(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
60秒以下の繰り返し時間で励起磁場のパルスを印加して磁気共鳴信号を連続的に取得するために使用される、
天然存在比を超える割合で13Cを含むポリエチレングリコールのみからなる化合物を含有することを特徴とする、
磁気共鳴造影剤。
【請求項２】
前記ポリエチレングリコールの13Cの割合が、全炭素原子の20〜100％である、請求項１に記載の磁気共鳴造影剤。
【請求項３】
前記ポリエチレングリコールの重量平均分子量が470〜10000000である、請求項１に記載の磁気共鳴造影剤。
【請求項４】
天然存在比を超える割合で13Cを含むポリエチレングリコールのみからなる化合物を含有する磁気共鳴造影剤が投与された被験体に対して、60秒以下の繰り返し時間で励起磁場のパルスを印加することにより磁気共鳴信号を連続的に取得して画像化することを特徴とする、磁気共鳴撮像方法。
【請求項５】
前記ポリエチレングリコールの13Cの割合が、全炭素原子の20〜100％である、請求項４に記載の磁気共鳴撮像方法。
【請求項６】
前記ポリエチレングリコールの重量平均分子量が470〜10000000である、請求項４に記載の磁気共鳴撮像方法。
【請求項７】
天然存在比を超える割合で13Cを含むポリエチレングリコールのみからなる化合物を含有する磁気共鳴造影剤が投与された被験体に対して、60秒以下の繰り返し時間で励起磁場のパルスを印加することにより磁気共鳴信号を連続的に取得することを特徴とする、磁気共鳴信号の取得方法。
【請求項８】
天然存在比を超える割合で13Cを含むポリエチレングリコールのみからなる化合物の、
60秒以下の繰り返し時間で励起磁場のパルスを印加して磁気共鳴信号を連続的に取得するために用いられる磁気共鳴造影剤の製造のための使用。
【請求項９】
天然存在比を超える割合で13Cを含むポリエチレングリコールのみからなる化合物の、
60秒以下の繰り返し時間で励起磁場のパルスを印加して磁気共鳴信号を連続的に取得するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリエチレングリコールを利用した磁気共鳴造影剤、より詳細には、60秒以下（好ましくは１秒以下、更に好ましくは250ミリ秒以下、特に好ましくは100ミリ秒以下）の繰り返し時間で励起パルスを印加して磁気共鳴信号を連続的に取得するために使用される磁気共鳴造影剤に関する。更に、本発明は、前記磁気共鳴造影剤を使用した磁気共鳴信号の取得方法及び磁気共鳴撮像方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近の造影剤を利用した画像診断としては、陽電子又は放射線標識造影剤を用いた撮像技術（PET、SPECT等）や磁気共鳴現象を利用したMRI（magnetic resonance imaging）が実用化されている。PETやSPECTによる撮像技術では、病変部位の定量的な情報を得ることも不可能ではないが、その反面、放射能の半減期の問題があるため、造影剤を安定に保存することができないという欠点がある。また、放射性化合物は人体に悪影響を及ぼす危険があるという点も被験者にとっては望ましくない。これに対して、MRIは、安定同位体核を測定するため、人体にとっては安全な撮像技術であり、放射性同位体の不安定性から生じる上記欠点も排除できるという利点がある。このような理由から、MRIによる撮像技術は、今後益々その利用が拡大していくと考えられている。【０００３】
従来、MRIには、核磁気共鳴の対象核として1Hが一般的に使用されており、その造影剤として、ガドリニウム（Gd）の配位化合物であるGd造影剤、酸化鉄微粒子を利用した超常磁性酸化鉄コロイド製剤（SPIO）等が知られている。このような造影剤では、被験体内で周囲に存在する水分子の1Hの緩和時間を短縮させることにより、その存在を間接的に可視化するという原理を利用している。しかしながら、核磁気共鳴の対象核として1Hを利用するMRIでは、1Hによる磁気共鳴信号と造影剤濃度の線形性が完全ではないため、分子イメージング等において定量分析を可能にする画像の取得は困難であるという欠点がある。また、プロトン以外の核種では、プロトンとほぼ同感度の19F核がMRIによる分子イメージングへの応用を目指して研究されているが、フッ素原子含有化合物の合成の困難さ等が原因で、実用化までには至っていない。更に、酸化鉄やガドリニウムを利用した造影剤、或いはフッ素等の原子を利用した造影剤では、それらを使用するにあたり、ある程度の毒性も考慮しなければならない。【０００４】
一方、13Cを含む分子を被験体内に存在させて、13Cによる磁気共鳴信号を測定することによっても、MRIによる撮像が可能であり、13Cを含む分子をMRI用の造影剤として使用できることが分かっている。この13Cによる磁気共鳴信号は、1Hの場合に比べて、被験体内でのバックグランド値が低いため、定量的な評価に使用される画像の取得に有用であると考えられている。しかしながら、13Cによる磁気共鳴信号は、該分子の構造によって影響を受け易いという欠点がある。そのため、13Cによる磁気共鳴信号を増強するために単一分子に複数の13Cが導入されている場合、分子内の各13Cの化学シフトが分散して測定精度を下げるという問題点が生じることがある。また、抗体等の比較的分子量が大きいタンパク質に対して13Cを導入した分子を結合させると、13Cによる磁気共鳴信号が減弱されるという不具合が生じたりする場合もある。【０００５】
また、MRIによる撮像では、被験者の負担の軽減等のために、磁気共鳴画像を短時間で取得することが求められており、MRI用の造影剤にはT1緩和（縦緩和）時間が適度に短い分子の利用が有効であると考えられている。しかしながら、13Cを含む分子を利用した磁気共鳴信号の取得において、T1緩和時間はその分子構造等に大きく依存するので、如何なる構造の分子のT1緩和時間が短く、磁気共鳴画像を短時間で連続的に取得するのに有用であるかは分かっていないのが現状である。【０００６】
このような従来技術を背景として、安全性が高く、定量的な評価にも使用可能であり、しかも磁気共鳴信号を短時間で連続的に取得できる技術の開発が切望されていた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、安全性及び定量性を備えつつ、短い繰り返し時間で磁気共鳴信号を連続的に取得することができる造影剤、及びこれを用いた磁気共鳴信号の取得方法及び磁気共鳴撮像方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討したところ、天然存在比以上の割合で13Cを含むポリエチレングリコール、又は該ポリエチレングリコールで標識された化合物を含む造影剤を使用して、繰り返し時間を60秒以下（好ましくは１秒以下、更に好ましくは100ミリ秒以下）に設定して励起パルスを繰り返し印加し、13Cによる磁気共鳴信号を連続的に定量的に測定することができ、定量的な分析に使用可能な磁気共鳴画像を短時間で取得できることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて、更に改良を重ねることにより完成したものである。【０００９】
即ち、本発明は、下記に掲げる造影剤を提供する。
項１．  60秒以下の繰り返し時間で励起磁場のパルスを印加して磁気共鳴信号を連続的に取得し画像化するために使用される、
天然存在比以上の割合で13Cを含むポリエチレングリコール、又は該ポリエチレングリコールで標識された化合物を含有することを特徴とする、
磁気共鳴造影剤。
項２．  前記ポリエチレングリコールの13Cの割合が、全炭素原子の20〜100％である、項１に記載の磁気共鳴造影剤。
項３．  前記ポリエチレングリコールの重量平均分子量が470〜10000000である、項１に記載の磁気共鳴造影剤。
項４．  前記化合物が、天然存在比以上の割合で13Cを含むポリエチレングリコールで標識された抗体である、項１に記載の磁気共鳴造影剤。【００１０】
また、本発明は、下記に掲げる磁気共鳴撮像方法を提供する。
項５．  天然存在比以上の割合で13Cを含むポリエチレングリコール、又は該ポリエチレングリコールで標識された化合物を含有する磁気共鳴造影剤が投与された被験体に対して、60秒以下の繰り返し時間で励起磁場のパルスを印加することにより磁気共鳴信号を連続的に取得し画像化することを特徴とする、磁気共鳴撮像方法。
項６．  前記ポリエチレングリコールの13Cの割合が、全炭素原子の20〜100％である、項５に記載の磁気共鳴撮像方法。
項７．  前記ポリエチレングリコールの重量平均分子量が470〜10000000である、項５に記載の磁気共鳴撮像方法。
項８．  前記化合物が、天然存在比以上の割合で13Cを含むポリエチレングリコールで標識された抗体である、項５に記載の磁気共鳴撮像方法。【００１１】
更に、本発明は、下記に掲げる磁気共鳴信号の取得方法を提供する。
項９．  天然存在比以上の割合で13Cを含むポリエチレングリコール、又は該ポリエチレングリコールで標識された化合物を含有する磁気共鳴造影剤が投与された被験体に対して、60秒以下の繰り返し時間で励起磁場のパルスを印加することにより磁気共鳴信号を連続的に取得することを特徴とする、磁気共鳴信号の取得方法。
項１０．  前記ポリエチレングリコールの13Cの割合が、全炭素原子の20〜100％である、項９に記載の方法。
項１１．  前記ポリエチレングリコールの重量平均分子量が470〜10000000である、項９に記載の方法。
項１２．  前記化合物が、天然存在比以上の割合で13Cを含むポリエチレングリコールで標識された抗体である、項９に記載の方法。【００１２】
更に、本発明は、下記に掲げる天然存在比以上の割合で13Cを含むポリエチレングリコール、又は該ポリエチレングリコールで標識された化合物の使用を提供する。
項１３．  天然存在比以上の割合で13Cを含むポリエチレングリコール、又は該ポリエチレングリコールで標識された化合物の、
60秒以下の繰り返し時間で励起磁場のパルスを印加して磁気共鳴信号を連続的に取得し画像化するために用いられる磁気共鳴造影剤の製造のための使用。
項１４．  前記ポリエチレングリコールの13Cの割合が、全炭素原子の20〜100％である、項１３に記載の使用。
項１５．  前記ポリエチレングリコールの重量平均分子量が470〜10000000である、項１３に記載の使用。
項１６．  前記化合物が、天然存在比以上の割合で13Cを含むポリエチレングリコールで標識された抗体である、項１３に記載の使用。
項１７．  天然存在比以上の割合で13Cを含むポリエチレングリコール、又は該ポリエチレングリコールで標識された化合物の、60秒以下の繰り返し時間で励起磁場のパルスを印加して磁気共鳴信号を連続的に取得し画像化するための使用。
項１８．  前記ポリエチレングリコールの13Cの割合が、全炭素原子の20〜100％である、項１７に記載の使用。
項１９．  前記ポリエチレングリコールの重量平均分子量が470〜10000000である、項１７に記載の使用。
項２０．  前記化合物が、天然存在比以上の割合で13Cを含むポリエチレングリコールで標識された抗体である、項１７に記載の使用。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の造影剤によれば、繰り返し時間を60秒以下（好ましくは１秒以下、更に好ましくは250ミリ秒以下、特に好ましくは100ミリ秒以下）に設定して励起パルスを繰り返し印加しても精度の高い磁気共鳴信号を得られるので、高速で鮮明な磁気共鳴画像を取得するのに有用である。【００１４】
本発明の造影剤で使用されるポリエチレングリコールは、13Cを複数含有していても、各13Cの化学シフトが分散することなく一点に集中するので、精度の高い磁気共鳴信号の取得が可能になる。また、本発明の造影剤によれば、13Cによる磁気共鳴信号を利用するので、1Hの場合に比べて、被験体内でのバックグランド値が低く、定量的な評価が可能な画像を取得できる。【００１５】
更に、天然存在比以上の割合で13Cを含むポリエチレングリコールは、タンパク質等の高分子量の他の化合物に結合しても、その磁気共鳴信号に影響が殆どない。従って、本発明によれば、以下の(1)〜(4)に示す診断、判定、可視化等を短時間で実施することが可能になる。
(1)特定の病巣部位を特異的に認識する抗体に、上記ポリエチレングリコールを結合させ、これを造影剤として使用することにより、病巣部位の可視化による診断。
(2)特定の細胞を特異的に認識する抗体に、上記ポリエチレングリコールを結合させ、これを造影剤として使用することにより、当該細胞の体内動態の可視化。
(3)リポソーム製剤等のDDS製剤に、上記ポリエチレングリコール又はそれを結合させた化合物を含有させ、これを投与することにより、目的部位への製剤の集積度の判定。
(4)13Cを含むポリエチレングリコールを直接人体に投与して、それが特定の臓器や部位に一定時間蓄積させることにより、特定の臓器や部位の可視化。【００１６】
そして更に、本発明の造影剤では、13Cを使用しているので、PETやSPECT等で使用されている放射性化合物を含む造影剤に比べて、安全性が高いだけでなく、経時的にも安定であるので、時間的余裕を持って磁気共鳴撮像を行うことができるという利点もある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の造影剤は、天然存在比以上の割合で13Cを含むポリエチレングリコール（以下、「13C-PEG」と表記する）、又は該13C-PEGで標識された化合物を含有するものである。【００１８】
本発明に使用される13C-PEGは、天然存在比以上の割合（即ち、全炭素原子の内約１％以上）で、13Cを含むものであればよい。磁気共鳴信号の検出感度を高めるという観点から、全炭素原子の内13Cが占める割合が20〜100％、好ましくは50〜100％、更に好ましくは90〜100％、特に好ましくはほぼ100%のものが好適である。ポリエチレングリコールは、−CH2CH2O-の繰り返し構造からなり、全ての炭素原子の化学的環境が同一であるため、同一分子内に複数の13Cが含まれていても、各13Cの化学シフトが分散することなく、一点に集中するので、磁気共鳴信号が増強されて検出されるという利点がある。【００１９】
また、本発明に使用される13C-PEGの分子量としては、特に制限されるものではなく、13Cの含有割合等に基づいて適宜設定される。例えば、13Cの含有割合が低い場合には、13C-PEGの分子量が高いものが望ましく、また13Cの含有割合が高い場合には、13C-PEGの分子量が低いものであってもよい。本発明に使用される13C-PEGの一例として、重量平均分子量が、470〜10000000、好ましくは6000〜2000000のものが例示される。【００２０】
本発明では、上記13C-PEGをそのまま使用してもよいが、上記13C-PEGで標識された化合物（以下、「13C-PEG修飾化合物」と表記する）を使用することもできる。ここで、13C-PEG修飾化合物とは、13C-PEGが、そのまま又はリンカーとなる基を介して化合物に結合しているものである。このような13C-PEG修飾化合物において、13C-PEGの標識（結合）対象となる化合物としては、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体等の抗体；前記抗体のFabフラグメント；アルブミン、トランスフェリン等の血清タンパク質；インターフェロン、エルスロポエチン、インターロイキン、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、インシュリン、アディポカイン等の薬理活性タンパク質；EP-1873（Epix Pharma）、エバンスブルー、Congo red、thioflavin-S、(E,E)-1-bromo-2,5-bis(3-hydroxycarbonyl-4-hydroxy)styrylbenzene (BSB)、(E,E)-1-fluoro-2,5-bis(3-hydroxycarbonyl-4-hydroxy)styrylbenzene (FSB)等の低分子化合物；内部に薬剤を封入できるようなリポソームを構成する化合物等が挙げられる。例えば、特定の病巣部位（例えば、癌、動脈硬化、炎症等の部位、）に対して特異的に結合可能な抗体が結合している13C-PEG修飾化合物によれば、当該特定病巣部位を可視化することが可能になる。また、例えば、薬理活性タンパク質が結合している13C-PEG修飾化合物を使用すれば、治療目的部位への当該薬理活性タンパク質の集積度の判定が可能になる。【００２１】
上記13C-PEG修飾化合物は、上記13C-PEGと、標識対象となる化合物とを公知の方法で結合させることにより調製される。好適な例としては、標識対象となる化合物がアミノ基を有する場合（具体的には、抗体や薬理活性タンパク質の場合）であれば、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)で上記ポリエチレングリコールを活性エステル化し、標識対象となる化合物とアミド結合を形成させる方法が例示される。【００２２】
上記13C-PEG修飾化合物において、標識対象となる化合物に対して結合する上記13C-PEGの数としては、標識対象となる化合物の所望の活性が損なわれないことを限度として特に制限されない。例えば、上記13C-PEG修飾化合物は、標識対象となる化合物に対して、１つの13C-PEGが結合していてもよく、また２つ以上の13C-PEGが結合していてもよい。【００２３】
本発明の造影剤は、上記13C-PEG又は13C-PEG修飾化合物を、薬学的又は化学的に許容される溶媒、例えば、生理食塩水、等張リン酸緩衝液等に溶解して調製される。本発明の造影剤において、上記ポリエチレングリコール、又は13C-PEG修飾化合物の濃度は、画像形成方式、測定方式、測定部位等に応じて適宜設定することができる。一例として、本発明の造影剤の総量当たり、上記13C-PEG又は13C-PEG修飾化合物が、0.0001〜100重量％、好ましくは0.001〜50重量％、更に好ましくは0.01〜10重量％となる濃度が例示される。【００２４】
更に、本発明の造影剤は、上記成分の他に、可溶化剤、乳化剤、粘度調節剤、緩衝剤等の添加剤を適量含んでいてもよい。【００２５】
本発明の造影剤は、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射、経口投与、又はその他の方法によって被験者に投与される。本発明の造影剤の投与量は、上記13C-PEG又は13C-PEG修飾化合物の13Cの含有量、磁気共鳴画像の測定部位等に応じて適宜設定される。例えば、本発明の造影剤の投与量は、測定部位において、上記13C-PEG又は13C-PEG修飾化合物の13C原子の数が、１cm3あたり、1×10-12mol以上、好ましくは1×10-８mol以上、更に好ましくは1×10-６mol以上となるように設定するとよい。【００２６】
本発明の造影剤は、60秒以下の繰り返し時間で励起磁場（RF波）のパルスを印加することにより、磁気共鳴信号を連続的に取得するために使用される。ここで、繰り返し時間（time of repetition: TR）とは、ひとつのパルス系列に要する総時間のことをさす。すなわち、言い換えると、TRは積算測定においてひとつのパルス系列の最初から次のパルス系列の最初までの時間間隔のことを意味する。本発明の造影剤で使用される上記13C-PEG又は13C-PEG修飾化合物は、T1緩和時間が適度に短いという有利な点があるので、磁気共鳴画像の取得を、その繰り返し時間を上記のように短く設定して連続的に実施することができる。本発明の造影剤は、一層高速で連続的に磁気共鳴信号を取得するという観点から、繰り返し時間を好ましくは1秒以下、更に好ましくは250ミリ秒以下、特に好ましくは60〜100ミリ秒に設定することが可能である。このように本発明の造影剤は、繰り返し時間を短く設定でき、連続的に磁気共鳴信号を取得することができるので、高速画像化のための使用に好適である。【００２７】
本発明の造影剤を使用して取得された磁気共鳴信号は、診断等にそのまま利用することができる。また、当該磁気共鳴信号を画像化して磁気共鳴画像を取得し、これを各種診断に利用することもできる。【００２８】
本発明の造影剤を使用して磁気共鳴信号を取得する際の他の条件、例えば、励起磁場のパルスの持続時間、磁気共鳴信号の測定方法等については、磁気共鳴信号の取得において一般的に採用されている条件から適宜設定することができる。また、磁気共鳴信号の画像化方法については、磁気共鳴画像の取得において一般的に採用されている条件から適宜設定することができる。【００２９】
従って、本発明の造影剤は、公知の撮像方法、具体的には、ケミカルシフトイメージング法、プロトン検出13Cケミカルシフトイメージング法、ファストスピンエコー法、グラジエントエコー法等の撮像方法に適用することが可能である。
【実施例】
【００３０】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。なお、以下、表記「13C-PEG」の前に付する割合（％）は、その13C-PEGにおいて、全炭素原子当たりの13Cの割合を意味する。また、表記「13C-PEG」の後ろに付する数値は、その13C-PEGの分子量を意味する。【００３１】
実施例１
13C-PEGのNMRスペクトル特性を調べるために、以下の試験を行った。ほぼ全ての炭素原子が13Cである13C-PEG6000［以下、99％13C-PEG6000と表記する、Cambridge Isotope Laboratories, Inc（CIL社）より購入］を重水（D2O）に2.2 mg/mlの濃度に溶解し、これをサンプルとしてNMRスペクトルを測定した。また、天然存在比（１％）の13Cを有する13C-PEG6000（以下、1％13C-PEG6000と表記する）を重水（D2O）に22 mg/mlの濃度に溶解し、これをサンプルとしてNMRスペクトルを測定した。【００３２】
なお、NMRスペクトルの装置及び測定条件は、以下の通りである：
装置：高分解能NMR装置
コンソール：Varian Unity INOVA
磁石：Oxford 300 MHz
測定条件：観測周波数75 MHz、測定温度23℃、１パルス法（プロトンデカップリング）、待ち時間1秒、45°パルスで測定【００３３】
得られた結果を図１に示す。99％13C-PEG6000は高分子であるにもかかわらず、非常にシャープなNMRシグナルを示した（図１a参照）。また、99％13C-PEG6000では、全炭素原子が同一の化学的環境にあるため、ケミカルシフトが一点に集中し、強いシグナル強度となっていた。一方、99％13C-PEG6000の10倍高い濃度に設定されている1％13C-PEG6000は、99％13C-PEG6000のほぼ10分の1のシグナル強度を示したことから、13Cに基づくシグナル強度は、13Cの数に対応しており、極めて定量性が高いものであることが確認された。【００３４】
実施例２
99%13C-PEG6000を重水（D2O）溶媒に2.5mg/mlの濃度に溶解し、これをサンプルとして、以下の測定条件下で、パルス（90°パルス）照射、FID取得（1.3秒）に続く待ち時間（エコー収集終了後から次の励起までの時間；デットタイム；acquisition delay；dead time）の間隔を短縮したときのシグナル強度への影響を調べた。また、比較として、13C-ピルビン酸［sodium pyruvate (1-13C,99%)、CIL社］を重水に25mg/mlの濃度に溶解したもの、及び1位の炭素原子が13Ｃであるグルコース［D-Glucose (1-13C,99%)、CIL社製］（以下、13C-グルコースと表記する）を重水に2.2mg/mlの濃度に溶解したものを各々サンプルとして、同様に試験した。
装置：高分解能NMR装置
コンソール：Varian Unity INOVA
磁石：Oxford 300 MHz
測定条件：観測周波数75 MHz、測定温度23℃、１パルス法（プロトンデカップリング）、90°パルスで測定【００３５】
得られた結果を図２及び３に示す。図２aに示すように、13C-ピルビン酸では、待ち時間を60秒以下にすると急激にシグナル強度が減少した。これは、13C-ピルビン酸のT1緩和時間が非常に長いことに由来する（プロトンが直接結合していない炭素原子のT1緩和時間は長くなる）。それに対して、99%13C-PEG6000に関しては、図２b及び図３ｂに示すように、待ち時間間隔を20msec程度まで短くしても、シグナル強度の減少はほとんど観測されなかった。これは、99%13C-PEG6000のT1緩和時間がある程度短いことに由来すると考えられる。【００３６】
また、13C-グルコースに関しては、グルコースのα型、β型異性体の両炭素のシグナルが観測されているが、これらはいずれもプロトンと直接共有結合しているので、ピルビン酸の場合よりもこれらのT1時間は短くなる。従って、待ち時間間隔を短縮しても、ピルビン酸で観測されたような60秒以下での急激な減少はみられなかった。しかしながら、それでもなお、α型、β型の1位の炭素ともに待ち時間間隔の短縮に伴うシグナル強度の減少が確認された（図３ａ参照）。グルコースのα型、β型異性体の両炭素のシグナル強度の和は、待ち時間間隔200秒から20ミリ秒になった時にはシグナル強度が21％減少するのに対して、99%13C-PEG6000の場合は、シグナル強度減少は僅か3.9％であった。このことから、99%13C-PEG6000において、20ミリ秒まで待ち時間間隔を短縮してもシグナル強度が減じないという現象は、13C-PEG特有のT1緩和時間に由来するものと考えられる。【００３７】
実施例３
99%13C-PEG6000を重水（D2O）溶媒に2.5mg/mlの濃度に溶解し、これをサンプルとして、磁場強度７テスラのMRI装置を用い、以下の測定条件下で、繰り返し時間を60〜200ミリ秒でパルスを印加したときのシグナル強度への影響を調べた。また、比較として、13C-グルコースを重水に2.2mg/mlの濃度に溶解したものをサンプルとして、同様に試験した。
装置：MRI装置（磁場強度７テスラ）
コンソール：Varian Unity INOVA
磁石：JASTEC 7T
測定条件：観測周波数75 MHz、測定温度23℃、１パルス法（プロトンデカップリング）、40°パルスで測定【００３８】
得られた結果を図４に示す。図４から明らかなように、40°パルスで測定した場合は、グルコースのシグナルがパルス間隔200ミリ秒から100ミリ秒になると約30％減少するのに対して、99%13C-PEG6000の場合は100ミリ秒に短縮してもシグナル強度の減少は４％程度しか観測されなかった。以上の結果から、MRI装置においても、13C-PEG6000は繰り返し時間を短縮できるという特徴を利用できることがわかった。【００３９】
実施例４
1%13C-PEGの一方の末端の水酸基にNHSを結合させた1%13C-PEG5000NHS及び1%13C-PEG20000NHS（日本油脂社製）を用いて、IgGを標識した。標識反応後、ゲルろ過及びProteinAカラムによる精製処理に供することにより、未反応の1%13C-PEGを除去した（図５ａ参照）。図５ａに示すSDS-PAGEの像から明らかなように、高分子側にバンドが数本確認でき、実際に1%13C-PEGが共有結合でIgGに標識されていることが確認された。【００４０】
斯くして得られた1%13C-PEG5000標識IgGを重水に14.1 mg/mlの濃度に溶解したもの、及び1%13C-PEG20000標識IgGを重水に5.1 mg/mlの濃度に溶解したものを、各々サンプルとして、NMRスペクトルの測定を行った。なお、NMRスペクトルの装置及び測定条件は、以下の通りである：
装置：高分解能NMR装置
コンソール：Varian Unity INOVA
磁石：Oxford 300 MHz
測定条件：観測周波数75 MHz、測定温度23℃、１パルス法（プロトンデカップリング）、待ち時間1秒、45°パルスで測定【００４１】
得られた結果を図５ｂ及び図６に示す。図５ｂから明らかなうように、1%13C-PEG5000及び1%13C-PEG20000はIgGに結合しても、IgGに結合していない場合と同様、一点のケミカルシフトに集中した非常にシャープなシグナルを示すことが確認された。更に、図６から分かるように、1%13C-PEG5000において、シグナルの半値幅も、IgGに結合した影響は殆ど認められなかった。この結果から、IgGのような高分子タンパク質に結合したことによる、PEGのシグナル強度の減少やスペクトルのブロードニング等の不具合は起きないことが判明した。【００４２】
実施例５
PEGの分子量が大きくなった場合、NMRシグナルの強度、半値幅がどのように変化するかを天然存在比(1%)の13Cを有するPEGを用いて検討した。用いたPEGの平均分子量は35000、500000、2000000の3種類である。NMRスペクトルの測定は高分解能核磁気共鳴装置を用いて行った。なお、測定条件は以下の通りである。
装置：日本電子 JNM-ECA500
磁石：Oxford (11.7 Tesla, 500MHz)
測定条件
観測周波数：125 MHz
温度：25℃
観測幅：31 KHz
データポイント：32 K
パルスシークエンス：シングルパルスデカップリング
フリップアングル：45°
待ち時間：２秒
データ取り込み時間：１秒【００４３】
結果を図７に示す。いずれの分子量のPEGも濃度は0.5 mg/ml（溶媒はD2O）で、内部コントロールとして0.5 mMの13C-alanine（CIL社、カルボン酸の炭素が13Cとなっている。）を各サンプルに添加して測定を行った。13C-alanineのカルボン酸の炭素のシグナルが176.5 ppmの位置に観測され、PEGのシグナルはいずれの分子量のものも69.5 ppm近傍（分子量により0.1 ppm程度のずれはある）に観測された。どのPEGのシグナルも非常にシャープなシグナルであり、それぞれのPEGのNMRシグナルの半値幅を測定した結果、PEG35000、PEG500000、PEG2000000の半値幅はそれぞれ、2.99、3.03、3.25Hzであり、分子量が大きくなってもほとんど半値幅に変化は見られないという結果であった。また、各PEGのNMRシグナルの信号強度をシグナルの高さで評価した場合、13C-alanineのカルボン酸のシグナルを１とすると、どのPEGにおいてもシグナルの強度（ピークの高さ）は8〜10程度であり、同じ重量濃度のPEG溶液サンプルでは、分子量の違いでシグナル強度（ピークの高さ）に大きな違いはみられなかった（図７a、ｂ、ｃ）。つまり、PEG分子量が2000000程度に大きくなっても、分子内の炭素のNMRシグナル強度が減弱するようなことは全くないということがこの実験から判明した。各PEGの濃度をモル濃度に換算すると、PEG35000、PEG500000、PEG2000000のサンプルは、14.2 μM、1.0 μM、0.25 μMとなる。ここからPEG単一分子あたりのシグナルの高さを評価すると、13C-alanineを１とした場合、それぞれ、283、4000、19400という計算になり、PEGの分子量にほぼ比例して信号強度（ピークの高さ）が大きくなるという結果であった。以上の結果から、PEGのNMRシグナルの信号強度（ピークの高さ）は、溶液の粘性が問題にならない場合、PEGの分子量にほぼ比例して大きくなることが明らかになった。
実施例６
99%13C-PEG6000を33mg/mlとなるように純水(H2O)に溶解してサンプルとした。このサンプル0.1mlをラット(日本クレアより購入、雄のＳＤラット、14週齢)側頭筋に注入投与し、以下の条件でMRI画像を取得した。
装置：MRコンソール Varian Unity INOVA、磁石 JASTEC 7T
パルス系列：プロトンデカップルド13C 2D化学シフトイメージング（no slice selection）
位相エンコード：8×8
撮影視野(FOV)：50 ×50 mm2
繰り返し時間：1秒
マトリックス：32 × 32
積算測定回数：8回
全測定時間：8分32秒【００４４】
得られた結果を図８に示す。この結果から、99%13C-PEG6000によって、１秒という短い繰り返し時間でも、ラットの側頭筋を鮮明に画像化して可視化することができることが確認された。【００４５】
実施例７
99%13C-PEG6000を0.05mg/ml、0.5mg/ml又は5mg/mlとなるように生理食塩水に溶解して、それぞれの１mlを1cm角のキュベットに添加した。それぞれの99%13C-PEG6000を添加したキュベットについて、以下の条件でMRI画像を取得した。また、比較として、10重量％の13C-glucoseを含む生理食塩水、又は生理食塩水単独を使用して、同様にMRI画像の取得を行った。
装置：MRコンソール Varian Unity INOVA、磁石 JASTEC 7T
パルス系列：プロトンデカップルド13C 2D化学シフトイメージング（no slice slection）
位相エンコード：8×8
撮影視野(FOV)：50 ×50 mm2
マトリックス：32 × 32
繰り返し時間：250ミリ秒
積算測定回数：128回
全測定時間：34分【００４６】
得られた結果を図９に示す。図９から分かるように、1cm角のキュベットに入った5mg/mlと0.5mg/mlの99%13C-PEG6000は、十分なコントラストで可視化できた。一方、0.05 mg/mlの場合はかなりSN比（信号雑音比）の低下がみられたが、それでもなお、99%13C-PEG6000のキュベットの位置は十分に確認できる程度には可視化することができた。【００４７】
実施例８
99%13C-PEG6000の水溶液を用いて、いくつかの撮像方法でMRI画像を取得し、それらを比較した。具体的には、99%13C-PEG6000を30 mg/ml又は5 mg/mlとなるように純水（H2O）に溶解し、これらをそれぞれ１cm3のキュベットに充填して画像化を行った。撮像方法としては、13Cケミカルシフトイメージング（13C-CSI）、プロトン検出13Cケミカルシフトイメージング（1H-detected 13C-CSI）、13Cグラジエントエコー（13C-GRE）、13Cファストスピンエコー（13C-FSE）の4種類の撮像方法を用いた。それぞれの撮像は下記に示した条件で行った。
13C-CSI；マトリックス: 8 x 8, FOV: 50 ×50 mm2, 繰り返し時間: 1秒, 測定時間：128秒
1H-detected 13C-CSI; マトリックス: 8 x 8, FOV: 50 ×50 mm2, 繰り返し時間: 1秒, 測定時間：128秒
13C-GRE; マトリックス：64 x 64, FOV: 50 ×50 mm2, 繰り返し時間: 30ミリ秒, 測定時間：123秒, プロトンデカップリング
13C-FSE；マトリックス：32 x 32, FOV: 50 ×50 mm2, 繰り返し時間: １秒, echo train: 8, echo space： 5ミリ秒, centric acquisition, 測定時間：64秒、プロトンデカップリング【００４８】
結果を図１０に示す。図１０中、aには13Cケミカルシフトイメージング法（13C-CSI）で撮像した画像、bにはプロトン検出13Cケミカルシフトイメージング法（1H-detected 13C-CSI）で撮像した画像、ｃには13Cグラジエントエコー法（13C-GRE）で撮像した画像、及びｄには13Cファストスピンエコー法（13C-FSE）で撮像した画像を示す。図１０のａ〜ｄの画像には、上に99%13C-PEG6000の5 mg/ml溶液が充填されたキュベット、下に99%13C-PEG6000の30 mg/ml溶液が充填されたキュベットが配置されている。【００４９】
99%13C-PEG6000の5 mg/ml 又は30 mg/ml溶液が充填されたキュベットのいずれでも可視化されたが、今回のような短時間の撮像条件下では、30 mg/mlの方が明確に可視化できることが確認された。また、13C-CSI（図10 a）と１H-detected 13C-CSI(図10 b)を比較すると、どちらもSN比や解像度などに関しては大差はみられなかった。一方、13C-GRE及び13C-FSEで撮像した画像は、キュベットの正方形の形が明瞭に認識できた。また、本結果から、13C-GRE及び13C-FSEで測定することにより、13C-CSIや1H-detected 13C-CSIに比較して、同程度の積算時間又はより短時間の積算時間で、高解像度の画像が取得できることが確認された。以上のことより、13C-PEGを造影剤とした場合でも、13C-GREや13C-FSEなどを適切に応用すれば、より短時間で高解像度の画像が取得できる可能性があること示された。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】実施例１において測定した99%13C-PEG6000（2.2 mg/ml）と1%13C-PEG6000(22 mg/ml)の13C-NMRスペクトルを示す図である。
【図２】実施例２において測定した結果、即ち、13C-ピルビン酸及び99%13C-PEG6000の13C-NMRシグナル強度と待ち時間（Acquisition delay）の関係を示す図である。
【図３】実施例２において測定した結果、即ち、13C-グルコース及び99%13C-PEG6000の13C-NMRシグナル強度と待ち時間（Acquisition delay）の関係を示す図である。
【図４】実施例３において測定した結果、即ち、40°のパルスで、繰り返し時間を60〜960ミリ秒にした場合の13C-グルコース及び99%13C-PEG6000の13C-NMRシグナル強度を示す図である。
【図５】図５中、ａは、各精製工程で得られた1%13C-PEG20000標識IgGのSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）の写真である。ａにおいて、レーン左から、分子量マーカー、標識前IgG（図中、IgGと表記）、標識反応後ゲルろ過（Sephacryl S-200、Pharmacia）した1%13C-PEG20000標識IgG（図中、gelfiltと表記）、ゲルろ過したものをProteinAカラムでアフィニティー精製した1%13C-PEG20000標識IgG（図中、ProAと表記）を示す。また、図５中、ｂは、実施例４において、1%13C-PEG5000標識IgG及び1%13C-PEG20000標識IgGの13C-NMRスペクトルを測定した結果である。
【図６】99%13C-PEG6000と、1%13C-PEG5000標識IgGのシグナル半値幅の比較を示す図である。
【図７】実施例５で得られたNMRスペクトルを示す図である。aは1%13C-PEG35000 0.5 mg/ml（14.2 μM）のNMRスペクトルである。ｂは1%13C-PEG500000 0.5 mg/ml（1.0 μM）のNMRスペクトルである。ｃは1%13C-PEG2000000 0.5 mg/ml（0.25 μM）のNMRスペクトルである。
【図８】実施例６で得られたMRI画像を示す図である。図８中、aはプロトン画像；ｂは99%13C-PEG6000の13C-化学シフト画像、青で表示する；ｃは、ラットの側頭筋に内在する脂肪の13C-化学シフト画像、赤で表示する；ｄはプロトン画像の上に99%13C-PEG6000の13C-化学シフト画像、及び内在脂肪の13C-化学シフト画像を重ねて表示したもの；eはプロトン画像の上に99%13C-PEG6000の13C-化学シフト画像を重ねて表示したもの；ｆは、プロトン画像の上に内在脂肪の13C-化学シフト画像を重ねて表示したものを、それぞれ示す。
【図９】実施例７で得られたMRI画像を示す図である。aは5 mg/mlの99%13C-PEG6000の画像［上の写真：プロトン画像。左上のキュベットは10重量％ 13C-glucose、右上のキュベットは5mg/mlの13C-PEG6000、下のキュベットは生理食塩水が入っている。下の写真：13C-PEG6000のCSI画像］である。ｂは0.5 mg/mlの99%13C-PEG6000の画像［上の写真：プロトン画像。左のキュベットは生理食塩水、右のキュベットは0.5 mg/mlの13C-PEG6000が入っている。下の写真：13C-PEG6000のCSI画像］である。ｃは0.05 mg/mlの99%13C-PEG6000の画像［上の写真：プロトン画像。左のキュベットは生理食塩水、右のキュベットは0.05 mg/mlの99%13C-PEG6000が入っている。中段の写真：99%13C-PEG6000のCSI画像。下の写真：画像処理により中段の画像のノイズレベルをカットしたもの。0.05 mg/mlの99%13C-PEG6000の存在が明確に認識できる。］である。
【図１０】実施例８で得られたMRI画像を示す図である。図１０中、ａは13Cケミカルシフトイメージング法（13C-CSI）で撮像した画像；bはプロトン検出13Cケミカルシフトイメージング法（1H-detected 13C-CSI）で撮像した画像；ｃは13Cグラジエントエコー法（13C-GRE）で撮像した画像；及びｄは13Cファストスピンエコー法（13C-FSE）で撮像した画像を示す。なお、a-dの画像中、上には5 mg/mlの99%13C-PEG6000のキュベット、及び下には30 mg/mlの99%13C-PEG6000のキュベットが置かれ、2つのキュベットが縦に配置されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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