(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
一過性病原性皮膚菌叢の1つもしくは複数の微生物の生育を阻害することができるが、健康で正常な皮膚常在菌叢の微生物の生育は阻害しない微生物であって、
DSMZ受託番号DSM 18006を有するラクトバチルス・デルブリュッキssp.デルブリュッキである該微生物。
【請求項２】
一過性病原性皮膚菌叢の1つもしくは複数の微生物の生育を阻害することができるが、健康で正常な皮膚常在菌叢の微生物の生育は阻害しない微生物であって、
DSMZ受託番号DSM 18006を有するラクトバチルス・デルブリュッキssp.デルブリュッキである微生物または熱失活もしくは凍結乾燥を受けている不活性型の該微生物を含んでなる、組成物。
【請求項３】
化粧品として許容される担体もしくは添加剤を必要に応じて含んでなる化粧品組成物である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
製薬上許容される担体もしくは添加剤を必要に応じて含んでなる医薬組成物である、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
病原菌から皮膚を保護するための化粧品もしくは医薬組成物の調製における、請求項１に記載の微生物の使用。
【請求項６】
皮膚炎の予防または治療のための医薬組成物の調製における、DSMZ受託番号DSM 18006を有するラクトバチルス・デルブリュッキssp.デルブリュッキである微生物または熱失活もしくは凍結乾燥を受けている不活性型の該微生物の使用。
【請求項７】
DSMZ受託番号DSM 18006を有するラクトバチルス・デルブリュッキssp.デルブリュッキである微生物または熱失活もしくは凍結乾燥を受けている不活性型の該微生物を、化粧品または医薬品として許容される担体もしくは添加剤とともに製剤化するステップを含んでなる、組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚の常在菌叢の微生物の増殖を刺激することができるが一過性病原性菌叢の微生物の増殖は刺激しない、微生物に関する。本発明はまた、このような微生物を含んでなる組成物、たとえば、化粧品もしくは医薬組成物に関するものであり、さらに化粧、予防、または治療の用途にこうした微生物を使用することに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの皮膚には、皮膚表面の比較的安定した構成において主に共生生物として生存する、多様な微生物が生着している(Roth and James, 1988)。この正常な皮膚菌叢を「皮膚常在菌叢」と呼ぶ。
【０００３】
ヒトの皮膚の主な機能は、皮膚の下の組織を周囲の環境から保護することである(Feingold, 1985)。こうした正常な皮膚菌叢は特に、病原性を有する可能性のある微生物の侵入から皮膚を保護する (Bisno, 1984)。一定の微生物が常在菌叢の大半を占める。常在菌叢の微生物の90％以上が表皮ブドウ球菌（Staphylococcus epidermidis）(コアグラーゼ陰性)、ミクロコッカス属菌（Micrococcus spec）、ジフテロイド（Diphteroid）、およびプロピオニバクテリウム属菌（propionibacteria）である。したがって、天然の皮膚菌叢の安定化が、皮膚の保護を維持し、病原体の侵入を防ぐ。皮膚の健康が増進される。天然の皮膚菌叢の重要性は、いくつかの臨床研究で報告されている。乳児の誕生後初期には、上記皮膚菌叢はまだ発達しておらず、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）感染の危険性が非常に高いことが示された。菌叢の発達が進むにつれて、皮膚は病原微生物の定着から防御される（Hurst, 1959）。乳児に関する別の研究では、抗生物質アモキシリンで処置した後、常在菌叢が大幅に（約50％）抑制されることが観察された。これによって、病原性酵母カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）は14倍以上に増加した。抗生物質処置の中止によって、常在菌叢は再生し、カンジダ・アルビカンスは抑制された（Brook, 2000）。
【０００４】
皮膚常在菌叢の微生物は、皮膚表面で付着部位および必須栄養素を取り合うことによって病原微生物の定着を妨げる（Sullivanら、2001）。病原微生物は、特別な結合タンパク質によって、表皮の構造体に特異的に付着することができる。これに関して、さまざまなメカニズムが知られている。たとえば、黄色ブドウ球菌由来の特異的アドヘシンが知られている。これによって病原微生物がフィブロネクチン構造に付着することができる。病原体は一般に、宿主に付着する高い能力を有する。これによって、こうした微生物の病原性が説明される（GibbonsおよびHoute, 1975）。
【０００５】
病原微生物が定着する危険性は、皮膚表面に小さな損傷もしくは他のダメージがある場合、特に、正常な皮膚菌叢が抗生物質、または過度な洗浄によって傷んでいる場合には、大幅に増大する（Elek, 1956）。しかしながら、皮膚常在菌叢は、栄養利用に関して、皮膚への適応にすぐれている。このことは、常在菌叢の利点となる（Larson, 2001）。これに加えて、皮膚常在菌叢の生物は、病原微生物に対抗する抗菌物質を産生することができる。これもまた、栄養およびエネルギー源に関する常在微生物の利点である（SelwynおよびEllis, 1972; MilyaniおよびSelwyn, 1978）。
【０００６】
さらに、皮膚から分泌される、複合脂質（トリグリセリド）のような物質は、不飽和脂肪酸へと分解されるが、これは化膿レンサ球菌（Streptococcus pyrogenes）、もしくはグラム陰性細菌および真菌のような病原微生物を抑制する（AIyら、1972）。
【０００７】
皮膚微生物叢は、化粧に関連する皮膚のいくつかの要因に影響を及ぼす。その要因とは、皮膚のpH値、バリア機能、および脂質含量である。表皮ブドウ球菌は、pH値を低下させる（約4〜6）ことによって病原微生物と対抗することができる。病原体は、低いpH値では生育することができない（Korting et al., 1990; Lukas, 1990; Korting, 1992; Yosipovitch and Maibach, 1996; Gfatter et al., 1997）。
【０００８】
皮膚の水バリア機能および脂質含量は、角質層のセラミド含量に依存する（Imokawa et al., 1986）。セラミド含量が低下すると、皮膚の乾燥およびひび割れを引き起こす。このような皮膚の外観を呈するアトピー性皮膚炎患者に関する研究は、皮膚微生物叢が黄色ブドウ球菌へと劇的に変化することを示した。この病原体は非常に高いセラミダーゼ活性を特徴とするが、皮膚常在菌叢の正常な共生生物はこの活性を持たない。皮膚においてセラミドの放出をもたらすスフィンゴミエリナーゼ活性は、アトピー性皮膚炎患者の常在菌叢および病原性菌叢において同程度である（Ohnishi et al., 1999）。
【発明の開示】
【０００９】
このように、皮膚、特にヒトの皮膚を病原微生物から保護することを可能にする手段および方法が必要である。本発明はこの必要性に対処し、病原微生物の定着から皮膚を保護する、微生物ならびに方法を提供する。詳細には、特許請求の範囲において特徴付けられるような実施形態を提供する。
【００１０】
したがって、第一の態様において、本発明は、皮膚常在菌叢の１つもしくは複数の微生物の生育を刺激することができるが、一過性病原性菌叢の微生物の生育は刺激しない微生物に関する。
【００１１】
本発明者らは、驚くべきことに、上記微生物もしくはその不活化型を皮膚に投与することによって、病原微生物の定着から皮膚を効果的に保護することが達成可能であることを見出した。本発明者らははじめて、該当する微生物を同定し、その同定方法を提供した。こうした微生物は、皮膚常在菌叢の微生物の生育を特異的に刺激するため、天然の皮膚菌叢を再生し、安定化することができる。これによって、病原微生物の生育は抑制される。さらに、病原微生物の皮膚菌叢への侵入を妨げることができる。本発明の微生物は、たとえば、皮膚の上部層の微生物が洗浄によって除去されたとき、皮膚のより深い角質層の常在微生物叢を刺激することができる。皮膚には多くのさまざまな微生物が存在する。正常な（常在）皮膚菌叢に属し無害な共生生物であるものもあれば、病原体となる可能性のあるものもある。
【００１２】
基本的に、皮膚の生物は２つのカテゴリーに分類することができる：
1. 常在性生物：常在性生物は、皮膚の表面上、角質層上、表皮の外層内部、ならびに皮膚および毛包の深い割れ目の中に定着した、永続的に皮膚に生息するものである。こうした皮膚常在菌叢の微生物は、皮膚組織に侵入することも、皮膚組織を損傷することもなく、皮膚上で生育し増殖することができる。皮膚の深い領域のこうした生物は洗浄によって容易には除去されない。常在微生物は無害の共生生物である。
【００１３】
2. 一過性生物：一過性生物は、皮膚に付着しているがそこでは増殖しない微生物、または皮膚で増殖し短期間存続する汚染菌である。これらは、健康な皮膚（その微小環境は常在菌叢によってほぼ決まっている）に永続的に定着することはできない。一過性生物は病原性を有する可能性がある。
【００１４】
このように、「皮膚常在菌叢」という用語は、通常、皮膚に、好ましくはヒトの皮膚に見出すことができる微生物であって、皮膚に存在する微生物の大部分を構成する微生物に関する。
【００１５】
具体的には、「皮膚常在菌叢」という用語は、皮膚の表面上、角質層上、表皮の外層内部、ならびに皮膚および毛包の深い割れ目の中に永続的に生息する、微生物に関する。
【００１６】
こうした微生物は、皮膚組織に侵入することなく、それを損傷することもなしに、皮膚上で生育し増殖することができるという特徴を有する。こうした微生物の一つの特徴は、皮膚の比較的深い領域では、微生物が洗浄によって容易に除去されないことである。
【００１７】
皮膚常在菌叢の微生物は無害の共生生物である。
【００１８】
「皮膚常在菌叢」という用語は、皮膚、好ましくはヒトの皮膚上に見出すことができる、好ましくは、好気性および嫌気性微生物の菌叢に関する。より好ましくは、前記用語は、表皮ブドウ球菌（コアグラーゼ陰性）、ミクロコッカス属菌、ジフテロイド、およびプロピオニバクテリウム属菌を含んでなる、微生物の菌叢に関する。典型的には、好気性の皮膚常在菌叢の約90％は、表皮ブドウ球菌で占められる。残りの約10％はおもに、ミクロコッカス属菌（80％ Micrococcus luteus）、およびジフテロイド（13％）からなる。「ジフテロイド」という用語は、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属に属する広範な細菌を指す。便宜上、皮膚ジフテロイドは次の4群に分類されている：親油性もしくは非親油性ジフテロイド；嫌気性ジフテロイド；ポルフィリン産生ジフテロイド。嫌気性微生物皮膚菌叢のうち大多数の代表的な菌（90％）は、プロピオニバクテリウム属菌である；特にPropionibacterium acnes, P. granulosumおよびP. avidumを皮膚から分離することができる。嫌気性菌叢は、皮膚常在菌叢全体の約4％を占める。
【００１９】
より好ましくは、菌叢の微生物の90％より多くが、表皮ブドウ球菌、ミクロコッカス属菌、ジフテロイド、およびプロピオニバクテリウム属菌に属する。さらにより好ましくは、皮膚常在菌叢は、その主成分が表皮ブドウ球菌であるという特徴を有する。
【００２０】
皮膚菌叢の成分および組成を、定量的ならびに定性的に、たとえば、スコッチテープによって皮膚上層を剥離することによって、決定することができる。皮膚常在菌叢の微生物は、たとえばスコッチテープで剥離した、上部の10層の皮膚層内で、同定することができる。典型的には、こうした微生物を分離するために、6枚の2 cm2スコッチテープをそれぞれ、好ましくは前腕の、皮膚の一定の領域に押しつけた後、各テープ片を皮膚から、グラム陽性（例、BHI, Difco Inc.）もしくはグラム陰性（例、MacConkey agar, Difco Inc.）用の選択培養寒天プレートに、または、酵母および真菌用の選択寒天培地（例、Plate Count Agar, Difco Inc.）に転写する。その後、皮膚から寒天培養プレートに転写された微生物を、30℃および37℃で、好気的ならびに嫌気的に、約24時間培養する。定性分析のために形態学的および生化学的方法によって、ならびに定量のために計数によって、コロニー形成単位を測定する。相対組成および全細胞数を決定する。当業者は、当技術分野で知られている方法によって、上記のように分離された皮膚常在菌叢の微生物の属および／または種を決定することができる。たとえば、当業者は、代謝フットプリンティング、脂肪酸組成および細胞壁組成などにより前記微生物を同定することができる。
【００２１】
「皮膚」という用語は、当業者に知られているように、身体の外側を覆うものを表す。好ましくは、この用語は、表皮、真皮、および皮下脂肪組織の3層に関する。表皮は、皮膚のもっとも外側の層である。表皮は、一般的に、身体表面を覆って、水を通さない保護被覆を形成し、下に基底層を有する重層扁平上皮からなる。表皮には普通、血管はなく、真皮からの拡散によって養分が与えられる。表皮を形成する細胞の主要タイプはケラチノサイトであるが、メラノサイトおよびランゲルハンス細胞も存在する。表皮は、いくつかの層に分けられるが、細胞はいちばん内側の層で有糸分裂によって生成される。細胞は、分化するにつれて形態および構成を変えながら層を上方に移行し、ケラチンで満たされるようになる。細胞は最終的に、角質層と呼ばれる最上層に到達し、脱落もしくは落屑を生じる。表皮の最外層は、25〜30層の死んだ細胞からなる。従来から、表皮は、5つの層にさらに分けられている（表層から深部へ）：角質層、透明層、顆粒層、有棘層、および胚芽層もしくは基底層。典型的には、表皮と真皮の間の境界は不規則で、一連の乳頭もしくは指状突起からなるが、これらは皮膚の薄いところでもっとも小さく、手掌および足底の皮膚ではもっとも長い。典型的には、手掌および足底の乳頭は、表皮の上昇に関連し、突起部を形成する。皮下脂肪組織は、皮膚の最下層である。この層の特徴は、結合組織、血管、および脂肪細胞からなることである。概して、この層は、皮膚を下にある組織に結合し、身体を寒さから防護し、エネルギーを脂肪の形で貯える。一般に、皮膚はより深部の組織への物理的、化学的、ならびに細菌による作用に対する保護バリアとなる。このことは、たとえば口腔もしくは膣部位に属する組織、すなわち粘膜が皮膚に属さないことを意味する。好ましい実施形態において、「皮膚」という用語は、身体を覆うもっとも外側の層、すなわち表皮に関する。より好ましい実施形態において、「皮膚」という用語は、表皮の角質層に関する。さらにより好ましい実施形態において、「皮膚」という用語は、表皮のうちもっとも外側の25〜30層の死んだ細胞の層に関する。もっとも好ましい実施形態において、「皮膚」という用語は、表皮のうちもっとも外側の10層の死んだ細胞の層に関する。
【００２２】
皮膚常在菌叢の微生物の生育に関わる「刺激」という用語は、１つもしくは複数のこうした微生物の生育が、本発明の微生物と接触したときに増加することを意味する。生育の増加は、好ましくは増殖、すなわち単位時間当たりの細胞分裂の増加を意味する。あるいはまた、「刺激」という用語は、個々の細胞の大きさの増加も表す。細菌細胞の大きさは、SYBR Green I（Molecular Probes, USA）色素で染色後、フローサイトメトリー（たとえば、Becton-Dickinson FACSort flow cytometer, San Jose, CA）によって評価することができる。細菌細胞の大きさは、Side-Angle Light Scatter (SSC)法で評価される。
【００２３】
このように、生育の増加は、単位時間当たりの生物体量の増加を意味する。
【００２４】
皮膚常在菌叢の微生物の生育の刺激は、好ましくはin vitroで、より好ましくは、本発明の微生物を皮膚常在菌叢の１つもしくは複数の微生物と接触させて、皮膚常在菌叢のそうした微生物の生育を測定するアッセイで、観察することができる。生育は、さまざまなインキュベーション時間の後に細胞／コロニー数を計数することによって測定することができ、それを、本発明の微生物を含有しない対照と比較することによって、生育増加が存在するかどうかを決定することができる。
【００２５】
生育の刺激を測定するin vitroアッセイは、実施例に記載されるが、いわゆる「in vitroホールプレートアッセイ」を含む。手短に述べると、このアッセイは次のステップを含んでなる：
-  皮膚常在菌叢の少なくとも1つの微生物を培養し、その（それぞれの）微生物の生育、および好ましくは検出に適した寒天培地を含む調製済み寒天プレート上にそれを均一に塗布する；
-  播種した寒天プレートにホール（穴）を設ける；
-  そのホールに、あらかじめ培養した本発明の微生物の細胞を満たす；
-  皮膚常在菌叢の微生物の生育を可能にする条件下で、適当な時間、この寒天プレートをインキュベートする；さらに
-  本発明の微生物を入れたホールの周囲の皮膚常在菌叢の微生物の生育を測定し、それを本発明の微生物を含有しないホールの周囲の皮膚常在菌叢の微生物の生育と比較する。
【００２６】
最終ステップでの生育の測定は、細胞数および／またはコロニー数を測定する利用可能な手段および方法、例を挙げると、適当な色素による染色および／または光学的手段、たとえば、デンシトメトリーおよび顕微鏡下での細胞／コロニー数の計数によって実施することができる。
【００２７】
さらにより好ましくは、皮膚常在菌叢の微生物の生育刺激は、in situ皮膚アッセイでも観察することができる。このアッセイは実施例に記載されるが、簡単に述べると、下記のステップを含んでなる：
-  皮膚常在菌叢の少なくとも1つの微生物を培養し、被験個体の皮膚の一定領域にそれを均一に薄く塗る；
-  この皮膚常在菌叢の微生物を塗布した区域の中の一定の領域に本発明の微生物の一定量を塗布する；
-  皮膚常在菌叢の微生物の生育を可能にするのに十分な期間、皮膚をインキュベートする；
-  皮膚の上層を、それに含まれる微生物を含めて、適当な生育培地を含有する寒天プレートに移す；
-  この寒天プレートを一定期間、皮膚常在菌叢の微生物の生育を可能にする条件下でインキュベートする；
-  本発明の微生物を塗布した領域の周囲の、皮膚常在菌叢の微生物の生育を測定し、それを、本発明の微生物を塗布していない、対照の常在微生物の生育と比較する。
【００２８】
上記アッセイに使用する皮膚の領域は、個体、好ましくはヒト個体の皮膚の任意の適当な領域とすることができる。好ましい実施形態において、それは、ヒト個体の前腕皮膚の領域である。領域の広さは決まっていないが、好ましくは、約1〜40 cm2、より好ましくは5〜20 cm2、さらにより好ましくは5〜10 cm2、たとえば、約5、6、7、8、9または10 cm2である。
【００２９】
皮膚常在菌叢の微生物は、その領域に均一に、好ましくは約102 cfu/cm2 〜 103 cfu/cm2の密度で分布させる。皮膚に塗り広げた微生物を自然乾燥させ、本発明の微生物の一定量をその領域内に、正確に塗布する。これは、当業者に知られている手段によって達成することができる。たとえば、本発明の微生物を遠心する（15分、4000 x g）。細胞ペレットを、K/Na-バッファーで2回洗浄する（各1 ml）。細胞を200μl K/Na-バッファー中に再懸濁し、調製された微生物10μlを、マイクロピペットを用いてあらかじめ接種された皮膚領域に正確に塗布する。
【００３０】
皮膚のインキュベーションは、好ましくは室温で、たとえば2時間行う。皮膚に含まれる微生物を含めた、皮膚の上層の移動は、たとえば粘着テープ片の助けを借りて行うことができる。皮膚の上層を移した寒天プレートは、テストすべき皮膚常在菌叢の微生物の生育を可能にする温度でインキュベートするが、このプレートは前記微生物の生育を維持することが知られている生育培地を含有する。インキュベーションは、一般的には約24時間行う。微生物の生育は当業者に知られている方法によって検出することができる。好ましくは、デンシトメトリーによって、もしくは本発明の微生物の一定量を塗布したポイントの近傍に形成されたコロニーを計数することによって測定される。細菌細胞の大きさは、SYBR Green I（Molecular Probes, USA）色素で染色後、フローサイトメトリー（たとえば、Becton-Dickinson FACSort flow cytometer, San Jose, CA）によって評価することができる。細菌細胞の大きさは、Side-Angle Light Scatter (SSC)法で評価される。
【００３１】
ある微生物が、in vitroホールプレートアッセイにおいて、微生物を加えなかった対照と比較して、少なくとも5％、好ましくは少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、もしくは70％、より好ましくは少なくとも75％、さらにいっそう好ましくは少なくとも80％、そしてもっとも好ましくは少なくとも85％の、皮膚常在菌叢の少なくとも１つの微生物の生育の増加をもたらすならば、その微生物は皮膚常在菌叢の1つもしくは複数の微生物の生育を刺激すると見なされる。
【００３２】
より好ましくは、ある微生物が、in situ皮膚アッセイにおいて、少なくとも5％、好ましくは少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％もしくは70％、より好ましくは少なくとも75％、さらにいっそう好ましくは少なくとも80％、そしてもっとも好ましくは少なくとも85％の、皮膚常在菌叢の少なくとも１つの微生物の生育の増加をもたらすならば、その微生物は皮膚常在菌叢の1つもしくは複数の微生物の生育を刺激すると見なされる。
【００３３】
好ましい実施形態において、本発明の微生物は、皮膚常在菌叢の過半を占める代表的な菌である表皮ブドウ球菌の生育を刺激する。「生育を刺激する」という言葉の意味は、上記に記載のとおりであるが、好ましくは、in vitroで、より好ましくは上記in vitroホールプレートアッセイにおける刺激を意味する。さらにより好ましくは、上記in situ皮膚アッセイにおける刺激を意味する。もっとも好ましくは、in vitroならびにin situアッセイにおける刺激を表す。in vitroホールプレートアッセイおよびin situ皮膚アッセイは、好ましくは実施例に記載のように実施される。好ましい実施形態において、本発明の微生物はまた、ミクロコッカス属菌、好ましくはミクロコッカス・ルテウス（Micrococcus luteus）の生育を刺激する。より好ましい実施形態において、好ましくはコリネバクテリウム属に属する細菌からなる、ジフテロイドの生育も刺激される。
【００３４】
特に好ましい実施形態において、本発明の微生物は皮膚常在菌叢のすべての微生物の生育を刺激する。
【００３５】
本発明の微生物は、一過性病原性菌叢の微生物の生育は刺激しないという特徴も有する。「一過性病原性菌叢」という用語は、皮膚に付着しているがそこでは増殖しない微生物、または皮膚上で増殖し短期間存続する汚染菌を表す。具体的には、微生物を皮膚に塗布し、その微生物がその場所で、健康な皮膚によって与えられる環境条件下で生育および複製増殖することができず、この器官（もしくはその部位）に永続的に定着することができない場合、その微生物は一過性病原性菌叢に属すると見なされる。いくつかの細菌、酵母および真菌がヒトの皮膚から一過性に分離されることがあるが、特に次の微生物は、頻繁に出現するため、一過性菌叢に分類することができる：黄色ブドウ球菌、化膿レンサ球菌、グラム陰性桿菌（例、アシネトバクター・カルコアセティカス（Acinetobacter calcoaceticus））、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、およびマラセジア・フルフル（Malassezia furfur）。一過性菌叢の微生物は、その細菌が障害のある皮膚部位に付着することを可能にする病原因子を有することが多い。これは、たとえば、コラーゲン構造もしくはケラチン構造への付着でありうる。
【００３６】
一過性病原性菌叢の微生物は、たとえば、代謝フットプリンティング、脂肪酸組成および細胞壁組成の評価、16S リボソームRNAの配列決定、または特異的病原因子をコードする特異的DNAプローブの検出によって、判定することができる。
【００３７】
「一過性病原性菌叢の微生物の生育を刺激しない」とは、本発明の微生物が、一過性病原性菌叢の微生物のうち少なくとも1種、好ましくは2種以上、好ましくは3種以上、より好ましくは6種以上の生育を刺激せず、特に好ましくはそのいずれの生育も刺激しないことを意味する。
【００３８】
ある微生物が一過性病原性菌叢の微生物と接触したとき、その一過性病原性菌叢微生物の生育増加をもたらさないならば、その微生物は一過性病原性菌叢の微生物の生育を刺激しないと見なされる。生育刺激の有無は、皮膚常在菌叢の少なくとも1つの微生物の生育を刺激する本発明の微生物の特性に関連して前に述べたように、in vitroまたはin situで調べることができる。もっとも好ましくは、刺激の有無を決定するテストは、上記のように、より好ましくは実施例に記載のように、in vitroホールプレートアッセイおよび／またはin situ皮膚アッセイを実施することによって行われる。ある微生物と接触したときに、一過性病原性菌叢の微生物の生育が増加しない、またはわずかしか増加しないならば、その微生物は一過性病原性菌叢の微生物の生育を刺激しないと見なされる。「わずかに増加する」とは、生育の増加が対照と比較して5％以下であること、好ましくは対照と比較して2％以下であることを意味する。「増加しない」とは、本発明の微生物なしの対照と比較したとき、本発明の微生物と接触した一過性病原性菌叢の微生物の生育に、統計的に関連性のある差異が認められないことを意味する。好ましい実施形態において「増加しない」という表現は、ある微生物が実際には、一過性病原性菌叢の微生物の生育の減少をもたらす、すなわちそうした微生物の生育を抑制する場合も包含する。
【００３９】
別の好ましい実施形態において、本発明の微生物は、一過性病原性菌叢の微生物の生育に悪影響を及ぼさない。「悪影響を及ぼさない」とは、本発明の微生物なしの対照と比較したとき、本発明の微生物と接触した一過性病原性菌叢の微生物の生育阻害が認められないことを意味する。
【００４０】
さらに好ましい実施形態において、本発明の微生物は、一過性病原性菌叢の主要な代表的微生物である黄色ブドウ球菌の生育を刺激しない。ある微生物が黄色ブドウ球菌の生育を刺激するかどうかを判定するテストは、好ましくは上記のようなin vitroおよび／またはin situテストであるが、より好ましくは実施例に記載のテストである。
【００４１】
特に好ましい実施形態において、本発明の微生物は、乳酸菌群に属する微生物である。「乳酸菌群に属する微生物」という表現は、細菌に属する、特にグラム陽性の発酵性真正細菌に属する、より具体的には乳酸菌を含む乳酸桿菌科（Lactobacillaceae）に属する微生物を包含する。乳酸菌は、分類学的観点から、レンサ球菌属（Streptococcus）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、ペディオコッカス属（Pediococcus）およびラクトバチルス属（Lactobacillus）の下位分類に分けられる。乳酸菌群の仲間は通常、ポルフィリンおよびシトクロムを欠き、電子伝達リン酸化を行わないため、エネルギーは基質レベルのリン酸化によってのみ得られる。すなわち、乳酸菌では、ATPは、炭水化物の発酵によって合成される。乳酸菌はすべて嫌気的に生育するが、多くの嫌気性菌とは異なって、ほとんどの乳酸菌は酸素に対して感受性でないため、無酸素状態のみならず酸素の存在下でも生育することができる。したがって、本発明の細菌は好ましくは酸素耐性嫌気性乳酸菌であり、好ましくはラクトバチルス属に属す。
【００４２】
本発明の乳酸菌は、好ましくは、桿状もしくは球状で、細長いものから短く曲がった桿状までさまざまであり、さらに好ましくは、不動性および／または無胞子性であって、発酵代謝の主要な、もしくは唯一の産物として乳酸を生成する。好ましい実施形態において本発明の微生物が属するラクトバチルス属は、下記の特性によって3つの大きな下位群に分けられ、それによって本発明のラクトバチルス属菌は3つの大きな下位群のそれぞれに帰属することができると考えられる：
(a)ホモ発酵型乳酸桿菌
(i)グルコースから解糖（Embden-Meyerhof）経路を経て、少なくとも85％の量の乳酸、好ましくは乳酸のL-、D-もしくはDL-異性体を産生する；
(ii)45℃で生育するが、15℃では生育しない；
(iii)長桿状である；ならびに
(iv)細胞壁にグリセロールタイコ酸を有する；
(b)ホモ発酵型乳酸桿菌
(i)解糖経路を経て、乳酸、好ましくは乳酸のL-もしくはDL-異性体を産生する；
(ii) 15℃で生育するが、45℃では変化しやすい生育を示す；
(iii)短桿状もしくはコリネ型である；ならびに
(iv)細胞壁にリビトールおよび／またはグリセロールタイコ酸を有する；
(c)ヘテロ発酵型乳酸桿菌
(i) グルコースからペントースリン酸経路を経て、少なくとも50％の量の乳酸、好ましくは乳酸のDL-異性体を産生する；
(ii)二酸化炭素およびエタノールを生成する；
(iii) 15℃もしくは45℃で変化しやすい生育を示す；
(iv)長桿状もしくは短桿状である；ならびに
(v)細胞壁にグリセロールタイコ酸を有する。
【００４３】
上記の特性に基づいて、本発明の微生物を分類し、乳酸菌群、特にラクトバチルス属に帰属することができる。古典的な分類学を用いて、たとえば、"Bergey's Manual of Systematic Bacteriology" (Williams & Wilkins Co., 1984)の中の適切な記述を参照することによって、本発明の微生物がラクトバチルス属に属すると決定することができる。あるいはまた、本発明の微生物を、当技術分野で既知の方法、たとえば、代謝フットプリント、すなわち本発明の微生物が糖類を代謝する能力に関する比較可能な概要によって分類し、または、たとえばSchleifer et al., System. Appl. Microb., 18 (1995), 461-467 またはLudwig et al., System. Appl. Microb., 15 (1992), 487-501に記載の他の方法によって分類し、ラクトバチルス属に帰属することができる。本発明の微生物は、ラクトバチルス属に属する微生物に典型的で、当業者に知られている糖源を代謝することができる。
【００４４】
本発明の微生物のラクトバチルス属への帰属は、当技術分野で知られている他の方法、たとえば、決定されるべき種の全タンパク質のSDS-PAGEゲル電気泳動を用いて、それを既知のすでに性質の明らかなラクトバチルス属菌株と比較することによって検討することもできる。上記の全タンパク質プロファイルを調製する方法は、そうしたプロファイルの数値解析と同様に、当業者によく知られている。しかしながら、その結果は、プロセスの各段階が十分に標準化された範囲でのみ、信頼性がある。ラクトバチルス属に微生物の帰属を決定する際の、正確さの要求に直面して、標準化された方法が、1994年の9月12〜16日にベルギーのGhent大学で欧州連合によって開催された「ワークショップ」で提示されたPotらの方法のように、著者らによって通常、一般に公開されている（細菌の分類および同定のためのフィンガープリンティング法、全細胞タンパク質のSDS-PAGE）。SDS-PAGE電気泳動ゲルを分析する方法に使用されるソフトウェアは、種間の相関性の度合いがそのソフトウェアで用いられるパラメータおよびアルゴリズムに依存するので、きわめて重要である。理論的な詳細に立ち入ることなく、ピアソンの相関係数を用いて、デンシトメーターで測定され、コンピューターで正規化されたバンドの量的比較をすることが好ましい。こうして得られる相似行列は、もっとも類似したプロファイルを集めてグループ化するだけでなく樹状図を作成することも可能にするUPGMA(群平均法、unweighted pair group method using average linkage)アルゴリズムを用いて構築することができる（Kersters, Numerical methods in the classification and identification of bacteria by electrophoresis, in Computer-assisted Bacterial Systematics, 337-368, M. Goodfellow. A. G. O'Donnell Ed., John Wiley and Sons Ltd, 1985を参照されたい）。
【００４５】
あるいはまた、本発明の前記微生物のラクトバチルス属への帰属は、いわゆるリボプリンターRTMにおいてリボソームRNAに関して位置付けることができる。より好ましくは、本発明の新規同定菌種のラクトバチルス属への帰属は、本発明の細菌の16SリボソームRNA、もしくはその16SリボソームRNAをコードするゲノムDNAのヌクレオチド配列を、現在までに知られている他の属および種の乳酸菌の配列と比較することによって証明される。本発明の新規同定種のラクトバチルス属への帰属を決定する、もう一つの好ましい別法は、16S-23S rRNAスペーサー領域を標的とする種特異的PCRプライマーを使用することである。別の好ましい代案は、RAPD-PCR（Niqatu et al. in Antonie van Leenwenhoek (79), 1-6, 2001）であるが、これは種特異的DNAパターンが生じることによるものであって、このパターンは本発明により同定された微生物のラクトバチルス属への帰属を決定することを可能にする。本発明の微生物の、ラクトバチルス属への帰属を決定するのに有用な方法はそのほかに、制限断片長多型（RFLP）（Giraffa et al.. Int. J. Food Microbiol. 82 (2003), 163-172）、反復成分のフィンガープリンティング（Gevers et al.. FEMS Microbiol. Lett. 205 (2001) 31-36）、または細菌細胞の脂肪酸メチルエステル（FAME）パターンの解析（Heyrman et al.. FEMS Microbiol. Lett. 181 (1991), 55-62）がある。あるいはまた、乳酸桿菌は、レクチンの分類（Annuk et al.. J. Med. Microbiol. 50 (2001), 1069-1074）、または細胞壁タンパク質の分析（Gatti et al.. Lett. Appl. Microbiol. 25 (1997), 345-348）によって決定することができる。
【００４６】
本出願のある好ましい実施形態において、微生物はラクトバチルス属のプロバイオティック乳酸菌である。「プロバイオティック」という用語は、本発明との関連において、微生物を皮膚に局所適用した場合、その微生物が健康に有益な影響を及ぼすことを意味する。好ましくは、「プロバイオティック」微生物は、生きた微生物であって、皮膚に局所適用したときに、この組織の健康に有益である。もっとも好ましくは、このことは、微生物が皮膚菌叢にプラス効果を及ぼすことを意味する。
【００４７】
好ましい実施形態において、本発明の微生物は、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）またはラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）に属する。しかしながら、ラクトバチルス属菌は、それに限定されない。
【００４８】
本発明の特に好ましい実施形態において、本発明の微生物は、受託番号DSM 17248 (Lactobacillus paracasei ssp paracasei LB-OB-H2)、DSM 17247 (Lactobacillus brevis LB-OB-H 1)、DSM 17250 (Lactobacillus brevis LB-OB-H4)およびDSM 17249 (Lactobacillus fermentum LB-OB-H3)としてDSMZに寄託されたラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・ブレビスまたはラクトバチルス・ファーメンタムからなる一群から選択される。本発明はまた、上記の寄託されたラクトバチルス菌株の変異体もしくは誘導体に関するが、この変異体もしくは誘導体は、皮膚常在菌叢の少なくとも1つの微生物の生育を刺激する能力、ならびに一過性病原性菌叢の微生物の生育を刺激しないという特性を保持している。
【００４９】
「受託番号のもとでDSMZに寄託されているラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・ブレビスまたはラクトバチルス・ファーメンタム」という表現は、2005年4月18日付でDeutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)に寄託され、下記の寄託番号を有する、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・ブレビスまたはラクトバチルス・ファーメンタム菌種に属する微生物の細胞に関するものである：DSM 17248 (Lactobacillus paracasei ssp paracasei LB-OB-H02)、DSM 17247 (Lactobacillus brevis LB-OB-H01、DSM 17250 (Lactobacillus brevis LB-OB-H04)およびDSM 17249 (Lactobacillus fermentum LB-OB-H03)。DSMZの所在地は、Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germanyである。前記寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に従って行われた。
【００５０】
特に好ましい実施形態において、本発明の微生物は「単離」もしくは「純化」される。「単離する」という用語は、材料をその本来の環境から取り出す、たとえばそれが天然に存在するならば自然環境から、培養されたなら培地から取り出すことを意味する。たとえば、自然の体系において共存するものの一部もしくは全体から分離された、天然に存在する微生物、好ましくは、ラクトバチルス属菌は、単離されている。こうした微生物は、ある組成物の一部である可能性があるが、その組成物がその微生物の自然環境の一部ではないという点で、やはり単離されていると見なされるべきである。
【００５１】
「純化する」という用語は、絶対的純粋さを要求しない；むしろ、相対的な定義と考えられる。ライブラリから得られる個々の微生物は、通常、微生物学的に均一にまで純化されており、すなわち、こうした微生物は、当技術分野で既知の方法によって寒天プレート上に画線したとき、単一コロニー群として生育する。好ましくは、この目的で使用する寒天プレートはラクトバチルス属菌に選択的である。このような選択的寒天プレートは当技術分野で知られている。
【００５２】
もう一つの態様において、本発明は、本発明の微生物の不活化型に関するものであり、この不活化型は、たとえば、熱失活もしくは凍結乾燥を受けているが、皮膚常在菌叢の微生物の生育を刺激するものの一過性病原性菌叢の微生物の生育は刺激しないという特性を保持している。
【００５３】
本発明によれば、「本発明の微生物の不活化型」という用語は、本発明の微生物、好ましくは本明細書に記載のラクトバチルス属菌の、死んだ細胞もしくは不活化された細胞を包含するが、こうした細胞はもはや、ラクトバチルス属に属する微生物に特異的なプレート上で、単一コロニーを形成することができない。前記の死んだ細胞もしくは不活化細胞は、無傷な細胞膜を有するかもしれないし、壊れた細胞膜を有する可能性もある。本発明の微生物の細胞を死滅させる、または不活性化する方法は、当技術分野で知られている。El-Nezami et al. J. Food Prot. 61 (1998), 466-468は、UV照射によってラクトバチルス属菌を不活化する方法を記載する。本発明の微生物の細胞は、熱失活もしくは凍結乾燥することが好ましい。本発明の細胞の凍結乾燥は、皮膚常在菌叢の微生物の生育を刺激するが一過性病原性菌叢の微生物の生育は刺激しないという特性を保持する一方で、保存および取り扱いを容易に行うことができるという利点を有する。その上、凍結乾燥された細胞は、当技術分野で知られている条件下で、適当な液体もしくは固体培地に加えられたとき、再び生育することができる。凍結乾燥は、当技術分野で既知の方法によって実施される。好ましくは、室温で、すなわち16℃から25℃までの任意の温度で、少なくとも2時間行われる。さらに、本発明の微生物の凍結乾燥細胞は、4℃で少なくとも4週間、安定であり、上記の特性を依然として保持する。熱失活は、本発明の微生物の細胞を、少なくとも2時間、170℃でインキュベートすることによって行うことができる。さらに、熱失活は好ましくは、前記細胞を121℃で少なくとも20分間、大気圧2バールにて飽和水蒸気の存在下でオートクレーブ処理することによって達成される。別法において、本発明の微生物の細胞の熱失活は、少なくとも4週間、3週間、2週間、1週間、12時間,6時間、2時間もしくは1時間のあいだ、−20℃で前記細胞を凍結することによって達成される。本発明の微生物の不活化型の細胞の、少なくとも70％、75％または80％、より好ましくは85％、90％または95％、特に好ましくは少なくとも97％、98％、99％、より特に好ましくは99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％もしくは99.9％、ならびにもっとも特に好ましくは100％が、死んでいる、または不活化されているが、それらは依然として、皮膚常在菌叢の微生物の生育を刺激するものの一過性病原性菌叢の微生物の生育は刺激しないという能力を有することが好ましい。本発明の微生物の不活化型が実際に死んでいるか、または不活化されているかどうかは、当技術分野で知られている方法、たとえば、生死判別試験によってテストすることができる。
【００５４】
「本発明の微生物の不活化型」という用語は、本発明の微生物、好ましくは本明細書に記載のラクトバチルス属菌の、溶菌液もしくは画分を包含するが、この溶菌液もしくは画分は、好ましくは、皮膚常在菌叢の微生物の生育を刺激するものの、一過性病原性菌叢の微生物、具体的には本明細書に記載の黄色ブドウ球菌の生育は刺激しない。こうした刺激は、本明細書に記載のように、具体的には、実施例に記載のようにテストすることができる。念のため、本発明の微生物の溶菌液もしくは画分は、一過性病原性菌叢の微生物の生育を刺激する可能性があるので、当業者はたとえば、当技術分野で知られた方法によって、前記溶菌液もしくは画分をさらに精製することができるが、そうした方法は下記に例示されており、そのようにして一過性病原性菌叢の微生物の生育を刺激する可能性のある物質を除去することができる。その後、当業者は、前記溶菌液もしくは画分が皮膚常在菌叢の微生物の生育を刺激するが、一過性病原性菌叢の微生物の生育は刺激しないかどうか、その溶菌液もしくは画分を再度テストすることができる。
【００５５】
本発明によれば、「溶菌液」という用語は、破壊または抽出された、本発明の微生物の細胞の、水性溶媒中の溶液または懸濁液を意味する。しかしながら、この用語は限定的に解釈されるべきでない。細胞溶解液は、たとえば、DNA、RNA、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質などのような巨大分子、および／または、アミノ酸、糖、脂肪酸などのような極小分子、またはその一部分を含んでなる。それに加えて、前記溶菌液は、平滑構造もしくは粒状構造をとりうる細胞片を含む。微生物の細胞溶解液を調製する方法は当技術分野で知られており、たとえば、フレンチプレス、ガラスビーズもしくは鉄製ビーズによる細胞破砕ミル、または酵素による細胞溶解などを用いる。さらに、細胞の溶解は、細胞を切断／破壊するための、当業界で知られているさまざまな方法に関わる。細胞を溶解する方法は重要でなく、本発明の微生物の細胞の溶解を達成できる方法であれば用いることができる。当業者は適当な方法を選択することができるが、たとえば、細胞の切断／破壊は、酵素的、化学的または物理的に行うことができる。酵素および酵素混合物の限定的ではない例としては、プロテイナーゼKのようなプロテアーゼ、リパーゼ、もしくはグリコシダーゼがある；化合物の限定的でない例は、イオノフォア、ドデシル硫酸ナトリウムのような界面活性剤、酸、または塩基である；さらに物理的手段の限定的でない例には、フレンチプレス処理のような高圧、浸透圧、高温もしくは低温といった温度がある。加えて、タンパク質分解酵素以外の酵素、酸、塩基などの適当な組み合わせを用いた方法も利用することができる。たとえば、本発明の微生物の細胞は、凍結および融解、より好ましくは、−70℃未満の温度での凍結、および30℃を超える温度での融解によって溶解し、特に凍結は、−75℃未満の温度が好ましく、融解は35℃を超える温度が好ましいが、さらにもっとも好ましいのは−80℃未満の凍結温度、ならびに37℃を上まわる融解温度である。前記の凍結／融解を少なくとも１回、より好ましくは少なくとも2回、さらにより好ましくは少なくとも3回、特に好ましくは少なくとも4回、そしてもっとも好ましくは少なくとも5回繰り返すことも推奨される。
【００５６】
したがって、当業者は、上記の一般的な説明を参照し、必要ならば上記方法を適切に修正もしくは変更することによって、望ましい溶菌液を調製することができる。好ましくは、上記溶菌液に使用される水性溶媒は、水、生理食塩水、またはバッファー溶液である。細菌細胞溶解液の利点は、必要とされる技術設備が少ないので費用効率よく、容易に作製および保存できることである。
【００５７】
本発明によれば、溶菌液は、上記溶菌液に由来する分子の分画調製物でもある。こうした画分は、当業者に周知の方法、たとえば、クロマトグラフィー（例としてアフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ならびにカラムおよびバッチ法での他のクロマトグラフィー材料によるクロマトグラフィーなど）、他の分画法、例を挙げると、濾過法、たとえば限外濾過、透析、遠心分離におけるサイズ排除による透析および濃縮、密度勾配もしくはステップマトリックスによる遠心分離、沈澱、たとえばアフィニティ沈澱、塩入法もしくは塩析法（硫安沈澱）、アルコール沈澱、または他の、溶菌液の上記成分を分離できるタンパク質化学的、分子生物学的、生化学的、免疫学的、化学的もしくは物理学的方法によって得ることができる。好ましい実施形態において、他よりも免疫原性の高い画分が好ましい。当業者は、上記の一般的説明および本明細書の実施例における個別の説明を参照し、必要ならばその方法を適切に修正もしくは変更することによって、適当な方法を選択し、その免疫原性を測定することができる。
【００５８】
したがって、「本発明の微生物の不活性型」という用語はまた、本発明の微生物、好ましくは本明細書に記載のラクトバチルス属菌の濾液も包含するものであって、前記濾液は、好ましくは、一過性病原性菌叢の1つもしくは複数の微生物の、好ましくは黄色ブドウ球菌の生育を阻害するが、健康で正常な皮膚常在菌叢の微生物の生育は阻害しない。この阻害は、本明細書に記載のように、具体的には添付の実施例に記載のように、調べることができる。念のため、本発明の微生物の濾液は、一過性病原性皮膚菌叢の微生物の生育を阻害することも刺激することもない可能性があるが、当業者は、たとえば、一過性病原性皮膚菌叢の微生物の生育を刺激する可能性のある物質を除去するために、当技術分野で周知の方法によって前記濾液をさらに精製することができる。その後、当業者は、再び前記濾液を、一過性病原性皮膚菌叢の微生物の生育は阻害するが皮膚常在菌叢の微生物の生育は阻害しないかどうか調べることができる。
【００５９】
「濾液」という用語は、当業者に周知の任意の適当な液体、培地、もしくはバッファー中で、本発明の微生物培養物の遠心分離操作の上清として得られた、本発明の微生物の無細胞溶液もしくは懸濁液を表す。しかしながら、この言葉は限定的に解釈されるべきではない。濾液は、たとえば、DNA、RNA、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質などのような巨大分子、および／または、アミノ酸、糖、脂肪酸などのような極小分子、またはその一部分を包含する。微生物の濾液を調製する方法は当技術分野で知られている。さらに、「濾液」は、当技術分野で周知のさまざまな方法に関わる。正確な方法は重要ではなく、本発明の微生物の細胞の濾液を実現することができる任意の方法を用いることができる。
【００６０】
「本発明の微生物の不活性型」という用語は、本発明の微生物の細胞の、任意の部分を包含する。好ましくは、前記不活性型は、膜調製物によって得られる膜画分である。ラクトバチルス属に属する微生物の膜調製物は、当技術分野で周知の方法によって、たとえば、Rollan et al.. Int. J. Food Microbiol. 70 (2001), 303-307、Matsuquchi et al.. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10 (2003), 259-266 またはStentz et al., Appl. Environ. Microbiol. 66 (2000), 4272-4278 またはVarmanen et al.. J. Bacteriology 182 (2000), 146-154に記載の方法を用いることによって得ることができる。あるいはまた、ホールセル調製物も想定される。
【００６１】
別の態様において、本発明は、上記の本発明の微生物、またはこの微生物の変異体、誘導体、もしくは不活性型を含んでなる組成物に関する。好ましい実施形態において、前記組成物は、固形の組成物中にmg当たり102から1012まで、好ましくは103から108までの細胞数の、上記の微生物を含んでなる。液体状の組成物の場合、微生物の量は、ml当たり102から1013までの細胞数である。さらに好ましい実施形態において、前記組成物は、乳濁液、たとえば、水中油型もしくは油中水型乳濁液、軟膏、またはマイクロカプセルの形をとる。乳濁液、軟膏、またはマイクロカプセルの場合、組成物は、ml当たり102から1013までの細胞数の、本明細書に記載の微生物を含んでなる。しかしながら、個別の組成物について、微生物の量は、本明細書に記載のように異なることがある。
【００６２】
さらに別の態様において、本発明は、上記の本発明の微生物、またはこの微生物の変異体、誘導体もしくは不活性型を、化粧品もしくは医薬品として許容される担体もしくは添加剤とともに製剤化するステップを含んでなる、病原微生物から皮膚を保護するための組成物の製造方法を提供する。
【００６３】
本発明にしたがって使用される「組成物」という用語は、少なくとも1つの本発明の微生物、または前記微生物の変異体、誘導体もしくは不活性型を含んでなる（1つまたは複数の）組成物に関するものである。以下に記載される本発明の組成物は、前記の成分を任意の組み合わせで含んでなると想定される。状況に応じて、皮膚を病原微生物から保護するのに適した、少なくとも1つの追加成分を含んでもよい。したがって、組成物は、状況に応じて、下記の追加成分を任意の組み合わせで包含することができる。「皮膚を病原微生物から保護するのに適した成分」という表現は、pHを低下させる化合物もしくは組成物、および／またはそれらの組み合わせを包含する。
【００６４】
組成物は、固体、液体、もしくは気体の状態とすることができるが、特に、粉末、溶液、エアロゾル、懸濁液、乳濁液、液体、エリキシル剤、エキス剤、チンキ剤もしくは流エキス剤の形態、または局所適用に特に適した形をとることができる。局所適用に適した形には、たとえば、ペースト、軟膏、ローション、クリーム、ジェル、もしくは経皮パッチがある。
【００６５】
好ましくは、本発明の組成物は、化粧品として許容される担体もしくは添加剤をさらに含んでなる、化粧品組成物である。より好ましくは、前記化粧品組成物は、ペースト、軟膏、ローション、クリームもしくはジェルである。
【００６６】
本発明の化粧品組成物は、本発明の組成物に関して上に記載したように、本発明の微生物、その変異体、誘導体、または不活性型を含んでなり、さらに化粧品として許容される担体を追加して含んでなる。好ましくは、本発明の化粧品組成物は、局所適用で用いられる。
【００６７】
本明細書で使用される「化粧品として許容される担体」という表現は、本発明の組成物を安全で効果的に、皮膚に適用するために使用することができる、適当なビヒクルを意味する。こうしたビヒクルには、乳濁液、たとえば、水中油型もしくは油中水型エマルジョン、軟膏、またはマイクロカプセルといった材料を含めることができる。活性成分をカプセル化された形で、たとえば、セルロースカプセル化として、ゼラチン中で、ポリアミド、ニオソーム、ワックスマトリックスとともに、シクロデキストリンとともに、またはリポソームでカプセル化して、投与することも有効である。本明細書で使用される「安全で有効な量」という用語は、皮膚常在菌叢の少なくとも1つの微生物の生育を刺激するのに十分な量を意味する。
【００６８】
もう一つの態様において、本発明は、上記の本発明の微生物、またはその誘導体もしくは変異体もしくは不活性型を含んでなり、製薬上許容される担体もしくは添加剤をさらに含んでなる、医薬組成物に関する。医薬組成物は好ましくは、局所適用に適した形をとる。
【００６９】
さらに、本発明は、上記のような本発明の微生物、またはその誘導体もしくは変異体もしくは不活性型を、組成物、好ましくは医薬もしくは化粧品組成物の調製に使用することに関する。
【００７０】
医薬組成物は、治療上有効な量の、上記の本発明の微生物、または本発明の前記微生物の誘導体もしくは変異体もしくは不活性型を上記のように含んでなるが、たとえば、固体、液体、粉末、水溶液、凍結乾燥品のようにさまざまな形に製剤化することができる。
【００７１】
医薬組成物は、本明細書に記載のように、製薬上許容される担体とともに患者に投与することができる。具体的な実施形態において、「製薬上許容される」という用語は、動物、より具体的にはヒトに使用するために、監督官庁もしくは他の一般に認められた薬局方によって承認されていることを意味する。
【００７２】
「担体」という用語は、治療薬とともに投与される希釈剤、補助剤、添加剤、もしくはビヒクルを指す。こうした担体は製薬上許容されている、すなわち、用いられる投与量および濃度でレシピエントに対して毒性がない。これは、好ましくは、等張性、低張性、もしくは弱い高張性であり、ショ糖溶液によって与えられるように、相対的に低いイオン強度を有する。こうした医薬品担体は、水および油のような無菌の液体とすることができるが、これには、石油、動物、植物、もしくは合成起源のもの、たとえば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などが含まれる。塩類溶液およびデキストロース溶液およびグリセロール溶液も、液体担体として使用することができる。適当な医薬品添加剤には、デンプン、ブドウ糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、ナトリウムイオン、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどがある。組成物は、必要ならば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤も含有することができる。こうした組成物は、たとえば、溶液、懸濁液、乳濁液、粉末、徐放性製剤などの形をとることができる。適当な医薬品担体の例は、E.W. Martinによる"Remington's Pharmaceutical Sciences"に記載されている。医薬品担体として機能しうる物質の、他の例には、ブドウ糖およびショ糖といった糖類；コーンスターチおよびジャガイモデンプンのようなデンプン；セルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースといったその誘導体；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；ステアリン酸；ステアリン酸マグネシウム；硫酸カルシウム；炭酸カルシウム；ピーナッツ油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油およびカカオ脂といった植物油；プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールといったポリオール類；寒天；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張食塩水；クランベリー抽出物およびリン酸バッファー溶液；脱脂粉乳；ならびに医薬品製剤に使用される、他の毒性のない適合物質、たとえば、ビタミンC、エストロゲンおよびエキナシアがある。湿潤剤および滑沢剤、たとえばラウリル硫酸ナトリウム、ならびに着色剤、香料、潤滑剤、賦形剤、打錠剤、安定化剤、抗酸化剤および防腐剤も入れることができる。活性成分をカプセル化された形で、たとえば、セルロースカプセル化として、ゼラチン中で、ポリアミド、ニオソーム、ワックスマトリックスとともに、シクロデキストリンとともに、またはリポソームでカプセル化して、投与することも有利である。
【００７３】
一般に、成分は、別々に提供されるか、あるいは単位投薬剤形として混合され、たとえば、凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、活性物質の量を表示したアンプルもしくは小袋のような密閉容器に入れて提供されるかのいずれかである。
【００７４】
本発明の医薬組成物は、中性型もしくは塩型として製剤化することができる。製薬上許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるような、陰イオンとともに形成される塩、ならびに、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されるような、陽イオンとともに形成される塩がある。
【００７５】
たとえば実施例に記載のようなin vitroもしくはin situアッセイを用いて、場合によっては、最適な投薬量の範囲を確定する一助とすることができる。製剤に用いられるべき正確な用量はまた、投与経路、および疾病もしくは障害の重さに依存するものであり、医師の判断ならびに各々の患者の状況に応じて決定されるべきである。局所経路の投与が好ましい。有効な用量は、in vitroもしくは（動物）モデル試験系から得られる用量反応曲線から外挿することができる。好ましくは、医薬組成物は、そのまま、もしくは補助剤と組み合わせて、投与される。補助剤は、クロロキン、プロトン性極性化合物、たとえば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール、エタノール、1 -メチル L-2-ピロリドン、もしくはそれらの誘導体、または非プロトン性化合物、たとえば、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ジエチルスルホキシド、ジ-n-プロピルスルホキシド、ジメチルスルホン、スルホラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、テトラメチル尿素、アセトニトリル、もしくはそれらの誘導体からなる一群から選択することができる。これらの化合物は、pH限界を考慮した条件で加えられる。本発明の組成物は、脊椎動物に投与することができる。本明細書で使用される「脊椎動物」は、当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有するものとする。特に、「脊椎動物」は哺乳類を包含し、より具体的にはヒトを包含する。
【００７６】
「投与する」という用語は、治療上有効な用量の前記組成物の投与を意味する。「治療上有効な量」は、投与のねらいとする効果を引き起こす用量を意味し、好ましくは、こうした効果は、病原微生物からの皮膚の保護である。正確な用量は、治療目的によって決まるものであり、当業者は既知の方法によってこれを確認することができる。当技術分野で知られているように、また上記のように、全身もしくは局所デリバリー、年齢、体重、全身状態、性別、食事、投与時期、薬物相互作用および病気の程度に対して調整は必要となるが、当業者は通常の実験によってこれを確認することができる。
【００７７】
本方法はヒトの治療にも獣医学的適用にも応用可能である。望ましい治療活性を有する本明細書に記載の化合物を、本明細書に記載のように、生理学的に許容される担体中で患者に投与することができる。投与形式に応じて、化合物を、下記のようにさまざまな方法で製剤化することができる。治療上活性のある化合物の製剤中の濃度は、約0.01から100重量％までさまざまとすることができる。この薬剤は単独で、または他の治療と併せて、投与することができる。
【００７８】
医薬組成物の投与は、さまざまな方法で行うことができる。好ましい投与経路は、局所経路である。
【００７９】
主治医および臨床学的ファクターによって投与計画が決定される。医学分野でよく知られているように、どの患者に対する投薬量も、患者の身体の大きさ、体表面積、年齢、投与される個別の化合物、性別、投与の時間および経路、全身状態、および同時に投与されている他の薬物などの、多くの要因に左右される。典型的な用量は、たとえば、0.001から1000μgである；しかしながら、特に前記要因を考慮すると、こうした典型的な範囲より少ない、もしくは多い用量が想定される。
【００８０】
投薬は、好ましくは週1回、より好ましくは、週2回、3回、4回、5回、もしくは6回行われるが、もっとも好ましくは毎日、さらにそれより好ましくは1日2回もしくはより頻回に行われる。具体的には、たとえば洗浄によって、皮膚常在菌叢の障害が起こるたびに、その後に投薬を行うことが好ましいと考えられる。しかしながら、治療の経過中に、もっとずっと長い時間間隔で投薬を行うことができ、必要ならばもっとずっと短い時間間隔で、たとえば1日数回与えることができる。好ましい場合において、本明細書に記載の方法、および当業者に知られた別の方法を用いて、免疫応答をモニターして、たとえば、時間、量、および／または組成物について投薬を最適化する。定期的な評価によって経過をモニターすることができる。併用療法のアプローチにおいて、すなわち他の薬剤もしくは薬物、たとえば病原微生物から皮膚を保護する他の薬物との同時投与で、医薬組成物を用いることも想定される。
【００８１】
本発明の化粧品もしくは医薬組成物の局所投与は、望ましい処置が局所投与によって容易に接近できる領域もしくは器官に関わる場合に、有用である。皮膚に局所的に適用するために、医薬組成物は、好ましくは、適当なペースト、軟膏、ローション、クリーム、ジェルもしくは経皮パッチとして製剤化される。化粧品もしくは医薬品は、使用分野に応じて、スプレー（ポンプスプレーもしくはエアロゾル）、フォーム、ジェルスプレー、ムース、懸濁液もしくは粉末の形をとることができる。
【００８２】
適当なペーストは、担体中に懸濁した活性成分を含んでなる。こうした担体には、石油、白色軟パラフィン、黄色ワセリンおよびグリセロールがあるが、それらに限定されない。
【００８３】
化粧品もしくは医薬組成物は、担体中に懸濁または溶解した活性成分を含んでなる、適当な軟膏として製剤化することもできる。こうした担体には、グリセロール、鉱油、液体油、石油、白色ワセリン、黄色ワセリン、プロピレングリコール、アルコール、トリグリセリド、セチルエステルのような脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、白蝋および黄色蜜蝋のようなワックス、セチルアルコール、ステアリルアルコールおよびセチルステアリルアルコールのような脂肪アルコール、ステアリン酸のような脂肪酸、ステアリン酸セチル、ラノリン、水酸化マグネシウム、カオリン、および水のうち1つもしくは複数が含まれるが、それらに限定されない。あるいはまた、化粧品もしくは医薬組成物は、担体中に懸濁または溶解した活性成分を含んでなる適当なローションもしくはクリームとして製剤化することもできる。こうした担体には、パラフィンのような鉱油、ヒマシ油および硬化ヒマシ油のような植物油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート、セチルエステルのような脂肪酸エステル、ワックス、セチルアルコール、ステアリルアルコール、2-オクチルドデカノール、ベンジルアルコールのような脂肪アルコール、アルコール、トリグリセリド、および水のうち1つもしくは複数が含まれるが、それらに限定されない。
【００８４】
あるいはまた、化粧品もしくは医薬組成物はまた、担体中に懸濁または溶解した活性成分を含んでなる適当なジェルとして製剤化することができる。こうした担体には、水、グリセロール、プロピレングリコール、流動パラフィン、ポリエチレン、脂肪油、セルロース誘導体、ベントナイト、およびコロイド状二酸化ケイ素のうち1つもしくは複数が含まれるが、それらに限定されない。
【００８５】
本発明のエアロゾルに適した噴射剤は、通常の噴射剤、たとえば、プロパン、ブタン、ペンタンなどである。
【００８６】
本発明の製剤は、一般に、そうした製剤に通例使用される助剤をさらに含むことができるが、これはたとえば、防腐剤、香料、消泡剤、色素、顔料、増粘剤、界面活性物質、乳化剤、皮膚軟化薬、表面処理剤、脂肪、油、ワックス、または他の化粧用もしくは皮膚用製剤の慣用成分、たとえば、アルコール、ポリオール、ポリマー、気泡安定剤、溶解促進剤、電解質、有機酸、有機溶媒、もしくはシリコーン誘導体である。
【００８７】
本発明の化粧品もしくは医薬組成物は、皮膚軟化薬を包含してもよい。乾燥を防止する、または軽減するために有効な量の皮膚軟化薬を使用することができる。有用な皮膚軟化薬には下記があるが、それらに限定されない：炭化水素油およびワックス；シリコーン油；トリグリセリドエステル；アセトグリセリドエステル；エトキシル化グリセリド；アルキルエステル；アルケニルエステル；脂肪酸；脂肪アルコール；脂肪アルコールエーテル；エーテルエステル；ラノリンおよび誘導体；多価アルコール（ポリオール）およびポリエーテル誘導体；多価アルコール（ポリオール）エステル；ワックスエステル；蜜蝋誘導体、植物蝋；リン脂質；ステロール；ならびにアミド。
【００８８】
このように、たとえば、典型的な皮膚軟化薬としては、鉱油、特に50から500 SUSまでの範囲の粘性を有する鉱油、ラノリン油、ミンク油、ココナッツ油、カカオバター、オリーブ油、アーモンド油、マカダミアナッツ油、アロエ抽出物、ホホバ油、紅花油、コーン油、液状ラノリン、綿実油、ピーナッツ油、PurCellin Oil（ピュアセリンオイル）、ペルヒドロスクアレン（スクアレン）、ヒマシ油、ポリブテン、無臭ミネラルスピリット、甘扁桃油、アボカド油、カロフィラム油、リシン油、ビタミンE酢酸エステル、オリーブ油、ミネラルスピリット、セテアリールアルコール（主としてセチルおよびステアリルアルコールからなる脂肪アルコール混合物）、リノレニルアルコール、オレイルアルコール、オクチルドデカノール、小麦胚芽のような穀物胚芽の油、オクタン酸セテアリール（セテアリールアルコールと2-エチルヘキサン酸のエステル）、パルミチン酸セチル、アジピン酸ジイソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、パルミチン酸オクチル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ブチル、ステアリン酸グリセリル、ステアリン酸ヘキサデシル、ステアリン酸イソセチル、ステアリン酸オクチル、ヒドロキシステアリン酸オクチル、ステアリン酸プロピレングリコール、ステアリン酸ブチル、オレイン酸デシル、オレイン酸グリセリル、アセチルグリセリド、(C12〜C15)アルコールのオクタン酸および安息香酸エステル、アルコールおよびポリアルコールのオクタン酸およびデカン酸エステル、たとえば、グリコールおよびグリセロールのエステル、ならびにアルコールおよびポリアルコールのリシノール酸エステル、たとえば、アジピン酸イソプロピル、ラウリン酸ヘキシル、ドデカン酸オクチル、ジメチコンコポリオール、ジメチコノール、ラノリン、ラノリンアルコール、ラノリンワックス、水添ラノリン、ヒドロキシル化ラノリン、アセチル化ラノリン、ペトロラタム、ラノリン脂肪酸イソプロピル、ミリスチン酸セチル、ミリスチン酸グリセリル、ミリスチン酸ミリスチル、乳酸ミリスチル、セチルアルコール、イソステアリルアルコール、ステアリルアルコール、およびラノリン脂肪酸イソセチルなどが挙げられる。
【００８９】
さらに、本発明の化粧品もしくは医薬組成物は乳化剤を包含してもよい。好ましくは組成物の成分の均一な混合をもたらすために有効な量の乳化剤（すなわち乳化作用のある物質）が使用される。有用な乳化剤には、(i)陰イオン性、たとえば脂肪酸石鹸、例としてはステアリン酸カリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸アンモニウム、およびステアリン酸トリエタノールアミン；脂肪酸石鹸を含むポリオール脂肪酸モノエステル、たとえば、カリウムもしくはナトリウム塩のいずれかを含有するモノステアリン酸グリセロール；硫酸エステル（ナトリウム塩）、たとえば、ラウリル硫酸ナトリウム、およびセチル硫酸ナトリウム；ならびに硫酸エステルを含有するポリオール脂肪酸モノエステル、たとえば、ラウリル硫酸ナトリウムを含有するモノステアリン酸グリセリル；(ii)陽イオン性、たとえば、N（ステアロイルコラミノホルミルメチル）ピリジウムクロリド； N-ソイ-N-エチルモルホリニウムエトサルフェート；アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ジイソブチルフェノキシエトキシエチルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；およびセチルピリジウムクロリド；ならびに(iii)非イオン性、たとえば、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル、たとえば、モノステアレート；ポリオキシエチレンラウリルアルコール；ポリオキシプロピレン脂肪アルコールエーテル、たとえば、プロポキシル化オレイルアルコール；ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、たとえば、ステアリン酸ポリオキシエチレン；ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、たとえば、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン；ソルビタン脂肪酸エステル、たとえば、ソルビタン；ポリオキシエチレングリコール脂肪酸エステル、たとえば、モノステアリン酸ポリオキシエチレングリコール；ならびにポリオール脂肪酸エステル、たとえば、モノステアリン酸グリセリル、およびモノステアリン酸プロピレングリコール；さらにエトキシル化ラノリン誘導体、たとえば、エトキシル化ラノリン、エトキシル化ラノリンアルコールおよびエトキシル化コレステロールがある。乳化剤の選択は、典型的には、Schrader, Grundlagen und Rezepturen der Kosmetika, Huethig Buch Verlag, Heidelberg, 第2版、1989、第3部に記載されている。
【００９０】
本発明の化粧品もしくは医薬組成物はまた、界面活性剤を包含することができる。適当な界面活性剤としては、たとえば、一般に洗浄剤、乳化剤、増泡剤、ハイドロトロープ、可溶化剤、懸濁化剤および非界面活性剤（固体の液体中での分散を促進する）として分類される界面活性剤がある。
【００９１】
界面活性剤は通常、両性、陰イオン性、陽イオン性および非イオン性界面活性剤として分類される。両性界面活性剤には、アシルアミノ酸および誘導体、ならびにN-アルキルアミノ酸がある。陰イオン性界面活性剤には：アシルアミノ酸および塩、たとえば、アシルグルタミン酸塩、アシルペプチド、アシルサルコシン酸塩、およびアシルタウリン塩；カルボン酸および塩、たとえば、アルカン酸、カルボン酸エステル、およびカルボン酸エーテル；スルホン酸および塩、たとえば、アシルイセチオン酸塩、アルキルアリールスルホン酸塩、アルキルスルホン酸塩、およびスルホコハク酸塩；硫酸エステル、たとえば、アルキルエーテル硫酸塩およびアルキル硫酸塩が含まれる。陽イオン性界面活性剤には：アルキルアミン、アルキルイミダゾリン、エトキシル化アミン、および4級アンモニウム化合物（たとえば、アルキルベンジルジメチルアンモニウム塩、アルキルベタイン、複素環式アンモニウム塩、およびテトラアルキルアンモニウム塩）がある。さらに、非イオン性界面活性剤には：アルコール、たとえば8〜18炭素原子を含む一級アルコール；アルカノールアミド、たとえば、アルカノールアミン誘導アミドおよびエトキシル化アミド；アミンオキシド；エステル、たとえばエトキシル化カルボン酸、エトキシル化グリセリド、グリコールエステルおよび誘導体、モノグリセリド、ポリグリセリルエステル、多価アルコールエステルおよびエーテル、ソルビタン／ソルビトールエステル、およびリン酸のトリエステル；ならびにエーテル、たとえば、エトキシル化アルコール、エトキシル化ラノリン、エトキシル化ポリシロキサン、およびプロポキシル化ポリオキシエチレンエーテルがある。
【００９２】
さらに、本発明の化粧品もしくは医薬組成物は皮膜形成剤を含むことができる。本発明にしたがって使用される適当な皮膜形成剤は、組成物を滑らかで均一に保つものであって、限定はしないが、下記のものがある：アクリルアミド／アクリル酸ナトリウムコポリマー；アクリル酸アンモニウムコポリマー；バルサムペル；セルロースガム；エチレン／無水マレイン酸コポリマー；ヒドロキシエチルセルロース；ヒドロキシプロピルセルロース；ポリアクリルアミド；ポリエチレン；ポリビニルアルコール； pvm/MA コポリマー（ポリビニルメチルエーテル／無水マレイン酸）； PVP（ポリビニルピロリドン)；無水マレイン酸コポリマー、たとえば、Gulf Science and Technology から入手可能なPA-18； PVP/ヘキサデセンコポリマー、たとえば、GAF Corporation から発売されているGanex V-216；アクリル／アクリル酸コポリマー；など。
【００９３】
一般に皮膜形成剤は、組成物全体に対する重量比で約0.1％から約10％までの量を使用することができるが、約1％から約8％までが好ましく、約0.1％から約5％までがもっとも好ましい。湿潤剤も有効な量を使用することができるが、これには、果糖；ブドウ糖；グルタミン酸；グリセリン；ハチミツ；マルチトール；メチルグルセス-10；メチルグルセス-20；プロピレングリコール；乳酸ナトリウム；ショ糖；などがある。
【００９４】
もちろん、本発明の化粧品もしくは医薬組成物は防腐剤を含むことができる。本発明の特定の組成物の防腐剤は、下記を包含するがそれに限定されない：ブチルパラベン；エチルパラベン；イミダゾリジニル尿素；メチルパラベン；O-フェニルフェノール；プロピルパラベン；クォータニウム-14；クォータニウム-15；デヒドロ酢酸ナトリウム；ジンクピリチオン；など。
【００９５】
防腐剤は、微生物の生育を防止もしくは遅延させるのに有効な量が用いられる。一般に、防腐剤は、組成物全体に対する重量比で約0.1％から約1％までの量を使用することができるが、約0.1％から約0.8％までが好ましく、約0.1％から約0.5％までがもっとも好ましい。
【００９６】
本発明の化粧品もしくは医薬組成物はまた、香料を含んでいてもよい。本発明の組成物に望ましい芳香および色を与えるのに有効な量の、当業者に周知の香料（芳香化合物）および着色料（着色剤）を使用することができる。
【００９７】
さらに、本発明の化粧品もしくは医薬組成物は、ワックスも含んでなることができる。本発明に有用な、適当なワックスには：動物ワックス、たとえば、蜜蝋、鯨蝋、もしくは羊毛ワックス（ラノリン）；植物ワックス、たとえば、カルナウバもしくはカンデリラ；ミネラルワックス、たとえば、モンタンワックスもしくはオゾケライト；ならびに石油ワックス、たとえば、パラフィンワックスおよびマイクロクリスタリンワックス（高分子量石油ワックス）がある。動物ワックス、植物ワックスおよび一部のミネラルワックスは、高分子量脂肪アルコールの高分子量脂肪酸との一級エステルである。たとえば、トリコンタノールのヘキサデカン酸エステルは、蜜蝋の主成分であると一般に報告されている。本発明の他の適当なワックスとしては、ポリエチレンポリオキシエチレン、ならびに一酸化炭素および水素から誘導された炭化水素ワックスなどの合成ワックスがある。
【００９８】
代表的なワックスには、次のようなものも含まれる：セロシン（cerosin）；セチルエステル；水添ホホバ油；水添ホホバワックス；水添米ぬかワックス；木蝋；ホホババター；ホホバ油；ホホバワックス；ミンクワックス；モンタン酸ワックス；オウリキュリー（ouricury）ワックス；米ぬかワックス；シェラックワックス；硫化ホホバ油；合成蜜蝋；合成ホホバ油；トリヒドロキシステアリン；セチルアルコール；ステアリルアルコール；カカオバター；ラノリンの脂肪酸；25℃で固体である、モノ-、ジ-、およびトリグリセリド、たとえば、トリベヘン酸グリセリル（ベヘン酸およびグリセリンのトリエステル）およびC1g-C36酸トリグリセリド（C1g-C36カルボン酸およびグリセリンのトリエステルの混合物）、それぞれCroda, Inc., New York, N.Y.から商標名Syncrowax HRC およびSyncrowax HGL-Cとして発売されている；25℃で固体である脂肪酸エステル；シリコーンワックス、たとえば、メチルオクタデカンオキシポリシロキサンおよびポリ（ジメチルシロキシ）ステアロキシシロキサン；ステアリル・モノ-およびジ-エタノールアミド；ロジンおよびその誘導体、たとえば、グリコールおよびグリセロールのアビエチン酸エステル；25℃で固体の硬化油；ならびにスクログリセリド。水性の系において有効な量を使用することができる増粘剤（粘度調整剤）には次のようなものがある：アルギン；カルボマー、たとえば、カルボマー934, 934P, 940 および941；セルロースガム；セテアリルアルコール；コカミドDEA；デキストリン；ゼラチン；ヒドロキシエチルセルロース；ヒドロキシプロピルセルロース；ヒドロキシプロピルメチルセルロース；ケイ酸マグネシウムアルミニウム；ミリスチルアルコール； エンバク粉；オレアミドDEA；オレイルアルコール；PEG-7M；PEG-14M；PEG-9OM；ステアラミドDEA；ステアラミドMEA；ステアリルアルコール；トラガカントゴム；コムギデンプン；キサンタンガム；などであるが、上記の増粘剤のリストにおいて、DEAは、ジエタノールアミンであり、MEAは、モノエタノールアミンである。非水系において有効な量を使用することができる増粘剤（粘度調整剤）には、ステアリン酸アルミニウム；蜜蝋；カンデリラワックス；カルナウバ；セレシン；セテアリルアルコール；セチルアルコール；コレステロール； 含水ケイ酸；水添ヒマシ油；水添綿実油；水添ダイズ油；水添牛脂脂肪酸グリセリド；水添植物油；ヒドロキシプロピルセルロース；ラノリンアルコール；ミリスチルアルコール；オクチルドデシルステアロイル硫酸；オレイルアルコール；オゾケライト；マイクロクリスタリンワックス；パラフィン；テトラオクタン酸ペンタエリスリチル；ポリアクリルアミド；ポリブテン；ポリエチレン；ジカプリル酸プロピレングリコール；ジペラルゴン酸プロピレングリコール；ステアラルコニウムヘクトライト；ステアリルアルコール；ステアリン酸ステアリル；合成蜜蝋；トリヒドロキシステアリン；トリリノレイン；トリステアリン；ステアリン酸亜鉛；などがある。
【００９９】
製剤において慣例の天然および合成増粘剤もしくはゲル生成剤は、架橋されたポリアクリル酸およびその誘導体、多糖類、たとえばキサンタンガムもしくはアルギン酸塩、カルボキシメチルセルロースもしくはヒドロキシカルボキシメチルセルロース、親水コロイド、たとえばアラビアゴムもしくはモンモリロナイト鉱物、たとえば、ベントナイトもしくは脂肪アルコール、ポリビニルアルコール、およびポリビニルピロリドンである。
【０１００】
本発明の化粧品もしくは医薬組成物に、目的とする用途に有効な量を添加もしくは使用することができる他の成分としては：性能や消費者アピールを高めるための生物学的添加物、たとえば、アミノ酸、タンパク質、バニラ、アロエ抽出物、バイオフラボノイドなど；緩衝剤、キレート剤、たとえば、EDTA；乳化安定剤；pH調整剤； 乳白剤；ならびに噴射剤、たとえば、ブタン、二酸化炭素、エタン、ヒドロクロロフルオロカーボン22 および142b、ヒドロフルオロカーボン152a、イソブタン、イソペンタン、窒素、亜酸化窒素、ペンタン、プロパンなどが挙げられる。
【０１０１】
さらに、本発明の製剤は、その作用を補い、または強めるために、抗酸化剤、フリーラジカルスカベンジャー、皮膚湿潤もしくは保湿、抗紅斑、抗炎症、または抗アレルギー作用を有する化合物も含むことができる。具体的には、こうした化合物は、ビタミン類、植物抽出物、α-およびβ-ヒドロキシ酸、セラミド、抗炎症性、抗菌性もしくはUVフィルタリング物質、ならびにそれらの誘導体およびそれらの混合物からなる一群から選択することができる。有利なことに、本発明の製剤は、UV-Bおよび／またはUV-A領域の紫外線を吸収する物質も含むことができる。脂質相は、鉱油、ミネラルワックス、分岐および／または非分岐炭化水素および炭化水素ワックス、飽和および／または不飽和、分岐および／または非分岐C8-C24アルカンカルボン酸からなる物質群から有利に選択される；これらは、合成、半合成、もしくは天然の油、たとえば、オリーブ油、パーム油、アーモンド油もしくは混合物；油、脂もしくはワックス、飽和および／または不飽和、分岐および／または非分岐C3-C30アルカンカルボン酸と飽和および／または不飽和、分岐および／または非分岐C3-C30アルコールのエステル、芳香族カルボン酸と飽和および／または不飽和、分岐および／または非分岐C3-C30アルコールからのエステル、たとえば、ミリスチン酸イソプロピル、ステアリン酸イソプロピル、ステアリン酸ヘキシルデシル、オレイン酸オレイル；ならびにまた、こうしたエステルの、合成、半合成、または天然の混合物、たとえば、ホホバ油、アルキル安息香酸エステルもしくはシリコーン油、たとえば、シクロメチコン、ジメチルポリシロキサン、ジエチルポリシロキサン、オクタメチルシクロ・テトラシロキサン、およびそれらの混合物、またはジアルキルエーテルから選択することができる。
【０１０２】
本発明の活性成分を、たとえば、皮膚の洗浄用の化粧品組成物、たとえば、固形石鹸、化粧石鹸、含核石鹸、透明石鹸、高級石鹸、脱臭石鹸、クリーム石鹸、ベビーソープ、皮膚保護石鹸、研磨剤、合成洗剤、液状石鹸、練り石鹸、軟石鹸、洗浄ペースト、液体洗浄、シャワーおよび浴用化粧品、たとえば、洗浄ローション、シャワー剤、シャワージェル、泡風呂入浴剤、クリーム泡風呂入浴剤、オイルバス、浴用エキス、スクラブ剤、in situ製品、シェービングフォーム、シェービングローション、シェービングクリームに使用することができる。さらに、本発明の活性成分は、皮膚の化粧品に適しており、これはたとえば、W/OもしくはO/Wスキンクリームおよびボディクリーム、デイクリームおよびナイトクリーム、光防護組成物、アフターサン製品、ハンドケア製品、フェイスクリーム、多重エマルション、ジュレ、マイクロエマルション、リポソーム製剤、ニオソーム製剤、しわ防止クリーム、フェイスオイル、リポジェル、スポーツジェル、保湿クリーム、美白クリーム、ビタミンクリーム、スキンローション、ケアローション、アンプル剤、アフターシェーブローション、ひげそり用ローション、保湿ローション、日焼けローション、セルライトクリーム、脱色組成物、マッサージ剤、ボディーパウダー、フェーストニック、デオドラント化粧品、制汗剤、毛ホールパック、にきび抑制組成物、虫除け剤などである。
【０１０３】
好ましい実施形態において、化粧品は、デイリーケアO/W製剤を含んでなるが、これは、国際化粧品成分命名法（International Nomenclature of Cosmetic Ingredients, INCI）に従って、たとえば、パーセント表示の下記成分を含有することができる：
A     1.7   セテアレス-6、ステアリルアルコール
0.7   セテアレス-25
2.0   ジエチルアミノヒドロキシベンゾイル安息香酸ヘキシル
2.0   PEG-14 ジメチコン
3.6   セテアリルアルコール
6.0   メトキシ桂皮酸エチルヘキシル
2.0   アジピン酸ジブチル
B     5.0   グリセロール
0.2   EDTA2ナトリウム
1.0   パンテノール
適量  防腐剤
67.8  水
C     4.0   トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル、アクリル酸ナトリウムコポリ
マー
D     0.2   アスコルビルリン酸ナトリウム
1.0   酢酸トコフェリル
0.2   ビサボロール
1.0   トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル、アスコルビン酸ナトリウム、
トコフェロール、レチノール
1.0   ラクトバチルス属菌
E     適量  水酸化ナトリウム
フェーズAおよびBを別々に約80℃に加熱する。フェーズBを、その後、かき混ぜながらフェーズAに入れ、ホモジナイズする。フェーズCを、フェーズAおよびBの混合物にかき混ぜながら入れ、ホモジナイズする。この混合物を、撹拌しながら約40℃に冷却する；次に、フェーズDを加え、フェーズEを用いてpHを約6.5に調整する。続いて、その溶液をホモジナイズし、室温に冷却する。
【０１０４】
さらに好ましい実施形態において、化粧品組成物は、保護作用のあるデイクリームO/W製剤を含んでなるが、これは、国際化粧品成分命名法（International Nomenclature of Cosmetic Ingredients, INCI）に従って、たとえば、パーセント表示の下記成分を含有することができる：
A     1.7   セテアレス-6、ステアリルアルコール
0.7   セテアレス-25
2.0   ジエチルアミノヒドロキシベンゾイル安息香酸ヘキシル
2.0   PEG-14 ジメチコン
3.6   セテアリルアルコール
6.0   メトキシ桂皮酸エチルヘキシル
2.0   アジピン酸ジブチル
B     5.0   グリセロール
0.2   EDTA2ナトリウム
1.0   パンテノール
適量  防腐剤
68.6  水
C     4.0   トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル、アクリル酸ナトリウムコポリ
マー
D     1.0   アスコルビルリン酸ナトリウム
1.0   酢酸トコフェリル
0.2   ビサボロール
1.0   ラクトバチルス属菌
E     適量  水酸化ナトリウム
フェーズAおよびBを別々に約80℃に加熱する。フェーズBを、その後、かき混ぜながらフェーズAに入れ、ホモジナイズする。フェーズCを、フェーズAおよびBの混合物に入れ、ホモジナイズする。この混合物を、撹拌しながら約40℃に冷却する；次に、フェーズDを加え、フェーズEを用いてpHを約6.5に調整する。続いて、その溶液をホモジナイズし、室温に冷却する。
【０１０５】
さらに好ましい実施形態において、化粧品組成物は、皮膚洗浄剤O/W製剤を含んでなるが、これは、国際化粧品成分命名法（International Nomenclature of Cosmetic Ingredients, INCI）に従って、たとえば、パーセント表示の下記成分を含有することができる：
A     10.0   エチルヘキサン酸セテアリル
10.0   トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル
1.5    シクロペンタシロキサン、シクロヘキサシロキサン
2.0    PEG-40 水添ヒマシ油
B     3.5    トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル、アクリル酸ナトリウムコポ
リマー
C     1.0    酢酸トコフェリル
0.2    ビサボロール
適量   防腐剤
適量   香油
D     3.0    ポリクォータニウム-44
0.5    ココトリモニウムメト硫酸
0.5    セテアレス-25
2.0    パンテノール、プロピレングリコール
4.0    プロピレングリコール
0.1    EDTA2ナトリウム
1.0    ラクトバチルス属菌
60.7   水
最初に、フェーズAを溶解し、続いてフェーズBをフェーズAに撹拌しながら入れる。その後、フェーズCをフェーズAおよびBの混合物に入れる。次の段階で、フェーズDを溶解してフェーズA、BおよびCの混合物に撹拌しながら加える。この混合物をホモジナイズし、15分間撹拌する。
【０１０６】
さらに好ましい実施形態において、化粧品組成物は、デイリーケアボディスプレー製剤を含んでなるが、これは、国際化粧品成分命名法（International Nomenclature of Cosmetic Ingredients, INCI）に従って、たとえば、パーセント表示の下記成分を含有することができる：
A     3.0    メトキシ桂皮酸エチルヘキシル
2.0    ジエチルアミノヒドロキシベンゾイル安息香酸ヘキシル
1.0    ポリクォータニウム-44
3.0    ポリエチレングリコール
2.0    パンテノール、プロピレングリコール
1.0    シクロペンタシロキサン、シクロヘキサシロキサン
10.0   オクチルドデカノール
0.5    PVP
10.0   トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル
3.0    安息香酸アルキル（C12-15）
3.0    グリセロール
1.0    酢酸トコフェリル
0.3    ビサボロール
1.0    ラクトバチルス属菌
59.2   アルコール
フェーズAの成分を秤量し、清澄になるまで溶解する。
【０１０７】
さらに好ましい実施形態において、化粧品組成物はスキンジェルを含んでなるが、これは、国際化粧品成分命名法（International Nomenclature of Cosmetic Ingredients, INCI）に従って、たとえば、パーセント表示の下記成分を含有することができる：
A     3.6    PEG-40 水添ヒマシ油
15.0   アルコール
0.1    ビサボロール
0.5    酢酸トコフェリル
適量   香油
B     3.0    パンテノール
0.6    カルボマー
1.0    ラクトバチルス属菌
75.4   水
C     0.8    トリエタノールアミン
はじめに、フェーズAを清澄になるまで溶解する。フェーズBを混合して柔らかくしたのちフェーズCで中和する。次の段階で、フェーズAを、ホモジナイズしたフェーズBに撹拌しながら加え、混合物をホモジナイズする。
【０１０８】
なおいっそう好ましい実施形態において、化粧品組成物はアフターシェーブローションを含んでなるが、これは、国際化粧品成分命名法（International Nomenclature of Cosmetic Ingredients, INCI）に従って、たとえば、パーセント表示の下記成分を含有することができる：
A     10.0   エチルヘキサン酸セテアリル
5.0    酢酸トコフェリル
1.0    ビサボロール
0.1    香油
0.3    アクリレート／アクリル酸アルキル（C10-30）クロスポリマー
B     15.0   アルコール
1.0    パンテノール
3.0    グリセロール
1.0    ラクトバチルス属菌
0.1    トリエタノールアミン
63.5   水
フェーズAの成分を混合する。次の段階で、フェーズBを溶解してフェーズAに入れたのち、ホモジナイズする。
【０１０９】
本発明はまた、上記の本発明の微生物、またはその誘導体、変異体もしくは不活性型を、皮膚炎、好ましくはアトピー性皮膚炎、乾癬、ツタウルシ皮膚炎、ヘルペス性湿疹、禿瘡、または疥癬を予防もしくは治療するための医薬組成物の調製に使用することに関する。
【０１１０】
別の態様において、本発明は、上記の本発明の微生物、またはその誘導体もしくは変異体もしくは不活性型を、化粧品および／または医薬品として許容される担体または添加剤とともに製剤化するステップを含んでなる、組成物の製造方法に関する。
【０１１１】
本発明はさらに、皮膚炎、好ましくはアトピー性皮膚炎、乾癬、ツタウルシ皮膚炎、ヘルペス性湿疹、禿瘡、または疥癬を予防もしくは治療する方法に関するが、その方法は、予防もしくは治療に効果のある量の本発明の組成物を、それを必要とする患者に投与するステップを含んでなる。
【０１１２】
当然のことながら、本明細書に記載された特定の方法、プロトコル、細菌、ベクターおよび試薬はさまざまに変化しうるので、本発明はこれらに限定されない。これも当然のことであるが、本明細書で使用される用語は、個別の実施形態の説明のみを目的としており、添付の請求の範囲によってのみ限定されるべき本発明の範囲を限定するものではない。特に指示しない限り、本明細書で使用されるすべての科学技術用語は当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【０１１３】
好ましくは、本明細書で使用される用語は、"A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberqer. H.G.W, Naqel. B. およびKoelbl. H.編(1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)に記載のように定義される。本明細書および下記の特許請求の範囲を通じて、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含んでなる」および「含む」という用語は、当然のことながら、記載の整数もしくはステップ、または整数群もしくはステップ群の包含を意味するが、他のいかなる整数もしくはステップ、または整数群もしくはステップ群の除外を意味しない。
【０１１４】
本明細書の本文を通じて、いくつもの文献が引用されている。本明細書に引用された各文献は、（特許、特許出願、科学出版物、製造者の仕様書、使用説明書など、すべてを含めて）上記下記にかかわらず、参照としてその全体を本明細書に組み入れるものとする。ここで、何ものも、本発明が先行発明の効力によってこうした開示に先行する権利を有しない、ことを容認すると解釈されるべきではない。
【０１１５】
本明細書および添付の請求の範囲において使用される場合、単数形は、文脈からそうでないことが明らかである場合を除き、複数の指示物を包含することに留意しなければならない。したがって、たとえば、「試薬」への言及は、１つもしくは複数の同様なさまざまの試薬を包含し、「方法」への言及は、本明細書に記載の方法に改変する、もしくは置き換えることのできる、当業者に周知の、同等のステップ（複数）および方法（複数）への言及を包含する。
【０１１６】
第二の態様において、本発明は、一過性病原性皮膚菌叢の１つもしくは複数の微生物の生育を阻害することができるが、健康で正常な皮膚常在菌叢の微生物の生育は阻害しない、微生物に関する。
【０１１７】
本発明者らは、驚くべきことに、上記微生物もしくはその不活化型を皮膚に投与することによって、病原微生物が定着しないよう皮膚を効果的に保護することが、達成可能であることを見出した。本発明者らは、はじめて当該微生物を同定し、それらの同定のための方法を提供した。上記微生物は、皮膚上での微生物の生育を個別に抑制することができる、すなわち、病原微生物の生育を選択的に阻害するが、健康な共生菌叢の常在菌の生育には影響を及ぼさない。したがってこうした微生物は、自然な皮膚菌叢を再生し、安定化することができる。
【０１１８】
多くのさまざまな微生物が皮膚上に存在する。皮膚の正常な（常在）菌叢に属し、無害の共生生物であるものもあるが、病原性を有する可能性のあるものもある。
【０１１９】
基本的に、皮膚上の生物は、２種類に分類することができる：
1. 常在生物：常在生物は、皮膚表面上、角質層上、ならびに表皮の外層および皮膚や毛包の深い割れ目の内部に定着した、皮膚の永続的な常在物である。皮膚常在菌叢のこうした微生物は、皮膚組織に侵入したりこれを損傷したりすることなく、皮膚上で生育し増殖することができる。皮膚の深い部位にいるこうした生物は、洗浄によって容易に除去されない。常在微生物は無害の共生生物である。
【０１２０】
2. 一過性生物：一過性生物は、皮膚に付着しているがそこでは増殖しない微生物、または皮膚上で増殖し短期間存続する汚染菌である。こうした微生物は、皮膚常在菌叢によって微小環境がきびしく決められた健康な皮膚上に永続的に定着することはできない。一過性生物は、病原性である可能性がある。
【０１２１】
したがって、「一過性病原性皮膚菌叢」という用語は、皮膚に付着しているが、そこでは増殖しない微生物、または皮膚上で増殖し短期間存続する汚染菌を指す。詳細には、微生物が皮膚に付いているが、健康な皮膚によって与えられる環境条件下ではその場で生育および増殖することができず、この器官（またはその一部）に永続的に定着することができないならば、その微生物は、一過性病原性皮膚菌叢に属すると見なされる。ヒトの皮膚から、一過性に、いくつかの細菌、酵母および真菌を単離することができるが、特に下記の微生物は、頻繁に出現するため、一過性病原性皮膚菌叢に分類することができる：黄色ブドウ球菌、化膿レンサ球菌、グラム陰性桿菌（例、アシネトバクター・カルコアセティカス）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、およびマラセジア・フルフル。一過性菌叢の微生物は、障害された皮膚部位にその細菌が付着できるようにする病原因子を有することが多い。これは、たとえば、コラーゲン構造もしくはケラチン構造への付着であることも考えられる。
【０１２２】
皮膚菌叢の成分および組成を、たとえば、スコッチテープによって皮膚上層を剥離することによって、定量的ならびに定性的に、決定することができる。皮膚菌叢の微生物は、たとえばスコッチテープで剥離した、上部の10層の皮膚において、同定することができる。典型的には、こうした微生物を単離するために、6枚の2 cm2スコッチテープをそれぞれ、好ましくは前腕の、皮膚の一定の領域に押しつけた後、各テープ片を皮膚から、グラム陽性（例、BHI, Difco Inc.）もしくはグラム陰性細菌（例、MacConkey agar, Difco Inc.）用の選択培養寒天プレートに、または、酵母および真菌用の選択培養寒天培地（例、Plate Count Agar, Difco Inc.）に転写する。その後、皮膚から寒天培養プレートに転写された微生物を、30℃および37℃で、好気的ならびに嫌気的に、約24時間培養する。定性分析のために形態学的および生化学的方法によって、ならびに定量のために計数によって、コロニー形成単位を測定する。相対組成および全細胞数を決定する。当業者は、当技術分野で知られている方法によって、上記のように単離された皮膚菌叢の微生物の属および／または種を決定することができる。
【０１２３】
一過性病原性皮膚菌叢の微生物は、たとえば、代謝フットプリンティング、脂肪酸組成および細胞壁組成の評価、16SリボソームRNAの配列決定、または特異的病原因子をコードする特異的DNAの検出によって、決定することができる。
【０１２４】
微生物が、一過性病原性皮膚菌叢の微生物と接触したとき、その生育の低下をもたらすならば、その微生物は、そうした一過性病原性皮膚菌叢の微生物の生育を阻害すると見なされる。「一過性病原性皮膚菌叢の微生物の生育を阻害する」という表現は、本発明の微生物が、一過性病原性皮膚菌叢の微生物のうち、少なくとも1つ、好ましくは2以上、好ましくは3以上、より好ましくは6以上、そして特に好ましくはそのいずれの生育も減少させることを意味する。もう一つの好ましい実施形態において、本発明の微生物は、一過性病原性皮膚菌叢を代表する主要な菌である、黄色ブドウ球菌の生育を阻害する。別の好ましい実施形態において、本発明の微生物は黄色ブドウ球菌の生育を特異的に阻害する。「特異的に」は、好ましくは、本発明の微生物が黄色ブドウ球菌の生育を阻害するが、他の微生物、特に皮膚常在菌叢に属する微生物の生育は、有意に阻害しない、もしくはわずかしか阻害しないことを意味する。より好ましくは、「特異的に」という用語は、ブドウ球菌に対する阻害の程度が、他の微生物、特に皮膚常在菌叢の微生物への阻害の程度より、はるかに大きいことを意味する。特に好ましくは、「特異的に」という用語は、当業者に周知の適当な生育アッセイにおいて、本発明の微生物存在下での黄色ブドウ球菌の増殖が、本発明の微生物存在下での、別の微生物、特に皮膚常在菌叢の別の微生物の増殖の、せいぜい50％であることを意味する。好ましくは、黄色ブドウ球菌の増殖は、本発明の微生物存在下で、別の微生物、特に皮膚常在菌叢の別の微生物の増殖の、40％、30％、20％、10％、より好ましくは5％、そしてもっとも好ましくは0％である。黄色ブドウ球菌の特異的阻害は、実施例10および11に示されるが、これらは、実例として、ミクロコッカス・ルテウスおよび大腸菌（Escherichia coli）がin vitro液体アッセイにおいて、本発明の微生物によって阻害されないことを示す。好ましい実施形態において、本発明の微生物は、黄色ブドウ球菌の生育を阻害するが、ミクロコッカス・ルテウスおよび／または大腸菌の生育は阻害しない。
【０１２５】
特に好ましい実施形態では、グリセロールを含有する培養条件を用いる場合に、黄色ブドウ球菌の特異的阻害を検出することができる。
【０１２６】
生育の減少は、好ましくは、増殖、すなわち単位時間当たりの細胞分裂の減少を意味する。あるいはまた、「阻害する」という用語は、個々の細胞サイズの減少も意味する。細菌細胞サイズは、染色試薬SYBR Green I（Molecular Probes, USA）で染色後、フローサイトメトリー（たとえば、Becton-Dickinson FACSort flow cytometer, San Jose, CA）によって評価することができる。細菌細胞サイズは、Side-Angle Light Scatter (SSC)法で評価される。
【０１２７】
したがって、生育の減少は、単位時間当たりの生物体量の減少を意味する。
【０１２８】
一過性病原性皮膚菌叢の微生物の生育阻害は、好ましくはin vitroで、より好ましくは、本発明の微生物を一過性病原性皮膚菌叢の１つもしくは複数の微生物と接触させて、一過性病原性皮膚菌叢のそうした微生物の生育を測定するアッセイで、観察することができる。生育は、インキュベーションのさまざまな時間間隔の後に、細胞／コロニー数を計数することによって測定することができるが、それを、本発明の微生物を含有しない対照と比較することによって、生育の増加もしくは減少が存在するかどうかを決定することができる。
【０１２９】
生育の阻害を測定するin vitroアッセイは、実施例に記載されるが、いわゆる「in vitroホールプレートアッセイ」を含む。手短に述べると、このアッセイは次のステップを含んでなる：
-  一過性病原性皮膚菌叢の少なくとも1つの微生物を培養し、その（それぞれの）微生物の生育、および好ましくは検出に適した寒天培地を含む、調製済み寒天プレート上にそれを均一に塗布する；
-  播種した寒天プレートにホール（穴）を設ける；
-  そのホールを、あらかじめ培養した本発明の微生物の細胞で満たす；
-  一過性病原性皮膚菌叢の微生物の生育を可能にする条件下で適当な時間、この寒天プレートをインキュベートする；ならびに、
-  本発明の微生物を入れたホールの周囲の一過性病原性皮膚菌叢の微生物の生育を測定し、それを本発明の微生物を含有しないホールの周囲の微生物の生育と比較する。
【０１３０】
最終ステップでの生育の測定は、細胞数および／またはコロニー数を測定する利用可能な手段および方法、例を挙げると、適当な色素による染色および／または光学的手段、たとえば、デンシトメトリーおよび顕微鏡下での細胞／コロニー数の計数によって実施することができる。好ましい実施形態において、ホールに続いて生じた透明ゾーンの直径によって、阻害面積を測定することができる。
【０１３１】
より好ましくは、一過性病原性皮膚菌叢の微生物の生育阻害は、「in vitro液体アッセイ」で測定することができる。このアッセイは実施例に記載されるが、手短に述べると、下記のステップを含んでなる：
-  一過性病原性皮膚菌叢の少なくとも1つの微生物を、液体培養物で培養する；
-  本発明の微生物の液体培養物の一定分量、および一過性病原性皮膚菌叢の微生物の液体培養物の一定量を、一過性病原性皮膚菌叢の微生物の生育を可能にする培地に加える；
-  本発明の微生物、および一過性病原性皮膚菌叢の微生物を、液体培養物で共培養する；
-  共培養した液体培養物の一定量を、適当な生育培地を含有する寒天プレートに移す；
-  一過性病原性皮膚菌叢の微生物の生育を可能にする条件下で適当な時間、この寒天プレートをインキュベートする；
-  コロニー形成単位の数値化によって一過性病原性皮膚菌叢の微生物の生育を測定し、それを、本発明の微生物を加えていない対照の微生物の生育と比較する。
【０１３２】
さらにより好ましくは、一過性病原性皮膚菌叢の微生物の生育阻害は、「in situ皮膚アッセイ」でも観察することができる。このアッセイは実施例に記載されるが、簡単に述べると、下記のステップを含んでなる：
-  一過性病原性皮膚菌叢の少なくとも1つの微生物を培養し、被験個体の皮膚の一定領域にそれを均一に薄く塗る；
-  この一過性病原性皮膚菌叢の微生物を塗布した区域の中の一定の領域に本発明の微生物の一定量を塗布する；
-  一過性病原性皮膚菌叢の微生物の生育を可能にするのに十分な期間、皮膚をインキュベートする；
-  皮膚の上層を、それに含まれる微生物を含めて、適当な生育培地を含有する寒天プレートに移す；
-  この寒天プレートを一定期間、一過性病原性皮膚菌叢の微生物の生育を可能にする条件下でインキュベートする；
-  本発明の微生物を塗布した領域の周囲の、一過性病原性皮膚菌叢の微生物の生育を測定し、それを、本発明の微生物を塗布しなかった対照の微生物の生育と比較する。
【０１３３】
上記アッセイに使用する皮膚の領域は、個体、好ましくはヒト個体の皮膚の任意の適当な領域とすることができる。好ましい実施形態において、それは、ヒト個体の前腕皮膚の領域である。領域の広さは決まっていないが、好ましくは、約1〜40 cm2、より好ましくは5〜20 cm2、さらにより好ましくは5〜10 cm2、たとえば、約5、6、7、8、9または10 cm2である。
【０１３４】
一過性病原性皮膚菌叢の微生物は、その領域に均一に、好ましくは約102 cfu/cm2 〜 103 cfu/cm2の密度で分布する。皮膚に塗り広げた微生物を自然乾燥させ、本発明の微生物の一定量をその領域内に、正確に塗布する。これは、当業者に知られている手段によって達成することができる。たとえば、本発明の微生物を遠心する（15分、4000 x g）。細胞ペレットを、K/Na-バッファーで2回洗浄する（各1 ml）。細胞を200μl K/Na-バッファー中に再懸濁し、調製された微生物10μlを、マイクロピペットを用いてあらかじめ接種された皮膚領域に正確に塗布する。
【０１３５】
皮膚のインキュベーションは、好ましくは室温で、たとえば2時間行う。皮膚に含まれる微生物を含めた、皮膚の上層の移動は、たとえば粘着テープ片の助けを借りて行うことができる。皮膚の上層を移した寒天プレートは、テストすべき一過性病原性皮膚菌叢の微生物の生育を可能にする温度でインキュベートするが、この微生物の生育を維持することが知られている生育培地を含有する。インキュベーションは一般に約24時間行う。微生物の生育は当業者に知られている方法によって検出することができる。好ましくは、デンシトメトリーによって、もしくは本発明の微生物の一定量を塗布したポイントの近傍に形成されたコロニーを計数することによって測定される。細菌細胞の大きさは、SYBR Green I（Molecular Probes, USA）色素で染色後、フローサイトメトリー（たとえば、Becton- Dickinson FACSort flow cytometer, San Jose, CA）によって評価することができる。細菌細胞の大きさは、Side-Angle Light Scatter (SSC)法で評価される。
【０１３６】
ある微生物が、in vitroホールプレートアッセイにおいて、微生物を加えなかった対照と比較して、少なくとも5％、好ましくは少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、もしくは70％、80％、より好ましくは少なくとも90％、さらにいっそう好ましくは95％、そしてもっとも好ましくは99％の一過性病原性皮膚菌叢の少なくとも１つの微生物の生育の減少をもたらすならば、その微生物は一過性病原性皮膚菌叢の1つもしくは複数の微生物の生育を阻害すると見なされる。より好ましくは、ある微生物が、「in vitro液体アッセイ」において、微生物を加えなかった対照と比較して、少なくとも5％、好ましくは少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、もしくは70％、80％、より好ましくは少なくとも90％、さらにいっそう好ましくは少なくとも95％、そしてもっとも好ましくは少なくとも99％の、一過性病原性皮膚菌叢の少なくとも１つの微生物の生育の減少をもたらすならば、その微生物は一過性病原性皮膚菌叢の1つもしくは複数の微生物の生育を阻害すると見なされる。
【０１３７】
より好ましくは、ある微生物が、in situ皮膚アッセイにおいて、少なくとも5％、好ましくは少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、もしくは70％、80％、より好ましくは少なくとも90％、さらにいっそう好ましくは少なくとも95％、そしてもっとも好ましくは少なくとも99％の、一過性病原性皮膚菌叢の少なくとも１つの微生物の生育の減少をもたらすならば、その微生物は一過性病原性皮膚菌叢の1つもしくは複数の微生物の生育を阻害すると見なされる。
【０１３８】
ある微生物が、一過性病原性皮膚菌叢の微生物、たとえば、黄色ブドウ球菌の生育を阻害するか否かを決定するためのテストは、好ましくは、上記のin vitroおよび／またはin situテストであり、より好ましくは実施例に記載のテストである。
【０１３９】
好ましい実施形態において、本発明の微生物は、一過性病原性皮膚菌叢の1つもしくは複数の微生物、好ましくは黄色ブドウ球菌の、生育阻害をもたらすが、その阻害は、抗生物質使用後の、少なくとも１つのそうした微生物の生育阻害に匹敵する。「匹敵する」とは、一定量の本発明の微生物の阻害活性が、抗生物質の活性と同程度の範囲にあることを意味する。具体的には、こうした効果は、好ましくは、1.0 x 108 から3.0 x 109まで、より好ましくは、2.0 x 108 から1.0 x 109まで、さらにいっそう好ましくは、3.0 x 108 から5.0 x 108まで、そしてもっとも好ましくは3.4 x 108の量の細胞を使用することにより達成されるが、前記の量の細胞によって達成される阻害活性は、好ましくは5〜15ユニットの抗生物質に相当する。「抗生物質」という用語は、微生物の生育を阻害する、または死滅させる能力を有する化学物質を指す。このような物質は当業者に知られている。好ましくは、この用語は、ペニシリン、セファロスポリンもしくはカルバペネムのようなβラクタム化合物；マクロライド；テトラサイクリン；フルオロキノロン；スルホンアミド；アミノグリコシド；イミダゾール；ペプチド抗生物質およびリンコサミドを意味する。より好ましくは、この用語は、バシトラシンおよびエリスロマイシンに関する。好ましい実施形態において、「匹敵する」とは、約3.4 x 108個の本発明の微生物細胞の阻害活性が、バシトラシン150μg、またはエリスロマイシン2.5μgに相当することを意味する。もっとも好ましくは、「匹敵する」という表現は、実施例12に示すように黄色ブドウ球菌を指示菌として、約3.4 x 108個の本発明の微生物細胞の阻害活性が、バシトラシン150μg、またはエリスロマイシン2.5μgに相当することに関する。
【０１４０】
「一過性病原性菌叢の微生物」という用語が、本明細書上記に記載されている。好ましくは、この用語は黄色ブドウ球菌に関する。一過性病原性皮膚菌叢の微生物（単数もしくは複数）の生育阻害の程度は、抗生物質使用後の少なくとも1つの前記微生物の生育阻害と比較して、好ましくはin vitroで、より好ましくは、本発明の微生物を一過性病原性皮膚菌叢の１つもしくは複数の微生物と接触させて、一過性病原性皮膚菌叢の前記微生物の生育を測定するアッセイで、観察することができる。もっとも好ましくは、生育阻害の比較は、実施例に記載され、上記でも言及された「in vitroホールプレートアッセイ」で判断することができる。要約すると、「in vitroホールプレートアッセイ」におけるこうした比較は、下記のステップを含んでなる：
-  一過性病原性皮膚菌叢の少なくとも1つの微生物を培養し、その（それぞれの）微生物の生育、および好ましくは検出に適した寒天培地を含む、調製済み寒天プレート上にそれを均一に塗布する；
-  播種した寒天プレートにホール（穴）を設ける；
-  ホールのうちあるものは、あらかじめ培養した本発明の微生物の細胞で満たし、またあるものには、さまざまな濃度の抗生物質を満たす；
-  一過性病原性皮膚菌叢の微生物の生育を可能にする条件下で適当な時間、寒天プレートをインキュベートする；
-  本発明の微生物を入れたホールの周囲の一過性病原性皮膚菌叢の微生物の生育を測定し、それをさまざまな濃度の抗生物質を含有するホールの周囲の微生物の生育と比較する；
-  ホールの阻害ゾーンの直径を測定し、阻害面積を算出する；ならびに
-  本発明の微生物、ならびに抗生物質によって引き起こされた生育阻害を相互に比較する。
【０１４１】
好ましい実施形態において、「一過性病原性皮膚菌叢の微生物の生育を阻害する」という表現は、一過性病原性皮膚菌叢の微生物生育の減少が、（防御的な）抗菌物質の放出に起因することを意味する。「抗菌物質」という用語は、一過性病原性皮膚菌叢の微生物の生育の、選択的な阻害をもたらすことができる物質を示す。好ましくは、この物質はプロテアーゼ消化に対して感受性でない。「感受性でない」とは、その物質がプロテアーゼ活性により影響を受けない、または部分的にしか影響を受けないことを意味する。「プロテアーゼ」は、当業者に周知の、タンパク質の内部ペプチド結合の開裂を触媒するあらゆる酵素を指す。好ましい実施形態において、この用語は、プロテイナーゼK、ストレプトミセス・グリセウス（Streptomyces griseus）由来のプロテアーゼ、トリプシンまたはキモトリプシンを表す。「プロテアーゼ消化」という用語は、当業者に知られている条件下でのプロテアーゼ反応を指す。好ましい実施形態においてこの用語は、37℃にて、たとえば1時間のインキュベーションを指す。
【０１４２】
さらに好ましい実施形態において、「抗菌物質」という用語は、高pHもしくは低pH値で妨害されないという特性によって特徴付けられる物質を表す。「妨害されない」とは、その物質が安定であり、生物学的活性を有することを意味する。「高pH値」および「低pH値」という表現は、当業者に明らかである。好ましくは、妨害されない特性は、pH3からpH11までに認められる。
【０１４３】
本発明の微生物は、健康で正常な皮膚常在菌叢の生育は阻害しないという特徴も有する。このように、「皮膚常在菌叢」および「健康で正常な皮膚常在菌叢」という用語は、健康な皮膚、好ましくはヒトの皮膚に通常認められる微生物であって、皮膚に認められる微生物の大半を占める微生物に関するものである。特に「皮膚常在菌叢」という用語は、皮膚の表面上、角質層上、表皮の外層内部、ならびに皮膚および毛包のより深い割れ目の中に定着した、永続的に皮膚に生息する微生物に関する。こうした微生物は、皮膚組織に侵入することも、皮膚組織を損傷することもなく、皮膚上で生育し増殖することができるという特徴を有する。こうした微生物の特徴は、皮膚の深い領域において、それらが洗浄によって容易には除去されないことである。皮膚常在菌叢の微生物は無害の共生生物である。
【０１４４】
好ましくは、「皮膚常在菌叢」という用語は、皮膚、好ましくはヒトの皮膚上に見出すことができる、好気性および嫌気性微生物の菌叢に関する。より好ましくは、前記用語は、表皮ブドウ球菌（コアグラーゼ陰性）、ミクロコッカス属菌、ジフテロイド、およびプロピオニバクテリウム属菌を含んでなる、微生物の菌叢に関する。典型的には、好気性の皮膚常在菌叢の約90％は、表皮ブドウ球菌で占められる。残りの約10％はおもに、ミクロコッカス属菌（80％ Micrococcus luteus）、およびジフテロイド（13％）からなる。「ジフテロイド」という用語は、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属に属する広範な細菌を指す。便宜上、皮膚ジフテロイドは次の4群に分類されている：親油性もしくは非親油性ジフテロイド；嫌気性ジフテロイド；ポルフィリン産生ジフテロイド。嫌気性皮膚菌叢を代表する主要な菌（90％）は、プロピオニバクテリウム属菌である；特にPropionibacterium acnes、P. granulosumおよびP. avidumを皮膚から分離することができる。嫌気性菌叢は、皮膚常在菌叢全体の約4％を占める。
【０１４５】
より好ましくは、菌叢の微生物の90％より多くが、表皮ブドウ球菌、ミクロコッカス属菌、ジフテロイド、およびプロピオニバクテリウム属菌に属する。さらにより好ましくは、皮膚常在菌叢は、その主要構成成分が表皮ブドウ球菌であるという特徴を有する。
【０１４６】
「皮膚」という用語は、当業者に知られているように、身体の外側を覆うものを表す。好ましくは、この用語は、表皮、真皮、および皮下脂肪組織の3層に関わる。表皮は、皮膚のもっとも外側の層である。表皮は、一般的に、身体表面を覆って、水を通さない保護被覆を形成し、下に基底層を有する重層扁平上皮からなる。表皮には普通、血管はなく、真皮からの拡散によって養分が与えられる。表皮を形成する細胞の主要タイプはケラチノサイトであるが、メラノサイトおよびランゲルハンス細胞も存在する。表皮は、いくつかの層に分けられるが、細胞はいちばん内側の層で有糸分裂によって生成される。細胞は、分化するにつれて形態および組成を変えながら層を上方に移行し、ケラチンで満たされるようになる。細胞は最終的に、角質層と呼ばれる最上層に到達し、脱落もしくは落屑を生じる。表皮の最外層は、25〜30層の死んだ細胞からなる。従来から、表皮は、5つの層にさらに分けられている（表層から深部へ）：角質層、透明層、顆粒層、有棘層、および胚芽層もしくは基底層。典型的には、表皮と真皮の間の境界は不規則で、一連の乳頭もしくは指状突起からなるが、これらは皮膚の薄いところでもっとも小さく、手掌および足底の皮膚ではもっとも長い。典型的には、手掌および足底の乳頭は、表皮の上昇に関連し、突起部を形成する。皮下脂肪組織は、皮膚の最下層である。この層の特徴は、結合組織、血管、および脂肪細胞からなることである。概して、この層は、皮膚を下にある組織に結合し、身体を寒さから防護し、エネルギーを脂肪の形で貯える。一般に、皮膚はより深部の組織への物理的、化学的、ならびに細菌性障害要因の作用に対する保護バリアとなる。このことは、たとえば口腔もしくは膣部位に属する組織、すなわち粘膜が皮膚に属さないことを意味する。好ましい実施形態において、「皮膚」という用語は、身体を覆うもっとも外側の層、すなわち表皮に関わる。より好ましい実施形態において、「皮膚」という用語は、表皮の角質層に関する。さらにより好ましい実施形態において、「皮膚」という用語は、表皮のうちもっとも外側の25〜30層の死んだ細胞の層に関する。もっとも好ましい実施形態において、「皮膚」という用語は、表皮のうちもっとも外側の10層の死んだ細胞の層に関する。
【０１４７】
「阻害しない」という表現は、皮膚常在菌叢の微生物の生育に関連して、皮膚常在菌叢の微生物のうち、少なくとも1つ、好ましくは2以上、好ましくは3以上、より好ましくは6以上、特に好ましくは任意の菌の生育が、本発明の微生物と接触させたときに変化しないことを意味する。生育が変化しないことは、好ましくは、増殖、すなわち単位時間当たりの細胞分裂が不変であることを意味する。ある微生物が皮膚常在菌叢の微生物と接触したときにそうした微生物の生育低下をもたらさないならば、その微生物は、皮膚常在菌叢の微生物の生育を変化させないと見なされる。生育阻害、または阻害の欠如は、上記のようにin vitroもしくはin situで、本発明の微生物が一過性病原性皮膚菌叢の少なくとも1つの微生物の生育を阻害する性質に関して、テストすることができる。もっとも好ましくは、阻害、もしくは阻害の欠如を判断するテストは、皮膚常在菌叢の微生物を用いて、以下に説明するように、より好ましくは実施例に記載のように、「in vitroホールプレートアッセイ」および／または「in vitro液体アッセイ」および／または「in situ皮膚アッセイ」を実施することによって行われる。
【０１４８】
手短に述べると、皮膚常在菌叢の微生物を用いた「in vitroホールプレートアッセイ」は、下記のステップを含んでなる：
-  皮膚常在菌叢の少なくとも1つの微生物を培養し、その（それぞれの）微生物の生育、および好ましくは検出に適した寒天培地を入れた、調製済み寒天プレート上にそれを均一に塗布する；
-  播種した寒天プレートにホール（穴）を設ける；
-  そのホールに、あらかじめ培養した本発明の微生物の細胞を満たす；
-  皮膚常在菌叢の微生物の生育を可能にする条件下で適当な時間、この寒天プレートをインキュベートする；ならびに、
-  本発明の微生物を入れたホールの周囲の皮膚常在菌叢の微生物の生育を測定し、それを本発明の微生物を含有しないホールの周囲の皮膚常在菌叢の微生物の生育と比較する。
【０１４９】
最終ステップでの生育の測定は、細胞数および／またはコロニー数を測定する利用可能な手段および方法によって、例を挙げると、適当な色素による染色および／または光学的手段、たとえば、デンシトメトリーおよび顕微鏡下での細胞／コロニー数の計数によって実施することができる。好ましい実施形態において、ホールに続いて生じる透明ゾーンの直径を用いて、阻害の面積を測定することができる。
【０１５０】
皮膚常在菌叢の微生物を用いた「in vitro液体アッセイ」は実施例に記載されるが、手短に述べると、下記のステップを含んでなる：
-  皮膚常在菌叢の少なくとも1つの微生物を、液体培養で培養する；
-  本発明の微生物の液体培養物の一定分量、および皮膚常在菌叢の微生物の液体培養物の一定分量を、皮膚常在菌叢の微生物の生育を可能にする培地に加える；
-  本発明の微生物、および皮膚常在菌叢の微生物を、液体培養で共培養する；
-  共培養した液体培養物の一定分量を、適当な生育培地を含有する寒天プレートに移す；
-  皮膚常在菌叢の微生物の生育を可能にする条件下で適当な時間、この寒天プレートをインキュベートする；
-  コロニー形成単位の数量化によって皮膚常在菌叢の微生物の生育を測定し、それを、本発明の微生物を加えていない対照の微生物の生育と比較する。
【０１５１】
皮膚常在菌叢の微生物を用いた「in situ皮膚アッセイ」は、要約すると、下記のステップを含んでなる：
-  皮膚常在菌叢の少なくとも1つの微生物を培養し、被験個体の皮膚の一定領域にそれを均一に薄く塗る；
-  この皮膚常在菌叢の微生物を塗布した区域の中の一定の領域に本発明の微生物の一定量を塗布する；
-  皮膚常在菌叢の微生物の生育を可能にするのに十分な期間、皮膚をインキュベートする；
-  皮膚の上層を、それに含まれる微生物を含めて、適当な生育培地を含有する寒天プレートに移す；
-  この寒天プレートを一定期間、皮膚常在菌叢の微生物の生育を可能にする条件下でインキュベートする；
-  本発明の微生物を塗布した領域の周囲の、皮膚常在菌叢の微生物の生育を測定し、それを、本発明の微生物を塗布しなかった対照の微生物の生育と比較する。
【０１５２】
皮膚常在菌叢の微生物の生育が、ある微生物との接触に際して、減少しない、もしくはわずかしか減少しないならば、その微生物は、皮膚常在菌叢の微生物の生育を変化させないと見なされる。「わずかに減少する」は、生育の減少が対照と比較して5％以下、より好ましくは、対照と比較して2％以下であることを意味する。「減少しない」という表現は、本発明の微生物が存在しない対照と比較したときに、本発明の微生物と接触した皮膚常在菌叢の微生物の生育に、統計的に関連性のある相違が認められないことを意味する。好ましい実施形態において「減少しない」という表現は、ある微生物が実際には皮膚常在菌叢の微生物の生育の増加をもたらす場合、すなわちこうした微生物の生育を刺激する場合も包含する。
【０１５３】
別の好ましい実施形態において、本発明の微生物は、皮膚常在菌叢の微生物の生育に悪影響を及ぼさない。「悪影響を及ぼさない」とは、本発明の微生物が存在しない対照と比較して、本発明の微生物と接触した皮膚常在菌叢の微生物の生育阻害が認められないことを意味する。
【０１５４】
特に好ましい実施形態において、本発明の微生物は、乳酸菌群に属する微生物である。「乳酸菌群に属する微生物」という用語は、細菌に属する、具体的にはグラム陽性の発酵性真正細菌に属する、より具体的には乳酸菌を含む乳酸桿菌科（Lactobacillaceae）に属する微生物を包含する。乳酸菌は、分類学的観点から、レンサ球菌属（Streptococcus）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、ラクトコッカス属（Lactococcus）およびラクトバチルス属（Lactobacillus）の下位分類に分けられる。本発明の微生物は好ましくはラクトバチルス属菌である。乳酸菌群の仲間は通常、ポルフィリンおよびシトクロムを欠き、電子伝達リン酸化を行わないため、エネルギーは基質レベルのリン酸化によってのみ得られる。すなわち、乳酸菌では、ATPは、炭水化物の発酵によって合成される。乳酸菌はすべて嫌気的に生育するが、多くの嫌気性菌とは異なって、ほとんどの乳酸菌は酸素に対して感受性でないため、無酸素状態のみならず酸素の存在下でも生育することができる。したがって、本発明の細菌は好ましくは酸素耐性嫌気性乳酸菌であり、好ましくはラクトバチルス属に属す。
【０１５５】
本発明の乳酸菌は、好ましくは、桿状もしくは球状で、細長いものから短く曲がった桿状までさまざまであり、さらに好ましくは、不動性および／または無胞子性であって、発酵代謝の主要な、もしくは唯一の産物として乳酸を生成する。好ましい実施形態において本発明の微生物が属するラクトバチルス属は、下記の特性によって3つの大きな下位群に分けられるが、それによって本発明のラクトバチルス属菌は3つの大きな下位群のそれぞれに帰属することができると考えられる：
(a)ホモ発酵型乳酸桿菌
(i)グルコースから解糖（Embden-Meyerhof）経路を経て、少なくとも85％の量の乳酸、好ましくは乳酸のL-、D-もしくはDL-異性体を産生する；
(ii)45℃で生育するが、15℃では生育しない；
(iii)長桿状である；ならびに
(iv)細胞壁にグリセロールタイコ酸を有する；
(b)ホモ発酵型乳酸桿菌
(i)解糖経路を経て、乳酸、好ましくは乳酸のL-もしくはDL-異性体を産生する；
(ii) 15℃で生育するが、45℃では変化しやすい生育を示す；
(iii)短桿状もしくはコリネ型である；ならびに
(iv)細胞壁にリビトールおよび／またはグリセロールタイコ酸を有する；
(c)ヘテロ発酵型乳酸桿菌
(i) グルコースからペントースリン酸経路を経て、少なくとも50％の量の乳酸、好ましくは乳酸のDL-異性体を産生する；
(ii)二酸化炭素およびエタノールを生成する；
(iii) 15℃もしくは45℃で変化しやすい生育を示す；
(iv)長桿状もしくは短桿状である；ならびに
(v)細胞壁にグリセロールタイコ酸を有する。
【０１５６】
上記の特性に基づいて、本発明の微生物を分類して乳酸菌群、特にラクトバチルス属に帰属することができる。古典的な分類学を用いて、たとえば、"Bergey's Manual of Systematic Bacteriology" (Williams & Wilkins Co., 1984)の中の適切な記述を参照することによって、本発明の微生物がラクトバチルス属に属すると決定することができる。あるいはまた、本発明の微生物を、当技術分野で既知の方法、たとえば、代謝フットプリント、すなわち本発明の微生物が糖類を代謝する能力に関する比較可能な概要によって分類し、または、たとえばSchleifer et al., System. Appl. Microb., 18 (1995), 461-467 or Ludwig et al., System. Appl. Microb., 15 (1992), 487-501に記載の他の方法によって分類して、ラクトバチルス属に帰属することができる。本発明の微生物は、ラクトバチルス属に属する微生物に典型的で、当業者に知られている糖源を代謝することができる。
【０１５７】
本発明の微生物のラクトバチルス属への帰属は、当技術分野で知られている他の方法、たとえば、決定されるべき種の全タンパク質のSDS-PAGEゲル電気泳動を用いて、それを既知のすでに性質の明らかなラクトバチルス属菌株と比較することによって、特徴付けることもできる。上記の全タンパク質プロファイルを調製する方法は、そうしたプロファイルの数値解析と同様に、当業者によく知られている。しかしながら、その結果は、プロセスの各段階が十分に標準化された範囲でのみ、信頼性がある。ラクトバチルス属への微生物の帰属を決定する際の、正確さの要求に直面して、標準化された方法が、1994年の9月12-16日にベルギーのGhent大学で欧州連合によって開催された「ワークショップ」で提示されたPotらの方法のように、通常、著者らによって一般に公開される（細菌の分類および同定のためのフィンガープリンティング法、全細胞タンパク質のSDS-PAGE）。SDS-PAGE電気泳動ゲルを分析する方法に使用されるソフトウェアは、種間の相関度がそのソフトウェアで用いられるパラメータおよびアルゴリズムに依存するので、きわめて重要である。理論的な詳細に立ち入ることなく、ピアソンの相関係数を用いて、デンシトメーターで測定され、コンピューターで正規化されたバンドの量的比較をすることが好ましい。こうして得られる相似行列は、もっとも類似したプロファイルを集めてグループ化するだけでなく樹状図を作成することも可能にするUPGMA(群平均法、unweighted pair group method using average linkage)アルゴリズムを用いて構築することができる（Kersters, Numerical methods in the classification and identification of bacteria by electrophoresis, in Computer-assisted Bacterial Systematics, 337-368, M. Goodfellow. A. G. O'Donnell Ed., John Wiley and Sons Ltd, 1985を参照されたい）。
【０１５８】
あるいはまた、本発明の前記微生物のラクトバチルス属への帰属は、いわゆるリボプリンターRTMにおいてリボソームRNAに関して位置付けることができる。より好ましくは、本発明の新規同定菌種のラクトバチルス属への帰属は、本発明の細菌の16SリボソームRNA、もしくはその16SリボソームRNAをコードするゲノムDNAのヌクレオチド配列を、現在までに知られている他の属および種の乳酸菌の配列と比較することによって証明される。本発明の新規同定種のラクトバチルス属への帰属を決定する、もう一つの好ましい別法は、16S-23S rRNAスペーサー領域を標的とする種特異的PCRプライマーを使用することである。別の好ましい代案は、RAPD-PCR（Niqatu et al. in Antonie van Leenwenhoek (79), 1-6, 2001）であるが、これは種特異的DNAパターンが生じることによるものであって、このパターンは本発明により同定された微生物のラクトバチルス属への帰属を決定することを可能にする。本発明の微生物の、ラクトバチルス属への帰属を決定するのに有用な方法はそのほかに、制限断片長多型（RFLP）（Giraffa et al.. Int. J. Food Microbiol. 82 (2003), 163-172）、反復成分のフィンガープリンティング（Gevers et al.. FEMS Microbiol. Lett. 205 (2001) 31-36）、または細菌細胞の脂肪酸メチルエステル（FAME）パターンの解析（Heyrman et al.. FEMS Microbiol. Lett. 181 (1991), 55-62）がある。あるいはまた、乳酸桿菌は、レクチンの分類（Annuk et al.. J. Med. Microbiol. 50 (2001), 1069-1074）、または細胞壁タンパク質の分析（Gatti et al.. Lett. Appl. Microbiol. 25 (1997), 345-348）によって決定することができる。
【０１５９】
本出願のある好ましい実施形態において、微生物はラクトバチルス属のプロバイオティック乳酸菌である。「プロバイオティック」という用語は、本発明との関連において、微生物を皮膚に局所適用した場合、その微生物が健康に有益な影響を及ぼすことを意味する。好ましくは、「プロバイオティック」微生物は、生きた微生物であって、皮膚に局所適用したときに、この組織の健康に有益である。もっとも好ましくは、このことは、微生物が皮膚菌叢にプラス効果を及ぼすことを意味する。
【０１６０】
好ましい実施形態において、本発明の微生物は、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）またはラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）に属する。しかしながら、ラクトバチルス属菌は、それに限定されない。
【０１６１】
本発明の特に好ましい実施形態において、本発明の微生物は、受託番号DSM 18007 (Lactobacillus buchneri OB-LB-Sa16) およびDSM 18006 (Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii OB-LB-Sa3)としてDSMZに寄託されたLactobacillus buchneriまたはLactobacillus delbrueckiiからなる一群から選択される。本発明はまた、上記の寄託されたラクトバチルス菌株の変異体もしくは誘導体に関するが、この変異体もしくは誘導体は、皮膚常在菌叢の少なくとも1つの微生物の生育を刺激する能力、ならびに一過性病原性皮膚菌叢の微生物の生育を刺激しないという特性を保持している。「受託番号を受けてDSMZに寄託されているLactobacillus buchneriまたはLactobacillus delbrueckii」という表現は、2006年2月24日付でDeutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ)に寄託され、下記の寄託番号を有する、Lactobacillus buchneriまたはLactobacillus delbrueckiiの種に属する微生物の細胞に関するものである：DSM 18007 (Lactobacillus buchneri OB-LB-Sa16) およびDSM 18006 (Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii OB-LB-Sa3)。DSMZの所在地は、Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germanyである。前記寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の条項に従って行われた。
【０１６２】
特に好ましい実施形態において、本発明の微生物は「単離」もしくは「純化」される。「単離する」という用語は、材料をその本来の環境から取り出す、たとえばそれが天然に存在するならば自然環境から、培養されたなら培地から取り出すことを意味する。たとえば、自然の体系において共存するものの一部もしくは全体から分離された、天然に存在する微生物、好ましくは、ラクトバチルス属菌は、単離されている。こうした微生物は、ある組成物の一部である可能性があるが、その組成物がその微生物の自然環境の一部ではないという点で、やはり単離されていると見なされるべきである。
【０１６３】
「純化する」という用語は、絶対的純粋さを要求しない；むしろ、相対的な定義と考えられる。ライブラリから得られる個々の微生物は、通常、微生物学的に均一にまで純化されており、すなわち、こうした微生物は、当技術分野で既知の方法によって寒天プレート上に画線したとき、単一コロニー群として生育する。好ましくは、この目的で使用する寒天プレートはラクトバチルス属菌に選択的である。このような選択的寒天プレートは当技術分野で知られている。
【０１６４】
もう一つの態様において、本発明は、本発明の微生物の不活化型に関するものであって、この不活化型は、たとえば熱失活もしくは凍結乾燥されているが、一過性病原性皮膚菌叢の１つもしくは複数の微生物の生育は阻害するものの、健康で正常な皮膚常在菌叢の微生物の生育は阻害しないという特性を保持している。
【０１６５】
本発明によれば、「本発明の微生物の不活化型」という用語は、本発明の微生物、好ましくは本明細書に記載のラクトバチルス属菌の、死んだ細胞もしくは不活化された細胞を包含するが、こうした細胞はもはや、ラクトバチルス属に属する微生物に特異的なプレート上で、単一コロニーを形成することができない。前記の死んだ細胞もしくは不活化細胞は、無傷な細胞膜を有するかもしれないし、壊れた細胞膜を有する可能性もある。本発明の微生物の細胞を死滅させる、または不活性化する方法は、当技術分野で知られている。El-Nezami et al. J. Food Prot. 61 (1998), 466-468は、UV照射によってラクトバチルス属菌を不活化する方法を記載する。本発明の微生物の細胞は、熱失活もしくは凍結乾燥することが好ましい。本発明の細胞の凍結乾燥は、一過性病原性皮膚菌叢の１つもしくは複数の微生物の生育を阻害するが健康で正常な皮膚常在菌叢の微生物の生育は阻害しないという特性を保持する一方で、保存および取り扱いを容易に行うことができるという利点を有する。その上、凍結乾燥された細胞は、当技術分野で知られている条件下で、適当な液体もしくは個体培地に加えられたとき、再び生育することができる。凍結乾燥は、当技術分野で既知の方法によって実施される。好ましくは、室温で、すなわち16℃から25℃までの任意の温度で、少なくとも2時間行われる。さらに、本発明の微生物の凍結乾燥細胞は、上記の特性を依然として保持するべく、4℃で少なくとも4週間、安定である。熱失活は、本発明の微生物の細胞を、少なくとも2時間、170℃でインキュベートすることによって行うことができる。さらに、熱失活は好ましくは、前記細胞を121℃で少なくとも20分間、大気圧2バールにて飽和水蒸気の存在下でオートクレーブ処理することによって達成される。別法において、本発明の微生物の細胞の熱失活は、少なくとも4週間、3週間、2週間、1週間、12時間,6時間、2時間もしくは1時間のあいだ、−20℃で前記細胞を凍結することによって達成される。本発明の微生物の不活化型の細胞の、少なくとも70％、75％または80％、より好ましくは85％、90％または95％、特に好ましくは少なくとも97％、98％、99％、より特に好ましくは99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％もしくは99.9％、ならびにもっとも特に好ましくは100％が、死んでいる、または不活化されているが、それらは依然として、一過性病原性皮膚菌叢の１つもしくは複数の微生物の生育を阻害するが健康で正常な皮膚常在菌叢の微生物の生育は阻害しないという能力を有することが好ましい。本発明の微生物の不活化型が実際に死んでいるか、または不活化されているかどうかは、当技術分野で知られている方法、たとえば、生死判別試験によってテストすることができる。
【０１６６】
「本発明の微生物の不活化型」という用語は、本発明の微生物、好ましくは本明細書に記載のラクトバチルス属菌の、溶菌液もしくは画分を包含するが、この溶菌液もしくは画分は、好ましくは、一過性病原性皮膚菌叢の1つもしくは複数の微生物、好ましくは黄色ブドウ球菌の生育を阻害するが、健康で正常な皮膚常在菌叢の微生物の生育は阻害しない。こうした阻害は、本明細書に記載のように、具体的には、添付の実施例に記載のようにテストすることができる。念のため、本発明の微生物の溶菌液もしくは画分は、一過性病原性皮膚菌叢の微生物の生育を阻害も刺激もしない可能性があるので、当業者はたとえば、当技術分野で知られた方法によって、前記溶菌液もしくは画分をさらに精製することができるが、そうした方法は下記に例示されており、そうして一過性病原性皮膚菌叢の微生物の生育を刺激する可能性のある物質を除去することができる。その後、当業者は、前記溶菌液もしくは画分が一過性病原性皮膚菌叢の微生物の生育を阻害するが皮膚常在菌叢の微生物の生育は阻害しないかどうか、その溶菌液もしくは画分を再度テストすることができる。
【０１６７】
本発明によれば、「溶菌液」という用語は、破壊または抽出された、本発明の微生物の細胞の、水媒体中の溶液または懸濁液を意味する。しかしながら、この用語は限定的に解釈されるべきでない。細胞溶解液は、たとえば、DNA、RNA、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質などのような巨大分子、および／または、アミノ酸、糖、脂肪酸などのような極小分子、またはその一部分を含んでなる。それに加えて、前記溶菌液は、平滑構造もしくは粒状構造をとりうる細胞片を含む。微生物の細胞溶解液を調製する方法は当技術分野で知られており、たとえば、フレンチプレス、ガラスビーズもしくは鉄製ビーズによる細胞破砕ミル、または酵素による細胞溶解などを用いる。さらに、細胞の溶解は、細胞を切断／破壊するための、当業界で知られているさまざまな方法に関わる。細胞を溶解する方法は重要でなく、本発明の微生物の細胞の溶解を達成できる方法であれば用いることができる。当業者は適当な方法を選択することができるが、たとえば、細胞の切断／破壊は、酵素的、化学的または物理的に行うことができる。酵素および酵素混合物の限定的でない例としては、プロテイナーゼKのようなプロテアーゼ、リパーゼ、もしくはグリコシダーゼがある；化合物の限定的でない例は、イオノフォア、ドデシル硫酸ナトリウムのような界面活性剤、酸、または塩基である；さらに物理的手段の限定的でない例には、フレンチプレス処理のような高圧、浸透圧、高温もしくは低温といった温度がある。加えて、タンパク質分解酵素以外の酵素、酸、塩基などの適当な組み合わせを用いた方法も利用することができる。たとえば、本発明の微生物の細胞は、凍結および融解、より好ましくは、−70℃未満の温度での凍結、および30℃を超える温度での融解によって溶解し、特に凍結は、−75℃未満の温度が好ましく、融解は35℃を超える温度が好ましいが、さらにもっとも好ましいのは−80℃未満の凍結温度、ならびに37℃を上まわる融解温度である。前記の凍結／融解を少なくとも１回、より好ましくは少なくとも2回、さらにより好ましくは少なくとも3回、特に好ましくは少なくとも4回、そしてもっとも好ましくは少なくとも5回繰り返すことも推奨される。
【０１６８】
したがって、当業者は、上記の一般的な説明を参照し、必要ならば上記方法を適切に修正もしくは変更することによって、望ましい溶菌液を調製することができる。好ましくは、上記溶菌液に使用される水性媒体は、水、生理食塩水、またはバッファー溶液である。細菌細胞溶解液の利点は、必要とされる技術設備が少ないので費用効率よく、容易に作製および保存できることである。
【０１６９】
本発明によれば、溶菌液は、上記溶菌液に由来する分子の分画調製物でもある。こうした画分は、当業者に周知の方法、たとえば、クロマトグラフィー（例としてアフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ならびにカラムおよびバッチ法での他のクロマトグラフィー材料によるクロマトグラフィーなど）、他の分画法、例を挙げると、濾過法、たとえば限外濾過、透析、遠心分離におけるサイズ排除による透析および濃縮、密度勾配もしくはステップマトリックスによる遠心分離、沈澱、たとえばアフィニティ沈澱、塩入法もしくは塩析法（硫安沈澱）、アルコール沈澱、または他の、溶菌液の上記成分を分離できるタンパク質化学的、分子生物学的、生化学的、免疫学的、化学的もしくは物理学的方法によって得ることができる。好ましい実施形態において、他よりも免疫原性の高い画分が好ましい。当業者は、上記の一般的説明および本明細書の実施例における個別の説明を参照し、必要ならばその方法を適切に修正もしくは変更することによって、適当な方法を選択し、その免疫原性を測定することができる。
【０１７０】
したがって、「本発明の微生物の不活性型」という用語はまた、本発明の微生物、好ましくは本明細書に記載のラクトバチルス属菌の濾液も包含するものであって、前記濾液は、好ましくは、一過性病原性菌叢の1つもしくは複数の微生物の、好ましくは黄色ブドウ球菌の生育を阻害するが、健康で正常な皮膚常在菌叢の微生物の生育は阻害しない。この阻害は、本明細書に記載のように、具体的には添付の実施例に記載のように、調べることができる。念のため、本発明の微生物の濾液は、一過性病原性皮膚菌叢の微生物の生育を阻害も刺激もしない可能性があるが、当業者は、たとえば、一過性病原性皮膚菌叢の微生物の生育を刺激する可能性のある物質を除去するために、当技術分野で周知の方法によって前記濾液をさらに精製することができる。その後、当業者は、再び前記濾液を、一過性病原性皮膚菌叢の微生物の生育は阻害するが皮膚常在菌叢の微生物の生育は阻害しないかどうか調べることができる。
【０１７１】
「濾液」という用語は、当業者に周知の任意の適当な液体、培地、もしくはバッファー中で、本発明の微生物培養物の遠心分離操作の上清として得られた、本発明の微生物の無細胞溶液もしくは懸濁液を表す。しかしながら、この言葉は限定的に解釈されるべきではない。濾液は、たとえば、DNA、RNA、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質などのような巨大分子、および／または、アミノ酸、糖、脂肪酸などのような極小分子、またはその一部分を包含する。微生物の濾液を調製する方法は当技術分野で知られている。さらに、「濾液」は、当技術分野で周知のさまざまな方法に関わる。正確な方法は重要ではなく、本発明の微生物の細胞の濾液を実現することができる任意の方法を用いることができる。
【０１７２】
「本発明の微生物の不活性型」という用語は、本発明の微生物の細胞の、任意の部分を包含する。好ましくは、前記不活性型は、膜調製物によって得られる膜画分である。ラクトバチルス属に属する微生物の膜調製物は、当技術分野で周知の方法によって、たとえば、Rollan et al., Int. J. Food Microbiol. 70 (2001), 303-307, Matsuquchi et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10 (2003), 259-266 またはStentz et al., Appl. Environ. Microbiol. 66 (2000), 4272-4278 or Varmanen et al., J. Bacteriology 182 (2000), 146-154に記載の方法を用いることによって得ることができる。あるいはまた、ホールセル調製物も想定される。
【０１７３】
別の態様において、本発明は、本発明の微生物、またはこの微生物の変異体、誘導体、もしくは不活性型を上記のように含んでなる組成物に関する。好ましい実施形態において、前記組成物は、固形の組成物中にmg当たり102から1012まで、好ましくは103から108までの細胞数の、上記の微生物を含んでなる。液体状の組成物の場合、微生物の量は、ml当たり102から1013までの細胞数である。さらに好ましい実施形態において、前記組成物は、乳濁液、たとえば、水中油型もしくは油中水型乳濁液、軟膏、またはマイクロカプセルの形をとる。乳濁液、軟膏、またはマイクロカプセルの場合、組成物は、ml当たり102から1013までの細胞数の、本明細書に記載の微生物を含んでなる。しかしながら、個別の組成物について、微生物の量は、本明細書に記載のように異なることがある。
【０１７４】
さらに別の態様において、本発明は、本発明の微生物、またはこの微生物の変異体、誘導体もしくは不活性型を上記のように、化粧品もしくは医薬品として許容される担体もしくは添加剤とともに調剤するステップを含んでなる、病原微生物から皮膚を保護するための組成物を製造する方法を提供する。
【０１７５】
本発明にしたがって使用される「組成物」という用語は、少なくとも1つの本発明の微生物、または前記微生物の変異体、誘導体もしくは不活性型を含んでなる（1つまたは複数の）組成物に関するものである。以下に記載される本発明の組成物は、前記の成分を任意の組み合わせで含んでなると想定される。状況に応じて、皮膚を病原微生物から保護するのに適した、少なくとも1つの追加成分を含んでもよい。したがって、組成物は、状況に応じて、下記の追加成分を任意の組み合わせで包含することができる。「皮膚を病原微生物から保護するのに適した成分」という表現は、pHを低下させる化合物もしくは組成物、および／またはそれらの組み合わせを包含する。
【０１７６】
組成物は、固体、液体、もしくは気体の状態とすることができるが、特に、粉末、溶液、エアロゾル、懸濁液、乳濁液、液体、エリキシル剤、エキス剤、チンキ剤もしくは流エキス剤の形態、または局所適用に特に適した形をとることができる。局所適用に適した形には、たとえば、ペースト、軟膏、ローション、クリーム、ジェル、もしくは経皮パッチがある。
【０１７７】
好ましくは、本発明の組成物は、化粧品として許容される担体もしくは添加剤をさらに含んでなる、化粧品組成物である。より好ましくは、前記化粧品組成物は、ペースト、軟膏、ローション、クリームもしくはジェルである。
【０１７８】
本発明の化粧品組成物は、本発明の組成物に関して上に記載したように、本発明の微生物、その変異体、誘導体、または不活性型を含んでなり、さらに化粧品として許容される担体を追加して含んでなる。好ましくは、本発明の化粧品組成物は、局所適用で用いられる。
【０１７９】
本明細書で使用される「化粧品として許容される担体」という表現は、本発明の組成物を安全で効果的に、皮膚に適用するために使用することができる、適当な賦形剤を意味する。こうした賦形剤には、乳濁液、たとえば、水中油型もしくは油中水型乳濁液、軟膏、またはマイクロカプセルといった材料を含めることができる。活性成分をカプセル化された形で、たとえば、セルロースカプセル化として、ゼラチン中で、ポリアミド、ニオソーム、ワックスマトリックスとともに、シクロデキストリンとともに、またはリポソームでカプセル化して、投与することも有効である。本明細書で使用される「安全で有効な量」という用語は、一過性病原性皮膚菌叢の1つもしくは複数の微生物の生育を阻害するのに十分な量を意味する。
【０１８０】
もう一つの態様において、本発明は、上記の、本発明の微生物またはその誘導体もしくは変異体もしくは不活性型を含んでなり、製薬上許容される担体もしくは添加剤をさらに含んでなる、医薬組成物に関する。医薬組成物は好ましくは、局所適用に適した形をとる。
【０１８１】
加えて、本発明は、上記の、本発明の微生物またはその誘導体もしくは変異体もしくは不活性型を、組成物、好ましくは医薬もしくは化粧品組成物の調製に使用することに関する。
【０１８２】
医薬組成物は治療上有効な量の、上記の、本発明の微生物、または本発明の誘導体もしくは変異体、または本発明の前記微生物の不活性型を含んでなり、さまざまな形態、たとえば、固体、液体、粉末、水溶液、凍結乾燥型に、製剤化することができる。
【０１８３】
医薬組成物は、上記のように製薬上許容される担体とともに患者に投与することができる。特定の実施形態において、「製薬上許容される」という表現は、動物に、より詳細にはヒトに使用するために、監督官庁もしくは他の一般に認められている薬局方によって、承認されていることを意味する。
【０１８４】
「担体」という用語は、治療薬とともに投与される、希釈剤、補助剤、添加剤、もしくは賦形剤を表す。こうした担体は製薬上許容されている、すなわち、用いられる投与量および濃度でレシピエントに対して毒性がない。これは、好ましくは、等張性、低張性、もしくは弱い高張性であり、ショ糖溶液によって与えられるように、相対的に低いイオン強度を有する。こうした医薬品担体は、水および油のような無菌の液体とすることができるが、これには、石油、動物、植物、もしくは合成起源のもの、たとえば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などが含まれる。塩類溶液およびデキストロース溶液およびグリセロール溶液も、液体担体として使用することができる。適当な医薬品添加剤には、デンプン、ブドウ糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、ナトリウムイオン、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどがある。組成物は、必要ならば、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤も含有することができる。こうした組成物は、たとえば、溶液、懸濁液、乳濁液、粉末、徐放性製剤などの形をとることができる。適当な医薬品担体の例は、E.W. Martinによる"Remington's Pharmaceutical Sciences"に記載されている。医薬品担体として機能しうる物質の、他の例には、ブドウ糖およびショ糖といった糖類；コーンスターチおよびバレイショデンプンのようなデンプン；セルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースといったその誘導体；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；ステアリン酸；ステアリン酸マグネシウム；硫酸カルシウム；炭酸カルシウム；ピーナッツ油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油およびカカオ脂といった植物油；プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールといったポリオール類；寒天；アルギン酸；パイロジェンフリー水；等張食塩水；クランベリー抽出物およびリン酸バッファー溶液；脱脂粉乳；ならびに医薬品製剤に使用される、他の毒性のない適合物質、たとえば、ビタミンC、エストロゲンおよびエキナシアがある。湿潤剤および潤滑剤、たとえばラウリル硫酸ナトリウム、ならびに着色剤、香料、潤滑剤、添加剤、打錠剤、安定化剤、抗酸化剤および防腐剤も入れることができる。活性成分をカプセル化された形で、たとえば、セルロースカプセル化として、ゼラチン中で、ポリアミド、ニオソーム、ワックスマトリックスとともに、シクロデキストリンとともに、またはリポソームでカプセル化して、投与することも有効である。
【０１８５】
一般に、成分は、別々に提供されるか、あるいは単位投薬剤形として、たとえば、凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、活性物質の量を表示したアンプルもしくは小袋のような密閉容器中で混合されているかのいずれかである。
【０１８６】
本発明の医薬組成物は、中性型もしくは塩型として調剤することができる。製薬上許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導されるような、陰イオンとともに形成される塩、ならびに、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導されるような、陽イオンとともに形成される塩がある。
【０１８７】
たとえば実施例に記載のようなin vitroもしくはin situアッセイを用いて、場合によっては、最適な投薬量の範囲を確定する一助とすることができる。製剤に用いられるべき正確な用量はまた、投与経路、および疾病もしくは障害の重さに依存するものであり、医師の判断ならびに各々の患者の状況に応じて決定されるべきである。局所経路の投与が好ましい。有効な用量は、in vitroもしくは（動物）モデル試験系から得られる用量反応曲線から外挿することができる。好ましくは、医薬組成物は、そのまま、もしくは補助剤と組み合わせて、投与される。補助剤は、クロロキン、プロトン性極性化合物、たとえば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール、エタノール、1 -メチル L-2-ピロリドン、もしくはそれらの誘導体、または非プロトン性化合物、たとえば、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ジエチルスルホキシド、ジ-n-プロピルスルホキシド、ジメチルスルホン、スルホラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、テトラメチル尿素、アセトニトリル、もしくはそれらの誘導体or their derivativesからなる一群から選択することができる。これらの化合物は、pH限界を考慮した条件で加えられる。本発明の組成物は、脊椎動物に投与することができる。本明細書で使用される「脊椎動物」は、当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有するものとする。特に、「脊椎動物」は哺乳類を包含し、より具体的にはヒトを包含する。
【０１８８】
「投与する」という用語は、治療上有効な用量の前記組成物の投与を意味する。「治療上有効な量」は、投与のねらいとする効果を引き起こす用量を意味し、好ましくは、こうした効果は、病原微生物からの皮膚の保護である。正確な用量は、治療目的によって決まるものであり、当業者は既知の方法によってこれを確認することができる。当技術分野で知られているように、また上記のように、全身もしくは局所デリバリー、年齢、体重、全身状態、性別、食事、投与時期、薬物相互作用および病気の程度に対して調整は必要となるが、当業者は通常の実験によってこれを確認することができる。
【０１８９】
本方法はヒトの治療にも獣医学的適用にも適用可能である。望ましい治療活性を有する本明細書に記載の化合物を、本明細書に記載のように、生理学的に許容される担体中で患者に投与することができる。投与形式に応じて、化合物を、下記のようにさまざまな方法で製剤化することができる。治療上活性のある化合物の製剤中の濃度は、約0.01から100重量％までさまざまとすることができる。この薬剤は単独で、または他の治療と併せて、投与することができる。
【０１９０】
医薬組成物の投与は、さまざまな方法で行うことができる。好ましい投与経路は、局所経路である。主治医および臨床学的ファクターによって投与計画が決定される。医学分野でよく知られているように、どの患者に対する投薬量も、患者の身体の大きさ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間および経路、全身状態、および同時に投与されている他の薬物などの、多くの要因に左右される。典型的な用量は、たとえば、0.001から1000μgである；しかしながら、特に前記要因を考慮すると、こうした典型的な範囲より少ない、もしくは多い用量が想定される。投薬は、好ましくは週1回、より好ましくは、週2回、3回、4回、5回、もしくは6回行われるが、もっとも好ましくは毎日、さらにそれより好ましくは1日2回もしくはより頻回に行われる。具体的には、たとえば洗浄によって、皮膚常在菌叢の障害が起こるたびに、その後に投薬を行うことが好ましいと考えられる。しかしながら、治療の経過中に、もっとずっと長い時間間隔で投薬を行うことができ、必要ならばもっとずっと短い時間間隔で、たとえば1日数回与えることができる。好ましい場合において、本明細書に記載の方法、および当業者に知られた別の方法を用いて、免疫応答をモニターして、たとえば、時間、量、および／または組成物について投薬を最適化する。定期的な評価によって経過をモニターすることができる。併用療法のアプローチにおいて、すなわち他の薬剤もしくは薬物、たとえば病原微生物から皮膚を保護する他の薬物とともに同時投与で、医薬組成物を用いることも想定される。
【０１９１】
本発明の化粧品もしくは医薬組成物の局所投与は、望ましい処置が局所投与によって容易に接触できる領域もしくは器官に関わる場合に、有用である。皮膚に局所的に適用するために、医薬組成物は、好ましくは、適当なペースト、軟膏、ローション、クリーム、ジェルもしくは経皮パッチとして製剤される。化粧品もしくは医薬製剤は、使用分野に応じて、スプレー（ポンプスプレーもしくはエアロゾル）、フォーム、ジェルスプレー、ムース、懸濁液もしくは粉末の形をとることができる。
【０１９２】
適当なペーストは、担体中に懸濁した活性成分を含んでなる。こうした担体には、石油、白色軟パラフィン、黄色ワセリンおよびグリセロールがあるが、それらに限定されない。化粧品もしくは医薬組成物は、担体中に懸濁または溶解した活性成分を含んでなる、適当な軟膏として製剤化することもできる。こうした担体には、グリセロール、鉱油、液体油、石油、白色ワセリン、黄色ワセリン、プロピレングリコール、アルコール、トリグリセリド、セチルエステルのような脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン化合物、白蝋および黄色蜜蝋のようなワックス、セチルアルコール、ステアリルアルコールおよびセチルステアリルアルコールのような脂肪アルコール、ステアリン酸のような脂肪酸、ステアリン酸セチル、ラノリン、水酸化マグネシウム、カオリン、および水のうち1つもしくは複数が含まれるがそれらに限定されない。あるいはまた、化粧品もしくは医薬組成物は、担体中に懸濁または溶解した活性成分を含んでなる適当なローションもしくはクリームとして製剤化することもできる。こうした担体には、パラフィンのような鉱油、ヒマシ油および硬化ヒマシ油のような植物油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート、セチルエステルのような脂肪酸エステル、ワックス、セチルアルコール、ステアリルアルコール、2-オクチルドデカノール、ベンジルアルコールのような脂肪アルコール、アルコール、トリグリセリド、および水のうち1つもしくは複数が含まれるが、それらに限定されない。あるいはまた、化粧品もしくは医薬組成物はまた、担体中に懸濁または溶解した活性成分を含んでなる適当なジェルとして製剤化することができる。こうした担体には、水、グリセロール、プロピレングリコール、流動パラフィン、ポリエチレン、脂肪油、セルロース誘導体、ベントナイト、およびコロイド状二酸化ケイ素のうち1つもしくは複数が含まれるが、それらに限定されない。
【０１９３】
本発明のエアロゾルに適した噴射剤は、通常の噴射剤、たとえば、プロパン、ブタン、ペンタンなどである。
【０１９４】
本発明の製剤は、一般に、そうした製剤に通例使用される助剤をさらに含んでなることができるが、これはたとえば、防腐剤、香料、消泡剤、色素、顔料、増粘剤、界面活性物質、乳化剤、皮膚軟化薬、表面処理剤、脂肪、油、ワックス、または他の化粧用もしくは皮膚用製剤の通常成分、たとえば、アルコール、ポリオール、ポリマー、気泡安定剤、溶解促進剤、電解質、有機酸、有機溶媒、もしくはシリコーン誘導体である。
【０１９５】
本発明の化粧品もしくは医薬組成物は、皮膚軟化薬を包含してもよい。乾燥を防止する、または軽減するために有効な量の皮膚軟化薬を使用することができる。有用な皮膚軟化薬には下記があるが、それらに限定されない：炭化水素油およびワックス；シリコーン油；トリグリセリドエステル；アセトグリセリドエステル；エトキシル化グリセリド； アルキルエステル；アルケニルエステル；脂肪酸；脂肪アルコール；脂肪アルコールエーテル；エーテルエステル；ラノリンおよび誘導体；多価アルコール（ポリオール）およびポリエーテル誘導体；多価アルコール（ポリオール）エステル；ワックスエステル；蜜蝋誘導体、植物蝋；リン脂質；ステロール；ならびにアミド。
【０１９６】
このように、たとえば、典型的な皮膚軟化薬としては、鉱油、特に50から500 SUSまでの範囲の粘性を有する鉱油、ラノリン油、ミンク油、ココナッツ油、カカオバター、オリーブ油、アーモンド油、マカダミアナッツ油、アロエ抽出物、ホホバ油、紅花油、コーン油、液状ラノリン、綿実油、ピーナッツ油、PurCellin Oil（ピュアセリンオイル）、ペルヒドロスクアレン（スクアレン）、ヒマシ油、ポリブテン、無臭ミネラルスピリット、甘扁桃油、アボカド油、カロフィラム油、リシン油、ビタミンE酢酸エステル、オリーブ油、ミネラルスピリット、セテアリールアルコール（主としてセチルおよびステアリルアルコールからなる脂肪アルコール混合物）、リノレニルアルコール、オレイルアルコール、オクチルドデカノール、小麦胚芽のような穀物胚芽の油、オクタン酸セテアリール（セテアリールアルコールと2-エチルヘキサン酸のエステル）、パルミチン酸セチル、アジピン酸ジイソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、パルミチン酸オクチル、ミリスチン酸イソプロピル、ミリスチン酸ブチル、ステアリン酸グリセリル、ステアリン酸ヘキサデシル、ステアリン酸イソセチル、ステアリン酸オクチル、ヒドロキシステアリン酸オクチル、ステアリン酸プロピレングリコール、ステアリン酸ブチル、オレイン酸デシル、オレイン酸グリセリル、アセチルグリセリド、(C12-C15)アルコールのオクタン酸および安息香酸エステル、アルコールおよびポリアルコールのオクタン酸およびデカン酸エステル、たとえば、グリコールおよびグリセロールのエステル、ならびにアルコールおよびポリアルコールのリシノール酸エステル、たとえば、アジピン酸イソプロピル、ラウリン酸ヘキシル、ドデカン酸オクチル、ジメチコンコポリオール、ジメチコノール、ラノリン、ラノリンアルコール、ラノリンワックス、水添ラノリン、ヒドロキシル化ラノリン、アセチル化ラノリン、ペトロラタム、ラノリン脂肪酸イソプロピル、ミリスチン酸セチル、ミリスチン酸グリセリル、ミリスチン酸ミリスチル、乳酸ミリスチル、セチルアルコール、イソステアリルアルコール、ステアリルアルコール、およびラノリン脂肪酸イソセチルなどが挙げられる。
【０１９７】
さらに、本発明の化粧品もしくは医薬組成物は乳化剤を包含することもできる。
【０１９８】
好ましくは組成物の成分の均一な混合をもたらすために有効な量の乳化剤（すなわち乳化作用のある物質）が使用される。有用な乳化剤には、(i)陰イオン性、たとえば脂肪酸石鹸、例としてはステアリン酸カリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸アンモニウム、およびステアリン酸トリエタノールアミン；脂肪酸石鹸を含むポリオール脂肪酸モノエステル、たとえば、カリウムもしくはナトリウム塩のいずれかを含有するモノステアリン酸グリセロール；硫酸エステル（ナトリウム塩）、たとえば、ラウリル硫酸ナトリウム、およびセチル硫酸ナトリウム；ならびに硫酸エステルを含有するポリオール脂肪酸モノエステル、たとえば、ラウリル硫酸ナトリウムを含有するモノステアリン酸グリセリル；(ii)陽イオン性、たとえば、N（ステアロイルコラミノホルミルメチル）ピリジウムクロリド； N-ソイ-N-エチルモルホリニウムエトサルフェート；アルキルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ジイソブチルフェノキシエトキシエチルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；およびセチルピリジウムクロリド；ならびに(iii)非イオン性、たとえば、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル、たとえば、モノステアレート；ポリオキシエチレンラウリルアルコール；ポリオキシプロピレン脂肪アルコールエーテル、たとえば、プロポキシル化オレイルアルコール；ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、たとえば、ステアリン酸ポリオキシエチレン；ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、たとえば、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン；ソルビタン脂肪酸エステル、たとえば、ソルビタン；ポリオキシエチレングリコール脂肪酸エステル、たとえば、モノステアリン酸ポリオキシエチレングリコール；ならびにポリオール脂肪酸エステル、たとえば、モノステアリン酸グリセリル、およびモノステアリン酸プロピレングリコール；さらにエトキシル化ラノリン誘導体、たとえば、エトキシル化ラノリン、エトキシル化ラノリンアルコールおよびエトキシル化コレステロールがある。乳化剤の選択は、典型的には、Schrader, Grundlagen und Rezepturen der Kosmetika, Huethig Buch Verlag, Heidelberg, 第2版、1989、第3部に記載されている。
【０１９９】
本発明の化粧品もしくは医薬組成物はまた、界面活性剤を包含することができる。適当な界面活性剤としては、たとえば、一般に洗浄剤、乳化剤、増泡剤、ハイドロトロープ、可溶化剤、懸濁化剤および非界面活性剤（固体の液体中での分散を促進する）として分類される界面活性剤がある。
【０２００】
界面活性剤は通常、両性、陰イオン性、陽イオン性および非イオン性界面活性剤として分類される。両性界面活性剤には、アシルアミノ酸および誘導体、ならびにN-アルキルアミノ酸がある。陰イオン性界面活性剤には：アシルアミノ酸および塩、たとえば、アシルグルタミン酸塩、アシルペプチド、アシルサルコシン酸塩、およびアシルタウリン塩；カルボン酸および塩、たとえば、アルカン酸、カルボン酸エステル、およびカルボン酸エーテル；スルホン酸および塩、たとえば、アシルイセチオン酸塩、アルキルアリールスルホン酸塩、アルキルスルホン酸塩、およびスルホコハク酸塩；硫酸エステル、たとえば、アルキルエーテル硫酸塩およびアルキル硫酸塩が含まれる。陽イオン性界面活性剤には：アルキルアミン、アルキルイミダゾリン、エトキシル化アミン、および4級アンモニウム化合物（たとえば、アルキルベンジルジメチルアンモニウム塩、アルキルベタイン、複素環式アンモニウム塩、およびテトラアルキルアンモニウム塩）がある。さらに、非イオン性界面活性剤には：アルコール、たとえば8-18炭素原子を含む一級アルコール；アルカノールアミド、たとえば、アルカノールアミン誘導アミドおよびエトキシル化アミド；アミンオキシド；エステル、たとえばエトキシル化カルボン酸、エトキシル化グリセリド、グリコールエステルおよび誘導体、モノグリセリド、ポリグリセリルエステル、多価アルコールエステルおよびエーテル、ソルビタン／ソルビトールエステル、およびリン酸のトリエステル；ならびにエーテル、たとえば、エトキシル化アルコール、エトキシル化ラノリン、エトキシル化ポリシロキサン、およびプロポキシル化ポリオキシエチレンエーテルがある。
【０２０１】
さらに、本発明の化粧品もしくは医薬組成物は皮膜形成剤を含んでなることができる。本発明にしたがって使用される適当な皮膜形成剤は、組成物を滑らかで均一に保つものであって、限定はしないが、下記のものがある：アクリルアミド／アクリル酸ナトリウムコポリマー；アクリル酸アンモニウムコポリマー；バルサムペル；セルロースガム；エチレン／無水マレイン酸コポリマー；ヒドロキシエチルセルロース；ヒドロキシプロピルセルロース；ポリアクリルアミド；ポリエチレン；ポリビニルアルコール； pvm/MA コポリマー（ポリビニルメチルエーテル／無水マレイン酸）； PVP（ポリビニルピロリドン)；無水マレイン酸コポリマー、たとえば、Gulf Science and Technology から入手可能なPA-18； PVP/ヘキサデセンコポリマー、たとえば、GAF Corporation から発売されているGanex V-216； アクリル／アクリル酸コポリマー；など。
【０２０２】
一般に皮膜形成剤は、組成物全体に対する重量比で約0.1％から約10％までの量を使用することができるが、約1％から約8％までが好ましく、約0.1％から約5％までがもっとも好ましい。湿潤剤も有効な量を使用することができるが、これには、果糖；ブドウ糖；グルタミン酸；グリセリン；ハチミツ；マルチトール；メチルグルセス-10；メチルグルセス-20；プロピレングリコール；乳酸ナトリウム；ショ糖；などがある。
【０２０３】
もちろん、本発明の化粧品もしくは医薬組成物は防腐剤を含むことができる。本発明の特定の組成物の防腐剤は、下記を包含するがそれに限定されない：ブチルパラベン；エチルパラベン；イミダゾリジニル尿素；メチルパラベン；O-フェニルフェノール；プロピルパラベン；クォータニウム-14；クォータニウム-15；デヒドロ酢酸ナトリウム；ジンクピリチオン；など。
【０２０４】
防腐剤は、微生物の生育を防止もしくは遅延させるのに有効な量が用いられる。一般に、防腐剤は、組成物全体に対する重量比で約0.1％から約1％までの量を使用することができるが、約0.1％から約0.8％までが好ましく、約0.1％から約0.5％までがもっとも好ましい。
【０２０５】
本発明の化粧品もしくは医薬組成物はまた、香料を含んでいてもよい。本発明の組成物に望ましい芳香および色を与えるのに有効な量の、当業者に周知の香料（芳香化合物）および着色料（着色剤）を使用することができる。
【０２０６】
さらに、本発明の化粧品もしくは医薬組成物は、ワックスも含んでなることができる。本発明に有用な、適当なワックスには：動物ワックス、たとえば、蜜蝋、鯨蝋、もしくは羊毛ワックス（ラノリン）；植物ワックス、たとえば、カルナウバもしくはカンデリラ；ミネラルワックス、たとえば、モンタンワックスもしくはオゾケライト；ならびに石油ワックス、たとえば、パラフィンワックスおよびマイクロクリスタリンワックス（高分子量石油ワックス）がある。動物ワックス、植物ワックスおよび一部のミネラルワックスは、高分子量脂肪アルコールの高分子量脂肪酸との一級エステルである。たとえば、トリコンタノールのヘキサデカン酸エステルは、蜜蝋の主成分であると一般に報告されている。本発明の他の適当なワックスとしては、ポリエチレンポリオキシエチレン、ならびに一酸化炭素および水素から誘導された炭化水素ワックスなどの合成ワックスがある。
【０２０７】
代表的なワックスには、次のようなものも含まれる：セロシン（cerosin）；セチルエステル；水添ホホバ油；水添ホホバワックス；水添米ぬかワックス；木蝋；ホホババター；ホホバ油；ホホバワックス；ミンクワックス；モンタン酸ワックス；オウリキュリー（ouricury）ワックス；米ぬかワックス；シェラックワックス；硫化ホホバ油；合成蜜蝋；合成ホホバ油；トリヒドロキシステアリン；セチルアルコール；ステアリルアルコール；カカオバター；ラノリンの脂肪酸；25℃で固体である、モノ-、ジ-、およびトリグリセリド、たとえば、トリベヘン酸グリセリル（ベヘン酸およびグリセリンのトリエステル）およびC1g-C36酸トリグリセリド（C1g-C36カルボン酸およびグリセリンのトリエステルの混合物）、それぞれCroda, Inc., New York, N.Y.から商標名Syncrowax HRC およびSyncrowax HGL-Cとして発売されている；25℃で固体である脂肪酸エステル；シリコーンワックス、たとえば、メチルオクタデカンオキシポリシロキサンおよびポリ（ジメチルシロキシ）ステアロキシシロキサン；ステアリル・モノ-およびジ-エタノールアミド；ロジンおよびその誘導体、たとえば、グリコールおよびグリセロールのアビエチン酸エステル；25℃で固体の硬化油；ならびにスクログリセリド。水性の系において有効な量を使用することができる増粘剤（粘度調整剤）には次のようなものがある：アルギン；カルボマー、たとえば、カルボマー934, 934P, 940 および941；セルロースガム；セテアリルアルコール；コカミドDEA；デキストリン；ゼラチン；ヒドロキシエチルセルロース；ヒドロキシプロピルセルロース；ヒドロキシプロピルメチルセルロース；ケイ酸マグネシウムアルミニウム；ミリスチルアルコール； エンバク粉；オレアミドDEA；オレイルアルコール；PEG-7M；PEG-14M；PEG-9OM；ステアラミドDEA；ステアラミドMEA；ステアリルアルコール；トラガカントゴム；コムギデンプン；キサンタンガム；などであるが、上記の増粘剤のリストにおいて、DEAは、ジエタノールアミンであり、MEAは、モノエタノールアミンである。非水系において有効な量を使用することができる増粘剤（粘度調整剤）には、ステアリン酸アルミニウム；蜜蝋；カンデリラワックス；カルナウバ；セレシン；セテアリルアルコール；セチルアルコール；コレステロール； 含水ケイ酸；水添ヒマシ油；水添綿実油；水添ダイズ油；水添牛脂脂肪酸グリセリド；水添植物油；ヒドロキシプロピルセルロース；ラノリンアルコール；ミリスチルアルコール；オクチルドデシルステアロイル硫酸；オレイルアルコール；オゾケライト；マイクロクリスタリンワックス；パラフィン；テトラオクタン酸ペンタエリスリチル；ポリアクリルアミド；ポリブテン；ポリエチレン；ジカプリル酸プロピレングリコール；ジペラルゴン酸プロピレングリコール；ステアラルコニウムヘクトライト；ステアリルアルコール；ステアリン酸ステアリル；合成蜜蝋；トリヒドロキシステアリン；トリリノレイン；トリステアリン；ステアリン酸亜鉛；などがある。製剤において慣例の天然および合成増粘剤もしくはゲル生成剤は、架橋されたポリアクリル酸およびその誘導体、多糖類、たとえばキサンタンガムもしくはアルギン酸塩、カルボキシメチルセルロースもしくはヒドロキシカルボキシメチルセルロース、親水コロイド、たとえばアラビアゴムもしくはモンモリロナイト鉱物、たとえば、ベントナイトもしくは脂肪アルコール、ポリビニルアルコール、およびポリビニルピロリドンである。
【０２０８】
本発明の化粧品もしくは医薬組成物に、目的とする用途に有効な量を添加もしくは使用することができる他の成分としては：性能や消費者アピールを高めるための生物学的添加物、たとえば、アミノ酸、タンパク質、バニラ、アロエ抽出物、バイオフラボノイドなど；緩衝剤、キレート剤、たとえば、EDTA；乳化安定剤；pH調整剤； 乳白剤；ならびに噴射剤、たとえば、ブタン、二酸化炭素、エタン、ヒドロクロロフルオロカーボン22 および142b、ヒドロフルオロカーボン152a、イソブタン、イソペンタン、窒素、亜酸化窒素、ペンタン、プロパンなどが挙げられる。
【０２０９】
さらに、本発明の製剤は、その作用を補い、または強めるために、抗酸化剤、フリーラジカルスカベンジャー、皮膚湿潤もしくは保湿、抗紅斑、抗炎症、または抗アレルギー作用を有する化合物も含んでなることができる。具体的には、こうした化合物は、ビタミン類、植物抽出物、α-およびβ-ヒドロキシ酸、セラミド、抗炎症性、抗菌性もしくはUVフィルタリング物質、ならびにそれらの誘導体およびそれらの混合物からなる一群から選択することができる。有利なことに、本発明の製剤は、UV-Bおよび／またはUV-A領域の紫外線を吸収する物質も含むことができる。脂質相は、鉱油、ミネラルワックス、分岐および／または非分岐炭化水素および炭化水素ワックス、飽和および／または不飽和、分岐および／または非分岐C8-C24アルカンカルボン酸からなる物質群から有利に選択される；これらは、合成、半合成、もしくは天然の油、たとえば、オリーブ油、パーム油、アーモンド油もしくは混合物；油、脂もしくはワックス、飽和および／または不飽和、分岐および／または非分岐C3-C30アルカンカルボン酸と飽和および／または不飽和、分岐および／または非分岐C3-C30アルコールのエステル、芳香族カルボン酸と飽和および／または不飽和、分岐および／または非分岐C3-C30アルコールからのエステル、たとえば、ミリスチン酸イソプロピル、ステアリン酸イソプロピル、ステアリン酸ヘキシルデシル、オレイン酸オレイル；ならびにまた、こうしたエステルの、合成、半合成、または天然の混合物、たとえば、ホホバ油、アルキル安息香酸エステルもしくはシリコーン油、たとえば、シクロメチコン、ジメチルポリシロキサン、ジエチルポリシロキサン、オクタメチルシクロ・テトラシロキサン、およびそれらの混合物、またはジアルキルエーテルから選択することができる。
【０２１０】
本発明の活性成分を、たとえば、皮膚の洗浄用の化粧品組成物、たとえば、固形石鹸、化粧石鹸、含核石鹸、透明石鹸、高級石鹸、脱臭石鹸、クリーム石鹸、ベビーソープ、皮膚保護石鹸、研磨剤、合成洗剤、液状石鹸、練り石鹸、軟石鹸、洗浄ペースト、液体洗浄、シャワーおよび浴用化粧品、たとえば、洗浄ローション、シャワー剤、シャワージェル、泡風呂入浴剤、クリーム泡風呂入浴剤、オイルバス、浴用エキス、スクラブ剤、in situ製品、シェービングフォーム、シェービングローション、シェービングクリームに使用することができる。さらに、本発明の活性成分は、皮膚の化粧品に適しており、これはたとえば、W/OもしくはO/Wスキンクリームおよびボディクリーム、デイクリームおよびナイトクリーム、光防護組成物、アフターサン製品、ハンドケア製品、フェイスクリーム、多重エマルション、ジュレ、マイクロエマルション、リポソーム製剤、ニオソーム製剤、しわ防止クリーム、フェイスオイル、リポジェル、スポーツジェル、保湿クリーム、美白クリーム、ビタミンクリーム、スキンローション、ケアローション、アンプル剤、アフターシェーブローション、ひげそり用ローション、保湿ローション、日焼けローション、セルライトクリーム、脱色組成物、マッサージ剤、ボディーパウダー、フェーストニック、デオドラント化粧品、制汗剤、毛ホールパック、にきび抑制組成物、虫除け剤などである。
【０２１１】
好ましい実施形態において、化粧品は、デイリーケアO/W製剤を含んでなるが、これは、国際化粧品成分命名法（International Nomenclature of Cosmetic Ingredients, INCI）に従って、たとえば、パーセント表示の下記成分を含有することができる：
A     1.7   セテアレス-6、ステアリルアルコール
0.7   セテアレス-25
2.0   ジエチルアミノヒドロキシベンゾイル安息香酸ヘキシル
2.0   PEG-14 ジメチコン
3.6   セテアリルアルコール
6.0   メトキシ桂皮酸エチルヘキシル
2.0   アジピン酸ジブチル
B     5.0   グリセロール
0.2   EDTA2ナトリウム
1.0   パンテノール
適量  防腐剤
67.8  水
C     4.0   トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル、アクリル酸ナトリウムコポリ
マー
D     0.2   アスコルビルリン酸ナトリウム
1.0   酢酸トコフェリル
0.2   ビサボロール
1.0   トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル、アスコルビン酸ナトリウム、
トコフェロール、レチノール
1.0   ラクトバチルス属菌
E     適量  水酸化ナトリウム
フェーズAおよびBを別々に約80℃に加熱する。フェーズBを、その後、かき混ぜながらフェーズAに入れ、ホモジナイズする。フェーズCを、フェーズAおよびBの混合物にかき混ぜながら入れ、ホモジナイズする。この混合物を、撹拌しながら約40℃に冷却する；次に、フェーズDを加え、フェーズEを用いてpHを約6.5に調整する。続いて、その溶液をホモジナイズし、室温に冷却する。
【０２１２】
さらに好ましい実施形態において、化粧品組成物は、保護作用のあるデイクリームO/W製剤を含んでなるが、これは、国際化粧品成分命名法（International Nomenclature of Cosmetic Ingredients, INCI）に従って、たとえば、パーセント表示の下記成分を含有することができる：
A     1.7   セテアレス-6、ステアリルアルコール
0.7   セテアレス-25
2.0   ジエチルアミノヒドロキシベンゾイル安息香酸ヘキシル
2.0   PEG-14 ジメチコン
3.6   セテアリルアルコール
6.0   メトキシ桂皮酸エチルヘキシル
2.0   アジピン酸ジブチル
B     5.0   グリセロール
0.2   EDTA2ナトリウム
1.0   パンテノール
適量  防腐剤
68.6  水
C     4.0   トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル、アクリル酸ナトリウムコポリ
マー
D     1.0   アスコルビルリン酸ナトリウム
1.0   酢酸トコフェリル
0.2   ビサボロール
1.0   ラクトバチルス属菌
E     適量  水酸化ナトリウム
フェーズAおよびBを別々に約80℃に加熱する。フェーズBを、その後、かき混ぜながらフェーズAに入れ、ホモジナイズする。フェーズCを、フェーズAおよびBの混合物に入れ、ホモジナイズする。この混合物を、撹拌しながら約40℃に冷却する；次に、フェーズDを加え、フェーズEを用いてpHを約6.5に調整する。続いて、その溶液をホモジナイズし、室温に冷却する。
【０２１３】
さらに好ましい実施形態において、化粧品組成物は、皮膚洗浄剤O/W製剤を含んでなるが、これは、国際化粧品成分命名法（International Nomenclature of Cosmetic Ingredients, INCI）に従って、たとえば、パーセント表示の下記成分を含有することができる：
A     10.0   エチルヘキサン酸セテアリル
10.0   トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル
1.5    シクロペンタシロキサン、シクロヘキサシロキサン
2.0    PEG-40 水添ヒマシ油
B     3.5    トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル、アクリル酸ナトリウムコポ
リマー
C     1.0    酢酸トコフェリル
0.2    ビサボロール
適量   防腐剤
適量   香油
D     3.0    ポリクォータニウム-44
0.5    ココトリモニウムメト硫酸
0.5    セテアレス-25
2.0    パンテノール、プロピレングリコール
4.0    プロピレングリコール
0.1    EDTA2ナトリウム
1.0    ラクトバチルス属菌
60.7   水
最初に、フェーズAを溶解し、続いてフェーズBをフェーズAに撹拌しながら入れる。その後、フェーズCをフェーズAおよびBの混合物に入れる。次の段階で、フェーズDを溶解してフェーズA、BおよびCの混合物に撹拌しながら加える。この混合物をホモジナイズし、15分間撹拌する。
【０２１４】
さらに好ましい実施形態において、化粧品組成物は、デイリーケアボディスプレー製剤を含んでなるが、これは、国際化粧品成分命名法（International Nomenclature of Cosmetic Ingredients, INCI）に従って、たとえば、パーセント表示の下記成分を含有することができる：
A     3.0    メトキシ桂皮酸エチルヘキシル
2.0    ジエチルアミノヒドロキシベンゾイル安息香酸ヘキシル
1.0    ポリクォータニウム-44
3.0    ポリエチレングリコール
2.0    パンテノール、プロピレングリコール
1.0    シクロペンタシロキサン、シクロヘキサシロキサン
10.0   オクチルドデカノール
0.5    PVP
10.0   トリ（カプリル酸／カプリン酸）グリセリル
3.0    安息香酸アルキル（C12-15）
3.0    グリセロール
1.0    酢酸トコフェリル
0.3    ビサボロール
1.0    ラクトバチルス属菌
59.2    アルコール
フェーズAの成分を秤量し、清澄になるまで溶解する。
【０２１５】
さらに好ましい実施形態において、化粧品組成物はスキンジェルを含んでなるが、これは、国際化粧品成分命名法（International Nomenclature of Cosmetic Ingredients, INCI）に従って、たとえば、パーセント表示の下記成分を含有することができる：
A     3.6    PEG-40 水添ヒマシ油
15.0   アルコール
0.1    ビサボロール
0.5    酢酸トコフェリル
適量   香油
B     3.0    パンテノール
0.6    カルボマー
1.0    ラクトバチルス属菌
75.4   水
C     0.8    トリエタノールアミン
はじめに、フェーズAを清澄になるまで溶解する。フェーズBを混合したのちフェーズCで中和する。次の段階で、フェーズAをホモジナイズしたフェーズBに撹拌しながら加え、混合物をホモジナイズする。
【０２１６】
なおいっそう好ましい実施形態において、化粧品組成物はアフターシェーブローションを含んでなるが、これは、国際化粧品成分命名法（International Nomenclature of Cosmetic Ingredients, INCI）に従って、たとえば、パーセント表示の下記成分を含有することができる：
A     10.0   エチルヘキサン酸セテアリル
5.0    酢酸トコフェリル
1.0    ビサボロール
0.1    香油
0.3    アクリレーツ／アクリル酸アルキル（C10-30）クロスポリマー
B     15.0   アルコール
1.0    パンテノール
3.0    グリセロール
1.0    ラクトバチルス属菌
0.1    トリエタノールアミン
63.5   水
フェーズAの成分を混合する。次の段階で、フェーズBを溶解してフェーズAに入れたのち、ホモジナイズする。
【０２１７】
本発明はまた、本発明の微生物、または上記のその誘導体、変異体もしくは不活性型を、皮膚炎、好ましくはアトピー性皮膚炎、乾癬、ツタウルシ皮膚炎、ヘルペス性湿疹、禿瘡、または疥癬を予防もしくは治療する医薬組成物の調製に使用することに関する。
【０２１８】
別の態様において、本発明は、本発明の微生物、またはその誘導体もしくは変異体、もしくは上記の不活性型を、化粧品および／または医薬品として許容される、担体もしくは添加剤とともに製剤化するステップを含んでなる、組成物を製造する方法に関する。
【０２１９】
本発明はさらに、皮膚炎、好ましくはアトピー性皮膚炎、乾癬、ツタウルシ皮膚炎、ヘルペス性湿疹、禿瘡、または疥癬を予防もしくは治療する方法に関するが、その方法は、予防もしくは治療に効果のある量の本発明の組成物を必要な患者に投与するステップを含んでなる。
【０２２０】
当然のことながら、本明細書に記載された特定の方法、プロトコル、細菌、ベクターおよび試薬はさまざまに変化しうるので、本発明はこれらに限定されない。これも当然のことであるが、本明細書で使用される用語は、個別の実施形態の説明のみを目的としており、添付の請求の範囲によってのみ限定されるべき本発明の範囲を限定するものではない。特に指示しない限り、本明細書で使用されるすべての科学技術用語は当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。好ましくは、本明細書で使用される用語は、"A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberqer. H.G.W, Naqel. B. およびKoelbl. H.編(1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)に記載のように定義される。本明細書および下記の特許請求の範囲を通じて、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含んでなる（comprise、その変化形comprisesおよびcomprising）」という用語は、当然のことながら、記載の整数もしくはステップ、または整数群もしくはステップ群の包含を意味するが、他のいかなる整数もしくはステップ、または整数群もしくはステップ群の除外を意味しない。
【０２２１】
本明細書の本文を通じて、いくつもの文献が引用されている。本明細書に引用された各文献は、（特許、特許出願、科学出版物、製造者の仕様書、使用説明書など、すべてを含めて）上記下記にかかわらず、参照としてその全体を本明細書に組み入れるものとする。ここで、なにものも、本発明が先行発明の効力によってこうした開示に先行する権利を有しない、ことを容認すると解釈されるべきではない。
【０２２２】
本明細書および添付の請求の範囲において使用される場合、単数形は、文脈からそうでないことが明らかである場合を除き、複数の指示物を包含することに留意しなければならない。したがって、たとえば、「試薬」への言及は、１つもしくは複数の同様なさまざまの試薬を包含し、「方法」への言及は、本明細書に記載の方法に改変する、もしくは置き換えることのできる、当業者に周知の、同等のステップ（複数）および方法（複数）への指示を包含する。
【０２２３】
本発明の最初の態様は、下記のように、図1〜4によって図解される：
図１は、in vitroホール／ウェルプレートアッセイにおける表皮ブドウ球菌の生育刺激を示す（実施例１）。ウェルの周りの黒いリングの形成は、指示菌である表皮ブドウ球菌の生育刺激を示す。顕微鏡によって、コロニー数の増加を観察することができる。
【０２２４】
図２は、皮膚上の表皮ブドウ球菌の、ラクトバチルス属菌による刺激を示す。指示菌の表皮ブドウ球菌と、ラクトバチルス属菌とを含む寒天プレートを示すが、これらはいずれも皮膚に塗布されていたものである。皮膚の上層を粘着テープによって寒天プレートに移した。このようにして指示菌は寒天プレートに移された。対照プレートは、ラクトバチルス属菌を含有しない。
【０２２５】
図３は、皮膚上の黄色ブドウ球菌の、ラクトバチルス属菌による刺激の欠如を示す。指示菌である黄色ブドウ球菌と、ラクトバチルス属菌とを含有する寒天プレートを示すが、これらはいずれも、皮膚に塗布されていたものである。皮膚の上層を粘着テープによって寒天プレートに移した。このようにして指示菌は寒天プレートに移された。対照プレートは、ラクトバチルス属菌を含有しない。
【０２２６】
図４は、in vitroホール／ウェルプレートアッセイにおける、黄色ブドウ球菌の刺激の欠如を示す（実施例４）。ウェルの周囲に細胞密度の高まった黒いリングの形成を認めることはできない。このことは、指示菌がラクトバチルス属菌によって刺激されないことを示す。
【０２２７】
本発明のもう一つの態様は、下記の図5〜11によって図示される：
図５は、in vitroホール／ウェルプレートアッセイにおける、黄色ブドウ球菌の生育阻害を示す（実施例５）。ウェルの周囲に透明なリングが形成されることは、指示菌である黄色ブドウ球菌の生育阻害を示す。
【０２２８】
図６は、in vitro液体アッセイにおける、黄色ブドウ球菌の生育阻害を示す（実施例６）。乳酸菌なしの対照と比較して、阻害の程度が示されているが、これは、指示菌の黄色ブドウ球菌のコロニー形成単位を計数することによって定量された。
【０２２９】
図７は、in vitro液体アッセイにおける、表皮ブドウ球菌の生育阻害の欠如を示す（実施例７）。乳酸菌なしの対照と比較して、阻害の程度が示されているが、これは、指示菌の表皮ブドウ球菌のコロニー形成単位を計数することによって定量された。
【０２３０】
図８は、in vitro液体アッセイにおける、ミクロコッカス・ルテウスの生育阻害の欠如を示す（実施例１０）。乳酸菌なしの対照と比較して、阻害の程度が示されているが、これは、指示菌のミクロコッカス・ルテウスのコロニー形成単位を計数することによって定量された。
【０２３１】
図９は、in vitro液体アッセイにおける、大腸菌の生育阻害の欠如を示す（実施例１１）。乳酸菌なしの対照と比較して、阻害の程度が示されているが、これは、指示菌の大腸菌のコロニー形成単位を計数することによって定量された。
【０２３２】
図１０は、in vitroホールプレートアッセイにおける黄色ブドウ球菌の生育阻害の程度を、バシトラシンおよびエリスロマイシンと比較して示す（実施例１２）。さまざまな濃度のバシトラシンおよびエリスロマイシンをあらかじめくり抜いた穴に入れ、黄色ブドウ球菌の生育を観察した。対応する検量線を図１０Aに示す。一定量の前培養されたラクトバチルス細胞（DSM 18006）による黄色ブドウ球菌の生育阻害を図１０Bに示す。
【０２３３】
図１１は、ラクトバチルスの阻害物質のプロテアーゼ安定性を示す（実施例１３）。ラクトバチルスDSM 18006の抗菌活性は、プロテイナーゼK、キモトリプシン、トリプシンおよびストレプトミセス・グリセウス由来プロテアーゼによる消化性について特徴づけられた。
【０２３４】
本発明の第１の態様は、下記の実施例１〜４によって例証される。
【実施例１】
【０２３５】
in vitroホールプレートアッセイにおける表皮ブドウ球菌の生育刺激
in vitroホールプレートアッセイにおいて、寒天プレート上の表皮ブドウ球菌の生育を刺激することができる、特定の乳酸菌が同定された。これらの乳酸菌は本明細書に記載されている。上記効果を調べるため、前培養された乳酸菌を、あらかじめくり抜いた穴に入れ、指示菌である表皮ブドウ球菌の生育刺激を観察した。生育刺激の視覚効果を高めるために、亜テルル酸塩を使用した。亜テルル酸塩は、ブドウ球菌を特異的に染色する。刺激は、ピペットで乳酸菌を入れた穴の周りに黒いリングが形成され、コロニー数が増加することとして定義された。データを図１に示す。
【０２３６】
ラクトバチルス属菌の培養および調製：
乳酸菌は、エッペンドルフ試験管内の1 ml MRS液体培地で、−80℃凍結培養物から培養した。この試験管を閉じ、37℃で2日間培養した。この前培養物の10μlをファルコンチューブ内の7 ml MRS液体培地からなる主培養に移した。この培養物を2日間インキュベートした。培養後、遠心（15分、4000 x g）によって集菌した。細胞ペレットをK/Naバッファーで2回洗浄した（各1 ml）。細胞を、200μlのK/Naバッファー中に再懸濁した。
【０２３７】
指示菌の培養および調製：
指示菌は表皮ブドウ球菌（DSM20044）とした。ガラス製振盪フラスコ内の20ml BHI液体培地に、24時間前培養物15μlを接種した。この指示菌を37℃にて24時間培養した。アリコートをBHI培養液中での吸光度OD595nmが0.025〜0.05となるように希釈し、800μlを指示プレート（BHI/亜テルル酸塩）上に塗抹した。コルクボーラーを用いて、この寒天に穴を開けた。穴に前培養した乳酸菌を入れた。
【０２３８】
培地およびバッファー：
BHI寒天培地                  Difco寒天1.8％；プレート当たり20 ml
BHI培地                      Difco
BHI/亜テルル酸塩-寒天培地    BHI寒天培地と同様、50℃に冷却後、滅菌濾過した1％ 亜
テルル酸カリウム1 mlを100 ml BHI培地に入れる；プレ
ート当たり20 ml
MRS液体培地                  Difco、150μl/ウェル
K/Naバッファー               Kuester Thiel、pH 7.0、オートクレーブ滅菌済み
- 0.066M Na2HPO4 x 2H2O   61.2 ml
- 0.066M KH2PO4           38.8 ml
【実施例２】
【０２３９】
in situ皮膚アッセイにおける表皮ブドウ球菌の生育刺激
皮膚上でそのまま表皮ブドウ球菌の生育を刺激することができる、プロバイオティック乳酸菌が同定された。  
表皮ブドウ球菌の培養物を希釈し、直接、皮膚に塗布して自然乾燥させた。その後、一定量の乳酸菌を、この皮膚領域に正確に塗布した。指示菌の表皮ブドウ球菌は、乳酸菌によって皮膚上で直接刺激を受けることができる。インキュベーション後、粘着テープを用いて、ブドウ球菌を皮膚から寒天プレートに移した。寒天プレートを37℃で培養した。コロニー数の増加は、皮膚上での指示菌の生育刺激を示す（図２）。本発明のラクトバチルス属菌株、特にDSMZに寄託された菌株は、本明細書に記載のように指示菌の生育刺激を示した。
【０２４０】
ラクトバチルス属菌の培養および調製：
乳酸菌は、エッペンドルフ試験管内の1 ml MRS液体培地で、−80℃凍結培養物から培養した。この試験管を閉じ、37℃で2日間培養した。この前培養物の10μlをファルコンチューブ内の7 ml MRS液体培地からなる主培養に移した。培養は2日間行った。培養後、遠心（15分、4000 x g）によって集菌した。細胞ペレットをK/Naバッファーで2回洗浄した（各1 ml）。細胞を200μlのK/Naバッファー中に再懸濁した。
【０２４１】
指示菌の培養および調製：
指示菌は表皮ブドウ球菌（DSM20044）とした。ガラス製振盪フラスコ内の20ml BHI液体培地に、24時間前培養物15μlを接種した。この指示菌を37℃にて24時間培養した。一定量を、BHI培養液中での吸光度OD595nmが0.025〜0.05となるように希釈した。この溶液を再度希釈した（1 :100）。
【０２４２】
培地およびバッファー：
BHI寒天培地                  Difco寒天1.8％；プレート当たり20 ml
BHI培地                      Difco
MRS液体培地                  Difco、150μl/ウェル
K/Naバッファー               Kuester Thiel、pH 7.0、オートクレーブ滅菌済み
- 0.066M Na2HPO4 x 2H2O   61.2 ml
- 0.066M KH2PO4           38.8 ml
【０２４３】
前腕への表皮ブドウ球菌の塗布：
調製された指示菌、表皮ブドウ球菌の1:100希釈物400μlを一定の皮膚領域（10 cm x 3 cm）に均一に塗り広げ、自然乾燥させた。
【０２４４】
表皮ブドウ球菌を接種した皮膚領域へのラクトバチルス属菌の塗布：
調製されたラクトバチルス属菌10μlを、表皮ブドウ球菌があらかじめ接種された皮膚の領域に正確に塗布した。通常の環境で2時間、腕をインキュベートした。
【０２４５】
皮膚からの微生物の再単離：
2時間後、粘着テープ片を用いて、4つの上部の皮膚層をBHI寒天プレートに移した。これによって、単離された皮膚細菌は寒天プレートに移された。寒天プレートを37℃にて24時間インキュベートした。
【実施例３】
【０２４６】
in situ皮膚アッセイにおける黄色ブドウ球菌の生育刺激の欠如
このアッセイによって、一過性病原性菌叢の望ましくない細菌が、保護的な皮膚常在菌叢の細菌を刺激することができる乳酸菌によって刺激されないかを調べることができる。この目的のために、指示菌である黄色ブドウ球菌を高度に希釈して、表皮ブドウ球菌と同様に皮膚に塗布した（実施例２を参照されたい）。この場合も同様に、乳酸菌の刺激活性を調べた。記載の乳酸菌による黄色ブドウ球菌の刺激は、観察されなかった。本発明のラクトバチルス属菌、特にDSMZに寄託された菌株は、黄色ブドウ球菌の刺激を示さなかった。データを図３に示す。
【０２４７】
ラクトバチルス属菌の培養および調製：
乳酸菌は、エッペンドルフ試験管内の1 ml MRS液体培地で、−80℃凍結培養物から培養した。この試験管を閉じ、37℃で2日間培養した。この前培養物の10μlをファルコンチューブ内の7 ml MRS液体培地からなる主培養に移した。培養は2日間行った。培養後、遠心（15分、4000 x g）によって集菌した。細胞ペレットをK/Naバッファーで2回洗浄した（各1 ml）。細胞を200μlのK/Naバッファー中に再懸濁した。
【０２４８】
指示菌の培養および調製：
指示菌は黄色ブドウ球菌（DSM346）とした。ガラス製振盪フラスコ内の20ml BHI液体培地に、24時間前培養物15μlを接種した。この指示菌を37℃にて24時間培養した。一定量を、BHI培養液中での吸光度OD595nmが0.025〜0.05となるように希釈した。この溶液を再度希釈した（1 :100）。
【０２４９】
培地およびバッファー：
BHI寒天培地                  Difco寒天1.8％；プレート当たり20 ml
BHI培地                      Difco
MRS液体培地                  Difco、150μl/ウェル
K/Naバッファー               Kuester Thiel、pH 7.0、オートクレーブ滅菌済み
- 0.066M Na2HPO4 x 2H2O   61.2 ml
- 0.066M KH2PO4           38.8 ml
【０２５０】
前腕への黄色ブドウ球菌の塗布：
調製された指示菌、黄色ブドウ球菌の1:100希釈物400μlを一定の皮膚領域（10 cm x 3 cm）に均一に塗り広げ、自然乾燥させた。
【０２５１】
黄色ブドウ球菌を接種した皮膚領域へのラクトバチルス属菌の塗布：
調製されたラクトバチルス属菌10μlを、黄色ブドウ球菌があらかじめ接種された皮膚の領域に正確に塗布した。通常の環境で2時間、腕をインキュベートした。
【０２５２】
皮膚からの微生物の再単離：
2時間後、粘着テープ片を用いて、4つの上部の皮膚層をBHI寒天プレートに移した。これによって、単離された皮膚細菌は寒天プレートに移された。寒天プレートを37℃にて24時間インキュベートした。データを図３に示す。
【実施例４】
【０２５３】
in vitroホールプレートアッセイにおける黄色ブドウ球菌の生育刺激の欠如
in vitroホールプレートアッセイにおいて寒天プレート上で、表皮ブドウ球菌の生育を刺激することができるが、一過性病原性皮膚菌叢の代表的な菌である黄色ブドウ球菌は刺激しない、特定の乳酸菌が同定された。この効果を調べるために、表皮ブドウ球菌を刺激することができる、前培養された乳酸菌をあらかじめくり抜いた穴に入れ、指示菌である黄色ブドウ球菌の生育刺激のないことを観察した。生育刺激の視覚効果を高めるために、亜テルル酸塩を使用した。亜テルル酸塩はブドウ球菌を特異的に染色する。刺激は、乳酸菌を入れた穴の周りに黒いリングの形成、およびコロニー数の増加として定義された。本発明のラクトバチルス属菌株、特にDSMZに寄託された菌株は、黄色ブドウ球菌の刺激を示さなかった。データを図４に示す。
【０２５４】
ラクトバチルス属菌の培養および調製：
乳酸菌は、エッペンドルフ試験管内の1 ml MRS液体培地で、−80℃凍結培養物から培養した。試験管を閉じ、37℃で2日間培養した。この前培養物の10μlをファルコンチューブ内の7 ml MRS液体培地からなる主培養に移した。培養は2日間行った。培養後、遠心（15分、4000 x g）によって集菌した。細胞ペレットをK/Naバッファーで2回洗浄した（各1 ml）。細胞を200μlのK/Naバッファー中に再懸濁した。
【０２５５】
指示菌の培養および調製：
指示菌は黄色ブドウ球菌（DSM346）とした。ガラス製振盪フラスコ内の20ml BHI液体培地に、15μlの24時間前培養物を接種した。この指示菌を37℃にて24時間培養した。一定量を、BHI培養液中での吸光度OD595nmが0.025〜0.05となるように希釈し、800μlを指示プレート（BHI/亜テルル酸塩）上に塗抹した。コルクボーラーを用いて、この寒天に穴を開けた。穴に前培養した乳酸菌を入れた。
【０２５６】
培地およびバッファー：
BHI寒天培地                  Difco寒天1.8％；プレート当たり20 ml
BHI培地                      Difco
BHI/亜テルル酸塩-寒天培地    BHI寒天培地と同様、50℃に冷却後、滅菌濾過した1％ 亜
テルル酸カリウム1 mlを100 ml BHI培地に入れる；プレ
ート当たり20 mlを分注する
MRS液体培地                  Difco、150μl/ウェル
K/Naバッファー               Kuester Thiel、pH 7.0、オートクレーブ滅菌済み
- 0.066M Na2HPO4 x 2H2O   61.2 ml
- 0.066M KH2PO4           38.8 ml
【０２５７】
本発明の第２の態様は、下記の実施例５〜13によって例証される。
【実施例５】
【０２５８】
in vitroホールプレートアッセイにおける黄色ブドウ球菌の生育阻害
in vitroホールプレートアッセイにおいて寒天プレート上で、黄色ブドウ球菌の生育を特異的に阻害することができる、特定の乳酸菌が同定された。この効果を調べるために、前培養された乳酸菌をあらかじめくり抜いた穴に入れ、指示菌である黄色ブドウ球菌の生育阻害を観察した。データを図５に示す。
【０２５９】
ラクトバチルス属菌の培養および調製：
乳酸菌（OB-LB-Sa3; DSM 18006）は、エッペンドルフ試験管内の1 ml MRS液体培地で、−80℃凍結培養物から培養した。試験管を閉じ、37℃で2日間培養した。この前培養物の10μlをファルコンチューブ内の7 ml MRS液体培地からなる主培養に移した。培養は2日間行った。培養後、遠心（15分、4000 x g）によって集菌した。細胞ペレットをK/Naバッファーで2回洗浄した（各1 ml）。細胞を200μlのK/Naバッファー中に再懸濁した。
【０２６０】
指示菌の培養および調製：
指示菌は黄色ブドウ球菌（DSM346）とした。ガラス製振盪フラスコ内の20ml BHI液体培地に、15μlの24時間前培養物を接種した。この指示菌を37℃にて24時間培養した。一定量を、BHI培養液中での吸光度OD595nmが0.025〜0.05となるように希釈し、800μlを指示プレート（BHI）上に塗抹した。コルクボーラーを用いて、この寒天に穴を開けた。穴に前培養した乳酸菌を5μlまたは10μl入れた。
【０２６１】
培地およびバッファー：
BHI寒天培地                  Difco寒天1.8％；プレート当たり20 ml
BHI培地                      Difco
MRS液体培地                  Difco
K/Naバッファー               Kuester Thiel、pH 7.0、オートクレーブ滅菌済み
- 0.066M Na2HPO4 x 2H2O   61.2 ml
- 0.066M KH2PO4           38.8 ml
【実施例６】
【０２６２】
in vitro液体アッセイにおける黄色ブドウ球菌の生育阻害
in vitro液体アッセイにおいて液体培地中で、黄色ブドウ球菌の生育を特異的に阻害することができる、特定の乳酸菌が同定された。この効果を調べるために、前培養された乳酸菌を、指示菌である黄色ブドウ球菌とともに、ブドウ球菌の生育に最適化した液体培地中で共培養した。阻害の程度は、乳酸菌なしの対照と比較して、指示菌のコロニー形成単位を計数することによって定量した。データは図6に示す。
【０２６３】
ラクトバチルス属菌の培養および調製：
乳酸菌（OB-LB-Sa3; DSM 18006）は、エッペンドルフ試験管内の1 ml MRS液体培地で、−80℃凍結培養物から培養した。試験管を閉じ、37℃で2日間培養した。この前培養物の10μlをファルコンチューブ内の7 ml MRS液体培地からなる主培養に移した。培養は2日間行った。培養後、遠心（15分、4000 x g）によって集菌した。細胞ペレットをK/Naバッファーで2回洗浄した（各1 ml）。細胞を、250 mMグリセロールを含有する200μlのK/Naバッファー中に再懸濁し、17時間インキュベートした。
【０２６４】
指示菌の培養および調製：
指示菌は黄色ブドウ球菌（DSM346）とした。ガラス製振盪フラスコ内の20ml BHI液体培地に、24時間前培養の凍結培養物15μlを接種した。この培養物を、2.5 x 108細胞/mlの細胞濃度となるように、新鮮なBHI液体培地で希釈した。
【０２６５】
液体阻害アッセイ：
液体アッセイのために、新調製の乳酸菌（200μlから）5μl、および前培養された指示菌の黄色ブドウ球菌10μlを、共培養するために、BHI液体培地10mlに接種した。培養は7時間行った。その後、コロニー形成単位を定量するために、1:10000希釈物のうち100μlをBHI寒天プレートに塗抹した。プレートを24時間インキュベートし、コロニー形成単位を計数した。
【０２６６】
培地およびバッファー：
BHI寒天培地                  Difco寒天1.8％；プレート当たり20 ml
BHI培地                      Difco
MRS液体培地                  Difco
K/Naバッファー               Kuester Thiel、pH 7.0、オートクレーブ滅菌済み
- 0.066M Na2HPO4 x 2H2O   61.2 ml
- 0.066M KH2PO4           38.8 ml
【実施例７】
【０２６７】
in vitro液体アッセイにおける表皮ブドウ球菌の生育阻害の欠如
このアッセイによって、病原微生物黄色ブドウ球菌の生育を阻害することができる選抜された乳酸菌が、in vitro液体アッセイにおいて、皮膚の共生菌叢の主要な菌である表皮ブドウ球菌を阻害しないかを調べることができる。
【０２６８】
この効果を調べるために、前培養された乳酸菌を、指示菌とともに、液体培地で共培養した。阻害の程度は、乳酸菌なしの対照と比較して、2つの指示菌のコロニー形成単位を計数することによって定量した。データは図７に示す。
【０２６９】
ラクトバチルス属菌の培養および調製：
乳酸菌（OB-LB-Sa3; DSM 18006）は、エッペンドルフ試験管内の1 ml MRS液体培地で、−80℃凍結培養物から培養した。試験管を閉じ、37℃で2日間培養した。この前培養物のうち10μlをファルコンチューブ内の7 ml MRS液体培地からなる主培養に移した。培養は2日間行った。培養後、遠心（15分、4000 x g）によって集菌した。細胞ペレットをK/Naバッファーで2回洗浄した（各1 ml）。細胞を、250 mMグリセロールを含有する200μl K/Naバッファー中に再懸濁し、17時間インキュベートした。
【０２７０】
指示菌の培養および調製：
指示菌は表皮ブドウ球菌（DSM20044）とした。ガラス製振盪フラスコ内の20ml BHI液体培地に、24時間前培養の凍結培養物15μlを接種した。
【０２７１】
液体阻害アッセイ：
液体アッセイのために、新調製の乳酸菌（200μlから）5μl、および前培養された指示菌の表皮ブドウ球菌10μlを、共培養するために、BHI液体培地10mlに接種した。培養は7時間行った。その後、コロニー形成単位を定量するために、1:10000希釈物のうち100μlをBHI寒天プレートに塗抹した。プレートを24時間インキュベートし、コロニー形成単位を計数した。
【０２７２】
培地およびバッファー：
BHI寒天培地                  Difco寒天1.8％；プレート当たり20 ml
BHI培地                      Difco
MRS液体培地                  Difco
K/Naバッファー               Kuester Thiel、pH 7.0、オートクレーブ滅菌済み
- 0.066M Na2HPO4 x 2H2O   61.2 ml
- 0.066M KH2PO4           38.8 ml
【実施例８】
【０２７３】
in situ皮膚アッセイにおける黄色ブドウ球菌の生育阻害
皮膚上でそのまま黄色ブドウ球菌の生育を阻害することができる乳酸菌が同定された。この効果を調べるために、黄色ブドウ球菌の培養物を希釈し、直接、皮膚に塗布して自然乾燥させた。その後、一定量の乳酸菌を、この皮膚領域に塗布した。このようにして、指示菌の黄色ブドウ球菌は、乳酸菌によって皮膚上で直接、阻害された。インキュベーション後、粘着テープを用いて、ブドウ球菌を皮膚から寒天プレートに移した。寒天プレートを37℃で培養した。乳酸菌なしの対照と比較して減少したコロニー数は、皮膚上での指示菌の生育阻害を示す。
【０２７４】
ラクトバチルス属菌の培養および調製：
乳酸菌（OB-LB-Sa3; DSM 18006）は、エッペンドルフ試験管内の1 ml MRS液体培地で、−80℃凍結培養物から培養した。試験管を閉じ、37℃で2日間培養した。この前培養物のうち10μlをファルコンチューブ内の7 ml MRS液体培地からなる主培養に移した。培養は2日間行った。培養後、遠心（15分、4000 x g）によって集菌した。細胞ペレットをK/Naバッファーで2回洗浄した（各1 ml）。細胞を、200μlのK/Naバッファー中に再懸濁した。
【０２７５】
指示菌の培養および調製：
指示菌は黄色ブドウ球菌（DSM346）とした。ガラス製振盪フラスコ内の20ml BHI液体培地に、15μlの24時間前培養物を接種した。この指示菌を37℃にて24時間培養した。
【０２７６】
培地およびバッファー：
BHI寒天培地                  Difco寒天1.8％；プレート当たり20 ml
BHI培地                      Difco
MRS液体培地                  Difco
K/Naバッファー               Kuester Thiel、pH 7.0、オートクレーブ滅菌済み
- 0.066M Na2HPO4 x 2H2O   61.2 ml
- 0.066M KH2PO4           38.8 ml
【０２７７】
前腕への黄色ブドウ球菌の塗布：
調製された指示菌、黄色ブドウ球菌の1:100希釈物400μlを一定の皮膚領域（10 cm x 3 cm）に均一に塗り広げ、自然乾燥させた。
【０２７８】
黄色ブドウ球菌を接種した皮膚領域へのラクトバチルス属菌の塗布：
調製されたラクトバチルス属菌10μlを、黄色ブドウ球菌があらかじめ接種された皮膚の領域に塗布した。通常の環境で6時間、腕をインキュベートした。
【０２７９】
皮膚からの微生物の再単離：
6時間後、粘着テープ片を用いて、4つの上部の皮膚層をBHI寒天プレートに移した。これによって、単離された皮膚細菌は寒天プレートに移された。寒天プレートを37℃にて24時間インキュベートした。
【実施例９】
【０２８０】
in situ皮膚アッセイにおける表皮ブドウ球菌の生育阻害の欠如
黄色ブドウ球菌の生育は阻害するが、表皮ブドウ球菌の生育は、皮膚上で直接的に影響されない、乳酸菌が同定された。  
このアッセイによって、健康で正常な皮膚菌叢の共生微生物である表皮ブドウ球菌が、黄色ブドウ球菌を阻害できる乳酸菌によって阻害されないかを調べることができる。したがって、指示菌である表皮ブドウ球菌は、黄色ブドウ球菌と同様に、高度に希釈して皮膚に塗布された。この場合も同様に、乳酸菌の阻害活性を調べた。記載の乳酸菌による表皮ブドウ球菌の阻害は観察されなかった。
【０２８１】
ラクトバチルス属菌の培養および調製：
乳酸菌（OB-LB-Sa3; DSM 18006）は、エッペンドルフ試験管内の1 ml MRS液体培地で、−80℃凍結培養物から培養した。試験管を閉じ、37℃で2日間培養した。この前培養物のうち10μlをファルコンチューブ内の7 ml MRS液体培地からなる主培養に移した。培養は2日間行った。培養後、遠心（15分、4000 x g）によって集菌した。細胞ペレットをK/Naバッファーで2回洗浄した（各1 ml）。細胞を、200μlのK/Naバッファー中に再懸濁した。
【０２８２】
指示菌の培養および調製：
指示菌は表皮ブドウ球菌（DSM20044）とした。ガラス製振盪フラスコ内の20ml BHI液体培地に、24時間前培養物15μlを接種した。この指示菌を37℃にて24時間培養した。
【０２８３】
培地およびバッファー：
BHI寒天培地                  Difco寒天1.8％；プレート当たり20 ml
BHI培地                      Difco
MRS液体培地                  Difco
K/Naバッファー               Kuester Thiel、pH 7.0、オートクレーブ滅菌済み
- 0.066M Na2HPO4 x 2H2O   61.2 ml
- 0.066M KH2PO4           38.8 ml
【０２８４】
前腕への表皮ブドウ球菌の塗布：
調製された指示菌、表皮ブドウ球菌の1:100希釈物400μlを一定の皮膚領域（10 cm x 3 cm）に均一に塗り広げ、自然乾燥させた。
【０２８５】
表皮ブドウ球菌を接種した皮膚領域へのラクトバチルス属菌の塗布：
調製されたラクトバチルス属菌10μlを、表皮ブドウ球菌があらかじめ接種された皮膚の領域に塗布した。通常の環境で6時間、腕をインキュベートした。
【０２８６】
皮膚からの微生物の再単離：
6時間後、粘着テープ片を用いて、4つの上部の皮膚層をBHI寒天プレートに移した。これによって、単離された皮膚細菌は寒天プレートに移された。寒天プレートを37℃にて24時間インキュベートした。
【実施例１０】
【０２８７】
in vitro液体アッセイにおけるミクロコッカス・ルテウスの生育阻害の欠如
病原微生物黄色ブドウ球菌の生育を阻害することができる、選抜された乳酸菌は、皮膚の共生菌叢の関連菌であるミクロコッカス・ルテウスを、in vitro液体アッセイにおいて阻害しない。この効果を調べるために、前培養された乳酸菌を、指示菌とともに、液体培地で共培養した。阻害の程度は、乳酸菌なしの対照と比較して、2つの指示菌のコロニー形成単位を計数することによって定量した。データは図８に示す。
【０２８８】
ラクトバチルス属菌の培養および調製：
乳酸菌（OB-LB-Sa3; DSM 18006およびOB-LB-Sa16; DSM 18007）は、エッペンドルフ試験管内の1 ml MRS液体培地で、−80℃凍結培養物から培養した。試験管を閉じ、37℃で2日間培養した。この前培養物のうち10μlをファルコンチューブ内の7 ml MRS液体培地からなる主培養に移した。培養は2日間行った。培養後、遠心（15分、4000 x g）によって集菌した。細胞ペレットをK/Naバッファーで2回洗浄した（各1 ml）。細胞を、250 mMグリセロールを含有する200μlのK/Naバッファー中に再懸濁し、17時間インキュベートした。
【０２８９】
指示菌の培養および調製：
指示菌はミクロコッカス・ルテウスとした。ガラス製振盪フラスコ内の20ml BHI液体培地に、24時間前培養の凍結培養物15μlを接種した。
【０２９０】
液体阻害アッセイ：
液体アッセイのために、新調製の乳酸菌（200μlから）5μl、および前培養された指示菌のミクロコッカス・ルテウス10μlを、共培養するために、BHI液体培地10mlに接種した。培養は7時間行った。その後、コロニー形成単位を定量するために、1:1000希釈物のうち100μlをBHI寒天プレートに塗抹した。プレートを24時間インキュベートし、コロニー形成単位を計数した。
【０２９１】
培地およびバッファー：
BHI寒天培地                  Difco寒天1.8％；プレート当たり20 ml
BHI培地                      Difco
MRS液体培地                  Difco
K/Naバッファー               Kuester Thiel、pH 7.0、オートクレーブ滅菌済み
- 0.066M Na2HPO4 x 2H2O   61.2 ml
- 0.066M KH2PO4           38.8 ml
【実施例１１】
【０２９２】
in vitro液体アッセイにおける大腸菌の生育阻害の欠如
病原微生物黄色ブドウ球菌の生育を阻害することができる、選抜された乳酸菌は、他のヒト関連微生物、たとえば大腸菌を、in vitro液体アッセイにおいて阻害しない。この効果を調べるために、前培養された乳酸菌を、指示菌とともに、液体培養で共培養した。阻害の程度は、乳酸菌なしの対照と比較して、2つの指示菌のコロニー形成単位を計数することによって定量した。データは図９に示す。
【０２９３】
ラクトバチルス属菌の培養および調製：
乳酸菌（OB-LB-Sa3; DSM 18006およびOB-LB-Sa16; DSM 18007）は、エッペンドルフ試験管内の1 ml MRS液体培地で、−80℃凍結培養物から培養した。試験管を閉じ、37℃で2日間培養した。この前培養物のうち10μlをファルコンチューブ内の7 ml MRS液体培地からなる主培養に移した。培養は2日間行った。培養後、遠心（15分、4000 x g）によって集菌した。細胞ペレットをK/Naバッファーで2回洗浄した（各1 ml）。細胞を、250 mMグリセロールを含有する200μlのK/Naバッファー中に再懸濁し、17時間インキュベートした。
【０２９４】
指示菌の培養および調製：
指示菌は大腸菌とした。ガラス製振盪フラスコ内の20ml BHI液体培地に、24時間前培養の凍結培養物15μlを接種した。
【０２９５】
液体阻害アッセイ：
液体アッセイのために、新調製の乳酸菌（200μlから）5μl、および前培養された指示菌の大腸菌10μlを、共培養するために、BHI液体培地10mlに接種した。培養は7時間行った。その後、コロニー形成単位を定量するために、1:1000希釈物のうち100μlをBHI寒天プレートに塗抹した。プレートを24時間インキュベートし、コロニー形成単位を計数した。
【０２９６】
培地およびバッファー：
BHI寒天培地                  Difco寒天1.8％；プレート当たり20 ml
BHI培地                      Difco
MRS液体培地                  Difco
K/Naバッファー               Kuester Thiel、pH 7.0、オートクレーブ滅菌済み
- 0.066M Na2HPO4 x 2H2O   61.2 ml
- 0.066M KH2PO4           38.8 ml
【実施例１２】
【０２９７】
in vitroホールプレートアッセイにおいてバシトラシンおよびエリスロマイシンと比較した黄色ブドウ球菌の生育阻害の程度
in vitroホールプレートアッセイにおいて寒天プレート上で黄色ブドウ球菌の生育を特異的に阻害することができる、特定の乳酸菌が同定された。この効果を、市販のバシトラシンおよびエリスロマイシンの抗菌クリーム製品と比較した。この効果を比較するために、２つの抗生物質をさまざまな濃度として、あらかじめくり抜いた穴に入れ、指示菌の黄色ブドウ球菌の生育阻害を観察した（図１０Aの検量線）。阻害ゾーンの直径を測定し、その阻害面積を計算した。その後、この面積を、一定の細胞数の前培養されたラクトバチルス属菌株OB-LB-Sa3 (DSM 18006)による黄色ブドウ球菌の生育阻害に、相互に関連づけた（図１０Bを参照されたい）。
【０２９８】
ラクトバチルス属の培養および調製：
乳酸菌（OB-LB-Sa3; DSM 18006）は、エッペンドルフ試験管内の1 ml MRS液体培地で、−80℃凍結培養物から培養した。試験管を閉じ、37℃で2日間培養した。この前培養物のうち10μlをファルコンチューブ内の7 ml MRS液体培地からなる主培養に移した。培養は2日間行った。培養後、遠心（15分、4000 x g）によって集菌した。細胞ペレットをK/Naバッファーで2回洗浄した（各1 ml）。細胞を、200μlのK/Naバッファー中に再懸濁した。
【０２９９】
指示菌の培養および調製：
指示菌は黄色ブドウ球菌（DSM346）とした。ガラス製振盪フラスコ内の20ml BHI液体培地に、15μlの24時間前培養物を接種した。この指示菌を37℃にて24時間培養した。一定量を、BHI培養液中での吸光度OD595nmが0.025〜0.05となるように希釈し、800μlを指示プレート（BHI）上に塗抹した。コルクボーラーを用いて、この寒天に穴を開けた。穴に前培養した乳酸菌を5μlまたは10μl、または対応する量の市販の抗菌製品を入れた。
【０３００】
培地およびバッファー：
BHI寒天培地                  Difco寒天1.8％；プレート当たり20 ml
BHI培地                      Difco
MRS液体培地                  Difco
K/Naバッファー               Kuester Thiel、pH 7.0、オートクレーブ滅菌済み
- 0.066M Na2HPO4 x 2H2O   61.2 ml
- 0.066M KH2PO4           38.8 ml
【実施例１３】
【０３０１】
ラクトバチルス阻害物質のプロテアーゼ安定性
in vitroホールプレートアッセイにおいて寒天プレート上で黄色ブドウ球菌の生育を特異的に阻害することができる、特定の乳酸菌が同定された。選抜されたラクトバチルスの抗菌活性は、プロテイナーゼK、ストレプトミセス・グリセウス由来プロテアーゼ、キモトリプシンおよびトリプシンによる消化可能性について性質を検討した。ラクトバチルス上清の無細胞調製物を調製し、さまざまなプロテアーゼとともに37℃にて1時間インキュベートした。その後これらの調製物が指示菌黄色ブドウ球菌の生育を阻害する能力を調べた。阻害ゾーンの直径を測定し、阻害面積を測定した（図１１を参照されたい）。
【０３０２】
ラクトバチルス属菌の培養および調製：
乳酸菌（OB-LB-Sa3; DSM 18006）は、ファルコンチューブ内の7 ml MRS液体培地で、−80℃凍結培養物から培養した。試験管を閉じ、37℃で2日間培養した。この前培養物7 mlをフラスコ内の40 ml MRS液体培地からなる主培養に移した。培養は2日間行った。培養後、遠心（15分、4000 x g）によって集菌した。細胞ペレットをK/Naバッファーで2回洗浄した（各2 ml）。細胞を、10 ml BHI培地中に再懸濁し、37℃にて6時間インキュベートした。遠心（15分、4000 x g）によって細胞を集め、上清をプロテアーゼとのインキュベーションに使用した。具体的には、上清150μlを10 mg/mlプロテアーゼ溶液15μlとともに、37℃にてインキュベートした。
【０３０３】
指示菌の培養および調製：
指示菌は黄色ブドウ球菌（DSM346）とした。ガラス製振盪フラスコ内の20ml BHI液体培地に、15μlの24時間前培養物を接種した。この指示菌を37℃にて24時間培養した。一定量を、BHI培養液中での吸光度OD595nmが0.025〜0.05となるように希釈し、800μlを指示プレート（BHI）上に塗抹した。コルクボーラーを用いて、この寒天に穴を開けた。穴に前培養した細胞を5μlまたは10μl入れ、10 mg/mlプロテアーゼ溶液15μlとともに、37℃にて1時間インキュベートした。その後、プロテアーゼ処理されたラクトバチルス上清5μlもしくは10μlを、阻害アッセイに使用した。
【０３０４】
培地およびバッファー：
BHI寒天培地                  Difco寒天1.8％；プレート当たり20 ml
BHI培地                      Difco
MRS液体培地                  Difco
K/Naバッファー               Kuester Thiel、pH 7.0、オートクレーブ滅菌済み
- 0.066M Na2HPO4 x 2H2O   61.2 ml
- 0.066M KH2PO4           38.8 ml
【０３０５】
引用文献
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【０３０６】
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【図面の簡単な説明】
【０３０７】
【図１】in vitroホール／ウェルプレートアッセイにおける表皮ブドウ球菌の生育刺激を示す。
【図２】皮膚上の表皮ブドウ球菌の、ラクトバチルス属菌による刺激を示す。
【図３】皮膚上の黄色ブドウ球菌の、ラクトバチルス属菌による刺激の欠如を示す。
【図４】in vitroホール／ウェルプレートアッセイにおける、黄色ブドウ球菌の刺激の欠如を示す。
【図５】in vitroホール／ウェルプレートアッセイにおける、黄色ブドウ球菌の生育阻害を示す。
【図６】in vitro液体アッセイにおける、黄色ブドウ球菌の生育阻害を示す。
【図７】in vitro液体アッセイにおける、表皮ブドウ球菌の生育阻害の欠如を示す。
【図８】in vitro液体アッセイにおける、ミクロコッカス・ルテウスの生育阻害の欠如を示す。
【図９】in vitro液体アッセイにおける、大腸菌の生育阻害の欠如を示す。
【図１０】in vitroホールプレートアッセイにおける黄色ブドウ球菌の生育阻害の程度を、バシトラシンおよびエリスロマイシンと比較して示す。A：さまざまな濃度のバシトラシンおよびエリスロマイシンをあらかじめくり抜いた穴に入れ、黄色ブドウ球菌の生育を観察した際の検量線を示す。B：一定量の前培養されたラクトバチルス細胞（DSM 18006）による黄色ブドウ球菌の生育阻害を示す。
【図１１】ラクトバチルス阻害物質のプロテアーゼ安定性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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