(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列表の配列番号2、4、6および8のいずれか1に記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質の少なくとも1種類を有効成分としてその有効量含有するWntシグナル伝達阻害剤。
【請求項２】
配列表の配列番号1、3、5および7のいずれか1に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの少なくとも1種類を有効成分としてその有効量含有するWntシグナル伝達阻害剤。
【請求項３】
配列表の配列番号2、4、6および8のいずれか1に記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質の少なくとも1種類を用いることを手段とするインビトロにおけるWntシグナル伝達阻害方法。
【請求項４】
配列表の配列番号1、3、5および7のいずれか1に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの少なくとも1種類を用いることを手段とするインビトロにおけるWntシグナル伝達阻害方法。
【請求項５】
配列表の配列番号2、4、6および8のいずれか1に記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質の少なくとも1種類を有効成分としてその有効量含有する、多能性幹細胞から心筋細胞への分化誘導剤。
【請求項６】
配列表の配列番号1、3、5および7のいずれか1に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの少なくとも1種類を有効成分としてその有効量含有する、多能性幹細胞から心筋細胞への分化誘導剤。
【請求項７】
配列表の配列番号2、4、6および8のいずれか1に記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質の少なくとも1種類を多能性幹細胞とインビトロで接触させることを手段とする心筋細胞分化誘導方法。
【請求項８】
配列表の配列番号1、3、5および7のいずれか1に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドの少なくとも1種類を多能性幹細胞とインビトロで接触させることを手段とする心筋細胞分化誘導方法。
【請求項９】
多能性幹細胞が胚性幹細胞である請求項7または請求項8に記載の心筋細胞分化誘導方法 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（以下、IGFBPと略称することがある）を含有するWntシグナル伝達阻害剤に関する。また本発明は、IGFBPをコードするポリヌクレオチドを含有するWntシグナル伝達阻害剤に関する。さらに本発明は、IGFBPを用いることを手段とするWntシグナル伝達阻害方法に関する。さらにまた本発明は、IGFBPをコードするポリヌクレオチドを用いることを手段とするWntシグナル伝達阻害方法に関する。また本発明は、IGFBPおよび／またはIGFBPをコードするポリヌクレオチドの、Wntシグナル伝達阻害剤の製造における使用に関する。さらに本発明は、前記Wntシグナル伝達阻害剤を含有する、Wntシグナル伝達の亢進に起因する疾患の防止および／または治療剤に関する。さらにまた本発明は、前記Wntシグナル伝達阻害剤を投与することを手段とする、Wntシグナル伝達の亢進に起因する疾患の防止および／または治療方法に関する。また本発明は、前記Wntシグナル伝達阻害剤の、Wntシグナル伝達の亢進に起因する疾患の防止および／または治療における使用に関する。さらに本発明は、前記Wntシグナル伝達阻害剤を含有する心筋細胞分化誘導剤に関する。さらにまた本発明は、前記Wntシグナル伝達阻害剤を心筋細胞に分化し得る細胞と接触させることを手段とする心筋細胞分化誘導方法に関する。また本発明は、前記Wntシグナル伝達阻害剤を投与することを手段とする心筋細胞分化誘導方法に関する。さらに本発明は、前記心筋細胞分化誘導方法により得られた心筋細胞およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
心臓は胚発生期に最初に形成される臓器であり、この過程の異常はヒトの先天的障害の最も一般的な原因である先天的心臓疾患を生じる（非特許文献1および2）。心臓発生をもたらす分子は、心臓再生へのその潜在的用途ゆえに特別な注目の的である（非特許文献3および4）。【０００３】
従前の研究において、Wnt、Wnt阻害剤、骨形成タンパク質（bone morphogenetic protein；以下、BMPと略称する）、および線維芽細胞増殖因子（fibroblast growth factor；以下、FGFと略称する）等の液性因子が、心筋細胞（cardiomyocyte）の特異化に決定的に重要な組織間相互作用を媒介することが示されている（非特許文献2および4）。【０００４】
Wntは、形態形成を制御するタンパク質であり、発生、幹細胞分化制御および細胞癌化等の様々な現象に関わることが知られている。また、Wntが、幹細胞の増殖調節および生存に重要な因子であることが報告されている（非特許文献5および6）。【０００５】
Wntは、細胞膜受容体に結合し、そして少なくとも3種類の経路を介して細胞内シグナルを伝達することにより、その作用を発現していることが知られている。Wntが結合する細胞膜受容体には、7回膜貫通型受容体であるフリズルド（Frizzled、Frzと略称することがある）と1回膜貫通型受容体である低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質5および6（それぞれLRP5およびLRP6と略称することがある）が知られている（非特許文献7および8）。Wntにより制御されるシグナル伝達経路には、β−カテニン経路、PCP（planar cell polarity、平面内細胞極性）経路、およびカルシウムイオン（Ca2+）経路の少なくとも3種類存在すると考えられる。β−カテニン経路は古くから知られており、古典的（canonical）経路とも呼ばれる。本経路は、核へのWntシグナルの伝達に重要な役割を果たす細胞質β−カテニンの安定化を特徴とし、その異常な活性化は発がんに関連すると考えられている。一方、PCP経路およびCa2+経路は、非古典的（non-canonical）経路と呼ばれる。PCP経路は、低分子量Gタンパク質であるRhoやMAPキナーゼファミリーに属するJunキナーゼの活性化を特徴とする。また、Ca2+経路は、細胞内カルシウム濃度の上昇による下流のタンパク質リン酸化酵素であるプロテインキナーゼC（PKC）やカルモデュリンキナーゼの活性化を特徴とする。【０００６】
IGFBPは、インスリン様増殖因子（以下、IGFと略称する）に結合してその作用を調節するタンパク質である。IGFには2つの分子種の存在が明らかにされており、それぞれIGF-IおよびIGF-IIと呼ばれている。IGF-IおよびIGF-IIは構造的にインスリンと高度に類似しており、細胞表面上に存在するそれぞれの受容体であるI型IGF受容体およびII型IGF受容体に結合して様々な細胞の増殖や分化に重要な役割を果たす。【０００７】
IGFBPは、IGFBP-1〜IGFBP-6と呼ばれる6つの分子種の存在が明らかにされており、様々な組織に広汎に発現している。IGFBP-1〜IGFBP-6はいずれもIGFに結合することによりIGFとその受容体との相互作用を調節し、その結果IGFの作用を制御している。【０００８】
一方、IGFBPのいくつかの作用はIGFに依存していないという報告がある。しかし、IGF非依存性のIGFBP作用の詳細なメカニズムはほとんど知られていない（非特許文献9および10）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Srivastava, D., Genetic assembly of the heart: implications for congenital heart disease., Annu Rev Physiol 63, 451-69 (2001).
【非特許文献２】Olson, E.N. & Schneider, M.D. ,Sizing up the heart: development redux in disease., Genes Dev 17, 1937-56(2003).
【非特許文献３】Leri, A., Kajstura, J. &Anversa, P. Cardiac stem cells and mechanisms of myocardial regeneration., Physiol Rev 85, 1373-416 (2005).
【非特許文献４】Foley, A. & Mercola, M., Heart induction: embryology to cardiomyocyte regeneration., Trends Cardiovasc Med 14, 121-5 (2004).
【非特許文献５】Willert K., Brown J.D., Danenberg E., Duncan A.W., Weissman I.L., Reya T., Yates JR 3rd, Nusse R., Nature 423, 448-52 (2003).
【非特許文献６】Reya T., Duncan A.W., Ailles L., Domen J., Scherer D.C., Willert K., Hintz L., Nusse R., Weissman I.L., Nature 423, 409-14 (2003).
【非特許文献７】Moon, R. T., Kohn, A.D., DeFerrari, G. V. & Kaykas, A., WNT and beta-catenin signalling: diseases and therapies., Nat Rev Genet 5, 691-701 (2004).
【非特許文献８】Kikuchi, A., Yamamoto, H. & Kishida, S., Multiplicity of the interactions of Wnt proteins and their receptors., Cell Signal 19, 659-71 (2007).
【非特許文献９】Firth, S.M. & Baxter, R.C., Cellular actions of the insulin-like growth factor binding proteins., Endocr Rev 23, 824-54 (2002).
【非特許文献１０】Mohan, S. & Baylink, D.J., IGF-binding proteins are multifunctional and act via IGF-dependent and-independent mechanisms., J Endocrinol 175, 19-31 (2002).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、形態形成や細胞増殖、例えば心臓の発達および／または心筋細胞の分化を調節する新たな液性因子を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記目的を達成すべく、心筋細胞に分化する細胞株P19CL6細胞を用いて鋭意研究を行った。そして、（1）IGFBP-4がP19CL6細胞の心筋細胞への分化をインビトロで誘導すること、（2）IGFBP-4のノックダウンによりインビトロおよびインビボのいずれにおいても心筋発生（cardiomyogenesis）が低減すること、（3）IGFBP-4のこれら作用がそのIGF結合活性とは無関係であること、（4）IGFBP-4がWnt受容体であるFrizzled 8（以下、Frz8と略称する）およびLRP5／6と物理的に相互作用してWnt3AのFrz8およびLRP6への結合を阻害することを見出し、これら結果からIGFBP-4がWntシグナル伝達を阻害すること、およびWntシグナル伝達の阻害により心筋細胞分化が誘導されることを明らかにした。さらに本発明者らは、IGFBP-4の他に、IGFBP-1、IGFBP-2、およびIGFBP-6も、Frz8およびLRP6と結合し、Wntシグナル伝達を阻害することを見出した。本発明はこれら知見に基づいて達成したものである。【００１２】
即ち、本発明は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質の少なくとも1種類を含有するWntシグナル伝達阻害剤に関する。【００１３】
また本発明は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質の少なくとも1種類が、下記タンパク質群より選ばれるタンパク質の少なくとも1種類であり、その少なくとも1種類を有効成分としてその有効量含有するWntシグナル伝達阻害剤に関する：
（1）配列表の配列番号2、4、6および8のいずれか1に記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質、
（2）前記（1）のタンパク質と70％以上の相同性を有し、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質、および
（3）前記（1）のタンパク質のアミノ酸配列において1個から10個のアミノ酸の変異を有するアミノ酸配列で表され、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質。【００１４】
さらに本発明は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質の少なくとも1種類が、配列表の配列番号2、4、6および8のいずれか1に記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質である前記Wntシグナル伝達阻害剤に関する。【００１５】
さらにまた本発明は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質の少なくとも1種類が、配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質である前記Wntシグナル伝達阻害剤に関する。【００１６】
また本発明は、Wnt受容体が低密度リポタンパク質受容体6（LRP6）およびFrizzled8（Frz8）である前記いずれかのWntシグナル伝達阻害剤に関する。【００１７】
さらに本発明は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドの少なくとも1種類を含有するWntシグナル伝達阻害剤に関する。【００１８】
さらにまた本発明は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドの少なくとも1種類が、下記ポリヌクレオチド群より選ばれるポリヌクレオチドの少なくとも1種類であり、その少なくとも1種類を有効成分としてその有効量含有するWntシグナル伝達阻害剤に関する：
（1）配列表の配列番号1、3、5および7のいずれか1に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチド、
（2）前記（1）のポリヌクレオチドと70％以上の相同性を有し、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（3）前記（1）のポリヌクレオチドの塩基配列において1個から30個のヌクレオチドの変異を有する塩基配列で表され、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（4）前記（1）から（3）のいずれか1に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。【００１９】
また本発明は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドの少なくとも1種類が、配列表の配列番号1、3、5および7のいずれか1に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドである前記Wntシグナル伝達阻害剤に関する。【００２０】
さらに本発明は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドの少なくとも1種類が、配列表の配列番号1に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドである前記Wntシグナル伝達阻害剤に関する。【００２１】
さらにまた本発明は、Wnt受容体が低密度リポタンパク質受容体6（LRP6）およびFrizzled8（Frz8）である前記いずれかのWntシグナル伝達阻害剤に関する。【００２２】
また本発明は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質の少なくとも1種類を用いることを手段とするWntシグナル伝達阻害方法に関する。【００２３】
さらに本発明は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質の少なくとも1種類が、下記タンパク質群より選ばれるタンパク質の少なくとも1種類である前記Wntシグナル伝達阻害方法に関する：
（1）配列表の配列番号2、4、6および8のいずれか1に記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質、
（2）前記（1）のタンパク質と70％以上の相同性を有し、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質、および
（3）前記（1）のタンパク質のアミノ酸配列において1個から10個のアミノ酸の変異を有するアミノ酸配列で表され、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質。【００２４】
さらにまた本発明は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質の少なくとも1種類が、配列表の配列番号2、4、6および8のいずれか1に記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質である前記Wntシグナル伝達阻害方法に関する。【００２５】
また本発明は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質の少なくとも1種類が、配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質である前記Wntシグナル伝達阻害方法に関する。【００２６】
さらに本発明は、Wnt受容体が低密度リポタンパク質受容体6（LRP6）およびFrizzled8（Frz8）である前記いずれかのWntシグナル伝達阻害方法に関する。【００２７】
さらにまた本発明は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドの少なくとも1種類を用いることを手段とするWntシグナル伝達阻害方法に関する。【００２８】
また本発明は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドの少なくとも1種類が、下記ポリヌクレオチド群より選ばれるポリヌクレオチドの少なくとも1種類である前記Wntシグナル伝達阻害方法に関する：
（1）配列表の配列番号1、3、5および7のいずれか1に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチド、
（2）前記（1）のポリヌクレオチドと70％以上の相同性を有し、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（3）前記（1）のポリヌクレオチドの塩基配列において1個から30個のヌクレオチドの変異を有する塩基配列で表され、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
（4）前記（1）から（3）のいずれか1に記載のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド。【００２９】
さらに本発明は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドの少なくとも1種類が、配列表の配列番号1、3、5および7のいずれか1に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドである前記Wntシグナル伝達阻害方法に関する。【００３０】
さらにまた本発明は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドの少なくとも1種類が、配列表の配列番号1に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドである前記Wntシグナル伝達阻害方法に関する。【００３１】
また本発明は、Wnt受容体が低密度リポタンパク質受容体6（LRP6）およびFrizzled 8（Frz8）である前記いずれかのWntシグナル伝達阻害方法に関する。【００３２】
さらに本発明は、インスリン様増殖因子結合タンパク質（IGFBP）であってWnt受容体と結合し得るタンパク質および／または該タンパク質をコードするポリヌクレオチドの、Wntシグナル伝達阻害剤の製造における使用に関する。【００３３】
さらにまた本発明は、前記いずれかのWntシグナル伝達阻害剤を有効成分としてその有効量含有するWntシグナル伝達の亢進に起因する疾患の防止および／または治療剤に関する。【００３４】
また本発明は、前記いずれかのWntシグナル伝達阻害剤の有効量を対象に投与することを手段とするWntシグナル伝達の亢進に起因する疾患の防止および／または治療方法に関する。【００３５】
さらに本発明は、前記いずれかのWntシグナル伝達阻害剤の、Wntシグナル伝達の亢進に起因する疾患の防止および／または治療における使用に関する。【００３６】
さらにまた本発明は、前記いずれかのWntシグナル伝達阻害剤を有効成分としてその有効量含有する心筋細胞分化誘導剤に関する。【００３７】
また本発明は、前記いずれかのWntシグナル伝達阻害剤の有効量を心筋細胞に分化し得る細胞と接触させることを手段とする心筋細胞分化誘導方法に関する。【００３８】
さらに本発明は、心筋細胞に分化し得る細胞が多能性幹細胞である前記心筋細胞分化誘導方法に関する。【００３９】
さらにまた本発明は、心筋細胞に分化し得る細胞が胚性幹細胞である前記心筋細胞分化誘導方法に関する。【００４０】
また本発明は、前記いずれかの心筋細胞誘導方法により得られた心筋細胞に関する。【００４１】
さらに本発明は、前記いずれかの心筋細胞誘導方法により得られた心筋細胞の使用に関する。【００４２】
さらにまた本発明は、前記いずれかのWntシグナル伝達阻害剤の有効量を対象に投与することを手段とする心筋細胞分化誘導方法に関する。
【発明の効果】
【００４３】
本発明によれば、IGFBPであってWnt受容体と結合するタンパク質および／または該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有効成分として含有するWntシグナル伝達阻害剤を提供できる。【００４４】
Wntシグナルは、形態形成の制御に関与し、発生、幹細胞の分化制御、増殖調節および生存、並びに細胞癌化等の様々な現象に重要である。従って、本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤は、形態形成や細胞増殖、例えば心臓の発達および／または心筋細胞の分化を調節する薬剤として医薬品開発分野や科学研究分野等において有用である。【００４５】
本発明によればさらに、前記タンパク質および／または該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有効成分として含有するWntシグナル伝達の亢進に起因する疾患の防止および／または治療剤、並びに心筋細胞分化誘導剤を提供できる。また本発明は、Wntシグナル伝達阻害剤、Wntシグナル伝達の亢進に起因する疾患の防止および／または治療剤、並びに心筋細胞分化誘導剤の製造における、IGFBPであってWnt受容体と結合するタンパク質および／または該タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用を提供できる。さらに本発明は、Wntシグナル伝達阻害、Wntシグナル伝達の亢進に起因する疾患の防止および／または治療、並びに心筋細胞分化誘導における、IGFBPであってWnt受容体と結合するタンパク質および／または該タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用を提供できる。本発明によればまた、IGFBPであってWnt受容体と結合するタンパク質および／または該タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いることを手段とするWntシグナル伝達阻害方法、Wntシグナル伝達の亢進に起因する疾患の防止および／または治療方法、心筋細胞分化誘導方法、並びに該心筋細胞分化誘導方法により得られた心筋細胞およびその使用を提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１−ａ】OP9細胞により馴化された培養培地によりP19CL6細胞の心筋細胞への分化が誘導されたが、COS7細胞で馴化した培養培地では誘導されなかったことを示す図である。心筋細胞への分化は、細胞形態（左側2枚のパネル）、MF20陽性領域の誘導（中央パネル）、並びに心臓マーカー遺伝子（αミオシン重鎖（αMHC）、Nkx2.5、GATA-4）および心臓トロポニン（cTnT）タンパク質の発現の誘導（右パネル）により評価した。目盛り線＝100μm。
【図１−ｂ】IGFBP-4（1μg/ml）での処理により、ジメチルスルホキシド（以下、DMSOと略称する）非存在下でP19CL6細胞の心筋細胞への分化が誘導されたことを示す図である。心筋細胞への分化は、MF20陽性領域の誘導（左パネル）、並びに心臓マーカー遺伝子（αMHC、Nkx2.5、GATA-4）およびcTnTタンパク質の発現の誘導（右パネル）により評価した。図中、IGFBP-4はBP4、コントロールはCと表示する。
【図１−ｃ】IGFBP-4に対する中和抗体（40μg/ml）での処理により、OP9馴化培地により誘導されるP19CL6細胞の心筋細胞への分化が低減したことを示す図である。心筋細胞への分化は、MF20陽性領域の誘導（左パネル）、並びに心臓マーカー遺伝子（αMHC、Nkx2.5、GATA-4）およびcTnTタンパク質の発現の誘導（右パネル）により評価した。図中、IGFBP-4に対する中和抗体はαBP4と表示する。
【図１−ｄ】IGF-Iに対する中和抗体およびIGF-IIに対する中和抗体の組み合わせ（各5μg/ml）による処理は、IGFBP-4により誘導されるP19CL6細胞の心筋細胞への分化になんら効果を示さなかったことを示す図である。心筋細胞への分化は、MF20陽性領域の誘導（上パネル）、およびcTnTタンパク質の発現の誘導（中パネル）により評価した。図中、中和抗体の組み合わせ（上記の組み合わせをαIGFs、コントロールをCと表示する。
【図１−ｅ】IGFに結合できない変異体IGFBP-4（IGFBP-4-H74P）が心筋発生活性を維持していることを示す図である。心筋発生活性は、P19CL6細胞の心筋細胞への分化で評価した。心筋細胞への分化は、MF20陽性領域の誘導（上パネル）、およびcTnTタンパク質の発現の誘導（中パネル）により評価した。図中、IGFBP-4-H74PはBP4（H74P）、コントロールはCと表示する。
【図１−ｆ】IGF-Iおよび-IIの組み合わせ（各100ng/ml）は野生型IGFBP-4により誘導されるP19CL6細胞の心筋細胞への分化を低減するが（左パネル）、変異体IGFBP-4-H74Pにより誘導されるP19CL6細胞の心筋細胞への分化は低減しない（右パネル）ことを示す図である。心筋細胞への分化は、MF20陽性領域の誘導（上パネル）、およびcTnTタンパク質の発現の誘導（中パネル）により評価した。図中、IGF-Iおよび-IIの組み合わせはIGFs、IGFBP-4はBP4、IGFBP-4-H74PはBP4（H74P）、コントロールはCと表示する。
【図２−ａ】IGFBP-4がP19CL6細胞においてWnt／β−カテニンシグナル伝達を低減したことを示す図である。P19CL6細胞にTOPFLASHレポーター遺伝子およびLRP6またはFrz8の発現ベクターをトランスフェクションし、Wnt3AとIGFBP-4で処理すると、Wnt3Aのみで処理したときと比較して、TOPFLASH活性が低下した。TOPFLASH活性はルシフェラーゼ活性の測定により評価した。図中、IGFBP-4はBP4と表示する。
【図２−ｂ】アフリカツメガエルIGFBP-4（以下、XIGFBP-4と略称することがある）が、アフリカツメガエル胚においてアフリカツメガエルWnt8（以下、Xwnt8と略称する）により誘導される二次体軸形成を阻害したことを示す図である（各群N＝20）。図中、XIGFBP-4はXBP4と表示する。
【図２−ｃ】XIGFBP-4が、アフリカツメガエル胚においてLRP6により誘導される二次体軸形成を阻害したことを示す図である（各群N＝30）。図中、XIGFBP-4はXBP4と表示する。
【図２−ｄ】IGFBP-4がLRP6Nと直接的に相互作用したことを示す図である。相互作用は、LRP6N-MycとIGFBP-4-V5とを反応させ、抗Myc抗体による免疫沈降（IP）後の抗V5抗体または抗Myc抗体によるイムノブロット（IB）（左パネル）、並びに、抗V5抗体による免疫沈降（IP）後の抗Myc抗体または抗V5抗体によるイムノブロット（IB）（右パネル）により評価した。
【図２−ｅ】IGFBP-4がFrz8システインリッチドメイン（以下、Frz8CRDと略称する）と直接的に相互作用したことを示す図である。相互作用は、Frz8CRD-MycとIGFBP-4-V5とを反応させ、抗Myc抗体による免疫沈降（IP）後の抗V5抗体または抗Myc抗体によるイムノブロット（IB）（左パネル）、並びに、抗V5抗体による免疫沈降（IP）後の抗Myc抗体または抗V5抗体によるイムノブロット（IB）（右パネル）により評価した。
【図２−ｆ】125I標識IGFBP-4とLRP6Nとの結合アッセイの結果を示す図である。挿入図はスカッチャードプロットであり、異なった結合親和性（Kd）をもつ2箇所の結合部位が存在することを示す。
【図２−ｇ】125I標識IGFBP-4とFrz8CRDとの結合アッセイの結果を示す図である。挿入図はスカッチャードプロットであり、結合親和性（Kd）が25nMである1箇所の結合部位が存在することを示す。
【図２−ｈ】IGFBP-4が、125I標識Wnt3AのLRP6Nとの結合を用量依存的に阻害したことを示す図である。
【図２−ｉ】IGFBP-4が、125I標識Wnt3AのFrz8CRDとの結合を用量依存的に阻害したことを示す図である。
【図３−ａ】DMSOによるP19CL6細胞の心筋細胞への分化誘導中の、IGFBPファミリーメンバー発現の変化を示す図である。IGFBP発現は、DMSO添加後、第0日（D0）、第2日（D2）、第4日（D4）、第6日（D6）および第8日（D8）に逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）により測定した。
【図３−ｂ】P19CL6細胞におけるIGFBP-4のノックダウンにより、該細胞のDMSO処理に対する応答における心臓マーカー（αMHC、Nkx2.5、GATA-4）発現（左パネル）およびcTnT発現（右パネル）が低減したことを示す図である。IGFBP-4のノックダウンは、2種類のIGFBP-4 siRNA（図中BP4-1およびBP4-2と表示する）を用いて行った。一方、IGFBP-3 siRNA（図中BP3と表示する）およびIGFBP-5 siRNA（図中BP5と表示する）によるIGFBP-3およびIGFBP-5のノックダウンはいずれもDMSO処理に対する応答におけるcTnT発現になんら影響しなかった（右パネル）。
【図３−ｃ】IGFBP-4に対する中和抗体（40μg/ml）での処理により、DMSOにより誘導されるP19CL6細胞の心筋細胞への分化が低減したことを示す図である。心筋細胞への分化は、MF20陽性領域の誘導（左パネル）、並びに心臓マーカー遺伝子（αMHC、Nkx2.5、GATA-4）およびcTnTタンパク質の発現の誘導（右パネル）により評価した。図中、IGFBP-4に対する中和抗体はαBP4と表示する。
【図３−ｄ】αMHC−緑色蛍光タンパク質（αMHC-GFP）レポーター遺伝子を安定トランスフェクションしたP19CL6細胞をDMSOにより分化誘導し、IGFBP-4を免疫染色した結果を示す図である。左上パネルはIGFBP-4染色、右上パネルは分化した心筋細胞を表すGFP発現、左下パネルはDAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole）による核染色、および右下パネルは重ね合わせた像を示す。目盛り線＝100μm。
【図３−ｅ】IGFBP-4ノックダウンにより低減されたP19CL6細胞の心筋細胞への分化が、Wnt／β−カテニンシグナル伝達の阻害により回復したことを示す図である。コントロールP19CL6細胞およびIGFBP-4をノックダウンしたP19CL6細胞をGFPまたはLRP6細胞外部分（LRP6N）の発現ベクターで処理し、そしてDMSO処理により心筋細胞への分化を誘導した。LRP6Nは野生型LRP6に対してドミナントネガティブ作用を有し、その過剰発現はIGFBP-4ノックダウンにより低減された心筋細胞への分化を回復した。心筋細胞への分化は、MF20陽性領域（左パネル）、並び心臓マーカー遺伝子（αMHC、Nkx2.5、GATA-4）およびcTnTタンパク質の発現（右パネル）により評価した。
【図４−ａ】アフリカツメガエル胚において、初期心臓マーカーであるNkx2.5、成熟心臓マーカーである心臓トロポニンI（cTnI）、肝臓マーカーであるHex、およびXIGFBP-4 mRNAの発現を、段階34、38および42にin situハイブリダイゼーション解析した結果を示す図である。図中、XIGFBP-4 mRNAはXBP4と表示する。
【図４−ｂ】XIGFBP-4を2つの別個のモルフォリノ（MO1またはMO2）によりノックダウンした結果、重大な心臓欠陥が生じたこと（左パネル）、および心臓欠陥がMO抵抗性野生型XIGFBP-4、変異体XIGFBP-4-H74P、またはLRP6細胞外部分（LRP6N）の共注入により回復したこと（中央パネルおよび右パネル）を示す図である。心臓の評価は段階42におけるcTnIのin situハイブリダイゼーションにより行った（各群N＝30）。図中、野生型XIGFBP-4はBP4、およびXIGFBP-4-H74PはBP4（H74P）と表示する。また、no inj.はモルフォリノによるノックダウンを行わなかったことを示す。中央パネルおよび右パネルにおいて、白カラム、斜線カラム、交差線カラム、点描カラムおよび黒カラムは、それぞれ正常心臓、異常心臓、小型心臓、無心臓および死亡例を示す。
【図４−ｃ】XIGFBP-4のモルフォリノ（MO1またはMO2）によるノックダウンにより誘導される心臓欠陥の時間的特徴を示す図である。心臓の形態は、cTnIのin situハイブリダイゼーションにより評価したところ、段階34ではほとんど正常であったが、段階38および42では重大な乱れが生じた。図中、no inj.はモルフォリノによるノックダウンを行わなかったことを示す。右カラムはコントロールおよびMOを注入した胚の切片を示す。矢印はコントロール胚における心臓を指し示す。MOを注入した胚では、心臓様構造はなんら認められなかった。
【図５−ａ】IGFBP-4はTOPFLASHのネガティブコントロールであるFOPFLASH活性を変化させなかったことを示す図である。
【図５−ｂ】IGFBP-4はBRE-lucレポーター遺伝子のBMPによる活性化を変化させなかったことを示す図である。BMP応答性BRE-lucは、BMP2により濃度依存性に活性化され（左パネル）、そしてこの活性化はIGFBP-4によって変化しなかった（右パネル）。図中、IGFBP-4はBP4と表示する。レポーター遺伝子アッセイは293細胞中で実施した。
【図５−ｃ】IGFBP-4による古典的Wnt経路の阻害をアニマルキャップアッセイにより検討した結果を示す図である。本アッセイは、LRP6、β−カテニン、β−ガラクトシダーゼ、またはXIGFBP-4のRNAをそれぞれ2細胞胚の動物極に注入し、段階85にアニマルキャップを切り出し、Wnt標的遺伝子（SiamoisおよびXnr-3）の発現を測定することにより実施した。XIGFBP-4は、LRP6により誘導されるSiamoisおよびXnr-3の発現を低減したが、β−カテニンにより誘導される該発現には影響しなかった。ODCはオルニチン脱炭酸酵素を表し、そしてこれはコントロールとして測定した。
【図５−ｄ】IGFBP-4が、Wnt3AまたはLRP6により活性化される古典的Wntシグナル伝達を阻害したことを示す図である（それぞれ左パネルおよび右パネル）。古典的Wntシグナル伝達の活性化は、TOPFLASHレポーター遺伝子アッセイにより測定し、TOPFLASH活性で評価した。図中、IGFBP-4はBP4と表示する。TOPFLASHレポーター遺伝子アッセイは293細胞中で実施した。
【図５−ｅ】IGFBP-4は、β−カテニン、Dishevelled-1（左パネル）、またはGSK3（glycogen synthase kinase 3）阻害剤である塩化リチウム（右パネル）により誘導される古典的Wntシグナル伝達を阻害しなかったことを示す図である。図中、IGFBP-4はBP4、Dishevelled-1はDiv-1と表示する。TOPFLASHレポーター遺伝子アッセイは293細胞中で実施した。
【図６−ａ】様々な濃度のIGFBP-4の存在下または非存在下における125I標識Wnt3AおよびFrz8CRD間の結合アッセイの結果を示す図である。図中、長方形の記号はIGFBP-4なし、円形の記号はIGFBP-4  50nM、および三角形の記号はIGFBP-4  100nMを示す。挿入図はラインウェーバー・バーグ  プロットであり、IGFBP-4がWnt3AのFrz8CRDへの結合の拮抗阻害剤であることを示す。
【図６−ｂ】実施例1で用いたLRP6欠失変異体（LRP6 deletion mutants）の模式図である。欠失変異体はすべて可溶型である。図中、SPはシグナルペプチド、β−proはβ−プロペラドメイン、EGFはEGF様ドメイン、LDLRはLDL受容体タイプAリピート、TMは膜貫通ドメインを意味する。
【図６−ｃ】IGFBP-4がLRP6NおよびLRP6のE1-4変異体と相互作用したことを示す図である。相互作用は、LRP6N-MycまたはLRP6変異体とIGFBP-4-V5とを反応させ、抗Myc抗体による免疫沈降（IP）後の抗V5抗体または抗Myc抗体によるイムノブロット（IB）（左パネル）、並びに、抗V5抗体による免疫沈降（IP）後の抗Myc抗体または抗V5抗体によるイムノブロット（IB）（右パネル）により評価した。図中、IGFBP-4はBP4と表示する。
【図６−ｄ】IGFBP-4がLRP6のＬ変異体、E1-2/L変異体、およびE3-4/L変異体と相互作用したことを示す図である。相互作用は、Mycタグを付加した各LRP6変異体とIGFBP-4-V5とを反応させ、抗Myc抗体による免疫沈降（IP）後の抗V5抗体または抗Myc抗体によるイムノブロット（IB）（左パネル）、並びに、抗V5抗体による免疫沈降（IP）後の抗Myc抗体または抗V5抗体によるイムノブロット（IB）（右パネル）により評価した。図中、IGFBP-4はBP4と表示する。
【図６−ｅ】IGFBP-4がLRP6のE1-2変異体およびE3-4変異体と相互作用したことを示す図である。一方、コントロールとして用いたDkk1はLRP6E3-4変異体と主に相互作用した。IGFBP-4とLRP6変異体との相互作用は、Mycタグを付加した各LRP6変異体とIGFBP-4-V5とを反応させ、抗Myc抗体による免疫沈降（IP）後の抗Myc抗体によるイムノブロット（IB）（左パネルの左側3レーン）、並びに、抗V5抗体による免疫沈降（IP）後の抗Myc抗体によるイムノブロット（IB）（左パネルの右側3レーン）により評価した。また、Dkk1とLRP6変異体との相互作用は、Mycタグを付加した各LRP6変異体とFLAGタグを付加したDkk1とを反応させ、抗FLAG抗体による免疫沈降（IP）後の抗Myc抗体によるイムノブロット（IB）（左パネルの左側3レーン）、並びに、抗Myc抗体による免疫沈降（IP）後の抗Myc抗体によるイムノブロット（IB）（左パネルの右側3レーン）により評価した。図中、IGFBP-4はBP4と表示する。また、NSは非特異的結合を意味する。
【図６−ｆ】IGFBP-4のアミノ末端欠失変異体は、LRP6およびFrz8と相互作用したが、カルボキシ末端サイログロブリンドメイン欠失変異体は、これらと相互作用しなかったことを示す図である。V5タグを付加した全長IGFBP-4、アミノ末端欠失IGFBP-4およびカルボキシ末端欠失IGFBP-4と、Mycタグを付加したLRP6またはFrz8とを反応させ、抗Myc抗体によるによる免疫沈降（IP）後の抗V5抗体によるイムノブロット（IB）、または、抗Myc抗体によるイムノブロット（IB）により、各IGFBP-4とFrz8またはLRP6との相互作を評価した（中パネル）。全長IGFBP-4およびIGFBP-4欠失変異体の模式図を左パネルに示す。図中、全長IGFBP-4はFLまたはBP4FL、アミノ末端欠失IGFBP-4はΔNまたはBP4ΔN、カルボキシ末端欠失IGFBP-4はΔCまたはBP4ΔCと表示する。また、IGFとはIGF結合ドメインを、TGとはサイログロブリンドメインを意味する。
【図７−ａ】ES細胞の心筋細胞への分化誘導に対するIGFBP-4の効果を検討した結果を示す図である。ES細胞にはαMHC-GFPレポーター遺伝子を安定的にトランスフェクションし、心筋細胞への分化をハンギングドロップ法により誘導した。IGFBP-4（1μg/ml）を第0日目から第3日目まで（D0-3）に適用したときES細胞の心筋細胞への分化は抑制されたが、一方、第3日目から第5日目まで（D3-5）に適用したときには心臓発生は増強された。ES細胞の心筋細胞への分化の程度はGFP陽性領域の顕微鏡下による観察により評価した。目盛り線＝200μm。
【図７−ｂ】ES細胞の心筋細胞への分化誘導に対するIGFBP-4の効果を検討した結果を示す図である。ES細胞にはαMHC-GFPレポーター遺伝子を安定的にトランスフェクションし、心筋細胞への分化をハンギングドロップ法により誘導した。IGFBP-4（1μg/ml）を第0日目から第3日目まで（D0-3）に適用したときES細胞の心筋細胞への分化は抑制されたが、一方、第3日目から第5日目まで（D3-5）に適用したときには心臓発生は増強された。ES細胞の心筋細胞への分化の程度はGFP陽性領域の割合により評価した。
【図７−ｃ】ES細胞の心筋細胞への分化誘導に対するIGFBP-4の効果を検討した結果を示す図である。ES細胞にはαMHC-GFPレポーター遺伝子を安定的にトランスフェクションし、心筋細胞への分化をハンギングドロップ法により誘導した。IGFBP-4（1μg/ml）を第0日目から第3日目まで（D0-3）に適用したときES細胞の心筋細胞への分化は抑制されたが、一方、第3日目から第5日目まで（D3-5）に適用したときには心臓発生は増強された。ES細胞の心筋細胞への分化の程度は心臓マーカー遺伝子（αMHC、Nkx2.5、GATA-4）およびcTnTタンパク質の発現（右パネル）により評価した。
【図７−ｄ】ES細胞の心筋細胞への分化におけるIGFBPファミリーメンバーの発現を示す図である。IGFBP発現は、分化誘導の第0日（D0）、第3日（D3）、第4日（D4）、および第5日（D5）にRT-PCRにより測定した。
【図７−ｅ】ES細胞におけるIGFBP-4のノックダウンにより、該細胞の心筋細胞への分化が低減されたことを示す図である。ES細胞にはαMHC-GFPレポーター遺伝子を安定的にトランスフェクションし、さらに2種類のIGFBP-4 siRNA（図中BP4-1およびBP4-2と表示する）を用いてIGFBP-4をノックダウンし、そして心筋細胞への分化をハンギングドロップ法により誘導した。心筋細胞への分化は、心臓マーカー遺伝子（αMHC、Nkx2.5、GATA-4）発現（左パネル）並びにGFP陽性領域およびcTnT発現（右パネル）により評価した。一方、IGFBP-3 siRNA（図中BP3と表示する）およびIGFBP-5 siRNA（図中BP5と表示する）によるIGFBP-3およびIGFBP-5のノックダウンはいずれもGFP陽性領域の割合およびcTnT発現になんの効果も示さなかった（右パネル）。
【図７−ｆ】IGFBP-4に対する中和抗体（40μg/ml）での処理により、ES細胞の心筋細胞への分化が低減したことを示す図である。ES細胞にはαMHC-GFPレポーター遺伝子を安定的にトランスフェクションし、そして心筋細胞への分化をハンギングドロップ法により誘導した。心筋細胞への分化は、GFP陽性領域の割合（左パネル）、並びに心臓マーカー遺伝子（αMHC、Nkx2.5、GATA-4）およびcTnTの発現（右パネル）により評価した。図中、IGFBP-4に対する中和抗体はαBP4と表示する。
【図７−ｇ】αMHC-GFPレポーター遺伝子を安定トランスフェクションしたES細胞を心筋細胞へ分化誘導し、IGFBP-4を免疫染色した結果を示す図である。左上パネルはIGFBP-4染色、右上パネルは分化した心筋細胞を表すGFP発現、左下パネルはDAPIによる核染色、および右下パネルは重ね合わせた像を示す。目盛り線＝100μm。
【図７−ｈ】マウス胚（E95）におけるIGFBP-4のin situハイブリダイゼーション解析において、咽頭弓、肝芽および肢芽で強いシグナルが検出されたことを示す図である。SおよびASはそれぞれセンスプローブおよびアンチセンスプローブを用いたin situハイブリダイゼーション解析の結果を示す。
【図８−ａ】XIGFBP-4の2つの対立遺伝子の部分配列、XIGFBP-4に対するMO1およびMO2の標的配列並びにその位置、MO感受性（MO-s）XIGFBP-4 cDNAの部分配列、並びにMO抵抗性（MO-r）XIGFBP-4 cDNAの部分配列示す図である。開始コドンATG、およびMO抵抗性XIGFBP-4 cDNAを作成するために導入したミスマッチを下線で示した。
【図８−ｂ】XIGFBP-4に対するMO1およびMO2の活性および特異性を検証した結果を示す図である。MO感受性（MO-s）およびMO抵抗性（MO-r）のXIGFBP-4-Myc mRNAをアフリカツメガエル胚に注入した。MO感受性mRNAから翻訳されたXIGFBP-4-Mycタンパク質の発現はMO1またはMO2の共注入により低減されたが、一方、MO抵抗性mRNAからのタンパク質発現は影響を受けなかった。RT-PCR分析により、注入されたmRNA（injected mRNA）が同等量であることが示された。ODCはオルニチン脱炭酸酵素を表し、そしてこれはRT-PCRコントロールとして測定した。
【図８−ｃ】XIGFBP-4に対するMO1およびMO2により誘導される心臓表現型の特異性を説明する図である。XIGFBP-4 MO1またはMO2により心臓欠陥が生じた。一方、XIGFBP-4 MO1またはMO2により誘導される心臓欠陥はMO抵抗性XIGFBP-4 cDNAの共注入により回復した（各群N＝30）。図中、白カラム、斜線カラム、交差線カラム、点描カラムおよび黒カラムは、それぞれ正常心臓、異常心臓、小型心臓、無心臓および死亡例を示す。
【図８−ｄ】Wnt経路の活性化により正常な心臓発達が損なわれたことを示す図である。Xwnt8をコードし細胞骨格アクチンプロモータの制御下にあるプラスミドDNA（pCSKA-Xwnt8）を、アフリカツメガエル胚の8細胞段階において、心臓および肝臓原基へと運命付けられた2つの背側植物割球の背側領域に注入することにより、心臓形成領域におけるWntを活性化した。pCSKA-Xwnt8を注入した胚（下パネル）は、段階42においてコントロール胚（上パネル）と比較して、心臓の大きさが低減していた。
【図８−ｅ】Wnt経路の活性化により胚発生後期における心臓発生が異常をきたしたことを示す図である。Xwnt8のmRNAを、段階28のアフリカツメガエルの心臓原基近辺へ電気穿孔法により導入した。このとき、GFP mRNAを共注入し、電気穿孔法の効率を評価した。段階34において、GFP発現が心臓形成部分で観察された（上パネル、頭部は左であり背側は上方である）。GFP mRNAのみを注入したコントロール胚（中間パネル）と比較して、Xwnt8およびGFPのmRNAを注入した胚で、段階42において心臓形態形成の異常が観察された（下パネル）。
【図８−ｆ】心臓発達へのWnt活性化の効果を定量分析した結果を示す図である。Xwnt8をコードし細胞骨格アクチンプロモータの制御下にあるプラスミドDNA（pCSKA-Xwnt8）を注入したアフリカツメガエル胚では、そのほとんどの心臓がコントロール胚の正常サイズ（normal size）の心臓と比較して小型（small size）であった。また、Xwnt8を電気穿孔法により導入したアフリカツメガエル胚でも同様に、小型の心臓である割合が高かった。
【図９−ａ】L細胞をWnt3A処理することにより増加した核内β−カテニン量が、IGFBP-4処理により低下したことを示す図である。図中、IGFBP-4はBP4と表示する。TOPO-Iは核内タンパク質の発現コントロールであり、Wnt3AやIGFBP-4による処理で影響を受けなかった。
【図９−ｂ】L細胞をWnt3A処理することにより増加した核内β−カテニン量が、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-4およびIGFBP-6により低下したが、IGFBP-3およびIGFBP-5によっては低下しなかったことを示す図である。図中、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5およびIGFBP-6はそれぞれBP1、BP2、BP3、BP4、BP5およびBP6と表示する。
【図９−ｃ】TOPFLASHレポーター遺伝子をトランスフェクションした細胞において、Wnt3A処理により増加したTOPFLASH活性が、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-4およびIGFBP-6により低下したが、IGFBP-3およびIGFBP-5によっては低下しなかったことを示す図である。図中、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5およびIGFBP-6はそれぞれBP1、BP2、BP3、BP4、BP5およびBP6と表示する。
【図９−ｄ】IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-4およびIGFBP-6がいずれもLRP6と相互作用したが、IGFBP-3および-5は相互作用しなかったことを示す図である。相互作用は、LRP6N-MycとV5タグを付加した各IGFBPとを反応させ、抗Myc抗体による免疫沈降（IP）後の抗V5抗体によるイムノブロット（IB）（上パネル）、並びに、抗V5抗体による免疫沈降（IP）後の抗V5抗体によるイムノブロット（IB）（下パネル）により評価した。図中、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5およびIGFBP-6はそれぞれBP1、BP2、BP3、BP4、BP5およびBP6と表示する。
【図９−ｅ】IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-4およびIGFBP-6がいずれもFrz8と相互作用したが、IGFBP-3および-5は相互作用しなかったことを示す図である。相互作用は、Frz8-MycとV5タグを付加した各IGFBPとを反応させ、抗Myc抗体による免疫沈降（IP）後の抗V5抗体によるイムノブロット（IB）（上パネル）、並びに、抗V5抗体による免疫沈降（IP）後の抗V5抗体によるイムノブロット（IB）（下パネル）により評価した。図中、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-5およびIGFBP-6はそれぞれBP1、BP2、BP3、BP4、BP5およびBP6と表示する。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本発明は、IGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質を有効成分としてその有効量含有するWntシグナル伝達阻害剤に関する。本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤は、IGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質の1種類を含有するものであってよく、また、該タンパク質の2種類以上を含有するものであってよい。
【００４８】
「Wntシグナル伝達」とは、分泌糖タンパク質リガンドのファミリーに属するWntがその細胞膜受容体に結合することより細胞内に生じるシグナル伝達をいう。Wntシグナル伝達は古典的Wntシグナル伝達および非古典的Wntシグナル伝達に大別される。古典的Wntシグナル伝達とは、β−カテニン依存性に機能するWntシグナル伝達をいう。すなわち、Wntタンパク質がその細胞表面受容体であるFrizzledファミリーに結合してディシェブルドファミリータンパク質を活性化し、その結果β−カテニンの核移行を誘導して転写因子Tcfを活性化してWnt応答性遺伝子の転写を促進するシグナル伝達をいう。非古典的Wntシグナル伝達には、PCP経路およびCa2+経路と呼ばれる2種類の経路が知られている。PCP経路は、低分子量Gタンパク質であるRhoやMAPキナーゼファミリーに属するJunキナーゼの活性化を特徴とする。また、Ca2+経路は、細胞内カルシウム濃度の上昇による下流のタンパク質リン酸化酵素であるPKCやカルモデュリンキナーゼの活性化を特徴とする。本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤は、好ましくは古典的Wntシグナル伝達阻害剤である。
【００４９】
IGFBPは、Wnt受容体と結合して、WntとWnt受容体との結合を阻害することにより、Wntシグナル伝達を阻害する。IGFBPが結合するWnt受容体として、好ましくはFrizzledおよびLRP、より好ましくはFrz8、LRP6、およびLRP5を例示できる。「Wnt受容体と結合する」とは、Wnt受容体タンパク質と複合体を形成するように、水素結合、疎水結合または静電的相互作用等の非共有結合により相互作用することを意味する。Wnt受容体とタンパク質の結合は、Wnt受容体と該タンパク質とがそれら分子の一部分において結合すれば足りる。「WntとWnt受容体との結合を阻害する」とは、WntとWnt受容体との結合を低減させること、または該結合を妨げることをいう。「Wntシグナル伝達を阻害する」とは、Wntシグナルの発生を阻害すること、および／またはWntシグナル伝達を低減させることをいう。
【００５０】
本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤に含有されるIGFBPは、Wnt受容体と結合し得るIGFBPであれば特に制限はない。好ましくはWnt受容体と結合してWntシグナル伝達を阻害するIGFBPが適当である。Wnt受容体と結合し得るIGFBPとして、好ましくはIGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-4およびIGFBP-6を例示できる。IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-4およびIGFBP-6はいずれも、Wnt3Aにより惹起されるWntシグナル伝達を阻害した（実施例2参照）。IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-4およびIGFBP-6のうち、IGFBP-4がWnt受容体との結合活性およびWntシグナル伝達阻害作用が最も高い。したがって、本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤に含有されるIGFBPとして、より好ましくはIGFBP-4を例示できる。IGFBPは、いずれの種由来のものであってもよく、好ましくは本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤が適用される対象および該対象由来の組織や細胞と同一の種由来であることが適当である。例えば、本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤を、ヒトおよびヒト由来の組織や細胞に適用するときには、本阻害剤に含有されるIGFBPはヒト由来であることが好ましい。
【００５１】
IGFBP-4として、好ましくは配列番号2に記載のアミノ酸配列で表されるヒト由来のタンパク質を例示できる。
【００５２】
IGFBP-1として、好ましくは配列番号4に記載のアミノ酸配列で表されるヒト由来のタンパク質を例示できる。
【００５３】
IGFBP-2として、好ましくは配列番号6に記載のアミノ酸配列で表されるヒト由来のタンパク質を例示できる。
【００５４】
IGFBP-6として、好ましくは配列番号8に記載のアミノ酸配列で表されるヒト由来のタンパク質を例示できる。
【００５５】
本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤に含有されるIGFBPの範囲には、配列番号2、配列番号4、配列番号6、および配列番号8から選ばれるいずれか1に記載のアミノ酸配列で表されるタンパク質と配列相同性を有し、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質が含まれる。配列相同性は、通常、アミノ酸配列の全体で約50％以上、好ましくは約70％以上、より好ましくは約80％以上、さらに好ましくは約90％以上、さらにより好ましくは約95％以上である。
【００５６】
本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤に含有されるIGFBPの範囲には、また、配列番号2、配列番号4、配列番号6、および配列番号8から選ばれるいずれか1に記載のアミノ酸配列において1個以上、例えば1〜100個、好ましくは1〜30個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個、さらにより好ましくは1〜3個、特に好ましくは1個または2個のアミノ酸の欠失、置換、付加または挿入といった変異を有するアミノ酸配列で表わされるタンパク質であって、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質が含まれる。変異の程度およびそれらの位置等は、該変異を有するタンパク質が、Wnt受容体と結合し得るタンパク質であり、さらに好ましくはWntシグナル伝達を阻害するタンパク質である限り特に制限されない。かかる変異を有するタンパク質は、天然において例えば突然変異や翻訳後の修飾等により生じたタンパク質であってよく、また天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入して得たタンパク質であってもよい。変異を導入する手段は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）等を単独でまたは適宜組み合せて用いることができる。例えば成書に記載の方法（例えば、Sambrook J., Russell D.W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual second edition, (1989) Cold Spring Harbor Laboratory）に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、ウルマーの技術（Ulmer K.M., Science, 219, 666-671 (1983)）を利用することもできる。変異の導入において、当該タンパク質の基本的な性質（物性、機能、生理活性または免疫学的活性等）を変化させないという観点からは、例えば、同族アミノ酸（極性アミノ酸、非極性アミノ酸、疎水性アミノ酸、親水性アミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互置換は容易に想定される。
【００５７】
Wnt受容体と結合し得るIGFBPの選択は、例えばWnt受容体であるFrz8やLRP6を用いて、IGFBPとの結合反応を行うことにより実施できる。Frz8やLRP6の代わりに、それらのWntとの結合ドメインFrz8システインリッチドメイン（Frz8CRD）やLPR6細胞外部分（LRP6N）等を使用して結合反応を行うこともできる（実施例1参照）。結合反応は、慣用のタンパク質結合アッセイにより実施できる。
【００５８】
IGFBPはさらに、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を、例えばアミド化修飾する等、機能の著しい変更を伴わない限りにおいて改変が可能である。また、アミノ末端側やカルボキシ末端側に別のタンパク質等を、直接的にまたはリンカーペプチド等を介して間接的に遺伝子工学的手法等を用いて付加することにより標識化したタンパク質であってもよい。好ましくは、IGFBPの基本的な性質が阻害されないような標識化が望ましい。付加するタンパク質等としては、例えばグルタチオン  S−トランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ等の酵素類、His-tag、Myc-tag、HA-tag、FLAG-tagまたはXpress-tag等のタグペプチド類、フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothiocyanate）またはフィコエリスリン（phycoerythrin）等の蛍光物質類、マルトース結合タンパク質、免疫グロブリンのFc断片あるいはビオチン等が挙げられるが、これらに限定されない。また、放射性同位元素により標識することも可能である。これら標識化されたIGFBPを含むWntシグナル阻害剤は、Wntシグナル伝達経路および該経路が関わる生理学的事象や疾患の解明に有効に利用できる。
【００５９】
IGFBPは、市販されているものを入手して利用することができる。あるいは、一般的な化学合成法によりIGFBPを製造することができる。タンパク質の化学合成方法としては、例えば、固相合成方法、液相合成方法等が知られているがいずれを用いることもできる。かかるタンパク質合成法は、より詳しくは、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を1個ずつ逐次結合させて鎖を延長させていくいわゆるステップワイズエロンゲーション法と、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメントコンデンセーション法とを包含し、IGFBPの合成は、そのいずれによっても行うことができる。上記タンパク質合成法において用いられる縮合法も、常法に従うことができ、例えば、アジド法、混合酸無水物法、DCC法、活性エステル法、酸化還元法、DPPA（ジフェニルホスホリルアジド）法、DCC＋添加物（1−ヒドロキシベンゾトリアゾール、N−ヒドロキシサクシンアミド、N−ヒドロキシ−5−ノルボルネン−2，3−ジカルボキシイミド等）法、ウッドワード法等を例示できる。化学合成により得られるIGFBPは、さらに慣用の各種精製方法に従って、適宜精製を行うことができる。分離および／または精製は、IGFBPの機能、例えばIGFやWnt受容体との結合活性を指標にして実施できる。分離操作方法としては、例えば硫酸アンモニウム沈殿、限外ろ過、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、透析法等を単独でまたは適宜組み合せて用いることができる。好ましくは、IGFBPに対する特異的抗体を用いて特異的に吸着する方法、例えば該抗体を結合させたカラムを利用するアフィニティクロマトグラフィーを用いることが推奨される。
【００６０】
IGFBPは、また、IGFBPをコードする遺伝子の配列情報に基づいて一般的遺伝子工学的手法（Sambrook J., Russell D.W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual second edition, (1989) Cold Spring Harbor Laboratory; Ulmer K.M., Science, 219, 666-671 (1983); Ehrlich H.A., PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, (1989) Stockton Press, New York等）により製造できる。具体的には、IGFBPをコードする遺伝子の発現が確認されている各種の細胞や組織、またはこれらに由来する培養細胞から常法に従ってcDNAライブラリーを調製し、該遺伝子に特有の適当なプライマーを用いて該遺伝子を増幅し、得られた遺伝子を公知の遺伝子工学的手法により発現誘導することにより取得することができる。IGFBP-4をコードする遺伝子の発現は、肝臓で高いレベルで認められ、その他、卵巣、甲状腺や、平滑筋細胞等に認められる。IGFBP-1をコードする遺伝子の発現は、肝臓で認められている。IGFBP-2をコードする遺伝子の発現は、前立腺、肝臓、心臓、膵臓等に認められる。IGFBP-6をコードする遺伝子の発現は、平滑筋、前立腺、甲状腺、心筋細胞等に認められる。IGFBPの遺伝子工学的手法による製造は、具体的には例えば、まずIGFBPをコードする遺伝子を適当な発現ベクターに挿入し、それにより得られた組み換えベクターを適当な宿主細胞に導入して形質転換体を作製し、その後、該形質転換体を培養して培養物を得ることにより実施できる。発現ベクターや宿主細胞は、タンパク質の発現に一般的に用いられているものから適宜選択することができる。形質転換体の培養条件や培養方法は、選択した宿主に最適な自体公知の条件および方法で行うことができる。IGFBPは得られた培養物から適宜回収することができる。IGFBPは分泌タンパク質であるため、形質転換体中のみならず培養液中にも産生される。したがって、IGFBPは、培養後の形質転換体を破砕したものや培養液から、上記慣用の各種精製方法で回収できる。
【００６１】
本発明はまた、IGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドを有効成分としてその有効量含有するWntシグナル伝達阻害剤に関する。本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤は、IGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドの1種類を含有するものであってよく、また、該ポリヌクレオチドの2種類以上を含有するものであってよい。
【００６２】
IGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドを適当な細胞内に導入することにより、IGFBPを該細胞に発現させることができる。IGFBPは分泌タンパク質であるため、細胞外に分泌される。したがって、上記ポリヌクレオチドを含有する薬剤は、細胞内に導入することによりIGFBPの発現を介してWntシグナル伝達阻害剤として作用する。ポリヌクレオチドの細胞内への導入は、該ポリヌクレオチドを挿入した適当な発現ベクターを用いて慣用の遺伝子工学的手法により実施できる。IGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するWntシグナル伝達阻害剤の範囲には、該ポリヌクレオチドが挿入された発現ベクター（以下、IGFBP発現ベクターと称することがある）を含有するWntシグナル伝達阻害剤、および該ポリヌクレオチドを含有し、かつ該ポリヌクレオチドを発現する細胞（以下、IGFBP発現細胞と称することがある）が含まれる。IGFBP発現細胞は、好ましくはIGFBP発現ベクターをトランスフェクションされた細胞であり得る。発現ベクターや発現ベクターをトランスフェクションする細胞は、タンパク質の発現に一般的に用いられているものから適宜選択することができる。例えば、ベクターDNAは宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、天然に存在するDNAを抽出して得られたベクターDNAの他、増殖に必要な部分以外のDNAの部分が一部欠落しているベクターDNAでもよい。代表的なベクターDNAとして、プラスミド、バクテリオファージおよびウイルス由来のベクターDNAを例示できる。プラスミドDNAとして、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミドを例示できる。バクテリオファージDNAとして、λファージを例示できる。ウイルス由来のベクターDNAとして例えばレトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、パポバウイルス、SV40、鶏痘ウイルス、および仮性狂犬病ウイルス等の動物ウイルス由来のベクター、あるいはバキュロウイルス等の昆虫ウイルス由来のベクターを例示できる。その他、トランスポゾン由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来のベクターDNAを例示できる。あるいは、これらを組み合わせて作成したベクターDNA、具体的には、プラスミドおよびバクテリオファージの遺伝学的エレメントを組み合わせて作成したベクターDNA（コスミドやファージミド等）を例示できる。細胞は、生体由来の細胞であれば特に制限はないが、好ましくは動物由来の細胞、より好ましくは哺乳動物由来の細胞、さらに好ましくはヒト由来の細胞である。細胞を阻害剤の有効成分として用いる場合、該細胞は単離された細胞または培養細胞であることが好ましく、さらに増殖抑制処理を施されたものであることがより好ましい。細胞の増殖抑制処理は、放射線照射等の公知方法により実施できる。
【００６３】
本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤に含有されるポリヌクレオチドは、IGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドであれば特に制限はない。好ましくはWnt受容体と結合してWntシグナル伝達を阻害するIGFBPをコードするポリヌクレオチドが適当である。Wnt受容体と結合し得るIGFBPをコードするポリヌクレオチドとして、好ましくはIGFBP-1をコードするポリヌクレオチド、IGFBP-2をコードするポリヌクレオチド、IGFBP-4をコードするポリヌクレオチドおよびIGFBP-6をコードするポリヌクレオチドを例示できる。IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-4およびIGFBP-6のうち、IGFBP-4がWnt受容体との結合活性およびWntシグナル伝達阻害作用が最も高い。したがって、本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤に含有されるIGFBPをコードするポリヌクレオチドとして、より好ましくはIGFBP-4をコードするポリヌクレオチドを例示できる。IGFBPをコードするポリヌクレオチドは、いずれの種由来のものであってもよく、好ましくは本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤の適用対象と同一の種由来であることが適当である。例えば、本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤の適用対象がヒトまたはヒト由来の組織や細胞であるときには、本阻害剤に含有されるIGFBPをコードするポリヌクレオチドはヒト由来であることが好ましい。
【００６４】
IGFBP-4をコードするポリヌクレオチドとして、好ましくは配列番号1に記載の塩基配列で表されるヒト由来のポリヌクレオチドを例示できる。
【００６５】
IGFBP-1をコードするポリヌクレオチドとして、好ましくは配列番号3に記載の塩基配列で表されるヒト由来のポリヌクレオチドを例示できる。
【００６６】
IGFBP-2をコードするポリヌクレオチドとして、好ましくは配列番号5に記載の塩基配列で表されるヒト由来のポリヌクレオチドを例示できる。
【００６７】
IGFBP-6をコードするポリヌクレオチドとして、好ましくは配列番号7に記載の塩基配列で表されるヒト由来のポリヌクレオチドを例示できる。
【００６８】
本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤に含有されるIGFBPをコードするポリヌクレオチドの範囲には、配列番号1、配列番号3、配列番号5、および配列番号7から選ばれるいずれか1に記載の塩基配列で表されるポリヌクレオチドと、配列相同性を有し、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドが含まれる。配列相同性は、通常、塩基配列の全体で約50％以上、好ましくは約70％以上、より好ましくは約80％以上、さらに好ましくは約90％以上、さらにより好ましくは約95％以上である。
【００６９】
本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤に含有されるIGFBPをコードするポリヌクレオチドの範囲には、また、配列番号1、配列番号3、配列番号5、および配列番号7から選ばれるいずれか1に記載の塩基配列において1個以上、例えば1〜100個、好ましくは1〜30個、より好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個、さらにより好ましくは1〜3個、特に好ましくは1個または2個のヌクレオチドの欠失、置換、付加または挿入といった変異を有する塩基配列で表わされるポリヌクレオチドであって、かつWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドが含まれる。変異の程度およびそれらの位置等は、該変異を有するポリヌクレオチドが、Wnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、さらに好ましくはWntシグナル伝達を阻害するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである限り特に制限されない。かかる変異を有するポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチドであってよく、また天然由来の遺伝子に基づいて変異を導入して得たポリヌクレオチド、例えば誘発変異を有するポリヌクレオチドであってよい。変異を導入する手段は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはPCR等を単独でまたは適宜組み合せて用いることができる。
【００７０】
本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤に含有されるIGFBPをコードするポリヌクレオチドの範囲には、上記ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドも含まれる。
【００７１】
Wnt受容体と結合し得るIGFBPをコードするポリヌクレオチドの選択は、例えば試験対象のポリヌクレオチドを細胞で発現させて該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を得、Wnt受容体であるFrz8やLRP6を用いて結合反応を行うことにより実施できる。Frz8やLRP6の代わりに、それらのWntとの結合ドメイン、Frz8システインリッチドメイン（Frz8CRD）やLRP6細胞外部分（LRP6N）、等を使用して結合反応を行うこともできる（実施例1参照）。結合反応は、慣用のタンパク質結合アッセイにより実施できる。
【００７２】
本発明はまた、IGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質を用いることを手段とするWntシグナル伝達阻害方法に関する。本発明に係るWntシグナル伝達阻害方法は、IGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質の1種類を用いるものであってよく、また、該タンパク質の2種類以上を用いるものであってよい。
【００７３】
Wntシグナル伝達の阻害は、IGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質とWntシグナル伝達経路を有する細胞（以下、標的細胞と称することがある）とを接触させることにより達成できる。IGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質と標的細胞との接触は、in vitroでの処理およびin vivoでの処理のいずれでも実施できる。in vitroでの処理は、標的細胞の培養中にIGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質を添加することにより実施できる。in vivoでの処理は、対象にWnt受容体と結合し得るタンパク質を投与することにより実施できる。
【００７４】
本発明はまた、IGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いることを手段とするWntシグナル伝達阻害方法に関する。本発明に係るWntシグナル伝達阻害方法は、IGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドの1種類を用いるものであってよく、また、該ポリヌクレオチドの2種類以上を用いるものであってよい。IGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドを用いることを手段とするWntシグナル伝達阻害方法の範囲には、IGFBP発現ベクターを用いることを手段とするWntシグナル伝達阻害方法、およびIGFBP発現細胞を用いることを手段とするWntシグナル伝達阻害方法が含まれる。
【００７５】
Wntシグナル伝達の阻害は、IGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入することにより達成できる。IGFBPは分泌タンパク質であるため、細胞内で発現されたIGFBPは細胞外に分泌され、そしてWntとWnt受容体との結合を阻害することによりWntシグナル伝達を阻害する。また、IGFBPはパラクリン様式に効果を示すため、IGFBPを分泌するIGFBP発現細胞で標的細胞を処理することによりWntシグナル伝達の阻害を実施できる。IGFBP発現細胞は、好ましくはIGFBP発現ベクターをトランスフェクションされた細胞であり得る。IGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチド、IGFBP発現ベクター、およびIGFBP発現細胞による標的細胞の処理は、in vitroでの処理およびin vivoでの処理のいずれであってもよい。in vitroでの処理は、培養標的細胞に上記ポリヌクレオチドやIGFBP発現ベクターを公知の遺伝子工学的手法により導入することにより、また、標的細胞の培養にIGFBP発現細胞を添加することにより実施できる。in vivoでの処理は、対象に上記ポリヌクレオチド、IGFBP発現ベクター、またはIGFBP発現細胞を投与することにより実施できる。in vivoでの処理においてIGFBP発現細胞を投与する場合には、該細胞は単離された細胞または培養細胞であることが好ましく、さらに増殖抑制処理を施されたものであることがより好ましい。細胞の増殖抑制処理は、放射線照射等の公知方法により実施できる。より好ましくは、対象から採取した細胞を、IGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入した発現ベクターで形質転換し、その後同一対象に投与することが好ましい。
【００７６】
本発明はまた、IGFBPであってWnt受容体と結合し得るタンパク質および／または該タンパク質をコードするポリヌクレオチドの、Wntシグナル伝達阻害剤の製造における使用に関する。
【００７７】
本発明はまた、上記Wntシグナル伝達阻害剤を有効成分としてその有効量含有するWntシグナル伝達の亢進に起因する疾患の防止および／または治療剤に関する。さらに本発明は、上記Wntシグナル伝達阻害剤を用いることを手段とするWntシグナル伝達の亢進に起因する疾患の防止および／または治療方法に関する。また本発明は、上記Wntシグナル伝達阻害剤の、Wntシグナル伝達の亢進に起因する疾患の防止および／または治療における使用に関する。
【００７８】
Wntは、形態形成を制御するタンパク質であり、発生、幹細胞分化制御および細胞癌化等の様々な現象に関わることが知られている。また、Wntが幹細胞の増殖調節および生存に重要な因子であることが報告されている（非特許文献5および6）。そのため、Wntシグナル伝達の異常は、発生異常による疾患、例えば先天性心不全や、細胞機能の異常に係る疾患、例えば癌疾患を引き起こす。
【００７９】
古典的Wntシグナル伝達は、心筋細胞の分化に決定的に重要な役割を果たす（非特許文献2および4）。また、古典的Wntシグナル伝達が、ヒヨコおよびカエルの胚で心臓発生を阻害すること、およびWnt拮抗剤、例えばDkk（dickkopf）や、前方内胚葉またはオーガナイザー領域から分泌されるクレセント（crescent）がWntに媒介される阻害シグナルと対抗して前方の側方中胚葉における心臓発生を誘導することが示されている（Naito, A.T. et al.,Developmental stage-specific biphasic roles of Wnt/beta-catenin signaling in cardiomyogenesis and hematopoiesis., Proc Natl Acad Sci USA 103, 19812-7 (2006); Tzahor, E. & Lassar, A.B., Wnt signals from the neural tube block ectopic cardiogenesis., Genes Dev 15, 255-60 (2001); Schneider, V.A. & Mercola, M., Wnt antagonism initiates cardiogenesis in Xenopus laevis., Genes Dev 15, 304-15 (2001); Marvin, M.J., Di Rocco, G., Gardiner, A., Bush, S.M. & Lassar, A.B., Inhibition of Wnt activityinduces heart formation from posterior mesoderm., Genes Dev 15, 316-27 (2001)）。古典的Wntシグナル伝達はES細胞における心臓発生に時間依存的効果を示すことが示されており、ES細胞分化の初期相における古典的Wntシグナル伝達は心筋発生を促進するのに対し、後期相では心筋細胞への分化を阻害する（Naito, A.T. et al., Developmental stage-specific biphasic roles of Wnt/beta-catenin signaling in cardiomyogenesis and hematopoiesis., Proc Natl Acad Sci USA 103, 19812-7 (2006); Ueno, S. et al., Biphasic role for Wnt/beta-catenin signaling in cardiac specification in zebrafish and embryonic stem cells., Proc Natl Acad Sci USA 104, 9685-90 (2007); Liu, Y. et al., Sox17 is essential for the specification of cardiac mesoderm in embryonic stem cells., Proc Natl Acad Sci USA 104, 3859-64 (2007)）。古典的Wntシグナル伝達の同様の時間依存的効果はゼブラフィッシュ胚で示されており（Ueno, S. et al., Biphasic role for Wnt/beta-catenin signaling in cardiac specification in zebrafish and embryonic stem cells., Proc Natl Acad Sci USA 104, 9685-90 (2007)）。さらに、いくつかの最近の報告で、古典的Wntシグナル伝達が二次心臓領域（secondary heart field）における心臓前駆細胞の増殖の正の調節装置であることが示唆されている（Lin, L. et al., Beta-catenin directly regulates Islet1 expression in cardiovascular progenitors and is required for multiple aspects ofcardiogenesis., Proc Natl Acad Sci USA 104, 9313-8 (2007); Ai, D. et al., Canonical Wnt signaling functions in second heart field to promote right ventricular growth., Proc Natl Acad Sci USA 104, 9319-24 (2007); Kwon, C. et al., Canonical Wnt signaling is a positive regulator of mammalian cardiac progenitors., Proc NatlAcad Sci USA 104, 10894-9 (2007); Cohen, E.D. et al., Wnt/beta-catenin signaling promotes expansion of Isl-1-positive cardiac progenitor cells through regulation of FGF signaling., J Clin Invest 117,1794-804 (2007); Qyang, Y. et al., The Renewal and Differentiation of Isl1+ Cardiovascular Progenitors Are Controlled by a Wnt/beta-Catenin Pathway., Cell Stem Cell 1, 165-79 (2007)）。このように、古典的Wntシグナル伝達は発達の多様な段階で心臓発生に相反する効果を示す。すなわち古典的Wntシグナル伝達は（i）原腸形成または中胚葉の特異化の時期に心臓発生を促進し、（ii）心臓中胚葉が前方の側方中胚葉において特異化される時期に心臓発生を阻害し、（iii）二次心臓領域において心臓前駆細胞の増大を促進し、そして（iv）胚性心臓が成長する後期には心臓発生を阻害する。
【００８０】
したがって、本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤は、心筋細胞の分化誘導による心筋細胞の調製に用いることでき、さらに、心臓発達の誘導に適用できる。実際、本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤に含まれるIGFBPは、心筋細胞の分化を誘導した（実施例1参照）。具体的には、IGFBP-4は、マウス由来細胞株P19CL6細胞および胚性幹細胞（ES細胞）の心筋細胞への分化を誘導した。また、IGFBP-4のノックダウンまたはWnt経路の活性化によりアフリカツメガエル胚での正常な心臓発達が損なわれたが、IGFBP-4のノックダウンによる心臓欠陥は、該ノックダウンに抵抗性のIGFBP-4の発現により回復した。このようなIGFBP-4の心筋細胞誘導活性および心臓発生活性は、IGFBP-4のWntシグナル伝達阻害作用によるものである。心臓発達においてWntシグナル伝達の阻害は、発達の後期、心臓が既に腹部で形成され、成長および再編を開始して胚の血液循環を維持するときに必要である。したがって、IGFBPを、例えばES細胞の心筋細胞への分化に用いるときには、後期相の胚葉体形成後に適用することが好ましい。
【００８１】
「分化」または「細胞の分化」とは、形態的および機能的に特定の特徴を有さないいわゆる未分化な細胞から、その細胞の分裂により形態的および機能的に特定の特徴を有する細胞が生じることをいう。また、分化の過程において、未分化の細胞には認められなかった特定の遺伝子が発現する。このような遺伝子の発現も「分化」に含まれる。「分化を誘導する」とは、未分化な細胞から形態的および機能的特徴を有する細胞を生じさせることをいう。また、未分化な細胞には認められなかった特定の遺伝子を発現させることも「分化を誘導する」ことに含まれる。
【００８２】
「心筋細胞の分化」とは、未分化な細胞の分裂により、心筋細胞としての形態的および機能的を有する細胞が生じることをいう。また、心筋細胞に特徴的な遺伝子が発現することも「心筋細胞の分化」に含まれる。心筋細胞は形態的特徴として接着性および伸展性を示す。心筋細胞は機能的特徴として、重層化したとき自発的に拍動を示す。心筋細胞に特徴的な遺伝子として、心臓発現マーカー遺伝子、例えばαミオシン重鎖（αMHC）遺伝子、Nkx2.5遺伝子、GATA-4遺伝子、心臓トロポニンT（cTnT）遺伝子等が挙げられる。「心筋細胞の分化を誘導する」とは、未分化な細胞から、心筋細胞としての形態的および機能的特徴を有する細胞を生じさせることをいう。また、心筋細胞に特徴的な遺伝子を発現させることも「心筋細胞の分化を誘導する」ことに含まれる。
【００８３】
本発明において、上記Wntシグナル伝達阻害剤の有効量を含有する心筋細胞分化誘導剤、上記Wntシグナル伝達阻害剤を用いることを手段とする心筋細胞分化誘導方法を提供できる。心筋細胞分化誘導は、上記Wntシグナル伝達阻害剤と心筋細胞に分化し得る細胞とを接触させることにより達成できる。心筋細胞に分化し得る細胞として、多能性幹細胞を挙げることができる。「多能性幹細胞」とは、様々な組織または器官を構成する機能的および形態的に特徴を有する細胞に分化することができ、かつ、自己複製能を有する細胞をいう。多能性幹細胞として、組織幹細胞、胚性幹細胞（ES細胞）および人工多能性幹細胞を例示できる。組織幹細胞とは、成体組織中に存在し、自己複製能を有する未分化の細胞をいう。組織幹細胞として骨髄由来幹細胞や心臓由来幹細胞を例示できる。ES細胞とは、動物の発生初期段階である胚盤胞期の胚の一部に属する内部細胞塊より作られる幹細胞の細胞株のことであり、様々な組織または器官を構成する機能的および形態的に特徴を有する細胞に分化できる細胞をいう。人工多能性幹細胞とは、体細胞、例えば線維芽細胞へ数種類の転写因子遺伝子を導入することにより、多能性を持たせた細胞をいう。上記Wntシグナル伝達阻害剤と心筋細胞に分化し得る細胞との接触は、in vitroでの処理およびin vivoでの処理のいずれでも実施できる。in vitroでの処理は、細胞の培養中に上記Wntシグナル伝達阻害剤を添加することにより実施できる。in vivoでの処理は、対象に上記Wntシグナル伝達阻害剤を投与することにより実施できる。
【００８４】
本発明においてまた、上記心筋細胞分化誘導方法により得られた心筋細胞およびその使用を提供できる。心筋細胞は好ましくは培養心筋細胞である。心筋細胞が誘導されたことは、細胞における心臓発現マーカー遺伝子、例えばαミオシン重鎖（αMHC）遺伝子、Nkx2.5遺伝子、GATA-4遺伝子等の発現により、また心臓トロポニンT（cTnT）タンパク質の発現により確認できる。これら遺伝子の発現の測定は、自体公知の遺伝子検出法により実施できる。遺伝子検出法として具体的には、プラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、サザンブロット法、ノザンブロット法、NASBA（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）法、またはRT-PCRを例示できる。また、in situ RT-PCRやin situ ハイブリダイゼーション等を利用した細胞レベルでの遺伝子検出法を例示できる。また、該遺伝子によりコードされるタンパク質を、該タンパク質を特異的に認識する抗体を用いて検出してもよい。
【００８５】
本発明に係る心筋細胞分化誘導方法により提供される心筋細胞は、in vitroあるいはin vivoにおける心筋組織の構築あるいは再構築に使用できる。近年、心筋組織の再構築による再生医療が、心不全の治療法として精力的に検討されている。心不全とは、心機能、例えば心臓の収縮力や拡張力が低下し、全身組織に必要な血液循環が不足した病態生理学的状態をいい、心筋症、心筋梗塞、および心臓弁膜症等あらゆる心臓疾患の末期に現れる病態である。このような心臓疾患の多くにおいては、心筋組織の障害や変性が認められる。障害や変性を生じた心筋組織の再構築により、これら疾患の治療、および心不全の防止および／または治療が可能である。心筋組織の再構築は、障害や変性を生じた心筋組織内に心筋細胞を注入することにより、あるいは心筋細胞を培養して得られる心筋細胞シートや心筋細胞シートを積層した重層化心筋細胞を外科的手法で移植することにより実施できる。また、重層化心筋細胞は、生体に移植すると自発的に拍動を示すことが報告されており、移植用心臓として使用可能である。このように、本方法により提供される心筋細胞は、心筋組織の構築あるいは再構築に有用であることから、障害や変性を生じた心臓における心筋の修復を目的とした処置に使用でき、ひいては心筋症、心筋梗塞、および心臓弁膜症等の多様な心臓疾患の治療に使用できる。
【００８６】
Wntシグナル伝達と疾患との関連についてはその他、その活性化がいくつかの形態の悪性腫瘍に関連していることが報告されている（Logan, C.Y. & Nusse, R., The Wnt signaling pathway in development and disease., Annu Rev Cell Dev Biol 20, 781-810 (2004); Clevers, H., Wnt/beta-catenin signaling in development and disease., Cell 127, 469-80 (2006)）。したがって、本発明に係るWntシグナル伝達阻害剤は、癌疾患の防止および／または治療に適用できる。一方、IGFBP-4処理によりいくつかのがん細胞株におけるin vitroでの細胞増殖が低減したこと、およびIGFBP-4の過剰発現により前立腺がんのin vivoでの成長が低減したことが示されている（Durai, R. et al., Biology of insulin-like growth factor binding protein-4 and its role in cancer (review)., Int J Oncol 28, 1317-25 (2006)）。また、IGFBP-4の血清レベルの減少は乳がんの危険率に関連している。従来、IGFBP-4の発癌抑制作用は、IGFが細胞増殖作用を引き起こすことが知られていることから、IGFに結合してその細胞増殖作用を阻害することによるものであると考えられていた。しかしながら、IGFBP-4の細胞増殖への阻害効果は、部分的に、古典的Wntシグナル伝達の阻害により媒介されている可能性がある。
【００８７】
本発明に係る薬剤は、有効成分の他、必要に応じて、一般に用いられる各種医薬用担体をさらに含む医薬組成物として調製し得る。医薬用担体として、例えば、1種以上の医薬的に許容され得る賦形剤、崩壊剤、希釈剤、滑沢剤、着香剤、着色剤、甘味剤、矯味剤、懸濁化剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤、コーティング剤等を含み得る。また、本発明に係るWntシグナル阻害剤は、医薬用担体の他、公知のWntシグナル阻害剤をさらに含む医薬組成物として調製し得る。また、本発明に係る心筋細胞分化誘導剤は、医薬用担体の他、公知の心筋細胞分化誘導剤を含む医薬組成物として調製し得る。
【００８８】
本発明に係る薬剤や医薬組成物に含有される有効成分の量は、該有効成分の用量範囲や投薬の回数等により適宜決定することができる。例えば、約0.1μg以上、好ましくは、1μg以上、より好ましくは10μg以上、さらに好ましくは100μg以上、さらにより好ましくは1mg以上である。
【００８９】
本発明に係る薬剤や医薬組成物をin vitroで適用する場合、その用量や適用条件は簡単な繰り返し実験により決定することができる。本発明に係る薬剤や医薬組成物の用量は、例えば、培養細胞に適用する場合、一般的には約1ng/ml乃至約1mg/ml、好ましくは約10ng/ml乃至約100μg/ml、より好ましくは約100ng/ml乃至約10μg/ml、さらに好ましくは約100ng/ml乃至約1μg/mlの範囲の濃度で有効である。
【００９０】
本発明に係る薬剤や医薬組成物を対象に投与する場合、その用量範囲は特に限定されず、含有される成分の有効性、投与形態、投与経路、疾患の種類、対象の性質（体重、年齢、病状および他の医薬の使用の有無等）、および担当医師の判断等応じて適宜選択される。本発明に係る薬剤を対象に投与する場合、一般的には適当な用量は、例えば対象の体重1kgあたり約0.01μg乃至約100mg程度、好ましくは約0.1μg乃至約1mg程度の範囲であることが好ましい。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。上記投与量は1日1回乃至数回に分けて投与することができる。
【００９１】
投与経路は、全身投与または局所投与のいずれも選択することができる。この場合、疾患、症状等に応じた適当な投与経路を選択する。本発明に係る薬剤は、経口経路、非経口経路のいずれによっても投与できる。非経口経路としては、通常の静脈内投与、動脈内投与の他、皮下、皮内、筋肉内等への投与を挙げることができる。さらに、経粘膜投与または経皮投与を実施することができる。
【００９２】
剤形は、特に限定されず、種々の剤形、例えば、経口投与のためには、錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、液剤、乳剤、懸濁液、溶液剤、酒精剤、シロップ剤、エキス剤、エリキシル剤とすることができる。非経口剤としては、例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤等の注射剤；経皮投与または貼付剤、軟膏またはローション；口腔内投与のための舌下剤、口腔貼付剤；ならびに経鼻投与のためのエアゾール剤；坐剤とすることができるが、これらには限定されない。これらの製剤は、製剤工程において通常用いられる公知の方法により製造することができる。
【００９３】
経口用固形製剤を調製する場合は、有効成分に賦形剤、必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等を製造することができる。そのような添加剤としては、当該分野で一般的に使用されるものでよく、例えば、賦形剤としては、乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、微結晶セルロース、珪酸等を、結合剤としては、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等を、崩壊剤としては乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等を、滑沢剤としては精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール等を、矯味剤としては白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等を例示できる。
【００９４】
経口用液体製剤を調製する場合は、有効成分に矯味剤、緩衝剤、安定化剤、矯臭剤等を加えて常法により内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等を製造することができる。この場合矯味剤としては上記に挙げられたもので良く、緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム等が、安定化剤としてはトラガント、アラビアゴム、ゼラチン等を挙げることができる。
【００９５】
注射剤を調製する場合は、有効成分にpH調節剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤、局所麻酔剤等を添加し、常法により皮下、筋肉内及び静脈内用注射剤を製造することができる。この場合のpH調節剤及び緩衝剤としてはクエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等を挙げることができる。安定化剤としてはピロ亜硫酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、チオグリコール酸、チオ乳酸等を挙げることができる。局所麻酔剤としては塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等を挙げることができる。等張化剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖等が例示できる。
【００９６】
坐剤を調製する場合は、有効成分に当業界において公知の製剤用担体、例えば、ポリエチレングリコール、ラノリン、カカオ脂、脂肪酸トリグリセライド等を、さらに必要に応じてツイーン登録商標のような界面活性剤等を加えた後、常法により製造することができる。
【００９７】
軟膏剤を調製する場合は、有効成分に通常使用される基剤、安定剤、湿潤剤、保存剤等が必要に応じて配合され、常法により混合、製剤化される。基剤としては、流動パラフィン、白色ワセリン、サラシミツロウ、オクチルドデシルアルコール、パラフィン等を挙げることができる。保存剤としては、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、パラオキシ安息香酸プロピル等を挙げることができる。
【００９８】
貼付剤を製造する場合は、通常の支持体に前記軟膏、クリーム、ゲル、ペースト等を常法により塗布すれば良い。支持体としては、綿、スフ、化学繊維からなる織布、不織布や軟質塩化ビニル、ポリエチレン、ポリウレタン等のフィルムあるいは発泡体シートが適当である。
【００９９】
また本発明に係る薬剤は、持続性または徐放性剤形であってもよい。
【０１００】
本発明に係る薬剤および医薬組成物を遺伝子治療剤として用いる場合は、一般的には、注射剤、点滴剤、あるいはリポソーム製剤として調製することが好ましい。遺伝子治療剤が、遺伝子が導入された細胞を含む形態に調製される場合は、該細胞をリン酸緩衝生理食塩水（pH7.4）、リンゲル液、細胞内組成液用注射剤中に配合した形態等に調製することもできる。また、プロタミン等の遺伝子導入効率を高める物質と共に投与されるような形態に調整することもできる。遺伝子治療剤として用いる場合、本医薬組成物は、1日に1回または数回に分けて投与することができ、1日から数週間の間隔で間歇的に投与することもできる。投与の方法は、一般的な遺伝子治療法で用いられている方法に従うことができる。
【０１０１】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【０１０２】
［1］材料および方法
（プラスミドおよび試薬）
マウスIGFBPおよびアフリカツメガエルIGFBP-4（以下、XIGFBP-4と略称することがある）のcDNAクローンはOpen Biosystmes社より購入した。XIGFBP-4において第74番目のヒスチジン（His）がプロリン（Pro）により置換された変異体（XIGFBP-4-H74P）はQuikChange登録商標 Site-Directed Mutagenesisキット（Stratagene社製）により作製した。このような変異体はIGFに結合しない。Hisタグが付加されたヒト野生型IGFBP-4および変異体IGFBP-4-H74P（Qin, X., Strong, D.D., Baylink, D.J. & Mohan, S., Structure-function analysis of the human insulin-like growth factor binding protein-4., J Biol Chem 273, 23509-16 (1998)）はHitTrap HPキット（Amersham社製）を用いて作製し、そして精製した。【０１０３】
可溶性LRP6欠失変異体およびin situハイブリダイゼーション解析用プローブ（Nkx2.5、cTnI、およびHex）はPCRにより作成した。IGFBP-4、Wnt3A、IGF-I、IGF-II、およびBMP2は、R＆D社より購入した。中和抗体はR＆D社（抗IGFBP-4抗体）、Sigma社（抗IGF-I抗体および抗IGF-II抗体）、およびOncogene社（抗I型IGF受容体抗体）より購入した。免疫沈降、ウエスタンブロッティング、および免疫染色に用いた抗体は、Invitrogen社（抗Myc抗体および抗V5抗体）、Santa Cruz社（抗トロポニンT（cTnT）抗体、抗IGFBP-4抗体、抗イトポイソメラーゼI（TOPO-I）抗体、Sigma社（抗β−アクチン抗体、抗β−カテニン抗体、および抗FLAG（M2）抗体）、およびDevelopmental Studies Hybridoma Bank（抗サルコメア  ミオシン重鎖抗体（MF20））より購入した。【０１０４】
全長Frz8、Frz8システインリッチドメイン（Frz8CRD）、およびLRP6細胞外部分（LRP6N）については文献に記載されている（He, X. et al., A member of the Frizzled protein family mediating axis induction by Wnt-5A., Science 275, 1652-4 (1997); Tamai, K. et al., LDL-receptor-related proteins in Wnt signal transduction., Nature 407, 530-5 (2000)）。全長LRP6、膜結合型LRP6欠失変異体、DKK1（dickkopf-1）については文献に記載されている（Mao, B. et al., LDL-receptor-related protein 6 is a receptor for Dickkopf proteins., Nature 411, 321-5 (2001)）。アフリカツメガエルWnt8（Xwnt8）の発現ベクターであるpXwnt8およびpCSKA-Xwnt8については文献に記載されている（Christian, J.L., McMahon, J.A., McMahon, A.P. & Moon, R.T., Xwnt-8, a Xenopus Wnt-1/int-1-related gene responsive to mesoderm-inducing growth factors, may play a role in ventral mesodermal patterning during embryogenesis., Development 111, 1045-55 (1991); Christian, J.L. & Moon, R.T., Interactions between Xwnt-8 and Spemann organizer signaling pathways generate dorsoventral pattern in the embryonic mesoderm of Xenopus., Genes Dev 7, 13-28 (1993)）。β−カテニン発現ベクターであるPCS2-β−カテニンについては文献に記載されている（Yost, C. et al., Theaxis-inducing activity, stability, and subcellular distribution of beta-cateninis regulated in Xenopus embryos by glycogen synthase kinase 3., Genes Dev 10, 1443-54 (1996)）。αミオシン重鎖（αMHC）プロモータにより制御されるグリーン蛍光タンパク質（GFP）の発現ベクターであるαMHC-GFPについては文献に記載されている（Kolossov, E. et al., Identification and characterization of embryonic stem cell-derived pacemaker and atrial cardiomyocytes., FASEB J 19, 577-9 (2005)）。BMP応答性レポーター遺伝子であるBRE-lucについては文献に記載されている（Korchynskyi, O. & ten Dijke, P., Identification and functional characterization of distinct critically important bone morphogenetic protein-specific response elements in the Id1 promoter., J Biol Chem 277, 4883-91 (2002)）。ディシェブルド1（Dishevelled-1;Dvl-1）発現ベクターであるpCGN-Dv1-1については文献に記載されている（Kishida, M. et al., Synergistic activation of the Wnt signaling pathway by Dvl and casein kinase Iepsilon., J Biol Chem 276, 33147-55 (2001)）。【０１０５】
（細胞培養実験）
P19CL6細胞およびES細胞の心筋細胞への分化の誘導および培養は、本質的には従前の報告に記載された方法と同様の方法で実施した（Monzen, K. et al., Bone morphogenetic proteins induce cardiomyocyte differentiation through the mitogen-activated protein kinase kinase kinase TAK1 and cardiac transcription factors Csx/Nkx-2.5 and GATA-4., Mol Cell Biol 19, 7096-105 (1999); Naito, A.T. et al., Developmental stage-specific biphasic roles of Wnt/beta-catenin signaling in cardiomyogenesis and hematopoiesis., Proc Natl Acad Sci USA 103, 19812-7 (2006)）。【０１０６】
αMHC-GFPを安定的にトランスフェクションされたP19CL6細胞またはES細胞は、P19CL6細胞またはht7 ES細胞にαMHC-GFPをトランスフェクションし、その後G418を用いて選択することにより作成した。【０１０７】
ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫染色、およびRT-PCRは、従前の報告に記載された方法と同様の方法で実施した（Naito, A.T. et al., Developmental stage-specific biphasic roles of Wnt/beta-catenin signaling in cardiomyogenesis and hematopoiesis., Proc Natl Acad Sci USA 103, 19812-7 (2006)）。レポーター遺伝子アッセイは少なくとも3回繰り返し行った。【０１０８】
PCRプライマーおよびPCR条件は表1に一覧表示する。【０１０９】
【表１】
0005435388.tif 000002
【０１１０】
短鎖干渉RNA（small interfering RNA、siRNA）コンストラクトによるIGFBPのノックダウンは、siRNAをpSIREN-RetroQベクター（Clontech社製）を用いて細胞内で発現させることにより実施した。具体的には、二重鎖オリゴヌクレオチドと結合させたpSIREN-RetroQベクターをP19CL6細胞またはES細胞にトランスフェクションし、そしてピューロマイシン抵抗性クローンを単離し、そして増殖させた。【０１１１】
二重鎖オリゴヌクレオチドを構成するオリゴヌクレオチドの塩基配列を表2に一覧表示する。【０１１２】
【表２】
0005435388.tif 000003
【０１１３】
β−カテニン安定化アッセイは、L細胞の核抽出物を用いて実施した。L細胞の核抽出物は、NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction試薬（Pierce社製）を用いて調製した。データは平均値±標準偏差で示した。【０１１４】
（免疫沈降（IP）／ウエスタン解析および結合アッセイ）
IP／ウエスタン解析は、全長IGFBPまたはその様々な欠失変異体、LRP6、Frz8CRD、およびDKK1をそれぞれ含む各馴化培地（conditioned medium）を293細胞を用いて作製し、これらを用いて実施した。結合反応は4℃にて一晩実施した。免疫沈降はProtein G Sepharose 4 Fast Flow（Amersham社製）を用いて実施した。IGFBP-4およびWnt3Aの125I標識は、IODO-BEADS登録商標ヨード化試薬（Pierce社製）を用いて実施した。液相結合アッセイは、基本的には従前報告された方法と同様の方法で実施した（Semenov, M.V. et al., Head inducer Dickkopf-1 is a ligand for Wnt coreceptor LRP6., Curr Biol 11, 951-61 (2001)）。簡潔にいえば、Mycタグを付加したLRP6N（LRP6N-Myc）またはMycタグを付加したFrz8CRD（Frz8CRD-Myc）を様々な濃度の125I標識IGFBP-4と混合し、そして4℃にて一晩インキュベーションした。LRP6N-MycまたはFrz8CRD-Mycを免疫沈降させ、そしてProtein G Sepharose ビーズを徹底的に洗浄した後、結合したIGFBP-4の放射活性を測定した。競合結合アッセイのために、LRP6N-MycまたはFrz8CRD-Mycを含む馴化培地を125I標識Wnt3Aおよび非標識IGFBP-4と混合し、そして4℃にて一晩インキュベーションした。次いで、LRP6N-MycまたはFrz8CRD-Mycを免疫沈降させ、そして結合したWnt3Aの放射活性を測定した。【０１１５】
（アフリカツメガエル実験およびマウスin situハイブリダイゼーション解析）
アフリカツメガエルにおけるアキシスデュプリケーションアッセイ、アニマルキャップアッセイ、およびin situハイブリダイゼーション解析は、基本的には従前報告された方法と同様の方法で実施した（Kobayashi, H. et al., Novel Daple-like protein positively regulates both the Wnt/beta-catenin pathway and the Wnt/JNK pathway in Xenopus., Mech Dev 122, 1138-53 (2005)）。XIGFBP-4について、2つの別個のcDNA、おそらく偽四倍体ゲノム（pseudotetraploid genome）に起因するものを、5'RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）法により同定した。これら2つのIGFBP-4転写物の両方を標的とする2つの別個のMOを設計した（Gene Tools社）。MO1は、翻訳開始コドン上流に隣接する2番目のヌクレオチドから翻訳領域の23番目のヌクレオチドまでの25ヌクレオチドからなる配列を標的とし、MO2は、非翻訳領域の25ヌクレオチドからなる配列を標的とする。MO感受性XIGFBP-4 cDNAは、41bpの5'非翻訳領域を含むものであり、PCRにより作成した。MO抵抗性XIGFBP-4 cDNA（野生型およびH74P変異体）は、MO1標的配列に5つのサイレント変異を導入し、そして5'非翻訳領域を削除することにより作成した。MOの特異性を決定するため、MO感受性またはMO抵抗性のXIGFBP-4-Myc mRNAをMOと共にまたはMOなしでアフリカツメガエル胚に注入し、そしてタンパク質およびmRNA発現を分析した。PCRプライマーおよびPCR条件は上記表1に一覧表示する。MOおよびプラスミドDNAは8細胞段階において、心臓および肝臓原基へと運命付けられた2つの背側植物割球の背側領域に注入した。mRNAの電気穿孔法による導入は、本質的には従前報告された方法と同様の方法で実施した（Sasagawa, S., Takabatake, T., Takabatake, Y., Muramatsu, T. & Takeshima, K., Improved mRNA electroporation method for Xenopus neurula embryos., Genesis 33, 81-5 (2002)）。mRNA（5nl溶液中5ng）の心臓原基近辺への注入および電気パルスの適用は段階29に実施した。マウスIGFBP-4のホールマウントin situハイブリダイゼーション解析は、従前報告された方法と同様の方法で実施した（Hosoda, T. et al., A novel myocyte-specific gene Midori promotes the differentiation of P19CL6 cells into cardiomyocytes., J Biol Chem 276, 35978-89 (2001)）。【０１１６】
［2］形態形成や細胞増殖を調節する新たな液性因子の探索
形態形成や細胞増殖、例えば心臓の発達および／または心筋細胞の分化を調節する新たな液性因子の探索を、心筋細胞に分化するマウス由来の細胞株P19CL6細胞を用いて実施した。P19CL6細胞は1％  DMSO存在下で高い効率をもって心筋細胞へ分化することが知られている（Monzen, K. et al., Bone morphogenetic proteins induce cardiomyocyte differentiation through the mitogen-activated protein kinase kinase kinase TAK1 and cardiac transcription factors Csx/Nkx-2.5 and GATA-4., Mol Cell Biol 19, 7096-105 (1999)）。【０１１７】
具体的には、P19CL6細胞（2000細胞／35mm  シャーレ）を様々な種類の細胞により馴化された培養培地でDMSO非存在下に培養し、各馴化培地の心臓発生活性を選別した。心筋細胞の分化の程度は、サルコメアのミオシン重鎖を認識するモノクローナル抗体（MF20、Developmental Studies Hybridoma Bank）を用いた免疫染色により評価した。MF20陽性領域の増加はP19CL6細胞の心筋細胞への分化を示す。また、培養されたP19CL6細胞における心臓マーカー（αミオシン重鎖（αMHC）、Nkx2.5、およびGATA-4）遺伝子の発現、並びに心臓のcTnTタンパク質の検出を行った。心臓マーカー遺伝子の発現の検出は、各遺伝子に対するプライマーを用いてRT-PCRにより実施した。コントロールとして、β−アクチン遺伝子の発現の検出を行った。用いたプライマーおよびPCR条件は上記表1に示す。cTnTタンパク質の検出は、抗cTnT抗体（Santa Cruz社製）を用いたウエスタンブロッティングにより実施した。コントロールとしてアクチンの検出を抗β−アクチン抗体（Sigma社製）を用いて行った。【０１１８】
試験した数種類の細胞のうち、マウス骨髄間葉系細胞株OP9により馴化された培養培地がP19CL6細胞の心筋細胞への分化をDMSO処理なしに誘導した（図1-a、左および中央パネル）。MF20陽性領域は、αMHC、Nkx2.5、およびGATA-4等の心臓のマーカー遺伝子の誘導およびcTnTタンパク質レベルの増加に伴って増加した（図1-a、右パネル）。それに反し、COS7細胞、マウス胚線維芽細胞、NIH3T3細胞、HeLa細胞、END2細胞（臓側内胚葉様細胞）、新生仔ラット心筋細胞、および新生仔ラット心臓線維芽細胞により馴化された培養培地はDMSO非存在下でのP19CL6細胞の心筋細胞への分化を誘導しなかった（図1-aおよびデータ未記載）。【０１１９】
これら観察結果から、OP9細胞は心臓発生因子（cardiogenic factor）を分泌すると考えた。OP9細胞に由来する心臓発生因子を特定するために、OP9細胞cDNAライブラリからシグナルシークエンストラップ法により単離したcDNAクローン（Ueno, H. et al., A stromal cell-derived membrane protein that supports hematopoietic stem cells., Nat Immunol 4, 457-63 (2003)）について、一過性発現によりそれらの心臓発生活性を試験した。可能である場合には、組換えタンパク質も用いて結果を確認した。【０１２０】
試験した候補因子の中で、IGFBP-4処理はP19CL6細胞の心筋細胞への分化を誘導することがMF20陽性領域の増大および心臓のマーカーの誘導により明らかになった（図1-b）。また、P19CL6細胞を抗IGFBP-4中和抗体（R＆D社製）で前処理したOP9馴化培地で培養したところ、抗IGFBP-4中和抗体の適用はOP9馴化培地により誘導される心筋細胞への分化の効率を低減させた（図1-c）。【０１２１】
上記結果はIGFBP-4がOP9細胞から分泌される心臓発生因子であることを強く示唆する。【０１２２】
［3］IGFBP-4が心筋発生を誘導するメカニズムの検討
IGFBPはIGFに結合してその作用を調節する分子とみなされているため、IGFBP-4による心臓発生促進効果がIGFの作用の増強および阻害のいずれによるかを検討した。まずP19CL6細胞を抗IGF-I中和抗体（Sigma社製）および抗IGF-II中和抗体（Sigma社製）の組み合わせ、またはIGFタイプI受容体に対する中和抗体（Oncogene社製）で処理した。これら抗体による処理が心筋細胞の分化を誘導するおよび／またはIGFBP-4の心臓発生効果を増大させる場合は、IGFBP-4がIGFシグナル伝達を阻害することにより心筋細胞の分化を誘導すると判定した。他方、これら抗体による処理がIGFBP-4による心臓発生を低減させる場合は、IGFBP-4がIGFシグナル伝達を増強することにより心筋細胞の分化を誘導すると判定した。また、IGFBP-4の代わりに、IGFに結合しないIGFBP-4変異体（IGFBP-4-H74P）を用いて、P19CL6細胞の心筋細胞への分化を試験した。【０１２３】
抗IGF-I中和抗体および抗IGF-II中和抗体の組み合わせ、またはIGFタイプI受容体に対する中和抗体による処理は、IGFBP-4が誘導する心筋細胞の分化の効率に影響しなかった（図1-dおよびデータ未記載）。また、P19CL6細胞をIGF-I（R＆D社製）およびIGF-II（R＆D社製）で処理しても心筋細胞の分化は誘導されなかった（データ未記載）。さらにまた、IGFBP-4-H74Pによる処理はP19CL6細胞の心筋細胞への分化を、野生型IGFBP-4よりさらにいっそう効率的に誘導した（図1-e）。これはおそらく内因性IGFにより野生型IGFBP-4が消失するが、変異体IGFBP-4-H74Pは消失しないことによる。この結果と一致して、外因性IGFは野生型IGFBP-4が誘導する心臓発生を低減させたがIGFBP-4-H74Pが誘導する心臓発生は低減させなかった（図1-f）。【０１２４】
これら観察結果を総合すると、IGFBP-4がIGF非依存的様式で心筋細胞の分化を誘導すると考えることができる。【０１２５】
心筋細胞の分化には古典的Wntシグナル伝達が決定的に重要な役割を果たしていることが示されている（非特許文献2および4）。【０１２６】
そこで、IGFBP-4が古典的Wntシグナル伝達を調節する可能性を検討した。検討は、β−カテニン依存的転写因子Tcfの転写活性を測定し得るレポーター遺伝子TOPLFASH（Upstate社製）およびそのネガティブコントロールであるFOPLFASH（Upstate社製）を用いて行った。まず、P19CL6細胞にレポーター遺伝子であるTOPLFASHまたはFOPLFASH、およびLRP6またはFrz8の発現ベクターをトランスフェクションし、Wnt3AとIGFBP-4で処理した。TOPLFASH活性はルシフェラーゼ活性の測定により評価した。また、コントロールとして、BMP2により惹起され、Smadを介して標的遺伝子の転写が行われるシグナル伝達経路へのIGFBP-4の効果を、BMP応答性レポーター遺伝子BRE-lucを用いて検討した。P19CL6細胞において、Wnt3A処理はTOPLFASH活性を増強した（図2-a）。また、Wnt3AによるTOPLFASH活性の増強は、LRP6またはFrz8の発現ベクターのトランスフェクションによりさらに増強された（図2-a）。一方、Wnt3AによるこれらTOPLFASH活性の増強は、IGFBP-4により低減された（図2-a）。ネガティブコントロールであるFOPLFASHを用いたときには、Wnt3A処理、LRP6またはFrz8の発現ベクターのトランスフェクション、およびIGFBP-4処理によるTOPLFASH活性の変化はなかった（図5-a）。また、IGFBP-4は、BMP2によるBMP応答性BRE-lucの濃度依存性活性化には影響しなかった（図5-b）。【０１２７】
これら結果から、IGFBP-4は、Wnt3A処理によるβ−カテニン依存性転写活性を阻害することが明らかになった。すなわち、IGFBP-4が古典的Wnt経路の特異的阻害剤であることが示唆された。【０１２８】
次に、IGFBP-4によるin vivoにおける古典的Wnt経路の阻害を、アフリカツメガエル胚におけるアキシスデュプリケーションアッセイにより検討した。アフリカツメガエル胚へのXwnt8 mRNAの注入により二次軸の形成が生じたが、Xwnt8 mRNAによる二次軸の形成はXIGFBP-4 mRNAの胚への注入により効果的に妨げられた（図2-b）。同様に、LRP6 mRNAの胚への注入により二次軸の形成が生じ、LRP6 mRNAによる二次軸の形成はXIGFBP-4 mRNAの胚への注入により効果的に妨げられた（図2-c）。XIGFBP-4 mRNAのみの注入は軸形成にほとんど影響しなかった（図2-bおよび図2-c）。【０１２９】
これら結果は、IGFBP-4が古典的Wntシグナル伝達をin vivoでもin vitroでも阻害することを示す。【０１３０】
IGFBP-4によるWnt阻害のメカニズムを解明するために、アフリカツメガエルキャップアッセイおよびTOPLFASHレポーター遺伝子アッセイを実施した。まず、LRP6 mRNA、β−カテニン mRNA、β−ガラクトシダーゼ mRNA、IGFBP-4 mRNAを図5-cに示した組み合わせで、アフリカツメガエルの2細胞期胚の動物極に注入した後、段階85の胚からアニマルキャップを切り出し、5ng/ml  アクチビンおよび0.1％  牛血清アルブミンを含むスタインバーグ溶液中で胚が段階17に達するまで培養した。次いで、得られた胚のWnt標的遺伝子、siamoisおよびXnr-3の発現を測定した。コントロールとして、オルニチン脱炭酸酵素（ODC）遺伝子の発現を測定した。TOPLFASHレポーター遺伝子アッセイは、上記同様に実施した。まず、P19CL6細胞にLRP6発現ベクター、β−カテニン発現ベクター、またはDvl-1発現ベクターおよびTOPLFASHをトランスフェクションし、Wnt3AとIGFBP-4で処理した。また、TOPLFASHのみをトランスフェクションしたP19CL6細胞を、Wntシグナルを活性化する塩化リチウムおよびIGFBP-4で処理した。【０１３１】
アニマルキャップアッセイでは、IGFBP-4は、LRP6により誘導されるWnt標的遺伝子発現を阻害したが、β−カテニンが誘導するWnt標的遺伝子発現を阻害しなかった（図5-c）。同様に、IGFBP-4はWnt3AまたはLRP6が誘導するTOPLFASH活性を低減した（図5-d）が、Wntシグナル伝達因子であるDvl-1やβ−カテニンが誘導するTOPLFASH活性、並びにWntシグナルを活性化する塩化リチウムが誘導するTOPLFASH活性には影響しなかった（図5-dおよび図5-e）。【０１３２】
これら結果はIGFBP-4が古典的Wntシグナル伝達を細胞表面受容体の段階で阻害することを示唆する。【０１３３】
次に、IGFBP-4がWntシグナル伝達をWnt受容体であるLRP5／6またはFrizzledとの直接的な物理的相互作用により競合するかどうかを試験した。まず、LRP6N-Myc、Frz8CRD-Myc、またはV5タグを付加したIGFBP4（IGFBP-4-V5）を含む馴化培地を293細胞を用いて調製した。そして、IGFBP-4-V5と、LRP6N-MycまたはFrz8CRD-Mycとの結合反応を4℃にて一晩実施した。結合解析は、抗Myc抗体による免疫沈降後の抗V5抗体または抗Myc抗体によるイムノブロット、並びに、抗V5抗体による免疫沈降後の抗Myc抗体または抗V5抗体によるイムノブロットにより行った。さらに、125I標識IGFBP-4を用いた液相結合アッセイ（liquid-phase binding assay:LBR）を、LRP6N-MycまたはFrz8CRD-Mycを含む馴化培地について実施した。同様の液相結合アッセイを、125I標識Wnt3Aを用いて実施し、Wnt3AとLRP6N-MycまたはFrz8CRD-Mycとの結合に対するIGFBP-4の効果を検討した。【０１３４】
上記試験の結果、IGFBP-4がLRP6N（図2-d）およびFrz8CRD（図2-e）と相互作用することが明らかになった。また、液相結合アッセイにより、IGFBP-4とLRP6Nとの間、あるいはIGFBP-4とFrz8CRDとの間の相互作用は特異的かつ飽和し得るものであることが実証された（図2-fおよび図2-g）。スカッチャードプロット解析により、LRP6Nに対する異なった結合親和性を有する2つの結合部位が（図2-f、差込図）、Frz8CRDに対しては1つの結合部位が存在することが明らかになった（図2-g、差込図）。また、LRP6N（図2-h）およびFrz8CRD（図2-i）に対するWnt3Aの結合をIGFBP-4が阻害することが実証され、そしてラインウェーバー・バーグ  プロットによりIGFBP-4はWnt3AのFrz8CDRへの結合の拮抗阻害剤であることが明らかになった（図6-a）。【０１３５】
さらに、結合解析をLRP6およびIGFBP-4の数々の欠失変異体（図6-b）を用いて行ったところ、IGFBP-4はLRP6の多種多様なドメインと相互作用すること、およびIGFBP-4のカルボキシ末端サイログロブリンドメインがIGFBP-4のLRP6またはFrz8CRDとの結合に重要であることが明らかになった（図6-c〜図6-f）。【０１３６】
上記結果から、IGFBP-4がWnt／β−カテニン経路をFrizzledおよびLRP5／6との直接的相互作用を介して競合阻害することが判明した。【０１３７】
古典的Wntシグナル伝達の阻害は、ES細胞、並びにヒヨコ、アフリカツメガエルおよびゼブラフィッシュの胚における心筋細胞の分化を促進することが報告されている（Naito, A.T. et al., Developmental stage-specific biphasic roles of Wnt/beta-catenin signaling in cardiomyogenesis and hematopoiesis., Proc Natl Acad Sci USA 103, 19812-7 (2006); Tzahor, E. & Lassar, A.B., Wnt signals from the neural tube block ectopic cardiogenesis., Genes Dev 15, 255-60 (2001); Schneider, V.A. & Mercola, M., Wnt antagonism initiates cardiogenesis in Xenopus laevis., Genes Dev15, 304-15 (2001); Marvin, M.J., Di Rocco, G., Gardiner, A., Bush, S.M. & Lassar, A.B., Inhibition of Wnt activity induces heart formation from posterior mesoderm., Genes Dev 15, 316-27 (2001); Ueno, S. et al., Biphasic role for Wnt/beta-catenin signaling in cardiac specification in zebrafish and embryonic stem cells., Proc Natl Acad Sci USA 104, 9685-90 (2007)）。したがって上記結果および従前の報告から、IGFBP-4は、古典的Wntシグナル伝達を阻害することにより、心臓発生を促進すると考えることができる。【０１３８】
［4］心筋細胞への分化における内因性IGFBP-4の役割の解明
P19CL6細胞の心筋細胞への分化におけるIGFBPファミリーメンバーの発現を検討した。P19CL6細胞の心筋細胞への分化はDMSO添加により誘導し、DMSO添加後、第0日、第2日、第4日、第6日および第8日にIGFBP発現をRT-PCRにより測定した。【０１３９】
IGFBP-4の発現は、P19CL6細胞の心筋細胞への分化の間中、増強されたことが明らかになった（図3-a）。IGFBP-3およびIGFBP-5もまた、分化の初期および後期にそれぞれ増強された。IGFBP-2の発現は変化せず、そしてIGFBP-1またはIGFBP-6の発現は検出されなかった。【０１４０】
次に、P19CL6細胞の心筋細胞への分化におけるIGFBP-4のノックダウンの効果を検討した。IGFBP-4のノックダウンは、IGFBP-4に対する2種類の2つの別個のsiRNAコンストラクトを用いて行った。P19CL6細胞の心筋細胞への分化はDMSO添加により誘導し、心筋細胞への分化は、心臓マーカー遺伝子（αMHC、Nkx2.5、GATA-4）の発現およびcTnTタンパク質の発現により評価した。また、IGFBP-3およびIGFBP-5のsiRNAによるノックダウンの効果も同様に検討した。【０１４１】
いずれのIGFBP-4 siRNAも、DMSOで誘導されるP19CL6細胞の心筋細胞への分化を阻害した（図3-b）。それに反して、IGFBP-3 siRNAまたはIGFBP-5 siRNAは、DMSOで誘導されるP19CL6細胞の心筋細胞への分化を阻害しなかった（図3-b、右パネル）。【０１４２】
また、抗IGFBP-4中和抗体による処理も、DMSOで誘導されるP19CL6細胞の心筋細胞への分化を阻害した（図3-c）。【０１４３】
これら結果から、内因性IGFBP-4の分泌が、P19CL6細胞の心筋細胞への分化に必要であることが明らかになった。内因性IGFBP-4の分泌とP19CL6細胞の心筋細胞への分化との関連性をさらに解明するために、αMHC-GFPレポーター遺伝子を安定的にトランスフェクションしたP19CL6細胞の心筋細胞への分化をDMSOにより誘導し、IGFBP-4の免疫染色を実施した。DMSOにより心筋細胞へ分化誘導されたP19CL6細胞はIGFBP-4陽性細胞に取り囲まれていることが、IGFBP-4の免疫染色により明らかになった（図3-d）。この結果は、IGFBP-4が心筋細胞分化に対して主にパラクリン効果を示すことを示唆する。さらに、ES細胞の心筋細胞への分化誘導に対するIGFBP-4の効果を同様に検討した。その結果、P19CL6細胞の心筋細胞への分化誘導に対するIGFBP-4の効果の検討結果と本質的に同様の結果が得られた（図7-a〜図7-g）。ES細胞にはαMHC-GFPレポーター遺伝子を安定的にトランスフェクションし、心筋細胞への分化をハンギングドロップ法により誘導した。IGFBP-4（1μg/ml）を第0日目から第3日目まで（D0-3）に適用したときES細胞の心筋細胞への分化は抑制されたが、一方、第3日目から第5日目まで（D3-5）に適用したときには心臓発生は増強された（図7-a〜図7-c）。また、ES細胞の心筋細胞への分化はIGFBP-4のsiRNAによるノックダウンや、抗IGFBP-4抗体処理により低減した（図7-e〜図7-f）。また、マウス胚（E95）におけるIGFBP-4のin situハイブリダイゼーション解析において、マウスIGFBP-4が、心臓の近隣の組織、例えばE95における咽頭弓や肝芽に強く発現していることが判明した（図7-h）。これら結果はIGFBP-4が筋細胞分化に対して主にパラクリン効果を示すことを強く支持する。心臓中胚葉が線維芽細胞増殖因子（FGF）を分泌して腹部中胚葉における肝臓前駆細胞を誘導することを示す従前の報告（Jung, J., Zheng, M., Goldfarb, M. & Zaret, K.S., Initiation of mammalian liver development from endoderm by fibroblast growth factors., Science 284, 1998-2003 (1999)）と合わせて、これら観察結果は心臓と肝臓の間に互いに発達を連携的に促進する相互シグナル伝達が存在することを示唆する。【０１４４】
次に、心筋細胞への分化における内因性IGFBP-4の効果が、古典的Wnt経路の阻害を介するかどうか検討した。具体的には、コントロールP19CL6細胞およびIGFBP-4をsiRNAによりノックダウンしたP19CL6細胞に、GFPまたはLRP6Nの発現ベクターをトランスフェクションし、そしてDMSO処理により心筋細胞への分化を誘導した。LRP6Nは野生型LRP6に対してドミナントネガティブ作用を有し、その過剰発現はWntシグナル伝達を阻害する。LRP6Nの発現は、P19CL6細胞の心筋細胞への分化を増強し、そしてIGFBP-4ノックダウンより低減されたP19CL6細胞の心筋細胞への分化を回復した（図3-e）。【０１４５】
上記観察結果は、内因性IGFBP-4がP19CL6細胞およびES細胞の心筋細胞への分化に必要であること、そしてIGFBP-4の心臓発生効果はWnt／β−カテニンシグナル伝達の阻害効果を介することを示唆する。【０１４６】
［5］in vivoでの心臓の発達における内因性IGFBP-4の役割の解明
内因性IGFBP-4のin vivoでの心臓の発達における役割を、アフリカツメガエル胚を用いて試験した。まず、アフリカツメガエル胚におけるNkx2.5（初期心臓マーカー）、cTnI（成熟心臓マーカー）、Hex（肝臓マーカー）、およびXIGFBP-4 mRNAの、段階34、38および42における発現をin situハイブリダイゼーション解析した。その結果、XIGFBP-4の強い発現が段階38において心臓に隣接する前方肝臓で検出された（図4-a）。【０１４７】
次に、XIGFBP-4を、2つの別個のモルフォリノ（MO）コンストラクト（図8-aおよび表2）によりノックダウンした心臓発生における効果を検討した。これら2つのMOは、2つのXIGFBP-4（XIGFBP-4およびXIGFBP-4d）に対して設計し合成したものである（図8-a）。その結果、XIGFBP-4の2つの別個のモルフォリノ（MO）コンストラクトによるノックダウンは心臓欠陥を引き起こし、70％以上の胚で心臓が小型であるか、または認められなかった（図4-b）。一方、XIGFBP-4 cDNA、IGF結合に欠陥のあるXIGFBP-4変異体（XIGFBP-4-H74P）、またはドミナントネガティブLRP6であるLRP6Nの共発現により、MOにより誘導される心臓欠陥が回復した（図4-b）。また、用いたMOがXIGFBP-4特異的であることは、MO感受性mRNAから翻訳されたXIGFBP-4-Mycタンパク質の発現はMO1またはMO2の共注入により低減されたが、MO抵抗性mRNAからのタンパク質発現は影響を受けなかったこと（図8-b）、およびMOにより誘導される心臓欠陥がMO抵抗性XIGFBP-4 cDNA（図8-a）の共注入によって回復したこと（図8-c）から明らかである。【０１４８】
重要なことは、IGF結合に欠陥のあるXIGFBP-4-H74PまたはドミナントネガティブLRP6の共発現がXIGFBPノックダウンにより誘導される心臓欠陥を回復させた（図4-b）が、一方、Xwnt8の心臓形成領域における過剰発現はXIGFBP-4ノックダウンにより誘導される心臓欠陥と同様の心臓欠陥を生じた（図8-d〜図8-f）ことであり、これはIGFBP-4の心臓発生効果がIGF非依存性であるがWnt／β−カテニン経路の阻害を介するという見解を支持する。【０１４９】
XIGFBP-4ノックダウンにより誘導される心臓欠陥の時間的特徴をまた、心臓トロポニンI（cTnI）in situハイブリダイゼーションにより試験した（図4-c）。段階34において、心臓の形態はコントロール胚とMO注入胚とで同様であった。しかしながら、段階38において、XIGFBP-4が前方肝臓で発現され始めると、cTnIの発現がMO注入胚において著しく減少し、そして段階42ではcTnIの発現が低減し心臓様構造は認められなかった。【０１５０】
このように、XIGFBP-4の非存在下では、心臓は初期には形成されるが、それに続く心臓の成長は異常をきたす。このことはIGFBP-4が胚性心筋細胞の増殖および／または生存を維持することにより心臓発生を促進することを示唆する。
【実施例２】
【０１５１】
IGFBPは、6つのメンバー、すなわちIGFBP-1からIGFBP-6で構成される。これらIGFBPファミリーメンバーによるWntシグナル伝達阻害作用をレポーター遺伝子アッセイおよびβ−カテニン安定化アッセイにより検討した。また、各IGFBPファミリーメンバーとLRP6またはFrz8との相互作用をIP／ウェスタン解析により検討した。レポーター遺伝子アッセイ、β−カテニン安定化アッセイ、およびIP／ウェスタン解析は、実施例1に記載した方法と同様の方法で実施した。【０１５２】
IGFBP-4はIGFBPファミリーメンバーの中で最も強く、Wnt3Aによるβ−カテニン発現を阻害した。IGFBP-1、IGFBP-2、およびIGFBP-6もまた中程度のWnt阻害活性を示すが、一方、IGFBP-3およびIGFBP-5はこのような活性を示さないことが明らかになった（図9-a〜図9-c）。この結果と一致して、IP／ウエスタン解析により、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-4、およびIGFBP-6がLRP6またはFrz8CRDと相互作用するが、IGFBP-3およびIGFBP-5はLRP6またはFrz8CRDと相互作用しないことが明らかになった（図9-dおよび図9-e）。【０１５３】
これら結果から、IGFBP-4のみならず、IGFBP-1、IGFBP-2、およびIGFBP-6もまたWnt受容体であるLRP6またはFrz8と結合し、それによりWntシグナル伝達を阻害することが判明した。
【配列表フリーテキスト】
【０１５４】
配列番号1：IGFBP-4（配列番号2）をコードする遺伝子。
配列番号3：IGFBP-1（配列番号4）をコードする遺伝子。
配列番号5：IGFBP-2（配列番号6）をコードする遺伝子。
配列番号7：IGFBP-6（配列番号8）をコードする遺伝子。
配列番号9：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号10：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号11：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号12：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号13：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号14：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号15：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号16：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号17：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号18：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号19：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号20：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号21：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号22：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号23：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号24：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号25：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号26：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号27：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号28：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号29：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号30：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド
配列番号31：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号32：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号33：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号34：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号35：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号36：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号37：プライマー用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号38：siRNA用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号39：siRNA用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号40：siRNA用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号41：siRNA用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号42：モルフォリノ用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号43：モルフォリノ用に設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号44：アフリカツメガエルIGFBP-4遺伝子の部分配列。
配列番号45：アフリカツメガエルIGFBP-4変異体遺伝子の部分配列。
配列番号46：アフリカツメガエルIGFBP-4遺伝子内のモルフォリノ標的配列。
配列番号47：アフリカツメガエルIGFBP-4遺伝子内のモルフォリノ標的配列。
配列番号48：モルフォリノ抵抗性のアフリカツメガエルIGFBP-4遺伝子の部分配列。
【図８−ａ】
0005435388.tif 000004
【図８−ｃ】
0005435388.tif 000005
【図１−ａ】
0005435388.tif 000006
【図１−ｂ】
0005435388.tif 000007
【図１−ｃ】
0005435388.tif 000008
【図１−ｄ】
0005435388.tif 000009
【図１−ｅ】
0005435388.tif 000010
【図１−ｆ】
0005435388.tif 000011
【図２−ａ】
0005435388.tif 000012
【図２−ｂ】
0005435388.tif 000013
【図２−ｃ】
0005435388.tif 000014
【図２−ｄ】
0005435388.tif 000015
【図２−ｅ】
0005435388.tif 000016
【図２−ｆ】
0005435388.tif 000017
【図２−ｇ】
0005435388.tif 000018
【図２−ｈ】
0005435388.tif 000019
【図２−ｉ】
0005435388.tif 000020
【図３−ａ】
0005435388.tif 000021
【図３−ｂ】
0005435388.tif 000022
【図３−ｃ】
0005435388.tif 000023
【図３−ｄ】
0005435388.tif 000024
【図３−ｅ】
0005435388.tif 000025
【図４−ａ】
0005435388.tif 000026
【図４−ｂ】
0005435388.tif 000027
【図４−ｃ】
0005435388.tif 000028
【図５−ａ】
0005435388.tif 000029
【図５−ｂ】
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【図５−ｃ】
0005435388.tif 000031
【図５−ｄ】
0005435388.tif 000032
【図５−ｅ】
0005435388.tif 000033
【図６−ａ】
0005435388.tif 000034
【図６−ｂ】
0005435388.tif 000035
【図６−ｃ】
0005435388.tif 000036
【図６−ｄ】
0005435388.tif 000037
【図６−ｅ】
0005435388.tif 000038
【図６−ｆ】
0005435388.tif 000039
【図７−ａ】
0005435388.tif 000040
【図７−ｂ】
0005435388.tif 000041
【図７−ｃ】
0005435388.tif 000042
【図７−ｄ】
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【図７−ｅ】
0005435388.tif 000044
【図７−ｆ】
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【図７−ｇ】
0005435388.tif 000046
【図７−ｈ】
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【図８−ｂ】
0005435388.tif 000048
【図８−ｄ】
0005435388.tif 000049
【図８−ｅ】
0005435388.tif 000050
【図８−ｆ】
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【図９−ａ】
0005435388.tif 000052
【図９−ｂ】
0005435388.tif 000053
【図９−ｃ】
0005435388.tif 000054
【図９−ｄ】
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【図９−ｅ】
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【配列表】
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