(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
検体中の電荷物質を回収する方法であって、
平均粒径が１〜１０００ｎｍである、上限臨界溶液温度を有する温度応答性ポリマーで表面修飾された磁性微粒子と、電荷物質に対する親和性物質とが結合した吸着剤と、電荷物質を含む検体とを混合し、吸着剤に電荷物質を吸着させ、さらに数平均分子量が２００〜２５，０００の範囲のポリアルキレングリコールと混合する工程、
前記工程で得られた混合物を上限臨界溶液温度未満にし、吸着剤を凝集させる工程、及び、
磁力により吸着剤を回収する工程、
を含み、
前記上限臨界溶液温度を有する温度応答性ポリマーが、アクリロイルグリシンアミド、メタクリロイルグリシンアミド、アクリロイルアスパラギンアミド、メタクリロイルアスパラギンアミド、アクリロイルグルタミンアミド及びメタクリロイルグルタミンアミドからなる群から選ばれる少なくとも１種類のモノマーを重合して得られるポリマーである、
検体中の電荷物質を回収する方法。
【請求項２】
前記上限臨界溶液温度を有する温度応答性ポリマーが、少なくとも２種類のモノマーを共重合して得られるコポリマーである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記上限臨界溶液温度を有する温度応答性ポリマーが、アクリロイルグリシンアミドとアクリロイルアスパラギンアミドとを共重合して得られるコポリマーである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールポリプロピレングリコールランダムコポリマー及びポリエチレングリコールポリプロピレングリコールブロックコポリマーからなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコールである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記電荷物質が、核酸である、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記核酸が、ＤＮＡ又はｍＲＮＡである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
上限臨界溶液温度を有する温度応答性ポリマーで表面修飾された磁性微粒子と、電荷物質に対する親和性物質とが結合した吸着剤と、数平均分子量が２００〜２５，０００の範囲のポリアルキレングリコールを含み、
前記上限臨界溶液温度を有する温度応答性ポリマーが、アクリロイルグリシンアミド、メタクリロイルグリシンアミド、アクリロイルアスパラギンアミド、メタクリロイルアスパラギンアミド、アクリロイルグルタミンアミド及びメタクリロイルグルタミンアミドからなる群から選ばれる少なくとも１種類のモノマーを重合して得られるポリマーである、
検体中の電荷物質を回収するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、上限臨界溶液温度を有する温度応答性ポリマーで表面修飾された磁性微粒子による電荷物質の回収方法及びこれを用いた電荷物質を回収するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸等の電荷物質を、上限臨界溶液温度を有する温度応答性ポリマーで表面修飾された磁性微粒子を用いて回収を行うと、電荷物質が存在することから、磁性微粒子の凝集が阻害される。したがって、回収するのに時間がかかり、回収率が低く、改良が望まれている（例えば、特許文献１参照）。
【０００３】
【特許文献１】国際公開WO2008/001868パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、核酸等の電荷物質を、上限臨界溶液温度を有する温度応答性ポリマーで表面修飾された磁性微粒子を用いて回収する場合において、回収する時間を短縮し、回収率を高める方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた。その結果、以下の構成を採用することにより、本発明の課題を解決することができることを見出し、この知見に基づいて本発明を完成させた。
【０００６】
本発明は以下の構成を有する。
［１］検体中の電荷物質を回収する方法であって、
上限臨界溶液温度を有する温度応答性ポリマーで表面修飾された磁性微粒子と、電荷物質に対する親和性物質とが結合した吸着剤と、電荷物質を含む検体とを混合し、吸着剤に電荷物質を吸着させ、さらにポリアルキレングリコールと混合する工程、
前記工程で得られた混合物を上限臨界溶液温度未満にし、吸着剤を凝集させる工程、及び、
磁力により吸着剤を回収する工程、
を含む、検体中の電荷物質を回収する方法。
［２］前記上限臨界溶液温度を有する温度応答性ポリマーが、アクリロイルグリシンアミド、メタクリロイルグリシンアミド、アクリロイルアスパラギンアミド、メタクリロイルアスパラギンアミド、アクリロイルグルタミンアミド及びメタクリロイルグルタミンアミドからなる群から選ばれる少なくとも１種類のモノマーを重合して得られるポリマーである、［１］に記載の方法。
［３］前記上限臨界溶液温度を有する温度応答性ポリマーが、少なくとも２種類のモノマーを共重合して得られるコポリマーである、［２］に記載の方法。
［４］前記上限臨界溶液温度を有する温度応答性ポリマーが、アクリロイルグリシンアミドとアクリロイルアスパラギンアミドとを共重合して得られるコポリマーである、［３］に記載の方法。
［５］前記ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールポリプロピレングリコールランダムコポリマー及びポリエチレングリコールポリプロピレングリコールブロックコポリマーからなる群から選ばれる少なくとも１種である、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］前記ポリアルキレングリコールが、ポリエチレングリコールである、［５］に記載の方法。
［７］前記電荷物質が、核酸である、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記核酸が、ＤＮＡ又はｍＲＮＡである、［７］に記載の方法。
［９］上限臨界溶液温度を有する温度応答性ポリマーで表面修飾された磁性微粒子と、電荷物質に対する親和性物質とが結合した吸着剤と、ポリアルキレングリコールを含む、検体中の電荷物質を回収するためのキット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の回収方法を用いることで、核酸等の電荷物質を、上限臨界溶液温度を有する温度応答性ポリマーで表面修飾された磁性微粒子を用いて回収する場合に、回収する時間を大幅に短縮することができ、また、回収率を高くすることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下、本発明について詳細に説明する。
１．電荷物質を回収する方法
本発明の方法は、検体中の電荷物質を回収する方法であって、上限臨界溶液温度を有する温度応答性ポリマーで表面修飾された磁性微粒子（以下、単に「温度応答性磁性微粒子」ということがある。）と電荷物質に対する親和性物質（以下、単に「リガンド」ということがある。）とが結合した吸着剤とを混合し、吸着剤に電荷物質を吸着させ、さらにポリアルキレングリコールと混合し、得られた混合物を温度応答性ポリマーが凝集する温度（上限臨界溶液温度）未満にすることにより、吸着剤を凝集させ、磁力により吸着剤を回収し、検体中の電荷物質を回収する方法である。
【０００９】
本発明の方法は、電荷物質を吸着させた吸着剤とポリアルキレングリコールとを混合する工程を含む。通常、電荷物質が存在すると、吸着剤の凝集が阻害されるが、吸着剤とポリアルキレングリコールとを混合することにより、吸着剤の凝集能が強化され、温度応答性ポリマーの上限臨界溶液温度が上昇することにより、電荷物質が存在しても吸着剤の凝集が可能又は容易となる。
【００１０】
２．温度応答性磁性微粒子
本発明に用いる温度応答性磁性微粒子は、磁性微粒子に上限臨界溶液温度を有する温度応答性ポリマーが表面修飾された粒子である。表面修飾とは、前記ポリマーが、磁性微粒子の表面に直接又は間接に化学的に固定されている状態や、磁性微粒子の表面に直接又は間接に絡まった状態も含む。ここで、間接とは、磁性微粒子と温度応答性ポリマーとが、他の物質を介していることをいう。温度応答性磁性微粒子の平均粒径は、１〜１０００ｎｍであることが好ましく、より好ましくは３〜２００ｎｍである。
【００１１】
２−１．上限臨界溶液温度を有する温度応答性ポリマー
温度応答性ポリマーとは、溶液中で温度変化により可逆的に凝集状態と溶解状態とに変化するポリマーをいう。温度応答性ポリマーとしては、下限臨界溶液温度（以下、「ＬＣＳＴ」ということがある。）を有する温度応答性ポリマーと、上限臨界溶液温度（以下、「ＵＣＳＴ」ということがある。）を有する温度応答性ポリマーとが知られているが、本発明には、上限臨界溶液温度を有する温度応答性ポリマーを用いる。
【００１２】
本発明に用いる上限臨界溶液温度を有する温度応答性ポリマーは特に限定されないが、分散状態では回収困難な磁性微粒子に前記温度応答性ポリマーを表面修飾することで、ＵＣＳＴ未満に温度を低下させることにより、回収可能な大きさの塊に温度応答性磁性微粒子を凝集させる能力を有していることが必要である。逆に、ＵＣＳＴ以上に温度を上昇させることにより、凝集した温度応答性磁性微粒子を分散させることができる。
【００１３】
上限臨界溶液温度を有する温度応答性ポリマーとしては、アクリロイルグリシンアミド、メタクリロイルグリシンアミド、アクリロイルアスパラギンアミド、メタクリロイルアスパラギンアミド、アクリロイルニペコタミド、アクリロイルグルタミンアミド、メタクリロイルグルタミンアミド等から選ばれるモノマーを単独で重合して得られるホモポリマー又は少なくとも２種類のモノマーを共重合して得られるコポリマーを挙げることができる。また、上記モノマーとアクリルアミド、アセチルアクリルアミド、ビオチノールアクリレート、Ｎ−ビオチニル−Ｎ′−メタクロイルトリメチレンアミド、アクリロイルザルコシンアミド、メタクリロイルザルコシンアミド及びアクリロイルメチルウラシル等から選ばれる少なくとも１種類のモノマーとを共重合して得られるコポリマーを挙げることができる。同コポリマー中、温度応答性ポリマーを構成するモノマー含量は、通常、コポリマーを構成する全モノマー含有量の９５ｍｏｌ％以上である。
【００１４】
上限臨界溶液温度を有する温度応答性ポリマーのうち、ホモポリマーとしては、例えば、ポリ（アクリロイルグリシンアミド）、ポリ（アクリロイルアスパラギンアミド）、又はポリ（アクリロイルグルタミンアミド）等が好ましく利用できる。また、コポリマーとしては、例えば、アクリロイルグリシンアミドとアクリロイルアスパラギンアミドとのコポリマー等が好ましく利用できる。
上限臨界溶液温度を有する温度応答性ポリマーのＵＣＳＴは、このポリマーを構成するモノマーの種類及びモノマー成分の比率により様々に変化させることができる。
【００１５】
本発明に好適に用いることができる温度応答性ポリマーの重合度は、通常５０〜１００００である。
【００１６】
温度応答性ポリマーは、例えば、上記モノマーを有機溶媒又は水に溶解し、不活性ガスで系中を置換した後、重合温度まで昇温し、有機溶媒中であればアゾビスイソブチロニトリル等のアゾ系開始剤、過酸化ベンゾイル等の過酸化物、水系であれば過硫酸アンモニウム、過硫酸カリウム、２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）等の重合開始剤を添加し、攪拌下加熱を続けることにより得ることができる。その後、貧溶媒中で再沈殿を行い、析出したポリマーをろ取することで、製造したポリマーを精製することができる。
【００１７】
２−２．磁性微粒子
磁性微粒子は、多価アルコールとマグネタイトとから製造することができる。例えば、特開２００５−０８２５３８号公報に、デキストランを用いた磁性微粒子の製造方法が開示されており、この方法によって製造することができる。
【００１８】
磁性微粒子は特に制限はないが、平均粒径が、０．９ｎｍ以上、１０００ｎｍ未満であることが好ましい。この範囲であれば、温度応答性ポリマーで表面修飾を行った後で良好な分散性を有する。さらに、目的物である電荷物質の認識性を高め、親和性物質との吸着速度を高めるためには、平均粒径が、２．９ｎｍ以上、２００ｎｍ未満であることが特に好ましい。また、特に、吸着剤の回収において、磁集速度を速めるためには、３０ｎｍ以上が好ましく、４０ｎｍ以上がより好ましい。
【００１９】
磁性微粒子の素材としては、例えば、マグネタイト、酸化ニッケル、フェライト、コバルト鉄酸化物、バリウムフェライト、炭素鋼、タングステン鋼、ＫＳ鋼、希土類コバルト磁石及びヘマタイト等の微粒子が挙げられる。
【００２０】
２−３．温度応答性ポリマーと磁性微粒子との結合
磁性微粒子を温度応答性ポリマーの表面に固定するためには、例えば、多価アルコール
（以下、多価アルコール誘導体を含めて、「多価アルコール等」という。）等を介して行うことができる。磁性微粒子と、多価アルコール等との結合体は、当技術分野における周知の方法によって調製することができる。例えば、米国特許第４４５２７７３号に記載されているように、デキストラン５０重量％水溶液（１０ｍｌ）中に、塩化第二鉄・六水和物（１．５１ｇ）及び塩化第一鉄・四水和物（０．６４ｇ）混合水溶液（１０ｍｌ）を加えて攪拌し、７．４（Ｖ／Ｖ）％アンモニア水溶液をｐＨ１０〜１１程度になるように滴下しながら、６０〜６５℃に水浴中で加熱し、１５分反応させる方法で得ることができる。
【００２１】
磁性微粒子において、磁性微粒子上の鉄イオンと、多価アルコール等の有する水酸基、カルボキシル、リン酸基等の基との結合により、磁性微粒子と多価アルコール等とが結合される。多価アルコール等の有する水酸基は、温度応答性ポリマーとの結合に利用されるだけでなく、電荷物質に対する親和性物質（リガンド）又はリガンドと結合した物質に対する親和性物質の有する反応性官能基との結合に利用され、更に磁性微粒子の水溶液中での分散性の向上に効果がある。そのため、本発明に用いる多価アルコールは、構成単位に水酸基を少なくとも２個有し、鉄イオンと結合可能なアルコール構造体であれば、特に制限なく使用することができる。例えば、デキストラン、ポリビニルアルコール、マンニトール、ソルビトール等が挙げられる。また、グリシジルメタクリレート重合体のようにエポキシを有し、開環後多価アルコール構造体を形成する化合物も使用できる。多価アルコール誘導体としては、修飾により、カルボキシル、アミノ、エポキシ、チオール、メタクリル又はアクリル等の反応性官能基や重合性基が導入された多価アルコールが使用できる。
【００２２】
温度応答性磁性微粒子は、磁性微粒子存在下で温度応答性ポリマーを反応性の官能基を介して結合する方法、又は磁性微粒子中の多価アルコール上の活性水素と、又は多価アルコールに重合性不飽和結合を導入し、磁性微粒子にグラフト重合する方法等の当技術分野で周知の方法で得ることができる（ＡＤＶ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，Ｖｏｌ．４、ｐ１１１、１９６５や、Ｊ．Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉ．，Ｐａｒｔ−Ａ，３，ｐ１０３１，１９６５に記載されている）。
【００２３】
３．検体
本発明の方法に用いられる検体とは、本発明の方法の検出対象物質である電荷物質を含有するものであれば特に限定されない。例えば、微生物や細胞の培養破砕懸濁液、遺伝子増幅装置（例えば、ＰＣＲ（Polymerase chain reaction）等）で増幅されたＤＮＡを含有する溶液等が挙げられる。
【００２４】
４．電荷物質
本発明の方法における検出対象物質である電荷物質としては、電荷を有する核酸、タンパク質等が挙げられ、好ましくは、核酸（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ）等である。
【００２５】
５．吸着剤
本発明の方法においては、電荷物質を回収するために、温度応答性磁性微粒子の表面又は温度応答性ポリマーに、電荷物質に対する親和性物質が結合されている吸着剤を用いる。例えば、電荷物質がｓｓＤＮＡの場合には、それの相補鎖となるアンチセンスＤＮＡが親和性物質であり、ｍＲＮＡの場合には、ｍＲＮＡのポリＡ配列と相補鎖となるオリゴｄＴが親和性物質である。アンチセンスＤＮＡやオリゴｄＴを温度応答性磁性微粒子の表面又は温度応答性ポリマーに固定することで、それらに対する特異的吸着作用を有するｓｓＤＮＡ又はｍＲＮＡを特異的に結合できる。電荷物質に対する親和性物質とは、上記に例示したような電荷物質と親和性を有する物質だけでなく、電荷物質に結合した他の物質と親和性を有する物質であってもよい。具体的には、ビオチン−アビジンの特異的な結合を
介して、親和性物質と温度応答性磁性微粒子とを結合することもできる。すなわち、ビオチン化した親和性物質を、ビオチンに対する親和性物質であるアビジンを介してビオチン化した温度応答性磁性微粒子と結合することができる。本発明では、市販されているアビジン化温度応答性磁性微粒子が利用でき、あるいはアビジン化、ビオチン化は、当技術分野で周知の方法に従えばよい。遺伝子増幅装置（例えば、ＰＣＲ等）で増幅されたＤＮＡの場合には、増幅の開始の起点となるプライマーにビオチンやヒスチジンタグ等のタグを結合させておき、ビオチンの親和性物質であるアビジンやヒスチジンタグの親和性物質であるイミノジ酢酸ニッケルを結合させた温度応答性磁性微粒子で回収する方法がある。
【００２６】
電荷物質がタンパク質の場合には、電荷物質に対する親和性物質として、ビオチン、アビジン、グルタチオン、レクチン及び抗体等を温度応答性磁性微粒子に表面修飾することで、それらに対する特異的吸着作用を有するタンパク質と特異的に結合できる。ビオチンの場合は、アビジンとの特異的な結合を介してビオチン化された検出対象のタンパク質と、またビオチン化された抗体を用いてそれらの抗原である種々のタンパク質と更に結合することが可能である。本発明では、市販されているアビジン、ビオチン化タンパク質が利用でき、ビオチン化は、当技術分野で周知の方法に従えばよい。グルタチオンの場合は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（以下、「ＧＳＴ」という。）を含有するタンパク質と特異的に結合できる。このようなＧＳＴ含有タンパク質の調製は当技術分野で周知の方法に従えばよい。
【００２７】
温度応答性ポリマーとリガンドとの結合の例として、温度応答性ポリマーと抗体の結合方法を示す。国際公開第０１／００９１４１号パンフレットに記載されているように、ビオチンを、メタクリルやアクリル等の重合性官能基と結合させて付加重合性モノマーとし、他のモノマーと共重合することにより温度応答性ポリマーにビオチンを結合させることができる。一方、リガンドとしての抗体にアビジンを結合させ、ビオチン結合温度応答性ポリマーと混合することにより、アビジンとビオチンの結合を利用して、温度応答性ポリマーに抗体を結合させることができる。なお、ビオチンの代わりにグルタチオンを用いた場合は、アビジンではなく、グルタチオンＳトランスフェラーゼを用いればよい。また、ポリマーの製造時にカルボキシル、アミノ又はエポキシ等の官能基を持つモノマーを他のモノマーと共重合させ、当技術分野で周知の方法に従い、この官能基を介して、抗体親和性物質（例えば、メロンゲル、プロテインＡ、プロテインＧ等）をポリマー上に結合させる方法も利用できる。このようにして得られた抗体親和性物質にリガンドとしての抗体を結合させることにより、温度応答性ポリマーに抗体を結合させることができる。
【００２８】
このようにして、リガンドと結合した温度応答性ポリマーを得ることができる。リガンドと結合した温度応答性ポリマーは、温度応答性ポリマーが凝集する条件にし、遠心分離、磁石での磁集等により、精製することができる。
【００２９】
６．ポリアルキレングリコール（凝集促進剤）
本発明の方法において、ポリアルキレングリコールは凝集促進剤として機能し、温度応答性磁性微粒子又は吸着剤の凝集を促進する。本発明の方法では、温度応答性磁性微粒子又は吸着剤の回収において、温度応答性磁性微粒子又は吸着剤の凝集促進剤としてポリアルキレングリコールを添加することで、ＵＣＳＴを有する温度応答性ポリマーの上限臨界溶液温度を変化（上昇）させることにより、温度応答性磁性微粒子又は吸着剤を回収する時間を短縮し、また、回収率を高めることができる。ポリアルキレングリコールとしては、本発明の効果を発揮するものであれば特に限定されないが、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコールポリプロピレングリコールランダムコポリマー、ポリエチレングリコールポリプロピレングリコールブロックコポリマー等が挙げられる。これらのポリアルキレングリコールを単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。なかでも、少量で温度応答性磁性微粒子を凝集させること
ができる点で、好ましくはポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールであり、より好ましくは、ポリエチレングリコールである。ポリエチレングリコールは、実験により最適な分子量を持つものを選んで使用することができ、例えば、約２００〜２５，０００の範囲の数平均分子量を持つもの、好ましくは約３，０００〜２０，０００、より好ましくは約６，０００〜１５，０００の範囲の数平均分子量を持つものが挙げられる。これらは、例えば、シグマ社、和光純薬社等から入手できる。
【００３０】
本発明の方法においては、温度応答性磁性微粒子又は吸着剤が所望の温度で容易に凝集する程度まで、温度応答性磁性微粒子又は吸着剤の分散液中にポリアルキレングリコールを添加すればよい。
【００３１】
例えば、ポリエチレングリコールによる温度応答性ポリマーのＵＣＳＴの上昇は、以下のとおりである。アクリロイルグリシンアミドであれば通常１〜１０℃であり、アクリロイルアスパラギンアミドであれば通常１〜１０℃である。
コポリマーのＵＣＳＴの変化は、コポリマーを構成するモノマーの種類及びモノマー成分の比率に応じて決定される。
【００３２】
ポリアルキレングリコールは、粉末のまま使用することもできるが、水溶液として用いることが好ましい。この場合、ポリアルキレングリコールの濃度は、好ましくは３０重量％以下である。この濃度範囲内であれば、粘度が高くなり過ぎることがなく、扱い易く、特に少量を分取する際にも問題が生じることがない。
【００３３】
ポリアルキレングリコールの添加量は、温度応答性磁性微粒子又は吸着剤の凝集を促進する効果を指標に当業者が適宜決定することができる。例えば、最終濃度として通常１０〜０．５重量％、好ましくは２〜０．５重量％とすることができる。また、温度応答性磁性微粒子又は吸着剤に使用される温度応答性ポリマーのＵＣＳＴの上昇として、通常１〜１０℃、好ましくは２〜５℃とすることができる。
【００３４】
例えば、４ｍｇ／ｍｌの温度応答性磁性微粒子又は吸着剤、及び０．５ｍｇ／ｍｌの電荷物質を含む溶液は、ポリエチレングリコール等のポリアルキレングリコール溶液を添加することで、温度応答性磁性微粒子又は吸着剤濃度４ｍｇ／ｍｌ、ポリエチレングリコール濃度１重量％の条件下、容易に凝集状態にすることができる。
【００３５】
一方、凝集させた吸着剤を再び分散させるには、溶液を上昇後のＵＣＳＴ以上の温度にするか、精製水等でポリアルキレングリコール濃度を希釈すればよい。
【００３６】
７．温度応答性磁性微粒子の製造方法
本発明の方法に用いる温度応答性磁性微粒子は、例えば、下記手順を有する１〜３のいずれかの製造方法を用いることで得ることができる。
【００３７】
７−１．温度応答性磁性微粒子の製造方法１
１）多価アルコール等を磁性微粒子の表面に固定するか、又は多価アルコール等の溶液中で磁性微粒子を調製する。
２）上限臨界溶液温度を有するポリマーが得られるモノマーと、前記多価アルコール等が固定された磁性微粒子とを混合し、ラジカル重合法で重合を行う。
３）重合未反応物を除去し、温度応答性磁性微粒子を分離する。
【００３８】
７−２．温度応答性磁性微粒子の製造方法２
１）多価アルコール等と、上限臨界溶液温度を有するポリマーが得られるモノマーとを混合し、ラジカル重合法でグラフト重合を行うか、又は上限臨界溶液温度を有するポリマー
上の官能基を介してグラフト重合法で結合を行う。
２）多価アルコール等を固定した温度応答性ポリマーの溶液中で磁性微粒子を調製する。３）多価アルコール等の未反応物を除去し、温度応答性磁性微粒子を分離する。
【００３９】
７−３．温度応答性磁性微粒子の製造方法３
１）多価アルコール等を磁性微粒子の表面に固定するか、又は多価アルコール等の溶液中で磁性微粒子を調製する。
２）温度応答性ポリマーの末端又はポリマーの側鎖に反応性の官能基を導入したポリマーを調製、精製する。
３）磁性微粒子表面に官能基を介して温度応答性ポリマーを結合する。
４）未結合の温度応答性ポリマーを除去し、温度応答性磁性微粒子を分離する。
【００４０】
８．吸着剤の製造方法
本発明の方法に用いる吸着剤は、温度応答性磁性微粒子にリガンドが固定された粒子である。温度応答性磁性微粒子へのリガンドの固定は、例えば、共有結合、水素結合、イオン結合又は疎水結合等から適切な結合手段を選択することによって行うことができる。また、温度応答性磁性微粒子とリガンドとの結合に、リガンドに対する親和性を有する他の物質を介させてもよい。例えば、ビオチン／アビジンの結合を介して温度応答性磁性微粒子とオリゴｄＴとを結合させることができる。この場合、温度応答性磁性微粒子−ビオチン／アビジン／ビオチン化されたオリゴｄＴの組み合わせが結合に介することになる。
【００４１】
９．温度応答性磁性微粒子又は吸着剤の回収方法
本発明においては、温度応答性磁性微粒子又は吸着剤を含む溶液を、温度応答性ポリマーのＵＣＳＴ未満の温度にして、温度応答性磁性微粒子又は吸着剤を回収する。
この場合、ＵＣＳＴと冷却温度の差が大きければ大きいほど回収速度（操作性）及び回収率がよい。凝集促進剤を添加するとＵＣＳＴが上昇するため、一定の冷却温度を設定する場合において、ＵＣＳＴと冷却温度の差が大きくなり、温度応答性ポリマーの凝集が促進され、温度応答性磁性微粒子又は吸着剤の回収速度及び回収率が向上する。なお、本発明の方法においては、ＵＣＳＴが、溶液が凍結する温度を上回らなければならないため、ＵＣＳＴが溶液の凝固点に近く、冷却温度を下げられない場合において、凝集促進剤を添加するとＵＣＳＴが上昇し、温度応答性微粒子の回収が可能となる。
【００４２】
溶液（凝集促進剤添加後）中の温度応答性磁性微粒子又は吸着剤の濃度は、検出対象物質（電荷物質）、温度応答性磁性微粒子の種類等によって異なるが、操作性等の点から、通常１〜４ｍｇ／ｍｌが好ましい。
【００４３】
温度応答性磁性微粒子又は吸着剤の回収に用いる磁石等の磁力は、用いる磁性微粒子の有する磁力の大きさによって異なる。磁力は、目的の磁性微粒子を磁集可能な程度の磁力を適宜使用できる。磁石の素材としては、例えば、上述した磁性微粒子の素材で構成されたものを使用することができる。例えば、マグナ社製ネオジ磁石等が利用できる。このように本発明では、磁石等の磁力によって、温度応答性磁性微粒子又は吸着剤を回収できるが、磁性微粒子の表面に温度応答性ポリマーが固定されていることで、分散状態では回収困難なナノサイズの磁性微粒子を意図的に凝集させて、回収率を高めることが可能になる。なお、本発明は、このような温度応答性磁性微粒子又は吸着剤を、溶液中で凝集促進剤濃度を変化させることにより凝集又は分散させることが可能である。したがって、短時間で、効率よく、核酸等の電荷物質を回収することが可能である。また、ＵＣＳＴが溶液の凝固点に近く、冷却温度を下げられない場合において、電荷物質の回収を可能にすることができる。
【００４４】
本発明の方法による電荷物質の回収方法の具体例を示す。
アビジン固定温度応答性磁性微粒子とビオチン化されたオリゴｄＴの複合物を用いて、ｍＲＮＡを濃縮する方法は下記のとおりである。
１）目的ｍＲＮＡを含有する細胞破砕懸濁液（検体）を調製する。
２）ビオチン化されたオリゴｄＴを温度応答性磁性微粒子に結合させる。
３）オリゴｄＴを結合した温度応答性磁性微粒子（吸着剤）とｍＲＮＡを含む細胞破砕懸濁液を混ぜて、ハイブリダイズさせ、ｍＲＮＡ／オリゴｄＴ−温度応答性磁性微粒子の結合体を生成させる。
４）前記混合液に凝集促進剤を加え、冷却後、攪拌もしくはピペッティングを行い、ｍＲＮＡ／オリゴｄＴ−温度応答性磁性微粒子／凝集促進剤の複合体を凝集させる。
５）磁気分離装置を用いて、凝集物を回収し、上澄をピペット等により注意深く除去する。
６）ｍＲＮＡはオリゴｄＴ−温度応答性磁性微粒子に結合したままでＲＴ−ＰＣＲを行ってもよいし、目的によっては、オリゴｄＴ−温度応答性磁性微粒子からｍＲＮＡを分離した後、ＲＴ−ＰＣＲを行ってもよい。ＲＴ−ＰＣＲ後にアガロース電気泳動にてｃＤＮＡのバンドを確認する。
【００４５】
本発明の検体中の電荷物質を回収するためのキットは、例えば、以下の試薬から構成される。
試薬Ａ：吸着剤（温度応答性磁性微粒子にリガンド又はリガンドに対する親和性物質が結合した粒子）の分散液
試薬Ｂ：凝集促進剤溶液
試薬Ｃ：希釈用バッファー（上記試薬Ａ及びＢの希釈、並びに検体の希釈に使用可能な緩衝液である。一例として、トリス塩酸緩衝液、リン酸緩衝液等が挙げられる。）
試薬Ｄ：検出対象物質（電荷物質）の標準品（一例として、精製したＤＮＡが挙げられる。）。
【実施例】
【００４６】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されることはない。また、実施例及び比較例中における物性の測定方法、用いた吸着剤（ストレプトアビジン固定化温度応答性磁性微粒子）の製造方法は以下の通りである。
【００４７】
［物性の測定方法１］ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)
アクリルアミド、ビスアクリルアミドから作られた１２．５重量％のポリアクリルアミドゲルを備えた電気泳動装置を用いて、２０ｍＡの電流で電気泳動を行った。なお、マーカーは、アトー社製タンパク質電気泳動用有色分子量マーカーを使用した。電気泳動を行った後、ポリアクリルアミドゲルを０．５重量％のクーマシーブリリアントブルー溶液に浸すことによって、該ゲル中のタンパク質の染色を行った。
【００４８】
［物性の測定方法２］温度応答性磁性微粒子の平均粒径の測定
大塚電子社製ＥＬＳ−８０００ＳＤ型「光散乱光度計」によって測定した。
測定数は、Ｎ＝１００である。
【００４９】
［物性の測定方法３］アガロース電気泳動
２重量％のアガロースから作られたゲルを備えたサブマリン電気泳動装置を用いて、１２５ｍＡの電流で電気泳動を行った。なお、マーカーはタカラバイオ社製ＤＮＡ電気泳動用分子量マーカーを使用した。電気泳動を行った後、アガロースゲルを０．０５重量％のエチジウムブロマイド溶液に浸すことによって、該ゲル中のＤＮＡの染色を行った。
【００５０】
［製造例１］磁性微粒子の調製
磁性微粒子（平均粒径４０ｎｍ）は、以下の方法で製造した。
１００ｍｌのフラスコに、塩化第二鉄・六水和物（１．０ｍｏｌ）及び塩化第一鉄・四水和物（０．５ｍｏｌ）混合水溶液を３ｍｌ、多価アルコールであるデキストラン（和光純薬社製、分子量３２０００〜４００００）の１０重量％水溶液６０ｍｌを入れ、メカニカルスターラーで攪拌し、この混合溶液を５０℃に昇温した後、これに２５重量％アンモニア水溶液５．０ｍｌを滴下し、１時間程度攪拌した。この操作で、デキストランが固定された、平均粒径が約４０ｎｍの磁性微粒子が得られた。
【００５１】
［製造例２］ビオチンモノマー〔Ｎ−ビオチニル−Ｎ′−メタクロイルトリメチレンアミド〕の調製
ビオチンモノマーは、以下の方法で製造した。
Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩１８ｇ、ビオチン２４ｇ及びトリエチルアミン３０ｇを３００ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、０℃に冷却し、ジフェニルホスフォニルアジド２８ｇを５０ｍｌのＤＭＦに溶解させた溶液を１時間かけて、この混合物中に滴下した。滴下終了後、０℃で３時間攪拌し、更に室温で１２時間攪拌した。この後、減圧下で、溶媒を留去し、展開溶媒としてクロロホルム−メタノール混合溶媒を用いて、カラムクロマトグラフィーに残留物をかけることで目的物であるＮ−ビオチニル−Ｎ′−メタクロイルトリメチレンアミドを得た。
【００５２】
［製造例３］ビオチン固定化温度応答性磁性微粒子の調製
温度応答性磁性微粒子は、以下の方法で製造した。
１０ｍＭ  炭酸ナトリウム溶液１５ｍｌに前記方法で調製した磁性微粒子（平均粒径４０ｎｍ）１ｍｌを添加し、２時間攪拌後、グリシジルメタクリレート１００ｍｇを添加し、７２時間反応させた。透析後に濃縮し、メタクリル化磁性微粒子を得た。５０ｍｌの三口フラスコに、Ｎ−アクリロイルグリシンアミド２００ｍｇ、前記メタクリル化磁性微粒子２ｍｇ及びビオチンモノマー３ｍｇを入れ、蒸留水で２０ｍｌに調整した。この溶液を窒素置換した後、過硫酸アンモニウム３０ｍｇを添加し、５０℃で２時間反応させることで、温度応答性磁性微粒子が得られた。この温度応答性磁性微粒子の平均粒径は、約１００ｎｍであった（光散乱光度計による測定）。また、この温度応答性磁性微粒子はＵＣＳＴを１０℃に有し、ＵＣＳＴ未満の水溶液中では凝集し、磁石で容易に回収できる。溶液をＵＣＳＴ以上にすると直ちに分散し、磁石では容易に回収できなかった。
【００５３】
［製造例４］ストレプトアビジン固定化温度応答性磁性微粒子の調製
ストレプトアビジン固定化温度応答性磁性微粒子は、以下の方法で製造した。
前記ビオチン固定化温度応答性磁性微粒子溶液の０．１重量％水溶液５０μｌを１．５ｍｌエッペンドルフチューブにとり、さらに１ｇ／ｌのストレプトアビジン溶液５０μｌをチューブに加え、室温で、２０分混合した。その後、チューブを２℃に冷却し、磁性微粒子を凝集させ、磁石で回収し、上清部分と分離した。凝集部分にバッファー（２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．０５％ＴＷＥＥＮ２０）２００μｌを加え、磁性微粒子を加温して分散させ、再度冷却して凝集させ、凝集塊に混入した成分を洗浄し取り除いた。この操作を４回繰り返した。各操作で凝集後に回収した磁性微粒子にそれぞれ２×ＳＤＳ サンプルバッファー（２０重量％グリセリン、２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４重量％ＳＤＳ、１０重量％メルカプトエタノール、８Ｍ  尿素、０．００４重量％ブロモフェノールブルー、ｐＨ６．８）を２０μｌ加え、９５℃で、１０分間加熱し、磁性微粒子に結合したタンパク質を抽出し、この抽出液を用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルをクーマシーブリリアントブルー染色液で染色、脱色した後、バンドの濃度を確認し、ストレプトアビジンの固定化を確認した。
【００５４】
なお、上記製造例で製造した温度応答性磁性微粒子以外に、Ｔｈｅｒｍａ−Ｍａｘ（登録商標）ＵＳＡ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（以下、「ＴＭ−ＵＳＡ」と略す。）として
、マグナビート社から温度応答性磁性微粒子を入手することができる。実施例ではマグナビートから入手したＴＭ−ＵＳＡを使用した。このＴＭ−ＵＳＡは、約２℃で十分に凝集が完了する。このＴＭ−ＵＳＡはミリポア製マイレスクＧＶ（孔径０．２２μｍ）で濾過滅菌した後に実験に使用し、Ｔｏｔａｌ−ＲＮＡからのｍＲＮＡの分離操作に関してはクリーンベンチ内で行い、使用する試薬も滅菌したものを使用した。
【００５５】
［実施例１］
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）によるＴＭ−ＵＳＡの凝集促進効果の確認
ＴＭ−ＵＳＡ（４ｍｇ／ｍｌ）  ５０μｌと１×Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１Ｍ  ＬｉＣｌ、ｐＨ８．０）  ４０μｌと、重量均分子量６０００のポリエチレングリコール１０％（ｗ／ｖ）水溶液  １０μｌを添加し、混合したサンプルをサンプル２とした。
【００５６】
［比較例１］
ＴＭ−ＵＳＡ（４ｍｇ／ｍｌ）  ５０μｌと１×Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  ４０μｌと超純水（ミリポア社製Ｄｉｒｅｃｔ−Ｑで精製した水）  １０μｌを添加し、混合したサンプルをサンプル１とした。
【００５７】
調製したサンプル１及び２を、氷水中で１分間冷却し、凝集させ、磁石で１分間回収した後、上清を回収し、上清の透過率（５５０ｎｍ）を測定した。コントロールとして、磁気回収を行っていないサンプルの透過率（吸光度）を測定した。測定した結果を表１に示す。
【００５８】
【表１】
0005540467.tif 000002
【００５９】
比較例１はコントロールの透過率（吸光度）とほとんど数値が変わらず、ＴＭ−ＵＳＡを回収できていないことが確認できた。実施例１はコントロールの透過率（吸光度）と比べ、数値が大きく減少していることからＴＭ-ＵＳＡを回収できていることが確認できた。
【００６０】
［実施例２］
ＴＭ−ＵＳＡを用いたＴｏｔａｌ−ＲＮＡからのｍＲＮＡの分離
【００６１】
（ＴＭ−ＵＳＡへのビオチン−オリゴｄＴの固定）
ＴＭ−ＵＳＡ（１６ｍｇ／ｍｌ）２５μｌとＴＥ  Ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）７５μｌを１．５ｍｌエッペンドルフチューブに採取し、よく混合し、氷水中で冷却し、凝集させ、磁石で回収し、上清部分を取り除いた。１×Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１Ｍ  ＬｉＣｌ、ｐＨ８．０）５０μｌ、重量平均分子量６０００のポリエチレングリコール１０％（ｗ／ｖ）水溶液１０μｌを加え、分散させた。再度チューブを氷水中で冷却し、凝集させ、磁石で回収し、上清部分を取り除いた。凝集部分に１×Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ  ２４μｌ、ビオチン化オリゴｄＴ（０．７５  ｐｍｏｌ／μｌ）１
μｌを加え、分散させ、室温で５００ｒｐｍ、５分間、振とうし、反応させた。
このようにして、ビオチン化オリゴｄＴ固定化ＴＭ−ＵＳＡを調製した。
【００６２】
（ビオチン化オリゴｄＴ固定化ＴＭ−ＵＳＡによるＴｏｔａｌ  ＲＮＡからのｍＲＮＡの分離）
Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ５μｌと、Ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ  ３５μｌとを１．５ｍｌエッペンドルフチューブに取り、混合し、７０℃で１５分加熱し、氷上に２分静置後に５×Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５Ｍ  ＬｉＣｌ、ｐＨ８．０）１０μｌを加え、調製したビオチン化オリゴｄＴ固定化ＴＭ−ＵＳＡ（４ｍｇ／ｍｌ）１００μｌと混合し、室温で５００ｒｐｍ、１０分間、振とうし、反応させた。その後、１０重量％ＰＥＧ（ＭＷ．６０００）  １０μｌを加えて氷水中で冷却し、凝集させ、磁石で回収し、上清部分を取り除いた。凝集部分にＷａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．１５Ｍ  ＥＤＴＡ、０．１５Ｍ  ＬｉＣｌ、ｐＨ７．５）５０μｌと１０重量％ＰＥＧ（ＭＷ．６０００）  １０μｌを加え、溶液中に分散させた。再度チューブを氷水中で冷却し、凝集させ、磁石で回収し、上清部分を取り除いた。この洗浄の操作を２回繰り返した。洗浄後、凝集部分にＮｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ  ５０μｌを加え、分散させ、１．５ｍｌエッペンドルフチューブに２０μｌ分注し（１）、残りの溶液を３７℃で５分間加熱後、氷水中で２分冷却し、凝集させ、磁石で回収し、上清部分を１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移し（２）、Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、「ＲＴ−ＰＣＲ」と略す。）を行った。
【００６３】
（ｍＲＮＡを用いたＲＴ−ＰＣＲによるｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ（以下、「ｃＤＮＡ」と略す。）の増幅の確認）
ビオチン化オリゴｄＴ固定化ＴＭ−ＵＳＡを用いて分離したｍＲＮＡ（上記（１）,（２））をＯｎｅ  ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、β−Ａｃｔｉｎ  ｐｒｉｍｅｒ  ｐａｉｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った（反応液組成及び反応条件については、表２を参照）。ＰＣＲ産物５μｌとＴａＫａＲａ  ６×Ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ（３０重量％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、３０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０３重量％Ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ  Ｂｌｕｅ、０．０３重量％Ｘｙｌｅｎｅ  Ｃｙａｎｏｌ）１μｌを混合し、アガロースゲル電気泳動を行った。エチジウムブロマイド染色液で染色し、脱色後、ＰＣＲ産物のバンド（２８５ｂｐ）を確認した。
【００６４】
ビオチン化オリゴｄＴ固定化ＴＭ−ＵＳＡにｍＲＮＡを結合させた後にＰＥＧを添加し、冷却磁気回収したｍＲＮＡに基づいて、ＲＴ−ＰＣＲで増幅したｃＤＮＡの目的産物のバンドを図１のレーン１、２に示す。レーン１は、ＴＭ−ＵＳＡとｍＲＮＡが結合した状態でＲＴ−ＰＣＲにかけ、増幅したＰＣＲ産物をアガロース電気泳動で確認した結果である。レーン２は、ＴＭ−ＵＳＡとｍＲＮＡの結合を外し、ＴＭ−ＵＳＡを除去した後にサンプルをＲＴ−ＰＣＲにかけ、増幅したＰＣＲ産物をアガロース電気泳動で確認した結果である。レーン３は、対象例として、ｍＲＮＡ分離キット（mRNAdembeads Purification Mini kit、ademtech社製）を用いて分離したｍＲＮＡからｃＤＮＡを増幅させたＰＣＲ産物をアガロース電気泳動で確認した結果である。レーン４は、１００ｂｐ  ＬａｄｄｅｒのＤＮＡ分子量マーカーである。
【００６５】
ＴＭ−ＵＳＡと結合したｍＲＮＡについてＰＣＲを行った場合、及びＴＭ−ＵＳＡから分離したｍＲＮＡについてＰＣＲを行った場合ともに、ｃＤＮＡが増幅されており、検体からｍＲＮＡが回収されたことが確認できた。
【００６６】
ＲＴ−ＰＣＲの条件を以下に示す。
【００６７】
【表２】
0005540467.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】実施例２のアガロースゲル電気泳動の結果を示す図（写真）である。
【図１】
0005540467.tif 000004