(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｓｉＲＮＡの腫瘍組織への局所投与のための、ＡＡＡＡＡＡＤ又はＡＡＡＡＡＡＫの配列で表されるペプチドを含む、トランスフェクション剤。
【請求項２】
脳腫瘍への局所投与のための、請求項１記載のトランスフェクション剤。
【請求項３】
請求項１または２記載のトランスフェクション剤を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド界面活性剤を含むトランスフェクション剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡｉは、特定遺伝子の発現を抑制することができることから、疾患の処置への応用が期待されている。現在の技術では、ｓｉＲＮＡを細胞にトランスフェクションする際に用いられるトランスフェクション剤は、カチオン性のリン脂質が主体であり、その毒性が指摘されている。【０００３】
しかし、ｓｉＲＮＡをはじめとする核酸医薬の臨床における応用を考慮すると、トランスフェクション剤は、限りなく毒性が低いことが望まれ、より毒性の低いトランスフェクション剤の開発が待たれている。【０００４】
ペプチド界面活性剤は、Ｇタンパク質結合レセプターウシロドプシンなどの膜タンパク質を安定させる作用や自己組織化する性質を有することが知られている（非特許文献１及び２）。しかし、トランスフェクション剤としての用途は知られていなかった。
【非特許文献１】X Zhao et al., PNAS, Vol.103, No. 47, 17707-17712
【非特許文献２】A Nagai et al., J. Nanosci. Nanotechnol. Vol. 7, No.7, 1-7
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題は、より毒性の低い臨床応用可能なトランスフェクション剤を提供することである。【０００６】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、驚くべきことに、ペプチド界面活性剤がトランスフェクション剤として有用であることを見出し、本発明を完成させた。【０００７】
したがって、本発明は、
１．ペプチド界面活性剤を含むトランスフェクション剤、
２．ペプチド界面活性剤が、４〜１０の親水性アミノ酸からなる頭部及び１又は２の疎水性アミノ酸からなる尾部からなる、上記１に記載のトランスフェクション剤、
３．ペプチド界面活性剤が、ＡＡＡＡＡＡＤ又はＡＡＡＡＡＡＫである、上記１に記載のトランスフェクション剤、
４．上記１〜３のいずれか１に記載のトランスフェクション剤及び核酸を含む、医薬品、
である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】ペプチド界面活性剤とカチオン性リポソーム遺伝子導入剤（リポフェクトアミン2000、siFECTOR）の細胞毒性比較である。
【図２】ペプチド界面活性剤によるｓｉＲＮＡのヒト悪性グリオーマ培養細胞3種への導入量の経時変化解析である。
【図３】ペプチド界面活性剤濃度とｓｉＲＮＡ導入効率の関係の解析である。
【図４】ペプチド界面活性剤によってヒト悪性グリオーマ培養細胞3種に導入されたｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉効果の確認である。
【図５】ペプチド界面活性剤によってヒト悪性グリオーマ培養細胞3種に導入されたｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉効果の確認である。
【図６】ペプチド界面活性剤によってヒト悪性グリオーマ培養細胞3種に導入されたｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉効果の確認である。
【０００９】
本発明において、ペプチド界面活性剤とは、６〜１０個のアミノ酸残基を含むものであり、その長さは、約２〜３nmであり、従来の界面活性剤、たとえば、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（ＤＭ）やオクチル−Ｄ−グルコシド（ＯＧ）と同様の特性を示す。【００１０】
本発明のペプチド界面活性剤は、好ましくは、４〜１０の親水性アミノ酸からなる頭部及び１又は２の疎水性アミノ酸からなる尾部からなる。【００１１】
より具体的には、ＧＧＧＧＤＤ（Ｇ４Ｄ２）、ＧＧＧＧＧＧＤＤ（Ｇ６Ｄ２）、ＧＧＧＧＧＧＧＧＤＤ（Ｇ８Ｄ２）、ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＤＤ（Ｇ１０Ｄ２）、ＡＡＡＡＡＡＤ（Ａ６Ｄ）、ＡＡＡＡＡＡＤＤ（Ａ６Ｄ２）、ＡＡＡＡＡＡＫ（Ａ６Ｋ）、ＡＡＡＡＡＡＫＫ（Ａ６Ｋ２）、ＶＶＶＶＶＶＤ（Ｖ６Ｄ）、ＶＶＶＶＶＶＤＤ（Ｖ６Ｄ２）、ＶＶＶＶＶＶＫ（Ｖ６Ｋ）、ＶＶＶＶＶＶＫＫ（Ｖ６Ｋ２）、ＬＬＬＬＬＬＤ（Ｌ６Ｄ）、ＬＬＬＬＬＬＤＤ（Ｌ６Ｄ２）、ＬＬＬＬＬＬＫ（Ｌ６Ｋ）、又はＬＬＬＬＬＬＫＫ（Ｌ６Ｋ２）を挙げることができるが、中でも、ＡＡＡＡＡＡＤ（Ａ６Ｄ）又はＡＡＡＡＡＡＫ（Ａ６Ｋ）が好ましく、ＡＡＡＡＡＡＫ（Ａ６Ｋ）が特に好ましい。【００１２】
本発明のペプチド界面活性剤は、従来公知の固相合成法を用いて製造することができる。またこのような、人工的に合成されたペプチドは、生体由来の物質を含まず、感染性の心配がないことから、好ましく用いることができる。【００１３】
本発明において、トランスフェクション剤とは、ｓｉＲＮＡ等のポリヌクレオチドや遺伝子を細胞内に導入する際に用い、その導入効率を高めることができる組成物をいう。【００１４】
本発明のトランスフェクション剤は、所望の核酸とともに、医薬品に配合することができる。また、本発明の医薬品は、経口投与または非経口投与のいずれにおいても使用することができる。【００１５】
本発明の医薬品に用いる核酸は、治療などの標的となる遺伝子の塩基配列の一部をそのまま又は修飾して使うものであり、ＤＮＡまたはＲＮＡの核酸から構成されており、生体内において、所望の遺伝子の機能を制御することができるものをいう。このような核酸は、一般には、核酸医薬として知られている。【００１６】
たとえば、転写調節因子が結合する核内のＤＮＡの一定領域（シスエレメント）と同じ配列のオリゴヌクレオチドに転写調節因子を結合させることにより遺伝子発現を阻害する薬をおとり型核酸医薬（デコイ）、特定の分子と特異的に結合することができる核酸アプタマー、ＲＮＡを切断する触媒活性があるリボザイム、標的遺伝子のｍＲＮＡの特定領域に相補的に結合して遺伝子発現を抑制するアンチセンスＲＮＡや標的遺伝子のｍＲＮＡの特定領域にＲＮＡサイレンシング複合体と共に結合することでｍＲＮＡを分解するｓｉＲＮＡを挙げることができる。おとり型核酸医薬、核酸アプタマー、リボザイムは高度に特異的な３次元構造を取る核酸で、アンチセンスＲＮＡはｍＲＮＡ配列の一部の逆鎖側の配列を持つ一本鎖ＲＮＡオリゴマーで、ｓｉＲＮＡは標的遺伝子のｍＲＮＡの一部と同じ配列を有する短い二本鎖ＲＮＡである。これらの核酸は、核酸合成機を用いて化学的反応により人工的に作ることができ、またベクターを用いて培養細胞で作ることもできる。【００１７】
これまでの医薬品は低分子化合物が主流であったが、現在、生体が持つ化学物質から成るバイオ医薬品が、その標的特異性と生物学的安全性の点で注目されている。バイオ医薬品の一つには核酸医薬が含まれ、現在多くの研究機関や製薬企業で開発が進められている。核酸医薬の中でも近年特にｓｉＲＮＡの特異的な遺伝子抑制効果が注目されており、様々な疾患に対するｓｉＲＮＡ医薬品の開発が進められている。ｓｉＲＮＡを用いることで治療効果が見込まれる例として、脳腫瘍の１種である膠芽腫の治療が挙げられる。膠芽腫において、ＭＭＰ−２を標的としたＲＮＡiによって腫瘍細胞のアポトーシスが誘導され、腫瘍成長が抑制される効果が知られている。【００１８】
医薬品の形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤などが挙げられる。これら医薬品は、通常の医薬製造における添加剤を使用して製造することができる。【００１９】
本発明の医薬品の投与量は特に限定されないが、たとえば、非経口投与の場合には一日あたり０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。上記投与量は１日１回または２〜３回に分けて投与することができ、年齢、病態、症状により適宜増減することもできる。【００２０】
添加剤の具体例としては、ラクトース、デキストリン、スクロース、マンニトール、コーンスターチ、ソルビトール、結晶性セルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられ、これらを単独または適宜組合わせて使用することができる。これら医薬品は、日本薬局方の記載に従い、各々の医薬品の形態に適した方法で製造することができる。また、香味料、着色料、甘味料など適宜使用することもできる。これら添加剤の含有量は当業者に適切に選択され得る。【００２１】
医薬部外品の形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、ゼリー剤、ドリンク剤などが挙げられる。これら医薬部外品は、通常の医薬部外品製造における添加剤を使用して製造することができる。さらに、これら医薬部外品は、例えばビタミン類などの他の有効成分を含有することもできる。また、甘味料、香味料、着色料、酸化防止剤などの添加剤を単独または適宜組み合わせて使用することもできる。これら医薬部外品は、当業者に周知の方法で製造することができる。
【実施例１】
【００２２】
ペプチド界面活性剤とカチオン性リポソーム遺伝子導入剤の細胞毒性比較
ペプチド界面活性剤と現在広く使用されているカチオン性リポソーム遺伝子導入剤２種について、ヒト培養細胞を用いて細胞毒性評価を行った。【００２３】
＜材料＞
・添加物質
１．ペプチド界面活性剤（配列：Ａｃ−ＡＡＡＡＡＡＫ−ＮＨ２、Ｃｅｌｔｅｋ社製）
２．リポフェクトアミン2000(インビトロジェン社製)
３．siFECTOR (B-Bridge International, Inc.社製)
・細胞
ヒト悪性グリオーマ培養細胞（U87MG、ＡＴＣＣから購入）
・ＭＴＴアッセイ試薬（細胞増殖数定量）
CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assayキット（プロメガ社製）【００２４】
＜方法＞
ＡＴＣＣ推奨プロトコルに従って、細胞を９６ウェルプレートに播種し（細胞密度：２×１０４／well）、一晩インキュベーションした。新鮮な培地に交換し、添加物質を添加した（最終濃度：0.0005, 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500μg/ml）。細胞を２４時間培養した。その後、CellTiter 96 Aqueous One Solutionを添加（２０μl／well）し、４時間後、プレートリーダーで４９５nmの吸光光度を測定し、生存細胞数の定量を行った。【００２５】
図１から明らかなとおり、ペプチド界面活性剤の毒性が最も低かった。ＬＤ５０は、ペプチド界面活性剤が２８５．９μg/ml、リポフェクトアミン2000が４２．４９μg/ml、siFECTORが２５．３μg/mlであった。ペプチド界面活性剤は２５μg/ml以下では細胞毒性を示さなかった。
【実施例２】
【００２６】
ペプチド界面活性剤による細胞へのｓｉＲＮＡ導入の確認
ペプチド界面活性剤によってｓｉＲＮＡが細胞に導入されたことを、蛍光標識したｓｉＲＮＡを顕微鏡観察することで確認した。【００２７】
＜材料＞
・ペプチド界面活性剤
配列：Ａｃ−ＡＡＡＡＡＡＫ−ＮＨ２、Celtek社製
・ｓｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡ／ＭＭＰ−２、Santa Cruz社製
・ｓｉＲＮＡ蛍光標識試薬
Label IT Cy-3 Labelling Kit、Mirus社製
・細胞
ヒト悪性グリオーマ培養細胞3種（Ｕ８７ＭＧ、Ｔ９８Ｇ、Ｕ２５１ＭＧ、それぞれＡＴＣＣから購入）
＜方法＞
Mirus社プロトコルに従い、ｓｉＲＮＡ／ＭＭＰ−２にｓｉＲＮＡ蛍光標識試薬でＣｙ３を標識した。ＡＴＣＣのプロトコルに従い、培養チャンバー付きスライドグラス（Chambered slide glass）に５０００個の細胞を播種し一晩置いた。培地を除去し、最終濃度がｓｉＲＮＡ  ５０nM、ペプチド界面活性剤２０μg/mlとなるよう、培地１mlに加え、８時間培養を行った。対照群は、ｓｉＲＮＡのみを最終濃度が５０nMとなるよう、培地１mlで培養を行った。倒立蛍光顕微鏡で、Ｃｙ３用のフィルターでの蛍光観察と明視での観察を行った。【００２８】
＜結果＞
３種の細胞すべてにおいて、ペプチド界面活性剤とｓｉＲＮＡの両方を加えた試験群でＣｙ３標識したｓｉＲＮＡ  の取り込みが確認された。ｓｉＲＮＡのみを加えた対照群では、いずれの細胞においても標識されたｓｉＲＮＡの取り込みは認められなかった。
【実施例３】
【００２９】
ペプチド界面活性剤によるｓｉＲＮＡの細胞への導入量の経時変化解析
ペプチド界面活性剤による細胞へのｓｉＲＮＡ導入量の経時的変化を、蛍光標識したｓｉＲＮＡを顕微鏡観察することで検討した。【００３０】
＜材料＞
・ペプチド界面活性剤
配列：Ａｃ−ＡＡＡＡＡＡＫ−ＮＨ２、Celtek社製
・ペプチド界面活性剤濃度
0、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、25.0μg/mL
・ｓｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡ／ＭＭＰ−２、Santa Cruz社製
・ｓｉＲＮＡ蛍光標識試薬
Label IT Cy-3 Labelling Kit、Mirus社製
・細胞
ヒト悪性グリオーマ培養細胞3種（U87MG、T98G、U251MG、ＡＴＣＣから購入）【００３１】
＜方法＞
Ｍｉｒｕｓ社標準プロトコルに従い、ｓｉＲＮＡ／ＭＭＰ−２にｓｉＲＮＡ蛍光標識試薬でＣｙ３を標識した。ラベルしたｓｉＲＮＡをペプチド界面活性剤と混合した。培地が１ml/well入った24wellプレートに播種した１×１０５個の細胞に対して、最終濃度がｓｉＲＮＡは５０nM、ペプチド界面活性剤は２０μg/mlになるよう投与して、０．５、１、２、４、８、１６及び２４時間培養した。ＰＢＳでウェルを洗浄後、細胞を回収して９６ウェルプレートに移して蛍光光度を測定した。【００３２】
結果を図２に示した。
・培養１〜８時間では、相対蛍光単位（ＲＦＵ）がほぼ比例的に増加し、時間に比例してｓｉＲＮＡが細胞に取り込まれることがわかった。
・培養８時間以降は、ほとんどプラトーに達していた。
【実施例４】
【００３３】
ペプチド界面活性剤濃度とｓｉＲＮＡ導入効率の関係の解析
ｓｉＲＮＡの細胞への導入効率がペプチド界面活性剤濃度にどのように依存するかを、蛍光標識したｓｉＲＮＡを顕微鏡観察することで検討した。【００３４】
＜材料＞
・ペプチド界面活性剤
配列：Ａｃ−ＡＡＡＡＡＡＫ−ＮＨ２、Celtek社製
・ペプチド界面活性剤濃度
0、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、25.0μg/mL
・ｓｉＲＮＡ
ｓｉＲＮＡ／ＭＭＰ−２、Santa Cruz社製
・siRNA蛍光標識試薬
Label IT Cy-3 Labelling Kit、Mirus社製
・細胞
ヒト悪性グリオーマ培養細胞3種（U87MG、T98G、U251MG、ＡＴＣＣから購入）【００３５】
＜方法＞
Ｍｉｒｕｓ社標準プロトコルに従い、ｓｉＲＮＡ／ＭＭＰ−２にｓｉＲＮＡ蛍光標識試薬でＣｙ３を標識した。ラベルしたｓｉＲＮＡ  をペプチド界面活性剤と混合した。培地が１ml/well入った２４ウェルプレートに播種した１×１０５個の細胞に対して、最終濃度がｓｉＲＮＡは５０nM、ペプチド界面活性剤は0、0.5、1、5、10、20、25μg/mlになるよう投与して、８時間培養した。ＰＢＳでウェルを洗浄後、細胞を回収して９６ウェルプレートに移して蛍光光度を測定した。【００３６】
結果を図３に示した。
・Ｙ９８Ｇにおいて１０μg/ml以上で濃度依存的なＲＦＵの上昇が弱まったものの、３種すべての細胞で濃度の増加に比例したＲＦＵの増加が認められ、細胞へのｓｉＲＮＡの導入がペプチド界面活性剤の濃度に依存することが明らかとなった。
・実施例３の結果とあわせ、ペプチド界面活性剤を濃度が２０μg/mlで８時間細胞にさらすことで、十分有意にｓｉＲＮＡが細胞に導入されることが明らかになった。
【実施例５】
【００３７】
ペプチド界面活性剤によって細胞に導入されたｓｉＲＮＡによるＲＮＡ干渉効果の確認
ペプチド界面活性剤によって細胞に導入されたｓｉＲＮＡがＲＮＡ干渉能力を持つことをＲＴ−ＰＣＲ法で確認を行った。【００３８】
＜材料＞
・ペプチド界面活性剤
配列：Ａｃ−ＡＡＡＡＡＡＫ−ＮＨ２、Celtek社製
・細胞
ヒト悪性グリオーマ培養細胞3種（U87MG、T98G、U251MG、ＡＴＣＣから購入）【００３９】
＜方法＞
ＡＴＣＣ社の標準プロトコルに従って、２４ウェルプレートに細胞を１×１０５個播種し一晩培養した。培地を除去後、前記と同じ培養条件のところへ、最終濃度が以下になるよう次の溶液を入れて８時間培養した。
（１）コントロール（培地）
（２）スクランブルオリゴｓｉＲＮＡ(Dharmacon社製）／ペプチド界面活性剤２０μg/ml
（３）ｓｉＲＮＡ５０nM
（４）ペプチド界面活性剤２０μg/ml
（５）ｓｉＲＮＡ  ５０ｎＭ／ペプチド界面活性剤２０μg/ml
Taqman Gene Expression Cell-to-Ct Kit （アプライドバイオシステムズ社製）を用いてｓｉＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。Gene Expression Assay（アプライドバイオシステムズ社製）でＭＭＰ−２を標的とし、ベータアクチンを内部標準としてApplied Biosystems 7500リアルタイムＰＣＲシステムによって定量解析を行った。【００４０】
結果を図４−６に示した。
・ｓｉＲＮＡ  ５０nM／ペプチド界面活性剤２０μg/mlを投与したもののみで有意にＭＭＰ−２  ｍＲＮＡの発現が抑制されていた。
・ｓｉＲＮＡのみでは細胞への導入効果がないことから、ペプチド界面活性剤のｓｉＲＮＡ導入効果によってｓｉＲＮＡが細胞内へ取り込まれ、その結果ＲＮＡ干渉効果が生じたと考えられた。
・ヒトゲノム中で相同性が認められない配列で構成され遺伝子に対する特異性のないスクランブルオリゴＲＮＡとペプチド界面活性剤を混合したものでは、ＭＭＰ−２遺伝子の抑制がみらないことから、ＲＮＡの配列に依存しない非特異的反応ではないと考えられた。
【図１】
0005606318.tif 000002
【図２】
0005606318.tif 000003
【図３】
0005606318.tif 000004
【図４】
0005606318.tif 000005
【図５】
0005606318.tif 000006
【図６】
0005606318.tif 000007
【配列表】
0005606318000001.app