(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
供試核酸上の少なくとも１つの対象ドメインの存在を検出する方法であって、
ａ）対象ドメイン上の少なくとも３つの標的領域を予め決定し、各標的領域に対応する標識されたプローブ（対象ドメインのプローブのセットと呼ぶ）を設計および取得する工程であって、各セットのうちの少なくとも２つのプローブが同じ標識を担時する工程；
ｂ）工程ａ）で得られたプローブを供試核酸に結合させる工程;
ｃ）展開された供試核酸に結合されている標識された各プローブに対応するシグナルを検出する工程；
ｄ）シグナルを連続するコードに置き換える工程であって、該コードは、２つの連続するプローブのシグナル間の距離の読み取りの結果である工程；
ｅ）対象ドメインのコードの並びを検出する工程
を含んでなり、
対象ドメインのコードの並びが検出されれば、供試核酸上に対象ドメインが存在することを示し、逆に、対象ドメインのコードの並びが検出されなければ、供試核酸上に対象ドメインが存在しないことを示す、方法。
【請求項２】
対象ドメインの位置が、化学反応または生化学反応を位置決定するための参照として用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対象ドメインの位置が、標的領域を包含する核酸における物理的地図を確立するために用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
標的領域のプローブのいくつかが、核酸上付近に位置した少なくとも１つの他の対象ドメインのコードの並びの一部でもある、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
総てのプローブが、同じ標識で標識される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
プローブが、少なくとも２つに異なる標識で標識される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
対象ドメインのコードの並びが、一連のシグナルの結果である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
プローブが、少なくとも１ｋｂのオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
核酸の展開が、線状化によりなされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
核酸の線状化が、核酸上にプローブが結合する前または結合した後に行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
核酸の線状化が分子コーミングまたはファイバーFishによって行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
プローブセットがさらに２つのプローブを含み、２つのプローブの各プローブが対象ドメインの異なる末端に結合することができ、対象ドメインにおいてその連続するプローブと関連する前記２つのプローブの１つのシグナルを検出すること（開始部または終了部の末端プローブ対と呼ぶ）によって、読み取りの開始または終了に関する情報が得られ、読み取りの開始に関する情報と読み取りの終了に関する情報とが異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
読み取りの開始に関する情報が、開始部の末端プローブ対の２つの連続するプローブのシグナル間の距離の読み取りの結果である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
読み取りの終了に関する情報が、終了部の末端プローブ対の２つの連続するプローブのシグナル間の距離の読み取りの結果である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
読み取りの開始に関する情報が、開始部の末端プローブ対の２つの連続するプローブのシグナル間の距離の読み取りの結果であり、読み取りの終了に関する情報が終了部の末端プローブ対の２つの連続するプローブのシグナル間の距離の読み取りの結果であり、この距離が、開始と終了の情報を区別するために開始部の末端プローブ対と終了部の末端プローブ対では異なる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
プローブが蛍光標識で標識される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
プローブが放射性標識で標識される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも２セットの３つのプローブを含み、各プローブセットは１つのドメイン上に特異的に結合することができ、かつ、同じ標識を担持する少なくとも２つのプローブを含有し、核酸上での１セットの少なくとも３つのプローブの結合が、少なくとも２つの異なるコード群から選択される少なくとも２つのコードの並びを形成し、この群が総てのドメインで同一であり、このコードの並びが１つのドメインに特異的である、核酸上の少なくとも２つの対象ドメインの存在を検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、供試巨大分子上の少なくとも１つの対象ドメインの存在を検出する方法に関し、該方法は、
ａ）対象ドメイン上の少なくとも２つの標的領域を予め決定し、各標的領域の対応する標識プローブ（対象ドメインのプローブのセットと呼ぶ）を設計および取得し、これらのプローブのいずれかの、他のものに対する位置が選択され、供試巨大分子上の対象ドメインの特異的サインを形成する工程；
ｂ）工程ａ）で得られたプローブが結合されている供試巨大分子を展開（spreading）した後、線状化巨大分子に結合されているプローブのいずれかの、他のものに対する位置を検出し、対象ドメインのサイン（signature）が検出されれば、供試巨大分子上に対象ドメインが存在することを示し、逆に、対象ドメインのサインまたはサインの一部が検出されなければ、供試巨大分子上の対象ドメインまたはドメインの一部が存在しないことを示す工程
を含む。
【０００２】
より詳しくは、本発明は、少なくとも２セットの３つのプローブを含み、各プローブセットは１つのドメイン上に特異的に結合することができ、巨大分子上での１セットの少なくとも３つのプローブの結合が、少なくとも２つの異なるコード群（例えば、「ドット（dot）」と「ダッシュ（dash）」）から選択される少なくとも２つのコードの配列を形成し、この群が総てのドメインで同一であり、このコード配列が１つのドメインに特異的であり、そのドメインのサインである、巨大分子上の少なくとも２つの対象ドメインの存在を検出するためのキットに関する。
【背景】
【０００３】
巨大分子（macromolecule）、特に、生体巨大分子（より具体的には、ＤＮＡ）の研究は、「地図作成」のため、すなわち、ドメインの空間構成を研究するため、または巨大分子上の、反応または一連の化学反応もしくは生化学反応の位置決定のためには、多くの場合、正確にいくつかのドメインに印をつける必要がある。
【０００４】
ＤＮＡ配列の空間構成の観察を可能とする方法（Ｆｉｂｅｒ−ＦＩＳＨ、分子コーミングなど）は、多くの適用において、いくつかの領域に目印が付けられる、すなわち、何らかの検出技術によって特定の領域の同定が可能な方法でマークされる必要がある。取り組む主題がいくつかの領域の相対的位置である地図作成での適用、ならびにある（いくつかの）特定の遺伝子座において生体現象が研究される適用の場合がそうである。そして、ドメインは特異的マーカー、実際には一般に、対象配列（対象ドメインと呼ぶ）に相補的なＤＮＡのプローブにより同定することができる。これらのマーカーは例えば蛍光顕微鏡、オートラジオグラフィーなどによって検出することができる。
【０００５】
用いる検出技術が何であれ、目印を付ける常法は、検出を可能とするエレメント（蛍光色素、放射性元素など）に結合されたプローブ、すなわち、対象領域に相補的な配列の合成からなる。いくつかの領域を識別するために、主要な方法は、それらの長さまたは検出可能なエレメントの性質（一般に、色の異なる蛍光色素）などのそれらの固有の特性に基づいて識別可能なプローブを設計することである。この場合、プローブは、個別に検出される場合であっても同定可能である（それらは異なる性質のものである）ことから識別可能である。
【０００６】
このアプローチは、極めて多数の領域を識別するようになると、すぐにその限界に達し、プローブの長さは技術的制約となり、異なる検出可能なエレメントの数が制限される場合が多い。
【０００７】
実際、いくつかのドメインを同時に区別可能な方法でマークする必要のある場合が多い。区別可能なマーカーを開発する努力は基本的に、異なる「性質」の、すなわち、用いる検出方法によって個々に区別することができるマーカーを併用し、蛍光を用いた顕微鏡においてスペクトルの異なる蛍光色素を結びつけ、蛍光およびオートラジオグラフィーを用いた顕微鏡において異なるプローブ長を用いることからなる。これらのアプローチに伴う主要な制限は、このようにして得られた異なるマーカーの数が限定されることである。さらに、性質の異なるマーカーの同時検出は一般に、実施するには繊細で時間のかかる獲得方法を用いざるを得ない。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、供試巨大分子上の少なくとも１つの対象ドメインの存在および／または位置を検出する方法に関し、該方法は、
ａ）対象ドメイン上の少なくとも２つの標的領域を予め決定し、各標的領域の対応する標識プローブ（対象ドメインのプローブのセットと呼ぶ）を設計および取得し、これらのプローブのいずれかの、他のものに対する位置が選択され、供試巨大分子上の対象ドメインの特異的サインを形成する工程；
ｂ）工程ａ）で得られたプローブが結合されている供試巨大分子を展開した後、線状化巨大分子に結合されているプローブのいずれかの、他のものに対する位置を検出し、対象ドメインのサインが検出されれば、供試巨大分子上に対象ドメインが存在することを示し、逆に、対象ドメインのサインまたはサインの一部が検出されなければ、供試巨大分子上に対象ドメインまたはドメインの一部が存在しないことを示す工程
を含む。
【０００９】
一実施形態では、この巨大分子は核酸、特にＤＮＡ、より詳しくは、二本鎖ＤＮＡである。
さらなる実施形態では、プローブのセットは、さらに２つのプローブ（プローブ１またはプローブ２）を含み、各プローブは対象ドメインの異なる末端に結合可能であり、対象ドメインにおいてその連続プローブと関連する（開始部または終了部の末端プローブ結合と呼ぶ）該プローブ１またはプローブ２の一方のシグナル（signal）を読み取ることにより、読み取りの開始または終了に関する情報が得られる。
【００１０】
さらなる実施形態では、本発明は、少なくとも２セットの３つのプローブを含み、各プローブセットは１つのドメイン上に特異的に結合することができ、巨大分子上での１セットの少なくとも３つのプローブの結合が、少なくとも２つの異なるコード群（例えば、「ドット」および「ダッシュ」）から選択される少なくとも２つのコードの配列を形成し、この群が総てのドメインで同一であり、このコード配列が１つのドメインに特異的であり、そのドメインのサインである、巨大分子上の少なくとも２つの対象ドメインの存在を検出するためのキットに関する。
【詳細な説明】
【００１１】
本発明者らは今般、性質の異なる極めて少数のプローブを用いて、あるいはある単一の性質のプローブ用いても、事実上無限数の領域の識別が可能なプローブを設計するための新規なアプローチを発見した。このアプローチでは、目印は、各目印に独特な記号を一緒に作り出す数個のプローブからなり、それはコードの配列であり、１つのコードは連続する２つのプローブの読み取りによって得られる。このモチーフ（コード配列）はプローブの性質と位置を合わせたものであり得る。
【００１２】
本発明は、このアプローチの適用のいくつかの例を示し、その１つはある１つの遺伝子座における複製の研究に首尾よく使用された。この場合、プローブのある単一の性質が用いられた。また、性質の異なる極めて少数のプローブを用い、全染色体の大きさを解像度の高い領域でいかにマークできるかも示される（例えば、３つの性質のプローブは解像度４０ｋｂで６０Ｍｂをマーク可能である）。
【００１３】
我々の発明は、性質が１つだけであるが、各ドメインに関して単一の連続するプローブを形成する（各ドメインに関して単一のコード配列を形成する）ように対象ドメインにおいて空間的にレイアウトされたマーカーを用いることにより、異なる方法でドメインをマークすることからなる。この方法の可能性のある実施の１つは、ゲノムの一部のドメインによる文字（コード）を用いることにより、モールスコード（Morse code）を採用することからなるので、本発明者らはコードネームを遺伝子モールス（Genetic Morse）とし、モールスコードの「ドット」と「ダッシュ」をそれぞれ短い、または長い間隔で隔てられたマーカーに置き換える。
【００１４】
あるドメインの特定のコード配列の開始部と終了部を一義的に位置決定することが必要であるか、またはより有効である場合がある。この位置は例えばマーカーの「ダブレット（doublet）」（開始部と終了部の末端プローブ対、これらのプローブは、マーカー（標識）、すなわち、あるドメインの特定のコード配列の中で用いられる総てのものより短い間隔で隔てられている２つのマーカーで標識される）を用いてコード配列の開始部と終了部をマークすることにより得ることができる。コード配列の開始部と終了部をマークする「ダブレット」における短い間隔は長さの異なるものであってよく、コード配列の配向が可能となる。
【００１５】
一般的な方法では、本発明者らの方法は、空間的にレイアウトされた、性質が１つだけのある数のマーカーからなる目印の巨大分子に、各目印に特異的なコードの配列を形成するように区切りを入れることからなり、これらのマーカーは検討される巨大分子に直接関連するものである。
【００１６】
これらのマーカーが総て同じである場合、これらのマーカーの検出の多くの様式が可能である（オートラジオグラフィー、シンチレーション、蛍光、化学発光など）。実際には無限数の、それぞれあるドメインに特異的なコードの配列を得ることができ、唯一の制限は使用する方法の空間的解像度とマーカーの特定の配置の緯度である。
【００１７】
明らかに、本発明によれば、性質の異なるマーカーが使用可能であれば、制限される数においても、これらの異なるマーカーの組合せによりコード配列を得ることができる。従って、目印のコード化の可能性はいっそう多い。
【００１８】
本願の実施例１は、これらの目印により境界が定められた正確な遺伝子座における生物現象（実際には、ＤＮＡ複製）の研究に関する。１．５Ｍｂのドメインは、モールスコードから直接示唆された４つのコード配列を用いてマークされている。これら４つのコード配列のそれぞれは、性質が１つだけ（１つだけの蛍光色素および同じ長さ）の、可変数の５または７プローブからなり、可変様式で間隔を置いた、蛍光により検出される（図５ａ）。対象ドメインの各開始部は、別個の「開始部末端プローブ対」によりマークされ、この対の各プローブは１７ｋｂの間隔があり、それぞれ対象ドメインの終了部は「終了部末端プローブ対」によりマークされ、この対の各プローブは６ｋｂの間隔がある。これらのコードはモールスコードの最初の４文字に相当し、ドットは短い距離（およそ２５〜３０ｋｂ）離れたプローブからなり、ダッシュは長い距離（５５〜７０ＫＢ）離れたプローブからなる。
【００１９】
また、規則的に間隔を置いた、２つの異なる性質のマーカーを用いることで、モールスコードに従いつつ、ビーコン（beacon）をコードすることもできる（図５ｂ）。例えば、蛍光では、モールスの「ドット」に特定の色が与え、「ダッシュ」に別の特定の色を与えることができる。この方法はより「小型（compact）」であるという利点を有し、すなわち、形成するコード配列全体が全体としてより短い配列中に含まれ、これが有利となり得る。
【００２０】
前記の場合と同様に、あるドメインに特異的なコードの配列の開始部と終了部をマークすることが望ましい場合がある。それぞれ異なる色でマークされた２つのプローブのダブレット（または対）が使用でき、これらは体系的に同じ方向に向かせることができる。そして、このダブレットはそのコード配列の読み取りの方向を示す。
【００２１】
また、これまでに記載した２つのシステムを組み合わせることもでき（図５ｃ）、「ドット」は、短いスペースで隔てられた同じ色の２つのプローブからなり、「ダッシュ」は、長いスペースで隔てられた、異なる色の２つのプローブからなる。この２つのコードシステムにより、より強固となる。
【００２２】
特に本発明の地図作成適用、例えば分子診断では、配列の変動が予測され、そのような変動はプローブにより形成されるコード配列を改変し、改変されたプローブ間が無くなったり、繰り返されたり、スペースができたりする可能性がある。コード配列の１つがこのように改変されれば、コードシステムを１つだけ用いる場合、良い場合には、そのコード配列を解説することができなくなり、悪い場合では、別のものとの混同が起こるおそれがある。２つの冗長システムを用いる場合には、別のコード配列との混同が起こるおそれがなくなり、良い場合には、コード配列を同定することができ、配列変動が明らかに定義できる（図６）。
【００２３】
本発明に記載されるプローブ設計のアプローチの利点の１つは、少数の異なる「色」の標識で極めて多数のプローブを作出できることである。
【００２４】
この特徴を強調するいくつかの実施を記載する。本発明に従い、３色だけを用いて作出した７つのプローブを用い、均一な長さおよび間隔のプローブで、２１８７（＝３７）の異なるコードを作出することができる。さらに、これら２１８７のコードを、１つのコードをなす最後の６つのプローブが次のコードの最初の６つのプローブに相当するような順序に並べることができる。
【００２５】
これらのコードを重ね合わせると、７つの連続するプローブが、独特なコード、よってこれらのプローブが位置している配列上の独特な部位、従って、巨大分子上の特定の対象ドメインを定義する２１９３の一連のプローブを得ることができる。
【００２６】
よって、例えば、５０ｋｂごとにプローブを配置しつつ、１００Ｍｂを超えるものを作出することができる（例えば、３色のカラーまたは擬似カラーで５ｋｂプローブ）。少なくとも７プローブ（従って、４００ｋｂを超える総てのフラグメント）を検出可能な各ＤＮＡフラグメントの元の位置（１００Ｍｂ−配列における位置）が明らかに同定される。図７の配列は３色のプローブに対応するＡ、ＢおよびＣの３文字、総数２１９３文字からなり、各連続７文字は１回である。
【００２７】
この実施の利点は、一方で、それがプローブの数と利用可能なフラグメント（すなわち、全配列において明白な方法で記録可能なもの）の解像度と割合の間の関係を至適化することであり、他方で、この実施が容易に自動化でき、これら一連のプローブがデータ処理によって容易に発見できることである。
【００２８】
対称配列のフラグメントの配向の問題に伴う解決策は、対称性とは無関係に上記の連続プローブに「一定の方向を向いた」プローブを周期的（例えば、７プローブごと）に導入することである。例えば、７プローブごとに、プローブの「色」とその配向を同時に与えるダブレットに置き換えることができる。ダブレットは２つの密に置かれたプローブからなる。よって、「Ａ」を「ＡＢ」ダブレットに「Ｂ」を「ＢＣ」ダブレットに、「Ｃ」を「ＣＡ」ダブレットに置き換えることができる。
【００２９】
本発明によって有利な多くの利点がある。実際に、先行技術では、これまでの開発努力は異なる検出可能なエレメントの数を掛け合わせることからなった。特に、これにより主要な検出法として蛍光検出を使用することになるが、それはプローブにタグ付けするために多くの異なる色を使用できるのは蛍光だけであるからである。これに関し、限定されたカラーセットを用いることで、獲得時間および分析時間を著しく軽減することができる。さらに、１つのみ、または２つの異なる検出可能なエレメントを保有することができれば、はるかに迅速かつより容易に自動化可能な検出技術が使用可能となる。最後に、蛍光検出であっても、プローブの異なる、潜在的性質の数にはなお限界があるが、本発明者らの方法は事実上無限数の目印を作出することができる。
【００３０】
結果として、一態様において、本発明は、供試巨大分子上の少なくとも１つの対象ドメインの存在および／または位置を検出する方法に関し、該方法は、
ａ）対象ドメイン上の少なくとも２つの標的領域を予め決定し、各標的領域の対応する標識プローブ（対象ドメインのプローブのセットと呼ぶ）を設計および取得し、これらのプローブのいずれかの、他のものに対する位置が選択され、供試巨大分子上の対象ドメインの特異的サインを形成する工程；
ｂ）工程ａ）で得られたプローブが結合されている供試巨大分子を展開した後、線状化巨大分子に結合されているプローブのいずれかの、他のものに対する位置を検出し、対象ドメインのサインが検出されれば、供試巨大分子上に対象ドメインが存在することを示し、逆に、対象ドメインのサインまたはサインの一部が検出されなければ、供試巨大分子上に対象ドメインまたはドメインの一部が存在しないことを示す工程
を含む。
【００３１】
これらのプローブのいずれかの、他のものに対する位置は、供試巨大分子上の対象ドメインの特異的サインを形成するように任意に、かつ特異的に選択される。
【００３２】
任意にとは、本発明によれば、当業者が、いずれの条件、特にドメイン配列に依存せずに対象ドメイン上のプローブの位置を選択することができることを意味する。
【００３３】
特異的にとは、本発明によれば、当業者が、巨大分子上のその有無の決定を可能とする対象ドメインの特異的サインを形成するように、対象ドメイン上のプローブの位置を選択することができることを意味する。このサインは当業者により選択され、唯一の条件は異なる対象ドメインに対して異なるサインを与えることである。
【００３４】
２つの連続するシグナル間の間隔（またはギャップ）は、例えば顕微鏡またはオートラジオグラフィーが用いられる場合には直接的測定、または検出方法に応じて他の好適ないずれかの方法により測定される。
【００３５】
一実施形態では、対象ドメインの存在の検出は部分的サインの検出であってもよく、例えば、１以上のプローブが存在しないか、または誤った位置に結合している場合（例えば、対象ドメイン上のその連続するプローブとともにより長い、またはより小さい間隔がある場合）には、この部分的サインは巨大分子上の対象ドメインの改変の指標となる。巨大分子がＤＮＡである場合、この改変は、巨大分子上の対象ドメインの１個または数個のヌクレオチドの欠失、挿入または置換などの突然変異であり得る。
【００３６】
一実施形態では、本方法は好ましくは、少なくとも２つの対象ドメイン存在および／または位置を決定するためのものであり、工程ａ）において対象ドメイン上の少なくとも３つの標的領域を予め決定することを含む。
【００３７】
一実施形態では、本発明の対象ドメインのサインは、連続するプローブ間の一連の間隔（spacing）から生じるものである。
【００３８】
一実施形態では、本発明の対象ドメインの位置は、化学反応または生化学反応を位置決定するための参照として用いられる。
【００３９】
一実施形態では、本発明の対象ドメインの位置は、標的領域を包含する巨大分子において物理的地図を確立するために用いられる。
【００４０】
一実施形態では、本発明の対象ドメインのサインは、一連の異なる標識プローブからなる。
【００４１】
一実施形態では、本発明の標的領域のプローブのいくつかは、巨大分子上の付近に位置する少なくとも１つの他の対象ドメインのサインの一部でもある。
【００４２】
一実施形態では、巨大分子は核酸、タンパク質、ポリマーまたは炭水化物である。特に、巨大分子はＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ、より詳しくは、分子コーミングの場合の二本鎖ＤＮＡがＤＮＡの線状化に用いられる。
【００４３】
本明細書では互換的に用いられるが、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「ポリヌクレオチド」とは、一本鎖型または二本鎖型のいずれかの１を超えるヌクレオチドのＲＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を含む。
【００４４】
本明細書において、「核酸」および「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）ならびにヌクレオチド類似体を用いて作製されたＤＮＡまたはＲＮＡの類似体を含むものとする。核酸分子は一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。本明細書を通じ、「ヌクレオチド配列」という表現は、ポリヌクレオチドまたは核酸を等しく表すために用い得る。より厳密には、「ヌクレオチド配列」という表現は核酸材料それ自体を包含し、よって、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ分子を生化学的に特徴付ける配列情報（すなわち、４つの塩基文字から選択される連続する文字）に限定されない。また、本明細書では、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は互換的に用いられる。
【００４５】
巨大分子が一本鎖ＤＮＡであり、プローブがオリゴヌクレオチドである場合、「結合する」とは「ハイブリダイズすること」を意味する。
【００４６】
本明細書において、「ハイブリダイゼーション」、「とハイブリダイズする」または「ハイブリダイズしている」とは、中ストリンジェントまたは高ストリンジェントのハイブリダイゼーション条件、好ましくは、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件が互いに少なくとも６０％相同なヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズされたままとなる場合を表すものとする。
【００４７】
好ましくは、これらの条件は、互いに少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、いっそうより好ましくは少なくとも約８５％、９０％、９５％または９８％相同な配列が互いにハイブリダイズされたままとなるようなものである。ストリンジェント条件は当業者に公知であり、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に見出せる。
【００４８】
好ましい配列と最適に整列した後、少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％および９８％の同一性％を有する核酸配列とは、参照核酸配列に対して、特に欠失、末端切断、延長、キメラ融合および／または置換、特に点置換などのある特定の修飾を有する核酸配列を示すものとする。それは好ましくは、配列が参照配列と同じアミノ酸配列をコードする場合の配列（これは遺伝コードの縮重に関連する）、または好ましくは特に以下に定義されるものなどの高ストリンジェント条件下で、参照配列と特異的にハイブリダイズし得る相補的配列に関する。
【００４９】
高ストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションは、温度条件およびイオン強度条件が相補的ＤＮＡの２つのフラグメント間でハイブリダイゼーションの維持が可能なように選択されることを意味する。例として、上記のポリヌクレオチド断片を定義することを目的とするハイブリダイゼーション工程の高ストリンジェンシーは有利には次の通りである。
【００５０】
ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションは２工程で行われる：（１）４２℃、３時間、５×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ＋０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム溶液に相当する）、５０％のホルムアミド、７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０×デンハート溶液、５％の硫酸デキストランおよび１％のサケ精子ＤＮＡを含有するリン酸バッファー（２０ｍＭ、ｐＨ７．５）中でのプレハイブリダイゼーション；（２）プローブサイズに応じた温度（すなわち、プローブサイズ＞１００ヌクレオチドの場合は４２℃）で２０時間、実際のハイブリダイゼーションの後、２０℃で２０分、２×ＳＳＣ＋２％のＳＤＳ中での洗浄２回、２０℃で２０分、０．１×ＳＳＣ＋０．１％のＳＤＳ中での洗浄１回。最後の洗浄は、０．１×ＳＳＣ＋０．１％のＳＤＳ中、プローブサイズ＞１００ヌクレオチドの場合には６０℃で３０分行う。当業者であれば、Sambrook et al., (1989, Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor)の教示に従い、所定サイズのポリヌクレオチドに関して上記された高ストリンジェントのハイブリダイゼーション条件を、より大きな、またはより小さなサイズのオリゴヌクレオチドにも適合させることができる。
【００５１】
一実施形態では、これらのプローブは、少なくとも１５ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１Ｋｂ、より好ましくは１〜１０ｋｂの間、いっそうより好ましくは４〜１０ｋｂの間のオリゴヌクレオチドである。
【００５２】
コーミングしたＤＮＡ（combed DNA）上での最大解像度が１〜４ｋｂであることから、本発明のプローブは好ましくは少なくとも４ｋｂである。
【００５３】
一実施形態では、巨大分子の線状化は、巨大分子上にプローブが結合する前または結合した後に行われる。
【００５４】
一実施形態では、巨大分子の線状化は分子コーミングまたはファイバーFishによって行われる。
【００５５】
分子コーミングは公表されている方法に従って行う(Lebofsky and Bensimon, 2005)。分子コーミング技術を用い、大きなゲノム領域におよぶ単一ゲノムの物理的特性決定が可能である。単一のコームＤＮＡ分子のアレイは、後退エア−ウォーターメニスカスにより、シラン化ガラス面にそれらの末端で結合した分子を延長することにより作製される。コームＤＮＡ上で蛍光ハイブリダイゼーションを行うことにより、ゲノムプローブの位置を直接可視化することができ、物理的地図を構成するため、例えば、微小再配列を検出するための手段を提供する。単一分子ＤＮＡ複製もまた、コームＤＮＡ分子上に組み込まれたヌクレオチド類似体の蛍光検出によりモニタリングすることができる。
【００５６】
ＦＩＳＨ（蛍光in situハイブリダイゼーション）は、染色体上のＤＮＡ配列を検出および位置決定するために使用可能な細胞遺伝学的技術である。それは、それらの染色体部分だけに結合する蛍光プローブを用い、それをもって高い配列類似性を示す。蛍光顕微鏡により、蛍光プローブが染色体に結合している場所を見つけることができる。
【００５７】
ＦＩＳＨ法では、まず、プローブを構築する。プローブはその標的と（ゲノム内の類似の配列とではなく）特異的にハイブリダイズするのに十分長くなければならないが、ハイブリダイゼーション法を妨げるほど大きくてはならず、蛍光団、抗体に対する標的またはビオチンで直接タグ付けすべきである。これは例えばニックトランスレーションおよびタグ付きヌクレオチドを用いたＰＣＲなどの種々の方法で行うことができる。その後、染色体調製を行う。染色体は基板、通常はガラスに固定する。作製後、このプローブを染色体ＤＮＡに適用し、ハイブリダイズを開始する。数回の洗浄工程で、ハイブリダイズしていないか、または部分的にしかハイブリダイズしていないプローブは総て洗い流される。シグナル増幅が顕微鏡の検出閾値を超える必要がある場合には（プローブの標識効率、プローブの種類および蛍光色素などの多くの因子によって異なる）、蛍光タグ抗体またはストレプトアビジンをタグ分子と結合させて蛍光を増幅する。最後に、このサンプルは漂白防止剤に包埋し、蛍光顕微鏡で観察する。
【００５８】
ファイバーFishでは、間期染色体を、従来のＦＩＳＨの場合のように強固に巻きつける、あるいは間期ＦＩＳＨの場合のようにランダムコンフォメーションを採用するのではなく、直線上に引き延ばすような方法でスライドに付着させる。これは、スライドに固定した後に溶解させた細胞か、精製されたＤＮＡの溶液のいずれかにスライドの長さに添って機械的剪断をかけることで行われる。これらの染色体の延長コンフォメーションは、数キロベースに引き下がったとしても、劇的に高い解像度をもたらす。しかし、ファイバーFishサンプルの調製は、概念的に単純ではあるが、むしろ熟練技術であり、専門の研究室だけが慣例的にその使用が可能であることを意味する。
【００５９】
ファイバーFish法のプロトコールは上記されている。
【００６０】
器具および試薬：
・リンパ芽球状細胞培養
・ＰＢＳ
・血球計算板
・溶解溶液
・５部の７０ｍＭ  ＮａＯＨ、２部の無水エタノール(Fidlerova et al. 1994)。この溶液は室温で数ヶ月保存可能である。
【００６１】
方法
・健全な培養物から細胞懸濁液１〜２ｍｌを採取する。
・５ｍｌ  ＰＢＳで２回洗浄する。
・１ｍｌ  ＰＢＳに再懸濁させる。
・血球計算板を用いて細胞のアリコートを計数する。
・細胞を追加のＰＢＳで希釈し、終濃度をおよそ２×１０６／ｍｌとする。
・１０μｌの細胞懸濁液を清浄な顕微鏡スライドの上部に１ｃｍの面積に広げる。
・風乾する。
・スライドをプラスチック製のCadenza(Shandon Southern)チャンバーおよびクランプにほぼ垂直の位置に取り付ける。
・このcadenzaの上に１５０μｌの溶解溶液を適用する。
・レベルがスライドのつや消しのエッジより下に下がれば、２００μｌのエタノールを加える。
・軽く排水する。
・エッジを持って、スライドとcadenzaユニットをクランプの外へ注意深く持ち上げる。
・cadenzaからスライドの背面の上部を抜き、メニスカスをスライドの下へ移動させる。
・アングルで風乾させる。
・アセトン中で１０分固定する。スライドは室温で数ヶ月、問題なく保存することができる。
【００６２】
一実施形態では、総てのプローブは同じ標識で標識される。
【００６３】
一実施形態では、プローブは少なくとも２つに異なる標識で標識される。一実施形態では、プローブは３つの標識で標識される。
【００６４】
一実施形態では、結合またはハイブリダイズしたプローブは、プローブと結合している１以上の標識を検出することにより検出される。これらの標識は当業者に周知のいくつかの手段のいずれによって組み込んでもよい。しかしながら、好ましい実施形態では、標識は、プローブ調製時の増幅工程中に同時に組み込まれる。例えば、標識プライマーまたは標識ヌクレオチドを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、標識された増幅産物が得られる。プローブ（例えばＤＮＡ）は標識デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の存在下で増幅される。
【００６５】
好ましい実施形態では、標識ヌクレオチド（例えば、蛍光標識ＵＴＰおよび／またはＣＴＰ）を用いた上記のような転写増幅が転写された核酸に標識を組み込む。
【００６６】
あるいは、標識は、ものとプローブ（例えば、ｍＲＮＡ、ポリＡ  ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡなど）または増幅が完了した後の増幅産物に直接加えてもよい。このような標識により、高収量の増幅産物が得られ、増幅反応に必要な時間が短縮される。プローブに標識を付着させる手段としては、例えば、ニックトランスレーションまたは核酸のキナーゼ処理の後に標識（例えば蛍光団）にプローブを結びつける核酸リンカーを付着（連結）させることによる末端標識（例えば、標識ＲＮＡを用いる）が挙げられる。
【００６７】
好ましくは、本発明の標識ヌクレオチドは、クロロデオキシウリジン（ＣＩｄＵ）、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）および／またはヨードデオキシウリジン（ＩｄＵ）である。
【００６８】
本発明に用いるのに好適な検出可能な標識としては、顕微鏡的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段または化学的手段によって検出可能ないずれの組成物も含む。本発明において有用な標識としては、標識ストレプトアビジンコンジュゲートで染色するためのビオチン、磁性ビーズ（例えば、Dynabeads（商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など。例えば、Molecular Probes, Eugene, Oreg., USA参照)、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３２Ｐ）、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼおよびその他ＥＬＩＳＡに慣用されるもの）、ならびに金コロイド（例えば、直径４０〜８０ｎｍ範囲の、高効率で緑色光を発する金粒子）またはカラーガラスもしくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズのような比色定量標識が挙げられる。このような標識の使用を教示する特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９３９，３５０号、同第３，９９６，３４５号、同第４，２７７，４３７号、同第４，２７５，１４９号および同第４，３６６，２４１号がある。
【００６９】
蛍光標識は、低いバックグラウンドで極めて強いシグナルを提供するので好ましい。また、迅速走査法によって高い解像度および感度で光学的に検出することもできる。
【００７０】
プローブは総て、単一の標識、例えば単一の蛍光標識で標識することができる。あるいは、別の実施形態では、異なるプローブを、各プローブが異なる標識を有するように同時にハイブリダイズさせることもできる。例えば、ある標的は緑色蛍光標識を有し、別の標的が赤色蛍光標識を有してもよい。走査工程は緑色蛍光標識の結合部位から赤色標識の結合部位を識別する。各プローブ（標的核酸）は互いに独立に分析することができる。
【００７１】
使用可能な好適な色素原としては、色が観察できるように識別的な波長域の光を吸収するか、あるいはまた例えば蛍光剤など、特定の波長または波長域の放射線を照射した際に発光する分子および化合物が挙げられる。
【００７２】
広範囲の好適な色素が利用可能であり、基本的に、それらの周囲による吸収が最小で強い色をもたらすように選択される。例示的な色素種としては、キノリン色素、トリアリールメタン色素、アクリジン色素、アリザリン色素、フタレイン、昆虫色素、アゾ色素、アントラキノイド色素、シアニン色素、フェンアザチオニウム色素およびフェンアゾキソニウム色素が挙げられる。
【００７３】
広範な蛍光剤が単独、あるいはまた消光分子と組み合わせて使用可能である。対象蛍光剤はある主要な官能基を有する多様なカテゴリーに分類される。これらの主要な官能基としては、１−および２−アミノナフタレン、ｐ，ｐ’−ジアミノスチルベン、ピレン、第四級フェナントリジン塩、９−アミノアクリジン、ｐ，ｐ’−ジアミノベンゾフェノンイミン、アントラセン、オキサカルボシアニン、マロシアニン、３−アミノエキレニン、ペリレン、ビスベンズオキサゾール、ビス−ｐ−オキサゾリルベンゼン、１，２−ベンゾフェナジン、レチノール、ビス−３−アミノピリジニウム塩、ヘレブリゲニン、テトラサイクリン、ステロフェノール、ベンズイミダゾリルフェニルアミン、２−オキソ−３−クロメン、インドール、キサンテン、７−ヒドロキシクマリン、フェノキサジン、サリチレート、ストロファンチジン、ポルフィリン、トリアリールメタンおよびフラビンが挙げられる。
【００７４】
連結のための官能基を有するか、またはこのような官能基を組み込むよう修飾可能な個々の蛍光化合物としては、例えば、塩化ダンシル；３，６−ジヒドロキシ−９−フェニルキサントヒドロールなどのフルオレセイン；ローダミンイソチオシアネート；Ｎ−フェニル１−アミノ−８−スルホナトナフタレン；Ｎ−フェニル２−アミノ−６−スルホナトナフタレン：４−アセトアミド−４−イソチオシアナト−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；ピレン−３−スルホン酸；２−トルイジノナフタレン−６−スルホン酸；Ｎ−フェニル、Ｎ−メチル２−アミノナフタレン(aminoaphthalene)−６−スルホン酸；臭化エチジウム；ステブリン；オーラミン(auromine)−０，２−（９’−アンスロイル）パルミチン酸；ダンシルホスファチジルエタノールアミン；Ｎ，Ｎ’−ジオクタデシルオキサカルボシアニン；Ｎ，Ｎ’−ジヘキシルオキサカルボシアニン；メロシアニン、４（３’ピレニル）酪酸；ｄ−３−アミノデソキシ−エキレニン；１２−（９’−アンスロイル）ステアリン酸；２−メチルアントラセン；９−ビニルアントラセン；２，２’（ビニレン−ｐ−フェニレン）ビスベンゾオキサゾール；ｐ−ビス[２−（４−メチル−５−フェニルオキサゾリル）]ベンゼン；６−ジメチルアミノ−１，２−ベンゾフェナジン；レチノール；ビス（３’−アミノピリジニウム）−１，１０−デカンジイルジヨージド；ヘリブリエニンのスルホナフチルヒドラゾン；クロロテトラサイクリン；Ｎ（７−ジメチルアミノ−４−メチル−２−オキソ−３−クロメニル）マレイミド；Ｎ−[ｐ−（２−ベンズイミダゾリル）−フェニル]マレイミド；Ｎ−（４−フルオランチル)マレイミド；ビス（ホモバニリン酸）；レサザリン；４−クロロ−７−ニトロ−２，１，３ベンゾオキサジアゾール；メロシアニン５４０；レゾルフィン；ローズベンガル；および２，４−ジフェニル−３（２Ｈ）−フラノンが挙げられる。
特に、本発明の蛍光標識は、１−クロロ−９，１０−ビス（フェニルエチニル）アントラセン、５，１２−ビス（フェニルエチニル）ナフタセン、９，１０−ビス（フェニルエチニル）アントラセン、アクリジンオレンジ、オーラミンＯ、ベンズアントロン、クマリン、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、臭化エチジウム、フルオレセイン、緑色蛍光タンパク質、ヘキストステイン(Hoechst stain)、インディアンイエロー、ルシフェリン、フィコビリン、フィコエリトリン、ローダミン、ルブレン、スチルベン、ＴＳＱ、テキサスレッドおよびウンベリフェロンである。
【００７５】
望ましくは、蛍光剤は約３００ｎｍ、好ましくは約３５０ｎｍより上、より好ましくは約４００ｎｍより上の光を吸収すべきであり、通常には、吸収される光の波長の約１０ｎｍを超える高い波長で発光する。結合色素の吸収および発光特性は結合していない色素とは異なることに注意すべきである。よって、種々の波長範囲および色素の特徴に対して言及する場合、コンジュゲートされておらず、任意の溶媒中で特徴付けられる色素ではなく、使用されるような色素を示すものとする。
【００７６】
蛍光剤は一般に、蛍光剤に光を照射することで複数の発光を得ることができるので好ましい。よって、単一の標識で複数の測定可能な事象を得ることができる。
【００７７】
本発明によれば、蛍光標識で標識が行われる場合、シグナルの読み取りは蛍光検出によりなされ、蛍光標識されたプローブは光により励起され、その後、その励起の発光が、デジタル画像を取り込み、さらなるデータ解析を可能とする適当な発光フィルターを装備したＣＣＤカメラなどの光センサーにより検出される。
【００７８】
また、化学発光源および生物発光源によっても検出可能なシグナルが得られる。化学発光源としては、化学反応により電気的に励起されるようになり、その後、検出可能なシグナルとして働くか、または蛍光アクセプターにエネルギーを与える光を発し得る化合物が含まれる。多様な数の化合物群が多様な条件下で化学発光を与えることが見出されている。１つの化合物群が２，３−ジヒドロ−１，−４−フタラジンジオンである。最も知られている化合物はルミノールであり、これは５−アミノ化合物である。この群の他のものとしては、５−アミノ−６，７，８−トリメトキシ−およびジメチルアミノ［ｃａ］ベンズ類似体がある。これらの化合物はアルカリ性過酸化水素または次亜塩素酸カルシウムおよび塩基で発光をもたらし得る。別の化合物群としては、２，４，５−トリフェニルイミダゾールがあり、親生成物の一般名はロフィンである。化学発光類似体としては、パラ−ジメチルアミノおよび−メトキシ置換基が挙げられる。化学発光はまた、塩基性条件下でシュウ酸塩、通常にはオキサリル活性エステル、例えばｐ−ニトロフェニルおよび過酸化物、例えば過酸化水素で得ることもできる。あるいは、生物発光を得るために、ルシフェリンをルシフェラーゼまたはルシゲニンと組み合わせて使用することもできる。
【００７９】
スピン標識は、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）分光法によって検出可能な不対電子スピンを伴うリポーター分子により得られる。スピン標識の例としては、有機フリーラジカル、遷移金属錯体、特に、バナジウム、銅、鉄およびマンガンなどが挙げられる。スピン標識の例としては、ニトロキシドフリーラジカルが挙げられる。
【００８０】
標識はハイブリダイゼーション前または後にプローブ（または標的、これは特に核酸である）に加えることができる。いわゆる「直接標識」は、ハイブリダイゼーション前にプローブに直接結合されるか、組み込まれる検出可能な標識である。これに対し、いわゆる「間接標識」は、ハイブリダイゼーション後にハイブリッド二本鎖に連結される。多くの場合、間接標識は、ハイブリダイゼーション前にプローブに結合されている結合部分に結合される。よって、例えば、プローブはハイブリダイゼーション前にビオチン化することができる。ハイブリダイゼーション後、アビジンとコンジュゲートされた蛍光団を、容易に検出される標識をもたらすビオチン担持ハイブリッド二本鎖に結合させる。核酸を標識し、標識されたハイブリダイズ核酸を検出する方法に関する詳細な総説としては、Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybridization With Nucleic Acid Probs, P. Tijssen, ed. Elsevier, N.Y., (1993)を参照。
【００８１】
これらの標識は直接、またはリンカー部分を介して結合させることができる。一般に、標識またはリンカー−標識結合部位は特定の位置に限定されない。例えば、標識は、所望により、検出またはハイブリダイゼーションを妨げないいずれの位置でヌクレオシド、ヌクレオチドまたは類似体と結合させてもよい。例えば、Clontech (Palo Alto, Calif.)からのある種のＬａｂｅｌ−ＯＮ試薬は、オリゴヌクレオチドのリン酸主鎖に散在した標識と３’および５’末端における末端標識を与える。例えば本明細書に示されるように、標識はリボース環上の位置に結合可能であり、このリボースは所望により修飾、さらには排除することもできる。有用な標識試薬の塩基部分は、天然に存在するもの、またはそれらが置かれている目的を妨げない様式で修飾されたものを含み得る。修飾塩基としては、限定されるものではないが、７−デアザＡおよびＧ、７−デアザ−８−アザＡおよびＧおよび他の複素環式部分が挙げられる。
【００８２】
末端標識プローブに関して、多くの適用では、増幅、転写またはその他の変換工程を介して行う必要のない直接的標識プローブに有用である。一般に、末端標識法は、標識される核酸のサイズの至適化を可能とする。末端標識法はまた、ポリメラーゼ補助標識法に伴うことがある配列の偏りを軽減する。末端標識は末端トランスフェラーゼ（ＴｄＴ）を用いて行うことができる。
【００８３】
末端標識はまた、プローブの末端に標識オリゴヌクレオチドまたはその類似体を連結することにより行うこともできる。他の末端標識法としては、例えばリガーゼまたは末端トランスフェラーゼを用いて核酸の標識または非標識「テール」を作出することを含む。次に、このテールを付けた核酸を、そのテールと優先的に結合する標識部分に曝す。このテールとそのテールと優先的に結合する部分は、核酸、ペプチドまたは炭水化物などのポリマーであり得る。このテールとその認識部分は両者の間の認識が可能ないずれのものであってもよく、ハプテン、エピトープ、抗体、酵素とそれらの基質、ならびに相補的核酸およびその類似体などの、リガンド−基質の関係を有する分子を含む。
【００８４】
テールまたはテール認識部分と結合される標識は検出可能な部分を含む。テールおよびその認識部分は双方とも標識され、それぞれと結合される個々の標識はそれ自体リガンド−基質の関係を有する。個々の標識はまた、異なる分光光度的特徴を有する色素などのエネルギー移動試薬も含み得る。エネルギー移動対は所望の組合せのスペクトル的特徴が得られるように選択することができる。例えば、第二の色素によって吸収されるよりも短い波長で吸収する第一の色素は、そのより短い波長で吸収する際に、第二の色素へエネルギーを移動する。その後、第二の色素は、第一の色素単独で発せられたものよりも長い波長で電磁線を発する。エネルギー移動試薬は、１９９５年９月１５日出願の米国出願番号０８／５２９，１１５の一部継続である、１９９６年１２月２３日に出願の同時係属中米国特許出願、および１９９０年１２月６日出願の米国出願番号０７／６２４，１１４の継続出願である、１９９３年１２月１５日出願の米国出願番号０８／１６８，９０４の分割出願である、１９９６年６月２５日出願の米国出願番号０８／６７０，１１８の一部継続出願でもある国際出願ＷＯ９６／１４８３９に示されているものなどの２色標識スキームに特に有用であり得る。米国出願番号０７／６２４，１１４は、参照することにより本明細書の一部とされる１９９０年６月７日出願の米国出願番号０７／３６２，９０１の一部継続出願である。
【００８５】
一実施形態では、標識が放射性標識で行われる場合、シグナルの読み取りは放射性検出により行われる。
【００８６】
放射性検出はＸ線フィルムまたはホスホルイメージャーを用いて行うことができる。
【００８７】
本発明の放射性標識の例は３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃまたは３２Ｐである。
【００８８】
好ましい実施形態では、プローブは蛍光標識で標識される。
【００８９】
好ましい実施形態では、プローブは放射性標識で標識される。
【００９０】
本発明によれば、プローブが少なくとも２つの異なる標識で標識される場合、対象ドメインのサインは連続する標識を生じる。
【００９１】
一実施形態では、巨大分子上の対象ドメインに対応する少なくとも３つのプローブの結合は、少なくとも２つの異なるスペース（例えば、「ショート」と「ラージ」）の群（この群は各対象ドメインで同一である）から選択される少なくとも２つのスペースの配列を形成する。
【００９２】
一実施形態では、プローブセットはさらに２つのプローブ（プローブ１またはプローブ２）を含み、各プローブは対象ドメインの異なる末端に結合することができ、対象ドメインにおけるその連続するプローブと関連する前記プローブ１またはプローブ２（開始部または終了部の末端（端部）プローブ対（extremity probe couple）と呼ぶ）の１つのシグナルを読み取ることによって、読み取りの開始または終了に関する情報を得ることができる。
【００９３】
一実施形態では、読み取りの開始に関する情報は、開始部の末端プローブ対の２つの連続するプローブ間の間隔の読み取りの結果である。
【００９４】
一実施形態では、読み取りの終了に関する情報は、終了部の末端プローブ対の２つの連続するプローブ間の間隔の読み取りの結果である。
【００９５】
一実施形態では、読み取りの開始に関する情報は、開始部の末端プローブ対の２つの連続するプローブ間の間隔の読み取りの結果であり、読み取りの終了に関する情報は、終了部の末端プローブ対の２つの連続するプローブ間の間隔の読み取りの結果であり、この間隔は、開始と終了の情報を区別するために、開始部の末端プローブ対と終了部の末端プローブ対では異なる。
【００９６】
本発明の別の態様は、巨大分子上の少なくとも１つの対象ドメインの存在を同定する方法に関し、前記ドメイン上に特異的に結合し得る少なくとも３つのプローブのセットが設計され、巨大分子上の１セットの少なくとも３つのプローブの結合が少なくとも２つの異なるコードの群（（例えば、「ドット」と「ダッシュ」）から選択される少なくとも２つのコードの配列を形成し、この群が各ドメインで同一であり、このコードの配列がそのドメインに特異的であり、そのドメインのサインであり、該方法は、
ａ）少なくとも３つのプローブの少なくとも２セットを巨大分子と接触させる工程（各セットは各対象ドメインに特異的である）；
ｂ）シグナルを読み取ること（１つのシグナルは１つのプローブに相当する）；
ｃ）該シグナルをコードで転写する工程；
ｄ）対象ドメインに特異的なコード配列の存在の有無を検出する工程（該コード配列の存在が存在に相当し、巨大分子上のドメインの位置を示す）；および
所望により、工程ａ）の前または工程ａ）とｂ）の間に巨大分子を線状化する工程
を含む。
【００９７】
好ましい実施形態では、方法は、巨大分子上の少なくとも２つの対象ドメインの存在を同定する。
【００９８】
好ましい実施形態では、得られたコードは２つの連続シグナルの特徴の読み取りの結果である。
【００９９】
一実施形態では、２つの連続シグナルの特徴はプローブの標識により得られる。
【０１００】
一実施形態では、標識は蛍光標識で行われ、特定の蛍光標識は特定のコードに相当する。
【０１０１】
一実施形態では、標識は放射性標識で行われ、特定の放射性標識は特定のコードに相当する。
【０１０２】
一実施形態では、得られたコードは２つの連続シグナル間の間隔の読み取りの結果である。
【０１０３】
一実施形態では、２つのシグナル間の特定の間隔は特定のコードに相当する。
【０１０４】
例えば、本発明によれば、小さなギャップはドットと呼ばれるコードに相当し、大きなギャップはダッシュと呼ばれるコードに相当する。小さなコードは例えば２５〜３０ｋｂを測定するように設計することができ、大きなコードは例えば５５〜７０ｋｂを測定するように設計することができる。
【０１０５】
一実施形態では、２つの連続シグナルの特徴はプローブの長さによって与えられ、各長さが特定のコードに相当する。
【０１０６】
本発明は、２つのコードにまで減少されず、３つ、４つまたは４つを超えるコードを含むことができ、コードを定義するためにいずれのサイズのギャップが選択されてもよく、このサイズは任意である。
【０１０７】
本発明によれば、これらのプローブセットはさらに２つのプローブ（プローブ１またはプローブ２）を含み、各プローブは対象ドメインの異なる末端に結合することができ、対象ドメインにおけるその連続プローブと関連する該プローブ１またはプローブ２（「開始または終了の末端プローブ対」と呼ばれる）の１つのシグナルを読み取ることで、読み取りの開始または終了に関する情報が得られる。
【０１０８】
一実施形態では、本発明のサインはプローブセットにおける第一のプローブと第二のプローブの間にスペースを含み、このスペースはそのサインにおいて他の総てのスペースと異なり、このスペースはサインの開始に関する情報を得るために使用することができる。
【０１０９】
一実施形態では、本発明のサインは、プローブセットにおいて最後の手前のプローブと最後のプローブの間にスペースを含み、このスペースはそのサインにおいて他の総てのスペースと異なり、このスペースはサインの終了に関する情報を得るために使用することができる。
【０１１０】
さらなる実施形態では、本発明は、少なくとも２セットの３つのプローブを含み、各プローブセットは１つのドメイン上に特異的に結合することができ、巨大分子上での１セットの少なくとも３つのプローブの結合が、少なくとも２つの異なるコード群（例えば、「ドット」と「ダッシュ」）から選択される少なくとも２つのコードの配列を形成し、この群が総てのドメインで同一であり、このコード配列が１つのドメインに特異的であり、そのドメインのサインである、巨大分子上の少なくとも２つの対象ドメインの存在を検出するためのキットに関する。
【０１１１】
本発明は、本出願者が行った研究に関して遂行された実験検討の記載を読めばより明確に理解される。これらは何ら限定と解釈されるべきでない。
【実施例】
【０１１２】
哺乳類ＤＮＡ複製開始点は数ｂｐ〜数十ｋｂの範囲の部位に位置する。個々の細胞周期における開始の規則的分布は、これら多くの潜在的開始部位のうち限られた数だけが活性化開始点へと変換されることを示唆する。開始点干渉は冗長開始点を封じることができるが、干渉が機能的ヒト開始事象のスペーシングに関与するかどうかは現在のところ知られていない。一次ケラチノサイト由来の単一にコーミングされたＤＮＡ分子に対して新規なハイブリダイゼーション戦略である遺伝子モールスコードを用いることにより、本発明者らは１．５Ｍｂのヒト染色体１４ｑ１１．２上に存在する開始部位を報告する。本発明者らは、開始ゾーンがヒト細胞に拡散していることを確認した。個々の細胞周期において用いられる開始点は、存在し得る開始部位よりも少なく、それらの限定された使用は規則的な開始点間発火距離を作り出す。
【０１１３】
ゾーン間干渉は活性開始点からの距離に比例して減少するが、ゾーン内干渉は１００％有効である。これらの結果によってヒト細胞において有効な開始点の階層的構成が確認される。機能的開始点は、その付近で開始点が発火する確率を支配し、これはゾーン間干渉およびゾーン内干渉によって媒介される。これにより、ＤＮＡ複製の複数の複雑な、潜在的開始部位に関して、開始事象がヒト染色体の長さに添って一様に分布していることが確認される。
【０１１４】
導入
真核細胞は、Ｓ期の長さによって規定され、ゲノム倍加回数が限定されている。これは、複数の開始部位から伸びる複製分岐においてＤＮＡを合成することにより果たされる。分岐（fork）の速度はＳ期の長さに応じて尺度化されるのではないので、各個の染色体の開始頻度の調節には有糸分裂の開始前に非複製ギャップを阻害する必要がある(Hand and Tamm, 1973; Edenberg and Huberman, 1975)。例外もあるが、一般的な見解では、体細胞哺乳類開始点は５０〜３００ｋｂ間隔で始まっている(Edenberg and Huberman, 1975; Berezney et al., 2000)。このことは、後生動物が開始事象を一様に分布させる機構を有していることを示唆する。一定の距離に強力なレプリケーター配列を配置することは、発芽酵母サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)に用いられているこのような機構の１つである(Newlon et al., 1991; Shirahige et al., 1993)。もっと高等な真核生物では、遺伝エレメントは開始点の活性化に役割を果たすが、それらはそれ自体開始を駆動するには十分なものでない(Gilbert, 2004)。さらに、後生動物の開始点には数ｂｐという限局化された部位に存在するものがあるが、大多数は数十ｋｂまでの範囲のより分散した開始ゾーンに存在する(DePamphilis, 1999)。これにより内因的効率の低い、ある範囲の潜在的部位からいかにして活性化開始点の規則的分布を果たすかという問題が持ち上がる。
【０１１５】
開始点活性を調節する１つの方法は、それが受動的に複製される確率を変化させることである。開始点付近から伸張している分岐はこの抑制を媒介するので、この形式の開始点の不活性化は「開始点干渉」と呼ばれている(Brewer and Fangman, 1993)。開始点干渉に関する本発明者らの理解の大部分は、Ｓ．セレビシエでの研究により得られたものである。発芽酵母では、複製の完了に必要とされるか、または用いられるものよりも多くのより集合した複製前駆複合体（ｐｒｅ−ＲＣ）がある(Dershowitz and Newlon, 1993; Raghuraman et al., 2001; Wyrick et al., 2001; Pasero et al., 2002)。酵母染色体ＩＩＩおよびＶＩに対して開始点効率を分析したところ、開始点が細胞周期の５〜９０％の間で用いられていることが明らかになった(Friedman et al., 1997; Yamashita et al., 1997; Poloumienko et al., 2001)。許可された開始点は、その近傍の他の開始点に比べて、予定されたＳ期のタイミングが遅いか、比較的遅いために効果的でない(Santocanale and Diffley, 1996; Vujcic et al., 1999)。結果として、これらの適格開始点は、隣接する開始部位から伸びている分岐により受動的に複製される(Santocanale et al., 1999)。
【０１１６】
酵母から得られたデータによれば、開始点が互いに干渉すべきであれば、開始点付近がＳ期の異なる時間に発火する（fire）ようにＧ１期において予めプログラムされていなければならない(Raghuraman et al., 1997)。しかし、この必要条件は、より高等な真核生物において、１）タイミングの制御が〜１００ｋｂという拡大された領域にわたって発揮され(MacAlpine et al., 2004; Norio et al., 2005)、かつ、２）クラスターにおいて互いに次に位置する開始点が同時に発する場合には満足のいくものでない可能性がある(Berezney et al., 2000)。
【０１１７】
実際、ＣＨＯ細胞の増幅されたＡＭＰＤ２遺伝子座では、近傍の開始点間の有意な予め定義されたタイミングの違いは見られなかった(Anglana et al., 2003)。やはり隣接する開始点の、よく定義されたｂｐ部位での同時活性化は遮断された(Anglana et al., 2003)。これが広い開始ゾーンに当てはまるかどうか依然として判定すべきである。
【０１１８】
規則的な開始間隔がヒト細胞でいかにして果たされるか、また、開始点干渉がこのプロセスに寄与するかどうかを理解するため、本発明者らは開始点活性に関して、一次ケラチノサイト由来のヒト染色体１４ｑ１１．２の１．５Ｍｂ領域に疑問を持った。次のような理由で、分子コーミング技術を採用した一分子アプローチを選択した。第一に、特定の細胞種におけるＤＮＡ複製の総ての潜在的開始部位の位置を特定するために十分な開始点発火事象が得られる。第二に、本発明者らは、単一の細胞が個々のＳ期においてどの開始点を用いるかということと、それらの互いに対する活性化のタイミングを決定することができる。これには開始事象の時空間分布を確認する必要がある。これらのデータを組み合わせて、既に発火した開始点が下流の、潜在的開始部位の使用を調節するかどうかを評価した。本発明者らは、開始点が活性開始点によって確立された階層に従って互いに自己調節し、予め定義されたタイミングの優先なく、確率論的に選択されることを見出した。さらに、開始点干渉により、開始事象の間隔の保存がもたらされる。その理由およびヒト開始点干渉の実行に用いられる機構が議論される。
【０１１９】
材料および方法
ＤＮＡ調製
正常なヒト一次ケラチノサイトを皮膚生検から誘導した。細胞を標準的なケラチノサイトＳＦＭ中で培養した。その後、新生ＤＮＡをそれぞれ記載されているように(Lebofsky and Bensimon, 2005)、ＩｄＵおよびＣＩｄＵで２０分間標識した。ＤＮＡ抽出およびコーミングは標準的なプロトコールに従って行った。
【０１２０】
ハイブリダイゼーションおよび蛍光呈示
表Ｓ１に示されているプライマー対を用い、広範囲ＰＣＲにより、２５ＧＭＣプローブを作製した。５〜７ｋｂのプローブの増幅を助けるため、ＴａＫａＲａ  ＬＡ  Ｔａｑを用いた(Takara Bio)。ＰＣＲ産物の鋳型として用いたＢＡＣを表Ｓ２に示す。プローブをそれらの記号（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）に従い、終濃度〜２０ｎｇ／μｌでプールした。プローブのビオチン化は、個別に４つの記号のランダムプライミング(Invitrogen)を行うことにより達成した。個々のスライドアッセイについては、〜２５０ｎｇの各ビオチン化プローブを１０μｇのヒトｃｏｔ−１  ＤＮＡ(Gibco BRL)と合わせた。その後のコームＤＮＡに対するハイブリダイゼーションは公表されている方法(Lebofsky and Bensimon, 2005)に従った。プローブＩｄＵおよびＣＩｄＵを検出する免疫蛍光工程は次の通り：（ｉ）Ａｌｅｘａ  ４８８コンジュゲートストレプトアビジン(Moleccular Probs)、マウス抗ブロモデオキシウリジン(Becton Dickinson)およびラット抗ブロモデオキシウリジン(Harlan Seralab)；（ｉｉ）ビオチンコンジュゲートウサギ抗ストレプトアビジン(Rockland)、Ａｌｅｘａ  ３５０コンジュゲートヤギ抗マウス(Moleccular Probs)およびテキサスレッドコンジュゲートロバ抗ラット(Jackson)；（ｉｉｉ）Ａｌｅｘａ  ４８８コンジュゲートストレプトアビジン(Moleccular Probs)およびＡｌｅｘａ  ３５０コンジュゲートロバ抗ヤギ(Moleccular Probs)。抗体のインキュベーション、洗浄およびスライドのマウントはこれまでに報告されている通りに行った(Lebofsky and Bensimon, 2005)。
【０１２１】
画像の採取
ＨＱ  ＣＣＤカメラを装備したＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ  ２顕微鏡(Photometries)を用いて画像の半分を取り込んだ。あとの半分をＣｙｔｏｓｃｏｕｔハイスループットスキャニング装置(Upper Austrian Research)を用いて採取した。バックグラウンド蛍光のドットを、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ(Adobe)を用いて除去し、対象分子を強調した。
【０１２２】
結果
ゲノムモールスコードハイブリダイゼーション戦略
ある細胞周期の中でどの開始点が活性、またサイレントなのかを分析するための第一段階として、ある領域内の総ての可能性ある開始部位を得た。このために、本発明者らは分子コーミングに基づく単一分子アプローチを用いた(Bensimon et al, 1994)。正常な核型を示す非同期性ヒト一次ケラチノサイトに２０分間ヨードデオキシウリジン（ＩｄＵ）、次いでクロロデオキシウリジン（ＣＩｄＵ）のパルスを与えた。この細胞集団からＤＮＡを抽出し、コーミングした。新たに合成されたＤＮＡにおけるＢｒｄＵ類似体の組み込みをＩｄＵ（青）およびＣＩｄＵ（赤）の免疫検出によって可視化した。この実験パラダイムは、二方向性複製の開始部位が推察できる３種類のシグナルを生じる（図１Ａ；詳細はAnglana et al, 2003; Lebofsky and Bensimon, 2005を参照）。コーミングＢｒｄＵのＦＩＳＨによる呈示により、複製トラックがプローブシグナルとどこで重複しようと、開始を特異的配列トラックに帰すことができる。
【０１２３】
慣例的に、スライド上のゲノム領域を可視化するためには色が異なる（図１Ｂｉ）か、サイズが異なる（図１Ｂｉｉ）プローブ対が用いられる。しかし、ＤＮＡの破断が、それらがカバーできる距離を制限する。結果として、このハイブリダイゼーション戦略を用いた染色体のウォーキングダウンは、実験がプローブ対の数に比例して増えるので、時間がかかる方法である。理想的には、数色および／または大きな領域をカバーするために様々な長さのプローブを使用することができるが、これらの戦略はそれぞれスペクトルの重複および繰り返し配列の非特異的ハイブリダイゼーションのために適切なものではない。
【０１２４】
本発明者ら独自の解決策の第一の部分は、サイズの異なるギャップが、色またはサイズの異なるプローブと同じ情報を与えることを実現したことによる。図１Ｂｉｉｉに示される例では、ギャップ１はあるプローブセットにより定義され、ギャップ２は別のプローブセットにより定義される。また、この２つのプローセット間のギャップサイズはギャップ１および２とは明瞭に異なる。ギャップ３はＤＮＡ破断の際に有用となる。その助けで、その分子は完全なプローブセットが可視化されなくてもなお一定方向を向くことができる（図１Ｂｉｖおよびｖ）。ギャップは位置情報を与えるので、それらの数にもはや制限はなく、すなわち、スペクトルの重複やハイブリダイゼーションの際の繰り返し配列はもはや問題でない。サイズの異なるギャップを用いることで、ヒト染色体１４ｑ１１．２において〜１．５Ｍｂに及ぶ遺伝子モールスコード（ＧＭＣ）が作製された（図１Ｃ）。この全ＧＭＣを個々のアッセイでハイブリダイズさせ、総てのプローブが緑で検出された。分子コーミングに先立つＤＮＡ操作は繊維をランダムな位置で破断させる。しかし、繊維のサイズは個々の分子上で複数の記号を可視化するに十分なものであった。これに対し、繊維破断のため、記号から数プローブだけしか検出されない場合もあった。開始点は、複製トラックが解読可能なＧＭＣプローブセットと同時に局在した開始点を示す限りマッピングされた（図１Ｄ）。よって、新規なハイブリダイゼーション戦略ＧＭＣにより、限られた数の実験で、大きな領域の開始点マッピングが可能であった。
【０１２５】
１．５Ｍｂのヒト染色体１４ｑ１１．２に対する開始点マッピング
この実験パラダイムを用い、本発明者らは、ＧＭＣ領域において２３２の単一ＤＮＡ分子に対し、３０７の開始事象を検出した。優先的開始ゾーンを客観的に確立するために、データのクラスター化を行った。まず、本発明者らは、階層的クラスタリングツリーを作出した。最適な区切りを設けるためには、クラスター内のデータの分散を最小化し、クラスター間の分離は最大にすべきである。これら２つの特徴を級内分散（Ｗ）および級間分散（Ｂ）と呼ぶ（図２Ａ）。従って、望ましいクラスターセットは小さなＷと大きなＢまたはＢ−Ｗの最大値を持たなければならない。これらのデータを９、２２および４５のクラスターに分けたところ、比較的高いＢ−Ｗ値が得られた（図２Ａ）。図２Ｂは、開始事象がこれらのクラスターセットに従ってどのように分割されるかを示している。データを４５のクラスターに分けると、最も狭い開始領域が得られる。本発明者らは、これら４５のクラスターを個々の開始ゾーンを示すものと考えた（図２Ｃ）。これらのクラスターの中には極めて少ない開始事象しか含まないものがあり、これはバックグラウンドのノイズによるものでる可能性がある。よって、３つを超える開始事象を有するクラスターだけを次の分析に用いた。このようにして、３８の開始ゾーンを同定した。
【０１２６】
開始ゾーンのサイズは２．６ｋｂ（最小）〜２１．６ｋｂ（最大）の間で様々であり、平均は１３．５＋／−５．２ｋｂであった。これらの値は哺乳類細胞に関して報告されている(DePamphilis, 1999)他の開始ゾーンの範囲内にある。このゾーン内で、１〜２ｋｂの特定の開始部位は見られなかった。
【０１２７】
これは、開始点ピークを識別するためのデータ数が不十分なためである可能性があった。コーミングされた分子上の最大解像度は１〜４ｋｂの間である。よって、これらの開始の優先性が、マッピングされた各開始点に固有の標準偏差の結果として取り払われた可能性もある。
【０１２８】
あるいは、散在した発火部位を含む開始ゾーンがこれまでに考えられていたものよりも優勢である可能性がある。本発明者らのデータは、他のもっと解像度の高い技術でプローブ可能な標的領域を提供する(Todorovic et al, 2005)。よって、これらの可能性を区別することができる。
【０１２９】
活性化された開始点近傍の時空間分析
本発明者らは次に、開始ゾーンが互いに対してどのように分布するかということに注意を向けた。ゾーン間の距離を測定したところ、ゾーン間平均は４０．６＋／−２０．７ｋｂ（最小値＝１４．３ｋｂ、最大値＝９３．１ｋｂ）であることが明らかになった。哺乳類細胞の開始点間距離が一般に１００〜１５０ｋｂであること(Berezney et al, 2000)を考えれば、これは驚くべきことである。この相違は、細胞周期ごとにゾーンのサブセットだけが活性化されるとすると説明がつく。この可能性を調べるため、本発明者らは個々の繊維上の複数の開始点間の間隔を分析した（図３Ａ）。
【０１３０】
本発明者らの分析は一分子レベルであるため、これらの開始点は、１回のＳ期において１個の細胞によって実際に用いられるものに相当する。ＤＮＡ破断は、観察された３０７の開始事象のうち１７３に関して、隣接する開始点の可視化を妨げた。残りの場合は、活性のある開始点近傍が存在する場合に見られた（１３４／３０７）。この２つの最も近い機能的開始点と最も遠い機能的開始点はそれぞれ３１．４ｋｂおよび３９０．８ｋｂ離れていた。興味深いことに、平均開始点間距離は１１３＋／−６６．４ｋｂであると算出された（図３Ｂ）。ゾーン間距離（〜４０ｋｂ）に比べて、この結果は、ある細胞周期において３つの潜在的ゾーンのうち平均して１つだけの開始点から発火することを示唆する（図３Ｃ）。
【０１３１】
特定のゾーンに由来する開始点が互いに対して早くまたは遅れて再現性よく発火されたかどうかを検討するため、活性化時間を調べた。開始点を示す複製シグナルの種類に基づき（図１Ａ）、開始時間を標識期間に対して関連づけることができる。これは、ＩｄＵまたはＣＩｄＵパルスのいずれかの際に発火した開始点にも当てはまり、各２０分の時間であった（図１Ａｉｉおよびｉｉｉ）。これは同様に、標識期間前に発火した開始点にも当てはまり、先行する分岐が修飾されたヌクレオチドの組み込みによって可視化できることが示された（図１Ａｉ）。これが生じるためには、開始点の活性化の時間が平均２０分を超えてＩｄＵ／ＣｌｄＵパルスに先行することはできなかった（例えば、図３Ｃｉの２番目の分子を参照）。従って、分析枠は、パルス２０分前、ＩｄＵパルス中２０分およびＣＩｄＵパルス中２０分を含む、全〜６０分に及ぶ。本発明者らは、これら３８の開始ゾーンのいずれにもタイミング的に優先されるものを見出すことができなかった。さらに、隣接する開始点は同時には発火しなかった（図３Ｃ）。個々の繊維上の複数の開始部が本発明者らの実験パラダイムによって与えられる６０分以内に検出可能であったことに注目すべきである。従って、開始事象間の厳密な同期性は見られなかったが、任意の２つの活性化開始点の間のタイミングの差はおよそ１時間に限定される。
【０１３２】
隣接する開始点間の活性化時間はわずかに違いがあることから、２つの接近する分岐間の非複製領域における潜在的開始点は、なお、いくらか後の時間に活性化された可能性がある（例えば、図３Ｃｉｉの３番目および５番目の分子を参照）。これらの領域から発火する開始点はより短い開始点間距離をもたらす。隣接する開始点の大部分は互いに３０分以内に発火すると考えられる(Berezney et al, 2000)。本発明者らの分析枠は６０分（前段参照）であるので、クラスター内のほとんど総ての開始点が活性化されると予測される。
【０１３３】
従って、開始点の発火の遅れが開始点間距離の測定値を有意に変化させる可能性は低い。
【０１３４】
潜在的開始部位にわたる分岐の伸張
これまでに、開始部位または開始部を意味するためには、唯一、複製トラックが用いられてきた。しかしながら、それらの周囲領域への二方向性の伸張は、データの別の重要な部分を提供する。隣接するゾーンと重複する１つの開始ゾーンから生じるシグナルは、後者の場合には、複製分岐の先行通過および開始点の許可の剥奪を意味する。
【０１３５】
これは、受動的に複製されたゾーンをＳ期のいくらか遅い時間における発火に不応とする。
【０１３６】
ヒト細胞における総ての潜在的開始点が、それらが酵母である場合(Santocanale and Diffley, 1996)と同様に許可される限り、この観察は開始点干渉の証拠となる（図４Ａ）。開始ゾーンへ向かっていくらか伸張する分岐では、ゾーンは重心が達せられた場合にのみ抑制されると考えられる。本発明者らは、伸張中の分岐からのシグナルを用い、活性開始点干渉からどれくらい離れて起こるのか分析した（図４Ｂ）。
【０１３７】
全部で５２８の開始ゾーンが抑制されることが分かった。末端小粒方向へ移動する分岐を表す標識（５５．１＋／−３８．４ｋｂ、Ｎ＝２６２；図４Ｃ）に対して動原体方向へ移動する分岐を表す標識（５６．５＋／−３７．７ｋｂ、Ｎ＝２６６）を考えると、それらの開始部位からの距離は有意には異なっていなかった。結果として、以下の分析のため、両方向に移動する分岐により媒介される開始点干渉を合わせた。活性開始点からの複製トラックは、平均して５５．８＋／−３８ｋｂ離れたゾーンと重複していた。最も近い、また最も遠い抑制ゾーンは機能的開始点からそれぞれ７ｋｂおよび２８４．６ｋｂの位置にあった。これらのデータは次のように解釈される。開始部位のすぐ隣に位置するゾーンは３１４回抑制された。２番目のゾーンは１３７回抑制され、その後（３番目以降）のゾーンは７７回抑制された。５２８の抑制された開始ゾーンに基づくこれらのデータを考え合わせると、開始点干渉が１〜２の隣接する開始ゾーンのほとんどの部分に及んでいることが示唆される。
【０１３８】
ゾーン間干渉の他、本発明者らはゾーン内干渉も分析した。
【０１３９】
活性開始点からの分岐は、１００％の時間、その固有の開始ゾーンの境界を越えて伸張した（例えば、図４Ｂ参照）。この形態の干渉が多ければ、与えられた任意の細胞周期において開始ゾーンにつき１を超える開始点が発火する確率は低いはずである。この分析を行うことは、比較的小さな開始ゾーンにおいて密に配置された開始点に代表的な短い複製トラックを識別する本発明者らの能力にかかっている。コームＤＮＡ上の線状蛍光セグメントの最大解像度は１〜４ｋｂである。これは平均１３．５ｋｂより小さいゾーンにおける複製の開始点の可視化を面倒にする。しかしながら、より大きな開始ゾーンでは、いくつかの開始点の観察を分子コーミングの解像度により制限されない。開始ゾーンのサイズにかかわらず、個々のＳ期において同じ開始ゾーン内から２以上の開始点が発火するということは見られなかった。よって、開始事象からの距離によって低下するゾーン間干渉とは対照的に、ゾーン内干渉は極めて効率的であり、分岐が移動しなければならない距離には依存しない。
【０１４０】
結論
結論として、本発明者らは、一分子アプローチを用い、ヒト染色体１４ｑ１１．２の１．５Ｍｂ領域の総ての潜在的開始ゾーンをマッピングした（図１および２）。本発明者らはまた、それらの一部だけが実際に個々の細胞周期に用いられることも実証した（図３）。
【０１４１】
最後に、限定された開始点の活性化は、規則的な開始点間発火距離をもたらす（図３）。
【０１４２】
従って、本発明者らは、保存された開始事象間隔が広範な哺乳類開始ゾーンに関して維持されていることを初めて示す。
【０１４３】
酵母およびＣＨＯ細胞では、高い潜在的開始点／活性開始点比が記載されている(Raghuraman et al, 2001; Wyrick et al, 2001; Pasero et al, 2002; Anglana et al, 2003)。本発明者らのデータは、この比がヒト細胞においても保存された特徴であることを示唆する。これにより、真核細胞において繰り返されるテーマである、なぜ開始点が冗長なのかという重要な疑問が持ち上がる。酵母染色体の１つの腕におけるいくつかの開始点を欠失させても、ゲノムの安定性に無視できるほどの影響しかなかった(Dershowitz and Newlon, 1993)。このことは、それほど多くの開始点が必要でないことを示唆する。
【０１４４】
しかしながら、さらに最近では、組み立てられたｐｒｅ−ＲＣの完全な相補物を阻害すると染色体の再配列が起こった(Lengronne and Schwob, 2002; Tanaka and Diffley, 2002)。この理由は分かっていないが、いくつかの提案が、余分な潜在的開始点が、混乱したＤＮＡ複製の事象において安全ネットを提供するという観点に収束している(Schwob, 2004)。第一に、分岐が遮断されれば、それは組換えの基質へと変換することができる(Rothstein et al, 2000)。下流の「余分な」開始点の活性化は接近する分岐を生じる。この分岐は遮断された分岐と合流し、それによりそれを組換えから救い出す。
【０１４５】
第二に、いくつかの開始点が発火できない場合、細胞は複製されないＤＮＡとともに有糸分裂を受け得る。このフラグメントは動原体が引き離される際に破断する。潜在的開始点の供給過剰は偶発事象の確率を減らす。最後に、Ｓ期のチェックポイントによる最適な細胞周期の休止には、十分な数の分岐が必要である(Shimada et al, 2002)。開始の試みに失敗すると、分岐が失われる。バックアップ開始点の発火が、補償のための２つの付加的な分岐を生成し、これによりチェックポイントが作動可能となる。これらのモデルのいずれかが適用可能であるかを評価するには、明らかにさらなる研究が必要である。
【０１４６】
開始点干渉は、高い潜在的開始点／活性開始点比が真核生物でいかに達成されるかを説明する機構として取り上げられてきた。それは、早期に活性化された開始点から進行する分岐により、許可された開始点を表すｐｒｅ−ＲＣの除去を含む(Brewer and Fangman, 1993)。
【０１４７】
開始点干渉は酵母、ツメガエルおよびＣＨＯ細胞で見られている(Brewer and Fangman, 1993; Lucas et al, 2000; Anglana et al, 2003)。ここで、本発明者らは、開始点干渉がヒト細胞における開始点機能の調節に重要な役割を果たすこと、さらにはこれが開始ゾーンに関して起こることを初めて示す（図４）。分子コーミングに先立ち、ＤＮＡは除タンパクされる。従って、どの開始ゾーンが許可された開始点を含んでいたか確認することはできなかった。実際に、受動的に複製されたゾーン（抑制されていると解釈される）は単にそれから始まることが許可されていないということかもしれない。今後の研究で、開始ゾーン間のｐｒｅ−ＲＣの会合がアッセイされる。これにより、本発明者らは、開始点干渉がこの用語の正式な定義に従って起こるかどうかを決定することができる。
【０１４８】
開始点干渉を説明するため、酵母から得られたデータを挙げられており、これによれば、Ｇ１において確立された種々の活性化時間が後の開始点を先の開始点からの分岐により受動的に複製させる(Lucas and Raghuraman, 2003)。ＣＨＯ細胞で行われた研究(Anglana et al., 2003)と一致して、本発明者らは隣接する開始点に関して強い、予めプログラムされたタイミングの違いを見出せなかった（図３）。よって、本発明者らのデータは、ヒト細胞では酵母に存在するものとは異なる機構が作動していることを示唆する。
【０１４９】
本発明者らは、ゾーン間干渉が活性開始点からの距離に応じて徐々に低下することを見出した（図４）。開始点の発火の確率が限定された開始因子のために低い場合(Walter and Newport, 1997)には、本明細書で報告されている開始点干渉はこの低い確率および結果としての受動的な現象の直接的結果であり得る。他方で、開始点発火確率が高ければ、開始点干渉は能動的に調節されるはずである。例えば、混乱のない伸張分岐に存在するチェックポイントタンパク質は遠位開始点の発火を抑制し得る。
【０１５０】
これにより、遅れた開始点が受動的に複製され、従って抑制される機会が能動的に増える(Marheineke and Hyrien, 2004; Shechter et al., 2004; Sorensen et al., 2004; Syljuasen et al., 2005)。今後の研究で、いずれのモデルがゾーン間干渉を担うのかが明らかになるであろう。
【０１５１】
最近、数学的研究により、複製中心においてともに隔離され、従って同時に活性化され得るのはわずかに１１ｋｂ離れた潜在的開始点だけであるということが提示された(Jun et al., 2004)。この制限は、ＤＮＡの屈曲を制限するＤＮＡの持続長により決定される。持続長はゾーン内干渉を説明することができ、ＤＮＡの堅さが、あるゾーンに由来する２つの潜在的開始部位が複製中心内に集中することを妨げ、従って、それらの同時活性化を妨げる。ＤＮＡの物理的特性に基づく機構が堅牢なため、本明細書で報告される高効率のゾーン内干渉が生じ得る。
【０１５２】
哺乳類開始ゾーン内およびゾーン間の開始点干渉機構は、これらの領域の基礎にある分子決定基に依存する。許可の過程で、複数のミニ染色体維持（MiniChromosome Maintenance)（ＭＣＭ）複合体はｐｒｅ−ＲＣから離れて拡散する(Ritzi et al, 1998; Edwards et al, 2002)。これらのＭＣＭ部位の１つで発火する開始点は哺乳類細胞における開始ゾーンの存在を説明することが示唆されている(Hyrien et al, 2003; Blow and Dutta, 2005; Cvetic and Walter, 2005)。よって、本明細書で報告される開始ゾーン（図２）は反復ＭＣＭローディングのために生じ得る。拡散ＭＣＭまたは他の未知の因子が哺乳類開始ゾーンを担っているかどうかの判定は、我々が、ヒト開始点干渉がいかにして実行され、開始事象間隔が調節されるかを理解する助けとなる。
【参考文献】
【０１５３】
0005461185.tif 000002
0005461185.tif 000003
0005461185.tif 000004
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【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１】ヒト染色体１４ｑ１１．２における１．５Ｍｂに対するＤＮＡ複製開始マッピングを示す。  （Ａ）開始点を示すコーミングされたＤＮＡ上の３種類の複製シグナル。開始は、標識前、ＩｄＵパルス（青）中、およびＣＩｄＵパルス（赤）中に起こり、それぞれ（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）に示されるシグナルを生じる。３つの場合の総てで、これらのトラックの中点が開始部位であると推定される。  （Ｂ）コーミングされたＤＮＡに対するハイブリダイゼーション戦略。長さが等しいが色の違いで検出される２つのプローブ（ｉ）または同じ色で検出される、長さが異なる２つのプローブ（ｉｉ）をハイブリダイズさせ、対象ゲノム領域を可視化する。あるいは、同じ情報を得るためにプローブセット間のギャップを使用することもできる。（ｉｉｉ）では、４つの短いプローブをハイブリダイズさせ、情報が得られる３つのギャップを生じさせる。ギャップ３は、分解の際に分子を一定の方向に向かせる（ｉｖ、ｖ）。ＤＮＡ分解は一対の垂直実線により表される。  （Ｃ）ヒト染色体１４ｑ１１．２における１．３５６Ｍｂにわたる遺伝子モールスコード（ＧＭＣ）。モールスコードＡ、Ｂ、ＣおよびＤで、最初の４つの記号の直線パターンを示す。ＧＭＣはこれら４つの記号を含み、各記号は１セットのプローブで表される。プローブは緑で示される。コードギャップは短ギャップと長ギャップである。開始ギャップおよび終了ギャップは、ＤＮＡ破断の際の記号の配向を助けるために含めた。記号はスペースギャップにより隔てられている。プローブおよびギャップのサイズ（ｋｂ）がそれぞれ上に示されている。  （Ｄ）ＧＭＣ領域において観察される開始事象の例。白い矢印は開始部位を示す。ファイバー２、７、８および１３では、ＧＭＣは、ある記号に属す総てのプローブが存在しない場合でもなお解読可能である。それらの記号と隣接する開始事象は、隣接する記号の１つが解読されるか（分子１、５、１１および１４）、スペースギャップ情報が入手可能な場合（分子４および１０）にマッピングされた（バー＝１００ｋｂ）。
【図２】クラスター分析による開始ゾーンの同定。  （Ａ）理想的クラスターの定義。分散内（Ｗ）および分散間（Ｂ）の方程式を挿入枠内に示す。Ｗに関して、Ｎはクラスター数であり。Ｖｉはクラスターｉの分散である。Ｂに関して、Ｃｉはクラスターｉの重心であり、Ｃはクラスターセットにおける総ての重心の平均である。クラスター数に関数としてＢ−Ｗをプロットしたところ、データを９群（青丸）、２２群（緑丸）および４５群（赤丸）に分けた際の最大値が明らかになった。  （Ｂ）９（青線）、２２（緑線）および４５（赤線）の区分がデータに適用される際の、あるクラスターの、その成分への分解。赤線の下の領域は開始ゾーンを表し、分子の上の白四角により示される。白い矢印は開始部位を示す（バー＝１００ｋｂ）。  （Ｃ）ＧＭＣ領域における開始ゾーンの分布。水平の赤線はゾーンのサイズと位置を表す。垂直の白線はマッピングされた３０７の開始部位の総ての位置を表す。４未満のデータ点を含むゾーンは、赤線の代わりに水平のグレーの線でマークされ、その後の分析では考慮されていない。この図面のパネルＢにおけるクラスターはアスタリスクで示される（バー＝１００ｋｂ）。
【図３】機能的開始点の時空間分析を示す。  （Ａ）開始点間距離（Ｘ）を示す複製シグナル。（ｉ）では、２つの開始部位からの複製トラックには隔たりがあるままである。（ｉｉ）および（ｉｉｉ）では、それぞれＩｄＵパルスおよびＣＩｄＵパルス中に、接近する分岐が合流する。（Ｂ）測定された開始点間距離の頻度を示すヒストグラム。  （Ｃ）記号Ａ、Ｂ（ｉ）およびＣ、Ｄ（ｉｉ）において少なくとも２つの開始事象を有する分子の例。白い矢印は開始部位を示す。開始ゾーンは水平の赤線でマークされている。個々の分子について、開始点が発火する開始ゾーンは白四角で示されている。影付きの四角はサイレント開始ゾーンを表す（バー＝１００ｋｂ）。
【図４】分岐の伸張に基づく開始点干渉を示す。  （Ａ）ゾーン（ｖ）の活性開始点から伸びている分岐は垂線対に接している領域を含んでいる。左に移動している分岐の終点が見られる（白ぬきの逆三角）。着目する開始点からの分岐はその境界部に達しない限り、開始ゾーン（ｉ）および（ｉｉ）は干渉を受けない。その分岐が受動的にその全長を複製すれば、ゾーン（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖｉ）は抑制される。右へ移動している分岐はゾーン（ｖｉｉ）を通り抜けるが、その重心（黒いドット）には達しない。このゾーンは開始点干渉データには含まれていない。グレーの長方形は開始ゾーンを表し、濃いグレーの長方形は抑制された開始ゾーンを表す。  （Ｂ）開始点干渉を示す分子の例。この図の開始ゾーンは水平の赤線で示される。白四角は開始点が発火する（白い矢印）開始ゾーンを示す。影付きの四角は、分岐の伸張によって抑制されている開始ゾーンを示す（バー＝１００ｋｂ）。  （Ｃ）開始事象と干渉を受けているゾーンの間の距離の頻度を示すヒストグラム。動原体方向へ移動している分岐および末端小粒方向へ移動している分岐により抑制されたゾーンはそれぞれ、負の値および正の値で表される。
【図５】３種類のコードを示す。  Ａ：連続するプローブ間の間隔に基づくコード。  Ｂ：標識（より詳しくは、色）に基づくコード。  Ｃ：標識（色）＋連続するプローブ間の間隔に基づく冗長コード。  ３種類のコード法。プローブはカラーの短いセグメントで示される。これらのプローブは例えば５〜１０Ｋｂを測定することができる。ここで示される「色」は、性質の異なるプローブと同様に含め／理解しなければならず、それは結びついている蛍光色素で異なる場合もあるし、大きさまたは他のいずれかの特徴または特徴の組合せで異なる場合もあり、特にそれ自体蛍光プローブの問題ではない。プローブ間の間隔は例えば短いスペースで約２０ＫＢ、長いものでは４０ＫＢ、ダブレットの場合では１０ＫＢ未満（最初の場合）であり得る。冗長コードは、その他の双方の組合せである。
【図６】冗長コードの興味深い点を示す。  冗長コードの興味深い点。記載されている３種類のコード１に関して、青い矢印のマークされている配列の一部における欠失が示されている。最初の両方の場合では、この欠失に関する理由の修正点として、別のコード配列との混同が含まれる。３番目の場合では、得られたコード配列には矛盾があり、従って、再配列があったことを明らかに示す。この再配列（欠失）の性質は本明細書によれば同定可能である。
【図７】重複コードを示す。  重複コード。プローブの３つの性質はＡ、ＢおよびＣの文字で表される。上段では、あるものが、７つの連続するプローブからなる種々のコード配列を、その最後の６つのプローブが次にくるものの最初の６つのプローブに相当するように並べることによりどのようなものかを示し、７文字の連続が１回である連続プローブを得ることができる。下段では、７文字のあり得る総ての前提など、連続する２１９３文字のＡ、ＢおよびＣが一度だけ表される。従って、例えばコード配列ａｂａａｃｃｂを含む／理解するフラグメントが検出されれば、それは赤色の領域から得られるものであることが分かる。
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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