(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２または配列番号４に少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むΔ４デサチュラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子。
【請求項２】
Δ４デサチュラーゼ酵素が配列番号２または配列番号４を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
ヌクレオチド配列が配列番号１または配列番号３を含む、請求項２に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
Δ４デサチュラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列の少なくとも１９１個のコドンが、ヤロウィア中での発現のためにコドン最適化される、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
少なくとも１つの制御配列に作動的に連結された、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離された核酸分子を含む組換え体。
【請求項６】
配列番号２および配列番号４からなる群から選択される、Δ４デサチュラーゼ酵素をコードするポリペプチド。
【請求項７】
請求項５に記載の組換え体を含む宿主細胞であって、酵母、藻類、細菌、ユーグレナ属、ストラメノパイル、真菌および植物からなる群から選択される、前記宿主細胞。
【請求項８】
油性酵母である請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
油性酵母がヤロウィア、カンジダ、ロドトルラ、ロドスポリジウム、クリプトコッカス、トリコスポロン、およびリポマイセスからなる群から選択される、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
油性酵母がヤロウィアである、請求項９に記載の宿主細胞。
【請求項１１】
植物細胞である、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項１２】
植物細胞が、ダイズ、トウモロコシ、亜麻、ナタネ、サクラソウ、カノーラ、メイズ、綿、ベニバナ、およびヒマワリからなる群から選択される、請求項１１に記載の宿主細胞。
【請求項１３】
ａ）さらにａｌｌ−ｃｉｓ−７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸（２２：５、ω−３）またはドコサテトラエン酸である原料脂肪酸
を含む請求項７〜１２のいずれか１項に記載の宿主細胞を備えるステップと、
ｂ）Δ４デサチュラーゼ酵素をコードする核酸配列が発現して、ａｌｌ−ｃｉｓ−７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸（２２：５、ω−３）が原料脂肪酸である場合、ドコサヘキサエン酸が生産され；ドコサテトラエン酸が原料脂肪酸である場合、ａｌｌ−ｃｉｓ−４，７，１０，１３，１６−ドコサペンタエン酸（２２：５、ω−６）が生産されるように、原料脂肪酸をａｌｌ−ｃｉｓ−７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸（２２：５、ω−３）またはドコサテトラエン酸に変換する条件下でステップ（ａ）の宿主細胞を成長させるステップと、
を含む、ドコサヘキサエン酸またはａｌｌ−ｃｉｓ−４，７，１０，１３，１６−ドコサペンタエン酸（２２：５、ω−６）を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本明細書は、その全体を参照によって本明細書に援用する、目下係属中の２００８年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／０４１７１６号明細書の優先権の利益を主張する。
【０００２】
本発明は生物工学分野にある。より具体的には、本発明はΔ４脂肪酸デサチュラーゼ酵素をコードする核酸断片の同定、長鎖多価不飽和脂肪酸[「ＰＵＦＡ」]の製造におけるこのデサチュラーゼの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
多価不飽和脂肪酸［「ＰＵＦＡ」］、特にω−３およびω−６ＰＵＦＡと関連付けられている健康上の利点は、文献で十分に立証されている。大量のω−３およびω−６ＰＵＦＡを製造する方法を見つけるために、研究者らは彼らの研究を遺伝子の発見、および脂質および脂肪酸をもたらすコードされた生合成経路の理解に向けている。
【０００４】
植物、藻類、真菌、ストラメノパイル、および酵母をはじめとする多様な異なる宿主が、商業的ＰＵＦＡ生産の手段として調査されている。遺伝子操作は、いくつかの宿主の自然の能力が、天然ではリノール酸[「ＬＡ」；１８：２ω−６]またはα−リノレン酸[「ＡＬＡ」；１８：３ω−３]脂肪酸生成に限定されているものでさえ、実質的に改変されて様々な長鎖ω−３／ω−６ＰＵＦＡの高レベルの生成をもたらし得ることを実証している。これが自然の能力の結果または組み換え技術の結果のいずれであっても、ドコサペンタエン酸[「ＤＰＡ」；２２：５ω−３]からのドコサヘキサエン酸[「ＤＨＡ」；２２：６ω−３]の生成は、Δ４デサチュラーゼの発現を必要とするかもしれない。より具体的には、これまでに同定されたほとんどのΔ４デサチュラーゼ酵素はＤＰＡをＤＨＡに変換する一次能力を有し、ドコサテトラエン酸[「ＤＴＡ」；２２：４ω−６]をω−６ドコサペンタエン酸[「ＤＰＡｎ−６」；２２：５ω−６]に変換する二次活性がある。
【０００５】
ＤＨＡの合成においてΔ４デサチュラーゼ酵素が果たす役割に基づいて、様々な起源からこれらの酵素を同定し特性決定するかなりの努力がなされている。多数のΔ４デサチュラーゼが、公開文献および特許文献の双方で開示されている。いくつかの例としては、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）（配列番号１３；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ２７８５５８；非特許文献１）；タラシオシラ・シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）（配列番号３７；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＸ１４５０６；非特許文献２）；スラウストキトリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ）（配列番号１４；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＮ７５７０７）；スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＤ４２４９６；特許文献１）；シゾキトリウム・アグレガタム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）（配列番号４１；特許文献２）；パブロバ・ルセリ（Ｐａｖｌｏｖａ  ｌｕｔｈｅｒｉ）（配列番号４２；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＱ９８７９３）；およびイソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）（配列番号４３；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＶ３３６３１；非特許文献３；特許文献３）が挙げられる。ω−３／ω−６脂肪酸の製造において使用される、多様な宿主生物中での異種性発現に適したΔ４デサチュラーゼをコードする、追加的遺伝子の同定および単離に対する必要性がある。
【０００６】
出願人らは、ユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４からΔ４脂肪酸デサチュラーゼをコードする遺伝子を単離することで、前述の問題を解決した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第７，０８７，４３２号明細書
【特許文献２】国際公開第２００２／０９０４９３号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００２／０９０４９３号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍｅｙｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２（３２）：９７７９〜９７８８（２００３年）
【非特許文献２】Ｔｏｎｏｎら、ＦＥＢＳ  Ｊ．，２７２（１３）：３４０１〜３４１２（２００５年）
【非特許文献３】Ｐｅｒｅｉｒａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３８４（２）：３５７〜３６６（２００４年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本明細書に記載されるのは、Δ４デサチュラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする新しい遺伝子コンストラクト、および藻類、細菌、酵母、ユーグレナ属、ストラメノパイル、真菌、植物、および動物中において多価不飽和脂肪酸[「ＰＵＦＡ」]を生成するためのそれらの使用である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本明細書に記載されるのは、
（ａ）配列番号２および配列番号４からなる群から選択される単離されたΔ４デサチュラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列；
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳというハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離されたヌクレオチド配列；および
（ｃ）（ａ）または（ｂ）と完全に相補的な単離されたヌクレオチド配列
からなる群から選択される単離された核酸分子である。
【００１１】
本明細書に記載されるその他の単離された核酸分子は、配列番号２に記載の配列を有するポリペプチドとの比較でアラインメントのクラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）Ｗ法に基づいて少なくとも６８％の同一性を有する、少なくとも５１４個のアミノ酸からなるΔ４デサチュラーゼ酵素をコードする第１のヌクレオチド配列、または第１のヌクレオチド配列の相補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を含む第２のヌクレオチド配列を含む。
【００１２】
本明細書に記載されるのはまた、本明細書に記載される核酸分子の遺伝的キメラおよびそれらを含む形質転換宿主細胞である。さらに本明細書に記載されるのは、ドコサヘキサエン酸を生成する方法であり、
ａ）（ｉ）アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法に基づいて、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドとの比較で少なくとも６８％の同一性を有するΔ４デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、および
（ｉｉ）ａｌｌ−ｃｉｓ−７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸（２２：５、ω３）源を含む宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）Δ４デサチュラーゼポリペプチドをコードする核酸断片が発現されて、ａｌｌ−ｃｉｓ−７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸（２２：５、ω３）がドコサヘキサエン酸に変換される条件下で、ステップ（ａ）の宿主細胞を生育させるステップと、
ｃ）ステップ（ｂ）のドコサヘキサエン酸を任意に回収するステップ
を含む。
【００１３】
同様に、
ａ）（ｉ）アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法に基づいて、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドとの比較で少なくとも６８％の同一性を有するΔ４デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子；および
（ｉｉ）ドコサテトラエン酸源
を含む宿主細胞を提供するステップと、
ｂ）Δ４デサチュラーゼポリペプチドをコードする核酸断片が発現して、ドコサテトラエン酸がａｌｌ−ｃｉｓ−４，７，１０，１３，１６−ドコサペンタエン酸（２２：５、ω−６）に変換される条件下で、ステップ（ａ）の宿主細胞を生育させるステップと；
ｃ）ステップ（ｂ）のａｌｌ−ｃｉｓ−４，７，１０，１３，１６−ドコサペンタエン酸（２２：５、ω−６）を任意に回収するステップ
を含む、ａｌｌ−ｃｉｓ−４，７，１０，１３，１６−ドコサペンタエン酸（２２：５、ω−６）を生成する方法が提供される。
【００１４】
生物学的寄託
以下の生体物質は、「特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約」の条項に従って為された。
【００１５】
【表１】
0005572620.tif 000002
【００１６】
本明細書での用法では、「ＡＴＣＣ」とは、ＡＴＣＣ，１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０−２２０９，Ｕ．Ｓ．Ａ．に所在する、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙを指す。列挙した寄託物は、表示された国際受託機関に少なくとも３０年間保存され、それを開示する特許の付与時に一般に公開される。寄託株の利用可能性は、政府の行動によって付与された特許権を失墜させて主題発明を実施する認可とはみなされない。
【００１７】
本発明は、本明細書の一部をなす以下の詳細な説明および添付の配列説明から、より完全に理解できる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路を図示する。この経路の説明を考察する際には図１Ｂと合わせ見るべきである。
【図１Ｂ】ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路を図示する。この経路の説明を考察する際には図１Ａと合わせ見るべきである。
【図２Ａ】Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ分析（ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム）を使用した、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ４脂肪酸デサチュラーゼ（配列番号１３；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ２７８５５８）、タラシオシラ・シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）Δ４脂肪酸デサチュラーゼ（配列番号３７；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＸ１４５０６）、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種ＦＪＮ−１０  Δ４脂肪酸デサチュラーゼ（配列番号３８；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＺ４３２５７）、およびパブロバ・ルセリ（Ｐａｖｌｏｖａ  ｌｕｔｈｅｒｉ）Δ４脂肪酸デサチュラーゼ（配列番号４２；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＱ９８７９３）の間のアラインメントを示す。縮重プライマーは枠線内領域に対応するようにデザインされた。
【図２Ｂ】Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ分析（ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム）を使用した、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ４脂肪酸デサチュラーゼ（配列番号１３；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ２７８５５８）、タラシオシラ・シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）Δ４脂肪酸デサチュラーゼ（配列番号３７；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＸ１４５０６）、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種ＦＪＮ−１０  Δ４脂肪酸デサチュラーゼ（配列番号３８；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＺ４３２５７）、およびパブロバ・ルセリ（Ｐａｖｌｏｖａ  ｌｕｔｈｅｒｉ）Δ４脂肪酸デサチュラーゼ（配列番号４２；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＱ９８７９３）の間のアラインメントを示す。縮重プライマーは枠線内領域に対応するようにデザインされた。
【図２Ｃ】Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ分析（ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム）を使用した、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ４脂肪酸デサチュラーゼ（配列番号１３；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ２７８５５８）、タラシオシラ・シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）Δ４脂肪酸デサチュラーゼ（配列番号３７；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＸ１４５０６）、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種ＦＪＮ−１０  Δ４脂肪酸デサチュラーゼ（配列番号３８；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＺ４３２５７）、およびパブロバ・ルセリ（Ｐａｖｌｏｖａ  ｌｕｔｈｅｒｉ）Δ４脂肪酸デサチュラーゼ（配列番号４２；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＱ９８７９３）の間のアラインメントを示す。縮重プライマーは枠線内領域に対応するようにデザインされた。
【図３Ａ】ユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４  Δ４デサチュラーゼ遺伝子（Ｅ１５９４Ｄ４と称する；配列番号１）と、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成遺伝子（Ｅ１５９４Ｄ４Ｓと称する；配列番号３）とのＤＮＡ配列比較を図示する。
【図３Ｂ】ユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４  Δ４デサチュラーゼ遺伝子（Ｅ１５９４Ｄ４と称する；配列番号１）と、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成遺伝子（Ｅ１５９４Ｄ４Ｓと称する；配列番号３）とのＤＮＡ配列比較を図示する。
【図３Ｃ】ユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４  Δ４デサチュラーゼ遺伝子（Ｅ１５９４Ｄ４と称する；配列番号１）と、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成遺伝子（Ｅ１５９４Ｄ４Ｓと称する；配列番号３）とのＤＮＡ配列比較を図示する。
【図３Ｄ】ユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４  Δ４デサチュラーゼ遺伝子（Ｅ１５９４Ｄ４と称する；配列番号１）と、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成遺伝子（Ｅ１５９４Ｄ４Ｓと称する；配列番号３）とのＤＮＡ配列比較を図示する。
【図３Ｅ】ユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４  Δ４デサチュラーゼ遺伝子（Ｅ１５９４Ｄ４と称する；配列番号１）と、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成遺伝子（Ｅ１５９４Ｄ４Ｓと称する；配列番号３）とのＤＮＡ配列比較を図示する。
【図４Ａ】ｐ１５９４Ｄ４Ｓのプラスミドマップを提供する。
【図４Ｂ】ｐＺＫＬ４−２２０ＥＳＣ４のプラスミドマップを提供する。
【図５】総脂質画分中に約３１％のＥＰＡを産生するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１８４Ｕ株の開発を図示する。
【００１９】
次の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．§８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則」）を満たし、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８年）、およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に記載の規則に従う。
【００２０】
配列番号１〜９、１３〜１４、３７〜４７は、表１に示すような、プライマー、遺伝子またはタンパク質（またはそれらの部分）をコードするＯＲＦ、あるいはプラスミドである。
【００２１】
【表２】
0005572620.tif 000003
【００２２】
配列番号１０〜１２は、ユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４  ｃＤＮＡの合成のために使用される、ＳＭＡＲＴ（商標）ＩＶオリゴヌクレオチドプライマー、ＣＤＳＩＩＩ／３’  ＰＣＲプライマーおよび５’ＣＤＳＩＩＩ  ＰＣＲプライマーにそれぞれ対応する。
【００２３】
配列番号１５〜１７は、縮重オリゴヌクレオチドプライマーＤ４−Ｆ１、Ｄ４−Ｆ２、およびＤ４−Ｆ３にそれぞれ対応し、それらは全て配列番号１８に記載のペプチドをコー
ドする。
【００２４】
配列番号１９は、配列番号２０に記載のペプチドをコードする縮重オリゴヌクレオチドプライマーＤ４−Ｆ４に対応する。
【００２５】
配列番号２１は、配列番号２２に記載のペプチドをコードする縮重オリゴヌクレオチドプライマーＤ４−Ｆ５に対応する。
【００２６】
配列番号２３〜２５は、縮重オリゴヌクレオチドプライマーＤ４−Ｆ６、Ｄ４−Ｆ７、およびＤ４−Ｆ８にそれぞれ対応し、それらは全て配列番号２６に記載のペプチドをコードする。
【００２７】
配列番号２７および２８は、縮重オリゴヌクレオチドプライマーＤ４−Ｒ１およびＤ４−Ｒ２に対応し、これらはどちらも配列番号２９に記載のペプチドをコードする。
【００２８】
配列番号３０〜３４は、ユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４  Δ４デサチュラーゼ遺伝子の５’コード領域を増幅するのに使用される、プライマー１５９４Ｄ４−５−１、１５９４Ｄ４−５−２、ＤＮＲ  ＣＤＳ５−２、１５９４Ｄ４−５−４および１５９４Ｄ４−５−５にそれぞれ対応する。
【００２９】
配列番号３５および３６は、ユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４  Δ４デサチュラーゼ遺伝子の３’コード領域を増幅するのに使用される、プライマー１５９４Ｄ４−３−１および１５９４Ｄ４−３−２にそれぞれ対応する。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
出願人らは、健康に良いＰＵＦＡを生成するための生化学的経路の操作に使用してもよい、新しいユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４  Δ４デサチュラーゼ酵素、および該酵素をコードする遺伝子を同定した。したがって主題発明には多くの用途がある。
【００３１】
ＰＵＦＡ、またはその誘導体は、食事代用物、または栄養補給剤、特に乳児用調製粉乳として、静脈内栄養補給を受ける患者のために、または栄養失調を予防しまたは治療するために使用できる。代案として、精製されたＰＵＦＡおよびその誘導体を料理用油、脂肪またはマーガリン中に組み込んで、消費者が日常の食事の一部として摂取することによって、消費者が所望の食事補給を得られるようにしてもよい。さらに、ＰＵＦＡはまた、乳児用調製粉乳、栄養補給剤またはその他の食品中に組み込んでもよく、抗炎症薬またはコレステロール低下剤としての用途があるかもしれない。場合により組成物は、ヒトまたは動物のいずれかのため製薬用途に使用してもよい。
【００３２】
定義
本開示では、いくつかの用語および略語を使用する。以下の定義が提供される。
「読み取り枠」はＯＲＦと略記される。
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略記される。
「米国微生物系統保存機関」はＡＴＣＣと略記される。
「多価不飽和脂肪酸」はＰＵＦＡと略記される。
「トリアシルグリセロール」はＴＡＧと略記される。
「総脂肪酸」は「ＴＦＡ」と略記される。
「乾燥細胞重量」は「ＤＣＷ」と略記される。
【００３３】
「発明」または「本発明」という用語は、本明細書での用法では限定を意図せず、特許請求の範囲で定義されるかまたは本明細書に記載される本発明のいずれにも全般的に当てはまる。
【００３４】
「脂肪酸」という用語は、約Ｃ１２〜Ｃ２２の鎖長の異なる長鎖脂肪酸（アルカン酸）を指すが、より長いおよびより短い鎖長の酸の双方が知られている。最も多数を占める鎖長はＣ１６〜Ｃ２２の間である。脂肪酸の構造は簡易表記体系「Ｘ：Ｙ」によって表され、Ｘは特定の脂肪酸中の炭素[「Ｃ」]原子総数であり、Ｙは二重結合の数である。「飽和脂肪酸」対「不飽和脂肪酸」、「一不飽和脂肪酸」対「多価不飽和脂肪酸」[「ＰＵＦＡ」]、および「ω−６脂肪酸」[「ω−６」または「ｎ−６」]対「ω−３脂肪酸」[「ω−３」または「ｎ−３」]の間の区別についてさらに詳しくは、米国特許第７，２３８，４８２号明細書に記載される。
【００３５】
本明細書でＰＵＦＡを記載するのに使用される命名法を表２に示す。「略記法」と題された欄ではω基準系が使用されて、炭素数、二重結合数、およびこの目的では１番とされるω炭素から数えたω炭素に最も近い二重結合の位置を示す。表の残部はω−３およびω−６脂肪酸およびそれらの前駆物質の一般名、明細書全体を通じて使用される略語、および各化合物の化学名を要約する。
【００３６】
【表３】
0005572620.tif 000004
【００３７】
表２に列挙されるω−３／ω−６ＰＵＦＡは、本明細書に記載される方法を使用すると油性酵母の油画分中に蓄積される可能性が最も高いが、この一覧は制限的または網羅的と見なすべきではない。
【００３８】
細胞の「総脂質画分」という用語は、本明細書では細胞の全てのエステル化脂肪酸を指す。トリアシルグリセロール［「油」］画分、ホスファチジルコリン画分、およびホスファチジルエタノールアミン画分をはじめとする、総脂質画分内の様々な下位画分が単離できるが、これは決して全ての下位画分を包含するものではない。
【００３９】
「トリアシルグリセロール」［「ＴＡＧ」］および「油」という用語は同義であり、グリセロール分子にエステル化された３つの脂肪酸アシル残基から構成される中性脂質を指す。ＴＡＧは、長鎖ＰＵＦＡ、ならびにより短い飽和および不飽和脂肪酸、およびより長鎖の飽和脂肪酸を含有できる。細胞のＴＡＧ画分はまた「油画分」とも称され、「油生合成」は総称的に細胞内のＴＡＧ合成を指す。油またはＴＡＧ画分は総脂質画分の下位画分であるが、それはまた油性生物中において、乾燥細胞重量の％としての細胞中の総脂肪酸の重量として測定される、総脂質含量の主要部分も構成する［下記参照］。油[「ＴＡＧ」]画分中の脂肪酸組成および総脂質画分の脂肪酸組成は、一般に類似している。したが
って総脂質画分中のＰＵＦＡ濃度の増大または減少は、油［「ＴＡＧ」］画分中のＰＵＦＡ濃度の増大または減少に対応し、逆もまた然りである。
【００４０】
「総脂肪酸」［「ＴＦＡ」］という用語は、本明細書では所定のサンプル中において、（当該技術分野で知られているような）塩基エステル交換法によって脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］に誘導体化できる全ての細胞脂肪酸の和を指し、それは例えば総脂質画分または油画分であってもよい。したがって総脂肪酸は、ホスファチジルコリン画分、ホスファチジルエタノールアミン画分、およびジアシルグリセロールとモノアシルグリセロールとトリアシルグリセロール［「ＴＡＧまたは油」］画分をはじめとする、中性および極性脂質画分からの脂肪酸を含むが、遊離脂肪酸は含まない。
【００４１】
細胞の「総脂質含量」という用語は、乾燥細胞重量［「ＤＣＷ」］の％としてのＴＦＡの測定値である。したがって総脂質含量［「ＴＦＡ％ＤＣＷ」］は、例えば１００ミリグラムのＤＣＷあたりの総脂肪酸のミリグラムに等しい。
【００４２】
一般に脂肪酸濃度は、本明細書では、例えば１００ミリグラムのＴＦＡあたりの所定の脂肪酸のミリグラムなどのＴＦＡ［「％ＴＦＡ」］の重量％として表される。本開示中で特に断りのない限り、総脂質に対する所定の脂肪酸の％への言及は、％ＴＦＡとしての脂肪酸濃度に等しく、例えば総脂質の％ＤＨＡは、ＤＨＡ％ＴＦＡに等しい。
【００４３】
場合によっては、細胞中の所定の脂肪酸の含量をその乾燥細胞重量の％［「％ＤＣＷ」］として表すことが有用である。したがって例えばドコサヘキサエン酸％ＤＣＷは、次式に従って求められる。
（ドコサヘキサエン酸％ＴＦＡ）＊（ＴＦＡ％ＤＣＷ）]／１００
【００４４】
「脂質プロフィール」および「脂質組成」という用語は同義であり、総脂質画分中または油［「ＴＡＧ」］画分中などの特定の脂質画分に含有される個々の脂肪酸の量を指し、量はＴＦＡの％として表される。混合物中に存在する個々の各脂肪酸の和は、１００になるはずである。
【００４５】
代謝経路または生合成経路は、生化学的意味において、細胞内で起きて酵素によって触媒され、細胞によって使用されまたは保存される代謝産物の形成、または「流束発生ステップ」と呼ばれる別の代謝経路の開始のどちらかを達成する一連の化学反応と見なすことができる。これらの経路の多くは複雑であり、開始物質を所望の正確な化学構造を有する生成物に成形する段階を追った改変を伴う。
【００４６】
「ＰＵＦＡ生合成経路」という用語は、オレイン酸をＬＡ、ＥＤＡ、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＤＲＡ、ＤＴＡ、およびＤＰＡｎ−６などのω−６脂肪酸に、そしてＡＬＡ、ＳＴＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡなどのω−３脂肪酸に変換する代謝過程を指す。この過程については文献に詳細に記載されている。例えば国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットを参照されたい。簡単に述べるとこの過程は、小胞体膜中に存在する「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」と称される一連の特別な延長および不飽和化酵素による、炭素原子の付加を通じた炭素鎖の延長、および二重結合の付加を通じた延長分子の不飽和化を伴う。より具体的には「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」とは、Δ９エロンガーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、Ｃ２０／２２エロンガーゼΔ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼおよび／またはΔ１７デサチュラーゼをはじめとする、ＰＵＦＡの生合成と関連付けられている酵素（および前記酵素をコードする遺伝子）のいずれかを指す。
【００４７】
「ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」という用語は、適切な条件下で発現すると、ω−３およびω−６脂肪酸の片方または双方の生成を触媒する酵素をコードする一組の遺伝子を指す。典型的にω−３／ω−６脂肪酸生合成経路に関与する遺伝子は、ＰＵＦＡ生合成経路酵素をコードする。代表的な経路を図１に示し、様々な中間体を経由するミリスチン酸のＤＨＡへの変換を提供して、ω−３およびω−６脂肪酸の双方が共通の原料からどのように生成できるかを実証する。経路は自然に２つの部分に別れ、１つの部分はω−３脂肪酸、別の部分はω−６脂肪酸のみを発生させる。ω−３脂肪酸のみを発生させる部分のみを本明細書ではω−３脂肪酸生合成経路と称する一方、ω−６脂肪酸のみを発生させる部分は本明細書ではω−６脂肪酸生合成経路と称する。
【００４８】
「機能性」という用語は、本明細書ではω−３／ω−６脂肪酸生合成経路に関して、経路中の遺伝子のいくつか（または全て）が、活性酵素を発現し、生体内触媒作用または基質変換をもたらすことを意味する。いくつかの脂肪酸生成物は、この経路の遺伝子のサブセットの発現のみを必要とするので、「ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」または「機能性ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」は、上の段落に列挙される遺伝子の全てが必要とされることを暗示しないものとする。
【００４９】
「ω６デサチュラーゼ／ω６エロンガーゼ経路」という用語は、最低限少なくとも１つのω６デサチュラーゼおよび少なくとも１つのＣ１８／２０エロンガーゼを含み、それによってＧＬＡおよび／またはＳＴＡを中間体脂肪酸として、ＬＡおよびＡＬＡからそれぞれＤＧＬＡおよび／またはＥＴＡを生合成できるようにするＰＵＦＡ生合成経路を指す。その他のデサチュラーゼおよびエロンガーゼが発現すれば、ＡＲＡ、ＤＴＡ、ＤＰＡｎ−６、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡもまた合成されるかもしれない。
【００５０】
「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」という用語は、最低限少なくとも１つのΔ９エロンガーゼおよび少なくとも１つのΔ８デサチュラーゼを含み、それによってＥＤＡおよび／またはＥＴｒＡを中間体脂肪酸として、ＬＡおよびＡＬＡからのそれぞれＤＧＬＡおよび／またはＥＴＡの生合成を可能にするＰＵＦＡ生合成経路を指す。その他のデサチュラーゼおよびエロンガーゼが発現すれば、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡもまた合成されるかもしれない。
【００５１】
「中間体脂肪酸」という用語は、脂肪酸代謝経路中でその他の代謝経路酵素の作用によって意図される生成物脂肪酸にさらに変換され得る、この経路中で生成されるあらゆる脂肪酸を指す。例えばΔ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路を使用してＥＰＡを生成する場合、ＥＤＡ、ＥＴｒＡ、ＤＧＬＡ、ＥＴＡ、およびＡＲＡが生成でき、これらの脂肪酸はその他の代謝経路酵素の作用を通じてＥＰＡにさらに変換され得るので「中間体脂肪酸」と見なされる。
【００５２】
「デサチュラーゼ」という用語は、隣接する炭素の１つから水素を取り去り、それによってそれらの間に二重結合を導入することによって、脂肪酸中の隣接する炭素を不飽和化できるポリペプチドを指す。不飽和化からは、対象の脂肪酸または前駆物質が生じる。特定の脂肪酸に言及するために明細書全体を通じてオメガ基準系を使用したにもかかわらず、デルタ系を使用して基質のカルボキシル末端から数えることによってデサチュラーゼ活性を示す方が、より都合がよい。本明細書で特に興味深いのは、基質脂肪酸ＤＰＡからＤＨＡへの変換および／またはまたは基質脂肪酸ＤＴＡからＤＰＡｎ−６への変換を触媒するΔ４デサチュラーゼである。その他のデサチュラーゼとしては、１）分子のカルボキシル末端から数えて１７番目および１８番目の炭素原子間で脂肪酸を不飽和化し、例えば基質脂肪酸ＡＲＡからＥＰＡへの変換および／または基質脂肪酸ＤＧＬＡからＥＴＡへの変換を触媒するΔ１７デサチュラーゼ；２）基質脂肪酸ＬＡからＧＬＡへの変換および／または基質脂肪酸ＡＬＡからＳＴＡへの変換を触媒するΔ６デサチュラーゼ；３）基質脂肪酸オレイン酸からＬＡへの変換を触媒するΔ１２デサチュラーゼ；４）基質脂肪酸ＬＡからＡＬＡへの変換および／または基質脂肪酸ＧＬＡからＳＴＡへの変換を触媒するΔ１５デサチュラーゼ；５）基質脂肪酸ＤＧＬＡからＡＲＡへの変換および／または基質脂肪酸ＥＴＡからＥＰＡへの変換を触媒するΔ５デサチュラーゼ；６）基質脂肪酸ＥＤＡからＤＧＬＡへの変換および／または基質脂肪酸ＥＴｒＡからＥＴＡへの変換を触媒するΔ８デサチュラーゼ；および７）基質脂肪酸パルミチン酸からパルミトレイン酸（１６：１）への変換および／または基質脂肪酸ステアリン酸からオレイン酸への変換を触媒するΔ９デサチュラーゼが挙げられる。当該技術分野ではΔ１５およびΔ１７デサチュラーゼはまた、ω−６脂肪酸をそれらのω−３対応物に変換するそれらの能力（例えばそれぞれＬＡからＡＬＡへおよびＡＲＡからＥＰＡへの変換）に基づいて、時折「オメガ−３デサチュラーゼ」、「ｗ−３デサチュラーゼ」、および／または「ω−３デサチュラーゼ」とも称される。脂肪酸デサチュラーゼの遺伝子で適切な宿主を形質転換して宿主脂肪酸プロフィールに対するその効果を判定することよって、特定の脂肪酸デサチュラーゼの特異性を経験的に判定することが望ましいかもしれない。
【００５３】
「Ｅ１５９４Ｄ４」という用語は、本明細書の配列番号１によってコードされる、ユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４から単離されたΔ４デサチュラーゼ酵素（配列番号２）を指す。同様に「Ｅ１５９４Ｄ４Ｓ」という用語は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された、ユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４に由来する合成Δ４デサチュラーゼを指す（すなわち配列番号３および４）。
【００５４】
「変換効率」および「％基質変換」という用語は、それによってデサチュラーゼなどの特定の酵素が基質を生成物に変換できる効率を指す。変換効率は、次式に従って測定される。
（［生成物］／［基質＋生成物］）＊１００
式中、「生成物」は即時生成物および経路中のそれから誘導される全生成物を含む。
【００５５】
「エロンガーゼ」という用語は、脂肪酸炭素鎖を延長して、エロンガーゼが作用する脂肪酸基質よりも炭素２個分だけ長い酸を生成できるポリペプチドを指す。この延長過程は、国際公開第２００５／０４７４８０号パンフレットに記載されるように、脂肪酸シンターゼと結びついた多段階機序で起きる。エロンガーゼ系によって触媒される反応の例は、ＧＬＡからＤＧＬＡへ、ＡＲＡからＤＴＡへ、ＳＴＡからＥＴＡへ、およびＥＰＡからＤＰＡへの変換である。一般にエロンガーゼの基質選択性はいくらか広いが、鎖長と不飽和の程度およびタイプとの双方によって差別される。例えばＣ１４／１６エロンガーゼは、例えばミリスチン酸などのＣ１４基質を利用し；Ｃ１６／１８エロンガーゼは、例えばパルミチン酸などのＣ１６基質を利用し；Ｃ１８／２０エロンガーゼ[Δ６エロンガーゼとしてもまた知られており用語は同義的に使用できる]は、例えばＧＬＡ、ＳＴＡなどのＣ１８基質を利用し；Ｃ２０／２２エロンガーゼ[Ｃ２０エロンガーゼとしてもまた知られており用語は同義的に使用できる]は、例えばＡＲＡ、ＥＰＡなどのＣ２０基質を利用する。同様にしてΔ９エロンガーゼは、ＬＡおよびＡＬＡからＥＤＡおよびＥＴｒＡへの各変換を触媒できる。
【００５６】
いくつかのエロンガーゼは特異性が広く、したがって単一酵素がいくつかのエロンガーゼ反応を触媒し得ることに留意することが重要である。したがって例えば単一酵素が、Ｃ１６／１８エロンガーゼおよびＣ１８／２０エロンガーゼの双方として機能してもよい。脂肪酸エロンガーゼの遺伝子で適切な宿主を形質転換して宿主脂肪酸プロフィールに対するその効果を判定することによって、特定の脂肪酸エロンガーゼの特異性を経験的に判定することが望ましいかもしれない。
【００５７】
「油性」という用語は、それらのエネルギー源を油の形態で保存する傾向がある生物を指す（Ｗｅｅｔｅ、「Ｆｕｎｇａｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第２版、Ｐｌｅｎｕｍ、１９８０年）。「油性酵母菌」という用語は、ＴＡＧである油を生成できる酵母菌として分類される微生物を指す。一般に油性微生物の細胞油またはＴＡＧ含量はＳ字形曲線に従い、対数増殖後期または定常増殖初期において脂質濃度が最大に達するまで増大し、次に定常増殖後期および死滅期において徐々に減少する（ＹｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉおよびＷａｒｄ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：４１９〜２５（１９９１年））。油性微生物が、それらの乾燥細胞重量の約２５％以上を油として蓄積することは珍しくない。油性酵母の例としては、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００５８】
「ミドリムシ綱（Ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｃｅａｅ）」という用語は、淡水、海洋、土壌、および寄生環境内で生活する一群の単細胞の無色または光合成鞭毛虫[「ユーグレナ属」]を指す。このクラスは孤立単細胞によって特徴付けられ、大部分は自由遊泳性であって２本の鞭毛を有し、その１本は非出現性（ｎｏｎｅｍｅｒｇｅｎｔ）であってもよく、貯胞として知られる前陥入からから立ち上がる。光合成ユーグレナ属は、微小ディスクから拡張プレートまたはリボンまで様々である、単数から多数の葉緑体を含有する。無色のユーグレナ属は、栄養素同化作用を浸透栄養または摂食栄養に依存する。約１０００種が記載されており、約４０属および６目に分類される。ミドリムシ綱（Ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｃｅａｅ）の例としては、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）、ユートレプチエラ（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ）、およびテトルエトレプチア（Ｔｅｔｒｕｅｔｒｅｐｔｉａ）属が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００５９】
本明細書での用法では「生物由来資源」という用語は、具体的には商業的に意味のある量でＰＵＦＡを産生する組み換え生産宿主発酵からの廃酵母または使用済み酵母細胞物質を指し、好ましい生産宿主は油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の組み換え株である。生物由来資源は、ホールセル、ホールセル溶解産物、均質化細胞、部分的加水分解細胞物質、および／または例えば微生物産生油などの部分的精製細胞物質の形態であってもよい。
【００６０】
本明細書の用法では、「単離された核酸断片」および「単離された核酸分子」という用語は同義的に使用されて、一本鎖または二本鎖で、場合により合成、非天然または改変ヌクレオチド塩基を含有するＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを指す。ＤＮＡポリマーの形態の単離された核酸断片は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの１つ以上のセグメントを含んでなってもよい。
【００６１】
核酸断片は、適切な温度および溶液イオン強度条件下で、核酸断片の一本鎖形態がその他の核酸断片とアニールできる場合、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡなどの別の核酸断片と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件については良く知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９年）で例証される。
【００６２】
温度およびイオン強度条件が、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ストリンジェンシー条件を調節して、中程度に類似した断片（遠縁生物からの相同的配列など）や類似性の高い断片（近縁関係にある生物からの機能性酵素を複製する遺伝子など）をスクリーンできる。ハイブリダイゼーション後洗浄は、ストリンジェンシー条件を決定する。好ましい条件の１つの組は、６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで室温を１５分間で開始して、次に２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで４５℃を３０分間繰り返して、次に０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで５０℃を３０分間を２回繰り返す一連の洗浄を使用する。ストリンジェントな条件のより好ましい組は、０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中での最後の２回の３０分間の洗浄温度が６０℃に上昇されること以外は、洗浄が上と同一である、より高い温度を使用する。高度にストリンジェントな条件の別の好ましい組は、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６５℃の最後の２回の洗浄を使用する。ストリンジェントな条件の追加的な組としては、例えば０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃のハイブリダイゼーション、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄後、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳが挙げられる。
【００６３】
ハイブリダイゼーションは２つの核酸が相補的配列を含有することを要とするが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー次第で塩基間のミスマッチも可能である。核酸がハイブリッド形成するための適切なストリンジェンシーは、当該技術分野で良く知られている変数である核酸の長さおよび相補性の程度に左右される。類似性の程度または２つのヌクレオチド配列間の相同性が大きいほど、これらの配列を有する核酸ハイブリッドのＴｍ値はより大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションのより高いＴｍに対応して、相対安定性は以下の順で低下する。ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さが１００クレオチドを超えるハイブリッドのためにＴｍを計算する式が導かれている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、９．５０〜９．５１を参照されたい）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションのためには、ミスマッチの位置がより重要となり、オリゴヌクレオチド長がその特異性を決定する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、１１．７〜１１．８を参照されたい）。一実施態様では、ハイブリダイズ可能な核酸長は、少なくとも約１０ヌクレオチドである。好ましくはハイブリダイズ可能な核酸の最小長さは少なくとも約１５ヌクレオチドであり；より好ましくは少なくとも約２０ヌクレオチドであり；最も好ましくは長さは少なくとも約３０ヌクレオチドである。さらに当業者は、プローブ長などの要因次第で、必要に応じて温度および洗浄液塩濃度を調節してもよいことを認識するであろう。
【００６４】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「かなりの部分」とは、当業者による配列の手動評価によって、あるいはＢＬＡＳＴ（「基礎的局在性配列検索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ」、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９３年））などのアルゴリズムを使用したコンピュータ自動化アラインメントおよび同定によって、遺伝子またはポリペプチドの推定上の同定を得るのに十分なポリペプチドまたは遺伝子のヌクレオチド配列のアミノ酸配列を含む部分である。一般に推定的にポリペプチドまたは核酸配列が既知のタンパク質または遺伝子に相同的であると同定するためには、１０個以上の隣接するアミノ酸または３０個以上のヌクレオチド配列が必要である。さらにヌクレオチド配列に関して、配列依存遺伝子同定法（例えばサザンハイブリダイゼーション）および単離（例えばバクテリアのコロニーまたはバクテリオファージプラークの原位置ハイブリダイゼーション）において、２０〜３０個の隣接するヌクレオチドを含む遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを使用しても良い。さらにプライマーを含む特定の核酸断片を得るために、塩基１２〜１５個の短いオリゴヌクレオチドを増幅プライマーとしてＰＣＲで使用しても良い。したがってヌクレオチド配列の「かなりの部分」は、配列を含む核酸断片を特異的に同定、および／または単離できるようにする十分な配列を含む。
【００６５】
本明細書の開示は、特定のユーグレナ属のタンパク質をコードする完全なアミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。明細書で報告される配列の便益を有する当業者は、今や開示される配列の全てまたは相当部分を当業者に既知の目的のために使用してもよい。したがって添付の配列一覧で報告される完全な配列、ならびに上で定義されるこれらの配列の相当部分は、本開示に包含される。
【００６６】
「相補的」という用語は、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係について述べるために使用される。例えばＤＮＡについて、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって添付の配列一覧で報告される完全な配列に相補的な単離された核酸断片、ならびにこれらと実質的に類似した核酸配列は、本開示に包含される。
【００６７】
「相同性」、および「相同的」という用語は、本明細書では区別なく使用される。これらは、１個もしくはそれ以上のヌクレオチド塩基の変化が、遺伝子発現を仲介するまたは特定の表現型を生成する核酸断片の能力に影響しない核酸断片を指す。これらの用語はまた、最初の未変性断片と比べて、得られる核酸断片の機能特性を実質的に変化させない、１個もしくはそれ以上のヌクレオチドの欠失または挿入などの本明細書に記載されている核酸断片の変更も指す。したがって当業者は、本発明が特定の例示的配列以上のものを包含することを理解するであろうと解釈される。
【００６８】
さらに当業者は、本発明によって包含される相同的な核酸配列が、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６０℃のような中程度にストリンジェントな条件下において、本明細書に例示されている配列と、または機能的にそれらと同等物である本明細書に記載されている本ヌクレオチド配列のあらゆる部分とハイブリダイズする、それらの能力によってもまた定義されることを認識する。
【００６９】
「コドン縮重」とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響しないヌクレオチド配列の変動を可能にする遺伝子コードの性質を指す。したがって本明細書に記載されるのは、配列番号２および／または配列番号４に記載されるユーグレナ属のポリペプチドをコードするアミノ酸配列の全てまたは相当部分をコードする、あらゆる核酸断片である。当業者は、特定のアミノ酸を特定化するヌクレオチドコドンの使用における、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」についてよく知っている。したがって宿主細胞中の改善された発現のために遺伝子を合成する場合、そのコドン使用頻度が、宿主細胞の好むコドン使用頻度に近くなるように遺伝子をデザインすることが望ましい。
【００７０】
「合成遺伝子」は、当業者に公知の手順を使用して化学的に合成されるオリゴヌクレオチド構成単位からアセンブルできる。これらのオリゴヌクレオチド構成単位をアニールし次にライゲーションして遺伝子セグメントを形成し、次にそれを酵素的にアセンブルして遺伝子全体を構築する。したがって遺伝子をヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適な遺伝子発現のために個別に調整し、宿主細胞のコドンバイアスを反映させることができる。当業者は、コドン利用が宿主によって好まれるコドンに偏っている場合の遺伝子発現成功の可能性を理解する。好ましいコドンの判定は、配列情報が利用できる宿主細胞由来の遺伝子の調査に基づくことができる。例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のコドン使用頻度プロフィールは、米国特許第７，１２５，６７２号明細書で提供される。
【００７１】
「遺伝子」とは特定のタンパク質を発現する核酸断片を指し、それはコード領域のみを指してもよく、またはコード配列に先行する（５’非コード配列）およびそれに続く（３’非コード配列）制御配列を含んでもよい。「天然遺伝子」とは、自然界にそれ自体の制御配列と共に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、自然界に共に見られない制御およびコード配列を含んでなる天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる起源由来の制御配列およびコード配列、あるいは同一起源由来であるが、自然界に見られるのとは異なる様式で配列される制御配列およびコード配列を含んでなってもよい。「内在性遺伝子」とは、生物ゲノム中のその天然位置にある天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子とは、遺伝子移入によって宿主生物に導入された遺伝子を指す。外来性遺伝子は、非天然生物中に挿入された天然遺伝子、天然宿主内の新しい位置に導入された天然遺伝子、あるいはキメラ遺伝子を含んでなることができる。「導入遺伝子」とは、形質転換によってゲノム中に導入された遺伝子である。「コドン最適化遺伝子」とは、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好むコドン使用頻度を模倣するようにデザインされた遺伝子である。
【００７２】
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適した制御配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、配列内、または下流（３’非コード配列）に位置して（またはそのイントロン内に位置して）、転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。制御配列は、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、５’非翻訳リーダー配列（例えば転写開始部位と翻訳開始コドンの間）、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位、およびステムループ構造を含んでもよい。
【００７３】
「プロモーター」とは、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を調節できるＤＮＡ配列を指す。一般にコード配列はプロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターはその全体が天然遺伝子に由来しても良く、あるいは自然界に見られる異なるプロモーター由来の異なる要素からなっても良く、あるいは合成ＤＮＡセグメントを含むことさえも良い。異なるプロモーターが、異なる組織または細胞タイプ中で、あるいは異なる発育段階で、あるいは異なる環境または生理学的条件に呼応して、遺伝子の発現を導いても良いことが当業者には理解される。ほとんどの場合にほとんどの細胞タイプ中で遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構造プロモーター」と称される。ほとんどの場合、制御配列の正確な境界は完全に画定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が、同一プロモーター活性を有してもよいこともさらに認識される。
【００７４】
「３’非翻訳配列」および「転写ターミネーター」という用語は、コード配列下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これには、ｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響できる調節シグナルをコードするポリアデニル化認識配列、およびその他の配列が含まれる。ポリアデニル化シグナルは、通常、ｍＲＮＡ前駆物質の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響することで特徴づけられる。３’領域は、関連したコード配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または翻訳に影響できる。
【００７５】
「ＲＮＡ転写物」とは、ＲＮＡポリメラーゼが触媒するＤＮＡ配列転写から得られる生成物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写物と称され、あるいはそれは一次転写物の転写後プロセッシング由来のＲＮＡ配列であってもよく、成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」とは、イントロンがなく、細胞によってタンパク質に翻訳されることができるＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡに対して相補的であり、それに由来する二重鎖ＤＮＡを指す。「センスＲＮＡ」とは、ｍＲＮＡを含み、細胞によってタンパク質に翻訳されることができるＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部または一部に相補的であり、標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５，１７０，０６５号明細書、国際公開第９９／２８５０８号パンフレット）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定の遺伝子転写物のあらゆる部分、すなわち５’非コード配列、３’非コード配列、またはコード配列にあっても良い。「機能性ＲＮＡ」とは、翻訳されないがそれでもなお細胞プロセスに影響するアンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、またはその他のＲＮＡを指す。
【００７６】
「作動的に結合した」という用語は、１つの機能が他方の機能による影響を受けるような、単一核酸断片上の核酸配列のつながりを指す。例えばプロモーターがコード配列の発現に影響を及ぼすことができる場合、それはそのコード配列と作動的に結合する、すなわちコード配列がプロモーターの転写調節下にある。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で制御配列に作動的に結合できる。
【００７７】
「発現」という用語は、本明細書での用法では、核酸断片由来のセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写と安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳も指す。
【００７８】
「形質転換」とは、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす核酸分子の宿主生物中への転移を指す。核酸分子は、例えば自律的に複製するプラスミドであってもよく、またはそれは宿主生物のゲノムに組み込まれてもよい。形質転換された核酸断片を含有する宿主生物は、「遺伝子導入」または「組み換え」または「形質転換」生物と称される。
【００７９】
「プラスミド」および「ベクター」という用語は、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を運ぶことが多く、通常環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である染色体外要素を指す。このような要素は、あらゆる供給源に由来する一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの配列、ゲノム一体化配列、直鎖または環状のファージまたはヌクレオチド配列を自律的に複製するかもしれず、そこではいくつかのヌクレオチド配列が、選択された遺伝子産物のために発現カセットを細胞中に導入することができる独自の構成に、結合または組み換えされる。
【００８０】
「発現カセット」という用語は、選択された遺伝子産物の発現に必要とされる、選択された遺伝子のコード配列、およびコード配列に先行する制御配列（５’非コード配列）およびコード配列に続く制御配列（３’非コード配列）を含んでなるＤＮＡ断片を指す。したがって発現カセットは、典型的に１）プロモーター配列、２）コード配列、すなわち読み取り枠［「ＯＲＦ」］、および３）３’非翻訳領域、すなわち真核生物中では通常ポリアデニル化部位を含有するターミネーターから構成される。発現カセットは通常ベクター内に含まれ、クローニングおよび形質転換を容易にする。各宿主に対する正しい制御配列が使用される限りは、異なる発現カセットを細菌、酵母、植物、および哺乳類細胞をはじめとする、異なる生物に形質転換することができる。
【００８１】
「％同一性」という用語は、配列を比較して判定される２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の関係であると言及される。「％同一性」は、場合によってはこのような比較配列間の整合パーセンテージによって判定される、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「％同一性」および「％類似性」は、１．）「計算分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＮＹ（１９８８年）、２．）「Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ」（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編）Ａｃａｄｅｍｉｃ、ＮＹ（１９９３年）、３．）「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ」、第一部、（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．、およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編）Ｈｕｍａｎｉａ、ＮＪ（１９９４年）、４．）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ、ＮＹ（１９８７年）、５．）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ」（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ、ＮＹ（１９９１年）に記載されているものをはじめとするが、これに限定されるものではない公知の方法によって容易に計算できる。
【００８２】
％同一性を判定する好ましい方法は、試験された配列間に最良の一致を与えるようにデザインされている。％同一性および％類似性を判定する方法は、公的に入手可能なコンピュータプログラム中で体系化されている。配列アラインメントおよび％同一性の計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））のＭｅｇＡｌｉｇｎＴＭプログラムを使用して実施されてもよい。配列の多重アラインメントは、「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｖ法」および「アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法」をはじめとするアルゴリズムのいくつかの変法を包含し、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎＴＭプログラムにある、「Ｃｌｕｓｔａｌアラインメント法」（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ，５：１５１〜１５３（１９８９年）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９〜１９１（１９９２年）に記載されている）を使用して実施される。いずれかのＣｌｕｓｔａｌプログラムを使用した配列アラインメントの後、プログラムの「配列距離」表を見ることで「％同一性」を得ることができる。
【００８３】
アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｖ法を使用する多重アラインメントでは、デフォルト値はＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０およびＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０に相当する。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖ法を使用するタンパク質配列のペアワイズアラインメントおよび％同一性計算のデフォルトパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５である。核酸ではこれらのパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ＝２、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝５、ＷＩＮＤＯＷ＝４、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝４である。アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法を使用する多重アラインメントのデフォルトパラメーターは、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝０．２、Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  Ｓｅｑｓ（％）＝３０、ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ＝０．５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ  Ｓｅｒｉｅｓ、ＤＮＡ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝ＩＵＢに相当する。
【００８４】
同一のまたは類似した機能または活性を有するポリペプチドをその他の種から識別するのに、配列％同一性の様々な測定が有用であることは、当業者によって良く理解されている。適切な核酸断片、すなわち本明細書の開示に記載される単離されたポリヌクレオチドは、本明細書で報告されるアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一、好ましくは少なくとも約７５％同一、より好ましくは少なくとも約８０％同一であるポリペプチドをコードする。好ましい核酸断片は、本明細書に記載のアミノ酸配列と少なくとも約８５％同一のアミノ酸配列をコードする。より好ましい核酸断片は、本明細書に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列をコードする。最も好ましいのは、本明細書に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列をコードする核酸断片である。好ましい範囲は上に記載したが、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％などの６８％から１００％までのあらゆる整数のアミノ酸同一性が、本発明で有用かもしれない。
【００８５】
適切な核酸断片は上の相同性を有するだけでなく、典型的に少なくとも５０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０個のアミノ酸、なおもより好ましくは少なくとも２００個のアミノ酸、最も好ましくは少なくとも２５０個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
【００８６】
「モチーフ」という用語は、進化的に関連したタンパク質の整合配列に沿って、特定の位置で保存されたアミノ酸の組を意味する。その他の位置のアミノ酸が相同的なタンパク質の間で変動できる一方で、特定の位置において高度に保存されたアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性、または活性に必須のアミノ酸を示唆する。それらはタンパク質相同体ファミリーの整合配列におけるそれらの高度な保存によって同定されるので、それらを識別子または「シグネチャー」として使用して、新たに配列が判定されたタンパク質が、以前同定されたタンパク質ファミリーに属するかどうかを判定できる。
【００８７】
「配列分析ソフトウェア」という用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析のために有用なあらゆるコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は、市販のものでも、あるいは独立して開発されても良い。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、１．）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からのＧＣＧプログラム一式（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０）、２．）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０年））、および３．）ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）からのＤＮＡＳＴＡＲ、４．）Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）からのＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ、および５．）スミス−ウォーターマン・アルゴリズムを組み入れたＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４年）、１９９２年会議、１１１〜２０、編集者：Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ、Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。この説明では、配列分析ソフトウェアを分析のために使用する場合、分析結果は特に断りのない限り、言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づく。本明細書での用法では、「デフォルト値」とは、最初に初期化されるときにソフトウェアに元からロードされる、あらゆる値またはパラメーターの組を意味することになる。
【００８８】
本明細書で使用される標準リコンビナントＤＮＡおよび分子クローニング技術については技術分野で良く知られており、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．、およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第二版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９年）（下文においてＭａｎｉａｔｉｓ）；Ｓｉｌｈａｖｙ，Ｔ．Ｊ．、Ｂｅｎｎａｎ，Ｍ．Ｌ．およびＥｎｑｕｉｓｔ，Ｌ．Ｗ．、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８４年）；およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪによる出版（１９８７年）に記載されている。
【００８９】
概説：脂肪酸およびトリアシルグリセロールの微生物生合成
一般に、油性微生物中の脂質蓄積は、増殖培地中に存在する全体的な炭素対窒素比に応えて誘発される。油性微生物中に遊離パルミチン酸（１６：０）の新規（ｄｅ  ｎｏｖｏ）合成をもたらすこのプロセスについては、米国特許第７，２３８，４８２号明細書に詳細に記載されている。パルミチン酸は、エロンガーゼおよびデサチュラーゼの作用を通じて形成される、より長鎖の飽和および不飽和脂肪酸誘導体の前駆物質である（図１）。
【００９０】
ＴＡＧ（脂肪酸の主要な貯蔵単位）は、以下が関与する一連の反応によって形成される。１．）アシルトランスフェラーゼによる１分子のアシル−ＣｏＡのグリセロール−３−リン酸塩へのエステル化がリゾホスファチジン酸を生じ、２．）アシルトランスフェラーゼによる第２のアシル−ＣｏＡ分子のエステル化が、一般にホスファチジン酸として同定される１，２−ジアシルグリセロールリン酸塩を生じ、３．）ホスファチジン酸ホスファターゼによるリン酸塩の除去が１，２−ジアシルグリセロール［「ＤＡＧ」］を生じ、４．）アシルトランスフェラーゼの作用による第３の脂肪酸の付加がＴＡＧを形成する。
【００９１】
飽和および不飽和脂肪酸および短鎖および長鎖脂肪酸をはじめとする、幅広い脂肪酸をＴＡＧに組み込むことができる。
【００９２】
オメガ脂肪酸の生合成
オレイン酸がω−３／ω−６脂肪酸に変換される代謝プロセスは、炭素原子付加を通じた炭素鎖の延長、および二重結合添加を通じた分子の不飽和化を伴う。これは、小胞体膜内に存在する一連の特別な不飽和化酵素および延長酵素を必要とする。しかし図１に示され下に記載されるように、特定ω−３／ω−６脂肪酸生成のための複数の代案の経路があることが多い。
【００９３】
具体的には、図１は下述の経路を描写する。全ての経路は、Δ１２デサチュラーゼによるオレイン酸から第１のω−６脂肪酸であるリノール酸[「ＬＡ」]への最初の変換を要する。次に「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」および基質としてＬＡを使用して、長鎖ω−６およびω−３脂肪酸が次のようにして形成される。１）ＬＡがΔ９エロンガーゼによってエイコサジエン酸[「ＥＤＡ」]に変換され；２）ＥＤＡがΔ８デサチュラーゼによってジホモ−γ−リノレン酸[「ＤＧＬＡ」]に変換され；３）ＤＧＬＡがΔ５デサチュラーゼによってアラキドン酸[「ＡＲＡ」]に変換され；４）ＡＲＡがＣ２０／２２エロンガーゼによってドコサテトラエン酸[「ＤＴＡ」]に変換され；５）ＤＴＡがΔ４デサチュラーゼによってドコサペンタエン酸[「ＤＰＡｎ−６」]に変換される。代案としては「Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路」は、次のように基質としてα−リノレン酸[「ＡＬＡ」]を使用して、長鎖ω−３脂肪酸を生成できる。１）ＬＡがΔ１５デサチュラーゼによって第１のω−３脂肪酸であるＡＬＡに変換され；２）ＡＬＡがΔ９エロンガーゼによってエイコサトリエン酸[「ＥＴｒＡ」]に変換され；３）ＥＴｒＡがΔ８デサチュラーゼによってエイコサテトラエン酸[「ＥＴＡ」]に変換され；４）ＥＴＡがΔ５デサチュラーゼによってエイコサペンタエン酸[「ＥＰＡ」]に変換され；５）ＥＰＡがＣ２０／２２エロンガーゼによってドコサペンタエン酸[「ＤＰＡ」]に変換され；６）ＤＰＡがΔ４デサチュラーゼによってドコサヘキサエン酸[「ＤＨＡ」]に変換される。任意にω−６脂肪酸は、ω−３脂肪酸に変換されてもよい。例えばＥＴＡおよびＥＰＡは、Δ１７デサチュラーゼ活性によってそれぞれＤＧＬＡおよびＡＲＡから生成する。
【００９４】
ω−３／ω−６脂肪酸生合成の代案の経路は、Δ６デサチュラーゼおよびＣ１８／２０エロンガーゼ、すなわち「Δ６デサチュラーゼ／Δ６エロンガーゼ経路」を利用する。より具体的にはＬＡおよびＡＬＡは、Δ６デサチュラーゼによってそれぞれγ−リノレン酸[「ＧＬＡ」]およびステアリドン酸[「ＳＴＡ」]に変換されてもよく、次にａＣ１８／２０エロンガーゼがＧＬＡをＤＧＬＡにおよび／またはＳＴＡをＥＴＡに変換する。引き続いて下流ＰＵＦＡが、上述のように形成される。
【００９５】
ω−３／ω−６脂肪酸生成のために特定の宿主生物中で発現されることが必要な特定の機能性は、宿主細胞（およびその天然ＰＵＦＡプロフィールおよび／またはデサチュラーゼ／エロンガーゼプロフィール）、基質可用性、および所望の最終産物に左右されるであろうことが考察される。当業者は、ω−３／ω−６脂肪酸生合成のために所望される各酵素をコードする様々な遺伝子候補を同定できるであろう。有用なデサチュラーゼおよびエロンガーゼ配列は、細菌、藻類、真菌、卵菌類、酵母、ストラメノパイル、植物、動物などの天然原料から単離されるあらゆる起源に由来してもよく、半合成経路または新規合成を通じて生成される。宿主に導入されるデサチュラーゼおよびエロンガーゼ遺伝子の特定の起源は重要でないが、デサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性を有する特定のポリペプチドを選択する上での考察としては、１）ポリペプチドの基質特異性および活性；２）ポリペプチドまたはその構成要素が律速酵素であるかどうか；３）デサチュラーゼまたはエロンガーゼが所望のＰＵＦＡの合成に必須であるかどうか；４）ポリペプチドが必要とする補助因子；および／または５）ポリペプチドがその生成後にキナーゼまたはプレニル基転移酵素などによって改変されるかどうかが挙げられる。発現されるポリペプチドは、好ましくは宿主細胞中のその位置の生化学的環境に適したパラメーターを有する。米国特許第７，２３８，４８２号明細書を参照されたい。
【００９６】
特定の各デサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼの変換効率を考慮することもまた有用かもしれない。より具体的には各酵素は、基質を生成物に変換するのに１００％効率では滅多に機能しないので、宿主細胞中に生じる未精製油の最終脂質プロフィールは、典型的に所望のω−３／ω−６脂肪酸、ならびに様々な上流中間ＰＵＦＡからなる様々なＰＵＦＡの混合物である。したがって各酵素の変換効率もまた、所望の脂肪酸の生合成を最適化する際に考慮すべき変数である。
【００９７】
上の各考察を念頭において、例えばＧｅｎＢａｎｋ、特許文献、およびＰＵＦＡ産生能力を有する生物の実験解析などの公的に入手可能な文献に従って、適切なデサチュラーゼおよびエロンガーゼ活性（例えばΔ６デサチュラーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Δ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、およびＣ２０／２２エロンガーゼ）を有する遺伝子候補を同定できる。これらの遺伝子は特定の宿主生物へ導入して、生物のＰＵＦＡ合成を可能にし、または増強するのに適するであろう。
【００９８】
新しいユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４  Δ４デサチュラーゼ配列の同定
本開示は、Δ４デサチュラーゼ（配列番号２）をコードする、ユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４から単離されたヌクレオチド配列（配列番号１）に関する。この配列を本明細書では「Ｅ１５９４Ｄ４」と称する。
【００９９】
Ｅ１５９４Ｄ４のヌクレオチド塩基および推定アミノ酸配列と公共データベースとの比較からは、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法を使用して、本明細書で報告されるＥ１５９４Ｄ４アミノ酸配列と最も類似した既知の配列が、５１４個のアミノ酸長にわたり約６８％同一であることが明らかにされる（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ，５：１５１〜１５３（１９８９年）；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．ら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，８：１８９〜１９１（１９９２年）に記載される；ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクス演算スイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラムにある）。より好ましいアミノ酸断片は本明細書の配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、少なくとも約８０％〜９０％同一の配列が特に適切であり、少なくとも約９０％〜９５％同一の配列が最も好ましい。同様に、ＯＲＦに対応する好ましいＥ１５９４Ｄ４をコードする核酸配列は活性タンパク質をコードするものであり、それは本明細書で報告されるＥ１５９４Ｄ４の核酸配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、少なくとも約８０％〜９０％同一の配列が特に適切であり、少なくとも約９０％〜９５％同一の配列が最も好ましい。
【０１００】
代案の実施態様では、特定の宿主生物中における発現のためにＥ１５９４Ｄ４デサチュラーゼ配列をコドン最適化できる。当該技術分野で良く知られているように、宿主が好むコドンの使用はポリペプチドをコードする外来遺伝子の発現を実質的に増強できることから、これは代案の宿主中で酵素発現をさらに最適化する有用な手段たり得る。一般には関心のある特定の宿主種中で、好ましくは最大量で発現されるタンパク質中のコドン使用頻度を調べ、最高頻度で使用されるコドンを判定することで、宿主が好むコドンを判定できる。次に宿主種中で好まれるコドンを使用して、例えばデサチュラーゼ活性を有する関心のあるポリペプチドのコード配列の全体または一部を合成できる。
【０１０１】
このようにしてＥ１５９４Ｄ４をヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化した。これは先のＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のコドン使用頻度プロフィールの決定、好まれるコドンの同定、および「ＡＴＧ」開始コドン周囲の共通配列の決定に基づいて可能であった（米国特許第７，２３８，４８２号明細書および米国特許第７，１２５，６７２号明細書を参照されたい）。本明細書で「Ｅ１５９４Ｄ４Ｓ」と称するコドン最適化された合成遺伝子は、野生型Ｅ１５９４Ｄ４のアミノ酸残基１および２の間に挿入された１個の追加的アラニンアミノ酸を有し；したがってＥ１５９４Ｄ４Ｓの全長は１５４８個のヌクレオチド（配列番号３）であるのに対し、配列番号４で記載されるコードされるタンパク質は長さが５１５個のアミノ酸である。
【０１０２】
当業者は本明細書の教示を使用して、野生型Ｅ１５９４Ｄ４の配列に基づいて、代案の宿主（すなわちヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）以外）中での最適発現に適した、様々なその他のコドン最適化Δ４デサチュラーゼタンパク質作り出せるであろう。したがって開示本明細書は、配列番号２によってコードされる、野生型Ｅ１５９４Ｄ４に由来するあらゆるコドン最適化されたΔ４デサチュラーゼタンパク質に関する。これとしては、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成Δ４デサチュラーゼタンパク質（すなわち配列番号４に記載のＥ１５９４Ｄ４Ｓ）をコードする、配列番号３に記載のヌクレオチド配列が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１０３】
相同体の同定および単離
配列分析ソフトウェアを使用して、本デサチュラーゼ配列（すなわちＥ１５９４Ｄ４、Ｅ１５９４Ｄ４Ｓ）のいずれかまたはその一部を使用して、同一または別の細菌、藻類、真菌、卵菌類、酵母、ストラメノパイル、ユーグレナ属、植物または動物種中でΔ４デサチュラーゼ相同体を検索してもよい。一般にこのようなコンピュータソフトウェアは、様々な置換、欠失、およびその他の修飾に相同性の程度を割り当てることにより、類似した配列をマッチさせる。
【０１０４】
代案としては、Δ４相同体同定のために本デサチュラーゼ配列またはその一部のいずれかをハイブリダイゼーション試薬として採用してもよい。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本的構成要素には、プローブ、対象とする遺伝子または遺伝子断片を含有することが疑われるサンプル、および特定のハイブリダイゼーション法が含まれる。本発明のプローブは、典型的に、検出される核酸配列に相補的な一本鎖核酸配列である。プローブは、検出される核酸配列と「ハイブリダイズ可能」である。プローブの長さは、５個の塩基から数万個の塩基の間で変動してもよいが、典型的に約１５個の塩基から約３０個の塩基のプローブ長が適切である。プローブ分子の一部のみが、検出される核酸配列に相補的であればよい。さらにプローブと標的配列との間の相補性は完璧でなくてもよい。ハイブリダイゼーションは不完全に相補的な分子間でも生じ、その結果、ハイブリダイズした領域の特定塩基の一部は、適切な相補的塩基と対合形成しない。
【０１０５】
ハイブリダイゼーション法については、良く定義されている。典型的には、プローブおよびサンプルは、核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で混合されなくてはならない。これは適切な濃度および温度条件下において、無機または有機塩存在下で、プローブとサンプルを接触させることを伴う。プローブとサンプル核酸の間であらゆる可能なハイブリダイゼーションが起き得るように、プローブおよびサンプル核酸は、十分長い時間接触しなくてはならない。混合物中のプローブまたは標的濃度が、ハイブリダイゼーションが生じるのに必要な時間を決定する。プローブまたは標的濃度が高いほど、必要なハイブリダイゼーションインキュベーション時間はより短くなる。任意にカオトロピック剤（例えば塩化グアニジニウム、グアニジウムチオシアネート、チオシアン酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸リチウム、過塩素酸ナトリウム、テトラクロロ酢酸ルビジウム、ヨウ化カリウム、トリフルオロ酢酸セシウム）を添加してもよい。所望ならば、ハイブリダイゼーション混合物にホルムアミドを典型的に３０〜５０％（ｖ／ｖ）で添加できる。
【０１０６】
様々なハイブリダイゼーション溶液を用いることができる。それらは典型的に約２０〜６０容量％、好ましくは３０容量％の極性有機溶剤を含む。一般的なハイブリダイゼーション溶液は、約３０〜５０％ｖ／ｖのホルムアミドと、約０．１５〜１Ｍの塩化ナトリウムと、（例えばクエン酸ナトリウム、トリス−ＨＣｌ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ（ｐＨ範囲約６〜９）などの）約０．０５〜０．１Ｍの緩衝液と、（例えばドデシル硫酸ナトリウムなどの）約０．０５〜０．２％の洗剤、または０．５〜２０ｍＭのＥＤＴＡ、ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．）からのＦＩＣＯＬＬ（約３００〜５００ｋｄａｌ）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００ｋｄａｌ）、および血清アルブミンを用いる。典型的なハイブリダイゼーション溶液にはまた、約０．１〜５ｍｇ／ｍＬの未標識キャリア核酸、断片化核ＤＮＡ（例えば仔ウシ胸腺またはサケ精子ＤＮＡ、または酵母ＲＮＡ）、および任意に約０．５〜２％ｗｔ／ｖｏｌのグリシンも含まれる。多様な極性水溶性剤または膨潤剤（例えばポリエチレングリコール）、アニオン性ポリマー（例えばポリアクリレートまたはポリメチルアクリレート）、およびアニオン性糖類ポリマー（例えば硫酸デキストラン）をはじめとする体積排除剤などのその他の添加剤もまた含まれてもよい。
【０１０７】
核酸ハイブリダイゼーションは多様なアッセイ型式に適合できる。最も適切なもの１つは、サンドイッチアッセイ型式である。サンドイッチアッセイは、特に非変性条件下でのハイブリダイゼーションに適合できる。サンドイッチタイプのアッセイの主要構成要素は、固体担体である。固体担体は、未標識で配列の一部と相補的である固定化核酸プローブをそれに吸着し、またはそれと共有結合する。
【０１０８】
追加の実施態様では、本明細書に記載されるΔ４デサチュラーゼ核酸断片（または同定されたあらゆるその相同体）のいずれかを使用して、同一または別の細菌、藻類、真菌、卵菌類、酵母、ストラメノパイル、ユーグレナ属、植物または動物種から、相同的なタンパク質をコードする遺伝子を単離してもよい。配列依存プロトコルを使用した相同的遺伝子の単離は、当該技術分野で周知である。配列依存プロトコルの例としては以下が挙げられるが、これに限定されるものではない。１．）核酸ハイブリダイゼーション法、２．）ポリメラーゼ連鎖反応［「ＰＣＲ」］（米国特許第４，６８３，２０２号明細書）などの核酸増幅技術の様々な使用で例示されるようなＤＮＡおよびＲＮＡ増幅法；リガーゼ連鎖反応［「ＬＣＲ」］（Ｔａｂｏｒ，Ｓ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８２、１０７４（１９８５年））；または連鎖置換増幅［「ＳＤＡ」］（Ｗａｌｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９、３９２（１９９２年））、および３．）相補性によるライブラリー構築およびスクリーニング法。
【０１０９】
例えば良く知られている方法を使用して、ＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして核酸断片の全てまたは一部を使用して、あらゆる所望の生物からのライブラリーをスクリーンし、本明細書に記載されるΔ４デサチュラーゼと類似したタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子を直接単離でき、そこではＤＰＡｎ−６またはＤＨＡを産生する生物が好ましい。核酸配列に基づく特定のオリゴヌクレオチドプローブは、当該技術分野で知られている方法によってデザインおよび合成できる（Ｍａｎｉａｔｉｓ、前出）。さらに配列全体を直接使用して、ランダムプライマーＤＮＡ標識、ニックトランスレーションまたは末端標識技術などの当業者に知られている方法によってＤＮＡプローブを合成でき、または利用できる生体外転写系を使用してＲＮＡプローブを合成できる。さらに特定のプライマーをデザインして、Δ４デサチュラーゼ配列の一部または全長を増幅するのに使用できる。得られた増幅生成物を増幅反応中に直接標識し、または増幅反応後に標識して、適切なストリンジェンシー条件下でプローブとして使用し、完全長ＤＮＡ断片を単離できる。
【０１１０】
典型的にＰＣＲ−タイプ増幅技術では、プライマーは異なる配列を有し、互いに相補的でない。所望の試験条件次第で、プライマーの配列は、標的核酸の効率的かつ忠実な複製を提供するようにデザインされるべきである。ＰＣＲプライマーデザインの方法は一般的であり、よく知られている。（Ｋ．Ｅ．Ｄａｖｉｓ編、「Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」よりＴｈｅｉｎおよびＷａｌｌａｃｅ、「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ」（１９８６年）３３〜５０、ＩＲＬ：Ｈｅｒｎｄｏｎ，ＶＡ；およびＷｈｉｔｅ，Ｂ．Ａ．編、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」よりＲｙｃｈｌｉｋ，Ｗ．、「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（１９９３年）第１５巻、３１〜３９、Ｈｕｍａｎａ：Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）。
【０１１１】
一般に、Δ４デサチュラーゼ配列の２本の短い断片をＰＣＲプロトコルで使用して、ＤＮＡまたはＲＮＡからの相同遺伝子をコードするより長い核酸断片を増幅してもよい。１つのプライマーの配列が本開示の核酸断片に由来する、クローンされた核酸断片ライブラリーに対して、ＰＣＲを実施してもよい。別のプライマーの配列は真核性の遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆物質の３’末端のポリアデニル酸トラクトの存在を利用する。
【０１１２】
代案としては第２のプライマー配列は、クローニングベクターに由来する配列に基づいてもよい。例えば当業者は、ＲＡＣＥプロトコル（Ｆｒｏｈｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８５：８９９８（１９８８年））に従って、ＰＣＲを使用して転写物の一点と３’または５’末端との間の領域のコピーを増幅し、ｃＤＮＡを作り出すことができる。３’および５’方向を向いたプライマーは、本開示の配列からデザインできる。市販される３’ＲＡＣＥまたは５’ＲＡＣＥシステム（例えば、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））からを使用して、特定の３’または５’ｃＤＮＡ断片を単離できる（Ｏｈａｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８６：５６７３（１９８９年）；Ｌｏｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：２１７（１９８９年））。
【０１１３】
代案としては、本明細書に記載されるΔ４デサチュラーゼ核酸断片（またはその同定されたあらゆる相同体）のいずれかを新しい改善された脂肪酸デサチュラーゼ創出のために使用してもよい。当該技術分野で良く知られているように、生体外変異誘発および選択、化学的変異誘発、「遺伝子シャフリング」法またはその他の手段を用いて、天然デサチュラーゼ遺伝子の変異を達成できる。さらに改善された脂肪酸をドメイン交換によって合成してもよく、本明細書に記載されるΔ４デサチュラーゼ核酸断片のいずれかからの機能ドメインが代案のデサチュラーゼ遺伝子の機能ドメインで交換され、それによって新しいタンパク質がもたらされる。
【０１１４】
様々なω−３および／またはω−６脂肪酸の製造法
適切なプロモーター制御下において、本明細書に記載されるΔ４デサチュラーゼ（すなわちＥ１５９４Ｄ４、Ｅ１５９４Ｄ４Ｓまたはその他の変異酵素、コドン最適化された酵素またはその相同体）をコードするキメラ遺伝子の導入は、形質転換宿主生物中にそれぞれＤＰＡｎ−６および／またはＤＨＡの増大する生成をもたらすことが予期される。したがって本明細書に記載されるのは、基質が所望の脂肪酸生成物（すなわちそれぞれＤＰＡｎ−６またはＤＨＡ）に変換されるように、脂肪酸基質（すなわちＤＴＡまたはＤＰＡ）を本明細書に記載されるデサチュラーゼ酵素（例えばＥ１５９４Ｄ４、Ｅ１５９４Ｄ４Ｓ）に曝露するステップを含む、ＰＵＦＡを直接生産する方法である。
【０１１５】
より具体的には、本明細書では宿主細胞中におけるＤＨＡの生成方法が提供され、宿主細胞は、
（ｉ）アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法に基づいて、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドとの比較で少なくとも６８％の同一性を有するΔ４デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、および
（ｉｉ）ＤＰＡ源
を含み、宿主細胞はΔ４デサチュラーゼが発現されてＤＰＡがＤＨＡに変換されるような条件下で生育されて、ＤＨＡが任意に回収される。
【０１１６】
当業者は、Δ４デサチュラーゼの広い基質範囲によって、ＤＴＡからＤＰＡｎ−６への変換のために本酵素がさらに使用できるかもしれないことを認識するであろう。したがって本明細書に記載されるのはまた、ＤＰＡｎ−６を生成する方法であり、宿主細胞は、
（ｉ）アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法に基づいて、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドとの比較で少なくとも６８％の同一性を有するΔ４デサチュラーゼポリペプチドをコードする単離されたヌクレオチド分子、および
（ｉｉ）ＤＴＡ源
を含み、宿主細胞はΔ４デサチュラーゼが発現されてＤＴＡがＤＰＡｎ−６に変換されるような条件下で生育されて、ＤＰＡｎ−６が任意に回収される。
【０１１７】
上記方法のどちらかで基質として使用されるＤＴＡまたはＤＰＡ源は天然または遺伝子導入宿主のどちらかによって産生されてもよく、または基質は外来性で提供されてもよい。特に本明細書に記載されるΔ４デサチュラーゼ（例えばＥ１５９４Ｄ４、Ｅ１５９４Ｄ４Ｓまたはその他の変異酵素、コドン最適化された酵素またはその相同体）をΔ６デサチュラーゼ、Ｃ１８／２０エロンガーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Ｃ１４／１６エロンガーゼ、Ｃ１６／１８エロンガーゼ、Δ９エロンガーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼおよび／またはＣ２０／２２エロンガーゼなどのＰＵＦＡ生合成経路の酵素をコードする追加的遺伝子と併せて発現させて、ＤＰＡｎ−６および／またはＤＨＡの生成をもたらしてもよいことが考察される。特定の発現カセットに含まれる特定の遺伝子は、宿主細胞（およびそのＰＵＦＡプロフィールおよび／またはデサチュラーゼ／エロンガーゼプロフィール）、基質可用性、および所望の最終産物に左右される。
【０１１８】
代案の実施態様では、本明細書に記載される完全配列、これらの完全配列の補体、これらの配列のかなりの部分、それから誘導されるコドン最適化されたデサチュラーゼ、および実質的にそれと相同的な配列に基づいて、宿主生物の天然Δ４デサチュラーゼを中断することが有用かもしれない。
【０１１９】
発現系、カセット、およびベクター
本明細書に記載される遺伝子および遺伝子産物は、異種の宿主細胞中で発現されてもよい。組み換え宿主中における発現は、様々なＰＵＦＡ経路中間体を生成するのに、または今まで宿主を使用して可能でなかった新しい生成物を合成するため宿主中の既存ＰＵＦＡ経路を調節するのに、有用かもしれない。
【０１２０】
外来性タンパク質の高レベルの発現を誘導する制御配列を含有する、発現系および発現ベクターについては良く知られている。これらのいずれかを使用して、本配列の遺伝子産物のいずれかを生成するためのキメラ遺伝子を構築できる。次にこれらのキメラ遺伝子を形質転換を通じて適切な宿主細胞に導入し、コードされる酵素の高レベルの発現を提供できる。
【０１２１】
適切な宿主細胞の形質転換のために有用なベクター（例えばコンストラクト、プラスミド）およびＤＮＡ発現カセットについては、良く知られている。コンストラクト中に存在する配列の特定の選択は、所望の発現産物（前出）、宿主細胞の性質、および形質転換細胞と非形質転換細胞を分離する提案される手段に左右される。しかし典型的にベクターは、少なくとも１つの発現カセット、選択可能なマーカー、および配列を含有して、自律複製または染色体の組み込みを可能にする。適切な発現カセットは、転写開始を制御する遺伝子の５’領域、すなわちプロモーターと、遺伝子コード配列と、転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’領域、すなわちターミネーターとを含む。双方の制御領域が、形質転換宿主細胞からの遺伝子に由来することが最も好ましいが、このような制御領域は必ずしも生産宿主として選択された特定種に天然の遺伝子に由来しないことを理解すべきである。
【０１２２】
所望の宿主細胞中におけるΔ４デサチュラーゼＯＲＦの発現を進めるのに有用な転写制御領域またはプロモーターは数多く、良く知られている。これらの制御領域は、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、イントロン配列、３’ＵＴＲおよび／または５’ＵＴＲ領域、およびタンパク質および／またはＲＮＡ安定化因子を含んでもよい。このような因子は、それらの強度および特異性が異なっていてもよい。選択される宿主細胞中でこれらの遺伝子の発現を誘導できる実質的にあらゆるプロモーター（すなわち天然、合成、またはキメラ）が適切であるが、宿主種からの転写および翻訳領域が特に有用である。宿主細胞中の発現は、誘導的または構成的様式で起きることができる。誘導的発現は関心のある遺伝子と作動的に連結する制御可能プロモーター活性を誘導することによって起き、一方構成的発現は関心のある遺伝子と作動的に連結する構成的プロモーターの使用によって起きる。
【０１２３】
宿主細胞が例えば酵母である場合、酵細胞中で機能する転写および翻訳領域が、特に宿主種から提供される。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で使用するのに好ましい転写開始調節領域については、国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットを参照されたい。構成的または誘導的転写が所望されるかどうか、関心のあるＯＲＦを発現するプロモーターの効率、構築の容易さなどに応じて、いくつかの制御配列のいずれを使用してもよい。
【０１２４】
転写終結シグナルコードする３’非コード配列、すなわち「終結領域」が、組み換えコンストラクト中に提供されなくてはならず、それから開始領域が得られた遺伝子の３’領域由来のもの、または異なる遺伝子からのものであってもよい。多数の終結領域が知られており、それらが由来するのと同一のおよび異なる属および種のどちらで利用しても、多様な宿主中で満足に機能する。終結領域は通常、特定の特質のためでなく、より便宜的に選択される。終結制御領域はまた、好ましい宿主に天然の様々な遺伝子に由来してもよい。当業者は入手できる情報を利用して、転写ターミネーターとして機能する３’領域配列をデザインおよび合成できるので、３’領域はまた合成することもできる。終結領域は不要かもしれないが、高度に好ましい。
【０１２５】
デサチュラーゼなどの遺伝子をクローニングベクターに単に挿入することは、所望の速度、濃度、量などでのその発現を保証しない。高発現率に対する必要に応えて、転写、ＲＮＡ安定性、翻訳、タンパク質安定性および位置、酸素制限、および宿主細胞からの分泌を制御する、いくつかの異なる遺伝的要素を操作することにより、多数の特殊発現ベクターが作り出されている。操作される特徴のいくつかはとしては、関連転写プロモーターおよびターミネーター配列の性質、クローンされた遺伝子のコピー数（プラスミドコピー数を増大させることで、または複数のクローンされた遺伝子をゲノムに組み込むことで、追加的コピーを単一発現コンストラクト中にクローンしてもよく、および／または追加的コピーを宿主細胞に導入してもよい）、遺伝子がプラスミド由来であるかまたは宿主細胞ゲノムに組み込まれるかどうか、合成される外来性タンパク質の最終細胞内所在、宿主生物中のタンパク質の翻訳および正確な折りたたみの効率、宿主細胞中のクローンされた遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパク質の固有の安定性、およびその頻度が宿主細胞の好むコドン使用頻度に近づくようなクローンされた遺伝子中のコドン使用頻度が挙げられる。これらのそれぞれを本明細書に記載される方法および宿主細胞で使用して、Δ４デサチュラーゼの発現をさらに最適化してもよい。
【０１２６】
宿主細胞の形質転換
例えばプロモーター、ＯＲＦ、およびターミネーターを含むキメラ遺伝子を含む組み換えコンストラクトを作り出した後、それを宿主細胞中で自律複製できるプラスミドベクターに入れ、またはそれを宿主細胞のゲノムに直接組み込む。発現カセットの組み込みは、宿主ゲノム中で無作為に起きることができ、または宿主遺伝子座での遺伝子組み換えを標的とするのに十分な宿主ゲノムとの相同性領域を含有するコンストラクトの使用を通じて、標的を定めることができる。コンストラクトが内在性遺伝子座に標的を定めれば、全てまたはいくつかの転写および翻訳調節領域を内在性遺伝子座によって提供できる。
【０１２７】
別々の複製ベクターから２つ以上の遺伝子が発現する場合、各ベクターは異なる選択手段を有してもよく、他のコンストラクトに対する相同性を欠いて、安定した発現を維持し、コンストラクト中の要素の再集合を防止すべきである。調節領域、選択手段、および導入コンストラクト増殖方法の思慮深い選択は、全ての導入された遺伝子が必要なレベルで発現して、所望の生成物の合成を提供するように実験的に判定できる。
【０１２８】
対象とする遺伝子を含むコンストラクトは、あらゆる標準的技術によって宿主細胞に導入してもよい。これらの技術としては、形質転換、例えば酢酸リチウム形質転換（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１９４：１８６〜１８７（１９９１年））、プロトプラスト融合、微粒子銃衝撃、電気穿孔、マイクロインジェクション、真空ろ過、または宿主細胞中に対象とする遺伝子を導入するその他のあらゆる方法が挙げられる。
【０１２９】
便宜上、例えば発現カセット中のＤＮＡ配列を取り込むように、あらゆる方法によって操作されている宿主細胞を本明細書では「形質転換された」または「組み換え」と称する。形質転換された宿主は、発現カセットがゲノム中に組み込まれるか、増幅されるか、または複数のコピー数を有する染色体外要素上に存在するかどうか次第で、発現カセットの少なくとも１つのコピーを有し、２つ以上を有してもよい。形質転換宿主細胞は、米国特許第７，２３８，４８２号明細書および米国特許第７，２５９，２５５号明細書に記載されるような、様々な選択技術によって同定できる。
【０１３０】
形質転換に続いて、Δ４デサチュラーゼに適した基質（および任意に宿主細胞中で同時発現されるその他のＰＵＦＡ酵素）が宿主によって自然にまたは遺伝子導入的に産生されてもよく、またはそれらは外来性で提供されてもよい。
【０１３１】
ω−３および／またはω−６脂肪酸生合成の代謝エンジニアリング
本Δ４デサチュラーゼ配列の知識は、様々な宿主細胞中でω−３および／またはω−６脂肪酸生合成を操作するのに有用であろう。これはＰＵＦＡ生合成経路内の直接的な代謝エンジニアリング、または炭素をＰＵＦＡ生合成経路に寄与する経路の追加的操作を必要とするかもしれない。
【０１３２】
望ましい生化学的経路をアップレギュレートし、望ましくない生化学的経路をダウンレギュレートするのに有用な技術については、当該技術分野で良く知られている。例えばエネルギーまたは炭素についてω−３および／またはω−６脂肪酸生合成経路と競合する生化学的経路、または特定のＰＵＦＡ最終産物の生成を妨げる天然ＰＵＦＡ生合成経路酵素を遺伝子破壊によって排除してもよく、またはアンチセンスｍＲＮＡおよび亜鉛フィンガー標的技術などのその他の手段によってダウンレギュレートしてもよい。
【０１３３】
国際公開第２００６／０３３７２３号パンフレット、国際公開第２００６／０５５３２２号パンフレット[米国特許出願公開第２００６−００９４０９２−Ａ１号明細書]、国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット[米国特許出願公開第２００６−０１１５８８１−Ａ１号明細書]、および国際公開第２００６／０５２８７１号パンフレット[米国特許出願公開第２００６−０１１０８０６−Ａ１号明細書]は、ＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡまたはＤＨＡをそれぞれ増大させる手段としてのＰＵＦＡ生合成経路の改変、およびＴＡＧ生合成経路中およびＴＡＧ分解経路中の望ましい操作についてそれぞれ検討している。
【０１３４】
Δ４デサチュラーゼの組み換え発現のための好ましい宿主
多様な真核生物が宿主として適切であり、それによって本明細書に記載されるようにΔ４デサチュラーゼを含む形質転換宿主生物を生じる。これらとしては、広い温度およびｐＨ値範囲にわたって、単純または複合糖質、脂肪酸、有機酸、油、グリセロールおよびアルコール、および／または炭化水素をはじめとする多様な原材料で生育する宿主が挙げられる。本明細書に記載される遺伝子は出願人らの譲受人のニーズに基づき、最初は油性酵母（特にヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））中での発現のために単離された。しかし転写、翻訳、およびタンパク質生合成器管は高度に保存されているので、あらゆる細菌、酵母、藻類、ストラメノパイル、卵菌類、ユーグレナ属および／または真菌が本核酸断片の発現に適切な宿主になるであろうことが考察される。
【０１３５】
好ましい宿主は、油性酵母などの油性生物である。これらの油性生物は、自然に油を合成および蓄積でき、総油分は、約２５％を超える細胞乾燥重量、より好ましくは約３０％を超える細胞乾燥重量、および最も好ましくは約４０％を超える細胞乾燥重量を構成できる。様々な藻類、コケ、真菌、酵母、およびストラメノパイルが天然油性に分類される。油性酵母菌として典型的に同定されている属としては、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。より具体的には、例示的な油合成酵母菌としては、ロドスポリジウム・トルイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポマイセス・スターケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、Ｌ．リポフェラス（Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕｓ）、カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．プルケリマ（Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ユチリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、トリコスポロン・プランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドトルラ・グルティナス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ）、Ｒ．グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（以前はカンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）として分類されていた）が挙げられる。
【０１３６】
最も好ましいのは油性酵母菌ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）であり、さらなる実施態様で最も好ましいのは、ＡＴＣＣ＃７６９８２、ＡＴＣＣ＃２０３６２、ＡＴＣＣ＃８８６２、ＡＴＣＣ＃１８９４４、および／またはＬＧＡＭＳ（７）１と称されるＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株である（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ  Ｓ．、およびＡｇｇｅｌｉｓ  Ｇ．、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．８２（１）：４３〜９（２００２年））。
【０１３７】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換に関する具体的教示は、米国特許第４，８８０，７４１号明細書、米国特許第５，０７１，７６４号明細書、およびＣｈｅｎ，Ｄ． Ｃ．ら（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４８（２）：２３２〜２３５（１９９７年））に含まれる。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中でＡＲＡ、ＥＰＡ、およびＤＨＡを改変するのに応用できる特定の教示は、国際公開第２００６／０５５３２２号パンフレット、国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット、および国際公開第２００６／０５２８７１号パンフレットでそれぞれ提供される。油性酵母（すなわちヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））中における、Δ４デサチュラーゼを含む発現ベクターの合成および形質転換の詳細な手段は、国際公開第２００６／０５２８７１号パンフレットで提供される。
【０１３８】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で遺伝子を発現する好ましい方法は宿主の線状ＤＮＡのゲノムへの組み込みによる。Ｕｒａ３遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ３０６４２１）、Ｌｅｕ２遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ２６０２３０）、Ｌｙｓ５遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３４９２９）、Ａｃｏ２遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ００１３００）、Ｐｏｘ３遺伝子遺伝子座（Ｐｏｘ３：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＰ_５０３２４４；または、Ａｃｏ３：ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ００１３０１）、Δ１２デサチュラーゼ遺伝子遺伝子座（国際公開第２００４／１０４０６７号パンフレット）、Ｌｉｐ１遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ５００２０）、Ｌｉｐ２遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ０１２６３２）、ＳＣＰ２遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ４３１３６２）、Ｐｅｘ３遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７８５６５）、Ｐｅｘ１６遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ７９６２２）および／またはＰｅｘ１０遺伝子遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＣＡＧ８１６０６）中などのゲノム内の複数位置への組み込みは、遺伝子の高レベル発現が所望される場合に特に有用であり得る。
【０１３９】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において使用される好ましい選択方法は、カナマイシン、ハイグロマイシン、およびアミノグリコシドＧ４１８に対する抵抗性、ならびにウラシル、ロイシン、リジン、トリプトファンまたはヒスチジンを欠く培地に生育する能力である。５−フルオロオロト酸［５−フルオロウラシル−６−カルボン酸一水和物；「５−ＦＯＡ」］もまた、酵母Ｕｒａ−突然変異体の選択のために使用され得る。この化合物はオロチジン５’−一リン酸デカルボキシラーゼ［ＯＭＰデカルボキシラーゼ］をコードする機能性ＵＲＡ３遺伝子を有する酵母細胞に対して有毒である。したがってこの毒性に基づいて、５−ＦＯＡはＵｒａ−突然変異酵母株の選択および同定のために特に有用である（Ｂａｒｔｅｌ，Ｐ．Ｌ．およびＦｉｅｌｄｓ，Ｓ．、「Ｙｅａｓｔ  ２−Ｈｙｂｒｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ」、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、第７巻、１０９〜１４７、１９９７年；ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）における５−ＦＯＡについての国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレットも参照）。
【０１４０】
その他の微生物宿主としては、油性の細菌、藻類、ユーグレナ属、ストラメノパイル、およびその他の真菌が挙げられ、この大きな微生物宿主グループ内で特に興味深いのは、天然でω−３／ω−６脂肪酸を産生する微生物である。例えばキクロテラ（Ｃｙｃｌｏｔｅｌｌａ）種、ニッチア（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ）種、クサレカビ（Ｐｙｔｈｉｕｍ）、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種、およびモルティエラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）によってＡＲＡ、ＥＰＡおよび／またはＤＨＡが生成される。したがって例えば（Δ１７デサチュラーゼおよびＣ２０／２２エロンガーゼに加えて）誘導性プロモーターまたは調節プロモーターの制御下における、本Δ４デサチュラーゼ遺伝子のいずれかによる、ＡＲＡの生成のために商業的に使用されるモルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）の形質転換は、ＤＨＡを合成できる形質転換生物を生じることができる。Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）の形質転換法については、Ｍａｃｋｅｎｚｉｅら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６６：４６５５（２０００年））によって記載される。同様にヤブレツボカビ目（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉａｌｅｓ）微生物（例えばスラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、シゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ））の形質転換法は、米国特許第７，００１，７７２号明細書で開示されている。
【０１４１】
代案の実施態様では、宿主は植物またはその他の動物であってもよい。例えばダイズ（ＧｌｙｃｉｎｅおよびＳｏｊａ種）、コーン（Ｚｅａ  ｍａｙｓ），亜麻（Ｌｉｎｕｍ種）、ナタネ（Ｂｒａｓｓｉｃａ種）、月見草、カノーラ、トウモロコシ、綿、紅花（Ｃａｒｔｈａｍｕｓ種）およびヒマワリ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ種）をはじめとするＰＵＦＡ生成のために容易に改変し得る油種子植物を使用する。例えば米国特許出願公開第２００７−０２３７８７６Ａ１号明細書を参照されたい。
【０１４２】
選択される宿主または発現コンストラクトにかかわらず、複数の形質転換体をスクリーンして所望の発現レベル、制御、およびパターンを示す株を得なくてはならない。このようなスクリーニングは、ＤＮＡブロットのサザン分析（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、９８：５０３（１９７５年））、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析（Ｋｒｏｃｚｅｋ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｐｐｌ．、６１８（１〜２）：１３３〜１４５（１９９３年））、タンパク質発現のＷｅｓｔｅｒｎおよび／またはＥｌｉｓａ分析、ＰＵＦＡ生成物の表現型分析またはＧＣ分析によって達成されてもよい。
【０１４３】
ω脂肪酸生成の発酵工程
形質転換された宿主細胞は、キメラデサチュラーゼ遺伝子の発現を最適化する条件下で生育させて、最大かつ最も経済的な所望のＰＵＦＡ収率を生じさせる。一般に、修正により最適化されてもよい培地条件としては、炭素源のタイプおよび量、窒素源のタイプおよび量、炭素−対−窒素比、異なる無機イオンの量、酸素レベル、生育温度、ｐＨ、バイオマス生成相の長さ、油蓄積相の長さ、および細胞収穫時間および方法が挙げられる。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のような対象の油性酵母は、一般に酵母菌抽出物−ペプトン−デキストロース液体培地（ＹＰＤ）のような複合培地で、または生育に必要な構成要素が欠如しており、それによって所望の発現カセットの選択を強要する合成最少培地（例えばＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）からの酵母菌窒素ベース）上で生育させる。
【０１４４】
本明細書に記載されている方法および宿主細胞のための発酵培地は、米国特許第７，２３８，４８２号明細書で教示されているものなどの適切な炭素源を含有しなくてはならない。適切な炭素源としては多種多様な原料が挙げられ、糖、グリセロールおよび／または脂肪酸が好ましい。最も好ましいのはグルコースおよび／または１０〜２２個の間の炭素を含有する脂肪酸である。
【０１４５】
窒素は、無機（例えば（ＮＨ４）２ＳＯ４）または有機（例えば尿素またはグルタミン酸）源から供給されてもよい。適切な炭素および窒素源に加えて、発酵培地はまた、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液、ビタミン、および油性宿主の生育と、ＰＵＦＡ生成の酵素的経路の促進とに適した、当業者に既知であるその他の構成要素を含有しなくてはならない。脂質およびＰＵＦＡの合成を促進する、Ｆｅ＋２、Ｃｕ＋２、Ｍｎ＋２、Ｃｏ＋２、Ｚｎ＋２、Ｍｇ＋２のようないくつかの金属イオンが注目されている（Ｄ．Ｊ．ＫｙｌｅおよびＲ．Ｃｏｌｉｎ編、「Ｉｎｄ．Ａｐｐｌ．Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｏｉｌ」より、Ｎａｋａｈａｒａ，Ｔ．ら、６１〜９７（１９９２年）。
【０１４６】
本明細書に記載されている方法および宿主細胞のための好ましい増殖培地は、ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）からの酵母菌窒素ベースなどの一般的な市販の調製培地である。その他の合成または人工増殖培地もまた使用されてもよく、形質転換宿主細胞の生育に適する培地は、微生物学または発酵科学の当業者に知られている。発酵に適したｐＨ範囲は、典型的に約ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０の間であり、ｐＨ５．５〜ｐＨ７．５が初期生育条件の範囲として好ましい。発酵は好気性または好気性条件下で実施されてもよく、微好気条件が好ましい。
【０１４７】
典型的に油性酵母菌細胞中のＰＵＦＡおよびＴＡＧの高レベルの蓄積は、代謝状態が生育と脂肪合成／貯蔵との間で「平衡状態」でなくてはならないので、二段階過程を必要とする。したがって最も好ましくは、油性酵母中のＰＵＦＡを含む油の生成には、二段階発酵過程が必要である。このアプローチについては米国特許第７，２３８，４８２号明細書に記載され、様々な適切な発酵過程デザイン（すなわちバッチ、供給バッチ、および連続）および成育中の考察事項についても同様に述べられる。
【０１４８】
ＰＵＦＡの精製および加工
ＰＵＦＡをはじめとする脂肪酸は、遊離脂肪酸として、またはアシルグリセロール、リン脂質、スルホ脂質または糖脂質などのエステル化形態体で、宿主微生物中にあってもよい。これらの脂肪酸は、当該技術分野で良く知られている多様な手段を通じて、宿主細胞から抽出されてもよい。酵母脂質の抽出技術、品質分析、および許容基準の１つのレビューは、Ｚ．Ｊａｃｏｂｓ（Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２（５／６）：４６３〜４９１（１９９２年））である。Ａ．ＳｉｎｇｈおよびＯ．Ｗａｒｄ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４５：２７１〜３１２（１９９７年））による後処理プロセスの簡潔なレビューもまた入手できる。
【０１４９】
一般に（ＰＵＦＡをはじめとする）脂肪酸を精製する手段としては、有機溶剤を用いた抽出（例えば米国特許第６，７９７，３０３号明細書および米国特許第５，６４８，５６４号明細書）、超音波処理、（例えば二酸化炭素を使用した）超臨界流体抽出、鹸化、および加圧などの物理的手段、またはそれらの組み合わせが挙げられる。米国特許第７，２３８，４８２号明細書を参照されたい。
【０１５０】
食材、健康食品、医薬品、および動物飼料で使用されるＰＵＦＡ
市場には、ω−３および／またはω−６脂肪酸、特にＡＬＡ、ＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡを組み込んだ多数の食品および飼料製品がある。本明細書に記載される方法および宿主細胞によって作られた長鎖ＰＵＦＡを含む油性酵母由来資源、ＰＵＦＡを含む部分的精製生物由来資源、ＰＵＦＡを含む精製油、および／または精製ＰＵＦＡは、それらの添加により改善された食品または飼料の摂取に際して健康上の利点を与えることが考察される。これらの油は、数例を挙げると類似食品、飲料、肉製品、穀物製品、ベークド食品、スナック食品、および乳製品に添加することができる。米国特許出願公開第２００６−００９４０９２号明細書を参照されたい。
【０１５１】
これらの組成物は、医療栄養物、栄養補助食品、乳児用調製粉乳、および医薬品をはじめとするメディカルフードに添加されることで、健康上の利点を与えてもよい。当業者は、健康上の利点を与えるために、食品、飼料、栄養補助食品、栄養補給食品、医薬品、およびその他の摂取可能な製品に添加されるべき油の量を認識するであろう。これらの油を摂取することの健康上の利点は、当該技術分野において記載されており、継続的に研究されている。このような量は本明細書では「効果的」量と称され、とりわけこれらの油を含有する摂取される製品の性質、およびそれらが対処することが意図される健康状態に左右される。
【実施例】
【０１５２】
本発明の具体化を例示するが、その可能なバリエーション全てを完全に定義するものではない以下の実施例において、本発明をさらに説明する。
【０１５３】
一般方法
実施例で使用する標準組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野でよく知られており、１．）Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９年）（Ｍａｎｉａｔｉｓ）；２．）Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ、Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ、およびＬ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ、「Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８４年）；および３．）Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる出版、Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ（１９８７年）に記載されている。
【０１５４】
微生物培養の維持および生育に適した材料および方法は、技術分野でよく知られている。以下の実施例で使用するのに適した技術については、以下に記載されている。Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ、Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ、Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ、Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ、Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ、Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ、およびＧ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ編、「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４年）、またはＴｈｏｍａｓ，Ｄ．Ｂｒｏｃｋ、「Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」、第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９年）。微生物細胞の生育および維持のために使用される全ての試薬制限酵素および材料は、特に断りのない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、またはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）コンピテント細胞は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、典型的にルリア・ベルターニ（Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）プレート上で３７℃で生育させた。
【０１５５】
一般分子クローニングは、標準法に従って実施された（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）。ＤＮＡ配列は、染料ターミネーター技術（米国特許第５，３６６，８６０号明細書、欧州特許第２７２，００７号明細書）を使用し、ベクターおよび挿入断片特異的プライマーの組み合わせを使用して、ＡＢＩ  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ配列決定装置上で作成した。配列編集はＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ））内で実施した。全ての配列は、両方向に少なくとも２回のカバレッジに相当する。遺伝子配列の比較は、特に断りのない限り、ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））を使用して達成した。
【０１５６】
略語の意味は以下の通り。「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」はマイクロモル濃度を意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋＢ」はキロベースを意味する。
【０１５７】
発現カセットの命名法
発現カセットの構造は単純な表記体系「Ｘ：：Ｙ：：Ｚ」によって表され、Ｘはプロモーター断片を記述し、Ｙは遺伝子断片を記述し、Ｚはターミネーター断片を記述し、それらは全て互いに作動的に連結する。
【０１５８】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換および培養
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２株はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、下に示す処方に従った数種の培地中で、慣例的に２８〜３０℃で生育させた。寒天プレートは、標準法に従って各液体培地に２０ｇ／Ｌ寒天を添加することによって、必要に応じて調製した。
【０１５９】
ＹＰＤ寒天培地（１Ｌあたり）：１０ｇ酵母抽出物［Ｄｉｆｃｏ］；２０ｇのＢａｃｔｏペプトン［Ｄｉｆｃｏ］；および２０ｇグルコース。
【０１６０】
基礎最少培地（ＭＭ）（１Ｌあたり）：２０ｇグルコース；１．７ｇアミノ酸非含有酵母窒素ベース；１．０ｇプロリン；およびｐＨ６．１（未調節）。
【０１６１】
最少培地＋ウラシル（ＭＭ＋ウラシルまたはＭＭＵ）（１Ｌあたり）：ＭＭ培地を上のように調製して、０．１ｇウラシルおよび０．１ｇウリジンを添加する。
【０１６２】
高グルコース培地（ＨＧＭ）（１Ｌあたり）：８０グルコース；２．５８ｇのＫＨ２ＰＯ４；５．３６ｇのＫ２ＨＰＯ４；ｐＨ７．５（調節の必要なし）。
【０１６３】
Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換は、特に断りのない限りＣｈｅｎ，Ｄ．Ｃ．ら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４８（２）：２３２〜２３５（１９９７年）の方法に従って実施した。簡単に述べると、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）をＹＰＤプレート上に画線培養し、３０℃でおよそ１８時間生育させた。いくつかの大型白金耳を満たす細胞をプレートからこすり取り、平均分子量３３５０の２．２５ｍＬの５０％ＰＥＧ、ｐＨ６．０の０．１２５ｍＬの２Ｍ酢酸Ｌｉ、および０．１２５ｍＬの２Ｍ  ＤＴＴを含有する１ｍＬの形質転換緩衝液に再懸濁した。次に約５００ｎｇの直線化プラスミドＤＮＡを１００μＬの再懸濁細胞内でインキュベートし、１５分間隔でボルテックス混合しながら３９℃に１時間保った。細胞を選択培地プレートに蒔いて、３０℃に２〜３日間保った。
【０１６４】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１８４Ｕ株の単離
国際公開第２００８／０７３３６７号パンフレットの実施例７に記載されるようにして、Δ９エロンガーゼ／Δ８デサチュラーゼ経路の発現を通じて、総脂質と比較してＥＰＡを産生するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１８４株を作り出した。簡単に述べると、図５に略図で示すように、Ｙ４１８４株は、Ｙ２２２４株（野生型ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２株のＵｒａ３遺伝子の自律突然変異からのＦＯＡ抵抗性変異体）、Ｙ４００１株（Ｌｅｕ−表現型が１７％ＥＤＡを産生する）、Ｙ４００１Ｕ１株（Ｌｅｕ−およびＵｒａ−）、Ｙ４０３６株（Ｌｅｕ−表現型が１８％ＤＧＬＡを産生する）、Ｙ４０３６Ｕ株（Ｌｅｕ−およびＵｒａ−）、Ｙ４０６９株（Ｕｒａ−表現型が１２％ＡＲＡを産生する）、Ｙ４０８４株（１４％ＥＰＡを産生する）、Ｙ４０８４Ｕ１株（Ｕｒａ−）、Ｙ４１２７株（１８％ＥＰＡを産生し、２００７年１１月２９日に米国微生物系統保存機関に登録番号ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−８８０２の下に寄託された）、Ｙ４１２７Ｕ２株（Ｕｒａ−）、Ｙ４１５８株（２５％ＥＰＡを産生する）、Ｙ４１５８Ｕ１株（Ｕｒａ−を産生する）、およびＹ４１８４株（総ＴＦＡと比較して３０．７％ＥＰＡを産生する）の構築を通じて、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２から誘導された。
【０１６５】
野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２と比較したＹ４１８４株の最終遺伝子型は、ｕｎｋｎｏｗｎ  １−、ｕｎｋｎｏｗｎ  ２−、ｕｎｋｎｏｗｎ  ３−、ｕｎｋｎｏｗｎ  ４−、ｕｎｋｎｏｗｎ  ５−、ｕｎｋｎｏｗｎ  ６−、ＹＡＴ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＥＸＰ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０（２コピー）、ＧＰＡＴ：：ＥｇＤ９ｅ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＧＰＤ：：ＥｇＤ９ｅＳ：：Ｌｉｐ２、ＧＰＤＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ１６、ＦＢＡＩＮｍ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ８Ｍ：：Ｌｉｐ１（２コピー）、ＧＰＭ／ＦＢＡＩＮ：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ｏｃｔ、ＥＸＰ１：：ＦｍＤ１２Ｓ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＦｍＤ１２：：Ｏｃｔ、ＧＰＤ：：ＦｍＤ１２：：Ｐｅｘ２０、ＥＸＰ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ｐｅｘ２０、ＹＡＴ１：：ＥｇＤ５Ｓ：：Ａｃｏ、ＹＡＴ１：：ＲＤ５Ｓ：：Ｏｃｔ、ＦＢＡＩＮ：：ＥｇＤ５：：Ａｃｏ、ＦＢＡＩＮｍ：：ＰａＤ１７：：Ａｃｏ、ＥＸＰ１：：ＰａＤ１７：：Ｐｅｘ１６、ＹＡＴ１：：ＰａＤ１７Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＹＡＴ１：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏ、ＧＰＤ：：ＹｌＣＰＴ１：：Ａｃｏであった（配列中ＦｍＤ１２はフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１２デサチュラーゼ遺伝子[国際公開第２００５／０４７４８５号パンフレット]であり；ＦｍＤ１２Ｓはフザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）に由来するコドン最適化されたΔ１２デサチュラーゼ遺伝子[国際公開第２００５／０４７４８５号パンフレット]であり；ＭＥ３Ｓはモルティエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）に由来するコドン最適化されたＣ１６／１８エロンガーゼ遺伝子[国際公開第２００７／０４６８１７号パンフレット]であり；ＥｇＤ９ｅはミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ９エロンガーゼ遺伝子[国際公開第２００７／０６１７４２号パンフレット]であり；ＥｇＤ９ｅＳはミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来するコドン最適化されたΔ９エロンガーゼ遺伝子[国際公開第２００７／０６１７４２号パンフレット]であり；ＥｇＤ８Ｍはミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）[米国特許第７，２５６，０３３号明細書]に由来する合成変異Δ８デサチュラーゼ[国際公開第２００８／０７３２７１号パンフレット]であり；ＥｇＤ５はミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ５デサチュラーゼ[米国特許出願公開第２００７−０２９２９２４−Ａ１号明細書]であり；ＥｇＤ５Ｓはミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）に由来するコドン最適化されたΔ５デサチュラーゼ遺伝子[米国特許出願公開第２００７−０２９２９２４号明細書]であり；ＲＤ５Ｓはペリディニウム（Ｐｅｒｉｄｉｎｉｕｍ）種ＣＣＭＰ６２６に由来するコドン最適化されたΔ５デサチュラーゼ[米国特許出願公開第２００７−０���７１６３２号明細書]であり；ＰａＤ１７はピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）Δ１７デサチュラーゼ[国際公開第２００８／０５４５６５号パンフレット]であり；ＰａＤ１７Ｓはピシウム・アファニデルマタム（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ａｐｈａｎｉｄｅｒｍａｔｕｍ）に由来するコドン最適化されたΔ１７デサチュラーゼ[国際公開第２００８／０５４５６５号パンフレット]であり；ＹｌＣＰＴ１はヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ジアシルグリセロールコリンリン酸転移酵素遺伝子[国際公開第２００６／０５２８７０号パンフレット]である）。
【０１６６】
最後に、Ｙ４１８４株中のＵｒａ３遺伝子を中断するために、コンストラクトｐＺＫＵＥ３Ｓ（国際公開第２００８／０７３３６７号パンフレットの表２２に記載される）を使用して、ＥＸＰ１：：ＭＥ３Ｓ：：Ｐｅｘ２０キメラ遺伝子をＹ４１８４株のＵｒａ３遺伝子に組み込んで、それぞれＹ４１８４Ｕ１株（総脂質の１１．２％のＥＰＡ）、Ｙ４１８４Ｕ２株（総脂質の１０．６％のＥＰＡ）、およびＹ４１８４Ｕ４株（総脂質の１５．５％のＥＰＡ）をもたらす（集合的にＹ４１８４Ｕ）。
【０１６７】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の脂肪酸分析
脂肪酸分析のために、Ｂｌｉｇｈ，Ｅ．Ｇ．およびＤｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．、Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：９１１〜９１７（１９５９年）に記載されているように、細胞を遠心分離して収集し、脂質を抽出した。ナトリウムメトキシドでの脂質抽出物のエステル交換反応によって、脂肪酸メチルエステル［「ＦＡＭＥ」］を調製し（Ｒｏｕｇｈａｎ，Ｇ．およびＮｉｓｈｉｄａ，Ｉ．、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．２７６（１）：３８〜４６（１９９０年））、引き続きＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄからの３０ｍ×０．２５ｍｍ（内径）ＨＰ−ＩＮＮＯＷＡＸカラムを装着したＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣで分析した。オーブン温度は３．５℃／分で、１７０℃（２５分間保持）から１８５℃であった。
【０１６８】
直接塩基エステル交換のために、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）培養物（３ｍＬ）を収集し、蒸留水で１回洗浄し、スピードバック（Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ）内で真空下において５〜１０分乾燥させた。ナトリウムメトキシド（１００μＬの１％）をサンプルに添加して、次にサンプルをボルテックスし２０分間振盪した。３滴の１Ｍ  ＮａＣｌおよび４００μＬのヘキサンを添加した後、サンプルをボルテックスして遠心分離した。上層を除去して上述のようにＧＣで分析した。
【０１６９】
実施例１
ユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４脂質プロフィール、全ＲＮＡ単離およびゲノムＤＮＡ単離
ユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４細胞（１Ｌの培養物）をＰｒｏｖａｓｏｌｉ−Ｇｕｉｌｌａｒｄ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｍａｒｉｎｅ  Ｐｈｙｔｏｐｌａｎｋｔｏｎ（ＣＣＭＰ）（Ｂｉｇｅｌｏｗ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｏｃｅａｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，（Ｗｅｓｔ  Ｂｏｏｔｈｂａｙ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ））から購入した。メタノールに溶解された６００μｌのナトリウムメトキシドに、５０ｍＬ培養物からの細胞を再懸濁した。サンプルを２０分間振盪して５０μｌの１Ｍ  ＮａＣｌを添加した。混合後、６００μｌのヘプタンを添加した。サンプルをボルテックスし、エッペンドルフ微量遠心管内で１分間遠心分離した。上層を下層から注意深く分離して、ＧＣ分析のためにガラスバイアルに入れた。分析結果を表３に示す。脂肪酸は１６：０（パルミチン酸）、１６：１（パルミトレイン酸）、１８：０、１８：１（オレイン酸）、１８：２、ＧＬＡ、ＡＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡと同定され；各組成は、総脂肪酸[「ＴＦＡ」]の重量％として表される。
【０１７０】
【表４】
0005572620.tif 000005
【０１７１】
ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡの存在に基づいて、ユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４は、ＤＰＡ（２２：５、ω−３）をＤＨＡ（２２：６、ω−３）に変換できる機能性Δ４デサチュラーゼを有すると結論された。
【０１７２】
トリゾール試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を使用して製造業者のプロトコルに従って、ユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４から全ＲＮＡおよびゲノムＤＮＡを単離した。１Ｌ培養物からの細胞ペレット（体積約０．２５ｍＬ）を０．７５ｍＬのトリゾール試薬に再懸濁して、０．５ｍＬの０．５ｍｍガラスビーズと混合し、最高速に設定したＢｉｏｓｐｅｃミニビードビーター（Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，ＯＫ）内で３分間均質化した。混合物をエッペンドルフ遠心機内で１４，０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離して、残骸およびガラスビーズを除去した。上清を１５０μＬの２４：１クロロホルム：イソアミルアルコールで抽出した。上部水相をＲＮＡ単離のために使用する一方、下部有機相をＤＮＡ単離のために使用した。
【０１７３】
ＲＮＡ単離では、水相０．３７５ｍＬのイソプロピルアルコールと混合し、室温で５分間インキュベートした。沈殿したＲＮＡを８，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離して収集した。ペレットを０．７ｍＬの８０％エタノールで１回洗浄して風乾した。このようにして７２０μｇの全ＲＮＡを得た。
【０１７４】
ゲノムＤＮＡ単離では、下部有機相を７５μＬのエタノールと混合して室温で５分間インキュベートした。次にサンプルをエッペンドルフ遠心機内で５，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。ペレットを１０％エタノール中の０．７５ｍＬの０．１Ｍクエン酸ナトリウムで２回洗浄した。毎回、サンプルを洗浄液中で室温で１５分間インキュベートし、エッペンドルフ遠心機内で４℃、５，０００ｒｐｍで５分間の遠心分離がそれに続いた。ペレットを風乾して、３００μＬの８ｍＭ  ＮａＯＨに再溶解した。１Ｍ  ＨＥＰＥＳでサンプルのｐＨを７．５に調節した。次にＤＮＡサンプルをＱｉａｇｅｎＰＣＲ精製キットを用いて、製造業者のプロトコルに従ってさらに精製した。このようにしてユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４から４５μｇのゲノムＤＮＡを得た。
【０１７５】
実施例２
ユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４  ｃＤＮＡ合成
ｃＤＮＡをユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４  ｍＲＮＡから、次のようにして直接合成した。ユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４からの全ＲＮＡ（２．４μｇ）をテンプレートとして使用して、二本鎖ｃＤＮＡを合成した。ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）からのＣｒｅａｔｏｒ（商標）ＳＭＡＲＴ（商標）ｃＤＮＡライブラリー構築キットを使用した。１μＬの全ＲＮＡサンプルを１μＬのＳＭＡＲＴ  ＩＶオリゴヌクレオチド（配列番号１０）、１μＬのＣＤＳＩＩＩ／３’ＰＣＲプライマー（配列番号１１）、および２μＬの水と混合した。混合物を７５℃で５分間加熱して、次に氷上で５分間冷却した。サンプルに２μＬの５×第一鎖緩衝液、１μＬの２０ｍＭ  ＤＴＴ、１μＬのｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）、および１μＬのＰｏｗｅｒＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素を添加した。サンプルを４２℃で１ｈインキュベートした。次に得られた第一鎖ｃＤＮＡを増幅のためのテンプレートとして使用した。反応混合物は、２μＬの上記第一鎖ｃＤＮＡサンプル、８０μＬの水、１０μＬの１０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２  ＰＣＲ緩衝液、２μＬの５０×ｄＮＴＰミックス（各１０ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ）、２μＬの５’ＣＤＳＩＩＩ  ＰＣＲプライマー（配列番号１２）、２μＬのＣＤＳＩＩＩ／３’ＰＣＲプライマー（配列番号１１）、および２μＬの５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ２ポリメラーゼミックスを含有した。９５℃で１分間と、それに続く９５℃で１０秒間および６８℃で６分間を２０サイクルの条件を使用して、ＰＣＲ増幅を実施した。増幅産物をＱｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キットを用いて、製造業者のプロトコルに従って精製した。精製産物を５０μＬの水で溶出した。
【０１７６】
実施例３
ユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４Δ４デサチュラーゼ遺伝子のコード領域の一部の単離
本実施例は、その他の既知のΔ４デサチュラーゼ配列の保存領域に由来するプライマーの使用による、Δ４デサチュラーゼをコードするユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４遺伝子の一部（本明細書で「Ｅ１５９４Ｄ４」（配列番号１および２）と称する）の同定について記載する。
【０１７７】
ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）Δ４脂肪酸デサチュラーゼ（配列番号１３；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ２７８５５８；Ｍｅｙｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２（３２）：９７７９〜９７８８（２００３年））、タラシオシラ・シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）Δ４脂肪酸デサチュラーゼ（配列番号３７；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＸ１４５０６；Ｔｏｎｏｎら，ＦＥＢＳ  Ｊ．，２７２（１３）：３４０１〜３４１２（２００５年））、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種ＦＪＮ−１０Δ４脂肪酸デサチュラーゼ（配列番号３８；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＺ４３２５７）、およびパブロバ・ルセリ（Ｐａｖｌｏｖａ  ｌｕｔｈｅｒｉ）（配列番号４２；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＱ９８７９３；Ｔｏｎｏｎら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，５５３（３）：４４０〜４４４（２００３年））をＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ法を使用して、（低速、正確、Ｇｏｎｎｅｔオプション；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２：４６７３〜４６８０（１９９４年））図２に示すように位置合わせした。このアラインメントに基づいて、縮重プライマーを表４に示すようにデザインした（配列番号１３、３７、３８、および４２に対するプライマー位置を図２の枠線領域内に示す）。
【０１７８】
【表５】
0005572620.tif 000006
【０１７９】
８個の順方向および２個の逆方向プライマーのあらゆる可能な組み合わせを使用して、合計１６の異なるＰＣＲ増幅反応を実施した。各反応混合物は１μｌの１：１０希釈ユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４  ｃＤＮＡ（実施例２から）、各５μｌの順方向および逆方向プライマー（２０μＭ）、１４μｌの水、および２５μｌのＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑ  ２×プレミクス（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ，（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ））を含有した。サーモサイクラー条件を９４℃で１分間、次に９４℃で２０秒間、５５℃で２０秒間、および７２℃で１分間を３０サイクルと、それに続く７２℃で７分間の最終延長に設定した。ＰＣＲ産物を標準アガロースゲル上で電気泳動法によって分析し、推定上のΔ４デサチュラーゼ断片を下の表５に示すように検出した。
【０１８０】
【表６】
0005572620.tif 000007
【０１８１】
上の表５に記載される各断片をＱｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キット（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で精製し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローンして配列決定した。
【０１８２】
ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース（全ての非重複性ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳と、３次元構造Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎタンパク質データバンク、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質配列データベース、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪデータベースに由来する配列とを含む）に含まれる配列との類似性を求めるＢＬＡＳＴ（基本的局所アラインメント検索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍａｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３〜４１０（１９９３年））検索を行って、ユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４配列のアイデンティティを判定した。国立バイオテクノロジー情報センター[「ＮＣＢＩ」]によって提供されるＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを使用して、「ｎｒ」データベース中に含まれる全ての公的に入手可能なＤＮＡ配列との類似性について配列を分析した。
【０１８３】
ＢＬＡＳＴ配列分析は、プライマーペアＤ４−Ｆ４／Ｄ４−Ｒ１およびＤ４−Ｆ７／Ｄ４−Ｒ１によって生成された断片が、その他の生物からの既知のΔ４デサチュラーゼとの多大な相同性を示す単一遺伝子からのものであることを示した。配列を８４７ｂｐのコンティグ（配列番号５）にアセンブルし、それはユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４からの推定上のΔ４デサチュラーゼの一部をコードすると想定された。
【０１８４】
実施例４
ユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４からの全長Δ４デサチュラーゼの単離
実施例３に記載される配列番号５に記載の部分的８４７ｂｐ配列に基づいて、ユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４のｃＤＮＡサンプルからの推定上のΔ４デサチュラーゼ遺伝子の５’および３’末端を単離するように、プライマーをデザインした。
【０１８５】
Δ４デサチュラーゼ５’コード領域の単離
ユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４からの推定上のΔ４デサチュラーゼの５’領域をｃＤＮＡ末端のネステッドＰＣＲ増幅によって単離した。推定上のΔ４デサチュラーゼ遺伝子の部分配列に基づいて、１回目の増幅のために、プライマー１５９４Ｄ４−５−１（配列番号３０）をＢＤ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｃｒｅａｔｏｒ（商標）Ｓｍａｒｔ（商標）ｃＤＮＡライブラリーキットからの５’ＣＤＳＩＩＩ  ＰＣＲプライマー（配列番号１２）と組み合わせて使用した。反応混合物は、１μｌの各プライマー（１０μＭ）、１μｌのユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４  ｃＤＮＡ（約５０ｎｇ）、２２μｌの水、および２５μｌのＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑ  ２×プレミクスを含有した。サーモサイクラー条件を９４℃で６０秒間、次に９４℃で２０秒間、５５℃で２０秒間、および７２℃で３０秒間を３０サイクルと、それに続く７２℃で５分間の最終延長に設定した。
【０１８６】
２回目のＰＣＲ増幅では、１回目のＰＣＲ反応からの１μｌの希釈生成物をテンプレートとして使用し、ＰＣＲ産物を水で１：５０に希釈した。各１μｌのプライマー１５９４Ｄ４−５−２（配列番号３１）およびＤＮＲ  ＣＤＳ５−２（配列番号３２）（各プライマーで１０μＭの原液）を使用したことを除いては、上述のように増幅を行った。
【０１８７】
２回目のＰＣＲ産物からの３５９ｂｐのＤＮＡ断片をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローンして配列決定した。分析は、この断片が元のＥ１５９４Ｄ４部分的断片（配列番号５）と部分的に重なって上流にさらに伸びることを示したので、本断片（配列番号６）を「Ｅ１５９４Ｄ４−５’−Ａ」と称した。しかし配列番号６の延長された３５９ｂｐ断片には、翻訳開始コドンがなかった。既知のΔ４デサチュラーゼとの配列比較に基づいて、およそ４００ｂｐが５’末端から欠損していると想定された。
【０１８８】
上述したのと同じＰＣＲ条件を用いて、上で利用される断片Ｅ１５９４Ｄ４−５’−Ａを得るための方法を反復し、Ｅ１５９４Ｄ４遺伝子の追加的５’領域を得た。しかし１回目の増幅では、プライマー１５９４Ｄ４−５−４（配列番号３３）でプライマー１５９４Ｄ４−５−１（配列番号３０）を置き換えた。１回目の生成物の１：５０希釈に続いて、プライマー１５９４Ｄ４−５−２（配列番号３１）の代わりにプライマー１５９４Ｄ４−５−５（配列番号３４）を使用して、２回目のＰＣＲを行った。
【０１８９】
２回目のＰＣＲ産物中の約４００ｂｐのＤＮＡ断片をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローンして配列決定した。配列分析は、この断片が開始コドンおよび９ｂｐの５’非翻訳領域も含めてＥ１５９４Ｄ４遺伝子の５’末端を含有したことを示した。断片を「１５９４Ｄ４−５’−Ｂ」（配列番号７）と称した。
【０１９０】
Δ４デサチュラーゼ３’コード領域の単離
推定上のΔ４デサチュラーゼの３’領域もまた、ネステッドＰＣＲ増幅によって単離された。１回目では、反応混合物は、各１μｌのプライマー１５９４Ｄ４−３−１（配列番号３５、１０μＭ）およびプライマーＣＤＳＩＩＩ／３’ＰＣＲプライマー（配列番号１１、１０μＭ）、１μｌのユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４  ｃＤＮＡ（約５０ｎｇ）、２２μｌの水、および２５μｌのＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑ  ２×プレミクスを含有した。サーモサイクラー条件を９４℃で６０秒間、次に９４℃で２０秒間、５５℃で２０秒間、および７２℃で３０秒間を３０サイクルとそれに続く７２℃で７分間の最終延長に設定した。２回目のＰＣＲでは、反応混合物は各１μｌのプライマー１５９４Ｄ４−３−２（配列番号３６、１０μＭ）およびＣＤＳＩＩＩ／３’ＰＣＲプライマー（配列番号１１、１０μＭ）、１μｌの１：５０希釈された１回目のＰＣＲ産物、２２μｌの水、および２５μｌのＴａＫａＲａ  ＥｘＴａｑ  ２×プレミクスを含有した。ＰＣＲ条件はその他の点では、１回目のＰＣＲで使用したものと同一である。
【０１９１】
２回目のＰＣＲによって、約９００ｂｐのＤＮＡ断片を作り出した。この断片をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにクローンして配列決定した。配列分析は、この断片（「１５９４Ｄ４−３」と称され、配列番号８に記載される）が、Ｅ１５９４Ｄ４遺伝子の３’領域を含むことを示した。
【０１９２】
完全なΔ４デサチュラーゼコード配列のアセンブリーおよび分析
Ｅ１５９４Ｄ４部分的断片（配列番号５）、１５９４Ｄ４−５’−Ａ断片（配列番号６）、１５９４Ｄ４−５’−Ｂ断片（配列番号７）、および１５９４Ｄ４−３’断片（配列番号８）のアセンブリーにより、推定上のユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４Δ４デサチュラーゼ（Ｅ１５９４Ｄ４）遺伝子全体のｃＤＮＡ配列を特定した。９ｂｐの５’非翻訳領域および５１６ｂｐの３’非翻訳領域を含む２０７０ｂｐのｃＤＮＡ配列を「Ｅ１５９４Ｄ４−ｃＤＮＡ」（配列番号９）と称した。Ｅ１５９４Ｄ４  ＣＤＳ（配列番号１）は長さが１３４５ｂｐであり、５１４個のアミノ酸のポリペプチド（配列番号２）をコードする。
【０１９３】
ＮＣＢＩによって提供されるＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（Ｇｉｓｈ，Ｗ．およびＳｔａｔｅｓ、Ｄ．Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３：２６６〜２７２（１９９３年））を使用して、Ｅ１５９４Ｄ４配列（すなわち配列番号２）を「ｎｒ」データベース中に含まれる全ての公的に入手可能なタンパク質配列との類似性について比較した。配列番号２がそれに対して最大の類似性を有する配列を要約するＢＬＡＳＴＸ比較の結果を％同一性、％類似性、および期待値によって報告する。「％同一性」は、２つのタンパク質の間で同一であるアミノ酸の百分率と定義される。「％類似性」は、２つのタンパク質の間で同一であるかまたは保存されているアミノ酸の百分率と定義される。「期待値」は、このサイズのデータベース検索において全くの偶然として予期される所定スコアでのマッチ数を特定して、マッチの統計的有意性を推定する。
【０１９４】
このようにして配列番号２は、タラシオシラ・シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）（配列番号３７；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＸ１４５０６）からのΔ４脂肪酸デサチュラーゼのアミノ酸配列と、期待値０．０で、６５％の同一性および７６％の類似性を共有することが分かった。さらに全長Ｅ１５９４Ｄ４遺伝子は、その他のΔ４脂肪酸デサチュラーゼと同一性および類似性を共有する。より具体的にはＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ分析（ＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアのＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラム）を使用した、ユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４（配列番号２）、タラシオシラ・シュードナナ（Ｔｈａｌａｓｓｉｏｓｉｒａ  ｐｓｅｕｄｏｎａｎａ）（配列番号３７、前出）、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）（配列番号１３；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ２７８５５８）、およびスラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）種ＦＪＮ−１０（配列番号３８；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＺ４３２５７）からのΔ４デサチュラーゼタンパク質の間のペアワイズ比較からは、下の表６に示す％類似性が得られた。
【０１９５】
【表７】
0005572620.tif 000008
【０１９６】
実施例５
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のためにコドン最適化されたΔ４デサチュラーゼ遺伝子[「Ｅ１５９４Ｄ４Ｓ」]の合成
国際公開第２００４／１０１７５３号パンフレットおよび米国特許第７，１２５，６７２号明細書に記載されるのと同様の方法で、ユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４（配列番号１および２；「Ｅ１５９４Ｄ４」）のΔ４デサチュラーゼ遺伝子のコドン使用頻度をヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のために最適化した。具体的には、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）コドン使用頻度パターン（国際公開第２００４／１０１７５３号パンフレット）、「ＡＴＧ」翻訳開始コドン周囲の共通配列、およびＲＮＡ安定性原則（Ｇｕｈａｎｉｙｏｇｉ，Ｇ．およびＪ．Ｂｒｅｗｅｒ，Ｇｅｎｅ，２６５（１〜２）：１１〜２３（２００１年））に従って、Ｅ１５９４Ｄ４のΔ４デサチュラーゼ遺伝子のコード配列に基づいて、コドン最適化されたΔ４デサチュラーゼ遺伝子（「Ｅ１５９４Ｄ４Ｓ」と称する、配列番号３および４）をデザインした。１５４５ｂｐのコード領域の内、合計２００ｂｐが改変され（１２．９％；図３）、１９１個のコドンが最適化された（３７．１％）。ＧＣ含量は、野性型遺伝子（すなわちＥ１５９４Ｄ４）中の５６．１％から、合成遺伝子（すなわちＥ１５９４Ｄ４Ｓ）中の５４．６％に低下した。Ｅ１５９４Ｄ４Ｓの翻訳開始コドンの周囲および停止コドンの後に、ＮｃｏＩ部位およびＮｏｔＩ部位をそれぞれ組み込んだ。ＮｃｏＩ部位を翻訳開始コドン周囲に付加するために、Ｅ１５９４Ｄ４Ｓは野生型Ｅ１５９４Ｄ４のアミノ酸残基１および２の間に挿入された１個の追加的アラニンアミノ酸を有した。したがってＥ１５９４Ｄ４Ｓの全長は５１５個のアミノ酸である（配列番号４）。デザインされたＥ１５９４Ｄ４Ｓ遺伝子（配列番号３；図４Ａで「１５９４Ｄ４Ｓ」と標識する）は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって合成され、ｐＵＣ５７（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｙ１４８３７）にクローンされてｐ１５９４Ｄ４Ｓ（図４Ａ；配列番号３９）が作り出された。
【０１９７】
実施例６
Ｅ１５９４Ｄ４Ｓを含むｐＺＫＬ４−２２０ＥＳＣ４コンストラクトの作成
本実施例は、プラスミドｐＺＫＬ４−２２０ＥＳＣ４の構築について記載する。このプラスミドは２個のキメラＣ２０／２２エロンガーゼ遺伝子および１個のキメラＥ１５９４Ｄ４Ｓ遺伝子をヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のリパーゼ４様遺伝子座（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ_５０３８２５）に組み込むように構築される。これはキメラ遺伝子をヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のゲノム中に組み込み、次にヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中におけるユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４に由来するコドン最適化されたΔ４デサチュラーゼの機能を研究できるようにデザインされた。
【０１９８】
プラスミドｐＺＫＬ４−２２０ＥＳＣ４（図４Ｂ）は、以下の構成要素を含有した。
【０１９９】
【表８】
0005572620.tif 000009
【０２００】
実施例７
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ４１８４Ｕ４株中におけるコドン最適化されたΔ４デサチュラーゼ（「Ｅ１５９４Ｄ４Ｓ」）の発現
ｐＺＫＬ４−２２０ＥＳＣ４プラスミドを含むＥ１５９４Ｄ４Ｓ（実施例６）をＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化して、次に標準形質転換手順を使用してＹ４１８４Ｕ４株（一般方法）を形質転換するために使用した。形質転換体をＭＭプレート上で選択した。３０℃で４日間の生育後、ＭＭプレート上に生育した３つの形質転換体を選択して、新鮮なＭＭプレート上に再度画線塗抹した。ひとたび生育したら、これらの株および対照株を３０℃の３ｍＬ液体ＭＭに個々に接種して、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集し、高グルコース培地[「ＨＧＭ」]に再懸濁して、次に２５０ｒｐｍ／分で５日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集し、脂質を抽出して脂肪酸メチルエステル[「ＦＡＭＥ」]をエステル交換によって調製し、引き続いてＨｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０  ＧＣで分析した。
【０２０１】
結果を下の表８に示す。具体的には、脂肪酸は１６：０（パルミチン酸）、１６：１、１８：０（ステアリン酸）、１８：１（オレイン酸）、ＬＡ、ＡＬＡ、ＥＤＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＴｒＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡと同定され；脂肪酸組成は、総脂肪酸[「ＴＦＡ」]の重量％（重量％）で表される。
【０２０２】
【表９】
0005572620.tif 000010
【０２０３】
表８のＧＣ分析は、３つの形質転換体全てで総脂質の約２％のＤＨＡおよび１０．２％のＤＰＡが生成されたが、対照Ｙ４１８４株では生成されなかったことを示した。Ｅ１５９４Ｄ４Ｓを発現する３つの形質転換株中の基質ＤＰＡのＤＨＡへの変換効率は、約１６％と測定された。変換効率は次式に従って測定された：（[生成物]／[基質＋生成物]）＊１００、式中、「生成物」は直接生成物およびそれに由来する経路中の全ての生成物を含む。このようにしてこの実験データは、ユートレプチエラ・ギムナスチカ近種（Ｅｕｔｒｅｐｔｉｅｌｌａ  ｃｆ＿ｇｙｍｎａｓｔｉｃａ）ＣＣＭＰ１５９４に由来して、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のためにコドン最適化された合成Δ４デサチュラーゼ（Ｅ１５９４Ｄ４Ｓ、配列番号３に記載される）が、基質ＤＰＡをＤＨＡに変換する上で活性であったことを実証した。
【図１Ａ】
0005572620.tif 000011
【図１Ｂ】
0005572620.tif 000012
【図２Ａ】
0005572620.tif 000013
【図２Ｂ】
0005572620.tif 000014
【図２Ｃ】
0005572620.tif 000015
【図３Ａ】
0005572620.tif 000016
【図３Ｂ】
0005572620.tif 000017
【図３Ｃ】
0005572620.tif 000018
【図３Ｄ】
0005572620.tif 000019
【図３Ｅ】
0005572620.tif 000020
【図４Ａ】
0005572620.tif 000021
【図４Ｂ】
0005572620.tif 000022
【図５】
0005572620.tif 000023
【配列表】
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