(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
官能基末端のチオールとフェロセン基末端のチオールとを含む第１の溶液に、電極を浸漬する第１の工程と、
前記第１の工程後、水素末端またはヒドロキシル基末端のチオールを含む第２の溶液に、前記電極を浸漬する第２の工程と、
前記第２の工程後、不活性ガス雰囲気下で前記電極をアニールする第３の工程と、
前記第３の工程後、標的物質に対する特異的結合性を、前記官能基に付与する第４の工程と、を含む、センサの製造方法。
【請求項２】
前記官能基末端のチオールが、ニトリロトリ酢酸末端のチオール、カルボキシル基末端のチオールおよびアミノ基末端のチオールからなる群から選択される少なくとも一種を含む、請求項１に記載のセンサの製造方法。
【請求項３】
前記第１の溶液は、エチレングリコール末端のチオールをさらに含む、請求項１または２に記載のセンサの製造方法。
【請求項４】
前記第１の溶液中における前記フェロセン基末端のチオールに対する前記官能基末端のチオールのモル比は、０．０１以上５以下である、請求項１から３のいずれか１項に記載のセンサの製造方法。
【請求項５】
電子伝達体を含む液に用いるセンサの製造方法であって、
前記電子伝達体が、フェロシアンイオン、ヘキサアミンルテニウム、塩化鉄および、フェロセン誘導体からなる群から選択される少なくとも一種を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載のセンサの製造方法。
【請求項６】
電極と、
前記電極上に設けられており、標的物質に対する特異的結合性を有する官能基末端のチオール、フェロセン基末端のチオールおよび、水素末端またはヒドロキシル基末端のチオールを含む混合自己組織化単分子膜と、を備える、センサ。
【請求項７】
前記官能基末端のチオールが、ニトリロトリ酢酸末端のチオール、カルボキシル基末端のチオールおよびアミノ基末端のチオールからなる群から選択される少なくとも一種を含む、請求項６に記載のセンサ。
【請求項８】
前記混合自己組織化単分子膜は、エチレングリコール末端のチオールをさらに含む、請求項６または７に記載のセンサ。
【請求項９】
電子伝達体を含む液に用いるセンサであって、
前記電子伝達体が、フェロシアンイオン、ヘキサアミンルテニウム、塩化鉄および、フェロセン誘導体からなる群から選択される少なくとも一種を含む、請求項６から８のいずれか１項に記載のセンサ。
【請求項１０】
下記の測定条件下における、ピーク電流値の変動率が１．０％以下である、請求項６から９のいずれか１項に記載のセンサ。
前記ピーク電流値は、フェロシアン化カリウムを含む測定溶液中でスクウェアウェーブボルタンメトリー法を用いて、２０回繰り返して電流値を測定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、センサおよびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
非特許文献１には、標的物質と受容体との特異的結合を利用して、標的物質の結合の有無により、電流値が変化することを検知するセンサが記載されている。このセンサの電極表面には、ニトリロトリ酢酸（以下、ＮＴＡと称する）末端のチオールの自己組織化単分子膜（以下、ＳＡＭと称することもある）が形成されている。このＮＴＡには、標的物質と結合する受容体が固定されている。同文献によれば、受容体に標的物質が結合すると、受容体の立体構造が変化して、受容体層におけるフェロシアンイオンの透過性が低下する。このフェロシアンイオンが電極に作用することにより、検知される電流値が減少する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Ｍｕｒａｔａ．Ｍ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００３  ＶＯＬ．１９，１５６９−１５７３
【非特許文献２】Ｇｅｏｒｇｅ  Ｂ．  Ｓｉｇａｌ  ｅｔ  ａｌ，  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １９９６，  ＶＯＬ．６８  ＮＯ．３，４９０−４９７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、発明者らの実験によれば、ＮＴＡ末端を有するチオールのＳＡＭを形成した金電極はフェロシアンイオンの透過性が極めて低いため、標的物質と受容体との結合が生じていない状態でも、フェロシアンイオンの反応電流が計測されないことがあった。このような測定値（電流値）のバラツキにより、非特許文献１の技術においては、標的物質の結合状態と非結合状態との電流値変化のＳ／Ｎ比が小さく、標的物質の結合に起因する電流変化を検知することができないことがあった。
【０００５】
本発明の目的は、測定値のバラツキが抑制されたセンサおよびその製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明によれば、
官能基末端のチオールとフェロセン基末端のチオールとを含む第１の溶液に、電極を浸漬する第１の工程と、
前記第１の工程後、水素末端またはヒドロキシル基末端のチオールを含む第２の溶液に、前記電極を浸漬する第２の工程と、
前記第２の工程後、不活性ガス雰囲気下で前記電極をアニールする第３の工程と、
前記第３の工程後、標的物質に対する特異的結合性を、前記官能基に付与する第４の工程と、を含む、センサの製造方法が提供される。
【０００７】
本発明によれば、
電極と、
前記電極上に設けられており、標的物質に対する特異的結合性を有する官能基末端のチオール、フェロセン基末端のチオールおよび、水素末端またはヒドロキシル基末端のチオールを含む混合自己組織化単分子膜と、を備える、センサが提供される。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、測定値のバラツキが抑制されたセンサおよびその製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】本発明の実施の形態におけるセンサの構成を示す模式図である。
【図２】本発明の実施の形態におけるセンサの要部を示す模式図である。
【図３】スクウェアウェーブボルタンメトリーの結果を示す図である。
【図４】スクウェアウェーブボルタンメトリーの結果を示す図である。
【図５】ピーク電流値のバラツキの結果を示す図である。
【図６】本発明の実施の形態におけるセンサの検出結果を示す図である。
【図７】非特許文献１に記載のセンサの追試実験の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。尚、すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、適宜説明を省略する。
【００１１】
図１は、本実施の形態のセンサ１００の構成の一例を示す模式図である。図２は、本実施の形態のセンサ１００の要部の一例を示す模式図である。
本実施の形態のセンサ１００は、混合自己組織化単分子膜１１０が表面に形成された電極（作用電極１０２）を備える。図１に示すように、このセンサ１００は、例えば、作用電極１０２、対極１１２、参照電極１１４、電流計１１６を備える。
【００１２】
以下、図１を用いて本実施の形態のセンサ１００の各構成について説明した後、図２を用いてセンサ１００の動作について説明する。
【００１３】
本実施の形態に係る作用電極１０２は、その表面の一部または全面に混合自己組織化単分子膜１１０を有する。
この混合自己組織化単分子膜１１０は、標的物質に対する特異的結合性を有する官能基末端のチオール（ＮＴＡ末端のチオール１０４）、フェロセン基末端のチオール１０６、水素末端またはヒドロキシル基末端のチオール１０８を含む。
【００１４】
上記の官能基末端のチオール（ＮＴＡ末端のチオール１０４）の官能基には、標的物質に対する特異的結合性が付与されている。例えば、このチオールの官能基には、標的物質に対する特異的結合性を有する抗体や受容体等が固定されている。固定する方法は、官能基に適した公知の方法を用いればよい。このため、作用電極１０２上の官能基末端のチオールでは、抗体抗原反応や、リガンドと受容体の特異的な結合等が起こる。
【００１５】
より具体的には、図２に示すように、ＮＴＡ末端のチオール１０４のＮＴＡには、例えば、抗体結合性物質２００を介して、抗体２１０が結合している。この抗体２１０は、図示しない標的物質（例えば、抗原等）と結合する特異的接合性を有する。抗体結合性物質２００としては、例えば、ＰｒｏｔｅｉｎＧを用いることができる。
なお、抗体結合性物質２００を用いずに、ＮＴＡ末端のチオール１０４のＮＴＡに抗体２１０が直接結合してもよい。この場合には、例えば、カルボジイミドとヒドロキシコハク酸イミドでＮＴＡ末端のチオール１０４が有するＣＯＯＨ基を活性化した電極を抗体溶液に浸漬する。
【００１６】
官能基末端のチオールとしては、例えば、アルカンチオールを用いることができる。アルカンチオールを用いることにより、高密度で配向性が高い混合自己組織化単分子膜１１０を形成することができる。これにより、抗体が再現性良く高密度に固定されるため、センサの歩留まりを向上させることができる。
【００１７】
また、官能基末端のチオールとしては、例えば、ＨＳ−（ＣＨ２）ｎ−Ｘで表すことができる。一般式中、ｎは、好ましくは１〜２０の整数であり、より好ましくは６〜１０の整数である。Ｘは、官能基を示し、例えば、置換または無置換のカルボキシル基、アミノ基、アミノベンジル基、カルボキシベンジル基等であり、より好ましくはカルボキシル基、アミノ基である。上記のｎを６以上とすることにより、混合自己組織化単分子膜１１０の配向性を向上させることができる。
【００１８】
官能基末端のチオールの具体例としては、例えば、ＮＴＡ末端のチオール１０４（ニトリロトリ酢酸末端のチオール）、カルボキシル基末端のチオールおよびアミノ基末端のチオール等が挙げられる。官能基末端のチオールは、単独または複数用いることができる。これらの官能基末端のチオールは、市販されているものを用いることができる。
【００１９】
ＮＴＡ末端のチオール１０４の一例を、例えば下記の式で表す。
【化１】
0005447233.tif 000002
【００２０】
フェロセン基末端のチオール１０６に用いるチオールとしては、例えば、アルカンチオールを用いることができる。アルカンチオールとしては、上記の官能基末端のチオールに用いるアルカンチオールと同様である。フェロセン基末端のチオール１０６は、市販されているものを用いることができる。
【００２１】
混合自己組織化単分子膜１１０中において、官能基末端のチオールとフェロセン基末端のチオール１０６とのｎ値（アルキル鎖の数）を同一にしてもよいし、フェロセン基末端のチオール１０６に対して官能基末端のチオールのｎ値を大きくしてもよい。ｎ値を同一にすることにより、混合自己組織化単分子膜１１０をより密に形成して、電子伝達効率を高くすることができる。
【００２２】
混合自己組織化単分子膜１１０における、フェロセン基末端のチオール１０６に対する官能基末端のチオールのモル比は、好ましくは０．０１以上５以下である。モル比の下限値を０．０１以上とすることにより、抗体等の固定量が増大して、抗原などの標的物質の結合量が増え、シグナルを得やすくなる。一方、モル比の上限値を５以下とすることにより、官能基末端のチオールとフェロシアンイオンの静電相互作用が無視できなくなり、電流値が充分に得られなかったり、電流値が不安定になることを抑制することができる。
【００２３】
混合自己組織化単分子膜１１０中のチオールの末端官能基の混合比率は、公知のＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）等を用いて求めることができる。例えば、Ｆｃ（フェロセン）基末端とＮＴＡ末端とＨ末端を有するチオールからなる混合ＳＡＭ中に含まれる各チオール分子の存在比率を求めたい場合は、ＸＰＳによりＦｃの鉄とＮＴＡの窒素と全チオール量（硫黄および炭素）を定量すればよい。
【００２４】
水素末端またはヒドロキシル基末端のチオール１０８に用いるチオールとしては、例えば、アルカンチオールを用いることができる。アルカンチオールとしては、上記の官能基末端のチオールに用いるアルカンチオールと同様である。水素末端またはヒドロキシル基末端のチオール１０８は、市販されているものを用いることができる。
【００２５】
また、水素末端またはヒドロキシル基は、アミノ基、カルボキシル基、アミノベンジル基、カルボキシベンジル基等の官能基と比較して小さい。このため、水素末端またはヒドロキシル基末端のチオール１０８は、混合自己組織化単分子膜１１０中のピンホールの発生を抑制することができる。
【００２６】
混合自己組織化単分子膜１１０中において、官能基末端のチオール、フェロセン基末端のチオール１０６およびヒドロキシル基末端のチオール１０８のｎ値を同一にしてもよいし、他のチオールに対して官能基末端のチオールのｎ値を大きくしてもよい（フェロセン基末端のチオール１０６とヒドロキシル基末端のチオール１０８とのｎ値は異なっていてもよい）。ｎ値を同一にすることにより、混合自己組織化単分子膜１１０をより密に形成して、電子伝達効率を高くすることができる。
【００２７】
本実施の形態においては、混合自己組織化単分子膜１１０は、さらにエチレングリコール末端のチオールを含んでもよい。エチレングリコール末端のチオールに用いるチオールとしては、例えば、アルカンチオールを用いることができる。アルカンチオールとしては、上記の官能基末端のチオールに用いるアルカンチオールと同様である。エチレングリコール末端のチオールは、市販されているものを用いることができる。
【００２８】
本実施の形態に係る作用電極１０２は、アニール処理されている。このため、作用電極１０２上の混合自己組織化単分子膜１１０においては、各チオール成分が分散性に優れている。
【００２９】
本実施の形態においては、アニールにより混合自己組織化単分子膜１１０内のチオールが均質に分散されたことは、公知の電気化学測定法を用いて確かめることができる。具体的には、例えば、０．１Ｍの水酸化カリウム水溶液中で、銀／塩化銀電極に対して０〜−１．５Ｖの範囲でサイクリックボルタンメトリーを行い、チオールの還元脱離にともなうファラデー電流を測定する。この際、チオール分子がＳＡＭ内で均質に分散している場合は、単一の還元電流ピークが観測されるが、チオール分子がＳＡＭ内に均質に分散せずにドメイン構造を形成している場合は複数の還元電流ピークが観測される。
【００３０】
作用電極１０２の材料としては、特に限定されないが、例えば、金、ロジウム、白金等の貴金属や、これらの合金を用いることができ、好ましくは金を用いることができる。
【００３１】
本実施の形態のセンサ１００においては、下記の測定条件下における、ピーク電流値の変動率が、好ましくは１．０％以下であり、より好ましくは０．５％以下であり、さらに好ましくは０．１％以下である。測定条件としては、ピーク電流値は、フェロシアン化カリウムを含む測定溶液中でスクウェアウェーブボルタンメトリー（Ｓｑｕａｒｅ  Ｗａｖｅ  Ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ；ＳＷＶ）法を用いて、２０回繰り返し測定する（例えば、２０ｃｙｃｌｅ目の電流値を基準に規格化してもよい）。ピーク電流値は、平均値でもよいが、各測定毎の値でもよい。
【００３２】
次に、本実施の形態のセンサ１００の動作について、図２を用いて説明する。
本実施の形態のセンサ１００は、検体試料中の標的物質を検出することができる。センサ１００においては、標的物質を含む検体試料と電子伝達体を含む測定試料とを分けて使用してもよいし、標的物質および電子伝達体を含む検体試料を使用してもよい。
【００３３】
まず、センサ１００を構成する作用電極１０２の表面には、混合自己組織化単分子膜１１０が形成されている。この混合自己組織化単分子膜１１０中のＮＴＡ末端のチオール１０４のＮＴＡには、抗体２１０が固定されている。
フェロシアンイオン等の電子伝達体（電極反応物質）を含む溶液（測定試料）中で、抗体２１０に標的物質が結合していない状態においては、ベア電極と同等の反応電流が流れる。
一方、抗体２１０に標的物質が結合すると、混合自己組織化単分子膜１１０上の抗体２１０の層におけるフェロシアンイオンの透過性が低下する。このフェロシアンイオンが電極に作用することにより、電圧または電流の変化が発生する。このような標的物質の結合状態と非結合状態との電流値変化や電圧値変化を測定することによって、検体試料中の標的物質を検出できる。
これにより、本実施の形態においては、試料中に標的物質が含まれているかを検知するセンサ、特に免疫センサを形成することができる。
【００３４】
本実施の形態に係る電子伝達体としては、フェロシアンイオンの他に、ヘキサアミンルテニウム、塩化鉄および、フェロセン誘導体（Ｆｃ−（ＣＨ２）ｎ−Ｘ；Ｘは、好ましくはカルボキシル基、アミノ基、メチル基、またはヒドロキシル基を表しており、ｎは、好ましくは０〜１０の整数である。）を用いることができる。これらを単独で使用してもよいしまたは併用してもよい。これらの電子伝達体は、混合自己組織化単分子膜１１０中の官能基末端のチオールにおいて、標的物質の結合状態と非結合状態とで、混合自己組織化単分子膜１１０上の抗体２１０の層に対する透過性を変化させることができる。なお、これらの電子伝達体は、ＢＳＡやデキストランなどの高分子に結合されていても良い。高分子に結合されることで、抗体２１０の層に対する透過性の変化がさらに大きくなり、測定感度が向上する。
【００３５】
また、本実施の形態に係る標的物質としては、抗体、リガンド、受容体、抗原、ペプチド、タンパク質、酵素、酵素基質、ホルモン、ハプテン、レクチン、アビジン、ストレプトアビジン、トキシン、炭水化物、オリゴ糖、多糖類、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ジデオキシリボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド及びリボヌクレオチド及びジデオキシヌクレオチドアナログ、変性デオキシヌクレオチド、変性リボヌクレオチド、変性ジデオキシヌクレオチドオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド等が挙げられる。
【００３６】
次に、本実施の形態のセンサ１００の製造方法について、説明する。
本実施の形態のセンサ１００の製造方法としては、官能基末端のチオール（ＮＴＡ末端のチオール１０４）とフェロセン基末端のチオール１０６とを含む第１の溶液に、電極（作用電極１０２）を浸漬する第１の工程と、第１の工程後、水素末端またはヒドロキシル基末端のチオール１０８を含む第２の溶液に、作用電極１０２を浸漬する第２の工程と、第２の工程後、不活性ガス雰囲気下で作用電極１０２をアニールする第３の工程と、第３の工程後、標的物質に対する特異的結合性を、官能基に付与する第４の工程と、を含む。
【００３７】
（第１の工程）
まず、作用電極１０２を第１の溶液に浸漬する前に、作用電極１０２の表面を洗浄してもよい。洗浄方法としては、各種の公知の方法を用いることができ、例えば、電極をピラニア溶液（濃硫酸と過酸化水素水の混合液）に所定時間浸漬した後、脱イオン水でリンスし、続いて、電極を１Ｍ硫酸水溶液に浸し、サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）を実施してもよい。
【００３８】
続いて、官能基末端のチオール（ＮＴＡ末端のチオール１０４）とフェロセン基末端のチオール１０６とを混合した第１の溶液に、電極（作用電極１０２）を所定時間浸漬する。この第１の溶液は、エチレングリコール末端のチオールをさらに含んでもよい。
【００３９】
第１の溶液に用いる溶媒としては、チオールが溶解し、かつ、化学反応しないものであれば特に制限されず、例えば、水やエタノール等のアルコール、それらの混合液等の一般的な溶媒が用いられる。
【００４０】
浸漬時間としては、特に限定されないが、例えば、０．５時間以上２４時間以下とすることができる。浸漬時間を上記下限値以上とすることにより、電極に対するチオールの反応量を確保することができる。浸漬時間が上記上限値を超えても特に問題ないが、上記上限値以下とすることにより、電極に対してチオールを、効率的に充分反応させることができる。
【００４１】
（第２の工程）
続いて、前述の第１の工程後、水素末端またはヒドロキシル基末端のチオール１０８を含む第２の溶液に、上記作用電極１０２を所定時間浸漬する。
第２の溶液に用いる溶媒の具体例としては、好ましくは第１の溶液に用いる溶媒と同様である。また、第２の工程における浸漬時間としては、好ましくは第１の工程と同様である。
【００４２】
（第３の工程）
続いて、前述の第２の工程後、不活性ガス雰囲気下で作用電極１０２をアニールする。
【００４３】
不活性ガスとしては、窒素ガスや、アルゴン等の希ガス等を用いることができる。アニール温度としては、特に限定されないが、例えば５０℃以上１００℃以下とすることができる。また、アニール時間としては、特に限定されないが、例えば１時間以上２４時間以下である。
【００４４】
（第４の工程）
続いて、第３の工程後、標的物質に対する特異的結合性を、ＮＴＡ末端のチオール１０４の官能基に付与する。例えば、上述のように、チオールの官能基に、標的物質に対する特異的結合性を有する抗体や受容体等を固定する。固定する方法としては、官能基に適した公知の方法を用いればよい。
以上により、本実施の形態に係るセンサ１００を得ることができる。
【００４５】
次に、本実施の形態の作用効果について説明する。
本実施の形態においては、フェロセン基末端のチオール１０６を作用電極１０２に固定することで、フェロセンが溶液中の電極反応物質と作用電極１０２との間の電子伝達を仲介するようになる。したがって、電極反応物質とＮＴＡ末端のチオール１０４との間に静電的な相互作用が生じるような場合でも、電流が流れやすくなる。第２の工程において、官能基の大きさが小さいＨ末端やＯＨ末端のチオール溶液に作用電極１０２を浸すことにより、第１の工程で混合ＳＡＭに生じたピンホールが塞がれ、混合ＳＡＭが密に整列された状態となり、前述のフェロセンによる電子伝達効率が向上する。また、これにより、電流値が安定化する。さらに、第３の工程において、高温条件下にすることで、混合ＳＡＭ内におけるチオール分子の移動が活発になり、混合ＳＡＭ内にそれぞれのチオール分子が均質に分散するようになる。このため、本実施の形態のセンサ１００のおいては、測定値（例えば電流値や電圧値）のバラツキが抑制されている。その結果、標的物質の結合状態と非結合状態との電流値変化のＳ／Ｎ比が大きくなり、標的物質の結合に起因する電流変化を精度よく検知することができる。
【００４６】
第１の工程で、必要に応じて、エチレングリコール末端のチオールを混ぜても良い。これにより、タンパク質の非特異的な吸着が抑制されて、測定時における電流値の安定性がさらに高まる。
以下、参考形態の例を付記する。
１．官能基末端のチオールとフェロセン基末端のチオールとを含む第１の溶液に、電極を浸漬する第１の工程と、
前記第１の工程後、水素末端またはヒドロキシル基末端のチオールを含む第２の溶液に、前記電極を浸漬する第２の工程と、
前記第２の工程後、不活性ガス雰囲気下で前記電極をアニールする第３の工程と、
前記第３の工程後、標的物質に対する特異的結合性を、前記官能基に付与する第４の工程と、を含む、センサの製造方法。
２．前記官能基末端のチオールが、ニトリルトリ酢酸末端のチオール、カルボキシル基末端のチオールおよびアミノ基末端のチオールからなる群から選択される少なくとも一種を含む、１．に記載のセンサの製造方法。
３．前記第１の溶液は、エチレングリコール末端のチオールをさらに含む、１．または２．に記載のセンサの製造方法。
４．前記第１の溶液中における前記フェロセン基末端のチオールに対する前記官能基末端のチオールのモル比は、０．０１以上５以下である、１．から３．のいずれか１つに記載のセンサの製造方法。
５．電子伝達体を含む液に用いるセンサの製造方法であって、
前記電子伝達体が、フェロシアン、ヘキサアミンルテニウム、塩化鉄および、フェロセン誘導体からなる群から選択される少なくとも一種を含む、１．から４．のいずれか１つに記載のセンサの製造方法。
６．電極と、
前記電極上に設けられており、標的物質に対する特異的結合性を有する官能基末端のチオール、フェロセン基末端のチオールおよび、水素末端またはヒドロキシル基末端のチオールを含む混合自己組織化単分子膜と、を備える、センサ。
７．前記官能基末端のチオールが、ニトリルトリ酢酸末端のチオール、カルボキシル基末端のチオールおよびアミノ基末端のチオールからなる群から選択される少なくとも一種を含む、６．に記載のセンサ。
８．前記混合自己組織化単分子膜は、エチレングリコール末端のチオールをさらに含む、６．または７．に記載のセンサ。
９．電子伝達体を含む液に用いるセンサであって、
前記電子伝達体が、フェロシアン、ヘキサアミンルテニウム、塩化鉄および、フェロセン誘導体からなる群から選択される少なくとも一種を含む、６．から８．のいずれか１つに記載のセンサ。
１０．下記の測定条件下における、ピーク電流値の変動率が１．０％以下である、６．から９．のいずれか１つに記載のセンサ。
前記ピーク電流値は、フェロシアン化カリウムを含む測定溶液中でスクウェアウェーブボルタンメトリー法を用いて、２０回繰り返して電流値を測定する。
【実施例】
【００４７】
以下、本発明を実施例を参照して詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例の記載に何ら限定されるものではない。
【００４８】
（非特許文献１の再現実験）
図７は、発明者らによる、非特許文献１の再現実験結果である。実験条件は非特許文献１に記載の条件に従った。図７（ａ）は、ベアＡｕ棒金属のサイクリックボルタモグラムを示す（横軸は銀／塩化銀電極に対する電位（Ｖ）、縦軸はμＡ）。図７（ｂ）は、ＮＴＡ末端のチオールのＳＡＭ形成後のサイクリックボルタモグラムを示す。図７（ｃ）は、ヒスチジン修飾したタンパク質（ＰｒｏｔｅｎＧ）の固定後のサイクリックボルタモグラムを示す。
図７（ｂ）に示すように、金電極にＮＴＡ末端を有するチオールを固定すると、大幅に電流が減少してしまった。そこに、ヒスチジン修飾したタンパク質（ＰｒｏｔｅｎＧ）を固定したが、電流値の変化はほとんど見られなかった（図７（ｃ））。
このように、非特許文献１の技術においては、抗原の結合状態と非結合状態との電流値変化のＳ／Ｎ比が小さく、抗原抗体反応に起因する電流変化を検知することができないことがあった。さらに引き続き、抗体および抗原を添加したが、電流値の変化は見られなかった。
【００４９】
（本発明に係る混合ＳＡＭを有する免疫センサの作製）
まず、金電極をピラニア溶液（濃硫酸と過酸化水素水とのモル比が３：１の混合液）に１０分間浸漬した後、脱イオン水でリンスした。続いて、金電極を１Ｍ硫酸水溶液に浸し、サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）を実施した。ＣＶは、対極として白金電極を、参照電極として銀／塩化銀電極を用い、走引範囲は−１．０Ｖ〜＋１．０Ｖ、掃引速度は０．５Ｖ／秒、サイクル数は５０回とした。
この金電極を、０．５ｍＭ  ＨＳ−（ＣＨ２）１１−ＮＴＡ（非特許文献２に記載の下記式で示す化学式２の製造条件に従って作製した）と０．５ｍＭ  １１−フェロセニル−１−ウンデカンチオール（（株）同仁化学研究所製、製品番号：Ｆ２４６）と、０．５ｍＭ  １１−メルカプトウンデシル−トリ（エチレングリコール）（（株）同仁化学研究所製、製品番号：Ｈ３５４）とを溶解した５０％エタノール／脱イオン水（第１の溶液）に１時間浸漬した。その後、金電極を脱イオン水でリンスした（第１の工程）。
【００５０】
【化２】
0005447233.tif 000003
【００５１】
続いて、上記金電極を、１１−ヒドロキシ−ウンデカンチオール（（株）同仁化学研究所製、製品番号：Ｈ３３７）を溶解した５０％エタノール／脱イオン水（第２の溶液）に１時間浸漬した。その後、脱イオン水でリンスした（第２の工程）。
続いて、上記金電極に対してアニール処理を行った。このアニール処理は窒素バブリングによって脱酸素した脱イオン水中で、温度が７０℃、時間が４時間にわたって実施した（第３の工程）。
【００５２】
（予備実験）
各種の上記工程を行った上記の金電極を、１ｍＭフェロシアン化カリウムを溶解した測定溶液に浸し、スクウェアウェーブボルタンメトリー（ＳＷＶ）を行った。ＳＷＶの測定パラメータは、ステップ電位５ｍＶ、パルス高さ２０ｍＶ、パルス周波数１０Ｈｚとした。以下、ＳＷＶの結果を、図３および図４に示す（図中、横軸は銀／塩化銀電極に対する電位（Ｖ）、縦軸はμＡ）。
【００５３】
（予備実験の比較例）
図３（ａ）は、ＮＴＡ端末のチオール単体のみが形成された金電極におけるＳＷＶの結果を示す。図３（ｂ）は、フェロセン端末のチオール単体のみが形成された金電極におけるＳＷＶの結果を示す。図３（ｃ）は、ＯＨ端末のチオール単体のみが形成された金電極におけるＳＷＶの結果を示す。図４（ａ）は、第１の工程の処理のみを行った金電極におけるＳＷＶの結果を示す。図４（ｂ）は、第１の工程および第２の工程の処理のみを行った金電極におけるＳＷＶの結果を示す。図４（ｃ）は、第１の工程および第３の工程の処理のみを行った金電極におけるＳＷＶの結果を示す。
（予備実験の実施例）
図４（ｄ）は、第１の工程から第３の工程の全ての工程を行った金電極におけるＳＷＶの結果を示す。
【００５４】
また、図５は、図３（ａ）、図４（ａ）〜図４（ｄ）の各グラフのピーク電流値の変化をプロットしたものである（２０ｃｙｃｌｅ目の電流値を基準に規格化した）。
図５（ａ）は、図４（ｄ）における第１の工程および第３の工程の処理のみを行った金電極のピーク電流値変化を示す。図５（ｂ）は、図４（ａ）における第１の工程の処理のみを行った金電極のピーク電流値変化を示す。図５（ｃ）は、図４（ｂ）における第１の工程および第２の工程の処理のみを行った金電極のピーク電流値変化を示す。図５（ｅ）は、図４（ｃ）における第１の工程および第３の工程の処理のみを行った金電極のピーク電流値変化を示す。図５（ｆ）は、図３（ａ）におけるＮＴＡ端末のチオール単体のみを行った金電極のピーク電流値変化を示す（非特許文献１の技術に相当する）。図５（ｆ）におけるピーク電流値の変動は、５．１％／ｃｙｃｌｅであった。これに対して、実施例の図５（ａ）におけるピーク電流値の変動は、０．０２％／ｃｙｃｌｅであった。
【００５５】
以上の結果によれば、本実施例は、比較例より、フェロシアンイオンの反応電流が安定した。また、本実施例は、比較例より、ピーク電流値の変動が低減した。
【００５６】
（抗原検出）
上記の混合ＳＡＭを有する免疫センサの作製において、第１の溶液中のチオールを、０．５ｍＭ  ＨＳ−（ＣＨ２）１１−ＮＴＡ、０．２５ｍＭ  １１−フェロセニル−１−ウンデカンチオール、０．２５ｍＭ  １１−メルカプトウンデシル−トリ（エチレングリコール）に変更した以外は同様に行った。
続いて、第３の工程後、非特許文献２を参考にして、抗体を固定した。すなわち、第３の工程後、金電極を脱イオン水でリンスし、２０ｍＭ  塩化ニッケル（ＩＩ）水溶液中に１０分間浸漬し、脱イオン水でリンスした。次いで、ＨｉｓＴａｇ修飾ＰｒｏｔｅｉｎＧ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社製（米国）、製品番号：６５１０−５）を２０μｇ／ｍＬの濃度で０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、金電極を１０分間浸漬した。０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで、金電極をリンスし、１００μｇ／ｍＬのヒト繊毛性ゴナドトロピン（以下、ｈＣＧ）抗体（ＨｙＴｅｓｔ社製（フィンランド）、製品番号：２Ｈ８−Ｇ９）溶液（溶媒：０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ）に１０分間浸漬した。その後、金電極を０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳでリンスして測定に使用した。
続いて、作製した金電極を作用電極に用いてＳＷＶ測定をおこなった。参照電極に銀／塩化銀電極を、対極に白金電極を用い、測定溶液の組成は、１ｍＭ  フェロシアン化カリウム、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０とした。ＳＷＶの測定パラメータは、ステップ電位５ｍＶ、パルス高さ２０ｍＶ、パルス周波数１０Ｈｚとした。
ＳＷＶを２０秒間隔で繰り返しておこない、途中で最終濃度５０μｇ／ｍＬとなるようｈＣＧおよびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加した。
【００５７】
図６は、０秒における値で規格化したＳＷＶピーク電流の変化率である。サンプルを添加する前（０〜２００秒）は、電流値は極めて安定しており、その間の電流変化率は約０．１％であった。
２００秒の時点でサンプルを添加すると、ｈＣＧ（図６（ａ））を添加した際は、約２．０％電流が低下したのに対し、ＢＳＡ（図６（ｂ））に対しては０．５％程度しか電流が変化しなかった。ｈＣＧ抗体を固定した本電極は、抗体と結合を形成するｈＣＧを添加した時だけに大きな電流変化を示したことから、ｈＣＧに対して選択的に反応するセンサとして機能することが確かめられた。すなわち、本発明の免疫センサによってｈＣＧ等の標的物質が検出されたことが示された。また、測定値（電流値等）のバラツキが抑制された結果、高感度に標的物質を検出できた。
なお、ｈＣＧとは妊娠中に産生されるホルモンであり、実際の妊娠の診断においてｈＣＧの検出がおこなわれている。本発明は、妊娠検査に用いることができる。
【００５８】
（ＮＴＡ末端の代わりにＣＯＯＨ末端のチオールを使用した場合）
また、上記の混合ＳＡＭを有する免疫センサの作製において、第１の溶液中のチオールを、０．１ｍＭ  カルボキシウンデカンチオール、０．２５ｍＭ  １１−フェロセニル−１−ウンデカンチオール、０．２５ｍＭ  １１−メルカプトウンデシル−トリ（エチレングリコール）に変更した以外は同様に行った。第３の工程まで終えた電極を脱イオン水でリンスし、１００ｍＭの１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩および１００ｍＭ  Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドを溶解したＰＢＳ（ｐＨ７．４）に、３０分間浸漬してＣＯＯＨ基を活性化した。次いで、電極をＰＢＳでリンスし、１００μｇ／ｍＬのＰｒｏｔｅｉｎＧを溶解したＰＢＳに１時間浸漬した。次いで、電極をＰＢＳでリンスし、１ｍＭ  エタノールアミン水溶液に３０分間浸漬して余剰な活性化したＣＯＯＨ基をブロッキングした。再びＰＢＳでリンスし、５０μｇ／ｍＬのｈＣＧ抗体を溶解したＰＢＳ中に１時間浸漬した。電極をＰＢＳでリンスし、測定に用いた。
このように作製した金電極を作用電極に用いて、上記と同様の条件でＳＷＶ測定をおこなった。
この場合においても、本発明のセンサがｈＣＧに対して選択的に反応するセンサとして機能することが確かめられた。
【００５９】
なお、当然ながら、上述した実施の形態および複数の変形例は、その内容が相反しない範囲で組み合わせることができる。また、上述した実施の形態および変形例では、各部の構造などを具体的に説明したが、その構造などは本願発明を満足する範囲で各種に変更することができる。
【符号の説明】
【００６０】
１００  センサ
１０２  作用電極
１０４  ＮＴＡ末端のチオール
１０６  フェロセン基末端のチオール
１０８  ヒドロキシル基末端のチオール
１１０  混合自己組織化単分子膜
１１２  対極
１１４  参照電極
１１６  電流計
２００  抗体結合性物質
２１０  抗体
【図１】
0005447233.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
0005447233.tif 000008
【図６】
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【図７】
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