(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原または抗原性調製物をアジュバントと組み合わせて含む、ヒトへのワクチン接種のための免疫原性組成物であって、該アジュバントが、リポソームの形態で提供されたキラヤ・サポナリア・モリナの樹皮に由来する免疫学的に活性なサポニン画分およびリピドA誘導体を含み、該サポニン画分およびリピドA誘導体が両方とも24〜26μgのレベルでヒト用量中に存在する、前記免疫原性組成物。
【請求項２】
前記アジュバントがステロールをさらに含み、サポニン：ステロールの比が1:1〜1:100 w/wである、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
前記免疫学的に活性なサポニン画分がQS21である、請求項１または２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
前記ステロールがコレステロールである、請求項２または３に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記リピドA誘導体が3D-MPLである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
QS21：3D-MPLの比が1:1である、請求項５に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記リピドA誘導体が25μgの量で存在する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記サポニンが25μgの量で存在する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
前記ヒト用量が0.5〜1.5 mlである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記用量が0.5 mlである、請求項９に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記用量が0.7 mlである、請求項９に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記用量が1.0 mlである、請求項９に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
前記抗原または抗原性調製物が水痘-帯状疱疹ウイルス(VZV)に由来する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
前記抗原または抗原性調製物が結核菌に由来する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
前記抗原または抗原性調製物がサイトメガロウイルス(CMV)に由来する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
前記抗原または抗原性調製物がプラスモジウム・ファルシパルムに由来する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物の調製における、抗原または抗原性調製物のアジュバントと組み合わせた使用であって、該アジュバントが、リポソームの形態で提供されたキラヤ・サポナリア・モリナの樹皮に由来する免疫学的に活性なサポニン画分およびリピドA誘導体を含み、該サポニン画分およびリピドA誘導体が両方とも24〜26μgのレベルでヒト用量中に存在する、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改善されたワクチン組成物、それらを作製する方法、および医学におけるそれらの使用に関する。特に、本発明は、アジュバントが、サポニンとリポ多糖とを含むリポソーム製剤である、アジュバント化ワクチン組成物に関する。本発明はさらに、インフルエンザワクチン組成物およびインフルエンザ疾患に対して免疫するためのワクチン接種計画に関する。
【背景技術】
【０００２】
改善された免疫原性を有する新規組成物またはワクチンが、常に必要である。1つの戦略として、任意の所与の抗原に対する免疫応答を試行し、改善するために、アジュバントが用いられてきた。
【０００３】
リポ多糖(LPS)は、グラム陰性細菌の外膜の外部小葉の主要な表面分子であり、専らその中に生じる。LPSは、血清成分および食細胞による細菌の破壊を妨げ、コロニー形成のための接着に関与する。LPSは、約10,000ダルトンの構造的に関連する複合分子の一群であり、3つの共有結合した領域からなる：
(i)外側領域のO特異的多糖鎖(O抗原)
(ii)コアオリゴ糖中心領域
(iii)リピドA-疎水性アンカーとして働く最も内部の領域であり、長鎖脂肪酸を担持するグルコサミンジサッカリド単位を含む。
【０００４】
致死的毒性、発熱性およびアジュバント性などのLPSの生物活性は、リピドA部分に関連することが示されている。対照的に、免疫原性は、O特異的多糖成分(O抗原)と関連する。LPSおよびリピドAは共に、その強力なアジュバント効果について長く知られてきたが、これらの分子の高い毒性はワクチン製剤におけるそれらの使用を不可能にしてきた。従って、アジュバント性を維持しながら、LPSまたはリピドAの毒性を低下させることに対して、多大な努力が払われてきた。
【０００５】
サルモネラ・ミネソタ(Salmonella minnesota)突然変異体R595は、親株(平滑)(Luderitzら、1966 Ann. N.Y. Acad. Sci. 133:349-374)の培養物から、1966年に単離された。選択されたコロニーを、ファージのパネルによる溶解に対するそれらの感受性についてスクリーニングし、狭い範囲の感受性(1種または2種のファージのみに対して敏感である)を示したコロニーのみを、さらなる研究のために選択した。この努力は、LPS生合成に欠陥を有し、S. minnesota R595と呼ばれる、深く粗い突然変異株の単離をもたらした。
【０００６】
他のLPSと比較して、突然変異S.minnesota R595により産生されたものは、比較的単純な構造を有する：
(i)それらは、野生型の平滑な表現型から突然変異体の粗い表現型へのシフトを担う特徴であるO特異的領域を含まず、毒性の喪失をもたらす、
(ii)コア領域は非常に短く、この特徴は、様々な化合物に対する株の感受性を増加させる、
(iii)リピドA部分は、最大7個の脂肪酸で高度にアシル化されている。
【０００７】
4'-モノホスホリルリピドA(MPL)は、グラム陰性細菌の深く粗い突然変異株から抽出されたLPSの酸加水分解により得られ、1000を超える因子(ニワトリ胚卵における致死用量により測定される)により低下する毒性を示しながら、LPSのアジュバント特性を保持している(Johnsonら、1987 Rev. Infect. Dis. 9 Suppl:S512-S516)。典型的には、LPSを、約30分間、中程度の強度の鉱酸溶液(例えば、0.1 M HCl)中で還流させる。このプロセスは、1位での脱リン酸化、および6'位での脱糖鎖化をもたらし、MPLが得られる。
【０００８】
3-O-脱アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)は、MPLの軽度のアルカリ加水分解により得られ、再度、アジュバント性を維持しながら、さらに低下した毒性を有する。米国特許第4,912,094号(Ribi Immunochemicals)を参照されたい。典型的には、アルカリ加水分解を、pH 10.5の0.5 M炭酸ナトリウムなどの、弱塩基の水性溶液との飽和により、クロロホルム／メタノールの混合物などの有機溶媒中で行う。
【０００９】
3D-MPLの調製に関するさらなる情報は、例えば、米国特許第4,912,094号およびWO02/078637(Corixa Corporation)で入手可能である。
【００１０】
キラヤサポニンは、キラヤ・サポナリア(Quillaja saponaria)の樹皮から抽出されたトリテルペングリコシドの混合物である。粗サポニンは、獣医用アジュバントとして幅広く用いられてきた。Quil-Aは、キラヤ・サポニン材料の部分精製された水性抽出物である。QS21は、Quil AのHPLC精製された非毒性画分であり、その製造方法は米国特許第5,057,540号に開示されている(QA21として)。
【００１１】
例えば、インフルエンザワクチンおよびヒトパピローマウイルス(HPV)に対するワクチンが、アジュバントと共に開発されてきた。
【００１２】
インフルエンザウイルスは、世界中に存在する最も普遍的なウイルスの1つであり、ヒトおよび家畜の両方を襲う。インフルエンザは、経済的負担、疾病率および死亡率でさえもたらし、深刻である。
【００１３】
インフルエンザウイルスは、直径約125 nmの粒子径を有するRNAエンベロープウイルスである。それは基本的には、脂質二重層構造を有するウイルスエンベロープと外部糖タンパク質により囲まれた、核タンパク質に結合した内部ヌクレオキャプシドまたはリボ核酸(RNA)のコアからなる。ウイルスエンベロープの内部層は、主にマトリックスタンパク質から構成され、外部層のほとんどは宿主由来脂質材料から構成される。インフルエンザウイルスは、2個の表面抗原、糖タンパク質ノイラミニダーゼ(NA)およびヘマグルチニン(HA)を含み、該粒子の表面に10〜12 nmの長さのスパイクとして出現する。それはこれらの表面タンパク質であり、具体的には、インフルエンザサブタイプの抗原特異性を決定するヘマグルチニンである。
【００１４】
これらの表面抗原は、進行的に、時には急速に、インフルエンザにおける抗原変異を誘導するいくらかの変化を受ける。これらの抗原性変化は、「ドリフト」および「シフト」と呼ばれ、予測不可能であり、最終的には、ウイルスが免疫系を逃れることを可能にし、よく知られた、ほとんど毎年の流行を引き起こす新しいインフルエンザ株の出現をもたらすため、免疫学的観点からは劇的な影響を有するかもしれない。
【００１５】
各季節にインフルエンザワクチンに組み入れられるインフルエンザウイルス株は、国際的な保健の専門家およびワクチンの製造業者と協力して、世界保健機関により決定される。
【００１６】
HAは、様々なインフルエンザ株の血清学的特異性の規定において最も重要な抗原である。この75〜80 kDタンパク質は、いくつかの抗原決定基を含み、そのいくつかは様々な株(株特異的決定基)において配列変化を受ける領域にあり、他のものは多くのHA分子に共通である領域にある(決定基に共通)。
【００１７】
インフルエンザウイルスは、ほぼ毎冬、流行を引き起こし、その感染率はA型またはB型ウイルスについては6週間に渡って40％にもなる。インフルエンザ感染は、軽度の上気道感染を介する無症状性感染から、重篤なウイルス性肺炎までの様々な疾患状態をもたらす。典型的なインフルエンザの流行は、入院または死亡の比率が増加することにより証明されるように、肺炎および下気道疾患の発生率の増加を引き起こす。この疾患の重篤度は、主に宿主の年齢、その免疫状態および感染部位により決定される。
【００１８】
65歳以上の高齢者は、特に脆弱であり、先進国においては、全てのインフルエンザに関連する死亡の80〜90％を占める。潜在的な慢性疾患を有する個体も、多くがそのような合併症を経験する可能性が高い。乳児も重篤な疾患を罹患し得る。従って、特にこれらの群を保護する必要がある。これらの「高リスク」群と違って、保健の専門家はまた、高齢者と接触する健常な成人にワクチン接種することを推奨している。
【００１９】
ワクチン接種は、毎年のインフルエンザ流行の制御において決定的な役割を果たしている。現在利用可能なインフルエンザワクチンは、不活化されているか、または生の弱毒化インフルエンザワクチンである。不活化インフルエンザワクチンは、3つの可能な形態の抗原性調製物から構成される：不活化全ウイルス、脂質エンベロープを可溶化するために精製されたウイルス粒子を界面活性剤もしくは他の試薬で破壊するサブビリオン(いわゆる「スプリット」ワクチン)または精製されたHAおよびNA(サブユニットワクチン)。これらの不活化ワクチンを、筋肉内(i.m.)または鼻内(i.n.)的に与える。
【００２０】
全ての種類のインフルエンザワクチンは、通常三価ワクチンである。これらは、一般的には2種のA型インフルエンザウイルス株および1種のB型インフルエンザウイルス株に由来する抗原を含む。多くの場合、標準的な0.5 mlの注射可能用量は、一元放射免疫拡散法(SRD) (J.M. Woodら、「インフルエンザヘマグルチニン抗原のアッセイのための改善された一元放射免疫拡散技術：不活化全ウイルスおよびサブユニットワクチンの効力決定のための適合化(An improved single radial immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: adaptation for potency determination of inactivated whole virus and subunit vaccines)」、J. Biol. Stand. 5 (1977) 237-247; J. M. Woodら、「インフルエンザウイルスのアッセイのための一元放射拡散および免疫電気泳動技術の国際共同研究(International collaborative study of single radial diffusion and immunoelectrophoresis techniques for the assay of haemagglutinin antigen of influenza virus)」、J. Biol. Stand. 9 (1981) 317-330)により測定されるように、各株に由来する15μgのヘマグルチニン抗原成分を含む。
【００２１】
現在利用可能なインフルエンザワクチンは、全ての年齢群において安全であると考えられる(De Donatoら、1999, Vaccine, 17, 3094-3101)。しかしながら、現在のインフルエンザワクチンが2歳以下の小さい子供において機能するという証拠はほとんどない。さらに、典型的な確認されたインフルエンザ疾患の予防のためのワクチンの報告された効力比は、高齢者については23〜72％であり、より若い成人について報告された60〜90％の効力比よりも有意に低い(Govaert, 1994, J. Am. Med. Assoc., 21, 166-1665; Gross, 1995, Ann Intern. Med. 123, 523-527)。インフルエンザワクチンの有効性は、ウイルス株に対する血球凝集抑制(HI)抗体の血清力価と相関することが示されており、いくつかの研究により、高齢者が、若い成人よりも、インフルエンザ免疫化の後により低いHI力価を示すことが見出された(Murasko, 2002, Experimental gerontology, 37, 427-439)。
【００２２】
従って、改善された免疫原性を有する新規ワクチンが依然として必要とされている。強力なアジュバントを含むワクチン抗原の製剤化は、サブビリオン抗原に対する免疫応答を増強するための可能性のある手法である。
【００２３】
水中油乳濁液の形態にある、アジュバントMF59でアジュバント化されたサブユニットインフルエンザワクチンは市販されており、非アジュバント化サブユニットワクチンを用いて得られたものよりも高い抗体力価を誘導する能力を有することが証明されている(De Donatoら、1999, Vaccine, 17, 3094-3101)。しかしながら、後の刊行物においては、同じワクチンが、非アジュバント化スプリットワクチンと比較して改善されたプロフィールを示さなかった(Puig-Barberaら、2004, Vaccine 23, 283-289)。
【００２４】
背景として、流行間期の間に、前の流行に由来するものに関連するインフルエンザウイルスが循環する。このウイルスは、人生の初期の感染から免疫のレベルを変化させながら人々の間に広がる。通常、2〜3年間に渡る、そのような循環は、一般的な集団の間で再び流行を引き起こすのに十分に変化させた新しい株の選択を促進する；このプロセスは「抗原性ドリフト」と呼ばれる。「ドリフト変異体」は、任意の1年に、様々な共同体、地域、国または大陸において様々な影響を有し得るが、その全体の影響は、数年に渡って類似していることが多い。換言すれば、インフルエンザの大流行は、ヒト集団が免疫を有さない新しいインフルエンザウイルスが出現した時に起こる。典型的なインフルエンザの流行は、入院または死亡の比率が増加することにより証明されるように、肺炎および下気道疾患の発生率の増加を引き起こす。高齢者または潜在的な慢性疾患を有する者は、そのような合併症を経験する可能性が最も高いが、乳児も重篤な疾患を罹患し得る。
【００２５】
予測不可能な間隔で、以前の季節に循環する株とは総合的に異なるサブタイプの、重要な表面抗原であるヘマグルチニンを有する新規インフルエンザウイルスが出現する。ここで、得られる抗原は、ヒトにおいて以前に循環していた株の対応するタンパク質と、20〜50％変化してもよい。これは、「集団免疫」を逃れるウイルスおよび大流行の確立をもたらし得る。この現象は、「抗原性シフト」と呼ばれる。少なくとも過去には、鳥または豚インフルエンザウイルスなどの異なる種に由来するインフルエンザウイルスが種の障壁を越えた場合に、大流行が起こってきたと考えられる。そのようなウイルスがヒトからヒトへ拡散する能力を有する場合、それらは数ヶ月から1年以内に世界中に拡散し、大流行をもたらすかもしれない。例えば、1957年(アジア風邪大流行)には、H2N2サブタイプのウイルスが、該ウイルスが最初に単離された少なくとも1918年以来、ヒト集団において循環してきたH1N1ウイルスと置き換わった。H2 HAおよびN2 NAは、HAが1968年(香港風邪大流行)にH3N2インフルエンザサブタイプの出現により置き換わるまで、1957年〜1968年に抗原性ドリフトを受け、その後、N2 NAはH3 HAと共にドリフトし続けた(Nakajimaら、1991, Epidemiol. Infect. 106, 383-395)。
【００２６】
大流行の発生を引き起こす能力を与えるインフルエンザウイルス株の特徴は、それが現在循環している株におけるヘマグルチニンと比較して新しいヘマグルチニンを含み、ノイラミニダーゼサブタイプの変化により達成することができてもできなくてもよく；それがヒト集団において垂直感染され得る；およびそれがヒトにとって病原性であることである。新しいヘマグルチニンは、H2などの、長期間、おそらく数十年間、ヒト集団において明らかでなかったものであってよい。または、それは、例えば、鳥において認められるH5、H9、H7もしくはH6などの、以前にはヒト集団において循環していなかったヘマグルチニンであってもよい。いずれの場合も、集団の大多数、または少なくとも大きい割合の集団、または集団全体でさえ、以前は前記抗原と遭遇しておらず、それに対して免疫学的にナイーブである。
【００２７】
パピローマウイルスは、高度に種特異的である、小さいDNA腫瘍ウイルスである。今までのところ、100を超える個々のヒトパピローマウイルス(HPV)遺伝子型が記載されている。HPVは、一般的には、皮膚(例えば、HPV-1および-2)または粘膜表面(例えば、HPV-6および-11)にとって特異的であり、通常、数ヶ月から数年間持続する良性腫瘍(疣)を引き起こす。そのような良性腫瘍は、憂慮している個人にとっては苦痛に満ちたものであるが、2〜3の例外を除いて、生命を脅かす傾向があるわけではない。
【００２８】
いくつかのHPVは、癌にも関連している。HPVとヒトの癌との間の最も強い正の関連は、HPV-16およびHPV-18と、頸部癌腫との間に存在するものである。頸部癌は、発展途上国においては最も一般的な悪性腫瘍であり、毎年世界中で約500,000人の新件が生じている。ワクチンを用いて、主要なHPV-16感染、および確立されたHPV-16を含む癌とでさえ、活発に闘うことは今や技術的に実現可能である。HPV-16に対する予防的および治療的ワクチン接種の可能性に関する概説については、Cason J., Clin. Immunother. 1994; 1(4) 293-306およびHagenesee M.E., Infections in Medicine 1997 14(7) 555-556,559-564を参照されたい。
【００２９】
小さい変異は起こるが、記載された全てのHPVゲノムは、少なくとも8個の初期遺伝子、E1〜E8と、2個の後期遺伝子、L1およびL2とを有する。さらに、上流の調節領域は、HPVゲノムのほとんどの転写事象を制御するようである調節配列を担持する。
【００３０】
HPV L1に基づくワクチンは、WO94/00152、WO94/20137、WO93/02184およびWO94/05792に開示されている。そのようなワクチンは、モノマー、キャプソマーまたはウイルス様粒子として、L1抗原を含んでもよい。VLPの調製のための方法は、当業界でよく知られており、例えば、WO9913056および米国特許第6,245,568号に記載のような、均一性の増強を提供するためのVLP分解-再集合手法が挙げられる。そのような粒子はさらに、L2タンパク質を含んでもよい。L2に基づくワクチンは、例えば、WO93/00436に記載されている。他のHPVワクチン手法は、E7などの初期タンパク質またはL2-E7などの融合タンパク質に基づいている。
【００３１】
特に、インフルエンザの場合、および特に、インフルエンザの大流行の場合ならびに高齢者の集団にとって、またはHPVワクチンの場合、改善されたワクチンの必要性が以前として存在する。
【００３２】
リポ多糖とキラヤサポニンとの組合せを含むアジュバントは、以前に、例えば、EP0671948に開示されている。この特許は、リポ多糖(3D-MPL)をキラヤサポニン(QS21)と組み合わせた場合の、強力な相乗作用を証明した。良好なアジュバント特性を、免疫刺激剤がヒト用量において少量で存在する場合でも、アジュバント組成物中で、該免疫刺激剤としてリポ多糖とキラヤサポニンとの組合せを用いて達成することができることが現在見出されている。
【発明の開示】
【００３３】
発明の説明
本発明の第一の態様においては、リポソームおよびリポ多糖の形態で提供されたキラヤ・サポナリア・モリナ(Quillaja Saponaria Molina)の樹皮に由来する免疫学的に活性なサポニン画分を含むアジュバント組成物と組み合わせた、抗原またはその抗原性調製物を含む免疫原性組成物が提供される。
【００３４】
本発明の第二の態様においては、リポソームの形態で提供されたサポニンアジュバントと組み合わせた、インフルエンザウイルスまたはその抗原性調製物を含む免疫原性組成物が提供される。この態様の特定の実施形態においては、免疫原性組成物は3D-MPLなどのリピドA誘導体をさらに含む。
【００３５】
好適には、本発明に従うリポソームの形態にあるサポニンアジュバントは、QS21などのキラヤ・サポナリア・モリナの樹皮に由来するサポニンの活性画分と、コレステロールなどのステロールを、1:1〜1:100 w/wのサポニン：ステロール比で含む。
【００３６】
特に、前記免疫原性組成物は、CD4 T細胞エピトープを有する抗原を含む。あるいは、前記免疫原性組成物は、B細胞エピトープを有する抗原を含む。
【００３７】
本発明はまた、インフルエンザウイルス感染および／または疾患の予防のための免疫原性組成物の製造における、インフルエンザウイルスまたはその抗原性調製物と、リポソームおよびリポ多糖の形態で提供されたキラヤ・サポナリア・モリナの樹皮に由来する免疫学的に活性なサポニン画分を含むアジュバントとの使用に関する。
【００３８】
本発明はまた、ヒトパピローマウイルス感染および／または疾患の予防のための免疫原性組成物の製造における、ヒトパピローマウイルス抗原またはその抗原性調製物と、リポソームおよびリポ多糖の形態で提供されたキラヤ・サポナリア・モリナの樹皮に由来する免疫学的に活性なサポニン画分を含むアジュバントとの使用に関する。
【００３９】
本発明はまた、サイトメガロウイルス感染および／または疾患の予防のための免疫原性組成物の製造における、サイトメガロウイルス抗原またはその抗原性調製物と、リポソームおよびリポ多糖の形態で提供されたキラヤ・サポナリア・モリナの樹皮に由来する免疫学的に活性なサポニン画分を含むアジュバントとの使用に関する。
【００４０】
本発明はまた、ストレプトコッカス・ニューモニア(Streptococcus pneumonaie)感染および／または疾患の予防のための免疫原性組成物の製造における、ストレプトコッカス・ニューモニア抗原またはその抗原性調製物と、リポソームおよびリポ多糖の形態で提供されたキラヤ・サポナリア・モリナの樹皮に由来する免疫学的に活性なサポニン画分を含むアジュバントとの使用に関する。
【００４１】
本発明はまた、プラスモジウム・ファルシパルム(Plasmodium falciparum)感染および／またはマラリア疾患の予防のための免疫原性組成物の製造における、プラスモジウム・ファルシパルム抗原またはその抗原性調製物と、リポソームおよびリポ多糖の形態で提供されたキラヤ・サポナリア・モリナの樹皮に由来する免疫学的に活性なサポニン画分を含むアジュバントとの使用に関する。
【００４２】
本発明はまた、水痘-帯状疱疹ウイルス感染および／または疾患の予防のための免疫原性組成物の製造における、水痘-帯状疱疹ウイルス抗原またはその抗原性調製物と、リポソームおよびリポ多糖の形態で提供されたキラヤ・サポナリア・モリナの樹皮に由来する免疫学的に活性なサポニン画分を含むアジュバントとの使用に関する。
【００４３】
別の態様においては、(a)抗原またはその抗原性調製物と、(b)上記で定義されたアジュバントとの使用であって、ヒトにおいて、以下：(i)前記抗原またはその抗原性調製物に対する改善されたCD4 T細胞免疫応答、(ii)前記抗原またはその抗原性調製物に対する改善された体液性免疫応答、(iii)前記抗原またはその抗原性調製物に対する改善されたB記憶細胞応答、のうちの少なくとも1つ、または少なくとも2つ、または全部を誘導するための免疫原性組成物の製造における、前記使用が提供される。
【００４４】
特に、前記抗原は、インフルエンザウイルス、HPV、サイトメガロウイルス(CMV)、水痘-帯状疱疹ウイルス(VZV)、ストレプトコッカス・ニューモニアもしくはマラリア抗原またはその抗原性調製物であり、前記ヒトは、高リスクの成人、高齢者または幼児などの、易感染性の個人または集団である。特定の実施形態においては、免疫原性組成物中の抗原が誘導された病原体に対する、ヒト、特に、ヒト高齢者のワクチン接種のための免疫原性組成物の調製における、抗原またはその抗原性調製物と本明細書で定義されたアジュバントの使用が提供される。具体的には、前記抗原は、インフルエンザウイルス、ヒトパピローマウイルス、サイトメガロウイルス、水痘-帯状疱疹ウイルス、ストレプトコッカス・ニューモニア、プラスモジウム寄生虫の抗原またはその抗原性調製物である。
【００４５】
また、抗原または抗原性組成物、特に、インフルエンザウイルスもしくはHPV、サイトメガロウイルス、水痘-帯状疱疹ウイルス、ストレプトコッカス・ニューモニア、プラスモジウム寄生虫、またはその抗原性調製物と、上記で定義されたアジュバントを、それを必要とする個人または集団に送達することを含む、ワクチン接種の方法も提供される。
【００４６】
特定の実施形態においては、前記免疫原性組成物は、前記抗原またはその抗原性調製物に対する改善されたCD4 T細胞免疫応答を誘導することができ、特に、非アジュバント化抗原または抗原性組成物を用いて得られたものと比較して、体液性免疫応答もしくは改善されたB記憶細胞応答またはその両方をさらに誘導することができる。具体的には、前記CD4 T細胞免疫応答は、交叉反応性CD4 Tヘルパー応答の誘導を含む。具体的には、前記体液性免疫応答は、交叉反応性体液性免疫応答の誘導を含む。
【００４７】
さらなる実施形態においては、免疫原性組成物中の抗原が誘導された病原体の変異体である病原体により引き起こされた感染または疾患に対する防御のための、上記で定義された方法または使用が提供される。別の実施形態においては、免疫原性組成物中のその抗原の変異体である抗原を含む病原体により引き起こされた感染または疾患に対する防御のための上記で定義された方法または使用が提供される。特定の実施形態においては、抗原、特に、インフルエンザもしくはHPVまたはその抗原性調製物と、本明細書に記載のアジュバントとを含む免疫原性組成物を以前にワクチン接種されたヒトのワクチン再接種のための免疫原性組成物の製造における、抗原、特に、インフルエンザもしくはHPV、またはその抗原性調製物の使用が提供される。
【００４８】
特定の実施形態においては、ワクチン再接種に用いられる組成物は、アジュバントをさらに含んでもよい。別の特定の実施形態においては、ワクチン再接種のための免疫原性組成物は、以前のワクチン接種に用いられた抗原または抗原性組成物と共通のCD4 T細胞エピトープを有する抗原を含む。具体的には、ワクチン再接種のための免疫原性組成物は、最初のワクチン接種に用いられたインフルエンザウイルスまたはそのウイルス抗原性調製物と共通のCD4 T細胞エピトープを有するインフルエンザウイルスまたはその抗原性調製物を含む。
【００４９】
一態様においては、ワクチン再接種を、インフルエンザに対して前の季節にワクチン接種された被験者において行う。典型的には、ワクチン再接種を、最初のワクチン接種の少なくとも6ヶ月後に、好ましくは、8〜14ヶ月後に、より好ましくは、約10〜12ヶ月後に行う。別の態様においては、ワクチン再接種を、少なくとも1種の株が大流行の発生に関連するか、または大流行の発生に関連する可能性を有するインフルエンザウイルスまたはその抗原性調製物を含む組成物をワクチン接種された被験者において行う。
【００５０】
本発明のさらなる態様においては、変異体インフルエンザ株により引き起こされたインフルエンザ感染に対する防御のための本明細書で定義された免疫原性組成物の製造における、最初のインフルエンザ株に由来するインフルエンザウイルスまたはその抗原性調製物の使用が提供される。
【００５１】
本発明はまた、インフルエンザウイルスまたはその抗原性調製物と、本明細書で定義されたアジュバントとを送達することを含む、ワクチン接種の方法に関する。
【００５２】
別の態様においては、インフルエンザウイルスまたはその抗原性調製物と、本明細書に定義されたアジュバントとを含むインフルエンザ免疫原性組成物を投与することを含む、高リスク成人または高齢者などの易感染性のヒト個人または集団のワクチン接種の方法が提供される。
【００５３】
さらに別の実施形態においては、本発明は、少なくとも1種のインフルエンザウイルス株に由来するインフルエンザ抗原または抗原性調製物と、本明細書で定義されたアジュバントとを含むインフルエンザ免疫原性組成物を以前にワクチン接種されたヒトをワクチン再接種するための方法であって、アジュバント化または非アジュバント化された、インフルエンザウイルスまたは抗原性調製物を含む免疫原性組成物を、該ヒトに投与することを含む前記方法が提供される。
【００５４】
本発明はまた、リポソームの形態にあるサポニンアジュバントを、インフルエンザウイルスまたはその抗原性調製物、および必要に応じて、3D-MPLと混合することを含む免疫原性組成物の調製のための方法に関する。
【００５５】
本発明の他の態様および利点を、以下の好ましい実施形態の詳細な説明にさらに記載する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５６】
発明の詳細な説明
本発明者らは、各免疫刺激剤がヒト用量あたり30μg以下のレベルで存在する場合、リポソームの形態で提供されたサポニン、およびリポ多糖を含むアジュバント組成物が、抗原性調製物に対する免疫応答を改善することができるが、同時に、免疫刺激剤がヒト用量あたりより高いレベルで存在した場合、従来技術の製剤のいくつかよりも低い反応性（reactogenicity）を有することを見出した。
【００５７】
本発明者らはさらに、インフルエンザウイルスまたはその抗原性調製物と、リポソームの形態で提供されたサポニンを含むアジュバント、および必要に応じて、さらに3D-MPLなどのリピドA誘導体とを含むインフルエンザ製剤が、非アジュバント化ウイルスまたはその抗原性調製物を用いて得られたものと比較して、前記抗原または抗原性組成物に対するCD4 T細胞免疫応答を改善することができることを見出した。リポソームの形態で提供されたサポニンでアジュバント化された製剤は、MHCクラスII分子により提示されるインフルエンザエピトープを検出することができる抗インフルエンザCD4-T細胞応答を誘導するために有利に用いられる。本出願人は、相同なおよびドリフトインフルエンザ株に対する応答性を増加させる(ワクチン接種および感染に際して)ためには、細胞性免疫系を標的化することが有効であることを見出した。
【００５８】
本発明における使用のための組成物を、防御のインフルエンザ関連要因を満たすヒト被験者の数により評価されるように、ヒトにおいて、ワクチン再接種後にインフルエンザに対するより良好な血清防御を提供することができることが、本発明の特定の実施形態である。さらに、本発明における使用のための組成物が、非アジュバント化組成物と比較して、ヒト被験者の最初のワクチン接種後により高いB細胞記憶応答、およびワクチン再接種後により高い体液性応答を誘導することもできることは、別の特定の実施形態である。
【００５９】
本発明に従うアジュバント化されたインフルエンザ組成物は、いくつかの利点を有する：
1)改善された免疫原性：それらは、高齢者(50歳を超える年齢、典型的には、65歳を超える年齢)における弱い免疫応答を、若者において認められるレベルまで回復させるであろう(抗体および／またはT細胞応答)；
2)改善された交叉防御プロフィール：変異体(ドリフトした)インフルエンザ株に対する交叉防御の増加；
3)それらは、同様の応答に用いられる抗原用量の低下も可能にし、かくして、緊急時(例えば、大流行)に生産量の増加を確保できるであろう。
【００６０】
本発明の別の態様においては、本発明者らは、本明細書で定義されたアジュバント組成物が、抗体の産生および非アジュバント化ワクチンについて生成されたものと等価であるか、または時にはそれより大きいインフルエンザ特異的CD4のワクチン接種後の頻度の両方をもたらす免疫原性を示すことを見出した。この効果は、高齢者の集団においては特に価値があり、より低用量の免疫刺激剤を含む本明細書で定義されたアジュバントを用いて達成することができる。さらに、反応性徴候は、免疫刺激剤がより低い濃度であるアジュバント化されたワクチンを受けた群と比較して、最も高い免疫刺激剤濃度でアジュバント化されたワクチンを受けた群においてより高い傾向を示した。
【００６１】
これらの知見を、他の形態の同じ抗原、および他の抗原に適用することができる。
【００６２】
サポニンアジュバント
本発明のアジュバント組成物は、リポソームの形態で提供されたサポニンアジュバントを含む。
【００６３】
本発明における使用にとって特に好ましいサポニンは、Quil Aおよびその誘導体である。Quil Aは、南米の樹木キラヤ・サポナリア・モリナから単離されたサポニン調製物であり、アジュバント活性を有することがDalsgaardらにより、1974年に初めて記載された(「サポニンアジュバント(Saponin adjuvants)」、Archiv. fur die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p243-254)。Quil Aの精製された断片は、Quil Aと関連する毒性を示さずにアジュバント活性を保持するHPLCにより単離され(EP 9 362 278)、例えば、QS7およびQS21(QA7およびQA21としても知られる)が挙げられる。QS-21は、キラヤ・サポナリア・モリナの樹皮に由来する天然のサポニンであり、CD8+細胞傷害性T細胞(CTL)、Th1細胞および顕著なIgG2a抗体応答を誘導し、本発明の内容において好ましいサポニンである。
【００６４】
本発明の好適な形態においては、免疫原性組成物内のサポニンアジュバントは、サポナリア・モリナのquil Aの誘導体、好ましくは、QS-17またはQS-21などのQuil Aの免疫学的に活性な画分、好適には、QS-21である。一実施形態においては、本発明の組成物は、実質的に純粋な形態の免疫学的に活性なサポニン画分を含む。好ましくは、本発明の組成物は、実質的に純粋な形態のQS21を含み、すなわち、QS21は少なくとも90％純粋、例えば、少なくとも95％純粋、または少なくとも98％純粋である。
【００６５】
特定の実施形態においては、例えば、コレステロールなどの外因性ステロールでクエンチした場合、その反応性の低い組成物中でQS21を提供する。QS21を外因性コレステロールでクエンチした場合、いくつかの特定の形態の反応性の低い組成物が存在する。特定の実施形態においては、サポニン／ステロールは、リポソーム構造の形態にある(WO 96/33739、実施例1)。この実施形態においては、リポソームは、好適には天然の脂質、例えば、室温で非結晶性であるホスファチジルコリン、例えば、卵黄ホスファチジルコリン、ジオレイルホスファチジルコリン(DOPC)またはジラウリルホスファチジルコリンを含む。リポソームはまた、飽和脂質から構成されるリポソームについてリポソーム-QS21構造の安定性を増加させる荷電した脂質を含んでもよい。これらの場合、荷電した脂質の量は、好適には1〜20％ w/w、好ましくは5〜10％である。ステロールとリン脂質の比率は、1〜50％(mol/mol)、好適には、20〜25％である。
【００６６】
好適なステロールとしては、β-シトステロール、スティグマステロール、エルゴステロール、エルゴカルシフェロールおよびコレステロールが挙げられる。1つの特定の実施形態においては、アジュバント組成物は、ステロールとしてコレステロールを含む。これらのステロールは当業界でよく知られており、例えば、コレステロールは、動物脂肪中に認められる天然のステロールとして、Merck Index、第11版、341頁に開示されている。
【００６７】
QS21およびステロール、特に、コレステロールを含む本発明のアジュバント組成物は、アジュバント効果を維持しながら、ステロールが存在しない組成物と比較した場合に反応性の低下を示す。反応性に関する研究を、WO 96/33739に開示された方法に従って評価することができる。本発明に従うステロールは、外因性ステロールを意味すると取られ、すなわち、抗原性調製物が取得されるが、該抗原性調製物に添加されるか、またはその後、製剤化の瞬間に添加される、生物に対して内因性ではないステロールを意味する。典型的には、ステロールを、例えば、ステロールでクエンチしたその形態にあるサポニンを用いることにより、サポニンアジュバントを含む抗原性調製物のその後の製剤化の間に添加することができる。好適には、外因性ステロールを、WO 96/33739に記載のサポニンアジュバントと結合させる。
【００６８】
活性サポニン画分がQS21である場合、QS21：ステロールの比率は、典型的には1:100〜1:1(w/w)、好適には、1:10〜1:1(w/w)、および好ましくは、1:5〜1:1(w/w)の範囲にあるであろう。好適には、過剰のステロールが存在し、QS21：ステロールの比率は、少なくとも1:2(w/w)である。一実施形態においては、QS21：ステロールの比率は、1:5(w/w)である。ステロールは、好適にはコレステロールである。
【００６９】
他の有用なサポニンは、植物エスクラス・ヒッポカスタナム(Aesculus hippocastanum)またはジオフィラ・ストルシアム(Gyophilla struthium)に由来するものである。文献に記載された他のサポニンとしては、セイヨウトチノキ、Lat：エスクラス・ヒッポカスタナムの種子中に生じるサポニンの混合物としてMerck Index(第12版、項目3737)に記載されたEscinが挙げられる。その単離は、クロマトグラフィーおよび精製(Fiedler, Arzneimittel-Forsch. 4, 213 (1953))、ならびにイオン交換樹脂(Erbringら、米国特許第3,238,190号)により記載されている。escinの画分は精製されており、生物学的に活性であることが示されている(Yoshikawa Mら、(Chem Pharm Bull (Tokyo) 1996 Aug; 44(8):1454-1464))。ジオフィラ・ストルシアムに由来するサポアルビン(R. Vochtenら、1968, J. Pharm.Belg., 42, 213-226)も、例えば、ISCOM産生に関連して記載されている。
【００７０】
本発明の重要な態様は、好ましくはQS21である、免疫学的に活性なサポニンを、免疫原性組成物のヒト用量あたり、以前に有用であると考えられてきたものよりも低い量、好適には、30μg未満、例えば、1〜30μgで用いることができるという事実である。
【００７１】
従って、本発明は、30μg以下のレベル、例えば、1〜30μgの、免疫学的に活性なサポニン、好ましくは、QS21を含む免疫原性組成物のヒト用量を提供する。
【００７２】
一実施形態においては、免疫原性組成物のヒト用量にとって好適である容量の免疫原性組成物は、約25μgのレベル、例えば、20〜30μg、好適には、21〜29μgまたは22〜28μgまたは23〜27μgまたは24〜26μg、または25μgのQS21を含む。別の実施形態においては、免疫原性組成物のヒト用量は、約10μgのレベル、例えば、5〜15μg、好適には、6〜14μg、例えば、7〜13μg、または8〜12μgまたは9〜11μg、または10μgのQS21を含む。
【００７３】
さらなる実施形態においては、免疫原性組成物のヒト用量は、約5μgのレベル、例えば、1〜9μg、または2〜8μgまたは好適には、3〜7μgまたは4〜6μg、または5μgのQS21を含む。
【００７４】
QS21の好適な量は、例えば、免疫原性組成物のヒト用量あたり、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30μg(w/w)のいずれかである。
【００７５】
用語「ヒト用量」とは、ヒトでの使用にとって好適な容量にある用量を意味する。一般的には、これは0.3〜1.5 mlである。一実施形態においては、ヒト用量は0.5 mlである。さらなる実施形態においては、ヒト用量は、0.5 mlより高く、例えば、0.6、0.7、0.8、0.9または1 mlである。さらなる実施形態においては、ヒト用量は、1〜1.5 mlである。本発明は、各ヒト用量が30μg以下、例えば、1〜30μgのQS21を含むことを特徴とする。
【００７６】
本発明はさらに、30μg以下、例えば、1〜30μgのQS21を含むアジュバント組成物を提供する。典型的には、そのようなアジュバント組成物は、ヒト用量に好適な容量にあるであろう。アジュバントが液体形態の抗原性組成物と混合しようとする液体形態にある場合、アジュバント組成物は、ヒト用量の意図される最終容量の約半分、例えば、0.7 mlの意図されるヒト用量については360μl容量、または0.5 mlの意図されるヒト用量については250μl容量である、ヒト用量に好適な容量となっているであろう。抗原性組成物と混合して、最終的なヒト用量のワクチンを提供する場合、アジュバント組成物を希釈する。そのような用量の最終容量は、勿論、アジュバント組成物の最初の容量およびアジュバント組成物に添加される抗原組成物の容量に応じて変化するであろう。代替的な実施形態においては、液体アジュバントを用いて、凍結乾燥させた抗原組成物を再構成させる。この実施形態においては、ヒト用量に好適な容量のアジュバント組成物は、ヒト用量の最終容量にほぼ等しい。液体アジュバント組成物を、凍結乾燥させた抗原組成物を含むバイアルに添加する。この最終ヒト用量は、0.5〜1.5 mlで変化してもよい。特定の実施形態においては、ヒト用量は0.5 mlであり、この実施形態においては、本発明のワクチン組成物は、0.5 mlのヒト用量あたり、30μg以下、例えば、1〜30μgのレベルのQS21を含み、さらにこの実施形態においては、本発明のアジュバント組成物は、アジュバント組成物が、それぞれ液体もしくは凍結乾燥された抗原組成物と混合されることを意図されるかどうかに応じて、250μlのアジュバント組成物あたり、または500μlのアジュバント組成物あたり、30μg以下、例えば、1〜30μgのレベルのQS21を含むであろう。
【００７７】
特に、インフルエンザ抗原と混合する場合、QS21の量を、例えば、組成物用量あたり1〜100μg(w/v)の量、好ましくは、組成物用量あたり10〜50μg(w/v)の量で用いることができる。QS21の好適な量は、例えば、組成物用量あたり、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50μg(w/v)のいずれかである。より好ましくは、QS21の量は、組成物用量あたり25〜75μg(w/v)の範囲である。通常、組成物用量は、約0.5 ml〜約1 mlの範囲であろう。典型的なワクチン用量は、0.5 ml、0.6 ml、0.7 ml、0.8 ml、0.9 mlまたは1 mlである。好ましい実施形態においては、1 mlのワクチン組成物あたり、50μgのQS21の最終濃度が含まれるか、または0.5 mlのワクチン用量あたり25μgが含まれる。他の好ましい実施形態においては、1 mlのワクチン組成物あたり、35.7μgまたは71.4μgのQS21の最終濃度が含まれる。具体的には、0.5 mlのワクチン用量容量は、用量あたり25μgまたは50μgのQS21を含む。
【００７８】
好適には、QS21の用量はヒトにおいて抗原に対する免疫応答を増強することができる。特に、好適なQS21量は、反応性プロフィールから許容されながら、非アジュバント化組成物と比較して、または別のQS21量でアジュバント化された組成物と比較して、該組成物の免疫学的能力を改善するものである。
【００７９】
3D-MPLアジュバント
前記組成物はさらに、リポ多糖、好適には、リピドAの非毒性誘導体、特に、モノホスホリルリピドAまたはより具体的には、3-脱アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)である追加のアジュバントを含む。
【００８０】
3D-MPLは、GlaxoSmithKline Biologicals N.A.によりMPLの名称の下で販売され、MPLまたは3D-MPLとして本明細書を通して呼ばれる。例えば、米国特許第4,436,727号; 第4,877,611号; 第4,866,034号および第4,912,094号を参照されたい。3D-MPLは、主にIFN-g(Th1)表現型を有するCD4+ T細胞応答を促進する。3D-MPLを、GB 2 220 211 Aに開示された方法に従って製造することができる。化学的には、それは3、4、5または6アシル化鎖を有する3-脱アシル化モノホスホリルリピドAの混合物である。好ましくは、本発明の組成物においては、小粒子3D-MPLを用いる。小粒子3D-MPLは、0.22μmのフィルターを通して滅菌濾過することができるような粒子径を有する。そのような調製物は、WO 94/21292に記載されている。
【００８１】
本発明の重要な態様は、好ましくは3D-MPLであるリポ多糖を、以前には有用であると考えられていた量よりも低い量で、好ましくは、免疫原性組成物のヒト用量あたり、30μg以下、例えば、1〜30μgのレベルで用いることができるという事実である。
【００８２】
従って、本発明は、30μg以下、例えば、1〜30μgのレベルのリポ多糖、好ましくは3D-MPLを含む免疫原性組成物のヒト用量を提供する。
【００８３】
一実施形態においては、免疫原性組成物のヒト用量は、約25μg、例えば、20〜30μg、好適には、21〜29μgまたは22〜28μgまたは23〜27μgまたは24〜26μg、または25μgのレベルの3D-MPLを含む。
【００８４】
別の実施形態においては、免疫原性組成物のヒト用量は、約10μg、例えば、5〜15μg、好適には、6〜14μg、例えば、7〜13μgまたは8〜12μgまたは9〜11μg、または10μgのレベルの3D-MPLを含む。
【００８５】
さらなる実施形態においては、免疫原性組成物のヒト用量は、約5μg、例えば、1〜9μg、または2〜8μgまたは好適には、3〜7μgまたは4〜6μg、または5μgのレベルの3D-MPLを含む。
【００８６】
好適な量の3D-MPLは、例えば、免疫原性組成物のヒト用量あたり、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30μg(w/v)のいずれかである。
【００８７】
一実施形態においては、ヒト用量の容量は、0.5 mlである。さらなる実施形態においては、免疫原性組成物は、容量が0.5 mlより高い、例えば、0.6、0.7、0.8、0.9または1 mlであるヒト用量にとって好適な容量となっている。さらなる実施形態においては、ヒト用量は、1〜1.5 mlである。本発明は、各ヒト用量が30μg以下、例えば、1〜30μgの3D-MPLを含むことを特徴とする。
【００８８】
本発明はさらに、30μg以下、例えば、1〜30μgの3D-MPLを含むアジュバント組成物を提供する。典型的には、そのようなアジュバント組成物は、ヒト用量に好適な容量となっているであろう。アジュバントが液体形態の抗原性組成物と混合しようとする液体形態となっている場合、アジュバント組成物は、ヒト用量の意図される最終容量の約半分、例えば、0.7 mlの意図されるヒト用量については360μl容量、または0.5 mlの意図されるヒト用量については250μl容量である、ヒト用量に好適な容量となっているであろう。抗原性組成物と混合して、最終的なヒト用量の免疫原性組成物を提供する場合、アジュバント組成物を希釈する。そのような用量の最終容量は、勿論、アジュバント組成物の最初の容量およびアジュバント組成物に添加される抗原組成物の容量に応じて変化するであろう。代替的な実施形態においては、液体アジュバント組成物を用いて、凍結乾燥させた抗原組成物を再構成させる。この実施形態においては、ヒト用量に好適な容量のアジュバント組成物は、ヒト用量の最終容量にほぼ等しい。液体アジュバント組成物を、凍結乾燥させた抗原組成物を含むバイアルに添加する。この最終ヒト用量は、0.5〜1.5 mlで変化してもよい。特定の実施形態においては、ヒト用量は0.5 mlであり、この実施形態においては、本発明のワクチン組成物は、0.5 mlのヒト用量あたり、30μg以下、例えば、1〜30μgのレベルの3D-MPLを含み、さらにこの実施形態においては、本発明のアジュバント組成物は、アジュバント組成物が、それぞれ液体もしくは凍結乾燥された抗原組成物と混合されることを意図されるかどうかに応じて、250μlのアジュバント組成物あたり、または500μlのアジュバント組成物あたり、30μg以下、例えば、1〜30μgのレベルの3D-MPLを含むであろう。
【００８９】
免疫原性組成物がインフルエンザウイルスまたはその抗原性調製物を含む場合、リポソームの形態となっているサポニンを含むアジュバント組成物は、必要に応じてリピドA誘導体、特に、モノホスホリルリピドAまたはより特には3D-MPLをさらに含む。この実施形態においては、3D-MPLを、例えば、組成物用量あたり1〜100μg(w/v)の量で、好ましくは、組成物用量あたり10〜50μg(w/v)の量で用いることができる。3D-MPLの好適な量は、例えば、組成物用量あたり、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、または50μg(w/v)のいずれかである。より好ましくは、3D-MPLの量は、組成物用量あたり25〜75μg(w/v)の範囲である。通常、組成物用量は、約0.5 ml〜約1 mlの範囲であろう。典型的なワクチン用量は、0.5 ml、0.6 ml、0.7 ml、0.8 ml、0.9 mlまたは1 mlである。好ましい実施形態においては、1 mlのワクチン組成物あたり、50μgの3D-MPLの最終濃度が含まれるか、または0.5 mlのワクチン用量あたり25μgが含まれる。別の実施形態においては、1 mlのワクチン組成物あたり、35.7μgまたは71.4μgの3D-MPLの最終濃度が含まれる。具体的には、0.5 mlのワクチン用量容量は、用量あたり25μgまたは50μgの3D-MPLを含む。
【００９０】
好適には、3D-MPLの用量はヒトにおいて抗原に対する免疫応答を増強することができる。特に、好適な3D-MPL量は、反応性プロフィールから許容されながら、非アジュバント化組成物と比較して、または別のMPL量でアジュバント化された組成物と比較して、該組成物の免疫学的能力を改善するものである。
【００９１】
本発明の好適な組成物は、最初にリポソームをMPLを用いずに調製し(WO 96/33739に記載)、次いで、好適には、100 nm粒子未満の小粒子または0.22μmの膜を通して滅菌濾過しやすい粒子として、MPLを添加するものである。従って、MPLは小胞膜内に含まれない(MPLoutとして知られる)。MPLが小胞膜内に含まれる(MPLinとして知られる)組成物も、本発明の態様を形成する。抗原を、小胞膜内に含有させるか、または小胞膜外に含有させることができる。好適には、可溶性抗原は外側であり、疎水性または脂質化抗原は膜の内側もしくは外側に含まれる。
【００９２】
一実施形態においては、本発明のアジュバント組成物は、リポ多糖および免疫学的に活性なサポニンの両方を含む。本発明の特定の実施形態においては、リポ多糖は3D-MPLであり、免疫学的に活性なサポニンはQS21である。本発明のさらなる実施形態においては、アジュバント組成物は、本質的にはリポソーム製剤中のリポ多糖および免疫学的に活性なサポニンからなる。好適には、この実施形態の一形態においては、アジュバント組成物は、本質的には3D-MPLおよびQS21、ならびに必要に応じてステロール、好ましくはコレステロールからなる。
【００９３】
本発明のさらなる実施形態においては、アジュバント組成物は、リポソーム製剤中に、リポ多糖および免疫学的に活性なサポニンと、1種以上のさらなる免疫刺激剤またはアジュバントとを含む。好適には、この実施形態の一形態においては、リポ多糖は3D-MPLであり、免疫学的に活性なサポニンはQS21である。
【００９４】
特定の実施形態においては、QS21および3D-MPLは、免疫原性組成物のヒト用量あたり、同じ最終濃度で存在する。この実施形態の一態様においては、免疫原性組成物のヒト用量は、25μgの3D-MPLおよび25μgのQS21の最終レベルを含む。さらなる実施形態においては、免疫原性組成物のヒト用量は、それぞれ10μgのMPLおよびQS21の最終レベルを含む。さらに特定の実施形態においては、250μlの容量を有し、25μgの3D-MPLおよび25μgのQS21、またはそれぞれ10μgのMPLおよびQS21のレベルを含むアジュバントが提供される。
【００９５】
本発明のアジュバント組成物と共に用いることができる抗原としては、ウイルス、寄生虫、細菌または腫瘍関連抗原、例えば、以下のものが挙げられる。
【００９６】
スプリットインフルエンザウイルスまたはそのスプリットウイルス抗原性調製物であってよい、本発明に従う使用のためのインフルエンザウイルスまたはその抗原性調製物。代替的な実施形態においては、インフルエンザ調製物は、不活化全ウイルスもしくは精製されたHAおよびNA(サブユニットワクチン)、またはインフルエンザビロソームなどの、別の型の不活化インフルエンザ抗原を含んでもよい。さらに別の実施形態においては、インフルエンザウイルスは生弱毒化インフルエンザ調製物であってよい。
【００９７】
本発明に従う使用のためのスプリットインフルエンザウイルスまたはそのスプリットウイルス抗原性調製物は、好適にはウイルス粒子を界面活性剤または他の試薬で破壊して脂質エンベロープを可溶化した不活化ウイルス調製物である。好適には、スプリットウイルスまたはそのウイルス抗原性調製物を、感染性もしくは不活化された、全インフルエンザウイルスを断片化し、有機溶媒もしくは界面活性剤の濃縮物を可溶化した後、可溶化剤の全部もしくは大部分およびウイルス脂質材料のいくらか、もしくはほとんどを除去することにより調製する。スプリットウイルス抗原性調製物とは、スプリットウイルス成分の抗原特性のほとんどを維持しながら、スプリットウイルスと比較してある程度の精製を受けたスプリットウイルス調製物を意味する。例えば、卵中で製造する場合、スプリットウイルスを卵夾雑タンパク質から枯渇させるか、または細胞培養物中で製造する場合、スプリットウイルスを宿主細胞夾雑物から枯渇させることができる。スプリットウイルス抗原性調製物は、2種以上のウイルス株のスプリットウイルス抗原成分を含んでもよい。スプリットウイルス(いわゆる「インフルエンザスプリットワクチン」)またはスプリットウイルス抗原性調製物を含むワクチンは、一般的には、残りのマトリックスタンパク質および核タンパク質および時には脂質、ならびに膜エンベロープタンパク質を含む。そのようなスプリットウイルスワクチンは、通常、ウイルス構造タンパク質のほとんどまたは全部を含むであろうが、それらが全ウイルス中で生じるのと同じ割合である必要はない。
【００９８】
あるいは、インフルエンザウイルスは、全ウイルスワクチンの形態にあってもよい。インフルエンザウイルスの新しい株のために、スプリットウイルスワクチンをうまく作製することができるかどうかに関する不確実性を回避するので、これは大流行の状況にとってはスプリットウイルスワクチンよりも有利であると証明できる。いくつかの株については、スプリットウイルスを作製するのに用いられる従来の界面活性剤は、ウイルスに損傷を与え、それを不安定にさせる場合がある。様々な界面活性剤を使用し、および／またはスプリットワクチンを作製するための様々なプロセスを開発する可能性は常にあるが、これには時間がかかり、大流行の状況においては利用可能ではない場合がある。全ウイルス手法に関する確実性の程度がより高いことに加えて、好適なスプリットワクチンを調製するのに必要な追加の精製工程の間に、かなりの量の抗原が失われるため、スプリットウイルスよりも高いワクチン製造能力も存在する。
【００９９】
別の実施形態においては、インフルエンザウイルス調製物は、精製されたサブユニットインフルエンザワクチンの形態となっている。一般的には、サブユニットインフルエンザワクチンは、２個の主要なエンベロープタンパク質、HAおよびNAを含み、一般的には、特に若いワクチン被接種者において反応性が低いため、全ビリオンワクチンよりも追加の利点を有し得る。サブユニットワクチンを、組換え的に製造するか、または破壊したウイルス粒子から精製することができる。
【０１００】
別の実施形態においては、インフルエンザウイルス調製物は、ビロソームの形態となっている。ビロソームは、真正の配置に機能的ウイルスエンベロープ糖タンパク質HAおよびNAを保持し、ビロソームのリン脂質二重層膜に挿入される球状の単層ベシクルである。
【０１０１】
前記インフルエンザウイルスまたはその抗原性調製物は、卵由来または細胞培養物由来のものであってよい。
【０１０２】
例えば、本発明に従うインフルエンザウイルス抗原またはその抗原性調製物を、卵中でインフルエンザウイルスを増殖させ、収穫された尿膜腔液を精製することによる、従来の孵化卵から誘導することができる。卵を、急いで多数集めてもよい。あるいは、それらは、ウイルスを増殖させるか、または組換えインフルエンザウイルス表面抗原を発現させるために細胞または細胞培養物を用いる新しい作製方法のいずれかに由来するものであってよい。ウイルスを増殖させるための好適な細胞基質としては、例えば、MDCKなどのイヌ腎臓細胞またはMDCKのクローンに由来する細胞、MDCK様細胞、Vero細胞などのAGMK細胞などのサル腎臓細胞、好適なブタ細胞系、またはワクチン目的でのインフルエンザウイルスの製造にとって好適な任意の他の哺乳動物細胞型が挙げられる。また、好適な細胞基質としては、例えば、MRC-5細胞などのヒト細胞も挙げられる。好適な細胞基質は、細胞系に限定されない；例えば、ニワトリ胚線維芽細胞および鳥類細胞系などの一次細胞も含まれる。
【０１０３】
インフルエンザウイルス抗原またはその抗原性調製物を、いくつかの商業的に適用可能なプロセスのうちのいずれか、例えば、参照により本明細書に組み入れられるものとする特許DD 300 833およびDD 211 444に記載のスプリットFluプロセスにより製造することができる。伝統的には、スプリットFluは、トリ-n-ブチルリン酸、Tween（商標）と混合したジエチルエーテル（「Tween-エーテル」スプリッティングとして知られる）などの溶媒／界面活性剤処理を用いて製造されたが、このプロセスはいくつかの生産施設においては今でも用いられている。現在用いられている他のスプリッティング剤としては、界面活性剤またはタンパク質溶解酵素または胆汁塩、例えば、参照により本明細書に組み入れられるものとする特許DD 155 875に記載のデオキシコール酸ナトリウムが挙げられる。スプリッティング剤として用いることができる界面活性剤としては、陽イオン性界面活性剤、例えば、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB)、他のイオン性界面活性剤、例えば、ラウリル硫酸塩、タウロデオキシコール酸、またはTriton X-100(例えば、Linaら、2000, Biologicals 28, 95-103に記載のプロセス)およびTriton N-101などの上記のものなどの非イオン性界面活性剤、または任意の２種以上の界面活性剤の組合せが挙げられる。
【０１０４】
スプリットワクチンのための調製プロセスは、いくつかの異なる濾過および／または他の分離工程、例えば、様々な組合せの超遠心分離、限外濾過、ゾーン遠心分離およびクロマトグラフィー(例えば、イオン交換)工程、ならびに必要に応じて、スプリッティングの前後で行ってもよい、例えば、熱、ホルムアルデヒドもしくはβ-プロピオラクトンもしくはU.V.を用いる不活化工程を含んでもよい。スプリッティングプロセスを、バッチ式、連続式、または半連続式プロセスとして行うことができる。スプリット免疫原性組成物のための好ましいスプリッティングおよび精製プロセスは、WO 02/097072に記載されている。
【０１０５】
本発明に従う好ましいスプリットFluワクチン抗原性調製物は、製造プロセスから残存する残存量のTween 80および／またはTriton X-100を含むが、これらをスプリット抗原の調製後に添加するか、またはその濃度を調整することもできる。Tween 80およびTriton X-100が両方とも存在するのが好ましい。ワクチン用量におけるこれらの非イオン性界面活性剤の最終濃度の好ましい範囲は、Tween 80:0.01〜1％、より好ましくは、約0.1％(v/v)、Triton X-100:0.001〜0.1％(w/v)、より好ましくは、0.005〜0.02％(w/v)である。
【０１０６】
特定の実施形態においては、Tween 80の最終濃度は、0.025％〜0.09％(w/v)である。別の特定の実施形態においては、前記抗原を、0.025％〜0.2％(w/v)の範囲のTween 80濃度を有し、アジュバント化製剤(または対照製剤中のバッファー)で最終製剤まで2回希釈しなければならない、2倍濃縮混合物として提供する。
【０１０７】
別の特定の実施形態においては、Triton X-100の最終濃度は、0.004％〜0.017％(w/v)である。別の特定の実施形態においては、前記抗原を、0.005％〜0.034％(w/v)の範囲のTriton X-100濃度を有し、アジュバント化製剤(または対照製剤中のバッファー)で最終製剤まで2回希釈しなければならない、2倍濃縮混合物として提供する。
【０１０８】
好ましくは、インフルエンザ調製物を、低レベルのチオマーサルの存在下で、または好ましくは、チオマーサルの非存在下で調製する。好ましくは、得られるインフルエンザ調製物は、有機水銀化合物保存剤の非存在下で安定であり、特に、該調製物は残存チオマーサルを含まない。特に、インフルエンザウイルス調製物は、チオマーサルの非存在下で、または低レベルのチオマーサル(一般的には、5μg/ml以下)で安定化されたヘマグルチニン抗原を含む。具体的には、インフルエンザB型株の安定化を、コハク酸α-トコフェロール(コハク酸ビタミンE、すなわちVESとしても知られる)などのα-トコフェロールの誘導体により実施する。そのような調製物およびそれらを調製する方法は、WO 02/097072に開示されている。
【０１０９】
好ましい組成物は、好適なインフルエンザの季節のWHOにより推奨される株から調製された3種の不活化スプリットビリオン抗原を含む。
【０１１０】
好ましくは、本発明に従うインフルエンザウイルスまたはその抗原性調製物およびアジュバントを、同じ容器中に含有させる。それは「1バイアル手法」と呼ばれる。好ましくは、このバイアルは、予め充填されたシリンジである。代替的な実施形態においては、本発明に従うインフルエンザウイルスまたはその抗原性調製物およびアジュバントを、別々の容器またはバイアル中に含有させ、被験者への投与の前またはそれに際して、手短に混合する。それは「2バイアル手法」と呼ばれる。例えば、ワクチンが総容量0.7 mlの2成分ワクチンである場合、濃縮された抗原(例えば、濃縮された三価不活化スプリットビリオン抗原)は1個のバイアル(335μl)(抗原容器)中で提供され、予め充填されたシリンジはアジュバント(360μl)(アジュバント容器)を含む。注入の時点で、濃縮された三価不活化スプリットビリオン抗原を含むバイアルの内容物を、アジュバントを含むシリンジを用いることによりバイアルから除去した後、シリンジを穏やかに混合する。注入の前に、使用した針を、筋肉内用の針に交換し、容量を530μlに補正する。この例では、再構成されたアジュバント化インフルエンザワクチン候補の1回用量は、530μlに一致する。
【０１１１】
本発明の一態様においては、多価組成物が存在する場合、本明細書で定義される前記多価免疫原性組成物中の少なくとも1種のインフルエンザ株は、世界的大流行と関連するか、または世界的大流行と関連する可能性を有する。そのような株を、以下の本文中では「大流行株」と呼ぶ。特に、ワクチンが二価、もしくは三価もしくは四価ワクチンなどの多価ワクチンである場合、少なくとも1種の株が世界的大流行と関連するか、または世界的大流行と関連する可能性を有する。好適な株は、限定されるものではないが、H5N1、H9N2、H7N7、およびH2N2である。
【０１１２】
前記インフルエンザウイルスまたはその抗原性調製物は、好適には、二価または三価または四価などの多価である。好ましくは、インフルエンザウイルスまたはその抗原性調製物は、三価または四価であり、3種の異なるインフルエンザ株に由来する抗原を有し、少なくとも1種の株は世界的大流行と関連するか、または世界的大流行と関連する可能性を有する。
【０１１３】
世界的大流行を引き起こす可能性を与えるインフルエンザウイルス株の特徴は、それが現在循環している株におけるヘマグルチニンと比較して新しいヘマグルチニンを含むこと；それがヒト集団において水平伝播することができること；およびそれがヒトにとって病原性であることである。新しいヘマグルチニンは、長期間、おそらく数十年に渡って、ヒト集団においては明らかではなかったもの、例えば、H2であってよい。または、それは、以前にはヒト集団においては循環していなかったヘマグルチニン、例えば、鳥類において認められるH5、H9、H7もしくはH6であってよい。いずれの場合も、大多数、または少なくとも大きい方の割合の集団、または集団全体でさえ、以前には該抗原に遭遇しておらず、それに対して免疫学的にナイーブである。
【０１１４】
特定の団体は、一般的には大流行の状況ではインフルエンザに感染するようになるリスクが増加している。高齢者、慢性疾患および小児は特に罹患しやすいが、多くの若者および明らかに健康な人々もまた危険である。H2インフルエンザについては、1968年以降に生まれた集団の一部が、リスクが増加した状態にある。これらの群にとっては、できるだけ早く、かつ単純な方法で効率的に保護することが重要である。
【０１１５】
リスクが増加した人々の別の群は、旅行者である。人々は今日では以前より活発に旅行し、多くの新しいウイルスが出現する地域である中国および東南アジアが、近年では人気のある旅行先になってきている。旅行パターンにおけるこの変化により、新しいウイルスは数ヶ月または数年というよりもむしろ、数週間で世界中に到達することができる。
【０１１６】
かくして、これらの群の人々にとっては、大流行の状況または潜在的な大流行の状況において、インフルエンザに対して保護するためのワクチン接種が特に必要である。好適な株は、限定されるものではないが、H5N1、H9N2、H7N7、およびH2N2である。
【０１１７】
必要に応じて、前記組成物は、4以上の価数、例えば、3種の非流行株＋1種の流行株を含んでもよい。あるいは、前記組成物は、3種の流行株を含んでもよい。好ましくは、前記組成物は、3種の流行株を含む。
【０１１８】
また、本発明の免疫原性組成物のための抗原の例は、A群連鎖球菌、またはB群連鎖球菌などの連鎖球菌抗原であるが、最も好ましくは、ストレプトコッカス・ニューモニアに由来するものである。最も好ましくは、少なくとも1種のタンパク質および／または少なくとも1種の糖類抗原を用いる。最も好ましくは、少なくとも1種のストレプトコッカス・ニューモニアタンパク質抗原を、ニューモリシン、PsPAもしくはその膜貫通欠失変異体、PspCもしくはその膜貫通欠失変異体、PsaAもしくはその膜貫通欠失変異体、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、CbpAもしくはその膜貫通欠失変異体、PhtA、PhtD、PhtB、PhtE、SpsA、LytB、LytC、LytA、Sp125、Sp101、Sp128、Sp130およびSp133、またはその免疫学的に機能的な等価物(例えば、上記タンパク質のドメインの融合物、例えば、WO 01/98334およびWO 03/54007に記載のPhtDE融合タンパク質)からなる群より選択する。
【０１１９】
特定の組成物は、WO 00/56359およびWO 02/22167およびWO 02/22168(参照により本明細書に組み入れられるものとする)に記載されている。
【０１２０】
前記抗原は、莢膜糖類抗原(好ましくは、担体タンパク質にコンジュゲートされている)を含んでもよく、この糖類(最も好ましくは、多糖類)は、少なくとも4種の血清型の肺炎球菌に由来するものである。一実施形態においては、4種の血清型は、6B、14、19Fおよび23Fを含む。さらなる実施形態においては、少なくとも7種の血清型、例えば、血清型4、6B、9V、14、18C、19F、および23Fに由来するものが前記組成物中に含まれる。さらなる実施形態においては、少なくとも10種の血清型が前記組成物中に含まれ、例えば、一実施形態においては、該組成物は、血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19Fおよび23Fに由来する莢膜糖類(好ましくは、担体タンパク質にコンジュゲートされている)を含む。別の実施形態においては、前記免疫原性組成物は、血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19Fおよび23Fに由来する莢膜糖類を含む。本発明の好ましい実施形態においては、少なくとも13種の糖類抗原(好ましくは、担体タンパク質にコンジュゲートされている)が含まれるが、さらなる糖類抗原、例えば、23価(血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23Fおよび33F)も本発明により意図される。
【０１２１】
上記糖類はその全長の天然多糖類形態において有利であるが、必要に応じて、タンパク質担体に結合させた場合、依然として免疫原性である(例えば、EP 497524および497525を参照)サイズを減少させた多糖類を用いることもできることが理解されるべきである。
【０１２２】
高齢者(55歳以上)集団における肺炎ならびに幼児(18ヶ月まで)および歩き始めの幼児(典型的には、18ヶ月〜5歳)における中耳炎の予防／改善のためには、本明細書に記載の多価ストレプトコッカス・ニューモニア糖類と、好ましくは、上記のタンパク質群より選択されたストレプトコッカス・ニューモニアタンパク質とを混合することが本発明の好ましい実施形態である。肺炎球菌タンパク質の組合せを、以下に記載のように有利に用いることもできる。
【０１２３】
肺炎球菌タンパク質
ストレプトコッカス・ニューモニア抗原を、ポリヒスチジントライアドファミリー(Pht)に由来するタンパク質、Lytファミリーに由来するタンパク質、コリン結合タンパク質、LPXTGモチーフ(式中、Xは任意のアミノ酸である)を有するタンパク質、LXXC(式中、Xは任意のアミノ酸である)のII型シグナル配列モチーフを有するタンパク質、およびI型シグナル配列モチーフを有するタンパク質からなる群より選択するのが好ましい。これらのカテゴリー(またはモチーフ)内の好ましい例は、以下のタンパク質(またはそのトランケートもしくはその免疫学的に機能的な等価物)である。
【０１２４】
Pht(ポリヒスチジントライアド)ファミリーは、タンパク質PhtA、PhtB、PhtD、およびPhtEを含む。このファミリーは、脂質化配列、おそらく金属もしくはヌクレオシド結合または酵素活性に関与する、プロリンに富む領域およびいくつかのヒスチジントライアドにより分離された2個のドメイン、(3-5)コイルドコイル領域、保存されたN末端ならびに異種性C末端を特徴とする。それは、試験した全ての株の肺炎球菌に存在する。相同なタンパク質は、他の連鎖球菌およびナイセリア菌にも認められている。このファミリーの好ましいメンバーは、PhtA、PhtBおよびPhtDを含む。より好ましくは、それはPhtAまたはPhtDを含む。しかしながら、用語PhtA、B、DおよびEは、以下の引用物に開示された配列を有するタンパク質ならびに参照タンパク質と少なくとも90％同一である配列相同性を有するその天然の(および人工の)変異体を指すことが理解される。好ましくは、それは少なくとも95％同一であり、最も好ましくは、それは97％同一である。
【０１２５】
Phtタンパク質に関して、PhtAはWO 98/18930に開示されており、Sp36とも呼ばれる。上記のように、それはポリヒスチジントライアドファミリーに由来するタンパク質であり、LXXCのII型シグナルモチーフを有する。
【０１２６】
PhtDは、WO 00/37105に開示されており、Sp036Dとも呼ばれる。上記のように、それもまたポリヒスチジントライアドファミリーに由来するタンパク質であり、II型LXXCシグナルモチーフを有する。PhtBは、WO 00/37105に開示されており、Sp036Bとも呼ばれる。別のメンバーのPhtBファミリーは、WO 00/17370に開示されたようなC3分解性ポリペプチドである。このタンパク質もポリヒスチジントライアドファミリーに由来し、II型LXXCシグナルモチーフを有する。好ましい免疫学的に機能的な等価物は、WO 98/18930に開示されたタンパク質Sp42である。PhtBトランケート(約79 kD)は、WO 99/15675に開示されており、これもPhtXファミリーのメンバーであると考えられる。
【０１２７】
PhtEはWO 00/30299に開示されており、BVH-3とも呼ばれる。
【０１２８】
SpsAは、WO 98/39450に開示されたコリン結合タンパク質(Cbp)である。
【０１２９】
Lytファミリーは、細胞溶解に関連する膜結合タンパク質である。そのN末端ドメインは、コリン結合ドメインを含むが、Lytファミリーは以下に注記されるコリン結合タンパク質ファミリー(Cbp)に認められる全ての特徴を有さず、かくして、本発明については、LytファミリーはCbpファミリーとは異なると考えられる。Cbpファミリーとは対照的に、C末端ドメインは、Lytタンパク質ファミリーの触媒ドメインを含む。このファミリーはLytA、BおよびCを含む。Lytファミリーに関しては、LytAはRondaら、Eur J Biochem, 164:621-624 (1987)に開示されている。LytBはWO 98/18930に開示されており、Sp46とも呼ばれる。LytCもWO 98/18930に開示されており、Sp91とも呼ばれる。そのファミリーの好ましいメンバーは、LytCである。
【０１３０】
別の好ましい実施形態は、「Lyt」が上記に定義されたものであり、「トランケート」が50％以上のコリン結合領域を欠くタンパク質を指すLytファミリー(特に、LytA)トランケートである。好ましくは、そのようなタンパク質は、コリン結合領域全体を欠く。Sp125は、LPXTG(式中、Xは任意のアミノ酸である)の細胞壁固定モチーフを有する肺炎球菌表面タンパク質の一例である。このモチーフを有する肺炎球菌表面タンパク質のこのクラス内の任意のタンパク質は、本発明の文脈内で有用であることが判明しており、従って、本発明のさらなるタンパク質であると考えられる。Sp125自身はWO 98/18930に開示されており、ZmpB(亜鉛メタロプロテイナーゼ)としても知られる。
【０１３１】
Sp101はWO 98/06734に開示されている(ここで、それは参照番号y85993を有する)。それはI型シグナル配列を特徴とする。
【０１３２】
Sp133はWO 98/06734に開示されている(ここで、それは参照番号y85992を有する)。それはI型シグナル配列を特徴とする。
【０１３３】
Sp128およびSp130は、WO 00/76540に開示されている。
【０１３４】
本発明で用いられるタンパク質を、群PhtD、PhtAおよびPhtE、またはこれらのタンパク質の2個もしくは3個全部の組合せ(すなわち、PhtA+D、A+E、D+EもしくはA+D+E)から選択するのが好ましい。
【０１３５】
挙げられるさらなる肺炎球菌タンパク質抗原は、ニューモリシン(Plyとも呼ばれる；好ましくは、化学的処理もしくは突然変異により解毒されたもの)[WO 96/05859、WO 90/06951、WO 99/03884]、PsaAおよびその膜貫通欠失変異体(Berry & Paton, Infect Immun 1996 Dec;64(12):5255-62)、PspAおよびその膜貫通欠失変異体(米国特許第5,804,193号、WO 92/14488、WO 99/53940)、PspCおよびその膜貫通欠失変異体(WO 97/09994、WO 99/53940)、コリン結合タンパク質(Cbp)ファミリーのメンバー[例えば、CbpAおよびその膜貫通欠失変異体(WO 97/41151; WO 99/51266)]、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(Infect. Immun. 1996 64:3544)、HSP70 (WO 96/40928)、PcpA (Sanchez-Beatoら、FEMS Microbiol Lett 1998, 164:207-14)、M様タンパク質(SB特許出願第EP 0837130号)、ならびにアドヘシン18627 (SB特許出願第EP 0834568号)からなる群に由来する1個以上のものである。本発明はまた、そのようなタンパク質(上記で定義されたような)の免疫学的に機能的な等価物またはトランケートも包含する。
【０１３６】
コリン結合タンパク質ファミリーに関して、そのファミリーのメンバーは、元々はコリンアフィニティクロマトグラフィーにより精製することができる肺炎球菌タンパク質として同定されたものである。全てのコリン結合タンパク質は、細胞壁のテイコ酸および膜結合リポテイコ酸のホスホリルコリン部分に非共有結合する。構造的には、それらはファミリー全体に渡って共通のいくつかの領域を有するが、該タンパク質の正確な性質(アミノ酸配列、長さなど)は変化し得る。一般的には、コリン結合タンパク質は、N末端領域(N)、保存された反復領域(R1および／またはR2)、プロリンに富む領域(P)および複数の反復から作られ、該タンパク質の約半分を含む保存されたコリン結合領域(C)を含む。本出願で用いられる用語「コリン結合タンパク質ファミリー(Cbp)」は、WO 97/41151に定義されたコリン結合タンパク質、PbcA、SpsA、PspC、CbpA、CbpDおよびCbpGからなる群より選択される。CbpAはWO 97/09994に開示されている。CbpDおよびCbpGはWO 00/29434に開示されている。PspCはWO 97/09994に開示されている。PbcAはWO 98/21337に開示されている。好ましくは、コリン結合タンパク質は、CbpA、PbcA、SpsAおよびPspCからなる群より選択される。
【０１３７】
Cbpが用いられるさらなるタンパク質である場合、それは「Cbp」が上記で定義されたものであり、「トランケート」が50％以上のコリン結合領域(C)を欠くタンパク質を指すCbpトランケートであってよい。好ましくは、そのようなタンパク質は、コリン結合領域全体を欠く。より好ましくは、そのようなタンパク質トランケートは、(i)コリン結合領域および(ii)同様に該タンパク質のN末端の半分の一部を欠くが、少なくとも1個の反復領域(R1またはR2)を保持する。さらにより好ましくは、該トランケートは2個の反復領域(R1およびR2)を有する。そのような好ましい実施形態の例は、WO 99/51266またはWO 99/51188に例示されたNR1xR2、R1xR2、NR1xR2PおよびR1xR2Pであるが、同様のコリン結合領域を欠く他のコリン結合タンパク質も、本発明の範囲内に意図される。
【０１３８】
Cbpトランケート-Lytトランケートキメラタンパク質(または融合物)を、本発明の組成物において用いることもできる。好ましくは、これはCbpのNR1xR2(またはR1xR2もしくはNR1xR2PもしくはR1xR2P)およびLytのC末端部分(Cterm、すなわち、コリン結合ドメイン)(例えば、LytCCtermもしくはSp91Cterm)を含む。より好ましくは、Cbpを、CbpA、PbcA、SpsAおよびPspCからなる群より選択する。さらにより好ましくは、それはCpbAである。好ましくは、LytはLytC(Sp91とも呼ばれる)である。
【０１３９】
コリン結合ドメイン(C)を欠き、Lytとの融合タンパク質として発現されるPspAまたはPsaAトランケートを用いることもできる。好ましくは、LytはLytCである。
【０１４０】
肺炎球菌組成物においては、本発明の異なる肺炎球菌タンパク質を混合することができる。好ましくは、本発明のタンパク質の組合せを、LXXCのII型シグナル配列モチーフを有するタンパク質(式中、Xは任意のアミノ酸であり、例えば、ポリヒスチジントライアドファミリー(Pht))、コリン結合タンパク質(Cbp)、I型シグナル配列モチーフを有するタンパク質(例えば、Sp101)、LPXTGモチーフを有するタンパク質(式中、Xは任意のアミノ酸であり、例えば、Sp128、Sp130)、毒素(例えば、Ply)などの2個以上(3または4)の異なるカテゴリーから選択する。これらのカテゴリー(またはモチーフ)内の好ましい例は、上記のタンパク質、またはその免疫学的に機能的な等価物である。毒素+Pht、毒素+Cbp、Pht+Cbp、および毒素+Pht+Cbpが好ましいカテゴリーの組合せである。好ましい有益な組合せとしては、限定されるものではないが、PhtD+NR1xR2、PhtD+NR1xR2-Sp91Ctermキメラもしくは融合タンパク質、PhtD + Ply、PhtD + Sp128、PhtD + PsaA、PhtD + PspA、PhtA + NR1xR2、PhtA + NR1xR2-Sp91Ctermキメラもしくは融合タンパク質、PhtA + Ply、PhtA + Sp128、PhtA + PsaA、PhtA + PspA、NR1xR2 + LytC、NR1xR2 + PspA、NR1xR2 + PsaA、NR1xR2 + Sp128、R1xR2 + LytC、R1xR2 + PspA、R1xR2 + PsaA、R1xR2 + Sp128、R1xR2 + PhtD、R1xR2 + PhtAが挙げられる。好ましくは、NR1xR2 (またはR1xR2)はCbpAまたはPspCに由来するものである。より好ましくは、それはCbpAに由来するものである。
【０１４１】
肺炎球菌タンパク質の特に好ましい組合せは、必要に応じて、NR1xR2(またはR1xR2もしくはNR1xR2PもしくはR1xR2P)を有するPly(またはそのトランケートもしくは免疫学的に機能的な等価物) + PhtD(またはそのトランケートもしくは免疫学的に機能的な等価物)を含む。好ましくは、NR1xR2(またはR1xR2もしくはNR1xR2PもしくはR1xR2P)は、CbpAまたはPspCに由来するものである。より好ましくは、それはCbpAに由来するものである。
【０１４２】
前記抗原は、少なくとも4種の血清型、好ましくは、少なくとも7種の血清型、より好ましくは、少なくとも10種の血清型、および少なくとも1種の、しかし好ましくは2、3、もしくは4種の、好ましくは上記タンパク質群から選択されるストレプトコッカス・ニューモニアタンパク質に由来する多糖類抗原を含む肺炎球菌糖類コンジュゲートであってよい。好ましくは、該タンパク質の1つはPhtD(またはその免疫学的に機能的な等価物)および／またはPly(またはその免疫学的に機能的な等価物)である。
【０１４３】
ワクチン接種に対する多糖類手法に関連する問題は、多糖類自体が免疫原として弱いという事実である。これを克服するために、糖類を、バイスタンダーT細胞ヘルプを提供するタンパク質担体とコンジュゲートさせることができる。従って、本発明で用いられる糖類を、そのようなタンパク質担体と連結することが好ましい。糖類免疫原の製造に現在一般的に用いられているそのような担体の例としては、ジフテリアおよび破傷風トキソイド(それぞれ、DT、DT CRM197およびTT)、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、髄膜炎菌(N. meningitidis)に由来するOMPCならびにツベルクリンの精製されたタンパク質誘導体(PPD)が挙げられる。
【０１４４】
肺炎球菌糖類に基づく免疫原性組成物(またはワクチン)のための好ましい担体は、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus influenzae)(EP 594610-B)に由来するDタンパク質、またはその断片である。使用にとって好適な断片としては、Tヘルパーエピトープを包含する断片が挙げられる。特に、好ましいDタンパク質断片は、該タンパク質のN末端の1/3を含むであろう。Dタンパク質担体は、複数の肺炎球菌糖類抗原をコンジュゲートさせる組成物における担体として有用である。組合せ中の1種以上の肺炎球菌糖類を、Dタンパク質上で有利にコンジュゲートさせることができる。
【０１４５】
肺炎球菌糖類のためのさらに好ましい担体は、肺炎球菌タンパク質自身である(「本発明の肺炎球菌タンパク質」の節で定義される)。
【０１４６】
前記糖類を、任意の公知の方法により担体タンパク質に連結することができる(例えば、Likhite、米国特許第4,372,945号およびArmorら、米国特許第4,474,757号)。好ましくは、CDAPコンジュゲーションを実行する(WO 95/08348)。
【０１４７】
好ましくは、前記コンジュゲートのタンパク質：糖類比(重量：重量)は、0.3:1〜1:1、より好ましくは、0.6:1〜0.8:1、最も好ましくは、約0.7:1である。
【０１４８】
特に好ましい本発明の組成物は、1種以上のコンジュゲート化肺炎球菌糖類、および1種以上の本発明の肺炎球菌タンパク質を含む。さらに、肺炎球菌糖類およびタンパク質を、液体形態のリン酸アルミニウム上に吸着させたバルク成分として安定に保存することができる。
【０１４９】
本発明の別の態様においては、前記ワクチン組成物は、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)抗原を含んでもよい。HCMVは、ヘルペスウイルスのファミリーに属するヒトDNAウイルスであり、新生児における先天的欠陥の主要な原因であり、免疫不全患者における重篤な医学的症状も引き起こす。臨床疾患は、発熱、肝炎、肺炎および感染性単核症などの様々な症候を引き起こす。
【０１５０】
一実施形態においては、HCMV抗原は、HSV糖タンパク質の一部に融合されたHCMV糖タンパク質の一部を含むキメラ融合タンパク質またはその免疫原性誘導体である。HCMV糖タンパク質は、典型的には、gBであり、HSV糖タンパク質は、典型的には、gD、特に2型HSV gD(gD2)である。典型的には、この融合物は、HCMV gBタンパク質の一部のN末端部分におけるアミノ酸と、HSV gDタンパク質の一部のC末端のアミノ酸との間にある。前記融合タンパク質のHCMV gBタンパク質とHSV gDタンパク質成分成分は共に、膜アンカードメインを欠いてもよい。
【０１５１】
HCMV gBタンパク質の部分は、非切断可能形態のHCMV gBを含んでもよい。好適には、該タンパク質の切断部位の1個以上のアミノ酸を変化させることにより、例えば、それぞれ、Arg458およびArg459をGluおよびThrに交換することにより、これを達成する。HSVタンパク質の一部は、gD2のシグナル配列(アミノ酸1〜25)および必要に応じて、gD2のアミノ酸26〜52ならびに／またはPEDSALLEDPEDであるgD2に由来する配列またはより短いか、もしくはより長いものであってよいその機能的等価物を含んでもよい。HSV gDに由来するさらなる配列を、前記融合タンパク質に、例えば、HCMV gBタンパク質のC末端に付加してもよい。
【０１５２】
一実施形態においては、前記融合タンパク質は、HCMV gBタンパク質の残基28〜685に融合されたHSV gD2タンパク質のアミノ酸1〜52を含む。そのような融合タンパク質を、HCMV gB685*と命名する。さらなる実施形態においては、内部gD2配列に由来するアミノ酸配列PEDSALLEDPEDを、タンパク質HCMV gB685*のC末端に含有させて、HCMV gB685**と命名されるタンパク質を作製することができる。これらの特異的な融合タンパク質は、WO 95/31555により詳細に記載されている。
【０１５３】
HCMVワクチンとしての使用にとって好適な別の免疫原は、WO 94/00150(City of Hope)に記載のHCMVマトリックスタンパク質であるpp65である。
【０１５４】
本発明のさらなる実施形態においては、免疫原性組成物は、生殖器疣の原因であると考えられるヒトパピローマウイルス(HPV)(HPV6もしくはHPV11など)、および／または頸部癌の原因となるHPVウイルス(HPV16、HPV18など)に由来する抗原または抗原性調製物を含む。
【０１５５】
一実施形態においては、生殖器疣の形態の予防用、または治療用組成物は、L1粒子またはキャプソマー、ならびにHPVタンパク質E1、E2、E5、E6、E7、L1およびL2から選択される1種以上の抗原を含む融合タンパク質を含む。
【０１５６】
一実施形態においては、融合タンパク質の形態は、WO 96/26277に開示されたL2E7、およびGB 9717953.5(PCT/EP98/05285)に開示されたDタンパク質(1/3)-E7である。
【０１５７】
好ましいHPV頸部感染または癌の予防用または治療用組成物は、HPV16または18抗原を含んでもよい。例えば、L1もしくはL2抗原モノマー、またはL1もしくはL2抗原を、ウイルス様粒子(VLP)として一緒に提供するか、またはL1タンパク質のみをVLPもしくはキャプソマー構造中で提供する。そのような抗原、ウイルス様粒子およびキャプソマーは、自体公知である。例えば、WO94/00152、WO94/20137、WO94/05792およびWO93/02184を参照されたい。
【０１５８】
追加の初期タンパク質を単独で、または例えば、E7、E2もしくは、好ましくはE5などの融合タンパク質として含有させることができる；これの特に好ましい実施形態は、L1E7融合タンパク質を含むVLPを含む(WO 96/11272)。
【０１５９】
一実施形態においては、HPV16抗原は、Dタンパク質担体との融合物中に初期タンパク質E6もしくはE7を含み、HPV16に由来するDタンパク質-E6もしくはE7融合物、またはその組合せ；またはE6もしくはE7とL2との組合せを形成する(WO 96/26277)。
【０１６０】
あるいは、HPV16もしくは18の初期タンパク質E6およびE7を、単一の分子、好ましくは、Dタンパク質-E6/E7融合物中で提供することができる。そのような組成物は、必要に応じて、好ましくはDタンパク質-E6もしくはDタンパク質-E7融合タンパク質またはDタンパク質-E6/E7融合タンパク質の形態の、HPV18に由来するE6およびE7タンパク質のいずれかまたは両方を含んでもよい。
【０１６１】
本発明の組成物はさらに、他のHPV型、好ましくはHPV31または33に由来する抗原を含んでもよい。癌原性HPV型としては、HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66および68を含む。かくして、本発明の組成物は、HPV16および／またはHPV18に加えて、これらのHPV型の1種以上に由来する抗原を含んでもよい。
【０１６２】
本発明において有用なHPV L1 VLPまたはキャプソマーは、完全長L1もしくはL1の免疫原性断片を含むか、またはそれからなってもよい。このVLPまたはキャプソマーが、L1の免疫原性断片を含むか、またはそれからなる場合、HPV L1の好適な免疫原性断片は、L1のトランケ-ション、欠失、置換、または挿入変異体を含む。そのような免疫原性断片は、好適には免疫応答を生じることができ、該免疫応答は、L1タンパク質が誘導されたHPV型から、ウイルス様粒子などのL1タンパク質を認識することができる。好適な免疫原性L1断片は、トランケートされたL1タンパク質を含む。一態様においては、このトランケーションは、核局在化シグナルを除去する。別の態様においては、トランケーションは、C末端トランケーションである。さらなる態様においては、C末端トランケーションは、40アミノ酸未満などの50アミノ酸より少ないアミノ酸を除去する。L1がHPV16に由来する場合、別の態様においては、C末端トランケーションはHPV16 L1に由来する34個のアミノ酸を除去する。L1がHPV18に由来する場合、さらなる態様においては、C末端トランケーションは、HPV18 L1に由来する35個のアミノ酸を除去する。
【０１６３】
好適なトランケートされたHPV16および18のL1配列は、WO 06/114312に与えられている。HPV16配列は、例えば、好適にトランケートされた、WO 9405792または米国特許第6,649,167号に開示されたものであってもよい。好適なトランケートは、配列比較により評価されるように、上記で考察されたものと等価な位置でトランケートされている。
【０１６４】
別のHPV18配列は、WO9629413に開示されており、好適にトランケートすることができる。好適なトランケートは、配列比較により評価されるように、上記で考察されたものと等価な位置でトランケートされている。
【０１６５】
他のHPV16およびHPV18配列は、当業界でよく知られており、本発明における使用にとって好適である。
【０１６６】
別のHPV型に由来するL1タンパク質が存在する場合、DNAまたはタンパク質配列アラインメントに基づいて、HPV16およびHPV18について作製されたものに対応するC末端トランケーションを用いることができる。HPV31および45のL1タンパク質の好適なトランケーションは、WO 06/114312に与えられている。
【０１６７】
例えば、HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66および68の好適なトランケーションを、一態様においては、配列アラインメントにより評価されるように、上記のものと等価なL1タンパク質のC末端部分を除去することにより作製することもできる。
【０１６８】
本発明のL1タンパク質または免疫原性断片は、必要に応じて、融合タンパク質、例えば、L1タンパク質とL2もしくは初期タンパク質との融合物の形態にあってもよい。
【０１６９】
HPV L1タンパク質は、好適にはキャプソマーまたはウイルス様粒子(VLP)の形態となっている。一態様においては、HPV VLPを、本発明において用いることができる。HPV VLPおよびVLPの製造のための方法は、当業界でよく知られている。典型的には、VLPを、L1および必要に応じて、前記ウイルスのL2構造タンパク質から構築する。例えば、WO9420137、US5985610、W09611272、US6599508B1、US6361778B1、EP 595935を参照されたい。L1またはL1+L2 VLPなどの、干渉効果を提供する任意の好適なHPV VLPを本発明において用いることができる。
【０１７０】
好適には、VLPはL1-VLPのみである。
【０１７１】
本発明の組成物は、HPV16 L1 VLPおよびHPV18 L1 VLPの組合せ、またはHPV16、18、31および45に由来するHPV L1 VLPの組合せ、またはより大きい組合せを含んでもよく、HPV16および18もしくはHPV16、18、31および45 L1 VLP、または大きい組合せを含み、ここでL1は必要に応じて本明細書に記載のようにトランケートされている。
【０１７２】
本発明の特定の実施形態においては、癌を引き起こすHPV型に由来する1種以上のさらなる抗原を、HPV16および／または18抗原と共に使用し、この抗原は以下のHPV型から選択される：HPV31、45、33、58および52。本明細書に記載のように、この抗原は、それぞれ、L1であってもよく、L1 VLPまたはキャプソマーの形態にあってもよい。かくして、前記組成物における使用のためのHPV抗原、本明細書に記載の方法および使用は、HPV16、18、31、45、33、58および52に由来するL1 VLPまたはキャプソマーを含むか、またはそれからなってもよい。L1 VLPは、L1-VLPのみであるか、またはL1+L2 VLP中のL2などの別の抗原との組合せにあってもよい。好適には、L1タンパク質を本明細書に記載のようにトランケートすることができる。
【０１７３】
VLP形成を、例えば、電子顕微鏡およびダイナミックレーザー光散乱などの標準的な技術により評価することができる。
【０１７４】
VLPは、完全長L1タンパク質を含んでもよい。一態様においては、VLPを形成させるのに用いられるL1タンパク質は、上記のようなトランケートされたL1タンパク質である。
【０１７５】
VLPを、酵母細胞または昆虫細胞などの任意の好適な細胞基質、例えば、バキュロウイルス発現系において作製することができ、VLPの調製のための技術は当業界でよく知られており、例えば、WO9913056、米国特許第6,416,945B1号、米国特許第6,261,765B1号および米国特許第6,245,568号、ならびにその参考文献などが挙げられ、その全体の内容は参照により本明細書に組み入れられるものとする。VLPを、より安定な、および／または均一なパピローマウイルスVLPを提供することができる分解および再集合技術により作製することができる。例えば、McCarthyら、1998、「in vitroでのヒトパピローマウイルスII型ウイルス様粒子の定量的分解および再集合(Quantitative Disassembly and Reassembly of Human Papillomavirus Type 11 Virus like Particles in Vitro)」、J. Virology 72(1):33-41は、VLPの均一な調製物を取得するための昆虫細胞から精製された組換えL1 HPV11 VLPの分解および再集合を記載している。WO 9913056および米国特許第6,245,568号はまた、HPV VLPを作製するための分解／再集合プロセスも記載している。
【０１７６】
一態様においては、HPV VLPを、WO 9913056または米国特許第6,245,568号に記載のように作製する。
【０１７７】
本発明の組成物は、プラスモジウム・ファルシパルムまたはプラスモジウム・ビバックスなどのマラリアを引き起こす寄生虫に由来する抗原または抗原性調製物を含んでもよい。例えば、プラスモジウム・ファルシパルムに由来する潜在的な抗原としては、スポロゾイト周囲タンパク質(CSタンパク質)、RTS、S、MSP1、MSP3、LSA1、LSA3、AMA1およびTRAPが挙げられる。RTSは、B型肝炎表面抗原のpreS2部分の4個のアミノ酸を介して、B型肝炎ウイルスの表面(S)抗原に連結されたP.falciparumのスポロゾイト周囲(CS)タンパク質のC末端部分の実質的に全部を含むハイブリッドタンパク質である。その完全な構造は、英国特許出願第9124390.7号から優先権を主張するWO 93/10152の下で公開された、国際特許出願PCT/EP92/02591に開示されている。酵母中で発現される場合、RTSはリポタンパク質粒子として産生され、HBVに由来するS抗原と共に同時発現される場合、RTS,Sとして知られる混合粒子を産生する。TRAP抗原は、WO 90/01496の下で公開された、国際特許出願PCT/GB89/00895に記載されている。本発明の好ましい実施形態は、抗原性調製物がRTS,SおよびTRAP抗原の組合せを含むマラリアワクチンである。多段階マラリアワクチンの成分の候補となる可能性のある他のプラスモジウム抗原は、P.falciparumのMSP1、AMA1、MSP3、EBA、GLURP、RAP１、RAP2、セクエストリン、PfEMP1、Pf332、LSA1、LSA3、STARP、SALSA、PfEXP1、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs16、Pfs48/45、Pfs230およびプラスモジウム種におけるその類似体である。本発明の一実施形態は、例えば、MSP1、MSP3、AMA1、LSA1もしくはLSA3からなる群より選択することができる1種以上のさらなるマラリア抗原と組み合わせた、RTS、SもしくはCSタンパク質またはRTS,SのCS部分などのその断片を含む組成物である。P.vivaxに由来する潜在的な抗原としては、スポロゾイト周囲タンパク質(CSタンパク質)およびDuffy抗原結合タンパク質およびPvRIIなどのその断片(例えば、WO 02/12292を参照)が挙げられる。
【０１７８】
本発明の免疫原性組成物において用いることができる他の潜在的な抗原としては、A群連鎖球菌、もしくはB群連鎖球菌などに由来する連鎖球菌抗原、好適には、HIV-1に由来する抗原(F4抗原もしくはその断片またはgagもしくはその断片、例えば、p24、tat、nef、gp120もしくはgp160またはこれらのいずれかの断片)、ヒトヘルペスウイルス、例えば、gDもしくはその誘導体、またはHSV1もしくはHSV2に由来するICP27などの極初期タンパク質、サイトメガロウイルス((特に、ヒト)(gBもしくはその誘導体など))、ロタウイルス(生弱毒化ウイルスなど)、エプスタインバーウイルス(gp350もしくはその誘導体など)、水痘-帯状疱疹ウイルス(gpI、IIおよびIE63)、またはB型肝炎ウイルス、A型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルスおよびE型肝炎ウイルスなどの肝炎ウイルスに由来する抗原(例えば、B型肝炎表面抗原もしくはその誘導体)、または他のウイルス病原体、例えば、パラミクソウイルス、呼吸器合胞体ウイルス(F、NおよびGタンパク質もしくはその誘導体)、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ヒトパピローマウイルス(例えば、HPV6、11、16、18)、フラビウイルス(例えば、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス)もしくはインフルエンザウイルス(卵もしくはMDCK細胞中で増殖させた、全生もしくは不活化ウイルス、スプリットインフルエンザウイルス、または全Fluビロソーム(R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920)またはHA、NP、NAもしくはMタンパク質、またはその組合せなどの精製された、もしくは組換えのタンパク質)に由来する抗原、またはナイセリア・ゴノレア(N. gonorrhea)およびナイセリア・メニンギティディス(N. meningitidis)などのナイセリア種などの細菌病原体に由来する抗原(例えば、莢膜糖類およびそのコンジュゲート、トランスフェリン結合タンパク質、ラクトフェリン結合タンパク質、PilC、アドヘシン)；ストレプトコッカス・ピオジェネス(S.pyogenes)(例えば、Mタンパク質もしくはその断片、C5Aプロテアーゼ、リポテイコ酸)、ストレプトコッカス・アガラクチア(S. agalactiae)、ストレプトコッカス・ミュータンス(S. mutans); ヘモフィルス・デュクレイ(H. ducreyi)；モラクセラ・カタラリス(M. catarrhalis)(ブランハメラ・カタラリス(Branhamella catarrhalis)としても知られる)などのモラクセラ種(例えば、高分子量および低分子量アドヘシンおよびインベイシン)；ボルデテラ・ペルツシス(B. pertussis)(例えば、ペルタクチン、百日咳毒素もしくはその誘導体、繊維性ヘマグルチニン、アデニル酸シクラーゼ、フィンブリア)、ボルデテラ・パラペルツシス(B. parapertussis)およびボルデテラ・ブロンキセプティカ(B. bronchiseptica)などのボルデテラ種；マイコバクテリウム・ツベルクロシス(M. tuberculosis)(例えば、ESAT6、85A、-Bもしくは-C抗原)、マイコバクテリウム・ボビス(M. bovis)、マイコバクテリウム・レプラ(M. leprae)、マイコバクテリウム・アビウム(M. avium)、マイコバクテリウム・パラツベルクロシス(M. paratuberculosis)、マイコバクテリウム・スメングマティス(M. smengmatis)などのマイコバクテリウム種；レジオネラ・ニューモフィラなどのレジオネラ種；腸毒性大腸菌(例えば、コロニー形成因子、熱不安定毒素もしくはその誘導体、熱安定毒素もしくはその誘導体)、腸管出血性大腸菌、病原性大腸菌(例えば、志賀毒素様毒��もしくはその誘導体)などのエシェリシア種；ビブリオ・コレラ(V. cholera)(例えば、コレラ毒素もしくはその誘導体)などのビブリオ種；シゲラ・ソネイ(S. sonnei)、シゲラ・ディセンテリエ(S. dysenteriae)、シゲラ・フレクスネリ(S. flexnerii)などのシゲラ種；エルシニア・エンテロコリティカ(Y. enterocolitica)(例えば、Yopタンパク質)、エルシニア・ペスティス(Y. pestis)、エルシニア・シュードツベルクロシス(Y. pseudotuberculosis)などのエルシニア種；カンピロバクター・ジェジュニ(C. jejuni)(例えば、毒素、アドヘシンおよびインベイシン)およびカンピロバクター・コリ(C. coli)などのカンピロバクター種；サルモネラ・ティフィ(S. typhi)、サルモネラ・パラティフィ(S. paratyphi)、サルモネラ・コレラスイス(S. choleraesuis)、サルモネラ・エンテリティディス(S. enteritidis)などのサルモネラ種；リステリア・モノサイトジェンス(L. monocytogenes)などのリステリア種；ヘリコバクター・ピロリ(例えば、ウレアーゼ、カタラーゼ、細胞空胞化毒素)などのヘリコバクター種；シュードモナス・エルギノーサ(P. aeruginosa)などのシュードモナス種；スタフィロコッカス・オーレウス(S. aureus)、スタフィロコッカス・エピデルミディス(S. epidermidis)などのスタフィロコッカス種；エンテロコッカス・ファカリス(E. faecalis)、エンテロコッカス・ファシウム(E. faecium)などのエンテロコッカス種；クロストリジウム・テタニ(C. tetani)(例えば、破傷風毒素およびその誘導体)、クロストリジウム・ボツリナム(C. botulinum)(例えば、ボツリヌス毒素およびその誘導体)、クロストリジウム・ディフィシル(C. difficile)(例えば、クロストリジウム毒素AもしくはBおよびその誘導体)などのクロストリジウム種；バチルス・アントラシス(B. anthracis)(例えば、ボツリヌス毒素およびその誘導体)などのバチルス種；コリネバクテリウム・ジフテリア(C. diphtheriae)(例えば、ジフテリア毒素およびその誘導体)などのコリネバクテリウム種；ボレリア・ブルグドフェリ(B. burgdorferi)(例えば、OspA、OspC、DbpA、DbpB)、ボレリア・ガリニ(B. garinii)(例えば、OspA、OspC、DbpA、DbpB)、ボレリア・アフゼリ(B. afzelli)(例えば、OspA、OspC、DbpA、DbpB)、ボレリア・アンダーソニー(B. andersonii)(例えば、OspA、OspC、DbpA、DbpB)、ボレリア・ヘルムシ(B. hermsii)などのボレリア種；エールリヒア・エクイ(E. equi)などのエールリヒア種およびヒト顆粒球性エールリヒア症の作用因子；リケッチア・リケッチ(R. rickettsii)などのリケッチア種；クラミジア・トラコマティス(C. trachomatis)(例えば、MOMP、ヘパリン結合タンパク質)、クラミジア・ニューモニア(C. pneumoniae)(例えば、MOMP、ヘパリン結合タンパク質)、クラミジア・シッタシ(C. psittaci)などのクラミジア種；レプトスピラ・インテロガンス(L. interrogans)などのレプトスピラ種；トレポネマ・パリダム(T. pallidum)(例えば、稀な外膜タンパク質)、トレポネマ・デンティコラ(T. denticola)、トレポネマ・ハイオディセンテリー(T. hyodysenteriae)などのトレポネマ種などの細菌に由来する抗原；またはプラスモジウム・ファルシパルム(P. falciparum)などのプラスモジウム種；トキソプラズマ・ゴンジ(T. gondii)(例えば、SAG2、SAG3、Tg34)などのトキソプラズマ種；エントアメーバ・ヒストリティカ(E. histolytica)などのエントアメーバ種；バベシア・ミクロチ(B. microti)などのバベシア種；トリパノソーマ・クルージ(T. cruzi)などのトリパノソーマ種；ジアルジア・ランブリア(G. lamblia)などのジアルジア種；レーシュマニア・メジャー(L. major)などのレーシュマニア種；ニューモシスティス・カリニ(P. carinii)などのニューモシスティス種；トリコモナス・バギナリス(T. vaginalis)などのトリコモナス種；スキゾストーマ・マンソニ(S. mansoni)などのスキゾストーマ種などの寄生虫に由来する抗原、またはカンジダ・アルビカンス(C. albicans)などのカンジダ種；クリプトコッカス・ネオフォーマンス(C. neoformans)などのクリプトコッカス種などの酵母に由来する抗原が挙げられる。
【０１７９】
結核菌(M. tuberculosis)のための他の好ましい特異的抗原は、例えば、Tb Ra12、Tb H9、Tb Ra35、Tb38-1、Erd14、DPV、MTI、MSL、mTTC2およびhTCC1(WO 99/51748)、Mtb72FならびにM72である。結核菌のためのタンパク質としては、少なくとも2種、好ましくは、3種の結核菌のポリペプチドを、より大きいタンパク質に融合させた融合タンパク質およびその変異体も挙げられる。好ましい融合物としては、Ra12-TbH9-Ra35、Erd14-DPV-MTI、DPV-MTI-MSL、Erd14-DPV-MTI-MSL-mTCC2、Erd14-DPV-MTI-MSL、DPV-MTI-MSL-mTCC2、TbH9-DPV-MTI (WO 99/51748)が挙げられる。記載することができる特定のRa12-TbH9-Ra35配列は、その配列のSer 704をセリン以外の残基、例えば、Alaに突然変異させた変異体、および好適な長さのN末端ヒスチジンタグを組込んだその誘導体(例えば、WO2006/117240の配列番号2もしくは4)と共に、WO2006/117240の配列番号6により定義される。
【０１８０】
クラミジア・トラコマチサレ(C. trachomatisare)などのクラミジア種のための例示的な抗原は、CT858、CT089、CT875、MOMP、CT622、PmpD、PmpGおよびその断片、SWIBおよびそれらのいずれか1種の免疫原性断片(PmpDpdおよびPmpGpd)ならびにそれらの組合せから選択される。抗原の好ましい組合せとしては、CT858、CT089およびCT875が挙げられる。用いることができる特定の配列および組合せは、WO2006/104890に記載されている。好ましい細菌組成物は、B型インフルエンザ菌(例えば、PRPおよびそのコンジュゲート)、非分類性インフルエンザ菌などのヘモフィルス種に由来する抗原を含み、例えば、OMP26、高分子量アドヘシン、P5、P6、Dタンパク質およびリポタンパク質D、ならびにフィンブリンおよびフィンブリン由来ペプチド(米国特許第5,843,464号)またはその複数コピー変異体もしくは融合タンパク質が挙げられる。
【０１８１】
B型肝炎表面抗原の誘導体は、当業界でよく知られており、特に、欧州特許出願EP-A-414 374、EP-A-0304 578およびEP 198-474に記載のPreS1、PreS2 S抗原が挙げられる。1つの好ましい態様においては、本発明のワクチン製剤は、特に、CHO細胞中で発現させる場合、HIV-1抗原、gp120を含む。さらなる実施形態においては、本発明の組成物は、上記で定義されたgD2tを含む。
【０１８２】
前記組成物はまた、抗腫瘍抗原も含んでもよく、癌の免疫治療的処理にとって有用である。例えば、該抗原は、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、腎臓癌またはメラノーマに対するものなどの腫瘍拒絶抗原であってよい。例示的な抗原としては、MAGE1、3およびMAGE4もしくはWO99/40188に開示されたものなどの他のMAGE抗原、PRAME、BAGE、Lage(NY Eos 1としても知られる)、SAGEおよびHAGE(WO 99/53061)もしくはGAGE(RobbinsおよびKawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, pps 628-636； Van den Eyndeら、International Journal of Clinical & Laboratory Research (1997年提出); Correaleら(1997), Journal of the National Cancer Institute 89, p293)が挙げられる。実際に、これらの抗原は、メラノーマ、肺癌、肉腫および膀胱癌などの様々な腫瘍型で発現される。
【０１８３】
本発明における使用のためのMAGE抗原を、発現エンハンサーまたは免疫学的融合パートナーとの融合タンパク質として発現させることができる。特に、Mageタンパク質を、B型インフルエンザ菌に由来するDタンパク質またはその脂質化誘導体に融合することができる。特に、この融合パートナーは、Dタンパク質の最初の1/3を含んでもよい。そのような構築物は、WO 99/40188に開示されている。
【０１８４】
他の腫瘍特異的抗原としては、限定されるものではないが、KSA(GA733)腫瘍特異的ガングリオシド、例えば、GM2およびGM3もしくは担体タンパク質とのそのコンジュゲートが挙げられる；または該抗原は、短い10アミノ酸長のペプチドである全長ゴナドトロピンホルモン放出ホルモン(GnRH、WO 95/20600)などの自己ペプチドホルモンであってよく、多くの癌の治療、または免疫去勢(immunocastration)において有用である。
【０１８５】
好ましい実施形態においては、前立腺特異的抗原(PSA)、PAP、PSCA(PNAS 95(4) 1735-1740, 1998)、PSMAまたはプロスターゼとして知られる抗原などの前立腺抗原を用いる。
【０１８６】
プロスターゼは、保存されたセリンプロテアーゼ触媒トライアドH-D-Sおよびアミノ末端のプレプロペプチド配列を有する254アミノ酸長の前立腺特異的セリンプロテアーゼ(トリプシン様)であり、潜在的な分泌機能を示す(P. Nelson, Lu Gan, C. Ferguson, P. Moss, R. Gelinas, L. Hood & K. Wand、「前立腺で限定的に発現されるアンドロゲン調節性セリンプロテアーゼであるプロスターゼの分子クローニングと特性評価(Molecular cloning and characterisation of prostase, an androgen-regulated serine protease with prostate restricted expression)」、In Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96, 3114-3119)。推定糖鎖付加部位が記載されている。予測される構造は、他の公知のセリンプロテアーゼと非常に類似しており、成熟なポリペプチドが単一のドメインに折り畳まれることを示している。成熟タンパク質は、1個のA2エピトープを有する224アミノ酸長であり、天然に加工されることが示されている。
【０１８７】
プロスターゼのヌクレオチド配列および推定されるポリペプチド配列ならびに相同体が、Fergusonら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 3114-3119)および国際特許出願WO 98/12302 (およびまた対応する許諾された特許である米国特許第5,955,306号)、WO 98/20117 (およびまた対応する許諾された特許である米国特許第5,840,871号および同第5,786,148号) (前立腺特異的カリクレイン)ならびにWO 00/04149 (P703P)に開示されている。
【０１８８】
本発明は、プロスターゼタンパク質ならびにその断片および相同体に基づくプロスターゼタンパク質融合物を含む組成物(「誘導体」)を提供する。そのような誘導体は、前立腺腫瘍の治療にとって好適である治療用ワクチン製剤における使用にとって好適である。典型的には、この断片は、上記の特許および特許出願に開示されるように、少なくとも20個、好ましくは50個、より好ましくは100個の連続したアミノ酸を含むであろう。
【０１８９】
さらに好ましい前立腺抗原は、P501Sとして知られ、WO 98/37814の配列番号113である。その免疫原性断片および部分は、上記特許および特許出願に開示されるように、少なくとも20個、好ましくは50個、より好ましくは100個の連続したアミノ酸を含む。例えば、PS108(WO 98/50567)を参照されたい。
【０１９０】
他の前立腺特異的抗原は、WO 98/37418およびWO/004149から公知である。別のものは、STEAP PNAS 96 14523-14528, 7-12, 1999である。
【０１９１】
本発明の文脈において有用な他の腫瘍関連抗原としては、Plu-1 (J Biol. Chem 274 (22) 15633-15645, 1999)、HASH-1、HasH-2、Cripto (Salomonら、Bioessays 199, 21 61-70、米国特許第5,654,1401号)、Criptin (米国特許第5,981,215号)が挙げられる。さらに、癌の治療に特に関連する抗原としては、チロシナーゼおよびスルビビンも挙げられる。
【０１９２】
Muc1などのムチン由来ペプチド、例えば、米国特許第5,744,144号、同第5,827,666号、WO 8805054、米国特許第4,963,484号を参照されたい。特に意図されるのは、Muc1ペプチドの少なくとも1個の反復単位、好ましくは、少なくとも2個のそのような反復を含み、SM3抗体(米国特許第6,054,438号)により認識されるMuc1由来ペプチドである。他のムチン由来ペプチドとしては、Muc5由来ペプチドが挙げられる。
【０１９３】
本発明の抗原は、her2/Neu、マンマグロビン(米国特許第5,668,267号)またはWO/00 52165、WO99/33869、WO99/19479、WO 98/45328に開示されたものなどの乳癌抗原であってもよい。Her2/neu抗原は、特に、米国特許第5,801,005号に開示されている。好ましくは、Her2/neuは、細胞外ドメイン全体(ほぼアミノ酸1〜645を含む)またはその断片およびほぼC末端の580アミノ酸の少なくとも免疫原性部分または細胞内ドメイン全体を含む。特に、細胞内部分は、リン酸化ドメインまたはその断片を含むべきである。そのような構築物は、WO 00/44899に開示されている。特に好ましい構築物は、ECD PDとして知られており、2番目のものはECD PDとして知られている。WO 00/44899を参照されたい。本明細書で用いられるher2/neuは、ラット、マウスまたはヒトに由来するものであってよい。
【０１９４】
前記組成物は、腫瘍支援機構(例えば、血管新生、腫瘍侵襲)と関連する抗原、例えば、tie 2、VEGFを含んでもよい。
【０１９５】
本発明の組成物はボレリア種に由来する抗原を使用することができると予測される。例えば、抗原としては、核酸、病原体由来抗原もしくは抗原性調製物、組換え産生されたタンパク質もしくはペプチド、およびキメラ融合タンパク質が挙げられる。特に、前記抗原は、OspAである。OspAは、(Lipo-OspA)と呼ばれる、宿主細胞(大腸菌)の理由で脂質化形態の完全な成熟タンパク質または非脂質化誘導体であってよい。そのような非脂質化誘導体としては、インフルエンザウイルスの非構造タンパク質(NS1)の最初の81個のN末端アミノ酸と、完全なOspAタンパク質とを有する非脂質化NS1-OspA融合タンパク質が挙げられ、他方、MDP-OspAは、3個のさらなるN末端アミノ酸を担持するOspAの非脂質化形態である。
【０１９６】
本発明の組成物を、アレルギーの予防または治療に用いることができる。そのようなワクチンは、アレルゲン特異的(例えば、Der p1)およびアレルゲン非特異的抗原(例えば、限定されるものではないが、スタンワース(stanworth)デカペプチド(EP 0 4777 231 B1)などのヒトIgEに由来するペプチド)を含むであろう。
【０１９７】
本発明の組成物を、アレルギー、癌または感染症以外の慢性障害の予防または治療に用いることもできる。そのような慢性障害は、アテローム性動脈硬化症、およびアルツハイマー病などの疾患である。
【０１９８】
本発明の組成物は、慢性症状および癌などの疾患の免疫治療的処理にとって特に好適であるだけでなく、持続的感染の治療にも好適である。従って、本発明の組成物は、結核症(TB)、AIDSおよびB型肝炎(HepB)ウイルス感染などの感染症の免疫治療にとって特に好適である。
【０１９９】
また、AIDSの文脈においては、AIDSに罹りやすいか、またはAIDSに罹患している個体の治療方法が提供される。この方法は、本発明のワクチンを個体に投与することによって、その後のHIV感染により引き起こされるCD4+ T細胞量の減少を低下させるか、または既にHIVに感染した個体におけるCD4+ T細胞の減少を遅延させるか、もしくは停止させることを含む。
【０２００】
他の抗原としては、上記の肺炎球菌抗原以外(またはそれに加えて)の細菌(好ましくは、莢膜)糖類が挙げられる。多糖類抗原は、リン酸アルミニウム上に吸着させたバルク液体中で都合よく保存される。従って、該バルク液体と、本発明のアジュバントとを即席で混合することにより、本発明のワクチン組成物を作製することは容易である。好ましくは、他の細菌糖類は、髄膜炎菌血清群A莢膜糖類(MenA)、髄膜炎菌血清群C莢膜糖類(MenC)、髄膜炎菌血清群Y莢膜糖類(MenY)、髄膜炎菌血清群W-135莢膜糖類(MenW)、B群連鎖球菌I群莢膜糖類、B群連鎖球菌II群莢膜糖類、B群連鎖球菌III群莢膜糖類、B群連鎖球菌IV群莢膜糖類、B群連鎖球菌V群莢膜糖類、5型黄色ブドウ球菌莢膜糖類、8型黄色ブドウ球菌莢膜糖類、チフス菌由来Vi糖類、髄膜炎菌LPS、カタラリス菌LPS、およびインフルエンザ菌LPSからなる群より選択される。LPSとは、天然のリポ多糖(もしくはリポオリゴ糖)、もしくはリピドA部分がいくつかの公知の方法(例えば、WO 97/18837もしくはWO 98/33923を参照)のいずれかにより解毒されたリポ多糖、または前記LPSに由来するO-多糖類を含む任意の分子を意味する。髄膜炎菌LPSとは、12種の公知の免疫型(L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10、L11またはL12)の1種以上を意味する。
【０２０１】
特に好ましい組合せは、1)コンジュゲート化Hib、コンジュゲート化MenAおよびコンジュゲート化MenC；2)コンジュゲート化Hib、コンジュゲート化MenYおよびコンジュゲート化MenC；3)コンジュゲート化Hibおよびコンジュゲート化MenC；ならびに4)コンジュゲート化MenA、コンジュゲート化MenC、コンジュゲート化MenYおよびコンジュゲート化MenW-135を含む組成物である。上記コンジュゲートのそれぞれにおけるPSの量は、0.5 mLヒト用量あたり5または10μgであってよい。好ましくは、Hib、MenA、MenC、MenW-135およびMenYはTTコンジュゲートである。
【０２０２】
ワクチン接種に対する多糖類手法に関連する問題は、多糖類自体が免疫原として弱いという事実である。これを克服するために、本発明の糖類を、バイスタンダーT細胞ヘルプを提供するタンパク質担体にコンジュゲートさせることができる。従って、本発明で用いられる糖類をそのようなタンパク質担体に連結するのが好ましい。糖類免疫原の製造に現在一般的に用いられているそのような担体の例としては、ジフテリアおよび破傷風トキソイド(それぞれ、DT、DT CRM197およびTT)、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、ヘモフィルス・インフルエンザに由来するDタンパク質(EP 594610-B)、髄膜炎菌に由来するOMPC、ならびにツベルクリンの精製されたタンパク質誘導体(PPD)が挙げられる。
【０２０３】
前記糖類を、任意の公知の方法(例えば、Likhite、米国特許第4,372,945号およびArmorら、米国特許第4,474,757号)により担体タンパク質に連結することができる。好ましくは、CDAPコンジュゲーションを実行する(WO 95/08348)。
【０２０４】
好ましくは、前記コンジュゲートのタンパク質：糖類(重量：重量)比は、0.3:1〜1:1、より好ましくは、0.6:1〜0.8:1、および最も好ましくは、約0.7:1である。
【０２０５】
肺炎球菌および異なる病原体に対する防御を提供する抗原の組合せが、本発明に含まれる。多くの小児用ワクチンは、現在、子供が受ける注射の回数を減らすために組合せワクチンとして与えられている。かくして、小児用ワクチンについては、他の病原体に由来する他の抗原を、本発明の肺炎球菌ワクチンと共に製剤化することができる。例えば、本発明のワクチンを、ジフテリアトキソイド(DT)、破傷風トキソイド(TT)、および百日咳成分(典型的には、必要に応じてペルタクチン(PRN)および／もしくはアグルチニン1+2を含む解毒された百日咳トキソイド(PT)および繊維性ヘマグルチニン(FHA))を含む、よく知られた「三価」組合せワクチン、例えば、DT、TT、PT、FHAおよびPRN抗原を含む市販のワクチンINFANRIX-DTPa(商標)(SmithKlineBeecham Biologicals)、または、例えば、Tritanrix(商標)としてSmithKlineBeecham Biologicalsにより市販された全細胞百日咳成分と共に製剤化する(または別々にであるが、同時に投与する)ことができる。この混合ワクチンはまた、B型肝炎表面抗原(HBsAg)、ポリオウイルス抗原(例えば、不活化三価ポリオウイルス-IPV)、カタラリス菌外膜タンパク質、非分類型インフルエンザ菌タンパク質、B型髄膜炎菌外膜タンパク質などの他の抗原を含んでもよい。
【０２０６】
組合せワクチン(特に、中耳炎の予防のための)に含有させることができる好ましいカタラリス菌タンパク質抗原の例は、OMP106(WO 97/41731(Antex)およびWO 96/34960(PMC))；OMP21；LbpAおよび／もしくはLbpB(WO 98/55606(PMC))；TbpAおよび／もしくはTbpB [WO 97/13785およびWO 97/32980 (PMC)]; CopB [Helminen MEら(1993) Infect. Immun. 61:2003-2010]; UspA1および／もしくはUspA2 [WO 93/03761 (University of Texas)]; OmpCD; HasR (PCT/EP99/03824); PilQ (PCT/EP99/03823); OMP85 (PCT/EP00/01468); lipo06 (GB 9917977.2); lipo10 (GB 9918208.1); lipo11 (GB 9918302.2); lipo18 (GB 9918038.2); P6 (PCT/EP99/03038); D15 (PCT/EP99/03822); OmplA1 (PCT/EP99/06781); Hly3 (PCT/EP99/03257); ならびにOmpEである。組合せワクチン(特に、中耳炎の予防のための)に含有させることができる非分類型インフルエンザ菌抗原の例としては、フィンブリンタンパク質(米国特許第5,766,608号-Ohio State Research Foundation)およびそれらに由来するペプチドを含む融合物(例えば、LB1(f)ペプチド融合物；米国特許第5,843,464号(OSU)もしくはWO 99/64067)；OMP26(WO 97/01638(Cortecs))；P6(EP 281673(State University of New York))；TbpAおよび／もしくはTbpB; Hia; Hsf; Hin47; Hif; Hmw1; Hmw2; Hmw3; Hmw4; Hap; D15 (WO 94/12641); Dタンパク質(EP 594610); P2; ならびにP5 (WO 94/26304)が挙げられる。
【０２０７】
意図される他の組合せは、例えば、インフルエンザ(弱毒化、スプリット、もしくはサブユニット[例えば、表面糖タンパク質ノイラミニダーゼ(NA)およびヘマグルチニン(HA)。例えば、Chaloupka I.ら、Eur. Journal Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1996, 15:121-127を参照]、RSV (例えば、FおよびG抗原もしくはF/G融合物。例えば、Schmidt A. C.ら、J Virol, May 2001, p4594-4603を参照)、PIV3 (例えば、HNおよびFタンパク質。Schmidtら、上掲を参照)、水痘(例えば、弱毒化、糖タンパク質I-Vなど)、ならびにMMR (麻疹、おたふく風邪、風疹)のいずれかの(もしくは全部の)成分などのウイルス抗原と組み合わせた本発明の肺炎球菌糖類およびタンパク質である。
【０２０８】
中耳炎の全体的な治療または予防のために本発明により意図される好ましい小児用組合せワクチンは、1種以上の肺炎連鎖球菌糖類抗原(好ましくは、Dタンパク質にコンジュゲートされている)、1種以上の肺炎球菌タンパク質(好ましくは、上記のもの)、ならびにカタラリス菌および／もしくは非分類型インフルエンザ菌に由来する1種以上の表面露出抗原を含む。有利には、Dタンパク質を肺炎球菌糖類(上記のような)のためのタンパク質担体として用いることができるが、それはそれ自身が非分類型インフルエンザ菌(ntHi)に対するB細胞を介する防御をもたらすことができる免疫原であるからである。カタラリス菌または非分類型インフルエンザ菌抗原を、サブユニット形態で前記ワクチン中に含有させるか、または細菌から作製された外膜ベシクル(ブレブ)の表面上に提示された抗原として添加することができる。
【０２０９】
本発明のワクチン接種に用いられる免疫原性組成物の免疫原特性
本発明においては、前記免疫原性組成物は、アジュバント化されていない、すなわち、任意の外因性アジュバントを含まない対応する組成物(本明細書では、以後「プレーン組成物」と呼ぶ)を用いて得られたCD4 T細胞免疫応答と比較して、少なくとも1種の成分抗原または抗原性組成物に対するCD4 T細胞免疫応答の改善を誘導することができるのが好ましい。特定の実施形態においては、免疫原性組成物がインフルエンザ組成物であり、インフルエンザワクチン調製物がいくつかのインフルエンザ株に由来する(そのうちの1つは流行株である)場合、前記改善されたCD4 T細胞免疫応答は、流行性インフルエンザ株に対するものである。
【０２１０】
「改善されたCD4 T細胞免疫応答」とは、アジュバントを含まない同じ組成物の投与後に得られるものよりも高いCD4応答が、アジュバント化免疫原性組成物の投与後に哺乳動物中で得られることを意味する。例えば、アジュバント化されていないインフルエンザウイルスまたはその抗原性調製物を含む免疫原性組成物の投与後に誘導される応答と比較して、本発明に従うアジュバントと共にインフルエンザウイルスまたはその抗原性調製物を含む免疫原性組成物の投与に際して、ヒト患者においてより高いCD4 T細胞応答が得られる。有利には、そのような製剤を用いて、MHCクラスII分子により提示されたインフルエンザエピトープを検出することができる抗インフルエンザCD4-T細胞応答を誘導することができる。
【０２１１】
専らではないが、特に、前記「改善されたCD4 T細胞免疫応答」は、免疫学的に初回免疫されていない患者、すなわち、前記インフルエンザウイルスまたは抗原に対して血清陰性である患者において得られる。この血清陰性は、そのようなウイルスもしくは抗原に直面したことがないか(いわゆる「ナイーブ」な患者)、またはあるいは、一度遭遇したが、該抗原に対して応答しなかった前記患者の結果であってもよい。特定の態様においては、前記CD4 T細胞免疫応答は、高齢者、典型的には、65歳以上の年齢、または高リスクの医学的症状を有する65歳より若い年齢の成人(「高リスク成人」)、または2歳以下の子供などの免疫不全被験者において得られる。
【０２１２】
改善されたCD4 T細胞免疫応答を、以下のサイトカインのいずれかを産生する細胞の数を測定することにより評価することができる：
・少なくとも2種の異なるサイトカイン(CD40L、IL-2、IFNγ、TNFα)を産生する細胞、
・少なくともCD40Lおよび別のサイトカイン(IL-2、TNFα、IFNγ)を産生する細胞、
・少なくともIL-2および別のサイトカイン(CD40L、TNFα、IFNγ)を産生する細胞、
・少なくともIFNγおよび別のサイトカイン(IL-2、TNFα、CD40L)を産生する細胞、
・少なくともTNFαおよび別のサイトカイン(IL-2、CD40L、IFNγ)を産生する細胞。
【０２１３】
上記サイトカインのいずれかを産生する細胞が、アジュバント化されていない組成物の投与後と比較して、アジュバント化組成物の投与後により高い量で存在する場合、CD4 T細胞免疫応答の改善が存在するであろう。典型的には、本明細書で上記された5個の条件のうちの少なくとも1個、好ましくは2個を満足するであろう。特定の実施形態においては、4種全部のサイトカインを産生する細胞が、アジュバント化されていない群と比較して、アジュバント化された群においてより高い量で存在するであろう。
【０２１４】
本発明のアジュバント化インフルエンザ組成物により与えられた改善されたCD4 T細胞免疫応答を、理想的には、1回の投与後に得ることができる。単回投与手法は、例えば、急速に発達する突発的状況において非常に関連しているであろう。特定の環境においては、特に高齢者集団について、またはインフルエンザに対して初めてワクチン接種される若い子供(9歳以下)の場合、または大流行の場合、その季節に同じ組成物の2回用量を投与することが有益である。該同じ組成物(依然として「初回ワクチン接種のための組成物」と考えられる)の2回目の用量を、進行中の一次免疫応答の間に投与することができ、十分に間隔を置く。典型的には、2回目の用量の前記組成物を、初回投与後2〜3週間、または約1ヶ月、例えば、2週間、3週間、4週間、5週間、もしくは6週間投与して、応答しないか、またはあまり応答しない個体における免疫系の初回免疫を助ける。
【０２１５】
別の実施形態においては、前記免疫原性組成物の投与は、アジュバント化されていない組成物で免疫された個体において誘導されるB記憶細胞応答と比較して、アジュバント化免疫原性組成物を投与された患者において改善されたB記憶細胞応答を誘導する。改善されたB記憶細胞応答とは、in vitroでの分化の刺激により測定されるように、抗原遭遇に際して抗体を分泌する形質細胞中で分化することができる末梢血Bリンパ球の頻度の増加を意味することが意図される。
【０２１６】
別の実施形態においては、前記免疫原性組成物の投与は、アジュバント化されていない組成物で免疫された個体において誘導された体液性応答と比較して、アジュバント化免疫原性組成物を投与された患者において改善された体液性応答を誘導する。前記体液性免疫応答を、実施例I、ならびに特に、I.1(I.1.1)、I.2(I.2.1)およびI.3(I.3.5.2)に詳述される手順のいずれかに従って測定することができる。免疫原性組成物がインフルエンザ組成物である場合、特に前記体液性応答は、相同的および異種性の株に対して得られる。特に、前記異種性体液性免疫応答は、インフルエンザ株間の体液性応答を意味し、「交叉反応性」体液性免疫応答と呼ばれる。前記「交叉反応性」体液性免疫応答は、ワクチン接種に用いられるインフルエンザ株の変異体(ドリフト)であるインフルエンザ株に対する応答の誘導を含む。そのような応答の例を、実施例III.3.1および図2に例示する。
【０２１７】
特定の実施形態においては、前記アジュバント化免疫原性組成物の投与は、アジュバント化されていない、すなわち、外因性アジュバントを含まない対応する組成物(本明細書では以後「プレーン組成物」と呼ぶ)を用いて得られるいずれかの免疫応答と比較して、少なくとも1種の成分抗原または抗原性組成物に対する、(i)改善されたCD4 T細胞免疫応答、(ii)改善されたB記憶細胞応答、(iii)改善された体液性応答のうちの少なくとも2つを誘導する。
【０２１８】
さらに特定の実施形態においては、初回ワクチン接種のための、アジュバント化された組成物を用いるワクチン接種は、CD8応答に対する測定可能な影響を有さない。
【０２１９】
リポソームの形態で提供されたサポニンアジュバント、特に、コレステロールとのクエンチされた形態となっているQS21サポニンと共に製剤化されたインフルエンザウイルスまたはその抗原性調製物を含む組成物が、免疫不全のヒト集団におけるT細胞応答を促進するのに有効であることが本発明の特定の実施形態である。一実施形態においては、前記アジュバントは、3D-MPLをさらに含む。特に、本発明に記載された初回ワクチン接種のための免疫原性組成物の単回用量の投与は、インフルエンザワクチンのための防御の相関により評価されるように、アジュバント化されていないインフルエンザワクチンを用いるワクチン接種よりも、ヒト高齢者集団におけるインフルエンザに対するワクチン再接種後に、より良好な血清防御を提供することができる。特許請求されたアジュバント化製剤は、アジュバント化されていない製剤を用いて得られるものと比較して、インフルエンザウイルスに対する改善されたCD4 T細胞免疫応答を誘導することもできた。この知見を、インフルエンザ抗原曝露と比べて、ワクチン接種または感染の際の応答性の増加と関連させることができる。さらに、これを、交叉反応性、すなわち、変異体インフルエンザ株に対して応答するより高い能力と関連させることもできる。この改善された応答は、高齢者集団(65歳以上の年齢)および特に、高リスクの高齢者集団などの免疫不全のヒト集団において特に有益であり得る。これは、全体の罹患率および死亡率の低下ならびに肺炎および他のインフルエンザ様疾患のための緊急入院の防止をもたらすことができる。これは、幼児集団(5歳以下、好ましくは2歳以下)にとっても有益である。さらに、それは、アジュバント化されていない製剤を用いて誘導される応答と比較して、より長時間持続する、例えば、初回ワクチン接種の1年後でも存在するCD4 T細胞応答を誘導することができる。
【０２２０】
特定の態様においては、初回免疫されていない被験者において得られる改善されたCD4 T細胞免疫応答などのCD4 T細胞免疫応答は、交叉反応性CD4 Tヘルパー応答の誘導を含む。具体的には、交叉反応性CD4 T細胞の量が増加する。「交叉反応性」CD4応答とは、CD4 T細胞標的化が、インフルエンザ株間でエピトープを共有することを意味する。
【０２２１】
通常、利用可能なインフルエンザワクチンは、類似する抗原特性のヘマグルチニンを有するインフルエンザウイルスの感染している株に対してのみ有効である。感染している(循環している)インフルエンザウイルスが、表面糖タンパク質、特にヘマグルチニン(抗原ドリフト変異体ウイルス株)における少しの変化(例えば、点突然変異もしくはアミノ酸変化をもたらす点突然変異の蓄積)を受けた場合、該ワクチンは依然としていくらかの防御を提供することができるが、新しく作製された変異体は以前のインフルエンザ感染またはワクチン接種により誘導された免疫を回避することができるため、限られた防御しか提供することができない。抗原ドリフトは、大流行間期の間に起こる毎年の流行の原因となる(Wiley & Skehel, 1987, Ann. Rev. Biochem. 56, 365-394)。交叉反応性CD4 T細胞の誘導は、それが干渉効果、換言すれば、異種性感染、すなわち、免疫原性組成物に含まれるインフルエンザ株の変異体(例えば、ドリフト)である循環するインフルエンザ株により引き起こされる感染に対する防御も提供することができるという点で、本発明の組成物に対してさらなる利点を提供する。循環する株が卵中で増殖するか、または細胞培養物中で産生させるのが困難である場合、これは有利であり、ドリフト株の使用を作用する代替物にする。これは、被験者が数ヶ月または1年間隔で初回および2回目のワクチン接種を受けた場合にも有利であり、2回目の免疫に用いられる免疫原性組成物におけるインフルエンザ株は、初回ワクチン接種に用いられる組成物において用いられる株のドリフト変異体株である。
【０２２２】
従って、本明細書で定義されたアジュバント化インフルエンザ免疫原性組成物は、ワクチン接種された高齢被験者における血清防御および交叉反応性CD4 T細胞を誘導するより高い能力を有する。この特徴は、免疫原性組成物中に存在する株の変異体株に対して応答するより高い能力と関連してもよい。これは、大流行の状況において重要な利点であることがわかっている。例えば、H5、H2、H9、H7もしくはH6株のいずれか、またはいくつかを含む多価インフルエンザ免疫原性組成物は、前記ドリフト株によるその後のワクチン接種または該株による感染の際に、大流行変異体、すなわち、前記大流行株のドリフト株に対して応答するより高い能力を提供することができる。
【０２２３】
インフルエンザワクチンを用いるワクチン接種後の交叉反応性CD4 T細胞の検出
相同なインフルエンザ株とドリフトインフルエンザ株の両方を認識することができるCD4 T細胞を、本明細書では「交叉反応性」と命名した。本明細書に記載のアジュバント化インフルエンザ組成物は、ドリフトインフルエンザ株に対する観察可能な交叉反応性が存在するため、異種サブタイプ交叉反応性を示すことができた。上記のように、ドリフト大流行株に対して有効である大流行ワクチン製剤の能力は、大流行の場合に重要な特徴であることがわかっている。
【０２２４】
上記観察と一致して、異なるインフルエンザ株により共有されたCD4 T細胞エピトープがヒトにおいて同定された(Gelder Cら、1998, Int Immunol. 10(2):211-22; Gelder CMら、1996 J Virol. 70(7):4787-90; Gelder CMら、1995 J Virol. 1995 69(12):7497-506)。
【０２２５】
特定の実施形態においては、アジュバント化組成物は、現在利用可能なワクチンが効力を有さないヘマグルチニン(抗原シフト)における主要な変化(例えば、2種の異なる種の間での遺伝子組換えなど)を受けた循環する株に対するより良好な防御を提供するさらなる利益を提供することができる。
【０２２６】
ワクチン再接種およびワクチン再接種に用いられる組成物(追加免疫組成物)
一実施形態においては、本発明は、本明細書で特許請求された免疫原性組成物を以前にワクチン接種されたヒトのワクチン再接種のための免疫原性組成物の製造における、インフルエンザウイルスまたはその抗原性調製物の使用を提供する。
【０２２７】
本発明の一態様においては、第1のインフルエンザ株の変異体であるインフルエンザ株により引き起こされたインフルエンザ感染に対する防御のための本明細書で定義されたアジュバント化免疫原性組成物の製造における、第1の大流行インフルエンザ株に由来する、インフルエンザウイルスまたはその抗原性調製物の使用が提供される。
【０２２８】
別の態様においては、本発明は、本明細書で特許請求されたアジュバント化インフルエンザ組成物またはアジュバントが本明細書で定義されたものである、変異体インフルエンザ株を含むアジュバント化インフルエンザ組成物を以前にワクチン接種されたヒトのワクチン再接種のためのインフルエンザ免疫原性組成物の製造における、インフルエンザウイルスまたはその抗原性調製物の使用を提供する。
【０２２９】
別の態様においては、本発明は、1種のインフルエンザウイルス株に対してヒト集団もしくは個体をワクチン接種した後、変異体インフルエンザウイルス株に対して該ヒトもしくは個体をワクチン再接種する方法であって、(i)第1のインフルエンザウイルス株に由来するインフルエンザウイルスもしくはその抗原性調製物と、本明細書に定義されたアジュバントを含む第1の組成物、および(ii)該第1のインフルエンザウイルス株のインフルエンザウイルス株変異体を含む第2の免疫原性組成物を、該ヒトに投与することを含む前記方法を提供する。特定の実施形態においては、前記第1の株は、大流行の発生と関連するか、または大流行の発生と関連する可能性を有する。別の特定の実施形態においては、前記変異体株は、大流行の発生と関連するか、または大流行の発生と関連する可能性を有する。具体的には、ワクチン再接種を、循環する大流行株である少なくとも1種の株を含むインフルエンザ組成物を用いて行う。初回免疫用組成物と追加免疫組成物の両方は多価であってよく、すなわち、少なくとも2種のインフルエンザウイルス株を含んでもよい。前記組成物が多価である場合、少なくとも1種の株は大流行の発生と関連するか、または大流行の発生と関連する可能性を有する。典型的には、ワクチン再接種を、1回目のワクチン接種の少なくとも6ヶ月後、好ましくは、8〜14ヶ月後、より好ましくは、約10〜12ヶ月後に行う。
【０２３０】
ワクチン再接種のための免疫原性組成物(追加免疫組成物)は、不活化または生弱毒化された、任意の型の抗原性調製物を含んでもよい。それは、1回目のワクチン接種に用いられる免疫原性組成物と同じ型の抗原性調製物、例えば、スプリットインフルエンザウイルスもしくはその抗原性調製物、全ビリオン、または精製されたHAおよびNA(サブユニット)ワクチンを含んでもよい。あるいは、追加免疫組成物は、1回目のワクチン接種に用いられるものとは別の型のインフルエンザ抗原を含んでもよい。好ましくは、スプリットウイルスを用いる。追加免疫組成物は、アジュバント化されていても、またはアジュバント化されていなくてもよい。アジュバント化されていない追加免疫組成物は、筋肉内投与されるFluarix(商標)／α-Rix(登録商標)／Influsplit(登録商標)であってよい。この製剤は、好適なインフルエンザの季節のWHOにより推奨された株から調製された3種の不活化スプリットビリオン抗原を含む。
【０２３１】
追加免疫組成物は、アジュバント化されたものであるか、またはアジュバント化されていないものであってよい。特定の実施形態においては、追加免疫組成物は、本明細書に定義されるサポニンアジュバントを含む。
【０２３２】
特定の実施形態においては、ワクチン再接種のための免疫原性組成物(本明細書では以後「追加免疫組成物」とも呼ぶ)は、1回目のワクチン接種に用いられたインフルエンザウイルスまたはその抗原性調製物と共通のCD4 T細胞エピトープを共有するインフルエンザウイルスまたはその抗原性調製物を含む。共通のCD4 T細胞エピトープとは、同じCD4細胞により認識され得る異なる抗原に由来するペプチド／配列／エピトープを意味すると意図される(例えば、Gelder Cら、1998, Int Immunol. 10(2):211-22; Gelder CMら、1996 J Virol. 70(7):4787-90; Gelder CMら、1995 J Virol. 1995 69(12):7497-506に記載のエピトープを参照)。
【０２３３】
本発明に従う実施形態においては、追加免疫組成物は、大流行の発生と関連するか、または大流行の発生と関連する可能性を有するインフルエンザ株を含む一価インフルエンザ組成物である。具体的には、追加免疫組成物中の前記株は、循環する大流行株である。好適な株は、限定されるものではないが、H5N1、H9N2、H7N7、およびH2N2である。前記株は、1回目のワクチン接種に用いられた組成物に存在するものと同じであるか、またはそのうちの1種であってもよい。代替的な実施形態においては、前記株は、1回目のワクチン接種に用いられた組成物中に存在する株の変異株、すなわち、ドリフト株であってよい。
【０２３４】
別の特定の実施形態においては、追加免疫組成物は、多価インフルエンザワクチンである。具体的には、追加免疫組成物が二価、三価または四価ワクチンなどの多価ワクチンである場合、少なくとも1種の株が大流行の発生に関連するか、または大流行の発生に関連する可能性を有する。特定の実施形態においては、追加免疫組成物中の2種以上の株が、大流行株である。別の特定の実施形態においては、追加免疫組成物中の少なくとも1種の大流行株は、1回目のワクチン接種に用いられた組成物中に存在するものと同じ型のものであるか、またはそのうちの1種である。代替的な実施形態においては、少なくとも1種の株は、1回目のワクチン接種に用いられた組成物中に存在する少なくとも1種の大流行株の変異株、すなわち、ドリフト株であってよい。具体的には、追加免疫組成物中の少なくとも1種の株は、循環する大流行株である。追加免疫組成物は、アジュバント化されていてもいなくてもよい。
【０２３５】
典型的には、用いる場合、追加免疫組成物を、次のインフルエンザの季節、例えば、1回目の免疫原性組成物の投与の約1年後に投与する。追加免疫組成物を、その後の毎年に投与してもよい(3、4、5回目のワクチン接種など)。追加免疫組成物は、1回目のワクチン接種に用いられた組成物と同じものであってよい。好適には、追加免疫組成物は、1回目のワクチン接種に用いられたインフルエンザウイルスの変異株であるインフルエンザウイルスまたはその抗原性調製物を含む。具体的には、このインフルエンザウイルス株またはその抗原性調製物を、それらがワクチン再接種の年に循環しているインフルエンザ株に適合するように、世界保健機関により配布された参照資料に従って選択する。
【０２３６】
ワクチン再接種に用いられるインフルエンザ抗原または抗原組成物は、好適には上記のようなアジュバントを含むのが好ましい。このアジュバントは、本明細書で上記されたような、リポソームの形態で提供されるサポニンであってよく、必要に応じて、3D-MPLなどの追加のアジュバントを含むのが好ましい。
【０２３７】
一態様においては、ワクチン再接種は、アジュバント化されていないインフルエンザウイルスもしくはその抗原性調製物を用いる1回目のワクチン接種後に誘導される等価な応答と比較して、(i)インフルエンザウイルスもしくはその抗原性調製物に対する改善されたCD4応答、または(ii)改善されたB細胞記憶応答または(iii)改善された体液性応答のうちのいずれか、好ましくは2種または全部を誘導する。本明細書で定義されたアジュバント化インフルエンザウイルスもしくはその抗原性調製物をワクチン再接種した後に誘導される免疫学的応答は、アジュバント化されていない組成物を用いるワクチン再接種後に誘導される対応する応答よりも高いのが好ましい。アジュバント化されていない、好ましくは、スプリットインフルエンザウイルスを用いるワクチン再接種後に誘導される免疫学的応答は、アジュバント化されていない、好ましくはスプリットインフルエンザ組成物を用いて1回目にワクチン接種された集団における対応する応答よりも、アジュバント化された、好ましくはスプリットインフルエンザ組成物を用いて1回目にワクチン接種された集団においてより高いのが好ましい。
【０２３８】
特定の実施形態においては、本明細書で定義されたような、インフルエンザウイルスとリポソームの形態のサポニンアジュバントとを含む追加免疫組成物を用いる被験者のワクチン再接種は、アジュバント化されていない組成物を1回目にワクチン接種され、アジュバント化されていない組成物を追加接種された人々の群における対応する値よりも高い抗体力価を示す。ワクチン再接種に対して抗体応答を増強させる該アジュバントの効果は、インフルエンザウイルスによるワクチン接種または感染に対して低い応答性を有することが知られる高齢者集団においては特に重要である。アジュバント化組成物に関連する利益は、ワクチン再接種後のCD4 T細胞応答を改善するという点でも顕著であった。
【０２３９】
具体的には、本発明のアジュバント化組成物は、対照ワクチンにより付与された防御と比較して、ドリフト株(次のインフルエンザの季節に由来するインフルエンザ株)に対するより良好な交叉反応性を誘導することができる。前記交叉反応性は、アジュバント化されていない製剤を用いて得られたものと比較して、より高い持続性を示した。ドリフト株に対する交叉反応性を増強する前記アジュバントの効果は、大流行の状況において重要である。
【０２４０】
さらなる実施形態においては、本発明は、大流行の発生を引き起こす可能性を有する少なくとも1種のインフルエンザ株を含むインフルエンザ組成物、好ましくは、スプリットインフルエンザ組成物を用いて1回目のワクチン接種を行い、循環する株である大流行株または古典的株を用いてワクチン再接種を行う、ワクチン接種計画に関する。
【０２４１】
HA中のCD4エピトープ
この抗原ドリフトは主に、ウイルス表面タンパク質ヘマグルチニン(HA)およびノイラミニダーゼ(NA)のエピトープ領域中に存在する。宿主の免疫系の適応できる応答を回避するためにウイルスにより用いられる、様々なインフルエンザ株間でのCD4およびB細胞エピトープの任意の差異が、インフルエンザワクチン接種において主要な役割を果たすであろうし、実際にそうであることが知られている。
【０２４２】
異なるインフルエンザ株により共有されるCD4 T細胞エピトープが、ヒトにおいて同定されている(例えば、Gelder Cら、1998, Int Immunol. 10(2):211-22; Gelder CMら、1996 J Virol. 70(7):4787-90;およびGelder CMら、1995 J Virol. 1995 69(12):7497-506を参照)。
【０２４３】
特定の実施形態においては、1回目のワクチン接種に用いられるインフルエンザウイルス抗原もしくはその抗原性調製物と共通のCD4 T細胞エピトープを共有するインフルエンザウイルスもしくはその抗原性調製物を含む追加免疫組成物を用いることにより、ワクチン再接種を行う。かくして、本発明は、追加用量として、1回目のワクチン接種で投与された用量の大流行インフルエンザウイルス抗原もしくはそのウイルス抗原性調製物と共通のCD4 T細胞エピトープを共有するインフルエンザウイルスもしくはその抗原性調製物をさらに含む複数回投与用ワクチンの1回目のワクチン接種成分の製造における、大流行インフルエンザウイルスもしくはその抗原性調製物と、リポソームの形態のサポニン、特に、必要に応じて3D-MPLを含むコレステロールを用いてその解毒された形態となっているQS21とを含む免疫原性組成物の使用に関する。
【０２４４】
ワクチン接種手段
本発明の免疫原性組成物を、皮内、粘膜、例えば、鼻内、経口、筋肉内または皮下などの任意の好適な送達経路により投与することができる。他の送達経路は、当業界でよく知られている。
【０２４５】
アジュバント化免疫原性組成物にとっては、筋肉内送達経路が好ましい。
【０２４６】
皮内送達は、別の好適な経路である。皮内送達には、任意の好適な装置、例えば、米国特許第4,886,499号、同第5,190,521号、同第5,328,483号、同第5,527,288号、同第4,270,537号、同第5,015,235号、同第5,141,496号、同第5,417,662号に記載のものなどの短い針の装置を用いることができる。皮内ワクチンを、参照により本明細書に組み入れられるものとするWO 99/34850およびEP1092444に記載のものなどの、針の皮膚中への有効な貫通長を制限する装置、およびその機能的等価物により投与することもできる。また、液体ジェット注入器を介して、または角質層を貫通し、真皮に達するジェットをもたらす針を介して真皮に液体ワクチンを送達するジェット注入装置も好適である。ジェット注入装置は、例えば、米国特許第5,480,381号、同第5,599,302号、同第5,334,144号、同第5,993,412号、同第5,649,912号、同第5,569,189号、同第5,704,911号、同第5,383,851号、同第5,893,397号、同第5,466,220号、同第5,339,163号、同第5,312,335号、同第5,503,627号、同第5,064,413号、同第5,520, 639号、同第4,596,556号、同第4,790,824号、同第4,941,880号、同第4,940,460号、WO 97/37705およびWO 97/13537に記載されている。また、粉末形態のワクチンが皮膚の外側の層から真皮に通るのを加速するために圧縮された気体を用いる弾道粉末／粒子送達装置も好適である。さらに、従来のシリンジを、皮内投与の古典的なマントゥー法において用いることができる。
【０２４７】
別の好適な投与経路は、皮下経路である。皮下送達のためには、任意の好適な装置、例えば、古典的な針を用いることができる。好ましくは、WO 01/05453、WO 01/05452、WO 01/05451、WO 01/32243、WO 01/41840、WO 01/41839、WO 01/47585、WO 01/56637、WO 01/58512、WO 01/64269、WO 01/78810、WO 01/91835、WO 01/97884、WO 02/09796、WO 02/34317に公開されたものなどの、針を用いないジェット注入器サービスを用いる。より好ましくは、該装置に液体ワクチン製剤を予め充填する。
【０２４８】
あるいは、前記ワクチンを、鼻内投与する。典型的には、該ワクチンを、好ましくは肺に吸入されることがないように、鼻咽頭領域に局所的に投与する。ワクチン製剤を肺に進入させないか、または実質的に肺に進入させることなく、該ワクチン製剤を鼻咽頭領域に送達する鼻内送達装置を使用するのが望ましい。
【０２４９】
本発明に従うワクチンの鼻内投与のための好ましい装置は、スプレー装置である。好適な市販の鼻スプレー装置としては、Accuspray(商標)(Becton Dickinson)が挙げられる。噴霧器は、肺に容易に吸入され得る非常に微細なスプレーを提供するため、鼻粘膜に効率的に到達しない。従って、噴霧器は好ましくない。
【０２５０】
鼻内使用のための好ましいスプレー装置は、該装置の性能が使用者により印加される圧力に依存しない装置である。これらの装置は、限界圧力装置として知られる。限界圧力が印加された場合にのみ、ノズルから液体が放出される。これらの装置により、規則的な液滴サイズを有するスプレーを達成することが容易になる。本発明と共に用いるのに好適な限界圧力装置は当業界で公知であり、例えば、参照により本明細書に組み入れられるものとするWO 91/13281およびEP 311 863 BおよびEP 516 636に記載されている。そのような装置は、Pfeiffer GmbHから市販されており、Bommer, R. Pharmaceutical Technology Europe, Sept 1999にも記載されている。
【０２５１】
好ましい鼻内装置は、1〜200μm、好ましくは、10〜120μmの範囲の液滴(液体として水を用いて測定)を提供する。10μm未満では吸入のリスクがあるため、10μm未満の液滴は約5％以下であるのが望ましい。120μmを超える液滴は、より小さい液滴と同様に拡散しないため、120μmを超える液滴は約5％以下であるのが望ましい。
【０２５２】
2用量送達は、本発明に従うワクチンと共に使用するための鼻内送達系のさらに好ましい特徴である。2用量装置は、1回ワクチン用量の2つのサブ用量を含み、1つのサブ用量はそれぞれの鼻孔への投与のためのものである。一般的には、2つのサブ用量が、1つのチェンバー中に存在し、該装置の構築物により、同時に単回サブ用量を効率的に送達することができる。あるいは、単回投与装置を、本発明に従うワクチンを投与するのに用いることができる。
【０２５３】
あるいは、表皮または経皮ワクチン接種も、本発明において意図される。
【０２５４】
本発明の特定の態様においては、1回目の投与のためのアジュバント化免疫原性組成物を筋肉内投与し、アジュバント化されていてもいなくてもよい追加免疫組成物を異なる経路、例えば、皮内、皮下または鼻内経路を回して投与することができる。別の特定の実施形態においては、1回目の投与のためのインフルエンザウイルス抗原またはその抗原性調製物を特異的に含む免疫原性組成物は、インフルエンザ株あたり15μgの標準的なHA含量を含み、追加用インフルエンザ組成物は、低用量、すなわち、15μg未満のHAを含み、投与経路に応じて、より少量で投与することができる。
【０２５５】
ワクチン接種するための集団
ワクチン接種するための標的集団は、免疫不全のヒトであってよい。一般的には、免疫不全のヒトは、健康な成人と比較して、抗原、特に、インフルエンザ抗原に対する応答性が低い。
【０２５６】
好ましくは、標的集団は、ナイーブである(大流行株に対してなど)か、またはインフルエンザ感染もしくはワクチン接種に対して以前に応答しなかった、インフルエンザに対して初回免疫されていない集団である。好ましくは、標的集団は、好適には、65歳以上の高齢者、医療機関で働く人々などの高危険度のより若い成人(すなわち、18〜64歳)、または心血管および肺疾患、もしくは糖尿病などの危険因子を有する若い成人である。別の標的集団は、6ヶ月以上の全ての子供、特に、比較的高いインフルエンザに関連する入院率を経験する6〜23ヶ月の子供である。好ましくは、標的集団は、65歳を超える高齢者である。
【０２５７】
ワクチン接種計画、投与および追加の有効性基準
好適には、本発明に従う免疫原性組成物は、多くの場合、標準的な0.5 mlの注入可能用量であり、インフルエンザ組成物の場合、一元放射免疫拡散法(SRD) (J.M. Woodら、J. Biol. Stand. 5 (1977) 237-247; J. M. Woodら、J. Biol. Stand. 9 (1981) 317-330)により測定したときに、その、またはそれぞれのインフルエンザ株に由来する15μgのヘマグルチニン抗原成分を含む。好適には、ワクチン用量は、0.5 ml〜1 ml、特に、標準的な0.5 ml、または0.7 mlワクチン用量であろう。インフルエンザワクチンについては、用量の微小な適合化を、元々のバルクサンプル中のHA濃度に応じて日常的に行うことができる。
【０２５８】
好適には、前記免疫原性組成物は、低用量のHA抗原、例えば、インフルエンザ株あたり、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13または14μgのHAを含む。
【０２５９】
有利には、本発明に従うワクチン用量、特に、低用量ワクチンを、一般的には1用量あたり約0.5、0.7または1 mlである従来の注入スプリットfluワクチンよりも少ない量で提供することができる。本発明に従う低容量は、好ましくは1用量あたり500μl未満、より好ましくは300μl未満および最も好ましくは約200μl以下である。
【０２６０】
かくして、本発明の一態様に従う好ましい低容量ワクチン用量は、低容量中の低い抗原用量、例えば、約200μlの容量中に、約15μgもしくは約7.5μgのHAまたは約3.0μgのHA(1株あたり)を含む用量である。
【０２６１】
本発明のインフルエンザ薬剤は、ワクチンに関する特定の国際基準を満たすのが好ましい。
【０２６２】
インフルエンザワクチンの効力を測定するために標準品が国際的に適用される。インフルエンザに対する有効なワクチンに関する欧州連合の公式基準を、以下の表1に示す。理論的には、欧州連合の要件を満たすためには、インフルエンザワクチンは、ワクチンに含まれる全てのインフルエンザ株について、表中の基準の1個を満たさなければならないだけである。本発明の組成物は、好適にはそのような基準の少なくとも1個を満たす。
【０２６３】
しかしながら実際には、特に異なる経路を介する送達のための新規ワクチンなどの新規ワクチンについては、全ての株について前記基準のうちの少なくとも2個、または3個全部を満たす必要があろう。いくつかの状況下では、2個の基準で十分である。例えば、3個の基準のうちの2個について、全ての株により満たされるが、第3の基準はいくつかであるが、全てではない株(例えば、3種の株のうちの2種)により満たされることが許容される。この要件は、成人集団(18〜60歳)および高齢者集団(60歳を超える)について異なる。
【０２６４】
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＊血清変換率は、それぞれのワクチン株について、ワクチン接種後の血清ヘマグルチニン抑制(HI)力価が少なくとも4倍増加したワクチン被接種者のパーセンテージとして定義される。 
＊＊変換係数は、それぞれのワクチン株について、ワクチン接種後の血清HI幾何平均力価(GMT)における増加の倍数として定義される。 
＊＊＊防御率は、ワクチン接種後に(それぞれのワクチン株について)1:40以上の血清HI力価を有するワクチン被接種者のパーセンテージとして定義され、これは防御を示すものとして通常認められている。
【０２６５】
さらなる態様において、本発明は、CD4+ T細胞活性化によって治癒するかまたは治療されることが知られる疾患のためのワクチンを設計する方法であって、
1)CD4+エピトープを含む抗原を選択すること、および
2)該抗原と、上記で定義されたようなリポソームの形態のサポニンアジュバントとを混合すること、
を含み、前記哺乳動物における投与に際して、該ワクチンが該哺乳動物においてCD4 T細胞応答の増強を誘導することができる、前記方法を提供する。
【０２６６】
特許出願および特許を含む本特許出願中の全ての参考文献の教示は、参照により本明細書に完全に組み入れられるものとする。
【０２６７】
疑いを避けるために、本明細書に記載の用語「含む」は、その場合毎に、それぞれ用語「からなる」に必要に応じて置換可能であることが本発明者らにより意図される。
【０２６８】
本発明を、以下の非限定的な実施例を参照してさらに説明する。
【実施例】
【０２６９】
実施例Iは、マウス、フェレットおよびヒトにおける研究で用いられた免疫学的読み出し方法を記載する。
【０２７０】
実施例IIは、MPL/QS21リポソームアジュバントの調製を記載する。
【０２７１】
実施例IIIは、フェレットにおけるアジュバント化されたインフルエンザワクチンとアジュバント化されていないインフルエンザワクチンの前臨床評価を記載する。
【０２７２】
実施例IVは、C57Bl/6のナイーブマウスおよび初回免疫されたマウスにおけるアジュバント化されたインフルエンザワクチンとアジュバント化されていないインフルエンザワクチンの前臨床評価を示す。
【０２７３】
実施例Vは、マウスにおける2つの異なる濃度の3D-MPLを含むアジュバント化インフルエンザワクチンの比較を記載する。
【０２７４】
実施例VIは、ヒト高齢者における2つの異なる濃度の3D-MPLを含むアジュバント化インフルエンザワクチンの比較を記載する。
【０２７５】
実施例VIIは、マウスにおけるアジュバント化HPVワクチンの前臨床評価を記載する。
【０２７６】
実施例VIIIは、アジュバント化された、およびアジュバント化されていないサイトメガロウイルス免疫原性組成物の前臨床評価を記載する。
【０２７７】
実施例IXは、2つの異なる濃度の3D-MPLを含むアジュバント化RTS,Sワクチン組成物の前臨床評価を記載する。
【０２７８】
実施例Xは、2つの異なる濃度の3D-MPLを含むアジュバント化RTS,Sワクチンの臨床評価を記載する。
【０２７９】
実施例I-免疫学的読み出し法
I.1.マウス方法
I.1.1. 血球凝集抑制試験
試験手順
3種のインフルエンザウイルス株に対する抗ヘマグルチニン抗体力価を、血球凝集抑制試験(HI)を用いて決定した。HI試験の原理は、インフルエンザウイルスヘマグルチニン(HA)によりニワトリ赤血球(RBC)の血球凝集反応を阻害する特異的抗インフルエンザ抗体の能力に基づく。熱不活化血清をKaolinおよびニワトリRBCにより予め処理して、非特異的阻害物質を除去した。予備処理後、血清の2倍希釈液を、4血球凝集単位の各インフルエンザ株と共にインキュベートした。次いで、ニワトリ赤血球細胞を添加し、凝集の阻害をスコア化した。力価を、血球凝集を完全に阻害した血清の最も高い希釈率の逆数として表した。血清の最初の希釈率は1:20であったので、検出不可能なレベルを10に等しい力価としてスコア化した。
【０２８０】
統計学的分析
UNISTATを用いて、ワクチン接種後のHI力価に対して統計学的分析を実施した。分散分析に適用されたプロトコルを以下に簡単に説明することができる：
・データのLog変換
・群分布の正規性を検証するための各集団(群)に対するシャピロ・ウィルク(Shapiro-Wilk)検定
・異なる集団(群)間の分散の均一性を検証するためのコクラン(Cochran)検定
・群に対して実施される分散の2方向分析
・多重比較のためのテューキー(Tukey)検定。
【０２８１】
I.1.2. 細胞内サイトカイン染色
この技術により、サイトカイン産生に基づく抗原特異的Tリンパ球の定量が可能になる。エフェクターT細胞および／もしくはエフェクター-記憶T細胞はIFN-γを産生し、ならびに／または中央記憶T細胞はIL-2を産生する。PMBCを、免疫の7日後に収穫する。
【０２８２】
リンパ球細胞を、分泌阻害剤(Brefeldine)の存在下、in vitroで再刺激する。次いで、これらの細胞を、蛍光抗体を用いる従来の免疫蛍光手順(CD4、CD8、IFN-γおよびIL-2)により処理する。結果を、CD4/CD8 T細胞内のサイトカイン陽性細胞の頻度として表す。T細胞のサイトカインの細胞内染色を、2回目の免疫の7日後にPBMCに対して実施した。血液をマウスから回収し、ヘパリン化培地RPMI+Add中にプールした。血液については、RPMI+Addで希釈したPBL懸濁液を、推奨されたプロトコル(2500 rpmかつ室温で20分間遠心分離)に従ってリンパ球-哺乳動物勾配上に重層した。境界面の単核細胞を除去し、RPMI+Add中で2回洗浄し、PBMC懸濁液をRPMI 5％ウシ胎仔血清中、2 x 106細胞/mlに調整した。
【０２８３】
PBMCのin vitroでの抗原刺激を、マイクロビーズ上のFlu三価スプリット(5μg HA/株)または全FI(1μg HA/株)を用いて1 x 106細胞/mlの最終濃度(チューブFACS)で実行した後、抗CD28および抗CD49d(両方とも1μg/ml)を添加して37℃で2時間インキュベートした。
【０２８４】
活性化されたTおよびNK細胞による増殖およびサイトカイン産生を増加させた両抗体の添加は、CTL誘導のための同時刺激シグナルを提供することができる。
【０２８５】
さらに、BMDCをFluスプリット(60μg/HA株)または全Flu三価FI(10μg HA/株)を用いて37℃で6時間パルスすることにより調製された、Flu三価スプリット(30μg HA/株)または全FI(5μg HA/株)-パルスBMDCと共に、PBMCも一晩刺激した。抗原再刺激工程後、PBMCを、37℃のBrefeldin(1μg/ml)の存在下、37℃で一晩インキュベートして、サイトカイン分泌を阻害する。
【０２８６】
IFN-γ/IL-2/CD4/CD8染色を、以下のように実施した：細胞懸濁液を洗浄し、2％Fcブロッキング試薬(1/50; 2.4G2)を含む50μlのPBS 1％FCS中に再懸濁した。4℃で10分間インキュベートした後、抗CD4-PE(2/50)と抗CD8 perCp(3/50)の混合物50μlを添加し、4℃で30分間インキュベートした。PBS 1％FCS中で洗浄した後、200μlのCytofix-Cytoperm (Kit BD)中に再懸濁することにより細胞を透過化し、4℃で20分間インキュベートした。次いで、細胞をPerm Wash (Kit BD)で洗浄し、Perm Wash中に希釈した抗IFN-γ APC(1/50)+抗IL-2 FITC(1/50)の混合物50μlで再懸濁した。4℃で最短2時間、最長一晩インキュベートした後、細胞をPerm Washで洗浄し、PBS 1％FCS+1％パラホルムアルデヒド中に再懸濁した。サンプル分析をFACSにより実施した。生細胞をゲート化し(FSC/SSC)、CD4+T細胞上で約50,000事象(リンパ球)または35,000事象に対して獲得を実施した。IFN-γ+またはIL2+の割合を、CD4+およびCD8+ゲート化集団上で算出した。
【０２８７】
I.2. フェレット方法
I.2.1. 血球凝集抑制試験(HI)
試験手順
3種のインフルエンザウイルス株に対する抗ヘマグルチニン抗体力価を、血球凝集抑制試験(HI)を用いて決定した。HI試験の原理は、インフルエンザウイルスヘマグルチニン(HA)によりニワトリ赤血球(RBC)の血球凝集反応を阻害する特異的抗インフルエンザ抗体の能力に基づく。最初に血清を25％ノイラミニダーゼ溶液(RDE)で処理し、熱不活化して非特異的阻害物質を除去した。予備処理後、血清の2倍希釈液を、4血球凝集単位の各インフルエンザ株と共にインキュベートした。次いで、ニワトリ赤血球細胞を添加し、凝集の阻害を、読み取りのために力価を用いてスコア化した。力価は、血球凝集を完全に阻害した血清の最も高い希釈率の逆数として表した。血清の最初の希釈率は1:10であったので、検出不可能なレベルを5に等しい力価としてスコア化した。
【０２８８】
統計学的分析
UNISTATを用いてHI力価(41日目、チャレンジ前)に対して統計学的分析を実施した。分散の分析のために適用したプロトコルを、以下に簡単に説明することができる：
・データのLog変換
・群分布の正規性を検証するための各集団(群)に対するシャピロ・ウィルク(Shapiro-Wilk)検定
・異なる集団(群)間の分散の均一性を検証するためのコクラン(Cochran)検定
・1方向ANOVAの相互作用に関する検定
・多重比較のためのテューキー(Tukey)-HSD検定。
【０２８９】
I.2.2. 鼻洗浄
目が覚めている動物の両方の鼻孔に5 mlのPBSを投与することにより、鼻洗浄を実施した。接種物をペトリ皿に回収し、ドライアイス上のサンプル容器中に入れた。
【０２９０】
鼻洗浄液中のウイルス力価
最初に、全ての鼻サンプルをSpin Xフィルター(Costar)を通して滅菌濾過して、細菌夾雑物を除去した。鼻洗浄液の連続10倍希釈液50μlを、50μlの培地を含むマイクロタイタープレートに移した(10ウェル／希釈液)。次いで、100μlのMDCK細胞(2.4 x 105細胞/ml)を各ウェルに添加し、35℃で5〜7日間インキュベートした。インキュベーションの6〜7日後、培養培地を穏やかに除去し、100μlの1/20 WST-1含有培地を添加し、さらに18時間インキュベートする。
【０２９１】
生細胞によりWST-1の低下に際して産生された黄色ホルマザン染料の強度は、ウイルス滴定アッセイの終わりにウェル中に存在する生細胞数に比例し、好適な波長(450ナノメートル)での各ウェルの吸光度を測定することにより定量する。カットオフを、未感染の対照細胞のOD平均-0.3 OD(0.3 ODは未感染の対照細胞のODの+/-3 StDevに一致する)として定義する。正のスコアは、ODがカットオフより小さい場合として定義し、対照的に、負のスコアはODがカットオフより大きい場合として定義する。ウイルス出芽力価を、「ReedおよびMuench」により決定し、Log TCID50/mlとして表した。
【０２９２】
I.3. ヒトにおける免疫応答を評価するためのアッセイ
I.3.1. 血球凝集抑制アッセイ
WHO Collaborating Centre for influenza, Centres for Dissease Control, Atlanta, USA (1991)により記載された方法を用いて、HI抗体を測定することにより、免疫応答を決定した。
【０２９３】
抗体力価測定を、4血球凝集抑制単位(4 HIU)の好適な抗原および0.5％のトリ赤血球懸濁液を用いて標準化され、包括的に検証された微小方法を用いて、解凍した凍結血清サンプルに対して行った。非特異的血清阻害物質を、熱処理および受容体を破壊する酵素により除去した。
【０２９４】
得られた血清を、HI抗体レベルについて評価した。1:10の最初の希釈率から開始して、連続希釈液(2倍で)を、1:20480の最終希釈率まで調製した。滴定の最終点を、血球凝集の完全な阻害(100％)を示した最も高い希釈段階として取得した。全てのアッセイを2回行った。
【０２９５】
I.3.2. ノイラミニダーゼ阻害アッセイ
このアッセイを、フェツイン被覆マイクロタイタープレート中で実施した。抗血清の2倍連続希釈液を調製し、標準化された量のA型インフルエンザH3N2、H1N1またはB型インフルエンザウイルスを用いて混合した。この試験は、フェツインからノイラミン酸を酵素的に放出するノイラミニダーゼの生物学的活性に基づくものであった。最終的なノイラミン酸の切断後、β-D-ガラクトース-N-アセチル-ガラクトサミンを脱マスキングした。ガラクトース構造に特異的に結合する、落花生(Arachis hypogaea)に由来する西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)標識されたピーナッツ凝集素を、ウェルに添加した。結合した凝集素の量を検出し、テトラ-メチルベンジジン(TMB)との基質反応中で定量する。依然としてウイルスのノイラミニダーゼ活性を少なくとも50％阻害する最も高い抗体希釈率をNI力価として示した。
【０２９６】
I.3.3. 中和抗体アッセイ
中和抗体測定を、解凍した凍結血清サンプルに対して行った。血清中に含まれる抗体によるウイルスの中和を、微小中和アッセイにおいて決定した。血清を、該アッセイにおいてさらに処理することなく用いた。それぞれの血清を3回試験した。標準化された量のウイルスを、血清の連続希釈液と混合し、インキュベートして、抗体をウイルスに結合させた。次いで、規定量のMDCK細胞を含む細胞懸濁液を、ウイルスと抗血清の混合物に添加し、33℃でインキュベートした。インキュベート期間の後、ウイルスの複製を、ニワトリ赤血球細胞の血球凝集反応により可視化した。血清の50％中和力価を、ReedおよびMuenchの方法により算出した。
【０２９７】
I.3.4. サイトカインフローサイトメトリー(CFC)による細胞性免疫の評価
末梢血抗原特異的CD4およびCD8 T細胞をin vitroで再刺激して、その対応する抗原と共にインキュベートした場合、IL-2、CD40L、TNF-αおよびIFNを産生させることができる。結果として、抗原特異的CD4およびCD8 T細胞を、細胞表現型の従来の免疫蛍光標識に従うフローサイトメトリーならびに細胞内サイトカイン産生により数えることができる。本研究においては、インフルエンザワクチン抗原ならびに特定のインフルエンザタンパク質に由来するペプチドを抗原として用いて、インフルエンザ特異的T細胞を再刺激した。結果を、CD4またはCD8 T細胞サブ集団内のサイトカイン陽性CD4またはCD8 T細胞の頻度として表した。
【０２９８】
I.3.5. 統計学的方法
I.3.5.1. 主要評価項目
・ワクチン接種後7日間の追跡期間(すなわち、ワクチン接種の日およびその後の6日間)および全体での応答型局所および全身徴候および症候の割合、強度およびワクチン接種との関係。
【０２９９】
・ワクチン接種後21日間の追跡期間(すなわち、ワクチン接種の日およびその後の20日間)および全体での非応答型局所および全身徴候および症候の割合、強度およびワクチン接種との関係。
【０３００】
・研究全体の間での重篤な有害事象の発生。
【０３０１】
I.3.5.2. 副次的評価項目
体液性免疫応答について
観察された変数：
・0日目および21日目：ワクチン中に示される3種のインフルエンザウイルス株のそれぞれに対して別々に試験された、血清血球凝集抑制(HI)およびNI抗体力価(抗H1N1、抗H3N2および抗B抗体)。
【０３０２】
・0日目および21日目：ワクチン中に示される3種のインフルエンザウイルス株のそれぞれに対して別々に試験された、中和抗体力価。
【０３０３】
誘導された変数(95％信頼区間)：
・ワクチン接種前後の95％信頼区間(95％CI)を有する血清HI抗体の幾何平均力価(GMT)
・21日目での95％CIを有する血清変換率＊
・21日目での95％CIを有する変換係数＊＊
・21日目での95％CIを有する血清防御率＊＊＊
・全ての時点での血清NI抗体GMT(95％信頼区間を有する)
＊血清変換率を、それぞれのワクチン株について、0日目と比較して21日目に血清HI力価が少なくとも4倍増加したワクチン被接種者のパーセンテージと定義した。
【０３０４】
＊＊変換係数を、それぞれのワクチン株について、0日目と比較して21日目での血清HI GMTの増加倍数と定義した。
【０３０５】
＊＊＊防御率を、防御を示すものとして通常認められているワクチン接種後の血清HI力価＝40を有するワクチン被接種者のパーセンテージと定義した。
【０３０６】
細胞性免疫(CMI)応答について
観察された変数
・0日目および21日目：様々な試験における106個あたりのサイトカイン陽性CD4/CD8細胞の頻度。
【０３０７】
各試験は、
・ペプチドインフルエンザ(pf)抗原(これらの抗原の正確な性質および起源を与える／説明する必要がある)
・スプリットインフルエンザ(sf)抗原
・全インフルエンザ(wf)抗原
に対するCD4/CD8 T細胞の応答を定量する。
【０３０８】
誘導された変数：
・少なくとも2種の異なるサイトカイン(CD40L、IL-2、IFNγ、TNFα)を産生する細胞
・少なくともCD40Lおよび別のサイトカイン(IL-2、TNFα、IFNγ)を産生する細胞
・少なくともIL-2および別のサイトカイン(CD40L、TNFα、IFNγ)を産生する細胞
・少なくともIFNγおよび別のサイトカイン(IL-2、TNFα、CD40L)を産生する細胞
・少なくともTNFαおよび別のサイトカイン(IL-2、CD40L、IFNγ)を産生する細胞
I.3.5.3. 免疫原性の分析
免疫原性の分析は、総ワクチン接種集団に基づいていた。各治療群について、以下のパラメーター(95％信頼区間を有する)を算出した：
・0日目および21日目のHIおよびNI抗体力価の幾何平均力価(GMT)
・0日目および21日目の中和抗体力価の幾何平均力価(GMT)
・21日目の変換係数
・0日目と比較して21日目での血清HI力価が少なくとも4倍増加したワクチン被接種者のパーセンテージとして定義された21日目での血清変換率(SC)
・血清HI力価＝1:40を有するワクチン被接種者のパーセンテージとして定義された21日目での防御率
・各時点(0日目、21日目)で、ならびに各抗原(ペプチドインフルエンザ(pf)、スプリットインフルエンザ(sf)および全インフルエンザ(wf))につき、各ワクチン接種群についてまとめられた応答におけるCD4/CD8 Tリンパ球分泌の頻度
・それぞれ5種の異なる試験での各ワクチン接種群ならびに各抗原(pf、sf、およびwf)についての時点(前後)の応答間での個々の差異における記述統計学
・非パラメーター検定(Kruskall-Wallis検定)を用いて、3群間の位置の差異を比較し、統計学的p値を、それぞれ5種の試験で各抗原について算出した。全ての有意差検定を両側検定した。0.05以下のP値を、統計学的に有意であるとみなした。
【０３０９】
実施例II-MPL/QS21リポソームアジュバントの調製
II.3 MPL液体懸濁液の調製
MPL(本明細書を通して用いられるように、これは3D-MPL、すなわち、3-O-脱アシル化モノホスホリルリピドAの省略形である)バルク液体を、3D-MPL凍結乾燥粉末から調製する。MPLバルク液体は、生材料の安定な濃縮(約1 mg/ml)水性分散物であり、ワクチンまたはアジュバント製剤としてすぐに使用できる。調製プロセスの略図を図1に与える。
【０３１０】
12 gの最大バッチサイズのために、MPLバルク液体調製物を滅菌ガラス容器中に持ち越す。MPLの分散は、以下の工程からなる：
・注射用の水中にMPL粉末を懸濁する
・加熱(温度処理)により大きい凝集物を分解する
・微小流体化により粒子径を100〜200 nmに低下させる
・Sartoclean プレフィルターユニット、0.8/0.65μm上で調製物を前置フィルターにかける
・室温で調製物を滅菌濾過する(Sartbran Pユニット、0.22μm)。
【０３１１】
MPL粉末を微小流体化により凍結乾燥し、安定なコロイド状水性分散物(滅菌濾過しやすいサイズのMPL粒子)を得る。MPL凍結乾燥粉末を注射用の水に分散させて、粗い10 mg/ml懸濁液を取得する。次いで、懸濁液を、攪拌下で温度処理する。室温まで冷却した後、微小流体化プロセスを開始して、粒子径を減少させる。微小流体化を、規定の圧力、最小量の通過(サイクル数：nmin)で微小流体化相互作用チェンバーを通して分散物を連続的に循環させることにより、Microfluidics装置M110EHを用いて行う。サイクル数で表される、微小流体化期間を、測定された流速と分散容量に基づいて算出する。所与の圧力の所与の装備上で、得られる流速は、一方の相互作用チェンバーから他方のチェンバーに、および特定の相互作用チェンバーの寿命を通して変化してもよい。本実施例においては、用いる相互作用チェンバーはF20Y型Microfluidicsのものである。微小流体化効率はカップル圧(couple pressure)-流速に関連するので、プロセッシング時間は一方のバッチから他方のバッチへ変化してもよい。1サイクルに要する時間を、流速に基づいて算出する。考えられる流速は、装置へのMPLの導入の直前に注射用の水を用いて測定された流速である。1サイクルを、MPLの全量が装置を1回通過するのに要する時間(分)と定義する。nサイクルを得るのに要する時間を、以下のように算出する：
n x処理するMPLの量(ml)/流速(ml/分)
かくして、サイクル数を相応に適合させる。実行すべきサイクルの最小量(nmin)を、用いる好ましい装備および相互作用チェンバーのために記載する。実行するサイクルの総量を、nminサイクル後に実行された粒子径測定の結果により決定する。粒子径限界(dlim)を、史料に基づいて定義する。光子相関分光法(PCS)技術により測定を実現し、dlimを単一モデル結果(Zaverage)として表す。この限界の下で、微小流体化をnminサイクル後に停止させることができる。この限界の上では、満足のいくサイズ低下が得られるまで、最大でさらに50サイクル、微小流体化を継続する。
【０３１２】
濾過を微小流体化後すぐに行わない場合、分散したMPLを+2〜+8℃で保存し、濾過領域への移動を待つ。微量流体化後、分散物を注入用の水で希釈し、層流下で0.22μmフィルターを通して滅菌濾過する。最終的なMPL濃度は、1 mg/ml(0.80〜1.20 mg/ml)である。
【０３１３】
II.2 MPL/QS21リポソームアジュバントの調製
AS01と命名されたこのアジュバントは、コレステロールと共にクエンチされた形態の3D-MPLおよびQS21を含み、参照により本明細書に組み入れられるものとするWO 96/33739に記載のように作製されたものである。具体的には、AS01アジュバントを、本質的にはWO 96/33739の実施例1.1に記載のように調製した。AS01Bアジュバントは、0.5 mlの容量に対して、順にジオレイルホスファチジルコリン(DOPC)、コレステロールおよび3D-MPL[1000μgのDOPC、250μgのコレステロールおよび50μgの3D-MPLの量であり、各値はほぼワクチン用量あたりに与えられるものである]を含むリポソーム、QS21[50μg／用量]、リン酸NaClバッファーならびに水を含む。
【０３１４】
AS01Eアジュバントは、AS01Bと同じ成分であるが、より低い濃度で、0.5 mlの容量に対して、500μgのDOPC、125μgのコレステロール、25μgの3D-MPLおよび25μgのQS21、リン酸NaClバッファーおよび水を含む。
【０３１５】
MPLを含むリポソームの製造のプロセスにおいては、DOPC(ジオレイルホスファチジルコリン)、コレステロールおよびMPLを、エタノール中に溶解する。減圧下での溶媒蒸発により、脂質フィルムを形成させる。pH 6.1のリン酸緩衝生理食塩水(9 mM Na2HPO4、41 mM KH2PO4、100 mM NaCl)を添加し、混合物を予備均質化にかけた後、15,000 psi(約15〜20サイクル)の高圧均質化にかける。これにより、リポソームの産物が得られ、これを無菌(クラス100)領域中で0.22μm膜を通して滅菌濾過する。次いで、滅菌産物を滅菌ガラス容器中に分配し、冷所(+2〜+8℃)で保存する。
【０３１６】
この方法で、製造されたリポソームは膜中にMPLを含む(「MPLin」、WO 96/33739の実施形態)。
【０３１７】
QS21を水性溶液に添加して、所望の濃度にする。
【０３１８】
実施例III-フェレットにおけるアジュバント化インフルエンザワクチンおよびアジュバント化されていないインフルエンザワクチンの前臨床評価
III.1. 原理と目的
フェレットモデルにおけるインフルエンザ感染は、感染に対する感受性と臨床応答の両方に関して、ヒトインフルエンザを厳密に模倣する。フェレットは、ウイルス株の先行適応なしに、A型インフルエンザウイルスおよびB型インフルエンザウイルスの両方による感染に対して非常に感受性が高い。従って、それは投与されたインフルエンザワクチンにより付与される防御の研究にとって優れたモデル系を提供する。この研究は、相同株をチャレンジしたフェレットの鼻分泌物における疾患症候(体温)およびウイルス出芽を減少させる、アジュバント化されていてもいなくてもよい種々の三価スプリットワクチンの効力を調査したものである。
【０３１９】
この実験の目的は、プレーン(アジュバント化されていない)ワクチンと比較した、アジュバント化インフルエンザワクチンの効力を証明することであった。
【０３２０】
その評価項目は、
1)主要評価項目：相同チャレンジ後の鼻洗浄液中のウイルス出芽の減少、
2)副次的評価項目：HI力価による体液性応答の分析、
であった。
【０３２１】
III.2. 実験設計
III.2.1. 治療／群(表1)
14〜20週齢のメスのフェレット(Mustela putorius furo)を、MISAY Consultancy (Hampshire, UK)から取得した。フェレットを0日目に異種サブタイプ株H1N1 A/ストックホルム/24/90(4 Log TCID50/ml)で初回免疫した。21日目に、フェレットに、完全なヒト用量(500μgワクチン用量、15μg HA/株)のH1N1 A/ニューカレドニア/20/99、H3N2 A/パナマ/2007/99およびB/山東省/7/97の組合せを筋肉内注入した。次いで、フェレットに異種サブタイプ株H3N2 A/ワイオミング/3/2003(4.5 Log TCID50/ml)を鼻内経路により42日目にチャレンジした。
【０３２２】
0005461015.tif 000003
【０３２３】
III.2.2. ワクチン製剤の調製(表2)
製剤1：三価スプリットプレーン(アジュバント化されていない)製剤：
PBS 10倍濃縮液(1倍濃縮液の場合、pH 7.4)ならびにTween 80、Triton X-100およびVES(株中に存在する界面活性剤を考慮した量)を含む混合物を、注射用の水に添加する。5分間攪拌した後、15μgのそれぞれの株H1N1、H3N2および17.5μgのB株を、それぞれの添加の間に10分間攪拌しながら添加する。この製剤を最小で15分間攪拌し、直接投与しない場合には4℃で保存する。
【０３２４】
製剤2：リポソーム中のMPL/QS21でアジュバント化された三価スプリットインフルエンザ：
PBS 10倍濃縮液(1倍濃縮液の場合、pH 7.4)ならびにTween 80、Triton X-100およびVES(株中に存在する界面活性剤を考慮した量)を含む混合物を、注射用の水に添加する。5分間攪拌した後、15μgのそれぞれの株H1N1、H3N2および17.5μgのB株を、それぞれの添加の間に10分間攪拌しながら添加する。この製剤を15分間攪拌する。いわゆる「DQS21-MPLin」のプレミックスを製剤に添加した後、最小で15分間攪拌する。DQS21-MPLinプレミックスは、リポソーム(DOPC 40 mg/ml、コレステロール10 mg/ml、MPL 2 mg/mlからなる)と、免疫刺激剤QS21との混合物である。このプレミックスを最小で15分間インキュベートした後、三価スプリット混合物を添加する。最終製剤中のMPLおよびQS21の濃度は、500μlあたり50μgである。この製剤を、直接投与しない場合は4℃で保存する。
【０３２５】
注釈：各製剤において、PBS 10倍濃縮液を添加して等張にし、最終容量中で1倍濃縮液にする。標的化された容量を達成するためのH2O容量を算出する。
【０３２６】
0005461015.tif 000004
【０３２７】
III.2.3. 読み取り(表3)
0005461015.tif 000005
【０３２８】
III.3. 結果
結果の略図を図1および図2に示す。
【０３２９】
III.3.1. 体液性免疫(図1)
H3N2ワクチン株(ワクチン株A/パナマ/2007/99とチャレンジ株A/ワイオミング/3/2003)に対する血球凝集抑制活性を、鼻内異種初回免疫後17日目および免疫後21日目およびチャレンジ後13日目に、1群あたり6匹の動物に由来する血清中で検出した。
【０３３０】
3種のインフルエンザウイルス株に対する抗ヘマグルチニン抗体力価を、実施例I.2.1.の下で詳述された血球凝集抑制試験(HI)を用いて決定した。その結果は以下の通りである：
・2種のA/H3N2株および全ての群について、免疫後の全てのワクチン接種群において、HI力価の追加が観察された。
【０３３１】
・A/パナマ/2007/99による免疫後、三価スプリットプレーンワクチンと比較して、三価スプリットワクチンをリポソーム中のMPL/QS21でアジュバント化した場合、統計学的に有意に高い抗A/パナマ/2007/99 HI力価が観察された。
【０３３２】
・A/パナマ/2007/99で免疫した後、リポソーム中のMPL/QS21でアジュバント化した三価スプリットのみが、異種株A/ワイオミング/3/2003に対するHI力価(このドリフト株を用いるチャレンジ前の交叉反応性)を有意に増加させることができた。
【０３３３】
・A/ワイオミング/3/2003によるチャレンジ後、三価スプリットプレーンおよびリポソーム中のMPL/QS21でアジュバント化した三価スプリットの両方について、抗A/ワイオミング/3/2003 HI力価の有意な増加が観察された。
【０３３４】
・A/ニューカレドニア/20/99およびB/山東省/7/97株について、三価スプリットプレーンワクチンと比較して、三価スプリットをリポソーム中のMPL/QS21でアジュバント化した場合、統計学的に有意に高いHI力価が観察された。
【０３３５】
III.3.2. ウイルス出芽(図3)
鼻洗浄物のウイルス滴定を、実施例I.2.3.の下で詳述されたように1群あたり6匹の動物に対して実施した。目が覚めている動物中の両方の鼻孔に5 mlのPBSを投与することにより、鼻洗浄を実施した。接種物をペトリ皿に回収し、-80℃でサンプル容器に入れた。
【０３３６】
・チャレンジの2日後、三価スプリットプレーンと比較して、リポソーム中のMPL/QS21でアジュバント化された三価スプリットについて、統計学的に有意に低いウイルス出芽が観察された。
【０３３７】
・49日目(チャレンジ後7日目)に、鼻洗浄物中にウイルスは検出されなかった。
【０３３８】
III.3.3. 実験の結論
4種全部の株について、三価スプリットプレーンと比較して、リポソーム中のMPL/QS21でアジュバント化された三価スプリットについて、より高い体液性応答(HI力価)が観察された。
【０３３９】
A/パナマ/2007/99による免疫後、リポソーム中のMPL/QS21でアジュバント化された三価スプリットのみが、異種株A/ワイオミング/3/2003に対するHI力価(この株によるチャレンジ前の交叉反応性)を有意に増加させることができた。
【０３４０】
リポソーム製剤中のMPL/QS21は、フェレットにおける防御効率の点で付加的な利益を示した(異種チャレンジ後のより低いウイルス出芽)。チャレンジに用いたドリフト株に対する、リポソーム中の三価スプリットMPL/QS21による免疫後に観察された交叉反応は、これらのフェレットにおいて観察された防御作用と相関するようであった。
【０３４１】
実施例IV-C57Bl/6初回免疫されたマウスにおけるアジュバント化インフルエンザウイルスおよびアジュバント化されていないインフルエンザウイルスの前臨床評価
IV.1. 実験設計および目的
異種株で初回免疫したC57Bl/6マウスを、この実験に用いた。
【０３４２】
目的は、GlaxoSmithKlineから市販されている三価スプリットワクチン(Fluarix(商標))対三価サブユニットワクチン(ChironのワクチンAgrippal(商標))により誘導された体液性(HI力価)およびCMI(ICS、細胞内サイトカイン染色)免疫応答ならびに3D-MPLのみ、DQS21(リポソーム中のQS21、すなわち、解毒されたQS21)のみ、またはリポソーム中のMPL/QS21を含むリポソームでアジュバント化されたこれらのワクチンを用いて得られたCMI応答を比較することであった。以下の実施例においては、市販のFluarix用量ではなく、Fluarixワクチンと同じ組成を達成するためのスプリットモノバルクから出発して、製剤を調製した。得られた製剤を「Fluarix様」と呼んだ。
【０３４３】
IV.1.1. 治療／群
6〜8週齢のメスのC57Bl/6マウスを、Harlan Horst, Netherlandから取得した。マウスを、異種サブタイプ株(5μg HA全不活化H1N1 A/北京/262/95、H3N2 A/パナマ/2007/99、B/山東省/7/97)で0日目に初回免疫した。28日目に、マウスに1.5μg HA三価スプリット(A/ニューカレドニア/20/99、A/ワイオミング/3/2003、B/江蘇省/10/2003)プレーンまたはアジュバント化を筋肉内注入した(以下の表4〜6中の群を参照)。
【０３４４】
0005461015.tif 000006
【０３４５】
IV.1.2. ワクチン製剤の調製
群1の製剤：
PBS 10倍濃縮液(1倍濃縮液の場合、pH 7.4)ならびにTween 80、Triton X-100およびVES(株中に存在する界面活性剤を考慮した量)を含む混合物を、注射用の水に添加する。5分間攪拌した後、15μgのそれぞれの株H1N1、H3N2および15μgのB株を、それぞれの添加の間に10分間攪拌しながら添加する。この製剤を最小で15分間攪拌し、直接投与しない場合は4℃で保存する。
【０３４６】
群2の製剤：
PBS 10倍濃縮液(1倍濃縮液の場合、pH 7.4)ならびにTween 80、Triton X-100およびVES(株中に存在する界面活性剤を考慮した量)を含む混合物を、注射用の水に添加する。5分間攪拌した後、15μgのそれぞれの株H1N1、H3N2および15μgのB株を、それぞれの添加の間に10分間攪拌しながら添加する。この製剤を15分間攪拌する。3D-MPLを含む濃縮リポソーム(DOPC 40 mg/ml、コレステロール10 mg/ml、3D-MPL 2 mg/mlからなる)を添加して、用量あたり50μgの最終MPL濃度を達成する。次いで、製剤を最小で15分間攪拌し、直接投与しない場合は4℃で保存する。
【０３４７】
群3の製剤：
PBS 10倍濃縮液(1倍濃縮液の場合、pH 7.4)ならびにTween 80、Triton X-100およびVES(株中に存在する界面活性剤を考慮した量)を含む混合物を、注射用の水に添加する。5分間攪拌した後、15μgのそれぞれの株H1N1、H3N2および15μgのB株を、それぞれの添加の間に10分間攪拌しながら添加する。この製剤を15分間攪拌する。次いで、リポソーム(DOPC 40 mg/ml、コレステロール10 mg/mlからなる)とQS21からなるプレミックス(「DQS21」と呼ぶ)を添加して、用量あたり50μgのQS21濃度を達成する、このプレミックスを少なくとも15分間インキュベートした後、三価スプリット混合物に添加する。製剤を最小で15分間攪拌し、直接投与しない場合は4℃で保存する。
【０３４８】
群4の製剤：
PBS 10倍濃縮液(1倍濃縮液の場合、pH 7.4)ならびにTween 80、Triton X-100およびVES(株中に存在する界面活性剤を考慮した量)を含む混合物を、注射用の水に添加する。5分間攪拌した後、15μgのそれぞれの株H1N1、H3N2および15μgのB株を、それぞれの添加の間に10分間攪拌しながら添加する。この製剤を15分間攪拌する。次いで、3D-MPLを含むリポソーム(DOPC 40 mg/ml、コレステロール10 mg/ml、3D-MPL 2 mg/mlからなる)とQS21からなる混合物を添加して、用量あたり50μgのQS21およびMPL濃度を達成する。この混合物を少なくとも15分間インキュベートした後、三価スプリット混合物に添加する。いわゆる「リポソーム中の三価スプリットMPL/QS21」製剤を、最小で15分間攪拌し、直接投与しない場合は4℃で保存する。
【０３４９】
注釈：群1〜4においては、PBS 10倍濃縮液を添加して等張を達成し、最終容量中で1倍濃縮にする。H2O容量を、標的化された容量を達成するように算出する。
【０３５０】
群5の製剤：
1回のAggripal(商標)用量を、等量のPBS pH 7.4と混合する。製剤を最小で15分間攪拌し、直接投与しない場合は4℃で保存する。
【０３５１】
群6の製剤：
PBS pH 7.4および1回のAggripal(商標)用量を混合した後、3D-MPLを含むリポソーム(DOPC 40 mg/ml、コレステロール10 mg/ml、3D-MPL 2 mg/mlからなる)を攪拌しながら添加して、用量あたり50μgのMPL/QS21の等価物を達成する。製剤を最小で15分間攪拌し、直接投与しない場合は4℃で保存する。
【０３５２】
注釈：PBSを添加して最終容量中で等張を達成する。Aggripalは製剤容量の半分である。
【０３５３】
群7の製剤：
PBS pH 7.4および1回のAggripal(商標)用量を混合する。次いで、リポソーム(DOPC 40 mg/ml、コレステロール10 mg/mlからなる)とQS21とのプレミックス(「DQS21」と呼ぶ)を攪拌しながら添加して、50μgのQS21の等価物を達成する。このプレミックスを少なくとも15分間インキュベートした後、添加する。製剤を最小で15分間攪拌し、直接投与しない場合は4℃で保存する。
【０３５４】
注釈：PBSを添加して最終容量中で等張を達成する。Aggripalは製剤容量の半分である。
【０３５５】
群8の製剤：
PBS pH 7.4および1回のAggripal(商標)用量を混合する。いわゆる「DQS21-MPLin」のプレミックスを、攪拌しながら製剤に添加する。DQS21-MPLinプレミックスは、リポソーム(DOPC 40 mg/ml、コレステロール10 mg/ml、MPL 2 mg/mlからなる)と、免疫刺激剤QS21との混合物である。このプレミックスを少なくとも15分間インキュベートした後、Aggripal/PBS混合物に添加する。製剤中のMPL/QS21およびQS21の量は、それぞれ50μgである。製剤を最小で15分間攪拌し、直接投与しない場合は4℃で保存する。
【０３５６】
注釈：PBSを添加して最終容量中で等張を達成する。Aggripalは製剤容量の半分である。
【０３５７】
0005461015.tif 000007
【０３５８】
0005461015.tif 000008
【０３５９】
IV.1.3. 読み取り(表7)
0005461015.tif 000009
【０３６０】
IV.2. 結果
IV.2.1. 体液性応答(免疫後21日目のHI力価)
HI力価による体液性応答-図4
3種のワクチン株(A/ニューカレドニア/20/99、A/ワイオミング/3/2003、B/江蘇省/10/2003)に対する血球凝集抑制活性を、免疫後21日目に1群あたり8匹の動物から得た血清中で検出した。
【０３６１】
・PBSで免役したマウスと比較して、3種全部の株について試験した全てのFluワクチン候補(三価スプリットまたは三価サブユニットワクチン)で免役した後、HI力価の増加が観察された。
【０３６２】
・3種全部の株について、三価スプリットFluプレーンまたは3D-MPLのみを含むリポソームでアジュバント化された三価スプリットFluで免疫したマウスと比較して、DQS21のみ、またはリポソーム中のMPL/QS21でアジュバント化された三価スプリットで免疫したマウスにおいて、統計学的に有意なより高いHI力価が観察された。体液性応答に関する順位は以下の通りであった：(リポソーム中のMPL/QS21＝DQS21のみ)＞(3D-MPLのみを含むリポソーム＝プレーン)＞PBS。
【０３６３】
・3種全部の株について、三価スプリットプレーンで免疫したマウスと比較して、DQS21のみ、3D-MPLのみを含むリポソームまたはリポソーム中のMPL/QS21でアジュバント化された三価サブユニットで免疫したマウスにおいて、統計学的に有意なより高いHI力価が観察された。体液性応答の順位は、以下の通りであった：(リポソーム中のMPL/QS21＝DQS21のみ＝3D-MPLのみを含むリポソーム)＞プレーン＞PBS。
【０３６４】
・製剤をアジュバント化しないか、またはDQS21のみ、もしくはリポソーム中のMPL/QS21でアジュバント化した場合、三価スプリットおよび三価サブユニットは同様のHI力価を誘導した。
【０３６５】
IV.2.2. 細胞性免疫応答(免疫後7日目のICS)
CD4 T細胞応答-図5
1群あたり8匹のマウスに由来するPBMCを、免疫後7日目に収穫し、2匹のマウス／群の4つのプールにおいて試験した。
【０３６６】
Flu全ウイルス特異的総CD4+ T細胞(IL-2、IFN-γおよび両方のサイトカインを発現する)の点で：
・製剤に関わらず、三価スプリットと三価サブユニットワクチンの間で、同一のCD4+ T細胞応答が観察された。
【０３６７】
・三価製剤(スプリットもしくはサブユニット)プレーンまたは3D-MPLのみ、もしくはDQS21のみを含むリポソームでアジュバント化した三価製剤と比較した場合、リポソーム中のMPL/QS21でアジュバント化した三価製剤(スプリットもしくはサブユニット)について、より高いCD4+ T細胞応答が観察された。
【０３６８】
・三価製剤(スプリットもしくはサブユニット)により誘導された細胞性応答について、DQS21のみ、もしくは3D-MPLのみを含むリポソームと比較して、3D-MPL + DQS21を含むリポソームの相乗作用が存在する。
【０３６９】
・細胞性応答の順位は以下の通りであった：リポソーム中のMPL/QS21＞(3D-MPL＋のみを含むリポソーム＝DQS21のみ＝プレーン＝PBS)。
【０３７０】
IV.3. 結果と結論のまとめ
・3種全部の株について、三価製剤(スプリットもしくはサブユニット)プレーンで免疫したマウスと比較して、DQS21のみ、またはリポソーム中のMPL/QS21でアジュバント化された三価製剤(スプリットもしくはサブユニット)で免疫したマウスにおいて、統計学的に有意に高いHI力価が観察された。3D-MPLのみを含むリポソームは、三価スプリットよりも、三価サブユニットを用いて製剤化した場合、より高い体液性応答を誘導するようであった。
【０３７１】
・製剤に関わらず、三価スプリット(Fluarix)および三価サブユニット(Agrippal)について、同様にCD4+ T細胞応答が観察された。
【０３７２】
・リポソーム中のMPL/QS21でアジュバント化された三価製剤(スプリットもしくはサブユニット)は、三価製剤(スプリットもしくはサブユニット)プレーンまたは3D-MPLのみ、もしくはリポソーム中のQS21(DQS21)のみを含むリポソームでアジュバント化された三価製剤と比較して、より高いCD4+ T細胞応答を誘導した。
【０３７３】
実施例V-リポソーム製剤中の3D-MPL/QS21(2種の異なる濃度の3D-MPL)でアジュバント化されたスプリットインフルエンザ抗原性調製物を含むワクチンの前臨床比較
V.1-マウス
V.1.1-実験設計および目的
異種株で初回免疫されたC57Bl/6マウスを、この実験に用いた。目的は、アジュバント化されていない形態の、および2種の異なる濃度の3D-MPLとQS21を含むリポソームでアジュバント化された場合の、GlaxoSmithKlineの市販の三価スプリットワクチン(Fluarix(商標))により誘導される、体液性(HI力価)およびCMI(ICS、細胞内サイトカイン染色)免疫応答を分析することであった。
【０３７４】
V.1.2 治療／群
8週齢のメスのC57Bl/6マウスを、Harlan Horst, Netherlandsから取得した。マウスを、異種サブタイプ株(全体不活化A/北京/262/95、H3N2 A/パナマ/2007/99、B/山東省/7/97)を用いて、0日目に鼻内で初回免疫した。28日目に、マウスに、三価スプリット(A/ニューカレドニア、A/ワイオミング、B/江蘇省)プレーンまたはリポソーム製剤中の2種の異なる濃度の免疫刺激剤でアジュバント化した三価スプリットを筋肉内注入した(以下の表8中の群を参照)。
【０３７５】
0005461015.tif 000010
【０３７６】
製剤を、実施例IVに記載のように調製した。
【０３７７】
V.1.3-結果
HI力価による体液性応答-図24
3種のワクチン株に対する血球凝集抑制活性を、免疫後21日目に9匹の動物／群から得た血清中で検出した。
【０３７８】
・PBSで免疫したマウスと比較して、3種全部の株について試験した全てのFluワクチン候補で免疫した後、HI力価の増加が観察された。
【０３７９】
・3種全部の株について、三価Fluスプリットプレーンで免疫したマウスと比較して、いずれかの濃度のMPLおよびQS21でアジュバント化した三価スプリットで免疫したマウスにおいて、統計学的に有意に高いHI力価が観察された(p値の最大値＝0.03)。
【０３８０】
・2つのリポソームアジュバント群の間では、統計学的な有意差は観察されなかった。
【０３８１】
細胞性免疫応答(免疫後7日目のICS)-図25
9匹のマウス／群に由来するPBMCを、免疫後7日目に収穫し、3匹のマウス／群の3つのプールにおいて試験した。IL-2、IFN-γまたは両方のサイトカインを発現する全Fluウイルス特異的CD4+ T細胞の点で：
図25から認められるように、最も高い濃度の免疫刺激剤でアジュバント化された三価スプリットで免疫した後に、最も高いIFN-γ CD4+ T細胞特異的応答が得られた。しかしながら、2つの濃度の免疫刺激剤の間では、IL2およびIL2+ IFN-γ T細胞応答は類似していた。
【０３８２】
実施例VI-リポソーム製剤中のMPL/QS21(2つの異なる濃度の3D-MPL)でアジュバント化されたスプリットインフルエンザ抗原性調製物を含むワクチンを用いる65歳を超える年齢の高齢者集団における臨床試験
VI.1. 試験設計および目的
成人(18〜40歳)に投与されたFluarix(商標)(ベルギーではα-Rix(商標)として知られる)と比較して、高齢者集団(65歳以上の年齢)に投与された種々のアジュバントを含むGlaxoSmithKline Biologicalsのインフルエンザ候補ワクチンの細胞性免疫応答の点で劣らないことを証明するための公開無作為化第I/II相試験。
【０３８３】
4つの並行群を割り当てた：
・1回用量のFluarix(商標)を受ける1つの対照群における75人の成人(18〜40歳)(Fluarix群)
・3つの群に3:3:2の比で無作為化された200人の高齢被験者(65歳以上の年齢)：
-AS01Bでアジュバント化されたインフルエンザワクチンを受ける75人の被験者を含む1群
-AS01Eでアジュバント化されたインフルエンザワクチンを受ける75人の被験者を含む1群
-1回用量のFluarix(商標)を受ける50人の被験者を含む参照Flu群。
【０３８４】
第1の目的
第1の目的は、少なくとも2種の異なるサイトカイン(CD40L、IL-2、TNF-α、IFN-γ)を産生するインフルエンザ特異的CD4 Tリンパ球の頻度に関して、成人(18〜40歳の年齢)に投与されたFluarix(商標)と比較して、高齢被験者(65歳以上の年齢)に投与されたインフルエンザアジュバント化ワクチンがワクチン接種後21日に劣らないことを証明することである。
【０３８５】
第2の目的
第2の目的は：
1)高齢被験者(65歳以上の年齢)におけるワクチンの筋肉内投与後21日間にアジュバント化された候補インフルエンザワクチンによるワクチン接種の安全性および反応性を評価することである。参照としてFluarix(商標)を用いる。
【０３８６】
2)アジュバント化されたインフルエンザ候補ワクチンによるワクチン接種の21、90および180日後に、体液性免疫応答(抗ヘマグルチニン力価)を評価することである。参照としてFluarix(商標)を用いる。
【０３８７】
第3の目的
第3の目的は、アジュバント化インフルエンザワクチンによるワクチン接種の21、90および180日後に、細胞性免疫応答(IFN-γ、IL-2、CD40L、およびTNF-αおよび記憶B細胞応答)を評価することである。参照としてFluarix(商標)を用いる。
【０３８８】
VI.2. ワクチン組成物と投与
2種の異なるアジュバントを用いた：
1. 50μgのMPLとQS21を含むリポソームに基づくアジュバントAS01B
2. AS01Bの2倍希釈製剤AS01E。
【０３８９】
対照：IM投与による完全用量のFluarix(商標)。
【０３９０】
全ワクチンは、筋肉内投与のために意図される。5種のワクチンにおいて用いられる株は、2005〜2006年の北半球の季節のためにWHOにより推奨されたものであり、すなわち、A/ニューカレドニア/20/99(H1N1)、A/ニューヨーク/7/2004(H3N2)およびB/江蘇省/10/2003である。
【０３９１】
アジュバント化インフルエンザ候補ワクチンの製剤において用いられる3種の不活化スプリットビリオン抗原(一価バルク)は、市販のFluarix(商標)／α-Rix(商標)-GSK Bioのスプリットビリオン不活化インフルエンザワクチンの製剤において用いられる活性成分と全く同じである。それらは卵中で増殖させたウイルスに由来するものである。インフルエンザ株は、市販のFluarix(商標)／α-Rix(商標)2005/2006の製剤において用いられるように、2005/2006年の季節のために推奨されたものである。
【０３９２】
3種のワクチンにおいて用いられる株は、2005-2006年の北半球の季節のためにWHOにより推奨されたもの、すなわち、
・A/ニューカレドニア/20/99 (H1N1)IVR-116
・A/ニューヨーク/55/2004(H3N2)NYMC X-157
・B/江蘇省/10/2003
である。
【０３９３】
Fluarix(商標)／α-Rix(商標)と同様、アジュバント化ワクチンは、用量あたり15μgのヘマグルチニン(HA)の各インフルエンザウイルス株を含む。
【０３９４】
VI.2.1. AS01Bアジュバント化ワクチンロットの説明
AS01Bアジュバント化インフルエンザ候補ワクチンは、ガラスバイアル中に提供された濃縮三価不活化スプリットビリオン抗原と、AS01Bアジュバントを含むガラスバイアルからなる2成分ワクチンである。注入の時点で、アジュバントバイアルの内容物を回収し、濃縮三価不活化スプリットビリオン抗原を含むバイアルに注入した。混合した後、内容物をシリンジ中に回収し、針を筋肉内用の針に交換した。用いた針を筋肉内用の針に交換し、容量を1 mlに補正した。1回用量の再構成されたAS01Bアジュバント化インフルエンザ候補ワクチンは1 mLに一致する。
【０３９５】
このAS01Bアジュバント化インフルエンザ候補ワクチンは、保存剤を含まないワクチンである。
【０３９６】
VI.2.2. AS01Bアジュバント化臨床ロットの組成
1回用量の再構成されたAS01Bアジュバント化インフルエンザワクチンは1 mLに一致する。その組成を表8に示す。それは登録されたFluarix(商標)/α-Rix(登録商標)ワクチンにおけると同様、15μgのHAの各インフルエンザウイルス株を含む。
【０３９７】
0005461015.tif 000011
【０３９８】
VI.2.3. AS01Bアジュバント化ワクチンロットの製造方法
AS01Bアジュバント化インフルエンザワクチンの製造は、3つの主要な工程からなる：
・アジュバントを含まない三価最終バルク(2倍濃縮)の製剤化および抗原容器への充填、
・AS01Bアジュバントの調製、
・AS01Bアジュバント化スプリットウイルスワクチンのその場での再構成。
【０３９９】
アジュバントを含まない三価最終バルクの製剤化および抗原容器への充填
3種の一価バルクの容量は、製剤化前の各一価バルク中で測定されたHA含量および1320 mlの標的容量に基づく。濃縮されたリン酸緩衝生理食塩水PO4 Na/K2(80μl／用量)と、Tween 80、Triton X-100およびコハク酸α-トコフェリル水素のプレ混合物とを、注入用の水に希釈する。次いで、3種の濃縮されたモノバルク(A/ニューカレドニア/20/99 IVR-116、A/ニューヨーク/55/2004 NYMC X-157、B/江蘇省/10/2003)を、三価最終バルク1 mlあたり30μg HAのA(H1N1およびH3N2)株(15μg HA/A株／500μl三価最終バルク)と、35μg HAのB株(17.5μg HA/B株／500μl三価最終バルク)を有するように、得られるリン酸緩衝生理食塩水／Tween 80-Triton X-100-コハク酸α-トコフェリル水素溶液(pH 7.8; 81 mM NaCl、1.56 mM KCl、4.79 mM Na2HPO4、0.87 mM KH2PO4、7.2 mM NAH2PO4、72.8 mM K2HPO4、750μg/ml Tween 80、110μg/ml Triton X-100および100μg/mlコハク酸α-トコフェリル水素)中に連続的に希釈する。各一価バルクの添加の間に、混合物を室温で10〜30分間攪拌する。最後の一価バルクを添加し、15〜30分間攪拌した後、pHを調べ、HClまたはNaOHを用いて7.65±0.25に調整する。
【０４００】
三価最終バルクの抗原を、3 mlの滅菌I型(Ph.Eur.)ガラスバイアル中に無菌的に充填する。各バイアルは、600μlの容量(500μl + 100μlの過剰充填)を含む。
【０４０１】
AS01Bアジュバントバルクの調製およびアジュバント容器への充填
アジュバントAS01Bを、2種の成分：QS21およびMPLを含むリポソームの混合により調製する。これらの成分の各々の調製を、以下にまとめる。QS21は、キラヤ・サポナリア(Quillaja saponaria)の樹皮から得られるトリテルペングリコシドであり、Aquila Worchester, MA, USA(現在はAntigenics)により製造されている。
【０４０２】
QS21は凍結乾燥粉末としてGSK Biologicalsに提供されている。GSK BioでのQS21の調製は、約5 mg/mLの濃度で注入用の水にQS21粉末を懸濁し、pH 6.0±0.2に調整し、滅菌濾過することからなる。バルク液体QS21を、ポリエチレン容器中で-20℃で保存する。
【０４０３】
MPLは、サルモネラ・ミネソタ(Salmonella minnesota)のRe595株に由来するリポ多糖の連続的酸塩基加水分解により得られる3-O-デアシル-4'-モノホスホリルリピドAである。それは、GSK Biologicals, Hamilton, Montanaにより製造されている。バルクMPLは、トリエチルアミン(TEA)の凍結乾燥塩として供給されている。
【０４０４】
MPLを含有するリポソームの製造プロセスにおいては、DOPC(ジオレイルホスファチジルコリン)、コレステロールおよびMPLを、エタノール中に溶解する。減圧下での溶媒蒸発により、脂質フィルムを形成させる。9 mM Na2HPO4、41 mM KH2PO4、100 mM NaCl pH 6.1からなるリン酸緩衝生理食塩水を添加し、混合物を予備均質化にかけた後、15,000 psi(+/-20サイクル)の高圧均質化にかける。これにより、リポソームの産物が得られ、これを無菌(クラス100)領域中で0.22μm膜を通して滅菌濾過する。次いで、滅菌産物を滅菌ガラス容器中に分配し、冷所(+2〜+8℃)で保存する。
【０４０５】
リポソームの滅菌バルク調製物を、滅菌QS21バルク溶液と混合する。30分間攪拌した後、この混合物を、注入用の水と10倍希釈した場合の500 mMリン酸、1M NaCl pH 6.1の混合物に添加する。10倍希釈した場合の500 mMリン酸、1M NaCl  pH 6.1の量を算出して、最終容量中で等張を達成する。pHを調べる。次いで、アジュバントを滅菌濾過(0.22μm)し、バイアル中に無菌的に分配する。バイアルを+2〜+8℃で保存する。
【０４０６】
AS01B希釈液は、滅菌1型ガラスバイアル中に含まれる、外来粒子を含まない、乳白無色の液体である。仕様(0.5 ml以上)を満たすためには、各バイアルのための標的充填量は0.7 mlである。
【０４０７】
AS01Bアジュバント化スプリットウイルスワクチンのその場での再構成
注入の時点で、アジュバントを含むバイアルの内容物を回収し、濃縮された三価不活化スプリットビリオン抗原を含むバイアル中に注入する。混合した後、内容物をシリンジに回収し、針を筋肉内用の針に交換し、容量を1 mlに補正する。1回用量の再構成されたAS01Bアジュバント化インフルエンザ候補ワクチンは、1 mLに一致する。
【０４０８】
VI.2.4. AS01Eアジュバント化ワクチンロットの説明
AS01Eアジュバント化インフルエンザ候補ワクチンは、ガラスバイアル中に提供された濃縮三価不活化スプリットビリオン抗原、AS01Bアジュバントを含むガラスバイアルおよびAS01Bの2倍希釈のための希釈剤(注入用の塩化ナトリウム溶液)を含むガラスバイアルからなる3成分ワクチンである。
【０４０９】
AS01Eアジュバントを調製するために、希釈剤バイアルの内容物を、シリンジを用いて回収し、AS01Bアジュバントを含むバイアル中に注入した後、混合する。注入の時点で、600μlのAS01Eアジュバントを、AS01Eバイアルからシリンジを用いて回収し、濃縮三価不活化スプリットビリオン抗原を含むバイアル中に注入する。混合した後、内容物をシリンジ中に回収し、針を筋肉内用の針に交換する。1回用量の再構成されたAS01Bアジュバント化インフルエンザ候補ワクチンは、1 mLに一致する。
【０４１０】
AS01Eアジュバント化インフルエンザ候補ワクチンは、保存剤を含まないワクチンである。
【０４１１】
VI.2.5. AS01Eアジュバント化臨床ロットの組成
1回用量の再構成されたAS01Eアジュバント化インフルエンザワクチンは、1 mLに一致する。その組成を表9に示す。それは、認可されたFluarix(商標)/α-Rix(登録商標)ワクチンにおけると同様に15μgのHAの各インフルエンザウイルス株を含む。
【０４１２】
0005461015.tif 000012
【０４１３】
VI.2.6. AS01Eアジュバント化ワクチンロットの製造方法
AS01Bアジュバント化インフルエンザワクチンの製造は、3つの主要な工程からなる：
・アジュバントを含まない三価最終バルク(2倍濃縮)の製剤化および抗原容器への充填、
・AS01Bアジュバントの調製、
・AS01Eアジュバントの調製後の、AS01Eアジュバント化スプリットウイルスワクチンのその場での再構成。
【０４１４】
アジュバントを含まない三価最終バルクの製剤化および抗原容器への充填
AS01Bアジュバント化インフルエンザワクチンについては、V.2.3節を参照されたい。
【０４１５】
AS01Bアジュバントバルクの調製およびアジュバント容器への充填
AS01Bアジュバント化インフルエンザワクチンについては、V.2.3節を参照されたい。
【０４１６】
AS01Eアジュバント化スプリットウイルスワクチンのその場での再構成
AS01Eアジュバントを調製するために、希釈液バイアルの内容物を、シリンジを用いて回収し、AS01Bアジュバントを含むバイアル中に注入した後、混合する。注入の時点で、600μlのAS01Eアジュバントを、AS01Eバイアルからシリンジを用いて回収し、濃縮三価不活化スプリットビリオン抗原を含むバイアル中に注入する。混合した後、内容物をシリンジ中に回収し、針を筋肉内用の針に交換する。1回用量の再構成されたAS01Eアジュバント化インフルエンザ候補ワクチンは、1 mLに一致する。
【０４１７】
被験者1人あたり、4回のスケジュール化された訪問を行う：0、21、90および180日目に、各訪問で血液サンプルを回収して、免疫原性を評価する。ワクチン接種スケジュール：0日目にインフルエンザワクチンを1回注入する。
【０４１８】
VI.2.7-免疫学的アッセイ
血球凝集抑制アッセイ
WHO collaborating Centre for influenxa, Centres for Diseases Control, Atlanta, USA (1991)により記載された方法を用いて血球凝集抑制(HI)抗体を測定することにより、免疫応答を決定する。抗体力価測定を、4血球凝集抑制単位(4 HIU)の好適な抗原および0.5％の鳥赤血球懸濁液を用いて標準化され、包括的に検証された微小方法を用いて、解凍した凍結血清サンプルに対して行った。非特異的血清阻害物質を、熱処理および受容体を破壊する酵素により除去した。得られた血清を、HI抗体レベルについて評価した。1:10の最初の希釈率から開始して、連続希釈液(2倍で)を、1:20480の最終希釈率まで調製した。滴定の最終点を、血球凝集の完全な阻害(100％)を示した最も高い希釈段階として取得した。全てのアッセイは二回ずつ行った。
【０４１９】
サイトカイン-陽性CD4またはCD8 Tリンパ球の頻度を評価するのに用いられるサイトカインフローサイトメトリー(CFC)
末梢血抗原特異的CD4およびCD8 T細胞をin vitroで再刺激して、その対応する抗原と共にインキュベートした場合、CD40L、IL-2、TNF-αおよびIFNを産生させることができる。結果として、抗原特異的CD4およびCD8 T細胞を、細胞表現型の従来の免疫蛍光標識に従うフローサイトメトリーならびに細胞内サイトカイン産生により数えることができる。本研究においては、インフルエンザワクチン抗原を抗原として用いて、インフルエンザ特異的T細胞を再刺激することができる。結果を、CD4またはCD8 T細胞サブ集団内のサイトカイン陽性CD4またはCD8 T細胞の頻度として表すことができる。
【０４２０】
記憶B細胞の頻度を評価するのに用いられるELISPOT
B細胞Elispot技術により、所与の抗原に特異的な記憶B細胞の定量が可能になる。記憶B細胞を、CpGと共に5日間培養した後、in vitroで形質細胞に分化するように誘導することができる。従って、in vitroで生成された抗原特異的形質細胞を、B細胞Elispotアッセイを用いて数えることができる。簡単に述べると、in vitroで生成された形質細胞を、抗原で被覆した培養プレート中でインキュベートする。抗原特異的形質細胞は、抗体／抗原スポットを形成するであろうが、これを従来の免疫酵素手順により検出することができる。本研究においては、インフルエンザワクチン株または抗ヒト免疫グロブリン領域(aree)を用いて培養プレートを被覆して、それぞれ抗インフルエンザまたはIgGを分泌する形質細胞を数える。結果を、100万のIgGを産生する形質細胞内の抗原特異的形質細胞の頻度として表す。
【０４２１】
PBMCの予備的特性評価
選択された界面活性剤／活性化マーカー(すなわち、CD4、CD8、CD45RO、CD45RA、CD28、CD27またはいくつかのKIR)の発現を実施することができる。ワクチンにより誘導されたTリンパ球の機能を、サイトカイン(Tヘルパー1もしくはTヘルパー2サイトカイン)のホーミングマーカー(すなわち、CCR7、CXCR5)の分析、またはFoxp3、CTLA-4、もしくはTGFβなどの調節機能と関連する因子の発現の分析により検討することができる。具体的には、CD8+CD28-集団または他の調節T細胞集団を、ワクチン抗原に対する体液性応答、BおよびT細胞応答に関して分析することができる。
【０４２２】
VI.3. 免疫原性の結果
VI.3.1. CMI評価項目および結果
アジュバント化インフルエンザワクチンによるワクチン接種後のCMI応答を特性評価するために、CD4およびCD8 Tリンパ球を、3種のワクチン株(個別に、またはプールして用いる)に由来する抗原を用いて、in vitroで再刺激した。インフルエンザ特異的CD4/CD8 Tリンパ球を、細胞内サイトカイン産生(IL-2、IFN-γ、TNF-αおよびCD40L)の従来の免疫蛍光標識後のフローサイトメトリーにより数えた。
【０４２３】
主要評価項目の評価
21日目：少なくとも2種の異なるサイトカイン(IL-2、IFN-γ、TNF-αおよびCD40L)を産生する試験における106個あたりのインフルエンザ特異的CD4 Tリンパ球の頻度に関する全被験者におけるCMI応答。
【０４２４】
CMI応答の評価のために、インフルエンザ特異的CD4の頻度を、以下のように分析する。
【０４２５】
劣らない手法を用いたところ、Fluarix(商標)(18〜40歳の成人に投与、Flu YoungもしくはFlu YNGと呼ばれる群)と比較して、少なくとも1種のインフルエンザアジュバント化候補ワクチン(65歳以上の高齢者に投与、Flu elderlyもしくはFlu ELDと呼ばれる群)は、幾何平均(GM)比(21日目に少なくとも2種のサイトカインを産生するインフルエンザ特異的CD4 T細胞の頻度に関して、Fluarix(商標)(18〜40歳)群と、インフルエンザアジュバント化候補ワクチン(65歳以上の群)との間)に対する両側98.75％信頼区間の上限が2.0である場合に、劣らないレベルを達成した。
【０４２６】
0005461015.tif 000013
【０４２７】
ワクチン接種の21日後のGM比の98.75％CIを、頻度のlog10変換に対する共分散(ANCPVA)モデルの分析を用いて計算した。ANCOVAモデルは、固定効果(Fluarix(商標)(18〜40歳)対インフルエンザアジュバント化候補ワクチン(65歳以上))としてのワクチン群と、リグレッサーとしてのワクチン接種前頻度を含んでいた。GM比およびその98.75％CIは、該モデル中の対応する群の定数の指数変換として導き出される。調整されたGMの98.75％CIを、上記ANCOVAモデルの最小二乗平均群に対する98.75％CIの指数変換により得る。
【０４２８】
結果-推論分析(表10)
「プールされた抗原II」でin vitroで再刺激した後、21日目で少なくとも2種のサイトカイン(IL-2、IFN-γ、TNF-αおよびCD40L)を産生するインフルエンザ特異的CD4 Tリンパ球の調整されたGMおよびGM比(その98.75％CIを用いる)を、表10に提示する。それぞれのアジュバント化インフルエンザワクチンについて、GM比の両側98.75％CIの上限は、2.0の臨床限界よりかなり下である。これは、インフルエンザ特異的CD4のワクチン接種後頻度に関して、18〜40歳の成人に投与されたFluarix(商標)ワクチンと比較して、高齢被験者に投与された両アジュバント化インフルエンザワクチンが劣っていないことを示している。
【０４２９】
0005461015.tif 000014
【０４３０】
結果-記述的分析(図6)
主な知見は、以下の通りであった：
1)ワクチン接種前に、CMI応答は高齢者よりも若い成人においてより高い。
【０４３１】
2)ワクチン接種後に、  
・若い成人(18〜40歳)におけるCMI応答に対するインフルエンザワクチンの追加効果が存在した。  
・アジュバント化インフルエンザワクチンを受けた高齢者におけるCMI応答は、若い成人のCMI応答に匹敵するものである。
【０４３２】
調査した全てのサイトカイン(IL-2、CD40L、TNF-αおよびIFN-γ)に関するCD4 Tリンパ球におけるワクチン接種前後での差異は、全ての試験について、Fluarix(商標)と比較してアジュバント化ワクチンの方が有意に高かった。
【０４３３】
第3の対象の分析：
第3の評価項目を評価するために、インフルエンザ特異的CD4/CD8 Tリンパ球および記憶B細胞の頻度を、0、21、90および180日目に測定した。  
・インフルエンザ特異的サイトカイン陽性CD4/CD8 Tリンパ球の頻度を、各抗原につき、0および21日目の各ワクチン接種群についてまとめた(記述統計)。  
・非パラメーター検定(Wilcoxon検定)を用いて、2群(インフルエンザアジュバント化ワクチン対Fluarix(商標))間の差異の位置を比較し、それぞれ異なる検定の各抗原について、統計的p値を算出した。  
・21日目／0日目(ワクチン接種前後)の応答の間の個々の差異における記述統計を、それぞれ異なる検定の各ワクチン接種群および各抗原について算出する。  
・非パラメーター検定(Wilcoxon検定)を用いて、個々の差異(ワクチン接種前後)を比較し、それぞれ異なる検定での各抗原について、統計的p値を算出する。  
インフルエンザ特異的CD4 Tリンパ球の頻度における差異を比較するのに用いられるWilcoxon検定に由来するp値を、表11に提示する。
【０４３４】
結果-第3の評価項目の評価(表11)
主な結論は以下の通りである：
・インフルエンザ特異的CD4 T細胞のワクチン接種前のGM頻度は、全ての群の高齢被験者において類似していたが、18〜40歳の年齢の成人においては優れていた。  
・高齢被験者においては、インフルエンザ特異的CD4 Tリンパ球のワクチン接種後(21日目)の頻度は、Fluarix(商標)よりも、アジュバント化ワクチンによるワクチン接種後に有意に高かった。  
・インフルエンザ特異的CD4 Tリンパ球のワクチン接種後の頻度は、Fluarix(商標)をワクチン接種された18〜40歳の成人におけるよりも、AS01BまたはAS01Eアジュバント化ワクチンをワクチン接種された高齢被験者において低いままであった。  
・インフルエンザ特異的CD8 T細胞のワクチン接種前およびワクチン接種後のGM頻度は、本質的には全ての群において類似していた。
【０４３５】
0005461015.tif 000015
【０４３６】
結果-体液性免疫応答の評価項目の評価
観察された変数：
0、21、90および180日目に、血清血球凝集抑制(HI)抗体力価を、ワクチン中に示される3種のインフルエンザウイルス株の各々に対して別々に試験した(抗H1N1、抗H3N2および抗B抗体)。
【０４３７】
全てのワクチン抗原に対するHI抗体のカットオフ値を、分析の前に実験室により定義する(1:10に等しい)。血清陰性被験者は、抗体力価がカットオフ値より低い被験者である。血清陽性被験者は、抗体力価がカットオフ値以上である被験者である。該アッセイのカットオフより低い抗体力価は、カットオフの半分の任意の値を与えられる。
【０４３８】
HI抗体力価に基づいて、以下のパラメーターを算出する：
・log力価変換の平均の抗logを取ることにより算出された、0および21日目でのHI力価の幾何平均力価(GMT)。  
・0日目と比較した21日目の血清HI GMTにおける増加倍数として定義された21日目の血清変換係数(SF)。  
・1:10より低いワクチン接種前のHI力価および1:40以上のワクチン接種後力価、または1:10以上のワクチン接種前の力価およびワクチン接種後の力価の最小で4倍の増加を有するワクチン被接種者のパーセンテージとして定義された21日目の血清変換率(SC)。  
・1:40以上の血清HI力価を有するワクチン被接種者のパーセンテージとして定義された21日目の血清防御率(SPR)。  
GMの95％CIを、各群内で個別に取得する。最初に、log変換された力価の平均に関する95％CIを取得し、log変換された力価が未知の分散と共に正規分布すると仮定する。次いで、log変換された力価の平均に関する95％CIの指数変換により、GMに関する95％CIを取得する。
【０４３９】
特定の抗体測定に関する紛失した血清学的結果は、元に戻らない。従って、所与の時点で血清学的結果を有さない被験者は、その時点に関するアッセイの分析に寄与しない。
【０４４０】
体液性免疫応答の結果(図7および表12)
3種全部のワクチン株に関するHI抗体のワクチン接種前のGMTは、4つの治療群において同じ範囲内にあった。ワクチン接種後に、同じ集団における標準的なFluarixと比較して、高齢者における体液性応答を増加させる2種のアジュバントの明確な影響が存在する(図7、直線尺度で示されるが、対数尺度で示される場合、同じ影響が明確に認められる)。
【０４４１】
GMTは、
・AS01Eに関するH1N1について有意に高い。
【０４４２】
・両アジュバントに関するH3N2について有意に高い。
【０４４３】
・アジュバント化ワクチンを受けた2群の被験者間でワクチン接種後のGMTに関して有意差は観察されなかった。
【０４４４】
ワクチン接種の21日後、Fluarixの被験者(18〜40歳)は、ニューカレドニアおよびB/江蘇省株について、より高いHI応答を有した。
【０４４５】
表12に示されるように、アジュバント化インフルエンザワクチンは、60歳を超える年齢の被験者において、スプリットビリオンインフルエンザワクチンの毎年の登録に関する欧州当局の要件[「毎年の株の変化の免疫学的評価のためのインフルエンザワクチンの要件の調和に関するガイダンスのための注釈(Note for Guidance on Harmonization of Requirements for Influenza Vaccines for the immunological assessment of the annual strain changes)」(CPMP/BWP/214/96)]を超えていた。
【０４４６】
ワクチン接種後、Fluarix(65歳以上)群と、
・A/H1N1/ニューカレドニア株に関するFlu/AS01BおよびFlu/AS01E、
との間のHI抗体の血清防御率に関して、統計学的な差異が存在した。
【０４４７】
各ワクチン株について、2種のインフルエンザアジュバント化ワクチン群についての血清防御率は、Fluarix(18〜40歳)群と比較して、同じ範囲内にある。
【０４４８】
各ワクチン株について、2種のインフルエンザアジュバント化ワクチン群についての血清変換率は、ニューカレドニア株について以外は、Fluarix(18〜40歳)群と比較して、同じ範囲内にある。
【０４４９】
0005461015.tif 000016
【０４５０】
VI.3.2. 免疫原性の結論
・インフルエンザ特異的CD4のワクチン接種前頻度は、18〜40歳の成人と比較して、高齢者において有意に劣っていた。Fluarix(商標)でワクチン接種した後、ワクチン接種後の頻度(21日目)は、より若い成人と比較して、高齢の成人において依然として劣っていた。対照的に、高齢被験者のアジュバント化ワクチンによるワクチン接種後のインフルエンザ特異的CD4のワクチン接種後の頻度に関して、18〜40歳の成人においてFluarix(商標)によるワクチン接種と比較して、劣らないことが証明された。
【０４５１】
・HI抗体応答に関する体液性免疫応答に関して、全てのインフルエンザワクチンは、インフルエンザ不活化ワクチンの毎年の登録に関する欧州当局の要件[「毎年の株の変化の免疫学的評価のためのインフルエンザワクチンの要件の調和に関するガイダンスのための注釈(Note for Guidance on Harmonization of Requirements for Influenza Vaccines for the immunological assessment of the annual strain changes)」(CPMP/BWP/214/96)]を満たしていた。高齢の成人においては、アジュバント化ワクチンは、Fluarix(商標)よりもインフルエンザヘマグルチニンに対するより高い体液性免疫応答の少なくとも傾向を媒介していた。Fluarix(商標)と比較した、アジュバント化ワクチンによる高齢被験者において媒介された各ワクチン株に対する体液性免疫応答間の有意差を、表13にまとめる。Fluarix(商標)をワクチン接種された18〜40歳の成人と比較して、アジュバント化ワクチンをワクチン接種された高齢被験者は、A/ニューヨーク株に対する21日目でのより高いワクチン接種後のGMTおよび血清変換係数に関する傾向を示した。
【０４５２】
0005461015.tif 000017
【０４５３】
VI.4 反応性の結論
VI.4.1. 有害事象(AE)の記録
7日間の追跡期間(ワクチン接種の当日およびその後の6日間)の間に生じる応答型症候(表14を参照)を記録した。21日間の追跡期間(ワクチン接種の当日およびその後の20+3日間)の間に生じる非応答型症候も記録した。以下のAEの強度を、表15に記載のように評価した。
【０４５４】
0005461015.tif 000018
【０４５５】
0005461015.tif 000019
【０４５６】
局所注入部位の発赤／腫脹の最大強度を、以下のようにスコア化する：0は0 mm；1は0 mmを超えて20 mm以下；2は20 mmを超えて50 mm以下；3は50 mmを超えるものである。
【０４５７】
発熱の最大強度を、以下のようにスコア化する：1は37.5℃を超えて38.0℃以下；2は38.0℃を超えて39.0℃以下；3は39.0℃を超えるものである。
【０４５８】
調査者は、他の全てのAE、すなわち、試験の間に報告されたSAEなどの非応答型症候に関する強度を評価する。この評価は、調査者の臨床判断に基づく。記録されたそれぞれのAEの強度を、以下のカテゴリーの1つに割り当てる：
1(軽度)＝被験者により容易に耐えられるAEであり、最小限の不快さを引き起こし、毎日の活動は妨げられない；
2(中程度)＝通常の毎日の活動を妨げるのに十分に不快であるAE；
3(重篤)＝通常の毎日の活動を阻むAE(成人／青年においては、AEなどは、例えば、仕事／学校への参加を阻み、矯正治療の投与を強制する)。
【０４５９】
VI.4.2. 有害事象(AE)の記録
高齢被験者においては、局所および全身症候の両方に関して、アジュバント化ワクチンで観察された反応性は、Fluarix(商標)より高かった。症候の発生率だけでなく、強度も、アジュバント化ワクチンによるワクチン接種後に増加した(図8)。3等級の症候は、免疫刺激剤はより低い濃度であるアジュバント化ワクチンを受けた群と比較して、最も高い免疫刺激剤(MPL、QS21)濃度でアジュバント化されたワクチンを受けた群においてより高い傾向を示した。しかしながら、全ての場合において、症候は迅速に消失した。
【０４６０】
実施例VII：マウスにおけるアジュバント化HPVワクチンの前臨床評価
この研究は、抗原としてHPV16のL1とHPV18のL1から形成されたウイルス様粒子(VLP)を混合するヒトパピローマウイルス(HPV)に由来する二価抗原組成物を用いた。この研究の目的は、GSKの頸部癌ワクチンに認められる現在のアジュバント、AS04(ミョウバン上のMPL)に対して評価された、AS01BおよびAS01Bの1/5希釈物と共に製剤化した場合の、この抗原性調製物の効力を比較することであった。
【０４６１】
VII.1-ワクチン接種
マウス(1群あたりn=12匹)に、Hi-5 80/80Lプロセスに由来するHPV16/18 L1(それぞれ2μgもしくは0.5μg)から構成されるワクチン製剤ならびにAS04(ミョウバンと共に製剤化された50μgのMPL)もしくはAS01B(0.5 ml中の50μgのQS21-50μgのMPL)の1/10および1/50ヒト用量と共に製剤化されたワクチン製剤を、0および28日目に注入した。研究をマウスにおいて行ったので、1/10ヒト用量を、AS01Bヒト製剤と等価であると取ることができる、すなわち、0.5 ml中の50μgのQS21および50μgのMPLならびに1/50を、AS01Bヒト製剤の1/5希釈物、すなわち、0.5 ml中の10μgのQS21および10μgのMPLと取ることができる。血液サンプルを投与IIの後14および45日目に取り、個々の血清中の総抗L1型特異的抗体についてアッセイした。細胞内サイトカイン染色を、PBMC上で投与IIの後7日および14日目に、ならびに脾臓細胞を用いて投与IIの後45日目に測定した。VLP特異的記憶B細胞の頻度を、脾臓細胞を用いて投与IIの後45日目に測定した。
【０４６２】
VII.2-抗HPV 16/18 L1 ELISA
抗HPV-16およびHPV-18 L1抗体の定量を、コーティングとしてHPV-16およびHPV-18 L1を用いるELISAにより実施した。抗原をPBS中0.5μg/mlの最終濃度に希釈し、96穴マイクロタイタープレート(Maxisorp Immuno-plate, Nunc, Denmark)のウェルに、4℃で一晩吸着させた。次いで、プレートを、1％ウシ血清アルブミン(飽和バッファー)を含むPBSと共に37℃で1時間インキュベートした。PBS+0.1％Tween20+1％BSAを含むバッファー中に希釈された血清を、HPV L1被覆されたプレートに添加し、37℃で1時間30分インキュベートした。プレートをPBS 0.1％Tween20で4回洗浄し、飽和バッファー中に1/1000で希釈されたビオチン結合抗マウスIg(Dako, UK)を各ウェルに添加し、37℃で1時間30分インキュベートした。洗浄工程の後、飽和バッファー中で1/3000に希釈された、ストレプトアビジン-西洋わさびペルオキシダーゼ(Dako, UK)を、37℃でさらに30分間添加した。プレートを上記のように洗浄し、0.1％Tween20、0.05Mクエン酸バッファーpH 4.5中の0.04％ o-フェニレンジアミン(Sigma)、0.03％ H2O2の溶液と共に、室温で20分間インキュベートした。2N H2SO4で反応を停止させ、492/620 nmで読み取った。ELISA力価を、SoftMaxPro(4パラメーターの式を用いる)による参照値から算出し、EU/mlで表した。
【０４６３】
VII.3-細胞内サイトカイン染色(ICS)
T細胞のサイトカインの細胞内染色を、投与II後7日および14日目にPBLに対して、および2回目の免疫後45日目に脾臓細胞に対して実施した。PBMC(1プール／群)または脾臓細胞(1群あたり3つの器官の4つのプール)を、マウスから回収した。脾臓細胞のin vitroでの抗原刺激を、VLP 16もしくは18(5μg/ml)+CD49d CD28抗体(1μg/ml)を用いて、5 x 106細胞／ml（96穴マイクロプレート)の最終濃度で行った後、37℃で3時間インキュベートした。抗原再刺激工程の後、細胞を37℃でBrefeldin(1μg/ml)の存在下で一晩インキュベートして、サイトカイン分泌を阻害した。細胞染色を以下のように実施した：細胞懸濁液を洗浄し、2％Fcブロッキング剤(1/50; 2.4G2)を含む50μlのPBS 1％FCS中に再懸濁した。4℃で10分間インキュベートした後、抗CD4-APC(1/50)および抗CD8 perCP(1/50)の混合物50μlを添加し、4℃で30分間インキュベートした。PBS 1％FCS中で洗浄した後、200μlのCytofix-Cytoperm (Kid BD)中に再懸濁することにより、細胞を透過処理し、4℃で20分間インキュベートした。次いで、細胞をPerm Wash (Kit BD)で洗浄し、PermWash中に希釈した抗IFγ APC(1/50)+抗IL-2 FITC(1/50)50μlで再懸濁した。4℃で2時間インキュベートした後、細胞をPerm Washで洗浄し、PBS 1％FCS+1％パラホルムアルデヒド中に再懸濁した。サンプル分析を、FACSにより実施した。生細胞をゲート化し(FSC/SSC)、獲得を約20,000事象(リンパ球)に対して実施した。IFγ+またはIL2+の割合を、CD4+およびCD8+ゲート化集団上で算出した。
【０４６４】
VII.4-B細胞記憶
2回目の免疫の45日後、マウスを犠牲にし、lymphoprep gardient (Cedarlane)により脾臓細胞を分離した。次いで、添加物(1 mMピルビン酸ナトリウム、MEM非必須アミノ酸、Pen/Strep、グルタミンおよびβ-2メルカプトエタノール)、5％ウシ胎仔血清、50U/ml rhIL-2 (eBioscience)ならびに3μg/ml CpGを含むRPMI 1640培地(Gibco)中に、B細胞を再懸濁した。細胞を、平底の6穴あたり5 ml中、106細胞/mlの最終濃度で5日間培養した。エタノールを用いる活性化工程の後、ニトロセルロースプレート(Multiscreen-IP; Millipore)を、10μg/mlのVLPまたはPBS中で1/200に希釈したヤギ抗マウスIg(GAM; Sigma)でコーティングした。完全培地を用いる飽和工程の後、100μlの2 x 106細胞/mlを、VLPでコーティングしたプレートに添加し、100μlの106および5 x 105細胞/mlをGAMプレートに添加した。37℃で2時間インキュベートした後、プレートを4℃で一晩保存した。プレートを、PBS、0.1％Tween20で4回洗浄し、PBS、1％BSA、5％FCS(希釈バッファー)中で1/200に希釈された抗マウスIg Biotをプレートに分配し、37℃で2時間インキュベートした。洗浄工程の後、希釈バッファー中で1/550に希釈されたExtravidin HRP (Sigma)を、37℃でさらに1時間添加した。プレートを上記のように洗浄し、AEC (Sigma)の溶液を用いて室温で10分間インキュベートした。水道水下でプレートを穏やかにリンスすることにより、反応を停止させる。プレートが乾燥したら、KS400と反応させる。
【０４６５】
VII.5-統計学的分析
分散の一方向分析(ANOVA 1)を用いて、製剤の平均を比較した。正規化のためにlog10変換されたデータに対して分析を行った。プロセス平均間の有意差を検出した場合(p値≦0.05)、対比較を、0.05の有意レベル(Studet-Newman-Keul多重比較検定)で実施した。
【０４６６】
VII.6-結果
マウスを、上記のVII.1に記載のように免疫した。以下の群を用いた。
【０４６７】
0005461015.tif 000020
【０４６８】
VII.6.1-体液性応答
抗HPV 16-L1抗体力価または抗HPV 18-L1抗体力価のためのアジュバントのいずれかの希釈物を含む抗原の2つの試験した用量について、有意な用量範囲は観察されなかった(図9)。
【０４６９】
抗HPV 16-L1抗体力価のための抗原の用量がどんなものでも、各アジュバントの2つの試験した用量について、有意な用量範囲は観察されなかった。
【０４７０】
抗HPV 18-L1抗体力価を見る場合、投与II後14日目に測定されたように、AS01B(1/50 HD)と比較して、AS01B(1/10 HD)について、力価のわずかな増加が認められたが(2.5倍の用量範囲、p値＝0.0035)、この範囲は2μg抗原についてのみ観察され、0.5μg抗原については観察されなかった(p値＝0.0867)。投与II後45日目までに、抗原の用量がどんなものでも、各アジュバントの2つの試験した用量について、有意な用量範囲は認められなかった。
【０４７１】
VII.6.2-細胞性応答
細胞内サイトカイン染色
HPV 18-L1のアジュバントの用量がどんなものであれ、2つの試験した用量の抗原について、抗原の用量範囲効果は観察されなかった。異なる用量のアジュバントを含む抗原の2つの試験した用量について、VLP16特異的CD4+ T細胞の同様の頻度が得られた(図10)。
【０４７２】
AS01B (1/50 HD)と比較して、AS01B (1/10 HD)について、わずかな用量効果(HPV 18-L1については、2.6倍、p値＝0.0009、HPV 16-L1については、2倍、p値＝0.0187)が認められたが、この範囲は、2μgの抗原についてのみ観察され、0.5μgの抗原については観察されなかった。
【０４７３】
特異的B記憶細胞
HPV 16または18 L1のためのアジュバントの用量がどんなものであれ、抗原の2つの試験した用量について、抗原の用量範囲効果は観察されなかった(図11)。
【０４７４】
HPV 17または18 L1のための抗原の用量がどんなものであれ、アジュバントの2つの試験した用量について、アジュバントの用量範囲効果は観察されなかった。
【０４７５】
上記結果から認められるように、AS01Bの1/5希釈物は、AS01B自身に対する免疫原性組成物において等価な効力を有する製剤をもたらす。
【０４７６】
実施例VIII：マウスにおけるアジュバント化肺炎連鎖球菌の前臨床評価
この試験に用いた肺炎球菌ワクチンは、AS01BまたはAS01Eを用いてアジュバント化された11種の肺炎球菌多糖類コンジュゲートの混合物からなる11価のアジュバント化肺炎球菌コンジュゲートワクチン(11PCV/AS)であった。このコンジュゲートは、それぞれ個々に担体タンパク質、ジフテリアトキソイド(DT)、破傷風トキソイド(TT)またはインフルエンザ菌に由来するDタンパク質(PD)にコンジュゲートされた、肺炎連鎖球菌血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19Fおよび23Fの精製された多糖類からなる。このワクチンを、凍結乾燥粉末として提供し、液体アジュバントの1つを用いて再構成する。
【０４７７】
11PCV/ASを以下のように産生する。
【０４７８】
活性化および会合条件は、各々の多糖類にとって特異的である。これらのものを以下の表に示す。サイズ分画された多糖類(PS5、6Bおよび23Fについて以外)を、2M NaClまたは注入用の水(WFI)に溶解した。最適な多糖類濃度を、全ての血清型について評価した。血清型18C以外の全ての血清型を、以下に詳述するように担体タンパク質に直接コンジュゲートさせた。
【０４７９】
アセトニトリルまたはアセトニトリル／水(50％／50％)溶液中の100 mg/ml保存溶液から、CDAP(CDAP/PS比0.75 mg/mg PS)を多糖類溶液に添加した。1.5分後、0.2〜0.3 M NaOHを添加して、特定の活性化pHを得た。多糖類の活性化を、25℃で3分間、このpHで実施した。精製されたタンパク質(Dタンパク質またはDT)(その量は最初のPS／担体タンパク質比に依存する)を活性化された多糖類に添加し、会合反応をpH調節下で最大2時間、特定のpHで実施した(血清型に依存)。未反応のシアン酸エステル基をクエンチするために、2 Mグリシン溶液を混合物に添加した。pHをクエンチするpH(pH 9.0)に調整した。溶液を25℃で30分間攪拌した後、連続的にゆっくり攪拌しながら、2〜8℃で一晩攪拌した。
【０４８０】
18Cの調製：18Cを、リンカー(アジピン酸ジヒドラジド(ADH))を介して担体タンパク質に連結した。
【０４８１】
EDACを用いる破傷風トキソイドの誘導体化
破傷風トキソイドの誘導体化のために、精製されたTTを0.2 M NaCl中で25 mg/mlに希釈し、0.2 Mの最終濃度を達成するためにADHスペーサーを添加した。スペーサーの溶解が完了した後、pHを6.2に調整した。次いで、EDAC(1-エチル-3-(3-ジメチル-アミノプロピル)カルボジイミド)を添加して、0.02 Mの最終濃度を達成し、混合物をpH調節下で1時間攪拌した。25℃で少なくとも30分間、pHを9.0に増加させることにより、縮合の反応を停止させた。次いで、誘導体化されたTTを透析濾過(10 kDa CO膜)して、残りのADHおよびEDAC試薬を除去した。
【０４８２】
最後に、会合工程までTTAHバルクを滅菌濾過し、-70℃で保存した。
【０４８３】
PS 18CへのTTAHの化学的会合
コンジュゲーションパラメーターの詳細を、表1に見出すことができる。
【０４８４】
2グラムの微小流体化されたPSを、水中で規定の濃度に希釈し、NaCl粉末の添加により2 M NaClに調整した。
【０４８５】
CDAP溶液(50/50 v/vアセトニトリル/WFI中で新鮮に調製された100 mg/ml)を添加して、好適なCDAP/PS比を達成した。
【０４８６】
0.3 M NaOHの添加により、pHを活性化pH 9.0まで上昇させ、TTAHの添加までこのpHで安定化させた。
【０４８７】
3分後、誘導体化されたTTAH(0.2 M NaCl中の20 mg/ml)を添加して、2のTTAH/PS比を達成した。pHを、会合pH 9.0に調節した。溶液を、pH調節下で1時間静置した。
【０４８８】
クエンチングのため、2 Mグリシン溶液を、混合物PS/TTAH/CDAPに添加した。pHをクエンチングpH(pH 9.0)に調整した。溶液を25℃で30分間攪拌した後、連続的にゆっくり攪拌しながら、2〜8℃で一晩静置した。
【０４８９】
コンジュゲートの精製：0.15 M NaClで平衡化させたSephacryl 500HRゲル濾過カラム(18CについてはS500HR)を用いるゲル濾過により、コンジュゲートを精製して、小分子(DMAPなど)ならびにコンジュゲートされなかったPSおよびタンパク質を除去した。反応成分の異なる分子サイズに基づいて、PS-PD、PS-TTまたはPS-DTコンジュゲートを最初に溶出させた後、遊離のPS、次いで遊離のPDまたは遊離のDTを溶出させ、最後にDMAPおよび他の塩(NaCl、グリシン)を溶出させる。
【０４９０】
コンジュゲートを含む画分を、UV280nmにより検出する。そのKdに従って画分をプールし、滅菌濾過(0.22μm)し、+2〜8℃で保存する。コンジュゲート調製物中のPS/タンパク質比を決定した。
【０４９１】
0005461015.tif 000021
0005461015.tif 000022
【０４９２】
次いで、11種のコンジュゲートを一緒に混合し、最終抗原性調製物を好適なアジュバントと混合した後、免疫した。40匹の4週齢Balb/cマウスの群を、AS01BまたはAS01Eと共に製剤化された11価PSコンジュゲート0.1μgを用いて、0、14および28日目にIMで免疫した。抗PS IgG抗体を、42日目に回収された血清中でのELISAにより投与した。
【０４９３】
図12から認められるように、AS01Bについてより高い応答が認められたPS 14、およびAS01Eについてより高い応答が認められたPS 19Fについて以外は、AS01B製剤と比較して、希釈されたAS01E製剤の間で同等の応答が認められた。
【０４９４】
実施例IX：アジュバント化された、およびアジュバント化されていないサイトメガロウイルス免疫原性組成物の前臨床評価
IX.1：モルモット
IX.1.1 ELISA抗gB
抗gB抗体の定量を、被覆抗原としてgBを用いるELISAにより実施した。抗原を、PBS中で4μg/mlの最終濃度に希釈し、100μlを96穴マイクロタイタープレート中、4℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを、1％ウシ血清アルブミンを含む200μlのPBSを用いて、37℃で1時間飽和させた。血清の2倍連続希釈液を添加し(100μl／ウェル)、37℃で1時間30分インキュベートした。プレートをPBS、0.1％Tween 20で4回洗浄し、100μlの西洋わさびペルオキシダーゼ抗モルモットIgG(Dako, UK)を各ウェルに添加し、37℃で1時間30分インキュベートした。プレートをPBS、0.1％Tween 20で4回洗浄し、水で1回洗浄した。次いで、それらを、0.1 Mクエン酸バッファーpH 4.2中の100μlのo-フェニレンジアミン(Sigma)の溶液と共に、22℃で20分間インキュベートした。100μlの2 N H2SO4で反応を停止させ、490/620 nmで読み取った。SoftMaxProにより、参照サンプルからOD値を内挿することにより、ELISA力価を決定した。力価をEU/mlで表した。
【０４９５】
UNISTATを用いて、投与2後14日目のELISAデータに対して、統計学的分析を実施した。分散の分析に適用したプロトコルを、以下のように簡単に説明することができる：
1)データのLog変換、
2)正規性を検証するための各集団(群)に対するシャピロウィルク検定、
3)異なる集団(群)間の分散の均一性を検証するためのコクラン検定、
4)選択されたデータ(1方向)に関する分散分析、
5)多重比較のためのテューキー-HSD検定。
【０４９６】
IX.1.2-中和アッセイ
アッセイの前に、MRC5細胞(10000細胞／200μl MEM培地)を96穴マイクロプレート中に分配し、CO2と共に37℃で3日間インキュベートした。不活化された血清の2倍希釈(56℃で30分間)を行い、100μlのウイルス溶液(800/ml)と共に37℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後、100μlの血清／ウイルス混合物を、MRC5単層を含む96穴マイクロプレート中に接種した。プレートを2000RPMで35℃で1時間遠心分離した。37℃で一晩インキュベートした後、プレートを、80％アセトン溶液を用いて固定した(-20℃で20分間)。アセトン溶液を廃棄し、CMV陽性細胞を特異的モノクローナル抗極初期抗原を用いて、37℃で1時間検出した。プレートをPBSで3回洗浄し、ビオチン結合した抗マウスIgを各ウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートした。洗浄工程の後、ストレプトアビジン-西洋わさびペルオキシダーゼを37℃でさらに30分間添加した。プレートを4回洗浄し、True-blueの溶液と共に10分間インキュベートした。比色シグナルを、顕微鏡下での試験により記録した。中和力価を、ウイルス対照(CMV+血清を含まない細胞)と比較して、CMV陽性細胞の50％の減少を与える血清の最も高い希釈率の逆数として表した。
【０４９７】
IX.1.3-免疫化プロトコル
4群を免疫した。各群は、4匹の被験体のみを含む対照群(群4)について以外は、5〜8週齢の8匹のメスHartley Crl:(ha)モルモットを含んでいた。被験体を、0および28日目にIMにより免疫した。血清サンプルを、1回目の免疫の28日後および2回目の免疫の14日後に回収した。投与I後28日および投与II後14日目に取得した血清に対して、ELISAを上記のように実施した。投与II後14日目に、上記のように中和アッセイを実施した。群は以下の通りであった。
【０４９８】
0005461015.tif 000023
【０４９９】
抗原を、以下のように調製した：ワクチン抗原を、NおよびC末端に単純ヘルペスウイルス2(HSV2)の糖タンパク質gDに由来するペプチド配列を含むトランケートされたキメラであるgB**として、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞中で発現させる。gB**は、膜固定化配列を含むそのC末端ドメインでトランケートされており、従って培養上清中に分泌される。最初の3群については、500μlのPBS、AS01BまたはAS01E(上記の実施例II.2い記載のように調製)中で作製された15μgのgB**を、筋肉内注入した。群4においては、PBSのみを筋肉内投与した。
【０５００】
IX.1.4-結果
図13に認められるように、gBプレーンと比較して、2種のアジュバント化された群について、有意に高い抗gB ELISA力価が観察された(それぞれ、gBならびにAS01Bおよびgb/AS01Eについて、8および5.5倍高い)。II回目の投与後の抗体力価は、gB/AS01E群と比較して、gB/AS01B群において非常にわずかに高かった(1.5倍)。
【０５０１】
0005461015.tif 000024
【０５０２】
中和力価(図14)に関して、
・非特異的中和抗体が、gBプレーン群において観察された。
【０５０３】
・特異的中和抗体が、両アジュバント化群において検出された。
【０５０４】
・同様のレベルの中和抗体が、両アジュバント化群において観察された。
【０５０５】
IX.2-マウス
IX.2.1-ELISA抗gB
抗gB抗体の定量を、被覆抗原としてgBを用いるELISAにより実施した。抗原を、PBS中で1μg/mlの最終濃度で希釈し、100μlを96穴マイクロタイタープレート中、4℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートを、1％ウシ血清アルブミンを含む200μlのPBSと共に、37℃で1時間飽和させた。血清の2倍連続希釈液(100μl/ウェル)を添加し、37℃で1時間30分インキュベートした。プレートをPBS、0.1％Tween 20で4回洗浄し、100μlのストレプトアビジン-西洋わさびペルオキシダーゼを、37℃でさらに30分間、各ウェルに添加した。プレートをPBS、0.1％Tween 20で4回洗浄し、水で1回洗浄した。次いで、それらを、0.1 Mクエン酸バッファーpH 5.8中の100μlの75％テトラメチルベンジジンと共に、22℃で10分間インキュベートした。100μlの0.4 N H2SO4を用いて、この反応を停止させ、450/620 nmで読み取った。SoftMaxProにより、参照サンプルからOD値を内挿することにより、ELISA力価を決定した。力価をEU/mlで表した。
【０５０６】
UNISTATを用いて、投与2後14日目のELISAデータに対して、統計学的分析を実施した。分散の分析に適用したプロトコルを、以下のように簡単に説明することができる：
1)データのLog変換、
2)正規性を検証するための各集団(群)に対するシャピロウィルク検定、
3)異なる集団(群)間の分散の均一性を検証するためのコクラン検定、
4)選択されたデータ(1方向)に関する分散分析、
5)多重比較のためのテューキー-HSD検定。
【０５０７】
IX.2.2-中和アッセイ
アッセイの前に、MRC5細胞(10000細胞／200μl MEM培地)を96穴マイクロタイタープレート中に分配し、5％CO2と共に37℃で3日間インキュベートした。不活化血清(56℃で30分間)の2倍希釈液(60μl)を、60μlのウイルス溶液(800IPU/ml)と共に、37℃で1時間インキュベートした。インキュベーション後、100μlの血清-ウイルス混合物を、MRC5細胞を含む96穴マイクロプレート中に接種した。プレートを35℃で1時間、2000RPMで遠心分離した。37℃で一晩インキュベートした後、プレートを80％アセトン溶液で固定した(-20℃で20分間)。アセトン溶液を廃棄し、37℃で1時間、特異的モノクローナル抗極初期I(IE-I)抗原を用いて、CMV陽性細胞を検出した。プレートをPBSで3回洗浄し、ビオチン結合抗マウスIgを各ウェルに添加し、37℃で1時間インキュベートした。洗浄工程の後、ストレプトアビジン-西洋わさびペルオキシダーゼを37℃でさらに30分間添加した。プレートを4回洗浄し、Tru-blueの溶液と共に10分間インキュベートした。顕微鏡下での試験により、比色シグナルを記録した。中和力価を、ウイルス対照(CMV+血清を含まない細胞)と比較して、CMV陽性細胞の50％の減少を与える血清の最も高い希釈率の逆数として表した。
【０５０８】
IX.2.3-細胞内サイトカイン染色
T細胞サイトカインの細胞内検出を、2回目の免疫の7日および21日後にPBLに対して実施した。PBLをマウスから回収し、プールした(1群あたり1つのプール)。リンパ球のin vitroでの抗原刺激(107細胞/mlの最終濃度)を、CMV配列をカバーするペプチドのプールまたはgBタンパク質を用いて行った。PBL/抗原混合物を、37℃で2時間インキュベートした。次いで、37℃でBrefelding(1μg/ml)の存在下、細胞を一晩インキュベートして、サイトカイン分泌を阻害した。
【０５０９】
細胞染色を以下のように実施した：細胞懸濁液を洗浄し、2％Fcブロッキング試薬を含む、50μlのPBS、1％FCS中に再懸濁した。4℃で10分間インキュベートした後、抗CD4 PEと抗CD8 perCpの混合物50μlを添加し、4℃で30分間インキュベートした。PBS、1％FCS中での洗浄工程の後、200μlのCytofix=Cytoperm(kit Beckton Dickinson)中に再懸濁することにより細胞膜を透過処理し、4℃で20分間インキュベートした。次いで、細胞をPerm Wash (kit BD)で洗浄し、PermWash中に希釈した50μlの抗IFN-γ APC + 抗IL-2 FITCを用いて再懸濁した。4℃で2時間インキュベートした後、細胞をPBS、1％FCS + 1％パラホルムアルデヒド中に再懸濁した。サンプル分析をFACSにより実施した。生細胞をゲート化し、+/-20000事象に対して獲得を実施した。IFNγ+またはIL2+の割合を、CD4+およびCD8+ゲート化集団に対して算出した。
【０５１０】
IX.2.4-免疫化プロトコル
4群を免疫した。各群は、4〜10週齢の12匹のメスC57Bl/6マウスを含んでいた。
【０５１１】
0005461015.tif 000025
【０５１２】
抗原を以下のように調製した：ワクチン抗原を、NおよびC末端に単純ヘルペスウイルス2(HSV2)の糖タンパク質gDに由来するペプチド配列を含むトランケートされたキメラであるgB**として、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞中で発現させる。gB**は、膜固定化配列を含むそのC末端ドメインでトランケートされており、従って培養上清中に分泌される。
【０５１３】
各群について、1.5μg／用量の濃度のgB**を、625μlのPBSまたはアジュバントAS01BもしくはAS01E(上記の実施例II.2に記載のように調製、それぞれ、1 mlあたり100μlの免疫刺激剤もしくは1 mlあたり50μlの免疫刺激剤を有する)中で作製した。50μl(すなわち、0.5 mlのヒト用量の1/10)を筋肉内注入した。マウスの1対照群に、塩水を注入した。注入を、0および28日目に実施した。ELISAおよび中和アッセイのために、血清サンプルを2回目の注入の14日後に回収した。ICSのために、PBLを2回目の注入の7および21日後に回収した。
【０５１４】
IX.2.5-結果
抗gB ELISA力価(図15)
アジュバント化されていない群において、非常に弱い検出不可能なレベルの抗gB抗体が観察された。しかしながら、両アジュバント群、それぞれAS01BおよびAS01Eにおいては、高い抗体応答(65および66倍高い)が観察された。AS01B群とAS01E群の間には統計学的有意差はなかった。
【０５１５】
0005461015.tif 000026
【０５１６】
抗CMV中和力価(図16)
gBプレーン群と比較して、2種のアジュバント化された群について、有意に高い抗gB中和力価が観察された。AS01B製剤とAS01E製剤の間には、中和抗体力価における有意差は観察されなかった。
【０５１７】
細胞性免疫
投与II後7日目のサンプルの再刺激後に観察された応答のレベルが非常に低かったため、群間で識別を行うことができず、CD4およびCD8刺激については、決定的な応答が認められなかった(図17)。これらの検出不可能なほど低い応答はおそらく、サンプル調製の間の技術的な問題に起因するものであった。しかしながら、2回目の注入の21日後には、応答が認められた。CD4のデータ(図18)は、gB(5μg/ml)またはペプチド(2μg/mlもしくは4μg/ml)による再刺激後に差異がないことを示している。同様のサイトカインプロフィールが、AS01EおよびAS01Bについて認められる。CD8刺激については、決定的な応答が認められない(図19)。
【０５１８】
これらの実験は、別の抗原性組成物について、および2種の異なる生物において、より低いレベルの免疫刺激剤を有するアジュバントが、より高いレベルを有するものよりも免疫学的に有効であることを示している。
【０５１９】
実施例X：アジュバント化RTS,Sワクチンの前臨床評価
X.1-製剤
抗原性組成物、RTS,Sは、サッカロミセス・セレビジア(Saccharomyces cerevisiae)中で産生され、2種のタンパク質RTSおよびSからなり、それぞれ平均で100個のポリペプチドを含むと見積もられる混合ポリマー粒子構造に細胞内的かつ同時的に集合する。RTSは、B型肝炎ウイルスSタンパク質のアミノ末端に融合された、マラリア寄生虫P. falciparum株NF53(CSP抗原、アミノ酸207〜395)のスポロゾイト表面抗原に由来する189アミノ酸からなる424アミノ酸の51 kDaハイブリッドポリペプチド鎖である。Sは、B型肝炎ウイルスの表面抗原に対応する24 kDaポリペプチド(226アミノ酸長)である。凍結乾燥抗原ペレットは、約50μg(AS01Bと共に0.5 ml中で製剤化されるように設計された場合)または25μg(AS01Eと共に0.5 ml中で製剤化されるように設計された場合)の抗原を含む。
【０５２０】
AS01BおよびAS01Eを、タンク中で様々な成分(PBS、リポソーム、MPLおよびQS21)を混合し、無菌条件下で攪拌することにより調製した。次いで、生成物を滅菌濾過した後、バイアルまたはシリンジ中に充填した。液体アジュバントを+2℃〜+8℃で保存した後、凍結乾燥した抗原ペレットを再構成するのに用いた。
【０５２１】
X.2-マウス実験
AS01Eと共に製剤化されたRTS,Sと比較して、RTS,S/AS01Bにより誘導されたRTS,Sに特異的な免疫応答を比較することを目的として、マウスにおいて2つの実験を実施した。各実験において、C57Bl/6マウス(10匹のマウス／群)を、AS01BまたはAS01Eアジュバントと共に製剤化されたRTS,Sの10、5または2.5μgを用いて、2週間間隔で3回、筋肉内的に免疫した。対照として、2群をAS01BまたはAS01Eのみで免疫した。HBおよびCSに特異的な抗体応答を、3回目の免疫の15日後にELISAにより各マウスについて評価した。幾何平均抗体力価およびその95％信頼区間を、両実験において同じ処理を受ける全てのマウスについて算出した。アジュバント効果および抗原用量効果を評価するための統計学的分析を、両実験からプールされたデータに対して実施した。CD4およびCD8特異的T細胞応答を、1群あたり5匹のマウスに由来する血液細胞のプールに対して、2回目および3回目の免疫の7日後に、フローサイトメトリーにより測定した。かくして、各実験における各群について、2個の値が生成された。
【０５２２】
体液性免疫応答
図20および21に示されるように、AS01BおよびAS01Eアジュバントは両方とも、CSPおよびHBに対する強力で同等の抗体応答を誘導する。抗CSP GMTに対する3方向ANOVAにより、5または2.5μg用量のRTS,Sについて、AS01BとAS01Eの間には有意差がないことが示された。10μg用量については、AS01Bアジュバントは、AS01Eよりも高い抗CS力価を誘導することが見出され、GMT比「AS01B群／AS01E群」は1.93(95％CI：1.33〜2.79；p=0.001)であった。
【０５２３】
細胞媒介性特異的免疫応答
図22および23は、IL-2および／またはIFNγを発現するCSPおよびHBに特異的なCD4およびCD8 T細胞のレベルを示す。
【０５２４】
CSPに特異的なCD4応答は、3回の免疫後に、AS01Eと比較してAS01Bを用いる方がより高い傾向にあるが、AS01Eを用いる場合のCD8 T細胞応答はAS01Bと同等以上である。
【０５２５】
HBに特異的なCD4応答は、CD4 T細胞のレベルが2種のアジュバント間で比較可能である、より低用量のRTS,Sについて以外は、3回の免疫後にAS01Eと比較して、AS01Bを用いる方がより高い傾向にある。AS01Eと共に製剤化されたRTS,Sにより誘導されたHB特異的CD8 T細胞応答は、AS01Bと共に製剤化されたRTS,Sにより誘導された応答と同等以上である。
【０５２６】
これらの差異は、細胞性免疫アッセイの予想される変動の範囲内にあると考えられる。
【０５２７】
マウスにおけるRTS,S/AS01Eの前臨床評価は、RTS,S/AS01Bのものと類似する、許容可能な安全性プロフィールを示した。
【０５２８】
実施例XI：RTS,S/AS01Eの臨床評価
製剤を、上記の実施例Xに記載のように調製する。凍結乾燥抗原ペレット中の賦形剤として、スクロースを用いる。実施例Xに記載のように、液体アジュバントを用いて、凍結乾燥抗原を再構成する。AS01Eを実施例II.2に記載のように調製し、再構成に必要となるまで、+2〜+8℃で保存する。
【０５２９】
AS01Eでアジュバント化されたRTS,Sの安全性および免疫原性の第II相無作為化二重盲検が、ガボンで生活する18ヶ月〜4歳の子供において現在進行中である。ワクチン接種スケジュールは、0、1、2ヶ月のワクチン接種スケジュールである。目的は、マラリア流行地域で生活する18ヶ月〜4歳の子供に、0、1、2ヶ月のスケジュールで3回用量を筋肉内投与する場合、RTS,S/AS01Eについて以下の通りである：
一次
・3回目の投与後1ヶ月までの安全性を評価すること、
・3回目の投与後1ヶ月での抗CS抗体応答に関して、水中油乳濁液アジュバント化RTS,Sワクチンに対して劣らないことを証明すること、
二次
・3回目の投与後1ヶ月までの反応性を評価すること、
・3回目の投与後1ヶ月での抗HB抗体応答に関して、水中油乳濁液アジュバント化RTS,Sワクチンに対して劣らないことを証明すること、
・3回目の投与後最長1ヶ月のB型肝炎に対する血清防御を説明すること、
・3回目の投与後最長1ヶ月の抗CS応答を説明すること、
三次
・3回目の投与後1ヶ月から3回目の投与後12ヶ月までの安全性、
・3回目の投与後12ヶ月でのCS抗原に対する体液性免疫応答、
・3回目の投与後12ヶ月でのHB抗原に対する体液性免疫応答、
予備
・3回目の投与後最長12ヶ月までのCS抗原に対するT細胞性免疫応答を評価すること、
・3回目の投与後最長12ヶ月までのCS抗原に対するB細胞記憶免疫応答を評価すること、
・スクリーニングの際に実証されたHBV免疫化状態に従って、3回目の投与後最長1ヶ月までの抗CS応答を説明すること。
【０５３０】
180人の被験者を登録し、90人には以前に検証された独占の水中油乳濁液アジュバント(以下の表中で「対照」と呼ぶ)でアジュバント化されたワクチンを与え、90人にはAS01Eでアジュバント化されたワクチンを与えた。18ヶ月から4歳の健常な男児および女児をスクリーニングした。左三角筋に対してIM経路によりワクチンを投与した。
【０５３１】
0005461015.tif 000027
【０５３２】
これらのデータは、AS01Eアジュバント化RTS,Sワクチンが、対照製剤と比較した場合、小児集団において許容し得る反応性結果を与えたことを示している。
【０５３３】
HBおよびCSP反復(抗R32LR)に対する抗体応答を評価することにより、血清学的応答を測定した。抗体決定のための血清を、スクリーニング時、60日目および90日目(2回目のワクチン接種および3回目のワクチン接種)に回収した。CSに対する抗体レベルを、実験室からSOPに従う対照としての標準的な参照抗体と共にR32LR抗原を吸着させたプレートを用いる標準的ELISA法により測定した。結果をEU/mlで報告する。
【０５３４】
B型肝炎表面抗原に対する抗体を、アッセイの説明書に従って、市販のELISA免疫アッセイ(Abbott社製AUSAB EIA試験キット)または等価物を用いて測定した。
【０５３５】
0005461015.tif 000028
0005461015.tif 000029
【０５３６】
これらのデータは、AS01Eでアジュバント化されたRTS,Sワクチン製剤が、検証された対照と比較した場合、小児集団において許容し得る体液性免疫応答を与えたことを示している。
【０５３７】
実施例XII：AS01Eと比較したAS01Bを含む水痘-帯状疱疹ウイルスの前臨床評価
候補ワクチンは、CHO細胞中で産生された、トランケートされたVZVエンベロープタンパク質であるgEから構成される。
【０５３８】
この試験のために、C57BL/6マウス(n=48)を、皮下投与されたVarilrix(約4 log pfu/用量)の1回ヒト用量(HD)を用いて初回免疫した。Varilrixを用いて初回免疫した5週間後、マウスを12匹のマウスの5群に分割し、5μgのgEのみ、5μgのgE + AS01E*(1/10 HD)または5μgのgE + AS01B (1/10 HD)を用いて0および28日目に筋肉内注入(脛骨)した。対照群のマウス(初回免疫のみ)には、塩水(0.9％NaCl)を注入した。免疫応答を、2回目のワクチン接種の14および／または30日後に評価した。gE特異的総抗体のレベルならびにサイトカインを産生する(IL2/IFNγ)CD4およびCD8 T細胞の頻度を評価した。
【０５３９】
gE特異的抗体応答：
被覆抗原としてgEタンパク質を用いて、マウス血清中のgE特異的抗体を検出および定量するために、ELISAを開発した。ELISA力価を、最大吸光値の50％に等しい吸光度(光密度)測定値をもたらす血清希釈率の逆数と定義した。ELISA力価を、回帰分析により算出した。
【０５４０】
そのデータは、gE AS01EおよびgE AS01Bが、同様のレベルのgE特異的抗体を誘導したことを示している(p値＞0.05)。両製剤は、II後14日目および30日目の両方で、gE抗原のみと比較して有意により高い応答を誘導した(10〜13倍、p値＜0.05)(図26)。
【０５４１】
0005461015.tif 000030
【０５４２】
gE特異的CD4およびCD8応答：
サイトカイン産生を、細胞内サイトカイン染色技術を用いて、CD4およびCD8 T細胞中で評価した。脾臓細胞を、II後30日目に12匹のマウスの各群から単離し、3個の脾臓の4群中にプールした。脾臓細胞(1 x 106個)を、完全なgEタンパク質(20アミノ酸のペプチド／10アミノ酸の重複)に及ぶgEペプチド(63個のペプチド)の存在下で2時間インキュベートした後、ブレフェルジンの存在下で一晩インキュベートした。続いて、細胞を、細胞表面のCD4/CD8および透過処理後、細胞内サイトカインIL-2およびIFNγに特異的な蛍光mAbを用いて染色した。
【０５４３】
図26に示されるように、gE AS01BおよびgE AS01E製剤の両方について、類似するサイトカインプロフィール(IL2/IFNγ)が誘導されたが、AS01B製剤は、より高いレベルでCD4およびCD8サイトカインの両方を産生する細胞を誘導した(CD4については、2倍、p＞0.05、CD8については、3.6倍、p＞0.05)。T細胞応答の予想外に高い生存能力に起因して、アジュバント用量間で有意差を検出する力は、非常に限られていた(＜50％)。重要なことには、AS01BまたはAS01Eと共に製剤化されたgEは両方とも、gEのみと比較して、有意により高い規模(13.3倍、p＜0.05)のサイトカインを産生するCD4 T細胞を誘導した。gE抗原のみと比較して、AS01BまたはAS01E(3.8倍、p＞0.05)と共に製剤化されたgEによって、より高いレベルのCD8細胞も誘導された。
【０５４４】
実施例XIII：インフルエンザフェレットモデルにおけるAS01B対AS01Eの前臨床評価
材料および方法
4〜6ヶ月齢のメスのフェレット(Mustela putorius furo)を、MISAY Consultancy (Hampshire, UK)から取得した。フェレットを、0日目に、異種サブタイプ株H1N1 A/ストックホルム/24/90(4LogTCID50/ml)250μlを鼻内投与することにより初回免疫した。21日目に、フェレットに、H1N1 A/ニューカレドニアC/20/99(15μg/ml)、H3N2 A/ワイオミング/3/2003(15μg/ml)およびB/江蘇省/10/2003(17.5μg/ml)の組合せの完全なヒト用量(1000μlワクチン用量、15μg HA／A株、17.5μg B株)を筋肉内注入した。次いで、250μlの異種サブタイプ株Wh.A/NY/55/04 (4.51 Log TCID50/ml)を用いる鼻内経路により、42日目にフェレットをチャレンジした。21日目のワクチン接種は、プレーン三価製剤(以下の表中の「プレーン」)またはAS01Bでアジュバント化された三価製剤(以下の表中の「AS01B」)もしくはAS01Eでアジュバント化された三価製剤(以下の表中の「AS01E」)を用いるものであった。製剤を、上記の実施例3に記載のように調製した。
【０５４５】
体温のモニタリング：
チャレンジ期間中の個体の温度をモニターし、チャレンジの前後に15分毎に各々の個体の動物温度を記録するテレメトリ埋め込み物を用いて評価した。全ての埋め込み物を調べ、改修し、腹腔中に置く前にDSIにより新しい補正を実施した。これらの測定の間に、全ての動物を1個のケージ中で個別に飼育した。温度を、初回免疫の6日前から初回免疫の4日後まで、ならびにチャレンジの3日前からチャレンジの7日後まで、15分毎に記録した。
【０５４６】
血球凝集抑制試験(HI)
試験手順
3種のインフルエンザウイルス株に対する抗ヘマグルチニン抗体力価を、血球凝集抑制試験(HI)を用いて決定した。HI試験の原理は、特異的抗インフルエンザ抗体が、インフルエンザウイルスヘマグルチニン(HA)によるニワトリ赤血球(RBC)の血球凝集を阻害する能力に基づいている。最初に、血清を25％ノイラミニダーゼ溶液(RDE)で処理し、熱不活化して非特異的抑制物質を除去した。予備処理後、血清の2倍希釈液を、4血球凝集単位の各インフルエンザ株と共にインキュベートした。次いで、ニワトリ赤血球細胞を添加し、血球凝集の抑制を、読み取りのために涙を用いてスコア化した。力価を、血球凝集を完全に阻害した血清の最も高い希釈率の逆数として表した。血清の最初の希釈率は1:10であったので、検出不可能なレベルを、5に等しい力価としてスコア化した。
【０５４７】
統計学的分析
UNISTATを用いて、HI力価に対して統計学的分析を実施した。分散の分析に適用されたプロトコルを、以下に記載のように簡単に説明することができる：
・データのLog変換、
・群分布の正規性を検証するための各集団(群)に対するシャピロ・ウィルク(Shapiro-Wilk)検定、
・異なる集団(群)間の分散の均一性を検証するためのコクラン(Cochran)検定
・群に対して実施される分散の1方向分析
・多重比較のためのテューキー(Tukey)-HSD検定。
【０５４８】
鼻洗浄液中のウイルス滴定
最初に、全ての鼻サンプルをSpin Xフィルター(Costar)を通して滅菌濾過して、細菌夾雑物を除去した。鼻洗浄液の50μlの連続10倍希釈液を、50μlの培地を含むマイクロタイタープレート(10ウェル／希釈液)に移した。次いで、100μlのMDCK細胞(2.4 x 105細胞/ml)を各ウェルに添加し、35℃で6〜7日間インキュベートした。6〜7日間のインキュベーション後、培養培地を穏やかに除去し、100μlの1/20 WST-1を含有する培地を添加し、さらに18時間インキュベートした。生細胞によりWST-1の低下の際に産生された黄色ホルマザン染料の強度は、ウイルス滴定アッセイの終わりにウェル中に存在する生細胞数に比例し、これを、好適な波長(450ナノメートル)で各ウェルの吸光度を測定することにより定量する。カットオフを、未感染の対照細胞のOD平均-0.3 OD(0.3 ODは未感染の対照細胞のODの+/-3 StDevに一致する)と定義する。ODがカットオフより小さい場合、正のスコアとして定義し、対照的に、ODがカットオフより大きい場合、負のスコアとして定義する。ウイルス出芽力価を、「ReedおよびMuench」により決定し、Log TCID50/mlとして表した。
【０５４９】
リンパ球増殖アッセイ
PBMCを、Ficoll Cedarlaneリンパ球哺乳動物溶液上での密度勾配遠心分離(2500 rpmかつ4℃で20分間)により回収した。PBMCを、5 mlの培養培地(RPMI/4℃で添加)および10％の正常なフェレットの血清中に再懸濁した。添加物は、100 mMピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸MEM、ペニシリン／ストレプトマイシン、グルタミンおよび1000倍濃縮されたβ2-メルカプトエタノールにより構成されていた。新鮮に単離されたPBMCを、in vitro増殖アッセイにすぐに用いた。細胞を、2 x 105細胞／ウェルで96穴平底組織培養プレート中に入れ、異なる濃度の抗原(全体不活化ウイルスの0.1〜1μgのHA)と共に44〜96時間培養した後、0.5μCiの[3H]チミジンでパルス標識した。放射性標識の取込みを、β発光分光法により4〜16時間後に見積もった。
【０５５０】
結果
チャレンジ後の鼻洗浄液中のウイルス量
初回免疫の2日前(初回免疫＝0日目)、初回免疫の1、2および7日後、ならびにチャレンジの4日前(チャレンジ＝42日目)およびチャレンジ後の7日間に、鼻洗浄液を回収した。
【０５５１】
0005461015.tif 000031
【０５５２】
図27中の結果を参照されたい。
【０５５３】
初回免疫後のウイルス出芽
初回免疫の2日後に、全てのフェレットにおいて、ウイルス出芽のピークが観察された。初回免疫の7日後に、全ての群において、残留ウイルス量のみが観察された。
【０５５４】
チャレンジ後のウイルス出芽
チャレンジの24時間後に、ウイルス出芽のピークが観察された。チャレンジの3日後のウイルス滴定により、三価スプリットプレーンで免疫されたフェレットにおいて、高いウイルス力価(防御なし)が示された。AS01Bでアジュバント化された三価スプリットを用いた場合に認められたものよりも、三価スプリットAS01Eを用いて免疫されたフェレットにおいて、ウイルス出芽の減少がより小さいことが観察された。
【０５５５】
温度モニタリング：
初回免疫の6日前(初回免疫＝0日目)から初回免疫の4日後まで、ならびにチャレンジの3日前からチャレンジの7日後まで(チャレンジ＝42日目)、体温をモニターした。測定値を15分毎に取得し、各群について中間日により平均を算出した。結果を図28に見出すことができる。
【０５５６】
初回免疫後
初回免疫の前、間および後にモニターされた体温は、全ての群において温度上昇を示していた。
【０５５７】
チャレンジ後
体温モニタリングの解釈は難しい。三価スプリットプレーンおよび三価スプリットAS01Eを用いて免疫されたフェレットにおいては、チャレンジ後に体温のわずかな上昇が観察されたが、三価スプリットAS01Bを用いた場合には観察されなかった。0.4℃を超えて体温が上昇したフェレットの数により、以下のスコアを取得した。
【０５５８】
チャレンジ後の温度上昇                  
三価プレーン:         5/8 (+0.4、+0.4、+0.5、+0.7、+0.8)
三価AS01B             0/8
三価AS01E             6/8(+0.4、+0.4、+0.5、+0.5、+0.9、+1.6)
この読み取り値は、フェレットにおいて用いられた他の読み取り値よりも弱い。
【０５５９】
血球凝集抑制試験(HI)
初回免疫の4日前、初回免疫の17日後、免疫の21日後、およびチャレンジの13日後に、血清サンプルを回収した。結果を図29および30に見出すことができる。3種全部のワクチン株について、三価スプリットプレーンと比較して、AS01BまたはAS01Eでアジュバント化された三価スプリットで免疫したフェレットにおいて、統計学的に有意により高いHI力価が観察された。2種のアジュバント化群間では差異は観察されなかった。他の群と比較して、AS01Bでアジュバント化された三価スプリットワクチンを用いてフェレットを免疫した後に、統計学的に有意により高い、A/ニューヨークH3N2(チャレンジ株)に対する交叉反応性HI力価が観察された。
【図面の簡単な説明】
【０５６０】
【図１】MPL調製を図示したものである。
【図２−１】実験的製剤を用いるフェレットの免疫後のインフルエンザの種々の株に対する体液性応答を示す。異種初回免疫(H1N1 A/ストックホルム/24/90)の前後、免疫後(H1N1 A/ニューカレドニア/20/99、H3N2 A/パナマ/2007/99およびB／山東省/7/97)。
【図２−２】実験的製剤を用いるフェレットの免疫後のインフルエンザの種々の株に対する体液性応答を示す。異種チャレンジ後(H3N2 A/ワイオミング/3/2003)の血球凝集抑制試験(GMT +/- IC95)。
【図３】フェレット試験：チャレンジ(42日目)後の鼻洗浄液中でのウイルス滴定。
【図４】マウス試験：実験的製剤を用いるマウスの免疫後のインフルエンザの3種のワクチン株に対する体液性応答：免疫の21日後(H1N1 A/ニューカレドニア/20/99、H3N2 A/ワイオミング/3/2003およびB/江蘇省/10/2003)の血球凝集抑制試験(GMT +/- IC95)。
【図５】マウス試験：細胞性免疫応答：免疫後7日目のFlu特異的CD4+ T細胞応答。
【図６】マウス試験：CD4に関するCMI-プールされた株(全て二重)-0日目および21日目。
【図７】HI抗体についての0日目および21日目のGMT。
【図８】2つの異なる濃度の免疫刺激剤を有するアジュバントと比較した、アジュバント化インフルエンザウイルス製剤で免疫した後の7日間の追跡期間の間に報告された、ヒトにおける局所および全身症候の発生率(合計および関連する3等級)。
【図９】2つの異なる濃度の免疫刺激剤を有するアジュバントと比較した、アジュバント化HPV製剤で免疫した後のマウスにおける、HPV 16および18 L1に対する体液性応答。
【図１０】マウスにおける細胞性免疫応答：細胞内サイトカイン染色-2つの異なる濃度の免疫刺激剤を有するアジュバントと比較した、アジュバント化HPV製剤を用いて免疫した後のVLP16および18 CD4+ T細胞。
【図１１】2つの異なる濃度の免疫刺激剤を有するアジュバントと比較した、アジュバント化HPV製剤を用いて免疫した後の特異的B記憶細胞の産生。
【図１２】2つの異なる濃度の免疫刺激剤を有するアジュバントと比較した、マウスにおけるアジュバント化肺炎連鎖球菌ワクチンの前臨床比較。
【図１３】2つの異なる濃度の免疫刺激剤を有するアジュバントと比較した、アジュバント化Gbワクチンを用いて免疫した後のモルモット抗gB ELISA力価。
【図１４】2つの異なる濃度の免疫刺激剤を有するアジュバントと比較した、アジュバント化Gbワクチンを用いて免疫した後のモルモット抗CMV中和力価。
【図１５】アジュバントgBワクチンで免疫した後のマウス抗gB ELISA力価。
【図１６】アジュバント化gBワクチンで免疫した後のマウス抗CMV中和力価。
【図１７】マウス試験：細胞性免疫-gBペプチドのプールを用いて再刺激した後のCMV特異的CD4+およびCD8+細胞(2回目の免疫の7日後)。
【図１８】マウス試験：細胞性免疫-2つの異なる用量のgBペプチドのプールで再刺激した後のCMV特異的CD4+細胞(2回目の免疫の21日後)。
【図１９】マウス試験：細胞性免疫-2つの異なる用量のgBペプチドのプールで再刺激した後のCMV特異的CD8+細胞(2回目の免疫の21日後)。
【図２０】2種の異なる濃度の免疫刺激剤を有するアジュバントと比較した、マウスにおけるアジュバント化RTS,Sワクチンで免疫した後のスポロゾイト周囲タンパク質CSPに対する幾何平均抗体力価(GMT)。
【図２１】2種の異なる濃度の免疫刺激剤を有するアジュバントと比較した、マウスにおけるアジュバント化RTS,Sワクチンで免疫した後のB型肝炎表面抗原(HB)に対する幾何平均抗体力価(GMT)。
【図２２】2種の異なる濃度の免疫刺激剤を有するアジュバントと比較した、アジュバント化RTS,S免疫原性組成物で免疫した後のCSP特異的CD4およびCD8 T細胞によるIL-2および／またはIFNγのex vivoでの発現。
【図２３】2種の異なる濃度の免疫刺激剤を有するアジュバントと比較した、アジュバント化RTS,S免疫原性組成物で免疫した後のHB特異的CD4およびCD8 T細胞によるIL-2および／またはIFNγのex vivoでの発現。
【図２４】2種の異なる濃度の免疫刺激剤を有するアジュバントと比較した、アジュバント化三価スプリットインフルエンザワクチン(A/ニューカレドニア、A/ワイオミング、B/江蘇省)で免疫した後のマウスにおける体液性応答。
【図２５】2種の異なる濃度の免疫刺激剤を有するアジュバントと比較した、アジュバント化三価スプリットインフルエンザワクチン(A/ニューカレドニア、A/ワイオミング、B/江蘇省)で免疫した後のマウスにおける細胞性免疫応答。
【図２６】AS01BまたはAS01Eを用いるVZV gEワクチンアジュバントと比較した、マウスにおける前臨床結果。
【図２７】フェレットにおける、インフルエンザウイルス抗原を用いる初回免疫およびチャレンジ後のウイルス鼻洗浄力価-プレーンまたは2種の異なる濃度の免疫刺激剤を含むアジュバント組成物でアジュバント化されたA/ニューカレドニア、A/ワイオミング、B/江蘇省で免疫した。
【図２８】インフルエンザ抗原を用いる初回免疫およびチャレンジ後のフェレットにおける体温モニタリング。プレーンまたは2種の異なる濃度の免疫刺激剤を含むアジュバント組成物でアジュバント化されたA/ニューカレドニア、A/ワイオミング、B/江蘇省で免疫した。
【図２９】インフルエンザ抗原性調製物で免疫およびチャレンジした後の三価ワクチン製剤におけるA株に関する抗HI力価。プレーンまたは2種の異なる濃度の免疫刺激剤を含むアジュバント組成物でアジュバント化されたA/ニューカレドニア、A/ワイオミング、B/江蘇省で免疫した。
【図３０】インフルエンザ抗原性調製物で免疫およびチャレンジした後のB/江蘇省およびチャレンジに用いたドリフト株に関する抗HI力価。プレーンまたは2種の異なる濃度の免疫刺激剤を含むアジュバント組成物でアジュバント化されたA/ニューカレドニア、A/ワイオミング、B/江蘇省で免疫した。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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