(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
変形性関節症発症の進行または可能性を阻害するための医薬組成物の製造のためのヒメニアルジシン（Ｈ）またはデブロモヒメニアルジシン（ＤＢＨ）以外のＪＡＫ−３阻害剤の使用であって、医薬組成物が軟骨細胞におけるＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達を乱すのに有効な量でＪＡＫ−３阻害剤を含有することを特徴とする、ＪＡＫ−３阻害剤の使用。
【請求項２】
ＪＡＫ３阻害剤が４−（４’−ヒドロキシフェニル）−アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリン（ＷＨＩ−Ｐ１３１）である、請求項１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【０００１】    （関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮特許出願第６０／１７７，８７２号（２０００年１月２４日出願）の優先権を主張する。
【０００２】    （発明の分野）
本発明は分子生物学および整形外科の分野に属する。本発明は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴにより媒介される疾患または障害（特に、ＪＡＫ３により媒介される疾患または障害）を、ＪＡＫ３阻害剤を使用して処置する新規な方法に関する。
【０００３】    （発明の背景）
退行性関節疾患の生物学
関節の軟骨は、滑膜性関節内の長骨の両端を覆って、身体の支持および動きに伴う通常の剪断力および圧縮力から、その下にある骨を保護している。軟骨は、細胞外マトリックスのコラーゲンから構成される。コラーゲンマトリックス内には、軟骨細胞（すなわち、分化した軟骨の細胞）および基質が含まれる。基質は、プロテオグリカンおよび水から構成される。コラーゲンは、引張り強度を付与するマトリックスを形成し、一方、プロテオグリカンは、圧縮に対する抵抗性をもたらす大きな集合体を形成する（Ｓｔｏｃｋｗｅｌｌ、１９９１）。プロテオグリカンは、強く負に帯電した大きな親水性分子であり、水を引き寄せている。関節機能の正常な圧力のもとでは、水は軟骨から滲出して、関節の表面を潤滑している。圧力が除かれると、その水は軟骨のプロテオグリカンによって吸収される。水の動きはまた、軟骨組織には血液が供給されていないので、軟骨細胞への栄養物の輸送および軟骨細胞からの老廃物の輸送をもたらす。軟骨の完全性を維持することは非常に重要である。異常な負荷は、増大または低下のいずれでも、軟骨の物理的完全性に作用し、細胞の代謝に影響し、そして生化学的な変化を誘導する、これらはすべて、軟骨の分解をもたらし、そして変形性関節症（ＯＡ）などの退行性関節疾患の発症をもたらし得る（Ｍｏｗ他、１９９２）。
【０００４】  ＯＡなどの退行性関節疾患は脊椎動物には広く存在する。退行性関節疾患は、軟骨の分解から生じる進行性の不可逆的な疾患として特徴付けられる（ＭａｎｋｉｎおよびＢｒａｎｄｔ、１９９１）。変形性関節症という名称は炎症性の疾患または障害であることを示唆するが、ＯＡは、軟骨の分解をもたらす軟骨内の生化学的なプロセスから生じる。この点で、ＯＡは、慢性関節リウマチ（ＲＡ）および血清反応陰性の脊椎関節症から区別される。滑膜が分解酵素の主要な供給源であるＲＡとは異なり、ＯＡでは、軟骨細胞が、軟骨の異化作用に関わる酵素の主要な供給源である。しかし、不定期的で一過性の炎症性反応は、ＯＡの進行に伴う別の二次的な合併症であることが多い（Ｇｏｌｄｒｉｎｇ、１９９９）。
【０００５】  ＯＡの発症における開始事象は依然として不明であるが、ＯＡの病因には、外因性の機械的な要因と内因性の軟骨代謝とのある種の相互作用が関与していることが考えられる。ＯＡの決定的な原因は、軟骨に対する物理的な外傷（二次的ＯＡ）から、正常な軟骨維持プロセスに影響を及ぼす代謝的な変化まで、低グレードの断続的な炎症性反応まで、遺伝子的な障害までに及ぶ可能性があり、これらはすべて、自己溶解性の酵素を誘導することがある（Ｗｉｌｓｏｎ、１９８８；Ｇｏｌｄｒｉｎｇ、１９９９）。ＯＡの発病を引き起こし得る開始事象または外傷にかかわらず、一般に受け入れられているモデルは、活性化されたサイトカインおよび／または受容体が、軟骨分解酵素および炎症性因子の遺伝子発現を含む、軟骨細胞の核へのシグナル伝達を生じさせるということである。
【０００６】  軟骨の直接的な傷害もまた、軟骨細胞に対する傷害を生じさせ得る。軟骨細胞は、分解酵素を産生することによって、そして不適切な修復プロセスを誘導することによって傷害に応答し得る（Ｍｏｗ他、１９９２）。ＯＡにおける生化学的な変化は、プロテオグリカン集合体およびコラーゲンを含むいくつかの軟骨成分に影響を及ぼす。プロテオグリカンの分解産物がＯＡ患者の滑液中に同定されている（Ｌｏｈｍａｎｄｅｒ他、１９９３）。コラーゲンの分解に伴うプロテオグリカン含有量の低下は、正常なマトリックスの生理学的性質の機能的喪失を生じさせる。
【０００７】  軟骨マトリックスの酵素的分解は、退行性関節疾患の発病および進行における重要な要因である（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ他、１９９２；Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ他、１９９３）。ＯＡの病理学において大きな役割を果たしていることが知られている軟骨分解酵素には、マトリックスメタロプロテアーゼ類（ＭＭＰ）、アグリカナーゼ類、ならびにセリンプロテアーゼ類およびチオールプロテアーゼ類が含まれる（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ他、１９９７）。
【０００８】  ＯＡに関与するマトリックスメタロプロテアーゼ類には、コラゲナーゼ類、ストロメライシン類、およびゼラチナーゼ類が含まれる。コラゲナーゼ類は、軟骨に足場を置くＩＩ型コラーゲンの分解に関わっている。コラゲナーゼ−１（ＭＭＰ−１）およびコラゲナーゼ−３（ＭＭＰ−１３）がＯＡのその場の軟骨において同定されている。コラゲナーゼ−１およびコラゲナーゼ−３のレベルは、ＯＡを罹っている軟骨の組織学的重篤度と相関している（Ｒｅｂｏｕｌ他、１９９６）。ストロメライシン類およびゼラチナーゼ類（ゼラチナーゼ−Ａおよびゼラチナーゼ−Ｂ（これらはそれぞれＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９と呼ばれることもある）を含む）はメタロプロテオグリカナーゼ類であり、これらもまたＯＡに関与している。ストロメライシンのレベルもまたＯＡの組織学的重篤度と相関している（Ｄｅａｎ他、１９８９）。また、ストロメライシンはまた、プロコラゲナーゼの活性化にも関与しており、したがって、ＯＡの病理学においてその全体的な作用を増幅している（Ｍｕｒｐｈｙ他、１９８７）。好中球のコラゲナーゼ（これはまたコラゲナーゼ−２またはＭＭＰ−８としても知られている）は、真のアグリカナーゼであると見なすには十分なほど選択的ではないが、アグリカナーゼが切断する部位を含む特異的な部位でアグリカンを切断することが示されている（Ａｒｎｅｒ他、１９９７）。これらのマトリックスメタロプロテイナーゼ類は、ＯＡが生じている軟骨のプロテオグリカン成分、ＩＩ型コラーゲン成分、およびＩＸ型コラーゲン成分を損傷させる一次的な原因因子であると考えられている（Ｄｅａｎ他、１９８９；Ｍｏｒｔ他、１９９３；Ｂｕｔｔｌｅ他、１９９３）。
【０００９】  アグリカナーゼ類は、軟骨におけるプロテオグリカン集合体の主成分であるアグリカンを分解する酵素のファミリーを表す。アグリカナーゼ類は、Ｇｌｕ３７３−Ａｌａ３７４間におけるアグリカンのその特徴的な切断によって定義される。アグリカナーゼ類は、最近では、細胞外マトリックスの結合に関係する多数のカルボキシトロンボスポンジンモチーフを含有するディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ（ＡＤＡＭ）ファミリーのサブファミリーとして特徴付けられている。トロンボスポンジンモチーフを有するこれらのディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）化合物、特に、ＡＤＡＭＴＳ−４、ＡＤＡＭＴＳ−１１およびあるいはＡＤＡＭＴＳ−１は、特徴的な切断特異的なアグリカナーゼ活性を有する（Ａｂｂａｓｚａｄｅ他、１９９９；Ｔｏｒｔｏｒｅｌｌａ他、１９９９）。
【００１０】  無機のフリーラジカルである一酸化窒素（ＮＯ）もまた退行性関節障害に関与している。ＮＯは、１−アルギニンからＮＯシンターゼ（ＮＯＳ）によって酵素的に合成される。ＮＯＳの２つのイソ型、すなわち、構成型ＮＯＳ（ｃＮＯＳ）および誘導型ＮＯＳ（ｉＮＯＳ）が現在知られている。ＯＡ患者の滑液に由来する亜硝酸塩レベルおよび硝酸塩レベルの臨床的測定により、ＮＯが変形性関節症の関節において産生していることが示される（Ｆａｒｒｅｌｌ他、１９９２）。また、ＮＯＳ阻害剤は、ラットにおけるいくつかの関節変化を抑制することが報告されている（ＭｃＣａｒｔｎｅｙ−Ｆｒａｎｃｉｓ他、１９９３）。
【００１１】  シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ２）は、痛み、発熱および炎症に関連する広範囲の生物学的プロセスにおいて機能する、局所的に作用するホルモン様分子であるエイコサノイド類の合成において大きな役割を果たしている。詳しくは、ＣＯＸ２は、アラキドン酸からのプロスタグランジン類、プロスタサイクリン類、およびトロンボキサン類の合成に必要である。ＮＦ−κＢ（ｐ６５とｐ５０とのヘテロダイマー）は、ＣＯＸ２の転写を活性化する転写因子である。ＣＯＸ２はプロスタグランジン類の合成において必要であるので、この酵素およびその転写因子であるＮＦ−κβもまた、ＯＡの発病および進行における重要な成分として標的化されている。
【００１２】  結合組織の代謝を調節する様々なサイトカインの役割およびそれらの付随する細胞内シグナル伝達経路が、慢性関節リウマチおよび変形性関節症などの関節疾患に関連した組織分解に関して広範囲に研究されている（例えば、Ｇｏｌｄｒｉｎｇ、１９９９；Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ他、１９９３参照のこと）。研究により、炎症性サイトカインが、軟骨細胞を刺激して上記の様々な軟骨分解性化合物を放出させる生化学的なシグナルとして中心的な役割を果たしていることが解明されている。現在、軟骨の分解に関係していると考えられる主要なサイトカインとしては、インターロイキン−１およびインターロイキン−６（ＩＬ−１およびＩＬ−６）ならびに腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）が挙げられる。
【００１３】  ＩＬ−１およびＴＮＦ−αは、メタロプロテアーゼを含む様々なプロテアーゼの合成（すなわち、遺伝子発現）を増大させることが報告されている。ＩＬ−１およびＴＮＦ−αを組み合わせて注射することにより、いずれかのサイトカインが単独で誘発するよりも大きい軟骨分解が誘発される（ＨｅｎｄｅｒｓｏｎおよびＰｅｔｔｉｐｈｅｒ、１９８９；Ｐａｇｅ−Ｔｈｏｍａｓ、１９９１）。また、ＩＬ−１は、正のフィードバック機構をもたらす、軟骨細胞におけるオートクリン活性を示すことが報告されている（Ａｔｔｕｒ他、１９９８；Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ他、１９９３）。ＩＬ−１およびＴＮＦ−αはまた、滑膜の繊維芽細胞においてＩＬ−６の発現を誘導する。このことは、他の細胞（転写）応答を誘導する際の中間シグナルとしてのＩＬ−６を示している。ＩＬ−６のレベルは、ＴＮＦ−αのレベルが高いことと相関することが見出されており、そしてＯＡ組織に由来する滑液中では増大している。ＩＬ−１は、ＯＡで認められる軟骨の分解において大きな役割を果たすことが示されている（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ他、１９９１；ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ他、１９９２）。ＩＬ−１は、メタロプロテイナーゼであるストロメライシンおよび間質性コラゲナーゼの合成および分泌を用量依存的にアップレギュレートしている（Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ他、１９８７；Ｌｅｆｅｂｖｒｅ他、１９９０）。マクロファージ様滑液細胞が、軟骨分解酵素を発現するように軟骨細胞を誘導するＩＬ−１および他のサイトカインの主要な供給源であると一部の研究者によって考えられている。軟骨細胞自身もまた、ＩＬ−１を産生することが知られている（Ｇｏｌｄｒｉｎｇ、１９９９）。
【００１４】  上記に詳述された広範囲の研究成果にもかかわらず、軟骨分解酵素の機構的誘導および／またはサイトカイン誘導の経過を変更するために細胞内の軟骨細胞シグナル伝達経路を操作することは依然として困難な目標である。現在の研究は、様々な刺激によって活性化されるだけでなく、様々なＭＭＰ遺伝子（例えば、コラゲナーゼ−１および３）およびある種の炎症性サイトカインの発現に関わっていることが疑われるいくつかの転写因子（特に、活性化因子タンパク質−１またはＡＰ−１）をも調節する、分裂促進因子により活性化されるタンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）ファミリーに向けられている（Ｒｕｔｔｅｒ他、１９９７；Ｐｅｎｄａｓ他、１９９７；Ｌｅｅ他、１９９４）。ストレスにより活性化されるタンパク質キナーゼ類（ＳＡＰＫｓ、これはまたＪＮＫｓとも呼ばれる）、細胞外の調節型キナーゼ類（ＥＲＫｓ）、およびｐ３８キナーゼ類はすべて、軟骨分解酵素の発現を生じさせるシグナル伝達経路における重要なタンパク質であると考えられている。
【００１５】  ＡＰ−１は、ｃ−Ｊｕｎおよびｃ−Ｆｏｓのポリペプチドを含む異種タンパク質複合体である。ＡＰ−１の活性化はまた、進行性の骨および軟骨の変性疾患において重要な役割を果たしていると考えられている（Ｆｉｒｅｓｔｅｉｎ、１９９６）。ＡＰ−１は、コラゲナーゼ遺伝子およびストロメライシンを調節していると考えられており（Ｍａｔｒｉｓｉａｎ、１９９４）、そしてＩＬ−１は、ＲＡの繊維芽細胞様滑液細胞におけるコラゲナーゼおよびＡＰ−１の最も強力な誘導因子の１つである（Ｚｕｏｎｉｎｇ他、１９９９）。
【００１６】  （退行性関節疾患の処置）
ＯＡなどの退行性関節疾患に対する治療薬を開発する現在の方法は、一般に、軟骨分解酵素阻害剤の合成、サイトカイン／細胞受容体レベルの調節およびタンパク質キナーゼの調節を含む。例えば、いくつかのタンパク質キナーゼＣ阻害剤が、特に、ＰＫＣにより媒介される炎症を緩和するために使用できることが一般に報告されている（ＮａｍｂｉおよびＰａｔｉｌ、１９９３；ＮａｍｂｉおよびＰａｔｉｌ、１９９７）。４−（２−アミノ−４−オキソ−２−イミダゾリン−５−イリデン）−２−ブロモ−４，５，６，７−テトラヒドロピロロ（２，３−ｃ）アゼピン−８−オン（ヒメニアルジシン、以降、「Ｈ」）および４−（２−アミノ−４−オキソ−２−イミダゾリン−５−イリデン）−４，５，６，７−テトラヒドロピロロ（２，３−ｃ）アゼピン−８−オン（デブロモヒメニアルジシン、以降、「ＤＢＨ」）およびそれらの様々な生理学的に活性な塩を含むこれらの阻害剤のいくつかが、その後、培養中および関節軟骨の外稙片における軟骨細胞による、グリコサミノグリカンおよび細胞外マトリックスのＩＬ−１により誘導される分解を阻害することが見出された（ＣｈｉｐｍａｎおよびＦａｕｌｋｎｅｒ、１９９７）。近年には、チロシンキナーゼ阻害剤のゲニステイン、ヘルビマイシンＡ、４，５−ジアニリノフタルイミド（ＤＡＰＨ）、チルホスチンＡＧ８２およびチルホスチンＡＧ５５６もまた、インビトロで軟骨細胞による軟骨分解を低下または防止することが見出されている（Ｓｈａｒｐｅ他、１９９７）。
【００１７】  それにも関わらず、退行性関節疾患に関与する軟骨分解酵素の発現を特異的に調節する細胞機構の多くは依然として不明である。軟骨分解酵素を、直接的に、または中間体を活性化することを介して、そのいずれかで調節する特異的なシグナル伝達経路の発見は、退行性関節疾患の誘導および進行を理解することにおける著しい進歩に対応し、そしてそのような疾患を処置するための新しい種類の効果的な治療薬を開発することに対する新しい方法を提供する。
【００１８】  （Ｊａｎｕｓキナーゼ（ＪＡＫ）経路）
軟骨分解酵素の調節に関しても、またはＩＬ−１のシグナル伝達経路に関連してもいかなる点でもこれまで決して関連していない独立した独特なシグナル伝達経路がＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路である。非常に様々なポリペプチド性のサイトカイン、リンホカイン、および増殖因子により、（サイトカイン受容体を介して）ＪＡＫファミリーが活性化される（総説、Ａｒｉｎｇｅｒ他、１９９９）。受容体により活性化されたＪＡＫの様々な結合は、次にＳＴＡＴ（転写のシグナル伝達因子および活性化因子）タンパク質を活性化する（すなわち、チロシンをリン酸化する）。ＪＡＫｓは、現在知られている５個のＳＴＡＴタンパク質の主要な活性化因子であり得ると考えられている（Ｓｉｌｖｅｎｎｏｉｎｅｎ他、１９９７）。
【００１９】  ＳＴＡＴの活性化に対する現在のモデルは、ＪＡＫｓが、活性化された細胞受容体における特定のチロシン残基をリン酸化し、これにより、ＳＴＡＴｓがそれらのＳｒｃ相同性２（ＳＨ２）ドメインで結合するための結合部位を生じさせるというものである。ＪＡＫｓはＳＴＡＴのリン酸化を触媒し、これによりＳＴＡＴの二量体化および受容体からのＳＴＡＴｓの解離を活性化する。ＳＴＡＴの二量体は、その後、細胞の核にトランスロケーションされ、そして核において、例えば、インターフェロンのＤＮＡプロモーター領域（ＩＲＥおよびＧＡＳ）に結合して転写因子として機能する（Ｄａｒｎｅｌｌ  Ｊｒ．他、１９９４；Ｉｈｌｅ、１９９５；Ｉｈｌｅ、１９９４；Ｄａｒｎｅｌｌ、１９９７）。
【００２０】  さらに上流のＪＡＫの活性化は、固有のキナーゼ活性を有しない、細胞のサイトカイン膜貫通受容体に直接関連している。ＪＡＫｓは、これらの受容体の細胞質モチーフに結合することができる。これらの細胞受容体は、細胞内のシグナリングを行うために、その非受容体タンパク質キナーゼとしてＪＡＫｓを呼び集め／活性化するように作用する（Ａｒｉｎｇｅｒ他、１９９９）。１つのモデルでは、リガンドにより誘導される受容体の二量体化またはオリゴマー化はＪＡＫ分子の局所的な集合を生じさせ、そして交差リン酸化機構によるＪＡＫの活性化を生じさせることが提案されている（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、１９９５）。
【００２１】  ＪＡＫファミリーのメンバーは、現在、ＪＡＫ１、ＪＡＫ２、ＴＹＫ２、およびＪＡＫ３からなっており、非受容体チロシンキナーゼである。ＪＡＫタンパク質は、他のチロシンキナーゼにおいて見出される高度に保存された触媒作用ドメインを含む（Ｆｉｒｍｂａｃｈ−Ｋｒａｆｔ、１９９０；Ｈａｎｋｓ他、１９９１；Ｈｕｎｔｅｒ、１９９１；Ｗｉｌｋｓ、１９８９）。しかし、ほとんどの他のチロシンキナーゼ類とは異なり、ＪＡＫｓは細胞質に局在化し、そして機能が未知である別のキナーゼ様ドメインを含んでいるが、ＳＨ２ドメインもしくはＳＨ３ドメイン、シグナルペプチド配列または膜貫通ドメインは含んでいない（Ｈａｒｐｕｒ他、１９９２；Ｗｉｌｋｓ他、１９９１）。
【００２２】  ＪＡＫタンパク質は、造血細胞に作用するいくつかのサイトカインからのシグナル伝達に関与していることが知られている。ＪＡＫシグナル伝達は、ＩＮＦ−α、βおよびγ（インターフェロン）；ＩＬ−２、３、４、６、７、１７（インターロイキン）；ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）；ＥＰＯ（エリスロポイエチン）；ＧＨ（成長ホルモン）；ＣＮＴＦ（毛様体神経栄養因子）；ＬＩＦ（白血病阻害因子）；ＯＳＭ（オンコスタチンＭ）；およびＰＲＬ（プロラクチン）によって活性化される（Ａｒｇｅｔｓｉｎｇｅｒ、１９９３；Ｇａｕｚｚｉ他、１９９６；ＨｅｌｄｅｎおよびＰｕｒｔｏｎ（編）、１９９６；Ｉｈｌｅ、１９９６；Ｌｉｕ他、１９９７；Ｌｕｔｔｉｃｈｅｎ、１９９４；Ｍｕｌｌｅｒ他、１９９３；ＳｃｈｉｎｄｌｅｒおよびＤａｒｎｅｌｌ  Ｊｒ．、１９９５；Ｓｔａｈｌ他、１９９４；Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｍ他、１９９９；Ｖｅｌａｚｑｕｅｚ他、１９９２；Ｗａｔｌｉｎｇ他、１９９３；Ｗｉｔｔｈｕｈｎ他、１９９３；Ｒｕｉ他、１９９４）。
【００２３】  絶対的な相関が、ＪＡＫ活性化といくつかのサイトカイン誘導による下流のシグナル伝達事象との間において明らかにされている。これらには、ホスホイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ−３Ｋ）、Ｓｈｃ、インスリン受容体基質−１および−２（ＩＲＳ−１および−２）、ならびにＶａｖリン酸化および、ｃ−Ｍｙｃ、ｃ−Ｆｏｓ、ｃ−Ｊｕｎ、Ｐｉｍ、およびＣＩＳの各遺伝子の誘導が含まれる（Ｓｉｌｖｅｎｎｏｉｎｅｎ他、１９９７）。
【００２４】  ＪＡＫ／ＳＴＡＴタンパク質は、胚および出生後の脳に存在し、およびインビボで調節されていることが見出されており、このことは脳の発達時における役割を示している（Ｄｅ−Ｆｒａｊａ他、１９９８）。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路は脳腫瘍（例えば、髄膜腫）において重要であることが見出されている。そして、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路はまた、糖尿病性腎症の病因におけるシグナル伝達経路として役立つことも見出されている。
【００２５】  Ｊａｎｕｓキナーゼ３（ＪＡＫ３）
ＪＡＫ３は、ＪＡＫタンパク質チロシンキナーゼファミリーの最も新しいメンバーである。ＪＡＫ３の３つのスプライス変化体が造血ガン細胞および上皮ガン細胞において報告されている。これらのＪＡＫ３スプライス変化体は、同一のアミノ末端領域を含むが、Ｃ末端は異なっている（Ｌａｉ他、１９９５；ＧｕｒｎｉａｋおよびＢｅｒｇ、１９９６）。これらのスプライス変化体の機能的重要性は完全には理解されていない。ＪＡＫ３のアミノ末端のＪＨ７−６ドメイン（アミノ酸１〜１９２）は、それがＩＬ−２Ｒサブユニットγｃと相互作用するために必要かつ十分であることが示されている（Ｃｈｅｎ他、１９９７）。
【００２６】  ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路、および特にＪＡＫ３の役割は、様々な疾患および障害に対する治療的介入の重要な点を表している。しかし、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の完全な範囲および機能は未解明のままである。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路をより完全に理解することがこの分野では求められており、そしてこのシグナル伝達経路を調節する方法によって、ＪＡＫ／ＳＴＡＴにより媒介される疾患または障害を処置する際に重要な新しい治療薬がもたらされる。
【００２７】    （発明の概要）
本発明は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路（特に、ＪＡＫ３）が退行性関節疾患の開始および進行に関与しているという発見に基づく。詳細には、ＪＡＫ３阻害剤によって、ＯＡの発症および進行に関与していることが知られている遺伝子のＩＬ−１誘導による発現が阻止されることが示される。本明細書中にはまた、ＪＡＫ３が軟骨細胞では少なくとも２つの形態で発現していることも最初に明らかにされる。ＤＢＨおよびＨなどの分子が、動物モデルにおいてＯＡなどの軟骨分解性障害を処置することにおいて効果的であることが示される一方で、様々な軟骨分解因子および炎症媒介因子の発現を直接的および／または間接的に低下させるまたは抑制するＪＡＫ３特異的阻害剤として作用することを明らかにする証拠が示される。最後に、他のＪＡＫ３阻害剤もまた、ＤＢＨおよびＨの様式と同一の様式で様々な軟骨分解性因子の発現を、直接的および／または間接的に、効果的に抑制し得ることを明らかにする証拠が示される。軟骨の変性におけるＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路のこの新規な役割の同定、およびそのような疾患の病状予防におけるＪＡＫ３阻害剤の特異的な機能の同定および決定は、退行性関節疾患の処置に対して効果的な種類の治療薬を開発する新しい方法をもたらす。本発明はまた、ＯＡ治療薬として以前に知られている分子に対する新しい使用法、すなわち、ＪＡＫ／ＳＴＡＴにより媒介される、ＯＡ以外の疾患または障害を処置することにおける使用法を明らかにする。
【００２８】  １つの態様において、本発明は、軟骨の分解を伴う疾患または障害を処置するためのＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤の使用に関する。
関連する態様において、本発明は、軟骨分解酵素の発現を調節するためのＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤の使用に関する。
【００２９】  他の態様において、本発明は、軟骨細胞をＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤と接触させることによって、ｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２またはＮＫ−κＢを含む前炎症性因子の軟骨細胞における発現を調節する方法を包含する。
【００３０】  さらに別の態様において、本発明は、軟骨細胞をＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤と接触させることによって、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１を含む前炎症性サイトカインの軟骨細胞における発現を調節する方法に関する。
【００３１】  本発明の別の態様は、一般には、ＰＫＣにより媒介される炎症なとの、ＪＡＫ／ＳＴＡＴにより媒介される、ＯＡ以外の疾患または障害あるいは関連する炎症性障害を、ＤＢＨまたはＨを投与することによって処置する方法に関する。
【００３２】  本発明の別の態様は、ＪＡＫ３との相互作用を伴うアッセイを包含する。１つの態様には、軟骨の分解を伴う疾患または障害を処置するために有用な化合物を、ＪＡＫ３を阻害し得る化合物を検出することによって検出するアッセイ、そしてこのアッセイを使用して発見されるそのような化合物を包含する。
【００３３】    （発明の詳細な説明）
軟骨細胞におけるＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達に関する役割、および退行性関節疾患の開始および進行におけるその関与を記載する、最初の報告が本明細書中に開示される。詳しくは、本発明者らは、ＤＢＨおよびＨ（これらは現在、ＯＡなどの退行性関節疾患の動物モデルにおける効果的な治療薬であることが知られている）が、実際に、軟骨細胞におけるＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達を乱すことによって、具体的には、ＪＡＫ３阻害剤として作用することによって機能することを発見した。退行性関節疾患におけるＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路のこの新規な役割を確認するために、軟骨分解因子の調節を行うことが以前には知られていなかったさらなる既知のＪＡＫ３阻害剤もまた、ＤＢＨおよびＨと同一な様式でそのような細胞プロセスを調節することを明らかにする証拠が示される。
【００３４】  これらの発見の結果、新規な種類の化合物、すなわち、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤、好ましくは、ＤＢＨおよびＨとは異なるＪＡＫ３阻害剤が、関節の変性を伴う疾患の経過を変化させるために有用であるとして同定される。したがって、１つの態様において、本発明は、ＤＢＨおよびＨとは異なるＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤の薬学的に効果的な量を投与することによって、軟骨の分解を伴う疾患または障害の発症の進行または可能性を阻害するための方法に関する。そのような疾患および障害には、ＯＡ、慢性関節リウマチ、ならびに一次性全身化ＯＡ、孤立型ＯＡ、二次性ＯＡ、外傷性関節炎、血清反応陰性多発性関節炎、血清反応陰性および血清反応陽性の慢性関節リウマチ、血清反応陰性関節炎、若年性慢性関節リウマチ、および乾癬性関節炎が含まれる。
【００３５】  本明細書中で使用される「ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤」は、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ相互作用の量および／または活性をダウンレギュレートまたはそうでなければ減少もしくは抑制することができる任意の化合物をいう。ＪＡＫ阻害剤は、ＪＡＫ分子の量または活性をダウンレギュレートする。ＳＴＡＴ阻害剤は、ＳＴＡＴ分子の量または活性をダウンレギュレートする。これらの細胞成分の阻害は、ＪＡＫに対する直接的な結合（例えば、ＪＡＫ阻害剤と化合物との結合複合体または基質模倣体）、ＳＴＡＴに対する直接的な結合、またはそのような細胞成分をコードする遺伝子の発現を阻害すること（これらに限定されない）を含む、この分野で知られている様々な機構によって達成され得る。本発明の好ましいＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤はＪＡＫ阻害剤であり、最も好ましいものはＪＡＫ３阻害剤である。一般に、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤は、タンパク質、ポリペプチド、小分子および他の化学的成分、または核酸であり得る。
【００３６】  上記に示された阻害剤の変異体、変化体、誘導体および類似体もまた本発明の方法において有用であり得る。本明細書中で使用される「変異体、変化体、誘導体および類似体」は、親化合物と類似した形または構造を有し、かつＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤として作用する能力を保持する分子をいう。例えば、本明細書中に開示されるＪＡＫ３阻害剤はどれも結晶化させることができ、そして有用な類似体を、活性部位（１つまたは複数）の形状を決める座標に基づいて合理的に設計することができる。あるいは、当業者は、過度な実験を行うことなく、既知の阻害剤の官能基を修飾して、そのような修飾分子を、増大した活性、半減期、生物利用性または他の望ましい特性についてスクリーニングすることができる。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤がポリペプチドである場合、ポリペプチドのフラグメントおよび修飾体を、送達の容易さ、活性、半減期などを増大させるために製造することができる。再度ではあるが、合成および組換えによるポリペプチド製造の分野における技術レベルが示された場合、そのような修飾は、過度な実験を行うことなく達成することができる。
【００３７】  本発明の方法において有用であり得るＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤の例としては、様々なＳＴＡＴタンパク質のレベルで結合して阻害するＰＩＡＳタンパク質（Ｃｈｕｎｇ他、１９９７）；ＪＡＫおよび／または受容体に結合して、シグナリングを阻止することができるＳＨ２含有タンパク質ファミリーのメンバー（例えば、ＡｍａｎおよびＬｅｏｎａｒｄ、１９９７；ＮｉｃｈｏｌｓｏｎおよびＨｉｌｔｏｎ、１９９８を参照のこと）；サイトカインにより誘導され得るＳｒｃ相同性２含有（ＣＩＳ）タンパク質、ＳＴＡＴシグナリング阻害剤（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ他、１９９５）；ＳＴＡＴシグナリングを阻害し得るか、またはＪａｎｕｓキナーゼに直接結合し得るＣＩＳ関連タンパク質（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ他、１９９５；Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ他、１９９７；Ｓｔａｒｒ他、１９９７；Ｅｎｄｏ他、１９９７；Ｎａｋａ他、１９９７）；ＳＴＡＴ３の下流の活性化を阻止するためにすべてのＪＡＫと会合すると考えられるサイトカインシグナリング−Ｉタンパク質の抑制因子（ＳＯＣＳ−１、これはまたＪＡＢまたはＳＳＩ−１とも呼ばれる）（Ｏｈｙａ他、１９９７）；チロシン成分およびエルブスタチン成分に類似するベンジリデンマロノニトリルの誘導体であるチルホスチン類（Ｇａｚｉｔ他、１９８９）；チロシンキナーゼ阻害剤のチロホスチンファミリーのメンバーであるＡＧ−４９０（Ｗａｎｇ他、１９９９；そしてまた、Ｋｉｒｋｅｎ他、１９９９）；ＪＡＫ３を特異的に阻害する４，５−ジメトキシ−２−ニトロ安息香酸および４，５−ジメトキシ−２−ニトロベンズアミド（Ｇｏｏｄｍａｎ他、１９９８）；ジメトキシキナゾリン化合物に構造的に由来する４−（フェニル）−アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリン（親化合物ＷＨＩ−２５８）およびこの化合物の誘導体（Ｓｕｄｂｅｃｋ他、１９９９）；４−（４’−ヒドロキシフェニル）−アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリン（ＷＨＩ−Ｐ１３１）、４−（３’−ブロモ−４’−ヒドロキシルフェニル）−アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリン（ＷＨＩ−Ｐ１５４）、および４−（３’、５’−ジブロモ−４’−ヒドロキシルフェニル）−アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリン（ＷＨＩ−Ｐ９７）を含む４’−ＯＨ基を含有する化合物；別のジメトキシキナゾリン化合物であるＷＨＩ−Ｐ１８０（Ｃｈｅｈ他、１９９９）；ホルスコリン（アデニル酸シクラーゼの直接的な活性化剤）およびジブチリルｃＡＭＰなどのｃＡＭＰ上昇剤、ならびに３−イソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ）（ｃＡＭＰホスホジエステラーゼの阻害剤）（Ｋｏｌｅｎｋｏ他、１９９９）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３８】  本明細書中で使用される「ＤＢＨ」および「Ｈ」は、それぞれデブロモヒメニアルジシンおよびヒメニアルジシンを示し、ならびにそれらの様々な類似体および生理学的に活性な塩をいい、これらには、遊離塩基のＤＢＨならびにＤＢＨのトリフルオロ酢酸形態およびメタンスルホン酸形態が含まれるが、これらに限定されない。ＤＢＨおよびＨの類似体には、ＤＢＨに見出されるピロロアゼピン環の４位に結合した５員環の窒素含有複素環を含有する化合物が含まれる。類似体の例には、ヒメニンおよびアクシノヒダントインが含まれる。具体的には、ＤＢＨおよびＨの類似体は下記の構造を含む：
【００３９】
【化１】
0005512909.tif 000002
【００４０】  式中、Ｒ1およびＲ2はそれぞれ独立して、−Ｈおよびハロゲンからなる群から選択され、そしてＸは、ＣｈｉｐｍａｎおよびＦａｕｌｋｎｅｒ（１９９７）に示されるように、
【００４１】
【化２】
0005512909.tif 000003
【００４２】からなる群から選択される（ただし、上記Ｘラジカル基の化学構造はそれぞれ、ＤＢＨに見出されるピロロアゼピン環の４位に対する化学結合の説明を含む）。
本明細書中で使用される、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤の「薬学的に効果的な量」は、インビトロで処置された細胞またはインビボで処置された対象体のいずれかにおいて所望する生理学的な結果を達成するために効果的な量である。具体的には、薬学的に効果的な量は、問題の疾患状態に関連した臨床的に定義される病理学的プロセスの１つまたは複数をある期間にわたって阻害するために十分な量である。効果的な量は、選択された特定のＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤に依存して変化し得、また処置される対象体に関連する様々な要因および状態ならびに障害の重篤度にも依存する。例えば、阻害剤がインビボで投与される場合、患者の年齢、体重および健康状態などの要因、ならびに臨床前の動物研究で得られた用量応答曲線および毒性データは特に考慮されるであろう。阻害剤をインビトロで細胞と接触させる場合、取り込み、半減期、用量、毒性などのようなパラメーターを評価するための様々な臨床前のインビトロ研究もまた設計される。所与の薬剤に対する薬学的に効果的な量を決定することは、十分に当業者の能力の範囲内である。
【００４３】  本発明の方法はまた、細胞をＤＢＨおよびＨとは異なるＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤の薬学的に効果的な量と接触させることによって、細胞における軟骨分解酵素の発現を調節することを含む。軟骨分解酵素には、マトリックスメタロプロテアーゼ類、アグリカナーゼ類ならびにセリンプロテアーゼ類およびチオールプロテアーゼ類が含まれるが、これらに限定されない。好ましいマトリックスメタロプロテアーゼ類には、ストロメライシン類（例えば、ストロメライシン−１）、ゼラチナーゼＡ、ゼラチナーゼＢ、コラゲナーゼ１、コラゲナーゼ３、および好中球コラゲナーゼが含まれる。好ましいアグリカナーゼ類には、ＡＤＡＭＴＳ−１、ＡＤＡＭＴＳ−４、およびＡＤＡＭＴＳ−１１が含まれる。そのような処置を受けやすい細胞には、軟骨細胞および滑液細胞を含む、そのような軟骨分解酵素を発現する任意の細胞が含まれる。
【００４４】  本明細書中で使用される、発現および／または活性を「調節する」という用語は、一般には、細胞成分の量または活性（機能性）を制御または調整するように機能する任意のプロセスをいう。静的な調節により、発現および／または活性が一定のレベルで維持される。アップレギュレーションは、発現および／または活性の相対的な増大をいう。ダウンレギュレーションは、発現および／または活性の相対的な低下である。本発明では、調節は、好ましくは、細胞成分のダウンレギュレーションである。本明細書中で使用されているように、ダウンレギュレーションは、所与の細胞成分の阻害と同義である。
【００４５】  本発明の別の態様において、軟骨細胞をＤＢＨおよびＨとは異なるＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤の薬学的に効果的な量と接触させることによって、ｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２またはＮＫ−κＢを含む前炎症性因子の軟骨細胞における発現を調節するための方法が提供される。
【００４６】  本発明の別の態様において、ＤＢＨまたはＨとは異なるＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤の薬学的に効果的な量が、ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１を含む前炎症性サイトカインの軟骨細胞における発現を調節するために使用される。
【００４７】  さらなる態様において、上記の方法は、軟骨分解酵素、前炎症性因子および前炎症性サイトカインの滑液細胞における発現を調節するために用いられる。
これらの発見の結果としてまた、ＪＡＥ−３阻害剤（すなわち、ＤＢＨおよびＨ）の新しいクラスが同定される。したがって、本発明の別の態様において、薬学的に効果的な量のＤＢＨまたはＨを投与することによって、ＯＡとは異なるＪＡＫ／ＳＴＡＴ媒介による疾患または障害あるいはＰＫＣ媒介による炎症を処置するための方法が提供される。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ媒介の疾患または障害は、疾患状態の臨床的に定義された症状または原因の１つまたは複数を媒介することにＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル変換経路が関与している疾患または障害である。そのような疾患および障害の例には、Ｔ細胞により媒介される障害、例えば、ＨＴＬＶ−１、ｓｄｚｏｒｙ’ｓ症候群、ｃ−ａｂｌ変換、ナチュラルキラー様Ｔ細胞リンパ腫（ＮＫ様腫瘍）および移植片対宿主病など；２型（サイトカイン過敏性）疾患または障害、例えば、リーシュマニア症、らい病、アレルギー、およびウイルス感染症など；マスト細胞により媒介される障害、例えば、アレルギー、枯草熱、喘息、じんま疹、およびアナフィラキシーなど；および、急性のリンパ性白血病およびリンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫および骨髄起源の白血病などの白血病およびリンパ腫が含まれるが、これらに限定されない。
【００４８】  例えば、ＪＡＫ３は、共通γ鎖（γｃ）ファミリーのサイトカイン受容体と、例えば、インターロイキン−２、−４、−７、−９および−１５に対する受容体、および、おそらくは同様にＩＬ−１３に対する受容体と特異的に会合することが見出されている（Ｒｏｌｌｉｎｇ他、１９９６；Ｙｕ他、１９９８；Ｋｅｅｇａｎ他、１９９５；Ｉｚｕｈａｒａ他、１９９６）。したがって、そのような会合を乱すことが有益であると考えられる疾患状態はいずれも、ＤＢＨおよびＨを用いた処置を受けることができる。
【００４９】  ＪＡＫ３は、免疫調整における重要な役割を示し、リンパ様（Ｔ細胞、Ｂ細胞）もしくは骨髄（例えば、単球）の活性化または細胞分化に続く発現での著しいアップレギュレーションよって他のＪＡＫファミリーメンバーから区別される（Ｋａｗａｍｕｒａ他、１９９４；Ｋｕｍａｒ他、１９９６；Ｔｏｒｔｏｌａｎｉ他、１９９５；Ｍｕｓｓｏ他、１９９５）。したがって、ＤＢＨおよびＨが、ＰＫＣ媒介による炎症とは異なる炎症状態を処置するために有用であることが本明細書中に開示される。
【００５０】  さらに、ショウジョウバエＪＡＫの活性化変異はショウジョウバエに白血病を生じさせ、そして関連したＳＴＡＴタンパク質の優性ネガティブ変異は白血病細胞の増殖を抑制する（Ｈｏｕ他、１９９６；Ｌｕｏ他、１９９５）。いくつかの他の研究は、ＨＴＬＶ−Ｉ変換（Ｍｉｇｏｎ他、１９９５）、Ｓｄｚａｒｙ’ｓ症候群（Ｚｈａｎｇ他、１９９６）、ｖ−ａｂｌによる変換（Ｄａｎｉａｌ他、１９９５）および様々な形態の白血病を含むガンにおいて一定の役割を果たしているとしてＪＡＫの過活性化を関連づけている。詳しくは、ＪＡＫ−３は、ＡＭＬｓ（ＫＧ１、ＴＦ−１、ＨＥＬ）、Ｂ系統ＡＬＬｓ（ＰＢ６９７、Ｎａｌｍ−１６、およびＮａｌｍ−６）、およびＴ−ＡＬＬｓ（Ｍｏｌｔ−１６およびＭｏｌｔ−３）を含む、数多くの白血病由来の細胞株において発現しており（Ｃｉｖｉｎ他、１９９８および１９９９）、ｏｙｏｂｉ急性リンパ芽球性白血病（小児ガンの最も一般的な形態）の小児に由来する原発性白血病細胞において非常に多く発現している（例えば、Ｓｕｄｂｅｃｋ他、１９９９）。したがって、ＤＢＨおよびＨは、ＪＡＫ−３が腫瘍形成の開始または進行において一定の役割を果たしているガンにおける治療剤として有用であり得る。
【００５１】  ＪＡＫ３はまた、例えば、放射線により誘導されるｃ−ｊｕｎ転写において一定の役割を果たすことも知られている（Ｇｏｏｄｍａｎほか、１９９８）。さらに、ＪＡＫ３／ＳＴＡＴ６阻害剤は、リーシュマニア症、らい病、アレルギー、およびウイルス感染症などの様々な２型疾患状態を処置する際に重要な役割を果たし得る（Ｗａｎｇ他、１９９９）。
【００５２】  最近、ＭａｌａｖｉｙａおよびＵｃｋｕｎ（１９９９）は、ＪＡＫ３がマスト細胞で発現していること、およびその酵素活性がＩｇＥ受容体／ＦｃεＲＩの架橋によって高められることを報告している。これらの結果は、ＪＡＫ３が、インビトロおよびインビボの両方でＩｇＥ受容体／ＦｃＲＩにより媒介されるマスト細胞応答において中枢の役割を果たしており、そして喘息およびアナフィラキシーなどの疾患状態に関与している、マスト細胞上の高親和性ＩｇＥ受容体の完全なシグナル伝達能に必須な非縮重的機能を有し得ることを示唆している。
【００５３】  上記のプロセスはいずれも、標的の細胞または器官を薬学的に効果的な量のＤＢＨまたはＨと接触させることによって調節することができる。
ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤を対象体に投与する経路は限定されておらず、非経口的（皮下注射、静脈内注射、髄内注射、関節内注射、筋肉内注射、または腹腔内注射を含む）、直腸的、局所的、経皮的または経口的を含み得る。例えば、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤は、対象者の局所的に冒された領域（例えば、関節）内に関節内投与することができ、したがって、そのような領域における治療効果を最大限にし、その一方で、非罹患領域に対する作用を最小限にすることができる。阻害剤はまた、罹患領域の近くに局所投与することができる。あるいは、阻害剤は、例えば、カプセル剤、懸濁剤または錠剤で経口投与することができる。
【００５４】  ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤は、単回用量または反復投与で、そして様々な生理学的に受容可能な塩の形態のいずれかで、および／または薬学的組成物の一部としての受容可能な薬学的キャリアととともに対象者に投与することができる。生理学的に受容可能な塩の形態および標準的な医薬品配合技術は当業者には十分に知られている（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．を参照のこと）。
【００５５】  本開示により、軟骨分解性の疾患または障害の発病および進行における軟骨細胞内でのＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の機能的な役割が初めて教示されるので、本発明はまた、そのような疾患または障害を処置するために有用な新規な化合物を検出するためのアッセイ、ならびにそのようなアッセイによって同定されたそのような有用な化合物に関する。
【００５６】  本発明のアッセイは、候補化合物または候補化合物のライブラリーをそのＪＡＫ３活性阻害能についてスクリーニングすることによって、軟骨分解性の疾患または障害を処置するために有用な化合物を同定する。様々なアッセイ・プロトコールおよび検出技術が、この分野では十分に知られており、当業者によってこの目的のために容易に適合される。そのようなアッセイには、高スループット・アッセイ、インビトロおよびインビボでの細胞アッセイおよび組織アッセイが含まれるが、これらに限定されない。
【００５７】  本明細書中に記載される本発明の組成物および方法の他の好適な改変および適合化は明らかであり、そして本発明または本明細書中に開示された態様の範囲から逸脱することなく行い得ることは当業者には容易に明らかである。これまで本発明を詳しく記載してきたが、本発明は、下記の実施例を参照することによってより明瞭に理解されが、下記の実施例は、例示目的のためにだけ含まれ、本発明の限定であることを意図するものではない。
【実施例】
【００５８】 実施例１：ヒト関節軟骨細胞培養物の調製
ＯＡなどの退行性軟骨の疾患または障害に関連した細胞病理学を研究するために、ヒト軟骨の細胞（ヒト軟骨細胞）培養物を調製した。【００５９】  正常なヒト関節軟骨の薄片を剖検の４８時間以内に３０歳の白人男性の膝から得た（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｃｈａｎｇｅ（ＮＤＲＩ）、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）。関節の軟骨細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中で３７℃で一晩の酵素消化（０．１％クロストリジウムヒストリチクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ）コラゲナーゼ；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、Ｆｒｅｅｈｏｌｄ、ＮＪ）によって軟骨のすりつぶした薄片から遊離させた。不完全な消化物を、ＤＭＥＭ中で０．２５％コラゲナーゼおよび０．０５％トリプシンを使用してさらに３時間消化した。【００６０】  軟骨細胞をプラスチック容器に単層で播種し、そしてＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ、Ｌｏｇａｎ、ＵＴ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン（ｐｅｎ）および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐ）の存在下、３７℃および８％ＣＯ2において、３日毎に培地交換を行いながらコンフルエンスになるまで培養した。コンフルエンスに達したとき、第１継代の軟骨培養をトリプシン処理によって集め、細胞株ＨＣ３０−０１９８と名付けて、将来の使用のために、ＤＭＥＭ、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ、４０％ＦＢＳ、および１０％ジメチルスルホキシドの存在下で液体窒素中に保存した。【００６１】 実施例２：正常なヒト関節軟骨細胞におけるＪＡＫ３の発現
ヒト軟骨細胞におけるＪＡＫ３の発現を明らかにするために、ＪＡＫ３特異的プライマーを使用する逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を、単層で培養された正常な成人ヒト軟骨細胞から単離された総ＲＮＡに対して行った。【００６２】  正常な成人のヒト関節軟骨細胞を、上記の実施例１に教示されているように軟骨の薄片から単離して培養した。凍結された軟骨細胞の細胞株ＨＣ３０−０１９８を解凍し、上記に記載されるように単層で培養して（第２継代）、コンフルエンス後５日目まで培養した。【００６３】  総ＲＮＡを、製造者が指示するプロトコールに従ってＱｉａｇｅｎ  Ｒｎｅａｓｙ（登録商標）キット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用してコンフルエンス後５日目のヒト関節軟骨細胞から抽出した。【００６４】  ＪＡＫ３プライマーを発表されたヒトＪＡＫ３遺伝子およびｃＤＮＡ配列（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｕ７００６５および同Ｕ０９０６０７）から設計した。ＪＡＫ３遺伝子に特異的な３つのＤＮＡプライマーは、ヒトＪＡＫ３遺伝子のエキソン１８およびエキソン１９を標的とした（表Ｉ）。【００６５】
【表１】
0005512909.tif 000004
【００６６】第１鎖ｃＤＮＡを、ＪＫ３−２プライマー、総ＲＮＡ、ならびにＲｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ（登録商標）Ｙｏｕ−Ｐｒｉｍｅの第１鎖ビーズおよび方法（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して作製した。【００６７】  ｃＤＮＡ産物（８μｌ）を、１０μｌのＰＣＲ用１０Ｘ緩衝液、２．４μｌの２５ｍＭのＭｇＣｌ2、０．５ｕｌのホットスタートを使用するＴａｑポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）、７３μｌの水、およびそれぞれ３μｌの１０μＭのＪＫ３−１プライマーおよびＪＫ３−３プライマーを使用する１００μｌの反応液で増幅した。ホットスタートＰＣＲプロトコールは、９４℃で５分間の最初の変性（その後、Ｔａｑポリメラーゼが添加される）、その後、９４℃で３０秒間の変性；５６℃で３０秒間のアニーリング；７２℃で３０秒間の伸長から構成された。変性、アニーリング、および伸長を４０サイクル行い、その後、７２℃で５分間の最後の伸長を行った。【００６８】  ＲＴ−ＰＣＲにより、２５４塩基対のＤＮＡ産物が得られ、これを、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（商標）ゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して、２％ＳｅａＫｅｍ（登録商標）ＧＴＧ（登録商標）アガロースゲル（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＥ）での電気泳動によって精製した。【００６９】  ＲＴ−ＰＣＲ産物の配列決定を、ＪＫ３−３プライマーおよびＡｍｐｌｉＣｙｃｌｅ（登録商標）の配列決定試薬およびプロトコール（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して行った。１０９ヌクレオチドのＤＮＡ配列が、ＲＴ−ＰＣＲ産物の一方の鎖のサイクル配列決定反応から得られ、うち１０６個のヌクレオチドは、ＧｅｎＢａｎｋのヒトＪＡＫ３のｃＤＮＡ配列（アクセション番号Ｕ０９０６７）に対して１００％の同一性を示した（図１）。３つのヌクレオチド不一致は、ＲＴ−ＰＣＲにより生じた配列決定テンプレートおよびＤＮＡ配列決定ゲルの品質が最適ではなかったことに起因した。【００７０】 実施例３：ヒト変形性関節症の軟骨に由来する関節軟骨細胞におけるＪＡＫ３の発現
ヒト変形性関節症の軟骨に由来する関節軟骨細胞におけるＪＡＫ３の発現を、上記の実施例２の正常なヒト軟骨細胞において見出されるＪＡＫ３の発現と比較するために、ＪＡＫ３特異的プライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲを、成人のヒト変形性関節症の軟骨から直接単離された総ＲＮＡに対して行った。【００７１】  全膝置換を受けている４７歳の白人女性の右膝に由来する変形性関節症の関節軟骨の薄片をＮＤＲＩから得た。軟骨を、集めた直後に液体窒素中に素早く凍結した。無傷の軟骨の２グラム〜４グラムの総量を、ＳＰＥＸミル（ＳＰＥＸ  ＣｅｒｔｉＰｒｅｐ，Ｉｎｃ．、Ｍｅｔｕｃｈｅｎ、ＮＪ）を使用して液体窒素の存在下で粉末化した。総ＲＮＡを、粉末化した軟骨から、Ｒｅｎｏ他（１９７７）によって記載されるＴＲＩｓｐｉｎ法を使用して単離した。【００７２】  ＲＴ−ＰＣＲを、実施例２に記載されるように、ＪＫ−１、ＪＫ−２、およびＪＫ−３のプライマーを使用して総ＲＮＡサンプルに対して行った。ＲＴ−ＰＣＲにより、２５４塩基対のＤＮＡ産物が得られ、続いてこれを、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して２％ＳｅａＫｅｍ（登録商標）ＧＴＧ（登録商標）アガロースゲル（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＥ）から精製した。【００７３】  ＲＴ−ＰＣＲ産物の配列決定を、製造者が指示するプロトコールに従って、ＪＫ３−３プライマーおよびＡＢＩプリズム・ダイ・ターミネーター・サイクル・シーケンシング・レディー反応キット（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ、ＣＡ）を使用して行った。ＤＮＡ配列を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３７７ＤＮＡ配列決定装置（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して決定した。２１４ｂｐの配列が決定された。【００７４】  配列決定された２１４個のヌクレオチドのうち、１９７個のヌクレオチドは、ＧｅｎＢａｎｋのヒトＪＡＫ３のｃＤＮＡ配列（アクセション番号Ｕ０９０６７）に対して１００％の同一性を示した（図２）。残る１７個のヌクレオチド不一致は、配列決定テンプレートの品質が最適ではなかったことに起因した。【００７５】 実施例４：ヒト軟骨細胞ｃＤＮＡライブラリーからのＪＡＫ３ｃＤＮＡの単離
ＪＡＫ３がヒト軟骨細胞で活発に発現していることをさらに明らかにするために、ＪＡＫ３をヒト軟骨細胞のｃＤＮＡライブラリーから単離した。【００７６】  この分野で知られている技術を使用して、アルギン酸塩中で培養されたヒト関節軟骨細胞から単離された総ＲＮＡを使用して、ｃＤＮＡライブラリーを作製した（ｃＤＮＡライブラリーの構築はＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）によって商業的に行われた）。ｃＤＮＡライブラリーを、十分に確立されたプロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９）、およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）の推奨されるプロトコール）に従って力価測定して、スクリーニングした。【００７７】  ＪＡＫ３のＤＮＡプローブを使用して、軟骨細胞のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。ｃＤＮＡライブラリー／フィルターのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを、１Ｘプレハイブリダイゼーション／ハイブリダイゼーション溶液（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を６５℃で使用して行った。ＪＡＫ３のＤＮＡプローブを用いた１５時間のハイブリダイゼーションを行った後、ブロットの洗浄を、順次、２ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回（室温で１５分／洗浄）、そして１ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回（６５℃で３０分／洗浄）行った。ブロットを空気乾燥して、放射能シグナルを、Ｋｏｄａｋ  Ｘ−Ｏｍａｔ（商標）ＡＲ（ＸＡＲ）オートラジオグラフィー・フィルム（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を使用して可視化した。【００７８】  二連のフィルターで陽性であったプラークを選択して、１ｍｌの滅菌ＳＭ緩衝液（０．０５ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．１ＭのＮａＣｌ、０．００８ＭのＭｇＳＯ4、０．０１％ゼラチン）に入れ、ボルテックスして、４℃で一晩インキュベーションした。一次スクリーニングから得られた１４個の陽性プラークを、２００μｌの細菌株ＸＬ−１ＢｌｕｅＭＲＦ’（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）への１×１０-2希釈物の１０μｌを使用して再置床し、上記のようにＪＡＫ３のＤＮＡプローブを用いてスクリーニングした。二次スクリーニングから得られた陽性プラークを選択して、上記のようにＳＭ緩衝液に入れた。【００７９】  二次スクリーニングから得られた２個の陽性ファージ・クローンを、ｉ）実施例２に記載されるようなＰＣＲ反応においてＪＫ３−１プライマーおよびＪＫ３−３プライマーを使用するＪＡＫ３同一性の確認、およびｉｉ）Ｔ７プライマーおよびＴ３プライマー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用するクローン化されたｃＤＮＡ挿入物のサイズの確認に基づくＤＮＡ配列分析のために選択した。ホットスタートＰＣＲプロトコールは、９３℃で５分間の最初の変性（その後、Ｔａｑポリメラーゼが添加される）、その後、９３℃で１分間の変性；５５℃で１分間のアニーリング；７５℃で４５秒間の伸長から構成された。変性、アニーリング、および伸長を４０サイクル行い、その後、７５℃で７分間の最後の伸長を行った。ＰＣＲ産物のサイズは、１％ＳｅａＫｅｍ（登録商標）ＧＴＧ（登録商標）アガロースゲル（ＦＭＣ  ＢｉｏＰｒ��ｄｕｃｔｓ、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ＭＥ）において可視化された。【００８０】  ＪＡＫ３の最長のｃＤＮＡ挿入物を含有する２つのラムダＺＡＰ（登録商標）ＩＩファージクローンのＰＣＲ産物を同定した後、ＪＡＫ３のｃＤＮＡ挿入物をそれぞれ、製造者が指示するプロトコールに従ってＥｘＡｓｓｉｓｔ（商標）干渉耐性ヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用してＳＯＬＲ大腸菌株にサブクローン化した。数個の細菌コロニーを単離して、プラスミドＤＮＡを、ＱＩＡｐｒｅｐスピン・ミニプレップ・キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用してこれらのクローンから精製した。【００８１】  ２つのサブクローンのそれぞれに由来する一方のＤＮＡ鎖のＤＮＡ配列分析により、それぞれのサブクローンから得られた約２０００ヌクレオチドの配列が発表されたＪＡＫ３のｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｕ０９６０７）と同一であることが明らかにされた。これらのサブクローンの１つから決定されたＤＮＡ配列が図３として示される。【００８２】  実施例２、３、および４の結果により、ＪＡＫ３の発現が、ヒト変形性関節症の軟骨と同様に、正常なヒト軟骨に由来する培養された関節軟骨細胞において最初に確認される。【００８３】 実施例５：ヒト関節軟骨細胞におけるＪＡＫ３発現のノーザンブロット分析
凍結された軟骨細胞の細胞株ＨＣ３０−０１９８（実施例１に記載されるように調製された正常なヒト関節軟骨細胞）を解凍して、単層で培養し（第２継代）、コンフルエンス後５日目まで培養した。試験培養物をリン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、その後、１）２ｎｇ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン−１β（ｒｈＩＬ−１β）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を１％抗生物質溶液を含有する無血清ＤＭＥＭ中で２４時間にわたって、または２）１％抗生物質溶液を含有する無血清ＤＭＥＭのみ（コントロール）のいずれかを加えた。【００８４】  単層培養物に由来する総ＲＮＡを、製造者が指示するプロトコールに従ってＴＲＩｚｏｌ試薬（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して２４時間の培養の後に集めた。上記のそれぞれのサンプルから得られた総ＲＮＡの１０μｇを２．２Ｍホルムアルデヒド／１．２％アガロースゲルで分離し、そして製造者が指示するプロトコールに従ってＴＵＲＢＯＢＬＯＴＴＥＲ（商標）（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）システムを使用して穏和なアルカリ転写によってナイロン支持メンブラン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｋｅｅｎｅ、ＮＨ）に転写した。ノーザンブロット上のＲＮＡを、Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（登録商標）１８００ＵＶ架橋装置（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用することによってメンブランに固定した。【００８５】  ＪＡＫ３の１０９塩基対のヒトｃＤＮＡがＲＴ−ＰＣＲによって得られた（上記の実施例２を参照のこと）。このｃＤＮＡを、製造者が指示するプロトコールに従ってＲｅａｄｙ−Ｔｏ−ＧｏＤＮＡ標識ビーズ（−ｄＣＴＰ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）で標識し、そしてＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ（商標）＋ＴＥ−３０カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用して精製し、ノーザンブロット分析用のプローブとして使用した。【００８６】  ノーザンブロットのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを、２Ｘプレハイブリダイゼーション／ハイブリダイゼーション溶液（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）およびホルムアミドの１：１希釈物を使用して４２℃で行った。ＪＡＫ３のＤＮＡプローブを使用して１５時間のハイブリダイゼーションを行った後、ブロットの洗浄を、順次、２ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回（室温で１５分／洗浄）、そして０．５ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回（６５℃で３０分／洗浄）行った。ブロットを空気乾燥して、放射能シグナルを、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ  ＢＡＳ−１５００ホスホルイメージャー（Ｆｕｊｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ、Ｓｔａｍｆｏｒｄ、ＣＴ）を使用して可視化した。【００８７】  ノーザンブロット分析の蛍光像を図４として示す。その結果は、ＪＡＫ３のｍＲＮＡが正常な成人の培養された関節軟骨細胞において発現していること、およびｒｈＩＬ−１βは、ｒｈＩＬ−１βで刺激されなかった正常な成���関節軟骨細胞で見出されたＪＡＫ３のｍＲＮＡレベルから増大させることも低下させることもないことを明らかにしている。さらに、ノーザンブロットにより、２つの分子量のＪＡＫ３種が単層培養のヒト関節軟骨細胞によって発現していることが明らかにされる（およそ４．２ｋｂおよび２．２ｋｂの長さ）。正常な成人の培養されたヒト関節軟骨細胞によって発現するＪＡＫ３のｍＲＮＡの優勢な形態は２．２ｋｂの形態である。大きい方の形態（４．２ｋｂ）は、リンパ系系統の正常なヒト血液細胞に見出される形態とサイズが一致しており、軟骨細胞において発現する総ＪＡＫ３のｍＲＮＡの小さい画分を表す。【００８８】 実施例６：ＪＡＫ３のＤＢＨによる阻害
ＯＡなどの退行性関節疾患に対して効果的な治療薬であるＤＢＨがＪＡＫ３を阻害するように機能することを明らかにするために、チロシンキナーゼの酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を行った。【００８９】  Ｎｕｎｃ免疫プレートのＭａｘｉｓｏｒｐ平底捕獲プレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を、コーティング緩衝液（１０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７．２）＋０．０２％のＮａＮ3）で２μｇ／ｍｌに希釈された抗ホスホチロシンＰＹ５４ＭＡｂ抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｓ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＫＹ）の８０μｌ／ウエルでコーティングし、４℃で一晩吸着させた。プレートを洗浄し（すべての洗浄は、ＴＢＳＴ（２５ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ＋０．０５％ツイーン−２０を用いて４回である）、その後、２００μｌ／ウエルのブロッキング緩衝液（ＴＢＳＴ＋１％ＢＳＡ）を加えた。プレートを密閉し、３７℃で６０分間または４℃で一晩インキュベーションして、再び洗浄した。【００９０】  キナーゼ反応を、丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）においてビオチン化ペプチド基質を用いて５０μｌの容量で行った。キナーゼ反応混合物は、２０μｌの５０μＭのＧＡＳ１ビオチン化ペプチド（ＬＣビオチン−ＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦ−アミド）、キナーゼ緩衝液中の０μＭ〜１２５０μＭのＡＴＰ、２Ｘキナーゼ緩衝液（５０ｍＭのイミダゾール／ＨＣｌ、２ｍＭのＤＴＴ、０．２ｍＭのＥＤＴＡ、０．０３０％のＢｒｉｊ−３５、ｐＨ６．８）中の１０μｌの５０ｍＭのＭｇＣｌ2、水（０．２％プルロニック−１０４および３％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する）中の１０μｌの０μＭ〜５０μＭのＤＢＨ、および１０μｌのＪＡＫ３酵素（キナーゼ緩衝液で希釈）を含有した。キナーゼ緩衝液を希釈剤として使用してホスホペプチドの標準曲線（０ｎＭ〜１０ｎＭ）もまた試験した。【００９１】  キナーゼ反応を３７℃で３０分間行い、その後、１５μｌ／ウエルの０．１２５ＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．８）を加えることによって停止させた。停止させた溶液のウエルあたり５０μｌのアリコートを、抗体をコーティングした捕捉プレートに移し、密閉して、３７℃で６０分間インキュベーションした。プレートを洗浄し、その後、Ｇｅｎｚｙｍｅ希釈緩衝液で１／５希釈されたＳＡ−ＨＲＰ試薬（Ｇｅｎｚｙｍｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）の８０μｌ／ウエルを加えた。プレートを密閉して、３７℃で６０分間再びインキュベーションした。プレートを洗浄し、その後、室温で予め平衡化したテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）の１００μｌ／ウエルを加えて、約５分間反応させた。反応を１ＮのＨ2ＳＯ4溶液の１００μｌ／ウエルで停止させた。サンプルをＡ450−Ａ620で読み取った。【００９２】  この実験の結果（図６として示される）により、ＤＢＨがＪＡＫ３の強い阻害剤であり、記録された阻害定数（Ｋi）が２８６±１６ｎＭであることが明らかにされる。【００９３】 実施例７：ＤＢＨ（およびその変化体）はＪＡＫ３を特異的に阻害する
様々な細胞成分に対するＤＢＨ（およびその変化体）の特徴的な阻害をさらに調べるために、ポリ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）４：１のＥＬＩＳＡを行った。ヒメニアルジシン（Ｈ）、ＤＢＨ（海産海綿動物の抽出物として：ＣｈｉｐｍａｎおよびＦａｕｌｋｎｅｒ（１９９７）を参照のこと）、および合成ＤＢＨの３つの変化体（ＤＢＨの遊離塩基形態（ＤＢＨ−２ＦＢ）、ＤＢＨのトリフルオロ酢酸塩形態（ＤＢＨ−２Ｓ）、およびＤＢＨのメタンスルホン酸塩形態（ＤＢＨ１））をＤＭＳＯに溶解して、ＺＡＰ−７０（７０ｋＤａのζ会合ポリペプチド）タンパク質チロシンキナーゼ、ＢＴＫ（ブルートン型無ガンマグロブリン血症チロシンキナーゼ）、ＪＡＫ３（Ｊａｎｕｓキナーゼ３）タンパク質チロシンキナーゼ、ＬＣＫ（リンパ様Ｔ細胞タンパク質チロシンキナーゼ）、およびＩＧＦＲ（インスリン様増殖因子受容体）タンパク質チロシンキナーゼを阻害する効力について試験した。【００９４】  Ｍａｘｉｓｏｒｂマイクロタイタープレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を、リン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）、０．０２％アジ化ナトリウムに溶解した、１ｍｇ／ｍｌのポリ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）４：１（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）でコーティングした。アッセイの当日に、マイクロタイタープレートを、Ｓｋａｔｒｏｎプレート洗浄機（Ｓｋａｔｒｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ）を使用してＴＢＳ−ツイーン（２５ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％ツイーン２０）で４回洗浄した。２００μｌの滅菌ブロッキング緩衝液（ＰＢＳ、０．０２％アジ化ナトリウムにおける３％ＢＳＡ）を各ウエルに加え、マイクロタイタープレートを３７℃で１時間インキュベーションした。ブロッキング緩衝液を除き、プレートを洗浄して、様々な濃度の阻害剤を２０μｌの容量でウエルに加えた。その後、６０μｌの適切な基質ミックスを加えた。基質ミックスを表２に記載されるように調製した。【００９５】
【表２】
0005512909.tif 000005
【００９６】  基質ミックスを加えた後、２０μｌの試験タンパク質チロシンキナーゼ（１Ｘアッセイ緩衝液において）を加えた。キナーゼ反応液を３７℃で３０分間インキュベーションし、その後、Ｓｋａｔｒｏｎプレート洗浄機で洗浄した。１００μｌのビオチン化ＰＴ−６６抗ホスホチロシンモノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）（０．５％ＢＳＡ、無菌ろ過ＴＢＳにおいて１：４０００希釈）を各ウエルに加え、３７℃でさらに３０分間インキュベーションした。プレートを洗浄して、０．５％ＢＳＡ−無菌ろ過ＴＢＳで１：３２，０００に希釈されたストレプトアビジン−ＨＲＰ結合体（ＩＣＮ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｃｏｓｔａ  Ｍｅｓａ、ＣＡ）の１００μｌを各ウエルに加え、最後に３７℃で３０分間インキュベーションした。プレートを洗浄して、１００μｌのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質溶液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｒｒｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を室温で１５分間かけて加え、その後、１００μｌの停止試薬（１Ｍリン酸）を加えた。その後、サンプルをプレート読み取り装置において４５０ｎｍで読み取った。【００９７】  ４ロットの海産物抽出物Ｈ（９７９−１、９７９−４、９７９−５、９７９−６として示される）および２ロットの海産物抽出物ＤＢＨ（５０２５−１１および５０２５−１２と呼ぶ）は、ＪＡＫ３の特異的な低マイクロモル濃度の阻害を示し、ｅｃ−５０値（５０％阻害に対する有効濃度）が２．６μＭ〜１０．７μＭ（９７９のロット物）および２３．４μＭ〜３４．４μＭ（５０２５のロット物）の範囲にあった（図７）。ＺＡＰ−７０、ＬＣＫ、ＢＴＫ、およびＩＧＦＲの阻害は弱く、ｅｃ−５０値は数百マイクロモル濃度から非阻害まで変化した（データ示さず）。【００９８】  試験された合成ＤＢＨの３つの形態もまたＪＡＫ３の阻害を示し、ｅｃ−５０値は１１．６０μＭ〜５３．９９μＭの範囲であった（図８Ａ）。ＤＢＨ−２ＦＢは、ＤＢＨの２つの塩形態と比較したときに、より大きなＪＡＫ３の阻害（すなわち、１１．６０μＭ）を示した。ＤＢＨ−２ＦＢはまた、ＺＡＰ−７０、ＬＣＫ、ＢＴＫ、およびＩＧＦＲに対するｅｃ−５０値が１９７１μＭから非阻害まで変化するＪＡＫ３の選択的阻害剤であることが示される（図８Ｂ）。
これらの結果は、ＤＢＨおよびその様々な誘導体がＪＡＫ３に特異的な阻害剤であることを明らかにしている。【００９９】 実施例８：ＯＡに関連したｍＲＮＡのＤＢＨ（およびその変化体）によるダウンレギュレーション
ＤＢＨによるＪＡＫ３阻害の下流の影響を調べるために、ノーザンブロットアッセイを行い、ＯＡに関連した様々な分子の定常状態のｍＲＮＡレベルにおける変化を検出した。【０１００】  凍結したヒト関節軟骨細胞の細胞株ＨＣ３０−０１９８（実施例１に記載）を解凍して、コンフルエンス後１日目〜５日目まで上記に記載されるようにＴ１５０組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）において単層で培養した。試験培養物をＰＢＳで洗浄して、５μＭのＤＢＨ（合成）をその遊離塩基形態またはトリフルオロ酢酸塩形態で含有する１０ｍｌの無血清ＤＭＥＭを用いて２時間プレインキュベーションした。その後、５μＭのＤＢＨ、４ｎｇ／ｍｌの組換えヒトインターロイキン−１β（ｒｈＩＬ−１β；２ｎｇ／ｍｌの最終濃度）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）および２％抗生物質溶液（１％の最終濃度）を含有する無血清ＤＭＥＭのさらなる１０ｍｌを２４時間かけて加えた。【０１０１】  ２つのコントロール培養物を並行して処理した：ＤＢＨを含まない培養物（ｒｈＩＬ−１β単独）と、ＤＢＨもｒｈＩＬ−１βも含まない培養物。
単層培養物に由来する総ＲＮＡを、製造者が指示するプロトコールに従ってＴＲＩｚｏｌ試薬（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して集めた。それぞれの試験サンプルから得られた総ＲＮＡの１０μｇを２．２Ｍホルムアルデヒド／１．２％アガロースゲルで分離し、そして製造者が支持するプロトコールに従ってＴＵＲＢＯＢＬＯＴＴＥＲ（商標）システム（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｋｎｅｅｎｅ、ＮＨ）を使用して穏和なアルカリ転写によってナイロン支持メンブラン（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｋｎｅｅｎｅ、ＮＨ）に転写した。総ＲＮＡを、Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（登録商標）１８００ＵＶ架橋装置（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用してメンブランに固定した。【０１０２】  ストロメライシン−１（ＭＭＰ３）、コラゲナーゼ１（ＭＭＰ１）、シクロオキシゲナーゼＩＩ（ＣＯＸ２）、ＮＦ−κＢ（ｐ６５）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）に対するヒトＤＮＡプローブを、製造者が指示するプロトコールに従ってＲｅａｄｙ−Ｔｏ−ＧｏＤＮＡ標識ビーズ（−ｄＣＴＰ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）で標識した。放射性プローブを、ＣＨＲＯＭＡ  ＳＰＩＮ（商標）＋ＴＥ−３０カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用して、取り込まれなかった［α−32Ｐ］ｄＣＴＰから分離し、そして精製されたプローブをノーザンブロットハイブリダイゼーション実験のために使用した。【０１０３】  放射性プローブを用いたノーザンブロットのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを、製造者が指示するプロトコールに従ってＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂ（商標）ハイブリダイゼーション溶液（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用して行った。ブロットの洗浄を、順次、２ＸＳＳＣ／０．０５％ＳＤＳで２回（室温で１５分／洗浄）、そして０．１ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで２回（６５℃で３０分／洗浄）行った。ブロットを空気乾燥して、放射性シグナルを、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ  ＢＡＳ−１５００ホスホルイメージャー（Ｆｕｊｉ、Ｓｔａｍｆｏｒｄ、ＣＴ）を使用して、可視化して定量化した。【０１０４】  ＲＮＡ負荷量の正規化を、ノーザンブロットを臭化エチジウムで染色することによって行った。５μｌの１０ｍｇ／ｍｌ臭化エチジウム（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を５０ｍｌの１Ｘ  ＭＯＰＳ溶液（ＭＥＳＡ緩衝液：Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）に加え、室温で７分かけて間染色した。ブロットを１Ｘ  ＭＯＰＳ緩衝液で３０分間（３回）洗浄した。臭化エチジウム染色パターンをＦｕｊｉｆｉｌｍ  ＬＡＳ−１０００インテリジェント・ダーク・ボックス（Ｆｕｊｉ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ、Ｓｔａｍｆｏｒｄ、ＣＴ）で可視化した。【０１０５】  ノーザンブロット実験の結果（図９Ａおよび図９Ｂに示す）により、５μＭのＪＡＫ３阻害剤ＤＢＨは、（変形性）関節炎の病理学に関連していることが知られてい���か、またはその関連が考えられるｍＲＮＡ、すなわち、ストロメライシン（ＭＭＰ３）、コラゲナーゼ１（ＭＭＰ１）、シクロオキシゲナーゼＩＩ（ＣＯＸ２）、ＮＦ−κＢ（ｐ６５）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）のＩＬ−１β誘導されるアップレギュレーションを様々な程度で阻害することができたことが明らかにされる。【０１０６】  ＤＢＨの遊離塩基形態が、いくつかのｍＲＮＡに対して、ＤＢＨのトリフルオロ酢酸塩形態よりも大きな程度でｒｈＩＬ−１β誘導のｍＲＮＡを阻害するという予想外の観測結果は注目される（図９Ａ）。この観測結果は、実施例７のチロシンキナーゼアッセイで得られたデータと一致している。【０１０７】 実施例９：ウシ軟骨細胞におけるＩＬ−１α誘導されるアグリカナーゼ活性のＤＢＨによる阻害
ＪＡＫ３特異的阻害剤としてのＤＢＨの細胞作用を明らかにするために、ＤＢＨおよびその変化体の阻害を、ＩＬ−１α誘導される35Ｓ標識プロテオグリカンのウシ軟骨細胞における放出によって測定した（培養された初代ウシ軟骨細胞および軟骨外稙片におけるＩＬ−１α誘導されるプロテオグリカンの放出は、アグリカナーゼとして知られている酵素によってアグリカンが切断されるためであることが十分に明らかにされている）。【０１０８】  初代ウシ関節軟骨細胞を、３０分間（３７℃）の１ｍｇ／ｍｌヒアルロニダーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）処理を使用し、その後、３０分間（３７℃）の２ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）および２．５ｍｇ／ｍｌトリプシン（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）の処理を使用して子ウシ膝関節の切開した関節軟骨から単離した。酵素溶液を、血清を含まない１：１のダルベッコ改変必須培地／ハムＦ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）において調製して、０．２２μｍのＭｉｌｌｅｘ（登録商標）−ＧＶフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓ．Ａ．、Ｍｏｌｓｈｅｉｍ、フランス）でろ過滅菌した。３回目の一晩の消化（３７℃で０．５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＰ）をＢｅｌｌｃｏ攪拌フラスコにおいて行った。【０１０９】  ウシ軟骨細胞を、酵素を中和するために１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充した等容量のＤＭＥＭ／Ｆ１２を加えることによって回収して、７０μｍのナイロン製Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）細胞ストレイナー（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）でろ過し、室温において１０００Ｘｇで１０分間遠心分離した。【０１１０】  軟骨細胞を、０．５ｍｌの１：１のＤＭＥＭ／Ｆ１２、１０％ＦＢＳ、１％抗生物質溶液（ペニシリン、ストレプトマイシン、フンギゾン）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して、Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）２４ウエル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）に８×１０4細胞／ウエルで播種して、３７℃、８％ＣＯ2でインキュベーションした。細胞を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ、１％抗生物質溶液を３日毎に再度与えながら２８日間培養した。【０１１１】  プロテオグリカンの代謝的標識を、２２日目に、血清を含まないＤＭＥＭ／Ｆ１２、１％抗生物質溶液において１０μＣｉの35Ｓｕｌｆａｔｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ、ＩＬ）を用いて４８時間行った。遊離の35Ｓｕｌｆａｔｅを２４日目に除き、軟骨細胞をＰＢＳで洗浄して、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％血清、１％抗生物質溶液を再び与えた。軟骨細胞をさらに２日間培養して、ＤＭＥＭ／Ｆ１２＋１０％ＦＢＳ、１％抗生物質溶液を２６日目に再び与え、そして２７日目にＰＢＳで洗浄した。【０１１２】  ＰＢＳで洗浄した後、軟骨細胞を、１）さらなる補充物なし、または２）５μＭのＤＢＨ（ＤＢＨ１、ＤＢＨ−２Ｓ、またはＤＢＨ−ＦＢのいずれかとして）のいずれかを含む無血清ＤＭＥＭ／Ｆ１２、１％抗生物質溶液の０．５ｍｌで処理した。２時間後、ｒｈＩＬ−１αを、��「ｒｈＩＬ−１αなし」のコントロールの場合を除き）１ｎｇ／ｍｌの最終濃度になるまで培養物に加えた。【０１１３】  ２８日目に、０．５ｍｌの培地を取り出し、シンチレーション用ミニバイアルに入れた。４ｍｌのシンチレーション液を加えて、培地中の放射能をシンチレーション計数によって定量した。細胞層をＰＢＳで洗浄して、０．５ｍｌの１Ｘトリプシン−ＥＤＴＡで集め、そして上記のようにシンチレーション計数によって定量した。すべてのサンプルは三連で培養された。【０１１４】  データは、下記のように測定し、そして表した：
１．バックグラウンド割合c
＝培地中に放出された非ＩＬ−１誘導による放射能量を表す総放射能（培地＋細胞層）の割合
＝［「ＩＬ−１αなし、ＤＢＨなしのコントロール」の培地中の総ＣＰＭ／（「ＩＬ−１αなし、ＤＢＨなしのコントロール」の培地中の総ＣＰＭ＋「ＩＬ−１αなし、ＤＢＨなしのコントロール」の細胞層における総ＣＰＭ）］
２．培地中へのＩＬ−１αによる35Ｓ標識プロテオグリカンの％放出
ａ）バックグラウンド＝非ＩＬ−１誘導の放出による試験サンプルの培地中のカウント
＝バックグラウンド割合c［試験サンプル培地中の総ＣＰＭ＋試験サンプル細胞層における総ＣＰＭ］
ｂ）ＩＬ−１αにより放出されたＣＰＭ＝培地中の総ＣＰＭ−バックグラウンド
ｃ）ＩＬ−１αによる％放出＝［ＩＬ−１αにより放出されたＣＰＭ／（ＩＬ−１αにより放出されたＣＰＭ＋細胞層における総ＣＰＭ）］１００％
３．ＤＢＨ存在下でのＩＬ−１αによる％放出＝｛（ＤＢＨ培地サンプルにおける総ＣＰＭ−バックグラウンド）／［（ＤＢＨ培地サンプルにおける総ＣＰＭ−バックグラウンド）＋ＤＢＨ細胞層サンプルにおける総ＣＰＭ］｝１００％
４．ＤＢＨによる％阻害＝［１−（ＤＢＨ存在下でのＩＬ−１αによる％放出／ＩＬ−１αによる％放出］１００％
合成ＤＢＨの３つの形態（すなわち、ＤＢＨ１、ＤＢＨ−２Ｓ、またはＤＢＨ−ＦＢ）はＩＬ−１α誘導による35Ｓ標識プロテオグリカンの放出の阻害を様々な程度で示した（それぞれ、約５０％、約４０％、および１００％）（図１０）。再度ではあるが、ＤＢＨの遊離塩基形態は、阻害剤として、ＤＢＨのそれ以外の２つの形態の結果を劇的に上回る結果をもたらした。【０１１５】 実施例１０：ＯＡに関連したｍＲＮＡの化合物ＷＨＩ−Ｐ１３１によるダウンレギュレーション
ＤＢＨおよびその関連する化合物が、ＪＡＫ３に特異的な阻害剤として機能することによって効果的なＯＡ治療薬として機能することを明らかにするために、そして一般にはＯＡ関連化合物の阻害剤として、したがって新規な種類のＯＡ治療薬としてのＪＡＫ３阻害剤の有効性を確認するために、よく知られているＪＡＫ３特異的阻害剤である４−（４’−ヒドロキシフェニル）−アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリン（これはまたこの分野ではＷＨＩ−Ｐ１３１として呼ばれれている）による様々なＯＡ関連ｍＲＮＡの阻害を評価した。【０１１６】  正常なヒト関節軟骨細胞を、実施例１に記載されるように軟骨の薄片から単離して培養した。ｍＲＮＡ阻害実験を、ＪＡＫ３特異的阻害剤のＷＨＩ−Ｐ１３１（４−（４’−ヒドロキシフェニル）−アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリン（Ａ．Ｇ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから購入））をＤＢＨの代わりに使用したことを除いて実施例８に記載されるプロトコールと同じように行った。ＤＭＳＯに溶解したＷＨＩ−Ｐ１３１の２つの濃度（３３．６μＭおよび１６８μＭ）を調べた。【０１１７】  ノーザンブロット実験の結果（図１１に示す）により、ＪＡＫ３特異的阻害剤であるＷＨＩ−Ｐ１３１の３３．６μＭおよび１６８μＭの処理はともに、（変形性）関節炎の病理学に関連することが知られているか、またはそのような関連が考えられるｍＲＮＡ、すなわち、ストロメライシン−１（ＭＭＰ３）、コラゲナーゼ（ＭＭＰ１）、シクロオキシゲナーゼＩＩ（ＣＯＸ２）およびＮＦ−κＢ（ｐ６５）のＩＬ−１β誘導によるアップレギュレーションを阻害することが明らかにされる。【０１１８】  本発明では、分子生物学の分野で十分に知られている様々な技術がそのまま参考により組み込まれる。このような技術には、下記の刊行物に記載される様々な技術（これらに限定されない）が含まれる：
Ｏｌｄ，Ｒ．Ｗ．＆Ｓ．Ｂ．Ｐｒｉｍｒｏｓｅ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ：Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｏ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（第３版、１９８５年）、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｂｏｓｔｏｎ。Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ；第２巻：４０９頁（ＩＳＢＮ０−６３２−０１３１８−４）。【０１１９】  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．他編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９年）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、第１巻〜第３巻（ＩＳＢＮ０−８７９６９−３０９−６）。【０１２０】  Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｅ．Ｌ．、Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  Ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ：Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｏ  Ｇｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９８７年）、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、ＮＹ（Ｈｏｒｓｔ  Ｉｂｅｌｇａｕｆｔｓにより翻訳）、６３４頁（ＩＳＢＮ０−８９５７３−６１４−４）。【０１２１】 参考文献【０１２２】
【表３】
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【０１２３】
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【０１２４】
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【０１２５】
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【０１２６】
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【０１２７】
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【０１２８】  本明細書中において言及された刊行物は，それぞれ参考により組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【図１】  図１は、培養されたヒト軟骨細胞のＲＴ−ＰＣＲ分析から得られた部分的なＪＡＫ３のｃＤＮＡ配列と、発表されているヒトＪＡＫ３のｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｕ０９６０７）との比較を示す。
【図２】  図２は、変形性関節症の軟骨サンプルから直接採取されたｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析から得られた部分的なＪＡＫ３のｃＤＮＡ配列の比較を示す。
【図３】  図３は、発表されているヒトＪＡＫ３のｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｕ０９６０７）と、ヒト軟骨細胞のｃＤＮＡライブラリーから単離されたＪＡＫ３ｃＤＮＡとの比較を示す。
【図４】  図４は、正常なヒト関節軟骨細胞におけるＪＡＫ３ｍＲＮＡのノーザンブロット分析の結果を例証する。
【図５】  図５は、ＥＬＩＳＡ分析により測定されたＪＡＫ３のＤＢＨ阻害を例証する。
【図６】  図６は、ＥＬＩＳＡ分析によって測定される、Ｈ（９７９）およびＤＢＨ（５０２５）によるＪＡＫ３阻害の例証となる比較を示す。
【図７】  図７は、ＥＬＩＳＡ分析によって測定される、ＤＢＨの様々な変化体形態による基質阻害の例証となる比較を示す。図７Ａは、ＤＢＨの２つの塩形態（ＤＢＨ−２ＳおよびＤＢＨ−１）および１つの遊離塩基形態（ＤＢＨ−２ＦＢ）の阻害曲線を示す。図７Ｂは、ＺＡＰ−７０、ＬＣＫ、ＢＴＫ、ＩＧＦ、およびＪＡＫ３に対する遊離塩基ＤＢＨの阻害の比較を示す。
【図８】  図８（ＡおよびＢ）は、ヒト関節軟骨細胞における様々な軟骨分解成分のｍＲＮＡのＤＢＨ阻害をノーザンブロット分析した結果を例証する。
【図９】  図９は、種々の変化体形態のＤＢＨによるＩＬ−１誘導されるアグリカナーゼ活性の阻害をグラフで示す。
【図１０】  図１０は、ヒト関節軟骨細胞における様々な軟骨分解成分のｍＲＮＡのＪＡＫ３特異的阻害剤４−（４’−ヒドロキシフェニル）−アミノ−６，７−ジメトキシキナゾリン（ＷＨＩ−Ｐ１３１としてこの分野では知られており、図ではＪ１０３０として識別される）の阻害をノーザンブロット分析した結果を例証する。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図３Ｌ】
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【図３Ｍ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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