(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号８に少なくとも９０％同一な配列を含み、配列番号１２のＢＧＨポリアデニル化シグナルを用いた場合より得られる力価／発現レベルが少なくとも１０％高いことを特徴とする、ポリアデニル化シグナル。
【請求項２】
配列番号８に少なくとも９５％同一な配列を含む、請求項１記載のポリアデニル化シグナル。
【請求項３】
配列番号８を含む、請求項１または２記載のポリアデニル化シグナル。
【請求項４】
配列が配列番号８を含む、核酸。
【請求項５】
前記ポリアデニル化シグナルまたは前記核酸が、異種コード配列に作動可能に連結されている、請求項１〜４のいずれか一項記載のポリアデニル化シグナルまたは核酸。
【請求項６】
請求項１〜５の前記ポリアデニル化シグナルまたは前記核酸のいずれか１つを含む、ベクターまたはポリヌクレオチド。
【請求項７】
対象の異種産物をコードする対象の異種遺伝子を含む、請求項６のベクターまたはポリヌクレオチド。
【請求項８】
対象の産物が対象のポリペプチドであり、そして前記対象のポリペプチドが抗体、抗体断片または融合タンパク質である、請求項７のベクター。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか１項のベクターを含む、細胞。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項記載の前記ポリアデニル化シグナルまたは前記核酸が、対象の産物をコードする転写ユニットに作動可能に連結され、そして対象の産物が対象の遺伝子によってコードされる対象のポリペプチドである、請求項９記載の細胞。
【請求項１１】
前記細胞がハムスター細胞である、請求項９または１０記載の細胞。
【請求項１２】
対象の遺伝子によってコードされる対象のポリペプチドを作製する方法であって、以下の工程を含む方法：
（ａ）請求項７または８のいずれか１項記載のベクターを含む宿主細胞を得るか、あるいは、請求項１０または１１のいずれか１項記載の細胞を得る工程、
（ｂ）前記細胞を、前記細胞の増殖および対象の遺伝子の発現を可能とする条件下で培養する工程、
（ｃ）対象のポリペプチドを収集する工程、そして
（ｄ）対象のポリペプチドを精製する工程。
【請求項１３】
インスレーターとしての請求項１〜５のポリアデニル化シグナルまたは核酸のいずれか１つの使用。
【請求項１４】
請求項１〜５のポリアデニル化シグナルまたは核酸のいずれか１つ、ベクター、細胞、および前記細胞の培養のための細胞培養培地を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
技術分野
本発明は、細胞培養技術の分野に関する。それは新規調節エレメント、並びにクローニングされた遺伝子などの核酸からのポリペプチドの発現を向上させるための方法、および前記新規調節エレメントを使用した真核生物宿主細胞における様々なポリペプチドの産生に関する。
【０００２】
背景
ヒト治療において使用するためのバイオ医薬品の市場は高い割合で成長し続け、２０１０年には９００を超えるバイオ医薬品が臨床試験で評価されており推定される売上は５００億である。現在、ますます多くの数のバイオ医薬品が、ヒトタンパク質を正しく処理し改変する能力に起因して、哺乳動物細胞から産生されるようになっている。それ故、組換えタンパク質は、機能的および薬物動態学的の両方の点でヒトと適合性がある。原核生物発現系と比較した欠点は、非常に低いタンパク質発現レベルであることが多い。従って、哺乳動物細胞からのバイオ医薬品の成功裏で高い収率での産生が重要であり、そして、それは宿主細胞株、発現系、細胞増殖および産生性、培養およびフィード培地、産生および精製プロセス、タンパク質構造および配列、タンパク質安定性および調合を含む様々な要因によって支配される。
【０００３】
組換えタンパク質の発現は、対象の所望の遺伝子をコードする発現ベクターを必要とする。効率的なタンパク質の産生のために発現ベクターを最適化するためのいくつかの方法が使用されている。遺伝子発現は、転写および翻訳レベルで調節される。従って、多くの方法が、遺伝子をコードするタンパク質が転写される効率を向上させるための強力なプロモーターおよびエンハンサーの同定および最適化に関する。これらの例は、ＣＭＶ最初期プロモーターおよびエンハンサー、ＳＶ４０プロモーターおよびエンハンサー、伸長因子（ＥＦ）プロモーター、ポリオーマエンハンサー、およびニワトリ[β]−アクチンプロモーターである。同様に、ｍＲＮＡを安定化しそして転写終結を増強する強力なポリアデニル化シグナル配列もまた、発現ベクターによってコードされる遺伝子からのタンパク質発現を増大させるために使用されている。得られるｍＲＮＡが翻訳される効率を向上させるための方法の中には、翻訳開始部位（ＡＵＧ）、最適リボソーム結合部位、例えばコザック配列（ＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＵＧＧ；ＡＵＧは開始コドンを構成する)または配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を使用するものがある。
【０００４】
真核生物細胞においてより高いレベルの組換え遺伝子発現を得るため、発現ベクターを最適化するために使用される方法の１つは、ポリアデニル化シグナルの使用および選択に関する。様々なポリアデニル化シグナルが、組換えタンパク質の発現用のベクターで使用されている。最も一般的に使用されるものには、例えば、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）(US 5,122,458)、サルウイルス４０後期および初期領域、ウサギβ−グロビン、マウスまたはヒト免疫グロブリン、ポリオーマウイルス後期領域由来のポリアデニル化シグナルが含まれる。
【０００５】
真核生物メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）において３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）は重要な調節エレメントである。多くの場合、それはｍＲＮＡの安定性を指令し、そしてまた翻訳効率も調節することができる。ポリアデニル化シグナルは、シグナル配列内のＡＡＵＡＡＡ配列へのポリアデニル化タンパク質複合体の結合を指示する３’ＵＴＲ内のヌクレオチド配列である。前記複合体は、ＡＡＵＡＡＡ配列の約１４〜３０ヌクレオチド下流においてｍＲＮＡを切断するエンドヌクレアーゼ、および連続した約１００〜２００アデニンヌクレオチド（ポリＡ尾部）を、切断された３’末端に転写後に取り込むポリメラーゼを含む。ポリＡ尾部は、安定性、翻訳効率、および核から細胞質への輸送を含む、ｍＲＮＡ代謝の多くの局面に影響を及ぼすと考えられている。典型的には、ポリアデニル化シグナルは、切断部位およびポリアデニル化部位にフランキングする２つの認識エレメント（切断部位の約１４〜３０ヌクレオチド上流の高度に保存されたＡＡＵＡＡＡ配列、およびＡＡＵＡＡＡ配列の約２０〜５０ヌクレオチド下流のあまり保存されていないＧ／ＵまたはＵの豊富な領域）からなる。これらの２つのエレメント間の切断は、通常、Ａ残基の３’側上にある。インビボでは、異なるポリアデニル化部位がプロセシングされる効率はかなり異なる。ポリアデニル化タンパク質複合体の会合速度は多段階プロセスであり、そしてポリアデニル化シグナル配列の強度に相関する。例えば、強いＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナルにおける切断は、より速い会合速度に因り、より弱いＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルより迅速に起こる(Chao et al., Molecular and Cellular Biology, Vol.19 (8), 5588 - 5600, 1999)。
【０００６】
組換えタンパク質の産生のための高い産生細胞株の作製を加速するために代替的で強力またはさらには非常に強力なポリアデニル化シグナルを同定する必要がある。強力またはさらには非常に強力なポリアデニル化シグナルの使用は、転写終結を増強し、これに続いて、ベクターにコードされるｍＲＮＡの産生、安定性、核輸送および／または翻訳の増加がもたらされる。これにより、より高いｍＲＮＡレベルがもたらされるはずであり、従って、産生細胞の産生性はより高くなる。
【０００７】
発明の要約／解決法
ここで我々は、チャイニーズハムスター（Cricetus griseus）の成長ホルモンから単離した新規ポリアデニル化シグナルを記載する。驚くべきことに、ＨＧＨと命名されたこの新規に同定されたポリアデニル化シグナルは、強力なポリアデニル化シグナルＢＧＨおよびＳＶ４０後期より優れていることが判明した。ポリアデニル化シグナル配列としてＨＧＨを含むベクターを使用した場合、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞の一過性トランスフェクションにおけるタンパク質力価は、ＢＧＨを含む細胞と比較して３５％まで増加した。安定な細胞では、４５ｐｇ/細胞/日までの高度に特異的な産生性および流加（fed batch）プロセスにおいては６.３ｇ/Ｌまでの力価が得られた。
【０００８】
本発明の１つの態様は、少なくとも１つのＨＧＨポリアデニル化シグナルおよび対象の産物をコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド配列である。ＨＧＨポリアデニル化シグナルは下流にあり、そして異種ヌクレオチド配列（群）と作動可能に連結している。本発明の別の態様は、対象の産物をコードする少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列および少なくとも１つのＨＧＨポリアデニル化シグナルを含む、新規ベクターである。ＨＧＨポリアデニル化シグナルは下流にあり、そして異種ヌクレオチド配列（群）と作動可能に連結している。本発明のさらなる態様は、制限エンドヌクレアーゼに対する認識配列を介して対象の遺伝子のクローニングを可能とする上流のマルチクローニングサイトに作動可能に連結された少なくとも１つのＨＧＨポリアデニル化シグナルを含む新規ベクターまたはポリヌクレオチド配列である。本発明のさらに別の態様は、ＨＧＨポリアデニル化シグナルを含む、真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞である。本発明のまたさらなる態様は、ＨＧＨポリアデニル化シグナルを含むベクターまたはポリヌクレオチド配列でトランスフェクトされた真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞を培養することを含む、対象の産物を産生するための方法である。好ましい態様において、対象の産物はポリペプチドであり、そして所望のポリペプチドは培養培地から回収される。
【０００９】
本発明のデータは、ｓＩＣＡＭの一過性発現に対するＨＧＨポリアデニル化シグナル配列の影響を示す（図６）。驚くべきことに、最も高いｓＩＣＡＭ発現が、ハムスターの成長ホルモン遺伝子に由来するポリアデニル化シグナル配列を用いて得られる。力価は、ＢＧＨポリアデニル化シグナルを含むベクターｐＪＲ１１０でトランスフェクトされた細胞と比較して２１％まで増加し（トランスフェクションシリーズ１番）、そしてＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナルを含むベクターｐＪＲ１０６でトランスフェクトされた細胞と比較して４０％まで増加した（トランスフェクションシリーズ１番）。
【００１０】
本発明のデータは、さらに、ＩｇＧ４抗体の一過性発現に対するＨＧＨポリアデニル化シグナルの影響を示す。驚くべきことに、ＨＧＨポリアデニル化シグナル配列を用いて得られた力価は、ＢＧＨポリアデニル化シグナルの場合よりも平均して３５％高い（図７）。
【００１１】
本発明のデータはさらに、異なるＨＧＨ変異体の試験も示す（図８）。発現ベクターｐＪＲ１３５に含まれる１１３ｂｐの最も短いＨＧＨ配列により、発現ベクターｐＪＲ１３１に含まれる３２４ｂｐのＨＧＨ配列と比較して、７８％まで減少したｓＩＣＡＭ発現がもたらされる。これに対して、発現ベクターｐＪＲ１３４に含まれる１８９ｂｐのＨＧＨ配列は、ＢＧＨで達成された発現レベルに匹敵するほどの非常に良好なｓＩＣＡＭ発現をもたらす（図７）。最善の発現結果は、発現ベクターｐＪＲ１３１に含まれる３２４ｂｐのＨＧＨ配列を用いて達成され（図８）、これは、ＢＧＨポリアデニル化シグナルを用いて達成された発現よりもはるかに良好（３５％）である（図７）。
【００１２】
これは、対象の遺伝子の効率的な発現に寄与する配列が、配列番号８のｂｐ１９０〜３２４のＨＧＨ領域に位置することを示す。
【００１３】
本発明のデータはさらに、ＨＧＨポリアデニル化シグナルを使用して高いレベルでの安定したタンパク質の発現を示す。１０〜４５ｐｇ/細胞/日の範囲の特異的産生性および６.３ｇ/Ｌまでの流加プロセスにおける力価を有する細胞プールおよび細胞クローンが得られる（図９）。
【００１４】
本発明は、配列番号９に少なくとも７５％同一な配列を含む核酸を含むポリアデニル化シグナルに関する。本発明はさらに、配列番号９に対して少なくとも７５％の同一性を有する配列を含む核酸を含むポリアデニル化シグナルに関する。本発明はさらに、配列番号９に対して少なくとも７５％の同一性を有する配列を含む核酸を含むポリアデニル化シグナルに関する。本発明は特に、配列番号９に少なくとも７５％同一な配列から本質的になる核酸を含むポリアデニル化シグナルに関する。
【００１５】
本発明は好ましくは、配列番号９に少なくとも７５％同一な配列からなる核酸を含むポリアデニル化シグナルに関する。本発明はさらに、配列番号９を含む核酸を含むポリアデニル化シグナルに関する。
【００１６】
特定の態様において、本発明は、配列番号８に少なくとも７５％同一な配列を含む核酸を含むポリアデニル化シグナルに関する。本発明は特に、配列番号８に少なくとも７５％同一な配列から本質的になる核酸を含むポリアデニル化シグナルに関する。本発明は好ましくは、配列番号８に少なくとも７５％同一な配列からなる核酸を含むポリアデニル化シグナルに関する。本発明はさらに、配列番号８を含む核酸を含むポリアデニル化シグナルに関する。
【００１７】
本発明のさらなる態様において、ポリアデニル化シグナルは、配列番号９または配列番号８に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％または９８％同一である配列を含む。特定の態様において、本発明は、配列番号９に少なくとも８５％同一な配列を含む核酸を含むポリアデニル化シグナルに関する。別の特定の態様において、本発明は、配列番号９に少なくとも９５％同一な配列を含む核酸を含むポリアデニル化シグナルに関する。特定の態様において、本発明は、配列番号８に少なくとも８５％同一な配列を含む核酸を含むポリアデニル化シグナルに関する。別の特定の態様において、本発明は、配列番号８に少なくとも９５％同一な配列を含む核酸を含むポリアデニル化シグナルに関する。
【００１８】
本発明は、その配列が配列番号９を含む、核酸に関する。好ましくは、本発明は、その配列が配列番号９から本質的になる、核酸に関する。より好ましくは、本発明は、その配列が配列番号９からなる、核酸に関する。
【００１９】
本発明は、その配列が配列番号８を含む、核酸に関する。好ましくは、本発明はその配列が配列番号８から本質的になる、核酸に関する。より好ましくは、本発明は、その配列が配列番号８からなる、核酸に関する。
【００２０】
好ましい態様において、前記ポリアデニル化シグナルは単離されている。好ましい態様において、本発明は、配列番号９に少なくとも７５％同一な配列を含む核酸を含む単離ポリアデニル化シグナルに関する。別の好ましい態様において、本発明は、配列番号９に少なくとも９５％同一な配列を含む核酸を含む単離ポリアデニル化シグナルに関する。さらに別の好ましい態様において、本発明は、配列番号９を含む核酸を含む単離ポリアデニル化シグナルに関する。さらに好ましい態様において、本発明は、配列番号８に少なくとも７５％同一な配列を含む核酸を含む単離ポリアデニル化シグナルに関する。別の好ましい態様において、本発明は、配列番号８に少なくとも９５％同一な配列を含む核酸を含む単離ポリアデニル化シグナルに関する。さらに別の好ましい態様において、本発明は、配列番号８を含む核酸を含む単離ポリアデニル化シグナルに関する。
【００２１】
好ましくは、本発明は、その配列が配列番号９を含む、単離核酸に関する。より好ましくは、本発明は、その配列が配列番号８を含む、単離核酸に関する。
【００２２】
好ましい態様において、前記ポリアデニル化シグナルは、異種コード配列に作動可能に連結されている。特に好ましい態様において、前記ポリアデニル化シグナルは、前記ポリアデニル化シグナルを用いて得られた力価／発現レベルが、ＢＧＨポリアデニル化シグナルで得られたものよりも少なくとも１０％、好ましくは２０％、最も好ましくは３０％高いことによって特徴づけられる。最も好ましい態様において、それらはＢＧＨポリアデニル化シグナルで得られたものより少なくともおよび／または平均して３５％高い。
【００２３】
本発明は、特に、その配列が、異種コード配列に作動可能に連結された配列番号９を含む核酸に関する。または、その配列は、異種コード配列に作動可能に連結された配列番号９から本質的になる。好ましくは、その配列は、異種コード配列に作動可能に連結された配列番号９からなる。
【００２４】
本発明はさらに、その配列が異種コード配列に作動可能に連結された配列番号８を含む、核酸に関する。または、その配列は、異種コード配列に作動可能に連結された配列番号８から本質的になる。好ましくは、その配列は、異種コード配列に作動可能に連結された配列番号８からなる。
【００２５】
核酸の配列は配列番号９または８を含み、ターミネーター機能を有する。好ましくは、前記核酸はターミネーター機能を有し、そして異種コード配列に作動可能に連結されている。
【００２６】
本発明はさらに、前記したようなポリアデニル化シグナルまたは核酸配列のいずれか１つを含む、ベクターまたはポリヌクレオチド配列に関する。特定の態様において、前記ポリアデニル化シグナルまたは核酸配列は、発現ユニット／発現カセットに作動可能に連結されている。本発明の別の態様において、ベクターは、選択および／または増幅マーカーのジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、グルタミンシンセターゼまたはネオマイシンホスファターゼ（ｎｅｏ）を含む。本発明の好ましい態様において、ベクターまたはポリヌクレオチド配列は、対象の異種産物をコードする対象の異種遺伝子を含む。好ましくは、前記産物はポリペプチドである。好ましくは、前記ポリペプチドは、抗体、抗体断片または融合タンパク質である。
【００２７】
本発明はさらに、前記したようなベクターまたはポリヌクレオチド配列のいずれか１つを含む細胞に関する。好ましくは、前記細胞は、対象の産物をコードする転写ユニットに作動可能に連結された前記したようなポリアデニル化シグナルまたは核酸配列のいずれか１つを含む。好ましくは、対象の前記産物は、対象のヌクレオチド／核酸である。前記細胞の別の態様において、対象の前記産物は、対象の遺伝子によってコードされる対象のポリペプチドである。好ましくは、前記ポリペプチドは、抗体、抗体断片または融合タンパク質である。
【００２８】
特定の態様において、前記細胞は、真核生物細胞、哺乳動物細胞、ハムスター細胞またはマウス細胞である。好ましくは、前記細胞はハムスター細胞である。より好ましくは、前記細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。最も好ましくは前記細胞はＣＨＯ ＤＧ４４、ＣＨＯ−Ｋ１またはＤＵＫＸ−Ｂ１１細胞である。別の好ましい態様において、前記細胞はＮＳＯ細胞である。好ましい態様において、記載したような前記細胞は培養細胞である。好ましくは、前記細胞は、血清非含有培地中で培養される。好ましくは、前記細胞は、懸濁培養液中で増殖する。本発明の別の好ましい態様において、前記細胞は、前記ポリアデニル化シグナルまたは核酸配列で得られた力価／発現レベルが、ＢＧＨポリアデニル化シグナルで得られたものよりも少なくとも１０％、好ましくは２０％、最も好ましくは３０％高いことによって特徴づけられる。最も好ましい態様において、それらは、ＢＧＨポリアデニル化シグナルで得られたものよりも少なくともおよび／または平均して３５％高い。好ましくは、前記細胞は、３５％高い発現レベルを有する。
【００２９】
本発明はさらに、対象の遺伝子によってコードされる対象のポリペプチドを作製する方法に関し、前記方法は、以下の工程：
（ａ）前記したようなベクターまたはポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞を得るか、あるいは、前記したような細胞を得る工程
（ｂ）前記細胞を、前記細胞の増殖および対象の遺伝子の発現を可能とする条件下で培養する工程、
（ｃ）対象のポリペプチドを収集する工程、そして
（ｄ）対象のポリペプチドを精製する工程
を含む。
【００３０】
前記方法の特定の態様において、前記細胞は、真核生物細胞、哺乳動物細胞、ハムスター細胞またはマウス細胞である。好ましくは、前記細胞はＣＨＯ細胞、最も好ましくはＣＨＯ ＤＧ４４、ＣＨＯ−Ｋ１またはＤＵＫＸ−Ｂ１１細胞である。さらに好ましいのはＮＳＯ細胞である。
【００３１】
前記方法の好ましい態様において、対象のポリペプチドは、組換えタンパク質、好ましくは分泌ポリペプチド、より好ましくは治療タンパク質である。最も好ましくは、対象のポリペプチドは、抗体、例えばモノクローナル、ポリクローナル、多重特異的または単鎖抗体、またはその断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｃおよびＦｃ’断片、重鎖および軽鎖免疫グロブリンおよびその定常、可変または超可変領域、並びにＦｖおよびＦｄ断片である。前記方法の別の好ましい態様において、対象のポリペプチドは、融合タンパク質または足場タンパク質である。
【００３２】
本発明はさらに、タンパク質の製造のための前記したような細胞の使用に関する。
【００３３】
本発明はさらに、インスレーターとして使用するための前記したようなポリアデニル化シグナルまたは核酸のいずれか１つの使用に関する。
【００３４】
さらに、本発明は、改良された宿主細胞株の作製のための前記したようなポリアデニル化シグナルまたは核酸のいずれか１つの使用に関する。
【００３５】
本発明は特に、遺伝子療法に使用するための前記したようなポリアデニル化シグナルまたは核酸のいずれか１つの使用に関する。
【００３６】
本発明はさらに、前記したようなポリアデニル化シグナルまたは核酸のいずれか１つ、ベクター、細胞、および前記細胞の培養のための細胞培養培地を含む、キットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】基本的な発現ベクター。図１は、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞のトランスフェクションのために使用される発現ベクターの設計を図示する。「Ｐ／Ｅ」は、ＣＭＶエンハンサーおよびプロモーターエレメントの両方を含む複合ユニットを意味し、「Ｐ」はプロモーターエレメントを意味し、「Ｔ」は転写の終結シグナルを意味し、これは転写されるメッセンジャーＲＮＡのポリアデニル化に必要とされる。ポリアデニル化シグナル「ＢＧＨ」、「ＳＶ４０Ｌ」および「ＨＧＨ」は、それぞれ、ウシ成長ホルモンの３’非翻訳領域（配列番号１２）、ＳＶ４０後期遺伝子領域（配列番号１１）およびチャイニーズハムスター成長ホルモンの３’非翻訳領域（配列番号８）に由来する転写のための終結シグナルである。これらのポリアデニル化シグナルは、「ＳｆｉＩ」および「ＸｂａＩ」の制限酵素部位によってフランキングされている。各転写ユニット内の転写開始の位置および方向は矢印によって示される。対象の遺伝子のクローニングのために、制限エンドヌクレアーゼのためのマルチカッティングサイト（マルチクローニングサイト−「ｍｃｓ」）を有する配列領域が、プロモーター／エンハンサーエレメントの後に挿入される。増幅可能で選択可能なマーカーのジヒドロ葉酸レダクターゼは「ｄｈｆｒ」と略称され、そして選択可能なマーカーのネオマイシンホスホトランスフェラーゼは「ｎｐｔ」と略称される。
【図２】CRICETUS CRISEUSの単離成長ホルモン遺伝子領域。図２は、合計で３６２ｂｐ（配列番号７）を用いたネステッドＰＣＲを使用してゲノムＣＨＯ−ＤＧ４４（チャイニーズハムスター卵巣細胞株；Cricetus griseus）ＤＮＡから増幅した成長ホルモン遺伝子領域のヌクレオチド配列を示す。矢印は、増幅反応に使用した遺伝子特異的プライマーＧＨ ｆｏｒ２の方向、長さおよび位置を示し、プライマー配列それ自体はイタリック体（配列番号２）で強調される。成長ホルモン遺伝子配列の終止コドンＴＡＧは、下線の太文字によって強調され、そしてその後に３２４ｂｐの３’非翻訳領域が続いている。
【図３】成長ホルモン遺伝子の３’非翻訳領域のアラインメント。このアラインメントにおいて、Cricetus griseus成長ホルモンの単離３’非翻訳領域（配列番号８）が、シリアンハムスターMesocricetus auratus (Genbank S66299)、Mus musculus (Genbank Z46663)、Rattus norvegicus (Genbank V01239)およびBos taurus  (Genbank  J00008)の３’非翻訳成長ホルモン領域と比較されている。影は、C. griseus配列とは異なるヌクレオチドを示す。
【図４】CRICETUS CRISEUS成長ホルモンの３’非翻訳領域のＨＧＨ欠失誘導体。このアラインメントでは、３’非翻訳領域だけを含む３６２ヌクレオチドCricetus griseus成長ホルモン（ＨＧＨ）配列（配列番号７）の欠失誘導体が示されている。全ての誘導体が同一の５’末端を有し、そしてその３’末端は異なっている。配列番号８を有する最も長い誘導体は、３２４ヌクレオチドからなる。配列番号９は、１８９ヌクレオチドからなりそして配列番号１０はたったの１１３ヌクレオチドからなる。成長ホルモン遺伝子配列の終止コドンＴＡＧは下線の太文字によって強調され、そしてポリアデニル化タンパク質複合体ＡＡＴＡＡＡの可能性ある結合部位はイタリック体で強調されている。
【図５】ＨＧＨパフォーマンスの評価のための組換え発現ベクター。全ての組換え発現ベクターは、ＣＭＶエンハンサーおよびプロモーターエレメント（「Ｐ／Ｅ」）の制御下に対象の遺伝子「ｓＩＣＡＭ」をコードする。ｓＩＣＡＭ転写は、ウシ成長ホルモン「ＢＧＨ」の３’非翻訳領域（配列番号１２）、ＳＶ４０後期遺伝子領域「ＳＶ４０Ｌ」（配列番号１１）またはチャイニーズハムスター成長ホルモン「ＨＧＨ」の３’非翻訳領域（配列番号８、配列番号９、配列番号１０）のいずれかによって終結される。後者のサイズが塩基対で示されている。これらのポリアデニル化シグナルは、「ＳｆｉＩ」および「ＸｂａＩ」の制限酵素部位によってフランキングされている。「Ｐ」はプロモーターエレメントを示し、そして「Ｔ」は転写の終結シグナルを示す。各転写ユニット内の転写開始の位置および方向は矢印によって示される。増幅可能で選択可能なマーカーのジヒドロ葉酸レダクターゼは「ｄｈｆｒ」と略称される。
【図６】一過性トランスフェクションにおけるＨＧＨパフォーマンスの評価。２つの独立したシリーズにおいて、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞が、発現ベクターｐＪＲ１０６、ｐＪＲ１１０およびｐＪＲ１３１（これらは全て、ＣＭＶエンハンサー／プロモーター下でｓＩＣＡＭをコードする）を用いてトランスフェクトされる。転写の終結のために、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル（配列番号１１）、ウシ成長ホルモンＢＧＨの３’非翻訳領域（配列番号１２）またはチャイニーズハムスター成長ホルモンＨＧＨの３’非翻訳領域（配列番号８）のいずれかが使用される。４８時間後、上清中のｓＩＣＡＭ力価をＥＬＩＳＡを使用して決定する。トランスフェクション効率を補正するために、細胞をプラスミドｐＣＭＶ−ＳＥＡＰを用いて同時トランスフェクションし、そしてＳＥＡＰ活性を測定する。ポリアデニル化シグナルとしてＨＧＨを使用した力価は、ＢＧＨを用いた終結と比べて２１％まで増加し、ＳＶ４０後期を用いた終結と比較して４０％まで増加する。
【図７】ＩｇＧ４／κ抗体の一過性発現におけるＨＧＨパフォーマンスの評価。ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を、ベクター組合せ体ｐＢＩＤ／ＩｇＧ４およびｐＢＩＮ／κ（ｎ＝６）を用いて同時トランスフェクションし、ここで、抗体の重鎖（ＩｇＧ４）および軽鎖（κ）の転写は、チャイニーズハムスター成長ホルモンＨＧＨの３２４ｂｐの３’非翻訳領域（配列番号８）によって終結される。対照としてＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を、ＢＧＨポリアデニル化シグナル（配列番号１２）を含むベクター組合せ体ｐＢＩＤ−Ｂ／ＩｇＧ４およびｐＢＩＮ−Ｂ／κ（ｎ＝６）を用いて同時トランスフェクションする。異なるポリアデニル化配列は別にして、様々なベクターの遺伝子的構成は同一である。４８時間後に、上清中の抗体力価をＥＬＩＳＡを使用して決定する。トランスフェクション効率を補正するために細胞をプラスミドｐＣＭＶ−ＳＥＡＰを用いて同時トランスフェクションし、そしてＳＥＡＰ活性を測定する。ポリアデニル化シグナルとしてＨＧＨを使用した力価は、ＢＧＨポリアデニル化シグナルよりも平均して３５％高い。
【図８】一過性トランスフェクションにおける異なるＨＧＨ欠失変異体の試験。２つの独立したシリーズにおいて、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を、発現ベクターｐＪＲ１３１、ｐＪＲ１３４およびｐＪＲ１３５（その全てがＣＭＶエンハンサー／プロモーターの下でｓＩＣＡＭをコードする）を用いてトランスフェクションする。転写の終結のためにチャイニーズハムスター成長ホルモンＨＧＨの３’非翻訳領域の３２４ｂｐ（配列番号８）、１８９ｂｐ（配列番号９）または１１３ｂｐ（配列番号１０）のいずれかを使用する。全ての変異体が同一の５’末端を有するがその３’末端は異なっている。異なるポリアデニル化配列は別にして、様々なベクターの遺伝子的構成は同一である。トランスフェクションから４８時間後、上清中のｓＩＣＡＭ力価をＥＬＩＳＡを使用して決定する。トランスフェクション効率を補正するために、細胞をプラスミドｐＣＭＶ−ＳＥＡＰを用いて同時トランスフェクションし、そしてＳＥＡＰ活性を測定する。３２４ｂｐのＨＧＨ配列を含むベクターでトランスフェクションした細胞と比較して、１８９ｂｐおよび１１３ｂｐのＨＧＨ欠失変異体を含むベクターでトランスフェクションした細胞は、それぞれ、ｓＩＣＡＭ発現レベルの２３％および７８％の減少を示す。
【図９】ＨＧＨを使用して安定にトランスフェクションされた細胞における高いレベルのタンパク質発現。図９において、バイオリアクターまたは振とうフラスコにおいて実施した流加プロセスにおいてＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４抗体またはＩｇＧ１およびＩｇＧ２Ｆｃ融合タンパク質を発現している安定にトランスフェクションされたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞クローンまたは細胞プールの特異的産生性および力価が要約されている。特異的産生性は、１０〜４５ｐｇ/細胞/日の範囲であり、そして力価は２.１〜６.３ｇ/Ｌの範囲である。様々なタンパク質の発現に使用されるベクターの遺伝子的構成は同一である。全てが、対象の遺伝子の転写を終結させるためのポリアデニル化シグナルとしてチャイニーズハムスター成長ホルモンの３２４ｂｐの３’非翻訳領域（配列番号８）を含む。トランスフェクションから２日後、安定な細胞プールをＤＨＦＲおよびＮＰＴに基づいた選択を使用して選択し、続いて、培養培地に１００nMおよび８００nMのＭＴＸを添加することによって２回の連続的なＤＨＦＲを媒介した遺伝子増幅ステップを行なった。希釈クローニングまたは９６ウェルプレートのウェルへの単一細胞のＦＡＣＳに基づいた沈着のいずれかによって単一細胞クローンが得られる。
【００３８】
発明の詳細な説明
一般的な態様「含む（comprising）」または「含む（comprised）」は、より特定の態様である「からなる（consisting of）」を包含する。さらに、単数形および複数形は制限的に使用しない。
【００３９】
本発明は、新規調節エレメント、並びに、異種遺伝子産物、好ましくは生物薬剤学的に関連したポリペプチドまたはタンパク質の高い発現を可能とする哺乳動物細胞株を調製し選択する方法を提供する。本発明によるプロセスは、主に、チャイニーズハムスター(Cricetus griseus)の成長ホルモンから単離された新規ポリアデニル化シグナルの使用に基づく。驚くべきことに、ＨＧＨ（配列番号８）と命名された、この新しく同定されたポリアデニル化シグナルは、強力なポリアデニル化シグナルＢＧＨおよびＳＶ４０後期よりも優れ、産生細胞のより高い産生性をもたらすことが判明した。
【００４０】
本発明の説明において使用される用語は、以下の意味を有する。用語「ポリアデニル化シグナル」、「ポリアデニル化部位」、「ポリＡシグナル」、「ポリＡ部位」または「終結シグナル」または「ターミネーター」は、シグナル配列内のＡＡＵＡＡＡ配列へのポリアデニル化タンパク質複合体の結合を指示する３’ＵＴＲ内のヌクレオチド配列をいう。前記複合体は、ＡＡＵＡＡＡ配列の約１４〜３０ヌクレオチド下流においてｍＲＮＡを切断するエンドヌクレアーゼ、および連続した約１００〜２００アデニンヌクレオチド（ポリＡ尾部）を、切断された３’末端に転写後に取り込むポリメラーゼを含む。ポリＡ尾部は、安定性、翻訳効率、および核から細胞質への輸送を含む、ｍＲＮＡ代謝の多くの局面に影響を及ぼすと考えられている。典型的には、ポリアデニル化シグナルは、切断部位およびポリアデニル化部位にフランキングする２つの認識エレメント（切断部位の約１４〜３０ヌクレオチド上流の高度に保存されたＡＡＵＡＡＡ配列、およびＡＡＵＡＡＡ配列の約２０〜５０ヌクレオチド下流のあまり保存されていないＧ／ＵまたはＵの豊富な領域）からなる。これらの２つのエレメント間の切断は、通常、Ａ残基の３’側上にある。様々なポリアデニル化シグナル、例えばｔｋポリＡ(Cole et al., Mol. Cell Biol.,5, 2104 - 2113, 1985)、ＳＶ４０後期(Schek et al., Mol. Cell Biol. 12, 5386 - 5393, 1992)および初期ポリＡまたはＢＧＨポリＡ（例えばU.S. Pat. No. 5,122,458に記載）が公知である。
【００４１】
ポリアデニル化シグナルにおいて前記したＡＡＵＡＡＡ配列が好ましいが、それは、ｍＲＮＡのポリアデニル化をシグナル伝達できる限りにおいてＡＡＵＡＡＡに相同性を有する他のヘキサヌクレオチド配列で置換されていてもよい。相同的なヘキサヌクレオチド配列の例は、ＡＡＡＡＡＡ、ＡＵＵＡＡＡ、ＡＡＵＡＵＡ、ＡＡＵＡＡＵ、ＵＡＵＡＡＡ、ＡＡＵＵＡＡ、ＡＡＵＡＡＧ、ＡＧＵＡＡＡ、ＧＡＵＡＡＡ、ＡＡＵＧＡＡ、ＡＡＵＡＧＡ、ＡＡＧＡＡＡ、ＡＣＵＡＡＡ、ＣＡＵＡＡＡ、ＡＡＵＣＡＡ、ＡＡＣＡＡＡ、ＡＡＵＣＡＡおよびＡＡＵＡＡＣを含む。それ故、１つの態様において、このＡＡＵＡＡＡ以外のＨＧＨポリアデニル化シグナルは、ＡＡＡＡＡＡ、ＡＵＵＡＡＡ、ＡＡＵＡＵＡ、ＡＡＵＡＡＵ、ＵＡＵＡＡＡ、ＡＡＵＵＡＡ、ＡＡＵＡＡＧ、ＡＧＵＡＡＡ、ＧＡＵＡＡＡ、ＡＡＵＧＡＡ、ＡＡＵＡＧＡ、ＡＡＧＡＡＡ、ＡＣＵＡＡＡ、ＣＡＵＡＡＡ、ＡＡＵＣＡＡ、ＡＡＣＡＡＡ、ＡＡＵＣＡＡおよびＡＡＵＡＡＣからなる群より選択されたヘキサヌクレオチド配列を、これらのヘキサヌクレオチド配列がｍＲＮＡのポリアデニル化をシグナル伝達できる限りにおいて、含む。
【００４２】
ポリアデニル化シグナルはまた、「インスレーター」または「遮蔽配列」としても使用され得る。遮蔽配列は、隣接する遺伝子配列の相互作用または干渉を遮断するＤＮＡセグメントである。例えば、インスレーターは、隣接遺伝子のプロモーターまたは隣接するヌクレオチド配列中の偽のプロモーターからの転写解読を減少させることができる。または、それらは、遮蔽配列の一方の側上のエンハンサーと、遮蔽配列の他方の側上の隣接遺伝子のプロモーターとの相互作用を遮断する。本発明の意味内における遮蔽配列の明確な特徴は、調節エレメントに作動可能に連結された規定の転写ユニットを、上流または下流の干渉遺伝子エレメントの影響から遮蔽または保護するその能力である。この目的のために遮蔽配列は、干渉する（可能性のある）遺伝子配列と、遮蔽しようとする転写ユニットの調節配列の間に配置する。遮蔽配列は、１つ以上のコピーで転写ユニットの片側または両方側に配置し得る。本発明の好ましい態様において、遮蔽配列はポリアデニル化シグナルである。本発明の好ましい態様において、ポリアデニル化配列は、ＨＧＨポリアデニル化配列である。
【００４３】
ＨＧＨポリアデニル化配列の機能的誘導体、例えば亜断片または亜配列、並びに、例えば、置換、挿入、付加および／または欠失によって改変された、完全配列またはその亜断片の機能的突然変異体／変異体を使用することも可能である。対応する亜断片または亜配列、突然変異体または変異体はまた、以後、本明細書において「改変ターミネーター」または「誘導体」と称する。
【００４４】
「改変ターミネーター」または「誘導体」は、亜断片または亜配列および機能的突然変異体／変異体を含み、そして好ましくは配列番号８に示されたヌクレオチド配列で得られた発現レベルと同等な対象の産物の発現レベルをもたらす、配列番号８の機能的誘導体である。改変ターミネーターは、作動可能に連結されたリポーター遺伝子の発現レベルが、比較リポーター遺伝子アッセイにおいて配列番号８で得られた発現レベルの少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも１００％である場合に本発明の目的に有用であると判明する。特に好ましいのは、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９７％の、ハムスター成長ホルモンポリアデニル化シグナルの野生型配列の配列番号８またはその相補的配列に対して最小の配列相同性を有し、そして比較リポーター遺伝子アッセイにおいて対応する発現レベルをもたらす、改変ターミネーターである。
【００４５】
対応する比較「リポーター遺伝子アッセイ」において、参照配列の配列番号８を含む試験しようとするターミネーター断片は、リポーター遺伝子の下流にクローニングされる。このリポーター遺伝子は、例えばルシフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼまたは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする。または、他のポリペプチドまたはタンパク質、例えば抗体またはｓＩＣＡＭをリポーター遺伝子として使用することができる。これらの構築物を続いて試験細胞、例えばＣＨＯ−ＤＧ４４にトランスフェクションによって導入し、そしてリポーター遺伝子の発現レベルに対する問題の改変ターミネーターの影響を、例えば、リポーター遺伝子のタンパク質含量を測定することによって決定する。対応する試験は、本発明の実施例２、３および４に記載されている。
【００４６】
好ましいＨＧＨポリアデニル化シグナルは、配列番号８の配列を含むヌクレオチド配列または配列番号９の配列を含むその亜配列である。他の態様において、ポリアデニル化シグナルは、配列番号７、配列番号８、配列番号９または配列番号１０に相同性または配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むまたはからなるヌクレオチド配列である。本明細書に使用したように、２つの配列は、ヌクレオチド配列が、少なくとも７５％、好ましくは８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％またはそれ以上相同または同一である場合に配列同一性または相同性を有する。核酸配列が、ストリンジェントな条件下で相補鎖にハイブリダイゼーションする場合にも実質的な同一性は存在する。
【００４７】
本明細書で使用したように、用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションする」は、当業者に公知のハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を記載する。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおいて特定の配列に対する熱融点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低くなるように選択される。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が、平衡時に標的配列とハイブリダイゼーションする温度（規定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度の下）である。ストリンジェントな条件は、塩の濃度がｐＨ７.０〜８.３において約１.０Ｍナトリウムイオン未満、典型的には約０．０１〜１.０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、そして温度は、短いプローブ（例えば１０〜約５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃、長いプローブ（例えば約５０ヌクレオチドより大きい）では少なくとも約６０℃である。例示的なストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーション緩衝液中５×ＳＳＣを用いて６０〜６５℃でのハイブリダイゼーション、そして０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳを用いての４２℃での洗浄を含む。正のハイブリダイゼーションシグナルは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも２倍である。
【００４８】
ハムスター成長ホルモンのポリアデニル化配列および改変ターミネーター（これはまた、例えば、配列番号７の単離ＨＧＨ配列またはその選択断片のさらに上流または下流に天然ヌクレオチド配列を含み得る）は、当分野において公知の様々な標準的な方法を使用して配列または相同的配列の知識を用いて当業者によって得られ得、そして適切な方法もまた本発明の実施例１に記載されている。配列番号７に記載の配列から出発して、例えば適切な断片を選択し得、そしてこの画分の配列を含むオリゴヌクレオチドプローブは化学的に合成され得る。この種類のプローブは、例えばハムスターゲノムのライブラリーからのハイブリダイゼーションによって、例えばハムスター成長ホルモン遺伝子または３’非翻訳領域またはその他の断片をクローニングするのに使用され得る。前記したリポーター遺伝子アッセイを使用して当業者は、全く大きな努力をすることなく機能的ターミネーター断片を同定しそして本発明の目的のためにそれらを使用することができる。３’非翻訳領域またはその特別な断片は、ゲノムＤＮＡまたはゲノムライブラリーから対応するプライマーを用いてＰＣＲ増幅によって容易に得ることができる。３’非翻訳領域の断片はまた、より大きなＤＮＡ断片からの制限エキソヌクレアーゼIIIの消化によって得ることができる。このようなＤＮＡ分子はまた、化学的に合成され得るか、またはライゲーションによって化学的に合成された断片から産生され得る。欠失、挿入、付加および置換突然変異体は、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲに基づいた突然変異誘発技術および／または当業者には公知である化学合成によって産生され得る。好ましくは、突然変異体は、３、６、１０、２０または５０ｂｐまでの位置において変化されている。好ましくは、突然変異体は、６ｂｐの位置において変化されている。
【００４９】
本発明の実施例１に記載したような類似したアプローチは、例えば、マウス、ラットまたはシリアンハムスター成長ホルモンまたは他の種の成長ホルモンのポリアデニル化シグナルを単離するために使用することができる。そのパフォーマンスは、本発明の実施例２、３または４に記載したようなリポーター遺伝子アッセイにおいて試験することができる。ハムスター成長ホルモン配列から、好ましくは３’非翻訳領域から得られたプローブとのクロスハイブリダイゼーションによって、他の種、好ましくは哺乳動物種の対応する相同遺伝子から適切なターミネーター配列を同定および単離することもできる。適切な技術は当業者には公知である。
【００５０】
用語「相同性」、「相同な」、「同一性」、「同一な」、「配列同一性」または「相同的配列」は同義語として使用される。「相同性」または「同一性」を計算するための方法は当分野において周知である。配列の比較のために典型的には１つの配列が参照配列として作用し、これに対して試験配列を比較する。配列は最大に対応するようにアラインさせる。最適なアラインメントの比較においてギャップをいずれかの核酸配列に導入することができる。２つの配列間の同一率は、２つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要のあるギャップの数および各ギャップの長さを考慮して、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。配列の比較および２つの配列間の同一率の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。デフォルトプログラムパラメーターを使用できるか、または代替的なパラメーターを指定することができる。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定されたパラメーターまたはデフォルトプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対して試験配列（群）の同一率を計算する。同一性を決定するのに適したアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403 - 410, 1990; Gish et al., Nature Genetics 3, 266 - 272, 1993; Madden et al., Meth. Enzymol. 266, 131 - 141, 1996; Zhang et al., Genome Res. 7, 649 - 656, 1997; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25, 3389 - 3402, 1997)。アラインメントアルゴリズムの他のコンピューターによる実行は、Wisconsin Geneticsソフトウェアパッケージにおける、ＧＡＰ、ＰＩＬＥＵＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡである。しかしながら、同一率はまた、手動アラインメント並びに眼による調査および計算によって決定することができる。
【００５１】
本明細書に使用した用語「ベクター」は、細胞、例えばプラスミド、ミニサークル、ファージミド、コスミド、人工染色体／ミニ染色体、バクテリオファージ、ウイルス、例えばバキュロウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルス、バクテリオファージ内への核酸の取り込み、増殖、発現または伝達のための天然または合成的に作製された構築物に関する。ベクターの構築に使用される方法は当業者には周知であり、そして様々な文献に記載されている。特に、プロモーター、エンハンサー、終結およびポリアデニル化シグナル、選択マーカー、複製起点、およびスプライシングシグナルなどの機能的および調節的成分の記載を含む、適切なベクターを構築するための技術は当業者に公知である。真核生物発現ベクターは、典型的には、複製起点および細菌中での選択のための抗生物質耐性遺伝子などの細菌中におけるベクターの増殖を容易にする原核生物配列も含む。クローニング部位（この中にポリヌクレオチドは作動可能に連結され得る）を含む、様々な真核生物発現ベクターは当分野において周知であり、そしていくつかは、Stratagene, La Jolla, CA; Invitrogen, Carlsbad, CA; Promega, Madison, WIまたはBD Biosciences Clontech, Palo Alto, CAなどの会社から市販されている。
【００５２】
本発明の好ましい態様は、転写終結および安定化のためおよび／または遮蔽配列として少なくとも１つのＨＧＨポリアデニル化シグナルを含む対象の遺伝子をコードする１つ以上の転写ユニットを含むベクターまたはポリヌクレオチド配列である。本発明によりまた好ましいのは、制限エンドヌクレアーゼの認識配列を介して対象の遺伝子のクローニングを可能とするマルチクローニングサイトのみを対象の遺伝子の代わりに有する、転写終結および安定化のためおよび／または遮蔽配列としてＨＧＨポリアデニル化シグナルを含むベクターまたはポリヌクレオチド配列である。
【００５３】
用語「プロモーター」は、それと作動可能に接続された遺伝子または配列の転写を可能としそして制御するポリヌクレオチド配列を示す。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼに結合するための認識配列および転写のための開始部位（転写開始部位）を含む。ある細胞種または宿主細胞において所望の配列を発現するために、適切な機能的プロモーターを選択しなければならない。様々な異なる起源に由来する構成的、誘導性および抑制性プロモーターを含む、多くのプロモーターが当分野において周知であり（そしてGenBankなどのデーターベースにおいて同定）、そして別々のエレメントとして、または商業的に（例えばＡＴＣＣなどの寄託並びに他の商業的に）もしくは個人にポリヌクレオチド配列内にクローニングされたエレメントとして入手できる。誘導性プロモーターにおいてはプロモーターの活性は、シグナルに応答して増加または減少し得る。例えば、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）を含むテトラサイクリン（ｔｅｔ）プロモーターは、テトラサイクリンにより調節されるトランスアクチベータータンパク質（ｔＴＡ）によって誘導することができる。ｔｅｔＯへのｔＴＡの結合は、ｔｅｔの存在下で阻害される。他の誘導性プロモーターの例は、ｊｕｎ、ｆｏｓ、メタロチオネインおよび熱ショックプロモーターである。真核生物における高い発現に特に適したプロモーターには、例えばハムスターのユビキチン／Ｓ２７ａプロモーター(WO 97/15664)、ＳＶ４０初期プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列領域、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の初期プロモーターがある。他の異種哺乳動物プロモーターの例は、アクチン、免疫グロブリンまたは熱ショックプロモーター（群）である。
【００５４】
前記プロモーターは当分野において周知である。対応する異種プロモーターは他の調節配列と機能的に接続して、発現カセットの転写活性を増加／調節することができる。例えば、プロモーターはエンハンサー配列と機能的に連結することにより転写活性は増加し得る。このために、１つ以上のエンハンサーおよび／またはエンハンサー配列の数個のコピー、例えばＣＭＶまたはＳＶ４０エンハンサーを使用し得る。従って、本発明による発現ベクターは、別の態様において、１つ以上のエンハンサー／エンハンサー配列、好ましくはＣＭＶまたはＳＶ４０エンハンサーを含む。
【００５５】
用語「エンハンサー」は、シス配置においてプロモーターの活性に対して作用し、従ってこのプロモーターに機能的に接続された遺伝子またはコード配列の転写を刺激する、ポリヌクレオチド配列を示す。プロモーターとは異なり、エンハンサーの効果は、位置および向きと無関係であり、それ故、それらは転写ユニットの前または後、イントロン内、またはさらにはコード領域内に位置することができる。エンハンサーは、転写ユニットのすぐ近くに位置するとともに、プロモーターからかなり離れた位置にも位置し得る。それはまたプロモーターと物理的および機能的重複を有することも可能である。当業者は、独立したエレメントまたはポリヌクレオチド配列内にクローニングされたエレメントとして入手可能である（例えばＡＴＣＣに寄託または商業的におよび個人的に）、様々な起源に由来する多くのエンハンサー（データバンク、例えばGenBankに寄託、例えばＳＶ４０エンハンサー、ＣＭＶエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサー）を知っているだろう。頻繁に使用されるＣＭＶプロモーターなどの多くのプロモーター配列はまた、エンハンサー配列も含む。ヒトＣＭＶエンハンサーは、これまでに同定された最も強いエンハンサーの１つである。誘導性エンハンサーの一例は、メタロチオネインエンハンサーであり、これはグルココルチコイドまたは重金属によって刺激され得る。
【００５６】
「転写調節エレメント」は、通常、発現しようとする遺伝子配列の上流にプロモーター、転写開始および終結部位、並びにポリアデニル化シグナルを含む。
【００５７】
用語「転写開始部位」は、一次転写物、すなわちｍＲＮＡ前駆体へと取り込まれた最初の核酸に相当する構築物中の核酸をいう。転写開始部位は、プロモーター配列と重複し得る。
【００５８】
用語「転写終結部位」は、ＲＮＡポリメラーゼによる転写終結を引き起こす、転写しようとする対象の遺伝子または配列のストレッチの３’末端に通常示されるヌクレオチド配列をいう。
【００５９】
「転写ユニット」、「発現ユニット」または「発現カセット」は、転写しようとする１つ以上の遺伝子を含むベクター、構築物またはポリヌクレオチド配列内の領域を定義し、ここで、セグメント内に含まれる遺伝子は互いに作動可能に連結している。それらは単一のプロモーターから転写され、そして転写は、少なくとも１つのポリアデニル化シグナルによって終結される。結果として、異なる遺伝子が少なくとも転写されるように連結している。１つより多いタンパク質または産物を、各転写ユニット（マルチシストロン転写ユニット）から転写および発現できる。各転写ユニットは、ユニット内に含まれる選択配列のいずれかの転写および翻訳に必要とされる調節エレメントを含む。そして各転写ユニットは、同じまたは異なる調節エレメントを含み得る。例えば、各転写ユニットは同じターミネーターを含み得る。ＩＲＥＳエレメントまたはイントロンを転写ユニット内の遺伝子の機能的に連結するために使用し得る。ベクターまたはポリヌクレオチド配列は、１つより多い転写ユニットを含み得る。
【００６０】
「翻訳調節エレメント」は、個々のポリペプチドがそれぞれ発現されるための翻訳開始部位（ＡＵＧ）、終始コドンおよびポリＡシグナルを含む。配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）がいくつかの構築物に含まれ得る。ＩＲＥＳは、以下に定義される。発現を最適化するために、発現しようとする核酸配列の５’および／または３’非翻訳領域を除去、付加または変化させることにより、転写または翻訳レベルのいずれかにおいて、発現を干渉または減少させ得る潜在的でかつ余分で不適切な代替翻訳開始コドンまたは他の配列を削除することが妥当であり得る。共通リボソーム結合部位（コザック配列：ＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＵＧＧ（配列番号１３）；ＡＵＧは開始コドンを構築する）を開始コドンのすぐ上流に挿入することにより、翻訳および従って発現を増強することができる。このリボソーム結合部位周辺のＡ／Ｕ含量の増加は、より効率的なリボソームの結合を促進する。分泌ポリペプチドを産生するために、対象の遺伝子は、通常、新しく合成されたポリペプチドをＥＲ膜（ここでポリペプチドは分泌のために送られ得る）へとおよびＥＲ膜を通るように指示するリーダーまたはシグナルペプチドをコードするシグナル配列を含む。リーダーまたはシグナルペプチドは、分泌タンパク質のアミノ末端にあることが多いが普遍的ではなく、タンパク質がＥＲ膜を通過した後にシグナルペプチダーゼによって除去される。遺伝子配列は、一般的であって必ずしもではないが、それ自体のシグナルペプチド配列を含む。天然シグナルペプチド配列が存在しない場合、異種シグナルペプチド配列を、選択配列に融合することができる。または、天然シグナルペプチド配列を、異種のそれによって置換してもよい。数多くのシグナルペプチド配列が当業者には公知であり、そしてGenBankおよびＥＭＢＬなどの配列データバンクに寄託されている。
【００６１】
「配列内リボソーム進入部位」または「ＩＲＥＳ」は、ＩＲＥＳの遺伝子５’とは独立して翻訳開始を機能的に促進し、そして動物細胞において単一転写物から２つのシストロン（オープンリーディングフレーム）の翻訳を可能とする配列を記載する。ＩＲＥＳは、そのすぐ下流のオープンリーディングフレームの翻訳のための独立したリボソーム進入部位を提供する。ポリシストロン性であり得る、すなわち、ｍＲＮＡから連続的に翻訳されるいくつかの異なるポリペプチドをコードし得る、細菌ｍＲＮＡとは異なり、動物細胞の殆どのｍＲＮＡは、単シストロン性であり、唯１つのポリペプチドの合成をコードする。真核生物細胞のポリシストロン転写物では、翻訳は最も５’に近い翻訳開始部位から開始し、最初の終止コドンで終結し、そして転写物はリボソームから遊離し、ｍＲＮＡにおいて最初にコードされたポリペプチドのみが翻訳される。真核生物細胞では、転写物において第二またはその後のオープンリーディングフレームに作動可能に連結されたＩＲＥＳを有するポリシストロン転写物により、下流オープンリーディングフレームの連続的な翻訳が可能となり、同じ転写物によってコードされる２つ以上のポリペプチドが産生される。ＩＲＥＳは、様々な長さであり得、そして、様々な起源、例えば脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、ピコルナウイルス（例えばＦＭＤＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に由来し得る。様々なＩＲＥＳ配列およびベクター構築におけるその使用が記載されており、そして当分野において周知である。下流コード配列は、下流遺伝子の発現に負の影響を及ぼさない任意の距離においてＩＲＥＳの３’末端に作動可能に連結されている。ＩＲＥＳから下流遺伝子の開始までの間の最適または許容される距離は、距離を変更し、そして距離の関数として発現を測定することによって容易に決定することができる。
【００６２】
本明細書で使用した用語「イントロン」は、スプライシングのプロセス（このためにイントロンのいずれかの末端または近くにおける高度に保存された配列が必要である）によって新しく転写されたｍＲＮＡ前駆体から除去される、多くの真核生物遺伝子内に通常存在する、様々な長さの非コード核酸配列をいう。一般に、スプライシングのプロセスは、イントロンの５’および３’末端が正しく切断され、そしてｍＲＮＡの生じる末端が正確に連結されることを必要とし、これによりタンパク質合成のために適切なリーディングフレームを有する成熟ｍＲＮＡが産生される。エキソン−イントロンおよびイントロン−エキソン境界のすぐ周辺の配列を意味する、多くのスプライスドナーおよびスプライスアクセプター部位が特徴付けられ記載されており、そして当業者には公知である。
【００６３】
本明細書で使用した用語「対象の遺伝子」、「所望の配列」、「対象のポリヌクレオチド」または「所望の遺伝子」は、同じ意味を有し、そして対象の産物をコードする任意の長さのポリヌクレオチド配列をいう。選択配列は、完全長または切断短縮された遺伝子、融合またはタグ化遺伝子であり得、そしてｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＤＮＡ断片であり得る。それは天然配列、すなわち天然に存在する形態（群）であり得るか、または突然変異または所望のように別様に改変され得る。これらの改変は、選択宿主細胞においてコドン使用を最適化するためのコドン最適化、ヒト化またはタグ化を含む。さらに、それらは、シス作用部位、例えば（潜在性）スプライスドナー、アクセプター部位および分岐点、ポリアデニル化シグナル、ＴＡＴＡボックス、カイ部位、リボソーム進入部位、反復配列、二次構造（例えばステムループ）、転写因子または他の調節因子のための結合部位、制限酵素部位などの除去または付加を含み得、これによりちょうどいくつかの、しかし限定的ではない例が得られる。選択配列は、分泌された、細胞質の、核の、膜結合のまたは細胞表面のポリペプチドをコードし得る。
【００６４】
本文書の範囲内において用語「機能的連結」、「機能的に連結した」または「作動可能に連結した」は、２つ以上の核酸配列または配列エレメントが、その意図する様式でそれらが機能することを可能とするように位置することを意味する。例えば、プロモーター／エンハンサーまたはターミネーターは、シス位で連結された遺伝子配列の転写を制御または変調できる場合に、コード遺伝子配列に機能的に連結されている。一般的にであって必ずしもではないが、機能的に連結しているＤＮＡ配列は連続しており、そして２つのポリペプチドコード領域を接続する必要がある場合または分泌シグナルペプチドの場合、連続しリーディングフレーム内にある。しかしながら、作動可能に連結されたプロモーターは一般的に上流に位置するかまたは作動可能に連結されたターミネーターは一般的にコード配列の下流に位置するが、それは必ずしもそれと連続しない。エンハンサーは、コード配列の転写を増加させる限り、連続する必要はない。このためにそれらはコード配列の上流または下流に、さらにはいくらかの距離を置いて位置し得る。ポリアデニル化部位は、転写がコード配列を通ってポリアデニル化シグナルへと進行するように、コード配列の３’末端に位置するならば、コード配列と作動可能に連結されている。連結は、当分野において公知の組換え法、例えばＰＣＲ法を使用することによって、適切な制限酵素部位でのライゲーションによってまたはアニーリングによって達成される。合成オリゴヌクレオチドリンカーまたはアダプターを、適切な制限酵素部位が存在しないならば、従来の慣行に従って使用することができる。
【００６５】
本明細書で使用した用語「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」または「ＤＮＡ配列」は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド並びにその断片および部分、並びに、一本鎖または二本鎖であり得、センスまたはアンチセンス鎖を示し得る、ゲノムまたは合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡをいう。配列は、非コード配列、コード配列またはその両方の混合物であり得る。本発明の核酸配列は、当業者に周知の標準的な技術を使用して調製することができる。
【００６６】
用語「コードする（encoding）」または「コードする（coding）」は、規定のヌクレオチド（すなわちｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、他のＲＮＡ分子）またはアミノ酸の配列およびそれに由来する物学的特性を有する、生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび巨大分子の合成のための鋳型として作用する、核酸、例えば染色体中の遺伝子またはｍＲＮＡにおける特定のヌクレオチド配列の固有の特性をいう。従って、所望のタンパク質が、ｍＲＮＡの転写およびその後の翻訳によって細胞または別の生物系において産生されるならば、遺伝子はタンパク質をコードしている。遺伝子またはｃＤＮＡのコード鎖（そのヌクレオチド配列はｍＲＮＡ配列に同一であり、そして通常、データバンク、例えばＥＭＢＬまたはGenBankなどの配列表に提供される）、および転写の鋳型として使用される非コード鎖の両方を、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードしているということができる。タンパク質をコードする核酸は、異なるヌクレオチド配列を有するが、遺伝子コードの縮重のためにタンパク質の同じアミノ酸配列をコードする任意の核酸を含む。タンパク質をコードする核酸およびヌクレオチド配列はイントロンを含み得る。配列表では、配列は、ＲＮＡ配列よりもむしろＤＮＡとして提示される。例えば、ＤＮＡとして提示される場合、開始コドンは、ＡＵＧよりもむしろＡＴＧとして提示される。
【００６７】
本発明の脈絡において用語「ｃＤＮＡ」は、遺伝子によって産生されたｍＲＮＡまたは他のＲＮＡの逆転写および典型的には２番目の鎖の合成によって産生されたデオキシリボ核酸をいう。ｃＤＮＡ分子は二本鎖である場合、コード鎖またはセンス鎖および非コード鎖またはアンチセンス鎖の両方を有する。
【００６８】
本明細書で使用した用語「発現」は、宿主細胞内の異種核酸配列の転写および／または翻訳をいう。宿主細胞内における所望の産物の発現レベルは、細胞中に存在する対応するＲＮＡまたはｍＲＮＡの量、あるいは、選択配列によってコードされる所望のポリペプチドの量のいずれかに基づいて決定され得る。例えば、選択配列から転写されるｍＲＮＡは、ノザンブロットハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼＲＮＡ保護、細胞ＲＮＡに対するインサイツハイブリダイゼーション、またはＰＣＲによって定量することができる。選択配列によってコードされるタンパク質は、様々な方法によって、例えばＥＬＩＳＡによって、ウェスタンブロットによって、ラジオイムノアッセイによって、免疫沈降法によって、タンパク質の生物活性をアッセイすることによって、またはタンパク質を免疫染色しその後ＦＡＣＳ解析ＰＣＲすることによって定量することができる。
【００６９】
用語「ポリペプチド」は、「アミノ酸残基配列」または用語「タンパク質」と同義語として使用され、そして任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。これらの用語はまた、グリコシル化、糖化、アセチル化、リン酸化、酸化、アミド化またはタンパク質プロセシングを含むがこれらに限定されるわけではない反応を通じて翻訳後に改変されたタンパク質を含む。改変および変化、例えば他のタンパク質への融合、アミノ酸配列の置換、欠失または挿入を、分子がその生物学的機能活性を維持しながら、ポリペプチドの構造において行なうことができる。例えば、あるアミノ酸配列の置換をポリペプチドまたはその基となる核酸コード配列に行なうことができ、そして類似の特性を有するタンパク質を得ることができる。例えば部位特異的突然変異誘発またはポリメラーゼ連鎖反応により介される突然変異誘発をその根底にある核酸配列に実施することによって、アミノ酸の改変を行うことができる。従って、用語「ポリペプチド」はまた、例えば、免疫グロブリン成分（例えばＦｃ成分）および成長因子（例えばインターロイキン）からなる融合タンパク質を含む。
【００７０】
本明細書に使用した用語「抗体」は、ポリクローナル、モノクローナル、二特異的、多重特異的、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体、単鎖抗体、抗体の抗原結合断片（例えばＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片）、ジスルフィド連結Ｆｖなどを含む。このような抗体は、化学合成、組換えまたはトランスジェニック手段、細胞（例えばハイブリドーマ）培養を介して、または他の手段によって産生され得る。
【００７１】
Ｆａｂ断片（抗原結合断片（Fragment antigen-binding）＝Ｆａｂ）は、隣接する定常領域によって共に保持された両方の鎖の可変領域からなる。これらは、プロテアーゼによる消化によって、例えばパパインを用いて、従来の抗体から形成され得るが、類似のＦａｂ断片はまた、遺伝子工学によってそのうちに産生され得る。さらなる抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片を含み、これは、ペプシンを用いたタンパク質分解的切断によって調製され得る。
【００７２】
遺伝子工学的方法を使用して、重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域のみからなる短縮された抗体断片を産生することが可能である。これらはＦｖ断片（可変断片（Fragment variable）＝可変部分の断片）ともいう。これらのＦｖ断片は、定常鎖のシステインによる２つの鎖の共有結合を欠失しているので、Ｆｖ断片は安定化されていることが多い。短いペプチド断片、例えば１０〜３０アミノ酸の断片、好ましくは１５アミノ酸の断片によって重鎖および軽鎖の可変領域を連結することが有利である。このように、ペプチドリンカーによって連結されたＶＨおよびＶＬからなる単一のペプチド鎖が得られる。この種類の抗体タンパク質は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる。この種類のｓｃＦｖ抗体タンパク質の例は、従来技術から公知である。
【００７３】
近年、多量体の誘導体としてｓｃＦｖを調製するための様々な戦略が開発されている。これは特に、向上した薬物動態および生体分布特性、並びに増加した結合親和力を有する組換え抗体をもたらすためである。ｓｃＦｖの多量体化を達成するために、ｓｃＦｖは、多量体ドメインを有する融合タンパク質として調製された。多量体ドメインは、例えば、ＩｇＧのＣＨ３領域またはコイルドコイル構造（らせん構造）例えばロイシン−ジッパードメインであり得る。しかしながら、ｓｃＦｖのＶＨ／ＶＬ領域間の相互作用が多量体化（例えば、ダイアボディ、トリボディおよびペンタボディ）に使用される戦略もある。ダイアボディによって当業者は、二価のホモ二量体ｓｃＦｖ誘導体を意味する。ｓｃＦｖ分子におけるリンカーを５〜１０アミノ酸に短縮することにより、ＶＨ／ＶＬ鎖間の重ね合わせによるホモダイマーの形成がもたらされる。ダイアボディは、ジスルフィド架橋の取り込みによってさらに安定化され得る。ダイアボディ−抗体タンパク質の例は、従来技術から公知である。
【００７４】
ミニボディによって当業者は、二価のホモ二量体ｓｃＦｖ誘導体を意味する。それは、ヒンジ領域（例えば同様にＩｇＧ１の）およびリンカー領域を介してｓｃＦｖに接続された二量体化領域として、免疫グロブリン、好ましくはＩｇＧ、最も好ましくはＩｇＧ１のＣＨ３領域を含む融合タンパク質からなる。ミニボディ−抗体タンパク質の例は従来技術から公知である。
【００７５】
トリアボディによって当業者は、三価のホモ三量体ｓｃＦｖ誘導体を意味する。ＶＨ−ＶＬがリンカー配列を伴わずに直接融合しているｓｃＦｖ誘導体により三量体の形成がもたらされる。
【００７６】
当業者はまた、二価、三価または四価の構造を有し、ｓｃＦｖに由来するいわゆるミニ抗体をよく知っているだろう。多量体化は、二量体、三量体または四量体コイルドコイル構造によって行なわれる。本発明の好ましい態様において、対象の遺伝子は、前記した所望のポリペプチドのいずれか、好ましくはモノクローナル抗体またはその誘導体もしくは断片をコードしている。
【００７７】
「対象のポリペプチド」、「対象のタンパク質」または「対象の産物」は、タンパク質、ポリペプチド、その断片、ペプチド、融合タンパク質（その全てが選択された宿主細胞において発現できる）を含む。所望のタンパク質は、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用し得および／または治療的もしくは診断的用途を有し得る、例えば、抗体、酵素、サイトカイン、リンホカイン、接着分子、レセプターおよびその誘導体もしくは断片、および任意の他のポリペプチドであり得る。
【００７８】
特に、対象の所望のタンパク質／ポリペプチドまたはタンパク質は、例えば、インスリン、インスリン様成長因子、ｈＧＨ、ｔＰＡ、サイトカイン、例えばインターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、インターフェロン（ＩＦＮ）α、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＦＮω、またはＩＦＮτ、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、例えばＴＮＦαおよびＴＮＦβ、ＴＮＦγ、ＴＲＡＩＬ；Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＣＰ−１、ＶＥＧＦおよびナノボディであるがこれらに限定されるわけではない。また、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用し得および／または治療的もしくは診断的用途を有し得る、エリスロポエチンまたは任意の他のホルモン成長因子および任意の他のポリペプチドの産生も含まれる。本発明による方法はまた、抗体、例えばモノクローナル、ポリクローナル、多重特異的および単鎖抗体、またはその断片、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｃおよびＦｃ’断片、重鎖および軽鎖免疫グロブリンおよびその定常、可変または超可変領域、並びにＦｖおよびＦｄ断片の産生に有利に使用できる。
【００７９】
「対象の産物」はまた、アンチセンスＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボタンパク質の一部である他のＲＮＡまたは他の調節ＲＮＡであり得る。
【００８０】
本発明の方法は、全ての真核生物細胞において実施し得る。細胞および細胞株は、例えば細胞培養液中に存在し得、そして、真核生物細胞、例えば酵母、植物、昆虫または哺乳動物細胞を含むがこれらに限定されるわけではない。例えば、細胞は、卵母細胞、胚幹細胞、造血幹細胞または任意のタイプの分化細胞であり得る。真核生物細胞が哺乳動物細胞である方法が好ましい。より好ましいのは、哺乳動物細胞が、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、ヤギ、ウシ、ヒツジまたはブタ細胞である方法である。バイオ医薬品の産生に好ましい細胞株または「宿主細胞」は、ヒト、マウス、ラット、サルまたはげっ歯類細胞株である。より好ましいのは、ハムスター細胞、好ましくはＢＨＫ２１、ＢＨＫ ＴＫ−、ＣＨＯ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ Ｂ１、ＣＨＯ−ＳおよびＣＨＯ−ＤＧ４４細胞またはこのような細胞株のいずれかの誘導体／子孫である。特に好ましいのは、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＳおよびＢＨＫ２１であり、さらにより好ましいのはＣＨＯ−ＤＧ４４およびＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞である。さらに、マウスミエローマ細胞、好ましくはＮＳ０およびＳｐ２／０細胞またはこのような細胞株のいずれかの誘導体／子孫もまた、バイオ医薬品タンパク質の産生細胞株として知られている。本発明の意味で使用できるマウスおよびハムスター細胞の例を表１に要約する。
【００８１】
【表１】
0005481478.tif 000002
【００８２】
宿主細胞は、血清非含有条件下で、そして場合により全く動物起源のタンパク質／ペプチドが含まれない培地中で確立、適合、そして完全に培養される場合に最も好ましい。市販されている培地、例えばHam's F12(Sigma, Deisenhofen, Germany)、RPMI-1640(Sigma)、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM; Sigma)、最小必須培地(MEM; Sigma)、イスコーブ改変ダルベッコ培地(IMDM; Sigma)、CD-CHO(Invitrogen, Carlsbad, CA)、CHO-S-SFMII(Invtirogen)、血清非含有CHO培地(Sigma)、タンパク質非含有CHO培地(Sigma)、EX-CELL培地(SAFC)、CDM4CHOおよびSFM4CHO(HyClone)は例示的な適切な栄養溶液である。どの培地も必要であれば様々な化合物を補充し得、その例は、ホルモンおよび／または他の成長因子（例えばインスリン、トランスフェリン、上皮増殖因子、インスリン様成長因子）、塩（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、ホスフェート）、緩衝液（例えばＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えばアデノシン、チミジン）、グルタミン、グルコースまたは他の等価なエネルギー源、抗生物質、微量元素である。任意の他の必要な補助物質もまた、当業者には公知であろう適切な濃度で含められ得る。本発明において血清非含有培地の使用が好ましいが、適切な量の血清の補充された培地もまた宿主細胞の培養に使用することができる。選択可能な遺伝子を発現している遺伝子的に改変された細胞の増殖および選択のために、適切な選択剤が培養培地に加えられる。
【００８３】
遺伝子的に改変された細胞、組換えまたはトランスジェニック細胞をもたらす、ポリヌクレオチド配列または発現ベクターを用いての真核生物宿主細胞の「トランスフェクション」は、当業者に周知の任意の方法によって実施することができる。トランスフェクション法は、リポソームにより媒介されるトランスフェクション、リン酸カルシウム共沈降、電気穿孔、ポリカチオン（例えばＤＥＡＥデキストラン）により媒介されるトランスフェクション、プロトプラスト融合、マイクロインジェクションおよびウイルス感染を含むがこれらに限定されるわけではない。好ましくは、トランスフェクションは安定なトランスフェクションである。特定の宿主細胞株およびタイプにおいて異種遺伝子またはポリヌクレオチドの最適なトランスフェクション頻度および発現を提供するトランスフェクション法が好ましい。適切な方法は、慣用的な手順によって決定することができる。安定なトランスフェクト体のために、構築物は、宿主細胞内で安定に維持されるために、宿主細胞ゲノムまたは人工染色体／ミニ染色体に組み込まれているか、またはエピソームに位置している。対象の産物（群）を発現している遺伝子的に改変された細胞の作製のために、全ての必要とされる異種遺伝子は、単一ベクターまたはポリヌクレオチド配列上にモノまたはマルチシストロン転写ユニットで位置し得る。この場合、宿主細胞は、単一ベクターまたはポリヌクレオチド配列でトランスフェクトされる。異種遺伝子はまた、異なるベクターまたはポリヌクレオチド配列上に位置することができる。この場合、宿主細胞は、全てのベクターまたはポリヌクレオチド配列で同時トランスフェクトされ、および／または対象の遺伝子をコードしているベクターまたはポリヌクレオチド配列で連続的に何回かトランスフェクトされる。
【００８４】
定義によって、宿主細胞に挿入されるあらゆるポリヌクレオチド配列またはあらゆる遺伝子およびそれによりコードされるそれぞれのタンパク質またはＲＮＡは、宿主細胞に対して「異種」、「異種配列」、「異種遺伝子」、「異種コード配列」、「導入遺伝子」または「異種タンパク質」といわれる。これは、導入しようとする配列または導入しようとする遺伝子が、宿主細胞の内因性配列または内因性遺伝子と同一である場合でさえ適用される。例えば、ハムスター宿主細胞に導入されるハムスターアクチン遺伝子は、定義によって異種遺伝子である。
【００８５】
用語「内因性」は、細胞または生物に天然に含まれることを意味する。内因性遺伝子は、従って、操作されていない野生型細胞のゲノムに見られる遺伝子である。
【００８６】
用語「選択マーカー遺伝子」は、対応する選択剤の存在下でその遺伝子を有する細胞のみを特異的に正にまたは負に選択することのできる遺伝子をいう。説明のために、抗生物質耐性遺伝子を、対応する抗生物質の存在下でその遺伝子で形質転換された宿主細胞を正に選択することを可能とする正に選択可能なマーカー遺伝子として使用でき；形質転換されていない宿主細胞は、選択培養条件下で増殖または生存できないだろう。選択可能なマーカーは、正、負または二機能性であり得る。正に選択可能なマーカーは、薬物に対する耐性を付与することによって、マーカーを有する細胞の選択を可能とするか、または宿主細胞における代謝または異化の欠陥を補う。これとは対照的に、負の選択マーカーは、マーカーを有する細胞が選択的に排除されることを可能とする。例えばマーカーとしてＨＳＶ−ｔｋ遺伝子を使用することにより、細胞は、アシクロビルまたはガンシクロビルなどの薬剤に感受性となる。本明細書で使用した選択可能なマーカー遺伝子（増幅可能な選択可能な遺伝子を含む）は、コードされる産物が選択特性を維持している限り、天然の選択可能なマーカー遺伝子の組換え操作された突然変異体および変異体、断片、機能的等価体、誘導体、相同体および融合体を含む。有用な誘導体は、一般に、選択特性に関連した選択可能なマーカーの領域またはドメインにおいて実質的な配列類似性（アミノ酸レベルで）を有する。当業者には周知の様々なマーカー遺伝子が記載され、これには参照により本明細書に組み入れられる二機能性（すなわち正／負）マーカーが含まれる(例えばWO 92/08796およびWO 94/28143参照)。例えば、真核生物細胞で一般的に使用される選択可能な遺伝子は、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミンシンセターゼ、アスパラギンシンセターゼのための遺伝子、およびネオマイシン（Ｇ４１８）、ピューロマイシン、ヒスチジノールＤ、ブレオマイシンおよびフレオマイシンに対する耐性をコードする遺伝子を含む。
【００８７】
「選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子」は、通常、そうした条件下で真核生物細胞の増殖に必要とされる酵素をコードする。例えば、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子は、ＤＨＦＲをコードし得、その遺伝子は、それでトランスフェクトされた宿主細胞が選択剤のメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で増殖される場合に増幅される。従って、本明細書に記載した任意の方法に従って遺伝子的に改変した宿主細胞が本発明によって包含され、選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子は、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、グルタミンシンセターゼ、ＣＡＤ、アデノシンデアミナーゼ、アデニル酸デアミナーゼ、ＵＭＰシンセターゼ、ＩＭＰ５'−デヒドロゲナーゼ、キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ＨＧＰＲＴアーゼ、チミジンキナーゼ、チミジレートシンセターゼ、Ｐ糖タンパク質１７０、リボヌクレオチドレダクターゼ、アスパラギンシンセターゼ、アルギノスクシネートシンセターゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、ＨＭＧ ＣｏＡレダクターゼ、アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ、トレオニル−ｔＲＮＡシンセターゼまたはＮａ＋Ｋ＋−ＡＴＰアーゼの機能を有するポリペプチドをコードする。表２に列挙した例示的な選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子の概説については、Kaufman, Methods in Enzymology, 185, 537 - 566, 1990を参照されたい。
【００８８】
１つの特定の選択可能で増幅可能なマーカー遺伝子は、プリンの生合成に必要とされるジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする遺伝子である。ＤＨＦＲ遺伝子を欠失した細胞は、プリンの欠失した培地上では増殖しないだろう。それ故、ＤＨＦＲ遺伝子は、プリンの欠失した培地中で増殖しているこのような細胞において遺伝子を選択および増幅するために有力な選択可能なマーカーとして有用である。ＤＨＦＲ遺伝子と共に使用される選択剤はメトトレキセート（ＭＴＸ）である。
【００８９】
別の選択および／または増幅マーカーは、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）遺伝子である。ＧＳ遺伝子は、アミノ酸グルタミンの合成に必要とされるグルタミンシンセターゼ酵素をコードする。ＧＳ遺伝子を欠失または低い内因性ＧＳレベルで発現している細胞は、グルタミンを含まない培地中では増殖しないだろう。それ故、ＧＳ遺伝子は、グルタミンを含まない培地中で増殖しているこのような細胞において遺伝子を選択および増幅するために有力な選択可能なマーカーとして有用である。ＧＳ遺伝子と共に使用される選択剤はメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）である。
【００９０】
【表２】
0005481478.tif 000003
0005481478.tif 000004
【００９１】
選択はまた、例えば細胞表面マーカー、細菌β−ガラクトシダーゼまたは蛍光タンパク質（例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびAequorea victoriaおよびRenilla reniformisまたは他の種由来のその変異体；赤色蛍光タンパク質、蛍光タンパク質および非バイオルミネッセント種（例えばDiscosoma sp., Anemonia sp., Clavularia sp., Zoanthus sp.）由来のその変異体を使用して蛍光標識セルソーター（ＦＡＣＳ）によって行ない、組換え細胞を選択し得る。
【００９２】
用語「選択剤」は、特定の選択可能な遺伝子が欠損している宿主細胞の増殖または生存を妨げる物質をいう。例えば、トランスフェクトされた細胞においてＡＰＨ（アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ）のような抗生物質耐性遺伝子の存在を選択するために、抗生物質のジェネティシン（Ｇ４１８）が使用される。選択剤はまた、依拠する選択可能なマーカー遺伝子が増幅可能で選択可能なマーカーであるならば、増幅可能な遺伝子のコピーを増幅するための薬剤として本明細書の目的に定義されている「増幅剤」を含むことができる。例えば、ＭＴＸは、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅に有用な選択剤である。
【００９３】
前記の方法のさらなる態様は、対象の遺伝子（群）によってコードされそして前記宿主細胞において発現されているポリペプチド（群）／産物（群）が、培養培地に分泌されるならば、細胞または細胞培養上清から単離される方法に関する。
【００９４】
前記産生細胞は、所望の遺伝子（群）の発現および細胞および／または細胞上清からの対象のタンパク質の単離に好ましい条件下で、血清を含まない培地および懸濁培養液中で優先的に培養される。好ましくは、対象のタンパク質は、分泌ポリペプチドとして培養培地から回収されるか、または分泌シグナルを伴わずに発現されているならば宿主細胞の溶解液から回収することができる。対象のタンパク質の実質的に均一な調製物が得られるように、他の組換えタンパク質、宿主細胞タンパク質および混入物から、対象のタンパク質を精製することが必要である。第一ステップとして細胞および／または粒子状の細胞細片が培養培地または溶解液から除去されることが多い。その後、対象の産物が、混入している可溶性タンパク質、ポリペプチドおよび核酸から、例えば、イムノアフィニティまたはイオン交換カラムでの分画、エタノール沈降、逆相ＨＰＬＣ、セファデックスクロマトグラフィー、シリカまたはカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥでのクロマトグラフィーによって精製される。一般に、当業者に宿主細胞によって発現される異種タンパク質の精製の仕方を教義する方法は、当技術分野において周知である。
【００９５】
本発明の実践は、特記しない限り、当業者の技術範囲内である従来の細胞生物学、分子生物学、細胞培養、免疫学などの技術を使用する。これらの技術は、本文献に完全に開示されている。
【００９６】
以下の実施例は制限するものではない。それらは単に本発明の可能な態様を示しているだけである。当業者は、他の態様にそれを適用するために条件を容易に調整し得る。
【００９７】
実施例
略称
ＡＰ：アルカリホスファターゼ
ＢＧＨ：ウシ成長ホルモン
ｂｐ：塩基対
ＣＨＯ：チャイニーズハムスター卵巣
ＤＨＦＲ：ジヒドロ葉酸レダクターゼ
ＥＬＩＳＡ：酵素結合免疫吸着アッセイ
ＦＡＣＳ：蛍光標識セルソーター
ＨＧＨ：ハムスター成長ホルモン
ＨＴ：ヒポキサンチン／チミジン
ＨＰＲＯ：セイヨウワサビペルオキシダーゼ
ＩｇＧ：免疫グロブリン
ＩＲＥＳ：配列内リボソーム進入部位
ｋｂ：キロベース
ｍＡｂ：モノクローナル抗体
ＭＴＸ：メトトレキセート
ＮＰＴ：ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ
ｎｔ：ヌクレオチド
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水
ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応
ＳＥＡＰ：分泌アルカリホスファターゼ
ｓＩＣＡＭ：可溶性細胞内接着分子
ＵＴＲ：非翻訳領域
【００９８】
材料および方法
細胞培養
ＣＨＯ−ＤＧ４４／ｄｈｆｒ−/−細胞を、ヒポキサンチンおよびチミジン（ＨＴ）の補充された血清を含まない培地ＣＨＯ-Ｓ−ＳＦＭＩＩ（Invitrogen）中の懸濁液で永久的に増殖させる。細胞を、５％ＣＯ２を含む加湿雰囲気中で３７℃で細胞培養フラスコ中でインキュベートする。細胞数並びに細胞生存率を、ＣＡＳＹ１細胞カウンター(Schaerfe System, Germany)、セデックス(Innovatis AG, Germany)を用いて、またはトリパンブルー色素排除を介して決定する。細胞を、２〜３日間に新しい培地中で１〜３×１０５細胞／mLの濃度で播種する。
【００９９】
トランスフェクション
ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞のトランスフェクションを、リポフェクタミンプラス試薬(Invitrogen)を使用して実施する。０．８mLのヒポキサンチン／チミジン（ＨＴ）補充ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地中に１回のトランスフェクションあたり６×１０５個の対数増殖期にある細胞を、６ウェルチャンバーのウェルに播種する。容量２００μL中のプラスミドＤＮＡ、４μLのリポフェクタミンおよび６μLのプラス試薬の混合物を各トランスフェクションについて、製造業者のプロトコルに従って作製し細胞に添加する。３時間インキュベーションした後、２mLのＨＴ補充ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地を添加する。
【０１００】
一過性トランスフェクションを３連で行ない、そして上清および細胞をトランスフェクションから２日後に回収する。安定にトランスフェクトされたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞のＤＨＦＲに基づいた選択のために、培地を、トランスフェクションから４８時間後にＨＴを含まないＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地と交換する。ＤＨＦＲに基づいた遺伝子増幅は、増幅選択剤として５〜２０００nMの範囲のＭＴＸ(Sigma)を培地に添加することによって達成される。同時トランスフェクションの場合、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ−ＤＧ４４細胞のＤＨＦＲおよびＮＰＴに基づいた選択は、細胞をトランスフェクションから４８時間後に、２００〜４００μg/mLの濃度のＧ４１８（Invitrogen）の補充されたＨＴを含まないＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ培地に導入することによって行なわれる。
【０１０１】
発現ベクター
真核生物発現ベクターは、ｐＡＤ−ＣＭＶ１ベクター(WO 9201055)の誘導体であり、ＣＭＶプロモーター／エンハンサーによって駆動される異種遺伝子の構成的発現を媒介する。対象の遺伝子の転写物の終結およびポリアデニル化のために、ベクターは、ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル（配列番号１１）またはＢＧＨポリアデニル化シグナル（配列番号１２）のいずれかを含む。ｐＢＩＤベクターは、増幅可能な選択マーカーとしてＤＨＦＲミニ遺伝子をコードし（例えばEP 0 393 438参照）、一方、ｐＢＩＮベクターは、ＳＶ４０初期プロモーターの制御下に選択マーカーとしてＮＰＴ遺伝子およびチミジンキナーゼポリアデニル化シグナルをコードする（図１）。
【０１０２】
ヒトｓＩＣＡＭ、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４アイソタイプ）またはＦｃ融合タンパク質をコードする対象の遺伝子を、プロモーターとポリアデニル化シグナルの間に位置するマルチクローニングサイトを使用してベクターにクローニングする。
【０１０３】
ＥＬＩＳＡ
ｓＩＣＡＭ力価を、２つの自家製のｓＩＣＡＭ特異的モノクローナル抗体を使用して標準的なプロトコルを用いてＥＬＩＳＡによって定量し（例えば、US patents No. 5,284,931及び5,475,091に記載）、ここで抗体の一方はＨＲＰＯコンジュゲート抗体である。精製されたｓＩＣＡＭタンパク質を標準として使用する。
【０１０４】
ｍＡｂ力価を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ断片(Dianova)およびＡＰコンジュゲートヤギ抗ヒトκ軽鎖抗体(Sigma)を使用して標準的なプロトコルを用いてＥＬＩＳＡによって定量する。発現されたｍＡｂと同じアイソタイプの精製ｍＡｂ抗体を標準として使用する。
【０１０５】
試料を、スペクトル・フルオア・プラス・リーダー（Spectra Fluor Plus reader）(TECAN, Crailsheim, Germany)を使用して分析する。
【０１０６】
細胞産生性（pg／細胞／日）を式ｐｇ／（（Ｃｔ−Ｃｏ）ｔ／ｌｎ（Ｃｔ−Ｃｏ））を用いて計算し、「Ｃｏ」は播種時の細胞数であり、「Ｃｔ」は収集時の細胞数であり、「ｔ」は培養期間である。
【０１０７】
ＳＥＡＰアッセイ
ＳＥＡＰ活性を、製造業者のプロトコルに従ってＳＥＡＰリポーター遺伝子アッセイを用いて決定する(Roche Diagnostics)。
【０１０８】
実施例１：ハムスター成長ホルモン（ＨＧＨ）の転写終結領域の単離およびクローニング
ＣＨＯ−ＤＧ４４ゲノム(チャイニーズハムスター、Cricetus griseus)からの成長ホルモン遺伝子の完全なポリアデニル化シグナル領域の単離のために、アダプターが結合したゲノムＣＨＯ−ＤＧ４４ＤＮＡは、ネステッドＰＣＲにおいて鋳型として作用する。一次ＰＣＲを、それぞれアダプター配列および成長ホルモン遺伝子配列と相補性を有するプライマー組合せ体を用いて行なう。遺伝子特異的プライマーＧＨ for1（５’−ＧＡＧＡＣＣＴＡＣＣＴＧＣＧＧＧＴＣＡ  ＴＧＡ−３’；配列番号１）は、シリアンハムスターの成長ホルモンのｃＤＮＡ配列(Mesocricetus auratus; Genbank S66299)に基づいて設計され、そして終止コドンの３５ｂｐ上流に位置する。二次ＰＣＲを、内部アダプタープライマーと、ＧＨ for1プライマー位置のすぐ下流に位置する２番目のネステッド遺伝子特異的プライマーＧＨ for2（５’−ＡＧＴＧＣＣＧＴＣＧＣＴＴＴＧＴＧＧＡＡＡ  Ｇ−３’；配列番号２）の組合せを用いて一次ＰＣＲ産物上で行なう。得られたＤＮＡ断片をＴＡクローニングベクター(Invitrogen)にサブクローニングし、そしてさらに配列解析によって解析する。最長のＤＮＡ断片は、ＧＨ for2プライマー配列とは別に、さらにコード領域の３'末端の１３ｂｐ、続く終止コドン、およびCricetus griseusの成長ホルモンの３'非翻訳領域の３２４ｂｐ（図２；配列番号７）を含む。
【０１０９】
合計して３２４ｂｐを有するちょうど３’非翻訳領域（配列番号８）を得るために、別のＰＣＲを、プライマーGH Sfi for1（配列番号３）およびGH Xba rev1 (配列番号４）を使用して行なう。その結果、ＴＡベクターにサブクローニングされた上記の３６２ｂｐＤＮＡ断片（配列番号７）は、ＰＣＲの鋳型として作用する。増幅した配列（配列番号８）は、様々な種の成長ホルモン３'非翻訳領域と以下の相同性を有する：シリアンハムスターMesocricetus auratus (Genbank S66299)の配列に対して７２．１％、Mus musculus (Genbank Z46663)の配列に対して７１．６％、Rattus norvegicus (Genbank V01239)の配列に対して６１％、およびBos taurus (Genbank J00008)のＢＧＨ配列に対して５０．４％（図３）。
【０１１０】
ＰＣＲに基づいたアプローチはまた、単離された３’非翻訳領域の３’末端が様々に欠失したサブクローンの作製に使用される。プライマー組合せ体GH Sfi for 1（配列番号３）およびGH Xba rev2（配列番号５）を使用して、３'非翻訳領域の１８９ｂｐ断片を作製し（配列番号９）、そしてプライマー組合せ体GH Sfi for 1 (配列番号３)およびGH Xba rev3（配列番号６）を用いて１１３ｂｐ（配列番号１０）亜断片を作製する。従って、３’非翻訳領域の全ての増幅断片が、終止コドンの後の最初のヌクレオチドに対応する同一５’末端および可変３’末端を有する（図４）。
【０１１１】
ＰＣＲ産物をＳｆｉＩおよびＸｂａＩで消化し、そして得られる制限断片を使用して、ヒトｓＩＣＡＭをコードするベクターｐＪＲ１０６におけるＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル配列を置換する（図５）。得られたベクターｐＪＲ１３１、ｐＪＲ１３４およびｐＪＲ１３５は、それぞれ３２４ｂｐ（配列番号８）、１８９ｂｐ（配列番号９）および１１３ｂｐ（配列番号１０）のサイズを有する、短いＨＧＨと呼ばれる、Cricetus griseusの成長ホルモンに由来するポリアデニル化シグナル配列を現在含む（図５）。
【０１１２】
実施例２：ｓＩＣＡＭの一過性発現に対するＨＧＨポリアデニル化シグナル配列の影響
対象の遺伝子ｓＩＣＡＭの発現に対するCricetus griseus成長ホルモン（ＨＧＨ）由来のポリアデニル化シグナル配列の影響を評価するために、染色体組込み部位とは独立的に一過性トランスフェクションを行なう。ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を、ハムスター成長ホルモンの３’ＵＴＲの３２４ｂｐ（＝ＨＧＨ、配列番号８）を含むプラスミドｐＪＲ１３１でトランスフェクションする（図５）。ＳＶ４０後期（ｐＪＲ１０６）またはＢＧＨ（ｐＪＲ１１０）ポリアデニル化シグナル配列のいずれかを含むベクターを対照として使用する（図５）。異なる終結配列は別にして、ｓＩＣＡＭの発現のための様々なベクターの遺伝子的構成は同一である。
【０１１３】
上清をトランスフェクションから２日後に回収し、そしてｓＩＣＡＭ力価をＥＬＩＳＡを使用して決定する。トランスフェクション効率を補正するために、細胞を、分泌アルカリホスファターゼをコードするプラスミドｐＣＭＶ−ＳＥＡＰ（１００ngＤＮＡ／トランスフェクション反応）を用いて同時トランスフェクションし、そしてＳＥＡＰ活性を測定する。
【０１１４】
図６は、２連で行なった２つの独立した一過性トランスフェクションシリーズのデータを示す。驚くべきことに、最も高いｓＩＣＡＭ発現は、ハムスターの成長ホルモン遺伝子に由来するポリアデニル化シグナル配列を用いて得られる。力価は、ＢＧＨポリアデニル化シグナルを含むベクターｐＪＲ１１０を用いてトランスフェクションした細胞と比較して２１％まで増加し（トランスフェクションシリーズ１番）、そしてＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナルを含むベクターｐＪＲ１０６を用いてトランスフェクションした細胞と比較して４０％まで増加する（トランスフェクションシリーズ１番）。
【０１１５】
実施例３：ＩｇＧ４抗体の一過性発現に対するＨＧＨポリアデニル化シグナルの影響
対象の遺伝子であるヒト化ＩｇＧ４／κｍＡｂの発現に対するCricetus griseus成長ホルモン（ＨＧＨ）由来のポリアデニル化シグナル配列の影響を評価するために、染色体組込み部位とは独立的に一過性トランスフェクションを行なう。ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を、ベクター組合せ体ｐＢＩＤ／ＩｇＧ４およびｐＢＩＮ／κを用いて同時トランスフェクションする。両方のベクターが、ポリアデニル化シグナル配列としてハムスター成長ホルモンの３’ＵＴＲの３２４ｂｐ（＝ＨＧＨ；配列番号８）を含む。対照として、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を、ＢＧＨポリアデニル化シグナルを含むベクター組合せｐＢＩＤ−Ｂ／ＩｇＧ４およびｐＢＩＮ−Ｂ／κを用いて同時トランスフェクションする（基本的なベクターについては図１参照）。異なる終結配列は別にして、ＩｇＧ４／κｍＡｂの発現のための様々なベクターの遺伝子的構成は同一である。
【０１１６】
上清をトランスフェクションから２日後に回収し、そしてＩｇＧ４力価をＥＬＩＳＡを使用して決定する。１つのベクター組合せ体につき６つの細胞プールをトランスフェクションする。トランスフェクション効率を補正するために、細胞を、分泌アルカリホスファターゼをコードするプラスミドｐＣＭＶ−ＳＥＡＰ（１００ngＤＮＡ／トランスフェクション反応）を用いて同時トランスフェクションし、そしてＳＥＡＰ活性を測定する。
【０１１７】
驚くべきことに、ＨＧＨポリアデニル化シグナル配列を用いて得られた力価は、ＢＧＨポリアデニル化シグナルよりも平均して３５％高い（図７）。
【０１１８】
実施例４：異なるＨＧＨ変異体の試験
Cricetus griseus成長ホルモン由来の３２４ｂｐのＨＧＨ配列（配列番号８）の２つの３’欠失クローンをＰＣＲによって作製し、そしてｓＩＣＡＭ遺伝子の下流にポリアデニル化シグナル配列として配置する。得られるベクターｐＪＲ１３４およびｐＪＲ１３５（図５）は、共通の５’末端位置を有する、それぞれより短い伸長鎖の１８９ｂｐ（配列番号９）および１１３ｂｐ（配列番号１０）のＨＧＨ配列を含む（図４）。
【０１１９】
対象の遺伝子であるｓＩＣＡＭの発現に対するＨＧＨ欠失変異体の影響を評価するために、染色体組込み部位とは独立的に一過性トランスフェクションを行なう。ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を、ベクターｐＪＲ１３４およびｐＪＲ１３５を用いてトランスフェクションする。３２４ｂｐのＨＧＨ配列を含むベクターｐＪＲ１３１を対照として使用する（図５）。異なる終結配列は別にして、ｓＩＣＡＭの発現のための様々なベクターの遺伝子的構成は同一である。
【０１２０】
上清をトランスフェクションから２日後に回収し、そしてｓＩＣＡＭ力価をＥＬＩＳＡを使用して決定する。トランスフェクション効率を補正するために、細胞を、分泌アルカリホスファターゼをコードするプラスミドｐＣＭＶ−ＳＥＡＰ（１００ngＤＮＡ／トランスフェクション反応）を用いて同時トランスフェクションし、そしてＳＥＡＰ活性を測定する。
【０１２１】
図８は、２連で行なった２つの独立した一過性トランスフェクションシリーズのデータを示す。両方のＨＧＨ欠失変異体が、ｓＩＣＡＭ発現レベルの減少をもたらす。発現ベクターｐＪＲ１３４に含まれる１８９ｂｐのＨＧＨ配列により、２３％までのより中程度の減少がもたらされる。従って、１８９ｂｐ断片は、ＢＧＨおよびＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナルと同等なパフォーマンスを示す（実施例２および３参照）。しかしながら、発現ベクターｐＪＲ１３５に含まれる１１３ｂｐの最も短いＨＧＨ配列により、７８％までのｓＩＣＡＭの発現の減少がもたらされる。これは、対象の遺伝子の効率的な発現に寄与する配列が、配列番号８の１９０〜３２４ｂｐのＨＧＨ領域に位置することを示す。
【０１２２】
実施例５：ＨＧＨポリアデニル化シグナルを使用した高いレベルでのタンパク質の安定な発現
ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞を、様々なアイソタイプのｍＡｂ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４）の重鎖および軽鎖、またはＦｃ融合タンパク質（Ｆｃ部分は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２由来である）のいずれかをコードするベクター組合せ体を用いて同時トランスフェクションする。発現のために使用した基本的なベクターｐＢＩＤおよびｐＢＩＮ（図１）は、対象の遺伝子の下流に位置するポリアデニル化シグナル配列として３２４ｂｐのＨＧＨ配列（配列番号８）を含む。安定な細胞プールを、トランスフェクションから２日後にＤＨＦＲおよびＮＰＴに基づいた選択を使用して選択する。安定なトランスフェクション体の最初の選択の後に、初回に培養培地に１００nMのＭＴＸを添加し、続いて８００nMのＭＴＸを添加することによって、２回の連続的なＤＨＦＲを介した遺伝子増幅ステップを行なう。希釈クローニングまたは９６ウェルプレートのウェルへの単一細胞のＦＡＣＳに基づいた沈着のいずれかによって単一細胞クローンが得られる。
【０１２３】
実験データは、安定なトランスフェクション体における対象のタンパク質の高い発現は、Cricetus griseus由来のＨＧＨポリアデニル化シグナルを使用して達成することができることを示す。１０〜４５ｐｇ/細胞/日の範囲の特異的産生性および６.３ｇ/Ｌまでの流加プロセスにおける力価を有する細胞プールおよび細胞クローンが得られる（図９）。
【０１２４】
【表３】
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【図１】
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【図５】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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