(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）５’アルファウイルス複製認識配列をコードする核酸配列と、
（ｂ）アルファウイルス非構造タンパク質をコードする核酸配列と、
（ｃ）５’から３’の方向に、アルファウイルスサブゲノムプロモーター−ＩＲＥＳ−目的の異種核酸（ＮＯＩ）であるカセットと、
（ｄ）３’アルファウイルス複製認識配列をコードする核酸と
を含む組換えレプリコン核酸。
【請求項２】
前記（ｂ）の核酸は、アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３およびｎｓｐ４をコードする連続ヌクレオチド配列である、請求項１に記載の組換えレプリコン核酸。
【請求項３】
前記（ｂ）の核酸は、アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓｐ１、ｎｓｐ２およびｎｓｐ３をコードする連続ヌクレオチド配列であり、前記組換えレプリコン核酸は、前記（ｂ）の核酸と連続していないアルファウイルス非構造タンパク質ｎｓｐ４をコードする核酸配列をさらに含む、請求項１に記載の組換えレプリコン核酸。
【請求項４】
前記ＩＲＥＳエレメントは、細胞ＩＲＥＳ、植物ＩＲＥＳ、哺乳動物ウイルスＩＲＥＳ、合成ＩＲＥＳおよび昆虫ウイルスＩＲＥＳからなる群より選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組換えレプリコン核酸。
【請求項５】
前記（ｃ）のアルファウイルスサブゲノムプロモーターは、最小または修飾アルファウイルスサブゲノムプロモーターである請求項１〜４のいずれか１項に記載の組換えレプリコン核酸。
【請求項６】
前記（ｃ）の異種ＮＯＩは、タンパク質、ペプチド、免疫原、アンチセンス配列、またはリボザイムをコードする請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換えレプリコン核酸。
【請求項７】
アルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組換えレプリコン核酸。
【請求項８】
前記アルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列、前記（ａ）の核酸配列、前記（ｂ）の核酸配列、前記（ｃ）の核酸配列、および前記（ｄ）の核酸配列の１つ以上が、シンドビス（Ｓｉｎｄｂｉｓ）ウイルス、ＳＦＶ、ＶＥＥ、Ｓ．Ａ．ＡＲ８６ウイルス、ロスリバー（Ｒｏｓｓ Ｒｉｖｅｒ）ウイルス、ＥＥＥおよびＷＥＥからなる群より選択されるアルファウイルス由来である、請求項７に記載の組換えレプリコン核酸。
【請求項９】
前記核酸がＲＮＡである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組換えレプリコン核酸。
【請求項１０】
前記核酸がＤＮＡである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の組換えレプリコン核酸。
【請求項１１】
弱毒化突然変異を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組換えレプリコン核酸。
【請求項１２】
（ａ）５’アルファウイルス複製認識配列をコードする核酸配列と、
（ｂ）アルファウイルス非構造タンパク質をコードする核酸配列と、
（ｃ）５’から３’の方向に、アルファウイルスサブゲノムプロモーター−ＩＲＥＳ−ＮＯＩである第１のカセットと、
（ｄ）５’から３’の方向に、アルファウイルスサブゲノムプロモーター−ＩＲＥＳ−ＮＯＩである第２のカセットと、
（ｅ）３’アルファウイルス複製認識配列をコードする核酸と
を含む組換えレプリコン核酸。
【請求項１３】
アルファウイルスパッケージングシグナルをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組換えレプリコン核酸。
【請求項１４】
感染性の複製欠損アルファウイルス粒子の集団であって、各粒子が請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組換えレプリコン核酸を含む集団。
【請求項１５】
前記集団が、細胞培養上での継代によって測定される検出可能な複製コンピテントウイルスを有していない、請求項１４に記載の感染性の複製欠損アルファウイルス粒子の集団。
【請求項１６】
医薬上許容される担体中に請求項１４または１５に記載の前記集団を含む医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組換えレプリコン核酸を含むアルファウイルス粒子。
【請求項１８】
弱毒化突然変異を含む、請求項１７に記載のアルファウイルス粒子。
【請求項１９】
（ａ）５’アルファウイルス複製認識配列と、
（ｂ）５’から３’の方向に、アルファウイルスサブゲノムプロモーター−ＩＲＥＳ−ＮＯＩであるカセットと、ここで、前記ＮＯＩは１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質をコードし、
（ｃ）３’アルファウイルス複製認識配列と
を含む組換え核酸。
【請求項２０】
請求項１９に記載の核酸を含む細胞。
【請求項２１】
感染性の複製欠損アルファウイルス粒子を作製する方法であって、
（ａ）細胞内に以下の、
（ｉ）請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組換えレプリコン核酸と、
（ｉｉ）アルファウイルス構造タンパク質をコードする１つ以上のヘルパー核酸と、ここで、前記１つ以上のヘルパー核酸は、前記アルファウイルス構造タンパク質の全部を生成し、
を導入するステップと、
（ｂ）前記細胞内で前記アルファウイルス粒子を生成するステップと
を含む方法。
【請求項２２】
前記組換えレプリコン核酸は、アルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列をさらに含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ヘルパー核酸は、５’アルファウイルス複製認識配列、アルファウイルスサブゲノムプロモーター、アルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸および３’アルファウイルス複製認識配列を含む組換え核酸である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ヘルパー核酸は、プロモーターと１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列とを含む組換え核酸である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ヘルパー核酸はＤＮＡである請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記プロモーターはＣＭＶプロモーターである請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ヘルパー核酸は、前記アルファウイルス構造タンパク質の全部をコードするヌクレオチド配列を含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記ヘルパー核酸は、５’アルファウイルス複製認識配列、ＩＲＥＳエレメント、アルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸および３’アルファウイルス複製認識配列を含む組換え核酸である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
感染性の複製欠損アルファウイルス粒子を作製する方法であって、
（ａ）細胞内に、
ｉ）５’アルファウイルス複製認識配列、アルファウイルス非構造タンパク質をコードする１つ以上の核酸配列、アルファウイルスサブゲノムプロモーター、異種核酸配列および３’アルファウイルス複製認識配列を含むアルファウイルスレプリコンＲＮＡと、
ｉｉ）請求項１９に記載の組換え核酸を含むアルファウイルス構造タンパク質をコードする１つ以上のヘルパー核酸と
を導入するステップであって、それによってアルファウイルス構造タンパク質の全部が前記細胞内で生成されるステップと、
（ｂ）前記細胞内で前記アルファウイルス粒子を生成するステップと
を含む方法。
【請求項３０】
感染性の複製欠損アルファウイルス粒子を作製する方法であって、
（ａ）細胞内に、
ｉ）請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組換えレプリコン核酸と、
ｉｉ）請求項１９に記載の組換え核酸を含むアルファウイルス構造タンパク質をコードする１つ以上のヘルパー核酸と
を導入するステップであって、それによってアルファウイルス構造タンパク質の全部が前記細胞内で生成されるステップと、
（ｂ）前記細胞内で前記アルファウイルス粒子を生成するステップと
を含む方法。
【請求項３１】
請求項２１〜２８または３０のいずれか１項に記載された方法により産生された、感染性の複製欠損アルファウイルス粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条ｅ項の下で、２００３年３月２０日に出願された米国
仮特許出願第６０／４５６，１９６号の利益を主張するものであり、その内容は全体とし
て参照して本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、組み換えアルファウイルス粒子の改良された構築物およびその作製方法に関
する。
【背景技術】
【０００３】
真核生物では、２つの別個のメカニズムが細胞内で展開して翻訳を開始する。それらの
１つでは、ｍＲＮＡの５’末端（「キャップ」）に存在するメチル−７−グアノシン（５
’）ｐｐｐＮ構造が、ｅＩＦ４Ｅ、ｅＩＦ４ＧおよびｅＩＦ４Ａから構成される翻訳開始
因子ｅＩＦ４Ｆによって認識される。この「開始前複合体」の形成には、多数の因子の中
でも特に、イニシエータｔＲＮＡ−Ｍｅｔiへ結合することに関与する開始因子ｅＩＦ２
と、４０Ｓリボソームサブユニットと相互作用するｅＩＦ３との協調作用を必要とする（
Ｈｅｒｓｈｅｙ  ＆  Ｍｅｒｒｉｃｋ，Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  
ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｐ．３３−８８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  
Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ  ２０００）。
【０００４】
もう１つのメカニズムでは、翻訳の開始は転写産物上で内部的に発生し、トランス作用
因子を用いてｍＲＮＡ内の内部開始コドンへ翻訳機構を補充する内部リボソームエントリ
ー配列（ＩＲＥＳ）エレメントによって媒介される（Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｔｒａｎｓｌａｔ
ｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｐ．１２７−
１８４，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，
ＮＹ  ２０００）。ＩＲＥＳエレメントは、脊椎動物、無脊椎動物、または植物細胞に感
染するウイルス由来の極めて多数の転写産物内、ならびに脊椎動物および無脊椎動物遺伝
子由来の転写産物内で見いだされている。
【０００５】
多数のウイルス感染症中、ならびに他の細胞ストレス条件下では、ｅＩＦ２のリン酸化
状態における変化は三重複合体ｅＩＦ２−ＧＴＰ−ｔＲＮＡ−Ｍｅｔiのレベルを低下さ
せ、結果としてタンパク質合成の総合的阻害を生じさせる。これとは逆に、キャップ構造
依存性（ｃａｐ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）開始の特異的遮断はｅＩＦ４Ｆ機能性の修飾に依
存する（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＆  Ｓａｒｎｏｗ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３：３６６−３７０（２０００））。
【０００６】
ＩＲＥＳエレメントはキャップ構造依存性翻訳阻害を迂回する；そこでＩＲＥＳエレメ
ントによって指令される翻訳は「キャップ構造非依存性（ｃａｐ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎ
ｔ）」と呼ばれている。ＩＲＥＳ駆動翻訳開始は、例えばピコルナウイルス感染症などの
多数のウイルス感染症中に優勢である（Ｍａｃｅｊａｋ  ＆  Ｓａｒｎｏｗ，Ｎａｔｕｒ
ｅ  ３５３：９０−９４（１９９１））。これらの状況下では、キャップ構造依存性開始
は少量の機能性ｅＩＦ４Ｆの存在に起因して阻害される、あるいは重度に損なわれる。こ
れは、ｅＩＦ４Ｇの開裂もしくは溶解性の消失（Ｇｒａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅ
ｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃ
ｅｓ，ＵＳＡ  ９５：１１０８９−１１０９４（１９９８））；４Ｅ−ＢＰ脱リン酸化（
Ｇｉｎｇｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎ
ａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ  ９３：５５７８−５５８３（
１９９６））またはポリ（Ａ）−結合タンパク質（ＰＡＢＰ）の開裂（Ｊｏａｃｈｉｍｓ
ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７３：７１８−７２７（１
９９９））によって引き起こされる。
【０００７】
目的の核酸（ＮＯＩ）を様々なレベルで発現するアルファウイルスについて報告されて
いる。これらの例は全てが、サブゲノムプロモーターからのベクター複製または転写を調
節するためのアルファウイルス非構造タンパク質遺伝子または２６Ｓ（サブゲノム）プロ
モーターの修飾について記載している。それらの例には、サブゲノムＲＮＡ転写を増加も
しくは減少させる、またはゲノムＲＮＡ複製を変化させて修飾されたＮＯＩ発現を生じさ
せる非構造タンパク質遺伝子における突然変異が含まれる。だがこれまで、サブゲノムｍ
ＲＮＡの翻訳レベルでのアルファウイルスベクターからのタンパク質発現の制御は記載さ
れていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＩＲＥＳエレメントの指令下でキャップ構造非依存性メカニズムを介してタ
ンパク質翻訳レベルでの１つ以上の異種核酸配列の発現を制御するために組み換えられた
アルファウイルスレプリコンおよびヘルパーベクターを提供する。
【０００９】
１つの実施形態では、本発明は、５’アルファウイルス複製認識配列をコードする第１
核酸配列と、アルファウイルス非構造タンパク質をコードする少なくとも１つの第２核酸
配列と、少なくとも１つのアルファウイルスサブゲノムプロモーターと、少なくとも１つ
のＩＲＥＳエレメントと、少なくとも１つの異種核酸と、３’アルファウイルス複製認識
配列をコードする第３核酸と、および該レプリコンが粒子内にパッケージングされるのを
許容するアルファウイルスパッケージングシグナルと、を含む組み換えレプリコン核酸を
提供する。
【００１０】
他の実施形態では、本発明は、５’アルファウイルス複製認識配列をコードする第１核
酸配列と、アルファウイルスサブゲノムプロモーターと、ＩＲＥＳエレメントと、１つも
しくは２つ以上のアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸と、および３’アル
ファウイルス複製認識配列をコードする第３核酸と、を含む組み換えヘルパー核酸を提供
する。
【００１１】
本明細書では、さらにまた本発明の組み換えレプリコン核酸を含むアルファウイルスレ
プリコンＲＮＡを含むアルファウイルス粒子が提供される。また別の実施形態において、
本明細書では感染性の複製欠損アルファウイルス粒子の集団が提供されるが、各粒子は本
発明の組み換えレプリコン核酸を含むアルファウイルスレプリコンＲＮＡを含有する。一
部の実施形態では、本発明は感染性の複製欠損アルファウイルス粒子の集団を提供するが
、各粒子は本発明の組み換えレプリコン核酸を含むアルファウイルスレプリコンＲＮＡを
含有し、そして該集団は細胞培養上の継代によって測定されるように、検出可能な複製コ
ンピテントウイルス（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｖｉｒｕｓ）を有
していない。特定の実施形態では、本発明の粒子は１つ以上の弱毒化突然変異を含有して
いてよい。
【００１２】
さらに、医薬上許容される担体中に本発明の粒子および集団を含む医薬組成物が含まれ
る。
【００１３】
他の実施形態では、本発明は、感染性の複製欠損アルファウイルス粒子を作製する方法
であって、（ａ）細胞集団内に（ｉ）本発明の組み換えレプリコン核酸と、（ｉｉ）アル
ファウイルス構造タンパク質をコードする１つ以上のヘルパー核酸であって、該アルファ
ウイルス構造タンパク質の全部が細胞内で提供されるヘルパー核酸とを導入するステップ
と、および（ｂ）該細胞集団内で前記アルファウイルス粒子を生成するステップと、を含
む方法を提供する。本発明の方法は、該細胞から前記アルファウイルス粒子を収集するス
テップをさらに含むことができる。
【００１４】
一部の実施形態では、本発明のヘルパー核酸はさらにまた本発明の組み換えレプリコン
核酸であってよい。例えば、本発明の組み換え核酸は、異種核酸として、および／または
異種核酸に加えて、１つのアルファウイルス構造タンパク質または１つ以上のアルファウ
イルス構造タンパク質をコードする核酸配列を含むことができる。そのような実施形態で
は、該組み換えレプリコン核酸は、他のヘルパー核酸および／または本発明の他の組み換
え核酸と一緒に該細胞内に存在しうる組み換えレプリコンヘルパー核酸であると考えられ
る。
【００１５】
そこで、特定の実施形態では、本発明の組み換えレプリコン核酸はさらに１つのアルフ
ァウイルス構造タンパク質または２つ以上のアルファウイルス構造タンパク質をさらにコ
ードする。この組み換えレプリコン核酸は、該組み換えレプリコン核酸および１つ以上の
該ヘルパー核酸がアルファウイルス構造タンパク質の全部を生成し、そして該組み換えレ
プリコン核酸が前記細胞内の粒子内にパッケージングされるように、１つ以上のヘルパー
核酸と一緒に細胞集団内に導入できる。
【００１６】
さらに、被験者において免疫反応を誘導する方法であって、本発明の免疫原性量の核酸
、ベクター、粒子集団および／または組成物を該被験者に投与するステップを含む方法が
提供される。
【００１７】
また別の実施形態では、本発明は、核酸の転写を指令するプロモーターと；ＩＲＥＳエ
レメントと；およびコード配列を含む核酸と、を含む組み換え核酸であって、ＩＲＥＳエ
レメントが、コード配列の翻訳がＩＲＥＳエレメントによって指令されるキャップ構造非
依存性メカニズムを介して発生するが、キャップ構造依存性メカニズムを介して発生しな
いように機能的に位置している組み換え核酸を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】スペーサー−ＩＲＥＳレプリコンサブゲノムＲＮＡのノーザンブロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本明細書で使用する「１つの」および「その」は、それが使用される状況に応じて、１
つまたは２つ以上を意味することがある。例として、「１つの細胞」は、１つの細胞また
は複数の細胞を意味することができる。そして「１つの異種核酸」は１つの異種核酸また
は複数の異種核酸を意味することがある。
【００２０】
本発明は、核酸の転写および核酸の翻訳を分離することができるという驚くべき予想外
の発見に基づいている。そこで、１つの実施形態では、本発明は、転写を指令するプロモ
ーターと、ＩＲＥＳエレメントと、およびコード配列と、を含み、このとき該ＩＲＥＳエ
レメントが、コード配列の翻訳がＩＲＥＳエレメントによって指令されるキャップ構造非
依存性メカニズムを介して発生するが、キャップ構造依存性メカニズムを介して発生しな
いように機能的に位置している組み換え核酸を提供する。本発明のためには、用語「転写
」は、それ自体がＲＮＡ分子であってよい組み換えレプリコン核酸のアルファウイルスサ
ブゲノムプロモーターからのＲＮＡの生成を含む。すなわち、本発明の組み換えレプリコ
ンＲＮＡ分子上のサブゲノムプロモーターは、異種ＮＯＩをコードするメッセンジャーＲ
ＮＡの転写を指令できる。これとは別に、組み換えレプリコン核酸は「複製」することが
できる、すなわち５’複製認識配列から３’複製認識配列までをコピーすることができる
。
【００２１】
他の実施形態では、本発明は、５’アルファウイルス複製認識配列をコードする第１核
酸配列と、アルファウイルス非構造タンパク質をコードする少なくとも１つの第２核酸配
列と、少なくとも１つのアルファウイルスサブゲノムプロモーターと、少なくとも１つの
ＩＲＥＳエレメントと、少なくとも１つの異種核酸と、および３’アルファウイルス複製
認識配列をコードする第３核酸と、を含む組み換えレプリコン核酸を提供する。特定の実
施形態では、該組み換えレプリコン核酸は、該レプリコンが粒子内にパッケージングされ
るようにアルファウイルスパッケージングシグナルをさらに含む。さらにまた別の実施形
態では、該組み換えレプリコン核酸は、ＩＲＥＳエレメントの上流に位置していてよいス
ペーサー核酸配列を含むことができる。
【００２２】
様々な実施形態では、本発明の組み換えレプリコン核酸のエレメントは本明細書に記載
した順番で存在してよい、および／またはあらゆる順番で存在してよいと理解されている
。そこで例えば、１つの実施形態では、本発明は以下の順序で、５’アルファウイルス複
製認識配列をコードする第１核酸配列と、アルファウイルス非構造タンパク質をコードす
る少なくとも１つの第２核酸配列と、少なくとも１つのアルファウイルスサブゲノムプロ
モーターと、少なくとも１つのＩＲＥＳエレメントと、少なくとも１つの異種核酸と、お
よび３’アルファウイルス複製認識配列をコードする第３核酸と、を含む組み換えレプリ
コン核酸を提供する。
【００２３】
本明細書で使用するように、「５’アルファウイルス複製認識配列」および「３’アル
ファウイルス複製認識配列」は、アルファウイルスゲノムの複製を制御する５’および３
’配列（５’および３’の記号表示はアルファウイルス核酸におけるそれらの位置を表し
ている）である。特定の実施形態では、５’および３’アルファウイルス複製認識配列の
片方または両方は、アルファウイルスゲノムの複製におけるそれらの機能が無傷で残って
いることを前提に、いずれの末端でも切断することができる。
【００２４】
同様に本明細書に記載するように、「アルファウイルス非構造タンパク質をコードする
少なくとも１つの第２核酸配列」には、少なくとも１つ、およびもしかすると２つ以上の
アルファウイルス非構造タンパク質をコードする核酸配列が含まれる。例えば、本発明の
第２核酸配列は、アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３およ
びｎｓｐ４をコードする連続ヌクレオチド配列、アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓ
ｐ１、ｎｓｐ２およびｎｓｐ３をコードする連続ヌクレオチド配列、アルファウイルス非
構造タンパク質ｎｓｐ２、ｎｓｐ３およびｎｓｐ４をコードする連続核酸、アルファウイ
ルス非構造タンパク質ｎｓｐ１およびｎｓｐ２をコードする連続核酸、アルファウイルス
非構造タンパク質ｎｓｐ３およびｎｓｐ４をコードする連続核酸、アルファウイルス非構
造タンパク質ｎｓｐ２およびｎｓｐ３をコードする連続核酸、アルファウイルス非構造タ
ンパク質ｎｓｐ１をコードする核酸、アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓｐ２をコー
ドする核酸、アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓｐ３をコードする核酸、アルファウ
イルス非構造タンパク質ｎｓｐ４をコードする核酸、および／または組み換えレプリコン
核酸がｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３およびｎｓｐ４の全部をコードするヌクレオチド配
列を含むようなあらゆる組み合わせおよび／またはその順序であってよい。
【００２５】
特定の実施形態では、本発明の組み換えレプリコン核酸は、該組み換えレプリコン核酸
がｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３およびｎｓｐ４の全部をコードするヌクレオチド配列を
含むように、１つ以上のアルファウイルス非構造タンパク質をコードする核酸をあらゆる
組み合わせおよび相互に対してあらゆる場所で含んでいてよい。例えば、本発明の組み換
えレプリコン核酸は、以下の順序で、５’アルファウイルス複製認識配列をコードする第
１核酸配列と、アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓｐ１、ｎｓｐ２およびｎｓｐ３を
コードする第２核酸配列と、少なくとも１つのアルファウイルスサブゲノムプロモーター
と、少なくとも１つのＩＲＥＳエレメントと、少なくとも１つの異種核酸と、アルファウ
イルス非構造タンパク質ｎｓｐ４をコードするまた別の第２核酸配列と、および３’アル
ファウイルス複製認識配列をコードする第３核酸と、を含んでいてよい。
【００２６】
同様に本明細書で使用するように、「アルファウイルスサブゲノムプロモーター」、「
サブゲノムプロモーター」、または「２６Ｓプロモーター」は、正常なアルファウイルス
複製プロセスにおいてサブゲノムメッセージの転写を指令する、アルファウイルスゲノム
内に存在するプロモーターである。アルファウイルスサブゲノムプロモーターは、当分野
において知られている方法によって、（例えば、最小のアルファウイルスサブゲノムプロ
モーターを生成するために）切断できる、および／またはその活性が低下する、維持され
る、または増加するように修飾することができる。
【００２７】
本発明の組み換え核酸は、本明細書に記載したように、そして当分野において周知のよ
うに、キャップ構造非依存性メカニズムを介してタンパク質内への核酸の翻訳を指令する
、内部リボソームエントリー配列（ＩＲＥＳ）エレメントを含むことができる。特に本発
明の組み換えレプリコン核酸では、翻訳レベルでの核酸発現の制御は、内部リボソームエ
ントリー部位（ＩＲＥＳ）をアルファウイルス２６Ｓサブゲノムプロモーターの下流およ
び翻訳されるコード配列の上流へ導入するステップによって遂行される。ＩＲＥＳエレメ
ントは、それがｍＲＮＡの翻訳を指令し、それによってサブゲノムｍＲＮＡの５’末端（
「キャップ」）に存在するメチル−７−グアノシン（５’）ｐｐｐＮ構造からのｍＲＮＡ
の翻訳の開始を最小限に抑える、制限するまたは防止するように配置される。この「ＩＲ
ＥＳ指令」キャップ構造非依存性翻訳は、複製および転写を変化させるであろうアルファ
ウイルス非構造タンパク質遺伝子の重大な修飾を必要としない、または生じさせない。
【００２８】
ゲノム複製またはサブゲノム転写を変調させる（例、阻害する、覆す、混乱させる、中
断させる、増加させる、増強する、減少させる、最小限に抑える）ことなく異種核酸の発
現レベルを制御するために設計されたアルファウイルスベクターは、以前のベクターデザ
インより優れたいくつかの長所を有している。第一に、ゲノム複製を変調させると、粒子
内にパッケージングするために利用できるゲノムＲＮＡの数を制限することによってＶＲ
Ｐ生成にマイナスの影響を及ぼすことができる。第二に、２６Ｓプロモーターを変化させ
ること（例えば、切断、欠失、付加および／または置換）によってサブゲノム転写を変調
させると、ゲノムＲＮＡ複製を変化させることができ、同様に粒子内へパッケージングす
るために利用できるゲノムＲＮＡの数の制限を生じさせる。第三に、アルファウイルス複
製は、ｍＲＮＡのキャップ構造依存性翻訳の減少を生じさせることのできる細胞内のスト
レス反応を誘導する。アルファウイルスサブゲノムｍＲＮＡのキャップ構造依存性翻訳か
らＩＲＥＳエレメントによって提供されるキャップ構造非依存性メカニズムへの切り替え
は、このＮＯＩ発現へのマイナスの影響を最小限に抑える。
【００２９】
本発明のＩＲＥＳエレメントには、ピコルナウイルス、例えばポリオウイルス（ＰＶ）
もしくはヒトエンテロウイルス７１、例えばその７４２３／ＭＳ／８７株およびＢｒＣｒ
株由来；脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）由来；口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）由来；フラビ
ウイルス、例えばＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）由来；ペスチウイルス、例えば古典的ブタ
コレラウイルス（ＣＳＦＶ）由来；レトロウイルス、例えばマウス白血病ウイルス（ＭＬ
Ｖ）由来；レンチウイルス、例えばサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）由来のウイルスＩＲ
ＥＳエレメント；翻訳開始因子、例えばｅＩＦ４ＧもしくはＤＡＰ５；転写因子、例えば
ｃ−Ｍｙｃ（Ｙａｎｇ  ａｎｄ  Ｓａｒｎｏｗ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ  ２５：２８００−２８０７（１９９７））もしくはＮＦ−κＢ抑制因子（ＮＲ
Ｆ）由来；成長因子、例えば血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧ
Ｆ−２）および血小板由来成長因子Ｂ（ＰＤＧＦ  Ｂ）由来；ホメオティック遺伝子、例
えばアンテナペディア（Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）由来；生存タンパク質、例えばアポ
トーシスのＸ連鎖阻害剤（ＸＩＡＰ）もしくはＡｐａｆ−１由来；シャペロン、例えば免
疫グロブリン重鎖結合タンパク質ＢｉＰ（Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｓａｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．
，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８２：９７３−９８４，
（２００１））由来などの細胞ｍＲＮＡ  ＩＲＥＳエレメント、植物ウイルス由来、なら
びに現在知られている、もしくは後になって同定されるいずれか他のＩＲＥＳエレメント
を含むことができるが、それらに限定されない。
【００３０】
特定の実施形態では、本発明のＩＲＥＳエレメントは、例えば、脳心筋炎ウイルス（Ｅ
ＭＣＶ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ００１４７９）、コオロギ麻痺病ウイル
ス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２１８０３９）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏ
ｓｏｐｈｉｌａ  Ｃ）ウイルス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０１４３８８）
、チャバネアオカメムシ（Ｐｌａｕｔｉａ  ｓｔａｌｉ）腸管ウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ
アクセッション番号ＡＢ００６５３１）、ムギクビレアブラムシ（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐ
ｈｕｍ  ｐａｄｉ）ウイルス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０２２９３７）、
ヒメトビ（Ｈｉｍｅｔｏｂｉ）Ｐウイルス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０１
７０３７）、急性ハチ麻痺病ウイルス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１５０６
２９）、Ｂｌａｃｋ  ｑｕｅｅｎ細胞ウイルス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ
１８３９０５）、サシガメ（Ｔｒｉａｔｏｍａ）ウイルス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッショ
ン番号ＡＦ１７８４４０）、エンドウヒゲナガアブラムシ（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ
ｐｉｓｕｍ）ウイルス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０２４５１４）、感染
性軟化病ウイルス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ０００９０６）、および／ま
たはサックブルード（Ｓａｃｂｒｏｏｄ）ウイルス（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号
ＡＦ０９２９２４）から誘導することができる。さらに、本発明は、天然型ＩＲＥＳエレ
メントの機能を模倣するために当分野において知られている方法（Ｃｈａｐｐｅｌｌ  ｅ
ｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．（２０００）９７（４）
：１５３６−４１を参照）によって設計できる合成ＩＲＥＳエレメントを提供する。
【００３１】
特定の実施形態では、ＩＲＥＳエレメントは、本発明の組み換えアルファウイルス粒子
をパッケージングするために選択された特定ヘルパー細胞系において機能的である昆虫Ｉ
ＲＥＳエレメントまたは他の非哺乳動物ＩＲＥＳエレメントであってよいが、標的宿主細
胞内では機能的ではない、または最小限に機能的であろう。昆虫ウイルスＩＲＥＳエレメ
ントは昆虫細胞内で最適に機能するように進化してきており、同様に哺乳動物ウイルスＩ
ＲＥＳ配列は哺乳動物細胞内で最適に機能する。そこで、翻訳の制御は、昆虫ウイルス特
異的ＩＲＥＳエレメントをレプリコンＲＮＡ内に挿入することによってレプリコンベクタ
ーシステムに導入できる。この方法で、レプリコンベクターからの異種ＮＯＩの翻訳は、
哺乳動物細胞内では調節する（弱毒化する）ことができ、昆虫細胞内では増強することが
できる。これは、パッケージング細胞にとって毒性、またはアルファウイルスパッケージ
ングプロセスにとって有害のどちらかであるそれらのＮＯＩのために有用である。この作
用を達成するためのまた別の方法は、昆虫細胞培養系内にパッケージングされるレプリコ
ンベクター内の哺乳動物ＩＲＥＳエレメントを使用し、それによってさらにパッケージン
グ中に発生する可能性のある異種ＮＯＩの重大な翻訳を回避する方法である。特定の仮説
または理論に固執せずとも、細胞因子および培養環境は、ＩＲＥＳの活性および機能にお
いて何らかの役割を果たす可能性がある。このため、同一細胞内の相違するＩＲＥＳ種の
追加のレベルの制御／調節は所定の細胞因子の供給／除去を通して、または第２のＩＲＥ
Ｓに比較して１つのＩＲＥＳへの翻訳を優先的に指令する培養環境（例、温度）における
変化によって達成され得ると予想される。
【００３２】
一部の実施形態では、ヘルパーもしくはパッケージング細胞系の細胞環境は、ＩＲＥＳ
の特異的活性が増強する、または低下するように変化させることができる。典型的には、
ＩＲＥＳエレメントは、ｅＩＦ−２αキナーゼのレベル上昇がキャップ構造依存性翻訳の
減少およびＩＲＥＳ構造依存性翻訳／活性における逆増加を生じさせる細胞ストレス条件
下で機能するように進化してきた。そのような条件は、選択されたＩＲＥＳエレメントか
らの発現を増加させることができるように、低酸素、低体温、栄養／アミノ酸飢餓、ＥＲ
ストレス誘導（例えば、タプシガルギン（Ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｉｎ）を用いる）、イン
ターフェロンもしくはＰＫＲエレメントの誘導（例えば、ポリＩＣを用いる）、ｔＲＮＡ
依存型合成の遮断（例えばエデイン（Ｅｄｅｉｎｅ）を用いる）、または過酸化水素およ
びソルビトールを含むがそれらに限定されない当分野において知られている他の一般的細
胞ストレッサーを含むがそれらに限定されない方法を含む様々な方法によって細胞パッケ
ージングシステム内で人工的に誘導できる。
【００３３】
他の実施形態では、ＮＯＩのＩＲＥＳエレメント指令翻訳は、例えば当分野において知
られていて本明細書に記載された多数の標準方法によってパッケージング細胞内にトラン
スフェクトできる、または形質導入する／一過性に発現させることができるＩＲＥＳエレ
メント／スペーサもしくはＮＯＩに対して特異的なアンチセンスｓｉＲＮＡを使用するこ
とで変調させることができる。
【００３４】
また別の実施形態として、ＮＯＩの発現はさらにまたリガンド結合対、例えば核酸エレ
メントと分子（すなわちリガンド）を使用することによっても変調させることができる（
例えば、米国特許第６，２４２，２５９号を参照されたい）。このため、本発明は、５’
アルファウイルス複製認識配列をコードする核酸配列と、アルファウイルス非構造タンパ
ク質をコードする１つ以上の第２核酸配列と、少なくとも１つのアルファウイルスサブゲ
ノムプロモーターと、少なくとも１つのＩＲＥＳエレメントと、リガンドによって結合さ
れるとサブゲノムＲＮＡの転写および／またはＩＲＥＳからの翻訳を変化させる非アルフ
ァウイルスヌクレオチド配列と、少なくとも１つの異種核酸と、および３’アルファウイ
ルス複製認識配列をコードする核酸と、を含む組み換えレプリコン核酸を提供する。
【００３５】
特定の実施形態として、該リガンドはＲＮＡ結合タンパク質（例、Ｒ１７コートタンパ
ク質）、アンチセンス配列、色素（例、ヘキスト色素Ｈ３３２５８もしくはＨ３３４２）
、および／または抗生物質（例、トブラマイシンもしくはカナマイシン）であってよい。
これらは当業者に知られている方法によってパッケージング細胞内に導入できる、または
パッケージング細胞内で生成できる（米国特許第６，２４２，２５９号を参照）。
【００３６】
本発明の状況の中で利用されるように、アルファウイルスサブゲノムプロモーターもし
くはＩＲＥＳの近位に位置する非アルファウイルスヌクレオチド配列へのリガンド結合の
作用に起因するサブゲノムＲＮＡの転写の減少、またはＩＲＥＳによって指令されたＮＯ
Ｉの翻訳の減少は、選択されたリガンドの存在下では転写または翻訳各々のいずれかの統
計的に有意な減少を意味すると理解すべきである。一部の実施形態では、細胞内でのサブ
ゲノムＲＮＡの転写もしくはＩＲＥＳ指令ＮＯＩ翻訳のいずれかのレベルは、結合リガン
ドの存在を伴わない場合のレベルに比較して少なくとも２５％、５０％、７５％、もしく
は９０％、または３倍、５倍、もしくは１０倍減少させられる。例えばレポーター遺伝子
の酵素アッセイ、ノーザンブロット、代謝性ＲＮＡ標識化などを含む当分野において知ら
れている極めて様々なアッセイを利用すると、転写または翻訳のレベル減少を評価するこ
とができる。
【００３７】
本発明の組み換えレプリコン核酸は１つ以上のＩＲＥＳエレメントを含むことができ、
そして２つ以上のＩＲＥＳエレメントを含む実施形態では、ＩＲＥＳエレメントは同一で
あってよい、またはいずれかの順序および／または組み合わせで相違していてもよい。特
定の実施形態では、組み換えレプリコン核酸は、各カセット内のプロモーター、ＩＲＥＳ
および異種ＮＯＩが相違していても同一であってもよい２つ以上の「プロモーター−ＩＲ
ＥＳ−異種ＮＯＩカセット」を含むことができる。あるいはまた、組み換えレプリコン核
酸は２つ以上のＮＯＩをコードしていてもよいが、それらの一方は「プロモーター−ＩＲ
ＥＳカセット」によって制御されるが、他方の１つ以上のＮＯＩはサブゲノムプロモータ
ー単独またはＩＲＥＳ単独によって制御することができる。
【００３８】
本発明の異種核酸は、野生型アルファウイルスのゲノム内には存在しない、および／ま
たは野生型アルファウイルスのゲノム内で本発明の組み換えレプリコン核酸内に存在する
順序と同一順序では存在しない核酸である。例えば、特定の実施形態では、本発明の異種
核酸は１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質（例、Ｃ、ＰＥ２／Ｅ２、Ｅ１、Ｅ３
、６Ｋ）および／または異種核酸に加えて１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質を
コードすることができる。本発明の組み換えレプリコン核酸が１つ以上のアルファウイル
ス構造タンパク質をコードする核酸を含む場合は、組み換えレプリコン核酸は本明細書に
記載するように感染性の複製欠損アルファウイルス粒子のアッセンブリー内の組み換えレ
プリコンヘルパー核酸として機能することができる。
【００３９】
本発明の異種核酸は、抗原、免疫原、もしくは免疫原性ポリペプチドもしくはペプチド
、融合タンパク質、融合ペプチド、癌抗原などであってよいがそれらに限定されないタン
パク質またはペプチドをコードすることができる。本発明の異種核酸によってコードされ
るタンパク質および／またはペプチドの例には、被験者を微生物症、細菌症、原虫症、寄
生虫症、およびウイルス疾患を含むがそれらに限定されない疾患から保護するために適合
する免疫原性ポリペプチドおよびペプチドが含まれるが、それらに限定されない。
【００４０】
一部の実施形態では、例えば、異種核酸によってコードされるタンパク質もしくはペプ
チドはオルトミクソウイルス免疫原（例、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ
）表面タンパク質もしくはインフルエンザウイルス核タンパク質、またはウマインフルエ
ンザウイルスタンパク質もしくはペプチドなどのインフルエンザウイルスタンパク質）、
またはパラインフルエンザウイルス免疫原、またはメタ肺炎ウイルス免疫原、またはＲＳ
（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ）ウイルス免疫原、またはライノウイル
ス免疫原、レンチウイルス免疫原（例えば、ウマ感染性貧血ウイルスタンパク質もしくは
ペプチド、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）タンパク質もしくはペプチド、またはＨＩＶ
もしくはＳＩＶエンベロープＧＰ１６０タンパク質、ＨＩＶもしくはＳＩＶマトリックス
／キャプシドタンパク質、およびＨＩＶもしくはＳＩＶ  ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺
伝子産物などのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）タンパク質もしくはペプチド）であって
よい。タンパク質もしくはペプチドは、さらにまたアレナウイルス免疫原（例えば、ラッ
サ（Ｌａｓｓａ）熱ウイルスヌクレオキャプシドタンパク質およびラッサ熱エンベロープ
糖タンパク質などのラッサ熱ウイルスタンパク質もしくはペプチド）、ピコルナウイルス
免疫原（例えば、口蹄疫ウイルスタンパク質もしくはペプチド）、ポックスウイルス免疫
原（例えば、ワクシニアＬ１もしくはＬ８タンパク質などのワクシニアタンパク質もしく
はペプチド）、オルビウイルス免疫原（例えばアフリカウマ病ウイルスタンパク質もしく
はペプチド）、フラビウイルス免疫原（例えば、黄熱ウイルスタンパク質もしくはペプチ
ド、西ナイルウイルスタンパク質もしくはペプチド、または日本脳炎ウイルスタンパク質
もしくはペプチド）、フィロウイルス免疫原（例えば、エボラウイルスタンパク質もしく
はペプチド、またはＮＰおよびＧＰタンパク質などのマールブルク（Ｍａｒｂｕｒｇ）ウ
イルスタンパク質もしくはペプチド）、ブンヤウイルス免疫原（例えば、ＲＶＦＶ、ＣＣ
ＨＦ、およびＳＦＳタンパク質もしくはペプチド）、またはコロナウイルス免疫原（例え
ば、ヒトコロナウイルスエンベロープ糖タンパク質などの感染性ヒトコロナウイルスタン
パク質もしくはペプチド、またはブタ伝染性胃腸炎ウイルスタンパク質もしくはペプチド
、またはニワトリ伝染性気管支炎ウイルスタンパク質もしくはペプチド）であってよい。
本発明の異種核酸によってコードされるタンパク質もしくはポリペプチドは、さらにまた
ポリオ抗原、ヘルペス抗原（例、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＳＶ抗原）、流行性耳下腺炎抗原、
麻疹抗原、風疹抗原、水痘抗原、ボツリヌス毒素、ジフテリア毒素もしくは他のジフテリ
ア抗原、百日咳抗原、肝炎（例、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、もしくはＥ
型肝炎）抗原、または当分野において知られている他のワクチン抗原であってよい。
【００４１】
本明細書で使用する「免疫反応を誘導する」および「被験者を免役化する」には、被験
者における本発明のタンパク質および／またはポリペプチド（例えば、免疫原、抗原、免
疫原性ペプチド、および／または１つ以上のエピトープ）に対する体液性および／または
細胞性免疫反応の発生が含まれる。「体液性」免疫反応という用語は、当分野において周
知のように、抗体を含む免疫反応を意味するが、他方「細胞性」免疫反応という用語は、
当分野において周知のように、Ｔ−リンパ球および他の白血球を含む免疫反応、特にＨＬ
Ａ拘束細胞溶解性Ｔ細胞、すなわち「ＣＴＬ」による免疫原特異的反応を意味する。細胞
性免疫反応は、処理された免疫原、すなわちペプチド断片が、２つの一般的タイプである
クラスＩおよびクラスＩＩの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）ＨＬＡタンパク質と一緒に
提示されたときに発生する。クラスＩ  ＨＬＡ拘束ＣＴＬは、一般的に９ｍｅｒのペプチ
ドに結合し、細胞表面上でそれらのペプチドを提示する。ＨＬＡクラスＩ分子の状況にお
けるこれらのペプチド断片は、Ｔリンパ球上の特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）タンパク質
によって認識され、Ｔ細胞の活性化を生じさせる。この活性化は、細胞毒性もしくはアポ
トーシス事象、または非破壊的メカニズムの活性化、例えばインターフェロン／サイトカ
インの生成を直接的に通してＨＬＡ−ペプチド複合体を有する細胞の破壊を結果として生
じさせる特異的Ｔ細胞サブセットへの拡大を含むがそれに限定されない多数の機能的転帰
を生じさせる可能性がある。クラスＩ  ＭＨＣタンパク質を介する免疫原の提示は、典型
的にはＣＤ８＋ＣＴＬ反応を刺激する。
【００４２】
細胞性免疫反応のまた別の態様は、それらの表面上のＭＨＣ分子との関連においてペプ
チド断片を提示する細胞に対する非特異的エフェクター細胞の活性を刺激して集中させる
ヘルパーＴ細胞の活性化を含むＨＬＡクラスＩＩ拘束Ｔ細胞反応を含む。少なくとも２つ
のタイプのヘルパー細胞：サイトカインであるインターロイキン２（ＩＬ−２）およびイ
ンターフェロン−γを分泌するＴヘルパー１細胞（Ｔｈ１）ならびにサイトカインである
インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン５（ＩＬ−５）、インターロイキン
６（ＩＬ−６）およびインターフェロン１０（ＩＬ−１０）を分泌するＴヘルパー２細胞
（Ｔｈ２）が認識される。クラスＩＩ  ＭＨＣタンパク質を介しての免疫原の提示は、典
型的にＣＤ４＋ＣＴＬ反応、ならびに抗体反応をもたらすＢリンパ球の刺激を誘導する。
【００４３】
本明細書で使用する「免疫原性ポリペプチド」、「免疫原性ペプチド」、または「免疫
原」には、被験者において免疫反応を誘導するあらゆるペプチド、タンパク質またはポリ
ペプチドが含まれ、特定の実施形態では、免疫原性ポリペプチドは被験者に疾患に対する
ある程度の保護を提供するために適切である。これらの用語は、用語「抗原」と互換的に
使用できる。
【００４４】
特定の実施形態では、本発明の免疫原は１つ以上の「エピトープ」を含んでいてよい、
本質的に１つ以上のエピトープから構成されてよい、または１つ以上のエピトープから構
成される。「エピトープ」は、特定の免疫グロブリンによる認識に含まれる１セットのア
ミノ酸残基である。Ｔ細胞の状況において、エピトープはＴ細胞受容体タンパク質および
／またはＭＨＣ受容体による認識のために必要なアミノ酸残基セットであると定義されて
いる。免疫系のインビボまたはインビトロ状況においては、エピトープは、免疫グロブリ
ン、Ｔ細胞受容体および／または受容体および／またはＨＬＡ分子によって認識される部
位を一緒に形成する一次、二次および／または三次ペプチド構造、および／または電荷な
どの分子の集合的機能を意味する。Ｂ細胞（抗体）エピトープの場合は、典型的には最小
３〜４個のアミノ酸、好ましくは少なくとも５個の、およそ５０個までのアミノ酸である
。好ましくは、体液性反応誘導性エピトープは５から３０個のアミノ酸、通常は１２から
２５個のアミノ酸、および最も一般的には１５から２０個のアミノ酸である。Ｔ細胞エピ
トープの場合は、１つのエピトープは少なくとも約７〜９個のアミノ酸、およびヘルパー
Ｔ細胞エピトープの場合は少なくとも約１２〜２０個のアミノ酸を含む。典型的には、そ
のようなＴ細胞エピトープは約７から１５個のアミノ酸、例えば７、８、９、１０、１１
、１２、１３、１４もしくは１５個のアミノ酸を含むであろう。
【００４５】
本発明は、被験者において免疫原性ポリペプチドをコードする核酸を発現させるため（
例、ワクチン接種のため）、または免疫療法のため（例、癌もしくは腫瘍を有する被験者
を治療するため）に使用できる。そこで、ワクチンの場合は、本発明はそれによって、本
発明の免疫原性量の核酸、粒子、集団および／または組成物を被験者に投与するステップ
を含む、被験者において免疫反応を誘導する方法を提供する。
【００４６】
さらにまた、本発明の核酸、粒子、集団および医薬組成物は被験者内の細胞であってよ
い細胞へ目的のＮＯＩを送達する方法において使用できると考えられている。そこで、本
発明は有効量の本発明の核酸、粒子、集団および／または組成物を細胞内へ導入するステ
ップを含む異種核酸を送達する方法を提供する。さらにまた、有効量の本発明の核酸、粒
子、集団および／または組成物を被験者へ送達するステップを含む、被験者内の細胞へ異
種核酸を送達する方法が提供される。そのような方法は、周知の遺伝子療法のプロトコー
ルによって、本発明の細胞および／または被験者に治療作用を与えるために使用できる。
【００４７】
本発明の「被験者」には、温血動物、例えばヒト、非ヒト霊長類、ウマ、ウシ、ネコ、
イヌ、ブタ、ラット、およびマウスが含まれるが、それらに限定されない。本発明の様々
な組成物（例、核酸、粒子、集団、医薬組成物）の投与は、数種の相違する経路のいずれ
かによって遂行できる。特定の実施形態では、組成物は、筋肉内、皮下、腹腔内、皮内、
鼻腔内、頭蓋内、舌下、膣内、直腸内、経口、または局所的に投与することができる。本
明細書の組成物は、皮膚擦過法、またはパッチもしくは液体により経皮的に投与されてよ
い。該組成物は、経時的に組成物を遊離する生体分解性物質の形状で皮下送達することが
できる。
【００４８】
本発明の組成物は、疾患を予防するために予防的に、または疾患を治療するために治療
的に使用できる。治療できる疾患には、ウイルス、細菌、真菌または寄生虫によって惹起
される感染性疾患、および癌が含まれる。例えばアルツハイマー病、多発性硬化症、脳卒
中などの異所性もしくは異常なタンパク質の発現または正常タンパク質の過剰発現に関係
する慢性疾患もまた治療できる。
【００４９】
本発明の組成物は最適化して他のワクチン接種レジメンと組み合わせると極めて広範囲
（すなわち、上記に記載した機能を含む、免疫反応の全ての態様）の細胞性および体液性
反応を提供することができる。特定の実施形態では、これは本発明の組成物を以下の、病
原体もしくは腫瘍由来の免疫原、組み換え免疫原、裸の核酸、脂質含有成分を用いて調製
された核酸、非アルファウイルスベクター（ポックスベクター、アデノウイルスベクター
、ヘルペスベクター、水疱性口内炎ウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、パ
ルボウイルスベクター、パポーバウイルスベクター、レトロウイルスベクターを含むがそ
れらに限定されない）、およびその他のアルファウイルスベクターの１つ以上を含む組成
物と組み合わせて使用される異種プライムブースト法の使用を含むことができる。これら
のウイルスベクターは、ウイルス様粒子または核酸であってよい。これらのアルファウイ
ルスベクターは、レプリコン含有粒子、ＤＮＡ型レプリコン含有ベクター（ときには「Ｅ
ＬＶＩＳ」系と呼ばれる、例えば米国特許第５，８１４，４８２号を参照）または裸のＲ
ＮＡベクターであってよい。
【００５０】
本発明の組成物は、それらが被験者において強力な免疫反応を誘導することができない
ために典型的には生残する、慢性もしくは潜在性感染性物質に対する免疫反応を生成する
ためにも使用できる。代表的な潜在的もしくは慢性的感染性因子には、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝
炎、エプスタインバー（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス、ヘルペスウイルス、ヒト
免疫不全ウイルス、およびヒト乳頭腫ウイルスが含まれるが、それらに限定されない。こ
れらの感染性因子由来のペプチドおよび／またはタンパク質をコードするアルファウイル
スベクターは、本明細書に記載した方法によって細胞または被験者に投与できる。
【００５１】
あるいは、免疫原性タンパク質もしくはペプチドはいずれかの腫瘍もしくは癌細胞抗原
であってよい。好ましくは、腫瘍もしくは癌細胞抗原は癌細胞の表面上で発現する。特異
的乳癌に対する代表的な癌抗原はＨＥＲ２およびＢＲＣＡ１抗原である。その他の代表的
な癌および腫瘍細胞抗原はＳ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，（１９９９），Ｉｍｍｕｎｉｔ
ｙ  １０：２８１に記載されており、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ、ｇｐ１００、チロシ
ナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−１／２、Ｂ
ＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＤＫ−４、β−カテニン、ＭＵＭ−１、カスパ
ーゼ−８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶＥ＆、ＳＡＲＴ−１、ＰＲＡＭＥ、ｐ１５およびｐ
５３抗原、ウィルムス（Ｗｉｌｍｓ）腫瘍抗原、チロシナーゼ、胎児性癌抗原（ＣＥＡ）
、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳ
ＣＡ）、ヒトアスパルチル（アスパラギニル）β−ヒドロキシラーゼ（ＨＡＡＨ）、およ
びＥｐｈＡ２（上皮細胞チロシンキナーゼ、国際特許公開第ＷＯ０１／１２１７２号を参
照）が含まれるが、それらに限定されない。
【００５２】
本発明の免疫原性ポリペプチドもしくはペプチドは、さらにまた、このような抗原につ
いて教示するために全体として参照して組み込まれる国際特許公開第ＷＯ９９／５１２６
３号に記載されたように「汎発性」もしくは「人工」癌抗原もしくは腫瘍細胞抗原であっ
てよい。
【００５３】
様々な実施形態では、本発明の異種核酸はアンチセンス核酸配列をコードすることがで
きる。「アンチセンス」核酸は、アンチセンス核酸の作用による生成の阻害もしくは減少
を目的とするポリペプチドをコードする核酸をコードする、もしくは核酸の発現に関係す
る核酸（例、遺伝子、ｃＤＮＡおよび／またはｍＲＮＡ）の全部もしくは一部に相補的（
すなわち、インビボまたはストリンジェントなインビトロ条件下でハイブリダイズするこ
とができる）核酸分子（すなわち、ＤＮＡもしくはＲＮＡ）である。所望であれば、従来
法を使用すると望ましい修飾を含有するアンチセンス核酸を生成することができる。例え
ば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、インビボでヌクレアーゼによるアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドの変性を阻害するためのアンチセンス核酸として使用できる。ア
ンチセンス核酸が標的とされるポリペプチドをコードする核酸の一部に相補的である場合
は、アンチセンス核酸は、機能的ポリペプチドの翻訳を阻害するようにポリペプチドをコ
ードする核酸の５’末端の十分近くへハイブリダイズするはずである。典型的には、これ
はそれにハイブリダイズする核酸の５’の半分もしくは３分の１以内である配列にアンチ
センス核酸が相補的なはずであることを意味する。
【００５４】
本発明のアンチセンス核酸はさらにまた、標的遺伝子産物をコードするｍＲＮＡを加水
分解することによって細胞内の標的核酸の発現を阻害する触媒性ＲＮＡ（すなわち、リボ
ザイム）をコードすることができる。さらに、ハンマーヘッドＲＮＡは、イントロンスプ
ライシングを防止するためのアンチセンス核酸として使用できる。本発明のアンチセンス
核酸は、アンチセンステクノロジーのための当分野において慣例的であるプロトコールに
よって生成および試験することができる。
【００５５】
本明細書に記載する用語「アルファウイルス」は当分野における通常の意味を有し、東
部ウマ脳炎（Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｅｑｕｉｎｅ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）（ＥＥＥ）ウ
イルス、ベネズエラウマ脳炎（Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ  Ｅｑｕｉｎｅ  Ｅｎｃｅｐｈａｌ
ｉｔｉｓ）（ＶＥＥ）ウイルス、エバグレーズ（Ｅｖｅｒｇｌａｄｅｓ）ウイルス、ムカ
ンボ（Ｍｕｃａｍｂｏ）ウイルス、ピクスナ（Ｐｉｘｕｎａ）ウイルス、西部脳炎（Ｗｅ
ｓｔｅｒｎ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）ウイルス（ＷＥＥ）、シンドビス（Ｓｉｎｄｂ
ｉｓ）ウイルス、南アフリカアルボウイルス（Ｓｏｕｔｈ  Ａｆｒｉｃａｎ  Ａｒｂｏｖ
ｉｒｕｓ）第８６号（Ｓ．Ａ．ＡＲ８６）、ガードウッド（Ｇｉｒｄｗｏｏｄ）Ｓ．Ａ．
ウイルス、Ｏｃｋｅｌｂｏウイルス、セムリキ森林（Ｓｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔ）ウ
イルス、ミドルバーグ（Ｍｉｄｄｌｅｂｕｒｇ）ウイルス、チクングンヤ（Ｃｈｉｋｕｎ
ｇｕｎｙａ）ウイルス、オニョンニョン（Ｏ’Ｎｙｏｎｇ−Ｎｙｏｎｇ）ウイルス、ロス
リバー（Ｒｏｓｓ  Ｒｉｖｅｒ）ウイルス、バーマ森林（Ｂａｒｍａｈ  Ｆｏｒｅｓｔ）
ウイルス、ゲタ（Ｇｅｔａｈ）ウイルス、サギヤマ（Ｓａｇｉｙａｍａ）ウイルス、ベバ
ル（Ｂｅｂａｒｕ）ウイルス、マヤロ（Ｍａｙａｒｏ）ウイルス、ウナ（Ｕｎａ）ウイル
ス、アウラ（Ａｕｒａ）ウイルス、ワタロア（Ｗｈａｔａｒｏａ）ウイルス、Ｂａｂａｎ
ｋｉウイルス、Ｋｙｚｌａｇａｃｈウイルス、Ｈｉｇｈｌａｎｄｓ  Ｊウイルス、Ｆｏｒ
ｔ  Ｍｏｒｇａｎウイルス、ヌドゥム（Ｎｄｕｍｕ）ウイルス、Ｂｕｇｇｙ  Ｃｒｅｅｋ
ウイルス、およびその他の国際ウイルス分類委員会（ＩＣＴＶ）によってアルファウイル
スであると分類された任意の他のウイルスを含む。
【００５６】
本発明の特定実施形態では、本発明の核酸によってコードされる核酸および／またはタ
ンパク質は弱毒化突然変異を含むことができる。本明細書で使用する熟語「弱毒化突然変
異」および「弱毒化アミノ酸」は、当分野における専門用語によって、その宿主内で疾患
を引き起こす確率の減少を生じさせる突然変異を含有するヌクレオチド配列、または突然
変異を含有するヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸を含む。例えば、Ｄａｖ
ｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  １３２（３ｄ  ｅｄ．１９８０）を参
照されたい。熟語「弱毒化突然変異」からは、ウイルスにとって致死的であろう突然変異
または突然変異の組み合わせが除外される。しかし、さもなければ致死性であるが弱毒化
表現型をもたらす突然変異を蘇生させる、もしくは救済する突然変異と組み合わせて組み
込むことのできる突然変異を含む。
【００５７】
適切な弱毒化突然変異は使用されるアルファウイルスに依存するが、当業者には知られ
ているであろう。代表的な弱毒化突然変異には、それらの各々の開示が本明細書に全体と
して参照して組み込まれるＪｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第５，５０５，
９４７号、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第５，１８５，４４０号、Ｄａ
ｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第５，６４３，５７６号、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  
ａｌ．への米国特許第５，７９２，４６２号、およびＪｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．へ
の米国特許第５，６３９，６５０号に記載された弱毒化突然変異が含まれるが、それらに
限定されない。
【００５８】
本発明の様々な実施形態では、本発明のアルファウイルス粒子の１つ以上のアルファウ
イルス構造タンパク質は、例えば米国特許第５，７９２，４６２号および第６，１５６，
５５８号に規定されたように１つ以上の弱毒化突然変異を含むことができる。ＶＥＥ  Ｅ
１糖タンパク質に対する特異的弱毒化突然変異は、Ｅ１アミノ酸の位置８１、２７２およ
び／または２５３のいずれか１つに弱毒化突然変異を含むことができる。ＶＥＥ−３０４
２変異体から作製されたアルファウイルス粒子はＥ１−８１でイソロイシン置換を含んで
おり、そしてＶＥＥ−３０４０変異体から作製されたウイルス粒子はＥ１−２５３で弱毒
化突然変異を含む。ＶＥＥ  Ｅ２糖タンパク質に対する特異的弱毒化突然変異は、Ｅ２ア
ミノ酸の位置７６、１２０または２０９のいずれか１つに弱毒化突然変異を含むことがで
きる。ＶＥＥ−３０１４変異体から作製されたアルファウイルス粒子はＥ１−２７２およ
びＥ２−２０９の両方で弱毒化突然変異を含有している（米国特許第５，７９２，４９２
号を参照）。ＶＥＥ  Ｅ３糖タンパク質に対する特異的弱毒化突然変異は、Ｅ３アミノ酸
５６−５９の欠失からなる弱毒化突然変異を含む。ＶＥＥ−３５２６変異体から作製され
たウイルス粒子は、Ｅ３（ａａ５６−５９）におけるこの欠失ならびにＥ１−２５３での
第２弱毒化突然変異を含有している。Ｓ．Ａ．ＡＲ８６  Ｅ２糖タンパク質に対する特異
的弱毒化突然変異は、Ｅ２アミノ酸の位置３０４、３１４、３７２、または３７６のいず
れか１つに弱毒化突然変異を含む。あるいは、弱毒化突然変異は、例えばいずれかの組み
合わせでの以下の、１５８、１５９、１６０、１６１および１６２アミノ酸位置のいずれ
か１つ以上で、Ｅ２糖タンパク質におけるアミノ酸の置換、欠失および／または挿入であ
ってよい（その全内容が参照して本明細書に組み込まれるＰｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．への国
際特許公開第ＷＯ００／６１７７２号を参照されたい）。
【００５９】
本発明のまた別の弱毒化突然変異はＶＥＥゲノムＲＮＡのヌクレオチド３、すなわち５
’メチル化キャップに続く第３ヌクレオチドでの弱毒化突然変異であってよい（例えば、
ｎｔ３でのＧ→Ｃ突然変異について記載している米国特許第５，６４３，５７６号を参照
されたい。）。この突然変異は、Ｇ→Ａ、ＵまたはＣであってよいが、一部の実施形態で
はＧ→Ａ突然変異であってもよい。
【００６０】
アルファウイルス構造タンパク質および／または非構造タンパク質がＳ．Ａ．ＡＲ８６
由来である場合は、構造タンパク質および／または非構造タンパク質における代表的な弱
毒化突然変異には弱毒化アミノ酸、好ましくはｎｓｐ１アミノ酸５３８としてのイソロイ
シンを特定するｎｓｐ１アミノ酸位置５３８でのコドン；弱毒化アミノ酸、好ましくはＥ
２アミノ酸３０４としてのトレオニンを特定するＥ２アミノ酸位置３０４でのコドン；弱
毒化アミノ酸、好ましくはＥ２アミノ酸３１４としてのリシンを特定するＥ２アミノ酸位
置３１４でのコドン；弱毒化アミノ酸、好ましくはＥ２アミノ酸残基３７２でのロイシン
を特定するＥ２アミノ酸３７２でのコドン；弱毒化アミノ酸、好ましくはＥ２アミノ酸３
７６としてのアラニンを特定するＥ２アミノ酸位置３７６でのコドン；組み合わせて、上
記に記載した弱毒化アミノ酸を特定するＥ２アミノ酸残基３０４、３１４、３７２および
３７６でのコドン；弱毒化アミノ酸、好ましくはｎｓｐ２アミノ酸９６としてのグリシン
を特定するｎｓｐ２アミノ酸位置９６でのコドン；および弱毒化アミノ酸、好ましくはｎ
ｓｐ２アミノ酸３７２としてのバリンを特定するｎｓｐ２アミノ酸位置３７２でのコドン
；組み合わせて、上記に記載したｎｓｐ２アミノ酸残基９６および３７２で弱毒化アミノ
酸をコードするｎｓｐ２アミノ酸残基９６および３７２でのコドン；弱毒化アミノ酸、好
ましくはｎｓｐ２アミノ酸残基５２９でのロイシンを特定するｎｓｐ２アミノ酸残基５２
９でのコドン；弱毒化アミノ酸、好ましくはｎｓｐ２アミノ酸残基５７１でのアスパラギ
ンを特定するｎｓｐ２アミノ酸残基５７１でのコドン；弱毒化アミノ酸、好ましくはｎｓ
ｐ２アミノ酸残基６８２でのアルギニンを特定するｎｓｐ２アミノ酸残基６８２でのコド
ン；弱毒化アミノ酸、好ましくはｎｓｐ２アミノ酸残基８０４でのアルギニンを特定する
ｎｓｐ２アミノ酸残基８０４でのコドン；弱毒化アミノ酸、好ましくはｎｓｐ３アミノ酸
残基２２でのアルギニンを特定するｎｓｐ３アミノ酸残基２２でのコドン；および組み合
わせて、上記に記載したような弱毒化アミノ酸を特定するｎｓｐ２アミノ酸残基５２９、
５７１、６８２および８０４ならびにｎｓｐ３アミノ酸残基２２でのコドンが含まれるが
、それらに限定されない。
【００６１】
他の例示的弱毒化突然変異には国際特許公開第ＰＣＴ／ＵＳ０１／２７６４４号（その
開示は参照して全体として本明細書に組み込まれる）に記載された弱毒化突然変異が含ま
れる。例えば、弱毒化突然変異はＳ．Ａ．ＡＲ８６  ｎｓｐ３タンパク質のアミノ酸位置
５３７での弱毒化突然変異であってよいが、より好ましくはこの位置での置換突然変異、
さらにいっそうより好ましくは停止コドンの置換を生じさせるナンセンス突然変異であっ
てよい。翻訳停止（すなわち、終止）コドンは当分野において知られており、「オパール
」（ＵＧＡ）、「アンバー」（ＵＡＧ）および「オーカー」（ＵＡＡ）終止コドンが含ま
れる。本発明の実施形態では、弱毒化突然変異はＳ．Ａ．ＡＲ８６  ｎｓｐ３アミノ酸位
置５３７でＣｙｓ→オパール置換を生じさせることができる。
【００６２】
また別の代表的な弱毒化突然変異は、Ｓ．Ａ．ＡＲ８６  ｎｓｐ３タンパク質のアミノ
酸３８５に続く弱毒化挿入突然変異を含むことができる。挿入は、少なくとも２、４、６
、８、１０、１２、１４、１６もしくは２０個のアミノ酸の挿入を含むことができる。本
発明の一部の実施形態では、挿入されたアミノ酸配列は、セリン／トレオニンキナーゼに
よるリン酸化のための基質として機能するセリンおよびトレオニン残基に富む（例えば、
少なくとも２、４、６、もしくは８個のそのような部位を含む）。
【００６３】
特定の実施形態では、弱毒化突然変異はｎｓｐ３のアミノ酸３８５に続くアミノ酸配列
Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−
Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ（配列番号１）の挿
入を含むことができる（すなわち、第１アミノ酸はｎｓｐ３におけるアミノ酸３８６と指
定される）。本発明の他の実施形態では、挿入突然変異は弱毒化表現型を生じさせる配列
番号１の断片の挿入を含むことができる。この断片は、配列番号１からの少なくとも４、
６、８、１０、１２、１４、１５、１６もしくは１７個の連続アミノ酸を含むことができ
る。
【００６４】
当業者であれば、上述した配列の断片を含む、または上述した配列内へ保存的アミノ酸
置換を組み込んでいる他の弱毒化挿入配列は慣例的方法によって慣例的に同定できること
を理解するであろう（上記のように）。本発明のいずれかの理論によって結び付けること
を望まなくても、配列番号１の挿入配列は、弱毒化表現型を与えるセリン残基で高度にリ
ン酸化されると思われる。そこで、セリン（もしくはトレオニン）リン酸化のための基質
として機能する他の弱毒化挿入配列は当分野において知られている従来技術によって同定
できる。あるいは、または追加して、Ｓ．Ａ．ＡＲ８６  ｎｓｐ３タンパク質のアミノ酸
３８５（すなわち、上述した挿入配列の直前）でのＴｙｒ→Ｓｅｒ置換がある。この配列
は、非毒性シンドビス群ウイルス内では保存されているが、Ｓ．Ａ．ＡＲ８６からは欠失
している。
【００６５】
他の実施形態では、本発明のアルファウイルスは、いずれかのシンドビスウイルス株（
例、ＴＲ３３９）、ＶＥＥ（メチル化キャップに続くゲノムＲＮＡのヌクレオチド３で突
然変異を有する）、Ｓ．Ａ．ＡＲ８６ウイルス、ガードウッドＳ．Ａ．ウイルス、Ｏｃｋ
ｅｌｂｏウイルス、および／またはそのキメラウイルスであってよい。多数のアルファウ
イルスについて、完全ゲノム配列、ならびに様々な構造タンパク質および非構造タンパク
質の配列は当分野において知られており、シンドビスウイルスゲノム配列（ＧｅｎＢａｎ
ｋアクセッション番号Ｊ０２３６３、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＣ＿００１５４７）
、Ｓ．Ａ．ＡＲ８６ゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３８３０５）、Ｖ
ＥＥゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ０４６５３、ＮＣＢＩアクセッシ
ョン番号ＮＣ＿００１４４９）、ガードウッドＳ．Ａゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセ
ッション番号Ｕ３８３０４）、セムリキ森林ウイルスゲノム配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセ
ッション番号Ｘ０４１２９、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＣ＿００３２１５）、および
ＴＲ３３９ゲノム配列（Ｋｌｉｍｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ
．７２：７３５７；ＭｃＫｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７
０：１９８１）が含まれる。
【００６６】
本発明の特定実施形態では、本発明のアルファウイルス構造タンパク質は、シンドビス
ウイルス構造タンパク質、ＳＦＶ構造タンパク質、ＶＥＥ構造タンパク質、ロスリバーウ
イルス構造タンパク質、Ｓ．Ａ．ＡＲ８６構造タンパク質、ＥＥＥ構造タンパク質および
／またはＷＥＥ構造タンパク質であってよい。これらは、相互とのいずれかの組み合わせ
で存在していてよく、そして本発明のキメラ組み換えアルファウイルス粒子およびまたは
キメラ組み換え核酸を生成するためのこれらおよび／または他のアルファウイルスのいず
れかからの５’アルファウイルス複製認識配列、アルファウイルスサブゲノムプロモータ
ーおよび３’アルファウイルス複製認識配列などのいずれかのアルファウイルス非構造タ
ンパク質および／または他のアルファウイルス配列との組み合わせで存在していてよい。
【００６７】
また別の実施形態では、本発明のＩＲＥＳエレメントは、異種核酸によってコードされ
る遺伝子産物の翻訳の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４
０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９
０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％が該
ＩＲＥＳエレメントの活性によって制御されるように、本発明の組み換え核酸の異種核酸
によってコードされる遺伝子産物の翻訳を指令する。該ＩＲＥＳによって制御されるよう
な本発明の組み換えレプリコン核酸中の異種核酸によってコードされる遺伝子産物の翻訳
のパーセンテージは、当分野において周知であり、本明細書に提供した実施例のセクショ
ンに記載したアッセイによって決定できる。
【００６８】
その上、本発明のＩＲＥＳエレメントが本発明のヘルパー構築物内に存在するアルファ
ウイルス構造タンパク質の翻訳を指令する本発明の実施形態では、本発明のＩＲＥＳエレ
メントは、構造タンパク質の翻訳の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％
、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％
、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１
００％が該ＩＲＥＳエレメントの活性によって制御されるように、１つ以上の構造タンパ
ク質の翻訳を指令できる。本発明のＩＲＥＳエレメントによって制御される１つ以上の構
造タンパク質の翻訳のパーセンテージは、当分野において周知であり、本明細書に提供し
た実施例のセクションに記載したアッセイによって決定できる。
【００６９】
本発明の核酸はＲＮＡまたはＤＮＡであってよい。
【００７０】
本発明のまた別の実施形態では、一連のヘルパー核酸（「ヘルパー構築物」または「ヘ
ルパー分子」）、すなわち１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質を発現する組み換
えＤＮＡまたはＲＮＡ分子が提供される。１セットのＲＮＡ実施形態では、該ヘルパー構
築物は（ｉ）５’アルファウイルス複製認識配列と、（ｉｉ）転写プロモーターと、（ｉ
ｉｉ）少なくとも１つの、しかし全部ではないアルファウイルス構造タンパク質をコード
する核酸配列と、および（ｉｖ）アルファウイルス３’複製認識配列と、をコードする第
１核酸配列を含む。特定の実施形態では、Ｅ１およびＥ２糖タンパク質は１つのヘルパー
構築物によってコードされ、そしてキャプシドタンパク質は他の別個のヘルパー構築物に
よってコードされる。また別の実施形態では、Ｅ１糖タンパク質、Ｅ２糖タンパク質、お
よびキャプシドタンパク質は各々別個のヘルパー構築物によってコードされる。他の実施
形態では、キャプシドタンパク質および糖タンパク質の１つは１つのヘルパー構築物によ
ってコードされ、そして他の糖タンパク質は別個の第２ヘルパー構築物によってコードさ
れる。さらにまた別の実施形態では、キャプシドタンパク質および糖タンパク質Ｅ１は１
つのヘルパー構築物によってコードされ、そしてキャプシドタンパク質および糖タンパク
質Ｅ２は別個のヘルパー構築物によってコードされる。特定の実施形態では、本発明のヘ
ルパー構築物はアルファウイルスパッケージングシグナルを含んでいない。
【００７１】
あるいは、上述したヘルパー核酸は、ヘルパー細胞のゲノム内に安定性で統合できる、
またはエピソーム（例、ＥＢＶ由来エピソーム）から発現させることのできるＤＮＡ分子
として構築される。ＤＮＡ分子はさらにまた細胞内で一過性に発現させることができる。
ＤＮＡ分子は、プラスミドなどの非組み込み型ＤＮＡベクター、またはウイルスベクター
を含むがそれらに限定されない当分野において知られているいずれかのベクターであって
よい。ＤＮＡ分子は、本明細書で記載するように、アルファウイルス構造タンパク質の１
つまたは全部をあらゆる組み合わせでコードすることができる。
【００７２】
本発明のヘルパー構築物は、本発明のアルファウイルス粒子を生成するために使用され
る「ヘルパー細胞」内に導入される。上述したように、アルファウイルス構造タンパク質
をコードする核酸はヘルパー細胞内に一過性で、またはヘルパー細胞のゲノム内への安定
性組込みによって存在してよい。本発明のアルファウイルス粒子を生成するために使用さ
れるアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸は、構成性および／または誘導性
プロモーターの制御下にあってよい。同様に上述したように、アルファウイルス構造タン
パク質コード配列は組み換えレプリコン核酸上および／またはＩＲＥＳエレメントを含む
ヘルパー構築物上で提供することができ、そしてこれらのコード配列の翻訳はＩＲＥＳエ
レメントの活性によって制御することができる。そのような実施形態では、ＩＲＥＳエレ
メントは特異的ヘルパー細胞タイプ内で活性であっても、活性でなくても、または他の細
胞タイプでは活性が極めて小さくてもよい。特定の実施形態では、本発明のヘルパー細胞
は、組み換えレプリコン核酸がそれによってアルファウイルス構造タンパク質が生成され
て組み換えレプリコン核酸が本発明のアルファウイルス粒子内にパッケージングされる条
件下で細胞内に導入されるときに、本発明のアルファウイルス粒子を生成するためにある
組み合わせおよび／または十分な量でアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸
配列を含む。
【００７３】
本発明の実施形態の全部において、組み換えレプリコン核酸および／またはヘルパー分
子によってコードされる少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質および／また
は非構造タンパク質、および／または組み換えレプリコンおよび／またはヘルパー核酸の
非翻訳領域は、本明細書に記載されており、そして文献において周知のように、あらゆる
組み合わせで１つ以上の弱毒化突然変異を含有することができると意図される。
【００７４】
本発明の特定構築物では、ＤＮＡからのＲＮＡの転写を指令するためのプロモーター、
すなわちＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが使用される。本発明のＲＮＡヘルパーおよび
レプリコン実施形態ではプロモーターを利用してインビトロ転写反応においてＲＮＡが合
成され、この使用のために適切な特異的プロモーターにはＳＰ６、Ｔ７、およびＴ３  Ｒ
ＮＡポリメラーゼプロモーターが含まれるが、それらに限定されない。ＤＮＡヘルパー実
施形態では、このプロモーターは細胞内で機能してＲＮＡの転写を指令する。該構築物の
インビボ転写のための潜在的プロモーターには、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、
ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターなどの真核生物プロモーター、またはＭＭＴＶお
よびＭｏＳＶ  ＬＴＲ、ＳＶ４０早期領域、ＲＳＶもしくはＣＭＶなどのウイルスプロモ
ーターが含まれるが、それらに限定されない。本発明のために多数の他の適切な哺乳動物
およびウイルスプロモーターが利用可能であり、当分野において知られている。あるいは
、細菌もしくはバクテリオファージ（例えばＳＰ６、Ｔ７、およびＴ３）由来のＤＮＡ依
存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、別個のプラスミド、ＲＮＡベクター、またはウ
イルスベクターのいずれかを介して、細胞へ提供される適合するＲＮＡポリメラーゼと一
緒にインビボで使用するために利用できる。特定の実施形態では、適合するＲＮＡポリメ
ラーゼは誘導性プロモーターの制御下でヘルパー細胞系に安定性で形質転換させることが
できる。細胞内で機能する構築物は細胞内に形質転換させた自律プラスミドとして機能す
ることができる、および／またはそれらはゲノム内に安定性で形質転換させることができ
る。安定性で形質転換された細胞系では、プロモーターは誘導性プロモーターであってよ
いので、その結果として細胞は、細胞が適切な刺激（誘導因子）へ曝露させられると安定
性で形質転換させられた構築物によってコードされるＲＮＡポリメラーゼだけを生成する
であろう。ヘルパー構築物は、該誘導因子と同時に、前に、および／または後に安定性で
形質転換された細胞内へ導入され、それによってアルファウイルス構造タンパク質の発現
に影響を及ぼす。あるいは、細胞内で機能するように設計された構築物を、哺乳動物ｐｏ
ｌ  ＩＩプロモーターとともに例えばアデノウイルス、ポックスウイルス、アデノ随伴ウ
イルス、ＳＶ４０、レトロウイルス、ノダウイルス（ｎｏｄａｖｉｒｕｓ）、ピコルナウ
イルス、水疱性口内炎（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ）ウイルス、および
バキュロウイルスなどのウイルスベクターを介して細胞内に導入することができる。
【００７５】
本明細書に提供した本発明の特定の実施形態では、本発明の組み換えレプリコン核酸お
よび／またはヘルパー核酸は、本発明の組み換えレプリコン核酸および／またはヘルパー
核酸内のＩＲＥＳエレメントの上流に位置していてよいスペーサー核酸を含むことができ
る。スペーサー核酸は、翻訳が次にＩＲＥＳによって一部または全部が指令されるように
、メッセンジャーＲＮＡの５’キャップからの少なくとも一部、および一部の実施形態で
は全部の翻訳を防止するために十分な長さであるいずれかのランダムもしくは特異的非コ
ーディング核酸配列を含んでいてよい、本質的にそれらから構成されてよい、または構成
される。あるいは、スペーサー核酸は、メッセンジャーＲＮＡの５’キャップからの少な
くとも一部およびもしかすると全部の翻訳活性を防止するために核酸へ十分な二次構造を
付与する長さおよび配列構造であってよい。
【００７６】
１つの例として、市販で入手できるプラスミドｐＣＤＮＡ３．１（−）は、このプラス
ミド内で頻回に切断する制限酵素ＡｌｕＩを用いて消化されたので、したがって多数のラ
ンダムおよび様々なサイズの断片を生成する（詳細については、実施例３を参照されたい
）。ｐＣＤＮＡプラスミドは長さが５４２７ヌクレオチドであり、挿入された核酸の発現
のための様々なプロモーター（ＣＭＶ、Ｔ７、ＳＶ４０）ならびにポリアデニル化シグナ
ルおよび抗生物質耐性遺伝子を含む真核生物発現ベクターである。ＡｌｕＩ酵素はこれら
のエレメント全体で切断し、ある範囲のランダム断片を提供する。以下では、この実施例
から生成された、そしてこのプラスミドからのいずれかの機能的エレメントをコードしな
い数種のスペーサーの実施例およびそれらの配列を提供する。
３５７ヌクレオチドスペーサー：
ＣＴＧＡＡＴＧＡＡＧＣＣＡＴＡＣＣＡＡＡＣＧＡＣＧＡＧＣＧＴＧＡＣＡＣＣＡＣＧＡ
ＴＧＣＣＴＧＴＡＧＣＡＡＴＧＧＣＡＡＣＡＡＣＧＴＴＧＣＧＣＡＡＡＣＴＡＴＴＡＡＣ
ＴＧＧＣＧＡＡＣＴＡＣＴＴＡＣＴＣＴＡＧＣＴＡＣＣＡＡＣＴＣＴＴＴＴＴＣＣＧＡＡ
ＧＧＴＡＡＣＴＧＧＣＴＴＣＡＧＣＡＧＡＧＣＧＣＡＧＡＴＡＣＣＡＡＡＴＡＣＴＧＴＴ
ＣＴＴＣＴＡＧＴＧＴＡＧＣＣＧＴＡＧＴＴＡＧＧＣＣＡＣＣＡＣＴＴＣＡＡＧＡＡＣＴ
ＣＴＧＴＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＡＴＡＣＣＴＣＧＣＴＣＴＧＣＴＡＡＴＣＣＴＧＴＴ
ＡＣＣＡＧＴＧＧＣＴＧＣＴＧＣＣＡＧＴＧＧＣＧＡＴＡＡＧＴＣＧＴＧＴＣＴＴＡＣＣ
ＧＧＧＴＴＧＧＡＣＴＣＡＡＧＡＣＧＡＴＡＧＴＴＡＣＣＧＧＡＴＡＡＧＧＣＧＣＡＧＣ
ＧＧＴＣＧＧＧＣＴＧＡＡＣＧＧＧＧＧＧＴＴＣＧＴＧＣＡＣＡＣＡＧＣＣＣＡＧ
３４２ヌクレオチドスペーサー：
ＣＴＡＴＴＣＣＡＧＡＡＧＴＡＧＴＧＡＧＧＡＧＧＣＴＴＴＴＴＴＧＧＡＧＧＣＣＴＡＧ
ＧＣＴＴＴＴＧＣＡＡＡＡＡＧＣＴＴＧＴＡＴＡＴＣＣＡＴＴＴＴＣＧＧＡＴＣＴＧＡＴ
ＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＡＴＧＡＧＧＡＴＣＧＴＴＴＣＧＣＡＴＧＡＴＴＧＡＡＣＡＡＧ
ＡＴＧＧＡＴＴＧＣＡＣＧＣＡＧＧＴＴＣＴＣＣＧＧＣＣＧＣＴＴＧＧＧＴＧＧＡＧＡＧ
ＧＣＴＡＴＴＣＧＧＣＴＡＴＧＡＣＴＧＧＧＣＡＣＡＡＣＡＧＡＣＡＡＴＣＧＧＣＴＧＣ
ＴＣＴＧＡＴＧＣＣＧＣＣＧＴＧＴＴＣＣＧＧＣＴＧＴＣＡＧＣＧＣＡＧＧＧＧＣＧＣＣ
ＣＧＧＴＴＣＴＴＴＴＴＧＴＣＡＡＧＡＣＣＧＡＣＣＴＧＴＣＣＧＧＴＧＣＣＣＴＧＡＡ
ＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＧＡＣＧＡＧＧＣＡＧＣＧＣＧＧＣＴＡＴＣＧＴＧＧＣＴＧＧＣＣ
ＡＣＧＡＣＧＧＧＣＧＴＴＣＣＴＴＧＣＧＣＡＧ
２５７ヌクレオチドスペーサー：
ＣＴＣＡＴＴＴＴＴＴＡＡＣＣＡＡＴＡＧＧＣＣＧＡＡＡＴＣＧＧＣＡＡＡＡＴＣＣＣＴ
ＴＡＴＡＡＡＴＣＡＡＡＡＧＡＡＴＡＧＡＣＣＧＡＧＡＴＡＧＧＧＴＴＧＡＧＴＧＴＴＧ
ＴＴＣＣＡＧＴＴＴＧＧＡＡＣＡＡＧＡＧＴＣＣＡＣＴＡＴＴＡＡＡＧＡＡＣＧＴＧＧＡ
ＣＴＣＣＡＡＣＧＴＣＡＡＡＧＧＧＣＧＡＡＡＡＡＣＣＧＴＣＴＡＴＣＡＧＧＧＣＧＡＴ
ＧＧＣＣＣＡＣＴＡＣＧＴＧＡＡＣＣＡＴＣＡＣＣＣＴＡＡＴＣＡＡＧＴＴＴＴＴＴＧＧ
ＧＧＴＣＧＡＧＧＴＧＣＣＧＴＡＡＡＧＣＡＣＴＡＡＡＴＣＧＧＡＡＣＣＣＴＡＡＡＧＧ
ＧＡＧＣＣＣＣＣＧＡＴＴＴＡＧＡＧ
３８３ヌクレオチドスペーサー：
ＣＴＧＣＧＣＡＡＧＧＡＡＣＧＣＣＣＧＴＣＧＴＧＧＣＣＡＧＣＣＡＣＧＡＴＡＧＣＣＧ
ＣＧＣＴＧＣＣＴＣＧＴＣＣＴＧＣＡＧＴＴＣＡＴＴＣＡＧＧＧＣＡＣＣＧＧＡＣＡＧＧ
ＴＣＧＧＴＣＴＴＧＡＣＡＡＡＡＡＧＡＡＣＣＧＧＧＣＧＣＣＣＣＴＧＣＧＣＴＧＡＣＡ
ＧＣＣＧＧＡＡＣＡＣＧＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＣＣＧＡＴＴＧＴＣＴＧＴＴＧ
ＴＧＣＣＣＡＧＴＣＡＴＡＧＣＣＧＡＡＴＡＧＣＣＴＣＴＣＣＡＣＣＣＡＡＧＣＧＧＣＣ
ＧＧＡＧＡＡＣＣＴＧＣＧＴＧＣＡＡＴＣＣＡＴＣＴＴＧＴＴＣＡＡＴＣＡＴＧＣＧＡＡ
ＡＣＧＡＴＣＣＴＣＡＴＣＣＴＧＴＣＴＣＴＴＧＡＴＣＡＧＡＴＣＣＧＡＡＡＡＴＧＧＡ
ＴＡＴＡＣＡＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＴＴＡＧＧＣＡＣＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＡＣＡＣＴＴ
ＴＡＴＧＣＴＴＣＣＧＧＣＴＣＧＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＡＧＣＧＧＡ
ＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧ
５７９ヌクレオチドスペーサー：
ＣＴＧＣＡＡＴＡＡＡＣＡＡＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＣＧＡＡＧＡＡＣＴＣＣＡＧＣＡＴ
ＧＡＧＡＴＣＣＣＣＧＣＧＣＴＧＧＡＧＧＡＴＣＡＴＣＣＡＧＣＣＧＧＣＧＴＣＣＣＧＧ
ＡＡＡＡＣＧＡＴＴＣＣＧＡＡＧＣＣＣＡＡＣＣＴＴＴＣＡＴＡＧＡＡＧＧＣＧＧＣＧＧ
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ＡＣＧＧＧＣＧＴＴＣＣＴＴＧＣＧＣＡＧ
７４９ヌクレオチドスペーサー：
ＣＴＧＣＡＡＴＡＡＡＣＡＡＧＴＴＧＧＧＧＴＧＧＧＣＧＡＡＧＡＡＣＴＣＣＡＧＣＡＴ
ＧＡＧＡＴＣＣＣＣＧＣＧＣＴＧＧＡＧＧＡＴＣＡＴＣＣＡＧＣＣＧＧＣＧＴＣＣＣＧＧ
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ＧＴＣＧＧＴＣＡＴＴＴＣＧＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＴＣＣＣＧＣＴＣＡＧＡＡＧＡＡＣＴ
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ＣＴＡＴＧＴＣＣＴＧＡＴＡＧＣＧＧＴＣＣＧＣＣＡＣＡＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＣＡ
ＧＴＣＧＡＴＧＡＡＴＣＣＡＧＡＡＡＡＧＣＧＧＣＣＡＴＴＴＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＴＡ
ＴＴＣＧＧＣＡＡＧＣＡＧＧＣＡＴＣＧＣＣＡＴＧＧＧＴＣＡＣＧＡＣＧＡＧＡＴＣＣＴ
ＣＧＣＣＧＴＣＧＧＧＣＡＴＧＣＧＣＧＣＣＴＴＧＡＧＣＣＴＧＧＣＧＡＡＣＡＧＴＴＣ
ＧＧＣＴＧＧＣＧＣＧＡＧＣＣＣＣＴＧＡＴＧＣＴＣＴＴＣＧＴＣＣＡＧＡＴＣＡＴＣＣ
ＴＧＡＴＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＧＧＣＴＴＣＣＡＴＣＣＧＡＧＴＡＣＧＴＧＣＴＣＧＣＴ
ＣＧＡＴＧＣＧＡＴＧＴＴＴＣＧＣＴＴＧＧＴＧＧＴＣＧＡＡＴＧＧＧＣＡＧＧＴＡＧＣ
ＣＧＧＡＴＣＡＡＧＣＧＴＡＴＧＣＡＧＣＣＧＣＣＧＣＡＴＴＧＣＡＴＣＡＧＣＣＡＴＧ
ＡＴＧＧＡＴＡＣＴＴＴＣＴＣＧＧＣＡＧＧＡＧＣＡＡＧＧＴＧＡＧＡＴＧＡＣＡＧＧＡ
ＧＡＴＣＣＴＧＣＣＣＣＧＧＣＡＣＴＴＣＧＣＣＣＡＡＴＡＧＣＡＧＣＣＡＧＴＣＣＣＴ
ＴＣＣＣＧＣＴＴＣＡＧＴＧＡＣＡＡＣＧＴＣＧＡＧＣＡＣＡＧ
【００７７】
関連しないプラスミドから生成されたランダム核酸断片（上述したＡｌｕＩ断片におけ
るように）の使用に加えて、スペーサーとして、細胞もしくはウイルス遺伝子から、例え
ば遺伝子の５’非コーディング領域からの断片を使用することも可能である。１つのアプ
ローチは、現在あるＩＲＥＳを取り囲んでいる非コード配列を使用する方法である（実施
例４Ｂ．４を参照）。もう１つのアプローチは、アルファウイルス遺伝子、例えばキャプ
シド遺伝子の５’非コーディング領域を使用する方法である（実施例４Ａ．２を参照）。
【００７８】
そこで、本発明のスペーサー核酸は最小であってよい、長さが少なくとも２５核酸であ
ってよい、および所与の組み換えレプリコン核酸内で許容される限りの長さでよいことが
企図されている。例えば、本発明のスペーサー核酸は、特定の実施形態では、長さがおよ
そ２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７５、８０、８５、９０、
９５、１００、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１
５０、１６０、１７０、１７５、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２２５、２
３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４
００、４２５、４５０、４７５、５０、６００、７００、８００、９００、１０００、１
５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５
５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９
５００、または１０，０００ヌクレオチドであってよい。「およそ」は、スペーサー核酸
は長さが１０％、１５％、２０％および／または２５％まで変動する可能性があることを
意味する。
【００７９】
本発明のスペーサー核酸はメッセンジャーＲＮＡの転写を開始するために３’から５’
へ配置された、および５’から機能的ＩＲＥＳエレメントへ置かれたヌクレオチド配列で
あってもよいが、前記ＩＲＥＳエレメントから指令された翻訳のレベルは非機能的ＩＲＥ
Ｓエレメントから入手されたレベルより少なくとも約５倍高い。好ましい実施形態では、
翻訳のレベルは少なくともおよそ１０倍、２０倍、５０倍、１００倍、１５０倍、１８０
倍、２００倍、３００倍、４００倍もしくは５００倍以上である。他の実施形態では、異
種核酸によってコードされる遺伝子産物および／またはＩＲＥＳ含有ヘルパー構築物によ
ってコードされる１つ以上の構造タンパク質の翻訳の少なくとも１０％、２０％、３０％
、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％
、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％は、該ＩＲＥＳエレメントの活性に
よって制御される。
【００８０】
本発明は、さらにまた本発明の組み換えレプリコン核酸を含むアルファウイルス粒子を
提供する。さらにまた、感染性の複製欠損アルファウイルス粒子の集団が提供されるが、
このとき各粒子は本発明の組み換えレプリコン核酸を含むアルファウイルスレプリコンＲ
ＮＡを含有する。一部の実施形態では、本発明の集団は、細胞培養上の継代および／また
は複製コンピテントウイルスを検出するために周知の他のアッセイによって測定されるよ
うに、検出可能な複製コンピテントウイルスを有していない。
【００８１】
本発明はさらに、医薬上許容される担体中に本発明の核酸、ベクター、粒子および／ま
たは集団を含む医薬組成物を提供する。「医薬上許容される」は生物学的または他の点で
有害ではない物質を意味する。すなわちこの物質は、実質的に有害な生物学的作用を引き
起こさずに、またはその中に含まれる組成物の他の成分のいずれかと有害な方法で相互作
用せずに選択されたペプチド、ポリペプチド、核酸、ベクターもしくは細胞と一緒に個々
に投与することができる。
【００８２】
その上に、本発明のいずれかの組成物は医薬上許容される担体および適切なアジュバン
トを含むことができる。本明細書で使用する「適切なアジュバント」は被験者または被験
者の細胞に有害な作用をもたらすことなく免疫反応をいっそう増強するために本発明のペ
プチドまたはポリペプチドと組み合わせることのできるアジュバントを意味する。適切な
アジュバントは、リン酸緩衝食塩水中の５％（ｗｔ／ｖｏｌ）スクアレン（ＤＡＳＦ社、
ニュージャージー州パーシッパニー）、２．５％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、Ｌ１２１ポリマー
（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、ミルウォーキー）、および０．２％のポリソル
ベート（Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｓｉｇｍａ社）から構成されるＳＹＮＴＥＸアジュバント調
製物１（ＳＡＦ−１）であるＭＯＮＴＡＮＩＤＥ  ＩＳＡ５１（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｉｎｃ．
社、ニュージャージー州フェアフィールド）であってよいが、それに限定されない。その
他の適切なアジュバントは当分野において周知であり、ＱＳ−２１、（完全および不完全
）フロイントのアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ）、アルミニウム塩
（ミョウバン）、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミール
−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ｎｏｒ−ム
ラミール−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ  １１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰと
呼ばれる）、Ｎ−アセチル−ムラミール−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−ア
ラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリ
ルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ  １９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる）、および
２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ  ８０エマルジョン中に細菌から抽出された３種の成分、モ
ノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジミコレートおよび細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋Ｃ
ＷＳ）を含有するＲＩＢＩが含まれる。アジュバントは、本発明の組成物と、または本発
明の組成物と組み合わせて使用できる他のワクチン組成物のいずれかと組み合わせること
ができる。アジュバントの例には、水中油エマルジョン調製物、細菌細胞壁成分もしくは
合成分子などの免疫刺激剤、またはまた別の骨格成分、オリゴヌクレオチド（例、ＣｐＧ
ｓ）および例えばポリビニルポリマーを組み込むことのできる核酸ポリマー（二本鎖およ
び一本鎖ＲＮＡおよびＤＮＡの両方）が含まれるが、それらに限定されない。
【００８３】
本発明の組成物は、さらにまた他の医薬品、医薬物質、担体、希釈剤、免疫刺激性サイ
トカインなどを含むことができる。そのような剤形を調製する実際的方法は、当業者には
知られている、または明白であろう。本発明によって企図されるアルファウイルスレプリ
コン粒子のために好ましい用量範囲は、投与１回当たり１０3から１０10個の粒子であっ
てよい。ヒトのためには、１０6、１０7または１０8が好ましい用量である。用法は、被
験者への本発明の組成物の投与によって達成される所望の予防作用および／または治療作
用を達成するために必要と見なされる１時間毎、１日毎、１週間毎、１カ月毎、１年毎な
どの１回以上の投与であってよい。特定投与の有効性は、当分野において周知の方法によ
って決定できる。
【００８４】
本発明は、感染性の複製欠損アルファウイルス粒子を作製する方法であって、ａ）細胞
内に以下の、（ｉ）本発明の組み換えレプリコン核酸と、（ｉｉ）アルファウイルス構造
タンパク質をコードする１つ以上のヘルパー核酸であって、該１つ以上のヘルパー核酸が
該アルファウイルス構造タンパク質の全部を生成するヘルパー核酸と、を導入するステッ
プと、および（ｂ）該細胞内で前記アルファウイルス粒子を生成するステップと、を含む
方法をさらに提供する。一部の実施形態では、該組み換えレプリコン核酸はアルファウイ
ルス構造タンパク質をコードする少なくとも１つの異種核酸を含むことができる。
【００８５】
本発明の方法の他の実施形態では、該ヘルパー核酸は５’アルファウイルス複製認識配
列と、アルファウイルスサブゲノムプロモーターと、アルファウイルス構造タンパク質を
コードする核酸と、および３’アルファウイルス複製認識配列と、を含む組み換え核酸で
あってよい。
【００８６】
さらにまた別の実施形態では、該ヘルパー核酸は、プロモーター（例、ＣＭＶプロモー
ター）および全部を含む１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質をコードするヌクレ
オチド配列を含む組み換え核酸（ＤＮＡであってよい）であってよい。
【００８７】
本発明のヘルパー核酸は、いずれかの順序および／またはいずれかの組み合わせでアル
ファウイルス構造タンパク質（Ｃ、Ｅ１、Ｅ２）のいずれか１つ以上をコードする核酸配
列を含むことができる。そこで、ヘルパー細胞はアルファウイルス粒子を生成するために
必要なアルファウイルス構造タンパク質の全部を提供するために必要とされるできる限り
多数のヘルパー核酸を含むことができる。ヘルパー細胞は、ヘルパー（例、パッケージン
グ）細胞のゲノム内に安定性に組み込まれた１つ以上のヘルパー核酸を含むことができる
。そのようなヘルパー細胞では、アルファウイルス構造タンパク質は誘導性プロモーター
であってよいプロモーターの制御下で生成できる。
【００８８】
一部の実施形態では、本発明の方法において使用されるヘルパー核酸は、５’アルファ
ウイルス複製認識配列と、ＩＲＥＳエレメントと、アルファウイルス構造タンパク質をコ
ードする核酸と、および３’アルファウイルス複製認識配列と、を含む組み換え核酸であ
ってよい。
【００８９】
さらにまた別の実施形態では、該ヘルパー核酸は５’アルファウイルス複製認識配列と
、アルファウイルスサブゲノムプロモーターと、ＩＲＥＳエレメントと、１つ以上のアル
ファウイルス構造タンパク質をコードする核酸と、および３’アルファウイルス複製認識
配列と、を含む組み換え核酸であってよい。
【００９０】
さらに、本明細書では、感染性の複製欠損アルファウイルス粒子を作製する方法であっ
て、ａ）細胞内に以下の、ｉ）５’アルファウイルス複製認識配列、アルファウイルス非
構造タンパク質をコードする１つ以上の核酸配列、アルファウイルスサブゲノムプロモー
ター、異種核酸配列および３’アルファウイルス複製認識配列を含むアルファウイルスレ
プリコンＲＮＡと；およびｉｉ）５’アルファウイルス複製認識配列、アルファウイルス
サブゲノムプロモーター、ＩＲＥＳエレメント、１つ以上のアルファウイルス構造タンパ
ク質をコードする核酸および３’アルファウイルス複製認識配列を含むアルファウイルス
構造タンパク質をコードする１つ以上のヘルパー核酸と、を導入するステップであって、
それによってアルファウイルス構造タンパク質の全部が該細胞内で生成されるステップと
、および（ｂ）該細胞内で前記アルファウイルス粒子を生成するステップと、を含む方法
が提供される。
【００９１】
さらに本明細書では、感染性の複製欠損アルファウイルス粒子を作製する方法であって
、ａ）細胞内に以下の、ｉ）５’アルファウイルス複製認識配列、アルファウイルス非構
造タンパク質をコードする１つ以上の核酸配列、少なくとも１つのアルファウイルスサブ
ゲノムプロモーター、少なくとも１つのＩＲＥＳエレメント、少なくとも１つの異種核酸
配列および３’アルファウイルス複製認識配列を含むアルファウイルスレプリコンＲＮＡ
と；およびｉｉ）５’アルファウイルス複製認識配列、アルファウイルスサブゲノムプロ
モーター、ＩＲＥＳエレメント、１つ以上のアルファウイルス構造タンパク質をコードす
る核酸および３’アルファウイルス複製認識配列を含むアルファウイルス構造タンパク質
をコードする１つ以上のヘルパー核酸と、を導入するステップであって、それによってア
ルファウイルス構造タンパク質の全部が該細胞内で生成されるステップと、および（ｂ）
該細胞内で前記アルファウイルス粒子を生成するステップと、を含む方法が提供される。
【００９２】
本発明のアルファウイルス粒子を作製する方法は、さらに該細胞から前記アルファウイ
ルス粒子を収集するステップをさらに含むことができる。
【００９３】
本発明は、５’アルファウイルス複製認識配列、アルファウイルスサブゲノムプロモー
ター、ＩＲＥＳエレメント、いずれかの組み合わせおよび／または順序で１つ以上のアル
ファウイルス構造タンパク質をコードする核酸および３’アルファウイルス複製認識配列
を含む組み換え核酸をさらに提供する。一部の実施形態では、この組み換えヘルパー核酸
は、ＩＲＥＳエレメントの上流に位置していてよいスペーサーヌクレオチド配列を含むこ
とができる。さらにまた、この組み換え核酸を含むベクターおよび／または細胞が提供さ
れる。
【００９４】
追加して本明細書では、５’アルファウイルス複製認識配列をコードする第１核酸配列
と；アルファウイルス非構造タンパク質をコードする少なくとも１つの第２核酸配列と、
第１アルファウイルスサブゲノムプロモーターと；第１ＩＲＥＳエレメントと、第１異種
核酸と；第２アルファウイルスサブゲノムプロモーターと；第２ＩＲＥＳエレメントと、
３’アルファウイルス複製認識配列をコードする第３核酸と、を含む組み換え核酸が提供
される。一部の実施形態では、第１および第２アルファウイルスサブゲノムプロモーター
は同一であっても相違していてもよく、該第１および第２ＩＲＥＳエレメントは同一であ
っても相違していてもよく、および／または該第１および第２異種核酸は同一であっても
相違していてもよい。この組み換え核酸はアルファウイルスパッケージングシグナルおよ
び／またはＩＲＥＳエレメントの上流であってよいスペーサーヌクレオチド配列を含むこ
とができる。この組み換え核酸は、アルファウイルス非構造タンパク質コード配列の４つ
全部が組み換え核酸上に存在するように、いずれかの順序および／または組み合わせでア
ルファウイルス非構造タンパク質をコードする１つ以上の第２核酸配列をさらに含むこと
ができる。この組み換え核酸は本発明のアルファウイルス粒子内に存在していてよく、そ
してそのような粒子は本発明の集団として、および／または本発明の医薬組成物内に存在
していてよい。
【００９５】
さらにまた、第３以降の追加のアルファウイルスサブゲノムプロモーターと、第３以降
の追加のＩＲＥＳエレメントと、および／または第３以降の追加の異種核酸と、をさらに
含む上述したような組み換えレプリコン核酸が提供される。この組み換え核酸は本発明の
アルファウイルス粒子内に存在していてよく、そしてそのような粒子は本発明の集団とし
て、および／または本発明の医薬組成物内に存在していてよい。この実施形態の組み換え
核酸を含むアルファウイルス粒子は、本発明のいずれかの方法によって生成することがで
き、免疫反応を誘導するおよび／またはＮＯＩを細胞へ送達する方法のいずれかにおいて
使用できる。
【００９６】
また別の実施形態として、本発明は、核酸の転写を指令するプロモーターと；ＩＲＥＳ
エレメントと；およびコード配列を含む核酸とを含み、ＩＲＥＳエレメントは、コード配
列の翻訳がＩＲＥＳエレメントによって指令されるキャップ構造非依存性メカニズムを介
するように機能的に位置している組み換え核酸を提供する。この実施形態では、該核酸の
転写は該核酸の翻訳から解除される。
【００９７】
上述した詳細な説明は単に例示するために提供されており、そして本発明の精神および
範囲から逸脱せずにその中で修飾および変更を加えることができることを理解されたい。
【実施例１】
【００９８】
トランスファー・クローニングベクターの構築
Ａ．ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ含有ベクター
脳心筋炎（ＥＭＣＶ）ＩＲＥＳ配列およびいずれかのＮＯＩを導入できるトランスファ
ーベクター（ｐＣＤＮＡ３．３）を調製した。制限酵素Ｂａｔｈｅを用いてプラスミドｐ
ＣＤＮＡ３．１（＋）（Ｎｉｔｒｏｇｅｎ社）を消化し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを用
いて処理して固有のＢａｔｈｅ制限部位を除去すると、ｐＣＤＮＡ３．２が生成した。さ
らに制限酵素Ｂａｙを用いてｐＣＤＮＡ３．２  ＤＮＡを消化し、同様にＴ４  ＤＮＡポ
リメラーゼを用いて処理して固有のＢａｙ制限部位を除去すると、ｐＣＤＮＡ３．３が得
られた。
【００９９】
〜２５０ｂｐのＡｐａＩ／ＮｏｔＩ  ＭＣＳ断片をＡｐａＩ／ＮｏｔＩ直線化ｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）ＤＮＡ内へライゲートしてｐＫＳ−
ｒｅｐ２を生成することによって、ＶＥＥレプリコンベクター由来の多重クローニング部
位（ＭＣＳ）を含有する中間クローニングベクターを調製した。制限酵素ＥｃｏＲＩおよ
びＢａｍＨＩを用いてＥＭＣＶ  ＩＲＥＳをｐＤ１＋２＋３から消化し（Ｋａｍｉｎｓｋ
ｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ直線化ｐＫＳ−ｒｅｐ２  
ＤＮＡ内にライゲートして、ｐＫＳ−ｒｅｐ２／ＥＭＣＶを生成した。プライマーＥＭＣ
ＶＦ（ＡｓｃＩ）．２およびＥＭＣＶＲ（ＡｓｃＩ）．１を使用してｐＫＳ−ｒｅｐ２／
ＥＭＣＶベクター由来のＥＭＣＶ  ＩＲＥＳおよびＭＣＳ配列をＰＣＲ増幅させた（表１
）。ＡｓｃＩ制限酵素を用いてＥＭＣＶ  ＰＣＲ産物を消化し、ＡｓｃＩ直線化ＶＥＥレ
プリコン（ｐＥＲＫ）ベクターＤＮＡ内にライゲートし、ｐＥＲＫ／ＥＭＣＶを生成した
。トランスファークローニングベクターを完成するために、ＥｃｏＲＶおよびＮｏｔＩ制
限酵素を用いてｐＥＲＫ／ＥＭＣＶ  ＤＮＡを消化し、８６２ｂｐ  ＥｃｏＲＶ／Ｎｏｔ
Ｉ断片をＥｃｏＲＶおよびＮｏｔＩ直線化ｐＣＤＮＡ３．３  ＤＮＡ内にライゲートし、
ｐＣＤＮＡ３．３／ＥＭＣＶを生成した。ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳおよび関連する多重クロー
ニング部位の配列は、それを用いてまた別の構築物を調製する前にｐＣＤＮＡ３．３／Ｅ
ＭＣＶベクター内で確認した。
【０１００】
【表１】
0005572144.tif 000002
【０１０１】
Ｂ．ＸＩＡＰ  ＩＲＥＳ含有ベクター
推定ＩＲＥＳエレメントを含有するアポトーシス（ＸＩＡＰ）遺伝子５’非コーディン
グ領域（ＮＣＲ）のＸ連鎖阻害剤（エレメントの配列およびサイズについてはＨｏｌｃｉ
ｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １：１９０−１９２
；Ｈｏｌｃｉｋ  ａｎｄ  Ｋｏｒｎｅｌｕｋ（２０００）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  
２０：４６４８−５７およびＨｏｌｃｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ  ２３：２８０−２８８を参照）は、ｃＤＮＡを補給したアダプタープライマ
ーおよびＸＩＡＰリバースプライマー（ＸＩＡＰ−Ｒ）を用いてヒト胎児肝ｍａｒａｔｈ
ｏｎ  ｒｅａｄｙ  ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、カリフォルニア州パロアルト）から
ＰＣＲ増幅させ、次にＸＩＡＰ  ＩＲＥＳ特異的プライマーを用いるネストＰＣＲを実施
した。プライマーは表２に列挙した。結果として生じたおよそ１００７および２４１ｂｐ
のＰＣＲ産物は市販で入手できるキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ
ｎ社；カリフォルニア州カールズバッド）を用いてＴＡクローニングした。これらの構築
物は、１６３ヌクレオチド推定ＸＩＡＰ  ＩＲＥＳに加えて、ＸＩＡＰ遺伝子非コーディ
ング領域の各々８４４ヌクレオチドまたは７８ヌクレオチドのどちらかを有する。各構築
物についての配列は、全自動ＤＮＡシーケンシングによって確認した。ＶＥＥレプリコン
内へクローニングするためのシャトルベクターを生成するために、ＸＩＡＰ配列をｐＫＳ
−ｒｅｐ２の等価部位内へＥｃｏＲＩ断片として移し、ｐＫＳ−ｒｅｐ２／ＸＩＡＰ１０
０７およびｐＫＳ−ｒｅｐ２／ＸＩＡＰ２４１  ＤＮＡを生成した。
【０１０２】
【表２】
0005572144.tif 000003
【０１０３】
１００７ｂｐ  ＸＩＡＰ  ５’ＮＣＲ
ＡＣＡＣＧＴＧＧＧＧＣＡＡＣＣＣＴＧＡＴＴＴＡＴＧＣＣＴＧＴＴＧＴＣＣＣＡＧＴＧ
ＴＧＡＴＴＡＴＴＡＣＴＡＧＴＧＴＡＡＴＴＴＴＴＣＡＣＴＴＴＧＡＧＡＡＧＴＧＴＣＣ
ＡＧＧＴＴＴＧＧＡＧＧＡＴＡＡＡＴＴＡＴＣＴＴＴＣＴＡＡＴＡＡＴＴＧＡＴＡＣＣＣ
ＴＴＣＴＣＡＴＡＡＣＣＴＡＡＣＧＧＧＴＴＣＣＴＴＴＴＡＧＴＡＴＴＴＴＡＴＣＴＧＧ
ＧＴＴＡＡＡＡＴＴＡＣＣＡＧＣＴＧＴＡＡＴＴＴＧＧＣＡＧＣＴＣＴＡＡＴＡＡＧＡＣ
ＴＧＣＡＧＣＡＡＴＡＣＴＴＡＴＣＴＴＣＣＡＴＴＴＧＡＡＣＡＧＡＴＴＧＴＴＡＣＴＴ
ＧＡＣＣＡＡＧＧＧＡＡＧＴＴＡＡＴＡＧＣＡＡＡＡＧＴＡＡＣＴＧＣＡＧＧＧＣＡＣＡ
ＴＧＴＡＴＧＴＣＡＴＧＧＧＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＴＡＡＣＡＧＣＡＡＴＴＡＡ
ＧＧＴＴＴＧＣＡＧＧＴＡＣＴＴＡＧＡＡＴＴＴＴＴＣＣＴＧＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＴＡ
ＧＡＧＧＧＣＡＧＴＧＴＴＡＣＡＴＡＴＡＴＡＴＣＴＧＴＡＡＴＴＡＴＣＣＡＧＴＴＡＣ
ＡＡＣＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＣＴＣＴＣＡＴＴＣＡＴＧＣＡＴＧＡＡＡＡＴＣＡＧＡＡＡ
ＴＡＴＴＴＣＡＴＡＣＴＣＴＴＡＡＡＧＡＡＣＡＣＡＴＴＧＧＡＡＣＣＡＡＴＡＴＴＡＴ
ＧＡＴＴＡＡＡＡＣＡＴＡＴＴＴＴＧＣＴＡＡＧＣＡＡＡＧＡＧＡＴＡＴＴＡＡＡＡＡＴ
ＴＡＡＴＴＣＡＴＴＡＡＣＡＴＴＣＴＧＡＡＣＡＴＴＴＴＴＴＡＡＣＴＴＧＴＡＡＡＡＡ
ＣＡＡＣＴＴＴＧＡＴＧＣＣＴＴＧＡＡＴＡＴＡＴＡＡＴＧＡＴＴＣＡＴＴＡＴＡＡＣＡ
ＡＴＴＡＴＧＣＡＴＡＧＡＴＴＴＴＡＡＴＡＡＴＣＴＧＣＡＴＡＴＴＴＴＡＴＧＣＴＴＴ
ＣＡＴＧＴＴＴＴＴＣＣＴＡＡＴＴＡＡＴＧＡＴＴＴＧＡＣＡＴＧＧＴＴＡＡＴＡＡＴＴ
ＡＴＡＡＴＡＴＡＴＴＣＴＧＣＡＴＣＡＣＡＧＴＴＴＡＣＡＴＡＴＴＴＡＴＧＴＡＡＡＡ
ＴＡＡＧＣＡＴＴＴＡＡＡＡＡＴＴＡＴＴＡＧＴＴＴＴＡＴＴＣＴＧＣＣＴＧＣＴＴＡＡ
ＡＴＡＴＴＡＣＴＴＴＣＣＴＣＡＡＡＡＡＧＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＴＧＣＴＡＧＡＴ
ＴＴＴＡＣＴＴＴＡＴＧＡＣＴＴＧＡＡＴＧＡＴＧＴＧＧＴＡＡＴＧＴＣＧＡＡＣＴＣＴ
ＡＧＴＡＴＴＴＡＧＡＡＴＴＡＧＡＡＴＧＴＴＴＣＴＴＡＧＣＧＧＴＣＧＴＧＴＡＧＴＴ
ＡＴＴＴＴＴＡＴＧＴＣＡＴＡＡＧＴＧＧＡＴＡＡＴＴＴＧＴＴＡＧＣＴＣＣＴＡＴＡＡ
ＣＡＡＡＡＧＴＣＴＧＴＴＧＣＴＴＧＴＧＴＴＴＣＡＣＡＴＴＴＴＧＧＡＴＴＴＣＣＴＡ
ＡＴＡＴＡＡＴＧＴＴＣＴＣＴＴＴＴＴＡＧＡＡＡＡＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＣＣＴＡＴ
ＴＴＴＣＡＡＧＡＧＡＡＧＡＴ
【実施例２】
【０１０４】
改良されたレプリコンベクターの構築
Ａ．ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳを含有する構築物
機能的アルファウイルス２６Ｓプロモーターの下流に配置されたＩＲＥＳ配列の機能性
を証明するために、レポーター遺伝子をｐＣＤＮＡ３．３／ＥＭＣＶトランスファーベク
ター内にサブクローニングし、次にＥＭＣＶ／レポーター遺伝子カセットをｐＥＲＫレプ
リコンベクター内へ移動させた。最初の実験は、クロラムフェニコール−アセチル−トラ
ンスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーター遺伝子を発現するレプリコンベクターを用いて実施
した。プライマーのＦ’−ＣＡＴ（ＢａｍＨＩ）およびＲ’−ＣＡＴ（ＸｂａＩ）を用い
てＣＡＴ遺伝子を増幅させた（表１）。ＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ制限酵素を用いてＰＣ
Ｒ産物を消化し、ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ直線化ｐＣＤＮＡ３．３／ＥＭＣＶ  ＤＮＡ内に
ライゲートし、ｐＣＤＮＡ３．３／ＥＭＣＶ／ＣＡＴを生成した。ＣＡＴ遺伝子の配列を
確認した後、ＡｓｃＩ制限酵素を用いてｐＣＤＮＡ３．３／ＥＭＣＶ／ＣＡＴ  ＤＮＡを
消化して１３０３ｂｐのＥＭＣＶ／ＣＡＴ断片を遊離させた。次にＡｓｃＩ消化ＥＭＣＶ
／ＣＡＴ断片をＡｓｃＩ直線化ｐＥＲＫベクターＤＮＡ内にライゲートし、ｐＥＲＫ／Ｅ
ＭＣＶ／ＣＡＴを生成した。
【０１０５】
ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳは指向性活性を有し、それがＮＯＩに関して間違った方向にある場
合は、キャップ構造非依存性翻訳は認められないことが証明されている（Ｒｏｂｅｒｔｓ
ａｎｄ  Ｂｅｌｓｈａｍ（１９９７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２７：５３−６２）。さら
に、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳの５’末端配列の欠失はジシストロニック発現ベクターとの関連
でのキャップ構造非依存性翻訳を無効にする（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｅｌｄｅｎ  ｅｔ  ａ
ｌ．（１９９５）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１４：８２−９０；Ｊａｎｇ  ＆  Ｗｉｍｍｅｒ
（１９９０）Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ４：１５６０−７２）。ＣＡＴ
遺伝子のキャップ構造非依存性翻訳が発生していることを証明するために、アンチセンス
方向にＥＭＣＶ  ＩＲＥＳだけを伴う（ｐＥＲＫ／ａｎｔｉ−ＥＭＣＶ／ＣＡＴ）、また
はＥＭＣＶ  ＩＲＥＳの末端配列５’欠失を伴う（ｐＥＲＫ／ΔＡｖｒ／ＣＡＴ）、ｐＥ
ＲＫ／ＥＭＣＶ／ＣＡＴと同一である２つのｐＥＲＫベクターを調製した。
【０１０６】
ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳのアンチセンスバージョンは、プライマーのａｎｔｉ−Ｅｎ（Ｅｃ
ｏＲＩ）およびａｎｔｉ−Ｅｎ（ＢａｍＨＩ）（表１）を用いてｐＫＳ  ｒｅｐ２／ＥＭ
ＣＶ  ＤＮＡからＰＣＲ増幅させた。ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素を用いて増幅
させたＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ断片を消化し、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ直線化ｐＫＳ−ｒｅｐ
２  ＤＮＡ内にライゲートし、ｐＫＳ−ｒｅｐ２／ａｎｔｉ−ＥＭＣＶを生成した。上述
したとおりのＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ消化ＣＡＴ遺伝子をＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ直線化ｐＫ
Ｓ−ｒｅｐ２／ａｎｔｉ−ＥＭＣＶ  ＤＮＡ内にライゲートし、ｐＫＳ−ｒｅｐ２／ａｎ
ｔｉ−ＥＭＣＶ／ＣＡＴを生成した。プライマーＥＭＣＶＲ（ＡｓｃＩ）．１およびａｎ
ｔｉ−Ｅｎ（ＡｓｃＩ）（表１）を用いて１２９５ｂｐのａｎｔｉ−ＥＭＣＶ／ＣＡＴ遺
伝子カセットをｐＫＳ−ｒｅｐ２／ａｎｔｉ−ＥＭＣＶ／ＣＡＴ  ＤＮＡからＰＣＲ増幅
させた。最後に、ＡｓｃＩ制限酵素を用いてａｎｔｉ−ＥＭＣＶ／ＣＡＴ断片を消化して
ＡｓｃＩ直線化ｐＥＲＫベクターＤＮＡ内にライゲートし、ｐＥＲＫ／ａｎｔｉ−ＥＭＣ
Ｖ／ＣＡＴを生成した。その後の実験を実施する前に、ａｎｔｉ−ＥＭＣＶ／ＣＡＴ遺伝
子領域の配列を確認した。
【０１０７】
ΔＡｖｒ／ＣＡＴ  ｐＥＲＫベクターを生成するために、最初にｐＫＳ−ｒｅｐ２／Ｅ
ＭＣＶ中間ベクター内に見いだされるＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ内でΔＡｖｒ欠失を作製した。
この欠失は、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳの５’領域からの１４５ｂｐを欠失しているＥｃｏＲＩ
およびＡｖｒＩＩ両方の制限酵素を用いてｐＫＳ−ｒｅｐ２／ＥＭＣＶ  ＤＮＡを消化す
ることによって実施した。平滑末端を作り出すためにＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて
直線化ＤＮＡを処理し、再ライゲートしてｐＫＳ−ｒｅｐ２／ΔＡｖｒ  ＤＮＡを生成し
た。ＣＡＴ遺伝子は、上述したＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ  ＣＡＴ遺伝子をＢａｍＨＩおよび
ＸｂａＩ制限酵素直線化ｐＫＳ−ｒｅｐ２／ΔＡｖｒ内へライゲートすることによって中
間ベクター内にクローニングし、ｐＫＳ−ｒｅｐ２／ΔＡｖｒ／ＣＡＴ  ＤＮＡを生成し
た。プライマーＥＭＣＶＲ（ＡｓｃＩ）．１およびｄＡｖｒ  Ｅｎ（ＡｓｃＩ）Ｒ（表１
）を用いて、１１７７ｂｐのΔＡｖｒ／ＣＡＴ遺伝子カセットをｐＫＳ−ｒｅｐ２／ΔＡ
ｖｒ／ＣＡＴ  ＤＮＡからＰＣＲ増幅させた。最後に、ＡｓｃＩ制限酵素を用いてΔＡｖ
ｒ／ＣＡＴ断片を消化し、ＡｓｃＩ直線化ｐＥＲＫベクターＤＮＡ内にライゲートし、ｐ
ＥＲＫ／ΔＡｖｒ／ＣＡＴを生成した。その後の実験を実施する前に、ΔＡｖｒ／ＣＡＴ
遺伝子領域の配列を確認した。
【０１０８】
Ｂ．ＥＶ７１  ＩＲＥＳを含有する構築物
ヒトエンテロウイルス７１（ＥＶ７１）ＩＲＥＳエレメント（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ａｎ
ｄ  Ｓａｒｎｏｗ（２００３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３１５：２５９−２６６）をセンスお
よびアンチセンス両方向にスペーサーレプリコンベクター内へクローニングし、ＣＡＴレ
ポーター遺伝子の発現について解析した。プライマーを用いてＥＶ７１  ＩＲＥＳエレメ
ント（７４２３／ＭＳ／８７株）をｐｄｃ／ＭＳ  ＤＮＡ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ａｎｄ  
Ｓａｒｎｏｗ，２００３）からＰＣＲ増幅させて、センス断片（ｄｃ／ＭＳ（ＥｃｏＲＩ
）Ｆおよびｄｃ／ＭＳ（ＢａｍＨＩ）Ｒ）ならびにアンチセンス断片（ｄｃ／ａｎｔｉ−
ＭＳ（ＥｃｏＲＩ）Ｒおよびｄｃ／ａｎｔｉ−ＭＳ（ＢａｍＨＩ）Ｆ）（表３）を生成し
た。ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素を用いてセンスおよびアンチセンスＥＶ７１−
ＭＳ  ＩＲＥＳ  ＰＣＲ産物を消化し、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩを用いて直線化した
ｐＣＤＮＡ３．３（実施例１を参照）内にライゲートし、ｐＣＤＮＡ３．３／ＭＳおよび
ｐＣＤＮＡ３．３／ａｎｔｉ−ＭＳを生成した。各ｐＣＤＮＡ３．３ベクター内のＥＶ７
１−ＭＳ  ＩＲＥＳ領域をシーケンシングして、その後の実験を開始する前にＰＣＲ増幅
中にヌクレオチド変化が導入されなかったことを立証した。
【０１０９】
上記のＡ．に記載したＣＡＴレポーター遺伝子をＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ直線化ｐＣ
ＤＮＡ３．３／ＭＳおよびｐＣＤＮＡ３．３／ａｎｔｉ−ＭＳベクター内にクローニング
し、各々ｐＣＤＮＡ３．３／ＭＳ／ＣＡＴおよびｐＣＤＮＡ３．３／ａｎｔｉ−ＭＳ／Ｃ
ＡＴを生成した。ＡｓｃＩ制限酵素を用いてｐＣＤＮＡ３．３／ＭＳ／ＣＡＴおよびｐＣ
ＤＮＡ３．３／ａｎｔｉ−ＭＳ／ＣＡＴ  ＤＮＡを消化し、ＭＳ−ＣＡＴまたはａｎｔｉ
−ＭＳ−ＣＡＴ  ＡｓｃＩ断片をスペーサーレプリコンベクター内にライゲートすること
によって、スペーサーレプリコン構築物を生成した。各ベクター内のスペーサー−ＩＲＥ
Ｓ−ＣＡＴ領域をシーケンシングして、その後の実験を開始する前にクローニング中にヌ
クレオチド変化が導入されなかったことを立証した。
【０１１０】
【表３】
0005572144.tif 000004
【０１１１】
Ｃ．ＸＩＡＰ  ＩＲＥＳを含有する構築物
ＣＡＴＦ（５’−ＧＧＡＧＡＡＡＡＡＡＡＴＣＡＣＴＧＧＡＴＡＴＡＣ−３’）および
ＣＡＴＲ（Ｂａｍ）（５’−ＧＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＧＣＣＣＣＧＣＣＣＴＧＣＣＡＣ
−３’）プライマーを用いてＣＡＴ遺伝子をＰＣＲ増幅させた後に、ＣＡＴ遺伝子をｐＫ
Ｓ−ｒｅｐ２／ＸＩＡＰ１００７のＥｃｏＲＶおよびＢａｍＨＩ部位内にクローニングし
（下記の実施例４を参照）、ｐＫＳ−ｒｅｐ２／ＸＩＡＰ／ＣＡＴ  １００７を生成した
。この方法は野生型ＸＩＡＰ遺伝子開始部位を再構成する。次に中間物をＡｐａＩ／Ｓｐ
ｈＩ断片としてｐＥＲＫ内にクローニングしてｐＥＲＫ／ＸＩＡＰ／ＣＡＴ  １００７を
生成した。インビトロ転写およびＶｅｒｏ細胞内へのエレクトロポレーション後に、感染
細胞内でのＶＲＰ収率およびＣＡＴタンパク質発現を測定し、ｐＥＲＫ／ＥＭＣＶ／ＣＡ
Ｔ  ３４２と比較した。ＶＲＰ収率はどちらの構築物についても同等であった。この特定
構築物では、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ（１．０８  ｅ６  ｎｇ／μｇ）を用いた場合と比較し
てＸＩＡＰ  ＩＲＥＳ（３．９７  ｅ５  ｎｇ／μｇ）を用いてＣＡＴタンパク質発現の
レベルを修飾することが可能であったので、このため本明細書で要求した発明における様
々なＩＲＥＳの有用性を証明している。
【０１１２】
Ｄ．ＨＩＶｇｐ１６０を発現する構築物
ＨＩＶｇｐ１６０の翻訳がＥＭＣＶ  ＩＲＥＳから指令されるＨＩＶｇｐ１６０  ｃｌ
ａｄｅ  Ｃ遺伝子を発現するレプリコンを構築した。この構築物では、ｐＨ１５００Ａ／
ＥＭＣＶ／Ｖｃａｐヘルパー構築物（実施例４．Ｂ．１．を参照）からの１６７ｂｐスペ
ーサーを下記のとおりにＥＭＣＶ  ＩＲＥＳレプリコン構築物内にクローニングした。Ａ
ｐａＩ制限酵素を用いてｐＨ１５００Ａ／ＥＭＣＶ／Ｖｃａｐ  ＤＮＡを消化して１６７
ｂｐスペーサーおよびＥＭＣＶ  ＩＲＥＳの一部分を含有する１９４ｂｐ断片を遊離させ
た。同様にＡｐａＩ制限酵素を用いてｐＥＲＫ／ＥＭＣＶ  ７４９ベクターを消化し、遊
離させた７４９ｂｐのスペーサーＡｐａＩ断片を１６７ｂｐのスペーサーＡｐａＩ断片で
置換し、ｐＥＲＫ／ＥＭＣＶ  １６７ベクターを生成した。異種遺伝子もまた効率的に発
現させることができ、ｐＥＲＫ／ＥＭＣＶ  １６７レプリコンベクターからパッケージン
グできることを証明するために、ＨＩＶ  ｃｌａｄｅ  Ｃ  ｇｐ１６０遺伝子（Ｗｉｌｌ
ｉａｍｓｏｎ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ  Ｈｕｍ  Ｒｅｔｒｏｖ
ｉｒｕｓｅｓ  １９：１３３−４４）を下記のとおりにこのベクター内にクローニングし
た。ＨＩＶ  ｇｐ１６０遺伝子を増幅させ（プライマーｅｎｖ−５’−ＸｂａＩおよびＤ
Ｕ１５１ｇｐ１６０  ３’−ＸｂａＩを用いて）（表４）、そしてｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰ
Ｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールスバッド）内にクローニングし、
ｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ／ｇｐ１６０を生成した。ｇｐ１６０遺伝子をシーケンシングし
て、その後の実験を開始する前にＰＣＲ増幅中にエラーが導入されなかったことを確認し
た。ＸｂａＩ制限酵素を用いてｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ／ｇｐ１６０  ＤＮＡを消化し、
次にｇｐ１６０断片をＸｂａＩ直線化ｐＣＤＮＡ３．３／ＥＭＣＶ内にライゲートし、ｐ
ＣＤＮＡ３．３／ＥＭＣＶ／ｇｐ１６０を生成した。ＡｓｃＩ制限酵素を用いてｐＣＤＮ
Ａ３．３／ＥＭＣＶ／ｇｐ１６０  ＤＮＡを消化してＥＭＣＶ／ｇｐ１６０断片を遊離さ
せた。次にＥＭＣＶ／ｇｐ１６０断片をＡｓｃＩ直線化ｐＥＲＫ／ＥＭＣＶ  １６７ベク
ターＤＮＡ内にライゲートし、ｐＥＲＫ／ＥＭＣＶ／ｇｐ１６０  １６７ベクターを生成
した。
【０１１３】
【表４】
0005572144.tif 000005
【０１１４】
Ｅ．複数のＮＯＩを発現する二重サブゲノムＩＲＥＳレプリコンの構築
連続する２つの２６Ｓ−スペーサー−ＩＲＥＳ−ＮＯＩカセットをコードするＩＲＥＳ
レプリコンベクターを構築した。二重サブゲノムＩＲＥＳレプリコン（ｐＥＲＫ  ＭＣＳ
２）を生成するために使用した塩基ｐＥＲＫベクターは２６Ｓプロモーターの下流の３４
２ｂｐスペーサー領域を含有し、そのＭＣＳ内の下記の制限部位（５’ＡｓｃＩ、Ｓｎａ
ＢＩ、ＳｐｈＩ  ３’）をコードした。
【０１１５】
ボツリヌス神経毒ＡおよびＢ（ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ  Ａおよ
びＢ）（ＢｏＮＴ  ＡおよびＢｏＮＴ  Ｂ）の重鎖（Ｈｃ）のＣ末端部分をＢａｍＨＩ／
ＸｂａＩ断片としてのｐＣＤＮＡ３．３／ＥＭＣＶ内にクローニングし、ｐＣＤＮＡ３．
３／ＥＭＣＶ／ＢｏＮＴ  ＡおよびｐＣＤＮＡ３．３／ＥＭＣＶ／ＢｏＮＴ  Ｂを各々生
成した。ＡｓｃＩ制限酵素を用いてＢｏＮＴ遺伝子をｐＣＤＮＡ３．３／ＥＭＣＶベクタ
ーから消化し、ＡｓｃＩ  ＥＭＣＶ／ＢｏＮＴカセットをＡｓｃＩ直線化ｐＥＲＫ  ＭＣ
Ｓ２  ＤＮＡ内にライゲートし、ｐＥＲＫ／ＢｏＮＴ  Ａ  ＭＣＳ２およびｐＥＲＫ／Ｂ
ｏＮＴ  Ｂ  ＭＣＳ２一価ベクターを生成した。挿入の方向は制限分析によって測定し、
センス方向における挿入を備えるクローンを単離した。ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳおよびＢｏＮ
Ｔ遺伝子をシーケンシングしてその後の実験を開始する前のクローニング中にエラーが導
入されなかったことを検証した。
【０１１６】
二重サブゲノムＢｏＮＴ  Ａ／Ｂ  ＩＲＥＳレプリコン構築物（ｐＥＲＫ−ＢｏＮＴ  
Ａ／Ｂ  ＭＣＳ２）を生成するために、一価ｐＥＲＫ  ＢｏＮＴ  ＭＣＳ  ２ベクターを
利用した。ＰｓｐＯＭ  Ｉ制限酵素を用いてｐＥＲＫ／ＢｏＮＴ  Ｂ  ＭＣＳ２ベクター
を部分的に消化し、両端はＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端にした。さらにＳ
ｐｈＩ制限酵素を用いてｐＥＲＫ／ＢｏＮＴ  Ｂ  ＭＣＳ２  ＤＮＡを消化して２６Ｓ−
３４２ｂｐスペーサー−ＥＭＣＶ−ＢｏＮＴ  Ｂ断片を遊離させた。２６Ｓ−３４２ｂｐ
のスペーサー−ＥＭＣＶ−ＢｏＮＴ  Ｂ断片を次にＳｎａＢＩ／ＳｐｈＩ消化ｐＥＲＫ／
ＢｏＮＴ  Ａ  ＭＣＳ２  ＤＮＡ内へライゲートし、ｐＥＲＫ−ＢｏＮＴ  Ａ／Ｂ  ＭＣ
Ｓ２ベクターを生成した。この構築物の最終構造は、５’ＮＣＲ−ｎｓＰ１，２，３，４
−２６Ｓ−３４２ｂｐスペーサー−ＥＭＣＶ−ＢｏＮＴ  Ａ−２６Ｓ−３４２ｂｐスペー
サー−ＥＭＣＶ−ＢｏＮＴ  Ｂ−ＮＣＲ  ３’である。二重サブゲノムＩＲＥＳレプリコ
ンの配列は、発現およびＶＲＰパッケージング試験を実施する前に検証した。
【０１１７】
Ｆ．ＩＲＥＳ含有Ｓ．Ａ．ＡＲ８６レプリコンの構築
Ｓ．Ａ．ＡＲ８６（ｐＲｅｐ８９；Ｈｅｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２０
０３  ７７（２）：１１４９−５６に記載された）由来のレプリコンベクターを、２６Ｓ
プロモーターの下流でスペーサ−ＥＭＣＶ−ＨＩＶ  ｇａｇカセットを含有するように修
飾した。プライマーのスタッファー３４２（ＣｌａＩ）および３−４２．ｐｒ４（表５）
を用いて３４２ｂｐのスペーサー−ＥＭＣＶ−ＨＩＶ  ｇａｇ断片をｐＥＲＫ／ＥＭＣＶ
／ｇａｇ３４２  ＤＮＡからＰＣＲ増幅させた。３−４２．ｐｒ４プライマーを用いての
増幅は、ｐＥＲＫ／ＥＭＣＶ／ｇａｇ  ３４２  ＤＮＡ内のＨＩＶ  ｇａｇ遺伝子からの
すぐ下流に存在する３’ＣｌａＩ部位の組込みを可能にする。次にＣｌａＩ制限酵素を用
いてＰＣＲ産物を消化し、ＣｌａＩ直線化ｐＲｅｐ８９内にライゲートし、ｐＲｅｐ８９
／ＥＭＣＶ／ｇａｇ  ３４２ベクターを生成した。全挿入領域をシーケンシングして、Ｐ
ＣＲ増幅中にエラーが導入されなかったことを確認した。
【０１１８】
【表５】
0005572144.tif 000006
【実施例３】
【０１１９】
ＩＲＥＳ指令レプリコンからのＮＯＩ発現分析
Ａ．ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳレプリコンの発現
１：  ＣＡＴの発現
ｐＥＲＫ／ＥＭＣＶ／ＣＡＴ、ｐＥＲＫ／ａｎｔｉ−ＥＭＣＶ／ＣＡＴ、およびｐＥＲ
Ｋ／ΔＡｖｒ／ＣＡＴレプリコン構築物を用いて、ＣＡＴタンパク質発現について試験し
た。Ｔ７  ＲｉｂｏＭａｘキット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社；ウィス
コンシン州マディソン；製品番号Ｐ１３００）を用いてキャップドレプリコンＲＮＡをイ
ンビトロ転写した。ＲＮｅａｓｙ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社
、メリーランド州ジャーマンタウン）を製造業者の取扱説明書にしたがって用いてＲＮＡ
を精製した。Ｖｅｒｏ細胞（６×１０6細胞）を０．４ｍＬのＩｎＶｉｔｒｕｓ（商標）
化学規定細胞培養培地（Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、スイ
ス国チューリッヒ；製品番号ＩＶＴ）中に懸濁させ、１５μｇのｐＥＲＫ／ＥＭＣＶ／Ｃ
ＡＴまたはｐＥＲＫ／ａｎｔｉ−ＥＭＣＶ／ＣＡＴ  ＲＮＡのどちらかを用いてＢｉｏ  
Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、カリフ
ォルニア州ハーキュリーズ）を使用してエレクトロポレーションした。２９０ボルトおよ
び２５マイクロファラッドに設定したエレクトロポレーターを用いて細胞を４回パルシン
グした。ＣＡＴ発現は、メタノール固定細胞上のウサギａｎｔｉ−ＣＡＴ抗体を使用する
ＩＦＡならびにエレクトロポレーションした細胞溶解液および市販で入手できるＣＡＴ  
ＥＬＩＳＡキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、インディアナ州インデ
ィアナポリス）を使用するＥＬＩＳＡによって検出した。
【０１２０】
ランダムＤＮＡ断片は、ｐＥＲＫベクター内に位置する固有のＥｃｏＲＶ部位でＥＭＣ
Ｖ  ＩＲＥＳ配列とＶＥＥサブゲノムプロモーターとの間にクローニングした。２６Ｓプ
ロモーターとＥＭＣＶ  ＩＲＥＳとの間にクローニングした短鎖ＤＮＡ断片はＡｌｕＩ制
限酵素消化ｐＣＤＮＡ３．１（−）ＤＮＡから生じた。ＡｌｕＩ制限酵素は、ｐＣＤＮＡ
３．１（−）ＤＮＡ内で頻回に切断し、７０６ｂｐから６ｂｐのサイズ範囲内にある平滑
末端断片を生じさせた。ＡｌｕＩ消化ｐＣＤＮＡ３．１（−）断片をＥｃｏＲＶ直線化ｐ
ＥＲＫ／ＥＭＣＶ／ＣＡＴ、ｐＥＲＫ／ａｎｔｉ−ＥＭＣＶ／ＣＡＴ、およびｐＥＲＫ／
ΔＡｖｒ／ＣＡＴ  ＤＮＡ内にライゲートした。個々のクローンをシーケンシングして、
どのスペーサー断片が各新規ベクター内へクローニングされていたのかを決定した。ベク
ター内で見いだされる一部のスペーサー断片のサイズは、これらのレプリコンのスペーサ
ー領域内への複数の断片をライゲーションしたために、予想された最大のｐＣＤＮＡ３．
１（−）ＡｌｕＩ断片より大きかった。上述したように各スペーサー−ＩＲＥＳレプリコ
ンを転写し、そしてＶｅｒｏ細胞内にＲＮＡエレクトロポレーションにした。ＣＡＴタン
パク質発現をＣＡＴ  ＥＬＩＳＡによって監視し、その結果を表６にまとめた。
【０１２１】
【表６】
0005572144.tif 000007
【０１２２】
これらの結果は、スペーサー断片を含有するｐＥＲＫ／ＩＲＥＳ／ＣＡＴレプリコン構
築物からのＣＡＴ発現は、スペーサー断片（ＣＡＴ／全タンパク質  およそ４〜７ｎｇ／
μｇ）を含有していない類似のベクターと比較して強固で、ＩＲＥＳによって指令される
ことを示している。異種遺伝子の最高レベルの発現は、およそ２００ヌクレオチドより大
きなスペーサー断片を２６ＳプロモーターとＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ配列との間に導入したと
きに発生した。
【０１２３】
２．単一レプリコンからの多重ＮＯＩ発現
ｐＥＲＫ−ＢｏＮＴ  Ａ／Ｂ  ＭＣＳ２レプリコンの発現およびパッケージングをＶｅ
ｒｏ細胞内で実施した。キャップドｐＥＲＫ−ＢｏＮＴ  Ａ／ＢレプリコンＲＮＡを上述
したとおり転写し、精製した。３０μｇのレプリコンＲＮＡ、３０μｇのキャプシドヘル
パーＲＮＡおよび３０μｇの糖タンパク質ヘルパーＲＮＡをＶｅｒｏ細胞（１×１０8細
胞）にエレクトロポレーションにより導入した。エレクトロポレーションした細胞は、Ｖ
ＲＰを採取する前にウマａｎｔｉ−ＢｏＮＴ  ＡおよびＢｏＮＴ  Ｂ抗体（Ｐｅｒｉｍｍ
ｕｎｅ社、メリーランド州ロックビル）を用いてＩＦＡによって分析した。ＩＦＡの結果
および生成したＶＲＰの滴定は表７に示した。
【０１２４】
【表７】
0005572144.tif 000008
【０１２５】
３．ＨＩＶ  ｇｐ１６０の発現
ｐＥＲＫ／ＥＭＣＶ／ｇｐ１６０  １６７レプリコン（実施例２Ｄ）をｇｐ１６０遺伝
子の発現およびＶＲＰ生成について分析した。上記に記載したとおり、レプリコン、ＧＰ
ヘルパーおよびキャプシドヘルパーのために精製ＲＮＡを調製した。ＲＮＡをＶｅｒｏ細
胞にエレクトロポレーションにより導入し、エレクトロポレーションの２０〜２４時間後
にＶＲＰを収集した。ＩＦＡの結果およびＶＲＰの滴定は表８にまとめた。比較のために
、２６Ｓプロモーターから直接的にｇｐ１６０を発現するｐＥＲＫレプリコンについても
評価した。
【０１２６】
【表８】
0005572144.tif 000009
【０１２７】
４．Ｓ．Ａ．ＡＲ８６レプリコンからのＨＩＶ  ＧＡＧの発現
キャップドレプリコンＲＮＡを生成するために、ＳＰ６  ＲｉｂｏＭａｘキット（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社；ウィスコンシン州マディソン；製品番号Ｐ１２
８０）を用いてｐＲｅｐ８９／ＥＭＣＶ／ｇａｇ３４２  ＤＮＡをインビトロ転写した。
ＲＮｅａｓｙ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、メリーランド州ジ
ャーマンタウン）を製造業者の取扱説明書にしたがって用いてＲＮＡを精製した。３０μ
ｇのＲｅｐ８９／ＥＭＣＶ／ｇａｇ３４２ＲＮＡを用いてＶｅｒｏ細胞（１×１０8細胞
）をエレクトロポレーションし、次にエレクトロポレーションの〜１８時間後にＧａｇタ
ンパク質発現について分析した。Ｒｅｐ８９／ＥＭＣＶ／ｇａｇ３４２エレクトロポレー
ションした細胞のａｎｔｉ−Ｇａｇ  ＩＦＡ分析はＧａｇタンパク質発現について陽性で
あった。
【０１２８】
Ｂ．ＥＶ７１−ＭＳ  ＩＲＥＳレプリコンの発現
各ＥＶ７１−ＭＳ含有レプリコンからのＣＡＴタンパク質の発現をＶｅｒｏ細胞内で実
施した。キャップドレプリコンＲＮＡを上述したとおり転写し、精製した。３０μｇのレ
プリコンＲＮＡを用いてＶｅｒｏ細胞（２〜３×１０7細胞）をエレクトロポレーション
した。エレクトロポレーションした細胞は、エレクトロポレーションのおよそ１８時間後
にａｎｔｉ−ＣＡＴ（Ｃｏｒｔｅｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍ社、カリフォルニア州サンリアンド
ロ）およびａｎｔｉ−ＶＥＥ  ｎｓｐ２抗体（ＡｌｐｈａＶａｘ社）を用いるＩＦＡによ
って分析した。さらに、ＣＡＴ発現を上述したとおりＥＬＩＳＡによって監視した。ｐＥ
ＲＫ／ＥＭＣＶ／ＣＡＴ  ３４２およびｐＥＲＫ／ＭＳ／ＣＡＴ  ３４２レプリコンから
検出された活性を比較したＩＦＡならびにＣＡＴ  ＥＬＩＳＡの結果は表９に示した。
【０１２９】
【表９】
0005572144.tif 000010
【実施例４】
【０１３０】
様々なスペーサーを用いたＩＲＥＳ指令翻訳
Ａ．レプリコン構築物
１．ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ含有構築物
正確に同一のスペーサー領域を含有する、ＥＭＣＶまたはアンチセンス−ＥＭＣＶ  Ｉ
ＲＥＳ配列のどちらかをコードする対のレプリコン構築物を調製した。これらの比較は、
センス方向における（すなわち、配列がウイルス内で見いだされる５’−３’方向におけ
る）ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ配列だけがキャップ構造非依存性翻訳を指令することを証明して
いる；すなわち、ＩＲＥＳがアンチセンス方向にある場合は極めてわずかな翻訳しか発生
せず、これはこれらの構築物内で有意なＣＡＴ発現を入手するには正しく方向付けられた
ＩＲＥＳエレメントが必要とされることを示している。これらのレプリコン構築物は上述
したとおりに調製した。各スペーサー−ＩＲＥＳレプリコンをインビトロ転写し、上述し
たとおりに３０μｇの各精製ＲＮＡを〜１×１０7細胞のＶｅｒｏ細胞内にエレクトロポ
レーションした。ＣＡＴタンパク質発現はＣＡＴ  ＥＬＩＳＡによって監視し、その結果
は表１０にまとめた。
【０１３１】
【表１０】
0005572144.tif 000011
【０１３２】
これらのデータは、レプリコンがＣＡＴ遺伝子の上流でスペーサーおよびアンチセンス
ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳを含有する場合はＣＡＴタンパク質発現が大きく（ほとんどの場合に
＞９５％）減少したことを示している。その上、これらのデータは、ＩＲＥＳ指令タンパ
ク質発現系がＮＯＩの発現レベルを最適化する能力を証明している。この最適化はＮＯＩ
特異的であるが、本明細書に記載の教示を利用すれば、当業者にはいずれか所与のＮＯＩ
のための所望の発現レベルを提供するスペーサー−ＩＲＥＳの組み合わせの同定は慣例的
であろう。
【０１３３】
２．５’非コーディング領域由来のスペーサーの使用
Ｃａｐ  ５’Ｆおよび３−１．１ｐｒ１プライマー（表１１）を用いてｐＨ５００Ａ／
Ｖｃａｐ由来のキャプシド配列をＰＣＲ増幅させることによって、全長ＶＥＥキャプシド
タンパク質遺伝子を含有するようにｐＥＲＫレプリコンを組み換えた。結果として生じた
ＰＣＲ産物をｐＥＲＫのＥｃｏＲＶおよびＳｐｈＩ制限酵素部位内に挿入した。市販で入
手できるキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて部位指向性突然変異のために、さら
にＡｓｃＩＦおよびＡｓｃＩＲプライマー（表１１）を用いてキャプシド遺伝子の３’末
端で固有のＡｓｃＩ制限酵素を含有するように「ｐＥＲＫ／Ｃａｐｓｉｄ」を修飾した。
次にｎｓＰ４遺伝子内にアニーリングするフォーワードプライマー（１３−８２．２．１
６）およびＡｓｃＩ制限酵素部位を含有するように組み換えられているリバースプライマ
ー（表１１）を用いてｐＥＲＫ／Ｃａｐｓｉｄからの配列のＰＣＲ増幅によってＶＥＥキ
ャプシド配列の連続切断を生成させた。ＡｐａＩおよびＡｓｃＩまたはＳｗａＩおよびＡ
ｓｃＩを用いてＰＣＲ産物を消化し、ｐＥＲＫ／Ｃａｐｓｉｄ内へクローニングし戻して
ｐＥＲＫ／Ｃａｐ２００、ｐＥＲＫ／Ｃａｐ４００およびｐＥＲＫ／Ｃａｐ６００を生成
した。これらのレプリコンは、２６Ｓプロモーターと挿入される下流構築物との間で「ス
ペーサー」として機能するためにキャプシド遺伝子の５’末端からの増加した量の配列を
維持している。上述したｐＥＲＫ／Ｃａｐベクター各々の中にＥＭＣＶ／ＣＡＴカセット
を導入するために、ＡｓｃＩ制限酵素を用いてｐＣＤＮＡ３．３／ＥＭＣＶ／ＣＡＴ  Ｄ
ＮＡを消化して１３０３ｂｐのＥＭＣＶ／ＣＡＴ断片を遊離させた。ＡｓｃＩ消化ＥＭＣ
Ｖ／ＣＡＴ断片を次にＡｓｃＩ直線化ｐＥＲＫ／ＣａｐベクターＤＮＡ内にライゲートし
、ｐＥＲＫ／ＥＭＣＶ／ＣＡＴ  Ｃａｐ２００、ｐＥＲＫ／ＥＭＣＶ／ＣＡＴ  Ｃａｐ４
００およびｐＥＲＫ／ＥＭＣＶ／ＣＡＴ  Ｃａｐ６００を生成した。
【０１３４】
【表１１】
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【０１３５】
ＶＥＥキャプシド遺伝子の５’領域の部分を含有するこれらのレプリコンを直線化し、
インビトロ転写し、Ｖｅｒｏ細胞内にエレクトロポレーションし、そしてＩＦＡおよびＥ
ＬＩＳＡによってＣＡＴタンパク質発現について分析した。ＣＡＴタンパク質発現はＣＡ
Ｔ特異的抗体を用いてＩＦＡによって検証した；しかし免疫蛍光の強度は使用したキャプ
シド遺伝子スペーサーの長さに依存して変動した。これらの結果はＣＡＴ  ＥＬＩＳＡに
反映された（表１２）。
【０１３６】
【表１２】
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【０１３７】
Ｂ．ヘルパー構築物
１．ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳを含む構築物
ＶＥＥ糖タンパク質遺伝子（「ＧＰ」）またはＶＥＥキャプシド遺伝子のどちらかを個
別に発現するヘルパーを構築した。最初に、キャプシドおよびＧＰヘルパーを含有するス
ペーサー−ＩＲＥＳの構築を促進するために２つの空ヘルパー骨格ベクターを生成した。
ＡｐａＩおよびＲｓｒＩＩ制限酵素を用いてｐＥＲＫベクターを消化することによって１
つの空ヘルパーを生成して６９８９ｂｐの非構造的タンパク質コーディング領域を除去し
た。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いてこのＤＮＡを処理して平滑末端を生成し、その後
に非構造的遺伝子欠失ｐＥＲＫベクターをライゲートしてｐＨ５００Ｇを生成した。ｐＨ
５００Ｇ空ヘルパーはおよそ５００ヌクレオチドの５’非コーディング領域（ＮＣＲ）を
含有していた。ｐＥＲＫベクターをＳｗａＩおよびＲｓｒＩＩ制限酵素を用いて消化する
ことによって第２の空ヘルパーを生成して６４４９ｂｐの非構造的タンパク質コーディン
グ領域を除去した。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを用いてこのＤＮＡを処理して平滑末端を
生成し、その後にそのＤＮＡをライゲートしてｐＨ１５００Ｇを生成した。ｐＨ１５００
Ｇ空ヘルパーは、ｐＨ５００Ｇヘルパー内には存在しない２６Ｓプロモーターのすぐ上流
に追加の５４０ｂｐのｎｓｐ４遺伝子を含むおよそ１５００ヌクレオチドの５’ＮＣＲを
含有していた。さらにヌクレオチド３でＧではなくむしろＡをコードする空ヘルパー構築
物を調製した（ｐＨ５００ＡおよびｐＨ１５００Ａ）。これらの構築物は、ｐＨ５００Ｇ
およびｐＨ１５００Ｇにおける同一領域の代わりにヌクレオチド３でＡを含有する、キャ
プシドヘルパー（ｐＨ５００Ａ／Ｖｃａｐ）からの５’ＮＣＲ領域をサブクローニングす
ることによって調製した。これは、ＸｂａＩおよびＳａｃＩ制限酵素を用いてｐＨ５００
Ａ／Ｖｃａｐを消化し、４３０ｂｐ断片を収集し、それをＸｂａＩおよびＳａｃＩ消化ｐ
Ｈ５００ＧおよびｐＨ１５００Ｇ  ＤＮＡ内にライゲートし、各々ｐＨ５００Ａおよびｐ
Ｈ１５００Ａを生成することによって遂行した。
【０１３８】
キャプシドおよびＧＰ遺伝子を上述したとおりにＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ断片として
ｐＣＤＮＡ３．３／ＥＭＣＶおよびｐＫＳ−ｒｅｐ２／ａｎｔｉ−ＥＭＣＶ内にクローニ
ングした。ＥＭＣＶ／キャプシド、ａｎｔｉ−ＥＭＣＶ／キャプシド、ＥＭＣＶ／ＧＰお
よびａｎｔｉ−ＥＭＣＶ／ＧＰカセットは、上述したとおりにＡｓｃＩ断片としてのｐＨ
５００Ｇ、ｐＨ５００Ａ、ｐＨ１５００ＧおよびｐＨ１５００Ａ空ヘルパー構築物内にク
ローニングした。各ヘルパーの配列は、その後の実験を開始する前に確認した。
【０１３９】
ランダムスペーサー断片は、前述したとおりに固有のＥｃｏＲＶ部位で各ヘルパー内の
２６ＳプロモーターとＥＭＣＶまたはａｎｔｉ−ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳとの間にクローニン
グした。挿入されたスペーサー断片の配列および長さを各新規ヘルパーについて決定し、
スペーサーインサートの長さを構築物の名称の最後に含めた。スペーサー＃１５、１６、
および２２についてはそれ以上特性解析しなかった。構築物ｐＨ５００Ａ／ＥＭＣＶ／Ｇ
ＰおよびｐＨ５００Ａ／ａｎｔｉ−ＥＭＣＶ／ＧＰはスペーサーを含有していない。
【０１４０】
２．ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ含有ＧＰおよび／またはキャプシドヘルパーの組み合わせを用い
たパッケージングおよび力価
様々な組み合わせのＧＰおよびキャプシドヘルパーを使用してＨＩＶ−ＧＡＧタンパク
質、ｐＥＲＫ−３４２／ＥＭＣＶ／ｇａｇを発現するＶＥＥレプリコンをパッケージング
した（このレプリコンの構築の説明については実施例７を参照）。表１３に示した結果に
ついては、５８０  Ｖおよび２５μＦで４パルスを用いて、０．８ｍＬのエレクトロポレ
ーションキュベット内のＶｅｒｏ細胞内へ３０μｇの各ＲＮＡヘルパーおよび３０μｇの
レプリコンＲＮＡを共エレクトロポレーションし、そして細胞を室温で１０分間にわたり
回復させた。エレクトロポレーションした細胞は、抗生物質とともに５０ｍＬのＥＭＥＭ
（１０％  ＦＢＳ）を含有するＴ−１７５フラスコ内に播種し、３７℃でインキュベート
した。２０〜２４時間後、ＶＥＥレプリコン粒子（「ＶＲＰ」）を収集し、免疫蛍光アッ
セイ（ＩＦＡ）を用いてＧＡＧタンパク質発現を測定することによって９６ウエルプレー
ト内のＶｅｒｏ細胞上で滴定した。各エレクトロポレーションからのＶＲＰ収率（表１３
）は、比較のために「ＩＵ／ｍＬ」ベースで表示した。
【０１４１】
【表１３】
0005572144.tif 000014
【０１４２】
他の実験では、ＧＰヘルパーＲＮＡの量はエレクトロポレーション環境において変動し
た；ＶＲＰ生成についての他の全部の条件は上述したとおりであった。結果は表１４に示
した。
【０１４３】
【表１４】
0005572144.tif 000015
【０１４４】
３．スペーサーを含まない２６Ｓ−ＩＲＥＳ  ＧＰヘルパー
この実験は、翻訳からの転写を解除するためにＧＰヘルパーにおいてスペーサーが必要
かどうかを判定するために実施した。Ｖｅｒｏ細胞は、下記の混合物各々を用いて個別に
エレクトロポレーションした。
【０１４５】
ａ．Ｇａｇレプリコンベクター（実施例６を参照）＋ｐＨ５００Ａ／ａｎｔｉ−ＥＭＣ
Ｖ／ＧＰ＋ｐＨ５００Ａ／ａｎｔｉ−ＥＭＣＶ／Ｖｃａｐ２９１
ｂ．Ｇａｇレプリコンベクター＋ｐＨ５００Ａ／ＥＭＣＶ／ＧＰ＋ｐＨ５００Ａ／ＥＭ
ＣＶ／Ｖｃａｐ２９１
【０１４６】
前述のとおりにＶＲＰ生成を可能にするために細胞をインキュベートし、ＶＲＰを採取
し、ＩＦＡによってＶｅｒｏ細胞上で滴定した。センス方向にＩＲＥＳを含むヘルパーの
場合は（「ｂ．」混合物）、ＶＲＰ収率は３．３  ｅ６であった；ＩＲＥＳがアンチセン
ス方向に置かれているヘルパーの場合は、ＶＲＰ収率は５．３  ｅ２であった。
【０１４７】
４．ＸＩＡＰ  ＩＲＥＳを含有するＶＥＥヘルパー構築物の生成および使用
ＰＦＵ  ｐｏｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社；カリフォルニア州ラ・ホーヤ）およびＣａ
ｐ５’Ｆまたは１３−８７ｐｒ１フォーワードプライマーおよび３−１．１ｐｒ１リバー
スプライマー（表２、実施例１Ｂを参照）を用いてＶＥＥキャプシド（「Ｖｃａｐ」）お
よび糖タンパク質（「ＶＧＰ」）遺伝子をｐＨ５００Ａ／ＶｃａｐおよびｐＨ５００Ａ／
ＧＰ各々からＰＣＲ増幅させた。結果として生じたＰＣＲ産物をｐＫＳ−ｒｅｐ２のＥｃ
ｏＲＶおよびＳｐｈＩ部位内にクローニングした。この戦略は、ＸＩＡＰ遺伝子の野生型
開始部位でＶＥＥ構造タンパク質開始コドンを再構成する。各プラスミド内のＶＥＥ構造
タンパク質配列を全自動ＤＮＡシーケンシングによって検証し、結果として生じたプラス
ミドをインビトロ転写のために使用した。Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙカラムを用いてＲ
ＮＡを精製し、タンパク質の発現の分析およびパッケージングのためにＶｅｒｏ細胞内に
エレクトロポレーションした。全ヘルパーはＩＦＡによって測定されたようにＶＥＥキャ
プシドまたは糖タンパク質のどちらかを発現し、ＨＩＶ  ＧＡＧタンパク質を発現するＶ
ＥＥレプリコンについて回収された力価の範囲は１×１０5から総計１×１０7に及んだ。
【０１４８】
上述したＸＩＡＰ１００７−ＶＥＥ構造タンパク質構築物をさらにまたＡｐａＩ／Ｓｐ
ｈＩ  ＤＮＡ断片としての第２ヘルパープラスミド、ｐＨ１５００Ａ内へクローニングす
ると、ｐＨ１５００Ａ／ＸＩＡＰ／Ｖｃａｐ１００７およびｐＨ１５００Ａ／ＸＩＡＰ／
ＧＰ１００７が生成した。これらのプラスミドを使用してＲＮＡを作製し、上述したとお
りにＶｅｒｏ細胞内へエレクトロポレーションし、タンパク質発現およびＶＲＰパッケー
ジングを分析した。同様に、結果として生じたヘルパーはＩＦＡによって測定したように
ＶＥＥキャプシドまたは糖タンパク質のいずれかを発現し、そして力価は総計１×１０8
から１×１０9  ＶＲＰ超に及び、これは２６ＳプロモーターからのサブゲノムｍＲＮＡ
の転写からの利得を証明していた。
【実施例５】
【０１４９】
その中にレプリコンＲＮＡをエレクトロポレーションにより導入したＶｅｒｏ細胞から
収集した全細胞ＲＮＡについてノーザン分析を実施した。スペーサー−ＩＲＥＳレプリコ
ン構築物をインビトロ転写し、上述したとおりに、３０μｇのＲＮＡｅａｓｙカラム精製
ＲＮＡをおよそ１×１０7のＶｅｒｏ細胞内にエレクトロポレーションにより導入した。
エレクトロポレーションした細胞を１０ｍＬのＤＭＥＭ培地中に再懸濁させ、次に７ｍＬ
（およそ７×１０6細胞）を１つの２５ｃｍ2フラスコ内に播種した。エレクトロポレーシ
ョンの１６時間後にＲＮＡｗｉｚ抽出キット（Ａｍｂｉｏｎ社）を製造業者の取扱説明書
にしたがって用いて細胞から全細胞ＲＮＡを収集した。ＲＮＡを定量し、各々の１０μｇ
を１％グリオキサールアガロースゲル上でランし、その後で受動転移によってＢｒｉｇｈ
ｔｓｔａｒ−Ｐｌｕｓ膜（Ａｍｂｉｏｎ社）へ移した。ＲＮＡをその膜へＵＶ架橋結合さ
せ、４５℃で１時間かけてＵｌｔｒａＨｙｂ（Ａｍｂｉｏｎ社）溶液を用いてブロッキン
グし、４５℃で３’ＵＴＲのＶＥＥサブゲノムＲＮＡ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、アイオワ州コラルビル）に対して特異的なビオニチル化ア
ンチセンスプライマー（３’ＵＴＲ４Ｘビオチン、表１）を含有するＵｌｔｒａＨｙｂ溶
液を用いて一晩かけて調査した。一晩にわたるハイブリダイゼーション後にＢｒｉｇｈｔ
ｓｔａｒ  Ｂｉｏｄｅｔｅｃｔキット（Ａｍｂｉｏｎ社）を製造業者の取扱説明書にした
がって用いて化学蛍光ＲＮＡ検出そしてＥｐｉ  Ｃｈｅｍｉ  ＩＩ  Ｄａｒｋｒｏｏｍ（
ＵＶＰ  Ｉｎｃ．社、カリフォルニア州アップランド）を用いて視認した。ｐＥＲＫ／Ｅ
ＭＣＶ／ＣＡＴ  ２５７、ｐＥＲＫ／ａｎｔｉ−ＥＭＣＶ／ＣＡＴ  ２５７、ｐＥＲＫ／
ＥＭＣＶ／ＣＡＴ  ５７９、またはｐＥＲＫ／ａｎｔｉ−ＥＭＣＶ／ＣＡＴ  ５７９を用
いてエレクトロポレーションしたＶｅｒｏ細胞からのＲＮＡのノーザン分析の結果は図１
に示した。ＥＭＣＶおよびａｎｔｉ−ＥＭＣＶレプリコン構築物はどちらもほぼ同等の強
度のサブゲノム転写産物を生成したが、これはスペーサー−ａｎｔｉ−ＥＭＣＶ／ＣＡＴ
レプリコン構築物からのＣＡＴタンパク質発現の欠如がサブゲノムＲＮＡにおける実質
的減少に起因していないことを示していた。
【実施例６】
【０１５０】
ＨＩＶgag遺伝子ＩＲＥＳ指令レプリコンベクターの構築
ＨＩＶサブタイプＣ  ｇａｇ遺伝子を、上述したとおりに３４２ｂｐのスペーサー（ｐ
ＥＲＫ−３４２）を含有するｐＥＲＫ／ＥＭＣＶベクター内にクローニングした。プライ
マーＧＡＧ−ＦおよびＧＡＧ−Ｒ（表１）を用いてＧａｇ遺伝子をｐＥＲＫ／ＨＩＶgag
ＤＮＡからＰＣＲ増幅させた。これらのプライマーは、ＰＣＲ産物が５’および３’末
端でこの部位をコードするようにＢａｍＨＩ制限部位を含有するように組み換えた。Ｂａ
ｍＨＩ制限酵素を用いてＰＣＲ産物を消化し、ＢａｍＨＩ直線化ｐＣＤＮＡ３．３／ＥＭ
ＣＶ  ＤＮＡ内へライゲートした。ｇａｇ遺伝子の方向付けを制限分析によって決定し、
正しい方向付けにある遺伝子を備える構築物を選択してｐＣＤＮＡ３．３／ＥＭＣＶ／ｇ
ａｇを生成した。ＡｓｃＩ制限酵素を用いてＥＭＣＶ／ｇａｇ遺伝子カセットをｐＣＤＮ
Ａ３．３／ＥＭＣＶ／ｇａｇ  ＤＮＡから消化し、ＡｓｃＩ直線化ｐＥＲＫ−３４２  Ｄ
ＮＡ内にライゲートした。ＥＭＣＶ／ｇａｇ遺伝子カセットの方向付けを制限分析によっ
て決定し、正しい方向付けにある遺伝子を備える構築物を選択してｐＥＲＫ−３４２／Ｅ
ＭＣＶ／ｇａｇを生成した。その後の実験を開始する前にＥＭＣＶ／ｇａｇ領域の配列を
検証した。
【０１５１】
ＩＦＡおよびウェスタンブロットによるｇａｇタンパク質発現の分析は、ｐＥＲＫ−３
４２／ＥＭＣＶ／ｇａｇレプリコンにおけるＩＲＥＳの指令下で発現したタンパク質は、
翻訳および転写の両方が２６Ｓ  ＶＥＥサブゲノムプロモーターによって指令されるｐＥ
ＲＫ／ＨＩＶgagレプリコンから発現したタンパク質から識別不能であることを示した。
さらに、ＶＲＰを滴定することによって測定された発現レベルは、２６Ｓプロモーター指
令系に比較してＩＲＥＳ指令系を用いると増加した（表１５）。
【０１５２】
【表１５】
0005572144.tif 000016
【実施例７】
【０１５３】
ＩＲＥＳ指令ＨＩＶｇａｇレプリコン粒子が接種されたマウスにおける体液性および細胞
性免疫反応
ｐＥＲＫ／ＥＭＣＶ／ｇａｇ  ３４２レプリコンは、動物にワクチン接種されると強固
な体液性および細胞性反応を惹起する。４〜５週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスをＣｈａｒ
ｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社から入手し、あらゆる手順の前に１週間にわたり馴化させた。プラ
イムおよびブーストのために、複数のマウス群の左右両方の足蹠にイソフルオレン麻酔下
で１％  ｖ／ｖヒト血清アルブミンおよび５％  ｗ／ｖスクロースを含むＰＢＳを含有す
る希釈液中のＶＲＰを５×１０5ＩＦＵの目標用量で接種した。足蹠注射は、３０．５Ｇ
注射針および０．１００ｍＬのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジを用いて各後足蹠に２０μＬを
注射することによって実施した。血清サンプルは、第１回接種前（出血前）の第０日、第
２１日（第１回接種２０日後）および第２９日（ブーストの７日後）にイソフルオレン麻
酔下で眼窩後出血により入手した。ワクチン接種スケジュールは表１６にまとめられてい
る。ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイのために、ブーストの１４日後に脾臓を採取した
。
【０１５４】
【表１６】
0005572144.tif 000017
【０１５５】
Ａ．ワクチン接種後に実施された免疫学的アッセイ
Ｇａｇ  ＥＬＩＳＡ：抗原コートとしてＨＩＶ−１サブタイプＣ単離物ＤＵ−４２２由
来の精製組み換えヒスチジン標識（ｈｉｓ）−ｐ５５を使用した。血清を標準間接的ＥＬ
ＩＳＡによってＧａｇ特異的抗体の存在について評価した。
【０１５６】
Ｇａｇ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ：ａｎｔｉ−ＩＦＮ−γモノクローナル抗体ＡＮ１８
（ラットＩｇＧ１、ＭａｂＴｅｃｈ社、オハイオ州マリーモント）をプレコートしたＭｕ
ｌｔｉｓｃｒｅｅｎ  Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ  ＥＬＩＳＰＯＴプレート（ＥＬＩＳＰＯ
Ｔ認定９６−ウエル濾過プレート、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、マサチューセッツ州ベッドフ
ォード）内の個別ＥＬＩＳＰＯＴアッセイウエル内へ脾臓から採取した生育可能なリンパ
球を播種し、そして１６〜２０時間にわたりインキュベートした。バッファーを用いた複
数回の洗浄によって細胞を取り出し、ウエルをビオチニル化ａｎｔｉ−ＩＦＮ−γモノク
ローナル抗体Ｒ４−６Ａ２（ラットＩｇＧ１、ＭａｂＴｅｃｈ社）と一緒にインキュベー
トし、その後に洗浄し、アビジン−ペルオキシダーゼ複合体（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ａ
ＢＣ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅキット、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、カリ
フォルニア州バーリンゲーム）と一緒のインキュベーションを実施した。複合体が形成さ
れるのを許容するために、二次抗体とのインキュベーション期間の完了する少なくとも３
０分前にアビジン−ペルオキシダーゼ複合体を調製し、室温で保存した。インキュベーシ
ョン後、培養中に個々のＩＦＮ−γ分泌細胞の位置を表すスポットの形成を促進するため
にウエルを洗浄して室温で４分間にわたり基質（ＡＥＣ錠剤、Ｓｉｇｍａ社）と一緒にイ
ンキュベートした。蒸留水によるリンスによってスポット発生を停止させた。
【０１５７】
ＨＩＶgag  ＶＲＰを用いて免役化させたマウス由来のリンパ球中のＧａｇ特異的ＩＦ
Ｎ−γ分泌細胞を計数するために、免疫優性ＣＤ８＋ＣＴＬ  Ｈ−２Ｋd−制限ＨＩＶ−
ＧａｇペプチドＡＭＱＭＬＫＥＴＩまたはＭＨＣクラスＩに結合する非関連性ＨＡ（イン
フルエンザ血球凝集素）ＣＤ８＋ＣＴＬ  Ｈ−２Ｋd−制限ペプチドＩＹＳＴＶＡＳＳＬ
を用いて１６〜２０時間にわたりリンパ球を刺激した（３７℃で５％ＣＯ2濃度。細胞か
らペプチドを抜いたものがバックグラウンドコントロールとして機能する。陽性コントロ
ールとして、細胞を類似期間にわたり４μｇ／ｍＬのコンカナバリンＡを用いて刺激した
。遊離末端を含むようにペプチドを合成し、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅに
よって＞９０％へ精製した。
【０１５８】
ＨＩＶgag  ＶＲＰの力価滴定：Ｖｅｒｏ細胞に感染させたＨＩＶgagＶＲＰのＧａｇ特
異的ＩＦＡを使用してワクチンの力価または感染力価を測定した。力価は１ｍＬ当たりの
感染単位ＩＦＵ／ｍＬとして測定した。各注射日に、残留接種材料を逆滴定して各動物が
受容した実際の用量を測定した（表１７）。
【０１５９】
【表１７】
0005572144.tif 000018
【０１６０】
ワクチン接種試験の結果は、ａｎｔｉ−Ｇａｇ抗体ＥＬＩＳＡおよびＧａｇ特異的ＥＬ
ＩＳＰＯＴアッセイによって測定されたように、３４２／ＥＭＣＶ／ｇａｇ  ＶＲＰをワ
クチン接種した動物がＨＩＶ−Ｇａｇへの強い体液性および細胞性免疫反応を展開するこ
とを示している。
【実施例８】
【０１６１】
数種の昆虫ウイルスＩＲＥＳ配列の活性を多数の昆虫細胞系内での哺乳動物ウイルスＩ
ＲＥＳ（ＥＭＣＶ）の活性と比較した。２６Ｓサブゲノム転写産物がバイシストロニック
であるようにレプリコンベクターを設計した。２６ＳサブゲノムＲＮＡがキャッピングさ
れているが、これはバイシストロニックＲＮＡ上の第１遺伝子（クロラムフェニコール−
アセチル−トランスフェラーゼ（ＣＡＴ））の翻訳はキャップ構造依存性であり、第２遺
伝子（ルシフェラーゼ（ＬＵＣ））の翻訳がＩＲＥＳ配列依存性（キャップ構造非依存性
）であることを意味している。シンドビスウイルスに基づくレプリコンベクターは、以下
のエレメント：５’ＮＣＲ、ｎｓｐ１、２、３、４、２６Ｓプロモーター、ＣＡＴ遺伝子
、ＩＲＥＳ、ＬＵＣ遺伝子、ＮＣＲ  ３’を含有するように組み換えた。１つはエンドウ
ヒゲナガアブラムシウイルス（Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ  ｖｉｒｕｓ）
（ＡＰＶ）由来およびもう１つはムギクビレアブラムシウイルス（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐ
ｈｕｍ  ｐａｄｉ  ｖｉｒｕｓ）（ＲｈＰＶ）由来の２つの昆虫ウイルスＩＲＥＳ配列を
ＣＡＴおよびＬＵＣ遺伝子の間に組み換えた。比較するために、哺乳動物ウイルスＩＲＥ
Ｓ（ＥＭＣＶ）を同一シンドビスレプリコンベクター内のＣＡＴおよびＬＵＣ遺伝子間に
組み換えた。ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼを用いて各レプリコン構築物のためのＲＮＡお
よびシンドビス構造タンパク質遺伝子（キャプシド−Ｅ３−Ｅ２−６Ｋ−Ｅ１）の全部を
コードするＲＮＡヘルパーをインビトロ転写した。ヘルパーＲＮＡおよびバイシストロニ
ックＲＮＡの各々を８×１０6ＢＨＫ−２１細胞内へエレクトロポレーションにより導入
することによって、シンドビスレプリコン粒子を調製した。溶媒を収集し、清浄化し、そ
して２０％蔗糖クッションを通して遠心分離することによってレプリコン粒子を精製した
（４℃で３時間にわたり２４，０００ＲＰＭ）。ウサギａｎｔｉ−ＣＡＴ抗体（Ｃｏｒｔ
ｅｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍ社、カリフォルニア州サンリアンドロ）を用いてレプリコン粒子を
滴定した。
【０１６２】
ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳに比較して昆虫ウイルスＩＲＥＳ配列の活性を測定するために、精
製シンドビスレプリコンのバイシストロニック粒子を使用して培養中で増殖している様々
な昆虫細胞を感染させた。これらの実験で使用した昆虫細胞は、Ｔｏｘｏｒｈｙｎｃｈｉ
ｔｅｓ  ａｍｂｏｉｎｅｎｓｉｓ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ａｌｂｉｍａｎｕｓ（マラリア
媒介蚊の一種）、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ（マラリア媒介蚊の一種）、およ
びＡｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（ヒトスジシマカ）であった。昆虫細胞はレプリコ
ンのバイシストロニック粒子を用いて０．１のＭＯＩで感染させた。感染からおよそ１６
時間後に細胞溶解液を調製し、ＣＡＴ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒｏｃｈｅ社、インディアナ
州インディアナポリス）を製造業者の取扱説明書にしたがって用いて溶解液中に存在する
ＣＡＴタンパク質の量を測定した。並行して、ルシフェラーゼアッセイキット（Ｒｏｃｈ
ｅ社）を用いて溶解液中に存在するＬＵＣタンパク質の量を測定した。２つの数値の比較
を可能にするために各アッセイにおいて使用したタンパク質の量について各溶解液中で検
出されたＣＡＴおよびＬＵＣの量を正規化した（表１７）。各細胞タイプにおいて検出さ
れたＣａｔタンパク質は、使用したレプリコンとは無関係に類似であった。これらのデー
タは、レプリコン粒子を含有する３種のＩＲＥＳ各々について細胞タイプ内で類似の感染
効率が達成されること、したがって各細胞タイプ内で検出されたＬＵＣ活性がその細胞タ
イプ内のＩＲＥＳ配列の活性を直接的に反映することを示している。分析した昆虫細胞タ
イプの各々において、昆虫ウイルスＩＲＥＳはＥＭＣＶ  ＩＲＥＳより高度の活性（８５
〜９５％以上）を有していた（表１７）。
【０１６３】
【表１８】
0005572144.tif 000019
【実施例９】
【０１６４】
霊長類におけるＩＲＥＳレプリコンに対する体液性および細胞性免疫反応
メリーランド州フレデリックに所在するＳｏｕｔｈｅｒｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓ
ｔｉｔｕｔｅでカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍａｃａｑｕｅ）においてＶＲＰ
を含有するｐＥＲＫ／ＥＭＣＶ／ｇａｇ３４２（実施例６）の免疫原性に関する試験も実
施した。各ワクチンは皮下注射および筋肉内注射によって６匹の動物に投与した（動物３
匹／経路）。動物は第０月および１カ月後に１×１０8個のワクチン粒子の接種を２回受
けた。第２回接種の４週間後に体液性免疫反応を分析し（実施例７Ａに記載したとおり）
、表１８に示した。比較のために、２６Ｓプロモーター（ｐＥＲＫ／ｇａｇ）から直接的
にｇａｇタンパク質を発現するＶＥＥレプリコンについても評価した。
【０１６５】
【表１９】
0005572144.tif 000020
【０１６６】
本発明を特定の実施形態の特定の詳細を参照しながら記載してきたが、そのような詳細
は添付の特許請求の範囲に含まれる範囲および程度を除いて本発明の範囲に関して制限さ
れると見なされることは企図していない。
本特許出願を通して、様々な特許、特許公報、雑誌出版物およびその他の出版物が参照
されている。これらの出版物の開示は、本発明が関与する当分野の最新状態をより完全に
記載するため、そしてこれらの参考文献がこの特許出願に現れる文章の主題についての文
書による説明を提供するために、本特許出願に全体として参照して組み込まれる。
【図１】
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【配列表】
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