(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
石灰化能を有する培養細胞から抽出されたＣａ／Ｐ比（モル比）が１．４５２〜１．４７２の石灰化物を含み、人工物のヒドロキシアパタイト及びβ―ＴＣＰを含まないことを特徴とする、ヒト骨組織を再生するための基材。
【請求項２】
前記石灰化能を有する培養細胞はほ乳類細胞であることを特徴とする、請求項１に記載のヒト骨組織を再生するための基材。
【請求項３】
前記石灰化能を有する培養細胞はヒト細胞であることを特徴とする、請求項２に記載のヒト骨組織を再生するための基材。
【請求項４】
前記石灰化能を有する培養細胞は硬組織に由来することを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１つに記載のヒト骨組織を再生するための基材。
【請求項５】
前記石灰化能を有する培養細胞は誘導性多分化能幹細胞に由来することを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１つに記載のヒト骨組織を再生するための基材。
【請求項６】
前記石灰化能を有する培養細胞は間葉系幹細胞に由来することを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１つに記載のヒト骨組織を再生するための基材。
【請求項７】
前記石灰化能を有する培養細胞は骨肉腫に由来することを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１つに記載のヒト骨組織を再生するための基材。
【請求項８】
前記石灰化物は高温で焼結することなく抽出されることを特徴とする、請求項１ないし７のいずれか１つに記載のヒト骨組織を再生するための基材。
【請求項９】
前記石灰化物は界面活性剤を用いて抽出されることを特徴とする、請求項８に記載のヒト骨組織を再生するための基材。
【請求項１０】
請求項１ないし９のいずれか１つに記載のヒト骨組織を再生するための基材を含むことを特徴とする、人工骨。
【請求項１１】
請求項１ないし９のいずれか１つに記載のin vitroでヒト骨組織を再生するための基材を添加するステップを含むことを特徴とする、石灰化能が亢進したヒト硬組織細胞を製造する方法。
【請求項１２】
請求項１ないし９のいずれか１つに記載のヒト骨組織を再生するための基材と、石灰化能を有するヒト細胞とを含むことを特徴とする、骨充填材。
【請求項１３】
石灰化能を有する培養細胞から石灰化物を抽出するステップを含むことを特徴とする、前記Ｃａ／Ｐ比（モル比）が１．４５２〜１．４７２の石灰化物を含み、人工物のヒドロキシアパタイト及びβ―ＴＣＰを含まないヒト骨組織を再生するための基材の製造方法。
【請求項１４】
前記石灰化能を有する培養細胞はほ乳類細胞であることを特徴とする、請求項１３に記載の製造方法。
【請求項１５】
前記石灰化能を有する培養細胞はヒト細胞であることを特徴とする、請求項１４に記載の製造方法。
【請求項１６】
前記石灰化能を有する培養細胞は硬組織に由来することを特徴とする、請求項１３ないし１５のいずれか１つに記載の製造方法。
【請求項１７】
前記石灰化能を有する培養細胞は誘導性多分化能幹細胞に由来することを特徴とする、請求項１３ないし１５のいずれか１つに記載の製造方法。
【請求項１８】
前記石灰化能を有する培養細胞は間葉系幹細胞に由来することを特徴とする、請求項１３ないし１５のいずれか１つに記載の製造方法。
【請求項１９】
前記石灰化能を有する培養細胞は骨肉腫に由来することを特徴とする、請求項１３ないし１５のいずれか１つに記載の製造方法。
【請求項２０】
前記石灰化物を抽出するステップは前記石灰化物を高温で焼結することなく抽出されることを特徴とする、請求項１３ないし１９のいずれか１つに記載の製造方法。
【請求項２１】
前記石灰化物を抽出するステップは界面活性剤を用いて抽出されることを特徴とする、請求項２０に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨組織再生を目的とした基材及び人工骨用の石灰化物と、その製造方法及び利用方法とに関し、具体的には、培養細胞が産生する石灰化物と、その製造方法及び利用方法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
骨組織再生を目的とした基材は多種多様であるが、近年、骨伝導能だけでなく骨誘導能を備えた基材の開発が盛んである。しかし、もっともよく臨床応用されている基材のひとつであり、骨の主要無機質成分であるヒドロキシアパタイト（ＨＡｐ）から作られたセラミックス基材は、高温で焼結されているため高い剛性が得られているものの、生体内での吸収はほとんど期待できない。また、骨伝導能に関する促進的効果はしばしば報告されているが、生吸収性が劣るためか、皮下に埋植した際に石灰化を誘導するという報告はない。【０００３】
一方、リン酸カルシウム系セラミックスは、α−ＴＣＰやβ−ＴＣＰに代表されるように、生体内に埋植した際には破骨細胞によって比較的速やかに吸収される。さらに、近傍に骨芽細胞が存在していれば、分解されたカルシウム（Ｃａ）及びリン（Ｐ）は直ちに骨形成に利用される。しかし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで骨芽細胞や骨膜シートに添加しても、そこには破骨細胞が存在しないため石灰化を誘導することはできない。したがって、β−ＴＣＰは間接的な骨誘導能を持っていると評価することも可能である。【０００４】
発明者は、これまでヒト骨膜の採取方法及び培養方法を検討し、培養期間を短縮するための技術を開発した（特許文献１）。しかしかかる培養骨膜自体の石灰化能も、ＨＡｐ、α−ＴＣＰ、β−ＴＣＰ等の人工物によっては促進されなかった。【０００５】
ＨＡｐ、α−ＴＣＰ、β−ＴＣＰ等の人工物と異なり、細胞はある一定の結晶の配向や析出物の形状の石灰化物を産生することができる。例えば、ウニの幼生の骨片は種ごとに特徴的な微細構造を有するが、これはウニの初期胚の特定の細胞系譜に属する数十個の細胞からなるシンシチウムによって形成されることが知られている（非特許文献１）。そこで、ヒトをはじめとするほ乳類でも、骨芽細胞が産生する石灰化物は、既存の硬組織に取り込まれ易く、また、破骨細胞によって分解されたり、骨芽細胞によって再利用されるのに適した微細構造を有すると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第ＷＯ／２００９／０２５３７４号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｏｋａｚａｋｉ，  Ｋ．  ａｎｄ  Ｉｎｏｕｅ，  Ｓ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒ．，  １８：４１３（１９７６）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
細胞が産生する石灰化物を用いて、より高く直接的な骨誘導能を有する基材を開発する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、石灰化能を有する培養細胞から抽出された石灰化物を含む、骨組織再生用基材を提供する。【００１０】
本発明の骨組織再生用基材において、前記石灰化能を有する培養細胞はほ乳類細胞の場合がある。【００１１】
本発明の骨組織再生用基材において、前記石灰化能を有する培養細胞はヒト細胞の場合がある。【００１２】
本発明の骨組織再生用基材において、前記石灰化能を有する培養細胞は硬組織に由来する場合がある。【００１３】
本発明の骨組織再生用基材において、前記石灰化能を有する培養細胞は誘導性多分化能幹細胞に由来する場合がある。【００１４】
本発明の骨組織再生用基材において、前記石灰化能を有する培養細胞は間葉系幹細胞に由来する場合がある。【００１５】
本発明の骨組織再生用基材において、前記石灰化能を有する培養細胞は骨肉腫に由来する場合がある。【００１６】
本発明の骨組織再生用基材において、前記石灰化物は高温で焼結することなく抽出される場合がある。【００１７】
本発明の骨組織再生用基材において、前記石灰化物は界面活性剤を用いて抽出される場合がある。【００１８】
本発明は、本発明の骨組織再生用基材を含む人工骨を提供する。【００１９】
本発明は、本発明の骨組織再生用基材を添加するステップを含む、硬組織細胞の石灰化能を亢進する方法を提供する。【００２０】
本発明は、本発明の骨組織再生用基材と、石灰化能を有する細胞とを含む骨充填材を提供する。【００２１】
本発明は、石灰化能を有する培養細胞から石灰化物を抽出するステップを含む、前記石灰化物を含む骨組織再生用基材の製造方法を提供する。【００２２】
本発明の骨組織再生用基材の製造方法において、前記石灰化能を有する培養細胞はほ乳類細胞の場合がある。【００２３】
本発明の骨組織再生用基材の製造方法において、前記石灰化能を有する培養細胞はヒト細胞の場合がある。【００２４】
本発明の骨組織再生用基材の製造方法において、前記石灰化能を有する培養細胞は硬組織に由来する場合がある。【００２５】
本発明の骨組織再生用基材の製造方法において、前記石灰化能を有する培養細胞は誘導性多分化能幹細胞に由来する場合がある。【００２６】
本発明の骨組織再生用基材の製造方法において、前記石灰化能を有する培養細胞は間葉系幹細胞に由来する場合がある。【００２７】
本発明の骨組織再生用基材の製造方法において、前記石灰化能を有する培養細胞は骨肉腫に由来する場合がある。【００２８】
本発明の骨組織再生用基材の製造方法において、前記石灰化物を抽出するステップは前記石灰化物を高温で焼結することなく抽出される場合がある。【００２９】
本発明の骨組織再生用基材の製造方法において、前記石灰化物を抽出するステップは前記石灰化物を界面活性剤を用いて抽出される場合がある。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１Ａ】培養ディッシュ上で５日間培養されたＵＭＲ−１０６細胞中の石灰化物についてアリザリン赤染色後の光学顕微鏡写真。
【図１Ｂ】分化誘導培地に切り替えてから培養ディッシュ上で５日間培養されたＵＭＲ−１０６細胞中の石灰化物について走査電子顕微鏡写真。
【図２Ａ】分化誘導培地に切り替えてから培養ディッシュ上で５日間培養されたＵＭＲ−１０６細胞から抽出された石灰化物の低倍率走査電子顕微鏡写真。
【図２Ｂ】分化誘導培地に切り替えてから培養ディッシュ上で２４日培養されたヒト骨膜培養細胞から抽出された石灰化物の高低倍率走査電子顕微鏡写真。
【図２Ｃ】培養ディッシュ上で５日間培養されたＵＭＲ−１０６細胞から抽出された石灰化物の高倍率走査電子顕微鏡写真。
【図２Ｄ】分化誘導培地に切り替えてから培養ディッシュ上で２４日培養されたヒト骨膜培養細胞から抽出された石灰化物の高倍率走査電子顕微鏡写真。
【図３Ａ】ＵＭＲ−１０６細胞から抽出された石灰化物標品及びＨＡｐのフーリエ変換赤外分光スペクトル波形図。
【図３Ｂ】ＵＭＲ−１０６細胞から抽出された石灰化物標品及びβ−ＴＣＰのフーリエ変換赤外分光スペクトル波形図。
【図４】ＵＭＲ−１０６細胞及びヒト骨膜培養細胞から抽出された石灰化物標品と、ＨＡｐ及びβ−ＴＣＰとのＸ線回折分析結果図。
【図５Ａ】ＵＭＲ−１０６細胞由来石灰化物標品を前記未分化ヒト培養骨膜シートに添加して８日目に固定して作成された組織標本にＨＥ染色を施した光学顕微鏡写真。
【図５Ｂ】ＵＭＲ−１０６細胞由来石灰化物標品を前記未分化ヒト培養骨膜シートに添加して８日目に固定して作成された組織標本にｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色を施した光学顕微鏡写真。
【図６Ａ】分化誘導骨膜シートにＵＭＲ−１０６細胞由来石灰化物標品を添加して８日間培養後に固定して作成された組織標本にＨＥ染色を施した光学顕微鏡写真。
【図６Ｂ】分化誘導骨膜シートにＵＭＲ−１０６細胞由来石灰化物標品を添加して８日間培養後に固定して作成された組織標本にｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色を施した光学顕微鏡写真。
【図７Ａ】分化誘導骨膜シートに粉砕されたβ−ＴＣＰ顆粒を添加して８日間培養後に固定して作成された組織標本にＨＥ染色を施した光学顕微鏡写真。
【図７Ｂ】分化誘導骨膜シートに粉砕されたβ−ＴＣＰ顆粒を添加して８日間培養後に固定して作成された組織標本にｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色を施した光学顕微鏡写真。
【図８】分化誘導骨膜シートにＵＭＲ−１０６細胞由来石灰化物標品を添加して培養した後で背部両側皮下に埋稙されたヌードマウスを１週間後にμＣＴを用いて測定した結果得られた断層画像。
【図９Ａ】分化誘導骨膜シートにＵＭＲ−１０６細胞由来石灰化物標品を添加し、さらに８日間培養した後で、ヌードマウスの背部皮下に埋稙し、４週間後に埋稙組織を摘出し固定して作成された組織標本にＨＥ染色を施した光学顕微鏡写真。
【図９Ｂ】分化誘導骨膜シートにＵＭＲ−１０６細胞由来石灰化物標品を添加し、さらに８日間培養した後で、ヌードマウスの背部皮下に埋稙し、４週間後に埋稙組織を摘出し固定して作成された組織標本にｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色を施した光学顕微鏡写真。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明において石灰化物とは、骨及び歯を含む硬組織で産生されるリン酸カルシウムを主成分とする物質をいう。石灰化能とは前記石灰化物を産生する能力をいう。
【００３２】
本明細書において用いるところの石灰化能を有する細胞とは、骨芽細胞又は造骨細胞、象牙芽細胞、エナメル芽細胞、セメント芽細胞を含むがこれらに限定されない生体内の硬組織細胞を含む。本発明の石灰化能を有する培養細胞は、前記生体内の硬組織細胞と共通の細胞系譜に属する細胞か、異形成又は分化転換により前記生体内の硬組織細胞に特異的な遺伝子を発現するようになった細胞かに由来して、培養条件下で増殖可能な細胞をいう。
【００３３】
本発明の石灰化能を有する培養細胞は、培養条件下で構成的に石灰化能を有する必要はなく、増殖培地で培養するときには石灰化能が弱いか又は全く示さないが、分化誘導培地で培養するときには石灰化能が検出できる細胞を含む。ここで分化誘導培地での培養には、本明細書の実施例に示すような１段階の分化誘導だけでなく、２段階または３段階以上の分化誘導を行う場合を含む。
【００３４】
２段階の分化誘導の例としては、間葉系幹細胞のように硬組織以外の細胞タイプ、例えば、筋肉、軟骨等にも分化することのできる細胞から、石灰化能を有する細胞に分化することのできる細胞へと分化誘導したうえで、石灰化物を産生するように分化誘導する場合がある。
【００３５】
また、３段階以上の分化誘導の例としては、間葉系以外の細胞タイプ、例えば、神経、感覚器、表皮、消化管上皮、血球、内分泌腺、外分泌腺、生殖細胞等の生体を構成する多数の細胞タイプに分化することのできる、誘導多分化能幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、成体幹細胞等の多分化能細胞から、間葉系幹細胞にのみ分化することができる細胞へと分化誘導する段階がさらに付加される場合がある。
【００３６】
なお、間葉系以外の細胞タイプにも分化することができる前記多分化能細胞から、一足飛びに石灰化能を有する細胞に分化することのできる細胞へと分化誘導させる場合も、本発明の分化誘導培地での培養に含まれる。
【００３７】
さらに、本発明の石灰化能を有する培養細胞には、生体内の正常細胞だけでなく、骨肉腫を含むがこれに限定されない、硬組織と関連のある良性又は悪性腫瘍細胞か癌細胞かに由来して、培養条件下で増殖可能な細胞も含まれる。
【００３８】
本明細書において分化誘導のための条件とは、デキサメタゾン、β−グリセロリン酸、アスコルビン酸、レチノイン酸、５−アザシチジン、バルプロ酸等のような低分子化合物の添加又は細胞内への送達の他、塩基性繊維芽細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子ベータ等のようなサイトカインと、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、ＭｙｏＤ等のような転写因子と、これらの受容体その他これらと特異的に会合するタンパク質又はペプチドとを含むタンパク質タンパク質又はペプチドの添加又は細胞内への送達と、これらのタンパク質タンパク質又はペプチドをエンコードする遺伝子の発現を調節することができるポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド等の核酸の添加又は細胞内への送達と、これらの核酸を含むウイルス、プラスミド等のベクターの添加又は細胞内への送達と、２次元又は３次元の細胞の足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）又はアーキテクチャーの使用と、振盪培養、旋回培養又はビーズ状の基質の使用とを含むが、これらに限定されない。
【００３９】
本発明の石灰化物を抽出することは、細胞が産生した石灰化物から培地及び細胞由来の有機物質を除去することをいう。石灰化物の抽出には、加熱により水分を蒸発させたり、微生物やウイルスを失活させる手順が含まれる場合がある。石灰化物の抽出には、高温で焼結しないことが好ましい。ここで高温で焼結するとは、細胞が産生した石灰化物の炭酸カルシウムの結晶構造又は結晶の配向に影響が生じるいずれかの温度をいう。
【００４０】
本発明の石灰化物を抽出することは、ＳＤＳその他の界面活性剤に曝露して該石灰化物に付着又は会合するタンパク質その他の生体分子を溶解させて洗浄することを含む。
【実施例１】
【００４１】
以下に本発明の実施例によって、本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら制限されるものではない。【００４２】
１．材料及び方法
（１）細胞培養と石灰化物抽出
ラット骨肉腫由来骨芽細胞様ＵＭＲ−１０６細胞（Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ，  Ｎ．Ｃ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４３：４３０８（１９８３））は６０ｍｍ径培養ディッシュに播種され、４．５ｇ／Ｌグルコース及び１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭ培地を用い、ＣＯ２インキュベータ中で培養された。細胞がコンフルエントに達してからは、骨芽細胞分化誘導用サプリメントＫＥ−２００（ＤＳ  Ｐｈａｒｍａ，  Ｏｓａｋａ）を３％培養液に添加した分化誘導培地に培地が切り替えられた。なお、前記サプリメント中には、デキサメタゾン、β−グリセロリン酸及びアスコルビン酸が主要成分として含まれている。細胞のグルコース消費が旺盛なため、培地交換は毎日実施された。【００４３】
以下におけるヒト骨膜培養細胞を使用する試験に関しては、新潟大学歯学部倫理審査委員会にて審査され、承認を受けている実験計画に従った。ヒト骨膜はボランティアの同意を得たうえで採取され、１０％ウシ胎児血清を添加したＭｅｄｉｕｍ１９９（以下、「通常培地」という。）で培養された。培地交換は、最初は培養開始から４−５日目で行い、その後は約３日ごとに行った。ヒト骨膜細胞は、１００ｍｍ径培養ディッシュでコンフルエントに達するとトリプシン分散により新しいディッシュに継代された。３代継代後１００ｍｍ径培養ディッシュでコンフルエント状態に達した細胞は、常法に従って、アンプル１本あたり約５×１０５個ずつ分注して凍結保存された。【００４４】
石灰化物標品抽出の際には、前記アンプル１本から解凍されたヒト骨膜細胞を１００ｍｍ径培養ディッシュ１枚に播種して、４−５日間通常培地で培養され、前記骨膜片から多孔質膜メッシュ上に細胞が遊走して骨膜シートとなった後、前記通常培地にＫＥ−２００を添加した分化誘導培地に切り替えて培養を続けた。【００４５】
ラットＵＭＲ−１０６細胞では、増殖培地で２日間培養し、分化誘導培地に切り替えてから３−５日間培養した後、細胞が回収された。ヒト骨膜培養細胞では、増殖培地で４−５日間培養し、分化誘導培地に切り替えてから２３−２４日間培養した後、細胞が回収された。回収された細胞はＬａｅｍｍｌｉ（Ｎａｔｕｒｅ，２２７：６８０−５（１９７０））によるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法のサンプルバッファーで溶解され、１．５ｍＬのサンプルチューブに移され、９８°Ｃで１０分間煮沸処理された。煮沸処理後残った不溶性残渣は、遠心（２０００ｒｐｍ、１０分間）と、超純水中でのボルテックス・ミキサーによる攪拌とを３回繰り返して洗浄された。さらに、前記超純水を７０％エタノールに切り替えて、遠心と超音波処理とを３回繰り返して洗浄された。最終的には、少量の７０％エタノールに懸濁された前記不溶性残渣は９８°Ｃヒートブロックに２０−３０分戴置され、溶媒を蒸発させて、培養細胞由来の石灰化物標品が調製された。前記石灰化物標品は実験に供するまでデシケータ中で室温保存された。培養骨膜に添加する直前に、１個の骨膜片の培養あたり約１０μｇの前記石灰化物標品が、ＤＭＥＭ培地中に溶解された０．２％アテロコラーゲン（ＫＯＫＥＮＣＥＬＬＧＥＮ、高研、東京）の２０μＬに懸濁された。【００４６】
（２）光顕および走査電顕による観察
培養中の石灰化物の状態を観察する目的で、ＵＭＲ−１０６細胞が固定され、アリザリン赤染色により石灰化物の産生レベルが確認された。さらに、固定した細胞は臨界点乾燥に供され、走査電顕による観察が行われた。一方、前記石灰化物標品についても、その微細形態が走査電顕により観察された。【００４７】
（３）Ｘ線マイクロアナライザ分析
Ｘ線マイクロアナライザ分析によるサンプルの成分元素の定量解析は、マイクロアナライザ用試料台に貼り付けた導電性カーボン両面テープにサンプルを付着させ、これをカーボン蒸着し、電子線マイクロアナライザ（ＥＰＭＡ−８７０５、島津製作所）を用いる定性分析およびスタンダードレス定量分析によって実施された。加速電圧は１５ｋＶ、試料電流は０．１μＡで、測定領域は直径約１００μｍの範囲とされた。測定結果は、リンに対するカルシウムのモル比（Ｃａ／Ｐ）で表された。
【００４８】
（４）フーリエ変換赤外分光分析
サンプルのフーリエ変換赤外分光分析は、フーリエ変換赤外分光光度計としてSpectrum One（パーキンエルマージャパン）を用いて、常法に従ってＫＢｒ錠剤法で実施された。【００４９】
（５）Ｘ線回折分析
サンプルのＸ線回折分析は、Ｘ線回折装置としてminiFlexII（リガク）を用いて、常法に従って粉末法で実施された。【００５０】
（６）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験
ヒト骨膜はボランティアの同意を得たうえで採取され、多孔質膜メッシュ（ＶＥＣＥＬＬ、旭硝子）上に２ｍｍ  ｘ  ２ｍｍに切り出された骨膜片が静置され、通常培地で培養された。培地交換は、最初は培養開始から４−５日目で行い、その後は約３日ごとに行った。１３−１５日間通常培地で培養されて、前記骨膜片から多孔質膜メッシュ上に細胞が遊走して骨膜シートとなった後、分化誘導条件に移行する場合にはＫＥ−２００を添加した分化誘導培地に切り替えて培養を続けた。前記骨膜シートは、分化誘導条件に移行しない場合には、そのまま通常培地で培養を続けた。分化誘導培地又は通常培地でさらに７−１０日間培養された後、１個の骨膜シートの培養あたり約１０μｇの前記石灰化物標品が２０μＬの０．２％アテロコラーゲン液に懸濁され、培養骨膜シートのうち最初に切り出されて前記多孔質膜メッシュ上に静置された骨膜片の中央部分に戴置されるように添加された。β−ＴＣＰ顆粒は、前記石灰化物標品と肉眼的に同等の大きさにするために、マイクロスパーテルで粉砕してから、前記石灰化物標品と同様にアテロコラーゲン液に懸濁して培養骨膜に添加された。前記石灰化物標品又はβ−ＴＣＰ顆粒が添加された後さらに８−９日前記多孔質膜メッシュ上で培養された培養骨膜シートが、直接組織学的検討に供されるか、ｉｎ  ｖｉｖｏ埋植実験に供された。【００５１】
（７）ｉｎ  ｖｉｖｏ埋植実験
前記培養骨膜シートは、ＰＢＳ（−）で３回リンスした後、５ｍｍ  ｘ  ５ｍｍ程度の骨膜シート断片に切り出して埋植に供された。ヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕ／ｎｕ、雄、１５−１８ｇ）の背部皮膚がイソジン及び消毒用エタノールで清拭され、７−１０ｍｍ切開され、前記骨膜シート断片が皮下に埋植された。なお、本実験計画は新潟大学動物実験倫理審査委員会にて審査され、承認されたものである。【００５２】
（８）組織学的検討
培養骨膜シートは前記多孔質膜メッシュ上で培養された状態のまま、アルコールの脱水シリーズとキシレンとで処理され、パラフィン包埋された。埋植した骨膜シートは周辺組織とともに摘出され、同様にパラフィン包埋された。薄切された組織標本は、ＨＥ染色のほか、ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色とＴＲＡＰ（酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ）染色とに供された。【００５３】
２．結果
（１）培養細胞由来石灰化物の光顕および走査電顕による観察
ＵＭＲ−１０６細胞は、培養日数に応じて分化誘導サプリメントの添加がなくとも石灰化物を形成する。しかし、骨芽細胞分化誘導用サプリメントの添加によって、より旺盛に石灰化物を形成するようになった。図１は、分化誘導培地に切り替えてから培養ディッシュ上で５日間培養されたＵＭＲ−１０６細胞中の石灰化物についてアリザリン赤染色後の光学顕微鏡写真（図１Ａ）と、走査電子顕微鏡写真（図１Ｂ）とを示す。図１Ａ及びＢのスケールバーはともに１００μｍを表す。【００５４】
図２Ａ及びＢは、分化誘導培地に切り替えてから前記培養ディッシュ上で５日間培養されたＵＭＲ−１０６細胞と、分化誘導培地に切り替えてから培養ディッシュ上で２４日培養されたヒト骨膜培養細胞とから抽出された石灰化物のそれぞれ低倍率走査電子顕微鏡写真を示す。図２Ａのスケールバーは３０μｍを表す。図２Ｃ及びＤはそれぞれ図２Ａ及びＢと同じサンプルの高倍率走査電子顕微鏡写真を示す。図２に示すとおり、前記ＵＭＲ−１０６細胞及びヒト骨膜培養細胞から抽出された石灰化物の微細構造は、ともに直径１−２μｍ程度の顆粒状石灰化物の集合体を構成単位として、直径５−１０μｍのマイクロポア状の構造を形成する点で共通する。このマイクロポア状構造は市販のＡｐａｃｅｒａｍ製のＨＡｐ顆粒の微細構造に類似している。【００５５】
（２）Ｘ線マイクロアナライザ分析
ＵＭＲ−１０６細胞から抽出された石灰化物標品の量は１００ｍｍ径培養ディッシュ１枚あたり約１５ｍｇで、ヒト骨膜培養細胞から抽出された石灰化物標品の量は、１００ｍｍ径培養ディッシュ１枚あたり約３ｍｇであった。なお、マウス（ＩＣＲ、６週齢、オス）の大腿骨１本から抽出された石灰化物標品の量は約７ｍｇであった。ＵＭＲ−１０６細胞及びヒト骨膜培養細胞から抽出された石灰化物標品のＣａ／Ｐ比の測定値は、それぞれ、１．４７２及び１．４５２であった。比較のために、ＨＡｐ（ＨＯＹＡ株式会社製、Ａｐａｃｅｒａｍ）及びβ−ＴＣＰ（オリンパス光学工業株式会社製、ＯＳｆｅｒｉｏｎ）のＣａ／Ｐ比の測定値は、それぞれ、１．８３２及び１．６８１であった。ＨＡｐ及びβ−ＴＣＰのＣａ／Ｐ比の理論値は、それぞれ、１．６７及び１．５０であるから、今回の測定値は理論値よりやや高い数値であった。培養細胞から抽出された石灰化物標品はＨＡｐ及びβ−ＴＣＰよりもＣａ／Ｐ比が低かった。【００５６】
（３）フーリエ変換赤外分光分析
図３は、ＵＭＲ−１０６細胞から抽出された石灰化物標品、ＨＡｐ及びβ−ＴＣＰのフーリエ変換赤外分光スペクトル波形図である。図３Ａでは前記石灰化物標品及びＨＡｐのスペクトル波形が重ね合わせられ、図３Ｂでは前記石灰化物標品及びβ−ＴＣＰのスペクトル波形が重ね合わせられる。図３Ａ及びＢから、前記石灰化物標品は、β−ＴＣＰよりＨＡｐに近い組成であることが推測された。【００５７】
（４）Ｘ線回折分析
図４は、ＵＭＲ−１０６細胞及びヒト骨膜培養細胞から抽出された石灰化物標品と、ＨＡｐ及びβ−ＴＣＰとのＸ線回折分析結果図である。グラフは上からβ−ＴＣＰ、ＨＡｐ（HA）、ＵＭＲ−１０６細胞石灰化物標品（rat UMR106）及びヒト骨膜培養細胞石灰化物標品（human perios）の回折曲線を表す。ＵＭＲ−１０６細胞及びヒト骨膜培養細胞の石灰化物標品はともに非晶質ではあるが、最大ピークの角度から、β−ＴＣＰよりＨＡｐに近いと考えられる。これは前記フーリエ変換赤外分光分析の結果とも矛盾しない。そして、前記Ｘ線マイクロアナライザ分析の結果と合わせると、カルシウム欠損型のＨＡｐではないかと推測される。【００５８】
（５）培養骨膜シート
ヒト培養骨膜シートは、通常の６週間培養では、骨芽細胞分化誘導サプリメントの添加によってはじめて石灰化が可能である。すなわち、このような分化誘導に頼らない自発的石灰化は期待できない。本実施例においては、通常のプラスチックディッシュの代わりに多孔質膜メッシュ膜上で培養を行なったが、通常培地だけで培養された場合には石灰化は認められなかった（図示されない）。以下、通常培地だけで培養された骨膜シートを「未分化骨膜シート」といい、途中から分化誘導培地で培養された骨膜シートを「分化誘導骨膜シート」という。【００５９】
未分化骨膜シート及び分化誘導骨膜シートの両方に、それぞれ前記ＵＭＲ−１０６細胞由来石灰化物標品か、前記粉砕されたβ−ＴＣＰ顆粒かが添加された。図５Ａ及びＢは、それぞれ、前記ＵＭＲ−１０６細胞由来石灰化物標品を前記未分化ヒト培養骨膜シートに添加して８日目に固定して作成された組織標本にＨＥ染色（図５Ａ）及びｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色（図５Ｂ）を施した光学顕微鏡写真である。図５Ａ及びＢに示すとおり、前記未分化骨膜シートに添加された前記ＵＭＲ−１０６細胞由来石灰化物標品は、顆粒状の原型を留めた状態で、多層化した骨膜シートの表面下に埋め込まれていた。前記粉砕されたβ−ＴＣＰ顆粒が前記未分化骨膜シートに添加された場合でも、同様に、β−ＴＣＰ顆粒は顆粒状の原型を留めた状態で多層化した骨膜シートの表面下に埋め込まれていた（図示されない）。【００６０】
図６Ａ及びＢは、前記分化誘導骨膜シートに前記ＵＭＲ−１０６細胞由来石灰化物標品を添加して８日間培養後に固定して作成された組織標本にＨＥ染色（図６Ａ）又はｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色（図６Ｂ）を施した光学顕微鏡写真である。図７Ａ及びＢは、前記分化誘導骨膜シートに粉砕されたβ−ＴＣＰ顆粒を添加して８日間培養後に固定して作成された組織標本にＨＥ染色（図７Ａ）又はｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色（図７Ｂ）を施した光学顕微鏡写真である。図６Ａ及びＢに示すとおり、分化誘導骨膜シートに前記ＵＭＲ−１０６細胞由来石灰化物標品を添加した場合には、前記ＵＭＲ−１０６細胞由来石灰化物標品が原型を留めた状態と考えられる顆粒状のｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色陽性の石灰化物は認められなかったが、ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色陽性の粉状の石灰化物は前記分化誘導骨膜シートに広範に分布していた。また前記分化誘導骨膜シートの一部には、ｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色強陽性の石灰化物が塊状に認められた。これに対し、図７Ａ及びＢに示すとおり、分化誘導骨膜シートに前記粉砕されたβ−ＴＣＰ顆粒を添加した場合には、該β−ＴＣＰ顆粒が原型を留めた状態と考えられる顆粒状のｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色陽性の石灰化物が認められた。【００６１】
前記分化誘導骨膜シートに前記ＵＭＲ−１０６細胞由来石灰化物標品を添加して培養した場合のｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色陽性の石灰化物の量は、前記ＵＭＲ−１０６細胞由来石灰化物標品を添加しないで培養した場合に比べて明らかに多かった。そこで、添加された前記ＵＭＲ−１０６細胞由来石灰化物標品は分解され、粉状又は塊状の石灰化物が新たに形成されたものと解釈できる。【００６２】
（６）ヌードマウス背部皮下への埋植実験
図８は、前記分化誘導骨膜シートに前記ＵＭＲ−１０６細胞由来石灰化物標品を添加して培養した後で背部両側皮下に埋稙されたヌードマウスを１週間後にμＣＴを用いて測定した結果得られた断層画像である。図８の灰色の部分はマウスの腹部の断面を表し、中央の白い構造は椎骨、その右側の白い帯状の構造は前記ＵＭＲ−１０６細胞由来石灰化物標品を添加して培養された分化誘導骨膜シートの埋稙物で、前記椎骨の左側の白い帯状の構造は前記ＵＭＲ−１０６細胞由来石灰化物標品を添加して培養された未分化骨膜シートの埋稙物である。図８に示すとおり、椎骨の右側に位置する、前記ＵＭＲ−１０６細胞由来石灰化物標品を添加して培養された分化誘導骨膜シートの埋稙物は、埋稙から１週間で明りょうなＸ線吸収像を示し、石灰化の程度が高いことを示唆した。これに対し、椎骨の左側に位置する、前記ＵＭＲ−１０６細胞由来石灰化物標品を添加して培養された未分化骨膜シートの埋稙物は石灰化の程度が低かった。【００６３】
図９Ａ及びＢは、分化誘導骨膜シートに前記ＵＭＲ−１０６細胞由来石灰化物標品を添加し、さらに８日間培養した後で、ヌードマウスの背部皮下に埋稙し、４週間後に埋稙組織を摘出し固定して作成された組織標本にＨＥ染色（Ａ）又はｖｏｎ  Ｋｏｓｓａ染色（Ｂ）を施した光学顕微鏡写真である。図７Ａに示すとおり、埋植期間を４週間に延ばすと、添加されたＵＭＲ−１０６細胞由来の石灰化物標品は、骨膜シートの中心部（すなわち、最初に切り出されて前記多孔質膜メッシュ上に静置された骨膜片に相当する部分）では原型を留めないで分解されて、新たな石灰化組織として形成されていた。図７Ｂに示すとおり破骨細胞の出現も増加していることから、いったん破骨細胞により吸収され、それが骨芽細胞の作用によって再石灰化したものと推定される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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