(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
妊娠女性の出生前胎児（ｕｎｂｏｒｎ ｆｅｔｕｓ）のゲノムの少なくとも一部を決定するための方法であって、ここで、該胎児は父親及び妊娠女性である母親を有し、さらに、父親は父親ハプロタイプをもつ父親ゲノムを有し、母親は母親ハプロタイプをもつ母親ゲノムを有し、該方法は、
妊娠女性から得られた生物試料から複数の核酸分子を分析すること、この場合、該生物試料は、母親核酸及び胎児核酸の混合物を含み、ここで、核酸分子の分析は、
ヒトゲノムにおける核酸分子の場所を特定し、及び該核酸分子のそれぞれの対立遺伝子を決定し、
第１の複数の遺伝子座の各々で父親から胎児に遺伝された父親対立遺伝子を決定し、ここで、母親ゲノムは該第１の複数の遺伝子座でヘテロ接合であることを含む；
該第１の複数の遺伝子座の２つの母親ハプロタイプの各々を決定し、
核酸分子の決定された対立遺伝子に基づいて、該第１の複数の遺伝子座の各々でそれぞれの対立遺伝子の量をコンピュータシステムで決定し；
該第１の複数の遺伝子座の１を超える遺伝子座で核酸分子のそれぞれの対立遺伝子の相対量を比較し；並びに
該比較に基づいて、２つの母親ハプロタイプのどれが、該第１の複数の遺伝子座によってカバーされたゲノムの一部で母親から胎児に遺伝されたかを決定する
ことを含む前記方法。
【請求項２】
相対量が核酸分子のサイズ分布を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１の複数の遺伝子座の２つの母親ハプロタイプの各々を決定することが、生物試料からの複数の核酸分子の分析に基づいている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第１の複数の遺伝子座の各々で父親から遺伝された対立遺伝子を決定することが、
ヘテロ接合である父親ゲノムの第２の複数の遺伝子座を決定し、ここで、母親ゲノムは第２の複数の遺伝子座でヘテロ接合であり；
複数の核酸分子において、第２の複数の遺伝子座のそれぞれで父親ゲノムに存在し、母親ゲノムに存在しない対立遺伝子を同定し；
同定された対立遺伝子を有するハプロタイプとして遺伝された父親ハプロタイプを同定し；並びに
遺伝された父親ハプロタイプを用いて、第１の複数の遺伝子座で父親から遺伝された対立遺伝子を決定する
ことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
第１の複数の遺伝子座の２つの母親ハプロタイプの各々を決定することが、
それぞれの遺伝子座での核酸分子の決定されたそれぞれの対立遺伝子の量に基づいて、第１の複数の遺伝子座の１以上で母親ゲノムの対立遺伝子を同定し；
複数の参照ハプロタイプを同定し；並びに
母親ゲノムの同定された対立遺伝子と、複数の参照ハプロタイプの対応する遺伝子座を比較し、２つの母親ハプロタイプを同定する
ことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
第１の複数の遺伝子座の２つの母親ハプロタイプの各々を決定することが、
２つの母親ハプロタイプの各々が固有に同定されるまで、母親ゲノムの同定された対立遺伝子と複数の参照ハプロタイプとを繰り返して比較すること
をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
第１の複数の遺伝子座の各々で父親から遺伝された対立遺伝子を決定することが、生物試料からの複数の核酸分子の分析に基づき、ここで、第１の複数の遺伝子座の各々で父親から遺伝された対立遺伝子を決定することが、
胎児ゲノムがヘテロ接合であり、母親ゲノムがホモ接合である第２の複数の遺伝子座を決定し；
第２の複数の遺伝子座の各々で父親から遺伝された対立遺伝子を、
第２の複数の遺伝子座のそれぞれの遺伝子座で核酸分子の決定されたそれぞれの対立遺伝子の相対量を決定し；及び
それぞれの遺伝子座で遺伝された対立遺伝子であるものとして、少なくとも相対量を有する対立遺伝子を同定する
ことによって決定し；
複数の参照ハプロタイプを同定し；
第２の複数の遺伝子座の各々で父親から遺伝された対立遺伝子を用いて、参照ハプロタイプのうちどれが父親から遺伝されたかを決定し、該決定されたハプロタイプが第１の複数の遺伝子座を含み；及び
父親から遺伝されることが決定されたハプロタイプ由来の第１の複数の遺伝子座で父親から遺伝された対立遺伝子を決定する
ことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
参照ハプロタイプのどれが父親から遺伝されたかを決定することが、
父親から遺伝された参照ハプロタイプが固有に同定されるまで、第２の複数の遺伝子座の各々で父親から遺伝されたことが決定された対立遺伝子と、複数の参照ハプロタイプの対応する遺伝子座における対立遺伝子とを繰り返して比較する
ことを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
特定の遺伝子座が、胎児ゲノムがヘテロ接合であり、母親ゲノムがホモ接合である第２の複数の遺伝子座の１つであることを決定することが、
特定の遺伝子座で対立遺伝子の予測されたカウントの数についてカットオフ値を決定し、該カットオフ値が母親ゲノムがホモ接合であり、胎児ゲノムがヘテロ接合であるかどうかを予測し、ここで、該カットオフ値は、特定の遺伝子座でホモ接合及びヘテロ接合の異なる組み合わせについてカウントの数の統計的分布に基づいて決定され；
生物試料由来の核酸分子の分析に基づいて、特定の遺伝子座で第１の対立遺伝子と第２の対立遺伝子を検出し；
生物試料由来の複数の核酸分子の配列決定に基づいて、第１の対立遺伝子の実際のカウント数を決定し；及び
実際のカウント数がカットオフ値未満であるとき、胎児ゲノムが第１の対立遺伝子についてヘテロ接合であり、及び母親ゲノムが第２の対立遺伝子についてホモ接合であると決定する
ことを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
統計的分布が、胎児由来である生物試料由来の核酸分子の分画濃度に依存している、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
統計的分布が、さらに、特定の遺伝子座に対応する複数の核酸分子の数に依存している、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
第１の複数の遺伝子座の各々で父親から遺伝された対立遺伝子を決定することが、
父親ゲノムを分析することによってホモ接合である父親ゲノムの第２の複数の遺伝子座を決定し、ここで、第１の複数の遺伝子座は第２の複数の遺伝子座であり；
第１の複数の遺伝子座の各々で父親ゲノムの対立遺伝子を決定し；及び
第１の複数の遺伝子座でのそれぞれの対立遺伝子を父親から遺伝された対立遺伝子であると帰属する
ことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
核酸分子を決定することが、大規模並列配列決定、マイクロアレイ、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、及び質量分析からなる群から選択される少なくとも１つの技術を、核酸分子の少なくとも一部に対して実施することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
第１の複数の遺伝子座の第１のサブセットの隣接遺伝子座の各々について、
ハプロタイプが、第１のサブセットの隣接遺伝子座を含む第１のゲノム区分について、母親からの胎児によって遺伝されたかどうかを決定することが、
（ａ）第１のサブセットの連続した遺伝子座に関して、２つの母親ハプロタイプのうちの一方と合致する核酸分子の決定されたそれぞれの対立遺伝子の第１の量を決定し；
（ｂ）第１のサブセットの連続した遺伝子座に関して、２つの母親ハプロタイプのうちの他方と合致する核酸分子の決定されたそれぞれの対立遺伝子の第２の量を決定し；及び
（ｃ）第１の量と第２の量との比較に基づいて、第１のゲノム区分について遺伝されたハプロタイプを決定する
ことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
第１の量と第２の量との比較が逐次確率比検定を用いる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
第１の量と第２の量を決定することが、第１のサブセットの隣接遺伝子座に関して、ともに連続して行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
第１のサブセットの隣接遺伝子座が２つのサブグループにさらに分割され、ここで、第１のサブグループは、父親の遺伝子型が母親の第１のハプロタイプの構成遺伝子型と合致する遺伝子座からなり、第２のサブグループは、父親の遺伝子型が母親の第２のハプロタイプの構成遺伝子型と合致する遺伝子座からなり；及び、ここで、（ａ）〜（ｃ）は２つのサブグループについて個別に行われる方法であって、該方法は、
これらの２つのサブグループについての（ｃ）の結果に基づいて、第１のゲノム区分に対して遺伝されたハプロタイプを決定する
ことをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
胎児が母親から突然変異を遺伝したことを
胎児によって遺伝された母親のハプロタイプを分析し；及び
遺伝されたハプロタイプにおいて突然変異を同定する
ことによって決定する
ことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
生物試料由来の複数の核酸分子を分析することが、
ゲノムの標的領域において核酸に関して生物試料を富化し；及び／又は
標的領域において核酸を選択的に配列決定し、ここで、第１の複数の遺伝子座が該標的領域にある
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
標的領域が、多数の有益な遺伝子座を含むものとして同定される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
配列決定が、標的領域における核酸だけを配列決定する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
妊娠女性の胎児のゲノムの少なくとも一部を決定する方法であって、胎児は父親及び妊娠女性である母親を有し、父親は父親ハプロタイプを含む父親ゲノムを有し、母親は、母親ハプロタイプを含む母親ゲノムを有し、該方法は、
妊娠女性から得られる生物試料由来の複数の核酸分子を分析し、この場合、生物試料は、母親核酸及び胎児の核酸の混合物を含み、ここで、核酸分子の分析は、
ヒトゲノムにおいて核酸分子の位置を同定し；及び
核酸分子のそれぞれの対立遺伝子を決定する
ことを含み；
ヘテロ接合である父親ゲノムの第１の複数の遺伝子座を決定し、ここで、該父親ゲノムは、胎児の父親から得られ、ここで、母親ゲノムは第１の複数の遺伝子座でホモ接合であり；及び
第１の複数の遺伝子座で決定されたそれぞれの対立遺伝子に基づいて、第１の複数の遺伝子座によってカバーされたゲノムの一部で父親から胎児に遺伝されるハプロタイプをコンピュータシステムで決定する
ことを含む方法。
【請求項２３】
父親から胎児に遺伝されるハプロタイプを決定することが、
複数の核酸分子において、第１の複数の遺伝子座のそれぞれで父親ゲノムに存在し、母親ゲノムに存在しない対立遺伝子を同定し；及び
同定された対立遺伝子を有するハプロタイプとして遺伝された父親ハプロタイプを同定する
ことを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
胎児が父親から突然変異を遺伝したことを、
胎児によって遺伝された父親のハプロタイプを分析し；及び
遺伝されたハプロタイプにおいて突然変異を同定する
ことによって決定する
ことをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
妊娠女性の胎児のゲノムの少なくとも一部を決定する方法であって、胎児は父親と妊娠女性である母親を有し、父親は父親ハプロタイプを含む父親ゲノムを有し、母親は母親ハプロタイプを含む母親ゲノムを有し、該方法は、
ヘテロ接合である父親ゲノムの第１の複数の遺伝子座を決定し、ここで、父親ゲノムは胎児の父親から得られ、胎児の母親から得られる母親ゲノムはまた第１の複数の遺伝子座でヘテロ接合であり、ここで、第１の複数の遺伝子座での２つの父親ハプロタイプの各々、及び２つの母親ハプロタイプの各々は知られ；
ヘテロ接合である父親ゲノムの１以上の第２の複数の遺伝子座を決定し、ここで、母親ゲノムは第２の遺伝子座でホモ接合であり、第１の複数の遺伝子座及び第２の遺伝子座は同じ染色体上に存在し；
妊娠女性から得られた生物試料から複数の核酸分子を分析し、この場合、生物試料は、母親核酸及び胎児の核酸の混合物を含み、ここで、核酸分子を分析することが、
ヒトゲノムにおける核酸分子の位置を同定し；及び
核酸分子のそれぞれの対立遺伝子を決定する
ことを含み；
２つの父親ハプロタイプのうちのどれが胎児に遺伝されたかを、少なくとも１つの第２の遺伝子座で生物試料由来の複数の核酸分子の決定されたそれぞれの対立遺伝子を分析することによって決定し；
第１の複数の対立遺伝子の１を超える遺伝子座で核酸分子の決定されたそれぞれの対立遺伝子の相対量をコンピュータシステムで比較し；及び
胎児に遺伝されたことが決定された父親ハプロタイプに基づいて、かつ相対量の比較に基づいて、第１の複数の遺伝子座でカバーされたゲノムの一部で母親から胎児に遺伝されるハプロタイプを決定する
ことを含む方法。
【請求項２６】
妊娠女性の胎児のゲノムの少なくとも一部を決定する方法であって、胎児は父親と妊娠女性である母親を有し、胎児は父親ハプロタイプを含む父親ゲノムを有し、母親は母親ハプロタイプを有する母親ゲノムを有し、該方法は、
妊娠女性から得られる生物試料由来の複数の核酸を分析し、この場合、生物試料は、母親核酸及び胎児の核酸の混合物を含み、ここで、核酸分子の分析は、
ヒトゲノムにおける核酸分子の位置を同定し；及び
核酸分子のそれぞれの遺伝子座を決定する
ことを含み；
胎児ゲノムがヘテロ接合であり、母親ゲノムがホモ接合である第１の複数の遺伝子座を決定し；
第１の複数の遺伝子座の各々で父親から得られる対立遺伝子を、
第１の複数の遺伝子座のそれぞれの遺伝子座で核酸分子の決定されたそれぞれの対立遺伝子の相対量を決定し；及び
それぞれの遺伝子座で遺伝された対立遺伝子であるものとして少なくとも相対量を有する対立遺伝子を同定する
ことによって第１の複数の遺伝子座の各々で父親から遺伝された対立遺伝子をコンピュータシステムで決定し；
複数の参照ハプロタイプを同定し；及び
第１の複数の遺伝子座の各々で父親から遺伝された対立遺伝子を用いて、第１の複数の遺伝子座によってカバーされたゲノムの一部で、参照ハプロタイプのうちのどれが父親から遺伝されたかを決定する
ことを含む方法。
【請求項２７】
参照ハプロタイプのうちのどれが父親から遺伝されたかを決定することが、
父親から遺伝された参照ハプロタイプが固有に同定されるまで、第１の複数の遺伝子座の各々で父親から遺伝されることが決定された対立遺伝子と、複数の参照ハプロタイプの対応する遺伝子座における対立遺伝子とを繰り返して比較する
ことを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
父親ゲノムがヘテロ接合であり、母親ゲノムがホモ接合である第１の複数の遺伝子座の１つである特定の遺伝子座を決定することが、
特定の遺伝子座で対立遺伝子の予測されたカウントの数についてカットオフ値を決定し、該カットオフ値が母親ゲノムがホモ接合であり、胎児ゲノムがヘテロ接合であるかどうかを予測し、ここで、該カットオフ値は、特定の遺伝子座でホモ接合及びヘテロ接合の異なる組み合わせについてカウントの数の統計的分布に基づいて決定され；
生物試料由来の核酸分子の分析に基づいて、特定の遺伝子座で第１の対立遺伝子と第２の対立遺伝子を検出し；
生物試料由来の複数の核酸分子の配列決定に基づいて、第１の対立遺伝子の実際のカウント数を決定し；及び
実際のカウント数がカットオフ値未満であるとき、胎児ゲノムが第１の対立遺伝子についてヘテロ接合であり、及び母親ゲノムが第２の対立遺伝子についてホモ接合であると決定する
ことを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１〜１８及び２２〜２８のいずれか１項に記載の方法に対して演算を行うプロセッサーを制御するための複数の指令を記憶するコンピュータ読み取り可能な媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２００９年１１月５に出願された、「Ｆｅｔａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ａｎａｌａｙｓｉｓ」と題する米国仮特許出願第６１／２５８５６７号；２００９年１１月６日に出願された、「Ｆｅｔａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ａｎａｌａｙｓｉｓ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｍａｔｅｒｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓａｍｐｌｅ」と題する米国仮特許出願第６１／２５９０７５号；及び２０１０年９月１０日に出願された、「Ｆｅｔａｌ  Ｇｎｏｍｉｃ  Ａｎａｌａｙｓｉｓ  ｆｒｏｍ  ａ  Ｍａｔｅｒｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓａｍｐｌｅ」と題する米国仮特許出願第６１／３８１８６４号の優先権を主張し、非仮特許出願であり、それらの全内容は、全ての目的で参照により本明細書中に援用される。
【０００２】
また、本出願は、２００８年７月２３日に出願された、「Ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ  Ｆｅｔａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  Ｐａｒａｌｌｅｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」と題する米国特許出願第１２／１７８，１８１号（代理人受任番号第０１６２８５−００５２２０ＵＳ）；「Ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ  Ｆｅｔａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  Ａｎｅｕｐｌｏｉｄｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｗｉｔｈ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ」と題する米国特許出願第１２／６１４３５０号（代理人受任番号第０１６２８５−００５２２１ＵＳ）；及び「Ｓｉｚｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」と題する米国特許継続出願（代理人受任番号第０１６２８５−００６６１０ＵＳ）に関連し、それらの全内容は、全ての目的で参照により本明細書中に援用される。
【０００３】
本発明は、概して、母親試料に基づく胎児ゲノムの分析、より具体的には、母親試料のゲノム断片の分析に基づいて、胎児ゲノムの全又は部分の決定に関する。
【背景技術】
【０００４】
１９９７年において、母親血漿中に細胞不含胎児核酸の発見が、非侵襲性の出生前診断の新たな可能性を切り開いた（Ｌｏ  ＹＭＤら、Ｌａｎｃｅｔ  １９９７；３５０：４８５−４８７；及び米国特許第６，２５８，５４０号）。この技術は、臨床応用に急速に変えられ、これは、胎児由来の父方遺伝の遺伝子又は配列の決定、例えば、胎児性別決定、胎児ＲｈＤ状態の決定、及び胎児が父方遺伝の突然変異を遺伝したかどうかの決定を行う（Ａｍｉｃｕｃｃｉ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２０００；４６：３０１−３０２；Ｓａｉｔｏ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｌａｎｃｅｔ  ２０００；３５６：１１７０；及びＣｈｉｕ  ＲＷＫ  ｅｔ  ａｌ，Ｌａｎｃｅｔ  ２００２；３６０：９９８−１０００）。この分野における最近の進歩により、母親血漿の核酸分析から、トリソミー２１などの胎児染色体異数性の出生前診断を可能にしている（Ｌｏ  ＹＭＤ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００７；１３：２１８−２２３；Ｔｏｎｇ  ＹＫ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００６；５２：２１９４−２２０２；ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ２００６／０２５２０７１；Ｌｏ  ＹＭＤ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００７；１０４：１３１  １６−１３１２１；Ｃｈｉｕ  ＲＷＫ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００８；１０５：２０４５８−２０４６３；Ｆａｎ  ＨＣ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ２００８；１０５：１６２６６−１６２７１；米国特許出願公開第２００７／０２０２５２５号；及び米国特許出願第２００９／００２９３７７号）。
【０００５】
重要な最近の進歩の別の領域は、母親と父親の両方が同じ突然変異を担持する単一遺伝子疾患の非侵襲性出生前診断について、デジタルＰＣＲなどの単一分子カウント法の使用である。これは、母親血漿中の相対的な突然変異用量（ＲＭＤ）によって達成される（米国特許出願第２００９／００８７８４７号；Ｌｕｎ  ＦＭＦ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００８；１０５：１９９２０−１９９２５；及びＣｈｉｕ  ＲＷＫ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  ２００９；２５：３２４−３３１）。
【０００６】
しかしながら、このような方法は、ゲノムの特定部分を分析するために可能な突然変異の従前の知識を使用し、したがって、潜在的又は珍しい突然変異又は遺伝病を同定することができない。したがって、非侵襲性技術を用いて、胎児ゲノムの全て又は一部を同定することができる新規な方法、システム、及び装置を提供することが望まれる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明のある種の態様は、妊娠女性の胎児（ｕｎｂｏｒｎ  ｆｅｔｕｓ）のゲノムの少なくとも一部を決定するための方法、システム、及び装置を提供することができる。全ゲノムの遺伝子マップ又は選択されたゲノム領域（単数又は複数）の遺伝子マップは、胎児及び母親のゲノム材料を含む試料（例えば、妊娠している母親の血液試料）を用いて、出生前に胎児から構成され得る。ゲノムマップは、胎児がその父親と母親の両方から遺伝され、又は両親のうちのちょうど１人から遺伝されている配列のようなものであり得る。このような遺伝子マップの１つ又はいくつかに基づいて、胎児が、遺伝的疾患、あるいは遺伝的疾患若しくは他の疾患、又は遺伝形質になる傾向を被るであろうという危険性を決定することができる。また、これらの態様の他の用途が本明細書に記載されている。
【０００８】
一態様では、母親試料からのＤＮＡ断片（母親及び胎児ＤＮＡを含む）を分析して、ある種の特定の遺伝子座での対立遺伝子（象徴）を同定することができる。次に、これらの遺伝子座のそれぞれの対立遺伝子のＤＮＡ断片の量を一緒に分析して、これらの遺伝子座のハプロタイプの相対量を決定し、それによって、どのハプロタイプが母親及び／又は父親のゲノムから胎児に遺伝されたかを決定することができる。胎児ハプロタイプを同定することによって、特定の遺伝子座を含む対応するゲノム領域内の個々の遺伝子座の胎児遺伝子型が決定され得る。種々の態様では、両親がホモ接合及びヘテロ接合の特定の組み合わせである遺伝子座は、胎児ゲノムの領域を決定する方法で分析することができる。１つの実施では、集団に共通のハロタイプの代表である参照ハロタイプを母親試料のＤＮＡ断片の分析と一緒に用いて、母親及び父親のゲノムを決定する。また、他の態様が提供され、例えば、突然変異の決定、母親試料中の画分胎児濃度の決定、母親試料の配列決定の被覆率の決定が挙げられる。
【０００９】
本発明の他の態様は、本発明に記載されている方法と関連したシステム、装置、及びコンピュータ読み取り可能な媒体に指向される。一態様では、コンピュータ読み取り媒体は、データ受信及びデータ分析のための指令を含むが、機器をデータ作製に仕向けるための指令（例えば、核酸分子の配列決定）は含まない。別の態様では、コンピュータ読み取り媒体は、機器をデータ作製に仕向ける指令を含む。一態様では、コンピュータプログラム製品は、本明細書に記載されている方法に対して演算を行うプロセッサーを制御するための複数の指令を記憶するコンピュータ読み取り媒体を含む。また、態様は、潜在的には、それぞれのステップ又はステップのそれぞれのグループを実行する異なるコンポーネントを用いて、本明細書に記載されている方法のいずれかのステップを実行するように構成されたコンピュータシステムに指向される。
【００１０】
図面及び特許請求の範囲を含む明細書の残り部分への参照は、本発明の態様の他の特徴及び利点を実現する。更なる特徴及び利点、並びに本発明の種々の態様の構造及び操作は、添付の図面に照らして以下に詳述される。図面では、同様に参照番号は、同一又は機能的に類似したエレメントを示すことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の態様に係る妊娠女性の胎児のゲノムの少なくとも一部を決定する方法１００のフローチャートである。
【図２】本発明の態様に係るハロタイプのそれぞれのゲノムコードの特定のセグメントについて、父親に対する２つのハロタイプ及び母親に対する２つのハロタイプを示す。
【図３】本発明の態様に係る図２の親のハロタイプにおけるＳＮＰの２つのタイプを示す。
【図４Ａ】本発明の態様に係る２つのタイプのＳＮＰについての胎児ハロタイプを決定するための分析を示す。
【図４Ｂ】本発明の態様に係る２つのタイプのＳＮＰについての胎児ハロタイプを決定するための分析を示す。
【図５Ａ】各遺伝子座についての断片の相対量（例えば、カウント）を比較し、比較の結果が、本発明の態様に係る、遺伝された又は遺伝されていない特定のハロタイプを分類されることであるかどうかの分析を示す。
【図５Ｂ】各遺伝子座についての断片の相対量（例えば、カウント）を比較し、比較の結果が、本発明の態様に係る、遺伝された又は遺伝されていない特定のハロタイプを分類されることであるかどうかの分析を示す。
【００１２】
【図６】本発明の態様に係るＳＰＲＴ分類に対する尤度比を変化させる効果を示す。
【図７】本発明の態様に係る、父親から遺伝された妊娠女性の胎児のゲノムの少なくとも一部を決定する方法７００のフローチャートである。
【図８】本発明の態様に係る、母親及び父親がヘテロ接合である領域における胎児のゲノムの少なくとも一部を決定するための方法８００のフローチャートである。
【図９】本発明の態様に係る、特定のゲノム領域においてともにヘテロ接合である父親及び母親のハロタイプを示す。
【図１０】本発明の態様に係る、母親試料中の胎児材料の分画濃度を決定するための方法１０００を示すフローチャートである。
【００１３】
【図１１】本発明の態様に係る、遺伝子座が情報を与えるかどうかを決定するための方法のフローチャートである。
【図１２Ａ】本発明の態様に係る、推定される画分胎児ＤＮＡ濃度がそれぞれ２０％及び５％である、３つのシナリオについて対立遺伝子Ｔ（シナリオ（ａ）及び（ｃ）において少量の対立遺伝子）についてのカウントの予測される分布を示す。
【図１２Ｂ】本発明の態様に係る、推定される画分胎児ＤＮＡ濃度がそれぞれ２０％及び５％である、３つのシナリオについて対立遺伝子Ｔ（シナリオ（ａ）及び（ｃ）において少量の対立遺伝子）についてのカウントの予測される分布を示す。
【図１３Ａ】本発明の態様に係る、２０％の画分胎児ＤＮＡ濃度について少量の対立遺伝子のカウントについて予測される分布を示し、各々はＳＮＰに対応する分子の異なる全体数である。
【図１３Ｂ】本発明の態様に係る、２０％の画分胎児ＤＮＡ濃度について少量の対立遺伝子のカウントについて予測される分布を示し、各々はＳＮＰに対応する分子の異なる全体数である。
【図１４】本発明の態様に係る、２０％の画分胎児ＤＮＡ濃度について少量の対立遺伝子のカウントについて予測される分布を示し、各々はＳＮＰに対応する分子の異なる全体数である。
【図１５Ａ】本発明の態様に係る、参照ハロタイプ、参照ハロタイプから採取された親のハロタイプ、及び得られた胎児ハロタイプの例を示す。
【図１５Ｂ】本発明の態様に係る、参照ハロタイプ、参照ハロタイプから採取された親のハロタイプ、及び得られた胎児ハロタイプの例を示す。
【００１４】
【図１６】本発明の態様に係る、一連の参照ハロタイプが知られているが、親のハロタイプが知られていない場合、胎児ゲノムの少なくとも一部を決定するための方法１６００のフローチャートである。
【図１７】本発明の態様に係る、母親試料由来のＤＮＡ断片の分析から情報を与える遺伝子座の決定の例を示す。
【図１８】３つの参照ハロタイプ（Ｈａｐ  Ａ、Ｈａｐ  Ｂ及びＨａｐ  Ｃ）並びに親の対立遺伝子を示す。
【図１９】本発明の態様に係る、親の対立遺伝子由来の親のハロタイプの決定を示す。
【図２０】本発明の態様に係る、母親試料分析から母親遺伝子型の推定を示す。
【００１５】
【図２１】本発明の態様に係る、母親遺伝子型由来の母親ハロタイプ及び参照ハロタイプを決定するための態様を示す。
【図２２】本発明の態様に係る、決定された母親ハロタイプ及び父親から遺伝されたハロタイプを示す。
【図２３】本発明の態様に係る、父親ハロタイプと比較した母親ハロタイプについて遺伝子座の異なるタイプ（アルファ（Ａ）とベータ（Ｂ））を示す。
【図２４】妊娠女性の胎児のゲノムにおいてデノボ突然変異を決定するための方法２４００を示すフローチャートである。
【図２５Ａ】本発明の態様に係る、父親、母親及び胎児（ＣＶＳ）について異なる遺伝子型由来の組み合わせを示すＳＮＰの絶対数と割合を示す。
【図２５Ｂ】最初の２０個のフローセルのアラインメント統計を列挙した表を示す。
【００１６】
【図２６】本発明の態様に係る、２つの方法を介して、ＳＮＰについて計算された胎児ＤＮＡの画分濃度を示す表である。
【図２７Ａ】図２７Ａは、本発明に係る、分析された最初の２０個のフローセルについての配列決定データから胎児対立遺伝子が観察されたこのサブセットにおけるＳＮＰの観察された割合を示すプロットを示し、図２７Ｂは、本発明の態様に係る、読み取りの範囲 対 数のプロットを示す。
【図２７Ｂ】図２７Ａは、本発明に係る、分析された最初の２０個のフローセルについての配列決定データから胎児対立遺伝子が観察されたこのサブセットにおけるＳＮＰの観察された割合を示すプロットを示し、図２７Ｂは、本発明の態様に係る、読み取りの範囲 対 数のプロットを示す。
【図２８Ａ】図２８Ａは、本発明の態様に係る、それぞれ、父親から遺伝された対立遺伝子の範囲とマッピング可能な配列の読み込みとフローセル配列の数との相関のプロットを示す。
【図２８Ｂ】図２８Ｂは、本発明の態様に係る、それぞれ、父親から遺伝された対立遺伝子の範囲とマッピング可能な配列の読み込みとフローセル配列の数との相関のプロットを示す。
【図２９Ａ】図２９Ａは、本発明の態様に係る、配列決定されたフローセルの偽陽性率と数との相関を示し、図２９Ｂは、本発明の態様に係る、配列決定されたフローセルの偽陽性率と数との相関を示す。
【図２９Ｂ】図２９Ａは、本発明の態様に係る、配列決定されたフローセルの偽陽性率と数との相関を示し、図２９Ｂは、本発明の態様に係る、配列決定されたフローセルの偽陽性率と数との相関を示す。
【図３０】本発明の態様に係る、異なる数の分析されたフローセルについての胎児特異的なＳＮＰの範囲を示す。
【００１７】
【図３１】本発明の態様に係る、１０個のフローセルからのデータを用いた場合のタイプＡの分析の精度を示す。
【図３２】本発明の態様に係る、１０個のフローセルからのデータを用いた場合のタイプＢの分析の精度を示す。
【図３３】本発明の態様に係る、２０個のフローセルからのデータを用いた場合のタイプＡの分析の精度を示す。
【図３４】本発明の態様に係る、２０個のフローセルからのデータを用いた場合のタイプＢの分析の精度を示す。
【図３５Ａ】図３５Ａは、本発明の態様に係る、コドン４１／４２の突然変異と野生型配列の読み込みを示す。
【図３５Ｂ】図３５Ｂは、本発明の態様に係る、コドン４１／４２の突然変異と野生型配列の読み込みを示す。
【００１８】
【図３６】本発明の態様に係る、タイプＡのＲＨＤＯ分析の表を示す。
【図３７】本発明の態様に係る、タイプＢのＲＨＤＯ分析の表を示す。
【図３８Ａ】例として事例ＰＷ２２６についてのＳＰＲＴ分類を示す。
【図３８Ｂ】例として事例ＰＷ２２６についてのＳＰＲＴ分類を示す。
【図３９】本発明の態様に係る、５つの事例についてのＲＨＤＯ分析の結果をまとめた表を示す。
【図４０】本発明の態様に係る、配列決定されたフローセルの数に対する配列決定深度のプロットを示す。
【００１９】
【図４１】胎児のサイズと全ゲノムの総配列のプロットを示す。
【図４２Ａ】本発明の態様に係る、各染色体の同じプロットを個別に示す。
【図４２Ｂ】本発明の態様に係る、各染色体の同じプロットを個別に示す。
【図４２Ｃ】本発明の態様に係る、各染色体の同じプロットを個別に示す。
【図４３】本発明の態様に係る、システム及び方法を用いて使用可能な一例のコンピュータシステム４３００のブロックダイアグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
定義
用語「生物試料」とは、本明細書で使用するとき、対象（例えば、妊娠女性などのヒト）から採取され、対象とする１以上の核酸分子を含むいずれかの試料を意味する。
【００２１】
用語「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）、及び一本又は二本鎖のいずれかの形態であるそのポリマーのことである。具体的に限定されない限り、当該用語は、基準核酸と同程度の結合特性を有する、既知の天然ヌクレオチドアナログを含む核酸を含み、そして天然に存在するヌクレオチドに同様の方法で代謝される。他に示されない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰｓ、及び相補的配列、並びに明確に示された配列を暗黙的に含む。具体的には、縮重コドン置換は、一つ以上選択された（又は全ての）コドンの第三の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を生じさせることによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ， Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。用語、核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、低分子ノンコーディングＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ相互作用ＲＮＡ、及び遺伝子又は遺伝子座によってコード化されたショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）と交換可能に使用される。
【００２２】
用語「遺伝子」は、ポリペプチド鎖を産生することに関与するＤＮＡ断片を意味する。それは、コード領域に先行する、及びコード領域に続く領域（リーダー及びトレイラー）、並びに個々のコード断片（エキソン）間の介在配列を含み得る。
【００２３】
本明細書において使用される用語「臨床的に重要な核酸配列」は、その潜在的不均衡が試験される、より大きな遺伝子配列断片に相当するポリヌクレオチド配列のことか、又はそのより大きな遺伝子配列自体に相当するポリヌクレオチド配列のことであり得る。一つの実施例は、第２１番染色体の配列である。他の例は、第１８番、第１３番、Ｘ及びＹ染色体を含む。さらに他の例は、胎児がその親の片方又は両方から受け継いているかもしれない変異遺伝子配列、又は遺伝子多型、又はコピー数変異を含む。さらに他の実施例は、悪性腫瘍中において変異した、欠失した、又は増幅された配列、例えばヘテロ接合性の欠損又は遺伝子重複が起こっている配列を含む。幾つかの実施形態において、複数の臨床的に重要な核酸配列、又は臨床的に重要な核酸配列の同等の複数のメーカーが、当該不均衡を検出するためのデータを提供するために使用され得る。例えば、第２１番染色体上の５つの不連続配列からのデータは、可能性のある第２１番染色体不均衡の決定のための付加的な方法において使用され得、効果的に試料の容量を１／５へと減少させる。
【００２４】
本明細書において使用される用語「に基づく」は、「少なくとも一部に基づく」ことを意味し、そして、一つの方法の入力とその方法の出力との関係において生じる、一つの値の決定において使用される別の値（又は結果）のことをいう。本明細書において使用される用語「導く」はまた、一つの方法の入力とその方法の出力との関係のことであり、例えば誘導が公式計算であるときに起こる。
【００２５】
本明細書において使用される用語「パラメータ」は、定量的データのセットを特徴づける数値、及び／又は定量的データセット間における数的関係を意味する。例えば、第一の核酸配列の第一の量と第二の核酸配列の第二の量との間における比率（又は比率の関数）はパラメータである。
【００２６】
本明細書において使用するとき、用語「遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）」又はその複数形の「遺伝子座（ｌｏｃｉ）」とは、ゲノム全体での改変を有する任意の長さのヌクレオチド（又は塩基対）の局在又は所在を意味する。
【００２７】
用語「配列不均衡」とは、本明細書で使用するとき、参照量からの臨床的に関連した核酸配列における少なくとも１つのカットオフ値によって定義される任意の有意な逸脱を意味する。配列不均衡は、染色体用量不均衡、対立遺伝子不均衡、突然変異用量不均衡、ハプロタイプ用量不均衡、及び他の類似した不均衡を含むことができる。一例として、対立遺伝子不均衡又は突然変異用量不均衡は、胎児が母親由来の異なる遺伝子型を有する場合に生じ、それにより試料中の特定の遺伝子座で不均衡を創出することができる。
【００２８】
本明細書において使用される用語「染色体異数性」は、２倍体ゲノムのもの由来の染色体量における変異を意味する。当該変異は、増加又は欠失であり得る。それは、一つの染色体の全体、又は一つの染色体の領域に関連し得る。
【００２９】
用語「ハプロタイプ」とは、本明細書において使用するとき、同じ染色体又は染色体領域上の一緒に伝えられる、複数の遺伝子座での対立遺伝子の組み合わせを意味する。ハプロタイプは、僅かに一対の遺伝子座、染色体領域、又は全染色体を意味する場合がある。用語「対立遺伝子」とは、異なる表現型形質に帰着するか又は帰着しない可能性がある同じ物理的ゲノム遺伝子座での代替のＤＮＡ配列を意味する。任意の特定の２倍体生物では、各染色体（男性対象における性染色体を除く）の２つのコピーを有し、各遺伝子についての遺伝子型は、ホモ接合体においては同じであり、ヘテロ接合体においては異なる、その遺伝子座に存在する対立遺伝子の対を含む。生物の集団又は種は、典型的には、種々の個体間で各遺伝子座に複数の対立遺伝子を含む。１を超える対立遺伝子がこの集団に見られるゲノム遺伝子座は多形性部位と呼ばれる。遺伝子座での対立遺伝子改変体は、存在する対立遺伝子の数（すなわち、多型の程度）、又は集団におけるヘテロ接合体の比率（すなわち、ヘテロ接合性率）として測定可能である。本明細書において使用するとき、用語「多型」とは、ヒトゲノムにおける任意の個体間改変を意味し、その頻度とは関係しない。このような改変体の例には、限定されないが、単一のヌクレオチド多型、単一のタンデムリピート多型、挿入−欠失多型、突然変異（疾患原因となり得る）、及びコピー数の改変体が含まれる。
【００３０】
出生前の胎児の部分的な遺伝子マップ又は完全なゲノム配列の構築は、その親の多型配列のハプロタイプに基づいて提供され得る。用語「ハプロタイプ」とは、本明細書中で使用するとき、同一の染色体又は染色体の領域上に一緒に伝わる複数の遺伝子座での対立遺伝子の組み合わせを意味する。例えば、態様は、母親の試料（母親と胎児のＤＮＡを含む）からのＤＮＡ断片を分析し、ある種の特定の遺伝子座（ランドマーク）で対立遺伝子を同定することができる。次に、それらの遺伝子座でのそれぞれの対立遺伝子のＤＮＡ断片量を一緒に分析して、これらの遺伝子座についてのハプロタイプの相対量を決定し、それによって、どのハプロタイプが母親及び／又は父親のゲノムから胎児に遺伝されたかを決定することができる。胎児ハプロタイプを同定することによって、特定の遺伝子座を含む対応するゲノム領域内の個々の遺伝子座での胎児遺伝子型を決定することができる。種々の態様では、親がホモ接合とヘテロ接合の特定の組み合わせである遺伝子座は、胎児ゲノムの領域を決定するように分析することができる。１つの実施において、集団に共通したハロタイプの代表である参照ハロタイプは、母親の試料のＤＮＡ断片の分析と一緒に用いられて、母親と父親のゲノムを決定する。
【００３１】
胎児ゲノムの少なくとも一部を決定するための態様の応用冷は、推定された胎児のゲノム又はハプロタイプと、疑われた父親のゲノム又はハプロタイプとを比較することによる実父確定検査に対するものであり得た。別の例は、胎児が獲得した１以上のデノボの突然変異を検出し、その親からの配偶子の生成中に起こる減数分裂性組み換え事象を検出することである。これらは受精された配偶子であり、得られた接合子は胎児で発生した。
【００３２】
さらに、いくつかの態様はまた、任意の所望の解像度で出生前の胎児のゲノム配列を決定することができる。例えば、ある種の応用では、態様は、完全又は完全に近い胎児のゲノム配列を決定することができる。一態様では、決定され得る胎児ゲノム配列の解像度は、胎児核酸を含む母親の生物試料からの配列決定情報と併せて、父親と母親のゲノムの知識の解像度に依存する。父親と母親の完全又は完全に近いゲノム配列が知られている事象では、出生前の胎児の完全又は完全に近いゲノム配列が推定され得た。
【００３３】
他の態様では、ゲノム内の選択された領域のゲノム配列だけが、例えば、選択された遺伝的障害、後成的障害（刷り込み障害など）、又は染色体障害の出生前診断について解明されている。態様が適用され得る遺伝的障害の例には、異常ヘモグロビン症（例えば、ベータ−サラセミア、アルファ−サラセミア、鎌状赤血球貧血、ヘモグロビンＥ疾患）、嚢胞性線維症、及び伴性障害（例えば、血友病及びデュシェンヌ型筋ジストロフィー）などが挙げられる。態様を用いて検出され得る更なる例は、Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｍｉｍ／ｇｅｔｍｏｒｂｉｄ．ｃｇｉ）から見出される。
【００３４】
また、いくつかの態様は、胎児ＤＮＡの画分濃度を決定するために使用することができ、それは、親の特定のゲノムの任意の従前の知識なしに行われてもよい。さらに、類似の分析を用いて、胎児ゲノムの正確な決定に必要とされる範囲の深度を決定することができる。このようにして、この範囲決定を用いて、どのくらいのデータが正確な結果を得るために分析される必要があるかを見積もることができる。
【００３５】
Ｉ．導入
母親の試料（例えば、血漿又は血清）が胎児ハプロタイプを解明するための材料として使用される場合、２つの主要な挑戦が存在し得る。第１の挑戦は、母親の血漿又は血清が胎児と母親のＤＮＡの混合物からなるということであり、胎児ＤＮＡは最小集団である。胎児ＤＮＡは、妊娠の最初の２つの第３期において、母親の血漿中の全ＤＮＡの約５％〜１０％の平均メジアン濃度を表すことが示されている（Ｌｏ  ＹＭＤ  ｅｔ  ａｌ  Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  １９９８；６２：７６８−７７５；Ｌｕｎ  ＦＭＦ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００８；５４：１６６４−１６７２）。ＤＮＡは血液凝固過程中に母親の血球によって置換されるので、母親の血清中の胎児ＤＮＡの画分濃度は、母親の血漿中のものよりもさらに低くなり得る。このようにして、いくつかの態様では、母親の血漿は母親の血清よりも好ましい。
【００３６】
第２の調製は、母親の血清中の胎児ＤＮＡと母親ＤＮＡは短い断片からなるということである（Ｃｈａｎ  ＫＣＡ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００４；  ５０：  ８８−９２）。確かに、胎児由来のＤＮＡは、一般に、母親の血漿中の母親由来のＤＮＡよりも短い。母親の血漿中の大部分の胎児ＤＮＡは、長さにして２００ｂｐ未満である。このように短い血漿ＤＮＡ断片を単独で用いて、長いゲノム距離と比較して、遺伝的多型のハプロタイプを構築することは挑戦的となり得る。また、母親の血漿及び血漿についての上記した挑戦は、母親の尿における胎児ＤＮＡの検出に適用される（Ｂｏｔｅｚａｔｕ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２０００；４６：１０７８−１０８４）。胎児ＤＮＡだけは、妊娠女性の尿中のＤＮＡの最小画分を表し、母親の尿中の胎児ＤＮＡはまた短いＤＮＡ断片からなる。
【００３７】
Ａ．母親試料の配列決定及び分析
いくつかの態様が第１の挑戦に取り組むために採用してきたアプローチは、高精度で母親の生物試料から得られた核酸の定量的遺伝子型を可能にする方法を用いることである。このアプローチの１つの例では、精度は、大多数（例えば、数百万、数十億）の核酸分子の分析によって達成される。さらに、この精度は、単一の核酸分子の分析、又は単一の核酸分子のクローナル増幅によって高めることができる。１つの態様は、大規模並列配列決定を用い、例えば、限定されないが、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒプラットフォーム（Ｂｅｎｔｌｅｙ  ＤＲ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  ２００８；  ４５６：  ５３−５９）、Ｒｏｃｈｅ  ４５４プラットフォーム（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００５；４３７：３７６−３８０）、ＡＢＩ  ＳＯＬｉＤプラットフォーム（ＭｃＫｅｒｎａｎ  ＫＪ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２００９；１９：１５２７−１５４１）、Ｈｅｌｉｃｏｓ単一分子配列決定プラットフォーム（Ｈａｒｒｉｓ  ＴＤ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００８；３２０：１０６−１０９）、単一ポリメラーゼ分子を用いたリアルタイム配列決定（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００９；３２３：１３３−１３８）、及びナノ細孔配列決定（Ｃｌａｒｋｅ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９；４：２６５−７０）によって実行されるものが挙げられる。一態様では、大規模並列配列決定は、生物試料中の核酸分子のランダムサブセットについて実施される。
【００３８】
いくつかの態様では、各分子からのできる限り長い配列読み込みを得ることは利点となり得る。達成され得る配列決定読み込みの長さの１つの制限は、母親の生物試料中の核酸分子の性質である。例えば、母親試料中の大部分のＤＮＡ分子は短い断片からなることは知られている（Ｃｈａｎ  ＣＡ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００４；５０：８８−９２）。さらに、読み込み長さは、長い読み込み長さでの配列決定システムの忠誠に対して平衡を保たなければならない。上記システムのいくつかについて、分子の両末端からの配列、いわゆる対末端配列決定を得ることが好ましい場合がある。例証として、１つのアプローチはＤＮＡ分子の各末端から５０ｂｐの配列決定を行い、すなわち、分子あたり全１００ｂｐの配列をもたらすことである。別の態様では、ＤＮＡ分子の各末端からの７５ｂｐの配列決定、すなわち、結果としての分子あたり全１５０ｂｐの配列決定がなされ得る。
【００３９】
配列決定がなされた後、次に、配列は参照ヒトゲノムに戻って整列される。態様は、両親からの出生前胎児によって遺伝されたゲノム改変体を解明するので、アラインメントアルゴリズムは配列改変体に対処し得る。このようなソフトウェアパッケージの一例は、Ｉｌｌｕｍｉｎａによって製造されるＥｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｌａｒｇｅ−Ｓｃａｌｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｄａｔａｂａｓｅｓ（ＥＬＡＮＤ）ソフトウェアである。このようなソフトウェアパッケージの別の例は、ＳＯＡＰ（短いオリゴヌクレオチドアラインメントプログラム）及びＳＯＡＰ２ソフトウェア（Ｌｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００８；２４：７１３−７１４；Ｌｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００９；２５：１９６６−１９６７）である。
【００４０】
実施されることが必要であり得るＤＮＡ配列決定の量は、胎児遺伝子マップ又は胎児ゲノム配列が構築される得る解像度に依存し得る。一般に、配列決定される分子が多くなれば、解像度も高くなる。ＤＮＡ配列決定の所定のレベル又は深度での胎児遺伝子マップ又は胎児ゲノム配列の別の決定因子は、母親の生物試料中の胎児ＤＮＡの画分濃度である。一般に、画分胎児ＤＮＡ濃度が高まると、ＤＮＡ配列決定の所定のレベルで解明され得る胎児遺伝子マップ又は胎児ゲノム配列の解像度が高まる。母親の血漿中の胎児ＤＮＡの画分濃度が母親の血漿中のものよりも高いので、母親の血漿は、いくつかの態様の母親の血清よりも好ましい母親の生物試料タイプである。
【００４１】
上記の配列決定に基づく方法のスループットは、インデキシング又はバーコーディングの使用とともに増加し得る。このようにして、試料又は患者特異的なインデックス又はバーコードは、特定の核酸配列決定ライブラリーにおける核酸断片に添加され得る。このようにして、このような多数のライブラリーは、各々が試料又は患者の特異的なインデックス又はバーコードであり、一緒に混合され、一緒に配列決定される。配列決定反応後、配列決定データは、バーコード又はインデックスに基づいて、各試料又は患者から回収され得る。この戦略は、本発明の態様のスループット、したがって、コストパフォーマンスを増大させ得る。
【００４２】
一態様では、生物試料中の核酸分子は、定量的なゲノタイピング（例えば、配列決定）前に選択されるか又は分画されてもよい。一変形では、核酸分子は、ゲノム中の選択された遺伝子座（例えば、ＣＦＴＲ遺伝子を含む第７染色体上の領域）由来の核酸分子に選択的に結合することができるデバイス（例えば、マイクロアレイ）を用いて処理される。次に、配列決定は、デバイスによって捕捉された核酸分子上で選択的に実施され得る。このスキームは、対象とするゲノム領域に対して配列決定を標的とすることを可能にする。このスキームの一態様では、Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ配列捕捉システム（ｗｗｗ．ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｓｅｑｃａｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）又はＡｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｗｗｗ．ｏｐｅｎｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｃｏｍ／ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｔａｒｇｅｔ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ）、又は類似のプラットフォームを用いることができる。いくつかの態様では、ゲノムの選択された領域由来の核酸分子をランダム配列決定に供される。
【００４３】
別の態様では、生物試料中の対象とするゲノム領域は、１セット又は複数セットの増幅プライマーによって最初に増幅され得る。次に、定量的なゲノタイピング、例えば、配列決定は、増幅産物上で実施され得る。このスキームの一態様では、ＲａｉｎＤａｎｃｅ（ｗｗｗ．ｒａｉｎｄａｎｃｅｔｅｃｈ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ／ｐｃｒ−ｇｅｎｏｍｉｃｓ−ｒｅｓｅａｒｃｈ．ａｓｐ）システムを用いることができる。いくつかの態様では、増幅された核酸分子はランダム配列決定に供される。
【００４４】
また、サイズ画分肯定は、生物試料中の核酸分子上で実施され得る。胎児ＤＮＡは母親の血漿中の母親ＤＮＡよりも短いことが知られている（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００４；５０：１００２−１０１１；米国特許出願第２００５０１６４２４１号；米国特許出願第２００７０２０２５２５号）ので、より小さい分子サイズの画分を回収し、次に、定量的なゲノタイピング、例えば、配列決定のために用いることができる。このような画分は、元の生物試料よりも高い胎児ＤＮＡの画分濃度を含む。このようにして、胎児ＤＮＡに富化された画分の配列決定は、非富化試料を用いた場合よりも、分析の特定レベル（例えば、配列決定の深度）で、より高い解像度を用いて、胎児ゲノムマップ又は胎児ゲノム配列を構築することができるようになる。したがって、これは、本技術をよりコストパフォーマンスにすることができる。サイズ分画の方法の例として、（ｉ）ゲル電気泳動、続く特定のゲル分画からの核酸分子の抽出；（ｉｉ）異なるサイズの核酸分子に対する差分親和性を有する核酸結合マトリックス；又は（ｉｉｉ）異なるサイズの核酸分子に対する差分保持を用いたろ過システムを用いることができた。
【００４５】
なお別の態様では、核酸配列決定を可能にする特定のサイズ又はサイズ範囲の核酸分子を選択的に分析することができた。例えば、ＤＮＡ分子の両末端が配列決定される、対末端配列決定を行うことができた。次に、これらの末端の両方のゲノム座標は、参照ヒトゲノムに戻ってマッピングすることができた。その後、両末端のゲノム座標を差し引くことによって分子サイズを推定することができた。このような対末端配列決定を行うための１つの方法は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｅｒの対末端配列決定プロトコールを用いることである。ＤＮＡ分子のサイズを推定するための別の方法は、全ＤＮＡ分子を配列決定することである。これは、相対的に長い読み込み長さを有するプラットフォーム、例えば、Ｒｏｃｈｅ  ４５４プラットフォーム（Ｍａｒｇｕｅｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  ２００５；４３７：３７６−３８０）及びＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ単一分子、リアルタイム（ＳＭＲＴ（商標））技術（Ｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００９；３２３：１３３−１３８）を配列決定することによって最も容易に行われる。核酸分子のサイズの検出後、特定のサイズのカットオフより小さい分子上の続く分析に焦点を合わせるように選択し、それにより胎児ＤＮＡの画分濃度において富化することができる。このサブセットの分子の分析は、この手法がなされなかった場合よりも、サイズ選択後に分析された少ない分子を用いて推定されるべき胎児ゲノムマップ又は胎児ゲノム配列を可能にする。一態様では、３００ｂｐのサイズカットオフを用いる。さらに他の態様では、２５０ｂｐ、２００ｂｐ、１８０ｂｐ、１５０ｂｐ、２５ｂｐ、１００ｂｐ、又は７５ｂｐのサイズカットオフを用いることができた。
【００４６】
Ｂ．スキャホールドとしての親のゲノムの使用
第２の挑戦に対処するために、いくつかの態様は「スキャホールド」として母親の染色体のハプロタイプを用いることができる。また、父親の染色体のハプロタイプは別の「スキャホールド」として用いることができる。このスキャホールドは、胎児ＤＮＡを含む母親試料から得られた胎児の遺伝子情報と比較することができる。この胎児ゲノム情報は、父親及び／又は母親のスキャホールドがどのようにして胎児ゲノムに構築されたかを決定するために使用して、それにより、そのスキャホールドのコンパートメント部分を用いて、得られた胎児ゲノムを決定することができる。
【００４７】
親のハプロタイプは、父親と母親由来、ファミリーの他のメンバー、例えば、現在妊娠している姉妹由来のゲノムＤＮＡから構築することができる。親のハプロタイプの利用可能性は、ゲノム配列決定の費用の削減を考慮して、益々通常になり得る。１つのシナリオでは、片親又は両親が、すでにそれらの配列決定されたゲノムを有し、１以上の染色体領域上のそれらのハプロタイプが決定されている場合、この情報は上述したスキャホールドとして用いることができる。
【００４８】
ゲノムにおける配列改変体を調べることができる、当業者に知られている任意のゲノタイピングプラットフォームを用いることができ、例えば、ＤＮＡ配列決定、マイクロアレイ、ハイブリダイゼーションプローブ、蛍光に基づく技術、光学技術、分子バーコード及び単一分子画像化（Ｇｅｉｓｓ  ＧＫ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００８；２６：３１７−３２５）、単一分子分析、ＰＣＲ、質量分析（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｏｍ  ＭａｓｓＡＲＲＡＹなどが挙げられる。より極端な例として、父親と母親のＤＮＡ配列は、大規模な並列配列決定法（例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙ  ＤＲ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００８；４５６：５３−５９；ＭｃＫｅｒｎａｎ  ＫＪ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  ２００９；１９：１５２７−１５４１）を用いて、全ゲノムＤＮＡ配列決定によって決定することができる。対象とし得る配列改変体の例は、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）である。親の遺伝子型を決定する特に好ましい方法は、ゲノム全般規模でＳＮＰのマイクロアレイ分析によるものであり、又は選択されたゲノム領域では、例えば、突然変異が遺伝子疾患を引き起こす可能性がある遺伝子（例えば、ベータ−グロビンクラスターにおける遺伝子、又は嚢胞性線維性膜貫通調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子）を含むものである。配列改変体とは異なって、コピー数改変体も用いることができる。配列改変体及びコピー数改変体はともに多型遺伝的特徴（ＰＭＦ）と呼ばれる。
【００４９】
一局面では、対象とする染色体又は染色体領域上の母親の遺伝子型をハプロタイプに構築することができる。これが行われ得る１つの方法は、母親に関連した他のファミリーメンバー、例えば、母親の息子又は娘、親、姉妹などの分析によるものである。ハプロタイプが構築され得る別の方法は、上記した当業者に周知である他の母親を介するものである。
【００５０】
次に、遺伝子型情報は、他のファミリーメンバー、例えば、現在妊娠の胎児の姉妹、又は祖父母の遺伝子型などからの遺伝子型情報と比較することによって、親のハプロタイプ情報に拡張することができる。また、親のハプロタイプは、当業者に周知の他の方法によって構築することができる。このような方法の例には、単一の分子分析に基づく方法、例えば、デジタルＰＣＲ（Ｄｉｎｇ  Ｃ  ａｎｄ  Ｃａｎｔｏｒ  ＣＲ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００３；１００：７４４９−７４５３；Ｒｕａｎｏ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９０；８７：６２９６−６３００）、精子ハプロタイピイング（Ｌｉｅｎ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ２００２；Ｃｈａｐｔｅｒ  １：Ｕｎｉｔ  １．６）、及び画像技術（Ｘｉａｏ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ  ２００７；２８：９１３−９２１）が挙げられる。他の方法には、対立遺伝子特異的なＰＣＲ（Ｍｉｃｈａｌａｔｏｓ−Ｂｅｌｏｉｎ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９９６；２４：４８４１−４８４３；Ｌｏ  ＹＭＤ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９９１；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９：３５６１−３５６７）、制限酵素消化（Ｓｍｉｒｎｏｖａ  ＡＳ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２００７；５９：９３−８）に基づくものなどが挙げられる。なお他の方法は、母親のハプロタイプが統計的評価から推定されることを可能にする集団におけるハプロタイプブロックの分布及び連鎖不均衡構造の基づく（Ｃｌａｒｋ  ＡＧ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ  １９９０；７：１１１−２２；１０：１３−９；Ｓａｌｅｍ  ＲＭ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２００５；２：３９−６６）。
【００５１】
Ｃ．スキャホールドを組み立てるための母親試料のゲノム情報の使用
一態様では、母親の染色体のうちのいずれが胎児に移動したかを解決すために、相対的なハプロタイプ用量（ＲＨＤＯ）法を用いる。このアプローチの一般的な原理は、母親が遺伝的多型の各々についてヘテロ接合である例に関して以下の通りである。このようにして、２つのハプロタイプが存在し、これらのハプロタイプの相対的な用量は１：１であった。しかしながら、母親の試料において、小比率の胎児ＤＮＡの存在は、相対的ハプロタイプ用量を変更する可能性があった。これは、胎児が、そのハプロタイプ補完物の半分を母親から遺伝され、他の半分を父親から遺伝したためである。さらに、各々の染色体について、胎児は、減数分裂性組み換えの出現に依存して、各親から１つのホモ接合染色体と他のホモ接合染色体に由来したハプロタイプの「パッチワーク」を遺伝した。これらの因子の全ては、母親の構成的ＤＮＡにおいて１：１の比率から相対的ハプロタイプ用量を逸脱させる可能性があった。したがって、所定の染色体又は染色体領域について、これらのハプロタイプの構成的対立遺伝子は、母親使用から生じた分析データ（例えば、配列決定データ）から探求され得る。
【００５２】
次に、統計的手法は、相対的ハプロタイプ用量、又はこれらのハプロタイプが他のハプロタイプに対して過剰表現されているかどうかを決定するために実施され得る。この統計的手法についての分類閾値は、画分胎児ＤＮＡ濃度に依存して調整することができる。一般に、より高い画分胎児ＤＮＡ濃度は、より少ない分子を用いて閾値が到達されるのを可能にする。また、分類閾値は、対象とするゲノム又はゲノム領域全体で達成することを希望する分類に成功した画分の数に依存して調整され得る。一態様では、逐次確率比検定を用いることができる。
【００５３】
一態様では、相対的突然変異用量（ＲＭＤ）は、米国特許出願第２００９／００８７８４７号に記載されるように、母親の特定の多型での対立遺伝子の相対量を決定するために用いることができる。これらの相対量は、（例えば、多型が連続的又は連結された遺伝子座である場合）胎児のハプロタイプの決定に使用可能である。一実施において、この標的化されたアプローチは、ＲＭＤ分析についてゲノムの選択された部分からの特定の配列を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用である。大きなゲノム領域又は全ゲノム全体で胎児遺伝を決定するためのこのＲＭＤアプローチを広げるために、多量の母親試料を必要とする。
【００５４】
ランダム配列決定を用いた態様では、対象とするゲノム領域は特異的に標的化される。したがって、対象とするゲノム領域において得られた配列の数は、（非常な深度の配列決定が行われない場合）標的化されたアプローチにおける場合と同程度に無数でない可能性がある。しかしながら、カウントは、診断目的で必要な統計的検出力を達成するために、多数の連結された多型全体でプールすることができる。この配列決定の態様を用いるという実際の意義は、過剰な深度配列決定の必要性を避けることによって費用を抑えることができるということである。また、デジタルＰＣＲに基づくアプローチよりも少ない量の母親試料をインプットする必要がある。
【００５５】
さらに、一括してこのようなＲＨＤＯ分析を行うことが望まれ得る。換言すると、各染色体は１つのブロックにおいて、又は好ましくは１を超えるブロックにおいて分析することができる。一局面では、後者は、減数分裂性組み換えが観察されるようになり得る。例えば、胎児の特定の染色体のセグメントのハプロタイプは、母親の層同染色体の１つに由来していた可能性があり、一方、同じ胎児染色体の別のセグメントは、他の母親の相同性由来のハプロタイプを持つようである。ＳＰＲＴ分析は、このセグメントを実施されるようにし得る。
【００５６】
例えば、ＳＰＲＴ分析は、染色体の一末端から開始して、必要とされる親の遺伝子型形状（すなわち、父親はホモ接合であり、母親はヘテロ接合である）を示す隣接するＳＮＰ上で行うことができる。これは、ＳＰＲＴ分析が、母親のハプロタイプの１つが母親の血漿分析データ（例えば、配列決定データ）において優位であることを示すまで継続される。次に、ＳＰＲＴ分析は、「リセット」され、必要とされる親の遺伝子型形状を示す次の隣接するＳＮＰから新たに開始され得る。これは、母親のハプロタイプの１つが母親の血漿分析データ（例えば、配列決定データ）において、母親のハプロタイプの１つが優位であることをＳＰＲＴ分析が再度指示するまで再び継続することができる。このプロセスは、その最後が該染色体上でＳＮＰを選択するまで継続することができる。染色体上のこれらの種々のＳＰＲＴ決定されたハプロタイプセグメントは、母親のゲノムにおける２つの相同な染色体のハプロタイプと比較することができる。減数分裂性組み換えは、胎児におけるハプロタイプセグメントが１つの母親の相同染色体から別のものにスイッチされているように見える場合に観察される。このシステムはまた、染色体あたり１を超える減数分裂性組み換えが存在するとしても作用可能である。
【００５７】
後述するように、ＲＨＤＯ分析はまた、父親及び母親がともに構成遺伝的多型に対してヘテロ接合であるゲノム領域について実施することができる。このシナリオは、特に、父親と母親が同じ先祖起源由来の疾患遺伝子の突然変異コピーを共有する場合、例えば、彼らが血族である場合、又は疾患について優性突然変異が大きな創始者効果に起因する（すなわち、大部分の個体が、集団の共通の先祖の創始者由来の同じハプロタイプを遺伝した）場合の状況に特に有用である。このようにして、この領域における父親及び母親のハプロタイプを用いて胎児ハプロタイプを推定することができる。
【００５８】
ＩＩ．母親ゲノム由来の胎児ゲノムの構築
親のゲノムの明確な知識を用いた胎児遺伝子マップの構築又は胎児ゲノム配列の解明をここに記載する。
【００５９】
Ａ．方法
図１は、妊娠女性の出生前胎児のゲノムの少なくとも一部を決定するための方法１００のフローチャートである。胎児は父親と妊娠女性である母親を有する。父親は２つのハプロタイプを有する父親ゲノムを有し、母親は２つのハプロタイプを有する母親ゲノムを有する。方法１００は、胎児のゲノムを決定するために、妊娠女性から得られた生物試料から核酸分子（断片）を分析する。方法１００は、主に、父親がホモ接合であり、母親が複数の遺伝子座でヘテロ接合である場合の例について記載し、一方、他の例は、他の態様を記載する。
【００６０】
方法１００及び本明細書に記載されているいずれかの方法は、全体として又は部分的に、工程を実行するために構築され得る、プロセッサーを含むコンピュータシステムを用いて実行されてもよい。したがって、態様は、潜在的に、各工程又はステップの各グループを実行する異なるコンパートメントを用いて、本明細書に記載されている方法のいずれかの工程を実行するために構築されたコンピュータシステムに指向される。番号付けされた工程として示されるが、本明細書の方法の工程は、同時又は異なる純分で実行することができる。さらに、これらの工程の一部は、他の方法からの他の抗体の一部とともに用いられてもよい。また、工程の全て又は一部は任意であってもよい。さらに、本方法のいずれかの工程のいずれかは、これらの工程を実行するためのモジュール、回路、又は他の手段を用いて実行することができる。
【００６１】
工程１１０では、母親ゲノムがヘテロ接合である第１の複数の遺伝子座が同定される。一態様では、この決定は、ゲノム全般レベルで又は対象とする選択されたゲノムの遺伝子座で、父親と母親のゲノタイピングの部分で実行され得る。他の態様では、第１の複数の遺伝子座の決定は、母親試料の分析中に実施され得て、これは、後のセクションに記載されている。
【００６２】
工程１２０では、第１の複数の遺伝子座を覆う２つの母親のハプロタイプの各々が決定される。上記したように、母親ゲノムは直接的な配列決定から得ることができた。他の態様では、ゲノタイピングは複数の遺伝子座で行い、次に、例えば、同じであるか又は類似の集団において共通するファミリーメンバー又は参照ゲノムから、類似のゲノムを有することが期待される者のマッピングされたゲノムを用いることができる。一態様では、工程１２０は、母親ゲノムの全て又は一部について最初に決定することができ、母親ゲノムは、母親がヘテロ接合である遺伝子座を見出すために調査され得る。
【００６３】
一局面では、父親の染色体のハプロタイプを構築することは本質的ではない。しかしながら、父親のハプロタイプが構築されると、追加の情報は配列決定結果から得ることができた。１つのこのような追加情報は、相対的なハプロタイプ用量分析が、両親がヘテロ接合である領域について実行され得る事実を含む。父親のハプロタイプが利用可能である場合に得ることができる別の追加情報は、１以上の父親の染色体と関わる減数分裂性組み換えに関する情報であり、疾患がこのような多型に連結された疾患対立遺伝子が胎児に移動したかどうかを決定する。
【００６４】
工程１３０では、第１の複数の遺伝子座の各々での父親から胎児に遺伝された対立遺伝子が決定される。いくつかの態様では、父親に対してはホモ接合であるが、母親に対してはヘテロ接合であるゲノム遺伝子座を用いる（工程１１０において言及されている）。したがって、父親は遺伝子座でホモ接合であるある場合、父親から遺伝される対立遺伝子が知られている。父親がホモ接合である遺伝子座を決定するための父親のゲノタイピングは、本明細書に記載されている方法のいずれかにおいて決定することができる。一態様では、第１の複数の遺伝子座の決定は、父親がホモ接合であり、母親がヘテロ接合である遺伝子座を見出すために、父親と母親のゲノタイピングに基づいて決定することができる。
【００６５】
別の態様では、ヘテロ接合である親のゲノムの第２の複数の遺伝子座を用いて、父親がホモ接合である第１の複数の遺伝子座で胎児によって遺伝された親のハプロタイプを決定することができる。例えば、母親のゲノムが第２の複数の遺伝子座でホモ接合である場合、第２の複数の遺伝子座のそれぞれでの父親ゲノムに存在し、母親ゲノムに存在しない対立遺伝子を同定することができる。次に、遺伝された父親のハプロタイプは、同定された対立遺伝子を有するハプロタイプとして同定し、これを用いて、第１の複数の遺伝子座で父親から遺伝された対立遺伝子を決定することができる。父親のハプロタイプを決定するとうこれらの局面は、以下により詳細に検討している。
【００６６】
工程１４０では、妊娠女性から得られた生物試料からの複数の核酸分子を分析した。試料は、母親と胎児の核酸の混合物を含む。母親の生物試料を採取し、次に、分析のために受け入れることができる。一態様では、母親の血漿及び血清を用いる。他の態様では、母親の血液、母親の尿、母親の唾液、子宮内洗浄液、又は母親の血液から得られる胎児細胞を用いることができる。
【００６７】
一態様では、核酸分子を分析することには、ヒトゲノムにおける核酸分子の局在を同定すること、及び個々の遺伝子座での核酸分子の対立遺伝子を決定することが含まれる。このようにして、一態様は、同一遺伝子座由来の核酸分子の決定された対立遺伝子を用いて、定量的ゲノタイピングを行うことができる。母親の生物試料における核酸分子のゲノム局在及び対立遺伝子（ゲノタイプに関する情報）の決定を可能にする任意の方法を用いることができる。このような方法のいくつかは、米国特許出願第１２／１７８，１８１号及び第１２／６１４３５０号、「Ｓｉｚｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」と題する出願に記載されている。
【００６８】
工程１５０では、核酸分子の決定された対立遺伝子に基づいて、第１の複数の遺伝子座の各々での各対立遺伝子の量が決定される。一態様では、この量は、第１の遺伝子座での各タイプの対立遺伝子の数であり得る。例えば、６個のＡと４個のＴである。別の態様では、量は、特定の対立遺伝子を有する核酸分子のサイズ分布であり得る。例えば、相対量はまた、ある種の長さの相対量の断片を運搬することができる、特定のゲノタイプを有する断片のサイズ分布を含むことができる。また、このような相対量は、胎児断片が母親断片よりも短い傾向にあるため、どのゲノムが胎児ゲノムにあるかについての情報を提供することができる。量及び方法のいくつかの例は、米国特許出願第１２／１７８，１８１号及び第１２／６１４３５０号、「Ｓｉｚｅ−Ｂａｓｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」と題する出願に記載されている。
【００６９】
一態様では、遺伝子座での対立遺伝子の相対量は、（例えば、データセットが十分な統計的検出力に到達した後に）どのゲノタイプが胎児によって遺伝されたかについての情報を提供することができる。例えば、相対量は、遺伝子座での母親のゲノタイプと比較して、配列不均衡が起こるかどうかを決定するために用いることができる。上記で引用された関連特許出願は、特定の遺伝子座又は領域での配列不均衡を検出するための態様の例を提供する。
【００７０】
工程１６０では、第１の複数の遺伝子座の１を超える遺伝子座での核酸分子の各対立遺伝子の相対量を比較する。いくつかの態様では、ハプロタイプを含む第１の複数の遺伝子座の各遺伝子座での各対立遺伝子の量は、比較をする前に統合される。親のハプロタイプの統合された量は、ハプロタイプが過剰に表され、等しく表され、又は過少に表されるかどうかを決定するために比較することができる。他の態様では、遺伝子座での対立遺伝子についての量が比較され、複数の遺伝子座での比較が用いられる。例えば、分離値（例えば、相違又は比率）が統合され、それは、カットオフ値との比較において用いることができる。これらの態様の各々は、本明細書に記載されている比較工程のいずれかに適用可能である。
【００７１】
種々の態様では、相対量は、特定の遺伝子座での特定の対立遺伝子を有する多数の各断片のカウント、特定のハプロタイプ上の任意の遺伝子座（又は領域内の任意の遺伝子座）からの多数の断片のカウント、及び特定の遺伝子座又は特定のハプロタイプ上のカウント（例えば、平均）の統計値であり得る。このようにして、一態様では、比較は、各遺伝子座での１つの対立遺伝子 対 別の対立遺伝子の分離値（例えば、相違又は比率）の決定であってもよい。
【００７２】
工程１７０では、第１の複数の遺伝子座によってカバーされたゲノムの一部で母親から出生前の胎児によって遺伝されたハプロタイプを決定することができる。一態様では、母親の染色体のいずれが胎児に移動されたかを解決するために、相対的はハプロタイプ用量（ＲＨＤＯ）法が、上記されるように用いられる。母親が第１の遺伝子座の各々についてヘテロ接合であるため、第１の遺伝子座は、第１の遺伝子座のゲノム領域について２つのハプロタイプに対応する。これらのハプロタイプの相対的用量は、試料がちょうど母親から由来する場合に１：１となったであろう。この比からの逸脱又は逸脱ではないことは、母親（及びよう詳細には後述される父親）から遺伝される胎児のハプロタイプを決定するために用いることができる。したがって、所定の染色体又は染色体領域について、これらのハプロタイプの構成対立遺伝子は、工程１３０において生じさせた分析データ（例えば、配列決定データ）から探索することができる。
【００７３】
複数の遺伝子座が分析され、母親のハプロタイプと比較されるため、遺伝子座間の配列は特定のハプロタイプに起因し得る。一態様では、いくつかの遺伝子座は特定のハプロタイプと合致する場合、遺伝子座間の配列セグメントは母親のハプロタイプのものと同じであると推測することができる。減数分裂性組み換えの出現のため、胎児に遺伝された最終のハプロタイプは、染色体のこれらの２つのホモログの１つを起源とする「ハプロタイプセグメント」のパッチワークからなることができる。態様はこのような組換えを検出することができる。
【００７４】
このような組換えを検出することができる解像度は、父親と母親の構成ＤＮＡにおいて決定した遺伝子マーカーの数と分布、及び（例えば、ＳＰＲＴを用いた）続くバイオインフォマティックス分析において使用する閾値に依存する。例えば、この比較は、第１セットの連続した遺伝子座の各々での母親から遺伝された対立遺伝子は第１のハプロタイプに対応し、次に、第１のハプロタイプは、第１セットの遺伝子座に対応するゲノム局在について遺伝されることを決定する。第２セットの連続遺伝子座が、第２のハプロタイプが遺伝されることを示唆した場合、第２のハプロタイプは、第２セットの遺伝子座に対応するゲノム局在について遺伝されることが決定される。
【００７５】
一態様では、複数の遺伝子座が分析されるため、ハプロタイプはより高い精度で決定され得る。例えば、１つの遺伝子座についての統計データは決定的でない場合があるが、他の遺伝子座の統計データと組み合わせた場合、ハプロタイプが遺伝されるという決定がなされ得る。別の態様では、各遺伝子座は、独立して分析され、分類することができ、次に、この分類は分析され、ハプロタイプが所定の領域について遺伝される決定を提供することができる。
【００７６】
一態様では、統計的手法は、（例えば、これらのハプロタイプの１つが他のハプロタイプと比較して過剰に表される場合）相対的はハプロタイプ用量を決定するために実施することができる。この統計的手法についての分類閾値は、画分胎児ＤＮＡ濃度に依存して調整され得る。一般に、より高い画分胎児ＤＮＡ濃度は、この閾値がより少ない分子を用いて到達されることを可能にする。分類閾値はまた、対象とするゲノム又はゲノム領域全体で達成することを希望する成功の分類したセグメントの数に依存して調整可能である。
【００７７】
図１に戻って参照すると、工程１８０では、胎児ゲノムは突然変異について分析され得る。例えば、態様は、特定の集団における遺伝疾患を引き起こす突然変異のパネルについて検索するために用いることができる。態様を用いて検出され得る突然変異の例は、Ｏｎｌｉｎｅ  Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ  Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍａｎ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｏｍｉｍ／ｇｅｔｍｏｒｂｉｄ．ｃｇｉ）から見出すことができる。これらの突然変異は、工程１４０〜１６０中に；又は本明細書に記載されている分離工程として探索可能である。例えば、父親が、母親には存在しない１以上の突然変異のキャリアーであるファミリーにおいて、突然変異（単数又は複数）は、母親の生物試料からの分析データ（配列決定データ）から探索され得た。
【００７８】
実際の突然変異を検出することは別にして、父親又は母親における突然変異又は野生型対立遺伝子に連結される多型遺伝子マーカーを探すこともできた。例えば、ＲＨＤＯ分析は、胎児が、疾患について突然変異を担持することが知られている母親からのハプロタイプを遺伝したことを示すことがある。また、本発明の態様は、染色体領域の検出によって引き起こされる疾患、例えば、アルファ−サラセミアを引き起こす東南アジア欠失の非浸襲性の出生前診断に用いることができる。父親と母親がともに欠失のキャリアーであるシナリオでは、胎児が欠失についてホモ接合である場合、及び大規模な並列配列決定が母親の血漿ＤＮＡ上で実施される場合、母親血漿における欠失領域を起源とするＤＮＡ配列の頻度の減少が存在するはずであった。
【００７９】
Ｂ．実施例
このセクションは、母親がヘテロ接合である単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）に適用される態様（例えば、方法１００）の例を記載する。同一染色体上のＳＮＰ対立遺伝子はハプロタイプを形成し、母親は各染色体の相同な対、すなわち、２つのハプロタイプを有する。このような決定がどのように行われるかを例証するために、例えば、図２に示されるように、第３染色体上のセグメントを考慮する。
【００８０】
図２は、各ゲノムコードの特定のセグメントに対して、父親についての２つのハプロタイプと、母親についての２つのハプロタイプを示す。５つのＳＮＰは、これらのＳＮＰの５つ全部について、父親と母親がそれぞれホモ接合とヘテロ接合であるこのセグメント内に見出された。父親の２つの相同な染色体は、同一のハプロタイプ（Ｈａｐ）、すなわち、Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ（図２における上部から下部まで）を有した。簡易化のため、父親のハプロタイプをＨａｐＩ及びＨａｐＩＩと呼び、これらの両方はこのセットの５個のＳＮＰについて同一であることを念頭におかれたい。母親について、２つのハプロタイプが観察され、すなわち、ＨａｐＩＩＩ、Ａ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｇ及びＨａｐＩＶ、Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａである。
【００８１】
この実施例におけるＳＮＰは、さらに２つのタイプに分類することができた。図３は、本発明の態様に従う２つのタイプのＳＮＰを示す。タイプＡは、父親の対立遺伝子が母親のハプロタイプＩＩＩ上のものと同じであるそれらのＳＮＰからなる。タイプＢは、父親の対立遺伝子が母親のハプロタイプＩＶのものと同じであるそれらのＳＮＰからなす。
【００８２】
これらの２つのタイプのＳＮＰは、僅かに異なる数学的処理を必要とし得る。したがって、タイプＡにおいて、ハプロタイプＩＩＩの胎児遺伝は、母親血漿中のハプロタイプＩＶと比較して、ハプロタイプＩＩＩの過剰表現をもたらす（図４Ａ）。例えば、検討の簡易化のためにちょうど１つのＳＮＰ４１０を調べると、対立遺伝子Ａは父親から遺伝され、ＨａｐＩＩＩｇａ母親から遺伝される場合、胎児は試料に対して２つのＡ対立遺伝子を寄与し、Ａの過剰表現を引き起こす。胎児がハプロタイプＩＶを遺伝した場合、胎児はまた遺伝子座にＡ及びＧを有したヘテロ接合であるため、過剰な表現は観察されなかったであろう。
【００８３】
他方では、タイプＢのシナリオでは、ハプロタイプＩＩＩの胎児遺伝は、母親の血漿におけるハプロタイプＩＩＩとハプロタイプＩＶの等しい表現をもたらしたであろう（図４Ｂ）。例えば、ＳＮＰ４２０に対して見ると、父親からＧ、及びＨａｐＩＩＩの部分としてＡの遺伝は、ちょうど母親のように、ＳＮＰ４２０でＡとＧの等量を寄与するように胎児を引き起こしたであろう。父親はハプロタイプＩＶを遺伝した場合、過剰表現は、上記での検討から明かのように観察されたであろう。
【００８４】
図５Ａ及び５Ｂは、各遺伝子座について断片の相対量（例えば、カウント）を比較する分析を示し、この比較の結果が、遺伝された特定のハプロタイプを分類することであるかどうかを示す。父親と母親のこれらの遺伝子型の構造（例えば、タイプＡ又はタイプＢシナリオ）の１つとフィットするＳＮＰが存在する任意のゲノム局在は、この実施例に用いることができる。母親血漿の配列決定データから、ＳＮＰの特定の対立遺伝子に対応する配列決定された分子の数に焦点を合わせることができる。ＳＰＲＴ分析（又は他の比較法）は、これらの対立遺伝子間に任意の対立遺伝子不均衡が存在するかどうかを決定するために用いることができる（Ｌｏ  Ｙ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００７；１０４：１３１１６−１３１２１）。
【００８５】
図５Ａは、タイプＡのＳＮＰについての分析を示す。示されるように、各ＳＮＰについて、カットオフあたいに対する相対量（例えば、分離値によって定義される）のＳＰＲＴ比較は分類を与える。一態様では、ＳＰＲＴについての分類閾値が到達すると、特定の母親のハプロタイプの胎児遺伝が結論付けられた。次に、ＳＰＲＴについてのカウントをリセットすることができる。続いて、テロメアからセントロメア方向又はその反対のいずれかで、必要とされる遺伝子型構造をフィットする隣接のＳＮＰフィッティングに移動することができる；新しいＳＰＲＴ分析はこの次のＳＮＰを用いて開始することができる。
【００８６】
他方、一態様では、ＳＰＲＴの分類はＳＮＰを用いて到達されなかった場合、本発明者らは、次のＳＮＰのカウントが前のものに加えることができ、ＳＰＲＴが再度行われ得ることを除いて、同じように隣接するＳＮＰに移動することができる。このプロセスは、分類閾値が到達されるまで続けることができる。図５Ａ及び図５Ｂは、タイプＡ及びタイプＢ分析のためのこのプロセルの操作を示す。一態様では、分類は、領域についての全分類を行うために一緒に分析される。例えば、ＳＮＰの第１のグループ、及びＳＮＰの次のグループについて分類が得られた場合、２つの分類は、分類が一致するかどうかを見るために比較することができる。
【００８７】
図６は、ＳＰＲＴ分類のための尤度比を変更する効果を示す（Ｚｈｏｕ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００１  ；１９：７８−８１；Ｋａｒｏｕｉ  ＮＥ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔａｔｉｓｔ  Ｍｅｄ  ２００６；２５：３１２４−３３）。一般に、分類のための低い尤度比（例えば、８）は、分類をより容易に行うようにさせる。これは、ゲノム内の大多数の分類された領域をもたらすことができる。しかしながら、多数のこのような領域は誤って分類されることが予測され得る。他方、より高い尤度比（例えば、１２００）は、より多くのＳＮＰがスコアされた場合にだけ分類を可能にする。これは、ゲノム内のより少数の分類された領域をもたらすことができる。誤った分類された領域の数及び比率は、より低い分類閾値を用いた場合の状況と比較して、より低いことが期待できる。
【００８８】
一態様では、分類は、２つの連続したＳＰＲＴ分類が同一のハプロタイプをもたらす場合にだけなされる（「２つの連続したブロック」アルゴリズムと呼ばれる）。一局面では、「２つの連続したブロック」アルゴリズムは、分類の精度を増加させることができる。いくつかの態様では、配列のいずれのストレッチについて、態様は、タイプＡのＳＮＰについてＳＰＲＴ分析を最初に行い、次にタイプＢのＳＮＰについて別のＳＰＲＴ分析を行うことができる。一態様では、タイプＡとタイプＢのＳＮＰは、遺伝子ランドマークの２つの飛び越し群（例えば、ＳＮＰ）を形成するための配列のストレッチについてのシナリオを考慮することができる。「２つの連続したブロック」アルゴリズムを用いた態様では、２つのブロックは異なるタイプのものであってもよい。
【００８９】
タイプＡとタイプＢ分析からのＳＰＲＴ結果は、それらの分類結果における一致又は不一致について調べることをできるようにする。分類精度を増大させるために、一態様（「飛び越しアプローチ」）は、所定のゲノム領域についてのタイプＡとタイプＢ分析の両方が一貫した結果をもたらすことができる場合に、分類を行うことができただけであった。２つの分析が不一致な結果を生じさせる場合、領域の次の分類の２つの接触領域（１つはセントロメア末端、他方はテロメア末端にある１つ）の分類結果を見ることができる。これらの２つの接触領域は一致した結果をもたらす場合、これらの２つの領域を有する接触したハプロタイプとして最初の領域を分類することができる。これらの２つの接触領域が一致した結果をもたらさない場合、一致が観察されるまで、次の２つの接触領域に移動することができる。このテーマの１つの変形は、ちょうど１つの方向に移動させ、関心のある元の領域の結果として、次の１つ、又は２つ、又はそれを超える接触領域の分類結果を採用することである。一般的な原理は、特定領域の分類結果を確実にするための隣接ゲノム領域の分類結果を用いることである。
【００９０】
ＩＩＩ．胎児によって遺伝された親の対立遺伝子の決定
図７は、父親から遺伝された、妊娠女性の出生前胎児のゲノムの少なくとも一部を決定するための方法７００のフローチャートである。方法７００は、胎児のゲノムを決定するために、妊娠女性から得られた生物試料由来の核酸分子（断片）を分析する。試料は母親と胎児の核酸の混合物を含む。
【００９１】
工程７１０では、生物試料由来の複数の核酸分子の各々は、ヒトゲノムにおいて核酸分子の局在を同定し、核酸分子の対立遺伝子タイプを決定するために分析される。したがって、特定の局在（遺伝子座）での核酸分子の遺伝子型は一態様において決定することができる。上記又は他に記載される方法のいずれかはこの分析に使用されてもよい。
【００９２】
工程７２０では、父親のゲノムがヘテロ接合であり、母親のゲノムがホモ接合である最初の複数の遺伝子座を決定する。一態様、最初の複数の遺伝子座は、父親と母親のゲノムを決定することによって得られる。ゲノムは、ヘテロ接合であり、母親がホモ接合であるゲノム遺伝子座について発掘されてもよい。
【００９３】
工程７３０では、最初の複数の遺伝子座によってカバーされたゲノムの一部で父親から出生前胎児に遺伝されるハプロタイプは、最初の複数の遺伝子座で決定された遺伝子型に基づいて決定される。一態様では、父親によって所有されるが、母親のゲノムには存在しないこれらの遺伝子座の対立遺伝子は、分析データ（例えば、配列決定データ）において探索される。これらの対立遺伝子の組み合わせは、胎児が父親から遺伝された染色体のハプロタイプを示したであろう。
【００９４】
別の提要では、父親ゲノムにおける、対象とする各々の染色体又は染色体領域のハプロタイプが知られると、減数分裂性組み換えが父親における精子形成中に発生した場所も決定することができる。したがって、父親の減数分裂性組み換えは、父親から遺伝された染色体におけるＤＮＡのストレッチのハプロタイプが胎児と父親との間で異なるときに観察される。このような組換え情報の包含は、分析データ（例えば、配列決定データ）が、遺伝子多型に対する連鎖分析による遺伝子疾患の出生前診断に用いられる場合に有用となり得る。
【００９５】
ＩＶ．父親と母親はゲノム領域に対してヘテロ接合である
態様は、父親と母親がゲノム領域に対してヘテロ接合であるシナリオを対処する。このシナリオは、父親と母親が血族であるファミリーに特に関係し得る。疾患が大きな創始者効果に起因している優性変異と関連付けられるときもまた関連し得る。このような状況において、出生前胎児の父親と母親がともに突然変異遺伝子のキャリアーである場合、遺伝子の突然変異コピーを担持する染色体のハプロタイプは、減数分裂性組み換え事象の出現を除いて、本質的には同定し得ることが期待されるべきである。この種の分析は、嚢胞性線維症、ベータ−サラセミア、鎌状赤血球貧血、及びヘモグロビンＥ疾患などの常染色体劣性疾患に特に有用であり得る。
【００９６】
図８は、本発明の態様に従って、母親と父親がヘテロ接合である領域において、出生前胎児のゲノムの少なくとも一部を決定するための方法８００のフローチャートである。
【００９７】
工程８１０では、父親と母親がともにヘテロ接合である第１の複数の遺伝子座が決定される。一態様では、第１の遺伝子座は、本明細書に言及されている方法のいずれかによって決定することができる。例えば、親のゲノムの全て又はその領域は配列決定することができ、あるいは異なる部分をゲノタイプして最初の遺伝子座を見出すことができる。このようにして、最初の複数の遺伝子座での父親の２つのハプロタイプの各々、及び母親の２つのハプロタイプを知ることができる。
【００９８】
一例として、図９は、特定のゲノム領域においてともにヘテロ接合である父親と母親のハプロタイプを示す。示されるように、両親は領域１において突然変異遺伝子（対立遺伝子）を有する。具体的には、父親のＨａｐＩと母親のＨａｐＩＩＩは突然変異遺伝子を有する。また示されるように、父親と母親は各々、遺伝子の野生型を担持する染色体の他のコピーを有することができる具体的には、父親のＨａｐＩＩと母親のＨａｐＩＶは野生型遺伝子を有する。このようにして、この例は、胎児が突然変異遺伝子を遺伝したかどうかの決定において関連性を有する。野生型遺伝子を担持する父親と母親由来の染色体は、この遺伝子のごく近辺に同一のハプロタイプを有するが、この遺伝子からさらに離れて不一致のハプロタイプを有してもよい。この染色体が様々な先祖期限を有する可能性があるので、この染色体は、全染色体を通じて、父親と母親との間に同一のハプロタイプを有する可能性がないようであった。
【００９９】
工程８２０では、父親がヘテロ接合であるが、母親がホモ接合である第２の複数の遺伝子座が決定される。示されるように、第１と第２の複数の遺伝子座は、同一の染色体上にある。領域２はこのような第２の遺伝子座を示す。領域２は、父親がこの領域における１以上のＳＮＰについてヘテロ接合であり、母親がこの領域においてホモ接合であるように選択され得る。
【０１００】
工程８３０では、妊娠女性の試料由来の断片は、ヒトゲノム及び遺伝子型において局在を同定するために分析することができる。局在は、断片（核酸分子）が１以上の第１の遺伝子座又は１以上の第２の遺伝子座を含むかどうかを決定するために用いることができる。次に、この情報は、父親から遺伝されたハプロタイプと母親から遺伝されたハプロタイプを決定するために用いることができる。
【０１０１】
工程８４０では、２つの父親のハプロタイプのどれが胎児によって遺伝されたかが、少なくとも１つの第２の遺伝子座で生物試料から複数の核酸分子の決定された遺伝子型を分析することによって決定される。例えば、父親のゲノムに固有に存在するが、母親のゲノムには存在しないＳＮＰ対立遺伝子、例えば、図９において、*によって記されたＴ対立遺伝子、及び+によって記されたＡ対立遺伝子は、母親の生物試料の分析データ（例えば、工程７１０からえられる局在及び遺伝子型）から探索され得る。方法７００について行われ得るように、*によって記されたＴ対立遺伝子が母親血漿から検出される場合、それはハプロタイプＩＩ（ＨａｐＩＩ）が父親から胎児に遺伝されることを意味する。反対に、+によって記されたＡ対立遺伝子が母親血漿から検出される場合、ＨａｐＩは父親から胎児に遺伝されることを意味する。
【０１０２】
工程８５０では、１を超える第１の複数の遺伝子座で核酸分子の決定された遺伝子型の相対量を比較することである。一態様では、各遺伝子座の量が集められ、母親のハプロタイプの相対量が比較される。相対量は、どの遺伝子型が特定の遺伝子座での父親ゲノムにあるかについての情報を伝えることができるカウントされた数、サイズ分布、及び任意の他のパラメータを指すことができる。
【０１０３】
工程８６０では、胎児によって遺伝されたことが決定された父親のハプロタイプに基づいて、及び相対量の比較に基づいて、第１の複数の遺伝子座によってカバーされたゲノムの一部で母親から出生前胎児に遺伝されるハプロタイプを決定することである。したがって、母親の生物試料の分析データから領域１におけるＳＮＰのＲＨＤＯ分析（例えば、上記される）は、領域２において胎児によって遺伝された父親のハプロタイプを考慮して、２つの母親のハプロタイプのどれが胎児に遺伝されたかを決定するために実施され得る。一態様では、領域１と領域２が親から胎児に移動する場合には、これらの領域間に組換えはないことが想定される。
【０１０４】
例えば、領域２の分析を通じて、胎児が父親からＨａｐＩを遺伝したことを決定したときを考慮すべきである。次に、母親からのＨａｐＩＩＩ（領域１のＨａｐＩと同一である）の胎児遺伝は、母親血漿中のＨａｐＩＶと比較して、ＨａｐＩＩＩの過剰表現をもたらす。反対に、胎児が母親からＨａｐＩＶを遺伝した場合、ＨａｐＩＩＩとＨａｐＩＶの等しい表現は母親血漿において観察される。
【０１０５】
別の例として、領域２の分析を通じて、胎児が、父親からＨａｐＩＩを遺伝したことが決定されたシナリオを考慮されたい。次に、母親からのＨａｐＩＶ（領域１のＨａｐＩＩと同一である）の胎児遺伝は、母親血漿中のＨａｐＩＩＩと比較して、ＨａｐＩＶの過剰表現をもたらす。反対に、胎児が母親からＨａｐＩＩＩを遺伝した場合、ＨａｐＩＩＩとＨａｐＩＶの等しい表現は母親血漿において観察される。
【０１０６】
前のセクションでは、本発明者らは、母親の血漿ＤＮＡの配列決定から得られたデータを用いて、胎児ゲノムと画分胎児ＤＮＡ濃度、並びに廃寺の親の遺伝子型情報を推定した。以下のセクションでは、本発明者らは、母親及び父親の遺伝子型／ハプロタイプの以前の情報なしに、画分胎児ＤＮＡ濃度及び胎児遺伝子型を推定するための態様を説明する。
【０１０７】
Ｖ．画分胎児ＤＮＡ濃度の決定
いくつかの態様では、任意の工程は、画分胎児ＤＮＡ濃度を決定することである。種々の局面では、この画分濃度は、分析量（例えば、必要とされる配列決定の量）を導き、又は所定量のデータ（ゲノム配列についての被覆率の深度）についての分析の精度を見積もることができるようにする。また、画分胎児ＤＮＡ濃度の決定は、ハプロタイプ及び／又は遺伝子型のどの分類が遺伝されるかを決定するためのカットフの決定に有用となり得る。
【０１０８】
一態様では、画分胎児ＤＮＡ濃度は、父親と母親についてホモ接合であるが、異なる対立遺伝子を有する遺伝子座に関しての分析データ（例えば、工程１４０と７１０において得られるものなど）を検索することによって決定することができる。例えば、２つの対立遺伝子、Ａ及びＧを有するＳＮＰについて、父親は、ＡＡであり得て、母親はＧＧであり得て、逆も場合も同じである。このような遺伝子座については、胎児は偏性的にヘテロ接合である。上記の例では、胎児遺伝子型はＡＧとなり、母親試料における対立遺伝子Ａの比率は、画分胎児ＤＮＡ濃度を決定するために使用され得る。別の態様では、統計的分析は、母親がホモ接合であり、胎児がヘテロ接合である遺伝子座を決定するために行われ得る。このようにして、母親ゲノム及び父親ゲノムについて予め情報は必要ない。
【０１０９】
分析データを検察するための代替として、画分胎児ＤＮＡ濃度はまた、多型遺伝子マーカーのパネル上で、別のアプローチ、例えば、ＰＣＲ分析の使用、デジタルＰＣＲアッセイ、又は質量分析に基づくアッセイによって決定することができる（Ｌｕｎ  ＦＭＦ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００８；５４：１６６４−１６７２）。別の代替は、胎児と母親との間の異なるＤＮＡメチル化を提示する１以上のゲノム遺伝子座を用いることである（Ｐｏｏｎ  ＬＬＭ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００２；４８：３５−４１；Ｃｈａｎ  ＫＣＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００６；５２：２２１１−２２１８；米国特許第６，９２７，０２８号）。さらに別の代替としては、例えば、同様の妊娠期間で、参照集団から決定される近似の画分胎児ＤＮＡ濃度を用いることである。しかしながら、画分胎児ＤＮＡ濃度は試料ごとに変化し得るので、この後者のアプローチは、濃度が試験される試料について特異的に測定されるかどうかよりも正確さが小さいことが期待され得る。
【０１１０】
Ａ．偏性的ヘテロ接合についての画分濃度の決定
胎児が偏性的ヘテロ接合である態様では、以下のシリーズの計算を用いて（例えば、大規模並列配列決定を用いて）画分胎児ＤＮＡ濃度を決定することができる。母親ゲノムにはない父親の対立遺伝子のカウントをｐとする。他の対立遺伝子、すなわち、母親と父親のゲノムによって共有される対立遺伝子のカウントをｑとする。画分胎児ＤＮＡ濃度は、以下の式によって与えられる：
【０１１１】
【数１】
0005540105.tif 000002
【０１１２】
一態様では、この計算は、親の遺伝子型形態（例えば、両親はホモ接合であるが、異なる対立遺伝子である）を満たす異なる多型遺伝子座又は多型遺伝子特徴全体で累積データについて実行され得る。
【０１１３】
Ｂ．情報を与えるＳＮＰに基づく決定
また、胎児ＤＮＡの画分濃度は、母親がホモ接合であり、父親がヘテロ接合である任意の遺伝子座について決定することができ、それは、母親が１つの対立遺伝子についてホモ接合であり、父親が異なる対立遺伝子についてホモ接合であるときだけではない。両者の方法は遺伝子座が情報を与えるかどうかを提供する。用語「情報を与えるＳＮＰ」は、どの情報が望ましいかに依存して異なる状況において用いることができる。１つの状況では、情報は、その遺伝子座で母親ゲノムに存在しない特定の遺伝子座での父親ゲノムにおける対立遺伝子である。したがって、母親がホモ接合であり、胎児がヘテロ接合であるＳＮＰのサブセットは、胎児ＤＮＡ濃度を決定するという状況について「情報を与えるＳＮＰ」と呼ぶことができる。また、母親及び胎児がともにヘテロ接合であるが、少なくとも１つは異なる対立遺伝子である例は、情報を与えるＳＮＰとして用いることができる。しかしながら、３対立遺伝子ＳＮＰは、ゲノムにおいて相対的に珍しい。
【０１１４】
図１０は、本発明の態様に従って、母親試料における父親材料の画分濃度を決定するための方法１０００を例証するフローチャートである。工程１０１０では、妊娠女性の試料由来の断片は、（その局在での遺伝子型決定をもたらすことができる）ヒトゲノム及び対立遺伝子型における局在を同定するために分析することができる。一態様では、断片は、妊娠女性から得られた生物試料由来の複数の核酸分子を配列決定することによって分析される。他の態様では、リアルタイムＰｃＲ又はデジタルＰＣＲを用いることができる。
【０１１５】
工程１０２０では、１以上の第１の遺伝子座が情報を与えるものとして決定される。いくつかの態様では、母親のゲノムはホモ接合であるが、非母親対立遺伝子は情報を与える遺伝子座で試料において検出される。一態様では、胎児ゲノムは、各第１の遺伝子座でヘテロ接合であり、母親ゲノムは各第１の遺伝子座でホモ接合である。例えば、胎児ゲノムは、第１の遺伝子座で各第１及び第２の対立遺伝子（例えば、ＴＡ）を有することができ、母親ゲノムは第１の遺伝子座で各第２の対立遺伝子の２つ（例えば、ＡＡ）を有することができる。しかしながら、このような遺伝子座は、例えば、胎児が偏性的ヘテロ接合でない状況では、推測的に知られ得ない。
【０１１６】
情報を与える遺伝子座を決定するための一態様では、母親がホモ接合であるＳＮＰが考慮される。母親がホモ接合であるＳＮＰについて、胎児は、同じ対立遺伝子であるか又はヘテロ接合であるかのいずれかである。例えば、ＳＮＰがＡとＴについて多型であり、母親がＡＡの遺伝子型を有する場合、胎児の遺伝子型はＡＡ又はＴＡである。この事例では、母親血漿試料におけるＴ対立遺伝子の存在は、胎児ゲノムがＡＡの代りにＴＡであることを指示するであろう。ある種の態様は、以下に記載されるように、必要なカットオフを計算することによって、Ｔ対立遺伝子の存在のどれくらいがＴＡの遺伝子型を示すかを対処することができる。
【０１１７】
工程１０３０では、少なくとも１つの第１の遺伝子座について、各第１の対立遺伝子のカウントの第１の数ｐ、及び各第２の対立遺伝子のカウントの第２の数ｑを決定する。一態様では、母親の血漿中の胎児特異的対立遺伝子（Ｔ対立遺伝子）及び共通の対立遺伝子（Ａ対立遺伝子）は、種々の方法、例えば、限定されないが、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、及び大規模並列配列決定によって決定することができる。
【０１１８】
工程１０４０では、画分濃度は、第１と第２の数に基づいて計算される。一態様では、遺伝子型ＡＡと女性の胎児がＴＡである遺伝子型を有する妊娠女性において、画分胎児ＤＮＡ濃度（ｆ）は、式：ｆ＝２×ｐ／（ｐ＋ｑ）を用いて計算することができ、式中、ｐは、胎児特異的な対立遺伝子（対立遺伝子Ｔ）に関するカウントを表し、ｑは、母親と胎児に共通する対立遺伝子（対立遺伝子Ａ）に関するカウントを表す。
【０１１９】
別の態様では、複数の情報を与えるＳＮＰの使用によって、母親血漿中の胎児ＤＮＡの画分濃度は、増加した精度とともに見積もることができる。複数のＳＮＰの対立遺伝子カウント（ｎ個のＳＮＰの合計）の使用について、胎児ＤＮＡの画分濃度（ｆ）は式：
【０１２０】
【数２】
0005540105.tif 000003
【０１２１】
を用いて計算され得て、式中、ｐiは、情報を与えるＳＮＰiについての胎児特異的な胎児ＤＮＡに対するカウントを表し；ｑiは、情報を与えるＳＮＰiについての母親と胎児に共通する対立遺伝子についてのカウントを表し；ｎは、情報を与えるＳＮＰの総数を表す。複数のＳＮＰの対立遺伝子カウントの使用は、画分胎児ＤＮＡ濃度の見積りの精度を増加させることができる。
【０１２２】
Ｃ．両親の明確な遺伝子情報がない画分濃度
胎児と母親の遺伝子型に関するこれまで情報を必要としない母親血漿中の画分胎児ＤＮＡ濃度を決定するための方法をここに記載する。一態様では、情報を与えるＳＮＰの同定は、母親血漿中のこれらのＳＮＰ遺伝子座での異なる対立遺伝子のカウントからなされる。このようにして、方法１０００は、以下に記載される態様に基づいて、情報を与えるＳＮＰの決定とともに使用可能である。第１に、可能性の記載は、情報を与えるＳＮＰを同定するために使用されるカットオフの計算の理解を助けるために提供される。
【０１２３】
一態様では、胎児特異的な対立遺伝子を決定するという可能性はポアソン分布に従う。胎児特異的な対立遺伝子を検出するための可能性（Ｐ）は、以下の式：Ｐ＝１−ｅｘｐ（−ｆ×Ｎ／２）を用いて計算可能であり、式中、ｆは母親血漿試料中の胎児ＤＮＡの画分濃度を表し、Ｎは分析される特定のＳＮＰ遺伝子座に例えば、対応する分子の総数を表し；ｅｘｐ（）は指数関数を表す。一局面では、Ｐは期待された分布であると考えられ、これは、多くの試料全体で分離の量を測定に起因する分布ではないためである。他の態様では、他の分布を用いることができる。
【０１２４】
胎児ＤＮＡの画分濃度が５％（妊娠第1三半期について典型的な値）であり、このＳＮＰ遺伝子座に対応する１００個の分子（母親＋胎児）が（５０個の２倍体ゲノムに含まれる量に等しい）が分析されると仮定すると、胎児特異的な対立遺伝子（Ｔ対立遺伝子）を検出する可能性は１−ｅｘｐ（−０．０５×１００／２）＝０．９２である。胎児特異的な対立遺伝子を検出する可能性は、画分胎児ＤＮＡ濃度、及びＳＮＰ遺伝子座について分析される分子とともに増加するであろう。例えば、胎児ＤＮＡ濃度が１０％であり、１００個の分子が分析されるとすると、胎児特異的な対立遺伝子を検出する可能性は０．９９である。
【０１２５】
したがって、母親がホモ接合であるＳＮＰ遺伝子座で、母親血漿中の母親のものとは異なる対立遺伝子の存在は、ＳＮＰが、画分胎児ＤＡＮ濃度の計算について「情報を与える」ものであることを指示し得る。任意の情報を与えるＳＮＰが見当たらない可能性は、分析される分子数に依存し得る。換言すると、情報を与えるＳＮＰを検出するための任意の所望の確かさについて、所望の精度を得るために分析されることが必要である分子数は、ポアソン確立関数に従って計算され得る。
【０１２６】
上記分析を用いて、いくつかの態様は、母親の遺伝子型がわからな場合に、遺伝子座が情報を与えるかどうかを決定することができる。いくつかの態様では、母親の血清試料において２つの異なる対立遺伝子が検出される遺伝子座が同定される。例えば、２つの可能な対立遺伝子ＡとＴを有するＳＮＰ遺伝子座について、Ａ対立遺伝子とＴ対立遺伝子はともに母親血漿において検出される。
【０１２７】
図１１は、遺伝子座が本発明の態様に従って情報を与えるものであるかどうかを決定するための方法１１００のフローチャートである。一態様では、方法１１００は、方法１０００の工程１０２０を実施するために用いることができる。別の態様では、方法１１００の一工程は、統計的分布に基づいてカット値を決定することであり、別の工程は、遺伝子座（ＳＮＰ）が情報を与えるかどうかを決定するためのカットオフ値を用いる。
【０１２８】
工程１１１０では、カットオフ値は、特定の遺伝子座で各第１の対立遺伝子の多数の予期されたカウントについて決定される。一実施において、カットオフ値は、母親ゲノムがホモ接合であり、胎児ゲノムがヘテロ接合であるかどうかを予期する。一態様では、カットオフ値は、特定の遺伝子座でのホモ接合性とヘテロ接合性の異なる組み合わせについてカウント数の統計的分布に基づいて決定される。例えば、対立遺伝子頻度分布は、ポアソン分布関数を用いて予期することができる。
【０１２９】
工程１２２０では、（例えば、工程１０１０からの）母親試料の核酸分子の分析に基づいて、第１の対立遺伝子と第２の対立遺伝子がその遺伝子座で検出される。例えば、１セットの断片は、分析される遺伝子座に対してマッピングすることができ、第１の対立遺伝子又は第２の対立遺伝子が検出された。第１の対立遺伝子は、工程１０２０からの各第１の対立遺伝子の１つに対応することができ、第２の対立遺伝子は、各第２の対立遺伝子の１つに対応することができる。一態様では、２つの異なる対立遺伝子が検出されない場合、遺伝子座が情報を与えるものではなきことが分かる。
【０１３０】
工程１１３０では、遺伝子座での各第１の対立遺伝子の多数の実際のカウントが、核酸分子の分析に基づいて決定される。例えば、複数の核酸分子の配列決定結果は、第１の対立遺伝子の遺伝子型を有する断片が遺伝子座に対してマッピングされる回数を決定するためにカウントされ得る。
【０１３１】
工程１１４０では、遺伝子座は、実際のカウントの数とカットオフ値との比較に基づいて、第１の遺伝子座として同定される。一局面では、カットオフ値は、３つの可能性：（ａ）母親がホモ接合であり（ＡＡ）、胎児がヘテロ接合である（ＡＴ）；（ｂ）母親がヘテロ接合であり（ＡＴ）、胎児がヘテロ接合である（ＡＴ）；並びに（ｃ）母親がヘテロ接合であり（ＡＴ）、胎児が（ＡＡ）又は（ＴＴ）についてホモ接合である、の間で区別するために用いることができる。例証のために、以下の例は、シナリオ（ｃ）においてＡＡである胎児遺伝子型を想定する。しかしながら、計算は、胎児の遺伝子型がＴＴである場合に同じであろう。情報を与える遺伝子座は可能性（ａ）を有するであろう。
【０１３２】
一態様では、胎児は、実際のカウントの数がカットオフ値よりも小さい場合に、第１の遺伝子座の１つとして同定される。別の態様では、低い閾値は、誤ったマッピングが起こらなかったことを確証するために用いることもできる。
【０１３３】
カットオフを決定するための態様をここに記載する。生理学的に可能な画分胎児ＤＮＡ濃度（この情報は以前の研究から利用可能である）、及びＳＮＰ遺伝子座に対応する分子の総数に基づいて、対立遺伝子カウントの分布が上記の３つの可能なシナリオについて予期され得る。予期される分布に基づいて、カットオフ値は、ＳＮＰが「情報を与える」（すなわち、シナリオ（ａ）」ものであるかどうかを決定するために、母親血漿中に観察された対立遺伝子カウントを解明するために決定され得る。
【０１３４】
胎児ＤＮＡの画分濃度は、典型的には、早期妊娠において５％〜２０％の範囲であり、後期妊娠において１０％〜３５％の範囲である（Ｌｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏ  ｆｌｕｉｄｉｃｓ  ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｈｉｇｈｅｒ  ｔｈａｎ  ｅｘｐｅｃｔｅｄ  ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｅｔａｌ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｐｌａｓｍａ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００８；５４：１６６４−７２）。このようにして、一態様では、胎児ＤＮＡの５％と２０％の画分濃度についての対立遺伝子カウントの予期される分布が決定された。
【０１３５】
図１２Ａは、推定される画分胎児ＤＮＡ濃度が２０％である３つのシナリオの対立遺伝子Ｔ（シナリオ（ａ）と（ｃ）では少ない量の対立遺伝子）についてのカウントの予期された分布を示す。図１２Ｂは、推定が５％胎児ＤＮＡである３つのシナリオの対立遺伝子Ｔ（シナリオ（ａ）と（ｃ）では少ない量の対立遺伝子）についてのカウントの予期された分布を示す。両者の予期されたモデルでは、総数２００個の分子がＳＮＰ遺伝子座について分析されることが推定された。
【０１３６】
カットオフとして少ない量の対立遺伝子（Ｔ対立遺伝子）の４０カウントの存在を用いて、３つの可能性が統計学的に区別し得る。換言すると、母親血漿において検出された２つの対立遺伝子を有し、かつ総数２００個の分子が分析された任意のＳＮＰ遺伝子座について、少数対立遺伝子（対立遺伝子の量が少ない）の対立遺伝子頻度が４０未満である場合、ＳＮＰ遺伝子座は「情報を与える」ものと見なし得る。５％と２０％の画分胎児ＤＮＡ濃度について、母親がヘテロ接合（シナリオ（ｂ）と（ｃ））であるＳＮＰ由来の「情報を与える」ＳＮＰ（シナリオ（ａ））の差異は１００％精度であろう。
【０１３７】
具体的には、検出される分子の総数は異なるＳＮＰについて異なる場合がある。各ＳＮＰ遺伝子座について、特定の予期される分布曲線は、ＳＮＰ遺伝子座を覆う母親の血漿試料中に検出される分子の総数を考慮することによって構築することができる。換言すると、ＳＮＰが情報を与えるものか否かを決定するためのカウントカットオフは、ＳＮＰの中で変化し得て、ＳＮＰ遺伝子座がカウントされた回数に依存する。
【０１３８】
以下の表は、配列決定された母親の血漿試料についての母親血漿中の３つのＳＮＰ遺伝子座の対立遺伝子カウントを示す。３つのＳＮＰの各々について、２つの異なる対立遺伝子が母親の血漿試料において検出される。これらの３つのＳＮＰに対応する母親血漿中に検出されるカウントの総数は異なる。
【０１３９】
【表１】
0005540105.tif 000004
【０１４０】
２０％の画分胎児ＤＮＡ濃度についての少量の対立遺伝子のカウント、及びＳＮＰに対応する分子の異なる総カウントについての予期された分布を図１３Ａ、１３Ｂ、及び１４Ｂに示す。予期された分布は、想定された２０％の胎児ＤＮＡ濃度を用いて描かれ、これは、妊娠第１期における胎児ＤＮＡ濃度の高い制限を示すためである。胎児ＤＮＡ濃度が高くなると、母親が、ヘテロ接合である場合と比較して、母親が多数の対立遺伝子についてホモ接合である少数の対立遺伝子の分布曲線間で、多くの重複が期待されるようになる。したがって、情報を与えるＳＮＰの予期に対して高い胎児ＤＮＡを用いて、少数の対立遺伝子カウントについてのカットオフを誘導することはより特異的である。
【０１４１】
図１３Ａは、総数が１７３個の分子、及び２０％の画分胎児ＤＮＡ濃度を有する少量の対立遺伝子のカウントについての予期された分布を示す。一態様では、この分布に基づいて、少量の対立遺伝子のカウントについての４０未満のカットオフ基準は、情報を与えるＳＮＰを同定するには適切であり得る。Ａ対立遺伝子についてのカウントが１０であるため、ＳＮＰ遺伝子座の第１は、画分胎児ＤＮＡ濃度の計算に対して「情報を与える」ものとして見なされる。
【０１４２】
図１３Ｂは、総数が１２１個の分子、及び２０％の画分胎児ＤＮＡ濃度を有する少量の対立遺伝子のカウントについての予期された分布を示す。一態様では、この分布に基づいて、少量の対立遺伝子のカウントについての２６未満のカットオフ値は、情報を与えるＳＮＰを同定するには適切であり得る。Ｔ対立遺伝子についてのカウント数が９であるため、ＳＮＰ遺伝子座の第２は、画分胎児ＤＮＡ濃度の計算に対して「情報を与える」ものとして見なされる。
【０１４３】
図１２は、総数が１３４個の分子、及び２０％の画分胎児ＤＮＡ濃度を有する少量の対立遺伝子のカウントについての予期された分布を示す。一態様では、この分布に基づいて、少量の対立遺伝子のカウントについての２５未満のカットオフ値は、情報を与えるＳＮＰを同定するには適切であり得る。Ｔ対立遺伝子についてのカウント数が６２であるため、ＳＮＰ遺伝子座の第３は、画分胎児ＤＮＡ濃度の計算に対して「情報を与えない」ものとして見なされ、その計算に用いられないであろう。
【０１４４】
一態様では、式ｆ＝２×ｐ／（ｐ＋ｑ）を用いて、胎児ＤＮＡの画分濃度は、ＳＮＰ１と２についての対立遺伝子カウントにより計算され、組み合わせることができる。結果を以下に示す。
【０１４５】
【表２】
0005540105.tif 000005
【０１４６】
Ｄ．胎児ゲノムの深度被覆率の決定
画分濃度を得ることに加えて、態様は、工程１０１０における分析手段（例えば、配列決定）が達成された胎児ゲノムの被覆率を決定することができる。いくつかの態様では、情報を与える遺伝子座は、被覆率を決定するために用いることができる。例えば、上記からの例のいずれかを使用することができる。一態様では、胎児が偏性的ヘテロ接合である遺伝子座を用いることができる。別の態様では、胎児がヘテロ接合であることが決定され、母親がホモ接合である遺伝子座を用いてもよい（例えば、方法１１００による）。
【０１４７】
情報を与える遺伝子座に対してマッピングされた断片は、被覆の比率を決定するために用いることができる。一態様では、各第１の対立遺伝子が配列決定の決定から検出される第１の複数の遺伝子座のうちの遺伝子座の比率が決定される。例えば、胎児が遺伝子座でＴＡであり、母親がその遺伝子座でＡＡである場合、対立遺伝子Ｔは、その遺伝子座が配列決定された場合の配列決定の結果において検出されなければならない。このようにして、生物試料から配列決定された胎児ゲノムの比率は、この比率に基づいて計算され得る。一態様では、胎児特異的な対立遺伝子が観察される第１の遺伝子座の比率は、胎児ゲノムの被覆率として採用され得る。他の態様では、この比率は、遺伝子座がどこにあるかに基づいて修飾され得る。例えば、被覆率は各染色体について決定することができる。別の例として、割合は、第１の遺伝子座がゲノムの良好な表現を形成しない場合の比率よりも小さく見積もることができる。別の例として、その比率が範囲の一端である範囲が提供されてもよい。高い比率、すなわち、１００％近くが、胎児ゲノムの完全な被覆率に近いことを意味する一方、大部分の遺伝子疾患は、１００％被覆率を大幅に低いものとして、例えば、８０％、又は５０％、又はそれ未満であると診断され得る。
【０１４８】
ＶＩ．母親と父親のゲノムの以前の情報がない
前のセクションでは、いくつかの態様は、母親のハプロタイプと父親の遺伝子型が知られているとき、胎児（又は胎児のゲノムの一部）の遺伝子マップを決定した。他の態様は、画分胎児ＤＮＡ濃度は、母親、父親、又は胎児の遺伝子型についての予めの知識なしに、母親の血漿ＤＮＡを分析することによって決定することができる。さらに他の態様では、本発明者らは、母親と父親の遺伝子型／ハプロタイプ（単数又は複数）の以前の情報なしに、ＲＨＤＯ分析を用いて、胎児（胎児ゲノムの一部）の遺伝子マップを決定するための方法をここにさらに記載する。
【０１４９】
一態様では、親が属する集団の参照（例えば、共通又は既知の）ハプロタイプの譲歩を用いる。この情報は、母親と父親のハプロタイプを推定するために用いることができる。例は、この方法の原理を例証するために使用される。このような参照ハプロタイプに関する情報は、例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＨａｐＭａｐ  Ｐｒｏｊｅｃｔのウェブサイト（ｈａｐｍａｐ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から得ることができる。
【０１５０】
例証の一部として、３つの参照ハプロタイプ（図１５Ａに示されるＨａｐＡ、ＨａｐＢ及びＨａｐＣ）がこの集団に存在するものと想定する。これらの３つのハプロタイプの各々は１４個のＳＮＰ遺伝子座からなり、各々の遺伝子座について２つの可能な対立遺伝子が存在する。この例では、図１５Ｂに示されるように、父親は、ＨａｐＢ及びＨａｐＣを有する一方、母親はＨａｐＡ及びＨａｐＢを有する。この例は、胎児は母親のＨａｐＡと父親のＨａｐＣを遺伝すると推定する。したがって、図１５Ｂに示されるように、胎児はＨａｐＡとＨａｐＣを有する。
【０１５１】
図１６は、本発明の態様に従って、１セットの参照ハプロタイプが知られているが、親のハプロタイプが知られていない場合、胎児ゲノムの少なくとも一部を決定するための方法１６００のフローチャートである。
【０１５２】
工程１６１０では、母親試料は、母親がホモ接合であり、胎児がヘテロ接合であるＳＮＰを同定するために分析することができる。この分析は、上記されるように、遺伝子座が情報を与えるものであるかどうかの決定として、類似したように行うことができる。したがって、一態様では、方法１０００及び／又は１１００を用いることができる。上記した他の態様では、母親と父親のゲノムは、胎児ゲノムマッピングを行うための情報を決定するために分析することができる。
【０１５３】
図１７は、母親試料由来のＤＮＡ断片の分析から情報を与える遺伝子座を決定する例を示す。１４個の遺伝子座の各々について、各遺伝子座についての２つの対立遺伝子のカウントを決定する。これらの対立遺伝子のカウントは、例えば、限定されないが、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、大規模並列配列決定を用いて決定され得る。これらの遺伝子座の各々について、２つの異なる対立遺伝子が母親血漿において検出されるであろう。母親がヘテロ接合であるそれらのＳＮＰとは対照的に、２つの対立遺伝子の比率は有意に異なるであろう。胎児特異的な対立遺伝子（胎児が父親から遺伝する対立遺伝子）は、母親の対立遺伝子と比較して、非常に少量であろう。情報を与える遺伝子座１７１０を図１７に記す。
【０１５４】
工程１６２０では、胎児に遺伝された親のハプロタイプの１以上の対立遺伝子が推定される。一態様では、遺伝子座１７１０の各々を用いて、遺伝された父親のハプロタイプを決定することができる。例えば、胎児が遺伝した父親の対立遺伝子は、胎児特異的な対立遺伝子が母親試料中の母親の対立遺伝子よりも非常に少量であるため、遺伝子座１７１０について胎児特異的な対立遺伝子として同定され得る。
【０１５５】
工程１６３０では、父親の対立遺伝子は、父親から遺伝されたハプロタイプを決定するために参照ハプロタイプと比較される。ある種の態様では、多数の可能な胎児ハプロタイプが推定され得て、各々は独自の可能性を有する。次に、最も可能性のある胎児ハプロタイプの１以上が、その後の分析、又は臨床診断に用いられ得る。
【０１５６】
図１８に示される例では、この集団において３つの可能なハプロタイプ（ＨａｐＡ、ＨａｐＢ及びＨａｐＣ）が存在する。母親の血漿分析から、４つのＳＮＰは、母親についてはホモ接合であり、胎児についてはヘテロ接合であるとして同定され、このようにして胎児が遺伝する父親の対立遺伝子を表す。これらの４つのＳＮＰの遺伝子型はＨａｐＣのパターンと適合する。したがって、胎児は、図１９に示されるように父親からＨａｐＣを遺伝した。換言すると、同一のハプロタイプブロック内のＳＮＰの全てについて、胎児が遺伝した父親の対立遺伝子を推定することができる。
【０１５７】
工程１６４０では、母親がヘテロ接合である遺伝子座（例えば、ＳＮＰ）を決定することができる。一態様では、母親試料の分析は、母親がヘテロ接合であるＳＮＰを提供し得る。例えば、これらのＳＮＰの各々で、２つの異なる対立遺伝子は、母親血漿において検出可能である。胎児特異的な対立遺伝子が母親血漿中の全対立遺伝子の小比率だけを分布する、母親がホモ接合であり、胎児がヘテロ接合であるＳＮＰと比較して、２つの対立遺伝子のカウントは、母親がヘテロ接合であるＳＮＰについて類似するであろう。したがって、ハプロタイプブロック内のＳＮＰ遺伝子座全てについての完全な母親の遺伝子型は、例えば、図２０に示されるように母親の血漿分析から決定し得た。
【０１５８】
工程１６５０では、母親のハプロタイプは、遺伝子座の遺伝子型と関連集団のハプロタイプ情報とを比較することによって、工程１６４０より母親の遺伝子型から推定される。図２１は、母親のハプロタイプと参照ハプロタイプから母親の遺伝子型を決定するための態様を示す。使用される例では、母親は、第３のＳＮＰ遺伝子座のＧ対立遺伝子に対してホモ接合である。ＨａｐＡとＨａｐＢがこの基準を満たすので、これは、母親が、３つのハプロタイプ組み合わせ、すなわち、ＨａｐＡ／ＨａｐＡ、ＨａｐＡ／ＨａｐＢ又はＨａｐＢ／ＨａｐＢの１つを有することを示す。さらに、母親が第１のＳＮＰについてＡとＣに対してヘテロ接合であるため、本発明者らは、母親がＨａｐＡ／ＨａｐＢのハプロタイプ組み合わせを有すると推定することができる。一態様では、１を超える可能性が帰着し得て、各々の可能性は次の工程において試験され得た。上記の分析から、母親のハプロタイプと、胎児が父親から遺伝するハプロタイプが推定された。図２２は、決定された母親のハプロタイプと、父親から遺伝されたハプロタイプを示す。
【０１５９】
工程１６６０では、胎児によって遺伝された母親のハプロタイプは、工程１６５０において同定された母親のハプロタイプ、及び工程１６３０において同定された父親から遺伝されたハプロタイプから決定される。この情報を用いて、態様は、どの母親のハプロタイプが胎児に移動されるかを決定するためにＲＨＤＯ分析を用いることができる。ＲＨＤＯ分析は、本明細書に記載される態様のいずれかに従って行うことができる。
【０１６０】
一態様では、ＲＨＤＯ分析について、母親がヘテロ接合であるＳＮＰは２つのタイプ、すなわち、アルファタイプとベータタイプ（例えば、図２３に示され、上記される）に分類することができる。アルファタイプのＳＮＰは、胎児に移動した父親の対立遺伝子が、ＨａｐＡに局在した母親の対立遺伝子と同一である遺伝子座を指す。タイプアルファＳＮＰについて、胎児が母親からＨａｐＡを遺伝する場合、ＨａｐＡ上の対立遺伝子は母親血漿において過剰に表されるであろう。一方、胎児が母親からＨａｐＢを遺伝する場合、２つの母親の対立遺伝子は母親血漿において等しく表されるであろう。
【０１６１】
ベータタイプのＳＮＰは、胎児に移動した父親の対立遺伝子がＨａｐＢ上に局在した母親の対立遺伝子と同一である遺伝子座を指す。ベータタイプのＳＮＰについて、胎児は母親からＨａｐＢを遺伝する場合、ＨａｐＢ上の対立遺伝子は母親血漿において過剰に表されるであろう。しかしながら、胎児が母親からＨａｐＡを遺伝する場合、２つの母親の対立遺伝子は母親血漿において等しく表されるであろう。ＨａｐＡ又はＨａｐＢ対立遺伝子の潜在的な過剰表現はＲＨＤＯ分析を用いて決定され得る。
【０１６２】
いくつかの態様では、母親のハプロタイプと父親の遺伝子型の以前の情報なしに、特定領域上でＲＨＤＯ分析を適用するために、ハプロタイプブロック内の相対的に高い被覆倍率のＳＮＰを必要とし得て、例えば、ＳＮＰ遺伝子座に対応する２００個の分子が一態様において分析するために必要となる場合がある。この情報は、例えば、限定されないが、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ及び大規模並列配列決定によって得ることができる。一態様では、標的化された配列決定（例えば、標的富化及び大規模並列配列決定による）は、標的化領域内の異なる対立遺伝子の代表的な公平な定量的情報を得るために用いることができる。以下の例は標的化配列決定を示す。したがって、このＲＨＤＯ分析は、その母親の対立遺伝子／ハプロタイプが、父親の遺伝子型／ハプロタイプに関する以前の情報なしに、胎児に移動するかどうかを決定するために、母親の血漿ＤＮＡの標的化配列決定データに適用され得る。
【０１６３】
ＶＩＩ．デノボ突然変異の検出
いくつかの態様は、胎児が獲得した突然変異を検出することができる。デノボ突然変異は父親又は母親によって担持されないが、例えば、父親若しくは母親又は両親からの配偶子形成中に生じる突然変異である。このような検出は、デノボ突然変異が、多数の遺伝子疾患、例えば、血友病Ａ及び軟骨形成不全症の誘因における重要な役割を果たすため、臨床用途を有する。
【０１６４】
図２４は、妊娠女性の出生前胎児のゲノムにおいてデノボ突然変異を同定するための方法２４００を例証するフローチャートである。父親と妊娠女性である母親を持つ胎児、２つのハプロタイプを含む父親ゲノムを有する父親、及び２つのハプロタイプを含む母親ゲノムを有する母親であり、以下を含む方法である。
【０１６５】
工程２４１０では、妊娠女性から得られた生物試料由来の複数の核酸分子を配列決定する。試料は母親と胎児の核酸の混合物を含む。
【０１６６】
工程２４２０では、ヒトゲノムにおける配列決定された核酸分子の各々の局在が同定される。一態様では、配列のマッピングは、単一末端又は対末端の配列決定によって実施され得る。一局面では、局在を見出すためのヒトゲノムに対するマッピングは、見出される局在のヌクレオチドの各々の正確な合致を必要としない。
【０１６７】
工程２４３０では、局在の少なくとも一部の各々について、母親の配列と父親の配列が対象とする局在で決定される。例えば、１００個の局在が工程２４２０において決定される場合、これらの１００此の局在での母親と父親のゲノムを決定することができる。一態様では、父親の配列は、上記される参照ハプロタイプを用いるのとは対照的に、父親からの試料より決定される。このようにして、参照ゲノムにはない突然変異がなおも検出され得た。種々の態様では、母親の配列は、例えば、本明細書に記載の方法を用いて、母親のＤＮＡだけを含む試料から得ることができ、又は生物試料から得ることができる。
【０１６８】
工程２４４０では、決定された母親又は父親の配列に存在しない複数の核酸分子における第１の配列が同定される。一態様では、第１の配列と決定された母親又は父親の配列との比較は正確な合致を要する。したがって、合致が正確でない場合、第１の配列は、決定された母親又は父親の配列に存在しないものと考えられる。このようにして、デノボ突然変異がちょうど１個のヌクレオチド変化であり得るため、ほんの僅かなデノボ突然変異を同定することができる。別の態様では、非母親及び非父親の配列を示すある種の数のＤＮＡ断片は、その配列がデノボ突然変異として見なされるようにするために必要とされる。例えば、３つのＤＮＡ断片のカットオフは、配列、すなわち、デノボ突然変異が存在するか否かを決定するために用いることができた。
【０１６９】
工程２４５０では、生物試料中の第１の配列の第１の画分濃度が決定される。例えば、第１の配列を示すＤＮＡ断片の数は、その遺伝子座から検出される全てのＤＮＡ断片の比率として表すことができた。
【０１７０】
工程２４６０では、生物試料における胎児核酸の第２の画分濃度は、胎児がその父親から遺伝し、父親ゲノムにおいて存在するが、母親ゲノムに存在しない核酸分子を用いて決定される。このような核酸分子は、父親がホモ接合であり、母親もまたホモ接合であるが、異なる対立遺伝子である遺伝子座で第１の対立遺伝子を含む場合があり、よって、胎児は偏性的ヘテロ接合である。上記される情報を与える遺伝子座は、第２の画分濃度を決定するために用いる核酸を決定するために使用され得る。
【０１７１】
他の態様では、第２の画分濃度は、他のアプローチ、例えば、ＰＣＲアッセイ、デジタルＰＣＲアッセイ又は質量分析に基づくアッセイの使用を用いて、Ｙ染色体、遺伝的多型の一団、すなわち、単一ヌクレオチド多型、又は挿入−欠失多型（Ｌｕｎ  ＦＭＦ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００８；５４；１５５４−１６７２）上で決定され得る。別の代替は、胎児と母親との間で異なるＤＮＡメチル化を示す１以上のゲノム遺伝子座を用いることである（Ｐｏｏｎ  ＬＬＭ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００２；４８：３５−４１；Ｃｈａｎ  ＫＣＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００６；５２：２２１１−２２１８；米国特許第６，９２７，０２８号）。
【０１７２】
一態様では、異なる後成的状況は異なるＤＮＡメチル化パターンによって反映される。異なるＤＮＡメチル化パターンは、ＲＡＳ関連ドメインファミリー１Ａ（ＲＡＳＳＦ１Ａ）又はホロカルボキシラーゼシンターゼ（ビオチン−プロプリオニル−コエンザイムＡ−カルボキシラーゼ（ＡＴＰ−加水分解））リガーゼ（ＨＬＣＳ）遺伝子を伴うことができる。胎児特異的なＤＮＡメチル化プロフィールを有するＤＮＡ断片の量は、特異的にメチル化された遺伝子座から生じる全てのＤＮＡ断片の比率として表現可能である。
【０１７３】
工程２４７０では、第１の配列は、第１と第２の画分濃度がほぼ同じである場合に、デノボ突然変異として分類される。分析過程における誤差、例えば、配列決定誤差から生じる非母親と非父親の配列は、ランダム事象であり、再現の低い可能性を有する。したがって、試料について測定された画分胎児ＤＮＡ濃度に類似した量で同じ非母親と父親の配列を示す多数のＤＮＡ断片は、配列決定誤差から生じたというよりはむしろ胎児ゲノムに存在するデノボ突然変異である可能性がある。一態様では、カットオフ値は、画分濃度が同じであるかどうかを決定するために使用されてもよい。例えば、濃度が互いに特定の値以内である場合、第１の配列はデノボ突然変異として分類される。種々の態様では、特定の値は５％、１０％、又は１５％であり得る。
【実施例】
【０１７４】
Ｉ．実施例１
本発明の態様を例証するために、以下の例を分析した。ベータ−サラセミアの出生前診断に対する産科クリニックに訪れたカップルを採用した。父親は、ヒトベータ−グロビン遺伝子のコドン４１／４２の−ＣＴＴＴの４塩基対欠失のキャリアーであった。妊娠母親は、ヒトベータ−グロビン遺伝子のヌクレオチド−２８でＡ→Ｇ突然変異のキャリアーであった。血液試料を父親と母親から採取した。母親については、血液試料は、妊娠１２週で絨毛膜標本採取（ＣＶＳ）前に採取された。ＣＶＳ後、一部を実験用に保存した。実験の目的は、ゲノム規模の遺伝子マップを構築するか、又は母親血漿ＤＮＡの大規模な並列配列決定による胎児の部分的若しくは完全なゲノム配列を決定することであった。
【０１７５】
１．親の遺伝子型の決定
ＤＮＡは、父親と母親の軟膜、及びＣＶＳ試料から抽出された。これらのＤＮＡ試料は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｇｅｎｏｍｅ−Ｗｉｄｅ  Ｈｕｍａｎ  ＳＮＰ  Ａｒｒａｙ  ６．０システムによる分析に供された。このシステムは、１８０万の遺伝子マーカーを特徴とし、約９００，０００個の単一のヌクレオチド多型（ＳＮＰ）と、コピー数改変体の検出用の約９５０，０００を超えるプローブが含まれる。父親、母親及び胎児（ＣＶＳ）についての異なる遺伝子型組み合わせを示すＳＮＰの絶対数及び割合を図２５Ａの表に示す。
【０１７６】
Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘシステムはこの実施例において使用されたが、実際には、当業者に知られている任意のゲノタイピングプラットフォームを用いることができた。確かに、ゲノタイピングとは別に、父親と母親の軟膜ＤＮＡはまた、全ゲノム基準又は選択されたゲノム領域について配列決定され得る。さらに、父親と母親由来の構造的ＤＮＡ（例えば、口腔細胞ＤＮＡ、毛嚢など）の任意の供給源が親の遺伝子型を確立するために用いることができた。
【０１７７】
ＣＶＳ試料は、母親血漿分析から推定された胎児遺伝子マップとの比較のための標準を与えるために分析された。さらに、この実験について、ＣＶＳ試料の遺伝子型又は、ＲＨＤＯ分析のための母親のハプロタイプを構築するために使用することができる。このシナリオでは、このようなハプロタイプ構築目的でのＣＶＳ遺伝子型の使用は、例示の目的で使用されただけであった。態様の臨床的応用では、母親ハプロタイプは、例えば、前の子孫、兄弟、親又は母親の他の親戚などのファミリーにおいて他の個人の分析を介して構築することができる。また、対象とする染色体領域の母親ハプロタイプは、当業者に周知な他の方法によって構築することができ、そのいくつかは本明細書に言及されている。
【０１７８】
選択された態様について、分析されるべきまだ生まれていない胎児の父親のハプロタイプを決定することができた。この情報は、父親と母親がヘテロ接合である染色体領域について相対的ハロタイプ用量について特に有用となり得る。
【０１７９】
２．母親血漿ＤＮＡの大規模な並列配列決定
母親から得られた血漿ＤＮＡは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒプラットフォームを用いて、大規模な並列配列決定に供された。血漿ＤＮＡ分子の対合末端配列決定は、各末端で５０ｂｐについて配列決定し、したがって全体で分子あたり１００ｂｐであった。各配列の２つの末端は、Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ａｔ  Ｓｈｅｎｚｈｅｎ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎ）（Ｌｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００９，２５（１５）：１９６６−７）を用いて、繰り返しの非マスク化されたヒトゲノム（ＵＣＳＣ  ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕからダウンロードされたＨｇ１８  ＮＣＢＩ．３６）に対して整列された。表、図２５Ｂは、最初の２０個のフローセルのアラインメント統計を列挙する。したがって、２０個のフローセルを用いて、３９．３２億を超える読み込みを参照ヒトゲノムに対して整列した。
【０１８０】
３．画分胎児ＤＮＡ濃度計算
上述したように、母親血漿試料中の胎児ＤＮＡの画分濃度は、配列決定データから計算することができる。１つの方法は、父親と母親がともにヘテロ接合であるが、互いに異なる対立遺伝子について、ＳＮＰを分析することである。このようなＳＮＰについて、胎児は、１つの父親により遺伝された対立遺伝子と１つの母親により遺伝された対立遺伝子について偏性のヘテロ接合である。一つの態様では、第５節に記載されている計算法のいずれも使用されてもよい。この実施例では、異なる染色体上の親の遺伝子型形態（すなわち、親がともにヘテロ接合であるが、異なる対立遺伝子についてである）を満たす、異なる多型ゲノム遺伝子座全体の累積データについて実行された。異なる染色体上に位置されたＳＮＰについて計算された胎児ＤＮＡの画分濃度は、図２６の最も右のカラムに列挙されている。表から分かるように、異なる染色体上に位置されたＳＮＰについて決定された画分濃度は、互いに非常に密接に相関している。
【０１８１】
品質管理実験として、母親がホモ接合であり、父親がヘテロ接合であるＳＮＰはまた、軟膜試料のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＳＮＰ  ６．０分析から調査された。ＤＮＡ配列の十分な深度で、この分析からの分画胎児ＤＮＡは、父親と母親がホモ接合であるが、異なる対立遺伝子についてであるＳＮＰについて測定されたものと非常に類似していた。
【０１８２】
一実施では、画分の胎児ＤＮＡ濃度の近似−一致がこれらの２つのタイプのＳＮＰから観察された場合、胎児ゲノムの完全な配列決定範囲に近いと結論付けることができた。一局面では、範囲のより小さな深度で、母親がホモ接合であり、父親がヘテロ接合であるＳＮＰについて測定された画分胎児ＤＮＡ濃度は、父親と母親がともにホモ接合であるが、異なる対立遺伝子についてであるＳＮＰについて測定されたものよりも高かった。このような範囲のより小さな深度で、配列決定の結果から父親固有の対立遺伝子についてであるＳＮＰについての不存在が２つの可能な原因を有することができる：（ｉ）胎児は父親からのこの対立遺伝子を遺伝しなかった；及び／又は（ｉｉ）胎児は父親からこの対立遺伝子を遺伝したが、次にこの対立遺伝子は、配列決定の深度が十分でなかったために、配列決定の結果からなくなっていた。
【０１８３】
４ａ．胎児ゲノムの割合範囲の計算
また、上述されたように、母親血漿ＤＮＡの配列決定によって分析された胎児ゲノムの割合は、父親と母親がともにホモ接合であるが、異なる対立遺伝子についてであるＳＮＰのサブセットでの観察によって決定することができた。このファミリーでは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＳＮＰ  ６．０アレイ上の４５，９００個ＳＮＰがこのサブセットに属していた。胎児ゲノムの割合範囲は、ＳＮＰのこのサブセットのどの割合において、胎児対立遺伝子が配列決定によって検出することができたかを観察するために、血漿ＤＮＡ配列決定を分析することによって推定することができた。
【０１８４】
図２Ａのプロットは、分析された最初の２０個のフローセルについての配列決定データから胎児対立遺伝子が観察され得たこのサブセットにおけるＳＮＰの観察された割合を示す。このようにして、胎児対立遺伝子はこのようなＳＮＰの９４％に観察することができた。この程度の配列決定は、３９．３２億を超える読み込みに対応し、各々は配列の１００ｂｐであった。図２７Ｂのプロットは、フローセルの数の代わりに、読み込みの範囲 対 数を示す。異なる配列決定プラットフォームの処理量の増加に伴って、フローセルの数、又は配列の読み込みのこれらの数若しくは配列の長さを生じさせるのに使用されるか又は必要とされるフローセル又は稼働の数が将来減少することが期待される。
【０１８５】
いくつかの態様では、複数のＳＮＰが各染色体の領域又は染色体において検出されたので、胎児ゲノムの埴は、正確なゲノムマッピングをなおも提供しながら、９４％よりも非常に低くなる可能性があった。例えば、染色体の領域において３０個の情報を与えるＳＮＰがあることを想定するが、胎児対立遺伝子は３０個のＳＮＰのうちたった２０個のＳＮＰについて検出される。しかしながら、染色体の領域は、なおも、２０個のＳＮＰを用いて正確に同定される可能性がある。このようにして、一態様では、同等な精度は、９４％未満の範囲を伴って観察され得る。
【０１８６】
４ｂ．胎児がその父親から遺伝された対立遺伝子の遺伝子マップの範囲
この例証的な分析は、父親がヘテロ接合であり、母親がホモ接合であるＳＮＰ対立遺伝子に焦点を合わせる。このファミリーでは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＳＮＰ  ６．０プラットフォーム上の１３１，０３７個のＳＮＰはこのカテゴリーに属した。これらのＳＮＰのサブセットは、母親がホモ接合であり、一方、胎児と父親がともにヘテロ接合である６５，８７５個のＳＮＰからなっていた。２０個のフローセルを用いて、父親から遺伝された対立遺伝子は、これらのＳＮＰの６１，８７５において観察され得て、９３．９％の範囲を指示した。この後者の割合は、前の段落において推定された割合範囲データと十分に一致した。父親から遺伝された対立遺伝子の範囲とマッピング可能な配列読み込みの数とフローセル配列の数との間の相関はそれぞれ図２８Ａと図２８Ｂに示されている。
【０１８７】
純粋に父親から遺伝された胎児の対立遺伝子を検出するためのこのアプローチの特異性を評価するために、母親が持つのと同じである対立遺伝子を胎児が遺伝した６５，１６２個（すなわち、１３１，０３７〜６５，８７５個）のＳＮＰを分析した。このようなＳＮＰについて、母親が持つものとは異なる対立遺伝子の見掛けの検出は偽陽性を表す。このようにして、６５，１６３個のＳＮＰのうち、たった３，２２５個の偽陽性（４．９５％）が、２０個のフローセルを分析したときに観察された。これらの偽陽性は、父親と母親のＤＮＡの配列決定エラー又は遺伝子型決定エラー、又は胎児におけるデノボ突然変異の結果であり得る。偽陽性率と配列決定されるフローセルの数との相関を図２９Ａに示す。
【０１８８】
また、偽陽性率は、父親と母親の両方がホモ接合であり、同じ対立遺伝子を有するＳＮＰのサブセットを考慮することによって見積もることができる。特定の遺伝子座での任意の代替の対立遺伝子の存在が偽陽性であると考えられた。これらの偽陽性は、父親若しくは母親のＤＮＡの配列決定エラー又は遺伝子型決定エラー、又は胎児におけるデノボ突然変異の結果であり得る。このサブセットには５００，６７３個のＳＮＰが存在した。２０個のフローセルからの配列データを用いて、偽陽性が４８，３９６個のＳＮＰ（９．６７％）において検出された。偽陽性率と配列決定されるフローセルの数との相関を図２９Ｂに示す。この偽陽性率は、母親と胎児がホモ接合であり、父親がヘテロ接合であるＳＮＰのサブセットを用いた見積りよりも高かった。これは、ＳＮＰの後者のサブセットにおいて、母親血漿における父親から遺伝された対立遺伝子の存在だけが偽陽性であると考えられる一方、前者のサブセットにおいては、父親と母親によって共有される共通の対立遺伝子以外の任意の対立遺伝子が偽陽性結果として考えられるためである。
【０１８９】
図３０は、分析されるフローセルの異なる数に対して胎児特異的なＳＮＰの範囲を示す。父親と母親の両方がホモ接合であるが、異なる対立遺伝子を有するＳＮＰがこの分析に含まれる。Ｘ軸は胎児特異的なＳＮＰの倍数範囲であり、Ｙ軸は特定の倍数大衆を有するＳＮＰの割合である。分析されるフローセルの数が増加するとともに、胎児特異的なＳＮＰについて倍数範囲の平均数が増加する。例えば、１つのフローセルが分析された場合、ＳＮＰの平均範囲は０．２３であった。平均範囲は、２０個のフローセルが分析された場合、４．５２倍に増加した。
【０１９０】
５．その母親から遺伝された遺伝子マップの精度
図３１は、１０個のフローセルからのデータを用いた場合、タイプＡ分析の精度を示す。セクションＩＩ．Ｂは、タイプＡとタイプＢの分析（アルファとベータとも呼ばれる）の態様を記載する。精度は、母親から遺伝されたハプロタイプの正しい決定についてである。精度は、各染色体についてそれぞれ存在する。
【０１９１】
ＳＰＲＴ分析（Ｚｈｏｕ  Ｗ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００１；１９：７８−８１；Ｋａｒｏｕｉ  ＮＥ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔａｔｉｓｔ  Ｍｅｄ  ２００６；２５：３１２４−３３）に対する１，２００の尤度比を用いると、精度は９６％〜１００％の範囲であった。示されるように、ＳＰＲＴ分類に対するこのような高い尤度比を用いたときでさえ、ゲノム全体で総２，７６０個のセグメントを分類することができた。この程度の解像度は、大部分の目的にとって十分であり、その場合、減数分裂性組み換えは、発生あたり、染色体アームにつき低い一桁分の１の頻度で起こると考える。さらに、インターレイシングアプローチを用いると、誤分類の全てが妨げられ得ることを見出すことができた（図３１の右側）。上記した通り、インターレイシングアプローチはタイプＡ分析及びＴｙｐｅＢ分析をモジュール散る。
【０１９２】
図３２は、１０個のフローセルからのデータを用いた場合、タイプＢ分析の精度を示す。ＳＰＲＴ分析について１，２００の尤度比を用いると、精度は９４．１％〜１００％の範囲であった。誤分類の全ては、図３１に示したように、インターレイシングアプローチを用いた場合に妨げられた（図３２の右側）。
【０１９３】
図３３は、３０個のフローセルからのデータを用いた場合、タイプＡの分析の精度を示す。ＳＰＲＴ分析についての１，２００の尤度比と「２つの連続ブロック」アルゴリズムを用いると、３，７８０分類の全部が作製され、ほんの３つ（０．１％）の分類が正しくなかった。図３４は、２０個のフローセルからのデータを用いた場合のタイプＢ分析の精度を示す。ＳＰＲＴについて１，２００の尤度比と「２つの連続ブロック」アルゴリズムを用いると、３，３５５分類の全部が作製され、ほんの６つ（０．２％）の分類が正しくなかった。これらの実施例では、ＳＰＲＴは、ＳＮＰなどの単数の遺伝子マーカーの全体で行われる。
【０１９４】
ＩＩ．ベータ−サラセミアの危険性の出生前決定
一態様では、胎児のベータ−サラセミア（常染色体劣性疾患）を有する危険性を決定するために、胎児が、その父親と母親によって担持された突然変異対立遺伝子を遺伝したかどうかを決定することができる。上記されたこのケースでは、父親は、ヒトベータグロビン遺伝子のコドン４１／４２の−ＣＴＴＴの４塩基対欠失のキャリアーである。妊娠女性は、ヒトベータ−グロビン遺伝子のヌクレオチド−２８でのＡ→Ｇの突然変異のキャリアーであった。
【０１９５】
胎児が父親のコドン４１／４２突然変異を遺伝したかどうかを決定するために、最初の１０個のフローセルを用いて、母親血漿ＤＮＡの配列決定データをこの突然変異について探索した。この突然変異を有する１０個の読み込みの全部を見出した（図３５Ａ）。したがって、胎児は、父親の突然変異を遺伝していた。さらに、６２個の読み込みは、コドン４１／４２での野生型配列を含むことが見出された（図３５Ｂ）。よって、突然変異を含むこの領域における読み込みの割合は０．１３８９である。この図は、図２６において決定された画分胎児ＤＮＡ濃度に非常に近い。一態様では、父親の突然変異の遺伝における胎児の危険性はまた、父親の突然変異に連結された遺伝子多型のその継承を解明することによって決定され得る。
【０１９６】
一態様では、胎児が母親血漿ＤＮＡ−２８突然変異を遺伝した危険性を決定するために、ＲＨＤＯ分析を行った。このファミリーでは、−２８突然変異はハプロタイプＩＶ上に局在し、一方、野生型対立遺伝子はハプロタイプＩＩＩに局在した。タイプＡのＲＨＤＯ分析の結果を図３６に示し、一方、タイプＢのＲＨＤＯ分析の結果を図３７に示す。両タイプの分析において、母親からのハプロタイプＩＩＩの胎児遺伝が推定された。換言すると、胎児は、母親からの野生型対立遺伝子を遺伝した。胎児の最終診断は、父親からのコドン４１／４２突然変異と、母親からの野生型対立遺伝子を遺伝したことであった。このようにして、胎児は、ベータ−サラセミアのヘテロ接合性キャリアーであり、よって臨床的には健常であるはずである。
【０１９７】
ＩＩＩ．標的富化及び標的化配列
前のセクションで検討したように、分画胎児ＤＮＡ濃度の見積もりの精度、及び母親血漿ＤＮＡの分析から推定された遺伝子マップの解像度は、対象とする遺伝子座の範囲の深度に依存し得る。例えば、本発明者らは、ＳＮＰに対応する２００個の分子の全体が、母親の遺伝子型の以前の情報なしに、高い精度で画分胎児ＤＮＡ濃度を決定するために必要とされ得ることを実証した。母親血漿におけるＳＮＰの対立遺伝子カウントは、例えば、限定されないが、リアルタイムＰＣＲ、デジタルＰＣＲ及び大規模な並列配列決定によって得ることができる。
【０１９８】
母親血漿ＤＮＡの大規模な並列配列決定が全ゲノム全体で数百万のＳＮＰの対立遺伝子カウントを同時に決定することができるため、異なる遺伝子座全体で全ゲノム分析について理想のプラットフォームである。大規模な並列配列決定の基本のフォーマットは、同じ深度で覆われるゲノム内の異なる領域を許容する。しかしながら、無作為な大規模な並列配列決定を用いた高い配列決定深度で特定の対象とする領域を配列決定するために、ゲノムの残りの部分（分析されることが意図されない）は、同程度まで配列決定されなければならない。このようにして、本アプローチは費用が嵩む可能性があった。大規模な並列配列決定アプローチのコストパフォーマンスを改善するために、１つの方法は、配列決定を進める前に、標的領域を富化することである。標的化された配列決定は、液相捕捉（Ｇｎｉｒｋｅ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｈｙｂｒｉｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｕｌｔｒａ−ｌｏｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００９；２７：１８２−９）、マイクロアレイ捕捉（例えば、ＮｉｍｂｌｅＧｅｎプラットフォームを用いる）、又は標的化増幅（Ｔｅｗｈｅｙ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｄｒｏｐｌｅｔ−ｂａｓｅｄ  ＰＣＲ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００９；２７：１０２５−３１）によって行うことができる。
【０１９９】
標的化配列決定は、例えば、遺伝子結合研究のために、集団遺伝子改変を検出するために初期に適用された。したがって、ゲノム研究における現在の応用は、定量的問題を解決すること（例えば、ゲノタイピング又は突然変異検出）を目的する。しかしながら、非浸襲性の出生前診断目的のために、母親のプラズマＤＮＡにおける標的化配列決定の応用は、定量的考察と関係し、その実行性は不明であった。例えば、標的化配列決定の使用は、母親血漿における胎児及び母親ＤＮＡの検出において定量的バイアスを導入することができた。さらに、従来の研究は、胎児ＤＮＡが母親ＤＮＡよりも短いことを示した（Ｃｈａｎ  ＫＣＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｉｚｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ａｎｄ  ｆｅｔａｌ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｍａｔｅｒｎａｌ  ｐｌａｓｍａ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００４；５０：８８−９２）。また、このサイズの相違は、母親血漿における胎児及び母親のＤＮＡの捕捉の定量的バイアス又は異なる効率を導入することができた。また、効率性について確認していないが、このような断片化されたＤＮＡ分子が捕捉され得ることについて確かめていなかった。以下の記載では、本発明者らは、標的化配列決定が、標的富化、続く大規模な並列配列決定によって達成され得る。また、全ゲノム配列決定と比較して、標的富化は、画分胎児ＤＮＡ濃度を見積もるための効率的な方法であることを示す。
【０２００】
Ａ．標的−富化を用いた画分濃度の決定
１．材料及び方法
一人の女子胎児を持つ４人の（Ｍ６０１１、Ｍ６０２８、Ｍ６０２９及びＭ６０４３）妊娠女性を採用した。母親の末梢血試料をＥＤＴＡ血液チューブに回収し、その後、妊娠第３期に選択的帝王切開をし、一方、胎盤試料を選択的帝王切開後に回収した。遠心分離後、末梢血細胞由来のＤＮＡは、Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いて抽出された。２．４ｍＬの胎盤由来のＤＮＡは、ＤＳＰ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ）によって抽出された。母親のゲノムＤＮＡは軟膜から抽出され、胎児のゲノムＤＮＡは胎盤組織から抽出された。妊娠第３期の試料は、例証目的のためだけにこの実験で使用された。妊娠第１期及び第２期の試料を同様に用いることができる。
【０２０１】
母親及び胎児の遺伝子型は、Ｇｅｎｏｍｅ−Ｗｉｄｅ  Ｈｕｍａｎ  ＳＮＰ  Ａｒｒａｙ  ６．０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）によって決定された。各事例について、５〜３０ｎｇの血漿ＤＮＡが、クロマチン免疫沈降配列決定試料調製の製造業者のプロトコールに従って、対末端試料調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）によってＤＮＡライブラリー構築のために用いられた。アダプター連結されたＤＮＡは、直接、更なるサイズ分離せずに、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）において提供されるスピンカラムを用いて精製された。次に、アダプター連結されたＤＮＡは、標準的なプライマーを用いた１５サイクルのＰＣＲにより増幅された。プライマーはＩｌｌｕｍｉｎａからのＰＣＲプライマーはＩｌｌｕｍｉｎａからのＰＥ１．０及び２．０であった。ＤＮＡライブラリーは、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いることによって定量し、サイズ分布について調べるために、ＤＮＡ１０００キット（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて２１００Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ上で稼働させた。０．６〜１μｇの増幅試料ＤＮＡライブラリーは、平均サイズが約２９０ｂｐである各試料について生じさせた。捕捉ライブラリーをＡｇｉｌｅｎｔから得て、ヒトｃｈｒＸ（カタログ番号：５１９０−１９９３）上の８５％のエクソンをカバーしていた。この試験における４人全ての事例について、各事例の５００ｎｇの増幅された血漿ＤＮＡライブラリーは、製造業者の説明書に従って、２４時間６５℃にて捕捉プローブとともにインキュベートされた。ハイブリダイゼーション後、捕捉された標的は、ストレプトアビジン被覆された磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ  ＤｙｎａＭａｇ−２  Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ）を用いることによってビオチン化プローブ／標的ハブリダイズを引き出すことによって選択し、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｕｉａｇｅｎ）により精製された。最後に、標的化ＤＮＡライブラリーは、ＡｇｉｌｅｎｔのＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＧＡＰＥプライマーを用いて１２サイクルのＰＣＲ増幅によって富化された。ＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｕｉａｇｅｎ）によって精製された。次に、標的富化とともに又は伴わないで精製されたＤＮＡライブラリーは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩｘを用いたランダム大規模並列配列決定に供された。標準のフローセル上の１つの配列決定レーンを用いて、各ＤＮＡライブラリーを並列決定した。
【０２０２】
２．標的富化なしの胎児ＤＮＡの画分濃度
画分胎児ＤＮＡ濃度は、情報を与えるＳＮＰ（すなわち、母親がホモ接合であり、胎児がヘテロ接合であるＳＮＰ）の対立遺伝子カウントに基づいて計算され得る。以下の表は、１２０１８４、１１０７３０、１０７３６２及び１１０３２１個の情報を与えるＳＮＰが４人の事例について全ゲノム全体で同定され、６３、６１、６９及び６５（それぞれ同事例の順番である）が染色体Ｘの標的化された領域内にあることを示す。標的富化しない場合、画分胎児ＤＮＡ濃度は、ゲノムの全ての情報を与えるＳＮＰのデータに基づいて、３３．４％、３１．３％、２９．２％及び３４．４％であった。
【０２０３】
【表３】
0005540105.tif 000006
【０２０４】
３．標的富化の有無による試料の比較
いくつかの態様では、各塩基あたりの平均時間数を表す配列割合の深度は、特定の領域において配列決定された。この態様では、本発明者らは、標的化された領域内の配列決定された塩基の総数を標的化された領域の長さ（３．０５Ｍｂ）で割ることによって、標的化された領域の配列深度を計算した。富化キットによってカバーされた領域について、平均配列割合は、非富化試料については０．１９倍であり、富化された試料については５４．９倍であり、これは、２８９倍の富化の平均を指示する。この配列決定深度では、標的化領域内のほんの４．０％の胎児特異的な対立遺伝子が標的富化前に検出された（以下の表を参照）。対照的に、それらのうちの９５．８％は、標的富化後に検出可能となった（以下の表を参照）。したがって、標的富化は、標的化領域内に胎児特異的対立遺伝子の検出率を大いに増大させた。
【０２０５】
次に、本発明者らは、富化の有無により、各試料について標的化領域内の全ての情報を与えるＳＮＰの読み込みカウントに基づいて、画分胎児ＤＮＡ濃度を比較した。標的富化しない場合、胎児特異的な読み込みの数は、４つの試料について０〜６の範囲であった（以下の表を参照）。低配列範囲により、胎児ＤＮＡ分子の不十分なサンプリングは、画分胎児ＤＮＡ濃度の正確な見積りを妨げる。標的富化の場合、標的領域内に大多数の胎児特異的対立遺伝子カウント（５１１〜７７６）及び共有の対立遺伝子カウント（２５７０〜３９２２）を観察した（以下の表を参照）。胎児ＤＮＡ割合は、非富化試料におけるゲノム全般のデータによって見積もられた胎児ＤＮＡ割合との３５．４％、３３．２％、２６．１％、及び３３．０％一致として計算された（以下の表を参照）。これらの結果は、母親及び胎児のＤＮＡ分子が標的領域内に同定に富化されたことを指示した。
【０２０６】
【表４】
0005540105.tif 000007
【０２０７】
Ｂ．標的−富化を用いた胎児ゲノムの決定
ＲＨＤＯ法の１つの応用は、母親から遺伝された遺伝病の非侵襲的出生前検出用である。標的富化なしの母親の血漿の大規模並列配列決定を用いて、ＲＨＤＯ分析は、母親の血漿ＤＮＡの配列決定深度が約６５倍のヒトゲノム範囲である場合に、どの母親のハプロタイプが１７個のＳＮＰの平均を有する胎児に移動するかを正確に決定することである。このアプローチのコストパフォーマンスを改善するために、ゲノム内の対象とする特定領域に配列決定を選択的に指向すること、次に、ＲＨＤＯ分析を配列決定に適用することを行うことができる。一例として、本発明者らは、染色体Ｘの標的化された配列決定及びＲＨＤＯ分析を用いた概念を示した。しかしながら、標的かされた配列決定及びＲＨＤＯ分析はまた、全ての染色体、例えば、常染色体に適用可能である。一態様では、上記されるＲＨＤＯ分析は標的化された態様について使用され得る。
【０２０８】
一人の女子胎児を持つ５人の（ＰＷ２２６、ＰＷ２６３、ＰＷ３１６、ＰＷ３７０及びＰＷ４２１）妊娠女性を採用した。母親の末梢血試料をＥＤＴＡ血液チューブに回収し、その後、妊娠第１期において絨毛膜標本採取した。遠心分離後、末梢血細胞由来 
３．２ｍＬの血漿からのＤＮＡは、ＤＳＰ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ）によって抽出された。母親のゲノムＤＮＡは軟膜から抽出され、胎児のゲノムＤＮＡは絨毛膜から抽出された。上記した通り、試料を調製し、分析した。次に、各試料は、Ｉｌｌｕｍｉｎａフローセル上の１レーンを用いて無作為に配列決定された。
【０２０９】
この実施例では、本発明者らは、母親の核酸からの配列決定情報とともに胎児遺伝子型を用いて、染色体Ｘについて母親のハプロタイプを推定し、母親からどのハプロタイプが遺伝されたかを推定した。母親がヘテロ接合である染色体Ｘ上の各ＳＮＰ（すなわち、情報を与えるＳＮＰ）について、胎児によって遺伝された対立遺伝子は母親のハプロタイプ１（ＨａｐＩ）に起因するものとして画定され、一方、胎児に移動しなかった母親の対立遺伝子は、母親のハプロタイプ２（ＨａｐＩＩ）に起因するものとして画定された。いくつかの態様では、臨床応用について、胎児遺伝子型は事前に利用可能でない場合もあり、母親のハプロタイプは、当業者に周知な方法及び本明細書に記載の方法によって決定又は推定することができる。また、他の染色体、例えば、常染色体は、このような分析において使用可能である。
【０２１０】
本明細書において上記される５人の事例について、それらの全ては一人の男子胎児を有していた。男子胎児は、父親からの染色体Ｘではなく、母親からの染色体Ｘを１つだけ遺伝するので、胎児に移動された母親の染色体Ｘは母親の血漿において過剰発現された。ＲＨＤＯ分析は、染色体Ｘのｐｔｅｒからｑｔｅｒまで実施された。染色体Ｘのｐｔｅｒに近いＳＮＰで開始して、ＳＰＲＴ分析は、ＨａｐＩ又はＨａｐＩＩ上の対立遺伝子が母親血漿において統計学的に有意に過剰発現されたかどうか決定することができる。２つのハプロタイプのいずれも統計学的に有意に過剰発現されなかった場合、次のＳＮＰについての対立遺伝子カウントは更なるＳＰＲＴ分析について組み合わせることができる。追加のＳＮＰは、ＳＰＲＴプロセスは、統計学的に有意に過剰発現されたハロタイプの１つを同定するまで、分析について組み合わせることができる。次に、分類プロセスを次のＳＮＰで再度開始することができる。
【０２１１】
図３８Ａ及び３８Ｂは、一例として事例ＰＷ２２６についてのＳＰＲＴ分類結果を示す。この事例において染色体Ｘについての９個の成功したＳＰＲＴ分類の全部が存在した。各ＳＰＲＴ分類について、ＨａｐＩ上の対立遺伝子は、母親の血漿試料において過剰発現されたことを示し、これは、胎児が母親からＨａｐＩを遺伝したことを指示する。本発明者らは、ＨａｐＩが胎児に移動した対立遺伝子を含むハプロタイプであると画定したので、全てのこれらのＳＰＲＴ分類の結果を回収した。
【０２１２】
５つの事例についてのＲＨＤＯ分析結果を図３９にまとめた。成功したＳＰＲＴ分類の数は１〜９の範囲であった。ＳＰＲＴ分類の全てを回収した。より高い画分胎児ＤＮＡ濃度は、より高い分類の数と関付けられた。これは、胎児ＳＮＡの存在による対立遺伝子不均衡が、胎児ＤＮＡの分画濃度が高くなる場合に、より容易に検出され得るからである。したがって、より少ないＳＮＰが、成功するＲＨＤＯ分類に到達するために必要とされ得る。このようにして、画定された染色体領域（単数又は複数）はより多くのＲＨＤＯブロックに分割され得る。本発明者らの結果は、ＲＨＤＯ分析が、標的富化後に得られる大規模配列決定データに対して実行され得ることを確実にする。
【０２１３】
さらに、本発明者らのデータは、標的化されたアプローチが、ＲＨＤＯ分析を実行するよりコストパフォーマンスな方法であることを示した。標的富化しない場合、類似の胎児ＤＮＡ濃度を含む試料について、約５個のフローセルによる配列決定（すなわち、４０個の配列決定レーン）は、図３９に示される試料について到達される平均深度に達するように要求される（図４０）。ここで、本発明者らは、標的富化の場合、たった１つのレーンによる配列決定は、すでに、成功するＲＨＤＯ分析について約１５〜１９倍の平均配列決定深度に達することを示す。あるいは、より高倍レベルの配列決定範囲は、標的富化を用いた場合、相対的に少ない追加費用で達成された。より高いレベルの配列決定範囲は、成功するＲＨＤＯ分類に必要とされるゲノム領域のサイズを効果的に減少させることができ、分析の解像度を改善する。
【０２１４】
ＩＶ．標的−富化
循環胎児ＤＮＡ分子は、一般には、母親の血漿における母親のＤＮＡよりも短いことが２００４年から知られている（Ｃｈａｎ  ＫＣＡ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００４；５０：８８−９２；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ  Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００４）。しかしながら、この観察の分子基礎は未解決のままであった。本発明者らの現在の研究では、研究の血漿試料において３．９３１×１０９個の読み込みを生じさせ、バイオインフォマティックス分析において１塩基ビン（ｂｉｎ）を用いた。各々の配列決定された血漿ＤＮＡ分子のサイズは、対末端読み込みの末端のゲノム座標から推定された。
【０２１５】
この研究について、本発明者らは、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）に焦点を合わせ、そこでは、父親と母親はともにホモ接合であるが、異なる対立遺伝子についてである。このようなＳＮＰについて、胎児は必然的にヘテロ接合であった。父親から遺伝された各ＳＮＰの対立遺伝子は、胎児特異的マーカーとして用いることができた。胎児（父親から遺伝された胎児特異的対立遺伝子）のサイズ、及び全配列は、全ゲノム（図４１）、及び、個別には各染色体（図４２Ａ〜４２Ｃ）について決定された。
【０２１６】
母親の血漿中の胎児及び母親のＤＮＡの間の最も有意な相違は、１４３ｂｐピークと比較して１６６ｂｐピークの減少であることを見出した（図４１）。最も豊富な全配列（選択的には母親である）は長さにして１６ｂｐであった。父親と母親との間のサイズ分布における最も有意な相違は、胎児ＤＮＡが１６６ｂｐ（図４１）の減少を提示し、相対的に顕著なものは１４３ｂｐピークであることであった。可能性として、後者は、ヌクレオソームから約１４６ｂｐのコア粒子への約２０ｂｐのリンカー断片のトリミングに対応していた（Ｌｅｗｉｎ  Ｂ，ｉｎ  Ｇｅｎｅ  ＩＸ，Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｓｕｄｂｕｒｙ，２００８，ｐｐ．７５７−７９５）。
【０２１７】
約１４３ｂｐ以下から、胎児と全ＤＡＮの分布は、ヌクレアーゼ開裂されたヌクレオソームの１０ｂｐの周期的な連想（ｒｅｍｉｎｉｓｃｅｎｔ）を示した。これらのデータは、血漿ＤＮＡ断片がアポトーシス性の酵素処理から誘導されることを示唆する。対照的に、非ヒストン結合のミトコンドリアゲノムに対してマッピングされた読み込みのサイズ分析はこのヌクレオソームパターンを示さなかった（図４１）。これらの結果は、Ｙ染色体と選択された多型遺伝子マーカーを用いて、父親と母親のＤＮＡ間の既知のサイズ再について従来知られていない分子説明を与ええ（Ｃｈａｎ  ＫＣＡ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００４；５０：８８−９２；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００４；５０：１００２−１０１１；米国特許出願第２００５０１６４２４１号；米国特許出願第２００７０２０２５２５号）、このようなサイズは全ゲノムの全体に存在することを示す。この相違の最も可能性のある説明は、循環胎児ＤＮＡ分子が、約２０ｂｐのリンカー断片がヌクレオソームからトリミングされているより多くの分子からなることである。
【０２１８】
これらの観察から、試料が胎児ＤＮＡについて富化され得る多くの方法が存在する。一態様では、リンカー断片に選択的に結合する試薬を用いることができる。このような試薬は、母親の血漿中の胎児誘導ＤＮＡと比較した場合、母親誘導ＤＮＡに選択的に結合することが期待された。このような試薬の一例は抗体である。このような抗体の１つの標的はヒストンＨ１に結合するものである。ヒストンＨ１はリンカー断片に結合することが知られている。このような抗体の１つの応用は、負の選択によって、すなわち、リンカー、ヒストンＨ１含有断片を含む母親の血漿における母親誘導ＤＮＡの選択的免疫沈降を介して、胎児ＤＮＡの富化の実施に関する。さらに、Ｈ１は多数の改変体を有することが知られ、それらのいくつかは発現において組織特異的なバリエーションを示す（Ｓａｎｃｈｏ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ  ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ  ２００８；４：ｅ１０００２２７）。さらに、これらの改変体は、胎児ＤＮＡ（胎盤選択的）及び母親ＤＮＡ（造血選択的（Ｌｕｉ  ＹＹＮ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  ２００２；４８：４２１−４２７））を識別するために開発され得た。例えば、母親血漿中の胎児誘導ＤＮＡについて選択的かつ陽性に選択するために、栄養膜細胞によって選択的に発現されるヒストンＨ１改変体を標的とすることができる。また、この戦略は、組織特異的、特に栄養膜特異的な発現パターンを示す他のヒストンタンパク質又は他のヌクレオソームタンパク質に提供され得る。
【０２１９】
母親ＤＮＡについて鋭い１６６ｂｐピークから、胎児ＤＮＡの富化の別の可能性は、長さにして１６６±２であるＤＮＡ断片の負の選択用のシステムを設計することである。例えば、キャピラリー電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーに基づくシステムは、ＤＮＡ分子の正確なサイズ測定及び分離を可能にすることができた。負の選択のための別の方法は、配列決定データのバイオインフォマティックス分析中にインシリコでこれを行うことである。
【０２２０】
血漿中の他のＤＮＡ種、例えば、腫瘍ＤＮＡ（Ｖｌａｓｓｏｖ  ＶＶ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ２０１０；１０：１４２−１６５）、及び移植された臓器ＤＮＡ（Ｌｏ  ＹＭＤ  ｅｔ  ａｌ，Ｌａｎｃｅｔ  １９９８；３５１：１３２９−１３３０）はまた、母親の血漿中の胎児ＤＮＡとこのような特徴を共有することが期待されるため、上記の（１）と（２）に列挙された戦略は、これらのＤＮＡ種の富化について用いることができた。
【０２２１】
一態様によれば、ヌクレオソームのリンカー断片の標的を介して、ヒト血漿又は血清におけるＤＮＡ種の異なる富化の方法が提供される。一態様では、この富化は、以下の母親誘導ＤＮＡ又は造血細胞由来のＤＮＡの１つを除くことによってなされる。別の態様では、標的化は、ヌクレオソームのリンカー断片のタンパク質又は核酸コンポーネントに選択的に結合する試薬（例えば、抗体又は別のタイプのタンパク質）を伴う。別の態様では、標的化試薬は、ヌクレオソームのリンカー断片に結合するヒストンＨ１又は別のタンパク質に選択的に結合する。別の態様では、標的化試薬は、ヌクレオソームのリンカー断片に結合するヒストンＨ１又は別のタンパク質の母親又は血液学的な改変体に結合する。一態様では、そのＤＮＡの除去は、免疫沈降又は固体表面への結合によって実施される。
【０２２２】
別の態様によれば、母親の血漿又は血清における胎児ＤＮＡの異なる富化の方法は、（ａ）ヌクレオソームのリンカー断片の１以上のコンポーネントに結合する抗体の使用；（ｂ）免疫沈降又は固体表面への捕捉による結合された断片の除去；及び（ｃ）胎児ＤＮＡの画分濃度の増加を含む未結合画分の回収を含む。
【０２２３】
本明細書において記載されている任意のソフトウェア・コンポーネント又はソフトウェア関数は、任意の適切なコンピュータ言語、例えばＪａｖａ、Ｃ＋＋又はＰｅｒｌを使用して、例えば従来の又はオブジェクト指向の技術を使用するプロセッサーによって実行されるソフトウェアコードとして実行され得る。ソフトウェアコードは、記憶及び／又は送信のためのコンピュータ読み取り可能媒体、ランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）、読み取り専用メモリー（ＲＯＭ）、磁気媒体、例えばハードドライブ若しくはフロッピーディスク、又は光学媒体、例えばコンパクトディスク（ＣＤ）若しくはＤＶＤ（デジタル多用途ディスク）、フラッシュメモリーなどを含む好ましい媒体における、一連の指令又はコマンドとして蓄積され得る。コンピュータ読み取り可能媒体は、かかる記憶又は送信装置の任意の組み合わせであり得る。
【０２２４】
また、このようなプログラムは、コード化され、インターネットを含む種々のプロトコールに適合する有線、光、及び／又は無線ネットワークを経由した送信のために適用されるキャリアー信号を使用して送信され得る。したがって、本発明の態様のコンピュータ読み取り可能媒体は、このようなプログラムでコード化されたデータ信号を使用して作られ得る。プログラムコードでコード化されたコンピュータ読み取り可能媒体は、互換性のあるデバイスとともにパッケージされるか、又は他のデバイスからは分離して（例えばインターネットダウンロードを通じて）提供され得る。任意のこのようなコンピュータ読み取り可能媒体は、単一のコンピュータプログラム製品（例えばハードドライブ若しくは全コンピュータシステム）上に又はその中に装備されてもよく、システム若しくはネットワーク内における異なるコンピュータプログラム製品上若しくはその中に存在してもよい。コンピュータシステムは、ユーザーに本明細書において言及された任意の結果を提供するためのモニター、プリンター、又は他の好ましいディスプレイを含んでもよい。
【０２２５】
コンピュータシステムの例を図４３に示す。図４３に示されたサブシステムは、システムバス９７５を通じて相互接続される。更なるサブシステム、例えばプリンター４３７４、キーボード４３７８、固定ディスク４３７９、ディスプレイアダプター４３８２と連結されたモニター４３７６、及びその他のものが示される。Ｉ／Ｏコントローラー４３７１と連結する、周辺機器及び入力／出力（Ｉ／Ｏ）装置は、当技術分野において既知である任意の数の手段、例えばシリアルポート４３７７によってコンピュータシステムと接続され得る。例えば、シリアルポート４３７７又は外部インターフェース４３８１は、コンピュータ装置をインターネットのような広域ネットワーク、マウス入力装置、又はスキャナーと接続するために使用され得る。システムバス経由の相互接続により、セントラルプロセッサ４３７３を個々のサブシステムと通信させ、システムメモリー４３７２又は固定ディスク４３７９からの指示の実行、及びサブシステム間の情報の交換をさせることが可能である。システムメモリー４３７２及び／又は固定ディスク４３７９は、コンピュータ読み取り可能媒体を具現化し得る。本明細書に言及されている値のいずれｋは、１つのコンポーネントから別のコンポーネントに出力することができ、ユーザーに出力することができる。
【０２２６】
コンピュータシステムは、例えば、外部インターフェース４３８１又は内部インターフェースによってともに連結される、複数の同じコンポーネント又はサブシステムを含むことができる。いくつかの態様では、コンピュータシステム、サブシステム、又は装置はネットワークを介して通信され得る。このような例において、１つのコンピュータがクライアントであり、別のコンピュータがサーバーであると考えることができ、その場合、各々は同じコンピュータシステムの一部であり得る。クライアント及びサーバーは、各々、多数のシステム、サブシステム、又はコンポーネントを含むことができる。
【０２２７】
特定の態様の特定の詳細は、任意の方法で組み合わせることができ、又は本発明の態様の精神及び範囲から逸脱することなしに、本明細書に示され、又は記載されたものから変更することができる。
【０２２８】
本発明の例示的態様の上記記載は、例証及び説明の目的のために存在する。記載された明確な形態に本発明を網羅する、又は限定することは意図されておらず、そして多くの変更及び変形は、上記教示の観点において可能である。該態様は、本発明の原理、並びにそれにより他の当業者が本発明を種々の実施形態で本発明を最もよく利用することができるように、意図された特定の使用に好適である種々の変形を有する、その実用的な利用を最もよく説明するために選択かつ記載された。
【０２２９】
本明細書において引用された全ての出願、特許及び特許出願は、全ての目的のために、それら全体で参照により本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４３】
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