(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
センス鎖およびアンチセンス鎖を含む単離ｉＲＮＡ物質であって、前記センス鎖およびアンチセンス鎖がＲＮＡ二重鎖を形成し、前記アンチセンス鎖が配列番号３８２の配列と相補的なヌクレオチド配列を含んでなることを特徴とするｉＲＮＡ物質。
【請求項２】
前記センス鎖が、配列番号６３４の配列を含んでなり、前記アンチセンス鎖が配列番号６３５の配列を含んでなる、請求項１に記載のｉＲＮＡ物質。
【請求項３】
前記センス鎖が、配列番号６３４の配列からなり、前記アンチセンス鎖が配列番号６３５の配列からなる、請求項１に記載のｉＲＮＡ物質。
【請求項４】
前記センス鎖が、配列番号６３６の配列を含んでなり、前記アンチセンス鎖が配列番号６３７の配列を含んでなる、請求項１に記載のｉＲＮＡ物質。
【請求項５】
前記センス鎖が、配列番号６３６の配列からなり、前記アンチセンス鎖が配列番号６３７の配列からなる、請求項１に記載のｉＲＮＡ物質。
【請求項６】
前記センス鎖が、配列番号６３８の配列を含んでなり、前記アンチセンス鎖が配列番号６３９の配列を含んでなる、請求項１に記載のｉＲＮＡ物質。
【請求項７】
前記センス鎖が、配列番号６３８の配列からなり、前記アンチセンス鎖が配列番号６３９の配列からなる、請求項１に記載のｉＲＮＡ物質。
【請求項８】
前記センス鎖が、配列番号６４０の配列を含んでなり、前記アンチセンス鎖が配列番号６４１の配列を含んでなる、請求項１に記載のｉＲＮＡ物質。
【請求項９】
前記センス鎖が、配列番号６４０の配列からなり、前記アンチセンス鎖が配列番号６４１の配列からなる、請求項１に記載のｉＲＮＡ物質。
【請求項１０】
非ヌクレオチド部分をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載のｉＲＮＡ物質。
【請求項１１】
前記非ヌクレオチド部分が、ナプロキセン、コレステロール、チオコレステロール、コラン酸およびレチノイン酸から選択されることを特徴とする、請求項１０に記載のｉＲＮＡ物質。
【請求項１２】
前記センス配列およびアンチセンス配列が核酸分解に対して安定化されている、請求項１０または１１に記載のｉＲＮＡ物質。
【請求項１３】
１つまたは２つの３’突出部分をさらに含み、前記３’突出部分が１〜６ヌクレオチドを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のｉＲＮＡ物質。
【請求項１４】
（ａ）アンチセンス配列およびセンス配列の５’端の最初のヌクレオチド間結合にあるホスホロチオエート；
（ｂ）アンチセンス配列およびセンス配列の３’端の最初のヌクレオチド間結合にあるホスホロチオエート；または
（ｃ）（ａ）と（ｂ）の両方
をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のｉＲＮＡ物質。
【請求項１５】
２’修飾ヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のｉＲＮＡ物質。
【請求項１６】
前記２’修飾ヌクレオチドが、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、および２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセタミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）からなる群から選択される修飾を含んでなる、請求項１５に記載のｉＲＮＡ物質。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載のｉＲＮＡ物質を含む、対象の細胞中のＶＥＧＦのＲＮＡ量を減少させるための組成物。
【請求項１８】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載のｉＲＮＡ物質を作製する方法であって、前記ｉＲＮＡ物質の合成を含み、前記センス鎖およびアンチセンス鎖が、核酸分解に対して該ｉＲＮＡ物質を安定化する修飾を少なくとも１つ含んでなることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載のｉＲＮＡ物質と、薬剤として許容可能な担体とを含んでなる医薬組成物。
【請求項２０】
有効量の請求項１〜１６のいずれか１項に記載のｉＲＮＡ物質を含む、ＶＥＧＦの発現を阻害するための組成物。
【請求項２１】
成人黄斑変性症（ＡＭＤ）を有する、あるいは成人黄斑変性症のリスクを有すると診断されたヒトを治療するための組成物であって、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のｉＲＮＡ物質を含む、組成物。
【請求項２２】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載のｉＲＮＡ物質を含む、腫瘍または転移性がんを治療するための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）の発現を阻害することが可能であるｉＲＮＡ物質の分野に属する。本発明はさらに、ＶＥＧＦの望ましくない発現と関係がある状態または障害、例えば加齢黄斑変性症または糖尿病性網膜症を治療するための、ＶＥＧＦ配列を標的とするｓｉＲＮＡの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連出願）
本願は、２００４年３月１２日に出願された米国仮出願第６０／５５２，６２０号、２００４年４月５日に出願された米国仮出願第６０／５５９，８２４号、および２００５年１月２５日に出願された米国仮出願第６０／６４７，１９１号の特典を主張するものである。３つの仮出願はいずれも、それらの全容を本願明細書に援用する。
【０００３】
（背景）
ＶＥＧＦ（血管透過性因子、ＶＰＦとしても知られている）は、血管形成、上皮細胞の増殖、および内皮細胞の生存を刺激する多機能性サイトカインである。ＶＥＧＦは広くさまざまな組織によって生成可能であり、その過剰発現または異常な発現は、加齢黄斑変性症および糖尿病性網膜症などの網膜障害、がん、喘息、および他の血管形成障害などのさまざまな障害をもたらす可能性がある。
【０００４】
黄斑変性症は米国における失明の主な原因であり、この障害の頻度は年齢と共に増大する。黄斑変性症は、網膜の黄斑領域中の視覚細胞が機能不全状態になるかあるいは機能を失い、重要な中心部の視力または細部の視力の弱体的消失をもたらす可能性がある疾患群を指す。黄斑変性症の最も一般的な形である成人黄斑変性症（ＡＭＤ）は、２つの主な種類として生じる。ＡＭＤを有する人々の９０パーセントは、「乾燥型」黄斑変性症として記載される種類を有する。網膜のある領域が侵され、これが黄斑中の細胞のゆっくりとした衰弱、および中心視力の段階的低下をもたらす。他の種類のＡＭＤは「湿潤型」黄斑変性症である。ＡＭＤを有する人々のわずか１０パーセントがこの型であるが、この型は該疾患が原因である失明の９０％を占める。乾燥型ＡＭＤが進行すると、新しい血管が成長し始め、「湿潤型」ＡＭＤを引き起こすこともある。これらの新しい血管は、黄斑下で血液および体液を漏出することが多い。これが黄斑に対する急激な損傷を引き起こし、短時間に中心視力の低下をもたらす可能性がある。ＶＥＧＦを標的とするｉＲＮＡ物質は、湿潤型および乾燥型黄斑変性症を治療するのに有用である可能性がある。
【０００５】
ＲＮＡ干渉すなわち「ＲＮＡｉ」は、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を線虫に導入すると遺伝子発現を阻害し得るという観察結果を説明するために、ファイヤー（Ｆｉｒｅ）および共同研究者によって最初に造り出された用語である（非特許文献１）。低分子ｄｓＲＮＡは脊椎動物を含めた多くの生物において、遺伝子特異的な転写後のサイレンシング（発現抑制）を誘導し、遺伝子機能を研究するための新しいツールを提供している。ＲＮＡｉは、新しい種類の治療剤を開発する方法として提案されている。しかし、今日まで、ＲＮＡｉを治療に使用し得るという証拠は実証されておらず、大部分は示唆にとどまっている状態である。
本発明は、ＶＥＧＦ遺伝子の詳細な遺伝子歩行を行い、該分子を分解に対して安定化し、細胞への取り込みおよび標的化を増大させるために使用可能な修飾の詳細な構造分析を行うことによって、当分野の技術を進展させるものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ファイヤーら（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ、第３９１巻、ｐ．８０６〜８１１、１９９８年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、ＶＥＧＦの発現を調節するのに有用な化合物、組成物および方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ＶＥＧＦの発現を調節するのに有用な化合物、組成物および方法を提供する。本発明は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子などの小さな核酸分子（まとめて一般用語ｉＲＮＡ物質に該当する）を用いたＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によりＶＥＧＦ活性の発現を調節するのに有用な、化合物、組成物および方法を提供する。ｉＲＮＡ物質は、修飾されていない核酸分子であってもよいし、化学的に修飾された核酸分子であってもよい。ｉＲＮＡ物質は化学的に合成されてもよいし、ベクターから発現されてもよいし、あるいは酵素によって合成されてもよい。本発明は、ＲＮＡｉによって細胞中および哺乳動物中のＶＥＧＦ遺伝子の発現または活性を調節することが可能な、化学的に修飾されたさまざまな合成ｉＲＮＡ物質を提供する。化学的に修飾されたｉＲＮＡ物質を使用することにより、分解に対する耐性の増大、標的部分に対する特異性の向上、細胞への取り込みの増大などによってｉＲＮＡ物質の１つまたは複数の性質を改善し得る。
【０００９】
１態様では本発明は、ＶＥＧＦ遺伝子の発現を下方制御するｉＲＮＡ物質を提供する。ＶＥＧＦ遺伝子とは、ＶＥＧＦをコードする配列および／またはＶＥＧＦのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の５’または３’に存在し得るものなどのＶＥＧＦ制御配列を含み得る。
【００１０】
１実施形態では、本発明は、センス配列およびアンチセンス配列を含む単離ｉＲＮＡ物質であって、そのセンス配列およびアンチセンス配列がＲＮＡ二重鎖を形成し得ることを特徴とする単離ｉＲＮＡ物質を提供する。センス配列は、ＶＥＧＦ配列の約１９〜２３ヌクレオチドの標的配列と同一または実質的に同一なヌクレオチド配列を含み得る。１実施形態では、標的とされるＶＥＧＦ配列は、配列番号２〜４０１のいずれか１つの配列を含む（表１参照）。
【００１１】
１実施形態では、ｉＲＮＡ物質のセンス配列は、ＶＥＧＦ標的配列のいずれかと同一または実質的に同一である配列、例えば表１に提示するセンス配列、配列番号２〜４０１のいずれかと実質的に同一である配列を含む。他の実施形態では、ｉＲＮＡ物質のアンチセンス配列は、標的配列のいずれかと相補的あるいは実質的に相補的な配列、例えば配列番号２〜４０１のいずれかと相補的な配列を含み得る。「実質的に同一」とは、ヌクレオチド配列間のミスマッチが５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、または１％未満であることを意味する。標的配列とセンス配列の間の違いがわずか１、２、３、４、または５ヌクレオチドであることが好ましい。さらに、互いに「相補的な」配列（例えば、センス配列とアンチセンス配列）は完全に相補的であってもよいし、あるいは完全な相補性を欠くヌクレオチドを１、２、３、４、または５個以下だけ有していてもよい。
【００１２】
１実施形態では、ｉＲＮＡ物質のセンス配列とアンチセンス配列との対は、表２に提示するｉＲＮＡ物質のいずれか１つを含むか、またはセンス鎖において表２に列挙した配列との違いが１、２、３、４、または５ヌクレオチド以下である配列か、アンチセンス鎖において違いが１、２、３、４、または５ヌクレオチド以下である配列か、あるいは両方の鎖において違いが１、２、３、４、または５ヌクレオチド以下である配列を含む。
【００１３】
１つの好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ物質のセンス配列は、配列番号４５６、配列番号５５０、配列番号６０８、および配列番号６３４からなる群から選択される配列、あるいは前記に列挙した配列との違いが１、２、３、４、または５ヌクレオチド以下である配列を含む。
【００１４】
他の実施形態では、ｉＲＮＡ物質のアンチセンス配列は、ＶＥＧＦ標的配列のいずれかと完全に相補的あるいは実質的に相補的な配列、例えば配列番号２〜４０１のいずれかと相補的あるいは実質的に相補的な配列を含む。
【００１５】
他の実施形態では、ｉＲＮＡ物質のアンチセンス配列は、表２に提示された任意のアンチセンス配列からなる群から選択される配列、あるいは表２に列挙した配列との違いが１、２、３、４、または５ヌクレオチド以下である配列を含む。好ましい実施形態では、このアンチセンス配列はセンス配列と完全に相補的であるか、あるいはセンス配列とのヌクレオチドのミスマッチをわずか１、２、３、４、または５個だけ有している。
【００１６】
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ物質のアンチセンス配列は、配列番号４５７、配列番号５５１、配列番号６０９、および配列番号６３５からなる群から選択される配列、あるいは前記に列挙した配列との違いが１、２、３、４、または５ヌクレオチド以下である配列を含む。
【００１７】
他の実施形態では、ｉＲＮＡ物質は化学的に修飾されている。例えば、ｉＲＮＡ物質は非ヌクレオチド部分を含み得る。化学修飾または他の非ヌクレオチド部分は、センス配列およびアンチセンス配列を核酸分解に対して安定化することが可能である。さらに、結合体を使用して取り込みを増大させ、特定の種類の細胞へのｉＲＮＡ物質の取り込みを狙うことも可能である。好ましい修飾には、実施例、表６〜１９に具体的に提示する修飾がある。
【００１８】
他の実施形態では、ｉＲＮＡ物質は、１ヌクレオチド〜約６ヌクレオチドの範囲の３’突出部分を含む。本明細書で使用する「３’突出部分」は、ｉＲＮＡ配列の３’端から伸びる少なくとも１つの対合しないヌクレオチドを指す。３’突出部分はリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド、あるいは修飾リボヌクレオチドまたは修飾デオキシリボヌクレオチドを含み得る。３’突出部分は好ましくは１ヌクレオチド長〜約５ヌクレオチド長、より好ましくは１ヌクレオチド長〜約４ヌクレオチド長、および最も好ましくは約２ヌクレオチド長〜約４ヌクレオチド長である。３’突出部分はｉＲＮＡ物質のセンス配列上またはアンチセンス配列上にあってもよいし、あるいは両方の配列上に存在していてもよい。
【００１９】
１つの好ましい実施形態では、本発明のｉＲＮＡ物質は、標的ＶＥＧＦ配列に相補的な２３ヌクレオチドのアンチセンス配列、および少なくとも２１ヌクレオチドのセンス配列を含む。それぞれの配列は互いに相補的な少なくとも２１個のヌクレオチドを含むことが可能であり、少なくともアンチセンス配列は２ヌクレオチドの３’突出部分を有し得る。
【００２０】
１実施形態では、ｉＲＮＡ物質のセンス配列とアンチセンス配列の両方が３’突出部分を含み、該３’突出部分の長さはそれぞれの配列に関して同じであっても異なっていてもよい。１実施形態では、それぞれの配列上の３’突出部分は１〜約６（例えば、１〜約３）ヌクレオチド長の範囲である。好ましい実施形態では、３’突出部分はｉＲＮＡ物質の両方の配列上に存在し、２ヌクレオチド長である。他の好ましい実施形態では、３’突出部分はｉＲＮＡ物質の両方の配列上に存在し、３’突出部分は２つのチミジル酸残基（「ＴＴ」）を含む。
【００２１】
１実施形態では、ｉＲＮＡ物質は、ＶＥＧＦタンパク質をコードするＲＮＡ配列との相補性を有する約１９〜２５（例えば約１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５）ヌクレオチドを有するアンチセンス配列を含む。該ｉＲＮＡ物質は、約１９〜２５（例えば約１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の）ヌクレオチドを有するセンス配列をさらに含むことが可能であり、アンチセンス配列とセンス配列は、少なくとも約１９、２０、または２１個の相補的ヌクレオチドを含む、異なるヌクレオチド配列を有し得る。
【００２２】
１実施形態では、本発明のｉＲＮＡ物質は、ＶＥＧＦをコードするＲＮＡ配列との相補性を有する約１９〜約２５（例えば、約１９〜約２３）ヌクレオチドを有するアンチセンス領域、および約１９〜２５（例えば、約１９〜約２３）ヌクレオチドを有するセンス領域を含む。センス領域およびアンチセンス領域は、少なくとも約１９個の相補的ヌクレオチドを有する直線状の分子中に含まれ得る。センス鎖配列は、ＶＥＧＦのヌクレオチド配列と実質的に同一なヌクレオチド配列を含み得る。
【００２３】
１実施形態では、ｉＲＮＡ物質は、ＶＥＧＦ標的配列に相補的な約２１ヌクレオチドのアンチセンス配列、および該アンチセンス配列に相補的な約２１ヌクレオチドのセンス配列を含む。ｉＲＮＡ物質は非ヌクレオチド部分を含み得る。１実施形態では、ｉＲＮＡ物質のセンス配列またはアンチセンス配列は、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）ピリミジンヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド（例えばデオキシシトジン）、２’−デオキシ−２’−フルオロ（２’−Ｆ）ピリミジンヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセタミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−ヒドロキシヌクレオチド、または２’−アラ−フルオロヌクレオチド、またはロック型核酸（ＬＮＡ；ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、拡張型核酸（ＥＮＡ；ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ヘキソース核酸（ＨＮＡ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、リボジフルオロトルイル、５−アリルアミノピリミジン、または５−Ｍｅ−２’−修飾ピリミジンを含み得る。２’修飾は２’−ＯＭｅ修飾であることが好ましく、２’−フルオロ修飾であることがより好ましい。好ましい実施形態では、１つまたは複数の２’修飾ヌクレオチドがｉＲＮＡ物質のセンス鎖上に存在する。
【００２４】
１実施形態では、ｉＲＮＡ物質は、核酸塩基の修飾、例えば３’脱塩基性のカチオン修飾などのカチオン修飾などを含む。カチオン修飾は、例えば、ｉＲＮＡ物質の１つまたは複数の末端ヌクレオチド上の、アルキルアミノ−ｄＴ（例えばＣ６アミノ−ｄＴ）、アリルアミノ結合体、ピロリジン結合体、フタルアミド、ヒドロキシプロリノール結合体またはアミノオキシ結合体であってよい。アルキルアミノ−ｄＴ結合体は、ｉＲＮＡ物質のセンス鎖またはアンチセンス鎖の３’端に結合していることが好ましい。ピロリジンリンカーは、センス鎖の３’または５’端、あるいはアンチセンス鎖の３’端に結合していることが好ましい。アリルアミンウリジンは、アンチセンス鎖の５’端にはなく、センス鎖の３’または５’端に存在することが好ましい。アミノオキシ結合体は、ヒドロキシルプロリノールと結合してセンス鎖またはアンチセンス鎖の３’または５’端  に存在することができる。
【００２５】
他の実施形態では、ＶＥＧＦを標的とするｉＲＮＡ物質は、例えば細胞内への進入を容易にするため、あるいはエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼによる切断を阻害するために、結合体を含む。結合体は、例えば親油性物質、テルペン、タンパク質結合物質、ビタミン、炭水化物、レチノイドまたはペプチドであってよい。例えば結合体は、ナプロキセン、ニトロインドール（またはスタッキング相互作用に貢献する他の結合体）、葉酸、イブプロフェン、レチノールまたはＣ５ピリミジンリンカーであってよい。他の実施形態では、結合体はグリセリド脂質結合体（例えばジアルキルグリセリド誘導体）、ビタミンＥ結合体、またはチオコレステロールである。結合体はアンチセンス鎖の３’端、あるいはセンス鎖の５’または３’端に存在することが好ましく、結合体はアンチセンス鎖の３’端およびセンス鎖の３’端には存在しないことが好ましい。
【００２６】
１実施形態では、結合体はナプロキセンであり、結合体はセンス鎖またはアンチセンス鎖の５’または３’端に存在することが好ましい。１実施形態では、結合体はコレステロールまたはチオコレステロールであり、結合体はセンス鎖の５’または３’端に存在することが好ましく、アンチセンス鎖には存在しないことが好ましい。幾つかの実施形態では、コレステロールは、ピロリジンリンカー、またはセリノールリンカー、またはヒドロキシプロリノールリンカーによってｉＲＮＡ物質と結合している。他の実施形態では、結合体はコラン酸であり、コラン酸はセンス鎖の５’または３’端、あるいはアンチセンス鎖の３’端と結合している。１実施形態では、コラン酸はセンス鎖の３’端およびアンチセンス鎖の３’端と結合している。他の実施形態では、結合体はレチノール酸であり、レチノール酸はセンス鎖の５’または３’端、あるいはアンチセンス鎖の３’端と結合している。１実施形態では、レチノール酸はセンス鎖の３’端およびアンチセンス鎖の３’端と結合している。
【００２７】
１態様では、本発明のｉＲＮＡ物質は、ＶＥＧＦ遺伝子によってコードされるＲＮＡの発現を調節するＲＮＡｉ活性を有する。ＶＥＧＦ遺伝子は互いにある程度の配列同一性を共有する可能性があり、したがってｉＲＮＡ物質は、異なるＶＥＧＦ標的間で共有されている配列、または特定のＶＥＧＦ標的に特有な配列を標的とすることによって、１群のＶＥＧＦ遺伝子、あるいは別例として特定のＶＥＧＦ遺伝子を標的とすることが可能である。したがって、１実施形態では、ｉＲＮＡ物質は、ＶＥＧＦヌクレオチド配列（例えばＲＮＡ配列）の保存領域を標的とすることが可能である。保存領域は、幾つかの異なるＶＥＧＦ関連配列（例えば、異なるＶＥＧＦアイソフォーム、スプライシング変異体、突然変異遺伝子など）と配列同一性を有し得る。したがって、１つのｉＲＮＡ物質が幾つかの異なるＶＥＧＦ関連配列を標的とすることが可能である。
【００２８】
１実施形態では、ｉＲＮＡ物質は化学的に修飾される。他の実施形態では、ｉＲＮＡ物質は二重鎖分子を含み、その二重鎖分子の１つまたは複数の配列が化学的に修飾されている。このような化学修飾の非限定的な例には、ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合、２’−デオキシリボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオチド、「共通塩基」ヌクレオチド、「非環状」ヌクレオチド、５’−Ｃ−メチルヌクレオチド、および末端へのグリセリルおよび／または逆方向デオキシ無塩基残基の取り込みがある。これらの化学修飾は、ｉＲＮＡ物質において使用すると、同物質の細胞内におけるＲＮＡｉ活性の維持を助長することが可能であり、ｉＲＮＡ物質の血清中安定性を増大させることが可能である。
【００２９】
１実施形態では、ｉＲＮＡ物質は１つまたは複数の化学修飾を含み、２本鎖ＲＮＡのセンス配列およびアンチセンス配列は約２１ヌクレオチド長である。
好ましい実施形態では、アンチセンス配列および／またはセンス配列の５’端の最初のヌクレオチド間結合、かつ好ましくは最初の２つのヌクレオチド間結合が、好ましくはホスホロチオエートによって修飾される。好ましい実施形態では、センス配列および／またはアンチセンス配列の３’端の最初の、および好ましくは最初の２つ、３つ、または４つのヌクレオチド間結合が、好ましくはホスホロチオエートによって修飾される。センス配列とアンチセンス配列の両方の５’端、およびセンス配列とアンチセンス配列の両方の３’端を、記載したように修飾されることがより好ましい。
【００３０】
他の態様では、ＶＥＧＦ発現の下方制御を仲介するｉＲＮＡ物質は、ｉＲＮＡ構築体のセンス配列とアンチセンス配列の間の結合親和性を調節する、１つまたは複数の化学修飾を含む。
【００３１】
１実施形態では、本発明は、ｉＲＮＡ物質の細胞への取り込みを調節することが可能な１つまたは複数の化学修飾を含むｉＲＮＡ物質を特徴とする。
他の実施形態では、本発明は、ｉＲＮＡ物質の薬物動態を改善する１つまたは複数の化学修飾を含むｉＲＮＡ物質を特徴とする。このような化学修飾には、結合体、例えば細胞受容体のリガンド、例えば天然に存在するタンパク質リガンド由来のペプチドなど；タンパク質局在化配列；抗体；核酸アプタマー；ビタミンおよび他の補助因子、例えば葉酸、レチノイドおよびＮ−アセチルガラクトサミンなど；ポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ、例えばＰＥＧ５およびＰＥＧ２０）など；リン脂質；ポリアミン、例えばスペルミンまたはスペルミジンなど；およびその他があるが、これらだけには限られない。
【００３２】
１実施形態では、ｉＲＮＡ物質は、ＡＬ−ＤＰ−４００３、ＡＬ−ＤＰ−４１１６、ＡＬ−ＤＰ−４０１５、ＡＬ−ＤＰ−４１２０、ＡＬ−ＤＰ−４００２、ＡＬ−ＤＰ−４１１５、ＡＬ−ＤＰ−４０１４、ＡＬ−ＤＰ−４１１９、ＡＬ−ＤＰ−４０９４、ＡＬ−ＤＰ−４１１８、ＡＬ−ＤＰ−４１０７、ＡＬ−ＤＰ−４１２２、ＡＬ−ＤＰ−４００４、ＡＬ−ＤＰ−４１１７、ＡＬ−ＤＰ−４０１６、ＡＬ−ＤＰ−４１２１、ＡＬ−ＤＰ−４１２７、ＡＬ−ＤＰ−４１２８、ＡＬ−ＤＰ−４１２９、およびＡＬ−ＤＰ−４０５５からなる群から選択される二重鎖分子を含む（表２および３を参照）。
【００３３】
１つの好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ物質は、アンチセンス配列５’ＡＡＧＣＵＣＡＵＣＵＣＵＣＣＵＡＵＧＵＧＣＵＧ３’（配列番号６０９）およびセンス配列５’ＧＣＡＣＡＵＡＧＧＡＧＡＧＡＵＧＡＧＣＵＵ３’（配列番号６０８）を含む、ＡＬ−ＤＰ−４０９４として記載される二重鎖を含む。
【００３４】
他の好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ物質は、アンチセンス配列５’ＣＵＵＵＣＵＵＵＧＧＵＣＵＧＣＡＵＵＣＡＣＡＵ３’（配列番号６３５）およびセンス配列５’ＧＵＧＡＡＵＧＣＡＧＡＣＣＡＡＡＧＡＡＡＧ３’（配列番号６３４）を含む、ＡＬ−ＤＰ−４００４として記載される二重鎖を含む。
【００３５】
他の好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ物質は、アンチセンス配列５’ＧＵＡＣＵＣＣＵＧＧＡＡＧＡＵＧＵＣＣＴＴ３’（配列番号５５１）およびセンス配列５’ＧＧＡＣＡＵＣＵＵＣＣＡＧＧＡＧＵＡＣＴＴ３’（配列番号５５０）を含む、ＡＬ−ＤＰ−４０１５として記載される二重鎖を含む。
【００３６】
他の好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ物質は、アンチセンス配列５’ＵＧＣＡＧＣＣＵＧＧＧＡＣＣＡＣＵＵＧＴＴ３’（配列番号４５７）およびセンス配列５’ＣＡＡＧＵＧＧＵＣＣＣＡＧＧＣＵＧＣＡＴＴ３’（配列番号４５６）を含む、ＡＬ−ＤＰ−４０５５として記載される二重鎖を含む。
【００３７】
１実施形態では、本明細書に記載するｉＲＮＡ物質のアンチセンス配列は、標的外の配列とはハイブリダイズしない。例えばアンチセンス配列には、標的外の配列と相補的なヌクレオチドは５、４、３、２、または１個未満しか含まれなくてよい。「標的外（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）」とは、ＶＥＧＦヌクレオチド配列以外の配列を意味する。
【００３８】
他の実施形態では、標的外の発現抑制を阻害するためにセンス鎖を修飾する。センス鎖は、ピロリジンリンカーによってセンス鎖と結合したコレステロールなどの、コレステロール部分を含み得る。
【００３９】
他の実施形態では、本明細書に記載のｉＲＮＡ物質のアンチセンス配列は、ヒトのＶＥＧＦ配列、およびヒト以外の哺乳動物、例えばマウス、ラット、またはサルのＶＥＧＦ配列とハイブリダイズし得る。
【００４０】
他の態様では、本発明は、ｉＲＮＡ物質、例えば本明細書に記載のｉＲＮＡ物質を対象、例えばマウス、ラット、サルまたはヒトなどの哺乳動物の対象の眼に送達する方法を提供する。
【００４１】
他の態様では、本発明は、対象、例えばマウス、ラット、サルまたはヒトなどの哺乳動物対象の眼にｉＲＮＡ物質を送達する方法を提供する。
１実施形態では、眼の脈絡膜領域内の１つまたは複数の細胞に、ｉＲＮＡ物質を送達することが可能である。１つの好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ物質は、眼内の標的部位におけるＶＥＧＦ遺伝子の発現を下方制御する。眼、例えば眼の脈絡膜細胞に送達されるｉＲＮＡ物質は、非修飾ｉＲＮＡ物質であってよい。
【００４２】
１実施形態では、ホスホロチオエート結合によってｉＲＮＡ物質を安定化することが可能である。他の実施形態では、ｉＲＮＡ物質のセンス配列またはアンチセンス配列、あるいは両方の配列の３’端は、３’脱塩基性のカチオン修飾などカチオン基を用いて修飾することが可能である。カチオン修飾は、例えば、１つまたは複数のｉＲＮＡ物質の末端ヌクレオチド上のアルキルアミノ−ｄＴ（例えばＣ６アミノ−ｄＴ）、アリルアミン、ピロリジン、フタルアミド、ヒドロキシプロリノール、ポリアミン、カチオンペプチド、またはカチオン性アミノ酸であってよい。修飾体は、外側または末端のカチオン残基であってよい。好ましい実施形態では、ピロリジンキャップがセンス鎖の３’または５’端、あるいはアンチセンス鎖の３’端に結合している。
【００４３】
１実施形態では、ｉＲＮＡ物質のセンス配列またはアンチセンス配列、あるいは両方の配列が、糖、例えば糖結合体またはアルキルグリコシド成分、例えばグルコース、マンノース、２−デオキシグルコース、またはこれらの類似体を用いて修飾されうる。他の実施形態では、酵素基質、例えば身体の他の組織（例えば眼以外の組織）における酵素レベルと比較して関連酵素が多量に存在する基質に、ｉＲＮＡ物質を結合させることが可能である。
【００４４】
１実施形態では、対象に投与されたｉＲＮＡ物質のうち少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上が眼に到達する。好ましい実施形態では、対象に投与されたｉＲＮＡ物質の約３０〜９０％、４０〜８０％または５０〜７０％が眼に到達する。
【００４５】
他の態様では、本発明は、組成物、例えば薬剤として許容可能な担体または希釈剤中に本発明のｉＲＮＡ物質を含む医薬組成物を特徴とする。ｉＲＮＡ物質は、本明細書に記載の任意の物質であってよい。１実施形態では、ｉＲＮＡ物質を、本明細書に記載する任意の化学修飾などによって化学的に修飾する。好ましい修飾ｉＲＮＡ物質には、表２〜１９に提示するｉＲＮＡ物質がある。
【００４６】
他の態様では、本発明は、対象における疾患または状態を治療または予防するための方法を特徴とする。この方法は、対象における疾患または状態を治療または予防するのに適した条件下において、本発明の組成物を、単独で、あるいは１つまたは複数の他の治療用化合物と組み合わせて、対象に投与することを含み得る。
【００４７】
１実施形態では、例えばカテーテルまたは他の配置式デバイス（例えば、多孔質材料、非多孔質材料、またはゼラチン材料を含む網膜用ペレットまたはインプラント）によって、望ましくないＶＥＧＦ発現が存在する部位またはその部位近辺にｉＲＮＡ物質が投与される。１実施形態では、例えば眼の前房または後房；または強膜、経脈絡膜空間、または硝子体外側の無血管野に挿入することが可能な眼内インプラントによって、ｉＲＮＡ物質が投与される。他の実施形態では、薬剤が強膜を越えて治療が望ましい部位、例えば眼の眼内空間および黄斑へと拡散するのが可能となるように、強膜上などの無血管野にインプラントが配置される。さらに、経強膜拡散の部位は黄斑の近辺であることが好ましい。
【００４８】
他の実施形態では、注射によって、例えば眼内注射、網膜注射、または網膜下注射によって、眼にｉＲＮＡ物質が投与される。
他の実施形態では、例えばパッチまたは液体点眼剤によって、あるいはイオン導入法などによって、眼にｉＲＮＡ物質が局所投与される。軟膏剤または滴下可能な液体は、アプリケータまたは点眼器など当分野で知られている眼内送達系によって送達することが可能である。
【００４９】
１実施形態では、血管新生の部位またはその部位の近辺にｉＲＮＡが送達される。
１実施形態では、ｉＲＮＡ物質は繰り返し投与される。ｉＲＮＡ物質の投与は、一定範囲の時間周期で行うことが可能である。ｉＲＮＡ物質は１時間毎、１日毎、数日毎に１回、１週間毎、あるいは１ヶ月毎に投与することが可能である。投与のタイミングは、患者の症状の重篤度などの要因に応じて、患者毎に変わる可能性がある。例えば、有効用量のｉＲＮＡ物質を、１ヶ月に１回として無期限に、あるいは患者が治療をもはや必要としなくなるまで、患者に投与することが可能である。さらに、ｉＲＮＡ物質を含む徐放性組成物を使用して、標的ＶＥＧＦヌクレオチド配列の領域において比較的一定な用量を保つことが可能である。
【００５０】
他の実施形態では、片眼当たり約０．００００１ｍｇ〜約３ｍｇ程度、あるいは好ましくは片眼当たり約０．０００１〜０．００１ｍｇ、片眼当たり約０．０３〜３．０ｍｇ、片眼当たり約０．１〜３．０ｍｇあるいは片眼当たり約０．３〜３．０ｍｇの用量で、眼にｉＲＮＡ物質を送達する。
【００５１】
他の実施形態では、例えば眼に影響を与える障害または状態の発症を予防するかまたは遅延させるために、ｉＲＮＡ物質を予防的に投与する。例えば、血管新生性の障害に罹患しやすいかあるいはそうでなければ該障害のリスクを有する患者に、ｉＲＮＡを投与することが可能である。
【００５２】
１実施形態では、本明細書に記載するｉＲＮＡ物質を用いてヒトの片眼を治療し、他の実施形態ではヒトの両眼を治療する。
他の態様では、ＶＥＧＦ発現を阻害する方法が提供される。１つのこのような方法は、有効量の本発明のｉＲＮＡ物質を投与することを含む。
【００５３】
他の態様では、成人発症型の黄斑変性症を治療する方法が提供される。この方法は、治療上有効な量の本発明のｉＲＮＡ物質を投与することを含む。
１実施形態では、乾燥型の成人黄斑変性症（ＡＭＤ）のヒトが診断され、他の実施形態では、湿潤型のＡＭＤのヒトが診断されている。
【００５４】
１実施形態では、本明細書に記載するｉＲＮＡ物質を用いた治療を受けるヒトは５０才より上、例えば７５才〜８０才であり、成人発症型の黄斑変性症のヒトが診断されている。他の実施形態では、本明細書に記載するｉＲＮＡ物質を用いた治療を受けるヒトは３０才〜５０才であり、後期発症型の黄斑変性症のヒトが診断されている。他の実施形態では、本明細書に記載するｉＲＮＡ物質を用いた治療を受けるヒトは５才〜２０才であり、中期発症型の黄斑変性症のヒトが診断されている。他の実施形態では、本明細書に記載するｉＲＮＡ物質を用いた治療を受けるヒトは７才以下であり、初期発症型の黄斑変性症のヒトが診断されている。
【００５５】
１態様では、望ましくないＶＥＧＦの発現によって特徴付けられる、任意の疾患または障害を治療する方法が提供される。特に好ましい実施形態は、望ましくないＶＥＧＦの発現によって特徴付けられる、眼または網膜の障害の治療を含む。該疾患または障害は、糖尿病性網膜症、血管新生緑内障、腫瘍または転移性がん（例えば、結腸がんまたは乳がん）、肺疾患（例えば、喘息または気管支炎）、関節リウマチ、乾癬であってよい。他の血管新生性の障害も、本発明において特徴付ける方法によって治療することが可能である。
【００５６】
他の態様では、本発明は、本発明のｉＲＮＡ物質を含むキットを特徴とする。キットのｉＲＮＡ物質は化学的に修飾することができ、また細胞、組織または生物中でＶＥＧＦ標的遺伝子の発現を調節するのに有用であり得る。１実施形態では、キットは２つ以上の本発明のｉＲＮＡ物質を含む。
本発明は例えば、以下の項目を提供する：
（項目１）
センス配列およびアンチセンス配列からなる単離ｉＲＮＡ物質であって、センス配列およびアンチセンス配列がＲＮＡ二重鎖を形成し、アンチセンス配列がＶＥＧＦのヌクレオチド配列の約１９〜２３ヌクレオチドの標的配列と十分相補的なヌクレオチド配列を含んでなり、前記標的配列は、配列番号１〜４０１からなる群から選択される配列との違いが１、２、または３ヌクレオチド以下であることを特徴とするｉＲＮＡ物質。
（項目２）
前記センス配列が、配列番号２〜４０１からなる群から選択される配列との違いが１、２、または３ヌクレオチド以下である配列を含んでなる、項目１に記載のｉＲＮＡ物質。
（項目３）
前記センス配列が、配列番号４５６、配列番号５４６、配列番号５４８、配列番号５５０、配列番号５５２、配列番号５９０、配列番号５９２、配列番号５９４、配列番号５９６、配列番号６０８、配列番号６１０、配列番号６１２、配列番号６１４、配列番号６３４、配列番号６３６、配列番号６３８、配列番号６４０、配列番号６４６、配列番号６４８、および配列番号６５０からなる群から選択される配列との違いが１、２、または３ヌクレオチド以下である配列を含んでなる、項目１に記載のｉＲＮＡ物質。
（項目４）
配列番号６０８との違いが１、２、または３ヌクレオチド以下であることを特徴とする、項目３に記載のセンス鎖配列。
（項目５）
前記アンチセンス配列が、配列番号４５７、配列番号５４７、配列番号５４９、配列番号５５１、配列番号５５３、配列番号５９１、配列番号５９３、配列番号５９５、配列番号５９７、配列番号６０９、配列番号６１１、配列番号６１３、配列番号６１５、配列番号６３５、配列番号６３７、配列番号６３９、配列番号６４１、配列番号６４７、配列番号６４９、および配列番号６５１からなる群から選択される配列との違いが１、２、または３ヌクレオチド以下である配列を含んでなる、項目１に記載のｉＲＮＡ物質。
（項目６）
配列番号６０９との違いが１、２、または３ヌクレオチド以下であることを特徴とする、項目５に記載のアンチセンス鎖配列。
（項目７）
非ヌクレオチド部分をさらに含むことを特徴とする、項目１に記載のｉＲＮＡ物質。
（項目８）
センス配列およびアンチセンス配列が核酸分解に対して安定化されている、項目７に記載のｉＲＮＡ。
（項目９）
１つの３’突出部分をさらに含み、前記３’突出部分が１〜６ヌクレオチドからなる、項目１に記載のｉＲＮＡ物質。
（項目１０）
第２の３’突出部分をさらに含み、前記第２の３’突出部分が１〜６ヌクレオチドからなる、項目９に記載のｉＲＮＡ。
（項目１１）
アンチセンス配列およびセンス配列の５’端の最初のヌクレオチド間結合にホスホロチオエートをさらに含む、項目１に記載のｉＲＮＡ物質。
（項目１２）
アンチセンス配列およびセンス配列の３’端の最初のヌクレオチド間結合にホスホロチオエートをさらに含む、項目１に記載のｉＲＮＡ物質。
（項目１３）
アンチセンス配列およびセンス配列の５’端の最初のヌクレオチド間結合にホスホロチオエートを、かつアンチセンス配列およびセンス配列の３’端の最初のヌクレオチド間結合にホスホロチオエートをさらに含む、項目１に記載のｉＲＮＡ物質。
（項目１４）
２’修飾ヌクレオチドをさらに含む、項目１に記載のｉＲＮＡ物質。
（項目１５）
前記２’修飾ヌクレオチドが、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）、および２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセタミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）からなる群から選択される修飾を含んでなる、項目１４に記載のｉＲＮＡ物質。
（項目１６）
項目１乃至１５のいずれか１項に記載のｉＲＮＡ物質と細胞を接触させることからなる、対象の細胞中のＶＥＧＦのＲＮＡ量を減少させる方法。
（項目１７）
項目１乃至１５のいずれか１項に記載のｉＲＮＡ物質を作製する方法であって、前記ｉＲＮＡ物質の合成からなり、センス鎖およびアンチセンス鎖が、核酸分解に対して該ｉＲＮＡ物質を安定化する修飾を少なくとも１つ含んでなることを特徴とする方法。
（項目１８）
項目１に記載のｉＲＮＡ物質と、薬剤として許容可能な担体とを含んでなる医薬組成物。
（項目１９）
有効量の項目１に記載のｉＲＮＡ物質を投与することからなる、ＶＥＧＦの発現を阻害する方法。
（項目２０）
成人黄斑変性症（ＡＭＤ）を有する、あるいは成人黄斑変性症のリスクを有すると診断されたヒトを治療する方法であって、治療上有効な量の項目１に記載のｉＲＮＡ物質をそのような治療の必要がある対象に投与することからなる方法。
別途定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載した方法および材料と同等または均等な方法および材料を、本発明を実施または試験する際に使用することが可能であるが、有用な方法および材料を以下に記載する。材料、方法、および実施例は単なる例示であり、限定することは目的としない。本発明の他の特徴および利点は、添付の図面および記載事項から、かつ特許請求の範囲から明らかとなろう。本願全体を通じて引用した全ての参照文献、係属中の特許出願および公開特許明細書の内容は、本願明細書に援用される。矛盾がある場合は、定義を含めて本明細書が優先される。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】１２１アミノ酸の形態の血管内皮増殖因子、ＶＥＧＦ１２１のｍＲＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１）を示す図。開始コドンの最初のヌクレオチドがヌクレオチド１である。シグナルペプチドはヌクレオチド１〜７８である。
【図２】ＨｅＬａ細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおける、突出部分が１つおよび２つのｓｉＲＮＡの活性の比較分析を示すグラフ。中実の記号を有する実線は突出部分が１つのｓｉＲＮＡを表し、中空の記号を有する実線は突出部分が２つのｓｉＲＮＡを表し；破線は対照のｓｉＲＮＡを表す。対照ｓｉＲＮＡであるｈＶＥＧＦは、ライヒら（Ｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．９：２１０、２００３）に記載されており；対照ｓｉＲＮＡであるｈｒｍＶＥＧＦはフィレウアーら（Ｆｉｌｌｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：３９１９、２００３）に記載されている。「Ｌ２０００」は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００試薬を表す。ｈＶＥＧＦの発現（ｙ軸）は内在性ＶＥＧＦの発現を表す。
【図３】ＡＲＰＥ−１９細胞における、突出部分が１つおよび２つのｓｉＲＮＡの活性の比較分析を示すグラフ。中実の記号を有する実線は突出部分が１つのｓｉＲＮＡを表し、中空の記号を有する実線は突出部分が２つのｓｉＲＮＡを表し；破線は対照のｓｉＲＮＡを表す。対照ｓｉＲＮＡであるｈＶＥＧＦはライヒら（Ｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．９：２１０、２００３）に記載されており；対照ｓｉＲＮＡであるｈｒｍＶＥＧＦはフィレウアーら（Ｆｉｌｌｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．）（上記）に記載されている。「Ｌ２０００」はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬を表す。ｈＶＥＧＦの発現（ｙ軸）は内在性ＶＥＧＦの発現を表す。
【図４】塩基対を成すヌクレオチドの数が２１である、突出部分が１つのｓｉＲＮＡのＨｅＬａ細胞におけるｓｉＲＮＡ活性を、その類似体である平滑末端ｓｉＲＮＡと比較分析したグラフ。対照ｓｉＲＮＡのｈＶＥＧＦはライヒら（Ｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．９：２１０、２００３）に記載されており；対照ｓｉＲＮＡのｈｒｍＶＥＧＦはフィレウアーら（Ｆｉｌｌｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．）（上記）に記載されている。「Ｌ２０００」はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬を表す。ｈＶＥＧＦの発現（ｙ軸）は内在性ＶＥＧＦの発現を表す。
【図５】塩基対を成すヌクレオチドの数が１９である、突出部分が２つのｓｉＲＮＡのＨｅＬａ細胞におけるｓｉＲＮＡ活性を、その類似体である平滑末端ｓｉＲＮＡと比較分析したグラフ。対照ｓｉＲＮＡのｈＶＥＧＦはライヒら（Ｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）（上記）に記載されており；対照ｓｉＲＮＡのｈｒｍＶＥＧＦはフィレウアーら（Ｆｉｌｌｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．）（上記）に記載されている。「Ｌ２０００」はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬を表す。ｈＶＥＧＦの発現（ｙ軸）は内在性ＶＥＧＦの発現を表す。
【図６】（Ａ）正常な酸素条件下（正常酸素条件、２０％酸素）の細胞における、ＯＲＦ３１９（配列番号３２０）を標的とする突出部分が１つおよび２つのｓｉＲＮＡ（それぞれＡＬ−ＤＰ−４００２およびＡＬ−ＤＰ−４０１４）ならびにＯＲＦ３４３（配列番号３４４）を標的とする突出部分が１つおよび２つのｓｉＲＮＡ（それぞれＡＬ−ＤＰ−４０９４およびＡＬ−ＤＰ−４１０７）の活性を示すグラフ。  （Ｂ）低酸素条件下（１％酸素）の細胞における、ＯＲＦ３１９（配列番号３２０）を標的とする突出部分が１つおよび２つのｓｉＲＮＡ（それぞれＡＬ−ＤＰ−４００２およびＡＬ−ＤＰ−４０１４）ならびにＯＲＦ３４３（配列番号３４４）を標的とする突出部分が１つおよび２つのｓｉＲＮＡ（それぞれＡＬ−ＤＰ−４０９４およびＡＬ−ＤＰ−４１０７）の活性を示すグラフ。  （Ｃ）低酸素条件下（１３０μＭのデフェロキサミン）の細胞における、ＯＲＦ３１９（配列番号３２０）を標的とする突出部分が１つおよび２つのｓｉＲＮＡ（それぞれＡＬ−ＤＰ−４００２およびＡＬ−ＤＰ−４０１４）ならびにＯＲＦ３４３（配列番号３４４）を標的とする突出部分が１つおよび２つのｓｉＲＮＡ（それぞれＡＬ−ＤＰ−４０９４およびＡＬ−ＤＰ−４１０７）の活性を示すグラフ。
【図７】ＨｅＬａ細胞における、ＯＲＦ３１９（配列番号３２０）を標的とする突出部分が２つの非修飾ｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−４０１４）と、ホスホロチオエート修飾されたｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−４１２７、ＡＬ−ＤＰ−４１２８、ＡＬ−ＤＰ−４１２９）との、活性比較を示すグラフ。対照ｓｉＲＮＡのｈＶＥＧＦはライヒら（Ｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）（上記）に記載されており；対照ｓｉＲＮＡのｈｒｍＶＥＧＦはフィレウアーら（Ｆｉｌｌｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．）（上記）に記載されている。「Ｌ２０００」はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬を表す。ｈＶＥＧＦの発現（ｙ軸）は内在性ＶＥＧＦの発現を表す。
【図８】（Ａ）正常な酸素条件下（正常酸素条件、２０％酸素）の細胞における、ＯＲＦ３１９（配列番号３２０）を標的とするｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−４０１４およびＡＬ−ＤＰ−４１２７）ならびに突然変異型のＡＬ−ＤＰ−４１４０（表５）の活性を示すグラフ。対照ｓｉＲＮＡのＣａｎｄ５は図７のｈＶＥＧＦ対照と同一であり、ライヒら（Ｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）（上記）に記載されている。「Ｌ２０００」はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬を表す。ＶＥＧＦの発現（ｙ軸）は内在性ＶＥＧＦの発現を表す。  （Ｂ）  標準または低酸素条件下（低酸素条件、１％酸素）の細胞における、ＯＲＦ３１９（配列番号３２０）を標的とするｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−４０１４およびＡＬ−ＤＰ−４１２７）ならびに突然変異型のＡＬ−ＤＰ−４０１４（表５）の活性を示すグラフ。対照ｓｉＲＮＡについては（Ａ）に記載したとおりである。
【図９】（Ａ）〜（Ｅ）ＡＬ−ＤＰ−４０９４の配列を有するが異なるヌクレオチド修飾を含んでいるｓｉＲＮＡ（表４参照）の活性を示すグラフ。図９Ａのセンス鎖は配列番号６５２として、そして図９Ａのアンチセンス鎖は配列番号６５３〜６５８として、それぞれ示した順に開示された。図９Ｂのセンス鎖は配列番号６５９として、そして図９Ｂのアンチセンス鎖は配列番号６５３〜６５８として、それぞれ示した順に開示された。図９Ｃのセンス鎖は配列番号６６０として、そして図９Ｃのアンチセンス鎖は配列番号６５３〜６５８として、それぞれ示した順に開示された。図９Ｄのセンス鎖は配列番号６６１として、そして図９Ｄのアンチセンス鎖は配列番号６５３〜６５８として、それぞれ示した順に開示された。図９Ｅのセンス鎖は配列番号６６２〜６６５、６５２、６５２および６５２として、そして図９Ｅのアンチセンス鎖は配列番号６５３、６５３、６５３、６５３および６６６〜６６８として、それぞれ示した順に開示された。対照ｓｉＲＮＡ「Ａｃｕｉｔｙ」は、図８ＡのＣａｎｄ５対照および図７のｈＶＥＧＦ対照と同一である。「Ｆｉｌｌｅｕｒ」対照ｓｉＲＮＡは、図７のｈｒｍＶＥＧＦ対照ｓｉＲＮＡに相当する。
【図１０】ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでのｓｉＲＮＡの発現抑制活性を示すグラフ。
【図１１】ヒト血清中でインキュベーションした後のＡＬ−ＤＰ−４０９４ｓｉＲＮＡの、ＲＰ−ＨＰＬＣスキャンを示す図。
【図１２】ＬＣ／ＭＳにより測定したＡＬ−ＤＰ−４０９４断片のマッピングの概要を示す図。ヒト血清中でのｓｉＲＮＡのインキュベーション後に、分析を行った（それぞれ示した順に、配列番号６０８〜６０９、１０８０〜１０８２、１０８２〜１０８３、６０８、６６１、６１１および１０８４）。
【図１３】２’−Ｏ−メチル修飾および／または２’−フルオロ修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表６）。
【図１４】２’−Ｏ−メチル修飾および／または２’−フルオロ修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表６）。
【図１５】２’−Ｏ−メチル修飾および／または２’−フルオロ修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表６）。
【図１６】２’−Ｏ−メチル修飾および／または２’−フルオロ修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表６）。
【図１７】２’−Ｏ−メチル修飾および／または２’−フルオロ修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表６）。
【図１８】２’−Ｏ−メチル修飾および／または２’−フルオロ修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表６）。
【図１９】２’−Ｏ−メチル修飾および／または２’−フルオロ修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表６）。
【図２０】２’−Ｏ−メチル修飾および／または２’−フルオロ修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表６）。
【図２１】２’−Ｏ−メチル修飾および／または２’−フルオロ修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表６）。
【図２２】２’−Ｏ−メチル修飾および／または２’−フルオロ修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表６）。
【図２３】２’−Ｏ−メチル修飾および／または２’−フルオロ修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表６）。
【図２４】２’−Ｏ−メチル修飾および／または２’−フルオロ修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表６）。
【図２５】２’−Ｏ−メチル修飾および／または２’−フルオロ修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表６）。
【図２６】２’−Ｏ−メチル修飾および／または２’−フルオロ修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表６）。
【図２７】２’−Ｏ−メチル修飾および／または２’−フルオロ修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表６）。
【図２８】２’−Ｏ−メチル修飾および／または２’−フルオロ修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表６）。
【図２９】２’−Ｏ−メチル修飾および／または２’−フルオロ修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表６）。
【図３０】２’−Ｏ−メチル修飾および２’−フルオロ修飾が交互になっているｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表７）。
【図３１】コレステロールおよびコラン酸が結合したｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表８）。
【図３２】コレステロールおよびコラン酸が結合したｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表８）。
【図３３】コレステロールおよびコラン酸が結合したｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表８）。
【図３４】ナプロキセンが結合したｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表９）。
【図３５】ビオチンが結合したｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表１０）。
【図３６】５’−レチナール結合ｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表１１）。
【図３７】リボ−ジフルオロトルイル修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表１３）。
【図３８】２’−アラフルオロ−２’−デオキシヌクレオシド修飾されたｓｉＲＮＡの、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発現抑制活性を示すグラフ（表１４）。
【図３９】オリゴヌクレオチド合成用の５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−２’−デオキシ−２’−フルオロＡ、Ｃ、ＧおよびＵのＣＰＧ支持体を示す図。これらの支持体は、表６および７に列挙する選択された配列の合成に使用された。
【図４０】オリゴヌクレオチドとの結合用の、コレステロールおよび５β−コラン酸（またはコラン酸）結合用構成単位を示す図。これらの構成単位は、表８に列挙する選択された配列の合成に使用された。
【図４１】オリゴヌクレオチド合成用の、５ＭｅＣおよび５ＭｅＵのＲＮＡ構成単位を示す図。これらの構成単位は、表８に列挙する選択された配列の合成に使用された。
【図４２】オリゴヌクレオチドとの結合用の、ナプロキセン−トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリノールおよびナプロキセン−セリノール構成単位を示す図。これらの構成単位は、表９に列挙する選択された配列の合成用に使用された。
【図４３】オリゴヌクレオチドとの結合用の、ビオチン−トランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリノールおよびビオチン−セリノール構成単位を示す図。これらの構成単位は、表１０に列挙する選択された配列の合成用に使用された。
【図４４】合成後に結合するための構成単位−オキシム法を示す図。これらの構成単位は、表１１に列挙する選択された配列の合成用に使用された／される。
【図４５】合成後に結合するための構成単位−活性エステル法を示す図。これらの構成単位は、表１２に列挙する選択された配列の合成に使用された。
【図４６】オリゴヌクレオチド合成用の、ＤＦＴのアミダイトおよびＣＰＧを示す図。これらの構成単位は、表１３に列挙する選択された配列の合成に使用された。
【図４７】オリゴヌクレオチド合成用の２’−デオキシ−２’−アラｆアミダイトを示す図。これらの構成単位は、表１４に列挙する選択された配列の合成に使用された。
【図４８】リボ５ＭｅＵおよびリボＣ（ＮＡｃ）のＰ−メチルホスホンアミダイトを示す図。これらの構成単位は、表１５に列挙する選択された配列の合成に使用された。
【図４９】Ｃ５−アミノアリルＵアミダイトを示す図。この構成単位は、表１６に列挙する選択された配列の合成に使用された。
【図５０】チオコレステロール結合の構成単位を示す図。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
（表の簡単な説明）
表１は、本発明の物質によって標的とされるＶＥＧＦ遺伝子中の配列を提示する。これらの配列は、本発明のｉＲＮＡ物質の一部のセンス鎖でもありうる。
【００５９】
表２は、ＶＥＧＦ遺伝子を標的とする１２３個のｉＲＮＡ二重鎖、ＶＥＧＦ遺伝子中の標的配列、および実施例中に記載の活性データを提示する。
表３は、ホスホロチオエートによる安定化を含むように修飾されたｉＲＮＡ二重鎖、および実施例中に記載の活性データを提示する。
【００６０】
表４は、ＡＬ−ＤＰ−４０９４二重鎖を基にして安定化のために修飾されたｉＲＮＡ二重鎖、および実施例中に記載の活性データを提示する。
表５は、本発明の幾つかのｉＲＮＡ物質に関する、ＨｅＬａ細胞中でのｉＲＮＡ二重鎖の活性データを提示する。
【００６１】
表６は、１つまたは複数のホスホロチオエート、２’−Ｏ−メチルおよび２’−フルオロ修飾を含むｉＲＮＡ物質に関する、ＨｅＬａ細胞中でのｉＲＮＡ物質の活性データを提示する。
【００６２】
表７は、交互に配列された２’−Ｏ−メチルおよび２’−フルオロ修飾を含むｉＲＮＡ物質に関する、ＨｅＬａ細胞中でのｉＲＮＡ物質の活性データを提示する。
表８ＡおよびＢは、コレステロールまたはコラン酸結合体を含むｉＲＮＡ物質に関する、ＨｅＬａ細胞中でのｉＲＮＡ物質の活性データを提示する。
【００６３】
表９は、ナプロキセン結合体を含むｉＲＮＡ物質に関する、ＨｅＬａ細胞中でのｉＲＮＡ物質の活性データを提示する。
表１０は、ビオチン結合体を含むｉＲＮＡ物質に関する、ＨｅＬａ細胞中でのｉＲＮＡ物質の活性データを提示する。
【００６４】
表１１は、アルデヒド、レチナールおよび他のレチノイド結合体を含むｉＲＮＡ物質を提示する。
表１２は、ポリエチレングリコール結合体を含むｉＲＮＡ物質を提示する。
【００６５】
表１３は、リボジフルオロトルイル修飾を含むｉＲＮＡ物質に関する、ＨｅＬａ細胞中でのｉＲＮＡ物質の活性データを提示する。
表１４は、２’−アラフルオロ−２’−デオキシヌクレオシド修飾を含むｉＲＮＡ物質に関する、ＨｅＬａ細胞中でのｉＲＮＡ物質の活性データを提示する。
【００６６】
表１５は、メチルホスホネート修飾を含むｉＲＮＡ物質を提示する。
表１６は、Ｃ−５アリルアミノ修飾を含むｉＲＮＡ物質を提示する。
表１７は、表中に示した様々な修飾および該修飾の組合せを含むｉＲＮＡ物質を提示する。
【００６７】
表１８は、表中に示した様々な修飾および該修飾の組合せを含むｉＲＮＡ物質の物理的特徴を提示する。
（詳細な説明）
二本鎖（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られるプロセスによって、ｍＲＮＡの配列特異的な発現抑制（サイレンシング）を誘導する。このプロセスは、哺乳動物および他の脊椎動物を含めた多種多様な生物において起きる。
【００６８】
ｄｓＲＮＡの２１〜２３ｎｔ断片が、例えばＲＮＡ分解を引き起こすことによる、ＲＮＡ発現抑制の配列特異的なメディエーターであることが実証されている。理論に縛られることは望むものではないが、これらの２１〜２３ｎｔ断片の中に存在する、特定の長さの断片にすぎない分子シグナルが、ＲＮＡｉを仲介する細胞因子を動員する可能性がある。本明細書に記載するのは、これらの２１〜２３ｎｔ断片、および他のｉＲＮＡ物質を調製し投与するための方法、ならびに遺伝子機能を特異的に不活性化させるためのそれらの使用である。ｉＲＮＡ物質（あるいは同一または類似の性質の組換え生成または化学合成されたオリゴヌクレオチド）を使用することによって、哺乳動物細胞において発現抑制するために特定のｍＲＮＡを標的とすることが可能になる。さらに、比較的長いｄｓＲＮＡ物質の断片を、例えば以下に記載したように使用することも可能である。
【００６９】
哺乳動物細胞では、長いｄｓＲＮＡは、有害であることが多いインターフェロン応答を誘導する可能性があるが、ｓｉＲＮＡは、少なくとも細胞および宿主に有害である程度にまでインターフェロン応答を誘導することはない。特に、ｉＲＮＡ物質中のセンス配列およびアンチセンス配列の長さは、例えば有害なインターフェロン応答の誘導を回避する程度に充分短い、３１、３０、２８、２５、または２３ｎｔ未満であってよい。したがって、哺乳動物細胞への（例えば、本明細書に記載したように調合した）ｉＲＮＡ物質の組成物の投与を使用して、インターフェロン応答を回避しながら、標的遺伝子の発現を抑制することが可能である。さらに、別種のｉＲＮＡ物質を使用して、例えば対立遺伝子がヘテロ接合である対象において、標的遺伝子の一方の対立遺伝子を選択的に標的とすることが可能である。
【００７０】
ＲＮＡ二重鎖などのｉＲＮＡ物質の標的相補配列（アンチセンス配列）は、５’リン酸を有することが可能であり、ＡＴＰを使用してｓｉＲＮＡ上の５’−リン酸部分を維持することが可能である（ニッカネンら（Ｎｙｋａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ）、Ｃｅｌｌ  １０７：３０９、２００１）が、５’−リン酸を欠くｉＲＮＡ物質を外部から導入しても活性があることが示されてきており、ｓｉＲＮＡ構築体の５’−リン酸化はｉｎ  ｖｉｖｏで起こりうることが示唆されている。
【００７１】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）
血管透過性因子としても知られているＶＥＧＦは、血管形成増殖因子である。ＶＥＧＦは、少なくとも３つの異なるアイソフォームが存在するホモ２量体の４５ｋＤａの糖タンパク質である。ＶＥＧＦのアイソフォームは内皮細胞中で発現される。ＶＥＧＦ遺伝子は、１８９アミノ酸のタンパク質アイソフォームを発現する８個のエクソンを含む。１６５アミノ酸のアイソフォームはエクソン６によってコードされる残基を欠き、一方１２１アミノ酸のアイソフォームは、エクソン６および７によってコードされる残基を欠く。ＶＥＧＦ１４５は、１４５個のアミノ酸を含みエクソン７を欠くと予測されるアイソフォームである。
【００７２】
ＶＥＧＦは、Ｆｌｔ−１（ＶＥＧＦＲ−１）またはＫＤＲ／ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦＲ−２）などの内皮のチロシンキナーゼ受容体と結合することによって、内皮細胞に作用することが可能である。ＶＥＧＦＲ−２は内皮細胞中で発現され、内皮細胞の分化および脈管形成に関与している。第３の受容体であるＶＥＧＦＲ−３は、リンパ球新生と関係があるとされている。
【００７３】
これらの種々のアイソフォームは、様々な生物活性および臨床上の意義を有している。例えばＶＥＧＦ１４５は血管形成を誘導し、ＶＥＧＦ１８９と同様に（ただしＶＥＧＦ１６５とは異なり）ＶＥＧＦ１４５は、細胞外マトリクス関連のヘパリン硫酸に依存しない機構によって細胞外マトリクスと効率良く結合する。ヒトＶＥＧＦ１２１のコード配列に相当するｍＲＮＡ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ２１４５７０、配列番号１）を、図１に示す。ＶＥＧＦはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて内皮細胞分裂促進因子および走化性誘因物質としての活性を示し、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて血管透過性および血管形成を誘導する。ＶＥＧＦは広くさまざまな種類のがん細胞によって分泌され、腫瘍に関連する脈管構造の発達を誘導することによって腫瘍の増殖を助長する。ＶＥＧＦの機能を阻害することにより、免疫不全マウスにおける実験的な原発性腫瘍の増殖と転移の発生の両方が制限されることが示されている。ＶＥＧＦはまた、関節リウマチおよび乾癬などの炎症性疾患においても異常に高いレベルで発現され、喘息症状の発現中に起こる炎症、気道リモデリングおよび血管リモデリングに関与している。ＶＥＧＦ発現の上昇は、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、および黄斑変性症を含めた、重度の視力低下をもたらすことの多い幾つかの形の眼部の血管新生とも関係がある。
【００７４】
ｉＲＮＡ物質
本明細書で使用する「ＲＮＡ物質」は、非修飾ＲＮＡ、修飾ＲＮＡ、またはヌクレオシド代用物である。好ましい例には、非修飾ＲＮＡよりもヌクレアーゼ分解に対して高い耐性を有するＲＮＡ物質がある。好ましい例には、２’糖修飾、１本鎖突出部分（好ましくは１本鎖の３’突出部分）の修飾、または特に１本鎖の場合、１つまたは複数のリン酸基あるいは１つまたは複数のリン酸基類似体を含む５’修飾を有するＲＮＡ物質がある。
【００７５】
本明細書で使用する「ｉＲＮＡ物質」は、標的遺伝子（好ましくは内在性または病原性の標的ＲＮＡ）の発現を下方制御することが可能なＲＮＡ物質であるか、切断されてそのようなＲＮＡ物質となることが可能なＲＮＡ物質である。理論によって縛られることは望むものではないが、ｉＲＮＡ物質は、当分野ではＲＮＡｉと呼ばれることもある標的ｍＲＮＡの転写後切断や、転写前または翻訳前の機構など幾つかの機構のうち１つまたは複数によって作用するのかもしれない。ｉＲＮＡ物質は１本の鎖を含んでいてもよいし、あるいは２本以上の鎖を含んでいてもよく、例えばｉＲＮＡ物質は２本鎖ｉＲＮＡ物質であってよい。ｉＲＮＡ物質が１本鎖である場合、１つまたは複数のリン酸基あるいは１つまたは複数のリン酸基類似体を含む５’修飾を含むことが特に好ましい。
【００７６】
ｉＲＮＡ物質またはその断片が標的遺伝子の下方制御を仲介することが可能であるように、ｉＲＮＡ物質は標的遺伝子との相同性が十分な領域を含むべきであり、かつヌクレオチド数として十分な長さでなければならない。（説明を容易にするために、本明細書では、用語ヌクレオチドまたはリボヌクレオチドは、ＲＮＡ物質の１つまたは複数のモノマーサブユニットに関して用いられる場合がある。本明細書では当然ながら、本明細書における用語「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」の使用は、修飾ＲＮＡまたはヌクレオチド代用物の場合には、修飾ヌクレオチド、または１つまたは複数の位置における代用物置換部分をも意味し得る。）したがってｉＲＮＡ物質は、標的ＲＮＡと少なくとも部分的に相補的であり、幾つかの実施形態では完全に相補的な領域であるか、あるいは該領域を含む。ｉＲＮＡ物質と標的の間に完璧な相補性が存在する必要はないが、その対応性は、ｉＲＮＡ物質またはその切断産物が、標的ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）のＲＮＡｉ切断などによって、配列特異的な発現抑制を誘導することが可能である程度に十分でなければならない。
【００７７】
標的鎖との相補性、または相同性の程度は、アンチセンス鎖において最も重要である。特にアンチセンス鎖における完全な相補性が望ましいことが多い一方で、幾つかの実施形態では、特にアンチセンス鎖中に、１つまたは複数、ただし好ましくは６、５、４、３、２、あるいはこれより少ない（標的ＲＮＡに対する）ミスマッチを含み得る。ミスマッチ、特にアンチセンス鎖中のミスマッチは、末端領域において最も許容され、存在する場合は、１つまたは複数の末端領域中、例えば５’および／または３’末端の６、５、４、または３ヌクレオチド以内に存在することが好ましい。センス鎖は、分子全体としての２本鎖の性質を維持するためにアンチセンス鎖と十分相補的でありさえすればよい。
【００７８】
ｉＲＮＡ物質の１本鎖領域は、修飾されるか、あるいはヌクレオシド代用物、例えばヘアピン構造の非対合領域、例えば２つの相補領域をつなぐ領域であって修飾またはヌクレオシド代用物を有し得る領域を含むことが多いと思われる。例えばエキソヌクレアーゼに対してｉＲＮＡ物質の３’または５’末端のうち１つまたは複数を安定化するための修飾、またはアンチセンスｓＲＮＡ物質がＲＩＳＣに進入するのを助けるための修飾も好ましい。修飾には、Ｃ３（またはＣ６、Ｃ７、Ｃ１２）アミノリンカー、チオールリンカー、カルボキシルリンカー、非ヌクレオチドスペーサー（Ｃ３、Ｃ６、Ｃ９、Ｃ１２、無塩基部位、トリエチレングリコール、ヘキサエチレングリコール）、ホスホロアミダイトを提供しかつ他のＤＭＴ保護ヒドロキシル基を有するためＲＮＡ合成中に多数の結合を可能にする、特殊なビオチン試薬またはフルオレセイン試薬が挙げられる。
【００７９】
ｉＲＮＡ物質には：インターフェロン応答を誘導するのに十分な長さの分子（ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）によって切断されて（ベルンシュタインら（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ）、Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：３６３〜３６６、２００１）、ＲＩＳＣ（ＲＮＡｉ誘導サイレンシング複合体）に進入しうる分子）；およびインターフェロン応答を誘導しない程度に十分短い分子（これらの分子もＤｉｃｅｒによって切断可能であり、かつ／またはＲＩＳＣに進入することが可能である）、例えばＲＩＳＣへの進入を可能にする大きさの分子、例えばＤｉｃｅｒ切断産物に類似の分子がある。インターフェロン応答を誘導しない程度に十分短い分子を、本明細書ではｓＲＮＡ物質または短いｉＲＮＡ物質と呼ぶ。本明細書で使用する「ｓＲＮＡ物質または短いｉＲＮＡ物質」は、ｉＲＮＡ物質、例えば２本鎖ＲＮＡ物質または１本鎖物質であって、ヒト細胞中で有害なインターフェロン応答を誘導しない程度に十分短い、例えばヌクレオチド対が６０未満、ただし好ましくは５０、４０、または３０未満の二重鎖領域を有するものを指す。ｓＲＮＡ物質またはその切断産物は、例えば標的ＲＮＡ（好ましくは内在性標的ＲＮＡまたは病原体標的ＲＮＡ）に関してＲＮＡｉを誘導することによって、標的遺伝子を下方制御することが可能である。
【００８０】
ｓＲＮＡ物質のそれぞれの鎖は、３０、２５、２４、２３、２２、２１、または２０ヌクレオチド長以下であってよい。鎖は少なくとも１９ヌクレオチド長であることが好ましい。例えばそれぞれの鎖が２１〜２５ヌクレオチド長であってよい。好ましいｓＲＮＡ物質は、１７、１８、１９、２９、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド対の二重鎖領域、および１つまたは複数の突出部分、好ましくは２〜３ヌクレオチドの１つまたは２つの３’突出部分を有する。
【００８１】
本明細書で使用する「１本鎖ｉＲＮＡ物質」は、１つの分子で構成されるｉＲＮＡ物質である。１本鎖ｉＲＮＡ物質は、鎖間の対合によって形成された二重鎖領域を含むことが可能であり、例えば１本鎖ｉＲＮＡ物質はヘアピン構造またはパン−ハンドル構造であってもよいし、該構造を含んでもよい。１本鎖ｉＲＮＡ物質は、標的分子に関してアンチセンスであることが好ましい。好ましい実施形態では、１本鎖ｉＲＮＡ物質は５’リン酸化状態であるか、あるいは５’最先端にホスホリル類似体を含む。５’リン酸修飾には、ＲＩＳＣ仲介型遺伝子発現抑制と適合性のある修飾があげられる。適切な修飾には：５’−１リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−２リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−３リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−モノチオリン酸（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−モノジチオリン酸（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−ホスホロチオレート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）；酸素／イオウ置換された１リン酸、２リン酸および３リン酸のその他の任意の組合せ（例えば５’−α−チオ３リン酸、５’−γ−チオ３リン酸など）、５’−ホスホロアミダイト（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−アルキルリン酸（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えばＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２−）、５’−アルキルエーテルリン酸（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２−）、エトキシメチルなど、例えばＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−）がある。（これらの修飾を、２本鎖ｉＲＮＡのアンチセンス鎖に使用することも可能である。）
１本鎖ｉＲＮＡ物質は、ＲＩＳＣに進入して標的ｍＲＮＡのＲＩＳＣ仲介型切断に関与することができる程度に十分長くなければならない。１本鎖ｉＲＮＡ物質は少なくとも１４、およびより好ましくは少なくとも１５、２０、２５、２９、３５、４０、または５０ヌクレオチド長である。１本鎖ｉＲＮＡ物質は、２００、１００、または６０ヌクレオチド長未満であることが好ましい。
【００８２】
ヘアピンｉＲＮＡ物質は、少なくとも１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド対以上の二重鎖領域を有することになろう。二重鎖領域は、長さが２００、１００、または５０以下であることが好ましいと思われる。二重鎖領域の好ましい範囲は、長さが１５〜３０、１７〜２３、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド対である。ヘアピンは、１本鎖突出部分または末端の非対合領域（好ましくは３’側、かつ好ましくはヘアピンのアンチセンス側）を有することが好ましいと思われる。好ましい突出部分は２〜３ヌクレオチド長である。
【００８３】
本明細書で使用する「２本鎖（ｄｓ）ｉＲＮＡ物質」は、鎖間ハイブリダイゼーションが二重鎖構造の領域を形成し得る、２本以上、および好ましくは２本の鎖を含むｉＲＮＡ物質である。
【００８４】
ｉＲＮＡ物質の糖、塩基、または骨格に対する他の適切な修飾は、２００４年１月１６日に出願された共願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１９３に記載されている。ｉＲＮＡ物質は、２００４年４月１６日に出願された共願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１８２２中に記載された塩基などの、非天然塩基を含み得る。ｉＲＮＡ物質は、非炭水化物の環状担体分子などの非天然の糖を含み得る。ｉＲＮＡ物質中に使用するための非天然の糖の代表的な特徴は、２００３年４月１６日に出願された共願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／１１８２９に記載されている。
【００８５】
ｉＲＮＡ物質は、ヌクレアーゼ耐性を高めるのに有用なヌクレオチド間結合（例えば、キラルホスホロチオエート結合）を含み得る。さらに、あるいは別例として、ｉＲＮＡ物質はヌクレアーゼ耐性を高めるためのリボース模倣体を含み得る。ヌクレアーゼ耐性を高めるための代表的なヌクレオチド間結合およびリボース模倣体は、２００４年３月８日に出願された共願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０に記載されている。
【００８６】
ｉＲＮＡ物質は、２００４年３月８日に出願された共願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０に記載された構造などのＺＸＹ構造を有し得る。
ｉＲＮＡ物質は、両親媒性部分と複合体形成し得る。ｉＲＮＡ物質と共に使用するための代表的な両親媒性部分は、２００４年３月８日に出願された共願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０に記載されている。
【００８７】
他の実施形態では、ｉＲＮＡ物質は、モジュラー複合体を特徴とする送達物質と複合体形成し得る。該複合体は、（ａ）縮合剤（例えば、例えばイオン相互作用または静電相互作用によって、核酸を引き寄せる、例えば核酸と結合することが可能な物質）；（ｂ）融合誘導物質（例えば、細胞膜と融合し得る、かつ／または細胞膜を介して輸送され得る物質）；および（ｃ）標的化基、例えば細胞または組織を標的とする物質、例えばレクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば、特定の種類の細胞と結合する抗体；のうち１つまたは複数（好ましくは２つ以上、より好ましくは３つ全て）と結合した担体物質を含み得る。送達物質と複合体形成したｉＲＮＡ物質は、２００４年３月８日に出願された共願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０に記載されている。
【００８８】
ｉＲＮＡ物質は、ｉＲＮＡ二重鎖のセンス配列とアンチセンス配列の間などに非標準的な対を有し得る。非標準的なｉＲＮＡ物質の代表的な特徴は、２００４年３月８日に出願された共願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０に記載されている。
【００８９】
これらの種類の修飾の多くは実施例に提示され、表３〜１８中に記載されている。
ｉＲＮＡの設計
本発明は、細胞中のＶＥＧＦ  ｍＲＮＡのレベルを低下させるために使用し得る活性ｉＲＮＡ物質を同定するための、ＶＥＧＦ遺伝子の遺伝子歩行に基づくものである。ＶＥＧＦ遺伝子中のｉＲＮＡ物質の配列候補の全てに活性があるわけではなく、その多くは相当な標的外の影響も有している。本発明は、活性があり相当な標的外の影響は有していない配列を選択することによって、当分野の技術を進展させる。さらに、本発明のｉＲＮＡ物質に関して選択した配列は多数の生物種間で保存されているため、動物試験および毒性試験に１つの物質を使用することが可能であると同時に、ヒトにおける治療目的でも同じものを使用することができる。
【００９０】
これらの結果に基づいて、本発明は特に、ＶＥＧＦが介在する障害、特にＡＭＤなどの眼の障害を治療する際に、単離形態および以下に記載する医薬組成物として使用することが可能なｉＲＮＡ物質を提供する。このような物質は、ＶＥＧＦ遺伝子と相補的な少なくとも１５個以上の連続したヌクレオチドを有するセンス鎖、およびセンス鎖の配列と相補的な少なくとも１５個以上の連続したヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を含むことになろう。特に有用なのは、表１に提示したヌクレオチド配列を含むか、本質的に該配列から構成されるか、あるいは該配列で構成されるｉＲＮＡ物質、例えば表２に提示した物質、あるいは表３〜１８に提示したその修飾体のいずれかである。
【００９１】
ｉＲＮＡの標的になると思われるＶＥＧＦ遺伝子の遺伝子歩行分析を、本明細書で行うように実施することによって、候補ｉＲＮＡ物質を設計することが可能である。被転写領域の全体または一部分に対応する、重複した、隣接した、または狭い間隔を置いた候補物質を作製し試験することが可能である。それぞれのｉＲＮＡ物質を試験し、標的遺伝子の発現を下方制御する能力に関して評価することが可能である（以下の「候補ｉＲＮＡ物質の評価」を参照されたい）。
【００９２】
本発明のｉＲＮＡ物質は、表２に活性があることが示されているｉＲＮＡ物質または表３〜１８に提示した修飾配列のうちの１つに由来する、少なくとも１５以上の連続したヌクレオチドを基本とし、該ヌクレオチドを含んでなることが好ましい。このような物質では、物質は表中に提示した配列全体を含んでもよいし、該配列で構成されてもよいし、あるいは本質的に該配列で構成されてもよく、あるいは１５以上の連続した残基と共に標的遺伝子の隣接領域由来の他のヌクレオチドを含んでもよい。
【００９３】
配列情報および望ましい特徴、ならびに表１に提示した標的配列の情報に基づいて、ｉＲＮＡ物質を合理的に設計することが可能である。例えば、候補の二重鎖の相対的融解温度に従い、ｉＲＮＡ物質を設計することが可能である。一般に二重鎖は、アンチセンス鎖の３’端よりもアンチセンス鎖の５’端において低い融解温度を有するべきである。
【００９４】
したがって本発明は、表１または２に提示した物質のうちの１つと本質的に同一である少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２３ヌクレオチドの配列をそれぞれ含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含んでなるｉＲＮＡ物質を提供する。
【００９５】
ｉＲＮＡ物質のアンチセンス鎖は、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、または５０ヌクレオチド長であるか、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、または５０ヌクレオチド長でなければならない。アンチセンス鎖は、５０、４０、または３０ヌクレオチド長以下でなければならない。好ましい範囲は１５〜３０、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド長である。代表的なｉＲＮＡ物質には、表２の物質（あるいは表１に提示した標的配列と相補的な物質）のうちの１つに由来する１５個以上のヌクレオチドを含むが、長さ２５ヌクレオチド長以下のｉＲＮＡ物質がある。
【００９６】
ｉＲＮＡ物質のセンス鎖は、１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、または５０ヌクレオチド長であるか、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２５、２９、４０、または５０ヌクレオチド長でなければならない。センス鎖は、５０、４０、または３０ヌクレオチド長以下でなければならない。好ましい範囲は１５〜３０、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド長である。代表的なｉＲＮＡ物質には、表２の物質（あるいは表２の標的配列）のうちの１つに由来する１５個以上のヌクレオチドを含むが、２５ヌクレオチド長以下のｉＲＮＡ物質がある。
【００９７】
ｉＲＮＡ物質の２本鎖部分は、長さが１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２９、４０、または５０ヌクレオチド対であるか、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２９、４０、または５０ヌクレオチド対でなければならない。２本鎖部分は、長さが５０、４０、または３０ヌクレオチド対以下でなければならない。好ましい範囲は長さ１５〜３０、１７〜２５、１９〜２３、および１９〜２１ヌクレオチド対である。
【００９８】
表２に提示した物質は、それぞれの鎖に関して２３ヌクレオチド長である。ｉＲＮＡ物質は、該物質の３’端のそれぞれに２ヌクレオチドの突出部分を備えた２１ヌクレオチドの２本鎖領域を含む。これらの物質を本明細書に記載したのと同様に修飾して、これらの配列の少なくとも一部分（１５個以上の連続したヌクレオチド）およびオリゴヌクレオチド塩基およびオリゴヌクレオチド結合に対する修飾のうち少なくともいずれかを含む同等な物質を得ることが可能である。特に好ましいのは、表３〜１８に提示した修飾および物質である。
【００９９】
一般に本発明のｉＲＮＡ物質は、ｉＲＮＡ物質またはその断片がＶＥＧＦ遺伝子の下方制御を仲介し得るように、ＶＥＧＦ遺伝子と十分相補的な領域を含み、ヌクレオチド数として充分な長さである。本発明のｉＲＮＡ物質のアンチセンス鎖は、ＶＥＧＦ遺伝子のｍＲＮＡ配列と完全に相補的であることが好ましい。しかし、ｉＲＮＡ物質と標的の間に完璧な相補性が存在する必要はなく、その対応性は、ｉＲＮＡ物質またはその切断産物が、例えばＶＥＧＦのｍＲＮＡのＲＮＡｉ切断によって配列特異的な発現抑制を誘導することができる程度に十分でなければならない。
【０１００】
したがって本発明のｉＲＮＡ物質は、表２に提示した物質などの、ＶＥＧＦ遺伝子の配列の１つと（以下に定義するように）ほぼ同一である少なくとも１６、１７または１８ヌクレオチドの配列をそれぞれ含んでなるセンス鎖およびアンチセンス鎖からなる物質を含み、ただし鎖１つ当たり１、２または３ヌクレオチド以下がそれぞれ他のヌクレオチドによって置換されており（例えば、ウラシルによって置換されたアデノシン）、ＶＥＧＦ発現を阻害する能力はほぼ保っているものとする。したがってこれらの物質は、ＶＥＧＦ遺伝子と同一な少なくとも１５個以上のヌクレオチドを有するが、ＶＥＧＦのｍＲＮＡ配列に関して、あるいはセンス鎖とアンチセンス鎖との間に関して１、２または３塩基のミスマッチが導入されていることになる。特にアンチセンス鎖では、標的ＶＥＧＦのｍＲＮＡ配列とのミスマッチは末端領域において最も許容され、存在する場合は好ましくは１つまたは複数の末端領域内、例えば５’および／または３’末端の６、５、４、または３ヌクレオチド以内、最も好ましくはセンス鎖の５’末端またはアンチセンス鎖の３’末端の６、５、４、または３ヌクレオチド以内に存在することが好ましい。センス鎖は、分子全体の２本鎖の特徴を維持するのに十分な程度にアンチセンス鎖と相補的でありさえすればよい。
【０１０１】
ｉＲＮＡ物質が、分子、例えば表２（および表３〜１８）に例示した分子などの一端または両端に１本鎖領域または非対合領域を含むように、センス鎖とアンチセンス鎖を選択することが好ましい。したがってｉＲＮＡ物質は、好ましくは突出部分（例えば１つまたは２つの５’または３’突出部分、ただし好ましくは２〜３ヌクレオチドの３’突出部分）を含むように対合したセンス鎖とアンチセンス鎖とを含む。大部分の実施形態は、３’突出部分を有することになろう。好ましいｓｉＲＮＡ物質は、ｉＲＮＡ物質の一端または両端に長さ１〜４ヌクレオチド、あるいは好ましくは２または３ヌクレオチドの１本鎖突出部分、好ましくは３’突出部分を有することになろう。突出部分は一方の鎖が他方の鎖より長い結果であってもよいし、あるいは同じ長さの２本の鎖がずれを生じた結果であってもよい。５’端はリン酸化されていることが好ましい。
【０１０２】
二重鎖領域の好ましい長さは１５〜３０ヌクレオチドであり、最も好ましくは、例えば上述したｓｉＲＮＡ物質の範囲内の、１８、１９、２０、２１、２２、および２３ヌクレオチド長である。ｓｉＲＮＡ物質の２本の鎖が例えば共有結合により結合している実施形態も含まれる。必要な２本鎖領域および好ましくは３’突出部分を提供するヘアピン構造または他の１本鎖構造も、本発明内にある。
【０１０３】
ｉＲＮＡ物質の合成
オリゴヌクレオチド（例えば、ある種の修飾オリゴヌクレオチド、またはリボヌクレオチドを欠くオリゴヌクレオチドの部分）は、例えばカルーテルら（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２１１：３、１９９２；トンプソンら（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ）、国際公開第９９／５４４５９号パンフレット；ビンコットら（Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：２６７７、１９９５；ビンコットら（Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．７４：５９、１９９７；ブレンナンら（Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．６１：３３、１９９８；およびブレンナン（Ｂｒｅｎｎａｎ）、米国特許第６，００１，３１１号明細書に記載されたのと同様の、当分野で知られているプロトコルを使用して合成することが可能である。これらの参照文献はいずれも、本願明細書に援用する。オリゴヌクレオチドの合成には、一般的な核酸保護基および結合基、例えば５’端にジメトキシトリチル、および３’端にホスホロアミダイトなどを使用する。
【０１０４】
本発明のある種のｉＲＮＡ物質などのＲＮＡに関して使用する合成法は、ユースマンら（Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ）、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０９：７８４５、１９８７；スカリンジら（Ｓｃａｒｉｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：５４３３、１９９０；ビンコットら（Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：２６７７、１９９５；およびビンコットら（Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．７４：５９、１９９７に記載されたのと同様の手順に従い、一般的な核酸保護基および結合基、例えば５’端にジメトキシトリチル、および３’端にホスホロアミダイトなどを使用する。修飾ｉＲＮＡ物質を生産するためのさまざまな合成法の詳細な説明は、実施例において提示する。
【０１０５】
あるいは、本発明の核酸分子を、個別に合成して合成後に例えばライゲーションによって（モーアら（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：９９２３、１９９２；ドレーパーら（Ｄｒａｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ）、国際公開第９３／２３５６９号パンフレット；シャバロバら（Ｓｈａｂａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４２４７、１９９１；ベロンら（Ｂｅｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ）、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１６：９５１、１９９７；ベロンら（Ｂｅｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ８：２０４、１９９７）、あるいは合成および／または脱保護の後のハイブリダイゼーションによって、連結させることが可能である。
【０１０６】
２つの異なる核酸配列から、または１つの断片がｉＲＮＡ物質のセンス領域を含み第２の断片がｉＲＮＡ物質のアンチセンス領域を含む断片から、ｉＲＮＡ物質を構築することも可能である。
【０１０７】
ｉＲＮＡ物質を広範囲にわたって修飾し、ヌクレアーゼ耐性基、例えば２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、ジフルオロトルイル、５−アリルアミノ−ピリミジン、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｈを用いた修飾によって安定性を増大させることが可能である（総説に関しては、ユースマンおよびセデルグレン（Ｕｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７：３４、１９９２を参照）。ｉＲＮＡ構築体は、一般的な方法を使用してゲル電気泳動によって精製してもよいし、あるいは高圧液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ；その全容を本願明細書に援用する、ビンコットら（Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ）の上記文献を参照）によって精製し、水中に再懸濁させてもよい。
【０１０８】
本発明の他の態様では、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターに挿入した転写ユニットからｉＲＮＡ物質を発現させることが可能である。組換えベクターはＤＮＡプラスミドであってもよいし、ウイルスベクターであってもよい。ｉＲＮＡ物質を発現するウイルスベクターは、限定するものではないが、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアルファウイルスに基づいて構築することが可能である。ｉＲＮＡ物質を発現することが可能である組換えベクターを、本明細書に記載するように送達し、標的細胞中に維持することが可能である。あるいは、ｉＲＮＡ物質の一過性の発現をもたらすウイルスベクターを使用することも可能である。
【０１０９】
ｉＲＮＡ物質の評価
本明細書に記載するｉＲＮＡ物質はいずれも、以下のように評価および修飾することが可能である。
【０１１０】
例えばｉＲＮＡ物質を対象の体内に導入するときなど、ｉＲＮＡ物質はエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼによる切断の影響を受ける可能性がある。切断、例えばｉＲＮＡ物質上でのエンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼによる切断の部位を決定する方法、および切断の機構を決定する方法を使用することが可能である。ｉＲＮＡ物質を修飾してこのような切断を阻害することが可能である。
【０１１１】
ｄｓＲＮＡ、例えばｉＲＮＡ物質を評価して、修飾、特に切断、例えば対象の体内に見られる成分による切断の影響を受けやすい部位を同定することが可能である。該成分は身体の特定の領域、例えば特定の組織、器官、または体液（例えば血液、血漿、または血清）などに特異的であってよい。身体のある領域において、エンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼによる切断のいずれかによる切断を受けやすいｉＲＮＡ物質中の部位は、身体の他の領域においては切断に対して耐性であってもよい。
【０１１２】
ｉＲＮＡ物質を評価するための方法は、（１）対象の体内に存在する物質、および好ましくは治療用ｄｓＲＮＡが導入される体内コンパートメント（これは、治療物質が直接導入されるコンパートメント、例えば循環系、および治療物質が最終的に標的とするコンパートメント、例えば肝臓または腎臓；場合によっては、例えば２つが同一である眼などを含む）に存在する成分が、ｄｓＲＮＡ、例えばｉＲＮＡ物質を切断する、１つまたは複数の地点を決定する工程と、および（２）例えばエンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、あるいは両方によるｄｓＲＮＡ中の１つまたは複数の切断地点を同定する工程とを含み得る。任意選択で、この方法は、このような部位における切断を阻害するように修飾したＲＮＡ（例えばｉＲＮＡ物質）を提供することをさらに含む。
【０１１３】
上述の工程は、１つまたは複数の以下のアッセイを使用することによって実施することが可能である。すなわち
（ｉ）（ａ）候補のｄｓＲＮＡ、例えばｉＲＮＡ物質と試験物質（例えば生物学的物質）を接触させることと、
（ｂ）大きさに基づくアッセイ、例えばゲル電気泳動を使用して、ｉＲＮＡ物質が切断されるかどうかを判定すること。好ましい実施形態では、経時変化を測定し、様々な時間インキュベートした幾つかのサンプルを上記の大きさに基づくアッセイに供する。好ましい実施形態では、候補ｄｓＲＮＡを標識しない。この方法は「全染色」法であってよい。
【０１１４】
（ｉｉ）（ａ）放射標識した候補ｄｓＲＮＡ、例えばｉＲＮＡ物質を供給することと；
（ｂ）候補ｄｓＲＮＡと試験物質を接触させることと、
（ｃ）大きさに基づくアッセイ、例えばゲル電気泳動を使用して、ｉＲＮＡ物質が切断されるかどうかを判定すること。好ましい実施形態では、経時変化を測定し、経時変化の測定においては幾つかのサンプルを様々な時間インキュベートし、大きさに基づくアッセイに供する。好ましい実施形態では、断片中に存在するヌクレオチドの数を測定することが可能である条件下において測定を行う。例えばインキュベートしたサンプルを、切断産物の長さの割り当てを可能にするマーカーを有するゲルで泳動する。ゲルが「ラダー型」消化物である標準品を含んでいてもよい。センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかを標識することが可能である。特定の実験では、１本の鎖のみを標識することが好ましい。５’端、３’端、あるいは内部の位置に標識を取り込ませることが可能である。断片の長さ（およびしたがって切断地点）は、ラダーに基づいた断片の大きさから、かつＲＮＡｓｅＴ１などの部位特異的エンドヌクレアーゼを使用するマッピングから決定することが可能である。
【０１１５】
（ｉｉｉ）任意の方法、例えば本明細書に記載する方法、例えば前述の方法の１つによって生成される断片を、質量分析法によって分析してもよい。ｉＲＮＡと試験物質を接触させた後に、フェノール−クロロホルム抽出とその後の沈殿などによって、ｉＲＮＡを精製（例えば、部分的に精製）することが可能である。次いで液体クロマトグラフィを使用して断片を分離することが可能であり、そして質量分析法を使用してそれぞれの断片の質量を測定することが可能である。これによって、例えば、直接的なリン酸の切断（例えば５’または３’エキソヌクレアーゼ切断）による場合、あるいは環状リン酸の形成を介して２’ＯＨによって仲介される場合など、切断の機構を決定することが可能である。
【０１１６】
他の実施形態では、切断部位に関する情報を使用して、修飾、例えば切断を低減させる修飾のための骨格の原子、糖または塩基を選択する。
代表的な修飾は、本明細書に記載する修飾など、エンドヌクレアーゼによる分解を阻害する修飾を含む。特に好ましい修飾には、２’修飾、例えば２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチドまたは２’−デオキシヌクレオチド（例えば２’デオキシ−シトジン）、または２’−フルオロ、ジフルオロトルイル、５−Ｍｅ−２’−ピリミジン、５−アリルアミノ−ピリミジン、２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−ヒドロキシ、または２’−アラ−フルオロヌクレオチド、またはロック型核酸（ＬＮＡ）、拡張型核酸（ＥＮＡ）、ヘキソース核酸（ＨＮＡ）、またはシクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）がある。１実施形態では、２’修飾は少なくとも１つの５’−ウリジン−アデニン−３’（５’−ＵＡ−３’）ジヌクレオチド、少なくとも１つの５’−ウリジン−グアニン−３’（５’−ＵＧ−３’）ジヌクレオチド、少なくとも１つの５’−ウリジン−ウリジン−３’（５’−ＵＵ−３’）ジヌクレオチド、または少なくとも１つの５’−ウリジン−シチジン−３’（５’−ＵＣ−３’）ジヌクレオチドのウリジン上、あるいは少なくとも１つの５’−シチジン−アデニン−３’（５’−ＣＡ−３’）ジヌクレオチド、少なくとも１つの５’−シチジン−シチジン−３’（５’−ＣＣ−３’）ジヌクレオチド、または少なくとも１つの５’−シチジン−ウリジン−３’（５’−ＣＵ−３’）ジヌクレオチドのシチジン上に存在する。２’修飾を、ｉＲＮＡ物質中の全てのピリミジンに施すことも可能である。１つの好ましい実施形態では、２’修飾はｉＲＮＡ物質のセンス鎖上の２’ＯＭｅ修飾である。より好ましい実施形態では、２’修飾は２’フルオロ修飾であり、２’フルオロはセンス鎖またはアンチセンス鎖、あるいは両方の鎖上に存在する。
【０１１７】
骨格の修飾、例えばリン酸骨格においてＯをＳで置換することによる修飾、例えばホスホロチオエート修飾の提供を使用して、エンドヌクレアーゼ活性を阻害することが可能である。幾つかの実施形態では、１つまたは複数のリボヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドで置換することによって、ｉＲＮＡ物質を修飾している。隣接するデオキシリボヌクレオチドがホスホロチオエート結合によって結合し、ｉＲＮＡ物質がセンス鎖またはアンチセンス鎖上に４個を超える連続したデオキシリボヌクレオチドを含まないことが好ましい。Ｃ５アミノリンカーでＵを置換すること；ＧでＡを置換すること（配列の変更はアンチセンス鎖上ではなくセンス鎖上に存在することが好ましい）、あるいは２’、６’、７’、または８’位置で糖を修飾することにより、ｉＲＮＡ物質のエンドヌクレアーゼによる切断を阻害することも可能である。好ましい実施形態は、１つまたは複数のこれらの修飾がアンチセンス鎖上ではなくセンス鎖上に存在する実施形態、またはアンチセンス鎖ではこのような修飾がより少ない実施形態である。
【０１１８】
代表的な修飾は、エキソヌクレアーゼによる分解を阻害する修飾も含む。エキソヌクレアーゼによる分解を阻害する修飾の例は、本明細書において見ることが可能である。１実施形態では、ｉＲＮＡ物質は、ｉＲＮＡ物質の１つまたは複数の末端ヌクレオチド間の結合に、ホスホロチオエート結合またはＰ−アルキル修飾を含む。他の実施形態では、ｉＲＮＡ物質の１つまたは複数の末端ヌクレオチドは、糖の修飾、例えば２’または３’糖修飾を含む。代表的な糖修飾体には、例えば２’−Ｏ−メチル化ヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド（例えばデオキシ−シトジン）、２’−デオキシ−２’−フルオロ（２’−Ｆ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセタミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−ＤＭＡＥＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−ヒドロキシヌクレオチド、または２’−アラ−フルオロヌクレオチド、またはロック型核酸（ＬＮＡ）、拡張型核酸（ＥＮＡ）、ヘキソース核酸（ＨＮＡ）、またはシクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）がある。２’修飾は２’ＯＭｅであることが好ましく、２’フルオロであることがより好ましい。
【０１１９】
エキソヌクレアーゼによる切断を阻害すると報告されている修飾を、１つのｉＲＮＡ物質上で組み合わせることも可能である。例えば１実施形態では、ｉＲＮＡ物質の少なくとも１つの末端ヌクレオチドが、ホスホロチオエート結合と２’糖修飾（例えば２’Ｆまたは２’ＯＭｅ修飾）とを有する。他の実施形態では、ｉＲＮＡ物質の少なくとも１つの末端ヌクレオチドが、５’Ｍｅ−ピリミジンと２’糖修飾（例えば２’Ｆまたは２’ＯＭｅ修飾）とを有する。
【０１２０】
エキソヌクレアーゼによる切断を阻害するために、ｉＲＮＡ物質は、核酸塩基の修飾、例えば３’脱塩基性のカチオン修飾などのカチオン修飾などを含むことが可能である。カチオン修飾は、ｉＲＮＡ物質の１つまたは複数の末端ヌクレオチド上の、例えばアルキルアミノ−ｄＴ（例えばＣ６アミノ−ｄＴ）、アリルアミノ結合体、ピロリジン結合体、フタルアミドまたはヒドロキシプロリノール結合体であってよい。アルキルアミノ−ｄＴ結合体は、ｉＲＮＡ物質のセンス鎖またはアンチセンス鎖の３’端に結合していることが好ましい。ピロリジンリンカーは、センス鎖の３’または５’端、あるいはアンチセンス鎖の３’端に結合していることが好ましい。アリルアミンウリジンは、センス鎖の３’または５’端に存在し、アンチセンス鎖の５’端には存在しないことが好ましい。
【０１２１】
他の実施形態ではｉＲＮＡ物質は、ｉＲＮＡ物質の１つまたは複数の末端ヌクレオチド上に結合体を含む。結合体は、例えば親油性物質、テルペン、タンパク質結合物質、ビタミン、炭水化物、レチノイドまたはペプチドであってよい。例えば結合体は、ナプロキセン、ニトロインドール（またはスタッキング相互作用に貢献する他の結合体）、葉酸、イブプロフェン、コレステロール、レチノイド、ＰＥＧ、またはＣ５ピリミジンリンカーであってよい。他の実施形態では、結合体はグリセリド脂質結合体（例えばジアルキルグリセリド誘導体）、ビタミンＥ結合体、またはチオコレステロールである。結合体はアンチセンス鎖の３’端、あるいはセンス鎖の５’または３’端に存在することが好ましく、結合体はアンチセンス鎖の３’端、およびセンス鎖の３’端には存在しないことが好ましい。
【０１２２】
１実施形態では、結合体はナプロキセンであり、結合体はセンス鎖またはアンチセンス鎖の５’または３’端に存在することが好ましい。１実施形態では、結合体はコレステロールであり、結合体はセンス鎖の５’または３’端に存在することが好ましく、アンチセンス鎖には存在しないことが好ましい。幾つかの実施形態では、コレステロールは、ピロリジンリンカー、またはセリノールリンカー、アミノオキシ、またはヒドロキシプロリノールリンカーによってｉＲＮＡ物質と結合している。他の実施形態では、結合体はｄＵ−コレステロールであり、あるいはコレステロールがジスルフィド結合によってｉＲＮＡ物質と結合している。他の実施形態では、結合体はコラン酸であり、コラン酸はセンス鎖の５’または３’端、あるいはアンチセンス鎖の３’端と結合している。１実施形態では、コラン酸はセンス鎖の３’端、およびアンチセンス鎖の３’端と結合している。他の実施形態では、結合体はＰＥＧ５、ＰＥＧ２０、ナプロキセンまたはレチナールである。
【０１２３】
他の実施形態では、１つまたは複数の末端ヌクレオチドは２’−５’結合を有する。２’−５’結合はセンス鎖上、例えばセンス鎖の５’端上に存在することが好ましい。
１実施形態では、ｉＲＮＡ物質はＬ−糖を、好ましくはセンス鎖の５’または３’端に含む。
【０１２４】
１実施形態では、ｉＲＮＡ物質は、エキソヌクレアーゼ耐性を増大させるために１つまたは複数の末端ヌクレオチドに、例えばｉＲＮＡ物質のセンス鎖またはアンチセンス鎖の３’端にメチルホスホネートを含む。
【０１２５】
１実施形態では、ｉＲＮＡ物質は、１つまたは複数のリボヌクレオチドをデオキシリボヌクレオチドで置換することによって修飾されている。隣接するデオキシリボヌクレオチドをホスホロチオエート結合によって連結し、ｉＲＮＡ物質が４個を超える連続したデオキシリボヌクレオチドをセンス鎖またはアンチセンス鎖上に含まないことが好ましい。
【０１２６】
幾つかの実施形態では、細胞および生物サンプル中での高い安定性を有するｉＲＮＡ物質は、ジフルオロトルイル（ＤＦＴ）修飾、例えば２，４−ジフルオロトルイルウラシル、またはグアニジンのイノシンへの置換を含む。
【０１２７】
記載の方法を使用して、治療用ｄｓＲＮＡ、例えばｉＲＮＡ物質を選択および／または最適化することが可能である。本明細書に記載の方法によって作製されたｄｓＲＮＡ、例えばｉＲＮＡ物質は、本発明の範囲内にある。
【０１２８】
これらの方法を使用して、候補のｄｓＲＮＡ（例えば候補ｉＲＮＡ物質）であって非修飾状態であるか、あるいは修飾（例えば分解を阻害する修飾、ｄｓＲＮＡ分子を標的化する修飾、あるいはハイブリダイゼーションを調節する修飾）を含むものを評価することが可能である。このような修飾は本明細書に記載されている。切断アッセイを、修飾または非修飾の候補体が標的を発現抑制する能力を決定するアッセイと組み合わせることも可能である。例えば、候補物を（任意選択で）試験して、標的（または標的外配列）を発現抑制する該候補物の能力を評価すること、切断に対する該候補物の感受性を評価すること、該候補物に（例えば分解を阻害するために、例えば本明細書に記載するようにして）修飾を施して修飾候補物を生成すること、この修飾候補物を、発現抑制の能力および分解に抵抗する能力のうち一方または両方に関して試験することが可能であると思われる。この手順を繰り返すことも可能である。修飾は１度に１つ導入してもよいし、まとめて導入してもよい。細胞を用いる方法を使用して標的ＲＮＡを発現抑制する能力を調べると、好都合であることが多いと思われる。この後に様々な方法、例えば動物全体を用いる方法を行って、活性を確認することが可能である。
【０１２９】
本発明は、本明細書に記載の方法によって得られた切断部位に関する情報を使用して、ｄｓＲＮＡ、例えばｉＲＮＡ物質を修飾することを含む。
本発明の核酸分子の活性の最適化
修飾（塩基、糖および／またはリン酸）を備えた核酸分子を化学合成することにより、血清リボヌクレアーゼによる核酸分子の分解を妨げ、該分子の効能を高める可能性がある（例えば、エクシュタインら（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ）、国際公開第９２／０７０６５号パンフレット；ペルラウルトら（Ｐｅｒｒａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ）、Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：５６５、１９９０；ピーケンら（Ｐｈｉｅｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：３１４、１９９１；ユースマンおよびセデルグレン（Ｕｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７：３３４、１９９２；ユースマンら（Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ）、国際公開第９３／１５１８７号パンフレット；およびロッシら（Ｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ）、国際公開第９１／０３１６２号パンフレット；スプロート（Ｓｐｒｏａｔ）、米国特許第５，３３４，７１１号明細書；ゴールドら（Ｇｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ）、米国特許第６，３００，０７４号明細書；およびブルジンら（Ｂｕｒｇｉｎ  ｅｔ  ａｌ）、上記を参照されたい；これらは全て本願明細書に援用する）。全ての前述の参照文献に、本明細書に記載の核酸分子の塩基、リン酸および／または糖部分に施すことが可能な種々の化学修飾が記載されている。細胞内でのそれらの有効性を高める修飾、ならびにオリゴヌクレオチド合成時間を短縮し化学的要件を減らすための核酸分子からの塩基の除去が望まれる。
【０１３０】
ｉＲＮＡ物質の糖、塩基、または骨格に対する他の適切な修飾は、本明細書の他の箇所に記載する。
核酸分子のヌクレアーゼ安定性および有効性の有意な増大を伴って核酸分子に導入することができる糖、塩基およびリン酸修飾について報告する幾つかの例が当分野に存在している。例えば、オリゴヌクレオチドを修飾して安定性を増大させ、かつ／またはヌクレアーゼ耐性の基、例えば２’−アミノ、２’−Ｃ−アリル、２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｈ、ヌクレオチド塩基修飾を用いた修飾によって生物学的活性を増大させる（総説に関しては、ユースマンおよびセデルグレン（Ｕｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７：３４、１９９２；ユースマンら（Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３１：１６３、１９９４；ブルジンら（Ｂｕｒｇｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１４０９０、１９９６を参照）。核酸分子の糖修飾は、当分野において広く報告されている（エクシュタインら（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．）、国際公開第９２／０７０６５号パンフレット；ペルラウルトら（Ｐｅｒｒａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ  ３４４：５６５、１９９０；ピーケンら（Ｐｉｅｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：３１４、１９９１；ユースマンおよびセデルグレン（Ｕｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１７：３３４、１９９２；ユースマンら（Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、国際公開第９３／１５１８７号パンフレット；スプロート（Ｓｐｒｏａｔ）、米国特許第５，３３４，７１１号明細書、およびビーグルマンら（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２５７０２、１９９５；ビーグルマンら（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、国際公開第９７／２６２７０号パンフレット；ビーグルマンら（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第５，７１６，８２４号明細書；ユースマンら（Ｕｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第５，６２７，０５３号明細書；ウルフら（Ｗｏｏｌｆ  ｅｔ  ａｌ．）、国際公開第９８／１３５２６号パンフレット；カルペイスキーら（Ｋａｒｐｅｉｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３９：１１３１、１９９８；エアルンショーおよびゲイト（Ｅａｒｎｓｈａｗ  ａｎｄ  Ｇａｉｔ）、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）４８：３９、１９９８；ベルマおよびエックシュタイン（Ｖｅｒｍａ  ａｎｄ  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：９９、１９９８；およびブルリーナら（Ｂｕｒｌｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．５：１９９９、１９９７を参照；これらの参照文献は全て、その全容を本願明細書に援用する）。このような刊行物には、触媒反応を変化させずに核酸分子中への糖、塩基、および／またはリン酸修飾などの取り込み位置を決定するための一般的な方法および戦略が記載されており、これらの参照文献は本願明細書に援用する。このような教示を鑑みると、細胞内でＲＮＡｉを促進するｉＲＮＡ物質の能力が著しく阻害されない限りは、本発明のｉＲＮＡ核酸分子を修飾す���ために、類似の修飾を本明細書に記載したのと同様に使用することが可能である。
【０１３１】
ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、および／または５’−メチルホスホネート結合によるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド間結合の化学修飾は、安定性を増大させるが、過剰な修飾は何らかの毒性または活性の低下を引き起こす可能性がある。したがって、核酸分子を設計するときは、これらのヌクレオチド間結合の量は最少限でなければならない。これらの結合の濃度を低下させれば、毒性が低下し、これらの分子の有効性の増大および高い特異性をもたらすはずである。
【０１３２】
ｉＲＮＡ物質の３’および５’端は修飾することが可能である。このような修飾は、分子の３’端、５’端あるいは両端にあってよい。このような修飾は、末端のリン酸全体、あるいはリン酸基の１つまたは複数の原子の修飾または置換を含み得る。例えば、オリゴヌクレオチドの３’および５’端を、他の官能性分子体、例えば標識成分、例えば蛍光物質（例えばピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３またはＣｙ５色素）あるいは保護基（例えばイオウ系、シリコン系、ホウ素系またはエステル系）などと結合させることが可能である。官能性分子体は、リン酸基および／またはスペーサーを介して糖と結合させることが可能である。スペーサーの末端原子は、リン酸基または糖のＣ−３’もしくはＣ−５’のＯ、Ｎ、Ｓ、Ｃ基の結合原子と結合することが可能であり、あるいは該結合原子を置換することが可能である。あるいはスペーサーは、ヌクレオチド代用物（例えばＰＮＡ）の末端原子と結合することが可能であり、あるいは該末端原子を置換することが可能である。これらのスペーサーまたはリンカーは、例えば−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮ−、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＨ（例えばｎ＝３または６）、脱塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、またはモルホリノ、またはビオチンおよびフルオレセイン試薬を含み得る。スペーサー／リン酸−官能性分子体−スペーサー／リン酸の配列構成をｉＲＮＡ物質の２つの配列間に挿入すると、該配列構成はヘアピン型ＲＮＡ物質中のヘアピンＲＮＡループの代用となり得る。３’端は−ＯＨ基であってよい。理論によって縛られることは望まないが、ある種の成分を結合すると、輸送、ハイブリダイゼーション、および特異性に関する特性を改善し得ると考えられる。同様に、理論によって縛られることは望まないが、ヌクレアーゼ耐性を改善するような末端の改変を導入することは、望ましい可能性がある。末端修飾の他の例には、色素、インターカレート剤（例えばアクリジン）、架橋剤（例えばソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えばフェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えばＥＤＴＡ）、親油性担体（例えばコレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メタノール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレイン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド結合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸塩、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えばＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射標識マーカー、酵素、ハプテン（例えばビオチン）、輸送／吸収促進物質（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、および合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール結合体、テトラアザ大環状化合物のＥｕ３＋結合体）がある。幾つかの実施形態では、レチノールまたはレチノイン酸などの結合体を、ｉＲＮＡ物質の５’または３’端、あるいは両端と結合させることが可能である。このような結合体の使用により、網膜色素上皮細胞などのレチノール受容体を発現する細胞への、ｉＲＮＡ物質の特異的な取り込みおよび送達を改善し得る。
【０１３３】
活性を調節するためあるいは分解に対する耐性を調節するためなどの幾つかの理由で、末端修飾を加えることが可能である。活性を調節するのに有用な末端修飾には、リン酸またはリン酸類似体を用いた５’端の修飾がある。例えば好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ物質、特にアンチセンス配列が、５’リン酸化を受けるか、あるいは５’の最末端にホスホリル類似体を含む。５’リン酸修飾には、ＲＩＳＣ仲介型遺伝子発現抑制と適合性のある修飾が挙げられる。適切な修飾には：５’−１リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−２リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−３リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ−Ｏ−５’−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’）；５’−モノチオリン酸（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）；５’−モノジチオリン酸（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−ホスホロチオレート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５’）；酸素／イオウ置換された１リン酸、２リン酸および３リン酸（例えば５’−α−チオ３リン酸、５’−γ−チオ３リン酸など）、５’−ホスホロアミダイト（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’）、５’−アルキルリン酸（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えばＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５’−ＣＨ２−）、５’−アルキルエーテルホスホネート（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２−）、エトキシメチルなど、例えばＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５’−）の任意の他の組合せがある。
【０１３４】
他の実施形態では本発明は、本発明のｉＲＮＡ物質の結合体および／または複合体を特徴とする。このような結合体および／または複合体を使用して、細胞などの生物系へのｉＲＮＡ物質の送達を容易にすることが可能である。本発明により提供される結合体および複合体は、細胞膜を横断して治療用化合物を移送すること、薬物動態を変えること、および／または本発明の核酸分子の局在化を調節することによって治療活性を与え得る。本発明は、小分子、脂質、リン脂質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、抗体、毒素、負に帯電したポリマーおよび他のポリマー、例えばタンパク質、ペプチド、ホルモン、炭水化物、ポリエチレングリコール、またはポリアミンなど（これらに限定はされない）の分子を、細胞膜を横断して送達するための、新規な結合体および複合体の設計および合成を含む。一般に、記載の輸送体は、分解性リンカーを用いて、または用いずに、単独あるいは多成分系の一部として使用するように設計される。これらの化合物は、血清の存在下または不在下において、異なる組織に由来する幾つかの種類の細胞への本発明の核酸分子の送達および／または局在化を改善すると予想される（シュレンジャーおよびチェック（Ｓｕｌｌｅｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｃｅｃｈ）、米国特許第５，８５４，０３８号明細書を参照）。本明細書に記載する分子の結合体は、生分解性核酸リンカー分子などの生分解性のリンカーを介して、生物学的に活性がある分子と結合させることが可能である。
【０１３５】
ｉＲＮＡ物質の投与
望ましくないＶＥＧＦ発現を特徴とする障害を有すると診断された患者は、ＶＥＧＦの悪影響を阻害することによって望ましくないＶＥＧＦ遺伝子発現と関係がある症状を軽減するために、本明細書に記載するｉＲＮＡ物質を投与することによって、治療することが可能である。例えばｉＲＮＡ物質は、血管新生障害などの眼の疾患と関係がある症状を軽減することが可能である。他の例では、結腸がんまたは乳がんなどの腫瘍または転移性がん；喘息または気管支炎などの肺疾患；または関節リウマチまたは乾癬などの自己免疫疾患を有する患者を治療するために、ｉＲＮＡ物質を投与することが可能である。抗ＶＥＧＦ  ｉＲＮＡ物質は、全身に、例えば経口で、または筋肉内注射によって、あるいは静脈内注射によって、投与経路に合った、薬剤として許容可能な担体と混合して投与することが可能である。ｉＲＮＡ物質は、対象に投与するためのリポソームなどの送達用ビヒクル、担体および希釈剤およびそれらの塩を含んでよく、かつ／あるいは薬剤として許容可能な調合物中に存在していてもよい。核酸分子を送達するための方法は、いずれも本願明細書に援用する、アクハターら（Ａｋｈｔａｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．２：１３９、１９９２；「Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」、アクハター（Ａｋｈｔａｒ）編、１９９５；マウラーら（Ｍａｕｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ：Ｂｉｏｌ．、１６：１２９、１９９９；ホフランドおよびフアング（Ｈｏｆｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ）、Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３７：１６５、１９９９；およびリーら（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．）、ＡＣＳ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．７５２：１８４、２０００に記載されている。ベイゲルマンら（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ）、米国特許第６，３９５，７１３号明細書、およびスリバンら（Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ）、国際公開第９４／０２５９５号パンフレットには、核酸分子を送達するための一般的な方法がさらに記載されている。核酸分子は、当業者に知られているさまざまな方法によって、例えば、リポソーム封入、イオン導入法、またはその他のビヒクル、例えばヒドロゲル、シクロデキストリン（例えば、ゴンザレスら（Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１０：１０６８、１９９９を参照）、生分解性ナノカプセル、および生体接着性ミクロスフェアへの組み込み、またはタンパク質様ベクター（オーハーレおよびノルマンド（Ｏ’Ｈａｒｅ  ａｎｄ  Ｎｏｒｍａｎｄ）、国際公開第００／５３７２２号パンフレット）など（これらに限定はされない）によって、細胞に投与することが可能である。
【０１３６】
本発明の方法では、ｉＲＮＡ物質を、裸のｉＲＮＡ物質として送達用試薬と共に、あるいはｉＲＮＡ物質を発現する組換えプラスミドまたはウイルスベクターとして、対象に投与することが可能である。ｉＲＮＡ物質は、裸のｉＲＮＡとして投与することが好ましい。
【０１３７】
本発明のｉＲＮＡ物質を、望ましくないＶＥＧＦ発現が存在する領域またはその近辺、例えば血管新生の領域またはその近辺などの組織の細胞へｉＲＮＡ物質を送達するのに適した任意の手段によって、対象に投与することが可能である。例えば、遺伝子ガン、エレクトロポレーションによって、あるいは他の適切な非経口投与経路によって、ｉＲＮＡ物質を投与することが可能である。
【０１３８】
適切な経腸投与経路には経口送達が挙げられる。
適切な非経口投与経路には、血管内投与（例えば、静脈内ボーラス注射、静脈内注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入、および血管へのカテーテル注入）；組織周囲および組織内への注射（例えば、眼内注射、網膜内注射、または網膜下注射）；皮下への注射またはデポー、例えば皮下注入（浸透圧ポンプなどによる）；血管新生部位またはその近辺の領域への直接施用、例えばカテーテルまたは他の配置式デバイス（例えば、多孔質、非多孔質、またはゼラチン材料を含んでなる網膜用ペレットまたはインプラント）による施用、がある。血管新生部位またはその近辺にｉＲＮＡ物質を注射または注入することが好ましい。
【０１３９】
本発明のｉＲＮＡ物質は、眼内インプラントを使用して送達することが可能である。このようなインプラントは生分解性および／または生体適合性インプラントであってもよいし、あるいは非生分解性インプラントであってもよい。インプラントは活性物質に対して透過性でも非透過性であってよく、前房または後房などの眼房に挿入されてもよいし、あるいは強膜、経脈絡膜空間、または硝子体外側の無血管野に移植されてもよい。好ましい実施形態では、治療が望ましい部位、例えば眼の眼内空間および黄斑へ薬剤が強膜を経て拡散しうるように、強膜上などの無血管野にインプラントを配置することが可能である。さらに、経強膜拡散の部位は黄斑の近辺であることが好ましい。
【０１４０】
本発明のｉＲＮＡ物質は、例えばパッチまたは眼への直接施用により、あるいはイオン導入法によって、局所投与することも可能である。軟膏剤、スプレー、または滴下可能な液体は、アプリケータまたは点眼器などの当分野で知られている眼部送達系によって送達することが可能である。該組成物を眼の表面に、あるいは瞼の内部に直接投与することも可能である。このような組成物は、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはポリ（ビニルアルコール）などのムコ多糖類似体、ソルビン酸、ＥＤＴＡまたは塩化ベンジルクロムなどの保存剤、ならびに通常量の希釈剤および／または担体を含み得る。
【０１４１】
本発明のｉＲＮＡ物質は、例えば米国特許第５，６７２，６５９号および米国特許第５，５９５，７６０号明細書に記載された組成物などの、徐放性組成物に含めて提供することが可能である。即放性または徐放性組成物の使用は、治療する状態の性質に依存する。状態が急性または超急性の障害で構成される場合、徐放性組成物よりも即放性の形態を用いる治療が好ましいと思われる。あるいは、ある種の予防的治療または長期治療に関しては、徐放性組成物が適切である場合がある。
【０１４２】
ニードルまたは他の送達用デバイスなどを用いて、眼の内部にｉＲＮＡ物質を注射することが可能である。
本発明のｉＲＮＡ物質は、単回用量または複数回用量として投与することが可能である。本発明のｉＲＮＡ物質の投与が注入による場合、その注入は単回の徐放性投与であってもよいし、あるいは複数回の注入によって送達されてもよい。血管新生部位またはその近辺の組織に本発明の物質を直接注射することが好ましい。血管新生部位またはその近辺の組織に本発明の物質を複数回注射することも好ましい。
【０１４３】
投与１回当たり体重に対して約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ程度の用量レベルが、血管新生疾患の治療において有用である。眼に直接投与するとき、好ましい用量範囲は片眼当たり約０．００００１ｍｇ〜約３ｍｇ、あるいは好ましくは片眼当たり約０．０００１〜０．００１ｍｇ、片眼当たり約０．０３〜３．０ｍｇ、片眼当たり約０．１〜３．０ｍｇあるいは片眼当たり約０．３〜３．０ｍｇである。当業者は、本発明のｉＲＮＡ物質をある対象に投与するための適切な投与計画を、容易に決定することも可能である。例えばｉＲＮＡ物質を、例えば血管新生部位またはその近辺への単回の注射またはデポーとして、対象に１回投与することが可能である。あるいはｉＲＮＡ物質を、約３〜約２８日、より好ましくは約７〜約１０日の期間、１日１回または２回対象に投与することが可能である。好ましい投与計画では、ｉＲＮＡ物質を、望ましくないＶＥＧＦ発現の部位またはその近辺（血管新生部位の近辺など）に、１日１回、７日間注射する。投与計画が複数回投与を含んでなる場合、対象に投与される有効量のｉＲＮＡ物質とは、投与計画全体で投与されるｉＲＮＡ物質の総量を含み得ることは理解されよう。当業者には当然のことであるが、投与される特定のｉＲＮＡ物質、投与の時間、投与の経路、調合物の性質、排泄速度、治療される特定の障害、疾患の重篤度、ｉＲＮＡ物質の薬力学的作用、ならびに患者の年齢、性別、体重、および一般的健康状態を含めたさまざまな要因に応じて、正確な個々の用量をある程度調節することが可能である。さまざまな投与経路の異なる有効性を鑑みると、必要な用量レベルは広範囲に変化することが予想される。例えば、経口投与は一般に、静脈内または硝子体内への注射による投与より高い用量レベルを必要とすると予想されるであろう。これらの用量レベルの変化は、当分野でよく知られている標準的かつ日常的な最適化実験を使用して調節することが可能である。正確な治療上有効な用量レベルおよび投与パターンは、上記に定義した要因を考慮して主治医により決定されることが好ましい。
【０１４４】
既存の血管新生疾患を治療すること以外に、本発明のｉＲＮＡ物質を予防的に投与して、これらの障害および関連障害の発症を予防するかあるいは遅延させることが可能である。予防用途では、特定の血管新生性障害に罹患しやすいか、そうでなければそのリスクのある患者に、本発明のｉＲＮＡを投与する。
【０１４５】
本発明により特徴付けられるｉＲＮＡ物質は、対象に投与する前に、当分野で知られている技法に従って医薬組成物として調合されることが好ましい。本発明の医薬組成物は、少なくとも滅菌状態で発熱物質を含まないことを特徴とする。本明細書で使用する「医薬調合物（医薬製剤）」とは、ヒトおよび家畜に使用するための調合物を含む。本発明の医薬組成物を調製するための方法は、当分野の技術の範囲内にあり、例えばその全開示を本願明細書に援用する、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ」、第１８版、米国ペンシルバニア州イーストン所在のマック出版社（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、１９９０年、および「Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」、２００３、ゲンナロら（Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されているものである。
【０１４６】
本発明の医薬調合物は、本発明のｉＲＮＡ物質（例えば０．１〜９０重量％）、または生理的に許容可能なその塩を、生理的に許容可能な担体媒体と混合させた状態で含む。好ましい生理的に許容可能な担体媒体は、水、緩衝水溶液、通常の生理食塩水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などである。
【０１４７】
本発明の医薬組成物は、従来の医薬品賦形剤および／または医薬品添加剤も含み得る。適切な医薬品賦形剤には、安定剤、抗酸化剤、浸透圧調節物質、緩衝剤、およびｐＨ調節剤がある。適切な添加剤には、生理的に生体適合性である緩衝剤（例えば、トロメタミン塩酸塩）、キレート剤（例えば、ＤＴＰＡまたはＤＴＰＡ−ビスアミドなど）の添加、またはカルシウムキレート複合体（例えば、カルシウムＤＴＰＡ、ＣａＮａＤＴＰＡ−ビスアミドなど）、あるいは任意選択で、カルシウム塩またはナトリウム塩（例えば、塩化カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、グルコン酸カルシウムまたは乳酸カルシウム）の添加がある。本発明の医薬組成物は、液体形態で使用するために包装することが可能であり、あるいは凍結乾燥させることも可能である。
【０１４８】
固形組成物用に、従来の非毒性の固形担体；例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを使用することが可能である。
【０１４９】
例えば、経口投与用の固形医薬組成物は、上記に列挙した担体および賦形剤のいずれかと、１０〜９５％、好ましくは２５％〜７５％の１つまたは複数の本発明のｉＲＮＡ物質とを含み得る。
【０１５０】
「薬剤として許容可能な調合物」とは、本発明の核酸分子が該分子の望ましい活性に最も適した物理的位置に有効に分布することを可能にする組成物または調合物を意味する。本発明の核酸分子と調合するのに適した物質の非制限的な例には、ＣＮＳへの薬物の進入を増大させることが可能なＰ−糖タンパク質阻害剤（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ８５など）（ジョリエット−リアントおよびティレメント（Ｊｏｌｌｉｅｔ−Ｒｉａｎｔ  ａｎｄ  Ｔｉｌｌｅｍｅｎｔ）、Ｆｕｎｄａｍ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３：１６、１９９９）、徐放送達用のポリ（ＤＬ−ラクチド−コグリコリド）ミクロスフェアなどの生分解性ポリマーがある。本発明の核酸分子の送達戦略に関する他の非制限的な例には、ボアドら（Ｂｏａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８７：１３０８、１９９８；タイラーら（Ｔｙｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４２１：２８０、１９９９；パルドリッジら（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ．９２：５５９２、１９９５；ボアド（Ｂｏａｄｏ）、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．１５：７３、１９９５；アルドリアン−ヘルラダら（Ａｌｄｒｉａｎ−Ｈｅｒｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２６：４９１０、１９９８；およびタイラーら（Ｔｙｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ９６：７０５３、１９９９中に記載された物質がある。
【０１５１】
本発明はさらに、ポリ（エチレングリコール）脂質を含む表面修飾リポソーム（ＰＥＧ修飾リポソーム、あるいは長期循環リポソームまたはステルスリポソーム）を含む組成物の使用を特徴とする。これらの調合物は、標的組織中の薬物の蓄積を増大させるための方法をもたらす。この種の薬物担体は単核性食細胞系（ＭＰＳまたはＲＥＳ）によるオプソニン作用および除去に耐性があり、したがって血中循環時間の延長および組織の封入薬物への暴露の増大を可能にする（ラジックら（Ｌａｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９５：２６０１、１９９５；イシワタら（Ｉｓｈｉｗａｔａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｅ．Ｂｕｌｌ．４３：１００５、１９９５）。
【０１５２】
このようなリポソームは、おそらく血管外漏出および血管が新生された標的組織における捕捉によって、腫瘍中に選択的に蓄積することが示されている（ラジックら（Ｌａｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：１２７５、１９９５；オクら（Ｏｋｕ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２３８：８６、１９９５）。長期循環リポソームは、特にＭＰＳの組織中に蓄積することが知られている従来のカチオンリポソームと比較して、ＤＮＡおよびＲＮＡの薬物動態および薬力学的作用を高める（リウら（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４２：２４８６４、１９９５；コイら（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．）、国際公開第９６／１０３９１号パンフレット；アンセルら（Ａｎｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．）、国際公開第９６／１０３９０号パンフレット；ホランドら（Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．）、国際公開第９６／１０３９２号パンフレット）。長期循環リポソームは、肝臓および脾臓などの代謝が活発なＭＰＳ組織への蓄積を回避する能力に基づいて、カチオンリポソームよりも強力にヌクレアーゼ分解から薬物を保護する可能性もある。
【０１５３】
本発明は、薬剤として許容可能な担体または希釈剤中に薬剤として有効な量の所望の化合物を含む、保存または投与用に調製された組成物も含む。治療用途に関して許容可能な担体または希釈剤は、薬学の分野でよく知られており、例えば本願明細書に援用する「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、マック出版社（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）（エイ．アール．ゲンナロ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ）編、１９８５）に記載されている。例えば、保存剤、安定剤、色素および着香剤を与えることが可能である。これらは安息香酸ナトリウム、ソルビン酸およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルなどである。さらに、抗酸化剤および懸濁剤を使用することが可能である。
【０１５４】
本発明の核酸分子を、他の治療用化合物と組み合わせて対象に投与して、全体的な治療効果を高めることも可能である。多数の化合物を使用して徴候を治療することによって、副作用の存在を減らしながら有益な効果を高めることが可能である。
【０１５５】
あるいは、本発明のある種のｉＲＮＡ物質を、細胞内で真核生物プロモーターから発現させることが可能である（例えば、アイザントおよびバイントラウブ（Ｉｚａｎｔ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：３４５、１９８５；マクギャリーおよびリンドクイスト（ＭｃＧａｒｒｙ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：３９９、１９８６；スカンロンら（Ｓｃａｎｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１０５９１、１９９１；カシャニ−サベットら（Ｋａｓｈａｎｉ−Ｓａｂｅｔ  ｅｔ  ａｌ．）、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．２：３、１９９２；ドロプリックら（Ｄｒｏｐｕｌｉｃ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１４３２、１９９２；ベエラシンゲら（Ｗｅｅｒａｓｉｎｇｈｅ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５：５５３１、１９９１；オージェーバンジェットら（Ｏｊｗａｎｇｅｔ  ａｌ．）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０８０２、１９９２；チェンら（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：４５８１、１９９２；サルバーら（Ｓａｒｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１２２２、１９９０；トンプソンら（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：２２５９、１９９５；グッドら（Ｇｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：４５、１９９７）。当業者であれば理解していることであるが、任意の核酸を、真核生物細胞中で適切なＤＮＡ／ＲＮＡベクターから発現させることが可能である。このような核酸の活性は、該核酸を酵素的核酸により一次転写産物から放出させることによって増大し得る（ドレーパーら（Ｄｒａｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、国際公開第９３／２３５６９号パンフレット、およびスリバンら（Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、国際公開第９４／０２５９５号パンフレット；オオカワら（Ｏｈｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２７：１５６、１９９２；タイラら（Ｔａｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：５１２５、１９９１；ベンチュラら（Ｖｅｎｔｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：３２４９、１９９３；コブリアら（Ｃｈｏｗｒｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２５８５６、１９９４）。
【０１５６】
本発明の他の態様では、本発明のＲＮＡ分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクター中に挿入した転写ユニット（例えば、カウチュレら（Ｃｏｕｔｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２：５１０、１９９６を参照）から発現させることが可能である。組換えベクターはＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターであってよい。ｉＲＮＡ物質を発現するウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアルファウイルス（これらに限定はされない）に基づいて構築することが可能である。他の実施形態では、ｐｏｌＩＩＩ系構築体を使用して本発明の核酸分子を発現させる（例えば、トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）、米国特許第５，９０２，８８０号明細書および同第６，１４６，８８６号明細書を参照）。ｉＲＮＡ物質を発現することが可能な組換えベクターを上述のように送達し、標的細胞中に維持することが可能である。あるいは、核酸分子の一過性の発現をもたらすウイルスベクターを使用することも可能である。このようなベクターは、必要に応じて繰り返し投与することが可能である。ひとたび発現すると、ｉＲＮＡ物質は標的ｍＲＮＡと相互作用し、ＲＮＡｉ応答を生じる。ｉＲＮＡ物質発現ベクターの送達は、全身的、例えば静脈内または筋肉内投与、対象から外部移植した標的細胞に投与した後の対象への再導入、あるいは所望の標的細胞への導入を可能にすると思われる任意の他の手段（総説に関しては、カウチュレら（Ｃｏｕｔｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２：５１０、１９９６を参照）などによるものよい。
【０１５７】
本発明のｉＲＮＡ物質の他の眼部適応症には、増殖性糖尿病性網膜症（糖尿病性網膜症の最も重度の段階）、ブドウ膜炎（黄斑浮腫をもたらすことが多い眼の炎症状態）、白内障手術後ののう胞状黄斑浮腫、近視性変性（高度の近視を有する患者が脈絡膜の血管新生を発症する状態）、炎症性黄斑変性症（感染または他の原因のため黄斑領域に炎症を有する患者が、脈絡膜の血管新生を発症する状態）、および虹彩の血管新生（虹彩の表面上の新しい血管の成長を伴う、糖尿病性網膜症または網膜静脈閉鎖症の重大な合併症）がある。
【０１５８】
本発明のｉＲＮＡ物質の他の眼部以外の適応症には、腎臓がんおよび結腸がんなど（これらに限定はされない）のがん、ならびに乾癬がある。固形腫瘍およびその転移は、該腫瘍が生存するための新しい血管の成長に依存する。
【０１５９】
乾癬は、皮膚細胞を過度に速く増殖させ、その結果濃い白色または赤色の皮膚の斑点を生じる、慢性的な炎症性皮膚疾患である。前臨床および臨床データから、ＶＥＧＦ誘導型の血管の成長および血管の漏出が、この病態の進行において役割を果たすことが示唆されている。
【０１６０】
本発明を以下の実施例によってさらに例示するが、これらの実施例はさらに限定するものとして解釈すべきではない。
【実施例１】
【０１６１】
ｓｉＲＮＡの設計
ＶＥＧＦ−Ａ１２１  ｍＲＮＡ配列のエクソン１〜５内の４００個の標的配列を同定し（表１参照、配列番号２〜４０１）、これらを標的とする、対応するｓｉＲＮＡをバイオインフォマティクス・スクリーニングに供した。
【０１６２】
配列がＶＥＧＦ配列に特異的であり、他のいかなる遺伝子由来の配列にも特異的ではないことを裏付けるために、上記標的配列を、ＮＣＢＩ提供のＢＬＡＳＴ検索エンジンを使用してＧｅｎｂａｎｋの配列に対して調べた。ＢＬＡＳＴアルゴリズムの使用については、アルトシュールら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３、１９９０；ならびにアルトシュールおよびギッシュ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ａｎｄ  Ｇｉｓｈ）、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：４６０、１９９６に記載されている。
【０１６３】
ｓｉＲＮＡがサル、ラットおよびヒトのＶＥＧＦ配列と交差反応する能力に関して、ｓｉＲＮＡの優先順位の付与も実施した。
少数のリード候補物を同定するために、これら４００個の標的配列候補のうち、実験的スクリーニングによる分析用に８０個を選択した。これら８０個の標的配列１１４について、合計１１４個のｓｉＲＮＡ分子を設計した（表２）。
【実施例２】
【０１６４】
ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの合成
Ｅｘｐｅｄｉｔｅ（商標）８９０９、ＡＢＩ３９２およびＡＢＩ３９４合成装置（ドイツ国６４２９３、ダルムスタット、フランクフルターシュトラーセ（Ｆｒａｎｋｆｕｒｔｅｒ  Ｓｔｒ．）１２９ｂ所在のアプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、アプレラ・ドイツランド・ゲーエムベーハー（Ａｐｐｌｅｒａ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄ  ＧｍｂＨ））で、ＣＰＧ固形支持体およびＥｘｐｅｄｉｔｅ（商標）ＲＮＡホスホロアミダイト（いずれもプロリゴバイオケミー・ゲーエムベーハー（Ｐｒｏｌｉｇｏ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ）、ドイツ国ハンブルグ、ゲオルグハイケンシュトラーセ１４（Ｇｅｏｒｇ−Ｈｙｋｅｎ−Ｓｔｒ．１４）から入手）を使用して、１μｍｏｌｅスケールでＲＮＡを合成した。補助試薬は、マリンクロート・バーケル（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ  Ｂａｋｅｒ）（ドイツ国６４３４７、グリーズハイム（Ｇｒｉｅｓｈｅｉｍ）、イムロイシュネルパルク４（Ｉｍ  Ｌｅｕｓｃｈｎｅｒｐａｒｋ４））から得た。ホスホロチオエート結合は、酸化ヨウ素溶液を、アセトニトリルに溶かしたＢｅａｕｃａｇｅ試薬（５％、重量／体積）の溶液で置換することによって導入した。
【０１６５】
固形支持体からのオリゴリボヌクレオチドの切断および塩基の脱保護は、水中メチルアミン（４１％）とエタノール中メチルアミン（３３％）の３：１（ｖ／ｖ）混合物を用いて実施した。２’−脱シリル化は、確立された手順（ビンコットら（Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：２６７７〜２６８４、１９９５）に従って行った。粗製オリゴリボヌクレオチドは、２２×２５０ｍｍのＤＮＡＰａｃ（登録商標）ＰＡ１００カラムを使用して、１０ｍＭのＮａＣｌＯ４、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ６．８）、６Ｍの尿素を含むバッファーＡ、および４００ｍＭのＮａＣｌＯ４、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ６．８）、６Ｍの尿素を含むバッファーＢを用いて、アニオン交換ＨＰＬＣによって精製した。流速は４．５ｍＬ／分で、１５％のバッファーＢで始めて４５分間で５５％まで増大させた。
【０１６６】
精製した化合物を、ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ（ＬＣ：Ｅｔｔａｎ  Ｍｉｃｒｏ（商標）、ドイツ国７９１１１、フライブルク  ムンツィンガーシュトラーセ９（Ｍｕｎｚｉｎｇｅｒ  Ｓｔｒａｓｓｅ９）所在のアマシャムバイオサイエンスヨーロッパ・ゲーエムベーハー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ）、ＥＳＩ−ＭＳ：ＬＣＱ、ＤｅｃａＸＰ（商標）、ドイツ国６３３０３、ドライアイヒ（Ｄｒｅｉｅｉｃｈ）イムスタイングルント４〜６（Ｉｍ  Ｓｔｅｉｎｇｒｕｎｄ４〜６）所在のサーモフィニガン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ）、およびキャピラリー電気泳動（Ｐ／ＡＣＥ  ＭＤＱ  キャピラリー電気泳動システム、ドイツ国８５７０２、ウンターシュライスハイム（Ｕｎｔｅｒｓｃｈｌｅｉｓｓｈｅｉｍ）所在のベックマンコールター・ゲーエムベーハー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＧｍｂＨ））によって特性解析を実施した。単離したオリゴリボヌクレオチドの純度は少なくとも８５％であった。
【０１６７】
収率および濃度は、分光光度計を使用して、２６０ｎｍの波長におけるそれぞれのＲＮＡ溶液のＵＶ吸収率によって測定した。アニーリングバッファー（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８；１００ｍＭの塩化ナトリウム）に溶かした相補鎖の等モル溶液を混合し、水浴中において８５〜９０℃で３分間加熱し、３〜４時間かけて室温に冷却することによって２本鎖ＲＮＡを作製した。ＲＮＡは使用するまで−２０℃に保った。
【実施例３】
【０１６８】
ｓｉＲＮＡの有効性スクリーニング
２つの有効性スクリーニングを使用して、ＶＥＧＦのｓｉＲＮＡを、リード候補物となるそれらの能力に関してスクリーニングした。表２は、幾つかのｓｉＲＮＡについての、内在性ＶＥＧＦ遺伝子の発現を阻害する能力の相対的有効性を示している。この工程で、候補ｓｉＲＮＡの数を選別した。ヒトＨｅＬａまたはＡＲＰＥ−１９（分化型の性質を有するヒト網膜色素上皮細胞株（ダンら（Ｄｕｎｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｅｘｐ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．６２：１５５、１９９６）を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％ウシ胎児血清１００μｌに含めて、９６ウェルプレート（１７，０００細胞／ウェル）で培養した。細胞が約９０％コンフルエントに達したとき（約２４時間後）、２０ｎＭで始めて３倍希釈系列としたｓｉＲＮＡを用いて細胞をトランスフェクションした。１ウェルあたり０．４μｌのトランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（米国カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）所在のインビトロジェンコーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））を使用し、トランスフェクションは製造業者のプロトコルに従って行った。すなわち、ｓｉＲＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００複合体を、以下のように調製した。適量のｓｉＲＮＡを無血清のＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ低血清培地で希釈し、軽く混合した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００を使用前に軽く混合し、次いで９６ウェルプレートの各ウェルについて０．４μｌを、無血清のＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）Ｉ低血清培地２５μｌで希釈し、軽く混合し、室温で５分間インキュベートした。５分間のインキュベーション後、１μｌの希釈ｓｉＲＮＡを、希釈したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００と合わせた（合計体積は２６．４μｌである）。この複合体を軽く混合し、室温で２０分間インキュベートしてｓｉＲＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００複合体を形成させた。次いで、１０％ウシ胎児血清をＤＭＥＭに加えたもの１００μｌを、ｓｉＲＮＡ：Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００複合体のそれぞれに加え、プレートを前後に揺らすことによって軽く混合した。１００μｌの前述の混合物を、細胞の入った各ウェルに加え、このプレートを２４時間ＣＯ２インキュベータ中で３７℃にてインキュベートし、次いで培養培地を除去し、１０％ウシ胎児血清を加えたＤＭＥＭ１００μｌを加えた。培地交換後、馴化培地を２４時間（ＨｅＬａ細胞）または７２時間（ＡＲＰＥ−１９細胞）で回収し、ＤｕｏＳｅｔ（登録商標）ヒトＶＥＧＦ用ＥＬＩＳＡ開発キット（米国５５４１３、ミネソタ州ミネアポリス所在のアール＆ディー・システムズ・インコーポレイテッド（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．））を使用してヒトＶＥＧＦのＥＬＩＳＡを行った。このキットは、細胞培養上清および血清中の天然および組換えヒトＶＥＧＦを測定するための、サンドウィッチＥＬＩＳＡの開発に必要な基本的要素を含む。
【０１６９】
使用した材料を以下に挙げる：
捕捉抗体：０．２５ｍｌのＰＢＳ（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、８．１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１．５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２〜７．４、０．２μｍ濾過）を用いて再構成した場合、５７６μｇ／ｍｌの抗ヒトＶＥＧＦヤギ抗体。再構成後、６０日間まで２〜８℃で保存するか、あるいは等分して６ヶ月まで霜取り手動式のフリーザーで−２０℃〜−７０℃にて保存した。担体タンパク質を含まないＰＢＳで０．８μｇ／ｍｌの作業濃度に希釈した。
【０１７０】
検出抗体：１．０ｍｌの試薬希釈液（Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｄｉｌｕｅｎｔ；１％ウシ血清アルブミンのＰＢＳ（ｐＨ７．２〜７．４）溶液、０．２μｍ濾過）を用いて再構成したとき、４．５μｇ／ｍｌのビオチン化抗ヒトＶＥＧＦヤギ抗体。再構成後、６０日間まで２〜８℃で保存するか、あるいは等分して６ヶ月まで霜取り手動式のフリーザーで−２０℃〜−７０℃にて保存した。試薬希釈液で２５ｎｇ／ｍｌの作業濃度に希釈した。
【０１７１】
標準品：０．５ｍｌの試薬希釈液を用いて再構成したとき、１１０ｎｇ／ｍｌの組換え体。この標準品を軽く攪拌しながら少なくとも１５分間を放置してから、希釈液を作製する。再構成した標準品は６０日間まで２〜８℃で保存するか、あるいは等分して６ヶ月まで霜取り手動式のフリーザーで−２０℃〜−７０℃にて保存することが可能である。試薬希釈液による２倍希釈系列を使用した７点標準曲線、および４０００ｐｇ／ｍｌの高濃度標準品が推奨される。
【０１７２】
ストレプトアビジン−ＨＲＰ：１．０ｍｌの、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼと結合したストレプトアビジン。６ヶ月まで２〜８℃で保存した。バイアルのラベルに指定された作業濃度に希釈した。
【０１７３】
一般的なＥＬＩＳＡプロトコルに従った（ミネソタ州ミネアポリス所在のアール＆ディー・システムズ・インコーポレイテッド）。
対照は、ｓｉＲＮＡ無し、ヒトＶＥＧＦのｓｉＲＮＡ（Ｃａｎｄ５、（ａ．ｋ．ａ．、ｈＶＥＧＦ５）ライヒら（Ｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｍｏｌ  Ｖｉｓ．９：２１０、２００３）、およびヒト、ラットおよびマウスのＶＥＧＦ間で保存されている２１ｎｔ配列に整合（マッチング）するｓｉＲＮＡ（ｈｒｍＶＥＧＦ、フィレウアーら（Ｆｉｌｌｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：３９１９〜３９２２、２００３）とした。
【０１７４】
ｓｉＲＮＡの活性を、ライヒら（Ｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）（上記）の対照ヒトＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡの活性と比較し、「＋」は対照のヒトＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡより低い活性を表し、「＋＋」は対照と類似の活性を表し、「＋＋＋」は対照より高い活性を表すものとした（表２）。図２は、突出部分が１つおよび２つのｓｉＲＮＡのＨｅＬａ細胞における活性を示す。中実の記号を有する実線は突出部分が１つのｓｉＲＮＡを表し、中空の記号を有する実線は突出部分が２つのｓｉＲＮＡを表し；破線は対照ｓｉＲＮＡを表す。全てのｓｉＲＮＡが対照ｓｉＲＮＡより活性が高く、ＶＥＧＦの発現を約８０％阻害する可能性がある。これに対し、ライヒら（Ｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）（上記）のｓｉＲＮＡは、同じ実験条件下において内在性ｈＶＥＧＦのレベルを約２０％低下させた。同様に、同じ実験条件下において、コンセンサス配列に基づくｓｉＲＮＡであるｈｒｍＶＥＧＦ（フィレウアーら（Ｆｉｌｌｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．）、上記）は、発現レベルを約４５％低下させた。
【０１７５】
図３は、突出部分が１つおよび２つのｓｉＲＮＡのＡＲＰＥ−１９細胞における活性を示す。中実の記号を有する実線は突出部分が１つのｓｉＲＮＡを表し、中空の記号を有する実線は突出部分が２つのｓｉＲＮＡを表し；破線は対照ｓｉＲＮＡを表す。全てのｓｉＲＮＡが対照ｓｉＲＮＡより活性が高く、ＶＥＧＦの発現を約９０％阻害する可能性がある。これに対し、ライヒら（Ｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．９：２１０、２００３）のｓｉＲＮＡは、同じ実験条件下においてｈＶＥＧＦのレベルを約３５％低下させた。同様に、同じ実験条件下において、コンセンサス配列に基づくｓｉＲＮＡであるｈｒｍＶＥＧＦ（フィレウアーら（Ｆｉｌｌｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．）、上記）は、発現レベルを約７０％低下させた。
【０１７６】
図４および５は、突出部分が１つおよび２つのｓｉＲＮＡを、その類似体である平滑末端ｓｉＲＮＡとそれぞれＨｅＬａ細胞において比較した結果を示す。その結果は、ｓｉＲＮＡ中の突出部分の存在が遺伝子の発現抑制の阻害において高い有効性をもたらす点で、エルバシルら（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１５：１８８、２００１）のデータと一致する。しかし重要なことは、平滑末端ｓｉＲＮＡの活性が、対照ｓｉＲＮＡを使用して得た結果に匹敵していることに留意することである。
【実施例４】
【０１７７】
低酸素条件下におけるＶＥＧＦ合成のサイレンシングに関するｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
ヒトＨｅＬａ細胞を、１００μｌの増殖培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）に含めて細胞１０，０００個／ウェルとして９６ウェルプレートで平板培養した。細胞接種の２４時間後に細胞が約５０％コンフルエントに達した時点で、３０ｎＭで始まるｓｉＲＮＡの３倍希釈系列液を用いて細胞をトランスフェクションした。ウェル当たり０．２μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００トランスフェクション試薬（米国カリフォルニア州カールスバッド所在のインビトロジェンコーポレーション（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））を使用し、トランスフェクションはインビトロジェン製品の挿入紙に記載されているように行った。対照は、ｓｉＲＮＡ無し、ヒトＶＥＧＦのｓｉＲＮＡ（ライヒら（Ｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｍｏｌ  Ｖｉｓ．９：２１０、２００３）、およびヒト、ラットおよびマウスのＶＥＧＦ間で保存されている２１ｎｔ配列に整合するｓｉＲＮＡ（ｈｒｍＶＥＧＦ、フィレウアーら（Ｆｉｌｌｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：３９１９〜３９２２、２００３）とした。トランスフェクションはそれぞれのプレートにおいて２連で行った。さらに、プレートを２連としてトランスフェクションを行うことによって、トランスフェクション後２４時間で増殖培地を交換し、１つのプレートを正常な酸素下増殖条件（３７℃、５％ＣＯ２、２０％酸素）に保ち、２つめのプレートは低酸素条件（３７℃、１％酸素、窒素で平衡）に保つことが可能であるようにした。低酸素条件は、Ｐｒｏ−ｏｘ酸素濃度コントローラ（米国ニューヨーク州レッドフィールド所在のバイオスフェリクス社（ＢｉｏＳｐｈｅｒｉｘ、Ｌｔｄ．））をＰｒｏ−ｏｘ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養用チャンバと結合させて使用することによって維持した。培地交換後２４時間、細胞を正常酸素条件または低酸素条件に保った。次いで馴化培養培地を両方のプレートから回収し、ＤｕｏＳｅｔ  ＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡ（米国ミネソタ州ミネアポリス所在のＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）において分泌されたＶＥＧＦのレベルを試験した。アッセイは製造者のプロトコルに従い、かつ実施例２に記載したのと同様に行った。
【０１７８】
デフェロキサミンによって化学的に低酸素条件を誘導するために、１３０μＭのデフェロキサミン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）Ｄ９５３３）を使用した。トランスフェクション後２４時間で、デフェロキサミンを新たな増殖培地に加えた。デフェロキサミンで処理した細胞を、次いで正常な増殖条件（３７℃、５％ＣＯ２、２０％酸素）下で増殖させた。
【０１７９】
図６は、最初のヌクレオチドがそれぞれ３１９および３４３に相当するＯＲＦ領域に対するｓｉＲＮＡ（突出部分が１つのｓｉＲＮＡと突出部分が２つのｓｉＲＮＡの両方）、および対照ｓｉＲＮＡを用いて得た結果を示す。低酸素条件である、１％酸素（図６Ｂ）または１３０μＭデフェロキサミン（図６Ｃ）では、３つの実験ｓｉＲＮＡ、すなわちＯＲＦ３４３を対象とするＡＬ−ＤＰ−４０９４（突出部分１つ）、およびＯＲＦ３１９を対象とする２つのｓｉＲＮＡ（突出部分１つおよび２つ）は、ＶＥＧＦの発現の約９５％の阻害を達成した。ライヒら（Ｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）（上記）およびフィレウアーら（Ｆｉｌｌｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．）（上記）の対照ｓｉＲＮＡは、ＶＥＧＦ発現をそれぞれ４５％および８５％阻害する能力を示す。
【０１８０】
図８のＡおよびＢは、ｓｉＲＮＡとしてＡＬ−ＤＰ−４０１４、ホスホロチオエート修飾型ＡＬ−ＤＰ−４０１４（ＡＬ−ＤＰ−４１２７、表３参照）、および突然変異型ＡＬ−ＤＰ−４０１４（ＡＬ−ＤＰ−４１４０、表５参照）を用いて得た結果を示す。正常および低酸素のいずれの条件下においても、非修飾型ｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−４０１４）およびホスホロチオエート修飾型ｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−４１２７）は、内在性ＶＥＧＦの発現を元の発現レベルの２０％未満に低下させた。低酸素条件下では、ホスホロチオエート修飾型ｓｉＲＮＡはＶＥＧＦの発現をほぼ無効にした。
【実施例５】
【０１８１】
ＶＥＧＦの修飾型ｓｉＲＮＡ分子は、完全な活性を保ちつつ増大した安定性を示す  ＶＥＧＦのＯＲＦ３１９を標的とするＡＬ−ＤＰ−４０１４についてホスホロチオエート誘導体を作製した。該誘導体を表３に示す。これらのｓｉＲＮＡを、実施例３に記載したＨｅＬａ細胞アッセイにおいて試験し、図７は、これらの誘導体がＨｅＬａアッセイにおいて非修飾型ｓｉＲＮＡと同程度の活性を有することを示す。
【０１８２】
ＡＬ−ＤＰ−４０９４  ｓｉＲＮＡの配列（表１）を保持しているが、ホスホロチオエート結合、Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、および２’−フルオロ修飾ヌクレオチドなどの様々な修飾を含む１群のｓｉＲＮＡを合成した（表４）。このｓｉＲＮＡ群をＨｅＬａ細胞において試験したが、図９のＡ〜Ｅは、ＡＬ−ＤＰ−４０９４  ｓｉＲＮＡの全ての修飾型が、ＶＥＧＦ発現を効率良く９０％超低下させたことを実証しており、以前に同定された２つのＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ（ライヒら（Ｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）（上記）の「Ａｃｕｉｔｙ」、およびフィレウアーら（Ｆｉｌｌｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．）（上記）の「Ｆｉｌｌｅｕｒ」）のいずれよりも有効性が高いことを示している。図１０も、ＨｅＬａ細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイのデータを示す。図１０中のグラフは、非修飾型のＡＬ−ＤＰ−４０９４  ｓｉＲＮＡおよびホスホロチオエート修飾型ＡＬ−ＤＰ−４００４のｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−４２１９）が、ＶＥＧＦ発現を７０％超低下させたことを示す（図１０）。化合物ＡＬ−ＤＰ−４０９４のスクランブル型（例えば、ＡＬ−ＤＰ−４２１６およびＡＬ−ＤＰ−４２１８（配列を以下に示す；下線を引いたヌクレオチドは、ＡＬ−ＤＰ−４０９４と比較したミスマッチなヌクレオチドを表す））は、ＶＥＧＦ発現を阻害しなかった。ホタルルシフェラーゼ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−３０１５；以下参照）も、ＶＥＧＦ発現を阻害しなかった。
ＡＬ−ＤＰ−４２１６
ＡＬ４０９４  ＭＩ  ｓ
５’−ＧＣＡＣＡＵＵＧＧＡＣＡＧＵＵＧＵＧＧＵＵ−３’  配列番号１０６５
ＡＬ４０９４  ＭＩ  ａｓ
’３−ＧＵＣＧＵＧＵＡＡＣＣＵＧＵＣＡＡＣＡＣＣＡＡ−’５  配列番号１０６４
ＡＬ−ＤＰ−４２１８
ＡＬ４０９４  Ｍ５  ｓ
５’−ＧＣＡＣＡＵＡＧＡＡＧＵＧＡＣＧＣＧＣＵＵ−３’  配列番号１０６２
ＡＬ４０９４  Ｍ５  ａｓ
’３−ＧＵＣＧＵＧＵＡＵＣＵＵＣＡＣＵＧＣＧＣＧＡＡ−’５  配列番号１０６３
ＡＬ−ＤＰ−３０１５
５’−ＧＡＡＣＵＧＵＧＵＧＵＧＡＧＡＧＧＵＣＣＵ−３’  配列番号８３０
’３−ＣＧＣＵＵＧＡＣＡＣＡＣＡＣＵＣＵＣＣＡＧＧＡ−’５  配列番号８３１
Ｓｔａｉｎｓ−Ａｌｌ染色法（米国ミズーリ州セントルイス所在のシグマ（Ｓｉｇｍａ））を行って、修飾ｓｉＲＮＡの安定性を調べた。アッセイを行うために、ｓｉＲＮＡ二重鎖を９０％ヒト血清中で３７℃にてインキュベートした。反応混合物のサンプルをさまざまな時間地点（０、０．２５、１、２、４、および２４時間）で急冷し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供した。経時的なＲＮＡの切断から、血清ヌクレアーゼによる分解に対するｓｉＲＮＡ二重鎖の感受性に関する情報が得られた。
【０１８３】
ホスホロチオエート修飾と組み合わせてＯ−メチルおよび２’フルオロ修飾を使用すると、ホスホロチオエート修飾を単独で使用した場合より、安定性がより高まることが分かった。例えば、ＡＬ−ＤＰ−４０９４  ｓｉＲＮＡの修飾型には、ホスホロチオエート修飾ｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−４１９８）、ホスホロチオエートおよびＯ−メチル修飾ｓｉＲＮＡ（例えば、ＡＬ−ＤＰ−４１８０、ＡＬ−ＤＰ−４１７５、およびＡＬ−ＤＰ−４２２０）、ならびにホスホロチオエートおよびＯ−メチルおよび２’−フルオロ修飾ｓｉＲＮＡ（例えば、ＡＬ−ＤＰ−４１９７およびＡＬ−ＤＰ−４２２１）があった（表４）。ＡＬ−ＤＰ−４１８０、ＡＬ−ＤＰ−４１７５、およびＡＬ−ＤＰ−４１９７のｓｉＲＮＡは、ヒト血清中でＡＬ−ＤＰ−４１９８  ｓｉＲＮＡよりも安定性が高いことが分かった。ホスホロチオエート修飾はエキソヌクレアーゼ分解に対してｓｉＲＮＡを安定化させ、Ｏ−メチルおよび２’−フルオロ修飾は、エンドヌクレアーゼ分解に対してｓｉＲＮＡを安定化させることが見出された。
【実施例６】
【０１８４】
異なるラット血清および眼部組織におけるＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性アッセイ
１．組織ホモジェネートの調製
少なくとも３匹のラットから集めた眼全体、網膜、硝子液からの組織を切除し、液体窒素中で直ぐに凍結させた。この凍結組織を、ドライアイスで予め冷却した装置を使用して、ドライアイス上で粉砕した。１ｍｌのＲＩＰＡバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣＬ、１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、０．５％のデオキシコール酸Ｎａデオキシコール酸、１％のＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０、０．０５％のＳＤＳ）を凍結組織粉末に加え、この混合物を完全に激しく混合した。このホモジェネートを４℃において５分間１０，０００×ｇで遠心分離し、ペレットを捨てた。上清の分割試料１００μｌを予め冷却した微量遠心分離チューブに移し、−７０℃で保存するか、あるいは直ぐに安定性アッセイに使用した。
【０１８５】
２．Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびγ３２Ｐ−ＡＴＰを使用する、１本鎖のセンスまたはアンチセンスｓｉＲＮＡの５’端標識
以下の試薬を使用した。
【０１８６】
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）１０ユニット／μｌ（米国マサチューセッツ州ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）所在のニューイングランドバイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））
１０×Ｔ４ＰＮＫバッファー（７００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ｐＨ７．６）
γ−３２Ｐ−ＡＴＰ（米国コネチカット州シェルトン（Ｓｈｅｌｔｏｎ）所在のパーキンエルマー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ））２５０μＣｉ、３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ（３．３μＭ）
Ｈ２Ｏで希釈した合成ＲＮＡオリゴの１０μＭストック
Ｍｉｃｒｏｓｐｉｎ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ−２５カラム（アマシャムバイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
ＲＮＡｓｅを含まない水および０．６５ｍｌ微量遠心分離（１．５ｍｌ）チューブ。
【０１８７】
２５μｌのキナーゼ反応混合物には以下のものを含めた：
２．５μｌ：１０μＭストックのセンスまたはアンチセンス（最終濃度１μＭ）由来
２．５μｌ：１０×ＰＮＫバッファー（１×）
１．５μｌ：γ３２−ＡＴＰ（約０．２ｎＭ）
１．０μｌ：１０ユニット／μｌのＴ４ＰＮＫ（１０ユニット）
１７．５μｌ：ｄＨ２Ｏ
反応混合物を３７℃で１時間インキュベート（水浴）した後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ−２５スピンカラム（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））によって標識ｓｉＲＮＡを分画した。０．５μＬを使用して、放射標識サンプル１ｍｌの１分あたりのカウント数（ｃｐｍ）／ｍｌを決定した。
【０１８８】
３．放射標識された１本鎖ｓｉＲＮＡの部分的なアルカリ加水分解ラダー
サイズマーカーのサンプルを作製するために、５’端がγ３２Ｐ標識されたｓｉＲＮＡの一部を、以下のようにアルカリ加水分解した：
５’端標識ｓｉＲＮＡ（センスまたはアンチセンス）を２．５μｌ、０．５ＭのＮａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．５）を６．０μｌ、１０ｍｇ／ｍｌのｔＲＮＡを１．５μｌ、およびｄＨ２Ｏを２０．０μｌ含んだ３０μｌの加水分解反応物を、９０℃で７．５分間インキュベートし、次いで氷上または４℃で冷却した。３０μｌの９０％ホルムアミド、５０ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ、１０ｍＭのＤＴＴ、ならびにＸＣ＆ＢＢ（キシレンシアノールおよびブロモフェノールブルー）、このうち１μｌ＋４μｌのホルムアミド色素をゲル電気泳動分析に使用した。
【０１８９】
４．放射標識された１μＭストックｓｉＲＮＡ二重鎖のアニーリング
センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかが放射標識された種々のｓｉＲＮＡ二重鎖の１μＭストック３０μｌを調製した。
【０１９０】
サンプルを９０℃で２分間加熱し、次いで３７℃で１時間インキュベートし、次いで使用するまで−２０℃で保存した。
５．ｓｉＲＮＡ二重鎖の品質管理：
ｓｉＲＮＡ二重鎖のサンプルを、トリス−ホウ酸、ＥＤＴＡ（ＴＢＥ）中の１５％ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動によって分析した。１５０Ｖで１時間電気泳動してからサンプルを泳動した。０．５〜１μｌのｓｉＲＮＡ二重鎖または１本鎖ｓｉＲＮＡ、３〜３．５μｌの０．５×ＴＢＥ、１μｌの５×非変性の色素液（合計体積＝５μｌ）を混合することによって、サンプルを調製した。
【０１９１】
６．安定性反応
２μｌのｓｉＲＮＡ二重鎖を、ＰＣＲチューブ（０．２ｍｌ）中で１８μｌの血清または組織溶解物または対照用バッファーに加えた。ｓｉＲＮＡ二重鎖を加えた直後に、２μｌを取り出して１８μｌの９０％ホルムアミド、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＤＴＴおよびキシレンシアノールおよびブロモフェノールブルー（ＸＣ＆ＢＢ）に加えることによって、ゼロ時間地点のサンプルを除去した。他のサンプルは、１５分、３０分、１時間、２時間、および４時間後に取り出し、同様に処理した。これらのサンプルは、９６ウェルプレート中に保存した。幾つかの実験では、時間地点を８、２４および４８時間に延長した。バッファー（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ、１×作業用ＰＢＳであり、０．１４Ｍの塩化ナトリウム、０．００３Ｍの塩化カリウム、０．００２Ｍのリン酸カリウム、０．０１Ｍのリン酸ナトリウムを含む）についての経時サンプルは、実験のゼロ時間地点および最終時間地点で採取した。２０％ポリアクリルアミドゲル（７５Ｗで１時間のプレラン済み）による１×ＴＢＥ（１０×＝８９０ｍＭ  トリス、８９０ｍＭ  ホウ酸、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中の電気泳動によって、サンプルを分析した。ゲルをｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（登録商標）用カセットに移し、増感スクリーンで覆い、一晩露光させた後にスキャンした。
【０１９２】
ポリアクリルアミドゲル分析から、眼部環境はヒト血清よりヌクレアーゼが少ないことが示された。非修飾型のＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡであるＡＬ−ＤＰ−４０１４を、ラット眼の抽出物中の安定性に関して試験することによって、エキソヌクレアーゼ活性のみが存在することが明らかになった。ヒト血清においては、ＡＬ−ＤＰ−４１２７および−４１４０（表４および５）を用いた実験から、末端を修飾するホスホロチオエート修飾はエキソヌクレアーゼ分解に対しては保護するが、エンドヌクレアーゼ活性に対しては保護しないことが示された。これらの結果は、ラットの眼全体の抽出物において行った実験と一致した。末端が修飾されたホスホロチオエート誘導体ＡＬ−ＤＰ−４１２７および−４１４０は、非修飾のＡＬ−ＤＰ−４０１４  ｓｉＲＮＡおよび非修飾のＣａｎｄ５  ｓｉＲＮＡ（ライヒら（Ｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）（上記））と比較して、エキソヌクレアーゼ活性に対して安定化されていた。しかし−４１２７および−４１４０  ｓｉＲＮＡは依然としてエンドヌクレアーゼ分解を受けていた。
【０１９３】
リード化合物ＡＬ−ＤＰ−４０９４に対する修飾は、ｓｉＲＮＡをエキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ分解に対して安定化した。ホスホロチオエート修飾されたｓｉＲＮＡ  ＡＬ−ＤＰ−４１９８は、非修飾型の４０９４化合物と同程度に分解されたが、ＡＬ−ＤＰ−４１８０およびＡＬ−ＤＰ−４２２０中と同様にＯ−メチル修飾を加えることによって、ラットの眼全体の抽出物においてｓｉＲＮＡを安定化した。
【０１９４】
特に、ｓｉＲＮＡは、上記のラットの眼全体の抽出物よりもラット網膜溶解物中において一般により安定であった。非修飾型のＡＬ−ＤＰ−４０９４も、修飾型のＡＬ−ＤＰ−４１９８、−４１８０、または−４２２０  ｓｉＲＮＡも、網膜溶解物中では分解されなかった。
【実施例７】
【０１９５】
エンドヌクレアーゼ感受性部位をＡＬ−ＤＰ−４０９４  ｓｉＲＮＡ上でマッピングした。
ヒト血清中でのインキュベーション後のＳｔａｉｎｓ−Ａｌｌ染色法および放射標識技法によって（上記参照）、ＡＬ−ＤＰ−４０９４  ｓｉＲＮＡの安定性を調べた。これらのアッセイから、エキソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼに対する感受性が明らかとなった。ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して、血清中インキュベーション後にｓｉＲＮＡの断片プロファイルを調べた（図１１）。
【０１９６】
ヒト血清中での−４０９４  ｓｉＲＮＡのインキュベーション後に、断片をフェノール−クロロホルム抽出し、沈殿させ、次いでＬＣ／ＭＳ分析に供した。図１２は、同定された断片および関連特性を示す。
【実施例８】
【０１９７】
ＶＥＧＦを標的とするｓｉＲＮＡに対する修飾の詳細な検討（表６）
ＶＥＧＦのｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖について８つの異なる主な化学修飾パターンを合成して評価した（表６）。使用したリボース糖修飾体は、２’−Ｏ−メチル（２’ＯＭｅ）または２’−フルオロ（２’Ｆ）のいずれかとした。表６に示したように、ピリミジン（Ｐｙ）とプリン（Ｐｕ）の両方を修飾することが可能であった。
【０１９８】
最初の４つのパターン（Ａ〜Ｄ）では、両方の鎖上の１つおきの位置に２’ＯＭｅを組み込んだ。４種の構成は、１）センス鎖上の各偶数位およびアンチセンス鎖の各奇数位、２）センス鎖上の各奇数位およびアンチセンス鎖の各偶数位、３）両方の鎖上の各偶数位、ならびに４）両方の鎖上の各奇数位に合成した。
【０１９９】
第５のパターン（Ｅ）では、二重鎖のセンス鎖とアンチセンス鎖の両方の、全てのピリミジンヌクレオチドに２’ＯＭｅ修飾を組み込んだ。
パターンＦでは、５’−ＰｙＰｕ−３’ジヌクレオチド、特にＵＡ、ＣＡ、ＵＧ部位（両方の鎖）のみの、ピリミジンにだけ２’ＯＭｅ修飾を有する二重鎖が含まれた。
【０２００】
パターンＧの二重鎖は、アンチセンス鎖のピリミジンに２’Ｆ修飾、およびセンス鎖のピリミジンに２’ＯＭｅ修飾を有するものとした。
パターン（Ｈ）は、５’−ＰｙＰｕ−３’ジヌクレオチド、ＵＡ、ＣＡ、ＵＧ部位（両方の鎖）のみに２’Ｆ修飾ピリミジンを有するアンチセンス鎖と、５’−ＰｙＰｕ−３’ジヌクレオチド、ＵＡ、ＣＡ、ＵＧ部位（両方の鎖）のみのピリミジンだけに２’ＯＭｅ修飾を有するセンス鎖とを有するものとした。
【０２０１】
Ａ〜Ｄ：２’−ＯＭｅが完全に交互（１つおき）になっている（両方の鎖）
４種の構成：偶数／奇数；奇数／偶数；偶数／偶数；奇数／奇数
Ｅ：    ２’−ＯＭｅピリミジン（両方の鎖）
Ｆ：    ＵＡ、ＣＡ、ＵＧ部位のみに２’−ＯＭｅピリミジン（両方の鎖）
Ｇ：    全てのピリミジンが２’−ＯＭｅピリミジン（センス）
全てのピリミジンが２’−Ｆピリミジン（アンチセンス）
Ｈ：    ＵＡ、ＣＡ、ＵＧ部位のみに２’−ＯＭｅピリミジン（センス）
ＵＡ、ＣＡ、ＵＧ部位のみに２’−Ｆピリミジン（アンチセンス）
表２由来の１７個の異なる親のＶＥＧＦ二重鎖について試験した。
【０２０２】
１．ｓｉＲＮＡ二重鎖の血清中安定性の評価
２μＭのｓｉＲＮＡ二重鎖（最終濃度）を、９０％のプールしたヒト血清中で３７℃にてインキュベートした。３０分、４時間、および２４時間後にドライアイス上でサンプルを急冷した。それぞれのｓｉＲＮＡ配列について、同じ濃度のサンプルを血清の不在下（ＰＢＳ中）で３７℃において２４時間インキュベートした。全てのサンプルを急冷した後、フェノール：クロロホルムを使用してＲＮＡを抽出し、エタノール沈殿によって濃縮した。サンプルを風乾し、変性ローディングバッファー中に再懸濁させた。それぞれの時間地点の３分の１について、施用した２０％アクリルアミド（１９：１）、７Ｍ尿素、１×ＴＢＥのゲルで６０℃にて泳動して分析した。Ｓｔａｉｎｓ−Ａｌｌ溶液で染色することによってＲＮＡを視覚化した。それぞれの修飾ｓｉＲＮＡの安定性の定性的評価は、それぞれの二重鎖のセットについて元の（親の）非修飾ｓｉＲＮＡとの比較によって行った。ＰＢＳ対照を、投入したｓｉＲＮＡの品質のマーカーとして用いた。
【０２０３】
２．ＶＥＧＦのモジュール式化学修飾体の安定性
４種のモジュール式化学修飾体、１）センス鎖とアンチセンス鎖の両方において全てのピリミジンを２’−Ｏ−メチル（２’ＯＭｅ）で置換、２）センス鎖とアンチセンス鎖の両方においてＵＡ、ＵＧ、ＣＡ対のピリミジンを２’ＯＭｅで置換、３）全てのピリミジンをセンス鎖においては２’ＯＭｅで、アンチセンス鎖においては２’−フルオロ（２’Ｆ）で置換、４）ＵＡ、ＵＧ、ＣＡ対のピリミジンをセンス鎖においては２’ＯＭｅで、アンチセンス鎖においては２’Ｆで置換、についてスクリーニングした。非修飾型である親の二重鎖および４種のモジュール式化学修飾体を含めて、合計８５種のｓｉＲＮＡをスクリーニングした。
【０２０４】
親の非修飾型二重鎖と肉眼により比較することによって評価すると、スクリーニングした８５個のｓｉＲＮＡのうち３５個は少なくとも２４時間安定であった。これら３５個の二重鎖は、両方の鎖に２’ＯＭｅピリミジンを有するか、またはセンス鎖に２’ＯＭｅピリミジン、およびアンチセンス鎖に２’Ｆを有していた（前述の化学修飾体１および３）。修飾された残基が比較的少ない二重鎖のうち、４時間の時間地点で非修飾の親二重鎖と比較して少なくとも５０％の完全長の物質が残存していたのは５個のみであった。
【０２０５】
全てのピリミジンを２’ＯＭｅまたは２’Ｆのいずれかで置換することによって、９０％ヒト血清中３７℃において約２４時間、血清中のヌクレアーゼによる分解からｓｉＲＮＡが保護される。保護された二重鎖は、血清の不在下でインキュベートした二重鎖と比較して、２４時間の時点で約８５％〜１００％の完全長の物質が残存していた。ＵＡ、ＵＧ、およびＣＡジヌクレオチド対のピリミジンを最小限修飾すると、非修飾の親二重鎖と比較して数個のｓｉＲＮＡを安定化しただけで、長期のヌクレアーゼ耐性に関しては十分には安定化しなかった。幾つかのＲＮａｓｅＡ標的候補部位はメチル化によって保護されず（ＹｐＮ、例えばＵＣ、ＵＵ）、おそらくこのことが血清エンドヌクレアーゼに対する耐性が低い理由である。
【０２０６】
３．二重鎖活性の分析
二重鎖を、前に記載したＨｅＬａ細胞アッセイで活性に関して試験した。表６および図１３〜２９は、上述のそれぞれの修飾に関するＨｅＬａ細胞における二重鎖活性の概要およびグラフを提示している。
【０２０７】
ｉＲＮＡ物質の合成
「即効型」脱保護モノマーを使用するＲＮＡ合成
１．ＲＮＡ合成
ＡＫＴＡ１０合成装置（アマシャムバイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を使用して、固相上でのホスホロアミダイト技術を使用することによって、３５〜６０μｍｏｌの範囲のスケールでオリゴリボヌクレオチドを合成した。多孔質ガラス（ＣＰＧ、
【０２０８】
【数１】
0005502025.tif 000002
負荷量７０μｍｏｌ／ｇ）またはポリスチレン（負荷量７１μｍｏｌ／ｇ）でできた固形支持体上で合成を行った。全てのアミダイトは無水アセトニトリル（７０ｍＭ）に溶解し、モレキュラーシーブ
【０２０９】
【数２】
0005502025.tif 000003
を加えた。５−エチルチオテトラゾール（ＥＴＴ、アセトニトリル中６００ｍＭ）を活性化溶液として使用した。結合時間は８分であった。ヨウ素／水／ピリジンの混合物（５０ｍＭ／ｌ０％／９０％（ｖ／ｖ））を用いて、あるいは無水アセトニトリルに溶かした３−エトキシ−１，２，４−ジチアゾリン−５−オン（ＥＤＩＴＨ）の１００ｍＭ溶液を使用して、ホスホロチオエート結合を導入するために酸化を行った。標準的なキャッピング試薬を使用した。ヒドロキシプロリノールリンカーを使用してコレステロールで修飾したＣＰＧ（以下に記載）から始めることにより、センス鎖の５’または３’端を介してＲＮＡにコレステロールを結合させた。ＤＭＴ保護基はコレステロール結合ＲＮＡからは除去したが、結合していないＲＮＡにはＤＭＴを残して精製を容易にした。
【０２１０】
２．支持体結合オリゴヌクレオチドの切断および脱保護
固相合成の後、該合成カラムに、４０％のメチルアミン水溶液とメチルアミンエタノール溶液の３：１（ｖ／ｖ）混合物１４ｍＬを３０分間かけて通過させることによって、支持体からＲＮＡを切断した。コレステロール結合ＲＮＡについては、メチルアミン水溶液とメチルアミンエタノール溶液との比を１：１３とした。溶出液を４つの１５ｍＬスクリューキャップ付きバイアルに分け、さらに３０分間６５℃に加熱した。この溶液を続いてスピードバック（登録商標）で減圧下において乾燥させた。それぞれのバイアル中の残渣を２５０μＬのＮ−メチルピロリジン−２−オン（ＮＭＰ）に溶解し、１２０μＬのトリエチルアミン（ＴＥＡ）および１６０μＬのＴＥＡ・３ＨＦを加えた。この混合物を２時間６５℃にした。周囲温度に冷却した後、１．５ｍＬのＮＭＰおよび１ｍＬのエトキシトリメチルシランを加えた。１０分後、３ｍＬのエーテルを加えることによってオリゴリボヌクレオチドを沈殿させた。ペレットを遠心分離によって回収し、上清は捨て、固形物を１ｍＬのバッファー１０ｍＭリン酸ナトリウム中で再構成した。
【０２１１】
３．オリゴリボヌクレオチドの精製
Ｓｏｕｒｃｅ（商標）ＲＰＣ１５で１０ｃｍの床高に詰め込んだ１６／１０ＨＲカラム（アマシャムバイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を使用して、ＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒシステム（アマシャムバイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））で、逆相ＨＰＬＣによって粗製オリゴヌクレオチドを精製した。バッファーＡは１０ｍＭのリン酸ナトリウムであり、バッファーＢは６５％アセトニトリルを含むバッファーＡとした。６．５ｍＬ／分の流速を使用した。２６０、２８０、および２９０ｎｍにおけるＵＶ透過について記録した。ＤＭＴを有するオリゴリボヌクレオチドについては、カラム体積（ＣＶ）の１０倍以内で７％Ｂ→４５％Ｂの勾配を使用し、コレステロール結合ＲＮＡについては、１４ＣＶ以内で５％Ｂ→１００％Ｂの勾配を使用した。適切な画分を集め、減圧下で約１０ｍＬに濃縮した。ＤＭＴを有するオリゴヌクレオチドは、周囲温度において数時間、体積の３分の１の１Ｍ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．２５で処理した。
【０２１２】
最後に、精製オリゴヌクレオチドを、Ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）Ｇ−２５を含むカラムでのサイズ排除クロマトグラフィによって脱塩した。このオリゴヌクレオチド溶液を体積１５ｍＬ未満まで濃縮した。溶液の濃度は、ＵＶ分光光度計で２６０ｎｍにおける吸光度を測定することによって決定した。アニーリングまで、個々の鎖は−２０℃で凍結溶液として保存した。
【０２１３】
４．オリゴリボヌクレオチドの分析
コレステロール結合ＲＮＡを、ＣＧＥおよびＬＣ／ＭＳによって分析した。非結合ＲＮＡもＩＥＸ−ＨＰＬＣによって分析した。ＣＧＥ分析は、２５４ｎｍの固定波長検出器を備えたベックマンコールター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）のＰＡＣＥ  ＭＤＱ  ＣＥ装置で行った。有効長２０ｃｍのｅＣａｐ（商標）ＤＮＡキャピラリー（ベックマンコールター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用した。全ての１本鎖ＲＮＡサンプルは、６Ｍの尿素を含む変性条件（ｅＣａｐ（商標）ｓｓＤＮＡ１００ゲルバッファーキット、ベックマンコールター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ））で４０℃にて分析した。サンプルは５〜８秒間１０ｋＶで動電学的に注入した。泳動時の電圧は１５ｋＶとした。
【０２１４】
ＩＥＸ  ＨＰＬＣ分析は、固定波長検出器（２６０および２８０ｎｍ）、カラムオーブン、オートサンプラーおよび内部脱気装置を備えたダイオネクス（Ｄｉｏｎｅｘ）ＢｉｏＬＣ（登録商標）システムで行った。ダイオネクスＤＮＡＰａｃ（登録商標）Ｐ１００カラム（４＊２５０ｍｍ）を、流速１．０ｍＬ／分および３０℃で使用した。非結合ＲＮＡ（２０μＬ、１ＯＤ／ｍＬの濃度）を注入した。溶出液Ａは２０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１０ｍＭのＮａＢｒ、１０％のアセトニトリル、ｐＨ１１を含み、溶出液Ｂは溶出液Ａに１ＭのＮａＢｒを含むものとした。溶出は、２０％Ｂ、１分間で開始し、次いで到達濃度を８０％Ｂとする２０分間の直線勾配を使用した。
【０２１５】
ＬＣ−ＭＳ分析は、Ｊｅｔｓｔｒｅａｍカラムヒーターおよび固定波長検出器（２５４ｎｍ）を備えたＥｔｔａｎ（商標）μＬＣシステム（アマシャムバイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））で行った。マイクロスプレー供給源およびイオントラップ検出器を備えたサーモフィニガン社（ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ）のＬＣＱ（商標）ＤｅｃａＸＰ  ＥＳＩ−ＭＳシステムを、ＨＰＬＣとオンラインで結合させた。オリゴヌクレオチドサンプル（非結合ＲＮＡに関しては水中濃度１ＯＤ／ｍＬで２５μＬサンプル、コレステロール結合ＲＮＡに関しては４０μＬ）を、６０℃において２００μＬ／分の流速で、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）のＸｔｅｒｒａ（登録商標）Ｃ８  ＭＳカラム（２．１×５０ｍｍ；粒径２．５μｍ）に注入した。溶出液Ａの組成はＨ２Ｏ中に４００ｍＭのヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、１６．３ｍＭのＴＥＡ、ｐＨ７．９であり、溶出液Ｂはメタノールとした。非結合ＲＮＡに関しては、溶出は７％Ｂ、３分間で開始し、次いで１３分間で７％Ｂ→２５％Ｂの勾配を使用した。コレステロールが結合したものに関しては、開始条件を３５％Ｂ、３分間とし、次いで溶出液Ｂの濃度を３０分間で７５％Ｂに増大させた。分析値は表６に提示する。
【０２１６】
５．オリゴリボヌクレオチドのアニーリング
等モル濃度のＲＮＡ溶液を組み合わせることによって、相補鎖をアニーリングした。混合物を凍結乾燥し、適切な体積のアニーリングバッファー（１００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８）で再構成して、所望の濃度とした。この溶液を９５℃の湯浴中に置き、次いで３時間以内に周囲温度に冷却した。二重鎖形成の程度を、非変性条件の１０％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって調べ、バンドを「ｓｔａｉｎｓ−ａｌｌ」試薬（シグマ（Ｓｉｇｍａ））で染色することによって視覚化した。
【０２１７】
リボおよび２’−Ｏ−メチルのホスホロアミダイトを含む「標準的」脱保護モノマーを使用するＲＮＡ合成
Ａ．ＲＮＡ／２’ＯＭｅ（チオエート端）
２’−ＯＭｅヌクレオチドを有するキメラＲＮＡ分子を、ＡＢＩの３９４型機で、製造者により文書化された標準サイクルを使用し数箇所の待機工程に変更を加えて合成した。固形支持体はＣＰＧ（５００Ａ）とした。モノマーは、標準的な保護基を有するＲＮＡホスホロアミダイトまたは２’ＯＭｅＲＮＡホスホロアミダイトのいずれかであり、別途記載のない限りはアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）中に０．１５Ｍの濃度で使用した。具体的には、ＲＮＡホスホロアミダイトは５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ６−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔブチルジメチルシリル−アデノシン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−イソブチリル−２’−Ｏ−ｔブチルジメチルシリル−グアノシン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−ｔブチルジメチルシリル−シチジン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイトおよび５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔブチルジメチルシリル−ウリジン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイトであり；２’ＯＭｅＲＮＡホスホロアミダイトは、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ６−ベンゾイル−２’−Ｏ−メチル−アデノシン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−イソブチリル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−メチル−シチジン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイトおよび５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイトとした。カップリング時間は全てのモノマーに関して１０分とした。他の試薬の詳細は以下の通りである。活性化物質：５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾール（０．２５Ｍ）；キャップＡ：５％無水酢酸／ＴＨＦ／ピリジン；キャップＢ：１０％のＮ−メチルイミダゾール／ＴＨＦ。リン酸の酸化にはＴＨＢＰ（１０％、ＡＣＮ中）１０分間を、一方ホスホロチオエートの酸化には０．０５ＭのＥＤＩＴＨ試薬／アセトニトリルを使用した。脱トリチル化は３％ＴＣＡ／ジクロロメタンを用いて行った。ＤＭＴ保護基はサイクルの最終工程後に除去した。
【０２１８】
合成の終了後、多孔質ガラス（ＣＰＧ）をスクリューキャップ付きの滅菌済み微量遠心分離チューブに移した。エタノールメチルアミン：アンモニア（８Ｍメチルアミンのエタノール溶液／３０％アンモニア水）の混合物（１：１）１．０ｍＬを用いて５５℃で５時間処理することにより、オリゴヌクレオチドを切断すると同時に塩基およびリン酸基についての脱保護を実施した。チューブを氷上で短時間冷却し、次いで溶液を５ｍＬの遠心分離チューブに移し；続いて０．２５ｍＬの５０％アセトニトリルで３回洗浄した。チューブを−８０℃で１５分間冷却し、その後凍結乾燥装置中で乾燥させた。
【０２１９】
得られた白色の残渣を２００ｕＬのＮＭＰ／Ｅｔ３Ｎ／Ｅｔ３Ｎ−ＨＦに再懸濁させ、６５℃で１．５時間加熱して、２’位のＴＢＤＭＳ基を除去した。次いでオリゴヌクレオチドを、Ｅｔ３Ｎ（１％）を含む乾燥ジエチルエーテル（４００ｕＬ）中に沈殿させた。液体を注意深く除去して、チューブの底にペレットを得た。残留エーテルをスピードバックで除去して、白い綿毛状の物質として「粗製」ＲＮＡを得た。サンプルを１ｍＬのＲＮａｓｅを含まない水に溶かし、２６０ｎｍにおける吸光度を測定することによって定量した。この粗製物を−２０℃で保存した。
【０２２０】
粗製オリゴヌクレオチドは、ＨＰＬＣによって分析および精製した。粗製オリゴヌクレオチドは、逆相イオン対（ＲＰＩＰ）ＨＰＬＣによって分析および精製した。ＲＰ  ＨＰＬＣ分析は、固定波長検出器（２６０および２８０ｎｍ）、カラムオーブン、オートサンプラーおよび内部脱気装置を備えたギルソン（Ｇｉｌｓｏｎ）ＬＣシステムで行った。ＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃｌ８カラム（４．６＊２５０ｍｍ）は、６５℃において１．０ｍＬ／分の流速で使用した。ＲＮＡ（１ＯＤ／ｍＬ濃度で、分析実施用に２０μＬ、分取実施用に１ｍＬ）を注入した。溶出液Ａは０．１ＭのＴＥＡＡｃ、ＨＰＬＣ水、ｐＨ７．０を含み、溶出液ＢはＨＰＬＣ水、７０％アセトニトリル、ｐＨ７．０中の０．１ＭのＴＥＡＡｃとした。溶出は１０％Ｂ、２分間で開始し、次に２５％Ｂ、４分間とし、次いで到達濃度５０％Ｂとしてさらに３０分間の直線勾配を使用した。次いで、精製された乾燥オリゴヌクレオチドを、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５Ｍを使用して脱塩した。
【０２２１】
Ｂ．２’−フルオロ修飾を有するオリゴヌクレオチドの合成
ＡＢＩの３９４型機で、製造者により文書化された標準サイクルを使用し数箇所の待機工程に変更を加えて、ＲＮＡ分子を合成した。固形支持体はＣＰＧとした（５００Ａ、ＴｓＴ  ＡＧ００１はエーエムケミカルズエルエルシー（ＡＭ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＬＬＣ）から、ならびにｒＣおよびｒＵはプライムシンセシス（Ｐｒｉｍｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）からのものであった）。モノマーは、標準的な保護基を有するＲＮＡホスホロアミダイトまたは２’Ｆホスホロアミダイトのいずれかであり、別途記載のない限りはアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）中に０．１５Ｍの濃度で使用した。具体的には、ＲＮＡホスホロアミダイトは５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ６−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔブチルジメチルシリル−アデノシン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−イソブチリル−２’−Ｏ−ｔブチルジメチルシリル−グアノシン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−ｔブチルジメチルシリル−シチジン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイトおよび５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔブチルジメチルシリル−ウリジン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイトであり；２’Ｆ  ＲＮＡホスホロアミダイトは５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−フルオロ−２’−デオキシ−シチジン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイトおよび５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−フルオロ−２’−デオキシ−ウリジン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイトであった。カップリング時間は全てのモノマーに関して１０分とした。他の試薬の詳細は以下の通りである。活性化物質：５−エチルチオテトラゾール（０．２５Ｍ）；キャップＡ：５％無水酢酸／ＴＨＦ／ピリジン；キャップＢ：１０％Ｎ−メチルイミダゾール／ＴＨＦ；リン酸の酸化にはＴＨＢＰ（１０％、ＡＣＮ中）で１０分間、一方ホスホロチオエートの酸化には０．０５ＭのＥＤＩＴＨ試薬／アセトニトリルを使用した。脱トリチル化は３％のＴＣＡ／ジクロロメタンを用いて行った。ＤＭＴ保護基はサイクルの最終工程後に除去した。
【０２２２】
合成の終了後、ＣＰＧをスクリューキャップ付き滅菌済み微量遠心分離チューブに移した。エタノールアンモニア混合物（１：３）１．０ｍＬを用いて５５℃で７時間処理することにより、オリゴヌクレオチドを切断すると同時に塩基およびリン酸基を脱保護した。チューブを氷上で短時間冷却し、次いで溶液を５ｍＬの遠心分離チューブに移し；続いて０．２５ｍＬの５０％アセトニトリルで３回洗浄した。チューブを−８０℃で１５分間冷却してから、凍結乾燥装置中で乾燥させた。
【０２２３】
得られた白色の残渣を２００ｕＬのＮＭＰ／Ｅｔ３Ｎ／Ｅｔ３Ｎ−ＨＦに再懸濁し、５０℃で１６時間加熱して、２’位のＴＢＤＭＳ基を除去した。次いでオリゴヌクレオチドを、Ｅｔ３Ｎ（１％）を含む乾燥ジエチルエーテル（４００ｕＬ）中に沈殿させた。液体を注意深く除去して、チューブの底にペレットを得た。残留エーテルをスピードバックで除去し、白い綿毛状の物質として「粗製」ＲＮＡを得た。サンプルを１ｍＬのＲＮａｓｅを含まない水に溶かし、２６０ｎｍにおける吸光度を測定することによって定量した。この粗製物を−２０℃で保存した。
【０２２４】
粗製オリゴヌクレオチドは、ＨＰＬＣによって分析および精製した。次いで、精製された乾燥オリゴヌクレオチドを、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５Ｍを使用して脱塩した。
Ｃ．ホスホロチオエートＲＮＡオリゴリボヌクレオチドの合成
ＡＢＩの３９４型機（ＡＬＮ０２０８）で、製造者により文書化された標準サイクルを使用し以下に記載したように数箇所の待機工程に変更を加えて、オリゴヌクレオチドを合成した。固形支持体は多孔質ガラス（ＣＰＧ、２μｍｏｌｅ  ｒＡ  ＣＰＧ、５２０Ａ、またはｒＵ  ＣＰＧ、５００Ａ）とした。モノマーは、標準的な保護基を有するＲＮＡホスホロアミダイトであり、別途記載のない限りはアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）中に０．１５Ｍの濃度で使用した。具体的には、ＲＮＡホスホロアミダイトは５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ６−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔブチルジメチルシリル−アデノシン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−イソブチリル−２’−Ｏ−ｔブチルジメチルシリル−グアノシン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−ｔブチルジメチルシリル−シチジン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイトおよび５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔブチルジメチルシリル−ウリジン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイトであった。カップリング時間は１０分とした。他の試薬の詳細は以下の通りである。活性化物質：５−エチルチオテトラゾール（０．２５Ｍ）；キャップＡ：５％無水酢酸／ＴＨＦ／ピリジン；キャップＢ：１０％Ｎ−メチルイミダゾール／ＴＨＦ；ＰＳ酸化、０．０５ＭのＥＤＩＴＨ試薬／アセトニトリル。脱トリチル化は３％ＴＣＡ／ジクロロメタンを用いて行った。
【０２２５】
合成の終了後、ＣＰＧをスクリューキャップ付き滅菌済み微量遠心分離チューブに移した。エタノールメチルアミン：アンモニアの混合物（１：１）１．０ｍＬを用いて５５℃で５時間処理することにより、オリゴヌクレオチドを切断すると同時に塩基およびリン酸基を脱保護した。チューブを氷上で短時間冷却し、次いで溶液を５ｍＬの遠心分離チューブに移し；続いて０．２５ｍＬの５０％アセトニトリルで３回洗浄した。チューブを−８０℃で１５分間冷却した後、凍結乾燥装置中で乾燥させた。
【０２２６】
得られた白色の残渣を２００μＬのＴＥＡ  ３ＨＦに再懸濁させ、６５℃で１．５時間加熱して、２’位のＴＢＤＭＳ基を除去した。次いでオリゴヌクレオチドを、乾燥ＭｅＯＨ４００μＬを加えることによって沈殿させた。可能な限り高速で５分間、微量遠心分離チューブ中で遠心した後、液体を除去した。残留メタノールはスピードバックで除去した。サンプルを１ｍＬのＲＮａｓｅを含まない水に溶かし、２６０ｎｍにおける吸光度を測定することによって定量した。この粗製物を−２０℃で保存した。オリゴヌクレオチドはＨＰＬＣによって分析および精製し、次いでＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５Ｍを使用して脱塩した。
【実施例９】
【０２２７】
２’−Ｆ  ＲＮＡおよび２’Ｏ−Ｍｅ  ＲＮＡを交互に有するオリゴヌクレオチド（表７）の合成
Ａ．２’Ｆ用のＣＰＧの合成
塩基が適切に保護された５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−２’−デオキシ−２’−フルオロリボヌクレオシドのＣＰＧを、スキームＡに示すように合成した。５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−２’−デオキシ−２’−フルオロ−ＮＮＢｚ−Ａおよび５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−２’−デオキシ−２’−フルオロ−ＮｉＢｕ−Ｇは、報告されたのと同様に合成した（カワサキら（Ｋａｗａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ、１９９３年、３６、８３１）。化合物１００１を、二塩化エチレン中ＤＭＡＰの存在下で無水コハク酸と反応させることによって、化合物１００５が生成した。化合物１００５を、アセトニトリル−二塩化エチレン中ＤＭＡＰの存在下において、２，２’−ジチオビス（５−ニトロピリジン）（ＤＴＮＰ）およびトリフェニルホスフィンで処理し、その後ｌｃａａＣＰＧでクーマーら（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９６年、１５、８７９）により報告されたのと同様に処理して、所望のＣＰＧ１００９が生成した。ＣＰＧの負荷量は文献中に報告されたのと同様に測定した（プラカッシュら（Ｐｒａｋａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ、２００２年、６７、３５７）。適切に保護された２’−デオキシ−２’−フルオロＡ、ＣおよびＧのＣＰＧは、上述と同様に得た（スキームＡ）。
【０２２８】
【化１】
0005502025.tif 000004
ａスキームＡにおいて、（ｉ）無水コハク酸、ＤＭＡＰ／ＥＣＤ；（ｉｉ）ＤＴＮＰ、Ｐｈ３Ｐ、ＤＭＡＰおよびｌｃａａＣＰＧである。
【０２２９】
２’−Ｆ  ＲＮＡおよび２’Ｏ−Ｍｅ  ＲＮＡを交互に有するキメラＲＮＡ分子を、ＡＢＩの３９４型機で、製造者により文書化された標準サイクルを使用し数箇所の待機工程に変更を加えて合成した。固形支持体はＣＰＧ（５００Ａ）とした。モノマーは、標準的な保護基を有する２’−Ｆ  ＲＮＡホスホロアミダイトまたは２’ＯＭｅ  ＲＮＡホスホロアミダイトのいずれかであり、別途記載のない限りはアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）中に０．１５Ｍの濃度で使用した。具体的には、２’ＯＭｅ  ＲＮＡホスホロアミダイトは、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ６−ベンゾイル−２’−Ｏ−メチル−アデノシン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−イソブチリル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−メチル−シチジン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイトおよび５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイトとした。２’−Ｆ  ＲＮＡホスホロアミダイトは、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−フルオロ−２’−デオキシ−シチジン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−フルオロ−２’−デオキシ−ウリジン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−フルオロ−Ｎ２−イソブチリル−２’−デオキシ−グアノシン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイトおよび５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−フルオロ−Ｎ２−イソブチリル−２’−デオキシ−グアノシン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイトとした。カップリング時間は全てのモノマーに関して１０分とした。他の試薬の詳細は以下の通りである。活性化物質：５−エチルチオテトラゾール（０．２５Ｍ）；キャップＡ：５％無水酢酸／ＴＨＦ／ピリジン；キャップＢ：１０％Ｎ−メチルイミダゾール／ＴＨＦ；リン酸の酸化は０．０２ＭのＩ２／ＴＨＦ／Ｈ２Ｏを、一方ＰＳ酸化は上述と同様にＥＤＩＴＨ試薬を使用して行った。脱トリチル化は３％ＴＣＡ／ジクロロメタンを用いて行った。最終的なＤＭＴ保護基は、合成装置中で除去した。
【０２３０】
合成の終了後、ＣＰＧをスクリューキャップ付き滅菌済み微量遠心分離チューブに移した。エタノール：アンモニアの混合物（１：３）１．０ｍＬを用いて５５℃で７時間処理することにより、オリゴヌクレオチドを切断すると同時に塩基およびリン酸基を脱保護した。チューブを氷上で短時間冷却し、次いで溶液を５ｍＬの遠心分離チューブに移し；続いて０．２５ｍＬの５０％アセトニトリルで３回洗浄した。−８０℃で１５分間チューブを冷却した後、凍結乾燥装置で乾燥させて、白い綿毛状の物質として「粗製」ＲＮＡを得た。サンプルを１ｍＬのＲＮａｓｅを含まない水に溶かし、２６０ｎｍにおける吸光度を測定することによって定量した。この粗製物は−２０℃で保存した。
【０２３１】
粗製オリゴヌクレオチドは、変性条件の２０％ポリアクリルアミドゲルによって分析および精製した。次いで、精製された乾燥オリゴヌクレオチドを、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５Ｍ（アマシャムバイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を使用して脱塩した。
【０２３２】
Ｂ．二重鎖活性の分析
前述のＨｅＬａ細胞アッセイにおける活性に関して、二重鎖を試験した。表７および図３０は、上述のそれぞれの修飾体についてのＨｅＬａ細胞における活性のグラフを提供する。
【実施例１０】
【０２３３】
結合型のＶＥＧＦ分子（表８、９、１０および１８）
１．合成：
ＡＢＩの３９４型機（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））にて、製造者により文書化された標準的な９３工程のサイクルを使用し、以下に記載したように数箇所の待機工程に変更を加えてＲＮＡ分子を合成した。固形支持体は多孔質ガラス（ＣＰＧ、１ｕｍｏｌｅ、５００Ａ）であり、モノマーは標準的な保護基を有するＲＮＡホスホロアミダイト（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ６−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−アデノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−シチジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−イソブチリル−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−グアノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホロアミダイト、および５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−ウリジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホロアミダイト）とした。全てのアミダイトはアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）中に０．１５Ｍの濃度で使用し、カップリング時間は非修飾および２’−Ｏ−Ｍｅ修飾モノマーに関しては６分、修飾および結合型モノマーに関しては１２分とした。５−エチルチオテトラゾール（０．２５Ｍ）を活性化物質として使用した。ＰＯ酸化用にはヨウ素／水／ピリジン、およびＰＳ酸化用にはビューケージ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）試薬（２％）の無水アセトニトリル溶液を使用した。硫化時間は約６分であった。全ての合成は１ｕｍｏｌｅスケールで行った。
【０２３４】
【表１】
0005502025.tif 000005
以下の種類の修飾を使用して、これらのプロトコルを使用する合成を行った：
１．  非修飾のホスホジエステル骨格（ＰＯ）のみ
２．  ホスホロチオエート（ＰＳ）のみ
３．  ２’−Ｏ−Ｍｅ、ＰＳ
４．  ３’−ナプロキセン、２’Ｆ−５Ｍｅ−Ｕ、ＰＳ
５．  ５’−コレステロール、ＰＳ
６．  ３’−コレステロール、ＰＳ
７．  ２’Ｆ−５Ｍｅ−Ｕ、ＰＳ
８．  ３’−ビオチン、２’Ｆ−５Ｍｅ−Ｕ、ＰＳ
９．  ３’−コラン酸、２’Ｆ−５Ｍｅ−Ｕ、ＰＳ
１０．メチルホスホネート
１１．Ｃ−５アリルアミノｒＵ。
【０２３５】
２．脱保護−Ｉ（核酸塩基の脱保護）
合成の終了後、多孔質ガラス（ＣＰＧ）をスクリューキャップ付きバイアル、またはスクリューキャップ付きのＲＮａｓｅを含まない微量遠心分離チューブに移した。５５℃で１５時間エタノールアンモニア混合物（アンモニア（２８〜３０％）：エタノール（３：１））（１．０ｍＬ）を使用することによって、オリゴヌクレオチドを支持体から切断し、同時に塩基およびリン酸の保護基を除去した。バイアルを氷上で短時間冷却し、次いでエタノールアンモニア混合物を新たな微量遠心分離チューブに移した。ＣＰＧは少量の脱イオン水（２×０．１ｍＬ）で洗浄した。上清を１つにし、１０分間ドライアイスで冷却し、次いでスピードバックで乾燥させた。
【０２３６】
３．脱保護−ＩＩ（２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ基の除去）
得られた白い残渣を、トリエチルアミン、トリエチルアミントリヒドロフルオリド（ＴＥＡ．３ＨＦ、約２４％ＨＦ））および１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）の混合物（４：３：７）（４００ｕｌ）に再懸濁し、６５℃で９０分間加熱して、２’位のｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基を除去した。次いで反応をイソプロポキシトリメチルシラン（ｉＰｒＯＭｅ３Ｓｉ、４００ｕｌ）を用いて停止させ、キャップを開けた状態でヒートブロックにて１０分間さらにインキュベートした（これによって、揮発性のイソプロポキシトリメチルシリルフルオリド付加生成物を蒸発させる）。残留している反応停止試薬を、スピードバックで乾燥させることによって除去した。３％トリエチルアミンのジエチルエーテル溶液（１．５ｍｌ）を加えた。この混合物を遠心分離した。ＲＮＡのペレットが形成された。ペレットを乱さずに、上清をピペットで取り出した。ペレットはスピードバックで乾燥させた。微量遠心分離チューブ中に白い綿毛状の物質として粗製ＲＮＡを得た。
【０２３７】
４．粗製オリゴマーの定量または粗分析
サンプルを脱イオン水（１．０ｍＬ）に溶かし、以下のように定量した。ブランク測定は、水のみ（１ｍＬ）を用いて最初に行った。ＲＮＡ溶液のサンプル（２０ｕ１）を水（９８０ｕＬ）で希釈し、微量遠心分離チューブ中で充分に混合させ、次いでキュベットに移し、２６０ｎｍにおける吸光度の読み取り値を得た。粗製物を乾燥させ、−２０℃で保存した。
【０２３８】
５．ＭＳ分析：
ＬＣ−ＭＳを使用して粗製サンプル（０．１ＯＤ）を分析した。
６．オリゴマーの精製
（ａ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）による精製  オール（Ｏｗｌ）の分離システム（米国ニューハンプシャー州ポーツマス（Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ）所在）を使用して、垂直型スラブポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によってオリゴヌクレオチドを精製した。電気泳動用のアクリルアミド（４０％）、Ｎ，Ｎ’−メチレン−ビス（アクリルアミド）（ＢＩＳ）、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ、Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）、ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）、キシレンシアノール（ＸＣ）、１０×ＴＢＥ（０．８９Ｍのトリス−ヒドロキシメチルアミノメタン、ホウ酸塩（ｐＨ８．３）、２０ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸２ナトリウム）は、ナショナルダイアグノスティック（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）（米国ジョージア州アトランタ所在）から得た。１２％の変性ゲルを、非修飾および修飾オリゴリボヌクレオチドの精製用に調製した。調製ゲルの厚さは１．５ｍｍとした。ローディングバッファーは１０×ＴＢＥに溶解した８０％ホルムアミドとした。ガラスプレートを除去した後、ゲルをサランラップ（登録商標）で覆い、蛍光ＴＬＣプレート上に置いて手持ち式ＵＶランプで照射して視覚化した。所望のバンドを切り出し、２ｍＬの水または０．０３Ｍ酢酸ナトリウム中で一晩振とうさせた。スピードバックで乾燥させることによって溶出液を除去した。
【０２３９】
（ｂ）高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）による精製：
条件Ａ：非修飾オリゴリボヌクレオチド、２’−Ｏ−Ｍｅ／ＰＳオリゴリボヌクレオチドの精製：
注入サンプルの量は約１００ＯＤである。
【０２４０】
カラム：ダイオネクス（Ｄｉｏｎｅｘ）  ＰＡ−１００  Ｓｅｍｉｐｒｅｐ
バッファーＡ：水
バッファーＢ：０．２５ＭのＴｒｉｓ．Ｃｌ  ｐＨ８．０
バッファーＣ：０．３７５Ｍの過塩素酸ナトリウム
加熱：６５℃
【０２４１】
【表２】
0005502025.tif 000006
条件Ｂ：２’−Ｏ−Ｍｅ／ＰＳオリゴリボヌクレオチドを精製するためのプロトコル：
カラム：ダイオネクス  ＰＡ−１００  Ｓｅｍｉｐｒｅｐ
バッファーＡ：水
バッファーＢ：０．２５ＭのＴｒｉｓ．Ｃｌ  ｐＨ８．０
バッファーＣ：０．８Ｍの過塩素酸ナトリウム
加熱：６５℃
【０２４２】
【表３】
0005502025.tif 000007
７．精製オリゴマーの脱塩
精製した乾燥オリゴマーを、次いでＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２５Ｍを使用して脱塩した。カートリッジを１０ｍＬの脱イオン水を用いて３回調整した。最後に、２．５ｍＬのＲＮＡｓｅを含まない水に完全に溶かした精製したオリゴマーを、非常にゆっくりと１滴ずつ溶出させながらカートリッジに装荷した。３．５ｍｌの脱イオン水を用いて、塩を含まないオリゴマーをスクリューキャップ付きバイアル中に直接溶出させた。精製したＲＮＡ物質をスピードバックで乾燥させ、−２０℃で保存した。
【０２４３】
ビオチン結合型ｓｉＲＮＡ（表１０）
１．合成：
ＡＢＩの３９４型機（アプライドバイオシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））にて、製造者により文書化された標準的な９３工程のサイクルを使用し、以下に記載するように数箇所の待機工程に変更を加えてＲＮＡ分子を合成した。固形支持体は多孔質ガラス（ＣＰＧ、１ｕｍｏｌｅ、５００Ａ）とし、モノマーは標準的な保護基を有するＲＮＡホスホロアミダイト（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ６−ベンゾイル−２’Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−アデノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−シチジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−イソブチリル−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−グアノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホロアミダイト、および５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル−ウリジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホロアミダイト）とした。修飾ＣＰＧおよびアミダイトは、周知の方法を使用して本明細書に記載したように合成した。全てのアミダイトはアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）中０．１５Ｍの濃度で使用し、カップリング時間は非修飾モノマーおよび２’−Ｏ−Ｍｅモノマーに関しては６分、修飾モノマーおよび結合型モノマーに関しては１２分であった。５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（０．２５Ｍ）を活性化物質として使用した。ＰＯ酸化用にはヨウ素／水／ピリジン、およびＰＳ酸化用にはＢｅａｕｃａｇｅ試薬（２％）無水アセトニトリル溶液を使用した。硫化時間は約６分である。３’−ビオチン結合ｓｉＲＮＡを合成するために、ｔ−ブチル−過酸化水素を酸化剤として使用した（酸化時間１０分）。
【０２４４】
【表４】
0005502025.tif 000008
２．脱保護−Ｉ（核酸塩基の脱保護）
合成の終了後、多孔質ガラス（ＣＰＧ）をスクリューキャップ付きバイアル、またはスクリューキャップ付きのＲＮａｓｅを含まない微量遠心分離チューブに移した。５５℃で１５時間エタノールアンモニア混合物［アンモニア（２８〜３０％）：エタノール（３：１）１．０ｍＬ］を用いて、オリゴヌクレオチドを支持体から切断すると同時に塩基およびリン酸の保護基を除去した。バイアルを氷上で短時間冷却し、次いでエタノールアンモニア混合物を新たな微量遠心分離チューブに移した。ＣＰＧを少量の脱イオン水（２×０．１ｍＬ）で洗浄した。１つにした濾過物を次いで１０分間ドライアイス上に置き、スピードバックで乾燥させた。
【０２４５】
３．脱保護−ＩＩ（２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ基の除去）
得られた白色の残渣を、トリエチルアミン、トリエチルアミントリヒドロフルオリド（ＴＥＡ．３ＨＦ、約２４％ＨＦ）および１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）の混合物（４：３：７）（４００ｕｌ）に再懸濁させ、６５℃で９０分間加熱して、２’位のｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基を除去した。次いで反応をイソプロポキシトリメチルシラン（ｉＰｒＯＭｅ３Ｓｉ、４００ｕｌ）を用いて停止させ、キャップを開けた状態でヒートブロックにて１０分間さらにインキュベートした（これによって、揮発性のイソプロポキシトリメチルシリルフルオリド付加生成物を蒸発させる）。残留している反応停止試薬を、スピードバックで乾燥させることによって除去した。３％トリエチルアミンのジエチルエーテル溶液（１．５ｍｌ）を加え、混合物を遠心分離にかけて、ＲＮＡのペレットを得た。ペレットを乱さずに、上清をピペットで取り出した。ペレットをスピードバックで乾燥させた。微量遠心分離チューブ中に白い綿毛状の物質として粗製ＲＮＡを得た。
【０２４６】
４．粗製オリゴマーの定量または粗分析
サンプルを脱イオン水（１．０ｍＬ）に溶かし、以下のように定量した。ブランク測定は、水のみ（１ｍＬ）を用いて最初に行った。ＲＮＡ溶液のサンプル（２０ｕ１）を水（９８０ｕＬ）で希釈し、微量遠心分離チューブ中で充分に混合し、次いでキュベットに移し、２６０ｎｍにおける吸光度の読み取り値を得た。粗製物を乾燥させ、−２０℃で保存した。
【０２４７】
５．ＭＳ分析：
ＭＳを使用してＲＮＡサンプル（０．１ＯＤ）を分析した。
６．オリゴマーの精製
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）による精製
オール（Ｏｗｌ）の分離システム（米国ニューハンプシャー州ポーツマス（Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ）所在）を使用して、垂直型スラブポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）によって、オリゴヌクレオチドを精製した。電気泳動用のアクリルアミド（４０％）、Ｎ，Ｎ’−メチレン−ビス（アクリルアミド）（ＢＩＳ）、過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’−テトラメチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）、ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）、キシレンシアノール（ＸＣ）、１０×ＴＢＥ（０．８９Ｍ  トリスヒドロキシ−メチルアミノメタン、ホウ酸塩（ｐＨ８．３）、２０ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸２ナトリウム）は、ナショナルダイアグノスティック（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）（米国ジョージア州アトランタ所在）から得た。１２％の変性ゲルを、オリゴリボヌクレオチドの精製用に調製した。調製ゲルの厚さは１．５ｍｍであった。ローディングバッファーは１０×ＴＢＥに溶解した８０％ホルムアミドとした。ＰＡＧＥのガラスプレートを除去した後、ゲルをサランラップ（登録商標）で覆い、蛍光ＴＬＣプレート上に置いて手持ち式ＵＶランプ（米国カリフォルニア州アップランド（Ｕｐｌａｎｄ））で照射して視覚化した。所望のバンドを切り出し、水（２ｍＬ）または０．０３Ｍの酢酸ナトリウム中で一晩振とうさせた。溶出液を取り出しスピードバックで乾燥させた。全てのビオチン結合配列をＰＡＧＥによって精製した。
【０２４８】
７．精製オリゴマーの脱塩
精製した乾燥オリゴマーを、次いでＳｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２５Ｍ（アマシャムバイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を使用して脱塩した。カートリッジは脱イオン水を用いて３回調整した（それぞれ１０ｍＬ）。最後に、２．５ｍＬのＲＮＡｓｅを含まない水中に完全に溶かした精製オリゴマーを、非常にゆっくりと１滴ずつ溶出させながらカートリッジに装荷した。塩を含まないオリゴマーを、脱イオン水（３．５ｍｌ）を用いてスクリューキャップ付きバイアルに直接溶出させた。精製したＲＮＡ物質をスピードバックで乾燥させ、−２０℃で保存した。
【０２４９】
８．品質管理
（ａ）キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）
（ｂ）エレクトロスプレーＬＣ／ＭＳ
オリゴマーのサンプル（約０．１０ＯＤ）を水に溶かし（５０ｕｌと１００ｍｌ、別々のチューブ中）、次いでＣＧＥ分析およびＬＣ／ＭＳ分析用の専用バイアル中にピペットで注入した。
【０２５０】
９．二重鎖の活性分析
上述のＨｅＬａ細胞アッセイにおける活性に関して、二重鎖を試験した。表８、９、１０および１８、ならびに図３１〜３５は、上記の各修飾体のＨｅＬａ細胞における活性のデータおよびグラフを提示している。
【実施例１１】
【０２５１】
レチノイドとＲＮＡの結合（表１４）
全トランスレチナールとオリゴヌクレオチド（ＲＮＡ）の結合：
レチナールをオリゴヌクレオチドに結合させるためのホスホロアミダイト１０４を、スキームＢ中に示すようにして合成した。
【０２５２】
【化２】
0005502025.tif 000009
スキームＢにおいて、ａ（ｉ）Ｐｈ３Ｐ、ＤＩＡＤ、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド／ＭｅＣＮ；（ｉｉ）Ｈ２、Ｐｄ−Ｃ（１０％）、１気圧（ａｔｍ）／ＥＴＯＡｃ；（ｉｉｉ）ホスフィチル化、である。
【０２５３】
工程１：化合物１０２
モノベンジルペンタン−１，５−ジオール（１５．７０ｇ、８０．８２ｍｍｏｌ）、Ｐｈ３Ｐ（２５．４３ｇ、９６．８４ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシフタルイミド（１１６．０ｇ、９８．０８ｍｍｏｌ）を、アルゴン雰囲気下において無水ＣＨ３ＣＮ（１００ｍｌ）中に入れた。非希釈ＤＩＡＤ（２０．０ｍＬ、１０３．２５ｍｍｏｌ）を、攪拌溶液に１滴ずつ２０分間かけて加え、攪拌を２４時間続けた。反応はＴＬＣによって調べた。溶媒を真空中で除去し；ジエチルエーテルを用いて残渣を練和し、濾過した。残渣をエーテルで洗浄し、濾過し、濾液を合わせた。ヘキサンを濾液に１滴ずつ、濾液が濁度を生じるまで加え、その後この溶液にエーテルを加えることによって、同溶液を均質にした。均質溶液を２４時間５℃で保存した。沈殿したＰｈ３ＰＯを濾過除去し、エーテル−ヘキサン混合物（１：１）で洗浄した。合わせた濾液を蒸発乾固させ、残渣をフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィ（ヘキサン中１０〜１５％ＥｔＯＡｃ）により精製して、粘性の淡黄色の油として２４．５ｇ（８９．３％）の化合物１０２を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，２５℃）：７．８４〜７．８２（ｍ，２Ｈ）；７．７５〜７．７３（ｍ，２Ｈ）；７．３４〜７．３３（ｍ，４Ｈ）；７．２９〜７．２６（ｍ，１Ｈ）；４．５１（ｓ，２Ｈ）；４．２２〜４．１８（ｔ，Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝６．７１Ｈｚ，２Ｈ）；３．５２〜３．４８（ｔ，Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）；２．０４〜１．７８（ｍ，２Ｈ）；１．７３〜１．５６（ｍ，４Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，２５℃）：１６３．９、１３８．８、１３４．６、１２９．２、１２８．６、１２７．８、１２７．７、１２３．７、７８．６、７３．１、７０．３、２９．６、２８．２、２２．５。
【０２５４】
工程２：化合物１０３
化合物１０２（２３．５ｇ、６９．２９ｍｍｏｌ）を、１００ｍｌのＥｔＯＡｃ／メタノール（１：１）中に入れた。この混合物を脱気し、アルゴンでパージし、これに２．４ｇのＰｄ−Ｃ（１０％−デグサ社（Ｄｅｇｕｓａ）の湿潤型）を加えた。この混合物を次いで一晩水素添加し、焼結漏斗でセライト床を介して濾過した。その後残渣をシリカゲルのカラムに通し、４０％ＥｔＯＡｃヘキサン溶液を使用して溶出させ、白色固体として化合物１０３（１５．７０ｇ、９０．９％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，２５℃）７．８３〜７．８１（ｂｍ．２Ｈ）；７．７５〜７．７３（ｂｍ，２Ｈ）；４．２３〜４．１９（ｔ，Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）；３．７０〜３．６６（ｔ，Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝５．８０Ｈｚ，２Ｈ）；１．８３〜１．７９（ｍ，２Ｈ）；１．６７〜１．６０（ｍ，４Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，２５℃）  １６３．９、１３４．７、１２９．１、１２３．７、７８．６、６２．７、３２．４、２８．０、２２．０。
【０２５５】
工程３：化合物１０４
化合物１０３（５．４ｇ、２１．６７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（４ｍｌ、２８．６９ｍｍｏｌ）を、アルゴン下において無水ＥｔＯＡｃ（３０ｍｌ）中に入れた。２−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（５．００ｍｌ、２１．９７ｍｍｏｌ）を、反応混合物に一滴ずつ加えた。Ｅｔ３Ｎ．ＨＣｌの白色の沈殿が試薬を加えた直後に形成され、この反応は１０分以内に終了した（ＴＬＣによって調べた）。この沈殿を、焼結漏斗を介して濾過し、減圧下で溶媒を除去した。残渣を精製用のシリカゲルカラムに直接装荷した。ヘキサン／ＥｔＯＡｃ（９：１）で溶出して、黄色い油、８．６８ｇ（８９．１３％）として化合物１０４を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，２５℃）  ７．８５〜７．８１（ｍ，２Ｈ）；δ７．７７〜７．７２（ｍ，２Ｈ）；４．２２〜４．１９（ｔ．Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝６．８０Ｈｚ，２Ｈ）；３．９１〜３．７６（ｍ，２Ｈ）；３．７２〜３．５３（ｍ，４Ｈ）２．６７〜２．６３（ｔ，Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝６．７１Ｈｚ，２Ｈ）；１．８６〜１．７８（ｍ，２Ｈ）；１．７３〜１．６６（ｍ，２Ｈ）；１．６２〜１．５６（ｍ，２Ｈ）；１．１９〜１．１６（ｍ，１２Ｈ）。３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，２５℃）δ１４５．０９。１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，２５℃）δ１６３．９、１３４．７、１２９．２、１２３．７、１１７．９、７８．６、６４．０、６３．４、５８．７、５８．５、４３．２、４３．１、３１．１、３１．０、２８．１、２４．９、２４．８、２４．７、２２．３、２０．６、２０．５。
【０２５６】
工程４：全トランスレチナールとオリゴヌクレオチドの結合
全トランスレチナールを、スキームＣ中に示したようにオリゴヌクレオチドと結合させた。標準的な固相オリゴヌクレオチド合成条件下において、化合物１０４を固体に結合したオリゴヌクレオチド１０５と結合させて、化合物１０６を得た。化合物１０６のフタルイミド保護基を、サロら（Ｓａｌｏ  ｅｔ  ａｌ．）（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１９９９年、第１０巻、ｐ．８１５）によって報告されたのと同様にヒドラジニウム水和物で処理することにより選択的に除去して、化合物１０７を得た。暗条件下において、全トランスレチナールで化合物１０７を処理することによって、文献（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１９９９、１０、８１５）中で報告されたのと同様に化合物１０８を得た。暗条件下での標準的なＲＮＡオリゴヌクレオチドの脱保護および精製によって、所望のオリゴヌクレオチド−レチナール結合体１０９を得た。化合物１０９は、スキームＣ中に示したように化合物１１０からも得た。化合物１０６の完全な脱保護および精製によって非結合状態の遊離オリゴヌクレオチド１１０を得て、続いてこれを全トランスレチナールと反応させて所望の化合物１０９を得た。
【０２５７】
【化３】
0005502025.tif 000010
スキームＣにおいて、ａ（ｉ）ホスホロアミダイト１０４、（標準的なオリゴヌクレオチド合成サイクル）；（ｉｉ）ヒドラジニウム水和物／Ｐｙ／ＡｃＯＨ（０．１２４／４／７）；（ｉｉｉ）ＤＭＦまたはＭｅＣＮに溶解した全トランスレチナール；（ｉｖ）オリゴヌクレオチド（ＲＮＡ）の脱保護（ＭｅＮＨ２、ＴＥＡ．３ＨＦ）および精製；（ｖ）オリゴヌクレオチド（ＲＮＡ）の脱保護（ＭｅＮＨ２、ＴＥＡ．３ＨＦ）および精製；（ｖｉ）ＤＭＳＯ−Ｈ２Ｏに溶解した全トランスレチナール、である。
【０２５８】
工程４．１．：オリゴヌクレオチド合成
ＡＬ−３１６６以外の全てのオリゴヌクレオチドは、ＡＢＩ４９０型ＤＮＡ合成装置で合成した。市販の多孔質ガラス固形支持体（ｄＴ−ＣＰＧおよびＵ−ＣＰＧ、
【０２５９】
【数３】
0005502025.tif 000011
および標準的な保護基を有するＲＮＡホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ６−ベンゾイル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−アデノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−シチジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−イソブチリル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−グアノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホロアミダイト、および５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−ウリジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホロアミダイトを、オリゴヌクレオチド合成用に使用した。全てのホスホロアミダイトは、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）中に０．１５Ｍの濃度で使用した。１０分のカップリング時間を使用した。活性化物質は５−エチルチオテトラゾール（０．２５Ｍ）であり、ＰＯ酸化用にはヨウ素／水／ピリジンを使用した。
【０２６０】
配列ＡＬ−３１６６はＡＫＴＡｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ（商標）合成装置で合成した。全てのホスホロアミダイトをアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）中に０．２Ｍの濃度で使用したが、グアノシンについては１０％ＴＨＥ／アセトニトリル（ｖ／ｖ）中に０．２Ｍの濃度として使用した。１６分のカップリング／リサイクル時間を使用した。活性化物質は５−エチルチオテトラゾール（０．７５Ｍ）であり、ＰＯ酸化用にはヨウ素／水／ピリジンを使用し、ＰＳ酸化用には２，６−ルチジン／ＡＣＮ（１：１  ｖ／ｖ）に溶解したＰＡＤＳ（２％）中を使用した。
【０２６１】
アミノオキシ−リンカーホスホロアミダイトを前述と同様に合成し、アセトニトリル中に０．１５Ｍの濃度で使用した。アミノオキシ−リンカーホスホロアミダイトに関するカップリング時間は１５分であった。全ての配列について、アミノオキシ−リンカーホスホロアミダイトのカップリングはＡＢＩ３９０型ＤＮＡ合成装置で行った。
【０２６２】
工程４．２．アミノオキシ−リンカーオリゴヌクレオチドからのフタルイミド保護基の切断
アミノオキシ−リンカーのカップリング後、ピリジンに溶解した０．５Ｍ酢酸ヒドラジニウム（０．１６／４／２の無水ヒドラジン、ピリジン、酢酸）２．５ｍｌで、デュアルシリンジ法を使用してＣＰＧを処理した。５分毎にシリンジを前後に押して、ＣＰＧ上に新たな溶液を送った。酢酸ヒドラジニウム処理の後、ＣＰＧを２×５ｍｌのピリジン、次に３×５ｍｌのアセトニトリルで洗浄した。乾燥アルゴンで３０秒間洗浄し、次いでＣＰＧを乾燥させた。
【０２６３】
工程４．３．支持体上でのアルデヒドとの結合
１−ピレン−カルボキシアルデヒドおよび全トランスレチナールはアルドリッヒ（Ａｌｄｒｉｃｈ）から得たものであり、ＤＭＦ中に０．５Ｍの濃度で使用した。４−ケト−レチノールはＤＭＦ中０．１３Ｍの濃度で使用した。上述のＣＰＧをアルデヒド溶液に加えた。結合は一晩（約１６時間）室温で行った。反応が終了した後、ＣＰＧをＤＭＦ、次にアセトニトリルですすぎ、１０〜１５分間風乾した。ＡＬ−３２１３配列については、全トランスレチナールおよび１−ピレン−カルボキシアルデヒドのいずれとの結合もアセトニトリル中で行った。１−ピレン−カルボキシアルデヒドの場合、アルデヒドは０．５Ｍでは完全には溶解せず、溶解しなかったアルデヒドを除去するための濾過を行わずに溶液をそのまま使用した。
【０２６４】
工程４．４．支持体に結合したオリゴヌクレオチドの脱保護−Ｉ（核酸塩基の脱保護）
支持体上のレチナール結合オリゴヌクレオチドについては、支持体を５ｍｌのチューブ（ＶＷＲ）に移した。１ｍＬの４０％メチルアミン水溶液を用いて６５℃で１５分間処理することにより、オリゴヌクレオチドを支持体から切断すると同時に塩基およびリン酸基の脱保護を実施した。チューブを氷上で短時間冷却し、次いでメチルアミンを濾過して新たな１５ｍｌチューブに入れた。ＣＰＧを３×１ｍＬのＤＭＳＯで洗浄した。
【０２６５】
工程４．５．支持体に結合したオリゴヌクレオチドの脱保護−ＩＩ（２’ＴＢＤＭＳ基の除去）
前述の混合物に、１．５ｍｌのトリエチルアミントリヒドロフルオリド（ＴＲＥＡＴ−ＨＦ）を加え、６０℃で１５分間加熱して、２’位のｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基を除去した。次いで反応を５．５ｍｌの５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）を用いて停止させ、精製するまでフリーザー中に保存した。
【０２６６】
工程４．６．脱保護後のアルデヒドとの結合
アミノオキシ−リンカーオリゴヌクレオチドを脱保護した後での、アルデヒド（１−ピレン−カルボキシアルデヒドおよび全トランスレチナール）との結合も、代替結合方法として行った。
【０２６７】
工程４．７．脱保護後の結合のための脱保護−Ｉ（核酸塩基の脱保護）
支持体を２ｍｌのスクリューキャップ付きチューブに移した。６５℃で１５分間の０．５ｍＬの４０％メチルアミン水溶液処理により、オリゴヌクレオチドを支持体から切断すると同時に塩基およびリン酸基を脱保護した。チューブを氷上で短時間冷却し、次いでメチルアミンを濾過して新たな１５ｍｌチューブに入れた。ＣＰＧを２×０．５ｍＬの５０％アセトニトリル／水で洗浄した。次いで混合物をドライアイス上で凍結させ、スピードバックで真空下において乾燥させた。
【０２６８】
工程４．８．脱保護後の結合のための脱保護−ＩＩ（２’ＴＢＤＭＳ基の除去）
乾燥させた残渣を０．５ｍｌのトリエチルアミントリヒドロフルオリド（ＴＥＡ．３ＨＦ）に再懸濁させ、６０℃で１５分間加熱して、２’位のｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基を除去した。次いで反応混合物を室温に冷却し、２ｍｌの乾燥メタノールを用いてＲＮＡを沈殿させ、スピードバックで真空下において乾燥させた。次いでサンプルを２ｍｌの水に溶かし、さらに分析するまでフリーザー中に凍結保存した。
【０２６９】
工程４．９．粗製オリゴマーの定量または粗分析
全てのサンプルに関して、１μｌ、１０μｌまたは３０μｌの分割試料を９９９μｌ、９９０μｌまたは９７０μｌのヌクレアーゼを含まない脱イオン水で希釈し（１．０ｍＬ）、２６０ｎｍにおいて吸光度の読み取り値を得た。
【０２７０】
工程４．１０．結合型オリゴマーの精製
（ａ）ＬＣ／ＭＳによる粗分析
粗製オリゴマーを最初にＬＣ／ＭＳにより分析して、予想される最終産物の存在および量を調べた。
【０２７１】
（ｂ）逆相精製
結合物のサンプルを、ＲＰＣ−Ｓｏｕｒｃｅ（商標）１５カラム（２１．５×１ｃｍ）で逆相ＨＰＬＣによって精製した。バッファー系は：Ａ＝１０％ＡＣＮ中の２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ８．５およびＢ＝７０％ＡＣＮ中の２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ８．５であり、流速５．０ｍＬ／分、ならびに波長を２６０および３７５とした。次いで、完全長オリゴヌクレオチドを含む画分を個々に脱塩した。
【０２７２】
工程４．１１．精製オリゴヌクレオチドの脱塩
精製したオリゴヌクレオチド画分を、ＰＤ−１０  Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）Ｇ−２５カラムを使用して脱塩した。最初に、２５〜３０ｍｌの水を用いてカラムを平衡化した。次いでサンプルを体積２．５ｍｌとして装荷した。次いで、３．５ｍｌの塩を含まない画分としてサンプルを溶出させた。脱塩した画分を１つに合せ、必要となるまで凍結保存した。
【０２７３】
工程４．１２．キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）、イオン交換ＨＰＬＣ（ＩＥＸ）およびエレクトロスプレーＬＣ／ＭＳ
約０．３ＯＤの脱塩オリゴヌクレオチドを水で希釈して３００μｌとし、次いでＣＧＥ、ＩＥＸおよびＬＣ／ＭＳ分析用の専用バイアルにピペットで移した。
【０２７４】
工程５．全トランスレチナールのオリゴヌクレオチド（ＲＮＡ）３’端への結合：
レチノイドの５’結合用のホスホロアミダイト１１６、およびレチノイドの３’結合用のＣＰＧ支持体１１５を、スキームＤに示すように合成した。ＣＰＧ支持体１１５は、レチノイドをオリゴヌクレオチドの３’に結合させるために使用した。
【０２７５】
【化４】
0005502025.tif 000012
ａスキームＤにおいて、（ｉ）ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ、イミダゾール／Ｐｙ、室温；（ｉｉ）（ａ）Ｈ２、Ｐｄ−Ｃ（１０％）／ＥｔＯＡＣ−ＭｅＯＨ、４時間および（ｂ）  −カプロラクトン、ＴＥＡ、５５℃、２４時間；（ｉｉｉ）ＴＥＡ．３ＨＦ／ＴＨＦ；（ｉｖ）（ａ）無水コハク酸、ＤＭＡＰ／ＥＤＣ、２４時間および（ｂ）ＤＴＮＰ、Ｐｈ３Ｐ、ＤＭＡＰ、その後ｌｃａａＣＰＧを添加；（ｖ）ホスフィチル化、である。
【０２７６】
工程５．１：化合物１１２
化合物１１１（１２０．０ｇ、３０．０１ｍｍｏｌ）を、無水ピリジン（１００ｍＬ）に溶かしたイミダゾール（７．５ｇ、１１０．１６ｍｍｏｌ）の存在下でＴＢＤＭＳ−Ｃｌ（５．４３ｇ、３６．０２ｍｍｏｌ）と共に一晩攪拌した。ピリジンを除去した後、生成物を酢酸エチル（３００ｍＬ）中に抽出し、炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、次いで標準的な後処理を施した。得られた残渣を、１％メタノールをジクロロメタンに溶かしたものを溶出液として用いてフラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィに供し、薄い白色の固体として化合物１１２を得た（２４．４ｇ、定量値。１ＨＮＭＲ（５００ＭＨｚ、［Ｄ６］ＤＭＳＯ、２５℃）：  ７．３３〜７．１３（ｂｍ、１５Ｈ、Ｄ２Ｏ交換後の１４Ｈに相当）；６．８７〜６．８２（ｂｍ、４Ｈ）；５．０１（ｓ、０．２Ｈ、回転異性体少数）；４．９９（ｓ、１．８Ｈ、回転異性体多数）、４．６８〜４．６４（ｍ、０．７２Ｈ、回転異性体多数）；４．１４〜４．０７（ｂｍ、１Ｈ）、３．７２（ｓ、７Ｈ）、３．３８〜３．３６（ｍ、０．６Ｈ、回転異性体少数）；３．２６〜３．２１（ｍ、１．４Ｈ、回転異性体多数）；３．０８〜３．０７（ｍ、０．３Ｈ、回転異性体、少数）；２．９９〜２．８９（ｍ、２．７Ｈ、回転異性体、多数）；２．２２〜２．１２（ｍ、２Ｈ）、２．０４〜１．７８（ｍ、２Ｈ）；１．４８〜１．２３（ｍ、６Ｈ）、０．８４、０．８２（ｓ、９Ｈ、回転異性体多数および少数）；０．０５（ｄ、Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝１．５Ｈｚ、４．３Ｈ、回転異性体多数）；０．０３〜０．０２（ｄ、Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝５．５Ｈｚ、１．７Ｈ）。
【０２７７】
工程５．２：化合物１１３
化合物１１２（９．４ｇ、１４．５４ｍｍｏｌ）を１５ｍＬのβ−カプロラクトンに懸濁させ、懸濁液に１０ｍＬのＴＥＡを加えた。この反応混合物を、５５℃の浴温で２４時間、アルゴン下において攪拌した。反応の終了はＴＬＣ分析によって調べた。真空中で反応混合物からＴＥＡを除去し、１５０ｍＬのジクロロメタン−ヘキサン（２：１混合物）を残渣に加えた。このようにして得た均質溶液を、シリカゲルのカラムに直接装荷し、ジクロロメタン−ヘキサン（２：１）、次に非希釈ジクロロメタンを用いて溶出した。ジクロロメタン中４％のメタノールを用いたシリカカラムの溶出によって、白色の固体として所望の化合物１１３を得た（８．７３ｇ、７８．９％）。１ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、［Ｄ６］ＤＭＳＯ、２５℃）δ７．７２〜７．６８（ｂｍ、１Ｈ、Ｄ２Ｏと交換可能）；７．３３〜７．１６（ｍ、９Ｈ）；６．８８〜６．８４（ｍ、４Ｈ）；４．６８〜４．６２（ｍ、０．８Ｈ）；４．５７〜４．５２（ｍ、０．２Ｈ）；４．３４〜４．３１（ｔ、Ｊ（Ｈ，Ｈ）＝５．１８Ｈｚ、１Ｈ、Ｄ２Ｏと交換可能）；４．１４〜４．０８（ｂｍ、１Ｈ）；３．７４〜３．６７（ｍ、７Ｈ）；３．３９〜３．３２（ｍ、３．３Ｈ）；３．２５〜３．２１（ｍ、１．７Ｈ）；３．０９〜２．８８（ｍ、４Ｈ）。
【０２７８】
６．二重鎖の活性分析
上述のＨｅＬａ細胞アッセイにおける活性に関して、二重鎖を試験した。表１４および図３８は、上記の各修飾物のＨｅＬａ細胞における活性のデータおよびグラフを提示している。
【実施例１２】
【０２７９】
ポリエチレングリコールとｓｉＲＮＡの結合（表１２）
ＰＥＧ結合用のアミノリンカーオリゴヌクレオチド
概要
ＴＳＫゲル−ＳｕｐｅｒＱ（商標）−５ＰＷ（東ソー）で、イオン交換分取クロマトグラフィを行った。イオン交換分析クロマトグラフィは、ＤＮＡＰａｃ（登録商標）Ｐａ１００（ダイオネクス（Ｄｉｏｎｅｘ））で行った。電子スプレーイオン化質量スペクトルはアジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）１１００ＭＳＤ−ＳＬを用いて記録した。
【０２８０】
ＨＰＬＣ法
ＲＮＡをイオン交換クロマトグラフィ（カラム、ＤＮＡＰａｃ（登録商標）Ｐａ１００、４×２５０ｍｍ、分析用）により分析したが、条件を、３０℃に加熱、流速１．５ｍＬ分−１、バッファーＡ＝１０％ＣＨ３ＣＮ中の０．０２０ＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ１１）；バッファーＢ＝バッファーＡ＋１０％ＣＨ３ＣＮ中の１ＭのＮａＢｒ（ｐＨ１１）、５３分間で０→７５％の直線勾配とした。ＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳの条件は以下の通り、すなわち：カラムはＸＴｅｒｒａ（登録商標）Ｃ８（２．１×３０ｍｍ、２．５μｍ）、２分間で５→３５％、３０．５分間で３５→７０％の直線勾配、流速０．２００ｍＬ分−１、バッファーＡ＝４００ｍＭ  ＨＦＩＰ／１６．３ｍＭ  ＴＥＡ水溶液、バッファーＢ＝１００％メタノールとした。ＲＮＡをイオン交換クロマトグラフィ（５ｃｍのインハウス充填カラム、ＴＳＫゲル−ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷ、２０μｍ）によって精製したが、条件を、７５℃に加熱、流速５０ｍＬ分−１、バッファーＡ＝１０％ＣＨ３ＣＮ中の０．０２０ＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．５）；バッファーＢ＝バッファーＡ＋１０％ＣＨ３ＣＮ中の１ＭのＮａＢｒ（ｐＨ８．５）、１２０分間で２０→５５％の直線勾配とした。
【０２８１】
ＲＮＡ合成
特注のインハウス支持体およびホスホロアミダイト化合物を使用して、１００〜１５０μｍｏｌスケールで、ＡＫＴＡ  ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ（商標）１００で保護ＲＮＡを構築した。ホスホロアミダイトは乾燥ＣＨ３ＣＮに溶かした０．２ｍｏｌＬ−１溶液として使用し、カップリング時間を９００秒とし、製造者の奨励する合成プロトコルを使用した。合成後、支持体に結合したＲＮＡを４５℃において９０分間ＣＨ３ＮＨ２水溶液（４０％）で処理し、冷却し、濾過し、ＤＭＳＯ（３×４０ｍＬ）で洗浄した。次いで濾液を４０℃において６０分間、ＴＥＡ．３ＨＦ（６０ｍＬ）で処理し、ＮａＯＡｃ水溶液（０．０５Ｍ、ｐＨ５．５、２００ｍＬ）を用いて急冷した。合成後に続いて分析イオン交換ＨＰＬＣ、分取ＨＰＬＣを実施し、次いでＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５で脱塩した。
【０２８２】
工程１．オリゴヌクレオチド合成：
一般的な結合手法をスキームＥに示す。
全てのオリゴヌクレオチドを、ＡＫＴＡｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ（商標）合成装置で合成した。市販の多孔質ガラス固形支持体（ｄＴ−ＣＰＧ、
【０２８３】
【数４】
0005502025.tif 000013
またはフタルイミド−ヒドロキシ−プロリノール固形支持体、ならびに標準的な保護基を有するＲＮＡホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ６−ベンゾイル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−アデノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−シチジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−イソブチリル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−グアノシン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホロアミダイト、および５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−ｔ−ブチルジメチルシリル−ウリジン−３’−Ｏ−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル−２−シアノエチルホスホロアミダイトを、オリゴヌクレオチド合成用に使用した。全てのホスホロアミダイトをアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）中に０．２Ｍの濃度で使用したが、グアノシンについては１０％ＴＨＥ／アセトニトリル（ｖ／ｖ）中に０．２Ｍの濃度で使用した。１６分のカップリング／リサイクル時間を使用した。活性化物質は５−エチルチオテトラゾール（０．７５Ｍ）であり、ＰＯ酸化用にはヨウ素／水／ピリジンを使用し、ＰＳ酸化用には２，６−ルチジン／ＡＣＮ（１：１  ｖ／ｖ）に溶解したＰＡＤＳ（２％）を使用した。アミノリンカーホスホロアミダイトを合成し、アセトニトリル中に０．２Ｍの濃度で使用した。アミノリンカーホスホロアミダイトのカップリング／リサイクル時間は１６分であった。
【０２８４】
【化５】
0005502025.tif 000014
ａスキームＥにおいて、（ｉ）固相オリゴヌクレオチド合成；（ｉｉ）脱保護および精製；（ｉｉｉ）ＰＥＧ−ＮＨＳエステル、ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．１、１時間、である。
【０２８５】
工程２．脱保護−Ｉ（核酸塩基の脱保護）
合成の終了後、支持体を１００ｍｌのガラス製容器に移した。４０ｍＬの４０％メチルアミン水溶液を用いて４５℃で９０分間処理することにより、オリゴヌクレオチドを支持体から切断すると同時に塩基およびリン酸基を脱保護した。容器を氷上で短時間冷却し、次いでメチルアミンを濾過して新たな５００ｍｌ容器中に入れた。ＣＰＧを３×４０ｍＬのＤＭＳＯで洗浄した。次いで混合物をドライアイスで冷却した。
【０２８６】
工程３．脱保護−ＩＩ（２’ＴＢＤＭＳ基の除去）
前述の混合物に６０ｍｌのトリエチルアミントリヒドロフルオリド（ＴＲＥＡＴ−ＨＦ）を加え、４０℃で６０分間加熱して、２’位のｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基を除去した。次いで反応を５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）２２０ｍｌを用いて停止させ、精製するまでフリーザー中に保存した。
【０２８７】
工程４．粗製オリゴマーの定量または粗分析
全てのサンプルについて、１０μｌの分割試料を９９０μｌのヌクレアーゼを含まない脱イオン水で希釈し（１．０ｍＬ）、２６０ｎｍにおける吸光度の読み取り値を得た。
【０２８８】
工程５．オリゴマーの精製
（ａ）ＨＰＬＣ精製
粗製オリゴマーは最初にＨＰＬＣ（ダイオネクスＰＡ１００）により分析した。バッファー系は：Ａ＝２０ｍＭのリン酸、ｐＨ１１、Ｂ＝２０ｍＭのリン酸、１．８ＭのＮａＢｒ、ｐＨ１１、流速１．０ｍＬ／分、および波長２６０〜２８０ｎｍであった。それぞれのサンプルに関して５〜１５μｌを注入した。サンプルは、ＴＳＫ−Ｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷ（２０）カラム（１７．３×５ｃｍ）でＨＰＬＣによって精製した。バッファー系は：Ａ＝１０％ＡＣＮ中の２０ｍＭのリン酸、ｐＨ８．５、およびＢ＝１０％ＡＣＮ中の２０ｍＭのリン酸、１．０ＭのＮａＢｒ、ｐＨ８．５、流速５０．０ｍＬ／分、ならびに波長２６０および２９４であった。完全長オリゴヌクレオチドを含む画分を次いで１つに集め、蒸発させ、脱イオン水で約１００ｍｌに再構成した。
【０２８９】
工程６．精製オリゴマーの脱塩
精製したオリゴヌクレオチドは、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムを使用してＡＫＴＡ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（アマシャムバイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））で脱塩した。最初に、水を用いて２５ｍｌ／分の流速で２０〜３０分間カラムを洗浄した。次いでサンプルをのせて２５ｍｌ画分とした。溶出させた塩を含まない画分を１つに組合せ、乾燥させ、５０ｍｌのＲＮａｓｅを含まない水で再構成した。
【０２９０】
工程７．キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）およびエレクトロスプレーＬＣ／ＭＳ
約０．１５ＯＤの脱塩オリゴヌクレオチドを水で希釈して１５０μｌとし、次いでＣＧＥ分析およびＬＣ／ＭＳ分析用の専用バイアルにピペットで移した。
【０２９１】
工程８．ＰＥＧの結合
Ａ）最初の反応条件
精製および脱塩したＲＮＡを凍結乾燥させた。ＲＮＡ（１ｍｇ）をＮａＨＣＯ３水溶液（０．１Ｍ、２００μｌ、ｐＨ８．１）およびＤＭＦ（それぞれ２００μＬ）に溶かした。５Ｋ（１３当量、１０ｍｇ）または２０Ｋ（３．４当量、１０ｍｇ）のＰＥＧを反応バイアルに直接加え、完全に攪拌混合した。反応は４℃で一晩継続し、その後イオン交換ＨＰＬＣ分析を実施した。反応の８５％超が完了したとき、ｐＨがおよそ７になるまでＮａＯＡｃ水溶液（０．０５Ｍ、ｐＨ５．５）を用いて反応を停止させた。
【０２９２】
Ｂ）ホウ酸バッファーでの結合
精製および脱塩したＲＮＡを凍結乾燥させた。ＲＮＡのサンプル（１ｍｇ）をホウ酸ナトリウムバッファー（２００μＬ、０．０５Ｍ、ｐＨ１０）に溶かした。５ＫＰＥＧ（３ｍｇ、４．５当量のＳｕｎｂｒｉｇｈｔ（登録商標）ＭＥ−５０ＨＳ、日本油脂）をＣＨ３ＣＮ（２００μＬ）に溶かした。ＲＮＡ溶液をＰＥＧ溶液に加え、完全に攪拌混合した。反応は室温で１時間継続し、その後イオン交換ＨＰＬＣ分析を実施した。反応の８５％超が完了したとき、ｐＨがおよそ７になるまでＮａＯＡｃ水溶液（０．０５Ｍ、ｐＨ５．５）を用いて反応を停止させた。
【０２９３】
Ｃ）ＰＥＧリンカー（ＡＳとＨＳ）の比較
ＲＮＡのサンプル（１ｍｇ）をＮａＨＣＯ３水溶液（０．１Ｍ、２００μｌ、ｐＨ８．１）およびＤＭＦ（２００μＬ）に溶かした。５ＫＰＥＧ（１３．５当量、１０ｍｇ、Ｓｕｎｂｒｉｇｈｔ  ＭＥ−５０ＨＳまたはＳｕｎｂｒｉｇｈｔ  ＭＥ−５０ＡＳ、日本油脂）を反応バイアルに直接加え、完全に攪拌混合した。反応は４℃で一晩継続し、その後イオン交換ＨＰＬＣ分析を実施した。反応の８５％超が完了したとき、ｐＨがおよそ７になるまでＮａＯＡｃ水溶液（０．０５Ｍ、ｐＨ５．５）を用いて反応を停止させた。
【０２９４】
Ｄ）最終的な最適化ＰＥＧ結合
精製および脱塩したＲＮＡを凍結乾燥させた。ＲＮＡのサンプル（５０ｍｇ）をＮａＨＣＯ３水溶液（０．１Ｍ、２ｍＬ、ｐＨ８．１）およびＤＭＦ（１ｍＬ）に溶かした。２０ＫＰＥＧ（約２．７当量、４００〜５２０ｍｇのＳｕｎｂｒｉｇｈｔ  ＭＥ−２００ＨＳ、異なる配列に関してこの範囲内で異なる量）をＣＨ３ＣＮ（２ｍＬ）に溶かした。ＲＮＡ溶液をＰＥＧ溶液に加え、完全に攪拌混合した。Ｈ２Ｏ（２５０ｍＬ）を反応混合物に加えて、濁度を低下させた。反応は室温で１時間継続し、その後イオン交換ＨＰＬＣ分析を実施した。反応の８５％超が完了したとき、ｐＨがおよそ７になるまでＮａＯＡｃ水溶液（０．０５Ｍ、ｐＨ５．５）を用いて反応を停止させた。
【０２９５】
工程９．二重鎖の活性分析
前述のＨｅＬａ細胞アッセイにおける活性に関して、二重鎖を試験した。表１２および図４５は、上記の各修飾体のＨｅＬａ細胞における活性のデータおよびグラフを提示している。
【実施例１３】
【０２９６】
リボ−ジフルオロトルイル（ＤＦＴ）ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチド（表１３）の合成
ＡＢＩの３９４型機にて、製造者により文書化された標準的なサイクルを使用し、数箇所の待機工程に変更を加えてＲＮＡ分子を合成した。固形支持体は５００ÅのｄＴ  ＣＰＧ（２ｕｍｏｌｅ）とした。モノマーはＲＮＡホスホロアミダイトまたはリボ−ジフルオロトルイルアミダイトのいずれかとした。別途記載のない限り、全てのモノマーは標準的な保護基を有しており、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）中に０．１５Ｍの濃度で使用した。具体的には、ホスホロアミダイトは、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ６−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔブチルジメチルシリル−アデノシン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−イソブチリル−２’−Ｏ−ｔブチルジメチルシリル−グアノシン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−ｔブチルジメチルシリル−シチジン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、および５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔブチルジメチルシリル−ウリジン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−ジフルオロトルイルＯ−ｔブチルジメチルシリル−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト（０．１２Ｍ）であった。カップリング時間は全てのＲＮＡモノマーに関して７分、ＤＦＴモノマーに関して１０分とした。他の試薬の詳細は以下の通りである：活性化物質：５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（０．２５Ｍ）；キャップＡ：５％無水酢酸／ＴＨＦ／ピリジン、キャップＢ：１０％Ｎ−メチルイミダゾール／ＴＨＦ；リン酸の酸化には０．０２ＭのＩ２／ＴＨＦ／Ｈ２Ｏを要した。脱トリチル化は３％ＴＣＡ／ジクロロメタンを用いて行った。ＤＭＴ保護基は、サイクルの最後の工程の後で除去した。
【０２９７】
合成の終了後、ＣＰＧをスクリューキャップ付き滅菌済み微量遠心分離チューブに移した。エタノールアンモニア混合物（１：３）１．０ｍＬを用いて５５℃で１６時間処理することにより、オリゴヌクレオチドを切断すると同時に塩基およびリン酸基を脱保護した。チューブを氷上で短時間冷却し、次いで溶液を５ｍＬの遠心分離チューブに移し；その後０．２５ｍＬの５０％アセトニトリルで３回洗浄した。−８０℃で１５分間チューブを冷却してから凍結乾燥装置中で乾燥させた。
【０２９８】
得られた白色の残渣を２００ｕＬのトリエチルアミントリヒドロフルオリドに再懸濁させ、６５℃で１．５時間加熱して、２’位のＴＢＤＭＳ基を除去した。次いでオリゴヌクレオチドを、乾燥メタノール（４００ｕＬ）中に沈殿させた。液体を注意深く除去して、チューブの底にペレットを得た。残留メタノールをスピードバックで除去し、白い綿毛状の物質を得た。１ｍＬのＲＮａｓｅを含まない水中にサンプルを溶かし、２６０ｎｍにおける吸光度を測定することによって定量した。この粗製物を−２０℃で保存した。
【０２９９】
粗製オリゴヌクレオチドは、２０％ポリアクリルアミド変性ゲルによって分析および精製した。精製した乾燥オリゴヌクレオチドを、次いでＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５Ｍを使用して脱塩した。
【０３００】
前述のＨｅＬａ細胞アッセイにおける活性に関して、二重鎖を試験した。表１３および図４６は、上述の各修飾体のＨｅＬａ細胞における活性のデータおよびグラフを提示している。
【実施例１４】
【０３０１】
２’−アラフルオロ−２’−デオキシヌクレオシドで修飾されたＲＮＡ（表１４）の合成
ＡＢＩの３９４型機にて、製造者により文書化された標準的なサイクルを使用し、数箇所の待機工程に変更を加えてキメラＲＮＡ分子を合成した。固形支持体は５００ÅのｄＴ  ＣＰＧ（２μｍｏｌｅ）とした。モノマーはＲＮＡホスホロアミダイトまたは２’−アラフルオロ−２’−デオキシ（２’アラＦ）ホスホロアミダイトのいずれかとした。別途記載のない限り、全てのモノマーは標準的な保護基を有しており、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）中に０．１５Ｍの濃度で使用した。具体的には、ＲＮＡホスホロアミダイトは、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ６−ベンゾイル−２’−Ｏ−ｔブチルジメチルシリル−アデノシン−３’−Ｏ−（α−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−イソブチリル−２’−Ｏ−ｔブチルジメチルシリル−グアノシン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−ｔブチルジメチルシリル−シチジン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、および５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−ｔブチルジメチルシリル−ウリジン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイトであり；２’アラＦホスホロアミダイトは、５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ４−ベンゾイル−２’−アラフルオロ−２’−デオキシシチジン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、および５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−アラフルオロ−２’−デオキシウリジン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイト、および５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−アラフルオロ−チミジン−３’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）ホスホロアミダイトであった。カップリング時間は全てのモノマーに関して１０分とした。他の試薬の詳細は以下の通りである：活性化物質：５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（０．２５Ｍ）；キャップＡ：５％無水酢酸／ＴＨＦ／ピリジン、キャップＢ：１０％Ｎ−メチルイミダゾール／ＴＨＦ；リン酸の酸化には０．０２ＭのＩ２／ＴＨＦ／Ｈ２Ｏを要した。脱トリチル化は３％ＴＣＡ／ジクロロメタンを用いて行った。最終的なＤＭＴ保護基は、最終サイクルの後で除去した。
【０３０２】
合成の終了後、ＣＰＧをスクリューキャップ付き滅菌済み微量遠心分離チューブに移した。エタノールと濃アンモニアの混合物（１：３）１．０ｍＬを用いて５５℃で５時間処理することにより、オリゴヌクレオチドを切断すると同時に塩基およびリン酸基を脱保護した。チューブを氷上で短時間冷却し、次いで溶液を５ｍＬの遠心分離チューブに移し；その後０．２５ｍＬの５０％アセトニトリルで３回洗浄した。−８０℃で１５分間チューブを冷却した後、凍結乾燥装置で乾燥させた。
【０３０３】
得られた白色の残渣を２００ｕＬのトリエチルアミントリヒドロフルオリドに再懸濁させ、６５℃で１．５時間加熱して、２’−ＯＨ位のＴＢＤＭＳ基を除去した。次いでオリゴヌクレオチドを、乾燥メタノール（４００ｕＬ）中に沈殿させた。液体を注意深く除去して、チューブの底にペレットを得た。残留メタノールをスピードバックで除去し、白い綿毛状の物質を得た。１ｍＬのＲＮａｓｅを含まない水中にサンプルを溶かし、２６０ｎｍにおける吸光度を測定することによって定量した。この粗製物を−２０℃で保存した。
【０３０４】
粗製オリゴヌクレオチドは、２０％ポリアクリルアミド変性ゲルによって分析および精製した。精製した乾燥オリゴヌクレオチドを、次いでＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５Ｍ（アマシャムバイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を使用して脱塩した。
【０３０５】
前述のＨｅＬａ細胞アッセイにおける活性に関して、二重鎖を試験した。表１４および図４７は、上記の各修飾体のＨｅＬａ細胞における活性のデータおよびグラフを提示している。
【実施例１５】
【０３０６】
メチルホスホネート修飾ｓｉＲＮＡ（表１５）の脱保護
脱保護工程１：
合成の終了後、多孔質ガラス（ＣＰＧ）をスクリューキャップ付きバイアルに移した。アセトニトリル／エタノール／ＮＨ４ＯＨ（４５：４５：１０）からなる溶液（０．５ｍｌ）を支持体に加えた。バイアルを密閉し、室温で３０分間放置した。エチレンジアミン（０．５ｍＬ）をバイアルに加え、室温でさらに６時間放置した。上清を傾瀉し、支持体を１：１のアセトニトリル／水（０．５ｍＬ）で２回洗浄した。上清を合わせて水（１５ｍＬ）で希釈した。ＡｃＣＮ／Ｈ２Ｏ（１：９）中の６ＭのＨＣｌを用いて、ｐＨを７．０に調整した。サンプルを、Ｓｅｐｐａｋ（登録商標）Ｃ１８カートリッジを使用して脱塩し、次いでスピードバックで乾燥させた。
【０３０７】
脱保護工程２：（２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ基の除去）
得られた白色の残渣をトリエチルアミン、トリエチルアミントリヒドロフルオリド（ＴＥＡ．３ＨＦ  約２４％ＨＦ）および１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）の混合物（４：３：７）（４００ｕｌ）に再懸濁させ、６５℃で９０分間加熱して、２’位のｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基を除去した。次いでイソプロポキシトリメチルシラン（ｉＰｒＯＭｅ３Ｓｉ、４００ｕｌ）を用いて反応を停止させ、キャップを開けた状態でヒートブロックにて１０分間さらにインキュベートした（これによって、揮発性のイソプロポキシトリメチルシリルフルオリド付加生成物を蒸発させる）。残留している反応停止試薬は、スピードバックで乾燥させることによって除去した。３％トリエチルアミンのジエチルエーテル溶液（１．５ｍｌ）を加え、混合物を遠心分離にかけて、ＲＮＡのペレットを得た。ペレットを乱さずに、上清をピペットで取り出した。ペレットをスピードバックで乾燥させた。粗製ＲＮＡは、微量遠心分離チューブ中に白い綿毛状の物質として得られた。
【０３０８】
精製：
全てのメチルホスホネート修飾配列はＰＡＧＥによって精製した。
二重鎖の活性分析
前述のＨｅＬａ細胞アッセイにおける活性に関して、二重鎖を試験した。表１５および図４８は、上記の各修飾体のＨｅＬａ細胞における活性のデータおよびグラフを提示している。
【０３０９】
【表５】
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【０３１０】
【表６】
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【０３１１】
【表７】
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【０３１２】
【表８】
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【０３１３】
【表９】
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【０３１４】
【表１０】
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【０３１５】
【表１１】
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【０３１６】
【表１２】
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【０３１７】
【表１３】
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【０３１８】
【表１４】
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【０３１９】
【表１５】
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【０３２０】
【表１６】
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【０３２１】
【表１７】
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【０３２２】
【表１８】
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【０３２３】
【表１９】
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【０３２４】
【表２０】
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【０３２５】
【表２１】
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【０３２６】
【表２２】
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（他の実施形態）
本発明の幾つかの実施形態について記載してきた。しかし、当然ながら、本発明の思想および範囲から逸脱することなく、さまざまな変更形態を作製することが可能である。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲の範疇内にある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【配列表】
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