(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドからなるフラビン結合型グルコース脱水素酵素；
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位したアミノ酸配列からなり、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド
【請求項２】
以下の（Ａ）〜（Ｅ）のいずれかのＤＮＡ：
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｃ）配列番号２に示される塩基配列との同一性が９０％以上である塩基配列からなり、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号２に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位されている塩基配列であり、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ｅ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位したアミノ酸配列からなり、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項２に記載のＤＮＡを組み込んだベクター。
【請求項４】
請求項３に記載のベクターが導入されている形質転換体。
【請求項５】
請求項２に記載のＤＮＡを保有する微生物を培養し、得られた培養液を精製する、請求項１に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を製造する方法。
【請求項６】
請求項４に記載の形質転換体を培養し、得られた培養液を精製する、請求項５に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。
【請求項７】
請求項１に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素をグルコースに作用させることを含む、グルコース濃度の測定方法。
【請求項８】
請求項１に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキット。
【請求項９】
請求項１に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコースセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はグルコース脱水素酵素（以下、ＧＤＨとも表す。）に関する。詳しくは、本発明はフラビン結合型グルコース脱水素酵素（以下、ＦＧＤＨとも表す。）、及び当該酵素の生産菌、当該酵素の製造方法、当該酵素を使用したグルコース測定方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
血糖自己測定（ＳＭＢＧ：Ｓｅｌｆ−Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅ）は糖尿病患者が自己の血糖値を管理し、治療に活用するために重要である。近年、ＳＭＢＧのために、電気化学的バイオセンサを用いた簡易型の自己血糖測定器が広く用いられている。バイオセンサは、絶縁性の基板上に電極、酵素反応層を形成したものである。【０００３】
ここで用いられる酵素としては、グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）などが挙げられる。ＧＯ（ＥＣ  １．１．３．４）を用いた方法は、測定サンプル中の溶存酸素の影響を受けやすく、溶存酸素が測定結果に影響を及ぼすといった問題点が指摘されている。一方でＧＤＨは、溶存酸素の影響を受けないが、例えば、ピロロキノリンキノン依存型グルコース脱水素酵素（ＰＱＱ−ＧＤＨ）（ＥＣ１．１．５．２（旧ＥＣ１．１．９９．１７））は、マルトースやラクトースといったグルコース以外の糖類にも作用するため正確な血糖値の測定には適していない。【０００４】
溶存酸素の影響を受けず、マルトースにもほとんど作用しないフラビン結合型グルコース脱水素酵素として、フラビンアデニンジヌクレオチド依存性グルコース脱水素酵素（以下、「ＦＡＤＧＤＨ」とも表す。）が知られている。
例えば、特許文献１〜５には、アスペルギルス・テレウスやアスペルギルス・オリゼ由来のもの、あるいは、それらを改変したものなどが報告されている。
また、非特許文献１には、子のう菌であるグロメレラ・シンギュレタ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｃｉｎｇｕｌａｔａ）（無性世代名コレトトリカム・グロエオスポロイデス（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｕｍ  ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｏｉｄｅｓ））由来のものが報告されている。
しかし、これらの酵素は、キシロースに対する反応性が比較的高いため（特許文献１、非特許文献１）、キシロース負荷試験を受けている者の血糖を測定する場合には、正確性の点で改善の余地がある。
一方、キシロースに対する作用性が比較的低いフラビン結合型ＧＤＨ（特許文献６）やＧＯとＧＤＨの長所を併せ持つ改変型ＧＤＨ（特許文献７）などが開発されているが依然として改善の余地がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２００４／０５８９５８
【特許文献２】ＷＯ２００６／１０１２３９
【特許文献３】特開２００７−２８９１４８
【特許文献４】特開２００８−２３７２１０
【特許文献５】ＷＯ２００８／０５９７７７
【特許文献６】ＷＯ２０１０／１４０４３１
【特許文献７】ＷＯ２０１１／０６８０５０
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（２０１１）１５７：３２０３−３２１２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のような現状の下、本発明者等は、ＳＭＢＧにおける使用により適した、新規なグルコース脱水素酵素を開発すべく日夜検討を重ね、優れた基質特異性に加えて、比活性が高く、安定性に優れた酵素を利用することで、測定時間を短縮し、且つ、少量の酵素量で正確な血糖値の測定が可能になるという課題を見出した。すなわち本発明は、基質特異性、比活性、及び熱安定性等に優れることにより、ＳＭＢＧ用センサーへの利用に適した新たなグルコース脱水素酵素を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するために、本発明者らは、日夜検討を重ね、多くの微生物についてスクリーニングした結果、これまでにグルコース脱水素酵素を生産することが報告されていない或る微生物がグルコース脱水素酵素活性を有することを見出した。そして、本発明者等は、当該酵素を単離精製し、その特性を調べた結果、フラビン結合型のグルコース脱水素酵素であり、特異性に優れ、高い比活性および優れた熱安定性を備えていることを見出した。
本発明は、係る知見に基づき、更なる研究と改良を重ねた結果完成したものであり、代表的な本発明は、以下の通りである。【０００９】
項１．
下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドからなるフラビン結合型グルコース脱水素酵素；
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位したアミノ酸配列からなり、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド
項２．
以下の（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかのＤＮＡ：
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（Ｃ）配列番号２に示される塩基配列との同一性が８０％以上である塩基配列からなり、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであり、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ｅ）配列番号２に示される塩基配列において、一若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加及び／又は逆位されている塩基配列であり、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（Ｆ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位したアミノ酸配列からなり、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
項３．
請求項２に記載のＤＮＡを組み込んだベクター。
項４．
請求項３に記載のベクターが導入されている形質転換体。
項５．
請求項２に記載のＤＮＡを保有する微生物を培養し、得られた培養液を精製する、請求項１に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を製造する方法。
項６．
請求項４に記載の形質転換体を培養し、得られた培養液を精製する、請求項５に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法。
項６．
請求項１に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素をグルコースに作用させることを含む、グルコース濃度の測定方法。
項７．
請求項１に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコースアッセイキット。
項８．
請求項１に記載のフラビン結合型グルコース脱水素酵素を含むグルコースセンサ。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のフラビン結合型グルコース脱水素酵素（ＦＧＤＨ）は、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースに対する反応性がそれぞれ有意に低いため、試料中にＤ−グルコースとこれらの糖が共存する場合であってもグルコース量又は濃度を正確に測定することを可能にする。更に、本発明のＦＧＤＨは、熱安定性に優れるため、熱処理等を伴う効率的なセンサストリップの製造を可能にする。加えて、本発明のＦＧＤＨは、広い範囲のｐＨ領域に対して安定であるため、幅広い条件下での使用に適している。これらの特性を備えるため、本発明のＦＧＤＨは、Ｄ−グルコースを含むあらゆる試料（例えば、血液や食品（調味料や飲料等））におけるグルコース濃度を正確に測定することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＲＤ０５６７７９由来ＧＤＨの吸収スペクトルを表す図である。
【図２】ＲＤ０５６７７９由来ＧＤＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。
【図３】ＲＤ０５６７７９由来ＧＤＨの活性に対するｐＨの影響を示す。
【図４】ＲＤ０５６７７９由来ＧＤＨの活性に対する温度の影響を示す。
【図５】ＲＤ０５６７７９由来ＧＤＨのｐＨ安定性を測定した結果を示す。
【図６】ＲＤ０５６７７９由来ＧＤＨの温度安定性を測定した結果を示す。
【図７】ＲＤ０５６７７９由来ＧＤＨの反応速度と基質濃度との関係を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．フラビン結合型グルコース脱水素酵素（ＦＧＤＨ）
１−１．グルコース脱水素酵素活性
グルコース脱水素酵素（ＧＤＨ）とは、電子受容体存在下でグルコースの水酸基を酸化してグルコノ−δ−ラクトンを生成する反応を触媒する理化学的性質を有する酵素である。本書においては、この理化学的性質をグルコースデヒドロゲナーゼ活性といい、特に断りが無い限り、「酵素活性」又は「活性」とは、当該酵素活性を意味する。前記電子受容体は、ＧＤＨが触媒する反応において、電子の授受を担うことが可能である限り特に制限されないが、例えば、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）、フェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）、１−メトキシ−５−メチルフェナジウムメチルサルフェート、及びフェリシアン化合物等を使用することができる。
【００１３】
グルコースデヒドロゲナーゼ活性の測定方法としては、種々の方法が知られているが、本書では、ＤＣＰＩＰを電子受容体として用い、反応前後における７５０ｎｍの波長における試料の吸光度の変化を指標に活性を測定する方法を適用する。具体的な試薬組成や測定条件は、特にことわらない限り下記のとおりである。
【００１４】
グルコースデヒドロゲナーゼ活性の測定方法
＜試薬＞
１．５Ｍ  Ｄ−グルコースを含む１５０ｍＭ  リン酸緩衝液ｐＨ７．０（０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む）
３．１ｍＭ  ２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＰＩＰ）溶液
上記Ｄ−グルコースを含むリン酸緩衝液２０ｍＬ、ＤＣＰＩＰ溶液１０ｍＬ、を混合して反応試薬とする。
【００１５】
＜測定条件＞
反応試薬３ｍＬを３７℃で５分間予備加温する。ＧＤＨ溶液０．１ｍＬを添加しゆるやかに混和後、水を対照に３７℃に制御された分光光度計で、７５０ｎｍの吸光度変化を５分記録し、直線部分から（即ち、反応速度が一定になってから）１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＴＥＳＴ）を測定する。盲検はＧＤＨ溶液の代わりにＧＤＨを溶解する溶媒を試薬混液に加えて同様に１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤＢＬＡＮＫ）を測定する。これらの値から次の式に従ってＧＤＨ活性を求める。ここでＧＤＨ活性における１単位（Ｕ）とは、濃度１ＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１マイクロモルのＤＣＰＩＰを還元する酵素量である。
活性（Ｕ／ｍＬ）＝
｛−（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×３．１×希釈倍率｝／｛０．８５×０．１×１．０｝
なお、式中の３．１は反応試薬＋酵素溶液の液量（ｍＬ）、０．８５は本活性測定条件におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）、１．０はセルの光路長（ｃｍ）を示す。本書においては、別段の表示しない限り、酵素活性は上記の測定方法に従って、測定される。
【００１６】
本発明のＧＤＨは、フラビンを補欠分子族として要求するフラビン結合型のＧＤＨ（ＦＧＤＨ）である。
【００１７】
本発明のＦＧＤＨは、単離されたＦＧＤＨ又は精製されたＦＧＤＨであることが好ましい。また、本発明のＦＧＤＨは、上記保存に適した溶液中に溶解した状態又は凍結乾燥された状態（例えば、粉末状）で存在してもよい。本発明のＦＧＤＨに関して使用する場合の「単離された」とは、当該酵素以外の成分（例えば、宿主細胞に由来する夾雑タンパク質、他の成分、培養液等）を実質的に含まない状態をいう。具体的には例えば、本発明の単離された酵素は、夾雑タンパク質の含有量が重量換算で全体の約２０％未満、好ましくは約１０％未満、更に好ましくは約５％未満、より一層好ましくは約１％未満である。一方で、本発明のＦＧＤＨは、保存又は酵素活性の測定に適した溶液（例えば、バッファー）中に存在してもよい。
【００１８】
１−２．ポリペプチド
本発明のＦＧＤＨは、下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドで構成されることが好ましい。
（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド；
（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド；
（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド。
配列番号１で示されるアミノ酸配列とは、実施例５に示される通り、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ＲＤ０５６７７９に由来するＦＧＤＨ（以下、ＣｓＧＤＨとも表す）のアミノ酸配列であり、後述の１−３〜１−９の特性を全て満たす。
【００１９】
上記（ｂ）のポリペプチドは、グルコース脱水素酵素活性を保持する限度で、配列番号１に示されるアミノ酸において、１若しくは数個のアミノ酸配残基が置換、欠失、挿入および／または付加（以下、これらを纏めて「変異」とも表す。）されたアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
【００２０】
当該変異がアミノ酸の置換である場合、置換の種類は、特に制限されないが、ＦＧＤＨの表現型に顕著な影響を与えないという観点から保存的アミノ酸置換が好ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、あるアミノ酸残基を、同様の性質の側鎖を有するアミノ酸残基に置換することをいう。アミノ酸残基はその側鎖によって塩基性側鎖（例えばリシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のように、いくつかのファミリーに分類されている。よって、同一のファミリー内のアミノ酸残基間で置換されることが好ましい。
【００２１】
一又は数個の変異は、制限酵素処理、エキソヌクレアーゼやＤＮＡリガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法やランダム突然変異導入法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １３  ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）など公知の手法を利用して、後述する本発明のＣｓＧＤＨをコードするＤＮＡに変異を導入することによって実施することが可能である。また、紫外線照射など他の方法によってもバリアントを得ることができる。バリアントには、ＣｓＧＤＨを保持する微生物の個体差、種や属の違いに基づく場合などの天然に生じるバリアント（例えば、一塩基多型）も含まれる。
【００２２】
また、ＦＧＤＨの活性を維持するという観点からは、ＣｓＧＤＨの活性部位又は基質結合部位に影響を与えない部位において上記変異が存在することが好ましい。
【００２３】
上記（ｃ）のポリペプチドは、グルコース脱水素酵素活性を保持することを限度で、好ましくは下記１−３〜１−９（特に１−３、１−４、１−８、及び１−９）の特性を保持する限度で、配列番号１に示されるアミノ酸配列と比較した同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。好ましくは、本発明のＦＧＤＨが有するアミノ酸配列と配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性は、８５％以上であり、より好ましくは８８％以上、更に好ましくは９０％以上、より更に好ましくは９３％以上、一層好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である。このような一定以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、上述するような公知の遺伝子工学的手法に基づいて作成することができる。
【００２４】
アミノ酸配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本書では、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／においてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、アミノ酸配列の同一性を算出する。
【００２５】
１−３．分子量
本発明のＦＧＤＨを構成するポリペプチド部分の分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合に約６５ｋＤａである。「約６５ｋＤａ」とは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分子量を測定した際に、当業者が、通常６５ｋＤａの位置にバンドがあると判断する範囲を含むことを意味する。「ポリペプチド部分」とは、実質的に糖鎖が結合していない状態のＦＧＤＨを意味する。微生物によって生産された本発明のＦＧＤＨが糖鎖結合型である場合は、それを熱処理や糖加水分解酵素によって処理することにより、糖鎖を除去した状態（即ち、「ポリペプチド部分」）にすることができる。実質的に糖鎖が結合していない状態とは、熱処理や糖加水分解酵素によって処理された糖鎖結合型ＦＧＤＨに不可避的に残存する糖鎖の存在を許容する。よって、ＦＧＤＨが本来的に糖鎖結合型でない場合は、それ自体が「ポリペプチド部分」に相当する。
【００２６】
糖鎖結合型ＦＧＤＨから糖鎖を除去する手段としては、種々の方法が知られている。
本書においては、後述する実施例に示すように、糖鎖結合型のＦＧＤＨを１００℃で１０分間加熱処理をして変性させた後、Ｎ−グリコシダーゼＥｎｄｏ  Ｈ（ニューイングランドバイオラボ社製）を用いて３７℃で６時間処理する方法を適用する。
【００２７】
本発明のＦＧＤＨに糖鎖が結合している場合、その分子量は、グルコース脱水素酵素活性、基質特異性、及び比活性などにネガティブに影響しない限り特に制限されない。例えば、糖鎖が結合した状態の本発明ＦＧＤＨの分子量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの測定において、７０〜９０ｋＤａであることが好ましい。糖鎖結合型のＦＧＤＨは、酵素をより安定にするという観点及び水溶性を高め、水に溶け易くするという観点から好ましい。
【００２８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分子量の測定は、一般的な手法及び装置を用い、市販される分子量マーカーを用いて行うことができる。
【００２９】
１−４．基質特異性
本発明のＦＧＤＨは、基質特異性に優れている。特に、本発明のＦＧＤＨは、Ｄ−グルコースに対する反応性を基準とした場合に、少なくともＤ−キシロースに対する反応性が有意に低い。より具体的に、本発明のＦＧＤＨは、同一濃度のＤ−グルコースに対する反応性を１００％とした場合に、Ｄ−キシロースに対する反応性が同一濃度のＤ−グルコースに対する反応性を１００％として、好ましくは２％以下であり、より好ましくは１．０％以下、更に好ましくは０．７％以下、更に好ましくは０．５％以下である。
【００３０】
本発明のＦＧＤＨは、Ｄ−キシロースに対する反応性が低いことに加えて、Ｄ−ガラクトース及びマルトースに対する反応性も低いことが好ましい。本発明のＦＧＤＨのＤ−ガラクトースに対する反応性は、同一濃度のＤ−グルコースに対する反応性を１００％として、好ましくは２％以下であり、より好ましくは１．０％以下、更に好ましくは０．７％以下、更に好ましくは０．５％以下、更に好ましくは０．２％以下である。
【００３１】
本発明のＦＧＤＨのマルトースに対する反応性は、同一濃度のＤ−グルコースに対する反応性を１００％として、好ましくは２％以下であり、より好ましくは１．０％以下、更に好ましくは０．７％以下、更に好ましくは０．５％以下、更に好ましくは０．３％以下である。
【００３２】
本書において、本発明のＦＧＤＨの各糖類に対する反応性は、上記１−１．に示すグルコースデヒドロゲナーゼ活性の測定方法において、Ｄ−グルコースを他の糖（例えば、Ｄ−キシロース、Ｄ−ガラクトース、又はマルトース）に置き換えて、Ｄ−グルコースの場合の活性を比較することにより求める。但し、比較する場合の各糖類の濃度は５０ｍＭを基準とする。また、基質特異性を測定する際の酵素濃度は、グルコースに対する反応性を測定する時は、反応液の最終酵素濃度を０．１μｇ／ｍｌ、キシロースやマルトース及びガラクトースに対する反応性を測定する時は０．５ｍｇ／ｍｌとする。
【００３３】
以上のような優れた基質特異性を有する本発明のＦＧＤＨは、試料中のグルコース量を正確に測定するための酵素として好ましい。即ち、本発明のＦＧＤＨによれば試料中にマルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースなどの夾雑物が存在する場合であっても目的のＤ−グルコースの量を正確に測定することが可能である。従って本酵素は、試料中にこのような夾雑物の存在が予想又は懸念される用途（典型的には血液中のグルコース量の測定）に適しており、当該用途も含め様々な用途に適用可能であり、汎用性が高い。
【００３４】
１−５．比活性
本発明のＦＧＤＨは、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に供した際に単一のバンドを示す程度に純化された精製標品において、高い比活性を有していることが好ましい。
ＦＧＤＨ精製標品が固体状（粉末状を含む）の場合は、その固体重量をタンパク質重量とみなし、別途酵素活性を測定して比活性を求める。精製標品が液体状の場合は、タンパク質重量をバイオラッド社のタンパク質定量試薬（商品名：バイオラッドプロテインアッセイ濃縮色素試薬）を用いて測定、計算して求める。
本発明のＦＧＤＨを精製標品とする場合は、例えば比活性が３０（Ｕ／ｍｇ）以上、さらに好ましくは５０（Ｕ／ｍｇ）以上、さらに好ましくは８０（Ｕ／ｍｇ）以上、さらに好ましくは１００（Ｕ／ｍｇ）以上、さらに好ましくは１３０（Ｕ／ｍｇ）以上の状態に精製することが好ましい。比活性の上限は特に限定されないが、好ましくは２００（Ｕ／ｍｇ）以下、さらに好ましくは１８０（Ｕ／ｍｇ）以下、さらに好ましくは１６０（Ｕ／ｍｇ）以下、さらに好ましくは１５０（Ｕ／ｍｇ）以下である。
また、本発明のＦＧＤＨの精製標品の最終的な形態は液体状であっても固体状（粉体状を含む）であってもよい。
【００３５】
１−６．至適活性ｐＨ
本発明のＦＧＤＨは、後述する実施例に示す通り、ｐＨ７．０（リン酸緩衝液）において最も高い活性を示すことが好ましい。また、本発明のＦＧＤＨは、ｐＨ６．５〜８．０の範囲において、ｐＨ７．０（リン酸緩衝液）における活性を１００％とした場合と比較して、８０％以上の相対活性を示すことが好ましい。即ち、本発明のＦＧＤＨの至適活性ｐＨは６．５〜８．０であり、好ましくはｐＨ７．０である。
【００３６】
１−７．至適活性温度
本発明のＦＧＤＨの至適活性温度は、３０℃〜５５℃であることが好ましい。ここで「３０℃〜５５℃」とは、典型的に至適活性温度が３０℃〜５５℃付近であり、更にある程度の許容可能な幅を有することを意味する。本明細書において、至適活性温度は、後述する実施例に示す通り、反応液の最終酵素濃度（０．２μｇ／ｍｌ）でリン酸カリウム緩衝溶液（ｐＨ７．０）中における酵素活性を測定することにより求められる。
【００３７】
１−８．ｐＨ安定性
本明細書において、特定のｐＨ条件の下、２Ｕ／ｍＬの酵素を２５℃で１６時間処理した後の残存酵素活性が、処理前の酵素活性と比較して８０％以上である場合に、当該酵素は、当該ｐＨ条件において安定であると判断する。本発明のＦＧＤＨは、少なくともｐＨ３．５〜１０．０の範囲全体で安定であることが好ましい。
【００３８】
１−９．温度安定性
本明細書において、特定の温度条件の下、適当な緩衝液中（例えば酢酸カリウムバッファー（ｐＨ５．０））で２Ｕ／ｍＬの酵素を１５分間処理した後の残存酵素活性が、処理前の酵素活性と比較して８０％以上である場合に、当該酵素は当該温度条件において安定であると判断する。本発明のＦＧＤＨは、少なくとも５５℃以下（即ち、０℃〜５５℃の温度範囲）において安定であることが好ましい。
【００３９】
本発明のＦＧＤＨは、上記１−３〜１−９で示される特徴のうち少なくとも１つ以上を備えていることが好ましく、より好ましくはその２つ以上を備え、更に好ましくはその３つの特性を更に備え、より更に好ましくはその４つ以上を備え、一層好ましくはその５つ以上を備え、より一層好ましくはその６つ以上を備え、特に好ましくはその全てを備える。本発明のＦＧＤＨは、上記１−３〜１−９の特性を如何なる組合せで備えていても良いが、上記１−３及び１−４の特性を備えていることが好ましく、更には上記１−３及び１−４の特性に加えて更に１−５、１−８及び１−９からなる群のうち１つ以上の特性を備えていることが好ましい。
【００４０】
１−１０．由来
本発明のＦＧＤＨは、上述する特性を備える限り、その由来は特に制限されない。本発明のＦＧＤＨは、例えば、コレトトリカム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属及びコレトトリカム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属の有性世代であるグロメレラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ）属に帰属する微生物に由来し得る。コレトトリカム属に属する微生物としては、特に制限されないが、例えば、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ａｃｕｔａｔｕｍ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ
ｂｏｎｉｎｅｎｓｅ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃａｐｓｉｃｉ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃｉｒｃｉｎａｎｓ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｃｏｃｃｏｄｅｓ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｄｅｍａｔｉｕｍ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｆａｌｃａｔｕｍ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｌｉｎｄｅｍｕｔｈｉａｎｕｍ  、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｍｕｓａｅ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｏｒｂｉｃｕｌａｒｅ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ
ｓａｓａｅｃｏｌａ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｔｒｉｃｈｅｌｌｕｍ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｔｒｉｆｏｌｉｉ、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｔｒｕｎｃａｔｕｍ、グロメレラ属に属する微生物としては、特に制限されないが、例えば、Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｃｉｎｇｕｌａｔａ、Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｆｒｕｃｔｉｇｅｎａ、Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｆｕｓａｒｉｏｉｄｅｓ、Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｇｌｙｃｉｎｅｓ、Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ、Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｌａｇｅｎａｒｉａ及び  Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｔｕｃｕｍａｎｅｎｓｉｓなどが例示できる。更に具体的には、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ＲＤ０５６７７９を例示することができる。Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ＲＤ０５６７７９は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター国際連携課に保管された菌株であり、所定の手続を経ることによってその分譲を受けることができる。
【００４１】
本発明のＦＧＤＨが由来する他の生物としては、例えば、土壌や河川・湖沼などの水系又は海洋に存在する微生物や各種動植物の表面または内部に常在する微生物等を挙げることができる。低温環境、火山などの高温環境、深海などの無酸素・高圧・無光環境、油田など特殊な環境に生育する微生物を単離源としてもよい。
【００４２】
本発明のＦＧＤＨには、微生物から直接単離されるＦＧＤＨだけでなく、単離されたＦＧＤＨを蛋白質工学的な方法によりアミノ酸配列等を改変したものや、遺伝子工学的手法により改変したものも含まれる。例えば、前述の、コレトトリカム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属、コレトトリカム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属の有性世代であるグロメレラ（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ）属に分類される微生物等から取得した酵素に改変を加えることによって、上述する特性を備えるように改変した酵素であってもよい。
【００４３】
２．フラビン結合型グルコース脱水素酵素をコードするＤＮＡ
本発明のＤＮＡは、上記１．のＦＧＤＨをコードするＤＮＡであり、具体的には以下の（Ａ）〜（Ｆ）のいずれかである。
（Ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ；
（Ｂ）配列番号２に示される塩基配列からなるＤＮＡ；
（Ｃ）配列番号２に示される塩基配列との同一性が８０％以上である塩基配列を有するＤＮＡであり、且つ、該塩基配列がグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｄ）配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡであり、且つ、該塩基配列がグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｅ）配列番号２に示される塩基配列において、１若しくは数個の塩基が置換、欠失、挿入、付加および／または逆位した塩基配列を有するＤＮＡであり、且つ、該塩基配列がグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ；
（Ｆ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入および／または付加したアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するＤＮＡであり、且つ、該塩基配列がグルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【００４４】
本書において「タンパク質（ポリペプチドまたはＦＧＤＨなどと言うこともある）をコードするＤＮＡ」とは、それを発現させた場合に当該タンパク質が得られるＤＮＡ、即ち、当該タンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有するＤＮＡのことをいう。従ってコドンの縮重によって相違するＤＮＡも含まれる。
【００４５】
本発明のＤＮＡは、それがコードするアミノ酸配列を有するタンパク質が、グルコース脱水素酵素活性及び好ましくは上記１−３〜１−９の特性の少なくとも１つ（特に、上記１−３、１−４、１−５、１−８及び１−９からなる群のうち１つ以上の特性）を備える限り、配列番号２に示される塩基配列との同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは８８％以上、更に好ましくは９０％以上、より更に好ましくは９３％以上、一層好ましくは９５%以上、特に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上である塩基配列を有する。
【００４６】
塩基配列の同一性を算出する方法としては、種々の方法が知られている。例えば、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができる。
本書では、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴにおいてデフォルト（初期設定）のパラメーターを用いることにより、塩基配列の同一性の値（％）を算出する。
【００４７】
本発明のＤＮＡは、それがコードするタンパク質がグルコース脱水素活性を有し、好ましくは上記１−３〜１−９の特性、より好ましくは上記１−３、１−４、１−５、１−８及び１−９からなる群のうち１つ以上の特性）の少なくとも１つを備える限り、配列番号２に示される塩基配列に相補的な塩基配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであっても良い。ここで「ストリンジェントな条件」とは、一般には、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。このようなストリンジェントな条件は当業者に公知であって、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照して設定することができる。
【００４８】
本書では、「ストリンジェントな条件」とは、以下に示す条件を言う。
ハイブリダイゼーション液として５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．１５Ｍ  ＮａＣｌ，  １５ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｉｔｒａｔｅ，  ｐＨ  ７．０）、１×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１％ＳＤＳ、１０％デキストラン硫酸、１０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ、５０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．５））を用いる。
【００４９】
このような条件でハイブリダイズするＤＮＡの中には途中にストップコドンが発生したものや、活性中心の変異により活性を失ったものも含まれ得るが、それらについては、市販の活性発現ベクターに組み込み、適当な宿主で発現させて、酵素活性を公知の手法で測定することによって容易に取り除くことができる。
【００５０】
好適な一実施形態において、本発明のＦＧＤＨをコードするＤＮＡは、単離された状態で存在するＤＮＡである。ここで「単離されたＤＮＡ」とは、天然状態において共存するその他の核酸やタンパク質等の成分から分離された状態であることをいう。但し、単離されたＤＮＡは、天然状態において隣接する核酸配列（例えばプロモーター領域の配列やターミネーター配列など）など一部の他の核酸成分を含んでいてもよい。例えば染色体ＤＮＡの場合の「単離された」状態とは、好ましくは、天然状態において共存する他のＤＮＡ成分を実質的に含まない。一方、ｃＤＮＡ分子など遺伝子工学的手法によって調製されるＤＮＡの場合の「単離された」状態では、好ましくは、細胞成分や培養液などを実質的に含まない。同様に、化学合成によって調製されるＤＮＡの場合の「単離された」状態では、好ましくは、ｄＮＴＰなどの前駆体（原材料）や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まない。尚、それと異なる意味を表すことが明らかでない限り、本明細書において単に「ＤＮＡ」と記載した場合には単離された状態のＤＮＡを意味する。本発明のＤＮＡには、上記（Ａ）〜（Ｆ）のＤＮＡと相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）も含まれる。
【００５１】
本発明のＤＮＡは、本明細書又は添付の配列表が開示する配列情報（特に、配列番号２）を基に、化学的ＤＮＡ合成法により製造、取得することができ、例えば、標準的な遺伝子工学的手法、分子生物学的手法、生化学的手法などを用いることによって容易に調製することができる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ３ｄ  Ｅｄ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．  Ｐｒｅｓｓ  （２００１）等参照）。化学的ＤＮＡ合成法としては、フォスフォアミダイト法による固相合成法を例示することができる。この合成法には自動合成機を利用することができる。
【００５２】
標準的な遺伝子工学的手法としては、具体的には、本発明のＦＧＤＨが発現される適当な起源微生物より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから、本発明のＤＮＡ配列（例えば、配列番号２の塩基配列）に特有の適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択することにより実施できる〔Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ．，  ７８，  ６６１３（１９８１）等参照〕。
【００５３】
ｃＤＮＡライブラリーを調整するための起源微生物は、本発明のＦＧＤＨを発現する微生物であれば特に制限されないが、好ましくは、コレトトリカム属に分類される微生物である。より具体的には、上記１−１０．に示す微生物を挙げることができる。
【００５４】
上記の微生物からの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニング等は、いずれも常法に従って実施することができる。本発明のＤＮＡをｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の方法に従うことができる。例えば、ｃＤＮＡによって産生されるポリペプチドに対して、該ポリペプチド特異抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応するｃＤＮＡクローンを選択する方法、目的のヌクレオチド配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等やこれらの組合せ等を適宜選択して実施することができる。
【００５５】
ＤＮＡの取得に際しては、ＰＣＲ法またはその変法によるＤＮＡ若しくはＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。殊に、ライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法、特に５’−ＲＡＣＥ法〔Ｍ．Ａ．  Ｆｒｏｈｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ．，  ８，  ８９９８  （１９８８）〕等の採用が好適である。
【００５６】
ＰＣＲ法の採用に際して使用されるプライマーは、配列番号２の塩基配列に基づいて適宜設計し合成することができる。尚、増幅させたＤＮＡ若しくはＲＮＡ断片の単離精製は、前記の通り常法に従うことができ、例えばゲル電気泳動法、ハイブリダイゼーション法等によることができる。
【００５７】
本発明のＤＮＡを使用することにより、本発明のＦＧＤＨを容易に大量に、安定して製造することができる。
【００５８】
３．ベクター
本発明のベクターは、上記２．で説明する本発明のＦＧＤＨをコードするＤＮＡが組み込まれたベクターである。ここで「ベクター」とは、それに挿入された核酸分子を細胞等のターゲット内へと輸送することができる核酸性分子（キャリアー）であり、適当な宿主細胞内で本発明のＤＮＡを複製可能であり、且つ、その発現が可能である限り、その種類や構造は特に限定されない。即ち、本発明のベクターは発現ベクターである。ベクターの種類は、宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。ベクターの具体例としては、プラスミドベクター、コスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター（アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター等）等を挙げることができる。また、糸状菌を宿主とする場合に適したベクターや、セルフクローニングに適したベクターを使用することも可能である。
【００５９】
大腸菌を宿主とする場合は、例えば、Ｍ１３ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、ｐＢＲ３２２又はその改変体（ｐＢ３２５、ｐＡＴ１５３、ｐＵＣ８など）など）を使用することができる。酵母を宿主とする場合は、ｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＹＥＳ２等を使用することができる。昆虫細胞を宿主とする場合は、例えば、ｐＡｃ、ｐＶＬ等が使用でき、哺乳類細胞を宿主とする場合は、例えば、ｐＣＤＭ８、ｐＭＴ２ＰＣ等を使用することができるが、これらに限定される訳ではない。
【００６０】
発現ベクターは通常、挿入された核酸の発現に必要なプロモーター配列や発現を促進させるエンハンサー配列等を含む。選択マーカーを含む発現ベクターを使用することもできる。かかる発現ベクターを用いた場合には選択マーカーを利用して発現ベクターの導入の有無（及びその程度）を確認することができる。本発明のＤＮＡのベクターへの挿入、選択マーカー遺伝子の挿入（必要な場合）、プロモーターの挿入（必要な場合）等は標準的な組換えＤＮＡ技術（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １．８４，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照することができる、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いた周知の方法）を用いて行うことができる。
【００６１】
４．形質転換体
本発明は、宿主細胞に本発明のＤＮＡが導入された形質転換体に関する。本発明のＤＮＡの宿主への導入手段は特に制限されないが、例えば、上記３．で説明するベクターに組み込まれた状態で宿主に導入される。宿主細胞は、本発明のＤＮＡを発現してＦＧＤＨを生産することが可能である限り、特に制限されない。具体的には、大腸菌、枯草菌等の原核細胞や、酵母、カビ、昆虫細胞、植物培養細胞、哺乳動物細胞等の真核細胞等を使用することができる。
宿主が原核細胞の場合は、エシェリヒア属、バチルス属、ブレビバチルス属、コリネバクテリウム属などが例として挙げられ、それぞれ、エシェリヒア・コリＣ６００、エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＤＨ５α、バチルス・サブチリス、ブレビバチルス・チョウシネンシス、コリネバクテリウム・グルタミカムなどが例として挙げられる。また、ベクターとしてはｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなどが例として挙げられる。
宿主が酵母の場合は、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、キャンデイダ属、ピキア属、クリプトコッカス属などが例として挙げられ、それぞれ、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、キャンデイダ・ウチリス、ピキア・パストリス、クリプトコッカス・エスピーなどが例として挙げられる。ベクターとしてはｐＡＵＲ１０１、ｐＡＵＲ２２４、ｐＹＥ３２などが挙げられる。
宿主が糸状菌細胞である場合は、アスペルギルス属、トリコデルマ属、コレトトリカム属などが例として挙げられ、それぞれ、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ニガー、トリコデルマ・レセイ、コレトトリカム・ヒエマリス等を例示することができる。
【００６２】
本発明においては、ＦＧＤＨが単離されたコレトトリカム属に帰属する微生物を宿主とすることも好ましい。即ち、形質転換体では、通常、外来性のＤＮＡが宿主細胞中に存在するが、ＤＮＡが由来する微生物を宿主とするいわゆるセルフクローニングによって得られる形質転換体も好適な実施形態である。
【００６３】
本発明の形質転換体は、好ましくは、上記３．に示される発現ベクターを用いたトランスフェクション乃至はトランスフォーメーションによって調製される。形質転換は、一過性であっても安定的な形質転換であってもよい。トランスフェクション及びトランスフォーメーションはリン酸カルシウム共沈降法、エレクトロポーレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、Ｈａｎａｈａｎの方法、酢酸リチウム法、プロトプラスト−ポリエチレングリコール法、等を利用して実施することができる。
【００６４】
本発明の形質転換体は、本発明のＦＧＤＨを産生する能力を有するため、それを用いて効率的に本発明のＦＧＤＨを製造することが可能となる。
【００６５】
５．フラビン結合型グルコース脱水素酵素の製造方法
本発明のＦＧＤＨは、典型的には、本発明のＦＧＤＨの生産能を有する微生物を培養することで製造される。培養に供される微生物は、本発明のＦＧＤＨを産生する能力を有する限り特に制限されず、例えば、上記１．に示すコレトトリカム属に帰属する野生型の微生物及び上記４．に示す形質転換体を好適に利用することができる。
【００６６】
上記のコレトトリカム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属に分類される微生物は、例えば、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター国際連携課に保管された菌株であり、所定の手続を経ることによってその分譲を受けることができる。
【００６７】
培養方法及び培養条件は、本発明のＦＧＤＨが生産される限り特に限定されない。即ち、ＦＧＤＨが生産されることを条件として、使用する微生物の生育に適合した方法及び条件を適宜設定できる。以下に、培養条件として、培地、培養温度、及び培養時間を例示する。
【００６８】
培地としては、使用する微生物が生育可能な培地であれば、特に制限されない。例えば、グルコース、シュクロース、ゲンチオビオース、可溶性デンプン、グリセリン、デキストリン、糖蜜、有機酸等の炭素源、更に硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、あるいは、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、ふすま、肉エキス等の窒素源、更にカリウム塩、マグネシウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マンガン塩、鉄塩、亜鉛塩等の無機塩を添加したものを用いることができる。使用する微生物の生育を促進するためにビタミン、アミノ酸などを培地に添加してもよい。
【００６９】
コレトトリカム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属に分類される微生物を培養して本発明のＦＧＤＨを得る場合は、その微生物の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよい。多くの場合は液体培養で行い、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。ただし、生産性を考えた場合に、固体培養で行った方が有利な場合もある。
【００７０】
培地のｐＨは、培養する微生物の生育に適していればよく、例えば約３〜８、好ましくは約５〜７程度に調整し、培養温度は通常約１０〜５０℃、好ましくは約２５〜３５℃程度で、１〜１５日間、好ましくは３〜７日間程度好気的条件下で培養する。培養法としては例えば振盪培養法、ジャー・ファーメンターによる好気的深部培養法が利用できる。
【００７１】
上記のような条件で培養した後、培養液又は菌体よりＦＧＤＨを回収することが好ましい。ＦＧＤＨを菌体外に分泌する微生物を用いる場合は、例えば培養上清をろ過、遠心処理等することによって不溶物を除去した後、限外ろ過膜による濃縮、硫安沈殿等の塩析、透析、各種クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて分離、精製を行うことにより本酵素を得ることができる。コレトトリカム属に属する微生物が産生するフラビン結合型グルコース脱水素酵素は基本的に分泌型のタンパク質である。
【００７２】
他方、菌体内から回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理、機械的手法、又はリゾチーム等の酵素を利用した手法等によって破砕した後、必要に応じて、ＥＤＴＡ等のキレート剤及び界面活性剤を添加してＦＧＤＨを可溶化し、水溶液として分離採取し、分離、精製を行うことにより本酵素を得ることができる。ろ過、遠心処理などによって予め培養液から菌体を回収した後、上記一連の工程（菌体の破砕、分離、精製）を行ってもよい。
【００７３】
精製は、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、さらに硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈殿法により沈殿処理、加熱処理や等電点処理、吸着剤あるいはゲルろ過剤などによるゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等を適宜組み合わせて実施することができる。
【００７４】
カラムクロマトグラフィーを用いる場合は、例えば、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ゲル（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）、オクチルセファロースＣＬ−６Ｂ（ＧＥヘルスケア  バイオサイエンス社製）等を用いることができる。該精製酵素標品は、電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的に単一のバンドを示す程度に純化されていることが好ましい。
【００７５】
なお、培養液からのグルコース脱水素酵素活性を有するタンパク質の採取（抽出、精製など）にあたっては、グルコース脱水素酵素活性、マルトース作用性、熱安定性などのうちいずれか１つ以上を指標に行ってもよい。
【００７６】
各精製工程では原則としてＧＤＨ活性を指標として分画を行い、次のステップへと進む。但し、予備試験などによって、適切な条件を予め設定可能な場合にはこの限りでない。
【００７７】
組換えタンパク質として本酵素を得ることにすれば種々の修飾が可能である。例えば、本酵素をコードするＤＮＡと他の適当なＤＮＡとを同じベクターに挿入し、当該ベクターを用いて組換えタンパク質の生産を行えば、任意のペプチドないしタンパク質が連結された組換えタンパク質からなる本酵素を得ることができる。また、糖鎖及び／又は脂質の付加や、あるいはＮ末端若しくはＣ末端のプロセッシングが生ずるような修飾を施してもよい。以上のような修飾により、組換えタンパク質の抽出、精製の簡便化、又は生物学的機能の付加等が可能である。
【００７８】
６．グルコースの測定方法
グルコースデヒドロゲナーゼを用いたグルコースの測定方法は既に当該技術分野において確立されている。よって、公知の方法に従い、本発明のＦＧＤＨを用いて、各種試料中のグルコースの量又は濃度を測定することができる。本発明のＦＧＤＨを用いてグルコースの濃度又は量が測定可能である限り、その態様は特に制限されないが、例えば、本発明のＦＧＤＨを試料中のグルコースに作用させ、グルコースの脱水素反応に伴う電子受容体（例えば、ＤＣＰＩＰ）の構造変化を吸光度で測定することにより実施することができる。より具体的には、上記１−１．に示す方法に従って、実施することができる。本発明に従った、グルコース濃度の測定は、試料に本発明のＦＧＤＨを添加すること、又は添加して混合することにより実施することができる。グルコースを含有する試料は、特に制限されないが、例えば、血液、飲料、食品等を挙げることができる。グルコース濃度又は量の測定が可能である限り、試料に添加する酵素の量はと特に制限されない。
【００７９】
後述するセンサの形態でのグルコース濃度の測定は、例えば、以下のようにして実施することができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明のＦＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【００８０】
７．グルコースアッセイキット
本発明のグルコースアッセイキットは、本発明のＦＧＤＨを少なくとも１回のアッセイに十分な量で含む。典型的には、キットは、本発明のＦＧＤＨに加えて、アッセイに必要な緩衝液、メディエーター、キャリブレーションカーブ作製のためのグルコース標準溶液、ならびに使用の指針を含む。本発明のＦＧＤＨは種々の形態で、例えば、凍結乾燥された試薬として、または適切な保存溶液中の溶液として提供することができる。
【００８１】
８．グルコースセンサ
本発明はまた、本発明のＦＧＤＨを用いるグルコースセンサを提供する。本発明のグルコースセンサは、電極として、カーボン電極、金電極、白金電極などを用い、この電極上に本発明の酵素を固定化することで作製することができる。固定化方法としては、架橋試薬を用いる方法、高分子マトリックス中に封入する方法、透析膜で被覆する方法、光架橋性ポリマー、導電性ポリマー、酸化還元ポリマーなどがある。その他、フェロセン又はその誘導体に代表される電子メディエーターとともにポリマー中に固定あるいは電極上に吸着固定してもよく、またこれらを組み合わせて用いてもよい。本発明のＦＧＤＨは、熱安定性に優れるため、比較的高温度（例えば、５０℃や５５℃）の条件下で固定化を実施することができる。典型的には、グルタルアルデヒドを用いて本発明のＦＧＤＨをカーボン電極上に固定化した後、アミン基を有する試薬で処理してグルタルアルデヒドをブロッキングすることができる。
【００８２】
センサーを用いたグルコース濃度の測定は、以下のようにして行うことができる。恒温セルに緩衝液を入れ、一定温度に維持する。メディエーターとしては、フェリシアン化カリウム、フェナジンメトサルフェートなどを用いることができる。作用電極として本発明のＦＧＤＨを固定化した電極を用い、対極（例えば白金電極）および参照電極（例えばＡｇ／ＡｇＣｌ電極）を用いる。カーボン電極に一定の電圧を印加して、電流が定常になった後、グルコースを含む試料を加えて電流の増加を測定する。標準濃度のグルコース溶液により作製したキャリブレーションカーブに従い、試料中のグルコース濃度を計算することができる。
【００８３】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。以下の実施例の記載はいかなる面においても本発明を限定しない。
【実施例】
【００８４】
実施例１  菌株の復元
独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジーセンター国際連携課から、コレトトリカム属に帰属する菌株を入手した。入手した菌株は２５℃で３日間から７日間、静置培養することで復元させた。復元培地としては、ＤＰ培地（デキストリン２．０％、ポリペプトン１．０％、ＫＨ２ＰＯ４１．０％、アガロース１．５％）を使用した。【００８５】
実施例２  培養上清の回収
小麦胚芽２ｇ、２％グルコース溶液２ｍＬを含む培地をオートクレーブで１２０℃、２０分間滅菌した固体培地に、実施例１で復元させたコレトトリカム属の各菌株を一白金耳植菌し、２５℃で５日間から７日間静置培養した。培養後、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を１ｍＬ添加し、ボルテックスで十分に懸濁した。懸濁液に少量のガラスビーズを加えた後、ビーズショッカー（安井器械（株）製）で３，０００ｒｐｍ、３分間×２回の条件で破砕し、４℃、２，０００×ｇ、５分間の条件で遠心分離して、回収した上清を粗酵素液とした。【００８６】
実施例３  グルコース脱水素酵素活性の確認
実施例２で得た粗酵素液中のグルコース脱水素酵素活性を、上記１−１．に示したグルコースデヒドロゲナーゼ活性測定方法を用いて測定した。その結果を表１に示す。【００８７】
【表１】
0005435180.tif 000002
【００８８】
表１に示す通り、Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ＲＤ０５６７７９由来の粗酵素液にＧＤＨ活性が存在することが確認された。【００８９】
実施例４  Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ＲＤ０５６７７９由来ＧＤＨの精製
５０ｍＬのＹＰＤ培地（０．５％酵母エキス、１％ペプトン、２％グルコース）を５００ｍＬ坂口フラスコに入れ、オートクレーブで滅菌し、前培養用の培地とした。予めＤＰプレート培地で復元したＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ＲＤ０５６７７９を前培養培地に一白金耳植菌し、２５℃、１８０ｒｐｍで５日間振とう培養し、種培養液とした。【００９０】
次に、６．０Ｌの生産培地（イーストイクストラクト３．０％、グリセロール３．０％、ｐＨ６．０）を１０Ｌ容ジャーファーメンターに入れ、オートクレーブで滅菌し、本培養培地とした。５０ｍＬの種培養液を本培養培地に植菌し、培養温度２５℃、攪拌速度４００ｒｐｍ、通気量２．０Ｌ／分、管内圧０．２ＭＰａの条件で５日間培養した。その後、培養液をろ過し、そのろ液を分画分子量３０，０００のＵＦ膜（ミリポア（株）製）を用いて濃縮し、濃縮液に５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加えるという工程を繰り返し、低分子を取り除いた。【００９１】
その後、脱塩液に０．４飽和になるように硫酸アンモニウムを徐々に添加し、予め０．４飽和の硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した４００ｍＬのＰＳセファロースＦａｓｔＦｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）カラムにかけ、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）のリニアグラジエントで溶出させた。そして、溶出されたＧＤＨ画分を分画分子量１０，０００の中空糸膜（スペクトラムラボラトリーズ製）で濃縮後、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＤＥＡＥセファロースＦａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア製）カラムにかけ、０．５ＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）のリニアグラジエントで溶出させた。さらに、０．４飽和の硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化した５ｍＬのＲｅｓｏｒｃｅ  Ｐｈｅ（ＧＥヘルスケア製）カラムにかけ、精製酵素を得た。得られた精製酵素をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（Ｐｈａｓｔ  Ｇｅｌ  １０−１５％  Ｐｈａｓｔｓｙｓｔｅｍ  ＧＥヘルスケア製）に供した。この際、タンパク質分子量マーカーとしてフォスフォリラーゼｂ（９７，４００ダルトン）、ウシ血清アルブミン（６６，２６７ダルトン）、アルドラーゼ（４２，４００ダルトン）、カルボニックアンヒドラーゼ（３０，０００ダルトン）、トリプシンインヒビター（２０，１００ダルトン）を用いた。【００９２】
その結果、単一のバンドが得られたことから、ＧＤＨが十分に精製されていることを確認した。分子量マーカーと比較した移動度から、精製したＧＤＨの分子量は７８，０００〜９０，０００ダルトンであることが判明した。【００９３】
実施例５  フラビン結合型酵素であることの確認
実施例４で精製した酵素を５０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で透析し、３００−６００ｎｍにおける吸収スペクトルを分光光度計Ｕ−３２１０（日立ハイテクノロジーズ社製）により測定した。その結果、波長３８０〜３９０ｎｍ付近および波長４５０〜４７０ｎｍ付近に極大を示す２つのピークが確認された（図１）。このような吸収スペクトルの形状から、本発明のＧＤＨがフラビン結合型タンパク質（すなわちＦＧＤＨ）であることが強く示唆された（以下このＧＤＨをＣｓＧＤＨとも表す。）。【００９４】
実施例６  単離されたＣｓＧＤＨのペプチド部分の分子量【００９５】
実施例４で精製したＣｓＧＤＨを１００℃、１０分間、加熱処理して変性させた後、５ＵのＥｎｄｏ  Ｈ（ニューイングランドバイオラボ社製）で３７℃、１時間処理し、タンパク質に付加している糖鎖を分解した。その後、実施例４と同様の方法でＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法で測定を行った。分子量マーカーは、実施例４と同じものを使用した。その結果、精製したＣｓＧＤＨのポリペプチド部分の分子量は約６５，０００ダルトンであることが判明した。電気泳動の結果を図２に示す。【００９６】
実施例６  基質特異性
上記１−１．に示したＧＤＨの活性測定法に従い、実施例４で精製したＣｓＧＤＨについて、Ｄ−グルコース、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースを基質とした場合の活性を測定した。Ｄ−グルコースを基質とした場合の活性を１００％とし、それと比較した他の糖に対する活性を求めた。各糖の濃度は５０ｍＭとした。結果を表２に示す。なお、酵素濃度については、グルコースに対しては最終濃度０．１μｇ／ｍｌ、それ以外の糖については、最終濃度０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で反応を行った。また、本実施例については、下記の酵素活性測定条件で測定した。
１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） １．７９ｍＬ、１．２５Ｍ Ｄ−グルコース溶液
０．０８ｍＬおよび２０ｍＭ ＤＣＰＩＰ溶液 ０．０１ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温する。次いで、２０ｍＭ ＰＭＳ溶液 ０．０２ｍＬおよび酵素サンプル溶液０．１ｍＬを添加し、反応を開始する。反応開始時、および、経時的な吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を求め、次式に従いフラビン結合型ＧＤＨ活性を算出する。この際、フラビン結合型ＧＤＨ活性は、３７℃において濃度５０ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１μｍｏｌのＤＣＰＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義する。
活性（Ｕ／ｍＬ）＝
｛−（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×２．０×希釈倍率｝／｛１６．３×０．１×１．０｝
なお、式中の２．０は反応試薬＋酵素試薬の液量（ｍＬ）、１６．３は本活性測定条件
におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／μｍｏｌ）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）
、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、ΔＯＤＢＬＡＮＫは１０ｍＭ
酢酸緩衝液を酵素サンプル溶液の代わりに添加して反応開始した場合の６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量を表す。【００９７】
【表２】
0005435180.tif 000003
【００９８】
表２の結果から、精製ＣｓＧＤＨの基質特異性は、Ｄ−グルコースに対する活性値を１００％とした場合、マルトース、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−キシロースに対する見かけの活性は、それぞれ０．３％以下、０，２％以下、０．５％以下であり、本発明のＣＳＧＤＨは基質特異性に優れていることが示された。【００９９】
実施例７  至適活性ｐＨ
実施例４で得られた精製ＣｓＧＤＨ酵素液（０．５Ｕ／ｍＬ）を用いて、至適ｐＨを調べた。１００ｍＭ
酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．０−５．５、図中■印でプロット）、１００ｍＭ ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ５．５−６．５、図中□印でプロット）、１００ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０−８．０、図中▲でプロット）を用い、それぞれのｐＨにおいて、温度３７℃にて酵素反応を行い、相対活性を比較した。結果を図３に示す。【０１００】
その結果、精製ＣｓＧＤＨの至適活性ｐＨは、リン酸カリウム緩衝液を使用した場合のｐＨ７．０において最も高い活性値を示した。また、ｐＨ６．５〜８．０の範囲で、ｐＨ７．０における活性を１００％とした場合と比較して８０％以上の相対活性を示した。以上のことから、精製ＣｓＧＤＨの至適活性ｐＨはｐＨ６．５〜８．０であることが示された。【０１０１】
実施例８  至適活性温度
実施例４で得られた精製ＣｓＧＤＨ酵素液（３．５μｇ／ｍｌ）を用いて、至適活性温度を調べた。２５℃、３０℃、３７℃、４０℃、４６℃、４９℃、５０℃、５５℃、６０℃における活性を求めた。結果を図４に示す。なお、本実施例については、下記の酵素活性測定条件で測定した。
１００ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ７．０） １．７９ｍＬ、１．２５Ｍ Ｄ−グルコース溶液
０．０８ｍＬおよび２０ｍＭＤＣＰＩＰ溶液０．０１ｍＬを混合し、３７℃で５分間保温する。次いで、２０ｍＭ ＰＭＳ溶液 ０．０２ｍＬおよび酵素サンプル溶液０．１ｍＬを添加し、反応を開始する。反応開始時、および、経時的な吸光度を測定し、酵素反応の進行に伴う６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量（ΔＡ６００）を求め、次式に従いフラビン結合型ＧＤＨ活性を算出する。この際、フラビン結合型ＧＤＨ活性は、３７℃において濃度５０ｍＭのＤ−グルコース存在下で１分間に１μｍｏｌのＤＣＰＩＰを還元する酵素量を１Ｕと定義する。
活性（Ｕ／ｍＬ）＝
｛−（ΔＯＤＴＥＳＴ−ΔＯＤＢＬＡＮＫ）×２．０×希釈倍率｝／｛１６．３×０．１×１．０｝
なお、式中の２．０は反応試薬＋酵素試薬の液量（ｍＬ）、１６．３は本活性測定条件
におけるミリモル分子吸光係数（ｃｍ２／μｍｏｌ）、０．１は酵素溶液の液量（ｍＬ）
、１．０はセルの光路長（ｃｍ）、ΔＯＤＢＬＡＮＫは１０ｍＭ
酢酸緩衝液を酵素サンプル溶液の代わりに添加して反応開始した場合の６００ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの減少量を表す。【０１０２】
その結果、精製ＣｓＧＤＨは、４６℃〜４９℃の範囲で最も高い活性値を示し、最大の活性値に対して８０％以上の相対活性を示す温度範囲は４６℃〜５８℃であった。以上のことから、精製ＣｓＧＤＨの至適活性温度は４６℃〜５８℃であることが示された。【０１０３】
実施例９  ｐＨ安定性
実施例４で得られた精製ＣｓＧＤＨ酵素液（２Ｕ／ｍＬ）を用いて、ｐＨ安定性を調べた。１００ｍＭ  グリシン−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ２．５−ｐＨ３．５：図中■印でプロット）１００ｍＭ  酢酸−カリウム緩衝液（ｐＨ３．０−ｐＨ５．５：図中□印でプロット）、１００ｍＭ  ＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ５．５−ｐＨ６．５：図中▲印でプロット）、１００ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０−ｐＨ８．０：図中△印でプロット）、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５−ｐＨ９．０：図中●印でプロット）、１００ｍＭ  グリシン−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．０−ｐＨ１０．５：図中○印でプロット）を用い、２５℃、１６時間、各緩衝液中で酵素を維持した後のグルコースを基質とした場合の活性を測定した。処理後の活性値と処理前の活性値を比較し、残存活性率を求めた。結果を図５に示す。【０１０４】
その結果、精製ＣｓＧＤＨは、ｐＨ３．５〜ｐＨ１０．０の範囲で８０％以上の活性残存率を示した。以上のことから、精製ＣｓＧＤＨの安定ｐＨ域はｐＨ３．５〜ｐＨ１０．０であることが示された。【０１０５】
実施例１０  温度安定性
実施例４で得られた精製ＣｓＧＤＨ酵素液（２Ｕ／ｍＬ）を用いて、温度安定性を調べた。１００ｍＭ酢酸カリウム緩衝液（ｐＨ５．０）を用いて、ＣｓＧＤＨ酵素液を各温度（４℃、３０℃、４０℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃）で１５分間処理した後、ＧＤＨ活性を測定し、処理前のＧＤＨ活性と比較して残存率を測定した。結果を図６に示す。【０１０６】
その結果、精製ＣｓＧＤＨは、４℃〜５５℃の範囲の温度での処理後、８０％以上の残存率を有していた。以上のことから、精製ＣｓＧＤＨは、５５℃以下で安定であることが示された。
なお、図６によれば、精製ＣｓＧＤＨは、４℃〜５０℃の範囲の温度での処理後では、９０％以上の残存率を有しており、５０℃以下ではきわめて安定であることが示された。【０１０７】
実施例１１  比活性の測定
実施例４で得られた精製ＣｓＧＤＨ酵素液（７μｇ／ｍＬ）を用いて、電子受容体としてＤＣＰＩＰのみを用いる方法で、グルコースデヒドロゲナーゼ活性を調べた。その結果、比活性は１３８（Ｕ／ｍｇ）と計算された。また、特許文献、ＷＯ２０１１／０６８０５０Ａ１に記載のアスペルギルス・ニガー由来グルコースオキシダーゼの変異酵素（Ｄ４４６ＨおよびＶ５８２Ｐの二重変異体）は、本発明同様に、基質特異性に優れた酵素であるが、特許文献に記載の通り、サッカロマイセス・セルビジエで発現させ、各種、クロマトグラフィーにより、変異酵素を調製し、上記、同条件でグルコースデヒドロゲナーゼ活性を測定した結果、比活性は２７（Ｕ／ｍｇ）と計算された。よって、本発明のＣｓＧＤＨは、基質特異性のみならず、比活性の点でも優れていることが確認された。【０１０８】
実施例１２  コレトトリカム属由来フラビン結合型ＧＤＨ遺伝子のクローニングと形質転換体による発現
（１）Ｔｏｔａｌ―ＲＮＡの調製
Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ＲＤ０５６７７９株をＧＤＨ生産培地（イーストイクストラクト３．０％、グリセロール３．０％、ｐＨ６．０）６０ｍＬに接種し、５日、２５℃で振とう培養した。この培養液を濾紙濾過し、菌糸体を回収した。得られた菌糸を液体窒素中で凍結させ、乳鉢を用いて菌糸を粉砕した。次いで、ホットフェノール法により、粉砕した菌体からＴｏｔａｌ―ＲＮＡを得た。【０１０９】
（２）ＧＤＨ部分アミノ酸配列の決定
実施例４より得られた精製ＣｓＧＤＨをＮｕ−ＰＡＧＥ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。電気泳動後のゲルをＳｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて染色し、当該酵素の分子量に相当するバンド部分を切り出した。切り出したゲル断片を外部機関に委託し、その中に含まれるタンパク質の内部アミノ酸配列情報を取得した。その結果、得られたアミノ酸配列は、ＫＧＴＡＤＷＳＷＤＧＩＬＰＦＦＫＫ（配列番号３）およびＫＹＤＡＳＹＷＧＤＳＳＥＩＹＡＧＷＰＲ（配列番号４）であった。【０１１０】
（３）ＧＤＨ遺伝子配列の決定
上記の部分アミノ酸配列情報に基づき、ミックス塩基を含有するディジェネレートプライマー（プライマーの一例を配列番号５（フォワードプライマー）、配列番号６（リバースプライマー）に示す）を作製した。なお、配列番号５および６に記載の１文字表記において、混合塩基はそれぞれ、ｈ＝ａ＋ｃ＋ｔ、ｒ＝ａ＋ｇ、ｙ＝ｃ＋ｔ、ｄ＝ａ＋ｇ＋ｔを表す。上記（１）にて調製したＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ＲＤ０５６７７９株のＴｏｔａｌ−ＲＮＡをテンプレートとし、Ｓｍａｒｔｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（クロンテック社製）を用いて、本キットのプロトコールに従ってＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲによるｃＤＮＡ増幅には配列番号５、６に示すディジェネレートプライマーを用いた。反応液をアガロースゲル電気泳動に供したところ、１００ｂｐ程度の長さに相当するシングルバンドが確認された。このバンドに含まれる増幅ＤＮＡ断片を精製し、Ｔａｒｇｅｔ  ｃｌｏｎｅ−ｐｌｕｓ−（東洋紡績社製）を用いて、ｐＴＡ２（東洋紡績社製）に前記増幅ＤＮＡ断片をライゲーションすることにより、組換えプラスミドｐＴＡ−Ｃ５６７７９ＧＤＨｐａｒｔｉａｌを構築した。【０１１１】
次いで、得られたｐＴＡ−Ｃ５６７７９ＧＤＨｐａｒｔｉａｌを用い、公知のヒートショック法により大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（東洋紡績社製）を形質転換した。得られた形質転換体からＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｐｌａｓｍｉｄ−（東洋紡績社製）を用いてプラスミドを抽出・精製し、プラスミド中に含まれる前記増幅ＤＮＡ断片の塩基配列を決定した（１１１ｂｐ）。【０１１２】
得られた前記増幅ＤＮＡ断片の配列情報を元に、Ｓｍａｒｔｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（クロンテック社製）を用いて３’側及び５‘側のＧＤＨ遺伝子未知領域を決定した。いずれも各キットのプロトコールに従い、３’ＲＡＣＥではでは本キット付属のＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ  Ｍｉｘおよび配列番号７に示すプライマーを用いて１ｓｔＰＣＲを行い、続いて、本キット付属のＮｅｓｔｅｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａおよび配列番号８に示すプライマーを用いてＮｅｓｔｅｄＰＣＲを行った。５’ＲＡＣＥではでは本キット付属のＵｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａ  Ｍｉｘおよび配列番号９に示すプライマーを用いて１ｓｔＰＣＲを行い、続いて、本キット付属のＮｅｓｔｅｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ａおよび配列番号１０に示すプライマーを用いてＮｅｓｔｅｄＰＣＲを行った。前記の方法に従って得られた複数のプラスミド中に含まれるＤＮＡ断片の塩基配列解析を行った結果、配列番号２に示す全鎖長１９０８ｂｐのＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ由来ＧＤＨ遺伝子配列が明らかとなった。当該遺伝子配列により予測した当該酵素遺伝子のアミノ酸配列を配列番号１に示す。【０１１３】
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。【０１１４】
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容が援用によってここに取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明のＣｓＧＤＨは基質特異性に優れ、グルコース量をより正確に測定することを可能にする。従って本発明のＣｓＧＤＨは血糖値の測定などに好適といえる。
【要約】
【課題】基質特異性、比活性、及び熱安定性等に優れることにより、ＳＭＢＧ用センサーへの利用に適した新たなグルコース脱水素酵素を提供する
【解決手段】下記の（ａ）〜（ｃ）のいずれかのポリペプチドからなるフラビン結合型グルコース脱水素酵素；（ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、（ｂ）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位したアミノ酸配列からなり、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド、（ｃ）配列番号１に示されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列からなり、かつ、グルコース脱水素酵素活性を有するポリペプチド。
【選択図】なし【図１】
0005435180.tif 000004
【図２】
0005435180.tif 000005
【図３】
0005435180.tif 000006
【図４】
0005435180.tif 000007
【図５】
0005435180.tif 000008
【図６】
0005435180.tif 000009
【図７】
0005435180.tif 000010
【配列表】
0005435180000001.app