(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のいずれかの抗体を含む免疫系細胞の浸潤抑制剤：
（１）ヒトテネイシンＣのフィブロネクチンIII様反復配列のＡ２配列部分に由来するペプチドを認識する抗体、及び
（２）配列番号２のアミノ酸配列で示されるペプチドを認識する抗体。
【請求項２】
以下のいずれかの抗体を含む炎症細胞の細胞死誘導剤：
（１）ヒトテネイシンＣのフィブロネクチンIII様反復配列のＡ２配列部分に由来するペプチドを認識する抗体、及び
（２）配列番号２のアミノ酸配列で示されるペプチドを認識する抗体。
【請求項３】
以下のいずれかの抗体を含む慢性炎症治療剤：
（１）ヒトテネイシンＣのフィブロネクチンIII様反復配列のＡ２配列部分に由来するペプチドを認識する抗体、及び
（２）配列番号２のアミノ酸配列で示されるペプチドを認識する抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、慢性炎症治療剤及びこれに用いる新規抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
テネイシンＣは、免疫組織を除いた正常細胞においてはほとんど発現が認められないが、炎症、腫瘍等の病態時に発現が誘導される化合物である。
テネイシンＣを検出する方法として、いくつかの抗テネイシンＣ抗体が知られている（例えば、特開２００４−２１７５４６号公報及び特開２００２−２３４９００号公報参照）。またテネイシンＣをマーカーとして、関節炎の診断を行なう方法が知られている（例えば、特開２００４−１３８４８９号公報参照）。【０００３】
テネイシンＣを構成するポリペプチドには、上皮増殖因子様ドメイン、フィブロネクチン（ＦＮ)III様ドメイン、およびフィブリノーゲン様ドメインが含まれている。このうちＦＮIII様ドメインでは、基本的な８種の反復配列（１−８）と、その５番目と６番目の間に挿入される９種のスプライシングされる反復配列（Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ｂ、ＡＤ２、ＡＤ１、Ｃ、Ｄ）とが連続していることが知られている。またこれらのスプライシングされる反復配列部位は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）で切断されやすい部位であり、テネイシンＣがＭＭＰにより切断されて生成するペプチドは種々の機能を有していると考えられている。【０００４】
一方、慢性炎症においては、マクロファージなどの単球やリンパ球などの免疫系細胞が、血管から血管内皮を浸潤し、血管基底膜を突き抜けてその炎症部位に集まっていることが知られている。このような炎症部位における免疫系細胞の浸潤は、免疫系細胞膜上の接着分子インテグリンを介した免疫系細胞と血管内皮細胞・細胞外マトリクスとの相互作用で調節されている。インテグリンには活性型と不活性型の２つのコンフォメーションがあり、活性型のみが細胞外マトリクスに接着しうることが知られている。
インテグリンの活性化を引き起こすペプチドとして、テネイシンＣのＦＮIII様ドメインにおけるＡ２ドメインに由来するペプチド（以下、「ＴＮIIIＡ２」ということがある）が知られている（例えば、J.Biol.Chem., Vol.282, pp.34929-34937（2007）参照）。
しかしながら、テネイシンＣおよびそれに由来するペプチドの炎症部位における役割については詳細が不明であり、特に慢性炎症との関係性については明確な知見は得られていなかった。さらに従来知られている抗テネイシンＣ抗体では、炎症に対する作用が部位によって相反する場合があった。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、慢性炎症に効果的な新たな薬剤を提供することを課題とする。
本発明の第一の態様は、ヒトテネイシンＣのフィブロネクチンIII様反復配列のＡ２配列部位に由来するペプチドを認識する抗ＴＮIIIＡ２抗体を提供する。前記抗体は配列番号１のアミノ酸配列を含むペプチドを認識することが好ましい。
本発明の第二の態様は、前記抗体を含む免疫系細胞の血管からの浸潤抑制剤を提供する。
本発明の第三の態様は、前記抗体を含む炎症細胞の細胞死誘導剤を提供する。
本発明の第四の態様は、前記抗体を含む慢性炎症治療剤を提供する
本発明によれば、慢性炎症に対する新たな薬剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】本発明の実施例１にかかるペプチドＴＮIIIＡ２誘導性の細胞接着に対する抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体の抑制効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明の抗体は、ヒトテネイシンＣのフィブロネクチンIII様反復配列のＡ２配列部位に由来するペプチドを認識する抗ＴＮIIIＡ２抗体である。
本発明の抗体は、ヒトテネイシンＣのフィブロネクチンIII様反復配列におけるＡ２配列部分に由来するペプチド（ＴＮIIIＡ２）を認識する。前記抗体がＴＮIIIＡ２に選択的に結合することにより、ＴＮIIIＡ２によって誘導され得る免疫系細胞の浸潤を、抑制することができる。
本発明者は、ヒトテネイシンＣに由来するペプチドＴＮIIIＡ２が、免疫系細胞の浸潤および、炎症部位における炎症細胞の細胞死の誘導機構に関与することを見出した。本発明は、この知見に基づくものである。
【０００８】
本明細書において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であっても本工程の所期の作用が達成されれば、本用語に含まれる。
また、本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
以下、本発明について説明する。
【０００９】
本発明における抗ＴＮIIIＡ２抗体は、ヒトテネイシンＣのＦＮIII様ドメインのＡ２配列部分に由来するペプチド（ＴＮIIIＡ２）を認識できるものであれば特に制限はなく、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。
【００１０】
ＴＮIIIＡ２は、ＲＳＴＤＬＰＧＬＫＡＡＴＨＹＴＩＴＩＲＧＶＣ（配列番号１）の２２個のアミノ酸からなるペプチドである（J.Biol.Chem., Vol.282, pp.34929-34937（2007）参照）。本発明の抗ＴＮIIIＡ２抗体は、ＴＮIIIＡ２を認識する抗体であって、配列番号１で示されるＴＮIIIＡ２のアミノ酸配列のうち少なくとも一部をエピトープとするものである。抗ＴＮIIIＡ２に認識されるエピトープとしては、ＹＴＩＴＩＲＧＶ（配列番号２）のアミノ酸配列を含む部分ペプチドであればよい。
【００１１】
前記ＴＮIIIＡ２を認識する抗体を作製するために用いられるペプチド、即ち本発明にかかる抗ＴＮIIIＡ２抗体が認識するペプチド（標的ペプチド）としては、配列番号２を含むペプチドであればよく、全長（配列番号１）であってもよい。抗原性や安定性を高める観点から、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチドに、リンカー機能又はリンカー機能を有する１つ以上の化合物、例えばアミノ酸を追加してもよい。このような付加的なアミノ酸としては、キャリアタンパク質を結合するためのアミノ酸を配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチドに付与可能とするアミノ酸を挙げることができ、例えばシステイン、酸性アミノ酸または塩基性アミノ酸等を挙げることができる。標的ペプチドとしては、中でも、ＣＡＴＨＹＴＩＴＩＲＧＶ（配列番号３）のアミノ酸配列であることが、抗体作製効率の観点から更に好ましい。
【００１２】
前記ＴＮＩＩＩＡ２を認識する抗体は、上述した標的ペプチドを用いて、通常行われる方法によって調製することができる。
例えば、ポリクローナル抗体であれば、次のようにして得てもよい。前記配列番号１〜配列番号３のアミノ酸配列のいずれか又はこれらの混合物を標的ペプチドとして使用し、この標的ペプチドをウサギ等の小動物に免疫して血清を得る。得られた血清を公知の抗体精製手段、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、前記特定ペプチドをカップリングしたアフィニティカラム等を用いることによって本抗体を精製することで調製できる。
【００１３】
また、例えばモノクローナル抗体であれば、前記標的ペプチドを、マウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、マウスミエローマ細胞とポリエチレングリコールなどの試薬により融合させ、これにより形成された融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、前記標的ペブチドと結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで選択したハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、前記特定ペプチドをカップリングしたアフィニティカラム等を用いることによって本抗体を精製することで調製できる。
【００１４】
なお標的ペプチドは、抗原性を高めるために公知のキャリアタンパク質との融合タンパク質として免役に用いてもよい。このようなキャリアタンパク質としては、この目的で使用される公知の分子であれば特に制限なく使用することができ、例えば、ＫＬＨ、ＧＳＴ、ＢＳＡなどを挙げることができる。
【００１５】
本発明の抗ＴＮIIIＡ２抗体によって浸潤が抑制される免疫系細胞としては、炎症部位において浸潤が観察される免疫系細胞であれば特に制限はない。このような免疫系細胞としては、好中球、好酸球、好塩基球、単球、リンパ球（プラスマ細胞を含む）やこれらの２種以上の組み合わせなどを挙げることができる。
本発明の抗ＴＮIIIＡ２抗体は、特定理論に限定されないが、例えば、テネイシンＣ等によって誘導される免疫系細胞の表面に発現しているインテグリンの活性化を阻害することで、免疫系細胞の細胞外マトリクス（例えば、フィブロネクチン等）への接着を抑制することができると推測される。従って、本抗ＴＮIIIＡ２抗体を用いることによって、免疫系細胞が血管内皮下へ浸潤することを抑制することができる。
【００１６】
また、慢性炎症における炎症部位においては、活性化した常在の免疫系細胞又は浸潤した免疫系細胞（これらの細胞を総称して「炎症細胞」ということがある）が通常に比べて長期に渡って生存することが知られている。本発明の抗ＴＮIIIＡ２抗体は、このような炎症細胞の細胞死を誘導して、長期生存を抑制することができる。
【００１７】
本発明の慢性炎症治療剤は、前記抗ＴＮIIIＡ２抗体を含む。
抗ＴＮIIIＡ２抗体を含むことにより、炎症部位における免疫系細胞の浸潤を抑制し、さらに炎症細胞の細胞死を誘導して炎症細胞の長期生存を抑制することで、慢性炎症を治療することができる。
前記慢性炎症治療剤の治療対象は、哺乳動物であることが好ましく、ヒトであることがより好ましい。
【００１８】
本発明の慢性炎症治療剤は、経口的にまたは非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。例えば、点滴などの静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐薬、注腸、経口性腸溶剤などを選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。また投与量についても患者の年齢、症状等により適宜選択することができる。
【００１９】
本発明の慢性炎症治療剤は、投与経路に応じて医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。このような担体および添加物の例として、水、医薬的に許容される有機溶媒、コラーゲン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、ゼラチン、寒天、ジグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、医薬添加物として許容される界面活性剤などが挙げられる。使用される添加物は、剤型に応じて上記の中から適宜選択されるが、これらに限定されるものではない。
【００２０】
本発明の免疫系細胞の浸潤抑制剤は、前記抗ＴＮIIIＡ２抗体を含む。
抗ＴＮIIIＡ２抗体を含むことにより、免疫系細胞の血管内皮下への浸潤を抑制することができ、例えば、慢性炎症抑制作用等を示すことができる。
前記免疫系細胞の浸潤抑制剤は、必要に応じて他の成分をさらに含んで構成することができる。他の成分としては前記慢性炎症治療剤における医薬的に許容される担体や添加物を同様に用いることができる。
【００２１】
本発明の炎症細胞の細胞死誘導剤は、前記抗ＴＮIIIＡ２抗体を含む。抗ＴＮIIIＡ２抗体を含むことにより、炎症部位において炎症細胞の細胞死を誘導して長期生存を抑制し、例えば、慢性炎症による症状の緩和作用等を示すことができる。
前記炎症細胞の細胞死誘導剤は、必要に応じて他の成分をさらに含んで構成することができる。他の成分としては前記慢性炎症治療剤における医薬的に許容される担体や添加物を同様に用いることができる。
【００２２】
また、本発明は、慢性炎症を生じている又は生じることが予測される患者に対して、本発明にかかる上述した抗ＴＮIIIＡ２抗体を含む薬剤を投与することを含む慢性炎症治療又は予防方法を含む。ここで、「慢性炎症治療」には、症状の改善であればよく、症状の緩和や、重症化の抑制も、この用語に包含される。これにより、慢性炎症の症状、又は炎症によって生じる症状を予防又は、軽減若しくは緩和することができる。
【００２３】
患者への投与量としては、適用される薬剤の剤型や、患者の性別、年齢、症状等又はこれらの組み合わせによって異なるが、一般に、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐薬、注腸、経口性腸溶剤、好ましくは静脈内注射とすることができる。
患者への投与方法としては、適用される薬剤の剤型や、患者の性別、年齢、症状等又はこれらの組み合わせによって異なるが、経口投与、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐薬、注腸、経口性腸溶剤を挙げることができ、これらの投与方法から患者の状態によって適宜選択すればよい。本発明の抗体の治療上有効用量は、症状の程度や患者の状態によって異なるが、例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重とすることができるが、これに限定されない。また、投与頻度は、例えば、毎日２回ないし１週間に１回の範囲とすることができるが、これに限定されない。
【実施例】
【００２４】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。尚、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。【００２５】
［実施例１］
＜抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体の作製＞
配列番号３のアミノ酸配列を有するペプチドを常法により合成した。合成したペプチドを、ハプテンとしてＫＬＨに融合し、得られた融合ペプチドを抗原ペプチドとして用いた。免疫は家兎を用いた通常の方法に従って行った。得られた目的とする抗体を含む混合物を通常の方法により精製した。
以上のようにして、ヒトＴＮIIIＡ２に対するポリクローナル抗体（抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体）を３種類（Ｎｏ．１〜Ｎｏ．３）得た。【００２６】
＜抗体活性の評価＞
上記で得られた抗ヒトＴＮIIIＡ２ポリクローナル抗体の抗体活性を、ヒトＴＮIIIＡ２によって誘導される細胞接着の抑制作用を指標とし、以下のようにして評価した。結果を図１に示した。【００２７】
細胞培地としてＲＰＭＩ１６４０（２０％ＦＢＳ添加）を用い、ＫＯＰ２．１６細胞（マウス骨髄由来血管内皮細胞株）を９６穴プレートの各ウェルに５×１０４ｃｅｌｌｓ／２００μＬ／ｗｅｌｌの密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で４時間培養した。培養上清の１００μＬを取り除き、２０％ＴＣＡ水溶液を１００μＬ添加した後、４℃で一晩もしくは常温で１時間放置して固相化した。これをＰＢＳ×５、ＲＰＭＩ１６４０（２０％ＦＢＳ添加）×１、ＰＢＳ×１で順次洗浄し、各ウェルをＫＯＰ２．１６細胞でコートした９６穴プレートを作製した。【００２８】
上記で得られたＫＯＰ２．１６細胞でコートした９６穴プレートの各ウェルに１２．５μｇ／ｍＬのヒトＴＮIIIＡ２を含むＲＰＭＩ１６４０（２０％ＦＢＳ添加）を加えた。上記で得られた抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体（Ｎｏ．１〜３）を濃度が１．５μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、６μｇ／ｍＬとなるようにそれぞれ添加し、Ｋ５６２細胞（白血病細胞株）を１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度でそれぞれ播種して、３７℃、５％ＣＯ２で１時間培養した。
ホルマリンを添加してさらに１時間常温で放置して固定した後、ＰＢＳで３回洗浄し、リリーマイヤー・ヘマトキシリン染色を行なった。光学顕微鏡で観察し、所定の視野内の接着細胞数を計数した。【００２９】
図１から、正常ウサギＩｇＧではヒトＴＮIIIＡ２によって誘導される細胞接着は抑制されないのに対して、本発明の抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体は細胞接着を用量依存的に抑制することが分かる。またＮｏ．１〜３のいずれの抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体も同等の抗体活性を示すことが分かる。さらに本発明の抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体は、マグネシウムイオンで誘導される細胞接着の抑制作用を示さなかった。
以上から、本発明の抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体は、ヒトＴＮIIIＡ２に特異的に結合し、その機能を抑制できることが分かる。【００３０】
［実施例２］
＜浸潤抑制性評価１＞
抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体による、Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｔ細胞系細胞株）の血管内皮に対する浸潤抑制を以下のようにして評価した。
９６穴プレートの各ウェルにヒトテネイシンＣを５μｇ／ｍＬの濃度で添加し、３７℃で１時間インキュベートした。ＢＳＡを２．５ｍｇ／ｍＬの濃度で加えて、３７℃で１時間インキュベートしてブロッキングした。ＰＢＳで３回で洗浄し、各ウェルをヒトテネイシンＣでコートしたアッセイ用ウェルプレートを得た。
次いで、このアッセイ用ウェルプレートの各ウェルに、ＤＭＥＭ（＋）培地に懸濁したＫＯＰ２．１６（マウス骨髄由来血管内皮細胞）を５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの条件で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で３時間培養した。これによりヒトテネイシンＣでコートしたウェル上にＫＯＰ２．１６細胞からなる単層を形成した。【００３１】
Ｊｕｒｋａｔ細胞の懸濁液に、正常ウサギＩｇＧまたは抗ヒトテネイシンＣ抗体を濃度が２０μｇ／ｍＬとなるように添加した後、ＫＯＰ２．１６細胞からなる単層上に１．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度になるように静かに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で３時間培養した。【００３２】
ホルマリンを添加してさらに１時間常温で放置して固定した後、ＰＢＳ（−）で３回洗浄し、リリーマイヤー・ヘマトキシリン染色を行なった。光学顕微鏡（×２００）下で、予め定めた４つの領域内の浸潤数をそれぞれ３つのウェルについて計数し、その算術平均値を浸潤数とした。
ヒトテネイシンＣを添加しなかった場合の浸潤数を同様にして計数し、これをバックグラウンドとして差し引いた浸潤数を表１に示した。さらに、正常ウサギＩｇＧと抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体とにおける浸潤数差の、正常ウサギＩｇＧにおける浸潤数に対する比を浸潤抑制率（％）として算出した。【００３３】
また、Ｊｕｒｋａｔ細胞の代わりに、ＴＨＰ−１（単球様細胞株）を用いた以外は上記と同様にして、抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体による、ＴＨＰ−１の血管内皮に対する浸潤抑制を評価した。結果を表１に示した。【００３４】
【表１】
0005590561.tif 000002
【００３５】
表１から、本発明の抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体は、Ｔリンパ球系細胞および単球様細胞のヒトテネイシンＣに誘導された血管内皮細胞層への浸潤を効果的に抑制できることがわかる。【００３６】
［実施例３］
＜浸潤抑制性評価２＞
実施例１で得られた抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体の浸潤抑制効果を、ヒトテネイシンＣに対する他の抗体４Ｆ１０ＴＴ及び正常ウサギＩｇＧと以下のようにして比較した。
４Ｆ１０ＴＴは、ヒトテネイシンＣの上皮増殖因子様ドメインのペプチド配列を認識するウサギＩｇＧ抗体であり、（株）免疫生物研究所より入手したものを使用した（Tsunoda T. et al., Am J Pathol 162: 1857-1867, 2003; Sato A. et al., J Am Coll Cardiol 47: 2319-2325, 2006）
上記の抗体をそれぞれ用いた以外は実施例２と同様にして、ＫＯＰ２．１６細胞の単層へ浸潤したＪｕｒｋａｔ細胞の個数を測定した。【００３７】
如何なる抗体も添加しない場合の浸潤数を同様にして計数した。抗体を添加しないときの浸潤数に対する浸潤数の比率を、正常マウスＩｇＧを添加した場合（normal IgG)、４Ｆ１０ＴＴを添加した場合、抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体を添加した場合をそれぞれについて算出した。結果を表２に示した（「Coated TNC」）。【００３８】
また、ヒトテネイシンＣで各ウェルをコートしたアッセイ用プレートの代わりに、未コートの９６穴プレートを用意し、ヒトテネイシンＣを２μｇ／ｍＬの濃度で各ウェル、総量１００μＬとなるように添加した以外は上記と同様にして、各抗体の細胞浸潤抑制効果を評価した。結果を表２に示した（「Soluble TNC」）。【００３９】
【表２】
0005590561.tif 000003
【００４０】
表２の結果から、ヒトテネイシンＣ由来のペプチドを認識する抗体であっても細胞浸潤抑制に対する効果が異なり、本発明にかかる抗ＴＮIIIＡ２抗体は、４Ｆ１０ＴＴと比較して強い細胞浸潤抑制効果を示すことが分かる。【００４１】
［実施例３］
＜長期生存抑制性評価＞
ヒトテネイシンＣ存在下における、マクロファージの生細胞数の時間変化に対する抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体の効果を以下のようにして評価した。【００４２】
ＰＭＡを濃度１０ｎｇ／ｍＬで添加した完全培地中で、ＴＨＰ−１細胞を３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養し、マクロファージに分化誘導した（以下、分化したＴＨＰ−１を「ＰＭＡ−ＴＨＰ−１」という）。【００４３】
９６穴プレートの各ウェルにフィブロネクチン（ＦＮ）を５μｇ／ｍＬの濃度で添加し、３７℃で1時間インキュベートした。ＢＳＡを２．５ｍｇ／ｍＬの濃度で加えて、３７℃で1時間インキュベートしてブロッキングした。ＰＢＳ×３で洗浄し、各ウェルがＦＮコートされたプレートを作製した。【００４４】
ＦＮコートしたウェルに、ヒトテネイシンＣを最終濃度が２μｇ／ｍＬとなるように添加したＲＰＭＩ１６４０（無血清）培地を加え、さらに正常ウサギＩｇＧ、４Ｆ１０ＴＴ抗体、または抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体を最終濃度が５０μｇ／ｍＬとなるように加えた。ここにＰＭＡ−ＴＨＰ−１細胞を２〜２．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度になるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養した。
ＷＳＴ法に準じたＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ（ＤＯＵＪＩＮ社製）を用いて細胞数を計数し、播種時の生細胞数（ｄａｙ０）に対する培養後の生細胞数（ｄａｙ２）の比率（生細胞数比）を算出した。結果を表３に示した。【００４５】
【表３】
0005590561.tif 000004
【００４６】
表３から、ヒトテネイシンＣが存在するとマクロファージが増殖していることが分かる。これに対して抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体を加えた場合には、マクロファージの増殖が抑制されること（抗体無添加の細胞数との比では０．６１）、さらに生細胞数が減少していること（播種時の細胞数との比では０．９３）が分かる。すなわち、抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体は、ヒトテネイシンＣ存在下におけるマクロファージの長期生存を抑制できることが分かる。
また、抗ヒトＴＮIIIＡ２抗体による生細胞数の減少は、細胞死によるものであった。【００４７】
以上から、本発明の抗ヒトＴＮIIＡ２抗体は、免疫系細胞の血管内皮下への浸潤を抑制することができ、さらにヒトテネイシンＣ存在下における炎症細胞の細胞死を誘導することができることが分かる。【００４８】
２００９年２月６日に出願された日本国特許出願第２００９−０２５７０７号の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に援用されて取り込まれる。
【図１】
0005590561.tif 000005
【配列表】
0005590561000001.app