(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１個以上の遊離システインアミノ酸を含む、システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体であって、以下：
【化３２】
0005606916.tif 000052
を含む重鎖配列、および
以下
【化３３】
0005606916.tif 000053
を含む軽鎖配列を含む、システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体。
【請求項２】
細菌またはＣＨＯ細胞において生成される、請求項１に記載のシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体。
【請求項３】
前記抗体は、オーリスタチン薬物部分に共有結合され、それによって、抗体薬物結合体化合物が形成される、請求項１または２に記載のシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体。
【請求項４】
システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体（Ａｂ）、およびオーリスタチン薬物部分（Ｄ）を含む請求項３に記載の抗体薬物結合体化合物であって、ここで、該システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体は、１個以上の遊離システインアミノ酸を介してリンカー部分（Ｌ）によってＤに結合されており；該化合物は、式Ｉ：
【化３４】
0005606916.tif 000054
を有し、ここでｐは、１、２、３、または４である、
抗体薬物結合体化合物。
【請求項５】
システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体（Ａｂ）、およびオーリスタチン薬物部分（Ｄ）を含む請求項３に記載の抗体薬物結合体化合物であって、ここで、該システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体は、１個以上の遊離システインアミノ酸を介してリンカー部分（Ｌ）によってＤに結合されており；該化合物は、式Ｉ：
【化３４】
0005606916.tif 000055
を有し、ここでｐは、２である、
抗体薬物結合体化合物。
【請求項６】
Ｌは、以下の式：
【化３５】
0005606916.tif 000056
を有し、
ここで
Ａは、前記システイン操作抗体（Ａｂ）のシステインチオールに共有結合される伸長因子ユニットであり；
ａは、０もしくは１であり；
各Ｗは、独立してアミノ酸ユニットであり；
ｗは、０〜１２の範囲の整数であり；
Ｙは、前記薬物部分に共有結合されるスペーサーユニットであり；そして
ｙは、０、１もしくは２である、
請求項４または５に記載の抗体薬物結合体化合物。
【請求項７】
以下の式を有する、請求項６に記載の抗体薬物結合体化合物：
【化３６】
0005606916.tif 000057
ここでＰＡＢは、パラアミノベンジルカルバモイルであり、Ｒ１７は、（ＣＨ２）ｒ、Ｃ３−Ｃ８カルボシクリル、Ｏ−（ＣＨ２）ｒ、アリーレン、（ＣＨ２）ｒ−アリーレン、−アリーレン−（ＣＨ２）ｒ−、（ＣＨ２）ｒ−（Ｃ３−Ｃ８カルボシクリル）、（Ｃ３−Ｃ８カルボシクリル）−（ＣＨ２）ｒ、Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクリル、（ＣＨ２）ｒ−（Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクリル）、−（Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクリル）−（ＣＨ２）ｒ−、−（ＣＨ２）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２）ｒ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−、−（ＣＨ２）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−、および−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２）ｒ−から選択される二価ラジカルであり；ここでＲｂは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、フェニル、もしくはベンジルであり；そしてｒは、独立して、１〜１０の範囲の整数である。
【請求項８】
Ｗｗは、バリン−シトルリンである、請求項６に記載の抗体薬物結合体化合物。
【請求項９】
以下の式を有する、請求項６に記載の抗体薬物結合体化合物：
【化３７】
0005606916.tif 000058
【請求項１０】
Ｒ１７は、（ＣＨ２）５もしくは（ＣＨ２）２である、請求項７または９のいずれかに記載の抗体薬物結合体化合物。
【請求項１１】
以下の式を有する、請求項６に記載の抗体薬物結合体化合物：
【化３８】
0005606916.tif 000059
【請求項１２】
Ｌは、ＳＭＣＣもしくはＢＭＰＥＯである、請求項６に記載の抗体薬物結合体化合物。
【請求項１３】
Ｄは、
以下の構造：
【化３９】
0005606916.tif 000060
を有するＭＭＡＥであり、
ここで波線は、前記リンカーＬへの結合部位を示すか；または
以下の構造：
【化４０】
0005606916.tif 000061
を有するＭＭＡＦであり、
ここで波線は、前記リンカーＬへの結合部位を示すか
のいずれかである、請求項６に記載の抗体薬物結合体化合物。
【請求項１４】
親抗ＴＥＮＢ２抗体は、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、およびヒト化抗体から選択される、請求項１または２に記載のシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体または請求項３〜１３のいずれか１項に記載の抗体薬物結合体化合物。
【請求項１５】
親抗ＴＥＮＢ２抗体は、Ｆａｂフラグメントである、請求項１または２に記載のシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体または請求項３〜１３のいずれか１項に記載の抗体薬物結合体化合物。
【請求項１６】
Ｌは、ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢもしくはＭＣ、ＳＭＣＣ、ＳＰＰ、もしくはＢＭＰＥＯである、請求項４に記載の抗体薬物結合体化合物。
【請求項１７】
以下の構造：
【化４１】
0005606916.tif 000062
【化４２】
0005606916.tif 000063
から選択され、ここでＶａｌはバリンであり；Ｃｉｔはシトルリンであり；ｐは、１、２、３、もしくは４であり；そしてＡｂは、請求項１に記載のシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体である、
抗体薬物結合体化合物。
【請求項１８】
請求項１に記載のシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体または請求項３に記載の抗体薬物結合体化合物、および薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアもしくは賦形剤を含む、薬学的処方物。
【請求項１９】
レトロゾール、オキサリプラチン、ドセタキセル、５−ＦＵ、ラパチニブ、カペシタビン、ロイコボリン、エルロチニブ、ペルツズマブ、ベバシズマブ、およびゲムシタビンから選択される化学療法剤の治療上有効な量をさらに含む、請求項１８に記載の抗体薬物結合体化合物を含む薬学的処方物。
【請求項２０】
製造物品であって、
請求項１８に記載の抗体薬物結合体化合物を含む薬学的処方物；
容器；および
前記化合物を使用して、ＴＥＮＢ２ポリペプチドの過剰発現によって特徴づけられる癌を処置することができることを示す、パッケージ挿入物もしくは表示、
を含み、ここで、該癌は、卵巣癌、前立腺癌、尿路の癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、もしくは
結腸癌から選択される、製造物品。
【請求項２１】
ＴＥＮＢ２タンパク質を含むと推測されるサンプル中のＴＥＮＢ２タンパク質の存在を決定するための方法であって、該方法は、該サンプルを、請求項１に記載のシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体に曝す工程、および該サンプル中の該ＴＥＮＢ２タンパク質への該抗体の結合を決定する工程を含み、ここで該タンパク質への該抗体の結合は、該サンプル中の該タンパク質の存在を示し、該抗体は、蛍光色素、放射性同位体、ビオチン、もしくは金属錯化配位子から選択される標識に共有結合されている、方法。
【請求項２２】
前記サンプルは、前記ＴＥＮＢ２タンパク質を発現すると推測される細胞を含み、ここで該細胞は、前立腺癌細胞、卵巣癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、もしくは膵臓癌細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
癌細胞を検出するためのインビトロアッセイであって、該アッセイは、
（ａ）細胞を、請求項３に記載の抗体薬物結合体化合物に曝す工程；および
（ｂ）該細胞への該抗体薬物結合体化合物の結合の程度を決定する工程、
を包含し、ここで、該細胞は、前立腺腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、乳房腫瘍細胞、結腸腫瘍細胞もしくは卵巣腫瘍細胞である、インビトロアッセイ。
【請求項２４】
細胞増殖を阻害する方法であって、該方法は、細胞培養培地中の哺乳動物腫瘍細胞を、請求項３に記載の抗体薬物結合体化合物で処理し、それによって、該腫瘍細胞の増殖を阻害する工程、を包含し、ここで、該哺乳動物腫瘍細胞は、卵巣腫瘍細胞である、方法。
【請求項２５】
癌を処置する方法において使用するための請求項１８に記載の薬学的処方物であって、該方法は、該薬学的処方物を患者に投与する工程を包含し、ここで該癌は、前立腺癌、尿路の癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、結腸癌および卵巣癌からなる群より選択される、薬学的処方物。
【請求項２６】
前記方法は、前記抗体薬物結合体化合物と組み合わせて化学療法剤を前記患者に投与する工程を包含し、ここで該化学療法剤は、レトロゾール、シスプラチン、カルボプラチン、タキソール、パクリタキセル、オキサリプラチン、ドセタキセル、５−ＦＵ、ロイコボリン、エルロチニブ、ペルツズマブ、ベバシズマブ、ラパチニブ、およびゲムシタビンから選択される、請求項２５に記載の薬学的処方物。
【請求項２７】
請求項１に記載のシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体（Ａｂ）およびオーリスタチン薬物部分（Ｄ）を含む、抗体薬物結合体化合物を作製するための方法であって、ここで該システイン操作抗体は、１個以上の操作されたシステインアミノ酸を介してリンカー部分（Ｌ）によってＤに結合され；該化合物は、式Ｉ：
【化４３】
0005606916.tif 000064
を有し、ここでｐは、１、２、３、もしくは４であり；
該方法は、
（ａ）該システイン操作抗体の操作されたシステイン基と、リンカー試薬とを反応させて、抗体−リンカー中間体Ａｂ−Ｌを形成する工程；および
（ｂ）Ａｂ−Ｌと、活性化された薬物部分Ｄとを反応させ；それによって、該抗体薬物結合体化合物が形成される、工程；
を包含するか、または
（ｃ）薬物部分の求核性基と、リンカー試薬とを反応させて、薬物−リンカー中間体Ｄ−Ｌを形成する工程；および
（ｄ）Ｄ−Ｌと、該システイン操作抗体の操作されたシステイン基とを反応させ；それによって、該抗体薬物結合体化合物が形成される、工程、
を包含し、ここで該方法は、該システイン操作抗体をチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において発現させる工程を包含する、方法。
【請求項２８】
請求項１に記載のシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体（Ａｂ）およびオーリスタチン薬物部分（Ｄ）を含む、抗体薬物結合体化合物を作製するための方法であって、ここで該システイン操作抗体は、１個以上の操作されたシステインアミノ酸を介してリンカー部分（Ｌ）によってＤに結合され；該化合物は、式Ｉ：
【化４３】
0005606916.tif 000065
を有し、ここでｐは、１、２、３、もしくは４であり；
該方法は、
（ａ）該システイン操作抗体の操作されたシステイン基と、リンカー試薬とを反応させて、抗体−リンカー中間体Ａｂ−Ｌを形成する工程；および
（ｂ）Ａｂ−Ｌと、活性化された薬物部分Ｄとを反応させ；それによって、該抗体薬物結合体化合物が形成される、工程；
を包含するか、または
（ｃ）薬物部分の求核性基と、リンカー試薬とを反応させて、薬物−リンカー中間体Ｄ−Ｌを形成する工程；および
（ｄ）Ｄ−Ｌと、該システイン操作抗体の操作されたシステイン基とを反応させ；それによって、該抗体薬物結合体化合物が形成される、工程、
を包含する、方法。
【請求項２９】
前記発現されたシステイン操作抗体を、還元剤で処理する工程をさらに包含し、ここで該還元剤はＴＣＥＰおよびＤＴＴから選択される、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記発現されたシステイン操作抗体を、前記還元剤で処理する工程の後に、酸化剤で処理する工程をさらに包含し、ここで該酸化剤は、硫酸銅、デヒドロアスコルビン酸、および空気から選択される、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、反応性システイン残基で操作された抗体、およびより具体的には、治療的もしくは診断的適用を有する抗体に関する。上記システイン操作された抗体は、化学療法剤、毒素、アフィニティーリガンド（例えば、ビオチン）、および検出標識（例えば、フルオロフォア）と結合体化され得る。本発明はまた、抗体および抗体薬物結合体化合物を、哺乳動物細胞、もしくは関連する病的状態のインビトロ、インサイチュ、およびインビボ診断もしくは処置のために使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
抗体治療は、癌、免疫学的障害および血管新生障害を有する患者の標的化処置のために確立されてきた。正常な非癌細胞と比較して、ガン細胞の表面で特異的に発現される膜貫通ポリペプチドもしくはさもなければ腫瘍関連ポリペプチドは、抗体を用いた癌診断および癌治療のための細胞標的として同定されてきた。このような腫瘍関連細胞表面抗原ポリペプチド（すなわち、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ））の同定は、抗体ベースの治療を介した破壊のための癌細胞の特異的標的化を可能にする。
【０００３】
細胞傷害性もしくは細胞増殖抑制性薬剤（すなわち、癌の処置において腫瘍細胞を死滅させるかもしくは阻害する薬物（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；米国特許第４９７５２７８号））の局所的送達のための抗体薬物結合体（ＡＤＣ）（すなわち、免疫結合体）の使用は、上記薬物部分の、腫瘍への標的化された送達、および腫瘍での細胞内蓄積を可能にし、ここでこれら結合体化されていない薬物因子の全身の蓄積は、正常細胞に対して、および排除されるべき上記腫瘍細胞に対しても許容不能な毒性レベルを生じる（非特許文献６；非特許文献７）。上記治療指数（すなわち、ＡＤＣの最大の効力および最小の毒性）を改善しようとする努力は、ポリクローナル抗体（非特許文献８）およびモノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ならびに薬物連結および薬物放出特性の選択性に焦点が当てられてきた（非特許文献１）。抗体薬物結合体において使用される薬物部分としては、細菌タンパク質毒素（例えば、ジフテリア毒素）、植物タンパク質毒素（例えば、リシン）、低分子（例えば、オーリスタチン、ゲルダナマイシン（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）、マイタンシノイド（ＥＰ  １３９１２１３；非特許文献１２）、カリチアマイシン（非特許文献１３；非特許文献１４）、ダウノマイシン、ドキソルビシン、メトトレキサート、およびビンデシン（非特許文献８）が挙げられる。上記薬物部分は、細胞傷害性機構および細胞増殖抑制性機構（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  チューブリン結合、ＤＮＡ結合、もしくはトポイソメラーゼ阻害）に影響を及ぼし得る。いくつかの細胞傷害性薬物は、大きな抗体もしくはタンパク質レセプターリガンドに結合体化される場合に、不活性もしくは活性が低い傾向がある。
【０００４】
上記オーリスタチンペプチド、オーリスタチンＥ（ＡＥ）およびモノメチルオーリスタチン（ＭＭＡＥ）、ドラスタチンの合成アナログ（特許文献１）は、薬物部分として以下に結合されてきた：（ｉ）キメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６（癌腫上のルイスＹに特異的）；（ｉｉ）血液悪性疾患のＣＤ３０に特異的なｃＡＣ１０（非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；ＵＳ  ２００４／００１８１９４；（ｉｉｉ）抗ＣＤ２０抗体（例えば、ＣＤ２０発現癌および免疫障害の処置のためのリツキサン（非特許文献２））；（ｉｖ）結腸直腸癌の処置のための抗ＥｐｈＢ２Ｒ抗体２Ｈ９（非特許文献１８）；（ｖ）Ｅ−セレクチン抗体（非特許文献１９）；（ｖｉ）トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標）、ＵＳ  ２００５／０２３８６４９）、ならびに（ｖｉ）抗ＣＤ３０抗体（特許文献３）。オーリスタチンＥの改変体は、米国特許第５７６７２３７号および同第６１２４４３１号に開示されている。モノクローナル抗体に結合体化されたモノメチルオーリスタチンＥは、非特許文献２０に開示されている。オーリスタチンアナログＭＭＡＥおよびＭＭＡＦは、種々の抗体に結合体化された（ＵＳ  ２００５／０２３８６４９）。
【０００５】
薬物部分を抗体に結合（すなわち、共有結合を介した連結）する従来の手段は、一般に、分子の不均質な混合物をもたらし、ここで上記薬物部分は、上記抗体上の多くの部位で結合される。例えば、細胞傷害性薬物は、代表的には、上記抗体のしばしば多くのリジン残基を介して抗体に結合体化されてきており、このことは、不均質な抗体薬物結合体混合物を生成した。反応条件に依存して、上記不均質な混合物は、代表的には、０〜約８、もしくはそれ以上で、薬物部分に結合された抗体の分布を含む。さらに、薬物部分  対  抗体の特定の整数比を有する結合体の各亜群内に、上記薬物部分が上記抗体の種々の部位に結合された潜在的に不均質な混合物が存在する。分析方法および分取方法は、結合体化反応から生じる不均一な混合物内の上記抗体薬物結合体種分子を分離および特徴付けるためには不適切であり得る。抗体は、大きく、複雑かつ構造的に多様な生体分子であり、しばしば、多くの反応性官能基を有する。それらの、リンカー試薬および薬物−リンカー中間体との反応性は、ｐＨ、濃度、塩濃度、および共溶媒のような要因に依存する。さらに、上記複数工程結合体化プロセスは、反応条件の制御、ならびに反応物および中間体の特徴付けが困難であることに起因して、再現性がない可能性があり得る。
【０００６】
システインチオールは、ｐＨ７付近では保護されかつ求核性の低い大部分のアミンとは異なり、中性ｐＨにおいて反応性である。遊離チオール（ＲＳＨ、スルフヒドリル）基は、比較的反応性であるので、システイン残基を有するタンパク質は、しばしば、ジスルフィド結合オリゴマーとしてそれらの酸化された形態で存在するか、または内部架橋されたジスルフィド基を有する。細胞外タンパク質は、一般に、遊離チオールを有さない（非特許文献２１）。抗体のシステインチオール基は、一般に、抗体のアミンもしくはヒドロキシル基よりも、求核性結合体化反応に対して反応性がより高い、すなわち、求核性がより高い。システイン残基は、遺伝子操作技術によってタンパク質の中に導入されて、リガンドに対する共有結合を形成したか、または新たな分子内ジスルフィド結合を形成した（非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６；非特許文献２７；米国特許第６２４８５６４号）。しかし、タンパク質の種々のアミノ酸残基をシステインアミノ酸残基へ変異させることによる、システインチオール基の操作は、潜在的に問題があり、特に、対形成していない残基（遊離Ｃｙｓ）、もしくは比較的反応もしくは酸化しやすい残基の場合には、問題がある。上記タンパク質の濃縮溶液において、Ｅ．ｃｏｌｉの周辺質、培養上清、または部分的もしくは完全に精製されたタンパク質においてであろうとそうでなかろうと、上記タンパク質の表面上の対形成していないＣｙｓ残基は、対形成および酸化して、分子間ジスルフィドを形成し得、従って、タンパク質ダイマーもしくは丸チマーを形成し得る。ジスルフィドダイマー形成は、上記新たなＣｙｓを、薬物、リガンド、もしくは他の標識への結合体化に対して非反応性にする。さらに、ｉｆ  上記タンパク質が、上記新たに操作されたＣｙｓと既存のＣｙｓ残基との間で分子内ジスルフィド結合を産科的に形成する場合、両方のＣｙｓチオール基は、活性部位関与および相互作用に利用できない。さらに、上記タンパク質は、間違った折りたたみもしくは四次構造の喪失によって、不活性もしくは非特異的にされ得る（非特許文献２８）。
【０００７】
システイン操作抗体は、ＦＡＢ抗体フラグメント（チオＦａｂ）と称され、全長のＩｇＧモノクローナル（チオＭａｂ）抗体として発現された（ＵＳ  ２００７／００９２９４０（その内容は、本明細書に参考として援用される）。チオＦａｂおよびチオＭａｂ抗体は、リンカーを介して、チオール反応性リンカー試薬および薬物−リンカー試薬と、上記新たに導入されたシステインチオールにおいて結合体化して、抗体薬物結合体（チオＡＤＣ）を調製した。
【０００８】
ＴＥＮＢ２は、腫瘍関連抗原ポリペプチド（ＰＲ１としても公知）であり、上記ＴＥＮＢ２タンパク質は、２個のフォリスタチン様ドメインおよび保存されたＥＧＦ様ドメインを含む。上記タンパク質をコードする遺伝子は、最初に、ヒト脳ｃＤＮＡライブラリーから特徴付けられ（非特許文献２９を参照のこと）、そして後に、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーから単離された（非特許文献３０を参照のこと）。例えば、Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ，ｎｕｍｂｅｒ  ６０５７３４；Ｕｎｉｇｅｎｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｈｓ．２２７９１；ＬｏｃｕｓＬｉｎｋ  ２３６７１；および他のリンクされたサイトもまた参照のこと。ＴＥＮＢ２は、ＰＲ１、トモレグリン（ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ）、ＴＲ、過形成ポリープ症（ｈｙｐｅｒｐｌａｓｔｉｃ  ｐｏｌｙｐｏｓｉｓ）遺伝子１、ＨＰＰ１、およびＴＭＥＦＦ２といわれてきた。その核酸配列は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＡＦ２６４１５０、ＡＢ００４０６４、ＡＢ０１７２６９、およびＡＦ１７９２７４によって同定され得る；そしてそのアミノ酸配列は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＡＡＦ９１３９７、ＢＡＡ９０８２０、ＢＡＡ８７８９７、およびＡＡＤ５５７７６によって同定され得る。ＴＥＮＢ２のＵｎｉＧｅｎｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ識別番号は、ｈｓ．２２７９１であり、Ｌｏｃｕｓｌｉｎｋ識別番号は、２３６７１であり、ＯＭＩＭ識別番号は、６０５７３４である。
【０００９】
上記遺伝子はまた、特定の癌状態に影響を与えた。非特許文献３１は、結腸直腸ポリープにおける発現を報告した。非特許文献３２は、前立腺癌についてのマーカーとして上記遺伝子を報告した。
【００１０】
特定のヒト腫瘍におけるその過剰発現に起因して、上記ＴＥＮＢ２ポリペプチドおよびそのポリペプチドをコードする上記核酸は、種々の哺乳動物組織サンプルの中で定量的および定性的比較の標的である。ＴＥＮＢ２ポリペプチドの上記独特の発現プロフィール、およびそのポリペプチドをコードする上記核酸は、哺乳動物における癌性腫瘍の特定のタイプの診断および治療的処置のために利用され得る。
【００１１】
最近、特定の抗ＴＥＮＢ２抗体（抗ＴＭＥＦＦ２抗体番号１９を含む）が開示され、前立腺の増殖状態（例えば、良性前立腺肥大および前立腺癌を含む）を処置するためにインターナライズされかつ有用であることが示された（ＰＣＴ／ＵＳ０３／０７２０９；米国特許出願第１０／３８３４４７号（２００３年３月７日）；Ｖｉｎａｙら，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ａｎｔｉｇｅｎ  ＴＭＥＦＦ２  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」（その内容は、本明細書に参考として援用される））。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第０２／０８８１７２号パンフレット
【特許文献２】国際公開第０４／０３２８２８号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０３／０４３５８３号パンフレット
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｊ．（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ５：５４３−５４９
【非特許文献２】Ｗｕら（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３（９）：１１３７−１１４６
【非特許文献３】Ｐａｙｎｅ，Ｇ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ３：２０７−２１２
【非特許文献４】Ｓｙｒｉｇｏｓ  ａｎｄ  Ｅｐｅｎｅｔｏｓ（１９９９）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９：６０５−６１４
【非特許文献５】Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−Ｄｕｖａｚ  ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９７）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．２６：１５１−１７２
【非特許文献６】Ｂａｌｄｗｉｎら（１９８６）Ｌａｎｃｅｔ  ｐｐ．（Ｍａｒ．１５，１９８６）：６０３−０５
【非特許文献７】Ｔｈｏｒｐｅ，（１９８５）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａ．Ｐｉｎｃｈｅｒａら（編），ｐｐ．４７５−５０６
【非特許文献８】Ｒｏｗｌａｎｄら（１９８６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２１：１８３−８７
【非特許文献９】Ｍａｎｄｌｅｒら（２０００）Ｊ．ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９２（１９）：１５７３−１５８１
【非特許文献１０】Ｍａｎｄｌｅｒら（２０００）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｅｒｓ  １０：１０２５−１０２８
【非特許文献１１】Ｍａｎｄｌｅｒら（２００２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１３：７８６−７９１
【非特許文献１２】Ｌｉｕら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：８６１８−８６２３
【非特許文献１３】Ｌｏｄｅら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：２９２８
【非特許文献１４】Ｈｉｎｍａｎら（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２
【非特許文献１５】Ｋｌｕｓｓｍａｎら（２００４），Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １５（４）：７６５−７７３
【非特許文献１６】Ｄｏｒｏｎｉｎａら（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１（７）：７７８−７８４
【非特許文献１７】Ｆｒａｎｃｉｓｃｏら（２００３）  Ｂｌｏｏｄ  １０２（４）：１４５８−１４６５
【非特許文献１８】Ｍａｏら（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６４（３）：７８１−７８８
【非特許文献１９】Ｂｈａｓｋａｒら（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：６３８７−６３９４
【非特許文献２０】Ｓｅｎｔｅｒら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ  ４５，Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ６２３（２００４年３月２８日に示された）
【非特許文献２１】Ｇａｒｍａｎ，１９９７，Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，第５５頁
【非特許文献２２】Ｂｅｔｔｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１３：９６４４−９６５０
【非特許文献２３】Ｂｅｒｎｈａｒｄら（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：１２６−１３２
【非特許文献２４】Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄら（１９９４）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １：２４７−２５５
【非特許文献２５】Ｔｕら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９６：４８６２−４８６７
【非特許文献２６】Ｋａｎｎｏら（２０００）  Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ７６：２０７−２１４
【非特許文献２７】Ｃｈｍｕｒａら（２００１）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８（１５）：８４８０−８４８４
【非特許文献２８】Ｚｈａｎｇら（２００２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３１１：１−９
【非特許文献２９】Ｕｃｈｉｄａら（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６６：５９３−６０２
【非特許文献３０】Ｈｏｒｉｅら（２０００）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６７：１４６−１５２
【非特許文献３１】Ｙｏｕｎｇら（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：２６５−２７０
【非特許文献３２】Ｇｌｙｎｎｅ−Ｊｏｎｅｓら（２００１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９４：１７８−１８４
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（要旨）
一局面において、本発明は、１個以上の遊離システインアミノ酸および配列番号８〜２３から選択される配列を含むシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体を包含する。上記システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体は、ＴＥＮＢ２ポリペプチドに結合し得る。腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）（例えば、ＴＥＮＢ２ポリペプチド）は、当該分野で周知である方法および情報、およびＰＣＴ／ＵＳ０３／０７２０９における例を使用して、システイン操作抗体を生成することにおいて使用するために調製され得る。上記システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体は、親抗ＴＥＮＢ２抗体１個以上のアミノ酸残基をシステインで置換する工程を包含するプロセスによって、調製され得る。
【００１５】
上記システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体の上記１個以上の遊離システインアミノ酸残基は、軽鎖もしくは重鎖に位置する。
【００１６】
一局面において、本発明は、ＴＥＮＢ２タンパク質を含むと推測されるサンプル中の上記タンパク質の存在を決定するための方法を包含し、上記方法は、上記サンプルをシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体に曝す工程、および上記サンプル中の上記ＴＥＮＢ２タンパク質への上記抗体の結合を決定する工程を包含する。ここで上記タンパク質への上記抗体の結合は、上記サンプル中に上記タンパク質が存在することを示す。
【００１７】
システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体は、裸の抗体（薬物にも標識部分にも結合体化されていない）もしくは抗体薬物結合体（ＡＤＣ）として使用され得る。上記システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体は、オーリスタチン薬物部分に共有結合され得、それによって、抗体薬物結合体が形成される。上記抗体薬物結合体は、システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体（Ａｂ）、およびオーリスタチン薬物部分（Ｄ）を含み得、ここで上記システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体は、１個以上の遊離システインアミノ酸を介して、リンカー部分（Ｌ）によって、Ｄへと結合され；上記化合物は、式Ｉを有し：
【００１８】
【化１−１】
0005606916.tif 000002
ここでｐは、１、２、３、もしくは４である。オーリスタチン薬物部分は、ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦを包含する。
【００１９】
本発明の一局面は、癌細胞を堅守するためのアッセイであり、上記方法は、（ａ）細胞を抗体薬物結合体化合物に曝す工程；および（ｂ）上記細胞への上記抗体薬物結合体化合物の結合の程度を決定する工程を包含する。
【００２０】
本発明の一局面は、上記抗体薬物結合体、および薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアもしくは賦形剤を含む、薬学的処方物である。
【００２１】
本発明の一局面は、細胞増殖を阻害するための方法であり、上記方法は、細胞培養培地中の哺乳動物腫瘍細胞を、抗体薬物結合体化合物で処理する工程を包含し、それによって、上記腫瘍細胞の増殖は、阻害される。
【００２２】
本発明の一局面は、癌を処置するための方法であり、上記方法は、患者に上記薬学的処方物を投与する工程を包含する。上記患者は、化学療法剤を、上記抗体薬物結合体化合物と組み合わせて投与され得る。
【００２３】
本発明の一局面は、上記薬学的処方物、容器；および上記化合物が、ＴＥＮＢ２ポリペプチドの過剰発現によって特徴付けられる癌を処置するために使用され得ることを示すパッケージ挿入物もしくは表示、を含む製造物品である。
【００２４】
本発明の一局面は、式Ｉの抗体薬物結合体化合物を作製するための方法であり、上記方法は、（ａ）上記システイン操作抗体の操作システイン基と、リンカー試薬とを反応させて、抗体−リンカー中間体Ａｂ−Ｌを形成する工程；および（ｂ）Ａｂ−Ｌと、活性化された薬物部分Ｄとを反応させる工程を包含し、それによって、上記抗体薬物結合体が形成されるか；または（ｃ）薬物部分の求核性基と、リンカー試薬とを反応させて、薬物−リンカー中間体Ｄ−Ｌを形成する工程；および（ｄ）Ｄ−Ｌと、上記システイン操作抗体の操作システイン基とを反応させる工程を包含し、それによって上記抗体薬物結合体が形成される。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（請求項１）
１個以上の遊離システインアミノ酸および配列番号８〜２３から選択される配列を含む、システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体。
（請求項２）
前記システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体は、ＴＥＮＢ２ポリペプチドに結合する、請求項１に記載のシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体。
（請求項３）
親抗ＴＥＮＢ２抗体の１個以上のアミノ酸残基を、システインで置換する工程を包含するプロセスによって調製される、請求項１に記載のシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体。
（請求項４）
前記１個以上の遊離システインアミノ酸残基は、軽鎖に位置する、請求項１に記載のシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体。
（請求項５）
以下から選択される１つ以上の配列を含む、請求項４に記載のシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体：
【表３】
0005606916.tif 000003
（請求項６）
前記１個以上の遊離システインアミノ酸残基は、重鎖に位置する、請求項１に記載のシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体。
（請求項７）
以下から選択される１つ以上の配列を含む、請求項６に記載のシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体：
【表４】
0005606916.tif 000004
（請求項８）
以下を含む重鎖配列を含む、請求項１に記載のシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体：
【化３２】
0005606916.tif 000005
（請求項９）
以下を含む軽鎖配列を含む、請求項１に記載のシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体：
【化３３】
0005606916.tif 000006
（請求項１０）
前記親抗ＴＥＮＢ２抗体は、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、およびヒト化抗体から選択される、請求項１に記載のシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体。
（請求項１１）
抗体フラグメントである、請求項１に記載のシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体。
（請求項１２）
前記抗体フラグメントは、Ｆａｂフラグメントである、請求項１１に記載のシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体。
（請求項１３）
キメラ抗体、ヒト抗体、もしくはヒト化抗体から選択される、請求項１に記載のシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体。
（請求項１４）
細菌において生成される、請求項１に記載のシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体。
（請求項１５）
ＣＨＯ細胞において生成される、請求項１に記載のシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体。
（請求項１６）
ＴＥＮＢ２タンパク質を含むと推測されるサンプル中のＴＥＮＢ２タンパク質の存在を決定するための方法であって、該方法は、該サンプルを、請求項１に記載のシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体に曝す工程、および該サンプル中の該ＴＥＮＢ２タンパク質への該抗体の結合を決定する工程を含み、ここで該タンパク質への該抗体の結合は、該サンプル中の該タンパク質の存在を示す、方法。
（請求項１７）
前記サンプルは、前記ＴＥＮＢ２タンパク質を発現すると推測される細胞を含む、請求項１６に記載の方法。
（請求項１８）
前記細胞は、前立腺癌細胞、卵巣癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、もしくは膵臓癌細胞である、請求項１６に記載の方法。
（請求項１９）
前記抗体は、蛍光色素、放射性同位体、ビオチン、もしくは金属錯化配位子から選択される標識に共有結合されている、請求項１６に記載の方法。
（請求項２０）
請求項１に記載のシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体、および薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアもしくは賦形剤を含む、薬学的処方物。
（請求項２１）
前記抗体は、オーリスタチン薬物部分に共有結合され、それによって、抗体薬物結合体が形成される、請求項１に記載のシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体。
（請求項２２）
システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体（Ａｂ）、およびオーリスタチン薬物部分（Ｄ）を含み、ここで、該システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体は、１個以上の遊離システインアミノ酸を介してリンカー部分（Ｌ）によってＤに結合されており；該化合物は、式Ｉ：
【化３４】
0005606916.tif 000007
を有し、ここでｐは、１、２、３、もしくは４である、
請求項２１に記載の抗体薬物結合体。
（請求項２３）
ｐは２である、請求項２２に記載の抗体薬物結合体化合物。
（請求項２４）
Ｌは、以下の式：
【化３５】
0005606916.tif 000008
を有し、
ここで
Ａは、前記システイン操作抗体（Ａｂ）のシステインチオールに共有結合される伸長因子ユニットであり；
ａは、０もしくは１であり；
各Ｗは、独立してアミノ酸ユニットであり；
ｗは、０〜１２の範囲の整数であり；
Ｙは、前記薬物部分に共有結合されるスペーサーユニットであり；そして
ｙは、０、１もしくは２である、
請求項２２に記載の抗体薬物結合体化合物。
（請求項２５）
以下の式を有する、請求項２４に記載の抗体薬物結合体化合物：
【化３６】
0005606916.tif 000009
ここでＰＡＢは、パラアミノベンジルカルバモイルであり、Ｒ１７は、（ＣＨ２）ｒ、Ｃ３−Ｃ８カルボシクリル、Ｏ−（ＣＨ２）ｒ、アリーレン、（ＣＨ２）ｒ−アリーレン、−アリーレン−（ＣＨ２）ｒ−、（ＣＨ２）ｒ−（Ｃ３−Ｃ８カルボシクリル）、（Ｃ３−Ｃ８カルボシクリル）−（ＣＨ２）ｒ、Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクリル、（ＣＨ２）ｒ−（Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクリル）、−（Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクリル）−（ＣＨ２）ｒ−、−（ＣＨ２）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２）ｒ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−、−（ＣＨ２）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−、および−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２）ｒ−か
ら選択される二価ラジカルであり；ここでＲｂは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、フェニル、もしくはベンジルであり；そしてｒは、独立して、１〜１０の範囲の整数である。
（請求項２６）
Ｗｗは、バリン−シトルリンである、請求項２４に記載の抗体薬物結合体化合物。
（請求項２７）
Ｒ１７は、（ＣＨ２）５もしくは（ＣＨ２）２である、請求項２４に記載の抗体薬物結合体化合物。
（請求項２８）
以下の式を有する、請求項２４に記載の抗体薬物結合体化合物：
【化３７】
0005606916.tif 000010
（請求項２９）
Ｒ１７は、（ＣＨ２）５もしくは（ＣＨ２）２である、請求項２８に記載の抗体薬物結合体化合物。
（請求項３０）
以下の式を有する、請求項２４に記載の抗体薬物結合体化合物：
【化３８】
0005606916.tif 000011
（請求項３１）
Ｌは、ＳＭＣＣもしくはＢＭＰＥＯである、請求項２２に記載の抗体薬物結合体化合物。
（請求項３２）
Ｄは、ＭＭＡＥであり、以下の構造：
【化３９】
0005606916.tif 000012
を有し、
ここで波線は、前記リンカーＬへの結合部位を示す、請求項２２に記載の抗体薬物結合体化合物。
（請求項３３）
Ｄは、ＭＭＡＦであり、以下の構造：
【化４０】
0005606916.tif 000013
を有し、
ここで波線は、前記リンカーＬへの結合部位を示す、請求項２２に記載の抗体薬物結合体化合物。
（請求項３４）
親抗ＴＥＮＢ２抗体は、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、およびヒト化抗体から選択される、請求項２１に記載の抗体薬物結合体化合物。
（請求項３５）
親抗ＴＥＮＢ２抗体は、抗体フラグメントである、請求項２１に記載の抗体薬物結合体化合物。
（請求項３６）
前記抗体フラグメントは、Ｆａｂフラグメントである、請求項３５に記載の抗体薬物結合体化合物。
（請求項３７）
前記オーリスタチンは、ＭＭＡＥもしくはＭＭＡＦである、請求項２１に記載の抗体薬物結合体。
（請求項３８）
Ｌは、ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢもしくはＭＣである、請求項２１に記載の抗体薬物結合体。
（請求項３９）
Ｌは、ＳＭＣＣ、ＳＰＰ、もしくはＢＭＰＥＯである、請求項２１に記載の抗体薬物結合体。
（請求項４０）
以下の構造：
【化４１】
0005606916.tif 000014
【化４２】
0005606916.tif 000015
から選択され、ここでＶａｌはバリンであり；Ｃｉｔはシトルリンであり；ｐは、１、２、３、もしくは４であり；そしてＡｂは、請求項１に記載のシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体である、
抗体薬物結合体化合物。
（請求項４１）
Ａｂは、配列番号１を含む、請求項４０に記載の抗体薬物結合体。
（請求項４２）
Ａｂは、配列番号２を含む、請求項４０に記載の抗体薬物結合体。
（請求項４３）
Ａｂは、配列番号１および配列番号２を含む、請求項４０に記載の抗体薬物結合体。
（請求項４４）
癌細胞を検出するためのアッセイであって、該アッセイは、
（ａ）細胞を、請求項２１に記載の抗体薬物結合体化合物に曝す工程；および
（ｂ）該細胞への該抗体薬物結合体化合物の結合の程度を決定する工程、
を包含する、アッセイ。
（請求項４５）
前記細胞は、前立腺腫瘍細胞、膵臓腫瘍細胞、肺腫瘍細胞、乳房腫瘍細胞、結腸腫瘍細胞もしくは卵巣腫瘍細胞である、請求項４４に記載のアッセイ。
（請求項４６）
細胞増殖を阻害するための方法であって、該方法は、細胞培養培地中の哺乳動物腫瘍細胞を、請求項２１に記載の抗体薬物結合体化合物で処理し、それによって、該腫瘍細胞の増殖を阻害する工程、を包含する、方法。
（請求項４７）
前記哺乳動物腫瘍細胞は、卵巣腫瘍細胞である、請求項４６に記載の方法。
（請求項４８）
請求項２１に記載の抗体薬物結合体、および薬学的に受容可能な希釈剤、キャリアもしくは賦形剤を含む、薬学的処方物。
（請求項４９）
レトロゾール、オキサリプラチン、ドセタキセル、５−ＦＵ、ラパチニブ、カペシタビン、ロイコボリン、エルロチニブ、ペルツズマブ、ベバシズマブ、およびゲムシタビンから選択される化学療法剤の治療上有効な量をさらに含む、請求項４８に記載の薬学的処方物。
（請求項５０）
請求項４８に記載の薬学的処方物を患者に投与する工程を包含する、癌を処置するための方法。
（請求項５１）
前記癌は、前立腺癌、尿路の癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、結腸癌および卵巣癌からなる群より選択される、請求項５０に記載の方法。
（請求項５２）
前記患者は、前記抗体薬物結合体化合物と組み合わせて化学療法剤を投与され、ここで該化学療法剤は、レトロゾール、シスプラチン、カルボプラチン、タキソール、パクリタキセル、オキサリプラチン、ドセタキセル、５−ＦＵ、ロイコボリン、エルロチニブ、ペルツズマブ、ベバシズマブ、ラパチニブ、およびゲムシタビンから選択される、請求項５０に記載の方法。
（請求項５３）
製造物品であって、
請求項４８に記載の薬学的処方物；
容器；および
前記化合物を使用して、ＴＥＮＢ２ポリペプチドの過剰発現によって特徴づけられる癌を処置することができることを示す、パッケージ挿入物もしくは表示、
を含む、製造物品。
（請求項５４）
前記癌は、卵巣癌、前立腺癌、尿路の癌、膵臓癌、肺癌、乳癌、もしくは結腸癌である、請求項５３に記載の製造物品。
（請求項５５）
請求項１に記載のシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体（Ａｂ）およびオーリスタチン薬物部分（Ｄ）を含む、抗体薬物結合体化合物を作製するための方法であって、ここで該システイン操作抗体は、１個以上の操作されたシステインアミノ酸を介してリンカー部分（Ｌ）によってＤに結合され；該化合物は、式Ｉ：
【化４３】
0005606916.tif 000016
を有し、ここでｐは、１、２、３、もしくは４であり；
該方法は、
（ａ）該システイン操作抗体の操作されたシステイン基と、リンカー試薬とを反応させて、抗体−リンカー中間体Ａｂ−Ｌを形成する工程；および
（ｂ）Ａｂ−Ｌと、活性化された薬物部分Ｄとを反応させ；それによって、該抗体薬物結合体が形成される、工程；
を包含するか、または
（ｃ）薬物部分の求核性基と、リンカー試薬とを反応させて、薬物−リンカー中間体Ｄ−Ｌを形成する工程；および
（ｄ）Ｄ−Ｌと、該システイン操作抗体の操作されたシステイン基とを反応させ；それによって、該抗体薬物結合体が形成される、工程、
を包含する、方法。
（請求項５６）
前記システイン操作抗体をチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において発現させる工程をさらに包含する、請求項５５に記載の方法。
（請求項５７）
前記発現されたシステイン操作抗体を、還元剤で処理する工程をさらに包含する、請求項５６に記載の方法。
（請求項５８）
前記還元剤は、ＴＣＥＰおよびＤＴＴから選択される、請求項５７に記載の方法。
（請求項５９）
前記発現されたシステイン操作抗体を、前記還元剤で処理する工程の後に、酸化剤で処理する工程をさらに包含する、請求項５７に記載の方法。
（請求項６０）
前記酸化剤は、硫酸銅、デヒドロアスコルビン酸、および空気から選択される、請求項５９に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、ヒト化抗ＴＥＮＢ２抗体（ｈｕ  ＴＭＥＦＦ２＃１９）の重鎖配列：配列番号１、および軽鎖配列：配列番号２を示す。
【図２】図２は、ヒト化システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体（Ａ１２１Ｃ  チオｈｕ  ＴＭＥＦＦ２＃１９）の重鎖配列：配列番号３、および軽鎖配列：配列番号２を示す。シグナル配列は、抗ＴＥＮＢ２抗体の配列番号付け（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ）に含まれない。
【図３】図３は、ヒト化トラスツズマブ軽鎖（ＨｕＴＭＡｂ−ＬＣ、配列番号４）およびｈｕ  ＴＭＥＦＦ２＃１９軽鎖（配列番号５）のアラインメントを示す。番号付けは、配列番号付けの慣例に従う。
【図４】図４は、ヒト化トラスツズマブ重鎖（ＨｕＴＭＡｂ−ＨＣ、配列番号６）、およびｈｕ  ＴＭＥＦＦ２＃１９重鎖（配列番号７）のアラインメントを示す。番号付けは、配列番号付けの慣例に従う。
【図５】図５は、システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体薬物結合体（ＡＤＣ）の説明を示し、ここで薬物部分は、軽鎖（ＬＣ−ＡＤＣ）；重鎖（ＨＣ−ＡＤＣ）；およびＦｃ領域（Ｆｃ−ＡＤＣ）における操作システイン基に結合される。
【図６】図６は、（ｉ）システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体（チオＭａｂ）においてシステインジスルフィド付加物ならびに鎖間ジスルフィドおよび鎖内ジスルフィドを還元する工程；（ｉｉ）部分的に酸化する工程（すなわち、再酸化して、鎖間ジスルフィドおよび鎖内ジスルフィドを再形成する工程）；ならびに（ｉｉｉ）上記再酸化された抗体と、薬物−リンカー中間体とを結合体化して、システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体薬物結合体（ＡＤＣ）を形成する工程、を示す。
【図７】図７は、癌および正常ヒト組織におけるＴＥＮＢ２の発現を示す：オリゴヌクレオチドマイクロアレイ分析は、４８４１個のヒト組織サンプルから抽出されたＲＮＡに対して行われた。プロット中の各ボックスは、上記示された組織のサンプルのＴＥＮＢ２に対するシグナル強度（１００に対してスケール化した平均差異）を提供する。緑色のボックスは、正常組織であり、赤色ボックスは腫瘍であり、青色ボックスは他の罹患した組織を示す。
【図８】図８は、ヒト前立腺腫瘍におけるＴＥＮＢ２発現を示す：上下のパネルは、それぞれ、ヒト前立腺外植片モデル（ＰＣ３ＴＥＮＢ２中程度安定（ｍｅｄｉｕｍ  ｓｔａｂｌｅ）細胞株）とベクターコントロール、および前立腺腫瘍に由来する。
【図９】図９は、ＰＣ３ＴＥＮＢ２中程度細胞株およびＬｕＣａＰ  ７０腫瘍に対するＴＥＮＢ２モノクローナル抗体（Ｍａｂ）のインターナリゼーション（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を示す。
【図１０】図１０は、ＴＥＮＢ２中程度細胞とチオ抗ＴＥＮＢ２  ＡＤＣ処置もしくは従来の抗ＴＥＮＢ２  ＡＤＣ処置を用いたＰＣ３に対するＦＡＣＳデータを示す。
【図１１】図１１は、従来の抗ＴＥＮＢ２  ＡＤＣおよびチオ抗ＴＥＮＢ２  ＡＤＣを用いたＰＣ３  ＴＥＮＢ２中程度細胞に対する細胞死滅アッセイを示す。
【図１２】図１２は、抗ＴＥＮＢ２  ＡＤＣおよびチオ抗ＴＥＮＢ２  ＡＤＣ（ｖｃ−ＭＭＡＥもしくはＭＣ−ＭＭＡＦと結合体化）を使用する、ＰＣ３  ＴＥＮＢ２中程度細胞に対する効力研究を示す。
【図１３】図１３は、ヒト化抗ＴＥＮＢ２  Ａｂ（ｈｕ  ＴＭＥＦＦ２＃１９）を使用する、種々のＬｕＣａＰ外植片腫瘍組織を用いたウェスタンブロットを示す。
【図１４】図１４は、ヒト前立腺癌ＬｕＣａＰ  ７０、７７および９６．１を使用する、異種移植片実験を示す。
【図１５】図１５は、チオ抗ＴＥＮＢ２および従来のＡＤＣを使用する、ラットの薬物動態評価を示す。
【図１６】図１６は、抗ＴＥＮＢ２−ｖｃ−ＭＭＡＥ  対  ＭＣ−ＭＭＡＦを用いたラットでの安全性評価を示す。
【図１７】図１７は、抗ＴＥＮＢ２−ｖｃ−ＭＭＡＥ  対  抗ＴＥＮＢ２−ＭＣ−ＭＭＡＦを用いたカニクイザルに対する安全性評価を示す。
【図１８】図１８は、チオ抗ＴＥＮＢ２−ｖｃ−ＭＭＡＥ  対  抗ＴＥＮＢ２−ｖｃ−ＭＭＡＥを用いたラットに対する安全性評価を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
（例示的な実施形態の詳細な説明）
いまや本発明の特定の実施形態に対して詳細に言及がなされ、その実施例は、添付の構造および式において例示される。本発明は、列挙される実施形態とともに記載される一方で、上記実施形態が、本発明をそれらの実施形態に限定することを意図しないことが理解される。対照的に、本発明は、全ての代替物、改変物および等価物を網羅することが意図され、それらは、特許請求の範囲によって定義されるように、本発明の範囲内に含まれ得る。
【００２７】
当業者は、本明細書に記載されるものと類似もしくは等価な多くの方法および材料を認識し、これらは、本発明の実施において使用され得る。本発明は、上記記載される方法および材料に決して限定されない。
【００２８】
（定義）
別段定義されない限り、本明細書において使用される技術的および化学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有し、以下と一致する：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら（１９９４）  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２版，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；およびＪａｎｅｗａｙ，Ｃ．，Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｐ．，Ｗａｌｐｏｒｔ，Ｍ．，Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋ（２００１）  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，第５版，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ。
【００２９】
本明細書において用語「抗体」とは、最も広い意味において使用され、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ダイマー、マルチマー、マルチ特異性抗体（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）（例えば、二重特異性抗体）、および抗体フラグメントが、望ましい生物学的活性を示す限りにおいて、これらモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ダイマー、マルチマー、マルチ特異性抗体、および抗体フラグメントを具体的に網羅する。（Ｍｉｌｌｅｒら（２００３）Ｊｏｕｒ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７０：４８５４−４８６１）。抗体は、マウス、ヒト、ヒト化、キメラ、もしくは他の種に由来するものであり得る。抗体は、特定の抗原を認識しかつこれに結合し得るタンパク質である（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃ．，Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｐ．，Ｗａｌｐｏｒｔ，Ｍ．，Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋ（２００１）Ｉｍｍｕｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第５版，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。標的抗原は、一般に、複数の抗体の上のＣＤＲによって認識される多くの結合部位（エピトープともいわれる）を有する。異なるエピトープに特異的に結合する各抗体は。異なる構造を有する。従って、１つの抗原は、１つより多くの対応する抗体を有し得る。抗体は、全長免疫グロブリン分子もしくは全長免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分（すなわち、目的の標的抗原を免疫特異的に結合する抗原結合部位もしくはその一部）を含み、このような標的としては、癌細胞もしくは自己免疫疾患と関連する自己免疫抗体を生成する細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で開示される免疫グロブリンは、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＡ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）もしくはサブクラスのものであり得る。上記免疫グロブリンは、任意の種（例えば、ヒト、マウス、もしくはウサギ）に由来し得る。上記異なるクラスの抗体の構造および特性については、例えば、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第８版，Ｄａｎｉｅｌ  Ｐ．Ｓｔｉｔｅｓ，Ａｂｂａ  Ｉ．Ｔｅｒｒ  ａｎｄ  Ｔｒｉｓｔｒａｍ  Ｇ．Ｐａｒｓｌｏｗ（編），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，１９９４，第７１頁および第６賞を参照のこと。
【００３０】
「抗体フラグメント」とは、全長抗体の一部、一般に、上記抗原結合領域もしくはその可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；ダイアボディー；直線上抗体；ミニボディー（米国特許第５６４１８７０号、実施例２；Ｚａｐａｔａら（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２）；Ｏｌａｆｓｅｎら（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｓｅｌ．１７（４）：３１５−３２３）、Ｆａｂ発現ライブラリーによって生成されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、ＣＤＲ（相補性決定領域）、および癌細胞抗原、ウイルス抗原もしくは微生物抗原に免疫特異的に結合する上記のうちのいずれかのエピトープ結合フラグメント、一本鎖抗体分子；抗体フラグメントから形成されるマルチ特異性抗体が挙げられる。
【００３１】
用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書において使用される場合、実質的に均質な抗体の集団（すなわち、上記集団を構成する個々の抗体が、少量存在し得る考えられる天然に存在する変異を除いて同一である）から得られる抗体をいう。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原性部位に対して指向されている。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対して指向される異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、上記抗原上の単一の決定基に対して指向される。それらの特異性に加えて、上記モノクローナル抗体は、それらが他の抗体により汚染されずに合成され得るという点で有利である。修飾語「モノクローナル」とは、実質的に均質な抗体の集団から得られるとして上記抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による上記抗体の生成を要すると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるべき上記モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製され得るか、または組換えＤＮＡ法（例えば：米国特許第４８１６５６７号；同第５８０７７１５号を参照のこと）によって作製され得る。上記ハイブリドーマ法において、マウスもしくは他の適切な宿主動物（例えば、ハムスター）が、免疫のために使用されるタンパク質に特異的に結合する抗体を生成するかまたは生成し得るリンパ球を惹起するために、上記のように免疫される。あるいは、リンパ球は、インビトロで免疫され得る。免疫後に、リンパ球は単離され、次いで、適切な融合剤（例えば、ポリエチレングリコール）を使用して、骨髄腫細胞株と融合されて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）。上記モノクローナル抗体はまた、Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８；Ｍａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７において記載される技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離され得る。
【００３２】
上記抗体をコードするＤＮＡは、キメラポリペプチドもしくは融合抗体ポリペプチドを、例えば、ヒト重鎖および軽鎖定常ドメイン（ＣＨおよびＣＬ）配列を、相同なマウス配列の代わりに使用すること（米国特許第４８１６５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１（１９８４））によってか、または上記免疫グロブリンコード配列と、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てもしくは一部（異種ポリペプチド）と融合することによって、生成するために改変され得る。上記非免疫グロブリンポリペプチド配列は、抗体の定常ドメインの代わりに使用され得るか、またはこれらは、抗体の１つに抗原結合部位（ａｎｔｉｇｅｎ−ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｓｉｔｅ）の可変ドメインの代わりに使用されて、抗原に対して特異性を有する１つの抗原結合部位（ａｎｔｉｇｅｎ−ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｓｉｔｅ）および異なる抗原に対する特異性を有する別の抗原結合部位（ａｎｔｉｇｅｎ−ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｓｉｔｅ）を含むキメラ二価抗体を作り出し得る。
【００３３】
「ネイティブ抗体」とは、通常、約１５０，０００ダルトンの異種テトラマー糖タンパク質であり、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される。各軽鎖は、１個の共有結合的ジスルフィド結合によって重鎖に連結される一方で、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの上記重鎖の中で変動する。各重鎖および軽鎖はまた、規則的に間隔を空けた鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＨ）を、続いて、多くの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）を、その他方の末端に定常ドメインを有する。上記軽鎖の定常ドメインは、上記重鎖の第１の定常ドメインとアラインされ、上記軽鎖可変ドメインは、上記重鎖の可変ドメインとアラインされる。特定のアミノ酸残基は、上記軽鎖可変ドメインと重鎖可変ドメインとの間に境界を形成すると考えられる。
【００３４】
上記モノクローナル抗体は、本明細書において、具体的には、「キメラ」抗体を含み、ここで上記重鎖および／もしくは軽鎖の一部は、特定の種から得られるか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一であるか、またはこれに相同である一方で、上記鎖の残りは、望ましい生物学的活性を示す限りにおいて、別の種に由来するか、または別のクラスもしくはサブクラスに属する抗体、ならびにこのような抗体のフラグメントにおける対応する配列と同一であるか、またはこれに相同である（米国特許第４８１６５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５）。目的のキメラ抗体は、本明細書において、非ヒト霊長類（例えば、旧世界サル（Ｏｌｄ  Ｗｏｒｌｄ  Ｍｏｎｋｅｙ）、無尾猿（Ａｐｅ）など）およびヒトの定常領域配列から得られる可変ドメイン抗原結合配列を含む「霊長類化」抗体を含む。
【００３５】
非ヒト（例えば、齧歯類）抗体の「ヒト化」形態は、上記非ヒト抗体に由来する最小の配列を含むキメラ抗体である。大部分については、ヒト化抗体は、上記レシピエントの超可変領域の残基が、所望の抗体特異性、親和性および能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）（例えば、マウス、ラット、ウサギもしくは非ヒト霊長類）の超可変領域に由来する残基で置換される、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。いくつかの場合において、上記ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、上記レシピエント抗体においても上記ドナー抗体においても見いだされない残基を含み得る。これら改変は、抗体性能をさらに精密にするために行われる。一般に、上記ヒト化抗体は、少なくとも１個の、および代表的には、２個の可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで上記超可変ループの全てもしくは実質的に全ては、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、そして上記ＦＲの全てもしくは実質的に全ては、ヒト免疫グロブリン配列のものである。上記ヒト化抗体は、必要に応じて、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（代表的には、ヒト免疫グロブリンのもの）の少なくとも一部分を含む。上記Ｆｃフラグメントは、ジスルフィドによって一緒に保持される両方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、上記Ｆｃ領域中の配列によって決定され、上記領域はまた、特定の細胞タイプ上で見いだされるＦｃレセプター（ＦｃＲ）によって認識される部分である（Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９；Ｐｒｅｓｔａ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６；Ｓｉｍｓら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６；Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１）。他の方法は、軽鎖もしくは重鎖の特定の亜群の全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワーク領域を使用する（Ｃａｒｔｅｒら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５；Ｐｒｅｓｔａら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３）。
【００３６】
「ヒト抗体」は、ヒトによって生成され、そして／または本明細書で開示されるヒト抗体を作製するための技術のうちのいずれかを使用して作製された抗体のものに対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を具体的に排除する。トラスジェニック動物（例えば、マウス）が利用可能であり、上記トランスジェニック動物は、免疫する際に、内因性免疫グロブリン生成の非存在下でヒト抗体の完全なレパートリーを生成することができる。例えば、キメラマウスおよび生殖系列変異マウスにおける上記抗体重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性欠失は、内因性抗体生成の完全な阻害を生じることが記載されてきた。上記ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの、このような生殖系列変異マウスへの移入は、抗原チャレンジの際にヒト抗体の生成を生じる（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら（１９９３）Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．７：３３；米国特許第５５４５８０６号；同第５５６９８２５号；同第５５９１６６９号；同第５５４５８０７号；およびＷＯ  ９７／１７８５２）。
【００３７】
「親和性成熟した（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒｅｄ）」抗体は、１個以上の変異を有しない抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性の改善を生じる１個以上のＣＤＲにおける１個以上を有する抗体である。好ましい親和性成熟した抗体は、上記標的抗原に対してｎＭもしくはさらにｐＭの親和性を有する。親和性成熟した抗体は、ＶＨドメインおよびＶＬドメインシャフリング（Ｍａｒｋｓら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３）、またはＣＤＲおよび／もしくはフレームワーク残基のランダム変異誘発（Ｂａｒｂａｓら（１９９４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ  ９１：３８０９−３８１３；Ｓｃｈｉｅｒら（１９９５）Ｇｅｎｅ  １６９：１４７−１５５；Ｙｅｌｔｏｎら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４−２００４；Ｊａｃｋｓｏｎら（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０−９；およびＨａｗｋｉｎｓら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６）によって、親和性成熟を生じる。
【００３８】
「インタクトな抗体」とは、本明細書において、ＶＬドメインおよびＶＨドメイン、ならびに軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）を含むものである。上記定常ドメインは、ネイティブ配列の定常ドメイン（例えば、ヒトのネイティブ配列の定常ドメイン）もしくはそのアミノ酸配列改変体であり得る。上記インタクトな抗体は、１個以上の「エフェクター機能」を有し得、このことは、抗体の上記Ｆｃ定常領域（ネイティブ配列のＦｃ領域もしくはアミノ酸配列改変Ｆｃ領域）に帰することができる生物学的活性に言及する。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害性；Ｆｃレセプター結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）；ファゴサイトーシス；および細胞表面レセプター（例えば、Ｂ細胞レセプターおよびＢＣＲ）のダウンレギュレーションが挙げられる。
【００３９】
用語「アミノ酸配列改変体」とは、ネイティブ配列のポリペプチドとある程度異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドをいう。通常は、アミノ酸配列改変体は、ネイティブ配列のポリペプチドの少なくとも１個のレセプター結合ドメインと、もしくはネイティブレセプターの少なくとも１個のリガンド結合ドメインと、少なくとも約７０％の配列同一性を有し、そして好ましくは、上記改変体は、このようなレセプター結合ドメインもしくはリガンド結合ドメインと、配列が少なくとも約８０％、より好ましくは、少なくとも約９０％相同である。上記アミノ酸配列改変体は、上記ネイティブアミノ酸配列のアミノ酸配列内の特定の位置における置換、欠失、および／もしくは挿入を有する。アミノ酸は、従来の名称、１文字表記および３文字表記で指定される。
【００４０】
「配列同一性」とは、上記配列をアラインし、必要であればギャップを導入して、最大％配列同一性を達成した後に同一であるアミノ酸配列改変体中の残基のパーセンテージとして定義される。上記アラインメントのための方法およびコンピュータープログラムは、当該分野で周知である。１つのこのようなコンピュータープログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．の著作物である「Ａｌｉｇｎ  ２」であり、これは、米国著作権局（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ  ２０５５９）に、１９９１年１２月１０日にユーザー説明書とともに提出され、そのコードは、ＰＣＴ／ＵＳ０３／０７２０９において見いだされる。
【００４１】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性」および「ＡＤＣＣ」とは、Ｆｃレセプター（ＦｃＲｓ）を発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が、標的細胞上の結合した抗体を認識し、その後、上記標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性反応をいう。ＡＤＣＣを媒介するための主な細胞（ＮＫ細胞）は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対して、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，（１９９１）「Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」９：４５７−９２の第４６４頁、表３にまとめられる。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、インビトロＡＤＣＣアッセイ（例えば、米国特許第５５００３６２号および同第５８２１３３７号に記載されているもの）を、行い得る。このアッセイのために有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代わりに、もしくはさらに、上記目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで（例えば、動物モデル（Ｃｌｙｎｅｓら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６に開示されるもの）において）評価され得る。
【００４２】
「ヒトエフェクター細胞」とは、１個以上の定常領域レセプター（ＦｃＲｓ）を発現しかつエフェクター機能を発揮する白血球である。好ましくは、上記細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現しかつＡＤＣＣエフェクター機能を発揮する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の齢としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞および好中球が挙げられる；ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。上記エフェクター細胞は、その天然供給源から（例えば、本明細書において記載されるように、血液もしくはＰＢＭＣから）単離され得る。
【００４３】
用語「Ｆｃレセプター」もしくは「ＦｃＲ」とは、抗体の上記Ｆｃ定常領域に結合するレセプターを意味する。好ましいＦｃＲは、ネイティブ配列のヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（γレセプター）を結合するものであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプター（これらレセプターの対立遺伝子改変体および選択的スプライス形態を含む）を含む。ＦｃγＲＩＩレセプターは、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化レセプター」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害レセプター」）を含み、これらは、その細胞質ドメインにおいて主に異なる、類似のアミノ酸配列を有する。活性化レセプターＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインにおいて免疫レセプターチロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害レセプターＦｃγＲＩＩＢは、免疫レセプターチロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）をその細胞質ドメインに含む（総説Ｍ．  ｉｎ  Ｄａｅｒｏｎ，（１９９７）「Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」１５：２０３−２３４を参照のこと）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，（１９９１）「Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ」．，９：４５７−９２；Ｃａｐｅｌら（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２５−３４；およびｄｅ  Ｈａａｓら（１９９５）Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１において総説されている。他のＦｃＲ（将来同定されるものも含む）は、本明細書において、用語「ＦｃＲ」によって包含される。上記用語はまた、新生児レセプター（ｎｅｏｎａｔａｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＦｃＲｎを含み、これは、母親のＩｇＧを胎児に移すことを担う（Ｇｕｙｅｒら（１９７６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１７：５８７およびＫｉｍら（１９９４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９）。
【００４４】
「補体依存性細胞傷害性」もしくは「ＣＤＣ」とは、補体の存在下での標的細胞の融解をいう。古典的補体経路の活性化は、上記補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）を、それらのコグネート抗原に結合される（適切なサブクラスの）抗体に結合させることによって開始される（Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３）。
【００４５】
用語「可変」とは、上記可変ドメインの特定の部分が、抗体の中でも配列において広範囲に異なり、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合および特異性において使用されるという事実をいう。しかし、その可変性は、上記抗体の可変ドメインを介して均一に分布しない。上記可変性は、軽鎖および重鎖両方の可変ドメインにおける超可変領域といわれる３つのセグメントにおいて、集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分が、フレームワーク領域（ＦＲ）といわれる。ネイティブの重鎖および軽鎖の可変ドメインは、各々４つのＦＲを含み、主に、３つの超可変領域によって接続されたβ−シート配置をとり、これは、ループ接続を形成し、ときおり、β−シート構造の一部を形成する。各鎖における超可変領域は、上記ＦＲ近接して、上記他の鎖に由来する超可変領域と一緒に保持されており、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤを参照のこと）。上記定常ドメインは、抗原への抗体の結合に直接は関与していないが、種々のエフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）における上記抗体の関与）を示す。
【００４６】
用語「超可変領域」、「ＨＶＲ」もしくは「ＨＶ」とは、本明細書において使用される場合、配列において超可変性であり、そして／または構造的に規定されたループに由来する抗体可変ドメインの領域をいう。一般に、抗体は、６個の超可変領域を含む；ＶＨ中に３個（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、およびＶＬ中に３個（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）。超可変領域の詳細図（ｄｅｌｉｎｅａｔｉｏｎ）の番号が使用されており、本明細書において包含される。上記Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列可変性に基づき、最も一般に使用されている（Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに、構造ループの位置に言及している（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。上記「接触」超可変領域は、利用可能な複雑な結晶構造の分析に基づく。これら超可変領域の各々からの残基は、以下に示される。別段示されなければ、タンパク質のアラインされた配列のＫａｂａｔデータベースに従うＫａｂａｔ番号付けが、使用される（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｋａｂａｔ（１９７０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３２：２１１−２５０；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｕ（２０００）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８（１）：２１４−２１８）。超可変領域の位置は、一般に、以下のとおりである：アミノ酸２４〜３４（ＨＶＲ−Ｌ１）、アミノ酸４９〜５６（ＨＶＲ−Ｌ２）、アミノ酸８９〜９７（ＨＶＲ−Ｌ３）、アミノ酸２６〜３５Ａ（ＨＶＲ−Ｈ１）、アミノ酸４９〜６５（ＨＶＲ−Ｈ２）、およびアミノ酸９３〜１０２（ＨＶＲ−Ｈ３）。超可変領域はまた、以下のような「伸長された（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）超可変領域」を含み得る：ＶＬ中のアミノ酸２４〜３６（Ｌ１）、およびアミノ酸４６〜５６（Ｌ２）。上記可変ドメイン残基は、Ｋａｂａｔらに従って番号付けされる（これらの定義の各々については前出）。本明細書における目的で、「変化した（ａｌｔｅｒｅｄ）超可変領域」とは、１個以上の（例えば、１〜約１６個の）アミノ酸置換をそこに含む超可変領域である。本明細書における目的で、「改変されていない超可変領域」とは、それが由来した非ヒト抗体と同じアミノ酸配列を有する超可変領域、すなわち、そこに１個以上のアミノ酸置換を欠いているものである。
【００４７】
用語「Ｋａｂａｔにおけるような可変ドメイン残基番号付け」、「Ｋａｂａｔにおけるようなアミノ酸位置番号付け」、およびそのバリエーションは、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）における、抗体の編集（ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ）の重鎖可変ドメインもしくは軽鎖可変ドメインに使用される番号付けシステムをいう。この番号付けシステムを使用して、実際の直線状アミノ酸配列は、上記可変ドメインのＦＲもしくはＣＤＲの短縮化（ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ）、または上記ＦＲもしくはＣＤＲへの挿入に対応する、少数のもしくはさらなるアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後ろの単一のアミノ酸挿入物（Ｋａｂａｔによれば、残基５２ａ）および重鎖ＦＲ残基８２の後ろの挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔによれば、残基８２ａ、８２ｂ、および８２ｃなど）を含み得る。残基の上記Ｋａｂａｔ番号付けは、上記抗体の配列の、「標準的」Ｋａｂａｔ番号付けされた配列との相同性の領域においてアラインメントによって、所定の抗体について決定され得る。
【００４８】
「結合親和性」とは、一般に、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位と、その結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合的相互作用の総合計の強さをいう。別段示されなければ、本明細書において使用される場合、「結合親和性」とは、結合対（例えば、抗体および抗原）のメンバーとの間の１：１相互作用を反映する内因性の結合親和性をいう。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）によって表され得る。親和性は、本明細書に記載されるものを含む、当該分野で公知の一般的方法によって測定され得る。低親和性抗体は、一般に、ゆっくりと抗原に結合し、容易に解離する傾向があるのに対して、高親和性抗体は、一般に、より素早く抗原に結合し、より長く結合されたままである傾向がある。結合親和性を測定するための種々の方法は、当該分野で公知であり、そのうちのいずれかは、本発明の目的のために使用され得る。特定の例示的実施形態は、以下において記載される。
【００４９】
「抗原」は、所定のポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン、または他の天然に存在するもしくは合成の化合物であり、これらに対して口蓋が選択的に結合し得る。
【００５０】
「フレームワーク」もしくは「ＦＲ」の残基は、本明細書に定義されるように、超可変領域の残基以外のこれらの可変ドメイン残基である。「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬもしくはＶＨフレームワーク配列の選択において、上記最も一般に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンＶＬもしくはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列の亜群からである。一般に、配列の亜群は、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）におけるように、亜群である。一実施形態において、上記ＶＬについては、上記亜群は、Ｋａｂａｔらにおけるように、亜群κIである。一実施形態において、上記ＶＨについては、上記亜群は、Ｋａｂａｔらにおけるように、亜群ＩＩＩである。「ＶＨ亜群ＩＩＩコンセンサスフレームワーク」は、Ｋａｂａｔらの可変重鎖亜群ＩＩＩ（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｓｕｂｇｒｏｕｐ  ＩＩＩ）におけるアミノ酸配列から得られるコンセンサス配列を含む。「ＶＬ亜群Ｉコンセンサスフレームワーク」は、Ｋａｂａｔらの可変軽鎖κ亜群Ｉ（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｉｇｈｔ  ｋａｐｐａ  ｓｕｂｇｒｏｕｐ  Ｉ）におけるアミノ酸配列から得られるコンセンサス配列を含む。
【００５１】
「Ｆｖ」とは、完全な抗原認識かつ抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントである。この領域は、密な非共有結合的会合において、１個の重鎖および１個の軽鎖の可変ドメインのダイマーからなる。各可変ドメインの３つの超可変領域は、上記ＶＨ−ＶＬダイマーの表面上の抗原結合部位を規定するように相互作用することは、この形態において存在する。まとめると、上記６個の超可変領域は、上記抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、さらに単一の可変ドメイン（もしくは抗原に対して特異的なわずか３個の超可変領域を含むＦｖの半分）は、結合部位全体よりも低い親和性においてであるが、抗原を認識しかつ結合する能力を有する。
【００５２】
上記Ｆａｂフラグメントはまた、上記軽鎖の定常ドメインおよび上記重鎖の最初の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’フラグメントは、上記抗体の本字領域に由来する１個以上のシステインを含む、上記重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端において数個の残基の添加によって、Ｆａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、Ｆａｂ’についての本明細書中の名称であり、ここで上記定常ドメインの上記システイン残基は、少なくとも１個の遊離チオール基を有する。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは、本来は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として生成された。抗体フラグメントの他の化学的カップリングはまた、公知である。
【００５３】
任意の脊椎動物種に由来する抗体の「軽鎖」は、２個の明らかに異なるタイプ（カッパ（κ）およびラムダ（λ）といわれる）のうちの１つに、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、割り当てられ得る。
【００５４】
「一本鎖Ｆｖ」もしくは「ｓｃＦｖ」抗体フラグメントは、抗体の上記ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含み、ここでこれらドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。好ましくは、上記Ｆｖポリペプチドは、上記ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、このことは、上記ｓｃＦｖが、抗原結合のための望ましい構造を形成することを可能にする（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）。
【００５５】
用語「ダイアボディー」とは、２個の抗原結合部位を有する小さな抗体フラグメントをいい、これらフラグメントは、同じポリペプチド鎖の中に可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）に接続された可変重鎖ドメイン（ＶＨ）を含む（ＶＨ−ＶＬ）。上記同じ鎖上の２個のドメイン間での追啓製を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、上記ドメインは、別の鎖の相補性ドメインと対形成し、２個の抗原結合部位を作り出すようにされる（ＥＰ  ４０４，０９７；ＷＯ  ９３／１１１６１；Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８）。
【００５６】
「遊離システインアミノ酸」とは、親抗体へと操作され、チオール官能基（−ＳＨ）を有し、分子内もしくは分子間ジスルフィドか共として対形成されていないか、またはさもなければその部分でないシステインアミノ酸残基をいう。
【００５７】
用語「チオール反応性値」は、遊離システインアミノ酸の反応性の定量的特徴である。上記チオール反応性値は、チオール反応性試薬と反応し、最大値は１に変換されるシステイン操作抗体中の遊離システインアミノ酸のパーセンテージである。例えば、１００％収率でチオール反応性試薬（例えば、ビオチン−マレイミド試薬）と反応して、ビオチン標識抗体を形成する、システイン操作抗体上の遊離システインアミノ酸は、１．０の反応性値を有する。８０％収率でチオール反応性試薬と反応する同じもしくは異なる親抗体へと操作された別のシステインアミノ酸は、チオール反応性値０．８を有する。チオール反応性試薬と全く反応しない同じもしくは異なる親抗体へ操作された別のシステインアミノ酸は、チオール反応性値０を有する。特定のシステインのチオール反応性値の決定は、ＥＬＩＳＡアッセイ、質量分析、液体クロマトグラフィー、オートラジオグラフィー、もしくは他の定量的分析試験によって行われ得る。上記システイン操作抗体の捕捉、ならびに上記システイン反応性の比較および定量を可能にするチオール反応性試薬としては、ビオチン−ＰＥＯ−マレイミド（（＋）−ビオチニル−３−マレイミドプロピオンアミジル−３，６−ジオキサオクタンジアミン（ｄｉｏｘａｏｃｔａｉｎｅｄｉａｍｉｎｅ）（Ｏｄａら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９：３７９−３８２，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）、ビオチン−ＢＭＣＣ、ＰＥＯ−インドアセチルビオチン、ヨードアセチル−ＬＣ−ビオチン、およびビオチン−ＨＰＤＰ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）、ならびにＮα−（３−マレイミジルプロピオニル）ビオチン（ＭＰＢ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）が挙げられる。ビオチン化、二官能性および多官能性リンカー試薬のための他の供給元としては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲおよびＳｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯが挙げられる。
【００５８】
「親抗体」とは、１個以上のアミノ酸残基が、１個以上のシステイン残基で置換されているアミノ酸配列を含む抗体である。上記親抗体は、ネイティブもしくは野生型の配列を含み得る。上記親抗体は、他のネイティブの、野生型、もしくは改変された形態の抗体と比較して、既存のアミノ酸配列改変（例えば、付加、欠失および／もしくは置換）を有し得る。親抗体は、目的の標的抗原（例えば、生物学的に重要なポリペプチド）に対して指向され得る。非ポリペプチド抗原（例えば、腫瘍関連糖脂質抗原；米国特許第５０９１１７８号を参照のこと）に対する抗体もまた、企図される。
【００５９】
「単離された抗体」とは、その天然の環境の成分から同定ならびに分離および／もしくは回収されたものである。その天然の環境の夾雑成分は、上記抗体の診断用途もしくは治療用途を妨害し、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性もしくは非タンパク質性溶質を含み得る物質である。好ましい実施形態において、上記抗体は、（１）Ｌｏｗｒｙ法によって決定される場合、抗体の重量の９５重量％より高くにまで、および最も好ましくは、９９重量％にまで、（２）スピニングカップシークエネーター（ｓｐｉｎｎｉｎｇ  ｃｕｐ  ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ）の使用によって、Ｎ末端アミノ酸配列もしくは内部アミノ酸配列のうちの少なくとも１５残基を得るに十分な程度にまで、または（３）還元条件もしくは非還元条件下で、クーマシーブルーもしくは、好ましくは、銀染色を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になる程度まで、精製される。単離された抗体は、組換え細胞内のインサイチュでの抗体を含む。なぜなら、上記抗体の天然の環境の少なくとも１個の成分は、存在しないからである。しかし、通常は、単離された抗体は、少なくとも１つの精製工程によって調製される。
【００６０】
分子標的もしくは目的の抗原（例えば、ＴＥＮＢ２もしくはＣＡ１２５抗原）を「結合する」抗体は、上記抗体が、その抗原を発現する細胞を標的とすることにおいて有用であるように、十分な親和性で上記抗原を結合することができるものである。上記抗体が、ＴＥＮＢ２を結合するものである場合、上記抗体は、通常、ＴＥＮＢ２を優先的に結合し、他のタンパク質と顕著に交叉反応しないものであり得る。このような実施形態において、上記抗体の、これら非ＴＥＮＢ２タンパク質への結合（例えば、内因性レセプターに結合する細胞表面）の程度は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析もしくは放射性免疫沈降（ＲＩＡ）によって決定される場合に、１０％未満である。
【００６１】
「処置する」もしくは「処置」もしくは「緩和」とは、治療的処置および予防的（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）手段もしくは予防的（ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）手段の両方をいい、ここで上記目的は、上記標的とされる病的状態もしくは障害を予防するか、もしくは遅らせる（軽減する）ことである。処置が必要なヒトとしては、上記障害を既に有するヒト、および上記障害を有する傾向のあるヒト、もしくは上記障害が予防されるべきヒトが挙げられる。被験体もしくは哺乳動物は、本発明の方法に従って、抗ＣＡ１２５／Ｏ７７２Ｐ抗体（例えば、システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体、もしくはその抗体薬物結合体）の治療的量を受けた後に、上記患者が、以下のうちの１個以上の観察可能なおよび／もしくは測定可能な低下、または以下のうちの１個以上の非存在を示す場合に、ＣＡ１２５／Ｏ７７２Ｐポリペプチドを発現する癌について首尾よく「処置」される：癌細胞数の低下もしくは癌細胞の非存在；腫瘍サイズの縮小；癌の、軟組織もしくは骨への拡がりを含む、末梢器官への癌細胞浸潤の阻害（すなわち、ある程度まで遅らせ、好ましくは停止する）；腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度まで遅らせ、好ましくは停止する）；腫瘍増殖のある程度までの阻害；ならびに／あるいは特定の癌と関連する症状のうちの１個以上のある程度までに軽減；罹患率および死亡率の低下、ならびにクオリティーオブライフの問題の改善。上記システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体、もしくはその抗体薬物結合体が、増殖を予防し得、そして／または存在する癌細胞を死別させ得る程度にまで、上記抗体は、細胞増殖抑制性および／もしくは細胞傷害性であり得る。これら徴候もしくは症状の軽減はまた、上記患者によって感じられ得る。上記疾患における首尾よい処置および改善を評価するための上記パラメーターは、医師が精通した慣用的手順によって容易に測定可能である。癌治療については、効力は、例えば、疾患進行までの時間（ＴＴＰ）を評価すること、および／もしくは応答率（ＲＲ）を決定することによって、測定され得る。転移は、ステージ決定試験によって、そして骨への拡がりを決定するための骨のスキャンならびにカルシウムレベルおよび他の酵素のための試験によって、決定され得る。ＣＴスキャンはまた、骨盤および上記領域におけるリンパ節への拡がりを探すために行われ得る。胸部Ｘ線および公知の方法による肝臓酵素レベルの測定は、それぞれ、肺および肝臓への転移を探すために使用される。上記疾患をモニターするための他の慣用的方法としては、経直腸的超音波検査（ＴＲＵＳ）および経直腸的針生検（ＴＲＮＢ）が挙げられる。
【００６２】
用語「癌」および「癌性」とは、代表的には、調節されない細胞増殖によって特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態を記載するために言及する。「腫瘍」は、１個以上の癌性細胞を含み、悪性か良性かに関わらず、全ての新生物細胞増殖（ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、および全ての前癌性および癌性の細胞および組織をいう。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病もしくはリンパ系悪性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。このような癌のより具体的な例としては、扁平上皮癌（例えば、扁平上皮癌（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｎｃｅｒ））、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞肺癌（「ＮＳＣＬＣ」）、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌が挙げられる）、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｏｒ  ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）（胃腸癌が挙げられる）、膵臓癌、神経膠芽細胞種、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌腫もしくは子宮癌種、唾液腺癌種、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｏｒ  ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌（ｈｅｐａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肛門癌、陰茎癌、ならびに頭頚部癌が挙げられる。
【００６３】
抗原性レセプターを「過剰発現する」癌は、同じ組織タイプの非癌性細胞と比較して、細胞表面において、上記レセプター（例えば、ＴＥＮＢ２）の顕著により高いレベルを有する癌である。このような過剰発現は、遺伝子増幅によって、または増大した転写もしくは翻訳によって引き起こされ得る。レセプター過剰発現は、細胞の表面に存在するレセプタータンパク質の増大したレベルを（例えば、免疫組織科学アッセイ；ＩＨＣを介して）評価することによって、診断アッセイもしくは予後アッセイにおいて決定され得る。代わりに、もしくはさらに、例えば、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ；ＷＯ９８／４５４７９を参照のこと）、サザンブロッティング、もしくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（例えば、リアルタイム定量的逆転写酵素ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ））を介して、細胞におけるレセプターコード核酸のレベルを測定し得る。
【００６４】
「ヒトエフェクター細胞」とは、１個以上のＦｃＲを発現しかつエフェクター機能を発揮する白血球、好ましくは、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現しかつＡＤＣＣエフェクター機能を発揮する細胞である。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞および好中球が挙げられる；ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。上記エフェクター細胞は、天然供給源から（例えば、血液から）単離され得る。
【００６５】
用語「細胞増殖障害」および「増殖障害」とは、ある程度の異常な細胞増殖と関連する障害をいう。一実施形態において、上記細胞増殖障害は、癌である。
【００６６】
用語「治療上有効な量」とは、薬物（例えば、システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体薬物結合体もしくは化学療法剤）の、哺乳動物における疾患もしくは障害を処置するために有効な量をいう。癌の場合において、上記薬物の治療上有効な量は、癌細胞数を低下させ得；腫瘍サイズを縮小させ得；末梢器官への癌細胞増浸潤を阻害し得（すなわち、ある程度まで遅らせ得、好ましくは停止し得る）；腫瘍転移を阻害し得（すなわち、ある程度まで遅らせ得、好ましくは停止し得る）；腫瘍増殖をある程度まで阻害し得；ならびに／または上記がんと関連する症状のうちの１個以上をある程度まで軽減し得る。上記薬物は、増殖を予防し得および／もしくは癌細胞を死滅させ得る程度にまで、細胞増殖抑制性および／もしくは細胞傷害性であり得る。用語「細胞増殖抑制性」とは、細胞の機能を制限する（例えば、細胞増殖（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｒ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ）を制限する）効果をいう。癌治療については、効力は、例えば、疾患進行までの時間（ＴＴＰ）を評価することおよび／もしくは応答率（ＲＲ）を決定することによって、測定され得る。
【００６７】
「化学療法剤」とは、癌の処置において有用な化合物である。化学療法剤の例としては、以下が挙げられる：エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ  Ｐｈａｒｍ．）、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標），Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍ．）、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（登録商標），ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ステント（ＳＵ１１２４８，Ｐｆｉｚｅｒ）、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（登録商標），Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、イマチニブメシレート（ＧＬＥＥＶＥＣ（登録商標），Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＰＴＫ７８７／ＺＫ  ２２２５８４（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、オキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ（登録商標），Ｓａｎｏｆｉ）、５−ＦＵ（５−フルオロウラシル）、ロイコボリン、ラパマイシン（シロリムス，ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標），Ｗｙｅｔｈ）、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（登録商標），ＧＳＫ５７２０１６，ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ロナファルニブ（ＳＣＨ  ６６３３６），ソラフェニブ（ＢＡＹ４３−９００６，Ｂａｙｅｒ  Ｌａｂｓ．）、およびゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標），Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａ）、ＡＧ１４７８、ＡＧ１５７１（ＳＵ  ５２７１；Ｓｕｇｅｎ）、アルキル化剤（例えば、チオテパおよびＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））、シクロホスファミド；アルキルスルホネート（例えば、ブスルファン、イムプロスルファンおよびピポスルファン）；アジリジン（例えば、ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、およびウレドパ）；エチレンイミンおよびメチルメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロメラミンを含む）；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブタタシノン）；カンプトテシン（合成アナログトポテカンが挙げられる）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成アナログが挙げられる）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１が挙げられる）；エリュテロビン；パンクラチスタチン（ｐａｎｃｒａｔｉｓｔａｔｉｎ）；サルコジクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、コロホスファミド（ｃｈｏｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード）；ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムスチン（ｒａｎｉｍｎｕｓｔｉｎｅ））；抗生物質（例えば、エネジイン抗生物質（例えば、カリチアマイシン、特に、カリチアマイシンγ１ＩおよびカリチアマイシンωＩ１（Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．（１９９４）３３：１８３−１８６））；ジネマイシン（ｄｙｎｅｍｉｃｉｎ）（���ネマイシンＡが挙げられる）；ビスホスホネート（例えば、クロドロネート）；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連色素タンパク質エネジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンが挙げられる）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン（ｍａｒｃｅｌｌｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン（例えば、マイトマイシンＣ）、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ））；葉酸アナログ（例えば、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、メトトレキサート、プテロプテリン（ｐｔｅｒｏｐｔｅｒｉｎ）、トリメトレキサート）；プリンアナログ（例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン）；ピリミジンアナログ（例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン）；アンドロゲン（例えば、カルステロン、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン）；抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）（例えば、アミノグルテチミド、ミトータン、トリロスタン）；葉酸補充剤（ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｅｒ）（例えば、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ））；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルチン（ｄｅｍｅｃｏｌｃｉｎｅ）；ジアジクオン（ｄｉａｚｉｑｕｏｎｅ）；エフロルニチン（ｅｌｆｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；マイタンシノイド（例えば、マイタンシンおよびアンサマイトシン（ａｎｓａｍｉｔｏｃｉｎ）；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸（ｐｏｄｏｐｈｙｌｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）  ポリサッカリド複合体（ＪＨＳ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテシン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリンＡ（ｖｅｒｒａｃｕｒｉｎ  Ａ）、ロリジンＡおよびアングイジン（ａｎｇｕｉｄｉｎｅ））；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド（例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標），Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥＴＭ  Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ非含有，パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子処方物（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、およびＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）  ドセタキセル（Ｒｈoｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ））；クロラムブシル；ＧＥＭＺＡＲ（登録商標）  ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金アナログ（例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン）；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標）  ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート（ｅｄａｔｒｅｘａｔｅ）；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ｄｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｌｈｙｌｏｒｎｉｔｈｉｎｅ）（ＤＭＦＯ）；レチノイド（例えば、レチノイン酸）；カペシタビン；ならびに上記の内のいずれかの薬学的に受容可能な塩、酸もしくは誘導体。
【００６８】
「化学療法剤」のこの定義においても含まれるのは、以下である：（ｉ）腫瘍に対するホルモン作用を調節もしくは阻害するように作用する抗ホルモン剤（例えば、抗エストロゲンおよび選択的エストロゲンレセプターモジュレーター（ＳＥＲＭ）（例えば、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標）  タモキシフェンを含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン（ｏｎａｐｒｉｓｔｏｎｅ）、およびＦＡＲＥＳＴＯＮ  トレミフェンが挙げられる）；（ｉｉ）副腎におけるエストロゲン生成を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼインヒビター（例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（登録商標）  メゲステロールアセテート、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（登録商標）  エキセメスタン、ホルメスタン（ｆｏｒｍｅｓｔａｎｉｅ）、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（登録商標）  ボロゾール、ＦＥＭＡＲＡ（登録商標）  レトロゾール、ならびにＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標）  アナストロゾール）；（ｉｉｉ）抗アンドロゲン（例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリン）；ならびにトロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシンアナログ）；（ｉｖ）アロマターゼインヒビター；（ｖ）プロテインキナーゼインヒビター；（ｖｉ）脂質キナーゼインヒビター；（ｖｉｉ）アンチセンスオリゴヌクレオチド（特に、異常な細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの（例えば、ＰＫＣ−α、ＲａｌｆおよびＨ−Ｒａｓ））；（ｖｉｉｉ）リボザイム（例えば、ＶＥＧＦ発現インヒビター（例えば、ＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（登録商標）  リボザイム）およびＨＥＲ２発現インヒビター）；（ｉｘ）ワクチン（例えば、遺伝子治療ワクチン（例えば、ＡＬＬＯＶＥＣＴＩＮ（登録商標）  ワクチン、ＬＥＵＶＥＣＴＩＮ（登録商標）  ワクチン、およびＶＡＸＩＤ（登録商標）  ワクチン））；ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ（登録商標）  ｒＩＬ−２；ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（登録商標）  トポイソメラーゼ１インヒビター；ＡＢＡＲＥＬＩＸ（登録商標）  ｒｍＲＨ；（ｘ）抗血管形成剤（例えば、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標），Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）；ならびに（ｘｉ）上記のうちのいずれかの薬学的に受容可能な塩、酸もしくは誘導体。
【００６９】
用語「サイトカイン」とは、細胞内メディエーターとしてある細胞に対して作用する、別の細胞集団によって放出されるタンパク質についての包括的用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および伝統的なポリペプチドホルモンである。以下が、サイトカインの中に含まれる：成長ホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモン）；副甲状腺ホルモン；サイロキシン；インスリン；プロインスリン；リラキシン；プロリラキシン；糖タンパク質ホルモン（例えば、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ））；肝細胞増殖因子（ｈｅｐａｔｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン；腫瘍壊死因子−αおよび腫瘍壊死因子−β；ミュラー管阻害物質（ｍｕｌｌｅｒｉａｎ−ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；神経増殖因子（例えば、ＮＧＦ−β）；血小板増殖因子；トランスホーミング増殖因子（ＴＧＦ）（例えば、ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）；インスリン様増殖因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子（ｏｓｔｅｏｉｎｄｕｃｔｉｖｅ  ｆａｃｔｏｒ）；インターフェロン（例えば、インターフェロン−α、−β、および−γ）；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）（例えば、マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ））；インターロイキン（ＩＬ）（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２）；腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦ−αもしくはＴＮＦ−β）；ならびに他のポリペプチド因子（ＬＩＦおよびｋｉｔリガンド（ＫＬ）が挙げられる）。本明細書において使用される場合、用語サイトカインは、天然供給源もしくは組換え細胞培養物に由来するタンパク質、および上記ネイティブ配列のサイトカインの生物学的に活性な等価物を含む。
【００７０】
用語「標識」とは、抗体に共有結合され得かつ以下を行うように機能する任意の部分を意味する：（ｉ）検出可能なシグナルを提供する；（ｉｉ）第２の標識と相互作用して、上記第１の標識もしくは第２の標識によって提供される検出可能なシグナルを改変する（例えば、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動））；（ｉｉｉ）抗原もしくはリガンドとの相互小夜を安定化させるか、またはその結合親和性を増大させる；（ｉｖ）電荷、疎水性、形状、もしくは他の物理的パラメーターによって、移動度（例えば、電気泳動的移動度）、もしくは細胞透過性に影響を及ぼす、あるいは（ｖ）捕捉部分を提供して、リガンド親和性、抗体／抗原結合、もしくはイオン性錯化を調節する。
【００７１】
語句「薬学的に受容可能な塩」とは、本明細書において使用される場合、ＡＤＣの薬学的に受容可能な有機性もしくは無機性の塩をいう。例示的な塩としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：硫酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、シュウ酸塩、塩酸塩、ブロミド、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、重酒石酸塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシネート（ｇｅｎｔｉｓｉｎａｔｅ）、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、サッカラート、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、およびパモ酸塩（すなわち、１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエート））塩。薬学的に受容可能な塩は、別の分子（例えば、アセテートイオン、スクシネートイオンもしくは他の対イオン）の包含を伴い得る。上記対イオンは、上記化合物上の電荷を安定化する任意の有機部分もしくは無機部分であり得る。さらに、薬学的に受容可能な塩は、その構造において１個より多い荷電した原子を有し得る。複数の荷電した原子が上記薬学的に受容可能な塩の一部である例は、複数の対イオンを有し得る。従って、薬学的に受容可能な塩は、１個以上の荷電した原子および／もしくは１個以上の対イオンを有し得る。
【００７２】
「薬学的に受容可能な溶媒和物」とは、１個以上の溶媒分子およびＡＤＣの会合をいう。薬学的に受容可能な溶媒和物を形成する溶媒の例としては、水、イソプロパノール、エタノール、メタノール、ＤＭＳＯ、酢酸エチル、酢酸、およびエタノールアミンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
「キャリア」とは、本明細書において使用される場合、使用される投与量および濃度でこれらに曝される細胞もしくは哺乳動物に対して非毒性である、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、もしくは安定化剤を含む。しばしば、この生理学的に受容可能なキャリアは、水性のｐＨ緩衝化溶液である。生理学的に受容可能なキャリアの例としては、以下が挙げられる：緩衝物質（例えば、ホスフェート、クエン酸塩、および他の有機酸）；抗酸化物質（アスコルビン酸が挙げられる）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質（例えば、ひと血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリジン）；単糖類、二糖類、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、もしくはデキストリンが挙げられる）；キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールもしくはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／または非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標））。
【００７４】
本明細書において使用される立体化学的定義および慣例は、一般に、Ｓ．Ｐ．Ｐａｒｋｅｒ編，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ（１９８４）  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｂｏｏｋ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；およびＥｌｉｅｌ，Ｅ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｎ，Ｓ．，Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｎｐｏｕｎｄｓ（１９９４）  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに従う。多くの有機化合物は、光学的に活性な形態で存在する。すなわち、それらは、平面偏光の面を回転する能力を有する。光学的に活性な化合物の記載にあたって、接頭辞ＤおよびＬ、またはＲおよびＳは、そのキラル中心の周りの分子の絶対配置を示すために使用される。接頭辞ｄおよびｌまたは（＋）および（−）は、上記化合物による平面偏光の回転のしるしを示すために使用され、（−）もしくは１は、上記化合物が左旋性であることを意味する。（＋）もしくはｄの接頭辞がついた化合物は、右旋性である。所定の化学的構造について、これら立体異性体は、互いに鏡像であることを除いて、同一である。特定の立体異性体はまた、エナンチオマーといわれ得、そしてこのような異性体の混合物は、しばしば、エナンチオマー混合物といわれる。エナンチオマーの５０：５０混合物は、ラセミ混合物（ｒａｃｅｍｉｃ  ｍｉｘｔｕｒｅ）もしくはラセミ化合物（ｒａｃｅｍａｔｅ）といわれ、これらは、化学反応もしくは化学プロセスにおいて、立体選択性もしくは立体特異性を何ら有さない場合に生じ得る。用語「ラセミ混合物」および「ラセミ化合物」とは、光学活性を欠いている、２個のエナンチオマー種の等モル混合物をいう。
【００７５】
以下の略語が本明細書において使用され、以下に示された定義を有する：ＢＭＥは、β−メルカプトエタノールであり、Ｂｏｃは、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）であり、ｃｉｔは、シトルリン（２−アミノ−５−ウレイドペンタン酸）であり、ｄａｐは、ドラプロイン（ｄｏｌａｐｒｏｉｎｅ）であり、ＤＣＣは、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミドであり、ＤＣＭは、ジクロロメタンであり、ＤＥＡは、ジエチルアミンであり、ＤＥＡＤは、ジエチルアゾジカルボキシレートであり、ＤＥＰＣは、ジエチルホスホリルシアニデートであり、ＤＩＡＤは、ジイソプロピルアゾジカルボキシレートであり、ＤＩＥＡは、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンであり、ｄｉｌは、ドライソロイシン（ｄｏｌａｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）であり、ＤＭＡは、ジメチルアセトアミドであり、ＤＭＡＰは、４−ジメチルアミノピリジンであり、ＤＭＥは、エチレングリコールジメチルエーテル（もしくは１，２−ジメトキシエタン）であり、ＤＭＦは、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドであり、ＤＭＳＯは、ジメチルスルホキシドであり、ｄｏｅは、ドラフェニン（ｄｏｌａｐｈｅｎｉｎｅ）であり、ｄｏｖは、Ｎ，Ｎ−ジメチルバリンであり、ＤＴＮＢは、５，５’−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）であり、ＤＴＰＡは、ジエチレントリアミン五酢酸であり、ＤＴＴは、ジチオスレイトールであり、ＥＤＣＩは、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリドであり、ＥＥＤＱは、２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリンであり、ＥＳ−ＭＳは、エレクトロスプレー質量分析法であり、ＥｔＯＡｃは、酢酸エチルであり、Ｆｍｏｃは、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニル）であり、ｇｌｙは、グリシンであり、ＨＡＴＵは、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートであり、ＨＯＢｔは、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールであり、ＨＰＬＣは、高速液体クロマトグラフィーであり、ｉｌｅは、イソロイシンであり、ｌｙｓはリジンであり、ＭｅＣＮ（ＣＨ３ＣＮ）はアセトニトリルであり、ＭｅＯＨはメタノールであり、Ｍｔｒは、４−アニシルジフェニルメチル（もしくは４−メトキシトリチル）であり、ｎｏｒは、（１Ｓ，２Ｒ）−（＋）−ノルエフェドリンであり、ＰＡＢは、ｐ−アミノベンジルカルバモイルであり、ＰＢＳは、リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７）であり、ＰＥＧは、ポリエチレングリコールであり、Ｐｈはフェニルであり、Ｐｎｐはｐ−ニトロフェニルであり、ＭＣは、６−マレイミドカプロリルであり、ｐｈｅはＬ−フェニルアラニンであり、ＰｙＢｒｏｐは、ｉｓ  ブロモトリス−ピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェートであり、ＳＥＣは、サイズ排除クロマトグラフィーであり、Ｓｕは、スクシンイミドであり、ＴＦＡは、トリフルオロ酢酸であり、ＴＬＣは、薄層クロマトグラフィーであり、ＵＶは紫外線であり、ｖａｌはバリンである。
【００７６】
（システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体）
本発明の化合物は、野生型もしくは親の抗ＴＥＮＢ２抗体の任意の形態のうちの１個以上のアミノ酸がシステインアミノ酸と置換されているシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体を含む。上記操作されたシステインアミノ酸は、遊離システインアミノ酸であり、鎖内ジスルフィドユニットの一部でもなく、鎖間ジスルフィドユニットの一部でもない。抗ＴＥＮＢ２抗体の任意の形態が、操作（すなわち、変異）され得る。例えば、親Ｆａｂ抗体フラグメントは、システイン操作Ｆａｂ（本明細書において「チオＦａｂ」といわれる）を形成するように操作され得る。同様に、親モノクローナル抗体は、「チオＭａｂ」を形成するように操作され得る。単一部位の変異が、単一の操作されたシステイン残基をチオＦａｂにおいて生じる一方で、単一部位の変異は、ＩｇＧ抗体のダイマー性質に起因して、２個の操作されたシステイン残基をチオＭａｂにおいて生じることに注意すべきである。本発明のシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体もしくはキメラモノクローナル抗体、抗体の抗原結合フラグメント、融合ポリペプチドおよび細胞に会合したＴＥＮＢ２ポリペプチドを優先的に結合するアナログを含む。
【００７７】
システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体は、それらの野生型、親抗ＴＥＮＢ２抗体対応物の抗原結合能を保持する。従って、システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体は、ＴＥＮＢ２抗原に結合し得る。
【００７８】
システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体は、還元スルフヒドリル（チオール）基を有する１個以上の遊離システインアミノ酸を含み、ここで上記システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体は、ＴＥＮＢ２ポリペプチドに結合する。
【００７９】
一実施形態において、上記システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体は、親抗ＴＥＮＢ２抗体の１個以上のアミノ酸残基をシステインで置換する工程を包含するプロセスによって、調製される。
【００８０】
置換された（「操作された」）システイン（Ｃｙｓ）残基を有する変異体は、上記新たに導入された、操作されたシステインチオール基の反応性について評価され得る。上記チオール反応性値は、０〜１．０の範囲の相対的数値であり、任意のシステイン操作抗体について測定され得る。本発明のシステイン操作抗体のチオール反応性値は、０．６〜１．０；０．７〜１．０；もしくは０．８〜１．０の範囲内にあり得る。
【００８１】
一局面において、本発明は、単離されたシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体に関し、上記抗体は、以下をコードするＤＮＡ分子の相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む：（ａ）本明細書に記載されるように、全長アミノ酸配列を有するシステイン操作抗体、（ｂ）本明細書で開示されるように、シグナルペプチドを欠いているシステイン操作抗体アミノ酸配列、（ｃ）本明細書で開示されるように、シグナル配列ありもしくはなしの、膜貫通システイン操作抗体タンパク質の細胞外ドメイン、（ｄ）本明細書で開示される核酸配列のうちのいずれかによってコードされるアミノ酸配列、あるいは（ｅ）本明細書で開示されるように、全長システイン操作抗体アミノ酸配列の任意の他の具体的に定義されたフラグメント。
【００８２】
一局面において、本発明は、Ｎ末端シグナル配列なしの、および／もしくは開始メチオニンなしの単離されたシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体を提供し、記載されるように、このようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる。上記抗体を生成するためのプロセスはまた、本明細書に記載され、ここでそのプロセスは、上記適切なコード核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を、上記システイン操作抗体の発現を適切な条件下で培養する工程、および上記システイン操作抗体を細胞培養物から回収する工程を包含する。
【００８３】
本発明の別の局面は、膜貫通ドメイン欠失もしくは膜貫通ドメイン不活性化のいずれかである、単離されたシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体を提供する。上記抗体を生成するためのプロセスはまた、本明細書に記載され、ここでそれらの方法は、上記適切なコード核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞を、上記システイン操作抗体の発現に適切な条件下で培養する工程、および上記システイン操作抗体を上記細胞培養物から回収する工程を包含する。
【００８４】
他の実施形態において、本発明は、異種（非ＴＥＮＢ２）ポリペプチドに融合された、本明細書に記載されるシステイン操作抗体のうちのいずれかを含む、単離された抗ＴＥＮＢ２キメラシステイン操作抗体を提供する。このようなキメラ分子の例は、異種ポリペプチド（例えば、エピトープタグ配列もしくは免疫グロブリンのＦｃ領域）に融合された、本明細書に記載されるシステイン操作抗体のうちのいずれかを含む。
【００８５】
上記システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体は、モノクローナル抗体、抗体フラグメント、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、もしくは抗ＴＥＮＢ２ポリペプチド抗体の、そのそれぞれの抗原性エピトープへの結合を競合的に阻害する抗体であり得る。本発明の抗体は、必要に応じて、増殖阻害因子もしくは細胞傷害性薬剤（例えば、毒素（例えば、オーリスタチン、抗生物質、放射活性同位体、核溶解酵素などを含む））に結合体化され得る。本発明の抗体は、必要に応じて、ＣＨＯ細胞もしくは細菌細胞において生成され得、好ましくは、結合する細胞の増殖を阻害し得るか、または死滅を誘導し得る。診断目的については、本発明の抗体は、検出可能に標識され得るか、固体支持体に結合され得る、など。
【００８６】
本発明の他の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体のいずれかをコードするＤＮＡを含むベクターを提供する。任意のこのようなベクターを含む宿主細胞がまた、提供される。例えば、上記宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、もしくは酵母細胞であり得る。本明細書に記載されるポリペプチドのうちのいずれかを生成するためのプロセスがさらに提供され、宿主細胞を、望ましいポリペプチドの発現に適切な条件下で培養する工程、および上記望ましいポリペプチドを上記細胞培養物から回収する工程を包含する。
【００８７】
親抗ＴＥＮＢ２抗体およびシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体は、ＴＥＮＢ２ポリペプチドもしくはＰＣＴ／ＵＳ０３／０７２０９に記載されるＴＥＮＢ２ポリペプチド改変体に結合する。
【００８８】
ＴＥＮＢ２ポリペプチド改変体は、以下のとおりであるＴＥＮＢ２と少なくとも約８０％  アミノ酸配列同一性を有するＴＥＮＢ２ポリペプチドである：（ｉ）全長ネイティブ配列；（ｉｉ）シグナル配列を欠いているポリペプチド配列；（ｉｉｉ）シグナル配列ありもしくはなしの細胞外ドメイン；または（ｉｖ）全長ＴＥＮＢ２ポリペプチド配列の任意の他のフラグメント。このようなＴＥＮＢ２ポリペプチド改変体は、例えば、全長ネイティブアミノ酸配列のＮ末端もしくはＣ末端において１個以上のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたポリペプチドを含む。通常は、ＴＥＮＢ２ポリペプチド改変体は、全長ネイティブ配列のＴＥＮＢ２ポリペプチド配列、シグナルペプチドを欠いているＴＥＮＢ２ポリペプチド配列、シグナルペプチドありもしくはなしのＴＥＮＢ２ポリペプチドの細胞外ドメイン、または全長ＴＥＮＢ２ポリペプチド配列の任意の他の具体的に規定されたフラグメントに対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、あるいは少なくとも約８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％のアミノ酸配列同一性を有する。通常は、ＴＥＮＢ２ポリペプチド改変体は、長さが少なくとも約１０アミノ酸、あるいは長さが少なくとも約２０アミノ酸、３０アミノ酸、４０アミノ酸、５０アミノ酸、６０アミノ酸、７０アミノ酸、８０アミノ酸、９０アミノ酸、１００アミノ酸、１１０アミノ酸、１２０アミノ酸、１３０アミノ酸、１４０アミノ酸、１５０アミノ酸、１６０アミノ酸、１７０アミノ酸、１８０アミノ酸、１９０アミノ酸、２００アミノ酸、２１０アミノ酸、２２０アミノ酸、２３０アミノ酸、２４０アミノ酸、２５０アミノ酸、２６０アミノ酸、２７０アミノ酸、２８０アミノ酸、２９０アミノ酸、３００アミノ酸、３１０アミノ酸、３２０アミノ酸、３３０アミノ酸、３４０アミノ酸、３５０アミノ酸、３６０アミノ酸、３７０アミノ酸、３８０アミノ酸、３９０アミノ酸、４００アミノ酸、４１０アミノ酸、４２０アミノ酸、４３０アミノ酸、４４０アミノ酸、４５０アミノ酸、４６０アミノ酸、４７０アミノ酸、４８０アミノ酸、４９０アミノ酸、５００アミノ酸、５１０アミノ酸、５２０アミノ酸、５３０アミノ酸、５４０アミノ酸、５５０アミノ酸、５６０アミノ酸、５７０アミノ酸、５８０アミノ酸、５９０アミノ酸、６００アミノ酸以上である。必要に応じて、ＴＥＮＢ２改変ポリペプチドは、上記ネイティブＴＥＮＢ２ポリペプチド配列と比較して、わずか１個の保存的アミノ酸置換、あるいは上記ネイティブＴＥＮＢ２ポリペプチド配列と比較して、わずか２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、もしくは１０個の保存的アミノ酸置換を有する。
【００８９】
ＴＥＮＢ２ポリペプチドは、以下における組換え発現によって調製され得る：（ｉ）ｐＢＲ３２２ベクターを有するＥ．ｃｏｌｉ；（ｉｉ）哺乳動物細胞（例えば、ヒトＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １５７３）、ＣＯＳ（シミアン線維芽細胞、ＳＶ−４０）細胞、ｐＲＫ５ベクターを含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）；（ｉｉｉ）酵母（例えば、酵母株ＡＢ１１０）；または（ｉｖ）バキュロウイルス感染昆虫細胞（ＰＣＴ／ＵＳ０３／０７２０９）。ネイティブもしくは組換えＴＥＮＢ２ポリペプチドは、タンパク質精製の分野の種々の標準的技術によって精製され得る。例えば、プロＴＥＮＢ２ポリペプチド、成熟ＴＥＮＢ２ポリペプチド、もしくはプレＴＥＮＢ２ポリペプチドは、目的のＴＥＮＢ２ポリペプチドに対して特異的な抗体を使用して、イムノアフィニティークロマトグラフィーによって精製される。一般に、イムノアフィニティーカラムは、上記抗ＴＥＮＢ２ポリペプチド抗体を、活性化クロマトグラフィー樹脂に共有結合的にカップリングすることによって構築される。ＴＥＮＢ２ポリペプチドは、異種ポリペプチド（これは、シグナル配列もしくは上記成熟タンパク質もしくはポリペプチドのＮ末端において特定の切断部位を有する他のポリペプチドであり得る）との融合タンパク質として組換え精製され得る。あるいは、ＴＥＮＢ２ポリペプチドは、シグナル配列、および上記ＴＥＮＢ２融合ポリペプチドの精製を可能にする異種ポリペプチド配列との融合ポリペプチドとして生成され得る；このようなポリペプチドの例は、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ６（配列番号２４）もしくはＨｉｓ８（配列番号２５））、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ、ＦＬＡＧエピトープ（ＫＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号２６））、およびｇＤエピトープ（ＫＹＡＬＡＤＡＳＬＫＭＡＤＰＮＲＦＲＧＫＤＬＰＶＬ（配列番号２７））である。上記シグナル配列は、上記ベクターの成分であり得るか、または上記ベクターに挿入される上記抗ＴＥＮＢ２抗体コードＤＮＡもしくはＴＥＮＢ２ポリペプチドコードＤＮＡの一部であり得る。上記シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐ、もしくは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であり得る。酵母分泌のために、上記シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓのα因子リーダー（米国特許第５０１０１８２号）を含む）、または酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼリーダー（ＥＰ  ０３６２１７９）、もしくはＷＯ  ９０／１３６４６に記載されるシグナルであり得る。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物のシグナル配列は、上記タンパク質の分泌を指向するために使用され得る（例えば、同種もしくは関連する種に分泌ポリペプチド由来のシグナル配列、ならびにウイルス分泌リーダー）。
【００９０】
ＴＥＮＢ２発現細胞は、細胞表面上でもしくは分泌形態において、内因性のもしくはトランスフェクトされたＴＥＮＢ２ポリペプチド抗原を発現する。ＴＥＮＢ２発現癌は、細胞表面上に存在するＴＥＮＢ２ポリペプチドを有するか、またはＴＥＮＢ２抗原性ポリペプチドを生成しかつ分泌する細胞を含む。ＴＥＮＢ２発現癌は、必要に応じて、抗ＴＥＮＢ２抗体、その抗体薬物結合体が、上記ＴＥＮＢ２ポリペプチドに結合し得、そして上記癌に関して治療的効果を発揮し得るように、その癌の表面上で十分なレベルのＴＥＮＢ２ポリペプチドを生成する。ＴＥＮＢ２ポリペプチドを過剰発現する癌は、同じ組織体包の非癌性細胞と比較して、その細胞表面において顕著に高いレベルのＴＥＮＢ２ポリペプチドを有するか、または生成および分泌するものである。このような過剰発現は、遺伝子増幅によって、または増大した転写もしくは翻訳によって引き起こされ得る。ＴＥＮＢ２ポリペプチド過剰発現は、細胞の表面に存在する増大したレベルのＴＥＮＢ２タンパク質を評価することによって臨床的設定において決定され得るか、または上記細胞によって（例えば、上記ＴＥＮＢ２ポリペプチドをコードする単離された核酸から組換えＤＮＡ技術を使用して調製され得る単離されたＴＥＮＢ２ポリペプチドに対して調製される抗ＴＥＮＢ２抗体を使用して、免疫組織化学的アッセイ；ＦＡＣＳ分析などを介して）分泌され得る。代わりに、もしくはさらに、細胞におけるＴＥＮＢ２ポリペプチドコード核酸もしくはｍＲＮＡのレベルを、例えば、ＴＥＮＢ２コード核酸もしくはその相補体に対応する核酸ベースのプローブを使用して、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）；（ＷＯ  ９８／４５４７９）、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、もしくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術（例えば、リアルタイム定量的逆転写酵素ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を介して、測定し得る。また、生物学的流体（例えば、血清）中の自由な（ｓｈｅｄ）抗原を、例えば、抗体ベースのアッセイ（米国特許第４９３３２９４号；ＷＯ  ９１／０５２６４；米国特許第５４０１６３８号；Ｓｉａｓら（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３２：７３−８０）を使用して測定することによって、ＴＥＮＢ２ポリペプチド過剰発現を検出し得る。種々の他のインビボアッセイが、企図され得る。あるいは、上記患者の身体内の細胞は、必要に応じて、検出可能な標識（例えば、放射活性同位体）で標識されている抗体に曝され得、上記患者における細胞への上記抗体の結合は、例えば、放射活性について外部スキャンすることによって、または上記抗体に以前に曝された患者から採取した生検を分析することによって、評価され得る。
【００９１】
親抗ＴＥＮＢ２抗体およびシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体は、本明細書に記載されるように、ＴＥＮＢ２ポリペプチドに、好ましくは特異的に結合し得る。ＴＥＮＢ２結合オリゴペプチドは、周知の技術を使用して、過度な実験無くして同定され得る。この点に関して、ポリペプチド標的に特異的に結合し得るオリゴペプチドについてのオリゴペプチドライブラリーをスクリーニングするための技術は、当該分野で周知であることが注意される（米国特許第５５５６７６２号；同第５７５０３７３号；同第４７０８８７１号；同第４８３３０９２号；同第５２２３４０９号；同第５４０３４８４号；同第５５７１６８９号；同第５６６３１４３号；ＷＯ  ８４／０３５０６；ＷＯ８４／０３５６４；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：３９９８−４００２；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：１７８−１８２；Ｇｅｙｓｅｎら，ｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，１３０−１４９（１９８６）；Ｇｅｙｓｅｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１０２：２５９−２７４（１９８７）；Ｓｃｈｏｏｆｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４０：６１１−６１６（１９８８），Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ．Ｅ．ら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３７８；Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．ら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０８３２；Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ら（１９９１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１；Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．ら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８３６３，およびＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２：６６８）。
【００９２】
上記親抗ＴＥＮＢ２抗体および本発明のシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体、および異種結合体抗体を含む。ヒト化抗ＴＥＮＢ２抗体の種々の形態が企図される。例えば、上記ヒト化抗体は、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ）であり得る。あるいは、上記ヒト化抗体は、インタクトな抗体（例えば、インタクトなＩｇＧ１抗体）であり得る。
【００９３】
二重特異性抗ＴＥＮＢ２抗体は、少なくとも２個の異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗ＴＥＮＢ２抗体は、本明細書に記載されるように、ＴＥＮＢ２タンパク質の２個の異なるエピトープに結合し得る。他のこのような抗体は、ＴＥＮＢ２結合部位と、別のタンパク質に対する結合部位とを併せもっている。あるいは、抗ＴＥＮＢ２アームは、白血球上のトリガー分子（ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）（例えば、Ｔ細胞レセプター分子（例えば、ＣＤ３）、もしくはＩｇＧについてのＦｃレセプター（ＦｃγＲ）（例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）））に結合するアームと合わせられて、細胞防御機構を上記ＴＥＮＢ２発現細胞へ集中させかつ局在させ得る。二重特異性抗体はまた、ＴＥＮＢ２を発現する再紡に細胞傷害性薬剤を局在させるために使用され得る。これら抗体は、ＴＥＮＢ２結合アームおよび上記細胞傷害性薬剤（例えば、サポリン、抗インターフェロン−α、ビンカ・アルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサートもしくは放射活性同位体ハプテン）を結合するアームを有する。二重特異性抗体は、全長抗体もしくは抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製され得る。全長二重特異性抗体の伝統的な生成は、２個の免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づき、ここで上記２個の鎖は、異なる特異性を有する（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７−５３９）。
【００９４】
異種結合体抗ＴＥＮＢ２抗体はまた、本発明の範囲内である。異種結合体抗体は、２個の共有結合された抗体から構成される。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を、望ましくない細胞に標的化すること（米国特許第４６７６９８０号）、およびＨＩＶ感染の処置のために（ＷＯ  ９１／００３６０；ＷＯ  ９２／２００３７３；ＥＰ  ０３０８９）が提唱された。上記抗体が、合成タンパク質化学（架橋剤を要するものを含む）において公知の方法を使用して、インビトロで調製され得ることが企図される。
【００９５】
本発明の抗ＴＥＮＢ２抗体は、３個以上の抗原結合部位を有する多価抗体（例えば、四価抗体）であり得、これらは、上記抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現によって、容易に生成され得る。上記多価抗体は、ダイマー化ドメインおよび３個以上の抗原結合部位を含み得る。上記好ましいダイマー化ドメインは、Ｆｃ領域もしくはヒンジ領域を含む（またはこれらからなる）。この状況において、上記抗体は、Ｆｃ領域、および上記Ｆｃ領域に対してアミノ末端側に３個以上の抗原結合部位を含む。上記好ましい多価抗体は、本明細書において、３〜約８個、しかし好ましくは４個の抗原結合部位を含む（もしくはこれらからなる）。上記多価抗体は、少なくとも１個のポリペプチド鎖（および好ましくは、２個のポリペプチド鎖）を含み、ここで上記ポリペプチド鎖は、２個以上の可変ドメインを含む。例えば、上記ポリペプチド鎖は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃを含み得、ここでＶＤ１は、第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は、第２の可変ドメインであり、Ｆｃは、Ｆｃ領域の１個のポリペプチド鎖であり、Ｘ１およびＸ２は、アミノ酸もしくはポリペプチドを表し、ｎは、０もしくは１である。例えば、上記ポリペプチド鎖は、以下を含み得る：ＶＨ−ＣＨ１−可撓性リンカー−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖；もしくはＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖。上記多価抗体は、本明細書において、好ましくは、少なくとも２個（および好ましくは４個）の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに含む。上記多価抗体は、本明細書において、例えば、約２〜約８個の軽鎖可変ドメインポリペプチドを含み得る。本明細書において企図された上記軽鎖可変ドメインポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、必要に応じて、ＣＬドメインをさらに含む。
【００９６】
抗ＴＥＮＢ２抗体のエフェクター機能は、１個以上のアミノ酸置換をＦｃ領域中に導入することによって改変され得る。このような改変は、抗ＴＥＮＢ２抗体の抗原依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および／もしくは補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を増強し得る。そのように生成された上記ホモダイマー性抗体は、改善されたインターナリゼーション能力および／もしくは増大した補体媒介性細胞死滅ならびに抗体依存性細胞性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を有し得る。Ｃａｒｏｎら（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７６：１１９１−１１９５およびＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２を参照のこと。増強された抗腫瘍活性を有するホモダイマー性抗ＴＥＮＢ２抗体はまた、Ｗｏｌｆｆら（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０−２５６５に記載されるように、ヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製され得る。あるいは、抗体は操作され得、二重Ｆｃ領域を有し、それによって、増大した補体溶解能力およびＡＤＣＣ能力を有し得る（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら（１９８９）Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３：２１９−２３０）。
【００９７】
抗ＴＥＮＢ２抗体の血清半減期は、救出レセプター結合エピトープ（ｓａｌｖａｇｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｅｐｉｔｏｐｅ）（例えば、抗体フラグメント（米国特許第５７３９２７７号））を組み込むことによって、調節され得る。本明細書において使用される場合、用語「救出レセプター結合エピトープ」とは、ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４）のインビボ血清半減期の増大を担うＩｇＧ分子のＦｃ領域のエピトープをいう。
【００９８】
ＴＥＮＢ２エピトープに結合するモノクローナル抗体（ＴＭＥＦＦ２＃１９を含む）は、標準的競合結合分析およびエピトープマッピング（ＰＣＴ／ＵＳ０３／０７２０９）によって決定される。
【００９９】
免疫組織化学的分析を、ＴＭＥＦＦ２＃１９モノクローナル抗体を使用して行った（ＰＣＴ／ＵＳ０３／０７２０９；Ｓａｍｂｒｏｏｋら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔ  ３．１６，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９７）。モノクローナル抗体ＴＭＥＦＦ２＃１９は、２４１個のヒト前立腺癌標本のうちの１７６個において、弱〜強の結合を示した。
【０１００】
モノクローナル抗体ＴＭＥＦＦ２＃１９は、細胞の中にインターナライズされ、上記抗体は、素早く細胞表面上のＴＥＮＢ２ポリペプチドに結合する。
【０１０１】
（抗ＴＥＮＢ２抗体の改変）
本明細書に記載される抗ＴＥＮＢ２抗体における改変およびバリエーションは、例えば、保存的および非保存的変異について当該分野で公知の技術およびガイドラインのうちのいずれかを使用して、作製され得る（例えば、米国特許第５３６４９３４号におけるもの）。バリエーションは、上記ネイティブ配列の抗ＴＥＮＢ２抗体と比較して、そのアミノ酸配列において変化を生じる、上記抗体もしくはポリペプチドをコードする１個以上のコドンの置換、欠失もしくは挿入であり得る。必要に応じて、上記バリエーションは、上記抗ＴＥＮＢ２抗体のドメインのうちの１個以上において、少なくとも１個のアミノ酸を任意の他のアミノ酸で置換することによる。上記バリエーションは、当該分野で公知の方法（例えば、オリゴヌクレオチド媒介性（部位指向性）変異誘発、アラニンスキャニング、およびＰＣＲ変異誘発）を使用して、作製され得る。部位指向性変異誘発（Ｃａｒｔｅｒら（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：４３３１；Ｚｏｌｌｅｒら（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１０：６４８７）、カセット変異誘発（Ｗｅｌｌｓら（１９８５）Ｇｅｎｅ，３４：３１５）、制限選択変異誘発（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｗｅｌｌｓら（１９８６）Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ  ＳｅｒＡ，３１７：４１５）もしくは他の公知の技術が、上記抗ＴＥＮＢ２抗体改変体ＤＮＡを生成するために、クローニングされたＤＮＡに対して行われ得る。アミノ酸変化は、上記抗ＴＥＮＢ２抗体の翻訳後プロセスを変化させ得る（例えば、グリコシル化部位の数もしくは位置を変化させるか、または膜固定特性（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）を変化させる）。他の改変は、グルタミニル残基およびアスパラギニル残基の、それぞれ、その対応するグルタミル残基およびアスパルチル残基への脱アミド、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリル残基もしくはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，（１９８３）  Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６）、Ｎ末端アミンのアセチル化、および任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。抗ＴＥＮＢ２抗体は、適切なヌクレオチド変化を上記コードＤＮＡに導入し、そして／または化学合成によって、調製され得る。
【０１０２】
抗ＴＥＮＢ２抗体フラグメントは、例えば、全長抗ＴＥＮＢ２抗体と比較した場合に、Ｎ末端もしくはＣ末端において短縮され得るか、または内部残基を欠き得る。特定のフラグメントは、上記抗ＴＥＮＢ２抗体の望ましい生物学的活性に必須でないアミノ酸残基を欠いている。抗ＴＥＮＢ２抗体フラグメントは、多くの従来技術のうちのいずれかによって調製され得る。望ましいペプチドフラグメントは、化学的に合成され得る。大腿のアプローチは、抗体フラグメントを、酵素消化によって（例えば、上記タンパク質を、特定のアミノ酸残基によって規定される部位でタンパク質を切断することが既知の酵素で処理することによって、もしくは上記ＤＮＡを、適切な制限酵素で消化し、望ましいフラグメントを単離することによって）生成する工程を包含する。なお別の適切な技術は、望ましい抗体もしくはフラグメントをコードするＤＮＡフラグメントを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、単離および増幅することを包含する。上記ＤＮＡフラグメントの望ましい末端を規定するオリゴヌクレオチドは、上記ＰＣＲにおいて５’プライマーおよび３’プライマーにおいて使用される。好ましくは、抗ＴＥＮＢ２抗体配列は、少なくとも１個の生物学的および／もしくは免疫学的活性を、本明細書で開示されるネイティブ抗ＴＥＮＢ２抗体と共有する。
【０１０３】
置換改変体の特定の好ましいタイプは、ヒト化抗体もしくはヒト抗体の１個以上の超可変領域残基を置換することを要する。一般に、さらなる開発のために選択された、上記得られた改変体は、これが生成される上記抗体と比較して改善された生物学的特性を有する。このような置換改変体を生成するための都合のよい方法は、ファージディスプレイを使用する親和性成熟を包含する。簡潔には、いくつかの超可変領域部（例えば、６〜７個の部位）は、各部位における全ての考えられるアミノ酸置換を生成するために変異させられる。このように生成された上記抗体改変体は、各粒子内でパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ生成物への融合物として、繊維状ファージ粒子から一価の様式でディスプレイされる。上記ファージディスプレイされた改変体は、次いで、本明細書で開示されるように、それらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。改変のための候補超可変領域部位を同定するために、アラニンスキャニング変異誘発は、抗原結合に顕著に寄与する超可変領域残基を同定するために行われ得る。代わりに、もしくはさらに、上記抗原−抗体複合体の結晶構造を分析して、上記抗体とヒトＴＥＮＢ２ポリペプチドとの間の接触点を同定することは有益であり得る。このような接触残基および隣り合う残基は、本明細書で詳述されている技術によれば、置換の候補である。一旦このような改変体が生成されると、改変体のパネルは、本明細書に記載されるようにスクリーニングに供され、１種以上の関連アッセイにおいて優れた特性を有する抗体が、さらなる開発のために選択され得る。
【０１０４】
本発明の範囲内に含まれる上記抗ＴＥＮＢ２抗体の共有結合的改変の別のタイプは、上記抗体もしくはポリペプチドのネイティブのグリコシル化パターンを、ネイティブ配列の抗ＴＥＮＢ２抗体において見いだされる１個以上の炭水化物部分を欠失させることによって（基礎にあるグリコシル化部位を除去することか、または化学的手段および／もしくは好訴的手段によりグリコシル化を欠失させるかのいずれかによって）変化させること、ならびに／あるいは上記ネイティブ配列の抗ＴＥＮＢ２抗体に存在しない１個以上のグリコシル化部位を付加することを包含する。さらに、上記改変は、上記ネイティブタンパク質のグリコシル化における定性的変化を含み、存在する種々の炭水化物部分の性質および特性において変化を伴う。抗体および他のポリペプチドのグリコシル化は、代表的には、Ｎ結合型もしくはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合をいう。トリペプチド配列であるアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（ここでＸは、プロリンを除く、任意のアミノ酸である）は、上記アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチドにおけるこれらトリペプチド配列のうちのいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を作り出す。Ｏ結合型グリコシル化とは、糖であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、もしくはキシロースのうちの１つの、ヒドロキシアミノ酸（最も一般的には、セリンもしくはスレオニン）への結合をいうが、５−ヒドロキシプロリンもしくは５−ヒドロキシリジンもまた、使用され得る。上記抗ＴＥＮＢ２抗体へのグリコシル化部位の付加は、上記アミノ酸配列を、上記トリペプチド配列（Ｎ結合型グリコシル化部位についての）のうちの１個以上を含むように改変することによって、都合よく達成される。上記改変はまた、上記抗ＴＥＮＢ２抗体の配列（Ｏ結合型グリコシル化部位について）へ１個以上のセリンもしくはスレオニン残基を付加、もしくはこれらの残基で置換することによって、行われ得る。上記抗ＴＥＮＢ２抗体のアミノ酸配列は、必要に応じて、ＤＮＡレベルでの変化を介して、特に、コドンが生成され、望ましいアミノ酸へ翻訳するように、所定の塩基において、上記抗ＴＥＮＢ２抗体をコードするＤＮＡを変異させることによって、改変され得る。
【０１０５】
上記抗ＴＥＮＢ２抗体上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、グリコシドを上記ポリペプチドへ化学的にもしくは酵素的にカップリングさせることによる。このような方法は、例えば、ＷＯ  ８７／０５３３０（１９８７年９月１１日公開）において、およびＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６（１９８１）において、当該分野で記載されている。
【０１０６】
上記抗ＴＥＮＢ２抗体に存在する炭水化物部分の除去は、化学的にもしくは酵素的に、またはグリコシル化の標的として働くアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換（ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）によって、達成され得る。化学的脱グリコシル化技術は、当該分野で公知であり、例えば、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２５９：５２（１９８７）およびＥｄｇｅら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１８：１３１（１９８１）によって記載されている。炭水化物部分の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０に記載されるように、種々のエンドグリコシダーゼもしくはエキソグリコシダーゼを使用することによって、達成され得る。
【０１０７】
抗ＴＥＮＢ２抗体の別のタイプの共有結合的改変は、上記抗体もしくはポリペプチドを、米国特許第４６４０８３５号；同第４４９６６８９号；同第４３０１１４４号；同第４６７０４１７号；同第４７９１１９２号もしくは同第４１７９３３７号に記載される様式において、種々の非タンパク質性ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、もしくはポリオキシアルキレン）のうちの１つに連結することを包含する。上記抗体もしくはポリペプチドはまた、コロイド性薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）、もしくはマクロエマルジョン中に、例えば、コアセルべーション技術によってもしくは界面重合によって調製されるマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）の中に捕捉され得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓｌｏ，Ａ．編（１９８０）で開示される。
【０１０８】
本発明の抗ＴＥＮＢ２抗体はまた、別の異種ポリペプチドもしくはアミノ酸配列に融合された抗ＴＥＮＢ２抗体を含むキメラ分子を形成する方法において、改変され得る。一実施形態において、このようなキメラ分子は、上記抗ＴＥＮＢ２抗体と、抗タグ抗体が選択的に結合し得るエピトープを提供するタグポリペプチドとの融合物を含む。上記エピトープタグは、一般に、上記抗ＴＥＮＢ２抗体のアミノ末端もしくはカルボキシ末端に位置する。上記抗ＴＥＮＢ２抗体のこのようなエピトープタグ化形態の存在は、上記タグポリペプチドに対する抗体を使用して、検出され得る。また、上記エピトープタグを提供すると、上記抗ＴＥＮＢ２抗体が、抗タグ抗体もしくは上記エピトープタグに結合する別のタイプのアフィニティーマトリクスを使用するアフィニティー精製によって、容易に精製されることが可能になる。種々のタグポリペプチドおよびそれらそれぞれの抗体は、当該分野で周知である。例としては、ポリ−ヒスチジン（ポリ−ｈｉｓ）もしくはポリ−ヒスチジン−グリシン（ポリ−ｈｉｓ−ｇｌｙ）タグ；インフルエンザ（ｆｌｕ）ＨＡタグポリペプチドおよびその抗体１２ＣＡ５（Ｆｉｅｌｄら（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，８：２１５９−２１６５）；ｃ−ｍｙｃタグおよびこれに対する８Ｆ９抗体、３Ｃ７抗体、６Ｅ１０抗体、Ｇ４抗体、Ｂ７抗体および９Ｅ１０抗体（Ｅｖａｎら（１９８５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５：３６１０−３６１６）；ならびにＨｅｒｐｅｓ  Ｓｉｍｐｌｅｘウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タグおよびその抗体（Ｐａｂｏｒｓｋｙら（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３（６）：５４７−５５３）が挙げられる。他のタグポリペプチドとしては、Ｆｌａｇ−ペプチド（Ｈｏｐｐら（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１２０４−１２１０）；ＫＴ３エピトープペプチド（Ｍａｒｔｉｎら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５：１９２−１９４）；α−チューブリンエピトープペプチド（Ｓｋｉｎｎｅｒら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１５１６３−１５１６６）；およびＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ（Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３９３−６３９７）が挙げられる。
【０１０９】
代替の実施形態において、上記キメラ分子は、上記抗ＴＥＮＢ２抗体と、免疫グロブリンもしくは免疫グロブリンの特定の領域との融合物を含み得る。上記キメラ分子（「イムノアドヘシン」ともいわれる）の二価形態については、このような融合物は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に対してであり得る。上記Ｉｇ融合物は、好ましくは、Ｉｇ分子内の少なくとも１個の可変領域の代わりに、抗ＴＥＮＢ２抗体の可溶性（膜貫通ドメイン欠失もしくは不活性化）形態を使うことを含む。特に好ましい実施形態において、上記免疫グロブリン融合物は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３、またはヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む（米国特許第５４２８１３０号）。
【０１１０】
（抗ＴＥＮＢ２抗体の調製）
本発明のシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体および親抗ＴＥＮＢ２抗体のアミノ酸配列改変体をコードするＤＮＡは、種々の方法によって調製され、これら方法としては、始めに調製した上記ポリペプチドをコードするＤＮＡの、天然供給源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列改変体の場合）、部位指向性（もしくはオリゴヌクレオチド媒介性）変異誘発（Ｃａｒｔｅｒ（１９８５）ら  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：４４３１−４４４３；Ｈｏら（１９８９）Ｇｅｎｅ（Ａｍｓｔ．）７７：５１−５９；Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８；Ｌｉｕら（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２０２５２−２０２６０）、ＰＣＲ変異誘発（Ｈｉｇｕｃｈｉ，（１９９０）  ｉｎ  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１７７−１８３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｉｔｏら（１９９１）Ｇｅｎｅ  １０２：６７−７０；Ｂｅｒｎｈａｒｄら（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：１２６−１３２；およびＶａｌｌｅｔｔｅら（１９８９）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７２３−７３３）、ならびにカセット変異誘発（Ｗｅｌｌｓら（１９８５）Ｇｅｎｅ  ３４：３１５−３２３）が挙げられるが、これらに限定されない。変異誘発プロトコル、キット、および試薬は、市販されている（例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）  Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））。単一の変異はまた、二本鎖プラスミドＤＮＡをテンプレートとして使用して、ｂｙ  ＰＣＲベースの変異誘発によって、オリゴヌクレオチド指向性変異誘発によって生成される（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版；Ｚｏｌｌｅｒら（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００；Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８２）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５００）。組換え抗体の改変体は、制限フラグメント操作によって、もしくは合成オリゴヌクレオチドとの重複伸長ＰＣＲ（ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ）によって構築され得る。変異誘発プライマーは、システインコドン置換をコードする。標準的な変異誘発技術は、このような変異システイン操作抗体をコードするＤＮＡを生成するために使用され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；およびＡｕｓｕｂｅｌら  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９３）。
【０１１１】
ファージティスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３）は、免疫していないドナーに由来する免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、抗ＴＥＮＢ２ヒト抗体ヒト抗体および抗体フラグメントをインビトロで生成するために使用され得る。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、繊維状バクテリオファージ（例えば、Ｍ１３もしくはｆｄ）のメジャーコートタンパク質遺伝子もしくはマイナーコートタンパク質遺伝子のいずれかの中にインフレームでクローニングされ、そして上記ファージ粒子の表面に機能的抗体フラグメントとしてディスプレイされる。上記繊維状粒子は、上記ファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、上記抗体の機能的特性に基づく選択はまた、それら特性を示す上記抗体をコードする遺伝子の選択を生じる。従って、上記ファージは、Ｂ細胞の特性のいくつかを模倣する（Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５６４−５７１；Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８；Ｍａｒｋｓら（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７；Ｇｒｉｆｆｉｔｈら（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４；米国特許第５５６５３３２号；同第５５７３９０５号；同第５５６７６１０号；同第５２２９２７５号）。
【０１１２】
抗ＴＥＮＢ２抗体は、公知のオリゴペプチド合成方法論を使用して化学的に合成され得るか、または組み換え技術を使用して調製および精製され得る。上記適切なアミノ酸配列、もしくはその一部は、固相技術を使用して、直接ペプチド合成によって生成され得る（Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（１９６９）Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，（１９６３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５４）。インビトロタンパク質合成は、手動の技術を使用して、もしくは自動化によって行われ得る。自動化固相合成は、例えば、ｔ−ＢＯＣ保護もしくはＦｍｏｃ保護されたアミノ酸を使用し、および製造業者の説明書を使用するＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を利用して、達成され得る。上記抗ＴＥＮＢ２抗体もしくはＴＥＮＢ２ポリペプチドの種々の部分は、化学的に別個に合成され得、そして所望の抗ＴＥＮＢ２抗体もしくはＴＥＮＢ２ポリペプチドを生成するために化学的もしくは酵素的方法を使用して、合わせられ得る。
【０１１３】
種々の技術は、抗体フラグメントの生成のために開発されてきた。伝統的には、これらフラグメントを、インタクトな抗体のタンパク質分解的消化を介して誘導したか（Ｍｏｒｉｍｏｔｏら（１９９２）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４：１０７−１１７；およびＢｒｅｎｎａｎら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１）、または組換え宿主細胞によって直接生成した。Ｆａｂ、ＦｖおよびＳｃＦｖ  抗ＴＥＮＢ２抗体フラグメントは、全て、Ｅ．ｃｏｌｉにおいは発現されかつＥ．ｃｏｌｉから分泌され得、従って、これらフラグメントの大量の容易な生成を可能にする。抗体フラグメントは、本明細書で議論される抗体ファージライブラリーから単離され得る。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントは、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収され、化学的に連結されて、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを形成するか（Ｃａｒｔｅｒら（１９９２）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７）、または組換え宿主細胞培養物から直接単離される。上記抗ＴＥＮＢ２抗体は、（ｓｃＦｖ）一本鎖Ｆｖフラグメントであり得る（ＷＯ  ９３／１６１８５；米国特許第５５７１８９４号；同第５５８７４５８号）。上記抗ＴＥＮＢ２抗体フラグメントはまた、「直線状抗体」であり得る（米国特許第５６４１８７０号）。このような直線状抗体フラグメントは、単一特異性もしくは二重特異性であり得る。
【０１１４】
以下の記載は、主に、抗ＴＥＮＢ２抗体コード核酸を含むベクターで形質転換もしくはトランスフェクトした細胞を培養することによる、抗ＴＥＮＢ２抗体の生成に関する。抗ＴＥＮＢ２抗体をコードするＤＮＡは、上記抗ＴＥＮＢ２抗体  ｍＲＮＡを有し、検出可能なレベルでこれを発現すると考えられている組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから得られ得る。従って、ヒト抗ＴＥＮＢ２抗体もしくはＴＥＮＢ２ポリペプチドのＤＮＡは、ヒト組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから都合よく得られ得る。上記抗ＴＥＮＢ２抗体コード遺伝子はまた、ゲノムライブラリーからもしくは公知の合成手順技術（例えば、自動化核酸合成）によって、得られ得る。
【０１１５】
ライブラリーは、目的の遺伝子もしくはこれによってコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ（例えば、少なくとも約２０〜８０塩基のオリゴヌクレオチド）でスクリーニングされ得る。上記ｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリーを上記選択されたプローブでスクリーニングすることは、標準的な手順（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９に記載された）を使用して行われ得る。抗ＴＥＮＢ２抗体もしくはＴＥＮＢ２ポリペプチドをコードする遺伝子を単離するための代替手段は、ＰＣＲ方法論（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，前出；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈら，ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５）である。
【０１１６】
宿主細胞は、抗ＴＥＮＢ２抗体もしくはＴＥＮＢ２ポリペプチドの生成について本明細書で記載される発現ベクターもしくはクローニングベクターでトランスフェクトもしくは形質転換され、プロモーターを誘導するか、形質転換体を選択するか、もしくは望ましい配列をコードする遺伝子を増幅するために適切な場合に改変される、従来の栄養培地中で培養される。上記培養条件（例えば、培地、温度、ｐＨなど）は、過度の実験なくして、当業者によって選択され得る。一般に、細胞培養の生産性を最大化するための原理、プロトコル、および実際的な技術は、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｍ．Ｂｕｔｌｅｒ，編．（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１）およびＳａｍｂｒｏｏｋら（前出）において見いだされ得る。
【０１１７】
上記ベクター中のＤＮＡをクローニングもしくは発現するための適切な宿主細胞としては、本明細書において、原核生物細胞、酵母細胞、もしくは高等真核生物細胞が挙げられる。適切な原核生物細胞としては、ユーバクテリア（例えば、グラム陰性生物もしくはグラム陽性生物（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）））が挙げられるが、これらに限定されない。種々のＥ．ｃｏｌｉ株が、公に利用可能である（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２株  ＭＭ２９４（ＡＴＣＣ  ３１，４４６）；Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ  ３１，５３７）；Ｅ．ｃｏｌｉ株  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ  ２７，３２５）およびＫ５  ７７２（ＡＴＣＣ  ５３，６３５）。他の適切な原核生物宿主細胞としては、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ））、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ（例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、およびＳｈｉｇｅｌｌａ、ならびにＢａｃｉｌｌｉ（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（例えば、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍは、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ  ２６６，７１０の４１頁に開示される）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓが挙げられる。これら例は、限定ではなく、例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生成物発酵のための例示的な宿主株である。好ましくは、上記宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０は、上記宿主に対して内因性のタンパク質をコードする遺伝子において遺伝的変異をもたらすために改変され得、このような宿主の例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株  １Ａ２（これは、完全遺伝子型ｔｏｎＡを有する）；Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株  ９Ｅ４（これは、完全遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有する）；Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株  ２７Ｃ７  （ＡＴＣＣ  ５５，２４４）（これは、完全遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５（ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｋａｎｒを有する）；Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株  ３７Ｄ６（これは、完全遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  （ａｒｇＦ−ｌａｃ）１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｒｂｓ７  ｉｌｖＧ  ｋａｎｒを有する）；Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０株  ４０Ｂ４（これは、非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を有する株３７Ｄ６である）；および変異ペリプラズムプロテアーゼを有するＥ．ｃｏｌｉ株（米国特許第４９４６７８３号）が挙げられる。あるいは、インビトロのクローニング法（例えば、ＰＣＲもしくた他の核酸ポリメラーゼ反応）が適している。
【０１１８】
全長抗体、抗体フラグメント、および抗体融合タンパク質は、細菌中で、特に、グリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要とされない場合に、例えば、上記治療的抗体が細胞傷害性薬剤（例えば、毒素）に結合体化される場合、生成され得、そしてその免疫結合体自体は、腫瘍細胞破壊において有効性を示し得る。全長抗体は、循環中でより長い半減期を有する。Ｅ．ｃｏｌｉにおける生成は、例えば、翻訳開始領域（ＴＩＲ）ならびに発現および分泌を最適化するためのシグナル配列を有する細菌における抗体フラグメントおよびポリペプチドの発現を使用して、より迅速にかつよりコスト効率的であり得る（米国特許第５，６４８，２３７号；同第５７８９１９９号；同第５８４０５２３号）。発現後に、上記抗体は、可溶性画分において、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞ペーストから単離され、そのアイソタイプに依存して、例えば、プロテインＡもしくはプロテインＧのカラムを通して生成され得る。最終的精製は、例えば、ＣＨＯ細胞において発現された抗体を精製するためのプロセスに類似して、行われ得る。
【０１１９】
原核生物に加えて、真核生物微生物（例えば、糸状菌もしくは酵母）は、抗ＴＥＮＢ２抗体コードベクターもしくはＴＥＮＢ２ポリペプチドコードベクターのための適切なクローニング宿主もしくは発現宿主である。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、一般に使用される下等真核生物宿主微生物である。他のものとしては、以下が挙げられる：Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ（Ｂｅａｃｈ  ａｎｄ  Ｎｕｒｓｅ，（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ，２９０：１４０；ＥＰ  １３９，３８３）；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主（米国特許第４９４３５２９号；Ｆｌｅｅｒら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９６８−９７５）（例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ（ＭＷ９８−８Ｃ、ＣＢＳ６８３、ＣＢＳ４５７４；Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら（１９８３）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５４（２）：７３７−７４２）、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ  １２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ  １６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ  ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ  ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ  ３６，９０６；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら（１９９０）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：１３５）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、およびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ  ４０２２２６）；Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ  １８３０７０；Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａら（１９８８）Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２８：２６５−２７８）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ  ２４４２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ（Ｃａｓｅら（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：５２５９−５２６３）；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ（例えば、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ（ＥＰ  ３９４５３８））；および糸状菌（例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ（ＷＯ  ９１／００３５７）、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主（例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ（Ｂａｌｌａｎｃｅら（１９８３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１１２：２８４−２８９；Ｔｉｌｂｕｒｎら（１９８３）Ｇｅｎｅ，２６：２０５−２２１；Ｙｅｌｔｏｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：１４７０−１４７４）およびＡ．ｎｉｇｅｒ（Ｋｅｌｌｙ  ａｎｄ  Ｈｙｎｅｓ，（１９８５）ＥＭＢＯ  Ｊ．，４：４７５−４７９））。メタノール資化性（Ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｉｃ）酵母は、本明細書において適切であり、これらとしては、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、およびＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａからなる属より選択されるメタノール上で増殖できる酵母が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２０】
グリコシル化された抗ＴＥＮＢ２抗体もしくはＴＥＮＢ２ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物から得られ得る。無脊椎動物細胞の例としては、昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９）、ならびに植物細胞（例えば、綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマトおよびタバコの細胞培養物）が挙げられる。多くのバキュロウイルス株および改変体、ならびにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（イモムシ）、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）、およびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉのような宿主に由来する、対応する許容可能な昆虫宿主細胞が、同定された。トランスフェクションのための種々のウイルス株は、公に入手可能であり、例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶのＬ−１改変体およびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶのＢｍ−５株、ならびにこのようなういるすは、本発明に従って、特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのための、本明細書に記載されるウイルスとして使用され得る。
【０１２１】
有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚性腎臓細胞株（２９３細胞、もしくは懸濁培養での増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９）；胎仔ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂら（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ（１９８０）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１）；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ，  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；水牛ラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ  ８０６５）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら（１９８２）Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８）；ＭＲＣ  ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０１２２】
宿主細胞は、抗ＴＥＮＢ２抗体生成のための上記発現ベクターもしくはクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導するか、形質転換体を選択するか、もしくは上記望ましい配列をコードする遺伝子を増幅するために適切な場合に改変される、従来の栄養培地中で培養される。上記抗ＴＥＮＢ２抗体もしくはＴＥＮＢ２ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）は、クローニング（上記ＤＮＡの増幅）もしくは発現のための複製可能なベクターに挿入され得る。上記ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、もしくはファージの形態において存在し得る。上記適切な核酸配列は、種々の手順によって上記ベクターに挿入され得る。
【０１２３】
インビトロもしくはインビボでの腫瘍細胞の増殖阻害は、当該分野で公知の種々の方法（例えば、未処置腫瘍細胞と比較して、ＴＥＮＢ２発現腫瘍細胞の細胞増殖をインビトロもしくはインビボで約２５〜１００％、もしくは約３０〜１００％、もしくは約５０〜１００％もしくは７０〜１００％、一実施形態において、約０．５〜３０μｇ／ｍｌの抗体濃度で阻害すること）において決定され得る。インビトロでの抗ＴＥＮＢ２抗体の増殖阻害性効果は、当該分野で公知の方法によって、例えば、内因的にもしくは上記ＴＥＮＢ２遺伝子でのトランスフェクション後のいずれかにおいて、ＴＥＮＢ２ポリペプチドを発現する細胞を使用して、評価され得る。例えば、適切な腫瘍細胞株およびＴＥＮＢ２トランスフェクト細胞は、数日間（例えば、２〜７日間）にわたって、種々の濃度の抗ＴＥＮＢ２モノクローナル抗体で処理され得、クリスタルバイオレットもしくはＭＴＴで染色され得るか、またはいくつかの他の比色アッセイによって分析され得る。低下したシグナルは、増殖阻害を示す。増殖を測定するための別の方法は、３Ｈ−チミジン取り込みを、抗ＴＥＮＢ２抗体の存在下もしくは非存在下で処理した細胞によって比較することによる。処理後、上記細胞は回収され、上記ＤＮＡへ組み込まれる放射活性の量は、シンチレーションカウンターにおいて定量される。増殖の阻害は、放射活性の低下によって示される。細胞死を誘導する抗ＴＥＮＢ２抗体について選択するために、例えば、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、トリパンブルーもしくは７ＡＡＤ取り込みによって示されるように、膜完全性の喪失は、コントロールに比較して評価され得る。適切なポジティブコントロールは、選択された細胞株を、その細胞株の増殖を阻害することが既知の増殖阻害性抗体で処理することを包含する。増殖阻害は、細胞培養物において約０．５〜３０μｇ／ｍｌもしくは約０．５ｎＭ〜２００ｎＭの抗体濃度で測定され得、ここで上記増殖阻害は、上記腫瘍細胞を上記抗体に曝した１〜１０日間後に、決定される。上記抗体は、約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ  体重の上記抗ＴＥＮＢ２抗体の投与が、上記抗体の最初の投与から約５日間〜３ヶ月以内に、好ましくは、約５〜３０日間以内に、腫瘍サイズの縮小もしくは腫瘍細胞増殖の低下を生じる場合、インビボで増殖阻害性である。
【０１２４】
（システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体の調製）
本発明の設計、選択、および調製方法は、求電子性官能基と反応性であるシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体を可能にする。これら方法は、指定され、設計された、選択的部位において薬物分子との抗体結合体化合物（例えば、抗体薬物結合体（ＡＤＣ）化合物をさらに可能にする。抗体表面上の反応性システイン残基は、薬物部分を、チオール反応性基（例えば、マレイミドもしくはハロアセチル）を介して特異的に結合体化することを可能にする。Ｃｙｓ残基の上記チオール官能基のマレイミド基に対する求核性の反応性は、タンパク質中の任意の他のアミノ酸官能基（例えば、リジン残基のアミノ基もしくはＮ末端アミノ基）と比較して、約１０００倍高い。ヨードアセチル試薬およびマレイミド試薬における特定の官能基は、アミン基と反応し得るが、より高いｐＨ（＞９．０）およびより長い反応時間が必要とされる（Ｇａｒｍａｎ，１９９７，Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）。タンパク質中の遊離チオールの量は、標準的なエルマンズアッセイ（Ｅｌｌｍａｎ’ｓ  ａｓｓａｙ）によって概算され得る。免疫グロブリンＭは、ジスルフィド架橋したペンタマーの例である一方で、免疫グロブリンＧは、サブユニットを一緒に結合する内部ジスルフィド架橋を有するタンパク質の例である。このようなタンパク質において、試薬（例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）もしくはセレノール（ｓｅｌｅｎｏｌ）（Ｓｉｎｇｈら（２００２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３０４：１４７−１５６））でのジスルフィド結合の還元は、上記反応性遊離チオールを生成するために必要とされる。このアプローチは、抗体三次元構造および抗原結合特異性の喪失を生じ得る。
【０１２５】
ＰＨＥＳＥＬＥＣＴＯＲ（Ｐｈａｇｅ  ＥＬＩＳＡ  ｆｏｒ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｔｈｉｏｌｓ）アッセイは、ＥＬＩＳＡファージフォーマットにおける抗体−Ｆａｂｓ中の反応性システイン基の検出を可能にし、それによって、システイン操作抗体の設計を補助する（ＵＳ  ２００７／００９２９４０）。上記システイン操作抗体似結合する抗原は、表面に十分にコーティングされ、続いて、システイン操作Ｆａｂをディスプレイするファージ粒子とともにインキュベートされ、ＨＲＰ標識2次抗体が添加され、吸光度が検出される。上記ファージ上にディスプレイされた変位タンパク質は、迅速で、強力かつハイスループットの様式でスクリーニングされ得る。システイン操作抗体のライブラリーが生成され得、同じアプローチを使用して結合選択に供されて、抗体もしくは他のタンパク質のタンパク質−ファージライブラリーから遊離Ｃｙｓ組み込みの適切に反応性の部位を同定し得る。この技術は、ファージ上にディスプレイされたシステイン変異タンパク質と、アフィニティー試薬もしくはチオール反応性でもあるレポーター基とを反応させることを包含する。
【０１２６】
上記ＰＨＥＳＥＬＥＣＴＯＲアッセイは、抗体中の反応性チオール基のスクリーニングを可能にする。この方法によるＡ１２１Ｃ改変体の同定は、例示である。Ｆａｂ分子全体は、反応性チオール基を有するより多くのチオＦａｂ改変体を同定するために効率的に検索され得る。パラメーター、部分的表面接近性（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）を使用して、ポリペプチド中のアミノ酸残基への溶媒の接近性を同定および定量した。上記表面接近性は、溶媒分子（例えば、水）が接触し得る表面積（Å２）として表され得る。上記水の占有空間は、１．４Å半径の球として概算される。ソフトウェアは、フリーで入手できるかまたは、タンパク質の各アミノ酸の表面接近性を、既知のｘ線結晶学由来の座標を用いて計算するある議リズムを使用する、結晶学プログラムのＣＣＰ４  Ｓｕｉｔｅとして許可制である（Ｓｅｃｒｅｔａｒｙ  ｔｏ  ＣＣＰ４，Ｄａｒｅｓｂｕｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＷＡ４  ４ＡＤ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ，Ｆａｘ：（＋４４）１９２５  ６０３８２５、もしくはインターネット：ｗｗｗ．ｃｃｐ４．ａｃ．ｕｋ／ｄｉｓｔ／ｈｔｍｌ／ＩＮＤＥＸ．ｈｔｍｌ）（「Ｔｈｅ  ＣＣＰ４  Ｓｕｉｔｅ：Ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ」（１９９４）Ａｃｔａ．Ｃｒｙｓｔ．Ｄ５０：７６０−７６３）。表面接近性計算を行う２つの例示的ソフトウェアモジュールは、Ｂ．Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ｆ．Ｍ．Ｒｉｃｈａｒｄｓ（１９７１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：３７９−４００のアルゴリズムに基づく、「ＡＲＥＡＩＭＯＬ」および「ＳＵＲＦＡＣＥ」である。ＡＲＥＡＩＭＯＬは、タンパク質の上記溶媒接近表面を、プローブ球体（ｐｒｏｂｅ  ｓｐｈｅｒｅ）（溶媒分子を表す）の中心の位置として規定する。なぜなら、上記プローブ球体は、上記タンパク質のファンデルワールス表面を転がるからである。ＡＲＥＡＩＭＯＬは、ｃａｌｃｕｌａｔｅｓ  上記溶媒接近表面積を、各原子の周りの拡張範囲（ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｓｐｈｅｒｅ）上の表面点を（原子およびプローブ半径の合計に等しい原子中心からの距離において）生成し、隣り合う原子と関連する等価な球内にあるものを排除することによって、計算する。ＡＲＥＡＩＭＯＬは、ＰＤＢ座標ファイルにおいて原子の上記溶媒接近面積を見いだし、残基ごとの、鎖ごとの、および分子全体に対する接近面積をまとめる。個々の原子についての接近面積（もしくは面積差）は、偽ＰＤＢ出力ファイル（ｐｓｅｕｄｏ−ＰＤＢ  ｏｕｔｐｕｔ  ｆｉｌｅ）に書き出され得る。ＡＲＥＡＩＭＯＬは、各元素に対する単一半径を想定し、異なる元素の制限された数を認識するのみである。
【０１２７】
ＡＲＥＡＩＭＯＬおよびＳＵＲＦＡＣＥは、絶対的接近性、すなわち、平方オングストローム（Å）の数を報告する。部分的表面接近性は、ポリペプチド内のアミノ酸に対して関連する標準的な状態を参照することによって計算される。上記参照状態は、トリペプチドＧｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙであり、ここでＸは、目的のアミノ酸であり、上記参照状態は、「拡張」配置、すなわち、β−鎖における配置のようであるはずである。上記拡張配置は、Ｘの接近性を最大にする。計算された接近可能面積は、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｇｌｙトリペプチド参照状態における接近可能面積によって除算され、その商を報告し、これは、部分的接近性である。％接近性は、１００を乗算した部分的接近性である。表面接近性を計算するための別の例示的アルゴリズムは、上記ポリペプチドのＸ線座標に基づく水の球体へのアミノ酸残基の部分的接近性を計算するプログラムｘｓａｅ（Ｂｒｏｇｅｒ，Ｃ．，Ｆ．Ｈｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ）のＳＯＬＶモジュールに基づく。抗体中のすべてのアミノ酸についての上記部分的表面接近性は、利用可能な結晶構造情報を使用して計算され得る（Ｅｉｇｅｎｂｒｏｔら（１９９３）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２２９：９６９−９９５）。
【０１２８】
上記システイン操作抗体をコードするＤＮＡは、容易に単離され、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定される。上記ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの供給源として働く。一旦単離されると、上記ＤＮＡは、発現ベクターの中に配置され得、次いで、上記発現ベクターは、宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、シミアンＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、もしくた他の哺乳動物宿主細胞（例えば、骨髄腫細胞（米国特許第５８０７７１５号；ＵＳ  ２００５／００４８５７２；ＵＳ  ２００４／０２２９３１０）（これは、上記組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成を得るために、他の方法では、上記抗体タンパク質を生成しない））にトランスフェクトされる。
【０１２９】
設計および選択の後に、操作され高度に反応性の不対Ｃｙｓ残基を有するシステイン操作抗体（例えば、チオＦａｂ）は、如何によって生成され得る：（ｉ）細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ系（Ｓｋｅｒｒａら（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２５６−２６２；Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．１３０：１５１−１８８））もしくは哺乳動物細胞培養系（ＷＯ  ０１／００２４５）（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ））における発現；ならびに（ｉｉ）一般的なタンパク質精製技術を使用する精製（Ｌｏｗｍａｎら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６（１７）：１０９８２−１０９８８）。
【０１３０】
上記操作されたＣｙｓチオール基は、求核性リンカー試薬、薬物−リンカー中間体と反応して、システイン操作抗体薬物結合体および他の表紙個システイン操作抗体を形成する。システイン操作抗体の、および親抗体に存在するＣｙｓ残基（これらは、対形成し、鎖間および鎖内のジスルフィド結合を形成する）は、いかなる反応性チオール基をも有さず（還元剤で処理されなければ）、そして求核性リンカー試薬とも薬物−リンカー中間体とも反応しない。上記新たに操作されたＣｙｓ残基は、対形成しないままであり得、求核性リンカー試薬もしくは薬物−リンカー中間体（例えば、薬物−マレイミド）と反応（すなわち、結合体化）し得る。例示的薬物−リンカー中間体としては、以下が挙げられる：ＭＣ−ＭＭＡＥ、ＭＣ−ＭＭＡＦ、ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、およびＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ。上記重鎖および軽鎖の操作されたＣｙｓ残基の構造的位置は、配列番号付けシステムに従って番号付けされる。この配列番号付けシステムは、Ｎ末端で始まって、Ｋａｂａｔ番号付けシステム（Ｋａｂａｔら，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）に相互に関係し、ａ、ｂ、ｃによって示される挿入によってＫａｂａｔ番号付けスキーム（下の行）とは異なる。上記Ｋａｂａｔ番号付けシステムを使用すると、実際の直線状アミノ酸配列は、上記可変ドメインのＦＲもしくはＣＤＲの短縮もしくは上記ＦＲもしくはＣＤＲへの挿入に対応するいくつかのもしくはさらなるアミノ酸を含み得る。上記システイン操作された重鎖改変部位は、上記配列番号付けおよびＫａｂａｔ番号付けスキームによって同定される。
【０１３１】
一実施形態において、上記システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体は、以下を包含するプロセスによって調製される：
（ａ）親抗ＴＥＮＢ２抗体の１個以上のアミノ酸残基を、システインで置換する工程；および
（ｂ）上記システイン操作抗体とチオール反応性試薬とを反応させることによって、上記システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体のチオール反応性を決定する工程。
【０１３２】
上記システイン操作抗体は、上記親抗体よりも上記チオール反応性試薬との反応性が高い。
【０１３３】
上記遊離システインアミノ酸残基は、上記重鎖もしくは軽鎖に位置し得るか、または定常ドメインもしくは可変ドメインに位置し得る。抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ）はまた、１個以上のシステインアミノ酸で操作され得、上記抗体フラグメントのアミノ酸を置換して、システイン操作抗体フラグメントを形成し得る。
【０１３４】
本発明の別の実施形態は、システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体を調製（作製）するための方法を提供し、上記方法は、
（ａ）上記システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体を精製するために、１個以上のシステインアミノ酸を、親抗ＴＥＮＢ２抗体に導入する工程；および
（ｂ）上記システイン操作抗体のチオールの、チオール反応性試薬とのチオール反応性を決定する工程；
を包含し、ここで上記システイン操作抗体は、親抗体よりも、上記チオール反応性試薬との反応性が高い。
【０１３５】
システイン操作抗体を調製するための方法の工程（ａ）は、
（ｉ）上記システイン操作抗体をコードする核酸配列を変異誘発する工程；
（ｉｉ）上記システイン操作抗体を発現する工程；および
（ｉｉｉ）上記システイン操作抗体を単離および精製する工程、
を含み得る。
【０１３６】
システイン操作抗体を調製するための方法の工程（ｂ）は、ファージもしくはファージミドから選択されるウイルス粒子上で上記システイン操作抗体を発現する工程を包含し得る。
【０１３７】
システイン操作抗体を調製するための方法の工程（ｂ）はまた、
（ｉ）上記システイン操作抗体とチオール反応性アフィニティー試薬とをを反応させて、アフィニティー標識されたシステイン操作抗体を生成する工程；および
（ｉｉ）上記アフィニティー標識されたシステイン操作抗体の、捕捉媒体への結合を測定する工程、
を含み得る。
【０１３８】
本発明の別の実施形態は、チオール反応性について、非常に反応性の不対システインアミノ酸でシステイン操作抗体をスクリーニングするための方法であり、上記方法は、
（ａ）システイン操作抗体を生成するために、１個以上のシステインアミノ酸を、親抗体に導入する工程；
（ｂ）上記システイン操作抗体と、チオール反応性アフィニティー試薬とを反応させて、アフィニティー標識されたシステイン操作抗体を生成する工程；および
（ｃ）上記アフィニティー標識されたシステイン操作抗体の、捕捉媒体への結合を測定する工程；および
（ｄ）上記システイン操作抗体の、上記チオール反応性試薬とのチオール反応性を決定する工程、
を包含する。
【０１３９】
システイン操作抗体をスクリーニングするための方法の工程（ａ）は、
（ｉ）上記システイン操作抗体をコードする核酸配列を変異誘発する工程；
（ｉｉ）上記システイン操作抗体を発現する工程；および
（ｉｉｉ）上記システイン操作抗体を単離および精製する工程
を包含し得る。
【０１４０】
システイン操作抗体をスクリーニングするための方法の工程（ｂ）は、ファージもしくはファージミド粒子から選択されるウイルス粒子上で上記システイン操作抗体を発現する工程を包含し得る。
【０１４１】
システイン操作抗体をスクリーニングするための方法の工程（ｂ）はまた、
（ｉ）上記システイン操作抗体と、チオール反応性アフィニティー試薬とを反応させて、アフィニティー標識されたシステイン操作抗体を生成する工程；および
（ｉｉ）上記アフィニティー標識されたシステイン操作抗体の、捕捉媒体への結合を測定する工程、
を包含し得る。
【０１４２】
（ＴＭＥＦＦ２＃１９  ＩｇＧ改変体のシステイン操作）
システインを、重鎖１２１（シグナル配列を除く配列番号付け）部位において、全長のヒト化親モノクローナル抗ＴＥＮＢ２  ＴＭＥＦＦ２＃１９抗体へと、本明細書に記載される上記システイン操作方法によって導入して、重鎖配列：配列番号１、および軽鎖配列：配列番号２（図１）を有するＡ１２１Ｃ  チオ  ｈｕ  抗ＴＥＮＢ２  ＴＭＥＦＦ２＃１９ヒト化改変体を得た。これらシステイン操作されたモノクローナル抗体を、１ｍＭ  システインを含む培地中での一時的な発酵によって、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞において発現させた。
【０１４３】
一実施形態によれば、ヒト化ＴＭＥＦＦ２＃１９  システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体は、遊離システインアミノ酸とともに、以下の可変領域重鎖配列のうちの１個以上を含む（表１）。
【０１４４】
【表１】
0005606916.tif 000017
一実施形態によれば、ヒト化ＴＭＥＦＦ２＃１９  システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体は、遊離システインアミノ酸とともに、以下の可変領域軽鎖配列のうちの１個以上を含む（表２）。
【０１４５】
【表２】
0005606916.tif 000018
（標識されたシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体）
システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体は、チオール反応性試薬と部位特異的にかつ効率的にカップリングされ得る。上記チオール反応性試薬は、多官能性リンカー試薬、捕捉（すなわち、アフィニティー）標識試薬（例えば、ビオチン−リンカー試薬）、検出標識（例えば、フルオロフォア試薬）、固相固定化試薬（例えば、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭ、ポリスチレンもしくはガラス）、もしくは薬物−リンカー中間体であり得る。チオール反応性試薬の一例は、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）である。例示的実施形態において、チオＦａｂとビオチン−リンカー試薬との反応は、ビオチン化チオＦａｂを提供し、それによって、上記操作されたシステイン残基の存在および反応性が検出および測定され得る。チオＦａｂと多官能性リンカー試薬との反応は、薬物部分試薬もしくは他の標識とさらに反応させられ得る官能化リンカーを有するチオＦａｂを提供する。チオＦａｂと薬物−リンカー中間体との反応は、チオＦａｂ薬物結合体を提供する。
【０１４６】
本明細書に記載される例示的方法は、一般に、抗体の同定および生成に適用され得、より一般には、本明細書に記載される設計およびスクリーニング工程の適用を介して他のタンパク質に適用され得る。
【０１４７】
このようなアプローチは、他のチオール反応性試薬の結合体に適用され、上記試薬において、上記反応性基は、例えば、マレイミド、ヨードアセトアミド、ピリジルジスルフィド、もしくは他のチオール反応性結合パートナー（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｐａｒｔｎｅｒ）である（Ｈａｕｇｌａｎｄ，２００３，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｒｉｎｋｌｅｙ，１９９２，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３：２；Ｇａｒｍａｎ，１９９７，Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ；Ｍｅａｎｓ（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１：２；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．ｉｎ  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９６）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ｐｐ．４０−５５，６４３−６７１）。上記チオール反応性試薬は、ｍａｙ  ｂｅ  ａ  薬物部分、フルオロフォア（例えば、フルオレセインもしくはローダミンのような蛍光色素）、画像化もしくは放射線療法剤のためのキレート化剤、ペプチジルもしくは非ペプチジル標識または検出タグ、あるいはクリアランス改変薬剤（例えば、ポリエチレングリコールの種々のアイソマー、第３の成分に結合するペプチド、または別の炭水化物もしくは親油性薬剤）
（システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体の使用）
システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体、およびその結合体は、治療的薬剤および／もしくは診断的薬剤としての用途を見いだし得る。本発明は、ＴＥＮＢ２関連障害と関連する１個以上の症状を予防、管理、処置もしくは緩和するための方法をさらに提供する。特に、本発明は、細胞増殖症外（例えば、癌（例えば、卵巣癌、子宮頚癌、子宮癌、膵臓がん、肺癌および乳癌））と関連する１個以上の症状を予防、管理、処置もしくは緩和するための方法を提供する。本発明は、ＴＥＮＢ２関連障害もしくはこのような障害を発症させる素因を診断するための方法、ならびに細胞関連ＴＥＮＢ２ポリペプチドを優先的に結合する抗体、および抗体の抗原結合フラグメントを同定するための方法をさらに提供する。
【０１４８】
本発明の別の実施形態は、ＴＥＮＢ２関連障害に応答性である状態の処置において有用な医薬の調製のための、システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体の使用に関する。
【０１４９】
（システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体薬物結合体）
本発明の別の局面は、システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体（Ａｂ）、およびオーリスタチン薬物部分（Ｄ）を含む抗体薬物結合体化合物であり、ここで上記システイン操作抗体は、１個以上の遊離システインアミノ酸を介して、リンカー部分（Ｌ）によってＤへと結合される；上記化合物は、式Ｉ：
【０１５０】
【化１−２】
0005606916.tif 000019
を有し、ここでｐは、１、２、３、もしくは４であり；そしてここで上記システイン操作抗体は、親抗ＴＥＮＢ２抗体のうちの１個以上のアミノ酸残基を、１個以上の遊離システインアミノ酸で置換する工程を包含するプロセスによって調製される得る。
【０１５１】
図５は、オーリスタチン薬物部分が以下の中の操作されたシステイン基に結合される、システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体薬物結合体（ＡＤＣ）の実施形態を示す：軽鎖（ＬＣ−ＡＤＣ）；重鎖（ＨＣ−ＡＤＣ）；およびＦｃ領域（Ｆｃ−ＡＤＣ）。
【０１５２】
システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体薬物結合体の潜在的利点としては、改善された安全性（より大きな治療指数）、改善されたＰＫパラメーターが挙げられ、抗体鎖間ジスルフィド結合が保持され、このことは、上記結合体を安定化させ得、その活性な結合配置を保持し得、薬物結合体の部位が規定され、そして薬物−リンカー試薬へのシステイン操作抗体の結合体化から、システイン操作抗体薬物結合体を調製すると、より均質な生成物が生じる。
【０１５３】
（薬物部分）
式Ｉの上記抗体薬物結合体（ＡＤＣ）のオーリスタチン薬物部分は、ドラスタチン、オーリスタチン（米国特許第５６３５４８３号；同第５７８０５８８号；同第５７６７２３７号；同第６１２４４３１号）、アナログおよびそれらの誘導体を含む。ドラスタチンおよびオーリスタチンは、微小管の動力学、ＧＴＰ加水分解、ならびに核分裂および細胞分裂を妨害し（Ｗｏｙｋｅら（２００１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５（１２）：３５８０−３５８４）、そして抗癌活性（米国特許第５６６３１４９号）および抗真菌活性（Ｐｅｔｔｉｔら（１９９８）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４２：２９６１−２９６５）を有することが示された。種々の形態のドラスタチンもしくはオーリスタチン薬物部分が、上記ペプチド性薬物部分のＮ（アミノ）末端もしくはＣ（カルボキシル）末端を介して抗体に共有結合され得る（ＷＯ  ０２／０８８１７２；Ｄｏｒｏｎｉｎａら（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２１（７）：７７８−７８４；Ｆｒａｎｃｉｓｃｏら（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０２（４）：１４５８−１４６５）。
【０１５４】
例示的オーリスタチンの実施形態は、ＷＯ  ２００５／０８１７１１；Ｓｅｎｔｅｒら，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅ  ４５，Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ６２３（２００４年３月２８日に発表）（これら各々の開示は、その全体が本明細書に参考として援用される）で開示される、上記Ｎ末端結合モノメチルオーリスタチン薬物部分ＤＥおよびＤＦを含む。例示的オーリスタチン薬物部分は、ＭＭＡＥ、およびＭＭＡＦを含む。
【０１５５】
式Ｉの上記抗体薬物結合体（ＡＤＣ）の上記オーリスタチン薬物部分（Ｄ）は、モノメチルオーリスタチン薬物部分ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦを含む。上記ＭＭＡＥもしくはＭＭＡＦ薬物部分のＮ末端は、上記抗体の操作されたシステインへのリンカーを介して共有結合される：
【０１５６】
【化２】
0005606916.tif 000020
他の例示的オーリスタチン薬物部分は、ペンタペプチドオーリスタチン薬物部分のＣ末端においてフェニルアラニンカルボキシ改変を有するモノメチルバリン化合物（ＷＯ  ２００７／００８８４８）およびペンタペプチドオーリスタチン薬物部分のＣ末端においてフェニルアラニン側鎖改変を有するモノメチルバリン化合物（ＷＯ  ２００７／００８６０３）を含む。
【０１５７】
代表的には、ペプチドベースの薬物部分は、２個以上のアミノ酸および／もしくはペプチドフラグメントの間にペプチド結合を形成することによって、調製され得る。このようなペプチド結合は、例えば、タンパク質化学の分野において周知の液相合成方法（Ｅ．Ｓｃｈｒｕｄｅｒ  ａｎｄ  Ｋ．  Ｌuｂｋｅ，「Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐｐ  ７６−１３６，１９６５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと）に従って、調製され得る。
【０１５８】
（リンカー）
「リンカー」、「リンカーユニット」、もしくは「連結」とは、薬物部分に抗体を共有結合する、共有結合もしくは原子の鎖を含む化学部分を意味する。種々の実施形態において、リンカーは、Ｌとして特定される。「リンカー」（Ｌ）は、１個以上の薬物部分（Ｄ）および抗体ユニット（Ａｂ）を連結して、式Ｉの抗体薬物結合体（ＡＤＣ）を形成するために使用され得る二官能性もしくは多官能性の部分である。抗体薬物結合体（ＡＤＣ）は、上記薬物および抗体へ結合するための反応性官能基を有するリンカーを使用して、都合よく調製され得る。システイン操作抗体（Ａｂ）のシステインチオールは、リンカー試薬、薬物部分もしくは薬物−リンカー中間体の求核性官能基との結合を形成し得る。
【０１５９】
一局面において、リンカーは、抗体に存在する求核性システインに対して反応性である求核性基を有する反応性部位を有する。上記抗体のシステインチオールは、リンカー上の求核性基と反応性であり、かつリンカーに対して共有結合を形成する。有用な求核性基としては、マレイミドおよびハロアセトアミド基が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６０】
リンカーとしては、二価ラジカル（例えば、アルキルジイル、アリーレン、ヘテロアリーレン、以下のような部分（例えば、−（ＣＲ２）ｎＯ（ＣＲ２）ｎ−、アルキルオキシの反復ユニット（例えば、ポリエチレンオキシ、ＰＥＧ、ポリメチレンオキシ）およびアルキルアミノ（例えば、ポリエチレンアミノ、ＪｅｆｆａｍｉｎｅＴＭ））；ならびに二酸エステルおよびアミド（スクシネート、スクシンアミド、ジグリコレート、マロネート、およびカプロアミド（ｃａｐｒｏａｍｉｄｅ）が挙げられる）が挙げられる。
【０１６１】
システイン操作抗体は、Ｋｌｕｓｓｍａｎら（２００４），Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １５（４）：７６５−７７３の第７６６頁および実施例３のプロトコルに従えば、リンカー試薬もしくは薬物−リンカー中間体と、求核性官能基（例えば、マレイミドもしくはα−ハロカルボニル）と反応する。
【０１６２】
上記リンカーは、１個以上のリンカー成分から構成され得る。例示的なリンカー成分は、６−マレイミドカプロイル（「ＭＣ」）、マレイミドプロパノイル（「ＭＰ」）、バリン−シトルリン（「ｖａｌ−ｃｉｔ」もしくは「ｖｃ」）、アラニン−フェニルアラニン（「ａｌａ−ｐｈｅ」もしくは「ａｆ」）、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（「ＰＡＢ」）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（「ＳＰＰ」）、Ｎ−スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボキシレート（「ＳＭＣＣ」）、Ｎ−スクシンイミジル（４−ヨード−アセチル）アミノベンゾエート（「ＳＩＡＢ」）、エチレンオキシ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（１個以上の反復ユニット（「ＥＯ」もしくは「ＰＥＯ」として）が挙げられる。さらなるリンカー成分は、当該分野で公知であり、いくらかは、本明細書において記載される。
【０１６３】
一実施形態において、ＡＤＣのリンカーＬは、以下の式：
【０１６４】
【化３】
0005606916.tif 000021
を有し、ここで
−Ａ−は、上記抗体（Ａｂ）のシステインチオールに共有結合された伸長因子ユニットであり；
ａは、０もしくは１であり；
各−Ｗ−は、独立して、アミノ酸ユニットであり；
ｗは、独立して、０〜１２の範囲に及ぶ整数であり；
−Ｙ−は、上記薬物部分に共有結合されるスペーサーユニットであり；そして
ｙは、０、１もしくは２である。
【０１６５】
（伸長因子ユニット）
上記伸長因子ユニット（−Ａ−）は、存在する場合、抗体ユニットをアミノ酸ユニット（−Ｗ−）に連結し得る。この点に関して、抗体（Ａｂ）は、伸長因子ユニットの求核性官能基との結合を形成し得る遊離システインチオールを有する。式Ｉの結合体における例示的伸長因子ユニットは、式ＩＩおよび式ＩＩＩによって示され、ここでＡｂ−、−Ｗ−、−Ｙ−、−Ｄ、ｗおよびｙは、上記で定義されるとおりであり、Ｒ１７は、以下から選択される二価ラジカルである：（ＣＨ２）ｒ、Ｃ３−Ｃ８カルボシクリル、Ｏ−（ＣＨ２）ｒ、アリーレン、（ＣＨ２）ｒ−アリーレン、−アリーレン−（ＣＨ２）ｒ−、（ＣＨ２）ｒ−（Ｃ３−Ｃ８カルボシクリル）、（Ｃ３−Ｃ８カルボシクリル）−（ＣＨ２）ｒ、Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクリル、（ＣＨ２）ｒ−（Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクリル）、−（Ｃ３−Ｃ８ヘテロシクリル）−（ＣＨ２）ｒ−、−（ＣＨ２）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２）ｒ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−、−（ＣＨ２）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−、−（ＣＨ２）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−、および−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２）ｒ−；ここでＲｂは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、フェニル、もしくはベンジルであり；そしてｒは、独立して、１〜１０の範囲に及ぶ整数である。
【０１６６】
アリーレンは、芳香族環系から２個の水素原子を除去することによって得られる、６〜２０個の炭素原子の二価の芳香族炭化水素ラジカルを含む。代表的なアリーレン基としては、ベンゼン、置換されたベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニルなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６７】
ヘテロシクリル基は、１個以上の環原子がヘテロ原子（例えば、窒素、酸素および硫黄）である環系を含む。上記複素環ラジカルは、１〜２０個の炭素原子および１〜３個のヘテロ原子（Ｎ、Ｏ、Ｐ、およびＳから選択される）を含む。複素環は、３〜７個の環員（２〜６個の炭素原子および１〜３個のヘテロ原子（Ｎ、Ｏ、Ｐ、およびＳから選択される））を有する単環もしくは７〜１０個の環員（４〜９個の炭素原子および１〜３個のヘテロ原子（Ｎ、Ｏ、Ｐ、およびＳから選択される））を有する二環（例えば、ビシクロ［４，５］、［５，５］、［５，６］、もしくは［６，６］系）であり得る。複素環は、Ｐａｑｕｅｔｔｅ，Ｌｅｏ  Ａ．；「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」（Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９６８）（特に、第１章、３章、４章、６章、７章、および９章）；「Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ａ  ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９５０〜最新版まで）（特に、第１３巻、１４巻、１６巻、１９巻、および２８巻）；およびＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９６０）８２：５５６６に記載されている。
【０１６８】
複素環の例としては、例えば、ピリジル、ジヒドロキシピリジル、テトラヒドロピリジル（ピペリジル）、チアゾリル、テトラヒドロチオフェニル、イオウ酸化型テトラヒドロチオフェニル、ピリミジニル、フラニル、チエニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、テトラゾリル、ベンゾフラニル、チアナフタレニル、インドリル、インドレニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾイミダゾリル、ピペリジニル、４−ピペリドニル、ピロリジニル、２−ピロリジニル、ピロリニル、テトラヒドロフラニル、ビス−テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、ビス−テトラヒドロピラニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オクタヒドロイソキノリニル、アゾシニル、トリアジニル、６Ｈ−１，２，５−チアジアジニル、２Ｈ，６Ｈ−１，５，２−ジチアジニル、チエニル、チアントレニル（ｔｈｉａｎｔｈｒｅｎｙｌ）、ピラニル、イソベンゾフラニル、クロメニル（ｃｈｒｏｍｅｎｙｌ）、キサンテニル、フェノキサチニル、２Ｈ−ピロリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、インドリジニル、イソインドリル、３Ｈ−インドリル、１Ｈ−インダゾリル、プリニル、４Ｈ−キノリジニル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シノリニル、プテリジニル（ｐｔｅｒｉｄｉｎｙｌ）、４Ａｈ−カルバゾリル、カルバゾリル、β−カルボリニル、フェナントリジニル、アクリジニル、ピリミジニル、フェナントロリニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フラザニル、フェノキサジニル、イソクロマニル、クロマニル、イミダゾリジニル、イミダゾイニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペラジニル、インドリニル、イソインドリニル、キヌクリジニル、モルホリニル、オキサゾリジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾイソキサゾリル、オキシインドリル、ベンゾオキサゾリニル、およびイサチノイル（ｉｓａｔｉｎｏｙｌ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６９】
カルボシクリル基としては、単環としての３〜７個の炭素原子を有する飽和もしくは不飽和の環、もしくは二環としての７〜１２個の炭素原子を含む。単環式炭素環は、３〜６個の環原子、さらにより代表的には、５もしくは６個の環原子を有する。二環式炭素環は、例えば、ビシクロ［４，５］、［５，５］、［５，６］もしくは［６，６］系として配置された７〜１２個の環原子、またはビシクロ［５，６］もしくは［６，６］系として配置される９もしくは１０個の環原子を有する。単環式炭素環の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、１−シクロペンタ−１−エニル、、１−シクロペンタ−２−エニル、１−シクロペンタ−３−エニル、シクロヘキシル、１−シクロヘキサ−１−エニル、１−シクロヘキサ−２−エニル、１−シクロヘキサ−３−エニル、シクロヘプチル、およびシクロオクチルが挙げられる。
【０１７０】
さらに明示的に示されないとしても、操作されたシステイン残基の数に依存して、１〜４個の薬物部分が、抗体に連結される（ｐ＝１〜４）ことが、式ＩのＡＤＣ（例えば、ＩＩ−Ｖ）
【０１７１】
【化４】
0005606916.tif 000022
の例示的実施形態の全てから理解されるべきである。
【０１７２】
例示的式ＩＩの伸長因子ユニットは、マレイミド−カプロイル（ＭＣ）：
【０１７３】
【化５】
0005606916.tif 000023
から得られ、ここでＲ１７は、−（ＣＨ２）５−である。
【０１７４】
式ＩＩの例示的伸長因子ユニットは、マレイミド−プロパノイル（ＭＰ）：
【０１７５】
【化６】
0005606916.tif 000024
から得られ、ここでＲ１７は、−（ＣＨ２）２−である。
【０１７６】
式ＩＩの別の例示的伸長因子ユニット（ここでＲ１７は、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−であり、ｒは２である）は以下である：
【０１７７】
【化７】
0005606916.tif 000025
式ＩＩの別の例示的伸長因子ユニット（ここでＲ１７は、−（ＣＨ２）ｒＣ（Ｏ）ＮＲｂ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｒ−ＣＨ２−であり、ここでＲｂはＨであり、各ｒは２である）は、以下のとおりである：
【０１７８】
【化８】
0005606916.tif 000026
式ＩＩＩの例示的伸長因子ユニット（ここでＲ１７は−（ＣＨ２）５−である）は、以下のとおりである：
【０１７９】
【化９】
0005606916.tif 000027
別の実施形態において、上記伸長因子ユニットは、上記抗体の上記操作されたシステイン硫黄原子と、上記伸長因子ユニットの硫黄原子との間のジスルフィド結合を介して、上記システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体に連結される。この実施形態の代表的伸長因子ユニットは、式ＩＶによって示され、ここでＲ１７、Ａｂ−、−Ｗ−、−Ｙ−、−Ｄ、ｗおよびｙは、上記で定義されるとおりである：
【０１８０】
【化１０】
0005606916.tif 000028
さらに別の実施形態において、上記伸長因子（Ｓｔｒｅｔｃｈｅｒ）の反応性基は、抗体の遊離システインチオールと形成を形成し得るチオール反応性官能基を含む。チオール反応官能基の例としては、マレイミド、α−ハロアセチル、活性化エステル（例えば、スクシンイミドエステル、４−ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロフェニルエステル）、無水物、酸クロリド、スルホニルクロリド、イソシアネートおよびイソチオシアネートが挙げられるが、これらに限定されない。この実施形態の代表的な伸長因子ユニットは、式ＶａおよびＶｂによって示され、ここで−Ｒ１７−、Ａｂ−、−Ｗ−、−Ｙ−、−Ｄ、ｗおよびｙは、上記で定義されるとおりである；
【０１８１】
【化１１】
0005606916.tif 000029
別の実施形態において、上記リンカーは、１個より多くの薬物部分を、分枝状の多官能性リンカー部分を介して抗体に共有結合するための樹状タイプのリンカーであり得る（Ｓｕｎら（２００２）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２：２２１３−２２１５；Ｓｕｎら（２００３）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１：１７６１−１７６８；Ｋｉｎｇ（２００２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４３：１９８７−１９９０）、樹状リンカーは、薬物  対  抗体のモル比（すなわち、負荷（ｌｏａｄｉｎｇ））を増大させ得、この比は、上記ＡＤＣの有効性に関する。従って、システイン操作抗体がわずか１個の反応性システインチオール基を有する場合、多くの薬物部分は、樹状リンカーを介して結合され得る。
【０１８２】
（アミノ酸ユニット）
上記リンカーは、アミノ酸残基を含み得る。上記アミノ酸ユニット（−Ｗｗ−）は、存在する場合、上記抗体（Ａｂ）を、本発明の上記システイン操作抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）の上記薬物部分（Ｄ）に連結する。
【０１８３】
−Ｗｗ−は、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチド、ウンデカペプチドもしくはドデカペプチドユニットである。上記アミノ酸ユニットを含むアミノ酸残基は、天然に存在するもの、およびマイナーアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸アナログ（例えば、シトルリン）を含む。各−Ｗ−ユニットは、独立して、大括弧中の如何に示される式を有し、ｗは、０〜１２の範囲に及ぶ整数である：
【０１８４】
【化１２】
0005606916.tif 000030
ここでＲ１９は、水素、メチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ベンジル、ｐ−ヒドロキシベンジル、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ３、−ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＯＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）３ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨ２、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＣＨ３、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＨＯ、−（ＣＨ２）４ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＣＨ３、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＨＯ、−（ＣＨ２）３ＮＨＣＯＮＨ２、−（ＣＨ２）４ＮＨＣＯＮＨ２、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２ＮＨ２、２−ピリジルメチル−、３−ピリジルメチル−、４−ピリジルメチル−、フェニル、シクロヘキシル、
【０１８５】
【化１３】
0005606916.tif 000031
である。Ｒ１９が水素以外である場合、Ｒ１９が結合される炭素原子は、キラルである。Ｒ１９が結合される各炭素原子は、独立して、（Ｓ）配置もしくは（Ｒ）配置において存在するか、まんたはラセミ混合物で存在する。アミノ酸ユニットは、従って、鏡像異性的に純粋であってもよいし、ラセミ体であってもよいし、ジアステレオマ−であってもよい。
【０１８６】
例示的な−Ｗｗ−アミノ酸ユニットとしては、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドもしくはペンタペプチドが挙げられる。例示的なジペプチドとしては、以下が挙げられる：バリン−シトルリン（ｖｃもしくはｖａｌ−ｃｉｔ）、アラニン−フェニルアラニン（ａｆもしくはａｌａ−ｐｈｅ）。例示的なトリペプチドとしては、以下が挙げられる：グリシン−バリン−シトルリン（ｇｌｙ−ｖａｌ−ｃｉｔ）およびグリシン−グリシン−グリシン（ｇｌｙ−ｇｌｙ−ｇｌｙ）。アミノ酸リンカー成分を含むアミノ酸残基は、天然に存在するもの、ならびにマイナーアミノ酸および天然に存在しないアミノ酸アナログ（例えば、シトルリン）が挙げられる。
【０１８７】
上記アミノ酸ユニットは、１種以上の酵素（腫瘍関連プロテアーゼが挙げられる）によって酵素的に切断されて、上記薬物部分（−Ｄ）を遊離し得、上記酵素は、一実施形態において、放出する際にインビボでプロトン化されて、薬物（Ｄ）を提供する。アミノ酸リンカー成分が設計され得、特定の酵素（例えば、腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、ＣおよびＤ、またはプラスミンプロテアーゼ）によって酵素的切断のためのそれらの選択性において最適化され得る。
【０１８８】
（スペーサーユニット）
上記スペーサーユニット（−Ｙｙ−）は、存在する（ｙ＝１もしくは２）場合、アミノ酸ユニットが存在する（ｗ＝１〜１２）場合に、アミノ酸ユニット（−Ｗｗ−）を上記薬物部分（Ｄ）に連結する。あるいは、上記スペーサーユニットは、上記アミノ酸ユニットが存在しない場合に、上記伸長因子ユニットを上記薬物部分に連結する。上記スペーサーユニットはまた、上記アミノ酸ユニットおよび伸長因子ユニットの両方が存在しない（ｗ、ｙ＝０）場合、上記薬物部分を上記抗体ユニットに連結する。スペーサーユニットは、２個の一般的タイプのものである：自壊型（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ）および非自壊型（ｎｏｎ  ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ）。非自壊型スペーサーユニットは、上記スペーサーユニットの一部もしくは全てが、アミノ酸ユニットを、上記抗体薬物結合体もしくは上記薬物部分−リンカーから切断した後（特に、酵素的に）に、上記薬物部分に結合したままであるものである。グリシン−グリシンスペーサーユニットもしくはグリシンスペーサーユニットを含むＡＤＣが、腫瘍細胞関連プロテアーゼを介して酵素的切断を受ける場合、癌細胞関連プロテアーゼもしくはリンパ球関連プロテアーゼ、グリシン−グリシン−薬物部分もしくはグリシン−薬物部分が、Ａｂ−Ａａ−Ｗｗ−から切断される。一実施形態において、独立した加水分解反応は、上記標的細胞内で起こり、上記グリシン−薬物部分結合を切断し、上記薬物を遊離させる。
【０１８９】
別の実施形態において、−Ｙｙ−は、フェニレン部分がＱｍで置換された（ここでＱは、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−ハロゲン、−ニトロもしくは−シアノであり；そしてｍは、０〜４の範囲に及ぶ整数である）ｐ−アミノベンジルカルバモイル（ＰＡＢ）ユニットである。
【０１９０】
非自壊型スペーサーユニット（−Ｙ−）の例示的実施形態は、以下のとおりである：−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−；−Ｇｌｙ−；−Ａｌａ−Ｐｈｅ−；−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−。
【０１９１】
一実施形態において、上記スペーサーユニットが存在しない（ｙ＝０）薬物部分−リンカーもしくはＡＤＣ、またはその薬学的に受容可能な塩もしくは溶媒和物が提供される。
【０１９２】
あるいは、自壊型スペーサーユニットを含むＡＤＣは、−Ｄを放出し得る。一実施形態において、−Ｙ−は、上記ＰＡＢ基のアミノ窒素原子を介して−Ｗｗ−に連結されるＰＡＢ基であり、カーボネート、カルバメートもしくはエーテル基を介して−Ｄに接続され、ここで上記ＡＤＣは、以下の例示的な構造を有する：
【０１９３】
【化１４】
0005606916.tif 000032
ここでＱは、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−ハロゲン、−ニトロもしくは−シアノであり；ｍは、０〜４の範囲二及ぶ整数であり；ｐは、１〜４の範囲に及ぶ。
【０１９４】
自壊型スペーサーの他の例としては、ＰＡＢ基（例えば、２−アミノイミダゾール−５−メタノール誘導体）に電子的に類似の芳香族化合物（Ｈａｙら（１９９９）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．９：２２３７）、複素環式ＰＡＢアナログ（ＵＳ  ２００５／０２５６０３０）、β−グルクロニド（ＷＯ  ２００７／０１１９６８）、およびオルト−もしくはパラ−アミノベンジルアセタールが挙げられるが、これらに限定されない。スペーサーが使用され、上記スペーサーは、アミド結合加水分解（例えば、置換されたおよび置換されていない４−アミノ酪酸アミド（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓら（１９９５）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：２２３）、適切に置換されたビシクロ［２．２．１］およびビシクロ［２．２．２］環系（Ｓｔｏｒｍら（１９７２）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９４：５８１５）ならびに２−アミノフェニルプロピオン酸アミド（Ａｍｓｂｅｒｒｙら（１９９０）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：５８６７））の際に環化を受ける。グリシンで置換されるアミン含有薬物の排除（Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙら（１９８４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２７：１４４７）はまた、ＡＤＣにおいて有用な自壊型スペーサーの例である。
【０１９５】
例示的スペーサーユニット（−Ｙｙ−）は、式Ｘ〜ＸＩＩによって表される：
【０１９６】
【化１５】
0005606916.tif 000033
（樹状リンカー）
別の実施形態において、リンカーＬは、１個より多くの薬物部分を、分枝状の多官能性リンカー部分を介して抗体に共有結合するための樹状タイプリンカーであり得る（Ｓｕｎら（２００２）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １２：２２１３−２２１５；Ｓｕｎら（２００３）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１：１７６１−１７６８）。樹状リンカーは、薬物  対  抗体のモル比（すなわち、負荷）を増大させ得、上記比は、上記ＡＤＣの有効性に関連する。従って、システイン操作抗体が、わずか１個の反応性システインチオール基を有する場合、多くの薬物部分が、樹状リンカーを介して結合され得る。分枝状の樹状リンカーの例示的実施形態としては、２，６−ビス（ヒドロキシメチル）−ｐ−クレゾールおよび２，４，６−トリス（ヒドロキシメチル）−フェノールデンドリマーユニット（ＷＯ  ２００４／０１９９３；Ｓｚａｌａｉら（２００３）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：１５６８８−１５６８９；Ｓｈａｍｉｓら（２００４）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２６：１７２６−１７３１；Ａｍｉｒら（２００３）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４２：４４９４−４４９９）が挙げられる。
【０１９７】
一実施形態において、上記スペーサーユニットは、分枝状のビス（ヒドロキシメチル）スチレン（ＢＨＭＳ）であり、これは、２−（４−アミノベンジリデン）プロパン−１，３−ジオールデンドリマーユニット（ＷＯ  ２００４／０４３４９３；ｄｅ  Ｇｒｏｏｔら（２００３）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４２：４４９０−４４９４）を含む以下の構造を有する複数の薬物を組み込みかつ放出するために使用され得る：
【０１９８】
【化１６】
0005606916.tif 000034
ここでＱは、−Ｃ１−Ｃ８アルキル、−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ８アルキル）、−ハロゲン、−ニトロもしくは−シアノであり；ｍは、０〜４の範囲に及ぶ整数であり；ｎは０もしくは１であり；そしてｐは、１〜４の範囲に及ぶ。
【０１９９】
式Ｉの抗体薬物結合体化合物の例示的実施形態としては、以下が挙げられる：ＸＩＩＩａ（ＭＣ）、ＸＩＩＩｂ（ｖａｌ−ｃｉｔ）、ＸＩＩＩｃ（ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ）、およびＸＩＩＩｄ（ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ）：
【０２００】
【化１７】
0005606916.tif 000035
【０２０１】
【化１８】
0005606916.tif 000036
式Ｉａの抗体薬物結合体化合物の他の例示的実施形態は、ＸＩＶａ〜ｅを含み：
【０２０２】
【化１９】
0005606916.tif 000037
ここでＸは：
【０２０３】
【化２０】
0005606916.tif 000038
Ｙは、以下：
【０２０４】
【化２１】
0005606916.tif 000039
であり、ここでＲは、独立して、ＨもしくはＣ１−Ｃ６アルキルであり；ｎは１〜１２である。
【０２０５】
別の実施形態において、リンカーは、抗体上に存在する求核性基に対して反応性である求核性基を有する反応性官能基を有する。抗体上の有用な求核性基としては、アルデヒドおよびケトンカルボニル基が挙げられるが、これらに限定されない。リンカーの求核性基の上記ヘテロ原子は、抗体上の求核性基と反応し得、そして抗体ユニットに対して共有結合を形成し得る。リンカー上の有用な求核性基としては、ヒドラジド、オキシム、アミノ、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジドが挙げられるが、これらに限定されない。抗体上の上記求核性基は、リンカーへの結合のための都合のよい部位を提供する。
【０２０６】
代表的には、ペプチドタイプリンカーは、２個以上のアミノ酸および／もしくはペプチドフラグメントの間にペプチド結合を形成することによって、調製され得る。このようなペプチド結合は、例えば、ペプチド合成の分野において周知である液相合成法（Ｅ．Ｓｃｈｒoｄｅｒ  ａｎｄ  Ｋ．Ｌuｂｋｅ（１９６５）「Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」，ｖｏｌｕｍｅ  １，ｐｐ  ７６−１３６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）に従って、調製され得る。リンカー中間体は、スペーサー、伸長因子、およびアミノ酸ユニットを含む任意の組み合わせもしくは一連の反応で組み立てられ得る。上記スペーサー、伸長因子、およびアミノ酸ユニットは、求電子性、求核性、もしくは性質が遊離ラジカルである反応性官能基を使用し得る。反応性官能基としては、カルボキシル、ヒドロキシル、パラ−ニトロフェニルカーボネート、イソチオシアネート、および脱離基（例えば、Ｏ−メシル、Ｏ−トシル、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ）；もしくはマレイミドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０７】
別の実施形態において、上記リンカーは、溶解度もしくは反応性を調節した基で置換され得る。例えば、荷電した置換基（例えば、スルホネート（−ＳＯ３−）もしくはアンモニウム）は、上記ＡＤＣを調製するために使用される合成経路に依存して、上記試薬の水溶性を増大させ得るか、上記リンカー試薬と、上記抗体もしくは上記薬物部分とのカップリング反応を促進し得るか、またはＡｂ−Ｌ（抗体−リンカー中間体）とＤとの、もしくはＤ−Ｌ（薬物−リンカー中間体）とＡｂとのカップリング反応を促進し得る。
【０２０８】
（リンカー試薬）
上記抗体およびオーリスタチンの結合体化は、種々の二官能性リンカー試薬（例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣｌ）の二官能性誘導体、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアネート）、およびビス活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン））を使用して作製され得る。
【０２０９】
上記抗体薬物結合体はまた、以下のリンカー試薬：ＢＭＰＥＯ、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ｓｕｌｆｏ−ＥＭＣＳ、ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ、ｓｕｌｆｏ−ＫＭＵＳ、ｓｕｌｆｏ−ＭＢＳ、ｓｕｌｆｏ−ＳＩＡＢ、ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ、ａｎｄ  ｓｕｌｆｏ−ＳＭＰＢ、およびＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）ベンゼン）、および以下を含むビス−マレイミド試薬：ＤＴＭＥ、ＢＭＢ、ＢＭＤＢ、ＢＭＨ、ＢＭＯＥ、ＢＭ（ＰＥＯ）３、およびＢＭ（ＰＥＯ）４（これらは、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １１７，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．６１１０５，ＵＳＡ．市販されている）で調製され得る。ビス−マレイミド試薬は、逐次的もしくは同時に起こる様式において、システイン操作抗体のチオール基を、チオール含有薬物部分、標識、もしくはリンカー中間体に結合することを可能にする。マレイミドの他の他の官能基（これは、システイン操作抗体、薬物部分、標識、もしくはリンカー中間体のチオール基と反応する）としては、ヨードアセトアミド、ブロモアセトアミド、ビニルピリジン、ジスルフィド、ピリジルジスルフィド、イソシアネート、およびイソチオシアネートが挙げられる。
【０２１０】
【化２２】
0005606916.tif 000040
有用なリンカー試薬はまた、他の市販の供給源（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ））を介して得られ得るか、またはＴｏｋｉら（２００２）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：１８６６−１８７２；Ｗａｌｋｅｒ，Ｍ．Ａ．（１９９５）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６０：５３５２−５３５５；Ｆｒｉｓｃｈら（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．７：１８０−１８６；米国特許第６２１４３４５号；ＷＯ  ０２／０８８１７２；ＵＳ  ２００３１３０１８９；ＵＳ２００３０９６７４３；ＷＯ  ０３／０２６５７７；ＷＯ  ０３／０４３５８３；およびＷＯ  ０４／０３２８２８に記載される手順に従って合成され得る。
【０２１１】
式（ＩＩＩａ）の伸長因子は、以下のリンカー試薬と、上記アミノ酸ユニットのＮ末端とを反応させることによって、リンカーに導入され得る：
【０２１２】
【化２３】
0005606916.tif 000041
（ここでｎは、１〜１０の範囲に及ぶ整数であり、Ｔは、−Ｈもしくは−ＳＯ３Ｎａである）；
【０２１３】
【化２４】
0005606916.tif 000042
（ここでｎは、０〜３の範囲に及ぶ整数である）；
【０２１４】
【化２５】
0005606916.tif 000043
伸長因子ユニットは、以下の二官能性試薬と、上記アミノ酸ユニットのＮ末端とを反応させることによって、リンカーに導入され得る：
【０２１５】
【化２６】
0005606916.tif 000044
（ここでＸは、ＢｒもしくはＩである）。
【０２１６】
式の伸長因子ユニットはまた、以下の二官能性試薬と、アミノ酸ユニットのＮ末端とを反応させることによって、リンカーに導入され得る：
【０２１７】
【化２７】
0005606916.tif 000045
マレイミド伸長因子およびパラアミノベンジルカルバモイル（ＰＡＢ）自壊型スペーサーを有する例示的なバリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔもしくはｖｃ）ジペプチドリンカー試薬は、以下の構造を有する：
【０２１８】
【化２８】
0005606916.tif 000046
マレイミド伸長因子ユニットおよびＰＡＢ自壊型スペーサーユニットを有する例示的なｐｈｅ−ｌｙｓ（Ｍｔｒ、モノ−４−メトキシトリチル）ジペプチドリンカー試薬は、Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋら（１９９７）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，３８：５２５７−６０に従って調製され得、以下の構造を有する：
【０２１９】
【化２９】
0005606916.tif 000047
例示的な薬物−リンカー中間体は、以下を含む：
【０２２０】
【化３０】
0005606916.tif 000048
本発明の例示的な抗体薬物結合体化合物は、以下を含む：
【０２２１】
【化３１】
0005606916.tif 000049
ここでＶａｌはバリンであり；Ｃｉｔはシトルリンであり；ｐは、１、２、３、もしくは４であり；そしてＡｂは、システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体である。
【０２２２】
（システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体−薬物結合体の調製）
式ＩのＡＤＣは、当業者に公知の有機化学反応、条件、および試薬を使用して、以下を含むいくつかの経路によって調製され得る：（１）抗体−リンカー中間体Ａｂ−Ｌを、共有結合を介して形成し、続いて、活性化薬物部分Ｄと反応させるための、システイン操作抗体のシステイン基と、リンカー試薬との反応；および（２）薬物−リンカー中間体Ｄ−Ｌを、共有結合を介して形成し、続いて、システイン操作抗体のシステイン基と反応させるための、薬物部分の求核性基と、リンカー試薬との反応。結合方法（１）および（２）は、種々のシステイン操作抗体、薬物部分、およびリンカーとともに使用して、式Ｉの抗体薬物結合体を調製し得る。
【０２２３】
抗体システインチオール基は、求核性でありかつリンカー試薬および薬物−リンカー中間体上の求核性基で共有結合を形成するように反応し得、上記求核性基としては、以下が挙げられる：（ｉ）活性エステル（例えば、ＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロホルメート、および酸ハライド）；（ｉｉ）アルキルハライドおよびベンジルハライド（例えば、ハロアセトアミド）；（ｉｉｉ）アルデヒド、ケトン、カルボキシル、およびマレイミド基；ならびに（ｉｖ）スルフィド交換を介するジスルフィド（ピリジルジスルフィドが挙げられる）。薬物部分上の求核性基としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボキシレート、およびアリールヒドラジド基。これらは、リンカー部分およびリンカー試薬上の求核性基と共有結合を形成するために反応し得る。
【０２２４】
システイン操作抗体は、還元剤（例えば、ＤＴＴ（クリーランド試薬、ジチオスレイトール）もしくはＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド；Ｇｅｔｚら（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ  ２７３：７３−８０；Ｓｏｌｔｅｃ  Ｖｅｎｔｕｒｅｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）での処理、続いて、再度酸化して、鎖間および鎖内ジスルフィド結合を再形成することによって、リンカー試薬との結合体化に対して反応性にされ得る（実施例２）。例えば、ＣＨＯ細胞において発現された全長システイン操作モノクローナル抗体（チオＭａｂ）は、ＴＣＥＰの約５０倍過剰で、３７℃で３時間にわたって還元されて、上記新たに導入されたシステイン残基と、上記培養培地中に存在するシステインとの間で形成し得るシステイン付加物におけるジスルフィド結合を還元する。上記還元されたチオＭａｂは希釈され、１０ｍＭ  酢酸ナトリウム，ｐＨ５中のＨｉＴｒａｐ  Ｓカラムに載せられ、０．３Ｍ  塩化ナトリウム含有ＰＢＳで溶出される。ジスルフィド結合を、上記親Ｍａｂに存在するシステイン残基の間で、希（２００ｎＭ）硫酸銅（ＣｕＳＯ４）水溶液を用いて室温において一晩で再確立した。あるいは、デヒドロアスコルビン酸（ＤＨＡＡ）は、上記システイン付加物の還元的切断を後に、上記システイン操作抗体の上記鎖内ジスルフィド基を再確立するための有効な酸化体である。他の酸化体（すなわち、酸化剤）、および当該分野で公知の酸化条件は、使用され得る。周囲の空気による酸化もまた、有効である。この温和な、部分的再酸化工程は、高い信頼性で効率的に鎖内ジスルフィドを形成し、上記新たに導入されたシステイン残基のチオール基を保存する。抗体（新たに導入されたシステイン残基と比較して約１．５倍過剰）と比較して、薬物−リンカー中間体（例えば、ＭＣ−ｖｃ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ）のほぼ３倍過剰がを、添加し、混合し、そして室温において約１時間放置して、結合体化を行い、上記ＴＭＥＦＦ２＃１９  抗ＴＥＮＢ２抗体−薬物結合体を形成した。上記結合体混合物をゲル濾過し、ＨｉＴｒａｐ  Ｓカラムに載せて、溶出して、過剰の薬物−リンカー中間体および他の不純物を除去した。
【０２２５】
図６は、結合体化のために細胞培養物から発現されたシステイン操作抗体を調製するための一般的プロセスを示す。上記細胞培養培地がシステインを含む場合、ジスルフィド付加物が、上記新たに導入されたシステインアミノ酸と、培地由来のシステインとの間に形成し得る。これらシステイン付加物（図６の例示的チオＭａｂ（左）において丸で示される）は、結合体化に対して反応性のシステイン操作抗体を生成するためには、還元されなければならない。システイン付加物は、（おそらく、種々の鎖間ジスルフィド結合と一緒に）、還元的に切断されて、還元剤（例えば、ＴＣＥＰ）により上記抗体の還元形態を与える。対形成したシステイン残基間の鎖間ジスルフィド結合は、硫酸銅、ＤＨＡＡ、もしくは周囲酸素への曝露により、部分的酸化条件下で再形成される。上記新たに導入され、操作されかつ対形成していないシステイン残基は、本発明の抗体結合体を形成するために、リンカー試薬もしくは薬物−リンカー中間体との反応に利用可能なままである。哺乳動物細胞株において発現された上記チオＭａｂは、−Ｓ−Ｓ−結合形成を介して操作されたＣｙｓに対して、外部に結合体化されたＣｙｓ付加物を生じる。従って、上記精製チオＭａｂは、実施例２に記載されるように、還元および再酸化手順で処理して、反応性チオＭａｂを生成する。これらチオＭａｂは、細胞傷害性薬剤、フルオロフォア、および他の標識を含むマレイミドとの結合体化するために使用される。
【０２２６】
システイン操作抗体薬物結合体反応の分析は、鎖間もしくは鎖内ジスルフィド結合の還元、続いて、チオール反応性薬物リンカー中間体との結合体化（標準的ＡＤＣ）によって調製される抗体薬物結合体に対して、不均一性を低下させた。
【０２２７】
（スクリーニング方法）
本発明のさらに別の実施形態は、上記ＴＥＮＢ２ポリペプチドを含むと推測されるサンプル中において、ＴＥＮＢ２ポリペプチドの存在を決定するための方法に関し、ここで上記方法は、上記サンプルを、上記ＴＥＮＢ２ポリペプチドに結合するシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体、もしくはその抗体薬物結合体に曝す工程、および上記システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体、もしくはその抗体薬物結合体の、上記サンプル中に上記ＴＥＮＢ２ポリペプチドへの結合を決定する工程を包含し、ここでこのような結合の存在は、上記サンプル中の上記ＴＥＮＢ２ポリペプチドの存在を示す。必要に応じて、上記サンプルは、上記ＴＥＮＢ２ポリペプチドを発現すると推測される細胞（これは、癌細胞であり得る）を含み得る。上記方法において使用される上記システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体、もしくはその抗体薬物結合体は、必要に応じて、検出可能に標識され得るか、固体支持体に結合され得るなどであり得る。
【０２２８】
本発明の別の実施形態は、哺乳動物における腫瘍の存在を診断するための方法に関し、ここで上記方法は、（ａ）上記哺乳動物から得られる組織細胞を含む試験サンプルと、ＴＥＮＢ２ポリペプチドに結合するシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体、もしくはその抗体薬物結合体とを接触させる工程、および（ｂ）上記システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体、もしくはその抗体薬物結合体と、上記試験サンプル中のＴＥＮＢ２ポリペプチドとの間の複合体の形成を検出する工程を包含し、ここで上記複合体の形成は、哺乳動物における腫瘍の存在を示す。必要に応じて、上記システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体、もしくはその抗体薬物結合体は、検出可能に標識されるか、固体支持体に結合されるなど、および／または組織細胞の上記試験サンプルは、癌性腫瘍を有すると推測される固体から得られる。
【０２２９】
（インビトロ細胞増殖アッセイ）
本発明の一実施形態は、ＴＥＮＢ２ポリペプチドを発現する再紡の増殖を阻害するための方法に関し、ここで上記方法は、上記細胞と、システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体、もしくはその抗体薬物結合体とを接触させて、上記ＴＥＮＢ２ポリペプチドが、上記ＴＥＮＢ２を発現する再紡の増殖の阻害を引き起こす工程を包含する。上記細胞は癌細胞であり得、上記システイン操作抗体もしくはその抗体薬物結合体の、上記ＴＥＮＢ２ポリペプチドへの結合は、上記ＴＥＮＢ２ポリペプチドを発現する再紡の死滅を引き起こす。
【０２３０】
一般に、抗体薬物結合体（ＡＤＣ）の上記細胞傷害性活性もしくは細胞増殖抑制性活性は、以下によって測定される：ＴＥＮＢ２ポリペプチドを発現する哺乳動物細胞を、細胞培養培地中のＡＤＣに曝すこと；上記細胞を、約６時間〜約５日間の期間にわたって培養すること；および細胞生存性を測定すること。細胞増殖アッセイに有用な哺乳動物細胞としては、以下が挙げられる：（１）ＴＥＮＢ２ポリペプチド発現ＬｕＣａＰ７７腫瘍異種移植片；（２）上記ＴＥＮＢ２ポリペプチドの一部を細胞表面に安定に発現するように操作されたＰＣ３由来細胞株（ＰＣ３／ＴＥＮＢ２）；および（３）ＴＥＮＢ２ポリペプチドを発現しないＰＣ３細胞株（ＰＣ３／ｎｅｏ）。細胞ベースのインビトロアッセイは、本発明のＡＤＣの生存性（増殖）、細胞傷害性、およびアポトーシスの誘導（カスパーゼ活性化）を測定するために使用される。
【０２３１】
（薬物動態−血清クリアランスおよび安定性）
上記抗ＴＥＮＢ２抗体−薬物結合体のインビボでの配置を、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに１回の静脈内ボーラス投与の後に、抗体のおよび薬物結合体の血清濃度を測定することによって、分析した。少なくとも１個の細胞傷害性薬物を有する抗体薬物結合体の濃度は、捕捉のための抗ＭＭＡＥを、ならびに検出のためのビオチン化ＴＥＮＢ２細胞外ドメイン（ＥＣＤ）およびストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を使用したＥＬＩＳＡで測定した。血清中の合計のＴＭＥＦＦ２＃１９およびチオＴＭＥＦＦ２＃１９濃度を、捕捉のためのＴＥＮＢ２  ＥＣＤを、および2次抗体として抗ヒト−Ｆｃ  ＨＲＰを使用したＥＬＩＳＡで測定した。このアッセイは、任意の抗ＴＥＮＢ２抗体（結合体化ＭＭＡＥありおよびなしの両方）を測定した。上記アッセイは、１：１００の最低希釈で、１６．４ｎｇ／ｍＬの定量の下限を有する。各動物からの上記血清濃度−時間データは、ＩＶボーラス投入を用いた２区画モデル、一次排除、およびマクロ速度定数（ｍａｃｒｏ−ｒａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）を使用して分析した（Ｍｏｄｅｌ  ８，ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｒｏ  ｖ．５．０．１，Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）。適合の全体的な良好さは、推定された概算値、推定についての標準誤差、ならびに一次パラメーターおよび二次パラメーターに対する変動係数のパーセンテージ、ならびに観察された濃度−時間データと推定された濃度−時間データとの間の残りのプロットの検査に基づいた。個々の一次ＰＫパラメーターは、それぞれ、α相およびβ相と関連するゼロ時切片（ＡおよびＢ）、ならびにミクロ速度定数（ｍｉｃｒｏ−ｒａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ）を含んでいた（αおよびβ得。以下のモデリング選択肢を使用した：初期概算値を、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎを使用して決定した；濃度を、推定平方濃度の逆数
【数１】
0005606916.tif 000050
によって秤量した；Ｎｅｌｄｅｒ−Ｍｅａｄ最小化アルゴリズムを使用した。以下のＰＫパラメーターを報告した：
【数２】
0005606916.tif 000051
、ＣＬ、Ｃｍａｘ、ＭＲＴ、ｔ１／２，ａ、ｔ１／２，ｂ、Ｖ１およびＶｓｓ。
【０２３２】
ラットにおける２８日の薬物動態分析の結果を、図１５に示す、ラットに、５ｍｇ／ｋｇ  体重  チオＴＭＥＦＦ２＃１９−ＶＣ−ＭＭＡＥもしくは５ｍｇ／ｋｇ  ＴＭＥＦＦ２＃１９−ＶＣ−ＭＭＡＥを投与した。ラット由来の血清を、投与後５分、１時間、６時間、２４時間、および２日、３日、４日、８日、１１日、１５日、２１日、および２８日で集めた。動態の用量直線性を、０．５〜５ｍｇ／ｋｇ  用量の間のｃｈ  ＴＭＥＦＦ２＃１９−ＶＣ−ＭＭＡＥに対して観察したので、上記５ｍｇ／ｋｇ  用量データを、チオＴＭＥＦＦ２＃１９−ＶＣ−ＭＭＡＥとの比較のために、５ｍｇ／ｋｇの推定データを反映するように算術的に変換した。
【０２３３】
（齧歯類毒性）
システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体−薬物結合体の毒性を、急性毒性ラットおよびカニクイザルモデルにおいて評価した。ＡＤＣの毒性を、雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットおよびカニクイザルの、上記ＡＤＣでの処置、およびその後の検査および種々の器官の効果の分析によって調査した。肉眼的観察（体重）、臨床的病理パラメーター（血清化学および血液学）および組織病理学に基づいて、ＡＤＣの上記毒性が、観察され得、特徴付けられ得、そして測定され得る。等しい用量レベルにおいて、標的依存性効果が見られないことが見いだされた。標的非依存性毒性を、動物腫瘍モデルにおいて有効用量を超える用量において観察された。
【０２３４】
（処置方法）
本発明の別の実施形態は、ＴＥＮＢ２ポリペプチドを発現する再紡を含む癌性腫瘍を有する哺乳動物を治療的に処置するための方法に関し、ここで上記方法は、上記哺乳動物に、上記ＴＥＮＢ２ポリペプチドに結合するシステイン操作抗体、もしくはその抗体薬物結合体の治療上有効な量を投与し、それによって、上記腫瘍の治療的処置を生じる工程を包含する。
【０２３５】
本発明の別の実施形態は、ＴＥＮＢ２ポリペプチドの活性の変化した、好ましくは増大した発現もしくは活性と関連する細胞増殖障害を、処置もしくは予防するための方法に関し、上記方法は、このような処置が必要な被験体に、有効量のシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体、もしくはその抗体薬物結合体を投与する工程を包含する。例示的な細胞増殖障害は癌である。上記細胞増殖障害の有効な処置もしくは予防はＴＥＮＢ２ポリペプチドを発現する細胞の直接的死滅もしくは増殖阻害の結果、ＴＥＮＢ２ポリペプチドの細胞増殖強化活性を、上記システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体、もしくはその抗体薬物結合体と拮抗させることによってまたはであり得る。
【０２３６】
本発明のさらに別の実施形態は、システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体、もしくはその抗体薬物結合体を、ＴＥＮＢ２ポリペプチドを発現する細胞に結合するための方法に関し、ここで上記方法は、ＴＥＮＢ２ポリペプチドを発現する細胞と、上記システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体、もしくはその抗体薬物結合体とを、上記システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体、もしくはその抗体薬物結合体の、上記ＴＥＮＢ２ポリペプチドへの結合に適した条件下で接触させる工程、ならびにそれらの間の結合を可能にする工程を包含する。好ましい実施形態において、上記システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体、もしくはその抗体薬物結合体は、上記システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体、もしくはその抗体薬物結合体の、位置および／もしくは上記細胞への結合の量を定性的および／もしくは定量的に決定するために有用である分子もしくは化合物で標識される。
【０２３７】
本発明の他の実施形態は、（ｉ）癌もしくは腫瘍の治療的処置もしくは診断的検出、または（ｉｉ）細胞増殖障害の治療的処置もしくは予防に有用な医薬の調製における、システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体、もしくはその抗体薬物結合体の使用に関する。
【０２３８】
本発明の別の実施形態は、癌細胞の増殖を阻害するための方法に関し、ここで上記癌細胞の増殖は、少なくとも一部、ＴＥＮＢ２ポリペプチドの増殖強化効果に依存し、ここで上記方法は、ＴＥＮＢ２ポリペプチドと、システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体、もしくはその抗体薬物結合体とを接触させ、それによって、上記ＴＥＮＢ２ポリペプチドの増殖強化活性を拮抗させ、続いて、上記癌細胞の増殖を阻害刷る工程を包含し、それによって、上記癌細胞の増殖が阻害される。
【０２３９】
本発明の別の実施形態は、哺乳動物における腫瘍を治療的に処置するための方法に関し、ここで上記腫瘍の増殖は、少なくとも一部、ＴＥＮＢ２ポリペプチドの増殖強化効果に依存し、ここで上記方法は、上記哺乳動物に、治療上有効な量の、上記ＴＥＮＢ２ポリペプチドに結合する抗ＴＥＮＢ２システイン操作抗体、もしくはその抗体薬物結合体を投与する工程を包含し、それによって、上記ＴＥＮＢ２ポリペプチドの増殖強化活性を拮抗し、上記腫瘍の有効な治療的処置を生じる。
【０２４０】
上記抗体、抗体フラグメント、およびその結合体は、細胞外液へと放出される形質膜ＴＥＮＢ２タンパク質の細胞外エピトープを認識する。本発明は、上記抗体、抗体フラグメントおよび結合体を使用して、悪性疾患（例えば、乳癌および卵巣癌）の検出、モニタリングおよび処置のための方法をさらに提供する。
【０２４１】
本発明の抗体薬物結合体（ＡＤＣ）は、種々の疾患もしくは障害を処置するために使用され得る（例えば、ＴＥＮＢ２腫瘍抗原の過剰発現によって特徴付けられ得る）。例示的な状態もしくは過剰増殖障害としては、良性腫瘍もしくは悪性腫瘍（前立腺癌を含む）が挙げられる。
【０２４２】
上記動物モデルおよび細胞ベースのアッセイにおいて同定される上記ＡＤＣ化合物は、腫瘍保有高等霊長類およびヒトの臨床試験においてさらに試験され得る。上記臨床試験は、ＡＤＣの効力を、既知の治療レジメン（例えば、公知の化学療法剤および／もしくは細胞傷害性薬剤を伴う照射および／もしくは化学療法）と組み合わせて評価するように設計され得る。
【０２４３】
一般に、処置されるべき上記疾患もしくは障害は、癌のような過剰増殖障害である。本明細書において処置されるべき癌の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病もしくはリンパ系悪性疾患。このような癌のより具体的な例としては、扁平上皮癌（例えば、扁平上皮癌（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｎｃｅｒ））、肺癌（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、および肺の扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｕｎｇ））、腹膜の癌、肝細胞がん、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｏｒ  ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）（胃腸癌を含む）、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌もしくは子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌（ｋｉｄｎｅｙ  ｏｒ  ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、ならびに頭頚部癌が挙げられる。
【０２４４】
疾患の予防もしくは処置のために、適切な用量のＡＤＣは、処置されるべき疾患のタイプ（上記のような）、上記疾患の重篤度および経過、上記分子が予防目的で投与されるのか、治療目的で投与されるのか、以前の治療、上記患者の臨床的履歴および上記抗体に対する応答、ならびに主治医の判断に依存する。上記分子は、上記患者に一度に、もしくは一連の処置にわたって、適切に投与される。上記疾患のタイプおよび重篤度に依存して、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）の分子が、例えば、１回以上の別個の投与によろうが、または連続注入によろうが、上記患者への投与のための最初の候補投与量である。代表的な一日用量は、前述の要因に依存して、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲に及び得る。患者に投与されるべきＡＤＣの例示的な用量は、約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ  患者体重の範囲内である。
【０２４５】
数日もしくはそれ以上にわたる反復投与については、状態に依存して、上記処置は、疾患の症状の望ましい抑制が起こるまで持続される。例示的な投与レジメンは、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷用量、続いて、約２ｍｇ／ｋｇの抗ＴＥＮＢ２抗体の１週間に１回の維持用量を投与する工程を包含する。他の投与レジメンも、有用であり得る。この治療の目的は、従来の技術およびアッセイ（超音波画像化を含む）によって容易にモニターされる。
【０２４６】
（抗体薬物結合体の投与）
本発明の抗体薬物結合体（ＡＤＣ）は、処置されるべき状態に適した任意の経路によって投与され得る。上記ＡＤＣは、代表的には、非経口的に（すなわち、注入、皮下、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮内、鞘内および硬膜外）投与される。
【０２４７】
（薬学的処方物）
本発明の治療的抗体薬物結合体（ＡＤＣ）の薬学的処方物は、代表的には、非経口投与（すなわち、薬学的に受容可能な非経口的ビヒクルとともに、単位投与量、滅菌注射用形態において、ボーラス注射、静脈内注射、腫瘍内注射）のために調製される。望ましい程度の純度を有する抗体薬物結合体（ＡＤＣ）は、凍結乾燥処方物もしくは水性溶液の形態において、必要に応じて、薬学的に受容可能な希釈剤、キャリア、賦形剤、もしくは安定化剤と混合される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９８０）第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．編）。
【０２４８】
受容可能な希釈剤、キャリア、賦形剤、および安定化剤は、使用される投与量および濃度において、レシピエントに対して非毒性であり、緩衝化剤（例えば、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸）；抗酸化剤（アスコルビン酸およびメチオニンを含む）；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド）；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン（例えば、メチルパラベンもしくはプロピルパラベン）；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質（例えば、ひと血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン）；単糖類、二糖類および他の炭水化物（グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む）；キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖（例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／または非イオン性界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭもしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））が挙げられる。
【０２４９】
上記活性な薬学的成分はまた、例えば、コアセルベーション技術によって、もしくは界面重合化によって調製されるマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセル、およびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル）中に、コロイド性薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）中に、またはマクロエマルジョン中に、捕捉され得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．編（１９８０）で開示されている。
【０２５０】
徐放性調製物は、が調製され得る。徐放性調製物の適切な例は、上記ＡＤＣを含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクス（このマトリクスは、成形物品（例えば、フィルム、もしくはマイクロカプセル）の形態で存在する）を含む。徐放性マトリクスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、もしくはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３７７３９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸塩とのコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴＴＭ（乳酸−グリコール酸コポリマーおよびロイプロリドアセテートから構成される注射用マイクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【０２５１】
上記処方物は、前述の投与経路に適したものを含む。上記処方物は、便利なことには、単位投与形態で存在し得、製薬の分野で周知の方法のうちのいずれかによって調製され得る。技術および処方物は、一般に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）に見いだされる。このような方法は、上記活性成分と１種以上の補助成分を構成する上記キャリアとを会合させる工程を包含する。一般に、上記処方物は、上記活性成分と、液体キャリアもしくは微細に分割した固体キャリアもしくはその両方とを、均質にかつ完全に会合させ、必要であれば、製品に成形することによって、調製される。
【０２５２】
本発明の水性懸濁物は、水性懸濁物の製造に適した賦形剤と混合した状態で、上記活性物質を含む。このような賦形剤としては、懸濁剤（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、クロスカルメロース、ポピドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム、およびアカシアガム、ならびに分散剤もしくは湿潤剤（例えば、天然に存在するホスファチド（例えば、レシチン））、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンステアレー）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシドと、脂肪酸およびヘキシトール無水物から得た部分エステルとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）が挙げられる。上記水性懸濁物はまた、１種以上の保存剤（例えば、エチルもしくはｎ−プロピル  ｐ−ヒドロキシ−ベンゾエート）、１種以上の着色剤、１種以上の矯味矯臭剤および１種以上の甘味剤（例えば、スクロースもしくはサッカリン）を含み得る。
【０２５３】
ＡＤＣの薬学的組成物は、滅菌注射用調製物（例えば、滅菌注射用水性懸濁物もしくは油性懸濁物）の形態で存在し得る。この懸濁物は、上記で言及した適切な分散剤もしくは湿潤剤および懸濁剤を使用して、公知の技術に従って処方され得る。上記滅菌注射用調製物はまた、非毒性の非経口的に受容可能な希釈剤もしくは溶媒中の滅菌注射用溶液もしくは懸濁物（例えば、１，３−ブタン−ジオール中の溶液）であり得るか、もしくは凍結乾燥粉末として調製され得る。使用され得る受容可能なビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンゲル溶液および等張性塩化ナトリウム溶液がある。さらに、滅菌不揮発性油は、溶媒もしくは懸濁媒体として従来どおりに使用され得る。この目的のために、任意の低刺激性の不揮発性油が使用され、それらとしては、合成モノグリセリドもしくはジグリセリドが挙げられる。さらに、脂肪酸（例えば、オレイン酸）は、注射用物の調製において、同様に使用され得る。
【０２５４】
上記キャリア物質とあわされて、単一の投与形態を生成する活性成分の量は、処置される宿主および特定の投与様式に依存して変動する。例えば、静脈内投与について意図された水性溶液は、約３０ｍＬ／時間の速度での適切な容積の注入が生じるように、溶液１ｍＬあたり約３〜５００μｇの活性成分を含み得る。
【０２５５】
非経口投与に適した処方物は、水性および非水性の滅菌注射溶液（これら溶液は、抗酸化剤、緩衝化剤、静菌剤、および上記処方物を、意図されたレシピエントの血液と等張にする溶質を含み得る）；ならびに水性および非水性の滅菌懸濁物（これら懸濁物は、懸濁剤および濃化剤を含み得る）を含む。
【０２５６】
タンパク質治療剤の経口投与は、兆における加水分解もしくは変性に起因して嫌われているが、経口投与に適したＡＤＣの処方物は、別個の単位（例えば、カプセル剤、カシェもしくは錠剤（各々は、上記ＡＤＣの所定の量を含む））として調製され得る。
【０２５７】
上記処方物は、単位用量もしくは複数用量の容器（例えば、密封されたアンプルおよびバイアル）中にパッケージされ得、そして使用直前に注射用の滅菌液体キャリア（例えば、水）の添加のみを要する凍結乾燥状態において貯蔵され得る。即席の注射溶液および懸濁物は、以前に記載された種類の滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製される。好ましい単位投与処方物は、上記のように、上記活性成分の１日用量もしくは単位１日分割用量（ｕｎｉｔ  ｄａｉｌｙ  ｓｕｂ−ｄｏｓｅ）、もしくはその適切な小部分を含むものである。
【０２５８】
本発明の組成物はまた、イムノリポソームとして処方され得る。「リポソーム」は、薬物を哺乳動物に送達するのに有用な、種々のタイプの脂質、リン脂質および／もしくは界面活性剤から構成される小さな小胞である。上記リポソームの成分は、生物学的膜の脂質配置に類似した二層形態において一般に配置される。上記抗体を含むリポソームは、当該分野で公知の方法（例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎら（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８；Ｈｗａｎｇら（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０；米国特許第４４８５０４５号；同第４５４４５４５号；同第５０１３５５６号；ＷＯ  ９７／３８７３１に記載される）によって調製される。リポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物との逆相エバポレーション法によって生成され得る。リポソームは、規定の孔サイズのフィルタを通して押し出されて、所望の直径を有するリポソームを生じ得る。本発明の組成物のＦａｂ’フラグメントは、ジスルフィド交換反応を介して、リポソームに結合体化され得る（Ｍａｒｔｉｎら（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：２８６−２８８）。化学療法剤は、必要に応じて、上記リポソーム内に含まれる（Ｇａｂｉｚｏｎら（１９８９）Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８１（１９）：１４８４）。
【０２５９】
（併用療法）
本発明の抗体薬物結合体（ＡＤＣ）は、薬学的組み合わせ処方物において、もしくは抗癌特性を有する第２の化合物との併用療法としての投与レジメンにおいて、組み合わせられ得る。上記薬学的組み合わせ処方物もしくは投与レジメンの第２の化合物は、好ましくは、上記組み合わせが互いに有害に影響しないように、上記組み合わせのＡＤＣに対して補完的な活性を有する。
【０２６０】
上記第２の化合物は、化学療法剤、細胞傷害性薬剤、サイトカイン、増殖阻害性薬剤、抗ホルモン剤、および／もしくは心臓保護剤（ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）であり得る。このような分子は、意図された目的に有効である量で、適切に、組み合わせにおいて存在する。本発明のＡＤＣを含む薬学的組成物はまた、治療上有効な量の化学療法剤（例えば、チューブリン形成インヒビター、トポイソメラーゼインヒビター、ＤＮＡインターカレーター、もしくはＤＮＡ結合剤）を有し得る。
【０２６１】
他の治療的レジメンは、本発明に従って同定された抗癌剤の投与と併用され得る。上記併用療法は、同時もしくは逐次的レジメンとして投与され得る。逐次的に投与される場合、上記併用は、２回以上の投与において投与され得る。上記組み合わせた投与は、別個の処方物もしくは単一の薬学的処方物を使用する同時投与、およびいずれかの順番での連続投与を含み、ここで好ましくは、両方（もしくは全ての）活性薬剤は、それらの生物学的活性を同時に発揮する一定期間存在する。
【０２６２】
一実施形態において、ＡＤＣでの処置は、システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体もしくはその抗体薬物結合体、および１種以上の化学療法剤、治療的生物製剤、もしくは増殖阻害薬剤の組み合わせた投与（異なる化学療法剤のカクテルの同時投与を含む）を含む。化学療法剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：タキサン（例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル）；白金含有化合物（例えば、カルボプラチン）；ＥＧＦＲインヒビター（例えば、エルロチニブ、およびゲフィチニブ）；チロシンキナーゼインヒビター（例えば、イマチニブ）；およびアントラサイクリン抗生物質（例えば、ドキソルビシンもしくはドキシル）。システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体もしくはその抗体薬物結合体と併用されるべき治療的生物製剤としては、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））もしくはペルツズマブ（ＯｍｎｉｔａｒｇＴＭ，Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ）が挙げられる。このような化学療法剤のための調製および投与スケジュールは、製造業者の説明書に従って、もしくは当業者によって経験的に決定されるように、使用され得る。このような化学療法の準備および投与スケジュールはまた、「Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ」，（１９９２）  編，Ｍ．Ｃ．Ｐｅｒｒｙ，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄに記載されている。
【０２６３】
上記ＡＤＣは、抗ホルモン化合物；例えば、抗エストロゲン化合物（例えば、タモキシフェン）；抗プロゲステロン（例えば、オナプリストン（ＥＰ  ６１６８１２））；もしくは抗アンドロゲン（例えば、フルタミド）と、このような分子について既知の投与量で、併用され得る。上記処置されるべき癌がホルモン非依存性癌である場合、上記患者は、抗ホルモン療法を以前に受けたことがあり得、そして癌がホルモン非依存性になった後に、上記ＡＤＣ（および必要に応じて、本明細書に記載される他の薬剤）が、上記患者に投与され得る。心臓保護剤（上記治療と関連した心筋機能不全を予防もしくは軽減するために）もしくは１種以上のサイトカインを、上記患者に同時投与することはまた、有益であり得る。上記治療レジメンに加えて、上記患者は、癌細胞の外科的除去および／もしくは放射線療法に供され得る。
【０２６４】
上記の同時投与される薬剤のうちのいずれかについての適切な投与は、現在使用されているものであるか、または上記新たに同定された薬剤および他の化学療法剤もしくは処置の併用作用（相乗効果）に起因して、低下させられ得る。
【０２６５】
上記併用療法は、「相乗効果」を提供し得、「相乗的」である、すなわち、上記活性化合物を一緒に使用する場合に達成される効果が、上記化合物を別個で使用することから生じる効果の合計よりも大きいと判明し得る。相乗的効果は、上記活性成分が以下である場合に達成され得る：（１）同時に処方され、投与されるか、または組み合わされた単位用量処方物において同時に送達される；（２）別個の処方物として交互にもしくは並行して送達される；あるいは（３）いくつかの他のレジメンによって。交互治療において送達される場合、相乗効果は、上記化合物が、逐次的に（例えば、別個のシリンジ中の異なる注射物によって）投与もしくは送達される場合に達成され得る。一般に、交互治療の間に、有効用量の各活性成分は、逐次的、すなわち、連続してに投与されるのに対して、併用療法では、有効用量の２種以上の活性成分が、一緒に投与される。
【０２６６】
（抗体薬物結合体の代謝産物）
このような生成物が新規でありかつ先行技術に対して自明でない程度にまで、本明細書に記載されるＡＤＣ化合物のインビボ代謝生成物はまた、本発明の範囲内に入る。このような生成物は、例えば、上記投与される化合物の酸化、還元、加水分解、アミド化、エステル化、酵素的切断などから生じ得る。従って、本発明は、本発明の化合物と、哺乳動物とを、その代謝生成物を生じるに十分な期間にわたって接触させる工程を包含するプロセスによって生成される、新規かつ非自明の化合物を包含する。
【０２６７】
代謝生成物は、代表的には、放射性標識した（例えば、１４Ｃもしくは３Ｈ）ＡＤＣを調製し、それを、検出可能な用量において（例えば、約０．５ｍｇ／ｋｇより高い）動物（例えば、ラット、マウス、モルモット、サルもしくはヒト）に投与し、ａｌｌｏｗｉｎｇ  代謝が起こるのに十分な時間（代表的には、約３０秒〜３０時間）を与え、尿、血液もしくは他の生物学的サンプルからその変換生成物を単離することによって、同定される。これら生成物は容易に単離される。なぜなら、それらは、標識されている（他は、上記代謝生成物中に残っているエピトープに結合し得る抗体の使用によって単離される）からである。上記代謝生成物構造は、従来の様式において（例えば、ＭＳ、ＬＣ／ＭＳもしくはＮＭＲ分析によって）決定される。一般に、代謝生成物の分析は、当業者に周知の従来の薬物代謝研究と同じ方法で行われる。その変換生成物は、それらがインビボで他の方法で見いだされない限りにおいて、本発明のＡＤＣ化合物の治療的投与のための診断アッセイにおいて有用である。
【０２６８】
（製造物品）
本発明の別の実施形態において、上記の障害の処置のために有用な物質を含む製造物品、もしくは「キット」が、提供される。上記製造物品は、容器および上記容器上のもしくは上記容器と関連づけられたラベルもしくはパッケージ挿入物を含む。上記パッケージ挿入物は、治療生成物の市販のパッケージ中に習慣的に含まれ、かつこのような治療生成物の使用に関する適応症、使用、投与量、投与、禁忌および／もしくは警告についての情報を含む説明書に言及し得る。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ブリスターパックなどが挙げられる。上記容器は、種々の物質（例えば、ガラスもしくはプラスチック）から形成され得る。
【０２６９】
一実施形態において、上記製造物品は、容器、および上記容器内に含まれるシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体、もしくはその抗体薬物結合体の処方物を含む。上記物品は、必要に応じて、腫瘍の上記治療的処置もしくは診断的検出のための組成物の使用に言及する、上記容器に貼付したラベル、もしくは上記容器と一緒に含まれるパッケージ挿入物をさらに含み得る。上記処方物を保持する上記容器は、貯蔵および治療剤の送達に有効であり、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、上記容器は、皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグもしくはバイアルであり得る）。上記ラベルもしくはパッケージ挿入物は、上記処方物が、選択した状態（例えば、癌）を処置するために使用されることを示す。代わりに、またはさらに、上記製造物品は、薬学的に受容可能な緩衝化剤（例えば、注射用制菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝化生理食塩水、リンゲル溶液およびデキストロース溶液）を含む第２の（もしくは第３の）容器をさらに含む。上記製造物品は、商業的およびユーザーの寒天から望ましい他の物質（他の緩衝化剤、希釈剤、フィルタ、針、およびシリンジを含む）をさらに含み得る。
【０２７０】
以下の例は、例示目的でのみ提供され、本発明の範囲をいかようにも制限することを意図しない。
【０２７１】
本明細書において引用される全ての特許および参考文献は、その全体が本明細書に参考として援用される。
【実施例】
【０２７２】
実施例において言及される市販の試薬は、別段示されない限り、製造業者の説明書に従って使用した。以下の実施例において、および本明細書全体を通じて、ＡＴＣＣアクセッション番号によって同定される細胞の供給源は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）である。
【０２７３】
（実施例１：抗ＴＭＥＦＦ２＃１９抗体の調製）
ヒト化ＴＭＥＦＦ２＃１９抗体は、ＰＣＴ／ＵＳ０３／０７２０９に従って調製した。図１は、重鎖アミノ酸配列（配列番号１）および軽鎖アミノ酸配列（配列番号２）を示す。
【０２７４】
（実施例２：還元および再酸化による結合体化のためのシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体の調製）
ＣＨＯ細胞において発現された全長のシステイン操作抗ＴＥＮＢ２モノクローナル抗体（チオＭａｂ）は、細胞培養条件に起因して、上記操作されたシステインに関するシステイン付加物（シスチン）を有する。上記操作されたシステインの反応性チオール基を遊離するために、上記チオＭａｂを、約ｐＨ８．０において、５００ｍＭ  ホウ酸ナトリウムおよび５００ｍＭ  塩化ナトリウムに溶解し、１ｍＭ  ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド；Ｇｅｔｚら（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｖｏｌ  ２７３：７３−８０；Ｓｏｌｔｅｃ  Ｖｅｎｔｕｒｅｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）の約５０〜１００倍過剰で３７℃において約１〜２時間にわたって還元する。上記還元したチオＭａｂ（図６）を希釈し、１０ｍＭ  酢酸ナトリウム（ｐＨ５）中でＨｉＴｒａｐ  Ｓカラム上に載せ、０．３Ｍ  塩化ナトリウム含有ＰＢＳで溶出する。上記溶出した還元したチオＭａｂは、２ｍＭ  デヒドロアスコルビン酸（ｄｈＡＡ）でｐＨ７において３時間にわたって、または室温において一晩２ｍＭ  硫酸銅水溶液（ＣｕＳＯ４）で処理した。周囲空気酸化はまた、有効であり得る。上記緩衝化剤を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５樹脂に対する溶出によって交換し、１ｍＭ  ＤＴＰＡ含有ＰＢＳで溶出した。上記チオール／Ａｂ値を、上記還元した抗体濃度を、上記溶液の、２８０ｎｍの吸光度から決定することによって、および上記チオール濃度を、ＤＴＮＢ（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）との反応および４１２ｎｍの吸光度の決定によって、チェックする。
【０２７５】
（実施例３：システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体および薬物−リンカー中間体の結合体化）
実施例２の還元および再酸化の手順の後に、上記システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体は、ＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）緩衝液中に溶解し、氷上で冷却する。オーリスタチン薬物リンカー中間体（例えば、ＭＣ−ＭＭＡＥ（マレイミドカプロイル−モノメチルオーリスタチンＥ）、ＭＣ−ＭＭＡＦ、ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ、もしくはＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＦ）の抗体あたりの操作されたシステインに対して約１．５モル当量と、チオール反応性官能基（例えば、マレイミド）はを、ＤＭＳＯに溶解し、アセトニトリルおよび水中に希釈し、ＰＢＳ中に、上記冷却し、還元し、再酸化した抗体に添加する。約１時間後に、過剰のマレイミドを添加して、上記反応をクエンチし、任意の反応していない抗体チオール基をキャップする。上記反応混合物を、遠心分離による限外濾過によって濃縮し、上記システイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体薬物結合体を、ＰＢＳ中にＧ２５樹脂を通じた溶出によって精製および脱塩し、滅菌条件下で０．２μｍ  フィルタを介して濾過し、貯蔵のために凍結する。
【０２７６】
上記の手順によって、以下のシステイン操作抗ＴＥＮＢ２抗体薬物結合体を調製した：
Ａ１１４Ｃ（Ｋａｂａｔ）チオ  ｈｕ  ＴＭＥＦＦ２＃１９およびＭＣ−ＭＭＡＦの結合体化によるチオｈｕ  ＴＭＥＦＦ２＃１９−ＭＣ−ＭＭＡＦ；および
Ａ１１４Ｃ（Ｋａｂａｔ）チオｈｕ  ＴＭＥＦＦ２＃１９およびＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥの結合体化によるチオｈｕ  ＴＭＥＦＦ２＃１９−ＭＣ−ｖａｌ−ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＭＭＡＥ。
【０２７７】
（実施例４：ＩＨＣ、インターナリゼーション研究、ＦＡＣＳ、細胞死滅アッセイ、ウェスタンブロット、異種移植片研究、薬物動態研究および安全性評価のための材料および方法）
抗体および組換えタンパク質：ヒト化抗ｔｅｎｂ２  Ｍａｂ  ＰＲ１を、ＰＤＬから得た。チオＭａｂ抗ｔｅｎＢ２  ＰＲ１（ＨＣ−Ａ１２１Ｃ；配列番号付け）およびｔｅｎＢ２ＥＣＤ  Ｆｌａｇタンパク質を、上記で議論されるように生成した。
【０２７８】
細胞株およびヒト腫瘍異種移植片：ＰＣ３は、ヒト前立腺癌細胞株（ＡＴＣＣ）である。ＰＣ３ＴｅｎＢ２中間安定細胞株（Ｍｅｄｉｕｍ  ｓｔａｂｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）を、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ．ヒト前立腺外移植片モデルによって生成し、ＬｕＣａｐ７０、７７および９６．１を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎから得た。
【０２７９】
ＲＮＡおよびタンパク質発現：ＲＮＡ発現分析、免疫学的手順（ＩＨＣ，Ｗｅｓｔｅｒｎ）、抗体結合（ＦＡＣＳ）およびインターナリゼーションは、以前に発表された方法に従った（Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６４，７８１−７８８（２００４））。
【０２８０】
従来のもしくはチオＭａｂ  抗ＴｅｎＢ２−バリン−シトルリン（ｖｃ）−モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）およびＭＣ−ＭＭＡＦアームの薬物結合体（ＡＤＣ）の調製：従来の、チオ−ｍａｂおよびコントロールｍａｂと、ｖｃ−ＭＭＡＥ、ＭＣ−ＭＭＡＦ  ＡＤＣとの結合体化を、上記のように行った。
【０２８１】
インビトロ細胞死滅およびインビボ研究：上記再紡死滅アッセイを、Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６４，７８１−７８８（２００４）に記載されるものと同様に行った。各前立腺外移植片モデル腫瘍細胞株を、去勢した（アンドロゲン非依存性モデル，ＬｕＣａｐ７０）もしくは去勢していない（アンドロゲン依存性モデル，ＬｕＣＡＰ７７およびＬｕＣＡＰ９６．１）、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ｌａｂ．からの雄性ＳＣＩＤ−ベージュマウスにおける連続移植によって維持した。腫瘍を、上記研究の期間にわたって１週間に１回〜２回、測定した。
【０２８２】
安全性評価のためのラットおよびカニクイザルモデル：抗ｔｅｎｂ２  Ｍａｂは、ヒト、サルおよびラットｔｅｎｂ２標的（ＦＳ  Ｉ  ドメイン）を特異的に認識した。
【０２８３】
薬物動態研究：標準的プロトコルおよびアッセイ方法を使用した。
【０２８４】
上記データは、ヒトＴｅｎＢ２（ＴＭＥＦＦ２）が、一般に、前立腺およびＣＮＳにおける発現に制限され、癌性前立腺において顕著に上昇したレベルを有することが実証する。抗ＴＥＮＢ２抗体はまた、迅速にインターナライズされることが示された。これら抗体は、ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦに結合体化された場合、種々の再紡死滅アッセイにおいて、インビトロおよびインビボで前立腺腫様細胞を死滅させることを示した。さらに、有効な用量のＴＥＮＢ２−ＡＤＣは、齧歯類および霊長類における毒性効果を誘発するのに必要とされる用量より顕著に低かった。
【０２８５】
前述の記載は、当業者が本発明を実施できるように具体的であるとみなされる。本発明は、寄託された構築物によって、範囲が限定されるべきではない。なぜなら、上記寄託された実施形態は、本発明の特定の範囲の単純な例示として意図され、機能的に等価な任意の構築物は、本発明の範囲内であるからである。本明細書における物質の寄託は、本明細書に含まれる記載が、本発明の任意の局面（その最良の実施形態を含む）の実施を実施するに不適切であるという容認を構成しないし、特許請求の範囲を、それが表す具体的例示に限定するとは解釈されない。実際に、本発明の種々の改変は、示され、本明細書において記載されるものに加えて、前述の記載から当業者に明らかになり、添付の特許請求の範囲内に入る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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