(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
サブクラスＩｇＧ１又はＩｇＧ２又はＩｇＧ４のヒト又はヒト化免疫グロブリンあるいはサブクラスＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３のマウス免疫グロブリンのＦａｂ２フラグメントのグリコシル化パターンの決定のための方法であって、以下の工程：
ａ）酵素ＩｄｅＳを用いた酵素処理により該免疫グロブリンをフラグメントに切断すること、
ｂ）工程ａ）の酵素消化された該免疫グロブリンを、ギ酸及び還元剤を用いて処理すること、
ｃ）得られる該免疫グロブリンのフラグメントを、逆相高速液体クロマトグラフィー又はサイズ排除クロマトグラフィーにより分離すること、
ｄ）工程ｃ）において得られる該免疫グロブリンの分離フラグメントを、マススペクトロメーター中への直接注入によるマススペクトロメトリー分析に供すること、及び
ｅ）該Ｆａｂ２フラグメントのグリコシル化パターンを、工程ｄ）において得られるマススペクトロメトリーデータから決定すること
を含む、方法。
【請求項２】
サブクラスＩｇＧ１又はＩｇＧ２又はＩｇＧ４のヒト又はヒト化免疫グロブリンあるいはサブクラスＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３のマウス免疫グロブリンのＦａｂ２フラグメント又はＦａｂフラグメントの産生のための方法であって、方法が以下の工程：
ａ）Ｆａｂ２フラグメント又はＦａｂフラグメントが得られる免疫グロブリンを提供すること、
ｂ）酵素ＩｄｅＳを用いた酵素消化により該免疫グロブリンをＦａｂ２フラグメント及びＨＣ−ＦＣフラグメントに切断すること、
ｃ）Ｆａｂフラグメントが産生される場合、工程ｂ）の酵素切断された該免疫グロブリンを、ギ酸及び還元剤を用いて処理すること、
ｄ）ｂ）又はｃ）において得られるフラグメントのプロテインＡクロマトグラフィー樹脂を用いたクロマトグラフィーにより該Ｆａｂ２フラグメント又は該Ｆａｂフラグメントを産生すること
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項３】
以下の工程：
ａ）サンプルを期間にわたり保存すること、
ｂ）酵素ＩｄｅＳを用いた酵素消化により該免疫グロブリンをフラグメントに切断すること、
ｃ）酵素消化により得られる該免疫グロブリンのフラグメントを、逆相高速液体クロマトグラフィーにより分離すること、
ｄ）工程ｃ）の酵素切断された該免疫グロブリンを、ギ酸及び還元剤を用いて処理すること、
ｅ）得られる該免疫グロブリンのフラグメントを、逆相高速液体クロマトグラフィー又はサイズ排除クロマトグラフィーにより分離すること、
ｆ）フラグメントの保持時間のシフトにより、工程ｂ）〜ｅ）を用いて処理された参照サンプルと比較して、分解産物の存在を決定すること
を含む、サンプルをモニタリングするための方法。
【請求項４】
分離工程が以下：
−  得られる免疫グロブリンのフラグメントをサイズ排除クロマトグラフィーにより脱塩すること
であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
切断工程が以下：
−  酵素ＩｄｅＳを用いた酵素消化により免疫グロブリンをフラグメントに切断すること、及び、該免疫グロブリンフラグメントを、カルボキシペプチダーゼＢを用いて処理すること
であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
方法が切断工程の後及び精製工程の前に以下：
−  酵素切断された免疫グロブリンを、ギ酸及び還元剤を用いて処理すること
を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
切断がｐＨ５．５〜ｐＨ８．５の間のｐＨ範囲で実施される、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
切断が２時間にわたり実施されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
還元剤がトリス（２−カルボキシエチル）−ホスフィンであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
ＩｄｅＳの免疫グロブリン分子に対するモル比が１：２５〜１：２５００の間であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリンＦｃフラグメントのグリコシル化パターンの決定のための方法に関する。また、Ｆａｂグリコシル化免疫グロブリンのグリコシル化パターンの決定のための方法ならびに免疫グロブリンＦａｂ２フラグメントを産生するための方法が提示される。
【０００２】
発明の背景
医薬産業は、近年、とりわけ、酵素、抗体、及びサイトカイン（例えば、エリスロポエチン、インターフェロン、プラスミノーゲンアクチベーターなど）に基づく産物を用いて非常に成功しており、世界でのタンパク質治療用薬剤の需用は毎年増加している。治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ、モノクローナル抗体）は、タンパク質治療法内で重要な群である。それらはモノクローナルと呼ばれる。なぜなら、ポリクローナル抗体とは対照的に、それらは単一の抗体形成細胞に由来する免疫細胞（細胞クローン）により分泌されるからである。モノクローナル抗体の特徴は、それらの各々が、免疫原性物質の１つのエピトープに対して向けられるだけであり、従って、疾患の処置において非常に特異的に使用することができることである。タンパク質治療法の例は、モノクローナル抗体トラスツズマブ（商品名：ハーセプチン）、ダクリズマブ（商品名：ゼナパックス）、及びリツキシマブ（商品名：マブセラ）であり、Rocheにより製造され、とりわけ乳癌の処置のために（トラスツズマブ）、臓器拒絶反応のために（ダクリズマブ）、及び非ホジキンリンパ腫のために（リツキシマブ）成功裏に使用されてきた。
【０００３】
治療用モノクローナル抗体は、複雑なバイオテクノロジープロセスを用いて得られる。分解産物は、それらの産生、製剤化、及び保存の間に形成されうるが、それらは、しばしば、酸化及び脱アミドならびにタンパク質分解的切断などのプロセスに起因する（Yan, B., et al., J. Chromatogr. A 1164 (2007) 153-161）。バイオ医薬品産物の品質、即ち、純度、完全性、凝集状態及びグリコシル化パターンは、その作用に加えて重要である。
【０００４】
ヒト病原体ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのシステインエンドプロテアーゼＩｄｅＳ（免疫グロブリン分解酵素Ｓ）は、Ｍａｃ−１又はｓｉｂ−３８とも呼ばれ、免疫グロブリンＧ型（ＩｇＧ）の抗体の重鎖を特異的に切断するシステインプロテアーゼである。ＩｇＧは、現在まで、ＩｄｅＳの唯一の公知の基質である（Vincents, B., et al., Biochem. 43 (2004) 15540-15549）。ＩｄｅＳは、２９のアミノ酸を含むシグナルペプチドを含む３３９のアミノ酸からなる（von Pawel-Rammingen, U., et al., EMBO J. 21 (2002) 1607-1615）。ＩｄｅＳは、ヒトＩｇＧサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を、認識配列（ＬＬ）ＧＧＰに含まれるアミノ酸２３６と２３７（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）の間で切断する。ヒトＩｇＧ２は、認識モチーフＰＶＡＧＰ中のアミノ酸アラニンとグリシンの間で切断される。ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、及びＩｇＧ３型のマウス抗体ならびにウサギＩｇＧ（ＬＬＧＧＰＳ）も切断される（例、Vincents, B., et al., Biochem. 43 (2004) 15540-15549; Wenig, K., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 17371-17376を参照のこと）。
【０００５】
Hess et al.（Hess, J. K., et al., J. Microbiol. Meth. 70 (2007) 284-291）は、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦマススペクトロメトリーの補助を用いた、ＩｄｅＳの酵素活性を決定するためのマススペクトロメトリー方法を報告する。Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓから単離され、ＩｇＧシステインプロテアーゼ活性を有するポリペプチドが、ＵＳ  ２００７／０２３７７８４に報告されている。抗体のＦｃ又はＦａｂフラグメントを形成するための方法が、ＥＰ  １  ４５８  ８６１  Ａに報告されている。Ａ．  ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ群からのＩｄｅＳプロテアーゼが、ＷＯ  ２００６／１３１３４７に報告されている。
【０００６】
例えば、ポリペプチドのグリコシル化プロファイルは、多くの組換え産生された治療用ポリペプチドについての重要な特徴である。グリコシル化ポリペプチドは、糖タンパク質とも呼ばれ、真核生物（例、ヒト）、及び一部の原核生物における多くの必須の機能（触媒、シグナル伝達、細胞間連絡、免疫系の活性、ならびに分子識別及び会合を含む）を媒介する。それらは、真核生物における非細胞質タンパク質の大半を構成する（Lis, H., et al., Eur. J. Biochem. 218 (1993) 1-27）。タンパク質へのオリゴ糖の形成／付着は翻訳時又は翻訳後修飾であり、したがって、遺伝的に制御されない。オリゴ糖の生合成は、いくつかの酵素を含む多段階プロセスであり、それは基質について互いに競合する。結果的に、グリコシル化ポリペプチドは、オリゴ糖のミクロ不均一アレイを含み、同じアミノ酸骨格を含む一連の異なるグリコフォームを生じる。
【０００７】
共有結合したオリゴ糖は、それぞれのポリペプチドの物理的な安定性、折り畳み、プロテアーゼ攻撃への耐性、免疫系との相互作用、生物活性、及び薬物動態に影響を与える。さらに、一部のグリコフォームは抗原性であり得、規制当局が、組換えグリコシル化ポリペプチドのオリゴ糖構造の分析を要求することを促している（例、Paulson, J. C., Trends Biochem. Sci. 14 (1989) 272-276; Jenkins, N., et al., Nature Biotechnol.14 (1998) 975-981を参照のこと）。グリコシル化ポリペプチドの末端シアリル化は、例えば、血中半減期を増加すると報告されており、末端ガラクトース残基を伴うオリゴ糖構造を含むグリコシル化ポリペプチドは、循環からの増加したクリアランスを示す（Smith, P. L., et al., J. Biol. Chem. 268 (1993) 795-802）。
【０００８】
免疫グロブリンは、それらのグリコシル化パターンにおいて他の組換えポリペプチドとは異なる。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、例えば、抗原結合に関与する２つの同一のＦａｂフラグメント及びエフェクター機能のためのＦｃフラグメントからなる分子量約１５０kDaの対称的な多機能性グリコシル化ポリペプチドである。グリコシル化は、ＩｇＧ分子においてＡｓｎ−２９７で高度に保存される傾向があり、それはＦｃ重鎖のＣＨ２ドメインの間に埋められており、ＣＨ２内のアミノ酸残基と広範な接触を形成する（Sutton and Phillips, Biochem. Soc. Trans. 11 (1983) 130-132）。Ａｓｎ−２９７連結オリゴ糖構造は不均一にプロセシングされ、ＩｇＧが複数のグリコフォームで存在する。変動が、Ａｓｎ−２９７残基の部位占有において（マクロ不均一性）又はグリコシル化部位でのオリゴ糖構造における変動（ミクロ不均一性）により存在する。例えば、Jenkins, N., et al., Nature Biotechnol. 14 (1996) 975-981を参照のこと。
【０００９】
パルスアンペロメトリック検出を伴う高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）及びマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型マススペクトロメトリー（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）を使用し、グリコシル化ポリペプチドの糖成分が分析されてきた（例、Fukuda, M., (ed.) Glycobiology: A Practical Approach, IRL Press, Oxford; Morelle, W. and Michalsky, J.C., Curr. Pharmaceut. Design 11 (2005) 2615-2645を参照のこと）。Hoffstetter-Kuhn et al.（Electrophoresis 17 (1996) 418-422）はキャピラリー電気泳動及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を使用し、ＮグリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ）を用いた抗体の脱グリコシル後にモノクローナル抗体のオリゴ糖媒介性の不均一性をプロファイリングした。
【００１０】
組換えグリコシル化ポリペプチドの機能的特性に対するグリコシル化の重要性及び十分に定義された一貫した産物産生プロセスの必要性を考えると、発酵プロセスの間での組換え産生されたグリコシル化ポリペプチドのグリコシル化パターンのオンライン又はアドライン分析が高く望ましい。Papac et al.（Glycobiol. 8 (1998) 445-454）は、フッ化ポリビニリデン膜上でのグリコシル化ポリペプチドの固定化、酵素消化、及びグリコシル化プロファイルのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析を含む方法を報告した。組換え産生されたｍＡｂの分析及び分子特徴付け（いくつかのクロマトグラフィー工程を含む）が、Bailey, M., et al., J. Chromat. 826 (2005) 177-187に報告されている。
【００１１】
哺乳動物細胞により産生された免疫グロブリンは、２〜３質量%の糖を含む（Taniguchi, T., et al., Biochem. 24 (1985) 5551-5557）。これは、例えば、クラスＧ（ＩｇＧ）の免疫グロブリンにおいて、マウス由来のＩｇＧにおける２．３の糖残基（Mizuochi, T., et al., Arch. Biochem. Biophys. 257 (1987) 387-394）及びヒト由来のＩｇＧにおける２．８の糖残基（Parekh, R. B., et al., Nature 316 (1985) 452-457）と等価であり、一般的にその２つがＦｃ領域においてＡｓｎ−２９７に、残りが可変領域において位置づけられる（Saba, J. A., et al., Anal. Biochem. 305 (2002) 16-31）。
【００１２】
クラスＧ（ＩｇＧ）の免疫グロブリンについて、例えば、オリゴ糖をアミノ酸骨格に結合させる又は結合させることができる異なるＮグリコシル化部位が公知である。ＩｇＧのＦｃ領域において、オリゴ糖残基を、Ｎグリコシル化を介して、アミノ酸残基２９７（アスパラギンである）（Ａｓｎ−２９７と表示される）に導入することができる。Youings et al.は、さらなるＮグリコシル化部位がＦａｂ領域中の１５〜２０%のポリクローナルＩｇＧにおいて存在することを示している（Youings, A., et al., Biochem. J., 314 (1996) 621-630；例、Endo, T., et al., Mol. Immunol. 32 (1995) 931-940も参照のこと）。
【００１３】
不均質、即ち、非対称オリゴ糖プロセッシングに起因して、免疫グロブリンの複数の糖構造アイソフォームが存在する（Patel, T.P., et al., Biochem. J. 285 (1992) 839-845; Yu-Ip, C. C., et al., Arch. Biochem. Biophys. 308 (1994) 387-399; Lund, J., et al., Immunol. 30 (1993) 741-748）。同時に、オリゴ糖の構造及び分布は、高度に再現可能（即ち、非ランダム）で部位特異的である（Dwek, R. A., et al., J. Anat. 187 (1995) 279-292）。
【００１４】
免疫グロブリンの一部の特徴は、Ｆｃ領域のグリコシル化（例、Dwek, R. A., et al., J. Anat. 187 (1995) 279-292; Lund, J., et al., J Immunol. 157 (1996) 4963-4969 and FASEB J. 9 (1995) 115-119; Wright, A., and Morrison, S. L., J. Immunol. 160 (1998) 3393-3402を参照のこと）、例えば熱安定性及び可溶性（West, C. M., Mol. Cell. Biochem. 72 (1986) 3-20）、抗原性（Turco, S. J., Arch. Biochem. Biophys. 205 (1980) 330-339）、免疫原性（Bradshaw, J. P., et al., Biochim. Biophys. Acta 847 (1985) 344-351;Feizi,T.,and Childs, R. A.,Biochem. J. 245 (1987)1-11; Schauer, R., Adv. Exp. Med. Biol. 228 (1988) 47-72）、クリアランス速度／循環半減期（Ashwell, G., and Harford, J., Ann. Rev. Biochem. 51 (1982) 531-554; McFarlane, I. G., Clin. Sci. 64 (1983) 127-135; Baenziger, J. U., Am. J. Path. 121 (1985) 382-391; Chan, V. T., and Wolf, G., Biochem. J. 247 (1987) 53-62; Wright, A., et al., Glycobiology 10 (2000) 1347-1355; Rifai, A., et al., J. Exp. Med. 191 (2000) 2171-2182; Zukier, L. S., et al., Cancer Res. 58 (1998) 3905-3908）、及び生物学的な比活性（Jefferis, R., and Lund, J., in Antibody Engineering, ed. by Capra, J. D., Chem. Immunol. Basel, Karger, 65 (1997) 111-128）に直接的に関連する。
【００１５】
ハイブリッド四重極飛行時間型マススペクトロメトリーと一体となった液体クロマトグラフィーを使用した２つのＮ連結グリコシル化部位を伴う治療用の組換えモノクローナル抗体のグリコシル化プロファイリングが、Lim, A., et al., Anal. Biochem. 375 (2008) 163-172に報告されている。Nandakumar, K. S. and Holmdahl, R., Trends. Immunol. 29 (2008) 173-178は、酵素の注射によりインビボでＩｇＧを切断又は改変する可能性を報告している。ストレプトコッカスのプロテアーゼＩｄｅｓは、細菌のＩｇＧＦｃ結合を調節し、多形核白血球を予備刺激する能力を伴う１／２Ｆｃフラグメントを生成し、Soderberg, J. J. and von Pawel-Rammingen, U., Mol. Immunol. 45 (2008) 3347-3353により報告されている。Bennet, K. L., et al., Anal. Biochem. 245 (1997) 17-27は、エレクトロスプレイイオン化マススペクトロメトリーによるモノクローナル抗体のパパイン消化のモニタリングを報告している。
【００１６】
発明の概要
本発明の一局面は、サブクラスＩｇＧ１（ｈｕＩｇＧ１）又はＩｇＧ２（ｈｕＩｇＧ２）又はＩｇＧ４（ｈｕＩｇＧ４）のヒト免疫グロブリンあるいはサブクラスＩｇＧ２ａ（ｍｕＩｇＧ２ａ）又はＩｇＧ２ｂ（ｍｕＩｇＧ２ｂ）又はＩｇＧ３（ｍｕＩｇＧ３）のマウス免疫グロブリンのグリコシル化パターン又は部位特異的グリコシル化パターンの決定のための方法であって、以下の工程：
ａ）免疫グロブリンを、酵素ＩｄｅＳを用いて消化すること、
ｂ）ａ）において得られる免疫グロブリンのフラグメントを、逆相高速液体クロマトグラフィーにより分離すること、
ｃ）ｂ）において得られる免疫グロブリンの分離フラグメントをマススペクトロメトリー分析に供すること、及び
ｄ）免疫グロブリンのグリコシル化パターンを、ｃ）において得られるマススペクトロメトリーデータから決定すること
を含む。
【００１７】
一実施態様において、本発明の方法は、以下の工程ｂ）及びｃ）：
ｂ）免疫グロブリンのフラグメントを、サイズ排除クロマトグラフィーにより脱塩すること、
ｃ）脱塩されたフラグメントをマススペクトロメトリー分析に直接的に適用すること
を含む。
【００１８】
さらなる実施態様において、本発明の方法は工程ａ）：
ａ）酵素ＩｄｅＳを用いた酵素消化により免疫グロブリンをフラグメントに切断すること、及び、免疫グロブリンフラグメントを、カルボキシペプチダーゼＢを用いて処理すること
を含む。
【００１９】
別の実施態様において、本発明の方法は、工程ａ）の後及び工程ｂ）の前に工程ａｂ）を含み、それは以下：
ａｂ）工程ａ）の消化された免疫グロブリンを、ギ酸及び還元剤を用いて処理すること
である。
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明は、サブクラスＩｇＧ１（ｈｕＩｇＧ１）又はＩｇＧ２（ｈｕＩｇＧ２）又はＩｇＧ４（ｈｕＩｇＧ４）のヒト免疫グロブリンあるいはサブクラスＩｇＧ２ａ（ｍｕＩｇＧ２ａ）又はＩｇＧ２ｂ（ｍｕＩｇＧ２ｂ）又はＩｇＧ３（ｍｕＩｇＧ３）のマウス免疫グロブリンのグリコシル化パターンの決定のための方法に関する。
【００２１】
ＩｄｅＳの使用は、非還元条件下でさえ、高度に再現可能な切断を提供することが見出されている。さらに、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）の添加は、マススペクトロメトリー分析について省略することができ、即ち、マススペクトロメトリー分析はトリフルオロ酢酸の非存在において実施される。さらに、ＩｄｅＳの使用は限定されない。例えば、それを使用し、溶液中の免疫グロブリンを消化することができる。
【００２２】
ＥＳＩ−ＭＳ技術は、一般的に、インタクトな免疫グロブリン又は免疫グロブリン重鎖のレベルで実施され、より大きなタンパク質についてより低い質量分解能を提供する。パパイン消化された免疫グロブリンのＥＳＩ−ＭＳ分析は、酵素の低い特異性及びその活性化のためのシステインの要求性のために限定され、それらは、例えば還元反応による副産物（即ち、データ分析において干渉するアーキファクト）の形成を起こす。ペプチドマップ技術において、比較的複雑なサンプル調製を実施しなければならず、定量分析は、とりわけ、塩付加物の形成のために困難である。
【００２３】
一般的に、全てのクロマトグラフィー方法で物質の標識が要求され、特定のグリカンの共溶出を避けることはできない。加えて、ＦｃフラグメントならびにＦａｂフラグメントにおいてグリコシル化された免疫グロブリンのグリコシル化パターンを区別することは可能ではない。
【００２４】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合により一緒に連結されたアミノ酸からなるポリマーである。それは、酵素的に又は合成的に産生することができる。２０未満のアミノ酸を含むポリペプチドも「ペプチド」と呼ばれる。「タンパク質」は、２つ又はそれ以上のポリペプチドを含む高分子である。あるいは、それは１００を上回るアミノ酸で構成されるポリペプチドである。ポリペプチドは、また、非ペプチド成分（例、糖など）を含むことができる。非ペプチド修飾が、ポリペプチドを発現する細胞により導入され、従って、細胞型に依存する。本願において、ポリペプチドは、それらのアミノ酸配列により定義される。修飾（例えば糖など）は明確に記載されないが、しかし、常に存在しうる。
【００２５】
「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は、本願内で同義的に使用され、少なくとも２つの軽ポリペプチド鎖（軽鎖、ＬＣ）及び２つの重ポリペプチド鎖（重鎖、ＨＣ）を含む分子を表示する。軽鎖及び重鎖の各々は、可変領域（通常、鎖のアミノ末端）を含み、それは抗原の結合のための結合ドメインを含む。重鎖及び軽鎖の各々は、定常領域（通常、鎖のカルボキシ末端）を含み、それは異なる受容体への抗体の結合を媒介する。軽鎖は、通常、可変ドメインＶＬ及び定常ドメインＣＬで構成される。重鎖は、通常、可変ドメインＶＨ及び定常領域で構成され、それは次にドメインＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及び、場合によりＣＨ４を含む。抗体は多数の形態、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、及びＦ（ａｂ）２ならびに単鎖（ｓｃＦｖ）として生じうる（例、Huston, J. S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 5879-5883; Bird, R. E., et al., Science 242 (1988) 423-426；及びHood, L. E., et al., Immunology, Benjamin N. Y., 2nd Edition (1984) and Hunkapiller, T. and Hood, L., Nature 323 (1986) 15-16）。免疫グロブリンは、重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依存してクラスに分けられる：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ。これらのクラスの一部は、さらに、サブクラス（アイソタイプ）に細分類される（例、ＩｇＧがＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４に又はＩｇＡがＩｇＡ１及びＩｇＡ２に）。重鎖の定常領域は、抗体が属するクラスに依存して、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）、及びμ（ＩｇＭ）と呼ばれる。
【００２６】
一般的なクロマトグラフィー方法が当業者に公知である（例、Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Heftmann, E. (ed.), Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992); Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z. (ed.), Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998); Chromatography Today, Poole, D. F. and Poole, S. K., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991); Scopes, R. K., Protein Purification: Principles and Practice (1982); Sambrook, J., et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989；又はCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M., et al. (eds.), John Wiley & Sons, Inc., New York）。
【００２７】
免疫グロブリン分解酵素ＩｄｅＳ（ＧＰ（Ｓ）モチーフで高度に特異的にＩｇＧを切断するシステインプロテアーゼ）を、ＬＣ−ＭＳ（マススペクトロメトリーと組み合わせた液体クロマトグラフィー）との組み合わせで、免疫グロブリンの詳細な部位特異的グリコシル化パターンの特徴付けのために使用することができることが見出されている。
【００２８】
２時間の消化処置において、ＩｄｅＳは抗体を切断し、２つのＨＣ−Ｆｃフラグメント（ＨＣ−Ｆｃフラグメント（免疫グロブリン重鎖のＣ末端部分を含む）とも呼ばれる）及びＦａｂ２フラグメント（Ｆａｂ２フラグメント（免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖のＮ末端部分を含む）とも呼ばれる）をもたらすことが見出されている。この方法は、Ｆｃフラグメントにおいてグリコシル化された又はＦｃフラグメント及びＦａｂ２フラグメントにおいてグリコシル化された免疫グロブリンのグリコシル化パターンの分析に特に適する。第２のグリコシル化部位の分析のために、ＩｄｅＳ消化物を還元させることができる。分解産物を、この方法を用いて分析することも可能である。酵素処理後、サンプルを、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を含むＬＣ−ＭＳ分析及びＱＴＯＦ機器（四重極飛行時間型マススペクトロメトリー）でのオンラインＭＳ分析に供する。本発明の方法を、例えば、バッチ特徴付けのため、下流のプロセシング工程のモニタリングのため、ならびにサンプル精製なしでの発酵プロセスのモニタリングのために使用することができる。
【００２９】
免疫グロブリンのＣＨ２ドメインのＮ末端領域中のＧＰ（Ｓ）モチーフが、ＩｄｅＳを用いた消化のために必須である。本明細書で使用するＨＣ−Ｆｃフラグメントという用語は、ＩｄｅＳ消化により得られる免疫グロブリン重鎖のＣ末端フラグメントを指し、Ｆａｂ２フラグメントという用語は、ＩｄｅＳ消化により得られる完全な軽鎖を含む免疫グロブリンのＮ末端フラグメントを指す。従って、一実施態様において、本発明の方法は、キメラ又はヒト化ＩｇＧ、即ち、サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４のヒト又はヒト化免疫グロブリン、あるいはその変異体について、及び、マウスＩｇＧの特定のサブクラスについて、即ち、サブクラスＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、又はＩｇＧ３のマウス免疫グロブリン、あるいはその変異体を特徴付けるためにある。一実施態様において、消化を弱塩基性ｐＨで２時間にわたり実施する。Ｆａｂ２フラグメントにおけるグリコシル化プロファイルの分析のために、酸性条件下でＴＣＥＰを０．５時間にわたり使用した追加の還元工程を、一実施態様において実施する。サンプルを、その後、以下及び実施例において記載する通りにＬＣ−ＭＳ分析に供する。
【００３０】
インタクトな免疫グロブリン重鎖又はさらにインタクトな免疫グロブリンのレベルでのグリコシル化パターン分析とは対照的に、この方法は、より高い質量精度、分解能、及び感度の利点を有することが見出されている。他の酵素（パパインなど）又は限定されたＬｙｓＣ消化と比較して、ＩｄｅＳは、固有の切断部位を有するという利点を示し、従って、高度に特異的であり、同様の効率で異なるサブクラスを切断する。過度の切断というリスクは存在せず、システインは酵素の活性化のために要求されない。分解産物の分析のために、ＩｄｅＳ消化物を還元させ、３つの抗体フラグメントを産出する：全長免疫グロブリン軽鎖、２つの重鎖Ｆａｂフラグメント（ＨＣ  Ｆａｂフラグメント）、及び重鎖Ｆｃフラグメント（ＨＣ  Ｆｃフラグメント）。３種をクロマトグラフィーにより分離し、個々に分析することができる。このアプローチは、分解（例えば酸化、脱アミド、又はフラグメンテーションなど）が、免疫グロブリンのＦｃフラグメント又はＦａｂフラグメントにおいて存在する／生じるか否かを決定するための簡単で迅速な方法である。特定の分解反応（例えば酸化など）が、保持時間におけるわずかなシフトに導き、従って、製剤からのサンプルの迅速なモニタリング及びＵＶ吸収検出（それも本発明の局面である）を使用することによる安定性試験のために使用することができる。一実施態様において、本発明の方法は、脱塩された分子混合物の直接的なマススペクトロメトリー分析を伴うサイズ排除クロマトグラフィーを使用した脱塩工程を含む。
【００３１】
免疫グロブリンの特異的な切断
モノクローナル免疫グロブリンは非常に大きなタンパク質であり、さらに、それらの重鎖の糖構造のため極めて不均一（ミクロ不均一性）である。分解産物の形成について及び／又は修飾について免疫グロブリンのグリコシル化パターンを検討するために、糖構造分析の前にそれらをより小さなフラグメントに切断することが好都合である。
【００３２】
ジスルフィド架橋の切断
免疫グロブリン分子において生じる全てのジスルフィド架橋を、還元により切断することができる。免疫グロブリンの遊離の重鎖及び軽鎖が、還元の間に得られる。トリス（２−カルボキシエチル）−ホスフィン（ＴＣＥＰ）が、しばしば使用される還元剤である。なぜなら、免疫グロブリンの全てのジスルフィド架橋が短時間内に完全に切断され、その還元は全ｐＨ範囲において生じるからである（例、Hau, J. C. and Hau, C. Y., Anal. Biochem. 220 (1994) 5-10を参照のこと）。一実施態様において、ｐＨ範囲はｐＨ１．５〜ｐＨ８．５である。ジチオトレイトール（ＤＴＴ）は、また、ジスルフィド架橋の迅速な切断により特徴付けられる。しかし、酸性環境におけるＤＴＴ還元は、非常に不十分に進行するだけである。変性工程が、通常、重鎖と軽鎖の解離を完了するために必要である。変性によって、加えて、ジスルフィド基がより接近可能になる。一実施態様における変性は、例えば、グアニジン／ＨＣｌ又はギ酸の助けで行うことができる。
【００３３】
酵素切断
パパイン（システインプロテアーゼ）は、アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、グルタミン酸（Ｅ）、ヒスチジン（Ｈ）、グリシン（Ｇ）、及びチロシン（Ｙ）の後で比較的、非特異的にペプチド結合を切断する。インキュベーション期間が十分に長い又は長過ぎる場合、パパイン消化は免疫グロブリンの全体の加水分解に導く。しかし、免疫グロブリンを、それらのヒンジ領域において、限定的なタンパク質分解により比較的、選択的に切断することができる（Lottspeich, F. and Engels, J. W., Bioanalytik Spektrum Akademischer Verlag, Munich, 2nd Edition (2006) 201-214）。切断は、２つの重鎖を連結するジスルフィド架橋のＮ末端側で生じる。ジスルフィド架橋はこのプロセスにおいて保持され、３つのフラグメント（２つのＦａｂフラグメント、１つのＦｃフラグメント）が得られる。２つのＮ末端フラグメントは抗原結合フラグメント（Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ、抗原結合フラグメント）と呼ばれ、Ｃ末端フラグメントはクリスタリンフラグメント（Ｆｃフラグメント、Ｆｃ、結晶化フラグメント）と呼ばれる。各Ｆａｂフラグメントは、完全な軽鎖及び重鎖のアミノ末端半分で構成される。Ｆｃフラグメントは、重鎖の２つのカルボキシ末端半分で構成され、それらは依然としてジスルフィド架橋により一緒に連結されている。
【００３４】
ＩｄｅＳ（Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓの免疫グロブリンＧ分解酵素）は、病原性細菌ストレプトコッカス・ピオゲネスから単離することができる細胞システインプロテアーゼである。この酵素は、配列ＧＰ（ＳＶＦＬＦＰ）、即ち、ＧＰ（Ｓ）モチーフの直前で高い特異性を伴いヒトＩｇＧを切断する。この配列は、２つの重鎖（ＨＣ）を一緒に連結するジスルフィド架橋のＣ末端側に位置付けられる。切断は、２つの重鎖（２つのＨＣ−Ｆｃフラグメント）のＣ末端及びジスルフィド架橋により連結される軽鎖及び重鎖のＦａｂフラグメントを含むＦａｂ２フラグメントをもたらす（図１）（von Pawel-Rammingen, U., et al., EMBO Journal 21 (2002) 1607-1615）。免疫グロブリンのＩｄｅＳ切断により得られるフラグメントが、消化後にＤＴＴ又はＴＣＥＰを用いて還元される場合、抗体の２つの軽鎖（２つのＬＣ）及び重鎖のＮ末端フラグメント（２つのＨＣ  Ｆａｂフラグメント）が、Ｆａｂ２フラグメントの代わりに得られる。重鎖のＣ末端（ＨＣ−Ｆｃ）は、還元により影響を受けない。
【００３５】
免疫グロブリン切断のための一般的に用いられる酵素パパインは、ヒンジ領域のＮ末端を切断する。従って、パパイン消化物は還元を必要とし、Ａｂの全ての３つのフラグメント（Ｆｃ、ＬＣ、及びＨＣ  Ｆａｂ）がマススペクトルにおいて同じm/z範囲で現れる。
【００３６】
本発明の第１の局面は、サブクラスＩｇＧ１又はＩｇＧ２又はＩｇＧ４のヒト又はヒト化免疫グロブリンあるいはサブクラスＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３のマウス免疫グロブリンあるいはその変異体のグリコシル化パターンの決定のための方法であって、以下の工程：
ａ）酵素ＩｄｅＳを用いた処理により免疫グロブリンを消化すること、
ｂ）酵素消化により得られる免疫グロブリンの酵素切断フラグメントを、逆相高速液体クロマトグラフィーにより分離すること、
ｃ）工程ｂ）において得られる免疫グロブリンの分離フラグメントを、マススペクトロメトリー分析に供すること、及び
ｄ）免疫グロブリンのグリコシル化パターンを、工程ｃ）において得られるマススペクトロメトリーデータから決定すること
を含む。
【００３７】
例えば、ＬｙｓＣ又はパパインを用いた限定タンパク質分解の代わりに、特異的に切断する酵素ＩｄｅＳの使用によって、免疫グロブリンの定義されたフラグメントを得ることができることが見出されており、それらは免疫グロブリンのグリコシル化パターンの決定に非常に適している。
【００３８】
「グリコシル化パターン」という用語は、本願内で使用される通り、免疫グロブリン中の１つ又は複数の特定のアミノ酸残基に付着されているオリゴ糖全体を表示する。細胞のグリコシル化不均一性のため、組換え産生された免疫グロブリンは、特定のアミノ酸残基に単一の定義されたＮ又はＯ連結オリゴ糖を含むだけでなく、ポリペプチドの混合物でもあり、各々が同じアミノ酸配列を有するが、しかし、特定のアミノ酸位置に異なる構成のオリゴ糖を含む。このように、上の用語は、組換え産生された免疫グロブリンの１つ又は複数の特定のアミノ酸位置に付着したオリゴ糖の群（即ち、付着したオリゴ糖の不均一性）を表示する。「オリゴ糖」という用語は、本願内で使用される通り、２つ又はそれ以上の共有結合した単糖単位を含む重合糖類を表示する。
【００３９】
本発明の方法において、グリコシル化パターンを決定しなければならない免疫グロブリンは、最初の工程において、ＨＣ  Ｆｃフラグメント及びＦａｂ２フラグメントにおいて酵素ＩｄｅＳを用いて酵素的に消化／切断される。Ｆａｂ２フラグメント中のグリコシル化部位のグリコシル化パターンを決定しなければならない場合、還元剤を用いた免疫グロブリンジスルフィド結合の還元を、本発明の方法の一実施態様において実施する。酵素切断及び任意の還元工程後、溶液を、２つの重鎖Ｆｃフラグメントの解離を誘導するために、酸性化させる。一実施態様において、酸性化は、免疫グロブリンジスルフィド結合の還元と同じ工程中である。得られるフラグメントを逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）により分離する。グリコシル化パターンの決定のために、解離した重鎖Ｆｃフラグメント及び場合により免疫グロブリンのＦａｂ２又はＦａｂフラグメントを含むサンプルを、マススペクトロメトリー（ＭＳ）分析に供する。ＭＳ分析の結果を用いて、免疫グロブリンのグリコシル化パターンを決定する。一実施態様において、ＭＳ分析を、ＲＰ−ＨＰＬＣ（オフライン）とは別の分離された工程において実施する。別の実施態様において、ＭＳ分析を、ＲＰ−ＨＰＬＣ（オンライン）の直後に実施する。即ち、ＲＰ−ＨＰＬＣの溶出液をＭＳ機器中に直接導入する。
【００４０】
オフラインの方法において、Ｆｃグリコシル化パターンの決定は、ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）脱塩工程及びマススペクトロメーター中へのサンプルの直接注入を含む。この方法は、極めて迅速であり、ハイスループットについて可能であり、免疫グロブリンのＨＣ  Ｆｃフラグメントのレベルでのオリゴ糖分析の高分解能、精度、及び感度から利益を得る。グリコシル化ＨＣ  Ｆｃフラグメントが８００〜２０００のm/z範囲中のマススペクトルにおいて現れるのに対し（例、図２を参照のこと）、Ｆａｂ２フラグメントはその二倍の重量のために１９００〜３０００m/zの範囲において現れる（例、図３を参照のこと）。免疫グロブリンの２つのフラグメントは、従って、マススペクトロメトリーにより分離することができ、それは、データ解釈を促す効果である。
【００４１】
このように、本発明の一局面は、サブクラスＩｇＧ１又はＩｇＧ２又はＩｇＧ４のヒト又はヒト化免疫グロブリンあるいはサブクラスＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３のマウス免疫グロブリンあるいはその変異体のグリコシル化パターンの決定のための方法であって、以下の工程：
ａ）酵素ＩｄｅＳを用いた処理により免疫グロブリンを消化すること、
ｂ）酵素消化により得られる免疫グロブリンの酵素切断フラグメントを、サイズ排除クロマトグラフィーにより脱塩すること、
ｃ）工程ｂ）において得られる免疫グロブリンの分離フラグメントを、マススペクトロメトリー分析に供すること、及び
ｄ）免疫グロブリンのグリコシル化パターンを、工程ｃ）において得られるマススペクトロメトリーデータから決定すること
を含む。
【００４２】
一実施態様において、本発明の方法は、工程ａ）として以下の工程：
ａ）酵素ＩｄｅＳ及び酵素カルボキシペプチダーゼＢを用いた処理により免疫グロブリンを消化すること
を含む。
【００４３】
この実施態様において、免疫グロブリンを、ＨＣ  Ｆｃフラグメント及びＦａｂ２フラグメントを得るために、酵素ＩｄｅＳにより切断し、同じ工程において、免疫グロブリン重鎖のＣ末端リジンを、免疫グロブリンの不均一性を低下させるために、即ち、グリコシル化パターンに影響を与えることなくより不均一なサンプルを得るために、除去する。
【００４４】
「Ｆａｂ２フラグメント」という用語は、本願内で使用される通り、酵素ＩｄｅＳを用いた酵素切断により得られる免疫グロブリンのＮ末端部分を表示する。「ＨＣ  Ｆｃフラグメント」という用語は、本願内で使用される通り、酵素ＩｄｅＳを用いた酵素切断により得られる免疫グロブリンのＣ末端部分を表示する。このフラグメントは、２つの非共有結合ポリペプチド、即ち、重鎖の各々のＣ末端フラグメントを含む。酵素ＩｄｅＳは、酵素パパイン及びペプシンとは異なる位置及び免疫グロブリンの単一部位で免疫グロブリンを切断するため、わずか２つの、しかし、十分に定義された免疫グロブリンのフラグメントが得られる。
【００４５】
別の実施態様において、方法は、工程ａ）の後及び工程ｂ）の前に工程ａ１）を含み、それは以下：
ａ１）工程ａ）の酵素消化により得られる免疫グロブリンの酵素切断フラグメントを、ギ酸を用いて処理すること
である。
【００４６】
この実施態様において、酵素ＩｄｅＳを用いた切断により免疫グロブリンから得られるＦｃフラグメントは、互いに共有結合されていないポリペプチドを含み、２つのｐＦｃフラグメントにおいて分離される。「ｐＦｃフラグメント」という用語は、本願内で使用される通り、酵素ＩｄｅＳを用いた酵素切断後に免疫グロブリン重鎖から得られる単一のＣ末端ポリペプチドを表示する。
【００４７】
別の実施態様において、本発明の方法の工程ａ１）は以下：
ａ１）工程ａ）の酵素消化により得られる免疫グロブリンの酵素切断フラグメントを、ギ酸及び還元剤を用いて処理すること
である。
【００４８】
この実施態様において、酵素ＩｄｅＳを用いた免疫グロブリンの酵素切断後に得られるＦａｂ２フラグメントを、２つのＦａｂ２フラグメントにおいて、連結ジスルフィド結合の還元によりさらに分離する。一実施態様において、ギ酸は、還元剤の添加と同時に加えられる。別の実施態様において、前記還元剤はＴＣＥＰ溶液である。この実施態様において、ギ酸及びＴＣＥＰ溶液は両方ともインキュベーション前に加えられ、そのため両成分が単一工程の間に存在する。
【００４９】
本発明の方法は、免疫グロブリンを含むサンプルのインキュベーションを含み、それから、グリコシル化パターンを、異なる酵素及び薬剤を用いて決定しなければならない。これらの化合物及び薬剤を使用し、サンプル中に含まれる免疫グロブリンを、定義されたフラグメントに変換する。方法の一実施態様において、ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼＩｄｅＳは、ストレプトコッカス・ピオゲネス又はトレポネーマ・デンティコラから得られるＩｄｅＳである。さらなる好ましい実施態様において、ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼは、アミノ酸配列配列番号１を有する。ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼを用いた酵素切断は、一実施態様において、ｐＨ５．５〜ｐＨ８．５の間のｐＨ範囲において起こる。一実施態様において、酵素切断はｐＨ７．０〜ｐＨ８．０のｐＨ範囲における。また、ＩｇＧ特異的システインプロテアーゼと免疫グロブリン分子のモル比が１：２５〜１：２５００の間、別の実施態様において１：２５〜１：１００にすべきであることが見出された。
【００５０】
本発明の方法の一実施態様において、逆相高速液体クロマトグラフィー又はサイズ排除クロマトグラフィーの溶出液をマススペクトロメーターに直接注入する。
【００５１】
本発明の方法において、免疫グロブリンのＦａｂフラグメントのグリコシル化パターンを決定しなければならない場合、方法は以下の工程：
ａ）酵素ＩｄｅＳを用いた処理により免疫グロブリンを消化すること、
ｂ）工程ａ）の酵素切断された免疫グロブリンを、ギ酸及び還元剤を用いて処理すること、
ｃ）得られる前記免疫グロブリンのフラグメントを、逆相高速液体クロマトグラフィーにより分離すること及び／又は得られるフラグメントをサイズ排除クロマトグラフィーにより脱塩すること、
ｄ）工程ｃ）において得られる免疫グロブリンの分離フラグメントを、マススペクトロメーター中への直接注入によるマススペクトロメトリー分析に供すること、及び
ｅ）免疫グロブリンのグリコシル化パターンを、工程ｄ）において得られるマススペクトロメトリーデータから決定すること
を含む。
【００５２】
本発明の別の局面は、サブクラスＩｇＧ１又はＩｇＧ２又はＩｇＧ４の組換え産生されたヒト又はヒト化免疫グロブリンあるいはサブクラスＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３のマウス免疫グロブリンのグリコシル化パターンの決定のための方法であって、以下の工程：
ａ）組換え産生された免疫グロブリンのサンプルを提供すること、
ｂ）酵素ＩｄｅＳを用いた処理により免疫グロブリンを消化すること、
ｃ）工程ｂ）の酵素切断された免疫グロブリンを、ギ酸及び還元剤を用いて処理すること、
ｄ）得られる前記免疫グロブリンのフラグメントを、逆相高速液体クロマトグラフィーにより分離すること及び／又は得られるフラグメントをサイズ排除クロマトグラフィーにより脱塩すること、
ｅ）工程ｄ）において得られる免疫グロブリンの分離フラグメントを、マススペクトロメーター中への直接注入によるマススペクトロメトリー分析に供すること、及び
ｆ）免疫グロブリンのグリコシル化パターンを、工程ｅ）において得られるマススペクトロメトリーデータから決定すること
を含む。
【００５３】
本発明の別の局面は、サブクラスＩｇＧ１又はＩｇＧ２又はＩｇＧ４のヒト又はヒト化免疫グロブリンあるいはサブクラスＩｇＧ２ａ又はＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３のマウス免疫グロブリンのＦａｂ２フラグメント又はＦａｂフラグメントの産生のための方法であって、以下の工程：
ａ）Ｆａｂ２フラグメント又はＦａｂフラグメントが得られる免疫グロブリンを提供すること、
ｂ）酵素ＩｄｅＳを用いた消化により前記免疫グロブリンを切断すること、
ｃ）Ｆａｂフラグメントが産生される場合、工程ｂ）の酵素切断された前記免疫グロブリンを、ギ酸及び還元剤を用いて処理すること、
ｄ）前記Ｆａｂ２フラグメント又は前記Ｆａｂフラグメントを、プロテインＡクロマトグラフィー又はサイズ排除樹脂を用いたクロマトグラフィーにより産生すること
を含む。
【００５４】
組換え産生された異種免疫グロブリンの精製のために、しばしば、異なるカラムクロマトグラフィー工程の組み合わせが用いられる。一実施態様において、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーの後に、１つ又は２つの追加のクロマトグラフィー分離工程（例、イオン交換クロマトグラフィー工程）が続く。最終の精製工程は、いわゆる「ポリッシング工程」であり、微量の不純物及び混入物（凝集した免疫グロブリン、残留ＨＣＰ（宿主細胞のタンパク質）、ＤＮＡ（宿主細胞の核酸）、ウイルス、及び／又はエンドトキシンなど）の除去のためである。このポリッシング工程のために、しばしば、フロースルー様式の陰イオン交換クロマトグラフィー材料が使用される。
【００５５】
様々な方法が、タンパク質回収及び精製のために、十分に確立され、広範に使用されている。例えば、微生物タンパク質を用いた親和性クロマトグラフィー（例、プロテインＡ又はプロテインＧ親和性クロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例、陽イオン交換（カルボキシメチル樹脂）、陰イオン交換（アミノエチル基樹脂）、及び混合モード交換）、チオフィリック吸着（例、ベータ−メルカプトエタノール及び他のＳＨリガンドを伴う）、疎水的相互作用又は芳香族吸着クロマトグラフィー（例、フェニル基−セファロース、アザ−アレノフィリック樹脂、又はｍ−アミノフェニルボロン酸を伴う）、金属キレート親和性クロマトグラフィー（例、Ｎｉ（ＩＩ）及びＣｕ（ＩＩ）親和性材料を伴う）、サイズ排除クロマトグラフィー、及び電気泳動方法（例えばゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動など）など（Vijayalakshmi, M. A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102）。
【００５６】
一実施態様において、方法は、免疫グロブリンをコードする核酸を含む真核細胞を、異種免疫グロブリンの発現に適した条件下で培養することを含む。「免疫グロブリンの発現に適した状態下で」という用語は、免疫グロブリンを発現する哺乳動物細胞の培養のために使用され、当業者により公知である又は簡単に決定することができる条件を表示する。また、これらの条件が、培養される哺乳動物細胞の型及び発現される免疫グロブリンの型に依存して変動しうることが当業者に公知である。一般的に、哺乳動物細胞を、免疫グロブリンの効果的なタンパク質産生を可能にするための温度（例、２０℃〜４０℃の間）で、十分な期間（例、４〜２８日）にわたり培養する。
【００５７】
本発明の別の局面は、本発明の方法を使用することにより、組換え産生された免疫グロブリンのグリコシル化パターンをモニタリングするための方法である。
【００５８】
本発明のさらなる局面は、以下の工程：
ａ）タンパク質−免疫グロブリン融合タンパク質を、酵素ＩｄｅＳを用いて酵素切断し、それによりタンパク質を産生すること
を含むタンパク質を産生するための方法である。
【００５９】
以下の実施例、配列リスト、及び図を提供し、本発明の理解を助け、その真の範囲が、添付の特許請求の範囲に示される。本発明の精神から逸脱することなく、示した手順に改変を施すことができることが理解される。
【００６０】
配列リストの説明
配列番号１  ストレプトコッカス・ピオゲネスからのＩｄｅＳのアミノ酸配列。
配列番号２  ＣＨ１で始まり、ＣＨ２で終わるマウスＩｇＧ２ａ免疫グロブリン配列。
配列番号３  ＣＨ１で始まり、ＣＨ２で終わるマウスＩｇＧ３免疫グロブリン配列。
配列番号４  ヒトＩｇＧ１定常領域。
配列番号５  ヒトＩｇＧ４定常領域。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】ＩｇＧ１免疫グロブリンのＩｄｅＳ消化の概略図。
【図２】ＳＥＣ及びマススペクトロメーター中への直接注入により分析されたＩｄｅＳ切断ヒトＩｇＧ１のマススペクトル。スペクトルは、グリコシル化Ｆｃフラグメントだけを示す。
【図３】ＳＥＣ及びマススペクトロメーター中への直接注入により分析されたＩｄｅＳ切断ヒトＩｇＧ１のマススペクトル。スペクトルは、グリコシル化Ｆｃフラグメント及びＦａｂ２フラグメントを示す。
【図４】ＩｄｅＳ消化及び還元されたマウスＩｇＧ３免疫グロブリンのクロマトグラム。
【図５】マウスＩｇＧ３免疫グロブリンのヒンジ領域におけるＯグリコシル化を伴う重鎖Ｆａｂフラグメントのズームマススペクトル。
【図６】マウスＩｇＧ３免疫グロブリンのＮグリコシル化を伴う重鎖Ｆｃフラグメントのズームマススペクトル。
【図７】ＬＣ−ＭＳから得られるＯグリコシル化トリプシンペプチド（ＩＰＫＰＳＴＰＰＧＳＳＣＰＰＧＮＩＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫ（ＨＣ＝重鎖、アミノ酸（ａａ）２１７−２４７；Ｓ及びＴ：可能なＯグリコシル化部位）のデコンボリューションマススペクトル。
【図８】ＩｄｅＳ消化ヒト化ＩｇＧ４免疫グロブリンのクロマトグラム。
【図９】ヒト化ＩｇＧ４免疫グロブリンのＮグリコシル化を伴う重鎖Ｆｃフラグメントのズームマススペクトル。
【図１０】ＩｄｅＳ消化ヒト化ＩｇＧ１免疫グロブリンのクロマトグラム。
【図１１】ヒト化ＩｇＧ１免疫グロブリンのＮグリコシル化を伴う重鎖Ｆｃフラグメントのズームマススペクトル。
【図１２】培養の上清及びプロテインＡ精製サンプルから取られたＩｄｅＳ消化ヒト化ＩｇＧ１免疫グロブリンのクロマトグラムのオーバーレイ。
【図１３】培養の上清及びプロテインＡ精製サンプルから取られたＩｄｅＳ消化ヒト化ＩｇＧ１免疫グロブリンのマススペクトルのオーバーレイ（保持時間：１６．８分）。
【図１４】培養の上清及びプロテインＡ精製サンプルから取られたＩｄｅＳ消化ヒト化ＩｇＧ１免疫グロブリンのマススペクトルのズームオーバーレイ（保持時間：１６．８分）。
【図１５】完全な免疫グロブリン、Ｆａｂ２フラグメント、及びスタンダードの分析サイズ排除クロマトグラムオーバーレイ。
【００６２】
実施例１
抗体濃度の決定：
抗体濃度を、タイプUVIKON XL（Goebel Company）の分光光度計で、２８０nmでの吸収測定を用いて決定した。使用された抗体の消衰係数は１．５５ml/(mg*cm)であり、Pace, C. N., et al.（Protein Sci. 4 (1995) 2411-2423）の方法に従って算出した。
【００６３】
実施例２
一般的な方法Ａ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ３用）
Ｆｃフラグメントにおけるグリコシル化パターンの分析のためのＩｄｅＳ消化：
１００μg（０．６６nmol）の免疫グロブリンを、５０mM  ＴＲＩＳ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中で最終濃度１mg/mlに希釈し、２μl（ｃ＝１mg/ml、０．０６nmol）の免疫グロブリン分解酵素（ＩｄｅＳ、ＭＷ  ３４５８９０Da）を加えて、酵素に免疫グロブリンの重量比１：５０を与える。溶液を、使用された免疫グロブリンに依存し、２〜５時間にわたり３７℃でインキュベートする。サイズ排除クロマトグラフィー及びマススペクトロメーター中への直接注入を用いた分析のために、酵素活性を、溶液への等容積の１%ギ酸の添加により停止させる。
【００６４】
Ｆａｂフラグメントにおけるグリコシル化パターンの追加分析のためのＩｄｅＳ消化免疫グロブリンの還元：
還元のために、サンプルの半分を、６４μlの１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて希釈し、最終容積１１５μlを与える。次に、６０μlの０．５M  ＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）−ホスフィン、Pierce）（４Ｍ塩酸グアニジンの容積中に溶解）及び５０mlの８M塩酸グアニジンを加える。その後、サンプルを３０分間にわたり３７℃でインキュベートする。反応を、５μlの２０%（ｖ／ｖ）ギ酸の添加により停止する。
【００６５】
実施例３
一般的な方法Ｂ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４用）
組み合わせたＩｄｅＳ及びＣｐＢ消化：
１００μg（０．６６nmol）の免疫グロブリンを、５０mM  ＴＲＩＳ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中で最終濃度１mg/mlに希釈し、２μl（ｃ＝１mg/ml、０．０６nmol）の免疫グロブリン分解酵素（ＩｄｅＳ、ＭＷ  ３４５８９０Da）を加えて、酵素に免疫グロブリンの重量比１：５０を与える。溶液を、使用された免疫グロブリンに依存し、２〜５時間にわたり３７℃でインキュベートする。１μl（１mg/ml）のカルボキシペプチダーゼＢ（ＣｐＢ、Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）を、ＩｄｅＳインキュベーション時間終了の３０分前に溶液に加え、酵素と免疫グロブリンの重量比１：２５を与える。
【００６６】
実施例４
一般的な方法Ｃ（複雑なグリコシル化パターンを伴うＩｇＧ用）
組み合わせたＩｄｅＳ及びＥｎｄｏＨ消化：
２５μg（０．１７nmol）の免疫グロブリンを、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で最終濃度０．５mg/mlに希釈し、２．５μl（ｃ＝２．５U／５００μl）のエンドペプチダーゼＨ（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）を加えて、１８時間にわたり３７℃でインキュベートし、オリゴ糖構造を切断する。続いて、ｐＨを、２５μlの０．１Ｍ  ＴＲＩＳ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）を加えることにより８．０に調整する。切断は、０．５μl（ｃ＝１mg/ml、０．０２nmol）の免疫グロブリン分解酵素（ＩｄｅＳ、ＭＷ  ３４５８９０Da）の添加及び２時間にわたる３７℃でのインキュベーションにより達成する。
【００６７】
実施例５
一般的な方法Ｄ（培養上清用）
組み合わせたＩｄｅＳ及びＣｐＢ消化：
５０μg（０．３３nmol）の免疫グロブリン発現真核細胞の培養での培養上清を、３分間にわたり１０，８００rcf（相対遠心力）で遠心し、５０mM  ＴＲＩＳ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中で最終濃度０．７mg/mlに希釈する。１μl（ｃ＝１mg/ml、０．０６nmol）の免疫グロブリン分解酵素（ＩｄｅＳ、ＭＷ  ３４５８９０Da）を加えて、酵素と免疫グロブリンの重量比１：５０を与える。溶液を、使用された免疫グロブリンに依存し、２〜５時間にわたり３７℃でインキュベートする。１μl（１mg/ml）のカルボキシペプチダーゼＢ（ＣｐＢ、Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany）を、ＩｄｅＳインキュベーション時間終了の３０分前に溶液に加え、酵素と免疫グロブリンの重量比１：２５を与える。
【００６８】
実施例６
ＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳ方法
ＬＣ−ＭＳを、QTOF II（Micromass/Waters）に連結したAgilent Cap LC1100で実施する。クロマトグラフィー分離を、Phenomenex Jupiter C18カラム（５μm粒径、３００A口径、１×２５０mmカラム）で実施する。溶出液Ａは０．５%ギ酸である。溶出液Ｂは、７０%イソプロパノール、２０%アセトニトリル、９．５%水、及び０．５%ギ酸である。流速は４０μl/分である。分離を７５℃で実施する。実施例２〜５の１つの方法を用いて得られる２μg（１０μl）の免疫グロブリンを、カラム上に注射する。以下の勾配を適用する：
【００６９】
【表１】
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【００７０】
最初の７分間に、溶離液を廃物に向け、マススペクトロメーターイオン供給源を塩汚染から予防する。２８０nm（参照３６０nm）でのＵＶシグナルが記録される。ＭＳスペクトルが、キャピラリー電圧２，７００V、コーン電圧３０Vを使用して、質量範囲６００〜２０００m/zにおいて、陽イオンモード中で、脱溶媒和温度１２０℃及びソース温度８０℃を使用して得られる。ＭＳデータが７〜５０分に得られる。
【００７１】
実施例７
直接注入によるＩｄｅＳ切断抗体の糖分析
サイズ排除クロマトグラフィー：
実施例２〜５の１つの方法を用いて得られる４５μg（９０μl）のＩｄｅＳ切断免疫グロブリンを、２%ギ酸、４０%アセトニトリルを用いて平衡化したSephadex G25セルフパックECO SRカラム（５×２５０mm）（KronLab）上に流速０．５ml/分で３０分間にわたり注射する。タンパク質を、２%ギ酸、４０%アセトニトリルを用いた流速１ml/分での８分間のイソクラティック溶出を使用して脱塩する。脱塩タンパク質の溶出をＵＶ（２８０nm）により記録する。サンプルを、分画コレクターを介して、マイクロタイタープレート中に回収する。マイクロタイタープレートをTriversaNanoMate（Advion）システム中に挿入することができる。ＭＳスペクトルを自動的に記録する。又は、サンプルを金属コートガラスニードル（Proxeon Biosystems Nano ESI-needles, cat# ES387）中に手動でピペッティングし、マススペクトロメーター中にスプレーすることができる。
【００７２】
QTOF II機器（Micromass/Waters）での直接注入についてのＭＳパラメーター：
ＭＳスペクトルが、キャピラリー電圧８００V、コーン電圧３３Vを使用して、質量範囲６００〜２０００m/z（グリコシル化Ｆｃフラグメント）において、陽イオンモード中で、脱溶媒和温度１２０℃及びソース温度８０℃を使用して得られる。ＭＳデータが約２分にわたり得られる。
【００７３】
実施例８
マウスＩｇＧ３免疫グロブリンの糖分析
本発明の方法が、この実施例に例示されており、マウスＩｇＧ３免疫グロブリンを伴う。この免疫グロブリンは２つのグリコシル化部位（１つがＦａｂフラグメント中及び１つがＦｃフラグメント中）を有する。
【００７４】
ＩｄｅＳ消化及び還元マウスＩｇＧ３免疫グロブリンのクロマトグラムを図４に示す。ヒンジ領域中のＯグリコシル化を伴う重鎖Ｆａｂフラグメントのマススペクトルのズームを図５に示すのに対し、Ｎグリコシル化部位を伴う重鎖Ｆｃフラグメントのマススペクトルのズームを図６に示す。図７には、Ｏグリコシル化トリプシンペプチドのデコンボリューションマススペクトルが、グリコシル化パターンを伴い示される。
【００７５】
実施例９
ヒト化ＩｇＧ４免疫グロブリンの糖分析
本発明の方法が、この実施例において例示されており、ヒト化免疫グロブリンがヒトＩｇＧ４免疫グロブリン定常領域を含む。この免疫グロブリンは、Ｆｃフラグメント中に１つのＮグリコシル化部位を有する。
【００７６】
ＩｄｅＳ消化ヒト化ＩｇＧ４免疫グロブリンのクロマトグラムを図８に示す。Ｎグリコシル化部位を伴う重鎖Ｆｃフラグメントのマススペクトルのズームを図９に示す。
【００７７】
実施例１０
ヒト化ＩｇＧ１免疫グロブリンの糖分析
本発明の方法が、この実施例において例示されており、ヒト化免疫グロブリンがヒトＩｇＧ１免疫グロブリン定常領域を含む。この免疫グロブリンは、Ｆｃフラグメント中に１つのＮグリコシル化部位を有する。
【００７８】
ＩｄｅＳ消化ヒト化ＩｇＧ１免疫グロブリンのクロマトグラムを図１０に示す。Ｎグリコシル化部位を伴う重鎖Ｆｃフラグメントのマススペクトルのズームを図１１に示す。
【００７９】
実施例１１
培養上清からのヒト化ＩｇＧ１免疫グロブリンの糖分析
本発明の方法が、この実施例において例示されており、ヒト化免疫グロブリンがヒトＩｇＧ１免疫グロブリン定常領域を含み、それにより分析のためのサンプルが、さらなる精製なしに培養の培養上清から直接的に得られた。この免疫グロブリンは、Ｆｃフラグメント中に１つのＮグリコシル化部位を有する。この実施例は、真核細胞の培養の間にグリコシル化をモニタリングするためのオンラインツールとして本発明の方法を使用することが可能であることを示す。
【００８０】
培養上清からのＩｄｅＳ消化サンプルのクロマトグラムを、プロテインＡクロマトグラフィーを用いて精製されたサンプルと比較し、図１２に示す。重鎖Ｆｃフラグメントがクロマトグラムの同じ点で溶出されることを見ることができる。プロテインＡ精製サンプルのクロマトグラムは、免疫グロブリンの軽鎖を含まない。なぜなら、軽鎖は、プロテインＡクロマトグラフィーの間に除去されるからである。
【００８１】
実施例１２
ヒト化ＩｇＧ１のＦａｂ２フラグメントの産生
１０mgの免疫グロブリンを、５０mM  ＴＲＩＳ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）中で最終濃度１mg/mlに希釈し、１８μl（ｃ＝１１．３mg/ml）の免疫グロブリン分解酵素（ＩｄｅＳ、ＭＷ  ３４５８９０Da）を加えて、酵素に免疫グロブリンの重量比１：５０を与える。溶液を、０．５〜２時間にわたり３７℃で撹拌しながらインキュベートする。ＩｄｅＳを用いたインキュベーションの直後、プロテインＡカラムクロマトグラフィーを、プロテインＡＨＰハイトラップカラムを使用して実施した。緩衝液Ａはリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）であった。緩衝液Ｂは、流速１ml/分を伴う１００mMのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．８）であった。Ｆａｂ２フラグメントがカラムのフロースルーから得られるのに対し、Ｆｃフラグメントは緩衝液Ｂを用いた溶出により得られる。得られる分画は、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定された場合、純度８４%〜９５%を有する。Superdex75HighLoad16/60カラム（容積１２０ml）を用いたサイズ排除クロマトグラフィーを使用したさらなる精製工程を実施することができる。緩衝液として、２０mMのリン酸ナトリウム緩衝液（１４０mMの塩化ナトリウムを伴う）（ｐＨ６．０）を流速１ml/分で使用した。図１５から見られる通り、本来の完全抗体が、そのＦａｂ２フラグメントに変換されている。
【図２】
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【図５】
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【図９】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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