(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＭＧＢ１タンパク質との解離定数が５×１０−７以下であり、下記（Ｂ１）の核酸分子である、ＨＭＧＢ１タンパク質に結合可能なＨＭＧＢ１結合核酸分子。
（Ｂ１）配列番号５６（#06）、配列番号４６（#08）、配列番号６５（#47）、配列番号６７（#80）および配列番号７４（R8c6_1）のいずれかで表わされる塩基配列からなる核酸分子
【請求項２】
前記核酸分子が、修飾化ヌクレオチド残基を含む、請求項１記載のＨＭＧＢ１結合核酸分子。
【請求項３】
前記修飾化ヌクレオチド残基が、メチル化ヌクレオチド残基、フルオロ化ヌクレオチド残基、アミノ化ヌクレオチド残基およびチオ化ヌクレオチド残基からなる群から選択された少なくとも一つである、請求項２記載のＨＭＧＢ１結合核酸分子。
【請求項４】
前記修飾化ヌクレオチド残基が、シトシンを有するヌクレオチド残基およびウラシルを有するヌクレオチド残基の少なくとも一方である、請求項２または３記載のＨＭＧＢ１結合核酸分子。
【請求項５】
前記修飾化ヌクレオチド残基が、リボース残基が修飾されたヌクレオチド残基である、請求項２から４のいずれか一項に記載のＨＭＧＢ１結合核酸分子。
【請求項６】
前記核酸分子が、ステムループ構造を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載のＨＭＧＢ１結合核酸分子。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一項に記載のＨＭＧＢ１結合核酸分子を含む、組成物。
【請求項８】
さらに、キャリアーを含む、請求項７記載の組成物。
【請求項９】
請求項１から６のいずれか一項に記載のＨＭＧＢ１結合核酸分子を含む、ＨＭＧＢ１タンパク質を検出するためのＨＭＧＢ１検出試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＨＭＧＢ１タンパク質に結合する核酸分子およびその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｈｉｇｈ−ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ  ｂｏｘ  １  ｐｒｏｔｅｉｎ、すなわち、ＨＭＧＢ１タンパク質（以下、「ＨＭＧＢ１」という）は、生存に必須なタンパク質であり（非特許文献１）、細胞核内では、転写開始に必要なクロマチン構造を形成するタンパク質として機能する（非特許文献２）。ＨＭＧＢ１は、細胞外に漏出、分泌されると、炎症反応、細胞の形態変化および細胞の移動を促進するサイトカインとして機能する（非特許文献３）。近年、細胞外におけるＨＭＧＢ１の機能解析が進み、自己免疫疾患、敗血症、外傷性ショック、虚血および虚血再灌流障害が起こる際、炎症反応を悪化させたり、細胞死を誘導することが明らかとなった。このことから、ＨＭＧＢ１が、これら疾患の治療の標的物質および診断マーカーとなることが示されている（非特許文献４）。また、癌に関しても、乳癌、大腸癌、メラノーマ、前立腺癌、膵臓癌および肺癌等の増殖および転移浸潤に関与し、正常組織と比較して、ＨＭＧＢ１発現量が増加することが報告されている（非特許文献５）。このような背景から、ＨＭＧＢ１に結合可能な物質を作製し、その作用を中和することで、前記疾患を予防および治療することが望まれている。しかし、現在までに有効性が示されているものは、単クローン抗ＨＭＧＢ１抗体を利用した診断法および実験動物での脳梗塞モデル治療のみである（特許文献１、２、非特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第３８７６３２５号公報
【特許文献２】特開２００８−５２０５５２号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｃａｌｏｇｅｒｏ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．（１９９９）２２，２７６−２８０．
【非特許文献２】Ｂｕｓｔｉｎ，Ｍ．  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  （１９９９）１９，５２３７−５２４６．
【非特許文献３】Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．  （２００２）７２，１０８４−１０９１．
【非特許文献４】Ｋｌｕｎｅ，Ｊ．Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．  （２００８）１４，４７６−４８４．
【非特許文献５】Ｅｌｌｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  （２００７）  １３、２８３６−２８４８．
【非特許文献６】Ｌｉｕ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  （２００７）２１，３９０４−１６．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、例えば、ＨＭＧＢ１が関係して引き起こされる疾患の発症機構の解明、前記疾患の診断および治療に利用可能な物質として、ＨＭＧＢ１に結合可能な核酸分子、ならびにその用途を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで、本発明者らは、市販の精製ＨＭＧＢ１を標的物質として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ法によりＲＮＡを作製した。本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、ＨＭＧＢ１タンパク質（以下、ＨＭＧＢ１という）との解離定数が５×１０−７以下であることを特徴とする、ＨＭＧＢ１に結合可能な結合核酸分子である。【０００７】
本発明の組成物は、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子を含むことを特徴とする組成物である。【０００８】
本発明の検出試薬は、前記本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子を含むことを特徴とする、前記ＨＭＧＢ１を検出するためのＨＭＧＢ１検出試薬である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、ＨＭＧＢ１に結合可能である。このため、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子によれば、例えば、ＨＭＧＢ１と結合してその機能を阻害することより、ＨＭＧＢ１が原因となる前述のような疾患の予防および治療が可能となる。また、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子によれば、例えば、ＨＭＧＢ１との結合の有無を確認することで、ＨＭＧＢ１を検出でき、疾患の早期診断が可能となる。また、例えば、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子を培養細胞内で発現させることで、遺伝子転写の阻害実験が可能となる、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子を使用して、細胞外のＨＭＧＢ１とその受容体との結合阻害実験が可能となる等、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、ＨＭＧＢ１の機能解明にも使用できる。このため、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、新たな研究用ツールとしても有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明の実施例１において、Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。
【図２】図２は、本発明の実施例１において、ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。
【図３】図３は、本発明の実施例１において、Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＭＩＦタンパク質に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明の実施例１において、生理条件下におけるＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。
【図５】図５は、本発明の実施例２において、Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。
【図６】図６は、本発明の実施例３において、Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。
【図７】図７は、本発明の実施例４において、Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。
【図８】図８は、本発明の実施例５において、Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。
【図９】図９は、本発明の実施例６において、ＨＭＧＢ１とＴＬＲ−２との結合を示すプルダウンアッセイの写真である。
【図１０】図１０は、本発明の実施例７において、Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。
【図１１】図１１は、本発明におけるＲＮＡアプタマーＲ８ｃ６＿１およびＲ８ｃ６＿１８の推定二次構造を示す図である。
【図１２】図１２は、本発明の実施例９において、Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。
【図１３】図１３は、本発明の実施例９において、Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。
【図１４】図１４は、本発明の実施例１０において、Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。
【図１５】図１５は、本発明の実施例１１において、Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。
【図１６】図１６は、本発明の実施例１２において、Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。
【図１７】図１７は、本発明の実施例１２において、Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。
【図１８】図１８は、本発明におけるＲＮＡアプタマーＲ８ｃ６＿１の推定二次構造を示す図である。
【図１９】図１９は、本発明におけるＲＮＡアプタマーＲ８ｃ６＿１−１８の推定二次構造を示す図である。
【図２０】図２０は、本発明におけるＲＮＡアプタマーＲ８ｃ６＿１−２５−Ｓ６の推定二次構造を示す図である。
【図２１】図２１は、本発明の実施例１３において、ＨＭＧＢ１とＲＮＡアプタマーとの相互作用を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
＜ＨＭＧＢ１結合核酸分子＞
本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、前述のように、ＨＭＧＢ１との解離定数が５×１０−７以下であることを特徴とする、ＨＭＧＢ１に結合可能な核酸分子である。本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、ＨＭＧＢ１アプタマーともいう。
【００１２】
本発明において、「ＨＭＧＢ１に結合可能」とは、例えば、ＨＭＧＢ１に対する結合能を有している、または、ＨＭＧＢ１に対する結合活性（ＨＭＧＢ１結合活性）を有しているともいう。本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、ＨＭＧＢ１に特異的に結合する。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子とＨＭＧＢ１との結合は、例えば、表面プラズモン共鳴分子相互作用解析等により決定できる。前記解析は、例えば、ビアコアＸ（商品名、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＫ  Ｌｔｄ．）が使用できる。
【００１３】
本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、ＨＭＧＢ１との解離定数が５×１０−７以下であればよく、その他の構成は、制限されない。前記ＨＭＧＢ１に対する解離定数は、特に制限されないが、その上限が、例えば、１０−８オーダーであり、より好ましくは１０−１０オーダーであり、さらに好ましくは１０−１２オーダーである。また、前記解離定数の範囲は、例えば、１０−１４〜１０−８オーダーであり、好ましくは１０−１４〜１０−１０オーダーであり、より好ましくは１０−１４〜１０−１２オーダーである。
【００１４】
本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、その構成単位は、特に制限されない。前記構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基、デオキシリボヌクレオチド残基があげられる。本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、リボヌクレオチド残基から構成されるＲＮＡでもよいし、デオキシリボヌクレオチド残基から構成されるＤＮＡでもよく、ＲＮＡが好ましい。本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、ＤＮＡの構成単位であるデオキシリボヌクレオチドと、ＲＮＡの構成単位であるリボヌクレオチドの両方を含んでもよい。この場合、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、デオキシリボヌクレオチド残基を含むＲＮＡでもよいし、リボヌクレオチド残基を含むＲＮＡでもよい。
【００１５】
前記ヌクレオチド残基は、例えば、修飾化されたヌクレオチド残基でもよい。前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、前記ヌクレオチド残基における糖残基が修飾されているものがあげられる。前記糖残基は、例えば、リボース残基またはデオキシリボース残基があげられる。前記ヌクレオチド残基における修飾部位は、特に制限されないが、例えば、前記糖残基の２’位および／または４’位があげられる。前記修飾は、例えば、メチル化、フルオロ化、アミノ化、チオ化等があげられる。前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、塩基としてピリミジン塩基（ピリミジン核）を有するヌクレオチド残基が修飾されたもの、または、塩基としてプリン塩基（プリン核）を有するヌクレオチド残基が修飾されたものがあげられ、好ましくは前者である。以下、ピリミジン塩基を有するヌクレオチド残基をピリミジンヌクレオチド残基といい、修飾されたピリミジンヌクレオチド残基を修飾化ピリミジンヌクレオチド残基といい、プリン塩基を有するヌクレオチド残基をプリンヌクレオチド残基といい、修飾されたプリンヌクレオチド残基を修飾化プリンヌクレオチド残基という。前記ピリミジンヌクレオチド残基は、例えば、ウラシルを有するウラシルヌクレオチド残基、シトシンを有するシトシンヌクレオチド残基、チミンを有するチミンヌクレオチド残基等があげられる。前記修飾化ヌクレオチド残基において、塩基がピリミジン塩基の場合、例えば、前記糖残基の２’位および／または４’位が修飾されていることが好ましい。前記修飾化ヌクレオチド残基の具体例としては、例えば、リボース残基の２’位が修飾された、２’−メチルウラシル（２’−メチル化−ウラシルヌクレオチド残基）、２’−メチルシトシン（２’−メチル化−シトシンヌクレオチド残基）、２’−フルオロウラシル（２’−フルオロ化−ウラシルヌクレオチド残基）、２’−フルオロシトシン（２’−フルオロ化−シトシンヌクレオチド残基）、２’−アミノウラシル（２’−アミノ化ウラシル−ヌクレオチド残基）、２’−アミノシトシン（２’−アミノ化−シトシンヌクレオチド残基）、２’−チオウラシル（２’−チオ化−ウラシルヌクレオチド残基）、２’−チオシトシン（２’−チオ化−シトシンヌクレオチド残基）等があげられる。
【００１６】
本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、前記構成単位として、例えば、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（２’−Ｏ，４’−Ｃ−Ｅｔｈｙｌｅｎｅｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）等のモノマー残基があげられる。本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、ＰＮＡ、ＬＮＡおよびＥＮＡの少なくともいずれかのモノマー残基を含むＲＮＡまたはＤＮＡがあげられる。本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子が、前記モノマー残基を含む場合、その数は、特に制限されない。
【００１７】
本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、一本鎖核酸でもよいし、二本鎖核酸でもよい。前記一本鎖核酸は、例えば、一本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＤＮＡがあげられる。前記二本鎖核酸は、例えば、二本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、およびＲＮＡとＤＮＡとの二本鎖核酸があげられる。本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子が二本鎖核酸の場合、例えば、使用に先立って、変性等により一本鎖にしてもよい。
【００１８】
本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子において、各塩基は、例えば、アデニン（ａ）、シトシン（ｃ）、グアニン（ｇ）、チミン（ｔ）およびウラシル（ｕ）の天然塩基（非人工核酸）でもよいし、人工塩基（非天然塩基）でもよい。前記人工塩基は、例えば、修飾塩基および改変塩基等があげられ、前記天然塩基（ａ、ｃ、ｇ、ｔまたはｕ）と同様の機能を有することが好ましい。前記同様の機能を有する人工塩基は、例えば、グアニン（ｇ）に代えて、シトシン（ｃ）に結合可能な人工塩基、シトシン（ｃ）に代えて、グアニン（ｇ）に結合可能な人工塩基、アデニン（ａ）に代えて、チミン（ｔ）またはウラシル（ｕ）に結合可能な人工塩基、チミン（ｔ）に代えて、アデニン（ａ）に結合可能な人工塩基、ウラシル（ｕ）に代えて、アデニン（ａ）に結合可能な人工塩基等があげられる。前記修飾塩基は、例えば、メチル化塩基、フルオロ化塩基、アミノ化塩基、チオ化塩基等があげられる。前記修飾塩基の具体例としては、例えば、２’−メチルウラシル、２’−メチルシトシン、２’−フルオロウラシル、２’−フルオロシトシン、２’−アミノウラシル、２’−アミノシトシン、２−チオウラシル、２−チオシトシン等があげられる。本発明において、例えば、ａ、ｇ、ｃ、ｔおよびｕで表わされる塩基は、前記天然塩基の他に、前記天然塩基のそれぞれと同様の機能を有する前記人工塩基の意味も含む。
【００１９】
本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、ヌクレアーゼに耐性であることが好ましい。前記ヌクレアーゼは、特に制限されないが、例えば、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ等があげられ、具体例として、例えば、ＲＮＡ分解酵素であるリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮＡ分解酵素であるデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）、ＲＮＡおよびＤＮＡの両方に作用するヌクレアーゼ等があげられる。本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、前述のように、ＲＮＡが好ましい。本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子がＲＮＡの場合、例えば、ＲＮＡ分解酵素、すなわち、ＲＮａｓｅに耐性であることが好ましい。前記ヌクレアーゼ耐性にする手法は、特に制限されず、例えば、前記核酸分子を構成するヌクレオチド残基を修飾する方法があげられる。具体的には、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子について、例えば、前記核酸分子を構成するヌクレオチド残基または一部のヌクレオチド残基が、修飾化ヌクレオチド残基であることが好ましい。前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、前述の修飾化ヌクレオチド残基があげられる。前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、前記メチル化ヌクレオチド残基、前記フルオロ化ヌクレオチド残基、前記アミノ化ヌクレオチド残基、前記チオ化ヌクレオチド残基等があげられ、中でも前記フルオロ化ヌクレオチド残基が好ましい。前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、塩基としてピリミジン塩基を有する前記ピリミジンヌクレオチド残基であり、前記糖残基（リボース残基またはデオキシリボース残基）が修飾されていることが好ましい。
【００２０】
前記ヌクレアーゼ耐性にする手法は、この他に、例えば、前記核酸分子を構成するヌクレオチド残基をＬＮＡ化する方法があげられる。具体的には、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子について、例えば、前記核酸分子を構成する全ヌクレオチド残基または一部のヌクレオチド残基が、前記ＬＮＡ残基であることが好ましい。前記ヌクレアーゼ耐性にする手法は、この他に、例えば、前記核酸分子であるＲＮＡを構成するヌクレオチド残基をＤＮＡ化する方法があげられる。具体的には、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子がＲＮＡの場合、例えば、ＲＮＡを構成する全ヌクレオチド残基のうち、ウラシルを有するヌクレオチド残基の全てまたは一部が、チミンを有するヌクレオチド残基に置換されてもよく、具体的には、前記チミンを有するデオキシリボヌクレオチド残基に置換されてもよい。また、前記核酸分子がＲＮＡの場合、ＲＮＡを構成する全ヌクレオチド残基または一部のヌクレオチド残基が、デオキシリボヌクレオチド残基および前記ＬＮＡ残基であってもよい。
【００２１】
前記ヌクレアーゼ耐性にする手法は、この他に、例えば、５’末端および／または３’末端に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはデオキシチミジンを結合させる方法があげられる。前記ＰＥＧは、例えば、数十ｋＤａであることが好ましい。
【００２２】
本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子の長さは、特に制限されないが、その全長は、例えば、２０〜１６０塩基長であり、好ましくは３０〜１２０塩基長であり、より好ましくは４０〜１００塩基長である。
【００２３】
本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、下記（Ａ１）、（Ａ２）、（Ｂ１）および（Ｂ２）のいずれかの核酸分子があげられる。
（Ａ１）配列番号１〜４２のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸分子
（Ａ２）配列番号１〜４２のいずれかで表わされる塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能である核酸分子
（Ｂ１）配列番号４５〜８１のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸分子
（Ｂ２）配列番号４５〜８１のいずれかで表わされる塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能である核酸分子
【００２４】
前記（Ａ１）の核酸分子について説明する。以下、前記（Ａ１）の核酸分子を、ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）という。また、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）において、配列番号１〜４２で表わされる塩基配列を、塩基配列（Ａ１）ともいう。前記配列番号１〜４２で表わされる塩基配列（Ａ１）および前記塩基配列（Ａ１）を含むＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）は、それぞれ、以下に示すように、配列番号の前に示す名称で表わすこともある。
（Ａ１）配列番号１〜４２のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸分子
【００２５】
C_0（配列番号１）
mmhbuaagmcacguagmaccag
C_1（配列番号２）
accguaagacacguagaaccag
C_2（配列番号３）
aauuuaagccacguagaaccag
C_3（配列番号４）
acaguaagacacguagcaccag
C_4（配列番号５）
cauguaagccacguagaaccag
#04（配列番号６）
ucccaugauuguucaggcacggccuuucgguucccucaau
#08（配列番号７）
agucccuugacacguccguuuucuaacuggaauagaggcc
#12（配列番号８）
gggcugcaccucuccgcuacguugucguuggaggcaccau
#43（配列番号９）
gguauuaaaacucccucguaggucauccgcccggccuagc
#49（配列番号１０）
cauccuuaucacauggucauccgcccggccaugcaauguu
#32（配列番号１１）
cauucuaaauucuaucaagggucauccgcccggcccgcau
#58（配列番号１２）
cauucuaaauucuaucaagggucauccgcccggccgcgcucgccaguca
#01（配列番号１３）
uggcauccuugcucacuccaggcuaaaccucucgguuccc
#26（配列番号１４）
ccaagcacuucaucgucuaggcaauugccucucgguaccc
#73（配列番号１５）
ccacaagcucgcacuaguuccaggcuuccucucgguaccc
#77（配列番号１６）
cauguauuucugcacguuccagagaauccucucgguaccc
#06（配列番号１７）
uacacugcacgcuccgcuuugaacaucaauggaggcccug
#22（配列番号１８）
gcgcucgcucauagucaaggugaaaacccccauagagacu
#10（配列番号１９）
uagucaaggugaaaacccccauagagacu
#21（配列番号２０）
ggccugugcuaacaugagucauccguccggcucgcaacuc
#36（配列番号２１）
ccuagcacguccguuucuggaucugucaguuagaggccua
#15（配列番号２２）
gcaucaaccucuguaagagcgcgcuuugcuucaccaaaaa
#23（配列番号２３）
acgguccuuaaaaucuuccuuaaccacgcccaggaucuua
#34（配列番号２４）
auucaccucagcauguccgcuugugacgauggaggcaccu
#40（配列番号２５）
gguccuuaaaaucuuccaaucuaaacgauccagacacggc
#47（配列番号２６）
aaaaacuacugccgaaccguaagacacguagaaccaggca
#79（配列番号２７）
gaccagguuccugacaucucugaacuauaccuccaaaacg
#80（配列番号２８）
caucugaauuuaagccacguagaaccaggcccuccacgcg
#82（配列番号２９）
uaauacgacucacuauagggacgcucacguacgcucagug
R4_1（配列番号３０）
aaugagggcccacuuccggaucuuugguuugcuuccuugc
R4_4（配列番号３１）
ucgcuuauggaugcccacuuccacucacuguccugcgcaa
R4_10（配列番号３２）
uauuaauaccucagcccucuucucuuagucuggugccgau
R4_11（配列番号３３）
ucucuuuucgaauuccguucuggcucacuccuuggguauu
R4_12（配列番号３４）
cugacaucuuuuacacugauuucuguuggcccacuucugu
R8c6_1（配列番号３５）
gaguacaguaagacacguagcaccagucugacguuugucg
R8c6_14（配列番号３６）
ugccaucaccauguaagccacguagaaccagcacuacuag
R8c9_1（配列番号３７）
ugagucuuauagccguccguuuacguuugucuagaggcca
R8c9_6（配列番号３８）
gcuucuugcauuguccgcuuaguuucuauggaggcauagu
R8c9_10（配列番号３９）
ccgaauauuuuugcaccguccgauugccaugcauugaggc
HMGB1R4_9068（配列番号４０）
ugauauuuaaauuuggccgcguuuaaaacauccccuacga
HMGB1R4_2478（配列番号４１）
gauuccguugcccuuccguugaacugugccaggcuuuuug
HMGB1R4_5108（配列番号４２）
accuuugccgcaucucacccacgucuugucaggccguuuc
【００２６】
前記配列番号１において、「ｍ」は、アデニンまたはシトシンであり、「ｈ」は、アデニン、シトシン、チミンまたはウラシルであり、「ｂ」は、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルである。前記配列番号１で表わされる塩基配列は、例えば、前記配列番号２〜５で表わされる塩基配列があげられる。前記配列番号１〜４２および後述する配列番号４５〜８１で表わされる塩基配列において、ウラシル（ｕ）は、チミン（ｔ）でもよい。これらの塩基配列において、例えば、１個または２個以上のウラシルがチミンでもよく、また、全てのウラシルがチミンでもよい。このように、チミンを含む塩基配列からなる核酸分子または前記塩基配列を含む核酸分子は、例えば、後述する（Ａ２）の核酸分子として例示できる。
【００２７】
前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）は、前記配列番号１〜４２のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列（Ａ１）からなる核酸分子でもよいし、前記塩基配列（Ａ１）を含む核酸分子でもよい。
【００２８】
前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）が、前記塩基配列（Ａ１）を含む場合、例えば、前記塩基配列（Ａ１）をＸ領域として、さらに、Ｙ領域および／またはＹ’領域を有してもよい。前記Ｘ領域、前記Ｙ領域および前記Ｙ’領域は、例えば、後述する通りである。前記Ｙ領域は、特に制限されず、例えば、配列番号４３または１１５で表わされる塩基配列を含む配列および前記塩基配列からなる配列があげられる。また、前記Ｙ’領域は、特に制限されず、例えば、配列番号４４で表わされる塩基配列を含む配列および前記塩基配列からなる配列があげられる。なお、これらの配列は、一例であって、本発明を制限するものではない。
gggacgcucacguacgcuca（配列番号４３）
acgcucacguacgcuca（配列番号１１５）
ucagugccuggacgugcagu（配列番号４４）
【００２９】
前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）が前記Ｙ領域を含む場合、前記Ｙ領域は、例えば、前記塩基配列（Ａ１）の５’側に結合していることが好ましい。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）が前記Ｙ’域を含む場合、前記Ｙ’領域は、例えば、前記塩基配列（Ａ１）の３’側に結合していることが好ましい。前記塩基配列（Ａ１）と前記Ｙ領域および前記Ｙ’領域とは、例えば、直接結合してもよいし、介在配列を介して結合してもよい。
【００３０】
前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）が、前記配列番号１〜４２のいずれかの塩基配列（Ａ１）を含む場合、例えば、配列番号４５〜８１のいずれかで表わされる塩基配列からなる核酸分子または前記塩基配列を含む核酸分子が例示できる。以下に示す配列番号４５〜８１の塩基配列は、それぞれ、前記配列番号６〜４２の塩基配列（Ａ１）を含み、下線部で表わされる領域が、それぞれ、前記配列番号６〜４２の塩基配列に相当する。前記配列番号４５〜８１の塩基配列および前記塩基配列を含む前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）は、それぞれ、以下に示すように、配列番号の前に示す名称で表わすこともある。
#04（配列番号４５）
gggacgcucacguacgcucaucccaugauuguucaggcacggccuuucgguucccucaauucagugccuggacgugcagu
#08（配列番号４６）
gggacgcucacguacgcucaagucccuugacacguccguuuucuaacuggaauagaggccucagugccuggacgugcagu
#12（配列番号４７）
gggacgcucacguacgcucagggcugcaccucuccgcuacguugucguuggaggcaccauucagugccuggacgugcagu
#43（配列番号４８）
gggacgcucacguacgcucagguauuaaaacucccucguaggucauccgcccggccuagcucagugccuggacgugcagu
#49（配列番号４９）
gggacgcucacguacgcucacauccuuaucacauggucauccgcccggccaugcaauguuucagugccuggacgugcagu
#32（配列番号５０）
gggacgcucacguacgcucacauucuaaauucuaucaagggucauccgcccggcccgcauucagugccuggacgugcagu
#58（配列番号５１）
gggacgcucacguacgcucacauucuaaauucuaucaagggucauccgcccggccgcgcucgccagucaucagugccuggacgugcagu
#01（配列番号５２）
gggacgcucacguacgcucauggcauccuugcucacuccaggcuaaaccucucgguucccucagugccuggacgugcagu
#26（配列番号５３）
gggacgcucacguacgcucaccaagcacuucaucgucuaggcaauugccucucgguacccucagugccuggacgugcagu
#73（配列番号５４）
gggacgcucacguacgcucaccacaagcucgcacuaguuccaggcuuccucucgguacccucagugccuggacgugcagu
#77（配列番号５５）
gggacgcucacguacgcucacauguauuucugcacguuccagagaauccucucgguacccucagugccuggacgugcagu
#06（配列番号５６）
gggacgcucacguacgcucauacacugcacgcuccgcuuugaacaucaauggaggcccugucagugccuggacgugcagu
#22（配列番号５７）
gggacgcucacguacgcucagcgcucgcucauagucaaggugaaaacccccauagagacuucagugccuggacgugcagu
#10（配列番号５８）
gggacgcucacguacgcucauagucaaggugaaaacccccauagagacuucagugccuggacgugcagu
#21（配列番号５９）
gggacgcucacguacgcucaggccugugcuaacaugagucauccguccggcucgcaacucucagugccuggacgugcagu
#36（配列番号６０）
gggacgcucacguacgcucaccuagcacguccguuucuggaucugucaguuagaggccuaucagugccuggacgugcagu
#15（配列番号６１）
gggacgcucacguacgcucagcaucaaccucuguaagagcgcgcuuugcuucaccaaaaaucagugccuggacgugcagu
#23（配列番号６２）
gggacgcucacguacgcucaacgguccuuaaaaucuuccuuaaccacgcccaggaucuuaucagugccuggacgugcagu
#34（配列番号６３）
gggacgcucacguacgcucaauucaccucagcauguccgcuugugacgauggaggcaccuucagugccuggacgugcagu
#40（配列番号６４）
gggacgcucacguacgcucagguccuuaaaaucuuccaaucuaaacgauccagacacggcucagugccuggacgugcagu
#47（配列番号６５）
gggacgcucacguacgcucaaaaaacuacugccgaaccguaagacacguagaaccaggcaucagugccuggacgugcagu
#79（配列番号６６）
gggacgcucacguacgcucagaccagguuccugacaucucugaacuauaccuccaaaacgucagugccuggacgugcagu
#80（配列番号６７）
gggacgcucacguacgcucacaucugaauuuaagccacguagaaccaggcccuccacgcgucagugccuggacgugcagu
#82（配列番号６８）
gggacgcucacguacgcucauaauacgacucacuauagggacgcucacguacgcucagugccuggacgugcagu
R4_1（配列番号６９）
gggacgcucacguacgcucaaaugagggcccacuuccggaucuuugguuugcuuccuugcucagugccuggacgugcagu
R4_4（配列番号７０）
gggacgcucacguacgcucaucgcuuauggaugcccacuuccacucacuguccugcgcaaucagugccuggacgugcagu
R4_10（配列番号７１）
gggacgcucacguacgcucauauuaauaccucagcccucuucucuuagucuggugccgauucagugccuggacgugcagu
R4_11（配列番号７２）
gggacgcucacguacgcucaucucuuuucgaauuccguucuggcucacuccuuggguauuucagugccuggacgugcagu
R4_12（配列番号７３）
gggacgcucacguacgcucacugacaucuuuuacacugauuucuguuggcccacuucuguucagugccuggacgugcagu
R8c6_1（配列番号７４）
gggacgcucacguacgcucagaguacaguaagacacguagcaccagucugacguuugucgucagugccuggacgugcagu
R8c6_14（配列番号７５）
gggacgcucacguacgcucaugccaucaccauguaagccacguagaaccagcacuacuagucagugccuggacgugcagu
R8c9_1（配列番号７６）
gggacgcucacguacgcucaugagucuuauagccguccguuuacguuugucuagaggccaucagugccuggacgugcagu
R8c9_6（配列番号７７）
gggacgcucacguacgcucagcuucuugcauuguccgcuuaguuucuauggaggcauaguucagugccuggacgugcagu
R8c9_10（配列番号７８）
gggacgcucacguacgcucaccgaauauuuuugcaccguccgauugccaugcauugaggcucagugccuggacgugcagu
HMGB1R4_9068（配列番号７９）
gggacgcucacguacgcucaugauauuuaaauuuggccgcguuuaaaacauccccuacgaucagugccuggacgugcagu
HMGB1R4_2478（配列番号８０）
gggacgcucacguacgcucagauuccguugcccuuccguugaacugugccaggcuuuuugucagugccuggacgugcagu
HMGB1R4_5108（配列番号８１）
gggacgcucacguacgcucaaccuuugccgcaucucacccacgucuugucaggccguuucucagugccuggacgugcagu
【００３１】
前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）は、例えば、前記配列番号４５〜８１のいずれかの塩基配列（Ａ１）において、５’側の４塩基目から３’側の末端塩基までの塩基配列からなる核酸分子または前記塩基配列を含む核酸分子であってもよい。すなわち、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）は、例えば、前記配列番号４５〜８１のいずれかの塩基配列（Ａ１）において、５’末端のｇｇｇを欠失してもよい。
【００３２】
前記塩基配列（Ａ１）は、例えば、配列番号１１４で表わされるモチーフ配列を含んでもよい。下記塩基配列において、ｎは、アデニン（ａ）、シトシン（ｃ）、グアニン（ｇ）、ウラシル（ｕ）、チミン（ｔ）であり、５塩基目のｎはアデニン（ａ）、１３塩基目のｎはシトシン（ｃ）、１７塩基目のｎはアデニン（ａ）が好ましい。前記モチーフ配列を含む塩基配列（Ａ１）は、例えば、＃４７（配列番号６５）、＃８０（配列番号６７）、Ｒ８ｃ６＿１（配列番号７４）、Ｒ８ｃ６＿１４（配列番号７５）があげられる。
モチーフ配列（配列番号１１４）
uaagncacguagnaccng
【００３３】
前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）において、各塩基は、例えば、前述と同様である。すなわち、前記塩基は、例えば、アデニン（ａ）、シトシン（ｃ）、グアニン（ｇ）、チミン（ｔ）およびウラシル（ｕ）の前記天然塩基（非人工塩基）でもよいし、前記人工塩基（非天然塩基）でもよい。前記人工塩基は、例えば、前述の通りである。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）において、例えば、ａ、ｇ、ｃ、ｔおよびｕで表わされる塩基は、前記天然塩基の他に、前記天然塩基のそれぞれと同様の機能を有する前記人工塩基の意味も含む。
【００３４】
前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）は、例えば、その構成単位は、特に制限されず、前述と同様である。すなわち、前記構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基、デオキシリボヌクレオチド残基があげられる。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）は、例えば、リボヌクレオチド残基から構成されるＲＮＡでもよいし、デオキシリボヌクレオチド残基から構成されるＤＮＡでもよく、好ましくはＲＮＡである。また、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）は、ＤＮＡの構成単位であるデオキシリボヌクレオチドと、ＲＮＡの構成単位であるリボヌクレオチドとの両方を含んでもよい。前記配列番号１〜４２および配列番号４５〜８１の塩基配列は、例えば、それぞれ、前述のような塩基が連続する配列であればよく、リボヌクレオチド残基から構成されるＲＮＡでもよいし、デオキシリボヌクレオチド残基から構成されるＤＮＡでもよいし、デオキシリボヌクレオチド残基を含むＲＮＡでもよいし、リボヌクレオチド残基を含むＲＮＡでもよい。
【００３５】
前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）は、前述と同様に、前記構成単位として、例えば、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＥＮＡ等のモノマー残基があげられる。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）は、例えば、ＰＮＡ、ＬＮＡおよびＥＮＡの少なくともいずれかのモノマー残基を含むＲＮＡまたはＤＮＡがあげられる。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）が、前記モノマー残基を含む場合、その数は、特に制限されない。
【００３６】
前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）は、例えば、前述のように、ヌクレアーゼに耐性であることが好ましい。前記ヌクレアーゼ耐性にする手法は、特に制限されず、前述と同様である。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）は、前述のように、ＲＮＡが好ましい。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）がＲＮＡの場合、例えば、ＲＮＡ分解酵素耐性であることが好ましい。ＲＮＡ分解酵素耐性にする手法は、特に制限されず、前述と同様である。
【００３７】
前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）がＲＮＡの場合、例えば、前述と同様に、ＲＮＡを構成する全ヌクレオチド残基または一部のヌクレオチド残基が、前記修飾化ヌクレオチド残基であることが好ましい。前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、前述の修飾化ヌクレオチド残基があげられる。また、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）がＲＮＡの場合、例えば、前述と同様に、ＲＮＡを構成する全ヌクレオチド残基または一部のヌクレオチド残基が、前記デオキシリボヌクレオチド残基および／または前記ＬＮＡ残基であることが好ましい。また、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）がＲＮＡの場合、前述と同様に、例えば、ＲＮＡを構成するヌクレオチド残基のうち、ウラシルを有するヌクレオチド残基の全てまたは一部が、チミンを有するヌクレオチド残基に置換されてもよく、具体的には、前記チミンを有するデオキシリボヌクレオチド残基に置換されてもよい。また、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）がＲＮＡの場合、例えば、前述と同様に、その５’末端および／または３’末端に、前記ＰＥＧまたは前記デオキシチミジンを有することが好ましい。このようにチミンに置換された塩基配列からなる核酸分子または前記塩基配列を含む核酸分子は、例えば、後述する（Ａ２）の核酸分子として例示できる。
【００３８】
前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）の長さは、特に制限されないが、その全長は、例えば、２０〜１６０塩基長であり、好ましくは３０〜１２０塩基長であり、より好ましくは４０〜１００塩基長である。
【００３９】
つぎに、前記（Ａ２）の核酸分子について、説明する。以下、前記（Ａ２）の核酸分子を、ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ２）という。
（Ａ２）配列番号１〜４２のいずれかで表わされる塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能である核酸分子
【００４０】
前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ２）は、前記置換等された塩基配列を含む核酸分子でもよいし、前記置換等された前記塩基配列からなる核酸分子でもよい。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ２）において、前記置換等された塩基配列を、塩基配列（Ａ２）ともいう。
【００４１】
「１または複数」とは、特に制限されない。「１または複数」は、前記配列番号１〜４２のいずれかの塩基配列において、例えば、１〜５個であり、好ましくは１〜４個であり、より好ましくは１〜３個であり、さらに好ましくは１個または２個であり、特に好ましくは１個である。また、「１または複数」は、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）の全長配列において、例えば、１〜５個であり、好ましくは１〜４個であり、より好ましくは１〜３個であり、さらに好ましくは１個または２個であり、特に好ましくは１個である。前記置換、付加または挿入に使用する塩基は、特に制限されず、例えば、前記天然塩基でもよいし、前記人工塩基でもよい。前記塩基の置換、付加または挿入は、例えば、前記ヌクレオチド残基を用いてもよいし、前記モノマー残基を用いてもよい。
【００４２】
本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、下記（Ａ３）の核酸分子でもよい。以下、前記（Ａ３）の核酸分子を、ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ３）という。
（Ａ３）配列番号１〜４２のいずれかで表わされる塩基配列において、６０％以上の相同性を有する塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能である核酸分子
【００４３】
前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ３）は、前記相同性を有する塩基配列を含む核酸分子でもよいし、前記相同性を有する塩基配列からなる核酸分子でもよい。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ３）において、前記相同性を有する塩基配列を、塩基配列（Ａ３）ともいう。
【００４４】
前記相同性は、例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上である。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ３）は、例えば、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）の全長配列において、６０％以上の相同性を有する塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能な核酸分子でもよい。この場合、前記相同性は、例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上である。前記相同性は、例えば、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算することにより、算出できる。
【００４５】
本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、下記（Ａ４）の核酸分子でもよい。以下、前記（Ａ４）の核酸分子を、ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ４）という。
（Ａ４）配列番号１〜４２のいずれかで表わされる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列または前記塩基配列に相補的な塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能である核酸分子
【００４６】
前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ４）は、前記ハイブリダイズする塩基配列からなる核酸分子でもよいし、前記塩基配列を含む核酸分子でもよい。また、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ４）は、前記相補的な塩基配列からなる核酸分子でもよいし、前記相補的な塩基配列を含む核酸分子でもよい。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ４）において、前記ハイブリダイズする塩基配列および前記相補的な塩基配列を、塩基配列（Ａ４）ともいう。
【００４７】
前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ４）において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、当該技術分野の当業者において、周知のハイブリダイゼーションの実験条件である。具体的には、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、０．７〜１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６０〜６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍のＳＳＣ溶液を用い、６５〜６８℃で洗浄することにより同定できる条件をいう。１×ＳＳＣとは、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムからなる。また、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ４）は、例えば、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）の全長塩基とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能である核酸分子でもよい。
【００４８】
前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ２）〜（Ａ４）において、例えば、塩基、構成単位、長さ、ヌクレアーゼ耐性の付与等、特に示さない限り、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）と同様である。
【００４９】
つぎに、前記（Ｂ１）の核酸分子について、説明する。以下、前記（Ｂ１）の核酸分子を、ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）という。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）において、配列番号４５〜８１で表わされる塩基配列を、塩基配列（Ｂ１）ともいう。
（Ｂ１）配列番号４５〜８１のいずれかで表わされる塩基配列を含む核酸分子
【００５０】
配列番号４５〜８１で表わされる塩基配列は、前述の通りである。配列番号４５〜８１で表わされる塩基配列を含むＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）は、それぞれ、前述した配列番号の前に示す名称で表わすこともある。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）は、例えば、配列番号４５〜８１のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列（Ｂ１）からなる核酸分子でもよいし、前記塩基配列（Ｂ１）を含む核酸分子でもよい。
【００５１】
前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）は、例えば、前記配列番号４５〜８１のいずれかの塩基配列（Ｂ１）において、５’側の４塩基目から３’側の末端塩基までの塩基配列からなる核酸分子または前記塩基配列を含む核酸分子であってもよい。すなわち、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）は、例えば、前記配列番号４５〜８１のいずれかの塩基配列（Ａ１）において、５’末端のｇｇｇを欠失してもよい。
【００５２】
前記塩基配列（Ｂ１）は、例えば、配列番号１１４で表わされるモチーフ配列を含んでもよい。下記塩基配列において、ｎは、アデニン（ａ）、シトシン（ｃ）、グアニン（ｇ）、ウラシル（ｕ）、チミン（ｔ）であり、５塩基目のｎはアデニン（ａ）、１３塩基目のｎはシトシン（ｃ）、１７塩基目のｎはアデニン（ａ）が好ましい。前記モチーフ配列を含む塩基配列（Ｂ１）は、例えば、＃４７（配列番号６５）、＃８０（配列番号６７）、Ｒ８ｃ６＿１（配列番号７４）、Ｒ８ｃ６＿１４（配列番号７５）があげられる。
モチーフ配列（配列番号１１４）
uaagncacguagnaccng
【００５３】
前記Ｒ８ｃ６＿１（配列番号７４）の推定二次構造を図１１に示す。同図において、丸で囲んだ塩基が、前記モチーフ配列に該当する。図１１の前記推定二次構造において、前記モチーフ配列における「ｎ」に該当する塩基は、丸を省略している。
【００５４】
前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）において、各塩基は、例えば、前述と同様である。すなわち、前記塩基は、例えば、アデニン（ａ）、シトシン（ｃ）、グアニン（ｇ）、チミン（ｔ）およびウラシル（ｕ）の前記天然塩基（非人工塩基）でもよいし、前記人工塩基（非天然塩基）でもよい。前記人工塩基は、例えば、前述の通りである。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）において、例えば、ａ、ｇ、ｃ、ｔおよびｕで表わされる塩基は、前記天然塩基の他に、前記天然塩基のそれぞれと同様の機能を有する前記人工塩基の意味も含む。
【００５５】
前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）は、例えば、その構成単位は、特に制限されず、前述と同様である。すなわち、前記構成単位は、例えば、ヌクレオチド残基であり、前記ヌクレオチド残基は、例えば、リボヌクレオチド残基、デオキシリボヌクレオチド残基があげられる。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）は、例えば、リボヌクレオチド残基から構成されるＲＮＡでもよいし、デオキシリボヌクレオチド残基から構成されるＤＮＡでもよく、好ましくはＲＮＡである。また、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ａ１）は、ＤＮＡの構成単位であるデオキシリボヌクレオチドと、ＲＮＡの構成単位であるリボヌクレオチドとの両方を含んでもよい。前記配列番号４５〜８１の塩基配列は、例えば、それぞれ、前述のような塩基が連続する配列であればよく、リボヌクレオチド残基から構成されるＲＮＡでもよいし、デオキシリボヌクレオチド残基から構成されるＤＮＡでもよいし、デオキシリボヌクレオチド残基を含むＲＮＡでもよいし、リボヌクレオチド残基を含むＲＮＡでもよい。
【００５６】
前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）は、前述と同様に、前記構成単位として、例えば、ＰＮＡ、ＬＮＡ、ＥＮＡ等のモノマー残基があげられる。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）は、例えば、ＰＮＡ、ＬＮＡおよびＥＮＡの少なくともいずれかのモノマー残基を含むＲＮＡまたはＤＮＡがあげられる。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）が、前記モノマー残基を含む場合、その数は、特に制限されない。
【００５７】
前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）は、例えば、前述のように、ヌクレアーゼに耐性であることが好ましい。前記ヌクレアーゼ耐性にする手法は、特に制限されず、前述と同様である。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）は、前述のように、ＲＮＡが好ましい。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）がＲＮＡの場合、例えば、ＲＮＡ分解酵素耐性であることが好ましい。ＲＮＡ分解酵素耐性にする手法は、特に制限されず、前述と同様である。
【００５８】
前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）がＲＮＡの場合、例えば、前述と同様に、ＲＮＡを構成する全ヌクレオチド残基または一部のヌクレオチド残基が、前記修飾化ヌクレオチド残基であることが好ましい。前記修飾化ヌクレオチド残基は、例えば、前述の修飾化ヌクレオチド残基があげられる。また、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）がＲＮＡの場合、例えば、前述と同様に、ＲＮＡを構成する全ヌクレオチド残基または一部のヌクレオチド残基が、前記デオキシリボヌクレオチド残基および／または前記ＬＮＡ残基であることが好ましい。また、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）がＲＮＡの場合、前述と同様に、例えば、ＲＮＡを構成するヌクレオチド残基のうち、ウラシルを有するヌクレオチド残基の全てまたは一部が、チミンを有するヌクレオチド残基に置換されてもよく、具体的には、前記チミンを有するデオキシリボヌクレオチド残基に置換されてもよい。また、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）がＲＮＡの場合、例えば、前述と同様に、その５’末端および／または３’末端に、前記ＰＥＧまたは前記デオキシチミジンを有することが好ましい。このようにチミンに置換された塩基配列からなる核酸分子または前記塩基配列を含む核酸分子は、例えば、後述する（Ｂ２）の核酸分子として例示できる。
【００５９】
前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）の長さは、特に制限されないが、その全長は、例えば、２０〜１６０塩基長であり、好ましくは３０〜１２０塩基長であり、より好ましくは４０〜１００塩基長である。
【００６０】
前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）は、中でも、下記（ｂ１）の核酸分子であることが好ましい。以下、前記（ｂ１）の核酸分子を、ＨＭＧＢ１結合核酸分子（ｂ１）ともいう。前記ＨＭＧＢ１核酸分子（ｂ１）は、例えば、配列番号７４の塩基配列からなる核酸分子でもよいし、前記塩基配列からなる核酸分子でもよい。
（ｂ１）配列番号７４で表わされる塩基配列を含む核酸分子
【００６１】
つぎに、前記（Ｂ２）の核酸分子について、説明する。以下、前記（Ｂ２）の核酸分子を、ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ２）という。
（Ｂ２）配列番号４５〜８１のいずれかで表わされる塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能である核酸分子
【００６２】
前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ２）は、前記置換等された塩基配列を含む核酸分子でもよいし、前記置換等された前記塩基配列からなる核酸分子でもよい。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ２）において、前記置換等された塩基配列を、塩基配列（Ｂ２）ともいう。
【００６３】
「１または複数」は、特に制限されず、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ２）が、ＨＭＧＢ１に結合可能であればよい。前記置換された塩基の数は、配列番号４５〜８１のいずれかの塩基配列において、例えば、１〜５個であり、好ましくは１〜４個であり、より好ましくは１〜３個であり、さらに好ましくは１個または２個であり、特に好ましくは１個である。前記付加または挿入された塩基の数は、配列番号４５〜８１のいずれかの塩基配列において、例えば、１〜５個であり、好ましくは１〜４個であり、より好ましくは１〜３個であり、さらに好ましくは１個または２個であり、特に好ましくは１個である。前記欠失された塩基の数は、特に制限されないが、例えば、配列番号４５〜８１のいずれかの塩基配列において、１〜４６個、１〜４３個、１〜２１個、〜１〜１８個、１〜４個、１〜３個、２個または１個である。
【００６４】
前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ２）の長さは、特に制限されないが、その全長は、例えば、２０〜１６０塩基長であり、好ましくは３０〜１２０塩基長であり、より好ましくは４０〜１００塩基長である。
【００６５】
前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ２）のうち、例えば、配列番号４５〜８１のいずれかで表わされる塩基配列において、１または複数の塩基が、欠失された塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能である核酸分子は、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）を小型化した核酸分子ともいえる。前記小型化した核酸分子を、小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ２）ともいう。前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子は、前記（Ｂ２）に示すように、配列番号４５〜８１のいずれかで表わされる塩基配列において、１または複数の塩基が、欠失するだけでなく、例えば、１または複数の塩基が、置換、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能である核酸分子でもよい。
【００６６】
前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ２）は、前述のように、前記欠失された塩基配列を含む核酸分子でもよいし、前記欠失された前記塩基配列からなる核酸分子でもよい。前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ２）において、前記欠失された塩基配列を、小型化塩基配列ともいう。前記欠失された塩基の数は、特に制限されず、例えば、前述の通りである。
【００６７】
前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ２）は、例えば、配列番号４５〜８１の塩基配列において、５’側の４塩基目から３’側の末端塩基まで塩基配列からなる核酸分子または前記塩基配列を含む核酸分子があげられる。すなわち、前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ２）は、例えば、配列番号４５〜８１のいずれかの塩基配列（Ｂ１）において、５’末端のｇｇｇを欠失した塩基配列からなる核酸分子または前記塩基配列を含む核酸分子があげられる。
【００６８】
前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ２）の長さは、特に制限されないが、その全長は、例えば、２０〜１６０塩基長であり、好ましくは３０〜１２０塩基長であり、より好ましくは４０〜１００塩基長である。
【００６９】
前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ２）としては、例えば、配列番号７４で表わされる塩基配列において、１または複数の塩基が、欠失された塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能である核酸分子が好ましく、具体的には、下記（ｂ２）の核酸分子が好ましい。以下、前記（ｂ２）の核酸分子を、小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（ｂ２）ともいう。
（ｂ２）配列番号７４で表わされる塩基配列における連続する１１塩基以上の部分配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能である核酸分子
【００７０】
前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（ｂ２）において、前記連続する１１塩基以上の部分配列を、以下、連続部分配列ともいう。前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（ｂ２）は、前記連続部分配列からなる核酸分子でもよいし、前記連続部分配列を含む核酸分子でもよい。前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（ｂ２）は、例えば、前述のように、配列番号７４の塩基配列において、１または複数の塩基が、欠失するだけでなく、例えば、１または複数の塩基が、置換、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能である核酸分子でもよい。
【００７１】
前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（ｂ２）は、例えば、前記配列番号７４の塩基配列における前記連続する１１塩基以上の連続部分配列を、１配列含んでもよいし、２配列以上有してもよい。
【００７２】
前記連続部分配列の長さは、前述のように、１１塩基以上である。前記連続部分配列の長さは、特に制限されず、例えば、１２塩基以上でもよく、１４塩基以上でもよく、１６塩基以上でもよい。前記連続部分配列の長さの上限は、特に制限されず、８０塩基以下であり、好ましくは７９塩基以下である。
【００７３】
前記連続部分配列は、特に制限されないが、例えば、以下に示すｙ配列、ｘ配列またはｙ’配列があげられる。前記ｙ配列は、例えば、前記配列番号７４の塩基配列における、１番目〜２０番目、４番目〜２０番目の領域があげられる。前記ｘ配列は、例えば、前記配列番号７４の塩基配列における、２１番目〜６０番目、２２番目〜６０番目、２４番目〜６０番目、２５番目〜６０番目、２９番目〜６０番目、３４番目〜６０番目、３８番目〜６０番目、２２番目〜４８番目、２２番目〜４７番目、２５番目〜４７番目、２６番目〜４７番目、２７番目〜４７番目、２８番目〜４７番目、２９番目〜４７番目、３０番目〜４７番目、３１番目〜４７番目、３４番目〜４７番目、２９番目〜４４番目、２９番目〜４０番目、２９番目〜４６番目、２５番目〜４６番目、２６番目〜４６番目、２７番目〜４６番目、２８番目〜４６番目、２９番目〜４６番目の領域があげられる。前記ｙ’配列は、例えば、前記配列番号７４の塩基配列における、６１番目〜８０番目、６１番目〜７９番目、６１番目〜７７番目、６１番目〜７６番目、６１番目〜７８番目、６４番目〜８０番目、６５番目〜８０番目、７０番目〜８０番目、６４番目〜７７番目の領域があげられる。
【００７４】
前記連続部分配列からなる塩基配列および前記連続部分配列を含む塩基配列を、以下、塩基配列（ｂ２）ともいう。前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（ｂ２）は、例えば、前記塩基配列（ｂ２）からなる核酸分子でもよいし、前記塩基配列（ｂ２）を含む核酸分子でもよい。前記塩基配列（ｂ２）は、例えば、前記ｘ配列と前記ｙ’配列とを含む塩基配列、前記ｙ配列と前記ｘ配列と前記ｙ’配列とを含む塩基配列があげられる。前記塩基配列（ｂ２）において、例えば、前記ｘ配列の５’側に前記ｙ配列、前記ｘ配列の３’側に前記ｙ’配列を含むことが好ましい。また、前記塩基配列（ｂ２）は、例えば、前記ｙ配列における５’末端のｇｇｇを欠失してもよい。
【００７５】
前記塩基配列（ｂ２）は、例えば、配列番号８３〜１１３で表わされる塩基配列があげられる。これらの塩基配列を、下記表１に示す。下記表１において、各塩基配列は、配列番号７４の塩基配列と対応するように示す。各塩基配列について、配列番号７４の塩基配列と対比して、欠失する部分は空欄で示し、異なる塩基は下線を付す。配列番号８３〜１１３の塩基配列を含む、前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（ｂ２）は、それぞれ、下記表１に示す名称で表わすこともある。
【００７６】
【表１】
0005582580.tif 000002
【００７７】
前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（ｂ２）は、例えば、配列番号８３〜１１３のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列からなる核酸分子でもよいし、配列番号８３〜１１３のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列を含む核酸分子でもよい。
【００７８】
前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（ｂ２）は、例えば、配列番号７４および前記配列番号８３〜１１３のいずれかの塩基配列（ｂ２）において、５’側の４塩基目から３’側の末端塩基までの塩基配列からなる核酸分子または前記塩基配列を含む核酸分子であってもよい。すなわち、前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（ｂ２）は、例えば、配列番号７４および配列番号８３〜１１３のいずれかの塩基配列において、５’末端のｇｇｇを欠失してもよい。
【００７９】
前記塩基配列（ｂ２）は、例えば、配列番号１１４で表わされるモチーフ配列を含んでもよい。下記塩基配列において、ｎは、アデニン（ａ）、シトシン（ｃ）、グアニン（ｇ）、ウラシル（ｕ）、チミン（ｔ）であり、５塩基目のｎはアデニン（ａ）、１３塩基目のｎはシトシン（ｃ）、１７塩基目のｎはアデニン（ａ）が好ましい。前記モチーフ配列を含む塩基配列（ｂ２）は、例えば、Ｒ８ｃ６＿１−１（配列番号８３）、Ｒ８ｃ６＿１−３（配列番号８４）、Ｒ８ｃ６＿１−４（配列番号８５）、Ｒ８ｃ６＿１−１５（配列番号８６）、Ｒ８ｃ６＿１−１８（配列番号８７）、Ｒ８ｃ６＿１−２０（配列番号８８）、Ｒ８ｃ６＿１−２１（配列番号８９）、Ｒ８ｃ６＿１−２５（配列番号９０）、Ｒ８ｃ６＿１−１８−Ｓ２（配列番号９３）、Ｒ８ｃ６＿１−１８−Ｓ４（配列番号９４）、Ｒ８ｃ６＿１−１８−Ｓ６（配列番号９５）、Ｒ８ｃ６＿１−２１−Ｓ６（配列番号９６）、Ｒ８ｃ６＿１−２２−Ｓ６（配列番号９７）、Ｒ８ｃ６＿１−２３−Ｓ６（配列番号９８）、Ｒ８ｃ６＿１−２４−Ｓ６（配列番号９９）、Ｒ８ｃ６＿１−２５−Ｓ６（配列番号１００）、Ｒ８ｃ６＿１−２５−Ｓ６Ａ３（配列番号１０５）、Ｒ８ｃ６＿１−２５−Ｓ６Ｃ２（配列番号１０７）、Ｒ８ｃ６＿１−２１−Ｓ８（配列番号１０８）、Ｒ８ｃ６＿１−２２−Ｓ８（配列番号１０９）、Ｒ８ｃ６＿１−２３−Ｓ８（配列番号１１０）、Ｒ８ｃ６＿１−２４−Ｓ８（配列番号１１１）、Ｒ８ｃ６＿１−２５−Ｓ８（配列番号１１２）等があげられる。また、前記モチーフ配列の一部を含む塩基配列（Ｂ１）は、例えば、Ｒ８ｃ６＿１−３０（配列番号９１）、Ｒ８ｃ６＿１−３４ＣＣ（配列番号９２）、Ｒ８ｃ６＿１−２６−Ｓ６（配列番号１０１）、Ｒ８ｃ６＿１−２５−Ｓ６Ａ２（配列番号１０４）、Ｒ８ｃ６＿１−２５−Ｓ６Ｃ（配列番号１０６）等があげられる。
モチーフ配列（配列番号１１４）
uaagncacguagnaccng
【００８０】
前記Ｒ８ｃ６＿１−１８（配列番号７４）の推定二次構造を図１１に示す。同図において、丸で囲んだ塩基が、前記モチーフ配列に該当する。前記推定二次構造において、前記モチーフ配列における「ｎ」に該当する塩基は、丸を省略している。前記Ｒ８ｃ６＿１−２５−Ｓ６（配列番号１００）の推定二次構造を図２０に示す。同図において、丸で囲んだ塩基が、前記モチーフ配列に該当する。前記推定二次構造において、前記モチーフ配列における「ｎ」に該当する塩基は、丸を省略している。
【００８１】
前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（ｂ２）の長さは、特に制限されないが、その全長は、例えば、２０〜１６０塩基長であり、好ましくは３０〜１２０塩基長であり、より好ましくは４０〜１００塩基長である。また、前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（ｂ２）において、前記塩基配列（ｂ２）は、その全長は、特に制限されないが、その下限が、例えば、２０塩基長以上、３０塩基長以上、３４塩基長以上、３７塩基長以上、４０塩基長以上であり、その上限が、例えば、１６０塩基以下、１２０塩基以下、１００塩基以下、８０塩基以下であり、好ましくは７９塩基長以下である。
【００８２】
前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ２）は、例えば、前記小型化ＨＭＧＢ１結合核酸分子（ｂ２）の前記連続部分配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能である核酸分子でもよい。具体例としては、配列番号８３〜１１３のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列において、１または複数の塩基が、置換、欠失、付加または挿入された塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能である核酸分子があげられる。前記置換等の塩基の数は、特に制限されず、配列番号８３〜１１３のいずれかの塩基配列において、例えば、１〜５個であり、好ましくは１〜４個であり、より好ましくは１〜３個であり、さらに好ましくは１個または２個であり、特に好ましくは１個である。
【００８３】
本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、下記（Ｂ３）の核酸分子でもよい。以下、前記（Ｂ３）の核酸分子を、ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ３）という。
（Ｂ３）配列番号４５〜８１のいずれかで表わされる塩基配列において、６０％以上の相同性を有する塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能である核酸分子
【００８４】
前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ３）は、前記相同性を有する塩基配列を含む核酸分子でもよいし、前記相同性を有する塩基配列からなる核酸分子でもよい。前記相同性は、例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上である。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ３）は、例えば、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）の全長配列において６０％以上の相同性を有する塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能な核酸分子でもよい。この場合、前記相同性は、例えば、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上である。前記相同性は、例えば、ＢＬＡＳＴ等を用いてデフォルトの条件で計算することにより、算出できる。
【００８５】
本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、下記（Ｂ４）の核酸分子でもよい。以下、前記（Ｂ４）の核酸分子を、ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ４）という。
（Ｂ４）配列番号４５〜８１のいずれかで表わされる塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列または前記塩基配列に相補的な塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能である核酸分子
【００８６】
前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ４）は、前記ハイブリダイズする塩基配列からなる核酸分子でもよいし、前記塩基配列を含む核酸分子でもよい。また、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ４）は、前記相補的な塩基配列からなる核酸分子でもよいし、前記相補的な塩基配列を含む核酸分子でもよい。
【００８７】
前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ４）において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、当該技術分野の当業者において、周知のハイブリダイゼーションの実験条件である。具体的には、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、０．７〜１ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６０〜６８℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍のＳＳＣ溶液を用い、６５〜６８℃で洗浄することにより同定できる条件をいう。１×ＳＳＣとは、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムからなる。また、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ４）は、例えば、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）の全長塩基とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含み、且つ、ＨＭＧＢ１に結合可能である核酸分子でもよい。
【００８８】
前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ２）〜（Ｂ４）において、例えば、塩基、構成単位、長さ、ヌクレアーゼ耐性の付与等、特に示さない限り、前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子（Ｂ１）と同様である。
【００８９】
本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、前述のように、例えば、一本鎖核酸でもよいし、二本鎖核酸でもよい。本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子が、前記二本鎖核酸の場合、例えば、一方の一本鎖が、前記（Ａ１）〜（Ａ４）および前記（Ｂ１）〜（Ｂ４）のいずれかの核酸分子であり、他方の一本鎖が、前記（Ａ１）〜（Ａ４）および前記（Ｂ１）〜（Ｂ４）のいずれかの核酸分子に相補的な塩基配列からなる核酸分子または前記塩基配列を含む核酸分子であることが好ましい。
【００９０】
本発明のＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、使用時において、前記ＨＭＧＢ１への結合性に影響を与えない範囲で、さらに、ポリアデニン等のリンカー配列等が結合されてもよい。
【００９１】
本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子の製造方法は、何ら制限されず、化学合成を利用した核酸合成方法等、公知の方法により合成できる。
【００９２】
本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、前述のように、前記配列番号１〜４２のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列からなる核酸分子でもよいし、前記塩基配列を含む核酸分子でもよい。後者の場合、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、前記配列番号１〜４２のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列以外の塩基配列を含んでもよい。このような本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子の一形態としては、例えば、Ｙ領域、Ｘ領域およびＹ’領域を含み、５’末端から、前記Ｙ領域、前記Ｘ領域および前記Ｙ’領域が連結した核酸分子があげられる。この形態の前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子において、前記Ｘ領域は、前記配列番号１〜４２のいずれかの配列番号で表わされる塩基配列を含み、前記Ｙ領域および前記Ｙ’領域は、それぞれ任意の塩基配列からなることが好ましい。
【００９３】
前記Ｘ領域の塩基数は、特に制限されないが、例えば、１０〜６０塩基であり、好ましくは１５〜５０塩基であり、より好ましくは２０〜４０塩基である。前記Ｙ領域およびＹ’領域の塩基数は、特に制限されないが、それぞれ、例えば、１０〜５０塩基であり、好ましくは１５〜４０塩基であり、より好ましくは２０〜３０塩基である。本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子の全塩基数は、特に制限されないが、例えば、２０〜１６０塩基であり、好ましくは３０〜１２０塩基であり、より好ましくは４０〜１００塩基である。
【００９４】
前記Ｙ領域の塩基配列およびＹ’領域の塩基配列は、それぞれ、特に制限されないが、例えば、プライマーがアニーリング可能なプライマー結合配列、および、ポリメラーゼが認識可能なポリメラーゼ認識配列等を含むことが好ましい。ターゲットに結合可能な核酸分子を大量に製造する場合、例えば、前述のような化学合成よりも、核酸増幅法により増幅させる方が、効率よい製造が可能である。そこで、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子を核酸増幅法により増幅させる場合、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、プライマーがハイブリダイズ可能なプライマー結合配列およびポリメラーゼが認識可能なポリメラーゼ認識配列を含むことが好ましい。本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、前記Ｘ領域の５’側上流、すなわち、前記Ｙ領域、および前記Ｘ領域の３’側下流、すなわち、前記Ｙ’領域の少なくとも一方に、前記プライマー結合配列およびポリメラーゼ認識配列を含むことが好ましい。前記ポリメラーゼ認識領域は、例えば、核酸増幅で使用するポリメラーゼの種類に応じて適宜決定できる。本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子がＲＮＡの場合、前記ポリメラーゼの認識配列は、例えば、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの認識配列（以下、「ＲＮＡポリメラーゼ認識配列」ともいう）が好ましく、具体例としては、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの認識配列であるＴ７プロモーター等があげられる。本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子がＲＮＡの場合、例えば、５’側の前記Ｙ領域は、前記ＲＮＡポリメラーゼ認識配列と前記プライマー結合配列（以下、「５’側プライマー領域」ともいう）とを、この順序で含むことが好ましい。そして、前記Ｙ領域の３’側に、前記Ｘ領域が連結されていることが好ましい。さらに、前記Ｘ領域の３’側に、前記Ｙ’領域が連結され、前記Ｙ’領域が、プライマー結合配列（以下、「３’側プライマー領域」ともいう）を含むことが好ましい。前記ＲＮＡにおける前記５’側プライマー領域は、例えば、前記ＲＮＡを鋳型として合成したＤＮＡアンチセンス鎖の３’側に対して相補的な配列、つまり、前記アンチセンス鎖の３’側に結合可能なプライマーと同様の配列であることが好ましい。また、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、さらに、ＨＭＧＢ１への結合を補助する領域を有してもよい。また、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、前記Ｙ領域と前記Ｘ領域、および、前記Ｘ領域と前記Ｙ’領域が、それぞれ、直接隣接してもよいし、介在配列を介して間接的に隣接してもよい。
【００９５】
本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子を核酸増幅により調製する方法は、特に制限されない。本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子がＲＮＡの場合、例えば、ＤＮＡを鋳型として調製できる。以下、ＲＮＡの鋳型となるＤＮＡ鎖をアンチセンス鎖、前記ＲＮＡのウラシル（ｕ）をチミン（ｔ）に置換した配列を含むＤＮＡ鎖をセンス鎖ともいう。前記鋳型ＤＮＡは、例えば、前記ＲＮＡにおける前記Ｘ領域の相補鎖のウラシル（ｕ）をチミン（ｔ）に置換したＤＮＡ（アンチセンス鎖）、および、前記Ｘ領域のウラシル（ｕ）をチミン（ｔ）に置換した配列を含むＤＮＡ（センス鎖）のいずれか一方を含むことが好ましい。これらのＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いて核酸増幅を行った後、得られたＤＮＡ増幅産物を鋳型として、さらに、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡを転写することにより、前記ＲＮＡを増幅できる。また、前記ＲＮＡを鋳型として、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを用いた逆転写反応によりｃＤＮＡを調製し、前記ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ等によりＤＮＡの核酸増幅を行い、得られたＤＮＡ増幅産物を鋳型として、さらに、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを用いてＲＮＡを転写することにより、前記ＲＮＡを増幅してもよい。
【００９６】
また、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子がＤＮＡの場合、例えば、ＤＮＡをポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）法等によって、増幅できる。
【００９７】
本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子において、前記Ｘ領域は、例えば、前述したｘ配列が例示できる。
【００９８】
本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子において、前述のように、前記Ｙ領域およびＹ’領域の塩基配列は、それぞれ、特に制限されず、任意に決定できる。前記Ｙ領域の配列の一例としては、例えば、配列番号４３および配列番号１１５のいずれかで表わされる塩基配列を含む配列および前記塩基配列からなる配列があげられる。また、前記Ｙ領域は、例えば、前述したｙ配列が例示できる。なお、これらの配列は、一例であって、本発明を制限するものではない。
gggacgcucacguacgcuca（配列番号４３）
acgcucacguacgcuca（配列番号１１５）
【００９９】
前記Ｙ’領域の配列の一例としては、例えば、配列番号４４で表わされる塩基配列を含む配列および前記塩基配列からなる配列があげられる。また、前記Ｙ’領域は、例えば、前述したｙ’配列が例示できる。なお、これらの配列は、一例であって、本発明を制限するものではない。
ucagugccuggacgugcagu（配列番号４４）
【０１００】
本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、自己アニーリングによる二次構造を有してもよい。前記二次構造は、例えば、ステムループ構造があげられる。前記ステムループ構造は、例えば、前記Ｙ領域、前記Ｘ領域および前記Ｙ’領域のいずれかが二本鎖を形成することによって、形成されてもよい。具体例としては、例えば、前記Ｙ領域の一部が、前記Ｘ領域の一部と二本鎖を形成することにより、ステムループ構造を形成してもよいし、前記Ｙ’領域の一部が、前記Ｘ領域の一部と二本鎖を形成することにより、ステムループ構造を形成してもよい。また、前記Ｙ領域の一部および前記Ｙ’領域の一部が、それぞれ、前記Ｘ領域の一部と二本鎖を形成することにより、ステムループ構造を形成してもよい。また、前記Ｙ領域の内部で二本鎖を形成することにより、ステムループ構造を形成してもよいし、前記Ｙ’領域の内部で二本鎖を形成することにより、ステムループ構造を形成してもよいし、前記Ｙ領域および前記Ｙ’領域の内部において、ステムループ構造を形成してもよい。
【０１０１】
本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、ＨＭＧＢ１と結合可能であることから、例えば、ＨＭＧＢ１との結合によりＨＭＧＢ１の機能を中和する中和剤として使用できる。
【０１０２】
本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、前述のように、ＨＭＧＢ１と結合可能であることから、例えば、ＨＭＧＢ１との結合によりＨＭＧＢ１の機能を阻害する阻害剤として使用できる。
【０１０３】
本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、前述のように、ＨＭＧＢ１と結合可能であることから、ＨＭＧＢ１の発現が原因となる疾患を予防または治療するための医薬品として使用できる。前記本発明の医薬品は、例えば、抗癌剤、抗炎症剤、抗脳卒中剤等として使用できる。
【０１０４】
本発明の中和剤、本発明の阻害剤および本発明の医薬品は、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は、何ら制限されない。本発明の中和剤、本発明の阻害剤および本発明の医薬品は、それぞれ、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子の他に、例えば、キャリアー等を含んでもよく、例えば、以下に示す組成物と同様の構成があげられ、同様にして使用できる。
【０１０５】
＜組成物＞
本発明の組成物は、前述のように、前記本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子を含むことを特徴とする。本発明の組成物は、前記本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は、何ら制限されない。
【０１０６】
本発明の組成物は、前述のように、ＨＭＧＢ１と結合可能であることから、例えば、ＨＭＧＢ１との結合によりＨＭＧＢ１の機能を中和する中和剤として使用できる。
【０１０７】
本発明の組成物は、前述のように、ＨＭＧＢ１と結合可能であることから、例えば、ＨＭＧＢ１との結合によりＨＭＧＢ１の機能を阻害する阻害剤として使用できる。
【０１０８】
本発明の組成物は、前述のように、ＨＭＧＢ１と結合可能であることから、ＨＭＧＢ１の発現が原因となる疾患を予防または治療するための医薬品として使用できる。前記本発明の医薬品は、例えば、抗癌剤、抗炎症剤、抗脳卒中剤等として使用できる。
【０１０９】
本発明の組成物の適用対象は、特に制限されず、その用途に応じて適宜決定できる。前記適用対象は、例えば、細胞、組織および生体等があげられる。前記細胞および組織の由来、ならびに生体の種類は、特に制限されない。前記生体は、例えば、ＨＭＧＢ１遺伝子および／またはＨＭＧＢ１オーソログ遺伝子を有する生物があげられ、具体例としては、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類、鳥類、魚類等の動物があげられる。生体に投与する場合、投与方法は、特に制限されず、例えば、経口投与および非経口投与があげられる。前記非経口投与は、例えば、静脈投与、動脈投与、リンパ管への投与、筋肉投与、皮下投与、直腸投与、経皮投与、腹腔内投与、局所投与等があげられる。
【０１１０】
本発明の組成物は、前記本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子の他に、例えば、各種添加剤を含んでもよい。前記添加剤は、特に制限されず、例えば、本発明の組成物の用途に応じて、適宜決定できる。
【０１１１】
本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子を、例えば、細胞、組織または生体内等にデリバリーする場合、本発明の組成物は、さらに、前記添加剤として、キャリアーを含むことが好ましい。前記キャリアーは、特に制限されないが、例えば、ナノ粒子、リポソーム、ミセル、逆ミセル、ポリカチオン、細胞膜透過性ペプチド、磁気粒子、リン酸カルシウム等があげられる。前記ナノ粒子は、特に制限されないが、例えば、カーボンナノホーンおよびカーボンナノチューブ等のナノカーボンがあげられる。これらのキャリアーは、いずれか一種類を使用してもよいし、二種類以上を併用してもよい。また、前記添加剤は、例えば、緩衝剤、金属塩、界面活性剤等があげられる。
【０１１２】
＜検出試薬＞
本発明の検出試薬は、前記本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子を含むことを特徴とする、前記ＨＭＧＢ１を検出するためのＨＭＧＢ１検出試薬である。本発明は、前記本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子を含んでいればよく、その他の構成は何ら制限されない。
【０１１３】
本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、前述のように、ＨＭＧＢ１に結合可能である。このため、例えば、本発明の検出試薬を用いて、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子とＨＭＧＢ１との結合の有無を確認することにより、試料中におけるＨＭＧＢ１を定性または定量可能となる。前記ＨＭＧＢ１結合核酸分子とＨＭＧＢ１との結合の有無の確認方法は、特に制限されず、核酸とタンパク質との結合を検出する公知の方法を利用できる。このように本発明の検出試薬を用いれば、ＨＭＧＢ１を容易に検出できることから、例えば、生化学や臨床の分野に有用である。
【０１１４】
＜治療方法＞
本発明の治療方法は、前記ＨＭＧＢ１が関与する疾患の対象に、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子を投与する工程を含むことを特徴とする。前記ＨＭＧＢ１が関与する疾患は、特に制限されないが、例えば、癌、炎症および脳卒中からなる群から選択された少なくとも一つの疾患があげられる。前記癌は、例えば、乳癌、大腸癌、メラノーマ、前立腺癌、膵臓癌および肺癌等があげられる。本発明の治療方法によれば、例えば、前記疾患の予防、前記疾患の進行の抑制または前記疾患の治療等が可能である。本発明の治療方法は、予防方法の意味も含み、前記疾患の危険性がある対象に、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子を投与する工程を含んでもよい。本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子の投与方法、投与条件等は、特に制限されず、前述の通りである。また、前記投与対象（例えば、患者）も、特に制限されない。前記生体は、例えば、ＨＭＧＢ１遺伝子および／またはＨＭＧＢ１オーソログ遺伝子を有する生物があげられ、具体例としては、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト哺乳類、鳥類、魚類等の動物があげられる。前記投与工程において、例えば、本発明の組成物を投与してもよい。
【０１１５】
本発明は、前記ＨＭＧＢ１が関与する疾患の治療に使用するための核酸分子であることを特徴とする。前記核酸分子は、前記本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子である。前記本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、前述の通りである。また、本発明は、前記ＨＭＧＢ１が関与する疾患の治療に使用するための組成物であることを特徴とする。前記組成物は、前記本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子を含む前記本発明の組成物である。前記本発明の組成物は、前述の通りである。
【実施例】
【０１１６】
つぎに、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコールに基づいて使用した。【０１１７】
［実施例１］
ＨＭＧＢ１に結合可能なＲＮＡアプタマーを作製し、各ＲＮＡアプタマーについて、ＨＭＧＢ１に対する結合能を確認した。【０１１８】
（１）ＲＮＡアプタマー
＃４７（配列番号６５）、＃８０（配列番号６７）、＃０６（配列番号５６）、＃３６（配列番号６０）、＃３４（配列番号６３）、＃０８（配列番号４６）、＃１０（配列番号５８）の各ＲＮＡアプタマーを、公知の核酸合成方法により作製し、実施例のＲＮＡアプタマーとして使用した。４０塩基長のランダム配列を含む下記配列番号８２で表わされるオリゴヌクレオチドからなるＲＮＡを複数含むＲＮＡライブラリー（４０Ｎ）を、比較例のＲＮＡとした（以下、同様）。配列番号８２において、「ｎ」は、アデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルである。
４０Ｎ（配列番号８２）
gggacgcucacguacgcucannnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnucagugccuggacgugcagu【０１１９】
（２）Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能
前記各ＲＮＡアプタマーについて、Ｎ末端にＨｉｓ−ｔａｇが付加されたＨＭＧＢ１（Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１）に対する結合能を確認した。前記結合能の解析には、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｘ（ＧＥヘルスケア社製）を、その使用説明書にしたがって使用した。【０１２０】
まず、ＢＩＡＣＯＲＥ専用のセンサーチップ（商品名Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ  ＳＡ、ＧＥヘルスケア社製）を、前記ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｘにセットした。前記センサーチップのフローセル２に、ランニングバッファーを用いて、５μｍｏｌ／Ｌのビオチン化デオキシチミジンをインジェクションし、シグナル強度（ＲＵ：Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｕｎｉｔ）が約１０００ＲＵになるまで結合させた。前記ビオチン化デオキシチミジンは、５’末端をビオチン化した２０塩基長のデオキシチミジンを使用した。そして、前記チップの前記フローセル１、２に、ランニングバッファーを用いて、１０μｇ／ｍＬのＲＮＡアプタマーを流速２０μＬ／ｍｉｎで１分間インジェクションし、シグナル強度が約１０００ＲＵになるまで結合させた。続いて、６７５ｎｍｏｌ／Ｌの前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１を、前記ランニングバッファーを用いて、流速２０μＬ／ｍｉｎで３０秒間インジェクションし、引き続き、同じ条件で前記ランニングバッファーを流して洗浄を行った。前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクションおよび前記ランニングバッファーによる洗浄に並行して、シグナル強度の測定を行った。前記ランニングバッファーの組成は、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ、５００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ-１００（登録商標）とし、そのｐＨは、７．２とした。また、非特異結合を抑えるためのブロッキング剤として、ｔＲＮＡを１ｍｇ／ｍＬ濃度で使用した。比較例は、前記実施例のＲＮＡアプタマーに代えて、前記比較例のＲＮＡを使用した以外は、同様にして、シグナル強度の測定を行った。これらの結果を図１に示す。【０１２１】
図１は、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。図１のグラフにおいて、縦軸は、前記ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｘで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示し、横軸は、解析時間（秒）を示す。横軸において、−１０秒〜０秒が、前記ランニングバッファーによるプレ洗浄の時間であり、０秒が、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション開始時点であり、０秒〜３０秒が、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション時間であり、３０秒以降が、前記ランニングバッファーによる洗浄の時間である。【０１２２】
図１に示すように、前記比較例のＲＮＡを使用した場合、シグナル強度の増加が見られないことから、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１と結合していないことがわかった。これに対して、実施例の各ＲＮＡアプタマーによれば、シグナル強度の増加が見られたことから、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１と結合していることがわかった。【０１２３】
そして、得られたシグナル強度から、各ＲＮＡアプタマーと前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１との解離定数を求めた。この結果を下記表２に示す。下記表２に示すように、前記比較例のＲＮＡは、解離定数が１．０４×１０−６であるのに対して、前記実施例の各ＲＮＡアプタマーは、解離定数が１０−１３〜１０−７オーダーという優れた値を示し、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能に優れることがわかった。特に、＃０６および＃０８のＲＮＡアプタマーは、それぞれ解離定数のオーダーが１０−１０および１０−１１であり、抗体の一般的なオーダー（１０−９オーダー）よりも十分に低い、つまり、十分に高い結合能を示した。さらに、＃４７および＃８０のＲＮＡアプタマーは、それぞれ、１０−１２オーダーおよび１０−１３オーダーを示し、このオーダーは、出願時において報告されたことのないオーダーである。【０１２４】
【表２】
0005582580.tif 000003
【０１２５】
（３）ＨＭＧＢ１に対する結合能
前記各ＲＮＡアプタマーについて、Ｎ末端にＨｉｓ−ｔａｇが付加されていないＨＭＧＢ１に対する結合能を確認した。前記結合能の解析は、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に代えて、１μｍｏｌ／Ｌの前記ＨＭＧＢ１を使用し、前記ＨＭＧＢ１のインジェクション時間を６０秒とした以外は、前記（２）と同様にして、結合能の解析を行った。これらの結果を、図２に示す。【０１２６】
図２は、前記ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。図２のグラフにおいて、縦軸は、前記ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｘで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示し、横軸は、解析時間（秒）を示す。横軸において、−１０秒〜０秒が、前記ランニングバッファーによるプレ洗浄の時間であり、０秒が、前記ＨＭＧＢ１のインジェクション開始時点であり、０秒〜６０秒が、前記ＨＭＧＢ１のインジェクション時間であり、６０秒以降が、前記ランニングバッファーによる洗浄の時間である。【０１２７】
図２に示すように、Ｈｉｓ−ｔａｇを付加していないＨＭＧＢ１についても、実施例の各ＲＮＡアプタマーは高い結合能を示した。この結果から、実施例のＲＮＡアプタマーが、Ｈｉｓ−ｔａｇではなく、ＨＭＧＢ１に結合するＲＮＡアプタマーであることがわかった。【０１２８】
（４）Ｈｉｓ-ｔａｇに対する結合能
前記各ＲＮＡアプタマーについて、Ｈｉｓ−ｔａｇに対する結合能を確認した。前記結合能の解析は、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に代えて、３００ｎｍｏｌ／Ｌの前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＭＩＦタンパク質を使用した以外は、前記（２）と同様にして、結合能の解析を行った。これらの結果を、図３に示す。【０１２９】
図３は、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＭＩＦタンパク質に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。図３のグラフにおいて、縦軸は、前記ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｘで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示し、横軸は、解析時間（秒）を示す。横軸において、−１０秒〜０秒が、前記ランニングバッファーによるプレ洗浄の時間であり、０秒が、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＭＩＦタンパク質のインジェクション開始時点であり、０秒〜３０秒が、前記Ｈｉｓ-ｔａｇ付加ＭＩＦタンパク質のインジェクション時間であり、３０秒以降が、前記ランニングバッファーによる洗浄の時間である。【０１３０】
図３に示すように、実施例の各ＲＮＡアプタマーは、Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＭＩＦタンパク質のインジェクション中（０秒〜３０秒）に若干のシグナル強度の増加が見られたが、経時的に増加することはなく、３０秒以降の洗浄により、シグナル強度の急速な減少が見られ、最終的にはシグナル強度が０となった。このことから、実施例の各ＲＮＡアプタマーは、Ｈｉｓ−ｔａｇに結合するものではないことが確認された。【０１３１】
（５）生体の生理条件下におけるＨＭＧＢ１に対する結合能
生理条件下でのＨＭＧＢ１に対する前記各ＲＮＡアプタマーの結合能を確認した。前記ランニングバッファーにおけるＮａＣｌ濃度５００ｍｍｏｌ／Ｌを、生体の生理条件である１５０ｍｍｏｌ／Ｌに設定し、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション時間を４５秒とした以外は、前記（２）と同様にして、結合能の解析を行った。これらの結果を、図４に示す。【０１３２】
図４は、生理条件下における、前記ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。図４のグラフにおいて、縦軸は、前記ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｘで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示し、横軸は、解析時間（秒）を示す。横軸において、−２０秒〜０秒が、前記ランニングバッファーによるプレ洗浄の時間であり、０秒が、前記ＨＭＧＢ１のインジェクション開始時点であり、０秒〜４５秒が、前記ＨＭＧＢ１のインジェクション時間であり、４５秒以降が、前記ランニングバッファーによる洗浄の時間である。【０１３３】
図４に示すように、実施例の各ＲＮＡアプタマーは、生理条件下においても、前記ＨＭＧＢ１に対して高い結合能を示した。この結果から、実施例のＲＮＡアプタマーが、生理条件下においても、ＨＭＧＢ１に結合するアプタマーであることがわかった。このため、本発明のＲＮＡアプタマーによれば、例えば、生体に投与しても、生体中のＨＭＧＢ１と優れた結合能で結合できるといえる。【０１３４】
［実施例２］
ＨＭＧＢ１に結合可能なＲＮＡアプタマーを作製し、各ＲＮＡアプタマーについて、ＨＭＧＢ１に対する結合能を確認した。【０１３５】
（１）ＲＮＡアプタマー
Ｒ８ｃ６＿１（配列番号７４）およびＲ８ｃ６＿１４（配列番号７５）の各ＲＮＡアプタマーを、公知の核酸合成方法により作製し、実施例のＲＮＡアプタマーとして使用した。【０１３６】
（２）Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能
前記（１）で調製したＲＮＡアプタマーを使用し、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１の濃度を１μｍｏｌ／Ｌ、インジェクション時間を６０秒とした以外は、前記実施例１の前記（２）と同様にして、Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能の解析を行った。これらの結果を、図５に示す。【０１３７】
図５は、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。図５のグラフにおいて、縦軸は、前記ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｘで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示し、横軸は、解析時間（秒）を示す。横軸において、−２０秒〜０秒が、前記ランニングバッファーによるプレ洗浄の時間であり、０秒が、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション開始時点であり、０秒〜６０秒が、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション時間であり、６０秒以降が、前記ランニングバッファーによる洗浄の時間である。【０１３８】
図５に示すように、実施例の各ＲＮＡアプタマーによれば、シグナル強度の増加が見られたことから、前記ＨＭＧＢ１と結合していることがわかった。また、Ｒ８ｃ６＿１およびＲ８ｃ６＿１４のＲＮＡアプタマーの解離定数は、それぞれ７．５２×１０−１４および１．０６×１０−１３と極めて低く、非常に優れた結合能を示した。【０１３９】
［実施例３］
Ｒ８ｃ６＿１（配列番号７４）のＲＮＡアプタマーを、さらに小型化し、ＨＭＧＢ１に対する結合能を確認した。【０１４０】
（１）ＲＮＡアプタマー
下記表３に示す各ＲＮＡアプタマーを、公知の核酸合成方法により作製し、実施例のＲＮＡアプタマーとして使用した。前記ＲＮＡアプタマーは、それぞれ、Ｒ８ｃ６＿１の５’側の領域または３’側の領域を欠失した塩基配列とした。【０１４１】
【表３】
0005582580.tif 000004
【０１４２】
（２）Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能
前記ＲＮＡアプタマーを使用し、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１の濃度を６３５ｎｍｏｌ／Ｌとし、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション時間を６０秒とした以外は、前記実施例１の前記（２）と同様にして、Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能の解析を行った。また、比較例として、前記４０Ｎについても、同様に解析を行った。これらの結果を、図６に示す。【０１４３】
図６は、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。図６のグラフにおいて、縦軸は、前記ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｘで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示し、横軸は、解析時間（秒）を示す。横軸において、−２０秒〜０秒が、前記ランニングバッファーによるプレ洗浄の時間であり、０秒が、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション開始時点であり、０秒〜６０秒が、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション時間であり、６０秒以降が、前記ランニングバッファーによる洗浄の時間である。【０１４４】
図６に示すように、Ｒ８ｃ６＿１を小型化したＲＮＡアプタマーは、それぞれ、シグナル強度の増加が見られたことから、前記ＨＭＧＢ１と結合していることがわかった。中でも、Ｒ８ｃ６＿１の５’側を欠失させたＲ８ｃ６＿１−１５、Ｒ８ｃ６＿１−１８、Ｒ８ｃ６＿１−２０およびＲ８ｃ６＿１−２１は、Ｒ８ｃ６＿１よりも優れた結合能を示した。【０１４５】
［実施例４］
Ｒ８ｃ６＿１（配列番号７４）の小型化ＲＮＡアプタマーをフルオロ化して、ＨＭＧＢ１に対する結合能を確認した。【０１４６】
（１）ＲＮＡアプタマー
リボース残基の２’位がフルオロ化された２’−フルオロ−ＣＴＰおよび２’−フルオロ−ＵＴＰ（以下、同様）を用いて、前記実施例３の前記表３に示す各ＲＮＡアプタマーを、公知の核酸合成方法により作製し、実施例のフルオロ化ＲＮＡアプタマーとして使用した。前記フルオロ化ＲＮＡアプタマーは、前記表３に示す塩基配列において、シトシンヌクレオチド残基およびウラシルヌクレオチド残基がフルオロ化されている。各フルオロ化ＲＮＡアプタマーは、それぞれ、２’Ｆ−Ｒ８ｃ６＿１、２’Ｆ−Ｒ８ｃ６＿１−１、２’Ｆ−Ｒ８ｃ６＿１−４、２’Ｆ−Ｒ８ｃ６＿１−１５、２’Ｆ−Ｒ８ｃ６＿１−１８、２’Ｆ−Ｒ８ｃ６＿１−２１と表わす。また、前記Ｎ４０について、シトシンヌクレオチド残基およびウラシルヌクレオチド残基がフルオロ化し、フルオロ化Ｎ４０（２’Ｆ−Ｎ４０）を作製し、比較例として使用した（以下、同様）。【０１４７】
（２）Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能
前記フルオロ化ＲＮＡアプタマーを使用し、Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１の濃度を２００ｎｍｏｌ／Ｌとし、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション時間を６０秒とした以外は、前記実施例１の前記（２）と同様にして、ＨＭＧＢ１に対する結合能の解析を行った。また、前記２’Ｆ−Ｎ４０、フルオロ化していない未修飾のＲ８ｃ６＿１についても、同様に解析を行った。これらの結果を、図７に示す。【０１４８】
図７は、前記ＨＭＧＢ１に対する各フルオロ化ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。図７のグラフにおいて、縦軸は、前記ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｘで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示し、横軸は、解析時間（秒）を示す。横軸において、−２０秒〜０秒が、前記ランニングバッファーによるプレ洗浄の時間であり、０秒が、前記ＨＭＧＢ１のインジェクション開始時点であり、０秒〜６０秒が、前記ＨＭＧＢ１のインジェクション時間であり、６０秒以降が、前記ランニングバッファーによる洗浄の時間である。【０１４９】
図７に示すように、Ｒ８ｃ６＿１を小型化した前記フルオロ化ＲＮＡアプタマーは、それぞれ、シグナル強度の増加が見られたことから、前記ＨＭＧＢ１と結合していることがわかった。中でも、２’Ｆ−Ｒ８ｃ６＿１−１８は、未修飾のＲ８ｃ６＿１と同等の優れた結合能を示した。フルオロ化したＲＮＡアプタマーは、通常、ＲＮａｓｅ耐性を示すことが知られている。このため、ＨＭＧＢ１に結合能を有する前記フルオロ化ＲＮＡアプタマーは、例えば、生体内に投与されても分解され難いため、例えば、医薬品等に有用であるといえる。【０１５０】
［実施例５］
Ｒ８ｃ６＿１（配列番号７４）およびその小型化ＲＮＡアプタマーであるＲ８ｃ６＿１−１８（配列番号８７）を、それぞれフルオロ化して、ＨＭＧＢ１に対する結合能を確認した。【０１５１】
（１）ＲＮＡアプタマー
前記２’−フルオロ−ＣＴＰおよび前記２’−フルオロ−ＵＴＰを用いて、前記Ｒ８ｃ６＿１および前記Ｒ８ｃ６＿１−１８の各ＲＮＡアプタマーを、公知の核酸合成方法により作製し、実施例のフルオロ化ＲＮＡアプタマーとして使用した。前記フルオロ化ＲＮＡアプタマーは、Ｒ８ｃ６＿１（配列番号７４）およびＲ８ｃ６＿１−１８（配列番号８７）の塩基配列において、シトシンヌクレオチド残基およびウラシルヌクレオチド残基がフルオロ化されている。各フルオロ化ＲＮＡアプタマーは、それぞれ、２’Ｆ−Ｒ８ｃ６＿１、２’Ｆ−Ｒ８ｃ６＿１−１８と表わす。【０１５２】
（２）Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能
前記フルオロ化ＲＮＡアプタマーを使用し、Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１の濃度を２００ｎｍｏｌ／Ｌとし、前記ランニングバッファーにおけるＮａＣｌの濃度を１５０ｍｍｏｌ／Ｌとし、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション時間を６０秒とした以外は、前記実施例１の前記（２）と同様にして、Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能の解析を行った。また、前記２’Ｆ−Ｎ４０、フルオロ化していない未修飾のＲ８ｃ６＿１についても、同様に解析を行った。これらの結果を、図８に示す。【０１５３】
図８は、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各フルオロ化ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。図８のグラフにおいて、縦軸は、前記ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｘで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示し、横軸は、解析時間（秒）を示す。横軸において、−２０秒〜０秒が、前記ランニングバッファーによるプレ洗浄の時間であり、０秒が、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション開始時点であり、０秒〜６０秒が、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション時間であり、６０秒以降が、前記ランニングバッファーによる洗浄の時間である。【０１５４】
図８に示すように、前記フルオロ化ＲＮＡアプタマーは、それぞれ、シグナル強度の増加が見られたことから、前記ＨＭＧＢ１と結合していることがわかった。中でも、２’Ｆ−Ｒ８ｃ６＿１−１８は、未修飾のＲ８ｃ６＿１と同等の優れた結合能を示した。【０１５５】
［実施例６］
Ｒ８ｃ６＿１−１８（配列番号８７）による、ＨＭＧＢ１とレセプターＴＬＲ−２との結合阻害を確認した。【０１５６】
（１）プルダウンアッセイ
Ｎ末端にＨｉｓ−ｔａｇが付加されたＴＬＲ−２（Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＴＬＲ−２）を使用した。２μｇのＨｉｓ−ｔａｇ付加ＴＬＲ−２、２μｇのＨＭＧＢ１および所定量のＲ８ｃ６＿１−１８を、５０μＬのバインディングバッファーに添加し、この混合液を、４℃で２０分間インキュベートした。Ｒ８ｃ６＿１−１８の添加量は、１μｇ、２μｇおよび４μｇとした。前記バインディングバッファーの組成は、前記ランニングバッファーと同じであり、１ｍｇ／ｍＬ  ｔＲＮＡ添加またはｔＲＮＡ未添加とした。前記混合液に、Ｃｏ２＋が結合したアガロースビーズ１μＬ（製品名ＢＤ  ＴＡＬＯＮ（登録商標）Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎ：ＢＤ  バイオサイエンス社製）を加えて、４℃で２０分間インキュベートした。インキュベート後、前記アガロースビーズを洗浄し、抗ＨＭＧＢ１抗体（製品名Ｒａｂｂｉｔ  ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ｔｏ  ＨＭＧＢ１：ａｂｃａｍ社製）を用いて、ウェスタンブロッティングを行った。また、比較例として前記４０Ｎについても、同様に解析を行った。これらの結果を、図９に示す。【０１５７】
図９は、ＨＭＧＢ１とＴＬＲ−２との結合を示すプルダウンアッセイの写真である。図９において、ｔＲＮＡ「−」は、ｔＲＮＡ未添加の前記バインディングバッファーの使用を示し、ｔＲＮＡ「＋」は、ｔＲＮＡ添加の前記バインディングバッファーの使用を示す。図９において、左から、レーン「Ｍ」は、分子量マーカー、レーン「−」は、ｔＲＮＡ未添加且つＲＮＡアプタマー未添加の結果、レーン「＋」は、ｔＲＮＡ添加且つＲＮＡアプタマー未添加の結果、レーン「４０Ｎ」は、それぞれ、添加量４μｇ、２μｇ、１μｇの結果、レーン「Ｒ８ｃ６＿１−１８」は、それぞれ、添加量４μｇ、２μｇ、１μｇの結果を示す。また、各レーンの結果について、検出したＨＭＧＢ１量をＴＬＲ−２量で補正し、レーン「＋」の補正値を１００とした相対値を、各レーンの下に示す。【０１５８】
図９に示すように、比較例の４０Ｎを添加した場合、添加量の増加によっても、ＨＭＧＢ１の量は変化しなかった。これに対して、Ｒ８ｃ６＿１−１８を添加した場合、添加量の増加によって、ＨＭＧＢ１量が低下した。この結果から、Ｒ８ｃ６＿１−１８によって、ＨＭＧＢ１とＴＬＲ−２との結合が阻害されていることがわかる。このため、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子は、例えば、ＨＭＧＢ１が関与する疾患の治療に有用であるといえる。【０１５９】
［実施例７］
ＲＮＡアプタマーをフルオロ化して、ＨＭＧＢ１に対する結合能を確認した。【０１６０】
（１）ＲＮＡアプタマー
前記２’−フルオロ−ＣＴＰおよび前記２’−フルオロ−ＵＴＰを用いて、下記表４に示す各ＲＮＡアプタマーを、公知の核酸合成方法により作製し、実施例のフルオロ化ＲＮＡアプタマーとして使用した。前記フルオロ化ＲＮＡアプタマーは、下記表４に示す塩基配列において、シトシンヌクレオチド残基および／またはウラシルヌクレオチド残基がフルオロ化されている。ウラシルヌクレオチド残基およびシトシンヌクレオチド残基がフルオロ化されたＲＮＡアプタマーを、それぞれ、２’Ｆ−ＣＵ−Ｒ８ｃ６＿１、２’Ｆ−ＣＵ−＃０６、２’Ｆ−ＣＵ−ＣＵ＃８０、２’Ｆ−ＣＵ−Ｒ４＿９０６８と表わす。シトシンヌクレオチド残基のみがフルオロ化されたＲＮＡアプタマーを、それぞれ、２’Ｆ−Ｃ−Ｒ８ｃ６＿１、２’Ｆ−Ｃ−＃０６、２’Ｆ−Ｃ−＃８０、２’Ｆ−Ｃ−Ｒ４＿９０６８と表わす。ウラシルヌクレオチド残基のみがフルオロ化されたＲＮＡアプタマーを、それぞれ、２’Ｆ−Ｕ−Ｒ８ｃ６＿１、２’Ｆ−Ｕ−＃０６、２’Ｆ−Ｕ−＃８０、２’Ｆ−Ｕ−Ｒ４＿９０６８と表わす。【０１６１】
【表４】
0005582580.tif 000005
【０１６２】
（２）Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能
前記フルオロ化ＲＮＡアプタマーを使用し、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１（Ｓｉｇｍａ社製）の濃度を２００ｎｍｏｌ／Ｌとし、前記ランニングバッファーにおけるＮａＣｌの濃度を１５０ｍｍｏｌ／Ｌとし、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション時間を６０秒とした以外は、前記実施例１の前記（２）と同様にして、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能の解析を行った。また、フルオロ化していない未修飾のＲ８ｃ６＿１についても、同様に解析を行った。また、比較例として、フルオロ化していない前記４０Ｎについても、同様に解析を行った。これらの結果を、図１０に示す。【０１６３】
図１０は、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各フルオロ化ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。図１０のグラフにおいて、縦軸は、Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション終了時における、前記ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｘで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示す。前記グラフは、左から、４０Ｎ、＃０６、＃８０、Ｒ８ｃ６＿１、ＨＭＧＢ１Ｒ４＿９０６８の結果を示す。前記グラフにおいて、「２’Ｆ−ＣＵ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ」は、シトシンヌクレオチド残基およびウラシルヌクレオチド残基の両方がフルオロ化されたＲＮＡアプタマーの結果であり、「２’Ｆ−Ｃ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ」は、シトシンヌクレオチド残基のみがフルオロ化されたＲＮＡアプタマーの結果であり、「２’Ｆ−Ｕ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ」は、ウラシルヌクレオチド残基のみがフルオロ化されたＲＮＡアプタマーの結果であり、「ｎｏｎ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ」は、未修飾のＲＮＡアプタマーＲ８ｃ６＿１および未修飾のＮ４０の結果である。【０１６４】
図１０に示すように、各フルオロ化ＲＮＡアプタマーは、それぞれ、比較例の未修飾の４０Ｎよりも高いシグナル強度の増加が見られたことから、前記ＨＭＧＢ１と結合していることがわかった。中でも、２’Ｆ−ＣＵ−Ｒ８ｃ６＿１、２’Ｆ−Ｃ−Ｒ８ｃ６＿１および２’Ｆ−Ｕ−Ｒ８ｃ６＿１は、優れた結合能を示し、特に、２’Ｆ−ＣＵ−Ｒ８ｃ６＿１は、未修飾のＲ８ｃ６＿１と同等の結合能を示した。【０１６５】
［実施例８］
Ｒ８ｃ６＿１（配列番号７４）およびＲ８ｃ６＿１−１８（配列番号８７）の二次構造を推定した。これらの二次構造を、図１１に示す。【０１６６】
［実施例９］
Ｒ８ｃ６＿１（配列番号７４）のＲＮＡアプタマーを、さらに小型化し、ＨＭＧＢ１に対する結合能を確認した。【０１６７】
（１）ＲＮＡアプタマー
下記表５および下記表６に示す各ＲＮＡアプタマーを、公知の核酸合成方法により作製し、実施例のＲＮＡアプタマーとして使用した。【０１６８】
【表５】
0005582580.tif 000006
【０１６９】
前記表５のＲＮＡアプタマーは、Ｒ８ｃ６＿１を小型化したアプタマーである。図１８に、Ｒ８ｃ６＿１、図１９に、Ｒ８ｃ６＿１−１８の推定二次構造の概略図を示す。前記表５において、Ｒ８ｃ６＿１−２５およびＲ８ｃ６＿１−１８は、それぞれ、Ｒ８ｃ６＿１から、その５’側の領域を欠失した塩基配列とした。Ｒ８ｃ６＿１−１８−Ｓ２、Ｒ８ｃ６＿１−１８−Ｓ４およびＲ８ｃ６＿１−１８−Ｓ６は、それぞれ、Ｒ８ｃ６＿１から、Ｒ８ｃ６＿１−１８と同様に、その５’側の領域を欠失し、さらに、図１８に示すＳ２、Ｓ４またはＳ６の領域を欠失した塩基配列とした。Ｒ８ｃ６＿１の推定二次構造において、Ｓ２およびＳ４は、それぞれ、ステム構造を形成する塩基対領域であり、Ｓ６は、ステムループ構造の領域である。【０１７０】
【表６】
0005582580.tif 000007
【０１７１】
前記表６のＲＮＡアプタマーは、前記表５のＲ８ｃ６＿１−２５−Ｓ６をさらに小型化したアプタマーである。図２０に、Ｒ８ｃ６＿１−２５−Ｓ６の推定二次構造の概略図を示す。Ｒ８ｃ６＿１−２５−Ｓ６Ａ２、Ｒ８ｃ６＿１−２５−Ｓ６Ｃ、Ｒ８ｃ６＿１−２５−Ｓ８は、それぞれ、図２０に示すＡ２、ＣおよびＳ８の領域を欠失した塩基配列とした。また、Ｒ８ｃ６＿１−２６−Ｓ６は、それぞれ、Ｒ８ｃ６＿１−２５−Ｓ６の５’側の１塩基を欠失した塩基配列とした。【０１７２】
（２）Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能
前記ＲＮＡアプタマーを使用し、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１の濃度を１６０ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記実施例１の前記（２）と同様にして、Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能の解析を行った。また、比較例として、前記４０Ｎについても、同様に解析を行った。これらの結果を、図１２および図１３に示す。【０１７３】
図１２および図１３は、それぞれ、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。図１２および図１３のグラフにおいて、縦軸は、前記ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｘで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示し、横軸は、解析時間（秒）を示す。横軸において、−１０秒〜０秒が、前記ランニングバッファーによるプレ洗浄の時間であり、０秒が、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション開始時点であり、０秒〜３０秒が、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション時間であり、３０秒以降が、前記ランニングバッファーによる洗浄の時間である。【０１７４】
図１２に示すように、Ｒ８ｃ６＿１を小型化したＲＮＡアプタマーは、それぞれ、シグナル強度の増加が見られたことから、前記ＨＭＧＢ１と結合していることがわかった。中でも、Ｒ８ｃ６＿１−１８−Ｓ２、Ｒ８ｃ６＿１−２５は、Ｒ８ｃ６＿１よりも優れた結合能を示した。【０１７５】
また、図１３に示すように、Ｒ８ｃ６＿１の小型化したＲＮＡアプタマーであるＲ８ｃ６＿１−２５を、さらに小型化した各ＲＮＡアプタマーは、それぞれ、シグナル強度の増加が見られたことから、前記ＨＭＧＢ１と結合していることがわかった。【０１７６】
［実施例１０］
ＲＮＡアプタマーをフルオロ化して、ＨＭＧＢ１に対する結合能を確認した。【０１７７】
（１）ＲＮＡアプタマー
前記２’−フルオロ−ＣＴＰおよび前記２’−フルオロ−ＵＴＰを用いて、下記表７に示す各ＲＮＡアプタマーを、公知の核酸合成方法により作製し、実施例のフルオロ化ＲＮＡアプタマーとして使用した。前記フルオロ化ＲＮＡアプタマーは、前記表７に示す塩基配列において、シトシンヌクレオチド残基およびウラシルヌクレオチド残基がフルオロ化されている。ウラシルヌクレオチド残基およびシトシンヌクレオチド残基がフルオロ化されたＲＮＡアプタマーを、それぞれ、２’Ｆ−Ｒ８ｃ６＿１−１８−Ｓ６、２’Ｆ−Ｒ８ｃ６＿１−２５、２’Ｆ−Ｒ８ｃ６＿１−２５−Ｓ６、２’Ｆ−Ｒ８ｃ６＿１−２５−Ｓ６Ａ、２’Ｆ−Ｒ８ｃ６＿１−２５−Ｓ６Ａ２、２’Ｆ−Ｒ８ｃ６＿１−２５−Ｓ６Ａ３、２’Ｆ−Ｒ８ｃ６＿１−２５−Ｓ６Ｃ、２’Ｆ−Ｒ８ｃ６＿１−２５−Ｓ６Ｃ２、２’Ｆ−Ｒ８ｃ６＿１−２５−Ｓ８と表わす。また、前記Ｎ４０についても、同様に、前記２’−フルオロ−ＣＴＰおよび前記２’−フルオロ−ＵＴＰを用いてフルオロ化を行った。【０１７８】
【表７】
0005582580.tif 000008
【０１７９】
（２）Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能
前記ＲＮＡアプタマーを使用し、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１の濃度を１５０５００ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記実施例１の前記（２）と同様にして、Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能の解析を行った。これらの結果を、図１４に示す。【０１８０】
図１４は、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各フルオロ化ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。図１４のグラフにおいて、縦軸は、前記ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｘで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示し、横軸は、解析時間（秒）を示す。横軸において、−１０秒〜０秒が、前記ランニングバッファーによるプレ洗浄の時間であり、０秒が、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション開始時点であり、０秒〜３０秒が、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション時間であり、３０秒以降が、前記ランニングバッファーによる洗浄の時間である。【０１８１】
図１４に示すように、小型化した前記フルオロ化ＲＮＡアプタマーは、それぞれ、シグナル強度の増加が見られたことから、前記ＨＭＧＢ１と結合していることがわかった。中でも、２’Ｆ−Ｒ８ｃ６＿１−１８−Ｓ６および２’−Ｒ８ｃ６＿１−２５は、優れた結合能を示した。【０１８２】
［実施例１１］
Ｒ８ｃ６＿１（配列番号７４）のＲＮＡアプタマーを、さらに小型化し、ＨＭＧＢ１に対する結合能を確認した。【０１８３】
（１）ＲＮＡアプタマー
下記表８に示す各ＲＮＡアプタマーを、公知の核酸合成方法により作製し、実施例のＲＮＡアプタマーとして使用した。【０１８４】
【表８】
0005582580.tif 000009
【０１８５】
前記表８のＲＮＡアプタマーは、Ｒ８ｃ６＿１を小型化したアプタマーである。Ｒ８ｃ６＿１−２１−Ｓ６、Ｒ８ｃ６＿１−２２−Ｓ６、Ｒ８ｃ６＿１−２３−Ｓ６、Ｒ８ｃ６＿１−２４−Ｓ６は、それぞれ、前記Ｒ８ｃ６＿１−１８−Ｓ６から、その５’側の領域を欠失した塩基配列とした。また、Ｒ８ｃ６＿１−２１−Ｓ８、Ｒ８ｃ６＿１−２２−Ｓ８、Ｒ８ｃ６＿１−２３−Ｓ８、Ｒ８ｃ６＿１−２４−Ｓ８は、それぞれ、５’側の配列が、Ｒ８ｃ６＿１−２１−Ｓ６、Ｒ８ｃ６＿１−２２−Ｓ６、Ｒ８ｃ６＿１−２３−Ｓ６、Ｒ８ｃ６＿１−２４−Ｓ６と同じであり、前記図２０に示す前記Ｓ８と同じ領域を欠失する塩基配列とした。【０１８６】
（２）Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能
前記ＲＮＡアプタマーを使用し、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１の濃度を１５０ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記実施例１の前記（２）と同様にして、Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能の解析を行った。また、比較例として、前記４０Ｎについても、同様に解析を行った。これらの結果を、図１５に示す。【０１８７】
図１５は、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。図１５のグラフにおいて、縦軸は、前記ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｘで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示し、横軸は、解析時間（秒）を示す。横軸において、−１０秒〜０秒が、前記ランニングバッファーによるプレ洗浄の時間であり、０秒が、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション開始時点であり、０秒〜３０秒が、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション時間であり、３０秒以降が、前記ランニングバッファーによる洗浄の時間である。【０１８８】
図１５に示すように、Ｒ８ｃ６＿１を小型化したＲＮＡアプタマーは、それぞれ、シグナル強度の増加が見られたことから、前記ＨＭＧＢ１と結合していることがわかった。【０１８９】
［実施例１２］
ＲＮＡアプタマーをフルオロ化して、ＨＭＧＢ１に対する結合能を確認した。【０１９０】
（１）ＲＮＡアプタマー
前記２’−フルオロ−ＣＴＰおよび前記２’−フルオロ−ＵＴＰを用いて、下記表９および下記表１０に示す各ＲＮＡアプタマーを、公知の核酸合成方法により作製し、実施例のフルオロ化ＲＮＡアプタマーとして使用した。前記フルオロ化ＲＮＡアプタマーは、前記表９および前記表１０に示す塩基配列において、シトシンヌクレオチド残基およびウラシルヌクレオチド残基がフルオロ化されている。ウラシルヌクレオチド残基およびシトシンヌクレオチド残基がフルオロ化されたＲＮＡアプタマーを、それぞれ、２’Ｆ−Ｒ８ｃ６＿１−２１−Ｓ６、２’Ｆ−Ｒ８ｃ６＿１−２２−Ｓ６、２’Ｆ−Ｒ８ｃ６＿１−２３−Ｓ６、２’Ｆ−Ｒ８ｃ６＿１−２４−Ｓ６、２’Ｆ−Ｒ８ｃ６＿１−２５−Ｓ６、２’Ｆ−Ｒ８ｃ６＿１−２６−Ｓ６、２’Ｆ−Ｒ８ｃ６＿１−２７−Ｓ６、２’Ｆ−Ｒ８ｃ６＿１−２１−Ｓ８、２’Ｆ−Ｒ８ｃ６＿１−２２−Ｓ８、２’Ｆ−Ｒ８ｃ６＿１−２３−Ｓ８、２’Ｆ−Ｒ８ｃ６＿１−２４−Ｓ８、２’Ｆ−Ｒ８ｃ６＿１−２５−Ｓ８、２’Ｆ−Ｒ８ｃ６＿１−２５−Ｓ８ＣＡと表わす。【０１９１】
【表９】
0005582580.tif 000010
【０１９２】
【表１０】
0005582580.tif 000011
【０１９３】
（２）Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能
前記ＲＮＡアプタマーを使用し、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１の濃度を１５０ｎｍｏｌ／Ｌとした以外は、前記実施例１の前記（２）と同様にして、Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する結合能の解析を行った。また、比較例として、未修飾の前記４０Ｎについても、同様に解析を行った。これらの結果を、図１６および図１７に示す。図１６および図１７において、各ＲＮＡアプタマーの名称は、Ｒ８ｃ６＿１を省略して表わした。【０１９４】
図１６および図１７は、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１に対する各フルオロ化ＲＮＡアプタマーの結合能を示すグラフである。図１６および図１７のグラフにおいて、縦軸は、前記ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｘで測定したシグナル強度（ＲＵ）を示し、横軸は、解析時間（秒）を示す。横軸において、−１０秒〜０秒が、前記ランニングバッファーによるプレ洗浄の時間であり、０秒が、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション開始時点であり、０秒〜３０秒が、前記Ｈｉｓ−ｔａｇ付加ＨＭＧＢ１のインジェクション時間であり、３０秒以降が、前記ランニングバッファーによる洗浄の時間である。【０１９５】
図１６および図１７に示すように、小型化した前記フルオロ化ＲＮＡアプタマーは、それぞれ、シグナル強度の増加が見られたことから、前記ＨＭＧＢ１と結合していることがわかった。中でも、２’Ｆ−Ｒ８ｃ６＿１−２１−Ｓ６および２’Ｆ−Ｒ８ｃ６＿１−２１−Ｓ８は、優れた結合能を示した。【０１９６】
［実施例１３］
ＥＬＩＳＡ法により、ＲＮＡアプタマーＲ８ｃ６＿１−１８−Ｓ６（配列番号９５）とＨＭＧＢ１との相互作用を確認した。【０１９７】
炭酸バッファー（ｐＨ９．０）を用いて、Ａｎｔｉ−ｈｉｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（製品名Ｐｅｎｔａ・Ｈｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＱＩＡＧＥＮ社）を、４ｕｇ／ｍＬとなるように希釈した。この希釈抗体液を、９６ウェルプレート（製品名９６ウエルエライサプレート：旭テクノグラス社）の各ウェルに、５０μＬずつ分注し、室温で２時間静置した。さらに、前記プレートの各ウェルに、１％ＢＳＡ／ＴＢＳを５０μＬずつ分注し、一晩静置した。前記ＴＢＳの組成は、２０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、０．９％ＮａＣｌとした。このようにして、前記プレートのブロッキング処理を行った。ブロッキング処理を行った前記プレートのウェルを、バッファー２００μＬで３回洗浄した。前記バッファーの組成は、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＨＥＰＥＳ、５００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２、０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（登録商標）とし、そのｐＨは、７．２とした。【０１９８】
ＨＭＧＢ１（製品名  ＨＭＧ−１：Ｓｉｇｍａ社）を、ｔＲＮＡを含む前記バッファーで、所定濃度（１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ）となるように希釈し、前記ＨＭＧＢ１希釈液を調製した。【０１９９】
他方、前記ＲＮＡアプタマーを前記バッファーで希釈し、前記ＲＮＡアプタマー希釈液を９５℃で５分間加熱処理した後、室温に戻した。そして、前記ＲＮＡアプタマー希釈液に、ＲＮａｓｅ阻害剤（製品名  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：ＴＯＹＯＢＯ社）およびビオチン化デオキシチミジンを混合し、ＲＮＡアプタマー混合液を調製した。前記ビオチン化デオキシチミジンは、５’末端をビオチン化した２０塩基長のデオキシチミジンを使用した。前記ＲＮＡアプタマー混合液において、前記ＲＮＡアプタマーの濃度は、１０μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬとした。また、前記ＲＮＡアプタマー混合液は、５０μＬあたり（すなわち、１ウェルあたり）、前記ＲＮａｓｅ阻害剤が０．２μＬ、前記ビオチン化デオキシチミジンが０．２μＬとなるように設定した。【０２００】
そして、前記洗浄後の前記プレートの各ウェルに、前記ＨＭＧＢ１希釈液を５０μＬずつ分注し、４℃で２時間静置した後、前記バッファー２００μＬで３回洗浄した。つぎに、前記各ウェルに、さらに、前記ＲＮＡアプタマー混合液を５０μＬずつ分注し、４℃で２時間反応させた。前記各ウェルに添加した前記ＨＭＧＢ１希釈液（５０μＬ）の濃度と前記ＲＮＡアプタマー混合液（５０μＬ）の濃度との比率は、１：２０、２：２０、１：１０、２：１０とした。【０２０１】
続いて、各ウェルに、アビジン付加したＨＲＰ（製品名Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ：ＧＥヘルスケア社）を、前記バッファーで１０００倍希釈し、各ウェルに５０ｕｌずつ分注し、４℃で１時間反応させた。前記プレートを、前記バッファー２００μＬで３回洗浄し、常温のＴＭＢ（製品名１−Ｓｒｅｐ（ＴＭ）Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ：Ｔｈｅｒｍｏ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社）を、各ウェルに、１００ｕＬずつ分注した。前記プレートを遮光した状態で、室温で３０分静置した。各ウェルに２ｍｏｌ／Ｌ硫酸を１００ｕＬずつ分注して、反応を停止させた。そして、前記各ウェルについて、４５０ｎｍの吸光度を測定した。また、対照例として、ＲＮＡアプタマーを添加しない以外は、同様にして処理を行い、吸光度の測定を行った。これらの結果を、図２１に示す。【０２０２】
図２１は、ＨＭＧＢ１と前記ＲＮＡアプタマーとの相互作用を示すグラフであり、縦軸は、吸光度を示す。図２１に示すように、ＨＭＧＢ１と前記ＲＮＡアプタマーとの結合を示す吸光度が増加したことから、ＨＭＧＢ１に前記ＲＮＡアプタマーが結合することが確認できた。また、前記ＲＮＡアプタマー濃度に対するＨＭＧＢ１濃度を増加させることで、前記吸光度が増加した。このことから、本発明のＨＭＧＢ１結合核酸分子によれば、ＨＭＧＢ１の定量が可能であるといえる。【０２０３】
以上、実施形態および実施例を参照して本願発明を説明したが、本願発明は、上記実施形態および実施例に限定されるものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。【０２０４】
この出願は、２００９年７月１６日に出願された日本出願特願２００９−１６７６２２を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
【産業上の利用可能性】
【０２０５】
本発明のアプタマーによれば、例えば、ＨＭＧＢ１と結合することより、ＨＭＧＢ１が原因となる前述のような疾患の予防および治療が可能となる。また、本発明のアプタマーによれば、例えば、ＨＭＧＢ１との結合の有無を確認することで、ＨＭＧＢ１を検出でき、また、ＨＭＧＢ１の機能解明にも使用できることから、新たな研究用ツールとしても有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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