(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（Ａ）または（Ｂ）で示されるオリゴヌクレオチドの組合せ。
（Ａ）配列番号１０および配列番号２９に示される２つのオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、および、配列番号２３に示されるオリゴヌクレオチドからなるプローブの組合せ。
（Ｂ）配列番号１０および配列番号１１に示される２つのオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、および、配列番号２５に示されるオリゴヌクレオチドからなるプローブの組合せ。
【請求項２】
以下の（Ａ）または（Ｂ）で示されるマイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ）の検出方法。
（Ａ）少なくとも以下の（１）〜（３）の工程を含む方法。
（１）配列番号１０に示されるオリゴヌクレオチドと、配列番号２９に示されるオリゴヌクレオチドとの組合せをプライマー対として用いて、核酸増幅を行う第一工程、
（２）第一工程で得られうる増幅産物と、配列番号２３に示される検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｋ）と、をハイブリダイズさせ複合体（Ｐｋ）を形成せしめる第二工程、
（３）第二工程で得られうる該複合体（Ｐｋ）を検出する第三工程。
（Ｂ）少なくとも以下の（１）〜（３）の工程を含む方法。
（１）配列番号１０に示されるオリゴヌクレオチドと、配列番号１１に示されるオリゴヌクレオチドとの組合せをプライマー対として用いて、核酸増幅を行う第一工程、
（２）第一工程で得られうる増幅産物と、配列番号２５に示される検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｋ）と、をハイブリダイズさせ複合体（Ｐｋ）を形成せしめる第二工程、
（３）第二工程で得られうる該複合体（Ｐｋ）を検出する第三工程。
【請求項３】
（１）〜（３）の工程を密封状態のままで行うことを特徴とする請求項２に記載の検出
方法。
【請求項４】
検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｋ）が蛍光色素で標識されていることを特徴と
する請求項２または３に記載の検出方法。
【請求項５】
複合体（Ｐｋ）の検出にＩＦＰ法を用いることを特徴とする請求項２〜４のいずれかに
記載の検出方法。
【請求項６】
複合体（Ｐｋ）の検出にＱ−Ｐｒｏｂｅ法を用いることを特徴とする請求項２〜４のい
ずれかに記載の検出方法。
【請求項７】
少なくとも以下の（Ａ）または（Ｂ）で示されるオリゴヌクレオチドの組合せを含むことを特徴とするマイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ）の検出キット。
（Ａ）配列番号１０および配列番号２９に示される２つのオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、および、配列番号２３に示されるオリゴヌクレオチドからなるプローブの組合せ。
（Ｂ）配列番号１０および配列番号１１に示される２つのオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、および、配列番号２５に示されるオリゴヌクレオチドからなるプローブの組合せ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は臨床診断上、マイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ）を迅速、確実かつ簡便に検出するためのオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを利用する抗酸菌属細菌の検出方法ならびにそれらの試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗酸菌属は抗酸性の性質をもつグラム陽性桿菌であり、結核菌やらい菌など、重篤な病変を引き起こす病原菌が多い。一般に抗酸菌は発育が遅く、培養にはかなりの時間を要する。
【０００３】
この中でもヒト型結核菌はヒトに結核を起こす病原体であり、その検査は臨床上、極めて重要である。ヒト型結核菌が起因となる病変には肺結核が圧倒的に多いが、ほとんど全ての臓器に結核性病変を起こし、結核性胸膜炎、結核性髄膜炎、カリエス、腸結核、腎結核、関節結核などを起こす。感染源は患者であり、飛沫感染などによって経気道的に感染する。
【０００４】
従来、結核菌の検査は培養法によって行っていた。一般的には小川培地上で結核菌を分離培養し、培地上の性状（増殖速度・温度、コロニーの形状や色素産生など）、ナイアシンテスト、硝酸還元試験、耐熱カタラーゼ試験、ツイーン８０水解試験などの結果から菌種を同定する。しかし、ヒト型結核菌は増殖が遅く、分離培養だけで約３〜４週間を要し、その後の各種試験で、さらに約２〜３週間を要する。そのため、ヒト型結核菌の検出または同定検査は、その臨床上の重要性・緊急性にもかかわらず、約１ヶ月以上を要し、機動的な診断や投薬に大きな制約となっていた。ヒト型結核菌が産生するタンパク質を抗原抗体反応で検出する方法などが開発されてきたが、未だ十分な菌種同定を行うまでに至っておらず、しかも、感度的に問題があるため分離培養が必要なことは変わりがなかった。
【０００５】
ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の他にも、トリ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｋａｎｓａｓｉｉ）、マイコバクテリウム・スクロフラセウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、マイコバクテリウム・フォーチュイタム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）などの非定型抗酸菌が、ヒトに病原性を示すことが知られている。症状は結核に比べて軽く、感染力も弱いが、抗結核剤に耐性であり、有効な薬剤はない。これらは結核菌と同様に、ヒトの肺、リンパ節、皮膚などを冒し、特に肺感染症が多い。
【０００６】
一般に、肺結核の鑑別は、臨床症状、病理組織学的所見からは極めて困難であるため、菌の同定によってなされなければならない。非定型抗酸菌の病原性はマイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｋａｎｓａｓｉｉ）＞トリ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）＞その他の順で大きく、上位３菌種は特に重要である。
【０００７】
従来から、これらの非定型抗酸菌をヒト結核菌と同様、小川培地上で分離培養し、培地上の性状（増殖速度・温度、コロニーの形状や色素産生など）、ナイアシンテスト、硝酸還元試験、耐熱カタラーゼ試験、ツイーン８０水解試験、光発光テストなどの結果から菌種を同定している。しかし、これらも一般的に増殖が遅く、菌種の同定までに約１ヶ月以上を要することが多い。
【０００８】
ヒト型結核菌と非定型抗酸菌の同定は、臨床上、極めて重要である。ヒト型結核菌は病状が重篤であるが、ストレプトマイシン、リファンピシン、エタンブトール、イソニコチン酸ヒドラジドなどの抗結核剤投与が有効なため、早期に治療を開始する必要がある。一方、非定型抗酸菌は一般にこれらの薬剤に対して耐性である。菌種の同定は、その後の治療方針を大きく左右するのである。しかしながら前述したように、これらの菌は増殖が遅く、菌種同定には数週間を要する。また、マイコバクテリウム・スメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｍｅｇｍａｔｉｓ）など、類似の非病原性菌が検出されることもある。迅速で確実な検出及び菌種同定法が望まれるのはこのためである。
【０００９】
最近、ＤＮＡやＲＮＡを人為的に増幅し、増幅後の核酸を検出することによって、高感度に病原体を検出する方法が開発されてきた。既に知られている核酸増幅方法としてＰＣＲ（特許文献１、特許文献２、特許文献３）、ＮＡＳＢＡ（非特許文献１）、ＬＣＲ（特許文献４、特許文献５）、ＳＤＡ（非特許文献２）、ＲＣＲ（特許文献６）、ＴＭＡ（非特許文献３）ＬＡＭＰ（非特許文献４）、ＩＣＡＮ（非特許文献５）などが挙げられる。
【００１０】
なかでもＰＣＲ法は、標的核酸、４種類のデオキシリボヌクレオシド三リン酸、一対のオリゴヌクレオチドプライマー、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、温度の上昇および下降を繰り返すことにより、当該一対のオリゴヌクレオチドプライマーで挟まれる標的核酸の特定領域を指数関数的に増幅させることができる。
【００１１】
通常ＰＣＲ法は特許文献３に示されているように、ａ）９０〜１０５℃の範囲内の温度（好ましくは９０〜１００℃）で０．５〜５分間（好ましくは０．５〜３分間）、変性させる工程、ｂ）３５〜６５℃の範囲内の温度（好ましくは３７〜６０℃）で０．５〜５分間（好ましくは１〜３分間）、プライマーと鋳型のハイブリッドを形成させる（アニーリング）工程、およびｃ）４０〜８０℃の範囲内の温度（好ましくは５０〜７５℃）で０．５〜４０分間（好ましくは１〜３分間）、プライマー伸長生成物を形成させる（伸長）工程、からなる増幅サイクルを用いる。
【００１２】
ＰＣＲ法のサイクルを繰り返し行うことで増幅した核酸断片は、各種の検出方法を用いて検出できるようになる。現在利用されている代表的な検出方法として、アガロースゲル電気泳動法がある。しかしながら、電気泳動による検出では指数関数的に増幅された標的核酸の増幅産物を取り扱う必要があり、コンタミネーションが起こる危険性が高かった。また、操作も煩雑であり検出終了までの時間も１時間以上を要するため、当該検出方法の臨床診断への適用は困難であった。
【００１３】
電気泳動以外の検出方法として、二本鎖核酸に結合した時に蛍光が増強される性質を示すＤＮＡ挿入色素（インターカレーター）を利用する方法が一般的に用いられている。核酸増幅中のＤＮＡ濃度の上昇に伴う蛍光の増強は、反応の進行を測定するために、また標的核酸分子のコピー数を決定するために利用できる。さらに、精密に制御された温度変化に伴う蛍光の変化をモニターすることにより、例えばＰＣＲサイクル反応の終了時点で、ＤＮＡ融解曲線を作成することができる。このような融解曲線解析では二本鎖核酸の性質をある程度識別することができ、融解曲線解析での融解温度が極端に低い場合はプライマーダイマーなど、標的核酸断片より短い核酸断片が増幅されたことが考えられるし、主なピークが一本でない場合は標的核酸断片ではない非特異的な増幅核酸断片が存在することを示している。このように、蛍光を測定する方法によれば、増幅核酸断片の飛散などによりコンタミネーションが起こり正しい判定結果が得られなくなる危険性や、煩雑な操作から起こり得る人為的なミスを防止することができるため、臨床診断に適している。しかし、一般的なインターカレーター法は二本鎖核酸特異的に蛍光が生じるため、特に臨床診断など、目的の核酸配列に特異的な検出が必要とされる場合には、当該核酸配列に非特異的な二本鎖核酸をも検出する可能性があるため、それほど有効ではない。
【００１４】
核酸配列特異的プローブ法は、増幅反応の進行をモニターするために、さらなる核酸反応成分（核酸プローブ）を利用する。この方法は、検出の基本として蛍光エネルギー転移（ＦＥＴ）を利用することが多い。一つあるいはそれ以上の核酸プローブを蛍光色素で標識し、一方のプローブに標識された蛍光色素はエネルギー供与体分子として、もう一方の蛍光色素はエネルギー受容体分子として働くことができるようにする。これらは時として、それぞれレポーター分子および消光分子として知られる。エネルギー供与体分子は励起スペクトラム範囲の特異的波長の光で励起され、引き続いて蛍光放出波長の範囲で光を放出する。エネルギー受容体分子も、様々な距離依存性エネルギー転移機構により、当該供与体分子からエネルギーを受け取ることにより、この波長で励起される。蛍光エネルギー転移の特別な例には、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）がある。一般に、エネルギー受容体分子とエネルギー供与体分子が近接している場合、例えば、これらが同じまたは隣接する分子上にある場合に、受容体分子は供与体分子の放出エネルギーを受け取ることができる。通常、ＦＥＴまたはＦＲＥＴプローブには二つの種類、すなわち、エネルギー受容体からエネルギー供与体を分離するために核酸プローブの加水分解を用いるものと、供与体分子と受容体分子の空間的関係を変化させるためにハイブリダイゼーションを用いるものが利用される。
【００１５】
加水分解を用いるプローブは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブとして市販されている。このプローブは、エネルギー供与体およびエネルギー受容体分子で標識されたオリゴヌクレオチドからなり、増幅核酸断片の一方の鎖の特異的領域にハイブリダイズするように設計される。例えばＰＣＲにおいて、プライマーがこの鎖にアニールした後、Ｔａｑポリメラーゼが５’から３’へのポリメラーゼ活性によりＤＮＡを伸長する。このときＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、Ｔａｑによる伸長の開始を防ぐために、３’末端がリン酸化で保護されている。もしＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが産物の鎖にハイブリダイズしていれば、伸長するＴａｑ分子がプローブを加水分解し、エネルギー受容体とエネルギー供与体を遊離し、検出可能なシグナルが発生する。このシグナルは累積的であり、遊離のエネルギー供与体および受容体分子の濃度は増幅反応の各サイクルで上昇する。しかし、蛍光シグナルの生成がプローブの加水分解反応の発生に依存するため、この方法には時間的不利益が存在する。また、５０サイクル以上というような多数回の増幅サイクルが必要な場合、加水分解が非特異的に起こり得る問題点も見出されている。
【００１６】
ハイブリダイゼーションを用いるプローブは、数多くの型式のものが利用可能である。例えば、分子ビーコンは、ヘアピンループを形成するような相補的な５’および３’配列を有するオリゴヌクレオチドであり、その末端に標識された蛍光色素は、ヘアピン構造が形成されるためにＦＲＥＴが起こるような近接位置にある。分子ビーコンの標的核酸配列へのハイブリダイゼーションに伴ってエネルギー受容体とエネルギー供与体が分離されるとＦＲＥＴは起こらなくなることを利用して、検出を行う。
【００１７】
また、標識プローブの対合も利用可能である。エネルギー供与体分子を標識したプローブとエネルギー受容体分子を標識したプローブが増幅核酸断片の鎖上で近接してハイブリダイズすることによってＦＲＥＴが生じ、このＦＲＥＴによって生じた波長の蛍光を検出する。このタイプの変種には、標識増幅プライマーと単一の近接する標識プローブの利用が含まれる。しかし、二つの標識オリゴヌクレオチドの使用、または二つの標識分子を含む分子ビーコンの使用は、一般に検出にかかるコストが高いことが問題である。さらに、例えば臨床診断において複数の病原体について菌種を同定しようとする場合には、複数のエネルギー受容体およびエネルギー供与体のペアと、それらから発せられる複数の波長の蛍光シグナルを検出する装置とが必要であり、非常に高価なシステムと複雑な試薬設計を強いられることが問題である。前述のように、ヒト型結核菌と非定型抗酸菌の同定は臨床診断上重要であり、迅速で確実な検出および菌種同定法が望まれているが、これらの技術では要望を満たすことができない。
【００１８】
特許文献７では、ＤＮＡ二本鎖結合剤と、ＤＮＡ二本鎖結合剤から蛍光エネルギーを吸収できるあるいは蛍光エネルギーを与えることができる反応性分子を含む核酸プローブを利用し、標的核酸の増幅反応を経て、蛍光をモニターする検出方法が開示されている。当該検出方法では標識オリゴヌクレオチドが一つで良いためコストの面で有利であるが、特許文献７に開示された技術を用いても、上述のような、臨床診断において複数の病原体について菌種を同定しようとする場合に、複数のエネルギー受容体およびエネルギー供与体のペアと、それらから発せられる複数の波長の蛍光シグナルを検出する装置とが必要であり、非常に高価なシステムと複雑な試薬設計を強いられる問題は解決されていない。
【００１９】
特許文献８では、ハイブリダイゼーションの際に蛍光が消光する核酸プローブを用いた検出方法が開示されている。蛍光色素で標識された核酸プローブを標的核酸にハイブリダイズさせ、当該ハイブリダイゼーションの前後において蛍光色素が発する蛍光の減少量を測定する方法、または蛍光色素で標識された核酸プライマーを標的核酸にハイブリダイゼーションさせた後に伸長させ、核酸変性時の蛍光量に対するアニーリング反応および伸長反応時の蛍光量の減少を測定する方法が示されている。さらに当該方法を用いたリアルタイム定量的ＰＣＲ法、および該ＰＣＲ法で得られるデータの解析の際にアニーリング反応時の蛍光強度値を変性反応時のもので補正する過程を有するデータ解析法が記載されている。当該検出方法では標識オリゴヌクレオチドが一つで良く、さらにインターカレーターも使用しないためコストの面で有利であるが、特許文献８に開示された技術を用いても、臨床診断において複数の病原体について菌種を同定しようとする場合には、複数の蛍光色素と、それらから発せられる複数の波長の蛍光シグナルを検出する装置とが必要であり、上述のような非常に高価なシステムと複雑な試薬設計を強いられる問題は解決されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】米国特許第４，６８３，１９５号
【特許文献２】米国特許第４，６８３，２０２号
【特許文献３】米国特許第４，９６５，１８８号
【特許文献４】国際公開８９／１２６９６号
【特許文献５】特開平２−２９３４号
【特許文献６】国際公開９０／１０６９号公報
【特許文献７】特表２００３−５００００１
【特許文献８】特許第３４３７８１６号
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ；Ｎａｔｕｒｅ第３５０巻、第９１頁（１９９１）
【非特許文献２】Ｓｔｒａｎｄ ＤｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ 第２０巻、第１６９１頁（１９９２）
【非特許文献３】Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ；Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． 第３１巻、第３２７０頁（１９９３）
【非特許文献４】Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ：Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２００４ 第４２巻：第１，９５６頁
【非特許文献５】Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ： Ｋｅｋｋａｋｕ． ２００３第７８巻、第５３３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
前述のように、電気泳動による検出では指数関数的に増幅された標的核酸の増幅産物を取り扱うことから、コンタミネーションが起こり、正しい判定結果が得られなくなる危険性があるため臨床診断には適していない。
【００２３】
また、インターカレーターを用いる方法ではコンタミネーションの可能性は低減されるが、二本鎖核酸特異的に蛍光が生じるため、標的核酸配列に非特異的な二本鎖核酸をも検出し、正しい判定結果が得られなくなる危険性があるため臨床診断には適していない。
【００２４】
核酸配列特異的なプローブを用いる方法では、上述したような判定結果の正確性に関する問題点はある程度改善されているが、例えばヒト型結核菌と非定型抗酸菌の同定など、臨床診断上重要である複数の病原体について菌種を同定しようとする場合には、複数の蛍光色素と、それらから発せられる複数の波長の蛍光シグナルを検出する装置とが必要であり、非常に高価なシステムと複雑な試薬設計を強いられるため臨床診断には適していない。
【００２５】
本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、臨床診断上重要な抗酸菌属細菌を迅速、確実かつ簡便に検出または菌種同定するためのオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを利用する抗酸菌属細菌の検出方法ならびにそれらの試薬を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、ヒト型結核菌をはじめとする抗酸菌属細菌のｄｎａＪ１遺伝子における特定領域の菌種特異性が高く、当該遺伝子領域を標的核酸とするプローブを用いることにより、マイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｋａｎｓａｓｉｉ）について非常に正確に検出または菌種同定できることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
【００２７】
［項１］
以下の（Ａ）または（Ｂ）で示されるオリゴヌクレオチドの組合せ。
（Ａ）配列番号１０および配列番号２９に示される２つのオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、および、配列番号２３に示されるオリゴヌクレオチドからなるプローブの組合せ。
（Ｂ）配列番号１０および配列番号１１に示される２つのオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、および、配列番号２５に示されるオリゴヌクレオチドからなるプローブの組合せ。
［項２］
以下の（Ａ）または（Ｂ）で示されるマイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ）の検出方法。
（Ａ）少なくとも以下の（１）〜（３）の工程を含む方法。
（１）配列番号１０に示されるオリゴヌクレオチドと、配列番号２９に示されるオリゴヌクレオチドとの組合せをプライマー対として用いて、核酸増幅を行う第一工程、
（２）第一工程で得られうる増幅産物と、配列番号２３に示される検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｋ）と、をハイブリダイズさせ複合体（Ｐｋ）を形成せしめる第二工程、
（３）第二工程で得られうる該複合体（Ｐｋ）を検出する第三工程。
（Ｂ）少なくとも以下の（１）〜（３）の工程を含む方法。
（１）配列番号１０に示されるオリゴヌクレオチドと、配列番号１１に示されるオリゴヌクレオチドとの組合せをプライマー対として用いて、核酸増幅を行う第一工程、
（２）第一工程で得られうる増幅産物と、配列番号２５に示される検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｋ）と、をハイブリダイズさせ複合体（Ｐｋ）を形成せしめる第二工程、
（３）第二工程で得られうる該複合体（Ｐｋ）を検出する第三工程。
［項３］
（１）〜（３）の工程を密封状態のままで行うことを特徴とする項２に記載の検出
方法。
［項４］
検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｋ）が蛍光色素で標識されていることを特徴とする項２または３に記載の検出方法。
［項５］
複合体（Ｐｋ）の検出にＩＦＰ法を用いることを特徴とする項２〜４のいずれかに記載の検出方法。
［項６］
複合体（Ｐｋ）の検出にＱ−Ｐｒｏｂｅ法を用いることを特徴とする項２〜４のいずれかに記載の検出方法。
［項７］
少なくとも以下の（Ａ）または（Ｂ）で示されるオリゴヌクレオチドの組合せを含むことを特徴とするマイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｋａｎｓａｓｉｉ）の検出キット。
（Ａ）配列番号１０および配列番号２９に示される２つのオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、および、配列番号２３に示されるオリゴヌクレオチドからなるプローブの組合せ。
（Ｂ）配列番号１０および配列番号１１に示される２つのオリゴヌクレオチドからなるプライマーセット、および、配列番号２５に示されるオリゴヌクレオチドからなるプローブの組合せ。
【発明の効果】
【００２８】
本発明によれば、以上のように、臨床診断上重要な抗酸菌属細菌について迅速、確実かつ簡便に検出または菌種同定することが可能となる。具体的には、ヒト型結核菌をはじめとする抗酸菌属細菌のｄｎａＪ１遺伝子において菌種特異性が極めて高い領域を標的核酸とするプローブを用いた融解曲線解析を行うことにより、マイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｋａｎｓａｓｉｉ）について非常に正確に検出または菌種同定できるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】本発明の抗酸菌属細菌のｄｎａＪ１遺伝子において菌種特異性が高い領域を示す図である。
【図２】融解曲線解析の原理を模式的に示す図である。
【図３】本発明のｄｎａＪ１遺伝子領域と１６ＳｒＲＮＡ遺伝子について、進化系統樹を示す図である。
【図４】実施例１のオリゴ１２を用いて検出した結果を示す図である。
【図５】実施例２のオリゴ２３を用いて検出した結果を示す図である。
【図６】比較例１のオリゴ２４を用いて検出した結果を示す図である。
【図７】実施例４のオリゴ１２を用いて検出した結果を示す図である。
【図８】実施例５のオリゴ２７を用いて検出した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本明細書において「抗酸菌属細菌のｄｎａＪ１遺伝子において菌種特異性が高い領域」とは、後述のＰＣＲ法を用いて、以下の配列を有する２種類のオリゴヌクレオチド、
５’−ＣＴＡＣＡＡＧＧＡＧＣＴＧＧＧＣＧＴＣＴＣＣＴＣＴＧ−３’（配列番号３）
および
５’−ＣＣＣＧＡＧＧＧＡＧＣＧＣＣＧＣＧＣＡＡＣＣＣＧＧＣＣＴＣＧＣＣＣＴＧ−３’（配列番号４）
をプライマーとして使用した際に、増幅される抗酸菌属細菌の遺伝子領域に含まれる。当該増幅領域について、トリ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｖｉｕｍ）は配列番号１３に、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）は配列番号１４に、マイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ）は配列番号１５に、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）は配列番号１６に、それぞれ具体的な核酸配列を記載する。
また、上記の「抗酸菌属細菌のｄｎａＪ１遺伝子において菌種特異性が高い領域」は、「領域Ａおよび領域Ｂ」として後述するが、従来公知であるｄｎａＪ遺伝子の部分配列（特許第２９６６４７８号、特許第３１３４９４０号、ＬＣｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．第３１巻４４６頁参照）より当該遺伝子の下流に位置し、従来技術において抗酸菌属細菌の検出および／または同定には使用されなかった領域である。
【００３１】
本発明の抗酸菌属細菌の検出方法は、上記のような抗酸菌属細菌のｄｎａＪ１遺伝子において菌種特異性が高い領域を検出する検出工程を含んでいる。
【００３２】
上記検出工程は、抗酸菌属細菌のｄｎａＪ１遺伝子において菌種特異性が高い領域の少なくとも一部をコードする核酸配列を増幅する増幅工程を含むことが好ましい。当該増幅工程では、試料中の全核酸配列中から増幅したい核酸配列（標的核酸）のみが、その固有の配列に対して相補性を有するプライマーを利用して増幅される。具体的に上記増幅工程では、一本鎖に変性させた抗酸菌属細菌の染色体またはその断片に、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、ＤＮＡポリメラーゼおよび２種類以上のオリゴヌクレオチド（プライマー）等を作用させることによって、上記プライマー間の配列が増幅される。
【００３３】
上記増幅工程に用いられる具体的な核酸増幅方法としては特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。例えば、上記核酸増幅方法としては、ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ；Ｎａｔｕｒｅ 第３５０巻、第９１頁、１９９１年参照）、ＬＣＲ（国際公開８９／１２６９６号、特開平２−２９３４号参照）、ＳＤＡ（ＳｔｒａｎｄＤｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． 第２０巻、第１６９１頁、１９９２年参照）、ＲＣＡ（国際公開９０／１０６９号参照）、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ；Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第３１巻、第３２７０頁、１９９３年参照）、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ：Ｊ． ＣｌｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ． 第４２巻：第１，９５６頁、２００４年参照）、ＩＣＡＮ（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｎｄ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ：Ｋｅｋｋａｋｕ． 第７８巻、第５３３頁、２００３年参照）などを挙げることができるが、これらに限定されない。上記核酸増幅方法を用いれば、従来では検出不可能であった、極めて微量（１分子でも可）の試料核酸をも検出することが可能であり、上記増幅工程に好適に用いることが可能である。
【００３４】
また、試料中の核酸量が少ない場合には、上記増幅工程に先立って、抗酸菌属細菌の染色体またはその断片を上記増幅工程と同じ方法によって増幅しておくことも可能である。
【００３５】
上記増幅工程において用いられる核酸増幅方法としては、上記方法の中でもＰＣＲ法を用いることが好ましい。ＰＣＲ法は、試料核酸、一対のプライマー（ＡおよびＢ）、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、変性工程、アニーリング工程、伸長反応の３工程からなる反応サイクルを繰り返すことによって、上記一対のプライマー（ＡおよびＢ）によって挟まれる試料核酸中の領域を、指数関数的に増幅させることができる。すなわち、変性工程にて試料核酸を変性し、続くアニーリング工程にて各プライマーと当該プライマーに相補的な試料核酸中の領域とをハイブリダイズさせ、続く伸長工程にて各プライマーを起点として、試料核酸に相補的なＤＮＡ鎖を伸長させる。この１サイクルによって、１本の二本鎖ＤＮＡが２本の二本鎖ＤＮＡに増幅される。従って、このサイクルをｎ回繰り返せば、理論上、上記一対のプライマー（ＡおよびＢ）で挟まれた試料ＤＮＡの領域は２のｎ乗倍に増幅される。
【００３６】
増幅工程に使用する一対のプライマー（ＡおよびＢ）としては、増幅された核酸断片に上記の抗酸菌属細菌のｄｎａＪ１遺伝子において菌種特異性が高い領域を含んでいれば特に限定されない。ＧＣ含量が６５％以下の領域に設計することが好適である。より好適には、配列番号１７（領域Ｃ）または配列番号１８（領域Ｄ）または配列番号１９（領域Ｅ）の核酸配列中または各配列に相補的な核酸配列中に設計できる。配列番号３及び配列番号４をプライマーとして使用した場合に増幅される核酸配列領域はＧＣ含量が高い（約７０％）。該領域中において、領域Ｃ、領域Ｄ、領域ＥはそれぞれＧＣ含量が５８．６２％、５８．１４％、５０．００％と比較的低い領域である。そのため、ＧＣ含量が高いことによるプライマーの非特異反応が起こりにくく、試料中の標的核酸を特異的に増幅することができる。
例えば、
プライマー（Ａ）としては、
５’−ＡＣＧＧＣＧＣＴＧＡＧＴＴＣＡＡＣＣＴＣＡＡＣＧ−３’（配列番号５）
５’−ＣＣＡＡＧＣＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＣＧＡＡ−３’（配列番号６）
プライマー（Ｂ）としては、
５’−ＧＡＡＣＡＡＧＣＣＡＣＣＧＡＡＣＡＡＧＴＣＡＣＣＧＡＴ−３’（配列番号７）
５’−ＣＧＴＣＧＡＡＣＡＴＴＴＣＧＴＴＧＡＧＧＴＴＧＡＡＣＴ−３’（配列番号８）
５’−ＣＡＡＧＣＣＡＣＣＧＡＡＣＡＧＧＴＣＧＣＣＧＡＴ−３’（配列番号９）
のような配列を有するオリゴヌクレオチドを使用することができる。
【００３７】
少なくともプライマー（Ａ）とプライマー（Ｂ）を用いて増幅させた核酸断片と配列番号１または２に示される核酸配列または該核酸配列に相補的な核酸配列が「９０％以上一致する」とは、マイコバクテリウム・カンサシイの株間で該核酸断片に変異が存在する場合の一致率を示している。マイコバクテリウム・カンサシイ株間で変異が存在する場合でも、カンサシイ以外の抗酸菌と区別して、カンサシイを特異的に検出できることを表している。好適には該一致率は９０％以上である。さらに好適には９７％以上である。臨床分離されたヒト型結核菌及び非結核性抗酸菌３５種の保有する核酸配列と配列番号１または２に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列との一致率を表１に示す。配列番号１と最も一致している菌種はマイコバクテリウム・マリナム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｒｉｎｕｍ）で、一致率８３％であり、配列番号２と最も一致している菌種はマイコバクテリウム・ゴルドナエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｏｒｄｏｎａｅ）で、一致率８３％である。マイコバクテリウム・カンサシイと同属の抗酸菌であっても一致率は９０％に満たない。また、マイコバクテリウム・カンサシイ７株の保有する核酸配列と、配列番号１または２に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列との一致率は、７株全て９０％以上である。
【００３８】
【表１】
0005626399.tif 000002
【００３９】
本発明の抗酸菌属細菌の検出方法において、検出工程で使用する検出用オリゴヌクレオチドプローブについて説明する。本発明の抗酸菌属細菌のｄｎａＪ１遺伝子において菌種特異性が高い領域は、図１に、一例としてヒト型結核菌をはじめとする４種類の抗酸菌属細菌についてｄｎａＪ１遺伝子の部分配列を用いて示したように、領域Ａおよび領域Ｂの２箇所があり、どちらの領域を用いても本発明の効果を得ることができる。なお、図１において、Ｍａは配列番号１３に記載のトリ型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｖｉｕｍ）に由来する核酸配列であり、Ｍｉは配列番号１４に記載のマイコバクテリウム・イントラセルラーレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）に由来する核酸配列であり、Ｍｋは配列番号１５に記載のマイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｋａｎｓａｓｉｉ）に由来する核酸配列であり、Ｍｔは配列番号１６に記載のヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に由来する核酸配列である。
【００４０】
マイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｋａｎｓａｓｉｉ）を特異的に検出するための検出用オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｋ）としては、配列番号１（領域Ａ）または配列番号２（領域Ｂ）に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を有していれば特に限定されない。連続した９塩基以下の核酸配列になると、オリゴヌクレオチドプローブ（Ｃｔ）の核酸配列がマイコバクテリウム・カンサシイ以外の抗酸菌や他属の細菌の核酸配列に一致し、マイコバクテリウム・カンサシイに特異的な検出ができなくなる。好適には、配列番号１（領域Ａ）中の、５‘−ＧＧＡＧＧＣＧＧＣＴ−３’（配列番号２０）または５‘−ＣＴＡＣＧＧＣＴＣＣ−３’（配列番号２１）を少なくとも含む核酸配列または該配列に相補的な核酸配列を使用できる。好適には、配列番号２（領域Ｂ）中の、５‘−ＴＴＣＣＧＧＣＧＧＡ−３’（配列番号２２）を少なくとも含む核酸配列または該配列に相補的な核酸配列を使用できる。配列番号２０〜２２の核酸配列または該配列に相補的な核酸配列は抗酸菌属の種間において特に変異が多く存在する領域であるため、より特異的な検出が可能となる。より好適には、本明細書の実施例に記載のオリゴヌクレオチドを使用することができる。
【００４１】
本発明の抗酸菌属細菌の検出方法において、検出にＩＦＰ法やＱ−Ｐｒｏｂｅ法など蛍光色素を用いる方法を用いれば、核酸増幅後の反応容器の蓋を開けることなく検出または菌種同定を行う、いわゆるホモジニアス検出が可能となり、臨床診断において致命的なコンタミネーションによる誤判定の危険性を抑制することができる。
【００４２】
ここで、図２を用いて、融解曲線解析の原理について説明する。図２は融解曲線解析の原理を模式的に示す図であり、（ａ）は検出にＩＦＰ法を用いる融解曲線解析の原理を示し、（ｂ）は検出にＱ−Ｐｒｏｂｅ法を用いる融解曲線解析の原理を示し、（ｃ）は融解曲線解析で核酸増幅の結果を確認した結果の一例を示す。
【００４３】
図２（ａ）に示すように、ＩＦＰ法では、特許文献７に記載のように、二本鎖核酸に結合する化合物（インターカレーター）と、当該化合物が当該二本鎖核酸に結合したときに、発する蛍光が変化する反応分子で標識したプローブとを用いる。つまり、二本鎖核酸が一本鎖核酸に解離した状態の当該反応分子が発する蛍光を検出してもよく、解離していない状態の当該反応分子が発する蛍光を検出してもよい。
【００４４】
インターカレーターは二本鎖核酸に特異的に結合し蛍光を発する物質であれば良く、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（商標）、ＬＣ ＧｒｅｅｎＩ（商標）、ＬＣ Ｇｒｅｅｎ Ｐｌｕｓ（商標）、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー、ローダミン等があるがこの限りではない。［２−［Ｎ−［（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−Ｎ−ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｏ］−４−［２，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−３−ｍｅｔｈｙｌ−（ｂｅｎｚｏ−１，３−ｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−ｍｅｔｈｙｌｉｄｅｎｅ］−１−ｐｈｅｎｙｌ−ｑｕｎｏｌｉｎｉｕｍ］を用いても良い。
【００４５】
二本鎖核酸構造は、標的核酸中の塩基とその相補的な核酸配列中の塩基の間で起こる塩基対生成によって形成される。塩基対生成はＣ（シトシン）とＧ（グアニン）、Ａ（アデニン）とＴ（チミン）またはＡ（アデニン）とＵ（ウラシル）の間で起こる水素結合により生じる。インターカレーターはこの二本鎖核酸構造を標的に結合し、蛍光を生じるようになる。
【００４６】
核酸プローブに標識する蛍光物質は、核酸増幅工程中分解もしくは減衰しなければよく、蛍光検出工程で検出できればよい。蛍光物質としてはＦＩＴＣ、６−ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡ、ＴｅｘａｓＲｅｄ（商標）、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ローダミン等があるが、好ましくはＦＲＥＴを生じる蛍光物質であり、より好ましくはインターカレーターと相互作用して特異的に検出できればよく、特に好ましい蛍光物質としてはＴｅｘａｓＲｅｄ（商標）が挙げられるがこの限りではない。ＦＲＥＴ現象を利用すれば、蛍光検出工程において核酸プローブの存在のみで発する蛍光が抑えられ、標的核酸とハイブリダイゼーションした核酸プローブの発する蛍光を特異的に検出することが可能となる。
【００４７】
本発明に用いられる、好ましいインターカレーターと核酸プローブに標識する蛍光物質の組み合わせは、（ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（商標）とＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（商標））、（ＬＣ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（商標）とＴｅｘａｓＲｅｄ（商標））、（ＬＣ Ｇｒｅｅｎ Ｐｌｕｓ（商標）とＴｅｘａｓＲｅｄ（商標））または（［２−［Ｎ−［（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−Ｎ− ｐｒｏｐｙｌａｍｉｎｏ］−４−［２，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−３−ｍｅｔｈｙｌ−（ｂｅｎｚｏ−１，３−ｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−ｍｅｔｈｙｌｉｄｅｎｅ］−１−ｐｈｅｎｙｌ−ｑｕｎｏｌｉｎｉｕｍ］とＴｅｘａｓＲｅｄ（商標））である。
【００４８】
図２（ｂ）に示すように、Ｑ−Ｐｒｏｂｅ法では、特許文献８に記載のように、３’末端にＣ（シトシン）を有し、Ｃ（シトシン）とＧ（グアニン）とが水素結合したときに蛍光が消える蛍光色素で標識したプローブを用いる。核酸増幅後に温度を徐々に上昇させて、二本鎖核酸が一本鎖核酸に解離すると、消光していた蛍光色素が再度発光する。この蛍光を検出すれば、核酸増幅の確認を行うことができる。
【００４９】
標識プローブに標識する蛍光物質は、核酸増幅工程中分解もしくは蛍光が減衰してなくならなければよく、ハイブリダイゼーション時に消光を生じる蛍光物質であればよい。特に標識プローブの末端においてグアニンとシトシンの塩基対形成時に蛍光の消光を生じる蛍光物質が好ましい。具体的には、フルオロセインまたはその誘導体（例えばフルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））、ＢＯＤＩＲＹ（商標）シリーズ、ローダミンまたはその誘導体（例えば５−カルボキシローダミン６Ｇ（ＧＲ６Ｇ）やテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ））などを使用できるが、ＢＯＤＩＰＹシリーズやＣＲ６Ｇの使用が特に好ましい。蛍光色素のオリゴヌクレオチドへの結合方法は、通常の方法に従って行うことができる。蛍光色素の消光を利用すれば、インターカレーターなど二本鎖核酸構造への挿入色素を用いることなく、またＦＲＥＴ現象を起こす二種類のプローブを用いることなく、一種類の蛍光物質に標識されたプローブを用いて単純かつ特異的に標的核酸配列を検出することができる。標識プローブの塩基配列中の蛍光物質の標識位置は特に限定されないが、末端部に標識されていることが好ましく、末端に標識されていることがより好ましい。
【００５０】
標識プローブの塩基配列とそれに対し相補的な標的核酸の塩基配列の選択はハイブリダイゼーション時に蛍光の消光を生じるために重要である。標識プローブの塩基配列は標的核酸とのハイブリダイゼーション時に消光を生じる塩基配列であればよく、二本鎖核酸構造形成時に、蛍光物質が修飾されている標識プローブ末端部にＧ（グアニン）とＣ（シトシン）の対が少なくとも１つ以上存在するように設計すればよい。標識プローブの末端が標識されている場合は、その末端塩基がＧ（グアニン）もしくはＣ（シトシン）であること、または標識プローブの末端と塩基対を形成する標的核酸の塩基から１もしくは３塩基離れてＧ（グアニン）が存在するように標識プローブの塩基配列が設計されていることがより好ましい。標識プローブの末端が標識されており、かつ末端塩基がＣ（シトシン）であるように設計することがさらに好ましい。
【００５１】
図２（ｃ）に示すように融解曲線解析の結果は、温度および蛍光強度の変化量によってアウトプットすればよい。図２（ｃ）は縦軸を蛍光強度の変化量としている。これは、上述のＩＦＰ法では、二本鎖核酸が一本鎖核酸に解離した状態で、上記反応分子が発する蛍光を検出した場合を示す。また、Ｑ−Ｐｒｏｂｅ法での蛍光色素の発光を検出した場合でもある。ＩＦＰ法で、解離していない状態の上記反応分子が発する蛍光を検出する場合は、解離した状態で発する蛍光を検出した場合と比べて、蛍光強度の変化量の正負が反対になる。つまり、得られる表の形は、図２（ｃ）に示す表の各線の形を、温度軸を対象に反転させた形となる。換言すれば、解離していない状態の上記反応分子が発する蛍光を検出して、縦軸を、蛍光強度の変化量のマイナスとすれば、図２（ｃ）に示す表の各線の形と同じになる。
【００５２】
また、図２（ｃ）では３通りの試料に対して核酸増幅を行なった結果を示している。つまり、形成される二本鎖核酸の配列によって解離する温度が異なるため、各線のピークを示す温度が異なることが試料中に含まれた核酸の塩基配列が異なっていたことを示している。実線及び破線の結果を示した試料には、それぞれ異なる塩基配列を有する標的核酸が、１種類ずつ含まれていたことを示す。一点鎖線の結果を示した試料には、実線及び破線の結果を示した試料に含まれていた標的核酸が共に含まれていたことを示す。このように融解曲線解析を行なうことで、核酸増幅による増幅及び試料中に含まれていた標的核酸の塩基配列すなわち抗酸菌属細菌の種類を判別することができる。
【００５３】
抗酸菌属細菌の検出には、１６ＳリボゾームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子が従来より広く用いられてきた。しかし、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子は菌種特異性が本発明のｄｎａＪ１遺伝子領域に比べて低く、したがってプローブの菌種特異性が低いため検出の際に非特異的なシグナルが生成することが問題であった。例えばマイコバクテリウム・カンサシイとマイコバクテリウム・ガストリイの１６ＳリボソームＲＮＡ遺伝子は、全く同じであった。ゆえに従来の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を用いたマイコバクテリウム・カンサシイの検出ではマイコバクテリウム・ガストリイが偽陽性として検出されていた。本発明で標的としているｄｎａＪ１遺伝子はマイコバクテリウム・カンサシイとマイコバクテリウム・ガストリイで塩基配列が異なっている。本発明のｄｎａＪ１遺伝子領域の菌種特異性が高いため、当該遺伝子を標的とするプローブの菌種特異性も高く、正確に菌種の判別を行うことができる。
【００５４】
図３に本発明のｄｎａＪ１遺伝子領域と１６ＳｒＲＮＡ遺伝子について、進化系統樹を示した。進化系統樹は菌種間で遺伝子配列に差異が生じる確率を示す指標であり、数値すなわち進化距離が大きいほど菌種間で遺伝子配列の差異が大きいことを表している。図３のように、本発明のｄｎａＪ１遺伝子領域は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に比べ、菌種による遺伝子配列の違いが約１０倍高く、抗酸菌属細菌の菌種を同定するための遺伝子として優れていることが分かる。遺伝子の進化系統樹は、例えば遺伝子解析ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ（株式会社ゼネティクス製）などを用いて、遺伝子配列より計算することができる。
【００５５】
また、本発明のｄｎａＪ１遺伝子領域の進化距離は、従来公知であるｄｎａＪ遺伝子の部分配列（特許第２５４００２３号、特許第２９６６４７８号、特許第３１３４９４０号、特許第３１５１４１５号、特許第３３６０７３６号、特開２００１−１０３９８６、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第３１巻４４６頁参照）より大きい。これは、本発明のｄｎａＪ１遺伝子領域の菌種特異性が、従来公知のｄｎａＪ遺伝子の部分配列より高く、抗酸菌属細菌の検出または菌種を同定するための遺伝子として優れていることを意味する。
【実施例】
【００５６】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【００５７】
〔実施例１：Ｑ−Ｐｒｏｂｅ法を用いたマイコバクテリウム・カンサシイの検出〕
（１）試料の調製
４種類の抗酸菌属細菌、すなわち、ヒト型結核菌、トリ型結核菌、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、マイコバクテリウム・カンサシイより、それぞれフェノール・クロロフォルム法を用いて抽出したＤＮＡを試料とした。陰性コントロールとしては、水を試料とした。
【００５８】
（２）プライマー及び標識プローブの合成
パーキンエルマー社製ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホスホアミダイト法にて、配列番号１０〜１２に示される核酸配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ１０〜１２と示す）を合成した。合成はマニュアルに従い、各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃、一夜実施した。オリゴヌクレオチドの精製はパーキンエルマー社ＯＰＣカラムにて実施した。もしくはＤＮＡ合成受託会社（（株）日本バイオサービス、シグマアルドリッチジャパン（株）、オペロンバイオテクノロジー（株）など）に依頼した。オリゴ１０がプライマー（Ａ）であり、オリゴ１１がプライマー（Ｂ）であり、オリゴ１２がプローブである。オリゴ１２は５’末端がＢＯＤＩＰＹ−ＦＬにより標識され、３‘末端がリン酸化されている。
【００５９】
（３）核酸増幅および融解曲線解析
４種類の抗酸菌属細菌ＤＮＡおよび陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりマイコバクテリウム・カンサシイを検出した。核酸増幅および融解曲線解析にはロシュ・ダイアグノスティック社製ライトサイクラー（登録商標）を使用した。測定モードは５３０ｎｍを利用し、ライトサイクラーソフトウェアにより結果を解析した。
【００６０】
試薬
以下の試薬を含む１０μＬ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ１０ ２５０ｎＭ、
オリゴ１１ １５００ｎＭ、
オリゴ１２（５’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識） ２５０ｎＭ、
×１０緩衝液 １μＬ、
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ、
ＭｇＳＯ４ ４ｍＭ、
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ０．２Ｕ、
抽出ＤＮＡ溶液 ２０ｎｇ
【００６１】
核酸増幅増幅および融解曲線解析条件
９４℃・２分
９８℃・０秒、
６５℃・５秒、（５０サイクル）
９４℃・１分、
４０℃・１分、
４０℃〜７５℃（０．５℃／秒で温度上昇）。
【００６２】
（４）結果
図４は、ライトサイクラーソフトウェアの解析により、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。図４より明らかなように、マイコバクテリウム・カンサシイ（ＭＫ）のＤＮＡを試料とした場合にのみ明瞭なピークが観察され、ヒト型結核菌（ＭＴ）、トリ型結核菌（ＭＡ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（ＭＩ）それぞれのＤＮＡを試料とした場合には陰性コントロール（ＮＣ）と同様にピークが得られなかった。これは、プローブ（オリゴ１２）の特異性が非常に高いことを示しており、プローブ（オリゴ１２）を用いることでマイコバクテリウム・カンサシイを特異的に検出できることを示している。
【００６３】
〔実施例２：Ｑ−Ｐｒｏｂｅ法を用いたマイコバクテリウム・カンサシイの検出２〕
（１）試料の調製
実施例１と同様に調製した４種類の抗酸菌属細菌のＤＮＡを試料とした。陰性コントロールとしては、水を試料とした。
【００６４】
（２）プライマー
実施例１同様に、配列番号２３、２９に示される核酸配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ２３，２９と示す）を合成した。オリゴ２９はプライマー（Ｂ）である。オリゴ２３はプローブであり、３’末端がＢＯＤＩＰＹ−ＦＬにより標識されている。
【００６５】
（３）核酸増幅および融解曲線解析
４種類の抗酸菌属細菌ＤＮＡおよび陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりＭＫを検出した。核酸増幅および融解曲線解析にはロシュ・ダイアグノスティック社製ライトサイクラー（登録商標）を使用した。測定モードは５３０ｎｍを利用し、ライトサイクラーソフトウェアにより結果を解析した。
【００６６】
試薬
以下の試薬を含む１０μＬ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ１０ ２５０ｎＭ、
オリゴ２９ １５００ｎＭ、
オリゴ２３（ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識） ２５０ｎＭ、
×１０緩衝液 １μＬ、
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ、
ＭｇＳＯ４ ４ｍＭ、
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ０．２Ｕ、
抽出ＤＮＡ溶液 ２０ｎｇ
【００６７】
核酸増幅および融解曲線解析条件
実施例１と同様の条件を使用した。
【００６８】
（４）結果
図５は、図４のオリゴ１２にかえてオリゴ２３を用いて検出した結果を表した図である。図５より明らかなように、配列番号２（領域Ｂ）に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を有していれば、ＭＫのＤＮＡを試料とした場合に特異的なピークが観察される。また、図４より明らかなように、配列番号１（領域Ａ）に示される核酸配列または該配列に相補的な核酸配列のうち少なくとも連続した１０塩基よりなる核酸配列を有していれば、ＭＫのＤＮＡを試料とした場合に特異的なピークが観察される。
【００６９】
〔比較例１：Ｑ−Ｐｒｏｂｅ法を用いたマイコバクテリウム・カンサシイの検出３〕
（１）試料の調製
実施例１と同様に調製した４種類の抗酸菌属細菌のＤＮＡを試料とした。陰性コントロールとしては、水を試料とした。
【００７０】
（２）プライマー
実施例１同様に、配列番号２４に示される核酸配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ２４と示す）を合成した。オリゴ２４はプローブである。オリゴ２４は５’末端がＢＯＤＩＰＹ−ＦＬにより標識されている。
【００７１】
（３）核酸増幅および融解曲線解析
４種類の抗酸菌属細菌ＤＮＡおよび陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりＭＫを検出した。核酸増幅および融解曲線解析にはロシュ・ダイアグノスティック社製ライトサイクラー（登録商標）を使用した。測定モードは５３０ｎｍを利用し、ライトサイクラーソフトウェアにより結果を解析した。
【００７２】
試薬
以下の試薬を含む１０μＬ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ１０ ２５０ｎＭ、
オリゴ２９ １５００ｎＭ、
オリゴ２４（ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識） ２５０ｎＭ、
×１０緩衝液 １μＬ、
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ、
ＭｇＳＯ４ ４ｍＭ、
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ０．２Ｕ、
抽出ＤＮＡ溶液 ２０ｎｇ
【００７３】
核酸増幅および融解曲線解析条件
実施例１と同様の条件を使用した。
【００７４】
（４）結果
図６は、図４のオリゴ１２にかえて、オリゴ２４を用いて検出した結果を表した図である。オリゴ２４は領域Ａまたは領域Ｂまたはそれらの相補的な核酸配列の連続した１０塩基以上を含まれない核酸配列を有したプローブである。図６より明らかなように、オリゴ２４を用いた場合ではＭＫを鋳型としたときに検出ピークが得られるが、ＭＡを鋳型としたときにも同様の検出ピークが得られた。つまり、ＭＫに特異的な検出ピークは得られなかった。
【００７５】
〔実施例３：Ｑ−Ｐｒｏｂｅ法を用いたマイコバクテリウム・カンサシイの検出４〕
（１）試料の調製
３６種類の抗酸菌属細菌をそれぞれマクファランドＮｏ．１の濃度となるようにＴＥバッファーに懸濁し、ＡＭＲ社製ＭＯＲＡ−ＥＸＴＲＡＣＴ用ビーズ充填チューブに入れた。チューブを９５℃１０分間加熱し、ボルテックスにより５分間菌体破砕処理を行った。その後破砕処理後の液を１００倍希釈して菌体破砕液とし、これを試料とした。陰性コントロールとしては、水を試料とした。
【００７６】
（２）核酸増幅および融解曲線解析
３６種類の抗酸菌属細菌菌体破砕液および陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりＭＫを検出した。核酸増幅および融解曲線解析にはロシュ・ダイアグノスティック社製ライトサイクラー（登録商標）を使用した。測定モードは５３０ｎｍを利用し、ライトサイクラーソフトウェアにより結果を解析した。
【００７７】
試薬
以下の試薬を含む１０μＬ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ１０ ２５０ｎＭ、
オリゴ１１ １５００ｎＭ、
オリゴ１２（３’末端をＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識） ２５０ｎＭ、
×１０緩衝液 １μＬ、
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ、
ＭｇＳＯ４ ４ｍＭ、
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ０．２Ｕ、
菌体破砕液 １μＬ
【００７８】
核酸増幅および融解曲線解析条件
実施例１と同様の条件を使用した。
【００７９】
（３）結果
表２に３６種類の抗酸菌属細菌の検出結果を示す。検出欄の「＋」が検出可能な菌種。「−」が検出されない菌種を示す。ＭＫの菌体破砕液を試料とした場合にのみ検出が確認された。抗酸菌属であっても種の異なる３５種類の抗酸菌属菌体破砕液を試料とした場合では陰性コントロール（ＮＣ）と同様にピークが得られなかった。これは、プローブ（オリゴ１２）の特異性が非常に高いことを示しており、プローブ（オリゴ１２）を用いることでマイコバクテリウム・カンサシイを特異的に検出できることを示している。
【００８０】
【表２】
0005626399.tif 000003
【００８１】
〔実施例４：Ｑ−Ｐｒｏｂｅ法を用いたマイコバクテリウム・カンサシイとマイコバクテリウム・ガストリイの判別〕
（１）試料の調製
マイコバクテリウム・カンサシイ（ＭＫ）およびマイコバクテリウム・ガストリイ（ＭＧ）をそれぞれマクファランドＮｏ．１の濃度となるようにＴＥバッファーに懸濁し、ＡＭＲ社製ＭＯＲＡ−ＥＸＴＲＡＣＴ用ビーズ充填チューブに入れた。チューブを９５℃１０分間加熱し、ボルテックスにより５分間菌体破砕処理を行った。その後破砕処理後の液を１００倍希釈して菌体破砕液とし、これを試料とした。陰性コントロールとしては、水を試料とした。
【００８２】
（２）プライマー
実施例１同様に、配列番号２５、２６に示される核酸配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ２５、２６と示す）を合成した。オリゴ２５、２６はプローブである。オリゴ２５は３’末端がＢＯＤＩＰＹ−ＦＬにより標識されている。オリゴ２６は５’末端がＢＯＤＩＰＹ−ＦＬにより標識されている。
【００８３】
（３）核酸増幅および融解曲線解析
ＭＫおよびＭＧの各菌体破砕液および陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりＭＫを検出した。核酸増幅および融解曲線解析にはロシュ・ダイアグノスティック社製ライトサイクラー（登録商標）を使用した。測定モードは５３０ｎｍを利用し、ライトサイクラーソフトウェアにより結果を解析した。
【００８４】
試薬１
以下の試薬を含む１０μＬ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ１０ ２５０ｎＭ、
オリゴ１１ １５００ｎＭ、
オリゴ１２、２６（ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識） ２５０ｎＭ、
×１０緩衝液 １μＬ、
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ、
ＭｇＳＯ４ ４ｍＭ、
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ０．２Ｕ、
ＭＫまたはＭＧ菌体破砕液 １μＬ
試薬２
以下の試薬を含む１０μＬ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ１０ １５００ｎＭ、
オリゴ１１ ２５０ｎＭ、
オリゴ２５（ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ標識） ２５０ｎＭ、
×１０緩衝液 １μＬ、
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ、
ＭｇＳＯ４ ４ｍＭ、
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ０．２Ｕ、
ＭＫまたはＭＧ菌体破砕液 １
【００８５】
核酸増幅および融解曲線解析条件
実施例１と同様の条件を使用した。
【００８６】
（４）結果
図７は、ライトサイクラーソフトウェアの解析により、グラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。図７はオリゴ１２を用いてＭＫおよびＭＧを検出した結果を表している。図７より明らかなように、オリゴ１２を用いればＭＫ菌体破砕液を試料にした場合６０℃付近に検出ピークが得られ、ＭＧ菌体破砕液を試料にした場合、検出ピークが得られなかった。本発明の標的核酸検出方法を用いれば、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子をターゲットとした遺伝子検査方法では判別できなかったＭＫとＭＧを判別できた。また、オリゴ２５をプローブとして用いた場合でも、ＭＫに特異的な検出ピークが得られ、ＭＧは検出されなかった。オリゴ２５を使用しても、図７に示すようなオリゴ１２使用の時と同様の結果が得られた（ただし、検出ピークは６５℃付近）。オリゴ１２およびオリゴ２５はそれぞれ配列番号２１及び配列番号２０を含む塩基配列である。なお、データは示さないがオリゴ２６を使用した場合、ＭＫとＭＧの判別はできなかった。オリゴ２６の塩基配列は領域Ａに含まれているため、ＭＫの検出は可能である。しかしながら、配列番号２０もしくは配列番号２１を含まないため、ＭＫとＭＧを判別することはできなかった。この結果からわかるように、領域Ａまたは領域Ｂ内でさらに配列番号２０〜２２を含むプローブを設計すれば、より特異的にＭＫを検出できることがわかる。
【００８７】
〔実施例５：ＩＦＰ法を用いたマイコバクテリウム・カンサシイの検出〕
（１）試料の調製
実施例１と同様に調製した４種類の抗酸菌属細菌のＤＮＡを試料とした。陰性コントロールとしては、水を試料とした。
【００８８】
（２）プライマー及び標識プローブの合成
実施例１同様に、配列番号２７、２８に示される核酸配列を有するオリゴヌクレオチド（以下、オリゴ２７、２８と示す）を合成した。オリゴ２７、２８はプローブである。オリゴ２７、２８は５’末端および３‘末端がＴｅｘａｓＲｅｄにより標識されている。
【００８９】
（３）核酸増幅および融解曲線解析
４種類の抗酸菌属細菌ＤＮＡおよび陰性コントロールにそれぞれ下記試薬を添加して、下記条件によりＭＫを検出した。核酸増幅および融解曲線解析にはロシュ・ダイアグノスティック社製ライトサイクラー（登録商標）を使用した。測定モードは６４０ｎｍを利用し、ライトサイクラーソフトウェアにより結果を解析した。
【００９０】
試薬１
以下の試薬を含む１０μＬ溶液を調製した。
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ反応液
オリゴ１０ １５００ｎＭ、
オリゴ１１ １５０ｎＭ、
オリゴ２７、２８（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ標識）１０００ｎＭ、
×１０緩衝液 １μＬ、
ｄＮＴＰ ０．２ｍＭ、
ＭｇＳＯ４ ４ｍＭ、
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ（商標）（インビトロジェン社製）１／２００００
ＫＯＤ ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ０．２Ｕ、
抽出ＤＮＡ溶液 ２０ｎｇ
【００９１】
核酸増幅および融解曲線解析条件
９４℃・２分
９８℃・０秒、
６５℃・５秒、（５０サイクル）
９４℃・１分、
４０℃・１分、
４０℃〜７５℃（０．５℃／秒で温度上昇）。
【００９２】
（４）結果
図８はオリゴ２７を用いて検出した結果を示しており、ライトサイクラーソフトウェアの解析によりグラフの横軸を温度、縦軸を蛍光シグナルの微分値として解析結果を表した図である。図８に示すように、ＭＫのＤＮＡを試料とした場合にのみ明瞭なピークが観察され、トリ型結核菌（ＭＡ）、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ（ＭＩ）、ヒト型結核菌（ＭＴ）それぞれのＤＮＡを試料とした場合には陰性コントロール（ＮＣ）と同様にピークが得られなかった。これは、プローブ（オリゴ２７）の特異性が非常に高いことを示しており、プローブ（オリゴ２７）を用いることでヒト型結核菌を特異的に検出できることを示している。また、図８のオリゴ２７にかえて、オリゴ２８を用いて検出した結果、ＭＫとＭＩで同じピークが検出された。オリゴ２８は領域Ａまたは領域Ｂまたはそれらの相補的な核酸配列の連続した１０塩基以上を含まれない核酸配列を有したプローブである。オリゴ２８を用いた場合では、ＭＫを鋳型としたときに検出ピークが得られるが、ＭＩを鋳型としたときにも同様の検出ピークが得られたことから、ＭＫに特異的な検出ができなかった。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明によれば、臨床診断上重要な抗酸菌属細菌について迅速、確実かつ簡便に検出または菌種同定することが可能となる。具体的には、ヒト型結核菌をはじめとする抗酸菌属細菌のｄｎａＪ１遺伝子において菌種特異性が極めて高い領域を標的核酸とするプローブを用いた融解曲線解析を行うことにより、マイコバクテリウム・カンサシイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｋａｎｓａｓｉｉ）について非常に正確に検出または菌種同定できるという効果を奏するため、産業界に大きく寄与することが期待される。
【図１】
0005626399.tif 000004
【図２】
0005626399.tif 000005
【図３】
0005626399.tif 000006
【図４】
0005626399.tif 000007
【図５】
0005626399.tif 000008
【図６】
0005626399.tif 000009
【図７】
0005626399.tif 000010
【図８】
0005626399.tif 000011
【配列表】
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