(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
黒人皮膚を免疫不全げっ歯類に移植してなることを特徴とするシミモデル動物。
【請求項２】
移植後約６ヶ月で、移植皮膚の５０〜６０％の面積が黒色となる請求項１記載の動物。
【請求項３】
黒色部分においてエンドセリン−１、ＳＣＦ及びＰＯＭＣから選ばれる少なくとも１種のサイトカインの遺伝子発現が上昇している請求項２記載の動物。
【請求項４】
シミが、老人性色素班、炎症後の色素沈着又はそばかすである請求項１〜３のいずれか１項記載の動物。
【請求項５】
黒人皮膚を免疫不全げっ歯類に移植し、少なくとも移植後６ヶ月間飼育することを特徴とするシミモデル動物の作製方法。
【請求項６】
請求項５の方法によって作製されたシミモデル皮膚。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項記載の動物を用いることを特徴とするシミ形成抑制剤又はシミ除去剤の評価又はスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、皮膚シミの評価のためのモデル動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
紫外線を皮膚に受けるとメラノサイトが活性化してメラニンの合成を促進し、このメラニンは有害な紫外線から皮膚を防御する働きを持つ。しかし、メラニンの合成は、皮膚の黒化を生じさせ、さらに皮膚の新陳代謝が悪くなると色素沈着化し、美容上のトラブルであるシミが形成される。従って、皮膚におけるメラニン合成系の研究やシミ形成を抑制又はシミを除去するための美白剤の評価に使用可能なモデルが必要とされている。
【０００３】
これまで、皮膚シミの評価のためのモデルとしては、三次元培養皮膚、褐色モルモット、C57blackマウス、有色ヘアレスマウス等が報告されている（非特許文献１〜４）。
【０００４】
三次元培養皮膚は、真皮に相当するコラーゲンなどの支持体の上にヒト由来のメラノサイトと表皮細胞（ケラチノサイト）が播種されたものであり、市販品も存在する（非特許文献４）。
しかしながら、三次元培養皮膚は、実際の皮膚とは明らかに異なっていることを前提とした状況下で研究を進める必要があり、最大でも２週間ぐらいしか評価できないという問題がある。
【０００５】
また、モデル動物では、ヒトと同様、表皮にメラノサイトが存在する褐色モルモットに紫外線（UVB）を照射すると、色素沈着が形成されることが明らかになって以来（非特許文献１）、当該褐色モルモットをモデルとして用いた研究が盛んに行われるようになっている（非特許文献５）。
また、有色ヘアレスマウスは、HRA:Skh-2などが知られており、褐色モルモットと同様に紫外線による色素沈着のモデルとして用いられている（非特許文献２）。
しかしながら、褐色モルモットにおいてはそれ自体の遺伝子情報がまだ明らかにされていないために、ある因子の機能を解析する際には他の種に対する抗体や遺伝子のプローブが使用できるかどうか否かその都度確認して行う必要がある。また、有色へアレスマウスにおいては、ヒトと比較した場合、表皮の厚さが明らかに異なるなどの問題がある。
【０００６】
このため、ヒト皮膚のメラニン合成系、特にシミの形成がより忠実に再現され、それが長期間安定的に維持されるモデルの創製が望まれていた。
【０００７】
【非特許文献１】Imokawa, G., Kawai, M., Mishima, Y., and Motegi, I. (1986) Differential analysis of experimental hypermelanosis induced by UVB, PUVA, and allergic contact dermatitis using a brownish guinea pig model. Arch. Dermatol. Res. 278, 352-362.
【非特許文献２】Welsh, B.M., Mason, R.S., and Halliday, G.M. (1999) Topical all-trans retinoic acid augments ultraviolet radiation-induced increases in activated melanocyte numbers in mice. J. Invest. Dermatol. 112, 271-278.
【非特許文献３】Kawaguchi, Y., Mori, N., and Nakayama, A. (2001) Kit(+) melanocytes seem to contribute to melanocyte proliferation after UV exposure as precursor cells. J. Invest. Dermatol. 116, 920-925.
【非特許文献４】Seiberg, M. (2001) Keratinocyte-melanocyte interactions during melanosome transfer. Pigment Cell Res. 4, 236-242.
【非特許文献５】Hachiya, A., Kobayashi, A., Ohuchi, A., Takema, Y., and Imokawa, G. (2001) The paracrine role of stem cell factor/c-kit signaling in the activation of human melanocytes in ultraviolet-B-induced pigmentation. J. Invest. Dermatol., 116, 578-586.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ヒト皮膚のシミ形成がより忠実に再現されたシミモデル動物を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、皮膚シミモデルについて種々検討したところ、黒人皮膚を免疫不全マウスに移植した場合に、シミと同様の色素沈着が形成されると共に、シミ部分においてみられるサイトカインの発現上昇や表皮肥厚が確認され、当該動物がシミモデル動物となり得ることを見出した。
【００１０】
本発明は、以下の発明に係るものである。
（１）黒人皮膚を非ヒト動物に移植してなることを特徴とするシミモデル動物。
（２）黒人皮膚を非ヒト動物に移植し、移植後少なくとも６ヶ月間飼育することを特徴とするシミモデル動物の作製方法。
（３）上記（１）の動物を用いることを特徴とするシミ形成抑制剤又はシミ除去剤の評価又はスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の動物は、シミの形成が忠実に再現され、それが長期間安定的に維持されるので、ヒト皮膚のシミモデルと成り得、当該モデルを用いれば、シミ形成抑制剤等の評価又はスクリーニングを行なうことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明のシミモデル動物は、黒人皮膚を非ヒト動物に移植することにより作製できる。
本発明に用いられる黒人皮膚は、黒人由来の皮膚（アフリカ系人種（African descent）又は、肌色の黒い人（dark skin））であれば新生児、子供又は成人等の何れの皮膚でもよく、その使用部位も限定されるものではない。例えば成人又は新生児の包皮、外科手術や病理解剖に採取された皮膚を用いることができ、入手の点から包皮を用いるのが好ましい。
【００１３】
本発明に用いられる非ヒト動物は、例えば、ネズミ、ウサギ、サル等の哺乳類が好ましく、哺乳類のうち、皮膚移植の簡便性の点から、例えばマウス、ラットやハムスター等のげっ歯類が好ましい。なお、非ヒト動物は、移植した皮膚が剥落するのを抑えるため、免疫能を抑制した動物又は免疫不全動物が好ましく、免疫不全動物がより好ましい。
免疫不全マウスとしては、例えば、SCIDマウス、BALBcA-nu/Scid、B-17/Icr-Scid等の免疫不全マウス、F344Jca-rnu等の免疫不全ラットが挙げられる。なお、免疫不全非ヒト動物を飼育する場合には、無菌条件下で行うことが好ましい。
【００１４】
黒人皮膚の移植は、公知の方法を用いればよい。例えば、以下に示す方法によって行えばよい。
黒人皮膚を全層又は分層の厚さで無菌的に採取する。採取した皮膚は、動物に移植するまで、無菌の生理的食塩水中、或いは適当な培養液、例えばＬ−グルタミン（L-glutamine）と抗生物質／抗カビ剤（antibiotic/antimycotic ）（Invitrogen, CA）を添加したＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）培養液にて、４〜２０℃で保存することができる。
次いで、移植動物をエーテル等で麻酔後、その背部に、例えば直径２〜３ｃｍ程度の皮膚の欠損部を作成する。この際、必要に応じて剃毛を行えばよい。その後、欠損部よりやや小さめの黒人皮膚移植片を動物の背部の皮膚欠損部に移植する。
次いで、常法に従い、モノフィラメント系、ナイロン等の好ましくは長鎖脂肪族ナイロン糸にて約５ｍｍ間隔で縫合する。この場合、移植片と欠損部位の形を同一にし、均一な張力で縫合することにより、移植片と移植床が密着し、移植片の生着を促進させることができる。
移植後、アミドタイプ等の局所麻酔薬を移植皮膚の境に投与し感覚脱失させて養生させる。通常、移植片が完全に生着するまでには、３〜１２週間を要する。
【００１５】
斯くして、移植された黒人皮膚移植片は、移植後７〜１５日で、当該皮膚から黒色が退色し、約１ヶ月には黒色部分は全体の２０％未満となる（図１）。その後、黒色部分は安定して増加し、移植後２ヶ月経過時点で２５〜４５％、移植後３ヶ月経過時点で３０〜５０％、移植後約４ヶ月経過時点で３５〜５５％、移植後約５ヶ月経過時点で４０〜６０％となり、移植後約６ヶ月経過時点で、平均して５０％以上、通常５０〜６０％の面積が黒色となる（図１）。その後、当該黒色部分はさらにほとんど増加することはなく比較的安定して維持される。
【００１６】
移植後約７ヶ月後の移植皮膚を、黒色部分と白色部分を含むように回収し、回収した皮膚をフォンタナ−マッソン（Fontana-Masson）染色し、皮膚の断面を観察すると、黒色部分のメラニン顆粒が染色した部分は、老人性色素斑と同様、表皮が顕著に肥厚している（図２）。
また、黒色部分では、メラニン合成に関するサイトカイン（例えば、エンドセリン−１〔（Endothelin-1）／その前駆体はプレプロエンドセリン−１（prepro-endothelin-1）〕；ＳＣＦ〔（stem cell factor）幹細胞因子〕；ＰＯＭＣ〔プロオピオメラノコルチン（pro-opiomelanocortin）／αメラニン細胞刺激ホルモン（α Melanocyte stimulating Hormone）の前駆体〕）遺伝子の発現が上昇している（図３）。
かように、本発明の皮膚移植において形成された黒色部分は、シミに見られるメラニン合成に関する特徴が酷似している。
【００１７】
従って、本発明の動物又はその移植皮膚を用いることにより、皮膚シミ形成の抑制又は形成されたシミを除去するための薬剤や化粧品等の評価又はスクリーニングを行うことができる。
例えば、本発明のシミモデル動物における移植皮膚の黒色部分（シミ部分）と白色部分（非シミ部分）の表皮由来のＲＮＡを解析し、エンドセリン−１、ＳＣＦ（幹細胞因子）、αメラニン細胞刺激ホルモン（ＰＯＭＣ（プロオピオメラノコルチン））等のサイトカインの遺伝子発現量を測定してそれを指標とすること、色差計を用いて皮膚色を測定してそれを指標とすること、或いは写真撮影若しくは肉眼観察を用いて皮膚色を比較してそれを指標とすることにより、シミ形成抑制剤又はシミ除去剤の評価又はスクリーニングが可能である。
なお、ここでいう「シミ」は、メラニンの生成により皮膚に過剰に色素が沈着した状態（hyperpigmentation）の広義を意味するが、「シミ」には、例えば老人性色素班、炎症後の色素沈着、そばかす等の色素沈着による皮膚の黒色化（pigment spot）が包含される。
【００１８】
上記のシミ形成抑制剤又はシミ除去剤の評価又はスクリーニングは、具体的には、被検物質の適量を、経皮(transepidermal)、表皮下投与(subepidermal)、注射、経口等の投与形態で本発明の動物に投与し、上記の効果を、判定することにより行うことができる。
【００１９】
具体的には、本発明のシミモデルマウスを移植２〜８ヶ月後飼育した後、前記所望の方法で被検物質を黒色部分に投与し、この部位におけるサイトカインの遺伝子発現量や皮膚色等を、コントロール（被検物質を含まないもの）のそれと比較し、サイトカインの遺伝子発現量が少ない、或いは皮膚明度（Ｌ＊値）が高い等の被検物質をシミ形成抑制剤又はシミ除去剤として評価又は選択することができる。
【実施例】
【００２０】
実施例１
１．移植皮膚の作成方法と黒色部経時的な変化
African descent由来の包皮をシンシナティ大学病院（University of Cincinnati Hospital）とキリスト病院（Christ Hospital）から受け取った後、ただちにリン酸緩衝溶液（Phosphate Buffered Saline）（PBS）で洗浄後、適当な大きさ（約1.5 cm×1.5 cm〜約2.0 cm×2.0 cm）にトリミング（trimming）した。動物施設に運ぶまでの間はＬ−グルタミン（L-glutamine）と抗生物質／抗カビ剤（antibiotic/antimycotic ）（Invitrogen, CA）を添加したＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Medium；Invitrogen, CA）中に浸漬させた。
【００２１】
4〜6週齢の雌のSCIDマウス（Taconic, NY）をシンシナティ小児科病院内の動物施設（Cincinnati Children's Hospital Medical Center, Cincinnati, OH）で実験の開始から終了まで病原体フリー（free）の状態で飼育した。
約1週間馴化した後、イソフルレン／酸素（isofluorane/oxygen）（3%/0.8 liter）を含む箱の中で麻酔し、バリカンとシェーバーでマウスの背部の毛を剃った。包皮移植の間はイソフルレン／酸素（2%/0.7 liter）を吸引させた。トリミングした包皮よりも若干大きめになるようにマウス背部皮膚を切除し（直径約2-3 cm）、常法に従いマウス皮膚と包皮を縫合した。移植した包皮とマウス皮膚の境界にはセンソーカイン（sensorcaine）を添加し、感覚脱失の処理を施した。移植後、マウスは1時間、もしくは麻酔から覚めるまで37℃にて維持した。
【００２２】
移植包皮は移植してから約1ヵ月後にマウス皮膚と完全に癒合するため、その時点からデジタルカメラを用いて、1ヶ月ごとに移植包皮を写真撮影し、黒色部分の面積を全体の面積に対する相対比で算出した。
図１に示したように移植後1ヶ月の時点では黒色部分の面積は全体の20%未満ではあるが、その後安定して増加し、移植後6ヶ月経過した時点では平均して50%以上の面積が黒色部分で覆われていることが明らかになった。その後はそのような安定した面積の増加が認められない移植包皮がほとんどであった。
【００２３】
２．移植皮膚の切片の比較
包皮を移植して黒色部分の面積増加が落ち着く約7ヶ月後に移植包皮を回収し、黒色部分と白色部分を含むように切片を作成した。切片作成後はメラニン顆粒をクリアーに検出できるようにフォンタナ−マッソン染色を常法に従い試みた。
ダラス（Dallas）にある研究所（contract laboratory）（Stephens & Associates）に依頼して入手した老人性色素斑（age spot）と比較したところ、移植包皮の黒色部分は老人性色素斑と同様、表皮が顕著に肥厚していることが明らかになった（図２）。
【００２４】
３．エンドセリン、SCF、POMCの発現
包皮を移植して約7ヶ月後に、移植包皮の黒い部分と白い部分から直径3 mmのパンチバイオプシーを用いてサンプルを回収し、RNAの分解を妨げるために直ちにＲＮＡ安定化試薬（RNAlater；Qiagen, Valencia, CA）に浸漬させ、その後キット（RNeasy micro kit；Qiagen）を用いて総RNA（total RNA）を回収した。常法に従いオリゴdT（oligo dT）とモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase）を用いてcDNAを合成後、メラニン合成における三大サイトカインとして知られているエンドセリン−１（Endothelin-1（プレポロエンドセリン−１；prepro-endothelin-1；Assay ID： Hs00174961_m1）、ＳＣＦ(Assay ID: Hs00241497_m1)、ＰＯＭＣ（proopiomelanocortin；プロオピオメラノコルチン）（αメラニン細胞刺激ホルモン（α Melanocyte Stimulating Hormone）の前駆体; Assay ID: Hs00174947_m1）遺伝子に特異的なプローブprobeと（TaqMan Gene Expression Assays）及びＰＣＲ試薬(TaqMan Gene Expression Master Mix）をApplied Biosystems（Foster City, CA）から購入して、シーケンス検出システム（ABI PRISM 7300 sequence detection system；（Applied Biosystems）を用いてリアルタイム（real-time）定量的RT-PCRを実施した。ＧＡＰＤＨ（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase（グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）；human GAPDH VIC-MGB No. 4326317E； Applied Biosystems）の発現を内部標準とした。
【００２５】
上記のサイトカインはシミ部位で発現が上昇していることが既に報告されているが（J Invest Dermatol 116: 578-586, 2001、J Invest Dermatol 122: 1256-1265, 2004、J Dermatol Sci 2: 120-123, 2005）、定量的RT-PCR解析の結果、黒い部分での上記全てのサイトカインの発現は白い部分と比較して高いことが明らかになった（図３）。特にSCFの発現は黒い部分で有意に（p<0.05）に高いことが明らかになった。
【００２６】
以上より、本発明の移植皮膚における黒色部分では、実際のシミ部位での発現上昇が確認されているエンドセリン−１（Endothelin-1（prepro-endothelin-1））、ＳＣＦ、ＰＯＭＣ遺伝子発現上昇が確認された。また、シミ部位は腫瘍壊死因子アルファ（tumor necrosis factor alpha）などの炎症性サイトカインの発現上昇（J Invest Dermatol 116: 571-577, 2001）や表皮肥厚を伴っていることが明らかになっているが、移植皮膚の黒色部分もシミ部位と同様に明瞭な表皮肥厚が観察された。
従って、移植皮膚とシミのメラニン合成に関する特徴は酷似している可能性が大きいと考えられる。
【００２７】
実施例２
上記の方法に従ってアフリカ系人種（African descent）由来の包皮を免疫不全マウスの背部に移植し、移植後６ヶ月経過したシミモデルマウスを用いてのシミ形成抑制剤又はシミ除去剤の評価又はスクリーニングについて検討を行った。
この際、シミ形成抑制剤として10μM  s-kit (R&D systems)を含むリン酸緩衝溶液(PBS)（以下、s-kitとする。）、コントロールとしてs-kitを含まないPBS（以下、PBSとする。）を用いた。当該s-kitは、SCFのシグナルを抑制することが知られており（D.D. Dahlen et al., Leukemia Research 25 (2001) 413-421）、シミ形成抑制作用又はシミ除去作用を有するものである。
シミモデルマウスの成着した皮膚の色素沈着部位に週に3回25μLの10μM s-kit （R&D systems)s-kit (R&D systems) を皮内投与しながら、投与開始０週、１週、２週目に皮膚外観の写真を撮影するとともに当該剤投与部位の皮膚明度（L*値）を色差計(Minolta CR-200)を用いて測定した。これと同時に当該剤を投与した箇所と異なる色素沈着部位にPBS25μLを同様に投与し、s-kit投与箇所とPBS投与箇所とで皮膚明度の比較を行った。色差計の結果は初期値との変化量（ΔL*値（０週のL*値−各週のL*値））で表した。
【００２８】
図４に示すように、シミ形成抑制作用のないPBS投与部位での皮膚明度は低下した（Δ
L*値の増加）。その一方で、シミ形成抑制作用のあるs-kit投与部位での皮膚明度は上昇した。
従って、当該シミモデル動物を用いれば、シミ形成抑制剤又はシミ除去剤の評価又はスクリーニングを行うことができる。また、当該シミモデル動物はヒトの皮膚を移植しているので、実際のヒトの皮膚に近い評価ができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】（Ａ）は、黒人包皮移植後の黒色面積の経時変化の写真である。（Ｂ）は、黒人包皮移植後の移植包皮全面積に対する黒色面積の割合の経時変化を示すグラフである。
【図２】移植包皮と老人性色素班のフォンタナマッソン（Fontana-Masson）染色を示す写真である。（Ａ）移植包皮。（Ｂ）老人性色素斑。
【図３】移植包皮の白色部分と黒色分におけるメラニン合成サイトカインの遺伝子発現量（mRNA量）を示すグラフである。（Ａ）ＳＣＦ（stem cell factor；幹細胞因子）。（Ｂ）エンドセリン−１（Endothelin-1）。（Ｃ）ＰＯＭＣ（（Pro-opiomelanocortin）プロオピオメラノコルチン／α Melanocyte stimulating Hormoneの前駆体）。
【図４】シミモデルマウスを用いてs-kitのシミ抑制効果を評価した結果を示す。（Ａ）左から投与前、最初の投与から１週間後及び２週間後の拡大写真である。上段；コントロール（PBS投与）、下段：s-kit投与。（Ｂ）PBS又はs-kitの投与した皮内投与部位の色差変化を示すグラフである。
【図３】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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