）−ピリジニウム；クロリド，０．２４２ｇ（０．４ｍｍｏｌ）ＡＴＰ二ナトリウム塩，３００ｍｇのＭｇＣｌ２×６Ｈ２Ｏ（１．４５ｍｍｏｌ）１６Ｕのリボシルキナーゼ、１．４５ｇ（４．４３ｍｍｏｌ）クレアチンホスフェート及び４．２７ｋＵのクレアチンキナーゼを２５ｍｌの滅菌水に溶解させた。混合物を３５℃で一晩インキュベートした。ついで、２．４２ｇ（４ｍｍｏｌ）のＡＴＰ二ナトリウム塩、４４０ｍｇのＭｇＣｌ２×６Ｈ２Ｏ（２．１６ｍｍｏｌ）及び３２ＵのＮＭＮＡＴを加えた。混合物を３５℃で一晩インキュベートした。ついで、それを９０℃に５分間加熱し、冷却後に濾過した。精製は国際公開第２００７／０１２４９４号に記載されたイオン交換クロマトグラフィーを使用して実施した。
【００３６】
実施例８：
エナンチオマー３−カルバモイル−１−（（１Ｓ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ））−２，３−ジヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−シクロペンチル）−ピリジニウム塩の存在下でのカルバ−ニコチンアミドへの３−カルバモイル−１−（（１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−シクロペンチル）−ピリジニウム塩の転換
３−カルバモイル−１−（（１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−シクロペンチル）−ピリジニウム；クロリド及び３−カルバモイル−１−（（１Ｓ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−２，３−ジヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−シクロペンチル）−ピリジニウム；クロリド０．２４２ｇ（０．４ｍｍｏｌ）、ＡＴＰ二ナトリウム塩、３００ｍｇのＭｇＣｌ２×６Ｈ２Ｏ（１．４５ｍｍｏｌ）の１６Ｕのリボシルキナーゼ、１．４５ｇ（４．４３ｍｍｏｌ）のクレアチンホスフェート及び４．２７ｋＵのクレアチンキナーゼからなる１ｇ（２．１６ｍｍｏｌ）の１：１混合物を２５ｍｌの滅菌水に溶解させた。混合物を３５℃で一晩インキュベートした。反応を逆相ＨＰＬＣ分析（ＯＤＳ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ，５μｍ，２５０×４．６ｍｍ Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐａｒｔ−Ｎｒ．：３０１０５−２５４６３０，溶出剤Ａ＝０．１ＭのトリエチルアンモニウムアセテートｐＨ７．０，溶出剤Ｂ＝０．２Ｌの０．１Ｍのトリエチルアンモニウムアセテート。ｐＨ７．０＋０．８Ｌのアセトニトリル，勾配２分０％のＢ，２３分１００％のＢ，流量１ｍｌ／分，検出：ＵＶ／２６０ｎｍ）によってモニターし、両エナンチオマーがリン酸化されたことが示された。２．９６分の３−カルバモイル−１−（（１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−２，３−ジヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−シクロペンチル）−ピリジニウム；クロリド及び（１Ｓ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）エナンチオマーに対応するピークは消え、３．４５分のリン酸化生成物に対応する新しいピークが現れる。
【００３７】
ついで、２．４２ｇ（４ｍｍｏｌ）ＡＴＰ二ナトリウム塩、４４０ｍｇのＭｇＣｌ２×６Ｈ２Ｏ（２．１６ｍｍｏｌ）及び３２ＵのＮＭＮ−ＡＴを添加した。混合物を３５℃で一晩インキュベートした。その後、それを９０℃に５分間加熱し、冷却後濾過した。逆相ＨＰＬＣ分析は、ｃＮＡＤに対応する７．９２分にピークを示す。３．４５分には、リン酸化（１Ｓ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）エナンチオマーに対応するピークが残っている。アルカリホスファターゼの添加時に７．９２のピークは影響されないが、３．４５分のリン酸化（１Ｓ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）エナンチオマーのピークは消え、２．９６分に３−カルバモイル−１−（（１Ｓ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−２，３−ジヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−シクロペンチル）−ピリジニウム塩に対応するピークが現れる。よって、ｃＮＡＤ（１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒエナンチオマーに基づく）はもたらされない一方、残存するリン酸化（１Ｓ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）エナンチオマーはアルカリホスファターゼによって脱リン酸化される。
【００３８】
コントロールとして、３−カルバモイル−１−（（１Ｓ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−２，３−ジヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−シクロペンチル）−ピリジニウム；クロリドだけを使用して同じ実験を実施し、ＨＰＬＣによってモニターした。リボシルキナーゼの添加時に（リン酸化エナンチオマーに対応する）３．４５分にピークの形成があったが、７．９２分の保持時間でのピークは、ＮＭＮ−ＡＴ添加後のＨＰＬＣクロマトグラムには見出されなかった。
【００３９】
よって、（１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ及び１Ｓ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）エナンチオマーからなる２，３−ジヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−１−アミノシクロペンタンのエナンチオマー混合物を用いたｃＮＡＤの合成を開始し、本発明において開示された方法だけによって、生物学的に関連したｃＮＡＤを得ることができる。
【００４０】
ついで、２．４２ｇ（４ｍｍｏｌ）のＡＴＰ二ナトリウム塩、４４０ｍｇのＭｇＣｌ２×６Ｈ２Ｏ（２．１６ｍｍｏｌ）及び３２ＵのＮＭＮ−ＡＴが添加された。混合物を３５℃で一晩インキュベートした。その後、それを５分間９０℃まで加熱し、冷却後、濾過した。ＨＰＬＣ分析は、ｃＮＡＤに対応する７．９２分にピークを示す。３．４５分には、リン酸化（１Ｓ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）エナンチオマーに対応するピークが残っている。アルカリホスファターゼの添加時に７．９２のピークは影響されないが、３．４５分のリン酸化（１Ｓ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）エナンチオマーのピークは消え、２．９６分に３−カルバモイル−１−（（１Ｓ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−２，３−ジヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−シクロペンチル）−ピリジニウム塩に対応するピークが現れる。よって、ｃＮＡＤ（１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒエナンチオマーに基づく）はもたらされない一方、残存するリン酸化（１Ｓ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）エナンチオマーはアルカリホスファターゼによって脱リン酸化される。
【００４１】
コントロールとして、３−カルバモイル−１−（（１Ｓ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）−２，３−ジヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−シクロペンチル）−ピリジニウム；クロリドだけを使用して同じ実験を実施し、ＨＰＬＣによってモニターした。リボシルキナーゼの添加時に（リン酸化エナンチオマーに対応する）３．４５分にピークの形成があったが、７．９２分の保持時間でのピークは、ＮＭＮ−ＡＴ添加後のＨＰＬＣクロマトグラムには見出されなかった。
【００４２】
よって、（１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ及び１Ｓ，２Ｒ，３Ｓ，４Ｓ）エナンチオマーからなる２，３−ジヒドロキシ−４−ヒドロキシメチル−１−アミノシクロペンタンのエナンチオマー混合物を用いたｃＮＡＤの合成を開始し、本発明において開示された方法によって、生物学的に関連した１Ｒ，２Ｓ，３Ｒ，４Ｒエナンチオマーだけに基づいてｃＮＡＤを得ることができる。
【００４３】
実施例９：
ＮＭＮ−ＡＴ及びＮ６ヘキシルアミノＡＴＰを用いたカルバ−ニコチンアミドモノヌクレオチド（物質１５）の酵素的転換
0005540096.tif 000013
一般的作業手順：
Ｎ６−ヘキシルアミノＡＴＰ二ナトリウム塩Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（０．３３ｍｇ）及びニコチンアミドモノヌクレオチドアデノシルトランスフェラーゼ（ＮＭＮ−ＡＴ，４．８μｌ，０．１５３Ｕ）を１ｍｇの１５の溶液に加えた。反応混合物を３７℃で１８時間インキュベートした。８０℃に短い間温めた後、混合物を濾過し、ＨＰＬＣ及びＬＣ／ＭＳによって調べた。
カルバ−ＮＭＮ（化合物１５）は完全に消費し、新規化合物（対応するアデノシル誘導体）がＨＰＬＣによって検出された。
正確な質量が見出された（ＭＳ：ＥＳＩ：Ｍ−＝７５９．７７）。
【図１】
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【図２】
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