(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または白血球の集団を、可溶性の形態の食品抗原または自己抗原で刺激するステップと、
２）前記食品抗原または自己抗原に特異的なＴｒ１細胞の集団を、前記刺激した細胞の集団から単離するステップと、
３）Ｍｐ培地でステップ（２）で単離した前記抗原特異的なＴｒ１細胞の集団を拡張するステップ、
を含む、食品抗原または自己抗原に特異的なＴｒ１細胞の集団を、白血球の集団またはＰＢＭＣの集団から獲得するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
【請求項２】
前記食品抗原または自己抗原に特異的なＴｒ１細胞の集団をＰＢＭＣの集団から獲得する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（１）の後、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ならびにインターロイキン−４（ＩＬ−４）およびインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）からなる群から選択される少なくとも１つのインターロイキンの存在下で、同じ抗原でＰＢＭＣまたは白血球の集団を少なくとも１回再刺激する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記食品抗原または自己抗原が組換えまたは合成の抗原である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記食品抗原が、オバルブミン、カゼイン、ソヤタンパク質、およびそれらの混合物を含む群から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記食品抗原が、配列番号２３の配列の鶏卵オバルブミン、配列番号２４の配列のウシαＳ１−カゼイン、および配列番号２５の配列のウシβ−カゼインを含む群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記自己抗原が、インスリン、ミエリン塩基性タンパク質、およびそれらの混合物を含む群から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（１）で刺激した前記ＰＢＭＣの集団が、０．０１．１０6から１００．１０6細胞／ｍＬまでからなる、請求項２から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（１）でＰＢＭＣ集団の刺激に用いられる前記食品抗原または自己抗原が、０．１μｇ／ｍＬから５ｍｇ／ｍＬまでの可溶性の形態である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗原特異的なＴｒ１細胞の集団を、限界希釈などのクローニング技術によりステップ（２）で回復する、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＰＢＭＣまたは白血球の集団が、ヒトの集団である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗原特異的なＴｒ１細胞の集団を拡張するステップ（３）が、前記細胞の集団を、ＩＬ−２およびＩＬ−４の存在下でＣＤ３＋ＣＤ２８ビーズと接触させることにある、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗原特異的なＴｒ１細胞の集団を拡張するステップ（３）が、Ｍｐ培地における因子のグループの存在を必要とし、前記拡張ステップが、
ａ）温度Ｔ1で、Ｍｆ培地で前記グループの因子を発現することができるフィーダー細胞を培養するステップであって、このＴ1が、前記フィーダー細胞の増殖を可能にするステップと、
ｂ）前記Ｍｆ培地を除いた、またはＭｆ培地のないステップ（ａ）で得たフィーダー細胞を、Ｍｐ培地に含まれる抗原特異的なＴｒ１細胞の集団と接触させるステップであって、ここで、前記抗原特異的なＴｒ１細胞の集団、フィーダー細胞、およびＭｐ培地を含む混合物を得るために、前記Ｍｐ培地は、前記因子のグループを最初に含んでいないステップと、
ｃ）前記Ｍｐ培地において、フィーダー細胞によって発現されているグループの因子を含むステップ（ｂ）で得られた混合物を培養するステップであって、ここで、
前記抗原特異的なＴｒ１細胞の集団が増殖し、且つ、
前記フィーダー細胞が増殖しないように、
培養する前記ステップ（ｃ）を少なくとも３５℃である温度Ｔ2で行い、抗原特異的なＴｒ１細胞の集団を拡張するステップと、
ｄ）そのように拡張した抗原特異的なＴｒ１細胞の集団を回復するステップと
を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記フィーダー細胞がステップ（ｃ）の間に死滅する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ｄ）で、前記フィーダー細胞の死滅によりもたらされる細胞膜のフラグメントが除去される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記因子のグループが、前記フィーダー細胞の細胞膜に固定されている因子、および前記フィーダー細胞により分泌される因子を含む、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記グループの因子が、拡張すべき抗原特異的なＴｒ１細胞の集団の細胞表面タンパク質と相互作用する、請求項１３から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記フィーダー細胞が組換え細胞であり、前記グループの因子をコードする異種核酸を含む、請求項１３から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記フィーダー細胞が、細胞の表面にいかなる内因性のクラスＩおよび／またはＩＩの主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子も持たない、請求項１３から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｂ）で前記フィーダー細胞がそのＭｆ培地から除去される、請求項１３から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記フィーダー細胞が昆虫のフィーダー細胞であり、Ｔ1がＴ2よりも低い、請求項１３から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記昆虫のフィーダー細胞が、２００５年３月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＮＣＭ）にＩ−３４０７番で寄託されているＳ２ショウジョウバエ細胞系由来である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｍｐ培地が無血清培地である、請求項１３から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｍｆ培地が無血清培地である、請求項１３から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記フィーダー細胞が、拡張すべき抗原特異的なＴｒ１細胞の集団の以下の細胞表面タンパク質：
ＣＤ３／ＴＣＲタンパク質複合体、
ＣＤ２８タンパク質、
ＣＤ２タンパク質、
インターロイキン−２（ＩＬ−２）受容体、および
インターロイキン−４（ＩＬ−４）受容体、
と相互作用をする組換え因子のグループを発現する組換えフィーダー細胞である、請求項１３から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記組換え因子のグループが、
抗−ＣＤ３抗体の修飾が抗−ＣＤ３重鎖の抗−ＣＤ３細胞質内ドメインの膜貫通ドメインとの置換にあり、前記修飾された抗−ＣＤ３抗体は前記フィーダー細胞の細胞膜に固定されており、前記Ｔ細胞のＣＤ３／ＴＣＲタンパク質複合体との相互作用を受けやすい、修飾された抗−ＣＤ３抗体、
前記Ｔ細胞のＣＤ２８タンパク質との相互作用を受けやすい、前記フィーダー細胞の細胞膜に固定されている、ＣＤ８０またはＣＤ８６タンパク質、および
前記Ｔｒ１細胞のＣＤ２タンパク質との相互作用を受けやすい、前記フィーダー細胞の細胞膜に固定されているＣＤ５８タンパク質、
前記Ｔｒ１細胞のＩＬ−２受容体との相互作用を受けやすい、前記フィーダー細胞により分泌されるＩＬ−２、
前記フィーダー細胞により分泌され、前記Ｔｒ１細胞のＩＬ−４受容体との相互作用を受けやすいインターロイキンであって、ＩＬ−４およびインターロイキン１３（ＩＬ−１３）を含む群から選択されるインターロイキン、
を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗−ＣＤ３抗体重鎖の細胞質内ドメインを置換する膜貫通ドメインが、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体の膜貫通ドメインである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記グループの因子がヒト起源である、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記修飾された抗−ＣＤ３抗体の軽鎖が、配列番号１の配列の異種核酸によってコードされ、前記修飾された抗−ＣＤ３抗体の重鎖が配列番号２の配列の異種核酸によってコードされる、請求項２６から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＣＤ８０タンパク質が、配列番号３の配列の異種核酸によってコードされる、請求項２６から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＣＤ８６タンパク質が、配列番号４の配列の異種核酸によってコードされる、請求項２６から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＣＤ５８タンパク質が、配列番号６の配列の異種核酸によってコードされる、請求項２６から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＩＬ−２が、配列番号５の配列の異種核酸によってコードされる、請求項２６から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＩＬ−４が、配列番号７の配列の異種核酸によってコードされる、請求項２６から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＩＬ−１３が、配列番号８の配列の異種核酸によってコードされる、請求項２６から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記のように拡張された抗原特異的なＴｒ１細胞の集団を、少なくとも１２時間の間、ステップ（ｃ）で抗原特異的なＴｒ１細胞の集団を培養した後、ステップ（ｄ）で回復する、請求項２６から３５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＢＭＣまたは白血球の集団を、食品抗原または自己抗原で刺激し、食品抗原または自己抗原に特異的なＴｒ１細胞の集団を、刺激した細胞の集団から回復することを含む、白血球またはＰＢＭＣの集団から食品抗原または自己抗原に特異的なＴｒ１細胞の集団を獲得するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法に関する。好ましくは、ＰＢＭＣまたは白血球の集団を、ＩＬ−２、ならびにＩＬ−４およびＩＬ−１３からなる群から選択される少なくとも１つのインターロイキンの存在下で、ステップ（１）の後、同じ抗原で少なくとも１回再刺激する。このｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法は、有利には、拡張に必要な因子を発現することができるフィーダー細胞と、回復した抗原特異的なＴｒ１細胞の集団を接触させることにより、これらを拡張する第３のステップをさらに含んでもよい。好ましくは、フィーダー細胞は組換え昆虫のフィーダー細胞である。
【０００２】
Ｔ細胞の集団の中でも、調節性Ｔｒ１細胞またはＴｒ１細胞と呼ばれる、新規な、機能的に異なるＴ細胞の亜集団に関して、現在、証拠が蓄積しつつある。本発明者らは、調節性Ｔ１（Ｔｒ１）細胞を、炎症性疾患（すなわち、クローン病（Ｈ.Ｇｒｏｕｘら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９７年、３８９巻、７３７〜７４２頁）、皮膚の炎症（Ｆｏｕｓｓａｔら、２００３年、Ｊ.Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７１巻、５０１８〜５０２６頁）、アテローム性動脈硬化（Ｍａｌｌａｔら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００３年、１０８巻、１２３２〜１２３７頁）、または多発性硬化症（Ｂａｒｒａｔら、２００２年、１９５巻、６０３〜６１６頁）を処置するのに用いることができることを示した。これらのモデル全てにおいて、抗炎症性のＴｒ１細胞は、特定の抗原に対して向けられており、抗原の、優先的には炎症部位上における送達は、その抗炎症の機能を誘発するためにＴｒ１細胞の刺激に必要とされることが示された。したがって、ヒトの疾患を処置するためのＴｒ１細胞を用いるために、抗原特異的なＴｒ１細胞を単離することができなければならない。しかし、これは非常に困難であることが証明されていた。
【０００３】
本発明者らは、Ｔｒ１細胞は、特異的な表面マーカーを発現し、かつＣＤ３およびＣＤ４マーカーの同時発現、ならびにＣＤ４９ｂの発現および高レベルのＣＤ１８の発現により特徴付けられ得ること、ならびに、好適な場合には、タンパク質ＣＤ４、ＰＳＧＬ−１、ＰＥＣＡＭ−１、およびαＶ／β３をコードする遺伝子の過剰発現を実証することにより特徴付けられ得ることも示している（ＷＯ２００５／０００３４４号で公開された国際特許出願を参照）。
【０００４】
驚くべきことに、本発明者らは、ヒト血液から、これらのマーカーの発現に基づいて単離された、精製されたＴｒ１細胞（および、結果的にＰＢＭＣまたは白血球の集団に存在するＴｒ１細胞）は、食品抗原または自己抗原に反応して活発に増殖すること、ならびにこれらの細胞の増殖性の反応はＩＬ−２およびＩＬ−４（ＩＬはインターロイキン）の両方を用いた刺激により維持され得ることを観察している。当業者に一般的である知識によれば、以前は、第一にＰＢＭＣの集団から抗原特異的なナイーブのＴ細胞を単離し、第二に抗原特異的なＴｒ１細胞の分化を誘発することが必要であったので、この可能性は、先行技術に勝る重要な利点をもたらすものであり、一方、食品抗原または自己抗原に特異的なＴｒ１細胞をＰＢＭＣ（または白血球）の集団から直接獲得することは、今や可能である。本発明では、食品抗原または自己抗原に特異的なＴｒ１細胞を獲得するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法が単純化され、これらの細胞は質に関して変化していないので、これらの細胞を投与する患者に対する安全性は増大している。
【０００５】
したがって、本発明の主題は、食品抗原または自己抗原に特異的なＴｒ１細胞の集団を、白血球の集団または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団から獲得するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であり、前記方法は：
１）ＰＢＭＣまたは白血球の集団を、食品抗原または自己抗原で刺激するステップと、
２）食品抗原または自己抗原に特異的なＴｒ１細胞の集団を、刺激した細胞集団から回復するステップと
を含む。
【０００６】
白血球は、その重要性、その分布、その数、その生存期間、およびその可能性により特徴付けられるいくつかのタイプの細胞を包含する。これらのタイプは、以下の通りである：多核または顆粒白血球、その中に好酸球性、好中球性、および抗塩基球性の白血球、ならびに単核細胞、または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、が見出され、末梢血単核細胞は大型の白血球細胞であり免疫系の細胞型（リンパ球および単球）である。白血球またはＰＢＭＣは、当業者には知られている任意の方法により末梢血から分離することができる。有利には、ＰＢＭＣを分離するために、遠心分離、好ましくは密度勾配遠心分離、好ましくは不連続密度勾配遠心分離を用いることができる。一代替は特異的なモノクローナル抗体の使用である。ある実施形態では、典型的には、標準の手順を用いて、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅにより全血製品からＰＢＭＣを単離する。他の実施形態では、ＰＢＭＣを白血球搬出法により回収する。
【０００７】
「抗原特異的なＴｒ１細胞の集団」の表現における「抗原」の語は、免疫原性のペプチドを意味する。免疫原性のペプチドは、個体の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に結合することができ、前記個体のＴ細胞受容体によって認識されるペプチドである。
【０００８】
本出願で使用されるタンパク質、ポリペプチド、ペプチドの語は、より小さい基本であるアミノ酸の長鎖における結合により形成される分子を、分け隔てなく意味するものである。
【０００９】
「食品抗原」の語は、以下の非限定的なリストの食品抗原などの、食料品に由来する免疫原性のペプチドを意味する：ウシ血清、例えばリポカリン、Ｃａ結合性Ｓ１００、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリン、ウシ血清アルブミン、免疫グロブリン、またはカゼイン。食品抗原は、また、タイセイヨウサケ抗原、例えばパルブアルブミン、トリ抗原、例えばオボムコイド、オバルブミン、Ａｇ２２、コナルブミン、リゾチーム、またはトリ血清アルブミン、エビ抗原、例えばトロポミオシン、コムギ抗原、例えばアグルチニンまたはω−５グリアジン、セロリ抗原、例えばセロリプロフィリン、ニンジン抗原、例えばニンジンプロフィリン、リンゴ抗原、例えば、タウマチン、リンゴ脂質輸送タンパク質、リンゴプロフィリン、洋ナシ抗原、例えば、洋ナシプロフィリン、イソフラボンレダクターゼ、アボカド抗原、例えばエンドキチナーゼ、アンズ抗原、例えばアンズ脂質輸送タンパク質、モモ抗原、例えばモモ脂質輸送タンパク質またはモモプロフィリン、大豆抗原、例えばＨＰＳ、大豆プロフィリン、または（ＳＡＭ２２）ＰＲ−１０プロット（ｐｒｏｔ）。
【００１０】
「自己抗原」の語は、前記個体のタンパク質に由来する免疫原性のペプチドを意味する。例示によるものでは、これは以下の非限定的なリストの自己抗原であってよい：アセチルコリン受容体、アクチン、アデニンヌクレオチドトランスロケーター、β−アドレナリン受容体、芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ、アシオアログリコプロテイン（ａｓｉｏａｌｏｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）受容体、殺菌性／透過性増強タンパク質（ＢＰｉ）、カルシウム感知受容体、コレステロール側鎖切断酵素、コラーゲンＩＶ型αγ鎖、チトクロームＰ４５０  ２Ｄ６、デスミン、デスモグレイン、デスモグレイン−３、Ｆ−アクチン、ＧＭ−ガングリオシド、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、グルタミン酸受容体、Ｈ／Ｋ  ＡＴＰａｓｅ、１７−α−ヒドロキシラーゼ、２１−ヒドロキシラーゼ、ＩＡ−２（ＩＣＡＳ１２）、インスリン、インスリン受容体、１型内因子、白血球機能抗原１、ミエリン関連糖タンパク質、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンオリゴデンドロサイトタンパク質、ミオシン、Ｐ８０−コイリン（ｃｏｉｌｉｎ）、ピルビン酸脱水素酵素複合体Ｅ２（ＰＤＣ−Ｅ２）、ヨウ化ナトリウム共輸送体、ＳＯＸ−１０、甲状腺および眼筋共有タンパク質、チログロブリン、甲状腺ペルオキシダーゼ、チロトロピン受容体、組織トランスグルタミナーゼ、転写活性化補助因子ｐ７５、トリプトファンヒドロキシラーゼ、チロシナーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、ＡＣＴＨ、アミノアシル−ｔＲＮＡ−ヒスチジル合成酵素、カルジオリピン、カルボン酸脱水酵素ＩＩ、セブトロメア（ｃｅｂｔｒｏｍｅｒｅ）関連タンパク質、ＤＮＡ依存ヌクレオソーム刺激ＡＴＰａｓｅ、フィブリラリン、フィブロネクチン、グルコース６リン酸イソメラーゼ、β２−糖タンパク質Ｉ、ゴルジン（９５、９７、１６０、１８０）、熱衝撃タンパク質、半接着斑タンパク質１８０、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、ケラチン、ＩｇＥ受容体、Ｋｕ−ＤＮＡタンパク質キナーゼ、Ｋｕ−核タンパク質、Ｌａリンタンパク質、ミエロペルオキシダーゼ、プロテイナーゼ３、ＲＮＡポリメラーゼＩ〜ＩＩＩ、シグナル認識タンパク質、トポイソメラーゼＩ、チューブリン、ビメンシン（ｖｉｍｅｎｓｃｉｎ）、ミエリン関連オリゴデンドロサイト塩基性タンパク質（ＭＯＢＰ）、プロテオリピドタンパク質、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質（ＯＳＰ／クローディン１１）、環状ヌクレオチド３’ホスホジエステラーゼ（ＣＮＰａｓｅ）、ＢＰ抗原１（ＢＰＡＧ１−ｅ）、トランスアルドラーゼ（ＴＡＬ）、ヒトミトコンドリア自己抗原ＰＤＣ−Ｅ２（Ｎｏｖｏ１および２）、ＯＧＤＣ−Ｅ２（Ｎｏｖｏ３）、およびＢＣＯＡＤＣ−Ｅ２（Ｎｏｖｏ４）、水疱性類天疱瘡（ＢＰ）１８０、ラミニン５（ＬＮ５）、ＤＥＡＤ−ｂｏｘタンパク質４８（ＤＤＸ４８）、またはインスリノーマ関連抗原２。
【００１１】
細菌またはウィルスの抗原などは、「食品抗原または自己抗原」の表現から除外される。
【００１２】
アミノ酸の一配列から大部分構成される食品抗原または自己抗原は、アミノ酸の配列が知られている場合にはＦｍｏｃ法などの通常の技術により、または知られている組換えＤＮＡ技術により合成することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ（１９８９年）を参照）。いくつかの食品抗原または自己抗原は、また、市販されている（Ｓｉｇｍａ、Ｌ’Ｉｓｌｅ  ｄ’Ａｂｅａｕ、フランス）。食品抗原または自己抗原は、また、抽出することができる。
【００１３】
好ましくは、Ｔｒ１細胞の集団に特異的な食品抗原または自己抗原は、ＰＢＭＣの集団から獲得することができる。
【００１４】
より好ましくは、ＰＢＭＣまたは白血球の集団を、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ならびにインターロイキン−４（ＩＬ−４）およびインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）からなる群から選択される少なくとも１つのインターロイキンの存在下で、ステップ（１）の後、同じ抗原で少なくとも１回再刺激する。
【００１５】
食品抗原または自己抗原の刺激の頻度は、少なくとも１回、好ましくは数週間（通常約３週間）にわたり週１回、または５から１２日の間隔で数回である。培地の上清の一部分を抗原を含む新鮮なＰＢＭＣまたは白血球の培地の同量で交換することにより、複数の刺激を行うことができる。ＰＢＭＣまたは白血球の集団の再刺激に用いられるＩＬ−２およびＩＬ−４は、合成または組換えインターロイキンであってよく、当業者であればこのようなインターロイキンを得るための方法に広い経験がある（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒ  ｐｒｅｓｓ（１９８９年）を参照）。ＩＬ−２およびＩＬ−４は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈなどの様々な供給源から購入することができる。
【００１６】
好ましくは、食品抗原または自己抗原は組換えまたは合成の抗原である。
【００１７】
より好ましくは、食品抗原は、オバルブミン、カゼイン、ソヤタンパク質、それらのフラグメント、変異体および混合物を含む群から選択される。
【００１８】
本明細書において食品抗原または自己抗原の「変異体」の語は、天然の抗原とほとんど同一である抗原、および同じ生物学的活性を共有する抗原を意味する。天然の抗原とその変異体との間の、最小の相違は、例えば、アミノ酸の置換、欠失、および／または付加にある。このような変異体は、例えば、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されている、保存的アミノ酸置換を含むことができる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野では定義されており、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷の極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。
【００１９】
最も好ましくは、食品抗原は、配列番号２３の配列の鶏卵オバルブミン、配列番号２４の配列のウシαＳ１−カゼイン、配列番号２５の配列のウシβ−カゼイン、ならびに配列番号２３、配列番号２４、および配列番号２５の配列の１つと少なくとも７０％、好ましくは、７５、７７、８０、８２、８５、８７、９０、９２、９５、９６、９７、９８、９９％の同一性を有する配列を含む群から選択される。
【００２０】
別の好ましい一実施形態では、自己抗原は、インスリン、ミエリン塩基性タンパク質、それらのフラグメント、変異体、および混合物を含む群から選択される
本明細書で用いられる「食品抗原または自己抗原でＰＢＭＣまたは白血球の集団を刺激する」の表現は、抗原を、ＰＢＭＣまたは白血球の集団に加え、前記ＰＢＭＣまたは白血球の集団のＴ細胞と反応するように培養することを意味する。食品抗原または自己抗原に特異的なＴｒ１細胞の集団を生成するために、ＰＢＭＣまたは白血球の集団を、前記ＰＢＭＣまたは白血球の集団のＴ細胞における主要な活性化シグナルを誘発するのに適する形態で、本発明による抗原と接触させ、すなわち、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体によりＴ細胞においてシグナルが誘発されるように、抗原がＰＢＭＣまたは白血球の集団に提示される。例えば、抗原は、可溶性の形態で（ＰＢＭＣもしくは白血球により発現されるＭＨＣ分子と複合体を形成するために直接、または抗原は可溶性の、重合体の、もしくは表面（プラスチック、．．．）に結合した形態のＭＨＣ分子のいずれかに連結することができる）、あるいはＭＨＣ分子と伝導して抗原提示細胞（ＡＰＣ）により、ＰＢＭＣまたは白血球に提示され得る。Ｂ細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、または前記ＰＢＭＣもしくは白血球の集団のＴ細胞に抗原を提示することができる他の細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）を、抗原提示細胞がＰＢＭＣまたは白血球に抗原を提示するように、抗原（例えば、可溶性の抗原）の存在下で、ＰＢＭＣまたは白血球とインキュベートすることができる。あるいは、ＡＰＣを、抗原とプレインキュベートしてから、ＰＢＭＣまたは白血球に加えることができる。あるいは、食品抗原または自己抗原を発現する細胞をＰＢＭＣまたは白血球の集団とインキュベートすることができる。
【００２１】
好ましくは、ＰＢＭＣまたは白血球の集団の刺激は、マイクロプレートのウェル、細胞培養フラスコ、または細胞培養バッグで行う。用いることができるＰＢＭＣまたは白血球の培地は、当業者には非常によく知られており、例えば、ＰＢＭＣまたは白血球は、ヒト血清またはＸ−ｖｉｖｏ  １５（Ｃａｍｂｒｅｘ）で補ったＲＰＭＩ培地で刺激してもよい。
【００２２】
有利には、ステップ（１）で刺激したＰＢＭＣの集団は、０．０１．１０6から１００．１０6細胞／ｍＬまで、好ましくは０．２．１０6から５．１０6細胞／ｍＬまで、より好ましくは０．１．１０6から３．１０6細胞／ｍＬまで、さらにより好ましくは０．５．１０6から２．５．１０6細胞／ｍｌまで、最も好ましくは１０6から２．１０6細胞／ｍＬまでを含む。
【００２３】
より有利には、ステップ（１）において、ＰＢＭＣの集団の刺激に用いられる食品抗原または自己抗原は、０．１μｇ／ｍＬから５ｍｇ／ｍＬまで、好ましくは１から２００μｇ／ｍＬまでの可溶性の形態である。
【００２４】
しかし、ＰＢＭＣまたは白血球の集団の刺激に用いる食品抗原または自己抗原の特定の量は、用いる食品抗原または自己抗原次第であるということは、当業者には知られている。
【００２５】
別の特定の一実施形態では、ＰＢＭＣまたは白血球の集団を、ステップ（１）の刺激の前に、細胞蛍光測定法により決定することを可能にする細胞分裂蛍光マーカーとインキュベートし、刺激した細胞集団の蛍光強度が、ＰＢＭＣまたは白血球の集団の蛍光強度の２分の１以下であり、細胞分裂が前記の刺激された細胞の集団で起こり、ステップ（２）で回復した前記の刺激された細胞集団が抗原特異的なＴｒ１細胞の集団である。
【００２６】
このような方法では、蛍光マーカーを用いて細胞分裂をモニターすることが可能であり、当業者にはよく知られており、抗原特異的なＴｒ１細胞の集団を回復するステップ（２）で用いるのに非常に良好に好適である、というのは蛍光強度がＰＢＭＣまたは白血球の集団の蛍光強度の２分の１以下である、刺激された細胞の集団は、食品抗原または自己抗原に特異的なＴｒ１細胞の集団を含むからである。有利には、蛍光強度がＰＢＭＣまたは白血球の集団の蛍光強度の２分の１以下である、刺激された細胞の集団は、食品抗原または自己抗原に特異的なＴｒ１細胞の集団である。
【００２７】
好ましくは、細胞分裂蛍光マーカーは、カルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）マーカー、オレゴングリーン４８８カルボン酸二酢酸（Ｃａｒｂｏｘｙ−ＤＦＦＤＡ  ＳＥ）マーカー、またはＰＫＨ２６（発見者であるＰａｕｌ  Ｋａｒｌ  Ｈｏｒａｎ、ＰＫＨより）マーカーであり、全て、数ある中でもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎで市販されている。
【００２８】
ステップ（２）の食品抗原または自己抗原に特異的なＴｒ１細胞の集団の回復は、当業者にはよく知られている様々な方法により行うことができる。例えば、Ｔｒ１細胞は、Ｅｌｉｓａ、フローサイトメトリー、前記Ｔｒ１細胞のマーカーに対して向けられた標識された抗体での、例えば：
ＡＰＣ−複合した抗−ＣＤ４（ＲＰＡ−Ｔ４）−Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＡＰＣは、アロフィコシアニン）
ＰＣ５−複合した抗−ＣＤ３（ＵＣＨＴ−１）−Ｃａｌｔａｇ（ＰＣ５はフィコエリスリン−シアニン５）
ＰＥ−複合した抗−ＣＤ１８（６．７）−Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＰＥはフィコエリスリン）
ＦＩＴＣ−複合した抗−ＣＤ４９ｂ（ＡＫ−７）−Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、またはＰＥ−標識したマウス抗ヒトＣＤ４９ｂ（１２Ｆ１−Ｈ６）（ＦＩＴＣはフルオレセインイソチオシアネート）
でのイムノアフィニティークロマトグラフィーで同定および／または精製することができる。特異的なＴｒ１細胞のマーカーは、今では当業者にはよく知られており、国際特許出願ＷＯ２００５／０００３４４に十分に記載されている。
【００２９】
したがって、好ましい一実施形態では、抗原特異的なＴｒ１細胞の集団を、前記抗原特異的なＴｒ１細胞の集団の細胞の表面に存在するタンパク質に対して向けられている蛍光標識した抗体を用いて、細胞蛍光測定法によりステップ（２）で回復する。
【００３０】
ＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＩＦＮ−γの発現を測定し、Ｔｒ１細胞をそのサイトカイン発現プロファイルにより同定するために、ＥＬＩＳＡ試験および細胞内染色も用いることができる。当業者は通常このような方法を使用する。例えば、ステップ（１）の刺激の後に得られた上清を、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、およびＩＦＮ−γの発現に対して向けられたＮＩＰ−標識した抗体（ＮＩＰは、（４−ヒドロキシ−５−ヨード−３−ニトロフェニル）アセチル（ＮＩＰ））と接触させ、その後、ペルオキシダーゼ標識した抗−ＮＩＰ抗体およびＡＢＴＳを加えてもよい（ＡＢＴＳは２,２'−アジノ−ジ(３−エチル−ベンズチアゾリン−６−スルホネート））（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ミネソタ州、およびＣｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．、Ｅｍｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、カリフォルニア州より）。
【００３１】
好ましくは、抗原特異的なＴｒ１細胞の集団を、ステップ（２）で、クローニング技術、例えば有利には限界希釈によりにより回復する。このような技術は当業者にはよく知られており、本記載ではさらに公開しない。
【００３２】
抗原特異的なＴｒ１細胞の集団を回復するこれらの方法は、単独で、または組み合わせて使用してもよいことを想定しなければならない。例えば「ＣＦＳＥ法」を、細胞蛍光測定法と、またはクローニング限界希釈技術と組み合わせて用いてもよい。細胞蛍光測定法と、その後クローニング技術を用いることも可能である。
【００３３】
ＰＢＭＣまたは白血球の集団は、哺乳動物の集団であることが好ましい。これは、ヒト、および非ヒトの哺乳動物（イヌ、ネコ、マウス、ラット；家畜、および家禽などの農業の対象の動物など）であってよい。より好ましくは、ＰＢＭＣまたは白血球の集団はヒトの集団である。
【００３４】
有利には、本発明は、さらに：
３）Ｍｐ培地で、ステップ（２）で回復した抗原特異的なＴｒ１細胞の集団を拡張するステップ
を含む。
【００３５】
Ｍｐ培地は、それが前記抗原特異的なＴｒ１細胞の集団に好適であるならば、任意の種類であってよく、当業者であれば選択は容易である（シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ'ｓ）培地、無血清培地、．．．）。
【００３６】
本出願において「拡張」、「増殖」、および「成長」の語は、交換可能に使用することができ、細胞集団における増大する数の細胞を意味する。好ましくは、抗原特異的なＴｒ１細胞の集団は指数関数的に拡張する。
【００３７】
有利には、ステップ（３）の抗原特異的なＴｒ１細胞の集団の拡張は、前記細胞の集団を、ＩＬ−２およびＩＬ−４の存在下でＣＤ３＋ＣＤ２８ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｌ、Ｏｓｌｏ、ノルウェーから購入）と接触させることにある。
【００３８】
特に有利な一実施形態では、抗原特異的なＴｒ１細胞の集団を拡張するステップ（３）が、Ｍｐ培地における因子のグループの存在を必要とし、前記拡張ステップが、
ａ）温度Ｔ1で、Ｍｆ培地で前記グループの因子を発現することができるフィーダー細胞を培養するステップであって、このＴ1が、前記フィーダー細胞の増殖を可能にするステップと、
ｂ）そのＭｆ培地を除いた、またはＭｆ培地のないステップ（ａ）で得たフィーダー細胞を、Ｍｐ培地に含まれる抗原特異的なＴｒ１細胞の集団と接触させるステップであって、ここで、抗原特異的なＴｒ１細胞の集団、フィーダー細胞、およびＭｐ培地を含む混合物を得るために、前記Ｍｐ培地は、因子のグループを最初に含んでいないステップと、
ｃ）Ｍｐ培地において、フィーダー細胞によって発現されているグループの因子を含むステップ（ｂ）で得られた混合物を培養するステップであって、ここで、
抗原特異的なＴｒ１細胞の集団が増殖し、
フィーダー細胞が増殖しないように
培養する前記ステップ（ｃ）を少なくとも約３５℃である温度Ｔ2で行い、
抗原特異的なＴｒ１細胞の集団を拡張するステップと、
ｄ）そのように拡張した抗原特異的なＴｒ１細胞の集団を回復するステップと
を含む。
【００３９】
フィーダー細胞を抗原特異的なＴｒ１細胞の集団に加える場合（ステップ（ｂ））、［フィーダー細胞：抗原特異的なＴｒ１細胞の集団］の比は重要ではない。有利には、この比は［１：１］であってよい。
【００４０】
フィーダー細胞は、少なくとも約３５℃であり、抗原特異的なＴｒ１細胞の集団の培養温度Ｔ2で増殖しないのであれば、任意のタイプであってよい。
【００４１】
「少なくとも約３５℃」の表現は、温度が３５℃より０．１℃下から（３４．９℃から３５℃まで）変化してよいことを意味する。当業者であればとにかく温度のこのような最小の変動を知っている。
【００４２】
細胞培養に広い経験のある当業者であれば、用いるべき特定の条件、特に、各々のフィーダー細胞の集団および抗原特異的なＴｒ１細胞の集団の至適培養温度Ｔ1およびＴ2を知っている。Ｍｆ培地は、それが前記フィーダー細胞のタイプに好適であるならば任意の種類であってよく、当業者であれば選択は容易である（シュナイダー培地、．．．）。
【００４３】
ステップ（ｂ）のフィーダー細胞の抗原特異的なＴｒ１細胞の集団との接触、およびステップ（ｃ）の温度Ｔ2での混合物の培養は、通常、同時のステップであると考えるべきであり、接触前、フィーダー細胞と抗原特異的なＴｒ１細胞の集団は、それぞれ一方はＭｆ培地で温度Ｔ1で、他方はＭｐ培地で温度Ｔ2で別々に培養される。次いで、フィーダー細胞「単独」、またはフィーダー細胞を含むＭｆ培地を、そのＭｐ培地に存在し、温度Ｔ2で培養される抗原特異的なＴｒ１細胞の集団と接触させる。その結果、フィーダー細胞によって発現される因子のグループのおかげで拡張する、抗原特異的なＴｒ１細胞の集団と異なり、フィーダー細胞は温度Ｔ1から温度Ｔ2に即座に通過し、止まって増殖する。
【００４４】
長時間、例えば、少なくとも２または３カ月の間、フィーダー細胞を定期的に、例えば毎週、前記抗原特異的なＴｒ１細胞の集団と接触させることにより、抗原特異的なＴｒ１細胞の集団のｉｎ  ｖｉｔｒｏの指数関数的な成長を維持することが可能である。
【００４５】
より有利には、フィーダー細胞は、フィーダー細胞の培養にそれ以上好適ではない温度Ｔ2のために、ステップ（ｃ）の間に死滅する。最も有利には、フィーダー細胞の死滅によってもたらされる前記細胞の細胞膜のフラグメントを、ステップ（ｄ）で除去する。
【００４６】
ステップ（ｃ）で、抗原特異的なＴｒ１細胞の集団を培養する十分な時間、例えば、好ましくは数時間の後、得られたＭｐ培地は抗原特異的なＴｒ１細胞の集団、生存可能なフィーダー細胞、および場合によりフィーダー細胞の細胞膜のフラグメントの混合物からなり、拡張された抗原特異的なＴｒ１細胞の集団をステップ（ｄ）で回復しなければならない。このような回復は、生存可能なフィーダー細胞、および場合により前記細胞膜のフラグメントから抗原特異的なＴｒ１細胞の集団を、当業者にはよく知られている任意の好適な分離方法、例えば、フィーダー細胞の表面で結合することができる特異的な標識されたリガンド、または抗原特異的なＴ細胞の集団の細胞表面タンパク質を用いて、フローサイトメトリーなどを用いて分離することにより行うことができる。他の方法、例えば、洗浄方法、および／または、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）などの分離培地を用いた密度勾配遠心分離などの遠心分離も使用することができ、このような遠心分離は、細胞膜のフラグメントを除去するのに好適な方法である。
【００４７】
拡張された抗原特異的なＴｒ１細胞の集団を哺乳動物に投与することが企図される場合にはなおさら、フィーダー細胞の細胞膜のフラグメントの除去は強制ではないが推奨されるものであることに留意しなければならない。そうでないと、前記の拡張された抗原特異的なＴｒ１細胞の集団が汚染される危険性がある。
【００４８】
有利には、因子のグループは、フィーダー細胞の細胞膜に固定される因子、および前記フィーダー細胞によって分泌される因子を含む。より有利には、前記グループの因子は、拡張するべき抗原特異的なＴｒ１細胞の集団の細胞表面タンパク質と相互作用する。
【００４９】
フィーダー細胞をステップ（ａ）で培養する場合、フィーダー細胞はその細胞膜表面でグループのいくつかの因子を、Ｍｆ培地でいくつかの他の因子を発現する。ステップ（ｂ）の接触では、「膜因子」はフィーダー細胞の膜にすでに固定されているが、フィーダー細胞がそのＭｆ培地から予め除去されている場合は「分泌因子」を除去してもよい。いずれにしても、フィーダー細胞がそれ以上増殖しない場合でも、前記フィーダー細胞が死滅するまで、「膜因子」および「分泌因子」の両方が、ステップ（ｃ）でフィーダー細胞により発現される。死滅したフィーダー細胞の細胞膜のフラグメントに固定されている「膜因子」が、抗原特異的なＴｒ１細胞の集団の生成で依然として役割を担っていることもあり得る。
【００５０】
拡張された抗原特異的なＴｒ１細胞の集団は、その拡張を可能にする細胞のシグナルに結び付けられている細胞表面タンパク質を有する。このような細胞表面タンパク質は、本発明ではフィーダー細胞により提供される特定のリガンド、または因子のおかげで活性化され、フィーダー細胞は抗原特異的なＴｒ１細胞の集団の拡張を可能にする因子のグループを発現する。当業者であれば、このような因子が抗原特異的なＴｒ１細胞の集団の細胞表面タンパク質と相互作用するように、フィーダー細胞が発現しなければならない特定の因子を知っている。
【００５１】
さらにより好ましくは、フィーダー細胞は組換え細胞であり、前記グループの因子をコードする異種核酸を含む。
【００５２】
「組換え細胞」または「組換えフィーダー細胞」の表現は、前記細胞においてグループの因子をコードする異種核酸を導入することを意味する。このような導入は、電気穿孔、リン酸カルシウム沈降、ＤＥＡＥ−デキストラン処置、リポフェクション、マイクロインジェクション、およびウィルスベクターでの感染を含む、核酸のフィーダー細胞中への導入に有用な様々な技術を包含する。このような適切な方法は、当業者には非常によく知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ（１９８９年））に見ることができる。導入すべき核酸は、例えば、拡張すべき抗原特異的なＴｒ１細胞の集団の細胞表面タンパク質との相互作用を受けやすい因子をコードする遺伝子を包囲するＤＮＡ、ゲノムのＤＮＡフラグメント、センス鎖のＲＮＡ、またはこのような遺伝子をコードするｃＤＮＡを含む組換え発現ベクターであってよい。異種核酸は、全長の因子をコードすることができ、あるいは、フィーダー細胞中に導入される場合は、本発明にしたがって抗原特異的なＴｒ１細胞の集団の生成を可能にするのに十分であるそのペプチドフラグメントをコードすることができる。核酸は、抗原特異的なＴｒ１細胞の集団の細胞表面タンパク質の天然のリガンド（共刺激タンパク質）、またはそのフラグメント、またはリガンドもしくはそのフラグメントの修飾された形態をコードすることができる。本発明は、抗原特異的なＴｒ１細胞の集団の拡張を増強する能力を保持する因子の、フラグメント、突然変異体、または変異体（例えば修飾された形態）の使用を含むことが企図される。因子の「変異体」は、天然のリガンドと著しい相同性を共有するタンパク質、および抗原特異的なＴｒ１細胞の集団の拡張に結び付けられるタンパク質を意味する。生物学的に活性な、または生物学的に活性な形態のタンパク質の語は、抗原特異的なＴｒ１細胞の集団の拡張をもたらすことができる因子の形態を含む。当業者であれば、フィーダー細胞において因子をコードする核酸を導入する際に、細胞の拡張を増強するその能力に基づいてそのような因子の変異体を選択することができる。因子の特定の変異体が抗原特異的なＴｒ１細胞の集団の拡張を増強する能力は、例えば、任意の知られているアッセイまたは方法により組換えフィーダー細胞を非組換えフィーダー細胞と比べることにより、容易に決定することができる。さらに、当業者であれば、因子の主要なアミノ酸配列における変更は、タンパク質が抗原特異的なＴｒ１細胞の集団の拡張を可能にする能力を著しく損なうことなしに許容されると考えられることを理解するであろう。したがって、比較可能な天然の因子の天然に存在するアミノ酸配列に比べてアミノ酸の置換、欠失、および／または付加を有する因子の変異体は、本明細書に記載する天然型の因子の機能上の活性を依然として保持しており、やはり本発明に包含される。このような変異体は、例えば保存的なアミノ酸の置換を含むことができる（上記を参照）。
【００５３】
核酸は、因子の発現に適する形態であり、前記の形態は、遺伝子の転写および翻訳に必要とされるコード配列および制御配列を全て含んでおり、プロモーター、エンハンサー、およびポリアデニル化シグナル、ならびにＮ末端シグナル配列を含む、場合により因子をフィーダー細胞の表面に輸送するのに必要な配列を含むことができる。制御配列は、また、構成性の、または誘導性の転写をもたらすように選択することもできる。フィーダー細胞の表面における因子の発現は、細胞を免疫蛍光染色することにより確認することができる。例えば、細胞を、共刺激分子に対して反応性の蛍光標識したモノクローナル抗体で、または因子に結合する蛍光標識した可溶性の受容体で染色してもよい。フィーダー細胞が発現する因子を非常によく知っている当業者であれば、フィーダー細胞が発現する因子を認識する好適なモノクローナル抗体も知っている。あるいは、因子に結合する標識した可溶性のリガンドタンパク質を用いて、フィーダー細胞表面上のそれらの発現を検出することができる。当業者であれば、免疫蛍光染色した細胞を検出するために使用される技術および装置を非常によく知っており、好ましくは、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）が検出に用いられる。
【００５４】
因子をコードする核酸が調節エレメントに操作可能に連結している場合、これは、典型的には、例えばプラスミドおよびウィルスを含むベクターで運ばれる。したがって、調節コントロールエレメントに操作可能に連結している、本発明の因子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を、本明細書では「発現ベクター」とも呼ぶ。発現ベクターは、形質転換されるべきフィーダー細胞のタイプを基準として選択される。例えば、フィーダー細胞がショウジョウバエの昆虫のフィーダー細胞である場合、培養した昆虫細胞においてタンパク質の発現に利用可能な、ショウジョウバエの構成的なベクターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら、(１９８３年）、Ｍｏｌ.Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、３巻、２１５６〜２１６５頁）、およびｐＶＬシリーズ(Ｌｕｃｋｌｏｗ,Ｖ.Ａ.、およびＳｕｍｍｅｒｓ,Ｍ.Ｄ.、(１９８９年)、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７０巻、３１〜３９頁)が含まれる。
【００５５】
さらに、フィーダー細胞は、その表面にいかなる内因性のクラスＩおよび／またはＩＩの主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子も有さないことが好ましい。これは、これらの細胞が、遺伝的に形質転換されていなければ、天然にＭＨＣ分子を発現しないことを意味する。フィーダー細胞の表面にこれらの内因性のクラスＩおよび／またはＩＩ  ＭＨＣ分子が存在しないことは、フィーダー細胞と抗原特異的なＴｒ１細胞の集団との間の同種間の反応を避けるのにきわめて重要である。その結果、本発明のフィーダー細胞を用いて、短時間で任意のドナーからの抗原特異的なＴｒ１細胞の集団を拡張することができる。
【００５６】
より特定の一実施形態では、ステップ（ｂ）でフィーダー細胞がそのＭｆ培地から除去される。
【００５７】
好ましくは、フィーダー細胞は昆虫のフィーダー細胞であり、Ｔ1がＴ2よりも低い。
【００５８】
本発明では、それが上記の条件を満たすのであれば、任意の好適な昆虫のフィーダー細胞を用いることができる。例えば、Ｓｆ９（数ある中で、ＡＴＣＣにＣＲＬ１７１１番で、またはＤＳＭＺにＡＣＣ１２５番で寄託され、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、米国により市販されてもいる）、Ｓｆ２１（数ある中でＤＳＭＺにＡＣＣ１１９番で寄託され、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、米国により、やはり市販されている）、またはＳ２細胞系の昆虫のフィーダー細胞であってよい。好ましくは、昆虫のフィーダー細胞はＳ２ショウジョウバエ細胞系由来である。Ｓ２ショウジョウバエ細胞系は当業者にはよく知られており、先行技術に広く開示されている。Ｓ２ショウジョウバエ細胞系は市販されており（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、フランス、など．．．）、特にＧｅｒｍａｎ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｅｌｌｓ  ＤＳＭＺ（「Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ」）にＡＣＣ１３０番で寄託されており、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ｊ  Ｅｍｂｒｙｏｌ  Ｅｘｐ  Ｍｏｒｐｈｏｌ、２７巻、１９７２年、３５３ページに公開されており、これはアメリカ培養細胞系統保存機関ＡＴＣＣにＣＲＬ１９６３番でやはり寄託されている。好ましくは、昆虫のフィーダー細胞は、２００５年３月２５日に、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＮＣＭ、Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、パリ）にＩ−３４０７番で寄託されているＳ２ショウジョウバエ細胞系由来である。
【００５９】
哺乳動物の細胞の集団、およびここでは抗原特異的なＴｒ１細胞の集団が拡張される場合に、昆虫のフィーダー細胞を使用することによってもたらされる大きな利点は、（１）フィーダー細胞および哺乳動物の細胞は、同じ温度で増殖せず（Ｔ1はＴ2より低く、Ｔ2は少なくとも約３５℃である）、（２）哺乳動物のウィルスは昆虫のフィーダー細胞では増殖せず、したがって抗原特異的なＴｒ１細胞の集団の、フィーダー細胞から可能なウィルス汚染を回避することである。
【００６０】
最も好ましくはＭｐ培地は無血清培地である。培地は、いかなる生物学的な汚染もなく、例えば市販されている無血清培地（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｋｅｒｓｖｉｌｌ、メリーランド州からのＸＶＩＶＯ−１５、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＡＩＭ  Ｖ培地）が好ましい。
【００６１】
最も好ましくはＭｆ培地は無血清培地である。培地は、いかなる生物学的な汚染もなく、例えばよく知られており市販されている無血清培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、メリーランド州により市販されている無血清シュナイダー培地、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって市販されているＳＦＭなどのＧＩＢＣＯ（登録商標）無血清昆虫細胞培地、またはＫｒａｃｋｅｌｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．、米国により市販されているＩｎｓｅｃｔａｇｒｏ（登録商標）無血清培地など．．．）が、細胞集団Ｐのその後の汚染を避けるために好ましい。
【００６２】
より有利には、フィーダー細胞は、拡張されるべき抗原特異的なＴｒ１細胞の集団の以下の細胞表面タンパク質：
ＣＤ３／ＴＣＲタンパク質複合体、
ＣＤ２８タンパク質、
ＣＤ２タンパク質、
インターロイキン−２（ＩＬ−２）受容体、および
インターロイキン−４（ＩＬ−４）受容体
と相互作用をする組換え因子のグループを発現する組換えフィーダー細胞である。
【００６３】
実際、抗原特異的なＴｒ１細胞の集団を拡張するために、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体（ＴＣＲはＴ細胞受容体であり、ＣＤは細胞分化抗原である）の刺激が、Ｔ細胞における主要な活性化シグナルの送達に必要とされている。抗−ＣＤ３モノクローナル抗体を、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体、有利には修飾された抗−ＣＤ３抗体によるＴ細胞の集団の活性化に用いることができ、この場合抗−ＣＤ３抗体の修飾は、細胞質内ドメインの膜貫通ドメインとの置換にあり、したがって前記修飾された抗−ＣＤ３抗体はフィーダー細胞の細胞膜を固定しており、Ｔ細胞のＣＤ３／ＴＣＲタンパク質複合体と相互作用をする。
【００６４】
さらに、Ｔ細胞の表面上の数々のタンパク質は、同じ意味に「共刺激分子」または「補助刺激因子」と呼ばれ、休止期のＴ細胞の芽細胞への形質転換への移行、およびその後の増殖および分化の調節に結び付けられている。したがって、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体によりもたらされる主要な活性化シグナルに加えて、Ｔ細胞の反応を誘導することは、第２の共刺激シグナルを必要とする。１つの共刺激または付属の分子であるＣＤ２８は、ＴＣＲ複合体によって刺激されるものと異なるシグナル伝達経路を開始し、または調節すると考えられている。
【００６５】
抗原特異的なＴｒ１細胞の表面に存在し、フィーダー細胞により発現されるＣＤ２８タンパク質と相互作用をする因子は、ＣＤ２８分子と架橋結合することができる抗−ＣＤ２８モノクローナル抗体またはそのフラグメントであってよく、この場合、膜貫通ドメインがフィーダー細胞の細胞表面に固定する目的で膜貫通ドメインを加えることにより、抗−ＣＤ２８モノクローナル抗体の修飾が想定され得る。好ましくは、ＣＤ２８に対する天然のリガンド、すなわち、例えばＢ７−１（ＣＤ８０）およびＢ７−２（ＣＤ８６）タンパク質などのＢ７ファミリーのタンパク質のメンバーが、抗−ＣＤ２８モノクローナル抗体の代わりに使用される。
【００６６】
別の共刺激分子であるＣＤ２は、抗原特異的なＴｒ１細胞の集団の拡張を可能にする細胞シグナルと結び付けられている。同様に、ＣＤ２と相互作用するフィーダー細胞により発現される因子は、ＣＤ２分子と架橋結合することができる抗−ＣＤ２モノクローナル抗体またはそのフラグメントであってよく、フィーダー細胞の細胞表面に固定するために、膜貫通ドメインを加えることにより、抗−ＣＤ２モノクローナル抗体の修飾が想定され得る。好ましくは、抗−ＣＤ２モノクローナル抗体の代わりに、ＣＤ２に対する天然のリガンド、すなわちＣＤ５８タンパク質が使用される。
【００６７】
フィーダー細胞の細胞膜に固定されている因子の他に、インターロイキンなど、分泌される因子が、抗原特異的なＴｒ１細胞の集団の拡張に、やはり必要とされている。これらインターロイキンの中には、抗原特異的なＴｒ１細胞の表面に存在するＩＬ−２受容体と相互作用するＩＬ−２、および抗原特異的なＴｒ１細胞のＩＬ−４受容体と相互作用するＩＬ−４またはＩＬ−１３のいずれかがある。
【００６８】
最も有利には、組換え因子のグループは、
抗−ＣＤ３抗体の修飾が抗−ＣＤ３重鎖の抗−ＣＤ３細胞質内ドメインの、膜貫通ドメインでの置換にあり、前記修飾された抗−ＣＤ３抗体はフィーダー細胞の細胞膜に固定されており、Ｔ細胞のＣＤ３／ＴＣＲタンパク質複合体との相互作用を受けやすい、修飾された抗−ＣＤ３抗体またはその変異体、
Ｔ細胞のＣＤ２８タンパク質との相互作用を受けやすい、フィーダー細胞の細胞膜に固定されている、ＣＤ８０またはＣＤ８６タンパク質、好ましくはＣＤ８０タンパク質、またはその変異体、および
Ｔｒ１細胞のＣＤ２タンパク質との相互作用を受けやすい、フィーダー細胞の細胞膜に固定されているＣＤ５８タンパク質、またはその変異体、
Ｔｒ１細胞のＩＬ−２受容体との相互作用を受けやすい、フィーダー細胞により分泌されるＩＬ−２、またはその変異体、および
インターロイキンがフィーダー細胞により分泌され、Ｔｒ１細胞のＩＬ−４受容体との相互作用を受けやすい、ＩＬ−４およびインターロイキン１３（ＩＬ−１３）を含む群から選択されるインターロイキン、好ましくはＩＬ−４、またはその変異体、
を含む。
【００６９】
好ましくは、抗−ＣＤ３抗体の重鎖の細胞質内のドメインに置換する膜貫通ドメインは、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）の膜貫通ドメインである。
【００７０】
フィーダー細胞が発現する因子は任意の起源であってよい。好ましくは、これらは、それから抗原特異的なＴｒ１細胞の集団が獲得されるＰＢＭＣまたは白血球の集団のものと同じ起源のものである。より有利には、ＰＢＭＣまたは白血球の集団はヒト集団である。最も好ましくは、前記グループの因子はヒト起源である。
【００７１】
好ましくは、修飾された抗−ＣＤ３抗体の軽鎖は、配列番号１の配列の異種核酸、または配列番号１と少なくとも７０％の同一性を有する任意の核酸によってコードされ、修飾された抗−ＣＤ３抗体の重鎖が配列番号２の配列の異種核酸、または配列番号２に少なくとも７０％の同一性を有する任意の核酸によってコードされる。
【００７２】
より好ましくは、ＣＤ８０タンパク質は、配列番号３の配列の異種核酸、または配列番号３と少なくとも７０％の同一性を有する任意の核酸によってコードされる。
【００７３】
有利には、ＣＤ８６タンパク質は、配列番号４の配列の異種核酸、または配列番号４と少なくとも７０％の同一性を有する任意の核酸によってコードされる。
【００７４】
さらにより好ましくは、ＣＤ５８タンパク質は、配列番号６の配列の異種核酸、または配列番号６と少なくとも７０％の同一性を有する任意の核酸によってコードされる。
【００７５】
好ましい一実施形態では、ＩＬ−２は、配列番号５の配列の異種核酸、または配列番号５と少なくとも７０％の同一性を有する任意の核酸によってコードされる。
【００７６】
有利には、ＩＬ−４は、配列番号７の配列の異種核酸、または配列番号７と少なくとも７０％の同一性を有する任意の核酸によってコードされる。
【００７７】
より有利には、ＩＬ−１３は、配列番号８の配列の異種核酸、または配列番号８と少なくとも７０％の同一性を有する任意の核酸によってコードされる。
【００７８】
「配列番号Ｘと少なくとも７０％の同一性を有する核酸分子」の表現は、前記配列番号Ｘの配列と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、または９９％の同一性を有する任意の配列を意味する。
【００７９】
一般的には、拡張すべき抗原特異的なＴｒ１細胞の集団を数時間、例えば１２時間、好ましくは２４時間の培養後、より好ましくは４８時間培養後、それ以上生存可能なフィーダー細胞は、Ｍｐ培地には存在しない。有利には、拡張された抗原特異的なＴｒ１細胞の集団を、フィーダー細胞が全て死滅したときに回復し、これにより、第一に、より大きく拡張した抗原特異的なＴｒ１細胞の集団を獲得し、第二に、フィーダー細胞の細胞膜のフラグメントを除去することにより、例えば、上記に公開したように、洗浄法および／または密度勾配遠心分離により除去することにより、抗原特異的なＴｒ１細胞の集団を迅速かつ容易に回復することが可能になる。
【００８０】
したがって、好ましい一実施形態では、非常に拡張された抗原特異的なＴｒ１細胞の集団を、少なくとも１２時間、有利には２４時間の間、ステップ（ｃ）で抗原特異的なＴｒ１細胞の集団を培養した後、ステップ（ｄ）で回復する。
【００８１】
本発明における２つの核酸（または核酸配列）または２つのプロテイック（ｐｒｏｔｅｉｃ）配列間の同一性パーセントは、最善のアラインメント後に得られた、比較すべき２配列間の同一のヌクレオチドまたはアミノ酸のパーセント値を意味し、このパーセント値は、純粋に統計上のものであり、２配列間の相違はランダムに分布し、全てその全長上にある。最善のアラインメントまたは最適のアラインメントは、比較すべき２配列間の同一性の最高のパーセント値に対応するアラインメントであり、これは本明細書で以降のように計算される。２つの核酸または２つのプロテイック配列間の配列比較は、それらの最適のアラインメント後にこれらの配列を比較することにより通常行い、前記の比較は、配列の類似性の局所領域を同定し、比較するために、１セグメントに対して、または１つの「比較ウィンドウ」に対して行う。比較のための配列の最適のアラインメントは、手作業により、またはＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１年）（Ａｄ.Ａｐｐ.Ｍａｔｈ．、２巻、４８２頁）の局所的ホモロジーのアルゴリズムにより、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０年）（Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.、４８巻、４４３頁）の局所的なホモロジーのアルゴリズムにより、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８年）（Ｐｒｏｃ.Ｎａｔｌ.Ａｃａｄ.Ｓｃｉ.ＵＳＡ．、８５巻、２４４４頁）の同様の調査方法により、これらのアルゴリズムを用いたコンピュータソフトウェア（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）により行うことができる。２つの核酸配列間または２つのプロテイック配列間の同一性パーセント値は、これら２つのアラインされた配列を、最適の様式で、核酸配列またはプロテイック配列の比較すべき領域がこれら２配列間の最適アラインメントに対する参照配列に関して付加または欠質を含むことができる「比較ウィンドウ」と比較することによって決定する。２配列間でヌクレオチドまたはアミノ酸が同一である位置の数を決定することにより、同一の位置の数を「比較ウィンドウ」における位置の総数で除することにより、および、これら２つの配列間の同一性のパーセントを得るために、得られた結果に１００をかけることにより同一性パーセント値が計算される。
【００８２】
フィーダー細胞を用いて本発明にしたがって抗原特異的なＴｒ１細胞の集団を拡張するステップ（３）は、以下の利点をもたらす：
フィーダー細胞の拡張システムは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで少なくとも２または３カ月間、抗原特異的なＴｒ１細胞の集団の指数関数的な成長を維持することができ、
フィーダー細胞は、同種間の反応を避けるために、ＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子を欠き、
フィーダー細胞にはマイコプラズマフリーであり、
フィーダー細胞は、無血清培地を用いて良好に成長することができ、
フィーダー細胞は、照射を必要とせず、
フィーダー細胞は、哺乳動物のウィルスの拡張を許さず、
拡張された抗原特異的なＴｒ１細胞の集団は、注射の目的に対して非常に良好に特徴付けられる。
【００８３】
本発明を以下の図面および実施例においてさらに記載する。これらの図面および実施例は、説明の目的で提供するにすぎず、添付の特許請求の範囲の範囲を限定することを意図するものではない。様々な筋書きが、多くの実際的な場合に関連し、当業者には単に例示を意図するにすぎない。したがって、本発明は、本明細書に提供する教示の結果として明らかになる任意の、かつ全ての変形形態を包含するものと解釈すべきである。
【００８４】
図の説明
図１は、ＣＤ４+ＣＤ１８brightＣＤ４９ｂ+Ｔｒ１細胞は、食品抗原に反応し、リコール抗原に反応しないで増殖することを示す図である。
Ａ）精製したＣＤ４＋Ｔ細胞（灰色バー）、ＣＤ４＋ＣＤ１８ｂｒｉｇｈｔＣＤ４９ｂ＋Ｔｒ１細胞（白色バー）、およびＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４９ｂ−メモリーＴ細胞を、自己由来の精製した単球の存在下で、破傷風毒素（１０μｇ／ｍＬ）、ＰＰＤ（２０μｇ／ｍＬ）、または抗−ＣＤ３＋抗ＣＤ２８ｍＡｂ（１０μｇ／ｍＬ）で刺激した。５日目に、チミジンの組入れにより増殖を分析した。Ｂ）Ａにおけるのと同じ集団を、オバルブミン（ＯＶＡ、２０μｇ／ｍＬ）、カゼイン（２０μｇ／ｍＬ）、またはソヤ（ｓｏｙａ）タンパク質の混合物（Ｓｏｙａ）、５０μｇ／ｍＬで刺激した。結果は、１０名の異なる患者の増殖反応の平均を表している。
【００８５】
図２は、ＣＤ４+ＣＤ１８brightＣＤ４９ｂ+Ｔ細胞は、食品抗原に対して増殖し、ワクチン抗原に対して増殖しないことを示す図である。
ＣＤ４+Ｔ細胞、または精製したＣＤ４+ＣＤ４５ＲＯ+ＣＤ４９ｂ-、またはＣＤ４+ＣＤ１８+ＣＤ４９ｂ+をＣＦＳＥで標識し、示してあるように、ワクチン抗原（ＰＰＤ、精製タンパク質誘導体：ツベルクリン、ＴＴ：破傷風毒素）、または食品抗原（ＯＶＡ：オバルブミン、カゼインまたはＳｏｙａタンパク質）のいずれかの異なる抗原で刺激した。８日後、細胞を細胞蛍光測定法により分析し、分裂した細胞のパーセント値をＣＦＳＥの発現の低減により分析した。ＣＦＳＥlow細胞のパーセント値を、各象限に示してある。
【００８６】
図３は、食品抗原に特異的なＣＤ４+増殖性Ｔ細胞はＴｒ１サイトカイン特性の表現型を有することを示す図である。
ＣＤ４+Ｔ細胞をＣＦＳＥで標識し、示してあるワクチン（ＰＰＤ、ＴＴ）、または食品（ＯＶＡ、Ｓｏｙａ、カゼイン）抗原で刺激した。ＣＦＳＥlowＣＤ４+Ｔ細胞を精製し、抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８ｍＡｂで再刺激し、４８時間後に上清をＥＬＩＳＡにより分析して示したサイトカインの量を測定した。食品抗原に特異的な増殖性ＣＤ４+Ｔ細胞は、ＩＬ−１０highＩＬ−４-ＩＦＮ−ｇ+/-、ＩＬ−５+/-、ＩＬ−２-分泌レベルを有するＴｒ１表現型を提示し、一方、リコール抗原特異的なＴ細胞はＩＦＮ−γ分泌の高いＴｈ１表現型を提示した。
【００８７】
図４は、ＣＤ４+ＣＤ１８brightＣＤ４９ｂ+Ｔ細胞は、自己抗原およびＴｒ１サイトカイン表現型を提示した自己抗原特異的細胞に対して増殖することを示す図である。
ＣＤ４+Ｔ細胞、または精製したＣＤ４+ＣＤ４５ＲＯ+ＣＤ４９ｂ-、またはＣＤ４+ＣＤ１８+ＣＤ４９ｂ+をＣＦＳＥで標識し、示してあるように、自己抗原（ＭＢＰ：ミエリン塩基性タンパク質）、またはインスリンで刺激した。８日後、細胞を細胞蛍光測定法により分析し、分裂した細胞のパーセント値をＣＦＳＥの発現の低減により分析した。ＣＦＳＥlow細胞のパーセント値を、各象限に示してある。ＣＦＳＥlow細胞を精製し、抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８ｍＡｂで再刺激し、４８時間後、上清をＥＬＩＳＡにより分析して、示されているサイトカインの量を測定した。自己抗原特異的な増殖性ＣＤ４+Ｔ細胞は、ＩＬ−１０highＩＬ−４-ＩＦＮ−γ+/-、ＩＬ−５+/-、ＩＬ−２-分泌レベルのＴｒ１表現型を提示した。
【００８８】
図５は、Ｔｒ１細胞は、試験した抗原に対する自己免疫疾患またはアレルギー性疾患に罹患している患者で観察することができることを示す図である。
ＣＤ４+Ｔ細胞、または精製したＣＤ４+ＣＤ４５ＲＯ+ＣＤ４９ｂ-、またはＣＤ４+ＣＤ１８+ＣＤ４９ｂ+を、示してあるように、多発性硬化症（ＭＳ）またはカゼインに対するアレルギーに罹患している患者から単離し、ＣＦＳＥで標識し、自己抗原（ＭＢＰ：ミエリン塩基性タンパク質）、またはカゼイン、または示してあるように陽性コントロールとして結核菌からの精製したプロテインド（ｐｒｏｔｅｉｎｄ）誘導体（ＰＰＤ）で刺激した。８日後、細胞を細胞蛍光測定法により分析し、分裂した細胞のパーセント値をＣＦＳＥの発現の低減により分析した。ＣＦＳＥlow細胞のパーセント値を、各象限で示してある。ＣＦＳＥlowＴ細胞を精製し、抗−ＣＤ３および抗−ＣＤ２８ｍＡｂで再刺激し、４８時間後、上清をＥＬＩＳＡにより分析して、示してあるサイトカインの量を測定した。
【００８９】
図６は、食品抗原特異的なＴｒ１細胞は、ＩＬ−２単独に反応して増殖しなかったが、ＩＬ−２およびＩＬ−４に反応して活発に増殖したことを示す図である。
ＣＤ４+Ｔ細胞をＣＦＳＥで標識し、示してある抗原で刺激し、図３におけるように精製した。次いで、精製した細胞を、ＩＬ−２単独（１μｇ／ｍＬ）、またはＩＬ−２およびＩＬ−４（それぞれ１μｇ／ｍＬおよび５００ｎｇ／ｍＬ）の存在下で拡張した。次いで、異なる条件下での細胞数を測定し、開始後の日数に対してプロットした。リコール抗原Ｔ細胞は、ＩＬ−２、ならびにＩＬ−２およびＩＬ−４の組合せに反応して増殖し、一方、食品抗原特異的なＴｒ１細胞は、ＩＬ−２およびＩＬ−４サイトカインの組合せに対してのみ増殖した。
【００９０】
図７は、ＩＬ−２およびＩＬ−４で拡張した食品抗原特異的なＴｒ１細胞は、拡張後そのサイトカインの特性を維持することを示す図である。
図５で得られた、異なる抗原特異的なＴ細胞の集団を、ＣＤ３およびＣＤ２８ｍＡｂで刺激し、それらのサイトカインの特性を、刺激４８時間後に回収した上清におけるＥＬＩＳＡにより決定した。ＰＰＤ特異的およびＴＴ特異的なＴ細胞は、ＩＬ−２単独で拡張した後、そのＴｈ１サイトカインの特性を維持し、一方、ＩＬ−４の添加により、予想通りこれらの細胞におけるＩＬ−４の分泌が誘発された。これとは対照的に、食品抗原特異的なＴｒ１細胞は、ＩＬ−２およびＩＬ−４の存在下における拡張後でも、それらのサイトカインの特性を維持した。
【００９１】
図８は、Ｓ２細胞系上のヒトタンパク質の発現の分析を示す図である。
ＯＫＴ３重鎖および軽鎖、ならびに親（Ｓ２）細胞またはセルファクトリー（ＣＦ）細胞におけるＣＤ８０およびＣＤ５８の発現の２色フローサイトメトリー分析。
【００９２】
図９は、操作されたＣＦがＣＤ４＋Ｔｒ１細胞と相互作用する画である。
Ｓ２細胞に、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体に結合させるために、膜結合している抗−ＣＤ３ｍＡｂを、ＣＤ２８およびＣＤ２分子との相互作用によりいくらかの共刺激シグナルを加えるためにそれぞれＣＤ８０、およびＣＤ５８を、ならびに細胞の成長を誘発するためにＩＬ−２およびＩＬ−４を形質移入した。
【００９３】
図１０：ＣＦ細胞系により誘発されたＴ細胞の増殖を示す図である。
セルファクトリーで刺激した、ポリクローナルＰＢＬ、ＣＤ４＋Ｔ細胞Ｔｒ１細胞系（Ｌ１およびＬ２）、またはＴｒ１クローン（Ｃ１およびＣ２）の増殖を、３および４日の間の培養物で、［３Ｈ］チミジンの組入れにより測定した。示してあるように、外因性のサイトカインの非存在下でＴ細胞をＣＦ細胞で刺激した。７２時間後、細胞を［３Ｈ］チミジンでパルス刺激を与え、さらなる１８時間インキュベートした後、回収した。１分あたりの計数値を、３個の培養物からの平均値ｓ．ｅ．ｍ．として示してある。
【００９４】
図１１は、セルファクトリーで刺激した主要なポリクローナルヒトＴｒ１細胞の長期の成長を示す図である。
Ｔｒ１細胞を、外因性のＩＬ−およびＩＬ−４の存在下、ＣＤ３／２８ビーズプラス外因性ＩＬ−２およびＩＬ−４；ＯＫＴ３、ＣＤ８０およびＣＤ５８を発現するがＩＬ−２およびＩＬ−４を発現しないＣＦ’細胞で、またはいかなる外因性の添加なしの完全なセルファクトリー系で刺激した。Ｔ細胞を、培養０、１０および２０日目にＣＦ細胞で刺激した。
【００９５】
図１２は、ＣＦ細胞系と同時培養後のＴ細胞の純度を示す図である。
Ｔ細胞の純度、およびＣＦ細胞系での刺激後を、培養の最初の７日間にＣＤ３、ＣＤ４の発現に対して染色することにより評価した。培養物における全細胞を表すために、この実験では細胞のサイズ／破片に対するゲーティングを用いなかった。生存細胞は、死細胞を除外するためにヨウ化プロピジウムに対してゲーティングすることにより示してある。結果は、各々異なるドナーの、＞１０の異なる実験を表す。
【００９６】
図１３は、Ｔ細胞との同時培養後のＣＦ細胞系の運命を示す図である。
ＣＦ刺激性因子細胞の運命を、培養の最初の７日間に、ＣＤ４およびＯＫＴ３Ｈ発現に対して染色することにより評価した。培養物における全細胞を表すために、この実験では細胞のサイズ／破片に対するゲーティングを用いなかった。生存細胞は、死細胞を除外するためにヨウ化プロピジウムに対してゲーティングすることにより示してある。結果は、各々異なるドナーの、＞１０の異なる実験を表す。
【００９７】
図１４は、用いた実験プロトコールの概略図である。
【００９８】
図１５は、ＯＶＡ特異的Ｔｒ１クローンの単離を示す図である。
ＣＦＳＥで染色したＰＢＬをＯＶＡで刺激し、ＣＤ４  ＣＤ４９ｂ、およびＣＤ１８で染色した。ＣＤ４+ＣＤ４９ｂ+ＣＤ１８bright細胞をゲーティングし、ＣＦＳＥ細胞を選別した。選別された細胞をクローニングして、クローン１および２を産生し、大量の集団をＯＶＡで刺激し、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γで染色し、Ｔｒ１表現型を明らかにした。
【００９９】
図１６は、Ｔｒ１クローンの長期増殖の分析を示す図である。
次いで、２つのクローンを照射したセルファクトリーで刺激した。細胞の総数を、細胞数対培養日数の、片対数のプロットで表してある。
【０１００】
図１７は、７０日間セルファクトリー上で拡張後のＯＶＡ−特異的Ｔクローン１および２のサイトカイン特性を示す図である。
サイトカインを、ＯＶＡで刺激したクローン、および自己由来の照射した単球の上清で測定した。抗原特異的な抑制を、また、トランスウェルアッセイにより試験した。自己由来のＰＢＬを、底部ウェルにおける抗−ＣＤ３ｍＡｂで刺激し、無細胞、コントロールのＣＤ４  Ｔ細胞、および２つのクローンを上部のバスケットにおいて加え、ＣＤ４細胞に対しては抗−ＣＤ３および自己由来の照射した単球で、２つのＴｒ１クローンに対してはＯＶＡおよび照射した自己由来の単球で刺激した。全体のプロトコールは、各々が異なるドナーからの、１０回の実験を代表するものである。
【０１０１】
実施例
実施例１：食品抗原または自己抗原での刺激による、ＰＢＭＣ集団からの食品抗原または自己抗原特異的Ｔｒ１細胞の集団のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの獲得
１．１  材料と方法
細胞の精製およびフローサイトメトリー
ヒト末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)を、健常ドナーのバフィーコートから、フィコール勾配上で遠心分離後、回収した。ＣＤ４+Ｔリンパ球を、ＣＤ１１ｂ+(ＯＫＭ１−９５)、ＣＤ２０+(１Ｆ５Ｃ９)、およびＣＤ８+(Ｇ４２−８)細胞の枯渇後、ヤギ抗マウス−コーティングしたＤｙｎａｂｅａｄｓ(Ｄｙｎａｌ、Ｏｓｌｏ、ノルウェー)を用いたネガティブ選択により、ＰＢＭＣから精製した。２０％ＦＣＳで補ったＲＰＭＩで３７℃、１時間、ＰＢＭＣを培養後、接着により、単球を精製した。回収した接着細胞の９０％を超えたものがＣＤ１４+単球であった。ＣＤ４+Ｔリンパ球を蛍光抗体で細胞を染色し、ＦＡＣＳ ｖａｎｔａｇｅ ＳＥ、Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｌｅ ｐｏｎｔ ｄｅ Ｃｌａｉｘ、フランス）上で選別後、ＣＤ４９ｂ+ＣＤ１８brightまたはＣＤ４９ｂ+ＣＤ４５ＲＯ+Ｔ細胞で分離した。フローサイトメトリーでは以下の抗体を用いた：ＦＩＴＣ、ＡＰＣ、またはＰＣ５標識したマウス抗ヒトＣＤ４(ＲＰＡ−Ｔ４)、ＰＣ５標識したマウス抗ヒトＣＤ３(ＵＣＨＴ１)、ＰＥ標識したマウス抗ヒトＣＤ４９ｂ(１２Ｆ１−Ｈ６)、ＦＩＴＣ標識したマウス抗ヒトＣＤ１４(Ｍ５−Ｅ２)、ＰＥまたはＰＣ５標識したマウス抗ヒトＣＤ８（６．７)、ＰＥ標識したマウス抗ヒトＣＤ２５(Ｍ−Ａ２５１)、ＰＥ標識したマウス抗ヒトＨＬＡ−ＤＲ(Ｇ４６−６)、ＰＥ標識したマウス抗ヒトＣＤ６９(ＦＮ５０)、ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ４５ＲＯ(ＵＣＨＬ−１)。抗体は全てＢＤ−Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ(Ｌｅ Ｐｏｎｔ ｄｅ Ｃｌａｉｘ、フランス)より購入した。
【０１０２】
細胞培養
ＣＤ４+抗原特異的Ｔリンパ球を検出するために、ＰＢＭＣ(１０００万細胞／ｍＬ)を、０．２μＭのＣＦＳＥまたは２．５μＭのＰＫＨ２６(Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ)のいずれかで、ＰＢＳ １Ｘ中、３７℃で５分間染色した。ＰＢＳ １Ｘで２回洗浄後、細胞の集団を、トリオバルブミン２００μｇ／ｍＬ、ウシカゼイン２００μｇ／ｍＬ、ヒトインスリン２００μｇ／ｍＬ（Ｓｉｇｍａ、Ｌ'Ｉｓｌｅ ｄ'Ａｂｅａｕ、フランス）、破傷風毒素５０μｇ／ｍＬ（Ｌｅｄｅｒｉｅ、Ｐｅａｒｌ Ｒｉｖｅｒ、ニューヨーク）および結核菌からの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）（Ｓｔａｔｅｎ ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、デンマーク）２μｇ／ｍＬ、またはＭＢＰ(Ｓｉｇｍａ、Ｌ'Ｉｓｌｅ ｄ'Ａｂｅａｕ、フランス）５０μｇ／ｍＬの存在下または非存在下で、５％ヒト血清ＡＢで補ったＲＰＭＩ中、２００万／ｍＬでインキュベートした。培養９日後、細胞をＰＣ５標識したマウス抗ヒトＣＤ４で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。ＣＤ４９ｂ+ＣＤ１８bright、またはＣＤ４９ｂ+ＣＤ４５ＲＯ+Ｔ細胞を、また、選別し、０．２μＭのＣＦＳＥまたは２．５μＭのＰＫＨ２６で染色し、４．１０5自己由来の単球の存在下、および抗原の存在下、２００万／ｍＬで培養した。
【０１０３】
抗原特異的細胞の選別および拡張
培養１０日後、ＣＤ４+ＣＦＳＥloまたはＣＤ４+ＰＫＨ２６lo抗原特異的Ｔ細胞を、ＦＡＣＳ  ｖａｎｔａｇｅ  ＳＥ（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上で選別し、抗原の存在下、ＩＬ−４  １０ｎｇ／ｍＬおよびＩＬ−２  ５ｎｇ／ｍＬで補ったＸ−ｖｉｖｏ１５培地（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｅｍｅｒａｉｎｖｉｌｌｅ、フランス）中、自己由来の照射ＰＢＭＣで拡張した。
【０１０４】
サイトカインの検出
サイトカインの生成を、１０％ＦＣＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｅｒｇｙ  Ｐｏｎｔｏｉｓｅ、フランス）で補い、コーティングした抗ＣＤ３（ＵＣＨＴ１）１０μｇ／ｍＬおよび可溶性抗ＣＤ２８（ＣＤ２８．２）１μｇ／ｍＬで刺激したＲＰＭＩ中４８時間培養したヒト細胞集団（２００万／ｍＬ）の上清で行ったＥＬＩＳＡにより検出した。用いた抗体は、抗−ＩＬ１０（ＪＥＳ３−９Ｄ７）、抗−ＩＬ４（８Ｄ４）、抗−ＩＬ２（１７Ｈ１２）、抗−ＩＬ５（３９Ｄ１０）、および抗−ＩＦＮγ（Ａ３５）捕捉抗体、およびＮＩＰ標識した抗−ＩＬ１０（ＪＥＳ３−１２Ｄ８）、抗−ＩＬ４（ＭＰ４−２５Ｄ２）、抗−ＩＬ２（Ｂ３３−２）、抗−ＩＬ５（５Ａ１０）、および抗−ＩＦＮγ（Ｂ２７）検出抗体であり、その後、ペルオキシダーゼ標識した抗−ＮＩＰ抗体およびＡＢＴＳを添加した。ＩＬ１０、ＩＬ４、およびＩＦＮγは、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ミネソタ州）からであり、ＩＬ２はＣｈｉｒｏｎ  ｃｏｒｐ（Ｅｍｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、カリフォルニア州）からであった。抗体は全て、ＢＤ  ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎからであった。
【０１０５】
増殖の測定
増殖を評価するために、Ｔ細胞の集団（１００万細胞／ｍＬ）を、１０％ＦＣＳで補ったＲＰＭＩ中、示してあるサイトカインの存在下３７℃で、自己由来の照射したＰＢＭＣおよび特異的な抗原を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて刺激した。Ｔ細胞の増殖を、生細胞を計数することにより評価した。
【０１０６】
抗原特異的Ｔｒ１細胞を単離する方法
本発明者らは、抗原特異的Ｔｒ１細胞の集団およびクローンを単離する方法をデザインした。
【０１０７】
第一の方法は、ＣＦＳＥまたは任意の類似の色素（ＰＨＫ）の組入れによる。細胞をＣＦＳＥで標識し、食品抗原で刺激し（０．１μｇ／ｍＬから５ｍｇ／ｍＬの範囲）、９から１０日後、細胞を細胞蛍光測定法により選別し、ＣＤ３＋ＣＤ２８ビーズ、およびＩＬ−２＋ＩＬ−４で維持する。これらの培養条件下で著しく増殖することができなかった任意の他の細胞を除去するために、細胞を、１ウェルにつき１細胞クローニングし、異なるクローンを特異性およびサイトカインの分泌について分析してもよい。
【０１０８】
第二の方法は、活性化または増殖マーカーの細胞表面の発現による。ＰＢＭＣを食品抗原または自己抗原で刺激し、抗原刺激した細胞を、抗−ＣＤ６９、抗−ＣＤ２５、または任意の活性化もしくは増殖マーカーに対して向けられた抗体により精製する。次いで、精製した細胞を、ＣＤ３＋ＣＤ２８刺激、およびＩＬ−２＋ＩＬ−４で維持する。あるいは、細胞を、ＩＬ−２およびＩＬ−４の存在下で、フィーダー細胞およびＣＤ３／ＣＤ２８刺激で維持してもよい。精製した細胞は、ＦＡＣＳ選別または限界希釈により、１ウェルにつき１細胞でクローニングしてもよい。
【０１０９】
第三の方法は、食品抗原または自己抗原で刺激後、増殖性の集団を濃縮することによる。ＰＢＭＣをオバルブミン（または、任意の他の食品もしくは自己抗原）で刺激し、１週間後、細胞を、ＩＬ−２およびＩＬ−４の存在下、同じ抗原で再刺激した。この組合せは最適であったが、任意の組合せまたは時間を用いてもよい。次いで、濃縮した集団を限界希釈によりクローニングした（が、任意の他のクローニング技術を用いてもよい）。次いで、クローンを、フィーダー細胞、抗−ＣＤ３、ＣＤ２８、ならびにＩＬ−２およびＩＬ−４で刺激することにより増加させた。次いで、増殖性のクローンを、自己由来の照射したＰＢＭＣにより提示されるオバルブミンを用いることにより、特異性およびサイトカインの分泌について分析した。
【０１１０】
１．２  結果
ＣＤ４+ＣＤ３+ＣＤ４９ｂ+ＣＤ１８brightＴｒ１細胞は、食品抗原に反応して増殖するがワクチン抗原には反応しない
本発明者らは、ＣＤ４+ＣＤ３+ＣＤ４９ｂ+ＣＤ１８brightＴｒ１細胞を精製した場合、これらの細胞は、相反する集団とは対照的に、ＰＰＤの破傷風毒素などのリコール抗原に反応して増殖しなかったことを観察した（図１Ａ）。本発明者らは、ＣＤ４+ＣＤ３+ＣＤ４９ｂ+ＣＤ１８brightＴｒ１細胞が、食品抗原に対して増殖する能力も試験した。以前に報告されているように、全体のＣＤ３+ＣＤ４+Ｔ細胞の集団を食品抗原（オバルブミン、カゼイン、ソヤタンパク質またはウシ免疫グロブリン）で刺激した場合に、バックグラウンドを超えた至って最小限の増殖性の反応だけが観察された。しかし、本発明者らは、精製したＣＤ４+ＣＤ３+ＣＤ４９ｂ+ＣＤ１８brightＴｒ１細胞の集団では活発な増殖性の反応を観察したものの、相反するメモリー集団では増殖を観察しなかった（図１Ｂ）。
【０１１１】
したがって、本発明者らは、ＣＦＳＥ組入れの、より感受性の高い技術を用い、Ｔｒ１細胞はリコール抗原に対して増殖しなかったが、オバルブミン、カゼイン、またはソヤタンパク質などの食品抗原に対して著しい増殖性の反応を示したことを観察した。これとは対照的に、ＣＤ４+Ｔ細胞の相反する集団は、食品抗原に対していかなる増殖性の反応を示さなかったが、リコール抗原に対して活発に増殖した（ＴＴおよびＰＰＤ）（図２）。
【０１１２】
食品抗原特異的なＣＤ４+ＣＤ３+ＣＤ４９ｂ+ＣＤ１８brightＴ細胞はＴｒ１サイトカインの特性を有する
ＣＦＳＥ組入れ技術を用いて（図３）、本発明者らは、ＦＡＣＳによりＣＦＳＥlow増殖性細胞を単離し、ポリクローナル刺激（抗−ＣＤ３＋ＣＤ２８  ｍＡｂ）により、それらのサイトカイン特性を分析した。これらの実験は、ＯＶＡ、カゼイン、およびソヤに特異的な細胞は、以前に記載されているように、高レベルのＩＬ−１０、いくらかのＩＦＮ−γ、いくらかのＩＬ−５を分泌し、ＩＬ−２およびＩＬ−４は分泌しないＴｒ１サイトカインの特性を有することを示した（Ｇｒｏｕｘら、Ｎａｔｕｒｅ、１９９７年）。これとは対照的に、ＴＴ特異的またはＰＰＤ特異的な細胞は、予想通り、主にＩＦＮ−γを分泌するＴｒ１表現型を提示した。
【０１１３】
Ｔｒ１細胞は自己抗原に対しても特異的である
ＣＦＳＥ技術を用いて、本発明者らは、様々なＣＤ４+Ｔ細胞集団の、ＭＢＰ（ミエリン塩基性タンパク質）またはインスリンなどの自己抗原に対する増殖性の反応も分析した。食品抗原同様、バルクのＣＤ４+集団に（報告されている通り）、またはＣＤ４９ｂ+メモリー（ＣＤ４５ＲＯ+）集団に認められた増殖性の反応は、最小から無であった。驚くべきことに、精製したＣＤ４+ＣＤ３+ＣＤ４９ｂ+ＣＤ１８brightＴｒ１細胞をインスリンまたはＭＢＰで刺激した場合に、活発な増殖反応が観察された。さらに、これらのインスリン特異的またはＭＢＰ特異的な細胞は、ＩＬ−１０分泌が高いＴｒ１サイトカインの特性を提示した（図４）。
【０１１４】
Ｔｒ１細胞は、試験した抗原に対する自己免疫またはアレルギーに罹患している患者で単離できる
食品抗原および自己抗原は、それぞれアレルギーまたは自己免疫疾患に結び付けられているので、本発明者らは、ＭＳに罹患している患者（ＭＢＰなどのミエリン成分に対して向けられている自己免疫疾患で）、またはカゼインに対する食品アレルギーを有する患者の、精製したＣＤ４+ＣＤ３+ＣＤ４９ｂ+ＣＤ１８brightＴ細胞の集団における増殖性のＴ細胞の存在を分析した。図５に示すように、本発明者らは、予想通り、ＭＢＰ刺激またはカゼイン刺激が、それぞれ多発性硬化症またはカゼインアレルギーに罹患している患者における精製したＣＤ４+ＣＤ３+ＣＤ４５ＲＯ+ＣＤ４９ｂ-中への細胞の増殖を誘発することを観察した。増殖性の細胞の再刺激により、予想通り、これらの細胞が、ＭＢＰで刺激したＭＳに罹患している患者からの細胞の場合はＴｈ１サイトカインの特性を、アレルギー患者の場合はカゼインに反応したＴｈ２サイトカインの特性を提示したことが示された。しかし、本発明者らは、予想外に、正常コントロール同様、食品または自己抗原特異的なＴｒ１細胞が、試験した抗原に対する自己免疫またはアレルギーを罹患している患者でも観察できたことを示す、ＣＤ４+ＣＤ３+ＣＤ４９ｂ+ＣＤ１８brightＴｒ１細胞における増殖も観察した（図５）。
【０１１５】
ＩＬ−２およびＩＬ−４の組合せは、Ａｇ特異的なＴｒ１細胞の増殖を維持するために必要とされる
Ｔｒ１細胞（ＣＤ４+ＣＤ３+ＣＤ４９ｂ+ＣＤ１８bright細胞）は、食品または自己抗原に反応して増殖したが、その増殖は、ＴＴ−またはＰＰＤ−特異的Ｔ細胞の増殖とは対照的に（図６）、ＩＬ−２単独を加えることにより維持することはできなかった（図６）。驚くべきことに、本発明者らは、ＩＬ−２およびＩＬ−４を組み合わせて加えることにより、食品抗原または自己抗原特異的なＴｒ１細胞の増殖性の反応を維持することができることを見出した（図７）。
【０１１６】
実施例２：フィーダー細胞を用いた、獲得された抗原特異的Ｔｒ１細胞集団の拡張
２．１  実験プロトコール
標識した抗体
ビーズ選別用
用いたビーズ：
《ＭａｇＣｅｌｌｅｃｔ  Ｆｅｒｒｏｆｌｕｉｄ、ストレプトアビジン》（Ｒ＆Ｄ）
《ヒツジ抗ラットビーズ》（Ｄａｋｏ）
ＣＤ８０用：ビオチン化マウス抗ヒトＣＤ８０（Ｂ７−１）、クローンＬ３０７．４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）
ＯＫＴ３用：精製ラット抗マウスＩｇκ軽鎖、クローン１８７．１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）。
【０１１７】
ＦＡＣＳ選別および通常のコントロールマーカー用
ＣＤ８０用：マウス抗ヒトＣＤ８０−ＰＥ（フィコエリスリン）またはＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート、クローンＬ３０７．４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）
ＣＤ５８用：マウス抗ヒトＣＤ５８−ＰＥまたはＰＥＣｙ５（フィコエリスリン−シアニン５）（ＬＦＡ−３）クローン１Ｃ３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）
ＯＫＴ３用：
重鎖：ビオチン化抗マウスＩｇＧ２ａ、クローンＲ１９−１５＋ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ、またはストレプトアビジン−ＰＥ、またはストレプトアビジン−ＰＥＣｙ５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）
軽鎖：精製ラット抗マウスＩｇκ軽鎖、クローン１８７．１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）＋ウサギ抗ラットＦＩＴＣ（Ｄａｋｏ）。
【０１１８】
増幅プライマー
ＯＫＴ３−Ｌ  ＦＷＤ：
５’−ＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＴＴＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＧ−３’（配列番号９）
ＯＫＴ３−Ｌ  ＲＥＶ：
５’−ＡＴＧＣＧＡＡＴＴＣＣＴＡＡＣＡＣＴＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＧ−３’（配列番号１０）。
【０１１９】
プライマーＯＫＴ３Ｈ１可変重鎖（５７１ｐｂ）：
ＨＳＰＡＴ１  ＦＷＤ：
５’−ＡＴＧ  ＣＣＣ  ＧＣＧ  ＧＧＧ  ＴＡＣ  ＣＣＡ  ＣＴＧ  ＡＡＡ  ＡＣＴ  ＣＴＧ  ＡＣＴ  ＣＡＡ  Ｃ−３’（配列番号１１）
ＯＫＴ３  Ｈ２／３  ＲＥＶ：
５’−ＡＣＴ  ＧＧＡ  ＣＡＧ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＡＧＡ  ＧＴＴ  Ｃ−３’（配列番号１２）。
【０１２０】
プライマーＯＫＴ３Ｈ２重鎖ＣＨ１−ＣＨ３（８５０ｐｂ）
ＯＫＴ３  Ｈ３／５  ＦＷＤ：
５’−ＧＡＡ  ＣＴＣ  ＴＧＧ  ＡＴＣ  ＣＣＴ  ＧＴＣ  ＣＡＧ  ＴＧ−３’（配列番号１３）
ＯＫＴ３  Ｈ３／３  ＲＥＶ：
５’−ＡＴＧ  ＣＧＡ  ＡＴＴ  ＣＴＴ  ＴＡＣ  ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＴＣＣ  ＧＧＧ  ＡＧＡ  ＡＧＣ  ＴＣ−３’（配列番号１４）。
【０１２１】
プライマーｐｄｇｆ血小板由来成長因子受容体、β（１５１ｐｂ）
ＰＤＧＦＲ  ５  ＦＷＤ：
５’−ＡＴＧ  ＣＧＡ  ＡＴＴ  ＣＧＣ  ＴＧＴ  ＧＧＧ  ＣＣＡ  ＧＧＡ  ＣＡＣ  ＧＣＡ  Ｇ−３’（配列番号１５）
ＰＤＧＦＲ  ３  ＲＥＶ：
５’−ＡＴＧ  ＣＧＧ  ＧＣＣ  ＣＡＡ  ＧＣＴ  ＴＣＴ  ＡＡＣ  ＧＴＧ  ＧＣＴ  ＴＣＴ  ＴＣＴ  ＧＣＣ  ＡＡＡ  Ｇ−３’（配列番号１６）
ＩＬ−２  ＦＷＤ：
５’−ＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＴＡＣＡＧＧＡＴＧＣＡＡＣＴＣＣＴ−３’（配列番号１７）
ＩＬ−２  ＲＥＶ：
５’−ＡＴＧＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＴＧＴＴＧＡＧＡＴＧＡ−３’（配列番号１８）
ＬＦＡ３  ＦＷＤ：
５’−ＡＴＧＣＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＴＴＧＣＴＧＧＧＡＧＣＧＡＣＧＣ−３’（配列番号１９）
ＬＦＡ３  ＲＥＶ：
５’−ＡＴＧＣＴＡＡＧＣＴＴＴＣＡＡＴＴＧＧＡＧＴＴＧＧＴＴＣＴＧＴ−３’（配列番号２０）
ＩＬ−４  ＦＷＤ：
５’−ＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＧＴＣＴＣＡＣＣＴＣＣＣＡＡＣＴ−３’（配列番号２１）
ＩＬ−４  ＲＥＶ：
５’−ＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＴＣＡＧＣＴＣＧＡＡＣＡＣＴＴＴＧＡＡＴ−３’（配列番号２２）。
【０１２２】
セルファクトリーのクローニングおよび構築
ヒトＣＤ８０、ＩＬ−２、ＩＬ−４、およびＣＤ５８を、健常ドナーから得た末梢血Ｔリンパ球(ＰＢＬ)から、ｐＡＣベクター(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)中に、昆虫アクチンプロモーターを用いてクローニングし（ＣｈｕｎｇおよびＫｅｌｌｅｒ、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１９９０年１２月、１０巻(１２)、６１７２〜８０頁；ＣｈｕｎｇおよびＫｅｌｌｅｒ、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１９９０年１月、１０巻(１)、２０６〜１６頁）、電気穿孔(ｅｌｃｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ Ｂｉｏｒａｄ、米国)により、Ｓ２細胞中に、ＣＮＣＭに、Ｉ−３４０７番で２００５年３月２５日に寄託されたＳ２細胞系から形質移入した。同様に、ＯＫＴ３の重鎖および軽鎖（Ｋｕｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．、１９７９年１０月１９日、２０６巻（４４１６）、３４７頁）を、ＯＫＴ３ハイブリドーマ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ８００１；Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、米国）から、ｐＡＣベクター中にクローニングし、ＦＡＣＳの前にＳ２細胞中に形質移入した。膜結合した抗−ＣＤ３ｍＡｂを得るために、重鎖の３'末端を除去し、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）遺伝子ＣＦ'細胞の膜貫通部分により置換し、すなわちｈＣＤ８０、ｈＣＤ５８、および抗−ＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡＢ）、およびＣＦを発現する細胞、すなわちｈＣＤ８０、ｈＣＤ５８、ｈＩＬ−２、ｈＩＬ−４、および抗−ＣＤ３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を発現する細胞を、蛍光活性化細胞選別ＦＡＣＳにより、上記に記載した抗体を用いて単離した。選択マーカーは用いず、安定して形質移入した細胞をＦＡＣＳ染色により選択した。選別された細胞をクローニングし、形質移入および選択の各ラウンドでは、Ｔｒ１細胞の刺激に対して最も効果的なクローンを選択した。
【０１２３】
ＣＤ４+Ｔリンパ球の調製およびＳ２細胞培養
新鮮な末梢血リンパ球を、Ｆｉｃｏｌｌ  ｈｙｐａｑｕｅ遠心分離により得、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗−ＣＤ８抗体（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてネガティブ選択により精製した。培養物全てを、血清無添加のＸ−ｖｉｖｏ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、メリーランド州）で維持した。指摘されている場合はヒトＩＬ−２（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｔｈｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、カリフォルニア州）を２０ＩＵ／ｍＬで加え、ｈＩＬ−４を１μｇ／ｍＬで用いた（フィーダー細胞がインターロイキンを発現した場合に得られる生物学的利点を組換えインターロイキンを培地に加えた場合に得られる結果と比べるため）。Ｓ２細胞を血清を含まないＳＦＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）で維持した。
【０１２４】
フローサイトメトリーおよびＦＡＣＳ選別
細胞を、４℃で、抗体で染色し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、カリフォルニア州）上で分析し、またはＦＡＣＳｔａｒシステムで選別した。
【０１２５】
２．２  結果
ａＡＰＣの構築
Ｔｒ１細胞は長期の成長に別個の共刺激の要求を有するという仮説を試験するために、本発明者らは、ＣＤ３／ＣＤ２８の古典的な刺激に加えて、様々な共刺激性分子およびサイトカインを発現するように遺伝子操作され得る細胞ベースの系をデザインした。本発明者らがＳ２細胞を選択したのは、これらが同種の反応を促進するヒトＨＬＡタンパク質を発現しないからであり、これらがヒトウィルスによって汚染され得ないからである(図８)。また、照射されたフィーダー細胞は、２７℃で成長し、３７℃で容易に死滅し、無血清培地で繁殖するので、これらの細胞が臨床上のセッティング中に最終的に導入されることは避けることができる。本発明者らは、ヒトＣＤ８０、ヒトＣＤ５８、および抗−ｈＣＤ３ｍＡｂの２本の鎖を発現するＳ２細胞に形質移入し、次いでクローニングして、ヒトＴｒ１細胞の刺激(ＣＦ')を可能にした(図８)。同様に、本発明者らは、ＣＦ'細胞にヒトＩＬ−４およびＩＬ−２のｃＤＮＡを形質移入することにより、ＣＦ系(図８、９)を産生した。ＣＦ細胞をネガティブ選択により調製した新鮮ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に加えることにより培養を開始した(実験プロトコールを参照)。
【０１２６】
ＣＦ細胞系はヒトポリクローナルＣＤ４＋Ｔ細胞およびＴｒ１細胞を効果的に活性化する
セルファクトリーが、主なＣＤ４＋Ｔ細胞およびＴｒ１細胞系またはＴｒ１細胞のクローンの、初期の活性化ならびに増殖を刺激するその能力について試験した。様々な精製したＴ細胞を、１／１比のセルファクトリーで刺激した。本発明者らは、Ｔｒ１細胞の増殖反応が他のＣＤ４+Ｔ細胞をわずかに上回って増強される［３Ｈ］チミジンの組入れ（図１０）により判断して、セルファクトリーで刺激したＴ細胞の初期の成長速度は等しいことを見出した。本発明者らは、新鮮なＴ細胞をカルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識し、培養の最初の５日間の間、細胞分裂を追跡することにより、この観察を確認した（データは示さず）。本発明者らは、細胞ベースの系は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖および細胞分裂を誘発するのにＣＤ３／２８ビーズよりもより有効であったことも見出した（データは示さず）。セルファクトリーまたはＣＤ４＋Ｔ細胞を別々にインキュベートした場合は、増殖は見られなかった（図１０、およびデータは示さず）。したがって、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖の最初のラウンドに対する必要は、ポリスチレンビーズの状況でもたらされたＣＤ３／ＣＤ２８刺激に比べて、セルファクトリーではさらにより十分であった。
【０１２７】
ＣＦ細胞系はヒトＴｒ１細胞の長期の拡張を可能にする
次に、本発明者らは、セルファクトリーはＴｒ１細胞の長期の繁殖を維持するのに十分であったか否かを決定した（図１１）。Ｔｒ１細胞を、ｈＩＬ−２およびＩＬ−４を分泌するＣＦで、サイトカインを分泌しないＣＦ'であるが外因性のサイトカインの添加で、および外因性のサイトカインと共にＣＤ３／２８ビーズで刺激した。ＣＤ３／２８ビーズで刺激した細胞は、第２の刺激の後、増殖することができず、先の試験と一致した。同様に、ＣＦ'で刺激したＴｒ１細胞は、ＩＬ−２およびＩＬ−４を外因性に添加した状況で、培養２から３週間以内に成長曲線のプラトー期に入り、再刺激後、さらなる最終的な細胞の成長は起こらなかった。これとは対照的に、Ｔｒ１細胞培養物をセルファクトリーで刺激した場合は、第３の刺激後でも指数関数的成長のままであった。Ｔ細胞の総数における平均的な増大は、６回の独立した実験においてＣＤ３／２８ビーズで刺激した培養物におけるよりもセルファクトリーで刺激した培養物において８１０倍高かったので、この長期の増殖の増大は再現性があった。
【０１２８】
培養物の表現型を分析すると、セルファクトリーで刺激した後、ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞に進行性の濃縮が示された（図１２）。７日後にフローサイトメトリーにより抗−ＣＤ３ｍＡｂを発現する細胞が検出できなかったことから分かるように、Ｓ２細胞は、細胞培養物から急速に消失し（図１３）、この発見は、大規模な実験で確認され、ショウジョウバエ遺伝子に対するＲＴ−ＰＣＲによっても確認された（データは示さず）。したがって、Ｔ細胞およびセルファクトリーの混合の培養により、１週間以内に純粋なＴ細胞の集団が得られる。
【０１２９】
セルファクトリーによる抗原特異的なＴｒ１細胞の効率的な繁殖
Ｔｒ１細胞での免疫療法は、抗原特異的な調節機能を有する細胞を必要とすると思われる。セルファクトリーを、抗原特異的なＴｒ１を拡張するために用いることができるか否かを決定するために、本発明者らは、１０週間、それを用いてＯＶＡ特異的Ｔｒ１クローンを培養した（図１４）。何百もの異なる自己抗原特異的な、または食品抗原特異的なＴ細胞のクローンで行った実験は、２つの異なるクローンの一例を示している。正常個体からのＰＢＬをＣＦＳＥで標識して細胞分裂を追跡し、細胞を７日間オバルブミン（２０μｇ／ｍＬ）で刺激した。次いで、細胞をＣＤ４、ＣＤ１８、およびＣＤ４９ｂで染色して、これらのマーカーを過剰発現するＴｒ１細胞に対して選択し、ＯＶＡ特異的細胞を、抗原特異的な細胞分裂によるＣＦＳＥ標識における低減にしたがって選別した（図１５）。これらの表現型をコントロールするために、大量の選別された集団をＯＶＡで刺激し、典型的なＴｒ１の集団を明らかにする細胞質内染色によりサイトカインの生成を分析した（図１５）。クローニングの後細胞をセルファクトリーで刺激した（図１６）。細胞全てを、１０日間隔でセルファクトリーで再刺激した。培養中、特定のＯＶＡの刺激は与えなかった。数カ月間、両クローンの指数対数的な成長曲線が得られた。ある抗原特異的なＴｒ１細胞は、培養１ヵ月半後に、免疫療法に十分な細胞数である、１．５  １０9細胞を産生した。培養３０日後に残存するＴｒ１細胞の実質的な増殖能力により、これらのＴｒ１は養子移植後、実質的に長期の移植の可能性があり得ることが示唆される。
【０１３０】
拡張された集団の抗原特異性が、培養中に維持されるか否かを決定するために、細胞をＯＶＡで刺激した（図１７）。１カ月半培養後、細胞をＯＶＡで刺激し、自己由来ＡＰＣおよびサイトカインの分泌を分析した。分析した２つの異なるクローンにＴｒ１の典型的な特性が観察された。
【０１３１】
培養したＴｒ１細胞のエフェクター機能を調べるために、典型的なトランスウェルアッセイで、抗原特異的な抑制性の機能を試験した（図１７、およびデータは示さず）。両クローンともバイスタンダー細胞に対する典型的なＴｒ１の抑制性効果を表した。抑制は、阻止抗体の使用により示されるように、ＩＬ−１０およびＴＧＦ−βの分泌によるものであった（示さず）。ＯＶＡ刺激の非存在下では抑制は得られなかった（データは示さず）。異なるドナーおよび異なるＴｒ１クローンで、同様の結果が得られた（データは示さず）。
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】ＣＤ４+ＣＤ１８brightＣＤ４９ｂ+Ｔｒ１細胞は、食品抗原に反応し、リコール抗原に反応しないで増殖することを示す図である。
【図２】ＣＤ４+ＣＤ１８brightＣＤ４９ｂ+Ｔ細胞は、食品抗原に対して増殖し、ワクチン抗原に対して増殖しないことを示す図である。
【図３】食品抗原に特異的なＣＤ４+増殖性Ｔ細胞はＴｒ１サイトカイン特性の表現型を有することを示す図である。
【図４】ＣＤ４+ＣＤ１８brightＣＤ４９ｂ+Ｔ細胞は、自己抗原およびＴｒ１サイトカイン表現型を提示した自己抗原特異的細胞に対して増殖することを示す図である。
【図５】Ｔｒ１細胞は、試験した抗原に対する自己免疫疾患またはアレルギー性疾患に罹患している患者で観察することができることを示す図である。
【図６】食品抗原特異的なＴｒ１細胞は、ＩＬ−２単独に反応して増殖しなかったが、ＩＬ−２およびＩＬ−４に反応して活発に増殖したことを示す図である。
【図７】ＩＬ−２およびＩＬ−４で拡張した食品抗原特異的なＴｒ１細胞は、拡張後そのサイトカインの特性を維持することを示す図である。
【図８】Ｓ２細胞系上のヒトタンパク質の発現の分析を示す図である。
【図９】操作されたＣＦがＣＤ４＋Ｔｒ１細胞と相互作用する画である。
【図１０】ＣＦ細胞系により誘発されたＴ細胞の増殖を示す図である。
【図１１】セルファクトリーで刺激した主要なポリクローナルヒトＴｒ１細胞の長期の成長を示す図である。
【図１２】ＣＦ細胞系と同時培養後のＴ細胞の純度を示す図である。
【図１３】Ｔ細胞との同時培養後のＣＦ細胞系の運命を示す図である。
【図１４】用いた実験プロトコールの概略図である。
【図１５】ＯＶＡ特異的Ｔｒ１クローンの単離を示す図である。
【図１６】Ｔｒ１クローンの長期増殖の分析を示す図である。
【図１７】７０日間セルファクトリー上で拡張後のＯＶＡ−特異的Ｔクローン１および２のサイトカイン特性を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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