(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アレルゲンに特異的なＩｇＥ抗体に対する親和性が低下した修飾β−ラクトグロブリンを製造するための方法であって、
（ａ）未修飾β−ラクトグロブリンをコードする核酸配列を修飾し、それにより、修飾した核酸から発現される修飾β−ラクトグロブリンにおいて、該未修飾β−ラクトグロブリンの平面状（平坦状）Ｉ型表面の構造が改変され、且つ該未修飾β−ラクトグロブリン特異的なＩｇＥ抗体の該修飾β−ラクトグロブリンに対する親和性が、未修飾β−ラクトグロブリンに対する親和性の１０分の１以下に低下し、そして
（ｂ）該修飾核酸から修飾β−ラクトグロブリンを発現させるか、または該修飾核酸を用いて修飾β−ラクトグロブリンを製造する
ことを包含し、
該平面状（平坦状）表面は、面積が６００〜９００Å２であり、且つ、抗体−β−ラクトグロブリン免疫複合体に含まれる未修飾β−ラクトグロブリン由来アミノ酸であるTrp19−Tyr20、Val43−Lys47、Leu57−Gln59、Cys66−Gln68、Pro126−Glu127およびThr154−Glu157の構造座標または三次元座標によって定義されるものであることを特徴とする方法。
【請求項２】
以下の工程（ａ）〜（ｄ）を包含することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
（ａ）未修飾β−ラクトグロブリンに含まれる潜在的なＩｇＥ結合部位を構造解析または分子モデリングによって検出し、
（ｂ）抗体−β−ラクトグロブリン免疫複合体に含まれる未修飾β−ラクトグロブリン由来アミノ酸であるTrp19−Tyr20、Val43−Lys47、Leu57−Gln59、Cys66−Gln68、Pro126−Glu127およびThr154−Glu157の三次元座標によって定義される、面積が６００〜９００Å２の平面状または平坦状の表面が該潜在的なＩｇＥ結合部位に含まれるか否かを、該未修飾β−ラクトグロブリンの三次元構造の計算機解析によって決定し、該平面状または平坦状の表面が検出された場合には、更に以下の工程を実施する：
（ｃ）該未修飾β−ラクトグロブリンをコードする核酸配列を修飾し、それにより、修飾した核酸から発現される修飾β−ラクトグロブリンにおいて、該未修飾β−ラクトグロブリンの平面状または平坦状表面の構造が改変され、且つ該未修飾β−ラクトグロブリン特異的なＩｇＥ抗体の該修飾β−ラクトグロブリンに対する親和性が、未修飾β−ラクトグロブリンに対する親和性の１０分の１以下に低下し、そして
（ｄ）上記工程（ｃ）で得た該修飾核酸から修飾β−ラクトグロブリンを発現させるか、または該修飾核酸を用いて修飾β−ラクトグロブリンを製造する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はタンパク質工学技術に関する。さらに詳細には、本発明は、非連続的なアレルゲン性エピトープである面積が６００〜９００Å2の平面状表面に結合する、ヒトＩｇＥ抗体およびその誘導体、例えば、牛乳β−ラクトグロブリンに対して高い親和性と特異性をもって結合するＩｇＥ抗体に関する。また、本発明は、Ｉ型相互作用を担う、上記のアレルゲン結合性モノクローナル抗体を作製したり改変したりするための方法、およびこのような抗体やその誘導体の使用方法にも関する。免疫診断分野での抗体やその誘導体の使用は、生物学的サンプルおよび原料サンプル中のアレルゲン性物質の定性的測定と定量的測定および除去を可能にし、さらにアレルゲンに対するフォーカスドＩｇＥライブラリーの構築のために使用すると、アレルゲン特異的モノクローナル抗体の開発を可能にする。免疫療法において本発明は、アレルゲンのアミノ酸残基の修飾によって、アレルゲン性物質のＩ型表面相互作用の遮断を可能とする。低アレルギー性の変異型は、平面状（平坦状）エピトープ表面の数個（１〜５個）のアミノ酸残基を嵩高の残基（例えば、Arg、Tyr、Lys、Trp）に変異させることで得られる。変異に用いる残基は、いずれも側鎖が外側の溶媒に向けられているものであるため、アレルゲンの基本構造の変化は最小限に抑えられる。変異の目的は、ＩｇＥ抗体が結合する平坦状表面を修飾して凸状表面にすることにより、ＩｇＥ抗体の結合を防止することである。結果として得られる修飾アレルゲンは、アレルギー患者に特定アレルゲンに対する寛容状態を誘導するために使用することができる。本発明は、タンパク質構造表面の突出領域以外の領域に対して結合特異性を示す治療用および診断用の標的に対する、ヒトＩｇＥ ＶＨ領域由来の抗体の開発を可能にする。さらに本発明は、抗体のＩ型アレルゲン性エピトープに対する結合を遮断することが可能な物質のスクリーニングまたは分子モデリングのための手段を提供する。本発明においては、イムノアッセイ用試薬として使用できるだけの高い親和性と特異性をもってアレルゲン性β−ラクトグロブリンに結合するヒトＩｇＥ抗体断片およびその誘導体の開発、特徴付けおよび構造決定についても記載する。
【背景技術】
【０００２】
世界の人口のおよそ２０％がアレルギーに苦しんでいる。このため、アレルギーは深刻さの増している健康問題である。アレルギーとは、空気、食物または水に存在する通常は害のない物質に対する過敏反応である（Corry and Kheradmand, 1999）。新規な外来の異質物が、それを体内から排除することを目的とする反応、つまりアレルギー反応を引き起こす。即時型またはＩ型過敏反応とも呼ばれるＩｇＥ仲介アレルギー反応においては、生体が外来物質であるアレルゲンに初めて曝された時に、ＩｇＥ産生Ｂ細胞が可溶性ＩｇＥ分子の産生を始める。そして可溶性ＩｇＥ分子は、種々の細胞、最も重要なものとしてはマスト細胞および好塩基性細胞、の表面に存在する高親和性ＩｇＥ受容体に結合する。生体が同じ外来物質に再び遭遇すると、受容体結合ＩｇＥ分子の交差結合がアレルゲンによって生じ、その結果、細胞が活性化されて、アレルギー反応の徴候および症状を誘発する毒性物質であるヒスタミンなどが放出される。
【０００３】
牛乳アレルギー（ＣＭＡ）は、生後２年の間に乳児および幼児に見られる、臨床的に重要な望ましくない食物反応の最も一般的な原因である（Savilahti, 1981、Host and Halken, 1990、Saarinen et al., 1999）。ＣＭＡは牛乳タンパク質に対する強度のＩｇＥ応答および皮膚と胃腸管の臨床症状、例えば、アトピー性湿疹、嘔吐や下痢、によって特徴付けられる（Vaarala et al., 1995、Saarinen, 2000）。呼吸管の症状およびアナフィラキシーショックの可能性もある（Host and Halken, 1990、Schrander et al., 1993、Hill et al., 1999、Vanto et al., 1999、Saarinen, 2000）。牛乳は幼い児童にとって重要なエネルギー源（最大５０％）であり、非乳性品で簡単に置き換えることのできるものではないため、ＣＭＡは児童にとって深刻な問題である。牛乳アレルギー児童の約８５％が３歳までにアレルギーを克服するが、ＣＭＡがその後消失するのは、最大でも年長児童の３分の１である（Sampson and Scanlon, 1989）。
【０００４】
牛乳に含まれる主要なアレルゲンの１つが、リポカリンというタンパク質ファミリーに属するβ−ラクトグロブリンである。リポカリンは、一群の小さなリガンド結合性タンパク質からなり、その大部分が、Mus m1やRat n1（マウスおよびラットの尿タンパク質）およびドイツゴキブリアレルゲンBla g4などの呼吸器系アレルゲンである（Rouvinen et al., 2001）。β−ラクトグロブリンは、天然では３６ｋＤの二量体の形態で存在し、各サブユニットが１６２アミノ酸からなる。β−ラクトグロブリンについては、合計６種の遺伝的変異型が配列の違いに基づいて同定されている。最も多く存在する変異型Ａと変異型Ｂとの違いは、６４位（Asp → Gly）と１１８位（Val → Ala）の違いのみである（Godovac-Zimmermann and Braunitzer, 1987）。β−ラクトグロブリンの三次元構造は、Ｘ線回析によって決定されている（Sawyer L. et al., 1985、Brownlow, S. et al., 1997）。
【０００５】
ＩｇＥ抗体はアレルゲン性エピトープを特異的に認識するので、臨床および免疫学的診断において複合材料のアレルゲン濃度を検出および決定するために有用である。さらに、本発明によれば、アレルゲン性エピトープは、通常、タンパク質の免疫原性エピトープとは異なる。このことは、ハイブリドーマ技術などの従来の方法による、アレルゲン性エピトープに特異的な結合を示すモノクローナル抗体の産生の妨げとなっている。アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の開発がファージディスプレイ法によって可能なことが最近報告されている（Steinberger et al., 1996）。この方法は、臨床および診断に使用するためのアレルゲン特異的組み換え抗体を一定の質を保持しながら産生するための新たな手段を提供する。
【０００６】
本発明の関連する技術的課題は、アレルゲン性ポリペプチド内の、ＩｇＥ抗体に対する実際の結合部位を検出すること、およびこの情報の用途、例えば、ポリペプチドのアレルギー誘導性を低下させるための修飾である。この課題を解決するための従来の手段は米国特許願第2003/0175312号（Holm et al.）、WO 03/096869（Alk Abello A/S）およびJenkins et al., 2005（J. Allergy Clin. Immunol. 115:163-170）に開示されている。上記文献には、アレルゲン性ポリペプチドの推定ＩｇＥ結合部位は、アレルゲン性ポリペプチドの保存性表面構造の配列解析によって検出できると記載されている。さらにUS 2005/0181446（Roggen et al.）およびHantusch et al., 2004（J. Allergy Clin. Immunol.）では、ＩｇＥ結合エピトープの探索にペプチド−スキャン法を使用している。しかし、いずれの文献にも、本発明の方法、即ち、アレルゲン性ポリペプチドのＩｇＥ結合部位を、実質的に平面状または平坦状の性質を有する新規な型のＩｇＥエピトープの実験的三次元データおよび分子モデリングデータに基づいて見いだす方法は開示されていない。MacCallum et al., 1996（J. Mol. Biol. 262:732-745）は、抗体に平面状表面が存在することを開示するものの、修飾については抗体構造についてのみを教示し、抗原構造の修飾についての開示はない。さらにMacCallum et al.の開示は抗体と種々の異なる抗原全般（炭水化物やペプチドなど）に関するものであり、ＩｇＥ抗体とアレルゲン性ポリペプチドとの結合や、これらポリペプチドの表面構造については格別何も教示はない。
【０００７】
発明の概要 
本発明は、非連続的なアレルゲン性エピトープである、面積が６００〜９００Å2の平面状Ｉ型表面に結合するＩｇＥ抗体とその誘導体、例えば、牛乳β−ラクトグロブリンに対して高い親和性と特異性をもって結合するＩｇＥ抗体に関する。また、本発明は、表面構造のアミノ酸残基を修飾するか、表面に結合するミメトープを作製することにより、アレルゲン物質によるＩ型相互作用の遮断を可能にする。
【０００８】
さらに本願においては、アレルゲン性β−ラクトグロブリンに結合するヒトＩｇＥ抗体断片およびその誘導体の開発、特徴付けおよび構造決定を開示する。本発明のヒトＩｇＥ抗体断片およびその誘導体は、生物学的試料中のβ−ラクトグロブリンを定性的および定量的に測定するために設計したイムノアッセイ、β−ラクトグロブリンの除去、アレルギー患者の免疫学的治療、および構造データに基づくフォーカスド抗体ライブラリーの構築のための試薬として用いるのに十分な高い親和性および特異性を有する。具体的には、本発明は、β−ラクトグロブリンに特異的なヒトＩｇＥ抗体のファージディスプレイ法による選択、E. coliを用いて産生した改変抗体断片の結合特性の特徴付け、および抗体−アレルゲン免疫複合体の構造決定について開示する。
【０００９】
従って、本発明は、種々のイムノアッセイ法、ヒトの免疫療法およびフォーカスド抗体ライブラリーの構築に使用するための新規な試薬を提供する。また、本発明は、均一な品質を保持する上記の特異的な試薬の継続的な供給を保証し、ポリクローナル抗血清に固有のバッチ間の品質のばらつきという問題の排除を可能にした。これらの有用な効果によって、本発明は、均一な品質の、新規であり、特異的であり且つ経済的な免疫診断アッセイの製造を可能にする。
【００１０】
上記から明かであるように、本発明の特定の目的の一つは、ヒトＩｇＥモノクローナル抗体、その機能的断片または上記抗体の誘導体であって、生物学的サンプル中のβ−ラクトグロブリンの定性的および定量的な測定に使用するのに十分な高いβ−ラクトグロブリン親和性および特異性を有するものを提供する。さらに本発明は、上記抗体、断片または誘導体の免疫療法における用途も提供する。本発明の一価の抗体はアレルゲン性β−ラクトグロブリンに特異的な結合性を示す。
【００１１】
本発明の他の目的の一つは、β−ラクトグロブリン特異的抗体鎖をコードするｃＤＮＡクローンの提供のみならず、該クローンを発現させてβ−ラクトグロブリン結合性の抗体、その断片または上記抗体の誘導体を産生するための構築物や産生方法を提供することである。
【００１２】
本発明の更なる目的の一つは、β−ラクトグロブリン結合性の抗体、その断片または上記抗体の誘導体を単独または組み合わせて用いることで、生物学的サンプル中のβ−ラクトグロブリンを定性的および定量的に測定する方法を提供することである。さらに、本発明は、アレルギー患者の免疫療法に使用するためのβ−ラクトグロブリン結合性抗体、その断片または上記抗体の誘導体およびそれらの組み合わせを提供する。
【００１３】
本発明の更なる目的の一つは、診断用のアレルゲンに対するフォーカスドＩｇＥ抗体ライブラリー、および治療用および診断用の標的のためのヒトＩｇＥ ＶＨ領域誘導抗体ライブラリーを構築するために得られた構造データを使用する方法を提供することにあり、ここで得られる結合特異性は、タンパク質構造中の、表面の突出領域以外に位置する領域に対するものである。
【００１４】
本発明の諸目的、諸特徴および諸利益は、添付の図面および詳細な説明の記載から明らかになる。しかしながら、以下の詳細な説明および実施例は本発明の好ましい態様を示すものの、あくまでもそれを例示しているに過ぎず、本発明の精神および発明の範囲内で行われる種々の変更および改良は、以下の詳細な説明より当業者には明らかであることを理解されたい。
尚、添付の図面において、構造を示す図面はいずれも実寸ではない。
【００１５】
略称 
ｃＤＮＡ      相補的デオキシリボ核酸
ＣＤＲ        相補性決定領域
ＤＮＡ        デオキシリボ核酸
E. coli Escherichia coli 
ＥＬＩＳＡ    酵素免疫測定法
Ｆａｂ        特異的抗原結合性を有する断片
Ｆｄ          重鎖の可変ドメインおよび第一定常ドメイン
Ｆｖ          特異的抗原結合性を有する抗体の可変領域
ＩｇＥ        免疫グロブリンＥ
ｍＲＮＡ      メッセンジャーリボ核酸
ＮＭＲ        核磁気共鳴
ＰＣＲ        ポリメラーゼ連鎖反応
ＲＮＡ        リボ核酸
ｓｃＦｖ      一本鎖抗体
supE-         グルタミン挿入型アンバーサプレッサーｔＲＮＡを保持する
菌株の遺伝子型
ＶH           重鎖の可変領域
ＶL           軽鎖の可変領域
【００１６】
発明の詳細な説明 
以下に、本願明細書で使用した用語の一部について、その定義を述べる。「免疫グロブリン」、「重鎖」、「軽鎖」および「Ｆａｂ」は欧州特許願第0125023号と同様に使用した。
【００１７】
本明細書において、種々の活用形の「抗体」という用語は集合名詞として使用されており、免疫グロブリン分子および／または免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部位、即ち抗原結合部位またはパラトープを含有する分子の総称である。
【００１８】
「抗原結合性部位」または「パラトープ」とは、抗体分子において、抗原に特異的に結合する構造を有する部位である。
【００１９】
抗体の例としては、免疫グロブリン分子の一部分であってパラトープを含む部分、例えばＦａｂやＦｖが挙げられる。
【００２０】
「Ｆａｂ」（特異的抗原結合性を有する断片）とは、公知の方法によって実質的に完全な抗体をパパインによるタンパク質分解に付すことで得られる抗体の一部分である（例えば、米国特許第4,342,566号参照）。Ｆａｂ断片は遺伝子組み換え法によって産生することもでき、このような方法は当業者にはよく知られている（例えば、米国特許第4,949,778号参照）。
【００２１】
「ドメイン」は、タンパク質の独立した折りたたみ部分を意味する。天然のタンパク質におけるドメイン間の境界に関する一般的な構造上の定義については、Argos, 1988を参照することができる。
【００２２】
「可変ドメイン」または「Ｆｖ」とは、免疫グロブリン分子中に存在し、抗原またはハプテンの結合を担う領域である。通常この領域は、免疫グロブリン分子の軽鎖（Ｌ鎖）および重鎖（Ｈ鎖）のそれぞれのＮ末端から数えて約１００個のアミノ酸からなる領域である。
【００２３】
「一本鎖抗体」（ｓｃＦｖ）とは、抗体の重鎖および軽鎖のそれぞれの可変ドメインがリンカーペプチドを介して結合した連続したアミノ酸鎖であって、一本鎖ｍＲＮＡ分子（転写物）から合成されたものである。
【００２４】
「リンカー」または「リンカーペプチド」とは、天然のまたは工学的に作製したタンパク質中の隣接する２つのドメインの間に存在するアミノ酸配列である。
【００２５】
「β−ラクトグロブリン結合性抗体」とは、β−ラクトグロブリンを特異的に認識し、その可変ドメインを介した相互作用によって結合する抗体である。本明細書において使用する「特異的結合」、「特異的認識」や「β−ラクトグロブリンのアレルゲン性エピトープに対して結合特異性を有する」などの表現は、抗体、その断片または誘導体とその標的分子との間で生じる、バックグラウンド値が低く高親和性の結合（即ち、非特異的結合のない結合）を意味する。本発明の１つの態様は、β−ラクトグロブリン（配列番号８）のアレルゲン性エピトープに対する結合特異性を有するモノクローナル抗体、あるいは該特異性を有する抗体の機能的断片または誘導体である。
【００２６】
「平面状（または平坦状）表面」とは、実施例８で定義した表面構造を意味する。
【００２７】
上記抗体の断片であって、本発明の範囲に属するものの例としては、図４および図５に開示した、Ｄ１ ＩｇＥ ＦａｂのｓｃＦｖ断片が挙げられる。本発明の一つの好ましい態様においては、β−ラクトグロブリン結合性抗体の誘導体、例えば、Ｆａｂ断片やｓｃＦｖ断片、が提供される。さらにＣＤＲ配列または完全なＶLおよびＶH配列の変異体であって、結合力に実質的に影響を与えない１つ以上の同類置換を有するものを代りに使用することも可能であり、このような誘導体も本発明の範囲に含まれる。
【００２８】
イムノアッセイ、例えば生物学的サンプル中のβ−ラクトグロブリンの定性的または定量的な検出、に使用する場合、本発明の抗体および抗体誘導体を標識してもよい。この目的のためには、従来から抗体の標識に用いられているいかなる種類の標識も用いることができる。
【００２９】
免疫学的治療、例えば、アレルギー患者におけるアレルゲン性β−ラクトグロブリンの遮断に使用するためにも、本発明の抗体および抗体誘導体を標識してもよい。この目的のためには、従来から抗体の標識に用いられている、薬学的に許容される標識を適宜使用することができる（例えば、US 2007/0003579を参照）。
【００３０】
本発明の他の一つの態様においては、本発明の抗体および抗体誘導体をコードするＤＮＡおよびこのようなＤＮＡの断片であって、ＶLおよび／またはＶH領域のＣＤＲをコードするＤＮＡ断片が提供される。これらＤＮＡ分子はベクターにクローニングされていてもよく、具体的には、例えば、本発明の抗体の誘導体、少なくとも１つの抗体鎖または抗体鎖の一部の発現を誘導しうる発現ベクターにクローニングされていてもよい。
【００３１】
本発明の更なる一つの態様においては、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞および哺乳動物細胞からなる群より選ばれる細胞であって、本発明のＤＮＡ分子を含むものが提供される。このような宿主細胞には、本発明の抗体または抗体誘導体を発現することが可能な宿主細胞も含まれる。従って、本発明の抗体誘導体を製造するためには、１種または複数種の必要な抗体鎖を発現しうる本発明の宿主細胞を培養し、そして宿主細胞の産生した目的タンパク質を直接回収するか、必要であれば、初めに個別の抗体鎖を回収し、組み合わせることもできる。
【００３２】
上記のｓｃＦｖ断片は、アレルゲン性組み換えβ−ラクトグロブリンを用いたヒトＩｇＥ ｓｃＦｖファージライブラリーのバイオパニング（biopanning）によって得たものである。ヒトＩｇＥ ｓｃＦｖファージライブラリーは、牛乳アレルギー患者のリンパ球から単離したｍＲＮＡから構築した。軽鎖および重鎖の可変領域のｃＤＮＡは、Ｆｄ ｃＤＮＡ用のヒトＩｇＥ特異的プライマーを用いて合成し、ヒト軽鎖のカッパ（κ）鎖およびラムダ（λ）鎖はヒトκ鎖特異的プライマーおよびλ鎖特異的プライマーを用いて合成した。軽鎖および重鎖の可変領域は、ＶκｃＤＮＡ用のヒトκ鎖特異的プライマーとＶλｃＤＮＡ用のλ鎖特異的プライマーおよびＶH ｃＤＮＡ用のヒトＩｇＥ特異的プライマーを用いてそれぞれＰＣＲによって増幅した。これらのＰＣＲプライマーに導入しておいた制限部位を利用して、ｓｃＦｖファージディスプレイベクターに可変領域のｃＤＮＡをクローニングし、ヒトＩｇＥ ｓｃＦｖライブラリーを構築した。
【００３３】
パニング法を利用したファージディスプレイによってヒトＩｇＥ ｓｃＦｖライブラリーを選択した。ヒトＩｇＥ ｓｃＦｖファージライブラリーのスクリーニングを溶液中のビオチン化したアレルゲン性未修飾（native）β−ラクトグロブリンで行い、結合物をストレプトアビジン上に捕捉した。ファージの溶出を１００μＭの非ビオチン化未修飾β−ラクトグロブリンＡＢ二量体で行った。ファージ溶出液をE. coli細胞で増幅した。バイオパニングを２ラウンド繰り返した後、単離したファージから可溶性のｓｃＦｖ断片を調製した。選択したｓｃＦｖ断片の結合特異性をＥＬＩＳＡで検出した。複数種のβ−ラクトグロブリン特異的ｓｃＦｖ断片クローンを得た。
【００３４】
本明細書に記載したように、ファージディスプレイ法は、診断および治療に適用するためのヒトＩｇＥ組み換え抗β−ラクトグロブリン抗体を開発するための、有効かつ実用的な方法である。
【００３５】
本発明の抗体断片を得るために有効な選択方法の一例を記載したが、当業者には明らかなように、様々な応用方法によっても本発明の抗体断片を得ることが可能である。ｓｃＦｖ断片またはその誘導体のファージディスプレイライブラリーまたは微生物ディスプレイライブラリーから本発明のｓｃＦｖ断片を直接選択すること可能性もある。本発明のｓｃＦｖ断片または他の抗体断片を表面タンパク質との融合タンパク質として提示するファージまたは微生物細胞は、本発明の更なる態様の一つである。
【００３６】
微生物細胞による本発明の抗体および抗体誘導体の発現は、免疫診断アッセイおよび免疫療法に適した均一な品質の高特異性試薬を効率よく且つ経済的に製造するための手段を提供する一方で、このような試薬またはその少なくとも一部が合成可能であることを示唆している。従来の遺伝子工学的手法を適用することにより、初めに得られた本発明の抗体断片をその結合特性を実質的に変えることなく改変する（例えば、新たな配列を連結する）ことができる。このような手法は、上記で定義したβ−ラクトグロブリンに対する親和性および特異性の両方を保持する新規なβ−ラクトグロブリン結合性ハイブリッドタンパク質の製造にも用いることができる。
【００３７】
アレルゲンの平面状表面および低アレルギー性物質の製造と使用
本発明は、非連続的なアレルゲン性エピトープ、即ち、アレルゲン性物質の面積が６００〜９００Å2の平面状表面（図１４と図１６を参照）、のアミノ酸残基を修飾することによって、アレルゲン性物質のＩ型表面相互作用の遮断を可能にする。平面状（平坦状）表面は、β−ラクトグロブリンやBet v 1のように、タンパク質表面のβ−シートを含んでいるか、またはFel d 1に見られるような、互いに隣接して集合した複数のα−へリックスを含んでいる。平面状構造を有する他のアレルゲンは、Equ c 1（ウマ 皮膚）、Bos d 2（ウシ フケ）、Cyp c 1（コイ パルブアルブミン）およびHev b 6（ラテックス）である。
【００３８】
低アレルギー性の変異型は、平面状（平坦状）エピトープ表面の数個（１〜５個）のアミノ酸残基を嵩高の残基に変異させる（例えば、AlaをArg、Tyr、LysまたはTrpに変異させる）ことで得られる。変異後の残基は、いずれも側鎖が外側の溶媒に向けられるため、アレルゲンの基本構造の変化は最小限に抑えられる。変異の目的は、平坦状表面を、ＩｇＥ抗体の結合を妨げる凸状表面に改変することである。平面状表面上の変異による効果は、修飾アレルゲンに対するアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の親和性の低下として観察され、特異的抗体の親和性を１０分の１以下に減少させる変異が好ましく、１０分の１未満に減少させる変異がさらに好ましい。結果として得られる修飾アレルゲンは、アレルギー患者に特定アレルゲンに対する寛容状態を誘導するために使用することができる。従って本発明は、１種または複数種の変異を直接導入することで破壊したＩ型平面状エピトープを有し、組み換えＩｇＥ分子に対する親和性が１０分の１以下、好ましくは１０分の１未満まで減少した修飾アレルゲンを提供する。
【００３９】
さらに本発明は、以下の工程を包含する、平面状アレルゲン性エピトープを有する特定アレルゲンに対する寛容状態を患者に誘導するための方法を提供する。
ａ）ＩｇＥエピトープに対する親和性を１０分の１以下に低下させる変異によって、アレルゲンの平面状表面を破壊し、
ｂ）変異したアレルゲン（即ち、低アレルギー性物質）を製造し、そして
ｃ）変異したアレルゲンを、患者に１回または複数回、好ましくは非経口的に投与する。
【００４０】
さらに本発明は、以下の工程を包含する、組み換えＩｇＥモノクローナル抗体を単離するための方法を提供する。
ａ）ヒト由来サンプルのＩｇＥ産生細胞からｍＲＮＡを単離し、
ｂ）ＩｇＥ Ｆｄ遺伝子領域およびカッパ／ラムダ軽鎖遺伝子をコードするｃＤＮＡを合成して、ＩｇＥ発現ライブラリーを構築し、
ｃ）アレルゲンに固有の平面状（平坦状）Ｉ型表面を有するポリペプチドまたはタンパク質に対して発現ライブラリーをスクリーニングし、該平面状表面に対して１０7 Ｍ-1を超える中度から高度の親和性を示すクローンを単離し、そして
ｄ）上記工程ｃ）で得たＩｇＥ抗体をコードするＤＮＡを単離する。
【００４１】
好ましくは、該ポリペプチドはβ−ラクトグロブリンであり、該平面状表面は、抗体−β−ラクトグロブリン免疫複合体に含まれるβ−ラクトグロブリン由来アミノ酸であるVal43−Lys47とLeu57−Gln59、およびこれらβ−ラクトグロブリン由来アミノ酸の近傍のアミノ酸からなる群より選ばれる少なくとも１種の構造座標または三次元座標によって定義されるものである（表８参照）。
【００４２】
さらに本発明は、以下の工程を包含する、修飾アレルゲン性ポリペプチドを製造するための方法を提供する。
（ａ）アレルゲン性ポリペプチドをコードする核酸配列を修飾し、それにより、修飾した核酸から発現される修飾アレルゲン性ポリペプチドにおいて、該アレルゲン性ポリペプチドの有するアレルゲン性エピトープの構造が改変され、そして（ｂ）該修飾核酸から修飾アレルゲン性ポリペプチドを発現させるか、または該修飾核酸を用いて修飾アレルゲン性ポリペプチドを製造する。工程（ｂ）は、適切な宿主細胞内の該修飾核酸を培養系内で発現させて、培養物から該修飾ポリペプチドを単離する工程、あるいは該修飾ポリペプチドを合成する工程をさらに包含することが好ましい。該修飾アレルゲン性ポリペプチドがβ−ラクトグロブリンであること、および／または該アレルゲン性エピトープが上記で定義した平面状表面であることが好ましい。より好ましくは、平面状表面は、抗体−β−ラクトグロブリン免疫複合体に含まれるβ−ラクトグロブリン由来アミノ酸であるVal43−Lys47とLeu57−Gln59、およびこれらβ−ラクトグロブリン由来アミノ酸の近傍のアミノ酸からなる群より選ばれる少なくとも１種の三次元座標によって定義されるものである。該アレルゲン性エピトープは、抗体−β−ラクトグロブリン免疫複合体に含まれるβ−ラクトグロブリン由来アミノ酸である、β−鎖ＡのTrp19とTyr20およびβ−鎖ＢのGlu44の構造座標によって定義されるものでもよい。
【００４３】
さらに本発明は、アレルゲンのアレルゲン性エピトープに結合する分子を同定するための方法であって、以下の工程を包含する方法を提供する。（ａ）アレルゲン性エピトープを有する粒子（例えば、ウイルス粒子）に、結合性分子候補物質を接触させ、そして（ｂ）該アレルゲン性エピトープに結合する結合性分子候補物質を単離する。アレルゲンがβ−ラクトグロブリンであり、該分子がペプチドであり、該アレルゲン性エピトープが上記で定義した平面状表面であることが好ましい。より好ましくは、平面状表面は、抗体−β−ラクトグロブリン免疫複合体に含まれるβ−ラクトグロブリン由来アミノ酸であるVal43−Lys47とLeu57−Gln59、およびこれらβ−ラクトグロブリン由来アミノ酸の近傍のアミノ酸からなる群より選ばれる少なくとも１種の構造座標または三次元座標によって定義されるものである。この方法を実施するために適した手法は、アフィニティークロマトグラフィーである。
【００４４】
結晶学的スクリーニングおよびin Silicoスクリーニング
β−ラクトグロブリンアレルゲン性エピトープの三次元構造は、以下に示す一群の構造座標によって定義されている。「構造座標」という用語は、結晶化した抗体-アレルゲン免疫複合体に含まれるβ−ラクトグロブリンのアレルゲン性エピトープの原子（散乱中心）による、Ｘ線単色放射の回析によって得られるパターンに関連した数式から導いたデカルト座標を意味する。回析データは、結晶中の繰り返し単位の電子密度地図を計算するために使用する。そして電子密度地図は、β−ラクトグロブリンのアレルゲン性エピトープの個別の原子の位置を確定するために使用する。
【００４５】
当業者には明らかなように、タンパク質やタンパク質複合体またはその一部に関する一群の構造座標は、三次元の形状を定義する点の相対的な集合である。従って、完全に異なる座標が、類似または同一の形状を定義することもある。さらに個々の座標のわずかなばらつきは、全体的な形状にあまり影響を与えない。
【００４６】
上述した座標のばらつきは、構造座標の計算操作によって発生することもある。例えば、後述する一群の構造座標は、構造座標の結晶学的置換、構造座標の分数化、一群の構造座標への整数の加算と減算、構造座標の反転、あるいはこれらのいかなる組み合わせによっても、操作することができる。
【００４７】
また、アミノ酸の変位、付加、置換および／または欠失、あるいは結晶を構成する成分の他の変化による結晶構造の修飾も、構造座標のばらつきの一因となりうる。このようなばらつきが、元の座標と比較して許容される標準誤差範囲にある場合には、結果として得られる三次元の形状は同一と見なす。
【００４８】
従って、分子、分子複合体またはそれらの一部が、ここに記載したβ−ラクトグロブリンアレルゲン性エピトープの全部または一部と同一であると見なすに十分な類似性を有するか否かを決定するためには、種々の計算解析が必要である。このような解析は、近年のソフトウエアアプリケーション、例えば、ＱＵＡＮＴＡの分子類似性アプリケーション（Molecular Similarity Application）（カリフォルニア州、サンディエゴ、Molecular Simulations Inc.製）、バージョン４．１および添付のユーザーズガイドを用いて実施することができる。
【００４９】
タンパク質結晶の構造座標を一度決定してしまえば、他の結晶の構造、特に類似したタンパク質の結晶の構造を解明する際に有用である。
【００５０】
従って本発明によれば、β−ラクトグロブリンのアレルゲン性エピトープおよびその部分の構造座標のデータを機械読み取り可能な保存媒体に保存する。このようなデータは、種々の目的、例えば、薬剤探索およびタンパク質結晶のＸ線結晶回析、に使用することができる。
【００５１】
従って、本発明の更に他の１つの態様においては、後述する一群の構造座標が符号化して記録された、機械読み取り可能なデータ保存媒体が提供される。
【００５２】
本発明によって、β−ラクトグロブリンのアレルゲン性エピトープまたはそのいかなる部分にも結合しうる阻害性物質などの化学物質（chemical entity）の設計、選択および合成に、構造に基づくドラッグデザイン技術、即ち、合理的なドラッグデザイン技術を使用することが初めて可能となった。
【００５３】
当業者には明らかなように、天然のリガンドまたは基質とそれに対応する受容体または酵素の結合ポケットとの会合は、多くの活性の生物学的メカニズムの根幹をなしている。本明細書で使用する「結合部位」という用語は、分子または分子複合体の領域であって、その形状故に他の化学物質または化合物と有利に会合する領域を意味する。同様に、多くの薬剤が受容体または酵素の結合ポケットとの会合を介して、その生物学的効果を発揮する。このような会合は、結合ポケットの全体またはいかなる部分にも生じる。このような会合に関する理解は、標的受容体または酵素とより有利に会合し、その結果、生物学的効果の向上した分子、例えば、薬剤、の設計の助けとなる。従って、受容体または酵素に対する潜在的なリガンドや阻害剤の設計において、このような情報は貴重である。
【００５４】
「会合する」または「相互作用する」という表現は、複数の化学物質もしくは化合物同士またはそれらの部分同士が近接した状態を意味する。会合または相互作用は、水素結合、ファンデルワールス力または静電相互作用によって物質間の近接状態がエネルギー的に保たれる非共有結合的なものであっても、共有結合的なものであっても良い。
【００５５】
反復分子デザインにおいては、一連のタンパク質／化合物複合体の結晶を得、それから各複合体の三次元構造を解明する。このような手法は、各複合体の中のタンパク質と化合物の間の会合に関する識見を提供する。これは、阻害活性を有する化合物を選択し、このような新規なタンパク質／化合物複合体の結晶を得、複合体の三次元構造を解明し、そして新規なタンパク質／化合物複合体における会合を、既に解明されているタンパク質／化合物複合体と比較することによって達成することができる。化合物の変化がどのようにしてタンパク質／化合物の会合に影響を与えたかを観察することで、これら会合を最適化することができる。
【００５６】
場合によっては、連続的なタンパク質／化合物複合体を形成し、新規な複合体をそれぞれ結晶化することで、反復分子デザインを実施する。または、予め形成しておいたタンパク質結晶を阻害剤の存在下でソーキングしてタンパク質／化合物複合体を形成することで、個々のタンパク質／化合物複合体を結晶化する必要性を省くこともできる。β−ラクトグロブリン結晶のアレルゲン性エピトープを、抗体などの１種または複数種の化合物の存在下でソーキングすることにより、β−ラクトグロブリン/抗体結晶複合体を容易に形成することができる。
【００５７】
本明細書において「ソーキングした」とは、目的の化合物を含む溶液に結晶を転移することを意味する。
【００５８】
保存媒体
原子座標を提供するための保存媒体は、好ましくはランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）であるが、リードオンリーメモリー（ＲＯＭ、例えばＣＤＲＯＭ）やディスクでもよい。コンピューターと保存媒体との接続は、ローカルでもリモート（例えば、インターネットを含む、ネットワーク化された保存媒体）でもかまわない。
【００５９】
さらに本発明は、コンピューター用のコンピューター読み取り可能な媒体であって、β−ラクトグロブリンアレルゲン性エピトープの原子座標が記録されていることを特徴とする媒体を提供する。
【００６０】
原子座標は、後述するものあるいはそれらの変異型が好ましい。
【００６１】
本発明においては、いかなる適切なコンピューターも使用可能である。
【００６２】
分子モデリング技術
β−ラクトグロブリンアレルゲン性エピトープの原子座標に分子モデリング技術を適用することによって、種々の三次元モデルの作製およびリガンド結合部位の構造研究を行うことができる。当業者であれば、種々の分子モデリング方法を、本発明に適用することができる。
【００６３】
最も単純なレベルにおいては、β−ラクトグロブリンのアレルゲン性エピトープのコンピューターモデルの目視検査を、官能基モデルの、結合部位への手動によるドッキングと共に使用することができる。
【００６４】
分子モデリング技術を実施するためのソフトウエアも使用することができる。このような分子モデリング技術は、in silicoのドラッグデザインおよびモデリングに使用するための構造モデルの構築を可能にする。
【００６５】
De novoの化合物デザイン
本発明の方法で使用する分子モデリング工程においては、結合表面を決定するために、β−ラクトグロブリンアレルゲン性エピトープの原子座標およびそれから誘導したモデルを使用することができる。
【００６６】
このような方法は、分子中のファンデルワールス接触、静電相互作用および／または水素結合を明らかにすることが好ましい。
【００６７】
これらの結合表面は、典型的には、グリッドに基づく技術（例えば、ＧＲＩＤ［Goodford (1985) J. Med. Chem. 28: 849-857］，ＣＥＲＩＵＳ２）、および／または官能基の好ましい相互作用位置をマッピングするための多重コピー同時探索（multiple copy simultaneous search，ＭＣＳＳ）技術で使用する。このような技術は、β−ラクトグロブリンのアレルゲン性エピトープにおいて相互作用が生じる位置を明らかにすることが好ましく、相互作用としては、プロトン、ヒドロキシル基、アミノ基、疎水性基（例えば、メチル基、エチル基、ベンジル基）および／または２価のカチオンとの相互作用が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００６８】
β−ラクトグロブリンアレルゲン性エピトープの結合表面の特異的部位と相互作用する官能基または小分子断片を一旦同定してしまえば、正しいサイズと幾何学的形態を有する架橋断片または官能基の好ましい配向を維持するフレームワークの使用によって、官能基または小分子断片を単一の化合物となるように連結することで、本発明の化合物を提供することができる。手動でもこのように官能基を結合することはできるが、ＱＵＡＮＴＡやＳＹＢＹＬ等のソフトウエアを利用して行うこともできる。さらに以下のソフトウエアも補助的に使用することができる：データベースから入手した分子テンプレートと複数の官能基を連結するＨＯＯＫ［Molecular Simulations Incより入手可能]、および／または非環式分子を拘束するための結合単位を設計するＣＡＶＥＡＴ［Lauri & Bartlett (1994) Comp. Aided Mol. Design 8: 51-66］。
【００６９】
ドッキング
公知のin silicoライブラリーに登録されている化合物についても、自動ドッキングアルゴリズムにおいてそれぞれの原子座標を使用することで、β−ラクトグロブリンアレルゲン性エピトープと相互作用する能力についてスクリーニングすることができる
【００７０】
適切なドッキングアルゴリズムとしては、以下のものが挙げられる。ＤＯＣＫ［Kuntz et al. (1982) J. Mol. Biol. 161: 269-288］、ＡＵＴＯＤＯＣＫ［Oxford Molecularより入手可能］、ＭＯＥ−ＤＯＣＫ［Chemical Computing Group Inc.より入手可能］、またはＦＬＥＸＸ［Tripos Inc.より入手可能］。ドッキングアルゴリズムは、de novoで設計したリガンドとの相互作用を検証するためにも使用することができる。
【００７１】
アレルゲンに対するフォーカスドＩｇＥ−抗体ライブラリー
文献に開示されたＩｇＥ配列のアミノ酸配列比較から、多様なアレルゲン群に結合する公知のＩｇＥ抗体の軽鎖は驚くほど保存性が高いことを明らかである（表７を参照）。この結果は、アレルゲンの診断に適用可能なアレルゲン特異的な抗体の単離に使用できる、フォーカスドアレルゲン特異的ライブラリーの構築に有効なツールを提供する。保存された軽鎖配列の情報は、ＩｇＥ抗体から同定した特徴的なアミノ酸配列を有する複数種の軽鎖に限定されたプールまたは単一の軽鎖の構築に使用される。この軽鎖配列の情報を、複数のアレルギー患者由来のリンパ球から単離したＩｇＥ重鎖遺伝子の多様なプールと組み合わせる。結果として得られる、ディスプレイ形式がｓｃＦｖ型またはＦａｂ型である抗体ファージディスプレイライブラリーを、実施例１のIIの記載またはHoogenboom et al. (1998)の記載と実質的に同様の方法で行う、アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の選択に使用する。
【００７２】
ヒト ＩｇＥ ＶＨ領域を含む、ヒト抗体（ｓｃＦｖ、Ｆａｂまたは全長抗体）のライブラリー
Ｄ１ ＩｇＥ ＦａｂのＩｇＥ ＶＨ領域、特にそのＨＣＤＲ３ループをＩｇＧ抗体と比較すると、構造的な違いが認められる。この領域は、ＢＬＧアレルゲン構造のクレフトを認識するループ構造を形成している。この知見に基づけば、ヒト ＩｇＥ ＶＨ領域を含む抗体であって、表面に露出していないタンパク質構造（例えば、酵素の基質結合部位や薬剤耐性ポンプ）に対する結合特異性を必要とする治療用標的について、抗体の開発が可能となる（De Genst et al., 2006）。ヒト リンパ球由来の多様なＩｇＥ ＶＨプールを構成単位として使用し、ｓｃＦｖ型、Ｆａｂ型または全長抗体型の機能的なヒト抗体ライブラリーを構築する。得られたライブラリーをクレフト構造に対する特異的認識を必要とする治療用標的に対して選択する。
【００７３】
ヒトβ−ラクトグロブリン結合性組み換え抗体の開発および特徴付け、並びにイムノアッセイにおけるその有用性について、以下の実施例において詳細に説明する。
【実施例１】
【００７４】
ファージディスプレイ選択法による、組み換えβ−ラクトグロブリン特異的ｓｃＦｖ断片の調製
本実施例においては、β−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）に対する親和性および特異性を有するｓｃＦｖ断片を単離するために、ヒトＩｇＥ ｓｃＦｖライブラリーを構築し、アレルゲン性β−ラクトグロブリンによる選択を行った。ＩｇＥ Ｆａｂ−κライブラリーおよびＩｇＥ Ｆａｂ−λライブラリーを初めに構築することによって、ヒトＩｇＥファージライブラリーを間接的に構築し、その後、特定のライブラリーのＤＮＡを用いて重鎖および軽鎖の可変ドメインをＰＣＲで増幅した。
【００７５】
Ｉ．ヒトＩｇＥ ｓｃＦｖファージライブラリーの構築
ヘパリンを加えた血液５０ｍｌを牛乳アレルギー患者から得た。リンパ球をＩｇプライムキットのプロトコル（Novagen製）に従って、次の手順で単離した。血液１０ｍｌあたり３０ｍｌの溶解緩衝液（１５５ｍＭのＮＨ4Ｃｌ、１０ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を加え、時々振とうさせながら氷上で１５分間インキュベートした。４５０ｇで１０分間遠心分離した後、リンパ球、即ち白血球ペレット、を回収した。回収したペレットを溶解緩衝液で２回洗浄し、最後の遠心分離の後に得られたリンパ球ペレットをＤ溶液に再懸濁した。リンパ球ＲＮＡをPromega社のRNAgents 全ＲＮＡ単離キットを用いて製造者のマニュアルに従って単離した。初めのｃＤＮＡ合成はPromega社の逆転写システムキットを用いて行った。Ｆｄ断片ｃＤＮＡおよび軽鎖ｃＤＮＡの合成には、イプシロン（ε）鎖の定常領域のプライマー（Ｃε１）、並びにカッパ鎖のプライマー（Ｃκ１）とラムダ鎖のプライマー（Ｃλ１）をそれぞれ用いた。ヒトＩｇＥ Ｆｄ領域および軽鎖のｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ増幅に用いたプライマーを表１および表２に示す。
【００７６】
ＰＣＲ増幅は２段階、具体的にはｃＤＮＡテンプレートからＦｄ鎖およびＬ鎖を増幅するための一次ＰＣＲと、一次ＰＣＲで得たＤＮＡ断片の５’末端に制限部位を加えるための二次ＰＣＲを行った。まず、重鎖可変領域に特異的なプライマー（ＶＨ１ａ−ＶＨ７ａ）およびＣε１プライマーを用いてＦｄ領域をＰＣＲで増幅した。次に、軽鎖のκ鎖およびλ鎖を軽鎖可変領域に特異的なプライマー（それぞれＶκ１ａ−Ｖκ６ｂとＶλ１ａ−Ｖλ１０）およびＣκ／λ１プライマーを用いて増幅した。二次ＰＣＲでは、カッパ軽鎖領域のＰＣＲ増幅にはＣκ１、Ｖκ／λ１およびＣκプライマーを用い、カッパ鎖のＰＣＲ増幅にはＶκ／λ１およびＣλ１プライマーを用い、ラムダ鎖のＰＣＲ増幅にはＶλ１ＡおよびＣκ／λ１プライマーを用いた。一次ＰＣＲは以下の条件で行った：９３℃で３分間の変性を１サイクル；９３℃で１分間、６３℃で３０秒および５８℃で５０秒のアニーリング、次いで７２℃で１分間の伸長を７サイクル；９３℃で１分間、６３℃で３０秒および７２℃で１分間を２３サイクル；最後に７２℃で１０分間を１サイクル。二次ＰＣＲは以下の条件で行った：９５℃で３分間の変性を１サイクル；９４℃で１．５分間、６５℃で１分間のアニーリング、次いで７２℃で１．５分間の伸長を２５サイクル；および７２℃で１０分間を１サイクル。一次ＰＣＲと二次ＰＣＲの間、および二次ＰＣＲの後には、増幅したＤＮＡ断片を精製した。
【００７７】
種々の抗体断片のＤＮＡからなる最終ＰＣＲ産物をプールし、適切な制限酵素で消化した。消化したＤＮＡ断片であり、ＩｇＥ Ｆｄ領域やκ軽鎖やλ軽鎖をコードするＤＮＡ断片をファージミドベクターに連結し、そのファージミドベクターでE. coli XL-1 Blueを形質転換して１０6個の独立したクローンからなるＦａｂ−κライブラリーおよびＦａｂ−λライブラリーを得た。ファージ粒子上のＦａｂ断片の発現に関連して生じうる問題を防止するために、ｓｃＦｖ形式の抗体ライブラリーを構築した。ヒトＩｇＥ ｓｃＦｖ−κライブラリーおよびｓｃＦｖ−λライブラリーを構築するために、種々のライブラリーからファージミドＤＮＡを単離して、ヒトＩｇＥ 重鎖およびヒトＩｇＥ 軽鎖の可変領域を増幅するための鋳型ＤＮＡとして用いた。
【００７８】
重鎖可変領域のＰＣＲ増幅を、ヒトＶH特異的プライマー（ＶＨ１−ＶＨ４およびＶＨ１Ａ）を用いて行った。軽鎖可変領域の増幅は、以下のプライマーペアを用いて行った：ヒト カッパ鎖の増幅にはＶκ１−Ｖκ７、Ｖκ２−Ｖκ８、Ｖκ３−Ｖκ９、Ｖκ４−Ｖκ１０、Ｖκ５−Ｖκ１１およびＶκ６−Ｖκ１１を用い、ヒト ラムダ鎖の増幅にはＶλ１−Ｖλ８、Ｖλ２−Ｖλ９、Ｖλ３−Ｖλ９、Ｖλ４−Ｖλ９、Ｖλ５−Ｖλ１０、Ｖλ６−Ｖλ１０およびＶλ７−Ｖλ１０を用いた（表３および表４参照）。ｓｃＦｖファージディスプレイベクターに連結するために、増幅したＤＮＡ断片を精製し消化した（図３）。連結混合物でE. coli XL-1 Blueを形質転換し、約１０5個の独立したクローンからなるヒトＩｇＥ ｓｃＦｖ−κライブラリーおよびヒトＩｇＥ ｓｃＦｖ−λライブラリーを得た。
【００７９】
II．ヒトｓｃＦｖライブラリーの選択
ヒトｓｃＦｖ−κライブラリーおよびヒトｓｃＦｖ−λライブラリーをファージディスプレイ法（McCafferty et al., 1990、Barbas et al., 1991）により選択した。β−ラクトグロブリン結合性抗体断片を単離するために、親和性パニング法（affinity panning procedure）（図２）を用いて、バクテリオファージの表面に提示されたヒトＩｇＥ ｓｃＦｖ−κライブラリーおよびｓｃＦｖ−λライブラリーのパニングを行った。初めに、ファージプールをビオチン化した免疫反応性のβ−ラクトグロブリンまたは負の対照となる抗原なしの系で１．５時間反応させた。その後、ファージプールをビオチン結合性ストレプトアビジンでコートしたマイクロタイタープレートのウェルに移した。３０分間インキュベートした後、ウェルをＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、結合物を可溶性抗原（１００μＭの非ビオチン化β−ラクトグロブリンＡＢ二量体）で溶出した。続くパニングラウンドのために、溶出したファージプールをE. coli XL-1 Blue細胞に感染させて増幅した。パニングは２ラウンド行った。
【００８０】
III．β−ラクトグロブリン結合性物質の特徴付け
最後のパニングサイクル終了後、可溶性ｓｃＦｖ断片を発現させるために、ｓｃＦｖファージディスプレイＤＮＡを単離し、単離したＤＮＡでE. coli HB2151（supE-）の形質転換を行った。ｓｃＦｖファージディスプレイベクターは、そのｓｃＦｖ配列とファージ遺伝子III配列との間にＴＡＧアンバー終止コドンを含んでいる。このコドンは、supE+遺伝子型のE. coli株ではグルタミン酸に翻訳されるが、supE-遺伝子型のE. coli株では終止コドンに翻訳される。６２個の独立したクローンの小規模培養を実施し、予備的な特徴付けに用いる可溶性ｓｃＦｖ断片を製造した。クローンは、β−ラクトグロブリン特異的結合性物質物を捕捉するためのβ−ラクトグロブリンでコートしたウェル、および非特異的な結合を検出するためのコントロールタンパク質でコートしたウェルを用いたＥＬＩＳＡで分析した（データは示さない）。大部分のクローンが高い親和性でβ−ラクトグロブリンに結合した。クローンを初めにＤＮＡフィンガープリント法で解析し、６クローンについて配列を決定した（Sanger et al., 1977）。最後に、そのうちの１クローンを更なる特徴付けのために選択した（図４および５）。
【実施例２】
【００８１】
β−ラクトグロブリン結合特異性を有するヒトＦａｂ断片のクローニングおよび特徴付け
本実施例においては、β−ラクトグロブリン結合特異性を有するヒトＩｇＥ ｓｃＦｖをＩｇＧ１サブタイプに属するヒトＦａｂ断片に変換した。多量体の形成が難しいことが知られていることから、ｓｃＦｖ抗体ライブラリーから得たＤ１ ｓｃＦｖをクローニングし、細菌にＦａｂ断片として発現させた（Holliger et al., 1993、Desplancq et al., 1994）。得られた抗体断片の更なる特徴付けを競合的ＥＬＩＳＡ法で行った。
【００８２】
Ｉ．β−ラクトグロブリン結合特異性を有するヒトＦａｂ断片のクローニング
Ｆｄ領域をオーバーラッピングＰＣＲで増幅した。ＰＣＲに用いたプライマーは表５に示した。
【００８３】
上記で得たＦｄ領域および軽鎖のｃＤＮＡを細菌性発現ベクターであるｐＫＫｔａｃにクローニングし、E. coli RV308を形質転換した。Ｄ１ ＩｇＥ Ｆａｂと命名した可溶性Ｆａｂ断片を細胞培養によって産生し（Nevanen et al., 2001）、これらのＦａｂ断片は、そのＣ末端に導入したヘキサヒスチジニルタグを用いて、ニッケルを固定化したセファロースカラムで実質的に純粋になるまで精製した（データは示さない）。
【００８４】
II．ヒトＩｇＥ Ｆａｂ断片の特徴付け
精製Ｄ１ ＩｇＥ Ｆａｂの特徴付けを競合的ＥＬＩＳＡ法によって行った。初めに、量を種々に増やしたの可溶性非ビオチン化β−ラクトグロブリンをＤ１ ＩｇＥ Ｆａｂと共にインキュベートし、インキュベートした反応混合物をそれぞれアレルゲン性ビオチン化β−ラクトグロブリンでコートしたストレプトアビジンマイクロタイタプレートのウェルに添加した。図６に競合的ＥＬＩＳＡの結果を示す。ビオチン化β−ラクトグロブリンに対するＤ１ ＩｇＥ Ｆａｂの結合（図６）は、未修飾β−ラクトグロブリンの添加量を増加することで阻害することができた。
【００８５】
Ｄ１ ＩｇＥ Ｆａｂが牛乳サンプル中のβ−ラクトグロブリンに結合するかどうかを検討するために、免疫沈降試験を実施した（図７）。Ｄ１ ＩｇＥ Ｆａｂはカッパ軽鎖を介してタンパク質Ｌ−ビーズに固定化し、得られた複合体を複数の牛乳サンプルに加え、種々の時間（０分、１５分、３０分および６０分）加熱した。タンパク質Ｌ−ビーズに結合したＤ１ ＩｇＥ Ｆａｂを牛乳サンプルと共に室温で１時間インキュベートし、その後、ＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０で複数回洗浄することで、牛乳タンパク質のタンパク質Ｌ−ビーズに対する非特異的結合を除去した。Ｄ１ ＩｇＥ Ｆａｂ−β−ラクトグロブリン複合体をタンパク質Ｌ−ビーズから低ｐＨ（０．１Ｍのグリシン，ｐＨ２．１）で溶出し、溶出した画分を３ＭのＴｒｉｓ，ｐＨ８．８で中和した。少量の溶出画分を１５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、銀染色を行った。正しいサイズのバンドをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから切り出し、さらに質量分析を行うことで、Ｄ１ ＩｇＥ Ｆａｂが牛乳から認識したタンパク質がβ−ラクトグロブリンであることを確認した。
【００８６】
Ｄ１ ＩｇＥ Ｆａｂが、ＩｇＥ抗体と同様に患者血清中のアレルゲン性エピトープを認識するのかどうか試験するために、ビオチン化β−ラクトグロブリンを、初めに、ストレプトアビジンで被覆したマイクロタイターウェルに固定化した。患者血清サンプルは、濃度を種々に増したＤ１ ＩｇＥ Ｆａｂと共にウェル内でインキュベートし、結合した患者血清ＩｇＥを、ヒト ＩｇＥアイソタイプを特異的に認識するアルカリフォスファターゼ標識二次抗体で検出した。試験したそれぞれの患者においてわずかながら阻害が検出され、これはＤ１ ＩｇＥ Ｆａｂが認識するエピトープが患者血清中のＩｇＥと同じであることを示唆している。患者血清ＩｇＥの結合が完全に遮断されない理由は、β−ラクトグロブリンが複数のＩｇＥ-エピトープを有しているためと考えられる。
【実施例３】
【００８７】
Ｉ．抗体−アレルゲン免疫複合体の結晶化
結晶化とデータの回収：  ＢＬＧ−Ｄ１ ＩｇＥ Ｆａｂの微小結晶（約７０×５０×５０μｍ）は、２μｌのＤ１／Ｆａｂ溶液（２０ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ７．０、による濃度１．４ｍｇ／ｍｌの溶液）、１μｌのＢＬＧ溶液（純水による２ｍｇ／ｍｌ溶液）、０．５μｌのｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド溶液および２．５μｌの貯留溶液（１４％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール３３５０、０．１ＭのＢＴＰ（１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパン／塩酸）緩衝液（ｐＨ５．５）を混合する、蒸気拡散法で得た。回析データセットは、ＥＳＲＦにおいて、ビームラインＩＤ２９（波長１．０００Å）で１００Ｋの条件下で単結晶から回収した。結晶は、ａ＝６７．０Å、ｂ＝１００．６Å、ｃ＝１６８．１Åの単位格子寸法を有する空間群Ｐ２1２1２1に属するものであった。データセットは、解像度が２．８Åの条件で回収した。
【００８８】
II．抗体-アレルゲン免疫複合体の構造決定
構造は、ＣＣＰ４プログラムパッケージに添付されたＭｏｌｒｅｐプログラムによって、分子置換法で解読した。ＢＬＧ単量体（ＰＤＢコード：１Ｂ８Ｅ）と、ＨＩＶウイルスのＧＰ４１（１ＤＦＢ）に対するＩｇＧ抗体のＦａｂ断片（軽鎖の同一性は９２％、重鎖の同一性は７９％）をサーチモデルとして使用した。最終的に得た構造は、１つのＢＬＧ二量体が２つのＦａｂ断片と複合化したものを含んでいた。モデルの構築と改良は、プログラムＯとプログラムＣＮＳで行った。反射数が少ないため、Ｆａｂ／Ｄ１断片とＢＬＧ単量体を類似した条件におくために拘束をかけた。ＢＬＧには２種の異性体が存在するが、電子密度は、このＢＬＧはグリシンが６４位に存在し、アラニンが１１８位に存在するものであることを示唆している。水分子は添加していないが、ＢＬＧの脂質結合キャビティの突出した電子密度領域をｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドのモデルとした。最終的な構造のＲ値は２４．５％であり、Ｒfree値は２９．９％だった。ラマチャンドランプロットにおいて、残基の８３．５％が最も好ましい（most favored）領域に存在し、残基の０．６％が非許容（disallowed）領域に存在した。全ての図面は、Pymol（Delano, W. L.、The PyMol Molecular Graphics System、http://www.pymol.org）で作製した。
【実施例４】
【００８９】
ＢＬＧに結合するＤ１ ＩｇＥ Ｆａｂの阻害を、短いペプチドであるＫＲＶＧで行った。ＫＲＧＶは、ＨＣＤＲ３内の直鎖状ＢＬＧ結合ペプチドの中で最も長いものである。競合ＥＬＩＳＡにおいては、ＢＬＧのビオチン化ＡＢ二量体を複数のストレプトアビジン被覆マイクロタイターウェルに固定化した。初めにペプチド（阻害剤）を０．５％のＢＳＡ−ＰＢＳに溶解し、次に種々の量を固定化ＢＬＧと共にインキュベートした。その後、ウェルの内、幾つかはＰＢＳで３回洗浄し、残りのウェルは洗浄しなかった。Ｄ１ ＩｇＥ Ｆａｂを添加し、続いてＰＢＳで洗浄した。結合した抗体は、ＡＦＯＳ接合ヤギ抗ヒト カッパ抗体で検出した。基質であるｐ−ニトロフェニルホスファターゼを添加した後、吸光度を４０５ｎｍで計測した。結果を図１５に示す。
【実施例５】
【００９０】
分子表面と曲率の計算による、平坦状エピトープの同定
本実施例においては、市販のＡＭＩＲＡプログラム（AmiraMolモジュールを使用）を用いて、溶媒排除表面の計算を行った（プローブ直径：１０Å）。２つの主要曲率の積であるガウス曲率に従って、表面の色分けを行った。双曲幾何学的な表面積（近接した鞍点のような凹凸状）は負の曲率であり、楕円幾何学的な面積（厳密な凸状または厳密な凹状）は正の曲率である。さらに分子境界面積の計算にもＡＭＩＲＡプログラムを用いた（カットオフ値：３Å）。このプログラムは、２つのタンパク質の正確に中央に位置する表面を表示する。図１７に、抗体と、平坦状エピトープ（ＢＬＧ Ｄ１（ＩｇＥ／Ｆａｂ））、凸状エピトープ（Ｂｅｔ ｖ１−ＩｇＧ／Ｆａｂ、１ＢＶ１）および凹状エピトープ（リゾチーム−一本鎖ラクダ抗体、１ＭＥＬ）のそれぞれとの結合を例示した。
【００９１】
三次元構造が入手可能であれば、アレルゲンの分子表面を大きなプローブ値を用いて計算することが可能である。このような分子表面を回転させて全ての方角から観察し、さらに曲率を色分けした表面の補助によって、大きな平坦状面積（６００〜９００Å2）を同定することができる。図１８には、５種のアレルゲンの分子表面を示した。１つ目はＢＬＧ（Bos d 5）であり、平坦状エピトープを２つの方向から示した。残りの図においては、他の４種のアレルゲン（即ち、Bet v 1、Bos d 2、Phl p 7およびHev b 6）の同様の平坦状領域を同定した。これらはＩｇＥ結合のための平坦状エピトープと示唆されるものである。４種のアレルゲンはそれぞれ構造的に非常に異なるクラスを代表するものである。Bos d 5とBos d 2はβ−タンパク質（主としてβ−鎖からなるもの）である。Bet v 1はβ−鎖とα−へリックスの両方を有している。Phl p 7はα−へリックスのみを有し、Hev b 6は二次構造含量の低い小タンパク質である。
【実施例６】
【００９２】
組み換えβ−ラクトグロブリンおよびその変異体の特徴付け
低アレルギー性の変位型を産生するために、Ｄ１ ＩｇＥとＢＬＧとの免疫複合体構造に基づいて、ＢＬＧの平坦状表面エピトープの変異を設計した。２種の組み換えＢＬＧ（ｒＢＬＧ）変異体であるＴ１８ＹとＴ１８Ｙ／Ｅ４５Ｙ／Ｌ５７Ｙを構築した（表９）。ｒＢＬＧをコードするｃＤＮＡおよびその変異体を細菌性発現ベクターにクローニングし、Escherichia coli細胞で産生し、実質的に純粋になるまでクロマトグラフィーで精製し、最後にそれらの性質を特徴付けた。
【００９３】
Ｉ．  組み換えＢＬＧのクローニング
ベクターｐＵＣ５７に含まれるウシ組み換えＢＬＧ（ｒＢＬＧ）ｃＤＮＡをGenScript Corporation（米国）より購入した。これは５’末端に制限部位SfiI/NcoIを有し、３’末端に制限部位HindIIIを有している（表１０）。ｒＢＬＧ ｃＤＮＡを、Ervinia carotovora由来ペクチン酸リアーゼ（pelB）シグナル配列（Takkinen et al., 1991）と融合するように、SfiI-HindIII断片としてｐＫＫＴａｃ細菌性発現ベクターにクローニングした。ヘキサヒスチジニル（Ｈｉｓ６）タグは、プライマー１と２（表１０）を用いたＰＣＲ増幅によってｒＢＬＧ ｃＤＮＡの３’末端に導入した。全てのＰＣＲ増幅で、Phusion ＤＮＡポリメラーゼ（Finnzymes製）を使用した。ｒＢＬＧ−Ｈｉｓ６の増幅したｃＤＮＡをSfiIおよびHindIII（New England Biolabs製）で消化し、ｐＫＫＴａｃ発現ベクターにクローニングした。Escherichia coli XL-1 Blueを、組み換えＢＬＧ（ｒＢＬＧ）およびその変異体を作製するための宿主株として使用した。
【００９４】
２種の異なるｒＢＬＧ変異体であるＴ１８ＹとＴ１８Ｙ／Ｅ４５Ｙ／Ｌ５７Ｙ（表９）をｐＫＫｔａｃベクターにクローニングした。ｒＢＬＧ−Ｈｉｓ６のＴ１８Ｙ変異体とＴ１８Ｙ／Ｅ４５Ｙ／Ｌ５７Ｙ変異体のｃＤＮＡを、ミスマッチプライマー２、３、４と５（表１０）およびテンプレートとしてｐＵＣ５７ベクター内の元のｒＢＬＧ ｃＤＮＡを使用して、ＰＣＲで増幅した。Ｔ１８Ｙ変異体をコードするｃＤＮＡをプライマー２と３を用いて増幅し、増幅したｃＤＮＡはStuIとHindIII（New England Biolabs製）で消化し、ｐＫＫｔａｃ／ｒＢＬＧ−Ｈｉｓ６ベクターにクローニングした（上記参照）。Ｔ１８Ｙ／Ｅ４５Ｙ／Ｌ５７Ｙ変異体をコードするｃＤＮＡは、重複するプライマーを用いて２段階で増幅した。初めに、２７−１６５ｂｐからなるｃＤＮＡ断片をプライマー３と４を用いて増幅し、１４７−５３０ｂｐからなるｃＤＮＡ断片をプライマー２と５を用いて増幅した。次に、得られたＤＮＡ断片をオーバーラッピングＰＣＲ増幅によって１つにした。プライマー４と５は重複する配列を有する。最後に、Ｔ１８Ｙ／Ｅ４５Ｙ／Ｌ５７Ｙ変異体をコードするｃＤＮＡをStuIとHindIIIで消化し、ｐＫＫＴａｃ／ｒＢＬＧｈｉｓ発現ベクターにクローニングした。
【００９５】
ｒＢＬＧ−Ｈｉｓ６およびその変異体のＤＮＡ配列は、ＤＮＡシーケンシング（ABI 3100遺伝子アナライザー（genetic analyzer）、Applied Biosystems製）で確認した。
【００９６】
II．組み換えＢＬＧの製造
ｒＢＬＧの細菌による発現のために、ｒＢＬＧ−Ｈｉｓ６およびその変異体を、E. coli RV308（ATCC 31608）株に形質転換した。各クローンの単一コロニーを、３ｍｌのＬＢ、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび１％のグルコースからなる培地に接種し、＋３７℃、２２０ｒｐｍの振とう下で１６時間培養した。次にアンピシリンを含む３ｍｌのＬＢで培養物を１：５０に希釈し、＋３７℃で３時間培養した。その後、終濃度１ｍＭのＩＰＴＧの添加によってタンパク質発現を誘導し、細胞を＋３０℃、２２０ｒｐｍの振とう下で１６時間培養した。細胞を回収し、培養上清は後の使用のために保存した。細胞のペリプラズム画分を凍結融解法（Boer et al., 2007）で単離した。簡単に説明すると、細胞を２０％のショ糖、３０ｍＭのトリスおよび１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）からなる溶液に再懸濁し、ドライアイス−エタノール中で５分間インキュベートし、次に５ｍＭのＭｇＳＯ4溶液で再懸濁した後、＋３７℃で５分間インキュベートした。この凍結融解工程を３回繰り返した。培養上清とペリプラズム画分をウエスタンブロッティングで分析した。初めに、サンプルを１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（β−メルカプトエタノール含有）に流し、次にタンパク質をニトロセルロースフィルターに転写した。ｒＢＬＧは、ウサギ抗ＢＬＧ抗体（Makinen-Kiljunen and Palosuo, 1992）、続いてＡＦＯＳ接合ヤギ抗ウサギ抗体（Bio-Rad製）で検出した。
【００９７】
細菌による産生においては、組み換えＢＬＧは培養液にほとんど漏れることなく、ペリプラズムの空間に分泌された。ｒＢＬＧの大規模生産のために、E. coli RV308株のｐＫＫＴａｃベクター内にｒＢＬＧ−Ｈｉｓ６とその変異体を保有する細胞を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと１％のグルコースを含有するＴＢ培地に接種した。細胞を＋３７℃、２２０ｒｐｍの振とう下で１６時間培養した。培養物を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＴＢ培地で１：５０に希釈した。細胞を＋３７℃、２２０ｒｐｍの振とう下でＯＤ600が４に達するまで培養し、終濃度が０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加した。細胞の誘導は、２８℃、２２０ｒｐｍの振とう下で６時間実施した。次に、＋４℃、４０００×ｇで１５分間の遠心分離によって細胞を回収した。組み換えＢＬＧを含むペリプラズム画分は、上述した凍結融解法で単離した。
【００９８】
III．ｒＢＬＧの精製
組み換えＢＬＧの精製は、公知の固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）（Porath and Olin, 1983）で行った。簡単に説明すると、ｒＢＬＧを含むペリプラズム画分を結合緩衝液（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ＭのＮａＣｌ、１０％のグリセリン、１ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４）で１：２に希釈し、Ｎｉ2+−ロード済キレート化セファロース（Pharmacia製）と共に＋４℃で１６時間インキュベートした。ｒＢＬＧの結合したカラムマトリクスを重力流によってカラムに充填し、１ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭそして５０ｍＭのイミダゾールを含む結合緩衝液を用いて段階的に洗浄した。最後に、７５ｍＭ、１００ｍＭ、２００ｍＭそして５×５００ｍＭのイミダゾールを含む結合緩衝液を用いてｒＢＬＧを溶出し、各２ｍｌの画分を回収した。溶出画分は１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（β−メルカプトエタノール含有）で分析した。目的タンパク質を含む画分をプールし、ＩＭＡＣ精製をより小規模で繰り返した。２回目のＩＭＡＣ精製の後にも、再びＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで画分を分析した（図１９）。その結果、特定の精製ＢＬＧを含む画分をプールし、０．９％のＮａＣｌを含む１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、に対して＋４℃で１６時間透析した。精製タンパク質は、ウサギ抗ＢＬＧ抗体とＡＦＯＳ接合ヤギ抗ウサギ抗体（Bio-Rad製）を検出に用いるウエスタンブロッティングで分析した（図２０）。
【００９９】
IV．円二色性の測定
円二色性（ＣＤ）の測定のために、カットオフ値が６０００ＤａのEcono Pac 10DG脱塩カラム（Bio-Rad製）を使用して、全てのｒＢＬＧの緩衝液を５ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）に交換した。１ｍｍの石英セルを用い、＋２０℃にペルチェサーモスタット（Jasco PTC-348WI）で維持する条件下で、未修飾ＢＬＧ（ｎＢＬＧ、Sigma製）、ｒＢＬＧ−Ｈｉｓ６およびｒＢＬＧ−Ｈｉｓ６変異体の遠紫外線スペクトルをJasco J-715旋光分散計で測定した。タンパク質濃度は、ｎＢＬＧが１ｍｇ／ｍｌであり、ｒＢＬＧ−Ｈｉｓ６変異体が０．２５ｍｇ／ｍｌ、ｒＢＬＧ−Ｈｉｓ６ Ｔ１８Ｙ変異体が１．３ｍｇ／ｍｌ、そしてｒＢＬＧ−Ｈｉｓ６ Ｔ１８Ｙ／Ｅ４５Ｙ／Ｌ５７Ｙ変異体が０．９３ｍｇ／ｍｌだった。ＣＤスペクトルは３回の測定の平均値を示している（図２１）。
【０１００】
V. ｒＢＬＧに結合するＤ１ ＩｇＥ Ｆａｂの、ＥＬＩＳＡによる特徴付け
初めに、ｒＢＬＧをビオチン化した。ｒＢＬＧのビオチン化には、１ｍｏｌのタンパク質（０．９％のＮａＣｌを含む１０ｍＭのＨｅｐｅｓ溶液）に対して２ｍｏｌのビオチンとなるように硫化−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Pierce製）を使用し、室温で３０分間穏やかな振とう下で反応させた。未反応のビオチンを、Econo Pac 10 DG脱塩カラム（Bio-Rad製）で除去した。ｒＢＬＧによるビオチンの取り込みは、ＳＡ−ＡＦＯＳ検出を用いたウエスタンブロッティングで分析した。
【０１０１】
次に、１１０μｌの０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ中の１μｇのビオチン化したｎＢＬＧ、ｒＢＬＧ−Ｈｉｓ６変異体またはｒＢＬＧ−Ｈｉｓ６ Ｔ１８Ｙ変異体を、ストレプトアビジンマイクロタイターウェル（Roche製）に室温で１時間固定化した。その後、１００μｌの、０．５％ ＢＳＡ／ＰＢＳで１：１５０００に希釈した抗ＢＬＧ Ｄ１ Ｆａｂ（１．６ｍｇ／ｍｌ）を、洗浄したウェルに加えた。１時間インキュベートした後、ウェルをＰＢＳで３回洗浄した。ＢＬＧの検出は、ＡＦＯＳ接合ヤギ抗ヒト カッパ抗体（Southern Biotech製）で実施した。次に、ｐ−ニトロフェニルリン酸基質（Sigma製）（ジエタノールアミン緩衝液による２ｍｇ／ｍｌ溶液）をウェルに添加した。基質を添加した２０分後には、波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した（図２２）。
【０１０２】
血清サンプル（０．５％のＢＳＡ／ＰＢＳで１：８に希釈したもの）のＥＬＩＳＡによる分析は、ＡＦＯＳ接合ヤギ抗ヒトＩｇＥ（Southern Biotech製）をアレルギー患者血清由来の結合ＩｇＥの検出に用いる以外は、上記と同様に実施した。基質添加後に２時間インキュベートし、波長４０５ｎｍにおける吸光度を測定した（図２３）。
【０１０３】
VI. 結合力学の分析
Ｄ１ ＩｇＥ Ｆａｂの、ｎＢＬＧ、ｒＢＬＧ−Ｈｉｓ６およびその変異体に対する会合定数および解離定数をBIAcoreで測定した。ビオチン化ＢＬＧを、ＨＢＳ緩衝液（１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、０．１５ＭのＮａＣｌ、３．４ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のBIAcore P20界面活性剤、ｐＨ７．４）中、濃度１μｇ／ｍｌで、ストレプトアビジンバイオセンサーチップに固定化し、約４００〜５００ＲＵの表面を得た。ビオチン化ｎＢＬＧは、わずか２００ＲＵをＳＡ−チップ表面に固定化した。精製Ｄ１ ＩｇＥ Ｆａｂの結合力学は、流速３０μｌ／分で、濃度が１３８．９ｎＭ、６９．６ｎＭ、３４．８ｎＭ、１７．４ｎＭ、８．７ｎＭ、４．３ｎＭ、２．２ｎＭおよび１．１ｎＭの条件で分析した。ＢＬＧ表面の再生は、１００μＭのｎＢＬＧ（Sigma製）を用いて行った。６９．６ｎＭのＤ１ ＩｇＥ Ｆａｂ溶液の結合曲線を図２４に示す。
【０１０４】
【表１】
0005444001.tif 000002
【０１０５】
【表２】
0005444001.tif 000003
【０１０６】
【表３】
0005444001.tif 000004
【０１０７】
【表４】
0005444001.tif 000005
【０１０８】
【表５】
0005444001.tif 000006
【０１０９】
【表６】
0005444001.tif 000007
【０１１０】
【表７】
0005444001.tif 000008
【０１１１】
【表８】
0005444001.tif 000009
0005444001.tif 000010
0005444001.tif 000011
0005444001.tif 000012
0005444001.tif 000013
0005444001.tif 000014
0005444001.tif 000015
0005444001.tif 000016
0005444001.tif 000017
0005444001.tif 000018
0005444001.tif 000019
0005444001.tif 000020
0005444001.tif 000021
0005444001.tif 000022
0005444001.tif 000023
0005444001.tif 000024
0005444001.tif 000025
0005444001.tif 000026
0005444001.tif 000027
0005444001.tif 000028
0005444001.tif 000029
0005444001.tif 000030
0005444001.tif 000031
0005444001.tif 000032
0005444001.tif 000033
0005444001.tif 000034
0005444001.tif 000035
0005444001.tif 000036
0005444001.tif 000037
0005444001.tif 000038
0005444001.tif 000039
0005444001.tif 000040
0005444001.tif 000041
0005444001.tif 000042
0005444001.tif 000043
0005444001.tif 000044
0005444001.tif 000045
0005444001.tif 000046
0005444001.tif 000047
0005444001.tif 000048
0005444001.tif 000049
0005444001.tif 000050
0005444001.tif 000051
0005444001.tif 000052
0005444001.tif 000053
0005444001.tif 000054
0005444001.tif 000055
0005444001.tif 000056
0005444001.tif 000057
0005444001.tif 000058
【０１１２】
【表９】
0005444001.tif 000059
【０１１３】
【表１０】
0005444001.tif 000060
【０１１４】
【表１１】
0005444001.tif 000061
【０１１５】
参考文献
Argos, P. (1988) Protein Engineering, 2, 101-113.
Banerjee, B., Wang, X., Kelly, K.J., Fink, J.N., Sussman, G.L., and Kurup, V.P. (1997) J. Immunol. 159, 5724-5732.
Barbas III, C.F., Kang, A.S., Lerner, R.A., and Benkovic, S.J. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 7978-7982.
Brownlow, S., Cabral, J.H.M, Cooper, R., Flower, D.R., Yewdall, S.J., Polikarpov, I., North, A.C.T., Sawyer, L. (1997) Structure 5, 481-495
Corry, D.B., and Kheradmand, F. (1999) Nature 402, B18-B23.
De Genst, E., Silence, K., Decanniere, K., Conrath, K., Loris, R., Kinne, J., Muyldermans, S. and Wyns, L. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 4586-4591.
Desplancq, D., King, D.J., Lawson, A.D.G., and Mountain, A. (1994) Protein Eng. 7, 1027-1033.
Godovac-Zimmermann J. and Braunitzer G. (1987) Milchwissenchaft 42(5), 294-297.
Hill, D.J., Hosking, C.S. and Heine, R.G. (1999) Ann. Med. 31, 272-281.
Holliger, P., Prospero, T., and Winter, G. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 6444-6448.
Hoogenboom, H.R., de Bruine, A.P., Hufton, S.E., Hoet, R.M., Arends, J.-W. and Roovers, R.C. (1998) Immunotechnolgy 4, 1-20.
Host, A. and Halken, S. (1990) Allergy 45, 587-596.
Kabat, E.A., Wu, T.T., Reid-Miller, M., Perry, H.M., and Gottesman, K.S. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Dept. of Health and Human Services, Bethesda, MD.
McCafferty, J., Griffiths, A.D., Winter, G., and Chiswell, F.J. (1990) Nature 348, 552-554.
Nevanen, T.K, Soderholm, L., Kukkonen, K., Suortti, T., Teerinen, T., Linder, M., Soderlund, H., Teeri, T.T. (2001) J. Chromatogr. A 925, 89-97.
Rouvinen, J., Virtanen, T., Mantyjarvi, R.(2001) J. Chromatogr. B 756, 199-206.
Saarinen, K.M., Juntunen-Backman, K., Jarvenpaa, A.L., Kuitunen, P., Lope, L., Renlund, M., Siivola, M. and Savilahti, E. (1999) J. Allergy Clin. Immunol. 104, 457-461.
Saarinen, K.M. (2000) Risk factors and characteristics of cow's milk allergy. In. Helsinki University, Helsinki, Finland.
Sampson, H.A. and Scanlon, S.M. (1989) J Pediatr 115, 23-7.
Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A.R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463-5467.
Savilahti, E. (1981) Allergy 36, 73-88.
Sawyer, L., Papiz, M.Z., North, A., Eliopoulos, E (1985) Biochemical Society Transactions 13(1), 265-6
Schrander, J.J., van den Bogart, J.P., Forget, P.P., Schrander-Stumpel, C.T., Kuijten, R.H. and Kester, A.D. (1993) Eur. J. Pediatr. 152, 640-644.
Steinberger, P., Kraft, D., and Valenta, R. (1996) J. Biol. Chem. 271, 10967-10972.
Vaarala, O., Saukkonen, T., Savilahti, E., Klemola, T. and Akerblom, H.K. (1995) J. Allergy Clin. Immunol. 96, 917-23.
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】図１は、完全なヒトＩｇＥサブクラス抗体、Ｆａｂ断片および一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の該略図である。抗原結合部位は三角形で示す。
【図２】図２は、パニング法の概略図である。
【図３】図３は、ｓｃＦｖファージライブラリーの構築に使用したｓｃＦｖファージディスプレイベクターの概略図である。
【図４】図４は、Ｄ１ ＩｇＥ Ｆａｂの重鎖可変領域の推定されるアミノ酸配列およびヌクレオチド配列である。相補性決定領域（ＣＤＲ）を下線で示した。番号付けはKabat（Kabat et al., 1991）に準ずる。
【図５】図５は、Ｄ１ ＩｇＥ Ｆａｂの軽鎖可変領域の推定されるアミノ酸配列およびヌクレオチド配列である。ＣＤＲを下線で示した。番号付けはKabat（Kabat et al., 1991）に準ずる。
【図６】図６は、ヒトＩｇＧ１サブタイプに属するＤ１ ＩｇＥ Ｆａｂ断片の競合的ＥＬＩＳＡで得られた曲線である。Ｄ１ ＩｇＥ Ｆａｂ断片の固定化ビオチン化β−ラクトグロブリンに対する結合は、可溶性未修飾β−ラクトグロブリンによって阻害された。
【図７】図７は、免疫沈降アッセイの結果である。Ｄ１ ＩｇＥ Ｆａｂは牛乳の未修飾β−ラクトグロブリンに結合する。１＝低分子量マーカー；２〜５＝タンパク質Ｌ−ビーズに固定化したＤ１ ＩｇＥ ｆａｂと、未処理牛乳サンプル、＋９５℃で１５分間加熱した牛乳サンプル、＋９５℃で３０分間加熱した牛乳サンプル、および＋９５℃で６０分間加熱した牛乳サンプル；６〜７＝負の対照（即ち、空のタンパク質Ｌ−ビーズと、未処理牛乳サンプル、または＋９５℃で６０分間加熱した牛乳サンプル）；８＝０．５μｇの精製β−ラクトグロブリン（Sigma製）；９＝０．５μｇの精製Ｄ１ ＩｇＥ Ｆａｂ。
【図８】図８は、競合的ＥＬＩＳＡの結果である。ヒト ＩｇＧ１サブタイプに属するＤ１ ＩｇＥ Ｆａｂ断片のβ−ラクトグロブリンに対する結合は、患者血清によって阻害される。
【図９】図９は、Ｄ１ ＩｇＥ Ｆａｂ-抗体のβ−ラクトグロブリンに対する結合を示す。（ａ）アレルゲン（灰色）と２つのＩｇＥ分子（軽鎖Ｌ、重鎖Ｈ）の結合の概略図である。
【図１０】図１０は、β−ラクトグロブリンエピトープの、１〜６と番号を付した種々のセグメントを示す。
【図１１】図１１は、Ｄ１ ＩｇＥ Ｆａｂのβ−ラクトグロブリンに対する結合を示す、Ｄ１／ＩｇＥ−Ｆａｂ断片表面の側面図である。
【図１２】図１２は、β−ラクトグロブリンエピトープの表面と共に、Ｄ１ ＩｇＥ ＦａｂのＣＤＲループおよびβ−ラクトグロブリンに接触するＤ１ ＩｇＥ Ｆａｂの残基を示す。
【図１３】図１３は、Ｄ１ ＩｇＥ Ｆａｂのβ−ラクトグロブリンに対する結合（左）、ＩｇＧ Ｆａｂ ２ＪＥＬのリン酸輸送タンパク質に対するＩｇＧ抗体−抗原型結合（中央）およびＢＶ１６／Ｆａｂの花粉アレルゲンBet v 1に対するＩｇＧ−アレルゲン型結合（右）を示す。
【図１４】図１４は、種々のアレルゲンに由来する潜在的なＩｇＥエピトープを示す。Equ c 1、ウマ皮膚（Lascombe et al., 2000, J. Biol. Chem. 275(28):21572-21577）；Bos d 5、β−ラクトグロブリン；Bet v 1、シラカバ花粉（Spangfort et al., 2003, J. Immunol. 171(6):3084-3090）；Bos d 2、ウシ フケ（Rautiainen et al., 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun. 247:746-750）；Cyp c 1、コイ パルブアルブミン（Swoboda et al., 2002, J. Immunol. 168(9):4576-4584）；およびHev b 6、ラテックス（WO02094878を参照）。平面状（平坦状）表面は太い横線／縦線で表した。
【図１５】図１５は、競合的ＥＬＩＳＡの結果である。Ｄ１ ＩｇＥ Ｆａｂ断片のＢＬＧに対する結合は、短いペプチドであるＫＲＶＧにより阻害される。Ｃｔｒ１およびｃｔｒ２はバックグラウンドとなる対照であり、ｃｔｒ１は、Ｄ１ ＩｇＥ Ｆａｂなしのインキュベーションで得られた結果であり、ｃｔｒ２は、ＢＬＧなしの結果である（実施例４を参照）。
【図１６】図１６は、Ｄ１／Ｆａｂ抗体の表面およびアレルゲンＢＬＧのリボンモデルを示す。この図においては、Ｄ１／Ｆａｂに含まれる、ヘベイン結合性ＩｇＥ抗体（クローンＩＣ２）と同一の残基を薄いグレーで示し、異なる残基を濃いグレーで示した。ａ）正面図とｂ）側面図は、構造的に非常に異なるアレルゲンに結合する２種のＩｇＥ抗体軽鎖間に大きな類似性が存在することを示している。
【図１７】平坦状エピトープ、凸状エピトープおよび凹状エピトープに結合する抗体。１列目に、溶媒排除表面（プローブ直径：１０Å）を示した。プローブ球面が大きいため、表面はより大規模の特徴を示している。表面はガウス曲率に基づいて色分けした。平坦状の領域は白で示した。抗体はリボンモデルで示した。２列目に類似構造を示したが、ここでは表面は、エピトープに対応する相互作用表面を表している。
【図１８】５種の異なるアレルゲンの分子表面（プローブ直径：１０Å）を２つの方向から示した。表面は曲率に基づいて色分けし、平坦状領域は白で示した。ＩｇＥ結合のための推定平坦状領域は左列の図に長方形で示した。側面図を右列に示し、左列と同じ領域の位置を線で示した。
【図１９】ｒＢＬＧ−Ｈｉｓ６およびその変異体の精製。２回目のＩＭＡＣ精製の後、タンパク質サンプルをクーマシー染色した１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（β−メルカプトエタノール含有）で分析した。プールした画分を矢印で示した。
【図２０】精製ｒＢＬＧ−Ｈｉｓ６およびその変異体をウエスタンブロッティングで分析し、続いてウサギ抗ＢＬＧ抗体とヤギＡＦＯＳ接合抗ウサギ抗体で検出した。３μｇのタンパク質をウェルにロードした。レーン１＝ＬＭＷ、レーン２＝未修飾ＢＬＧ（Sigma製）、レーン３＝ｒＢＬＧ−Ｈｉｓ６、レーン４＝ｒＢＬＧ−Ｈｉｓ６ Ｔ１８Ｙ、およびレーン５＝ｒＢＬＧ−Ｈｉｓ６ Ｔ１８Ｙ／Ｅ４５Ｙ／Ｌ５７Ｙ。
【図２１】ｎＢＬＧ、ｒＢＬＧ−Ｈｉｓ６およびその変異体のＣＤスペクトルを示す。
【図２２】Ｄ１ ＩｇＥ Ｆａｂの種々のＢＬＧに対する結合特性をＥＬＩＳＡで分析した。ビオチン化したｎＢＬＧ、ｒＢＬＧ−Ｈｉｓ６またはその変異体を、ＳＡ−マイクロタイターウェルに固定化した。結合したＤ１ ＩｇＥ ＦａｂはＡＦＯＳ接合ヤギ抗カッパ抗体で検出した。３重変異＝ｒＢＬＧ−Ｈｉｓ６ Ｔ１８Ｙ／Ｅ４５Ｙ／Ｌ５７Ｙ変異体、Ｂｓａ＝ウシ血清アルブミン、対照サンプルは、ＢＬＧを固定化したが、Ｄ１ ＩｇＥ Ｆａｂを使用しない時に、抗カッパ−ＡＦＯＳ接合体によって得られるバックグラウンド値である。
【図２３】アレルギー性ドナーと非アレルギー性ドナーから得たＩｇＥ血清サンプルの、種々のＢＬＧに対する結合特性をＥＬＩＳＡで分析した。ビオチン化したｎＢＬＧ、ｒＢＬＧ−Ｈｉｓ６またはその変異体を、ＳＡ−マイクロタイターウェルに固定化した。結合したＩｇＥは、ＡＦＯＳ接合ヤギ抗ヒトＩｇＥで検出した。
【図２４】ｎＢＬＧ、ｒＢＬＧ−Ｈｉｓ６およびその変異体の、BIAcoreによる解析。種々のＢＬＧに結合する６９．６ｎＭのＤ１ ＩｇＥ Ｆａｂ溶液の結合曲線である。ｎＢＬＧ、ｒＢＬＧ−Ｈｉｓ６およびその変異体に対するＤ１ ＩｇＥ Ｆａｂの会合定数および解離定数を計算し、表１１に示した。
【配列表フリーテキスト】
【０１１７】
配列番号５：  配列中の第５番アミノ酸Ｘは任意のアミノ酸であり、第８番アミノ酸Ｘはセリンまたはスレオニンである。
配列番号６：  配列中の第３番〜第５番アミノ酸Ｘは任意のアミノ酸であり、第８番アミノ酸Ｘはセリンまたはスレオニンであり、第９番〜第１１番アミノ酸Ｘは任意のアミノ酸である。
配列番号８：  β−ラクトグロブリンのアミノ酸配列
配列番号９：  ウシ組み換えＢＬＧ
配列番号１０：  ウシ組み換えＢＬＧ変異体
配列番号１１：  ウシ組み換えＢＬＧ変異体
配列番号１２：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号１３：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号１４：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号１５：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号１６：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号１７：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号１８：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号１９：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号２０：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号２１：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号２２：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号２３：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号２４：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号２５：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号２６：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号２７：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号２８：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号２９：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号３０：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号３１：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号３２：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号３３：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号３４：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号３５：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号３６：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号３７：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号３８：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号３９：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号４０：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号４１：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号４２：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号４３：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号４４：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号４５：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号４６：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号４７：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号４８：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号４９：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号５０：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号５１：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号５２：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号５３：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号５４：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号５５：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号５６：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号５７：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号５８：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号５９：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号６０：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号６１：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号６２：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号６３：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号６４：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号６５：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号６６：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号６７：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号６８：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号６９：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号７０：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号７１：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号７２：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号７３：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号７４：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号７５：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号７６：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号７７：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号７８：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号７９：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号８０：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号８１：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号８２：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号８３：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号８４：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号８５：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号８６：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号８７：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号８８：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号８９：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号９０：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号９１：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号９２：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号９３：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号９４：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号９５：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号９６：  ＣＤＲ−Ｌ１領域の保存性ペプチド配列
配列番号９７：  ＣＤＲ−Ｌ１領域の保存性ペプチド配列
配列番号９８：  ＣＤＲ−Ｌ１領域の保存性ペプチド配列
配列番号９９：  ＣＤＲ−Ｌ１領域の保存性ペプチド配列
配列番号１００：  ＣＤＲ−Ｌ１領域の保存性ペプチド配列
配列番号１０１：  ＣＤＲ−Ｌ１領域の保存性ペプチド配列
配列番号１０２：  ＣＤＲ−Ｌ１領域の保存性ペプチド配列
配列番号１０３：  ＣＤＲ−Ｌ１領域の保存性ペプチド配列
配列番号１０４：  ＣＤＲ−Ｌ１領域の保存性ペプチド配列
配列番号１０５：  ＣＤＲ−Ｌ１領域の保存性ペプチド配列
配列番号１０６：  ＣＤＲ−Ｌ１領域の保存性ペプチド配列
配列番号１０７：  ＣＤＲ−Ｌ１領域の保存性ペプチド配列
配列番号１０８：  ＣＤＲ−Ｌ２領域の保存性ペプチド配列
配列番号１０９：  ＣＤＲ−Ｌ２領域の保存性ペプチド配列
配列番号１１０：  ＣＤＲ−Ｌ２領域の保存性ペプチド配列
配列番号１１１：  ＣＤＲ−Ｌ２領域の保存性ペプチド配列
配列番号１１２：  ＣＤＲ−Ｌ２領域の保存性ペプチド配列
配列番号１１３：  ＣＤＲ−Ｌ３領域の保存性ペプチド配列
配列番号１１４：  ＣＤＲ−Ｌ３領域の保存性ペプチド配列
配列番号１１５：  ＣＤＲ−Ｌ３領域の保存性ペプチド配列
配列番号１１６：  ＣＤＲ−Ｌ３領域の保存性ペプチド配列
配列番号１１７：  ＣＤＲ−Ｌ３領域の保存性ペプチド配列
配列番号１１８：  ＣＤＲ−Ｌ３領域の保存性ペプチド配列
配列番号１１９：  ＣＤＲ−Ｌ３領域の保存性ペプチド配列
配列番号１２０：  ＣＤＲ−Ｌ３領域の保存性ペプチド配列
配列番号１２１：  ＣＤＲ−Ｌ３領域の保存性ペプチド配列
配列番号１２２：  ＣＤＲ−Ｌ３領域の保存性ペプチド配列
配列番号１２３：  ＣＤＲ−Ｌ３領域の保存性ペプチド配列
配列番号１２４：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号１２５：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号１２６：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号１２７：  ＰＣＲ増幅用プライマー
配列番号１２８：  ＰＣＲ増幅用プライマー
【図１】
0005444001.tif 000062
【図２】
0005444001.tif 000063
【図３】
0005444001.tif 000064
【図４】
0005444001.tif 000065
【図５】
0005444001.tif 000066
【図６】
0005444001.tif 000067
【図７】
0005444001.tif 000068
【図８】
0005444001.tif 000069
【図９】
0005444001.tif 000070
【図１０】
0005444001.tif 000071
【図１１】
0005444001.tif 000072
【図１２】
0005444001.tif 000073
【図１３】
0005444001.tif 000074
【図１４】
0005444001.tif 000075
【図１５】
0005444001.tif 000076
【図１６】
0005444001.tif 000077
【図１７】
0005444001.tif 000078
【図１８】
0005444001.tif 000079
【図１９】
0005444001.tif 000080
【図２０】
0005444001.tif 000081
【図２１】
0005444001.tif 000082
【図２２】
0005444001.tif 000083
【図２３】
0005444001.tif 000084
【図２４】
0005444001.tif 000085
【配列表】
0005444001000001.app