(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料液中に含まれる被検出物質の濃度を測定する方法であって、
前記試料液と、発光基質と、酸化剤と、還元剤とを溶媒中で混合することにより化学発光が生じる工程と、
前記混合直後から前記化学発光の発光強度がピークとなる時までの時間を測定する工程と、
前記測定した時間から前記被検出物質の濃度を計算する工程と
を含み、
前記発光基質が鉄ポルフィリン錯体またはヘモグロビンである測定方法。
【請求項２】
前記鉄ポルフィリン錯体が鉄フタロシアニン錯体または鉄クロロフィリン錯体である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酸化剤が過酸化水素である請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記還元剤がＬ−アスコルビン酸またはＬ−システインである請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記被検出物質が、銅イオン、アルミニウムイオン、鉄イオン、亜鉛イオン、およびニッケルイオンからなる群より選択される一つの金属イオン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン、Ｄ−グルコース、Ｌ−アスコルビン酸、過酸化水素、ペルオキシダーゼ、または酵素標識抗体である請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
試料中に含まれる被検出物質の濃度を測定するためのキットであって、
前記キットは、発光基質と、酸化剤と、還元剤とを含み、
溶媒中で前記被検出物質と前記発光基質と前記酸化剤と前記還元剤とを混合すると前記被検出物質の濃度に応じた時間の経過後に化学発光が生じ、
前記発光基質が鉄ポルフィリン錯体またはヘモグロビンであるキット。
【請求項７】
前記鉄ポルフィリン錯体が、鉄フタロシアニン錯体または鉄クロロフィリン錯体である請求項６に記載のキット。
【請求項８】
前記酸化剤が過酸化水素である請求項６または７に記載のキット。
【請求項９】
前記還元剤がＬ−アスコルビン酸またはＬ−システインである請求項６〜８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１０】
前記被検出物質が、銅イオン、アルミニウムイオン、鉄イオン、亜鉛イオン、およびニッケルイオンからなる群より選択される一つの金属イオン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン、Ｄ−グルコース、Ｌ−アスコルビン酸、過酸化水素、ペルオキシダーゼ、または酵素標識抗体である請求項６〜９のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学発光反応の時間計測による被検出物質の濃度を測定する方法およびそれに使用するキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
化学発光とは、化学反応によって生じる過剰のエネルギーを熱として失う代わりに光として放出する現象であり、これには励起種から共存する蛍光性物質にエネルギーが遷移して光を放出する現象も含まれる（特許文献１および非特許文献２）。化学発光が観測される反応の多くは発光基質と酸化還元試薬との酸化還元反応である。酸化剤には溶存酸素や過酸化水素が用いられるが、触媒として金属イオンを用いた場合には、これらの酸化剤との反応によりヒドロキシラジカル（・ＯＨ）やスーパーオキシドラジカル（・Ｏ２−）といった、酸化力の強い活性酸素種が生成することにより、発光基質の酸化反応の速度が大きくなり、結果として単位時間当たりの発光強度が大きくなる。
【０００３】
また、化学発光は分析化学的な応用面で急速な発展を遂げており、その理由として、化学発光を利用する分析法が非常に高感度なことが挙げられる。たとえば、高感度な分析法の一つである蛍光光度法では、蛍光分子を励起させるためにキセノンランプなどの光源が必要であるが、それに由来する迷光現象や溶媒由来のラマン光が原因となって、バックグラウンドのレベルを上昇させてしまう。そのため、検出器の感度を上げることに伴い、シグナルレベルのみならずノイズレベルも上昇させてしまう。
ところが化学発光においては、蛍光分子の励起源は化学反応によるエネルギーであるため光源が不要になりその影響を考慮しなくてよい。したがって、光電子倍増管の感度を高くすることで、極めて微弱な光でも検出することが可能である。この他にも、高感度であることによって試料のダウンサイジングが可能であるという利点がある。これにより高濃度で起こりがちな副反応が生じにくくなり、試薬の使用量を少なくできるため、結果として試薬コストを抑えつつ、高感度分析ができるといったメリットがある。また、化学発光法は励起源が不要なことにより装置化が簡便であることや、応答性が速くて迅速であるなど、多くの利点がある。
【０００４】
しかしながら、現在化学発光分析法に使用可能な発光基質の絶対数は約１０種であり、また発光収率の高い化学発光反応系には限りがある。さらに、使用する有機溶媒や触媒の選択といった試薬の問題も有しており、これらにより化学発光分析法の分析対象成分には制限があり選択性が低いという問題を抱えている。このように、化学発光計測を支えている化学発光系については、新しい反応系や発光体が容易に見出されておらず、広範な分野に応用することが可能な化学発光系の分析法の発見が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−７４８４１号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】T. Nagoshi, O. Ohno, T. Kotake, S. Igarashi, Luminescence,20, 401-404(2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
化学発光系を利用した高感度かつ再現性の高い新規な被検出物質の濃度測定法を提供し、またその濃度測定法に使用するためのキットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、試料液中に含まれる被検出物質の濃度を測定する方法であって、前記方法は、前記試料液と、発光基質と、酸化剤と、還元剤とを溶媒中で混合することにより化学発光が生じる工程と、前記混合直後から前記化学発光の発光強度がピークとなる時までの時間を測定する工程と、前記測定した時間から前記被検出物質の濃度を計算する工程とを含むことを特徴とする。
【０００９】
また、本発明の濃度測定方法は、前記発光基質が鉄ポルフィリン錯体またはヘモグロビンであることを特徴とする。また、本発明の濃度測定方法は、前記鉄ポルフィリン錯体が鉄フタロシアニン錯体または鉄クロロフィリン錯体であることを特徴とする。また、本発明の濃度測定方法は、前記酸化剤が過酸化水素であることを特徴とする。また、本発明の濃度測定方法は、前記還元剤がＬ−アスコルビン酸またはＬ−システインであることを特徴とする。
【００１０】
また、本発明の濃度測定方法は、前記被検出物質が、銅イオン、アルミニウムイオン、鉄イオン、亜鉛イオン、およびニッケルイオンからなる群より選択される一つの金属イオン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン、Ｄ−グルコース、ペルオキシダーゼ、または酵素標識抗体であることを特徴とする。
【００１１】
また、本発明の別の態様によれば、試料中に含まれる被検出物質の濃度を測定するためのキットであって、前記キットは、発光基質と、酸化剤と、還元剤とを含み、溶媒中で前記被検出物質と前記発光基質と前記酸化剤と前記還元剤とを混合すると前記被検出物質の濃度に応じた時間の経過後に化学発光が生じることを特徴とする。
【００１２】
また、本発明のキットは、前記発光基質が、鉄ポルフィリン錯体またはヘモグロビンであることを特徴とする。また、本発明のキットによれば、前記鉄ポルフィリン錯体が、鉄フタロシアニン錯体または鉄クロロフィリン錯体であることを特徴とする。また、本発明のキットによれば、前記酸化剤が過酸化水素であることを特徴とする。また、本発明のキットによれば、前記還元剤がＬ−アスコルビン酸またはＬ−システインであることを特徴とする。
【００１３】
また、本発明のキットは、前記被検出物質が、銅イオン、アルミニウムイオン、鉄イオン、亜鉛イオン、およびニッケルイオンからなる群より選択される一つの金属イオン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン、Ｄ−グルコース、ペルオキシダーゼ、または標識抗体であることを特徴とする。
【００１４】
また、本発明の別の態様によれば、被検出物質の濃度を測定する装置であって、前記装置は、前記被検出物質と、発光基質と、酸化剤と、還元剤とを溶媒中で混合することにより生じる化学発光を測定する化学発光測定手段と、前記混合直後から前記化学発光の発光強度がピークとなる時までの誘導時間を測定する時間計測手段と、前記誘導時間から前記被検出物質の濃度を算出する濃度算出手段とを含むことを特徴とする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係る化学発光反応の時間計測による被検出物質の定量によれば、試薬コストの低減や装置化の簡便さ、応答性が速いといった従来の化学発光系の利点を有しつつ、さらに化学発光系シグナル計測と比較して高感度かつ再現性の高い定量が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明に係る一実施の形態における化学発光反応の時間計測を示すフローチャートである。
【図２】本発明の一実施の形態における化学発光反応において、Ｌ−アスコルビン酸無添加による化学発光の誘導時間を示すグラフである。
【図３】本発明の一実施の形態における化学発光反応において、Ｌ−アスコルビン酸を添加したときの化学発光の誘導時間を示すグラフである。
【図４】本発明の一実施の形態における化学発光反応において、化学発光強度とＬ−アスコルビン酸濃度との関係を示すグラフである。
【図５】本発明の一実施の形態における化学発光反応において、化学発光強度と過酸化水素濃度との関係を示すグラフである。
【図６】本発明の一実施の形態における化学発光反応において、化学発光強度とｐＨとの関係を示すグラフである。
【図７】本発明の一実施の形態における化学発光反応において、化学発光強度とＤＭＳＯの体積との関係を示すグラフである。
【図８】本発明の一実施の形態における化学発光反応において、化学発光強度とＦｅ−ＰＴＳ濃度との関係を示すグラフである。
【図９】本発明の一実施の形態による時間計測において、銅イオン濃度と誘導時間との関係を示すグラフ（検量線）である。時間計測にはＬＵＭＩＣＯＵＮＴＥＲ  ＮＵ−６００を使用した。
【図１０】本発明の一実施の形態による時間計測において、銅イオン濃度と誘導時間との関係を示すグラフ（検量線）である。時間計測にはＧＥＮＥＬＩＧＨＴ  ＧＬ−２００Ｓを使用した。
【図１１】本発明の一実施の形態による時間計測において、ペルオキシダーゼ濃度と誘導時間との関係を示すグラフ（検量線）である。時間計測にはＬＵＭＩＣＯＵＮＴＥＲ  ＮＵ−６００を使用した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明者らは、発光基質と酸化剤との化学発光反応に還元剤を添加することで、溶液を混合してから化学発光シグナルが観測されるまでに時間差が生じることを見出した。さらに、この反応系に触媒として機能する物質を添加することにより、化学発光シグナルが観測されるまでの時間が変化した。このことから、発光強度ではなく化学発光系の時間計測について検討を行った結果、特定の被検出物質の定量が高感度かつ再現性よく可能であることを見出した。
【００１８】
以下、本発明の実施の形態を、図面を参照しながら詳細に説明する。
【００１９】
図１は、本発明の一実施の形態における化学発光反応の時間計測を示すフローチャートである。図１に示すように、本発明の化学発光反応の時間計測は、化学発光用セル１と、化学発光用セル１内で化学発光を生じさせるために混合される有機溶媒２とｐＨ緩衝溶液３と還元剤４と試料液５と発光基質６と酸化剤７とを順に添加する工程から構成されている。
【００２０】
化学発光用セル１は、有機溶媒２と、ｐＨ緩衝液３と、還元剤４と、試料液５と発光基質６と酸化剤７とを混合し、そのまま化学発光測定装置にセットすることで混合液中に生じた発光の強度を測定できるようなものであれば、従来から使用されているものを使用することができる。特に限定はされないが、例えば石英セルやポリスチレン製セル等が挙げられる。また、化学発光を測定する混合液の温度は、１５℃〜４０℃で保たれていることが好ましく、２０℃〜３０℃で保たれていることがより好ましい。
【００２１】
本発明で使用する有機溶媒２としては、ＤＭＳＯ等を使用することができる。また、有機溶媒の代わりに蒸留水を使用することもできる。有機溶媒２としてＤＭＳＯを使用する際の体積としては、最終的な混合液中において１５体積％〜２５体積％の範囲にあることが好ましく、１８体積％〜２２体積％の範囲にあることがより好ましく、約２０体積％が最も好ましい。
【００２２】
本発明に使用されるｐＨ緩衝液３としては、混合液のｐＨを一定に保つことができるものであれば、特に限定されず、例えばＢｏｒａｘ緩衝液や、水酸化ナトリウム−酢酸系、アンモニア−酢酸系緩衝液等を使用することができる。ｐＨ緩衝液３により保つｐＨとしては、８〜１２が好ましく、９〜１１がより好ましく、約ｐＨ１０が最も好ましい。
【００２３】
還元剤４は、酸化剤７による発光基質６の酸化を抑制し、化学発光に誘導時間を生じさせることのできるものであれば使用することができる。特に限定されないが、例えば、Ｌ−アスコルビン酸やＬ−システイン等を使用することができ、特にＬ−アスコルビン酸が好ましい。Ｌ−アスコルビン酸を使用する際の濃度は、最終的な混合液中に０．５×１０−３Ｍ〜２．０×１０−３Ｍの範囲となることが好ましく、１．０×１０−３Ｍ〜２．０×１０−３Ｍの範囲にあることがより好ましく、約１．６×１０−３Ｍが最も好ましい。
【００２４】
試料液５は、濃度を測定したい物質を含んでおり、本発明の化学発光の時間計測を利用した濃度測定法で測定可能な物質としては、銅イオン、アルミニウムイオン、鉄イオン、亜鉛イオン、およびニッケルイオンからなる群より選択される一つの金属イオン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−システイン、Ｄ−グルコース、ペルオキシダーゼ、または酵素標識抗体を挙げることができる。これらの物質は、例えばＬ−アスコルビン酸等の還元剤に影響し、化学発光の誘導時間に影響を与える。測定対象により異なるが本濃度測定法の検出限界は、数ｐｐｔレベルの超微量を計測可能である。酵素標識抗体を用いる場合は、抗体に標識として酵素が付加されているので、被検出物質と特異的に結合させ、精製した標識抗体を本化学発光反応系に使用することができる。酵素標識抗体は、例えばＨＲＰ(Horse Radish Peroxidase)等を標識として従来の方法（Bull. Natl. Inst. Anim. Health No. 111. 37-42 (March 2005)等参照）により付加した酵素標識抗体を使用することができ、このような酵素標識抗体は、さらに極微量の成分濃度を測定することが可能である。酵素標識抗体としては、特にペルオキシダーゼ標識抗体が好ましい。また、血清などタンパク質を多く含む試料を用いる場合には、化学発光反応系に使用する前に除タンパクの操作を行うことが望ましい。
【００２５】
本発明に使用する発光基質６としては、酸化剤７との反応により混合液中に発光を生じるものであればよく、ポルフィリン骨格を有する金属錯体またはポルフィリン金属錯体をサブユニットに有するヘモグロビン等であることが好ましい。錯体を形成する金属は、鉄が好ましく、鉄ポルフィリン錯体としては、例えば鉄フタロシアニン錯体または鉄クロロフィリン錯体、ヘミン等を使用することができる。鉄フタロシアニン錯体としては、鉄フタロシアニンテトラスルホン酸、鉄フタロシアニンオクタスルホン酸、鉄フタロシアニンテトラカルボン酸、鉄フタロシアニンオクタカルボン酸等の鉄フタロシアニン誘導体錯体を使用することができる。発光基質として鉄フタロシアニンスルホン酸を使用する際の濃度は、最終的な混合液中に２．０×１０−５Ｍ〜６．０×１０−５Ｍの範囲内となることが好ましく、３．０×１０−５Ｍ〜５．０×１０−５Ｍの範囲内となることがより好ましく、約４．０×１０−５Ｍが最も好ましい。
【００２６】
本発明で使用する酸化剤７としては、発光基質６を酸化させることにより混合液中に発光を生じさせることができるものであればよく、例えば、過酸化水素や２ＫＨＳＯ５・ＫＨＳＯ４・Ｋ２ＳＯ４を挙げることができるが、好ましくは過酸化水素を使用することができる。過酸化水素を使用するときの濃度は、最終的な混合液中に１．０×１０−３Ｍ〜４．０×１０−３Ｍの範囲内となることが好ましく、２．０×１０−３Ｍ〜３．０×１０−３Ｍの範囲内となることがより好ましく、約２．４×１０−３Ｍが最も好ましい。
【００２７】
以上の構成によれば、化学発光用セル１内へ有機溶媒２と、ｐＨ緩衝液３と、還元剤４と、試料液５と、発光基質６とを加え、軽く振り混ぜた後、セルホルダーにセットする。次に酸化剤７を添加し、混合液内で生じる化学発光を測定するとともに、化学発光の誘導時間も測定する。ここで、本明細書中で使用する「誘導時間」とは、混合液中で化学発光を生じさせるための最終的な試薬（例えば、酸化剤）を添加した時点から、混合液中で生じる化学発光の発光強度がピークとなる時までの時間をいう。このような化学発光の時間計測において、発光基質濃度、酸化剤濃度、還元剤濃度、およびｐＨ等の条件を一定にすることで、反応系に含まれる特定の被検出物質の濃度に依存して誘導時間が増減する。被検出物質の濃度と誘導時間との相関グラフは、良好な検量線として用いるため、被検出物質の存在下で本発明の化学発光反応の時間を計測することで、予め求めた検量線より、被検出物質の濃度を測定することが可能となる。
【００２８】
また、本発明に係る化学発光の時間計測を利用した濃度測定装置は、被検出物質を含む試料液と、発光基質と、酸化剤と、還元剤とを溶媒中で混合することにより生じる化学発光を測定する化学発光測定手段と、混合直後から前記化学発光の発光強度がピークとなる時までの誘導時間を測定する誘導時間測定手段と、誘導時間と予め求めた検量線とから被検出物質の濃度を算出する濃度算出手段とから構成される。
【００２９】
本発明に使用する化学発光測定手段としては、化学発光用セル内に添加された混合液中に生じる化学発光の発光強度および発光の経時的測定ができるものであれば、従来から用いられている化学発光測定装置等を用いることができる。測定波長としては３００〜７００ｎｍの範囲を測定できればよい。
【００３０】
時間計測手段は、化学発光測定手段により測定された化学発光測定結果により、化学発光の誘導時間を算出する機能を有する。
【００３１】
本発明に使用する濃度算出手段は、時間計測手段で算出された誘導時間から、被検出物質の濃度を導き出す機能を有する。また、濃度算出手段は、測定した化学発光強度や誘導時間から検量線を作成することもでき、さらに、検量線の情報や算出後の被検出物質濃度等の情報を濃度算出手段内または別の記録手段等に記憶させておく機能も有する。このような濃度算出手段は、化学発光測定手段または時間計測手段と一体となっていてもよいし、独立して存在してもよい。
【実施例】
【００３２】
本発明に係る化学発光反応の発光強度および時間計測を、以下のような基本操作に基づいて測定した。なお、特に断りのない限り、操作に使用した試薬は市販特級品を用いた。
（１．基本操作）
化学発光用セルにｐＨ緩衝溶液（和光純薬社製四ホウ酸ナトリウム（Ｂｏｒａｘ）を使用した。Ｂｏｒａｘを蒸留水に溶解させ、水酸化ナトリウム水溶液を加えてｐＨを調整したのち、０．１Ｍに希釈して使用した。以下、同じ）１００μｌ、Ｌ−アスコルビン酸水溶液（和光純薬社製）１００μｌ、ＤＭＳＯ（和光純薬社製）１００μｌ、Ｃｕ２＋標準溶液１２０μｌ、発光基質（鉄フタロシアニンスルホン酸水溶液：Ａｌｄｒｉｃｈ社製鉄フタロシアニンスルホン酸ナトリウムを蒸留水に溶解させて使用した。以下、同じ。）４０μｌをマイクロシリンジにより注入して混合した。化学発光測定装置（日音医理科機器製作所製のＬＵＭＩＣＯＵＮＴＥＲ  ＮＵ−６００またはマイクロテック・ニチオン社製ＧＥＮＥＬＩＧＨＴ  ＧＬ−２００Ｓ）のセルホルダーにセットし、過酸化水素水溶液（和光純薬社製３０％溶液を蒸留水で希釈して使用した。）４０μｌをマイクロシリンジにより注入した。その後、注入後に現れる化学発光シグナルを測定した。
【００３３】
（２．除タンパク操作）
２０ｍｌサンプル管にウシ血清２００μｌ、２ＭＬ−アスコルビン酸を含む塩酸水溶液（関東化学製１２Ｎ塩酸を蒸留水で１Ｎに希釈して使用した。）１００μｌを加えて混合し５分間静置した。次に、１．２Ｍトリクロロ酢酸（関東化学製）１００μｌを加え、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、ろ過した。このろ液を０．１Ｍ  Ｂｒａｘ  ＢｕｆｆｅｒでｐＨを調整したものをサンプルとして使用した。
【００３４】
（化学発光系におけるＬ−アスコルビン酸の影響）
鉄フタロシアニンスルホン酸錯体（Ｆｅ−ＰＴＳ）と過酸化水素との化学発光反応系を用いてＬ−アスコルビン酸の影響を検討した。過酸化水素濃度が６．４×１０−３Ｍ、Ｆｅ−ＰＴＳ濃度が４．０×１０−５Ｍ、ＤＭＳＯが２０体積％、ｐＨ１０のアルカリ性条件下において、過酸化水素水溶液中にＦｅ−ＰＴＳを注入すると、その直後に鋭い化学発光シグナルが観測された（図２）。しかしながら、酸化反応に起因する化学発光に対して強い還元剤であるＬ−アスコルビン酸（１．６×１０−３Ｍ）を添加すると、溶液を混合後、ある一定時間経過後に化学発光シグナルが観測された（図３）。このように、酸化剤と、鉄ポルフィリン錯体との反応系に還元剤を添加すると、化学発光のピーク検出までに一定の誘導時間が生じた。
【００３５】
Ｌ−アスコルビン酸添加の有無によるＦｅ−ＰＴＳの吸光度の波長変化を検討したところ、Ｌ−アスコルビン酸を添加に伴い過酸化水素を加えた直後の吸収スペクトルが上方へとシフトした。（データ省略）。また、Ｌ−アスコルビン酸を添加したときの方が、経時的に高い吸光度を維持し、Ｌ−アスコルビン酸無添加と同程度の吸光度へ下がるまでに時間がかかった（データ省略）。このように、Ｌ−アスコルビン酸はＦｅ−ＰＴＳを基質とする化学発光系の酸化分解反応を抑制した。
【００３６】
（触媒の検討）
化学発光基質と酸化剤と還元剤とからなる本化学発光反応系において、触媒の影響について検討した。Ｌ−アスコルビン酸が１．６×１０−３Ｍ、過酸化水素濃度が６．４×１０−４Ｍ、Ｆｅ−ＰＴＳ濃度が４．０×１０−５Ｍ、ＤＭＳＯが２０体積％の条件下において、各触媒の化学発光の誘導時間への影響を観察した。その結果を表１に示す。
表１は、触媒無添加の誘導時間に対して、±５％以上の影響を与えた濃度を許容濃度として示している。表１に示すように、検討した物質では、一重項酸素の消去剤であるＬ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、還元性の物質であるＬ−システイン、還元糖であるＤ−グルコースにおいて誘導時間に強い影響が見られた。これらの物質は、活性酸素種の消去などの作用により誘導時間に影響を及ぼしていると考えられる。
【００３７】
また、化学発光において触媒として用いられている金属イオンの中では、Ｃｕ２＋、Ａｌ３＋、Ｆｅ３＋、Ｚｎ２＋、Ｎｉ２＋において強い影響が見られたが、特にＣｕ２＋において大きな影響が見られた。Ｃｕ２＋を添加すると化学発光が観測されるまでの誘導時間が短縮された。アスコルビン酸は酸化されることでデヒドロアスコルビン酸に変わるが、この酸化は銅などの重金属の存在や光の照射によって促進される。したがって、Ｃｕ２＋を共存させることでアスコルビン酸が酸化され、Ｆｅ−ＰＴＳや過酸化水素に対する影響が小さくなり誘導時間が短縮されたと推測される。このように、本化学発光反応系の誘導時間に影響を有する物質については、本発明により濃度測定可能である。
【００３８】
【表１】
0005582745.tif 000002
【００３９】
以下では、本化学発光系に、Ｃｕ２＋を触媒としたときの分析をさらに行う。
還元剤としてＬ−アスコルビン酸を、化学発光基質としてＦｅ−ＰＴＳを、酸化剤として過酸化水素を使用した場合の各条件（Ｌ−アスコルビン酸濃度、過酸化水素濃度、ｐＨ、ＤＭＳＯ（溶媒）の体積、Ｆｅ−ＰＴＳ濃度）の最適化を行った。
【００４０】
（Ｌ−アスコルビン酸濃度の影響）
Ｌ−アスコルビン酸濃度の影響を図４に示す。過酸化水素濃度が４．８×１０−３Ｍ、Ｆｅ−ＰＴＳ濃度が４．０×１０−５Ｍ、ＤＭＳＯが２０体積％、ｐＨが１０、銅イオン濃度が４．０×１０−８Ｍの条件下において、Ｌ−アスコルビン酸濃度を０〜２．０×１０−３Ｍの範囲において添加した結果、Ｌ−アスコルビン酸濃度が高くなるに従い誘導時間が延長された。この理由としては、Ｌ−アスコルビン酸濃度がＦｅ−ＰＴＳあるいは過酸化水素に影響を与え、誘導時間が延長されためと考えられる。ブランクとＣｕ２＋濃度４．０×１０−８Ｍとにおける誘導時間差が大きいことから、Ｌ−アスコルビン酸の濃度は１．６×１０−３Ｍに設定した。
【００４１】
（過酸化水素濃度の影響）
過酸化水素濃度の影響を図５に示す。Ｌ−アスコルビン酸が１．６×１０−３Ｍ、Ｆｅ−ＰＴＳ濃度が４．０×１０−５Ｍ、ＤＭＳＯが２０体積％、ｐＨが１０、銅イオン濃度が４．０×１０−８Ｍの条件下において、過酸化水素濃度を１．２×１０−３〜７．３×１０−３Ｍの範囲で検討した結果、過酸化水素濃度が高くなるに従い、誘導時間が短縮された。この理由としては、共存するＬ−アスコルビン酸に対し過酸化水素濃度が高くなることにより、化学発光反応が起こりやすくなり誘導時間が短縮されたと考えられる。ブランクとＣｕ２＋濃度４．０×１０−８Ｍとにおける誘導時間差が大きいことから、過酸化水素の濃度は２．４×１０−３Ｍに設定した。
【００４２】
（ｐＨの影響）
ｐＨの影響を図６に示す。Ｌ−アスコルビン酸が１．６×１０−３Ｍ、過酸化水素濃度が４．８×１０−３Ｍ、Ｆｅ−ＰＴＳ濃度が４．０×１０−５Ｍ、ＤＭＳＯが２０体積％、銅イオン濃度が４．０×１０−８Ｍの条件下において、ｐＨ１〜１２までの範囲で検討した結果、ｐＨ１〜８までの範囲において化学発光は観測されなかった。また、この範囲は、Ｌ−アスコルビン酸を添加していないＦｅ−ＰＴＳ化学発光系においても化学発光はほとんど観測されない。一方、ｐＨ９〜１２の範囲においてはｐＨが高くなるに従い、誘導時間が短縮した。Ｌ−アスコルビン酸水溶液は、アルカリ性が強くなるほど還元性が強くなり、酸素分子（Ｏ２）などの水素受容体によって酸化されやすくなる。従って、化学発光反応を抑制していたＬ−アスコルビン酸が酸化され、Ｆｅ−ＰＴＳの酸化分解反応がおこりやすくなったためと考えられる。ブランクとＣｕ２＋濃度４．０×１０−８Ｍとにおける誘導時間差が大きいことから、ｐＨを１０に設定した。
【００４３】
（ＤＭＳＯの体積の影響）
ＤＭＳＯの体積変化による影響を図７に示す。Ｌ−アスコルビン酸が１．６×１０−３Ｍ、過酸化水素濃度が４．８×１０−３Ｍ、Ｆｅ−ＰＴＳ濃度が４．０×１０−５Ｍ、ｐＨ１０、銅イオン濃度が４．０×１０−８Ｍの条件下において、ＤＭＳＯの体積を変化させた。ＤＭＳＯの体積の増加に従い、誘導時間が短縮された。この理由としては、アルカリ性溶液中においてＤＭＳＯ、Ｏ２、ＯＨ−の反応からスーパーオキシドラジカル（・Ｏ２−）が生成されるため、ＤＭＳＯ体積の増加に伴い・Ｏ２−の生成率が高くなり、Ｆｅ−ＰＴＳの酸化分解がおこりやすくなるためであると考えられる。ブランクとＣｕ２＋の濃度４．０×１０−８Ｍにおける誘導時間差が大きいことから、ＤＭＳＯの体積は２０体積％に設定した。
【００４４】
（Ｆｅ−ＰＴＳ濃度による影響）
Ｆｅ−ＰＴＳの濃度変化に伴う影響を図８に示す。Ｌ−アスコルビン酸濃度が１．６×１０−３Ｍ、過酸化水素濃度が４．８×１０−３Ｍ、ＤＭＳＯが２０体積％、ｐＨ１０、銅イオン濃度が４．０×１０−８Ｍの条件下において、Ｆｅ−ＰＴＳ濃度を２．０×１０−５〜６．０×１０−５Ｍの範囲で検討した結果、Ｆｅ−ＰＴＳの濃度が高くなるに従い、誘導時間が短縮された。この理由としては、Ｆｅ−ＰＴＳの濃度増加に伴い化学発光反応を抑制しているＬ−アスコルビン酸の影響が小さくなるため、Ｆｅ−ＰＴＳの酸化分解がより速く起こるためであると考えられる。ブランクとＣｕ２＋濃度４．０×１０−８Ｍとにおける誘導時間差が大きいことから、Ｆｅ−ＰＴＳの濃度は４．０×１０−５Ｍに設定した。
【００４５】
（Ｃｕ２＋の検量線）
鉄フタロシアニンスルホン酸濃度が４．０×１０−５Ｍ、過酸化水素濃度が２．４×１０−３Ｍ、Ｌ−アスコルビン酸濃度が１．６×１０−３Ｍ、ＤＭＳＯが２０体積％、ｐＨ１０の条件下において、ＬＵＭＩＣＯＵＮＴＥＲ  ＮＵ−６００によりＣｕ２＋の濃度と誘導時間との相関グラフ（検量線）を作成した（図９）。また、同様の条件において、ＧＥＮＥＬＩＧＨＴ  ＧＬ−２００Ｓにより作成した検量線を図１０に示す。その結果、図９では１．２×１０−１０〜１．２×１０−５Ｍ、図１０では１．２×１０−１０〜６．０×１０−６Ｍの濃度範囲において良好な直線が得られた。検量線の相関係数は図９では０．９８７１、図１０では０．９１５３であった。Ｃｕ２＋の濃度４．０×１０−８Ｍにおいて、５回測定での変動係数は図９では２．０２％、図１０では２．２７％であった。また、検出限界（３σ）は図９では１．６６×１０−１１Ｍ、図１０では９．５２×１０−１１Ｍであった。これらはルミノール／ＯＨ−／Ｈ２Ｏ２／Ｃｕ化学発光系の検出限界である６×１０−６Ｍの他、１，１０−ｐｈｅｎ／ＯＨ−／Ｈ２Ｏ２／Ｃｕ２＋／ヘキサデシルエチルジメチルアンモニウムブロミド（ＨＥＤＡＢ）化学発光系を利用したＣｕ２＋の定量法の２×１０−１０Ｍ、Ｈ２Ｏ２／フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）／リン酸緩衝液化学発光系を利用したＣｕ２＋の定量法の２×１０−８Ｍのいずれの定量法よりも高感度である。
【００４６】
（ペルオキシダーゼの検量線）
鉄フタロシアニンスルホン酸濃度が４．０×１０−５Ｍ、過酸化水素濃度が２．４×１０−３Ｍ、Ｌ−アスコルビン酸濃度が１．６×１０−３Ｍ、ＤＭＳＯが２０体積％、ｐＨ１０の条件下において、ＬＵＭＩＣＯＵＮＴＥＲ  ＮＵ−６００によりペルオキシダーゼの濃度と誘導時間との相関グラフ（検量線）を作成した（図１０）。その結果、図１１に示すように、ペルオキシダーゼ濃度０．１ｐｐｍ〜３０ｐｐｍの範囲において良好な直線を得ることができた。検量線の相関係数は、図１１において０．９４７であった。ペルオキシダーゼ濃度１０ｐｐｍにおいて、５回測定したときの変動係数は１．０７％であり、標準偏差は１．１５であった。また、検出限界は４．３０×１０−２ｐｐｍ（４３．０ｐｐｂ）であった。
【００４７】
（妨害物の検討）
Ｃｕ２＋の濃度４．０×１０−８Ｍに対して、金属、糖類、アミノ酸、ビタミン類といった各物質を共存させたときの誘導時間への影響を検討した。結果をそれぞれ表４〜表７に示す。妨害物質無添加時の誘導時間に対し±５％の誤差を与える妨害物質の濃度を、Ｃｕ２＋の濃度（４．０×１０−８Ｍ）とのモル比により比較した。
【００４８】
表２において、Ｆｅ３＋はＣｕ２＋と同様にＬ−アスコルビン酸の酸化を促進する。そのため誘導時間を短くしたと考えられる。
【００４９】
【表２】
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【００５０】
表３において用いた糖類はいずれも還元糖であり、いずれも誘導時間を長くしていた。これは各糖が過酸化水素を還元して酸化力を低下させたことにより誘導時間が長くなったと考えられる。
【００５１】
【表３】
0005582745.tif 000004
【００５２】
表４において、Ｌ−システイン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−トリプトファンなどで誘導時間が長くなった。Ｌ−システインは還元性の物質であり、過酸化水素による酸化反応に影響を及ぼしていると推測される。Ｌ−ヒスチジンはヘモグロビンのタンパク中に含まれ、ヘム鉄と結合している。本化学発光系においても、Ｆｅ−ＰＴＳの軸配位部位に配位し、触媒活性の低下が起こり、誘導時間が長くなったと考えられる。Ｌ−トリプトファンは一重項酸素の消去剤として用いられることから、活性酸素種に影響を与えているものと考えられる。
【００５３】
【表４】
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【００５４】
表５において、塩酸チアミンが誘導時間を長くしていた。これは、Ｌ−アスコルビン酸と同様にアルカリ性条件下では不安定で分解されやすい性質をもっており、過酸化水素による酸化反応に影響を及ぼしていると考えられる。
これらの結果から、本系において特に大きな影響を及ぼす物質は確認されなかったことから、Ｃｕ２＋が選択的に作用していると推測される。
【００５５】
【表５】
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【００５６】
（ウシ血清中のＣｕ２＋の定量）
実サンプルへの応用として、ウシ血清中のＣｕ２＋の定量を行った。まず、除タンパク処理を施したウシ血清アルブミンをサンプルとして、Ｌ−アスコルビン酸を添加したＦｅ−ＰＴＳの化学発光系に適用し、化学発光が観測されるまでの誘導時間を測定した。なお、Ｌ−アスコルビン酸が１．６×１０−３Ｍ、過酸化水素濃度が２．４×１０−３Ｍ、Ｆｅ−ＰＴＳ濃度が４．０×１０−５Ｍ、ＤＭＳＯが２０体積％、ｐＨ１０の条件下でおこなった。次に、測定された誘導時間（１３９ｓｅｃ）＝Ｙを検量線の式に代入し、Ｃｕ２＋の濃度を算出した。なお、下式はＧＥＮＥＬＩＧＨＴ  ＧＬ−２００Ｓの検量線のものである。
【数１】
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以上より、算出された計算値と原子吸光法により得られた値を表６に示す。その相対誤差は８．７０％であり、ほぼ近似した結果が得られた。
【００５７】
【表６】
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【００５８】
（他法との比較）
本化学発光系とＣｕ２＋の定量に関する他の方法との比較を表７に示す。本系は他法と比較して、低濃度かつ幅広い濃度範囲においてＣｕ２＋を定量することができる系である。
【表７】
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【符号の説明】
【００５９】
１  化学発光用セル
２  有機溶媒
３  ｐＨ緩衝液
４  還元剤
５  試料液
６  発光基質
７  酸化剤
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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