(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者から入手された生物学的試料におけるmiRNAを分析するための方法であって、
前記試料からmiR-21を含むmiRNA発現プロファイルを生成する段階、および
前記発現プロファイルを非癌性の試料におけるmiRNA発現プロファイルと比較する段階を含み、
前記患者から入手された生物学的試料におけるmiR-21の発現レベルが、前記非癌性の試料におけるmiR-21の発現レベルに比較して増加していることに基づいて、前記患者から入手された生物学的試料が癌患者由来の試料であると同定され、かつ前記癌が、膀胱癌、乳癌、結腸癌、肺癌、前立腺癌、および甲状腺癌からなる群より選択される、
方法。
【請求項２】
miRNAプロファイルが、let-7、let-7A、let-7C、let-7F-2、miR-7、miR-9a、miR-9-as、miR-10a、miR-15A、miR-16、miR-17、miR-20、miR-22、miR-23a、miR-23b、miR-24、miR-25、miR-26a、miR-28、miR-29、miR-29b、miR-30a、miR-30a-as、miR-31、miR-92、miR-95、miR-99b、miR-103、miR-105、miR-106a、miR-125a、miR-126、miR-126-as、miR-130a、miR-133、miR-135a、miR-137、miR-138、miR-139、miR-140、miR-141、miR-143、miR-144、miR-145、miR-152、miR-181a、miR-181b、miR-182、miR-183、miR-186、miR-188、miR-189、miR-192、miR-194、miR-195、miR-199a、miR-199a-as、miR-200b、miR-201、miR-203、miR-205、miR-211、miR-215、miR-219、miR-221、miR-222、miR-223、miR-224、miR-290、miR-291、miR-291-5P、miR-298、miR-301、miR-326、miR-328、mu-miR-329、miR-331、miR-341、miR-342、miR-344、miR-361、およびmiR-425からなる群より選択される少なくとも1つのmiRNAに対するプロファイリングに関与する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
miRNAプロファイルが、miR-126、miR-143、miR-145、miR-188、miR-200B、miR-219、およびmiR-331の少なくとも1つに対するプロファイリングに関与する、請求項2記載の方法。
【請求項４】
miRNAプロファイルが、let-7、miR-16、miR-17、miR-22、miR-24、miR-26a、miR-29b、miR-30a、miR-125a、miR-181a、miR-182、miR-183、miR-195、miR-201、miR-205、miR-328、およびmiR-342の少なくとも1つに対するさらなるプロファイリングに関与する、請求項3記載の方法。
【請求項５】
癌が乳癌である、請求項1記載の方法。
【請求項６】
miRNAプロファイルがmiR-15A、miR-21、miR-24、miR-135A、miR-145、miR-200B、miR-205、miR-211、miR-298、およびmu-miR-329からなる群より選択される少なくとも1つのmiRNAに対するプロファイリングに更に関与し、非癌性試料と比較してmiRNAの一つまたは複数の発現における差が乳癌を示す、請求項5記載の方法。
【請求項７】
miRNAプロファイルが少なくともmiR-15A、miR-21、miR-24、miR-135A、miR-145、miR-200B、miR-205、miR-211、miR-298、およびmu-miR-329に対するプロファイリングに関与し、非癌性試料と比較してmiRNAの一つまたは複数の発現における差が乳癌を示す、請求項6記載の方法。
【請求項８】
非癌性試料と比較してmiR-135A、miR-145、miR-205、miR-211、miR-298、もしくはmu-miR-329の発現における減少および/またはmiR-15A、miR-21、miR-24、もしくはmiR-200Bの発現における増加が乳癌を示す、請求項6記載の方法。
【請求項９】
癌が結腸癌である、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
miRNAプロファイルが、miR-31、miR-106A、miR-125a、mir-130a、miR-133、miR-135A、miR-143、miR-145、miR-200B、miR-203、およびmiR-223からなる群より選択される少なくとも1つのmiRNAに対するプロファイリングに更に関与し、非癌性試料と比較してmiRNAの一つまたは複数の発現における差が結腸癌を示す、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
miRNAプロファイルがmiR-21、miR-31、miR-106A、miR-125a、mir-130a、miR-133、miR-135A、miR-143、miR-145、miR-200B、miR-203、およびmiR-223からなる群より選択される少なくとも3つのmiRNAに対するプロファイリングに関与し、非癌性試料と比較してmiRNAの一つまたは複数の発現における差が結腸癌を示す、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
miRNAプロファイルが、miR-31、miR-106A、miR-125a、mir-130a、miR-133、miR-135A、miR-143、miR-145、miR-200B、miR-203、およびmiR-223に対するプロファイリングに関与し、非癌性試料と比較してmiRNAの一つまたは複数の発現における差が結腸癌を示す、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
非癌性試料と比較してmiR-125a、mir-130a、miR-133、miR-135A、miR-143、もしくはmiR-145の発現における減少および/またはmiR-21、miR-31、miR-106A、miR-200B、miR-203、もしくはmiR-223の発現における増加が結腸癌を示す、請求項10記載の方法。
【請求項１４】
癌が前立腺癌である、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
miRNAプロファイルがmiR-15A、miR-29、miR-141、miR-188、miR-290、およびmiR-331からなる群より選択される少なくとも1つのmiRNAに対するプロファイリングに更に関与し、非癌性試料と比較して一つまたは複数のmiRNAの発現における差が前立腺癌を示す、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
miRNAプロファイルがmiR-15A、miR-21、miR-29、miR-141、miR-188、miR-290、およびmiR-331に対するプロファイリングに関与し、非癌性試料と比較して一つまたは複数のmiRNAの発現における差が前立腺癌を示す、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
非癌性試料と比較してmiR-188、miR-290、もしくはmiR-331の発現における減少および/またはmiR-15A、miR-21、miR-29、もしくはmiR-141の発現における増加が前立腺癌を示す、請求項14記載の方法。
【請求項１８】
癌が甲状腺癌である、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
miRNAプロファイルがmiR-15A、miR-30A-as、miR-31、miR-135A、miR-138、miR-152、miR-199A-as、miR-200B、miR-203、およびmiR-331からなる群より選択される少なくとも1つのmiRNAに対するプロファイリングに更に関与し、非癌性試料と比較して一つまたは複数のmiRNAの発現における差が甲状腺癌を示す、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
miRNAプロファイルがmiR-15A、miR-21、miR-30A-as、miR-31、miR-135A、miR-138、miR-152、miR-199A-as、miR-200B、miR-203、およびmiR-331に対するプロファイリングに関与し、非癌性試料と比較して一つまたは複数のmiRNAの発現における差が甲状腺癌を示す、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
非癌性試料と比較してmiR-30A-as、miR-31、miR-135A、miR-138、miR-152、miR-199A-as、miR-203、もしくはmiR-331の発現における減少および/またはmiR-15A、miR-21、もしくはmiR-200Bの発現における増加が甲状腺癌を示す、請求項19記載の方法。
【請求項２２】
癌が肺癌である、請求項1記載の方法。
【請求項２３】
miRNAプロファイルがlet-7a、let-7c、miR-26a、miR-30A-AS、miR-95、miR-125a、miR-126、miR-200b、miR-205、miR-331、およびmiR-342からなる群より選択される少なくとも1つのmiRNAに対するプロファイリングに更に関与し、非癌性試料と比較して一つまたは複数のmiRNAの発現における差が肺癌を示す、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
miRNAプロファイルがlet-7a、let-7c、miR-21、miR-26a、miR-30A-AS、miR-95、miR-125a、miR-126、miR-200b、miR-205、miR-331、およびmiR-342からなる群より選択される少なくとも3つのmiRNAに対するプロファイリングに関与し、非癌性試料と比較して一つまたは複数のmiRNAの発現における差が肺癌を示す、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
miRNAプロファイルがlet-7a、let-7c、miR-21、miR-26a、miR-30A-AS、miR-95、miR-125a、miR-126、miR-200b、miR-205、miR-331、およびmiR-342に対するプロファイリングに関与し、非癌性試料と比較して一つまたは複数のmiRNAの発現における差が肺癌を示す、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
非癌性試料と比較してlet-7a、let-7c、miR-26a、miR-30A-AS、miR-95、miR-125a、miR-126、miR-331、もしくはmiR-342の発現における減少および/またはmiR-21、miR-200B、もしくはmiR-205の発現における増加が肺癌を示す、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
癌が膀胱癌である、請求項1記載の方法。
【請求項２８】
miRNAプロファイルがmiR-9as、miR-133、miR-143、miR-145、miR-182、およびmiR-200Bからなる群より選択される少なくとも1つのmiRNAに対するプロファイリングに更に関与し、非癌性試料と比較して一つまたは複数のmiRNAの発現における差が膀胱癌を示す、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
miRNAプロファイルがmiR-9as、miR-21、miR-133、miR-143、miR-145、miR-182、およびmiR-200Bに対するプロファイリングに関与し、非癌性試料と比較して一つまたは複数のmiRNAの発現における差が膀胱癌を示す、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
非癌性試料と比較してmiR-133、miR-143、もしくはmiR-145の発現における減少および/またはmiR-9as、miR-21、miR-182、もしくはmiR-200Bの発現における増加が膀胱癌を示す、請求項28記載の方法。
【請求項３１】
試料が固定された、請求項1記載の方法。
【請求項３２】
試料におけるmRNAおよび/またはrRNAの少なくとも50％が分解されている、請求項1記載の方法。
【請求項３３】
試料におけるmRNAおよび/またはrRNAの少なくとも90％が分解されている、請求項31記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
1. 発明の分野
本発明は、概して、分子生物学の分野に関する。より詳しくは、それは、マイクロRNA（miRNA）分子に関与する方法および組成物に関係する。miRNAアレイなどの、分析のためにmiRNAを単離、標識、調製するための、または分析のためのツールとしての方法および組成物を記載する。加えて、診断、治療、および予後診断におけるmiRNAに対する応用がある。
【背景技術】
【０００２】
2. 関連技術の説明
2001年、いくつかのグループが、C.エレガンス（C. elegans）、ショウジョウバエ（Drosophila）、およびヒトから多種多様な「マイクロRNA」（miRNA）を単離および同定するための新しいクローニング方法を使用した（Lagos-Quintana et al., 2001(非特許文献1); Lau et al., 2001(非特許文献2); Lee and Ambros, 2001(非特許文献3)）。数百のmiRNAが、植物および動物−ヒトを含む−において同定されており、内因性siRNAを有するようには見えない。したがって、miRNAは、siRNAと類似しているが、それでもなお異なる。
【０００３】
したがって、ずっと観測されているmiRNAは、長さがおよそ21〜22ヌクレオチドであり、それらは非タンパク質コード遺伝子から転写される、より長い前駆体から生じる。Carrington et al. (2003)(非特許文献4)の概論を参照されたい。前駆体は、自己相補的領域において互いに折り畳む構造を形成する；次いでそれらは、動物におけるDicerまたは植物におけるDCL1というヌクレアーゼよってプロセス化される。miRNA分子は、それらの標的との不正確な塩基対を介して翻訳を妨げる。
【０００４】
ほとんどのmiRNAの機能は、未知である。しかしながら、多くのmiRNAは、遺伝子調節に関与しているように見える。lin-4およびlet-7を含むこれらのmiRNAのいくつかは、標的mRNAの部分的に相補的な3'非翻訳領域（3' UTR）に結合することによって、タンパク質合成を阻害する。植物において見出されたScarecrow miRNAを含むその他は、siRNAのように機能し、標的転写を破壊するために、完全に相補的なmRNA配列に結合する（Grishok et al., 2001(非特許文献5)）。
【０００５】
lin-4、let-7、mir-14、mir-23、およびbantamなどのいくつかのmiRNAは、細胞分化および組織発生において重大な役割を果たすことが示されている（Ambros, 2003(非特許文献6); Xu et al., 2003(非特許文献7)）。その他は、それらの差次的、空間的、および時間的な発現パターンにより、同様に重要な役割を有すると信じられている。
【０００６】
マイクロRNA（miRNA）に関する研究は、科学者が、これらの分子が真核生物遺伝子発現の調節において果たす広範な役割を高く評価し始めているので、増加している。2つの最も良く理解されたmiRNA、lin-4およびlet-7は、主要なmRNAのファミリーの翻訳を調節することによって、C.エレガンスにおける発生のタイミングを調節する（Pasquinelli, 2002(非特許文献8)において概説される）。数百のmiRNAが、C.エレガンス、ショウジョウバエ、マウス、およびヒトにおいて同定されている。遺伝子発現を調節する分子に対して予期されるように、miRNAレベルは、組織と発生状態との間で変化することが示されている。多くのmiRNAの特徴付けは、それらが、初期発生（Reinhart, 2000(非特許文献9)）、細胞増殖および細胞死（Brennecke, 2003(非特許文献10)）、ならびにアポトーシスおよび脂肪代謝（Xu, 2003(非特許文献7)）を含む、様々なプロセスに影響することを示す。加えて、1つの調査が、2つのmiRNAの軽減された発現と慢性リンパ球性白血病との間の強い相関を示し、miRNAと癌との間の可能性のあるリンクを提供する（Calin, 2002(非特許文献11)）。分野はまだ若いが、miRNAが、より高等な真核生物における遺伝子発現を調節することにいて、転写因子と同じくらい重要であり得るだろうという推測がある。
【０００７】
いくつかの刊行物は、分析のためにmiRNAを標識することを記載する。これらの刊行物は、ポリヌクレオチドキナーゼを使用して、miRNA集団の5'末端に放射性リン酸塩を追加すること（Krichevsky, 2003(非特許文献12)）、またはRNAリガーゼを用いて、放射性標識単一ヌクレオチドを3'末端に追加すること（Dostie, 2003(非特許文献13)）を記載する。試料におけるmiRNAの相対存在量を推定するためにアレイを使用することの目的に対して、これらの方法は、2つの顕著な難点を有する：（1）miRNAあたり単一標識のみが追加され、達成され得る感度を限定する、および（2）方法が、放射性標識化のみと互換性があり、アレイに対する非同位体プラットフォームと比較して不都合を有する。さらに、RNAオリゴヌクレオチドは、非同位体標識で標識されているが（Martin et al., 1998(非特許文献14)）、細胞溶解物からの小さなRNA分子が、それらが溶解物から濃縮または単離された後に、同様の様式で効果的に標識され得るという証拠はない。
【０００８】
マイクロアレイは、典型的には、長さが数百または数千のヌクレオチドであるメッセンジャーRNAを分析するために使用されるので、本発明者らは、典型的にはマイクロアレイにおいて使用される60〜500merのプローブが、miRNA分析と互換性がないことを見出した。
【０００９】
それ故に、miRNAの機能および活性に関する情報、ならびにそれらの特徴付けおよび分析に対して使用され得る方法および組成物が必要とされる。
【００１０】
【非特許文献１】Lagos-Quintana et al., Science, 294(5543):853-858, 2001
【非特許文献２】Lau et al., Science, 294(5543):858-862, 2001
【非特許文献３】Lee and Ambros, Science, 294(5543):862-864, 2001
【非特許文献４】Carrington et al., Science, 301(5631):336-338, 2003
【非特許文献５】Grishok et al., Cell, 106:23-34, 2001
【非特許文献６】Ambros et al., RNA, 9(3):277-279, 2003
【非特許文献７】Xu et al., Curr. Biol., 13:790-795, 2003
【非特許文献８】Pasquinelli and Ruvkun, Ann. Rev. Cell Dev. Biol., 18:495-513, 2002
【非特許文献９】Reinhart et al., Nature, 403:901-906, 2000
【非特許文献１０】Brennecke et al., Cell, 113:25-36, 2003
【非特許文献１１】Calin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 99:15524-15529, 2002
【非特許文献１２】Krichevsky et al., RNA, 9(10):1274-1281, 2003
【非特許文献１３】Dostie et al., RNA, 9:180-186, 2003
【非特許文献１４】Martin et al., RNA, 4(2):226-230, 1998
【発明の開示】
【００１１】
発明の概要
本発明は、細胞におけるmiRNAの役割および機能を特徴付けるためのmiRNAの操作およびmiRNAの使用に関する本発明者らの調査に基づく。それは、miRNAを単離する、それを標識する、miRNAに向けたアレイ（miRNAアレイまたはマイクロアレイ）を調製する、アレイを使用してmiRNAを分析する、ならびに診断的、治療的および予後診断的応用に対してmiRNAを特徴付けるための方法および組成物に関係する。
【００１２】
「miRNA」という語は、その普通かつ単純な意味に従って使用され、真核生物において見出され、RNAに基づく遺伝子調節に関与するマイクロRNA分子を指す。例えば、本明細書において参照により組み入れられるCarrington et al., 2003を参照されたい。その語は、前駆体からプロセス化されたRNA分子を指すために使用されると思われる。個々のmiRNAは、異なる生物体において同定およびシークエンスされており、それらは名称が与えられている。miRNAの名称およびそれらの配列は、本明細書において提供される。付加的に、その他のmiRNAは、当業者にとって公知であり、本発明の態様において簡単に導入され得る。方法および組成物は、それらが、必ずしも本発明の限定としてではなく、例として提供されるので、本出願において同定されるmiRNAに限定されるべきではない。
【００１３】
本発明のいくつかの態様は、miRNAを標識するための方法に関係する。miRNAが単一の標識で標識され得ることが意図されるが、本発明の多くの態様において、複数の標識（同じまたは異なる標識であり得る）がmiRNAに付着する。結果として、多重標識化のための方法は、本発明の一部として、具体的に意図される。いくつかの態様において、標識されるmiRNAは、miRNAの3'末端へのヌクレオチド二または三リン酸の付加を触媒し、miRNAにヌクレオチドテールを効果的に付加する酵素に接触させる。miRNAおよび酵素は、反応混合物（テーリングのための）が形成されるように、酵素による触媒が生じることを可能にする条件下で、インキュベートされると思われる。さらに、反応混合物は、テール化miRNA（tailed miRNA）分子を形成するために酵素によってmiRNAの3'末端に付加される標識または非標識ヌクレオチドを含むと思われる。ヌクレオチドは、DNAおよび/またはRNAであり得るが、いくつかの態様において、ヌクレオチドは、リボヌクレオチドである。「ヌクレオチド」という語は、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの両方を指すが、「ヌクレオチド」との文脈で議論される任意の態様は、他に特に規定または限定されなければ、「リボヌクレオチド」または「デオキシリボヌクレオチド」において具体的に用いられ得ることが、具体的に意図される。反応において使用されるヌクレオチドは、ウリジン、アデノシン、グアノシン、および/またはシトシンであってもよく、その任意の組み合わせを含む。特定の態様において、ヌクレオチドはウリジンであり、以下で議論されるように修飾されていてもよく、または修飾されていなくてもよい。miRNAに付加されるテールは、長さが少なくともまたは多くとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500ヌクレオチドもしくはより多く、またはそこに導き出せる任意の範囲である。
【００１４】
miRNAに付加されるヌクレオチドは、付着した標識をすでに有し得る、または標識は、miRNAがテール化された後に付着し得る。非標識ヌクレオチドがmiRNAに付加される場合、方法は、テール化miRNA分子に標識を付着させることをさらに含む。その後、多重標識miRNA分子は単離されてもよく、これはそれが以下の任意またはすべてから分離され得ることを意味する：取り込まれなかった標識またはヌクレオチド、酵素、非テール化miRNA、およびその他のRNA。多重標識miRNA分子を単離するプロセスにおいて、分子はその後の使用のために乾燥され得る。
【００１５】
反応において使用されるmiRNAは、様々な方法によってかつ様々な供給源から得られ得る。miRNAは、細胞、組織、または器官などの、生物学的試料から得られ得る。それは、mRNA、tRNA、および/またはrRNAなどと同様に、その他のRNA分子を含む生物学的試料から単離され得る。特定の例において、全RNAが最初に試料から単離され、次いでmiRNAがその他のRNAから分離され、それによってmiRNAを濃縮する。いくつかの態様において、miRNAは、miRNAが実質的に純粋であり、その他のRNA分子に対して、それが少なくとも純度約80％、85％、90％、95％またはより高いが、純度100％よりも低いことを意味するように、miRNAを濃縮するために、その他のRNAから単離されている。または、miRNAの濃縮は、倍の濃縮（fold-enrichment）という語で表現され得る。特定の態様において、miRNAは、試料におけるRNA単離体または全RNAにおけるmiRNAの濃度に対して、約、少なくとも約、または多くとも約5×、10×、20×、30×、40×、50×、60×、70×、80×、90×、100×、110×、120×、130×、140×、150×、160×、170×、180×、190×、200×、210×、220×、230×、240×、250×、260×、270×、280×、290×、300×、310×、320×、330×、340×、350×、360×、370×、380×、390×、400×、410×、420×、430×、440×、450×、460×、470×、480×、490×、500×、600×、700×、800×、900×、1000×、1100×、1200×、1300×、1400×、1500×、1600×、1700×、1800×、1900×、2000×、3000×、4000×、5000×、6000×、7000×、8000×、9000×、10,000×、もしくはより高く、またはそこに導き出せる任意の範囲に濃縮される。
【００１６】
miRNAは、当業者にとって公知の方法を使用して、その他のRNA分子から分離され得る。いくつかの態様において、miRNAは、クロマトグラフィーを使用して、その他のRNAから分離される。ゲルクロマトグラフィーは、miRNA分子を単離するために導入され得る。特定の態様において、ゲルクロマトグラフィーは、ポリアクリルアミドゲルおよびチューブ電気泳動を使用して行われ得る。
【００１７】
生物学的試料は、内因性miRNAを有する任意の生物体に由来し得る。生物体は、節足動物（キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster））；線虫（カエノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）およびカエノラブディティス・ブリグサエ（Caenorhabditis briggsae））；脊椎動物（ヒト（homo sapiens）、ハツカネズミ（mus musculus）、ドブネズミ（Rattus norvegicus））；植物（シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）およびコメ（Oryza sativa））を含むが、それらに限定されるべきではなく、それらのすべては、シークエンスされたmiRNAを有する。ワールドワイドウェブ上のsanger.ac.uk/cgi-bin/Rfam/mirna/browse.plにおけるmiRNA Registryを参照されたい。または、miRNAは、細胞のないシステムもしくは反応混合物から、または内因性miRNAを有し得るもしくは有し得ない組み換え宿主細胞から得られるような、組み換え型であり得る。さらに、miRNAは、あらかじめ固定された試料において評価され得る。本発明のいくつかの態様において、試料は、そのmiRNAを評価する段階に進むことに先行して、ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドにおいて固定された。付加的な態様において、本発明に従って使用され得る試料は、試料におけるRNAが分解されているものを含む。そのような試料は、試料におけるmRNAおよび/またはrRNAの、約または少なくとも約50％、60％、70％、80％、90％、95％もしくはより多く、またはそこに導き出せる任意の範囲が、分解されているものを含む。特定の態様において、実質的な分解がある試料−つまり、試料におけるmRNAおよび/またはrRNAの少なくとも約80％の分解−が、本発明の方法および組成物に従って分析される。
【００１８】
いくつかの態様において、本発明の方法および組成物において使用される酵素は、ポリ(A)ポリメラーゼ、末端トランスフェラーゼ、およびポリヌクレオチドホスホリラーゼからなる群より選択される。特定の態様において、酵素は、ポリ(A)ポリメラーゼである。いくつかの場合、ポリ(A)ポリメラーゼは、大腸菌または酵母に由来する。酵素は、精製されていてもよく、組み換え型であってもよく、および/または市販購入してもよい。
【００１９】
本発明の標識化方法は、多くの態様において、一つまたは複数の修飾ヌクレオチドに関与する。「修飾ヌクレオチド」という語は、化学的に修飾されるが、それでもヌクレオチドとして機能するヌクレオチド−核酸の基本的な構造ユニット、RNAおよびDNA−を指す。修飾ヌクレオチドは、蛍光または化学発光標識などの、共有結合した検出可能部分を有するヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドは、標識核酸を作り出すために、修飾ヌクレオチドの取り込みの前、間、または後に、検出可能部分と反応し得る反応基を有するヌクレオチドも含む。特定の態様において、修飾ヌクレオチドは、アミン修飾ヌクレオチドであり、ヌクレオチドが反応アミン基を有するように修飾されていることを意味する。修飾ヌクレオチドは、ウリジン、アデノシン、グアノシン、および/またはシトシンであり得る。特定の態様において、アミン修飾ヌクレオチドは、5-(3-アミノアリール)-UTP；8-[(4-アミノ)ブチル]-アミノ-ATPおよび8-[(6-アミノ)ブチル]-アミノ-ATP；N6-(4-アミノ)ブチル-ATP、N6-(6-アミノ)ブチル-ATP、N4-[2,2-オキシ-ビス-(エチルアミン)]-CTP；N6-(6-アミノ)ヘキシル-ATP；8-[(6-アミノ)ヘキシル]-アミノ-ATP；5-プロパルギルアミノ-CTP、5-プロパルギルアミノ-UTPからなる群より選択される。しかしながら、例えば5-(3-アミノアリール)-UTPの代わりに5-(3-アミノアリール)-GTPなどの、その他のヌクレオチドが、同様に修飾され得ることが意図される。
【００２０】
特定の態様において、反応混合物は、付着した標識部分（「標識ヌクレオチド」）を有する修飾ヌクレオチドを含む。この場合、付着した少なくとも2つの標識を有するmiRNA分子を指す、多重標識miRNAを生成するために、一段階プロセス（単一酵素反応）が使用される。標識ヌクレオチドは、簡単に利用できる；それらは、市販で取得され得る、またはそれらは当業者にとって公知の反応によって合成され得る。反応が、標識ヌクレオチドを含む場合、その他の態様において、標識および非標識ヌクレオチドの両方が含まれることが意図される。標識および非標識ヌクレオチドは、同じヌクレオチドであり得る（しかし標識および非標識）、またはそれらは、異なるヌクレオチドであり得る（標識UTPであるが非標識CTP、GTP、および/またはATPなど）。
【００２１】
特定のその他の態様において、テーリング反応は、その後の反応（二段階プロセス）において標識される、非標識だが修飾されたヌクレオチドを含む（「非標識/修飾ヌクレオチド」）。反応が、テーリング効率を改善し、かつすぐ近くに色素分子を有することによって誘導される色素消光を避けるために、修飾および非修飾ヌクレオチドを含み得ることが意図される。非修飾および修飾ヌクレオチドは、同じヌクレオチドであり得る（しかし1つは修飾されるが他方は修飾されない）、またはそれらは異なるヌクレオチドであり得る（修飾UTPであるが非修飾CTP、GTP、および/またはATPなど）。
【００２２】
したがって、本発明の一段階および二段階プロセスの両方において、テーリングのための反応混合物は、修飾および非修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、反応混合物における修飾ヌクレオチドと非修飾ヌクレオチドの比は、約1:1〜約10:1であり、具体的には、約5:1である。比は、約1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、もしくはより大きく、またはそこに導き出せる任意の範囲であり得る。比は濃度に基づくことが理解される。
【００２３】
反応混合物が、初めに非標識/修飾ヌクレオチドを含む場合、ヌクレオチドはmiRNAに付加し、テール化され、その後一つまたは複数の標識が、これらのヌクレオチドの一つまたは複数に付着するようになる。この方式では、使用される標識に依存して標識の付着化が生じ、当業者は、その後の反応においてどのように標識を付着させるかを知っていると考えられる。
【００２４】
miRNAに付着し得る標識は、核酸に共有結合するものを含む。標識ヌクレオチド上の標識またはテール化miRNAにおいてヌクレオチドへの付着化が生じる標識は、ビオチン、放射能、または色素であることが意図される。または、標識は、陽電子放出、比色、酵素、発光、蛍光、またはリガンドとして修飾され得る。
【００２５】
本発明の特定の態様において、色素は、Alexa Fluor、BODIPY、カスケードブルー、カスケードイエロー、シアニン色素、エオシンおよびエリトロシン、フルオレセイン、HEX、マリーナブルー、オレゴングリーン、ローダミン、Quantum Dye(商標)、SYPRO、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、TOTAB、ならびにその誘導体からなる群より選択される。
【００２６】
単一の試料に由来するmiRNAが、同じ標識または異なる標識で標識され得ることが意図される。
【００２７】
テーリング反応は、少なくともまたは多くとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55分、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12時間またはより長い間、インキュベートされ得る。典型的には、反応は、2時間などの、約1〜3時間である。インキュベーションは、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、または40℃、またはより高い温度であり得るが、温度が、30〜40℃の範囲、特に約37℃であり得ることが具体的に意図される。
【００２８】
本発明のいくつかの態様において、ヌクレオチドがmiRNAに付加される反応混合物は、体積排除試薬（volume exclusion reagent）をさらに含む。そのような試薬の例は、ポリエチレングリコール（PEG）およびデキストランからなる群より選択される試薬を含むが、それらに限定されない。本発明のいくつかの態様において、反応における体積排除試薬の濃度は、約1％から約20％の間、または約5％〜10％である。反応における体積排除試薬の濃度は、反応の態様において、約、少なくとも約、または多くとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、もしくは20％、またはそこに導き出せる任意の範囲である。特定の場合、反応における体積排除試薬の濃度は、約10％までである。
【００２９】
miRNA分子をテール化するための反応混合物は、約、または多くとも約5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、もしくは7.8、またはそこに導き出せる任意の範囲のpHを有する。特定の態様において、反応混合物は、約6.0から約7.8の間のpHを有し、特定の場合は、pHは約6.5である。
【００３０】
本発明は、miRNA分子を評価するためのアレイにも関係する。明らかに意図されるのは、マイクロアレイであるアレイである。アレイは、一つまたは複数のmiRNA分子に向けられる一つまたは複数のプローブを有する（「miRNAアレイ」）。いくつかの態様において、miRNAアレイは、固体支持体上に固定化される一つまたは複数のmiRNAプローブを含む。「miRNAプローブ」は、miRNA遺伝子、同族miRNA前駆体、またはプロセス化miRNA（processed miRNA）に特異的にハイブリダイズすることが可能なように、miRNA前駆体または遺伝子のすべてまたは一部に相補的または同一な配列を有する核酸を指す。典型的には、プローブは、miRNA前駆体のすべてもしくは一部に相補的な少なくとも10の近接ヌクレオチド、またはmiRNA遺伝子のすべてもしくは一部に相補的もしくは同一な少なくとも10の近接ヌクレオチドを含むと思われる。miRNA遺伝子に対する配列を有するDNAプローブが、配列において遺伝子のコード配列のすべてまたは一部と同一であり、かつ配列において遺伝子の非コード配列のすべてまたは一部に相補的であることが理解されると思われる。特定の態様において、miRNAプローブは、miRNAをコードする配列を含む（「miRNAコード配列」、プロセス化miRNAをコードする配列を指す）。特定のプロセス化miRNAの正確な長さおよび結果として配列は、時折変化することが見出されているので、優勢種が、プロセス化miRNAの配列および長さとして理解される。優勢種は、通常、時間の少なくとも90％観測されるものである。
【００３１】
本発明の態様において、プローブの5'または3'末端に付着するアミンがある。アミンは、プローブのアレイへの付着を可能にするプローブ上の反応基であった。
【００３２】
アレイ上の異なるプローブの数は可変である。少なくともまたは多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、31、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、6000、7000、8000、9000、10000、もしくはより多く、またはそこに導き出せる任意の範囲の、アレイ上の異なるmiRNAプローブがあり得ることが意図される。特定の態様において、アレイは、5から1000個の間の異なるmiRNAプローブ、20から500個の間の異なるmiRNAプローブ、50から250個の間の異なるmiRNAプローブ、または100から225個の間の異なるmiRNAプローブを有する。「異なる」プローブは、異なる配列をもつプローブを指す。それ故に、異なるプローブが、同じmiRNAを標的とするために使用され得ることが意図される。さらに、同じmiRNAに対する多数の異なるプローブが、アレイ上に含まれ得る。例えば、1つのプローブは、前駆体miRNAまたはmiRNA遺伝子を特異的に標的にすることができ（アレイにハイブリダイズするために何の試料が使用されるかに依存する−すなわち、試料がDNAまたはRNAを含むかどうか）、別のプローブは、プロセス化miRNA、その前駆体、または遺伝子にハイブリダイズすることが可能であり得る。さらに、同じmiRNAを標的にするmiRNAプローブは、それらが近接配列を共有するように、重複し得る。単一のプローブが、多数のmiRNA、特に同じ遺伝子ファミリーに由来するmiRNAまたは関連miRNA（文字により識別される）を標的にし得ることも意図される。「遺伝子ファミリー」は、同じmiRNAコード配列を有する遺伝子の群を指すことが、当業者によって理解される。典型的には、遺伝子ファミリーのメンバーは、初めの記号に続く番号によって同定される。例えば、miR-16-1およびmiR-16-2は、miR-16遺伝子ファミリーのメンバーである。また、プローブは、複数のmiRNAを標的にすることを可能にする配列を有し得る。プローブとmiRNAとの間の2塩基対ミスマッチは、実施例において記載される条件下で、ミスマッチmiRNAの少なくとも90％とハイブリダイズするのに十分であると理解される。結果として、他に特に示されなければ、特定のmiRNAに対するプローブは、同じ番号だが付加された文字記号によって指定されるものなどの、関連miRNAを捕らえもするということが理解されると思われる。例えば、他に特に示されなければ、miR-15aに完全に相補的なmiRNAプローブは、miR-15bにもハイブリダイズすると考えられる。したがって、miRNAプローブは、1、2、3、4、5、6、またはより多くの異なるmiRNAを標的にし得る。
【００３３】
miRNAプローブは、DNAで作られることが意図されるが、いくつかの態様において、それらは、RNA、ヌクレオチド類似体、PNA、またはDNA、RNA、ヌクレオチド類似体、およびPNAの任意の組み合わせであり得る。
【００３４】
上に示唆されるように、本発明のアレイが、一つまたは複数のmiRNAを標的にし得ることが意図される。本発明の態様において、アレイは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、31、3200、3300、3400、3500、3600、3700、3800、3900、4000、4100、4200、4300、4400、4500、4600、4700、4800、4900、5000、6000、7000、8000、9000、10000、もしくはより多く、またはそこに導き出せる任意の範囲の異なるmiRNAを標的にするプローブを有する。従って、アレイは、これらの異なるmiRNAに対する一つまたは複数のプローブを含むことが理解される。特定の態様において、ヒトmiRNAが標的にされるが、単一のアレイまたはその他の方法もしくは技術を使用する多数の生物体または種を標的にすることが意図される。特定のその他の態様において、哺乳類のmiRNAが標的にされる。そのような哺乳類は、サル、ゴリラ、チンパンジー、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウサギ、ハムスター、フェレット、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヒト、げっ歯類、およびヤギを含むが、それらに限定されない。したがって、ヒトmiRNAコード配列またはその他の哺乳類miRNAコード配列を有するmiRNAプローブを含むアレイまたは方法は、本発明の一部である。
【００３５】
本発明のmiRNAプローブは、長さが19〜34ヌクレオチドの間のmiRNAコード配列を有する。もちろん、これは、プローブが、miRNA遺伝子と同一またはほぼ同一な、かつプロセス化miRNAまたはその前駆体に相補的な、19〜34の近接ヌクレオチドを有することを意味するということが理解される。上に議論されるように、プローブは、それがハイブリダイゼーションにおいて2塩基対ミスマッチを有するmiRNAを標的にするために使用され得る。したがって、本発明のmiRNAプローブが、標的にされる任意のmiRNA配列または配列のセット（関連miRNAまたは同じ遺伝子ファミリーに由来するmiRNAなど）にほぼ完全に相補的（2塩基対ミスマッチまたはより少ない）または完全に相補的であり得ることが意図される。「ほぼ同一」という語は、配列における任意の差が、2塩基またはより少ないことを意味する。miRNAが、その前駆体において、完全に相補的なステムループ有する場合、miRNAコード配列は、同様に前駆体における配列と同一であるべきである。本発明のいくつかの態様において、プローブは、プロセス化miRNA配列全体を含むmiRNAコード配列を有する。プローブが、miRNAコード配列に由来する、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、もしくはより多くの近接ヌクレオチド、またはそこに導き出せる任意の範囲を有することが意図される。特定の態様において、miRNAプローブは、補遺に含まれる、SEQ ID NO：1〜593を含めた、ならびに本明細書において議論される任意のその他の配列の任意に対して、以前の文において議論される長さにわたって、同一もしくは相補的な配列、または少なくとも90％もしくはより大きな同一性もしくは相補性を有する。補遺は以下のリストを提供する：1）スクリーニングされたmiRNA、そのうちの任意の１つが、本発明の任意のアレイまたは方法を使用するためにスクリーニングされ得る；2）そのmiRNAに対してスクリーニングするために使用されるプローブの名称；および3）名付けられたプローブの配列。
【００３６】
上に議論されるように、miRNAは、前駆体分子からプロセス化される。特定の態様において、プローブは、プロセス化miRNA配列の上流および/または下流のコード配列の少なくとも2〜5ヌクレオチドも含むmiRNAコード配列を有する。プローブは、片側または両側（5'および/または3'末端）において、優勢プロセス化miRNAをコードする配列の側面に位置する、1、2、3、4、5、6、7まで、もしくはより多くの近接ヌクレオチド、またはそこに導き出せる任意の範囲を有する。特定の態様において、プローブは、プロセス化miRNA配列の上流（5'）および/または下流（3'）のコード配列の4ヌクレオチドを含むmiRNAコード配列を有する。その他の態様において、miRNAプローブは、miRNAコード配列の側面に位置する一つまたは複数のリンカーも有する。特定の態様において、miRNAコード配列の3'末端に、リンカーがある。いくつかの態様において、リンカーは、長さが3〜25ヌクレオチドの間の配列を有する。
【００３７】
本発明のいくつかの態様において、miRNAプローブは、3'末端に付着するアミンを介して、アレイに付着する。
【００３８】
本発明は、特定の材料で構築されるアレイに限定されない。典型的には、アレイは、プローブと試料との間のハイブリダイゼーションを干渉しない材料で作られる。いくつかの態様において、アレイは、ガラス、プラスチック、または金属で作られる固体支持体である。
【００３９】
本発明は、miRNA発現と疾患または病態との相関を同定するための方法に関係する。特定の態様において、方法は、正常試料と比較して、疾患または病態（非正常試料）を表す試料において差次的に発現するmiRNAを同定することに関与する。疾患もしくは病態を表す試料は、疾患もしくは病態を有し、疾患もしくは病態によって影響を受け、および/または疾患もしくは病態を引き起こすものであると思われる。特定の態様において、差次的発現miRNA（differentially expressed miRNA）を同定することは、以下に関与する：a）試料におけるmiRNAを標識すること；およびb）標識miRNAをmiRNAアレイにハイブリダイズさせること。さらなる態様において、試料におけるmiRNAは、標識化の前または後に単離される。
【００４０】
特定の態様において、試料におけるmiRNAを単離することは、電気泳動に関係する方法に関与する。本発明は、電気泳動を使用する核酸の単離のための方法を提供する。これらの方法は、miRNAなどの小さな核酸分子を含むが、それに限定されない、任意の核酸分子を単離するために使用され得る。いくつかの態様において、核酸分子は、長さが200ヌクレオチドより少ない。その他の態様において、核酸分子は、長さが100ヌクレオチドより少ない。特定の局面において、核酸分子は、長さが15〜200ヌクレオチドの間、長さが15〜100ヌクレオチドの間、長さが15〜40ヌクレオチドの間、または長さが<40ヌクレオチドである。
【００４１】
一つの態様において、試料から核酸分子を単離するための方法は、以下の段階を含む：陽性電極に電気的に連結された下層バッファー収集チャンバー、陰性電極に電気的に連結された上層バッファーチャンバー、および下層バッファー収集チャンバーと上層バッファーチャンバーとの間に配置されるゲルマトリクスを含む電気泳動装置を提供する段階；ランニングバッファーを、下層バッファー収集チャンバーおよび上層バッファーチャンバーに添加する段階；試料をゲルマトリクスの表面に加える段階；試料における核酸分子を、電気泳動によってゲルマトリクス中を移動させる段階；および、ゲルマトリクスを通り抜けた核酸分子を含む下層収集バッファーチャンバーのランニングバッファーを、下層収集バッファーチャンバーから収集する段階。本発明の実施において使用される電気泳動装置は、flashPAGE Fractionator（Ambion, Inc.）などのマイクロ電気泳動装置であり得る。いくつかの態様において、方法は、収集されたランニングバッファーに存在する核酸分子を精製することをさらに含む。特定の態様において、約1μg〜約100μgの間の核酸が、ゲルマトリクスに加えられる。
【００４２】
本発明の特定の局面において、電気泳動は、約50〜約100ボルト（V）および約2〜約5ミリアンペア（mA）で行われる。本発明のその他の局面において、電気泳動は約60〜80 Vおよび約3 mAで行われる。いくつかの態様において、電気泳動は、約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または約20分間行われる。
【００４３】
核酸分子は、一つの画分において単離され得る、またはそれらは、複数の画分において単離され得る。望ましいサイズまたはサイズ範囲の核酸分子は、それらがゲルから移出する時に、特定の画分を収集することによって単離され得る。ゲルから移動してきた核酸分子の第一の画分を収集するために、ランニングバッファーが下層バッファー収集チャンバーから除去された後に、電気泳動を継続し、核酸分子の付加的な画分を収集するために、下層バッファー収集チャンバーに付加的なランニングバッファーを添加する必要がある。核酸分子が多数の画分において単離される場合、それらが、30秒、1分、2分、または3分間隔などの、一定の間隔で単離されることが望まれ得る。実行の間に条件が一貫性を保たれる限り、核酸サイズ画分が、各々の実行の間の同じ時間ポイントにおいてゲルを出ると思われるので、時間経過を行い、かつ初めの実行における各々の時間ポイントにおいて収集される核酸のサイズを評価することによって、核酸分子の任意の望ましいサイズクラスが、その後の実行において単離され得る。
【００４４】
色素マーカーが、核酸を含む試料がゲルにロードされるのと同時に、ゲルマトリクスの表面に加えられてもよい。核酸の特定のサイズにて、ゲルマトリクス中を移動することが公知の色素マーカーは、対象となるサイズまたは複数のサイズの核酸の溶離に対するおよその時間を同定することにおいて有用である。例えば、40ヌクレオチド核酸の移動する色素マーカーは、40ヌクレオチドよりも小さいまたは大きい核酸を含む核酸画分を収集することにおいて有用であると考えられる。長さが40ヌクレオチドよりも小さい核酸分子を収集するためには、電気泳動は、色素がゲルから移出し始めるちょうどその時に停止され、ランニングバッファーが、下層バッファー収集チャンバーから収集されるべきである。40ヌクレオチドよりも大きい核酸に対しては、下層ランニングバッファーの収集は、色素がゲルから移出し始めた時点で、開始すると考えられる。
【００４５】
核酸の電気泳動精製は、望ましいサイズまたはサイズ範囲の核酸分子が、実質的には純粋であり、それらが、試料におけるその他の核酸分子に対して少なくとも純度約80％、85％、90％、95％またはより高いが、純度100％より低いこと意味するように、望ましいサイズまたはサイズ範囲の核酸を、その他のサイズの核酸分子から単離し得る。または、望ましいサイズまたはサイズ範囲の核酸の濃縮は、倍の濃縮という語で表現され得る。特定の態様において、望ましいサイズまたはサイズ範囲の核酸は、核酸試料における望ましいサイズまたはサイズ範囲の核酸の濃度に対して、約、少なくとも約、または多くとも約5×、10×、20×、30×、40×、50×、60×、70×、80×、90×、100×、110×、120×、130×、140×、150×、160×、170×、180×、190×、200×、210×、220×、230×、240×、250×、260×、270×、280×、290×、300×、310×、320×、330×、340×、350×、360×、370×、380×、390×、400×、410×、420×、430×、440×、450×、460×、470×、480×、490×、500×、600×、700×、800×、900×、1000×、1100×、1200×、1300×、1400×、1500×、1600×、1700×、1800×、1900×、2000×、3000×、4000×、5000×、6000×、7000×、8000×、9000×、10,000×、もしくはより高く、またはそこに導き出せる任意の範囲に濃縮される。
【００４６】
さらなる態様において、方法は、分析または評価するのに適当な試料を同定することに関与する。いくつかの態様において、適当な試料が、特定の疾患もしくは病態またはあるその他の表現型に関する情報を提供し得るものであることが特に意図される。
【００４７】
本発明のその他の方法は、試料におけるmiRNAが、正常試料と比較して差次的に発現されるかどうかを決定するために、試料に対するmiRNAプロファイルを生成し、miRNAプロファイルを評価することを含む、試料におけるmiRNAを分析することに関係する。特定の態様において、本発明の方法は、生物学的試料におけるmiRNAを評価するための方法を含む。特定の例において、生物学的試料は、患者に由来する。この方法は、本発明のアレイ組成物および方法を使用して、試料における一つまたは複数のmiRNAを分析することによって導入される。特定の態様において、miRNAは、以下の段階の一つまたは複数によって評価される：a）miRNAを試料におけるその他のRNAから単離する段階；b）miRNAを標識する段階；c）miRNAをmiRNAアレイにハイブリダイズさせる段階；および、d）アレイへのmiRNAハイブリダイゼーションを決定する段階。miRNAがアレイにハイブリダイズするかどうか、どのmiRNAがアレイにハイブリダイズするのか、および/またはどれだけの全miRNAまたは任意の特定のmiRNAがアレイにハイブリダイズするのかは、アレイへのmiRNAハイブリダイゼーションの程度を決定する方式である。ハイブリダイゼーションを検出、測定、および定量する方法は、当業者にとって周知である。特定の態様において、miRNAハイブリダイゼーションは定量される。
【００４８】
本発明は、試料に対するmiRNAプロファイルを生成する方法にも関係する。「miRNAプロファイル」という語は、miRNAアレイを使用して得られた、試料における複数のmiRNAに対する発現パターンに関するデータのセットを指す。本発明のいくつかの態様において、miRNAプロファイルは、以下を含む段階によって生成される：a）試料におけるmiRNAを標識する段階；b）miRNAをmiRNAアレイにハイブリダイズさせる段階；および、c）アレイへのmiRNAハイブリダイゼーションを決定し、miRNAプロファイルが生成される段階。
【００４９】
miRNAプロファイルは、任意の2つ以上の異なる試料間のmiRNA発現における差を比較するために生成され得る。miRNAプロファイルは、例えば、特定の疾患、障害、または病態を有する試料と特定の疾患、障害、または病態を有しない試料との間；特定の疾患、障害、または病態を有するが、疾患、障害、または病態の異なるステージを有する試料間；特定の疾患、障害、または病態を有するが、疾患、障害、または病態に対して異なる予後診断を有する試料間；特定の薬剤によって処置されている試料とその薬剤によって処置されていない試料との間；処置に反応するものおよびしないもの、または処置に耐性があるものおよびないものなどの、特定の物質または薬剤に異なって反応した試料間；供給源の性差によって異なる試料；供給源の年齢または発生のステージによって異なる試料；組織型によって異なる試料；少なくとも一つの公知の多型によって異なる試料；特定の突然変異を有する試料と有しない試料との間；特定の経路において欠陥がある、または欠陥タンパク質を有する試料、およびそうでない試料；特定の疾患、障害、または病態に明らかに耐性がある試料とその特定の疾患、障害、または病態に耐性があることが予期されない試料との間で比較することができ、上に記載されるような特徴の組み合わせを有する任意の試料に関与する比較も同様である。
【００５０】
miRNAプロファイルが生成される試料は、以下の一つまたは複数に基づいて特徴付けられ得る試料を含む：年齢；発生ステージ；疾患、病態、または障害の予後診断；細胞型；組織型；器官型；人種または民族性；性差；特定の疾患、病態、または障害への罹患性（susceptibility）またはリスク；食事；特定の化学的薬剤または物質への曝露またはそれらを用いる処置；特定の疾患、病態、または障害の診断；生物型；遺伝的体質、など。
【００５１】
本発明の方法は、二つ以上の生物学的試料間の差を、各々の試料に対するmiRNAプロファイルの生成、およびプロファイルの比較によって決定することを可能にし、プロファイルにおける差は、差次的発現miRNA分子を同定する。特定の態様において、第一の試料は、miRNAプロファイルを生成することに先行して物質で処置され、第二の試料は未処置である。その他の態様において、第一の試料は、疾患または病態を示し、第二の試料は、同じ疾患または病態を示すが、進行の異なるステージにある。さらなる態様において、第一の試料は、治療剤に有利に反応し、第二の試料は、治療剤に反応しない。さらに、その他の態様において、第一の試料は、治療剤に不利に反応する第一の被験者に由来し、第二の試料は、治療剤に不利に反応しない第二の被験者に由来する。
【００５２】
本発明のその他の方法は、miRNA発現と疾患または病態との間の相関を同定することに関係し、1）疾患もしくは病態を有する、または疾患もしくは病態を有する被験者に由来する試料のmiRNAプロファイル、および2）その疾患もしくは病態に関して正常である、または疾患もしくは病態を有しない被験者に由来する試料のmiRNAプロファイルなどの、異なるmiRNAプロファイルを比較することを含む。特定の態様において、方法は、a）疾患または病態を示す試料に由来するmiRNAを単離する段階；b）miRNAを標識する段階；c）miRNAをmiRNAアレイにハイブリダイズさせる段階；および、d）正常試料と比較して、試料において差次的に発現するmiRNAを同定する段階を含む。miRNAプロファイルが、方法を行うプロセスにおいて生成され得る；または、それらは以前に得られた結果から得られ得ることが意図される。さらに、比較が、複数のmiRNAプロファイル（同じもしくは異なる時間に得られる同じ供給源に由来する多数の試料、および/または異なる供給源に由来する試料）を使用することによってなされ得ることが意図される。この場合、基準化miRNAプロファイルが、比較目的のために、生成されかつ使用され得る。
【００５３】
特定の態様において、方法は、特定のmiRNAの発現と疾患または病態を有すると信じられている試料との間の相関を検出することによって、疾患または病態を示すmiRNAを同定することに関係する。
【００５４】
特定の態様においては、試料におけるmiRNAが、正常試料と比較して差次的に発現されるかどうかを決定するために、試料に対するmiRNAプロファイルを生成し、miRNAプロファイルを評価することを含む、疾患または病態に対して患者に由来する生物学的試料を分析するための方法がある。比較は、疾患または病態を示す選択的miRNAプローブを有するアレイを使用することに関与し得る。本発明のアレイは、マクロアレイおよびマイクロアレイを含む。
【００５５】
アレイは、具体的には、ヒト、マウス、およびラットなどの哺乳類を含む、miRNAを有する任意の生物体に由来するmiRNA配列を含み得る。しかしながら、具体的に示されない限り、特定のmiRNAの名付けは、ヒトmiRNAを指す。少なくともまたは多くとも
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の、またはより多くの異なるmiRNAプローブ（つまり、同じまたは異なるmiRNA、miRNA前駆体、またはmiRNA遺伝子を標的にする異なる配列を有するmiRNAプローブ）を有するアレイが、具体的に意図される。SEQ ID NO：1〜703の任意に対するプローブを用いる、またはSEQ ID NO：704〜899において同定されるものを含む、本明細書において提供される任意のその他の配列を用いる、以前の文において記載されるそのようなアレイが、具体的に意図される。さらに、態様は、表1Cにおいて同定されるプローブの任意またはすべてを、具体的に含み得る、または採用し得る。プローブは、SEQ ID NO：704〜899の5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、またはより多くの近接核酸（またはそこに導き出せる任意の範囲）と同一であるまたは相補的であり得る。または、使用される任意のプローブは、SEQ ID NO：1〜899における任意の配列に対して、少なくともまたは多くとも80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100％相補的または同一（またはそこに導き出せる任意の範囲）であり得る。miRNAアレイとの関連で議論される任意の態様が、本発明のスクリーニングもしくはプロファイリングの方法またはキットにおいて、より一般的に採用され得ることが具体的に意図される。言い換えれば、特定のアレイに何が含まれ得るかを記載する任意の態様は、より一般的にmiRNAプロファイリングとの関連で実施されることがあり、アレイそれ自体に関与する必要はない。
【００５６】
特定の態様において、アレイは、let-7、miR-7、let-7F-2、miR-9、miR-10a、miR-16、miR-17、miR-21、miR-22、miR-23、miR-24、miR-26a、miR-28、miR-29b、miR-30a、miR-31、miR-95、miR-105、miR-106、miR-125a、miR-126、miR-130、miR-130a、miR-133、miR-135A、miR-137、miR-138、miR-139、miR-140、miR-143、miR-144、miR-145、miR-181a、miR-182、miR-183、miR-186、miR-188、miR-192、miR-194、miR-195、miR-199a、miR-200b、mu-miR-201、miR-205、miR-211、miR-215、miR-219、miR-223、miR-224、mu-miR-290、mu-miR-291-5P、mu-miR-298、miR-301、miR-328、miR-331、およびmiR-342からなる群より選択されるヒトmiRNAに対する少なくともまたは多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55のプローブ（またはそこに導き出せる任意の範囲）を有する。miRNAの総称的記載が、他に特に示されなければ、その遺伝子ファミリーメンバー（番号によって識別される）および関連メンバー（文字によって識別される）の任意を指すように、簡単な表記法が採用されることが理解されると思われる。例えば、「mir-7」はmiR-7-1、miR-7-2、および、miR-7-3を指す。同様に、例えば、「let-7」は、let7-a-1、let7-a-2、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-1、およびlet-7f-2を指す。この簡単な表記法の例外は、別に同定されると思われる。少なくとも90％相補性を有するプローブは、miRNAへのハイブリダイゼーションを可能にすると思われる。非ヒトmiRNAに対するプローブは、非ヒトmiRNAプローブを用いる検出を可能にするための十分な相補性を有するヒトホモログまたは配列を標的にするために、本発明の態様において使用され得る。そのようなプローブは、マウスもしくはラット、またはその他の哺乳類を含む任意のその他の生物体において同定されるmiRNAに対するものであり得る。例えば、mu-miR-201は、マウスmiRNAであるが、その配列に対するプローブがヒト試料とともに採用された場合、mu-miRNA-201に対するヒトホモログが検出された。
【００５７】
これらのプローブまたは標的miRNAの任意の組み合わせが、本発明の方法および組成物において使用され得ることが意図される。さらに、正常試料に対するこれらのmiRNAの少なくともまたは多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、またはより多くの発現における増加および/または減少であって、ここで「正常試料」は、試料が疾患、病態、または試験される状態を有しない、またはそれらに苦しまないことを意味する。そのようなアレイが、表1に載せられるmiRNAに対するプローブを含んでもよいことが意図される。
【００５８】
さらに、特定の態様において、方法および組成物は、癌もしくは腫瘍細胞を含む、または癌と診断された被験者に由来する試料に関与し得る。特定の態様において、癌は、星状細胞腫、骨癌、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、消化管癌、膠芽腫癌、頭部癌、肝細胞癌、白血病、肺癌、リンパ腫、メラノーマ、中皮腫、神経芽腫、頸部癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、網膜芽腫、小細胞肺癌、胃癌、精巣癌、胸腺癌、および甲状腺癌からなる群より選択される。
【００５９】
特定の態様において、アレイは、let-7、let-7A、let-7C、let-7F-2、miR-7、miR-9a、miR-9-as、miR-10a、miR-15A、miR-16、miR-17、miR-20、miR-21、miR-22、miR-23a、miR-23b、miR-24、miR-25、miR-26a、miR-28、miR-29b、miR-30a、miR-30a-as、miR-31、miR-92、miR-95、miR-99b、miR-103、miR-105、miR-106a、miR-125a、miR-126、miR-126-as、miR-130a、miR-133、miR-137、miR-138、miR-139、miR-140、miR-141、miR-143、miR-144、miR-145、miR-152、miR-181a、miR-181b、miR-182、miR-183、miR-186、miR-188、miR-192、miR-194、miR-195、miR-199a、miR-199a-as、miR-200b、mu-miR-201、miR-203、miR-205、miR-211、miR-215、miR-219、miR-221、miR-222、miR-223、miR-224、miR-290、miR-291、miR-291-5P、miR-298、miR-301、miR-326、miR-328、mu-mu-miR-329、miR-331、miR-341、miR-342、miR-344、miR-361、およびmiR-425からなる群より選択されるヒトmiRNAに対する少なくともまたは多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、または40のプローブ（またはそこに導き出せる任意の範囲）を有する。そのようなアレイに関与する特定の態様において、正常試料と比較された発現における変化は癌を示す。さらに、方法が、アレイを伴うまたは伴わないそのようなmiRNAプローブに関与し得ることが意図される。
【００６０】
特定の態様において、アレイまたは方法は、以下のmiRNAの一つまたは複数に対する少なくとも一つのプローブに関与する：miR-21、miR-126、miR-143、miR-145、miR-188、miR-200B、miR-219、およびmiR-331。そのようなアレイを使用する本発明の方法において、miR-17、miR-21、miR-182、miR-183、miR-200b、miR-205、miR-223、および/もしくはmiR-224発現における増加は癌を示し、ならびに/またはlet-7、miR-10a、miR-16、miR-22、miR-23、miR-24、miR-26a、miR-29b、miR-30a、miR-106、miR-125a、miR-126、miR-130、miR-130a、miR-133、miR-143、miR-144、miR-145、miR-181a、miR-188、miR-219、miR-192、miR-194、miR-195、miR-199a、mu-miR-201、miR-215、miR-328、miR-331、および/もしくはmiR-342の発現における減少は癌を示す。
【００６１】
これは、以下の任意が癌を示すことを意味する：1）同定されるmiRNA（またはそのヒトホモログ）の一つまたは複数の発現における減少；2）同定されるmiRNA（またはそのヒトホモログ）の一つまたは複数の発現における増加；または3）同定されるmiRNA（またはそのヒトホモログ）の一つまたは複数の発現における増加および減少の両方。少なくとも
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の異なるmiRNAの発現における差が、疾患、病態またはその他の表現型の指標として使用され得ることが、いくつかの態様において意図される。さらに、いくつかの場合において、指標が、特定の疾患、病態、または表現型を有するまたは発生するリスクに関する情報を提供することが意図される。これらの異なるmiRNAは、以下の任意を含む：let-7、let-7A、let-7C、let7D-as、let-7F-2、miR-7、miR-9a、miR-9-as、miR-10a、miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-17、miR-20、miR-21、miR-22、miR-23a、miR-23b、miR-24、miR-25、miR-26a、miR-27a、miR-28、miR-29、miR-29b、miR-30a、miR-30a-as、miR-31、miR-32、miR-92、miR-95、miR-99b、miR-103、miR-105、miR-106a、miR-125a、miR-125b、miR-126、miR-126-as、miR-126a、miR-128、miR-130a、miR-133、miR-133a、miR-135a、miR-137、miR-138、miR-139、miR-140、miR-141、miR-143、miR-144、miR-145、miR-150、miR-152、miR-181a、miR-181b、miR-182、miR-183、miR-184、miR-186、miR-188、miR-189、miR-192、miR-194、miR-195、miR-199、miR-199a、miR-199a-as、miR-200b、miR-201、miR-203、miR-204、miR-205、miR-207、miR-211、miR-212、miR-215、miR-219、miR-221、miR-222、miR-223、miR-224、miR-239、miR-290、miR-291、miR-291-5P、miR-298、miR-301、miR-326、miR-328、mu-miR-329、miR-331、miR-338、miR-341、miR-342、miR-344、miR-361、およびmiR-425。
【００６２】
任意のキット、アレイ、またはその他の検出技術もしくはツール、または任意の方法が、これらのmiRNAの任意に対するプロファイリングに関与し得ることが具体的に意図される。
【００６３】
癌は、悪性癌、腫瘍、転移性癌、切除不能癌、化学療法および/または放射線耐性癌、ならびに末期癌を含むが、それらに限定されない。特定のmiRNAの発現における可能性のある減少または増加に関与する任意の態様において、減少のみが評価され得る、増加のみが評価され得る、またはその関連（またはそこに導き出せる任意の範囲）において記述されるmiRNAの任意の発現における増加および減少の両方が評価され得るということが具体的に意図される。
【００６４】
特定の態様において、miRNAアレイまたは方法は、miR-21、miR-15a、miR-16、miR-24、miR-25、miR-99、miR-100、miR-205、miR-197、miR-126、miR-143、およびmiR-145からなる群より、または、miR-15A、miR-21、miR-24、miR-135A、miR-145、miR-200B、miR-205、miR-211、miR-298、およびmu-miR-329からなる群より選択されるmiRNAに対する、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、または13のプローブ（またはそこに導き出せる任意の範囲）に関与する。本発明の方法において、正常試料と比較して、miRNAの少なくともまたは多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、または13（またはそこに導き出せる任意の範囲）の発現における差は乳癌を示す。本発明の方法において、正常試料と比較して、miR-21、miR-15a、miR-16、miR-24、および/もしくはmiR-25発現における増加、ならびに/またはmiR-99、miR-100、miR-205、miR-197、miR-126、miR-143、および/もしくはmiR-145発現における減少は乳癌を示す。その他の態様において、正常試料と比較して、miR-135A、miR-145、miR-205、miR-211、miR-298、もしくはmu-miR-329の発現における減少、および/またはmiR-15A、miR-21、miR-24、もしくはmiR-200Bの発現における増加は乳癌を示す。アレイは、この段落において記載されるmiRNAに対するプローブの任意の組み合わせ、ならびに任意のその他のmiRNAプローブに具体的に関与し得る。
【００６５】
その他の態様において、miRNAアレイまたは方法は、miR-10a、miR-17、miR-21、mir-23、miR-26a、miR-30a、miR-106、miR-125a、miR-126、miR-130、miR-130a、miR-133、miR-143、miR-144、miR-145、miR-188、miR-192、miR-194、miR-195、miR-199a、miR-200b、miR-215、miR-223、miR-224、miR-331、およびmiR-342からなる群より選択される、またはmiR-21、miR-31、miR-106A、miR-125a、mir-130a、miR-133、miR-135、miR-143、miR-145、miR-200B、miR-203、およびmiR-223からなる群より選択されるmiRNAに対する1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26のプローブ（またはそこに導き出せる任意の範囲）に関与する。本発明の方法において、正常試料と比較して、miRNAの少なくともまたは多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、または26（またはそこに導き出せる任意の範囲）の発現における差は結腸癌を示す。
【００６６】
特定の態様において、以下のmiRNAの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、または21（またはそこに導き出せる任意の範囲）の発現における減少は結腸癌を示す：miR-145、miR-143、miR-133、miR-342、miR-125a、miR-195、miR-30a、miR-10a、miR-130、miR-130a、miR-192、miR-194、miR-215、miR-144、miR-23、miR-26a、miR-126、miR-199a、miR-188、miR-331、および/またはmiR-21；ならびに以下のmiRNAの1、2、3、4、5、6、または7（またはそこに導き出せる任意の範囲）の発現における増加は結腸癌を示す：miR-21、miR-106、miR-200b、miR-223、miR-224、および/またはmiR-17。アレイは、この段落において記載されるmiRNAに対するプローブの任意の組み合わせ、ならびに任意のその他のmiRNAプローブに具体的に関与し得る。
【００６７】
特定の態様において、miRNAアレイまたは方法は、miR-21、miR-31、miR-106A、miR-125a、mir-130a、miR-133、miR-135A、miR-143、miR-145、miR-200B、miR-203、およびmiR-223からなる群より選択されるmiRNAに対する、1、2、3、4、5、6、7、8、または9のプローブ（またはそこに導き出せる任意の範囲）に関与する。正常試料と比較して、miRNAの少なくともまたは多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、または9（またはそこに導き出せる任意の範囲）の発現における差は結腸癌を示す。本発明の特定の方法において、正常試料と比較して、miR-17、miR-21、miR-106、および/もしくはmiR-223発現における増加；ならびに/またはmiR-130a、miR-143、miR-145、miR-195、および/もしくはmiR-331発現における減少は結腸癌を示す。その他の態様において、正常試料と比較して、miR-125a、mir-130a、miR-133、miR-135A、miR-143、もしくはmiR-145の発現における減少、および/またはmiR-21、miR-31、miR-106A、miR-200B、miR-203、もしくはmiR-223の発現における増加は結腸癌を示す。アレイは、この段落において記載されるmiRNAに対するプローブの任意の組み合わせ、ならびに任意のその他のmiRNAプローブに具体的に関与し得る。
【００６８】
本出願を通じて、「発現における差」という語は、試料における特定のmiRNAのレベルが、正常試料におけるその特定のmiRNAのレベルよりも高いまたは低いことを意味する。癌に対する試験との関連で、「正常試料」は非癌性試料を意味する。
【００６９】
さらなる態様において、miRNAアレイまたは方法は、miR-21、miR-23、およびmiR-143からなる群より選択される、またはmiR-15A、miR-21、miR-29、miR-141、miR-188、miR-290、およびmiR-331からなる群より選択される1、2、または3のmiRNA（またはそこに導き出せる任意の範囲）に関与する。本発明の方法において、正常試料と比較して、miR-21、miR-23、および/またはmiR-143発現における減少は前立腺癌を示す。特定の態様において、正常試料と比較して、miR-188、miR-290、もしくはmiR-331の発現における減少、および/またはmiR-15A、miR-21、miR-29、もしくはmiR-141の発現における増加は前立腺癌を示す。アレイは、この段落において記載されるmiRNAに対するプローブの任意の組み合わせ、ならびに任意のその他のmiRNAプローブに具体的に関与し得る。
【００７０】
さらに、付加的な態様において、miRNAアレイまたは方法は、miR-21、miR-125、miR-24、miR-200b、miR-29b、miR-221、miR-222、miR-224、miR-10a、miR-183、miR-145、miR-22、miR-331、miR-126、miR-30a、miR-199a、およびmiR-223からなる群より選択される、またはmiR-15A、miR-21、miR-30A-as、miR-31、miR-135A、miR-138、miR-152、miR-199A-as、miR-200B、miR-203、およびmiR-331からなる群より選択されるmiRNAに対する1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、1、12、13、14、15、16、17、または18のプローブ（またはそこに導き出せる任意の範囲）に関与する。本発明の方法において、正常試料と比較して、miR-21、miR-125、miR-24、miR-200b、miR-29b、miR-221、miR-222、miR-224、miR-10a、および/もしくはmiR-183発現における増加、ならびに/またはmiR-145、miR-22、miR-126、miR-30a、miR-199a、miR-223、および/もしくはmiR-331発現における減少は甲状腺癌を示す。特定の態様において、正常試料と比較して、miR-30A-as、miR-31、miR-135A、miR-138、miR-152、miR-199A-as、miR-203、もしくはmiR-331の発現における減少、および/またはmiR-15A、miR-21、もしくはmiR-200Bの発現における増加は甲状腺癌を示す。アレイは、この段落において記載されるmiRNAに対するプローブの任意の組み合わせ、ならびに任意のその他のmiRNAプローブに具体的に関与し得る。
【００７１】
特定の態様において、miRNAアレイまたは方法は、let-7、miR-16、miR-17、miR-21、miR-22、miR-24、miR-26a、miR-29b、miR-30a、miR-106、miR-125a、miR-126、miR-143、miR-145、miR-181a、miR-182、miR-183、miR-188、miR-195、miR-200b、mu-miR-201、miR-205、miR-223、miR-328、miR-331、およびmiR-342からなる群より選択される、またはlet-7a、let-7c、miR-21、miR-26a、miR-30A-AS、miR-95、miR-125a、miR-126、miR-200b、miR-205、miR-331、およびmiR-342からなる群より選択されるmiRNAに対する、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27または28のプローブ（またはそこに導き出せる任意の範囲）に関与する。本発明の方法において、正常試料と比較して、miRNAの少なくともまたは多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、または28（またはそこに導き出せる任意の範囲）の発現における差は肺癌を示す。特定の態様において、以下のmiRNAの1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、または19（またはそこに導き出せる任意の範囲）の発現における減少は肺癌を示す：miR-130a、miR-145、miR-126、miR-331、miR-342、miR-143、Let-7、miR-30a、miR-16、miR-26a、miR-125a、miR-29b、miR-24、miR-328、mu-miR-201、miR-195、miR-22、miR-181a、およびmiR-331；ならびに/または以下のmiRNAの1、2、3、4、5、6、7、8、または9（またはそこに導き出せる任意の範囲）の発現における増加は肺癌を示す：miR-223、miR-106、miR-21、miR-200b、miR-182、miR-183、miR-17、およびmiR-205。その他の態様において、正常試料と比較して、let-7a、let-7c、miR-26a、miR-30A-AS、miR-95、miR-125a、miR-126、miR-331、もしくはmiR-342の発現における減少、および/またはmiR-21、miR-200B、もしくはmiR-205の発現における増加は肺癌を示す。アレイは、この段落において記載されるmiRNAに対するプローブの任意の組み合わせ、ならびに任意のその他のmiRNAプローブに具体的に関与し得る。
【００７２】
特定の態様において、miRNAアレイまたは方法は、miR-21、miR-30a、miR-16、miR-126、miR-143、miR-145、miR-188、miR-200b、およびmiR-331からなる群より選択されるmiRNAに対する、1、2、3、4、5、6、7、8、または9のmiRNAプローブ（またはそこに導き出せる任意の範囲）に関与する。そのようなアレイを使用する本発明の方法において、正常試料と比較して、少なくともまたは多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、または9のmiRNA（またはそこに導き出せる任意の範囲）の発現における差は肺癌を示す。本発明の方法において、正常試料と比較して、miR-21および/もしくはmiR-200b発現における増加；ならびに/またはmiR-30a、miR-126、miR-143、miR-145、miR-188、および/もしくはmiR-331発現における減少は肺癌を示す。アレイは、この段落において記載されるmiRNAに対するプローブの任意の組み合わせ、ならびに任意のその他のmiRNAプローブに具体的に関与し得る。
【００７３】
特定の態様において、miRNAアレイまたは方法は、miR-145、miR-143、miR-126、miR-30a、miR-125a、miR-21、miR-195、miR-17、miR-182、およびmiR-183からなる群より選択されるmiRNAに対する1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または11のプローブ（またはそこに導き出せる任意の範囲）に関与する。本発明の方法において、正常試料と比較して、miRNAの少なくともまたは多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または11（またはそこに導き出せる任意の範囲）の発現における差は癌を示す。特定の態様において、以下のmiRNAの1、2、3、4、5、6、7、8、または9（またはそこに導き出せる任意の範囲）の発現における減少は癌を示す：miR-145、miR-143、miR-126、miR-30a、miR-125a、miR-21、miR-195、および/またはmiR-17；ならびに以下のmiRNAの1、2、3、4、5、6、または7（またはそこに導き出せる任意の範囲）の発現における増加は癌を示す：miR-125a、miR-21、miR-195、miR-17、miR-182、および/またはmiR-183。アレイは、この段落において記載されるmiRNAに対するプローブの任意の組み合わせ、ならびに任意のその他のmiRNAプローブに具体的に関与し得る。
【００７４】
さらなる態様において、miRNAアレイまたは方法は、miR-9as、miR-21、miR-133、miR-143、miR-145、miR-182、およびmiR-200Bからなる群より選択される任意のmiRNAに対する1、2、3、4、5、6、または7のプローブ（またはそこに導き出せる任意の範囲）に関与する。本発明の方法において、正常試料と比較して、少なくともまたは多くとも1、2、3、4、5、6、または7のmiRNA（またはそこに導き出せる任意の範囲）の発現における差は膀胱癌を示す。特定の態様において、正常試料と比較して、miR-133、miR-143、もしくはmiR-145の発現における減少、および/またはmiR-9as、miR-21、miR-182、もしくはmiR-200Bの発現における増加は膀胱癌を示す。アレイまたはその他の検出技術は、この段落において記載されるmiRNAに対するプローブの任意の組み合わせ、ならびに任意のその他のmiRNAプローブに具体的に関与し得る。アレイまたはその他の検出技術に関与する方法は、この段落において記載されるmiRNAに対するプローブの任意の組み合わせ、ならびに任意のその他のmiRNAプローブに同様に関与し得る。
【００７５】
本発明は、miR-29B、miR-326、miR-361、およびmiR-425からなる群より選択される任意のmiRNAに対する1、2、3、または4のプローブ（またはそこに導き出せる任意の範囲）に関与するmiRNAアレイまたは方法にも関係する。本発明の方法において、正常試料と比較して、miRNAの少なくともまたは多くとも1、2、3、または4（またはそこに導き出せる任意の範囲）の発現における差は子宮頸癌を示す。そのようなアレイを使用する本発明の方法において、miR-29B、miR-326、miR-361、またはmiR-425の発現における増加は子宮頸癌を示す。アレイは、この段落において記載されるmiRNAに対するプローブの任意の組み合わせ、ならびに任意のその他のmiRNAプローブに具体的に関与し得る。
【００７６】
本発明は、let-7、miR-15A、miR-16、miR-20、miR-21、miR-23A、miR-23B、miR-25、miR-26A、miR-92、miR-99B、miR-103、miR-106A、miR-126、miR-126AS、miR-181A、miR-181B、miR-221、miR-222、miR-223、miR-291、miR-341、miR-361、およびmiR-425、miR-326、miR-361、またはmiR-425からなる群より選択される任意のmiRNAに対する1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、または27のプローブ（またはそこに導き出せる任意の範囲）に関与するmiRNAアレイまたは方法にも関係する。本発明の方法において、正常試料と比較して、少なくともまたは多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、または27のmiRNA（またはそこに導き出せる任意の範囲）の発現における差は白血病を示す。
【００７７】
特定の態様において、miRNAアレイまたは方法は、miR-25、miR-126、miR-126AS、miR-181B、miR-221、miR-222、miR-291、miR-361、およびmiR-425からなる群より選択される任意のmiRNAに対する1、2、3、4、5、6、7、8、または9のプローブ（またはそこに導き出せる任意の範囲）に関与する。本発明の方法において、正常試料と比較して、少なくともまたは多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、または9のmiRNA（またはそこに導き出せる任意の範囲）の発現における差は急性骨髄性白血病を示す。さらに、いくつかの場合において、正常試料と比較して、miR-25、miR-291、miR-361、もしくはmiR-425の発現における減少、および/またはmiR-126、miR-126AS、miR-181B、miR-221、もしくはmiR-222の発現における増加は急性骨髄性白血病を示す。
【００７８】
その他の態様において、miRNAアレイまたは方法は、let-7、miR-15A、miR-16、miR-20、miR-21、miR-23A、miR-23B、miR-26A、miR-92、miR-99B、miR-103、miR-106A、miR-181A、miR-181B、miR-221、miR-222、miR-223、miR-341、miR-361、およびmiR-425からなる群より選択される任意のmiRNAに対する1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20のプローブ（またはそこに導き出せる任意の範囲）に関与する。本発明の方法において、正常試料と比較して、少なくともまたは多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、または9のmiRNA（またはそこに導き出せる任意の範囲）の発現における差は慢性リンパ球性白血病を示す。さらに、いくつかの場合において、正常試料と比較して、let-7、miR-15A、miR-16、miR-20、miR-21、miR-23A、miR-23B、miR-26A、miR-92、miR-99B、miR-103、miR-106A、miR-181A、miR-181B、miR-221、miR-222、もしくはmiR-223の発現における減少、および/またはmiR-341、miR-361、もしくはmiR-425の発現における増加は慢性リンパ球性白血病を示す。
【００７９】
本発明のその他の態様は、miR-21、miR-95、miR-105、miR-137、miR-186、miR-188、miR-199、miR-211、miR-215、miR-223、mu-miR-290、miR-301、miR-331、およびmiR-342からなる群より選択される、またはlet7D-AS、miR-21、miR-32、miR-95、miR-133A、miR-137、miR-141、miR-144、miR-181A、miR-184、miR-186、miR-188、miR-199、miR-201、miR-203、miR-204、miR-211、miR-212、miR-223、miR-224、mu-miR-329、miR-331、およびmiR-344からなる群より選択されるmiRNAに対する1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、または14のプローブ（またはそこに導き出せる任意の範囲）を含むmiRNAアレイを含む。本発明の方法において、正常試料と比較して、少なくともまたは多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、または14のmiRNA（またはそこに導き出せる任意の範囲）の発現における差は狼瘡を示す。そのようなアレイを使用する本発明の方法において、正常試料と比較して、miR-21、miR-223、および/もしくはmir-342発現における増加；ならびに/またはmiR-95、miR-105、miR-137、miR-186、miR-188、miR-199、miR-211、miR-215、mu-miR-290、miR-301、および/もしくはmiR-331発現における減少は全身性紅斑性狼瘡（SLE）を示す。アレイは、この段落において記載されるmiRNAに対するプローブの任意の組み合わせ、ならびに任意のその他のmiRNAプローブに具体的に関与し得る。
【００８０】
本発明は、miR-7、miR-9-as、miR-16、miR-24、miR-26A、miR-27A、miR-95、miR-130A、およびmiR-135Aからなる群より選択される、またはmiR-7、miR-9-as、miR-16、miR-24、miR-26A、miR-27A、miR-95、miR-130A、miR-135A、およびmiR-239からなる群より選択されるmiRNAに対する1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10のプローブ（またはそこに導き出せる任意の範囲）に関与するmiRNAアレイまたは方法にも関与する。本発明の方法において、正常試料と比較して、少なくともまたは多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、または14のmiRNA（またはそこに導き出せる任意の範囲）の発現における差は、プリオン病またはプリオン病罹患性を示す。本発明の特定の方法において、正常試料（プリオンに非感染およびまたは非感受性である）と比較して、miR-7、miR-9-as、miR-16、miR-24、miR-26A、miR-27Aおよび/もしくはmiR-130A発現における増加；ならびに/またはmiR-95および/もしくはmiR-135A発現における減少は、プリオン病またはプリオン病罹患性を示す。その他の態様において、正常試料と比較して、miR-95もしくはmiR-135Aの発現における減少、および/またはmiR-7、miR-9-as、miR-16、miR-24、miR-26A、miR-27A、miR-130A、もしくはmiR-239の発現における増加は、プリオン病またはプリオン病罹患性を示す。アレイは、この段落において記載されるmiRNAに対するプローブの任意の組み合わせ、ならびに任意のその他のmiRNAプローブに具体的に関与し得る。
【００８１】
本発明の別のmiRNAアレイは、Let7F-2、miR-16、miR-28、miR-30A、miR-31、miR-138、miR-139、miR-140、mu-miR-291-5P、およびmu-miR-298からなる群より選択されるmiRNAに対する1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10のプローブ（またはそこに導き出せる任意の範囲）を含むものである。本発明の方法において、正常試料と比較して、miR-28、miR-30A、miR-31、miR-138、miR-139、miR-140、mu-miR-291-5Pおよび/もしくはmu-miR-298発現における増加；ならびに/またはLet7F-2および/もしくはmiR-16発現における減少は、虚血または虚血罹患性を示す。アレイは、この段落において記載されるmiRNAに対するプローブの任意の組み合わせ、ならびに任意のその他のmiRNAプローブに具体的に関与し得る。
【００８２】
本発明は、miR-125B、miR-126a、miR-150、miR-192、miR-194、miR-207、およびmiR-223からなる群より選択されるmiRNAに対する1、2、3、4、5、6、または7のプローブ（またはそこに導き出せる任意の範囲）に関与するmiRNAアレイまたは方法にも関係する。本発明の方法において、正常試料と比較して、少なくともまたは多くとも1、2、3、4、5、6、または7のmiRNA（またはそこに導き出せる任意の範囲）の発現における差は、クローン病またはクローン病罹患性を示す。本発明の特定の方法において、正常試料と比較して、miR-126as、miR-192、miR-194もしくはmiR-207の発現における減少、および/またはmiR-125B、miR-150もしくはmiR-223の発現における増加は、クローン病またはクローン病罹患性を示す。アレイは、この段落において記載されるmiRNAに対するプローブの任意の組み合わせ、ならびに任意のその他のmiRNAプローブに具体的に関与し得る。
【００８３】
本発明のその他の態様は、let-7F2、miR-16、miR-126、miR-143、miR-145、miR-204、miR-223、miR-291、miR-338、およびmiR-425からなる群より選択されるmiRNAに対する1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10のプローブ（またはそこに導き出せる任意の範囲）に関与するmiRNAアレイまたは方法に関する。本発明の方法において、正常試料と比較して、少なくともまたは多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10のmiRNA（またはそこに導き出せる任意の範囲）の発現における差は、アルツハイマー病またはアルツハイマー病罹患性を示す。本発明の特定の方法において、正常試料と比較して、let-7F2、miR-16、miR-126、miR-143、miR-145、もしくはmiR-223の発現における減少、および/またはmiR-204、miR-291、miR-338もしくはmiR-425の発現における増加は、アルツハイマー病またはアルツハイマー病罹患性を示す。その他の態様において、miR-182の発現における差は、アルツハイマー病またはアルツハイマー病罹患性を示す。アレイは、この段落において記載されるmiRNAに対するプローブの任意の組み合わせ、ならびに任意のその他のmiRNAプローブに具体的に関与し得る。
【００８４】
本発明は、let-7A、let-7C、miR-15B、miR-16、miR-17、miR-106、miR-128、miR-181A、およびmiR-326からなる群より選択されるmiRNAに対する1、2、3、4、5、6、7、または8のプローブ（またはそこに導き出せる任意の範囲）に関与するmiRNAアレイまたは方法にも関係する。本発明の方法において、正常試料と比較して、少なくともまたは多くとも1、2、3、4、5、6、7、または8のmiRNA（またはそこに導き出せる任意の範囲）の発現における差はT細胞発生を示す。本発明の特定の方法において、正常試料と比較して、miR-326の発現における減少、および/またはlet-7A、let-7C、miR-15B、miR-16、miR-17、miR-106A、miR-128、もしくはmiR-181Aの発現における増加はT細胞発生を示す。アレイは、この段落において記載されるmiRNAに対するプローブの任意の組み合わせ、ならびに任意のその他のmiRNAプローブに具体的に関与し得る。
【００８５】
本発明は、miR-23A、miR-23B、miR-99B、miR-126、miR-133A、およびmiR-326からなる群より選択されるmiRNAに対する1、2、3、4、5、または6のプローブ（またはそこに導き出せる任意の範囲）に関与するmiRNAアレイまたは方法にも関係する。本発明の方法において、正常試料と比較して、少なくともまたは多くとも1、2、3、4、5、または6のmiRNA（またはそこに導き出せる任意の範囲）の発現における差は、心臓肥大または心臓肥大のリスクを示す。本発明の特定の方法において、正常試料と比較して、miR-23A、miR-23B、miR-99B、miR-126、miR-133A、またはmiR-326の発現における減少は、心臓肥大または心臓肥大のリスクを示す。アレイは、この段落において記載されるmiRNAに対するプローブの任意の組み合わせ、ならびに任意のその他のmiRNAプローブに具体的に関与し得る。
【００８６】
患者、特に特定の疾患または病態を有することが疑われる患者に対するmiRNAプロファイルが、本出願において議論されるmiRNAの任意を評価することによって生成され得ることが具体的に意図される。患者から生成されるmiRNAプロファイルは、特定の疾患または病態に関する情報を提供するものであると思われる。多くの態様において、miRNAプロファイルは、議論されるmiRNAアレイを使用して生成される。
【００８７】
本発明は、a）疾患または病態を示す第一の試料に対するmiRNAプロファイルを作成する段階；b）第一のmiRNAプロファイルにおける任意の差を、正常試料の第二のmiRNAプロファイルと比較して同定する段階であって、試料間の任意の差により、差次的発現miRNAが、疾患または病態に対する候補診断マーカーまたは候補治療標的として同定される段階を含む、疾患または病態の候補診断マーカーまたは候補治療標的を同定するための方法にも関係する。いくつかの態様において、疾患または病態を示す試料および正常試料は、単一の患者から同定される。その他の態様において、方法は、正常試料における発現と比較される少なくとも一つのmiRNAの発現における差に対して、第一の試料と同じ疾患または病態を示す第二の試料を評価することも含む。上に議論される方法またはアレイの任意は、miRNAプロファイリングに関与し得る。
【００８８】
さらに、miRNAアレイとの関連において議論される任意の態様が、本発明の方法において、アレイ形式を用いてまたは用いずに導入され得ることが具体的に意図される；言い換えれば、miRNAアレイにおける任意のmiRNAは、当業者にとって公知の任意の技術に従って、本発明の任意の方法において、スクリーニングまたは評価され得る。アレイ形式は、導入されるスクリーニングおよび診断的方法に対して必要とされない。
【００８９】
上に議論される態様において、miRNAの「セット」の発現は、特定の疾患または病態に関する情報に対して評価され得る。本発明が導入されてよく、セットの一部として同定される一つまたは複数のmiRNAが、それがプローブされるという点から、またはその発現データがセットの残りの分析または結論から排除されるという点から、排除されることが具体的に意図される。言い換えれば、個々のmiRNAは、提供される態様に関して本明細書において同定される任意のセットにおいて放棄され得る。
【００９０】
本発明のその他の方法は、a）疾患または病態を示す試料を物質に接触させる段階；b）試料に対するmiRNAプロファイルを生成する段階；およびc）試料に対するmiRNAプロファイルを、物質に接触しなかった試料のmiRNAプロファイルと比較し、miRNAプロファイルにおける差が、候補治療薬剤を同定する段階を含む、疾患または病態に対する候補治療薬剤をスクリーニングする方法を含む。
【００９１】
特定の方法において、治験に対してまたは特定の投薬計画に対して、患者を彼または彼女のmiRNAプロファイルに基づいて、同定または選択し得る。それ故に、本発明のいくつかの態様において、患者は、彼のmiRNAプロファイルに基づいて、薬物または投薬計画の適したレシピエントとして同定される。そのような方法は、患者に対するmiRNAプロファイルを生成することに関与し、そのプロファイルは、問題になっている薬物または投薬計画に関して効能または毒性を示す一つまたは複数のmiRNAに関与する。いくつかの態様において、方法は、薬物または投薬計画によって提供され得る処置を必要とする患者を同定することに関与する。
【００９２】
キットも、本発明の一部として含まれる。本明細書において記載される本発明の方法を導入するためのキットが、具体的に意図される。いくつかの態様において、多重標識化に対してmiRNAを調製するためのキット、ならびにmiRNAプローブおよび/またはmiRNAアレイを調製するためのキットがある。これらの態様において、キットは、適した容器手段において、以下の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12またはより多くを含む：1）ポリ(A)ポリメラーゼ；2）非修飾ヌクレオチド（G、A、T、C、および/またはU）；3）修飾ヌクレオチド（標識または非標識）；4）ポリ(A)ポリメラーゼバッファー；および、5）少なくとも一つのマイクロフィルター；6）ヌクレオチドに付着し得る標識；7）少なくとも一つのmiRNAプローブ；8）反応バッファー；9）miRNAアレイまたはそのようなアレイを作るための構成要素；10）酢酸；11）アルコール；12）miRNAまたはmiRNAプローブもしくはアレイを調製、単離、濃縮、および精製するための溶液。その他の試薬は、ホルムアミド、ローディング色素、リボヌクレアーゼ阻害剤、およびDNA分解酵素などの、RNAを操作するために一般的に使用されるものを含む。バッファー、ならびにその他の溶液は、本発明の特定の態様において、約、少なくとも約、または多くとも約5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、またはより高い（またはそこに導き出せる任意の範囲）pHを有するように意図される。
【００９３】
ポリ(A)ポリメラーゼは、任意の供給源に由来し得るが、組み換え型であり得るまたは生物体から精製され得る、酵母または大腸菌に由来するポリ(A)ポリメラーゼが具体的に意図される。ポリ(A)ポリメラーゼに対する反応バッファーは、本発明の任意のキットに含まれ得る。典型的には、そのようなポリ(A)ポリメラーゼ反応バッファーは、PEG、マグネシウム、およびナトリウムなどの、体積排除試薬を含む。特定の態様において、キットにおけるポリ(A)ポリメラーゼ反応バッファーは、少なくとも以下を含む：約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15％、またはより多くの（またはそこに導き出せる任意の範囲）PEG；約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mM、またはより多くのMgCl2（またはそこに導き出せる任意の範囲）；約100、200、300、400、500、600、700、800、900 mM NaCl（またはそこに導き出せる任意の範囲）；約50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150 mM、またはより多くのMES（またはそこに導き出せる任意の範囲）；および約0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 mM、またはより多くのDTT（またはそこに導き出せる任意の範囲）。キットは、マンガン源も含んでいてよく、これは、キットの別個の構成要素として、または反応バッファーなど、その他の構成要素を有する溶液もしくはバッファーに含まれ得る。約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mM、またはより多くのMnCl2が、キットに含まれることが意図される。
【００９４】
ヌクレオチドも、本発明のキットに含まれ得る。ヌクレオチドは、DNAまたはRNAに対するものであり得る。ヌクレオチドの濃度またはヌクレオチドミックスの濃度（すべてのヌクレオチドの全濃度）は、約、少なくとも約、または多くとも約0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0 mM、またはより高い濃度（またはそこに導き出せる任意の範囲）を含むが、それらに限定されない。さらに、それらは修飾され得る、または修飾され得ない。それらが修飾される場合、それらは反応基を有し得る、またはそれらはそれに付着する標識を有し得る。特定の態様において、キットにおける一つまたは複数のヌクレオチドは、アミン反応基などの反応基を有する。その他の態様において、ヌクレオチドはすでに標識されている。それは、色素などの、化学発光または蛍光標識で標識され得る。アミン反応性色素が、具体的に意図される。さらに、キットが、修飾および非修飾ヌクレオチドの両方を含み得るまたは含み得ないことが、具体的に意図される。また、キットは、ヌクレオチドに付着すると思われる標識を含み得る。ヌクレオチドに付着し得る任意の標識、ならびに本明細書において具体的に同定される任意のものは、本発明のキットに含まれ得る。
【００９５】
キットに含まれ得るその他の溶液は、miRNAを混合試料から単離および/または濃縮することに関与する溶液である。溶解溶液は、カオトロピック塩、界面活性剤、塩、および/または還元剤を含み得る。特定の態様において、溶解溶液は、以下の一つまたは複数を含む：約1、2、3、4、5、6、7、または8 Mチオシアン酸グアニジニウム（またはそこに導き出せる任意の範囲）；約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0％、またはより多くのNラウリルサルコシン（またはそこに導き出せる任意の範囲）；約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mM、またはより多くのクエン酸Na；および/または約0.0.5、0.1、0.15、0.2 M、またはより多くの2-メルカプトエタノール（またはそこに導き出せる任意の範囲）。キットに含まれ得る洗浄溶液は、カオトロピック塩およびエタノールを有する洗浄溶液ならびに塩およびバッファーを有する洗浄溶液を含む。特定の態様において、洗浄溶液は以下を含む：約1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5 M、もしくはより多くのチオシアン酸グアニジニウム（またはそこに導き出せる任意の範囲）および/または10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60％、もしくはより多くのエタノール（またはそこに導き出せる任意の範囲）。その他の洗浄溶液は、以下を含み得る：約50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150 mM NaCl（またはそこに導き出せる任意の範囲）；3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0 mM、またはより多くのEDTA（またはそこに導き出せる任意の範囲）;約5、10、15、20、25、30、35、40 mM、またはより多くのトリス（またはそこに導き出せる任意の範囲）。
【００９６】
ゲルまたはチューブ電気泳動を使用してmiRNAを精製するための試薬が、本発明のキットに含まれ得ることも意図される。
【００９７】
様々なマイクロフィルターを使用することができ、ガラスファイバーまたはシリカフィルターカラムが、本発明のいくつかの態様において具体的に意図される。そのようなマイクロフィルターとともに使用され得る溶液は、結合バッファーおよび/または洗浄バッファーを含む。特定の態様において、結合バッファーは、塩およびアルコールを含む。特定の場合において、結合または洗浄バッファーは、約0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 M、もしくはより多くのNaCl（またはそこに導き出せる任意の範囲）および/または約40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90％、もしくはより多くのエタノール（またはそこに導き出せる任意の範囲）を有する。
【００９８】
miRNAアレイを調製するための試薬および材料は、キットに含まれ得る。一つまたは複数のスライドなどの、アレイのための固体支持体は、キットに含まれ得る。キットは、いくつかの態様において、塩、バッファー、および/または界面活性剤を含む、スライド洗浄バッファーを含み得る。特定の態様において、スライド洗浄バッファーは、約100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200 mM、もしくはより多くのNaCl（またはそこに導き出せる任意の範囲）；50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150 mM、もしくはより多くのトリス（またはそこに導き出せる任意の範囲）；および/または0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.15、0.02％、もしくはより多くのTween 20（またはそこに導き出せる任意の範囲）を有する。キットは、アレイ上での使用のために、本明細書において記載される一つまたは複数のmiRNAプローブを含み得る。
【００９９】
miRNAアレイを使用するための試薬も、キット構成要素として含まれることが意図される。いくつかの態様において、ハイブリダイゼーション溶液および/またはアレイ洗浄溶液がある。そのような溶液は、約1.5、2.0、2.3、3.0、3.5、4.0×、またはより高いSSC（またはそこに導き出せる任意の範囲）を含み得る。
【０１００】
キットは、チューブ、ボトル、バイアル、シリンジ、またはその他の適した容器手段などの容器に個々に包装され得るまたは置かれ得る構成要素を含み得る。
【０１０１】
個々の構成要素は、高濃度でキットにおいて提供されてもよい；いくつかの態様において、構成要素は、その他の構成要素を有する溶液において考えられる濃度と同じ濃度で、個々に提供される。構成要素の濃度は、1×、2×、5×、10×、または20×、またはより高く提供され得る。
【０１０２】
治療的、予後診断的、または診断的応用に対して本発明のmiRNAアレイを使用するためのキットは、本発明の一部として含まれる。そのようなキットは、miRNAアレイ、ならびにアレイ上のmiRNAに対する標準的または基準化miRNAプロファイルに関する情報を含み得る。
【０１０３】
対照RNAまたはDNAは、いくつかのキット態様に含まれる。対照RNAは、標識化および/またはアレイ分析に対する陽性対照として使用され得るmiRNAである。
【０１０４】
本発明のその他の態様は、核酸を単離するための試料の電気泳動に対するシステムおよび/または装置に関与する。一つの態様において、本発明は、マイクロ電気泳動装置を提供する。本発明のマイクロ電気泳動装置は、任意の核酸分子を単離するために使用され得る。いくつかの態様において、装置は、miRNAまたはその他の小さな核酸分子を単離するために使用される。一つの態様において、マイクロ電気泳動装置は、陰性電極に電気的に連結される上層バッファーチャンバー；陽性電極に電気的に連結される下層バッファー収集チャンバー；および上層バッファーチャンバーと下層バッファー収集チャンバーとの間に配置されるゲルマトリクス、を含む。一つの態様において、マイクロ電気泳動装置は、flashPAGE Fractionator（Ambion, Inc.）である。
【０１０５】
特定の態様において、上層バッファーチャンバーは、約10ミリリットル（ml）と等しい、またはより少ない容積を有する。特定の局面において、上層バッファーチャンバーは、約9 ml、8 ml、7 ml、6 ml、5 ml、4 ml、3 ml、2 ml、1 ml、または500マイクロリットル（μl）と等しい、またはより少ない容積を有する。特定の態様において、下層バッファー収集チャンバーは、約10 mlと等しい、またはより少ない容積を有する。特定の局面において、下層バッファー収集チャンバーは、約9 ml、8 ml、7 ml、6 ml、5 ml、4 ml、3 ml、2 ml、1 ml、または500μlと等しい、またはより少ない容積を有する。
【０１０６】
本発明の特定の態様において、ゲルマトリクスは、ポリアクリルアミドゲルマトリクスである。ゲルマトリクスは、flashPAGE Pre-Cast Gel cartridges（Ambion, Inc.）などのプレキャストゲルマトリクスであり得る。
【０１０７】
本発明のマイクロ電気泳動装置は、任意の低電流DC電力源で稼動するように構成され得る。例えば、装置は、50〜100 Vおよび2〜5 mA DC源で稼動し得る。
【０１０８】
本発明の組成物および方法に関して議論される任意の態様、ならびに実施例における任意の態様は、キットの一部として具体的に意図される。
【０１０９】
本明細書において記載される任意の方法または組成物が、本明細書において記載される任意のその他の方法または組成物に関して導入され得ることが意図される。
【０１１０】
本出願の全体において、「約」という語は、値が、値を決定するために採用されるデバイスまたは方法に対するエラーの標準偏差を含むことを示すために使用される。
【０１１１】
請求項の範囲および/または明細書において、「含む」という語と連結して使用される場合、「a」または「an」という単語の使用は、「一つ」を意味し得るが、「一つまたは複数」、「少なくとも一つ」および「一つまたは一つよりも多い」の意味と一致もする。
【０１１２】
実施例のセクションにおいて記載される任意の態様が、本発明の態様として含まれることが具体的に意図される。
【０１１３】
本発明のその他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明白になると思われる。しかしながら、本発明の精神および範囲内での様々な変化および改変が、この詳細な説明から当業者にとって明白になると思われるので、詳細な説明および特定の例は、本発明の特定の態様を示すが、実例としてのみ与えられる、ということが理解されるべきである。
【０１１４】
添付の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の局面をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書において提示される特定の態様の詳細な説明との組み合わせにおいて、これらの図面の一つまたは複数への参照によって、より良く理解され得る。
【０１１５】
例示的態様の説明
本発明は、治療的、予後診断的、および診断的応用に対するmiRNAの使用と同様に、miRNAの調製および特徴付けに関する組成物および方法に向けられる。
【０１１６】
I. miRNA分子
マイクロRNA分子（「miRNA」）は、概して、長さが21〜22ヌクレオチドであるが、19および23までのヌクレオチドの長さが報告されている。miRNAは、より長い前駆体RNA分子（「前駆体miRNA」）から各々プロセス化される。前駆体miRNAは、非タンパク質コード遺伝子から転写される。前駆体miRNAは、動物においてDicerと呼ばれる酵素によって切断される、ステムループまたは折り畳み様構造をそれらが形成することを可能にする相補性の2つの領域を有する。Dicerは、リボヌクレアーゼIII様ヌクレアーゼである。プロセス化miRNAは、典型的にはステムの一部である。
【０１１７】
プロセス化miRNA（「成熟miRNA」とも呼ばれる）は、特定の標的遺伝子を下方調節するために、大きな複合体の一部となる。動物miRNAの例は、標的と不完全に塩基対をなし、翻訳を停止するものを含む（Olsen et al., 1999; Seggerson et al., 2002）。siRNA分子も、Dicerによってプロセス化されるが、長い二本鎖RNA分子からである。siRNAは、動物細胞において自然に見出されていないが、それらは、mRNA標的の配列特異的切断を方向付けるために、そのような細胞においてRNA誘導サイレンシング複合体（RISC）において、機能し得る（Denli et al., 2003）。
【０１１８】
A. 核酸
本発明は、標識され得る、アレイ分析において使用され得る、または診断的、治療的、もしくは予後診断的応用において採用され得るmiRNAに関係する。RNAは、細胞によって内因的に産生され得る、または化学的もしくは組み換え的に合成もしくは産生され得る。それらは、単離および/または精製され得る。「miRNA」という語は、他に特に示されなければ、その前駆体から切断された後の、プロセス化されたRNAを指す。表1は、どのSEQ ID NOが、miRNAの特定の前駆体配列に対応し、SEQ ID NO内のどの配列が、成熟配列に対応するのかを示す。miRNAの名称は、状況に応じて、しばしば短縮されて接頭語なしで呼ばれ、そのようなものとして理解されると思われる。他に特に示されなければ、本出願において言及されるmiRNAは、mir-Xまたはlet-Xとして同定されるヒト配列であり、Xは番号および/または文字である。
【０１１９】
特定の態様において、「5P」または「3P」という接尾語によって指定されるmiRNAプローブが、使用され得る。ワールドワイドウェブ上のsanger.ac.uk/cgi-bin/rfam/mirnaにおいて記載されるように、「5P」は、成熟miRNAが、前駆体の5'末端に由来することを示し、対応する「3P」は、それが前駆体の3'末端に由来することを示す。さらに、いくつかの態様において、公知のヒトmiRNAに対応しないmiRNAプローブが使用される。これらの非ヒトmiRNAプローブが、本発明の態様において使用され得ること、または非ヒトmiRNAと相同であるヒトmiRNAが存在し得ることが意図される。本発明は、ヒトmiRNAに限定されないが、特定の態様において、ヒト細胞またはヒト生物学的試料に由来するmiRNAが評価される。その他の態様において、任意の哺乳類細胞または生物学的試料が採用され得る。
【０１２０】
本発明のいくつかの態様において、miRNAに関与する方法および組成物は、miRNAおよび/またはその他の核酸に関係し得る。核酸は、長さが、少なくともまたは多くとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、もしくは1000ヌクレオチド、またはそこに導き出せる任意の範囲であり得る。そのような長さは、プロセス化miRNA、miRNAプローブ、前駆体miRNA、対照核酸、ならびにその他のプローブおよびプライマーの長さをカバーする。多くの態様において、miRNAは長さが19〜24ヌクレオチドであるが、プロセス化miRNAおよび付加される任意のフランキング領域の長さに応じて、miRNAプローブは長さが19〜35ヌクレオチドである。miRNA前駆体は、概して、ヒトにおいて、62から110ヌクレオチドの間である。
【０１２１】
本発明の核酸は、別の核酸に対する同一性または相補性の領域を有し得る。相補性または同一性の領域は、少なくとも5つの近接残基であり得ることが意図されるが、その領域が、少なくともまたは多くとも6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、441、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800、810、820、830、840、850、860、870、880、890、900、910、920、930、940、950、960、970、980、990、または1000の近接ヌクレオチドであることが具体的に意図される。前駆体miRNA内またはmiRNAプローブとmiRNAもしくはmiRNA遺伝子との間の相補性の長さは、そのような長さであることがさらに理解される。さらに、相補性は、パーセンテージとして表現されてもよく、プローブの長さにわたって、プローブとその標的との間の相補性が90％またはより大きいことを意味する。いくつかの態様において、相補性は、少なくとも90％、95％、または100％である。特に、そのような長さは、（「SEQ ID NO：1〜SEQ ID NO：898」）または本明細書において開示される任意のその他の配列を含めて、SEQ ID NO：1からSEQ ID NO：898の任意において同定される任意のSEQ ID NOに適用され得る。これらのSEQ ID NOの各々は、以下の表において開示される。表は、公知のヒトmiRNA（表1A）、マウスmiRNA（表2）、およびラットmiRNA（表3）を載せる。表において、miRNAの一般的に使用される名称が与えられ（例えばヒト配列に対して「hsa」などの、接頭語においてその同定する供給源とともに）、対応するSEQ ID NO：において同定されるようなmiRNA前駆体配列、およびmiRNA前駆体配列において同定されるヌクレオチドに対するプロセス化miRNA配列が与えられる。他に特に示されなければ、接頭語のないmiRNAは、ヒトmiRNAを指すと理解されると思われる。例えば本出願においてmiR-1-2として指定されるmiRNAは、以下のhsa-mir-1-2を指すことが理解されると思われる。さらに、以下の表における小文字は、小文字であり得るまたはあり得ない；例えば、hsa-mir-130bは、miR-130Bとも呼ばれ得る。加えて、「mu」または「mmu」のついたmiRNA配列は、マウスmiRNAを指すことが理解されると思われる。
【０１２２】
（表１Ａ）ヒトmiRNA配列
0005435864.tif 000004
0005435864.tif 000005
0005435864.tif 000006
0005435864.tif 000007
【０１２３】
「miRNAプローブ」という語は、特定のmiRNAまたは構造的関連miRNAを同定し得る核酸プローブを指す。表1Bは、どのmiRNAを同定またはスクリーニングするために、何のプローブが使用されたのかを示す。表1Cは、プローブの配列を提供する。表1Bまたは1Cにおいて開示されるプローブの任意のすべてまたは一部が、miRNAプローブに関与する本発明の任意の態様において導入され得ることが意図される。さらに、表1Bにおいて同定されるmiRNAの任意が、本発明の態様においてスクリーニングされ得る、またはプロファイルされ得る。
【０１２４】
（表１Ｂ）
0005435864.tif 000008
0005435864.tif 000009
【０１２５】
（表１Ｃ）
0005435864.tif 000010
0005435864.tif 000011
0005435864.tif 000012
0005435864.tif 000013
【０１２６】
（表２）マウスmiRNA配列
0005435864.tif 000014
0005435864.tif 000015
0005435864.tif 000016
0005435864.tif 000017
【０１２７】
（表３）ラットmiRNA配列
0005435864.tif 000018
0005435864.tif 000019
0005435864.tif 000020
0005435864.tif 000021
【０１２８】
miRNAは、ゲノム配列または遺伝子に由来することが理解される。この点において、「遺伝子」という語は、所与のmiRNAに対する前駆体miRNAをコードするゲノム配列を指すために簡単のために使用される。しかしながら、本発明の態様は、プロモーターまたはその他の調節性配列などの、その発現に関与するmiRNAのゲノム配列に関与し得る。
【０１２９】
「組み換え型」という語が使用されることがあり、これは概して、インビトロで操作されている分子、またはそのような分子の複製もしくは発現産物である分子を指す。
【０１３０】
「核酸」という語は、当技術分野において周知である。本明細書において使用されるように、「核酸」は、概して、核酸塩基を含むDNA、RNA、またはその誘導体もしくは類似体の分子（一本鎖または二本鎖）を指す。核酸塩基は、例えば、DNA（例えば、アデニン「A」、グアニン「G」、チミン「T」、またはシトシン「C」）またはRNA（例えば、A、G、ウラシル「U」、またはC）において見出される自然発生的なプリンまたはピリミジン塩基を含む。「核酸」という語は、各々「核酸」という語の亜属として、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という語を包含する。
【０１３１】
「miRNA」という語は、概して、一本鎖分子を指すが、特定の態様において、本発明において導入される分子は、同じ一本鎖分子の別の領域または別の核酸に、部分的に（鎖の長さにわたって10から50％の間で相補的）、実質的に（鎖の長さにわたって50％よりも高いが100％よりは低く相補的）または完全に相補的である、領域または付加的な鎖も包含すると思われる。したがって、核酸は、一つもしくは複数の相補的もしくは自己相補的鎖を含む分子、または分子を含む特定の配列の「相補体」を包含し得る。例えば、前駆体miRNAは、100％相補的までの、自己相補的領域を有し得る。本発明のmiRNAプローブは、それらの標的に少なくとも60、65、70、75、80、85、90、95、または100％相補的であり得る。
【０１３２】
本明細書において使用されるように、「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」、または「ハイブリダイズすることが可能な」は、二本鎖もしくは三本鎖分子、または部分的な二本鎖もしくは三本鎖性質を有する分子の形成を意味することが理解される。本明細書において使用されるように、「アニールする」という語は、「ハイブリダイズする」の同義語である。「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイズする」、または「ハイブリダイズすることが可能な」という語は、「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー」という語、および「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件」という語を包含する。
【０１３３】
本明細書において使用されるように、「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー」は、相補的配列を含む一つまたは複数の核酸鎖の間または内のハイブリダイゼーションを可能にするが、ランダム配列のハイブリダイゼーションを不可能にする条件である。ストリンジェントな条件は、もしあれば、核酸と標的鎖との間のわずかなミスマッチを許容する。そのような条件は、当業者にとって周知であり、高い選択性を必要とする応用に対して好ましい。非限定的な応用は、遺伝子もしくはその核酸セグメントなどの核酸を単離すること、または少なくとも一つの特定のmRNA転写もしくはその核酸セグメント、および同類のものを検出することを含む。
【０１３４】
ストリンジェントな条件は、約42℃〜約70℃の温度における約0.02 M〜約0.5  M NaClによって提供されるような、低塩および/または高温条件含み得る。望ましいストリンジェンシーの温度およびイオン強度は、部分的に、特定の核酸の長さ、標的配列の長さおよび核酸塩基含有量、核酸の電荷組成物によって、ならびにハイブリダイゼーション混合物におけるホルムアミド、塩化テトラメチルアンモニウムまたはその他の溶剤の存在または濃度に対して、決定されることが理解される。
【０１３５】
ハイブリダイゼーションに対するこれらの範囲、組成物、および条件が、非限定的な例のみによって記述され、特定のハイブリダイゼーション反応に対する望ましいストリンジェンシーが、一つまたは複数の陽性または陰性対照との比較によって実験的にしばしば決定されることも理解される。想定される応用に応じて、標的配列への核酸の選択性の様々な度合を達成するために、ハイブリダイゼーションの様々な条件が採用されることが好ましい。非限定的な例において、ストリンジェントな条件下で核酸にハイブリダイズしない関連標的核酸の同定または単離は、低温および/または高イオン強度におけるハイブリダイゼーションによって達成され得る。そのような条件は、「低ストリンジェンシー」または「低ストリンジェンシー条件」と呼ばれ、低ストリンジェンシーの非限定的な例は、約20℃〜約50℃の温度範囲における約0.15 M〜約0.9 M NaClにおいて行われるハイブリダイゼーションを含む。もちろん、特定の応用に合わせるために、低または高ストリンジェンシー条件をさらに改変することは、当業者の技能の範囲内である。
【０１３６】
1. 核酸塩基
本明細書において使用されるように、「核酸塩基」は、例えば、少なくとも一つの自然発生的な核酸（すなわちDNAおよびRNA）において見出される自然発生的な核酸塩基（すなわちA、T、G、C、またはU）、ならびにそのような核酸塩基の自然発生的または非自然発生的な誘導体および類似体などの、複素環塩基を指す。核酸塩基は、概して、自然発生的な核酸塩基対（例えば、AとT、GとC、およびAとUの間の水素結合）を置換し得る様式で、少なくとも一つの自然発生的な核酸塩基との一つまたは複数の水素結合を形成し得る（「アニールする」または「ハイブリダイズする」）。
【０１３７】
「プリン」および/または「ピリミジン」核酸塩基は、自然発生的なプリンおよび/またはピリミジン核酸塩基を包含し、アルキル、カルボキシアルキル、アミノ、ヒドロキシル、ハロゲン（すなわち、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード）、チオール、またはアルキルチオール部分の一つまたは複数によって置換されるプリンまたはピリミジンを含むがそれらに限定されない、その誘導体および類似体も包含する。好ましいアルキル（例えば、アルキル、カルボキシアルキルなど）部分は、約1、約2、約3、約4、約5から、約6までの炭素原子を含む。プリンまたはピリミジンのその他の非限定的な例は、デアザプリン、2,6-ジアミノプリン、5-フルオロウラシル、キサンチン、ヒポキサチン、8-ブロモグアニン、8-クロログアニン、ブロモチミン、8-アミノグアニン、8-ヒドロキシグアニン、8-メチルグアニン、8-チオグアニン、アザグアニン、2-アミノプリン、5-エチルシトシン、5-メチルシトシン、5-ブロモウラシル、5-エチルウラシル、5-ヨードウラシル、5-クロロウラシル、5-プロピルウラシル、チオウラシル、2-メチルアデニン、メチルチオアデニン、N,N-ジメチルアデニン、アザアデニン、8-ブロモアデニン、8-ヒドロキシアデニン、6-ヒドロキシアミノプリン、6-チオプリン、4-(6-アミノヘキシル/シトシン)、および同様のものを含む。その他の例は、当業者にとって周知である。
【０１３８】
核酸塩基は、本明細書において記載されるまたは当業者にとって公知の、任意の化学的または天然の合成方法を使用して、ヌクレオシドまたはヌクレオチドに含まれ得る。そのような核酸塩基は、標識され得る、またはそれは、標識されかつ核酸塩基を含む分子の一部であり得る。
【０１３９】
2. ヌクレオシド
本明細書において使用されるように、「ヌクレオシド」は、核酸塩基リンカー部分に共有結合される核酸塩基を含む、個々の化学的ユニットを指す。「核酸塩基リンカー部分」の非限定的な例は、5-炭素原子を含む糖（すなわち、「五炭糖」）であり、デオキシリボース、リボース、アラビノース、または五炭糖の誘導体もしくは類似体を含むが、それらに限定されない。五炭糖の誘導体または類似体の非限定的な例は、2'-フルオロ-2'-デオキシリボースまたは糖環において炭素が酸素原子に置換される炭素環式糖を含む。
【０１４０】
核酸塩基リンカー部分への核酸塩基の共有結合の異なる型は、当技術分野において公知である。非限定的な例として、プリン（すなわち、AまたはG）または7-デアザプリン核酸塩基を含むヌクレオシドは、典型的には、プリンまたは7-デアザプリンの9位を五炭糖の1'位に共有結合させる。別の非限定的な例において、ピリミジン核酸塩基（すなわち、C、T、またはU）を含むヌクレオシドは、典型的には、ピリミジンの1位を五炭糖の1'位に共有結合させる（Kornberg and Baker, 1992）。
【０１４１】
3. ヌクレオチド
本明細書において使用されるように、「ヌクレオチド」は、「骨格部分」をさらに含むヌクレオシドを指す。骨格部分は、概して、核酸を形成するために、ヌクレオチドを含む別の分子または別のヌクレオチドに、ヌクレオチドを共有結合させる。自然発生的なヌクレオチドにおける「骨格部分」は、典型的には、五炭糖に共有結合しているリン部分を含む。骨格部分の付着は、典型的には、五炭糖の3'または5'位において生じる。しかしながら付着のその他の型は、特に、ヌクレオチドが自然発生的な五炭糖またはリン部分の誘導体または類似体を含む場合、当技術分野において公知である。
【０１４２】
4. 核酸類似体
核酸は、自然発生的な核酸に存在し得る、核酸塩基の誘導体もしくは類似体、核酸塩基リンカー部分、および/または骨格部分を含み得る、または完全にそれらからなり得る。核酸類似体を有するRNAは、本発明の方法に従って標識されてもよい。本明細書において使用されるように、「誘導体」は、自然発生的な分子の化学的に修飾または変更される型を指し、「模倣体」または「類似体」という語は、自然発生的な分子または部分に構造的に類似し得るまたは類似し得ないが、同様の機能を保有する分子を指す。本明細書において使用されるように、「部分」は、概して、より大きな化学的または分子的構造のより小さな化学的または分子的構成要素を指す。核酸塩基、ヌクレオシド、およびヌクレオチド類似体または誘導体は、当技術分野において周知であり、記載されている（例えば、参照により本明細書に組み入れられるScheit, 1980を参照されたい）。
【０１４３】
五炭糖および/または骨格部分誘導体または類似体を含むヌクレオシド、ヌクレオチド、または核酸の付加的な非限定的な例は、以下におけるものを含む：dsDNAと三重らせんを形成しかつ/またはdsDNAの発現を妨げるプリン誘導体を含むオリゴヌクレオチドを記載する、米国特許第5,681,947号；特に蛍光核酸プローブとしての使用のために、DNAまたはRNAにおいて見出されたヌクレオシドの蛍光類似体を取り込む核酸を記載する、米国特許第5,652,099号および第5,763,167号；強化ヌクレアーゼ安定性を保有するピリミジン環における置換を有するオリゴヌクレオチド類似体を記載する、米国特許第5,614,617号；核酸検出において使用される修飾五炭糖（すなわち、修飾2'-デオキシフラノシル部分）を有するオリゴヌクレオチド類似体を記載する、米国特許第5,670,663号、第5,872,232号、および第5,859,221号；ハイブリダイゼーションアッセイにおいて使用され得る、水素以外の置換基によって4'位で置換される少なくとも一つの五炭糖部分を含むオリゴヌクレオチドを記載する、米国特許第5,446,137号；3'-5'インターヌクレオチドリンケージを有するデオキシリボヌクレオチドおよび2'-5'インターヌクレオチドリンケージを有するリボヌクレオチドの両方を有するオリゴヌクレオチドを記載する、米国特許第5,886,165号；インターヌクレオチドリンケージの3'位酸素が、核酸のヌクレアーゼ耐性を強化するために、炭素によって置換される、修飾インターヌクレオチドリンケージを記載する、米国特許第5,714,606号；ヌクレアーゼ耐性を強化する一つまたは複数の5'メチレンホスホン酸インターヌクレオチドリンケージを含むオリゴヌクレオチドを記載する、米国特許第5,672,697号；強化ヌクレアーゼ安定性および薬物を送達する能力または検出部分を提供するために、オリゴヌクレオチドの2'炭素への薬物または標識を含み得る置換基部分のリンケージを記載する、米国特許第5,466,786号および第5,792,847号；細胞取り込み、ヌクレアーゼへの耐性、および標的RNAへのハイブリダイゼーションを強化するために、隣接五炭糖部分の4'位および3'位を付着させる2または3炭素骨格リンケージを有するオリゴヌクレオチド類似体を記載する、米国特許第5,223,618号；核酸ハイブリダイゼーションプローブとして有用な少なくとも一つのスルファミン酸またはスルファミドインターヌクレオチドリンケージを含むオリゴヌクレオチドを記載する、米国特許第5,470,967号；改善されたヌクレアーゼ耐性、細胞取り込み、およびRNA発現を調節することに対して使用されるホスホジエステル骨格部分を置換する3または4の原子リンカー部分を有するオリゴヌクレオチドを記載する、米国特許第5,378,825号、第5,777,092号、第5,623,070号、第5,610,289号、および第5,602,240号；それらの膜浸透性および安定性を強化するために、オリゴヌクレオチドの2'-O位へ付着する疎水性担体薬剤を記載する、米国特許第5,858,988号；DNAまたはRNAへの強化ハイブリダイゼーション；ヌクレアーゼへの強化安定性を保有する、5'末端においてアントラキノンに結合するオリゴヌクレオチドを記載する、米国特許第5,214,136号；DNAが、強化ヌクレアーゼ耐性、結合親和性、およびRNA分解酵素Hを活性化する能力のために、2'-デオキシ-エリスロ-ペントフラノシルヌクレオチドを含む、PNA-DNA-RNAキメラを記載する、米国特許第5,700,922号��および、DNA-RNAハイブリッドを形成するために、DNAにリンクされるRNAを記載する、米国特許第5,708,154号；ユニバーサル蛍光標識を用いるヌクレオシド類似体の標識化を記載する、米国特許第5,728,525号。
【０１４４】
ヌクレオシド類似体および核酸類似体に対する付加的な技術は、末端標識されるヌクレオシド類似体を記載する、米国特許第5,728,525号；米国特許第5,637,683号、第6,251,666号（L-ヌクレオチド置換）、および第5,480,980号（7-デアザ-2'デオキシグアノシンヌクレオチドおよびその核酸類似体）である。
【０１４５】
5. 修飾ヌクレオチド
本発明の標識化方法およびキットは、標識の付着のために修飾され、miRNA分子に取り込まれ得るヌクレオチドの使用を具体的に意図する。そのようなヌクレオチドは、蛍光色素を含む色素、またはビオチンなどの分子で標識され得るものを含む。標識ヌクレオチドは、簡単に利用できる；それらは、市販で取得され得る、またはそれらは当業者にとって公知の反応により合成され得る。
【０１４６】
本発明における使用のための修飾ヌクレオチドは、自然発生的なヌクレオチドではなく、その代わり、それらの上に反応性部分を有する調製ヌクレオチドを指す。対象となる特定の反応性官能基は、以下を含む：アミノ、スルフィドリル、スルホキシル、アミノスルフィドリル、アジド、エポキシド、イソチオシアン酸、イソシアン酸、無水、モノクロロトリアジン、ジクロロトリアジン、一または二ハロゲン置換ピリジン、一または二置換ジアジン、マレイミド、エポキシド、アジリジン、ハロゲン化スルホニル、ハロゲン化酸、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリル、アルキルスルホン酸、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、イミドエステル、ヒドラジン、アジドニトロフェニル、アジド、3-(2-ピリジルジチオ)-プロピナミド、グリオキサル、アルデヒド、ヨードアセチル、シアノメチルエステル、p-ニトロフェニルエステル、o-ニトロフェニルエステル、ヒドロキシピリジンエステル、カルボニルイミダゾール、およびその他のそのような化学基。いくつかの態様において、反応性官能基は、ヌクレオチドに直接結合され得る、またはそれは、架橋基を介してヌクレオチドに結合され得る。官能部分および任意のリンカーは、実質的には、ヌクレオチドがmiRNAに付加されるまたは標識される能力を害し得ない。代表的な架橋基は、典型的には約2〜18、通常は約2〜8の炭素原子の範囲で、炭素含有架橋基を含み、炭素含有架橋基は、例えば、S、O、Nなどの一つまたは複数のヘテロ原子を含み得るまたは含み得ない、かつ不飽和の一つまたは複数の部位を含み得るまたは含み得ない。多くの態様において、特に関心対象であるのは、アルキル架橋基であり、典型的には1〜16の、通常は1〜4の炭素原子の低アルキル架橋基であり、架橋基は、不飽和の一つまたは複数の部位を含み得る。官能化標的生成の上の方法において使用される官能化ヌクレオチド（またはプライマー）は、公知のプロトコールを使用して加工され得る、または例えば、Sigma、Roche、Ambion、およびNENなどの商業的製造業者から購入され得る。官能基は、参照によりすべて組み入れられる、米国特許第4,404,289号；第4,405,711号；第4,337,063号および第5,268,486号、ならびにブラジル特許第1,529,202号において見出される代表的な情報を含む、当業者にとって公知の方式に従って調製され得る。
【０１４７】
アミン修飾ヌクレオチドは、本発明のいくつかの態様において使用される。アミン修飾ヌクレオチドは、標識の付着のために反応性アミン基を有するヌクレオチドである。任意のリボヌクレオチド（G、A、U、またはC）またはデオキシリボヌクレオチド（G、A、T、またはC）が、標識化のために修飾され得ることが意図される。例は、以下の修飾リボ-およびデオキシリボ-ヌクレオチドを含むが、それらに限定されない：5-(3-アミノアリール)-UTP；8-[(4-アミノ)ブチル]-アミノ-ATPおよび8-[(6-アミノ)ブチル]-アミノ-ATP；N6-(4-アミノ)ブチル-ATP、N6-(6-アミノ)ブチル-ATP、N4-[2,2-オキシ-ビス-(エチルアミン)]-CTP；N6-(6-アミノ)ヘキシル-ATP；8-[(6-アミノ)ヘキシル]-アミノ-ATP；5-プロパルギルアミノ-CTP；5-プロパルギルアミノ-UTP；5-(3-アミノアリール)-dUTP；8-[(4-アミノ)ブチル]-アミノ-dATPおよび8-[(6-アミノ)ブチル]-アミノ-dATP；N6-(4-アミノ)ブチル-dATP、N6-(6-アミノ)ブチル-dATP、N4-[2,2-オキシ-ビス-(エチルアミン)]-dCTP；N6-(6-アミノ)ヘキシル-dATP；8-[(6-アミノ)ヘキシル]-アミノ-dATP；5-プロパルギルアミノ-dCTP、および5-プロパルギルアミノ-dUTP。そのようなヌクレオチドは、当業者にとって公知の方法に従って調製され得る。さらに、当業者は、5-(3-アミノアリール)-UTPの代わりに5-(3-アミノアリール)-CTP、GTP、ATP、dCTP、dGTP、dTTP、またはdUTPなどの、同じアミン修飾を用いてその他のヌクレオチド実体を調製し得ると考えられる。
【０１４８】
B. 核酸の調製
核酸は、例えば、化学的合成、酵素的産生、または生物学的産生などの、当業者にとって公知の任意の技術によって作られ得る。本発明のmiRNAプローブが、化学的に合成されることが、具体的に意図される。
【０１４９】
本発明のいくつかの態様において、miRNAは、生物学的試料から回収される。miRNAは、組み換え型であり得る、またはそれは細胞に対して天然もしくは内因性であり得る（細胞のゲノムから産生される）。生物学的試料が、miRNAなどの小さなRNA分子の回収を強化するための方式において処置され得ることが意図される。米国特許出願第10/667,126号は、そのような方法を記載し、それは参照により本明細書に具体的に組み入れられる。概して、方法は、実施例1において記載されるように、グアニジニウムおよび界面活性剤を有する溶液を用いて細胞を溶解することに関与する。
【０１５０】
または、核酸合成は、標準的な方法に従って行われる。例えば、Itakura and Riggs (1980)を参照されたい。付加的に、米国特許第4,704,362号、米国特許第5,221,619号、および米国特許第5,583,013号は、各々、合成核酸を調製する様々な方法を記載する。合成核酸（例えば、合成オリゴヌクレオチド）の非限定的な例は、ホスホトリエステル、ホスファイトまたはホスホロアミダイト化学を使用するインビトロ化学的合成、および参照により本明細書に組み入れられる欧州特許第266,032号において記載されるような固相技術によって、または参照により本明細書に各々組み入れられる、Froehler et al., 1986および米国特許出願第5,705,629号によって記載されるようなデオキシヌクレオシドH-ホスホン酸中間体によって作られる核酸を含む。本発明の方法において、一つまたは複数のオリゴヌクレオチドが使用され得る。オリゴヌクレオチド合成の様々な異なるメカニズムが、例えば、米国特許第4,659,774号、第4,816,571号、第5,141,813号、第5,264,566号、第4,959,463号、第5,428,148号、第5,554,744号、第5,574,146号、第5,602,244号において開示されており、その各々が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１５１】
酵素的に産生される核酸の非限定的な例は、PCR(商標)（例えば、参照により本明細書に各々組み入れられる、米国特許第4,683,202号および米国特許第4,682,195号を参照されたい）などの増幅反応、または参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,645,897号において記載されるオリゴヌクレオチドの合成において、酵素によって産生されるものを含む。生物学的に産生される核酸の非限定的な例は、バクテリアにおいて複製される組み換えDNAベクターなどの、生きた細胞において産生される（すなわち、複製される）組み換え核酸を含む（例えば、参照により本明細書に組み入れられるSambrook et al. 1989を参照されたい）。
【０１５２】
オリゴヌクレオチド合成は、当業者にとって周知である。オリゴヌクレオチド合成の様々な異なるメカニズムが、例えば、米国特許第4,659,774号、第4,816,571号、第5,141,813号、第5,264,566号、第4,959,463号、第5,428,148号、第5,554,744号、第5,574,146号、第5,602,244号において開示されており、その各々が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１５３】
基本的に、化学的合成は、ジエステル法、トリエステル法、ポリヌクレオチドホスホリラーゼ法によって、および固相化学によって、達成され得る。これらの方法は、以下でさらに詳細に議論される。
【０１５４】
ジエステル法
ジエステル法は、主としてKhoranaおよび共同研究者らによって、使用可能な状態まで開発された最初のものであった（Khorana, 1979）。基本的な段階は、ホスホジエステル結合を含むジデオキシヌクレオチドを形成するための、二つの適切に保護されたデオキシヌクレオチドの接合である。ジエステル法は、良く確立されており、DNA分子を合成するために使用されている（Khorana, 1979）。
【０１５５】
トリエステル法
ジエステル法とトリエステル法との間の主な差は、後者における、反応物質および産物のリン酸原子上の余分な保護基の存在である（Itakura et al., 1975）。リン酸保護基は、通常はクロロフェニル基であり、ヌクレオチドおよびポリヌクレオチド中間体が有機溶剤において可溶なようにする。それ故に、精製は、クロロホルム溶液において行われる。方法におけるその他の改善は、（i）トリマーとより大きなオリゴマーとのブロック連結、（ii）中間体および最終産物の両方の精製に対する高性能液体クロマトグラフィーの大規模な使用、ならびに（iii）固相合成を含む。
【０１５６】
ポリヌクレオチドホスホリラーゼ法
これは、多くの有用なオリゴヌクレオチドを合成するために使用され得る、DNA合成の酵素的方法である（Gillam et al., 1978; Gillam et al., 1979）。制御条件下で、ポリヌクレオチドホスホリラーゼは、主に、短いオリゴヌクレオチドに単一のヌクレオチドを付加する。クロマトグラフィー精製は、望ましい単一の付加化合物が得られるのを可能にする。少なくともトリマーは、手順を開始するために必要とされ、このプライマーは、あるその他の方法によって得られなければならない。ポリヌクレオチドホスホリラーゼ法は、正常に機能し、関与する手順がほとんどの生化学者に良く知られているという利点を有する。
【０１５７】
固相法
ポリペプチドの固相合成のために開発されたテクノロジーを利用して、それは、最初のヌクレオチドを固体支持体材料に付着させ、ヌクレオチドの段階的な付加を進めることが可能である。すべての混合および洗浄段階は、簡略化されており、手順は自動化できるようになる。これらの合成は、現在、自動核酸合成器を使用して、日常的に実施されている。
【０１５８】
ホスホロアミダイト化学（Beaucage and Lyer, 1992）は、オリゴヌクレオチドの合成に対して、断然最も広く使用される連結化学になった。当業者にとって周知のように、オリゴヌクレオチドのホスホロアミダイト合成は、活性化中間体を形成するための活性化剤を用いた反応による、ヌクレオシドホスホロアミダイトモノマー前駆体の活性化、その後に続くオリゴヌクレオチド産物を形成するための成長ヌクレオチド鎖への活性化中間体の逐次付加（概して、適した固体支持体へ一端で固着される）に関与する。
【０１５９】
組み換え法
細胞において核酸を産生するための組み換え法は、当業者にとって周知である。これらは、（望ましいRNA分子の大きな量を産生するために）標的細胞または単に宿主細胞であり得る細胞へ核酸を送達するための、ベクター（ウィルス性および非ウィルス性）、プラスミド、コスミド、およびその他の媒体の使用を含む。または、そのような媒体は、RNA分子を生成するための試薬が存在する限りは、細胞を含まないシステムとの関連で使用され得る。そのような方法は、参照により本明細書に組み入れられる、Sambrook, 2003、Sambrook, 2001、およびSambrook, 1989において記載されるものを含む。
【０１６０】
特定の態様において、本発明は、合成的ではない核酸分子に関係する。いくつかの態様において、核酸分子は、自然発生的な核酸の化学的構造、および一本鎖一次miRNA（Lee 2002を参照されたい）、一本鎖前駆体miRNA、または一本鎖成熟miRNAの正確で完全な配列などの自然発生的な核酸の配列を有する。組み換えテクノロジーの使用に加えて、そのような非合成的核酸は、オリゴヌクレオチドを作り出すために使用されるテクノロジーを採用することによってなど、化学的に生成され得る。
【０１６１】
C. 核酸の単離
核酸は、当業者にとって周知の技術を使用して単離され得るが、特定の態様において、小さな核酸分子を単離するおよび/またはRNA分子を単離するための方法が採用され得る。クロマトグラフィーは、タンパク質からまたはその他の核酸から核酸を分離または単離するために、しばしば使用されるプロセスである。そのような方法は、ゲルマトリクス、フィルターカラム、アルコール沈殿、および/またはその他のクロマトグラフィーを伴う電気泳動に関与し得る。細胞に由来するmiRNAが使用されるまたは評価される場合、方法は、概して、RNAの特定の集団を単離するためにプロセスを導入することに先行して、カオトロピック物質（例えば、イソチオシアン酸グアニジニウム）および/または界面活性剤（例えば、N-ラウリルサルコシン）を用いて、細胞を溶解することに関与する。
【０１６２】
その他の核酸からmiRNAを分離するための特定の方法において、ゲルマトリクスは、ポリアクリルアミドを使用して調製されるが、アガロースが使用されてもよい。ゲルは、濃度によって勾配をつけられ得る、またはそれらは均一であり得る。プレートまたはチュービングが、電気泳動のためのゲルマトリクスを保持するために使用され得る。通常は、核酸の分離に対して、一次元電気泳動が採用される。プレートは、スラブゲルを調製するために使用されるが、チュービング（典型的には、ガラスまたはゴム）は、チューブゲルを調製するために使用され得る。「チューブ電気泳動」という語句は、プレートの代わりに、ゲルを形成するためのチューブまたはチュービングの使用を指す。チューブ電気泳動を導入するための材料は、当業者によって簡単に調製され得る、またはC.B.S. Scientific Co., Inc.またはScie-Plasなどから購入され得る。
【０１６３】
方法は、核酸、特に本発明の方法および組成物において使用されるmiRNAを単離するために、有機溶剤および/またはアルコールの使用に関与し得る。いくつかの態様は、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願第10/667,126号において記載される。概して、この開示は、細胞溶解物にアルコール溶液を添加する段階、および固体支持体からRNA分子を溶離する前に、固体支持体にアルコール/溶解物混合物を加える段階を含む、細胞から小さなRNA分子を効率的に単離するための方法を提供する。いくつかの態様において、細胞溶解物に添加されるアルコールの量は、約55％〜60％のアルコール濃度に達する。異なるアルコールが採用され得るが、エタノールが良く正常に機能する。固体支持体は、任意の構造であってもよく、それは電気陰性基を有するミネラルまたはポリマー支持体を含み得る、ビーズ、フィルター、およびカラムを含む。ガラスファイバーフィルターまたはカラムが、そのような単離手順に対して、特に良く正常に機能した。
【０１６４】
特定の態様において、miRNA単離手順は、a）グアニジニウムを含む溶解溶液を用いて、試料における細胞を溶解し、少なくとも約1 Mグアニジニウムの濃度を有する溶解物が産生される段階；b）フェノールを含む抽出溶液を用いて、溶解物からmiRNA分子を抽出する段階；c）溶解物/アルコール混合物を形成するために、溶解物にアルコール溶液を添加し、混合物におけるアルコールの濃度が、約35％〜約70％の間である段階；d）溶解物/アルコール混合物を固体支持体に加える段階；e）イオン溶液を用いて、固体支持体からmiRNA分子を溶離する段階；および、f）miRNA分子を捕獲する段階を含む。典型的に試料は、乾燥され、その後の操作に適当な液体および容積に再懸濁される。
【０１６５】
II. 標識および標識化技術
いくつかの態様において、本発明は、標識されるmiRNAに関係する。miRNAは、標識化に先行して、最初に単離および/または精製され得る。これは、標識化に先行してmiRNAが単離または精製されない試料におけるその他のRNAとは対照的に、miRNAをより効率的に標識する反応を達成し得る。本発明の多くの態様において、標識は非放射性である。概して、核酸は、標識ヌクレオチドを付加すること（一段階プロセス）、またはヌクレオチドを付加し、かつ付加されたヌクレオチドを標識すること（二段階プロセス）によって、標識され得る。
【０１６６】
A. 標識化技術
いくつかの態様において、核酸は、すでに標識されたヌクレオチドまたはすでに標識された複数のヌクレオチドを核酸に触媒的に付加することによって標識される。一つまたは複数の標識ヌクレオチドが、miRNA分子に付加され得る。参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第6,723,509号を参照されたい。
【０１６７】
その他の態様において、非標識ヌクレオチドまたは複数の非標識ヌクレオチドは、miRNAに触媒的に付加され、非標識ヌクレオチドは、その後にそれが標識されることを可能にする化学的部分を伴って修飾される。本発明の態様において、化学的部分は、ヌクレオチドがアミン修飾ヌクレオチドであるような、反応性アミンである。
【０１６８】
アミン修飾ヌクレオチドの例は、当業者にとって周知であり、多くが、Ambion、Sigma、Jena Bioscience、およびTriLinkなどから市販されている。
【０１６９】
cDNAのその合成の間の標識化とは対照的に、miRNAを標識することに対する問題点は、すでに存在する分子をどのように標識するのか、ということである。本発明は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド二または三リン酸を、miRNA、小さなRNA分子へのその付加のための基質として使用することが可能な酵素の使用に関係する。さらに、特定の態様において、それは、miRNAの3'末端に付加される、修飾リボヌクレオチド二または三リン酸の使用に関与する。酵素の供給源は限定的ではない。酵素に対する供給源の例は、酵母、大腸菌などのグラム陰性バクテリア、乳酸連鎖球菌、および羊痘ウィルスを含む。
【０１７０】
そのようなヌクレオチドを付加することが可能な酵素は、ポリ(A)ポリメラーゼ、末端トランスフェラーゼ、およびポリヌクレオチドホスホリラーゼを含むが、それらに限定されない。本発明の特定の態様において、リガーゼは、標識を付加するために使用される酵素としては意図されず、代わりに、非リガーゼ酵素が採用される。
【０１７１】
ポリ(A)ポリメラーゼは、植物からヒトまでの多くの生物体からクローニングされている。それは、RNAへのホモポリマートラクトの付加を触媒することが示されている（Martin et al., 1998）。
【０１７２】
末端トランスフェラーゼは、核酸の3'末端へのヌクレオチドの付加を触媒する。
【０１７３】
ポリヌクレオチドホスホリラーゼは、プライマーの必要なしに、ヌクレオチド二リン酸を重合し得る。
【０１７４】
B. 標識
miRNAまたはmiRNAプローブ上の標識は、比色（蛍光を含む可視およびUVスペクトルを含む）、発光、酵素、または陽電子放出であり得る（放射性を含む）。標識は、直接的または間接的に検出され得る。放射性標識は、125I、32P、33P、および35Sを含む。酵素標識の例は、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、およびβ-ガラクトシダーゼを含む。標識は、例えば、緑蛍光タンパク質およびフィコエリスリンなどの、発光特性を有するタンパク質であってもよい。
【０１７５】
複合体としての使用に対して意図される比色および蛍光標識は、Alexa Fluor色素、BODIPY FLなどのBODIPY色素；カスケードブルー；カスケードイエロー；7-アミノ-4-メチルクマリン、アミノクマリン、およびヒドロキシクマリンなどの、クマリンおよびその誘導体；Cy3およびCy5などの、シアニン色素；エオシンおよびエリトロシン；イソチオシアン酸フルオレセインなどの、フルオレセインおよびその誘導体；Quantum Dye(商標)などの、ランタニドイオンの大環状キレート；マリーナブルー；オレゴングリーン；ローダミンレッド、テトラメチルローダミン、ローダミン6Gなどの、ローダミン色素；テキサスレッド；チアゾールオレンジ-エチジウムへテロダイマーなどの、蛍光エネルギー移動色素；ならびにTOTABを含むが、それらに限定されない。
【０１７６】
色素の特定の例は、上に同定されるものおよび以下を含むが、それらに限定されない：Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700、およびAlexa Fluor 750；BODIPY 493/503、BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/655、BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR、およびBODIPY-TRなどの、アミン反応性BODIPY色素；Cy3、Cy5、6-FAM、イソチオシアン酸フルオレセイン、HEX、6-JOE、オレゴングリーン488、オレゴングリーン500、オレゴングリーン514、パシフィックブルー、REG、ローダミングリーン、ローダミンレッド、レノグラフィン（Renographin）、ROX、SYPRO、TAMRA、2',4',5',7'-テトラブロモスルホンフルオレセイン、およびTET。
【０１７７】
蛍光標識リボヌクレオチドの特定の例は、Molecular Probesから利用でき、これらは、Alexa Fluor 488-5-UTP、フルオレセイン-12-UTP、BODIPY FL-14-UTP、BODIPY TMR-14-UTP、テトラメチルローダミン-6-UTP、Alexa Fluor 546-14-UTP、テキサスレッド-5-UTP、およびBODIPY TR-14-UTPを含む。その他の蛍光リボヌクレオチドは、Cy3-UTPおよびCy5-UTPなど、Amersham Biosciencesから利用できる。
【０１７８】
蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの例は、ジニトロフェニル（DNP）-11-dUTP、カスケードブルー-7-dUTP、Alexa Fluor 488-5-dUTP、フルオレセイン-12-dUTP、オレゴングリーン488-5-dUTP、BODIPY FL-14-dUTP、ローダミングリーン-5-dUTP、Alexa Fluor 532-5-dUTP、BODIPY TMR-14-dUTP、テトラメチルローダミン-6-dUTP、Alexa Fluor 546-14-dUTP、Alexa Fluor 568-5-dUTP、テキサスレッド-12-dUTP、テキサスレッド-5-dUTP、BODIPY TR-14-dUTP、Alexa Fluor 594-5-dUTP、BODIPY 630/650-14-dUTP、BODIPY 650/655-14-dUTP；Alexa Fluor 488-7-OBEA-dCTP、Alexa Fluor 546-16-OBEA-dCTP、Alexa Fluor 594-7-OBEA-dCTP、Alexa Fluor 647-12-OBEA-dCTPを含む。
【０１７９】
核酸が、二つの異なる標識で標識され得ることが意図される。さらに、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）が、本発明の方法において採用され得る（例えば、Klostermeier et al., 2002；Emptage, 2001；Didenko, 2001、参照により各々組み入れられる）。
【０１８０】
または、標識は、それ自体、検出可能ではあり得ないが、間接的に検出可能であり得る、または標的核酸の単離もしくは分離を可能にし得る。例えば、標識は、ビオチン、ジゴキシゲニン、多価カチオン、キレート剤群、およびその他のリガンドであってもよく、抗体に対するリガンドを含むと考えられる。
【０１８１】
C. 可視化技術
標識核酸を可視化または検出するための多くの技術が、簡単に利用できる。Stanley T. Crooke, 2000による参照は、そのような技術の議論を有し（6章）、参照により組み入れられる。そのような技術は、顕微鏡法、アレイ、蛍光光度法、ライトサイクラーまたはその他のリアルタイムPCRマシン、FACS分析、シンチレーションカウンター、ホスホイメージャー、ガイガーカウンター、MRI、CAT、抗体に基づく検出方法（ウェスタン、免疫蛍光法、免疫組織化学）、組織化学技術、HPLC（Griffey et al., 1997）、分光法、キャピラリーゲル電気泳動（Cummins et al., 1996）、分光法；質量分析；放射線技術；および物質収支技術を含む。
【０１８２】
二つ以上の異なって色付けされる標識が採用される場合、dsRNAを特徴付けるために、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）技術が採用され得る。さらに、当業者は、標識核酸を可視化、同定、および特徴付けする方式を十分承知しており、従って、そのようなプロトコールは、本発明の一部として使用され得る。使用され得るツールの例は、蛍光顕微鏡法、BioAnalyzer、プレートリーダー、Storm（Molecular Dynamics）、アレイスキャナ、FACS（蛍光活性化細胞ソーター）、または蛍光分子を励起し検出する能力を有する任意の機器も含む。
【０１８３】
III. アレイ調製およびスクリーニング
A. アレイ調製
本発明は、複数のmiRNA分子または前駆体miRNA分子に完全にまたはほぼ相補的または同一であり、空間的に離れた組織体における支持体材料上に置かれる核酸分子（プローブ）の秩序マクロアレイまたはマイクロアレイであるmiRNAアレイの調製および使用に関係する。マクロアレイは、典型的には、プローブがスポットされているニトロセルロースまたはナイロンのシートである。マイクロアレイは、10,000までの核酸分子が、典型的には1〜4平方センチメートルの領域に取り付けられ得るように、核酸プローブをより密に置く。マイクロアレイは、例えば、遺伝子、オリゴヌクレオチドなどの核酸分子を基質上にスポットすることによって、または基質上でインサイチューでオリゴヌクレオチド配列を加工することによって、加工され得る。スポットされたまたは加工された核酸分子は、平方センチメートルあたり約30までの、またはより高い、例えば、平方センチメートルあたり約100までの、またはさらに約1000の非同一核酸分子の高密度マトリクスパターンにおいて適用され得る。マイクロアレイは、典型的には、フィルターアレイのニトロセルロースに基づく材料とは対照的に、固体支持体としてコーティングされたガラスを使用する。miRNA-相補的核酸試料の秩序アレイを有することにより、各々の試料の位置が、追跡され、オリジナルの試料にリンクされ得る。複数の相異なる核酸プローブが固体支持体の表面に安定して結合される様々な異なるアレイデバイスが、当業者にとって公知である。アレイに対する有用な基質は、ナイロン、ガラス、およびシリコンを含む。そのようなアレイは、平均プローブ長、プローブの配列または型、例えば共有または非共有などのプローブとアレイ表面との間の結合の性質、および同類のものを含む、多くの異なる方式において変化し得る。本発明の標識化およびスクリーニング方法ならびにアレイは、プローブがmiRNAを検出するということを除いては、任意のパラメータに関して、その実用性において限定されない；結果として、方法および組成物は、miRNAアレイの様々な異なる型とともに使用され得る。
【０１８４】
マイクロアレイを調製するための代表的な方法および装置は、例えば
0005435864.tif 000022
において記載されている；これらの開示は、参照により本明細書にすべて組み入れられる。
【０１８５】
アレイが、それらが100またはより多くの異なるプローブを含むような、高密度アレイであり得ることが意図される。それらが、1000、16,000、65,000、250,000、または1,000,000、またはより多くの異なるプローブを含み得ることが意図される。プローブは、一つまたは複数の異なる生物体における標的に向けられ得る。オリゴヌクレオチドプローブは、いくつかの態様において、長さが5〜50、5〜45、10〜40、または15〜40ヌクレオチドの範囲である。特定の態様において、オリゴヌクレオチドプローブは、長さが20〜25ヌクレオチドである。
【０１８６】
アレイにおける各々の異なるプローブ配列の場所および配列は、概して公知である。さらに、多数の異なるプローブは、cm2あたり約60、100、600、1000、5,000、10,000、40,000、100,000、または400,000の異なるオリゴヌクレオチドプローブよりも概して大きいプローブ密度を有する高密度アレイを提供する、比較的小さな領域を占め得る。アレイの表面領域は、約1、1.6、2、3、4、5、6、7、8、9、または10cm2以下であり得る。
【０１８７】
さらに、当業者は、アレイを使用して生成されるデータを簡単に分析し得ると考えられる。そのようなプロトコールは、上に開示され、かつ国際公開公報第9743450号；国際公開公報第03023058号；国際公開公報第03022421号；国際公開公報第03029485号；国際公開公報第03067217号；国際公開公報第03066906号；国際公開公報第03076928号；国際公開公報第03093810号；国際公開公報第03100448A1号において見出される情報を含み、そのすべてが参照により具体的に組み入れられる。
【０１８８】
B. 試料調製
広く様々な試料のmiRNAが、本発明のアレイテクノロジーを使用して分析され得ることが意図される。内因性miRNAが、本発明の組成物および方法を伴う使用に対して意図されるが、組み換えmiRNA−内因性miRNAまたは前駆体miRNAに相補的または同一である核酸を含む−は、本明細書において記載されるように取り扱われかつ分析され得る。試料は、生物学的試料であってもよく、その場合は、それらは、血液、組織、器官、精液、唾液、涙液、その他の体液、毛嚢、皮膚、または生物学的細胞を含むもしくは構成する任意の試料に由来し得る。または、試料は、生物学的試料ではあり得ないが、細胞を含まない反応混合物（一つまたは複数の生物学的酵素を含み得る）などの、化学的混合物であり得る。
【０１８９】
C. ハイブリダイゼーション
アレイが調製され、試料におけるmiRNAが標識された後、標的核酸の集団は、ハイブリダイゼーション条件下でアレイと接触し、そのような条件は、行われる特定のアッセイを考慮して、特異性の最適なレベルを提供するために、望ましいように調整され得る。適したハイブリダイゼーション条件は、当業者にとって周知であり、Sambrook et al., 1989および国際公開公報第95/21944号において概説される。多くの態様において特に関心対象であるのは、ハイブリダイゼーションの間のストリンジェントな条件の使用である。ストリンジェントな条件は、当業者にとって公知である。
【０１９０】
単一のアレイが、多数の試料に接触され得ることが、具体的に意図される。試料は、試料を識別するために、異なる標識で標識され得る。例えば、単一のアレイは、Cy3で標識された腫瘍組織試料、およびCy5で標識された正常組織試料に接触され得る。アレイ上のプローブに対応する特定のmiRNAに対する試料間の差は、簡単に解明されかつ定量され得る。
【０１９１】
アレイの小さな表面領域は、温度調節および塩含有量などの、均一なハイブリダイゼーション条件を可能にする。さらに、高密度アレイによって占められる小さな領域により、ハイブリダイゼーションは、極めて少ない液容積（例えば、約5、10、25、50、60、70、80、90、100μl、もしくはより少ない、またはそこに導き出せる任意の範囲の容積を含む、約250μlもしくはより少ない）において実行され得る。少ない容積において、ハイブリダイゼーションは、非常に急速に進行され得る。
【０１９２】
D. 差次的発現分析
本発明のアレイは、2つの試料間の差を検出するために使用され得る。具体的に意図される応用は、正常である試料からおよび正常ではない試料に由来するmiRNA間の差または2つの異なって処置された試料間の差を、同定および/または定量することを含む。また、miRNAは、特定の疾患または病態の影響を受けやすいと信じられている試料とその疾患または病態の影響を受けやすくないまたは耐性があると信じられている試料との間で比較されてもよい。正常ではない試料は、疾患もしくは病態の表現型形質を示すもの、またはその疾患もしくは病態に関して正常ではないと信じられているものである。それは、その疾患または病態に関して正常である細胞と比較され得る。表現型形質は、構成要素が遺伝的である、または遺伝的であり得る、または遺伝的であり得ない、疾患または病態の症状を含む、またはそれらへの罹患性を含む。
【０１９３】
特にアレイは、以下を含むがそれらに限定されない疾患または病態に関して、試料を評価するために使用され得る：AIDS、自己免疫疾患（関節リウマチ、多発性硬化症、糖尿病−インシュリン依存性および非依存性、全身性紅斑性狼瘡、およびグレーブス病）；癌（例えば、悪性、良性、転移性、前癌状態）；心臓血管疾患（心疾患または冠動脈疾患、脳卒中−虚血性および出血性、ならびにリウマチ性心疾患）；神経系の疾患；および病原性微生物による感染（水虫、水疱瘡、風邪、下痢性疾患、インフルエンザ、性器ヘルペス、マラリア、癌性髄膜炎、肺炎、静脈洞炎、皮膚疾患、連鎖球菌性咽頭炎、結核、尿路感染症、膣感染症、ウィルス性肝炎）；炎症（アレルギー、喘息）；プリオン病（例えば、CJD、クールー、GSS、FFI）。
【０１９４】
さらに、miRNAは、以下の疾患、病態、および障害に関して評価され得る：腹部癒着；肛門膿瘍；脳膿瘍；扁桃周囲膿瘍；アブサンス発作；アカラシア；座瘡；聴神経腫；後天性免疫不全症候群（AIDS）；先端線維性軟疣；光線性角化症；肺腺癌；ADHD；成人発症型糖尿病；航空性耳炎；そばかす；加齢性難聴；加齢性黄斑変性症；加齢性視力変化（老眼）；広場恐怖症；アルコール離脱；アルコール依存症；アレルゲン免疫療法；アレルギー性鼻炎；アレルギー；脱毛症（円形、遺伝型、および外傷性）；高山病；アルツハイマー病；黒内障性家族性小児白痴；弱視（Amblyopia）；無月経；アミロイドーシス；筋萎縮性側索硬化症（ALS）；アナフィラキシー；アンドロゲン性脱毛症；貧血（再生不良性、溶血性、悪性、および鎌状赤血球）；狭心症；クモ状血管腫；血管形成術；強直性脊椎炎；拒食症；無排卵性出血；抗生物質起因性下痢；抗リン脂質抗体症候群；非社会性人格障害；肛門裂、瘻、痔、肛門掻痒、狭窄；不安障害（全般性、強迫性障害、パニック障害、恐怖症、および心的外傷後ストレス障害）；大動脈瘤；大動脈弓症候群；虫垂炎；心不整脈；高安動脈炎；関節炎疾患（硬直性脊椎炎、痛風、感染性、若年性、変形性関節症、偽痛風、乾癬性関節炎、およびリウマチ性）；石綿肺症；上行性胆管炎；乾皮性湿疹；喘息；乱視；無症候性細菌尿；フリードライヒ失調症；アテローム性動脈硬化症；水虫；アトピー性皮膚炎；心房性細動；萎縮性膣炎；注意欠陥多動性障害；自閉症；自己免疫疾患（セリアック病、クローン病、真性糖尿病1型（インシュリン依存性；若年発症型）、真性糖尿病2型（非インシュリン依存性；成人発症型）、グレーブス病、甲状腺機能亢進症、免疫性血小板減少性紫斑病、狼瘡、重症筋無力症、結節性多発性動脈炎、関節リウマチ、強皮症、高安動脈炎、および潰瘍性大腸炎）；B12欠乏症；細菌性赤痢；細菌性胃腸炎；細菌性膣炎；亀頭炎；遺伝型禿頭症；白癬性毛瘡（Barber's Itch）；気圧性中耳炎；気圧障害；バルトリン腺嚢腫；基底細胞癌；夜尿症；褥瘡；ベーチェット症候群；ベル麻痺；減圧病；良性前立腺過形成；胆管疾患；胆石疝痛；生検；双極性障害；膀胱病態（感染症；間質性膀胱炎；脱；尿道炎；尿失禁；尿路感染症）；眼瞼炎；眼瞼下垂；枯死卵；摩擦発疹(Friction Blisters)；高血圧；激高（Boils）；骨疾患および病態（骨粗鬆症；パジェット病）；骨ヨー（Bone Yaws）；境界性人格障害；ボーンホルム病；ボツリヌス中毒症；腸閉塞症；徐脈；気管支炎；過食症；腱膜瘤；滑液包炎；クロストリジウム・ディフィシル（C. Difficile）大腸炎；踵骨骨端炎；ピロリン酸カルシウム沈着症；カンピロバクター感染症；癌；カンジダ症；一酸化炭素中毒；癰；心不整脈（心房性細動、徐脈）；心筋症；手根管症候群；白内障；蜂巣炎；中心性漿液性網膜症；脳性麻痺；大脳黄斑変性症；耳垢詰まり（Cerumen Impaction）；子宮頸管炎、ナボット嚢胞、頸管ポリープ、頸管疣贅；霰粒腫；水疱瘡；クラミジア感染症；褐色斑；胆管炎；胆嚢炎；コレステリン腫；軟骨軟化症；舞踏病；脈絡膜メラノーマ；慢性気管支炎；慢性疲労症候群；慢性肝炎；慢性白血病；慢性閉塞性肺疾患；慢性中耳炎；肝硬変；群発性頭痛；コーガン症候群；風邪；胆石疝痛；偽膜性大腸炎、潰瘍性大腸炎、肺虚脱；鎖骨骨折；昏睡；複合性局所疼痛症候群；鬱血性心不全；結膜炎；便秘；接触性皮膚炎；転換性障害；COPD；角膜剥離、角膜炎；コーン病（Corns）；冠動脈疾患；クロイツフェルト・ヤコブ病；内斜視；クループ；潜在睾丸；嚢胞性線維症；間質性膀胱炎；膀胱脱；嚢胞；サイトメガロ・ウイルス感染；涙嚢炎；ふけ；減圧症；褥瘡性潰瘍；精神錯乱；妄想性障害；認知症；抑鬱障害（双極性障害、気分変調、大鬱病、躁鬱病、産後抑鬱症）；皮膚炎；皮膚線維腫；皮膚筋炎；網膜剥離（Detached Retina）；発達性股関節形成不全；鼻中隔彎曲症；流行性胸膜痛（Devil's Grip）；糖尿病（妊娠性糖尿病；1型糖尿病（インシュリン依存性；若年性）；2型糖尿病（非インシュリン依存性；成人発症型）；低血糖症、ケトアシドーシス、腎症、神経症、網膜症）抗生物質起因性下痢；二重視；椎間板ヘルニア；水晶体脱臼；股関節脱臼（発達性）；憩室炎；憩室症；めまい；ドエルダーランド（Doerderland's）膣炎；複視；ダウン症候群；うなだれた眼瞼；乾皮症；太陽で痛んだ皮膚；乾性眼症候群；水かき足；家族性自律神経失調症；不正子宮出血；失読症；性交疼痛症；気分変調性障害；排尿障害；摂食障害（拒食症、過食症）；子癇；湿疹；浮腫；肺気腫；脳炎；遺糞症；末期腎疾患；心内膜炎；子宮内膜症；眼内炎；内視鏡；前立腺肥大；遺尿症；流行性良性乾性胸膜炎；精巣上体炎；喉頭蓋炎；癲癇；鼻出血；勃起不全；伝染性紅斑；食道炎；食道アカラシア；食道炎；本態性高血圧症；本態性振戦；ユーイング肉腫；家族性自律神経失調症；遠視（Farsightedness）；熱性発作；便失禁；発熱；発熱誘導性（Fever-Induced）発作；類線維腫；線維筋痛；第5病；糸状疣贅；扁平疣贅；鼓腸；インフルエンザ；焦点性発作；食物アレルギー；食中毒；前肢神経腫；脆弱性X症候群；摩擦発疹；フリードライヒ失調症；凍傷；真菌感染症（水虫、脳膿瘍、感染性関節炎、いんきんたむし、爪甲真菌症、輪癬、スイマー耳、股部白癬、爪白癬、癜風）；フルンケル；胆石；ガルドネレラ膣炎；胃炎；腓腹筋緊張（Gastrocnemius Strain）；胃腸炎；逆流性食道炎；胃腸アメーバ症；全般性不安障害；全般性気圧障害；性器ヘルペス；性器疣贅；GERD;性腺外胚細胞腫瘍；巨細胞性動脈炎；ランブル鞭毛虫症；緑内障；糸球体腎炎；グルテン過敏性腸疾患；GM2ガングリオシドーシス；淋病；痛風；大発作；グレーブス病；グレーブス眼病；ギラン・バレー症候群；槌状足指症；花粉症；頭痛；難聴；心臓発作；日射病；踵骨骨棘；鶏眼；クモ状ヘマンジオーマ；血腫；血尿；ヘモクロマトーシス；溶血性貧血；血友病；出血性脳卒中；クモ膜下出血脳卒中；痔核；A型肝炎；B型肝炎；C型肝炎；遺伝型禿頭症；ヘルニア；椎間板ヘルニア；高血圧；高コレステロール；多毛症；ヒスチオサイトーシスX；HIV/AIDS；麦粒腫；ヒトパピローマウィルス（HPV）；ハンチントン病；胞状奇胎；水頭症；活動過剰；高コレステロール血症；過角化症；遠視（Hyperopia）；高血圧症；高眼圧症；二次性高血圧症；高血圧性網膜症；高熱；甲状腺機能亢進症；心気症；低血糖症；上皮小体機能低下症；甲状腺機能低下症；IBS；ICD；魚鱗癬；免疫性血小板減少性紫斑病；膿痂疹；インポテンス；失禁；小児ガングリオシドリピドーシス；感染性関節炎；感染性単核球症；不妊症；炎症性大腸炎；鼠径ヘルニア；不眠症；大脳半球間出血；趾間神経腫；中足骨間神経腫；間欠性跛行；間質性膀胱炎；腸閉塞；鉄欠乏症；過敏性腸症候群；若年性関節炎；カポジ肉腫；川崎症候群；ケロイド；角膜炎；光線性角化症；内耳炎；乳糖不耐症；ラクナ脳卒中；ランゲルハンス細胞組織球増加症；喉頭炎；喉頭気管炎；外側上顆炎；ラテックスアレルギー；弱視（Lazy Eye）；鉛中毒；間欠性跛行；下肢静止不能症候群；過労性脛部痛；下肢緊張；白内障；水晶体脱臼；白血病；シラミ；慢性単純性苔癬；肝硬変；肝炎；肝斑；開口障害；ルー・ゲーリック病；全身性紅斑性狼瘡；ライム病；リンパ水腫；リンパ腫；黄斑変性症；吸収不良症候群；マラリア；男性型禿頭症；悪性高体温症；躁鬱病；マルファン症候群；乳様突起炎；嚢虫症；メッケル憩室；黒皮症；メニエール病；髄膜炎；閉経；知的障害；フェニルケトン尿症；片頭痛；流産；僧帽弁逸脱；排卵痛；奇胎妊娠；伝染性軟属腫；単核球症；モートン神経腫；モザイク疣贅；運動性チック；粘膜皮膚リンパ節症候群；多発性硬化症；流行性耳下腺炎；筋ジストロフィー；骨格筋障害（線維筋痛、巨細胞性動脈炎、痛風、感染性関節炎、筋ジストロフィー、筋炎、変形性関節症、骨粗鬆症、骨のパジェット病、リウマチ性多発筋痛、偽痛風；反射性交感神経性ジストロフィー、関節リウマチ、強皮症、全身性紅斑性狼瘡、腱炎）；重症筋無力症；心筋梗塞；心筋炎；近視；筋炎；ひょう疽；爪甲離床症；爪甲真菌症；爪周囲炎；爪下血腫；ナルコレプシー；鼻ポリープ；吐き気；近眼；針生検；腎摘出術；腎芽細胞腫；腎結石症；糖尿病性腎症；球後視神経炎；神経芽細胞腫；神経筋障害；神経症；ギラン・バレー症候群；球後；母斑；火炎状母斑；単純性母斑；夜尿；非熱帯性スプルー；肥満；強迫性障害；職業性難聴；高眼圧症；眼酒さ（Ocular Rosacea）；爪甲離床症；爪甲真菌症；緑内障；球後視神経炎；視神経腫脹；眼窩骨折；精巣炎；オズグッド・シュラッター病；変形性関節症；骨粗鬆症；骨肉腫；外耳炎；中耳炎；慢性中耳炎；耳硬化症；中毒性難聴；骨盤内炎症性疾患；多嚢胞性卵巣症候群；膀胱痛（Painful-Bladder）症候群；膵炎；パニック障害；乳頭浮腫；嵌頓包茎；パーキンソン病；爪周囲炎；部分発作；PCL損傷；有茎性疣贅；骨盤弛緩；嵌頓包茎；ペイロニー病；消化性潰瘍；鼓膜穿孔；心膜炎；閉経期；末梢血管疾患；扁桃周囲膿瘍；遷延性植物状態；人格障害；小発作；ペイロニー病；咽頭炎；咽頭癌；フェニルケトン尿症；包茎；恐怖症；光過敏性；色素異常症（褐色斑、黒皮症、白斑）；痔疾；伝染性結膜炎；薔薇色粃糠疹；PKU；ペスト；足底筋膜炎；足底疣贅；足底緊張；胸膜炎；胸膜痛；PMS；塵肺症；肺全摘術；肺炎；気胸；鉛中毒；ポリオ；灰白髄炎；結節性多発性動脈炎；多発性軟骨炎；リウマチ性多発筋痛；多発性筋炎；大腸ポリープ；鼻ポリープ；声帯ポリープ；ポートワイン母斑；ポリオ後症候群；感染後血小板減少症；産後抑鬱症；子癇前症；妊娠高血圧症；月経前症候群；床ずれ；原発性硬化性胆管炎；脱；前立腺肥大；急性前立腺炎；慢性前立腺炎；肛門掻痒；偽痛風；乾癬；乾癬性関節炎；下垂症；脈なし病；腎盂腎炎；四頭筋緊張；化膿性扁桃腺炎；皮疹；レイノー現象；直腸掻痒；直腸ヘルニア；反射性交感神経性ジストロフ��ー；腎不全；呼吸器疾患；呼吸器合胞体ウィルス；網膜剥離（Retinal Detachment）；網膜色素変性症；網膜症；球後視神経炎；ライ症候群；横紋筋肉腫；関節リウマチ；アレルギー性鼻炎；ウィルス性鼻炎（風邪）；ライリー・デイ症候群；輪癬；ロッキー山発疹熱；酒さ；麻疹；流行性耳下腺炎；唾液腺障害；サーモンパッチ；サルコイドーシス；疥癬；猩紅熱；瘢痕；統合失調症；統合失調症性人格障害；坐骨神経痛；強膜炎；強皮症；側弯症；皮脂嚢胞；脂漏症；脂漏性角化症；二次性高血圧症；発作；性的不全；性感染症；細菌性赤痢；帯状疱疹；唾液腺炎；唾液腺症；唾石症；鎌状赤血球貧血；鉄沈着症；珪肺症；洞（Sinus）癌；シェーグレン症候群；睡眠障害；天然痘；社会不安障害；日光黒子；身体表現性障害（心気症、身体化障害）；夢遊病；痙攣性結腸；クモ状静脈；二分脊椎；脊髄損傷；自然流産；鬱滞性皮膚炎；斜視；連鎖球菌性咽頭炎；連鎖球菌毒素性ショック症候群；脳卒中；クモ膜下出血；一過性脳虚血発作；吃音；爪下血腫；太陽アレルギー；太陽で痛んだ皮膚；シルベスト病（Sylvest's Disease）；全身性紅斑性狼瘡；全身性硬化症；頻脈；高安動脈炎；テイ・サックス病；涙管感染症；休止期脱毛；側頭動脈炎；腱炎；テニス肘；緊張性頭痛；睾丸捻転；停留睾丸；破傷風；血小板減少症；静脈血栓症；血栓性脳卒中；白癬；耳鳴；扁桃炎；捻転；妊娠中毒症；連鎖球菌毒素性ショック症候群；トキソプラズマ症；トリコモナス症；三叉神経痛（疼痛性チック）；結核；胼胝症；潰瘍；尿道炎；尿路障害および病態；ウロリニアシス（Uroliniasis）；蕁麻疹；子宮障害；子宮脱；ブドウ膜炎；膣炎；細菌性（ガルドネレラ）膣炎；水痘；食道静脈瘤；静脈瘤；血管障害（高血圧症、間欠性跛行、末梢血管疾患、結節性多発性動脈炎、レイノー現象、高安動脈炎、静脈血栓症、血管炎、ウェゲナー肉芽腫症）；静脈炎；静脈瘤；目眩；前庭神経鞘腫；ウィルス性鼻炎；ビタミンB12欠乏症；白斑；声帯チック；声帯障害；尋常性疣贅；性器疣贅；足底疣贅；脳水腫；外耳道の耳垢詰まり；食道膜；ウェルホーフ病；しわ；ペスト菌感染。
【０１９５】
本発明の方法および組成物によって評価され得る癌は、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、消化管、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、または子宮に由来する癌細胞を含む。加えて、癌は、具体的に、以下の組織型であり得るが、それらに限定されない：悪性新生物；癌腫；未分化癌；巨細胞および紡錘細胞癌；小細胞癌；乳頭癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；毛基質（pilomatrix）癌；移行上皮癌；乳頭状移行上皮癌；腺癌；悪性ガストリノーマ；胆管癌；肝細胞癌；混合型（combined）肝細胞癌および胆管癌；索状腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫性ポリープにおける腺癌；家族性大腸ポリポージス腺癌；固形癌；悪性カルチノイド腫瘍；ブランキオロ（branchiolo）-歯槽腺癌；乳頭腺癌；嫌色素性細胞癌；好酸性癌；好酸性腺癌；好塩基性癌；透明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞状腺癌；乳頭および濾胞状腺癌；被嚢性硬化性癌；副腎皮質癌；類内膜癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；脂腺癌；耳垢腺癌；粘液性類表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢胞腺癌；乳頭状漿液性嚢胞腺癌；ムチン性嚢胞腺癌；粘液腺癌；印環細胞癌；浸潤性導管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性乳癌；乳房パジェット病；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生を伴う腺癌；悪性胸腺腫；悪性卵巣間質腫瘍；悪性卵胞膜細胞腫；悪性顆粒膜細胞腫；悪性男性ホルモン産生細胞腫；セルトリ細胞癌；悪性ライディッヒ細胞腫；悪性脂質細胞（lipid cell）腫；悪性傍神経節腫；悪性乳房外傍神経節腫；褐色細胞腫；血管球血管肉腫；悪性メラノーマ；メラニン欠乏性メラノーマ；表在拡大型メラノーマ；巨大色素性母斑における悪性メラノーマ；類上皮細胞メラノーマ；悪性青色母斑；肉腫；線維肉腫；悪性線維性組織球腫；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質肉腫；悪性混合腫瘍；ミュラー管混合腫瘍；腎芽細胞腫；肝芽腫；癌肉腫；悪性間葉腫；悪性ブレンナー腫瘍；悪性葉状腫瘍；滑膜肉腫；悪性中皮腫；未分化胚細胞腫；胎生期癌；悪性奇形腫；悪性卵巣甲状腺腫；絨毛癌；悪性中腎腫；血管肉腫；悪性血管内皮腫；カポジ肉腫；悪性血管外皮腫；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；悪性軟骨芽細胞腫；間葉性軟骨肉腫；骨巨細胞腫；ユーイング肉腫；悪性歯原性腫瘍；エナメル上皮肉腫；悪性エナメル上皮腫；エナメル上皮線維肉腫；悪性松果体腫；脊索腫；悪性グリオーマ；上衣腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；膠芽細胞腫；希突起膠腫；希突起膠芽腫；原始神経外胚葉腫瘍；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅神経原性腫瘍；悪性髄膜腫；神経線維肉腫；悪性神経鞘腫；悪性顆粒細胞腫；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキンリンパ腫；傍肉芽腫；悪性小リンパ球性リンパ腫；悪性びまん性大細胞リンパ腫；悪性濾胞性リンパ腫；菌状息肉腫；その他の特定の非ホジキンリンパ腫；悪性組織球増殖症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞性白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄肉腫；および有毛細胞白血病。さらに、miRNAは、化生、異形成、および過形成などの、前癌状態において評価され得る。
【０１９６】
本発明が、前癌状態と癌との間、または原発腫瘍と転移腫瘍との間などの、疾患のステージ間の差を評価するために使用され得ることが、具体的に意図される。
【０１９７】
さらに、特定の経路の活性における差を有する試料も比較され得ることが意図される。これらの経路は、以下と、以下の因子に関与するものを含む：抗体反応、アポトーシス、カルシウム/NFATシグナル伝達、細胞周期、細胞移動、細胞接着、細胞分裂、サイトカインおよびサイトカイン受容体、薬物代謝、成長因子および成長因子受容体、炎症性反応、インシュリンシグナル伝達、NFκ-Bシグナル伝達、血管形成、脂質生成、細胞接着、ウィルス感染、バクテリア感染、老化、運動性、グルコース輸送、ストレス反応、酸化、老化現象、テロメア伸長、テロメア短縮、神経伝達、血液凝固、幹細胞分化、Gタンパク質共役受容体（GPCR）シグナル伝達、ならびにp53活性化。
【０１９８】
プロファイルされ得る細胞経路は、以下も含むが、それらに限定されない：サイクリックAMP、タンパク質キナーゼA、Gタンパク質共役受容体、アデニリルシクラーゼ、L-セレクチン、E-セレクチン、PECAM、VCAM-1、α-アクチニン、パキシリン、カドヘリン、AKT、インテグリン-α、インテグリン-β、RAF-1、ERK、PI-3キナーゼ、ビンキュリン、マトリクス・メタロプロテイナーゼ、Rho GTP分解酵素、p85、トレフォイル因子、プロフィリン、FAK、MAPキナーゼ、Ras、カベオリン、カルパイン-1、カルパイン-2、上皮成長因子受容体、ICAM-1、ICAM-2、コフィリン、アクチン、ゲルゾリン、RhoA、RAC1、ミオシン軽鎖キナーゼ、血小板由来成長因子受容体、もしくはエズリンに関与するものを含むが、それらに限定されない、任意の接着もしくは運動性経路；AKT、Fasリガンド、NFκB、カスパーゼ-9、PI3キナーゼ、カスパーゼ-3、カスパーゼ-7、ICAD、CAD、EndoG、グランザイムB、Bad、Bax、Bid、Bak、APAF-1、シトクロームC、p53、ATM、Bcl-2、PARP、Chk1、Chk2、p21、c-Jun、p73、Rad51、Mdm2、Rad50、c-Abl、BRCA-1、パーフォリン、カスパーゼ-4、カスパーゼ-8、カスパーゼ-6、カスパーゼ-1、カスパーゼ-2、カスパーゼ-10、Rho、Junキナーゼ、Junキナーゼキナーゼ、Rip2、ラミン-A、ラミン-B1、ラミン-B2、Fas受容体、H2O2、グランザイムA、NADPHオキシダーゼ、HMG2、CD4、CD28、CD3、TRADD、IKK、FADD、GADD45、DR3死受容体、DR4/5死受容体、FLIP、APO-3、GRB2、SHC、ERK、MEK、RAF-1、サイクリックAMP、タンパク質キナーゼA、E2F、網膜芽細胞腫タンパク質、Smac/Diablo、ACH受容体、14-3-3、FAK、SODD、TNF受容体、RIP、サイクリン-D1、PCNA、Bcl-XL、PIP2、PIP3、PTEN、ATM、Cdc2、タンパク質キナーゼC、カルシニューリン、IKKα、IKKβ、IKKγ、SOS-1、c-FOS、Traf-1、Traf-2、IκBβ、もしくはプロテアソームに関与するものを含むが、それらに限定されない、任意のアポトーシス経路；タンパク質キナーゼA、一酸化窒素、カベオリン-1、アクチン、カルシウム、タンパク質キナーゼC、Cdc2、サイクリンB、Cdc25、GRB2、SRCタンパク質キナーゼ、ADP-リボシル化因子（ARF）、ホスホリパーゼD、AKAP95、p68、オーロラB、CDK1、Eg7、ヒストンH3、PKAc、CD80、PI3キナーゼ、WASP、Arp2、Arp3、p16、p34、p20、PP2A、アンジオテンシン、アンジオテンシン変換酵素、プロテアーゼ活性化受容体-1、プロテアーゼ活性化受容体-4、Ras、RAF-1、PLCβ、PLCγ、COX-1、Gタンパク質共役受容体、ホスホリパーゼA2、IP3、SUMO1、SUMO2/3、ユビキチン、Ran、Ran-GAP、Ran-GEF、p53、グルココルチコイド、グルココルチコイド受容体、SWI/SNF複合体の構成要素、RanBP1、RanBP2、インポーチン、エクスポーチン、RCC1、CD40、CD40リガンド、p38、IKKα、IKKβ、NFκB、TRAF2、TRAF3、TRAF5、TRAF6、IL-4、IL-4受容体、CDK5、AP-1転写因子、CD45、CD4、T細胞受容体、MAPキナーゼ、神経成長因子、神経成長因子受容体、c-Jun、c-Fos、Junキナーゼ、GRB2、SOS-1、ERK-1、ERK、JAK2、STAT4、IL-12、IL-12受容体、一酸化窒素シンターゼ、TYK2、IFNγ、エラスターゼ、IL-8、エピセリン、IL-2、IL-2受容体、CD28、SMAD3、SMAD4、TGFβ、もしくはTGFβ受容体に関与するものを含むが、それらに限定されない、任意の細胞活性化経路；TNF、SRCタンパク質キナーゼ、Cdc2、サイクリンB、Grb2、Sos-1、SHC、p68、オーロラキナーゼ、タンパク質キナーゼA、タンパク質キナーゼC、Eg7、p53、サイクリン、サイクリン依存性キナーゼ、神経成長因子、上皮成長因子、網膜芽細胞腫タンパク質、ATF-2、ATM、ATR、AKT、CHK1、CHK2、14-3-3、WEE1、CDC25、CDC6、起点認識複合体タンパク質、p15、p16、p27、p21、ABL、c-ABL、SMAD、ユビキチン、SUMO、熱ショックタンパク質、Wnt、GSK-3、アンジオテンシン、p73任意PPAR、TGFα、TGFβ、p300、MDM2、GADD45、Notch、cdc34、BRCA-1、BRCA-2、SKP1、プロテアソーム、CUL1、E2F、p107、ステロイドホルモン、ステロイドホルモン受容体、IκBα、IκBβ、Sin3A、熱ショックタンパク質、Ras、Rho、ERK、IKK、PI3キナーゼ、Bcl-2、Bax、PCNA、MPAキナーゼ、ダイニン、RhoA、PKAc、サイクリンAMP、FAK、PIP2、PIP3、インテグリン、トロンボポエチン、Fas、Fasリガンド、PLK3、MEK、JAK、STAT、アセチルコリン、パキシリン、カルシニューリン、p38、インポーチン、エクスポーチン、Ran、Rad50、Rad51、DNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、Ran-GAP、Ran-GEF、NuMA、Tpx2、RCC1、ソニックヘッジホッグ、Crm1、パッチド（Ptc-1）、MPF、CaMキナーゼ、チューブリン、アクチン、動原体関連タンパク質、セントロメア結合タンパク質、テロメラーゼ、TERT、PP2A、c-MYC、インシュリン、T細胞受容体、B細胞受容体、CBP、IKB、NFκB、RAC1、RAF1、EPO、ジアシルグリセロール、c-Jun、c-Fos、Junキナーゼ、低酸素誘導因子、GATA4、β-カテニン、α-カテニン、カルシウム、アレスチン、スルビビン、カスパーゼ、プロカスパーゼ、CREB、CREM、カドヘリン、PECAM、コルチコステロイド、コロニー刺激因子、カルパイン、アデニリルシクラーゼ、成長因子、一酸化窒素、膜貫通受容体、レチノイド、Gタンパク質、イオンチャネル、転写アクチベータ、転写コアクチベータ、転写リプレッサー、インターロイキン、ビタミン、インターフェロン、転写コリプレッサー、核孔、窒素、毒、タンパク質分解、もしくはリン酸化反応に関与するものを含むが、それらに限定されない、任意の細胞周期調節、シグナル伝達、もしくは分化経路；または、アミノ酸の生合成、脂肪酸の酸化、神経伝達物質およびその他の細胞シグナル伝達分子の生合成、ポリアミンの生合成、脂質およびスフィンゴ脂質の生合成、アミノ酸および栄養素の異化、ヌクレオチド合成、エイコサノイド、電子伝達反応、ER関連分解、解糖、線維素溶解、ケトン体の形成、ファゴソームの形成、コレステロール代謝、食物摂取の調節、エネルギーホメオスタシス、プロトロンビン活性化、ラクトースおよびその他の糖の合成、多剤耐性、ホスファチジルコリンの生合成、プロテアソーム、アミロイド前駆体タンパク質、Rab GTP分解酵素、デンプン合成、グリコシル化、ホスホグリセリドの合成、ビタミン、クエン酸回路、IGF-1受容体、尿素回路、小胞輸送、もしくはサルベージ経路に関与するものを含むが、それらに限定されない、任意の代謝経路。本発明の核酸分子が、上の経路または因子の任意に関して、診断的および治療的方法において採用され得ることがさらに意図される。したがって、本発明のいくつかの態様において、miRNAは、上の経路または因子の一つまたは複数に関して、差次的に発現され得る。
【０１９９】
表現型形質は、寿命、罹患率、外見（禿頭症、肥満）、体力、スピード、忍耐力、繁殖力、特定の薬物または治療的処置に対する影響の受け易さまたは受容力（薬物効能）、および薬物毒性のリスクなどの特徴も含む。これらの表現型形質において異なる試料は、記載されるアレイおよび方法を使用して評価されてもよい。
【０２００】
特定の態様において、miRNAプロファイルは、薬物動態学によってそれらのプロファイルを評価しかつ相関させるために生成され得る。例えば、miRNAプロファイルは、発現が患者の帰結と相関するmiRNAがあるかどうかを決定するために、患者が処置されることに先行して、または処置の間に、患者の腫瘍および血液試料に対して作り出されかつ評価され得る。異なったmiRNAの同定は、どの投薬計画を患者が提供されるべきかを決定するために、腫瘍および/または血液試料を評価するために使用され得るそれらに関与する診断的アッセイをもたらし得る。加えて、それは、特定の治験に適した患者を同定または選択するために使用され得る。miRNAプロファイルが、薬物効能または薬物毒性と相関されるために決定される場合、それは、その患者が薬物を受け取ることまたは薬物の特定の用量に適当な患者であるかどうかに関連性があり得る。
【０２０１】
上の予後診断的アッセイに加えて、様々な疾患を有する患者に由来する血液試料は、異なる疾患が、血液miRNAレベルに基づいて同定され得るかどうかを決定するために、評価され得る。診断的アッセイは、医者が、疾患を有する、または疾患を発生するリスクがある個人を同定するために使用し得るプロファイルに基づいて作り出され得る。または、処置は、miRNAプロファイリングに基づいて設計され得る。そのような方法および組成物の例は、David brown、Lance Ford、Angie Cheng、およびRich Jarvisの名において2005年5月23日に出願された「Methods and Compositions Involving miRNA and miRNA Inhibitor Molecules」と題される米国特許仮出願において記載され、全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【０２０２】
E. その他のアッセイ
アレイおよびマイクロアレイの使用に加えて、多くの異なるアッセイが、miRNA、それらの活性、およびそれらの効果を分析するために採用され得ると考えられることが意図される。そのようなアッセイは、RT-PCR、インサイチューハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション保護アッセイ（HPA）（GenProbe）、分岐DNA（bDNA）アッセイ（Chiron）、ローリングサイクル増幅（RCA）、単一分子ハイブリダイゼーション検出（US Genomics）、インベーダーアッセイ（ThirdWave Technologies）、Bridge Litigationアッセイ（Genaco）を含むが、それらに限定されない。
【０２０３】
III. キット
本明細書において記載される組成物の任意は、キットに含まれ得る。非限定的な例において、miRNAを単離する、miRNAを標識する、および/またはアレイを使用してmiRNA集団を評価するための試薬が、キットに含まれる。キットは、miRNAプローブを作り出すまたは合成するための試薬をさらに含み得る。したがって、キットは、適した容器手段において、標識ヌクレオチドまたはその後に標識される非標識ヌクレオチドを取り込むことによってmiRNAを標識するための酵素を含むと思われる。それは、反応バッファー、標識化バッファー、洗浄バッファー、またはハイブリダイゼーションバッファーなどの一つまたは複数のバッファー、miRNAプローブを調製するための化合物、およびmiRNAを単離するための構成要素を含んでもよい。本発明のその他のキットは、miRNAを含む核酸アレイを作るための構成要素を含んでいてもよく、したがって、例えば固体支持体を含み得る。
【０２０４】
キットも、本発明の一部として含まれる。本明細書において記載される本発明の方法を導入するためのキットが、具体的に意図される。いくつかの態様において、多重標識化に対してmiRNAを調製するためのキット、ならびにmiRNAプローブおよび/またはmiRNAアレイを調製するためのキットがある。これらの態様において、キットは、適した容器手段において、以下の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、またはより多くを含む：1）ポリ(A)ポリメラーゼ；2）非修飾ヌクレオチド（G、A、T、C、および/またはU）；3）修飾ヌクレオチド（標識または非標識）；4）ポリ(A)ポリメラーゼバッファー；および5）少なくとも一つのマイクロフィルター；6）ヌクレオチドに付着し得る標識；7）すくなくとも一つのmiRNAプローブ；8）反応バッファー；9）miRNAアレイまたはそのようなアレイを作るための構成要素；10）酢酸；11）アルコール；12）miRNAまたはmiRNAプローブもしくはアレイを調製、単離、濃縮、および精製するための溶液。その他の試薬は、ホルムアミド、ローディング色素、リボヌクレアーゼ阻害剤、およびDNA分解酵素などの、RNAを操作するために一般的に使用されるものを含む。
【０２０５】
特定の態様において、本発明のキットは、本出願において記載されるように、miRNAプローブを含むアレイを含む。アレイは、生物体のすべての公知のmiRNAに対応するプローブまたはそのようなプローブのサブセットに対応するプローブを有し得る。本発明のアレイ上のプローブのサブセットは、特定の診断的、治療的、または予後診断的応用に関連性があるとして同定されるものであり得る、またはそれらを含み得る。例えば、アレイは、1）疾患または病態、2）特定の薬物または処置に対する影響の受け易さまたは耐性；3）薬物または物質に由来する毒性に対する影響の受け易さ；4）疾患または病態の発生または重症度のステージ（予後診断）；および5）疾患または病態に対する遺伝的素因を示す、または連想させる一つまたは複数のプローブを含み得る。
【０２０６】
アレイを含む任意のキットの態様に対して、SEQ ID NO：1〜899の任意のすべてまたは一部と同一または相補的である配列を含む核酸分子があり得る。特定の態様において、本発明のキットまたはアレイは、SEQ ID NO：1〜703およびSEQ ID NO：899に対する一つもしくは複数のプローブを含んでいてもよく、かつ/またはSEQ ID NO：704〜898の任意における配列のすべてまたは一部を有する一つもしくは複数のプローブを含み得る。上で議論される任意の核酸は、キットの一部として導入され得る。
【０２０７】
キットの構成要素は、水性媒質において、または凍結乾燥形式で、包装され得る。キットの容器手段は、概して、構成要素が置かれてよく、好ましくは適切に等分され得る、少なくとも一つのバイアル、試験チューブ、フラスコ、ボトル、シリンジ、またはその他の容器手段を含むと思われる。キットに複数の構成要素がある場合（標識化試薬および標識が一緒に包装され得る）、キットは、概して、第二、第三、または付加的な構成要素が別個に置かれ得るその他の付加的な容器も含むと思われる。しかしながら、構成要素の様々な組み合わせが、バイアルに含まれ得る。本発明のキットは、典型的には、委託販売のために厳重な管理化で、核酸を含むための手段、および任意のその他の試薬容器も含むと思われる。そのような容器は、望ましいバイアルが保持される注射または中空形成プラスチック容器を含み得る。
【０２０８】
キットの構成要素が、一つおよび/または複数の液体溶液において提供される場合、液体溶液は水性溶液であり、滅菌水性溶液が特に好ましい。
【０２０９】
しかしながら、キットの構成要素は、乾燥粉末として提供され得る。試薬および/または構成要素が、乾燥粉末として提供される場合、粉末は、適した溶剤の添加によって再構成され得る。溶剤は、別の容器手段において提供されてもよいことが想定される。いくつかの態様において、標識化色素は、乾燥粉末として提供される。10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、700、800、900、1000μg、または少なくとも、もしくは多くともこれらの量の乾燥粉末が、本発明のキットにおいて提供されることが意図される。次いで、色素は、DMSOなどの任意の適した溶剤において再懸濁され得る。
【０２１０】
容器手段は、概して、核酸剤形が置かれる、好ましくは適切に配分される、少なくとも一つのバイアル、試験チューブ、フラスコ、ボトル、シリンジ、および/またはその他の容器手段を含むと思われる。キットは、滅菌の、薬学的に許容されるバッファーおよび/またはその他の希釈剤を含むための第二の容器手段を含んでもよい。
【０２１１】
本発明のキットは、典型的には、委託販売のために厳重な管理化で、例えば望ましいバイアルが保持される注射および/または中空形成プラスチック容器などの、バイアルを含むための手段も含むと思われる。
【０２１２】
そのようなキットは、標識miRNAの単離を促進する構成要素を含んでもよい。それは、miRNAを保存するもしくは維持する、またはその分解から保護する構成要素を含んでもよい。そのような構成要素は、RNA分解酵素フリーであり得る、またはRNA分解酵素から保護し得る。そのようなキットは、概して、適した手段において、各々の個々の試薬または溶液に対する相異なる容器を含むと思われる。
【０２１３】
キットは、キットに含まれない任意のその他の試薬の使用と同様に、キット構成要素を採用するための取扱説明書も含むと思われる。取扱説明書は、導入され得るバリエーションを含み得る。
【０２１４】
本発明のキットは、以下の一つまたは複数を含んでもよい：対照RNA；ヌクレアーゼフリー水；1.5 mlチューブなどのRNA分解酵素フリー容器；RNA分解酵素フリー溶離チューブ；PEGまたはデキストラン；エタノール；酢酸；酢酸ナトリウム；酢酸アンモニウム；グアニジニウム；界面活性剤；核酸サイズマーカー；RNA分解酵素フリーチューブチップ；およびRNA分解酵素またはDNA分解酵素阻害剤。
【０２１５】
そのような試薬が、本発明のキットの態様であることが意図される。しかしながら、そのようなキットは、上に同定される特定の項目に限定されず、miRNAの操作または特徴付けのために使用される任意の試薬を含み得る。
【０２１６】
実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために含まれる。以下の実施例において開示される技術は、本発明者らによって本発明の実施においてよく機能することが発見された技術を示し、したがって、その実施に対して好ましいモードを構成すると考えられ得るということが、当業者によって高く評価されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示される特定の態様において多くの変化がなされ得ることを高く評価するべきであり、それでも、本発明の精神と範囲から逸脱することなく同類のまたは同様の結果を得るべきである。
【０２１７】
他に特に指定されなければ、カタログ番号は、Ambion, Inc.(登録商標)、The RNA Companyからのその番号によって利用できる製品を指す。
【０２１８】
実施例1：
miRNA単離および濃縮
miRNAは、二段階プロセスを使用して、細胞または組織試料から得られた。第一において、試料におけるRNAのすべてが、試料のその他の内容物から単離される。第二段階において、miRNAが顕著に濃縮されるRNA画分を作り出すために、miRNAを含む小さなRNAが、試料から選択的に抽出される。
【０２１９】
A. 全RNA単離
試料におけるRNAのすべてを回収するために使用され得る様々な方法があるが、シリカ結合およびRNA溶離が、以下に記載されるように使用された。
【０２２０】
組織試料に対して、0.1 gの組織あたり、1 mlの溶解/結合溶液[4 Mチオシアン酸グアニジニウム、0.5％ Nラウリルサルコシン、25 mM クエン酸Na pH 7.2、0.1 M 2-メルカプトエタノール]が添加された。試料は、低温に保たれ、組織は、電動ローターステーターホモジナイザーを使用して、溶解/結合溶液において徹底的に崩壊された。細胞試料に対して、107細胞あたり、0.6 mlの溶解/結合溶液が添加された。細胞は、30〜60秒間ボルテックスすることによって溶解された。
【０２２１】
1/10容積の氷冷酢酸が、ホモジネートに添加された。例えば、溶解物容積が300μlだった場合、30μlの氷冷酢酸が添加された。次いで、試料は、10分間氷上に放置する前に、ボルテックスまたはチューブを数回倒置することによって、よく混合された。
【０２２２】
試料溶解物容積と等しい容積の酸性フェノール：クロロホルムが、試料に添加され、次いで、それを混合するために、30〜60秒間ボルテックスされた。混合物は、水相および有機相を分離するために、室温で、最大スピード（10,000×g）で、5分間遠心された。水（上）相は、下相を乱さずに慎重に除去され、新鮮なチューブに移された。1.25容積の100％エタノールが、水相に添加された（例えば、300μlが水相から回収された場合、375μlのエタノールが添加された）。溶解物/エタノール混合物（以前の段階に由来する）は、ガラスファイバーフィルターカラム上へピペットされた。次いで、カラムは、混合物がフィルターを通り抜けるように、RCF（相対遠心力）10,000×gで、およそ15秒間遠心された。フロースルーを捨てた後、プロセスは、溶解物/エタノール混合物のすべてがフィルターを通り抜けるまで、繰り返された。
【０２２３】
700μlのmiRNA洗浄溶液1[1.6 Mチオシアン酸グアニジニウム、30％エタノール]が、フィルターカラムに加えられ、その後、溶液をフィルターから引くために、〜5から10秒間遠心された、または真空下に置かれた。フロースルーは捨てられた。500μlの洗浄溶液2/3[100 mM NaCl、4.5 mM EDTA、10 mMトリス pH 7.5]が、フィルターカラムに加えられ、以前の段階におけるようにそれから引き出された。洗浄は、洗浄溶液2/3の第二の500μl分割量で繰り返された。最後の洗浄からフロースルーを捨てた後、フィルターから残留液を除去するために、アセンブリは、1分間スピンされた。100μlの室温ヌクレアーゼフリー水が、フィルターの中心に添加され、キャップが閉められた。それは、RNAを回収するために、最大スピードでおよそ20〜30秒間スピンされた。
【０２２４】
B. miRNA濃縮
miRNA標識化プロセスは、全RNA試料中にあるより大きなmRNAおよびrRNAのほとんどを欠く試料に対して最も効果的である。これらのRNAを試料から除去するために、以下の一つが採用された：70ヌクレオチドよりも大きい試料におけるRNAの大部分を除去するための濃縮プロセス、または長さが15〜30ヌクレオチドであったRNAの集団を得るためのゲル精製プロセス。
【０２２５】
1. その他のRNAの除去
単離された全RNAに、300μlの溶解/結合溶液が添加された。次いで、100μlの100％エタノールが添加された。それは、ボルテックスまたはチューブを数回倒置にすることによって、徹底的に混合された。
【０２２６】
溶解物/エタノール混合物は、ガラスファイバーフィルターカラム上へピペットされ、RCF 10,000×g（典型的には10,000 rpm）で、〜15秒間遠心された。濾液は収集され、2/3容積の100％エタノールが、濾液（すなわちフロースルー）に添加され、それは徹底的に混合された。
【０２２７】
濾液/エタノール混合物（以前の段階に由来する）は、新しいガラスファイバーフィルターカラム上へピペットされた。カラムは、混合物がフィルターを通り抜けるように、RCF（相対遠心力）10,000×gで、およそ15秒間遠心された。700μlのmiRNA洗浄溶液1[1.6 Mチオシアン酸グアニジニウム、30％エタノール]が、フィルターカラムに加えられ、その後に、溶液をフィルターから引くために、〜5から10秒間遠心された、または真空下に置かれた。フロースルーは捨てられた。500μlの洗浄溶液2/3[100 mM NaCl、4.5mM EDTA、10 mMトリス pH 7.5]が、フィルターカラムに加えられ、以前の段階におけるようにそれから引き出された。洗浄は、洗浄溶液2/3の第二の500μl分割量で繰り返された。最後の洗浄からフロースルーを捨てた後、フィルターから残留液を除去するために、アセンブリは、1分間スピンされた。100μlの室温ヌクレアーゼフリー水が、フィルターの中心に添加され、キャップが閉められた。それは、miRNAを回収するために、最大スピードでおよそ20〜30秒間スピンされた。miRNAは、分析のために標識されるまで、凍結乾燥されかつ保存された。
【０２２８】
2. ゲル精製
混入するmRNA、tRNA、およびrRNAから試料におけるmiRNAを単離することは、ゲル電気泳動を使用してなされ得る。ゲル電気泳動に対する二つの方法が使用された。第一は、標準的ゲル条件および電気泳動後のゲルのmiRNA画分の切除を特徴とする。第二は、チューブ電気泳動と呼ばれる方法を特徴とし、ゲルで満たされたチューブが、RNA試料を分画し、miRNA画分の回収を促進するために使用される。
【０２２９】
a. 標準的ゲル精製
等しい容積のゲルローディングバッファー（95％ホルムアミド、18 mM EDTA、0.01％キシレンシアノール、および0.01％ブロモフェノールブルー）が、150μgほどの全RNAに添加された。次いで、混合物は、95℃で5分間、ウォーターバス中で加熱され、RNAを分画するために15％変性ポリアクリルアミドゲルに加えられた。
【０２３０】
ゲルが、実行された後、19〜30 nt（キシレンシアノール下からブロモフェノールブルーとキシレンシアノールとの間まで）に相当するゲルスライスが、切除された。miRNAは、4℃一晩、10容積のゲル溶離バッファー（0.5 mM NaCl、10 mM EDTA）においてゲルスライスをインキュベートすることによって抽出された。次いで、これは、2500 rpm（1000×G）で遠心され、ゲル溶離バッファーは除去され、新しいチューブへ置かれた。2容積のゲル溶離バッファーがゲルに添加され、室温で60分間インキュベートされた。再度、これは遠心され、ゲル溶離バッファー試料がプールされた。
【０２３１】
回収されプールされたバッファー試料は、60％最終エタノール濃度を作り出すために、十分な100％エタノールと混合された。試料/エタノールは、ガラスファイバーフィルターカラム上にロードされ、真空が適用された。2容積のmiRNA結合/洗浄バッファー（0.5 mM NaCl、55％エタノール）が、カラムに加えられた。次いで、カラムは、試料収集チューブに置かれた。カラムは、0.6 mlのmiRNA結合/洗浄バッファーで洗浄された。次いで、カラムは、10,000×Gで少なくとも1分間遠心された。濾液は除去され、カラムは、再度10,000×Gで1分間遠心された。50μlの熱い（95℃）ヌクレアーゼフリー水が、カラムに添加され、10,000×Gで30秒間遠心された。以前の2段階は、第二の50μl洗浄で繰り返された。miRNAは、標識化まで、凍結乾燥されかつ保存された。
【０２３２】
b. チューブ電気泳動によるゲル精製
チューブ電気泳動は、ナイロンチュービングがポリアクリルアミドゲルマトリクスで満たされ、ゲルチューブが特別な電気泳動デバイスに置かれる方法である。全RNA試料は、チューブの上面に添加され、サイズに基づいてRNAを分画するために、電流が加えられる。miRNA画分は、それが、チューブの端から電気泳動バッファーへ流れる際に、捕獲される。次いで、miRNAは、バッファーから回収される。このプロセスは、以下により詳細に記載される。
【０２３３】
ゲルカートリッジは、ナイロン6チュービングをおよそ10〜15インチの長さに切ることによって、調製された。それを破砕および/または破損することを回避するために、穏やかな圧が切る間に加えられた。チュービングは、ガラスプレート上に置かれ、180℃で6〜12分間オーブンにおいて加熱された、チュービングがオーブンから除去された後、チュービングの各々の端は、プラスチックが冷えるまで、長さをまっすぐにするために保持された。
【０２３４】
16％変性アクリルアミド溶液は、4 ml 20％アクリルアミド/7M尿素/1×TBEを1 mL 7M尿素/1×TBEと混合することによって調製された。これに、50μLの10％ APS＋5μL TEMEDが添加された。溶液を混合した後、ゲルマトリクスは、Drummondピペッターを使用してチュービングへ引き上げられた。ゲルは、30分間、重合させた。
【０２３５】
次いで、チュービングは、50 mLコニカルに合うように切られた。チュービングは、一晩、1×TBE溶液（10×TBEカタログ番号9866）に浸された。使用に際して、1.2 cmチューブ長が、穏やかな圧を使用して切られた。カートリッジは、下層バッファーチャンバープラットフォームを使用して、チューブ電気泳動装置にロードされた。ゲルカートリッジは、その端を下にして置かれ、上層プレートカートリッジレセプタクルホールが調整された。安定で一様な圧で、チューブカートリッジが適所にスライドされた。200μL 1×TBEが、ゲルカートリッジの底面を囲うように、底面カートリッジに添加され、上面プラットフォームが、適所に置かれた。125μL 1×TBEが、上層バッファーチャンバーに置かれ、試料が添加される前に漏れについてチェックされた。
【０２３６】
試料は、等しい容積の脱イオン化ホルムアミド（カタログ番号9342）を全RNAに添加することによって調製された（全容積<50μL）。2μLのフィルターされたservaブルーR色素（5 mg/mL）が、試料に添加され、次いで、2分間95℃で加熱された。次いで、試料は、ゲル表面の直上で、上層バッファーチャンバーに加えられた。ゲルは、70Vで7〜10分間実行された。miRNA画分（<40 bp）は、ゲルから下層バッファーチャンバーへ移出させた。ゲルは、40ヌクレオチド種を指定するservaブルー色素が、ゲルの底面に到達した際に、停止された。200μLバッファーが、下層チャンバーから収集され、エッペンドルフチューブに置かれた。
【０２３７】
15μL 0.5 mg/mLの直鎖アクリルアミド（5 mg/mLカタログ番号7118）、60μL 5 M NaCl、および400μLの無水エタノールが、試料に添加された。ガラスファイバーフィルターカラム（カタログ番号10066G）は、洗浄溶液#1（0.5 M NaCl；55％エタノール）であらかじめ湿らせる（prewetting）ことによって調製された。試料は、カラムに添加された。カラムは、5000 rpmで1分間スピンされた。500μLの洗浄溶液#2（80％エタノール）が、カラムに添加され、再度、5000 rpmで1分間スピンされた。カラムは、任意の過剰なエタノールを取り除くために、再度、10000 rpmで1分間スピンされた。95℃に加熱された15μLのH2Oが、カラムに加えられ、室温（RT）で2分間、そのままにされた。次いで、カラムは、10000 rpmで1分間スピンされた。別の15μLの加熱された溶離溶液が、添加された。室温で2分間そのままにした後、カラムは、10000 rpmで1分間スピンされた。試料は、標識化まで、凍結乾燥されかつ保存された。
【０２３８】
実施例2：
miRNAの標識化：反応に影響を及ぼす因子
A. 大腸菌ポリ(A)ポリメラーゼによるmiRNAの3'末端への様々なヌクレオチドの追加
数百ヌクレオチドのポリAテールは、ATPおよび大腸菌ポリ(A)ポリメラーゼを使用して、miRNAの3'末端に効率的に付加された。その他のヌクレオチドは、酵素に対する基質としての役目もし得ると考えられ、最も著しくはUTPである。5-(3-アミノアリール)-UTP、アデノシン'5'-(1-チオ三リン酸)、ウリジン'5'-(1-チオ三リン酸)、8-[(4-アミノ)ブチル]-アミノ-ATP、および8-[(6-アミノ)ブチル]-アミノ-ATPなどの修飾ヌクレオチドは、大腸菌ポリ(A)ポリメラーゼに対する基質であったが、3'テールの長さは、ATPおよびUTPで生成されるものよりも顕著に短かった。修飾ヌクレオチドのみがポリ(A)ポリメラーゼ反応にあった場合、テールは、典型的には、3〜10ヌクレオチド長であった。
【０２３９】
標準的および修飾NTP（ATPまたはUTP）の様々な混合物は、ポリAポリメラーゼによって取り込まれるそれらの能力に対して試験された。テールの長さは、わずか10μM標準的NTPを反応に添加して、大いに伸張され得ると考えられる。蛍光NTPのみでテール化されるmiRNA試料の標識化効率は、標準的NTPの様々な比に対して蛍光NTPでテール化されるmiRNA試料の標識化効率と比較された。最適な修飾NTP：標準的NTP比は、これらの条件下で5:1であった。
【０２４０】
B. miRNAの放射性標識化および蛍光標識化
miRNAは、様々な方式で標識された。放射性標識化に対して、0.5〜5μMでのα-32P-ATPまたはα-32P-UTPが、ポリ(A)ポリメラーゼ反応において使用された。数百ヌクレオチドが、各々のmiRNAに追加されてよく、各々のmiRNAに対して実質的な放射性シグナルを提供する。蛍光標識化に対して、色素標識ヌクレオチド（担体標準的ヌクレオチドに加えて）が取り込まれる、またはテーリング反応の後に色素分子が追加され得る反応基を有するヌクレオチドが取り込まれる。後者の方法は、より大きな蛍光を伴うより長いテールを生成した。500μMの最終濃度でのアミノアリールUTPおよび100μMの最終濃度でのUTPの使用は、有利な結果を提供する条件であった。この組み合わせは、典型的には、10〜50ヌクレオチドのテールおよびおそらくmiRNAあたり20もの色素分子を得た。
【０２４１】
C. ポリ(A)ポリメラーゼ反応最適化
文献において記載されるポリ(A)ポリメラーゼ反応条件は、全RNAの試料から単離されたngおよびナノグラム下の量のmiRNAを使用する場合は、あまり効率的ではなかった。ポリエチレングリコール（PEG）などの体積排除試薬の添加は、標識化反応を顕著に改善した。10％PEGは、0.1 ngのmiRNAを有する試料において、10倍もの多くの標識材料を提供した。
【０２４２】
D. pH最適化
miRNAポリ-Aテーリング反応のpHの最適化は、pH 6〜7が、文献（Sillero et al., 2001）において推奨されるpH 7.9よりもより良いテーリング効率を提供することを明らかにした。pH 6.5においてポリ(A)ポリメラーゼでテール化されるmiRNAは、文献において記載されるpH 7.9よりも、10倍もの大きなシグナルを提供した。miRNA標識化に対する本発明者らの最終的な反応バッファーは以下であった：10％ポリエチレングリコール（MW 3,350）、10 mM MgCl2、250 mM NaCl、50 mM MES pH 6.5、および1 mM DTT。
【０２４３】
実施例3：
miRNAの標識化：二段階蛍光miRNA標識化
1. ポリAポリメラーゼ反応
単離されたmiRNAは、4.0μL H2Oに再懸濁された。以下が、miRNA試料に添加された：10μL 2×ポリ(A)ポリメラーゼ（PAP）バッファー（20％ポリエチレングリコール（MW 3,350）、20 mM MgCl2、500 mM NaCl、100 mM MES pH 6.5、2 mM DTT）；2.0μL 25 mM MnCl2；2.0μL NTPミックス（1 mM UTP、5 mM アミノアリール-UTP）；2.0μL PAP（2 U/μL）（カタログ番号2030G）。反応混合物は、37℃で2時間インキュベートされた。
【０２４４】
混合物からテール化miRNAを得るプロセスを始めるために、10μgの剪断酵母RNAおよび80μLのmiRNA結合バッファー（0.6 M NaCl、70％エタノール）が、反応ミックスに添加され、RTで5分間インキュベートされた。ミックスは、その後、ガラスファイバーフィルターカラムに加えられ、次いで、5000 rpmで1分間スピンされた。300μLのmiRNA洗浄バッファー（0.5 M NaCl、55％エタノール）が添加され、カラムは、再度、5000 rpmで1分間スピンされた。洗浄/スピン段階は、カラムが、再度、10000 rpmで1分間スピンされる前に、繰り返された。95℃で加熱された25μLのddH2Oが、カラムに添加され、次いで、65℃で5分間インキュベートされた。カラムは、10000 rpmで1分間スピンされ、溶離画分は、乾燥され、典型的には4または7μLに再懸濁された。
【０２４５】
2. 標識化反応
アミン修飾miRNAは、NHS-エステルCy3、Cy5、AlexaFluor 555、AlexaFluor 647、およびビオチンなどのアミン修飾標識部分と反応させた。これは、以下の手順によって遂行された。
【０２４６】
アミン修飾色素が、8μLジメチルスルホキシド（DMSO）に再懸濁された。2つの試料が、色素チューブあたりで標識された。標識化反応は、7μLのRNAと9μL 0.2 M重炭酸ナトリウムpH 9.0および4μLのDMSO中のアミン反応性色素とを混合することによってセットアップされた。この反応は、暗所においてRTで1時間インキュベートされた。4.5μLの4Mヒドロキシルアミンが添加され、混合物は、暗所においてRTで15分間インキュベートされた。
【０２４７】
標識miRNAを単離するために、80μLのmiRNA結合バッファーが、混合物に添加された。これは、RTで5分間インキュベートされた。次いで、これは、ガラスファイバーフィルターカラムに加えられ、5000 rpmで1分間スピンされた。300μLのmiRNA洗浄バッファー（0.5 M NaCl、55％エタノール）が、マイクロフィルターに加えられ、5000 rpmで1分間スピンされた。洗浄/スピン段階は、それを再度10,000 rpmで1分間スピンする前に、繰り返された。25μLの95℃ ddH2Oが、マイクロフィルターとともに65℃で5分間インキュベートされた。次いで、それは、10,000 rpmで1分間スピンされた。
【０２４８】
実施例4：
miRNAの標識化：一段階蛍光miRNA標識化
miRNAは、4.0μL H2Oに再懸濁された。反応は、10μL 2×PAPバッファー（20％ポリエチレングリコール（MW 3,350）、20 mM MgCl2、500 mM NaCl、100 mM MES pH 6.5、2 mM DTT）；2.0μL 25 mM MnCl2；2.0μL NTPミックス（1 mM UTP、5 mM Cy3 UTP）；および2.0μL PAP（2 U/μL）（カタログ番号2030G）を含んだ。反応混合物は、37℃で2時間インキュベートされた。次いで、10μg剪断酵母RNA（カタログ番号7118）および80μL miRNA結合バッファーが添加され、混合物はRTで5分間インキュベートされた。混合物は、マイクロフィルター（シリカフィルターカラム）に加えられ、次いで、5000 rpmで1分間スピンされた。300μLのmiRNA洗浄バッファー（0.5 M NaCl、55％エタノール）が、マイクロフィルターに加えられ、5000 rpmで1分間スピンされた。洗浄/スピン段階は、それを再度10,000 rpmで1分間スピンする前に、繰り返された。25μLの95℃ ddH2Oが、マイクロフィルターとともに65℃で5分間インキュベートされた。次いで、それは、10,000 rpmで1分間スピンされた。溶離画分は、乾燥され、再懸濁された。
【０２４９】
実施例5：
miRNAの標識化：一段階miRNA放射性標識化
miRNAは、4.0μL H2Oに再懸濁された。反応は、10μL 2×PAPバッファー（20％ポリエチレングリコール（MW 3,350）、20 mM MgCl2、500 mM NaCl、100 mM MES pH 6.5、2 mM DTT）；2.0μL 25 mM MnCl2；2.0μL α-[32P]-ATPミックス；および2.0μL PAP（2 U/μL）（カタログ番号2030G）を含んだ。反応混合物は、37℃で2時間インキュベートされた。次いで、10μg剪断酵母RNA（カタログ番号7118）および80μL miRNA結合バッファーが添加され、混合物はRTで5分間インキュベートされた。混合物は、マイクロフィルター（シリカフィルターカラム）に加えられ、次いで、5000 rpmで1分間スピンされた。300μLのmiRNA洗浄バッファー（0.5 M NaCl、55％エタノール）が、マイクロフィルターに加えられ、5000 rpmで1分間スピンされた。洗浄/スピン段階は、それを再度10,000 rpmで1分間スピンする前に、繰り返された。25μLの95℃ ddH2Oが、マイクロフィルターとともに65℃で5分間インキュベートされた。次いで、それは、10,000 rpmで1分間スピンされた。溶離画分は、乾燥され、7μLに再懸濁された。
【０２５０】
実施例6：
miRNAプローブ最適化
様々なプローブの設計が、標識miRNAからの検出の最高のレベルを得るために試験された。アミン修飾、アミン修飾の位置、および外来のヌクレオチドの利点が、検査される因子であった。化学的に合成されるおよび内因性miRNAの両方とのハイブリダイゼーションに基づいて、21 ntを有するリンカーが、最高のシグナルを引き起こすことが決定されたが、しかしながら、リンカー長は、必要であれば、15 ntまで減少されてもよく、それでも同程度のシグナルを得ると結論された。5'末端よりもむしろ3'末端に位置するスライド付着のために必要なアミン基は、より良い結果を与え、miRNA前駆体に相補的なmiRNAプローブ配列の各々の側への4 bpの付加は、いくつかのmiRNAにおけるシグナルを増加した。
【０２５１】
3'および5'アミン、ならびに末端アミンとマイクロRNAプローブ配列との間の3〜21ヌクレオチドのリンカー長をもつマイクロRNAプローブが、調製された。プローブは、マイクロアレイを作り出すために、ガラススライド上にスポットされた。上に記載される手順を使用して3'末端標識されたmiRNAは、マイクロアレイにハイブリダイズされた。概して、より長いリンカー長をもつプローブは、より大きなシグナルを提供した。3'アミンを有するmiRNAプローブは、5'アミンを有する等価のプローブよりもより良く機能した（図3）。
【０２５２】
末端アミンとmiRNAプローブ配列との間のリンカーの配列は、ハイブリダイゼーションシグナルを影響することなく変化された。配列ACCの5回繰り返しが、miRNAプローブの3'末端において使用された。
【０２５３】
最終成熟miRNAにおいて予測される19〜24 ntのみを有するプローブの性能が、miRNAコード領域の両側からのフランキング領域の4ヌクレオチドを含むプローブの性能と比較された。理論は、miRNAプロセシングが、必ずしも正確ではなく、したがって、いくつかのmiRNAは、予測される成熟配列のどちらかの側からの配列を含み得ると考えれれる、というものであった。
【０２５４】
実施例7：
miRNArrayプロトコール
A. アレイ調製
miRNAプローブは、調製され、製造業者の推奨に従って、SpotBot（TeleChem）を使用してスポットされた。次いで、アレイは、以下に記載される方法を使用して処理された。
【０２５５】
5つのスライドまでが、50 mlスライド洗浄器に置かれた。40 mlのスライド洗浄バッファー（150 mM NaCl；100 mMトリス pH 7.5；0.1％ Tween 20）が添加され、バッファーおよびスライドは、倒置によって60秒間混合された。最初の洗浄バッファーは、捨てられた。別の40 mlの新鮮なスライドバッファーが添加され、それらが攪拌せずに5分間置くことを可能にされる前に、スライドとともに60秒間倒置された。バッファーが捨てられ、スライドは、脱イオン化水でリンスされた。水が捨てられ、別の40 ml の脱イオン化水が添加され、スライドとともに倒置によって60秒間激しく混合された。洗浄プロセスは、繰り返された。アレイは、一つずつ除去された。次いで、それらは、マイクロフュージまたは50 mlコニカルにおいて乾燥された。それらが、ピコフュージによって乾燥される場合、4スライドまでが含まれ、ピコフュージは10秒間スピンされた。
【０２５６】
B. ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション溶液（3×SSC）は、10分間65℃で加熱され、インキュベーションの間中、数回徹底的に混合された。35μlのあらかじめ温められたものが、標識miRNAに添加され、ボルテックスされた。混合物は、加熱温度ブロックにおいて、3分間95℃に加熱された。miRNA/ハイブリダイゼーション溶液混合物が加熱される間、35μlのハイブリダイゼーション溶液が、ハイブリダイゼーションチャンバーの上面および底面湿度貯蔵器に添加され、付加的な150μlが、チャンバーの中心スパン全体に広げられた。アレイは、チャンバーに置かれ、スライドがチャンバーの側面と接触しないことを確実にするために予防措置が取られた。カバースリップが、エッチングされた領域によって輪郭を描かれたサブアレイ上に置かれた。35μlの加熱miRNA混合物が、アレイに添加され、それは、毛管作用によって、カバースリップの別の側に移動させた。ハイブリダイゼーションチャンバーは密封され、アレイは42℃で4〜16時間インキュベートされたが、16時間より長くはない。
【０２５７】
C. 洗浄
スライドは、ハイブリダイゼーションチャンバーから除去され、カバースリップを除去するために、2×SSC/0.1 SDSに浸された。カバースリップが除去された時点で、スライドは、10回上下に動かされ、即座に2×SSCバッファーに置かれた。それらは、洗浄チャンバーにおいて、穏やかな攪拌（150〜200 rpm）により2分間洗浄された。スライドは、新鮮な2×SSCを含む新しい容器における新しいスライドホルダーに移され、上下運動を伴って1分間洗浄された。ホルダーは、新鮮なバッファーを有する新しい容器に移され、付加的に1分間洗浄された。次いで、スライドは、遠心またはピコフュージを使用して乾燥された。
【０２５８】
実施例8：
miRNArray再現性
一つの試料におけるRNAなどの生体分子の存在量を、別の試料における生体分子と比較するために使用される任意の方法に対して、プロセスが高度に再現性のあるものであることが重大である。miRNArrayシステムの再現性は、ヒト前立腺および結腸試料のmiRNAプロファイルを繰り返し比較することによって試験された。
【０２５９】
単一のヒト前立腺試料に由来する全RNAが、上に記載されるガラスファイバーフィルター法を使用して単離された。全RNAは、miRNAを回収するために、チューブ電気泳動によって分画された。miRNAは、上に記載される二段階蛍光標識化プロセスを使用して、Cy3で蛍光標識された。単一のヒト結腸試料に由来する全RNAが、上に記載されるガラスファイバーフィルター法を使用して単離された。全RNAは、6つの非依存的な試料に分割され、各々の試料は、miRNAを回収するために、チューブ電気泳動によって分画された。6つのmiRNA試料は、上に記載される二段階蛍光標識化プロセスを使用して、Cy5で蛍光標識された。
【０２６０】
Cy3標識前立腺miRNAは、6つの等しい試料に分割され、各々は、Cy5標識結腸試料の1つと混合された。6つの非依存的な標識miRNA混合物は、上に記載されるような6つの異なるガラススライド上にアレイされたmiRNAにハイブリダイズされた。ハイブリダイズされたmiRNAからのシグナルは、GenePix 4000B Scanner（Axon）を使用して定量され、腫瘍およびNAT試料シグナルが、差次的発現miRNAを同定するために比較された。各々のエレメントに対する相対シグナル強度は、前立腺試料と結腸試料との間で比較された。各々のエレメントにおけるシグナル比は、対数比として表現され、図4に示される。6つの非依存的な反応間の平均相関は98％であり、miRNArrayプロセスが、高度に再現性があることを示す。
【０２６１】
実施例9：
miRNA発現正常ヒト組織
未知の試料の組織起源を識別する分子的方法が必要とされる。例は、転移性腫瘍が見出され、その起源が未知である場合である。由来する組織を同定することは、医師が、その他の影響を受けた器官を同定し、ならびに成功のより高い可能性を伴う治療規制を作り出すことを可能にする。
【０２６２】
24個のヒト組織に由来する全RNAが、上に記載されるガラスファイバーフィルター法を使用して単離された。全RNAの各々は、各々の試料からmiRNAを回収するために、チューブ電気泳動によって分画された。各々の試料の半分は、すべての24個の試料に由来するmiRNAを含むmiRNAプールを作り出すために、単一のチューブに置かれた。プールされた試料ならびに24個の単一組織試料の各々に由来するmiRNAは、上に記載される二段階蛍光標識化プロセスを使用して、Cy3またはCy5で蛍光標識された。標識miRNAは、上に記載されるようなガラススライド上にアレイされたmiRNAプローブにハイブリダイズされた。ハイブリダイズされたmiRNAからのシグナルは、GenePix 4000B Scanner（Axon）を使用して定量され、各々の単一組織試料からのシグナルが、プールされた試料からのシグナルと比較された。単一およびプールされた試料の相対シグナル強度は、各々のmiRNAに対して比較された。以下の表に示されるのは、1つまたは数個の関連組織において、独占的にまたは主として発現されたmiRNAのリストである。これらのmiRNAの発現は、ヒト組織試料の起源を決定するために使用され得ると考えられる。同様に、年齢、性別、人種なども、miRNAプロファイリングを使用して決定され得ると考えられる。
【０２６３】
（表４）特定のヒト器官において独占的/選択的に発現されたmiRNA
0005435864.tif 000023
＊は、このmiRNAに相補的な鎖も、細胞において検出されていることを示す。
【０２６４】
実施例10：
アレイ結果の確認-正常試料
アレイ結果の最終的な試験は、RNA定量化の第二の方法とともにマイクロアレイ発現プロファイルを確認することである。リボヌクレアーゼ保護アッセイが、9つのヒト組織試料における3つの異なるmiRNAの発現を、以前の実施例において生成されたmiRNArrayデータと比較するために、使用された。
【０２６５】
副腎、結腸、腎臓、肝臓、肺、骨格筋、膵臓、前立腺、脾臓、および胸腺のヒト試料に由来する全RNAが、上に記載されるガラスファイバーフィルター法を使用して単離された。全RNAの各々は、let-7、miR-16、およびmiR-200bの発現を測定するために、以下の手順を使用して分析された。
【０２６６】
let-7、miR-16、およびmiR-200bに相補的な配列を有する放射性標識RNAが、miRNAプローブラベリングキット（Ambion）に従って産生された。各々のプローブの104 cpmが、別個のチューブにおいて、1μgの上に載せられる9つのヒト組織試料RNAの各々と混合された。5μgの酵母RNA（Ambion）およびハイブリダイゼーションバッファー（40％ホルムアミド、50 mM クエン酸Na pH 6.4、150 mM 酢酸Na pH 6.4、1 mM EDTA、2.5％PEG 8000）が、各々の試料に添加された。試料は、3分間95℃に加熱され、次いで、42℃において一晩インキュベートされた。各々の試料に、150μlのRNA分解酵素分解溶液（300 mM酢酸Na pH 7.5、10 mM HEPES pH 7.5、5 mM EDTA、20 μg/mlサケ精子DNA、150μg/ml Glyco Blue、2.5 U/ml RNA分解酵素A、および100 U/ml RNA分解酵素T1）が添加された。結果として生じる混合物は、37℃で30分間インキュベートされた。220μlのRNA分解酵素不活性化/沈殿バッファー（1 Mチオシアン酸グアニジニウム、0.167％N-ラウリルサルコシン、10 mM DTT、83％イソプロパノール）が、各々の試料に添加された。試料は、-20℃で15分間インキュベートされた。試料チューブは、12,000 RPMで15分間遠心された。ペレットは、70％エタノールで洗浄され、乾燥され、ゲルローディングバッファー（95％ホルムアミド、18 mM EDTA pH 8.0、0.025％ブロモフェノールブルー、0.025％キシレンシアノール）に溶解された。試料は、95℃に加熱され、15％変性ポリアクリルアミドゲルを使用して分画された。
【０２６７】
標的miRNAにハイブリダイズした放射性標識プローブは、ヌクレアーゼ分解から保護され、miRNA試料が分画されたゲルに曝露されたオートラジオグラフ上のバンドとして見られた。様々な試料におけるバンドの強度は、試料におけるmiRNAの存在量と相関する。図5に示されるように、リボヌクレアーゼ保護アッセイデータは、以前の実施例において記載される実験において生成された同じ9つの試料に対するmiRNArrayデータに酷似している。これは、miRNArrayシステムが、試料におけるmiRNAの存在量を推定することにおいて正確であることを確認する。
【０２６８】
実施例11：
肺腫瘍試料のmiRNA分析
実験の一つのセットにおいて、腫瘍および正常隣接組織（NAT）試料は、7人の肺癌患者から得られた。実験の第二のセットにおいて、腫瘍およびNAT試料は、16人の付加的な肺癌患者から評価された。最終データセットは、第一の表に示される第一の7つの試料＋16個の付加的な試料を含む。
【０２６９】
これらの試料に由来する全RNAは、上に記載されるガラスファイバーフィルター法を使用して単離された。全RNAは、miRNAを回収するために、チューブ電気泳動によって分画された。miRNAは、上に記載される二段階蛍光標識化プロセスを使用して、Cy3またはCy5で蛍光標識された。標識miRNAは、上に記載されるようなガラススライド上にアレイされたmiRNAプローブにハイブリダイズされた。ハイブリダイズされたmiRNAからのシグナルは、GenePix 4000B Scanner（Axon）を使用して定量され、腫瘍およびNAT試料シグナルが、差次的発現miRNAを同定するために比較された。各々のエレメントに対する相対シグナル強度は、各々の患者に由来する腫瘍試料とNAT試料との間で比較された。miRNAエレメントのいくつかに対する腫瘍：NATのシグナル比は、図6に示される。実験の第一のセットに由来する7つの肺腫瘍/NAT試料の少なくとも4つにおいて差次的に発現されたmiRNAを載せる表は、以下の表5Aに提供される。16個の付加的な肺癌試料は、アレイを使用して分析された。組み合わせられた23個の試料に由来する、正常組織に対して腫瘍において顕著にかつ再現性よく上方または下方調節されるmiRNAは、表5Bに示される。表5Bに示されるmiRNAは、所与の試料が癌性であるかどうかを決定するために使用され得ると考えられる。これらのmiRNAは、治療的開発に対する潜在的な標的を示す。同様に、これらのmiRNAによって調節される遺伝子は、治療的開発に対する効果的な標的を提供し得ると考えられる。試料のサブセットのみにおいて差次的に発現されるmiRNAは、癌試料のサブクラスの分子マーカーを示す可能性が高い。これらは、予後診断的指標として価値があるということがわかる可能性が高いと思われる。
【０２７０】
（表５Ａ）肺腫瘍/NAT試料において差次的に発現されたmiRNA
0005435864.tif 000024
＊は、このmiRNAに相補的な鎖も、細胞において検出されていることを示す。
【０２７１】
（表５Ｂ）肺腫瘍/NAT試料において差次的に発現されたmiRNA
0005435864.tif 000025
【０２７２】
実施例12：
アレイ結果の確認-肺腫瘍/NAT試料
上に記載される正常組織試料のように、RNA定量化の第二の方法は、実験の第一のセットにおいて、miRNArrayプロセスによって差次的に発現されることが観測されたmiRNAが、実際に差次的に発現されたのかどうかを確認するために使用された。肺癌患者の2人に由来する腫瘍/NAT試料が、miR-16、miR-21、miR-143、miR-145、およびlet-7の発現に対して分析された。正常試料におけるmiRNA発現プロファイルの比較において観測されたように、miRNArrayシステムからの定量的データは、第二の分析に非常に類似していた（図7）。上のように、これはmiRNArrayシステムの妥当性確認である。さらに、それは、代わりとなるRNA分析システムが、臨床環境において、定義されるmiRNAの発現を分析するために使用され得ると考えられることを示す。
【０２７３】
実施例13：
結腸腫瘍試料のmiRNA分析
腫瘍および正常隣接組織（NAT）試料は、実験の第一のセットにおいて、6人の結腸癌患者から得られた。実験の第二のセットにおいて、腫瘍およびNAT試料は、18人の付加的な結腸癌患者から評価された。これらの試料に由来する全RNAは、上に記載されるガラスファイバーフィルター法を使用して単離された。全RNAは、miRNAを回収するために、チューブ電気泳動によって分画された。miRNAは、上に記載される二段階蛍光標識化プロセスを使用して、Cy3またはCy5で蛍光標識された。標識miRNAは、上に記載されるようなガラススライド上にアレイされたmiRNAプローブにハイブリダイズされた。ハイブリダイズされたmiRNAからのシグナルは、GenePix 4000B Scanner（Axon）を使用して定量され、腫瘍およびNAT試料シグナルが、差次的発現miRNAを同定するために比較された。各々のエレメントに対する相対シグナル強度は、各々の患者に由来する腫瘍試料とNAT試料との間で比較された。miRNAエレメントのいくつかに対する腫瘍：NATのシグナル比は、図8に示される。実験の第一のセットに由来する第一の6つの結腸腫瘍/NAT試料の少なくとも4つにおいて差次的に発現されたmiRNAを載せる表は、表6Aにおいて以下に提供される。実験の第一および第二のセットの組み合わせからのデータは、表6Bに提供される。腫瘍試料において下方または上方調節されるように一貫して見えるそれらのmiRNAは、所与の試料が癌性であるかどうかを決定するために使用され得ると考えられる。同様に、これらのmiRNAは、治療的開発に対する潜在的な標的を示す。また、これらのmiRNAによって調節される遺伝子は、治療的開発に対する効果的な標的を提供し得ると考えられる。試料のサブセットのみにおいて差次的に発現されるmiRNAは、癌試料のサブクラスの分子マーカーを示す可能性が高い。これらは、予後診断的指標として価値があるということがわかる可能性が高いと思われる。
【０２７４】
（表６Ａ）結腸腫瘍/NAT試料において差次的に発現されたmiRNA
0005435864.tif 000026
＊は、このmiRNAに相補的な鎖も、細胞において検出されていることを示す。
【０２７５】
（表６Ｂ）結腸腫瘍/NAT試料において差次的に発現されたmiRNA
0005435864.tif 000027
【０２７６】
実施例14：
様々な腫瘍試料のmiRNA分析
腫瘍および正常隣接組織（NAT）試料は、3人の乳癌患者、2人の甲状腺癌患者、および1人の膀胱癌患者から得られた。これらの試料に由来する全RNAは、上に記載されるガラスファイバーフィルター法を使用して単離された。全RNAは、miRNAを回収するために、チューブ電気泳動によって分画された。miRNAは、上に記載される二段階蛍光標識化プロセスを使用して、Cy3またはCy5で蛍光標識された。標識miRNAは、上に記載されるようなガラススライド上にアレイされたmiRNAプローブにハイブリダイズされた。ハイブリダイズされたmiRNAからのシグナルは、GenePix 4000B Scanner（Axon）を使用して定量され、腫瘍およびNAT試料シグナルが、差次的発現miRNAを同定するために比較された。各々のエレメントに対する相対シグナル強度は、各々の患者に由来する腫瘍試料とNAT試料との間で比較された。
【０２７７】
興味深いことに、肺および結腸腫瘍試料において差次的に発現されたmiRNAの多くが、乳房、甲状腺、および膀胱試料において同様に差次的に発現された。差次的発現miRNAのサブセットを示すヒートマップ（heat map）が、図9に示される。緑四角は、腫瘍において正常隣接組織よりも少なくとも50％低く発現されるmiRNAを示し、赤は、腫瘍において正常隣接組織よりも少なくとも50％高く発現されるmiRNAを示すことに留意されたい。癌型の各々に由来する試料において差次的に発現されたmiRNAを載せる表は、以下に提供される。これらのmiRNAは、公知のタンパク質発現癌遺伝子の機能的な等価物であるように見え、細胞増殖および細胞死ならびに血管形成を調節することに関与する可能性が高い。これらのmiRNAは、治療的開発に対する潜在的な標的を表す。同様に、これらのmiRNAによって調節される遺伝子は、治療的開発に対する効果的な標的を提供し得ると考えられる。
【０２７８】
（表７）異なる腫瘍/NAT試料において差次的に発現されたmiRNA
0005435864.tif 000028
＊は、このmiRNAに相補的な鎖も、細胞において検出されていることを示す。
【０２７９】
実施例15：
試料変動
多くの分子診断的方法の想定は、腫瘍試料が、癌性組織全体で比較的同じであるということである。この想定の妥当性は、1人の患者に由来する単一の甲状腺腫瘍の2つの単離体のmiRNAプロファイルを測定することによって試験された。
【０２８０】
2つの甲状腺腫瘍および正常隣接試料に由来する全RNAは、上に記載されるガラスファイバーフィルター法を使用して単離された。全RNAは、miRNAを回収するために、チューブ電気泳動によって分画された。miRNAは、上に記載される二段階蛍光標識化プロセスを使用して、Cy3またはCy5で蛍光標識された。標識miRNAは、上に記載されるようなガラススライド上にアレイされたmiRNAプローブにハイブリダイズされた。ハイブリダイズされたmiRNAからのシグナルは、GenePix 4000B Scanner（Axon）を使用して定量され、腫瘍およびNAT試料シグナルが、差次的発現miRNAを同定するために比較された。各々のエレメントに対する相対シグナル強度は、同じ腫瘍の単離体の間で比較された。各々のエレメントにおけるシグナル比は、対数比として表現され、図10に示される。2つの単離体の間の平均相関は92％であり、同じ試料の異なる領域の間では、わずかなバリエーションしかないことを示す。
【０２８１】
実施例16：
固定組織試料からのmiRNAプロファイル
ホルムアルデヒドおよびパラホルムアルデヒド固定組織は、臨床的に興味深い試料の莫大な資料を示す。臨床環境において、ほとんどの腫瘍およびその他の疾患組織は、固定され、分析され、無期限に保存される。これらの歴史的試料を分析することは、固定試料の分子的特徴を試料が由来する患者に対する臨床帰結に合致させる機会を、科学者に与える。研究者は、固定組織に対してRNA分析を行うことの利点を長く認識してきたが、試料から高質のRNAを単離することが本質的に不可能であるので、固定組織は使用されていない。これは、固定剤が、RNA分子に化学的部分を取り入れ、それらを本質的にすべての定量的RNA技術と互換性がないようにするという事実による。
【０２８２】
miRNAが固定組織から抽出され分析され得るかどうかが試験された。マウス腎臓および脳試料が、3週間4％パラホルムアルデヒドにおいて固定された、または凍結され3週間-80℃で保存された。3週間のインキュベーションの後、固定試料は、製造業者の推奨に従って、Optimum(商標)キット（Ambion）を使用して処理された。全RNAが、上に記載されるガラスファイバーフィルター法を使用して、固定および凍結試料の両方から単離された。全RNAの各々は、各々の試料からmiRNAを回収するために、チューブ電気泳動によって分画された。各々の試料に由来するmiRNAは、上に記載される二段階蛍光標識化プロセスを使用して、Cy3またはCy5で蛍光標識された。標識miRNAは、上に記載されるようなガラススライド上にアレイされたmiRNAプローブにハイブリダイズされた。ハイブリダイズされたmiRNAからのシグナルは、GenePix 4000B Scanner（Axon）を使用して定量され、各々の固定試料からのシグナルが、その対応する凍結試料からのシグナルと比較された。固定および凍結試料の相対シグナル強度は、各々のmiRNAに対して比較された。固定試料と凍結試料との間の相関は99％に達し、miRNAが固定組織を分析するために使用され得ることを示す。試料比較の一つに対する代表的なアレイプロファイルが、図11において提供される。
【０２８３】
実施例17：
分解RNAを有する試料からのmiRNAプロファイリング
異なる試料の遺伝子発現プロファイルを比較している研究者によって直面される別の問題は、RNAが脆弱であるということである。組織におけるヌクレアーゼならびに手違いによって取り入れられるものは、試料におけるmRNAおよびその他の興味深いRNA分子を分解する可能性がある。RNA分析のほとんどの方法は、RNA分解によって影響を受け、分析における一つまたは複数のRNA試料が、少なくとも部分的に分解される場合、信頼できるデータを得ることを本質的に不可能にする。固定試料におけるmiRNAを用いた驚くべき結果を鑑みて、miRNA発現プロファイルに対する組織におけるRNA分解の影響を試験することが決められた。
【０２８４】
RNA試料のシリーズは、マウスの結腸を採り、試料を2つの等しい部分に分けることによって、分解の可変レベルを伴って作り出された。部分の1つに由来するRNAは、上に記載されるガラスファイバーフィルター法を使用して単離された。このRNAは、非分解対照を示した。第二の部分は、5つの等しい試料に細分された。5つの試料は、リン酸緩衝生理食塩水に置かれ、室温で0〜120分間インキュベートされた。RNAは、上に記載されるガラスファイバーフィルター法を使用して、0、5、10、20、および120分における5つの試料の1つから単離された。全RNA試料の各々は、製造業者の推奨プロトコールに従って、Bio-Analyzer（Agilent）を使用して分析された。様々な試料のプロファイルは、図11に示される。非分解（凍結として示される）試料が、試料における18S rRNAおよび28S rRNAに相当する2つの相異なるバンドを有することに留意されたい。18S rRNAおよび28S rRNAバンドは、結腸試料におけるヌクレアーゼが、室温インキュベーションの間に組織におけるRNAを分解することを可能にされるので、消滅する。
【０２８５】
全RNAの各々は、各々の試料に由来するmiRNAを回収するために、チューブ電気泳動によって分画された。各々の試料に由来するmiRNAは、上に記載される二段階蛍光標識化プロセスを使用して、Cy3またはCy5で蛍光標識された。標識miRNAは、上に記載されるようなガラススライド上にアレイされたmiRNAプローブにハイブリダイズされた。ハイブリダイズされたmiRNAからのシグナルは、GenePix 4000B Scanner（Axon）を使用して定量され、各々の分解試料からのシグナルが、非分解試料からのシグナルと比較された。分解および非分解試料の相対シグナル強度は、各々のmiRNAに対して比較された（図12）。分解試料と非分解試料との間の相関は95％に達し、miRNAが分解RNA試料を分析するために使用され得ることを示す。試料を比較するためにmiRNAプロファイリングを使用することに対する利点は、それが、試料取扱に必要とされるストリンジェンシー（これは、臨床および現場環境に対して本質的に重要である）を軽減し、かつそれが、下手に調製された多くの歴史的試料が、比較分析に対して使用されることを可能にするということである。
【０２８６】
実施例18：
血液試料のmiRNA分析
多くの診断的アッセイは、血液が、簡単に利用でき、かつ患者の健康をしばしば表すので、血液試料をアッセイするために設計される。miRNAが血液試料において分析され得ることを確認するために、10人の異なる個人に由来する試料が得られた。試料の各々に由来する全RNAは、再利用可能シリンジデバイスにおけるLK4白血球除去フィルター（Pall）に付着された10 mlシリンジに、全血液を流し込むことによって単離された。血液は、試料あたり〜75秒の期間にわたって、LK4フィルターを通り抜けた。次いで、フィルターデバイスは、3 mlのAmbionのRNAlater(登録商標)を含む3 mlシリンジに移され、滴下形式で、捕獲WBCを含むフィルターを通り抜けた。次いで、プランジャが引っ込められ、RNAlater(登録商標)の残留液滴が排出されたが、フィルターは湿ったまま放置された。次いで、処置されたWBCを有するフィルターは、デバイスから除去され、15 mlコニカルに移された。フィルターは、RNA抽出が始まる前に、およそ1時間室温で保存された。
【０２８７】
RiboRure(商標)血液キット（Ambion）からの2.5 ml溶解溶液および0.25 mlの2 M NaOAcが、捕獲処置細胞を有するLK4フィルターを含む各々の15 mlコニカルに添加され、これらは30秒間激しく振盪され、次いで、氷上で5分間保存された。2.5 ml酸性フェノール/ChCl3が、各々のチューブに添加され、内容物は、30秒間激しい振盪によって混合された。プレップは、回転バケット卓上遠心機において3,200rpmで10分間遠心され、次いで、水相が、第二の15 mlコニカルに除去された。1.25容積の100％エタノールが、各々のプレップに添加され（エタノールを添加することに先行して、プレップの容積を決定するために15 mlチューブ上のキャリブレーションマークを使用して）、内容物が、ボルテックスによって混合された。プレップは、真空吸引、真空マニホールドを使用して、RiboPure(商標)血液キット（Ambion）におけるシリカフィルターで濾過された。シリカフィルターは、2 mlマイクロフュージチューブに移され、0.75 mlの洗浄1（1.6 M GuSCN/70％エタノール）を添加し、かつ溶液がフィルターを通り抜けるように手短に遠心することによって洗浄された。シリカフィルターは、上のようにRiboPure血液キット（Ambion）からの0.75 mlの洗浄2/3で2回洗浄され、次いで、残留液を除去するために、13.2 K rpmで1分間遠心された。RNAは、シリカフィルターを新鮮な2 ml収集チューブへ移し、200μlの78℃に加熱されたヌクレアーゼフリー水を各々のシリカフィルターに添加し、室温で1分間保存し、次いで、13.2 K rpmで1分間遠心することによって溶離された。各々の試料に由来するmiRNAは、上に記載されるような標準的ゲル精製を使用して単離された。各々の試料に由来するmiRNAは、上に記載される二段階蛍光標識化プロセスを使用して、Cy3またはCy5で蛍光標識された。標識miRNAは、上に記載されるようなガラススライド上にアレイされたmiRNAプローブにハイブリダイズされた。ハイブリダイズされたmiRNAからのシグナルは、GenePix 4000B Scanner（Axon）を使用して定量された。様々なmiRNAのシグナル強度が、プロットされた。図13は、ドナーの3人に対するmiRNAプロファイルを提供する。miRNAの多くに対するシグナルは、本発明者らが組織試料に対して観測するものと同等であり、miRNAが、血液試料に実際に存在し、診断的アッセイに対して使用され得ることを示す。興味深いことに、miRNAプロファイルは、10人の異なるドナーに対して非常に類似しており、血液においてmiRNAに対する全体的規準があることを示唆する。これは、より小さなmiRNA混乱（perturbation）が、正常な個人の比較的不可変な背景に対して見られることを考えると、病気の個人を同定することをより容易にし得ると考えられる。
【０２８８】
実施例19：
発癌性miRNA-差次的発現および癌調節
以前の実施例において示されるように、同じ癌患者に由来する腫瘍試料と正常隣接組織試料との間で差次的に発現される多くのmiRNAが同定されている。興味深いことに、異なる癌の間で差次的に発現されるmiRNAにおいて、顕著な重複があり、変更された場合に癌をもたらす細胞プロセスに影響するmiRNAのコアセットがあることを示唆する。以下は、miRNA調節ミスと癌との間のリンクを開発することを目的とした実験を記載する。
【０２８９】
肺癌におけるmiRNA発現
肺癌患者に由来する22個の腫瘍および正常隣接組織（NAT）試料が、上に記載されるmiRNAアレイシステムを使用して分析された。アレイは、分析され、各々のmiRNAの相対発現が、各々の患者に由来する腫瘍と正常隣接組織との間で比較された。様々なmiRNAが、異なる患者にわたって腫瘍におけるそれらの相対発現に基づいてクラスターされた（図14）。6つのmiRNA（miR-126、30a、143、145、188、および331）は、患者の70%より多くの腫瘍において、顕著により低いレベルで発現された。3つのmiRNA（miR-21および200b）は、患者の70%より多くの腫瘍において、顕著により高いレベルで発現された。多くのこれらのmiRNAの差次的発現は、ノーザン分析によって検証された（図15）。
【０２９０】
結腸癌におけるmiRNA発現
結腸癌患者に由来する25個の腫瘍およびNAT試料が、本発明者らのmiRNAアレイプロセスを使用して分析された。肺癌比較と同様に、様々なmiRNAが、異なる結腸癌患者にわたって腫瘍におけるそれらの相対発現に基づいてクラスター化された（図14）。5つのmiRNA（miR-143、145、195、130a、およびmiR-331）は、患者の70%より多くの腫瘍において、顕著により低いレベルで発現された。5つのmiRNA（miR-223、31、21、17、および106）は、患者の70%より多くの腫瘍において、顕著により高いレベルで発現された。
【０２９１】
癌マーカーとしてのmiRNA
8つの異なるmiRNAが、本発明者らが分析した肺および結腸患者試料のほとんどに対して、腫瘍試料と正常隣接試料との間で差次的に発現されたことは興味深い（図16）。これらの同じmiRNAは、本発明者らが分析した乳、胸腺、膀胱、膵臓、および前立腺癌患者において差次的に発現されることも見出され、これらのmiRNAは、変更された場合に癌をもたらす細胞プロセスを制御し得ることが示唆される。
【０２９２】
癌遺伝子発現の調節因子としてのmiRNA
特定のmiRNAが、癌遺伝子の調節ミスを介して癌に関与している可能性があるかどうかに取り組むために、本発明者らは、本発明者らのマイクロアレイ分析において同定されたmiRNAへの顕著な相同性を有する配列に対して、150の周知の癌遺伝子の3'非翻訳領域（UTR）をスキャンした。潜在的標的部位は、2つの基準に基づいて選択された：
（1）miRNAの位置2〜9と癌遺伝子との間の完全相補性。このmiRNAコア配列は、miRNAの活性に重大であるとして同定されており、公知のmiRNA標的部位は、この部位において本質的に100％相補性を有する（Doench et al. 2004）。
（2）miRNA/mRNA相互作用の全体のTm。コア配列に加えて、miRNAとmRNAとの間の全体の結合安定性が、miRNA活性の重要な指標であることが示されている（Doench et al., 2004）。
【０２９３】
表8において見られるように、公知の癌遺伝子の3’UTRにおける潜在的標的部位は、腫瘍試料において日常的に差次的に発現されると観測されたmiRNAの全てに対して同定された。興味深いことに、KRAS2、MYCL1、およびCBLは、miRNA調節における重要な因子として関与している協調miRNA結合を提供し得ると考えられる多数の予測miRNA結合部位を有する（Doench et al. 2003; Zeng et al., 2003）。表8に挙げた遺伝子の多くは、それらが過剰発現している場合に発癌性になり、したがって、miRNAの軽減された発現が、一つまたは複数の癌遺伝子の上方調節をもたらすことがあり、その後の発癌をもたらし得ると考えられることが想像できる。
【０２９４】
（表８）癌関連miRNAおよびそれらの推定癌遺伝子標的
0005435864.tif 000029
【０２９５】
実施例20：
癌遺伝子発現に対するmiRNAの効果の測定
miRNA標的部位予測を確認することは、様々な方式でなされ得る。ショウジョウバエおよびC.エレガンスにおいて、遺伝的アプローチが適用されており、miRNAおよび推定miRNA標的部位における突然変異が作られ、類似の表現型を引き起こすことが示されている（Ha et al., 1996; Vella et al., 2004）。哺乳類細胞において、遺伝的アプローチははるかに難しいが、レポーター構築は、推定標的遺伝子の3'UTRが、推定miRNA結合部位における突然変異を含むレポーターベクター制御に対して不均衡なレベルで細胞において調節されることを示すために使用されている（Lewis et al. 2003）。加えて、ベクターおよびオリゴヌクレオチドは、推定標的遺伝子の内因性レベルに対する効果を決定するために、細胞におけるmiRNAを取り入れるまたは阻害するために使用されている（Lewis et al., 2003; Kiriakidou et al. 2004）。後者のアプローチは、miRNA標的部位予測を認証するために行われている。
【０２９６】
細胞にmiRNAを取り入れるため、または細胞におけるmiRNAの活性を阻害するために、それぞれ、哺乳類細胞にトランスフェクトされ得る合成miRNAおよびmiRNA阻害剤が、開発されている。両方とも参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第60/627,171号および第60/649,634号を参照されたい。let-7に対応する合成miRNAおよびmiRNA阻害剤が、標的部位予測が正しいかどうかを決定するために使用された。これらの実験において、検出不可能なレベルのmiRNAを発現する培養細胞は、siPORT(商標)NeoFX(商標)トランスフェクション薬剤（Ambion）を使用して、合成miRNAをトランスフェクトされた。免疫蛍光アッセイは、トランスフェクト細胞におけるRASおよびC-MYCに対して使用された。両方の癌遺伝子に由来するタンパク質は、陰性対照miRNA（Ambion）をトランスフェクトされた細胞よりも、合成miRNAをトランスフェクトされた細胞において、だいたい3倍低いレベルで発現された。相互実験において、高いレベルのmiRNAを自然に発現する細胞が、let-7 miRNA阻害剤をトランスフェクトされた。予期されたように、両方の癌遺伝子に由来するタンパク質は、陰性対照阻害剤（Ambion）をトランスフェクトされた細胞においてよりも、miRNA阻害剤をトランスフェクトされた細胞においてより高かった。これらの結果は、miRNAが、2つの癌遺伝子の発現を調節するというモデルと一致する。これらのデータは、主要なmiRNAの調節ミスが、一つまたは複数の癌遺伝子の発現を調節することに失敗することによって、癌進行に関与し得ることを示唆する。
【０２９７】
実施例21：
狼瘡におけるmiRNA
全身性紅斑性狼瘡（SLE；狼瘡）は、最終的には免疫複合体媒介標的器官不全をもたらす慢性炎症性自己免疫疾患である。それは、CD4+ Tヘルパー細胞の過剰な活性化およびCD8+ T細胞毒性活性の抑制によって特徴付けられ、天然抗体および病原性自己抗体の過剰産生をもたらす。最近、いくつかのヒストン修飾が、狼瘡患者から単離された末梢血単核細胞（PBMC）において報告された。狼瘡の診断は、主に、症状がとても広く変化し、それらが頻繁に出たり止んだりするので、かつ疾患が、とても多くのその他の障害を模倣するので、今もなお頻繁に間違いである。さらに、診断は、使用される特定の治療を示さない。治療法がないので、狼瘡の今日の処置は、今もなお、主として症状緩和に合わせられ、診断には合わせられない。高特異性および感度をもつ診断的アッセイは、非常に重要であると考えられる。
【０２９８】
試料は、16人の個人、臨床的に検証された狼瘡を有する8人ならびに狼瘡患者と年齢および性差を合致させた8人の非狼瘡患者から分析された。これらの試料に由来する全RNAは、上に記載されるガラスファイバーフィルター法を使用して単離された。全RNAは、miRNAを回収するために、チューブ電気泳動によって分画された。miRNAは、上に記載される二段階蛍光標識化プロセスを使用して、Cy3またはCy5で蛍光標識された。標識miRNAは、上に記載されるようなガラススライド上にアレイされたmiRNAプローブにハイブリダイズされた。ハイブリダイズされたmiRNAからのシグナルは、GenePix 4000B Scanner（Axon）を使用して定量され、狼瘡および正常試料シグナルが、差次的に発現されるmiRNAを同定するために比較された。各々のアレイ実験は、再現アレイを含んだ。
【０２９９】
14個のmiRNAは、合致試料に対して狼瘡試料のすべてにおいて差次的に発現された。miR-301、miR-199、miR-95、miR-105、mu-miR-290、miR-215、miR-188、miR-186、miR-211、miR-331、およびmiR-137は、対応する正常試料よりも狼瘡試料において50％低くまたはそれより低く発現された。miR-21、miR-223、およびmiR-342は、対応する正常試料よりも狼瘡試料において50％高くまたはそれより高く発現された。miRNAのいくつかは、狼瘡試料と正常試料との間で10倍も差次的に発現された。これらのmiRNAは、治療的開発の診断的アッセイに対する標的を示す。
【０３００】
これらの試料のさらなる分析において、23個のmiRNAは、合致試料に対して狼瘡試料の少なくとも50％において差次的に発現された（1.5倍またはより高い）。これらのmiRNAの中でも、miR-95、miR-144、miR-184、およびmiR-186が、すべての狼瘡試料において差次的に発現された。let7D-AS、miR-21、miR-32、miR-133A、miR-137、miR-141、miR-181A、miR-188、miR-199、miR-201、miR-203、miR-204、miR-211、miR-212、miR-223、miR-224、mu-miR-329、miR-331、およびmiR-344とともに、これらのmiRNAは、診断的アッセイまたは治療的開発に対する標的を示す。
【０３０１】
実施例22：
miRNAおよびプリオン病
主におよびおそらく単独で単一のタンパク質からなるプリオンと呼ばれる新しい感染性粒子は、認知および運動機能の致命的な低下を産生する感染性海綿状脳症の群の、可能性が高い原因物質である。証拠は、関与するタンパク質が、偏在性の組織分布を有する正常型からの誤った折り畳みによって病原性状態に達することを示す。
【０３０２】
2つの細胞に基づくプリオンモデルシステムを使用して、プロセスに関連し得ると考えられるmiRNAの同定が追跡された。1つのモデルシステムは、2つの細胞株を含み、そのうちの1つはプリオン形成の影響を受けやすく、もう1つはそうではない。第二のモデルシステムは、プリオンに感染している前および後の細胞に関与する。プリオン感受性細胞、プリオン非感受性細胞、およびプリオン感染細胞に由来する全RNAが、上に記載されるガラスファイバーフィルター法を使用して単離された。全RNAは、miRNAを回収するために、チューブ電気泳動によって分画された。miRNAは、上に記載される二段階蛍光標識化プロセスを使用して、Cy3またはCy5で蛍光標識された。標識miRNAは、上に記載されるようなガラススライド上にアレイされたmiRNAプローブにハイブリダイズされた。ハイブリダイズされたmiRNAからのシグナルは、GenePix 4000B Scanner（Axon）を使用して定量され、試料の各々からのシグナルが、差次的に発現されるmiRNAを同定するために比較された。
【０３０３】
図17において見られるように、10個のmiRNAは、プリオン耐性、非感染細胞に対して、プリオン感受性およびプリオン感染細胞の両方において、顕著に上方または下方調節された。両方のモデルシステムに対する多数の生物学的反復におけるアレイが、これらの結果を確認した。それらの発現プロファイルに基づいて、miR-95、135A、7、9-as、27A、130A、16、26A、および24は、プリオン感染に直接的または間接的に関与する可能性が高く、プリオン病に対する診断または治療標的を示し得ると考えられる。
【０３０４】
付加的な分析は、約40個のmiRNAが、感染に対して感受性のある細胞と耐性がある細胞との間で差次的に発現されることが見出され、約20個のmiRNAが、プリオンによる感染の間に差次的に発現されることが見出されることを明らかにした。10個のmiRNAは、両方のモデルシステムにおいて、顕著に上方または下方調節された。miR-7、miR-9-as、miR-16、miR-24、miR-26A、miR-27A、miR-130A、およびmiR-239は、感染の間に誘導され、感染に対して感受性のある細胞においてより高いレベルで発現される。これらのmiRNAは、プリオン感染のメカニズムに関与し得ると考えられる。miR-95およびmiR-135Aは、感染の間に抑制され、感染に対して感受性のない細胞においてより高いレベルで発現され、それ故に、プリオン感染への耐性のある型を与え得ると考えられる。両方のモデルシステムに対する多数の生物学的反復におけるアレイが、これらの結果を確認した。それらの発現プロファイルに基づいて、miR-95、135A、7、9-as、27A、239、130A、16、26A、および24は、プリオン感染に直接的または間接的に関与する可能性が高く、プリオン病に対する診断または治療標的を示し得ると考えられる。
【０３０５】
実施例23：
脳卒中関連miRNA
脳卒中は、ヒトにおける死および永久的障害の主要な原因である。それらは、脳の領域への血流が閉塞される場合に生じ、脳組織の死を引き起こし得る。脳卒中の2つの主な型がある：虚血性および出血性。虚血性脳卒中は、血液を脳へ供給する動脈における閉塞によって引き起こされ、血流の欠乏（虚血）を引き起こす。出血性脳卒中は、脳において破裂された血管（出血）の出血によって引き起こされる。脳卒中に関与するmiRNAを理解することは、検出および/または処置を強化し得ると考えられる。
【０３０６】
マウスが、脳への酸素流を軽減することによって「プレコンディション」される脳卒中モデルシステムが使用された（Kitagawa, 1991）。6匹のマウスの等価セットが使用された;3匹はプレコンディションされ、3匹は未処置であった。プレコンディショニングの24時間後、マウスは屠殺された。これらの試料に由来する全RNAは、上に記載されるガラスファイバーフィルター法を使用して単離された。全RNAは、miRNAを回収するために、チューブ電気泳動によって分画された。miRNAは、上に記載される二段階蛍光標識化プロセスを使用して、Cy3またはCy5で蛍光標識された。標識miRNAは、上に記載されるようなガラススライド上にアレイされたmiRNAプローブにハイブリダイズされた。ハイブリダイズされたmiRNAからのシグナルは、GenePix 4000B Scanner（Axon）を使用して定量され、プレコンディションおよび正常試料シグナルが、差次的発現miRNAを同定するために比較された。
【０３０７】
プレコンディション動物（P1、P2、およびP4と標識される）のmiRNAプロファイルの分析は、3匹の未処置動物に対してすべての3匹のプレコンディション動物において顕著に異なるレベルで発現される10個のmiRNAを明らかにした（図18）。これらのmiRNAは、虚血プレコンディショニングに起因し、脳卒中診断、予防、または処置に対する潜在的標的を示す。
【０３０８】
実施例24：
乳腫瘍試料のmiRNA分析
腫瘍および正常隣接組織（NAT）試料は、6人の乳癌患者から得られた。これらの試料に由来する全RNAは、上に記載されるガラスファイバーフィルター法を使用して単離された。全RNAは、miRNAを回収するために、チューブ電気泳動によって分画された。miRNAは、上に記載される二段階蛍光標識化プロセスを使用して、Cy3またはCy5で蛍光標識された。標識miRNAは、上に記載されるようなガラススライド上にアレイされたmiRNAプローブにハイブリダイズされた。ハイブリダイズされたmiRNAからのシグナルは、GenePix 4000B Scanner（Axon）を使用して定量され、腫瘍およびNAT試料シグナルが、差次的発現miRNAを同定するために比較された。各々のエレメントに対する相対シグナル強度は、各々の患者に由来する腫瘍試料とNAT試料との間で比較された。乳腫瘍/NAT試料の少なくとも80％において差次的に発現されたmiRNAを載せる表は、表9において提供される。腫瘍試料において下方または上方調節されるように一貫して見えるそれらのmiRNAは、所与の試料が癌性かどうかを決定するために使用され得ると考えられる。同様に、これらのmiRNAは、治療的開発に対する潜在的標的を示す。また、これらのmiRNAによって調節される遺伝子は、治療的開発に対する効果的な標的を提供し得ると考えられる。試料のサブセットのみにおいて差次的に発現されるmiRNAは、癌試料のサブクラスの分子マーカーを示す可能性が高い。これらは、予後診断的指標として価値があるということがわかる可能性が高いと思われる。
【０３０９】
（表９）乳腫瘍/NAT試料において差次的に発現されたmiRNA
0005435864.tif 000030
【０３１０】
実施例25：
甲状腺腫瘍試料のmiRNA分析
腫瘍および正常隣接組織（NAT）試料は、6人の甲状腺癌患者から得られた。これらの試料に由来する全RNAは、上に記載されるガラスファイバーフィルター法を使用して単離された。全RNAは、miRNAを回収するために、チューブ電気泳動によって分画された。miRNAは、上に記載される二段階蛍光標識化プロセスを使用して、Cy3またはCy5で蛍光標識された。標識miRNAは、上に記載されるようなガラススライド上にアレイされたmiRNAプローブにハイブリダイズされた。ハイブリダイズされたmiRNAからのシグナルは、GenePix 4000B Scanner（Axon）を使用して定量され、腫瘍およびNAT試料シグナルが、差次的発現miRNAを同定するために比較された。各々のエレメントに対する相対シグナル強度は、各々の患者に由来する腫瘍試料とNAT試料との間で比較された。甲状腺腫瘍/NAT試料の少なくとも80％において差次的に発現されたmiRNAを載せる表は、表10において提供される。腫瘍試料において下方または上方調節されるように一貫して見えるそれらのmiRNAは、所与の試料が癌性かどうかを決定するために使用され得ると考えられる。同様に、これらのmiRNAは、治療的開発に対する潜在的標的を示す。また、これらのmiRNAによって調節される遺伝子は、治療的開発に対する効果的な標的を提供し得ると考えられる。試料のサブセットのみにおいて差次的に発現されるmiRNAは、癌試料のサブクラスの分子マーカーを示す可能性が高い。これらは、予後診断的指標として価値があるということがわかる可能性が高いと思われる。
【０３１１】
（表１０）甲状腺腫瘍/NAT試料において差次的に発現されたmiRNA
0005435864.tif 000031
【０３１２】
実施例26：
前立腺腫瘍試料のmiRNA分析
腫瘍および正常隣接組織（NAT）試料は、前立腺癌患者から得られた。これらの試料に由来する全RNAは、上に記載されるガラスファイバーフィルター法を使用して単離された。全RNAは、miRNAを回収するために、チューブ電気泳動によって分画された。miRNAは、上に記載される二段階蛍光標識化プロセスを使用して、Cy3またはCy5で蛍光標識された。標識miRNAは、上に記載されるようなガラススライド上にアレイされたmiRNAプローブにハイブリダイズされた。ハイブリダイズされたmiRNAからのシグナルは、GenePix 4000B Scanner（Axon）を使用して定量され、腫瘍およびNAT試料シグナルが、差次的発現miRNAを同定するために比較された。各々のエレメントに対する相対シグナル強度は、各々の患者に由来する腫瘍試料とNAT試料との間で比較された。前立腺腫瘍/NAT試料において差次的に発現されたmiRNAを載せる表は、表11において提供される。腫瘍試料において下方または上方調節されるように一貫して見えるそれらのmiRNAは、所与の試料が癌性かどうかを決定するために使用され得ると考えられる。同様に、これらのmiRNAは、治療的開発に対する潜在的標的を示す。また、これらのmiRNAによって調節される遺伝子は、治療的開発に対する効果的な標的を提供し得ると考えられる。試料のサブセットのみにおいて差次的に発現されるmiRNAは、癌試料のサブクラスの分子マーカーを示す可能性が高い。これらは、予後診断的指標として価値があるということがわかる可能性が高いと思われる。
【０３１３】
（表１１）前立腺腫瘍/NAT試料において差次的に発現されたmiRNA
0005435864.tif 000032
【０３１４】
実施例27：
膀胱腫瘍試料のmiRNA分析
腫瘍および正常隣接組織（NAT）試料は、膀胱癌患者から得られた。これらの試料に由来する全RNAは、上に記載されるガラスファイバーフィルター法を使用して単離された。全RNAは、miRNAを回収するために、チューブ電気泳動によって分画された。miRNAは、上に記載される二段階蛍光標識化プロセスを使用して、Cy3またはCy5で蛍光標識された。標識miRNAは、上に記載されるようなガラススライド上にアレイされたmiRNAプローブにハイブリダイズされた。ハイブリダイズされたmiRNAからのシグナルは、GenePix 4000B Scanner（Axon）を使用して定量され、腫瘍およびNAT試料シグナルが、差次的発現miRNAを同定するために比較された。各々のエレメントに対する相対シグナル強度は、各々の患者に由来する腫瘍試料とNAT試料との間で比較された。膀胱腫瘍/NAT試料において差次的に発現されたmiRNAを載せる表は、表12において提供される。腫瘍試料において下方または上方調節されるように一貫して見えるそれらのmiRNAは、所与の試料が癌性かどうかを決定するために使用され得ると考えられる。同様に、これらのmiRNAは、治療的開発に対する潜在的標的を示す。また、これらのmiRNAによって調節される遺伝子は、治療的開発に対する効果的な標的を提供し得ると考えられる。試料のサブセットのみにおいて差次的に発現されるmiRNAは、癌試料のサブクラスの分子マーカーを示す可能性が高い。これらは、予後診断的指標として価値があるということがわかる可能性が高いと思われる。
【０３１５】
（表１２）膀胱腫瘍/NAT試料において差次的に発現されたmiRNA
0005435864.tif 000033
【０３１６】
実施例28：
クローン病におけるmiRNA
クローン病は、限局性回腸炎とも呼ばれる；それは、腸の慢性、進行性、炎症性疾患である。症状は、最も一般的には、下痢および痛みの症状である。体重減少、疲労、および過敏性は、疾患の特徴である。排便は、感染のために、粘液、血液、および膿をしばしば含む。脂肪が、排便において生じることがあり、それらはかさばりかつ悪臭があるようになる。クローン病の根本的原因は、未知であり、疾患を有する患者のための市販されている治療的選択肢がある。クローン病の分子的原因を同定することは、強化された診断ならびに治療をもたらし得ると考えられる。
【０３１７】
腸組織は、クローン病患者および正常な個人から回収された。これらの試料に由来する全RNAは、上に記載されるガラスファイバーフィルター法を使用して単離された。全RNAは、miRNAを回収するために、チューブ電気泳動によって分画された。miRNAは、上に記載される二段階蛍光標識化プロセスを使用して、Cy3またはCy5で蛍光標識された。標識miRNAは、上に記載されるようなガラススライド上にアレイされたmiRNAプローブにハイブリダイズされた。ハイブリダイズされたmiRNAからのシグナルは、GenePix 4000B Scanner（Axon）を使用して定量され、クローン病および正常試料シグナルが、差次的発現miRNAを同定するために比較された。各々のアレイ実験は、再現アレイを含んだ。
【０３１８】
7つのmiRNAが、正常対照に対してクローン病患者試料のすべてにおいて差次的に発現された。miR-126as、miR-194、miR-192、およびmu-miR-207は、クローン病患者腸試料において2倍よりも大きく低いレベルで発現され、miR-150、miR-125B、およびmiR-223は、クローン病患者において2倍よりも大きく高いレベルで発現された。これらのmiRNAは、クローン病のための診断的アッセイまたは治療的開発に対する標的を示す。
【０３１９】
実施例29：
miRNAおよび子宮頸癌
子宮頸管の癌は、世界的に女性の間で癌関連死の第2番目の原因である。疫学的および分子的調査は、ヒトパピローマウィルス（HPV）が、子宮頸癌の大部分（〜99％）の病原物質であることを実証した。100より多い異なるHPV型が、今までのところ特徴付けられており、新しい型が、このリストに定期的に付加される。同定されたHPVの間で、約3分の1（the third）（46）が、生殖管に感染する。これらのHPV型は、性的に感染し、それらが引き起こす損傷の悪性進行に対する傾向に従って、低リスクまたは高リスクにさらに分類され得る。高リスク粘膜HPV型は、浸潤癌へと進行し得る上皮内損傷を引き起こす。日常的な細胞学スクリーニングおよび再帰HPV試験が、子宮頸癌検出を改善し、死亡率を軽減したが、費用のかかる侵襲的な試験および患者における感情的ストレスをもたらす、現在の試験の低予測値を含む、顕著な問題および障壁が残っている。
【０３２０】
高リスクHPV型を持つ患者における宿主ヒトmiRNA形跡（signature）を同定するために、HPV陰性または高リスクHPV陽性の液体ベースの頸管パップスメアに由来する全RNAが、上に記載されるガラスファイバーフィルター法を使用して単離された。全RNAは、miRNAを回収するために、チューブ電気泳動によって分画された。miRNAは、上に記載される二段階蛍光標識化プロセスを使用して、Cy3またはCy5で蛍光標識された。標識miRNAは、上に記載されるようなガラススライド上にアレイされたmiRNAプローブにハイブリダイズされた。ハイブリダイズされたmiRNAからのシグナルは、GenePix 4000B Scanner（Axon）を使用して定量され、試料の各々からのシグナルが、差次的発現miRNAを同定するために比較された。4つのmiRNAが、HPV陰性対照に対して高リスクHPV陽性患者において少なくとも1.5倍高いレベルで一貫して発現された。それらの発現プロファイルに基づいて、miR-29B、miR-326、miR-361、およびmiR-425が、ウィルス感染および/または子宮頸癌発症に直接的または間接的に関与する可能性が高く、子宮頸癌に対する診断または治療標的を示し得ると考えられる。
【０３２１】
実施例30：
白血病試料のmiRNA分析
白血病は、T細胞の癌である。白血病の2つの最も一般的な型は、急性骨髄性白血病および慢性リンパ球性白血病である。急性骨髄性白血病は、主に未発達または初期の（まだ完全に発生または分化していない）細胞に影響を及ぼす急速に進行する疾患である。これらの未熟細胞は、それらの正常な機能を実施することができない。慢性白血病は、ゆっくりと進行し、より多くのより発生した細胞の成長を可能にする。概して、これらのより成熟した細胞は、それらの正常な機能のいくつかを実施し得る。miRNAが白血病によってどのように影響を受けるのか、またはどのように白血病に貢献している可能性があるのかを理解するために、白血病患者に由来する試料が、正常な個人に由来する試料と比較された。
【０３２２】
急性骨髄性白血病（AML）、慢性リンパ球性白血病（CLL）を有する、および疾患を有さない患者の白血球に由来する全RNAが、上に記載されるガラスファイバーフィルター法を使用して単離された。全RNAは、miRNAを回収するために、チューブ電気泳動によって分画された。miRNAは、上に記載される二段階蛍光標識化プロセスを使用して、Cy3またはCy5で蛍光標識された。標識miRNAは、上に記載されるようなガラススライド上にアレイされたmiRNAプローブにハイブリダイズされた。ハイブリダイズされたmiRNAからのシグナルは、GenePix 4000B Scanner（Axon）を使用して定量され、腫瘍およびNAT試料シグナルが、差次的発現miRNAを同定するために比較された。各々のエレメントに対する相対シグナル強度は、各々の患者に由来する白血病試料と正常試料との間で比較された。
【０３２３】
以下のmiRNAは、対応する正常試料よりもAML試料のすべてにおいて低いレベルで発現された：miR-425、miR-361、miR-25、およびmu-miR-291-5P。以下のmiRNAは、対応する正常試料よりもAML試料のすべてにおいて高いレベルで発現された：miR-126、miR-126-AS、miR-222、miR-221、およびmiR-181B。AML患者において下方または上方調節されるように一貫して見えるそれらのmiRNAは、患者を診断するために使用され得ると考えられる。同様に、これらのmiRNAは、治療的開発に対する潜在的標的を示す。同様に、これらのmiRNAによって調節される遺伝子は、治療的開発に対する効果的な標的を提供し得ると考えられる。
【０３２４】
以下のmiRNAは、対応する正常試料よりもCLL試料のすべてにおいて低いレベルで発現された：miR-361、miR-425、およびmu-miR-341。以下のmiRNAは、対応する正常試料よりもCLL試料のすべてにおいて高いレベルで発現された：miR-92、miR-99B、miR-23A、miR-23B、miR-223、miR-26A、miR-221、miR-222、miR-21、miR-20、miR-181A、miR-181B、miR-16、miR-15、miR-106A、let-7、およびmiR-103。CLL患者において下方または上方調節されるように一貫して見えるそれらのmiRNAは、患者を診断するために使用され得ると考えられる。同様に、これらのmiRNAは、治療的開発に対する潜在的標的を示す。同様に、これらのmiRNAによって調節される遺伝子は、治療的開発に対する効果的な標的を提供し得ると考えられる。
【０３２５】
実施例31：
アルツハイマー病試料のmiRNA分析
アルツハイマー病は、徐々にヒトの記憶ならびに学習する、論理的に考える、判断する、意思疎通する、および日々の活動を実施する能力を破壊する進行性脳障害である。アルツハイマー病が進行すると、個人は、不安、不信感、または動揺、ならびに妄想または幻覚などの、人格および行動における変化も経験し得る。
【０３２６】
現在、アルツハイマー病に対する治療法はなく、疾患の陽性診断は、「斑」および「タングル」と呼ばれる2つの異常な微視的構造に対して患者脳を分析することによって、死後に達成され得るのみである。アミロイド斑は、脳の神経細胞の外側に蓄積するタンパク質の塊である。タングルは、細胞内で形成する別のタンパク質のねじれた鎖である。アルツハイマー病の分子的基礎を理解することは、効果的な薬物および診断的アッセイの開発にとって重大であると思われる。本発明者らは、差次的発現miRNAを同定するために、アルツハイマー病患者の脳のmiRNA発現プロファイルを分析する。
【０３２７】
アルツハイマー病および正常扁桃体組織試料は、8人の個人から得られた。これらの試料に由来する全RNAは、上に記載されるガラスファイバーフィルター法を使用して単離された。全RNAは、miRNAを回収するために、チューブ電気泳動によって分画された。扁桃体miRNAは、上に記載される二段階蛍光標識化プロセスを使用して、Cy3で蛍光標識された。標識miRNAは、上に記載されるようなガラススライド上にアレイされたmiRNAプローブにハイブリダイズされた。ハイブリダイズされたmiRNAからのシグナルは、GenePix 4000B Scanner（Axon）を使用して定量され、アルツハイマー病および正常扁桃体試料からのシグナルが、差次的発現miRNAを同定するために比較された。各々のエレメントに対する相対シグナル強度は、各々の患者に由来する腫瘍試料とNAT試料との間で比較された。以下のmiRNAは、対応する正常試料よりもアルツハイマー試料のすべてにおいて下方調節された：miR-425、mu-miR-291-5P、miR-204、およびmiR-338。以下のmiRNAは、対応する正常試料よりもアルツハイマー試料のすべてにおいて上方調節された：miR-145、miR-16、miR-223、miR-126、let-7F2、およびmiR-143。アルツハイマー病試料において下方または上方調節されるように一貫して見えるそれらのmiRNAは、アルツハイマー病患者を診断するために使用され得ると考えられる。同様に、これらのmiRNAは、治療的開発に対する潜在的標的を示す。これらのmiRNAによって調節される遺伝子は、治療的開発に対する効果的な標的を提供し得ると考えられる。
【０３２８】
実施例32：
アルツハイマー病マウスモデルのmiRNA分析
アルツハイマー病（AD）は、認知症の最も一般的な型だが、現在、ADに対する分子的試験はなく、最も確実な診断は、ヒト脳切片における細胞外アミロイド斑および細胞内神経原線維タングルを同定するための死後の組織学的検査によってのみなされ得る。前途有望な新しい治療は、最も確実な診断に対する方法が開発され得るならば、ADのより良い管理の前途を提示する。早期および後期発症ヒトADの両方は、ApoEアポリポタンパク質トランスポーターをコードする配列の特定のハプロタイプにリンクされている。Apo Eマウス(JAX系統02052)は、ヒトアルツハイマー病（1,2,3）に対する動物モデルとしての役目をする。これらのマウスは、アポリポタンパク質E遺伝子におけるApoetm/Uncノックアウト突然変異に対する同型であり、脂質輸送における欠陥、コレステロール代謝における欠陥、および脳における黄色腫性損傷をもたらす。これらのマウスは、ストレス、害された学習および記憶、ならびにシナプス損害に対する変更された反応も示す。ADに関連するバイオマーカーを同定するために、本発明者らは、差次的発現miRNAを認証するために、Ambionにおいて開発された新しいマイクロアレイシステム、その後の、qRT-PCRアッセイを使用して、ApoEおよび対照マウスの脳領域におけるmRNAおよびマイクロRNA（miRNA）転写の全体的な発現プロファイリングを実施した。これらの調査は、対象マウスと比較してApoEの特定の脳領域において差次的に発現されるmiRNA、miR-182の同定を引き起こした。miR-182分子は、試験されたすべての脳領域（皮質、視床下部、小脳、および海馬）において異常調節され（dysregulated）、最も劇的な差は、ADマウスの皮質において〜10倍下方調節された（qRT-PCRによって決定されるように）。コンピューター分析が、候補mRNA標的を同定するために使用され、関連遺伝子産物レベルが、ADマウスにおいて査定された。これらの努力は、ADの診断および処置に対して有用な新しいRNAに基づくバイオマーカーの発見をもたらし得る。
【０３２９】
実施例33：
多発性硬化症脳試料のmiRNA分析
正常脳とともに多発性硬化症を有する患者の脳に由来する全RNAが、上に記載されるガラスファイバーフィルター法を使用して単離された。全RNAは、miRNAを回収するために、チューブ電気泳動によって分画された。miRNAは、上に記載される二段階蛍光標識化プロセスを使用して、Cy3で蛍光標識された。標識miRNAは、上に記載されるようなガラススライド上にアレイされたmiRNAプローブにハイブリダイズされた。ハイブリダイズされたmiRNAからのシグナルは、GenePix 4000B Scanner（Axon）を使用して定量され、多発性硬化症および正常試料からのシグナルが、差次的発現miRNAを同定するために比較された。以下のmiRNAは、多発性硬化症脳試料の各々においてより高く発現された：miR-370、miR-30A、miR-132、mu-miR-298、miR-422A、miR-31、およびmiR-155。以下のmiRNAは、多発性硬化症脳試料の各々においてより低く発現された：mu-miR-322、miR-326、miR-328、miR-9as、miR-137、miR-126、miR-21、miR-181B、およびmiR-218。多発性硬化症試料において下方または上方調節されるように一貫して見えるそれらのmiRNAは、ヒトが多発性硬化症を有するかどうかを決定するために使用され得ると考えられる。同様に、これらのmiRNAは、治療的開発に対する潜在的標的を示す。また、これらのmiRNAによって調節される遺伝子は、治療的開発に対する効果的な標的を提供し得ると考えられる。
【０３３０】
実施例34：
T細胞発生に関連するmiRNA
T細胞は、白血病およびリンパ腫の両方、ならびにHIV感染の主要な構成要素である。これらの疾患を理解することは、T細胞の分子的構成要素を理解することを必要とする。顕著な量が、T細胞発生に関してすでに公知である。T細胞発生は、胸腺において生じる；胸腺微小環境が、陽性および陰性選択と同様に分化を方向付ける。骨髄において造血幹細胞から発生したリンパ前駆細胞は、機能的T細胞へのそれらの抗原非依存性成熟を完成するために胸腺へ移動する。胸腺において、T細胞は、TCR、CD3、CD4またはCD8、およびCD2を含む、それらの特異的T細胞マーカーを発生する。前駆細胞が、CD2を発現し始めるが、まだそれらのTCR遺伝子を再配列していない場合（CD2+ CD3-）、それらは、ThおよびTc系統に対するマーカーであるCD4およびCD8に対して二重陰性である（CD4- CD8-）。胸腺における二重陰性細胞のうち、約20％は、再配列されたgd TCRを有し、約20％は、非常に均質なab TCRを有し、60％は、成熟ab T細胞の大部分になるようにされる。これらの細胞は、次に、接着分子CD44を発現し、次いで、IL-2受容体のα鎖（CD25）を発現する。CD44low CD25+二重陰性T細胞は、TCRβ鎖を再配列する。β鎖再配列は、D-J接合で始まり、V-DJ接合が続く。成功したb鎖再配列の機会が、2つのDJCb遺伝子クラスターの存在によって増加される。第一のクラスターにおける再配列が失敗した場合、第二における再配列が生じ得る。
【０３３１】
β鎖の生産的な再配列は、CD3および代理のa鎖、pTa（B細胞におけるl5に類似）を有するT細胞膜上でのその発現が後に続く。前T受容体を介するシグナル伝達は、細胞が、b鎖を再配列することを停止し、増殖の期間を経験し、CD4およびCD8の両方を発現し始め、二重陽性T細胞になることを引き起こす。
【０３３２】
T細胞発生のマウスモデルを使用して、本発明者らは、二重陽性T細胞をより成熟したCD4+細胞と比較した。二重陽性およびCD4+T細胞に由来する全RNAが、上に記載されるガラスファイバーフィルター法を使用して単離された。全RNAは、miRNAを回収するために、チューブ電気泳動によって分画された。miRNAは、上に記載される二段階蛍光標識化プロセスを使用して、Cy3またはCy5で蛍光標識された。標識miRNAは、上に記載されるようなガラススライド上にアレイされたmiRNAプローブにハイブリダイズされた。ハイブリダイズされたmiRNAからのシグナルは、GenePix 4000B Scanner（Axon）を使用して定量され、シグナルが、差次的発現miRNAを同定するために比較された。各々のエレメントに対する相対シグナル強度は、二重陽性試料とCD4+試料との間で比較された。より成熟したCD4+細胞において2倍よりも大きく高いレベルで発現されるmiRNAは、miR-181A、miR-16、miR-15B、miR-128A、miR-17-5P、let-7A、let-7C、およびmiR-106である。1つのmiRNAが、より成熟したCD4+細胞において2倍よりも大きく低いレベルで発現された：miR-326。
【０３３３】
実施例35：
心臓肥大に関連するmiRNA
慢性心不全を有する患者は、心臓肥大と呼ばれる心臓の拡張を発生する。心臓肥大の原因および影響は、大規模に立証されているが、分子シグナルを細胞変化にリンクする基礎をなす分子的メカニズムまたは心臓シグナル伝達経路は、ほとんど理解されないままである。心臓肥大を誘導するmiRNAは、診断的または治療的診療に対する標的を供給すると考えられる。
【０３３４】
2つの異なる肥大性マウスモデルのmiRNA発現プロファイルが検査された。第一のマウスモデルは、ストレスに対する心臓肥大性反応に関与している、Gq共役受容体シグナル伝達経路を除外されたノックアウトであった。第二のマウスモデルは、Gq共役受容体シグナル伝達経路およびSTE20 HGK経路の両方を除外された二重ノックアウトであり、その両方は、心臓肥大に関与している。
【０３３５】
GqおよびGq/HGKトランジェニックの心臓ならびに正常マウス心臓に由来する全RNAが、上に記載されるガラスファイバーフィルター法を使用して単離された。全RNAは、miRNAを回収するために、チューブ電気泳動によって分画された。miRNAは、上に記載される二段階蛍光標識化プロセスを使用して、Cy3またはCy5で蛍光標識された。標識miRNAは、上に記載されるようなガラススライド上にアレイされたmiRNAプローブにハイブリダイズされた。ハイブリダイズされたmiRNAからのシグナルは、GenePix 4000B Scanner（Axon）を使用して定量され、シグナルが、差次的発現miRNAを同定するために比較された。各々のエレメントに対する相対シグナル強度は、トランスジェニックマウス試料と正常心臓試料との間で比較された。Gqトランスジェニック心臓において2倍よりも大きくより低いレベルで発現されるmiRNAは、miR-23B、miR-326、miR-126、miR-133A、miR-23A、およびmiR-99Bである。興味深いことに、miR-326のみが、Gq/HGKトランスジェニックマウスにおいても下方調節された。
【０３３６】
実施例36：
電気泳動精製システム
以前の実施例は、少ない容積の分離ゲルマトリクス（各々が0.5 mlよりも少ない）を有する小さな電極バッファーチャンバーを含むマイクロ電気泳動システムを使用するmiRNAの精製に関与した。この精製は、すべての望ましい種が、サイズスペクトルの小さな端にあるという事実に頼る。これは、これらの種がゲルマトリクスを通って完全に移動した後に、単にすべての下層電極バッファーの除去による試料の収集を可能にする。種は、アルコール沈殿または高アルコール濃度におけるガラスファイバーフィルター上での固定化（Ambion特許出願においてカバーされる）によって濃縮され得る。これは、試料を特定のnmサイズの孔を有するフィルターに通り抜けさせることに類似しているが、それは、原動力が、大気または遠心圧下での担体液の通過よりもむしろ、種の電気泳動運動であるという点で識別可能である。また、通り抜けられる分離マトリクスの全厚さが、実質的にはより大きいので（〜150対<1 mm）、分離は、より効率的である。システムは、下層電極バッファーを除去しかつ補充することによる連続収集をするために使用されてもよい。
【０３３７】
これを遂行するために、試料は、100μlまでの容積と等しい容積の、95％ホルムアミドを含む変性溶液と混合され、分離ゲルマトリクスの上面に上層電極バッファー（250μl）下に加えられた。ゲルは、尿素溶液におけるポリアクリルアミドマトリクスであった。変性条件の使用は、小さなRNAが、それらが形成する任意のハイブリッドから分離される、およびそれらの移動度が、それらの構造よりもむしろそれらのサイズを反映するということの両方を確実にした。ゲルバッファーは、標準的なトリスホウ酸EDTAシステムであった。10％ポリアクリルアミド（9.33％モノマー：0.67％メチレンビス-アクリルアミド）ゲルマトリクスを使用することによって、標準的手順が、色素が現れ始める時にゲルを停止することであるように、キシレンシアノール色素が、約40 ntのRNA鎖の位置を追跡するために使用され得る。試料は、〜3 mAの電流を引き出す60〜80 Vにおいて、12〜15分間実行された。次いで、下層電極チャンバーのすべての内容物（250μl）が収集され、RNA種が、80％エタノールにおける沈殿、または75％エタノール、0.5 Mチオシアン酸グアニジニウム、3.75 mM CaCl2、16 mM 酢酸Na、pH 4.0の存在下におけるガラスファイバーフィルター上での捕獲を使用して、それから精製された。エタノール洗浄の後、試料は、>65℃の温度において水に溶離された。
【０３３８】
本明細書において開示および主張する組成物および方法のすべては、本開示に照らして、必要以上の実験なしに、作られかつ施行され得る。本発明の組成物および方法が、態様の観点から記載されているが、変形物が、本発明の概念、精神および範囲を逸脱することなく本明細書において記載される、組成物および方法に、ならびに方法の段階または一連の段階において適用され得ることが当業者にとって明白であると思われる。さらに具体的には、化学的および生理学的の両方に関連する特定の薬剤が、本明細書において記載される薬剤に置換され得るが、同じまたは類似の結果が達成されると考えられることは明白であると思われる。当業者にとって明白なすべてのそのような類似の置換および改変は、添付の特許請求の範囲によって定義されるように、本発明の精神、範囲、および概念の範囲内であると考えられる。
【０３３９】
参考文献
以下の参考文献は、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
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【図面の簡単な説明】
【０３４０】
【図１】miRNA発現および活性化の概観。miRNAは、1000ヌクレオチドもの長さであり得るより長いRNA分子の一部として転写される（Lee, 2002）。RNAは、核において、dsRNA特異的リボヌクレアーゼDroshaによって、70〜100ヌクレオチドのヘアピンRNAにプロセス化される（Lee 2003）（図1）。ヘアピンRNAは、細胞質に輸送され、Dicerと呼ばれる第二の二本鎖特異的リボヌクレアーゼによって分解される。結果として生じる19〜23merのmiRNAは、RNA干渉に関与するRNA誘導サイレンシング複合体（RISC）と同様のまたは同一の複合体によって結合される（Hutvagner 2002）。複合体結合一本鎖miRNAは、miRNAに顕著にしかし完全ではなく相補的な配列を有するmRNAに結合する。完全に理解されていないがmRNA分解には関与しないメカニズムにより、結合mRNAは翻訳されず、対応遺伝子の軽減された発現を引き起こす。
【図２】miRNArray標識化手順の略図。単離されたmiRNAは、ポリ(A)ポリメラーゼを使用してテール化される。テーリング反応は、Cy3-NHSエステルまたはCy5 NHS-エステルなどのアミン反応性色素分子と反応し得るアミン修飾ヌクレオチドを取り込む。標識miRNA試料は、ガラススライドなどの固体支持体上にアレイされるプローブにハイブリダイズされる。ゲルマトリクスおよびフィルターも、固体支持体として使用され得ると考えられる。標識されたおよびハイブリダイズされたmiRNAからのシグナルは、可視化され、試料におけるmiRNAの量を推定するために使用される。
【図３】miRNArray性能に対するプローブ長の影響。いくつかの異なるmiRNAに相補的なドメインを有するDNAプローブが、調製されアレイされた。各々のプローブは、末端付着基とmiRNAに相補的な配列との間に、ユニークなリンカー長を有した。全RNAに由来するmiRNAは、標識されかつアレイにハイブリダイズされ、様々なプローブからのシグナルが定量されかつプロットされた。グラフは、3'付着を有するより長いリンカーが、より大きなシグナル強度を提供したというデータを表す。
【図４】miRNArray再現性。ヒト結腸全RNA試料が、6つの方式に分割され、各々の分割量は、miRNArrayシステムを使用して処理されかつ標識された。標識試料は、同様に調製されたヒト前立腺試料と比較された。6回の反復の各々に対する結腸試料と前立腺試料との間の平均の差次的発現が決定された。各々のmiRNAに対する平均の差次的発現は、エラーバーを伴ってプロットされる。6回の反復に対する平均相関は98％であり、miRNAシステムの高い再現性の性質を示した。
【図５】リボヌクレアーゼ保護アッセイ（RPA）を使用したmiRNArray結果の確認。miRNArray分析は、9つのヒト組織のmiRNA発現プロファイルを、24個のヒト組織を含む「平均」試料と比較するために使用された。9つの組織における3つのmiRNAの相対発現が、棒グラフにプロットされ、100％は、平均試料における各々のmiRNAの測定された発現である。3つのmiRNAのレベルも、製造業者の勧める手順を使用してmirVana miRNA検出キット（Ambion）を使用して、9つの試料において測定された。miRNA産物バンドは、オートラジオグラフにおいて、各々のmiRNArray棒グラフの上に表示される。パネルA：miR-200b発現に対するRPAおよびmiRNArrayの結果。パネルB：miR-16発現に対するRPAおよびmiRNArray。パネルC：let-7発現に対するRPAおよびmiRNArray。9つの試料にわたる3つのmiRNAに対する発現プロファイルは、非常に類似しており、miRNArrayが試料におけるmiRNAの正確な定量化を提供しているという非依存的な確認を提供する。
【図６】肺腫瘍/NAT試料。7人の異なる肺腫瘍患者に由来する腫瘍および正常隣接組織に対するmiRNArrayは、腫瘍試料と正常試料との間で差次的に発現される多くのmiRNAを明らかにした。これらのmiRNAの最も一般的なものに対する発現における差は、差次的発現のlog比としてプロットされた。これらのmiRNAの多くに対する発現における2倍〜4倍の差は、患者試料において検出をしやすいと考えられ、臨床環境における効果的な診断的または予後診断的ツールを提供し得ると考えられる。
【図７】肺腫瘍マーカー検証。図6におけるように同定されたmiRNAマーカーのいくつかが、それらの妥当性を検証するためにさらに評価された。上段チャートは、アレイ比較データを示し、下段チャートは、肺癌患者に由来する、正常試料と比較された腫瘍におけるmiRNAの相対発現を示す。予期されたように、miRNArray分析からのデータは、分析の第二の方法によって確認された。
【図８】結腸腫瘍/NAT試料。6人の異なる結腸腫瘍患者に由来する腫瘍および正常隣接組織に対するmiRNArrayは、腫瘍試料と正常試料との間で差次的に発現される多くのmiRNAを明らかにした。これらのmiRNAの最も一般的なものに対する発現における差は、差次的発現のlog比としてプロットされた。これらのmiRNAの多くに対する発現における2倍〜4倍の差は、患者試料において検出をしやすいと考えられ、臨床環境における効果的な診断的または予後診断的ツールを提供し得ると考えられる。
【図９】腫瘍/NAT試料。miRNArray分析は、肺、結腸、乳、甲状腺、および膀胱癌を有する患者に由来する、腫瘍およびNAT試料のmiRNA発現プロファイルを比較するために使用された。対応する腫瘍試料よりも正常試料においてより高いレベルで発現されるmiRNAは、黒四角で示される。対応する腫瘍試料よりも正常試料においてより低いレベルで発現されるmiRNAは、白四角で示される。いくつかのmiRNAが、すべての腫瘍において差次的に発現されるが、その他は、一つまたは二つの腫瘍型のみにおいて差次的に発現されるということを示すのは興味深い。差次的発現miRNAは、潜在的な診断標的、予後診断標的、および治療標的を表す。
【図１０】単一腫瘍の異なる領域からのmiRNA発現プロファイルの類似性。単一の癌患者の甲状腺に由来する2つの異なる腫瘍および正常隣接試料が、miRNArray分析によって評価された。2つの腫瘍およびNAT試料におけるmiRNAの相対発現は、log比としてプロットされる。2つの非依存的な試料は、92％の相関を有し、miRNAプロファイルが、腫瘍単離体の間で非常に類似していることを示す。これは、診断的試料としてmiRNAなどの検体を使用することを考慮する場合、重要である。
【図１１】固定組織のmiRNArray分析。ほとんどの病院では、診断的プロセスの一部は、ホルムアルデヒド固定腫瘍試料である。固定は、試料における生体分子の多くを架橋し、それらが分子分析との互換性がないようにする。いくつかの組織が、マウスから除去され、固定または凍結された。次いで、固定および凍結試料に由来するmiRNAが、miRNArrayシステムを使用して分析された。これらの試料の代表が示される。上段パネルは、miRNArray上の様々なmiRNAプローブエレメントに対するシグナル強度を示す。下段パネルは、固定対凍結試料に対するシグナル強度の散布図である。miRNAプロファイルは、固定試料と凍結試料との間で本質的には同一であり、miRNAが、固定試料において効果的に分析され得ることを示す。これは、miRNA診断的アッセイが、現存する医療プロトコールと互換性があることを意味する。加えて、病院に預けられている古い固定組織を使用する過去の調査を行うことも可能であると思われる。
【図１２】図12A〜E。分解RNA試料のmiRNArray分析。増加するレベルにおいて分解されたRNA試料を作り出すために、マウス組織試料が、時間の様々な期間、室温でインキュベートされた。分解（および非分解）試料が、miRNAプロファイリングが適合し得る分解に対する耐性のレベルを確立するために、miRNArrayシステムを使用して評価された。パネルA：非分解凍結組織の試料に由来するmiRNAを、0分間分解されたRNAを有する試料と比較するmiRNArray分析。パネルB：凍結組織の試料に由来するmiRNAを、5分間分解されたRNAを有する試料と比較するmiRNArray分析。パネルC：凍結組織の試料に由来するmiRNAを、20分間分解されたRNAを有する試料と比較するmiRNArray分析。パネルD：凍結組織の試料に由来するmiRNAを、120分間分解されたRNAを有する試料と比較するmiRNArray分析。パネルE：異なる試料における分解の程度を示すポリアクリルアミドゲル。興味深いことに、miRNAプロファイルは、試料におけるその他のRNAを分解する条件によって、かき乱されないように見える。これは、miRNAが、細胞においてそれらを使用するタンパク質複合体によって結合されかつヌクレアーゼ分解から保護されているため、またはmiRNAがとても小さいので、ヌクレアーゼによって効果的に分解されないためであり得ると考えられる。それらがなぜ保護されるのかにかかわらず、miRNAが安定であるという観測は、それらのレベルが、mRNAに基づくアッセイに対する問題である下手な試料取扱によって影響を受ける可能性がないので、診断的/予後診断的検体としてのそれらの有用性を増加する。
【図１３】異なる患者に由来する血液試料のmiRNArray分析。クリニックにおいて使用される最も一般的な試料の1つは、血液である。miRNArrayシステムが、10人の異なる血液ドナーのmiRNAプロファイルを分析するために使用された。3つのパネルは、代表的な患者の3人におけるmiRNAの精選されたセットに由来する相対シグナル強度を示す。データは、miRNAプロファイルが、血液から得られ得ることを示す。加えて、様々なドナーのmiRNAプロファイルにおける類似性に留意することは重要であり、異なる個人が非常に類似したmiRNA発現パターンを有することが示唆され、彼らのmiRNAプロファイルをかき乱す病態を有する個人を同定しやすくすると思われる。
【図１４】肺および結腸癌患者におけるmiRNA発現。腫瘍対正常隣接組織のmiRNA発現プロファイルが、肺および結腸癌患者に対して比較された。miRNAは、行において提供される；患者は、列において提示される。ヒートマップにおける緑は、正常隣接組織試料に対して、腫瘍試料において下方調節されるmiRNAを示し、赤は、正常隣接組織試料に対して、腫瘍試料において上方調節されるmiRNAを示す。
【図１５】肺癌患者におけるmiRNAアレイ発現結果の検証。2人の肺癌患者に由来する全RNA試料が、ノーザン分析を使用して、miR-16、miR-21、miR-143、miR-145、およびlet-7の発現に対して分析された。グラフは、アレイ分析およびノーザンホスホイメージャー分析からの各々のmiRNAの相対存在量（腫瘍：NATの比）を示す。
【図１６】いくつかのmiRNAは多数の癌型において差次的に発現される。癌の様々な型を有する患者に由来する腫瘍および正常隣接組織を比較するmiRNAアレイ分析が、癌における差次的発現miRNAを同定するために使用された。所与のmiRNAの上方または下方調節を示す患者のパーセンテージは、各々の癌型に対して計算された。試料型にわたって最もしばしば差次的に発現された8つが提示される。
【図１７】感染対非感染と感受性対非感受性の両方の間で1.5倍より大きい発現変化を有するmiRNAが示される。右にあるのは、各々のモデルの2アレイからの結果のクラスターである。
【図１８】非処置マウスに対する3匹のプレコンディションマウスにおける差次的発現miRNA。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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