(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドに特異的に結合して該ポリペプチドの副腎皮質毛細管内皮細胞成長を刺激する能力を阻害する抗体を含む、副腎皮質毛細管内皮細胞の成長阻害剤であって、
前記ポリペプチドは、
図２６６（配列番号：３７１）に示されるアミノ酸配列を備え、さらにシグナルペプチドを伴う、または伴わないか、
ＡＴＣＣ受託番号２０３０９１で寄託された核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を備え、さらにシグナルペプチドを伴う、または伴わないか、
のいずれかである、
副腎皮質毛細管内皮細胞の成長阻害剤。
【請求項２】
請求項１記載の成長阻害剤において、
前記抗体はモノクローナル抗体である、成長阻害剤。
【請求項３】
請求項1または2記載の成長阻害剤において、
前記抗体はヒト化抗体である、成長阻害剤。
【請求項４】
ポリペプチドに特異的に結合して該ポリペプチドの副腎皮質毛細管内皮細胞成長を刺激する能力を阻害する抗体フラグメントを含む、副腎皮質毛細管内皮細胞の成長阻害剤であって、
前記ポリペプチドは、
図２６６（配列番号：３７１）に示されるアミノ酸配列を備え、さらにシグナルペプチドを伴う、または伴わないか、
ＡＴＣＣ受託番号２０３０９１で寄託された核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を備え、さらにシグナルペプチドを伴う、または伴わないか、
のいずれかである、
副腎皮質毛細管内皮細胞の成長阻害剤。
【請求項５】
請求項４記載の成長阻害剤において、
前記抗体フラグメントは、モノクローナル抗体フラグメントである、成長阻害剤。
【請求項６】
請求項４または５記載の成長阻害剤において、
前記抗体フラグメントは、ヒト化抗体フラグメントである、成長阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、新規なＤＮＡの同定及び単離、及び新規なポリペプチドの組換え生産に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞外タンパク質は、特に、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を担っている。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、泳動、分化又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び／又は直近の環境から受け取る情報に支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、翻って多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル分子は、通常は細胞分泌経路を通過して、細胞外環境におけるその作用部位に到達する。
【０００３】
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターを含む、様々な産業上の利用性を有している。血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び種々の他のサイトカインのような、現在入手可能な大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。それらのレセプターはまた、膜タンパクであり、治療又は診断薬剤としての潜在性を有する。新規な未変性分泌タンパク質を同定する努力が産業界及び学術界の両方によってなされている。多くの努力が新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc. Natl. Acad. Sci. 93;7108-7113(1996);米国特許第５５３６６３７号を参照されたい]。
【０００４】
膜結合タンパク質及びレセプターは、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を担っている。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化又は他の細胞との相互作用は、典型的には他の細胞及び／又は直近の環境から受け取られる情報に支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞-細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞の増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は、様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるプロテインチロシンキナーゼはまた成長因子レセプターとしても作用する。具体例には、繊維芽細胞増殖因子及び神経成長因子レセプターが含まれる。
【０００５】
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断薬を含む、様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター-リガンド間相互作用を阻止する治療薬として使用することができる。膜結合タンパク質はまた、関連するレセプター／リガンド間相互作用の可能性のあるペプチド又は小分子インヒビターをスクリーニングするために使用することもできる。
【０００６】
新規な未変性レセプタータンパク質を同定するための努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規なレセプタータンパク質のコード配列を同定するために、哺乳類の組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに注がれている。
【０００７】
ＰＲＯ１１８６
デンドロアスピスポリレピス(Dendroaspis polylepis)（ブラックマンバ）毒液からのプロテインＡは、１０の半システイン残基を含む８１アミノ酸を含む。毒液は、一方では武器として、他方では毒液又は類似の毒の効果を覆す又は阻害する薬剤を同定するアッセイにおける用途において興味深い。ブラックマンバ(black mamba)毒液は、非特許文献１及び非特許文献２に更に記載されている。
【０００８】
ここに我々は、ここでＰＲＯ１１８６ポリペプチドと命名する、ヘビ毒液プロテインＡに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定について記載する。
【０００９】
【非特許文献１】Int. J. Biochem., 17(6): 695-699 (1985)
【非特許文献２】Joubert及びStrydom, Hoppe Seylers Z Physiol. Chem., 361(12): 1787-1794 (1980)
【発明の開示】
【００１０】
本発明は、ポリペプチドに特異的に結合して該ポリペプチドの副腎皮質毛細管内皮細胞成長を刺激する能力を阻害する抗体を含む、副腎皮質毛細管内皮細胞の成長阻害剤であって、そのポリペプチドは、図２６６（配列番号：３７１）に示されるアミノ酸配列を備え、さらにシグナルペプチドを伴う、または伴わないか、ＡＴＣＣ受託番号２０３０９１で寄託された核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を備え、さらにシグナルペプチドを伴う、または伴わないか、のいずれかである、副腎皮質毛細管内皮細胞の成長阻害剤を提供する。
【００１１】
本発明は、ポリペプチドに特異的に結合して該ポリペプチドの副腎皮質毛細管内皮細胞成長を刺激する能力を阻害する抗体フラグメントを含む、副腎皮質毛細管内皮細胞の成長阻害剤であって、そのポリペプチドは、図２６６（配列番号：３７１）に示されるアミノ酸配列を備え、さらにシグナルペプチドを伴う、または伴わないか、ＡＴＣＣ受託番号２０３０９１で寄託された核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を備え、さらにシグナルペプチドを伴う、または伴わないか、のいずれかである、副腎皮質毛細管内皮細胞の成長阻害剤を提供する。
【００１２】
本発明は、ポリペプチドに特異的に結合して該ポリペプチドの副腎皮質毛細管内皮細胞成長を刺激する能力を阻害するアンタゴニストを含む、副腎皮質毛細管内皮細胞の成長阻害剤であって、そのポリペプチドは、図２６６（配列番号：３７１）に示されるアミノ酸配列を備え、さらにシグナルペプチドを伴う、または伴わないか、ＡＴＣＣ受託番号２０３０９１で寄託された核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を備え、さらにシグナルペプチドを伴う、または伴わないか、のいずれかである、副腎皮質毛細管内皮細胞の成長阻害剤を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
ＰＲＯ１１８６
ベノムプロテインＡと配列同一性を有し、本出願において「ＰＲＯ１１８６」と命名された新規なポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローン（ＤＮＡ６０６２１−１５１６）が同定された。
【００１４】
一実施態様では、ＰＲＯ１１８６ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子を提供する。
【００１５】
一態様では、単離された核酸は、（ａ）図２６６(配列番号：３７１)のアミノ酸残基約２０から約１０５の配列を有するＰＲＯ１１８６ポリペプチドコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる。
【００１６】
他の態様では、図２６５(配列番号：３７０)の残基約１４８から約４０５の核酸の相補鎖にハイブリッド形成するＤＮＡを含んでなるＰＲＯ１１８６ポリペプチドをコードする単離された核酸分子に関する。好ましくは、ハイブリッド形成は緊縮性ハイブリッド形成及び洗浄条件下で起こる。
【００１７】
さらなる態様では、（ａ）ＡＴＣＣ寄託番号２０３０９１のヒトタンパク質ｃＤＮＡ(ＤＮＡ６０６２１−１５１６)によりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するＤＮＡを含んでなる単離された核酸分子に関する。好適な実施態様では、核酸はＡＴＣＣ寄託番号２０３０９１のヒトタンパク質ｃＤＮＡ(ＤＮＡ６０６２１−１５１６)にコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡを含んでなる。
【００１８】
またさらなる態様では、（ａ）図２６６(配列番号：３７１)のアミノ酸残基約２０から約１０５の配列と少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、又は（ａ）のＤＮＡの相補鎖を含んでなる単離された核酸分子に関する。
【００１９】
さらなる態様では、少なくとも約５０のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約１００のヌクレオチドを有し、かつ（ａ）図２６６(配列番号：３７１)のアミノ酸残基約２０から約１０５の配列を有するＰＲＯ１１８６ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖と緊縮性条件下で被験ＤＮＡ分子をハイブリッド形成させ、ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）に対して少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する場合に、被験ＤＮＡ分子を単離することにより生産される単離された核酸分子に関する。
【００２０】
他の態様では、（ａ）図２６６(配列番号：３７１)の残基２０から約１０５のアミノ酸配列と比較したときに少なくとも約８０％ポジティブ、好ましくは少なくとも約８５％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約９０％ポジティブ、最も好ましくは少なくとも約９５％ポジティブのスコアのポリペプチドをコードするＤＮＡ、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡの相補鎖を含んでなる単離された核酸分子に関する。
【００２１】
他の実施態様は、ハイブリッド形成プローブとしての用途が見いだされるＰＲＯ１１８６ポリペプチドコード化配列の断片に関する。このような核酸断片は、約２０から約８０ヌクレオチド長、好ましくは約２０から約６０ヌクレオチド長、より好ましくは約２０から約５０ヌクレオチド長、最も好ましくは約２０から約４０ヌクレオチド長である。
【００２２】
他の実施態様では、上記した単離された核酸配列の任意のものによりコードされる単離されたＰＲＯ１１８６ポリペプチドを提供する。
【００２３】
特定の態様では、単離された天然配列ＰＲＯ１１８６ポリペプチドを提供し、それは一実施態様では、図２６６(配列番号：３７１)の残基２０から１０５を含むアミノ酸配列を含んでいる。
【００２４】
他の態様では、図２６６(配列番号：３７１)のアミノ酸残基２０から約１０５の配列に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＰＲＯ１１８６ポリペプチドに関する。
【００２５】
さらなる態様では、図２６６(配列番号：３７１)の残基２０から１０５のアミノ酸配列と比較したときに少なくとも約８０％ポジティブ、好ましくは少なくとも約８５％ポジティブ、より好ましくは少なくとも約９０％ポジティブ、最も好ましくは少なくとも約９５％ポジティブのスコアのアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＰＲＯ１１８６ポリペプチドに関する。
【００２６】
さらに他の態様では、図２６６(配列番号：３７１)のアミノ酸残基２０から約１０５の配列、又は抗-ＰＲＯ１１８６抗体に対する結合部位を提供するのに十分なその断片を含んでなる、単離されたＰＲＯ１１８６ポリペプチドに関する。好ましくは、ＰＲＯ１１８６断片は天然ＰＲＯ１１８６ポリペプチドの定性的生物活性を保持する。
【００２７】
また更なる態様では、（ｉ）（ａ）図２６６(配列番号：３７１)の約２０から約１０５のアミノ酸残基の配列を有するＰＲＯ１１８６ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖と、緊縮性条件下で被験ＤＮＡ分子をハイブリッド形成し、被験ＤＮＡ分子が（ａ）又は（ｂ）に対して少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する場合、（ｉｉ）ポリペプチドの発現に適した条件下で被験ＤＮＡ分子を含んでなる宿主細胞を培養し、（ｉｉｉ）細胞培養物からポリペプチドを回収することにより、生産されるポリペプチドを提供する。
【００２８】
さらに他の実施態様では、天然ＰＲＯ１１８６ポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストに関する。特定の実施態様では、アゴニスト又はアンタゴニストは抗-ＰＲＯ１１８６抗体である。
【００２９】
さらなる実施態様では、天然ＰＲＯ１１８６ポリペプチドを候補分子と接触させ、前記ポリペプチドによって媒介される生物学的活性をモニターすることによる、天然ＰＲＯ１１８６ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法に関する。
【００３０】
またさらなる実施態様では、ＰＲＯ１１８６ポリペプチド、又は上述したアゴニスト又はアンタゴニストを、製薬的に許容される担体とともに含んでなる組成物に関する。
【００３１】
他の実施態様では、上述の又は下記のポリペプチドの任意のものをコードするＤＮＡを含んでなるベクターを提供する。そのようなベクターを含んでなる宿主細胞もまた提供される。例を挙げると、宿主細胞はＣＨＯ細胞、大腸菌、又は酵母でありうる。上述の又は下記のポリペプチドの任意のものを生産するための方法が更に提供され、これは、所望のポリペプチドの発現に適した条件下で宿主細胞を培養し、細胞培養から所望のポリペプチドを回収することを含んでなる。
【００３２】
他の実施態様では、異種性ポリぺプチド又はアミノ酸配列に融合した上述の又は下記のポリペプチドの任意のものを含んでなるキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分子の例は、免疫グロブリンのＦｃ領域又はエピトープタグ配列に融合した上述の又は下記のポリペプチドの任意のものが含まれる。
【００３３】
他の実施態様では、上述の又は下記のポリペプチドの任意のものに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗体断片又は１本鎖抗体である。
【００３４】
さらに他の実施態様では、ゲノム及びｃＤＮＡヌクレオチド配列を単離するために有用なオリゴヌクレオチドプローブを提供し、ここでこれらプローブは上述の又は下記のヌクレオチド配列の任意のものから取り出されうる。
【００３５】
他の実施態様では、ＰＲＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子を提供する。
【００３６】
一態様では、単離された核酸分子は、（ａ）ここに開示された全長アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長アミノ酸配列又はここに開示した膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを有するＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８３％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８４％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８６％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８７％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８９％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９０％の酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９１％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９３％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９４％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９６％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９９％の配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含んでなる。
【００３７】
他の態様では、単離された核酸分子は、（ａ）ここに開示された全長ＰＲＯポリペプチドｃＤＮＡのコード配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長ＰＲＯポリペプチドｃＤＮＡのコード配列又はここに開示した膜貫通ＰＲＯポリペプチドの細胞外ドメインのコード配列、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８３％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８４％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８６％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８７％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８９％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９０％の酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９１％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９３％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９４％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９６％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９９％の配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含んでなる。
【００３８】
さらなる態様では、（ａ）ここに開示されたＡＴＴＣに寄託されたヒトタンパク質ｃＤＮＡの任意のものによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子、又は（ｂ）（ａ）のＤＮＡ分子の相補鎖に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８３％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８４％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８６％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８７％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８９％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９０％の酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９１％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９３％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９４％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９６％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９９％の配列同一性を有しているヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子に関する。
【００３９】
他の態様は、膜貫通ドメインが欠失されているか膜貫通ドメインが不活性化されているＰＲＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子を提供し、またはそのようなコードヌクレオチド配列に相補的であり、ここでそのようなポリペプチドの膜貫通ドメインがここに開示される。従って、ここに記載されたＰＲＯポリペプチドの可溶性細胞外ドメインが考慮される。
【００４０】
他の実施態様は、例えばハイブリッド形成プローブとしての又は抗ＰＲＯ抗体に対する結合部位を含んでなるポリペプチドを場合によってはコードするＰＲＯポリペプチドの断片をコードするための用途が見出されるＰＲＯポリペプチドコード配列の断片に関する。そのような核酸断片は通常少なくとも約２０のヌクレオチド長さ、好ましくは少なくとも約３０のヌクレオチド長さ、より好ましくは少なくとも約４０のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約５０のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約６０のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約７０のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約８０のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約９０のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約１００のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約１１０のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約１２０のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約１３０のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約１４０のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約１５０のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約１６０のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約１７０のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約１８０のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約１９０のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約２００のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約２５０のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約３００のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約３５０のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約４００のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約４５０のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約５００のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約６００のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約７００のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約８００のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約９００のヌクレオチド長さ、更により好ましくは少なくとも約１０００のヌクレオチド長さであり、ここで、「約」という用語は、その参照長さのプラス又はマイナス１０％の参照ヌクレオチド配列長さを意味する。ＰＲＯポリペプチドコードヌクレオチド配列の新規な断片は、多くのよく知られた配列アラインメントプログラムの任意のものを使用してＰＲＯポリペプチドコードヌクレオチド配列を他の既知のヌクレオチド配列にアラインメントさせ、どのＰＲＯポリペプチドコードヌクレオチド配列断片が新規であるかを決定することにより常套的に決定することができることに留意される。そのようなＰＲＯポリペプチドコードヌクレオチド配列の全てがここで考慮される。また考慮されるものは、これらのヌクレオチド分子断片によりコードされるＰＲＯポリペプチド断片、好ましくは抗ＰＲＯ抗体に対する結合部位を含んでなるＰＲＯポリペプチド断片である。
【００４１】
他の実施態様では、上記において特定した単離核酸配列の任意のものによりコードされる単離されたＰＲＯポリペプチドを提供する。
【００４２】
ある態様では、ここに開示された全長アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長アミノ酸配列又はここに開示した膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを有するＰＲＯポリペプチドに対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８３％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８４％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８６％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８７％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８９％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９０％の酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９１％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９３％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９４％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９６％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたＰＲＯポリペプチドに関する。
【００４３】
さらなる態様では、ここに開示されたＡＴＴＣに寄託されたヒトタンパク質ｃＤＮＡの任意のものによりコードされるアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８３％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８４％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８６％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８７％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約８９％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９０％の酸配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９１％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９２％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９３％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９４％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９６％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９７％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９８％の配列同一性、更により好ましくは少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる単離されたＰＲＯポリペプチドに関する。
【００４４】
さらなる態様では、ここに開示された全長アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長アミノ酸配列又はここに開示された膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを有するＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列と比較したとき、少なくとも約８０％のポジティブ、好ましくは少なくとも約８１％のポジティブ、より好ましくは少なくとも約８２％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約８３％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約８４％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約８５％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約８６％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約８７％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約８８％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約８９％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９０％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９１％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９２％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９３％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９４％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９５％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９６％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９７％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９８％のポジティブ、更により好ましくは少なくとも約９９％のポジティブのスコアを示すアミノ酸配列を含んでなる単離されたＰＲＯポリペプチドに関する。
【００４５】
特定の態様では、Ｎ末端シグナル配列及び／又は開始メチオニンを持たない単離されたＰＲＯポリペプチドを提供し、それは上述したそのようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によりコードされる。これを生産する方法もまたここに記載され、ここで、これらの方法はＰＲＯポリペプチドの発現に適した条件下で適当なコード化核酸分子を含むベクターを含んでなる宿主細胞を培養し、細胞培養からＰＲＯポリペプチドを回収することを含んでなる。
【００４６】
他の態様は、膜貫通ドメインが欠失されたか膜貫通ドメインが不活性化された単離されたＰＲＯポリペプチドを提供する。これを生産する方法もまたここに記載され、ここで、これらの方法はＰＲＯポリペプチドの発現に適した条件下で適当なコード化核酸分子を含むベクターを含んでなる宿主細胞を培養し、細胞培養からＰＲＯポリペプチドを回収することを含んでなる。
【００４７】
さらに他の実施態様では、ここで同定される天然ＰＲＯポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストに関する。特別な実施態様では、アゴニスト又はアンタゴニストは抗-ＰＲＯ抗体又は小分子である。
【００４８】
さらなる実施態様では、ＰＲＯポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法に関し、それは、ＰＲＯポリペプチドを候補分子と接触させ、前記ＰＲＯポリペプチドによって媒介される生物学的活性を監視することを含む。好ましくは、ＰＲＯポリペプチドは天然ＰＲＯポリペプチドである。
【００４９】
またさらなる実施態様では、ＰＲＯポリペプチド、又はここに記載するＰＲＯポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗-ＰＲＯ抗体を、担体と組み合わせて含有する物質の組成物に関する。場合によっては、担体は製薬的に許容される担体である。
【００５０】
他の実施態様は、上述のＰＲＯポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニスト又は抗ＰＲＯ抗体に応答性である症状の治療に有用な医薬の調製のための、ＰＲＯポリペプチド、またはそのアゴニスト又はアンタゴニスト又は抗ＰＲＯ抗体の使用に関する。
【００５１】
Ｉ．定義
ここで使用される際の「ＰＲＯポリペプチド」及び「ＰＲＯ」という用語は、直後に数値符号がある場合に種々のポリペプチドを指し、完全な符号（例えば、ＰＲＯ／数字）は、ここに記載する特定のポリペプチド配列を意味する。ここで使用される「ＰＲＯ／数字ポリペプチド」及び「ＰＲＯ／数字」は、天然配列ポリペプチド及び変異体（ここで更に詳細に定義する）を含む。ここの記載されるＰＲＯポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源といった種々の供給源から単離してもよく、組換え又は合成方法によって調製してもよい。
「天然配列ＰＲＯポリペプチド」は、天然由来の対応するＰＲＯポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列ＰＲＯポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列ＰＲＯポリペプチド」という用語には、特に、特定のＰＲＯポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列)、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びそのポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の種々の実施態様において、ここに開示されている天然配列ＰＲＯポリペプチドは、関連する図に示されている全長アミノ酸配列を含有する成熟又は全長天然配列ポリペプチドである。開始及び終止コドンは、太い書体及び下線で図中に示さている。しかし、関連する図に開示されているＰＲＯポリペプチドがメチオニン残基で開始すると図のアミノ酸位置１において示されている一方で、図のアミノ酸位置１より上流又は下流のいずれかに位置する他のメチオニン残基が、ＰＲＯポリペプチドの開始アミノ酸残基として用いられることが考えられるし可能である。
【００５２】
ＰＲＯポリペプチド「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」は、膜貫通及び細胞質ドメインを実質的に有しないＰＲＯポリペプチドの形態を意味する。通常、ＰＲＯポリペプチドＥＣＤは、それらの膜貫通及び／又は細胞質ドメインを１％未満、好ましくはそのようなドメインを０．５％未満しか持たない。本発明のＰＲＯポリペプチドについて同定された任意の膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのその型を同定するために当該分野において日常的に使用される基準に従い同定されることが理解されるであろう。膜貫通ドメインの厳密な境界は変わり得るが、最初に同定されたドメインのいずれかの末端から約５アミノ酸を越えない可能性が高い。従って、ＰＲＯポリペプチド細胞外ドメインは、場合によっては、実施例又明細書おいてに同定された膜貫通ドメインのいずれかの末端から約５を越えないアミノ酸を含みうるし、付着のシグナルペプチドを有する又は有しないそのようなポリペプチド及びそれらをコードする核酸は、本発明において考慮される。    
ここに開示する種々のＰＲＯポリペプチドの「シグナルペプチド」の適切な位置は、本明細書と添付の図面に示される。しかし、注記するように、シグナルペプチドのＣ-末端境界は変化しうるが、ここで最初に定義したようにシグナルペプチドＣ-末端境界のいずれかの側で約５アミノ酸未満である可能性が最も高く、シグナルペプチドのＣ-末端境界は、そのような型のアミノ酸配列成分を同定するのに日常的に使用される基準に従って同定しうる（例えば、Nielsen等, Prot. Eng. 10: 1-6 (1997)及びvon Heinje等, Nucl. Acids. Res. 14: 4683-4690 (1986)）。さらに、幾つかの場合には、分泌ポリペプチドからのシグナルペプチドの切断は完全に均一ではなく、一以上の分泌種をもたらすことも認められる。シグナルペプチドがここに定義されるシグナルペプチドのＣ-末端境界の何れかの側の約５アミノ酸未満内で切断されるこれらの成熟ポリペプチド、及びそれらをコードするポリヌクレオチドは、本発明で考慮される。
【００５３】
「ＰＲＯポリペプチド変異体」とは、上記又は下記に定義されるように、ここに開示される全長天然配列ＰＲＯポリペプチド、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、シグナルペプチド有無のここに開示されたＰＲＯの細胞外ドメイン又はここに開示された全長ＰＲＯポリペプチドの他の断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する活性ＰＲＯポリペプチドを意味する。このようなＰＲＯポリペプチド変異体には、例えば、全長天然アミノ酸配列のＮ-又はＣ-末端において一又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたＰＲＯポリペプチドが含まれる。通常、ＰＲＯポリペプチド変異体は、ここに開示される全長天然アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、シグナルペプチド有無のここに開示されたＰＲＯの細胞外ドメイン又はここに開示された全長ＰＲＯポリペプチドの他の断片と、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、そして、より好ましくは少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有している。通常は、ＰＲＯ変異体ポリペプチドは、少なくとも約１０アミノ酸長、より多くは少なくとも約２０アミノ酸長、より多くは少なくとも約３０アミノ酸長、より多くは少なくとも約４０アミノ酸長、より多くは少なくとも約５０アミノ酸長、より多くは少なくとも約６０アミノ酸長、より多くは少なくとも約７０アミノ酸長、より多くは少なくとも約８０アミノ酸長、より多くは少なくとも約９０アミノ酸長、より多くは少なくとも約１００アミノ酸長、より多くは少なくとも約１５０アミノ酸長、より多くは少なくとも約２００アミノ酸長、より多くは少なくとも約３００アミノ酸長、又はそれ以上である。
【００５４】
ここに定義されるＰＲＯポリペプチドに対してここで同定されている「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、ＰＲＯポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードが下記の表１に提供されている配列比較プログラムALIGN-2を使用することによって得られ。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、下記の表１に示したソースコードは米国著作権事務所, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2はジェネンテク社、South San Francisco, Californiaから好適に入手可能であり、下記の表１に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、UNIXオペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
【００５５】
アミノ酸配列比較にALIGN-2が用いれれる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた％アミノ酸配列同一性の計算の例として、「ＰＲＯ」が対象となる仮説的ＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「比較タンパク質」が対象となる「比較」タンパク質が比較されているアミノ酸配列を表し、そして「Ｘ」、「Ｙ」及び「Ｚ」の各々が異なった仮説的アミノ酸残基を表し、表２及び３は、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の「ＰＲＯ」と称されるアミノ酸配列に対する％アミノ酸配列同一性の計算方法を示す。
【００５６】
特に断らない限りは、ここでの全ての％アミノ酸配列同一性値は上記のようにALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％アミノ酸配列同一性値は、WU-BLAST-2コンピュータプログラム（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて決定してもよい。さらに、殆どのWU-BLAST-2検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62。ここでの目的のために、％アミノ酸配列同一性値は、（ａ）天然ＰＲＯポリペプチドから誘導された配列を有する対象とするＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列と、対象とする比較アミノ酸配列（即ち、対象とするＰＲＯポリペプチドが比較されるＰＲＯポリペプチド変異体であってもよい配列）との間の、WU-BLAST-2によって決定した一致する同一アミノ酸残基の数を、（ｂ）対象とするＰＲＯポリペプチドの残基の総数で除した商によって決定される。例えば、「アミノ酸配列Ｂに対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を持つ又は持っているアミノ酸配列Ａを含んでなるポリペプチド」という表現では、アミノ酸配列Ａが対象とする比較アミノ酸配列であり、アミノ酸配列Ｂが対象とするＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列である。
【００５７】
また、％アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2（Altschul等, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)）を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://ww.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードできる。NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ-値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62を含む。
アミノ酸配列比較にNCBI-BLAST2が用いれれる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
【００５８】
「ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチド」又は「ＰＲＯ変異体核酸配列」とは、下記に定義されるように、活性ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸分子であり、ここに開示する全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠いた全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、シグナルペプチド有無のここに開示するＰＲＯポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示する全長ＰＲＯポリペプチド配列の他の任意の断片をコードする核酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する。通常は、ＰＲＯ変異体ポリペプチドヌクレオチドは、ここに開示する全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠いた全長天然配列ＰＲＯポリペプチド配列、シグナルペプチド有無のここに開示するＰＲＯポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示する全長ＰＲＯポリペプチドの他の任意の断片をコードする核酸配列と、少なくとも約８０％の核酸配列同一性、好ましくは少なくとも約８１％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８２％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８３％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８４％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８５％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８６％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８７％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８８％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約８９％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９１％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９２％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９３％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９４％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９６％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９７％の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９８％の核酸配列同一性、そして、より好ましくは少なくとも約９９％の核酸配列同一性を有している。変異体は、天然ヌクレオチド配列を含まない。
通常は、ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約３０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約６０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約９０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約１２０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約１５０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約１８０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約２１０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約２４０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約２７０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約３００ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約４５０ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約６００ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約９００ヌクレオチド長、又はそれ以上である。
【００５９】
ここで同定されるＰＲＯコード化核酸配列に対する「パーセント(％)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、ＰＲＯ配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、ALIGN-2プログラム用の完全なソースコードが下記の表１に提供されている配列比較プログラALIGN-2を使用することによって得られ。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、下記の表１に示したソースコードは米国著作権事務所,
Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN-2はジェネンテク社、South San Francisco, Californiaから好適に入手可能であり、下記の表１に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、UNIXオペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
【００６０】
核酸配列比較にALIGN-2が用いれれる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアの核酸残基の数であり、ＺはＤの全核酸残基数である。
核酸配列Ｃの長さがアミノ酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた％核酸配列同一性の計算の例として、「ＰＲＯ−ＤＮＡ」が対象となる仮説的ＰＲＯコード化核酸配列を表し、「比較ＤＮＡ」が対象となる「ＰＲＯ−ＤＮＡ」核酸分子が比較されている核酸配列を表し、そして「Ｎ」、「Ｌ」及び「Ｖ」の各々が異なった仮説的アミノ酸残基を表し、表４及び５が「比較ＤＮＡ」と称される核酸配列の「ＰＲＯ−ＤＮＡ」と称される核酸配列に対する％核酸配列同一性の計算方法を示す。
【００６１】
特に断らない限りは、ここでの全ての％核酸配列同一性値は、直上のパラグラフに示したようにALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、％核酸配列同一性値は、WU-BLAST-2コンピュータプログラム（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて決定してもよい。さらに、殆どのWU-BLAST-2検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する：オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62。WU-BLAST-2が用いられた場合、％核酸配列同一性値は、（ａ）天然配列ＰＲＯポリペプチドコード化核酸から誘導された配列を有する対象とするＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列と、対象とする比較核酸配列（即ち、対象とするＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子が比較されるＰＲＯポリペプチド変異体であってもよい配列）との間の、WU-BLAST-2によって決定した一致する同一核酸残基の数を、（ｂ）対象とするＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子のヌクレオチドの総数で除した商によって決定される。例えば、「核酸配列Ｂに対して少なくとも８０％の核酸配列同一性を持つ又は持っている核酸配列Ａを含んでなるポリペプチド」という表現では、核酸配列Ａが対象とする比較核酸配列であり、核酸配列Ｂが対象とするＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列である。
【００６２】
また、％核酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2（Altschul等, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)）を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードできる。NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask＝可、鎖＝全て、予測される発生＝１０、最小低複合長＝１５／５、マルチパスｅ-値＝０．０１、マルチパスの定数＝２５、最終ギャップアラインメントのドロップオフ＝２５、及びスコアリングマトリクス＝BLOSUM62を含む。
核酸配列比較にNCBI-BLAST2が用いれれる状況では、与えられた核酸配列Ｃの、与えられた核酸配列Ｄとの、又はそれに対する％核酸配列同一性（あるいは、与えられた核酸配列Ｄと、又はそれに対して或る程度の％核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Ｃと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｗ／Ｚの１００倍
ここで、Ｗは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のＣ及びＤのアラインメントによって同一であると一致したスコアの核酸残基の数であり、ＺはＤの全核酸残基数である。核酸配列Ｃの長さが核酸配列Ｄの長さと異なる場合、ＣのＤに対する％核酸配列同一性は、ＤのＣに対する％核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
他の実施態様では、ＰＲＯ変異体ポリペプチドヌクレオチドは、活性ＰＲＯポリペプチドをコードし、好ましくは緊縮性ハイブリッド形成及び洗浄条件下で、ここに開示する全長ＰＲＯポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリッド形成する核酸分子である。ＰＲＯ変異体ポリペプチドは、ＰＲＯ変異体ポリヌクレオチドにコードされるものであってもよい。
【００６３】
「陽性（ポジティブ）」という用語は、上記のように実施された配列比較の中で、比較された配列において同一ではないが類似の特性を有している残基（例えば、保存的置換の結果として、下記の表６参照）を含む。ここでの目的のために、陽性の％値は、（ａ）天然ＰＲＯポリペプチドから誘導された配列を有する対象とするＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列と、対象とする比較アミノ酸配列（即ち、ＰＲＯポリペプチド配列が比較されるアミノ酸配列）との間の、WU-BLAST-2のBLOSUM62マトリクス内でポジティブな値を記録したアミノ酸残基の数を、（ｂ）対象とするＰＲＯポリペプチドのアミノ酸残基の総数で除した商によって決定される。
特に断らない限り、陽性の％値は、直上のパラグラフに記載したようにして計算される。WU-BLAST-2コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、ALIGN-2及びNCBI-BLAST2について上記したように実施されるアミノ酸配列同一性には、同一のみならず類似した特性をもつ配列におけるアミノ酸残基を含む。対象とするアミノ酸残基に対して陽性とされたアミノ酸残基は、対象とするアミノ酸残基と同一であるか、又は対象とするアミノ酸残基の好ましい置換（下記の表６に定義）であるものである。
ALIGN-2又はNCBI-BLAST2を用いたアミノ酸配列比較では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する陽性の％値（あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる）は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2又はNCBI-BLAST2のＡ及びＢのアラインメントによって陽性であるとされたスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対する％陽性は、ＢのＡに対する％陽性とは異なることが理解されるであろう。
【００６４】
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離されたポリペプチドには、ＰＲＯポリペプチドの自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
「単離された」ＰＲＯポリペプチドコード化核酸は、同定され、ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸の天然源に通常付随している少なくとも１つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離されたＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子は、天然の細胞中に存在するＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子とは区別される。しかし、単離されたＰＲＯポリペプチドコード化核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にあるＰＲＯポリペプチドを通常発現する細胞に含まれるＰＲＯポリペプチド核酸分子を含む。
【００６５】
「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００６６】
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、例えば、単一の抗-ＰＲＯポリペプチドモノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む)、多エピトープ特異性を持つ抗-ＰＲＯ抗体組成物、一本鎖抗-ＰＲＯ抗体、及び抗-ＰＲＯ抗体の断片を包含している（下記参照）。ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である集団から得られる抗体を称する。
ハイブリッド形成反応の「緊縮性」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補的鎖がその融点に近いがそれより低い環境に存在する場合における変性ＤＮＡの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリッド形成可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下させる。さらに、緊縮性は塩濃度に逆比例する。ハイブリッド形成反応の緊縮性の更なる詳細及び説明は、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
【００６７】
ここで定義される「緊縮性条件」又は「高度の緊縮性条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において0.015Ｍの塩化ナトリウム／0.0015Ｍのクエン酸ナトリウム／0.1％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；（２）ハイブリッド形成中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において５０％（v/v）ホルムアミドと0.1％ウシ血清アルブミン／0.1％フィコール／0.1％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いるもの；（３）４２℃における５０％ホルムアミド、５ｘSSC（0.75ＭのＮａＣｌ、0.075Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（pH6.8）、0.1％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（50μg/ml）、0.1％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸と、４２℃における0.2ｘＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中の洗浄及び５５℃での５０％ホルムアミド、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む0.1ｘSSCからなる高緊縮性洗浄を用いるものによって同定される。
「中程度の緊縮性条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989に記載されているように同定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリッド形成条件（例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度の緊縮性条件は、２０％ホルムアミド、５ｘSSC（150mMのＮａＣｌ、15mMのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハード液、１０％デキストラン硫酸、及び２０mg/mLの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、次いで１ｘＳＳＣ中３７−５０℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識するであろう。
【００６８】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したＰＲＯポリペプチド、又はそれらのドメイン配列を含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープ、又は幾つかの他の試薬によって同定できるエピトープを提供するに十分な数の残基を有しているが、その長さは対象とするＰＲＯポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０の残基)を有する。
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質（「アドヘシン」）の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインとを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である（即ち「異種の」）アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、IgG-1、IgG-2、IgG-3又はIgG-4サブタイプ、ＩｇＡ（IgA-1及びIgA-2を含む）、IgE、IgD又はIgMなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【００６９】
ここで意図している「活性な」及び「活性」とは、天然又は天然発生ＰＲＯポリペプチドの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持するＰＲＯの形態を意味し、「生物学的」活性とは、天然又は天然発生ＰＲＯによって生ずる（阻害性又は刺激性の）生物学的機能であって、天然又は天然発生ＰＲＯが有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を除くものを意味し、「免疫学的」活性とは、天然又は天然発生ＰＲＯが有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を意味する。
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然ＰＲＯポリペプチドの生物学的活性を阻止、阻害、又は中和する任意の分子を指す。同様に「アゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然ＰＲＯポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子を指す。好適なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は特に、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然ＰＲＯポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、有機小分子、などを含む。ＰＲＯポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法は、ＰＲＯポリペプチドを候補アンタゴニスト又はアゴニストと接触させ、ＰＲＯポリペプチドに通常付随する一又は複数の生物学的活性の変化を測定することを含みうる。
【００７０】
ここで使用される「治療」とは、治癒的処置、予防的療法及び防止的療法の両方を意味し、患者は標的とする病理学的状態又はしっかんを防止又は低下（減少）させられる。治療が必要なものとは、既に疾患に罹っているもの、並びに疾患に罹りやすいもの又は疾患が防止されているものを含む。
「慢性」投与とは、急性様式とは異なり連続的な様式での薬剤を投与し、初期の治療効果（活性）を長時間に渡って維持することを意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
治療の対象のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
一又は複数の治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時（同時期）及び任意の順序での連続した投与を含む。
【００７１】
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる用量及び濃度でそれらに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン；グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又は祖ルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、TWEEN（商品名)、ポリエチレングリコール（PEG）、及びPLURONICS(商品名)を含む。
【００７２】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Fab、Fab'、F(ab')２、及びFv断片；ダイアボディ(disbodies)；直鎖状抗体（Zapata等, Protein Eng. 8(10): 1057-1062 [1995]）；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
抗体のパパイン消化は、「Fab」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Fc」断片と命名される。ペプシン処理はF(ab')２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Fv」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、密接に非共有結合した１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。この配置において各ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬに量体の表面に抗原結合部位を決定する。正しくは、６つのＣＤＲｓが抗体にたいする抗原結合特異性を持つ。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分）でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。
またFab断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Fab断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されていることによりFab断片と相違する。ここで、Fab'-SHは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持つFab'を表す。F(ab')２抗体断片は、最初はFab'断片の対として生成され、それらの間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
【００７３】
任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる二つの明らかに異なる型の一方に分類される。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは異なるクラスに分類できる。免疫グロブリンの五つの主要なクラス：IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMがあり、それらの幾つかは更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばIgG1、IgG2、IgG3、  IgG4、IgA及びIgA2に分類される。
「一本鎖Fv」又は「sFv」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体断片を含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはsFVが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。scFvの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
用語「ダイアボディ(diabodies)」は、二つの抗原結合部位を持つ小型の抗体断片を指し、その断片は同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖の二つのドメイン間に対形成するには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは強制的に他の鎖の相補的ドメインと対形成して二つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは、例えば、EP 404,097; WO 93/11161; 及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)により十分に記載されている。
【００７４】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、（１）ローリ法(Lowry method)で測定した場合９５％を越える抗体、最も好ましくは９９重量％を越えるまで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのSDS-PAGEによる均一性まで精製される。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程により調製される。
「標識」なる語は、ここで用いられる場合、抗体に直接又は間接的に抱合して「標識」抗体を生成する検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識は、それ自身検出可能でもよく（例えば、放射性標識又は蛍光標識）、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変換を触媒してもよい。
「固相」とは、本発明の抗体がそれに付着することのできる非水性マトリクスを意味する。ここに意図する固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス（例えば、孔制御ガラス）、多糖類（例えばアガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。或る種の実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを構成することができ；その他では精製カラム（例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム）とすることもできる。また、この用語は、米国特許第4,275,149号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物（ＰＲＯポリペプチド又はその抗体など）の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。
「小分子」とは、ここで、約５００ダルトン未満の分子量を持つと定義される。
【００７５】
0005512073.tif 000002
【００７６】
0005512073.tif 000003
【００７７】
0005512073.tif 000004
【００７８】
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【００７９】
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【００８０】
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【００８１】
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【００８２】
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【００８３】
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【００８４】
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【００８５】
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【００８６】
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【００８７】
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【００８８】
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【００８９】
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【００９０】
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【００９１】
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【００９２】
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【００９３】
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【００９４】
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【００９５】
0005512073.tif 000022
【００９６】
ＩＩ.  本発明の組成物と方法
Ａ．全長ＰＲＯポリペプチド
本発明は、本出願でＰＲＯポリペプチドと呼ばれるポリペプチドをコードする新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に下記の実施例でさらに詳細に説明するように、種々のＰＲＯポリペプチドをコードするｃＤＮＡが同定され単離された。別々の発現ラウンドで生成されたタンパク質には異なるＰＲＯ番号が与えられるが、ＵＮＱ番号は全ての与えられたＤＮＡ及びコード化タンパク質に独特であり、変わることはないことを記しておく。しかしながら、単純化のために、本明細書において、ここに開示した全長天然核酸分子にコードされるタンパク質並びに上記のＰＲＯの定義に含まれるさらなる天然相同体及び変異体は、それらの起源又は調製形式に関わらず、「ＰＲＯ／番号」で呼称する。
下記の実施例に開示するように、種々のｃＤＮＡクローンがＡＴＣＣに寄託されている。これらのクローンの正確なヌクレオチド配列は、この分野で日常的な方法を用いて寄託されたクローンを配列決定することにより容易に決定することができる。予測されるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列から常套的技量を用いて決定できる。ここに記載したＰＲＯポリペプチド及びコード化核酸について、本出願人は、現時点で入手可能な配列情報と最も良く一致するリーディングフレームであると考えられるものを同定した。
【００９７】
１．全長ＰＲＯ２８１ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ２８１（ＵＮＱ２４４）と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ２８１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。  ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ２８１（図２及び配列番号：２に示す）がラットＴＥＧＴタンパク質と或る程度のアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ２８１が新規に同定されたＴＥＧＴ相同体であり、そのタンパク質に典型的な活性を有すると考えられている。
２．全長ＰＲＯ２７６ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ２７６（ＵＮＱ２４３）と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ２７６ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。  知りうる限り、ＤＮＡ１６４３５−１２０８配列はここでＰＲＯ２７６と命名される新規な因子をコードし；ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントプログラムを用いて、任意の公知のタンパク質に対して配列同一性を持たないことが明らかとなった。見出された配列同一性の同定は下記の実施例に列挙する。
【００９８】
３．全長ＰＲＯ１８９ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１８９と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１８９ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。本出願人の知識では、ＤＮＡ２１６２４−１３９１ヌクレオチド配列は新規な因子をコードし；ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、任意の公知のタンパク質に対して配列同一性を持たないことが明らかとなった。
４．全長ＰＲＯ１９０ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１９０と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１９０ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＰＲＯ１９０コード化クローンは、ヒト網膜ライブラリから単離した。本出願人の現在の知識では、ＤＮＡ２３３３４−１３９２ヌクレオチド配列は新規な多重膜貫通スパンニングタンパク質をコードし；ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、ＣＭＰ−シアル酸及びＵＤＰ−ガラクトーストランスポーターと或る程度の配列同一性があり、ＰＲＯ１９０がトランスポーターに関連すること及びＰＲＯ１９０が新規なトランスポーターでありうることを示している。
【００９９】
５．全長ＰＲＯ３４１ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ３４１（ＵＮＱ３００）と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ３４１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＤＮＡ２６２８８−１２３９クローンはヒト胎盤ライブラリから単離した。知りうる限り、ＤＮＡ２６２８８−１２３９配列はここでＰＲＯ３４１と命名される新規な因子をコードし；ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、任意の公知のタンパク質に対して有意な配列同一性を持たないことが明らかとなった。
６．全長ＰＲＯ１８０ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１８０（ＵＮＱ１５４）と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１８０ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＤＮＡ２６８４３−１３８９クローンはヒト胎盤ライブラリから、アミラーゼスクリーンから単離したＤＮＡ１２９２２から形成したオリゴを用いて単離した。知りうる限り、ＤＮＡ２６８４３−１３８９配列は、ここでＰＲＯ１８０と命名される新規な因子をコードする。
【０１００】
７．全長ＰＲＯ１９４ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１９４と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１９４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＰＲＯ１９４コード化クローンは、ヒト胎児肺ライブラリから単離した。本出願人の現在の知識では、ＤＮＡ２６８４４−１３９４ヌクレオチド配列は新規な因子をコードし；ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、任意の公知のタンパク質に対して有意な配列同一性を持たないことが明らかとなった。
８．全長ＰＲＯ２０３ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ２０３と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ２０３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ２０３がＧＳＴ  ＡＴＰａｓｅと配列同一性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ２０３ポリペプチドがＡＴＰａｓｅファミリーの新たに同定されたメンバーであり、ＧＳＴ  ＡＴＰａｓｅに典型的な活性を有すると考えられている。
【０１０１】
９．全長ＰＲＯ２９０ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ２９０と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ２９０ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
図２３（配列番号：３３）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いた、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ２９０アミノ酸配列と以下のＤａｙｈｏｆｆ配列との間の配列同一性が明らかになった：P_R99800, CC4H_HUMAN, YCS2_YEAST, CEF35G12_13, HSFAN_1, MMU52461_1, MMU70015_1, HSU67615_1, CET01H10_8及びCELT28F2_6。
現在では、ＰＲＯ２９０は上記のタンパク質の一又は複数に関連する細胞内タンパク質であると考えられている。
１０．全長ＰＲＯ８７４ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ８７４と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ８７４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＰＲＯ８７４コード化クローンは、ヒト胎児肺ライブラリから単離した。本出願人の現在の知識では、ＤＮＡ４０６２１−１４４０ヌクレオチド配列は新規な因子をコードする。しかし、ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、公知のタンパク質に対して或る程度の配列同一性が明らかとなった。
【０１０２】
１１．全長ＰＲＯ７１０ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ７１０と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ７１０ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ７１０がＣＤＣ４５タンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ７１０ポリペプチドが新たに同定されたＣＤＣ４５相同体であると考えられている。
１２．全長ＰＲＯ１１５１ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１５１と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１５１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、天然配列ＰＲＯ１１５１（図３０及び配列番号：４７に示す）がヒト３０ｋＤ脂肪細胞補体-関連前駆体タンパク質（ACR3 HUMAN）と或るアミノ酸配列同一性を有していることが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１１５１が補体タンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、そのファミリーに典型的な活性を有すると考えられている。
【０１０３】
１３．全長ＰＲＯ１２８２ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１２８２と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１２８２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
知りうる限り、ＤＮＡ４５４９５−１５５０配列は、ここでＰＲＯ１２８２と命名される新規な因子をコードする。ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、下記の実施例で議論するように、ＰＲＯ１２８２と他のロイシンリッチ反復タンパク質との間に或る程度の配列同一性が明らかとなり、ロイシンリッチ反復スーパーファミリーの新規なメンバーが同定されたことを示している。
１４．全長ＰＲＯ３５８ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ３５８と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、新規なヒトＴｏｌｌポリペプチド（ＰＲＯ３５８）をコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメント分析を用いて、本出願人は、ＰＲＯ３５８のコード化配列が、ＧｅｎＢａｎｋのＤＮＡ配列HSU_88540_1, HSU88878_1, HSU88879_1, HSU88880_1, HS88881_1, 及びHSU79260_1と有意な相同性を示すことを見出した。但し、HSU79260_1を除き、記載したタンパク質はヒトｔｏｌｌ様レセプターとして同定されている。
従って現在では、本出願で開示されたＰＲＯ３５８タンパク質は、ショウジョウバエタンパク質Ｔｏｌｌの新規に同定されたヒト相同体であり、適応免疫において重要な役割を担うであろうと考えられている。より詳細には、ＰＲＯ３５８は、炎症、敗血性ショック、及び病原に対する反応に含まれており、免疫反応によって悪化する多様な医学的状態、例えば、糖尿病、ＡＬＳ、癌、慢性関節リウマチ、及び潰瘍などにおいて役割を果たしうる。病原パターン認識レセプター、微生物上の保存された分子構造の存在の検知としてのＰＲＯ３８５の役割は、本出願で開示されるデータによって更に支持され、公知のヒトＴｏｌｌ様レセプター、ＴＬＲ２はＬＰＳシグナル伝達の直接メディエータであることを示している。
【０１０４】
１５．全長ＰＲＯ１３１０ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１３１０と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１３１０ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１３１０（図３６及び配列番号：６２に示す）は、カルボキシペプチダーゼＸ２と或るアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されたＰＲＯ１３１０が新規に同定されたカルボキシペプチダーゼファミリーのメンバーであり、カルボキシル末端アミノ酸除去活性を有すると考えられている。
１６．全長ＰＲＯ６９８ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ６９８と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ６９８ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ６９８ポリペプチドがオルファクトメジン(olfactomedin)タンパク質と有意な類似性を有することを見出した。従って、現在では、本出願で開示されたＰＲＯ６９８が新規に同定されたオルファクトメジン相同体であると考えられている。
【０１０５】
１７．全長ＰＲＯ７３２ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ７３２と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ７３２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ７３２ポリペプチドがヒト胎盤Ｄｉｆｆ３３タンパク質と有意な類似性を有することを見出した。従って、現在では、本出願で開示されたＰＲＯ７３２ポリペプチドが新規に同定されたＤｉｆｆ３３相同体であると考えられている。
１８．全長ＰＲＯ１１２０ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１２０と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１２０ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１１２０（図４７及び配列番号：８４に示す）は、Ｄａｙｈｏｆｆ（バージョン35.45 SwissProt 35）データベースで各々CELK09C4_1及びGL6S_HUMANと称される公知のスルファターゼと或るアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されたＰＲＯ１１２０が新規に同定されたスルファターゼファミリーのメンバーであり、スルファターゼの典型的な活性を有すると考えられている。
【０１０６】
１９．全長ＰＲＯ５３７ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ５３７と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ５３７ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＤＮＡ４９１４１−１４３１クローンはヒト胎盤ライブラリから、分泌タンパク質をコードするヌクレオチド配列のために選択する捕捉技術を用いて単離した。知りうる限り、ＤＮＡ４９１４１−１４３１配列は、ここでＰＲＯ５３７と命名される新規な因子をコードし；ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、任意の公知のタンパク質と有意な配列同一性が無いことが明らかになった。
２０．全長ＰＲＯ５３６ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ５３６と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ５３６ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＤＮＡ４９１４２−１４３０クローンはヒト乳児脳ライブラリから、分泌タンパク質をコードするヌクレオチド配列のために選択する捕捉技術を用いて単離した。知りうる限り、ＤＮＡ４９１４２−１４３０配列は、ここでＰＲＯ５３６と命名される新規な因子をコードし；ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、任意の公知のタンパク質と有意な配列同一性が無いことが明らかになった。
【０１０７】
２１．全長ＰＲＯ５３５ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ５３５と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ５３５ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ５３５（図５３及び配列番号：９９に示す）は、推定ペプチジル−プロリルイソメラーゼタンパク質とアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されたＰＲＯ５３５が新規に同定されたイソメラーゼタンパク質ファミリーのメンバーであり、これらのタンパク質に典型的な活性を有すると考えられている。
２２．全長ＰＲＯ７１８ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ７１８と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ７１８ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＰＲＯ７１８−コード化クローンはヒト胎児肺ライブラリから単離した。本出願人の知識では、ＤＮＡ４９６４７−１３９８ヌクレオチド配列は新規な因子をコードし；ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、任意の公知のタンパク質と有意な配列同一性が無いことが明らかになった。
【０１０８】
２３．全長ＰＲＯ８７２ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ８７２と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ８７２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ８７２ポリペプチドがデヒドロゲナーゼと配列同一性を有することを見出した。従って、現在では、本出願で開示されたＰＲＯ８７２ポリペプチドが新規に同定されたデヒドロゲナーゼファミリーのメンバーであり、デヒドロゲナーゼ活性を有すると考えられている。
２４．全長ＰＲＯ１０６３ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１０６３と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１０６３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ１０６３ポリペプチドがヒトＩＶ型コラゲナーゼタンパク質と有意な類似性を有することを見出した。従って、現在では、本出願で開示されたＰＲＯ１０６３ポリペプチドが新規に同定されたコラゲナーゼ相同体であると考えられている。
【０１０９】
２５．全長ＰＲＯ６１９ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ６１９と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ６１９ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ６１９（図６８及び配列番号：１１７に示す）は、ＶｐｒｅＢ３と或るアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されたＰＲＯ６１９が新規に同定されたＩｇＧスーパーファミリーのメンバーであり、発達中のＢ細胞に関連する代理の軽鎖の組立及び／又は成分に関連する活性を有すると考えられている。
２６．全長ＰＲＯ９４３ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ９４３と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ９４３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ９４３（図７０及び配列番号：１１９に示す）は、繊維芽成長因子レセプター-４タンパク質とアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されたＰＲＯ９４３が新規に同定された繊維芽成長因子レセプターファミリーのメンバーであり、このファミリーに典型的な活性を有すると考えられている。
【０１１０】
２７．全長ＰＲＯ１１８８ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１８８と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１８８ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
下記の実施例１で議論されるように、ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１１８８（図７２；配列番号：１２４に示す）は、ヌクレオチドピロホスホヒドロラーゼ（SSU83114_1）と或るアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されたＰＲＯ１１８８が新規に同定されたヌクレオチドホスホヒドロラーゼファミリーのメンバーであり、このタンパク質ファミリーに典型的な活性を有すると考えられている。
２８．全長ＰＲＯ１１３３ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１３３と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１３３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１１３３（図７４及び配列番号：１２９に示す）は、ネトリン(netrin)１ａ、Ｄａｙｈｏｆｆ登録AF002717_1と或るアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されたＰＲＯ１１３３がネトリンと少なくとも１つの関連するメカニズムを共有すると考えられている。
【０１１１】
２９．全長ＰＲＯ７８４ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ７８４と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ７８４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ７８４（図７６；配列番号：１３５に示す）は、ｓｅｃ２２相同体と或るアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されたＰＲＯ７８４が新規に同定されたｓｅｃ２２ファミリーのメンバーであり、ｓｅｃ２２ファミリーに典型的な小胞輸送活性を有すると考えられている。
３０．全長ＰＲＯ７８３ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ７８３と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ７８３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＰＲＯ７８３−コード化クローンはヒト胎児腎臓ライブラリから単離した。本出願人の現在の知識では、ＤＮＡ５３９９６−１４４２ヌクレオチド配列は新規な因子をコードする。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、公知のタンパク質と或る程度の配列同一性が見られた。
【０１１２】
３１．全長ＰＲＯ８２０ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ８２０と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ８２０ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ８２０の種々の部分が低親和性免疫グロブリンガンマＦｃレセプター、ＩｇＥ高親和性Ｆｃレセプター及び高親和性免疫グロブリンイプシロンレセプターと配列同一性を有することを見出した。従って、現在では、本出願で開示されたＰＲＯ８２０ポリペプチドがＦｃレセプターファミリーの新規に同定されたメンバーであると考えられている。
３２．全長ＰＲＯ１０８０ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１０８０と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１０８０ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラム、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 swissProt 35）を用いて、本出願人は、ＰＲＯ１０８０ポリペプチドが「YRY1_CAEEL」と称される３９．９ｋｄタンパク質、「AF0127149_5」と称されるＤｎａＪ相同体、「RNU95727_1」と称されるＤｎａＪ相同体２、及び「AF011793_1」と称されるＤｎａ３/Ｃｐｒ３と配列同一性を有することを見出した。従って、これらの結果は、本出願で開示されたＰＲＯ１０８０ポリペプチドがＤｎａＪ様タンパク質ファミリーの新規に同定されたメンバーであり、よってタンパク質生合成に含まれることを示している。
【０１１３】
３３．全長ＰＲＯ１０７９ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１０７９と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１０７９ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
知りうる限り、ＤＮＡ５６０５０−１４５５配列はここでＰＲＯ１０７９と命名される新規な因子をコードする。しかし、ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、公知のタンパク質に対して或る程度の配列同一性を持つことが明らかとなった。
３４．全長ＰＲＯ７９３ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ７９３と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ７９３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＤＮＡ５６１１０−１４３７クローンはヒト皮膚腫瘍ライブラリから単離した。知りうる限り、ＤＮＡ５６１１０−１４３７配列はここでＰＲＯ７９３と命名される新規な因子をコードし；ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、任意の公知のタンパク質に対して配列同一性を持たないことが明らかとなった。
【０１１４】
３５．全長ＰＲＯ１０１６ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１０１６と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１０１６ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ１０１６ポリペプチドがアシルトランスフェラーゼと配列同一性を有することを見出した。従って、現在では、本出願で開示されたＰＲＯ１０１６ポリペプチドがアシルトランスフェラーゼファミリーの新規に同定されたメンバーであり、このファミリーに典型的なアシル化能を有すると考えられている。
３６．全長ＰＲＯ１０１３ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１０１３と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１０１３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＰＲＯ１０１３−コード化クローンはヒト乳腫瘍組織ライブラリからのものである。よって、ＰＲＯ１０１３コード化クローンは癌に関連する分泌因子をコードしうる。本出願人の現在の知識では、ＤＮＡ５６４１０−１４１４ヌクレオチド配列は新規な因子をコードする。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、ＫＩＡＡ０１５７及びＰ１２０と或る程度の配列同一性が見られたＰＲＯ１０１３は成長因子及びサイトカインレセプターと共通の少なくとも１つの領域を有する。
【０１１５】
３７．全長ＰＲＯ９３７ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ９３７と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ９３７ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ９３７ポリペプチドがグリピカン(glypican)ファミリーのタンパク質と有意な配列同一性を有することを見出した。従って、現在では、本出願で開示されたＰＲＯ９３７ポリペプチドがグリピカンファミリーの新規に同定されたメンバーであり、グリピカンファミリーに典型的な特性を有すると考えられている。
３８．全長ＰＲＯ８４２ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ８４２と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ８４２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
知りうる限り、ＤＮＡ５６８５５−１４４７配列はここでＰＲＯ８４２と命名される新規な因子をコードする。しかし、ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、公知のタンパク質に対して或る程度の配列同一性を持つことが明らかとなった。
【０１１６】
３９．全長ＰＲＯ８３９ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ８３９と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ８３９ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
知りうる限り、ＤＮＡ５６８５９−１４４５配列はここでＰＲＯ８３９と命名される新規な因子をコードする。しかし、ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、公知のタンパク質に対して或る程度の配列同一性を持つことが明らかとなった。
４０．全長ＰＲＯ１１８０ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１８０と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１８０ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ１１８０ポリペプチドがメチルトランスフェラーゼと有意な配列同一性を有することを見出した。従って、現在では、本出願で開示されたＰＲＯ１１８０ポリペプチドがメチルトランスフェラーゼファミリーの新規に同定されたメンバーであり、このファミリーに典型的な活性を有すると考えられている。
【０１１７】
４１．全長ＰＲＯ１１３４ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１３４と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１３４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＤＮＡ５６８６５−１４９１クローンはヒト胎児肝臓ライブラリから、分泌タンパク質をコードするヌクレオチド配列を選択する捕捉技術を用いて単離した。即ち、ＤＮＡ５６８６５−１４９１クローンは分泌された因子をコードする。知りうる限り、ＤＮＡ５６８６５−１４９１配列はここでＰＲＯ１１３４と命名される新規な因子をコードし；ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、任意の公知のタンパク質に対して配列同一性を持たないことが明らかとなった。
４２．全長ＰＲＯ８３０ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ８３０と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ８３０ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＤＮＡ５６８６６−１３４２クローンはヒト胎児肝臓／脾臓ライブラリから、分泌タンパク質をコードするヌクレオチド配列を選択する捕捉技術を用いて単離した。即ち、ＤＮＡ５６８６６−１３４２クローンは分泌された因子をコードする。知りうる限り、ＤＮＡ５６８６６−１３４２配列はここでＰＲＯ８３０と命名される新規な因子をコードし；ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、任意の公知のタンパク質に対して配列同一性を持たないことが明らかとなった。
【０１１８】
４３．全長ＰＲＯ１１１５ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１１５と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１１５ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
知りうる限り、ＤＮＡ５６８６８−１４７８配列はここでＰＲＯ１１１５と命名される新規な因子をコードする。しかし、ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、公知のタンパク質に対して或る程度の配列同一性を持つことが明らかとなった。
４４．全長ＰＲＯ１２７７ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１２７７と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１２７７ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１２７７（図１１３及び配列番号：１７９に示す）は、Ｃｏｃｈ-５Ｂ２タンパク質（Ｄａｙｈｏｆｆデータベースで「AF012252_1」と称する）と或るアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されたＰＲＯ１２７７が新規に同定されたＣｏｃｈ-５Ｂ２タンパク質ファミリーのメンバーであり、Ｃｏｃｈ-５Ｂ２と同様の活性及び特性を有すると考えられている。
【０１１９】
４５．全長ＰＲＯ１１３５ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１３５と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１３５ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ１１３５ポリペプチドがアルファ１，２-マンノシダーゼタンパク質と有意な類似性を有することを見出した。従って、現在では、本出願で開示されたＰＲＯ１１３５ポリペプチドがマンノシダーゼ酵素ファミリーの新規に同定されたメンバーであり、このファミリーのタンパク質に典型的な活性を有すると考えられている。
４６．全長ＰＲＯ１１１４ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプターと称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプターポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１１１４（図１１７及び配列番号：１８３に示す）は、他の公知のインターフェロンレセプターと配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、ＰＲＯ１１１４インターフェロンレセプターがインターフェロンレセプターに典型的な活性を有すると考えられている。
【０１２０】
４７．全長ＰＲＯ８２８ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ８２８と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ８２８ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ８２８ポリペプチドがグルタチオンペルオキシダーゼと配列同一性を有することを見出した。従って、現在では、本出願で開示されたＰＲＯ８２８ポリペプチドがグルタチオンペルオキシダーゼファミリーの新規に同定されたメンバーであり、ペルオキシダーゼ活性及びグルタチオンペルオキシダーゼに典型的な他の活性を有すると考えられている。
４８．全長ＰＲＯ１００９ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１００９と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１００９ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１００９（図１２２及び配列番号：１９４に示す）は、「F69893」と称される長鎖アシル-ＣｏＡシンセターゼ相同体と或るアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１００９が長鎖アシル-ＣｏＡシンセターゼファミリーの新規に同定されたメンバーであり、このファミリーに関連する活性を有すると考えられている。
【０１２１】
４９．全長ＰＲＯ１００７ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１００７と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１００７ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ１００７ポリペプチドがＭＡＧＰＩＡＰと配列同一性を有することを見出した。従って、現在では、本出願で開示されたＰＲＯ１００７ポリペプチドがＭＡＧＰＩＡＰファミリーの新規に同定されたメンバーであり、転移及び／又は細胞シグナル伝達及び／又は細胞複製に関連すると考えられている。
５０．全長ＰＲＯ１０５６ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１０５６と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１０５６ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１０５６（図１２７及び配列番号：１９９に示す）は、塩素イオンチャンネルタンパク質とアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１０５６が新規に同定された塩素イオンチャンネルタンパク質相同体であると考えられている。
【０１２２】
５１．全長ＰＲＯ８２６ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ８２６と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ８２６ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＤＮＡ５７６９４−１３４１クローンはヒト胎児心臓ライブラリから、分泌タンパク質をコードするヌクレオチド配列を選択する捕捉技術を用いて単離した。即ち、ＤＮＡ５７６９４−１３４１クローンは分泌された因子をコードする。知りうる限り、ＤＮＡ５７６９４−１３４１配列はここでＰＲＯ８２６と命名される新規な因子をコードし；ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、任意の公知のタンパク質に対して有意な配列同一性を持たないことが明らかとなった。
５２．全長ＰＲＯ８１９ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ８１９と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ８１９ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＤＮＡ５７６９５−１３４０クローンはヒト胎児肝臓脾臓ライブラリから、分泌タンパク質をコードするヌクレオチド配列を選択する捕捉技術を用いて単離した。即ち、ＤＮＡ５７６９５−１３４０クローンは分泌された因子をコードする。知りうる限り、ＤＮＡ５７６９５−１３４０配列はここでＰＲＯ８１９と命名される新規な因子をコードし；ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、任意の公知のタンパク質に対して有意な配列同一性を持たないことが明らかとなった。
【０１２３】
５３．全長ＰＲＯ１００６ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１００６と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１００６ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＰＲＯ１００６−コード化クローンはヒト子宮ライブラリから単離した。本出願人の現在の知識では、ＤＮＡ５７６９９−１４１２ヌクレオチド配列は新規な因子をコードし；ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、推定チロシンタンパク質キナーゼとの或る程度の配列同一性が明らかになった。
５４．全長ＰＲＯ１１１２ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１１２と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１１２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。出願人の現在の知識では、ＤＮＡ５７７０２−１４７６ヌクレオチド配列は新規な因子をコードするが、ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、他の公知のタンパク質に対して或る程度の配列同一性が見出された。
【０１２４】
５５．全長ＰＲＯ１０７４ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１０７４と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１０７４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ１０７４ポリペプチドがグリコシルトランスフェラーゼと配列同一性を有することを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１０７４ポリペプチドが新規に同定されたグリコシルトランスフェラーゼファミリーのメンバーであり、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有すると考えられている。
５６．全長ＰＲＯ１００５ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１００５と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１００５ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
知りうる限り、ＤＮＡ５７７０８−１４１１配列はここでＰＲＯ１００５と命名される新規な因子をコードする。しかし、ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、公知のタンパク質に対して或る程度の配列同一性が明らかとなった。
【０１２５】
５７．全長ＰＲＯ１０７３ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１０７３と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１０７３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
知りうる限り、ＤＮＡ５７７１０配列はここでＰＲＯ１０７３と命名される新規な因子をコードする。しかし、ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、公知のタンパク質に対して或る程度の配列同一性が明らかとなった。
５８．全長ＰＲＯ１１５２ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１５２と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１５２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＤＮＡ５７７１１−１５０１クローンはヒト乳児脳ライブラリから単離した。知りうる限り、ＤＮＡ５７７１１−１５０１配列はここでＰＲＯ１１５２と命名される新規な因子をコードし；ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、任意の公知のタンパク質に対して有意な配列同一性を持たないことが明らかとなった。
【０１２６】
５９．全長ＰＲＯ１１３６ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１３６と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１３６ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１１３６（図１４７及び配列番号：２１９に示す）は、ＰＤＺドメイン含有タンパク質とアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１１３６が新規に同定されたＰＤＺドメイン含有タンパク質ファミリーのメンバーであり、このファミリーに典型的な活性を有すると考えられている。
６０．全長ＰＲＯ８１３ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ８１３と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ８１３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ８１３ポリペプチドが肺胞界面活性物質関連プロテインＣと有意な類似性を有することを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ８１３ポリペプチドが新規に同定された肺胞界面活性物質関連プロテインＣ相同体であると考えられている。
【０１２７】
６１．全長ＰＲＯ８０９ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ８０９と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ８０９ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。出願人の現在の知識では、ＤＮＡ５７８３６−１３３８ヌクレオチド配列は新規な因子をコードする。
６２．全長ＰＲＯ７９１ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ７９１と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ７９１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。出願人の現在の知識では、ＤＮＡ５７８３８−１３３７ヌクレオチド配列は新規な因子をコードし；しかし、ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、ＭＨＣ-１抗原との或る程度の配列同一性が明らかとなり、ＰＲＯ７９１が構造及び機能においてそれに関連しうることを示している。
【０１２８】
６３．全長ＰＲＯ１００４ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１００４と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１００４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
知りうる限り、ＤＮＡ５７８４４−１４１０配列はここでＰＲＯ１００４と命名される新規な因子をコードする。しかし、ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、公知のタンパク質に対して或る程度の配列同一性が明らかとなった。
６４．全長ＰＲＯ１１１１ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１１１と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１１１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１１１１（図１５７及び配列番号：２２９に示す）は、ＬＩＧと或るアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１１１１が新規に同定されたこの糖タンパク質ファミリーのメンバーであると考えられている。
【０１２９】
６５．全長ＰＲＯ１３４４ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１３４４と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１３４４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１３４４（図１５９及び配列番号：２３１に示す）は、カルシノスコルピオス・ロツンジカウダ(Carcinoscorpious rotundicauda)の因子Ｃタンパク質と或るアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１３４４が新規に同定された因子Ｃタンパク質であり、そのタンパク質に典型的な活性を有すると考えられている。
６６．全長ＰＲＯ１１０９ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１０９と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１０９ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１１０９（図１６１及び配列番号：２３６に示す）は、ヒトＵＰＤ-Ｇａｌ：ＧｌｃＮＡｃガラクトシルトランスフェラーゼタンパク質と或るアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１１０９が新規に同定されたβ-ガラクトシルトランスフェラーゼ酵素であり、それらの酵素に典型的な活性を有すると考えられている。
【０１３０】
６７．全長ＰＲＯ１３８３ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１３８３と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１３８３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１３８３（図１６３及び配列番号：２４１に示す）は、推定ヒト膜貫通タンパク質ｎｍｂ前駆体（NMB_HUMAN）と或るアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１３８３が新規に同定されたｎｍｂ相同体であると考えられている。
６８．全長ＰＲＯ１００３ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１００３と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１００３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＰＲＯ１００３−コード化クローンはヒト乳腫瘍組織ライブラリから単離した。ＰＲＯ１００３−コード化クローンは、分泌タンパク質をコードするヌクレオチド配列を選択する捕捉技術を用いて単離した。よって、ＰＲＯ１００３コード化クローンは分泌因子をコードしうる。本出願人の現在の知識では、ＵＮＱ４８７（ＤＮＡ５８８４６−１４０９）ヌクレオチド配列は新規な因子をコードし；ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、任意の公知のタンパク質と配列同一性が無いことが明らかになった。
【０１３１】
６９．全長ＰＲＯ１１０８ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１０８と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１０８ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ１１０８ポリペプチドがＬＰＡＡＴタンパク質と有意な類似性を有することを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１１０８が新規に同定されたＬＰＡＡＴ相同体であると考えられている。
７０．全長ＰＲＯ１１３７ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１３７と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１３７ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ１１３７ポリペプチドがリボシルトランスフェラーゼと配列同一性を有することを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１１３７ポリペプチドが新規に同定されたリボシルトランスフェラーゼファミリーのメンバーであり、リボシルトランスフェラーゼ活性を有すると考えられている。
【０１３２】
７１．全長ＰＲＯ１１３８ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１３８と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１３８ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ１１３８ポリペプチドがＣＤ８４白血球抗原と配列同一性を有することを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１１３８ポリペプチドが新規に同定されたＩｇスーパーファミリーのメンバーであり、Ｉｇスーパーファミリーの他のメンバーに典型的な活性を有すると考えられている。
７２．全長ＰＲＯ１０５４ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１０５４と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１０５４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１０５４（図１７４及び配列番号：２５６に示す）は、一又は複数の主要な尿タンパク質とアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１０５４が新規に同定されたＭＵＰファミリーのメンバーであり、そのファミリーに典型的な活性を有すると考えられている。
【０１３３】
７３．全長ＰＲＯ９９４ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ９９４と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ９９４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ９９４（図１７６及び配列番号：２５８に示す）は、腫瘍関連抗原Ｌ６とアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ９９４が新規に同定されたＬ６抗原相同体であると考えられている。
７４．全長ＰＲＯ８１２ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ８１２と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ８１２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ８１２（図１７８及び配列番号：２６０に示す）は、前立腺ステロイド−結合ｃ１タンパク質とアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ８１２が新規に同定された前立腺ステロイド−結合ｃ１タンパク質相同体であると考えられている。
【０１３４】
７５．全長ＰＲＯ１０６９ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１０６９と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１０６９ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ１０６９ポリペプチドがＣＨＩＦと配列同一性を有することを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１０６９ポリペプチドが新規に同定されたＣＨＩＦポリペプチドであり、イオン伝導又はイオン伝導の調節に含まれると考えられている。
７６．全長ＰＲＯ１１２９ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１２９と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１２９ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ１１２９ポリペプチドがチトクロムＰ-４５０ファミリーのタンパク質と有意な類似性を有することを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１１２９が新規に同定されたチトクロムＰ-４５０ファミリーのメンバーであり、そのファミリーに典型的な活性を有すると考えられている。
【０１３５】
７７．全長ＰＲＯ１０６８ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１０６８と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１０６８ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１０６８は、ウロテンシンとアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１０６８が新規に同定されたウロテンシンファミリーのメンバーであり、ウロテンシンファミリーに典型的な活性を有すると考えられている。
７８．全長ＰＲＯ１０６６ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１０６６と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１０６６ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＰＲＯ１０６６−コード化クローンはヒト膵臓腫瘍組織ライブラリから、分泌タンパク質をコードするヌクレオチド配列を選択する捕捉技術を用いて単離した。即ち、ＰＲＯ１０６６−コード化クローンは分泌因子をコードする。本出願人の現在の知識では、ＤＮＡ５９２１５−１４２５ヌクレオチド配列は新規な因子をコードし；ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、任意の公知のタンパク質と配列同一性が無いことが明らかになった。
【０１３６】
７９．全長ＰＲＯ１１８４ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１８４と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１８４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。本出願人の現在の知識では、ＤＮＡ５９２２０−１５１４ヌクレオチド配列は新規な分泌因子をコードする。
８０．全長ＰＲＯ１３６０ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１３６０と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１３６０ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
知りうる限り、ＤＮＡ５９４８８−１６０３配列はここでＰＲＯ１３６０と命名される新規な因子をコードし；ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、任意の公知のタンパク質に対して有意な配列同一性が無いことが明らかとなった。以下の実施例に示すように、幾分の配列同一性は見られた。
【０１３７】
８１．全長ＰＲＯ１０２９ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１０２９と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１０２９ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＤＮＡ５９４９３−１４２０クローンはヒト胎児肝臓脾臓ライブラリから、分泌タンパク質をコードするヌクレオチド配列を選択する捕捉技術を用いて単離した。即ち、ＤＮＡ５９４９３−１４２０クローンは分泌因子をコードする。知りうる限り、ＤＮＡ５９４９３−１４２０配列はここでＰＲＯ１０２９と称される新規な因子をコードし；ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、任意の公知のタンパク質と配列同一性が無いことが明らかになった。
８２．全長ＰＲＯ１１３９ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１３９と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１３９ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、最初に同定されたＰＲＯ１１３９ポリペプチドが、Bailleul等, Nucleic Acids Res. 25, 2752-2758 (1997)(EMBL登録番号: Y12670)に記載されたＯＢレセプター関連タンパク質HSOBRGRP_1と有意な配列相同性を示すことを見出した。
【０１３８】
８３．全長ＰＲＯ１３０９ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１３０９と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１３０９ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１３０９（図１９６及び配列番号：２７８に示す）は、Ｄａｙｈｏｆｆ表記AB007876_1で与えられる、ＫＩＡＡ０４１６と称されるタンパク質と或るアミノ酸配列同一性を有することが見出された。さらに、ＰＲＯ１３０９はロイシンリッチ反復を有し、従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１３０９が新規に同定されたロイシンリッチ反復ファミリーのメンバーであり、タンパク質タンパク質相互作用に含まれると考えられている。
８４．全長ＰＲＯ１０２８ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１０２８と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１０２８ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。本出願人の現在の知識では、ＤＮＡ５９６０３−１４１９ヌクレオチド配列は新規な因子をコードする。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムは、「A53050」と称するもののようなタンパク質との或る程度の配列同一性を示した。
【０１３９】
８５．全長ＰＲＯ１０２７ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１０２７と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１０２７ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＰＲＯ１０２７−コード化クローンはヒト子宮頸部組織ライブラリから単離した。本出願人の現在の知識では、ＤＮＡ５９６０５−１４１８ヌクレオチド配列は新規な因子をコードする。
８６．全長ＰＲＯ１１０７ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１０７と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１０７ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ１１０７ポリペプチドがＰＣ-１タンパク質、ヒトインシュリンレセプターチロシンキナーゼインヒビター、アルカリホシホジエステラーゼ、及び自己毒素と或る程度の類似性を有することを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１１０７ポリペプチドが新規に同定されたホスホジエステラーゼファミリーのメンバーであると考えられている。
【０１４０】
８７．全長ＰＲＯ１１４０ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１４０と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１４０ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、公知のタンパク質との或る程度の配列同一性が見いだされた。
８８．全長ＰＲＯ１１０６ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１０６と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１０６ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ１１０６ポリペプチドがペルオキシソーマルカルシウム依存性溶質担体と有意な類似性を有することを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１１０６ポリペプチドが新規に同定されたミトコンドリア担体スーパーファミリーのメンバーであり、このファミリーに典型的な活性を有すると考えられている。
【０１４１】
８９．全長ＰＲＯ１２９１ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１２９１と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１２９１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１２９１（図２０８及び配列番号：２９１に示す）は、ブチロフィリンタンパク質と或るアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１２９１が新規に同定されたブチロフィリン相同体であり、そのタンパク質に典型的な活性を有していると考えられている。
９０．全長ＰＲＯ１１０５ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１０５と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１０５ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。本出願人の現在の知識では、ＤＮＡ５９６１２−１４６６ヌクレオチド配列は新規な因子をコードする。しかし、Ｄａｙｈｏｆｆデータベースで「ATTS1623_1」と称されるペルオキシダーゼ前駆対と或る程度の配列同一性がある。
【０１４２】
９１．全長ＰＲＯ５１１ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ５１１と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ５１１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＰＲＯ５１１コード化クローンはヒト結腸組織ライブラリから単離した。本出願人の現在の知識では、ＤＮＡ５９６１３−１４１７ヌクレオチド配列は新規な因子をコードし；ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、ＲｏＢｏ-１、ホスホリパーゼインヒビター及び「SSC20F10_1」と称するタンパク質
との配列同一性が示され、ＰＲＯ５１１がこれらのタンパク質の一又は複数と関連していることを示している。
９２．全長ＰＲＯ１１０４ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１０４と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１０４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。本出願人の現在の知識では、ＤＮＡ５９６１６−１４６５ヌクレオチド配列は新規な因子をコードし；ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、「AB002107_1」、「AF022991_1」及び「SP96_DICDI」と称するタンパク質との或る程度の配列同一性が示された。
【０１４３】
９３．全長ＰＲＯ１１００ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１００と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１００ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。本出願人の現在の知識では、ＤＮＡ５９６１９−１４６４ヌクレオチド配列は新規な因子をコードし；ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、公知のタンパク質との或る程度の配列同一性が明らかとなった。「YSCT4_YEAST」と称される、ＴＳＭ１-ＡＲＥ１遺伝子内領域にある酵母仮説的４２．５ＫＤタンパク質（登録番号: 140496）との或る程度の配列同一性がある。
９４．全長ＰＲＯ８３６ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ８３６と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ８３６ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。本出願人の現在の知識では、ＤＮＡ５９６２０−１４６３ヌクレオチド配列は新規な因子をコードする。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、ＳＬＳ１との或る程度の配列同一性が示された。
【０１４４】
９５．全長ＰＲＯ１１４１ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１４１と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１４１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＤＮＡ５９６２５−１４９８クローンはヒト回腸組織ライブラリから単離した。知りうる限り、ＤＮＡ５９６２５−１４９８配列はここでＰＲＯ１１４１と称される新規な因子をコードし；ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、任意の公知のタンパク質と配列同一性が無いことが明らかになった。
９６．全長ＰＲＯ１１３２ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１３２と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１３２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１１３２（図２２６及び配列番号：３０９に示す）は、エナメルマトリクスセリンプロテイナーゼ１及びニューロプシンと或るアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１１３２が新規に同定されたセリンプロテアーゼファミリーのメンバーであり、そのファミリーに典型的な活性を有していると考えられている。
【０１４５】
９７．全長ＰＲＯ１３４６ポリペプチド
本発明は、本出願においてＮＬ７（ＵＮＱ７０１）と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＮＬ７ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
下記の実施例に開示するように、クローンＤＮＡ５９７７６−１６００がＡＴＣＣに寄託されている。このクローンの正確なヌクレオチド配列は、この分野で日常的な方法を用いて寄託されたクローンを配列決定することにより容易に決定することができる。予測されるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列から常套的技量を用いて決定できる。ここのＮＬ７（ＰＲＯ１３４６）について、本出願人は、出願時点で入手可能な配列情報と最も良く一致するリーディングフレームであると考えられるものを同定した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＮＬ７（図２２８及び配列番号：３１４に示す）は、微生物関連糖タンパク質４（MFA4_HUMAN）；フィコリン-Ａ-マウス（AB007813_1）；ヒトレクチンＰ３５（D63155S6_1）；フィコリンＢ-マウス（AF0063217_1）；ヒトテナシン-Ｒ（制限）（HS518E13_1）；ラットジャヌシン(janusin)前駆体（A45445）；フィブリノーゲン関連タンパク質ＨＦＲＥＰ-１前駆体（JNO596）；ヒトテナシン前駆体（TENA HUMAN）；ヒトＣＤＴ６（HSY16132_1）；及びアンギオポエチン(angiopoietin)-１-マウス（MMU83509_1）と或るアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＮＬ７が新規なＴＩＥリガンド相同体であり、血管形成及び／又は血管維持及び／又は創傷治癒及び／又は炎症及び／又は腫瘍発達及び／又は成長において役割を果たすと考えられている。
９８．全長ＰＲＯ１１３１ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１３１と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１３１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１１３１（図２３０及び配列番号：３１９に示す）は、レクチン様酸化LDL
レセプターと或るアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１１３１が少なくとも１つのＬＤＬレセプターと類似のメカニズムを有すると考えられている。
【０１４６】
９９．全長ＰＲＯ１２８１ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１２８１と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１２８１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＤＮＡ５９８２０−１５４９クローンはヒト胎児肝臓ライブラリから、分泌タンパク質をコードするヌクレオチド配列を選択する捕捉技術を用いて単離した。知りうる限り、ＤＮＡ５９８２０−１５４９配列はここでＰＲＯ１２８１と称される新規な因子をコードする。ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、公知のタンパク質と或る程度の配列同一性が見られたが、有意ではないと決定された。
１００．全長ＰＲＯ１０６４ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１０６４と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１０６４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＤＮＡ５９８２７−１４２６クローンはヒト胎児肝臓ライブラリから単離した。知りうる限り、ＤＮＡ５９８２７−１４２６配列はここでＰＲＯ１０６４と称される新規な因子をコードし；ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、任意の公知のタンパク質と配列同一性が無いことが明らかになった。
【０１４７】
１０１．全長ＰＲＯ１３７９ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１３７９と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１３７９ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＤＮＡ５９８２８クローンはヒト胎児肝臓ライブラリから単離した。知りうる限り、それによりコードされたＰＲＯ１３７９ポリペプチドは新規な分泌因子である。ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、ＰＲＯ１３７９と酵母タンパク質「YHY8_YEAST」（Ｄａｙｈｏｆｆデータベース；バージョン35/45 SwissProt 35）、特にＣ-末端との間に配列同一性が見出された。他のタンパク質との配列相同性が見られたが、有意ではないと決定された。
１０２．全長ＰＲＯ８４４ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ８４４と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ８４４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ８４４ポリペプチドがセリンプロテアーゼインヒビターと配列同一性を有することを見出した。従って現在では、本出願で開示されたＰＲＯ８４４ポリペプチドは、新規に同定されたセリンプロテアーゼインヒビターであり、セリンプロテアーゼを阻害できると考えられている。
【０１４８】
１０３．全長ＰＲＯ８４８ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ８４８と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ８４８ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、本出願人は、ＰＲＯ８４８ポリペプチドがシアリルトランスフェラーゼと配列同一性を有することを見出した。従って現在では、本出願で開示されたＰＲＯ８４８ポリペプチドは、新規に同定されたシアリルトランスフェラーゼファミリーのメンバーであり、このファミリーに典型的なようにシアル化能を持つと考えられている。
１０４．全長ＰＲＯ１０９７ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１０９７と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１０９７ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。本出願人の現在の知識では、ＤＮＡ５９８４１−１４６０ヌクレオチド配列は新規な因子をコードする。ＢＬＡＳＴ及びＦａｓｔＡ配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、「CELK05G3_3」、「CRU26344_1」、「SPBC16C6_8」、「P_W13844」及び「AF013403」と称されるタンパク質との或る程度の配列同一性が明らかになった。
【０１４９】
１０５．全長ＰＲＯ１１５３ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１５３と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１５３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１１５３（図２４６及び配列番号：３５１に示す）は、ＥＭＢＬデータライブラリに1992年6月に提出されたＨＰＢＲＩＩ-７タンパク質と或るアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１１５３がＨＰＢＲＩＩ-７と関連すると考えられている。
１０６．全長ＰＲＯ１１５４ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１５４と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１５４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１１５４（図２４８及び配列番号：３５３に示す）は、AB011097と称されるＫＩＡＡ０５２５タンパク質と整合することが見出された。ＰＲＯ１１５４は７３アミノ酸の新規なＮ-末端を有する。従って、ＰＲＯ１１５４は新規であると考えられる。またＰＲＯ１１５４は、アミノペプチダーゼＮ、インシュリン調節膜アミノペプチダーゼ、スロトロピン放出ホルモン分解酵素及び胎盤ロイシンアミノペプチダーゼと有意な配列同一性を有する。従って、ＰＲＯ１１５４が新規なアミノペプチダーゼ、又はペプチドを分解するペプチドであると考えられている。
【０１５０】
１０７．全長ＰＲＯ１１８１ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１８１と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１８１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＤＮＡ５９８４７−１５１１クローンはヒト前立腺組織から、分泌タンパク質をコードするヌクレオチド配列を選択する捕捉技術を用いて単離した。よって、ＤＮＡ５９８４７−１５１１クローンは分泌因子をコードする。知りうる限り、ＤＮＡ５９８４７−１５１１クローンは分泌因子をコードし；ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、任意の公知のタンパク質と配列同一性が無いことが明らかとなった。
１０８．全長ＰＲＯ１１８２ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１８２と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１８２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１１８２（図２５２及び配列番号：３５７に示す）は、コングルチニンタンパク質とアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１１８２が新規に同定されたコングルチニン相同体であると考えられている。
【０１５１】
１０９．全長ＰＲＯ１１５５ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１５５と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１５５ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１１５５（図２５４及び配列番号：３５９に示す）は、ニューロキニンＢと或るアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１１５５が新規に同定されたニューロキニンファミリーのメンバーであると考えられている。
１１０．全長ＰＲＯ１１５６ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１５６と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１５６ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＤＮＡ５９８５３−１５０５クローンは成人ヒト心臓ライブラリから、分泌タンパク質をコードするヌクレオチド配列を選択する捕捉技術を用いて単離した。知りうる限り、ＤＮＡ５９８５３−１５０５クローンはここでＰＲＯ１１５６と称される新規な因子をコードする。しかし、ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、公知のタンパク質と或る程度の配列同一性が明らかとなった。
【０１５２】
１１１．全長ＰＲＯ１０９８ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１０９８と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１０９８ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。ＰＲＯ１０９８−コード化クローンはヒト肺組織ライブラリから単離し；ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、任意の公知のタンパク質と配列同一性が無いことが明らかとなった。「Ｅｎｖ」ポリプロテイン及びメチルトランスフェラーゼ等のタンパク質と或る程度の配列同一性が明らかになった。
１１２．全長ＰＲＯ１１２７ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１２７と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１２７ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＤＮＡ６０２８３−１４８４クローンは分泌因子をコードする。知りうる限り、ＤＮＡ６０２８３−１４８４配列はここでＰＲＯ１１２７と称される新規な因子をコードし；ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、任意の公知のタンパク質と最小の配列同一性が明らかとなった。
【０１５３】
１１３．全長ＰＲＯ１１２６ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１２６と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１２６ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１１２６（図２６２及び配列番号：３６７に示す）は、オルファクトメジンタンパク質と或るアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１１２６が新規に同定されたオルファクトメジン相同体であり、そのタンパク質に典型的な活性を有すると考えられている。
１１４．全長ＰＲＯ１１２５ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１２５と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１２５ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１１２５（図２６４及び配列番号：３６９に示す）は、転写リプレッサーｒｃｏ-１と或るアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１１２５が新規に同定されたＷＤスーパーファミリーのメンバーであると考えられている。
【０１５４】
１１５．全長ＰＲＯ１１８６ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１８６と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１８６ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１１８６（図２６６及び配列番号：３７１に示す）は、デンドロアスピスポリレプシス毒液からの毒液プロテインＡとアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１１８６が新規に同定された毒液プロテインＡのメンバーであり、関連するメカニズムを共有すると考えられている。
１１６．全長ＰＲＯ１１９８ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１９８と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１９８ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
知りうる限り、ＤＮＡ６０６２２−１５２５配列はここでＰＲＯ１１９８と称される新規な因子をコードする。しかし、ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、公知のタンパク質と或る程度の配列同一性が明らかとなった。
【０１５５】
１１７．全長ＰＲＯ１１５８ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１５８と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１５８ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＤＮＡ６０６２５−１５０７クローンはヒト肺腫瘍組織ライブラリから単離した。知りうる限り、ＤＮＡ６０６２５−１５０７配列はここでＰＲＯ１１５８と称される新規な因子をコードする。しかし、ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、公知のタンパク質と或る程度の配列同一性が示された。
１１８．全長ＰＲＯ１１５９ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１５９と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１５９ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＤＮＡ６０６２７−１５０８クローンはヒト末梢血液顆粒球組織ライブラリから、分泌タンパク質をコードするヌクレオチド配列を選択する捕捉技術を用いて単離した。即ち、ＤＮＡ６０６２７−１５０８クローンは分泌因子をコードする。知りうる限り、ＤＮＡ６０６２７−１５０８配列はここでＰＲＯ１１５９と称される新規な因子をコードし；ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、任意の公知のタンパク質と配列同一性が無いことが明らかとなった。
【０１５６】
１１９．全長ＰＲＯ１１２４ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１２４と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１２４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１１２４（図２７４及び配列番号：３７７に示す）は、ボスタウルス（bos taurus）からの上皮塩素イオンチャンネルタンパク質とアミノ酸配列同一性を有することが見出された。またＰＲＯ１１２４はＥＣＡＭ-１とも配列同一性を有する。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１１２４がイオンチャンネル又は細胞接着分子のいずれかを介する細胞伝達に含まれる新規に同定された細胞膜タンパク質であると考えられている。
１２０．全長ＰＲＯ１２８７ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１２８７と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１２８７ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１２８７（図２７６及び配列番号：３８１に示す）は、ガルス(Gallus)からのラジカルフリンジタンパク質（GGU82088_1）ととアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１２８７が新規に同定されたフリンジタンパク質相同体であり、フリンジタンパク質に典型的な活性を有すると考えられている。
【０１５７】
１２１．全長ＰＲＯ１３１２ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１３１２と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１３１２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、公知のタンパク質と或る程度の配列同一性が明らかとなったが、有意ではないと決定された。従って、知りうる限り、ＤＮＡ６１８７３−１５７４配列はここでＰＲＯ１３１２と称される新規な膜貫通タンパク質をコードする。
１２２．全長ＰＲＯ１１９２ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１９２と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１９２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１１９２（図２８０及び配列番号：３８９に示す）は、マスＰ０-様糖タンパク質（GEN12838IP1）とアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１１９２が新規に同定されたミエリンＰ０糖タンパク質ファミリーのメンバーであると考えられている。
【０１５８】
１２３．全長ＰＲＯ１１６０ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１６０と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１６０ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＤＮＡ６２８７２−１５０９クローンはヒト乳組織ライブラリから、分泌タンパク質をコードするヌクレオチド配列を選択する捕捉技術を用いて単離した。即ち、ＤＮＡ６２８７２−１５０９クローンは分泌因子をコードする。知りうる限り、ＤＮＡ６２８７２−１５０９配列はここでＰＲＯ１１６０と称される新規な因子をコードし；ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、任意の公知のタンパク質と配列同一性が無いことが明らかとなった。
１２４．全長ＰＲＯ１１８７ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１８７と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１８７ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
知りうる限り、ＤＮＡ６２８７６−１５１７配列はここでＰＲＯ１１８７と称される新規な因子をコードし；ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、任意の公知のタンパク質と配列同一性が無いことが明らかとなった。
【０１５９】
１２５．全長ＰＲＯ１１８５ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１８５と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１８５ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
知りうる限り、ＤＮＡ６２８８１−１５１５配列はここでＰＲＯ１１８５と称される新規な因子をコードし；ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、任意の公知のタンパク質と配列同一性が無いことが明らかとなった。
１２６．全長ＰＲＯ１３４５ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１３４５と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１３４５ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１３４５（図２８８及び配列番号：４０３に示す）は、ボスタウルスのＣ-型レクチン相同体タンパク質（BTU22298_1）とアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１３４５が新規に同定されたＣ-型レクチンタンパク質ファミリーのメンバーであり、特にテトラネクチンタンパク質のファミリーに典型的な活性を有すると考えられている。
【０１６０】
１２７．全長ＰＲＯ１２４５ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１２４５と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１２４５ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＤＮＡ６４８８４−１５２７クローンは、分泌タンパク質をコードするヌクレオチド配列を選択する方法を用いて同定した。知りうる限り、ＤＮＡ６４８８４−１５２７配列はここでＰＲＯ１２４５と称される新規な因子をコードする。ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、公知のタンパク質と或る程度の配列同一性が明らかとなった；しかしそれは有意ではないと決定された。
１２８．全長ＰＲＯ１３５８ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１３５８と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１３５８ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１３５８（図２９２及び配列番号：４１０に示す）は、ＲＡＳＰ-１とアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１３５８が新規に同定されたセリンプロテアーゼインヒビターのセルピンファミリーのメンバーであり、セルピンプロテアーゼ阻害活性、タンパク質異化作用阻害活性を有し及び／又は組織の再生に関連すると考えられている。
【０１６１】
１２９．全長ＰＲＯ１１９５ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１１９５と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１１９５ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１１９５（図２９４及び配列番号：４１２に示す）は、マウスからのプロリンリンリッチ酸性タンパク質、遺伝子座MMU28486、John W. Kasikによ1995年6月6日に提出された、データベースＧＢＴＲＡＮＳの登録：U28486、と称されるMMU28486_1とアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１１９５がこのタンパク質ファミリーの新規に同定されたメンバーであると考えられている。
１３０．全長ＰＲＯ１２７０ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１２７０と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１２７０ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１２７０（図２９６及び配列番号：４１４に示す）は、アフリカツメガエルのレクチンタンパク質（XLU86699_1）とアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１２７０がレクチンタンパク質ファミリーの新規に同定されたメンバーであり、このファミリーに典型的な活性を有すると考えられている。
【０１６２】
１３１．全長ＰＲＯ１２７１ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１２７１と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１２７１ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
知りうる限り、ＤＮＡ６６３０９−１５３８配列はここでＰＲＯ１２７１と称される新規な因子をコードし；ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、任意の公知のタンパク質と配列同一性が無いことが明らかとなった（その結果は下記の実施例に記載する）。
１３２．全長ＰＲＯ１３７５ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１３７５と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１３７５ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１３７５（図３００及び配列番号：４１８に示す）は、ＰＵＴ２とアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１３７５がＰＵＴ２の少なくとも１つの関連するメカニズムを有すると考えられている。
【０１６３】
１３３．全長ＰＲＯ１３８５ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１３８５と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１３８５ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＤＮＡ６８８６９−１６１０クローンはヒト組織ライブラリから、分泌タンパク質をコードするヌクレオチド配列を選択する捕捉技術を用いて単離した。即ち、ＤＮＡ６８８６９−１６１０クローンは分泌因子をコードする。知りうる限り、ＤＮＡ６８８６９−１６１０配列はここでＰＲＯ１３８５と称される新規な因子をコードし；ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、任意の公知のタンパク質と配列同一性が無いことが明らかとなった。
１３４．全長ＰＲＯ１３８７ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１３８７と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１３８７ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１３８７（図３０４及び配列番号：４２２に示す）は、ミエリンｐ０タンパク質前駆体（MYP0_HETFR）とアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１３８７が新規に同定されたミエリンタンパク質ファミリーのメンバーであり、そのファミリーに典型的な活性を有すると考えられている。
【０１６４】
１３５．全長ＰＲＯ１３８４ポリペプチド
本発明は、本出願においてＰＲＯ１３８４と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するような、ＰＲＯ１３８４ポリペプチドをコードするｃＤＮＡを同定し単離した。
ＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメントコンピュータプログラムを用いて、全長天然配列ＰＲＯ１３８４（図３０６及び配列番号：４２４に示す）は、ＮＫＧ２-Ｄ（AF054819_1；Ｄａｙｈｏｆｆデータベース、バージョン35.45 SwissProt 35）とアミノ酸配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、本出願で開示されるＰＲＯ１３８４が新規に同定されたＮＫＧ２ファミリーのメンバーであり、ＮＫＧファミリーに典型的なＭＨＣ活性化／不活性化活性を有すると考えられている。
【０１６５】
Ｂ．ＰＲＯ変異体
ここに記載した全長天然配列ＰＲＯポリペプチドに加えて、ＰＲＯ変異体も調製できると考えられる。ＰＲＯ変異体は、ＰＲＯポリペプチドＤＮＡに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、あるいは所望のＰＲＯポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、グリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのアミノ酸変化がＰＲＯポリペプチドの翻訳後プロセスを変えうることを理解するであろう。
天然全長配列ＰＲＯ又はここに記載したＰＲＯポリペプチドの種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載されている保存的及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、結果として天然配列ＰＲＯと比較してＰＲＯポリペプチドのアミノ酸配列が変化するＰＲＯポリペプチドをコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも１つのアミノ酸のＰＲＯポリペプチドの一又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、ＰＲＯポリペプチドの配列を相同性の知られたタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸の類似した構造及び／又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては１から５のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた変異体を下記の実施例に記載するインビトロアッセイの任意のもので活性について試験することにより決定される。
【０１６６】
ＰＲＯポリペプチド断片がここに提供される。このような断片は、例えば、全長天然タンパク質と比較した際に、Ｎ-末端又はＣ-末端で切断されてもよく、又は内部残基を欠いていてもよい。或る種の断片は、ＰＲＯポリペプチドの所望の生物学的活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。
ＰＲＯ断片は、多くの従来技術の任意のものによって調製してよい。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替的方法は、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基によって決定される部位のタンパク質を切断することが知られた酵素でタンパク質を処理することにより、あるいは適当な制限酵素でＤＮＡを消化して所望の断片を単離することによるＰＲＯ断片の生成を含む。さらに他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、所望のポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することを含む。ＤＮＡ断片の所望の末端を決定するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの５’及び３’プライマーで用いられる。好ましくは、ＰＲＯポリペプチド断片は、ここに開示した天然ＰＲＯポリペプチドと少なくとも１つの生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
【０１６７】
特別の実施態様では、対象とする保存的置換を、好ましい置換を先頭にして表１に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表１に例示的置換と名前を付けた又は以下にアミノ酸分類でさらに記載するように、より置換的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
表１
元の残基 例示的置換 好ましい置換
Ala(A)               val; Leu; ile                  val
Arg(R)               lys; gln; asn                  lys
Asn(N)        gln; his; lys; arg               gln
Asp(D)        glu                          glu
Cys(C)               ser                          ser
Gln(Q)               asn                          ans
Glu(E)               asp                          asp
Gly(G)               pro; ala                      ala
His(H)               asn; gln; lys; arg          arg
Ile(I)                leu; val; met; ala; phe;
ノルロイシン                       leu
Leu(L)               ノルロイシン; ile; val;
met; ala; phe                   ile
Lys(K)               arg; gln; asn                   arg
Met(M)               leu; phe; ile                   leu
Phe(F)                leu; val; ile; ala; tyr             leu
Pro(P)                ala                          ala
Ser(S)                thr                          thr
Thr(T)                ser                          ser
Trp(W)         tyr; phe                        tyr
Tyr(Y)                trp; phe; thr; ser               phe
Val(V)                ile; leu; met; phe;
ala; ノルロイシン                   leu
【０１６８】
ＰＲＯポリペプチドの機能及び免疫学的同一性の置換的修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において実質的に異なる置換基を選択することにより達成される。天然発生残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる：
（１）疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
（２）中性の親水性：cys, ser, thr;
（３）酸性：asp, glu;
（４）塩基性：asn, gln, his, lys, arg;
（５）鎖配向に影響する残基：gly, pro; 及び
（６）芳香族：trp, tyr, phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、好ましくは残された（非保存）部位に導入されうる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発［Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)］、カセット突然変異誘発［Wells等, Gene, 34: 315 (1985)］、制限的選択突然変異誘発［Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)］等のこの分野で知られた方法を用いてなすことができ、又は他の知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施してＰＲＯ変異体ＤＮＡを作成することもできる。
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman &amp; Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)］。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
【０１６９】
Ｃ．ＰＲＯの修飾
ＰＲＯポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一型は、ＰＲＯポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、ＰＲＯポリペプチドの選択された側鎖又はＮ又はＣ末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることである。二官能性試薬での誘導体化が、例えばＰＲＯを水不溶性支持体マトリクスあるいは抗-ＰＲＯ抗体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、１，１-ビス（ジアゾアセチル）-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４-アジドサリチル酸、３，３’-ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１，８-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-３-[(ｐ-アジドフェニル)-ジチオ］プロピオイミダート等の試薬を含む。
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチルへの脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman &amp;amp; Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)]、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【０１７０】
本発明の範囲内に含まれるＰＲＯポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、ここで意図されるのは、天然配列ＰＲＯに見られる１又は複数の炭水化物部分の欠失（存在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び／又は酵素的手段によるグリコシル化の削除のいずれかによる）、及び／又は天然配列ＰＲＯに存在しない１又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。さらに、この文節は、存在する種々の炭水化物部分の性質及び特性の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含む。
ＰＲＯポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。この変更は、例えば、１又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列ＰＲＯ（Ｏ-結合グリコシル化部位）への付加、又は置換によってなされてもよい。ＰＲＯアミノ酸配列は、場合によっては、ＤＮＡレベルでの変化、特に、ＰＲＯポリペプチドをコードするＤＮＡを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。
【０１７１】
ＰＲＯポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、1987年9月11日に発行されたWO 87/05330、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。
ＰＲＯポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddin等, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura等, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
本発明のＰＲＯの共有結合的修飾の他の型は、ＰＲＯポリぺプチドの、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法での結合を含む。
【０１７２】
また、本発明のＰＲＯポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したＰＲＯポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとＰＲＯポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的にはＰＲＯポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなＰＲＯポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってＰＲＯポリペプチドを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン（poly-his）又はポリ−ヒスチジン−グリシン（poly-his-gly）タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体［Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)］；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ（gD）タグ及びその抗体［Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)］を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド［Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)］；ＫＴ３エピトープペプチド［Martin等, Science, 255:192-194 (1992)］；α-チューブリンエピトープペプチド［Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)］；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ［Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)］を含む。
それに換わる実施態様では、キメラ分子はＰＲＯの免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態（「イムノアドヘシン」とも呼ばれる）については、そのような融合体はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。Ｉｇ融合体は、好ましくはＩｇ分子内の少なくとも１つの可変領域に換えてＰＲＯポリペプチドの可溶化（膜貫通ドメイン欠失又は不活性化）形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、1995年6月27日発行の米国特許第5,428,130号を参照のこと。
【０１７３】
Ｄ．ＰＲＯの調製
以下の説明は、主として、ＰＲＯ核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりＰＲＯを生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてＰＲＯを調製することができると考えられる。例えば、ＰＲＯ配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい［例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照］。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機（Foster City, CA）を用いて、製造者の指示により実施してもよい。ＰＲＯの種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長ＰＲＯを生産してもよい。
【０１７４】
１．ＰＲＯをコードするＤＮＡの単離
ＰＲＯをコードするＤＮＡは、ＰＲＯｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから得ることができる。従って、ヒトＰＲＯＤＮＡは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリから簡便に得ることができる。またＰＲＯ-コード化遺伝子は、ゲノムライブラリから又は公知の合成方法（例えば、自動化核酸合成）により得ることもできる。
ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(ＰＲＯに対する抗体又は少なくとも約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。所望のＰＲＯポリペプチドをコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Sambrook等,上掲；Dieffenbach等, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
【０１７５】
下記の実施例には、ｃＤＮＡライブラリのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリ内のＤＮＡとのハイブリッド形成時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識されたＡＴＰのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性及び高度の厳密性を含むハイブリッド形成条件は、上掲のSambrook等に与えられている。
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、Genbank等の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内又は全長に渡っての（アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの）配列同一性は、この分野で知られた、そしてここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用し、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリをスクリーニングすることにより得られる。
【０１７６】
２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したＰＲＯ生産のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。  一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrook等, 上掲に見出すことができる。
原核生物細胞形質移入及び真核生物細胞形質移入の方法、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315 (1983)及び1989年6月29日公開のWO 89/05859に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【０１７７】
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ATCC31,446）；大腸菌Ｘ１７７６（ATCC31,537）；大腸菌株Ｗ３１１０（ATCC27,325）及びＫ５７７２（ATCC53,635）である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌、例えば、E. coli、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバシリスブチリス(B. subtilis)及びバシリリチェニフォルミス(B. licheniformis)（例えば、1989年4月12日発行のDD 266,710に記載されたバシリリチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿筋及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生産発行のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０は、細胞に外来のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異をするように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｒｔ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  (ａｒｇＦ-ｌａｃ)１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴｋａｎを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ATCC 55,244）；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  (ａｌｇＦ-ｌａｃ)１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｒｂｓ７ｉｌｖＧｋａｎを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び1990年8月7日発行の米国特許第4,946,783号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼポリメラーゼ反応が好ましい。
【０１７８】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＰＲＯポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセスプロンブ(Schizosaccharomyces prombe)（Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; 1985年5月2日発行のEP 139,383）；クルベロミセスホスツ(Kluveromyces hosts)（米国特許第4,943,529号; Fleer等, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991)）、例えばケーラクチス(K. lactis)（MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt等, J. Bacteriol. 737 [1983]）、ケーフラギリス(K. fragilis)（ATCC 12,424）、ケーブルガリクス(K. bulgaricus)（ATCC 16,045）、ケーウィケラミイ(K. wickeramii)（ATCC 24,178）、ケーワルチイ(K. waltii)（ATCC 56,500）、ケードロソフィラルム(K. drosophilarum)（ATCC 36,906; Van den Berg等, Bio/Technology, 8: 135 (1990)）、ケーテモトレランス(K. themotolerans)及びケーマルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)（EP 402,226）；ピッチャパストリス(Pichia pastoris)（EP 183,070; Sheekrishna等, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988]）；カンジダ；トリコデルマレーシア(reesia)（EP 244,234）；アカパンカビ（Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979]）；シュワニオマイセス(schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス(occidentalis)（1990年10月31日発行のEP 394,538）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)（1991年1月10日発行のWO 91/00357）；及びコウジ菌、例えば偽巣性コウジ菌（Ballance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn等, Gene, 26: 205-221 [1983]; Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]）及びクロカビ（Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985]）が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピチア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されるメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
【０１７９】
グリコシル化ＰＲＯの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエＳ２及びスポドスペラＳｆ９等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞を含む。より詳細な例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株（293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）;チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞（TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065); 及びマウス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562, ATTC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識内にある。
【０１８０】
３．複製可能なベクターの選択及び使用
ＰＲＯをコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
ＰＲＯは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるＰＲＯ-コード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日発行のEP362179)、又は1990年11月15日に公開されたWO 90/13646に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【０１８１】
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、ＰＲＯ-コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub 等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)；Kingman等, Gene, 7：141(1979)；Tschemper等, Gene, 10：157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。
【０１８２】
発現及びクローニングベクターは、通常、ＰＲＯ-コード化核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Cahng等, Nature, 275:615 (1978)； Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモータもまたＰＲＯをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1987)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモータはEP 73,657に更に記載されている。
【０１８３】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＰＲＯ転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK 2,211,504)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
より高等の真核生物による所望のＰＲＯをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＰＲＯコード化配列の５’又は３’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５’位に位置している。
また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、ＰＲＯをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのＰＲＯの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; 及びEP 117,058に記載されている。
【０１８４】
４．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリッド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＰＲＯポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＰＲＯＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【０１８５】
５．ポリペプチドの精製
ＰＲＯの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。ＰＲＯの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
ＰＲＯを、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びＰＲＯポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutcher, Methodes in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産される特定のＰＲＯの性質に依存する。
【０１８６】
Ｅ．ＰＲＯの用途
ＰＲＯをコードする核酸配列（又はそれらの相補鎖）は、ハイブリッド形成プローブとしての使用を含む分子生物学の分野において、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡの生成において種々の用途を有している。また、ＰＲＯ核酸も、ここに記載される組換え技術によるＰＲＯポリペプチドの調製に有用であろう。
全長天然配列ＰＲＯ遺伝子又はその一部は、全長ＰＲＯｃＤＮＡの単離又はここに開示したＰＲＯ配列に対して所望の配列同一性を持つ更に他の遺伝子（例えば、ＰＲＯの天然発生変異体又は他の種からのＰＲＯをコードするもの）の単離のためのｃＤＮＡライブラリ用のハイブリッド形成プローブとして使用できる。場合によっては、プローブの長さは約２０〜約５０塩基である。ハイブリッド形成プローブは、少なくとも部分的に全長天然ヌクレオチド配列の新規な領域から誘導してもよく、それらの領域は、過度の実験をすることなく、天然配列ＰＲＯのプロモーター、エンハンサー成分及びイントロンを含むゲノム配列から誘導され得る。例えば、スクリーニング法は、ＰＲＯポリペプチド遺伝子のコード化領域を周知のＤＮＡ配列を用いて単離して約４０塩基の選択されたプローブを合成することを含む。ハイブリッド形成プローブは、３２Ｐ又は３５Ｓ等の放射性ヌクレオチド、又はアビディン／ビオチン結合系を介してプローブに結合したアルカリホスファターゼ等の酵素標識を含む種々の標識で標識されうる。本発明のＰＲＯポリペプチド遺伝子に相補的な配列を有する標識されたプローブは、ヒトｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡのライブラリーをスクリーニングし、そのライブラリーの何れのメンバーがプローブにハイブッド形成するかを決定するのに使用できる。ハイブリッド形成技術は、以下の実施例において更に詳細に記載する。
【０１８７】
本出願で開示する任意のＥＳＴはプローブと同様に、ここに記載した方法で用いることができる。
ＰＲＯ核酸の他の有用な断片は、標的ＰＲＯｍＲＮＡ（センス）又はＰＲＯＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合できる一本鎖核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか）を含むアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、本発明によると、ＰＲＯＤＮＡのコード化領域の断片を含む。このような断片は、一般的には少なくとも約１４ヌクレオチド、好ましくは約１４から３０ヌクレオチドを含む。与えられたタンパク質をコードするｃＤＮＡ配列に基づく、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを制御する可能性は、例えば、Stein及びCohen（CancerRes. 48: 2659: 1988）及び van der Krol等（BioTechniques 6: 958, 1988）に記載されている。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は二重鎖の形成をもたらし、それは、二重鎖の分解の促進、転写又は翻訳の期外停止を含む幾つかの方法の一つ、又は他の方法により、標的配列の転写又は翻訳を阻止する。よって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＰＲＯタンパク質の発現を阻止するのに用いられる。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖−ホスホジエステル骨格（又は他の糖結合、WO 91/06629に記載のもの等）を有するオリゴヌクレオチドをさらに含み、そのような糖結合は内因性ヌクレアーゼ耐性である。そのような耐性糖結合を持つオリゴヌクレオチドは、インビボで安定であるが（即ち、酵素分解に耐えうるが）、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性は保持している。
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例は、WO 90/10048に記載されているもののような、有機部分、及びオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への親和性を向上させる他の部分、例えばポリ-(Ｌ-リジン)に共有結合したオリゴヌクレオチドを含む。さらにまた、エリプチシン等の挿入剤、アルキル化剤又は金属作体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させ、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列への結合特異性を改変してもよい。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ＣａＰＯ４-媒介ＤＮＡ形質移入、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子転換方法により、又はエプスタイン-バーウイルスなどの遺伝子転換ベクターを用いることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入される。好ましい方法では、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、適切なレトロウイルスベクターに挿入される。標的核酸配列を含む細胞は、インビボ又はエキソビボで組換えレトロウイルスベクターに接触させる。好適なレトロウイルスベクターは、これらに限られないが、マウスレトロウイルスＭ-ＭｕＬＶから誘導されるもの、Ｎ２（Ｍ-ＭｕＬＶから誘導されたレトロウイルス）、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃと命名されたダブルコピーベクター（WO 90/13641参照）を含む。
また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、WO 91/04753に記載されているように、リガンド結合分子との複合体の形成により標的配列を含む細胞に導入してもよい。適切なリガンド結合分子は、これらに限られないが、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドを含む。好ましくは、リガンド結合分子の複合体形成は、リガンド結合分子がその対応する分子又はレセプターに結合する、あるいはセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその複合体の細胞への侵入を阻止する能力を実質的に阻害しない。
あるいは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、WO 90/10448に記載されたように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは内因性リパーゼにより細胞内で分解される。
【０１８８】
また、プローブは、ＰＣＲ技術に用いて、密接に関連したＰＲＯコード化配列の同定のための配列のプールを作成することができる。
また、ＰＲＯをコードする核酸配列は、そのＰＲＯをコードする遺伝子のマッピングのため、及び遺伝子疾患を持つ個体の遺伝子分析のためのハイブリッド形成プローブの作成にも用いることができる。ここに提供される核酸配列は、インサイツハイブリッド形成、既知の染色体マーカーに対する結合分析、及びライブラリーでのハイブリッド形成スクリーニング等の周知の技術を用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングすることができる。
ＰＲＯのコード化配列が他のタンパク質に結合するタンパク質をコードする場合（例えば、ＰＲＯがレセプターである場合）、ＰＲＯは、そのリガンドを同定するアッセイに用いることができる。このような方法により、レセプター／リガンド結合性相互作用の阻害剤を同定することができる。このような結合性相互作用に含まれるタンパク質も、ペプチド又は小分子阻害剤又は結合性相互作用のアゴニストのスクリーニングに用いることができる。また、レセプターＰＲＯは関連するリガンドの単離にも使用できる。スクリーニングアッセイは、天然ＰＲＯ又はＰＲＯのレセプターの生物学的活性に似たリード化合物の発見のために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングにも用いられ、小分子候補薬剤の同定に特に適したものとする。考慮される小分子は、合成有機又は無機化合物を含む。アッセイは、この分野で良く知られ特徴付けられているタンパク質−タンパク質結合アッセイ、生物学的スクリーニングアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施される。
【０１８９】
また、ＰＲＯ又はその任意の修飾型をコードする核酸は、トランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物を産生するのにも使用でき、これらは治療的に有用な試薬の開発やスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物(例えばマウス又はラット)とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡである。一実施形態では、ＰＲＯをコードするｃＤＮＡは、確立された技術によりＰＲＯをコードするゲノムＤＮＡをクローン化するために使用することができ、ゲノム配列を、ＰＲＯをコードするＤＮＡを発現する細胞を有するトランスジェニック動物を産生するために使用することができる。トランスジェニック動物、特にマウス又はラット等の特定の動物を産生する方法は当該分野において常套的になっており、例えば米国特許第4,736,866号や第4,870,009号に記述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのＰＲＯ導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入されたＰＲＯコード化導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物はＰＲＯをコードするＤＮＡの増大した発現の影響を調べるために使用できる。このような動物は、例えばその過剰発現を伴う病理学的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用できる。本発明のこの態様においては、動物を試薬で治療し、導入遺伝子を有する未治療の動物に比べ病理学的状態の発症率が低ければ、病理学的状態に対する治療的処置の可能性が示される。
【０１９０】
あるいは、ＰＲＯの非ヒト相同体は、動物の胚性細胞に導入されたＰＲＯをコードする変更ゲノムＤＮＡと、ＰＲＯをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、ＰＲＯをコードする欠陥又は変更遺伝子を有するＰＲＯ「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、ＰＲＯをコードするｃＤＮＡは、確立された技術に従い、ＰＲＯをコードするゲノムＤＮＡのクローニングに使用できる。ＰＲＯをコードするゲノムＤＮＡの一部を欠失したり、組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化のフランキングＤＮＡ(５’と３’末端の両方)を数キロベース含む［例えば、相同的組換えベクターについてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照のこと］。ベクターは胚性幹細胞に(例えばエレクトロポレーションによって)導入し、導入されたＤＮＡが内在性ＤＮＡと相同的に組換えられた細胞が選択される［例えば、Li等, Cell, 69:915(1992)参照］。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入されて集合キメラを形成する［例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113-152参照］。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物をつくり出す。胚細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、ＰＲＯポリペプチドが不在であることによるある種の病理的状態及びその病理的状態の進行に対する防御能力によって特徴付けられる。
【０１９１】
また、ＰＲＯポリペプチドをコードする核酸は遺伝子治療にも使用できる。遺伝子治療用途においては、例えば欠陥遺伝子を置換するため、治療的有効量の遺伝子産物のインビボ合成を達成するために遺伝子が導入される。「遺伝子治療」とは、１回の処理により継続的効果が達成される従来の遺伝子治療と、治療的に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの１回又は繰り返し投与を含む遺伝子治療薬の投与の両方を含む。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡは、ある種の遺伝子のインビボ発現を阻止する治療薬として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞膜による制限された取り込みに起因する低い細胞内濃度にもかかわらず、それが阻害剤として作用する細胞中に移入できることは既に示されている（Zamecnik等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4143-4146 [1986]）。オリゴヌクレオチドは、それらの負に荷電したリン酸ジエステル基を非荷電基で置換することによって取り込みを促進するように修飾してもよい。
【０１９２】
生存可能な細胞に核酸を導入するための種々の技術が存在する。これらの技術は、核酸が培養細胞にインビトロで、あるいは意図する宿主の細胞においてインビボで移入されるかに応じて変わる。核酸を哺乳動物細胞にインビトロで移入するのに適した方法は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などを含む。現在好ましいインビボ遺伝子移入技術は、ウイルス（典型的にはレトロウイルス）ベクターでの形質移入及びウイルス被覆タンパク質-リポソーム媒介形質移入である（Dzau等, Trends, in Biotechnology 11, 205-219）。幾つかの状況では、核酸供給源を、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンド等の標的細胞を標的化する薬剤とともに提供するのが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型向性のカプシドタンパク質又はその断片、サイクルにおいて内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし細胞内半減期を向上させるタンパク質が、標的化及び／又は取り込みの促進のために用いられる。レセプター媒介エンドサイトーシスは、例えば、Wu等, J. Biol. Chem. 262, 4429-2232 (1987); 及びWagner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)によって記述されている。遺伝子作成及び遺伝子治療のプロトコールの概説については、Anderson等, Science 256, 808-813 (1992)を参照のこと。
【０１９３】
ここに記載したＰＲＯポリペプチドは、タンパク質電気泳動目的の分子量マーカーとして用いてもよい。
ここに記載したＰＲＯポリペプチド又はその断片をコードする核酸分子は染色体同定に有用である。この点において、実際の配列に基づく染色体マーキング試薬は殆ど利用可能ではないため、新規な染色体マーカーの同定の必要性が存在している。本発明の各ＰＲＯ核酸分子は染色体マーカーとして使用できる。
また本発明のＰＲＯポリペプチド及び核酸分子は組織タイピングに使用でき、本発明のＰＲＯポリペプチドは一方の組織で他方に比較して異なる発現をする。ＰＲＯ核酸分子は、ＰＣＲ、ノーザン分析、サザン分析及びウェスタン分析のプローブ生成のための用途が見出されるであろう。
ここに記載したＰＲＯポリペプチドは治療薬として用いてもよい。本発明のＰＲＯポリペプチドは、製薬的に有用な組成物を調製するのに知られた方法に従って製剤され、それにより、このＰＲＯ生成物は製薬的に許容される担体媒体と混合される。治療用製剤は、凍結乾燥された製剤又は水性溶液の形態で、任意的な製薬上許容可能なキャリア、賦形剤又は安定剤と、所望の精製度を有する活性成分とを混合することにより(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osol, Ed., [1980])、調製され保管される。許容される担体、賦形剤又は安定剤は、用いる投与量及び濃度ではレシピエントに対して無毒性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量(残基数１０個未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリン等の単糖類、二糖類又は他の炭水化物、ＥＤＴＡ等のキレート剤、マンニトール又はソルビトール等の糖類、ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又はＴＷＥＥＮ(商品名)、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ(商品名)又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。
インビボ投与に使用される製剤は滅菌されていなくてはならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌フィルター膜を通す濾過により容易に達成される。
ここで、本発明の製薬組成物は一般に、無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを持つ静脈内バッグ又はバイアル内に配される。
投与経路は周知の方法、例えば、静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内又は病巣内経路での注射又は注入、局所投与、又は徐放系による。
本発明の製薬組成物の用量及び望ましい薬物濃度は、意図する特定の用途に応じて変化する。適切な用量又は投与経路の決定は、通常の内科医の技量の範囲内である。動物実験は、ヒト治療のための有効量の決定についての信頼できるガイダンスを提供する。有効量の種間スケーリングは、Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi等, 編, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96のMordenti, J. 及びchappell, W. 「The use of interspecies scaling in toxicokinetics」に記載された原理に従って実施できる。
【０１９４】
ＰＲＯポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストのインビボ投与が用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり１日に約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまで、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日である。特定の用量及び輸送方法の指針は文献に与えられている；例えば、米国特許第4,657,760号、第5,206,344号、又は第5,225,212号参照。異なる製剤が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、例えば一つの器官又な組織を標的とする投与には他の器官又は組織とは異なる方式で輸送することは必要であることが予想される。
ＰＲＯポリペプチドの投与を必要とする任意の疾患又は疾病の治療に適した放出特性を持つ製剤でＰＲＯポリペプチドの持続放出が望まれる場合、ＰＲＯポリペプチドのマイクロカプセル化が考えられる。持続放出のための組換えタンパク質のマイクロカプセル化は、ヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）、インターフェロン（ｒｈＩＦＮ）、インターロイキン-２、及びＭＮｒｇｐ１２０で成功裏に実施されている。Johnson等, Nat. Med., 2: 795-799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27: 1221-1223 (1993); Hora等, Bio/Technology, 8: 755-758 (1990); Cleland, 「Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polyactide Polyglycolide Microsphere Systems」Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell 及び Newman編, (Plenum Press: New York, 1995), p. 439-462; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; 及び米国特許第5,564,010号。
【０１９５】
これらのタンパク質の持続放出製剤は、ポリ-乳酸-コグリコール酸（ＰＬＧＡ）ポリマーを用い、その生体適合性及び広範囲の生分解特性に基づいて開発された。ＰＬＧＡの分解生成物である乳酸及びグリコール酸は、ヒト身体内で即座にクリアされる。さらに、このポリマーの分解性は、分子量及び組成に依存して数ヶ月から数年まで調節できる。Lewis, 「Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer」: M. Chasin及び R. Langer (編), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1-41。
本発明は、ＰＲＯポリペプチドに類似する（アゴニスト）又はＰＲＯポリペプチドの効果を阻害する（アンタゴニスト）ものを同定するための化合物のスクリーニング方法も包含する。アンタゴニスト候補薬のスクリーニングアッセイは、ここに同定した遺伝子にコードされるＰＲＯポリペプチドと結合又は複合体形成する化合物、又は他にコード化ポリペプチドお他の細胞性タンパク質との相互作用を阻害する化合物を同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、それを特に小分子候補薬の同定に適したものにする、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングに適用可能なアッセイを含む。
このアッセイは、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、及び細胞ベースのアッセイで、この分野で知られたものを含む種々の方式で実施される。
アンタゴニストについての全てのアッセイは、それらが候補薬をここで同定された核酸にコードされるＰＲＯポリペプチドと、これら２つの成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間で接触させることを必要とすることにおいて共通する。
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるＰＲＯポリペプチド又は候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばミクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化されるＰＲＯポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、それを固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。
【０１９６】
候補化合物が相互作用するがここに同定した遺伝子にコードされる特定のＰＲＯポリペプチに結合しない場合、そのポリペプチドとの相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質−タンパク質相互作用は、Fields及び共同研究者等［Fiels及びSong, Nature(London) 340, 245-246 (1989); Chien等, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578-9582 (1991)］に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより、Chevray及びNathans［Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789-5793 (1991)］に開示されている酵母菌ベースの系を用いて監視することができる。酵母菌ＧＡＬ４などの多くの転写活性化剤は、２つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はＤＮＡ結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母菌発現系（一般に「２-ハイブリッド系」と呼ばれる）は、この特性の長所を利用して、２つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。ＧＡＬ１-ｌａｃＺリポーター遺伝子のＧＡＬ４活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質-タンパク質相互作用を介したＧＡＬ４活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β-ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。２-ハイブリッド技術を用いた２つの特定なタンパク質間のタンパク質-タンパク質相互作用を同定するための完全なキット（MATCHMAKER(商品名)）は、Clontechから商業的に入手可能である。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
【０１９７】
ここで同定されたＰＲＯポリペプチドをコードする遺伝子と細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物は、次のように試験できる：通常は反応混合物は、遺伝子産物と細胞外又は細胞内成分を、それら２つの生成物が相互作用及び結合する条件下及び時間で含むように調製される。候補化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応は試験化合物の不存在及び存在下で実施される。さらに、プラシーボを第３の反応混合物に添加してポジティブ対照を提供してもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との結合（複合体形成）は上記のように監視される。試験化合物を含有する反応混合物ではなく対照反応における複合体の形成は、試験化合物が試験化合物とその結合パートナーとの相互作用を阻害することを示す。
アンタゴニストを検定するために、ＰＲＯポリペプチドを特定の活性についてスクリーニングする化合物とともに添加してよく、ＰＲＯポリペプチド存在下での対象とする活性を阻害する化合物の能力が化合物がＰＲＯポリペプチドのアンタゴニストであることを示す。あるいは、アンタゴニストは、ＰＲＯポリペプチド及び膜結合ＰＲＯポリペプチドレセプター又は組換えレセプターを持つ潜在的アンタゴニストを、競合的阻害アッセイに適した条件下で結合させることにより検出してもよい。ＰＲＯポリペプチドは、放射活性等で標識でき、レセプターに結合したＰＲＯポリペプチドの数を潜在的アンタゴニストの有効性を決定するのに使用できる。レセプターをコードする遺伝子は、当業者に知られた多くの方法、例えばリガンドパンニング及びＦＡＣＳソートにより同定できる。Coligan等, Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991)。好ましくは、発現クローニングが用いられ、ポリアデニル化ＲＮＡがＰＲＯポリペプチドに反応性の細胞から調製され、このＲＮＡから生成されたｃＤＮＡライブラリがプールに分配され、ＣＯＳ細胞又はＰＲＯポリペプチド反応性でない他の細胞の形質移入に使用される。スライドガラスで成長させた形質移入細胞を標識したＰＲＯポリペプチドに暴露する。ＰＲＯポリペプチドは、ヨウ素化又は部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位の包含を含む種々の手段で標識できる。固定及びインキュベーションの後、スライドにオートラジオグラフィ分析を施す。ポジティブプールを同定し、相互作用サブプール化及び再スクリーニング工程を用いてサブプールを調製して再形質移入し、結果的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生成する。
レセプター同定の代替的方法として、標識下ＰＲＯポリペプチドをレセプター分子を発現する細胞膜又は抽出調製物に光親和性結合させることができる。架橋材料はＰＡＧＥに溶解させ、Ｘ線フィルムに暴露する。レセプターを含む標識複合体を励起し、ペプチド断片に分離し、タンパク質マイクロ配列決定を施すことができる。マイクロ配列決定から得たアミノ酸配列は、推定レセプターをコードする遺伝子を同定するｃＤＮＡライブラリをスクリーニングする分解性オリゴヌクレオチドプローブの組の設計に用いられる。
【０１９８】
アンタゴニストの他の検定では、レセプターを発現する哺乳動物細胞又は膜調製物を、候補化合物の存在下で標識ＰＲＯポリペプチドとともにインキュベートする。次いで、この相互作用を促進又は阻止する化合物の能力を測定する。
潜在的なアンタゴニストのより特別な例は、免疫グロブリンとＰＲＯポリペプチドとの融合体に結合するオリゴヌクレオチド、特に、限られないが、ポリペプチド-及びモノクローナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及びこれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形態、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。あるいは、潜在的アンタゴニストは、密接に関連したタンパク質、例えば、レセプターを認識するが効果を与えず、従ってＰＲＯポリペプチドの作用を競合的に阻害するＰＲＯポリペプチドの変異形態であってもよい。
他の潜在的なＰＲＯポリペプチドアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡ作成物であり、例えば、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡは、標的ｍＲＮＡにハイブリッド形成してタンパク質翻訳を妨害することによりｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセンス技術は、トリプルへリックス形成又はアンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを通して遺伝子発現を制御するのに使用でき、それらの方法はともに、ポリペプチドヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡへの結合に基づく。例えば、ここでの成熟ＰＲＯポリペプチドをコードするポリペプチドヌクレオチド配列の５’コード化部分は、約１０から４０塩基対長のアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドの設計に使用される。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に含まれる遺伝子の領域に相補的であるように設計され（トリプルへリックス−Lee等, Nucl, Acid Res., 6: 3073 (1979); Cooney等, Science, 241: 456 (1988); Dervan等, Science, 251: 1360 (1991)参照）、それによりＰＲＯポリペプチドの転写及び生成を防止する。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドはインビボでｍＲＮＡにハイブリッド形成してｍＲＮＡ分子のＰＲＯポリペプチドへの翻訳を阻止する（アンチセンス−Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (SRS Press: Boca Raton, FL, 1988)）。上記のオリゴヌクレオチドは、細胞に輸送され、アンチセンスＲＮＡ又はＤＮＡをインビボで発現させて、ＰＲＯポリペプチドの生産を阻害することもできる。アンチセンスＤＮＡが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の−１０から＋１０位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【０１９９】
潜在的アンタゴニストは、ＰＲＯポリペプチドの活性部位、レセプター結合部位、又は成長因子又は他の関連結合部位に結合し、それによりＰＲＯポリペプチドの正常な生物学的活性を阻止する小分子を含む。小分子の例は、これらに限られないが、小型ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチド有機又は無機化合物を含む。
リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子である。リボザイムは、相補的標的ＲＮＡへの配列特異的ハイブリッド形成、次いでヌクレオチド鎖切断的切断により作用する。潜在的ＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Rossi, Current Protocols in Biology 4: 469-471 (1994)及びＰＣＴ公報、番号WO 97/33551（1997年9月18日発行）を参照。
転写阻害に用いられるトリプルヘリックス形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介するトリプルヘリックス形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。さらなる詳細は、例えば、ＰＣＴ公報、番号WO 97/33551, 上掲を参照。
これらの小分子は、上記で議論したスクリーニングアッセイの一又は複数の任意のものにより及び／又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。
ＰＲＯ１８９は、線虫のW01A6.1、ホスホジエステラーゼ、トランスポーター及び脂肪酸に結合するタンパク質での検定において、これらのタンパク質に対するＰＲＯ１８９の相対的活性を決定するのに使用できる。結果は適宜用いることができる。
【０２００】
Ｆ．抗-ＰＲＯ抗体
本発明は、さらに抗-ＰＲＯ抗体を提供するものである。抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロ抱合体抗体が含まれる。
１．ポリクローナル抗体
抗-ＰＲＯ抗体はポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、ＰＲＯポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に抱合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ-ＴＤＭアジュバント(モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
【０２０１】
２．モノクローナル抗体
あるいは、抗-ＰＲＯ抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫化剤は、典型的には対象とするＰＲＯポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬ」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【０２０２】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63］。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＰＲＯに対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
【０２０３】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる［Goding, 上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びＲＰＭＩ-１６４０倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［米国特許第4,816,567号；Morrison等, 上掲］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにＦｃ領域の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特にＦａｂ断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。
【０２０４】
３．ヒト及びヒト化抗体
本発明の抗-ＰＲＯ抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のＣＤＲの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)］。
【０２０５】
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のＣＤＲ又はＣＤＲ配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンター(winter)及び共同研究者［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ［Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1992)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Cole等及びBoerner等の方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる［Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBoerner等, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991) ］。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；同第5,661,016号、及び次の科学文献：Marks等, Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg等, Nature 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild等, Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)に記載されている。
【０２０６】
４．二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合において、結合特異性の一方はＰＲＯに対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく［Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)］。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が1993年5月13日公開のWO 93/08829、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655-3656 (1991)に開示されている。
所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
【０２０７】
WO 96/27011に記載された他の方法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収される異種二量体の割合を最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片（例えば、Ｆ(ａｂ')２二重特異性抗体）として調製できる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
大腸菌からＦａｂ'フラグメントを直接回収でき、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby等, J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'フラグメントは大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
【０２０８】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産されている。Kostelnyら, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruberら, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
例示的な二重特異性抗体は、ここに与えられたＰＲＯポリペプチドの２つの異なるエピトープに結合しうる。あるいは、抗-ＰＲＯポリペプチドのアームは、特定のＰＲＯポリペプチド発現細胞に細胞防御メカニズムを集中させるように、Ｔ細胞レセプター分子(例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、又はＢ７)等の白血球上のトリガー分子又はＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ３２)及びＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)等のＩｇＧ(ＦｃγＲ)に対するＦｃレセプターに結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体は特定のＰＲＯポリペプチドを発現する細胞に細胞毒性薬を局在化させるためにも使用されうる。これらの抗体はＰＲＯ結合アーム及び細胞毒性薬又は放射性キレート化剤、例えばＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ、又はＴＥＴＡと結合するアームを有する。興味の対象となる他の二重特異性抗体はＰＲＯポリペプチドに結合し、そしてさらに組織因子（ＴＦ）に結合する。
５．ヘテロ抱合体抗体
ヘテロ抱合抗体もまた本発明の範囲に入る。ヘテロ抱合抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため［米国特許第4,676,980号］及びＨＩＶ感染の治療のために［WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089］提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第4,6767,980号に開示されているものが含まれる。
【０２０９】
６．エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば癌治療における抗体の有効性を向上させるのが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させるようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上した内部移行能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体-依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有しうる。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体はまた、Wolff等, Cancer research 53: 2560-2565 (1993)に記載されたような異種二官能性架橋を用いても調製しうる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。
【０２１０】
７．免疫複合体
本発明はまた、化学治療薬、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片）などの細胞毒性薬、あるいは放射性同位体（即ち、放射性抱合）に抱合された抗体を含む免疫複合体にも関する。
このような免疫複合体の生成に有用な化学治療薬は上記した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ-Ｓ）、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria oficinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)を含む。様々な放射性ヌクレオチドが放射性抱合抗体の生成に利用可能である。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅを含む。
【０２１１】
抗体及び細胞毒性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオネート（ＳＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベレート等）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス-アジド化合物（ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等）、ビス-ジアゾニウム誘導体（ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２，６-ジイソシアネート等）、及びビス-活性フッ素化合物（１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されたように調製することができる。カーボン-１４-標識１--イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ-ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。WO 94/11026参照。
他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」（ストレプトアビジン等）に抱合されてもよく、抗体-レセプター複合体は患者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合複合体を循環から除去し、次に細胞毒性薬（例えば、放射性ヌクレオチド等）に抱合された「リガンド」（アビジン等）を投与する。
【０２１２】
８．免疫リポソーム
また、ここに開示する抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Epstein等, Proc. Natl. acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang等, Proc. natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及び米国特許第4,485,045号及び第4,544,545号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ-ＰＥ）を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。リポソームは、所定サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Martin等, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに抱合され得る。化学治療薬（ドキソルビシン等）は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizon等, J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)参照。
【０２１３】
９．抗体の製薬組成物
ここで同定されるＰＲＯポリペプチドに特異的に結合する抗体、並びに上記に開示したスクリーニングアッセイで同定された他の分子は、種々の疾患の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。
ＰＲＯポリペプチドが細胞内であり、全抗体が阻害剤として用いられる場合、内在化抗体が好ましい。しかし、リポフェクション又はリポソームも抗体、又は抗体断片を細胞に導入するのに使用できる。抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、又は組換えＤＮＡ技術によって生成できる。例えば、Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993)参照。ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に１以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞毒性薬、サイトカイン又は成長阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル）中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Science, 上掲に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなけらばならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。除放性マトリクスの例は、ポリエステルヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール））、ポリアクチド（米国特許第3,773,919号）、Ｌ-グルタミン酸及びγ-エチル-Ｌ-グルタメート、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(商品名)（乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球）などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、ポリ-(Ｄ)-３-ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーは分子を１００日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは３７℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
【０２１４】
Ｇ．抗-ＰＲＯ抗体の用途
本発明の抗-ＰＲＯ抗体は様々な有用性を有している。例えば、抗-ＰＲＯ抗体は、ＰＲＯの診断アッセイ、例えばその特定細胞、組織、又は血清での発現の検出に用いられる。競合的結合アッセイ、直接又は間接サンドウィッチアッセイ及び不均一又は均一相で行われる免疫沈降アッセイ［Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158］等のこの分野で知られた種々の診断アッセイ技術が使用される。診断アッセイで用いられる抗体は、検出可能な部位で標識される。検出可能な部位は、直接又は間接に、検出可能なシグナルを発生しなければならない。例えば、検出可能な部位は、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ等の放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、あるいはアルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってよい。抗体に検出可能な部位を抱合させるためにこの分野で知られた任意の方法が用いられ、それにはHunter等 Nature, 144:945 (1962)；David等, Biochemistry, 13: 1014 (1974)；Pain等, J. Immunol. Meth., 40:219 (1981) ;及びNygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982)に記載された方法が含まれる。
また、抗-ＰＲＯ抗体は組換え細胞培養又は天然供給源からのＰＲＯのアフィニティー精製にも有用である。この方法においては、ＰＲＯに対する抗体を、当該分野でよく知られている方法を使用して、セファデックス樹脂や濾紙のような適当な支持体に固定化する。次に、固定化された抗体を、精製するＰＲＯを含む試料と接触させた後、固定化された抗体に結合したＰＲＯ以外の試料中の物質を実質的に全て除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、ＰＲＯを抗体から脱離させる他の適当な溶媒で支持体を洗浄する。
【実施例】
【０２１５】
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。
実施例で言及されている全ての市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ登録番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、ＶＡである。
実施例１：新規なポリペプチド及びそれをコードするｃＤＮＡを同定するための細胞外ドメイン相同性スクリーニング
Swiss-Prot公的データベースからの約９５０の公知の分泌タンパク質からの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列（必要ならば、分泌シグナル配列を含む）を、ＥＳＴデータベースの検索に使用した。ＥＳＴデータベースは、公的データベース（例えば、Dayhoff、GenBank）及び独自に開発したデータベース（例えば、LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む。検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST-2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて、ＥＣＤタンパク質配列のＥＳＴ配列の６フレーム翻訳との比較として実施した。公知のタンパク質をコードせず、Ｂｌａｓｔスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, WA）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列に構築した。
この細胞外ドメイン相同性スクリーニングを用いて、phrapを用いて他の同定されたＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。さらに、得られたコンセンサスＤＮＡ配列を、しばしば（全てではない）BLAST又はBLAST-2及びphrapの繰り返しサイクルを用いて伸長し、コンセンサス配列を上で議論したＥＳＴ配列の供給源を用いて可能な限り伸長させた。
上記のように得られたコンセンサス配列に基づいて、次いでオリゴヌクレオチドを合成し、ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及びＰＲＯポリペプチドの全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして用いるために使用した。正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは一般的に２０から３０ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約１００−１０００ｂｐ長のＰＣＲ産物を与えるために設計される。プローブ配列は、典型的に４０−５５ｂｐ長である。或る場合には、コンセンサス配列が約１−１．５ｋｂｐより大きいときに付加的なオリゴヌクレオチドが合成される。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, のように、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲによりスクリーニングした。ポジティブライブラリを、次いで、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いて対象とする遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
ｃＤＮＡクローンの単離に用いたｃＤＮＡライブラリは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法によって作成した。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、そして適切なクローニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐＲＫ５Ｄ等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫＤの前駆体である；Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照）に、独特のＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ部位において、所定の方向でクローニングした。
【０２１６】
実施例２：アミラーゼスクリーニングによるｃＤＮＡクローンの単離
１．オリゴｄＴプライムｃＤＮＡライブラリの調製
ｍＲＮＡを対象とするヒト組織からInvitrogen, San Diego, CAからの試薬及びプロトコールを用いて単離した（Fast Track 2）。このＲＮＡを、Life Technologies, Gaithersburg, MD (Super Script Plasmid System)からの試薬及びプロトコールを用いるベクターｐＲＫ５ＤにおけるオリゴｄＴプライムしたｃＤＮＡの生成に使用した。この方法において、二本鎖ｃＤＮＡは１０００ｂｐを越えるサイズ分類し、ＳａｌＩ／ＮｏｔＩ結合ｃＤＮＡをＸｈｏＩ／ＮｏｔＩ切断ベクターにクローニングした。ｐＲＫ５Ｄを、ｓｐ６転写開始部位、それに続くＳｆｉＩ制限酵素部位、さらにＸｈｉＩ／ＮｏｔＩｃＤＮＡクローニング部位を持つベクターにクローニングした。
２．ランダムプライムｃＤＮＡライブラリの調製
一次ｃＤＮＡクローンの５’末端を好ましく表現するために二次ｃＤＮＡライブラリを作成した。Ｓｐ６ＲＮＡを（上記の）一次ライブラリから生成し、このＲＮＡを、ベクターｐＳＳＴ-ＡＭＹ．０におけるLife Technologies (上で参照したSuper Script Plasmid System)からの試薬及びプロトコールを用いたランダムプライムしたｃＤＮＡライブラリの生成に使用した。この方法において、二本鎖ｃＤＮＡを５００−１０００ｂｐにサイズ分類し、平滑末端でＮｏｔＩアダプターに結合させ、ＳｆｉＩ部位で切断し、そしてＳｆｉＩ／ＮｏｔＩ切断ベクターにクローニングした。ｐＳＳＴ-ＡＭＹ．０は、ｃＤＮＡクローニング部位の前に酵母アルコールデヒドロゲナーゼプロモータ、及びクローニング部位の後にマウスアミラーゼ配列（分泌シグナルを持たない成熟配列）に次いでアルコールデヒドロゲナーゼ転写終結区を有するクローニングベクターである。即ち、アミラーゼ配列でフレームに融合するこのベクターにクローニングされたｃＤＮＡは、適当に形質移入された酵母コロニーからのアミラーゼの分泌を導くであろう。
【０２１７】
３．形質転換及び検出
上記２パラグラフに記載したライブラリからのＤＮＡを氷上で冷却し、それにエレクトロコンピテントＤＨ１０Ｂ細菌（Life Technoligies、２０ｍｌ）を添加した。細菌及びベクターの混合物は、次いで製造者に推奨されているように電気穿孔た。次いで、ＳＯＣ培地（Life Technplogies、１ｍｌ）を添加し、この混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。形質転換体は、次いでアンピシリンを含む２０標準１５０ｍｍＬＢプレートに蒔き、１６時間インキュベートした（３７℃）。ポジティブコロニーをプレートから廃棄し、細菌ペレットから標準的な方法、例えばＣｓＣｌ-勾配を用いてＤＮＡを単離した。精製ＤＮＡは、次いで以下の酵母プロトコールにのせた。
酵母方法は３つの範疇に分けられる：（１）酵母のプラスミド／ｃＤＮＡ結合ベクターでの形質転換；（２）アミラーゼを分泌する酵母クローンの検出及び単離；及び（３）酵母コロニーから直接的な挿入物のＰＣＲ増幅及び配列決定及びさらなる分析のためのＤＮＡの精製。
用いた酵母菌株はＨＤ５６-５Ａ（ATCC-90785）であった。この株は以下の遺伝子型：ＭＡＴアルファ、ｕｒａ３-５２、ｌｅｕ２-３、ｌｅｕ２-１１２、ｈｉｓ３-１１、ｈｉｓ３-１５、ＭＡＬ＋、ＳＵＣ＋、ＧＡＬ＋を有する。好ましくは、不完全な翻訳後経路を持つ酵母変異体を用いることができるが、。このような変異体は、ｓｅｃ７１、ｓｅｃ７２、ｓｅｃ６２に転位不全対立遺伝子を持つが、切断されたｓｅｃ７１が最も好ましい。あるいは、これらの遺伝子の正常な操作を阻害するアンタゴニスト（アンチセンスヌクレオチド及び／又はリガンドを含む）、この翻訳後経路に含まれる他のタンパク質（例えば、ＳＥＣ６１ｐ、ＳＥＣ７２ｐ、ＳＥＣ６２ｐ、ＳＥＣ６３ｐ、ＴＤＪ１ｐ、ＳＳＡ１ｐ-４ｐ）又はこれらのタンパク質の複合体形成も、アミラーゼ発現酵母と組み合わせて好ましく用いられる。
形質転換は、Gietz等, Nucl. Acid. Res., 20: 1425 (1992)に概略が記されたプロトコールに基づいて実施された。形質転換細胞は、次いで寒天からＹＥＰＤ複合培地ブロス（１００ｍｌ）に播種し、３０℃で終夜成長させた。ＹＥＰＤブロスは、Kaiser等, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 207 (1994)に記載されているように調製した。終夜培地は、次いで新鮮なＹＥＰＤブロス（５００ｍｌ）中におよそ２ｘ１０６細胞／ｍｌ（約ＯＤ６００＝０．１）に希釈し、１ｘ１０７細胞／ｍｌ（約ＯＤ６００＝０．４−０．５）まで再成長させた。
次いで細胞を収穫し、5,000rpmで５分間のSorval GS3 ローターのＧＳ３ローターボトルに移し、上清を捨て、次いで無菌水に再懸濁することにより形質転換のために調製し、そして５０ｍｌのファルコン管内で、Beckman GS-6KR遠心機において3,500rpmで再度遠心分離した。上清を捨て、細胞をＬｉＡｃ／ＴＥ（10ml, 10mMのトリス-HCl, 1mMのEDTA  pH7.5, 100mMのＬｉ２ＯＯＣＣＨ３）で続けて洗浄し、ＬｉＡｃ／ＴＥ（2.5ml）中に再懸濁させた。
形質転換は、マイクロチューブ内で、調製した細胞（100μl）を新鮮な変性一本鎖サケ精子ＤＮＡ（Lofstrand Labs, Gaitherburg, MD）及び形質転換ＤＮＡ（1μg vol. ＜ 10μl）と混合することにより起こした。混合物はボルテックスにより簡単に混合し、次いで40%ＰＥＧ／ＴＥ（600μl, 40%のポリエチレングリコール-４０００, 10mMのトリス-HCl, 1mMのEDTA, 100mMのLiOOCCH3, pH 7.5）を添加した。この混合物を緩く撹拌し、３０℃で撹拌しながら３０分間インキュベートした。次いで細胞に４２℃で１５分間熱衝撃を与え、反応容器をミクロチューブ内で12,000rpmで5-10秒間遠心分離し、デカント及びＴＥ（500μl, 10mMのトリス-HCl, 1mMのEDTA pH 7.5）への再懸濁に次いで遠心分離した。次いで、細胞をＴＥ（1ml）中に希釈し、アリコート（200μl）を150mm成長プレート（ＶＷＲ）に予め調製した選択培地に拡げた。
あるいは、複数の少量反応ではなく、形質転換を１回の大規模反応で実施したが、試薬の量はしかるべくスケールアップした。
用いた選択培地は、Kaiser等, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor press, Cold Spring Harbor, NY, p. 208-210 (1994)に記載されているように調製したウラシルを欠く合成完全デキストロース寒天（ＳＣＤ-Ｕｒａ）であった。形質転換体は３０℃で２−３日成長させた。
アミラーゼを分泌するコロニーの検出は、選択成長培地における赤色デンプンの包含により実施した。Biely等, Anal. Biochem., 172: 176-179 (1988)に記載された方法に従って、デンプンを赤色染料（反応性 Red-120, Sigma）に結合させた。結合したデンプンをＳＣＤ-Ｕｒａ寒天プレートに最終濃度0.15%（w/v）で導入し、リン酸カリウムでｐＨ７．０に緩衝した（最終濃度50-100mM）。
ポジティブコロニーを拾って新鮮な選択培地（150mmプレート）に画線し、良好に単離され同定可能な単一コロニーを得た。アミラーゼ分泌についてポジティブな良好に単離されたコロニーは、緩衝ＳＣＤ-Ｕｒａ寒天への赤色団分の直接導入により検出した。ポジティブコロニーは、デンプンを分解して、ポジティブコロニーの周囲に直接目視できる暈を形成する能力により決定した。
【０２１８】
４．ＰＣＲ増幅によるＤＮＡの単離
ポジティブコロニーが単離された場合、その一部を楊枝で拾い、９６ウェルプレートにおいて無菌水（30μl）に希釈した。この時点で、ポジティブコロニーは凍結して次の分析のために保存するか、即座に増幅するかのいずれかである。細胞のアリコート（5μl）を、0.5μlのKlentaq（Clontech, Palo Alto, CA）; 4.0μlの10mM dNTP（Perkin Elmer-Cetus）; 2.5μlのKentaqバッファー(Clontech); 0.25μlの正方向オリゴ１；0.25μlの逆方向オリゴ２；12.5μlの蒸留水を含有する25μl容量におけるＰＣＲ反応のテンプレートとして使用した。正方向オリゴヌクレオチド１の配列は：
5'- TGTAAAACGACGGCCAGTTAAATAGACCTGCAATTATTAATCT -3'
（配列番号：3）であった。
逆方向オリゴヌクレオチド２の配列は：
5'- CAGGAAACAGCTATGACCACCTGCACACCTGCAAATCCATT-3'
（配列番号：4）であった。
次いで、ＰＣＲは以下の通り実施した：
ａ．                  変性           92℃、5分間
ｂ．次の３サイクル    変性           92℃、30秒間
アニール       59℃、30秒間
伸長           72℃、60秒間
ｃ．次の３サイクル    変性           92℃、30秒間
アニール       57℃、30秒間
伸長           72℃、60秒間
ｄ．次の２５サイクル  変性           92℃、30秒間
アニール       55℃、30秒間
伸長           72℃、60秒間
ｅ．                  保持           4℃
下線を施した領域は、各々ＡＤＨプロモーター領域及びアミラーゼ領域にアニーリングされ、挿入物が存在しない場合はベクターｐＳＳＴ-ＡＭＹ．０からの３０７ｂｐ領域を増幅する。典型的には、これらのオリゴヌクレオチドの５’末端の最初の１８ヌクレオチドは、配列プライマーのアニーリング部位を含んでいた。即ち、空のベクターからのＰＣＲ反応の全生成物は３４３ｂｐであった。しかしながら、シグナル配列融合ｃＤＮＡは、かなり長いヌクレオチド配列をもたらした。
ＰＣＲに続いて、反応のアリコート（5μl）を、上掲のSambrook等に記載されたように1%アガロースゲル中でトリス-ボレーと-ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）緩衝系を用いたアガローススゲル電気泳動により試験した。４００ｂｐより大きな単一で強いＰＣＲ産物をもたらすクローンを、96 Qiaquick PCR 清浄化カラム（Quagen Inc., Charsworth, CA）での精製の後にＤＮＡ配列によりさらに分析した。
【０２１９】
実施例３：シグナルアルゴリズム分析を用いたｃＤＮＡクローンの単離
種々のポリペプチド-コード化核酸配列は、ジェネンテク，インク（South San Francisco, CA）によって開発された独自の配列発見アルゴリズムを、公的（例えば、GenBank）及び／又は個人的（LIFESEQ(登録商標), Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA）データベースからのＥＳＴｓ並びに集団化及び組み立てられたＥＳＴ断片に適用することにより同定した。シグナル配列アルゴリズムは、考慮している配列又は配列断片の５'-末端の第１の、場合によっては第２のメチオニンコドン（ＡＴＧ）を取り囲むＤＮＡヌクレオチドの文字に基づく分泌シグナルスコアを計算する。第１のＡＴＧに続くヌクレオチドは、停止コドンを持たない少なくとも３５の不明瞭でないアミノ酸をコードしなければならない。第１のＡＴＧが必要なアミノ酸を有する場合、第２のものは試験しない。何れも要件を満たさない場合、候補配列にスコアをつけなかった。ＥＳＴ配列が真正のシグナル配列を含むか否かを決定するために、ＡＴＧコドンを取り囲むＤＮＡ及び対応するアミノ酸配列を、分泌シグナルに関連することが知られた７つのセンサー（評価パラメータ）の組を用いてスコアをつけた。このアルゴリズムの使用により、多くのポリペプチド-コード化核酸配列の同定がなされた。
【０２２０】
実施例４：ヒトＰＲＯ２８１をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ＰＲＯ２８１をコードするｃＤＮＡクローンを得るために、Klein等, Proc.Natl.Acad.Sci., 93:7108-7113 (1996)に記載された方法に以下の修正を加えて用いた。酵母形質転換は、多重形質転換された酵母細胞の数を減少させるために制限された量の形質転換ＤＮＡで実施した。上掲のKlein等に記載されたような酵母からのプラスミドの単離に続く大腸菌の形質転換ではなく、ＰＣＲ分析を単一の酵母菌コロニーに実施した。用いたＰＣＲプライマーは、挿入物及びインベルターゼ遺伝子の小部分を増幅（挿入物がインベルターゼを持つ枠内であることを決定）するため、そして全配列プライマー部位を付加するために二連とした。
インベルターゼライブラリを酵母に形質転換し、スクロースプレート上でポジティブを選択した。ポジティブクローンを再試験し、ＰＣＲ産物を配列決定した。一つのクローン、ＰＲＯ２８１が単一のシグナルペプチドコード化配列を含むと同定した。ＰＲＯ２８１のヌクレオチド配列を用いてオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブを設計した。ヒト臍静脈上皮組織からのｃＤＮＡの全長プラスミドライブラリを滴定し、約100,000cfuを96-ウェルの丸底プレートに、500cfu/プールの192プール中で蒔いた。プレートを密閉し、プールを振盪（200rpm）させながら37℃で終夜成長させた。アガロースゲル電気泳動を実施し、ポジティブウェルを予測されるサイズのバンドを可視化することにより同定した。個々のポジティブクローンは、コロニーリフトに続く３２Ｐ-標識オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成により得た。これらのクローンを、ＰＣＲ、制限消化、及びサザンブロット分析で特徴付けした。
全長クローンは、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置８０−８２に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１１１５−１１１７に停止シグナルを持つと同定された（図１；配列番号：１）。予測されるポリペプチド前駆体は３４５アミノ酸長であり、約３７，２０５の計算された分子量及び約１０．１５の見積もられたｐＩを有する。図２（配列番号：２）に示した全長ＰＲＯ２８１の分析は、以下のものの存在を明らかにした：アミノ酸約１〜アミノ酸約１４のシグナルペプチド、アミノ酸位置約８３〜アミノ酸位置約１０５、アミノ酸位置約１２６〜アミノ酸位置約１４６、アミノ酸位置約１５８〜アミノ酸位置約１７７、アミノ酸位置約１９７〜アミノ酸位置約２１６、アミノ酸位置約２１８〜アミノ酸位置約２３８、アミノ酸位置約２４５〜アミノ酸位置約２６５、及びアミノ酸位置約２７１〜アミノ酸位置約２９０の多重膜貫通ドメイン、及びアミノ酸約１１５〜アミノ酸約１５５のＧ-タンパク質結合レセプタータンパク質に相同性を持つアミノ酸配列ブロック。クローンＵＮＱ２２４（ＤＮＡ１６４２２−１２０９）は1998年6月2日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９２９が付与されている。
図２（配列番号：２）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ２８１アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、H64634, AF033095_1, B64815, YBHL_ECOLI, EMEQUTR_1, AF064763_3, S53708, A69253, AF035413_12及びS63281との間の有意な相同性が明らかになった。
【０２２１】
実施例５：ヒトＰＲＯ２７６をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ＰＲＯ２７６をコードするｃＤＮＡクローンを得るために、Klein等, PNAS, 93: 7108-7113 (1996)に記載された方法に以下の修正を加えて用いた。酵母形質転換は、多重形質転換された酵母細胞の数を減少させるために制限された量の形質転換ＤＮＡで実施した。上掲のKlein等に記載されたような酵母からのプラスミドの単離に続く大腸菌の形質転換ではなく、ＰＣＲ分析を単一の酵母菌コロニーに実施した。用いたＰＣＲプライマーは、挿入物及びインベルターゼ遺伝子の小部分を増幅（挿入物がインベルターゼを持つ枠内であることを決定）するため、そして全配列プライマー部位を付加するために二連とした。
インベルターゼライブラリを酵母に形質転換し、スクロースプレート上でポジティブを選択した。ポジティブクローンを再試験し、ＰＣＲ産物を配列決定した。一つのクローン、ＰＲＯ２７６が単一のシグナルペプチドコード化配列を含むと同定した。ＰＲＯ２７６のヌクレオチド配列を用いてオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブを設計した。ヒト臍静脈上皮組織からのｃＤＮＡの全長プラスミドライブラリを滴定し、約100,000cfuを96-ウェルの丸底プレートに、500cfu/プールの192プール中で蒔いた。プレートを密閉し、プールを振盪（200rpm）させながら37℃で終夜成長させた。アガロースゲル電気泳動を実施し、ポジティブウェルを予測されるサイズのバンドを可視化することにより同定した。個々のポジティブクローンは、コロニーリフトに続く３２Ｐ-標識オリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成により得た。これらのクローンを、ＰＣＲ、制限消化、及びサザンブロット分析で特徴付けした。
全長クローンは、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１８０−１８２に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置９３３−９３５に停止シグナルを持つと同定された（図３；配列番号：５）。予測されるポリペプチド前駆体は２５１アミノ酸長であり、約２８，８０１の計算された分子量及び約９．５８の見積もられたｐＩを有する。膜貫通ドメインは、およそ図４（配列番号：６）に示したアミノ酸９８〜１１６及び１５２〜１７２にある。クローンＤＮＡ１６４３５−１２０８（ＵＮＱ２４３）はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９３０が付与されている。
図４（配列番号：６）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ２７６アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、CEG25D7_2, ATT8O5_2, S69696, GRHR_RAT, NPCBAABCD_3, AB013149_1, P_R85942及びAP000006_5との間の或る程度の配列同一性が明らかになった。
【０２２２】
実施例６：ヒトＰＲＯ１８９をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例２に記載したように、ヒト網膜組織ライブラリからここでＤＮＡ１４１８７と命名されるクローンを単離した。ＤＮＡ１４１８７配列を図７（配列番号：９）に示す。図７（配列番号：９）に示したＤＮＡ１４１８７配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ１８９の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは一般的に２０から３０ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約１００−１０００ｂｐ長のＰＣＲ産物を与えるために設計される。プローブ配列は、典型的に４０−５５ｂｐ長である。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, のように、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。ポジティブライブラリを、次いで、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いて対象とする遺伝子をコードするクローンの単離するのに使用した。
ＰＣＲプライマーの対（正及び逆）を合成した：：
正方向ＰＣＲプライマー  5'-TTGACCTATACAGAGATTCATC-3'（配列番号：10）
逆方向ＰＣＲプライマー  5'-CTAAGAACTTCCCTCAGGATTTT-3'（配列番号：11）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つＤＮＡ１４１８７配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5'-ATGAAGATCAATTTCAAGAAGCATGCACTTCTCCTCTTGC-3'（配列番号：12）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ１８９遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト網膜組織（ＬＩＢ９４）から単離した。ｃＤＮＡクローンを単離するのに用いたｃＤＮＡライブラリは、Invitrogen, San Diego, Caからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法により作成した。ｃＤＮＡをＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、所定の方向で適当なクローニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照）に、独特のＸｏｌ及びＮｏｔＩ部位でクローニングした。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ１８９の全長ＤＮＡ配列及びＰＲＯ１８９の誘導タンパク質配列を与えた。
ＤＮＡ２１６２４−１３９１の全核酸配列を図５（配列番号：７）に示す。クローンＤＮＡ２１６２４−１３９１は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２００−２０２に見かけの翻訳開始部位そしてヌクレオチド位置１３０１−１３０３の停止コドンで終端する（図５）。予測されるポリペプチド前駆体は３６７アミノ酸長である（図６）。図６に示した全長ＰＲＯ１８９タンパク質は約４１，８７１ダルトンの見積もられた分子量及び約５．０６のｐＩを有する。クローンＤＮＡ２１６２４−１３９１はＡＴＣＣに寄託されている。配列について、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供された配列は公知の配列技術に基づくと理解される。
配列番号：８のアミノ酸配列の分析により、推定Ｎ-グリコシル化部位は約アミノ酸２２４−２２７、２４６−２４９及び２８５−２８８である。サイトソル脂肪酸結合タンパク質は配列番号：８のアミノ酸７８−１０７である。対応するヌクレオチドは、ここに提供される配列が与えられれば日常的に決定できる。
Ｄａｙｈｏｆｆデータベースにおいて各々CEW01A6_10及びCELF35D11_11と称される線虫タンパク質、W01A6.1およびF35D11.11に対して或る程度の配列同一性が見られた。また、Ｄａｙｈｏｆｆデータベースで各々P_R05766及びAF01412_1と称されるマラリア及びレスチンの抗原に対しても或る程度の配列同一性が見られた。また、Ｄａｙｈｏｆｆデータベースで各々AF041382_1及びS07537と称される微小管結合タンパク質及びミオシンに対しても或る程度の配列同一性が見られた。また、PIP1_RATと称される１-ホスファチジリノシトール-４，５-ビスホスフェートに対しても或る程度の配列同一性がある。
【０２２３】
実施例７：ヒトＰＲＯ１９０をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例２に記載したように、ヒト網膜組織ライブラリからここでＤＮＡ１４２３２と命名されるクローンを単離した。ＤＮＡ１４２３２配列を図１０（配列番号：１５）に示す。ＤＮＡ１４２３２配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ１９０の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは一般的に２０から３０ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約１００−１０００ｂｐ長のＰＣＲ産物を与えるために設計される。プローブ配列は、典型的に４０−５５ｂｐ長である。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, のように、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。ポジティブライブラリを、次いで、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いて対象とする遺伝子をコードするクローンの単離するのに使用した。
ＰＣＲプライマーの対（正及び逆）を合成した：：
正方向ＰＣＲプライマー  5'-CTATACCTACTGTAGCTTCT-3'（配列番号：16）
逆方向ＰＣＲプライマー  5'-TCAGAGAATTCCTTCCAGGA-3'（配列番号：17）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つＤＮＡ１４２３２配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5'-ACAGTGCTGTAGTCATCCTGTAATATGCTCCTTGTCAACA-3'（配列番号：18）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ１９０遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト網膜組織（ＬＩＢ９４）から単離した。ｃＤＮＡクローンを単離するのに用いたｃＤＮＡライブラリは、Invitrogen, San Diego, Caからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法により作成した。ｃＤＮＡをＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、所定の方向で適当なクローニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照）に、独特のＸｏｌ及びＮｏｔＩ部位でクローニングした。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ１９０の全長ＤＮＡ配列［ここでＤＮＡ２３３３４−１３９２と命名する］（配列番号：１３）及びＰＲＯ１９０の誘導タンパク質配列を与えた。
ＤＮＡ２３３３４−１３９２の全核酸配列を図８（配列番号：１３）に示す。クローンＤＮＡ２３３３４−１３９２は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１９３−１９５に見かけの翻訳開始部位そしてヌクレオチド位置１４６５−１４６７の停止コドンで終端する（図８）。予測されるポリペプチド前駆体は４２４アミノ酸長である（図９）。図９に示した全長ＰＲＯ１９０タンパク質は約４８，５００ダルトンの見積もられた分子量及び約８．６５のｐＩを有する。クローンＤＮＡ２３３３４−１３９２はＡＴＣＣに寄託されている。配列について、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供された配列は公知の配列技術に基づくと理解される。
配列番号：１４のアミノ酸配列の分析により、推定膜貫通ドメインは配列番号：１４のおよそアミノ酸１６−３６、５０−７４、１４７−１６８、２２９−２５０、２７１−２９３、２９８−３１８及び３２８−３６８である。Ｎ-グリコシル化部位は、配列番号：１４のおよそアミノ酸１２８−１３１、２０４−２０７、２１８−２２１及び２７４−３７７である。対応するヌクレオチドは、ここに提供された配列が与えられれば日常的に決定できる。
ＰＲＯ１９０は、少なくとも以下のように称されるDayhoff配列：CEZK896_2, JC5023, GMS1_SCHPO及びS44668と配列同一性を有する。
【０２２４】
実施例８：ヒトＰＲＯ３４１をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例２に記載したように、ヒト網膜組織ライブラリからここでＤＮＡ１２９２０と命名されるクローンを単離した。ＤＮＡ１２９２０配列を図１３（配列番号：２１）に示す。ＤＮＡ１２９２０配列は、次いで、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々のＥＳＴデータベースと比較し、相同性ＥＳＴ配列を同定した。比較は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2［Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)］を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ２５３１４と命名する。次いでＤＮＡ２５３１４配列に基づいて、オリゴヌクレオチドプローブを合成し、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリのスクリーニングに使用し、図１１に示すＤＮＡ２６２８８−１２３９クローンを同定した。クローニングベクターはｐＲＫ５Ｂであり（ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)）、ｃＤＮＡサイズ切断は２８００ｂｐ未満であった。
全長クローンが同定され、それは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置３８０−３８２に見かけの翻訳開始部位、そしてヌクレオチド位置１７５４−１７５６に停止シグナルを持つ（図１１；配列番号：１９）。予測されるポリペプチド前駆体は４５８アミノ酸長であり、約５０，２６４の計算された分子量及び約８．１７の見積もられたｐＩを有する。図１２（配列番号：２０）に示した全長ＰＲＯ３４１配列の分析は、以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸１〜約アミノ酸１７のシグナルペプチド、約アミノ酸１７１〜約アミノ酸１９０、約アミノ酸２２０〜約アミノ酸２３９、約アミノ酸２５９〜約アミノ酸２７５、約アミノ酸２８６〜約アミノ酸３０５、約アミノ酸３１６〜約アミノ酸３３５、約アミノ酸３５３〜約アミノ酸３７８、及び約アミノ酸３９６〜約アミノ酸４１７の膜貫通ドメイン、及び約アミノ酸１４５〜約アミノ酸１４７及び約アミノ酸１５５〜約アミノ酸１５８の潜在的Ｎ-グリコシル化部位。クローンＤＮＡ２６２８８−１２３９は1998年4月21日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９７９２が付与されている。
図１２（配列番号：２０）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ３４１アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、S75696, H69788, D69852, A69888, B64918, F64752, LPU89276_1, G64962, S52977及びS44253との間の相同性が明らかになった。
【０２２５】
実施例９：ヒトＰＲＯ１８０をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例２に記載したように、ヒト網膜組織ライブラリからここでＤＮＡ１２９２２と命名されるクローンを単離した。ＤＮＡ１２９２２配列を図１６（配列番号：２４）に示す。ＤＮＡ１２９２２配列は、次いで、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々のＥＳＴデータベースと比較し、相同性ＥＳＴ配列を同定した。比較は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2［Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)］を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。
上記で得られたコンセンサス配列に基づいて、オリゴヌクレオチドプローブを合成した。このプローブは次の配列を有していた：
5'-ACCTGTTAGAAATGTGGTGGTTTCAGCAAGGCCTCAGTTT（配列番号：２５)
このプローブを、実施例２のパラグラフ１に記載したように調製したヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリのスクリーニングに使用した。クローニングベクターはｐＲＫ５Ｂであり（ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)）、ｃＤＮＡサイズ切断は２８００ｂｐ未満であった。ここでＤＮＡ２６８４３−１３８９と命名されるクローンを得た。
ＤＮＡ２６８４３−１３８９の全ヌクレオチド配列を図１４（配列番号：２２）に示す。クローンＤＮＡ２６８４３−１３８９は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１２１−１２３に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置９１９−９２１の停止コドンで終端する（図１４）。予測されるポリペプチド前駆体は２６６アミノ酸長である（図１５）。図１５に示す全長ＰＲＯ１８０タンパク質は、約２９，７６６の見積もられた分子量及び約８．３９のｐＩを有する。クローンＤＮＡ２６８４３−１３８９はＡＴＣＣに寄託された。配列について、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供された配列は公知の配列技術に基づくと理解される。
配列番号：２３のアミノ酸配列の分析により、膜貫通ドメインは配列番号：２３のおよそアミノ酸１３−３３（ＩＩ型）、５４−７３、９４−１１３、１６０−１８０、及び１２２−１４１である。Ｎ-ミリストイル化部位は、配列番号：２３のおよそアミノ酸５７−６２、９５−１００、９９−１０４、１２４−１２９及び１８３−１８８である。対応するヌクレオチドは、ここに提供された配列が与えられれば日常的に決定できる。
図１５（配列番号：２３）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１８０アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、CEC33A11_2, CEG11E6_5, CELW03A5_1及びPEU83861_2(NADHデヒドロゲナーゼサブユニット4L, ミトコンドリオン)との間の相同性が明らかになった。
【０２２６】
実施例１０：ヒトＰＲＯ１９４をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように、phrapを用いて他のＥＳＴに対してコンセンサスＤＮＡ配列を組み立てた。このコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ１９４６４とする。ＤＮＡ１９４６４配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ１９４の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。ＤＮＡ１９４６４配列に基づいてＰＣＲプライマー（正及び逆）を合成した。さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブをコンセンサスＤＮＡ１９４６４配列から作成した。
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ１９４遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児肺組織（ＬＩＢ２５）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ１９４の全長ＤＮＡ配列［ここでＤＮＡ２６８４４−１３９４と命名する］（配列番号：２７）及びＰＲＯ１９４の誘導タンパク質配列を与えた。
ＤＮＡ２６８４４−１３９４の全核酸配列を図１７（配列番号：２７）に示す。クローンＤＮＡ２６８４４−１３９４は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置８１−８３に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置８７３−８７５の停止コドンで終端する（図１７）。予測されるポリペプチド前駆体は２６４アミノ酸長である（図１８）。図１８に示した全長ＰＲＯ１９４タンパク質は約２９，６６５ダルトンの見積もられた分子量及び約９．３４のｐＩを有する。図１８（配列番号：２８）に示す全長ＰＲＯ１９４配列の分析により、図１８に示す種々の重要なポリペプチドドメインの存在が明らかになった。クローンＤＮＡ２６８４４−１３９４は1998年6月2日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９２６が付与された。
全長ＰＲＯ１９４ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、任意の公知のヒトタンパク質と有意な相同性を示さないことが示唆された。しかし、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１９４アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、HUMORFT_1, CET07F10_5, ATFCA9_12, F64934, YDJX_ECOLI, ATAF00065719F29G20.19, H70002, S76980, H64934及びS76385との間の相同性が明らかになった。
【０２２７】
実施例１１：ヒトＰＲＯ２０３をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例２に記載したように、ヒト胎児肺組織ライブラリからここでＤＮＡ１５６１８と命名されるクローンを単離した。ＤＮＡ１５６１８配列を図２１（配列番号：３１）に示す。ＤＮＡ１５６１８分子の配列からオリゴヌクレオチドプローブを作成し、上記実施例２のパラグラフ１に記載したように調製したヒト胎児肺ライブラリ（ＬＩＢ２６）のスクリーニングに使用した。クローニングベクターはｐＲＫ５Ｂであり（ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)）、ｃＤＮＡサイズ切断は２８００ｂｐ未満であった。
全長クローンが同定され、それは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１５９−１６１に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１２００−１２０２の停止コドンで終端する（図１９；配列番号：２９）。予測されるポリペプチド前駆体は３４７アミノ酸長であり、約３９，８７０の計算された分子量及び約６．７６の見積もられたｐＩを有する。図２０（配列番号：３０）に示した全長ＰＲＯ２０３配列の分析は、以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸６４〜約アミノ酸８７のＩＩ型膜貫通ドメイン；約アミノ酸１４７〜約アミノ酸１５０、約アミノ酸１５５〜約アミノ酸１５８、及び約アミノ酸２３７〜約アミノ酸２４０の可能なＮ-グリコシル化部位；約アミノ酸２３〜約アミノ酸４５の重金属結合ドメインタンパク質との配列同一性；及び約アミノ酸２４〜約アミノ酸３４のＤ-異性体特異的２-ヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼとの配列同一性。クローンＤＮＡ３０８６２−１３９６は1998年6月2日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９２０が付与されている。
全長ＰＲＯ２０３ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、ＧＳＴ ＡＴＰａｓｅとの配列相同性を有することが示唆され、ＰＲＯ２０３が新規なＧＣＴ ＡＴＰａｓｅであることを示している。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ２０３アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、AF008124_1, CFRCD1GEN_1, 及び P_R82566との間の相同性が明らかになった。
【０２２８】
実施例１２：ヒトＰＲＯ２９０をコードするｃＤＮＡクローンの単離
発現配列タグ（ＥＳＴ）データベース（LIFESEQ(登録商標)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を検索してベージュ及びＦＡＮと相同性を持つＥＳＴを同定した。次いで同定したＥＳＴ配列に基づいてオリゴヌクレオチドプローブを合成し、全長ｃＤＮＡクローンの同定を目的とするヒト胎児腎臓ｃＤＮＡライブラリのスクリーニングに使用した。オリゴヌクレオチドプローブは、以下の配列を有していた：
5'-TGACTGCACTACCCCGTGGCAAGCTGTTGAGCCAGCTCAGCTG-3'（配列番号：34）
ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織から単離した。ｃＤＮＡクローンを単離するのに用いたｃＤＮＡライブラリは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法により作成した。ｃＤＮＡをＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、所定の方向で適当なクローニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照）に、独特のＸｏｌ及びＮｏｔＩ部位でクローニングした。
ｃＤＮＡクローン全体を同定し配列決定した。
ＤＮＡ３５６８０−１２１２の全ヌクレオチド配列を図２２（配列番号：３２）に示す。クローンＤＮＡ３５６８０−１２１２は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２９３−２９５に見かけの翻訳開始部位、そしてヌクレオチド位置３３０２−３３０４にの停止コドンを持つ（図２２；配列番号：３２）。予測されるポリペプチド前駆体は１００３アミノ酸長である
現在では、ＰＲＯ２９０ポリペプチドはＦＡＮ及び／又はベージュに関連すると考えられている。クローンＤＮＡ３５６８０−１２１２はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９７９０が付与された。寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供された配列は公知の配列技術に基づくと理解される。図２３に示した全長ＰＲＯ２９０タンパク質は、約１１２，０１３ダルトンの見積もり分子量及び約６．４のｐＩを有する。
【０２２９】
実施例１３：ヒトＰＲＯ８７４をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ここでＤＮＡ３６４５９と命名されるコンセンサスＤＮＡ配列を上記実施例１に記載したようにphrapを用いて同定した。ＤＮＡ３６４５９コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ８７４のコード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正及び逆）を合成した：：
正方向ＰＣＲプライマー  5'-TCGTGCCCAGGGGCTGATGTGC-3'（配列番号：37）
逆方向ＰＣＲプライマー  5'-GTCTTTACCCAGCCCCGGGATGCG-3'（配列番号：38）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つＤＮＡ３６４５９配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5'-GGCCTAATCCAACGTTCTGTCTTCAATCTGCAAATCTATGGGGTCCTGGG-3'（配列番号：39）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ８７４遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児肺組織（ＬＩＢ２５）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ８７４の全長ＤＮＡ配列［ここでＤＮＡ４０６２１−１４４０と命名する］（配列番号：３５）及びＰＲＯ８７４の誘導タンパク質配列を与えた。
【０２３０】
ＤＮＡ４０６２１−１４４０の全ヌクレオチド配列を図２４（配列番号：３５）に示す。クローンＤＮＡ４０６２１−１４４０は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置９６４−９６６の停止コドンで終端する（図２４）。ＤＮＡ４０６２１−１４４０にコードされる予測されるポリペプチドは３２１アミノ酸長である（図２５）。図２５に示したＰＲＯ８７４タンパク質は約３６，１９４ダルトンの見積もられた分子量及び約９．８５のｐＩを有する。図２５（配列番号：３６）に示した全長ＰＲＯ８７４配列の分析は、以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸５７〜約アミノ酸８０のＩＩ型膜貫通ドメイン；約アミノ酸１１０〜１２６、２１５−２３１、及び２５４−２７４の付加的膜貫通ドメイン；約アミノ酸１６−１９、２７−３０、及び２８９−２９２の潜在的Ｎ-グリコシル化部位；約アミノ酸２７６〜２８７の仮定的ＹＢＲ００２ｃファミリータンパク質との配列同一性；及び約アミノ酸２０４〜２３０のアンモニウムトランスポータータンパク質との配列同一性。クローンＤＮＡ４０６２１−１４４０は1998年6月2日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９２２が付与されている。
全長ＰＲＯ８７４ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、新規の多重スパン膜貫通タンパク質であることが示唆された。しかし、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ８７４アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、S67049, AF054839_1, S73437, S52460, 及び HIVU80570_1との間の相同性が明らかになった。
【０２３１】
実施例１４：ヒトＰＲＯ７１０をコードするｃＤＮＡクローンの単離
潜在的な分泌タンパク質をコードするｃＤＮＡの同定に酵母スクリーニングアッセイを用いた。この酵母スクリーニングアッセイの使用により、その配列（ここでＤＮＡ３８１９０と命名する）が図２８（配列番号：４２）に示される単一のｃＤＮＡの同定が可能になった。図２８に示すＤＮＡ３８１９０配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ７１０の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, のように、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。ポジティブライブラリを、次いで、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いて対象とする遺伝子をコードするクローンの単離するのに使用した。
ＰＣＲプライマーの対（正及び逆）を合成した：：
正方向ＰＣＲプライマー  5'-TTCCGCAAAGAGTTCTACGAGGTGG-3'（配列番号：43）
逆方向ＰＣＲプライマー  5'-ATTGACAACATTGACTGGCCTATGGG-3'（配列番号：44）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つＤＮＡ３８１９０配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5'-GTGGATGCTCTGTGTGCGTGCAAGATCCTTCAGGCCTTGTTCCAGTGTGA-3'（配列番号：45）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ７１０遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織（ＬＩＢ２２７）から単離した。ｃＤＮＡクローンを単離するのに用いたｃＤＮＡライブラリは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法により作成した。ｃＤＮＡをＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、所定の方向で適当なクローニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照）に、独特のＸｏｌ及びＮｏｔＩ部位でクローニングした。
全長クローンが同定され、それは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置６７−６９に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１７６５−１７６７に見られる停止コドンで終端する（図２６；配列番号：４０）。予測されるポリペプチド前駆体は５６６アミノ酸長であり、約６５，５５５の計算された分子量及び約５．４４の見積もられたｐＩを有する。図２７（配列番号：４１）に示した全長ＰＲＯ７１０配列の分析は、以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸１〜約アミノ酸３２のシグナルペプチド、約アミノ酸４５４〜約アミノ酸４７６の膜貫通ドメイン、約アミノ酸６〜約アミノ酸２６のアミノアシル-トランスファーRNAシンセターゼクラスＩＩシグネーチャー配列、約アミノ酸１１１〜約アミノ酸１１４、約アミノ酸１４６〜約アミノ酸１４９の及び約アミノ酸２９２〜約アミノ酸２９５の潜在的Ｎ-グリコシル化部位。クローンＤＮＡ４４１６１−１４３４は1998年5月27日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９０７が付与されている。
全長ＰＲＯ７１０ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、ＣＤＣ４５タンパク質との有意な配列相同性を有することが示唆され、ＰＲＯ７１０が新規なＣＤＣ４５相同体であることを示している。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ７１０アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、HSAJ3728_1, CEF34D10_1, S64939, UMU50276_1, TRHY_SHEEP, CELT14E8_1, RNA1_YEAST, LVU89340_1, HSU80736_1及びCEZK337_2との間の相同性が明らかになった。
【０２３２】
実施例１５：ヒトＰＲＯ１１５１をコードするｃＤＮＡクローンの単離
コンセンサスＤＮＡ配列を上記実施例１に記載したように他のＥＳＴ配列に対してphrapを用いて作成した。ＤＮＡ４０６６５コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ１１５１のコード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正及び逆）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー  5'-CCAGACGCTGCTCTTCGAAAGGGTC-3'（配列番号：48）
逆方向ＰＣＲプライマー  5'-GGTCCCCGTAGGCCAGGTCCAGC-3'（配列番号：49）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つＤＮＡ４０６６５配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5'-CTACTTCTTCAGCCTCAATGTGCACAGCTGGAATTACAAGGAGACGTACG-3'（配列番号：50）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ１１５１遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ１１５１の全長ＤＮＡ配列（ここでＤＮＡ４４６９４−１５００と命名する［図２９；配列番号：４６］）及びＰＲＯ１１５１の誘導タンパク質配列を与えた。
ＤＮＡ４４６９４−１５００の全ヌクレオチド配列を図２９（配列番号：４６）に示す。クローンＤＮＡ４４６９４−１５００は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２７２−２７４に見かけの翻訳開始部位を持ちヌクレオチド位置１０４９−１０５１の停止コドンで終端する（図２９）。予測されるポリペプチドは２５９アミノ酸長である（図３０）。図３０に示したＰＲＯ１１５１タンパク質は約２８，７７０ダルトンの見積もられた分子量及び約６．１２のｐＩを有する。図３０（配列番号：４７）に示した全長ＰＲＯ１１５１配列の分析は、以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸１〜約アミノ酸２０のシグナルペプチド、約アミノ酸７２〜約アミノ酸７５の潜在的Ｎ-グリコシル化部位、及び約アミノ酸１４４〜約アミノ酸１７８、約アミノ酸７８〜約アミノ酸１１１及び約アミノ酸８４〜約アミノ酸１１７のＣ１ｑドメイン含有タンパク質と相同性を持つアミノ酸配列ブロック。クローンＵＮＱ５８１（ＤＮＡ４４６９４−１５００）は1998年8月11日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３１１４が付与されている。
図３０（配列番号：４７）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１１５１アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、ACR3_HUMAN, HP25_TAMAS, HUMC1QB2_1, P_R99306, CA1F_HUMAN, JX0369, CA24_HUMAN, S32436, P_R28916及びCA54_HUMANとの間の相同性が明らかになった。
【０２３３】
実施例１６：ヒトＰＲＯ１２８２をコードするｃＤＮＡクローンの単離
コンセンサスＤＮＡ配列を上記実施例１に記載したように他のＥＳＴ配列に対してphrapを用いて作成した。ＤＮＡ３３７７８コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ１２８２のコード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正及び逆）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー  5'-TCTTCAGCCGCTTGCGCAACCTC-3'（配列番号：53）
逆方向ＰＣＲプライマー  5'-TTGCTCACATCCAGCTCCTGCAGG-3'（配列番号：54）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つＤＮＡ３３７７８配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5'-TGGATGTTGTCCAGACAACCAGCTGGAGCTGTATCCGAGGC-3'（配列番号：55）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ１２８２遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児肝臓から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ１２８２の全長ＤＮＡ配列（ここでＤＮＡ４５４９５−１５５０と命名する［図３１；配列番号：５１］）及びＰＲＯ１２８２の誘導タンパク質配列を与えた。
ＰＲＯ１２８２の全コード化配列を図３１（配列番号：５１）に示す。クローンＤＮＡ４５４９５−１５５０は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１２０−１２２に見かけの翻訳開始部位を持ちヌクレオチド位置２１３９−２１４１の停止コドンで終端する（図５１）。予測されるポリペプチドは６７３アミノ酸長である。シグナルペプチドは、配列番号：５２の約アミノ酸１〜２３であり；膜貫通ドメインは約アミノ酸５７９−５９９であり；ＥＧＦ様ドメインシステインパターンシグネーチャーは約アミノ酸４３０で開始し；そしてロイシンジッパーパターンは約アミノ酸１９７及び２６９で開始する、図３２参照。クローンＤＮＡ４５４９５−１５５０はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３１５６が付与されている。図３２に示した全長ＰＲＯ１２８２タンパク質は約７１，６５５ダルトンの見積もられた分子量及び約７．８のｐＩを有する。
図３２（配列番号：５２）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１２８２アミノ酸配列と以下のDayhoff配列（データベースからのデータは参考として取り入れる）、AB007876_1, RNPLGPV_1, MUSLRRP_1, ALS_PAPPA, AC004142_1, ALS_HUMAN, AB014462_1, DMTARTAN_1, HSCHON3_1 及びS46224との間の相同性が明らかになった。
【０２３４】
実施例１７：ヒトＰＲＯ３５８をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載した方法を用いて、Incyteデータベースにおいて、ここでＩＮＣ３１１５９４９と命名される単一のＥＳＴ配列を同定した。ＩＮＣ３１１５９４９ＥＳＴ配列に基づいて、ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定し、ＰＲＯ３５８の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するためにオリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正及び逆）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー  5'-TCCCACCAGGTATCATAAACTGAA-3'（配列番号：58）
逆方向ＰＣＲプライマー  5'-TTATAGACAATCTGTTCTCATCAGAGA-3'（配列番号：59）
プローブも合成した：
5'-AAAAAGCATACTTGGAATGGCCCAAGGATAGGTGTAAATG-3'（配列番号：60）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及び対の一方を用いてＰＲＯ１２８２遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト骨髄（ＬＩＢ２５６）から単離した。ｃＤＮＡクローンを単離するのに用いたｃＤＮＡライブラリは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法により作成した。ｃＤＮＡをＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、所定の方向で適当なクローニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照）に、独特のＸｏｌ及びＮｏｔＩ部位でクローニングした。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ３５８の全長ＤＮＡ配列（図３３；配列番号：５６）及びＰＲＯ３５８の誘導タンパク質配列（図３４，配列番号：５７）を与えた。
同定されたクローン（ＤＮＡ４７３６１−１１５４）の全ヌクレオチド配列を図３３（配列番号：５６）に示す。クローンＤＮＡ４７３６１−１１５４は、単一のオープンリーディングフレームを含み、図３３に下線を付したヌクレオチド位置に見かけの翻訳開始部位（ＡＴＧ開始シグナル）を持つ。予測されるポリペプチド前駆体は８１１アミノ酸長であり、推定シグナル配列（アミノ酸１〜１９）、細胞外ドメイン（アミノ酸２０〜５７５、位置５５〜位置５７５の領域にロイシンリッチ反復を含む）、推定膜貫通ドメイン（アミノ酸）５７６〜５９５）を含む。クローンＤＮＡ４７３６１−１２４９はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９４３１が付与されている。
【０２３５】
実施例１８：ヒトＰＲＯ１３１０をコードするｃＤＮＡクローンの単離
コンセンサスＤＮＡ配列を上記実施例１に記載したように他のＥＳＴ配列に対してphrapを用いて作成した。このコンセンサス配列をここでＤＮＡ３７１６４と命名する。ＤＮＡ３７１６４コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ１３１０のコード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正及び逆）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー  5'-GTTCTCAATGAGCTACCCGTCCCC-3'（配列番号：63）及び
逆方向ＰＣＲプライマー  5'-CGCGATGTAGTGGAACTCGGGCTC-3'（配列番号：64）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つＤＮＡ４７３９４配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ：
5'-ATCCGCATAAACCCTCAGTCCTGGTTTGATAATGGGAGCATCTGCATGAG-3'（配列番号：65）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ１３１０遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児肝臓から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ１３１０の全長ＤＮＡ配列及びＰＲＯ１３１０の誘導タンパク質配列を与えた。
ＰＲＯ１３１０の全コード化配列を図３５（配列番号：６１）に示す。クローンＤＮＡ４７３９４−１５７２は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置３２６−３２８に見かけの翻訳開始部位及びヌクレオチド位置２５９４−２５９６に見かけの停止コドンを持つ（図６１）。予測されるポリペプチドは７６５アミノ酸長である。シグナルペプチドは、配列番号：６２の約アミノ酸１〜２５である。クローンＤＮＡ４７３９４−１５７２はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３１０９が付与されている。図３６に示した全長ＰＲＯ１３１０タンパク質は約８５，８９８ダルトンの見積もられた分子量及び約６．８７のｐＩを有する。
図３６（配列番号：６２）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１３１０アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：AF017639_1, P_W36817, JC5256, CBPH_HUMAN, MMU23184_1, CBPN_HUMAN, HSU83411_1, CEF01D4_7, RNU62897_1及びP_W11851との間の配列同一性が明らかになった。
【０２３６】
実施例１９：ヒトＰＲＯ６９８をコードするｃＤＮＡクローンの単離
潜在的な分泌タンパク質をコードするｃＤＮＡの同定に酵母スクリーニングアッセイを用いた。この酵母スクリーニングアッセイの使用により、その配列（ここでＤＮＡ３９９０６と命名する）が図３９（配列番号：６８）に示される単一のｃＤＮＡの同定が可能になった。図３９に示すＤＮＡ３９９０６配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ６９８の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, のように、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。ポジティブライブラリを、次いで、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いて対象とする遺伝子をコードするクローンの単離するのに使用した。
ＰＣＲプライマーの対（正及び逆）を合成した：：
正方向ＰＣＲプライマー  5'-AGCTGTGGTCATGGTGGTGTGGTG-3'（配列番号：69）
逆方向ＰＣＲプライマー  5'-CTACCTTGGCCATAGGTGATCCGC-3'（配列番号：70）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つＤＮＡ３９９０６配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5'-CATCAGCAAACCGTCTGTGGTTCAGCTCAACTGGAGAGGGTT-3'（配列番号：71）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ６９８遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト骨髄組織（ＬＩＢ２５５）から単離した。ｃＤＮＡクローンを単離するのに用いたｃＤＮＡライブラリは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法により作成した。ｃＤＮＡをＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、所定の方向で適当なクローニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照）に、独特のＸｏｌ及びＮｏｔＩ部位でクローニングした。
全長クローンが同定され、それは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１４−１６に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１５４４−１５４６に見られる停止コドンで終端する（図３７；配列番号：６６）。予測されるポリペプチド前駆体は５１０アミノ酸長であり、約５７，２８０の計算された分子量及び約５．６１の見積もられたｐＩを有する。図３８（配列番号：６７）に示した全長ＰＲＯ６９８配列の分析は、以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸１〜約アミノ酸２０のシグナルペプチド、約アミノ酸７２〜約アミノ酸７５、約アミノ酸１３６〜約アミノ酸１３９、約アミノ酸１９３〜約アミノ酸１９６、約アミノ酸２５３〜約アミノ酸２５６、約アミノ酸３５２〜約アミノ酸３５５、及び約アミノ酸４１１〜約アミノ酸４１４の潜在的Ｎ-グリコシル化部位、約アミノ酸２０〜約アミノ酸３９のマメ科レクチンベータ鎖タンパク質に相同性を持つアミノ酸ブロック、及び約アミノ酸３３８〜約アミノ酸３６５のＨＢＧＦ／ＦＥＦファミリーのタンパク質に相同性を持つアミノ酸ブロック。クローンＤＮＡ４８３２０−１４３３は1998年5月27日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９０４が付与されている。
全長ＰＲＯ６９８ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、オルファクトメジンタンパク質との有意な配列相同性を有することが示唆され、ＰＲＯ６９８が新規なオルファクトメジン相同体であることを示している。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ６９８アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、OLFM_RANCA, I73637, AB006686S3_1, RNU78105_1, RNU72487_1, P_R98225, CELC48E7_4, CEF11C3_3, XLU85970_1およびS42257との間の有意な相同性が明らかになった。
【０２３７】
実施例２０：ヒトＰＲＯ７３２をコードするｃＤＮＡクローンの単離
潜在的な分泌タンパク質をコードするｃＤＮＡの同定に酵母スクリーニングアッセイを用いた。この酵母スクリーニングアッセイの使用により、その配列（ここでＤＮＡ４２５８０と命名する）が図４５（配列番号：７７）に示される単一のｃＤＮＡの同定が可能になった。ＤＮＡ４２５８０配列は、次いで、種々の公知のＥＳＴ配列と比較して相同性を同定した。用いたＥＳＴデータベースは、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む。検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いてＥＳＴ配列の６フレーム翻訳との比較として実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。
上記の分析を用いて、コンセンサスＤＮＡ配列をphrapを用いて他のＥＳＴ配列に対して組み立てた。独自に開発したジェネンテクＥＳＴ配列をコンセンサス組立に用い、それらをここでＤＮＡ２０２３９（図４２；配列番号：７４）、ＤＮＡ３８０５０（図４３；配列番号：７５）およびＤＮＡ４０６８３（図４４；配列番号：７６）と命名した。
ｃｏｎｓｅｎ０１配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ７３２の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは一般的に２０から３０ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約１００−１０００ｂｐ長のＰＣＲ産物を与えるために設計される。プローブ配列は、典型的に４０−５５ｂｐ長である。或る場合には、コンセンサス配列が１−１．５ｋｂｐより大きい場合に付加的オリゴヌクレオチドが合成される。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, のように、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。ポジティブライブラリを、次いで、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いて対象とする遺伝子をコードするクローンの単離するのに使用した。
ＰＣＲプライマーの対（正及び逆）を合成した：：
正方向ＰＣＲプライマー  5'-ATGTTTGTGTGGAAGTGCCCCG-3'（配列番号：78）
正方向ＰＣＲプライマー  5'-GTCAACATGCTCCTCTGC-3'（配列番号：79）
逆方向ＰＣＲプライマー  5'-AATCCATTGTGCACTGCAGCTCTAGG-3'（配列番号：80）
逆方向ＰＣＲプライマー  5'-GAGCATGCCACCACTGGACTGAC-3'（配列番号：81）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つＤＮＡ４４１４３配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5'-GCCGATGCTGTCCTAGTGGAAACAACTCCACTGTAACTAGATTGATCTATGCAC-3'（配列番号：82）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ７３２遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児肺組織（ＬＩＢ２６）から単離した。ｃＤＮＡクローンを単離するのに用いたｃＤＮＡライブラリは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法により作成した。ｃＤＮＡをＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、所定の方向で適当なクローニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照）に、独特のＸｏｌ及びＮｏｔＩ部位でクローニングした。
全長クローンが同定され、それは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置８８−９０に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１４４７−１４４９に見られる停止コドンで終端する（図４０；配列番号：７２）。予測されるポリペプチド前駆体は４５３アミノ酸長であり、約５０，４１９の計算された分子量及び約５．７８の見積もられたｐＩを有する。図４１（配列番号：７３）に示した全長ＰＲＯ７３２配列の分析は、以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸１〜約アミノ酸２８のシグナルペプチド、約アミノ酸３７〜約アミノ酸５７、約アミノ酸９３〜約アミノ酸１０９、約アミノ酸１２６〜約アミノ酸１４８、約アミノ酸１５１〜約アミノ酸１７２、約アミノ酸１９７〜約アミノ酸２１５、約アミノ酸２３１〜約アミノ酸２４５、約アミノ酸２６０〜約アミノ酸２７９、約アミノ酸３１５〜約アミノ酸３３３、約アミノ酸３８４〜約アミノ酸４０３及び約アミノ酸４２２〜約アミノ酸４４７の膜貫通ドメイン、約アミノ酸３３〜約アミノ酸３６、約アミノ酸３４〜約アミノ酸３７、約アミノ酸１７９〜約アミノ酸１８３、約アミノ酸２９８〜約アミノ酸３０１、約アミノ酸３３７〜約アミノ酸３４０及び約アミノ酸４０６〜約アミノ酸４０９の潜在的Ｎ-グリコシル化部位、約アミノ酸１１９〜約アミノ酸１４９のＭＩＰファミリーのタンパク質に相同性を持つアミノ酸ブロック、及び約アミノ酸２７９〜約アミノ酸２８６のＤＮＡ／ＲＮＡ非特異的エンドヌクレアーゼタンパク質に相同性を持つアミノ酸ブロック。クローンＤＮＡ４８３３４−１４３５は1998年6月2日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９２４が付与されている。
全長ＰＲＯ７３２ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、Ｄｉｆｆ３３タンパク質との有意な配列相同性を有することが示唆され、ＰＲＯ７３２が新規なＤｉｆｆ３３相同体であることを示している。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ７３２アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、HS179M20_2, MUSTETU_1, CER11H6_2, RATDRP_1, S51256, E69226, AE000869_1, JC4120, CYB_PARTE及びP_R50619との間の有意な相同性が明らかになった。
【０２３８】
実施例２１：ヒトＰＲＯ１１２０をコードするｃＤＮＡクローンの単離
コンセンサスＤＮＡ配列を上記実施例１に記載したように他のＥＳＴ配列に対してphrapを用いて作成した。このコンセンサス配列をここでｃｏｎｓｅｎ０３５２と命名する。次いでｃｏｎｓｅｎ０３５２をBLAST及びphrapの繰り返しサイクルを用いて伸長させ、上記のＥＳＴ配列の供給源を用いてコンセンサス配列をできるだけ伸長させた。伸長させたコンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ１１２０のコード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正及び逆）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー：5'-GAAGCCGGCTGTCTGAATC-3'（配列番号：85）、
5'-GGCCAGCTATCTCCGCAG-3'（配列番号：86）、
5'-AAGGGCCTGCAAGAGAAG-3'（配列番号：87）、
5'-CACTGGGACAACTGTGGG-3'（配列番号：88）、
5'-CAGAGGCAACGTGGAGAG-3'（配列番号：89）、及び
5'-AAGTATTGTCATACAGTGTTC-3'（配列番号：90）；
逆方向ＰＣＲプライマー：5'-TAGTACTTGGGCACGAGGTTGGAG-3'（配列番号：91）、及び
5'-TCATACCAACTGCTGGTCATTGGC-3'（配列番号：92）；
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つＤＮＡ３４３６５配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ：
5'-CTCAAGCTGCTGGACACGGAGCGGCCGGTGAATCGGTTTCACTTG-3'（配列番号：93）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ１１２０遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ１１２０の全長ＤＮＡ配列（ここでＤＮＡ４８６０６−１４７９と命名される［図４６、配列番号：８３］）及びＰＲＯ１１２０の誘導タンパク質配列を与えた。
ＰＲＯ１１２０の全コード化配列を図４６（配列番号：８３）に示す。クローンＤＮＡ４８６０６−１４７９は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置６０８−６１０に見かけの翻訳開始部位及びヌクレオチド位置３２０９−３２１１に見かけの停止コドンを持つ。予測されるポリペプチドは８６７アミノ酸長である。図４７に示した全長ＰＲＯ１１２０タンパク質は約１００，１５６ダルトンの見積もられた分子量及び約９．４４のｐＩを有する。ＰＲＯ１１２０ポリペプチドのさらなる特徴は、約アミノ酸１−１７のシグナルペプチド；約アミノ酸８６−９８のスルファターゼシグネーチャー；約アミノ酸８７−１０６、１３３−１４６、２１６−２２９、２９１−３２０、及び３６５−３７５のスルファターゼに相同な領域；及び約アミノ酸６５−６８、１１２−１１５、１３２−１３５、１４９−１５２、１７１−１７４、１９８−２０１、２４１−２４５、５６１−５６４、６０８−６１１、７１７−７２０，７５４−７５７及び７６４−７６７の潜在的Ｎグリコシル部位を含む。
図４７（配列番号：８４）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１１２０アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：CELK09C4_1, GL6S_HUMAN, G65169, NCU89492_1, BCU44852_1, E64903, P_R51355, STS_HUMAN, GA6S_HUMAN, 及びIDS_MOUSEとの間の配列同一性が明らかになった。クローンＤＮＡ４８６０６−１４７９は1998年7月1日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３０４０が付与されている。
【０２３９】
実施例２２：ヒトＰＲＯ５３７をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、IncyteデータベースからのＩｎｃｙｔｅＥＳＴクラスター番号２９６０５と命名されるＥＳＴクラスター配列の同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQＲ、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ４８３５０と命名する。
ＤＮＡ４８３５０コンセンサス配列とＭｅｒｃｋのＥＳＴクローン番号Ｒ６３４４３に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＭｅｒｃｋＥＳＴクローン番号Ｒ６３４４３を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図４８に示し、ここでＤＮＡ４９１４１−１４３１と命名する。
クローンＤＮＡ４９１４１−１４３１は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置９７−９９に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置４４２−４４４の停止コドンで終端する（図４８）。予測されるポリペプチド前駆体は１１５アミノ酸長である（図４９）。図４９に示す全長ＰＲＯ５３７タンパク質は、約１３，１８３の見積もられた分子量及び約１２．１３のｐＩを有する。図４９（配列番号：９５）に示した全長ＰＲＯ５３７配列の分析は、以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸１〜約アミノ酸３１のシグナルペプチド、約アミノ酸４４〜約アミノ酸４７の潜在的Ｎ-グリコシル化部位、約アミノ酸３〜約アミノ酸８及び約アミノ酸１６〜約アミノ酸２１の潜在的Ｎ-ミリストリル化部位、及び約アミノ酸９７〜約アミノ酸１０５のマルチカッパーオキシダーゼタンパク質と相同性を有するアミノ酸ブロック。クローンＤＮＡ４９１４１−１４３１は1998年6月23日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３００３が付与されている。
図４９（配列番号：９５）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ５３７アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：A54523, CELF22H10_2, FKH2_MOUSE, OTX1_HUMAN, URB1_USTMA, KNOB_PLAFN, A32895_1, AF036332_1, HRG_HUMAN及びHRP3_PLAFSとの間の配列同一性が明らかになった。
【０２４０】
実施例２３：ヒトＰＲＯ５３６をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、Incyteデータベースからの、ここでｓｓ．ｃｌｕ２４３７．ｉｎｉｔと命名されるＥＳＴクラスター配列の同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ４８３５１と命名する。
ＤＮＡ４８３５１コンセンサス配列とＭｅｒｃｋのＥＳＴクローン番号Ｈ１１１２９に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＭｅｒｃｋＥＳＴクローンＨ１１１２９を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図５０に示し、ここでＤＮＡ４９１４２−１４３０と命名する。
クローンＤＮＡ４９１４２−１４３０は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置４８−５０に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置９８７−９８９の停止コドンで終端する（図５０）。予測されるポリペプチド前駆体は３１３アミノ酸長である（図５１）。図５１に示す全長ＰＲＯ５３６タンパク質は、約３４，１８９の見積もられた分子量及び約４．８のｐＩを有する。図５１（配列番号：９７）に示した全長ＰＲＯ５３６配列の分析は、以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸１〜約アミノ酸２５のシグナルペプチド、約アミノ酸４５〜約アミノ酸４８の潜在的Ｎ-グリコシル化部位、及び約アミノ酸１６〜約アミノ酸２６のスルファターゼタンパク質と相同性を有するアミノ酸ブロック。クローンＤＮＡ４９１４２−１４３０は1998年6月23日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３００２が付与されている。
図５１（配列番号：９７）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ５３６アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：APU46857_1, PK2_DICDI, H64743, F5114_18, CEAM_ECOLI, GEN14267, H64965, TCU39815_1, PSBJ_ODOSI及びP_R06980との間の配列同一性が明らかになった。
【０２４１】
実施例２４：ヒトＰＲＯ５３５をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、Incyteデータベースからの、ここでｓｓ．ｃｌｕ１２６９４．ｉｎｉｔと命名されるＥＳＴクラスター配列の同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ４８３５２と命名する。２つの独自に開発したジェネンテクＥＳＴ配列を組立に用い、図５４及び５５に示した。
ＤＮＡ４８３５２コンセンサス配列とＭｅｒｃｋのＥＳＴクローン番号Ｈ８８６９９４に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＭｅｒｃｋＥＳＴクローンＨ８６９９４を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図５２に示し、ここでＤＮＡ４９１４３−１４２９と命名する。
クローンＤＮＡ４９１４３−１４２９は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置７８−８０に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置６８１−６８３の停止コドンで終端する（図５２）。予測されるポリペプチド前駆体は２０１アミノ酸長である（図５３）。図５３に示す全長ＰＲＯ５３５タンパク質は、約２２，１８０の見積もられた分子量及び約９．６８のｐＩを有する。図５３（配列番号：９９）に示した全長ＰＲＯ５３５配列の分析は、以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸１〜約アミノ酸２５のシグナルペプチド、約アミノ酸１５５〜約アミノ酸１７４の膜貫通ドメイン、約アミノ酸１９６〜約アミノ酸１９９の潜在的Ｎ-グリコシル化部位、及び約アミノ酸６２〜約アミノ酸７７、約アミノ酸８７〜約アミノ酸１２３及び約アミノ酸１２８〜約アミノ酸１４１のＦＫＢＲ型ペプチジル-プロリルシス-トランス異性体シグネーチャー配列。クローンＤＮＡ４９１４３−１４２９は1998年6月23日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３０１３が付与されている。
図５３（配列番号：９９）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ５３５アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：S71237, P_R93551, P_R28980, S71238, FKB2_HUMAN, CELC05C8_1, S55383, S72485, CELC50F2_6及びS75144との間の配列同一性が明らかになった。
【０２４２】
実施例２５：ヒトＰＲＯ７１８をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例２（ヒト胎児肺ライブラリ）に記載したアミラーゼスクリーニングで単離したｃＤＮＡ配列を、ここでＤＮＡ４３５１２と命名する（図６２；配列番号：１０８参照）。次いでＤＮＡ４３５１２配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ４５６２５と命名する。独自に開発したジェネンテクＥＳＴ配列を組立に用い、図５８−６１に示した。
ＤＮＡ４５６２６配列に基づいてオリゴヌクレオチドプローブを作成し、上記実施例２のパラグラフ１に記載したように調製したヒト胎児肺ライブラリ（ＬＩＢ２５）のスクリーニングに使用した。クローニングベクターはｐＲＫ５Ｂであり（ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)）、ｃＤＮＡサイズ切断は２８００ｂｐ未満であった。
ＰＣＲプライマーの対（正及び逆）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー：5'-GGGTGGATGGTACTGCTGCATCC-3'（配列番号：109）
逆方向ＰＣＲプライマー：5'-TGTTGTGCTGTGGGAAATCAGATGTG-3'（配列番号：110）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つＤＮＡ４５６２５配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ：
5'-GTGTCTGGAGGCTGTGGCCGTTTTGTTTTCTTGGGCTAAAATCGGG-3'（配列番号：111）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ７１８遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
全長クローンが同定され、それは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置３６−３８に見かけの翻訳開始部位を持ち、ヌクレオチド位置６０７−６０９に見られる停止コドンで終端する（図５６；配列番号：１０２）。予測されるポリペプチドは１５７アミノ酸長であり、約１７，４００ダルトンの計算された分子量及び約５．７８の見積もられたｐＩを有する。図５７（配列番号：１０３）に示すＰＲＯ７１８配列の分析により以下の存在が明らかとなった：約アミノ酸２１−約アミノ酸４０のＩＩ型膜貫通ドメイン、及び約アミノ酸５８−約アミノ酸７８、約アミノ酸９５−約アミノ酸１１４及び約アミノ酸１２７−約アミノ酸１４７の他の膜貫通ドメイン；約アミノ酸７９−約アミノ酸８１の細胞接着配列；約アミノ酸５３−約アミノ酸５６の潜在的Ｎ-グリコシル化部位。クローンＤＮＡ４９６４７−１３９８は1998年6月2日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９１９が付与されている。
全長ＰＲＯ７１８ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが任意の公知のタンパク質と有意な相同性を持たないことを示唆している。しかし、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ７１８アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：AF045606_1, AF039906_1, SPBC8D2?2, S63441, F64728, COX1_TRYBB, F64375, E64173, RPYGJT_3, MTCY261_23との間の或る程度の相同性が明らかになった。
【０２４３】
実施例２６：ヒトＰＲＯ８７２をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、Incyteデータベースからの、ここでｓｓ．ｃｌｕ１２０７０９．ｉｎｉｔと命名されるＥＳＴクラスター配列の同定が可能となった。次いでｃｌｕ１２０７０９．ｉｎｉｔ配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ４８２５４と命名する。
ＤＮＡ４８２５４コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号３４３８０６８に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅＥＳＴクローン３４３８０６８を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図６３に示し、これはＰＲＯ８７２の全長ＤＮＡ配列である。クローンＤＮＡ４９８１９−１４３９は1998年6月2日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９３１が付与されている。
ＤＮＡ４９８１９−１４３９の全ヌクレオチド配列を図６３（配列番号：１１２）に示す。クローンＤＮＡ４９８１９−１４３９は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１４−１６に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１８４４−１８４６の停止コドンで終端する（図６３）。予測されるポリペプチド前駆体は６１０アミノ酸長である（図６４）。図６４に示す全長ＰＲＯ８７２タンパク質は、約６６，８２０の見積もられた分子量及び約８．６５のｐＩを有する。図６４（配列番号：１１３）に示した全長ＰＲＯ８７２配列の分析は、以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸１〜約アミノ酸１８のシグナルペプチド、約アミノ酸７０−８７、２００−２２２及び５６８−５８８の推定膜貫通ドメイン；約アミノ酸７１−１０５の細菌型フィトエンデヒドロゲナーゼタンパク質との配列同一性；約アミノ酸２０１−２１１の染色体縮合レギュレータ（ＲＣＣ１）シグネーチャー２との配列同一性；約アミノ酸２１４−２３５、２２１−２４２、２２８−２４９及び３６４−３８５のロイシンジッパーパターン；約アミノ酸２７１−２７４の潜在的Ｎ-グリコシル化部位；及び約アミノ酸７５−７８のグリコサミノグリカン結合部位。全長ＰＲＯ８７２ポリペプチドのアミノ酸配列のＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）を用いた分析により、ＰＲＯ８７２アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：PRCRTI_1, S5951, S74689, CELF37C4_3, CRTI_RHOCA, S76617, YNI2_ METTL, MTV014_14, APFB_HUMAN, 及び MMU70429_1との間の相同性が明らかになった。
【０２４４】
実施例２７：ヒトＰＲＯ１０６３をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、Incyteデータベースからの、ここでｓｓ．ｃｌｕｌ１９７４３．ｉｎｉｔと命名される単一のＩｎｃｙｔｅＥＳＴクラスター配列の同定が可能となった。次いでこのＩｎｃｙｔｅＥＳＴクラスター配列ｓｓ．ｃｌｕｌ１９７４３．ｉｎｉｔ配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ４８２８８と命名する。
ＤＮＡ４８２８８コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号２７８３７２６に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅＥＳＴクローン２７９３７２６を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図６５に示し、ここでＤＮＡ４９８２０−１４２７と命名する。
図６５に示した全長クローンはクローンは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置９０−９２に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置９９３−９９５の停止コドンで終端する（図６５；配列番号：１１４）。予測されるポリペプチド前駆体は３０１アミノ酸長であり、約３３，５３０の計算された分子量及び約４．８０の見積もられたｐＩを有する。図６６（配列番号：１１５）に示した全長ＰＲＯ１０６３配列の分析は、以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸１〜約アミノ酸２１のシグナルペプチド、約アミノ酸１９５〜約アミノ酸１９８、約アミノ酸２１７〜約アミノ酸２２０及び約アミノ酸２７２〜約アミノ酸２７５の潜在的Ｎ-グリコシル化部位、約アミノ酸２６７〜約アミノ酸２７０のグリコサミノグリカン結合部位、約アミノ酸２９９〜約アミノ酸３０１の微小体Ｃ-末端標的化部位、約アミノ酸１２７〜約アミノ酸１６８のＩＩ型フィブロネクチンコラーゲン結合ドメイン相同配列、及び約アミノ酸１０１〜約アミノ酸１１８のフルクトースビスホスフェート或る度ラーゼクラスＩＩタンパク質相同配列。クローンＤＮＡ４９８２０−１４２７は1998年6月2日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９３３２が付与されている。
全長ＰＲＯ１０６３ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、ヒトＩＶ型コラゲナーゼタンパク質との配列相同性を有することが示唆された。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１０６３アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、S68303, CFU68533_1, P_P91139, RNU65656_1, PA2R_RABIT, MMU56734_1, FINC_XENLA, A48925, P_R92778及びFA12_HUMANとの間の相同性が明らかになった。
【０２４５】
実施例２８：ヒトＰＲＯ６１９をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、Incyteデータベースからの、ここで８８４３４と命名されるＥＳＴクラスター配列の同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。
コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号１６６５６６９４に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅＥＳＴクローン１６６５６６９４を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図６７に示し、ここでＤＮＡ４９８２１−１５６２と命名する。
図６７に示した全長クローンは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置８１−８３に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置４５０−４５２の停止コドンで終端する（図６７；配列番号：１１６）。予測されるポリペプチド前駆体（図６８；配列番号：１１７）は１２３アミノ酸長であり、約アミノ酸１−２０に予測されるシグナルペプチドを含む。ＰＲＯ６１９タンパク質は、約１３，７１０の計算された分子量及び約５．１９の見積もられたｐＩを有する。クローンＤＮＡ４９８２１−１５６２は1998年6月16日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９８１が付与されている。
図６８（配列番号：１１７）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ６１９アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：S35302, D87009_1, HSU93494_1, HUMIGLAM5_1, D86999_2, HUMIGLYM1_1, HUMIGLYMKE_1, A29491\1, A29498_1, 及びVPR2_MOUSEとの間の有意な相同性が明らかになった。
【０２４６】
実施例２９：ヒトＰＲＯ９４３をコードするｃＤＮＡクローンの単離
コンセンサスＤＮＡ配列を上記実施例１に記載したように他のＥＳＴ配列に対してphrapを用いて作成した。次いでこのコンセンサス配列をBLAST及びphrapの繰り返しサイクルを用いて伸長させ、上記のＥＳＴ配列の供給源を用いてコンセンサス配列をできるだけ伸長させた。伸長させたコンセンサス配列をここでＤＮＡ３６３６０と命名する。ＤＮＡ３６３６０コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ９４３のコード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正及び逆）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー：5'-CGAGATGACGCCGAGCCCCC-3'（配列番号：120）
逆方向ＰＣＲプライマー：5'-CGGTTCGACACGCGGCAGGTG-3'（配列番号：121）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つＤＮＡ３６３６０配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ：
5'-TGCTGCTCCTGCTGCCGCCGCTGCTGCTGGGGGCCTTCCCGCCGG-3'（配列番号：122）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ９４３遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児脳組織から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ９４３の全長ＤＮＡ配列（ここでＤＮＡ５２１９２−１３６９と命名される［図６９、配列番号：１１８］）及びＰＲＯ９４３の誘導タンパク質配列を与えた。
ＰＲＯ９４３の全コード化配列を図６９（配列番号：１１８）に示す。クローンＤＮＡ５２１９２−１３６９は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１５０−１５２に見かけの翻訳開始部位を持ちヌクレオチド位置１６６２−１６６４の停止コドンで終端する（図６９）。予測されるポリペプチドは５０４アミノ酸長である（図７０）。図７０に示した全長ＰＲＯ９４３タンパク質は約５４，５３７ダルトンの見積もられた分子量及び約１０．０４のｐＩを有する。図７０（配列番号：１１９）に示した全長ＰＲＯ９４３配列の分析により、以下のものの存在が明らかとなった：約アミノ酸１〜約アミノ酸１７のシグナルペプチド；約アミノ酸３７６〜約アミノ酸３９６の膜貫通ドメイン、約アミノ酸２１２〜約アミノ酸２１９及び約アミノ酸３２９〜約アミノ酸３３６のチロシンキナーゼリン酸化部位、約アミノ酸１１１〜約アミノ酸１１４、約アミノ酸２３１〜約アミノ酸２３４、約アミノ酸２５５〜約アミノ酸２５８及び約アミノ酸２９３〜約アミノ酸２９６の潜在的Ｎ-グリコシル化部位、及び約アミノ酸２１９〜約アミノ酸２３６の免疫グロブリン及びＭＨＣタンパク質配列相同ブロック。クローンＤＮＡ５２１９２−１３６９は1998年7月1日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３０４２が付与されている。
図７０（配列番号：１１９）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ９４３アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：B49151, A39752, FGR1_XENLA, S38579, RATHBFGFRB_1, TVHU2F, FRG&quot;_MOUSE, CEK3_CHICK, P_R21080及びA27171_1との間の有意な相同性が明らかになった。
【０２４７】
実施例３０：ヒトＰＲＯ１１８８をコードするｃＤＮＡクローンの単離
コンセンサスＤＮＡ配列を上記実施例１に記載したように他のＥＳＴ配列に対してphrapを用いて作成した。このコンセンサス配列をここでＤＮＡ４５６７９と命名する。ＤＮＡ４５６７９コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ１１８８のコード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正及び逆）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー：5'-CTGGTGCCTCAACAGGGAGCAG-3'（配列番号：125）
逆方向ＰＣＲプライマー：5'-CCATTGTGCAGGTCAGGTCACAG-3'（配列番号：126）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つＤＮＡ４５６７９配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ：
5'-CTGGAGCAAGTGCTCAGCTGCCTGTGGTCAGACTGGGGTC-3'（配列番号：127）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ１１８８遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ１１８８の全長ＤＮＡ配列（ここでＤＮＡ５２５９８−１５１８と命名される［図７１、配列番号：１２３］）及びＰＲＯ１１８８の誘導タンパク質配列を与えた。
ＰＲＯ１１８８の全コード化配列を図７１（配列番号：１２３）に示す。クローンＤＮＡ５２５９８−１５１８は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１３６−１３８に見かけの翻訳開始部位を持ちヌクレオチド位置３６８８−３６９０の停止コドンで終端する。予測されるポリペプチドは１１８４アミノ酸長である。図７２に示した全長ＰＲＯ１１８８タンパク質は約１３２，５８２ダルトンの見積もられた分子量及び約８．８０のｐＩを有する。さらなる特徴は、約アミノ酸１−３１のシグナルペプチド；約アミノ酸２６６−２７３のＡＴＰ／ＧＴＰ結合部位モチーフＡ（Ｐ-ループ）；約アミノ酸１８８−１９９のアルデヒドデヒドロゲナーゼシステイン活性部位；約アミノ酸１５３−１５９の成長因子及びサイトカインレセプターファミリーシグネーチャー２；及び約アミノ酸１２９−１３２、１３２−１３５、  ３４６−３４９、４２０−４２３、５５０−５５３、６３１−６３４、１０００−１００３，及び１０５６−１０５９の潜在的Ｎ-グリコシル化部位を含む。
図７２（配列番号：１２４）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１１８８アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：SSU83114_1, S56015, CET21B6_4, CELT19D&quot;_1, 及びTSP1_MOUSEとの間の有意な相同性が明らかになった。
クローンＤＮＡ５２５９８−１５１８はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３１０７が付与されている。
【０２４８】
実施例３１：ヒトＰＲＯ１１３３をコードするｃＤＮＡクローンの単離
コンセンサスＤＮＡ配列を上記実施例１に記載したように他のＥＳＴ配列に対してphrapを用いて作成した。この配列をphrapの繰り返しサイクルを用いて伸長させた。伸長させたコンセンサス配列をここでＤＮＡ３８１０２と命名する。ＤＮＡ３８１０２コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ１１３３のコード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正及び逆）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー：5'-TCGATTATGGACGAACATGGCAGC-3'（配列番号：130）；
正方向ＰＣＲプライマー：5'-TTCTGAGATCCCTCATCCTC-3'（配列番号：131）；及び
逆方向ＰＣＲプライマー：5'-AGGTTCAGGGACAGCAAGTTTGGG-3'（配列番号：132）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つＤＮＡ３８１０２配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ：
5'-TTTGCTGGACCTCGGCTACGGAATTGGCTTCCCTCTACGGACAGCTGGAT-3'（配列番号：133）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ１１３３遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ１１３３の全長ＤＮＡ配列及びＰＲＯ１１３３の誘導タンパク質配列を与えた。
ＰＲＯ１１３３の全コード化配列を図７３（配列番号：１２８）に示す。クローンＤＮＡ５３９１３−１４９０は、単一のオープンリーディングフレームを含み、配列番号：１２８のヌクレオチド位置２６６−２６８に見かけの翻訳開始部位及びヌクレオチド位置１５８０−１５８２に見かけの停止コドンを有する。予測されるポリペプチドは４３８アミノ酸長である。シグナルペプチドは配列番号：１２９のアミノ酸１−１８である。ＥＧＦ様ドメインシステインパターンシグネーチャーは図７４に示した配列番号：１２９の３１５及び３８５で開始する。クローンＤＮＡ５３９１３−１４９０はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３１６２が付与されている。図７４に示す全長ＰＲＯ１１３３タンパク質は約４９，２６０ダルトンの見積もられた分子量及び約６．１５のｐＩを有する。
図７４（配列番号：１２９）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１１３３アミノ酸配列と以下のDayhoff配列（データベースからのデータはここに取り込む）：AF002717_1, LMG1_HUMAN, B54665, UNC6_CAEEL, LML1_CAEEL, LMA5_MOUSE, MMU88353_1, LMA1_HUMAN,, HSLN2C64_1及びAF005258_1との間の或る程度の相同性が明らかになった。
【０２４９】
実施例３２：ヒトＰＲＯ７８４をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ここでＤＮＡ４４６６１と命名され図７７に示す初期ＤＮＡ配列（配列番号：１３６）を、一次ｃＤＮＡクローンの５’末端を優勢に示すヒト胎児ｃＤＮＡライブラリにおいて、酵母スクリーニングを使用して同定した。ＤＮＡ４４６６１配列は、次いで、種々の公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）と、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2［Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)］を用いて比較した。次いでＥＳＴをコンピュータプログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。得られたコンセンサス配列を、ここで「ＤＮＡ４５４６３」と命名する。ＤＮＡ４５４６３コンセンサス配列に基づいて、ヒト胎児肺ｃＤＮＡライブラリからＰＲＯ７８４の全長コード化配列のクローンを単離するためのプローブとして使用するためにオリゴヌクレオチドを合成した。
図７５に示した全長ＤＮＡ５３９７８−１４３３クロンは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置３７−３９に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置８２１−８２３に見られる停止コドンで終端する（図７５；配列番号：１３４）。予測されるポリペプチド前駆体（図７６；配列番号：１３５）は２２８アミノ酸長である。ＰＲＯ７８は、約２５，７３５の計算された分子量及び約５．４５の見積もられたｐＩを有する。ＰＲＯ７８４は以下特徴を有する：約アミノ酸１〜約１５のシグナルペプチド；約アミノ酸６８〜約８７、約１８３〜約２０４の膜貫通ドメイン；約アミノ酸１５−２０、５１−５６、６６−６０、１６３−１６、及び２０６−２１１のＮ-ミリストイル化部位；約アミノ酸１０８〜約１１７のＲＮＰ-１タンパク質ＲＮＡ結合領域。
クローンＤＮＡ５３９７８−１４４３は1998年6月16日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９８３が付与されている。
全長配列の（ALIGNコンピュータプログラムを用いた）BLAST及びFastA配列アラインメント分析に基づき、ＰＲＯ７８４は、以下のタンパク質：RNU42209_1, MMU91538_1, CGU91742_1, CELF55A4_6, SC22_YEAST,及びF48188とのアミノ酸配列同一性を示した。
【０２５０】
実施例３３：ヒトＰＲＯ７８３をコードするｃＤＮＡクローンの単離
潜在的な分泌タンパク質をコードするｃＤＮＡの同定に酵母スクリーニングアッセイを用いた。この酵母スクリーニングアッセイの使用により、ここでＤＮＡ４５２０１（図８０；配列番号：１３９）と命名される単一のｃＤＮＡの同定が可能になった。
ＤＮＡ４５２０１配列は、次いで、ＥＳＴ配列と比較して相同性を同定するのに使用した。ＥＳＴデータベースは、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む。検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。得られたコンセンサス配列を、ここで「ｃｏｎｓｅｎ０１」と銘々する。独自に開発したジェネンテクＥＳＴ配列をコンセンサス組立に用い、それをここでＤＮＡ１４５７５（図８１；配列番号：１４０）と命名した。
ｃｏｎｓｅｎ０１配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ７８３の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, のように、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。ポジティブライブラリを、次いで、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いて対象とする遺伝子をコードするクローンの単離するのに使用した。
ＰＣＲプライマーの対（正及び逆）を合成した：：
正方向ＰＣＲプライマー  5'-GACTGTATCTGAGCCCCAGACTGC-3'（配列番号：141）、
正方向ＰＣＲプライマー  5'-TCAGCAATGAGGTGCTGCTC-3'（配列番号：142）、及び
逆方向ＰＣＲプライマー  5'-TGAGGAAGATGAGGGACAGGTTGG-3'（配列番号：143）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つＤＮＡｃｏｎｓｅｎ０１配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5'-TATGGAAGCACCTGACTACGAAGTGCTATCCGTGCGAGAACAGCTATTCC-3'（配列番号：144）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ７８３遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織（ＬＩＢ２２８）から単離した。ｃＤＮＡクローンを単離するのに用いたｃＤＮＡライブラリは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法により作成した。ｃＤＮＡをＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、所定の方向で適当なクローニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照）に、独特のＸｏｌ及びＮｏｔＩ部位でクローニングした。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ７８３の全長ＤＮＡ配列（ここでＤＮＡ５３９９６−１４４２と命名される）［配列番号：１３７］）及びＰＲＯ７８３の誘導タンパク質配列を与えた。
ＰＲＯ７８３の全コード化配列を図７８（配列番号：１３７）に示す。クローンＤＮＡ５３９９６−１４４２は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置３１０−３１２に見かけの翻訳開始部位を持ちヌクレオチド位置１７７７−１７７９の停止コドンで終端する（図７８）。予測されるポリペプチドは４８９アミノ酸長である（図７９）。図７９に示した全長ＰＲＯ７８３タンパク質は約５５，２１９ダルトンの見積もられた分子量及び約８．４７のｐＩを有する。図７９（配列番号：１３８）に示した全長ＰＲＯ７８３配列の分析により、以下のものの存在が明らかとなった：約アミノ酸２３−４２、６７−８９、１１１−１３５、１５４−１７６、１９４−２１８、２９６−３１９、３４８−３７０、３８７−４１０及び４２７−４５２の膜貫通ドメイン；約アミノ酸２６３−２８３及び３９９−４２０に局在化したロイシンジッパーパターン；約アミノ酸１８０−１８７の潜在的チロシンキナーゼリン酸化部位；約アミノ酸１０５−１０８及び１２１−１２４の潜在的Ｎ-グリコシル化部位；約アミノ酸２８８−２９１のｃＡＭＰ及びｃＧＭＰ依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位；及び約アミノ酸１９０−２１８の細菌ロドプシン網膜結合部位タンパク質と相同性を持つ領域。
Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ７８３アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：YNC2_CAEEL, D64048, ATAC002332_3F4P9.3, NY2R_SHEEP, 及びVSH_MUMPAとの間の或る程度の配列同一性が明らかになった。
クローンＤＮＡ５３９９６−１４４２は1998年6月2日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９２１が付与されている。
【０２５１】
実施例３４：ヒトＰＲＯ８２０をコードするｃＤＮＡクローンの単離
発現配列タグ（ＥＳＴ）データベース（Merck/wsh.U）を検索してＥＳＴ番号ＡＡ５０４０８０，Ｍｅｒｃｋクローン番号８２５１３６と称されるＥＳＴを同定した（ライブラリ３１２、ヒトＢ細胞扁桃腺）。相同性検索により、このＥＳＴが低親和性免疫グロブリンガンマＦｃレセプターＩＩと配列同一性を示すことが明らかになった。ＤＮＡ配列分析は、ＰＲＯ８２０の全長ＤＮＡ配列とＰＲＯ８２０の誘導タンパク質配列を与えた。
ＤＮＡ５６０４１−１４１６の全ヌクレオチド配列を図８２（配列番号：１４５）に示す。クローンＤＮＡ５６０４１−１４１６は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１１５−１１７に見かけの翻訳開始部位を持ち、ヌクレオチド位置４８７−４８９の停止コドンで終端する（図８２）。予測されるポリペプチドは１２４アミノ酸長である（図８３）。図８３に示した全長ＰＲＯ８２０タンパク質は約１４，０８０ダルトンの見積もられた分子量及び約７．４８のｐＩを有する。クローンＤＮＡ５６０４１−１４１６はＡＴＣＣに寄託されている。配列について、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供された配列は公知の配列技術に基づくと理解される。
配列番号：１４６のアミノ酸配列のさらなる分析により、推定シグナルペプチドは配列番号：１４６の約アミノ酸１−１５である。タンパク質キナーゼＣリン酸化部位は配列番号：１４６のおよそアミノ酸２０−２２及び４３−４５である。Ｎ-ミリストイル化部位は、配列番号：１４６のおよそアミノ酸８９−９４である。免疫グロブリン及び主要組織適合性複合体ドメインは配列番号：１４６のおよそアミノ酸８３−９０である。対応するヌクレオチドは、ここに提供された配列が与えられれば日常的に決定できる。
【０２５２】
実施例３５：ヒトＰＲＯ１０８０をコードするｃＤＮＡクローンの単離
コンセンサスＤＮＡ配列を他のＥＳＴ配列に対してphrapを用いて作成し、BLAST及びphrapの繰り返しサイクルを用いて伸長させて上記実施例１に記載したようなＥＳＴ配列の供給源を用いてコンセンサス配列をできるだけ伸長させた。このコンセンサス配列をここでＤＮＡ５２６４０と命名する。ジェネンテクが独自に開発したＥＳＴをコンセンサス組立に用い、ここでＤＮＡ３６５２７（図８６；配列番号：１４９）と命名する。
ＤＮＡ３６５２７コンセンサス配列とＭｅｒｃｋのＥＳＴクローン番号５２６４２３に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＭｅｒｃｋＥＳＴクローン５２６４２３を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図８４に示し、ここでＤＮＡ５６０４７−１４５６の全ヌクレオチド配列を図８４（配列番号：１４７）に示す。クローンＤＮＡ５６０４７−１４５６は、単一のオープンリーディングフレームを含み、配列番号：１４７（図８４）のヌクレオチド位置１５９−１６１に見かけの翻訳開始部位及びヌクレオチド位置１２３３−１２３５の停止コドンで終端する。予測されるポリペプチド前駆体は３５８アミノ酸長である（図８５）。図８５に示す全長ＰＲＯ１０８０タンパク質は約４０，５１４ダルトンの見積もられた分子量及び約６．０８のｐＩを有する。クローンＤＮＡ５６０４７−１４５６は1998年6月9日にＡＴＣＣに寄託されている。寄託されたクローンは実際のヌクレオチド配列を含み、ここに提供された配列は公知の配列技術に基づくと理解される。
また図８５には、シグナルペプチド、細胞接着部位、Ｎｔ-Ｄｎａｊドメインシグネーチャー、Ｎｔ-Ｄｎａｊドメインタンパク質と配列同一性を持つ領域、及びＮ-グリコシル化部位のおよその位置も示した。ここに提供されたこれらのアミノ酸配列に対応する核酸及びその他は、ここに与えられた情報により日常的に決定できる。
【０２５３】
実施例３６：ヒトＰＲＯ１０７９をコードするｃＤＮＡクローンの単離
コンセンサスＤＮＡ配列を上記実施例１に記載したように他のＥＳＴ配列に対してphrapを用いて作成し、ここでＤＮＡ５２７１４と命名する。組立によって提供された情報に基づき、ＭｅｒｃｋのＥＳＴ番号ＨＯ６８９８のクローンを得て配列決定し、それにより、ここでＤＮＡ５６０５０−１４５５と命名するクローンのヌクレオチド配列を与えた。ＤＮＡ５６０５０−１４５５の全ヌクレオチド配列を図８７（配列番号：１５０）に示す。クローンＤＮＡ５６０５０−１４５５は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１８３−１８５に見かけの翻訳開始部位を持ちヌクレオチド位置８６１−８６３の停止コドンで終端する（図８７）。予測されるポリペプチドは２２６アミノ酸長である（図８８）。図８８に示した全長ＰＲＯ１０７９タンパク質は約２４，６１１ダルトンの見積もられた分子量及び約４．８５のｐＩを有する。図８８（配列番号：３）に示した全長ＰＲＯ１０７９配列の分析により、以下の特徴の存在が明らかとなった：約アミノ酸１−２９のシグナルペプチド；約アミノ酸１０−１５及び５１−５６のＮ-ミリストイル化部位；約アミノ酸２−２０の光化学系ＩｐｓａＧ及びｐｓａＫタンパク質に対する相同性；及び約アミノ酸１５０−１６３のプロリルエンドペプチダーゼタンパク質に対する相同性。
Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）を用いた全長ＰＲＯ１０７９ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、ＰＲＯ１０７９アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：CEK10C3_4, MMU50734_1, D69503, AF51149_1, 及びVSMP_CVMSとの間の有意な相同性が明らかになった。
クローンＵＮＱ５３６（ＤＮＡ５６０５０−１４５５）は1998年6月22日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３０１１が付与されている。
【０２５４】
実施例３７：ヒトＰＲＯ７９３をコードするｃＤＮＡクローンの単離
天然ヒトＰＲＯ７９３ポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローン（ＤＮＡ５６１１０−１４３７）を、一次ｃＤＮＡクローンの５’末端を優勢に示すヒト皮膚腫瘍ｃＤＮＡライブラリにおいて、酵母スクリーニングを使用して同定した。用いた酵母スクリーニングは、ここでＤＮＡ５０１７７（図９１；配列番号：１５４）と命名される単一のＥＳＴクローンを同定した。次いでＤＮＡ５０１７７配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５０９７２と命名する。
ＤＮＡ５０９７２コンセンサス配列とＭｅｒｃｋのＥＳＴクローン番号Ｎ３３８７４に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＭｅｒｃｋＥＳＴクローンＮ３３８７４を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図８９に示し、ここでＤＮＡ５６１１０−１４３７と命名する。
図８９に示した全長ＤＮＡ５６１１０−１４３７クロンは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置７７−７９に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置４９１−４９３の停止コドンで終端する（図８９）。予測されるポリペプチド前駆体は１３８アミノ酸長である（図９０）。図９０に示したＰＲＯ７９３タンパク質は、約１５，４２６の見積もられた分子量及び約１０．６７のｐＩを有する。図９０（配列番号：１５３）に示した全長ＰＲＯ１１８０配列の分析は、以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸１２〜約アミノ酸３０、約アミノ酸３３〜約アミノ酸５２、約アミノ酸６９〜約アミノ酸８９及び約アミノ酸９３〜約アミノ酸１０９の膜貫通ドメイン、約アミノ酸１１〜約アミノ酸１６、約アミノ酸５１〜約アミノ酸５６及び約アミノ酸１１６〜約アミノ酸１２１の潜在的Ｎ-ミリストイル化部位、及び約アミノ酸４９〜約アミノ酸５９のアミノアシル転移ＲＮＡ合成酵素クラスＩＩタンパク質との相同性を持つアミノ酸配列ブロック。クローンＤＮＡ５６１１０−１４３７は1998年8月11日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３１１３が付与されている。
図９０（配列番号：１５３）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ７９３アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：S47453, AF015193_12, MTEHGN9_2, E64030, H69784, D64995, CD53_MOUSE, GEN8006, AE001138_7及びCOX2_STRPUとの間の或る相同性が明らかになった。
【０２５５】
実施例３８：ヒトＰＲＯ１０１６をコードするｃＤＮＡクローンの単離
コンセンサスＤＮＡ配列を、実施例１に記載したように、phrapを用いて他のＥＳＴ配列に対して作成した。このコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５３５０２と命名する。
ＤＮＡ５３５０２コンセンサス配列とＭｅｒｃｋのＥＳＴクローン番号３８６８０に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＭｅｒｃｋＥＳＴクローン３８６８０を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図９２に示す。
ＤＮＡ５６１１３−１３７８の全長ヌクレオチド配列を図９２（配列番号：１５５）に示す。クローンＤＮＡ５６１１３−１３７８は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１６８−１７０に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１３０２−１３０４の停止コドンで終端する（図９２）。予測されるポリペプチド前駆体は３７８アミノ酸長である（図９３）。図９３に示した全長ＰＲＯ１０１６タンパク質は、約４４，０２１ダルトンの見積もられた分子量及び約９．０７のｐＩを有する。クローンＤＮＡ５６１１３−１３７８はＡＴＣＣに寄託されている。配列について、寄託されたクローンは実際のヌクレオチド配列を含み、ここに提供された配列は公知の配列技術に基づくと理解される。
全長ＰＲＯ１０１６ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がアシルトランスフェラーゼと配列同一性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ１０１６が新規なアシルトランスフェラーゼであることを示している。
配列番号：１５６のアミノ酸配列をさらに分析すると、推定シグナルペプチドは配列番号：１５６の約アミノ酸１−１８である。膜貫通ドメインは配列番号：１５６の約アミノ酸３３２−３５２及び３０５−３３０である。フルクトース-ビスホスフェートアルドラーゼクラスＩＩタンパク質は配列番号：１５６の約アミノ酸７３−９０である。エクストラジオール環切断ジオキシゲナーゼタンパク質は配列番号：１５６の約アミノ酸２５２−２７５である。対応するヌクレオチドは、ここに与えられた配列により日常的に決定できる。
ＰＲＯ１０１６が配列同一性を持つ配列の特定のＤａｙｈｏｆｆデータベース表記名は以下を含む：S52645, P_R59712, P_R99249, P_R59713, BNAGPATRF_1, CELT054_15及びCELZK40_1。
【０２５６】
実施例３９：ヒトＰＲＯ１０１３をコードするｃＤＮＡクローンの単離
コンセンサスＤＮＡ配列を、実施例１に記載したように、phrapを用いて他のＥＳＴ配列に対して作成した。次いでこのコンセンサスＤＮＡ配列をBLAST及びphrapの繰り返しサイクルを用いて伸長させてＥＳＴ配列の供給源を用いてコンセンサス配列をできるだけ伸長させた。
コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号３１０７６９５に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅＥＳＴクローン３１０７６９５を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図９４に示し、ここでＤＮＡ５６４１０−１４１４と命名する。
ＤＮＡ５６４１０−１４１４の全長ヌクレオチド配列を図９４（配列番号：１５７）に示す。クローンＤＮＡ５６４１０−１４１４は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１７−１９に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１２４４−１２４６の停止コドンで終端する（図９４）。予測されるポリペプチド前駆体は４０９アミノ酸長である（図９５）。図９５に示した全長ＰＲＯ１０１３タンパク質は、約４６，６６２ダルトンの見積もられた分子量及び約７．１８のｐＩを有する。クローンＤＮＡ５６４１０−１４１４はＡＴＣＣに寄託されている。配列について、寄託されたクローンは実際のヌクレオチド配列を含み、ここに提供された配列は公知の配列技術に基づくと理解される。
配列番号：１５８のアミノ酸配列をさらに分析すると、推定シグナルペプチドは配列番号：１５８の約アミノ酸１−１９である。Ｎ-グリコシル化部位は配列番号：１５８の約アミノ酸７５−７８及び３２２−３２５である。Ｎ-ミリストイル化部位は配列番号：１５８の約アミノ酸１８４−１８９である。成長因子及びサイトカインレセプターファミリードメインは配列番号：１５８の約アミノ酸１３４−１４９である。対応するヌクレオチドは、ここに与えられた配列により日常的に決定できる。
Ｂｌａｓｔ分析は他のタンパク質との幾分の配列同一性を示した。特にＰＲＯ１０１３は少なくともD63877_1, MHU22019_1, AE000730_10, 及びAF019079_1と称されるＤａｙｈｏｆｆ配列と或る程度の配列同一性を有する。
【０２５７】
実施例４０：ヒトＰＲＯ９３７をコードするｃＤＮＡクローンの単離
コンセンサスＤＮＡ配列を上記実施例１に記載したように他のＥＳＴ配列に対してphrapを用いて作成した。このコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ４９６５１と命名する。ＤＮＡ４９６５１コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ９３７のコード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正及び逆）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー  5'-CTCCGTGGTAAACCCCACAGCCC-3'（配列番号：161）
逆方向ＰＣＲプライマー  5'-TCACATCGATGGGATCCATGACCG-3'（配列番号：162）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つＤＮＡ４９６５１配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5'-GGTCTCGTGACTGTGAAGCCATGTTACAACTACTGCTCAAACATCATGAG-3'（配列番号：163）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ９３７遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織（ＬＢ２２７）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ９３７の全長ＤＮＡ配列［ここでＤＮＡ５６４３６−１４４８と命名する（図２９；配列番号：１５９）］及びＰＲＯ９３７の誘導タンパク質配列を与えた。
ＤＮＡ５６４３６−１４４８の全ヌクレオチド配列を図９６（配列番号：１５９）に示す。クローンＤＮＡ５６４３６−１４４８は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置４９９−５０１に見かけの翻訳開始部位を持ちヌクレオチド位置２１６７−２１６９に見られる停止コドンで終端する（図９６、配列番号：１５９）。予測されるポリペプチド前駆体は５５６アミノ酸長であり、
約６２，４１２ダルトンの計算された分子量及び約６．６２の見積もられたｐＩを有する。図９７（配列番号：１６０）に示した全長ＰＲＯ９３７配列の分析は、以下の特徴の存在を明らかにした：約アミノ酸１−２２のシグナルペプチド；約アミノ酸５１５−５２３のＡＴＰ／ＧＴＰ結合部位モチーフＡ（Ｐ-ループ）；約アミノ酸５１４−５１７の潜在的Ｎ-グリコシル化部位；及び約アミノ酸５４−７４、１０６−１５６、２３８−２７９、３０９−３４５、４２３−４５９及び４６８−５０５のグリピカン相同性の部位。
クローンＤＮＡ５６４３６−１４４８は1998年5月27日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９０２が付与されている。
全長ＰＲＯ９３７のアミノ酸配列の分析は、グリピカンタンパク質と有意な配列類似性をもつことを示唆し、それによりＰＲＯ９３７が新規なグリピカンタンパク質であることを示したいる。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ９３７アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、GPCK_MOUSE, GPS2_RAT, GPC5_HUMAN, GPC3_HUMAN, P_R30168, CEC03H12_2, GEN13820, HS119E23_1, HDAC_DROME, 及びAF017637_1との間の有意な相同性が明らかになった。
【０２５８】
実施例４１：ヒトＰＲＯ８４２をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、IncyteデータベースからのＩｎｃｙｔｅＥＳＴクラスター番号６９５７２と命名されるＥＳＴクラスター配列の同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５４２３０と命名する。
ＤＮＡ５４２３０コンセンサス配列とＭｅｒｃｋのＥＳＴクローン番号ＡＡ４７７０９２に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＭｅｒｃｋＥＳＴクローン番号ＡＡ４７７０９２を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図９８に示し、ここでＤＮＡ５６８５５−１４４７と命名する。
図９８に示した全長クローンは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１５３−１５５に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置５１０−５１２の停止コドンで終端する（図９８；配列番号：１６４）。予測されるポリペプチド前駆体は１１９アミノ酸長である（図９９；配列番号：１６５）。ＰＲＯ８４２は、約１３，８１９ダルトンの計算された分子量及び約１１．１６の見積もられたｐＩを有する。ＰＲＯ８４２の他の特徴は、
約アミノ酸１−２２シグナルペプチド、約アミノ酸３９−４１のタンパク質キナーゼＣリン酸化部位、及び約アミノ酸２７−３２及び約アミノ酸４６−５１の潜在的Ｎ-グリコシル化部位を含む。
図９９（配列番号：１６４）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ８４２アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：CEZK131_11, P_R80843, RAT5HT2X_1, S81882_1, A60912, MCU60315_137MC137L, U93422_1, p_P91996, U93462_1, 及びZN18_HUMANとの間の或る程度の相同性が明らかになった。
クローンＤＮＡ５６８５５−１４４７は1998年6月23日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３００４が付与されている。
【０２５９】
実施例４２：ヒトＰＲＯ８３９をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、IncyteのLIFESEQ(登録商標)データベースからのＩｎｃｙｔｅＥＳＴクラスター番号２４４７９と命名されるＥＳＴクラスター配列の同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５５７０９と命名する。
ＤＮＡ５５７０９コンセンサス配列とＭｅｒｃｋのＥＳＴクローン番号７５４５２５に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＭｅｒｃｋＥＳＴクローン７５４５２５を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１００に示し、ここでＤＮＡ５６８５９−１４４５と命名する。
図１００に示した全長クローンは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２−４に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置２６３−２６５の停止コドンで終端する（図１００；配列番号：１６６）。予測されるポリペプチド前駆体は８７アミノ酸長である（図１０１；配列番号：１６７）。ＰＲＯ８３９は、約９，７１９ダルトンの計算された分子量及び約４．６７の見積もられたｐＩを有する。ＰＲＯ８３９の他の特徴は、約アミノ酸１−２３のシグナルペプチド、約アミノ酸３７−４０及び約アミノ酸８５−８７のタンパク質キナーゼＣリン酸化部位、約アミノ酸３７−４０の潜在的カゼインキナーゼＩＩリン酸化部位、約アミノ酸５０−６０のリボヌクレオチドレダクターゼ大サブユニットタンパク質との配列同一性、及び約アミノ酸７０−７９の真核生物ＲＮＡ結合領域ＲＮＰ-１タンパク質との配列同一性。
図１０１（配列番号：１６７）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ８３９アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：CD14_MOUSE, XPR6_YARLI, HS714385_1, S49783, BB19_RABIT, GVPH-HALME, AB003135_1, P_R85453, LUU27081_2, 及びTP2B_MOUSEとの間の或る程度の相同性が明らかになった。
クローンＤＮＡ５６８５９−１４４５は1998年6月23日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９０１９が付与されている。
【０２６０】
実施例４３：ヒトＰＲＯ１１８０をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、単一のIncyteＥＳＴクラスター配列（Ｉｎｃｙｔｅクラスター配列番号１４７３２）の同定が可能となった。次いでこのＩｎｃｙｔｅクラスター配列番号１４７３２配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５５７１１と命名する。
ＤＮＡ５５７１１コンセンサス配列とＭｅｒｃｋのＥＳＴクローン番号Ｔ６０９８１に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＭｅｒｃｋＥＳＴクローンＴ６０９８１を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１０２に示し、ここでＤＮＡ５６８６０−１５１０と命名した。
図１０２に示す全長クローンは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置７８−８０に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置９０９−９１１の停止コドンで終端する（図１０２；配列番号：１６８）。予測されるポリペプチド前駆体は２７７アミノ酸長であり、約３１，４１６の計算された分子量及び約８．８８の見積もられたｐＩを有する。図１０３（配列番号：１６９）に示した全長ＰＲＯ１１８０配列の分析は、以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸１〜約アミノ酸２３のシグナルペプチド、約アミノ酸１０〜約アミノ酸３１のロイシンジッパーパターン配列、及び約アミノ酸６４〜約アミノ酸６９、約アミノ酸７８〜約アミノ酸８３、約アミノ酸８０〜約アミノ酸８５、約アミノ酸９１〜約アミノ酸９６及び約アミノ酸２０１〜約アミノ酸２０６のＮ-ミリストイル化部位。クローンＤＮＡ５６８６０−１５１０は1998年6月9日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９５２が付与されている。
全長ＰＲＯ１１８０ポリペプチドのアミノ酸分析により、メチルトランスフェラーゼファミリーのタンパク質と配列類似性を有することが示唆された。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）を用いた分析により、ＰＲＯ１１８０アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：MTC165_14, D69267, YH09_TEAST, BIOC_SERMA, ATAC00448415T1D16.16, SHGCPIR_18, SPBC3B9_4, AB009504_14, P_W1797及びA69952との間の或る程度の相同性が明らかになった。
【０２６１】
実施例４４：ヒトＰＲＯ１１３４をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、Incyteデータベースからの７５１１と命名されるＥＳＴクラスター配列の同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５５７２５と命名する。２つの独自に開発したＥＳＴ配列を組立に用い、図１０６（配列番号：１７２）及び図１０７（配列番号：１７３）に示す。
ＤＮＡ５５７２５コンセンサス配列とＭｅｒｃｋのＥＳＴクローン番号Ｈ９４８９７に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＭｅｒｃｋＥＳＴクローンＨ９４８９７を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１０６に示し、ここでＤＮＡ５６８６５−１４９１と命名する。
クローンＤＮＡ５６８６５−１４９１は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１５３−１５５に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１２６６−１２６８の停止コドンで終端する（図１０４）。予測されるポリペプチド前駆体は３７１アミノ酸長である（図１０５）。図１０５に示した全長ＰＲＯ１１３４は、約４１，９３５ダルトンの見積もられた分子量及び約９．５８のｐＩを有する。全長ＰＲＯ１１３４の分析により以下のものの存在が明らかとなった：約アミノ酸１〜約アミノ酸２３のシグナルペプチド、約アミノ酸１０３〜約アミノ酸１０６、約アミノ酸２４９〜約アミノ酸２５２、及び約アミノ酸２５７〜約アミノ酸２６０のＮ-グリコシル化部位、及び約アミノ酸２８０〜約アミノ酸３０６のチロシナーゼＣｕＡ結合領域タンパク質と相同性を有するアミノ酸ブロック。クローンＤＮＡ５６８６５−１４９１は1998年6月23日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３０２２が付与されている。
図１０５（配列番号：１７１）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１１３４アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：F20P5_18, AC002396_10, S47847, C64146, GSPA_BACSU, P_W10564, RFAI_ECOLI, Y258_HAEIN, RFAJ_SALTY及びP_R32985との間の有意な相同性が明らかになった。
【０２６２】
実施例４５：ヒトＰＲＯ８３０をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、Incyteデータベースからの２０２５１と命名されるＥＳＴクラスター配列の同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５５７３３と命名する。
ＤＮＡ５５７３３コンセンサス配列とＭｅｒｃｋのＥＳＴクローン番号Ｈ７８５３４に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＭｅｒｃｋＥＳＴクローンＨ７８５３４を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１０８に示し、ここでＤＮＡ５６８６６−１３４２と命名する。
クローンＤＮＡ５６８６６−１３４２は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１５４−１５６に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置４１５−４１７の停止コドンで終端する（図１０８）。予測されるポリペプチド前駆体は８７アミノ酸長である（図１０９）。図１０９に示した全長ＰＲＯ８３０は、約９，２７２ダルトンの見積もられた分子量及び約９．１９のｐＩを有する。図１０９（配列番号：１７５）に示す全長ＰＲＯ８３０の分析により以下のものの存在が明らかとなった：約アミノ酸１〜約アミノ酸３３のシグナルペプチド、約アミノ酸２〜約アミノ酸７及び約アミノ酸８〜約アミノ酸１３の潜在的Ｎ-ミリストイル化部位、及び約アミノ酸２３〜約アミノ酸３９のチオレドキシンファミリーのタンパク質相同性ブロック。クローンＵＮＱ４７０（ＤＮＡ５６８６６−１３４２）は1998年6月22日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３０２３が付与されている。
図１０９（配列番号：１７５）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ８３０アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：HSU88154_1, HSU88153_1, SAPKSGENE_1, HPU31791_5, GGCNOT2_1, CPU91421_1, CHKESTPC09_1, PQ0769, U97553_79及びB60095との間の有意な相同性が明らかになった。
【０２６３】
実施例４６：ヒトＰＲＯ１１１５をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、IncyteのLIFESEQ(登録商標)データベースからのＩｎｃｙｔｅＥＳＴクラスター番号１６５００８と命名されるＥＳＴクラスター配列の同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５５７２６と命名する。
ＤＮＡ５５７２６コンセンサス配列とＭｅｒｃｋのＥＳＴクローン番号Ｒ７５７８４に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＭｅｒｃｋＥＳＴクローンＲ７５７８４を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１１１に示し、ここでＤＮＡ５６８６８−１４７８と命名する。
図１１０に示した全長クローンは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１８９−１９１に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１５２４−１５２６の停止コドンで終端する（図１１０；配列番号：１７６）。予測されるポリペプチド前駆体は４４５アミノ酸長である（図１１１；配列番号：１７７）。ＰＲＯ１１１５は、約５０，５３３ダルトンの計算された分子量及び約８．２６の見積もられたｐＩを有する。他の特徴は、約アミノ酸１−２０のシグナルペプチド、約アミノ酸２０４−２０７、２９５−２９８及び３１３−３１６の潜在的Ｎ-グリコシル化部位、及び約アミノ酸３５−５４、７５−９７、１２６−１４６、１８５−２０４、３３３−３５０及び３５３−３７１の推定膜貫通ドメインを含む。
図１１１（配列番号：１７７）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１１１５アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：AF053947_79, S73698, CEC47A10_4, CCOMTNDS5G_1, HS4LMP2AC_1, LMP2_EBV, PA24_MOUSE, HCU33331_7, P-W05508, 及びAF002273_1との間の或る程度の配列同一性が明らかになった。
クローンＤＮＡ５６８６８−１４７８は1998年6月23日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３０２４が付与されている。
【０２６４】
実施例４７：ヒトＰＲＯ１２７７をコードするｃＤＮＡクローンの単離
コンセンサスＤＮＡ配列を、実施例１に記載したように、BLAST及びプログラム「phrap」の繰り返しサイクルを用いて他のＥＳＴ配列に対して作成した。組立からの一又は複数のＥＳＴは疾患冠状動脈組織から誘導した。得られたコンセンサス配列を、ここで「ＤＮＡ４９４３４」と命名する。
ＤＮＡ４９４３４コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号３０４２６０５に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅＥＳＴクローン３０４２６０５を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１１２（配列番号：１７８）に示した。
クローンＤＮＡ５６８６９−１５４５は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１８８−１９０に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置２２２２−２２２４の停止コドンで終端する（図１１２）。予測されるポリペプチド前駆体は６７８アミノ酸長である（図１１３）。図１１３に示した全長ＰＲＯ１２７７タンパク質は、約７３，９３０ダルトンの見積もられた分子量及び約９．４８のｐＩを有する。さらなる特徴は、約アミノ酸１−２６のシグナルペプチド；約アミノ酸１８１−２００の膜貫通ドメイン；及び約アミノ酸３９０−３９３及び５２０−５２３の潜在的Ｎ-グリコシル化部位を含む。
図１１３（配列番号：１７９）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１２７７アミノ酸配列と以下のDayhoff配列番号AF012252_1との間の有意な相同性が明らかになった。相同性は、ＰＲＯ１２７７アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：AF006740_1, CA36_HUMAN, HSU1_1, HUMCOL7A1X_1, CA17_HUMAN, MMZ78163_1, CAMA_CHICK, HSU69263_1, YNX3_CAEEL及びMMRNAM3_1との間にも見られた。
クローンＤＮＡ５６８６９−１５４５はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３１６１が付与されている。
【０２６５】
実施例４８：ヒトＰＲＯ１１３５をコードするｃＤＮＡクローンの単離
コンセンサスＤＮＡ配列を上記実施例１に記載したように他のＥＳＴ配列に対してphrapを用いて作成した。このコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５２７６７と命名する。ＤＮＡ５２７６７コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ１１３５のコード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡをＤＮＡ５２７６７配列に基づいて調製したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅することによりスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及び対の一方を用いてＰＲＯ１１３５遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト冠状動脈平滑筋組織（ＬＩＢ３０９）から単離した。ｃＤＮＡクローンを単離するのに用いたｃＤＮＡライブラリは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法により作成した。ｃＤＮＡをＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、所定の方向で適当なクローニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照）に、独特のＸｏｌ及びＮｏｔＩ部位でクローニングした。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ１１３５の全長ＤＮＡ配列［ここでＤＮＡ５６８７０−１４９２と命名する（配列番号：１８０）］及びＰＲＯ１１３５の誘導タンパク質配列を与えた。
ＤＮＡ５６８７０−１４９２の全ヌクレオチド配列を図１１４（配列番号：１８０）に示す。クローンＤＮＡ５６８７０−１４９２は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置６２−６４に見かけの翻訳開始部位を持ちヌクレオチド位置１６８５−１６８７に見られる停止コドンで終端する（図１１４）。予測されるポリペプチド前駆体は５４１アミノ酸長である（図１１５）。図１１５に示した全長ＰＲＯ１１３５配列は、約６０，３３５ダルトンの見積もられた分子量及び約５．２６のｐＩを有する。図１１５（配列番号：１８１）に示した全長ＰＲＯ１１３５配列の分析は、以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸１〜約アミノ酸２１のシグナルペプチド；約アミノ酸５３〜約アミノ酸５６、約アミノ酸７５〜約アミノ酸７８、約アミノ酸２５２〜約アミノ酸２５５及び約アミノ酸４１３〜約アミノ酸４１６の潜在的Ｎ-グリコシル化部位、及び約アミノ酸３９９〜約アミノ酸４１４のグリコシルヒドロラーゼファミリー３５タンパク質と相同性を持つアミノ酸ブロック。クローンＤＮＡ５６８７０−１４９２は1998年6月2日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９２５が付与されている。
全長ＰＲＯ１１３５のアミノ酸配列の分析は、アルファ１，２-マンノシダーゼタンパク質と有意な配列類似性をもつことを示唆し、それによりＰＲＯ１１３５が新規なグリピカンタンパク質であることを示したいる。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１１３５アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、DMC86E4_5, D86967_1, SPAC23A1_4, YH04_YEAST, B54408, SSMAN9MAN_1, CEZC410_4, S61631及びMSU14190_1との間の有意な相同性が明らかになった。
【０２６６】
実施例４９：ヒトＰＲＯ１１１４をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例２（ヒト胎児肺ライブラリ）に記載したアミラーゼスクリーニングで単離したｃＤＮＡ配列を、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２配列アラインメントコンピュータプログラムにより、他の公知のインターフェロンレセプターと或る配列同一性を持つことを見出した。このｃＤＮＡ配列を、ここでＤＮＡ４８４６６と命名して図１１８（配列番号：１８４）に示す。ＤＮＡ４８４６６分子から配列同一性に基づいてプローブを作成し、上記実施例２のパラグラフ１に記載したように調製したヒト乳癌（ＬＩＢ１３５）ライブラリのスクリーニングに使用した。クローニングベクターはｐＲＫ５Ｂであり（ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)）、ｃＤＮＡサイズ切断は２８００ｂｐ未満であった。
ＰＣＲプライマーの対（正及び逆）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー：5'-AGGCTTCGCTGCGACTAGACCTC-3'（配列番号：185）
逆方向ＰＣＲプライマー：5'-CCAGGTCGGGTAAGGATGGTTGAG-3'（配列番号：186）
ハイブリッド形成プローブ：
5'-TTTCTACGCATTGATTCCATGTTTGCTCACAGATGAAGTGGCCATTCTGC-3'（配列番号：187）
全長クローンが同定され、それは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２５０−２５２に見かけの翻訳開始部位、及びヌクレオチド位置１１８３−１１８５の停止シグナルを持つ（図１１６；配列番号：１８２）。予測されるポリペプチド前駆体は３１１アミノ酸長であり、約３５，０７６ダルトンの計算された分子量及び約５．０４の見積もられたｐＩを有する。図１１７（配列番号：１８３）に示すＰＲＯ１１１４配列の分析により以下の存在が明らかとなった：約アミノ酸１〜約アミノ酸２９のシグナルペプチド、約アミノ酸２３０〜約アミノ酸２５５の膜貫通ドメイン、約アミノ酸４０〜約アミノ酸４３及び約アミノ酸１３４〜約アミノ酸１３７の潜在的Ｎ-グリコシル化部位、約アミノ酸９２〜約アミノ酸１１９の組織因子タンパク質と相同性を持つアミノ酸配列ブロック、及び約アミノ酸２３２〜約アミノ酸２６２のインテグリンアルファ鎖タンパク質と相同性を持つアミノ酸配列ブロック。クローンＤＮＡ５７０３３−１４０３は1998年5月27日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９０５が付与されている。
図１１７（配列番号：１８３）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１１１４アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：G01418, INR1_MOUSE, P_R71035, INGS_HUMAN, A26595_1, A26593_1, I56215及びTF_HUMANとの間の有意な相同性が明らかになった。
【０２６７】
実施例５０：ヒトＰＲＯ８２８をコードするｃＤＮＡクローンの単離
コンセンサスＤＮＡ配列を上記実施例１に記載した方法を用いて作成した。このコンセンサス配列をここでＤＮＡ３５７１７と命名する。ＤＮＡ３５７１７コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ８２８のコード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正及び逆）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー：5'-GCAGGACTTCTACGACTTCAAGGC-3'（配列番号：190）
逆方向ＰＣＲプライマー：5'-AGTCTGGGCCAGGTACTTGAAGGC-3'（配列番号：191）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つＤＮＡ３５７１７配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ：
5'-CAACATCCGGGGCAAACTGGTGTCGCTGGAGAAGTACCGCGGATCGGTGT-3'（配列番号：192）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ８２８遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児肺組織（ＬＩＢ２５）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ８２８の全長ＤＮＡ配列［ここでＤＮＡ５７０３７−１４４４と命名される］（図１８８）及びＰＲＯ８２８の誘導タンパク質配列を与えた。
ＰＲＯ８２８の全コード化配列を図１１９（配列番号：１８８）に示す。クローンＤＮＡ５７０３７−１４４４は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置３４−３６に見かけの翻訳開始部位を持ちヌクレオチド位置５９５−５９７の停止コドンで終端する（図１１９）。予測されるポリペプチド前駆体は１８７アミノ酸長である（図１２０）。図１２０に示した全長ＰＲＯ８２８タンパク質は約２０，９９６ダルトンの見積もられた分子量及び約８．６２のｐＩを有する。図１２０（配列番号：１８９）に示した全長ＰＲＯ８２８配列の分析により、以下のものの存在が明らかとなった：約アミノ酸１−２１のシグナルペプチド；約アミノ酸８２−８９のグルタチオンペルオキシダーゼシグネーチャー２との配列同一性；約アミノ酸３５−６０、６３−１００、１０７−１３４及び１３８−１５９のグルタチオンペルオキシダーゼセレノシステインタンパク質との配列同一性。クローンＤＮＡ５７０３７−１４４４は1998年5月27日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９０３が付与されている。
全長ＰＲＯ８２８ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、グルタチオンペルオキシダーゼと有意な配列類似性を持つことを示唆し、それによりＰＲＯ８２８は新規なペルオキシダーゼ酵素であることを示している。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ８２８アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：AF053311_1, CELT09A12_2, AC004151_3, BTUE_ECOLI, CER05H10_3, P_P80918, PWU88907_1, 及びP_W22308との間の配列同一性が明らかになった。
【０２６８】
実施例５１：ヒトＰＲＯ１００９をコードするｃＤＮＡクローンの単離
天然ヒトＰＲＯ１００９をコードするｃＤＮＡクローン（ＤＮＡ５７１２９−１４１３）を、好ましくは一次ｃＤＮＡクローンの５’末端を代表するＳＫ-Ｌｕ-１腺癌細胞系ｃＤＮＡライブラリにおいて、酵母スクリーニングを用いて同定した。最初に配列番号：
１９５（図１２３）を同定し、それを他のＥＳＴ配列に対するアラインメントにより伸長してコンセンサス配列を形成した、コンセンサス配列に基づくオリゴヌクレオチドプローブを合成し、全長ＤＮＡ５７１２９−１４１３クローンをもたらすｃＤＮＡライブラリのスクリーニングに使用した。
図１２１に示す全長ＤＮＡ５７１２９−１４１３クローンは、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置４１−４３に見かけの翻訳開始部位を持ちヌクレオチド位置１８８６−１８８８の停止コドンで終端する（図１２１；配列番号：１９３）。予測されるポリペプチド前駆体は６１５アミノ酸長である（図１２２、配列番号：１９４）。図１２２は、シグナル配列、膜貫通ドメイン、ミリストイル化部位、グリコシル化部位及びＡＭＰ結合ドメインのおよその位置も示している。ＰＲＯ１００９は約６８，１２５ダルトンの計算された分子量及び約７．８２の見積もられたｐＩを有する。クローンＤＮＡ５７１２９−１４１３はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９７７が付与されている。寄託されたクローンは、実際の正しい配列を有し、ここでの提示は微量の通常の配列誤差を含みうると理解される。
全長配列の（ALIGNコンピュータプログラムを用いた）WU-BLAST-2配列アラインメント分析に基づき、ＰＲＯ１００９は、少なくともＤａｙｈｏｆｆデータベーで以下のように称される以下のタンパク質と配列同一性を有することが示された：F69893, CEF28F8_2, BSY13917_7, BSY13917_7, D69187, D69649, XCRPEB_1, E649928, YDID_ECOLI, BNACSF8_1及びRPU75363_2。
【０２６９】
実施例５２：ヒトＰＲＯ１００７をコードするｃＤＮＡクローンの単離
コンセンサスＤＮＡ配列を実施例１に記載したように他のＥＳＴ配列に対してphrapを用いて作成した。このコンセンサス配列をここでＤＮＡ４０６７１と命名する。
ＤＮＡ４０６７１コンセンサス配列とＭｅｒｃｋのＥＳＴクローン番号Ｔ７０５１３に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＭｅｒｃｋＥＳＴクローンＴ７０５１３を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１２４に示す。
ＤＮＡ５７６９０−１３７４の全ヌクレオチド配列を図１２４（配列番号：１９６）に示す。クローンＤＮＡ５７６９０−１３７４は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１６−１８に見かけの翻訳開始部位及びヌクレオチド位置１０５４−１０５６の停止コドンで終端する（図１２４）。予測されるポリペプチド前駆体は３４６アミノ酸長である（図１２５）。図１２５に示す全長ＰＲＯ１００７タンパク質は約３５，９１７ダルトンの見積もられた分子量及び約８．１７のｐＩを有する。クローンＤＮＡ５７６９０−１３７４は1998年6月9日にＡＴＣＣに寄託されている。配列について、寄託されたクローンは実際のヌクレオチド配列を含み、ここに提供された配列は公知の配列技術に基づくと理解される。ここでの代表的な図面は代表的な番号付けを示す。
全長ＰＲＯ１００７ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、その一部がＭＡＧＰＩＡＰと配列同一性を有することが示唆され、それによりＰＲＯ１００７がＭＡＧＰＩＡＰが属するファミリーの新規なメンバーであることを示している。
配列番号：１９７のアミノ酸配列のさらなる分析により、推定シグナルペプチドは配列番号：１９７の約アミノ酸１−３０である。膜貫通ドメインは配列番号：１９７のおよそアミノ酸３２５−３４６である。Ｎ-グリコシル化部位は、配列番号：１９７のおよそアミノ酸１１８−１２１、１２９−１３２、１３６−１６６、１７６−１７９、１８３−１８６及び２２７−１３０である。Ｌｙ-６／ｕ-Ｐａｒドメインタンパク質相同性は配列番号：１９７のおよそアミノ酸１７−３６及び２０９−２２２である。対応するヌクレオチドは、ここに提供された配列が与えられれば日常的に決定できる。
【０２７０】
実施例５３：ヒトＰＲＯ１０５６をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、Incyteデータベースからの、ここで６４２５と命名されるＥＳＴクラスター配列の同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５５７３６と命名する。
ＤＮＡ５５７３６コンセンサス配列とＭｅｒｃｋのＥＳＴクローン番号Ｒ８８０４９に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＭｅｒｃｋＥＳＴクローン番号Ｒ８８０４９を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１２６に示し、ここでＤＮＡ５７６９３−１４２４と命名する。
クローンＤＮＡ５７６９３−１４２４は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置５６−５８に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置４１６−４１８の停止コドンで終端する（図１２６）。予測されるポリペプチド前駆体は１２０アミノ酸長である（図１２７）。図１２７に示す全長ＰＲＯ１０５６タンパク質は、約１３，３４５の見積もられた分子量及び約５．１８のｐＩを有する。図１２７（配列番号：１９９）に示した全長ＰＲＯ１０５６配列の分析は、以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸１〜約アミノ酸１８のシグナルペプチド、約アミノ酸３９〜約アミノ酸５８の膜貫通ドメイン、約アミノ酸８６〜約アミノ酸８９の潜在的Ｎ-グリコシル化部位、約アミノ酸３６〜約アミノ酸３８及び約アミノ酸５８〜約アミノ酸６０のタンパク質キナーゼCリン酸化部位、約アミノ酸２５〜約アミノ酸３２のチロシンキナーゼリン酸化部位、及び約アミノ酸２４〜約アミノ酸５６のチャンネル形成コリシンタンパク質に対して相同性を持つアミノ酸ブロック。クローンＤＮＡ５７６９３−１４２４は1998年6月23日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３００８が付与されている。
図１２７（配列番号：１９９）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１０５６アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：PLM_HUMAN, A4053, ATNG_HUMAN, A55571, ATNG_SHEEP, S31524, GEN13025, RIC_MOUSE, A48678及びA10871_1との間の有意な相同性が明らかになった。
【０２７１】
実施例５４：ヒトＰＲＯ８２６をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、Incyteデータベースからの、４７２８３と命名されるＥＳＴクラスター配列の同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５６０００と命名する。
ＤＮＡ５６０００コンセンサス配列とＭｅｒｃｋのＥＳＴクローン番号Ｗ６９２３３に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＭｅｒｃｋＥＳＴクローン番号Ｗ６９２３３を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１２８に示し、ここでＤＮＡ５７６９４−１３４１と命名する。
クローンＤＮＡ５７６９４−１３４１は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１３−１５に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置３１０−３１２の停止コドンで終端する（図１２８）。予測されるポリペプチド前駆体は９９アミノ酸長である（図１２９）。図１２９に示す全長ＰＲＯ８２６タンパク質は、約１１，０５０の見積もられた分子量及び約７．４７のｐＩを有する。図１２９（配列番号：２０１）に示した全長ＰＲＯ８２６配列の分析は、以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸１〜約アミノ酸２２のシグナルペプチド、約アミノ酸２２〜約アミノ酸２７及び約アミノ酸９０〜約アミノ酸９５の潜在的Ｎ-ミリストイル化部位、約アミノ酸１６〜約アミノ酸４８のペルオキシダーゼに相同性を有するアミノ酸ブロック。クローンＤＮＡ５７６９４−１３４１は1998年6月22日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３０１７が付与されている。
図１２９（配列番号：２０１）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ８２６アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：CCU12315_1, SCU96108_6, CELF39F10_4及びHELT_HELHOとの間の有意な相同性が明らかになった。
【０２７２】
実施例５５：ヒトＰＲＯ８１９をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、Incyteデータベースからの、４９６０５と命名されるＥＳＴクラスター配列の同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５６０１５と命名する。
ＤＮＡ５６０１５コンセンサス配列とＭｅｒｃｋのＥＳＴクローン番号Ｈ６５７８５に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＭｅｒｃｋＥＳＴクローン番号Ｈ６５７８５を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１３０に示し、ここでＤＮＡ５７６９５−１３４０と命名する。
クローンＤＮＡ５７６９５−１３４０は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置４６−４８に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置２０２−２０４の停止コドンで終端する（図１３０）。予測されるポリペプチド前駆体は５２アミノ酸長である（図１３１）。図１３１に示す全長ＰＲＯ８１９タンパク質は、約５，２１６の見積もられた分子量及び約４．６７のｐＩを有する。図１３１（配列番号：２０３）に示した全長ＰＲＯ８１９配列の分析は、以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸１〜約アミノ酸２４のシグナルペプチド、約アミノ酸２〜約アミノ酸７の潜在的Ｎ-ミリストイル化部位、及び約アミノ酸５〜約アミノ酸３３の免疫グロブリン軽鎖に相同性を有する領域。クローンＤＮＡ１５６９５−１３４０は1998年6月23日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３００６が付与されている。
図１３１（配列番号：２０３）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ８１９アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：HSU03899_1, HUMIGLITEB_1, VG28_HSVSA, AF31522_1, PAD1_YEAST及びAF045484_1との間の有意な相同性が明らかになった。
【０２７３】
実施例５６：ヒトＰＲＯ１００６をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムを使用して、Incyteクラスター配列番号４５７４８から最初の候補配列を同定した。次いでこの配列を、種々の公的データベース及びＩｎｃｙｔｅＥＳＴ配列と比較して、ここでＤＮＡ５６０３６と称されるコンセンサス配列を同定した。
ＤＮＡ５６０３６コンセンサス配列とＭｅｒｃｋのＥＳＴクローン番号４８９７３７に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＭｅｒｃｋＥＳＴクローン番号４８９７３７を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１３２に示す。
ＤＮＡ５７６９９−１４１２の全ヌクレオチド配列を図１３２（配列番号：２０４）に示す。クローンＤＮＡ５７６９９−１４１２は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２８−３０に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１２０４−１２０６の停止コドンで終端する（図１３２）。予測されるポリペプチド前駆体は３９２アミノ酸長である（図１３３）。図１３３に示す全長ＰＲＯ１００６タンパク質は、約４６，１８９の見積もられた分子量及び約９．０４のｐＩを有する。クローンＤＮＡ５７６９９−１４１２はＡＴＣＣに寄託されている。配列について、寄託されたクローンは実際のヌクレオチド配列を含み、ここに提供された配列は公知の配列技術に基づくと理解される。
配列番号：２０５のアミノ酸配列のさらなる分析により、推定シグナルペプチドは配列番号：２０５の約アミノ酸１−２３であるＮ-グリコシル化部位は配列番号：２０５のおよそアミノ酸４０−４３、５３−５６、２０４−２０７及び３７３−３７６である。Ｎ-ミリストイル化部位は、配列番号：２０５のおよそアミノ酸２７３−２７８である。対応するヌクレオチドは、ここに提供された配列が与えられれば日常的に決定できる。
【０２７４】
実施例５７：ヒトＰＲＯ１１１２をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により特定のＥＳｔクラスター配列の同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５６０１８と命名する。
ＤＮＡ５６０１８コンセンサス配列とＭｅｒｃｋのＥＳＴクローン番号ＡＡ２２３５４６に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＭｅｒｃｋＥＳＴクローン番号ＡＡ２２３５４６を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１３４に示し、ここでＤＮＡ５７７０２−１４７６と命名する。
ＤＮＡ５７７０２−１４７６の全ヌクレオチド配列を図１３４（配列番号：２０６）に示す。クローンＤＮＡ５７７０２−１４７６は単一のオープンリーディングフレームを含み、配列番号：２０６のヌクレオチド位置２０−２２に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置８０６−８０８の停止コドンで終端する（図１３４）。予測されるポリペプチド前駆体は２６２アミノ酸長である（図１３５）。図１３５に示す全長ＰＲＯ１１１２タンパク質は、約２９，３７９の見積もられた分子量及び約８．９３のｐＩを有する。また図１３５はシグナルペプチド及び膜貫通ドメインのおよその位置も示す。クローンＤＮＡ５７７０２−１４７６は1998年6月9日にＡＴＣＣに寄託されている。寄託されたクローンは実際のヌクレオチド配列を含み、ここに提供された配列は公知の配列技術に基づくと理解される。
全長ＰＲＯ１１１２ポリペプチドのアミノ酸分析により、他のタンパク質との或る程度の相同性が示唆された。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１１１２アミノ酸配列と少なくとも以下のDayhoff配列：MTY20B11_13(微生物結核ペプチド), F64471, AE000690_6, XLU16364_1, E43259(Ｈ＋−トランスポートＡＴＰ合成酵素)及びPIGSLADRXE_1(ＭＨＣクラスＩＩ組織適合性抗原)との間の或る程度の配列同一性が明らかになった。
【０２７５】
実施例５８：ヒトＰＲＯ１０７４をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、単一のIncyteＥＳＴクラスター配列（Ｉｎｃｙｔｅクラスター配列番号４２５８６）の同定が可能となった。次いでこのクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５６２５１と命名する。
ＤＮＡ５６２５１コンセンサス配列とＭｅｒｃｋのＥＳＴクローン番号ＡＡ０８１９１２に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＭｅｒｃｋＥＳＴクローン番号ＡＡ０８１９１２を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１３６に示し、ＰＲＯ１０７４に対する全長ＤＮＡ配列である。クローンＤＮＡ５７７０４−１４５２は1998年6月9日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９５３が付与されている。
ＤＮＡ５７７０４−１４５２の全長ヌクレオチド配列を図１３６（配列番号：２０８）に示す。クローンＤＮＡ５７７０４−１４５２は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置３２２−３２４に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１３１５−１３１７の停止コドンで終端する（図１３６）。予測されるポリペプチド前駆体は３３１アミノ酸長である（図１３７）。図１３７に示す全長ＰＲＯ１０７４タンパク質は、約３９，５１２の見積もられた分子量及び約８．０３のｐＩを有する。図１３７（配列番号：２０９）に示した全長ＰＲＯ１０７４配列の分析は、以下の特徴の存在を明らかにした：約アミノ酸２０−３９の膜貫通ドメイン；約アミノ７２−７５、１５４−１５７、１９８−２０１、２１２−２１５及び３２６−３２９の潜在的Ｎ-グリコシル化部位、約アミノ酸２３９−２４２のグリコサミノグリカン結合部位、及び約アミノ酸２３−３６のＬｙ-６／ｕ-ＰＡＲドメイン。
全長ＰＲＯ１０７４ポリペプチドのアミノ酸分析により、ベータ１，３-ガラクトシルトランスフェラーゼとの有意な配列類似性が示唆され、ＰＲＯ１０７４がガラクトシルトランスフェラーゼファミリーのタンパク質の新規なメンバーであることが示された。
他のタンパク質との或る程度の相同性が示唆された。Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）を用いた全長ＰＲＯ１０７４ポリペプチドの分析により、ＰＲＯ１０７４アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：AF029792_1, P_R57433, DMU41449_1, AC000348_14, P_R47479, CET09F5_2, CEF14B6_4, CET15D6_5, CEC54C8_4, 及びCEE03H4_10との間の相同性が明らかになった。
クローンＤＮＡ５７７０４−１４５２は1998年6月9日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９５３が付与されている。
【０２７６】
実施例５９：ヒトＰＲＯ１００５をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、LIFESEQ(登録商標)データベースからのＥＳＴクラスター配列、Ｉｎｃｙｔｅクラスター配列番号４９２４３の同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５６３８０と命名する。
ＤＮＡ５６３８０コンセンサス配列とＭｅｒｃｋのＥＳＴクローン番号ＡＡ２５６６５７に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＭｅｒｃｋＥＳＴクローン番号ＡＡ２５６６５７を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１３８に示し、ここでＤＮＡ５７７０８−１４１１と命名する。
図１３８に示した全長クローンは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置３０−３２に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置５８５−５８７の停止コドンで終端する（図１３８；配列番号：２１０）。予測されるポリペプチド前駆体は１８５アミノ酸長である（図１３９；配列番号：２１１）。ＰＲＯ１００５タンパク質は、約２０，３３１の計算された分子量及び約５．８５の見積もられたｐＩを有する。クローンＤＮＡ５７７０８−１４１１は1998年6月23日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３０２１が付与されている。
図１３９（配列番号：２１１）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１００５アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：DDU07187_1, DDU87912_1, CELD1007_14, A42239, DDU42597_1, CYAG_DICDI, S50452, MRKC_KLEPN, P-R41998, 及びXYNA_RUMFLとの間の或る程度の相同性が明らかになった。
【０２７７】
実施例６０：ヒトＰＲＯ１０７３をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ここでＤＮＡ５５９３８と命名され図１４２（配列番号：２１４）に示す最初のＤＮＡ配列を、一次ｃＤＮＡクローンの５’末端を優勢に示すヒトＳＫ-Ｌｕ-１肉芽腫細胞系ｃＤＮＡライブラリにおいて、酵母スクリーニングを使用して同定した。次いでＤＮＡ５５９３８を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）からのＥＳＴｓと、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて比較した。ＥＳＴｓは、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５６４１１と命名する。
ＤＮＡ５６４１１コンセンサス配列とＭｅｒｃｋのＥＳＴクローン番号Ｈ８６０２７に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＭｅｒｃｋＥＳＴクローンＨ８６０２７を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１４０に示た。
図１４０に示した全長ＤＮＡ５７７１０−１４５１クロンは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置３４５−３４７に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１２１４−１２４４に見られる停止コドンで終端する（図１４０；配列番号：２１２）。予測されるポリペプチド前駆体は２９９アミノ酸長である（図１４１；配列番号：２１３）。ＰＲＯ１０７３は、約３４，６８９の計算された分子量及び約１１．４９の見積もられたｐＩを有する。ＰＲＯ１１７３配列は以下のさらなる特徴を持つ：約アミノ酸１０３１のシグナルペプチド、約アミノ酸のｂＺＩＰ転写因子塩基性ドメインシグネーチャーに対する配列同一性、約アミノ酸２−５の潜在的Ｎ-グリコシル化部位、及び約アミノ酸１５８−１８３のプロタミンＰ１タンパク質に対する配列同一性。
図１４１（配列番号：２１３）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１０７３アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：MMU37351_1, ATAC00250510T9J22.10, S59043, ENXNUPR_1, B4328, SR55_DROME, S26650, SON_HUMAN, VIT2_CHICK, 及びXLC4SRPRT_1との間の或る程度の配列同一性が明らかになった。
クローンＤＮＡ５７７１０−１４５１は1998年6月1日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３０４８が付与されている。
【０２７８】
実施例６１：ヒトＰＲＯ１１５２をコードするｃＤＮＡクローンの単離
天然ヒトＰＲＯ１１５２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡクローン（ＤＮＡ５７７１１−１５０１）を、一次ｃＤＮＡクローンの５’末端を優勢に示すヒト乳児脳ｃＤＮＡライブラリにおいて、酵母スクリーニングを使用して同定した。特に、酵母スクリーニングは、ここでＤＮＡ５５８０７（配列番号：２１７；図１４５参照）と命名されるｃＤＮＡを同定するのに用いた。
ＤＮＡ５５８０７配列とＭｅｒｃｋのＥＳＴクローン番号Ｒ５６７５６に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＭｅｒｃｋＥＳＴクローンＲ５６７５６を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１４３に示す。
図１４３に示した全長ＤＮＡ５７７１１−１５０１クロンは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置５８−６０に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１４９５−１４９７の停止コドンで終端する（図１４３）。予測されるポリペプチド前駆体は４７９アミノ酸長である（図１４４）。図１４４に示したＰＲＯ１１５２タンパク質は、約５３，６０２の見積もられた分子量及び約８．８２のｐＩを有する。図１４４（配列番号：２１６）に示した全長ＰＲＯ１１５２配列の分析は、以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸１〜約アミノ酸２８のシグナル配列、約アミノ酸１３３〜約アミノ酸１５５、約アミノ酸１６８〜約アミノ酸１８７、約アミノ酸２２９〜約アミノ酸２４７、約アミノ酸２６４〜約アミノ酸２８５、約アミノ酸３０９〜約アミノ酸３３０、約アミノ酸３７１〜約アミノ酸３９０及び約アミノ酸４４１〜約アミノ酸４６４の膜貫通ドメイン、約アミノ酸３４〜約アミノ酸３７及び約アミノ酸３８７〜約アミノ酸３９０の潜在的Ｎ-グリコシル化部位、及び約アミノ酸２４３〜約アミノ酸２８７の呼吸鎖ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニットと相同性を持つアミノ酸配列ブロック。クローンＤＮＡ５７７１１−１５０１は1998年6月1日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３０４７が付与されている。
図１４４（配列番号：２１６）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１１５２アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：AF052239_1, SYNN9CGA_1, SFCYTB_1, GEN12507, P_R11769, MTV025_109, C61168, S43171, P_P61689及びP_P61696との間の有意な相同性が明らかになった。
【０２７９】
実施例６２：ヒトＰＲＯ１１３６をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、Incyteデータベースからの、ここで１０９１４２と命名されるＥＳＴクラスター配列の同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５６０３９と命名する。
ＤＮＡ５６０３９コンセンサス配列とＭｅｒｃｋのＥＳＴクローン番号ＨＳＣ１ＮＦ０１１に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＭｅｒｃｋＥＳＴクローンＨＳＣ１ＮＦ０１１を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１４６に示し、ここでＤＮＡ５７８２７−１４９３と命名する。
クローンＤＮＡ５７８２７−１４９３は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２１６−２１８に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置２１１２−２１１４の停止コドンで終端する（図１４６）。予測されるポリペプチド前駆体は６３２アミノ酸長である（図１４７）。図１４７に示す全長ＰＲＯ１１３６タンパク質は、約６９，６４３の見積もられた分子量及び約８．５のｐＩを有する。図１４７（配列番号：２１９）に示した全長ＰＲＯ１１３６配列の分析は、以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸１〜約アミノ酸１５のシグナルペプチド、約アミノ酸１０８〜約アミノ酸１１、約アミノ酸１５７〜約アミノ酸１６０、２８９〜約アミノ酸２９２及び約アミノ酸３８４〜約アミノ酸３８７の潜在的Ｎ-グリコシル化部位。クローンＤＮＡ５７８２７−１４９３は1998年6月1日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３０４５が付与されている。
図１４７（配列番号：２１９）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１１３６アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：AF034745_1, MMAF000168_19, HSMUPP1_1, AF060539_1, SP97_RAT, I38757&lt; MMU93309_1, CEK01A6_4及びHSA224747_1との間の有意な相同性が明らかになった。
【０２８０】
実施例６３：ヒトＰＲＯ８１３をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、単一のIncyteＥＳＴクラスター配列（ＩｎｃｙｔｅＥＳＴクラスター配列番号４５５０１）の同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列番号４５５０１を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５６４００と命名する。
ＤＮＡ５６４００コンセンサス配列とＭｅｒｃｋのＥＳＴクローン番号Ｔ９０５９２に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＭｅｒｃｋＥＳＴクローン番号Ｔ９０５９２を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１４８に示し、ここでＤＮＡ５７８３４−１３３９と命名する。
図１４８に示した全長クローンは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１０９−１１１に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置６３７−６３９の停止コドンで終端する（図１４９；配列番号：２２１）。予測されるポリペプチド前駆体は１７６アミノ酸長であり、約１９，６１６の計算された分子量及び約７．１１の見積もられたｐＩを有する。図１４９（配列番号：２２１）に示した全長ＰＲＯ８１３配列の分析は、以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸１〜約アミノ酸２６のシグナルペプチド、約アミノ酸４８〜約アミノ酸５３、約アミノ酸１５３〜約アミノ酸１５８、１５６〜約アミノ酸１６１及び約アミノ酸１６７〜約アミノ酸１７２の潜在的Ｎ-グリコシル化部位。クローンＤＮＡ５７８３４−１３３９は1998年6月9日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９５４が付与されている。
全長ＰＲＯ８１３ポリペプチドのアミノ酸分析により、複数の表面関連プロテインＣと配列同一性を有することが示唆された。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ８１３アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：PSPC_MUSVI, P_P92071, G02964, P_R65489&lt; P_P82977, P_R84555, S55542, MUSIGHAJ_1及びPH1158との間の或る程度の相同性が明らかになった。
【０２８１】
実施例６４：ヒトＰＲＯ８０９をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、単一のIncyteＥＳＴクラスター配列の同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５６４１８と命名する。
ＤＮＡ５６４１８コンセンサス配列とＭｅｒｃｋのＥＳＴクローン番号Ｈ７４３０２に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＭｅｒｃｋＥＳＴクローン番号Ｈ７４３０２を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１５０に示し、ここでＤＮＡ５７８３６−１３３８と命名する。
ＤＮＡ５７８３６−１３３８の全長ヌクレオチド配列を図１５０（配列番号：２２２）に示す。クローンＤＮＡ５７８３６−１３３８は単一のオープンリーディングフレームを含み、配列番号：２２２のヌクレオチド位置６３−６５に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置８５８−８６０の停止コドンで終端する（図１５０）。予測されるポリペプチド前駆体は２６５アミノ酸長である（図１５１）。図１５１に示す全長ＰＲＯ８０９タンパク質は約２９，０６１の見積もられた分子量及び約９．１８のｐＩを有する。図１５１はシグナルペプチド及びＮ-グリコシル化部位のおよその位置も示す。対応するヌクレオチドは、図１５０を参照して容易に決定できる。クローンＤＮＡ５７８３６−１３３８は1998年6月23日にＡＴＣＣに寄託された。配列について、寄託されたクローンは実際のヌクレオチド配列を含み、ここに提供された配列は公知の配列技術に基づくと理解される。
全長ＰＲＯ８０９ポリペプチドのアミノ酸配列分析により、ヘパリン表面プロテオグリカン及び内皮細胞接着因子-１と或る程度の配列相同性を有することが示唆された。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ８０９アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：PGBM_MOUSE, D82082_1及びPW14158との間の配列同一性が明らかになった。
【０２８２】
実施例６５：ヒトＰＲＯ７９１をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、単一のIncyteＥＳＴクラスター配列の同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５６４２９と命名する。
ＤＮＡ５６４２９コンセンサス配列とＭｅｒｃｋのＥＳＴクローン番号３６３６７に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＭｅｒｃｋＥＳＴクローン番号３６３６７を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１５２に示し、ここでＤＮＡ５７８３８−１３３７と命名する。
ＤＮＡ５７８３８−１３３７の全長ヌクレオチド配列を図１５２（配列番号：２２４）に示す。クローンＤＮＡ５７８３８−１３３７は単一のオープンリーディングフレームを含み、配列番号：２２４のヌクレオチド位置９−１１に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置７４７−７４９の停止コドンで終端する（図１５２）。予測されるポリペプチド前駆体は２４６アミノ酸長である（図１５３）。図１５３に示す全長ＰＲＯ７９１タンパク質は約２７，３６８の見積もられた分子量及び約７．４５のｐＩを有する。図１５３はシグナルペプチド、膜貫通ドメイン及びＮ-グリコシル化部位及び細胞外タンパク質に保存される領域のおよその位置も示す。対応するヌクレオチドは、図１５２を参照してここに提供する一実施態様である。クローンＤＮＡ５７８３８−１３３７は1998年6月23日にＡＴＣＣに寄託された。配列について、寄託されたクローンは実際のヌクレオチド配列を含み、ここに提供された配列は公知の配列技術に基づくと理解される。
全長ＰＲＯ７９１ポリペプチドのアミノ酸配列分析により、ＭＨＣ-Ｉ抗原と配列類似性を有することが示唆され、ＰＲＯがＭＨＣ-Ｉ抗原に関連することが示された。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ７９１アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：AF034346_1, MMQ1K5_1及びHFE_HUMANとの間の或る程度の配列同一性が明らかになった。
【０２８３】
実施例６６：ヒトＰＲＯ１００４をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、単一のＩｎｃｙｔｅＥＳＴクラスター配列、Ｉｎｃｙｔｅクラスター配列番号７３６８１の同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５６５１６と命名する。
ＤＮＡ５６５１６コンセンサス配列とＭｅｒｃｋのＥＳＴクローン番号Ｈ４３８３７に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＭｅｒｃｋＥＳＴクローンＨ４３８３７を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１５４に示す。
図１５４に示す全長クローンは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１１９−１２１に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置４６４−４６６の停止コドンで終端する（図１５４；配列番号：２２６）。予測されるポリペプチド前駆体は１１５アミノ酸長である（図１５５；配列番号：２２７）。図１５５に示す全長ＰＲＯ１００４タンパク質は、約１３，６４９の見積もられた分子量及び約９．５８のｐＩを有する。図１５５（配列番号：２２７）に示した全長ＰＲＯ１００４配列の分析は、以下の特徴の存在を明らかにした：約アミノ酸１１３−１１５の微小体Ｃ末端標的化シグナル、約アミノ酸７１−７４の潜在的Ｎ-グリコシル化部位、及び約アミノ酸２２−４８のジヒドロフォレートレダクターゼタンパク質と配列同一性を持つドメイン。
全長ＰＲＯ１００４ポリペプチドのアミノ酸配列の、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）を用いた分析により、ＰＲＯ１００４アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：CELR02D3_7, LECI_MOUSE, AF06691, SSZ97390, SSZ97395_1, 及びSSZ97400_1との間の相同性が明らかになった。
クローンＤＮＡ５７８４４−１４１０は1998年6月23日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３０１０が付与されている。
【０２８４】
実施例６７：ヒトＰＲＯ１１１１をコードするｃＤＮＡクローンの単離
発現配列タグ（ＥＳＴ）ＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を検索し、インシュリン様成長因子結合タンパク質と相同性を持つＥＳＴを同定した。
ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児脳から単離した。ＰＲＯ１１１１をコードするｃＤＮＡクローンを単離するのに用いたｃＤＮＡライブラリは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法により作成した。ｃＤＮＡをＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、所定の方向で適当なクローニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照）に、独特のＸｏｌ及びＮｏｔＩ部位でクローニングした。
（上記のように調製した）ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリを、上記のIncyteＥＳＴ配列に基づく合成オリゴヌクレオチドプローブ：
5'-CCACCACCTGGAGGTCCTGCAGTTGGGCAGGAACTCCATCCGGCAGATTG-3'  (配列番号：251)
でのハイブリッド形成によりスクリーニングした。
同定したｃＤＮＡクローンは全体を配列決定した。ＰＲＯ１１１１の全ヌクレオチド配列を図１５６（配列番号：２２８）に示す。クローンＤＮＡ５８７２１−１４７５は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置５７−５９に見かけの翻訳開始部位及びヌクレオチド位置２０１６−２０１８の停止コドンを持つ（図１５６；配列番号：２２８）。予測されるポリペプチド前駆体は６５３アミノ酸長である（図１５７）。膜貫通ドメインは位置２１−４０（ＩＩ型）及び５２８−５４８である。クローンＤＮＡ５８７２１−１４７５はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３１１０が付与されている。図１５７に示した全長ＰＲＯ１１１１タンパク質は約７２，７１７ダルトンの見積もられた分子量及び約６．９９のｐＩを有する。
図１５７（配列番号：２２９）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１１１１アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：A58532, D86983_1, RNPLGPV_V, PGS2_HUMAN, AF038127_1, ALS_MOUSE, GPV_HUMAN, PGS2_BOVIN, ALS_PAPPA及びI147020との間の或る程度の配列同一性が明らかになった。
【０２８５】
実施例６８：ヒトＰＲＯ１３４４をコードするｃＤＮＡクローンの単離
コンセンサスＤＮＡ配列を、上記実施例１に記載したようにphrapを用いて他のＥＳＴ配列に対して作成した。このコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ３３７９０と命名する。ＤＮＡ３３７９０配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ１３４４の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正及び逆）を合成した：：
正方向ＰＣＲプライマー  5'-AGGTTCGTGATGGAGACAACCGCG-3'（配列番号：232）
逆方向ＰＣＲプライマー  5'-TGTCAAGGACGCACTGCCGTCATG-3'（配列番号：233）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つＤＮＡ３３７９０配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5'-TGGCCAGATCATCAAGCGTGTCTGTGGCAACGAGCGGCCAGCTCCTATCC-3'（配列番号：234）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ１３４４遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ１３４４の全長ＤＮＡ配列（ここでＤＮＡ５８７２３−１５８８と命名する）［図１５８、配列番号：２３０］及びＰＲＯ１３４４の誘導タンパク質配列を与えた。
ＤＮＡ５８７２３−１５８８の全核酸配列を図１５８（配列番号：２３０）に示す。クローンＤＮＡ５８７２３−１５８８は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２６−２８に見かけの翻訳開始部位そしてヌクレオチド位置２１８６−２１８８の停止コドンで終端する（図１５８）。予測されるポリペプチド前駆体は７２０アミノ酸長である（図１５９）。図１５９に示した全長ＰＲＯ１３４４タンパク質は約８０，１９９ダルトンの見積もられた分子量及び約７．７７のｐＩを有する。
図１５９（配列番号：２３１）に示した全長ＰＲＯ１３４４配列の分析は、以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸１〜約アミノ酸２３のシグナルペプチド、約アミノ酸２６０〜約アミノ酸２７１のＥＧＦ様ドメインシステインタンパク質シグネーチャー配列、約アミノ酸９６〜約アミノ酸９９、約アミノ酸２７９〜約アミノ酸２８２、約アミノ酸３１６〜約アミノ酸３１９、約アミノ酸４５１〜約アミノ酸４５４及び約アミノ酸６１４〜約アミノ酸６１７の潜在的Ｎ-グリコシル化部位、約アミノ酸４８９〜約アミノ酸５０５のセリンプロテアーゼ、トリプシンファミリーと相同性を持つアミノ酸配列ブロック、及び約アミノ酸１５０〜約アミノ酸１６６のＣＵＢドメインタンパク質プロフィール配列。クローンＤＮＡ５８７２３−１５８８は1998年8月18日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３１３３が付与されている。
図１５９（配列番号：２３１）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１３４４アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：S77063_1, CRAR_MOUSE, P_R74775, P_P90070, P_R09217, P_P70475, HSBMP16_1及びU50330_1との間の有意な相同性が明らかになった。
【０２８６】
実施例６９：ヒトＰＲＯ１１０９をコードするｃＤＮＡクローンの単離
コンセンサスＤＮＡ配列を、上記実施例１に記載したようにphrapを用いて他のＥＳＴ配列に対して作成した。このコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５２６４２と命名する。できる限り上記のようなＥＳＴ配列の供給源を用いて前もって得たコンセンサス配列のBLAST及びphrapの繰り返しサイクルを用いた伸長によりコンセンサスＤＮＡ配列を得た。ＤＮＡ５２６４２配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ１１０９の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正及び逆）を合成した：：
正方向ＰＣＲプライマー  5'-CCTTACCTCAGAGGCCAGAGCAAGC-3'（配列番号：237）
逆方向ＰＣＲプライマー  5'-GAGCTTCATCCGTTCTGCGTTCACC-3'（配列番号：238）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つＤＮＡ５２６４２配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5'-CAGGAATGTAAAGCTTTACAGAGGGTCGCCATCCTCGTTCCCCACC-3'（配列番号：239）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ１１０９遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒトＳＫ-Ｌｕ-１肉芽腫細胞組織（ＬＩＢ２４７）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ１１０９の全長ＤＮＡ配列（ここでＤＮＡ５８７３７−１４７３と命名する）［図１６０、配列番号：２３５］及びＰＲＯ１１０９の誘導タンパク質配列を与えた。
ＤＮＡ５８７３７−１４７３の全核酸配列を図１６０（配列番号：２３５）に示す。クローンＤＮＡ５８７３７−１４７３は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１１９−１２０に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１１５１−１１５３の停止コドンで終端する（図１６０）。予測されるポリペプチド前駆体は３４４アミノ酸長である（図１６１）。図１６１に示した全長ＰＲＯ１１０９タンパク質は約４０，０４１ダルトンの見積もられた分子量及び約９．３４のｐＩを有する。図１６１（配列番号：２３６）に示した全長ＰＲＯ１１０９配列の分析は、以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸１〜約アミノ酸２７のシグナルペプチド、約アミノ酸４〜約アミノ酸７、約アミノ酸２２０〜約アミノ酸２２３及び約アミノ酸３３５〜約アミノ酸３３８の潜在的Ｎ-グリコシル化部位、及び約アミノ酸１９１〜約アミノ酸２０１のキシロースイソメラーゼタンパク質と相同性を持つアミノ酸配列ブロック。クローンＤＮＡ５８７３７−１４７３は1998年8月18日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３１３６が付与されている。
図１６１（配列番号：２３６）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１１０９アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：HSUDPGAL_1, HSUDPB14_1, NALS_BOVIN, HSU10473_1, CEW02B12_11, YNJ4_CAEEL, AE000738_11, CET24D1_1, S48121及びCEGLY9_1との間の有意な相同性が明らかになった。
【０２８７】
実施例７０：ヒトＰＲＯ１３８３をコードするｃＤＮＡクローンの単離
コンセンサスＤＮＡ配列を、上記実施例１に記載したようにphrapを用いて他のＥＳＴ配列に対して作成した。このコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５３９６１と命名する。ＤＮＡ５３９６１配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ１３８３の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正及び逆）を合成した：：
正方向ＰＣＲプライマー  5'-CATTTCCTTACCCTGGACCCAGCTCC-3'（配列番号：242）
逆方向ＰＣＲプライマー  5'-GAAAGGCCCACAGCACATCTGGCAG-3'（配列番号：243）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つＤＮＡ５３９６１配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5'-CCACGACCCGAGCAACTTCCTCAAGACCGACTTGTTTCTCTACAGC-3'（配列番号：244）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ１３８３遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児脳組織から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ１３８３の全長ＤＮＡ配列（ここでＤＮＡ５８７４３−１６０９と命名する）［図１６２、配列番号：２４０］及びＰＲＯ１３８３の誘導タンパク質配列を与えた。
ＤＮＡ５８７４３−１６０９の全核酸配列を図１６２（配列番号：２４０）に示す。クローンＤＮＡ５８７４３−１６０９は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１２２−１２４に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１３９１−１３９３の停止コドンで終端する（図１６２）。予測されるポリペプチド前駆体は４２３アミノ酸長である（図１６３）。図１６３に示した全長ＰＲＯ１３８３タンパク質は約４６，９８９ダルトンの見積もられた分子量及び約６．７７のｐＩを有する。図１６３（配列番号：２４１）に示した全長ＰＲＯ１３８３配列の分析は、以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸１〜約アミノ酸２４のシグナルペプチド、約アミノ酸３３９〜約アミノ酸３６２の膜貫通ドメイン、及び約アミノ酸３４〜約アミノ酸３７、約アミノ酸５８〜約アミノ酸６１、約アミノ酸１４２〜約アミノ酸１４５、約アミノ酸１９７〜約アミノ酸２００、約アミノ酸３００〜約アミノ酸３０３及び約アミノ酸３６４〜約アミノ酸３６７のＮ-グリコシル化部位。クローンＤＮＡ５８７４３−１６０９は1998年8月25日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３１５４が付与されている。
図１６３（配列番号：２４１）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１３８３アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：NMB_HUMAN, QNR_COTJA, P_W38335, P115_CHICK, P_W38164, A45993_1, MMU70209_1, D83704_1及びP_W39176との間の有意な相同性が明らかになった。
【０２８８】
実施例７１：ヒトＰＲＯ１００３をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、ここで４３０５５と命名される単一のＩｎｃｙｔｅＥＳＴクラスター配列の同定が可能となった。次いでこの配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでｃｏｎｓｅｎ０１と命名する。
コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号２８４９３８２に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅＥＳＴクローン２８４９３８２を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１６４に示た。
ＤＮＡ５８８４６−１４０９の全ヌクレオチド配列を図１６４（配列番号：２４５）に示す。クローンＤＮＡ５８８４６−１４０９は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置４１−４３に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置２９３−２９５の停止コドンで終端する（図１６４）。予測されるポリペプチド前駆体は８４アミノ酸長である（図１６５）。図１６５に示す全長ＰＲＯ１００３は、約９，４０８の見積もられた分子量及び約９．２８のｐＩを有する。図１６５（配列番号：２４６）に示した全長ＰＲＯ１００３配列の分析は、約アミノ酸１〜約アミノ酸２４のシグナルペプチド、約アミノ酸５８〜約６１のｃＡＭＰ-及びｃＧＭＰ-依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位の存在を明らかにした。Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）を用いた全長ＰＲＯ１００３ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、ＰＲＯ１００３アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：AOPCZA363_3, SRTX_ATREN, A48298, MHVJHMS_1, VGL2_CVMJH, DHDHTC2_2, CORT_RAT, TAL6_HUMAN, P_W14123, 及びDVUFI_2との間の相同性が明らかになった。
【０２８９】
実施例７２：ヒトＰＲＯ１１０８をコードするｃＤＮＡクローンの単離
コンセンサスＤＮＡ配列を、上記の実施例１に記載したようにphrapを用いて他のＥＳＴ配列に対して作成した。このコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５３２３７と命名する。
ＤＮＡ５３２３７コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号２３７９８８１に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅＥＳＴクローン２３７９８８１を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１６６に示し、ここでＤＮＡ５８８４８−１４７２と命名する。
ＤＮＡ５８８４８−１４７２の全ヌクレオチド配列を図１６６（配列番号：２４７）に示す。クローンＤＮＡ５８８４８−１４７２は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置７７−７９に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１４４５−１４４７の停止コドンで終端する（図１６６）。予測されるポリペプチド前駆体は４５６アミノ酸長である（図１６７）。図１６７に示す全長ＰＲＯ１１０８タンパク質は、約５２，０７１の見積もられた分子量及び約９．４６のｐＩを有する。図１６７（配列番号：２４８）に示した全長ＰＲＯ１１０８配列の分析は、以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸２２〜約アミノ酸４２、約アミノ酸１５６〜約アミノ酸１７６、約アミノ酸１８０〜約アミノ酸１９９及び約アミノ酸３６９〜約アミノ酸３８８のＩＩ型膜貫通ドメイン、約アミノ酸２４７〜約アミノ酸２５０、約アミノ酸３２７〜約アミノ酸３３０、約アミノ酸３２８〜約アミノ酸３３１及び約アミノ酸３６２〜約アミノ酸３６５の潜在的Ｎ-グリコシル化部位、及び約アミノ酸１５３〜約アミノ酸１９０のＥＲルーメンタンパク質保持レセプタータンパク質と相同性を持つアミノ酸ブロック。クローンＤＮＡ５８８４８−１４７２は1998年6月9日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９５５が付与されている。
全長ＰＲＯ１１０８ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、ＬＰＡＡＴタンパク質と有意な配列類似性を有することが示唆され、それによりＰＲＯ１１０８が新規なＬＰＡＡＴ相同体であることが示された。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１１０８アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：AF01511_1, CER07E3_2, YL35_CAEEL, S73863, CEF59F4_4, P?W06422, MMU41736_1, MTV008_39, P_R99248及びY67_BPT7との間の相同性が明らかになった。
【０２９０】
実施例７２：ヒトＰＲＯ１１３７をコードするｃＤＮＡクローンの単離
Swiss-Prot公的タンパク質データベースからの約９５０の公知の分泌タンパク質からの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）配列（必要ならば、分泌シグナルを含む）を、発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースの検索に使用した。ＥＳＴデータベースは、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む。検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いてＥＳＴ配列の６フレーム翻訳に対するＥＣＤタンパク質配列の比較として実施した。この手法を用いて、ここで「ＤＮＡ７１０８」とも称されるＩｎｃｙｔｅＥＳＴ番号３４５９４４９を、公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０以上を持つＥＳｔとして同定した。
コンセンサスＤＮＡ配列を、BLAST及びプログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）の繰り返しサイクルを用いてＤＮＡ７１０８配列及び他のＥＳＴに対して構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５３９５２と命名する。
ＤＮＡ５３９５２コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号３６６３１０２に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅＥＳＴクローン３６６３１０２を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１６８に示す。
ＤＮＡ５８８４９−１４９４の全ヌクレオチド配列を図１６８（配列番号：２４９）に示す。クローンＤＮＡ５８８４９−１４９４は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置７７−７９に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置７９７−７９９の停止コドンで終端する（図１６８）。予測されるポリペプチド前駆体は２４０アミノ酸長である（図１６９）。図１６９に示す全長ＰＲＯ１１３７タンパク質は、約２６，０６４の見積もられた分子量及び約８．６５のｐＩを有する。図１６９（配列番号：２５０）に示した全長ＰＲＯ１１３７配列の分析は、約アミノ酸１〜１４のシグナルペプチド及び約アミノ酸１０１〜１０５の潜在的Ｎ-グリコシル化部位の存在を明らかにした。
全長ＰＲＯ１１３７ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、リボシルトランスフェラーゼと有意な配列類似性を有することが示唆され、それによりＰＲＯ１１３７がリボシルトランスファラーゼファミリーのタンパク質の新規なメンバーであることが示された。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１１３７アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：MMART5_1, NARG_MOUSE, GEN1909, GEN13794, GEN14406, MMRNART62_1, 及びP_R41876との間の相同性が明らかになった。
【０２９１】
実施例７４：ヒトＰＲＯ１１３８をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、ここで１６５２１２と命名される単一のＩｎｃｙｔｅＥＳＴ配列の同定が可能となった。次いでこのクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５４２２４と命名する。この組立物は、ここでＤＮＡ４９１４０（図１７２；配列番号：２５４）と命名される独自に開発したジェネンテクＥＳＴを含んでいた。
ＤＮＡ５４２２４コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号３８３６６１３に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅＥＳＴクローン３８３６６１３を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１７０に示し、ＰＲＯ１１３８の全長ＤＮＡ配列である。クローンＤＮＡ５８８５０−１４９５は1998年6月9日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９５６が付与されている。
ＤＮＡ５８８５０−１４９５の全ヌクレオチド配列を図１７０（配列番号：２５２）に示す。クローンＤＮＡ５８８５０−１４９５は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置３８−４０に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１０４３−１０４５の停止コドンで終端する（図１７０）。予測されるポリペプチド前駆体は３３５アミノ酸長である（図１７１）。図１７１に示す全長ＰＲＯ１１３８は、約３７，４２１ダルトンの見積もられた分子量及び約６．３６のｐＩを有する。図１７１（配列番号：２５３）に示した全長ＰＲＯ１１３８配列の分析は以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸１〜約アミノ酸２２のシグナルペプチド、約アミノ酸２２４〜約２５０の膜貫通ドメイン；約アミノ酸２２９〜約アミノ酸２５０のロイシンジッパーパターン；約アミノ酸９８−１０１、１４２−１４５、１４８−１５１、１７２−１７５、１７６−１７９、２０４−２０７及び２９１−２９５の潜在的グリコシル化部位。
全長ＰＲＯ１１３８のアミノ酸配列の分析は、ＣＤ８４との有意な配列類似性を示唆し、それによりＰＲＯ１１３８がＩｇスーパーファミリーのポリペプチドの新規なメンバーであることを示している。Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）を用いた全長ＰＲＯ１１３８ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、ＰＲＯ１１３８アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：HSU82988_1, HUMLY9_1, P_R97631, P_R97628, P_R97629, P_R97630, CD48_RAT, CD2_HUMAN, P_P93996, 及びHUMBGP_1との間の相同性が明らかになった。
クローンＤＮＡ５８８５０−１４９５は1998年6月9日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９５６が付与されている。
【０２９２】
実施例７５：ヒトＰＲＯ１０５４をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、ここで６６２１２と命名されるＥＳＴクラスター配列のＩｎｃｙｔｅデータベースからの同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５５７２２と命名する。
ＤＮＡ５５７２２コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号３１９７５１に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅＥＳＴクローン３１９７５１を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１７３に示し、ここでＤＮＡ５８８５３−１４２３と命名する。
クローンＤＮＡ５８８５３−１４２３は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置４６−４８に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置５８６−５８８の停止コドンで終端する（図１７３）。予測されるポリペプチド前駆体は１８０アミノ酸長である（図１７４）。図１７４に示す全長ＰＲＯ１０５４タンパク質は、約２０，６３８ダルトンの見積もられた分子量及び約５．０のｐＩを有する。図１７４（配列番号：２５６）に示した全長ＰＲＯ１０５４配列の分析は以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸１〜約アミノ酸１８のシグナルペプチド、約アミノ酸１５５〜約アミノ酸１７６のロイシンジッパーパターン；約アミノ酸２７〜約アミノ酸３８及び約アミノ酸１１０〜約アミノ酸１２０のリポカリンタンパク質と相同性を持つアミノ酸ブロック。クローンＤＮＡ５８８５３−１４２３は1998年6月23日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３０１６付与されている。
図１７４（配列番号：２５６）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１１３６アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：MUP1_MOUSE, MUP6_MOUSE, MUP2_MOUSE, MUP2_MOUSE, MUP8_MOUSE, MUP5_MOUSE, MUP4_MOUSE, S10124, MUPM_MOUSE, MUP_RAT及びECU70823_1との間の有意な相同性が明らかになった。
【０２９３】
実施例７６：ヒトＰＲＯ９９４をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、ここで１５７５５５と命名されるＥＳＴクラスター配列のＩｎｃｙｔｅデータベースからの同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５５７２８と命名する。
ＤＮＡ５５７２８コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号２８６０３６６に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅＥＳＴクローン２８６０３６６を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１７５に示し、ここでＤＮＡ５８８５５−１４２２と命名する。
クローンＤＮＡ５８８５５−１４２２は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置３１−３３に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置７１８−７２０の停止コドンで終端する（図１７５）。予測されるポリペプチド前駆体は２２９アミノ酸長である（図１７６）。図１７６に示す全長ＰＲＯ９９４タンパク質は、約２５，１０９ダルトンの見積もられた分子量及び約６．８３のｐＩを有する。図１７６（配列番号：２５８）に示した全長ＰＲＯ９９４配列の分析は以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸１０〜約アミノ酸３１、約アミノ酸５０〜約アミノ酸７２、約アミノ酸８７〜約アミノ酸１１０及び約アミノ酸１９１〜約アミノ酸２１３の膜貫通ドメイン、約アミノ酸８０〜約アミノ酸８３、約アミノ酸１３２〜約アミノ酸１３５、約アミノ酸１４８〜約アミノ酸１５１及び約アミノ酸１６３〜約アミノ酸１６６の２１３潜在的Ｎ-グリコシル化部位、及び約アミノ酸４〜約アミノ酸１１のＴＮＦＲ／ＮＧＦＲ脂捨て印リッチ領域タンパク質と相同性を持つアミノ酸ブロック。クローンＤＮＡ５８８５５−１４２２は1998年6月23日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３０１８付与されている。
図１７６（配列番号：２５８）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ９９４アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：AF027204_1, TAL6_HUMAN, ILT4_HUMAN, JC6205, MMU57570_1, S40363, ETU56093_1, S42858, P_R66849及びP_R74751との間の有意な相同性が明らかになった。
【０２９４】
実施例７７：ヒトＰＲＯ８１２をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、ここで１７００７９と命名されるＥＳＴクラスター配列のＩｎｃｙｔｅデータベースからの同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５５７２１と命名する。
ＤＮＡ５５７２１コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号３８８９６４に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅＥＳＴクローン３８８９６４を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１７７に示し、ここでＤＮＡ５９２０５−１４２１と命名する。
クローンＤＮＡ５９２０５−１４２１は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置５５−５７に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置３０４−３０６の停止コドンで終端する（図１７７）。予測されるポリペプチド前駆体は８３アミノ酸長である（図１７８）。図１７８に示す全長ＰＲＯ８１２タンパク質は、約９，２０１ダルトンの見積もられた分子量及び約９．３のｐＩを有する。図１７８（配列番号：２６０）に示した全長ＰＲＯ８１２配列の分析は以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸１〜約アミノ酸１５のシグナルペプチド、約アミノ酸７３〜約アミノ酸７６のｃＡＭＰ-及びｃＧＭＰ-依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位、及び約アミノ酸７０〜約アミノ酸７２及び約アミノ酸７６〜約アミノ酸７８のタンパク質キナーゼＣリン酸化部位。クローンＤＮＡ５９２０５−１４２１は1998年6月23日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３００９付与されている。
図１７８（配列番号：２６０）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ８１２アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：P_W35802, P_W35803, PSC1_RAT, S68231, GEN13917, PSC2_RAT, CC10_HUMAN, UTER_RABIT, AF008595_1及びA56413との間の有意な相同性が明らかになった。
【０２９５】
実施例７８：ヒトＰＲＯ１０６９をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、ここで１００７２７と命名される単一のＩｎｃｙｔｅＥＳＴ配列の同定が可能となった。次いでこの配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５６００１と命名する。
ＤＮＡ５６００１コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号３５３３８８１に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅＥＳＴクローン３５３３８８１を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１７９に示し、これはＰＲＯ１０６９の全長ＤＮＡ配列である。
クローンＤＮＡ５９２１１−１４５０は1998年6月9日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９６０が付与されている。
図１７９（配列番号：２６１）にＤＮＡ５９２１１−１４５０の全ヌクレオチド配列を示す。クローンＤＮＡ５９２１１−１４５０は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１９７−１９９に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置４６４−４６６の停止コドンで終端する。予測されるポリペプチド前駆体は８９アミノ酸長である（図１８０）。図１８０に示す全長ＰＲＯ１０６９タンパク質は、約９，４３３ダルトンの見積もられた分子量及び約８．２１のｐＩを有する。図１８０（配列番号：２６２）に示した全長ＰＲＯ１０６９配列の分析は以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸１〜約１６のシグナルペプチド；約アミノ酸３６〜約５９の膜貫通ドメイン；約アミノ酸４１−４６、４５−５０及び８４−８９の潜在的Ｎ-ミリストイル化部位；及び約アミノ酸５４〜約６６の細胞外タンパク質ＳＣＰ／Ｔｐｘ-１／Ａｇ５／ＰＲ-１／Ｓｃ７との相同性。
全長ＰＲＯ１０６９のアミノ酸配列の分析は、ＣＨＩＦとの有意な配列類似性を示唆し、それによりＰＲＯ１０６９がＣＨＩＦファミリーのポリペプチドの新規なメンバーであることを示している。Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）を用いた全長ＰＲＯ１０６９ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、ＰＲＯ１０６９アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：CHIF_RAT, A55571, PLM_HUMAN, A40533, ATNG_BOVIN, RIC_MOUSE, PETD_SYNY3, VTB1_XENLA, A059009, 及びS75086との間の相同性が明らかになった。
クローンＤＮＡ５９２１１−１４５０は1998年6月9日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９６０が付与されている。
【０２９６】
実施例７９：ヒトＰＲＯ１１２９をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、ここで９８８３３と命名される単一のＩｎｃｙｔｅＥＳＴクラスター配列の同定が可能となった。次いでこのＩｎｃｙｔｅＥＳＴクラスター配列番号９８８３３配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５６０３８と命名する。
ＤＮＡ５６０３８コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号１３３５２４１に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅＥＳＴクローン１３３５２４１を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１８１に示し、ここでＤＮＡ５９２１３−１４８７と命名する。
図１８１に示す全長クローンは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置４２−４４に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１６１４−１６１６の停止コドンで終端する（図１８１；配列番号：２６３）。予測されるポリペプチド前駆体は５２４アミノ酸長であり、約６０，３１０ダルトンの計算された分子量及び約７．４６の見積もられたｐＩを有する。図１８２（配列番号：２６４）に示した全長ＰＲＯ１１２９配列の分析は以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸１３〜約アミノ酸３２及び約アミノ酸７７〜約アミノ酸１０２のＩＩ型膜貫通ドメイン、約アミノ酸４６１〜約アミノ酸４７０のチトクロムＰ-４５０システインヘム-鉄リガンド脂具ネーチャー配列、及び約アミノ酸１１２〜約アミノ酸１１５及び約アミノ酸１６８〜約アミノ酸１７１の潜在的Ｎ-グリコシル化部位。クローンＤＮＡ５９２１３−１４８７は1998年6月9日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９５９が付与されている。
全長ＰＲＯ１１２９のアミノ酸配列の分析は、チトクロムＰ-４５０ファミリーのタンパク質との配列類似性を示唆した。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１１２９アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：AC004523_1, S45702, AF054821_1,及びI53015との間の或る程度の相同性が明らかになった。
【０２９７】
実施例８０：ヒトＰＲＯ１０６８をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、ここでＩｎｃｙｔｅクラスター番号１４７３６と命名されるＥＳＴクラスター配列のLIFESEQ(商品名)データベースからの同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５６０９４と命名する。
ＤＮＡ５６０９４コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号００４９７４に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅＥＳＴクローン００４９７４を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１８３に示し、ここでＤＮＡ５９２１４−１４４９（配列番号：２６５）と命名する。
図１８３に示した全長クローンは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置４２−４４に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置４１４−４１６の停止コドンで終端する（図１８３；配列番号：２６５）。予測されるポリペプチド前駆体は１２４アミノ酸長である。ＰＲＯ１０６８は、約１４，２８４ダルトンの計算された分子量及び約８．１４の見積もられたｐＩを有する。図１８４に示すように、ＰＲＯ１０６８ポリペプチドは以下のさらなる特徴を持つ：約アミノ酸１−２０のシグナル配列、約アミノ酸１１８−１２３のウロテシンＩＩシグネーチャー配列、約アミノ酸６４−６６の細胞接着配列、約アミノ酸１１２−１１５の潜在的ｃＡＭＰ-及びｃＧＭＰ-依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位。
図１８４（配列番号：２６６）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１０６８アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：HALBOP_1, MTV043_36, I50498,及びP_R78445との間の相同性が明らかになった。
クローンＤＮＡ５９２１４−１４４９は1998年7月1日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３０４６付与されている。
【０２９８】
実施例８１：ヒトＰＲＯ１０６６をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、ここで７９０６６と命名される単一のＩｎｃｙｔｅＥＳＴクラスター配列の同定が可能となった。次いでこのＩｎｃｙｔｅＥＳＴクラスター配列番号７９０６６配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５６１２１と命名する。
ＤＮＡ５６１２１コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号１５１５３１５に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅＥＳＴクローン１５１５３１５を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１８５に示し、ここでＤＮＡ５９２１５−１４２５と命名する。
図１８５に示す全長クローンは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１７６−１７８に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置５２７−５２９の停止コドンで終端する（図１８５；配列番号：２６７）。予測されるポリペプチド前駆体は１１７アミノ酸長であり、約１２，９１１ダルトンの計算された分子量及び約５．４６の見積もられたｐＩを有する。図１８６（配列番号：２６８）に示した全長ＰＲＯ１０６６配列の分析は以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸１〜約アミノ酸２３のシグナルペプチド、約アミノ酸３８〜約アミノ酸４１のｃＡＭＰ-及びｃＧＭＰ-依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位、及び約アミノ酸５〜約アミノ酸１０、約アミノ酸６３〜約アミノ酸６８及び約アミノ酸８３〜約アミノ酸８８の潜在的Ｎ-ミリストイル化部位。クローンＵＮＱ５２４（ＤＮＡ５９２１５−１４２５）は1998年6月9日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９６１が付与されている。
全長ＰＲＯ１０６６のアミノ酸配列の分析は、公知のタンパク質と有意な配列同一性を持たないことを示唆した。しかし、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１０６６アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：MOTI_HUMAN, AF025667_1, MTCY19H9_8及びRABIGKCH_1との間の或る程度の相同性が明らかになった。
【０２９９】
実施例８２：ヒトＰＲＯ１１８４をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムのＩｎｃｙｔｅデータベースからのＥＳＴｓに対する使用により、ここでＤＮＡ５６３７５と命名される候補配列の同定が可能となった。次いでこの配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５６３７５と命名する。
ＤＮＡ５６３７５コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号１４２８３７４に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅＥＳＴクローン１４２８３７４を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１８７に示す。
図１８７に示す全長クローンは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１０６−１０８に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置５３２−５３４に見られる停止コドンで終端する（図１８７；配列番号：２６９）。予測されるポリペプチド前駆体は１４２アミノ酸長であり、約１５，６９０ダルトンの計算された分子量及び約９．６４の見積もられたｐＩを有する。図１８８（配列番号：２７０）に示した全長ＰＲＯ１１８４配列の分析は、約アミノ酸１−３８のシグナルペプチドの存在を明らかにした。クローンＤＮＡ５９２２０−１５１４は1998年6月9日にＡＴＣＣに寄託された。寄託されたクローンは実際のヌクレオチド配列を含み、ここに代表が提供されたと理解される。
全長ＰＲＯ１１８４ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）で「DVTIMS02_1」と称される、ショウジョウバエからのＴＩＭと呼ばれるタンパク質と幾分の配列同一性を有することを示唆した。ＰＲＯ１１８４と或る程度の配列同一性を持つ他のＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）配列は、WISI_SCHPO, F002186_1, ATAC00239124及びMSAIPRP_1を含む。
【０３００】
実施例８３：ヒトＰＲＯ１３６０をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、ＤＮＡ１０５７２と命名されるＥＳＴのＩｎｃｙｔｅデータベースからの同定が可能となった。次いでこのＥＳＴ配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５７３１４と命名する。
ＤＮＡ５７３１４コンセンサス配列とＭｅｒｃｋのＥＳＴクローン番号ＡＡ４０６４４３に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＭｅｒｃｋＥＳＴクローンＡＡ４０６４４３を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１８９に示し、ここでＤＮＡ５９４８８−１６０３と命名する。
図１８９に示した全長クローンは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置５４−５６に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置９０９−９１１の停止コドンで終端する（図１８９；配列番号：２７１）。予測されるポリペプチド前駆体は２８５アミノ酸長である（図１９０；配列番号：２７２）。ＰＲＯ１３６０は、約３１，４３３ダルトンの計算された分子量及び約７．３２の見積もられたｐＩを有する。クローンＤＮＡ５９４８８−１６０３は1998年8月25日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３１５７が付与されている。
図１９０（配列番号：２７２）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１３６０アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：UN51_CAFEL, YD4B_SCHPO, AF000634_1, GFO_ZYMMO, YE1J_SCHPO, D86566_1, ZMGFO_1, S76976, PPSA_SYNY3, 及びCEF28B1_4との間の配列同一性が明らかになった。
【０３０１】
実施例８４：ヒトＰＲＯ１０２９をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、１８７６３と命名されるＥＳＴクラスター配列のＩｎｃｙｔｅデータベースからの同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５７８５４と命名する。
ＤＮＡ５７８５４コンセンサス配列とＭｅｒｃｋのＥＳＴクローン番号Ｔ９８８８０に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＭｅｒｃｋＥＳＴクローンＴ９８８８０を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１９１に示し、ここでＤＮＡ５９４９３−１４２０と命名する。
クローンＤＮＡ５９４９３−１４２０は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置３９−４１に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置２９７−２９９の停止コドンで終端する（図１９１）。予測されるポリペプチド前駆体は８６アミノ酸長である（図１９２）。全長ＰＲＯ１０２９タンパク質は、約９，５４８ダルトンの見積もられた分子量及び約８．５２のｐＩを有する。図１９２（配列番号：２７４）に示す全長ＰＲＯ１０２９配列の分析により、以下のものの存在があきらかとなった：約アミノ酸１〜約アミノ酸１９のシグナル配列、約アミノ酸５０〜約アミノ酸６１の細菌ロドプシン網膜結合部位タンパク質と相同性を持つアミノ酸ブロック、約アミノ酸８３〜約アミノ酸８６のプレニル基結合部位、及び約アミノ酸４５〜約アミノ酸４８の潜在的Ｎ-グリコシル化部位。クローンＤＮＡ５９４９３−１４２０は1998年7月1日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３０５０が付与されている。
図１９２（配列番号：２７４）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１０２９アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：AF031815_1, MM4A6L_1, PSEIS2a-1, S17699及びP_R63635との間の有意な相同性が明らかになった。
【０３０２】
実施例８５：ヒトＰＲＯ１１３９をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、４４６１と命名されるＥＳＴクラスター配列のＩｎｃｙｔｅデータベースからの同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５７３１２と命名する。
ＤＮＡ５７３１２コンセンサス配列は、１７２ヌクレオチド長の公的ＥＳＴ（Ｔ６２０９５、Ｍｅｒｃｋ／ワシントン大学公的データベース）を含んでいた。ここで推定タンパク質コード化配列と称されるこのＥＳＴクローンをＭｅｒｃｋから購入し、配列決定してＰＲＯ１１３９のコード化配列を提供した（図１９３）。既に記したように、ＤＮＡ５９４９７−１４９６の推定アミノ酸配列はHSOBRGRP_1の推定アミノ酸配列と有意な配列同一性を示す。全長タンパク質（図１９４）はアミノ酸残基１と２８の間に推定シグナルペプチド、そして３つの推定膜貫通ドメイン（約アミノ酸残基３３−５２、７１−８９、９８−１２０）を含む。
【０３０３】
実施例８６：ヒトＰＲＯ１３０９をコードするｃＤＮＡクローンの単離
発現配列タグ（ＥＳＴ）データベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を検索してＳＬＩＴと相同性を示すＥＳＴを同定した。
ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児脳組織から単離した。ｃＤＮＡクローンを単離するのに用いたｃＤＮＡライブラリは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法により作成した。ｃＤＮＡをＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼアダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、所定の方向で適当なクローニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照）に、独特のＸｏｌ及びＮｏｔＩ部位でクローニングした。
ｃＤＮＡライブラリ（上記のように調製）を、上記のＩｎｃｙｔｅＥＳＴ配列から誘導した合成オリゴヌクレオチドプローブ：
5'-TCCGTGCAGGGGGACGCCTTTCAGAAACTGCGCCGAGTTAAGGAAC-3'（配列番号：279）
でのハイブリッド形成によりスクリーニングした。
ｃＤＮＡクローンを単離して配列決定した。ＤＮＡ５９５８８−１５７１の全ヌクレオチド配列を図１９５（配列番号：２７７）に示す。クローンＤＮＡ５９５８−１５７１は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置７２０−７２２に見かけの翻訳開始部位を持ちヌクレオチド位置２２８６−２２８８の停止コドンで終端する（図１９５；配列番号：２７７）。予測されるポリペプチド前駆体は５２２アミノ酸長である。シグナルペプチドは、配列番号：２７８のおよそ１−３４、膜貫通ドメインはおよそ４２８−４５０である。クローンＤＮＡ５９５８８−１５７１はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３１０６が付与されている。図１９６に示した全長ＰＲＯ１３０９タンパク質は約５８，６１４ダルトンの見積もられた分子量及び約７．４２のｐＩを有する。
図１９６（配列番号：２７８）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１３０９アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：AB007876_1, GPV?MOUSE, ALS_RAT, P_R85889, LUM_CHICK, AB014462_1, PGS1_CANFA, CEM88_7, A58532及びGEN11209との間の配列同一性が明らかになった。
【０３０４】
実施例８７：ヒトＰＲＯ１０２８をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、或る種のＥＳＴクラスター配列のＩｎｃｙｔｅデータベースからの同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５９６０３と命名する。
ＤＮＡ５９６０３コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号１４９７７２５に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅＥＳＴクローン番号１４９７７２５を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１９７に示し、ここでＤＮＡ５９６０３−１４１９と命名する。
ＤＮＡ５９６０３−１４１９の全長ヌクレオチド配列を図１９７（配列番号：２８０）に示す。クローンＤＮＡ５９６０３−１４１９は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２１−２３に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置６１２−６１４の停止コドンで終端する（図１９７）。予測されるポリペプチド前駆体は１９７アミノ酸長である（図１９８）。図１９８に示した全長ＰＲＯ１０２８タンパク質は、約２０，８３２ダルトンの見積もられた分子量及び約８．７４のｐＩを有する。クローンＤＮＡ５９６０３−１４１９はＡＴＣＣに寄託された。配列について、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供された配列は公知の配列技術に基づくと理解される。
配列番号：２８１のアミノ酸配列を分析すると、推定シグナルペプチドは配列番号：２８１の約アミノ酸１−１９である。Ｎ-グリコシル化部位は配列番号：２８１の約アミノ酸３５−３８である。Ｃ型レクチンドメインは配列番号：２８１の約アミノ酸１０８−１１７であり、ＰＲＯ１０２８がレクチンに関連又はレクチンであることを示している。対応するヌクレオチドは、ここに提供された配列が与えられれば日常的に決定できる。
【０３０５】
実施例８８：ヒトＰＲＯ１０２７をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、或る種のＥＳＴクラスター配列のＩｎｃｙｔｅデータベースからの同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５６３９９と命名する。
ＤＮＡ５６３９９コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号９３７６０５に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅＥＳＴクローン番号９３７６０５を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図１９９に示し、ここでＤＮＡ５９６０５−１４１８と命名する。
ＤＮＡ５９６０５−１４１８の全長ヌクレオチド配列を図１９９（配列番号：２８０）に示す。クローンＤＮＡ５９６０５−１４１８は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置３１−３３に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置２６２−２６４の停止コドンで終端する（図１９９）。予測されるポリペプチド前駆体は７７アミノ酸長である（図２００）。図２００に示した全長ＰＲＯ１０２７タンパク質は、約８，７７２ダルトンの見積もられた分子量及び約９．６２のｐＩを有する。クローンＤＮＡ５９６０５−１４１８はＡＴＣＣに寄託された。配列について、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供された配列は公知の配列技術に基づくと理解される。
配列番号：２８３のアミノ酸配列を分析すると、推定シグナルペプチドは配列番号：２８３の約アミノ酸１−３３である。ＩＩ型膜貫通ドメインは配列番号：２８３の約アミノ酸３０である。対応するヌクレオチドは、ここに提供された配列が与えられれば日常的に決定できる。ＰＲＯ１０２７は組織形成又は修復に含まれうる。
以下のＤａｙｈｏｆｆ表記はＰＲＯ１０２７と幾分の配列同一性をもつことが明らかとなった：SFT2_YEAST; ATM3E9_2; A69826; YM16_MARPO; E64896; U60193_2; MTLRAJ205_1; MCU60315_70; SPAS_SHIFL及びS54213。
【０３０６】
実施例８９：ヒトＰＲＯ１１０７をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、或る種のＥＳＴクラスター配列のＩｎｃｙｔｅデータベースからの同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５６４０２と命名する。
ＤＮＡ５６４０２コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号３２０３６９４に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅＥＳＴクローン３２０３６９４を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図２０１に示し、ここでＤＮＡ５９６０６−１４７１と命名する。
ＤＮＡ５９６０６−１４７１の全長ヌクレオチド配列を図２０１（配列番号：２８４）に示す。クローンＤＮＡ５９６０６−１４７１は単一のオープンリーディングフレームを含み、配列番号：２８４のヌクレオチド位置２４４−２４６に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１６７５−１６７７の停止コドンで終端する（図２０１）。予測されるポリペプチド前駆体は４７７アミノ酸長である（図２０２）。図２０２に示したＰＲＯ１１０７タンパク質は、約５４，６６８ダルトンの見積もられた分子量及び約６．３３のｐＩを有する。クローンＤＮＡ５９６０６−１４７１は1998年6月9日にＡＴＣＣに寄託された。寄託されたクローンは実際の配列を含み、ここに提供された配列は公知の配列技術に基づくと理解される。
全長ＰＲＯ１１０７ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、ホスホジエステラーゼＩ／ヌクレオチドピロホスファターゼ、ヒトインシュリンレセプターチロシンキナーゼイン非ビター、アルカリホスホジエステラーゼ、及び自己毒素との有意な配列類似性を示唆し、それによりＰＲＯ１１０７がこれらのタンパク質の少なくとも１つ又は全部の活性を有することを示している。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１１０７アミノ酸配列と少なくとも１つの以下のDayhoff配列：AF005632_1, P_R79148, RNU78787_1, AF60218_4, A57080及びHUMATXT_1との間の配列同一性が明らかになった。
【０３０７】
実施例９０：ヒトＰＲＯ１１４０をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、ここで１３５９１７と命名される単一のＩｎｃｙｔｅＥＳＴクラスター配列の同定が可能となった。次いでこの配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５６４１６と命名する。
ＤＮＡ５６４１６コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号３３４５７０５に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅＥＳＴクローン３３４５７０５を得て、そのｃＤＮＡ挿入物を配列決定した。図２０３に示し、ここでＤＮＡ５９６０７−１４９７と命名する配列は、ＰＲＯ１１４０の全長ＤＮＡ配列である。クローンＤＮＡ５９６０７−１４９７は1998年6月9日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９４６が付与されている。
ＤＮＡ５９６０７−１４９７の全ヌクレオチド配列を図２０３（配列番号：２８６）に示す。クローンＤＮＡ５９６０７−１４９７は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２１０−２１２に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置９７５−９７７の停止コドンで終端する（図２０３）。予測されるポリペプチド前駆体は２５５アミノ酸長である（図２０４）。図２０４に示した全長ＰＲＯ１１４０は、約２９，４０５ダルトンの見積もられた分子量及び約７．６４のｐＩを有する。図２０４（配列番号：２８７）に示した全長ＰＲＯ１１４０配列の分析は、約アミノ酸１０１−１１８、１４１−１６１及び１７２−１９１の３つの膜貫通ドメインの存在を明らかにした。
全長ＰＲＯ１１４０のアミノ酸配列のＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）を用いた分析により、ＰＲＯ１１４０アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：AF023602_1, AF000368_1, CIN3_RAT, AF003373_1, GEN13279, 及びAF003372_1との間の相同性が明らかになった。
クローンＤＮＡ５９６０７−１４９７は1998年6月9日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９４６が付与されている。
【０３０８】
実施例９１：ヒトＰＲＯ１１０６をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、単一のＩｎｃｙｔｅＥＳＴ配列の同定が可能となった。次いでこの配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５６４２３と命名する。
ＤＮＡ５６４２３コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号１７１１２４７に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅＥＳＴクローン番号１７１１２４７を得て、そのｃＤＮＡ挿入物を配列決定した。図２０５に示し、ここでＤＮＡ５９６０９−１４７０と命名する配列は、ＰＲＯ１１０６の全長ＤＮＡ配列である。クローンＤＮＡ５９６０９−１４７０は1998年6月9日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９６３が付与されている。
ＤＮＡ５９６０９−１４７０の全ヌクレオチド配列を図２０５（配列番号：２８８）に示す。クローンＤＮＡ５９６０９−１４７０は単一のオープンリーディングフレームを含み、配列番号：２８８のヌクレオチド位置６１−６３に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１４６８−１４７０の停止コドンで終端する（図２０５）。予測されるポリペプチド前駆体は４６９アミノ酸長である（図２０６）。図２０６に示した全長ＰＲＯ１１０６は、約５２，６８９ダルトンの見積もられた分子量及び約８．６８のｐＩを有する。当業者は、ポリペプチド又はそれをコードする核酸を、これら全てのドメインの一又は複数を排除するように構築できると理解される。例えば、膜貫通ドメイン及び／又はアミノ末端又はカルボキシル末端のいずれかを排除することができる。クローンＤＮＡ５９６０９−１４７０は1998年6月9日にＡＴＣＣに寄託された。寄託されたクローンは実際の核酸配列を含み、ここに提供された配列は公知の配列技術に基づくと理解される。
全長ＰＲＯ１１０６ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、ペルオキシソームＣａ依存性溶質キャリアとの有意な配列類似性を示唆し、それによりＰＲＯ１１０６が新規なトランスポーターであることを示した。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１１０６アミノ酸配列と少なくとも１つの以下のDayhoff配列：AF004161_1, IG002N01_25, GDC_BOVIN及びBT_MAIZEとの間の配列同一性が明らかになった。
【０３０９】
実施例９２：ヒトＰＲＯ１２９１をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、ここで１２０４８０と命名されるＥＳＴクラスター配列のＩｎｃｙｔｅデータベースからの同定が可能となった。次いでこのＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴＤＮＡデータベース（LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア７０（９０の場合もある）又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５６４２５と命名する。
ＤＮＡ５６４２５コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号２７９８８０３に含まれるＥＳＴ配列との間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅＥＳＴクローン２７９８８０３を購入し、ｃＤＮＡ挿入物を得て配列決定した。この挿入物は全長タンパク質をコードすることがわかった。このｃＤＮＡ挿入物の配列を図２０７に示し、ここでＤＮＡ５９６１０−１５５６と命名する。
クローンＤＮＡ５９６１０−１５５６は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置６１−６３に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置９０７−９０９の停止コドンで終端する（図２０７）。予測されるポリペプチド前駆体は２８２アミノ酸長である（図２０８）。図２０８に示す全長ＰＲＯ１２９１タンパク質は、約３０，８７８ダルトンの見積もられた分子量及び約５．２７のｐＩを有する。図２０８（配列番号：２９１）に示した全長ＰＲＯ１２９１配列の分析は以下のものの存在を明らかにした：約アミノ酸１〜約アミノ酸２８のシグナルペプチド、約アミノ酸２５８〜約アミノ酸２８１の膜貫通ドメイン、約アミノ酸１１２〜約アミノ酸１１５、約アミノ酸１６０〜約アミノ酸１６３、約アミノ酸１９０〜約アミノ酸１９３、約アミノ酸１９６〜約アミノ酸１９９、約アミノ酸２０５〜約アミノ酸２０８、約アミノ酸２１６〜約アミノ酸２１９及び約アミノ酸２２０〜約アミノ酸２２３のＮ-グリコシル化部位。クローンＤＮＡ５９６１０−１５５６は1998年6月16日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９９０が付与されている。
図２０８（配列番号：２９１）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ-２配列アラインメント分析を用いたＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析により、ＰＲＯ１２９１アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：HSU90552_1, HSU90144_1, AF33107_1, HSB73_1, HSU90142_1, GGCD80_1, P_W34452, MOG_MOUSE, B39371, 及びP_R71360との間の有意な相同性が明らかになった。
【０３１０】
実施例９３：ヒトＰＲＯ１１０５をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、ＩｎｃｙｔｅデータベースからのＥＳＴクラスター配列の同定が可能になった。ついで、このＥＳＴクラスター配列を、公のＥＳＴデータベース（例えばGenBank）と企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LifeseqR, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）を含む様々な発現配列タグ（ＥＳＴ）と比較して、現存の相同体を同定した。相同体サーチはコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を使用して行った。既知のタンパク質をコードしなかった７０（又はある場合には９０）以上のＢＬＡＳＴスコアになったその比較物を集合化し、「ｐｈｒａｐ」プログラム（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。得られたコンセンサス配列をここでＤＮＡ５６４３０と命名する。
ＤＮＡ５６４３０配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号１８５３０４７内に含まれていたＥＳＴ配列の間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号１８５３０４７を購入し、ｃＤＮＡ挿入断片を得て配列決定した。この挿入断片は全長タンパク質をコードしていたことが分かった。このｃＤＮＡ挿入断片の配列を図２０９に示し、ここでＤＮＡ５９６１２−１４６６と命名する。
ＤＮＡ５９６１２−１４６６の全ヌクレオチド配列を図２０９（配列番号：２９２）に示す。ＤＮＡ５９６１２−１４６６は、配列番号：２９２（図２０９）のヌクレオチド位置２８−３０に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置５６８−５７０の停止コドンで終端する単一の読み取り枠を含む（図２０９）。予測されたポリペプチド前駆体は１８０アミノ酸長である（図２１０）。図２１０に示した全長ＰＲＯ１１０５タンパク質は約２０，０４０ダルトンの見積もり分子量と約８．３５のｐＩを有する。クローンＤＮＡ５９６１２−１４６６は１９９８年６月９日にＡＴＣＣに寄託された。寄託されたクローンは実際の核酸配列を有し、ここに提供された配列は既知の配列決定法に基づいていることが理解される。
図２１０を分析すると、シグナル配列は配列番号：２９３のアミノ酸約１−１９にあり、膜貫通ドメインは配列番号：２９３のアミノ酸約８０−９９及び１４５−１６２に示されている。当業者であればこれらの領域の全て又は任意の組み合わせ又は個々に選択したものを持つポリペプチドを生成するであろうと理解される。対応する核酸は常套的に同定することができ、ここに提供した情報に基づいて調製することができることもまた理解される。
【０３１１】
実施例９４：ヒトＰＲＯ５１１をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、ＩｎｃｙｔｅデータベースからのＥＳＴクラスター配列の同定が可能になった。ついで、このＥＳＴクラスター配列を、公のＥＳＴデータベース（例えばGenBank）と企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LifeseqR, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）を含む様々な発現配列タグ（ＥＳＴ）と比較して、現存の相同体を同定した。相同体サーチはコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を使用して行った。既知のタンパク質をコードしなかった７０（又はある場合には９０）以上のＢＬＡＳＴスコアになったその比較物を集合化し、「ｐｈｒａｐ」プログラム（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。得られたコンセンサス配列をここでＤＮＡ５６４３４と命名する。
ＤＮＡ５６４３４配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号１２２７４９１内に含まれていたＥＳＴ配列の間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号１２２７４９１を購入し、ｃＤＮＡ挿入断片を得て配列決定した。この挿入断片は全長タンパク質をコードしていたことが分かった。このｃＤＮＡ挿入断片の配列を図２１１に示し、ここでＤＮＡ５９６１３−１４１７と命名する。
ＤＮＡ５９６１３−１４１７の全ヌクレオチド配列を図２１１（配列番号：２９４）に示す。ＤＮＡ５９６１３−１４１７は、ヌクレオチド位置２３３−２３５に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置９４４−９４６の停止コドンで終端する単一の読み取り枠を含む（図２１１）。予測されたポリペプチド前駆体は２３７アミノ酸長である（図２１２）。図２１２に示した全長ＰＲＯ５１１タンパク質は約２５，２８４ダルトンの見積もり分子量と約５．７４のｐＩを有する。クローンＤＮＡ５９６１３−１４１７はＡＴＣＣに寄託された。配列に関しては、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供された配列は既知の配列決定法に基づいていることが理解される。
配列番号：２９５のアミノ酸配列を分析すると、推定上シグナル配列は配列番号：２９５のアミノ酸約１−２５にある。Ｎ-グリコシル化部位は、配列番号：２９５のアミノ酸約４５−４８、７３−７６、１０７−１１０、１１８−１２１、１３２−１３５、１７２−１７５、１７５−１７８及び１８５−１８８にある。節足動物デフェンシン保存領域は配列番号：２９５のアミノ酸約１７６−１８２にある。クリングル(kringle)ドメインは配列番号：２９５のアミノ酸約１２８に始まり、ｌｙ-６／ｕ-ＰＡＲドメインは配列番号：２９５のアミノ酸約６に始まる。これらのアミノ酸配列及び他のものの対応するヌクレオチドはここに提供される配列が与えられると常套的に決定することができる。
ＰＲＯ５１１がある配列同一性を有しているＤａｙｈｏｆｆデータベースに現れる記号表示は次の通りである：SSC20F10_1; SF041083; P_W26579; S44208; JC2394; PSTA_DICDI; A27020; S59310; RAG1_RABIT;及びMUSBALBC1_1。
【０３１２】
実施例９５：ヒトＰＲＯ１１０４をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、ＩｎｃｙｔｅデータベースからのＥＳＴクラスター配列の同定が可能になった。ついで、このＥＳＴクラスター配列を、公のＥＳＴデータベース（例えばGenBank）と企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LifeseqR, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）を含む様々な発現配列タグ（ＥＳＴ）と比較して、現存の相同体を同定した。相同体サーチはコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を使用して行った。既知のタンパク質をコードしなかった７０（又はある場合には９０）以上のＢＬＡＳＴスコアになったその比較物を集合化し、「ｐｈｒａｐ」プログラム（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。得られたコンセンサス配列をここでＤＮＡ５６４４６と命名する。
ＤＮＡ５６４４６配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号２８３７４９６内に含まれていたＥＳＴ配列の間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号２８３７４９６を購入し、ｃＤＮＡ挿入断片を得て配列決定した。この挿入断片は全長タンパク質をコードしていたことが分かった。このｃＤＮＡ挿入断片の配列を図２１３に示し、ここでＤＮＡ５９６１６−１４６５と命名する。
ＤＮＡ５９６１６−１４６５の全ヌクレオチド配列を図２１３（配列番号：２９６）に示す。ＤＮＡ５９６１６−１４６５は、配列番号：２９６（図２１３）のヌクレオチド位置１０９−１１１に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置１１３２−１１３４の停止コドンで終端する単一の読み取り枠を含む（図２１３）。予測されたポリペプチド前駆体は３４１アミノ酸長である（図２１４）。図２１４に示した全長ＰＲＯ１１０４タンパク質は約３６，７６９ダルトンの見積もり分子量と約９．０３のｐＩを有する。クローンＤＮＡ５９６１６−１４６５は１９９８年６月１６日にＡＴＣＣに寄託された。寄託されたクローンは実際の核酸配列を有し、ここに提供された配列は既知の配列決定法に基づいていることが理解される。
図２１４を分析すると、シグナル配列は配列番号：２９７のアミノ酸約１−２２にある。Ｎ-ミリストイル化部位は配列番号：２９７のアミノ酸約４１−４６、１１０−１１５、１３３−１３８、１６７−１７２及び１７９−１８４にある。
【０３１３】
実施例９６：ヒトＰＲＯ１１００をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、ＩｎｃｙｔｅデータベースからのＥＳＴクラスター配列の同定が可能になった。ついで、このＥＳＴクラスター配列を、公のＥＳＴデータベース（例えばGenBank）と企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LifeseqR, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）を含む様々な発現配列タグ（ＥＳＴ）と比較して、現存の相同体を同定した。相同体サーチはコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を使用して行った。既知のタンパク質をコードしなかった７０（又はある場合には９０）以上のＢＬＡＳＴスコアになったその比較物を集合化し、「ｐｈｒａｐ」プログラム（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。
得られたコンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号２３０５３７９内に含まれていたＥＳＴ配列の間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン２３０５３７９を購入し、ｃＤＮＡ挿入断片を得て配列決定した。この挿入断片は全長タンパク質をコードしていたことが分かった。このｃＤＮＡ挿入断片の配列を図２１５に示し、ここでＤＮＡ５９６１９−１４６４と命名する。
ＤＮＡ５９６１９−１４６４の全ヌクレオチド配列を図２１５（配列番号：２９８）に示す。ＤＮＡ５９６１９−１４６４は、配列番号：２９８（図２１５）のヌクレオチド位置３３−３５に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置９９３−９９５の停止コドンで終端する単一の読み取り枠を含む（図２１６）。予測されたポリペプチド前駆体は３２０アミノ酸長である（図２１６）。図２１６に示した全長ＰＲＯ１１００タンパク質は約３６，４７５ダルトンの見積もり分子量と約７．２９のｐＩを有する。クローンＤＮＡ５９６１９−１４６４は１９９８年７月１日にＡＴＣＣに寄託された。寄託されたクローンは実際の核酸配列を有し、ここに提供された配列は既知の配列決定法に基づいていることが理解される。
配列番号：２９９を分析すると、シグナルペプチド、膜貫通ドメイン、Ｎ-グリコシル化部位、Ｎ-ピリストイル化部位、ＣＵＢドメイン及びアミロライド感受性ナトリウムチャンネルドメインのおよその位置が存在する。ＰＲＯ１１００はチャンネルとして機能しうると考えられる。これらのアミノ酸及び他のものに対する対応核酸は配列番号：２９９が与えられれば、常套的に決定することができる。
【０３１４】
実施例９７：ヒトＰＲＯ８３６をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、ＩｎｃｙｔｅデータベースからのＥＳＴクラスター配列の同定が可能になった。ついで、このＥＳＴクラスター配列を、公のＥＳＴデータベース（例えばGenBank）と企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LifeseqR, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）を含む様々な発現配列タグ（ＥＳＴ）と比較して、現存の相同体を同定した。相同体サーチはコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を使用して行った。既知のタンパク質をコードしなかった７０（又はある場合には９０）以上のＢＬＡＳＴスコアになったその比較物を集合化し、「ｐｈｒａｐ」プログラム（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。得られたコンセンサス配列をここでＤＮＡ５６４５３と命名する。
ＤＮＡ５６４５３コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン２６１００７５内に含まれていたＥＳＴ配列の間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン２６１００７５を購入し、ｃＤＮＡ挿入断片を得て配列決定した。この挿入断片は全長タンパク質をコードしていたことが分かった。このｃＤＮＡ挿入断片の配列を図２１７に示し、ここでＤＮＡ５９６２０−１４６３と命名する。
ＤＮＡ５９６２０−１４６３の全ヌクレオチド配列を図２１７（配列番号：３００）に示す。ＤＮＡ５９６２０−１４６３は、配列番号：３００（図２１７）のヌクレオチド位置６５−６７に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置１４４８−１４５０の停止コドンで終端する単一の読み取り枠を含む（図２１７）。予測されたポリペプチド前駆体は４６１アミノ酸長である（図２１８）。図２１８に示した全長ＰＲＯ８３６タンパク質は約５２，０８５ダルトンの見積もり分子量と約５．３６のｐＩを有する。図２１８（配列番号：３０１）に示した全長ＰＲＯ８３６配列の分析により、次のもの：シグナルペプチド、Ｎ-グリコシル化部位、Ｎ-ミリストイル化部位、タンパク質のＹＪＬ１２６ｗ／ＹＬＲ３５１ｃ／ｙｈｃＸファミリーに保存されているドメイン、及びＳＬＳ１と配列同一性を有する領域、の存在が証明される。クローンＤＮＡ５９６２０−１４６３は１９９８年６月１６日にＡＴＣＣに寄託された。寄託されたクローンは実際の核酸配列を有し、ここに提供された配列は既知の配列決定法に基づいていることが理解される。
全長ＰＲＯ８３９ポリペプチドのアミノ酸配列を分析すると、ＳＬＳ１とある配列同一性を有することが示唆され、よってＰＲＯ８３６はＥＲのタンパク質トランスロケーションに関与していることを示している。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン３５．４５SwissProt３５）の解析によりＰＲＯ８３６アミノ酸配列と少なくとも次のＤａｙｈｏｆｆ配列、S58132, SPBC3B9_1, S66714, CRU40057_1及びIMA_CAEELの間のある相同性が証明された。
【０３１５】
実施例９８：ヒトＰＲＯ１１４１をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、１１８７３と命名されるＩｎｃｙｔｅデータベースからのＥＳＴクラスター配列の同定が可能になった。ついで、このＥＳＴクラスター配列を、公のＥＳＴデータベース（例えばGenBank）と企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQR, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）を含む様々な発現配列タグ（ＥＳＴ）と比較して、現存の相同体を同定した。相同体サーチはコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を使用して行った。既知のタンパク質をコードしなかった７０（又はある場合には９０）以上のＢＬＡＳＴスコアになったその比較物を集合化し、「ｐｈｒａｐ」プログラム（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。得られたコンセンサス配列をここでＤＮＡ５６５１８と命名する。
ＤＮＡ５６５１８コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン２６７９９９５内に含まれていたＥＳＴ配列の間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン２６７９９９５を購入し、ｃＤＮＡ挿入断片を得て配列決定した。この挿入断片は全長タンパク質をコードしていたことが分かった。このｃＤＮＡ挿入断片の配列を図２１９に示し、ここでＤＮＡ５９６２５−１４９８と命名する。
クローンＤＮＡ５９６２５−１４９８は、ヌクレオチド位置２０４−２０６に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置９４５−９４７の停止コドンで終端する単一の読み取り枠を含む（図２１９）。予測されたポリペプチド前駆体は２４７アミノ酸長である（図２２０）。図２２０に示した全長ＰＲＯ１１４１タンパク質は約２６，８４０ダルトンの見積もり分子量と約８．１９のｐＩを有する。図２２０（配列番号：３０３）に示した全長ＰＲＯ１１４１配列の分析により、次のもの：アミノ酸約１からアミノ酸約１９のシグナルペプチド及びアミノ酸約３８からアミノ酸約５７、アミノ酸約６７からアミノ酸約８３、アミノ酸約１１７からアミノ酸約１３９及びアミノ酸約１５３からアミノ酸約１７０の膜貫通ドメイン、の存在が証明される。クローンＤＮＡ５９６２５−１４９８は１９９８年６月１６日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９９２が付されている。
図２２０（配列番号：３０３）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用してのＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン３５．４５SwissProt３５）の解析により、ＰＲＯ１１４１アミノ酸配列と次のＤａｙｈｏｆｆ配列、CEVF36H2L_2, PCRB7PRJ_1, AB000506_1, LEU95008_1, MRU87980_15, YIGM_ECOLI, STU65700_1, GHU62778_1, CYST_SYNY3及びAF009567_1の間の有意な相同性が証明された。
【０３１６】
実施例９９：ヒトＰＲＯ１１３２をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上述の実施例１に記載したように、phrapを用いて他のＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。このコンセンサス配列をＤＮＡ３５９３４と命名する。ＤＮＡ３５９３４コンセンサス配列に基づき、１）対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリをＰＣＲにより同定するために、また２）ＰＲＯ１１３２に対する全長コード配列のクローンを単離するためのプローブとしての使用のために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー：5'-TCCTGTGACCACCCCTCTAACACC-3'（配列番号：310）及び
逆方向ＰＣＲプライマー：5'-CTGGAACATCTGCTGCCCAGATTC-3'（配列番号：311）。
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、次のヌクレオチド配列：
5'-GTCGGATGACAGCAGCAGCCGCATCATCAATGGATCCGACTGCGATATGC-3'（配列番号：312）
を持つコンセンサス配列から作成した。
全長クローンの供給源に対して数種のライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを、上で同定したＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマーの一方を用いてＰＲＯ１１３２遺伝子をコードするクローンを単離するために使用した。ｃＤＮＡライブラリの作成のためのＲＮＡはヒト胎児腎臓から単離した。
上述のようにして単離したクローンのＤＮＡ配列決定により、ＰＲＯ１１３２に対する全長ＤＮＡ配列とＰＲＯ１１３２に対する誘導タンパク質配列が得られた。
ＰＲＯ１１３２の全ヌクレオチド配列を図２２５（配列番号：３０８）に示す。クローンＤＮＡ５９７６７−１４８９は、ヌクレオチド位置３５４−３５６に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置１２３３−１２３５の停止コドンで終端する単一の読み取り枠を含む（図２２５；配列番号：３０８）。予測されたポリペプチド前駆体は２９３アミノ酸長である。シグナルペプチドは配列番号：３０９のアミノ酸約１−２２にあり、ヒスチジン活性部位はアミノ酸約１０４−１０９にある。クローンＤＮＡ５９７６７−１４８９（ここに提供した配列決定法に基づく表示よりもむしろ実際の配列を有する）はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３１０８が付されている。図２２６に示した全長ＰＲＯ１１３２タンパク質は約３２，０２０ダルトンの見積もり分子量と約８．７のｐＩを有する。
図２２６（配列番号：３０９）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用してのＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン３５．４５SwissProt３５）の解析により、ＰＲＯ１１３２アミノ酸配列と次のＤａｙｈｏｆｆ配列：SSU76256_1, P_W10694, MMAE000663_6, AF013988_1, U66061_8, MMAE000665_2, MMAE00066415, MMAE00066414, MMAE000665_4及びMMAE00066412の間の配列同一性が証明された。
【０３１７】
実施例１００：ヒトＮＬ７(ＰＲＯ１３４６)をコードするｃＤＮＡクローンの単離
単一のＥＳＴ配列（＃１３９８４２２）が上述の実施例１に記載したようなＬＩＦＥＳＥＱＲデータベースに見出された。このＥＳＴ配列をＤＮＡ４５６６８と改めて名付けた。ＤＮＡ４５６６８配列に基づき、１）対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリをＰＣＲにより同定するために、また２）ＮＬ７に対する全長コード配列のクローンを単離するためのプローブとしての使用のために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー：5'-CACACGTCCAACCTCAATGGGCAG-3'（配列番号：315）及び
逆方向ＰＣＲプライマー：5'-GACCAGCAGGGCCAAGGACAAGG-3'（配列番号：316）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、次のヌクレオチド配列：
ハイブリッド形成プローブ：
5'-GTTCTCTGAGATGAAGATCCGGCCGGTCCGGGAGTACCGCTTAG-3'
（配列番号：317）
を持つコンセンサスＤＮＡ４５６６８配列から作成した。
全長クローンの供給源に対して数種のライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを、上で同定したＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマーの一方を用いてＮＬ７遺伝子をコードするクローンを単離するために使用した。ｃＤＮＡライブラリの作成のためのＲＮＡはヒト胎児腎臓ライブラリ（ＬＩＢ２２７）から単離した。
上述のようにして単離したクローンのＤＮＡ配列決定により、（ここでＤＮＡ５９７７６−１６００[図２２７、配列番号：３１３]と命名した）ＮＬ７に対する全長ＤＮＡ配列とＮＬ７(ＰＲＯ１３４６)に対する誘導タンパク質配列が得られた。
ＮＬ７(ＰＲＯ１３４６)の全ヌクレオチド配列を図２２７（配列番号：３１３）に示す。クローンＤＮＡ５９７７６−１６００は、ヌクレオチド位置１−３に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置１３８４−１３８６に見かけの停止コドンを有する単一の読み取り枠を含む。予測されたポリペプチド前駆体は４６１アミノ酸長である。タンパク質は、約３１から約５０のアミノ酸位置に見かけのＩＩ型膜貫通ドメインを；アミノ酸位置約４０９から始まって、フィブリノーゲンβ及びγ鎖Ｃ末端ドメインサイン、及びアミノ酸位置約１４０、１４７、１５４及び１６１からそれぞれ始まってロイシンジッパーパターンを含んでいる。クローンＤＮＡ５９７７６−１６００はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３１２８が付されている。図２２８に示した全長ＮＬ７タンパク質は約５０，７４４ダルトンの見積もり分子量と約６．３８のｐＩを有する。
全長配列の（ＷＵ-ＢＬＡＳＴ２コンピュータプログラムを使用しての）ＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析に基づき、ＮＬ７は、ヒトミクロフィブリル関連糖タンパク質（1 MFA4_HUMAN）に対して；既知のＴＩＥ-２リガンド及びリガンド相同体、フィコリン、血清レクチン及びＴＧＦ-１結合タンパク質に対して、有意なアミノ酸配列同一性を示している。
【０３１８】
実施例１０１：ヒトＰＲＯ１１３１をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例２に記載したアミラーゼスクリーニングにおいて単離されたｃＤＮＡ配列をここでＤＮＡ４３５４６と命名する（図２３１；配列番号：３２０を参照されたい）。ついで、該ＤＮＡ４３５４６配列を、公のＥＳＴデータベース（例えばGenBank）と企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQＴＭ, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）を含む様々な発現配列タグ（ＥＳＴ）と比較して、現存の相同体を同定した。相同体サーチはコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を使用して行った。既知のタンパク質をコードしなかった７０（又はある場合には９０）以上のＢＬＡＳＴスコアになったその比較物を集合化し、「ｐｈｒａｐ」プログラム（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。得られたコンセンサス配列をここでＤＮＡ４５６２７と命名する。
ＤＮＡ４５６２７配列に基づいて、オリゴヌクレオチドプローブを産生し、上述の実施例２の第１段落に記載したヒトライブラリをスクリーニングするために使用した。クローニングベクターはｐＲＫ５Ｂであり（ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science 253:1278-1280 (1991)を参照されたい）、切断されたｃＤＮＡサイズは２８００ｂｐ未満であった。
ＰＣＲプライマー（正方向及び２つの逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー  5'-ATGCAGGCCAAGTACAGCAGCAC-3'（配列番号：321）；
逆方向ＰＣＲプライマー１  5'-CATGCTGACGACTTCCTGCAAGC-3'（配列番号：322）；及び
逆方向ＰＣＲプライマー２  5'-CCACACAGTCTCTGCTTCTTGGG-3'（配列番号：323）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、次のヌクレオチド配列：
ハイブリッド形成プローブ：
5'-ATGCTGGATGATGATGGGGACACCACCATGAGCCTGCATT-3'（配列番号：234）
を持つＤＮＡ４５６２７配列から作成した。
全長クローンの供給源に対して数種のライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを、上で同定したＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマーの一方を用いてＰＲＯ１１３１遺伝子をコードするクローンを単離するために使用した。
ヌクレオチド位置１４４−１４６に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置９８４−９８６に停止シグナルを有する単一の読み取り枠を含む全長クローンが同定された（図２２９；配列番号：３１８）。予測されたポリペプチド前駆体は２８０アミノ酸長であり、約３１，９６６ダルトンの算定分子量と約６．２６の推定ｐＩを有する。膜貫通ドメインは配列番号：３１９の約４９−７４にあり、ＬＤＬレセプターと配列同一性を有する領域は配列番号：３１９の約５０−２６５にある。ＰＲＯ１１３１は配列番号：３１９のアミノ酸位置９５−９８及び１６９−１７２に潜在的なＮ結合グリコシル化部位を含む。クローンＤＮＡ５９７７７−１４８０はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３１１１が付されている。
図２３０（配列番号：３１９）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用してのＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン３５．４５SwissProt３５）の解析により、ＰＲＯ１１３１アミノ酸配列と次のＤａｙｈｏｆｆ配列、AB010710_1, I49053, I49115, RNU56863_1, LY4A_MOUSE, I55686, MMU56404_1, I49361, AF030313_1及びMMU09739_1の間のある配列同一性が証明された。
【０３１９】
実施例１０２：ヒトＰＲＯ１２８１をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上述の実施例１に記載したように、phrapを用いて他のＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。このコンセンサス配列をＤＮＡ３５７２０と命名する。ＤＮＡ３５７２０配列に基づき、１）対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリをＰＣＲにより同定するために、また２）ＰＲＯ１２８１に対する全長コード配列のクローンを単離するためのプローブとしての使用のために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー：
5'-TGGAAGGCTGCCGCAACGACAATC-3'（配列番号：327）；
5'-CTGATGTGGCCGATGTTCTG-3'（配列番号：328）；及び
5'-ATGGCTCAGTGTGCAGACAG-3'（配列番号：329）。
逆方向ＰＣＲプライマー：
5'-GCATGCTGCTCCGTGAAGTAGTCC-3'（配列番号：330）；及び
5'-ATGCATGGGAAAGAAGGCCTGCCC-3'（配列番号：331）。
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、次のヌクレオチド配列：
ハイブリッド形成プローブ：
5'-TGCACTGGTGACCACGAGGGGGTGCACTATAGCCATCTGGAGCTGAG-3'（配列番号：332）
を持つＤＮＡ３５７２０配列から作成した。
全長クローンの供給源に対して数種のライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを、上で同定したＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマーの一方を用いてＰＲＯ１２８１遺伝子をコードするクローンを単離するために使用した。ｃＤＮＡライブラリの作成のためのＲＮＡはヒト胎児腎臓から単離した。
上述のようにして単離したクローンのＤＮＡ配列決定により、ＰＲＯ１２８１に対する全長ＤＮＡ配列（ここでＤＮＡ５９８２０−１５４９と命名[図２３２，配列番号：３２５]）とＰＲＯ１２８１に対する誘導タンパク質配列が得られた。
ＰＲＯ１２８１の全コード配列を図２３２（配列番号：３２５）に示す。クローンＤＮＡ５９８２０−１５４９は、ヌクレオチド位置２２８−２３０に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置２５５３−２５５５に見かけの停止コドンを有する単一の読み取り枠を含む。予測されたポリペプチド前駆体は７７５アミノ酸長である。図２３３に示した全長ＰＲＯ１２８１タンパク質は約８５，４８１ダルトンの見積もり分子量と約６．９２のｐＩを有する。さらなる特徴は、アミノ酸約１−１５のシグナルペプチド；及びアミノ酸約１３８−１４１及び３６１−３６４の潜在的なＮ-グリコシル化部位を含む。
図２３３（配列番号：３２６）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用してのＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン３５．４５SwissProt３５）の解析により、ＰＲＯ１２８１アミノ酸配列と次のＤａｙｈｏｆｆ配列：S44860, CET24D1_1, CEC38H2_3, CAC2_HAECO, B3A2_HUMAN, S22373, CEF38A3_2, CEC34F6_2, CEC34F6_3,及びCELT22B11_3の間のある配列同一性が明らかになった。
クローンＤＮＡ５９８２０−１５４９はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３１２９が付されている。
【０３２０】
実施例１０３：ヒトＰＲＯ１０６４をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例２に記載したアミラーゼスクリーニングにおいて単離されたｃＤＮＡ配列は、ＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメントコンピュータプログラムにより、既知のヒトタンパク質とは有意な配列同一性を持たないことが分かった。このｃＤＮＡ配列をここでＤＮＡ４５２８８と命名する。ついで、該ＤＮＡ４５２８８配列を、公のＥＳＴデータベース（例えばGenBank）と企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQR, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）を含む様々なＥＳＴデータベースと比較して、相同性ＥＳＴ配列を同定した。比較はコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２[Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)]を使用して行った。既知のタンパク質をコードしなかった７０（又はある場合には９０）以上のＢＬＡＳＴスコアになったその比較物を集合化し、「ｐｈｒａｐ」プログラム（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。このコンセンサス配列をここでＤＮＡ４８６０９と命名する。ついで、ＤＮＡ４８６０９配列に基づいてオリゴヌクレオチドプローブを合成し、ヒト胎児腎臓ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするために使用し、図２３４に示したＤＮＡ５９８２７−１４２６クローンが同定された。クローニングベクターはｐＲＫ５Ｂであり（ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science 253:1278-1280 (1991)を参照されたい）、切断されたｃＤＮＡサイズは２８００ｂｐ未満であった。
用いたオリゴヌクレオチドプローブは次の通りである：
正方向ＰＣＲプライマー  5'-CTGAGACCCTGCAGCACCATCTG-3'（配列番号：336）
逆方向ＰＣＲプライマー  5'-GGTGCTTCTTGAGCCCCACTTAGC-3'（配列番号：337）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、次のヌクレオチド配列
ハイブリッド形成プローブ
5'-AATCTAGCTTCTCCAGGACTGTGGTCGCCCCGTCCGCTGT-3'（配列番号：338）
を持つコンセンサスＤＮＡ４８６０９配列から作成した。
ヌクレオチド位置５３２−５３４に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置９９１−９９３に停止シグナルを有する単一の読み取り枠を含む全長クローンを同定した（図２３４、配列番号：３３３）。予測されたポリペプチド前駆体は１５３アミノ酸長で、約１７，３１７ダルトンの算定分子量と約５．１７の推定ｐＩを有する。図２３５（配列番号：３３４）に示した全長ＰＲＯ１０６４配列の分析により、次のもの：アミノ酸約１からアミノ酸約２４のシグナルペプチド、アミノ酸約８９からアミノ酸約１１０の膜貫通ドメイン、アミノ酸約１１４からアミノ酸約１３７のＭｙｂ ＤＮＡ結合ドメインタンパク質反復タンパク質相同ブロック、の存在が証明される。クローンＤＮＡ５９８２７−１４２６は１９９８年８月４日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３０８９が付されている。
図２３５（配列番号：３３４）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用してのＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン３５．４５SwissProt３５）の解析により、ＰＲＯ１０６４アミノ酸配列と次のＤａｙｈｏｆｆ配列：MMNP15PRO_1, BP187PLYH_1, CELF42G8_4, MMU58888_1, GEN14270, TUB8_SOLTU, RCN_MOUSE, HUMRBSY79_1, SESENODA_1及びA21467_1の間の相同性が証明された。
【０３２１】
実施例１０４：ヒトＰＲＯ１３７９をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上述の実施例１に記載したように、phrapを用いて他のＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。このコンセンサス配列をＤＮＡ４５２３２と命名する。ＤＮＡ４５２３２コンセンサス配列に基づき、１）対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリをＰＣＲにより同定するために、また２）ＰＲＯ１３７９に対する全長コード配列のクローンを単離するためのプローブとしての使用のために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー：5'-TGGACACCGTACCCTGGTATCTGC-3'（配列番号：341）
逆方向ＰＣＲプライマー：5'-CCAACTCTGAGGAGAGCAAGTGGC-3'（配列番号：342）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、次のヌクレオチド配列：
ハイブリッド形成プローブ
5'-TGTATGTGCACACCCTCACCATCACCTCCAAGGGCAAGGAGAAC-3'（配列番号：343）
を持つＤＮＡ４５２３２配列から作成した。
全長クローンの供給源に対して数種のライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを、上で同定したＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマーの一方を用いてＰＲＯ１３７９遺伝子をコードするクローンを単離するために使用した。ｃＤＮＡライブラリの作成のためのＲＮＡはヒト胎児腎臓組織から単離した。
上述のようにして単離したクローンのＤＮＡ配列決定により、ここでＤＮＡ５９８２８−１６０８と命名され図２３７（配列番号：３３９）に示されるＰＲＯ１３７９に対する全長ＤＮＡ配列とＰＲＯ１３７９に対する誘導タンパク質配列（配列番号：３４０）が得られた。
ＰＲＯ１３７９の全ヌクレオチド配列を図２３７（配列番号：３３９）に示す。クローンＤＮＡ５９８２８−１６０８は、ヌクレオチド位置１０−１２に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置１７３２−１７３４に見かけの停止コドンを有する単一の読み取り枠を含む。予測されたポリペプチド前駆体は５７４アミノ酸長である。図２３８に示した全長ＰＲＯ１３７９タンパク質は約６５，３５５ダルトンの見積もり分子量と約８．７３のｐＩを有する。さらなる特徴は、アミノ酸約１−１７のシグナルペプチド及びアミノ酸約１６０−１６３、２８７−２９０、及び３２３−３２６の潜在的なＮ-グリコシル化部位を含む。
図２３８（配列番号：３４０）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用してのＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン３５．４５SwissProt３５）の解析により、ＰＲＯ１３７９アミノ酸配列と次のＤａｙｈｏｆｆ配列：YHY8_YEAST, AF040625_1, HP714394_1,及びHIV18U45630_1の間のある相同性が明らかになった。
クローンＤＮＡ５９８２８−１６０８はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３１５８が付されている。
【０３２２】
実施例１０５：ヒトＰＲＯ８４４をコードするｃＤＮＡクローンの単離
発現配列タグ（ＥＳＴ）ＤＮＡデータベース（LIFESEQＴＭ, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）をサーチして、ＬＰと配列同一性を示したＥＳＴを同定した。ここに提供された情報と発見に基づいて、このＥＳＴに対するクローン、ガン性肺ライブラリからのＩｎｃｙｔｅクローン番号２６５７４９６をさらに調べた。
このクローンに対する挿入断片のＤＮＡ配列決定により、ＰＲＯ８４４に対する全長ＤＮＡ配列を含む配列（ここでＤＮＡ５９８３８−１４６２と命名；配列番号：３４４）とＰＲＯ８４４に対する誘導タンパク質配列が得られた。
ＤＮＡ５９８３８−１４６２の全ヌクレオチド配列は図２３９（配列番号：３４４）に示す。クローンＤＮＡ５９８３８−１４６２は、配列番号：３４４（図２３９）のヌクレオチド位置５−７に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置３３８−３４０の停止コドンで終端する単一の読み取り枠を含む。予測されたポリペプチド前駆体は１１１アミノ酸長である（図２４０）。図２４０に示した全長ＰＲＯ８４４タンパク質は約１２，０５０ダルトンの見積もり分子量と約５．４５のｐＩを有する。クローンＵＮＱ５４４ＤＮＡ５９８３８−１４６２は１９９８年６月１６日にＡＴＣＣに寄託された。寄託されたクローンは実際の核酸配列を有し、ここに提供された配列は既知の配列決定法に基づいていることが理解される。
全長ＰＲＯ８４４のアミノ酸配列を分析すると、セリンプロテアーゼ阻害剤に対して有意な配列類似性を有していることが示唆され、ＰＲＯ８４４は新規なプロテイナーゼ阻害剤となりうることを示している。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン３５．４５SwissProt３５）の解析により、ＰＲＯ８４４アミノ酸配列と少なくとも次のＤａｙｈｏｆｆ配列、ALK1_HUMAN, P_P82403, P_P82402, ELAF_HUMAN及びP_P60950の間の有意な相同性が証明された。
【０３２３】
実施例１０６：ヒトＰＲＯ８４８をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、Ｉｎｃｙｔｅデータベースからの単一のＥＳＴクラスター配列の同定が可能になった。ついで、このＥＳＴクラスター配列を、公のＥＳＴデータベース（例えばGenBank）と企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQR, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）を含む様々な発現配列タグ（ＥＳＴ）と比較して、現存の相同体を同定した。相同体サーチはコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を使用して行った。既知のタンパク質をコードしなかった７０（又はある場合には９０）以上のＢＬＡＳＴスコアになったその比較物を集合化し、「ｐｈｒａｐ」プログラム（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。得られたコンセンサス配列をここでＤＮＡ５５９９９と命名する。
ＤＮＡ５５９９９コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号２７６８５７１内に含まれていたＥＳＴ配列の間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン２７６８５７１を購入し、ｃＤＮＡ挿入断片を得て配列決定した。この挿入断片は全長タンパク質をコードしていたことが分かった。このｃＤＮＡ挿入断片の配列を図２４１に示し、ここでＤＮＡ５９８３９−１４６１と命名する。
ＤＮＡ５９８３９−１４６１の全ヌクレオチド配列を図２４１（配列番号：３４６）に示す。クローンＤＮＡ５９８３９−１４６１は、配列番号：３４６（図２４１）のヌクレオチド位置１４６−１４８に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置１９４６−１９４８の停止コドンで終端する単一の読み取り枠を含む。予測されたポリペプチド前駆体は６００アミノ酸長である（図２４２）。図２４２に示した全長ＰＲＯ８４８タンパク質は約６８，５３６ダルトンの見積もり分子量を有する。クローンＤＮＡ５９８３９−１４６１は１９９８年６月１６日にＡＴＣＣに寄託された。寄託されたクローンは実際の核酸配列を有し、ここに提供された配列は既知の配列決定法に基づいていることが理解される。
全長ＰＲＯ８４８ポリペプチドのアミノ酸配列を分析すると、新規なシアリルトランスフェラーゼでありうることが示唆される。より詳細には、Ｄａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン３５．４５SwissProt３５）の解析により、ＰＲＯ８４８アミノ酸配列と少なくとも次のＤａｙｈｏｆｆ配列、P_R78619(GalNAc-α-2,6-シアリルトランスフェラーゼ), CAAG5_CHICK(α-n-アセチルガラクトサミド α-2,6-シアリルトランスフェラーゼ), HSU14550_1, CAG6_HUMAN及びP_R63217(ヒトα-2,3-シアリルトランスフェラーゼ)の間の配列同一性が証明された。
【０３２４】
実施例１０７：ヒトＰＲＯ１０９７をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、Ｉｎｃｙｔｅデータベースからの単一のＥＳＴクラスター配列の同定が可能になった。ついで、このＥＳＴクラスター配列を、公のＥＳＴデータベース（例えばGenBank）と企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQR, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）を含む様々な発現配列タグ（ＥＳＴ）と比較して、現存の相同体を同定した。相同体サーチはコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を使用して行った。既知のタンパク質をコードしなかった７０（又はある場合には９０）以上のＢＬＡＳＴスコアになったその比較物を集合化し、「ｐｈｒａｐ」プログラム（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。得られたコンセンサス配列をここでＤＮＡ５６００６と命名する。
ＤＮＡ５６００６コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号２４０８１０５内に含まれていたＥＳＴ配列の間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン２４０８１０５を購入し、ｃＤＮＡ挿入断片を得て配列決定した。この挿入断片は全長タンパク質をコードしていたことが分かった。このｃＤＮＡ挿入断片の配列を図２４３に示し、ここでＤＮＡ５９８４１−１４６０と命名する。
ＤＮＡ５９８４１−１４６０の全ヌクレオチド配列を図２４３（配列番号：３４８）に示す。クローンＤＮＡ５９８４１−１４６０は、配列番号：３４８（図２４３）のヌクレオチド位置３−５に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置２７６−２７８の停止コドンで終端する単一の読み取り枠を含む。予測されたポリペプチド前駆体は９１アミノ酸長である（図２４４）。図２４４に示した全長ＰＲＯ１０９７タンパク質は約１０，５４２ダルトンの見積もり分子量と約１０．０４のｐＩを有する。クローンＤＮＡ５９８４１−１４６０は１９９８年７月１日にＡＴＣＣに寄託された。寄託されたクローンは実際の核酸配列を有し、ここに提供された配列は既知の配列決定法に基づいていることが理解される。
図２４４を分析すると、シグナルペプチドは配列番号：３４９のアミノ酸約１−２０にある。グリコプレテアーゼファミリーのタンパク質ドメインは配列番号：３４９のアミノ酸約５６で始まり、アシルトランスフェラーゼＣｈｏＡｃｔａｓｅ／ＣＯＴ／ＣＰＴファミリーペプチドはアミノ酸約４９で始まる。
【０３２５】
実施例１０８：ヒトＰＲＯ１１５３をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、Ｉｎｃｙｔｅデータベースからの単一のＥＳＴクラスター配列の同定が可能になった。ついで、このＥＳＴクラスター配列を、公のＥＳＴデータベース（例えばGenBank）と企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQR, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）を含む様々な発現配列タグ（ＥＳＴ）と比較して、現存の相同体を同定した。相同体サーチはコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を使用して行った。既知のタンパク質をコードしなかった７０（又はある場合には９０）以上のＢＬＡＳＴスコアになったその比較物を集合化し、「ｐｈｒａｐ」プログラム（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。得られたコンセンサス配列をここでＤＮＡ５６００８と命名する。
ＤＮＡ５６００８コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号２４７２４０９内に含まれていたＥＳＴ配列の間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン２４７２４０９を購入し、ｃＤＮＡ挿入断片を得て配列決定した。この挿入断片は全長タンパク質をコードしていたことが分かった。このｃＤＮＡ挿入断片の配列を図２４５に示し、ここでＤＮＡ５９８４２−１５０２と命名する。
図２４５に示す全長クローンは、ヌクレオチド位置９２−９４に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置６８３−６８５に見出される停止コドンで終端する単一の読み取り枠を含む（図２４５；配列番号：３５０）。予測されたポリペプチド前駆体（図２４６、配列番号：３５１）は１９７アミノ酸長である。ＰＲＯ１１５３は約２１，５４０ダルトンの算定分子量と約８．３１の推定ｐＩを有する。クローンＤＮＡ５９８４２−１５０２はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９８２が付された。正しい実際の配列は寄託されたクローンにあり、ここには少しの誤差がありうる現在の配列決定法に基づくものが提供されていることが理解される。
全長配列の（ＡＬＩＧＮコンピュタープログラムを使用する）ＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析に基づいて、ＰＲＯ１１５３は、次のＤａｙｈｏｆｆ標記：S57447; SOYHRGPC_1; S46965; P_P82971; VCPHEROPH_1; EXTN_TOBAC; MLCB2548_9; ANXA_RABIT; JC5437及びSSGP_VOLCAに対してある程度のアミノ酸配列同一性を示している。
【０３２６】
実施例１０９：ヒトＰＲＯ１１５４をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、Ｉｎｃｙｔｅデータベースからの単一のＥＳＴクラスター配列の同定が可能になった。ついで、このＥＳＴクラスター配列を、公のＥＳＴデータベース（例えばGenBank）と企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQR, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）を含む様々な発現配列タグ（ＥＳＴ）と比較して、現存の相同体を同定した。相同体サーチはコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を使用して行った。既知のタンパク質をコードしなかった７０（又はある場合には９０）以上のＢＬＡＳＴスコアになったその比較物を集合化し、「ｐｈｒａｐ」プログラム（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。得られたコンセンサス配列をここでＤＮＡ５６０２５と命名する。
ＤＮＡ５６０２５コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号２１６９３７５内に含まれていたＥＳＴ配列の間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン２１６９３７５を購入し、ｃＤＮＡ挿入断片を得て配列決定した。この挿入断片は全長タンパク質をコードしていたことが分かった。このｃＤＮＡ挿入断片の配列を図２４７に示し、ここでＤＮＡ５９８４６−１５０３と命名する。
図２４７に示す全長クローンは、ヌクレオチド位置８６−８８に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置２９０９−２９１１に見出される停止コドンで終端する単一の読み取り枠を含む（図２４７；配列番号：３５２）。予測されたポリペプチド前駆体（図２４８、配列番号：３５３）は９４１アミノ酸長である。ＰＲＯ１１５４は約１０７，１４４ダルトンの算定分子量と約６．２６の推定ｐＩを有する。クローンＤＮＡ５９８４６−１５０３はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９７８が付された。
全長配列の（ＡＬＩＧＮコンピュタープログラムを使用する）ＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析に基づいて、ＰＲＯ１１５４は、少なくとも次のＤａｙｈｏｆｆ標記：AB011097_1, AMPN_HUMAN, RNU76997_1, 159331, GEN14047, HSU62768_1, P_R51281, CET07F10_1, SSU66371_1,及びAMPRE_HUMANに対して配列同一性を示している。
【０３２７】
実施例１１０：ヒトＰＲＯ１１８１をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、ここで８２４６８と命名した、Ｉｎｃｙｔｅデータベースからの単一のＥＳＴクラスター配列の同定が可能になった。ついで、このＥＳＴクラスター配列を、公のＥＳＴデータベース（例えばGenBank）と企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQR, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）を含む様々な発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、現存の相同体を同定した。相同体サーチはコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を使用して行った。既知のタンパク質をコードしなかった７０（又はある場合には９０）以上のＢＬＡＳＴスコアになったその比較物を集合化し、「ｐｈｒａｐ」プログラム（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。得られたコンセンサス配列をここでＤＮＡ５６０２９と命名する。
ＤＮＡ５６０２９コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号２１８６５３６内に含まれていたＥＳＴ配列の間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン２１８６５３６を購入し、ｃＤＮＡ挿入断片を得て配列決定した。この挿入断片は全長タンパク質をコードしていたことが分かった。このｃＤＮＡ挿入断片の配列を図２４９に示し、ここでＤＮＡ５９８４７−１５１１と命名する。
クローンＤＮＡ５９８４７−１５１１は、ヌクレオチド位置１７−１９に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置１３２８−１３３０の停止コドンで終端する単一の読み取り枠を含む（図２４９）。予測されたポリペプチド前駆体は４３７アミノ酸長である（図２５０）。図２５０に示した全長ＰＲＯ１１８１タンパク質は約４６，３６３ダルトンの見積もり分子量と約６．２２のｐＩを有する。図２５０（配列番号：３５５）に示した全長ＰＲＯ１１８１配列の分析により、次のもの：アミノ酸約１からアミノ酸約１５のシグナルペプチド、アミノ酸約４６からアミノ酸約４９、アミノ酸約１８９からアミノ酸約１９２及びアミノ酸約１９２からアミノ酸約３８２の潜在的なＮ-グリコシル化部位及びアミノ酸約２８７からアミノ酸約３００及びアミノ酸約９８からアミノ酸約１１１のＬｙ-６／ｕ-ＰＡＲドメインタンパク質と相同性を有するアミノ酸配列ブロック、の存在が証明される。クローンＤＮＡ５９８４７−１５１１は１９９８年８月４日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３０９８が付されている。
図２５０（配列番号：３５５）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用してのＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン３５．４５SwissProt３５）の解析により、ＰＲＯ１１８１アミノ酸配列と次のＤａｙｈｏｆｆ配列：AF041083_1, P_W26579, RNMAGPIAN_1, CELT13C2_2, LMSAP2GN_1, S61882, CEF35C5_12, DP87_DICDI, GIU47631_1及びP_R07092の間の相同性が証明された。
【０３２８】
実施例１１１：ヒトＰＲＯ１１８２をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、ここで１４６６４７と命名した、Ｉｎｃｙｔｅデータベースからの単一のＥＳＴクラスター配列の同定が可能になった。ついで、このＥＳＴクラスター配列を、公のＥＳＴデータベース（例えばGenBank）と企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQR, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）を含む様々な発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、現存の相同体を同定した。相同体サーチはコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を使用して行った。既知のタンパク質をコードしなかった７０（又はある場合には９０）以上のＢＬＡＳＴスコアになったその比較物を集合化し、「ｐｈｒａｐ」プログラム（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。得られたコンセンサス配列をここでＤＮＡ５６０３３と命名する。
ＤＮＡ５６０３３コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号２５９５１９５内に含まれていたＥＳＴ配列の間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン２５９５１９５を購入し、ｃＤＮＡ挿入断片を得て配列決定した。この挿入断片は全長タンパク質をコードしていたことが分かった。このｃＤＮＡ挿入断片の配列を図２５１に示し、ここでＤＮＡ５９８４８−１５１２と命名する。
クローンＤＮＡ５９８４８−１５１２は、ヌクレオチド位置６７−６９に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置８８０−８８２の停止コドンで終端する単一の読み取り枠を含む（図２５１）。予測されたポリペプチド前駆体は２７１アミノ酸長である（図２５２）。図２５２に示した全長ＰＲＯ１１８２タンパク質は約２８，６６５ダルトンの見積もり分子量と約５．３３のｐＩを有する。図２５２（配列番号：３５７）に示した全長ＰＲＯ１１８２配列の分析により、次のもの：アミノ酸約１からアミノ酸約２５のシグナルペプチド、アミノ酸約２４７からアミノ酸約２５６のＣ型レクチンドメインタンパク質と相同性を有するアミノ酸ブロック及びアミノ酸約４４からアミノ酸約７７のＣ１ｑドメインタンパク質と相同性を有するアミノ酸配列ブロック、の存在が証明される。クローンＤＮＡ５９８４８−１５１２は１９９８年８月４日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３０８８が付されている。
図２５２（配列番号：３５７）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用してのＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン３５．４５SwissProt３５）の解析により、ＰＲＯ１１８２アミノ酸配列と次のＤａｙｈｏｆｆ配列：PSPD_BOVIN, CL43_BOVIN, CONG_BOVIN, P_W18780, P_R45005, P_R53257及びCELEGAP7_1の間の有意な相同性が証明された。
【０３２９】
実施例１１２：ヒトＰＲＯ１１５５をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、Ｉｎｃｙｔｅデータベースからの単一のＥＳＴクラスター配列の同定が可能になった。ついで、このＥＳＴクラスター配列を、公のＥＳＴデータベース（例えばGenBank）と企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQR, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）を含む様々な発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、現存の相同体を同定した。相同体サーチはコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を使用して行った。既知のタンパク質をコードしなかった７０（又はある場合には９０）以上のＢＬＡＳＴスコアになったその比較物を集合化し、「ｐｈｒａｐ」プログラム（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。得られたコンセンサス配列をここでＤＮＡ５６１０２と命名する。
ＤＮＡ５６１０２コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号２８５８８７０内に含まれていたＥＳＴ配列の間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン２８５８８７０を購入し、ｃＤＮＡ挿入断片を得て配列決定した。この挿入断片は全長タンパク質をコードしていたことが分かった。このｃＤＮＡ挿入断片の配列を図２５３に示し、ここでＤＮＡ５９８４９−１５０４と命名する。
図２５３に示した全長クローンは、ヌクレオチド位置１５８−１６０に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置５６３−５６５の停止コドンで終端する単一の読み取り枠を含む（図２５３；配列番号：３５８）。予測されたポリペプチド前駆体（図２５４、配列番号：３５９）は１３５アミノ酸長である。ＰＲＯ１１５５タンパク質は約１４，８３３ダルトンの算定分子量と約９．７８のｐＩを有する。クローンＤＮＡ５９８４９−１５０４はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９８６が付されている。実際のクローンは正しい配列を有する一方、ここに記載したものは些細な配列決定誤差のおそれがある表示にすぎないことが理解される。
全長配列の（ＡＬＩＧＮコンピュータプログラムを使用する）ＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析に基づいて、ＰＲＯ１１５５は次のＤａｙｈｏｆｆ表示：TKNK_BOVIN; PVB19X587_1; AF019049_1; P_W00948; S72864; P_W00949; I62742; AF038501_1; TKNG_HUMAN;及びYAT1_RHOBLとある程度のアミノ酸配列同一性を示している。ここに提供された情報に基づいて、ＰＲＯ１１５５は神経保護と向知性化の提供にある役割を果たしうる。
【０３３０】
実施例１１３：ヒトＰＲＯ１１５６をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、ここで１３８８５１と命名した、Ｉｎｃｙｔｅデータベースからの単一のＥＳＴクラスター配列の同定が可能になった。ついで、このＥＳＴクラスター配列を、公のＥＳＴデータベース（例えばGenBank）と企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQR, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）を含む様々な発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、現存の相同体を同定した。相同体サーチはコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を使用して行った。既知のタンパク質をコードしなかった７０（又はある場合には９０）以上のＢＬＡＳＴスコアになったその比較物を集合化し、「ｐｈｒａｐ」プログラム（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。得られたコンセンサス配列をここでＤＮＡ５６２６１と命名する。
ＤＮＡ５６２６１コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号３６７５１９１内に含まれていたＥＳＴ配列の間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン３６７５１９１を購入し、ｃＤＮＡ挿入断片を得て配列決定した。この挿入断片は全長タンパク質をコードしていたことが分かった。このｃＤＮＡ挿入断片の配列を図２５５に示し、ここでＤＮＡ５９８５３−１５０５と命名する。
図２５５に示した全長クローンは、ヌクレオチド位置２１２−２１４に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置６８９−６９１に見いだされる停止コドンで終端する単一の読み取り枠を含む（図２５５；配列番号：３６０）。予測されたポリペプチド前駆体（図２５６；配列番号：３６１）は１５９アミノ酸長である。ＰＲＯ１１５６は約１７，４７６ダルトンの算定分子量、約９．１５の推定ｐＩ、アミノ酸約１から約２２のシグナルペプチド配列、及びアミノ酸約２７−３０及び４１−４４の潜在的なＮ-グリコシル化部位を有する。
クローンＤＮＡ５９８５３−１５０５は１９９８年６月１６日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９８５が付されている。
図２５６（配列番号：３６１）に示した全長配列の（ＡＬＩＧＮコンピュータプログラムを使用する）ＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用してのＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン３５．４５SwissProt３５）の解析により、ＰＲＯ１１５６アミノ酸配列と次のＤａｙｈｏｆｆ配列：D45027_1, P_R79914, JC5309, KBF2_HUMAN, AF010144_1, GEN14351, S68681, P_R79915, ZMTAC_3, 及びHUMCPGO_1の間のある程度の相同性が明らかになった。
【０３３１】
実施例１１４：ヒトＰＲＯ１０９８をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、Ｉｎｃｙｔｅデータベースからの単一のＥＳＴクラスター配列の同定が可能になった。ついで、このＥＳＴクラスター配列を、公のＥＳＴデータベース（例えばGenBank）と企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQR, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）を含む様々な発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、現存の相同体を同定した。相同体サーチはコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を使用して行った。既知のタンパク質をコードしなかった７０（又はある場合には９０）以上のＢＬＡＳＴスコアになったその比較物を集合化し、「ｐｈｒａｐ」プログラム（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。得られたコンセンサス配列をここでＤＮＡ５６３７７と命名する。
ＤＮＡ５６３７７コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号３０５０９１７内に含まれていたＥＳＴ配列の間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン３０５０９１７を購入し、ｃＤＮＡ挿入断片を得て配列決定した。この挿入断片は全長タンパク質をコードしていたことが分かった。このｃＤＮＡ挿入断片の配列を図２５７に示し、ここでＤＮＡ５９８５４−１４５９と命名する。
ＤＮＡ５９８５４−１４５９の全ヌクレオチド配列を図２５７（配列番号：３６２）に示す。クローンＤＮＡ５９８５４−１４５９は、配列番号：３６２（図２５７）のヌクレオチド位置５８−６０に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置２９２−２９４の停止コドンで終端する単一の読み取り枠を含む。予測されたポリペプチド前駆体は７８アミノ酸長である（図２５８）。図２５８に示した全長ＰＲＯ１０９８タンパク質は約８，３９６ダルトンの見積もり分子量と約７．６６のｐＩを有する。クローンＤＮＡ５９８５４−１４５９は１９９８年６月１６日にＡＴＣＣに寄託された。寄託されたクローンは実際の核酸配列を有し、ここに提供された配列は既知の配列決定法に基づいていることが理解される。
図２５８を分析すると、シグナル配列は配列番号：３６３のアミノ酸約１−１９にあり、Ｎ-グリコシル化部位は配列番号：３６３のアミノ酸約３７−４０にあるように思われ、Ｎ-ミリストイル化部位は配列番号：３６３のアミノ酸約１５−２０、１９−２４及び６０−６５にあるように思われる。
【０３３２】
実施例１１５：ヒトＰＲＯ１１２７をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、Ｉｎｃｙｔｅデータベースからの単一のＥＳＴクラスター配列の同定が可能になった。ついで、このＥＳＴクラスター配列を、公のＥＳＴデータベース（例えばGenBank）と企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQR, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）を含む様々な発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、現存の相同体を同定した。相同体サーチはコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を使用して行った。既知のタンパク質をコードしなかった７０（又はある場合には９０）以上のＢＬＡＳＴスコアになったその比較物を集合化し、「ｐｈｒａｐ」プログラム（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。得られたコンセンサス配列をここでＤＮＡ５７９５９と命名する。
ＤＮＡ５７９５９コンセンサス配列とＭｅｒｃｋのＥＳＴクローン番号６８５１２６内に含まれていたＥＳＴ配列の間の観察された配列相同性に鑑みて、ＭｅｒｃｋのＥＳＴクローン６８５１２６を購入し、ｃＤＮＡ挿入断片を得て配列決定した。この挿入断片は全長タンパク質をコードしていたことが分かった。このｃＤＮＡ挿入断片の配列を図２５９に示し、ここでＤＮＡ６０２８３−１４８４と命名する。
図２５９に示す全長クローンは、ヌクレオチド位置１２６−１２８に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置３２７−３２９に見いだされる停止コドンで終端する単一の読み取り枠を含む（図２５９；配列番号：３６４）。予測されたポリペプチド前駆体（図２６０、配列番号：３６５）は配列番号：３６５の約１−２９のシグナルペプチドを含む６７アミノ酸長である。ＰＲＯ１１２７は約７，５２８ダルトンの算定分子量と約４．９５の推定ｐＩを有する。クローンＤＮＡ６０２８３−１４８４は１９９８年７月１日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３０４３が付された。寄託されたクローンは実際の核酸配列を有する一方、些細な配列決定誤差を有しうる表示がここに提供されていることが理解される。
図２６０（配列番号：３６５）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用してのＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン３５．４５SwissProt３５）の解析により、ＰＲＯ１１２７アミノ酸配列と次のＤａｙｈｏｆｆ配列：AF037218_48, P_W09638, HBA_HETPO, S39821, KR2_EBV, CET20D3_8, HCU37630_1, HS193B12_10, S40012 及びTRITUBC_1の間のある程度の相同性が明らかになった。
【０３３３】
実施例１１６：ヒトＰＲＯ１１２６をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、Ｉｎｃｙｔｅデータベースからの単一のＥＳＴクラスター配列の同定が可能になった。ついで、このＥＳＴクラスター配列を、公のＥＳＴデータベース（例えばGenBank）と企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQR, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）を含む様々な発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、現存の相同体を同定した。相同体サーチはコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を使用して行った。既知のタンパク質をコードしなかった７０（又はある場合には９０）以上のＢＬＡＳＴスコアになったその比較物を集合化し、「ｐｈｒａｐ」プログラム（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。得られたコンセンサス配列をここでＤＮＡ５６２５０と命名する。
ＤＮＡ５６２５０コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号１４３７２５０内に含まれていたＥＳＴ配列の間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン１４３７２５０を購入し、ｃＤＮＡ挿入断片を得て配列決定した。この挿入断片は全長タンパク質をコードしていたことが分かった。このｃＤＮＡ挿入断片の配列を図２６１に示し、ここでＤＮＡ６０６１５−１４８３と命名する。
クローンＤＮＡ６０６１５−１４８３は、ヌクレオチド位置１１０−１１２に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置１３１６−１３１８の停止コドンで終端する単一の読み取り枠を含む（図２６１）。予測されたポリペプチド前駆体は４０２アミノ酸長である（図２６２）。図２６２に示される全長ＰＲＯ１１２６タンパク質は約４５，９２１ダルトンの見積もり分子量と約８．６０のｐＩを有する。図２６２（配列番号：３６７）に示した全長ＰＲＯ１１２６配列の分析により、次のもの：アミノ酸約１からアミノ酸約２５のシグナルペプチド及びアミノ酸約６６からアミノ酸約６９、アミノ酸約１３８からアミノ酸約１４１及びアミノ酸約１８３からアミノ酸約１８６の潜在的なＮ-グリコシル化部位の存在が証明される。クローンＤＮＡ６０６１５−１４８３は１９９８年６月１６日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９８０が付されている。
図２６２（配列番号：３６７）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用してのＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン３５．４５SwissProt３５）の解析により、ＰＲＯ１１２６アミノ酸配列と次のＤａｙｈｏｆｆ配列：I73636, NOMR_HUMAN, MMUSMYOC3_1, HS454G6_1, P_R98225, RNU78105_1, RNU72487_1, AF035301_1, CEELC48E7_4及びCEF11C3_3の間の有意な相同性が証明された。
【０３３４】
実施例１１７：ヒトＰＲＯ１１２５をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、Ｉｎｃｙｔｅデータベースからの単一のＥＳＴクラスター配列の同定が可能になった。ついで、このＥＳＴクラスター配列を、公のＥＳＴデータベース（例えばGenBank）と企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQR, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）を含む様々な発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、現存の相同体を同定した。相同体サーチはコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を使用して行った。既知のタンパク質をコードしなかった７０（又はある場合には９０）以上のＢＬＡＳＴスコアになったその比較物を集合化し、「ｐｈｒａｐ」プログラム（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。得られたコンセンサス配列をここでＤＮＡ５６５４０と命名する。
ＤＮＡ５６５４０コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号１４８６１１４内に含まれていたＥＳＴ配列の間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン１４８６１１４を購入し、ｃＤＮＡ挿入断片を得て配列決定した。この挿入断片は全長タンパク質をコードしていたことが分かった。このｃＤＮＡ挿入断片の配列を図２６３に示し、ここでＤＮＡ６０６１５−１４８２と命名する。
図２６３に示される全長クローンは、ヌクレオチド位置４７−４９に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置１３８８−１３９０に見いだされる停止コドンで終端する単一の読み取り枠を含む（図２６３，配列番号：３６８）。予測されたポリペプチド前駆体（図２６４，配列番号：３６９）は４４７アミノ酸長である。ＰＲＯ１１２５は約４９，７９８ダルトンの算定分子量と約９．７８の推定ｐＩを有する。クローンＤＮＡ６０６１９−１４８２はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９９３が付された。クローンは実際の核酸配列を有し、ここに提供された配列は些細な誤差を含みうる現在の方法に基づく表示であることが理解される。
全長配列の（ＡＬＩＧＮコンピュータプログラムを使用する）ＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法に基づいて、ＰＲＯ１１２５は次のＤａｙｈｏｆｆ表記：RCO1_NEUCR; S58306; PKWA_THECU; S76086; P_R85881; HET1_PODAN; SPU92792_1; APAF_HUMAN; S76414及びS59317とある程度の配列同一性を示す。
【０３３５】
実施例１１８：ヒトＰＲＯ１１８６をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、Ｉｎｃｙｔｅデータベースからの単一のＥＳＴクラスター配列の同定が可能になった。ついで、このＥＳＴクラスター配列を、公のＥＳＴデータベース（例えばGenBank）と企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQR, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）を含む様々な発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較して、現存の相同体を同定した。相同性サーチはコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を使用して行った。既知のタンパク質をコードしなかった７０（又はある場合には９０）以上のＢＬＡＳＴスコアになったその比較物を集合化し、「ｐｈｒａｐ」プログラム（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。得られたコンセンサス配列をここでＤＮＡ５６７４８と命名する。
ＤＮＡ５６７４８配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号３４７６７９２内に含まれていたＥＳＴ配列の間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン３４７６７９２を購入し、ｃＤＮＡ挿入断片を得て配列決定した。この挿入断片は全長タンパク質をコードしていたことが分かった。このｃＤＮＡ挿入断片の配列を図２６５に示し、ここでＤＮＡ６０６２１−１５１６と命名する。
図２６５に示す全長クローンは、ヌクレオチド位置９１−９３に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置４０６−４０８に見出される停止コドンで終端する単一の読み取り枠を含む（図２６５；配列番号：３７０）。予測されたポリペプチド前駆体（図２６６；配列番号：３７１）は１０５アミノ酸長である。シグナルペプチドは配列番号：３７１のアミノ酸１−１９にある。ＰＲＯ１１８６は約１１，７１５ダルトンの算定分子量と約９．０５の推定ｐＩを有する。クローンＤＮＡ６０６２１−１５１６は１９９８年８月４日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３０９１が付された。
図２６６（配列番号：３７１）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用してのＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン３５．４５SwissProt３５）の解析により、ＰＲＯ１１８６アミノ酸配列と次のＤａｙｈｏｆｆ配列：VPRA_DENPO, LFE4_CHICK, AF034208_1, AF030433_1, A55035, COL_RABIT, CELB0507_9, S67826_1, S34665及びCRU73817_1の間のある程度の配列同一性が明らかにされた。
【０３３６】
実施例１１９：ヒトＰＲＯ１１９８をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ＤＮＡ５２０８３とここで呼ばれる最初のＤＮＡ配列は、一次ｃＤＮＡクローンの５’末端を優先的に表すヒト臍静脈内皮細胞ｃＤＮＡライブラリにおいて酵母スクリーニングを使用して同定された。ＤＮＡ５２０８３を、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２[Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)]を使用して、公のデータベース（例えばGenBank）と企業のＥＳＴデータベース（LIFESEQR, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）からのＥＳＴと比較した。ＥＳＴを集合化し、コンピュータプログラム「ｐｈｒａｐ」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）を用いてコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。一または複数のＥＳＴがヒト乳房皮膚組織バイオプシーから得られた。このコンセンサス配列をここでＤＮＡ５２７８０と命名する。
ＤＮＡ５２７８０コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号３８５２９１０内に含まれていたＥＳＴ配列の間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン３８５２９１０を購入し、ｃＤＮＡ挿入断片を得て配列決定した。この挿入断片は全長タンパク質をコードしていたことが分かった。このｃＤＮＡ挿入断片の配列を図２６７に示し、ここでＤＮＡ６０６２２−１５２５と命名する。
図２６７（配列番号：３７２）に示す全長ＤＮＡ６０６２２−１５２５クローンは、ヌクレオチド位置５４から５６に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置７４１から７４３に見出される停止コドンで終端する単一の読み取り枠を含む。図２６８（配列番号：３７３）に示す、予測されたポリペプチド前駆体は２２９アミノ酸長である。ＰＲＯ１１９８は約２５，７６４ダルトンの算定分子量と約９．１７の推定ｐＩを有する。アミノ酸約１から３４にシグナルペプチドがある。アミノ酸約１４２から約１７５にグリコシルヒドラーゼファミリー３１タンパク質と配列同一性がある。
図２６８（配列番号：３７３）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用してのＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン３５．４５SwissProt３５）の解析により、ＰＲＯ１１９８アミノ酸配列と次のＤａｙｈｏｆｆ配列：ATF6H11_6, UCRI_RAT, TOBSUP2NT_1, RCUERF3_1, AMU88186_1, P_W22485, S56579, AF040711_1, DPP4_PIGの間のある程度の相同性が明らかにされた。
クローンＤＮＡ６０６２２−１５２５は１９９８年８月４日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３０９０が付された。
【０３３７】
実施例１２０：ヒトＰＲＯ１１５８をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、Ｉｎｃｙｔｅデータベースからの単一のＥＳＴクラスター配列の同定が可能になった。ついで、このＥＳＴクラスター配列を、公のＥＳＴデータベース（例えばGenBank）と企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQR, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）を含む様々な発現配列タグ（ＥＳＴ）と比較して、現存の相同体を同定した。相同体サーチはコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を使用して行った。既知のタンパク質をコードしなかった７０（又はある場合には９０）以上のＢＬＡＳＴスコアになったその比較物を集合化し、「ｐｈｒａｐ」プログラム（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。得られたコンセンサス配列をここでＤＮＡ５７２４８と命名する。
ＤＮＡ５７２４８コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号２６４０７７６内に含まれていたＥＳＴ配列の間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン２６４０７７６を購入し、ｃＤＮＡ挿入断片を得て配列決定した。この挿入断片は全長タンパク質をコードしていたことが分かった。このｃＤＮＡ挿入断片の配列を図２６９に示し、ここでＤＮＡ６０６２５−１５０７と命名する。
図２６９に示す全長クローンは、ヌクレオチド位置１６３から１６５に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置５３２から５３４に見出される停止コドンで終端する単一の読み取り枠を含む（図２６９；配列番号：３７４）。予測されたポリペプチド前駆体（図２７０；配列番号：３７５）は１２３アミノ酸長である。ＰＲＯ１１５８は約１３，１１３ダルトンの算定分子量と約８．５３の推定ｐＩを有する。さらなる特徴は、アミノ酸約１−１９のシグナルペプチド配列、アミノ酸約５６−８０の膜貫通ドメイン及びアミノ酸約３６−３９の潜在的なＮ-グリコシル化部位を含む。クローンＤＮＡ６０６２５−１５０７は１９９８年６月１６日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９７５が付された。
図２７０（配列番号：３７５）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用してのＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン３５．４５SwissProt３５）の解析により、ＰＲＯ１１５８アミノ酸配列と次のＤａｙｈｏｆｆ配列：ATAC00310510F18A8.10, P_R85151, PHS2_SOLTU, RNMHCIBAC_1, RNA1FMHC_1, I68771, RNRT1A10G_1, PTPA_HUMAN, HUMGACA_1, 及びCHKPTPA_1の間のある程度の相同性が明らかにされた。
【０３３８】
実施例１２１：ヒトＰＲＯ１１５９をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、Ｉｎｃｙｔｅデータベースからの単一のＥＳＴクラスター配列の同定が可能になった。ついで、このＥＳＴクラスター配列を、公のＥＳＴデータベース（例えばGenBank）と企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQR, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）を含む様々な発現配列タグ（ＥＳＴ）と比較して、現存の相同体を同定した。相同体サーチはコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を使用して行った。既知のタンパク質をコードしなかった７０（又はある場合には９０）以上のＢＬＡＳＴスコアになったその比較物を集合化し、「ｐｈｒａｐ」プログラム（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。得られたコンセンサス配列をここでＤＮＡ５７２２１と命名する。
ＤＮＡ５７２２１コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号３７６７７６内に含まれていたＥＳＴ配列の間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン３７６７７６を購入し、ｃＤＮＡ挿入断片を得て配列決定した。この挿入断片は全長タンパク質をコードしていたことが分かった。このｃＤＮＡ挿入断片の配列を図２７１に示し、ここでＤＮＡ６０６２７−１５０８と命名する。
クローンＤＮＡ６０６２７−１５０８は、ヌクレオチド位置９２−９４に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置３６２−３６４の停止コドンで終端する単一の読み取り枠を含む（図２７１）。予測されたポリペプチド前駆体は９０アミノ酸長である（図２７２）。図２７２に示された全長ＰＲＯ１１５９タンパク質は約９，８４０ダルトンの見積もり分子量と約１０．１３の推定ｐＩを有する。図２７２（配列番号：３７７）に示した全長ＰＲＯ１１５９配列の分析により、次のもの：アミノ酸約１からアミノ酸約１５のシグナルペプチド及びアミノ酸約３８からアミノ酸約４１の潜在的なＮ-グリコシル化部位の存在が証明される。クローンＤＮＡ６０６２７−１５０８は１９９８年８月４日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３０９２が付されている。
図２７２（配列番号：３７７）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用してのＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン３５．４５SwissProt３５）の解析により、ＰＲＯ１１５９アミノ酸配列と次のＤａｙｈｏｆｆ配列：AF016494_6, AF036708_20, DSSCUTE_1, D89100_1, S28060, MEFA_XENLA, AF020798_12, G70065, E64423, JQ2005の間の有意な相同性が明らかにされた。
【０３３９】
実施例１２２：ヒトＰＲＯ１１２４をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、Ｉｎｃｙｔｅデータベースからの単一のＥＳＴクラスター配列の同定が可能になった。ついで、このＥＳＴクラスター配列を、公のＥＳＴデータベース（例えばGenBank）と企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQR, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）を含む様々な発現配列タグ（ＥＳＴ）と比較して、現存の相同体を同定した。相同体サーチはコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を使用して行った。既知のタンパク質をコードしなかった７０（又はある場合には９０）以上のＢＬＡＳＴスコアになったその比較物を集合化し、「ｐｈｒａｐ」プログラム（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。得られたコンセンサス配列をここでＤＮＡ５６０３５と命名する。
ＤＮＡ５６０３５コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号２７６７６４６内に含まれていたＥＳＴ配列の間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン２７６７６４６を購入し、ｃＤＮＡ挿入断片を得て配列決定した。この挿入断片は全長タンパク質をコードしていたことが分かった。このｃＤＮＡ挿入断片の配列を図２７３に示し、ここでＤＮＡ６０６２９−１４８１と命名する。
図２７３に示した全長クローンは、ヌクレオチド位置２５−２７に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置２７８２−２７８４に見いだされる停止コドンで終端する単一の読み取り枠を含む（図２７３；配列番号：３７８）。予測されたポリペプチド前駆体（図２７４、配列番号：３７９）は９１９アミノ酸長である。ＰＲＯ１１２４は約１０１，２８２ダルトンの算定分子量と約５．３７の推定ｐＩを有する。クローンＤＮＡ６０６２９−１４８１はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９９７９が付されている。寄託されたクローンは実際の核酸配列を有する一方、通常の些細な誤差を含みうる現在の配列決定法に基づく表示のみがここに提供されることが理解される。
全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析に基づくと、ＰＲＯ１１２４は塩素イオンチャンネルタンパク質とＥＣＡＭ-１に対して有意なアミノ酸配列同一性を示している。特に、次のＤａｙｈｏｆｆ表示は、ＰＲＯ１１２４と配列同一性を有すると同定された：ECLC_BOVIN, AF001261_1, P_W06548, SSC6A10_1, AF004355_1, S76691, AF017642, BYU06866_2, CSA_DICDI及びSAU47139_2。
【０３４０】
実施例１２３：ヒトＰＲＯ１２８７をコードするｃＤＮＡクローンの単離
発現配列タグ（ＥＳＴ）ＤＮＡデータベース（LIFESEQR, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）をサーチして、フリンジタンパク質と相同性を示したＥＳＴを同定した。ついで、このＥＳＴクラスター配列を、公のＥＳＴデータベース（例えばGenBank）と企業のＥＳＴデータベース（LIFESEQR, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）を含む様々なＥＳＴデータベースと比較して、相同性ＥＳＴ配列を同定した。比較はコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２[Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)]を使用して行った。既知のタンパク質をコードしなかった７０（又はある場合には９０）以上のＢＬＡＳＴスコアになったその比較物を集合化し、「ｐｈｒａｐ」プログラム（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。このコンセンサス配列をここでＤＮＡ４０５６８と命名する。
ＤＮＡ４０５６８コンセンサス配列に基づき、１）対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリをＰＣＲにより同定するために、また２）ＰＲＯ１２８７に対する全長コード配列のクローンを単離するためのプローブとしての使用のために、オリゴヌクレオチドを合成した。正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは一般に２０から３０ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約１００−１０００ｂｐ長のＰＣＲ生成物を生じるように設計される。プローブ配列は典型的には４０−５５ｂｐ長である。ある場合には、コンセンサス配列が約１−１．５ｋｂｐよりも大きい場合に、さらなるオリゴヌクレオチドが合成される。全長クローンについて数種のライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを、ＰＣＲプライマー対での、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, 上掲のようなＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いて対象遺伝子をコードするクローンを単離するために使用した。
ＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー  5'-CTCGGGGAAAGGGACTTGATGTTGG-3'（配列番号：382）
逆方向ＰＣＲプライマー１  5'-GCGAAGGTGAGCCTCTATCTCGTGCC-3'（配列番号：383）
逆方向ＰＣＲプライマー２  5'-CAGCCTACACGTATTGAGG-3'（配列番号：384）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、次のヌクレオチド配列：
ハイブリッド形成プローブ
5'-CAGTCAGTACAATCCTGGCATAATATACGGCCACCATGATGCAGTCCC-3'（配列番号：385）
を持つコンセンサスＤＮＡ４０５６８配列から作成した。
全長クローンの供給源に対して数種のライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを、上で同定したＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマーの一方を用いてＰＲＯ１２８７遺伝子をコードするクローンを単離するために使用した。
ｃＤＮＡライブラリの作成のためのＲＮＡはヒト骨髄組織から単離された。ｃＤＮＡクローンを単離するために使用されるｃＤＮＡライブラリは、Invitrogen, San Diego, CAからのもののような商業的に入手可能な試薬を使用する標準的な方法により作成した。ｃＤＮＡはＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴで初回刺激され、ＳａｌＩヘミキナーゼ化アダプターに平滑末端化されて結合され、ＮｏｔＩで切断され、ゲル電気泳動により適切なサイズにされ、独特のＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ部位において適当なクローニングベクター（例えばｐＲＫＢ又はｐＲＫＤ；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science, 253:1278-1280 (1991)を参照のこと）に決まった配向でクローニングされた。
上述のようにして単離したクローンのＤＮＡ配列決定により、ＰＲＯ１２８７に対する全長ＤＮＡ配列（ＤＮＡ６１７５５−１５５４[図２７５、配列番号：３８０]と命名）とＰＲＯ１２８７に対する誘導タンパク質配列が得られた。
ＤＮＡ６１７５５−１５５４の全ヌクレオチド配列を図２７５（配列番号：３８０）に示す。全長クローンは、ヌクレオチド位置６５５−６５７に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置２２５１−２２５３に停止シグナルを有する単一の読み取り枠を含む（図２７５；配列番号：３８０）。予測されたポリペプチド前駆体は５３２アミノ酸長であり、約６１，３５１ダルトンの算定分子量と約８．７７の推定ｐＩを有する。図２７６（配列番号：３８１）に示した全長ＰＲＯ１２８７配列の分析により、次のもの：アミノ酸約１からアミノ酸約２７のシグナルペプチド及びアミノ酸約３１５からアミノ酸約３１８およびアミノ酸約３２４からアミノ酸約３２７の潜在的なＮ-グリコシル化部位の存在が証明される。クローンＤＮＡ６１７５５−１５５４は１９９８年８月１１日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３１１２が付されている。
図２７６（配列番号：３８１）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用してのＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン３５．４５SwissProt３５）の解析により、ＰＲＯ１２８７アミノ酸配列と次のＤａｙｈｏｆｆ配列：CET24D1_1, EZRI_BOVIN, GGU19889_1, CC3_YEAST, S74244, NALS_MOUSE, MOES_PIG, S28660, S44860及びYNA4_CAEELの間の有意な相同性が証明された。
【０３４１】
実施例１２４：ヒトＰＲＯ１３１２をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ＤＮＡ５５７７３は、一次ｃＤＮＡクローンの５’末端を優先的に表す酵母スクリーニングを使用してヒト胎児腎臓ｃＤＮＡライブラリにおいて同定された。ＤＮＡ５５７７３配列に基づいて、ＰＲＯ１３１２に対する全長コード配列のクローンを単離するためのプローブとしての使用のためにオリゴヌクレオチドを合成した。
図２７７（配列番号：３８６）に示す全長ＤＮＡ６１８７３−１５７４クローンは、ヌクレオチド位置７−９に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置６４３−６４５に見出される停止コドンで終端する単一の読み取り枠を含む。予測されたポリペプチド前駆体は２１２アミノ酸長である（図２７８、配列番号：３８７）。ＰＲＯ１３１２は約２４，０２４ダルトンの算定分子量と約６．２６の推定ｐＩを有する。他の特徴は、アミノ酸約１−１４のシグナルペプチド、アミノ酸約１４１−１６０の膜貫通ドメイン、及びアミノ酸約７６−７９及び９３−９６の潜在的なＮ-グリコシル化部位を含む。
図２７８（配列番号：３８７）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用してのＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン３５．４５SwissProt３５）の解析により、ＰＲＯ１３１２アミノ酸配列と次のＤａｙｈｏｆｆ配列：GCINTALPH_1, GIBMUC1A_1, P_R96298, AF001406_1, PVU88874_1, P_R85151, AF041409_1, CELC50F2_7, C45875,及びAB009510_21の間のある程度の相同性が明らかにされた。
クローンＤＮＡ６１８７３−１５７４はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３１３２が付された。
【０３４２】
実施例１２５：ヒトＰＲＯ１１９２をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上述の実施例１に記載したように、phrapを用いて他のＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。このコンセンサス配列をＤＮＡ３５９２４と命名する。ＤＮＡ３５９２４コンセンサス配列に基づき、１）対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリをＰＣＲにより同定するために、また２）ＰＲＯ１１９２に対する全長コード配列のクローンを単離するためのプローブとしての使用のために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー：5'-CCGAGGCCATCTAGAGGCCAGAGC-3'（配列番号：390）
逆方向ＰＣＲプライマー：5'-ACAGGCAGAGCCAATGGCCAGAGC-3'（配列番号：391）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、次のヌクレオチド配列：
ハイブリッド形成プローブ
5'-GAGAGGACTGCGGGAGTTTGGGACCTTTGTGCAGACGTGCTCATG-3'（配列番号：392）
を持つコンセンサスＤＮＡ３５９２４配列から作成した。
全長クローンの供給源に対して数種のライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを、上で同定したＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマーの一方を用いてＰＲＯ１１９２遺伝子をコードするクローンを単離するために使用した。ｃＤＮＡライブラリの作成のためのＲＮＡはヒト胎児肝臓および脾臓組織から単離した。
上述のようにして単離したクローンのＤＮＡ配列決定により、ここでＤＮＡ６２８１４−１５２１と命名され図２７９（配列番号：３８８）に示されるＰＲＯ１１９２に対する全長ＤＮＡ配列と図２８０に示されるＰＲＯ１１９２に対する誘導タンパク質配列（配列番号：３８９）が得られた。
ＰＲＯ１１９２の全コード配列を図２７９（配列番号：３８８）に示す。クローンＤＮＡ６２８１４−１５２１は、ヌクレオチド位置１２１−１２３に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置７６６−７６８に見かけの停止コドンを有する単一の読み取り枠を含む。予測されたポリペプチド前駆体は２１５アミノ酸長である。予想されたポリペプチド前駆体は、次の特徴：図２８０のアミノ酸約１−２１のシグナルペプチド；アミノ酸約１５３−１７６の膜貫通ドメイン；アミノ酸約３９−４２及び１１８−１２１の潜在的なＮ-グリコシル化部位；及びアミノ酸約２７−６８及び９９−１２８のミエリンＰ０タンパク質との相同性を有する。図２８０に示した全長ＰＲＯ１１９２タンパク質は約２４，４８４ダルトンの見積もり分子量と約６．９８のｐＩを有する。
図２８０（配列番号：３８９）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用してのＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン３５．４５SwissProt３５）の解析により、ＰＲＯ１１９２アミノ酸配列と次のＤａｙｈｏｆｆ配列：GEN12838, MYP0_HUMAN, AF049498_1, GEN14531, P_W14146, HS46KDA_1, CINB_RAT, OX2G_RAT, D87018_1,及びD86996_2の間の相同性が明らかになった。
クローンＤＮＡ６２８１４−１５２１は１９９８年８月４日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３０９３が付されている。
【０３４３】
実施例１２６：ヒトＰＲＯ１１６０をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上述の実施例１に記載したように、phrapを用いて他のＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。このコンセンサス配列をＤＮＡ４０６５０と命名する。ＤＮＡ４０６５０コンセンサス配列に基づき、１）対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリをＰＣＲにより同定するために、また２）ＰＲＯ１１６０に対する全長コード配列のクローンを単離するためのプローブとしての使用のために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー：5'-GCTCCCTGATCTTCATGTCACCACC-3'（配列番号：395）
逆方向ＰＣＲプライマー：5'-CAGGGACACACTCTACCATTCGGGAG-3'（配列番号：396）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、次のヌクレオチド配列：
ハイブリッド形成プローブ
5'-CCATCTTTCTGGTCTCTGCCCAGAATCCGACAACAGCTGCTC-3'（配列番号：397）
を持つコンセンサスＤＮＡ４０６５０配列から作成した。
全長クローンの供給源に対して数種のライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを、上で同定したＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマーの一方を用いてＰＲＯ１１６０遺伝子をコードするクローンを単離するために使用した。ｃＤＮＡライブラリの作成のためのＲＮＡはヒト乳房組織から単離した。
上述のようにして単離したクローンのＤＮＡ配列決定により、（ここでＤＮＡ６２８７２−１５０９[図２８１，配列番号：３９３]と命名された）ＰＲＯ１１６０に対する全長ＤＮＡ配列とＰＲＯ１１６０に対する誘導タンパク質配列が得られた。
ＤＮＡ６２８７２−１５０９の全ヌクレオチド配列を図２８１（配列番号：３９３）に示す。クローンＤＮＡ６２８７２−１５０９は、ヌクレオチド位置４０−４２に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置３１０−３１２の停止コドンで終端する単一の読み取り枠を含む（図２８１）。予測されたポリペプチド前駆体は９０アミノ酸長である（図２８２）。図２８２に示した全長ＰＲＯ１１６０タンパク質は約９，０３９ダルトンの見積もり分子量と約４．３７のｐＩを有する。図２８２（配列番号：３９４）に示した全長ＰＲＯ１１６０配列の分析により、次のもの：アミノ酸約１からアミノ酸約１９のシグナルペプチド及びアミノ酸約６８からアミノ酸約７０のプロテインキナーゼＣリン酸化部位の存在が証明される。クローンＤＮＡ６２８７２−１５０９は１９９８年８月４日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３１００が付されている。
図２８２（配列番号：３９４）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用してのＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン３５．４５SwissProt３５）の解析により、ＰＲＯ１１６０アミノ酸配列と次のＤａｙｈｏｆｆ配列：B30305, GEN13490, I53641, S53363, HA34_BRELC, SP96_DICDI, S36326, SSU51197_10, MUC1_XENLA, TCU32448_1及びAF000409_1の間の有意な相同性が証明された。
【０３４４】
実施例１２７：ヒトＰＲＯ１１８７をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、Ｉｎｃｙｔｅデータベースからの単一のＥＳＴクラスター配列の同定が可能になった。ついで、このＥＳＴクラスター配列を、公のＥＳＴデータベース（例えばGenBank）と企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQR, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）を含む様々な発現配列タグ（ＥＳＴ）と比較して、現存の相同体を同定した。相同体サーチはコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を使用して行った。既知のタンパク質をコードしなかった７０（又はある場合には９０）以上のＢＬＡＳＴスコアになったその比較物を集合化し、「ｐｈｒａｐ」プログラム（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。得られたコンセンサス配列をここでＤＮＡ５７７２６と命名する。
ＤＮＡ５７７２６コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号３５８５６３内に含まれていたＥＳＴ配列の間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン３５８５６３を購入し、ｃＤＮＡ挿入断片を得て配列決定した。この挿入断片は全長タンパク質をコードしていたことが分かった。このｃＤＮＡ挿入断片の配列を図２８３に示し、ここでＤＮＡ６２８７６−１５１７と命名する。
図２８３に示した全長クローンは、ヌクレオチド位置１２１−１２３に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置４８１−４８３に見いだされる停止コドンで終端する単一の読み取り枠を含む（図２８３；配列番号：３９８）。予測されたポリペプチド前駆体（図２８４、配列番号：３９９）は１２０アミノ酸長である。シグナルペプチドは配列番号：３９９のアミノ酸約１−１７にある。ＰＲＯ１１８７は約１２，９２５ダルトンの算定分子量と約９．４６の推定ｐＩを有する。クローンＤＮＡ６２８７６−１５１７は１９９８年８月４日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３０９５が付されている。寄託されたクローンは実際の核酸配列を有する一方、ここに記載の表示は些細な配列決定誤差を含みうることが理解される。
図２８４（配列番号：３９９）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用してのＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン３５．４５SwissProt３５）の解析により、ＰＲＯ１１８７アミノ酸配列と次のＤａｙｈｏｆｆ配列：MGNENDOBX_1, CELF41G3_9, AMPG_STRLI, HSBBOVHERL_2, LEEXTEN10_1, AF029958_1及びP_W04957の間のある程度の配列同一性（従って、ある程度の関係）が明らかにされた。
【０３４５】
実施例１２８：ヒトＰＲＯ１１８５をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、Ｉｎｃｙｔｅデータベースからの単一のＥＳＴクラスター配列の同定が可能になった。ついで、このＥＳＴクラスター配列を、公のＥＳＴデータベース（例えばGenBank）と企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQR, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）を含む様々な発現配列タグ（ＥＳＴ）と比較して、現存の相同体を同定した。相同体サーチはコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を使用して行った。既知のタンパク質をコードしなかった７０（又はある場合には９０）以上のＢＬＡＳＴスコアになったその比較物を集合化し、「ｐｈｒａｐ」プログラム（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。得られたコンセンサス配列をここでＤＮＡ５６４２６と命名する。
ＤＮＡ５７７２６コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号３２８４４１１内に含まれていたＥＳＴ配列の間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン３２８４４１１を購入し、ｃＤＮＡ挿入断片を得て配列決定した。この挿入断片は全長タンパク質をコードしていたことが分かった。このｃＤＮＡ挿入断片の配列を図２８５に示し、ここでＤＮＡ６２８８１−１５１５と命名する。
図２８５に示した全長ＤＮＡ６２８８１−１５１５クローンは、ヌクレオチド位置４−６に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置５９８−６００に見いだされる停止コドンで終端する単一の読み取り枠を含む（図２８５；配列番号：４００）。予測されたポリペプチド前駆体（図２８６、配列番号：４０１）は１９８アミノ酸長である。シグナルペプチドは配列番号：４０１のアミノ酸約１−２１にある。ＰＲＯ１１８５は約２２，１０５ダルトンの算定分子量と約７．７３の推定ｐＩを有する。クローンＤＮＡ６２８８１−１５１５はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３０９６が付されている。
図２８６（配列番号：４０１）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用してのＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン３５．４５SwissProt３５）の解析により、ＰＲＯ１１８５アミノ酸配列と次のＤａｙｈｏｆｆ配列：TUP1_YEAST, AF041382_1, MAOM_SOLTU, SPPBPHU9_1, I41024, EPCPLCFAIL_1, HSPLEC_1, YKL4_CAEEL, A44643, TGU65922_1の間のある程度の配列同一性が明らかにされた。
【０３４６】
実施例１２９：ヒトＰＲＯ１３４５をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上述の実施例１に記載したように、phrapを用いて他のＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。このコンセンサス配列をＤＮＡ４７３６４と命名する。ＤＮＡ４７３６４コンセンサス配列に基づき、１）対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリをＰＣＲにより同定するために、また２）ＰＲＯ１３４５に対する全長コード配列のクローンを単離するためのプローブとしての使用のために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー：5'-CCTGGTTATCCCCAGGAACTCCGAC-3'（配列番号：404）
逆方向ＰＣＲプライマー：5'-CTCTTGCTGCTGCGACAGGCCTC-3'（配列番号：405）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、次のヌクレオチド配列：
ハイブリッド形成プローブ
5'-CGCCCTCCAAGACTATGGTAAAAGGAGCCTGCCAGGTGTCAATGAC-3'（配列番号：406）
を持つコンセンサスＤＮＡ４７３６４配列から作成した。
全長クローンの供給源に対して数種のライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを、上で同定したＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマーの一方を用いてＰＲＯ１３４５遺伝子をコードするクローンを単離するために使用した。ｃＤＮＡライブラリの作成のためのＲＮＡはヒト乳ガン組織から単離した。
上述のようにして単離したクローンのＤＮＡ配列決定により、（ここでＤＮＡ６４８５２−１５８９[図２８７、配列番号：４０２]と命名された）ＰＲＯ１３４５に対する全長ＤＮＡ配列とＰＲＯ１３４５に対する誘導タンパク質配列が得られた。
ＤＮＡ６４８５２−１５８９の全ヌクレオチド配列を図２８７（配列番号：４０２）に示す。クローンＤＮＡ６４８５２−１５８９は、ヌクレオチド位置７−９または３４−３６に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置６２５−６２７の停止コドンで終端する単一の読み取り枠を含む（図２８７）。予測されたポリペプチド前駆体は２０６アミノ酸長である（図２８８）。図２８８に示した全長ＰＲＯ１３４５タンパク質は約２３，１９０ダルトンの見積もり分子量と約９．４０のｐＩを有する。図２８８（配列番号：４０３）に示した全長ＰＲＯ１３４５配列の分析により、次のもの：アミノ酸約１からアミノ酸約３１またはアミノ酸約１０からアミノ酸約３１のシグナルペプチド及びアミノ酸約１７６からアミノ酸約１９０のＣ型レクチンドメインシグネーチャー配列の存在が証明される。クローンＤＮＡ６４８５２−１５８９は１９９８年８月１８日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３１２７が付されている。
図２８８（配列番号：４０３）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用してのＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン３５．４５SwissProt３５）の解析により、ＰＲＯ１３４５アミノ酸配列と次のＤａｙｈｏｆｆ配列：BTU22298_1, TETN_CARSP, TETN_HUMAN, MABA_RAT, S34198, P_W13144, MACMBPA_1, A46274, PSPD_RAT及びP_R32188の間の有意な相同性が証明された。
【０３４７】
実施例１３０：ヒトＰＲＯ１２４５をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、Ｉｎｃｙｔｅデータベースからの単一のＥＳＴクラスター配列の同定が可能になった。ついで、このＥＳＴクラスター配列を、公のＥＳＴデータベース（例えばGenBank）と企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQR, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）を含む様々な発現配列タグ（ＥＳＴ）と比較して、現存の相同体を同定した。相同体サーチはコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を使用して行った。既知のタンパク質をコードしなかった７０（又はある場合には９０）以上のＢＬＡＳＴスコアになったその比較物を集合化し、「ｐｈｒａｐ」プログラム（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。得られたコンセンサス配列をここでＤＮＡ５６０１９と命名する。
ＤＮＡ５６０１９コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号１３２７８３６内に含まれていたＥＳＴ配列の間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン１３２７８３６を購入し、ｃＤＮＡ挿入断片を得て配列決定した。この挿入断片は全長タンパク質をコードしていたことが分かった。このｃＤＮＡ挿入断片の配列を図２８９に示し、ここでＤＮＡ６４８８４−１５２７と命名する。
図２８９に示した全長クローンは、ヌクレオチド位置７９−８１に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置３９１−３９３に見いだされる停止コドンで終端する単一の読み取り枠を含む（図２８９；配列番号：４０７）。予測されたポリペプチド前駆体（図２９０、配列番号：４０８）は１０４アミノ酸長であり、シグナルペプチド配列はアミノ酸約１からアミノ酸約１８にある。ＰＲＯ１２４５は約１０，１００ダルトンの算定分子量と約８．７６の推定ｐＩを有する。
図２９０（配列番号：４０８）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用してのＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン３５．４５SwissProt３５）の解析により、ＰＲＯ１２４５アミノ酸配列と次のＤａｙｈｏｆｆ配列：SYA_THETH, GEN11167, MTV044_4, AB011151_1, RLAJ2750_3, SNELIPTRA_1, S63624, C28391, A37907,及びS14064の間のある程度の相同性が明らかにされた。
クローンＤＮＡ６４８８４−１２４５は１９９８年８月２５日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３１１５が付されている。
【０３４８】
実施例１３１：ヒトＰＲＯ１３５８をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、Ｉｎｃｙｔｅデータベースからの単一のＥＳＴクラスター配列の同定が可能になった。ついで、このＥＳＴクラスター配列を、公のＥＳＴデータベース（例えばGenBank）と企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQR, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）を含む様々な発現配列タグ（ＥＳＴ）と比較して、現存の相同体を同定した。相同体サーチはコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を使用して行った。既知のタンパク質をコードしなかった７０（又はある場合には９０）以上のＢＬＡＳＴスコアになったその比較物を集合化し、「ｐｈｒａｐ」プログラム（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。
コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号８８７１８内に含まれていたＥＳＴ配列の間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン８８７１８を購入し、ｃＤＮＡ挿入断片を得て配列決定した。この挿入断片は全長タンパク質をコードしていたことが分かった。このｃＤＮＡ挿入断片の配列を図２９１に示し、ここでＤＮＡ６４８９０−１６１２と命名する。
図２９１に示した全長クローンは、ヌクレオチド位置８６から８８に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置１４１８から１４２０に見いだされる停止コドンで終端する単一の読み取り枠を含む（図２９１；配列番号：４０９）。予測されたポリペプチド前駆体（図２９２、配列番号：４１０）は４４４アミノ酸長である。シグナルペプチドは配列番号：４１０のアミノ酸約１−１８にある。ＰＲＯ１３５８は約５０，７１９ダルトンの算定分子量と約８．８２の推定ｐＩを有する。クローンＤＮＡ６４８９０−１６１２は１９９８年８月１８日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３１３１が付されている。
図２９２（配列番号：４１０）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用してのＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン３５．４５SwissProt３５）の解析により、ＰＲＯ１３５８アミノ酸配列と次のＤａｙｈｏｆｆ配列：P_W07607, AB000545_1, AB000546_1, A1AT_RAT, AB015164_1, P_P50021, COTR_CAVPO,及びHAMHPP_1の間の配列同一性が明らかにされた。この出願の請求の範囲に記載した変異体はこれらの配列を除くものである。
【０３４９】
実施例１３２：ヒトＰＲＯ１１９５をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、Ｉｎｃｙｔｅデータベースからの単一のＥＳＴクラスター配列の同定が可能になった。ついで、このＥＳＴクラスター配列を、公のＥＳＴデータベース（例えばGenBank）と企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQR, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）を含む様々な発現配列タグ（ＥＳＴ）と比較して、現存の相同体を同定した。相同体サーチはコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を使用して行った。既知のタンパク質をコードしなかった７０（又はある場合には９０）以上のＢＬＡＳＴスコアになったその比較物を集合化し、「ｐｈｒａｐ」プログラム（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。得られたコンセンサス配列をここでＤＮＡ５５７１６と命名する。
ＤＮＡ５５７１６コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号３２５２９８０内に含まれていたＥＳＴ配列の間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン３２５２９８０を購入し、ｃＤＮＡ挿入断片を得て配列決定した。この挿入断片は全長タンパク質をコードしていたことが分かった。このｃＤＮＡ挿入断片の配列を図２９３に示し、ここでＤＮＡ６５４１２−１５２３と命名する。
図２９３に示した全長クローンは、ヌクレオチド位置５８−６０に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置５１１−５１３に見いだされる停止コドンで終端する単一の読み取り枠を含む（図２９３；配列番号：４１１）。予測されたポリペプチド前駆体（図２９４、配列番号：４１２）は１５１アミノ酸長である。シグナルペプチドは配列番号：４１２のアミノ酸約１−２２にある。ＰＲＯ１１９５は約１７，２７７ダルトンの算定分子量と約５．３３の推定ｐＩを有する。クローンＤＮＡ６５４１２−１５２３は１９９８年８月４日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３０９４が付されている。
図２９４（配列番号：４１２）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用してのＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン３５．４５SwissProt３５）の解析により、ＰＲＯ１１９５アミノ酸配列と次のＤａｙｈｏｆｆ配列：MMU28486_1, AF044205_1, P_W31186, CELK03C7_1, F69034, EF1A_METVA, AF024540_1, SSU90353_1, MRSP_STAAU及びP_R97680の間のある程度の配列同一性が明らかにされた。
【０３５０】
実施例１３３：ヒトＰＲＯ１２７０をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、Ｉｎｃｙｔｅデータベースからの単一のＥＳＴクラスター配列の同定が可能になった。ついで、このＥＳＴクラスター配列を、公のＥＳＴデータベース（例えばGenBank）と企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQR, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）を含む様々な発現配列タグ（ＥＳＴ）と比較して、現存の相同体を同定した。相同体サーチはコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を使用して行った。既知のタンパク質をコードしなかった７０（又はある場合には９０）以上のＢＬＡＳＴスコアになったその比較物を集合化し、「ｐｈｒａｐ」プログラム（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。得られたコンセンサス配列をここでＤＮＡ５７９５１と命名する。
ＤＮＡ５７９５１コンセンサス配列とＭｅｒｃｋのＥＳＴクローン番号１２４８７８内に含まれていたＥＳＴ配列の間の観察された配列相同性に鑑みて、ＭｅｒｃｋのＥＳＴクローン１２４８７８を購入し、ｃＤＮＡ挿入断片を得て配列決定した。この挿入断片は全長タンパク質をコードしていたことが分かった。このｃＤＮＡ挿入断片の配列を図２９５に示し、ここでＤＮＡ６６３０８−１５３７と命名する。
クローンＤＮＡ６６３０８−１５３７は、ヌクレオチド位置１０３−１０５に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置１０４２−１０４４の停止コドンで終端する単一の読み取り枠を含む（図２９５）。予測されたポリペプチド前駆体は３１３アミノ酸長である（図２９６）。図２９６に示した全長ＰＲＯ１２７０タンパク質は約３４，９７８ダルトンの見積もり分子量と約５．７１のｐＩを有する。図２９６（配列番号：４１４）に示した全長ＰＲＯ１２７０配列の分析により、次のもの：アミノ酸約１からアミノ酸約１６のシグナルペプチド、アミノ酸約１６３からアミノ酸約１６６の潜在的なＮ-グリコシル化部位及びアミノ酸約７４からアミノ酸約７７及びアミノ酸約２８９からアミノ酸約２９２のグリコサミノグリカン付着部位の存在が証明される。クローンＤＮＡ６６３０８−１５３７は１９９８年８月２５日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３１５９が付されている。
図２９６（配列番号：４１４）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用してのＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン３５．４５SwissProt３５）の解析により、ＰＲＯ１２７０アミノ酸配列と次のＤａｙｈｏｆｆ配列：XLU86699_1, S49589, FIBA_PARPA, FIBB_HUMAN, P_R47189, AF004326_1, DRTENASCN_1, AF004327_1, P_W01411及びFIBG_BOVINの間の有意な相同性が証明された。
【０３５１】
実施例１３４：ヒトＰＲＯ１２７１をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、Ｉｎｃｙｔｅデータベースからの単一のＥＳＴクラスター配列の同定が可能になった。ついで、このＥＳＴクラスター配列を、公のＥＳＴデータベース（例えばGenBank）と企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQR, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）を含む様々な発現配列タグ（ＥＳＴ）と比較して、現存の相同体を同定した。相同体サーチはコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を使用して行った。既知のタンパク質をコードしなかった７０（又はある場合には９０）以上のＢＬＡＳＴスコアになったその比較物を集合化し、「ｐｈｒａｐ」プログラム（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。得られたコンセンサス配列をここでＤＮＡ５７９５５と命名する。
ＤＮＡ５７９５５コンセンサス配列とＭｅｒｃｋのＥＳＴクローン番号ＡＡ６２５３５０内に含まれていたＥＳＴ配列の間の観察された配列相同性に鑑みて、ＭｅｒｃｋのＥＳＴクローンＡＡ６２５３５０を購入し、ｃＤＮＡ挿入断片を得て配列決定した。この挿入断片は全長タンパク質をコードしていたことが分かった。このｃＤＮＡ挿入断片の配列を図２９７に示し、ここでＤＮＡ６６３０９−１５３８と命名する。
クローンＤＮＡ６６３０９−１５３８は、ヌクレオチド位置９４−９６に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置７１８−７２０の停止コドンで終端する単一の読み取り枠を含む（図２９７）。予測されたポリペプチド前駆体は２０８アミノ酸長である（図２９８）。図２９８に示した全長ＰＲＯ１２７１タンパク質は約２１，５３１ダルトンの見積もり分子量と約８．９９のｐＩを有する。図２９８（配列番号：４１６）に示した全長ＰＲＯ１２７１配列の分析により、次のもの：アミノ酸約１からアミノ酸約３１のシグナルペプチドおよびアミノ酸約１６６からアミノ酸約１８７の膜貫通ドメインの存在が証明される。クローンＤＮＡ６６３０９−１５３８は１９９８年９月１５日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３２３５が付されている。
図２９８（配列番号：４１６）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用してのＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン３５．４５SwissProt３５）の解析により、ＰＲＯ１２７１アミノ酸配列と次のＤａｙｈｏｆｆ配列：S57180, S63257, AGA1_YEAST, BPU43599_1, YS8A_CAEEL, S67570, LSU54556_2, S70305, VGLX_HSVEB,及びD88733_1の間の有意な相同性が証明された。
【０３５２】
実施例１３５：ヒトＰＲＯ１３７５をコードするｃＤＮＡクローンの単離
Ｍｅｒｃｋ／Ｗａｓｈ．Ｕ．データベースをサーチしてＭｅｒｋ ＥＳＴを同定した。ついで、この配列をＳｗｉｓｓ-Ｐｒｏｔ公的データベース、公のＥＳＴデータベース（例えばGenBank、Merck/Wash. U.）と企業のＥＳＴデータベース（LIFESEQR, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）からの他の配列とそれを整列化させるプログラムに入力した。サーチは、ＥＳＴ配列の６フレーム翻訳との細胞外ドメイン（ＥＣＤ）タンパク質配列の比較としてコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２[Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)]を使用して行った。既知のタンパク質をコードしなかった７０（又はある場合には９０）以上のＢＬＡＳＴスコアになったその比較物を集合化し、「ｐｈｒａｐ」プログラム（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。
ｐｈｒａｐを使用して他のＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列が構築された。このコンセンサス配列はここで「ＤＮＡ６７００３」と命名する。
ＤＮＡ６７００３コンセンサス配列に基づいて、ヒト膵臓ライブラリにおいて核酸（配列番号：４１７）を同定した。クローンのＤＮＡ配列決定により、ＰＲＯ１３７５に対する全長ＤＮＡ配列とＰＲＯ１３７５に対する誘導タンパク質配列が得られた。
ＰＲＯ１３７５の全コード配列は図２９９（配列番号：４１７）に示される。クローンＤＮＡ６７００４−１６１４は、配列番号：４１７のヌクレオチド位置１０４−１０６に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置６９８−７００に見かけの停止コドンを有する単一の読み取り枠を含む。予測されたポリペプチド前駆体は１９８アミノ酸長である。膜貫通ドメインは配列番号：４１８のアミノ酸約１１−２８（ＩＩ型）と１０３−１２５にある。クローンＤＮＡ６７００４−１６１４はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３１１５が付されている。図３００に示した全長ＰＲＯ１３７５タンパク質は約２２，５３１ダルトンの見積もり分子量と約８．４７のｐＩを有する。
図３００（配列番号：４１８）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用してのＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン３５．４５SwissProt３５）の解析により、ＰＲＯ１３７５アミノ酸配列と次のＤａｙｈｏｆｆ配列：AF026198_5, CELR12C12_5, S73465, Y011_MYCPN, S64538_1, P_P8150, MUVSHPO10_1, VSH_MUMPL及びCVU59751_5の間の配列同一性が明らかにされた。
【０３５３】
実施例１３６：ヒトＰＲＯ１３８５をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、Ｉｎｃｙｔｅデータベースからの単一のＥＳＴクラスター配列の同定が可能になった。ついで、このＥＳＴクラスター配列を、公のＥＳＴデータベース（例えばGenBank）と企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQR, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）を含む様々な発現配列タグ（ＥＳＴ）と比較して、現存の相同体を同定した。相同体サーチはコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を使用して行った。既知のタンパク質をコードしなかった７０（又はある場合には９０）以上のＢＬＡＳＴスコアになったその比較物を集合化し、「ｐｈｒａｐ」プログラム（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。得られたコンセンサス配列をここでＤＮＡ５７９５２と命名する。
ＤＮＡ５７９５２コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号３１２９６３０内に含まれていたＥＳＴ配列の間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン３１２９６３０を購入し、ｃＤＮＡ挿入断片を得て配列決定した。この挿入断片は全長タンパク質をコードしていたことが分かった。このｃＤＮＡ挿入断片の配列を図３０１に示し、ここでＤＮＡ６８８６９−１６１０と命名する。
クローンＤＮＡ６８８６９−１６１０は、ヌクレオチド位置２６−２８に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置４１０−４１２の停止コドンで終端する単一の読み取り枠を含む（図３０１）。予測されたポリペプチド前駆体は１２８アミノ酸長である（図３０２）。図３０２に示した全長ＰＲＯ１３８５タンパク質は約１３，６６３ダルトンの見積もり分子量と約１０．９７のｐＩを有する。図３０２（配列番号：４２０）に示した全長ＰＲＯ１３８５配列の分析により、次のもの：アミノ酸約１からアミノ酸約２８のシグナルペプチド、およびアミノ酸約８２からアミノ酸約８５およびアミノ酸約９１からアミノ酸約９４のグリコシルアミノグリカン付着部位の存在が証明される。クローンＤＮＡ６８８６９−１６１０は１９９８年８月２５日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３１６４が付されている。
図３０２（配列番号：４２０）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用してのＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン３５．４５SwissProt３５）の解析により、ＰＲＯ１３８５アミノ酸配列と次のＤａｙｈｏｆｆ配列：CELT14A8_1, LMNACHRA1_1, HXD9_HUMAN, CHKCMLF_1, HS5PP34_2, DMDRING_1, A37107_1, MMLUNGENE_1, PUM_DROME及びDMU25117_1の間の低い相同性が証明された。
【０３５４】
実施例１３７：ヒトＰＲＯ１３８７をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記の実施例３に記載したシグナル配列アルゴリズムの使用により、Ｉｎｃｙｔｅデータベースからの単一のＥＳＴクラスター配列の同定が可能になった。ついで、このＥＳＴクラスター配列を、公のＥＳＴデータベース（例えばGenBank）と企業のＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQR, Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA）を含む様々な発現配列タグ（ＥＳＴ）と比較して、現存の相同体を同定した。相同体サーチはコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２（Altshul等, Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）を使用して行った。既知のタンパク質をコードしなかった７０（又はある場合には９０）以上のＢＬＡＳＴスコアになったその比較物を集合化し、「ｐｈｒａｐ」プログラム（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）でコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。得られたコンセンサス配列をここでＤＮＡ５６２５９と命名する。
ＤＮＡ５６２５９コンセンサス配列とＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン番号３５０７９２４内に含まれていたＥＳＴ配列の間の観察された配列相同性に鑑みて、ＩｎｃｙｔｅのＥＳＴクローン３５０７９２４を購入し、ｃＤＮＡ挿入断片を得て配列決定した。この挿入断片は全長タンパク質をコードしていたことが分かった。このｃＤＮＡ挿入断片の配列を図３０３に示し、ここでＤＮＡ６８８７２−１６２０と命名する。
クローンＤＮＡ６８８７２−１６２０は、ヌクレオチド位置８５−８７に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置１２６７−１２６９の停止コドンで終端する単一の読み取り枠を含む（図３０３）。予測されたポリペプチド前駆体は３９４アミノ酸長である（図３０４）。図３０４に示した全長ＰＲＯ１３８７タンパク質は約４４，３３９ダルトンの見積もり分子量と約７．１０のｐＩを有する。図３０４（配列番号：４２２）に示した全長ＰＲＯ１３８７配列の分析により、次のもの：アミノ酸約１からアミノ酸約１９のシグナルペプチド、アミノ酸約２７５からアミノ酸約２９６の膜貫通ドメイン、アミノ酸約７６からアミノ酸約７９、アミノ酸約２３１からアミノ酸約２３４、アミノ酸約３０２からアミノ酸約３０５、アミノ酸約３０７からアミノ酸約３１０およびアミノ酸約３７６からアミノ酸約３７９の潜在的なＮ-グリコシル化部位、およびアミノ酸約２１０からアミノ酸約２３９およびアミノ酸約９２からアミノ酸約１２１のミエリンｐ０タンパク質と相同性を有するアミノ酸配列ブロックの存在が証明される。クローンＤＮＡ６８８７２−１６２０は１９９８年８月２５日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３１６０が付されている。
図３０４（配列番号：４２２）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用してのＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン３５．４５SwissProt３５）の解析により、ＰＲＯ１３８７アミノ酸配列と次のＤａｙｈｏｆｆ配列：P_W36955, MYP0_HETFR, HS46KDA_1, AF049498_1, MYO0_HUMAN, AF030454_1, A53268, SHPTCRA_1, P_W14146及びGEN12838の間の有意な相同性が証明された。
【０３５５】
実施例１３８：ヒトＰＲＯ１３８４をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上述の実施例１に記載したように、phrapを用いて他のＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を構築した。このコンセンサス配列をＤＮＡ５４１９２と命名する。ＤＮＡ５４１９２コンセンサス配列に基づき、１）対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリをＰＣＲにより同定するために、また２）ＰＲＯ１３８４に対する全長コード配列のクローンを単離するためのプローブとしての使用のために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマー（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー  5'-TGCAGCCCCTGTGACACAAACTGG-3'（配列番号：425）
逆方向ＰＣＲプライマー  5'-CTGAGATAACCGAGCCATCCTCCCAC-3'（配列番号：426）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、次のヌクレオチド配列：
ハイブリッド形成プローブ
5'-GGAGATAGCTGCTATGGGTTCTTCAGGCACAACTTAACATGGGAAG-3'（配列番号：27）
を持つＤＮＡ５４１９２配列から作成した。
全長クローンの供給源に対して数種のライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを、上で同定したＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマーの一方を用いてＰＲＯ１３８４遺伝子をコードするクローンを単離するために使用した。ｃＤＮＡライブラリの作成のためのＲＮＡはヒト胎児肝臓から単離した。
上述のようにして単離したクローンのＤＮＡ配列決定により、（ここでＤＮＡ７１１５９−１６１７[図３０５、配列番号：４２３]と命名される）ＰＲＯ１３８４に対する全長ＤＮＡ配列とＰＲＯ１３８４に対する誘導タンパク質配列が得られた。
ＰＲＯ１３８４の全コード配列を図３０５（配列番号：４２３）に示す。クローンＤＮＡ７１１５９−１６１７は、ヌクレオチド位置１８２−１８４に見かけの翻訳開始部位を有し、ヌクレオチド位置８６９−８７１に見かけの停止コドンを有する単一のリーディングフレームを含む。予測されたポリペプチド前駆体は２２９アミノ酸長である。図３０６に示した全長ＰＲＯ１３８４タンパク質は約２６，６５０ダルトンの見積もり分子量と約８．７６のｐＩを有する。さらなる特徴は、アミノ酸約３２−５７のＩＩ型膜貫通ドメイン、およびアミノ酸約６８−７１、１２０−１２３、および１３４−１３７の潜在的なＮ-グリコシル化部位を含む。
図３０６（配列番号：４２４）に示した全長配列のＷＵ-ＢＬＡＳＴ２配列アラインメント分析法を使用してのＤａｙｈｏｆｆデータベース（バージョン３５．４５SwissProt３５）の解析により、ＰＲＯ１３８４アミノ酸配列と次のＤａｙｈｏｆｆ配列：AF054819_1, HSAJ1687_1, AF009511_1, AB010710_1, GEN13595, HSAJ673_1, GEN13961, AB005900_1, LECH_CHICK, AF021349_1, 及びNK13_RATの間の相同性が明らかになった。
クローンＤＮＡ７１１５９−１６１７はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０３１３５が付されている。
【０３５６】
実施例１３９：ハイブリッド形成プローブとしてのＰＲＯの使用
以下の方法は、ＰＲＯをコードする核酸配列のハイブリッド形成プローブとしての使用を記載する。
ここに開示する全長又は成熟ＰＲＯのコード化配列を含むＤＮＡは、ヒト組織ｃＤＮＡライブラリ又はヒト組織ゲノムライブラリにおける同種ＤＮＡ類（ＰＲＯポリペプチドの天然発生変異体をコードするものなど）のスクリーニングのためのプローブとして用いられる。
いずれかのライブラリＤＮＡを含むフィルターのハイブリッド形成及び洗浄は、以下の高い緊縮条件で実施した。放射性標識ＰＲＯ-誘導プローブのフィルターへのハイブリッド形成は、50%ホルムアミド、5xＳＳＣ、0.1%ＳＤＳ、0.1%ピロリン酸ナトリウム、50mMリン酸ナトリウム、pH6.8、2xデンハード液、及び10%デキストラン硫酸の溶液中で、42℃において20時間行った。フィルターの洗浄は、0.1xＳＳＣ及び0.1%ＳＤＳの水溶液中、42℃で行った。
次いで、全長天然配列ＰＲＯをコードするＤＮＡと所望の配列同一性を有するＤＮＡは、この分野で知られた標準的な方法を用いて同定できる。
【０３５７】
実施例１４０：大腸菌におけるＰＲＯの発現
この実施例は、大腸菌における組み換え発現による所望のＰＲＯの非グリコシル化形態の調製を例示する。
ＰＲＯをコードするＤＮＡ配列は、選択されたＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位を持たなければならない。種々の発現ベクターが用いられる。好適なベクターの例は、ｐＢＲ３２２（大腸菌から誘導されたもの；Bolivar等, Gene, 2:95 (1977)参照）であり、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含む。ベクターは、制限酵素で消化され、脱リン酸される。ＰＣＲ増幅した配列は、次いで、ベクターに結合させる。ベクターは、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ｐｏｌｙｈｉｓリーダー（最初の６つのＳＴＩＩコドン、ｐｏｌｙｈｉｓ配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、特定のＰＲＯコード化領域、ラムダ転写終結区、及びａｒｇＵ遺伝子を含む。
ライゲーション混合物は、次いで、上掲のSambrook等に記載された方法を用いた選択した大腸菌の形質転換に使用される。形質転換体は、それらのＬＢプレートで成長する能力により同定され、次いで抗生物質耐性クローンが選択される。プラスミドＤＮＡが単離され、制限分析及びＤＮＡ配列分析で確認される。
選択されたクローンは、抗生物質を添加したＬＢブロスなどの液体培地で終夜成長させることができる。終夜培地は、続いて大規模培地の播種に用いられる。次に細胞を最適光学密度まで成長させ、その間に発現プロモーターが作動する。
更に数時間の培養の後、細胞を採集して遠心分離できる。遠心分離で得られた細胞ペレットは、この分野で知られた種々の試薬を用いて可溶化され、次いで可溶化ＰＲＯタンパク質を金属キレート化カラムを用いてタンパク質を緊密に結合させる条件下で精製した。
【０３５８】
以下の手法を用いて、大腸菌においてポリＨｉｓタグ形態でＰＲＯを発現させてもよい。ＰＲＯをコードするＤＮＡを選択したＰＣＲプライマーを用いて最初に増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位、及び効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムでの迅速な精製、及びエンテロキナーゼでのタンパク質分解的除去を与える他の有用な配列を含む。次いでＰＣＲ増幅された、ポリ-Ｈｉｓタグ配列を発現ベクターに結合させ、それを株５２（W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) cllpP(lacIq)）に基づく大腸菌宿主の形質転換に使用した。形質転換体は、最初に50mg/mlのカルベニシリンを含有するＬＢ中、30℃で振盪しながら3-5のＯ．Ｄ．６００に達するまで成長させた。ついで培地をＣＲＡＰ培地（3.57gの（ＮＨ４）２ＳＯ４、0.71gのクエン酸ナトリウム・2H2O、1.07gのＫＣｌ、5.36gのDifco酵母抽出物、500mL水中の5.36gのShefield hycase SF、並びに110mMのＭＰＯＳ、pH7.3、0.55%（w/v）のグルコース及び７ｍMのＭｇＳＯ４の混合で調製）中に50-100倍希釈し、30℃で振盪させながら約20-30時間成長させた。試料を取り出してＳＤＳ-ＰＡＧＥにより発現を確認し、バルク培地を遠心分離して細胞のペレットとした。細胞ペレットを精製及び再折りたたみまで凍結させた。
0.5から1Lの発酵（6-10gペレット）からの大腸菌ペーストを、7Mのグアニジン、20mMのトリス、pH8バッファー中で10容量（w/v）で再懸濁させた。固体硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々0.1M及び0.02Mとし、溶液を4℃で終夜撹拌した。この工程により、亜硫酸によりブロックされたシステイン残基を持つ変性タンパク質がもたらされた。溶液をBeckman Ultracentrifuge中で40,000rpmで30分間濃縮した。上清を金属キレートカラムバッファー（6Mのグアニジン、20mMのトリス、pH7.4）の3-5容量で希釈し、0.22ミクロンフィルターを通して濾過して透明化した。透明化抽出物を、金属キレートカラムバッファーで平衡化させた5mlのQiagen Ni-NTA金属キレートカラムに負荷した。カラムを50mMのイミダゾール（Calbiochem, Utrol grade）を含む添加バッファー、pH7.4で洗浄した。タンパク質を250mMのイミダゾールを含有するバッファーで溶離した。所望のタンパク質を含有する画分をプールし、4℃で保存した。タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて280nmにおけるその吸収により見積もった。
試料を、20mMのトリス、pH8.6、0.3MのＮａＣｌ、2.5Mの尿素、５ｍＭのシステイン、20mMのグリシン及び1mMのＥＤＴＡからなる新たに調製した再折りたたみバッファー中に徐々に希釈することによりタンパク質を再折りたたみさせた。リフォールディング容量は、最終的なタンパク質濃度が50〜100マイクログラム/mlとなるように選択した。リフォールディング溶液を4℃で12-36時間ゆっくり撹拌した。リフォールディング反応はＴＦＡを採取濃度0.4%（約３のｐＨ）で添加することにより停止させた。タンパク質をさらに精製する前に、溶液を0.22ミクロンフィルターを通して濾過し、アセトニトリルを最終濃度2-10%で添加した。再折りたたみされたタンパク質を、Poros R1/H逆相カラムで、0.1%ＴＦＡの移動バッファーと10〜80%のアセトニトリル勾配での溶離を用いてクロマトグラフにかけた。A280吸収を持つ画分のアリコートをＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分析し、相同な再折りたたみされたタンパク質を含有する画分をプールした。一般的に、殆どのタンパク質の正しく再折りたたみされた種は、これらの種が最もコンパクトであり、その疎水性内面が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているので、アセトニトリルの最低濃度で溶離される。凝集した種は通常、より高いアセトニトリル濃度で溶離される。タンパク質の誤って折りたたまれた形態を所望の形態から除くのに加えて、逆相工程は試料からエンドトキシンも除去する。
所望の折りたたまれたＰＲＯポリペプチドを含有する画分をプールし、溶液に向けた窒素の弱い気流を用いてアセトニトリルを除去した。タンパク質を、透析又は調製バッファーで平衡化したG25 Superfine（Pharmacia）樹脂でのゲル濾過及び滅菌濾過により、0.14Mの塩化ナトリウム及び4%のマンニトールを含む20mMのＨｅｐｅｓ、pH6.8に調製した。
ここに開示した多くのＰＲＯポリペプチドが上記のようにして成功裏に発現された。
【０３５９】
実施例１４１：哺乳動物細胞におけるＰＲＯポリペプチドの発現
この実施例は、哺乳動物細胞における組み換え発現によるＰＲＯのグリコシル化形態の調製を例示する。
発現ベクターとしてｐＲＫ５（1989年3月15日発行のEP 307,247参照）を用いた。場合によっては、ＰＲＯＤＮＡを選択した制限酵素を持つｐＲＫ５に結合させ、Sambrook等, 上掲に記載されたようなライゲーション方法を用いてＰＲＯＤＮＡを挿入させる。得られたベクターは、ｐＲＫ５−ＰＲＯと呼ばれる。
一実施態様では、選択された宿主細胞は２９３細胞とすることができる。ヒト２９３細胞（ATCC CCL 1573）は、ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分及び／又は抗生物質を添加したＤＭＥＭなどの媒質中で組織培養プレートにおいて成長させて集密化した。約10μｇのｐＲＫ５−ＰＲＯポリペプチドＤＮＡを約1μgのＶＡ  ＲＮＡ遺伝子コード化ＤＮＡ［Thimmappaya等, Cell, 31:543 (1982))］と混合し、500μlの1mMトリス-ＨＣｌ、0.1mMＥＤＴＡ、0.227MＣａＣｌ２に溶解させた。この混合物に、滴状の、500μlの50mMＨＥＰＥＳ（pH7.35）、280mMのＮａＣｌ、1.5mMのＮａＰＯ４を添加し、25℃で10分間析出物を形成させた。析出物を懸濁し、２９３細胞に加えて37℃で約4時間定着させた。培養培地を吸引し、2mlのＰＢＳ中20%グリセロールを30秒間添加した。２９３細胞は、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約5日間インキュベートした。
形質移入の約24時間後、培養培地を除去し、培養培地（のみ）又は200μCi/ml３５Ｓ−システイン及び200μCi/ml３５Ｓ−メチオニンを含む培養培地で置換した。12時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、15%ＳＤＳゲルに添加した。処理したゲルを乾燥させ、ＰＲＯポリペプチドの存在を現す選択された時間にわたってフィルムにさらした。形質転換した細胞を含む培地は、更なるインキュベーションを施し（無血清培地で）、培地を選択されたバイオアッセイで試験した。
これに換わる技術において、ＰＲＯは、Somparyac等, Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用いて２９３細胞に一過的に導入される。２９３細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、700μｇのｐＲＫ５−ＰＲＯＤＮＡを添加する。細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄した。ＤＮＡ−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で4時間インキュベートした。細胞を20%グリセロールで90秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、5μg/mlウシインシュリン及び0.1μg/mlウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入した。約4日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去した。次いで発現されたＰＲＯを含む試料を濃縮し、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって精製した。
他の実施態様では、ＰＲＯをＣＨＯ細胞で発現させることができる。ｐＲＫ５−ＰＲＯは、ＣａＰＯ４又はＤＥＡＥ−デキストランなどの公知の試薬を用いてＣＨＯ細胞に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地（のみ）又は３５Ｓ-メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。ＰＲＯポリペプチドの存在を同定した後、培養培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約6日間インキュベートし、次いで条件培地を収集する。次いで、発現されたＰＲＯを含む培地を濃縮して、選択した方法にとって精製することができる。
また、エピトープタグＰＲＯは、宿主ＣＨＯ細胞において発現させてもよい。ＰＲＯはｐＲＫ５ベクターからサブクローニングした。サブクローン挿入物は、次いで、ＰＣＲを施してバキュロウイルス発現ベクター中のポリ-ｈｉｓタグ等の選択されたエピトープタグを持つ枠に融合できる。ポリ-ｈｉｓタグＰＲＯ挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のためのＤＨＦＲ等の選択マーカーを含むＳＶ４０誘導ベクターにサブクローニングできる。最後に、ＣＨＯ細胞をＳＶ４０誘導ベクターで（上記のように）形質移入した。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。発現されたポリ-ｈｉｓタグＰＲＯを含む培養培地は、次いで濃縮し、Ｎｉ２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィー等の選択された方法により精製できる。
またＰＲＯは、一過性発現法によりＣＨＯ及び／又はＣＯＳ細胞で、他の安定な発現方法によりＣＨＯ細胞で発現させてもよい。
【０３６０】
ＣＨＯ細胞における安定な発現は以下の方法を用いて実施された。タンパク質は、それは対応するタンパク質の可溶化形態及び／又はポリ-Ｈｉｓタグ形態のコード化配列（例えば、細胞外ドメイン）がＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ２ドメインを含む定常領域配列に融合したＩｇＧ作成物（イムノアドヘシン）、又はポリ-Ｈｉｓタグ形態として発現された。
ＰＣＲ増幅に続いて、対応するＤＮＡを、Ausubel等, Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.26, John Wiley and Sons (1997)に記載されたような標準的技術を用いてＣＨＯ発現ベクターにサブクローニングした。ＣＨＯ発現ベクターは、対象とするＤＮＡの５’及び３’に適合する制限部位を有し、ｃＤＮＡの便利なシャトル化ができるように作成される。ベクターは、Lucas等, Nucl. Acids res. 24: 9, 1774-1779 (1996)に記載されたようにＣＨＯ細胞での発現を用い、対象とするｃＤＮＡ及びジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）の発現の制御にＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを用いる。ＤＨＦＲ発現は、形質移入に続くプラスミドの安定な維持のための選択を可能にする。
所望のプラスミドＤＮＡの12マイクログラムを、市販の形質移入試薬Superfect(登録商標)(Quiagen), Dosper(登録商標)及びFugene(登録商標)（Boehringer Mannheim）約一千万のＣＨＯ細胞に導入した。細胞は、上掲のLucas等に記載されているように成長させた。約3x10−７細胞を、下記のような更なる成長及び生産のためにアンプル中で凍結させた。
プラスミドＤＮＡを含むアンプルを水槽に配して解凍し、ボルテックスにより混合した。内容物を10mLの媒質を含む遠心管にピペットして、1000rpmで５分間遠心分離した。上清を吸引して細胞を10mLの選択培地（0.2μm濾過ＰＳ２０、5%の0.2μm透析濾過ウシ胎児血清を添加）中に懸濁させた。次いで細胞を90mLの選択培地を含む100mlスピナーに分けた1-2日後、細胞を150mLの選択培地を満たした250mLスピナーに移し、37℃でインキュベートした。さらに2-3日後、250mL、500mL及び2000mLのスピナーを3x10５細胞/mLで播種した。細胞培地を遠心分離により新鮮培地に交換し、生産培地に再懸濁させた。任意の適切なＣＨＯ培地を用いてもよいが、実際には1992年6月16日に発行された米国特許第5,122,469号に記載された生産培地を使用した。3Lの生産スピナーを1.2ｘ10６細胞/mLで播種した。0日目に、細胞数とｐＨを測定した。1日目に、スピナーをサンプルし、濾過空気での散布を実施した。2日目に、スピナーをサンプルし、温度を33℃に変え、500g/Lのグルコース及び0.6mLの10%消泡剤（例えば35%ポリジメチルシロキサンエマルション、Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion）の30mLとした。生産を通して、ｐＨは7.2近傍に調節し維持した。10日後、又は生存率が70%を下回るまで、細胞培地を遠心分離で回収して0.22μmフィルターを通して濾過した。濾過物は、4℃で貯蔵するか、即座に精製用カラムに負荷した。
【０３６１】
ポリ-Ｈｉｓタグ作成物について、タンパク質はNi-NTAカラム(Qiagen)を用いて精製した。精製の前に、イミダゾールを条件培地に5mMの濃度まで添加した。条件培地を、0.3MのＮａＣｌ及び5mMイミダゾールを含む20mMのＨｅｐｅｓ, pH7.4バッファーで平衡化した6mlのNi-NTAカラムに4-5ml/分の流速で4℃においてポンプ供給した。負荷後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を0.25Mイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて10mMのＨｅｐｅｓ、0.14MのＮａＣｌ及び4%のマンニトールを含む貯蔵バッファー中で25mlのG25 Superfine（Pharmacia）を用いて脱塩し、-80℃で貯蔵した。
イムノアドヘシン（Ｆｃ含有）作成物を以下のようにして条件培地から精製した。条件培地を、20mMのリン酸ナトリウムバッファー, pH6.8で平衡化した5mlのプロテインＡカラム（Pharmacia）に負荷した。負荷後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、100mMのクエン酸, pH3.5で溶離した。溶離したタンパク質は、1mlの画分を275μlの1Mトリスバッファー, pH9を含む管に回収することにより即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ-Ｈｉｓタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。均一性はＳＤＳポリアクリルアミドゲルで試験し、エドマン(Edman)分解によりＮ-末端アミノ酸配列決定した。
ここに開示したＰＲＯポリペプチドの多くが上記のようにして成功裏に発現された。
【０３６２】
実施例１４２：酵母菌でのＰＲＯの発現
以下の方法は、酵母菌中でのＰＲＯの組換え発現を記載する。
第１に、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターからのＰＲＯの細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。ＰＲＯをコードするＤＮＡ及びプロモーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してＰＲＯの細胞内発現を指示する。分泌のために、ＰＲＯをコードするＤＮＡを選択したプラスミドに、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターをコードするＤＮＡ、天然ＰＲＯシグナルペプチド又は他の哺乳動物シグナルペプチド、又は、例えば酵母菌アルファ因子分泌シグナル／リーダー配列、及び（必要ならば）ＰＲＯの発現のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる。
酵母菌株ＡＢ１１０等の酵母菌は、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、10%トリクロロ酢酸での沈降及びＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離で分析し、次いでクマシーブルー染色でゲルの染色をすることができる。
続いて組換えＰＲＯは、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。ＰＲＯを含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
ここに開示したＰＲＯポリペプチドの多くが上記のようにして成功裏に発現された。
【０３６３】
実施例１４３：バキュロウイルス感染昆虫細胞でのＰＲＯの発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中におけるＰＲＯの組換え発現を記載する。
ＰＲＯコードする配列を、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させた。このようなエピトープタグは、ポリ-ｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（ＩｇＧのＦｃ領域など）を含む。ｐＶＬ１３９３（Navogen）などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、ＰＲＯ又はＰＲＯコード化配列の所定部分、例えば膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列又はタンパク質が細胞外である場合の成熟タンパク質をコードする配列などが、５’及び３’領域に相補的なプライマーでのＰＣＲにより増幅される。５’プライマーは、隣接する（選択された）制限酵素部位を包含していてもよい。生産物は、次いで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGold(商品名)ウイルスＤＮＡ（Pharmingen）を、Spodoptera frugiperda（「Ｓｆ９」）細胞（ATCC CRL 1711）中にリポフェクチン（GIBCO-BRLから市販）を用いて同時形質移入することにより作成される。28℃で4-5日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'Reilley等, Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されているように実施した。
次に、発現されたポリ-ｈｉｓタグＰＲＯは、例えばＮｉ２＋−キレートアフィニティクロマトグラフィーにより次のように精製される。抽出は、Rupert等, Nature, 362:175-179 (1993)に記載されているように、ウイルス感染した組み換えＳｆ９細胞から調製した。簡単には、Ｓｆ９細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー（25mMのＨｅｐｅｓ、pH7.9；12.5mMのＭｇＣｌ２；0.1mM  ＥＤＴＡ；10%グリセロール；0.1%のＮＰ−４０；0.4MのＫＣｌ）中に再懸濁し、氷上で2回20秒間超音波処理した。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を負荷バッファー（50mMリン酸塩、300mMのＮａＣｌ、10%グリセロール、pH7.8）で50倍希釈し、0.45μmフィルターで濾過した。Ｎｉ２＋−ＮＴＡアガロースカラム（Qiagenから市販）を5mLの総容積で調製し、25mLの水で洗浄し、25mLの負荷バッファーで平衡させた。濾過した細胞抽出物は、毎分0.5mLでカラムに負荷した。カラムを、分画回収が始まる点であるＡ２８０のベースラインまで負荷バッファーで洗浄した。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー（50mMリン酸塩；300mMのＮａＣｌ、10%グリセロール、pH6.0）で洗浄した。Ａ２８０のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で0から500mMイミダゾール勾配で展開した。1mLの分画を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び銀染色又はアルカリホスファターゼ（Qiagen）に複合したＮｉ２＋−ＮＴＡでのウェスタンブロットで分析した。溶離したＨｉｓ１０−タグＰＲＯを含む画分をプールして負荷バッファーで透析した。
あるいは、ＩｇＧタグ（又はＦｃタグ）ＰＲＯの精製は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
ここに開示したＰＲＯポリペプチドの多くが上記のようにして成功裏に発現された。
【０３６４】
実施例１４４：ＰＲＯに結合する抗体の調製
この実施例は、ＰＲＯに特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば、Goding,上掲に記載されている。用いられ得る免疫原は、精製ＰＲＯ、ＰＲＯを含む融合タンパク質、細胞表面に組換えＰＲＯを発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
Ｂａｌｂ／ｃ等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に1-100マイクログラムで注入したＰＲＯ免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（Ribi Immunochemical Researh, Hamilton, MT）に乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。免疫化したマウスは、次いで10から12日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。抗-ＰＲＯ抗体の検出のためのＥＬＩＳＡアッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「ポジティブ（陽性）」な動物に、ＰＲＯ静脈内注射の最後の注入をすることができる。3から4日後、マウスを屠殺し、脾臓を取り出した。次いで脾臓細胞を（35%ポリエチレングリコールを用いて）、ＡＣＴＴから番号ＣＲＬ１５９７で入手可能なＰ３Ｘ６３ＡｇＵ．１等の選択されたマウス骨髄腫株化細胞に融合させた。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン）培地を含む96ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害した。
ハイブリドーマ細胞は、ＰＲＯに対する反応性についてのＥＬＩＳＡでスクリーニングされる。ＰＲＯに対するモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ（陽性）」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
陽性ハイブリドーマ細胞を同系のＢａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注入し、抗-ＰＲＯモノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインＡ又はプロテインＧへの親和性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
【０３６５】
実施例１４５：特異的抗体を用いたＰＲＯポリペプチドの精製
天然又は組換えＰＲＯポリペプチドは、この分野の種々の標準的なタンパク質精製方法によって精製できる。例えば、プロ-ＰＲＯポリペプチド、成熟ポリペプチド、又はプレ-ＰＲＯポリペプチドは、対象とするＰＲＯポリペプチドに特異的な抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫親和性カラムは抗-ＰＲＯポリペプチド抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂に共有結合させて作成される。
ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムでの沈殿又は固定化プロテインＡ（Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.）での精製のいずれかにより免疫血清から調製される。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿又は固定化プロテインＡでのクロマトグラフィーによりマウス腹水液から調製される。部分的に精製された免疫グロブリンは、ＣｎＢｒ-活性化セファロース(商品名)（Pharmacia LKB Biotechnology）等のクロマトグラフィー樹脂に共有結合される。抗体が樹脂に結合され、樹脂がブロックされ、誘導体樹脂は製造者の指示に従って洗浄される。
このような免疫親和性カラムは、可溶化形態のＰＲＯポリペプチドを含有する細胞からの画分を調製することによるＰＲＯポリペプチドの精製において利用される。この調製物は、洗浄剤の添加又はこの分野で公知の方法により微分遠心分離を介して得られる全細胞又は細胞成分画分の可溶化により誘導される。あるいは、シグナル配列を含む可溶化ＰＲＯポリペプチドは、細胞が成長する培地中に油様な量で分泌される。
可溶化ＰＲＯポリペプチド含有調製物は、免疫親和性カラムを通され、カラムはＰＲＯポリペプチドの好ましい吸着をさせる条件下（例えば、洗浄剤存在下の高イオン強度バッファー）で洗浄される。次いで、カラムは、抗体／ＰＲＯポリペプチド結合を分解する条件下（例えば、約2-3といった低ｐＨ、高濃度の尿素又はチオシアン酸イオン等のカオトロープ）で溶離され、ＰＲＯポリペプチドが回収される。
【０３６６】
実施例１４６：薬剤スクリーニング
本発明は、ＰＲＯポリペプチド又はその結合断片を種々の薬剤スクリーニング技術において使用することによる化合物のスクリーニングに特に有用である。そのような試験に用いられるＰＲＯポリペプチド又は断片は、溶液中の自由状態でも、固体支持体に固定されても、細胞表面に位置しても、細胞内に局在化していてもよい。薬剤スクリーニングの１つの方法は、ＰＲＯポリペプチド又は断片を発現する組換え核酸で安定に形質移入される真核生物又は原核生物宿主細胞を利用する。薬剤は、そのような形質移入細胞に対して、競合的結合アッセイにおいてスクリーニングされる。そのような細胞は、生存可能又は固定化形態のいずれかにおいて、標準的な結合アッセイに使用できる。例えば、ＰＲＯポリペプチド又は断片と試験される試薬の間での複合体形成を測定してよい。あるいは、試験する試薬によって生ずるＰＲＯポリペプチドとその標的細胞との間の複合体形成における減少を試験することもできる。
即ち本発明は、ＰＲＯポリペプチド関連疾患又は障害に影響を与えうる薬剤又は任意の他の試薬のスクリーニング方法を提供する。これらの方法は、その試薬をＰＲＯポリペプチド又は断片に接触させ、(I)試薬とＰＲＯポリペプチド又は断片との間の複合体の存在について、又は(ii)ＰＲＯポリペプチド又は断片と細胞との間の複合体の存在について検定することを含む。これらの競合結合アッセイでは、ＰＲＯポリペプチド又は断片が典型的には標識される。適切なインキュベーションの後、自由なＰＲＯポリペプチド又は断片を結合形態のものから分離し、自由又は未複合の標識の量が、特定の試薬がＰＲＯポリペプチドに結合する又はＰＲＯポリペプチド／細胞複合体を阻害する能力の尺度となる。
薬剤スクリーニングのための他の技術は、ポリペプチドに対して適当な結合親和性を持つ化合物についての高スループットスクリーニングを提供し、1984年9月13日に発行されたWO 84/03564に詳細に記載されている。簡単に述べれば、多数の異なる小型ペプチド試験化合物が、プラスチックピン等の固体支持体又は幾つかの他の表面上で合成される。ＰＲＯポリペプチドに適用すると、ペプチド試験化合物はＰＲＯポリペプチドと反応して洗浄される。結合したＰＲＯポリペプチドはこの分野で良く知られた方法により検出される。精製したＰＲＯポリペプチドは、上記の薬剤スクリーニング技術に使用するためにプレート上に直接被覆することもできる。さらに、非中和抗体は、ペプチドを捕捉し、それを固体支持体上に固定化するのに使用できる。
また、本発明は、ＰＲＯポリペプチドに結合可能な中和抗体がＰＲＯポリペプチド又はその断片について試験化合物と特異的に競合する競合薬剤スクリーニングアッセイも考慮する。この方法において、抗体は、ＰＲＯポリペプチドで、一又は複数の抗原決定基を持つ任意のペプチドの存在を検出するのに使用できる。
【０３６７】
実施例１４７：合理的薬剤設計
合理的薬剤設計の目的は、対象とする生物学的活性ポリペプチド（例えば、ＰＲＯポリペプチド）又はそれらが相互作用する小分子、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターの構造的類似物を製造することである。これらの例は、ＰＲＯポリペプチドのより活性で安定な形態又はインビボでＰＲＯポリペプチドに機能を促進又は阻害する薬剤の創作に使用できる（参考、Hodgson, Bio/Technology, 9: 19-21 (1991)）。
１つの方法において、ＰＲＯポリペプチド、又はＰＲＯポリペプチド-インヒビター複合体の三次元構造が、ｘ線結晶学により、コンピュータモデル化により、最も典型的には２つの方法の組み合わせにより決定する。分子の構造を解明し活性部位を決定するためには、ＰＲＯポリペプチドの形状及び電荷の両方が確認されなければならない。数は少ないが、ＰＲＯポリペプチドの構造に関する有用な情報が相同タンパク質の構造に基づいたモデル化によって得られることもある。両方の場合において、関連する構造情報は、類似ＰＲＯポリペプチド様分子の設計又は行こうなインヒビターの同定に使用される。合理的な薬剤設計の有用な例は、Braxton及びWells, Biochemistry, 31: 7796-7801 (1992)に示されているような向上した活性又は安定性を持つ分子、又はAthauda等, J. Biochem., 113: 742-746 (1993)に示されているような天然ペプチドのインヒビター、アゴニスト、又はアンタゴニストとして作用する分子を含む。
また、上記のような機能アッセイによって選択された標的特異的な抗体を単離しその結晶構造を解明することもできる。この方法は、原理的には、それに続く薬剤設計が基礎をおくことのできるファーマコア(pharmacore)を生成する。機能的な薬理学的に活性な抗体に対する抗-イディオタイプ抗体（抗-ids）を生成することにより、タンパク質結晶学をバイパスすることができる。鏡像の鏡像として、抗-idsの結合部位は最初のレセプターの類似物であると予測できる。抗-idは、次いで、化学的又は生物学的に製造したペプチドのバンクからペプチドを同定及び単離するのに使用できる。単離されたペプチドは、ファーマコアとして機能するであろう。
本発明により、十分な量のＰＲＯポリペプチドがＸ線結晶学などの分析実験を実施するために入手可能である。さらに、ここに提供したＰＲＯポリペプチドアミノ酸配列の知識は、ｘ線結晶学に換える、又はそれに加えるコンピュータモデル化技術で用いられる知識を提供する。
【０３６８】
実施例１４８：心臓新生児肥大の刺激（アッセイ１）
このアッセイは新生児心臓の肥大を刺激するＰＲＯポリペプチドの能力を測定するように設計されている。このアッセイで陽性と試験されるＰＲＯポリペプチドは様々な心不全疾患の治療上の処置に利用できることが期待される。
１日齢のHarlan Sprague Dawleyラットから筋細胞を得た。細胞（7.5x10４/mlで180μl、血清＜0.1%、新たに単離）をDMEM/F12＋4%FCSで予めコートした９６ウェルプレートに１日目に添加した。試験ＰＲＯポリペプチド又は成長培地のみ(ネガティブコントロール)を含有する試験試料(20μL/ウェル)を１日目にウェルに直接添加した。次いで２日目に最終濃度が１０−６ＭとなるようにＰＧＦ(20μL/ウェル)が加えられる。次いで４日目に細胞が染色され、５日目に視覚によりスコアをつけ、ここでサイズの増加しない細胞(ネガティブコントロールと比較)は０．０とスコアされ、サイズの小から中規模の増加を示した細胞(ネガティブコントロールと比較)は１．０とスコアされさらにサイズの大きな増大を示した細胞(ネガティブコントロールと比較)は２．０とスコアされる。このアッセイで陽性の結果としたのは、１．０又はそれ以上のスコアである。
次のポリペプチドはこのアッセイで陽性と試験された：ＰＲＯ１３１２
【０３６９】
実施例１４９：内皮細胞増殖の刺激（アッセイ８）
このアッセイは、本発明のＰＲＯポリペプチドが副腎皮質毛細管内皮細胞（ＡＣＥ）成長を刺激する能力を示すか否かを測定するように設計されている。このアッセイにおいて陽性と試験されたポリペプチドは、例えば創傷治癒、及びこれに類似のものを含み、血管新生が有益である症状や疾患の治療的処置において有用であると期待される（これらＰＲＯポリペプチドのアゴニストがそうあろうように）。このアッセイにおいて陽性と試験されたＰＲＯポリペプチドのアンタゴニストは、癌性腫瘍の治療的処置に対して有用であると期待される。
ウシ副腎皮質毛細管内皮（ＡＣＥ）細胞（初代培養からのもの、最大１２−１４継代）を９６ウェルのプレートにおいて１００マイクロリットル当たり５００細胞／ウェルでプレーティングした。アッセイ媒体は、低グルコースＤＭＥＭ、１０％子ウシ血清、２ｍＭグルタミン、及び１ｘペニシリン／ストレプトマイシン／ファンギゾンを含む。対照ウェルは以下を含む：（１)ＡＣＥ細胞無添加；（２）ＡＣＥ細胞のみ；（３）ＡＣＥ細胞＋ＶＥＧＦ(5 ng/ml)；及び（４）ＡＣＥ細胞＋ＦＧＦ(5 ng/ml)。次いで、対照及び試験試料（100マイクロリットル容量）をウェルに添加した（各々、1％、0.1％及び0.01％希釈）。細胞培地を３７℃／５％ＣＯ２で６−７日間インキュベートした。インキュべーションの後、ウェル中の培地を吸引して細胞をＰＢＳで１ｘ洗浄した。次いで、酸ホスファターゼ反応混合物（100マイクロリットル、0.1Ｍ酢酸ナトリウム, ｐＨ5.5，0.1％ トリトンX-100、10mMのリン酸ｐ-ニトロフェニル）を各ウェルに添加した。３７℃で２時間のインキュベーション後に、１０マイクロリットルの１ＮのＮａＯＨの添加により反応を停止させた。光学密度（ＯＤ）を４０５ｎｍでマイクロタイタープレートで測定した。
ＰＲＯポリペプチドの活性は、（１）細胞のみのバックグラウンドに対する、及び（２）ＶＥＧＦによる最大刺激に対する（酸ホスファターゼ活性、ＯＤ405nmで測定した）増殖の増加倍数として計算した。最大刺激に対する活性の規準としてＶＥＧＦ（3−10ng/ml）及びＦＧＦ（1−5ng/ml）を使用した。アッセイの結果は、観察された刺激がバックグラウンドに対して≧５０%増加している場合に「陽性」と考えた。ＶＥＧＦ（5 ng/ml）対照は１％希釈において１．２４倍の刺激を与え；ＦＧＢ（5 ng/ml）対照は１％希釈において1.46倍の刺激を与えた。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった：ＰＲＯ１１５４及びＰＲＯ１１８６。
【０３７０】
実施例１５０：血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）刺激の内皮細胞成長の増殖を阻害するＰＲＯポリペプチドの能力(アッセイ９）
ＶＥＧＦに刺激された内皮細胞の増殖を阻害する種々のＰＲＯポリペプチドの能力を試験した。このアッセイにおいてポリペプチド試験がポジティブであると哺乳類の内皮細胞の阻害に有用であり、このような効果は、例えば腫瘍成長の阻害する等の恩恵となる。
特に、ウシ副腎皮質性毛細管内皮（ＡＣＥ）細胞（一次培地から、最大12-14継代）を９６-ウェルの１００マイクロタイタープレートに500細胞/ウェルで蒔いた。アッセイ用培地は、低グルコースＤＭＥＭ、10%のウシ血清、2mMのグルタミン、1xペニシリン/ストレプトマイシン/フンギゾンを含有する。対照ウェルは次のものを含む：(１)ＡＣＥ細胞を添加しないもの；(２)ＡＣＥ細胞単独；(３)ＡＣＥ細胞プラス5ng/mlのＦＧＦ；(４)ＡＣＥ細胞プラス3ng/mlのＶＥＧＦ；(５)ＡＣＥ細胞プラス3ng/mlのＶＥＧＦプラス1ng/mlのＴＧＦ-ベータ；及び(６)ＡＣＥ細胞プラス3ng/mlのＶＥＧＦプラス5ng/mlのＬＩＦ。ついで、試験用試料であるポリ-hisタグＰＲＯポリペプチド(100マイクロタイター容量中)をウェル(それぞれ１％、０．１％及び０．００１％に希釈)の添加した。細胞を３７℃／５％のＣＯ２で６−７日インキュベートした。インキュベート後、ウェルの培地を吸引し、細胞を１ｘＰＢＳで洗浄した。酸ホスファターゼ反応混合物（100マイクロタイター、0.1Mの酢酸ナトリウム、pH5.5、0.1%のトリトンX-100、10mMのｐ-ニトロフェニルホスフェート）を各ウェルに添加した。３７℃で２時間インキュベートした後、１０マイクロタイターの1NのＮａＯＨの添加で反応を停止した。光学密度(ＯＤ)をマイクロプレートリーダーで405nmにおいて測定した。
ＰＲＯポリペプチドの活性を、刺激無しの細胞に対するＶＥＧＦ（３ng/ml）刺激増殖のパーセント阻害(ＯＤ405nmにおける酸ホスファターゼ活性を測定することにより決定)として算出した。ＴＧＦ-βはＶＥＧＦ刺激ＡＣＥ細胞増殖を７０−９０%阻止するので、1ng/mlで活性参照として使用した。結果は、ＰＲＯポリペプチドの癌治療、特に腫瘍新脈管形成の阻害における有用性を示している。数値(相対阻害度)は刺激なし細胞に対するＰＲＯポリペプチドによるＶＥＧＦ刺激増殖のパーセント阻害を算出し、ついで1ng/ml濃度でのＴＧＦ-βが、ＶＥＧＦ刺激細胞増殖を７０−９０％阻止することが知られていることで得られたパーセント阻害をパーセンテージに除することで決定される。結果は、ＰＲＯポリペプチドが内皮細胞成長のＶＥＧＦ刺激を３０％又はそれ以上(相対阻害度30％又はそれ以上)を阻害したときにポジティブと考える。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイにおいてポジティブであった：ＰＲＯ８１２。
【０３７１】
実施例１５１：混合リンパ球反応(ＭＬＲ）アッセイにおける刺激性活性（アッセイ２４）
この実施例は、本発明のあるペプチドが、刺激されたＴ−リンパ球の増殖の刺激剤として活性であることを示す。リンパ球の増殖を刺激する化合物は、免疫応答の増強が有益な 場合、治療的に有益に有用である。治療剤は、本発明のポリペプチドのアンタゴニストの形をとり、例えば、ポリペプチドに対するマウス−ヒトキメラ、ヒト化又はヒト抗体である。
このアッセイの基本的プロトコールは、Current Protocols in Immunology, unit3.12；J E Coligan, A M Kruisbeek, D H Marglies, E M Shevach, W Strober編, 国立衛生研究所, John Wiley &amp;amp; Sons, Incから出版に記載されている。
さらに具体的には、このアッセイの一変形例では、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)を個々の哺乳類、例えばヒトのボランティアからロイコフェレーシスにより単離する(一人のドナーには刺激物ＰＢＭＣを供給し、他のドナーにはレスポンダーＰＢＭＣを供給する)。所望するならば、単離後に、細胞をウシ胎児血清及びＤＭＳＯ中で凍結する。凍結細胞をアッセイ用培地(37℃、5％ＣＯ２)で一晩解凍し、ついで洗浄し、アッセイ用培地(RPMI；10％ウシ胎児血清、1％ペニシリン／ストレプトマイシン、1％グルタミン、1％HEPES、1％非必須アミノ酸、1％ピルビン酸塩)に３ｘ１０６細胞/mlに再懸濁させる。刺激物ＰＢＭＣは細胞を光にさらす(約3000ラド)ことにより調製される。
このアッセイは混合物：
100:1の１％又は0.1％に希釈された試験料試料、
50:1の光にさらされた刺激物細胞、及び
50:1のレスポンダーＰＢＭＣ細胞、
を三重ウェルに蒔くことにより調製される。100マイクロタイターの細胞培養培地又は100マイクロタイターのCD4-IgGを対照体として使用する。ついで、ウェルを３７℃、５％ＣＯ２で４日間インキュベートする。５日目、各ウェルにトリチウム化チミジン（1.0 mC/ウェル；Amersham）を適用する。６時間後、細胞を３回洗浄し、ついで標識の取込を評価する。
このアッセイの他の変形例では、ＰＢＭＣをBalb/cマウス及びC57B6マウスの脾臓から単離する。細胞を、アッセイ用培地（RPMI；１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％グルタミン、１％HEPES、１％非必須アミノ酸、１％ピルバート）において新たに回収された脾臓から顕微鏡検査用に細かく切断し、リンパライトＭ(Lympholyte M）（Organon Teknika）上にこれらの細胞をオーバーレイすることによりＰＭＢＣを単離し、2000 rpmで２０分間遠心分離し、集め、アッセイ用培地における単核細胞層を洗浄し、アッセイ用培地に１ｘ１０７細胞/mlになるように細胞を再懸濁させる。ついで、このアッセイは上記のように行われる。
対照体に対する増加が陽性であると考えられ、好ましくは180％以上又は180％と同等の増加が好ましい。しかしながら、対照体より大きい全ての値は、試験用タンパク質について刺激効果を示す。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった：ＰＲＯ８２６、ＰＲＯ１０６８、ＰＲＯ１１８４、ＰＲＯ１３４６及びＰＲＯ１３７５。
【０３７２】
実施例１５２：網膜ニューロン生存(アッセイ５２）
この実施例は種々のＰＲＯポリペプチドが網膜ニューロン細胞の生存の促進において有効性を有することを示し、それ故に、例えば網膜色素変性症、ＡＭＤ等による哺乳類の視力喪失の治療を含む網膜疾患又は損傷の治療的処置に有用であることを示す。
妊娠７日のＳＤラット胎児（混合集団：グリア及び網膜ニューロン型）をＣＯ２麻酔に続いて断頭により屠殺し、無菌条件下で眼を取り出した。神経網膜を色素上皮から切除し、他の眼組織をＣａ２＋、Ｍｇ２＋無しのＰＢＳ中の0.25%トリプシンを用いて単細胞懸濁物中に解離させた。網膜を３７℃で７−１０分間インキュベートし、その後1mlのダイズトリプシンインヒビターを添加することによりトリプシンを不活性化した。細胞を、Ｎ２を添加し、特異的な試験ＰＲＯポリペプチド有り又は無しのDMEM/F12中、９６-ウェルプレートにウェル当たり100,000細胞で蒔いた。全ての実験について、細胞は5%ＣＯ２の水飽和雰囲気下、３７℃で成長させた。培地中で２−３日後に細胞をカルセインＡＭで染色し、次いで4%のパラホルムアルデヒドで固定し、全細胞カウントの測定のためにＤＡＰＩで染色した。全細胞（蛍光）は、ＣＣＤカメラ及びMacIntosh用ＮＩＨ画像ソフトウェアを用いて20X対物倍率で定量化した。ウェルの視野は無作為に選択した。
種々の濃度のＰＲＯポリペプチドの効果は、培地中２−３日でのカルセインＡＭポジティブ細胞の合計数を、培地中２−３日のＤＡＰＩ標識細胞の合計数で除することにより計算した。３０％を越える生存をポジティブと考える。
以下のＰＲＯポリペプチドが、このアッセイで０．０１％−１．０％の範囲のポリペプチド濃度の使用でポジティブであった：ＰＲＯ８２８、ＰＲＯ８２６、ＰＲＯ１０６８及びＰＲＯ１１３２。
【０３７３】
実施例１５３：杆状体光受容体細胞の生存(アッセイ５６)
このアッセイは、本発明の所定のポリペプチドが杆状体光受容体細胞の生存／増殖を高めるように作用し、よって、例えば色素性網膜炎、ＡＭＤ等による哺乳類の視力喪失の治療を含む網膜疾患又は損傷の治療的処置に有用であることを示す。
妊娠７日のSprague Dawleyラット胎児（混合集団：グリア及び網膜ニューロン細胞型）をＣＯ２麻酔に続いて断頭により屠殺し、無菌条件下で眼を取り出した。神経網膜を色素上皮及び他の眼組織から切除し、ついでＣａ２＋、Ｍｇ２＋無しのＰＢＳ中の0.25%トリプシンを用いて単細胞懸濁物中に解離させた。網膜を３７℃で７−１０分間インキュベートし、その後1mlのダイズトリプシンインヒビターを添加することによりトリプシンを不活性化した。細胞を、Ｎ２を添加したDMEM/F12中、９６-ウェルプレートにウェル当たり100,000細胞で蒔いた。全ての実験について、細胞は5%ＣＯ２の水飽和雰囲気下、３７℃で成長させた。培地中で２−３日後に細胞を4%のパラホルムアルデヒドで固定し、次いでセルトラッカーグリーンＣＭＦＤＡ染色した。Rho 4D2（腹水又はＩｇＧ1:100）、可視色素ロドプシンに対するモノクローナル抗体を、間接的免疫蛍光法による杆状体光受容体の検出に使用した。結果は％生存：培地中２−３日のカルセイン−ロドプシンポジティブ細胞の全数を、培地中２−３日でのカルセイン−ロドプシンポジティブ細胞の全数で除するものとして計算する。全細胞（蛍光）は、ＣＣＤカメラ及びMacIntosh用ＮＩＨ画像ソフトウェアを用いて20X対物倍率で定量化した。ウェルの視野は無作為に選択した。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった：ＰＲＯ５３６、ＰＲＯ９４３、ＰＲＯ８２８、ＰＲＯ８２６、ＰＲＯ１０６８及びＰＲＯ１１３２。
【０３７４】
実施例１５４：内皮細胞におけるｃ-ｆｏｓの誘導（アッセイ３４）
このアッセイはＰＲＯポリペプチドが内皮細胞においてｃ-ｆｏｓを誘導する能力を示すか否かを決定するために設計されている。このアッセイで陽性と試験されたＰＲＯポリペプチドは、症状や疾患の治療上の処置に役立ち、その脈管形成は例えば創傷治癒、及びその様なもの(これらのＰＲＯポリペプチドのアゴニストのような)を含むものに有用である。このアッセイで陽性と試験されたＰＲＯポリペプチドは癌性腫瘍の治療上の処置に役立つことが期待される。
成長培地（50%のハムのＦ１２ｗ／ｏＧＨＴ：低グルコース、及びグリシンなしの50%ＤＭＥＭ：ＮａＨＣＯ３、1%グルタミン、10mMのＨＥＰＥＳ、10%のＦＢＳ、10ng/mlのｂＦＧＦ）中のヒト静脈臍静脈内皮細胞（HUVEC, Cell Systems）を1x10４細胞／ウェルの細胞密度で９６ウェルマクロタイタープレートにプレーティングした。プレーティングの次の日、成長培地を除き、細胞を100μl／ウェルの試験試料とコントロール（ポジティブコントロール：成長培地；ネガティブコントロール：10mMのＨＥＰＥＳ、140mMのＮａＣｌ、4%（w/v）マンニトール、pH6.8）で処理することにより、細胞を飢餓させた。細胞を5%ＣＯ２中で37℃において30分間インキュベートした。試料を取り除いて、ｂＤＮＡキットプロトコール（Chiron Diagnostics, cat.#6005-037）の最初の部分に従った。ここで、下記の各大文字の試薬／バッファーはキットから利用可能であった。
簡単には、試験に必要なＴＭ溶菌バッファー(TM Lysis Buffer)及びプローブの量を製造者により提供された情報に基づいて計算した。適当な量の解凍プローブをＴＭ溶菌バッファーに添加した。捕獲ハイブリッド形成バッファー(Capture Hybridization Buffer)を室温まで温めた。ｂＤＮＡ条片を金属条片ホルダーにセットアップし、100μｌの捕獲ハイブリッド形成バッファーを必要な各ｂ-ＤＮＡウェルに添加し、少なくとも30分インキュベートした。細胞内の試験プレートをインキュベータから取り除き、真空マニフォールドを使用して培地を穏やかに除いた。マイクロタイタープレートの各ウェルに100μｌのプローブを伴う溶菌ハイブリッド形成バッファーを各ｂ-ＤＮＡウェルにピペットで素早く添加した。ついで、プレートを15分間55℃でインキュベートした。インキュベーターからの取り出し、マイクロタイターアダプターヘッドを備えたボルテックスミキサーにプレートを配し、1分の間、#2の設定でボルテックスした。80μlの溶菌液を取り除き、捕獲ハイブリッド形成バッファーを含むｂＤＮＡウェルに添加し、ピペットで上下して混合した。プレートを少なくとも16時間の間53℃でインキュベートした。
次の日に、ｂＤＮＡキットプロトコールの第２の部分に従った。すなわち、プレートをインキュベーターから取り除き、ベンチに配置して10分間冷却した。必要な添加の容積は製造者により適用された情報に基づいて計算した。ＡＬハイブリッド形成バッファー中に1:100の希釈のアンプリファイアー濃縮物（Amplifier Concentrate）（20fm/μl）を作成することによりアンプリファイアー作用液を調製した。ハイブリダイゼーション混合物はウォシュＡで２回洗浄された。50μlのアンプリファイアー作用液がそれぞれのウェルに加えられ、該ウェルは５３℃で３０分でインキュベートされた。ついで、プレートをインキュベーターから取り除いて10分間冷却した。標識プローブ作用液を、ＡＬハイブリッド形成バッファー中に1:100の希釈で標識濃縮物（40pmoles/μl）を作成することにより調製した。10分の冷却期間後、アンプリファイアーハイブリッド形成混合物を除去し、プレートを洗浄剤Ａで2回洗浄した。50μlの標識プローブ作用液を各ウェルに添加し、ウェルを53℃で15分間インキュベートした。10分間の冷却後、基質を室温まで温めた。アッセイに必要な各モルの基質に3μlの基質エンハンサーを添加して、プレートを10分間冷却し、標識ハイブリッド形成混合物を取り除き、プレートを洗浄剤Ａで2回、洗浄剤Ｄで3回洗浄した。50μlのエンハンサーを伴う基質溶液を各ウェルに添加した。プレートを37℃で30分間インキュベートし、ＲＬＵを適当な照度計で読みとった。
複製を平均化し変動係数を決定した。ネガティブコントロール（上述のＨＥＰＥＳバッファー）値に対する増加倍数の活性の測定は化学発光単位（ＲＬＵ）によって示された。結果を下記の表９に示し、ネガティブコントロール値に対して少なくとも２倍の値を示す試料は陽性と考えた。ネガティブコントロール＝1.00%希釈で1.00RLU。ポジティブコントロール＝1.00%希釈で8.39RLU。
次のポリペプチドはこのアッセイで陽性と試験された：ＰＲＯ５３５、ＰＲＯ８２６、ＰＲＯ８１９、ＰＲＯ１１２６、ＰＲＯ１１６０及びＰＲＯ１３８７。
【０３７５】
実施例１５５：混合リンパ球反応(ＭＬＲ)における阻害活性アッセイ(アッセイ６７)
この実施例は、本発明の一又は複数のポリペプチドが刺激されたＴリンパ球の増殖阻害剤として活性であることを示す。リンパ球の増殖を阻害する化合物は、免疫反応の抑制が好ましい治療において有用である。
このアッセイの基本的プロトコールは、Immunology, unit3.12；J E Coligan, A M Kruisbeek, D H Marglies, E M Shevach, W Strober編, 国立衛生研究所, John Wiley & Sons, Incから出版のCurrent Protocolsに記載されている。
さらに、このアッセイの一変形例では、末梢血液単核細胞（PBMC）を個々の哺乳類、例えばヒトのボランティアからロイコフェレーシスにより単離する（一人のドナーには刺激物PBMCを供給し、他のドナーにはレスポンダーPBMCを供給する）。所望するならば、単離後に、細胞をウシ胎児血清及びＤＭＳＯ中で凍結する。凍結細胞をアッセイ用培地（37℃、5％ＣＯ２）で一晩解凍し、ついで洗浄し、アッセイ用培地（RPMI；10％ウシ胎児血清、1％ペニシリン／ストレプトマイシン、1％グルタミン、1％HEPES、1％非必須アミノ酸、1％ピルビン酸塩）に３ｘ１０６細胞/mlに再懸濁させる。刺激物ＰＢＭＣは細胞を光にさらす（約3000ラド）ことにより調製される。
このアッセイは混合物：
100:1の１％又は0.1％に希釈された試験料試料、
50:1の光にさらされた刺激物細胞、及び
50:1のレスポンダーＰＢＭＣ細胞、
を三重ウェルに蒔くことにより調製される。100マイクロタイターの細胞培養培地又は100マイクロタイターのCD4-IgGを対照体として使用する。ついで、ウェルを３７℃、５％ＣＯ２で４日間インキュベートする。５日目、各ウェルにトリチウム化チミジン（1.0mC/ウェル；Amersham）を適用する。６時間後、細胞を３回洗浄し、ついで標識の取込を評価する。
このアッセイの他の変形例では、ＰＢＭＣをBalb/cマウス及びC57B6マウスの脾臓から単離する。細胞を、アッセイ用培地（RPMI；10％ウシ胎児血清、1％ペニシリン／ストレプトマイシン、1％グルタミン、1％HEPES、1％非必須アミノ酸、1％ピルビン酸塩）において新たに回収された脾臓から顕微鏡検査用に細かく切断し、リンパライトＭ（Lympholyte M）（Organon Teknika）上にこれらの細胞をオーバーレイすることによりＰＭＢＣを単離し、2000rpmで２０分間遠心分離し、集め、アッセイ用培地における単核細胞層を洗浄し、アッセイ用培地に１ｘ１０７細胞/mlになるように細胞を再懸濁させる。ついで、このアッセイは上記のように行われる。
任意に以下の対照体が減少することは、阻害用化合物についてのポジティブな結果であると考えられ、８０％未満の減少が好ましい。しかしながら、任意の値が対照体未満であるなら、試験用タンパク質について阻害効果を示す。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった：ＰＲＯ１１１４、ＰＲＯ８３６、ＰＲＯ１１５９、ＰＲＯ１３１２、ＰＲＯ１１９２、ＰＲＯ１１９５及びＰＲＯ１３８７。
【０３７６】
実施例１５６：マウス腎メサンギウム細胞増殖アッセイ(アッセイ９２）
このアッセイ３７は、本発明のあるペプチドが、哺乳類の腎メサンギウム細胞の増殖を誘導するように作用し、それ故にバーガー病又はシェーンライン−ヘノーホ紫斑病、セリアック病、疱疹状皮膚炎又はクローン病に関連する他の腎障害のようなメサンギウム細胞の機能低下と関連する腎疾患の治療に有用である。このアッセイは以下のようにおこなわれる。１日目、マウス腎メサンギウム細胞を、９６ウェルプレート上の成長培地(ダルベッコの改変イーグル培地及びハムF12培地の3:1混合、95％ウシ胎児血清、5％14mM HEPES補充）にプレートし、一晩生育させる。２日目には、ＰＲＯポリペプチドを無血清培地で二つの濃度(１％及び５％）に希釈し、細胞へ添加する。対照試料は無血清培地である。４日目には、２０μlのCell Titer 96 Aqueous one solution reagent(Progema)を各々のウェルへ添加し、比光分析反応を２時間に渡り継続させる。そして、吸光度を490nmで測定した。このアッセイにおける陽性は、少なくとも対照試料の示度よりも１５％上の吸光度示度を与える全てのものである。
以下の試験ポリペプチドが、このアッセイでポジティブであった：ＰＲＯ８１９、ＰＲＯ８１３及びＰＲＯ１０６６。
【０３７７】
実施例１５７：周皮細胞c-fos誘導(アッセイ９３）
このアッセイは、本発明の所定のポリペプチドが周皮細胞におけるc-fosの発現を誘発するように作用し、よって特定の種類の周皮細胞結合腫瘍の診断用マーカーとして有用であるばかりでなく、周皮細胞結合腫瘍の治療的処置に有用であると予期されるアンタゴニストを生じせしめることを示す。特に１日目に、周皮細胞をVEC Technologiesから得、５ｍｌの培地以外をフラスコから取り出す。２日目に周皮細胞をトリプシン化し、洗浄し、スピンさせ、ついで９６ウェルプレートに蒔く。７日目に培地を取り出し、周皮細胞を１００μlのＰＲＯポリペプチドテスト用試料及び対照体（正の対照体＝DEM＋５％血清+/-500ng/mlのPDGF；負の対照体＝プロテイン３２）で処理する。複製を平均し、SD/CVを決定する。蛍光ルミネセンス単位（ＲＬＵ）照度計リーディングバース頻度により示されたプロテイン３２値を越える折り畳み増加（バッファー対照）をヒストグラム上にプロットし、上記のプロテイン３２値を２倍越えると、アッセイについてポジティブであると考えられる。ＡＳＹマトリックス：成長培地＝低グルコースＤＭＥＭ＝２０％ＦＢＳ＋１ｘペンストレップ（pen strep）＋１Ｘフンギゾン（fungizone）。アッセイ用培地＝低グルコースＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳ。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった：ＰＲＯ９４３及び８１９。
【０３７８】
実施例１５８：初期ラット脂肪細胞によるグルコース又はＦＦＡ取り込みに影響を与えるＰＲＯポリペプチドの検出(アッセイ９４）
このアッセイは、ＰＲＯポリペプチドが脂肪細胞によるグルコース又はＦＦＡ取りみに影響を及ぼす能力を示すかどうかを決定するために設計されている。このアッセイにおいて陽性と評価されたＰＲＯポリペプチドは、例えば肥満、糖尿病又は高或いは低インシュリン血症を含む脂肪細胞によるグルコース取り込みの刺激又は阻害である疾患の治療上の処置にとって有用であると期待される。
９６ウェルフォーマットにおいて、アッセイされるＰＲＯポリペプチドは初期ラット脂肪細胞へ加えられ、そして一晩インキュベートされる。４及び１６時間目に、グリセロール、グルコース及びＦＦＡ取り込みのアッセイのための試料が取られる。１６時間のイキュベーション後、インシュリンを培地へ加え、４時間のインキュベートをおこなう。この時、試料が取られて、グリセロール、グルコース及びＦＦＡの取り込みが測定される。ＰＲＯポリペプチドが無くインシュリンを含む培地を、陽性の基準コントロールとして使用する。試験されるＰＲＯポリペプチドがグルコース又はＦＦＡ取り込みを刺激或いは阻害した場合、インシュリンのコントロールより１．５倍より高い又は０．５倍より低いと、結果は陽性と記録される。              
以下のＰＲＯポリペプチドが、このアッセイにおいてグルコース及び／又はＦＡＡの取り込みの刺激剤として陽性と評価された：ＰＲＯ１１１４、ＰＲＯ１００７、ＰＲＯ１０６６、ＰＲＯ８４８、ＰＲＯ１１８２、ＰＲＯ１１９８、ＰＲＯ１１９２、ＰＲＯ１２７１、ＰＲＯ１３７５及びＰＲＯ１３８７。
以下の試験ＰＲＯポリペプチドが、このアッセイにおいてグルコース及び／又はＦＡＡの取り込みの阻害剤として陽性であった：ＰＲＯ１１８４、ＰＲＯ１３６０、ＰＲＯ１３０９、ＰＲＯ１１５４、ＰＲＯ１１８１、ＰＲＯ１１８６、ＰＲＯ１１６０及びＰＲＯ１３８４。
【０３７９】
実施例１５９：軟骨細胞再分化アッセイ(アッセイ１１０）
このアッセイは、本発明のあるペプチドが軟骨細胞の再分化を誘導し、それ故に例えば、スポーツ傷害及び関節炎などの種々の骨及び／又は軟骨組織疾患の治療に有用であると期待されることを示す。このアッセイは、以下のようにおこなわれる。ブタ軟骨細胞を、４−６ヶ月齢の雌ブタの中手指節関節の関節軟骨より一晩に渡るコラゲナーゼ消化によって単離する。そして、単離された細胞を、１０％ＦＢＳ及び４μg/mlゲンタマイシンを含むハムＦ−１２へ２５，０００細胞／ｃｍ２の割合で蒔く。培地は、３日ごとに換えられ、そして細胞を血清を含まない１００μlの同じ培地へ５，０００細胞／ウェルとなるよう９６ウェルプレートへ接種し、１００μlの試験ＰＲＯポリペプチド、５ｎＭスタウロスポリン(正の対照）又は培地のみ(負の対照）を添加して最終容量を２００μｌ／ウェルとする。５日間のインキュベーション後、各ウェルの写真を撮り、軟骨細胞の分化段階を測定する。軟骨細胞の再分化が負の対照よりも正の対照へ似ている場合には、アッセイにおいて陽性の結果が生じたとした。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった：ＰＲＯ１２８２、ＰＲＯ１３１０、ＰＲＯ６１９、ＰＲＯ９４３、ＰＲＯ８２０、ＰＲＯ１０８０、ＰＲＯ１０１６、ＰＲＯ１００７、ＰＲＯ１０５６、ＰＲＯ７９１、ＰＲＯ１１１１、ＰＲＯ１１８４、ＰＲＯ１３６０、ＰＲＯ１３０９、ＰＲＯ１１０７、ＰＲＯ１１３２、ＰＲＯ１１３１、ＰＲＯ８４８、ＰＲＯ１１８１、ＰＲＯ１１８６、ＰＲＯ１１５９、ＰＲＯ１３１２、ＰＲＯ１１９２及びＰＲＯ１３８４。
【０３８０】
実施例１６０：軟骨細胞増殖アッセイ（アッセイ１１１）
このアッセイは、本発明のＰＲＯポリペプチドが培養において軟骨細胞の増殖を阻害する能力を示すか否かを測定するように設計されている。このアッセイにおいて陽性と試験されたポリペプチドは、例えばスポーツ傷害及び関節炎などの種々の骨及び／又は軟骨組織疾患の治療的処置に対して有用であると期待される。
ブタ軟骨細胞を、４−６ヶ月の年長雌ブタの中手指節関節の関節軟骨より一晩に渡るコラゲナーゼ消化によって単離した。そして、単離された細胞を25,000細胞/cm２の割合で、１０％ＦＢＳ及び４μg/mlゲンタマイシンを含むハムＦ−１２へ接種する。培地は３日ごとに換えられ、細胞は25,000細胞/cm２となるように５日ごとに再接種された。１２日目に、細胞を5,000細胞／ウェルの割合の血清を含まない100μlの同じ培地の９６ウェルプレートへ接種し、無血清培地(負の対照）、スタウロスポリン(最終濃度５nM；正の対照）又は試験ＰＲＯポリペプチドを添加して200μl/ウェルの最終容量とした。３７℃の５日間の後、20μlのアラマーブルー(Alamar blue)を各ウェルへ添加し、プレートをさらに３時間、３７℃でインキュベートした。そして、各ウェルの蛍光を測定した(Ｅｘ：530 nm；Ｅｍ：590 nm）。バックグラウンドを得るために、200μlの無血清培地を含むプレートの蛍光を測定した。このアッセイの陽性の結果は、ＰＲＯポリペプチド処理試料の蛍光が負の対照のそれよりも正の対照のそれのような場合において得られる。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった：ＰＲＯ１３１０、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ１３１２、ＰＲＯ１１９２及びＰＲＯ１３８７。
【０３８１】
実施例１６１：膵臓β細胞前駆体の増殖の誘導(アッセイ１１７）
このアッセイは、本発明のあるペプチドが膵臓β細胞前駆体の増殖を誘導し、それ故に糖尿病を含む哺乳類における種々のインシュリン欠乏状態の治療に有用であると期待されることを示す。このアッセイは、以下のようにおこなわれた。このアッセイは、マウス胎児膵臓細胞の一次培養を使用し、一次計測は、β細胞前駆体又は成熟β細胞のいずれかを示すマーカーの発現の変化である。マーカー発現は、実時間数量化ＰＣＲ(RT-PCR、real time quatitative PCR）によって測定する：評価されるマーカーは、Pdx1と呼ばれる転写因子である。
膵臓は、Ｅ１４胚(CD1マウス）から解剖された。そして、膵臓はF12/DMEＭ中のコラゲナーゼ／デスパーゼ(dispase）で３７℃、４０−６０分で消化された(コラゲナーゼ／デスパーゼ(dispase）、1.37mg/ml、べーリンガーマンハイム、#1097113）。次に、消化物を等量の５％ＢＳＡによって中和し、細胞を、一度、RPMI1640で洗浄する。第１日目、細胞を１２ウェルの組織培養プレート(ＰＢＳ中の２０μl/mlのラミニン、べーリンガーマンハイム、#124317によって,前被覆された）へ接種する。１−２の胚からの膵臓の細胞を一つのウェルに分布させる。この一次培養の為の培地は、14F/1640である。第２日目には、培地を取り除き、RPMI/1640によって付着細胞を洗浄する。試験されるタンパク質に加えて、２mlの最小培地を添加する。第４日目には、培地を取り除き、細胞よりＲＮＡを調製し、マーカー発現を実数時間数量化逆転写ＰＣＲ(real time quantitative RT-PRC）によって分析する。タンパク質は、関連するβ細胞マーカーの発現が未処理対照に比較して増加した場合、このアッセイにおいて活性があるものと考える。
14F/1640は、以下のもの加えたRPMI1640である：
グループＡ1:1000
グループＢ1:1000組み換えヒトインシュリン10μg/ml
アプロチニン(50μg/ml）1:2000（べーリンガーマンハイム#981532）
ウシ下垂体抽出物(ＢＰＥ）60μg/ml
ゲンタマイシン100ng/ml
グループＡ：（10ml PBS中）
トランスフェリン、100mg(シグマ  T2252）
上皮細胞成長因子、100μg(ＢＲＬ  100004）
トリヨードチロニン、５ｘ10−６Ｍの10μl(シグマ  T5516）
エタノールアミン、10−１Ｍの100μl(シグマ E0135）
ホスホエタノールアミン、10−１Ｍの100μl(シグマ  P0503）
セレニウム、10−１Ｍの4μl(Aesar #12574）        
グループＣ：（10ml 100％エタノール中）
ヒドロコルチゾン、５ｘ10−３Ｍの2μl(シグマ #H0135）
プロジェステロン、１ｘ10−３Ｍの100μl（シグマ #P6149）
フォルスコリン、20mMの500μl(カルバイオケム #344270）
最小培地：
RPMI1640プラストランスフェリン(10μg/ml）、インシュリン(1μg/ml）、ゲンタマイシン（100ng/ml）、アプロチニン(50μg/ml）及びＢＰＥ(15μg/ml）。
限定培地：
RPMI1640プラストランスフェリン(10μg/ml）、インシュリン(1μg/ml）、ゲンタマイシン（100ng/ml）及びアプロチニン(50μg/ml）
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった：ＰＲＯ１３１０、ＰＲＯ１１８８、ＰＲＯ１１３１及びＰＲＯ１３８７。
【０３８２】
実施例１６２：骨格筋のグルコース又はＦＦＡ取り込みに影響を与えるポリペプチドの検出(アッセイ１０６）
このアッセイは、ＰＲＯポリペプチドが骨格筋のグルコース又はＦＦＡ取り込に影響を及ぼす能力を示すかどうかを決定するために設計されている。このアッセイにおいて陽性と評価されたＰＲＯポリペプチドは、例えば糖尿病又は高或いは低インシュリン血症を含む骨格筋によるグルコース取り込みの刺激又は阻害である疾患の治療上の処置にとって有用であると期待される。
９６ウェルフォーマットにおいて、アッセイされるＰＲＯポリペプチドは初期ラット分化型骨格筋へ加えられ、そして一晩インキュベートされる。ついで、ＰＲＯポリペプチド及び+/-インシュリンを含む新鮮な培地がウェルに加えられる。その後、試料培地は、骨格筋によるグルコース又はＦＦＡ取り込みを測定するために監視される。イシュリンは、骨格筋によるグルコース又はＦＦＡ取り込みを刺激し、ＰＲＯポリペプチドを含まないインシュリンを含む培地を、陽性の基準コントロール及びスコーリング制限として使用する。試験されるＰＲＯポリペプチドがグルコース又はＦＦＡ取り込みを刺激或いは阻害した場合、インシュリンのコントロールより1.5倍より高い又は0.5倍より低いと、結果は陽性と記録される。
以下の試験ＰＲＯポリペプチドが、このアッセイにおいてグルコース及び／又はＦＡＡの取り込みの刺激剤又は阻害剤として陽性であった：ＰＲＯ３５８、ＰＲＯ１０１６、ＰＲＯ１００７、ＰＲＯ８２６、ＰＲＯ１０６６、ＰＲＯ１０２９及びＰＲＯ１３０９。
【０３８３】
実施例１６３：赤芽球細胞系における胎児ヘモグロビン誘発(アッセイ１０７)
このアッセイは、成人のヘモグロビンから赤芽球細胞系における胎児ヘモグロビンへの切替を誘発する、ＰＲＯポリペプチドの能力をスクリーニングするのに有用である。このアッセイにおいて試験する分子がポジティブであると、種々のサラセミア等の、多様な哺乳類ヘモグロビン関連疾患を治療的に処置するのに有用であることが期待される。このアッセイは以下のようにして行われる。赤芽球細胞を標準的成長培地において、９６ウェルフォーマットに1000細胞／ウェルで蒔く。0.2％又は２％の濃度でＰＲＯポリペプチドを成長培地に添加し、細胞を３７℃で５日間インキュベートする。正の対照体として、細胞を１００μMのヘミンで処理し、負の対照体として、細胞を処理しない。５日後、細胞溶解物を調製し、ガンマグロブリンの発現について分析する（胎児用マーカー）。このアッセイにおいてポジティブとは、ガンマグロブリンレベルが負の対照体の少なくとも２倍であることである。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった：ＰＲＯ１１１４、ＰＲＯ８２６、ＰＲＯ１０６６、ＰＲＯ８４４、ＰＲＯ１１９２及びＰＲＯ１３５８。
【０３８４】
実施例１６４：膵臓β細胞前駆体分化の誘導（アッセイ８９）
このアッセイは、本発明のあるペプチドが膵臓β細胞前駆体の分化を誘導し、それ故に糖尿病を含む哺乳類における種々のインシュリン欠乏状態の治療に有用であると期待されることを示す。このアッセイは、以下のようにおこなわれた。このアッセイは、マウス胎児膵臓細胞の一次培養を使用し、一次計測は、β細胞前駆体又は成熟β細胞のいずれかを示すマーカーの発現の変化である。マーカー発現は、実時間数量化ＰＣＲ(RTQ-PCR、real time quatitative PCR）によって測定される：評価されるマーカーは、インシュリンである。
膵臓は、Ｅ１４胚(CD1マウス）から解剖される。そして、膵臓はF12/DMEＭ中のコラゲナーゼ／デスパーゼ(dispase）で３７℃、４０−６０分で消化される(コラゲナーゼ／デスパーゼ(dispase）、1.37mg/ml、べーリンガーマンハイム、#1097113）。次に、消化物を等量の５％ＢＳＡによって中和し、細胞を、一度、RPMI1640で洗浄する。第１日目、細胞を１２ウェルの組織培養プレート(ＰＢＳ中の20μl/mlのラミニン、べーリンガーマンハイム、#124317によって,前被覆された）へ接種する。１−２の胚からの膵臓の細胞を一つのウェルに分布させる。この一次培養の為の培地は、14F/1640である。第２日目には、培地を取り除き、RPMI/1640によって付着細胞を洗浄する。試験されるタンパク質に加えて、２mlの最小培地を添加する。第４日目には、培地を取り除き、細胞よりＲＮＡを調製し、マーカー発現を実数時間数量化逆転写ＰＣＲ(real time quantitative RT-PRC）によって分析する。タンパク質は、関連するβ細胞マーカーの発現が未処理対照に比較して増加した場合、このアッセイにおいて活性があるものと考える。
14F/1640(Gibco）は、以下のものを加えたRPMI1640：
グループＡ1:1000
グループＢ1:1000
組み換えヒトインシュリン10μg/ml
アプロチニン(50μg/ml）1:2000（べーリンガーマンハイム#981532）
ウシ下垂体抽出物(ＢＰＥ）60μg/ml
ゲンタマイシン100 ng/ml
グループＡ：（10 mlＰＢＳ中）
トランスフェリン、100 mg(シグマ  T2252）
上皮細胞成長因子、100μg(ＢＲＬ  100004）
トリヨードチロニン、５ｘ１０−６Ｍの10μl(シグマ  T5516）
エタノールアミン、10−１Ｍの100μl(シグマ  E0135）
ホスホエタノールアミン、10−１Ｍの100μl(シグマ  P0503）
セレニウム、10−１Ｍの4μl(Aesar #12574）        
グループＣ：（10 ml 100％エタノール中）
ヒドロコルチゾン、５ｘ１０−３Ｍの2μl(シグマ #H0135）
プロジェステロン、1 x 10−３Ｍの100μl（シグマ #P6149）
フォルスコリン、20 mMの500μl(カルバイオケム  #344270）
最小培地：
RPMI1640プラストランスフェリン(10μg/ml）、インシュリン(1μg/ml）、ゲンタマイシン（100ng/ml）、アプロチニン(50μg/ml）及びＢＰＥ(15μg/ml）。
限定培地：
RPMI1640プラストランスフェリン(10μg/ml）、インシュリン(1μg/ml）、ゲンタマイシン（100 ng/ml）及びアプロチニン(50μg/ml）。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった：ＰＲＯ１１８８、ＰＲＯ１１３２、ＰＲＯ１１３１及びＰＲＯ１１８１。
【０３８５】
実施例１６５：皮膚血管透過性アッセイ(アッセイ６４）
このアッセイは、本発明のあるポリペプチドが免疫系を刺激し、哺乳類の注射の部位での単核球、好酸球及びＰＭＮ浸潤を誘導することによる炎症を誘導することを示す。免疫応答を刺激する化合物は、免疫応答が有益である場合には治療的に有用である。この皮膚血管透過性アッセイは，以下のようにおこなわれる。３５０ｇ又はそれ以上の無毛モルモットにケタミン（70−80mg/kg）と５mg/kgのキシラジンを筋肉内投与して麻酔をかける(ＩＭ）。本発明の精製ポリペプチド又は条件付試験試料を、注射部位当たり１００μlで試験動物の背の皮膚に皮内注射する。動物当たりおよそ１０−３０、好ましくは１６−２４の注射部位を有する可能性がある。ついで１μlのエバンスブルー染料（１％の緩衝化された生理的食塩水）を心臓内注射する。そして、注射部位の斑点を注射後１及び６時間後に測定する(mm直径）。動物は、注射から６時間後に犠牲となった。各々の皮膚注射部位は、生検されてホルマリンで固定される。そして、この皮膚は、組織病理学的評価のために調整される。各々の部位は、皮膚への炎症細胞湿潤のために評価される。可視的な炎症細胞湿潤の部位は、陽性とスコアされる。炎症細胞は、好中球、好酸球、単核球又はリンパ性である可能性がある。少なくとも、注射部位の最小血管周囲湿潤物は陽性とスコアされ、注射の部位の湿潤物でないものは、陰性とスコアされる。
以下の試験ＰＲＯポリペプチドが、このアッセイにおいて陽性であった：ＰＲＯ１００７、ＰＲＯ１３５８及びＰＲＯ１３７５。
【０３８６】
実施例１６６：内皮細胞アポトーシスの誘導（ELISA）（アッセイ１０９）
内皮細胞においてアポトーシスを誘導するＰＲＯポリペプチドの能力を、100ng/mlのＶＥＧＦ、0.1％のＢＳＡ、１Ｘpenn/strepを補充した０％血清培地中で９６ウェルフォーマットを使用して、ヒト静脈の臍静脈内皮細胞（HUVEC, Cell Systems）中で試験した。使用した９６ウェルプレートはFalconにより製造された（番号３０７２）。９６ウェルのコーティングは、ＰＢＳ溶液中の0.2％ゼラチン100μlで＞３０分間ゼラチン化を起こすことにより調製した。ゼラチン混合物を全部吸引した後、１０％血清含有培地中で最終濃度２ｘ１０４細胞/mlの最終濃度−ウェル当たり100μl容量でプレーティングした。対象とするＰＲＯポリペプチドを含有する試験試料を添加する前に細胞を２４時間成長させた。
全てのウェルに、100ng/mlのＶＥＧＦ、0.1％のＢＳＡ、１Ｘpenn/strepを補充した０％血清培地中100μlを添加した。ＰＲＯポリペプチドを含有する試験試料を1％、0.33％及び0.11％の希釈で三つ組で添加した。細胞の無いウェルをブランクとして使用し、細胞だけのウェルをネガティブ対照として使用した。ポジティブ対照として、３ｘ原液のスタウロスポリンの50μlの１：３の連続希釈物を使用した。ＥＬＩＳＡに先立って、細胞を２４から３５時間インキュベートした。
ＥＬＩＳＡを、Boehringer マニュアル［Boehringer, 細胞死検出ELISA plus, カタログ番号1920685］に従ってアポトーシス調製溶液のレベルを決定するのに使用した。試料調製：９６ウェルプレートを１krpmで１０分間スピン沈降させ（200g）、高速反転により上清を除去し、プレートをペーパータオル上に上下逆に置いて残りの液体を除去した。各ウェルに、100μlの１X溶菌バッファーを添加して振盪させずに30分間室温でインキュベートした。プレートを１krpmで１０分間スピン沈降させ、20μlの溶菌液（細胞質画分）をストレプトアビジン被覆ＭＴＰに移した。80μlの免疫試薬混合物を各ウェルで20μl溶菌液に加えた。ＭＴＰを粘着性ホイルでカバーし、それを軌道振盪機（200 rpm）に配することにより２時間室温でインキュベートした。２時間後、上清を吸引により除去し、ウェル当たり250μlの１Xインキュべーションバッファーで３回ウェルをリンスした（吸引で除去した）。各ウェルに基質溶液を添加し（100μl）、軌道振盪機で室温において250 rpmで、光度測定分析に十分な発色がされるまでインキュベートした（約10−20分後）。参照波長492nmとして405nmでプレートを読むのに９６ウェルリーダーを用いた。ＰＩＮ３２（対照バッファー）について得られたレベルを100％に設定した。レベル＞130％の試料をアポトーシス誘導についてのポジティブと考えた。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった：ＰＲＯ８４４。
【０３８７】
実施例１６７：モルモット血管漏洩(アッセイ３２）
このアッセイは本発明のＰＲＯポリペプチドが血管透過性を誘導する能力を示すかどうかを決定するためのものである。このアッセイにおいて陽性と評価されたＰＲＯポリペプチドは、例えば肥大した局所免疫系細胞浸潤から恩恵を受ける状態を含む肥大血管透過性によって益を受ける状態の治療上の処置にとって有用であると期待される。
３５０ｇ又はそれ以上の無毛モルモットにケタミン（70−80mg/kg）と５mg/kgのキシラジンを筋肉内投与して麻酔をかける。ＰＲＯ３０２ポリペプチド又は試験ポリペプチドを含まない生理緩衝液を含む試験試料を、注射部位当たり１００μlで試験動物の背の皮膚に皮内注射する。動物当たりおよそ１６−２４の注射部位があった。ついで１mlのエバンスブルー染料（ＰＢＳ中１％）を心臓内注射する。化合物に対する皮膚血管透過性応答（すなわち、注射部位の斑点）について、試験動物の投与１、６及び２４時間後に注射部位からの青色の漏出の直径（mm）を測定することで視覚によりスコアをつける。注射部位の青さのmm直径を観察し、血管漏出の重症度と共に記録する。少なくとも５mmの直径の斑点は、精製タンパク質を試験する場合はアッセイでは陽性であると考えられ、血管漏出又は透過性を誘導する能力を示している。７mmの直径より大きな応答は、条件付けられた培地試料に対して陽性であると考えられる。0.1μg/100μlのヒトＶＥＧＦが正の対照として使用され、４−８mm直径の応答を誘導した。
以下の試験ＰＲＯポリペプチドが、このアッセイにおいて陽性であった：ＰＲＯ１１５５。
【０３８８】
実施例１６８：マウスMesengial細胞阻害アッセイ（アッセイ１１４）
このアッセイは、本発明のＰＲＯポリペプチドが培養においてマウスMesengial細胞の増殖を阻害する能力を示すか否かを測定すように設計されている。このアッセイにおいて陽性と試験されたポリペプチドは、例えば嚢胞性腎形成不全、多発性嚢胞腎疾患、又はMesengial細胞の異常増殖に関連する他の腎疾患、腎腫瘍、及びそれに類似のものなどのMesengial細胞増殖の阻害が有益である症状や疾患の治療的処置に対して有用であると期待される。    
１日目、マウスMesengial細胞を、96ウェルプレート上の成長培地(ダルベッコの改変イーグル培地及びハムF12培地の3:1混合、95％ウシ胎児血清、5％14mM HEPES補充）にプレートし、一晩生育させた。２日目には、ＰＲＯポリペプチドを無血清培地で二つの異なった濃度(1％及び0.1％）に希釈し、細胞へ添加した。対照試料はＰＲＯポリペプチドが無添加の成長培地である。４８時間に渡り細胞をインキュベーションした後、20μlのCell Titer 96 Aqueous one solution reagent(Progema)を各々のウェルへ添加し、比光分析反応を２時間に渡り継続させた。そして、吸光度を490 nmで測定した。このアッセイにおける陽性は、少なくとも対照試料の示度よりも10％上の吸光度示度を与える全てのものである。
以下の試験ポリペプチドが、このアッセイでポジティブであった：ＰＲＯ１１９２、ＰＲＯ１１９５。
【０３８９】
実施例１６９：インビトロ抗増殖性アッセイ(アッセイ１６１)
種々のＰＲＯポリペプチドの抗増殖活性を、本質的にSkehan等, J. Natl. Cancer Inst. 82: 1107-1112 (1990)に記載されたスルホローダミンＢ（ＳＲＢ）染料結合アッセイを用いる国立癌研究所（ＮＣＩ）の実験的、疾患指向的インビトロ抗癌薬発見アッセイにおいて測定した。このアッセイで用いた６０の腫瘍細胞系（「ＮＣＩパネル」）、並びにそれらの維持およびインビトロ培養の条件は、Monks等, J. Natl. Cancer Inst. 83: 757-766 (1991)に記載されている。このスクリーニングの目的は、異なる型の腫瘍に対する試験化合物の細胞毒性及び／又は細胞分裂停止活性を最初に評価することである（Monks等, 上掲; Boyd, Cancer: Princ. Pract. Oncol. Update 3(10): 1-12[1989]）。
約６０のヒト腫瘍細胞系からの細胞をトリプシン／ＥＤＴＡ（Gibco）で回収し、１回洗浄し、ＩＭＥＭ中に再懸濁し、それらの生存を測定した。細胞懸濁物をピペット（100μL容量）で別の９６-ウェルマイクロタイタープレートに添加した。６日インキュベーションの細胞密度は２日インキュベーションより小さく過剰成長は防止された。播種後、安定化のために３７℃で２４時間プレインキュベーションした。目的とする試験濃度の２倍希釈をゼロ時に100μlのアリコートにマイクロタイタープレートウェルに添加した（1:2希釈）。試験化合物を２分の５log希釈（1000〜100,000倍）で評価した。インキュベーションは5%ＣＯ２雰囲気および100%湿度で２日および６日実施した。
インキュベーション後、培地を除去し、細胞を10%トリクロロ酢酸の0.1mlで４０℃において固定した。プレートを脱イオン水で５回洗浄し、乾燥させ、1%酢酸に溶解した0.4%スルホローダミンＢ染料（Sigma）の0.1mlで３０分間染色し、1%酢酸で４回洗浄して非結合染料を除去し、乾燥させ、染色物を10mMトリス塩基［トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン］, pH10.5の0.1mlで５分間抽出した。スルホローダミンＢの492nmにおける吸収（ＯＤ）を、コンピュータ接続96-ウェルマイクロタイタープレートリーダーを使用して測定した。
試験試料は、一又は複数の濃度で少なくとも50%の成長阻害を示すときにポジティブと考える。このアッセイにおいてポジティブを示したＰＲＯポリペプチドは、表７に示されており、略語は以下の通りである：
ＮＳＣＬ＝非小細胞肺癌腫
ＣＮＳ＝中枢神経系
【０３９０】
0005512073.tif 000023
【０３９１】
0005512073.tif 000024
【０３９２】
0005512073.tif 000025
これらのアッセイの結果は、ポジティブと試験されるＲＰＯポリペプチドが、多くの異なる腫瘍細胞型の腫瘍性成長を抑制するのに役立ち、その治療に役立ちうることを示している。これらのＰＲＯポリペプチドに対する抗体は、これらの有用なポリペプチドの親和性精製に役立つ。これらのＰＲＯポリペプチドをコードする核酸は、これらのポリペプチドの組換え生産に役立つ。
【０３９３】
実施例１７０：腫瘍の遺伝子増幅
この実施例は、種々のＰＲＯポリペプチドをコードする遺伝子が或る種のヒト癌のゲノムで増幅されることを示す。増幅は遺伝子産物の過剰発現を伴い、ＰＲＯポリペプチドが結腸、肺及び他の癌等の或る種の癌において治療的介入の有用な標的であることを示している。治療薬はＰＲＯポリペプチドコード化遺伝子のアンタゴニスト、例えばマウス-ヒトキメラ、ＰＲＯポリペプチドに対するヒト化又はヒト抗体の形態をとりうる。
スクリーニングの出発物質は種々の癌から単離したゲノムＤＮＡである。ＤＮＡは、定量的、例えば蛍光定量的に正確である。ネガティブ対照として、ＤＮＡを１０の正常健常個体からＤＮＡを単離し、それをプールして健常個体における遺伝子コピーのアッセイ対照として使用した（示さず）。５' ヌクレアーゼアッセイ（例えばTaqMan(商品名））及び実時間定量的ＰＣＲ（例えば、ABI Prizm 7700 Sequence Detection System(商品名）(Perkin Elmer, applied Biosystems Division, Foster City, CA)）を、或る種の癌で潜在的に増幅される遺伝子の発見に使用した。結果は、ＰＲＯポリペプチドがスクリーニングした肺及び結腸癌において過剰発現されたか否かの決定に用いた。原発性肺癌は、表８に示してあるように、個々の腫瘍の型及び段階から得た。表８の原発性腫瘍の命名に用いた省略形の説明及び本実施例を通して言及されている原発性腫瘍と細胞株は、下記に示されている。
TaqMan（商品名）の結果はデルタ（Δ）ＣＴ単位で報告した。１単位は１ＰＣＲサイクル又は正常に対して約２倍の増幅に相当し、２単位は４倍、３単位は８倍等々に相当する。定量化はプライマー及びＰＲＯポリペプチドコード化遺伝子から誘導したTaqMan(商品名）蛍光を用いて得た。最も独特の核酸配列を含むと思われ、スプライシングされたイントロンを最も持たないと思われるＰＲＯポリペプチドの領域、例えば３' -非翻訳領域がプライマー誘導に好ましい。ＰＲＯポリペプチドの遺伝子増幅分析に使用されたプライマー及びプローブ(正、逆及びプローブ）のための配列は、以下の通りであった：
【０３９４】
ＰＲＯ２９０(DNA35680-1212):
35680.tm.p:
5'-CCACCAATGGCAGCCCCACCT -3' （配列番号：428）
35680.tm.f:
5'-GACTGCCCTCCCTGCCA-3'（配列番号：429）
35680.tm.r:
5'-CAAAAAGCCTGGAAGTCTTCAAAG-3'（配列番号：430）
ＰＲＯ３４１(DNA26288-1239)：
26288.tm.f1:
5'-CAGCTGGACTGCAGGTGCTA-3'（配列番号：431）
26288.tm.r1:
5'-CAGTGAGCACAGCAAGTGTCCT-3'（配列番号：432）
26288.tm.p1:
5'-GGCCACCTCCTTGAGTCTTCAGTTCCCT-3'（配列番号：433）
ＰＲＯ５３５(DNA49143-1429）：
49143.tm.f1:
5'-CAACTACTGGCTAAAGCTGGTGAA-3'（配列番号：434）
49143.tm.r1:
5'-CCTTTCTGTATAGGTGATACCCAATGA-3'（配列番号：435）
49143.tm.p1:
5'-TGGCCATCCCTACCAGAGGCAAAA-3'（配列番号：436）
ＰＲＯ６１９(DNA49821-1562）：
49821.tm.f1:
5'-CTGAAGACGACGCGGATTACTA-3'（配列番号：437）
49821.tm.r1:
5'-GGCAGAAATGGGAGGCAGA-3'（配列番号：438）
49821.tm.p1:
5'-TGCTCTGTTGGCTACGGCTTTAGTCCCTAG-3'（配列番号：439）
ＰＲＯ８０９(DNA57836-1338）：
57836.tm.f1:
5'-AGCAGCAGCCATGTAGAATGAA-3'（配列番号：440）
57836.tm.r1:
5'-AATACGAACAGTGCACGCTGAT-3'（配列番号：441）
57836.tm.p1:
5'-TCCAGAGAGCCAAGCACGGCAGA-3'（配列番号：442）
ＰＲＯ８３０(DNA56866-1342):
56866.tm.f1:
5'-TCTAGCCAGCTTGGCTCCAATA-3'（配列番号：443）
56866.tm.r1:
5'-CCTGGCTCTAGCACCAACTCATA-3'（配列番号：444）
56866.tm.p1:
5'-TCAGTGGCCCTAAGGAGATGGGCCT-3'（配列番号：445）
ＰＲＯ８４８(DNA59839-1461):
59839.tm.f1:
5'-CAGGATACAGTGGGAATCTTGAGA -3'（配列番号：446）
59839.tm.r1:
5'-CCTGAAGGGCTTGGAGCTTAGT-3'  （配列番号：447）
59839.tm.p1:
5'-TCTTTGGCCATTTCCCATGGCTCA-3'（配列番号：448）
ＰＲＯ９４３(DNA52192-1369):
52192.tm.f1:
5'-CCCATGGCGAGGAGGAAT-3'（配列番号：449）
52192.tm.r1:
5'-TGCGTACGTGTGCCTTCAG-3'（配列番号：450）
52192.tm.p1:
5'-CAGCACCCCAGGCAGTCTGTGTGT-3' （配列番号：451）
ＰＲＯ１００５(DNA57708-1411):
57708.tm.f1:
5'-AACGTGCTACACGACCAGTGTACT-3' （配列番号：452）
57708.tm.r1:
5'-CACAGCATATTCAGATGACTAAATCCA-3'（配列番号：453）
57708.tm.p1:
5'-TTGTTTAGTTCTCCACCGTGTCTCCACAGAA-3'（配列番号：454）
ＰＲＯ１００９(DNA57129-1413):
57129.tm.f1:
5'-TGTCAGAATGCAACCTGGCTT-3'（配列番号：455）
57129.tm.r1:
5'-TGATGTGCCTGGCTCAGAAC-3'（配列番号：456）
57129.tm.p1:
5'-TGCACCTAGATGTCCCCAGCACCC-3' （配列番号：457）
ＰＲＯ１０９７(DNA59841-1460):
59841.tm.f1:
5'-AAGATGCGCCAGGCTTCTTA-3'（配列番号：458）
59841.tm.r1:
5'-CTCCTGTACGGTCTGCTCACTTAT-3'（配列番号：459）
59841.tm.p1:
5'-TGGCTGTCAGTCCAGTGTGCATGG-3'（配列番号：460）
ＰＲＯ１１０７(DNA59606-1471):
59606.tm.f1:
5'-GCATAGGGATAGATAAGATCCTGCTTTAT-3'（配列番号：461）
59606.tm.r1:
5'-CAAATTAAAGTACCCATCAGGAGAGAA-3'（配列番号：462）
59606.tm.p1:
5'-AAGTTGCTAAATATATACATTATCTGCGCCAAGTCCA-3'（配列番号：463）
ＰＲＯ１１１１(DNA58721-1475):
58721.tm.f2:
5'-GTGCTGCCCACAATTCATGA-3' （配列番号：464）
58721.tm.p2:
5'-GTCCTTGGTATGGGTCTGAATTATAT-3'  （配列番号：465)
58721.tm.r2:
5'-ACTCTCTGCACCCCACAGTCACCACTATCTC-3'（配列番号：466）
ＰＲＯ１１５３(DNA59842-1502):
59842.tm.f1:
5'-CTGAGGAACCAGCCATGTCTCT-3' （配列番号：467）
59842.tm.r1:
5'-GACCAGATGCAGGTACAGGATGA-3'（配列番号：468）
59842.tm.p1:
5'-CTGCCCCTTCAGTGATGCCAACCTT-3'（配列番号：469）
ＰＲＯ１１８２(DNA59848-1512):
59848.tm.f1:
5'-GGGTGGAGGCTCACTGAGTAGA-3'（配列番号：470）
59848.tm.r1:
5'-CAATACAGGTAATGAAACTCTGCTTCTT-3'  （配列番号：471）
59848.tm.p1:
5'-TCCTCTTAAGCATAGGCCATTTTCTCAGTTTAGACA-3'（配列番号：472）
ＰＲＯ１１８４(DNA59220-1514):
59220.tm.f1:
5'-GGTGGTCTTGCTTGGTCTCAC-3'（配列番号：473）
59220.tm.r1:
5'-CCGTCGTTCAGCAACATGAC-3'（配列番号：474）
59220.tm.p1.
5'-ACCGCCTACCGCTGTGCCCA-3'（配列番号：475）
ＰＲＯ１１８７(DNA62876-1517):
62876.tm.f1:
5'-CAGTAAAACCACAGGCTGGATTT-3'（配列番号：476）
62876.tm.r1:
5'-CCTGAGAGCAAGAAGGTTGAGAAT-3'  （配列番号：477）
62876.tm.p1:
5'-TAGACAGGGACCATGGCCCGCA-3' （配列番号：478）
ＰＲＯ１２８１(DNA59820-1549):
59820.tm.f1:
5'-TGGGCTGTAGAAGAGTTGTTG-3' （配列番号：479）
59820.tm.r1:
5'-TCCACACTTGGCCAGTTTAT-3'   （配列番号：480）
59820.tm.p1:
5'-CCCAACTTCTCCCTTTTGGACCCT-3'（配列番号：481）
ＰＲＯ１１１２(DNA57702-1476):
57702.tm.f1:
5'-GTCCCTTCACTGTTTAGAGCATGA-3' （配列番号：482）
57702.tm.r1:
5'-ACTCTCCCCCTCAACAGCCTCCTGAG-3' （配列番号：483）
57702.tm.p1:
5'-GTGGTCAGGGCAGACCTTT-3'  （配列番号：484）
ＰＲＯ１１８５(DNA62881-1515):
62881.tm.f1:
5'-ACAGATCCAGGAGAGACTCCACA-3'（配列番号：485）
62881.tm.r1:
5'-AGCGGCGCTCCCAGCCTGAAT-3'（配列番号：486）
62881.tm.p1:
5'-CATGATTGGTCCTCAGTTCCATC-3' (配列番号：487）
ＰＲＯ１２４５(DNA64884-1527):
64884.tm.f1:
5'-ATAGAGGGCTCCCAGAAGTG -3'（配列番号：488）
64884.tm.p1:
5'-CAGGGCCTTCAGGGCCTTCAC-3'（配列番号：489）
64884.tm.r1:
5'-GCTCAGCCAAACACTGTCA-3'（配列番号：490）
64884.tm.f2:
5'-GGGGCCCTGACAGTGTT-3'（配列番号：491）
64884.tm.p2:
5'-CTGAGCCGAGACTGGAGCATCTACAC-3'（配列番号：492）
64884.tm.r2:
5'-GTGGGCAGCGTCTTGTC-3'（配列番号：493）
【０３９５】
５' ヌクレアーゼアッセイ反応は蛍光ＰＣＲベースの技術であり、実時間での増幅監視のためのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素の５' エキソヌクレアーゼ活性を使用する。ＰＣＲ反応に典型的な単位複製配列の生成に２つのオリゴヌクレオチドプライマー(正［.f］及び逆［.r］）を使用した。第３のオリゴヌクレオチド、又はプローブ(.p）は、２つのＰＣＲプライマーの間に位置する核酸配列を検出するために設計された。プローブはＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素により非伸展性であり、レポーター蛍光染料及び消光剤蛍光染料で標識される。２つの染料がプローブ上に接近して位置する場合、レポーター染料からのレーザー誘導発光は消光染料によって消光される。増幅反応の間、プローブはＴａｑＤＮＡポリメラーゼ酵素によりテンプレート依存的方式で切断される。得られたプローブ断片は溶液中に解離し、放出されたレポーター染料からのシグナルは第２のフルオロホアからの消光効果を受けない。レポーター染料の一分子は、新たに合成された各分子について標識され、非消光レポーター染料の検出がデータの定量的解釈の基礎を提供する。
５' ヌクレアーゼ法は、ABI Prism 7700TM配列検出などの実時間定量的ＰＣＲ装置で実施される。系は温度サイクル器、レーザー、電荷結合装置（ＣＣＤ）カメラ及びコンピュータからなる。系は温度サイクル器上で96-ウェルでの試料を増幅させる。増幅中に、レーザー誘導蛍光シグナルは光ファイバーケーブルで９６ウェルに集められ、ＣＣＤで検出される。系は装置の実行及びデータの分析のためのソフトウェアを含む。
５' ヌクレアーゼアッセイデータは、最初はＣｔ又は境界サイクルで表現される。これは、レポーターシグナルが蛍光のバックグラウンドを越えて蓄積されるサイクルとして定義される。癌ＤＮＡの結果と正常ヒトＤＮＡの結果を比較する場合、ΔＣｔ値は核酸試料における特定の標的配列の種発コピー相対数の定量的尺度として使用しされる。
表８は、本発明のＰＲＯポリペプチド化合物のスクリーニングに用いられた種々の原発腫瘍のＴ段階及びＮ段階を示す。
【０３９６】
0005512073.tif 000026
【０３９７】
ＤＮＡ調製：
ＤＮＡは培養した細胞系、原発腫瘍、正常ヒト血液から調製した。単離は、全てQuiagenからの、精製キット、バッファーセット及びプロテアーゼを用い、製造者の指示と下記に従って実施した。
細胞培養溶解：
細胞を洗浄し、チップ当たり7.5x10８の濃度でトリプシン化し、４℃で５分間1000rpmで遠心分離してペレット化し、次いで1/2容量のＰＢＳ再遠心で洗浄した。ペレットを３回洗浄し、懸濁細胞を回収して2xＰＢＳで洗浄した。次いで細胞を10mLのＰＢＳに懸濁させた。バッファーＣ１を４℃で平衡化させた。Quiagenプロテアーゼ#19155を6.25mlの冷ｄｄＨ２Ｏで最終濃度20mg/mlまで希釈して４℃で平衡化させた。10mLのＧ２バッファーを、QuiagenＲＮＡｓｅＡストック（100mg/ml）を200μg/mlの最終濃度まで希釈して調製した。
バッファーＣ１（10mL、４℃）及びddＨ２Ｏ（40mL、４℃）を、次いで10mLの細胞懸濁物に添加し、反転させて混合し、氷上で１０分間インキュベートした。細胞核をBeckmanスイングバケットロータで４℃において2500rpmで１５分間遠心分離することによりペレット化した。上清を捨て、核をボルテックスしながら2mLのバッファーＣ１（４℃）及び6mLのddＨ２Ｏに懸濁し、１秒後に４℃において2500rpmで１５分間遠心分離した。次いで核を残りのバッファー中にチップ当たり200μlを用いて再懸濁した。Ｇ２バッファー（10ml）を懸濁した核に添加しながら緩いボルテックスを適用した。バッファー添加が完了したら、強いボルテックスを３０秒間適用した。Quiagenプロテアーゼ（200μl上記のように調製）を添加し、５０℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション及び遠心分離を、溶解物が透明になるまで繰り返した（例えば、さらに30-60分間インキュベートし、４℃で１０分間3000xgでペレット化する）。
【０３９８】
固体ヒト腫瘍試料の調製及び溶解：
腫瘍試料を秤量し50mlのコニカル管に配して氷上に保持した。加工は調製当たり250mgの組織未満に制限した（１チップ／調製）。プロテアーゼ溶液を6.25mlの冷ｄｄＨ２Ｏ中に最終濃度20mg/mlまで希釈することにより新たに調製して４℃で貯蔵した。DNAseAを最終濃度200mg/mlまで希釈することによりＧ２バッファー（20ml）を調製した（100mg/mlのストックから）。エアロゾルの吸入を避けるために層流Ｔフード内でポリトロンの大きなチップを用いて、腫瘍組織を19mlのＧ２バッファー中で６０秒間均一化し、室温に保持した。試料間で、各々2LのｄｄＨ２Ｏで２ｘ３０秒間、次いでＧ２バッファー（50ml）でスピンさせることによりポリトロンを透明化した。組織がジェネレータチップ上に存在する場合は、装置を分解して清浄化した。
Quiagenプロテアーゼ（上記の用に調製、1.0ml）を添加し、次いでボルテックスして５０℃で３時間インキュベートした。インキュベーション及び遠心分離を、溶解物が透明になるまで繰り返した（例えば、さらに30-60分間インキュベートし、４℃で１０分間3000xgでペレット化する）。
ヒト血液調製及び溶解：
健常なボランティアから標準的な感染薬プロトコールを用いて血液を採りだし、チップ当たり10mlの試料にクエン酸化した。Quiagenプロテアーゼを6.25mlの冷ｄｄＨ２Ｏ中に最終濃度20mg/mlまで希釈することにより新たに調製して４℃で貯蔵した。ＤＮＡｓｅＡを100mg/mlのストックから最終濃度200mg/mlまで希釈することによりＧ２バッファー（20ml）を調製した。血液（10ml）を50mlのコニカル管に配し、10mlのＣ１バッファー及び30mlのddＨ２Ｏ（ともに４℃で平衡化したもの）を添加し、反転させて混合して氷上に１０分間保持した。Beckmanスイングバケットローターで、４℃において2500rpmで１５分間核をペレット化し、上清を捨てた。ボルテックスしながら、核を2mlのＣ１バッファー（４℃）及び6mlのddＨ２Ｏ（４℃）中に懸濁させた。ボルテックスはペレットが白くなるまで繰り返した。次いで核を残りのバッファー中に200μlチップを用いて懸濁させた。Ｇ２バッファー（10ml）を懸濁核に添加しながら緩くボルテックスし、次いで３０秒間強くボルテックスした。Quiagenプロテアーゼを添加（200μl）し、５０℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション及び遠心分離を、溶解物が透明になるまで繰り返した（例えば、さらに30-60分間インキュベートし、４℃で１０分間3000xgでペレット化する）。
【０３９９】
透明化溶解物の精製：
（１）ゲノムＤＮＡの単離：
ゲノムＤＮＡを10mlのＱＢＴバッファーで平衡化した（最大チップ調製当たり１試料）。ＱＦ溶離バッファーを５０℃で平衡化した。試料を３０秒間ボルテックスし、次いで平衡化チップに負荷して重力により排液した。チップを2x15mlのＱＣバッファーで洗浄した。ＤＮＡを、30mlのシラン化したオートクレーブ30mlCortex管に15mlのＱＦバッファー（５０℃）で溶離した。イソプロパノール（10.5ml）を各試料に添加し、管をパラフィンで被覆し、ＤＮＡが沈殿するまで繰り返し反転させて混合した。試料を、SS-34ロータで４℃において15,000rpmで１０分間遠心分離してペレット化した。ペレット位置をマークして上清を捨て、10mlの70%エタノール（４℃）を添加した。試料を、SS-34ロータで４℃において10,000rpmで１０分間遠心分離して再度ペレット化した。ペレット位置をマークして上清を捨てた。次いで管を乾燥棚の各面に置き、３７℃で１０分間乾燥させたが、使用の過剰乾燥には注意した。
乾燥後、ペレットを1.0mlのＴＥ（pH8.5）に溶解し、５０℃に１−２時間置いた。試料を４℃に終夜保持して溶解を続けた。次いでＤＮＡ溶液を、ツベルクリンシリンジ上に２６ゲージの針を具備する1.5ml管に移した。ＤＮＡを剪断するために移行を５ｘ繰り返した。次いで試料を５０℃に１−２時間置いた。
【０４００】
（２）ゲノムＤＮＡの定量及び遺伝子増幅アッセイのための調製：
各管のＤＮＡレベルを1:20希釈（5μlＤＮＡ＋95μlddＨ２Ｏ）での標準的なＡ２６０、Ａ２８０スペクトルにより、Beckman DU640分光光度計の0.1ml石英キュベットを用いて定量した。Ａ２６０／Ａ２８０比率は1.8-1.9の範囲であった。次いで各ＤＮＡ試料をＴＥ（pH8.5）中に約200ng/mlまで希釈した。最初の材料が高濃度（約700ng/μl）である場合、材料を５０℃に再懸濁するまで数時間置いた。
次いで、希釈した材料（20−600ng/ml）に対して、製造者の指示を以下のように改変して蛍光ＤＮＡ定量を実施した。これは、Hoeffer DyNA Quant 200蛍光計を約１５分間暖めて実施した。Hoechst染料作業溶液（#H33258、10μl、使用の１２時間以内に調製）を100mlの1xＴＮＥバッファーに希釈した。2mlキュベットを蛍光計溶液で満たし、機械に配し、機械をゼロ調節した。ｐＧＥＭ３Ｚｆ(＋)（２μl、ロット#360851026）を2mlの蛍光計溶液に添加して200単位で校正した。次いで、さらに２μlのｐＧＥＭ３Ｚｆ(＋)ＤＮＡを試験し、400+/-10単位で読みを確認した。次いで各試料を少なくとも３回読んだ。３試料が互いに10%以内であることが見られたとき、それらの平均をとり、この値を定量化値として用いた。
次いで、蛍光測定で決定した濃度を、各試料をddＨ２Ｏ中に10ng/μlまで希釈するのに用いた。これは、１回のTaqManプレートアッセイについて全てのテンプレート試料について同時に行い、500−1000アッセイを実施するのに十分な材料で行った。試料は、Taqman(商品名)プライマー及びプローブで３回試験し、Ｂ-アクチン及びＧＡＰＤＨともに正常なヒトＤＮＡを持ちテンプレート対照を持たない単一のプレート上にある。希釈した試料を用いたが、試験ＤＮＡから減算した正常ヒトＤＮＡのＣＴ値は+/-１ＣＴであった。希釈した、ロット定性化したゲノムＤＮＡを、1.0mlアリコートで−８０℃において保存した。続いて遺伝し増幅アッセイに使用するアリコートは、４℃で保存した。各1mlのアリコートは、８−９プレート又は６４試験に十分である。
【０４０１】
遺伝子増幅アッセイ：
本発明のＰＲＯポリペプチド化合物を以下の原発腫瘍でスクリーニングし、１．０以上の得られたΔＣｔ値を表９に報告する。
【０４０２】
0005512073.tif 000027
0005512073.tif 000028
0005512073.tif 000029
0005512073.tif 000030
0005512073.tif 000031
【０４０３】
上記に記載した種々のＤＮＡの増幅が種々の腫瘍において生じるため、種々ＤＮＡの増幅は腫瘍の形成及び／又は成長と関連しているようである。結果として、これらポリペプチドを標的としたアンタゴニスト(例えば抗体）は、癌治療において有用であると期待される。
【０４０４】
実施例１７１：レセプター／リガンド相互作用の同定
このアッセイにおいて、様々なＰＲＯポリペプチドの、レセプター／リガンドを同定するために１パネルの潜在的なレセプター分子に結合する能力を試験した。既知のレセプターに対するリガンド、既知のリガンドに対するレセプター又は新規なレセプター／リガンド対の同定は、例えば、レセプター又はリガンドを発現することが知られる細胞に対する（リガンド又はレセプターに結合する）生物活性分子の標識、組成物がリガンド又はレセプターを発現すると示唆される細胞を構成しうる、同一のものを含むと示唆される組成物のレセプター又はリガンドの存在を検出する試薬としてのレセプター又はリガンドの使用、レセプター又はリガンドを発現する細胞に対する又は細胞に応答する免疫の調節、レセプター又はリガンドを発現する細胞の生物又は免疫活性の発達を調節するレセプター又はリガンドに対するアゴニスト、アンタゴニスト及び／又は抗体の調製の許容、及び通常の技術者にとってすでに明らかな様々な他の様々な表示などを含む様々な表示に役立つ。
該アッセイは次のように実施される。レセプターのリガンドであることが示唆される本発明のＰＲＯポリペプチドは、ヒトＩｇＧのＦｃドメインを含む融合タンパク質（イムノアドヘシン）として発現される。レセプター-リガンド結合は、候補ＰＲＯポリペプチドレセプターを発現する細胞（例えばＣｏｓ細胞）を用いたイムノアドヘシンの相互作用、及びＦｃ融合ドメインに対する蛍光試薬及び顕微鏡による検査を用いた結合イムノアドヘシンの明視化をさせることにより検出される。候補レセプターを発現する細胞は、一過性形質移入により、並びにレセプター分子として機能しうるＰＲＯポリペプチドをコードするｃＤＮＡ発現ベクターのライブラリーの定義されたサブセットの一過性形質移入により作成される。次いで、細胞は、可能なレセプター結合のために検査されるＰＲＯポリペプチドイムノアドヘシンの存在下で１時間インキュベートされる。次いで細胞は、パラホルムアルデヒドで洗浄され、固定される。次いで細胞は、ＰＲＯポリペプチドイムノアドヘシンのＦｃ部分に対する蛍光コンジュゲートされた抗体（例えば、ＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗-ヒトＦｃ抗体）と共にインキュベートされる。次いで、細胞は再び洗浄され、顕微鏡により検査される。陽性の相互作用は、特定のＰＲＯポリペプチドレセプターをコードするｃＤＮＡ又はレセプターのプールを用いて形質移入された細胞の蛍光標識の存在、及び他のｃＤＮＡ又はｃＤＮＡのプールで形質移入された同様にして調製された細胞の同様の蛍光標識の非存在により判断される。ｃＤＮＡ発現ベクターの確定したプールがＰＲＯポリペプチドイムノアドヘシンを用いた相互作用にとって陽性であると判断される場合には、プールを構成する個々のｃＤＮＡの種は、ＰＲＯポリペプチドイムノアドヘシンと相互作用できるレセプターをコードする特定のｃＤＮＡの決定を個々に試験される（プールは「分解される」）。
【０４０５】
このアッセイの他の実施様態においては、エピトープタグされた潜在的なリガンドＰＲＯポリペプチド（例えば、８ヒスチジン「Ｈｉｓ」タグ）は、ヒトＩｇＧ（イムノアドヘシン）のＦｃドメインとの融合として発現される潜在的レセプターＰＲＯポリペプチドのパネルと相互作用される。エピトープタグされたＰＲＯポリペプチドとの１時間の共インキュベーションに続いて、補助レセプターはそれぞれタンパク質Ａビーズで免疫凝結され、ビーズは洗浄される。潜在的なリガンド相互作用は、エピトープタグに対する抗体との免疫凝結複合体のウェスタンブロット分析により決定される。期待される分子量のエピトープタグされたタンパク質のバンドが候補レセプターを用いたウェスタンブロット分析で観察されるが、潜在的なレセプターのパネルの他のメンバーによって観察されない場合には、相互作用は存在すると判断される。
これらのアッセイを用いて、次のレセプター／リガンド相互作用がここで同定された：
（１）ＰＲＯ９４３は、ＦＨＦ１、ＰＲＯ１８３（ＦＨＦ２）、ＰＲＯ１８４（ＦＨＦ３）、及びＰＲＯ１８５（ＦＨＦ４）に結合し、逆もまた同じ。
（２）ＰＲＯ３３１は、ＰＲＯ１１３３に結合し、逆もまた同じ。
（３）ＰＲＯ３６３は、ＰＲＯ１３８７に結合し、逆もまた同じ。
（４）ＰＲＯ５７２３は、ＰＲＯ１３８７に結合し、逆もまた同じ。
（５）ＰＲＯ１１１４は、ＰＲＯ３３０１及びＰＲＯ９９４０に結合し、逆もまた同じ。
（６）ＰＲＯ９８２８は、既知のＦＧＦレセプターＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２ＩＩＩＣ、ＦＧＦＲ３ＩＩＩＣ及びＦＧＦＲ４に結合する点で、新規な繊維芽細胞成長因子レセプター（ＦＧＦＲ）リガンドであることが示される。従って、ＰＲＯ９８２８及びアゴニストは、例えば細胞成長及び増殖を含むＦＧＦ分子によって通常活性化される生物活性を活性化するための使い道が見出されうる。ＰＲＯ９８２８のアンタゴニストは、ＦＧＦレセプターを通じて媒介される生物活性の阻害の利用が見出されうる。
（７）ＰＲＯ１１８１は、ＰＲＯ７１７０、ＰＲＯ３６１及びＰＲＯ８４６に結合する。
【０４０６】
実施例１７２：組織発現分布
オリゴヌクレオチドプローブを、定量ＰＣＲ増幅反応の使用において、付随する図に示すＰＲＯポリペプチドコード化ヌクレオチド配列から構築した。オリゴヌクレオチドプローブを、標準的ＰＣＲ反応に関連したテンプレートの３' 末端から、約200−600塩基対の増幅された断片が付与されるように選択した。オリゴヌクレオチドプローブを、異なるヒト成人及び／又は胎児の組織源から単離されたｃＤＮＡライブラリーを用いた標準的な定量ＰＣＲ増幅反応に使用し、試験した種々の組織におけるＰＲＯポリペプチドコード化核酸の発現レベルを定量的測定を得るためにアガロースゲル電気泳動により分析した。種々の異なるヒト組織型におけるＰＲＯポリペプチドコード化核酸の発現パターンの知識は、転移腫瘍等の一次組織源を決定するために、他の組織特異的マーカーを用いて又は用いない組織分類分けに有用な診断用マーカーが提供される。これらのアッセイは、以下の結果を提供する。
DNA分子 組織 w/ 有意な発現 組織 w/o 有意な発現
DNA16422-1209  黒質, テ゛ント゛ロサイト, 子宮                海馬
DNA16435-1208  黒質, テ゛ント゛ロサイト, 子宮                海馬
DNA26843-1389  テ゛ント゛ロサイト, 心臓, 子宮, 結腸腫瘍       海馬, 黒質, 軟骨
DNA26844-1394  HUVEC, テ゛ント゛ロサイト, 軟骨             黒質, 海馬, 子宮, 前立腺
DNA40621-1440  前立腺, 子宮, 結腸腫瘍               脳, 心臓, HUVEC, 軟骨
DNA44161-1434  結腸腫瘍, テ゛ント゛ロサイト                 黒質, 海馬, 前立腺, 子宮
DNA44694-1500  テ゛ント゛ロサイト, 海馬, 前立腺              結腸腫瘍, 黒質, 心臓
DNA48320-1433  前立腺, 子宮                        結腸腫瘍, 脳, 心臓, 軟骨
DNA49647-1398  脳, 心臓, 前立腺, 子宮                軟骨
DNA53913-1490  海馬                               黒質, テ゛ント゛ロサイト
DNA53978-1443  テ゛ント゛ロサイト, 子宮, 前立腺              黒質, 結腸腫瘍
DNA53996-1442  脾臓, 前立腺, 子宮, 海馬              黒質, 心臓
DNA56050-1455  前立腺, 子宮, 軟骨, 海馬            心臓, 結腸腫瘍, テ゛ント゛ロサイト
DNA56110-1437  脾臓, 結腸腫瘍, 脳, 前立腺            心臓
DNA56410-1414  子宮, テ゛ント゛ロサイト                     海馬, 黒質, 心臓
DNA56436-1448  黒質, 前立腺, 海馬                  テ゛ント゛ロサイト, 心臓, HUVEC
DNA56855-1447  前立腺, 子宮                        脳, 軟骨, 心臓, 結腸腫瘍
DNA56860-1510  結腸腫瘍                           前立腺, 子宮, テ゛ント゛ロサイト
DNA56868-1478  結腸腫瘍, 前立腺                    子宮, 脳, 心臓, 軟骨
DNA56869-1545  前立腺, 子宮, 軟骨                   脳, 結腸腫瘍, 脾臓, 心臓
DNA57699-1412  テ゛ント゛ロサイト, 海馬, 前立腺              黒質, 心臓
DNA57704-1452  脳, 心臓, 脾臓, 子宮, 前立腺           結腸腫瘍
DNA57710-1451  テ゛ント゛ロサイト, 海馬, 脾臓, 子宮           黒質, 心臓
DNA57711-1501  テ゛ント゛ロサイト, 海馬, 心臓, 軟骨           黒質
DNA57827-1493  結腸腫瘍, 海馬, 前立腺               黒質, テ゛ント゛ロサイト, 子宮
DNA58723-1588  黒質, 軟骨 子宮                     海馬, テ゛ント゛ロサイト, HUVEC
DNA58743-1609  脳, 前立腺, 子宮                    結腸腫瘍, 心臓, 脾臓, 軟骨
DNA58846-1409  海馬, テ゛ント゛ロサイト                  黒質, 子宮, 前立腺, 結腸腫瘍
DNA58849-1494  前立腺                          脳, 子宮, 軟骨, 心臓, 結腸腫瘍
DNA58850-1495  脾臓, 前立腺, テ゛ント゛ロサイト              海馬, 黒質, 結腸腫瘍
DNA59213-1487  脾臓, 軟骨, 前立腺, 黒質             心臓, 海馬, テ゛ント゛ロサイト
DNA59497-1496  テ゛ント゛ロサイト, 前立腺, 子宮, 心臓        軟骨, 海馬, 黒質
DNA59605-1418  テ゛ント゛ロサイト, 前立腺, 子宮             海馬, 黒質, 結腸腫瘍
DNA59609-1470  テ゛ント゛ロサイト                   黒質, 海馬, 心臓, 前立腺, 子宮, 脾臓
DNA59612-1466  前立腺, テ゛ント゛ロサイト                 海馬, 黒質, 子宮, 結腸腫瘍
DNA59616-1465  テ゛ント゛ロサイト, 黒質, 結腸腫瘍           海馬
DNA59619-1464  テ゛ント゛ロサイト, 黒質, 結腸腫瘍           海馬
DNA59625-1498  脳, 結腸腫瘍, 前立腺, 子宮           THP-1 マクロファージ
DNA59827-1426  黒質, 前立腺, 子宮                  海馬, テ゛ント゛ロサイト, 心臓
DNA59828-1608  テ゛ント゛ロサイト, 黒質, 結腸腫瘍           海馬
DNA59853-1505  前立腺                          脳, 子宮, 脾臓, 心臓, 結腸腫瘍
DNA59854-1459  軟骨                              前立腺, 脳, 心臓, 結腸腫瘍
DNA60283-1484  テ゛ント゛ロサイト, 脾臓, 前立腺, 子宮        海馬, 黒質, 心臓
DNA60619-1482  テ゛ント゛ロサイト, 黒質, 結腸腫瘍           海馬
DNA60625-1507  軟骨                              前立腺, 脳, 心臓, 結腸腫瘍
DNA60629-1481  子宮, 結腸腫瘍, 黒質                海馬, テ゛ント゛ロサイト, 脾臓, 前立腺
DNA61755-1554  テ゛ント゛ロサイト, 黒質, 結腸腫瘍           海馬
DNA64852-1589  前立腺, 子宮                       脳, 心臓, 軟骨, 結腸腫瘍
DNA66308-1537  前立腺, 心臓 子宮                  脳, 結腸腫瘍, 軟骨
DNA68869-1610  脾臓, 前立腺, 心臓, 子宮, 結腸腫瘍, 黒質 海馬, テ゛ント゛ロサイト, 前立腺
【０４０７】
実施例１７３：ヒトＰＲＯ８４６をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ３９９４９と命名される。ＤＮＡ３９９４９コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ８４６の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
正方向及び逆方向のプライマーを合成した：
正方向ＰＣＲプライマー  5'-CCCTGCAGTGCACCTACAGGGAAG-3'（配列番号：518）
逆方向ＰＣＲプライマー  5'-CTGTCTTCCCCTGCTTGGCTGTGG-3'（配列番号：519）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ３９９４９配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5'-GGTGCAGGAAGGGTGGGATCCTCTTCTCTCGCTGCTCTGGCCACATC-3'（配列番号：520）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ８４６遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織（LIB227）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ８４６の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ４２２(DNA44196-1353)と命名される］（配列番号：２１５）及びＰＲＯ８４６の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ４２２(DNA44196-1353)の全核酸配列を図３２９（配列番号：５１６）に示す。クローンＵＮＱ４２２(DNA44195-1353)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２５−２７に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１０２１−１０２３の停止コドンで終端する（図３２９）。予測されるポリペプチド前駆体は３３２アミノ酸長である（図３３０）。図３３０に示した全長ＰＲＯ８４６タンパク質は、約３６，１４３ダルトンの見積もり分子量及び約５．８９のｐＩを有する。ＰＲＯ８４６のアミノ酸配列の重要な領域は、図３３０に示したように、シグナルペプチド、膜貫通ドメイン、Ｎ-グリコシル化部位、フィフ゛リノーケ゛ンベータ及びガンマ鎖Ｃ末端ドメインに典型的な配列、及びＩｇ様Ｖ型ドメインに典型的な配列を含む。クローンＵＮＱ４２２(DNA44196-1353)はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９８４７が付与されている。
【０４０８】
実施例１７４：ヒトＰＲＯ３６３をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したように種々のＥＳＴ配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ４２８２８と命名される。ＤＮＡ４２８２８コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ３６３の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
ＰＣＲプライマーの対（正方向及び逆方向）を合成した：
正方向ＰＣＲプライマー(42828.f1)  5'-CCAGTGCACAGCAGGCAACGAAGC-3'（配列番号：521）
逆方向ＰＣＲプライマー(42828.r1)  5'-ACTAGGCTGTATGCCTGGGTGGGC-3'（配列番号：522）
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスＤＮＡ４２８２８配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ（42828.p1）
5'-GTATGTACAAAGCATCGGCATGGTTGCAGGAGCAGTGACAGGC-3'（配列番号：523）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対でＰＣＲ増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びＰＣＲプライマー対の一方を用いてＰＲＯ３６３遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織（LIB227）から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列は、ＰＲＯ３６３の全長ＤＮＡ配列［ここで、ＵＮＱ３１８(DNA45419-1252）と命名される］（配列番号：５００）及びＰＲＯ３６３の誘導タンパク質配列を与えた。
ＵＮＱ３１８(DNA45419-1252）の全核酸配列を図３１３（配列番号：５００）に示す。クローンＵＮＱ３１８(DNA45419-1252）は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置１９０−１９２に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１３０９−１３１１の停止コドンで終端する（図３１３）。予測されるポリペプチド前駆体は３７３アミノ酸長である（図３１４）。図３１４に示した全長ＰＲＯ３６３タンパク質は、約４１．２８１の分子量及び約８．３３のｐＩを有する。図３１４（配列番号：５０１）に示したアミノ酸配列のアミノ酸２２１〜２５４に膜貫通ドメインが存在する。またＰＲＯ３６３ポリペプチドは、約アミノ酸１５〜５６及び約アミノ酸８７〜１１６に少なくとも２つのミエリンＰ０タンパク質ドメインを有する。クローンＵＮＱ３１８(DNA45419-1252）は、1998年2月5日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９６１６が付与されている。
全長ＰＲＯ３６３ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが細胞表面タンパク質ＨＣＡＲと有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりＰＲＯ３６３が新規なＨＣＡＲ相同体となりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース（version 35.45 SwissProt 35）は、ＰＲＯ３６３アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、HS46KDA_1, HSU90716_1, MMCARH_1, MMCARHOM_1, MMU90715_1, A33_HUMAN, P_W14146, P_W14158, A42632,及びB42632との間の有意な相同性を明らかにした。
【０４０９】
実施例１７５：ヒトＰＲＯ９８２８をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したようにphrapコンセンサス用いて他の核酸配列に関して構築された。このコンセンサス配列は、ここにＤＮＡ１３９８１４と命名される。ＤＮＡ１３９８１４コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ９８２８の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーは一般に２０から３０のヌクレオチドの範囲であり、しばしば約１００−１０００ｂｐ長のＰＣＲ産物をもたらすように設計される。プローブ配列は、典型的には４０−５５ｂｐ長である。ある場合には、コンセンサス配列が約１−１．５ｋｂｐより大きいときに更なるオリゴヌクレオチドが合成される。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを、上掲のAusubel等, Current Protocols in Molecular Biology に従って、ＰＣＲプライマー対でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。ついで、ポジティブライブラリをプローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いて対象とする遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
ＰＣＲプライマー（正及び逆）を合成した：
5'-AATCTCAGCACCAGCCACTCAGAGCA -3'（配列番号：524）
5'-GTTAAAGAGGGTGCCCTTCCAGCGA -3'（配列番号：525）
5'-TATCCCAATGCCTCCCCACTGCTC -3'（配列番号：526）
5'-GATGAACTTGGCGAAGGGGCGGCA -3'（配列番号：527）
【０４１０】
ｃＤＮＡライブラリの作成のためのＲＮＡはヒト胎児肝組織から単離した。ｃＤＮＡクローンの単離に用いたｃＤＮＡライブラリは、カリフォルニア州サンジエゴのInvitrogen からのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法によって作成した。ｃＤＮＡは、ＮｏｔＩ部位を含むオリゴｄＴでプライムし、平滑末端でＳａｌＩヘミキナーゼ化アダプターに結合させ、ＮｏｔＩで切断し、ゲル電気泳動法で適当にサイズ分類し、適切なクローニングベクター（ｐＲＫＢ又はｐＲＫＤ等；ｐＲＫ５ＢはＳｆｉＩ部位を含まないｐＲＫ５Ｄの前駆体である；Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照）に、独特のＸｈｏＩ及びＮｏｔＩ部位において、所定の方向でクローニングした。
上述のようにして単離されたクローンのＤＮＡ配列決定により、全長ＰＲＯ９８２８ポリペプチドの全長ＤＮＡ配列（ここでDNA142238−2768と命名［図３２３、配列番号：５１０］）と、ＰＲＯ９８２８ポリぺプチドの誘導タンパク質配列が得られた。
上で同定された全長クローンは、ヌクレオチド位置２３２−２３４に見かけの転写開始部位、ヌクレオチド位置９８５−９８７の停止シグナルを含む（図３２３、配列番号：５１０）。予想されたポリペプチド前駆体は２５１アミノ酸長、約２７９５４ダルトンの推定分子量及び約９．２２の推定ＰＩを有する。図３２４（配列番号：５１１）に示された全長ＰＲＯ９８２８配列の分析により、図３２４に示されるような様々な重要なポリペプチドドメインの存在が明らかになり、ここで、これらの重要なポリペプチドドメインを与える位置は上述されるようにおおよそである。染色体地図は、ＰＲＯ９８２８コード化核酸がヒトにおいて染色体１２ｐ１３に位置づけられることを示す。クローンＤＮＡ１４２２３８−２７６８は１９９９年１０月５日にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号８１９−ＰＴＡを付与されている。
図３２４（配列番号：５１１）に示された全長配列のＡＬＩＧＮ−２配列アラインメント分析を使用した、Dayhoffデータベース（version 35.45 SwissProt 35）の解析により、ＰＲＯ９８２８アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：P_Y08581、AB018122_1、FGF3_HUMAN、P_R70824、S54407、P_R80780、P_Y23761、P_W92312、OMFGF6_1及びP_R80871との間の配列同一性が証明された。
【０４１１】
実施例１７６：ヒトＰＲＯ７１７０をコードするｃＤＮＡクローンの単離
ＤＮＡ１０８７２２−２７４３は、ジェネンテク，インク（South San Francisco, CA）によって開発された独自の配列発見アルゴリズムを、公的（例えば、GenBank）及び／又は私的（LIFESEQR Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA）データベースからのＥＳＴｓ並びに集団化及び構築されたＥＳＴ断片に適用することにより同定した。シグナル配列アルゴリズムは、考慮している配列又は配列断片の５'-末端の第１の、場合によっては第２のメチオニンコドン（ＡＴＧ）を取り囲むＤＮＡヌクレオチドの性質に基づく分泌シグナルスコアを計算する。第１のＡＴＧに続くヌクレオチドは、停止コドンを持たない少なくとも３５の不明瞭でないアミノ酸をコードしなければならない。第１のＡＴＧが必要なアミノ酸を有する場合、第２のものは試験しない。何れも要件を満たさない場合、候補配列にスコアをつけなかった。ＥＳＴ配列が真正のシグナル配列を含むか否かを決定するために、ＡＴＧコドンを取り囲むＤＮＡ及び対応するアミノ酸配列を、分泌シグナルに関連することが知られた７つのセンサー（評価パラメータ）の組を用いてスコアをつけた。このアルゴリズムの使用により、多くのポリペプチド-コード化核酸配列の同定がなされた。
上述したシグナル配列アルゴリズムの使用は、LIFESEQRデータベースIncyte Pharmaceuticals、Palo Alto, からの、ここにおいてＣＬＵ５７８３６と命名された、ＥＳＴクラスター配列の同定を可能にした。このＥＳＴクラスター配列を、公的データベース（例えば、GenBank）及び独自に開発したＥＳＴ ＤＮＡデータベース（LIFESEQR、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA）を含む種々の発現配列タグ（ＥＳＴ）データベースと比較し、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2（Altschulら, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996)）を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア70（90の場合もある）又はそれ以上を持つこれらの比較物は、プログラム「phrap」（Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington）で集団化してコンセンサスDNA配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ５８７５６と命名する。
【０４１２】
ＤＮＡ５８７５６配列とIncyte（Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CAIncyte）データーベースからのno.2251462に包含されるＥＳＴ配列に認められる配列相同性に鑑み、クローンno.2251462は購入され、そのcDNA挿入部は得られて配列を決められた。ここにおいて、ｃＤＮＡ挿入部が全長タンパク質をコードすることが見出された。ここにおいて、cDNA挿入部が全長タンパク質をコードしていることが見出された。このｃＤＮＡ挿入部の配列は、図３２５に示され、ここにおいてＤＮＡ１０８７２２−２７４３と命名された。
クローンＤＮＡ１０８７２２−２７４３は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置６０−６２に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置１５０６−１５０８の停止コドンで終端する（図３２５）。予測されるポリペプチド前駆体は、４８２アミノ酸長である（図３２６）。図３２６に示されている全長ＰＲＯ７１７０タンパク質は、約４９０６０の見積もり分子量及び約４．７４のｐＩを有する。図３２６（配列番号：５１３）に示された全長ＰＲＯ７１７０配列の分析は、図３２６に示されているような種々の重要なポリペプチドドメインの存在を証明し、これら重要なポリペプチドドメインへ与えられている位置は、上記に記載のようにおおよそである。クローンＤＮＡ１０８７２２−２７４３は、１９９９年８月１７日にＡＴＣＣへ寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号５５２−ＰＴＡが付与された。
図３２６（配列番号：５１３）に示した全長配列のＡＬＩＧＮ−２配列アラインメント分析法を使用しての、Dayhoffデータベース（バージョン35.45 SwissProt 35）の分析は、ＰＲＯ７１７０アミノ酸配列と以下のDayhoff配列：P_Y12291、I47141、D88733_1、DMC56G7_1、P_Y11606、HWP1_CANAL、HSMUC5BEX_1、HSU78550_1、HSU70136_1、及びSGS3_DROMEとの間の配列同一性を明らかにした。
【０４１３】
実施例１７７：ヒトＰＲＯ３６１をコードするｃＤＮＡクローンの単離
上記実施例１に記載したようにphrapを用いて他のＥＳＴ配列に対してコンセンサスＤＮＡ配列を組み立てた。このコンセンサス配列を、ここでＤＮＡ４０６５４と命名する。ＤＮＡ４０６５４コンセンサス配列に基づいて、１）ＰＣＲにより対象とする配列を含むｃＤＮＡライブラリを同定するため、及び２）ＰＲＯ３６１の全長コード配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
次のように正方向及び逆方向ＰＣＲプライマーを合成した：
正方向ＰＣＲプライマー  5'-AGGGAGGATTATCCTTGACCTTTGAAGACC-3'（配列番号：５２８）
正方向ＰＣＲプライマー  5'-GAAGCAAGTGCCCAGCTC-3'（配列番号：５２９）
正方向ＰＣＲプライマー  5'-CGGGTCCCTGCTCTTTGG-3'（配列番号：５３０）
逆方向ＰＣＲプライマー  5'-CACCGTAGCTGGGAGCGCACTCAC-3'（配列番号：５３１）
逆方向ＰＣＲプライマー  5'-AGTGTAAGTCAAGCTCCC-3'（配列番号：５３２）
さらに、以下のヌクレオチド配列を持つ合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブをコンセンサスＤＮＡ４０６５４配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5'-GCTTCCTGACACTAAGGCTGTCTGCTAGTCAGAATTGCCTCAAAAAGAG-3'（配列番号：４２７）
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのＤＮＡを上で同定したＰＣＲプライマー対の一方でのＰＣＲ増幅によりスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチドを用いてＰＲＯ３６１遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。ｃＤＮＡライブラリー作成のためのＲＮＡは、ヒト胎児腎臓組織から単離した。
上記のように単離したクローンのＤＮＡ配列決定により、ＰＲＯ３６１の全長ＤＮＡ配列［ここではＤＮＡ４５４１０−１２５０と命名］（配列番号：５１４）及びＰＲＯ３６１の誘導タンパク質配列が得られた。
ＤＮＡ４５４１０−１２５０の全ヌクレオチド配列を図３２７（配列番号：５１４）に示す。クローンＤＮＡ４５４１０−１２５０は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置２２６−２２８に見かけの翻訳開始部位を持ち、ヌクレオチド位置１５１９−１５２１の停止コドンで終端する（図３２７）。予測されるポリペプチド前駆体は４３１アミノ酸長である（図３２８）。図３２８に示した全長ＰＲＯ３６１タンパク質は約４６，８１０ダルトンの推定分子量及び約６．４５のｐＩを有する。また、膜貫通ドメイン（アミノ酸３８０−４０９）及びアルギナーゼタンパク質ファミリーに典型的な配列（アミノ酸３−１４及び３９−５７）を含む興味ある領域が図３２８に示されている。クローンＤＮＡ４５４１０−１２５０はＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ寄託番号２０９６２１が付与された。
全長ＰＲＯ３６１ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、その部分がムチン及び／又はキチナーゼタンパク質と有意な相同性を有していることが示唆され、ＰＲＯ３６１が新規なムチン及び／又はキチナーゼタンパク質でありうることを示している。
【０４１４】
実施例１７８：ヒトＰＲＯ１８３、ＰＲＯ１８４、ＰＲＯ１８５、ＰＲＯ５７２３、ＰＲＯ３３０１又はＰＲＯ９９４０をコードするｃＤＮＡクローンの単離
付随される図面に示されるヒトＰＲＯ１８３、ＰＲＯ１８４、ＰＲＯ１８５、ＰＲＯ５７２３、ＰＲＯ３３０１又はＰＲＯ９９４０ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子はGenBankを通じて得られた。
【０４１５】
材料の寄託
次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション, 10801 ユニバーシティ  ブルバード，  マナッサス，  ヴァージニア20110-2209，米国(ATCC)に寄託した：
表１０
材料 ATCC寄託番号 寄託日
DNA45410-1250        ATCC 209612      1998年2月5日
DNA108722-2743       ATCC 522-PTA     1999年8月17日
DNA142238-2768       ATCC 819-PTA     1999年10月5日
DNA40981-1234        ATCC 209439      1997年11月7日
DNA45419-1252        ATCC 209616      1998年2月5日
DNA44196-1353        ATCC 209847      1998年5月6日
DNA16422-1209        ATCC 209929      1998年6月2日
DNA16435-1208        ATCC 209930      1998年6月2日
DNA21624-1391        ATCC 209917      1998年6月2日
DNA23334-1392        ATCC 209918      1998年6月2日
DNA26288-1239        ATCC 209792      1998年4月21日
DNA26843-1389        ATCC 203099      1998年8月4日
DNA26844-1394        ATCC 209926      1998年6月2日
DNA30862-1396        ATCC 209920      1998年6月2日
DNA35680-1212        ATCC 209790      1998年4月21日
DNA40621-1440        ATCC 209922      1998年6月2日
DNA44161-1434        ATCC 209907      1998年5月27日
DNA44694-1500        ATCC 203114      1998年8月11日
DNA45495-1550        ATCC 203156      1998年8月25日
DNA47361-1154        ATCC 209431      1997年11月7日
DNA47394-1572        ATCC 203109      1998年8月11日
DNA48320-1433        ATCC 209904      1998年5月27日
DNA48334-1435        ATCC 209924      1998年6月2日
DNA48606-1479        ATCC 203040      1998年7月1日
DNA49141-1431        ATCC 203003      1998年6月23日
DNA49142-1430        ATCC 203002      1998年6月23日
DNA49143-1429        ATCC 203013      1998年6月23日
DNA49647-1398        ATCC 209919      1998年6月2日
DNA49819-1439        ATCC 209931      1998年6月2日
DNA49820-1427        ATCC 209932      1998年6月2日
DNA49821-1562        ATCC 209981      1998年6月16日
DNA52192-1369        ATCC 203042      1998年7月1日
DNA52598-1518        ATCC 203107      1998年8月11日
DNA53913-1490        ATCC 203162      1998年8月25日
DNA53978-1443        ATCC 209983      1998年6月16日
DNA53996-1442        ATCC 209921      1998年6月2日
DNA56041-1416        ATCC 203012      1998年6月23日
DNA56047-1456        ATCC 209948      1998年6月9日
DNA56050-1455        ATCC 203011      1998年6月23日
DNA56110-1437        ATCC 203113      1998年8月11日
DNA56113-1378        ATCC 203049      1998年7月1日
DNA56410-1414        ATCC 209923      1998年6月2日
DNA56436-1448        ATCC 209902      1998年5月27日
DNA56855-1447        ATCC 203004      1998年6月23日
DNA56859-1445        ATCC 203019      1998年6月23日
DNA56860-1510        ATCC 209952      1998年6月9日
DNA56865-1491        ATCC 203022      1998年6月23日
DNA56866-1342        ATCC 203023      1998年6月23日
DNA56868-1209        ATCC 203024      1998年6月23日
DNA56869-1545        ATCC 203161      1998年8月25日
DNA56870-1492        ATCC 209925      1998年6月2日
DNA57033-1403        ATCC 209905      1998年5月27日
DNA57037-1444        ATCC 209903      1998年5月27日
DNA57129-1413        ATCC 209977      1998年6月16日
DNA57690-1374        ATCC 209950      1998年6月9日
DNA57693-1424        ATCC 203008      1998年6月23日
DNA57694-1341        ATCC 203017      1998年6月23日
DNA57695-1340        ATCC 203006      1998年6月23日
DNA57699-1412        ATCC 203020      1998年6月23日
DNA57702-1476        ATCC 209951      1998年6月9日
DNA57704-1452        ATCC 209953      1998年6月9日
DNA57708-1411        ATCC 203021      1998年6月23日
DNA57710-1451        ATCC 203048      1998年7月1日
DNA57711-1501        ATCC 203047      1998年7月1日
DNA57827-1493        ATCC 203045      1998年7月1日
DNA57834-1339        ATCC 209954      1998年6月9日
DNA57836-1338        ATCC 203025      1998年6月23日
DNA57838-1337        ATCC 203014      1998年6月23日
DNA57844-1410        ATCC 203010      1998年6月23日
DNA58721-1475        ATCC 203110      1998年8月11日
DNA58723-1588        ATCC 203133      1998年8月18日
DNA58737-1473        ATCC 203136      1998年8月18日
DNA58743-1609        ATCC 203154      1998年8月25日
DNA58846-1409        ATCC 209957      1998年6月9日
DNA58848-1472        ATCC 209955      1998年6月9日
DNA58849-1494        ATCC 209958      1998年6月9日
DNA58850-1495        ATCC 209956      1998年6月9日
DNA58853-1423        ATCC 203016      1998年6月23日
DNA58855-1422        ATCC 203018      1998年6月23日
DNA59205-1421        ATCC 203009      1998年6月23日
DNA59211-1450        ATCC 209960      1998年6月9日
DNA59213-1487        ATCC 209959      1998年6月9日
DNA59214-1449        ATCC 203046      1998年7月1日
DNA59215-1425        ATCC 209961      1998年6月9日
DNA59220-1514        ATCC 209962      1998年6月9日
DNA59488-1603        ATCC 203157      1998年8月25日
DNA59493-1420        ATCC 203050      1998年7月1日
DNA59497-1496        ATCC 209941      1998年6月4日
DNA59588-1571        ATCC 203106      1998年8月11日
DNA59603-1419        ATCC 209944      1998年6月9日
DNA59605-1418        ATCC 203005      1998年6月23日
DNA59606-1471        ATCC 209945      1998年6月9日
DNA59607-1497        ATCC 209957      1998年6月9日
DNA59609-1470        ATCC 209963      1998年6月9日
DNA59610-1559        ATCC 209990      1998年6月16日
DNA59612-1466        ATCC 209947      1998年6月9日
DNA59613-1417        ATCC 203007      1998年6月23日
DNA59616-1465        ATCC 209991      1998年6月16日
DNA59619-1464        ATCC 203041      1998年7月1日
DNA59620-1463        ATCC 209989      1998年6月16日
DNA59625-1498        ATCC 209992      1998年6月17日
DNA59767-1489        ATCC 203108      1998年8月11日
DNA59776-1600        ATCC 203128      1998年8月18日
DNA59777-1480        ATCC 203111      1998年8月11日
DNA59820-1549        ATCC 203129      1998年8月18日
DNA59827-1426        ATCC 203089      1998年8月4日
DNA59828-1608        ATCC 203158      1998年8月25日
DNA59838-1462        ATCC 209976      1998年6月16日
DNA59839-1461        ATCC 209988      1998年6月16日
DNA59841-1460        ATCC 203044      1998年7月1日
DNA59842-1502        ATCC 209982      1998年6月16日
DNA59846-1503        ATCC 209978      1998年6月16日
DNA59847-1511        ATCC 203098      1998年8月4日
DNA59848-1512        ATCC 203088      1998年8月4日
DNA59849-1504        ATCC 209986      1998年6月16日
DNA59853-1505        ATCC 209985      1998年6月16日
DNA59854-1459        ATCC 209974      1998年6月16日
DNA60283-1484        ATCC 203043      1998年7月1日
DNA60615-1483        ATCC 209980      1998年6月16日
DNA60619-1482        ATCC 209993      1998年6月16日
DNA60621-1516        ATCC 203091      1998年8月4日
DNA60622-1525        ATCC 203090      1998年8月4日
DNA60625-1507        ATCC 209975      1998年6月16日
DNA60627-1508        ATCC 203092      1998年8月4日
DNA60629-1481        ATCC 209979      1998年6月16日
DNA61755-1554        ATCC 203112      1998年8月11日
DNA61873-1574        ATCC 203132      1998年8月18日
DNA62814-1521        ATCC 203093      1998年8月4日
DNA62872-1509        ATCC 203100      1998年8月4日
DNA62876-1517        ATCC 203095      1998年8月4日
DNA62881-1515        ATCC 203096      1998年8月4日
DNA64852-1589        ATCC 203127      1998年8月18日
DNA64884-1527        ATCC 203155      1998年8月25日
DNA64890-1612        ATCC 203131      1998年8月18日
DNA65412-1523        ATCC 203094      1998年8月4日
DNA66308-1537        ATCC 203159      1998年8月25日
DNA66309-1538        ATCC 203235      1998年9月15日
DNA67004-1614        ATCC 203115      1998年8月11日
DNA68869-1610        ATCC 203164      1998年8月25日
DNA68872-1620        ATCC 203160      1998年8月25日
DNA71159-1617        ATCC 203135      1998年8月18日
【０４１６】
この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、どれが最初であろうとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第１２２条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号８８６ＯＧ６３８の３７ＣＦＲ第１．１４条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと即座に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの物質の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【０４１７】
【図１】天然配列ＰＲＯ２８１（ＵＮＱ２４４）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１）を示す。配列番号：１は、ここで「ＤＮＡ１６４２２−１２０９」と命名されるクローンである。
【図２】図１に示した配列番号：１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。
【図３】天然配列ＰＲＯ２７６（ＵＮＱ２４３）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５）を示す。配列番号：５は、ここで「ＤＮＡ１６４３５−１２０８」と命名されるクローンである。
【図４】図３に示した配列番号：５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：６）を示す。
【図５】天然配列ＰＲＯ１８９（ＵＮＱ１６３）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：７）を示す。配列番号：７は、ここで「ＤＮＡ２１６４２−１３９１」と命名されるクローンである。
【図６】図５に示した配列番号：７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：８）を示す。
【図７】ここでＤＮＡ１４１８７（配列番号：９）と命名されるヌクレオチド配列を示す。
【図８】天然配列ＰＲＯ１９０（ＵＮＱ１６４）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１３）を示す。配列番号：１３は、ここで「ＤＮＡ２３３３４−１３９２」と命名されるクローンである。
【図９】図８に示した配列番号：１３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１４）を示す。
【図１０】ここでＤＮＡ１４２３２（配列番号：１５）と命名されるヌクレオチド配列を示す。
【図１１】天然配列ＰＲＯ３４１（ＵＮＱ３００）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１９）を示す。配列番号：１９は、ここで「ＤＮＡ２６２８８−１２３９」と命名されるクローンである。
【図１２】図１１に示した配列番号：１９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２０）を示す。
【図１３】ここでＤＮＡ１２９２０（配列番号：２１）と命名されるヌクレオチド配列を示す。
【図１４】天然配列ＰＲＯ１８０（ＵＮＱ１５４）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２２）を示す。配列番号：２２は、ここで「ＤＮＡ２６８４３−１３８９」と命名されるクローンである。
【図１５】図１４に示した配列番号：２２のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２３）を示す。
【図１６】ここでＤＮＡ１２９２２（配列番号：２４）と命名されるヌクレオチド配列を示す。
【図１７】天然配列ＰＲＯ１９４（ＵＮＱ１６８）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２７）を示す。配列番号：２７は、ここで「ＤＮＡ２６８４４−１３９４」と命名されるクローンである。
【図１８】図１７に示した配列番号：２７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２８）を示す。
【図１９】天然配列ＰＲＯ２０３（ＵＮＱ１７７）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２９）を示す。配列番号：２９は、ここで「ＤＮＡ３０８６２−１３９６」と命名されるクローンである。
【図２０】図１９に示した配列番号：２９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３０）を示す。
【図２１】ここでＤＮＡ１５６１８（配列番号：３１）と命名されるヌクレオチド配列を示す。
【図２２】天然配列ＰＲＯ２９０（ＵＮＱ２５３）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３２）を示す。配列番号：３２は、ここで「ＤＮＡ３５６８０−１２１２」と命名されるクローンである。
【図２３】図２２に示した配列番号：３２のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３３）を示す。
【図２４】天然配列ＰＲＯ８７４（ＵＮＱ４４１）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３５）を示す。配列番号：３５は、ここで「ＤＮＡ４０６２１−１４４０」と命名されるクローンである。
【図２５】図２４に示した配列番号：３５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３６）を示す。
【図２６】天然配列ＰＲＯ７１０（ＵＮＱ３７４）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４０）を示す。配列番号：４０は、ここで「ＤＮＡ４４１６１−１４３４」と命名されるクローンである。
【図２７】図２６に示した配列番号：４０のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４１）を示す。
【図２８】ここでＤＮＡ３８１９０（配列番号：４２）と命名されるヌクレオチド配列を示す。
【図２９】天然配列ＰＲＯ１１５１（ＵＮＱ５８１）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４６）を示す。配列番号：４６は、ここで「ＤＮＡ４４６９４−１５００」と命名されるクローンである。
【図３０】図２９に示した配列番号：４６のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４７）を示す。
【図３１】天然配列ＰＲＯ１２８２（ＵＮＱ６５２）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５１）を示す。配列番号：５１は、ここで「ＤＮＡ４５４９５−１５５０」と命名されるクローンである。
【図３２】図３１に示した配列番号：５１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５２）を示す。
【図３３】天然配列ＰＲＯ３５８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５６）を示す。配列番号：５６は、ここで「ＤＮＡ４７３６１−１１５４」と命名されるクローンである。
【図３４】図３３に示した配列番号：５６のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５７）を示す。
【図３５】天然配列ＰＲＯ１３１０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：６１）を示す。配列番号：６１は、ここで「ＤＮＡ４７３９４−１５７２」と命名されるクローンである。
【図３６】図３５に示した配列番号：６１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：６２）を示す。
【図３７】天然配列ＰＲＯ６９８（ＵＮＱ３６２）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：６６）を示す。配列番号：６６は、ここで「ＤＮＡ４８３２０−１４３３」と命名されるクローンである。
【図３８】図３７に示した配列番号：６６のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：６７）を示す。
【図３９】ここでＤＮＡ３９９０６（配列番号：６８）と命名されるヌクレオチド配列を示す。
【図４０】天然配列ＰＲＯ７３２（ＵＮＱ３９６）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：７２）を示す。配列番号：７２は、ここで「ＤＮＡ４８３３４−１４３５」と命名されるクローンである。
【図４１】図４０に示した配列番号：７２のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：７３）を示す。
【図４２】ここでＤＮＡ２０２３９（配列番号：７４）と命名されるヌクレオチド配列を示す。
【図４３】ここでＤＮＡ３８０５０（配列番号：７５）と命名されるヌクレオチド配列を示す。
【図４４】ここでＤＮＡ４０６８３（配列番号：７６）と命名されるヌクレオチド配列を示す。
【図４５】ここでＤＮＡ４２５８０（配列番号：７７）と命名されるヌクレオチド配列を示す。
【図４６Ａ】天然配列ＰＲＯ１１２０（ＵＮＱ５５９）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：８３）の前半部を示す。配列番号：８３は、ここで「ＤＮＡ４８６０６−１４７９」と命名されるクローンである。
【図４６Ｂ】天然配列ＰＲＯ１１２０（ＵＮＱ５５９）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：８３）の後半部を示す。配列番号：８３は、ここで「ＤＮＡ４８６０６−１４７９」と命名されるクローンである。
【図４７】図４６Ａ−Ｂに示した配列番号：８３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：８４）を示す。
【図４８】天然配列ＰＲＯ５３７（ＵＮＱ３３８）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：９４）を示す。配列番号：９４は、ここで「ＤＮＡ４９１４１−１４３１」と命名されるクローンである。
【図４９】図４８に示した配列番号：９４のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：９５）を示す。
【図５０】天然配列ＰＲＯ５３６（ＵＮＱ３３７）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：９６）を示す。配列番号：９６は、ここで「ＤＮＡ４９１４２−１４３０」と命名されるクローンである。
【図５１】図５０に示した配列番号：９６のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：９７）を示す。
【図５２】天然配列ＰＲＯ５３５（ＵＮＱ３３６）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：９８）を示す。配列番号：９８は、ここで「ＤＮＡ４９１４３−１４２９」と命名されるクローンである。
【図５３】図５２に示した配列番号：９８のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：９９）を示す。
【図５４】ここでＤＮＡ３０８６１（配列番号：１００）と命名されるヌクレオチド配列を示す。
【図５５】ここでＤＮＡ３６３５１（配列番号：１０１）と命名されるヌクレオチド配列を示す。
【図５６】天然配列ＰＲＯ７１８（ＵＮＱ３８６）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１０２）を示す。配列番号：１０２は、ここで「ＤＮＡ４９６４７−１３９８」と命名されるクローンである。
【図５７】図５６に示した配列番号：１０２のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１０３）を示す。
【図５８】ここでＤＮＡ１５３８６（配列番号：１０４）と命名されるヌクレオチド配列を示す。
【図５９】ここでＤＮＡ１６６３０（配列番号：１０５）と命名されるヌクレオチド配列を示す。
【図６０】ここでＤＮＡ１６８２９（配列番号：１０６）と命名されるヌクレオチド配列を示す。
【図６１】ここでＤＮＡ２８３５７（配列番号：１０７）と命名されるヌクレオチド配列を示す。
【図６２】ここでＤＮＡ４３５１２（配列番号：１０８）と命名されるヌクレオチド配列を示す。
【図６３】天然配列ＰＲＯ８７２（ＵＮＱ４３９）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１１２）を示す。配列番号：１１２は、ここで「ＤＮＡ４９８１９−１４３９」と命名されるクローンである。
【図６４】図６３に示した配列番号：１１２のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１１３）を示す。
【図６５】天然配列ＰＲＯ１０６３（ＵＮＱ１２８）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１１４）を示す。配列番号：１１４は、ここで「ＤＮＡ４９８２０−１４２７」と命名されるクローンである。
【図６６】図６５に示した配列番号：１１４のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１１５）を示す。
【図６７】天然配列ＰＲＯ６１９（ＵＮＱ３５５）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１１６）を示す。配列番号：１１６は、ここで「ＤＮＡ４９８２１−１５６２」と命名されるクローンである。
【図６８】図６７に示した配列番号：１１６のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１１７）を示す。
【図６９】天然配列ＰＲＯ９４３（ＵＮＱ４８０）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１１８）を示す。配列番号：１１８は、ここで「ＤＮＡ５２１９２−１３６９」と命名されるクローンである。
【図７０】図６９に示した配列番号：１１８のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１１９）を示す。
【図７１】天然配列ＰＲＯ１１８８（ＵＮＱ６０２）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１２３）を示す。配列番号：１２３は、ここで「ＤＮＡ５２５９８−１５１８」と命名されるクローンである。
【図７２】図７１に示した配列番号：１２３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１２４）を示す。
【図７３】天然配列ＰＲＯ１１３３（ＵＮＱ５７１）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１２８）を示す。配列番号：１２８は、ここで「ＤＮＡ５３９１３−１４９０」と命名されるクローンである。
【図７４】図７３に示した配列番号：１２８のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１２９）を示す。
【図７５】天然配列ＰＲＯ７８４（ＵＮＱ４５９）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１３４）を示す。配列番号：１３４は、ここで「ＤＮＡ５３９７８−１４４３」と命名されるクローンである。
【図７６】図７５に示した配列番号：１３４のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１３５）を示す。
【図７７】ここでＤＮＡ４４６６１（配列番号：１３６）と命名されるヌクレオチド配列を示す。
【図７８】天然配列ＰＲＯ７８３（ＵＮＱ４５８）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１３７）を示す。配列番号：１３７は、ここで「ＤＮＡ５３９９６−１４４２」と命名されるクローンである。
【図７９】図７８に示した配列番号：１３７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１３８）を示す。
【図８０】ここでＤＮＡ４５２０１（配列番号：１３９）と命名されるヌクレオチド配列を示す。
【図８１】ここでＤＮＡ１４５７５（配列番号：１４０）と命名されるヌクレオチド配列を示す。
【図８２】天然配列ＰＲＯ８２０（ＵＮＱ５０３）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１４５）を示す。配列番号：１４５は、ここで「ＤＮＡ５６０４１−１４１６」と命名されるクローンである。
【図８３】図８２に示した配列番号：１４５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１４６）を示す。
【図８４】天然配列ＰＲＯ１０８０（ＵＮＱ５３７）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１４７）を示す。配列番号：１４７は、ここで「ＤＮＡ５６０４７−１４５６」と命名されるクローンである。
【図８５】図８４に示した配列番号：１４７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１４８）を示す。
【図８６】ここでＤＮＡ３６５２７（配列番号：１４９）と命名されるヌクレオチド配列を示す。
【図８７】天然配列ＰＲＯ１０７９（ＵＮＱ５３６）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１５０）を示す。配列番号：１５０は、ここで「ＤＮＡ５６０５０−１４５５」と命名されるクローンである。
【図８８】図８７に示した配列番号：１５０のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１５１）を示す。
【図８９】天然配列ＰＲＯ７９３（ＵＮＱ４３２）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１５２）を示す。配列番号：１５２は、ここで「ＤＮＡ５６１１０−１４３７」と命名されるクローンである。
【図９０】図８９に示した配列番号：１５２のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１５３）を示す。
【図９１】ここでＤＮＡ５０１７７（配列番号：１５４）と命名されるヌクレオチド配列を示す。
【図９２】天然配列ＰＲＯ１０１６（ＵＮＱ４９９）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１５５）を示す。配列番号：１５５は、ここで「ＤＮＡ５６１１３−１３７８」と命名されるクローンである。
【図９３】図９２に示した配列番号：１５５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１５６）を示す。
【図９４】天然配列ＰＲＯ１０１３（ＵＮＱ４９６）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１５７）を示す。配列番号：１５７は、ここで「ＤＮＡ５６４１０−１４１４」と命名されるクローンである。
【図９５】図９４に示した配列番号：１５７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１５８）を示す。
【図９６】天然配列ＰＲＯ９３７（ＵＮＱ４７４）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１５９）を示す。配列番号：１５９は、ここで「ＤＮＡ５６４３６−１４４８」と命名されるクローンである。
【図９７】図９６に示した配列番号：１５９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１６０）を示す。
【図９８】天然配列ＰＲＯ８４２（ＵＮＱ４７３）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１６４）を示す。配列番号：１６４は、ここで「ＤＮＡ５６８５５−１４４７」と命名されるクローンである。
【図９９】図９８に示した配列番号：１６４のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１６５）を示す。
【図１００】天然配列ＰＲＯ８３９（ＵＮＱ４７２）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１６６）を示す。配列番号：１６６は、ここで「ＤＮＡ５６８５９−１４４５」と命名されるクローンである。
【図１０１】図１００に示した配列番号：１６６のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１６７）を示す。
【図１０２】天然配列ＰＲＯ１１８０（ＵＮＱ５９４）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１６８）を示す。配列番号：１６８は、ここで「ＤＮＡ５６８６０−１５１０」と命名されるクローンである。
【図１０３】図１０２に示した配列番号：１６８のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１６９）を示す。
【図１０４】天然配列ＰＲＯ１１３４（ＵＮＱ５７２）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１７０）を示す。配列番号：１７０は、ここで「ＤＮＡ５６８６５−１４９１」と命名されるクローンである。
【図１０５】図１０４に示した配列番号：１７０のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１７１）を示す。
【図１０６】ここでＤＮＡ５２３５２（配列番号：１７２）と命名されるヌクレオチド配列を示す。
【図１０７】ここでＤＮＡ５５７２５（配列番号：１７３）と命名されるヌクレオチド配列を示す。
【図１０８】天然配列ＰＲＯ８３０（ＵＮＱ４７０）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１７４）を示す。配列番号：１７４は、ここで「ＤＮＡ５６８６６−１３４２」と命名されるクローンである。
【図１０９】図１０８に示した配列番号：１７４のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１７５）を示す。
【図１１０】天然配列ＰＲＯ１１１５（ＵＮＱ５５８）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１７６）を示す。配列番号：１７６は、ここで「ＤＮＡ５６８６８−１４７８」と命名されるクローンである。
【図１１１】図１１０に示した配列番号：１７６のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１７７）を示す。
【図１１２】天然配列ＰＲＯ１２７７（ＵＮＱ６４７）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１７８）を示す。配列番号：１７８は、ここで「ＤＮＡ５６８６９−１５４５」と命名されるクローンである。
【図１１３】図１１２に示した配列番号：１７８のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１７９）を示す。
【図１１４】天然配列ＰＲＯ１１３５（ＵＮＱ５７３）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１８０）を示す。配列番号：１８０は、ここで「ＤＮＡ５６８７０−１４９２」と命名されるクローンである。
【図１１５】図１１４に示した配列番号：１８０のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１８１）を示す。
【図１１６】天然配列ＰＲＯ１１１４（ＵＮＱ５５７）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１８２）を示す。配列番号：１８２は、ここで「ＤＮＡ５７０３３−１４０３」と命名されるクローンである。
【図１１７】図１１６に示した配列番号：１８２のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１８３）を示す。
【図１１８】ここでＤＮＡ４８４６６（配列番号：１８４）と命名されるヌクレオチド配列を示す。
【図１１９】天然配列ＰＲＯ８２８（ＵＮＱ４６９）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１８８）を示す。配列番号：１８８は、ここで「ＤＮＡ５７０３７−１４４４」と命名されるクローンである。
【図１２０】図１１９に示した配列番号：１８８のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１８９）を示す。
【図１２１】天然配列ＰＲＯ１００９（ＵＮＱ４９３）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１９３）を示す。配列番号：１９３は、ここで「ＤＮＡ５７１２９−１４１３」と命名されるクローンである。
【図１２２】図１２１に示した配列番号：１９３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１９４）を示す。
【図１２３】ここでＤＮＡ５０８５３（配列番号：１９５）と命名されるヌクレオチド配列を示す。
【図１２４】天然配列ＰＲＯ１００７（ＵＮＱ４９１）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１９６）を示す。配列番号：１９６は、ここで「ＤＮＡ５７６９０−１３７４」と命名されるクローンである。
【図１２５】図１２４に示した配列番号：１９６のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１９７）を示す。
【図１２６】天然配列ＰＲＯ１０５６（ＵＮＱ５２１）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１９８）を示す。配列番号：１９８は、ここで「ＤＮＡ５７６９３−１４２４」と命名されるクローンである。
【図１２７】図１２６に示した配列番号：１９８のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：１９９）を示す。
【図１２８】天然配列ＰＲＯ８２６（ＵＮＱ４６７）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２００）を示す。配列番号：２００は、ここで「ＤＮＡ５７６９４−１３４１」と命名されるクローンである。
【図１２９】図１２８に示した配列番号：２００のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２０１）を示す。
【図１３０】天然配列ＰＲＯ８１９（ＵＮＱ４６６）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２０２）を示す。配列番号：２０２は、ここで「ＤＮＡ５７６９５−１３４０」と命名されるクローンである。
【図１３１】図１３０に示した配列番号：２０２のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２０３）を示す。
【図１３２】天然配列ＰＲＯ１００６（ＵＮＱ４９０）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２０４）を示す。配列番号：２０４は、ここで「ＤＮＡ５７６９９−１４１２」と命名されるクローンである。
【図１３３】図１３２に示した配列番号：２０４のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２０５）を示す。
【図１３４】天然配列ＰＲＯ１１１２（ＵＮＱ５５５）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２０６）を示す。配列番号：２０６は、ここで「ＤＮＡ５７７０２−１４７６」と命名されるクローンである。
【図１３５】図１３４に示した配列番号：２０６のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２０７）を示す。
【図１３６】天然配列ＰＲＯ１０７４（ＵＮＱ５３１）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２０８）を示す。配列番号：２０８は、ここで「ＤＮＡ５７７０４−１４５２」と命名されるクローンである。
【図１３７】図１３６に示した配列番号：２０８のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２０９）を示す。
【図１３８】天然配列ＰＲＯ１００５（ＵＮＱ４８９）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２１０）を示す。配列番号：２１０は、ここで「ＤＮＡ５７７０８−１００５」と命名されるクローンである。
【図１３９】図１３８に示した配列番号：２１０のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２１１）を示す。
【図１４０】天然配列ＰＲＯ１０７３（ＵＮＱ５３０）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２１２）を示す。配列番号：２１２は、ここで「ＤＮＡ５７７１０−１４５１」と命名されるクローンである。
【図１４１】図１４０に示した配列番号：２１２のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２１３）を示す。
【図１４２】ここでＤＮＡ５５９３８（配列番号：２１４）と命名されるヌクレオチド配列を示す。
【図１４３】天然配列ＰＲＯ１１５２（ＵＮＱ５８２）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２１５）を示す。配列番号：２１５は、ここで「ＤＮＡ５７７１１−１５０１」と命名されるクローンである。
【図１４４】図１４３に示した配列番号：２１５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２１６）を示す。
【図１４５】ここでＤＮＡ５５８０７（配列番号：２１７）と命名されるヌクレオチド配列を示す。
【図１４６】天然配列ＰＲＯ１１３６（ＵＮＱ５７４）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２１８）を示す。配列番号：２１８は、ここで「ＤＮＡ５７８２７−１４９３」と命名されるクローンである。
【図１４７】図１４６に示した配列番号：２１８のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２１９）を示す。
【図１４８】天然配列ＰＲＯ８１３（ＵＮＱ４６５）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２２０）を示す。配列番号：２２０は、ここで「ＤＮＡ５７８３４−１３３９」と命名されるクローンである。
【図１４９】図１４８に示した配列番号：２２０のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２２１）を示す。
【図１５０】天然配列ＰＲＯ８０９（ＵＮＱ４６４）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２２２）を示す。配列番号：２２２は、ここで「ＤＮＡ５７８３６−１３３８」と命名されるクローンである。
【図１５１】図１５０に示した配列番号：２２２のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２２３）を示す。
【図１５２】天然配列ＰＲＯ７９１（ＵＮＱ４６３）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２２４）を示す。配列番号：２２４は、ここで「ＤＮＡ５７８３８−１３３７」と命名されるクローンである。
【図１５３】図１５２に示した配列番号：２２４のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２２５）を示す。
【図１５４】天然配列ＰＲＯ１００４（ＵＮＱ４８８）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２２６）を示す。配列番号：２２６は、ここで「ＤＮＡ５７８４４−１４１０」と命名されるクローンである。
【図１５５】図１５４に示した配列番号：２２６のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２２７）を示す。
【図１５６】天然配列ＰＲＯ１１１１（ＵＮＱ５５４）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２２８）を示す。配列番号：２２８は、ここで「ＤＮＡ５８７２１−１４７５」と命名されるクローンである。
【図１５７】図１５６に示した配列番号：２２８のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２２９）を示す。
【図１５８】天然配列ＰＲＯ１３４４（ＵＮＱ６９９）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２３０）を示す。配列番号：２３０は、ここで「ＤＮＡ５８７２３−１５８８」と命名されるクローンである。
【図１５９】図１５８に示した配列番号：２３０のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２３１）を示す。
【図１６０】天然配列ＰＲＯ１１０９（ＵＮＱ５５２）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２３５）を示す。配列番号：２３５は、ここで「ＤＮＡ５８７３７−１４７３」と命名されるクローンである。
【図１６１】図１６０に示した配列番号：２３５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２３６）を示す。
【図１６２】天然配列ＰＲＯ１３８３（ＵＮＱ７１９）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２４０）を示す。配列番号：２４０は、ここで「ＤＮＡ５８７４３−１６０９」と命名されるクローンである。
【図１６３】図１６２に示した配列番号：２４０のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２４１）を示す。
【図１６４】天然配列ＰＲＯ１００３（ＵＮＱ４８７）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２４５）を示す。配列番号：２４５は、ここで「ＤＮＡ５８８４６−１４０９」と命名されるクローンである。
【図１６５】図１６４に示した配列番号：２４５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２４６）を示す。
【図１６６】天然配列ＰＲＯ１１０８（ＵＮＱ５５１）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２４７）を示す。配列番号：２４７は、ここで「ＤＮＡ５８８４８−１４７２」と命名されるクローンである。
【図１６７】図１６６に示した配列番号：２４７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２４８）を示す。
【図１６８】天然配列ＰＲＯ１１３７（ＵＮＱ５７５）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２４９）を示す。配列番号：２４９は、ここで「ＤＮＡ５８８４９−１４９４」と命名されるクローンである。
【図１６９】図１６８に示した配列番号：２４９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２５０）を示す。
【図１７０】天然配列ＰＲＯ１１３８（ＵＮＱ５７６）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２５２）を示す。配列番号：２５２は、ここで「ＤＮＡ５８８５０−１４９５」と命名されるクローンである。
【図１７１】図１７０に示した配列番号：２５２のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２５３）を示す。
【図１７２】ここでＤＮＡ４９１４０（配列番号：２５４）と命名されるヌクレオチド配列を示す。
【図１７３】天然配列ＰＲＯ１０５４（ＵＮＱ５１９）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２５５）を示す。配列番号：２５５は、ここで「ＤＮＡ５８８５３−１４２３」と命名されるクローンである。
【図１７４】図１７３に示した配列番号：２５５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２５６）を示す。
【図１７５】天然配列ＰＲＯ９９４（ＵＮＱ５１８）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２５７）を示す。配列番号：２５７は、ここで「ＤＮＡ５８８５５−１４２２」と命名されるクローンである。
【図１７６】図１７５に示した配列番号：２５７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２５８）を示す。
【図１７７】天然配列ＰＲＯ８１２（ＵＮＱ５１７）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２５９）を示す。配列番号：２５９は、ここで「ＤＮＡ５９２０５−１４２１」と命名されるクローンである。
【図１７８】図１７７に示した配列番号：２５９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２６０）を示す。
【図１７９】天然配列ＰＲＯ１０６９（ＵＮＱ５２６）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２６１）を示す。配列番号：２６１は、ここで「ＤＮＡ５９２１１−１４５０」と命名されるクローンである。
【図１８０】図１７９に示した配列番号：２６１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２６２）を示す。
【図１８１】天然配列ＰＲＯ１１２９（ＵＮＱ５６８）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２６３）を示す。配列番号：２６３は、ここで「ＤＮＡ５９２１３−１４８７」と命名されるクローンである。
【図１８２】図１８１に示した配列番号：２６３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２６４）を示す。
【図１８３】天然配列ＰＲＯ１０６８（ＵＮＱ５２５）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２６５）を示す。配列番号：２６５は、ここで「ＤＮＡ５９２１４−１４４９」と命名されるクローンである。
【図１８４】図１８３に示した配列番号：２６５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２６６）を示す。
【図１８５】天然配列ＰＲＯ１０６６（ＵＮＱ５２４）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２６７）を示す。配列番号：２６７は、ここで「ＤＮＡ５９２１５−１４２５」と命名されるクローンである。
【図１８６】図１８５に示した配列番号：２６７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２６８）を示す。
【図１８７】天然配列ＰＲＯ１１８４（ＵＮＱ５９８）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２６９）を示す。配列番号：２６９は、ここで「ＤＮＡ５９２２０−１５１４」と命名されるクローンである。
【図１８８】図１８７に示した配列番号：２６９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２７０）を示す。
【図１８９】天然配列ＰＲＯ１３６０（ＵＮＱ７０９）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２７１）を示す。配列番号：２７１は、ここで「ＤＮＡ５９４８８−１６０３」と命名されるクローンである。
【図１９０】図１８９に示した配列番号：２７１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２７２）を示す。
【図１９１】天然配列ＰＲＯ１０２９（ＵＮＱ５１４）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２７３）を示す。配列番号：２７３は、ここで「ＤＮＡ５９４９３−１４２０」と命名されるクローンである。
【図１９２】図１９１に示した配列番号：２７３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２７４）を示す。
【図１９３】天然配列ＰＲＯ１１３９（ＵＮＱ５７７）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２７５）を示す。配列番号：２７５は、ここで「ＤＮＡ５９４９７−１４９６」と命名されるクローンである。
【図１９４】図１９３に示した配列番号：２７５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２７６）を示す。
【図１９５】天然配列ＰＲＯ１３０９（ＵＮＱ６７５）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２７７）を示す。配列番号：２７７は、ここで「ＤＮＡ５９５８８−１５７１」と命名されるクローンである。
【図１９６】図１９５に示した配列番号：２７７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２７８）を示す。
【図１９７】天然配列ＰＲＯ１０２８（ＵＮＱ５１３）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２８０）を示す。配列番号：２８０は、ここで「ＤＮＡ５９６０３−１４１９」と命名されるクローンである。
【図１９８】図１９７に示した配列番号：２８０のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２８１）を示す。
【図１９９】天然配列ＰＲＯ１０２７（ＵＮＱ５１２）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２８２）を示す。配列番号：２８２は、ここで「ＤＮＡ５９６０５−１４１８」と命名されるクローンである。
【図２００】図１９９に示した配列番号：２８２のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２８３）を示す。
【図２０１】天然配列ＰＲＯ１１０７（ＵＮＱ５５０）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２８４）を示す。配列番号：２８４は、ここで「ＤＮＡ５９６０６−１４７１」と命名されるクローンである。
【図２０２】図２０１に示した配列番号：２８４のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２８５）を示す。
【図２０３】天然配列ＰＲＯ１１４０（ＵＮＱ５７８）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２８６）を示す。配列番号：２８６は、ここで「ＤＮＡ５９６０７−１４９７」と命名されるクローンである。
【図２０４】図２０３に示した配列番号：２８６のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２８７）を示す。
【図２０５】天然配列ＰＲＯ１１０６（ＵＮＱ５４９）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２８８）を示す。配列番号：２８８は、ここで「ＤＮＡ５９６０９−１４７０」と命名されるクローンである。
【図２０６】図２０５に示した配列番号：２８８のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２８９）を示す。
【図２０７】天然配列ＰＲＯ１２９１（ＵＮＱ６５９）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２９０）を示す。配列番号：２９０は、ここで「ＤＮＡ５９６１０−１５５６」と命名されるクローンである。
【図２０８】図２０７に示した配列番号：２９０のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２９１）を示す。
【図２０９】天然配列ＰＲＯ１１０５（ＵＮＱ５４８）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２９２）を示す。配列番号：２９２は、ここで「ＤＮＡ５９６１２−１４６６」と命名されるクローンである。
【図２１０】図２０９に示した配列番号：２９２のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２９３）を示す。
【図２１１】天然配列ＰＲＯ５１１（ＵＮＱ５１１）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２９４）を示す。配列番号：２９４は、ここで「ＤＮＡ５９６１３−１４１７」と命名されるクローンである。
【図２１２】図２１１に示した配列番号：２９４のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２９５）を示す。
【図２１３】天然配列ＰＲＯ１１０４（ＵＮＱ５４７）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２９６）を示す。配列番号：２９６は、ここで「ＤＮＡ５９６１６−１４６５」と命名されるクローンである。
【図２１４】図２１３に示した配列番号：２９６のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２９６）を示す。
【図２１５】天然配列ＰＲＯ１１００（ＵＮＱ５４６）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：２９８）を示す。配列番号：２９８は、ここで「ＤＮＡ５９６１９−１４６４」と命名されるクローンである。
【図２１６】図２１５に示した配列番号：２９８のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：２９９）を示す。
【図２１７】天然配列ＰＲＯ８３６（ＵＮＱ５４５）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３００）を示す。配列番号：３００は、ここで「ＤＮＡ５９６２０−１４６３」と命名されるクローンである。
【図２１８】図２１７に示した配列番号：３００のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３０１）を示す。
【図２１９】天然配列ＰＲＯ１１４１（ＵＮＱ５７９）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３０２）を示す。配列番号：３０２は、ここで「ＤＮＡ５９６２５−１４９８」と命名されるクローンである。
【図２２０】図２１９に示した配列番号：３０２のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３０３）を示す。
【図２２１】ここでＤＮＡ３３１２８（配列番号：３０４）と命名されるヌクレオチド配列を示す。
【図２２２】ここでＤＮＡ３４２５６（配列番号：３０５）と命名されるヌクレオチド配列を示す。
【図２２３】ここでＤＮＡ４７９４１（配列番号：３０６）と命名されるヌクレオチド配列を示す。
【図２２４】ここでＤＮＡ５４３８９（配列番号：３０７）と命名されるヌクレオチド配列を示す。
【図２２５】天然配列ＰＲＯ１１３２（ＵＮＱ５７０）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３０８）を示す。配列番号：３０８は、ここで「ＤＮＡ５９７６７−１４８９」と命名されるクローンである。
【図２２６】図２２５に示した配列番号：３０８のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３０９）を示す。
【図２２７】天然配列ＰＲＯ１３４６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３１３）を示す。配列番号：３１３は、ここで「ＤＮＡ５９７７６−１６００」と命名されるクローンである。
【図２２８】図２２７に示した配列番号：３１３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３１４）を示す。
【図２２９】天然配列ＰＲＯ１１３１（ＵＮＱ５６９）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３１８）を示す。配列番号：３１８は、ここで「ＤＮＡ５９７７７−１４８０」と命名されるクローンである。
【図２３０】図２２９に示した配列番号：３１８のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３１９）を示す。
【図２３１】ここでＤＮＡ４３５４６（配列番号：３２０）と命名されるヌクレオチド配列を示す。
【図２３２】天然配列ＰＲＯ１２８１（ＵＮＱ６５１）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３２５）を示す。配列番号：３２５は、ここで「ＤＮＡ５９８２０−１５４９」と命名されるクローンである。
【図２３３】図２３２に示した配列番号：３２５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３２６）を示す。
【図２３４】天然配列ＰＲＯ１０６４（ＵＮＱ１１１）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３３３）を示す。配列番号：３３３は、ここで「ＤＮＡ５９８２７−１４２６」と命名されるクローンである。
【図２３５】図２３４に示した配列番号：３３３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３３４）を示す。
【図２３６】ここでＤＮＡ４５２８８（配列番号：３３５）と命名されるヌクレオチド配列を示す。
【図２３７】天然配列ＰＲＯ１３７９（ＵＮＱ７１６）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３３９）を示す。配列番号：３３９は、ここで「ＤＮＡ５９８２８−１６０８」と命名されるクローンである。
【図２３８】図２３７に示した配列番号：３３９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３４０）を示す。
【図２３９】天然配列ＰＲＯ８４４（ＵＮＱ５４４）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３４４）を示す。配列番号：３４４は、ここで「ＤＮＡ５９８３８−１４６２」と命名されるクローンである。
【図２４０】図２３９に示した配列番号：３４４のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３４５）を示す。
【図２４１】天然配列ＰＲＯ８４８（ＵＮＱ５４３）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３４６）を示す。配列番号：３４６は、ここで「ＤＮＡ５９８３９−１４６１」と命名されるクローンである。
【図２４２】図２４１に示した配列番号：３４６のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３４７）を示す。
【図２４３】天然配列ＰＲＯ１０９７（ＵＮＱ５４２）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３４８）を示す。配列番号：３４８は、ここで「ＤＮＡ５９８４１−１４６０」と命名されるクローンである。
【図２４４】図２４３に示した配列番号：３４８のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３４９）を示す。
【図２４５】天然配列ＰＲＯ１１５３（ＵＮＱ５８３）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３５０）を示す。配列番号：３５０は、ここで「ＤＮＡ５９８４２−１５０２」と命名されるクローンである。
【図２４６】図２４５に示した配列番号：３５０のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３５１）を示す。
【図２４７】天然配列ＰＲＯ１１５４（ＵＮＱ５８４）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３５２）を示す。配列番号：３５２は、ここで「ＤＮＡ５９８４６−１５０３」と命名されるクローンである。
【図２４８】図２４７に示した配列番号：３５２のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３５３）を示す。
【図２４９】天然配列ＰＲＯ１１８１（ＵＮＱ５９５）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３５４）を示す。配列番号：３５４は、ここで「ＤＮＡ５９８４７−１５１１」と命名されるクローンである。
【図２５０】図２４９に示した配列番号：３５４のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３５５）を示す。
【図２５１】天然配列ＰＲＯ１１８２（ＵＮＱ５９６）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３５６）を示す。配列番号：３５６は、ここで「ＤＮＡ５９８４８−１５１２」と命名されるクローンである。
【図２５２】図２５１に示した配列番号：３５６のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３５７）を示す。
【図２５３】天然配列ＰＲＯ１１５５（ＵＮＱ５８５）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３５８）を示す。配列番号：３５８は、ここで「ＤＮＡ５９８４９−１５０４」と命名されるクローンである。
【図２５４】図２５３に示した配列番号：３５８のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３５９）を示す。
【図２５５】天然配列ＰＲＯ１１５６（ＵＮＱ５８６）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３６０）を示す。配列番号：３６０は、ここで「ＤＮＡ５９８５３−１５０５」と命名されるクローンである。
【図２５６】図２５５に示した配列番号：３６０のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３６１）を示す。
【図２５７】天然配列ＰＲＯ１０９８（ＵＮＱ５４１）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３６２）を示す。配列番号：３６２は、ここで「ＤＮＡ５９８５４−１４５９」と命名されるクローンである。
【図２５８】図２５７に示した配列番号：３６２のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３６３）を示す。
【図２５９】天然配列ＰＲＯ１１２７（ＵＮＱ５６５）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３６４）を示す。配列番号：３６４は、ここで「ＤＮＡ６０２８３−１４８４」と命名されるクローンである。
【図２６０】図２５９に示した配列番号：３６４のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３６５）を示す。
【図２６１】天然配列ＰＲＯ１１２６（ＵＮＱ５６４）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３６６）を示す。配列番号：３６６は、ここで「ＤＮＡ６０６１５−１４８３」と命名されるクローンである。
【図２６２】図２６１に示した配列番号：３６６のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３６７）を示す。
【図２６３】天然配列ＰＲＯ１１２５（ＵＮＱ５６３）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３６８）を示す。配列番号：３６８は、ここで「ＤＮＡ６０６１９−１４８２」と命名されるクローンである。
【図２６４】図２６３に示した配列番号：３６８のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３６９）を示す。
【図２６５】天然配列ＰＲＯ１１８６（ＵＮＱ６００）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３７０）を示す。配列番号：３７０は、ここで「ＤＮＡ６０６２１−１５１６」と命名されるクローンである。
【図２６６】図２６５に示した配列番号：３７０のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３７１）を示す。
【図２６７】天然配列ＰＲＯ１１９８（ＵＮＱ６１１）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３７２）を示す。配列番号：３７２は、ここで「ＤＮＡ６０６２２−１５２５」と命名されるクローンである。
【図２６８】図２６７に示した配列番号：３７２のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３７３）を示す。
【図２６９】天然配列ＰＲＯ１１５８（ＵＮＱ５８８）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３７４）を示す。配列番号：３７４は、ここで「ＤＮＡ６０６２５−１５０７」と命名されるクローンである。
【図２７０】図２６９に示した配列番号：３７４のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３７５）を示す。
【図２７１】天然配列ＰＲＯ１１５９（ＵＮＱ５８９）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３７６）を示す。配列番号：３７６は、ここで「ＤＮＡ６０６２７−１５０８」と命名されるクローンである。
【図２７２】図２７１に示した配列番号：３７６のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３７７）を示す。
【図２７３】天然配列ＰＲＯ１１２４（ＵＮＱ５６２）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３７８）を示す。配列番号：３７８は、ここで「ＤＮＡ６０６２９−１４８１」と命名されるクローンである。
【図２７４】図２７３に示した配列番号：３７８のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３７９）を示す。
【図２７５】天然配列ＰＲＯ１２８７（ＵＮＱ６５６）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３８０）を示す。配列番号：３８０は、ここで「ＤＮＡ６１７５５−１５５４」と命名されるクローンである。
【図２７６】図２７５に示した配列番号：３８０のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３８１）を示す。
【図２７７】天然配列ＰＲＯ１３１２（ＵＮＱ６７８）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３８６）を示す。配列番号：３８６は、ここで「ＤＮＡ６１８７３−１５７４」と命名されるクローンである。
【図２７８】図２７７に示した配列番号：３８６のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３８７）を示す。
【図２７９】天然配列ＰＲＯ１１９２（ＵＮＱ６０６）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３８８）を示す。配列番号：３８８は、ここで「ＤＮＡ６２８１４−１５２１」と命名されるクローンである。
【図２８０】図２７９に示した配列番号：３８８のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３８９）を示す。
【図２８１】天然配列ＰＲＯ１１６０（ＵＮＱ５９０）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３９３）を示す。配列番号：３９３は、ここで「ＤＮＡ６２８７２−１５０９」と命名されるクローンである。
【図２８２】図２８１に示した配列番号：３９３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３９４）を示す。
【図２８３】天然配列ＰＲＯ１１８７（ＵＮＱ６０１）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３９８）を示す。配列番号：３９８は、ここで「ＤＮＡ６２８７６−１５１７」と命名されるクローンである。
【図２８４】図２８３に示した配列番号：３９８のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：３９９）を示す。
【図２８５】天然配列ＰＲＯ１１８５（ＵＮＱ５９９）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４００）を示す。配列番号：４００は、ここで「ＤＮＡ６２８８１−１５１５」と命名されるクローンである。
【図２８６】図２８５に示した配列番号：４００のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４０１）を示す。
【図２８７】天然配列ＰＲＯ１３４５（ＵＮＱ７００）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４０２）を示す。配列番号：４０２は、ここで「ＤＮＡ６４８５２−１５８９」と命名されるクローンである。
【図２８８】図２８７に示した配列番号：４０２のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４０３）を示す。
【図２８９】天然配列ＰＲＯ１２４５（ＵＮＱ６２９）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４０７）を示す。配列番号：４０７は、ここで「ＤＮＡ６４８８４−１５２７」と命名されるクローンである。
【図２９０】図２８９に示した配列番号：４０７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４０８）を示す。
【図２９１】天然配列ＰＲＯ１３５８（ＵＮＱ７０７）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４０９）を示す。配列番号：４０９は、ここで「ＤＮＡ６４８９０−１６１２」と命名されるクローンである。
【図２９２】図２９１に示した配列番号：４０９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４１０）を示す。
【図２９３】天然配列ＰＲＯ１１９５（ＵＮＱ６０８）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４１１）を示す。配列番号：４１１は、ここで「ＤＮＡ６５４１２−１５２３」と命名されるクローンである。
【図２９４】図２９３に示した配列番号：４１１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４１２）を示す。
【図２９５】天然配列ＰＲＯ１２７０（ＵＮＱ６４０）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４１３）を示す。配列番号：４１３は、ここで「ＤＮＡ６６３０８−１５３７」と命名されるクローンである。
【図２９６】図２９５に示した配列番号：４１３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４１４）を示す。
【図２９７】天然配列ＰＲＯ１２７１（ＵＮＱ６４１）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４１５）を示す。配列番号：４１５は、ここで「ＤＮＡ６６３０９−１５３８」と命名されるクローンである。
【図２９８】図２９７に示した配列番号：４１５のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４１６）を示す。
【図２９９】天然配列ＰＲＯ１３７５（ＵＮＱ７１２）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４１７）を示す。配列番号：４１７は、ここで「ＤＮＡ６７００４−１６１４」と命名されるクローンである。
【図３００】図２９９に示した配列番号：４１７のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４１８）を示す。
【図３０１】天然配列ＰＲＯ１３８５（ＵＮＱ７２０）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４１９）を示す。配列番号：４１９は、ここで「ＤＮＡ６８８６９−１６１０」と命名されるクローンである。
【図３０２】図３０１に示した配列番号：４１９のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４２０）を示す。
【図３０３】天然配列ＰＲＯ１３８７（ＵＮＱ７２２）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４２１）を示す。配列番号：４２１は、ここで「ＤＮＡ６８８７２−１６２０」と命名されるクローンである。
【図３０４】図３０３に示した配列番号：４２１のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４２２）を示す。
【図３０５】天然配列ＰＲＯ１３８４（ＵＮＱ７２１）ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４２３）を示す。配列番号：４２３は、ここで「ＤＮＡ７１１５９−１６１７」と命名されるクローンである。
【図３０６】図３０５に示した配列番号：４２３のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４２４）を示す。
【図３０７】天然配列ＰＲＯ１８３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４９４）を示す。配列番号：４９４は、ここで「ＤＮＡ２８４９８」と命名されるクローンである。
【図３０８】図３０７に示した配列番号：４９４のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４９５）を示す。
【図３０９】天然配列ＰＲＯ１８４ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４９６）を示す。配列番号：４９６は、ここで「ＤＮＡ２８５００」と命名されるクローンである。
【図３１０】図３０９に示した配列番号：４９６のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４９７）を示す。
【図３１１】天然配列ＰＲＯ１８５ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：４９８）を示す。配列番号：４９８は、ここで「ＤＮＡ２８５０３」と命名されるクローンである。
【図３１２】図３１１に示した配列番号：４９８のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：４９９）を示す。
【図３１３】天然配列ＰＲＯ３３１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５００）を示す。配列番号：５００は、ここで「ＤＮＡ４０９８１−１２３４」と命名されるクローンである。
【図３１４】図３１３に示した配列番号：５００のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５０１）を示す。
【図３１５】天然配列ＰＲＯ３６３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５０２）を示す。配列番号：５０２は、ここで「ＤＮＡ４５４１９−１２５２」と命名されるクローンである。
【図３１６】図３１５に示した配列番号：５０２のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５０３）を示す。
【図３１７】天然配列ＰＲＯ５７２３ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５０４）を示す。配列番号：５０４は、ここで「ＤＮＡ８２３６１」と命名されるクローンである。
【図３１８】図３１７に示した配列番号：５０４のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５０５）を示す。
【図３１９】天然配列ＰＲＯ３３０１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５０６）を示す。配列番号：５０６は、ここで「ＤＮＡ８８００２」と命名されるクローンである。
【図３２０】図３１９に示した配列番号：５０６のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５０７）を示す。
【図３２１】天然配列ＰＲＯ９９４０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５０８）を示す。配列番号：５０８は、ここで「ＤＮＡ９２２８２」と命名されるクローンである。
【図３２２】図３２１に示した配列番号：５０８のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５０９）を示す。
【図３２３】天然配列ＰＲＯ９８２８ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５１０）を示す。配列番号：５１０は、ここで「ＤＮＡ１４２２３８−２７６８」と命名されるクローンである。
【図３２４】図３２３に示した配列番号：５１０のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５１１）を示す。
【図３２５】天然配列ＰＲＯ７１７０ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５１２）を示す。配列番号：５１２は、ここで「ＤＮＡ１０８７２２−２７４３」と命名されるクローンである。
【図３２６】図３２５に示した配列番号：５１２のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５１３）を示す。
【図３２７】天然配列ＰＲＯ３６１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５１４）を示す。配列番号：５１４は、ここで「ＤＮＡ４５４１０−１２５０」と命名されるクローンである。
【図３２８】図３２７に示した配列番号：５１４のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５１５）を示す。
【図３２９】天然配列ＰＲＯ８４６ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５１６）を示す。配列番号：５１６は、ここで「ＤＮＡ４４１９６−１３５３」と命名されるクローンである。
【図３３０】図３２９に示した配列番号：５１６のコード化配列から誘導されたアミノ酸配列（配列番号：５１７）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【図９０】
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【図９１】
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【図９２】
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【図９３】
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【図９４】
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【図９５】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８】
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【図９９】
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【図１００】
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【図１０１】
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【図１０２】
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【図１０３】
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【図１０４】
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【図１０５】
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【図１０６】
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【図１０７】
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【図１０８】
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【図１０９】
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【図１１０】
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【図１１１】
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【図１１２】
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【図１１３】
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【図１１４】
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【図１１５】
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【図１１６】
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【図１１７】
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【図１１８】
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【図１１９】
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【図１２０】
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【図１２１】
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【図１２２】
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【図１２３】
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【図１２４】
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【図１２５】
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【図１２６】
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【図１２７】
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【図１２８】
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【図１２９】
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【図１３０】
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【図１３１】
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【配列表】
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