(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
問題のタンパク質の遺伝子をコードする外来性ヌクレオチド配列を含む形質転換マイコバクテリウムまたはその子孫であって、前記形質転換マイコバクテリウムがグラム陰性菌で複製できないプラスミドを含むことと、抗生物質耐性を示さないこと、および栄養素要求性であることと、前記外来性ヌクレオチド配列が前記プラスミドの一部であり、前記プラスミドが選択可能なマーカーを欠いており、前記タンパク質が生存に必要なタンパク質であって前記形質転換マイコバクテリウムの菌ゲノムから欠失させたヌクレオチド配列でコードした生存タンパク質に対応するタンパク質であることとを特徴とする形質転換マイコバクテリウムまたはその子孫。
【請求項２】
前記タンパク質がｌｅｕＤである請求項１記載の形質転換マイコバクテリウムまたはその子孫。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結核ワクチン剤としての用途に対して改良されたワクチン性質を有するマイコバクテリウム株類を提供する。前記マイコバクテリウム株類は、好適には、強力な免疫原性を有することにより同定され、抗生物質耐性を示さず、グラム陰性菌に対して水平移行を示さない親株から選択される。本発明はまた、他の疾患に対して予防接種するための用途および癌治療における用途に対してワクチン性質を有するであろうトランスジーン類を運搬するために改良された性質を有するマイコバクテリウムを提供する。
【背景技術】
【０００２】
マイコバクテリウム・チューバキュローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（Ｍ．ｔｂ）は世界人口の３分の１に感染し、８００万人に激烈な疾患を引き起こしかつ毎年１６０万人−２２０万人を死亡させており、そのほとんどは、発展途上国に生活している。結核（ＴＢ）は、世界的にも流行しており、ＨＩＶの拡大と重なってさらにいっそう致命的になる。ＴＢは、ＡＩＤＳ患者の最大の死亡原因となっている。
【０００３】
ＢＣＧは現在ＴＢワクチンとして広く使用されており、８０年以上前に開発され、試験によると肺結核に対する効果比が大きく変動し、インドで行った最近の大規模治験では全く効果がなかった（Ｆｉｎｅほか、Ｖａｃｃｉｎｅ、１６（２０）：１９２３−１９２８；１９９８；Ａｎｏｎｙｍｏｕｓ，Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ．，Ａｕｇ；１１０：５６−６９；１９９９）。にもかかわらず、世界保健機構（ＷＨＯ）は現在、ＴＢが高罹患率の国において（ＨＩＶ疾患／ＡＩＤＳ症状を有するものを除き）全ての小児が出生時においてまたは最初に医療保健サービスに接触してきた際にＢＣＧを勧めている。この方針は、ＢＣＧがＴＢの重篤な小児形態を防御するという知見に基づいている（Ｌａｎｃｋｒｉｅｔほか、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ，２４（５）：１０４２−１０４９；１９９５；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓほか、Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  Ｈｅａｌｔｈ  ４５（１）：７８−８０；１９９１）。小児期を過ぎてまでＴＢをＢＣＧにより防御することは論議を呼ぶ問題となっており、データは限られておりしかもさまざまな結果を示している。しかし、乳児期ＢＣＧ予防接種が広く実施されている発展途上国において小児および成人でＴＢが高罹患率であることは、現在投与されているＢＣＧが、ヒトがＴＢリスクにある長年にわたっては高い効果を有していないことを示している。したがって、ＢＣＧは、ＴＢ介入および制御のための公衆衛生手段としては適切でないと考えられている。
【０００４】
ＴＢ菌に暴露しかつ正常な免疫系を有するヒトの約７０％が感染せず、感染したヒトのうちの約５％しか最初の２年以内に発病しない。感染したヒトの大半は感染を抑制し、このことは、Ｍ．ｔｂ抗原類に対する優れた細胞免疫応答の出現と関連している。さらにもう５％が、後日、免疫が低下すると再活性化される。一次および再活性化疾患の両者ともに、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ患者ではるかに頻度が高く、このことは、感染予防および制御において免疫の役割を強調している。
【０００５】
【非特許文献１】Ｆｉｎｅほか、Ｖａｃｃｉｎｅ、１６（２０）：１９２３−１９２８；１９９８
【非特許文献２】Ａｎｏｎｙｍｏｕｓ，Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ．，Ａｕｇ；１１０：５６−６９；１９９９
【非特許文献３】Ｌａｎｃｋｒｉｅｔほか、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ，２４（５）：１０４２−１０４９；１９９５
【非特許文献４】Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓほか、Ｊ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  Ｈｅａｌｔｈ  ４５（１）：７８−８０；１９９１
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
多くのヒトは、ＴＢは制御できるので、適切な種類の長期持続免疫を導入することによって暴露後始めての感染を防御し、疾患への初期進行を予防し、潜伏状態からの再活性化を防御しかつ治療後の再燃を予防する有効なワクチン類を開発できるはずであると期待するだけの十分な理由がある。最終的に、ヒト病原体としてのＭ．ｔｂを結果的に撲滅するであろう系統的ワクチン使用＋化学療法介入の組み合わせとなる。
【０００７】
小児期ＢＣＧワクチンが急性ＴＢ予防に果たした重要な役割を考慮すれば、新しい候補ＴＢワクチンが非常に優れた製品であるとの圧倒的証拠がなければこのＴＢワクチン類を評価するための治験においてＢＣＧに取ってかわることは難しい。問題となっているのは、Ｍ．ｔｂが元来ヒト特異的病原体であること、および動物モデルは宿主−病原体作用の一部を模倣するにすぎないことにある。したがって、新しいＴＢワクチンが改良された能力を有しているという明確な証拠は、ヒトでのコントロール治験からしか得られない。多くの研究者らはこうしたことを考慮して、改良ＴＢワクチンを得るための重要なステップが、ＢＣＧの改良株類を開発すること、限界があるとはいえ動物モデルを開発することであると結論し、防御性抗原類を過剰発現する組み換えＢＣＧ類が、ＢＣＧに比較してより高い能力を有していると示唆している。
【０００８】
あるＭ．ｔｂ抗原類はワクチン性質を有しており、ワクチン製剤として動物に投与すると、ＢＣＧ単独により活性化されたものと同様の防御を付与する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６２（６）２５３６−２５４４；１９９４）。これらの候補類を推し進めるため、ＢＣＧにおけるこれらの抗原類の免疫原性を高める手段が開発された。したがって、選択したＭ．ｔｂ抗原類を過剰発現するＢＣＧ株類が開発され、これらの組み換えＢＣＧ（ｒＢＣＧ）株類は、ｒＢＣＧ株を誘導した親ＢＣＧ株類に比較してより高い防御を誘発することが明らかになった（Ｈｏｒｗｉｔｚほか、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７２（４）：１６７２−１６７９；２００３）。ある研究では、抗原８５Ｂ（本文では、“Ａｇ８５Ｂ”と称する）を発現したｒＢＣＧ株が同一抗原を混合したＢＣＧよりもより有効であることが証明された（Ｈｏｒｗｉｔｚほか，同上、２００３）。これらの知見に基づけば、このアプローチは非常に有力である。
【０００９】
ある環境において、抗原類を過剰発現するＢＣＧ株類を用いて、ＴＢによる感染から防御する免疫応答を安全かつ効果的に惹起することもできる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、結核に対するワクチン剤として使用するための改良されたワクチン性質を有する遺伝子工学で作製した（組み換え）マイコバクテリウム株類を提供する。それらはさまざまな特徴を有しており、それら特徴のそれぞれは、前記株類の免疫原性を増大させるように作用する。本発明の組み換えマイコバクテリウム株類は、それらの強力な免疫原性のゆえに意図的に選択した親株類から開発される。すなわち、（例えば、結核抗原を過剰発現させるため）遺伝子操作を受ける親株として選択したマイコバクテリウム株は、遺伝子操作の前にすでにワクチン投与した宿主において強力な免疫応答を惹起する能力を示すがゆえに、選択される。ＢＣＧ  Ｄａｎｉｓｈ  １３３１株が、一例である。このような株類は、次に、問題の結核抗原を過剰発現するように好適に修飾される。好適には、インビボで活性化されるプロモータを前記遺伝子組み換えマイコバクテリウムにおいて用いる。さらに、本発明の組み換えマイコバクテリウム株類は、抗生物質耐性以外の基準に基づいて選択できるように遺伝子工学処理するか、または、それらが全く選択マーカーを必要としないように構築し、それらが、ヒト公衆におけるワクチン剤としての用途のために総合的に安全であるようにする。一例として、マイコバクテリウム複製に必要な遺伝子を除去して発現プラスミド中に入れる。さらに、本発明の組み換えマイコバクテリウム株類はグラム陰性菌への水平移動を受けないので、宿主生物体から“エスケープ（逃亡）”することができない。これによりまた、ヒト公衆におけるワクチン剤としての安全性が確保される。
【００１１】
別の例として、本発明は、プラスミド安定化因子としてのプラスミドによる抗原８５ｂの使用を述べるが、それにより、それらの維持のための抗生物質選択の必要性がなくなる。それらの同定のため、ＰＣＲ陽性選択を利用してＡｇ８５Ｂ＋他の抗原類を発現する高濃度最小プラスミド類によりマイコバクテリウム株類を直接形質転換することによって、抗生物質または栄養素要求性選択がなくても、プラスミド安定性を有する抗原類過剰発現マイコバクテリウム株類を得る。さらに、本発明の組み換えマイコバクテリウム株類は、結核ワクチンとしての用途には優れた物質であるが、それらはまた遺伝子工学処理して、結核関連以外の抗原類を発現または過剰発現するようにすることもでき、従って、それらは、他の疾患に対するワクチン剤としても同様に有用である。さらに、ＴＢ抗原類または他の疾患で重要な抗原類を過剰発現するｒＢＣＧを、ブースターとしてのアジュバント類、組み換えウイルスベクター類またはＤＮＡまたはＲＮＡワクチン類とともに組み換えタンパク質類によるプライムブースト処方においても使用できる。
【００１２】
本発明は、形質転換菌またはその子孫を提供し、それは、形質転換菌（または子孫）中で複製し発現する外来性のヌクレオチド配列を取り込んでおり、一方、この外来性ヌクレオチド配列は、選択を可能とするマーカーに連結していない。一態様において、この外来性ヌクレオチド配列はプラスミド上にあり、他の態様では、プラスミドが生存に必要な遺伝子をコードし、この生存に必要な遺伝子は、前記形質転換菌のゲノムから欠失させてある。さらに別の態様では、プラスミドが、例えばｐｆｏのようなエンドソームエスケープをコードする遺伝子を保有している。他の態様では、この外来性ヌクレオチド配列が、ｐｆｏのようなエンドソームエスケープをコードする。他の態様において、この外来性ヌクレオチド配列が、抗原８５ａ、抗原８５ｂまたは抗原８５ａ／８５ｂをコードする。さらに他の態様において、プラスミドは、プラスミドを維持しかつ／または安定化させるタンパク質類をコードする遺伝子を保有する。いくつかの態様において、タンパク質類をコードする遺伝子は、抗原８５ａ、抗原８５ｂ、または抗原８５ａ／８５ｂをコードする。本発明の一態様においては、前記菌がマイコバクテリウムである。さらに別の態様においては、前記外来性ヌクレオチド配列が、アポトーシスをコードする。他の態様においては、プラスミドが、アポトーシスをコードする遺伝子を保有する。さらに本発明の別の態様においては、この外来性ヌクレオチド配列は、グラム陰性菌中で複製できない。いくつかの態様において、形質転換菌は、栄養素要求性である。さらに別の態様において、前記外来性ヌクレオチド配列は、少なくとも、ワンウェイシャトルベクターの一部である。
【００１３】
本発明はさらに、細菌を形質転換する方法を提供する。本方法は、細菌中で複製し発現する外来性ヌクレオチド配列を取り込む過程を含み、前記外来性ヌクレオチド配列は、選択を可能とするマーカーに連結していない。本発明の一態様においては、取り込み過程は、エレクトロポレーションによって行われる。さらに別の態様においては、前記外来性ヌクレオチド配列はプラスミド上にあり、前記のエレクトロポレーションは、下記の条件下で行われる：プラスミドＤＮＡの菌体に対する割合は、１．２５×１０８菌体に対してプラスミドＤＮＡが１μｇから５μｇの範囲である。本発明の一態様においては、前記割合は、約１．２５×１０８菌体に対してプラスミド約１．６μｇである。本発明のいくつかの態様において、外来性ヌクレオチド配列は、グラム陰性菌で複製できない。他の態様においては、外来性ヌクレオチド配列は、少なくとも、ワンウェイシャトルベクターの一部である。さらに別の態様においては、前記外来性ヌクレオチド配列は、プラスミド上に配置され、前記菌の菌ゲノムから欠失させた生存に必要な遺伝子をコードする。
【００１４】
本発明はさらに、問題の遺伝子をコードする外来性ヌクレオチド配列を含む形質転換マイコバクテリウムまたはその子孫を提供し、ここで、ひとつ以上の下記条件が存在している：ａ）前記形質転換マイコバクテリウムは、グラム陰性菌で複製できないプラスミドを含むこと；ｂ）前記形質転換マイコバクテリウムは、抗生物質耐性を示さないこと；ｃ）前記形質転換マイコバクテリウムは、栄養素要求性であること；およびｄ）前記形質転換マイコバクテリウムは、ワンウェイシャトルベクターを保有していること。一つの態様においては、前記外来性ヌクレオチド配列は、プラスミドの一部である。別の態様においては、プラスミドは、選択を可能とするマーカーを欠損している。さらに本発明の別の態様において、前記外来性ヌクレオチド配列は、生存に必要な遺伝子をコードし、ここで、前記の生存に必要な遺伝子は、形質転換マイコバクテリウムの菌ゲノムから欠失させてある。いくつかの態様において、生存に必要な遺伝子は、ｌｅｕＤである。形質転換マイコバクテリウムまたは子孫はさらに、インビボで活性化されるプロモータ配列を含むことができる。前記形質転換マイコバクテリウムまたはその子孫は、弱毒化させることもできる。前記形質転換マイコバクテリウムまたはその子孫はＢＣＧであることもでき、それは、例えば、ＢＣＧ  １３３１、ＢＣＧ  Ｐａｓｔｅｕｒ、ＢＣＧ  ＴｏｋｙｏまたはＢＣＧ  Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎであることもできる。
【００１５】
本発明はさらに、問題の遺伝子をコードする外来性ヌクレオチド配列を含む形質転換マイコバクテリウムまたはその子孫を含むワクチンを提供し、ここで、ひとつ以上の下記条件が存在している：ａ）前記形質転換マイコバクテリウムが、グラム陰性菌で複製できないプラスミドを含むこと；ｂ）前記形質転換マイコバクテリウムが、抗生物質耐性を示さないこと；ｃ）前記形質転換マイコバクテリウムが、栄養素要求性であること；およびｄ）前記形質転換マイコバクテリウムが、ワンウェイシャトルベクターを保有していること。
【発明の効果】
【００１６】
結核ワクチン剤用として改良ワクチン性を備えるマイコバクテリウム株類を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明は、結核に対するワクチン剤として使用するための改良されたワクチン性質を有する遺伝子工学で作製した（組み換え）マイコバクテリウム株類を提供する。それらはさまざまな特徴を有しており、それら特徴のそれぞれは、前記株類の免疫原性を増大させるように作用する。本発明の組み換えマイコバクテリウム株類は、その強力な免疫原性のゆえに意図的に選択した親株類から開発される。すなわち、（例えば、結核抗原を過剰発現させるため）遺伝子操作を受ける親株として選択したマイコバクテリウム株は、遺伝子操作の前にすでにワクチン投与した宿主において強力な免疫応答を惹起する能力を示すがゆえに、選択される。ＢＣＧ  Ｄａｎｉｓｈ  １３３１株が、一例である。このような株類は、次に、問題の結核抗原を過剰発現するように、好適に修飾される。好適には、インビボで活性化されるプロモータを前記遺伝子組み換えマイコバクテリウムにおいて用いる。さらに、本発明の組み換えマイコバクテリウム株類は、抗生物質耐性以外の基準に基づいて選択できるように遺伝子工学処理され、それらが、ヒト公衆におけるワクチン剤としての用途に総合的に安全であるようにする。一例として、複製に必要な遺伝子を除去して発現プラスミド中に入れる。さらに、本発明の組み換えマイコバクテリウム株類は、グラム陰性菌に水平移動しないので、したがって、宿主生物体から“エスケープ（逃亡）”することができない（すなわち、それらは、“ワンウェイベクター”である）。これによりまた、ヒト公衆におけるワクチン剤としての安全性が確保される。さらに、本発明の組み換えマイコバクテリウム株類は結核ワクチンとしての用途に優れた物質であるが、それらは、また、遺伝子工学処理して、結核関連以外の抗原類を発現または過剰発現するようにすることもでき、従って、それらは、他の疾患に対するワクチン剤としても同様に有用である。
【００１８】
さらに、本発明の好適な態様において、マイコバクテリウム株類は、例えばＢＣＧのような弱毒化株類である。しかし、当業者は容易に理解するであろうが、他の弱毒化または非弱毒化マイコバクテリウム株類もまた利用できる。他のマイコバクテリウムタイプ例には、マイコバクテリウム・ミクロティ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｃｒｏｔｉ）、マイコバクテリウムＨ３７Ｒａ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｈ３７Ｒａ）、マイコバクテリウム・バカエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖａｃｃａｅ）等が含まれるが、それらに限定されない。
【００１９】
ＢＣＧ株選択
先行技術から、ＢＣＧが均質な株ではなく、それどころか、明確な遺伝系統アレイを示すことが示唆されている（Ｏｅｔｔｉｎｇｅｒほか、Ｔｕｂｅｒ  Ｌｕｎｇ  Ｄｉｓ．７９（４）：２４３−２５０；１９９０）。最近になるまで、これらの差異がＢＣＧ族メンバーの免疫原性および能力を変化させるのかどうか、明らかではなかった。しかし、本明細書にも述べたように、現在、組み換えＢＣＧ（本明細書でｒＢＣＧと称する）を誘導するもととなったある特定の株がｒＢＣＧの免疫能力において実質的差異を生じることが発見されている。下記の実施例１は、ＢＣＧ  Ｄａｎｉｓｈ  １３３１株（本明細書で“ＢＣＧ１３３１”と称する）がＢＣＧＴｉｃｅと比較して優れたワクチンであることを示している。したがって、株ｒＢＣＧ３０における抗原８５Ｂの過剰発現は、ｒＢＣＧ３０を誘導するもととなった親株ＢＣＧＴｉｃｅの免疫原性を増大させたが、ＢＣＧ  ｔｉｃｅ株において抗原８５Ｂを過剰発現するｒＢＣＧ３０は、ＢＣＧ１３３１の能力を獲得しなかった。したがって、ＢＣＧにおける抗原過剰発現から得られた利点は、ワクチン構築プロセスの最初に強力な親ＢＣＧ株を選択することによって、得ることもできる。この解決法は後知恵から見れば自明であるように思われるが、当技術に明るい者たちもこの埋め合わせ的工夫をしておらず（Ｈｏｒｗｉｔｚほか、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７（２５）：１３８５３−１３８５８；２０００）、これまでは、ｒＢＣＧワクチン作成前に親ＢＣＧ株が適切な能力を示すかどうか最初に決めることは一般的でも必須でもなかったことを明らかにしている。このような株類は、ＢＣＧおよびＴＢ抗原類または外来性抗原類の過剰発現に非常に適している。
【００２０】
強力な親ＢＣＧ株類は、ＢＣＧ１３３１、ＢＣＧ  Ｐａｓｔｅｕｒ、ＢＣＧ  ＴｏｋｙｏおよびＢＣＧ  Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎを含む群から選択されるが、それらに限定されない。親ＢＣＧ株は、下記実施例１に示したような低用量のエアゾールによるモルモットチャレンジモデルにおいてＢＣＧ  Ｔｉｃｅよりも少なくとも０．４×１０１０だけ、生Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓチャレンジのレベルを低下させるはずである。
【００２１】
ＢＣＧ免疫原性の増大
上にも述べたとおり、ＢＣＧ免疫原性は、変動しないというものではない。さらに、実施例１は、ＢＣＧ抗原類の免疫原性はＢＣＧを遺伝子修飾することで増強できるが、組み換え変化を行った親ＢＣＧ株がモルモットチャレンジモデルにおいて能力を欠いているならば、このような修飾が非現実的となることを示している。この規則から推定すれば、ＢＣＧの免疫原性をさらに増強する修飾はまた、このような親株類に由来する組み換え株類の免疫原性をさらに増強するであろう。
【００２２】
ｒＢＣＧワクチン類およびワクチンベクター類を誘導する親として作用する適切なＢＣＧ株を選択するために上に詳細に述べたアプローチを適用し、前記株中に遺伝的修飾を導入して、所望のｒＢＣＧワクチン類およびワクチンベクター類を作成する。それぞれのｒＢＣＧ株類の構築に用いた方法は本発明にとって重大というわけではなく、当業者に公知の方法のいずれかひとつまたはその組み合わせから選択できる（Ｈｏｒｗｉｔｚほか，ＰＮＡＳ  ９７（２５）：１３８５３−１３８５８；２０００：Ｈｅｓｓほか、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９５：５２９９−５３０４；１９９８）。
【００２３】
さらに、前記ｒＢＣＧワクチン類は、感染後インビボで活性化されるプロモータを用いることにより恩恵を受ける。たとえば、抗原８５Ｂ，抗原８５Ａ、Ｈｓｐ６０またはＲｖ１９０８ｃ（ＫａｔＧ）由来プロモータ類のような構造的に活性のプロモータを用いることで、前記抗原が免疫後インビボで構造的に発現できるようになる。したがって、確実な免疫応答が、感染過程のそれぞれの段階で感染に対して惹起される。Ｒｖ２０３２、Ｒｖ３１２７、Ｒｖ２０３１ｃまたはＲｖ３０３０ｃ等の遺伝子類に由来するプロモータ類のような潜伏段階活性プロモータ類を選択することで、ｒＢＣＧワクチンが免疫後インビボにおいて潜伏段階に入った時に、選択した抗原類、特に潜伏期特異的抗原類をｒＢＣＧが発現できるようになる。
【００２４】
発現ベクター類
非抗生物質選択システムの開発
上にも述べたとおり、ｒＢＣＧ株類において防御性抗原類の過剰発現に現在利用されているプラスミド類は、維持のために抗生物質耐性遺伝子類に依存していること、および、これらのプラスミド類が広範囲の微生物宿主に水平移行できるというそれらに固有の能力により、環境生物に対して抗生物質耐性遺伝子類と抗原発現カセット類を伝播するかもしれないという恐れがあるので、受け入れられない。こうした重大な限界を克服するため、本発明は、ｒＢＣＧのようなマイコバクテリウム宿主株類に発現ベクター類を導入し維持するための新規非抗生物質選択システムおよびワンウェイシャトルシステムを記載する。
【００２５】
プラスミド類の非抗生物質選択は、複製に必須の宿主遺伝子を選択的に欠失させ、その後発現プラスミド中に前記遺伝子の機能的コピーを取り込ませることでこの欠失させたものを補完することによって行う。したがって、細菌宿主は、生存のために発現プラスミドに依存しており、その結果、抗生物質選択のない場合にマイコバクテリウム宿主内部でプラスミドを維持するためのメカニズムができることになる。好適な方法では、遺伝子類の不活性化により栄養素要求性表現型を新たに作製することを含む。例えば、Ｍ．ｔｂおよびＢＣＧにおいて、ｌｅｕＤ遺伝子（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑ  ＩＤ＃Ｍｂ３０１１Ｃ）の不活性化は、ロイシン依存性表現型を新たに作製し、不活性化ｌｅｕＤ遺伝子を有する株類は、生存のためにロイシン補充に依存している（Ｈｏｎｄａｌｕｓほか、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．６８（５）：２８８８−９８．２０００）。さらに、マイコバクテリウム△ｌｅｕＤ株類はインビボで複製できず（Ｈｏｎｄａｌｕｓほか、同上、２０００）、従って、Ｍ．ｔｂおよびｒＢＣＧ△ｌｅｕＤ変異体は、インビトロおよびインビボでｌｅｕＤ＋プラスミド類を維持するであろう。
【００２６】
栄養素要求性変異体を標的マイコバクテリウム株類に導入するための特定の方法は本発明にとって重要ではなく、当業者に周知のいかなる対立遺伝子交換方法類からも選択することができる（Ｐａｒｉｓｈほか、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１４５：３４９７−３５０３；１９９９）。同様に、栄養素要求性変異の補完は、不活性化遺伝子（例  ｌｅｕＤ＋）の機能的コピーを発現ベクターに導入することによって可能である。前記発現ベクターはまた、マイコバクテリウム複製開始点を必要とし（例  ＯｒｉＭ；Ｌａｂｉｄｉほか、Ｐｌａｓｍｉｄ、２７（２）：１３０−１４０；１９９２）、標的Ｍ．ｔｂおよびｒＢＣＧ株中において複製できるようにする。ロイシンを培地から取り去ると、このようなプラスミドを保有するマイコバクテリウム株類は、生存のために、プラスミドがコードしたｌｅｕＤ遺伝子の発現に依存するようになるであろう。
【００２７】
新規ワンウェイシャトルベクターの開発
上記操作では、Ｍ．ｔｂおよびｒＢＣＧにおける発現ベクターの維持のための選択システムを新たに作る手法を述べた。しかし、このベクターシステムは、マイコバクテリウム中に導入する前にプラスミド構造の効率的取り扱いを可能とするためには、大腸菌中で複製できなければならない。さらに、プラスミド構築時に利用できる強力な組み換え大腸菌宿主株類の種類を多くしてプラスミド構築を円滑にするために研究者らが大腸菌宿主を使用できるようにするため、発現ベクター中に抗生物質選択マーカー（例  カナマイシン耐性）および広範囲の複製開始点を含ませることが好適である（例  ＯｒｉＥ；Ｈａｌｐｅｒｎほか、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，ＵＳＡ  ７６（１２）：６１３７−６１４１；１９７９；Ｍｏｓｉｇほか、Ｎｅｗ  Ｂｉｏｌ  １（２）：１７１−１７９；１９８９）。これらの要素類は、独自の制限酵素エンドヌクレアーゼ消化部位（例  ＮｄｅＩ）に隣接し、標的マイコバクテリウム株類にプラスミドを導入する前に抗生物質耐性マーカーおよびＥ．ｃｏｌｉ複製開始点を除去できるようにする。さらに、抗原発現カセットを導入できる独自の制限酵素エンドヌクレアーゼ部位（例  ＰａｃＩ）も含む。
【００２８】
大腸菌でいったんこのことが行われ所望のプラスミドが同定され特性解析されると、組み換えプラスミドＤＮＡを単離し、抗生物質選択マーカーとＯｒｉＥを放出する制限酵素エンドヌクレアーゼで消化する。消化したプラスミドＤＮＡを次に、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて連結する。生成したプラスミドは、従って、宿主マイコバクテリウムの栄養素要求性を補完するが抗生物質耐性を示さずグラム陰性菌で複製できない遺伝子を含むことになる。このプラスミドは抗原発現カセットも含むことができ、これを次に標的マイコバクテリウム栄養素要求性変異体中に標準的エレクトロポレーション操作を用いて導入する。このプラスミドを保有している組み換え株類は、増殖に必要な代謝物（例  ロイシン）を欠損している培地中で培養することによって、単離する。このシステム独自の利点は、最終発現プラスミドがもはや抗生物質耐性遺伝子を有していないということである。したがって、現在非常に一般的に使用されている発現プラスミド類のように環境中に抗生物質耐性遺伝子をばらまくということができない。さらに、本発明の発現プラスミドは、もはや、広範囲の宿主で複製することはできず、その理由は、このような複製を可能とする遺伝要素類が欠失しているからである。このようなベクター類は、従って、“ワンウェイ”シャトルベクター類と称される。
【００２９】
ＴＢ抗原類の過剰発現
本発明において、ワンウェイシャトルベクター中の発現カセット中に取り込まれ次にｒＢＣＧに取り込まれた遺伝子は、Ｍ．ｔｂ免疫原をコードすることもできる。このＭ．ｔｂ免疫原は、例えば、天然の全長タンパク質、２種以上のＭ．ｔｂ免疫原類またはその模倣物類間でのキメラ融合体、またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のＭ．ｔｂ免疫原の断片または断片類であることもできる。
【００３０】
Ｍ．ｔｂ抗原類は、インビボにおけるマイコバクテリウム感染の少なくとも１段階で活性であるプロモータの制御下にワンウェイシャトルベクターによって発現される。特定のプロモータが本発明にとって重要というわけではなく、Ａｎｔｉｇｅｎ  ８５Ｂ，Ｈｓｐ６０、Ａｎｔｉｇｅｎ  ８５Ａ、Ｒｖ１９０８ｃ（ＫａｔＧ）プロモータのような構造的に活性のプロモータ類および／または遺伝子類Ｒｖ３１３０Ｃ（Ｆｌｏｒｓｚｙｋほか、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７１（９）：５３３２−５３４３；２００３；Ｖｏｓｋｕｉｌほか、Ｊ  Ｅｘｒ  Ｍｅｄ  １９８（５）；７０５−７１３；２００３）、Ｒｖ２０３２、Ｒｖ３１２７、および／またはＲｖ２０３１ｃに対するプロモータのような潜伏感染時に活性のプロモータ類から選択することもできる。抗原発現レベルを高めるため、マイコバクテリウムベクター株類のミニセル産生誘導体も使用できる。マイコバクテリウム種のミニセル産生株類は、ＦｔｓＺ（Ｇｅｎｏｍｅ  データベース＃Ｍｂ２１７４ｃ）を過剰発現させることによってまたはｗｈｉＢ３の部位特異的不活性化により産生される。ＦｔｓＺ発現レベルまたはｗｈｉＢ３不活性化の修飾は、当業者に周知の標準的遺伝子方法を用いて行うことができる。たとえば、ＦｔｓＺ過剰発現は、構造的に活性であるＡｎｔｉｇｅｎ  ８５Ｂ，Ａｎｔｉｇｅｎ  ８５Ａ，Ｈｓｐ６０、またはＲｖ１９０８ｃ（ＫａｔＧ）に対するプロモータ類および／または遺伝子類Ｒｖ２０３２、Ｒｖ３１２７、Ｒｖ２０３１ｃおよびＲｖ３１３０Ｃに対する潜伏感染時に活性であるプロモータ類のような強力なプロモータの制御下にワンウェイシャトルベクター中にｆｔｓＺ遺伝子を取り込ませることによって、行われる（Ｆｌｏｒｃｚｙｋほか、同上、２００３；Ｖｏｓｋｕｉｌほか、同上、２００３）。部位特異的ｗｈｉＢ３の不活性化は、下記に概略を示した操作を用いて対立遺伝子交換によって行われる。
【００３１】
組み換えマイコバクテリウムに挿入できる外来性抗原類の例
本発明において、マイコバクテリウムが保有するワンウェイシャトルベクター中発現カセットは、免疫原をコードでき、それは、ウイルス、細菌性または寄生病原体由来の外来性免疫原であるか、または、自己免疫抗原または癌抗原のような内因性免疫原のいずれかであるが、自己免疫抗原または癌抗原に限定されることはない。前記免疫原は、例えば、天然型全長タンパク質；外来性免疫原と内因性タンパク質または模倣体とのキメラ融合体；またはウイルス、細菌および寄生病原体から派生する免疫原の断片または断片類であり得る。
【００３２】
本文では、“外来性免疫原”とは、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、寄生タンパク質、サイトカイン類、ケモカイン類、免疫制御剤類または治療剤類のようなレシピエント動物細胞または組織に正常時には発現されないタンパク質またはその断片を意味するが、それらに限定されない。
【００３３】
“内因性免疫原”とは、内因性細胞タンパク質、免疫制御剤または治療剤のようなレシピエント動物細胞または組織に天然に存在するタンパク質またはその部分を意味するが、これらに限定されない。これとは別にまたはさらに、前記免疫原は、合成遺伝子によってコードすることもでき、当業者に公知の従来の組み換えＤＮＡ法を用いて構築することもできる。
【００３４】
外来性免疫原は、その動物宿主中に入る前または入るとき、そのコロニー化前またはその間、または複製の前またはその間において、あらゆるウイルス、細菌または寄生病原体により発現される全ての分子であり得る。ｒＢＣＧは、ウイルス、細菌および寄生病原体から派生した免疫原またはその部分を発現できる。これらの病原体類は、ヒト、家禽または野生動物宿主中において感染性となることができる。
【００３５】
ウイルス抗原を誘導したウイルス病原体には、インフルエンザウイルス（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：５９７７１のようなオルソミキソウイルス類；ＲＳＶ，ＨＴＬＶ−１（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：３９０１５）およびＨＴＬＶ−２（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：１１９０９）のようなレトロウイルス類、ＥＢＶ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：１０２９５）のようなヘルペスウイルス類；ＣＭＶ（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：１０３５８）または単純ヘルペスウイルス（ＡＴＣＣ＃：ＶＲ−１４８７）；ＨＩＶ−１（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：１２７２１）およびＨＩＶ−２  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：１１７０９）のようなレンチウイルス類；ラビーのようなラブドウイルス類；ポリオウイルス（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：１２０８０）のようなピコルノウイルス類；ワクシニア（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：１０２４５）のようなポックスウイルス類；ロタウイルス（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：１０９１２）；およびアデノ関連ウイルス１（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：８５１０６）のようなパルボウイルス類を含むが、それらに限定されない。
【００３６】
ウイルス抗原の例は、ヒト免疫不全ウイルス抗原類Ｎｅｆ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ＨＩＶ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  Ｃａｔ．＃１８３；ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃ＡＦ２３８２７８）、Ｇａｇ，Ｅｎｖ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ＨＩＶ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  Ｃａｔ．＃２４３３；ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃Ｕ３９３６２）、Ｔａｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ＨＩＶ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  Ｃａｔ．＃８２７；ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ＃Ｍ１３１３７）、Ｔａｔ−△３１−４５（Ａｇｗａｌｅほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．印刷中、７月８日；２００２）のようなＴａｔの変異誘導体類、Ｒｅｖ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ＨＩＶ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  Ｃａｔ．＃２０８８；ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃Ｌ１４５７２）、およびＰｏｌ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ＨＩＶ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  Ｃａｔ．＃２３８；ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃ＡＪ２３７５６８）、およびｇｐ１２０のＴおよびＢ細胞エピトープ類（ＨａｎｋｅおよびＭｃＭｉｃｈａｅｌ，ＡＩＤＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．６６：１７７；１９９９；Ｈａｎｋｅほか、Ｖａｃｃｉｎｅ、１７：５８９；１９９９；Ｐａｌｋｅｒほか、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２：３６１２−３６１９；１９８９）、限定するわけではないがｇｐ１２０とＣＤ４の融合体（Ｆｏｕｔｓほか、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２０００、７４：１１４２７−１１４３６；２０００）のようなＨＩＶ−１  Ｅｎｖとｇｐ１２０との間のキメラ誘導体；限定するわけではないがｇｐ１４０（Ｓｔａｍａｔｏｓほか、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７２：９６５６−９６６７；１９９８）のような短く切断したかまたは修飾したＨＩＶ−１  ｅｎｖの誘導体類、またはＨＩＶ−１  Ｅｎｖおよび／またはそのｇｐ１４０の誘導体類（Ｂｉｎｌｅｙほか、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７６：２６０６−２６１６；２００２；Ｓａｎｄｅｒｓほか、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ、７４：５０９１−５１００；２０００；Ｂｉｎｌｅｙほか、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７４：６２７−６４３；２０００）、Ｂ型肝炎表面抗原（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃ＡＦ０４３５７８；Ｗｕほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：４７２６−４７３０；１９８９）；ＶＰ４（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃ＡＪ２９３７２１；Ｍａｃｋｏｗほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、８７：５１８−５２２；１９９０）およびＶＰ７（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃ＡＹ００３８７１；Ｇｒｅｅｎほか、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１８１９−１８２３；１９８８）のようなロタウイルス抗原類、ヘマグルチニン（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃ＡＪ４０４６２７；Ｐ���ｒｔｍｅｒおよびＲｏｂｉｎｓｏｎ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２５７：４０６；１９９９）のようなインフルエンザウイルス抗原類、ヌクレオプロテイン（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃ＡＪ２８９８７２；Ｌｉｎほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９７：９６５４−９６５８；２０００）、チミジンキナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ＃ＡＢ０４７３７８；Ｗｈｉｔｌｅｙほか、Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，８２５−８５４ページ；２００４）のような単純ヘルペスウイルス抗原類が含まれるが、それらに限定されない。
【００３７】
細菌性抗原類を誘導した細菌病原体類には、マイコバクテリウム種、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｒｏｌｉ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）種、大腸菌、リケッチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）種、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）種、レジオネラ・ニューモニアエ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）種およびボレリア・バーグドルフェリ（Ｂｏｒｅｌｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）が含まれるが、それらに限定されない。
【００３８】
細菌性病原体の防御性抗原類の例には、ＣＦＡ／Ｉ  フィンブリアル抗原（Ｙａｍａｍｏｔｏほか、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５０：９２５−９２８；１９８５）および熱に不安定な毒物の非毒性Ｂサブユニット（Ｋｌｉｐｓｔｅｉｎほか、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，４０：８８８−８９３；１９８３）のようなエンテロトキシン性大腸菌の全身抗原類；ボルデテラ・ペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）のペルタクチン（Ｒｏｂｅｒｔｓほか、Ｖａｃｃ．，１０：４３−４８；１９９２）、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのアデニレートシクラーゼ−ヘモライシン（Ｇｕｉｓｏほか、Ｍｉｃｒｏ．Ｐａｔｈ．，１１：４２３−４３１；１９９１）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）の破傷風毒素断片Ｃ（Ｆａｉｒｗｅａｔｈｅｒほか、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．，５８：１３２３−１３２６；１９９０）、Ｂｏｒｅｌｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉのＯｓｐＡ（Ｓｉｋａｎｄほか、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ，１０８：１２３−１２８；２００１；Ｗａｌｌｉｃｈほか，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，６９：２１３０−２１３６；２００１）、リケッチア・プロワゼッキ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）およびリケッチア・チフィ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｔｙｐｈｉ）の防御性パラクリスタリン−表面層（Ｃａｒｌほか、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８７：８２３７−８２４１；１９９０）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）のリステリオライシン（“Ｌｌｏ”および“Ｈｌｙ“としても公知）および／またはスーパーオキサイドディスムターゼ（“ＳＯＤ”および“ｐ６０”としても公知）（Ｈｅｓｓ  Ｊ．ほか，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：１２８６−９２；１９９７；Ｈｅｓｓ  Ｊ．ほか，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１４５８−１４６３；１９９６；Ｂｏｕｗｅｒほか、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：１４６７−７１；１９９２）、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）のウレアーゼ（Ｇｏｍｅｚ−Ｄｕａｒｔｅほか、Ｖａｃｃｉｎｅ  １６、４６０−７１；１９９８；Ｃｏｒｔｈｅｓｙ−Ｔｈｅｕｌａｚほか、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ＆Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６６，５８１−６；１９９８）、および致死的毒素のレセプター結合ドメインおよび／またはバシラス・アンスラックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｘ）の防御性抗原（Ｐｒｉｃｅほか、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９、４５０９−４５１５；２００１）を含む。
【００３９】
寄生抗原類を誘導する寄生病原体類には、プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｓｉｐａｒｕｍ）（ＡＴＣＣ＃３０１４５）のようなプラスモジウム種；トリパノソム・クルジ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）（ＡＴＣＣ＃５０７９７）のようなトリパノソム種；ジアルジア・インテスチナリス（Ｇｉａｒｄｉａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ）（ＡＴＣＣ＃３０８８８Ｄ）のようなジアルジア種；ブウフィラス（Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ）種、バベシア・ミクロティ（Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ）（ＡＴＣＣ＃３０２２１）のようなバベシア（Ｂａｂｅｓｉａ）種；エンタモエバ・ヒストリティカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）（ＡＴＣＣ＃３００１５）のようなエンタモエバ種；エイメリア・マクシマ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍａｘｉｍａ）（ＡＴＣＣ＃４０３５７）のようなエイメリア種；リューシュマニア種（Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ＩＤ：３８５６８）；シストソム（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｅ）種、ブルギア（Ｂｒｕｇｉａ）種、ファスシダ（Ｆａｓｃｉｄａ）種、ディロフィラリア（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ）種、ウチェレリア（Ｗｕｃｈｅｒｅｒｉａ）種およびオンコセレア（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｅａ）種が含まれるが、それらに限定されない。
【００４０】
寄生病原体の防御性抗原類の例には、Ｐ．ベルゲリ（Ｐ．ｂｅｒｇｅｒｉｉ）のサーカムスポロゾイテ抗原またはＰ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍのサーカムスポロゾイテ抗原のようなプラスモジウム種のサーカムスポロゾイテ抗原類（Ｓａｄｏｆｆほか、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：３３６−３３７；１９８８）；プラスモジウム種のメロゾイテ表面抗原（Ｓｐｅｔｚｌｅｒほか、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．，４３：３５１−３５８；１９９４）；Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａのガラクトース特異的レクチン（Ｍａｎｎほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、８８：３２４８−３２５２；１９９１）、リューシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）のｇｐ６３（Ｒｕｓｓｅｌｌほか、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４０：１２７４−１２７８；１９８８；ＸｕおよびＬｉｅｗ、Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８４：１７３−１７６；１９９５）、リューシュマニア・メジャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｍａｊｏｒ）のｇｐ４６（Ｈａｎｄｍａｎほか、Ｖａｃｃｉｎｅ，１８：３０１１−３０１７；２０００）、ブルジア・マライ（Ｂｒｕｇｉａ  ｍａｌａｙｉ）のパラミオシン（Ｌｉほか、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，４９：３１５−３２３；１９９１）、シストソマ・マンソニ（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ）のトリオース−ホスフェートイソメラーゼ（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、８９：１８４２−１８４６；１９９２）；トリコストロンガイラス・コルブリホルミス（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ  ｃｏｌｕｂｒｉｆｏｒｍｉｓ）の分泌グロビン様タンパク質（Ｆｒｅｎｋｅｌほか、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，５０：２７−３６；１９９２）；フラスシオラ・ヘパチカ（Ｆｒａｓｃｉｏｌａ  ｈｅｐａｔｉｃａ）（Ｈｉｌｌｙｅｒほか、Ｅｘｐ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，７５：１７６−１８６；１９９２）、シストソマ・ボビス（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｂｏｖｉｓ）およびＳ・ジャポニクム（Ｓ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）（Ｂａｓｈｉｒほか、Ｔｒｏｐ．Ｇｅｏｇ．Ｍｅｄ．，４６：２５５−２５８；１９９４）のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ；およびＳｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｂｏｖｉｓおよびＳ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍのＫＬＨ（Ｂａｓｈｉｒほか、同上、１９９４）を含む。
【００４１】
先にも述べたように、ｒＢＣＧワクチン類は内因性免疫原をコードでき、それらは、腫瘍、移植および自己免疫原類、または腫瘍、移植および自己免疫性免疫原類の断片類および誘導体類を含むいかなる細胞性タンパク質、免疫制御剤または治療剤、またはそれらの部分類であってもよく、それらに限定されないレシピエントの細胞で発現できる。したがって、本発明において、ｒＢＣＧ類は、腫瘍、移植および自己免疫性免疫原類、またはその部分または誘導体類をコードできる。これとは別に、前記ｒＢＣＧは、（上に述べたような）合成遺伝子類をコードでき、それらは、腫瘍特異的、移植および自己免疫抗原類またはその部分類をコードする。
【００４２】
腫瘍特異的抗原類の例には、前立腺特異的抗原（Ｇａｔｔｕｓｏほか、Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌ．，２６：１２３−１２６；１９９５）、ＴＡＧ−７２およびＣＥＡ（Ｇｕａｄａｇｎｉほか、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｒｋｅｒｓ、９：５３−６０；１９９４）、ＭＡＧＥ−１およびチロシナーゼ（Ｃｏｕｌｉｅほか、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａ．，１４：１０４−１０９；１９９３）が含まれる。最近になって、腫瘍抗原を発現する非悪性細胞による免疫によりワクチン効果が得られ、それが、同一抗原を示す悪性腫瘍細胞を一掃する免疫応答を動物が得るのを補助することが、マウスにおいて明らかになった（Ｋｏｅｐｐｅｎほか、Ａｎａｌ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６９０：２４４−２５５；１９９３）。
【００４３】
移植抗原類の例には、Ｔ細胞上のＣＤ３分子（Ａｌｅｇｒｅほか、Ｄｉｇｅｓｔ．Ｄｉｃ．Ｓｃｉ．，４０：５８−６４；１９９５）が含まれる。ＣＤ３受容体に対する抗体で処置すると、循環しているＴ細胞および逆細胞媒介移植拒絶を急激に一掃することが明らかになった（Ａｌｅｇｒｅほか、同上、１９９５）。
【００４４】
自己免疫抗原類の例には、ＩＡＳ  βチェーン（Ｔｏｐｈａｍほか、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、９１：８００５−８００９；１９９４）が含まれる。ＩＡＳ  βチェーン由来のアミノ酸１８個のペプチドでマウスにワクチン接種すると、実験的自己免疫脳脊髄炎マウスに対して防御と治療ができることが明らかになった（Ｔｏｐｈａｍほか、同上、１９９４）。
【００４５】
アジュバントを発現するｒＢＣＧの開発
ｒＢＣＧは、免疫原およびアジュバントをコードするように構築でき、ｒＢＣＧに対する宿主応答を増大させるために用いることができる。これとは別に、ｒＢＣＧはアジュバントをコードするように構築でき、他のｒＢＣＧと混合してパートナーｒＢＣＧによってコードされた免疫原類に対する宿主応答を増大させることができる。
【００４６】
ｒＢＣＧがコードした特定アジュバントは本発明にとって重要ではなく、いかなる従来のビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）（例  Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ株３９５、ＡＴＣＣ＃３９５４１）またはＥ１  Ｔｏｒ  Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ（例  Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ株２１２５、ＡＴＣＣ＃３９０５０）由来のコレラトキシンのサブユニットＡ（すなわち、ＣｔｘＡ；ＧｅｎＢａｎｋ  アクセス番号Ｘ００１７１、ＡＦ１７５７０８、Ｄ３００５３、Ｄ３００５２）、またはその部分類および／または変異誘導体類（例  ＣｔｘのサブユニットＡのＡ１ドメイン（すなわち、ＣｔｘＡ１；ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｋ０２６７９））であることもできる。これとは別に、細菌性アデノシンジホスフェートリボシル化エクソトキシン類族のメンバーであるいかなる細菌性トキシン（ＫｒｕｅｇｅｒおよびＢａｒｂｉｅｒ、Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，８：３４；１９９５）も、ＣｔｘＡの代わりに用いることができ、例えば、腸毒性大腸菌（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号＃Ｍ３５５８１）の熱不安定トキシンのサブユニットＡ（ＥｌｔＡと本文で称する）、百日咳トキシンＳ１サブユニット（例  ｐｔｘＳ１，ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号  ＃ＡＪ００７３６４、ＡＪ００７３６３、ＡＪ００６１５９、ＡＪ００６１５７等）であることができる；さらにこれとは別に、前記アジュバントは、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（ＡＴＣＣ＃８４６７）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）（ＡＴＣＣ＃７７７３）またはボルデテラ・パラペルツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）（ＡＴＣＣ＃１５２３７）のアデニレートシクラーゼ−ヘモライシン類のひとつであることもでき、例えば、Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのｃｙａＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｘ１４１９９）、Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓのｃｙａＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＪ２４９８３５）またはＢ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａのｃｙａＡ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｚ３７１１２）等である。
【００４７】
免疫制御剤を発現するｒＢＣＧの開発
ｒＢＣＧは、免疫原およびサイトカインをコードするように構築でき、これを用いて、ｒＢＣＧに対する宿主応答を増大させることができる。これとは別に、ｒＢＣＧは前記サイトカインのみをコードするように構築することもでき、他のｒＢＣＧと混合して、パートナーｒＢＣＧによってコードされた免疫原類に対する宿主応答を増大させることができる。
【００４８】
ｒＢＣＧによってコードされた特定のサイトカインは本発明にとって重大というわけではなく、インタロイキン−４（本文で“ＩＬ−４”と称する；ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＡＦ３５２７８３（マウスＩＬ−４）またはＮＭ＿０００５８９（ヒトＩＬ―４））、ＩＬ−５（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ＿０１０５５８（マウスＩＬ−５）またはＮＭ＿０００８７９（ヒトＩＬ−５））、ＩＬ−６（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｍ２０５７２（マウスＩＬ−６）またはＭ２９１５０（ヒトＩＬ−６））、ＩＬ−１０（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ＿０１０５４８（マウスＩＬ−１０）またはＡＦ４１８２７１（ヒトＩＬ−１０））、ＩＬ−１２ｐ４０（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ＿００８３５２（マウスＩＬ−１２  ｐ４０）またはＡＹ００８８４７（ヒトＩＬ−１２  ｐ４０））、ＩＬ−１２ｐ７０（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ＿００８３５１／ＮＭ＿００８３５２（マウスＩＬ−１２  ｐ３５／４０）またはＡＦ０９３０６５／ＡＹ００８８４７（ヒトＩＬ−１２  ｐ３５／４０））、ＴＧＦβ（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号ＮＭ＿０１１５７７（マウスＴＧＦβ１）またはＭ６０３１６（ヒトＴＧＦβ１））、およびＴＮＦα  ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号Ｘ０２６１１（マウスＴＮＦα）またはＭ２６３３１（ヒトＴＮＦα））を含むが、それらに限定されない。
【００４９】
アポトーシスはプログラムされた細胞死であり、その誘導と結果という観点からして壊死性細胞死とは大きく異なる。外来性抗原類を含む細胞のアポトーシスは、このような抗原類に対する細胞性免疫の公知の強力な刺激物である。抗原含有細胞のアポトーシスが細胞性免疫につながるプロセスは、クロスプライミングと称されることもある。（Ｈｅａｔｈ，Ｗ．Ｒ．，Ｇ．Ｔ．Ｂｅｌｚ、Ｇ．Ｍ．Ｂｅｈｒｅｎｓ、Ｃ．Ｍ．Ｓｍｉｔｈ、Ｓ．Ｐ．Ｆｏｒｅｈａｎ，Ｉ．Ａ．，Ｐａｒｉｓｈ，Ｇ．Ｍ．Ｄａｖｅｙ、Ｎ．Ｓ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｆ．Ｒ．ＣａｒｂｏｎｅおよびＪ．Ａ．Ｖｉｌｌａｎｄａｎｇｏｓ．２００４。Ｃｒｏｓｓ−ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ，  ｄｅｎｔｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｅｔｓ，  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｔｉｇｅｎｓ．  （クロスプレゼンテーション、樹状細胞サブセット類、および細胞性抗原類に対する免疫の発生。）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ  １９９：９；Ｇａｌｌｕｃｃｉ，Ｓ．，Ｍ．Ｌｏｌｋｅｍａ、およびＰ．Ｍａｔｚｉｎｇｅｒ．１９９９．Ｎａｔｕｒａｌ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ（ナチュラルアジュバント類）：Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．（樹状細胞の内因性活性化剤類。）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．５：１２４９；Ａｌｂｅｒｔ，Ｍ．Ｌ．，Ｂ．ＳａｕｔｅｒおよびＮ．Ｂｈａｄｒｄｗａｊ．１９９８．Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｃｑｕｉｒｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｆｒｏｍ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅ  ｃｌａｓｓ  Ｉ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ＣＴＬｓ．（樹状細胞は、アポトーシス細胞から抗原を獲得し、クラスＩ制限ＣＴＬｓを誘発する。）Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：８６．）抗原特異的細胞媒介免疫増強を起こすアポトーシス誘導メカニズムにはいくつかある。カスパーゼ８媒介アポトーシスは、抗原特異的細胞性免疫防御につながる。ｒＢＣＧ発現外来性抗原という文脈でのカスパーゼ８のｒＢＣＧによる産生と真核細胞の細胞質中におけるｒＢＣＧによる分泌は、ＢＣＧおよびｒＢＣＧにより過剰発現した他の結核抗原類に対しておよびＢＣＧそれ自体の抗原類に対して、高レベルの抗原特異的細胞性免疫につながるであろう。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２（ＴＲＡＩＬレセプタ２）としても公知のデスレセプター−５（ＤＲ−５）またはＴＮＦ−ＳＦ−１０Ｂ（腫瘍壊死因子−スーパーファミリメンバー１０Ｂ）もまた、カスパーゼ８媒介アポトーシスを媒介する（Ｓｈｅｒｉｄａｎ、Ｊ．Ｐ．，Ｓ．Ａ．Ｍａｒｓｔｅｒｓ、Ｒ．Ｍ．Ｐｉｔｔｉ，Ａ．Ｇｒｕｎｅｙ、Ｍ．Ｓｋｕｔｂａｔｃｈ、Ｄ．Ｂａｌｄｗｉｎ、Ｌ．Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｃ．Ｌ．Ｇｒａｙ、Ｋ．Ｂａｋｅｒ、Ｗ．Ｉ．Ｗｏｏｄ，Ａ．Ｄ．Ｇｏｄｄａｒｄ，Ｐ．Ｇｏｄｏｗｓｋｉ、およびＡ．Ａｓｈｋｅｎａｚｉ．１９９７．Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｔｒａｉｌ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｂｙ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｄｅｃｏｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．（シグナルファミリおよびデコイレセプター類によるＴｒａｉｌ誘発アポトーシスの制御。）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７７：８１８��）  レオウイルス誘発アポトーシスは、ＴＲＡＩＬ−ＤＲ５により媒介され、このウイルスがその後クリアランスされることになる（Ｃｌａｒｋｅ、Ｐ．Ｓ．，Ｍ．Ｍｅｉｎｔｚｅｒ，Ｓ．Ｇｉｂｓｏｎ，Ｃ．Ｗｉｄｍａｎｎ，Ｔ．Ｐ．Ｇａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｇ．Ｌ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，およびＫ．Ｌ．Ｔｙｌｅｒ。２０００．Ｒｅｏｖｉｒｕｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ＴＲＡＩＬ．（レオウイルス誘発アポトーシスは、ＴＲＡＩＬにより媒介される。）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：８１３５）。組み換えＢＣＧによるＤＲ−５発現は、ｒＢＣＧ発現抗原類に対する抗原特異的細胞性免疫の誘導に対して強力なアジュバント効果を付与する。抗原発現細胞はまた、抗原特異的細胞性免疫応答の誘導に強力な刺激物であるＦａｓ連結を介してアポトーシスを受けるように誘導することができる（Ｃｈａｔｔｅｒｇｏｏｎ、Ｍ．Ａ．，Ｊ．Ｊ．Ｋｉｍ，Ｊ．Ｓ．Ｙａｎｇ、Ｔ．Ｍ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｊ．Ｌｅｅ，Ｔ．Ｄｅｎｔｃｈｅｖ，Ｄ．Ｍ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｖ．Ａｙｙａｖｏｏ，およびＤ．Ｂ．Ｗｅｉｎｅｒ．２０００．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ａｎｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｄｅｎｔｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｆａｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．（工学的に作製したＦａｓ媒介アポトーシスによる樹状細胞を含む抗原提示細胞類に対する標的抗原運搬。）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １８：９７４）。ＦａｓまたはＦａｓ細胞質ドメイン／ＣＤ４エクトドメイン融合タンパク質を発現する組み換えＢＣＧは、アポトーシスおよび抗原特異的細胞性免疫応答を誘発するであろう。
【００５０】
ｒＢＣＧによる細胞性免疫の増強は、上に述べたようなアポトーシス増強剤を産生し、ＢＣＧ抗原類またはｒＢＣＧによる過剰発現のために特異的にコードされた抗原類に限定されず、上記のｒＢＣＧが侵入できる真核細胞中のすべての抗原を含む。もしこのようなｒＢＣＧが、アポトーシスが誘導された腫瘍細胞に運搬されるならば、例として、重要な腫瘍抗原類に対する細胞性免疫が、腫瘍および／または転移の除去、減少または防御とともに誘導されるであろう。この抗腫瘍効果は、膀胱癌症例の場合のように局所投与されるとＢＣＧがもたらす一般的抗腫瘍効果に追加されるであろう。
【００５１】
本発明の他の態様において、アポトーシスの特異的メディエータ産生により増強されたｒＢＣＧは、腫瘍内またはｒＢＣＧがまた強力な細胞性免疫応答が起こすであろう外来性抗原を産生する他の細胞内に運搬されると、これらの外来性抗原類を含む細胞類に対して強力な細胞性応答の産生を誘発するであろう。これらの細胞性応答は、免疫媒介腫瘍細胞破壊、さらに、クロスプライミングおよび腫瘍または他の重要抗原類に対する細胞性免疫の誘導を起こし、その後腫瘍および／または転移の除去、減少または防御を起こすであろう。このような外来性抗原の例は、宿主細胞ＨＬＡとは異なるＨＬＡ抗原であり、それらに対して強力な非相同細胞性応答が起こるだろう。
【００５２】
特異的腫瘍抗原類を同様に発現するアポトーシスの特異的メディエータの発現によりアポトーシス誘導性が増強されるｒＢＣＧは、これらの腫瘍抗原類に対して強力な抗原特異的細胞性応答を誘発し、これらの抗原類に対しての寛容性の破壊を含み、それにより、ｒＢＣＧを腫瘍自体に直接運搬する必要もなく、腫瘍および／または転移を除去、減少または防御することになるであろう。
【００５３】
ＤＮＡ破壊後のアポトーシスまたはカスパーゼ９は、ある抗原類に対して寛容性を誘発する（Ｈｕｇｕｅｓ，Ｓ．，Ｅ．Ｍｏｕｇｎｅａｕ，Ｗ．Ｆｅｒｌｉｎ、Ｄ．Ｊｅｓｋｅ、Ｐ．Ｈｏｆｍａｎ、Ｄ．Ｈｏｍａｎｎ，Ｌ．Ｂｅａｕｄｏｉｎ，Ｄ．Ｓｃｈｒｉｋｅ，Ｍ．Ｖｏｎ  Ｈｅｒｒａｔｈ，Ａ．Ｌｅｈｕｅｎ，およびＮ．Ｇｌａｉｃｈｅｎｅｎｈａｕｓ．２００２）。Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  ｉｓｌｅｔ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｂｅｔａ  ｃｅｌｌｓ．（ランゲルハンス島抗原類に対する寛容性および膵臓β細胞の限定アポトーシスにより誘発された糖尿病の予防。）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １６：１６９）。寛容性誘導は、糖尿病、関節リューマチ、クローン病、炎症性腸疾患および多発性強皮症のような自己免疫疾患の制御または予防において重要であるが、これらに限定されない。Ｂ膵細胞、結腸直腸および神経細胞のような細胞中においてカスパーゼ９または他のアポトーシス媒介寛容性誘発タンパク質類がｒＢＣＧにより産生されることは、限定アポトーシスをもたらすであろうが、それは、これらの細胞中において自己免疫の抗原標的に対しての寛容性を誘発し、それにより、自己免疫疾患状態を治療または予防するであろう。上記細胞の例は、限定するものではない。自己免疫反応に関与する特異的抗原類の同定は、これらの抗原類とカスパーゼ９またはアポトーシス媒介寛容性誘導可能な他の分子類の両者のｒＢＣＧ産生を介して、これらの自己免疫標的抗原類に対する寛容性誘導を可能とするであろう。このようなｒＢＣＧは、これらの自己免疫疾患を治療および／または予防するであろう。
【００５４】
機能的発現カセット類の誘導により真核細胞または組織において免疫制御剤を発現可能なｒＢＣＧを産生させるための組み換えＤＮＡおよびＲＮＡ操作について、下記で説明する。
【００５５】
下記の実施例は、本発明のさまざまな面を例示するものとして考えるべきであり、本発明の実施に関して限定することを意図していない。当業者は、本発明の全般的範囲から逸脱することなく、別の材料類、条件類、および操作の採用が可能であることを理解するであろう。
【００５６】
（実施例）
方法類
マイコバクテリウム株類の培養
選択したＢＣＧ株類を、ミドルブルック（Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ）７Ｈ９またはソールトンシンセティック培地（Ｓａｕｌｔｏｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｍｅｄｉｕｍ）のような液体培地中で好適には３７℃で培養する。前記株類は、静止または攪拌培養物として維持できる。さらに、ＢＣＧの増殖率は、オレイン酸（０．０６％ｖ／ｖ；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．０１２５７）およびタイレキサポル（Ｔｙｌｏｘａｐｏｌ）（０．０５％ｖ／ｖ；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃａｔ．Ｎｏ．７０４００）のような界面活性剤類を添加することで、高めることができる。ＢＣＧ培養物の純度は、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１０のような固体培地２５−３０ｍｌを含む３．５インチのプレート上に、リン酸緩衝生理食塩水（本文でＰＢＳと称する）で系列希釈（例  無希釈から１０倍ずつ１０−８まで）したＢＣＧ培養物アリコットを１００μｌずつ均等に広げて、評価できる。さらに、前記培養物の純度は、チグリケート培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌａｂ，カタログ番号＃１８９１）および大豆カシン培地（ＢＤ、カタログ番号＃２１１７６８）のような市販のキット類を用いて、評価できる。
【００５７】
ＢＣＧ種ロットは、密度０．１−２×１０７ｃｆｕ／ｍｌで‐８０℃で保存する。この液体培養物を通常、（６００ｎｍにおいて）無菌コントロールに対して光学密度０．２−４．０で採取する；この培養物を適当な大きさの遠心管に入れ、菌を８，０００×ｇで５−１０分間、遠心する。上清を捨て、菌をもう一度、１０−３０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含むＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９で構成した保存溶液中に密度０．１−２×１０７ｃｆｕ／ｍｌで懸濁させる。これらの懸濁物を、アリコット１ｍｌとして無菌の１．５ｍｌ容量のホウケイ酸塩フリーザーバイアルに入れ、その後、‐８０℃とする。
【００５８】
通常の分子生物学手法
制限酵素エンドヌクレアーゼ（本明細書で、“ＲＥｓ”と表記；Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ，Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂ，Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）およびＴａｑポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を、製造業者のプロトコールに従って用いる；プラスミドＤＮＡは、小型（Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎｉｐｒｅｐＲキット、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ，ＣＡ）または大型（Ｑｉａｇｅｎ  ＭａｘｉｐｒｅｐＲキット、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ，ＣＡ）プラスミドＤＮＡ精製キットを、製造業者のプロトコール（Ｑｉａｇｅｎ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ，ＣＡ）に従い用い、調製する；ヌクレアーゼを含まない分子生物学等級のｍｉｌｌｉ−Ｑ水、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、ＥＤＴＡ  ｐＨ８．０、１Ｍ  ＭｇＣｌ２、１００％（ｖ／ｖ）エタノール、超純粋アガロース、およびアガロースゲル電気泳動緩衝液は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤから購入する。ＲＥ消化、ＰＣＲｓ、ＤＮＡ連結反応およびアガロースゲル電気泳動は、周知の操作（Ｓａｍｂｒｏｏｋほか、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．１，２，３；１９８９）；Ｓｔｒａｕｓほか、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．Ｍａｒ；８７（５）１８８９−９３；１９９０）に従い行う。下記の章で述べる各組み換えプラスミドのＤＮＡ配列を明らかにするためのヌクレオチド配列決定は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ自動シークエンサーモデル３７３Ａを用いて、従来の自動ＤＮＡ配列決定法により、実施できた。
【００５９】
ＰＣＲプライマー類は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のような市販業者から購入し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＤＮＡシンセサイザー（モデル３７３Ａ）を用いて合成する。ＰＣＲプライマー類は、濃度１５０−２５０μＭで使用し、ＰＣＲ反応のためのアニーリング温度は、Ｃｌｏｎｅマネージャーソフトウェアバージョン４．１（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）を用いて、決める。ＰＣＲは、ストラタジーンロボサイクラー（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ  Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ）モデル４００８８０（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）中で行う。増幅用ＰＣＲプライマー類は、Ｃｌｏｎｅ  Ｍａｎａｇｅｒ（登録商標）ソフトウェアバージョン４．１（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）を用いて、設計する。このソフトウェアにより、ＰＣＲプライマー設計ができ、操作する特定ＤＮＡ断片と両立するＲＥ部位を識別する。ＰＣＲは、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ  Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒモデル４００８８０（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）のようなサーモサイクラー機器中で行い、ＰＣＲにおけるプライマーアニーリング、伸長および変性時間は、標準的操作（Ｓｔｒａｕｓほか、同上、１９９０）により設定する。ＲＥ消化およびＰＣＲは、その後、アガロースゲル電気泳動によって標準的操作（Ｓｔｒａｕｓほか、同上１９９０；Ｓａｍｂｒｏｏｋほか、同上、１９８９）を用いて、分析する。陽性クローンは、適切なＲＥパターンおよび／またはＰＣＲパターンを示すものとして定義する。この操作で同定したプラスミド類は、さらに、標準的ＤＮＡ配列決定操作を用いて上記に述べたように評価できる。
【００６０】
ＤＨ５αおよびＳａｂｌｅ２Ｒのような大腸菌株類は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）から購入し、下記の実施例に述べた組み換えプラスミド類の最初の宿主として作用させる。組み換えプラスミド類は、ジーンパルサー（Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ）（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）のような高電圧電気パルス装置を記載されているように（Ｓｔｒａｕｓほか、同上、１９９０）、１００−２００Ω、１５−２５μＦおよび１．０−２．５ｋＶに設定し、これを用いるエレクトロポレーションすなわち電気穿孔法により大腸菌株類中に導入する。最適エレクトロポレーション条件は、最大形質転換速度／ＤＮＡ  ｍｃｇ／菌をもたらす設定を定めることによって、同定する。
【００６１】
菌株類は、トリプチックソーイ寒天（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）またはトリプチックソーイ培地（Ｄｉｆｃｏ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）で増殖させ、製造業者の指示に従い、調製する。特に断りがなければ、全ての菌は、静かに攪拌しながら５％ＣＯ２（ｖ／ｖ）中３７℃で増殖させる。適している場合には、前記培地に抗生物質類（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加する。菌株類は、３０％（ｖ／ｖ）グリセロール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）含有（Ｄｉｆｃｏ）中におよそ１０９コロニー形成単位（本文で“ｃｆｕ”と称する）／ｍｌで懸濁させ、‐８０℃で保存する。
【００６２】
ＢＣＧにおける対立遺伝子交換
先行技術では、マイコバクテリウム株類に改変対立遺伝子類を導入する方法を教示しており、当業者は、このような方法を理解しかつ実行できるであろう（Ｐａｒｉｓｈほか、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４６：１９６９−１９７５；２０００）。対立遺伝子交換プラスミドを調製するための新しい方法では、合成ＤＮＡを用いることを含む。この手法の利点は、調製プラスミドが極めて明らかな調製の経緯を有しており政府規制に沿ってコンプライアンスを有していることであろう。一方これまでに用いられてきた方法は、効果的ではあるが、ラボでの培養記録記載が満足のいくものではなくしたがってコンプライアンスを有しているとはいえないであろう。上記規制へのコンプライアンスは、もしヒトでの使用のために製品のライセンスを米国および欧州政府当局から取得しようとするならば、必須である。
【００６３】
マイコバクテリウムにおける対立遺伝子交換のための自殺ベクターは、大腸菌で置き換わる能力を有しているがＭ．ｔｂのようなＭｙｃｏｂａｔｅｒｉｕｍ種およびＢＣＧにおいて複製できないプラスミドである。本発明における対立遺伝子交換操作における用途のための特異的自殺ベクターは、学界（Ｐａｒｉｓｈほか、同上、２０００）および市販業者から取得できるものから、選択できる。対立遺伝子交換のための自殺プラスミドの好適な設計を、図１に示した。このプラスミドは、下記のＤＮＡセグメントから構成されている：大腸菌中での複製のためのプラスミド用ｏｒｉＥ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号＃Ｌ０９１３７）、大腸菌およびマイコバクテリウム両者における選択のためのカナマイシン耐性配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号  ＃ＡＡＭ９７３４５）、および追加の抗生物質選択マーカー（例  マイコバクテリウムプロモータ（例  ｈｓｐ６０プロモータ）の制御下にあるであろうゼオシン耐性遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋアクセス番号＃ＡＡＵ０６６１０））。第二の抗生物質選択マーカーは、必須というわけではないが、対立遺伝子交換プロセスにおいて自然発生カナマイシン耐性単離物の過剰増殖を防止するための二重選択を可能とするために、含ませる（Ｇａｒｂｅほか、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４０：１３３−１３８；１９９４）。
【００６４】
このような自殺ベクター類の構築は、本明細書に述べたような標準的組み換えＤＮＡ手法を用いて、行うことができる。しかし、現在の規制基準では、ＢＳＥ感染物を含むウシ製品に暴露したものから得たプリオン粒子を導入してしまうという恐ろしい問題が生じている。したがって、起源が不明の物質（例  ＤＮＡ配列類）を標的株に導入してしまうのを避けるため、自殺ベクター中の全てのＤＮＡが市販業者（例  Ｐｉｃｏｓｃｒｉｐｔ社）により合成されることが望ましい。したがって、自殺ベクターを構築するための好適な方法は、ＤＮＡソフトウェア（例  Ｃｌｏｎｅ  Ｍａｎａｇｅｒ）を用いてＤＮＡ配列計画を立て、その後、サービスの都度随時費用が発生する方式でこのようなサービスを行う商業的業者（例  Ｐｉｃｏｓｃｒｉｐｔ社）によりＤＮＡを合成してもらうことである。この方法を用いて、自殺ベクターｐＡＦ１００（示さず）を作製し、それを次に、この特定適用のために修飾した（ｐＡＦ１０３、図１に概略を示し、さらに表１に示した）。
【００６５】
【表１】
0005461776.tif 000002
【００６６】
このような自殺ベクターは、２種の抗生物質選択マーカー類を含み従って１種の抗生物質に耐性を示す自然発生変異体選択を最小とするなどの利点を有している。こうした選択は、１世代あたり約１／１０８で起こる。２種の抗生物質に対する自然発生的耐性は、非常にまれで、１世代あたり約１／１０１６でしか起こらない。したがって、対立遺伝子交換操作実施に用いた培養物中に現れる二重耐性株の確率は、１／１０８未満である。
【００６７】
対立遺伝子交換プロセス時における陰性選択のため、ショ糖感受性表現型を付与するｓａｃＢ遺伝子（ゲノム配列番号（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑ  ＩＤ）＃ＮＴ０１ＢＳ４３５４）を含ませ、最終ＤＮＡ組み換え段階を受けた株類の培養物を濃厚にし、対立遺伝子交換を完了した。
【００６８】
処方およびワクチン戦略
ワクチン処方の戦略は、製造プロセス全てにおいて、最大の生存度と安定性を求めるための研究に基づいて、作成する。これには、マイコバクテリウム菌の培養のために一般的に用いられるさまざまな培地を利用した培養時において、最大菌生存度（生きているか死んでいるか）を調べることが含まれ、培養には、グリセロール、糖類、アミノ酸類、および界面活性剤類または塩類の添加を含む。遠心分離または接線フローろ過により培養細胞を採取した後、凍結または凍結乾燥プロセスにおいて細胞を保護できる安定化培地に再懸濁する。一般的に用いられる安定化剤には、グルタミン酸ナトリウム、またはアミノ酸またはアミノ酸誘導体類、グリセロール、糖類または一般的に使用される塩類が挙げられる。最終処方は、十分に高い生存度の菌体を提供し、それらは、筋肉内、経皮注入、潅流または経口投与により運搬され、維持のための十分な安定性と市販および使用のための適切な保存期間を有しているであろう。
【００６９】
ＴＢワクチン類の前臨床評価
一般的安全性試験
１群６匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを、問題のｒＢＣＧ株（類）および同族の親株類２×１０６ＣＦＵで腹腔内感染させる。前記動物を全身健康と体重について感染後１４日間、モニタリングする。ＢＣＧおよびｒＢＣＧ株類を投与した動物は健康のままであり、観察期間中体重減少を起こすこともなく、あるいは病気の明らかな症状も示さない。
【００７０】
免疫能力を有するマウスにおける新規ｒＢＣＧ株類の毒性
ＢＡＬＢ／ｃマウス１５匹を１群とし、これらに静注でそれぞれｒＢＣＧおよびＢＣＧ親株  ２×１０６ＣＦＵを感染させる。感染第１日において、各群のマウス３匹を屠殺し、脾臓、肺および肝臓におけるＣＦＵを分析し、各動物が同等の感染量であるようにする。感染後第４、８、１２および１６週において、各群のマウス３匹を屠殺し、脾臓、肝臓および肺におけるＣＦＵを得て、親ＢＣＧ株と比較してｒＢＣＧ株類のインビボ増殖を評価する。ｒＢＣＧ株類は、親ＢＣＧと同等の毒性を示すと考えられる。
【００７１】
免疫妥協マウスにおける厳密な安全試験
各群１０匹としてＳＣＩＤ（重症複合免疫不全症）を有する免疫妥協マウスに、静注でそれぞれｒＢＣＧおよびＢＣＧ親株  ２×１０６ｃｆｕを感染させる。感染後第１日において、各群のマウス３匹を屠殺し、脾臓、肝臓および肺におけるｃｆｕを分析し、接種用量を確認する。各群７匹の残りのマウスは、全身状態および体重をモニタリングする。これらのマウスの生存を追跡し、全観察期間において親株感染動物よりもｒＢＣＧ感染マウスの生存が悪くないときに良好な結果が得られる。
【００７２】
モルモット安全試験
ｒＢＣＧ株類の安全性をまた、親ＢＣＧワクチンと比較しモルモットモデルで評価すると、ヒトにおける十分に確立された安全性を有している。最初に、動物の全般健康状態に及ぼすワクチンの効果を検討するが、それには、体重も含める。モルモットは、組み換えおよび親株類を１０７（ワクチン用量の１００倍）ｃｆｕ筋肉注射で免疫し、６週間、全般健康状態と体重をモニタリングする。この６週間という期間の前に死亡した動物については、死後検査も行う。感染後６週間の期間が終わった時点で、動物は全て屠殺し、総合病理検査を行う。体重減少および異常行動は全くなく、この６週時剖検において全ての臓器は正常のように見える。ｒＢＣＧ−Ｐｆｏワクチンについて、全く健康に対する悪影響が見られずしかも親株を接種した動物に比較して正常速度で動物が体重を増やす時、試験成功が示唆される。
【００７３】
同時に、動物臓器における細菌レベルをモニタリングする。親または組み換えワクチンのいずれかで免疫したモルモットを、接種後さまざまな時点で安楽死させ、その後、肺、脾臓および局所（鼠径部）リンパ節について、ＢＣＧまたはｒＢＣＧのｃｆｕをアッセイする。
【００７４】
毒性試験：
ｒＢＣＧ株類の毒性を評価するため、各群１２匹のモルモットを、それぞれ、ヒト用ｒＢＣＧ株類、ＢＣＧ親株または生理食塩水の単回投与量よりも４倍の１回投与量または４分の１の１回投与量で、筋肉内投与によりワクチン接種する。ワクチン後第３日において、動物６匹を屠殺し、これらの動物に及ぼすワクチンの急性効果を評価する。ワクチン後第２８日において、残りの動物６匹を屠殺し、動物に及ぼす慢性効果を評価する。両方の時点で各動物の体重を調べ、全般病理状態と注射部位の様子を調べる。血液を採取し、血液検査を行い、内臓および注射部位の組織病理を調べる。
【００７５】
防御決定のための試験：
マウス防御研究
１群１３匹としたＣ５７Ｂｌ／６マウス（雌性、５−６週齢）を、皮下からｒＢＣＧ、親ＢＣＧまたは生理食塩水１０６ｃｆｕで免疫するであろう。別のマウス群は、健常対照として使用する。免疫後８週時点で、マウスに対して、Ｍ．ｔｂ  Ｅｒｄｍａｎ株（または、Ｈ３７Ｒｖ  Ｋａｎ耐性株）を総計１０７ＣＦＵ含む１０ｍｌの単細胞懸濁液から作製したエアゾールとして、このチャレンジ株によりチャレンジするが、この量は、先にも述べたように各動物の肺に１００個の生きている菌を伝播する。チャレンジしていない動物とともに、実験動物の生存をモニタリングする。チャレンジ後、体重減少と全般健康状態についても動物をモニタリングする。チャレンジ後第１日において、各群３匹のマウスを屠殺し、肺におけるｃｆｕを調べ、チャレンジ用量を確認し、動物１匹は、脾臓および肺の組織病理検査のために屠殺する。その後、チャレンジ後第５週において、各群の動物９匹を屠殺し、動物の組織病理検査と顕微鏡検査を行う。マウス６匹の肺と脾臓組織を、ｃｆｕ計測のために評価する（選択サプリメントを有するプレートを用いて、チャレンジ株からワクチン株を識別する）。もしＨ３７Ｒｖ−ｋａｎ耐性株でチャレンジするならば、ＫａｎまたはＴＣＨを用いてワクチン株からチャレンジ株を識別する。もしＭ．ｔｂ  Ｅｒｄｍａｎ株をチャレンジに使用するならば、ＴＣＨを用いてチャレンジ株からワクチン株を識別する（ＢＣＧは感受性であるが、Ｍ．ｔｂは本来耐性である）。
【００７６】
皮膚遅延型過敏症（ＤＴＨ）の誘導
ＳＰＦモルモットを、ｒＢＣＧまたは親ＢＣＧ株１０３により筋肉注射で免疫するであろう。免疫後９週で、動物背部の毛を剃り、リン酸緩衝生理食塩水１００μｌ中のＰＰＤ１０μｇを筋肉内注射する。２４時間後、硬い硬変部の直径を測定する。ｒＢＣＧ株は、親ＢＣＧ株類で誘導した硬変と同じかそれよりも大きいＤＴＨを誘発する。
【００７７】
モルモットチャレンジ研究
Ｍ．ｔｂチャレンジに対してのｒＢＣＧワクチン類の有効性を調べるため、各群１２匹のモルモット（若い成熟ＳＰＦハートレイ（Ｈａｒｔｌｅｙ）、２５０−３００グラム、雄性）を、ｒＢＣＧ、親ＢＣＧ株または生理食塩水で免疫する。ワクチン類および対照は、１０６ｃｆｕを筋肉注射で投与する。免疫後１０週時点で、ｒＢＣＧ免疫動物、ＢＣＧ免疫動物および偽免疫動物に対して、Ｍ．ｔｂを総計１０７ｃｆｕ含む１０ｍｌの単細胞懸濁液から作製したエアゾールでチャレンジする；この操作では、先にも述べたように各動物の肺に約１００個の生きている菌を伝播する（Ｂｒｏｄｉｎほか、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．１９０（１）、２００４）。チャレンジ後、ワクチン接種していない未チャレンジの健常群とともに、動物の生存をモニタリングする。チャレンジ後、体重減少と全般健康状態についても動物をモニタリングする。各群から６匹のマウスをチャレンジ後第１０週で屠殺し、各群中残りの６匹は、チャレンジ後第７０週で屠殺したが、それは、長期評価のためである。両方の時点において、動物の組織病理検査と顕微鏡検査を行うであろう。肺および脾臓組織を、組織病理検査とｃｆｕ計測のために評価する（選択サプリメントを有するプレートを用いて、チャレンジ株からワクチン株を識別する）。もしＨ３７Ｒｖ−ｋａｎ耐性株でチャレンジするならば、ＫａｎまたはＴＣＨを用いてワクチン株からチャレンジ株を識別する。もしＭ．ｔｂ  Ｅｒｄｍａｎ株をチャレンジに使用するならば、ＴＣＨ（ＢＣＧは感受性であるが、Ｍ．ｔｂは本来耐性である）を用いてチャレンジ株からワクチン株を識別する。チャレンジ後偽免疫動物が最も早く死亡し、一方、ｒＢＣＧ免疫動物がＢＣＧ親株免疫動物よりも長く生存すれば、成功が示唆される。
【００７８】
霊長類安全性とチャレンジ研究：
さらに最近になってカニクイザルを用いてＭ．ｔｂに対するワクチン接種の評価が行われた。ヒトと非ヒト霊長類の進化上の関係とこれらの種における結核の臨床および病理的表れ方が似ていることにより、ＴＢとワクチン効果についての実験的研究にとってこの非ヒト霊長類モデルが魅力的となっている。
【００７９】
このモデルは肺空洞形成が進行することを特徴とし、ヒトＴＢに適用できるように思われる。感染と疾病の過程を、Ｘ線および体重減少、ならびに赤沈速度（ＥＳＲ）、末梢血単核球（ＰＢＭＬ）増殖およびサイトカイン産生、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性、および抗体応答を含むさまざまな血液検査により追跡する。感染後、カニクイザルは特徴的病巣を有する肺病理を示し、急性呼吸器感染による死が、チャレンジ用量に応じて、感染後４乃至６ヶ月以内に起こる。低感染用量では、ヒトと非常によく似て慢性感染を起こすが、病状はでない。
【００８０】
研究計画
本研究では、組み換えＢＣＧ単独投与またはｒＢＣＧ構築物中に過剰発現される配列類を含むワクチンをその後２回追加接種する投与を、さまざまな用量のＢＣＧ親株投与と直接比較するであろう。後者は、適当なアジュバント処方に基づく組み換えタンパク質、ＤＮＡまたはＡｄ３５構築物類のいずれかとして運搬できた。
【００８１】
最初の研究では、ブースターを行わず親ＢＣＧ対ｒＢＣＧ構築物類の防御効果を評価する。本研究では、下記のように作製した３群（各群１０匹）を含む：群１は、それぞれＢＣＧ，ｒＢＣＧおよび生理食塩水を含む。各群中２匹は、ｒＢＣＧ構築物類中における過剰発現抗原により皮膚試験を行い、さらに、対照として標準的ＰＰＤと生理食塩水で皮膚試験する。ＢＣＧに比較してｒＢＣＧ群における陽性でかつ大きな硬変部は、インビボにおけるワクチン摂取と免疫応答惹起を示唆する。各群中残りの８匹について、低用量Ｍ．ｔｂ  Ｅｒｄｍａｎ株でエアゾールチャレンジし、防御を、チャレンジ後１６週において菌負荷の減少または終点における生存により、測定した。
【００８２】
追跡ＢＣＧプライムプロトコールは、上記と必然的に同一であるが、ただし、動物を最初にＢＣＧ，ｒＢＣＧおよび生理食塩水でワクチンし、その後、過剰発現抗原で２回、追加接種する。
【００８３】
非ヒト霊長類モデルにおける免疫原性および防御研究では、ｒＢＣＧ構築物についての有効性を研究するためのアカゲザルにおいて、結核の免疫生物学的側面および免疫病理側面を調べることを目的とするであろう。この動物は、実験開始前に十分に体調を調整し平均体重２乃至３ｋｇの閉じ込めて育てた若年アカゲザルから若いが大人のアカゲザルである。接種前研究では、通常の血液検査と赤沈速度ならびにリンパ球増殖アッセイを含む標準血液検査で構成する。皮膚試験はＰＰＤで行い、ツベルクリンに対する感受性がないことを確認し、胸部Ｘ線を感染前プロフィールの一部として得る。免疫期間は総計２１週間とし、０週におけるＢＣＧまたはｒＢＣＧによる最初のワクチン接種、第１２週および第１６週における抗原追加接種を含むであろう。抗原特異的免疫性は、リンパ球刺激試験において増殖およびインタフェロンγ（ＩＦＮγ）分泌を測定することによって評価する。ＩＦＮγ産生リンパ球の出現頻度は、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＰＯＴ）または蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）により求める。この目的のため、血液サンプルを最初のワクチン接種後第０、４、８、１２、１６および２０週で採取する。
【００８４】
最終免疫後第４乃至６週において、同日に同一処方でＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｅｒｄｍａｎを３ｍｌ（１，０００ｃｆｕ）、気管内留置によりチャレンジさせるであろう。感染過程は、体重減少、発熱、ＥＳＲ上昇、ＰＰＤ対ＤＴＨ、ＰＰＤ刺激ＰＢＭＣのインビトロ増殖性応答、およびｒＢＣＧ中に過剰発現した抗原類について評価し、その後、ＩＦＮ−ｇ産生レベルを測定する。胸部Ｘ線は、肺ＴＢと一致する異常を検出するために行い、剖検は、チャレンジ後第１２−１６週に行うであろう。
【００８５】
ＴＢベクターとワクチン類の臨床評価
安全性と毒性試験：
規制ガイドラインにより規制されている前臨床安全性および毒性試験を、上記のような前臨床毒性および安全性試験として行う。これらを調べた後、ヒト安全性試験を行う。これらの研究は、健常クアンティフェロン（Ｑｕａｎｔｉｆｅｒｏｎ）陰性成人で当初行い、その後、小児および新生児に年齢を移行して行う。
【００８６】
免疫原性研究：
マウスおよび霊長類における免疫原性研究では、ＩＮＦγのような細胞免疫評価のための標準的手法類、ＥＬＩＳＰＯＴおよび／またはフローサイトメトリを短期および長期抗原またはペプチド刺激とともに用いるが、これらに限定されない。同様の方法論は、ヒト応答を評価するために利用する。テトラマー研究を、ヒトワクチン後のＣＤ４およびＣＤ８応答を評価するために用いる。
【００８７】
プライム−ブースト戦略の最適化：
ｒＢＣＧは、ＴＢまたは関連トランスジーン類を発現するように工学的に作製した他の疾患に対する単独ワクチンとしても、同様に作用する。本文では、“トランスジーン”は、マイコバクテリウムプロモータに機能的に連結して問題のタンパク質を発現するＤＮＡセグメントである。本文でＴＢに対するワクチンとしてまたは他の疾患に対する防御のためのトランスジーンを発現するワクチンとして述べたｒＢＣＧは、また、アジュバントまたはウイルスまたは細菌ベクター抗原類と混合した組み換えタンパク質類による追加免疫のための免疫系を用意するためにも、非常によく作用する。動物前臨床研究およびヒト前臨床研究の両者において、ＢＣＧプライムとその後の組み換えタンパク質／アジュバントまたはベクターブーストを、投与法および用量の観点から最適化する。これらのプライムブースト戦略は、ヒトにおいて免疫を誘発するための最も強力な手段であり、その理由は、特に本発明の態様にあるＢＣＧのプライム能力とその後組み換えタンパク質またはベクターが免疫系のブースター応答を集束させ増強させることにある。
【００８８】
動物における暴露後治療ワクチン研究
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを用いて、潜伏感染を確立し；低用量感染によって無視可能なＭ．ｔｂ特異的免疫性が誘発された時点およびＭ．ｔｂ特異的免疫性がメモリＴ細胞で低下され圧倒される別の時点で、治療用ワクチンをマウスに投与するであろう。ワクチン類の治療上の利点は、その後、最終処置用ワクチン投与後２ヶ月および５ヶ月にマウスで、各マウスの肺および脾臓におけるｃｆｕを計数することにより、評価されるであろう。このｃｆｕ計数値を、マウス群で標準的統計方法により分析し、その結果を用いて治療的ワクチン接種がマウスにおいて潜伏Ｍ．ｔｂ感染を有意に低下させるかどうかを分析し；同様の方法論を用いて、必要に応じて他の動物の応答評価のために利用する。
【００８９】
ＢＣＧベクターの臨床評価：ｒＢＣＧワクチンの経口投与
本発明のｒＢＣＧによる標的動物の経口ワクチン投与はまた、先に記載した方法類を用いて行うことができる（Ｍｉｌｌｅｒほか、Ｃａｎ  Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃ  Ｊ  １２１（１）：４５−５４；１９７９）。経口投与したｒＢＣＧ量は、対象の種により、また治療しようとしている疾患または状態に応じて、変わるであろう。一般的に、使用した投与量は、生きている菌体約１０３乃至１０１１個であり、好適には生きている菌体約１０５乃至１０９個であろう。
【００９０】
ｒＢＣＧは一般的に、薬学的に許容できる担体または希釈剤とともに投与する。使用した特定の薬学的に許容できる担体または希釈剤は、本発明にとって重要ではない。希釈剤類の例には、リン酸緩衝生理食塩水、ショ糖を含むクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、重炭酸緩衝液（ｐＨ７．０）単独（Ｌｅｖｉｎｅほか、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ，７９：８８８−９０２；１９８７；およびＢｌａｃｋほか、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１５５：１２６０−１２６５；１９８７）またはアスコルビン酸、ラクトースおよび適宜アスパルテームを含む重炭酸緩衝液（ｐＨ７．０）（Ｌｅｖｉｎｅほか、Ｌａｎｃｅｔ、ＩＩ：４６７−４７０；１９８８）のような胃内胃酸に対して緩衝するための緩衝液が含まれる。担体の例には、スキムミルク中にあるようなタンパク質類、ショ糖のような糖類、またはポリビニルピロリドンが含まれる。これらの担体類は、典型的には、濃度約０．１−９０％（ｗ／ｖ）で使用するが、好適には範囲１−１０％（ｗ／ｖ）である。
（実施例）
【実施例１】
【００９１】
モルモット中における親ＢＣＧ株類の能力：ｒＢＣＧ３０によるモルモット防御研究
既存のｒＢＣＧ３０ワクチンで行った研究の例として、モルモットでの大規模研究を行い、その目的は、親ＢＣＧ  Ｔｉｃｅ株および市販され世界中で広くヒトで使用されているもうひとつのＢＣＧワクチン（ＳＳＩ−１３３１）と２種のロットのｒＢＣＧ３０の防御効果を比較することであった。この２種のｒＢＣＧ３０ロットは、ヒトでの用途のために実験室条件で作製されたか（ｒＢＣＧ３０−ＵＣＬＡ）またはＧＭＰ条件下で製造されたもの（ｒＢＣＧ３０−ＫＩＴ）である。
【００９２】
モルモット（各群動物１０匹）を、各ＢＣＧワクチンの単回投与量１０３ｃｆｕによる皮下経路で免疫した。陰性対照群（生理食塩水免疫）も、本研究に含めた。ワクチン接種後８週において、動物に対して、エアゾール経路で強力なＥｒｄｍａｎ株をチャレンジさせたが、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ空気感染装置のネブライザーコンパートメントを、肺に約１０−１５個の菌を伝播するようにキャリブレーションし、行った。動物は、チャレンジ後１０週で屠殺した。剖検時、肺と脾臓を動物から摘出し、生きている菌の数は、肺葉および脾臓ホモジネートの１０倍系列希釈物を栄養Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１１に接種することにより、求めた。菌コロニー形成は、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２存在下３７℃で２１日間インキュベーション後、計測した。データは、回収した菌の数平均のｌｏｇ１０として表した。
【００９３】
結果（図２）は、陰性、生理食塩水対照に比較してＭ．ｔｂチャレンジに対して全てのワクチン類が防御性であったが、ワクチン類間の差異が２種のグループに分けられる傾向があることを示している：
１）ｒＢＣＧ３０（ＵＣＬＡ）およびＢＣＧ  Ｄａｎｉｓｈ  １３３１はより防御性が高い；および
２）ＢＣＧ（親Ｔｉｃｅ株）およびｒＢＣＧ３０（ＫＩＴ）は防御性が低い。
【００９４】
したがって、実験室条件で作製しＧＭＰ等級ではないｒＢＣＧ３０（ＵＣＬＡ）はせいぜい、親Ｔｉｃｅ株よりも高い防御性を誘発するようではあるものの、その防御効果は市販のＢＣＧ  ＳＳＩに匹敵するに過ぎないと結論することは、妥当である。したがって、ＢＣＧ  Ｄａｎｉｓｈ  １３３１株の改良が、当然、新しいｒＢＣＧワクチン産生の目的となるはずである。
【実施例２】
【００９５】
抗生物質耐性マーカーを有していない発現ベクター類の担体として作用する宿主の構築
ＢＣＧ  Ｄａｎｉｓｈ  １３３１株におけるｌｅｕＤ遺伝子ノックアウトプラスミド構築体：
ｌｅｕＤ遺伝子の左側および右側にある１ｋｂの隣接領域を、ＤＮＡ合成により（ＤＮＡ２．０、ＣＡ）組み立て、両端にｐａｃＩ部位を有する２ｋｂのＤＮＡセグメントを作製した。ＰａｃＩ制限酵素消化とその後の連結を用いて、上記対立遺伝子交換プラスミド中にこのＤＮＡ断片をクローニングし、ｌｅｕＤノックアウトプラスミドを作製した。
【００９６】
ｌｅｕＤ遺伝子の対立遺伝子交換不活性化：
ｌｅｕＤ遺伝子の不活性化を上記のように行うが、ただし、ｌｅｕＤ遺伝子ノックアウト株については、培地にロイシン５０μｇ／ｍｌを添加するであろう。この操作の主要段階のフローチャートを図４に示す。
【００９７】
ＬｅｕＤノックアウトの証明：
表現型試験：
得られた株について、増殖にロイシン添加が必要かどうかを試験する。具体的に述べると、菌をロイシン５０μｇ／ｍｌ存在下または非存在下において１０％ＯＡＤＣおよび０．０５％（ｖ／ｖ）タイロキサポル（Ｔｙｌｏｘａｐｏｌ）を添加した７Ｈ９培地中で培養し、菌増殖を、ＯＤ６００値を測定することによって、モニタリングする。
【００９８】
ゲノム局所配列分析：
構築した株のゲノムＤＮＡを、先に述べたようにして調製する。標的遺伝子の左側および右側両方の１ｋｂ隣接領域に相補性のプライマー対をＰＣＲ増幅に用い、染色体から約２ｋｂの断片を得る。このＰＣＲ産物の配列を決定し、この領域にｌｅｕＤ遺伝子がないことを確認する。
【実施例３】
【００９９】
ｒＢＣＧ株におけるＭ．ｔｂ抗原類の過剰発現
ＤＮＡ操作：
Ｍ．ｔｂ抗原類ＴＢ１０．４（Ｒｖ０２８８）、Ａｇ８５Ｂ（Ｒｖ１８８６ｃ）およびＡｇ８５Ａ（Ｒｖ３８０４ｃ）は、Ａｇ８５Ｂ＋Ｒｖ３１３０から得たプロモータを用いて、この順序でポリシストロンとして発現させる（Ｆｌｏｒｃｚｙｋほか、同上、２００３）。配列ＫＤＥＬを有するペプチドをコードするＤＮＡ配列類を、小胞体保持シグナルとして各抗原の末端に置き、各抗原について抗原提示性を向上させる。さらに、５´ループ構造および３´転写終止配列を置き、転写ポリシストロンｍＲＮＡの安定性を確保する。最後に、制限酵素ＰａｃＩ配列を用いて両端に隣接させ、発現カセットが容易に発現ベクター中にクローニングされるようにする。発現カセット中の全てのＤＮＡは、遺伝子合成により作製する（Ｐｉｃｏｓｃｒｉｐｔ社、ＴＸ）。発現カセットを、ＰａｃＩ部位を利用して発現ベクター中にクローニングする。大腸菌中で増幅させた後、プラスミドをＮｄｅＩで消化し、ｏｒｉＥとカナマイシン耐性遺伝子を除去し、その後消化して、ワンウェイシャトルシステムを新たに作製し、それを次に、標準的エレクトロポレーション操作を用いてマイコバクテリウムｌｅｕＤ栄養素要求性変異体に導入する（Ｐａｒｉｓｈほか、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４５：３４９７−３５０３；１９９９）。図３は、非抗生物質発現ベクターの例を概略、図示している。
【０１００】
非抗生物質選択システムを用いたＭ．ｔｂ抗原の発現：
非抗生物質選択システムの宿主として用いるロイシン栄養素要求性ＢＣＧ    Ｄａｎｉｓｈ  １３３１を、１０％ＯＡＤＣ（オレイン酸−アルブミン−デキストロース−カタラーゼ）、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｙｌｏｘａｐｏｌおよびロイシン５０μｇ／ｍｌを添加した７Ｈ９培地中で培養する。エレクトロポレーション後、抗原発現プラスミドを保有する組み換え株類を、ロイシンを含まない７Ｈ１０プレート（ＢＤ  Ｄｉｆｃｏ）に接種することによって単離する。菌の生存は、プラスミドによるｌｅｕＤ遺伝子の抗原発現に依存性で、それは、細胞中にプラスミドを保持するメカニズムとして次に作用する。生成したそれぞれのコロニーを単離し、上記の７Ｈ９培地で培養するが、ただし、ロイシン添加は行わなかった。
【０１０１】
発現の証明：
各抗原の発現は、ウェスタンブロット分析により検出する。具体的には、培養上清を採取し、先に記載したとおり処理する（Ｈａｒｔｈほか、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６５（６）：２３２１−２３２８；１９９７）。その後、発現した抗原をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、抗原８５Ａ，８５Ｂおよび１０．４に対する抗体でブロッティングする。各抗原の発現レベルは、発現プラスミド陰性宿主菌が産生したものと比較して各特異的バンドの強度を定量的に測定することによって、評価する。
【実施例４】
【０１０２】
抗生物質選択を行わないで、マイコバクテリア中で選択した抗原類を発現させること
【０１０３】
材料および方法：
エレクトロポレーション用プラスミドおよびマイコバクテリウム調製：
組み換えプラスミドＤＮＡを単離し、制限エンドヌクレアーゼＮｄｅＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で消化し、抗生物質選択マーカー（例  カナマイシン耐性）および大腸菌の複製開始点（ＯｒｉＥ）を放出させる。その後、消化したプラスミドＤＮＡ断片を、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用い製造業者の指示に従い環状にした。生成したプラスミドは、マイコバクテリウムの複製開始点と選択抗原類を含むが抗生物質耐性遺伝子を有さずグラム陰性菌で複製できず、それを、選択したマイコバクテリウムに導入した。エレクトロポレーション用マイコバクテリウムを調製するため、ＢＣＧ  Ｄａｎｉｓｈ  １３３１を、１０％ＯＡＤＣを添加したＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ９培地（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中３７℃で対数増殖相になるまで培養した。Ｔｙｌｏｘａｐｏｌ（０．０５％ｖ／ｖ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃａｔ．Ｎｏ．７０４００）を用いて菌を分散させた。その後細胞を１０％グリセロール＋０．０５％Ｔｙｌｏｘａｎｏｌで３回、洗浄し、エレクトロポレーション前に培地を除去した。各エレクトロポレーションのため、菌体１．２５×１０８についてプラスミド１．６μｇを用いた。エレクトロポレーションは、２．２ｋＶ，容量２５μＦおよび抵抗１．０ｋΩで行った。エレクトロポレーション後、細胞をすぐに１０倍希釈物としてＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ  ７Ｈ１０寒天（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）プレート上に置き、３７℃でインキュベーションした。
【０１０４】
発現プラスミドを保有する菌コロニーのＰＣＲスクリーニング：
組み換え株類は、最初に、フォーワードプライマーＧＴＴＡＡＧＣＧＡＣＴＣＧＧＣＴＡＴＣＧ（配列番号１）およびリバースプライマーＡＴＧＣＣＡＣＣＡＣＡＡＧＣＡＣＴＡＣＡ（配列番号２）を用いてＰＣＲによりスクリーニングし、発現プラスミド中においてｏｒｉＭ領域のＤＮＡ配列を増幅させる。ＰＣＲパラメータは下記のようであった：段階１：９５℃で４分間を１サイクル；段階２：９５℃で１分間、６０℃で１分間、およびその後７２℃で１分間を総計３０サイクル；段階３：７２℃で１０分間を１サイクル。段階４：４℃で保存。生成したＰＣＲ生成物は、アガロースゲル電気泳動で分析し、細胞中において前記プラスミド類の存在を証明した。
【０１０５】
結果
プラスミドの複製領域（ｏｒｉＭ）を増幅するために設計したＰＣＲを行い、生成したコロニーについて過剰発現プラスミドを保有しているか、スクリーニングした。この領域は菌染色体に存在していないので、細胞中にこの領域が存在することは、プラスミドが細胞中に導入されたことを強く示唆している。スクリーニングしたｒＢＣＧコロニー中、いくつかのコロニーがＰＣＲ産物を産生し、その産物は、大きさがプラスミド陽性対照反応のものと類似しており、そのことは、ゲル電気泳動で分析した。対照的に、親ＢＣＧ菌は図５に示したように、全くＰＣＲ産物を産生しなかった。この実験は、このプラスミドがマイコバクテリウム中にうまく取り込まれたことおよびこのプラスミドを保有する菌クローンが、抗生物質選択を用いることなく単離されたことを明らかに証明している。
【０１０６】
考察
組み換えマイコバテクリウム株類用従来のプラスミド類は、組み換えＤＮＡ実験で用途を有する必須プラスミド要素としての複製領域と選択マーカーを含む（通常、カナマイシン耐性遺伝子のような抗生物質耐性遺伝子または例えばｌｅｕＤまたはａｓｄのような代謝欠陥を補完する遺伝子（Ｇａｌａｎほか、Ｇｅｎｅ，９４：２９；１９９０））。通常は、抗生物質類を用いて組み換えプラスミド類を保有するクローン類を選択する。しかし、これにより、抗生物質耐性遺伝的修飾生物体を実験室内部に限定した以外の用途に使用しようとする場合、抗生物質耐性遺伝子類が意図に反して広がってしまうリスクがでてくる。
【０１０７】
上記の研究において、我々は抗原を発現できる組み換えプラスミドを導入したが、それは、ｏｒｉＥ領域も抗生物質選択マーカーも菌中に含まず、我々は、選択を行わないでも前記プラスミド保有クローン類単離に成功した。この実験では、プラスミド複製領域としてｏｒｉＭを用いたが、他のプラスミド複製領域も置換物として作用するであろうと考えており、例えばｐＭＦ１の複製領域である（Ｂａｃｈｒａｃｈほか、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１４６：２９７；２０００）。このシステム独自の利点は、この組み換えプラスミドがもはや抗生物質耐性遺伝子を有していないことである。したがって、一般的に使用する発現プラスミド類では起こることであるかもしれないが、意図せずに抗生物質耐性を環境にばら撒くということは、ありえない。さらに、本発明のワンウェイシャトルベクター発現プラスミドはもはや広範囲の宿主複製ができず、その理由は、このような複製を可能とする遺伝的要素が欠失しているからである。こうした制約がさらに、組み換えプラスミドにもうひとつの封じ込めレベルを付与し、従って、遺伝的修飾（ＧＭＯ）生物を環境中に放出することに関連したリスクを実質的に低下させる。
【０１０８】
この結果は、選択しないでも減弱マイコバクテリウム株類に組み換えプラスミド類を導入できることを明らかにしているが、他の要因も、選択マーカーを含まないプラスミドのマイコバクテリウム中における安定性になんらかの作用をしているのかも知れない。したがって、複製領域は、プラスミド複製を促進しプラスミドの同胞細胞への分離を媒介する遺伝子類を含み、それによって、選択を行わないでもこのプラスミドを保有するクローンを識別できるという能力に貢献している。
【０１０９】
選択を行わないでも前記プラスミドを保有するクローン類の単離ができる要因として、おそらく、この手法において細胞に対するプラスミド比が高いことがある。細胞に対して高比率のプラスミドを使用することで、細胞がプラスミドを取り込む確率を高め、プラスミドのない細胞の数を減少させる。本研究では、細胞に対するプラスミドの比が選択システムを用いる従来手法で通常利用するよりも約１０倍高かった。理論上、細胞に対するプラスミド比がこれよりもはるかに高いと、プラスミド保有クローンがはるかに多くなり、プラスミド飽和点に到達し、そうなると、エレクトロポレーションを行った細胞によるプラスミドＤＮＡの取り込みを阻害するであろう。本発明の好適な態様において、菌に対するプラスミドの比率は、約１．２５×１０８菌体に対して約０．５μｇ乃至約１０μｇのプラスミドＤＮＡの範囲にあり、好適には、約１．２５×１０８菌体に対して約１μｇ乃至約５μｇのプラスミドＤＮＡの範囲にある。
【０１１０】
さらに、プラスミドｐＡＦ１０５により過剰発現したＴＢ抗原類は、プラスミド安定化に重要な役割を果たすこともできる。このプラスミドは抗原８５複合体（Ａｇ８５Ａ（Ｒｖ３８０４ｃ）およびＡｇ８５Ｂ（Ｒｖ１８８６ｃ））中の２種のタンパク質を過剰発現するが、その両者ともに、細胞壁一体性を保持するために必須の主要構造であるトレハロースジマコレートの生合成に必要なマイコリルトランスフェラーゼ活性を有する。したがって、もしプラスミド保有細胞において増殖上の利点を与えることによって、これらの抗原類の少なくともひとつの過剰発現が、選択物を有さないプラスミドの安定性に寄与でき、従って、選択を行わないでも前記プラスミドを保有するクローン類が同定できるようになる。
【産業上の利用可能性】
【０１１１】
ワクチン性質を改良した結核ワクチン剤の製造に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】自殺ベクターｐＡＦ１０３のためのマップ。各ＤＮＡセグメントの意味は、下記のとおりである：Ｌ−ｆｌａｎｋおよびＲ−ｆｌａｎｋは、それぞれｌｅｕＤ遺伝子の左側および右側の隣接領域である；ａｐｈは、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｅｎｅ  ｂａｎｋアクセス番号：Ｘ０６４０２）であり、プラスミドにカナマイシン耐性を付与する；ｏｒｉＥは、ｐＵＣ複製開始点である（ｇｅｎｅ  ｂａｎｋアクセス番号ＡＹ２３４３３１）；ｂｌｅは、プラスミドに対してゼオシン（Ｚｅｏｃｉｎ）耐性を付与する遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｌ３６８５０）である；ｓａｃＢは、レバンシュークラーゼをコードする遺伝子であり（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号Ｙ４８９０４８）、ショ糖に対する感受性を前記菌に付与する；Ｐｈｓｐ６０は、熱ショックタンパク質遺伝子（すなわち、Ｒｖ０４４０）のプロモータ配列である；ＭＣＳは、示した制限酵素類の複数クローニング部位である；２個のＰａｃＩ部位間のカセットが、適用可能な際には他のエンドソーム溶解性の酵素類遺伝子で置き換えることができることに注意。
【図２】現在ある異なるワクチン株について、チャレンジ後の肺ＣＦＵ量によって測定した防御レベル。
【図３】組み換えマイコバクテリウムすなわちｒＢＣＧへの発現ベクター類導入のための非抗生物質発現ベクターの概略を示した。ｒＢＣＧで発現する遺伝子は、ｐａｃＩ部位を介してプラスミド中にクローニングする。ｒＢＣＧ中にエレクトロポレーションする前に、示した制限酵素類でプラスミドを消化し、ｏｒｉＥおよびＫａｎ領域を除去し、ワンウェイシャトルベクターを新たに作製する。ＤＮＡセグメントそれぞれの意味は下記のとおりである：ＰＲｖ３１３０は、抗原Ｒｖ３１３０ｃのプロモータ配列である；ＰＡｇ８５Ｂは、抗原８５Ｂ（すなわち、Ｒｖ１８８６ｃ）のプロモータ配列である；抗原Ｙは、マイコバクテリウム抗原ＴＢ１０．４（すなわち、Ｒｖ０２８８）である；Ａｇ８５Ｂは抗原８５ＢをコードするＤＮＡ配列である（すなわち、Ｒｖ１８８６ｃ）；Ａｇ８５Ａは、抗原８５Ａをコードする遺伝子である（すなわち、Ｒｖ３８０４ｃ）；ａｐｈは、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｅｎｅ  ｂａｎｋアクセス番号：Ｘ０６４０２）であり、それは、前記プラスミドにカナマイシン耐性を付与する；ｏｒｉＥは、ｐＵＣ複製開始点である（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋアクセス番号：ＡＹ２３４３３１）；ｌｅｕＤは、３−イソプロピルマレートデハイドラターゼをコードする遺伝子である（すなわち、Ｒｖ２９８７ｃ）；ｏｒｉＭは、マイコバクテリウム中の複製開始点である（Ｇｅｎｂａｎｋアクセス番号：Ｍ２３５５７）。
【図４】対立遺伝子交換の主要段階のフローチャート。
【図５】発現プラスミドの存在について選択したコロニーのＰＣＲ分析。ＰＣＲは、材料および方法に述べたように実施した。ＰＣＲ産物は、１．０％アガロースゲル中ゲル電気泳動で分析した。レーン１：ＤＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１Ｋｂ＋ＤＮＡ標準として用いた；レーン２：ＰＣＲテンプレート陰性対照；レーン３：ＢＣＧ  Ｄａｎｉｓｈ  １３３１株のＰＣＲ；レーン４から７：それぞれ５９、６１、６９および８４と番号を付したコロニーのＰＣＲ；レーン８：ブランクを入れたウェル；レーン９：オリジナルプラスミドのＰＣＲ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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