(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型ラルストニア ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）のポリヒドロキシアルカノエート（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ：ＰＨＡ）生合成遺伝子オペロンが除去され、ラクテートをラクチル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子及びラクチル−ＣｏＡを基質として使用するＰＨＡ合成酵素遺伝子が導入されたヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体生成能を有する組換えラルストニア ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）であって、上記ラクテートをラクチル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子は、プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ｐｃｔ）遺伝子であり、上記ラクチル−ＣｏＡを基質として使用するＰＨＡ合成酵素遺伝子は、シュードモナス属６−１９（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．６−１９）に由来する、組換えラルストニア ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）。
【請求項２】
上記ｐｃｔ遺伝子は、クロストリジウム プロピオニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）由来のｐｃｔ遺伝子であることを特徴とする請求項１に記載の組換えラルストニア ユートロファ。
【請求項３】
上記ｐｃｔ遺伝子は、
配列番号１の核酸配列（ｃｐ−ｐｃｔ）；
配列番号１の核酸配列でＡ１２００Ｇの変異を有する核酸配列（ｃｐｐｃｔ５１２）；
配列番号１の核酸配列でＴ７８Ｃ、Ｔ６６９Ｃ、Ａ１１２５Ｇ及びＴ１１５８Ｃの変異を有する核酸配列（ｃｐｐｃｔ５２２）；
配列番号１の核酸配列でＡ１２００Ｇの変異を有し、配列番号１の核酸配列に対応するアミノ酸配列でＧｌｙ３３５Ａｓｐの変異を有する核酸配列（ｃｐｐｃｔ５３１）；
配列番号１の核酸配列でＡ１２００Ｇの変異を有し、配列番号１の核酸配列に対応するアミノ酸配列でＡｌａ２４３Ｔｈｒの変異を有する核酸配列（ｃｐｐｃｔ５３２）；
配列番号１の核酸配列でＴ６６９Ｃ、Ａ１１２５Ｇ及びＴ１１５８Ｃの変異を有し、配列番号１の核酸配列に対応するアミノ酸配列でＡｓｐ６５Ｇｌｙの変異を有する核酸配列（ｃｐｐｃｔ５３３）；
配列番号１の核酸配列でＡ１２００Ｇの変異を有し、配列番号１の核酸配列に対応するアミノ酸配列でＡｓｐ２５７Ａｓｎの変異を有する核酸配列（ｃｐｐｃｔ５３４）；
配列番号１の核酸配列でＴ６６９Ｃ、Ａ１１２５Ｇ及びＴ１１５８Ｃの変異を有し、配列番号１の核酸配列に対応するアミノ酸配列でＡｓｐ６５Ａｓｎの変異を有する核酸配列（ｃｐｐｃｔ５３５）；
配列番号１の核酸配列でＴ６６９Ｃ、Ａ１１２５Ｇ及びＴ１１５８Ｃの変異を有し、配列番号１の核酸配列に対応するアミノ酸配列でＴｈｒ１９９Ｉｌｅの変異を有する核酸配列（ｃｐｐｃｔ５３７）；並びに
配列番号１の核酸配列でＴ７８Ｃ、Ｔ６６９Ｃ、Ａ１１２５Ｇ及びＴ１１５８Ｃの変異を有し、配列番号１の核酸配列に対応するアミノ酸配列でＶａｌ１９３Ａｌａの変異を有する核酸配列（ｃｐｐｃｔ５４０）
よりなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項１に記載の組換えラルストニア ユートロファ。
【請求項４】
上記ｐｃｔ遺伝子は、配列番号１の核酸配列でＴ７８Ｃ、Ｔ６６９Ｃ、Ａ１１２５Ｇ及びＴ１１５８Ｃの変異を有し、配列番号１の核酸配列に対応するアミノ酸配列でＶａｌ１９３Ａｌａの変異を有する核酸配列（ｃｐｐｃｔ５４０）を有するものであることを特徴とする請求項３に記載の組換えラルストニア ユートロファ。
【請求項５】
上記ラクチル−ＣｏＡを基質として使用するＰＨＡ合成酵素の遺伝子は、
配列番号２のアミノ酸配列でＥ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｌ４１２Ｍ、Ｓ４７７Ｒ、Ｓ４７７Ｈ、Ｓ４７７Ｆ、Ｓ４７７Ｙ、Ｓ４７７Ｇ、Ｑ４８１Ｍ、Ｑ４８１Ｋ及びＱ４８１Ｒよりなる群から選択される１つ以上の変異を含むアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するものであることを特徴とする請求項１に記載の組換えラルストニア ユートロファ。
【請求項６】
上記ラクチル−ＣｏＡを基質として使用するＰＨＡ合成酵素の遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列でＥ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｌ４１２Ｍ、Ｓ４７７Ｇ及びＱ４８１Ｍの変異を有するアミノ酸配列（Ｃ１３３５）；
配列番号２のアミノ酸配列でＥ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｋの変異を有するアミノ酸配列（Ｃ１３１０）；並びに
配列番号２のアミノ酸配列でＥ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｒの変異を有するアミノ酸配列（Ｃ１３１２）
よりなる群から選択されたいずれか１つのアミノ酸配列に対応する核酸配列を有するものであることを特徴とする請求項５に記載の組換えラルストニア ユートロファ。
【請求項７】
上記組換えラルストニア ユートロファが３ＨＢ−ＣｏＡ生成酵素をコーディングする遺伝子をさらに含むものであることを特徴とする請求項１に記載の組換えラルストニア ユートロファ。
【請求項８】
上記３ＨＢ−ＣｏＡ生成酵素をコーディングする遺伝子は、ケトチオラーゼ遺伝子及びアセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ遺伝子であることを特徴とする請求項７に記載の組換えラルストニア ユートロファ。
【請求項９】
上記ケトチオラーゼ遺伝子及びアセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ遺伝子は、ラルストニア ユートロファから由来したものであることを特徴とする請求項８に記載の組換えラルストニア ユートロファ。
【請求項１０】
上記組換えラルストニア ユートロファがＭＣＬのヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体生成能を有するものであることを特徴とする請求項１に記載の組換えラルストニア ユートロファ。
【請求項１１】
上記組換えラルストニア ユートロファがＰｈａＧ遺伝子をさらに含むものであることを特徴とする請求項１に記載の組換えラルストニア ユートロファ。
【請求項１２】
上記ＰｈａＧ遺伝子は、シュードモナス  プチダ(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ．ｐｕｔｉｄａ)  ＫＴ２４４０由来のＰｈａＧ遺伝子であることを特徴とする請求項１１に記載の組換えラルストニア ユートロファ。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかの記載の組換えラルストニア ユートロファを炭素源及びラクテート；または炭素源、ラクテート及びヒドロキシアルカノエートを含む培地で培養し；
上記組換えラルストニア ユートロファからヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体を回収することを含む
ヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体の製造方法。
【請求項１４】
上記ヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体中のヒドロキシアルカノエートは、３−ヒドロキシ酪酸（3-hydroxybutyrate）、３−ヒドロキシ吉草酸（3-hydroxyvalerate）、４−ヒドロキシ酪酸（4-hydroxybutyrate）、炭素数が６〜１４個の中間鎖長さの（Ｄ）−３−ヒドロキシカルボン酸（(D)-3-hydroxycarboxylic acid）、２−ヒドロキシプロピオン酸（2-hydroxypropionic acid）、３−ヒドロキシプロピオン酸（3-hydroxypropionic acid）、３−ヒドロキシヘキサン酸（3-hydroxyhexanoic acid）、３−ヒドロキシヘプタン酸（3-hydroxyheptanoic acid）、３−ヒドロキシオクタン酸（3-hydroxyoctanoic acid）、３−ヒドロキシノナン酸（3-hydroxynonanoic acid）、３−ヒドロキシデカン酸（3-hydroxydecanoic acid）、３−ヒドロキシウンデカン酸（3-hydroxyundecanoic acid）、３−ヒドロキシドデカン酸（3-hydroxydodecanoic acid）、３−ヒドロキシテトラデカン酸（3-hydroxytetradecanoic acid）、３−ヒドロキシヘキサデカン酸（3-hydroxyhexadecanoic acid）、４−ヒドロキシ吉草酸（4-hydroxyvaleric acid）、４−ヒドロキシヘキサン酸（4-hydroxyhexanoic acid）、４−ヒドロキシヘプタン酸（4-hydroxyheptanoic acid）、４−ヒドロキシオクタン酸（4-hydroxyoctanoic acid）、４−ヒドロキシデカン酸（4-hydroxydecanoic acid）、５−ヒドロキシ吉草酸（5-hydroxyvaleric acid）、５−ヒドロキシヘキサン酸（5-hydroxyhexanoic acid）、６−ヒドロキシドデカン酸（6-hydroxydodecanoic acid）、３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸（3-hydroxy-pentenoic acid）、３−ヒドロキシ−４−ｔｒａｎｓ−ヘキセン酸（3-hydroxy-4-trans-hexenoic acid）、３−ヒドロキシ−４−ｃｉｓ−ヘキセン酸（3-hydroxy-4-cis-hexenoic acid）、３−ヒドロキシ−５−ヘキセン酸（3-hydroxy-5-hexenoic acid）、３−ヒドロキシ−６−ｔｒａｎｓ−オクテン酸（3-hydroxy-6-trans-octenoic acid）、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−オクテン酸（3-hydroxy-6-cis-octenoic acid）、３−ヒドロキシ−７−オクテン酸（3-hydroxy-7-octenoic acid）、３−ヒドロキシ−８−ノネン酸（3-hydroxy-8-nonenoic acid）、３−ヒドロキシ−９−デセン酸（3-hydroxy-9-decenoic acid）、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−ドデセン酸（3-hydroxy-5-cis-dodecenoic acid）、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−ドデセン酸（3-hydroxy-6-cis dodecenoic acid）、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸（3-hydroxy-5-cis tetradecenoic acid）、３−ヒドロキシ−７−ｃｉｓ−テトラデセン酸（3-hydroxy-7-cis tetradecenoic acid）、３−ヒドロキシ−５、８−ｃｉｓ−ｃｉｓ−テトラデセン酸（3-hydroxy-5、8-cis-cis tetradecenoic acid）、３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸（3-hydroxy-4-methylvaleric acid）、３−ヒドロキシ−４−メチルヘキサン酸（3-hydroxy-4-methylhexanoic acid）、３−ヒドロキシ−５−メチルヘキサン酸（3-hydroxy-5-methylhexanoic acid）、３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸（3-hydroxy-6-methylheptanoic acid）、３−ヒドロキシ−４−メチルオクタン酸（3-hydroxy-4-methyloctanoic acid）、３−ヒドロキシ−５−メチルオクタン酸（3-hydroxy-5-methyloctanoic acid）、３−ヒドロキシ−６−メチルオクタン酸（3-hydroxy-6-methyloctanoic acid）、３−ヒドロキシ−７−メチルオクタン酸（3-hydroxy-7-methyloctanoic acid）、３−ヒドロキシ−６−メチルノナン酸（3-hydroxy-6-methylnonanoic acid）、３−ヒドロキシ−７−メチルノナン酸（3-hydroxy-7-methylnonanoic acid）、３−ヒドロキシ−８−メチルノナン酸（3-hydroxy-8-methylnonanoic acid）、３−ヒドロキシ−７−メチルデカン���（3-hydroxy-7-methyldecanoic acid）、３−ヒドロキシ−９−メチルデカン酸（3-hydroxy-9-methyldecanoic acid）、３−ヒドロキシ−７−メチル−６−オクテン酸（3-hydroxy-7-methyl-6-octenoic acid）、リンゴ酸（malic acid）、３−ヒドロキシコハク酸−メチルエステル（3-hydroxysuccinic acid-methyl ester）、３−ヒドロキシアジピン酸−メチルエステル（3-hydroxyadipinic acid-methyl ester）、３−ヒドロキシスベリン酸−メチルエステル（3-hydroxysuberic acid-methyl ester）、３−ヒドロキシアゼライン酸−メチルエステル（3-hydroxyazelaic acid-methyl ester）、３−ヒドロキシセバシン酸−メチルエステル（3-hydroxysebacic acid-methyl ester）、３−ヒドロキシスベリン酸−エチルエステル（3-hydroxysuberic acid-ethyl ester）、３−ヒドロキシセバシン酸−エチルエステル（3-hydroxysebacic acid-ethyl ester）、３−ヒドロキシピメリン酸−プロピルエステル（3-hydroxypimelic acid-propyl ester）、３−ヒドロキシセバシン酸−ベンジルエステル（3-hydroxysebacic acid-benzil ester）、３−ヒドロキシ−８−アセトキシオクタン酸（3-hydroxy-8-acetoxyoctanoic acid）、３−ヒドロキシ−９−アセトキシノナン酸（3-hydroxy-9-acetoxynonanoic acid）、フェノキシ−３−ヒドロキシ酪酸（phenoxy-3-hydroxybutyric acid）、フェノキシ−３−ヒドロキシ吉草酸（phenoxy-3-hydroxyvaleric acid）、フェノキシ−３−ヒドロキシヘプタン酸（phenoxy-3-hydroxyheptanoic acid）、フェノキシ−３−ヒドロキシオクタン酸（phenoxy-3-hydroxyoctanoic acid）、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシ酪酸（para-cyanophenoxy-3-hydroxybutyric acid）、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシ吉草酸（para-cyanophenoxy-3-hydroxyvaleric acid）、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸（para-cyanophenoxy-3-hydroxyhexanoic acid）、ｐａｒａ−ニトロフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸（para-nitrophenoxy-3-hydroxyhexanoic acid）、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸（3-hydroxy-5-phenylvaleric acid）、３−ヒドロキシ−５−シクロヘキシル酪酸（3-hydroxy-5-cyclohexylbutyric acid）、３、１２−ジヒドロキシドデカン酸（3、12-dihydroxydodecanoic acid）、３、８−ジヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸（3、8-dihydroxy-5-cis-tetradecenoic acid）、３−ヒドロキシ−４、５−エポキシデカン酸（3-hydroxy-4、5-epoxydecanoic acid）、３−ヒドロキシ−６、７−エポキシドデカン酸（3-hydroxy-6、7-epoxydodecanoic acid）、３−ヒドロキシ−８、９−エポキシ−５、６−ｃｉｓ−テトラデカン酸（3-hydroxy-8、9-epoxy-5、6-cis-tetradecanoic acid）、７−シアノ−３−ヒドロキシヘプタン酸（7-cyano-3-hydroxyheptanoic acid）、９−シアノ−３−ヒドロキシノナン酸（9-cyano-3-hydroxynonanoic acid）、３−ヒドロキシ−７−フルオロヘプタン酸（3-hydroxy-7-fluoroheptanoic acid）、３−ヒドロキシ−９−フルオロノナン酸（3-hydroxy-9-fluorononanoic acid）、３−ヒドロキシ−６−クロロヘキサン酸（3-hydroxy-6-chlorohexanoic acid）、３−ヒドロキシ−８−クロロオクタン酸（3-hydroxy-8-chlorooctanoic acid）、３−ヒドロキシ−６−ブロモヘキサン酸（3-hydroxy-6-bromohexanoic acid）、３−ヒドロキシ−８−ブロモオクタン酸（3-hydroxy-8-bromooctanoic acid）、３−ヒドロキシ−１１−ブロモウンデカン酸（3-hydroxy-11-bromoundecanoic acid）、３−ヒドロキシ−２−ブテン酸（3-hydroxy-2-butenoic acid）、６−ヒドロキシ−３−ドデセン酸（6-hydroxy-3-dodecenoic acid）、３−ヒドロキシ−２−メチル酪酸（3-hydroxy-2-methylbutyric acid）、３−ヒドロキシ−２−メチル吉草酸（3-hydroxy-2-methylvaleric acid）、及び３−ヒドロキシ−２、６−ジメチル−５−ヘプテン酸（3-hydroxy-2、6-heptenoic acid）よりなる群から選択される１つ以上であることを特徴とする請求項１３に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体生成能を有する組換えラルストニア ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）及びこれを利用してポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリラクテート（ＰＬＡ）は、ラクテートから由来した代表的な生分解性高分子であって、汎用高分子あるいは医療用高分子としての応用性が高い高分子である。現在ＰＬＡは、微生物発酵によって生産されたラクテートを重合して製造されているが、ラクテートの直接重合によっては、低い分子量（１０００〜５０００ダルトン）のＰＬＡだけが生成される。１００，０００ダルトン以上のＰＬＡを合成するためには、ラクテートの直接重合により得られた低い分子量のＰＬＡから連鎖カップリング剤を利用してさらに分子量が大きいＰＬＡに重合する方法があるが、有機溶剤や連鎖カップリング剤の添加によって工程が複雑になり、また、これらを除去することが容易ではないという短所がある。現在商用化されている高分子量ＰＬＡ生産工程は、ラクテートをラクチドに転換した後、ラクチドリングの開環縮合反応を通じてＰＬＡを合成する方法が使用されている。
【０００３】
化学合成を通じてラクテートを利用してＰＬＡを合成する場合、ＰＬＡホモポリマーは、容易に収得することができるが、多様なモノマー組成を有するＰＬＡ共重合体の合成は難しくて、商業的に効用性が非常に低下しているという短所がある。
【０００４】
一方、ポリヒドロキシアルカノエート（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｓｔｅ；ＰＨＡ）は、過度な炭素源が存在しながら、リン、窒素、マグネシウム、酸素などの他の営養分が足りない時、微生物がエネルギーや炭素源貯蔵物質としてその内部に蓄積するポリエステルである。ＰＨＡは、既存の石油から由来した合成高分子と類似な物性を有し、且つ完全な生分解性を示すので、既存の合成プラスチックを代替する物質として認識されている。
【０００５】
微生物からＰＨＡを生産するためには、微生物の代謝産物をＰＨＡモノマーに転換する酵素とＰＨＡモノマーを利用してＰＨＡ高分子を合成するＰＨＡ合成酵素が必須である。微生物を利用してＰＬＡ及びＬＡ共重合体を合成する時にも、同一のシステムが必要であり、元々のＰＨＡ合成酵素の基質であるヒドロキシアシル−ＣｏＡ（ｈｙｄｒｏｘｙａｃｙｌ−ＣｏＡ）を提供することができる酵素以外に追加にラクチル−ＣｏＡ（ラクチル−ＣｏＡ）を提供することができる酵素が必要である。
【０００６】
さらに、生分解性高分子の経済的な生産のためには、効率的にセル内にＰＬＡ及びＰＬＡ共重合体を蓄積させることが非常に重要であり、特に高濃度培養を通じて高濃度のＰＬＡ及びＰＬＡ共重合体を生産することが重要である。したがって、この条件に符合する効率的な組換え微生物を製造することができる技術が必要な実情である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】大韓民国特許出願第１０−２００６−０１１６２３４号
【特許文献２】大韓民国特許出願１０−２００７−００８１８５５号
【特許文献３】大韓民国特許出願１０−２００８−００６８６０７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明は、高濃度のポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体を生産することができる新しい組換え微生物及びこれを利用したポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体を製造する方法を提供することを目的にする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を達成するために、本発明は、高濃度のポリラクテート重合体またはポリラクテート共重合体を生産することができる組換えラルストニア ユートロファ及びこれを利用したポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体を製造する方法を提供する。
【００１０】
本発明者らは、ラクチル−ＣｏＡを提供するためのクロストリジウム プロピオニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ及びこれにより作られたラクチル−ＣｏＡを基質として利用するシュードモナス属６−１９（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．６−１９）のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素の変異体を使用して成功的にポリラクテート重合体及び共重合体を合成することができた（大韓民国特許出願第１０−２００６−０１１６２３４号）。
【００１１】
さらに、本発明者らは、生分解性高分子の経済的な生産のためにポリラクテート重合体を効率的に生産することができる組換えラルストニア ユートロファを製作しようとした。このために、本発明者らは、まず、ＰＨＡ生産能を消失した組換えラルストニア ユートロファを製作し、この組換えラルストニア ユートロファをクロストリジウム プロピオニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼとシュードモナス属６−１９（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．６−１９）のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を発現するプラスミドに形質転換するか、またはクロストリジウム プロピオニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼを発現する遺伝子とシュードモナス属６−１９（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．６−１９）のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素を発現する遺伝子をＰＨＡ生産能を消失した組換えラルストニア ユートロファに導入することによって、形質転換された組換えラルストニア ユートロファを製造し、このように製造された組換えラルストニア ユートロファを利用してグルコースからポリラクテート重合体及びポリラクテート共重合体を効率的に製造することができることを確認し、本発明を完成するに至った。
【発明の効果】
【００１２】
本発明は、ポリラクテート重合体またはポリラクテート共重合体を効率的に製造することができる組換えラルストニア ユートロファを提供し、このような組換えラルストニア ユートロファを培養することを特徴とするポリラクテート重合体または共重合体の製造方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明のシュードモナス属６−１９由来ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素変異体遺伝子とクロストリジウム プロピオニカム由来プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ変異体遺伝子及びラルストニア ユートロファ由来ｐｈａＡＢ遺伝子を含む組換え発現ベクターを製作する過程を図式化したものである。
【図２】本発明のシュードモナス属６−１９由来ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素変異体遺伝子とクロストリジウム プロピオニカム由来プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ変異体遺伝子及びラルストニア ユートロファ由来ｐｈａＡＢ遺伝子を含む組換え発現ベクターを製作する過程を図式化したものである。
【図３】組換えラルストニア ユートロファ製作のために大腸菌Ｓ１７−１とラルストニア ユートロファの交配及びラルストニア ユートロファクロモソーム内のターゲット遺伝子の挿入過程を図式化したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、野生型ラルストニア ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）のポリヒドロキシアルカノエート（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ：ＰＨＡ）生合成遺伝子オペロンが除去され、外来のラクテートをラクチル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子及びラクチル−ＣｏＡを基質として使用するＰＨＡ合成酵素の遺伝子が導入されたポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体生成能を有する組換えラルストニア ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）を提供する。
【００１５】
本発明において、上記ラクテートをラクチル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子は、プロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ｐｃｔ）遺伝子であることができる。
本発明の一具体例において、上記ｐｃｔ遺伝子は、クロストリジウム プロピオニカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）由来のｐｃｔ遺伝子であることができる。
【００１６】
本発明において、上記ｐｃｔ遺伝子は、実質的に同等であるか、または優れたラクチル−ＣｏＡ生成活性を有するプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼをコーディングするその変異体を含む。
【００１７】
本発明の一具体例において、上記ｐｃｔ遺伝子は、これに限定されるものではないが、
配列番号１の核酸配列（ｃｐ−ｐｃｔ）；
配列番号１の核酸配列でＡ１２００Ｇが変異された核酸配列（ｃｐｐｃｔ５１２）；
配列番号１の核酸配列でＴ７８Ｃ、Ｔ６６９Ｃ、Ａ１１２５Ｇ及びＴ１１５８Ｃが変異された核酸配列（ｃｐｐｃｔ５２２）；
配列番号１の核酸配列でＡ１２００Ｇが変異され、配列番号１の核酸配列に対応するアミノ酸配列でＧｌｙ３３５Ａｓｐが変異された核酸配列（ｃｐｐｃｔ５３１）；
配列番号１の核酸配列でＡ１２００Ｇが変異され、配列番号１の核酸配列に対応するアミノ酸配列でＡｌａ２４３Ｔｈｒが変異された核酸配列（ｃｐｐｃｔ５３２）；
配列番号１の核酸配列でＴ６６９Ｃ、Ａ１１２５Ｇ及びＴ１１５８Ｃが変異され、配列番号１の核酸配列に対応するアミノ酸配列でＡｓｐ６５Ｇｌｙが変異された核酸配列（ｃｐｐｃｔ５３３）；
配列番号１の核酸配列でＡ１２００Ｇが変異され、配列番号１の核酸配列に対応するアミノ酸配列でＡｓｐ２５７Ａｓｎが変異された核酸配列（ｃｐｐｃｔ５３４）；
配列番号１の核酸配列でＴ６６９Ｃ、Ａ１１２５Ｇ及びＴ１１５８Ｃが変異され、配列番号１の核酸配列に対応するアミノ酸配列でＡｓｐ６５Ａｓｎが変異された核酸配列（ｃｐｐｃｔ５３５）；
配列番号１の核酸配列でＴ６６９Ｃ、Ａ１１２５Ｇ及びＴ１１５８Ｃが変異され、配列番号１の核酸配列に対応するアミノ酸配列でＴｈｒ１９９Ｉｌｅが変異された核酸配列（ｃｐｐｃｔ５３７）；及び
配列番号１の核酸配列でＴ７８Ｃ、Ｔ６６９Ｃ、Ａ１１２５Ｇ及びＴ１１５８Ｃが変異され、配列番号１の核酸配列に対応するアミノ酸配列でＶａｌ１９３Ａｌａが変異された核酸配列（ｃｐｐｃｔ５４０）よりなる群から選択された塩基配列を有するものであることができる。上記ｐｃｔ遺伝子変異体は、大韓民国特許出願１０−２００７−００８１８５５号に開示された方法によって製造されることができる。本発明の好ましい具体例において、上記ｐｃｔ遺伝子は、配列番号１の核酸配列でＴ７８Ｃ、Ｔ６６９Ｃ、Ａ１１２５Ｇ及びＴ１１５８Ｃが変異され、配列番号１の核酸配列に対応するアミノ酸配列でＶａｌ１９３Ａｌａが変異された核酸配列（ｃｐｐｃｔ５４０）を有するものであることができる。
【００１８】
一方、本発明において、上記ラクチル−ＣｏＡを基質として使用するＰＨＡ合成酵素の遺伝子は、シュードモナス属６−１９（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．６−１９）のＰＨＡ合成酵素遺伝子であることができる。
【００１９】
本発明において、上記ラクチル−ＣｏＡを基質として使用するＰＨＡ合成酵素の遺伝子は、実質的に同等であるか、または優れたＰＨＡ合成能を有するＰＨＡ合成酵素をコーディングするその変異体を含む。
【００２０】
本発明の一具体例において、上記ラクチル−ＣｏＡを基質として使用するＰＨＡ合成酵素の遺伝子は、これに限定されるものではないが、
配列番号２のアミノ酸配列；または
配列番号２のアミノ酸配列でＥ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｌ４１２Ｍ、Ｓ４７７Ｒ、Ｓ４７７Ｈ、Ｓ４７７Ｆ、Ｓ４７７Ｙ、Ｓ４７７Ｇ、Ｑ４８１Ｍ、Ｑ４８１Ｋ及びＱ４８１Ｒよりなる群から選択される１つ以上の変異を含むアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するものであることができる。
【００２１】
上記ラクチル−ＣｏＡを基質として使用するＰＨＡ合成酵素の遺伝子変異体は、大韓民国特許出願１０−２００８−００６８６０７号に開示された方法によって製造されることができる。本発明の好ましい具体例において、上記ＰＨＡ合成酵素の遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列でＥ１３０Ｄ、Ｓ３２５Ｔ、Ｌ４１２Ｍ、Ｓ４７７Ｇ及びＱ４８１Ｍが変異されたアミノ酸配列（Ｃ１３３５）；配列番号２のアミノ酸配列でＥ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｋが変異されたアミノ酸配列（Ｃ１３１０）；及び配列番号２のアミノ酸配列でＥ１３０Ｄ、Ｓ４７７Ｆ及びＱ４８１Ｒが変異されたアミノ酸配列（Ｃ１３１２）よりなる群から選択されたいずれか１つのアミノ酸配列に対応する核酸配列を有するものであることができる。
【００２２】
本発明において、上記組換えラルストニア ユートロファは、３ＨＢ−ＣｏＡ生成酵素をコーディングする遺伝子をさらに含むことができる。３ＨＢ−ＣｏＡ生成酵素をコーディングする遺伝子をさらに含む場合、培地にヒドロキシアルカノエートを含ませないとしても、ヒドロキシアルカノエートのモル分率が高いヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体の製造が可能である。
【００２３】
本発明の一具体例において、上記３ＨＢ−ＣｏＡ生成酵素をコーディングする遺伝子は、ケトチオラーゼ遺伝子及びアセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ遺伝子であることができる。上記ケトチオラーゼ遺伝子及びアセトアセチル−ＣｏＡリダクターゼ遺伝子は、これに限定されるものではないが、ラルストニア ユートロファから由来したものであることができる。本発明において、上記組換えラルストニア ユートロファは、ＰｈａＧ遺伝子をさらに含むことができる。
【００２４】
本発明の一具体例において、上記ＰｈａＧ遺伝子は、Ｐ．Ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０由来のＰｈａＧ遺伝子であることができる。組換えラルストニア ユートロファがＰｈａＧ遺伝子をさらに含む場合、上記組換えラルストニア ユートロファは、ＭＣＬのヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体生成能を有するようになる。
【００２５】
上記ラクテートをラクチル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子、ラクチル−ＣｏＡを基質として使用するポリヒドロキシアルカノエート（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ：ＰＨＡ）合成酵素の遺伝子、３ＨＢ−ＣｏＡ生成酵素をコーディングする遺伝子及び／またはＰｈａＧ遺伝子を組換えラルストニア ユートロファに導入することは、当業界に公知された通常の方法を利用することができる。例えば、ラクテートをラクチル−ＣｏＡに転換する酵素の遺伝子及び／またはラクチル−ＣｏＡを基質として使用するポリヒドロキシアルカノエート（ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｏａｔｅ：ＰＨＡ）合成酵素の遺伝子を含むベクターを製作し、このような組換えベクターで野生型のＰＨＡ合成オペロンが除去されたラルストニア ユートロファを形質転換させる方法を利用することができる。
【００２６】
用語「ベクター」は、適当な宿主内でＤＮＡを発現させることができる適当な調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。本発明において、上記ベクターとしては、プラスミドベクター、バクテリオファージベクター、コスミドベクター、ＹＡＣ（Ｙｅａｓｔ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ）ベクターなどが使用されることができる。本発明の目的上、プラスミドベクターを利用することが好ましい。そのような目的に使用されることができる典型的なプラスミドベクターは、（ａ）宿主細胞当たり数百個のプラスミドベクターを含むように複製が効率的に行われるようにする複製開始点、（ｂ）プラスミドベクターに形質転換された宿主細胞が選定されるようにする抗生剤耐性遺伝子及び（ｃ）外来ＤＮＡ断片が挿入されることができる制限酵素切断部位を含む構造を有している。適切な制限酵素切断部位が存在しなくても、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプタ（adaptor）またはリンカー（linker）を使用すれば、ベクターと外来ＤＮＡを容易にライゲイション（ligation）することができる。
【００２７】
当業界で周知のように、宿主細胞で形質転換遺伝子の発現水準を高めるためには、当該遺伝子が選択された発現宿主内で機能を発揮する転写及び解読発現調節配列に作動可能に連結されなければならない。好ましくは、発現調節配列及び当該遺伝子は、細菌選択マーカー及び複製開始点（replication origin）を共に含んでいる１つの発現ベクター内に含まれるようになる。発現宿主が真核細胞の場合には、発現ベクターは、真核発現宿主内で有用な発現マーカーをさらに含まなければならない。
【００２８】
上記「発現調節配列」という表現は、特定の宿主生物で作動可能に連結されたコーディング配列の発現に必須なＤＮＡ配列を意味する。そのような調節配列は、転写を実施するためのプロモータ、そのような転写を調節するための任意のオペレータ配列、適当なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコーディングする配列及び転写及び解読の終決を調節する配列を含む。例えば、原核生物に適した調節配列は、プロモータ、任意にオペレータ配列及びリボソーム結合部位を含む。真核細胞は、プロモータ、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーがこれに含まれる。プラスミドで遺伝子の発現量に最も影響を及ぼす因子は、プロモータである。高発現用のプロモータとして、ＳＲａプロモータとサイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏ ｖｉｒｕｓ）由来プロモータなどが好ましく使用される。
【００２９】
本発明のＤＮＡ配列を発現させるために、非常に多様な発現調節配列のうちいずれもベクターに使用されることができる。有用な発現調節配列の例としては、例えば、ＳＶ４０またはアデノウイルスの初期及び後期プロモータ、ｌａｃシステム、ｔｒｐシステム、ＴＡＣまたはＴＲＣシステム、Ｔ３及びＴ７プロモータ、ラムダファージの主要オペレータ及びプロモータ領域、ｆＤコードタンパク質の調節領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他のグリコール分解酵素に対するプロモータ、上記ホスファターゼのプロモータ、例えば、Ｐｈｏ５、酵母アルファ−交配システムのプロモータ及び原核細胞または真核細胞またはこれらのウイルスの遺伝子の発現を調節するものと知られた構成と誘導のその他の配列及びこれらの様々な組合が含まれる。
【００３０】
核酸は、他の核酸配列と機能的関係で配置される時、「作動可能に連結（operably linked）」される。これは、適当な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が調節配列に結合される時、遺伝子発現を可能にする方式で連結された遺伝子及び調節配列であることができる。例えば、プレ配列（pre-sequence）または分泌リーダー（leader）に対するＤＮＡは、ポリペプチッドの分泌に参加するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチッドに対するＤＮＡに作動可能に連結され；プロモータまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コーディング配列に作動可能に連結されるか；または、リボソーム結合部位は、配列の転写に影響を及ぼす場合、コーディング配列に作動可能に連結されるか、；または、リボソーム結合部位は、翻訳を容易にするように配置される場合、コーディング配列に作動可能に連結される。一般的に、「作動可能に連結された」は、連結されたＤＮＡ配列が接触し、また、分泌リーダーの場合、接触し、リーディングフレーム内に存在することを意味する。しかし、エンハンサーは、接触する必要がない。これら配列の連結は、便利な制限酵素部位でライゲイション（連結）によって行われる。そのような部位が存在しない場合、前述したように、通常の方法による合成オリゴヌクレオチドアダプタ（oligonucleotide adaptor）またはリンカー（linker）を使用する。
【００３１】
もちろん、すべてのベクターと発現調節配列が本発明のＤＮＡ配列を発現するにあたって、すべて同等に機能を発揮するものではないことを理解しなければならない。同様に、すべての宿主が同一の発現システムに対して同一に機能を発揮するわけではない。しかし、当業者なら、過度な実験的負担なく、本発明の範囲を逸脱しない範囲で、様々なベクター、発現調節配列及び宿主のうち適切な選択をすることができる。例えば、ベクターを選択するにあたって、宿主を考慮しなければならないが、これは、ベクターがその中で複製されなければならないからである。ベクターの複製数、複製数を調節することができる能力及び当該ベクターによってコーディングされる他のタンパク質、例えば、抗生剤マーカーの発現をもさらに考慮されなければならない。これら変数の範囲内で、当業者は、本発明に適した各種ベクター／発現調節配列／宿主組合を選定することができる。
【００３２】
また、本発明は、前述の組換えラルストニア ユートロファを炭素源及びラクテート；または炭素源、ラクテート及びヒドロキシアルカノエートを含む培地で培養し；
上記組換えラルストニア ユートロファからポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体を回収することを含む、ポリラクテートまたはヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体の製造方法を提供する。
【００３３】
例えば、上記組換えラルストニア ユートロファを、グルコースを含む培地で培養すれば、組換えラルストニア ユートロファからポリラクテートを収得することができ、上記組換えラルストニア ユートロファを、グルコース及びヒドロキシアルカノエートを含む培地中で培養すれば、組換えラルストニア ユートロファからヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体を収得することができる。上記組換えラルストニア ユートロファが３ＨＢ−ＣｏＡ生成酵素をコーディングする遺伝子をさらに含む場合、培地にヒドロキシアルカノエートを含ませないとしても、ヒドロキシアルカノエートのモル分率が高いヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体の製造が可能であり、上記組換えラルストニア ユートロファがＰｈａＧ遺伝子をさらに含む場合には、ＭＣＬのヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体を生成することが可能である。
【００３４】
これに限定されるものではないが、上記ヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体は、例えば、ポリ（３ＨＡ−ｃｏ−ＬＡ）、ポリ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）、ポリ（３ＨＰ−ｃｏ−ＬＡ）、ポリ（３ＨＢ−ｃｏ−４ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）、ポリ（３ＨＰ−ｃｏ−４ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）、ポリ（３ＨＢ−ｃｏ−３ＨＶ−ｃｏ−ＬＡ）、ポリ（４ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ−ｃｏ−３ＨＰ）、ポリ（ＭＣＬ３−ＨＡ−ｃｏ−ＬＡ）などを含む。
【００３５】
より具体的に、培地に含ませるヒドロキシアルカノエートの種類によって収得されるヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体の種類は変わることができる。
【００３６】
本発明において、上記ヒドロキシアルカノエート−ラクテート共重合体中のヒドロキシアルカノエートは、３−ヒドロキシ酪酸（3-hydroxybutyrate）、３−ヒドロキシ吉草酸（3-hydroxyvalerate）、４−ヒドロキシ酪酸（4-hydroxybutyrate）、炭素数が６〜１４個の中間鎖長さの（Ｄ）−３−ヒドロキシカルボン酸（(D)-3-hydroxycarboxylic acid）、２−ヒドロキシプロピオン酸（2-hydroxypropionic acid）、３−ヒドロキシプロピオン酸（3-hydroxypropionic acid）、３−ヒドロキシヘキサン酸（3-hydroxyhexanoic acid）、３−ヒドロキシヘプタン酸（3-hydroxyheptanoic acid）、３−ヒドロキシオクタン酸（3-hydroxyoctanoic acid）、３−ヒドロキシノナン酸（3-hydroxynonanoic acid）、３−ヒドロキシデカン酸（3-hydroxydecanoic acid）、３−ヒドロキシウンデカン酸（3-hydroxyundecanoic acid）、３−ヒドロキシドデカン酸（3-hydroxydodecanoic acid）、３−ヒドロキシテトラデカン酸（3-hydroxytetradecanoic acid）、３−ヒドロキシヘキサデカン酸（3-hydroxyhexadecanoic acid）、４−ヒドロキシ吉草酸（4-hydroxyvaleric acid）、４−ヒドロキシヘキサン酸（4-hydroxyhexanoic acid）、４−ヒドロキシヘプタン酸（4-hydroxyheptanoic acid）、４−ヒドロキシオクタン酸（4-hydroxyoctanoic acid）、４−ヒドロキシデカン酸（4-hydroxydecanoic acid）、５−ヒドロキシ吉草酸（5-hydroxyvaleric acid）、５−ヒドロキシヘキサン酸（5-hydroxyhexanoic acid）、６−ヒドロキシドデカン酸（6-hydroxydodecanoic acid）、３−ヒドロキシ−４−ペンテン酸（3-hydroxy-pentenoic acid）、３−ヒドロキシ−４−ｔｒａｎｓ−ヘキセン酸（3-hydroxy-4-trans-hexenoic acid）、３−ヒドロキシ−４−ｃｉｓ−ヘキセン酸（3-hydroxy-4-cis-hexenoic acid）、３−ヒドロキシ−５−ヘキセン酸（3-hydroxy-5-hexenoic acid）、３−ヒドロキシ−６−ｔｒａｎｓ−オクテン酸（3-hydroxy-6-trans-octenoic acid）、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−オクテン酸（3-hydroxy-6-cis-octenoic acid）、３−ヒドロキシ−７−オクテン酸（3-hydroxy-7-octenoic acid）、３−ヒドロキシ−８−ノネン酸（3-hydroxy-8-nonenoic acid）、３−ヒドロキシ−９−デセン酸（3-hydroxy-9-decenoic acid）、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−ドデセン酸（3-hydroxy-5-cis-dodecenoic acid）、３−ヒドロキシ−６−ｃｉｓ−ドデセン酸（3-hydroxy-6-cis dodecenoic acid）、３−ヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸（3-hydroxy-5-cis tetradecenoic acid）、３−ヒドロキシ−７−ｃｉｓ−テトラデセン酸（3-hydroxy-7-cis tetradecenoic acid）、３−ヒドロキシ−５、８−ｃｉｓ−ｃｉｓ−テトラデセン酸（3-hydroxy-5、8-cis-cis tetradecenoic acid）、３−ヒドロキシ−４−メチル吉草酸（3-hydroxy-4-methylvaleric acid）、３−ヒドロキシ−４−メチルヘキサン酸（3-hydroxy-4-methylhexanoic acid）、３−ヒドロキシ−５−メチルヘキサン酸（3-hydroxy-5-methylhexanoic acid）、３−ヒドロキシ−６−メチルヘプタン酸（3-hydroxy-6-methylheptanoic acid）、３−ヒドロキシ−４−メチルオクタン酸（3-hydroxy-4-methyloctanoic acid）、３−ヒドロキシ−５−メチルオクタン酸（3-hydroxy-5-methyloctanoic acid）、３−ヒドロキシ−６−メチルオクタン酸（3-hydroxy-6-methyloctanoic acid）、３−ヒドロキシ−７−メチルオクタン酸（3-hydroxy-7-methyloctanoic acid）、３−ヒドロキシ−６−メチルノナン酸（3-hydroxy-6-methylnonanoic acid）、３−ヒドロキシ−７−メチルノナン酸（3-hydroxy-7-methylnonanoic acid）、３−ヒドロキシ−８−メチルノナン酸（3-hydroxy-8-methylnonanoic acid）、３−ヒドロキシ−���−メチルデカン酸（3-hydroxy-7-methyldecanoic acid）、３−ヒドロキシ−９−メチルデカン酸（3-hydroxy-9-methyldecanoic acid）、３−ヒドロキシ−７−メチル−６−オクテン酸（3-hydroxy-7-methyl-6-octenoic acid）、リンゴ酸（malic acid）、３−ヒドロキシコハク酸−メチルエステル（3-hydroxysuccinic acid-methyl ester）、３−ヒドロキシアジピン酸−メチルエステル（3-hydroxyadipinic acid-methyl ester）、３−ヒドロキシスベリン酸−メチルエステル（3-hydroxysuberic acid-methyl ester）、３−ヒドロキシアゼライン酸−メチルエステル（3-hydroxyazelaic acid-methyl ester）、３−ヒドロキシセバシン酸−メチルエステル（3-hydroxysebacic acid-methyl ester）、３−ヒドロキシスベリン酸−エチルエステル（3-hydroxysuberic acid-ethyl ester）、３−ヒドロキシセバシン酸−エチルエステル（3-hydroxysebacic acid-ethyl ester）、３−ヒドロキシピメリン酸−プロピルエステル（3-hydroxypimelic acid-propyl ester）、３−ヒドロキシセバシン酸−ベンジルエステル（3-hydroxysebacic acid-benzil ester）、３−ヒドロキシ−８−アセトキシオクタン酸（3-hydroxy-8-acetoxyoctanoic acid）、３−ヒドロキシ−９−アセトキシノナン酸（3-hydroxy-9-acetoxynonanoic acid）、フェノキシ−３−ヒドロキシ酪酸（phenoxy-3-hydroxybutyric acid）、フェノキシ−３−ヒドロキシ吉草酸（phenoxy-3-hydroxyvaleric acid）、フェノキシ−３−ヒドロキシヘプタン酸（phenoxy-3-hydroxyheptanoic acid）、フェノキシ−３−ヒドロキシオクタン酸（phenoxy-3-hydroxyoctanoic acid）、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシ酪酸（para-cyanophenoxy-3-hydroxybutyric acid）、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシ吉草酸（para-cyanophenoxy-3-hydroxyvaleric acid）、ｐａｒａ−シアノフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸（para-cyanophenoxy-3-hydroxyhexanoic acid）、ｐａｒａ−ニトロフェノキシ−３−ヒドロキシヘキサン酸（para-nitrophenoxy-3-hydroxyhexanoic acid）、３−ヒドロキシ−５−フェニル吉草酸（3-hydroxy-5-phenylvaleric acid）、３−ヒドロキシ−５−シクロヘキシル酪酸（3-hydroxy-5-cyclohexylbutyric acid）、３、１２−ジヒドロキシドデカン酸（3、12-dihydroxydodecanoic acid）、３、８−ジヒドロキシ−５−ｃｉｓ−テトラデセン酸（3、8-dihydroxy-5-cis-tetradecenoic acid）、３−ヒドロキシ−４、５−エポキシデカン酸（3-hydroxy-4、5-epoxydecanoic acid）、３−ヒドロキシ−６、７−エポキシドデカン酸（3-hydroxy-6、7-epoxydodecanoic acid）、３−ヒドロキシ−８、９−エポキシ−５、６−ｃｉｓ−テトラデカン酸（3-hydroxy-8、9-epoxy-5、6-cis-tetradecanoic acid）、７−シアノ−３−ヒドロキシヘプタン酸（7-cyano-3-hydroxyheptanoic acid）、９−シアノ−３−ヒドロキシノナン酸（9-cyano-3-hydroxynonanoic acid）、３−ヒドロキシ−７−フルオロヘプタン酸（3-hydroxy-7-fluoroheptanoic acid）、３−ヒドロキシ−９−フルオロノナン酸（3-hydroxy-9-fluorononanoic acid）、３−ヒドロキシ−６−クロロヘキサン酸（3-hydroxy-6-chlorohexanoic acid）、３−ヒドロキシ−８−クロロオクタン酸（3-hydroxy-8-chlorooctanoic acid）、３−ヒドロキシ−６−ブロモヘキサン酸（3-hydroxy-6-bromohexanoic acid）、３−ヒドロキシ−８−ブロモオクタン酸（3-hydroxy-8-bromooctanoic acid）、３−ヒドロキシ−１１−ブロモウンデカン酸（3-hydroxy-11-bromoundecanoic acid）、３−ヒドロキシ−２−ブテン酸（3-hydroxy-2-butenoic acid）、６−ヒドロキシ−３−ドデセン酸（6-hydroxy-3-dodecenoic acid）、３−ヒドロキシ−２−メチル酪酸（3-hydroxy-2-methylbutyric acid）、３−ヒドロキシ−２−メチル吉草酸（3-hydroxy-2-methylvaleric acid）、及び３−ヒドロキシ−２、６−ジメチル−５−ヘプテン酸（3-hydroxy-2、6-heptenoic acid）よりなる群から選択される１つ以上であることができるが、これに限定されるものではない。
【００３７】
本発明の利点及び特徴、そしてそれらを達成する方法は、詳細に後述されている実施例を参照すれば明確になる。しかし、本発明は、以下で開示される実施例に限定されるものではなく、互いに異なる多様な形態で具現されることができ、但し、本実施例は、本発明の開示が完全にし、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に発明の範疇を完全に知らせるために提供されるものである。本発明は、請求項の範疇により定義される。
【００３８】
［実施例］
〔実施例１〕ＰＨＡ生成能が消失されたラルストニア ユートロファの製作
Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａでポリ（３−ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒａｔｅ）［Ｐ（３ＨＢ）］合成に関与するＰＨＡ生合成遺伝子オペロンを除去するために、組換えベクターを次のように製作した。
【００３９】
ｐＳＹＬ１０５ベクター（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１９９４，４４：１３３７−１３４７）においてＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６由来のＰＨＢ生産オペロンが含有されたＤＮＡ断片をＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩで切断し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ認識部位に挿入することによって、ｐＲｅＣＡＢ組換えベクターを製造した。
【００４０】
ｐＲｅＣＡＢベクターは、ＰＨＡ合成酵素（ｐｈａＣＲＥ）と単量体供給酵素（ｐｈａＡＲＥ＆ｐｈａＢＲＥ）がＰＨＢオペロンプロモータによって常時的に発現され、大腸菌でもよく作動すると知られている（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１９９４，４４：１３３７−１３４７）。ｐＲｅＣＡＢをＢｓｔＢＩ／ＮｄｅＩで切断し、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６  ＰＨＡ合成酵素（ｐｈａＣＲＥ）とｂ−ｋｅｔｏｔｈｉｏｌａｓｅ（ｐｈａＡＲＥ）とａｃｅｔｏａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ｐｈａＢＲＥ）をコーディングする遺伝子を除去した後、ＰＣＲを通じてプラスミドｐＥＧＦＰ（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から増幅したＧＦＰ遺伝子を挿入した（ｐ△ＣＡＢ−ＧＦＰ）。
【００４１】
EGFP_F_BstBI aaaaattcgaaac aggaaacagaat  atggtgagcaag (配列番号3)
EGFP_R_NdeI ggaattcCATATGttacttgtacagctcgtcca (配列番号4)
【００４２】
ｐ△ＣＡＢ−ＧＦＰをＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで切断し、ＧＦＰ遺伝子シーケンスの５’方向にＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＰＨＡ生合成プロモータが、３’方向にｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ遺伝子が付いている遺伝子断片を収得し、その遺伝子断片をＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで切断したｐＫ１８ｍｏｂＳａｃＢベクター（Ｓｃｈａｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ（１９９４）１４５：６９−７３）に挿入し、ｐＫ１８−△ＣＡＢ−ＧＦＰベクターを製作した。ｐＫ１８ｍｏｂＳａｃＢベクターは、ｓａｃＢ遺伝子を発現することができ、スクロースを利用したクロモソームに外来遺伝子を挿入し、組換え微生物を製作するのに有用に使用される。
【００４３】
ｐＫ１８−△ＣＡＢ−ＧＦＰベクターを大腸菌Ｓ１７−１に形質転換した後、Ｓ１７−１（ｐＫ１８−△ＣＡＢ−ＧＦＰ）を、２５ｍｇ／        Ｌカナマイシンが含まれたＬＢ培地で３７℃、２４時間液体培養した。Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＮＣＩＭＢ１１５９９も、ＬＢ培地で３０℃、２４時間液体培養後、この２つの培養液をＳ１７−１（ｐＫ１８−△ＣＡＢ−ＧＦＰ）とＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＮＣＩＭＢ１１５９９の体積比が３：１となるように混合し、ＬＢ固体培地に１００μＬずつ滴加した。これを１８時間３０℃停滞培養器で培養した。この過程で、交配が生じ、Ｓ１７−１のｐＫ１８−△ＣＡＢ−ＧＦＰベクターがＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａに移され、図３に示されたように、ＲａｌｓｔｏｎｉａのクロモソームＤＮＡにｈｏｍｏｌｏｇｙ位置で１次クロスオーバーが起きる。ｐＫ１８−△ＣＡＢ−ＧＦＰは、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａで複製が不可能なので、遺伝子の１次クロスオーバーを通じてｐＫ１８−△ＣＡＢ−ＧＦＰは、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａのクロモソームに挿入され、挿入が正常に起きる時、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａは、カナマイシン５００ｍｇ／Ｌが含まれたプレートで抵抗性を示すようになる。
【００４４】
１次クロスオーバーを通じてｐＫ１８−△ＣＡＢ−ＧＦＰがＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａのクロモソームに挿入されたコロニーは、ＬＢプレートで交配した細胞をＬＢ液体培地に懸濁し、カナマイシン５００ｍｇ／Ｌとクロラムフェニコール３５ｍｇ／Ｌが含まれたプレートに塗抹して選別した。２次クロスオーバーのために、１次クロスオーバーが起きた組換えＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａをＬＢ液体培地で３０℃、２４時間培養した後、１００μＬをスクロース７０ｇ／Ｌが含有されたＬＢプレートに塗抹した。ｓａｃＢ遺伝子によって２次クロスオーバーが起きたＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａをＰＣＲを通じて組換えＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａとして選択した（図３）。正常に２次クロスオーバーが起きる場合、組換えＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａは、ＰＨＡ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓオペロン（ｐｈａＣＡＢ）を消失するようになり、その代わりに、ＧＦＰ遺伝子がクロモソームに残っているようになる。コロニーＰＣＲを通じてＧＦＰが正常にクロモソームに挿入された組換えＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａを捜し出し、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａＧＦＰと命名した。
【００４５】
〔実施例２〕Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．６−１９（ＫＣＴＣ１１０２７ＢＰ）由来ＰＨＡｓｙｎｔｈａｓｅとＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ由来のｐｒｏｐｉｏｎｙｌ−ＣｏＡ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＰＰＣＴ）が挿入された組換えＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａの製作
実施例１で製作したｐＫ１８−△ＣＡＢ−ＧＦＰベクターをＢａｍＨＩ／ＮｄｅＩで切断し、ＧＦＰを除去した後、ｐＰｓ６１９Ｃ１３３５ＣＰＰＣＴ５４０ベクターをＢａｍＨＩ／ＮｄｅＩで切断して収得した遺伝子断片を挿入することによって、ｐＫ１８−△ＣＡＢ−３３５５４０ベクターを製作した。このベクターを利用してｐｈａＣＡＢが除去され、クロモソームにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．６−１９（ＫＣＴＣ１１０２７ＢＰ）由来ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９３３５とＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ由来のプロピオニル−ＣｏＡトランスフェラーゼ（ＣＰＰＣＴ５４０）が挿入された組換えＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａ３３５５４０を製作した（表１）。製作方法は、大腸菌Ｓ１７−１を利用して実施例１と同様の方法で行った（図３）。
【００４６】
【表１】
0005626735.tif 000002
【００４７】
〔実施例３〕Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．６−１９（ＫＣＴＣ１１０２７ＢＰ）由来ＰＨＡｓｙｎｔｈａｓｅとＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａＨ１６由来のｋｅｔｏｔｈｉｏｌａｓｅ（ｐｈａＡＲＥ）及びａｃｅｔｏａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ｐｈａＢＲＥ）が挿入された組換えＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａの製作
実施例１で製作したｐＫ１８−△ＣＡＢ−ＧＦＰベクターをＢａｍＨＩ／ＮｄｅＩで切断してＧＦＰを除去した後、ｐＰｓ６１９Ｃ１３３５ＲｅＡＢベクターをＢａｍＨＩ／ＮｄｅＩで切断して収得した遺伝子断片を挿入することによって、ｐＫ１８−△ＣＡＢ−３３５ＲｅＡＢベクターを製作した。このベクターを利用してｐｈａＣＡＢが除去され、クロモソームにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．６−１９（ＫＣＴＣ１１０２７ＢＰ）由来ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９３３５とＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａＨ１６由来のＰＨＢ単量体供給酵素である（ｐｈａＡＲＥ＆ｐｈａＢＲＥ）が挿入された組換えＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａ  ３３５ＲｅＡＢを製作した（表１）。製作方法は、大腸菌Ｓ１７−１を利用して実施例１と同様の方法で行った（図３）。
【００４８】
〔実施例４〕Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．６−１９（ＫＣＴＣ１１０２７ＢＰ）由来ＰＨＡｓｙｎｔｈａｓｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ由来ｐｒｏｐｉｏｎｙｌ−ＣｏＡ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＰＰＣＴ）とＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６由来のｋｅｔｏｔｈｉｏｌａｓｅ（ｐｈａＡＲＥ）及びａｃｅｔｏａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ｐｈａＢＲＥ）が挿入された組換えＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａの製作
実施例１で製作したｐＫ１８−△ＣＡＢ−ＧＦＰベクターをＢａｍＨＩ／ＮｄｅＩで切断してＧＦＰを除去した後、ｐＰｓ６１９Ｃ１３１０ＣＰＰＣＴ５４０ＲｅＡＢとｐＰｓ６１９Ｃ１３１２ＣＰＰＣＴ５４０ＲｅＡＢベクターをＢａｍＨＩ／ＮｄｅＩで切断して収得した遺伝子断片を挿入することによって、ｐＫ１８−△ＣＡＢ−３１０５４０ＲｅＡＢとｐＫ１８−△ＣＡＢ−３１２５４０ＲｅＡＢベクターを製作した。このベクターを利用してｐｈａＣＡＢが除去され、クロモソームにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．６−１９（ＫＣＴＣ１１０２７ＢＰ）由来ｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９３１０またはｐｈａＣ１Ｐｓ６−１９３１２、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ由来のｐｒｏｐｉｏｎｙｌ−ＣｏＡｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＰＰＣＴ５４０）とＲａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ  Ｈ１６由来のＰＨＢ単量体供給酵素である（ｐｈａＡＲＥ＆ｐｈａＢＲＥ）が挿入された組換えＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａ３１０５４０ＲｅＡＢとＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａ３１２５４０ＲｅＡＢを製作した（表１）。製作方法は、大腸菌Ｓ１７−１を利用して実施例１と同様の方法で行った（図３）。
【００４９】
〔実施例５〕組換えＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａの培養を通じたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）共重合体の生合成
表１に示された組換えＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａを葡萄糖を基本基質とする３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含む最小培地で培養し、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）共重合体を生合成した。最小培地の成分は、次の通りである（／Ｌ）。ＫＨ２ＰＯ４、２．６５ｇ；Ｎａ２ＨＰＯ４、３．８ｇ；ＮＨ４Ｃｌ、０．７２ｇ；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．４ｇ；Ｔｒａｃｅｒ、１ｍＬ。また、ｔｒａｃｅｒの成分は、次の通りである（／Ｌ）。ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｇ；ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．２５ｇ；ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１ｇ；ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．５ｇ；ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２ｇ；Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・７Ｈ２Ｏ、０．２３ｇ；（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４、０．１ｇ；３５％ＨＣｌ、１０ｍＬ。本培養の前に、種菌培養は、抗生剤を含むＬＢ培地で３０時間行われた。種菌培養液を基質と抗生剤が含有された最小培地に１％となるように接種し、本培養を４日間行った。すべての培養は、３０℃、２００ｒｐｍの速度で行った。培養後、遠心分離を通じて菌体を回収した。回収された菌体を８０℃の乾燥器で４８時間乾燥後、ガスクロマトグラフィ分析を行い、菌体内に蓄積されたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ）共重合体含量を測定し、その結果を表２に示した。分析に使用された標準物質は、Ｐ（３ＨＢ−ｃｏ−１２ｍｏｌ％３ＨＶ）共重合体及びＰＬＡ高分子であった。
【００５０】
【表２】
0005626735.tif 000003
【００５１】
〔実施例６〕組換えＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａの培養を通じたＰ（３ＨＢ−ｃｏ−ＬＡ−ｃｏ−ｍｃｌ３ＨＡ）共重合体の生合成
Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ  ＧＦＰをＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．６−１９（ＫＣＴＣ１１０２７ＢＰ）由来ＰＨＡｓｙｎｔｈａｓｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ由来ｐｒｏｐｉｏｎｙｌ−ＣｏＡ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＣＰＰＣＴ）、Ｐ．Ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０由来ＰｈａＧを発現するベクターに形質転換した後、実施例５のように、培養した。炭素源としては、２％葡萄糖を使用した。菌体内の蓄積された共重合体含量の結果を表３に示した。
【００５２】
ベクター製作過程は、次の通りである。
まず、ｐＰｓ６１９Ｃ１３００ＣＰＰＣＴ５３２あるいはｐＰｓ６１９Ｃ１３３４ＣＰＰＣＴ５３２ベクターにＰ．ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０からＰＣＲで増幅したｐｈａＧ遺伝子をＮｄｅＩ  ｓｉｔｅに挿入した（ｐＰｓ６１９Ｃ１３００ＣＰＰＣＴ５３２ＰｈａＧまたはｐＰｓ６１９Ｃ１３３４ＣＰＰＣＴ５３２ＰｈａＧ）。次に、ｐＰｓ６１９Ｃ１３００ＣＰＰＣＴ５３２ＰｈａＧまたはｐＰｓ６１９Ｃ１３３４ＣＰＰＣＴ５３２ＰｈａＧをＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで切断した後、遺伝子断片をｐＢＢＲ１ＭＣＳ２ベクターに同じｓｉｔｅに挿入することによって、Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａで複製可能な組換えプラスミドを製作した（ｐＭＣＳ２Ｐｓ６１９Ｃ１３００ＣＰＰＣＴ５３２ＰｈａＧまたはｐＭＣＳ２Ｐｓ６１９Ｃ１３３４ＣＰＰＣＴ５３２ＰｈａＧ）。上記ベクターを利用して組換えＲ．ｅｕｔｒｏｐｈａを製作した。
【００５３】
KTPhaG500f-NdeI ggaattc catatg ggggttggcgccggg ggag  (配列番号5)
KTPhaGb-2100-NdeI 5- ggaattc catatg gga tcg gtg ggt aat tgg cc (配列番号6)
【００５４】
【表３】
0005626735.tif 000004
【図１】
0005626735.tif 000005
【図２】
0005626735.tif 000006
【図３】
0005626735.tif 000007
【配列表】
0005626735000001.app