(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノウイルスが、下記：
−  欠損している機能的野生型Ｅ１領域、ここで前記欠損している機能的野生型Ｅ１領域は、タンパク質ＩＸマイナスである、及び
−  Ｅ１Ｂ５５Ｋをコードする核酸及びＥ４ｏｒｆ６をコードする核酸、ここでＥ１Ｂ５５Ｋをコードする核酸は、プロモーターのコントロール下にあり、Ｅ４ｏｒｆ６をコードする核酸は、プロモーターのコントロール下にあり、Ｅ４ｏｒｆ６タンパク質及びＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質の複合体が、アデノウイルスに感染した細胞の核内へのＹＢ−１の輸送のためのトランスポーターを形成する
を含むこと、そして、
前記アデノウイルスが、タンパク質ＩＸをコードする組換え核酸を含み、タンパク質ＩＸを発現し、
ここでアデノウイルスは、核内にＹＢ−１を有するか、または細胞周期から独立して核内にＹＢ−１を有する細胞内で複製可能であるが、ＹＢ−１が調節解除されたところのか、または調節解除された場合の細胞内で複製欠損である
ことを特徴とする、アデノウイルス。
【請求項２】
欠損している機能的野生型Ｅ１Ａ領域がＥ１Ａマイナスであることを特徴とする、請求項１に記載のアデノウイルス。
【請求項３】
欠損している機能的野生型Ｅ１領域がＥ１Ｂマイナスであることを特徴とする、請求項１又は２に記載のアデノウイルス。
【請求項４】
欠損している野生型Ｅ１領域がＥ１Ｂ５５Ｋマイナス及び／又はＥ１Ｂ１９Ｋマイナスであることを特徴とする、請求項３に記載のアデノウイルス。
【請求項５】
前記トランスポーターがアデノウイルスによって提供されるトランスポーターであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項６】
前記トランスポーターが少なくとも二つのファクターの複合体であり、各ファクターが核酸によってコードされ、両核酸が共通のプロモーターによってコントロールされることを特徴とする、請求項１に記載のアデノウイルス。
【請求項７】
両核酸が発現強度をコントロールする要素によって結合され、前記要素がＩＲＥＳを含む群から選択されることを特徴とする、請求項６に記載のアデノウイルス。
【請求項８】
前記トランスポーターが少なくとも二つのファクターの複合体であり、各ファクターが核酸によってコードされ、両核酸が適切なプロモーターによってコントロールされることを特徴とする、請求項１に記載のアデノウイルス。
【請求項９】
前記プロモーターがアデノウイルスＥ４プロモーターとは異なり、かつ、アデノウイルスＥ１Ｂプロモーターとは異なることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項１０】
前記プロモーターが組織特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ウイルスプロモーターおよびアデノウイルスプロモーターを含む群から選択され、ただし、これらは、Ｅ４プロモーター、Ｅ１ＢプロモーターおよびＥ２後期プロモーターとは異なることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項１１】
トランスポーターをコードする前記核酸がＥ１Ｂ５５Ｋの３’末端に３’−ＵＴＲを有することを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項１２】
トランスポーターをコードする核酸がタンパク質ＩＸをコードすることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項１３】
アデノウイルスがＥ１Ｂ５５ＫおよびＥ１Ｂ１９Ｋをコードする核酸を含み、Ｅ１Ｂ５５ＫおよびＥ１Ｂ１９Ｋがプロモーターのコントロール下にあることを特徴とする、請求項１または１２に記載のアデノウイルス。
【請求項１４】
アデノウイルスがＥ１Ｂ５５Ｋおよび／またはＥ１Ｂ１９Ｋおよび／またはタンパク質ＩＸをコードする核酸を含み、Ｅ１Ｂ５５Ｋおよび／またはＥ１Ｂ１９Ｋおよび／またはタンパク質ＩＸをコードする核酸がプロモーターのコントロール下にあり、前記プロモーターがＥ１Ａ依存性プロモーターとは異なることを特徴とする、請求項１または１２に記載のアデノウイルス。
【請求項１５】
前記欠損している機能的野生型Ｅ１領域がＥ１Ａ１３Ｓマイナスおよび／またはＥ１Ａ１２Ｓマイナスであることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項１６】
前記欠損している機能的野生型Ｅ１領域がＥ１Ａ１３Ｓマイナスであることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項１７】
前記欠損している野生型Ｅ１領域がＥ１Ａ１３ＳマイナスおよびＥ１Ａ１２Ｓマイナスであり、前記アデノウイルスがＥ１Ａ１２Ｓタンパク質をコードする核酸を含み、前記核酸が、異種核酸であることを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項１８】
Ｅ１Ａ１２Ｓタンパク質をコードする核酸がプロモーターのコントロール下にあり、前記プロモーターがＹＢ−１依存性プロモーター、またはアデノウイルスＥ２後期プロモーター、ＭＤＲプロモーターおよびＤＮＡポリメラーゼαプロモーターを含む群から選択されるプロモーターであることを特徴とする、請求項１７に記載のアデノウイルス。
【請求項１９】
前記アデノウイルスがタンパク質ＩＸをコードする核酸を含み、Ｅ１Ａ１２Ｓをコードする核酸およびタンパク質ＩＸをコードする核酸が共通のプロモーターのコントロール下にあり、両核酸が発現をレギュレーションする要素によって互いに連結されており、前記要素がＩＲＥＳを含む群から選択されることを特徴とする、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項２０】
Ｅ１Ａ１２Ｓタンパク質をコードする前記核酸およびタンパク質ＩＸをコードする前記核酸がそれぞれプロモーターのコントロール下にあり、前記プロモーターが同一のプロモーターであることを特徴とする、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項２１】
前記プロモーターがＹＢ−１依存性プロモーター、またはアデノウイルスＥ２後期プロモーター、ＭＤＲプロモーターおよびＤＮＡポリメラーゼαプロモーターを含む群から選択されるプロモーターであることを特徴とする、請求項１９または２０に記載のアデノウイルス。
【請求項２２】
前記アデノウイルスがＹＢ−１をコードする核酸を含むことを特徴とする、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項２３】
Ｅ１Ａ１２Ｓタンパク質をコードする核酸およびＹＢ−１をコードする前記核酸が共通のプロモーターのコントロール下にあり、両核酸が発現をレギュレーションする要素によって互いに連結されており、前記要素がＩＲＥＳを含む群から選択されることを特徴とする、請求項２２に記載のアデノウイルス。
【請求項２４】
ＹＢ−１をコードする前記核酸およびＥ１Ａ１２Ｓタンパク質をコードする核酸がそれぞれプロモーターのコントロール下にあり、前記プロモーターが同一のプロモーターであることを特徴とする、請求項２２に記載のアデノウイルス。
【請求項２５】
プロモーターがＹＢ−１依存性プロモーターであり、アデノウイルスＥ２後期プロモーター、ＭＤＲプロモーターおよびＤＮＡポリメラーゼαプロモーターを含む群から選択されることを特徴とする、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項２６】
Ｅ１Ａ１２Ｓをコードする核酸がＥ３領域またはＥ４領域内にクローニングされていることを特徴とする、請求項１６〜２５のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項２７】
Ｅ１Ａ１２Ｓをコードする核酸およびタンパク質ＩＸをコードする核酸またはＹＢ−１をコードする核酸がＥ３領域またはＥ４領域内にクローニングされていることを特徴とする、請求項１６〜２６のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項２８】
前記アデノウイルスが少なくとも一つの、Ｅ３領域内にクローニングされているトランスジーンを含むことを特徴とする、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項２９】
前記アデノウイルスが少なくとも一つの、Ｅ４領域内にクローニングされているトランスジーンを含むことを特徴とする、請求項２８に記載のアデノウイルス。
【請求項３０】
ＲＧＤモチーフをコードする核酸を含み、前記ＲＧＤモチーフがファイバーノブのＨＩループドメイン内にクローニングされている、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項３１】
さらにＭＬＰ遺伝子および／またはＥ２Ａ遺伝子とＥ２Ｂ遺伝子および／またはＥ３遺伝子および／またはＥ４遺伝子を含む、１〜３０のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項３２】
前記アデノウイルスが核内にＹＢ−１を含まない細胞内で複製欠損であることを特徴とする、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項３３】
前記アデノウイルスが腫瘍細胞内、または細胞分裂阻害剤および／または放射線に対して耐性である腫瘍細胞内で複製することができることを特徴とする、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のアデノウイルス。
【請求項３４】
前記細胞が多剤耐性であることを特徴とする、請求項３３に記載のアデノウイルス。
【請求項３５】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載のアデノウイルスをコードする核酸。
【請求項３６】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載のアデノウイルスまたは請求項３５に記載の核酸または前記核酸を含むベクターまたは該核酸を含む複製システムの、腫瘍および／または癌を形成する細胞が核内にＹＢ−１を有するか、または調節解除されたＹＢ−１を有する、腫瘍および／または癌の処置のための薬剤の製造、および／または細胞が細胞分裂阻害剤および／または放射線に対して耐性である腫瘍細胞である、細胞分裂阻害剤および／または放射線に対する細胞の感受性の回復のための薬剤の製造のための、使用。
【請求項３７】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載のアデノウイルスまたは請求項３５に記載の核酸の細胞内でのインビトロ複製のための使用であって、前記細胞が核内にＹＢ−１を含むか、または前記細胞周期から独立して核内にＹＢ−１を含むか、または前記細胞が調節解除されたＹＢ−１を含む、使用。
【請求項３８】
前記細胞が、前記細胞に適用されたかまたは前記細胞に適用される、放射線、細胞分裂阻害剤の投与および温熱療法を含む群から選択される手段の後かまたは手段によって前記核内にＹＢ−１を含むことを特徴とする、請求項３７に記載の使用。
【請求項３９】
腫瘍を形成する細胞の少なくとも一部が細胞周期から独立して核内にＹＢ−１を含む細胞であるか、または前記腫瘍を形成する細胞の少なくとも一部が腫瘍細胞であり、細胞分裂阻害剤および／または放射線に対して耐性である腫瘍細胞であることを特徴とする、請求項３６に記載の使用。
【請求項４０】
前記腫瘍を形成する細胞またはその一部が、細胞分裂阻害剤に対する耐性または多剤耐性であることを特徴とする、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
前記細胞が、膜結合輸送タンパク質Ｐ糖タンパク質の過発現を示すことを特徴とする、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４２】
前記細胞が核内にＹＢ−１を有するか、または腫瘍を形成する細胞またはその一部が核内にＹＢ−１を有することを特徴とする、請求項３６〜４１のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４３】
前記腫瘍が核内へのＹＢ−１の輸送の誘導後に核内にＹＢ−１を含むことを特徴とする、請求項３６〜４２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項４４】
前記核内へのＹＢ−１の輸送が放射線、細胞分裂阻害剤および温熱療法の適用を含む群から選択される少なくとも一つの手段によってトリガーされることを特徴とする、請求項４３に記載の使用。
【請求項４５】
腫瘍の処置のためのおよび／または細胞分裂阻害剤および／または放射線に対する細胞の感受性の回復のための薬剤の製造のための請求項１〜３４のいずれか１項に記載のアデノウイルスをコードする核酸の使用であって、前記細胞が、細胞分裂阻害剤および／または放射線に対して耐性である腫瘍細胞であり、前記耐性が因子により媒介され、因子の転写、翻訳および／または活性がＹＢ−１によりコントロールされる、使用。
【請求項４６】
腫瘍を形成する細胞またはその一部が、細胞分裂阻害剤に対して耐性であるか、または多剤耐性であることを特徴とする、請求項４５に記載の使用。
【請求項４７】
請求項３６〜４４のいずれか１項に記載の使用のための請求項３５に記載の核酸を含むベクター。
【請求項４８】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載のアデノウイルスまたは請求項３５に記載の核酸を含む医薬組成物。
【請求項４９】
前記組成物が少なくとも一つのさらなる医薬的に活性な薬剤を含む、請求項４８に記載の医薬組成物。
【請求項５０】
前記医薬的に活性な薬剤がサイトカイン、メタロプロテイナーゼ阻害剤、血管新生阻害剤、細胞分裂阻害剤、細胞周期阻害剤、プロテオソーム阻害剤、組換え抗体、シグナル変換カスケードおよびタンパク質キナーゼの阻害剤を含む群から選択される、請求項４９に記載の医薬組成物。
【請求項５１】
前記組成物が少なくとも二つの化合物の組み合わせを含み、任意の化合物がそれぞれそして独立して細胞分裂阻害剤を含む群から選択されることを特徴とする、請求項４８〜５０のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５２】
少なくとも二つの化合物が異なる標的分子を標的にすることを特徴とする、請求項５１記載の医薬組成物。
【請求項５３】
少なくとも二つの化合物が異なる作用機序による活性を有することを特徴とする、請求項５０〜５２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５４】
少なくとも一つの化合物がアデノウイルスが複製している細胞の感染性を高めることを特徴とする、請求項５１〜５３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５５】
少なくとも一つの化合物が、前記化合物の有効性を増加させ、前記化合物が一度でアデノウイルスの、又はアデノウイルスが複製する細胞におけるアデノウイルスの取り込みを媒介することを特徴とする、請求項５１〜５４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５６】
少なくとも一つの化合物が核内へのＹＢ−１の輸送を媒介するか、または増加させることを特徴とする、請求項５１〜５５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５７】
少なくとも一つの化合物がヒストンデアシラーゼ阻害剤であることを特徴とする、請求項５１〜５６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５８】
ヒストンデアシラーゼ阻害剤がトリコスタチンＡ、ＦＲ９０１２２８、ＭＳ−２７−２７５、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、ＰＸＤ１０１、アピシジン及びスクリプタイドを含む群から選択されることを特徴とする、請求項５７に記載の医薬組成物。
【請求項５９】
少なくとも一つの化合物がトリコスタチンＡ、ＦＲ９０１２２８、ＭＳ−２７−２７５、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、ＰＸＤ１０１、アピシジン及びスクリプタイドを含む群から選択されることを特徴とする、請求項５１〜５７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６０】
少なくとも一つの化合物がトポイソメラーゼ阻害剤であることを特徴とする、請求項５１〜５９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６１】
前記トポイソメラーゼ阻害剤がカンプトテシン、イリノテカン、トプテカン、ＤＸ−８９５Ｉｆ、ＳＮ−３８、９−アミノカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシン、ダウノルビシン及びエトポシドを含む群から選択されることを特徴とする、請求項６０に記載の医薬組成物。
【請求項６２】
前記組成物がトリコスタチンＡ及びイリノテカンを含むことを特徴とする、請求項４９〜６１のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６３】
前記アデノウイルスが少なくとも二つの化合物の一つまたは両者または全部から分離されていることを特徴とする、請求項４８〜６２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６４】
少なくとも１単位用量のアデノウイルスが少なくとも１単位用量のまたは全部のさらなる医薬的に活性な化合物、または一つの化合物または少なくとも二つの化合物から分離されていることを特徴とする、請求項６３に記載の医薬組成物。
【請求項６５】
請求項１〜３４のいずれか１項に記載のアデノウイルスおよび少なくとも二つの医薬的に活性な薬剤を含み、各医薬的に活性な薬剤が個々にかつ独立して細胞分裂阻害剤を含む群から選択されるキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＥ１−マイナス・アデノウイルスおよびそれの核酸コードするおよびそれの使用に関する。
【０００２】
多くの治療的な構想が、腫瘍の処置において、現在使用されている。手術を使用するこを除くと、化学療法および放射線療法が、支配的である。全てのこれらの技術は、しかしながら、患者のための相当な副作用を伴う。複製選択的な腫瘍退縮性ウイルスの使用は、腫瘍の処置のための新規なプラットフォームを提供する。それに関連して、ウイルスの選択的な腫瘍内複製が始められると、ウイルス複製、感染した腫瘍細胞の溶解および隣接した腫瘍細胞へのウイルスの伸展をもたらす。ウイルスの複製能力が腫瘍細胞に限定されていることから、正常組織は複製から、そして、ウイルスによる溶解を免れる。
【０００３】
目下のところ、いくつかのウイルス・システムが、腫瘍溶解を目的とする臨床試験に付されている。この種のアデノウイルスのための1つの実施例は、Ｄｌ１５２０（オニキス０１５）であり、臨床Ｉ相およびII相において首尾よく使用された（Khuri, F.ら、Nature Medicine 6, 879-885, 2000）。オニキス０１５は、完全に欠失されたＥ１Ｂ−５５ｋＤａの遺伝子を有するアデノウィルスである。アデノウィルスのＥ１Ｂ−５５ｋＤａのタンパク質の完全な欠失は、ｐ５３欠損を有する細胞の複製そして細胞溶解はアデノウイルスベクターを用いて可能であり、（Kirn, D.ら、Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 17, 391a, 1998）、それによって、正常細胞は害されないという発見に基づく。より詳しくは、Ｅ１Ｂ−５５ｋＤａの遺伝子産物は、ｐ５３の阻害、ウィルスｍＲＮＡの輸送及び宿主細胞のタンパク質合成のスイッチオフに関与する。ｐ５３の阻害は、ｐ５３およびＥ１Ｂ−５５ｋＤａのタンパク質をコードするアデノウイルス及び／又はＥ１Ｂ−５５ｋＤａ及びＥ４ｏｒｆ６からなる複合体の生成を経て起こる。ＴＰ５３によってコードされるｐ５３は、複合体調節メカニズムのための開始点であり（Zambetti, G.P.ら、FASEB J. 7, 855-865, 1993）、特に、アデノウイルスのようなウイルスの細胞複製の効果的な抑制をもたらす。遺伝子ＴＰ  ５３は、ヒト腫瘍の約50%において欠失するかまたは突然変異しており、化学療法または放射線療法のために、そして、このように通常不成功の腫瘍処置において−所望の−アポトーシスの不在という結果になる。
【０００４】
腫瘍溶解性アデノウイルスの更なる構想は、E1Aタンパク質が、Ｒｂ／Ｅ２Ｆおよび／またはｐ１０７／Ｅ２Ｆおよび／またはｐ１３０／Ｅ２Ｆの結合に影響を及ぼさない、特定の欠失形態にあるか又は１またはいくつかの突然変異を含む場合、このアデノウイルスが感染細胞をＳ期への進入を誘導せず、機能的Ｒｂタンパク質を有しない腫瘍細胞において複製することができる発見に基づく。加えて、Ｅ１Ａタンパク質は、Ｎ末端で欠失することができ、Ｅ１Ａタンパク質のアミノ酸位置１〜７６の領域における１またはいくつかの突然変異を含むことができ、Ｅ１Ａのｐ３００への結合を阻害し、そして腫瘍細胞におけるより選択的な複製を提供する。これらの方法は、欧州特許EP 0 931 830に例示的な様式で記載されている。この種のウイルスの例は、ＡｄＤ２４、ｄｌ９２２〜９４７、Ｅ１Ａｄ／０１／０７及びＣＢ０１６である（Howe, J. A.ら、Molecular Therapy 2, 485-495, 2000、 Fueyo, J.ら、Oncogene 19, 2-12, 2000、 Heise, C.ら、Nature Medicine 6, 11341139, 2001、Balague, C.ら、J. Virol. 75, 7602-7611, 2001）。これらのアデノウイルスシステムは先行技術として知られており、機能的Rbタンパク質及びそれぞれ、インタクトなＲｂタンパク質およびE2Fをからなっている複合体が有効なインビボでの複製をブロックし、そして、Ｒｂ−ネガティブ／突然変異された細胞だけで、インビボでのアデノウイルス複製を示すことを前提として、Ｅ１Ａタンパク質における異なった欠失を含む。従来の技術に従うこれらのアデノウイルスシステムは、Ｅ１Ａに基づき、初期E2プロモーター（Ｅ２初期プロモーター）及びフリーのＥ２Ｆによって、インビボでの複製をコントロールする（Dyson, N. Genes & Development, 12, 2245-2262, 1998）。腫瘍溶解性アデノウイルスシステムの他の形態は、
【０００５】
ウィルスの癌遺伝子E1Aを特異的に発現する選択的なプロモーターの使用に基づき、腫瘍細胞における選択的な複製を提供する（Rodriguez, R.ら、Cancer Res. 57, 2559-2563, 1997）。
【０００６】
上述の通り、それぞれの構想の基礎をなしている作用様式に適切である細胞バックグラウンドの選択は、アデノウイルス腫瘍溶解性ウイルスのさまざまな構想にとって重要である。換言すれば、異なった分子生物学的必要条件が現実になる場合、現在公知のさまざまなアデノウイルスシステムを、使用できるだけである。これは、異なった患者グループへのこの種のシステムの使用を制限する。
【０００７】
腫瘍疾患の処置における特定の課題は、一旦患者が、細胞増殖抑止剤に対する腫瘍の耐性の特に良く研究された形態を示す、いわゆる多剤耐性（ＭＤＲ）になると生じる（Gottesman and Pastan, Annu. Rev. Biochem. 62, 385-427, 1993）。それは、いわゆるＡＢＣ輸送体に属する膜結合型輸送タンパク質Ｐ糖タンパク質の過剰発現に基づく（Stein, U.ら、JBC 276, 28562-69, 2001, J. Wijnholds, Novartis Found Symp., 243, 69-79, 2002）。Bargou, R. C.ら、およびOda, Y.らは、（Bargou, R. C.ら、Nature Medicine 3, 447-450, 1997, Clin. Cancer Res. 4, 2273-2277, 1998）ヒト転写因子Ｙｂ−１の核局在化がＰ糖タンパク質の発現の活性化に直接に関与することを示すことができた。更なる研究は、Ｙｂ−１が、さまざまなストレス状態、例えばＵＶ照射、細胞増殖抑止剤の投与（Koike, K.ら、FEBS Lett 17, 390-394, 1997）および温熱療法（Stein, U.ら、JBC 276, 28562-69, 2001））によって、核に輸送されることを確認した。更なる研究は、Ｙｂ−１の核局在化が他のＡＢＣトランスポーターに影響を及ぼすことを確認した。このＡＢＣトランスポーターは、ＭＲＰ（多種薬剤の耐性関連のタンパク質）と称し、そして、非定型の、非Ｐ糖タンパク質依存性多剤耐性の形成に関与する（Stein, U.ら、JBC 276, 28562-69, 2001）。
【０００８】
本発明の基礎をなしている課題は、生物、より具体的には、ヒト及び一群の患者を、それぞれ、腫瘍溶解性な活性薬剤で治療することを可能にする、技術的な教示、特に手段を提供することである。細胞増殖抑止剤、特に多剤耐性を有するそれらに対して耐性を示す腫瘍病を患っている患者において腫瘍溶解を引き起こすために適切である手段を提供することは、本発明の基礎となる更なる課題である。本発明の基礎をなしているさらなる課題は、細胞溶解に適しているアデノウイルスを提供することである。本発明の基礎をなしている他の課題は、腫瘍細胞において、特に細胞周期から独立している核内にＹｂ−１を有する腫瘍細胞において、又は調節解除されたYb-1を有する腫瘍細胞においてで複製し、そして、特に高い粒子生成を示すウイルスを提供することである。
【０００９】
本発明によると、課題は、添付した独立項の主題により解決される。好ましい実施態様は、また、取り付けられた従属クレームからとられることが可能である。
【００１０】
第１の形態において、課題はまた、ウイルス、好ましくはアデノウイルスによって、本発明によって解決される、ここで、ウイルスは、
−  欠損している機能的野生型Ｅ１領域、及び
−  ウイルスに感染した細胞の核内へのＹＢ−１の輸送のためのトランスポーター
を含む。
【００１１】
第１の形態の実施態様において、ウイルスがタンパク質ＩＸをコードする核酸を含み、タンパク質ＩＸを発現する。
【００１２】
第１の形態の実施態様において、欠損している機能的な野生型E1A領域は、Ｅ１Ａ−マイナスである。
【００１３】
第１の形態の実施態様において、欠損している機能的な野生型E1領域は、Ｅ１Ｂ−マイナスである。
【００１４】
欠損している野生型Ｅ１領域がＥ１Ｂ５５Ｋマイナス及び／又はＥ１Ｂ１９Ｋマイナス及び／又はタンパク質ＩＸマイナスである。
【００１５】
第１の形態の実施態様において、トランスポーターは、ウイルスにより提供されるトランスポーターである。
【００１６】
第１の形態の好ましい実施態様において、トランスポーターは、ウイルストランスポーターである。
【００１７】
第１の形態の実施態様において、トランスポーターは、タンパク質Ｅ４ｏｒｆ６を含む。
【００１８】
第１の形態の実施態様において、トランスポーターは、タンパク質Ｅ１Ｂ５５Ｋを含む。
【００１９】
第１の形態の実施態様において、トランスポーターは、Ｅ４ｏｒｆ４、及び、Ｅ１Ｂ５５Ｋの複合体を含む。
【００２０】
第１の形態の実施態様において、前記トランスポーターが核酸によってコードされ、前記核酸がプロモーターのコントロール下にある。
【００２１】
第１の形態の好ましい実施例において、前記トランスポーターが少なくとも二つのファクターの複合体であり、各ファクターが核酸によってコードされ、両核酸が共通のプロモーターによってコントロールされる。
【００２２】
第１の態様の好ましい実施例において、両核酸が発現強度をコントロールする要素によって結合され、前記要素が好ましくはＩＲＥＳを含む群から選択される。
【００２３】
第１の形態の好ましい別の実施例において、前記トランスポーターが少なくとも二つのファクターの複合体であり、各ファクターが核酸によってコードされ、両核酸が適切なプロモーターによってコントロールされる。
第１の形態の実施態様において、プロモーターがＥ４プロモーター、特にアデノウイルスＥ４プロモーターとは異なり、かつ、Ｅ１Ｂプロモーター、特にアデノウイルスＥ１Ｂプロモーターとは異なる。
【００２４】
第１の態様の実施態様において、プロモーターが組織特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ウイルスプロモーター、特にアデノウイルスプロモーターを含む群から選択され、ただし、これらは、Ｅ４プロモーター、Ｅ１Ｂプロモーターおよび好ましくはＥ２後期プロモーターとは異なる。
【００２５】
第１の態様の実施態様において、トランスポーターをコードする前記核酸がＥ１Ｂ５５Ｋの３′末端に３′−ＵＴＲを有する。
【００２６】
第１の形態の実施態様において、欠損している野生型Ｅ１領域がＥ１Ｂ５５Ｋポジティブである場合は、前記トランスポーターをコードする核酸がＥ１Ｂ５５Ｋをコードする核酸を含まない。
【００２７】
第１の形態の実施態様において、トランスポーターをコードする前記核酸がＥ１Ｂ５５ＫおよびＥ１Ｂ１９Ｋをコードする。
【００２８】
第１の態様の実施態様において、トランスポーターをコードする前記核酸がタンパク質ＩＸをコードする。
【００２９】
第１の形態の好ましい実施例において、Ｅ１Ｂ５５ＫおよびＥ１Ｂ１９Ｋをコードする前記核酸がプロモーターのコントロール下にある。
【００３０】
第１の形態の他の好ましい実施例において、Ｅ１Ｂ５５Ｋおよび／またはＥ１Ｂ１９Ｋおよび／またはタンパク質ＩＸをコードする前記核酸がプロモーターのコントロール下にあり、前記プロモーターがＥ１Ａ依存性プロモーターとは異なる。
【００３１】
第１の形態の実施態様において、欠損している機能的野生型Ｅ１領域がＥ１Ａ１３Ｓマイナスおよび／またはＥ１Ａ１２Ｓマイナスである。
【００３２】
第１の形態の実施態様において、欠損している機能的野生型Ｅ１領域がＥ１Ａ１３Ｓマイナスである。
【００３３】
好ましくは第１の形態の実施態様において、好ましくは、前記欠損している野生型Ｅ１領域がＥ１Ａ１３ＡマイナスおよびＥ１Ａ１２マイナスであり、前記ウイルスがＥ１Ａ１２Ｓタンパク質をコードする核酸を含み、好ましくは、前記核酸が、異種核酸である。
【００３４】
第１の形態の好ましい実施例において、Ｅ１Ａ１２Ｓタンパク質をコードする前記核酸がプロモーターのコントロール下にあり、好ましくは、前記プロモーターがＹＢ−１依存性プロモーター、より好ましくは、アデノウイルスＥ２後期プロモーター、ＭＤＲプロモーターおよびＤＮＡポリメラーゼαプロモーターを含む群から選択される。
【００３５】
第１の態様、及び、特に前の実施態様において、前記トランスポーターをコードする前記核酸がＥ４ｏｒｆ６およびＥ１Ｂ５５Ｋをコードする。
【００３６】
第１の態様、及び、特に前の実施態様において、前記ウイルスがタンパク質ＩＸをコードする核酸を含み、好ましくは、Ｅ１Ａ１２Ｓをコードする前記核酸およびタンパク質ＩＸをコードする前記核酸が共通のプロモーターのコントロール下にあり、より好ましくは、両核酸が発現をレギュレーションする要素によって互いに連結されており、より好ましくは、前記要素がＩＲＥＳを含む群から選択される。
【００３７】
第１の形態の実施態様において、Ｅ１Ａ１２Ｓタンパク質をコードする前記核酸および前記タンパク質ＩＸをコードする前記核酸がそれぞれプロモーターのコントロール下にあり、好ましくは、前記プロモーターが同一のプロモーターである。
【００３８】
第１の形態の好ましい実施例において、プロモーターがＹＢ−１依存性プロモーターであり、好ましくは、アデノウイルスＥ２後期プロモーター、ＭＤＲプロモーターおよびＤＮＡポリメラーゼαプロモーターを含む群から選択される。
【００３９】
第１の形態の実施態様において、ウイルスがＹＢ−１コード核酸を含む。
【００４０】
第１の態様、及び、特に前の実施態様において、Ｅ１Ａ１２Ｓタンパク質をコードする前記核酸およびＹＢ−１をコードする前記核酸が共通のプロモーターのコントロール下にあり、好ましくは、両核酸が発現をレギュレーションする要素によって互いに連結されており、好ましくは、前記要素がＩＲＥＳを含む群から選択される。
【００４１】
第１の形態の好ましい別の実施例において、ＹＢ−１をコードする前記核酸およびＥ１Ａ１２Ｓタンパク質をコードする前記核酸がそれぞれプロモーターのコントロール下にあり、好ましくは、前記プロモーターが同一のプロモーターである。
【００４２】
第１の形態の好ましい実施例において、プロモーターがＹＢ−１依存性プロモーターであり、好ましくは、アデノウイルスＥ２後期プロモーター、ＭＤＲプロモーターおよびＤＮＡポリメラーゼαプロモーターを含む群から選択される。
【００４３】
第１の形態の実施態様において、Ｅ１Ａ１２Ｓをコードする前記核酸がＥ３領域またはＥ４領域内にクローニングされている。
【００４４】
第１の形態の実施態様において、Ｅ１Ａ１２Ｓをコードする前記核酸およびタンパク質ＩＸをコードする前記核酸またはＹＢ−１をコードする前記核酸がＥ３領域またはＥ４領域内にクローニングされている。
【００４５】
第１の形態の実施態様において、タンパク質ＩＸをコードする前記核酸の前記発現がＥ１Ｂ１９ＫまたはＥ１２ＡＳによるＥ１Ｂとは異なるプロモーターによってコントロールされる。
【００４６】
第１の形態の実施態様において、ウイルスが少なくとも一つの、好ましくは、Ｅ３領域内にクローニングされているトランスジーンを含む。
【００４７】
第１の形態の好ましい実施例において、ウイルスが少なくとも一つの、好ましくは、Ｅ４領域内にクローニングされているトランスジーンを含む。
【００４８】
第１の形態の実施態様において、ＲＧＤモチーフをコードする核酸を含み、好ましくは、前記ＲＧＤモチーフがファイバーノブのＨＩループドメイン内にクローニングされている。
【００４９】
第１の形態の実施態様において、ウイルスは、さらに、ＭＬＰ遺伝子および／またはＥ２Ａ遺伝子とＥ２Ｂ遺伝子および／またはＥ３遺伝子および／またはＥ４遺伝子を含む。
【００５０】
第１の形態の実施態様において、ウイルスは、核内にＹＢ−１を含まない細胞内で複製欠損である。
【００５１】
第１の形態の実施態様において、ウイルスが核内にＹＢ−１を有する、特に細胞周期から独立して核内にＹＢ−１を有する細胞内で複製可能である。
【００５２】
第１の形態の別の実施例において、ウイルスは、ＹＢ−１が調節解除されたところのかまたは調節解除された場合の細胞内で複製欠損である。
【００５３】
第１の形態のさらなる別の実施例において、ウイルスは、腫瘍細胞内、好ましくは、細胞分裂阻害剤および／または放射線に対して耐性である腫瘍細胞内で複製することができる。
【００５４】
第１の形態の好ましい実施例において、細胞は、多剤耐性である。
【００５５】
第２の形態において、課題は、発明の第１の態様に従ってウイルスをコードする核酸によって、本発明によって解決される。
【００５６】
第３の形態において、課題は、第１の態様のウイルスまたは第２の態様の核酸または前記核酸またはその一部を含むベクターまたは該核酸を含む複製システムの、薬剤の製造のための、使用によって、本発明によれば解決される。
【００５７】
第４の態様において、課題は、第１の態様のウイルスまたは第２の態様の核酸の細胞内での複製のための使用であって、前記細胞が核内にＹＢ−１を含み、好ましくは、前記細胞周期から独立して核内にＹＢ−１を含むか、または前記細胞が調節解除されたＹＢ−１を含むかまたは前記細胞が腫瘍細胞であり、好ましくは、前記腫瘍細胞が細胞分裂阻害剤および／または放射線に対して耐性である、使用よって、本発明によれば解決される。
【００５８】
第４の形態の実施態様において、細胞が、前記細胞に適用されたかまたは前記細胞に適用されており、放射線、細胞分裂阻害剤および温熱療法を含む群から選択される手段の後かまたは手段によって前記核内にＹＢ−１を含む。
【００５９】
第３の形態の実施態様において、薬剤が腫瘍および／または癌の処置のためおよび／または細胞分裂阻害剤および／または放射線に対する細胞の感受性の回復のためであり、好ましくは、前記細胞が細胞分裂阻害剤および／または放射線に対して耐性である腫瘍細胞である。
【００６０】
第３の態様の実施態様において、腫瘍を形成する前記細胞の少なくとも一部が前記核内にＹＢ−１を有する細胞であり、好ましくは、前記細胞周期から独立して核内にＹＢ−１を含むか、または前記腫瘍を形成する細胞の少なくとも一部が調節解除されたＹＢ−１を有するかまたは前記腫瘍を形成する細胞の少なくとも一部が腫瘍細胞であり、より好ましくは、細胞分裂阻害剤および／または放射線に対して耐性である腫瘍細胞である。
【００６１】
第３の形態の好ましい実施態様において、細胞、具体的には、前記腫瘍を形成する前記細胞またはその一部が耐性、特に、薬物、好ましくは、抗腫瘍剤、より好ましくは、細胞分裂阻害剤に対する多剤耐性である。
【００６２】
第３及び第４の形態の実施態様において、細胞が発現、より好ましくは、膜結合輸送タンパク質Ｐ糖タンパク質の過発現を示す。
【００６３】
第３及び第４の形態の実施態様において、細胞が前記核内にＹＢ−１を有する、具体的には、腫瘍を形成する前記細胞またはその一部が前記核内にＹＢ−１を有する。
【００６４】
第３及び第４の形態の実施態様において、腫瘍が前記核内へのＹＢ−１の輸送の誘導後に前記核内にＹＢ−１を含む。
【００６５】
第３及び第４の形態の好ましい実施態様において、核内へのＹＢ−１の前記輸送が放射線、細胞分裂阻害剤および温熱療法の適用を含む群から選択される少なくとも一つの手段によってトリガーされる。
【００６６】
第３及び第４の形態の好ましい実施例において、手段が細胞、器官または生物に適用される。
【００６７】
第５の形態において、課題は、第１の態様またはそれの一部に従って、ウイルス、特にアデノウイルスまたはその一部をコードする核酸を含み、ヘルパーウイルスの核酸を含む、ウイルス複製システム、具体的にはアデノウイルス複製システムの使用であって、前記ヘルパーウイルスの核酸がＹＢ−１をコードする核酸配列を含み、場合により、前記ウイルスと相補的である、好ましくは、薬剤の製造のための、より好ましくは、腫瘍および／または癌の処置のための、および／または細胞分裂阻害剤および／または放射線に対する細胞の感受性の回復のための使用であって、前記細胞が好ましくは、細胞分裂阻害剤および／または放射線に対して耐性である腫瘍細胞である、使用によって、本発明により解決される。
【００６８】
第５の形態の実施態様において、ウイルス核酸、好ましくは、アデノウイルス核酸および／またはヘルパーウイルスの核酸が複製可能なベクターとして存在する。
【００６９】
第６の形態において、課題は、薬剤の製造のための、具体的には、腫瘍の処置のためのおよび／または細胞分裂阻害剤および／または放射線に対する細胞の感受性の回復のための薬剤の製造のための第１の態様に従うウイルス、好ましくは、アデノウイルスをコードする核酸の使用であって、前記細胞が、好ましくは、細胞分裂阻害剤および／または放射線に対して耐性である腫瘍細胞である、使用によって、本発明により解決される。
【００７０】
第６の形態の実施態様において、細胞、好ましくは、腫瘍を形成する前記細胞またはその一部が、耐性、特に、薬物、好ましくは、抗腫瘍剤、より好ましくは、細胞分裂阻害剤に対する多剤耐性である。
【００７１】
第６の形態の実施態様において、細胞、好ましくは、腫瘍を形成する前記細胞またはその一部が、耐性、特に、薬物、好ましくは、抗腫瘍剤、より好ましくは、細胞分裂阻害剤に対する多剤耐性である。
【００７２】
第７の形態において、好ましくは、第３及び第４の形態による使用のために、課題は、第２の形態による核酸を含むベクターによって、本発明により解決される。
【００７３】
第８の形態において、課題は、細胞、腫瘍組織または患者の細胞が第１の形態のウイルス、特にアデノウイルスまたは第１の形態の核酸と接触および／または処置することができる／すべきであるか否かを決定するための、細胞、腫瘍組織または患者の細胞の特徴づけのためのＹＢ−１と相互作用する薬剤の使用
【００７４】
第８の形態の実施態様において、薬剤が抗体、高アフィニティー結合ペプチド、アンチカリン、アプタマー、アプタザイムおよびスピーゲルマーを含む群から選択される。
【００７５】
第９の形態において、課題は、第１の形態によるウイルスまたは第２の形態の核酸または第５の形態のウイルス複製システムを含む医薬組成物によって、本発明により解決される。
【００７６】
第９の形態の実施態様において、組成物が少なくとも一つのさらなる医薬的に活性な薬剤を含む。
【００７７】
第９の形態の好ましい実施態様において、薬学的に活性薬剤は、部位カイン、メタロプロテイナーゼ阻害剤、血管新生阻害剤、細胞分裂阻害剤、細胞周期阻害剤、プロテオソーム阻害剤、組換え抗体、シグナル変換カスケードおよびタンパク質キナーゼの阻害剤を含む群から選択される。
【００７８】
第９の形態の実施態様において、組成物は、少なくとも二つの化合物の組み合わせを含み、好ましくは、任意の化合物がそれぞれそして独立して部位カインを含む群から選択される。
【００７９】
好ましい第９の形態の実施態様において、少なくとも二つの化合物が異なる標的分子を標的にする。
【００８０】
第９の形態の実施態様において、少なくとも二つの化合物が異なる作用機序によって活性である。
【００８１】
第９の形態の実施態様において、少なくとも一つの化合物は、ウイルスが複製している細胞の感染性を高める。
【００８２】
第９の形態の実施態様において、少なくとも一つの化合物が前記細胞内の化合物の有効性に影響し、好ましくは、前記化合物の有効性を増加させ、前記化合物が一度でウイルスの、又は前記細胞、好ましくはウイルスが複製する細胞におけるウイルスの取り込みを媒介する。
【００８３】
第９の実施態様において、少なくとも一つの化合物が前記核内へのＹＢ−１の輸送を媒介する、好ましくは増加させる。
【００８４】
第９の形態の実施態様において、少なくとも一つの化合物は、ヒストンデアシラーゼ阻害剤である。
【００８５】
第９の形態の好ましい実施態様において、ヒストンデアシラーゼ阻害剤がトリコスタチンＡ、ＦＲ９０１２２８、ＭＳ−２７−２７５、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、ＰＸＤ１０１、アピシジン及びスクリプタイドを含む群から選択される。
【００８６】
第９の形態の実施態様において、少なくとも一つの化合物は、トリコスタチンＡ、ＦＲ９０１２２８、ＭＳ−２７−２７５、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、ＰＸＤ１０１、アピシジン及びスクリプタイドを含む群から選択される。
【００８７】
第９の形態の実施態様において、少なくとも一つの化合物は、トポイソメラーゼ阻害剤である。
【００８８】
第９の形態の好ましい実施態様において、トポイソメラーゼ阻害剤は、カンプトテシン、イリノテカン、トプテカン、ＤＸ−８９５Ｉｆ、ＳＮ−３８、９−アミノカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシン、ダウノルビシン及びエトポシドを含む群から選択される。
【００８９】
第９の形態の実施態様において、組成物は、トリコスタチンＡ及びイリノテカンを含む
【００９０】
第９の形態の実施態様において、ウイルス、特に本発明の第１の態様によるウイルスが前記少なくとも二つの化合物の一つまたは両者または全部から分離されている。
【００９１】
第9の形態の好ましい実施態様において、少なくとも１単位用量のウイルスが少なくとも１単位用量のまたは全部のさらなる医薬的に活性な化合物、または一つの化合物または少なくとも二つの化合物から分離されている。
【００９２】
第１０の形態において、課題は、ウイルス、好ましくは本発明の第１の態様によるウイルスおよび少なくとも二つの医薬的に活性な薬剤を含み、各医薬的に活性な薬剤が個々にかつ独立して細胞分裂阻害剤を含む群から選択されるキットによって、本発明により解決される。
【００９３】
本発明は、その本発明によるウイルス、すなわち、野生型アデノウイルス存在する機能的なＥ１領域を欠き、及び、同時に、トランスポーター、トランスポーターのためのコードを含み、細胞周期から独立している核またはＹＢ−１が調節解除されている細胞においてＹＢ−１を含む細胞において複製することができるという驚くべき発見に基づく。
【００９４】
加えて、本発明者は、本発明によるウイルスが、また、特に、複製がＹＢ−１によって媒介されるとき、Ｅ１Ａ１３Ｓとは独立して複製することができることを発見した。これに関して、複製は、上記のとおり、それらの細胞において、特に生じる。ここで用いられる、核内にＹＢ−１を含む細胞、好ましくは、細胞周期から独立して核内にＹＢ−１を含む細胞は、本発明によるウイルスの使用による核において、特に、それらを有する細胞の感染のために、核内にＹＢ−１を含む細胞を含む。
【００９５】
最後に、本発明者は、腫瘍退縮性ウイルスとして使用されるときに、タンパク質ＩＸが重要なファクター、特に本発明によるウイルスの有効性のために重要なファクターであること、そして、このファクターが、ここで開示された構築物によって発現され、Ｅ１Ａ１３Ｓとは独立した複製を介在するＹＢ−１における高い粒子形成をもたらすことを発見した。
【００９６】
調節解除された形態におけるＹＢ−１を含む細胞は、少なくとも一つの下記の特性を有するおよび／またはＹＢ−１を含み、ＹＢ−１は、下記特性の少なくとも一つを奏する。（１）ＹＢ−１は、好ましくは細胞周期とは独立して、細胞において過剰発現し、それによって、好ましくは、発現のための手段として、正常細胞におけるＹＢ−１の発現、すなわち、腫瘍細胞とは異なる細胞または細胞および細胞系、たとえば、肝細胞および繊維芽細胞系ＷＩ３８及びＣＣＤ３２−Ｌｕに言及する。好ましくは、過剰発現は、約２〜１０、好ましくは５〜１０のファクターで増加する発現である。発現、特に過剰発現を測定するための方法は、当業者にとって公知であり、特に、それぞれ好ましくは、ＹＢ−１関するかまたはＹＢ−１の、タンパク質、特にＹＢ−１濃度の測定、ＲＮＡ、特にＹＢ−１のＲＮＡの測定、ウエスタンブロット分析、ノーザンブロット分析およびＲＴ−ＰＣＲを含む。ＹＢ−１でなくてもここに記載された代わりのマーカーも使用することができる。ＹＢ−１の過剰発現を示す細胞系の例は、下記である。結腸癌細胞系２５７ＲＤＢ、膵臓癌細胞系１８１ＲＤＢ、乳癌細胞系ＭＣＦ−７Ａｄｒ、前立腺癌細胞系ＤＵ１４５、前立腺癌細胞系ＰＣ３、神経膠腫細胞系Ｕ３７３、神経膠腫細胞系Ｕ８７、肺癌細胞系Ａ５４９、肝臓癌細胞系Ｈｅｐ３Ｂ及びＨｅｐＧ２。細胞に存在するＹＢ−１は、本発明によるウイルスの複製を可能にする。該条件下での複製効力が強く減らされた複製とは異なることが本発明において好ましい。
【００９７】
ここで用いられる実施態様において、用語、機能的な野生型Ｅ１領域は、特に野生型アデノウイルスＡｄ５に含まれているＥ１領域をいう。実施態様において、用語、機能的な野生型Ｅ１領域を欠損するは、野生型のアデノウイルスに含まれる一つまたはいくつかの機能および機能性を含まないかまたは完全に含まないＥ１領域をいう。一般に機能として以下において称される、機能性または機能は、核酸またはタンパク質、好ましくはタンパク質によって示されるかまたは媒介される。
【００９８】
本発明について、機能の欠如は、翻訳レベルで活性ではない機能によって生じることができる、すなわち、それをコードする核酸がウィルスゲノムにおいてまだあるにもかかわらず、機能を媒介するタンパク質が存在しない。これは、例えば、活性ではない、好ましくは、それぞれの特徴についての野生型のウイルスに存在するような調節およびコントロールコンテキストにはない、翻訳をコントロールしている調節エレメントによって、達成されることが可能であり、これによって、特に、ｍＲＮＡの安定性を提供する該調節エレメントは、例えば、ｍＲＮＡの３′ＵＴＲに存在する。
【００９９】
本発明と関連して機能の欠如は、代替的にまたは追加的に、転写レベルで活性ではない機能によって、生じることがありえる、すなわち、機能の媒介となっているタンパク質が存在せず、そして、それをコードする核酸はウィルスゲノムに含まれないかまたは完全に含まれない。核酸が、機能の減失をもたらす一つまたはいくつかの突然変異を含むことは、この実施態様の範囲内である。好ましくは、該突然変異は、点突然変異および／またはいくつかの塩基を含む欠失および／または転写読み枠またはタンパク質をコードする核酸の完全な欠失である。
【０１００】
タンパク質が野生型の対応するタンパク質の機能または活性の全てを呈するというわけではない場合、機能は、上記の意味において、欠損している。実施態様において、活性のための手段は、該条件下で成し遂げられる複製の範囲であり、それによって、好ましくは、強く異なる複製とは異なる。
【０１０１】
本発明の好ましい実施態様において、野生型ウイルスと比較して、異なる調節性コンテキストのウイルスに含まれるとき、また、機能は、欠損している。異なる調節性のコンテキストは、実施態様1にあり、それによって、他機能と比較して、異なる時点で機能は発現され、および／または転写および／または翻訳をコントロールするかまたは影響する異なる要素のコントロール下である。該要素は、特定の実施態様においてはプロモーターである。
【０１０２】
上記の意味において、機能の欠如は、また、「マイナス」としてそれぞれの機能を参照することによって、ここで表される。例えば、Ｅ１Ａ１３Ｓの欠如は、Ｅ１Ａ１３Ｓマイナスと称する。
【０１０３】
実施態様において、強く減らされた複製とは、特に、野生型と比較して２倍に、好ましくは５倍に、より好ましくは１０倍に、そして最も好ましくは１００倍に、減らされる複製である。好ましい実施態様において、複製の比較は、同一であるか類似した細胞系、同一であるか類似した感染のウィルス力価（感染の多重度、ＭＯＩ、またはプラーク形成単位、ｐｆｕ）および／または同一であるか類似したアッセイ条件を使用して実行される。複製は、特に粒子生成を意味する。さらなる実施態様において、複製のための手段は、ウイルス核酸合成の範囲でありえる。ウイルス核酸の合成の程度を決定する方法は、粒子形成の測定方法であるとして、当業者にとって公知である。
【０１０４】
本発明によるウイルスは、核内にＹＢ−１の輸送のためのトランスポーターを含む。好ましい実施態様において、トランスポーターは、タンパク質、好ましくはウィルスタンパク質である。細胞の核にトランスポーターにより輸送されるＹＢ−１は、特に本明細書で定義されるように、好ましくは調節解除されたＹＢ−１である。しかし、また、ＹＢ−１が、代替的にまたは調節解除されたＹＢ−１に加えたＹＢ−１であり、本発明のウイルスによってコードされるＹＢ−１であり、そして前記ウイルスが感染している細胞において、前記ウイルスにより発現されることは、本発明の範囲内である。
【０１０５】
本発明のウイルスが核内にＹＢ−１を輸送する細胞は、好ましくは、調節解除されたＹＢ−１を含む細胞である。
【０１０６】
ウイルスが該トランスポーターを含むかまたはそれをコードするかどうかを決定することは当業者の技術の範囲内である。実施態様において、細胞を用いることができ、該細胞は子宮頸癌細胞系Ｈｅｌａまたは骨肉腫細胞系Ｕ２ＯＳのような核内に細胞周期とは独立した様式でＹＢ−１を含まず、そして感染、続くウイルスの複製、感染している細胞が核内に、ＹＢ−１を含むかどうかを決定することがでる。別の実施態様において、使用される細胞は、調節解除されたＹＢ−１を含む細胞である。該実験条件下の核内のＹＢ−１の検出は、本願明細書に記載されている手段、特にＹＢ−１に向けられた抗体を使用することにより、当業者により実行されることができる。ウイルスの影響下で、ＹＢ−１が核内で検出されたときは、試験されたウイルスはトランスポーターを含む。
【０１０７】
Ｅ１領域内でコードされた一方または両方のタンパク質群に関して、Ｅ１領域が上記の意味における「マイナス」であるのは、本発明の範囲内である。
【０１０８】
二つのタンパク質群は、Ｅ１Ａタンパク質、特にＥ１Ａ  １３Ｓタンパク質、また、本明細書において、１３Ｓ  Ｅ１Ａとも称される、及び、Ｅ１Ｂタンパク質、特にＥ１Ｂ５５Ｋタンパク質、また、本明細書において、Ｅ１Ｂ５５Ｋとも称される、Ｅ１Ｂ１９Ｋタンパク質、本明細書において、Ｅ１Ｂ１９Ｋとも称される、及びタンパク質ＩＸの群である。
【０１０９】
Ｅ１Ａプロモーター、好ましくは、アデノウイルスＥ１Ａプロモーター、より好ましくは、野生型のアデノウイルスＥ１Ａプロモーターと異なるプロモーターのコントロール下である場合、ウイルスがＥ１Ａ１３Ｓマイナスであること；Ｅ１Ａプロモーター、好ましくはアデノウイルスＥ１Ａプロモーター、より好ましくは、野生型のアデノウイルスＥ１Ａプロモーターと異なるプロモーターのコントロール下である場合、ウイルスが、Ｅ１Ａ１２Ｓマイナスであること；Ｅ１Ｂプロモーター、好ましくはアデノウイルスＥ１Ａプロモーター、より好ましくは、野生型アデノウイルスＥ１Ｂプロモーターとは異なるプロモーターのコントロール下である場合、ウイルスが、Ｅ１Ｂ５５Ｋマイナスであること；Ｅ１Ｂプロモーター、好ましくはアデノウイルスＥ１Ｂプロモーター、より好ましくは、野生型アデノウイルスＥ１Ｂプロモーターと異なるプロモーターのコントロール下である場合、ウイルスが、Ｅ１Ｂ１９Ｋマイナスであること；Ｅ１ＢＩＸプロモーター、好ましくはアデノウイルスＥ１ＢＩＸプロモーター、より好ましくは、野生型アデノウイルスＥ１ＢＩＸプロモーターと異なるプロモーターのコントロール下である場合、ウイルスが、タンパク質ＩＸマイナスであること；そして、Ｅ１ＢＩＸプロモーターのコントロール下であるときは、プロモーターは、ウイルスファクター特にＥ１ＢＩＸプロモーターの活性をコントロールするファクターの欠如のために不活性であり、したがって後者は、調節コンテキストが変化し、より詳しくは調節コンテキストが間接的に変化するかまたはより高い統合または調節レベルで変化した例であること；は本発明の実施態様の範囲内である。一般に、用語変換した調節コンテキストは、間接的にまたはより高い統合または調節のレベルで活性である変化も含む、しかしながら、いかなるケースにおいても、野生型、特に、野生型アデノウイルスの環境とは異なる。
【０１１０】
本発明の実施態様では、ウイルスはＥ１Ａ１３Ｓマイナスである。さらなる実施態様では、ウイルスはＥ１Ａ１２マイナスでもある。これと関連して、ウイルスのＥ１Ａ１２Ｓは、その活性がＹＢ−１によって制御されるプロモーターの制御下にある、特にＹＢ−１によって活性化される場合に特に好ましい。これらのプロモーターは本明細書ではＹＢ−１依存的プロモーターと呼ばれる。特に好適なＹＢ−１依存的プロモーターはアデノウイルスＥ２後期プロモーターである。この構築によって、ＹＢ−１が核酸内に存在する場合にのみウイルス複製中でのＥ１Ａ１２Ｓの活性化が保証される。これは、調節解除されたＹＢ−１を感染細胞の核内に転位させる本発明のウイルストランスポーターを介した調節解除されたＹＢ−１を有する細胞の場合に成立する。野生型における発現と比較して、ウイルストランスポーターおよびＥ１Ａ１２Ｓの経時的に逆転した発現に起因して、Ｅ１Ａ１２Ｓは調節解除されたＹＢ−１を含む細胞において特異的に発現されるため、ウイルス複製がこれらの細胞に限られ、結果的に溶解がこれらの細胞に限定され、このことは特に安全性という点でこのウイルスの顕著な利点を示す。
【０１１１】
これを考慮すると、粒子数は、ＹＢ−１依存性複製において、増加した。本発明者は、ＹＢ−１依存性複製において、タンパク質ＩＸが重要な役割を奏し、そして、その発現がＥ１Ｂ領域のタンパク質によって、好ましくは提供されるトランスポーターの発現の上記経時的な変化によって、不変のままであり、及び、本願明細書において開示される構築物が理解される場合、Ｅ１Ａ１２Ｓは影響を受けないことを認めた。ＹＢ−１依存性複製のための従来技術において記載されているアデノウイルス構築物は、顕著な腫瘍溶解特性にもかかわらず、例えば、別の腫瘍溶菌ウイルスの適用を必要とする、いくつかの適用のためには低い粒子形成を示した。該ウイルスの他の適用は、原則として、可能である、しかしながら、ほとんどの場合所望されない。本願明細書において記載されている構築物については、粒子形成は、明らかに増加させることができた。その範囲において、本発明は、タンパク質ＩＸおよび／またはそれをコードする核酸の、ＹＢ−１依存性複製ウイルス、特にアデノウイルスと関連する、ウイルスの形成、特にアデノウイルス粒子の形成のための、使用に関する。さらにまた、本発明は、薬剤の製造のためのＹＢ−１依存的様式で複製している、ウイルス、好ましくはアデノウイルスの使用に関し、前記ウイルスは、タンパク質ＩＸおよび／またはそれをコードする核酸を含む。特に好ましい実施態様において、薬剤は、本願明細書において記載されているような腫瘍及び腫瘍疾患の処置のためである。さらなる、追加のか又は他の実施態様において、薬剤は、本願明細書において記載される動物細胞において耐性を逆転させるためおよび／または細胞増殖抑止剤および／または放射線に対する細胞の感度の回復のためにあり、それによって、細胞は、好ましくは、耐性、特に本願明細書に記載される細胞増殖抑止剤及び放射線に対する耐性を示す腫瘍細胞である。
【０１１２】
さまざまなトランスジーンがウィルスゲノム内の適切な部位でクローニングされることは、本発明の範囲内である。特に好ましいのは、領域Ｅ１、Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３及びＥ４である。Ｅ１領域へのトランスポーターのクローニングは、特に好ましい。ウィルスゲノムの前記部位へのこれらのトランスジーンのクローニングが該部位によってコードされる遺伝子を部分的にまたは完全に不活化できるかまたは欠失させることは当業者に理解される。しかしながら、それぞれの部位によってコードされる遺伝子が部分的にまたは完全に活性ままでありえることは、本発明の範囲内である。
【０１１３】
本発明のウイルスは、好ましくはアデノウイルスである。
【０１１４】
用語疾患または状態の処置は、好ましい実施態様において、該疾患または状態の予防も含む。
【０１１５】
アデノウイルスのタンパク質ＩＸはカプシド構造を強固にして、ビリオン内におけるウイルスＤＮＡのパッケージングに重要である（Boulangerら、Journal of Virology, 44, 783-800, 1979; Jones und Shenk, Cell, 17, 683-689, 1979）。遺伝子はウイルスゲノム内の３５８１−４０７１位に位置するが（Colby und Shenk T, Journal of Virology, 1981, 39、977-980）、タンパク質ＩＸの遺伝子は複製中のＤＮＡ分子からのみ発現される（Matusi Tら、Molecular and Cellular Biology, 1986, 6, 4149-4154）。
【０１１６】
先行技術に記載されており、ＹＢ−１依存的な複製を行うウイルスＸｖｉｒ０３−３′ＵＴＲは、３′ＵＴＲ配列は同じものを含んでいるため、本発明と関連して一時的に実施された分析で示されたように、タンパク質ＩＸの他、プロモーターを含んでいる。一方、該タンパク質は腫瘍細胞内では弱くしか発現しておらず、野生型ウイルスと比較して、粒子形成は比較的低い。ウイルスＸｖｉｒ０３−３′ＵＴＲは、Ｘｖｉｒ０３−３′ＵＴＲ内に導入された異種ＣＭＶプロモーター（Clontech: Plasmid pShuttle）によって媒介されるように、ウイルスタンパク質Ｅ１Ｂ５５ｋおよびＥ４ｏｒｆ６を発現する。ＣＭＶプロモーターよりも、Ｅ１Ａ発現と関連して本明細書で開示されている全てのプロモーターも使用可能である。両遺伝子のオープンリーディングフレームは、いわゆるＩＲＥＳ配列（内部リボソーム侵入部位、英語：internal ribosomal entry site）によって互いに結合されている（Pelletier, J. and Sonenberg, N. Nature, 1988, 334, 320-325）。このエレメント（Ｎｏｖａｇｅｎ：ｐＣＩＴＥ）は１つのｍＲＮＡから２つのタンパク質の発現を可能にする。１つのＲＮＡから２つのタンパク質の発現のための別の選択肢は短鎖ペプチド（２Ａ）の使用であり、これは口蹄疫ウイルスに由来する（Pablo de Felipe, Genetic Vaccines and Therapy, 2004, 2, 13）。原理上、このエレメントは本明細書に記載の様々な態様において調節ＩＲＥＳ配列の代用として使用可能である。
【０１１７】
本出願以前には未知であった、ＹＢ−１依存的に複製するウイルス、特にアデノウイルスにおけるタンパク質ＩＸの発現調節バックグラウンドから、ＹＢ−１依存的な複製と関連した、ＹＢ−１依存的に複製するウイルスの場合に、基本的に以下の異なる戦略によってタンパク質ＩＸを発現可能であることを本発明者は認識した：
【０１１８】
１．好ましくはタンパク質Ｅ１Ａ１２Ｓおよびタンパク質Ｅ１Ｂ１９の発現を制御する非依存的プロモーターによる。
【０１１９】
非依存的プロモーターは好ましくはＥ１Ｂ  ＩＸプロモーターとは異なるプロモーターである。好ましくは、非依存的プロモーターは組織特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーター、ＹＢ−１依存的ウイルスプロモーターを含むグループから選択される。
【０１２０】
２．Ｅ１Ａ１２Ｓによるタンパク質ＩＸの発現制御。感染細胞におけるＳ期誘導は、Ｅ１Ａ１２Ｓタンパク質の発現によって起こり、これは天然型プロモーターによるタンパク質ＩＸの活性化をもたらす。
【０１２１】
原理上、該プロモーターはトランスポーターの発現のために使用され、野生型ウイルスにおけるトランスポーターの発現を制御するプロモーターとは異なることは本発明の範囲内である。好適な実施態様では、このことはＥ１５５ｋがＥ１Ｂとは異なるプロモーターによって制御され、Ｅ４ｏｒｆ６はＥ４プロモーターとは異なるプロモーターによって制御されることを意味する。別の実施態様では、プロモーターはＥ１Ａ非依存的、即ち、その活性がＥ１Ａの影響を受けないプロモーターである。好適なプロモーターはこのように、特に本明細書に記載されているプロモーターである、組織特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーター、ウイルスプロモーターである。
【０１２２】
特にその任意の態様と関連して、本発明の範囲内において使用可能なＹＢ−１依存的プロモーターは、アデノウイルスＥ２後期プロモーター、ＭＤＲプロモーター［Steinら、J. Biol. Chem, 2001, 276, 28562-28569］、ＤＮＡポリメラーゼαプロモーターの他［En-Niaら、J. Biol. Chem., 2004, Epub ahead of print］であるが、これらに限定されるわけではない。
【０１２３】
本発明の範囲内において有用な適当な非アデノウイルスプロモーターは、サイトメガロウイルスプロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、アデノウイルスベースのプロモーターＶａＩおよび非ウイルスＹＢ−１プロモーター（Makino Y.ら、Nucleic Acids Res. 1996, 15, 1873-1878）を含むグループから選択可能である。本明細書で開示されている発明の任意の態様と関連して使用可能な別のプロモーターは、テロメラーゼプロモーター、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーター、癌胎児性抗原プロモーター（ＣＥＡ）（Cao, G., Kuriyama, S., Gao, J., Mitoro, A., Cui, L., Nakatani, T., Zhang, X., Kikukawa, M., Pan, X., Fukui, H., Qi, Z. Int. J. Cancer, 78, 242-247, 1998）、Ｌプラスチンプロモーター（Chung, I., Schwartz, PE., Crystal, RC., Pizzorno, G, Leavitt, J., Deisseroth, AB. Cancer Gene Therapy, 6, 99-106, 1999）、アルギニンバソプレシンプロモーター（Coulson, JM, Staley, J., Woll, PJ. British J. Cancer, 80, 1935-1944, 1999）、Ｅ２ｆプロモーター（Tsukadaら、Cancer Res., 62, 3428-3477, 2002）、ウロプラキンＩＩプロモーター（Zhangら、Cancer Res., 62, 3743-3750, 2002）、ＰＳＡプロモーター（Hallenbeck PL, Chang, YN, Hay, C, Golightly, D., Stewart, D., Lin, J., Phipps, S., Chiang, YL. Human Gene Therapy, 10, 1721-1733, 1999）である。さらにドイツ特許出願ＤＥ  １０１  ５０  ９８４．７で開示されているアデノウイルスのＹＢ−１依存的Ｅ２後期プロモーターは、本発明の範囲内で使用できるプロモーターである。
【０１２４】
テロメラーゼプロモーターから、それがヒト細胞にとって重要であることは公知である。テロメラーゼ活性は、エンザイムの触媒サブユニットであるテロメラーゼリバーストランスクリプターゼ遺伝子（ｈＴＥＲＴ）の転写コントロールによってコントロールされる。テロメラーゼの発現は、ヒト腫瘍細胞の８５％において活性である。対照的に、それは、生殖細胞及び胎組織を除く大部分の正常細胞において、不活性である（Braunstein, I.ら、Cancer Research, 61, 5529-5536, 2001; Majumdar, A. S.ら、Gene Therapy 8, 568-578, 2001)。ｈＴＥＲＴプロモーターのより詳細な分析は、それぞれ、出発コドンから離れた２８３ｂｐ及び８２ｂｐであるプロモーターの断片が腫瘍細胞における特定の発現に充分であることを示した（Braunstein I.ら；Majumdar ASら、前記)。したがって、このプロモーター及び特定の断片は、それぞれ、腫瘍細胞だけにおいて、遺伝子、特にトランスジーン、好ましくは本願明細書において開示されるトランスジーンの特異的な発現を提供することに適している。
【０１２５】
該プロモーターは、また、腫瘍細胞だけにおいて、本発明のウイルスの、改変癌遺伝子、好ましくはＥ１Ａ癌遺伝子タンパク質の発現を可能にする。また、実施態様において、トランスジーン、特に、Ｅ４ｏｒｆ６、Ｅ１Ｂ５５ｋＤ、ＡＤＰ、及び、ＹＢ−１を含む群から選択される特定のトランスジーンは、これらのプロモーターのうちの一つのコントロール下のアデノウイルスベクターにおいて、発現される。トランス活性化癌遺伝子タンパク質、特にＥ１Ａタンパク質の読み枠がアデノウイルスシステムの遺伝子産物の一つ又はいくつか有するフレームであることは、本発明の範囲内である。このトランス活性化Ｅ１Ａタンパク質の読み枠は、しかしながら、そこから独立していてもよい。
【０１２６】
本明細書で使用されているように、トランス遺伝子という用語は、一実施態様では、ウイルス、特に野生型アデノウイルス、より好ましくはアデノウイルスＡｄ５野生型に含まれない全ての遺伝子、もしくは本明細書で定義される異なる調節コンテクストに含まれる全ての遺伝子を含む。本明細書に記載の１つ以上のトランス遺伝子は、１つ以上のヘルパーウイルスによってコードおよび／または発現されることは本発明の一実施態様の範囲内である。
【０１２７】
本明細書に記載の知見および方法、使用、または核酸、タンパク質、複製系などはそれぞれ必ずしもアデノウイルスに限定されるわけではない。原理上、該システムは本明細書にも含まれる、そして開示される他のウイルスにも存在する。
【０１２８】
本発明のウイルスを使用する場合、または本発明に従って使用する場合、記載のウイルスは野生型ウイルス、好ましくは野生型アデノウイルスと同程度にまで複製し、該程度は、先行技術に従った１０−１００ｐｆｕ／細胞と比較して、１−１０ｐｆｕ／細胞の感染数で既に実現可能である。
【０１２９】
本発明のウイルスは、先行技術のＹＢ−１依存的ウイルスと比較して、粒子形成の顕著な増大をもたらす。好ましくは、粒子形成はファクター２〜５０、より好ましくはファクター１０〜５０だけ増加する。
【０１３０】
最後に、実施態様において、本発明によれば使用されるアデノウイルスは、Ｅ１Ｂ欠損、特にＥ１Ｂ  １９Ｋ欠損である。一般に本願明細書において使用される欠損は、Ｅ１Ｂが野生型に固有の特性の全部を示さず、そして、これらの特性のうちの少なくとも一つがなくなっている状態を意味する。アデノウイルスＢＣＬ２ホモログＥ１Ｂ１９ｋは、プロアポトーシスタンパク質Ｂａｋ及びＢａｘとの相互作用によって、Ｅ１Ａ誘導アポトーシスを防止する。このため、最大の複製および／または粒子形成は、感染細胞において可能である（Ramya Sundararajan and Eileen White, Journal of Virology 2001, 75, 7506-7516）。もし存在すれば、アデノウイルス死亡タンパク質の機能を最小にすることから、Ｅ１Ｂ  １９ｋの欠如は、ウイルスのより良好な遊離をもたらす。該欠失によって、ウイルスにより誘導される細胞変性効果は増加し、そして、感染した腫瘍細胞の亢進された溶解をもたらす（Ta-Chiang Liuら、Molecular Therapy, 2004）。加えて、Ｅ１Ｂ１９Ｋの欠如は、腫瘍細胞における該組換えアデノウイルスの複製への影響を有さないＴＮＦ−αをもたらすが、正常細胞において、ＴＮＦ−αでの処置は、複製の減少、及び、感染性のウイルスの遊離をもたらす。このように、選択性及び特異性が増加した（Ta-Chiang Liuら、Molecular Therapy 2004, 9, 786-803）。
【０１３１】
本発明のために必須ではないアデノウイルス核酸配列を欠失及び突然変異させることは、当業者の技術の範囲内である。また、該欠失は、例えば、本願明細書に記載される、Ｅ３及びＥ４の一部をコードする核酸に関連があってもよい。Ｅ４が欠失する場合、該欠失がタンパク質Ｅ４ｏｒｆ６に及ばない、換言すれば、本発明にしたがって使用されるアデノウイルスがＥ４ｏｒｆ６をコードすることは特に好ましい。好ましい実施態様において、該アデノウイルス核酸がウイルスカプシド内にまだパックされることができ、及び、このように感染性粒子形成される。これは、等しく本発明による核酸の使用に適用する。一般に、アデノウイルスシステムが単一またはいくつかの発現産物に関して欠損してもよいことは、留意しなければならない。これについて、発現産物をコードする核酸の完全な欠失又は突然変異、又は実質的に発現産物がもはや全く形成されないような、該核酸の欠失または突然変異、プロモーターまたは転写因子のようなそれぞれ制御及び発現コントロール要素の欠損、又は、核酸のレベル（プロモーターの欠如、シス作用要素）又は翻訳及び転写のそれぞれのレベル（トランス作用要素）でその野生型と異なる活性に基づいてもよい点に留意する必要がある。特に、後者の形態は、それぞれ細胞バックグラウンドに強く依存できる。
【０１３２】
本発明によるウイルスのＹＢ−１依存性複製は、以下に説明するように、野生型のアデノウイルスの複製に関して起こる。
【０１３３】
ウイルス感染中、まず「初期遺伝子」Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４が発現される。「後期遺伝子」群はウイルスの構造タンパク質の合成に関与している。異なるＥ１Ａ、Ｅ１Ｂタンパク質をコード化する２つの転写単位Ｅ１Ａ、Ｅ１Ｂを含むＥ１領域は、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４遺伝子の転写を誘導するため、初期・後期遺伝子いずれの活性化においても重要な役割を果たす（Nevins, J. R., Cell 26, 213-220, 1981）。また、Ｅ１Ａタンパク質は休止中の細胞においてＤＮＡ合成を開始させて、Ｓ期への移行を引き起こすことができる（Boulanger and Blair, 1991参照）。また、それらはＲｂクラスの腫瘍抑制因子と相互作用する（Whyte, P.ら、Nature 334, 124-127, 1988）。この過程で、細胞の転写因子Ｅ２Ｆが放出される。次に、Ｅ２Ｆ因子が細胞およびウイルスの両遺伝子の対応するプロモーター領域（特にアデノウイルスのＥ２初期プロモーター）に結合して、転写、ひいては複製を開始させる（Nevins, J. R., Science 258, 424-429, 1992）。
【０１３４】
Ｅ２領域の遺伝子産物は、それらが３つの必須タンパク質をコードするため、複製の開始および完了において特に必要とされる。Ｅ２タンパク質の転写は、「Ｅ２初期Ｅ２Ｆ依存的プロモーター」という２つのプロモーターによって制御されており、本明細書ではＥ２初期プロモーターまたは初期Ｅ２プロモーター、および「Ｅ２後期プロモーター」とも呼ばれる（Swaminathan and Thimmapaya, The Molecular Repertoire of Adenoviruses III: Current Topics in Microbiology and Immunology, vol 199, 177-194, Springer Verlag 1995）。また、Ｅ４領域の産物は、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ−５５ｋＤａタンパク質とともに、Ｅ２Ｆの活性およびｐ５３の安定性において重要な役割を果たす。例えば、Ｅ２プロモーターは、Ｅ２ＦおよびＤＰ１を含むヘテロ二量体と、Ｅ４領域によってコード化されるＥ４ｏｒｆ６／７との直接の相互作用によってさらにトランス活性化される（Swaminathan and Thimmapaya, JBC 258, 736-746, 1996）。さらに、感染の溶菌サイクルを成功裏に完了させるために、Ｅ１Ｂ−５５ｋＤａおよびＥ４ｏｒｆ６を含む複合体はｐ５３によって不活化される（Steegenga, W. T.ら、Oncogene 16, 349-357, 1998）。また、Ｅ１Ｂ−５５ｋＤａは、Ｅ４ｏｒｆ６タンパク質と相互作用する際に、ウイルスＲＮＡの核外への輸送を促進させるが、細胞のＲＮＡは核内に保持されるため、この意味でさらに重要な機能を有する（Bridge and Ketner, Virology 174, 345-353, 1990）。さらに重要な知見は、Ｅ１Ｂ−５５ｋＤａ／Ｅ４ｏｒｆ６を含むタンパク質複合体が、いわゆる「ウイルス封入体（viral inclusion body）」内に局在することである。これらの構造は複製および転写の場と考えられる（Ornelles and Shenk, J. Virology 65, 424-429、1991）。
【０１３５】
Ｅ３領域は、複製、特にアデノウイルスの放出において重要なもう１つの領域である。Ｅ３領域は、インビトロ（即ち、細胞培養）においてアデノウイルスの感染サイクルに必須ではない比較的小さな様々なタンパク質の遺伝情報をより正確に含んでいる。しかし、それらは、特に免疫調節機能およびアポトーシス機能を有するため、インビボでの急性および／または潜伏感染中のウイルスの生存において重要な役割を果たす（Marshall S. Horwitz, Virologie, 279, 1-8, 2001; Russell, 前記）。約１１．６ｋＤａの大きさを持つタンパク質が細胞死を誘導することが示されている。このタンパク質は、その機能のため、ＡＤＰ（adenovirus death protein：アデノウイルス死タンパク質）と名付けられている（Tollefson, J. Virology, 70, 2296-2306, 1996）。該タンパク質は主に感染サイクルの後期に形成される。さらに、該タンパク質の過剰発現によって、感染細胞のより良好な溶解がもたらされる（Doroninら、J. Virology, 74, 6147-6155, 2000）。これと一致して、各遺伝子およびタンパク質は本発明のウイルス内にそれぞれ含まれる。
【０１３６】
本発明に従った、特に全身投与と関連するアデノウイルスの薬剤としての使用は、アデノウイルスの適当なターゲティングによって向上できる。腫瘍細胞のアデノウイルス感染は、特にコクサッキーウイルスアデノウイルス受容体ＣＡＲおよび特定のインテグリンの存在にある程度左右される。これらが細胞内、特に腫瘍細胞内において強く発現される場合、既に非常に低い力価（ｐｆｕ／細胞）で感染可能である。組換えアデノウイルスのいわゆる再ターゲティングを実現するために、例えば、タンパク質ＩＸのファイバーノブ（fiber knob）領域およびＣ末端への異種配列の挿入、二重特異性抗体の使用、アデノウイルスのポリマーコーティング、Ａｄ−ｆｉｂｅｒ内へのリガンドの導入、それぞれ血清型５ｋｎｏｐおよび血清型５ファイバーシャフト（fiber shaft）の置換、血清型３ｋｎｏｐおよびＡｄ３５ファイバーシャフト、ペントン基のｋｎｏｐおよび修飾による異なる戦略が今までに取られてきた（Nicklin S. A.ら、Molecular Therapy 2001, 4, 534-542; Magnusson, M. K.ら、J. of Virology 2001, 75, 7280-7289; Barnett B. G. ら、Biochimica et Biophysica Acta 2002, 1575, 1-14; Dimitrev IPら、Journal of Virology, 2002, 76, 6893-6899; Mizuguchi und Hayakawa, Human Gene Therapy, 2004, 15, 1034-1044）。本発明のアデノウイルスおよび本発明に従って使用されるアデノウイルスと関連する別の設計および特性を実現することは、本発明の様々な実施態様において、本発明の範囲内である。
【０１３７】
Ｅ１Ｂ５５ｋＤ、Ｅ４ｏｒｆ６、ＡＤＰなどを含む様々なトランス遺伝子は、特にそれらがウイルス遺伝子の場合、原理上、各ウイルス、好ましくはアデノウイルス、さらに好ましくはアデノウイルスＡｄ５からクローニングできる。様々なプラスミドが先行技術において追加的に記載されており、これらは各遺伝子を含み、これらから該遺伝子を適時回収可能であり、これらを本発明に従って使用されるウイルスの他、本発明に従った両方のアデノウイルスに導入できる。Ｅ１Ｂ５５ｋＤを発現するプラスミドの例は、例えば、Dobbelstein, M.ら、EMBO Journal, 16, 4276-4284, 1997に記載されている。Ｅ１Ｂ５５Ｋ遺伝子のコーディング領域は、例えば、ｐＤＣＲＥ１ＢプラスミドからＢａｍＨＩによってこの遺伝子の３′非コード領域（３′ＵＴＲ領域は好ましくはアデノウイルスの野生型ゲノムの約３５０７〜４１０７位にある）と共に切り出すことができる。３′非コード領域の他、Ｅ１Ｂ５５ｋＤを含む各断片は、アデノウイルス５型の２０１９〜４１０７位のヌクレオチドに対応する。しかし、Ｅ１Ｂ５５ｋＤ遺伝子がそれぞれＢａｍＨＩ、ＢｆｒＩ、ＸｂａＩ制限酵素でプラスミドから切り出され、それに続いてアデノウイルスにクローニングされることも本発明の範囲内である。この遺伝子の類似物質、特に３′領域の類似物質を本発明において使用できることも本発明の範囲内である。３′ＵＴＲ領域の類似物質は、３′ＵＴＲ領域と同じ作用、特に遺伝子、好ましくはＥ１Ｂ５５ｋＤ遺伝子の発現に関して同じ作用を有する任意の配列である。該類似物質は、当業者が実施する通常の実験（例、３′ＵＴＲ領域の１つ以上のヌクレオチドの伸長または短縮、そして次にこのようにして得られた類似物質が過去に記載された３′ＵＴＲ領域と同じ作用を依然として有しているか否かを試験する）によって判定できる。一実施態様では、３′ＵＴＲ領域はこのように遺伝子の各類似物質および任意の類似物質を含む。
【０１３８】
治療用遺伝子またはトランス遺伝子が、好適な実施態様において、好ましくは特異的プロモーター、特に腫瘍特異的プロモーターまたは組織特異的プロモーターの制御下にクローニングされたウイルスは、本発明に従ったウイルスをさらに発展させたものである。Ｅ４領域が機能的に不活性である、または好ましくは欠失されていることも該ウイルスの範囲内である。本明細書に記載のトランス遺伝子もＥ４領域内にクローニング可能であり、これはＥ３領域内へのトランス遺伝子のクローニングの代わり、もしくは追加的に実施可能であり、Ｅ３領域は部分的または完全に無傷でありうる。本明細書で使用されるトランス遺伝子は、治療用遺伝子またはウイルス遺伝子、好ましくはアデノウイルス遺伝子であり、好ましくは野生型アデノウイルスのゲノム中には存在せず、現在特定のウイルス中に位置するゲノム部位には存在しない。
【０１３９】
治療用遺伝子はプロドラッグ遺伝子、サイトカイン遺伝子、アポトーシス誘導遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、メタロプロテイナーゼインヒビター遺伝子、および／または血管形成抑制剤、チロシンキナーゼインヒビター遺伝子でありうる。また、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、アンチセンス分子、リボザイムは好ましくは癌関連標的分子に対して発現可能である。好ましくは、個別の、もしくはいくつかの標的分子を、耐性関連因子、抗アポトーシス因子、癌遺伝子、血管形成因子、ＤＮＡ合成酵素、ＤＮＡ修復酵素、増殖因子およびその受容体、転写因子、メタロプロテイナーゼ、特にマトリクスメタロプロテイナーゼ、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子から選択される。これらの好ましい実施態様は本明細書において既に開示されている。
【０１４０】
一実施態様では、耐性関連因子は好ましくはＰ糖タンパク質、ＭＲＰ、ＧＳＴを含むグループから選択され、これらをコードする核酸も含む。
【０１４１】
好適な実施態様において使用可能なプロドラッグ遺伝子は、例えば、シトシンデアミナーゼ、チミジンキナーゼ、カルボキシペプチダーゼ、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ、プリンヌクレオチドホスフォリラーゼ（ＰＮＰ）である（Kirnら、Trends in Molecular Medicine, volume 8, no. 4 (suppl), 2002; Wybranietz W.A. ら、Gene Therapy, 8, 1654-1664, 2001; Niculescu-Duvazら、Curr. Opin. Mol. Therapy, 1, 480.486, 1999; Koyamaら、Cancer Gene Therapy, 7, 1015-1022, 2000; Rogers ら, Human Gene Therapy, 7, 2235-2245, 1996; Lockettら、Clinical Cancer Res., 3, 2075-2080, 1997; Vijayakrishnaら、J. Pharmacol. And Exp. Therapeutics, 304, 1280-1284, 2003）。
【０１４２】
好適な実施態様において使用可能なサイトカインは、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＣＳＦまたはインターフェロンγである（Gene Therapy, Adavnces in Pharmacology, volume 40, editor; J. Thomas August, Academic Press; Zhang and Degroot, Endocrinology, 144, 1393-1398, 2003; Descamps ら、J. Mol. Med., 74, 183-189, 1996; Majumdarら、Cancer Gene Therapy, 7, 1086-1099, 2000）。
【０１４３】
一実施態様では、抗アポトーシス因子はＢＣＬ２を含むグループから選択され、これらをコード化する核酸も含む。一態様の場合、癌遺伝子はＲａｓ、特に変異Ｒａｓ、Ｒｂ、Ｍｙｃを含むグループから選択され、これらをコード化する核酸も含む。一実施態様では、血管新生因子はＶＥＧＦおよびＨＭＧタンパク質を含むグループから選択され、これらをコード化する核酸も含む。一態様の場合、ＤＮＡ合成酵素はテロメラーゼを含むグループから選択され、これらをコード化する核酸も含む。一実施態様では、ＤＮＡ修復酵素はＫｕ−８０を含むグループから選択され、これらをコード化する核酸も含む。一実施態様では、増殖因子はＰＤＧＦ、ＥＧＦ、Ｍ−ＣＳＦを含むグループから選択され、これらをコード化する核酸も含む。さらなる実施態様では、受容体は特に増殖因子の受容体であり、好ましくは、増殖因子はＰＤＧＦ、ＥＧＦ、Ｍ−ＣＳＦを含むグループから選択され、これらをコード化する核酸も含む。一実施態様では、転写因子はＹＢ−１を含むグループから選択され、これらをコード化する核酸も含む。一実施態様では、メタロプロテイナーゼは特にマトリクスメタロプロテイナーゼである。好適な態様の場合、マトリクスメタロプロテイナーゼはＭＭＰ−１およびＭＭＰ−２を含むグループから選択され、これらをコード化する核酸も含む。一実施態様では、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子はｕＰａ−Ｒを含むグループから選択され、これらをコード化する核酸も含む。
【０１４４】
好適な実施態様において使用可能なアポトーシス誘導遺伝子は、例えば、デコリン（Tralhaoら、FASEB J, 17, 464-466, 2003）、網膜芽細胞腫（Zhangら、Cancer Res., 63, 760-765, 2003）、BaxおよびBad（Zhangら、Hum. Gene Ther., 20, 2051-2064, 2002）、アポプチン（Noteborn and Pietersen, Adv. Exp. Med. Biol., 465, 153-161, 2000）、ADP（Tothら、Cancer Gene Therapy, 10, 193-200, 2003）、bcl-xs（Sumantranら、Cancer Res, 55, 2507-2512, 1995）E4orf4（Braithwaite and Russell, Apoptosis, 6, 359-370, 2001）、FasL、Apo-1、Trail（Boehringer Manheim, Guide to Apoptotic Pathways, Araiら、PNAC, 94, 13862-13867, 1997）、Bims（Yamaguchiら、Gene Therapy, 10, 375-385, 2003）、GNR163（Oncology News, 17 June, 2000）である。
【０１４５】
好適な実施態様において使用可能な腫瘍抑制遺伝子は、例えば、Ｅ１Ａ、ｐ５３、ｐ１６、ｐ２１、ｐ２７、ＭＤＡ−７である（Opalkaら、Cell Tissues Organs, 172, 126-132, 2002, Jiら、Cancer Res., 59, 3333-3339, 1999, Suら、Oncogene, 22, 1164-1180, 2003)。
【０１４６】
好適な実施態様において使用可能な血管新生インヒビターは、例えば、エンドスタチンまたはアンジオスタチン（Hajitouら、FASEB J., 16, 1802-1804, 2002）および抗ＶＥＧＦ抗体（Ferrara, N., Semin Oncol 2002 Dec; 29 (6 suppl 16): 10-4）である。
【０１４７】
好適な実施態様において使用可能なメタロプロテイナーゼインヒビターは、例えば、Ｔｉｍｐ−３（Ahonenら、Mol Therapy, 5, 705-715, 2002)、PAI-1（Soffら、J. Clin. Invest., 96, 2593-2600, 1995）、Timp-1（Brandt K. Curr. Gene Therapy, 2, 255-271, 2002）である。
【０１４８】
本発明のグループＩアデノウイルスおよびグループＩＩアデノウイルスによって発現可能な本発明の意味での別のトランス遺伝子もチロシンキナーゼインヒビターである。例示的なチロシンキナーゼはＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）である［Onkologie, Entstehung und Progression maligner Tumoren; 著者:Christoph Wagner, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1999］。好適なチロシンキナーゼインヒビターはハーセプチンである［Zhang Hら、Cancer Biol Ther. 2003, Jul-Aug; 2 (4suppl1): S122-6］。
【０１４９】
本明細書で使用される、ｓｉＲＮＡ（短鎖干渉ＲＮＡ）は、塩基の相同性に起因して互いにハイブリダイズする２本の、好ましくは別々のＲＮＡ鎖からなり、これらが本質的に塩基対を作って存在し、好ましくは、鎖長は最高５０ヌクレオチド、好ましくは１８−３０ヌクレオチド、より好ましくは２５ヌクレオチド未満、最も好ましくは２１、２２、２３ヌクレオチドであり、これらの数字はｓｉＲＮＡの一本鎖、特により正確には第二の一本鎖とハイブリダイズする、もしくは塩基対を作る一本鎖の鎖長を示す。このために必要な特異性は、ｓｉＲＮＡの配列、そしてその結合部位によって媒介される。分解の標的配列は、第一または第二のｓｉＲＮＡ形成鎖と本質的に相同である。厳密な作用機序は依然として不明であるが、ｓｉＲＮＡは進化の途中で別の対立遺伝子を阻害して、ウイルスから自身を守るための細胞の生物学的戦略と予測される。ｓｉＲＮＡ媒介性ＲＮＡ干渉は、遺伝子特異的な二本鎖ＲＮＡの導入によってタンパク質の発現の特異的抑制または完全な除外の方法として使用される。高等動物では、１９−２３ヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡが、インターロイキン反応などの非特異的な防衛反応を活性化させないため、この範囲で特に適している。対称な２ヌクレオチドの３′突出を有する２１ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡの直接的トランスフェクションは、哺乳動物細胞においてＲＮＡ干渉を媒介するのに適しており、リボザイムやアンチセンス分子などの他の技術と比較して非常に効率的であった（Elbashir, S. Harborth J. Lendeckel W. Yalvcin, A. Weber K, Tuschl T: Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature 2001, 411: 494-498）。標的遺伝子の発現を抑制するために数本のｓｉＲＮＡ分子だけで十分である。特に干渉現象の一過性およびｓｉＲＮＡ分子の特異的デリバリーにおける外来ｓｉＲＮＡの限界を回避するために、内因性ｓｉＲＮＡ発現を可能にする先行技術のベクターを使用する。該目的のために、例えば、９ヌクレオチドのスペーサー配列によって隔てられた、センスおよびアンチセンス両方向の１９ヌクレオチド長の標的配列を含むベクターに６４ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを導入する。結果として得られる転写産物は、例えば１９塩基対のステム構造（ステム）を有するヘアピン構造に折りたたまれる。ループは細胞内において急速に分解され、機能的なｓｉＲＮＡ分子が産生される（Brummelkampら、Science, 296, 550-553, 2002）。
【０１５０】
さらなる形態において、本発明は、少なくとも本発明によるウイルスを含む薬剤に関する。さらなる形態において、本発明は、薬剤の製造のための本発明のウイルスの使用に関する。これに関して、薬剤は、腫瘍及び癌病の処置のためにある。腫瘍及び癌病は、好ましくは、本願明細書において記載されているそれらである。好ましくは、腫瘍及び癌疾患は、それぞれ耐性を有する。好ましくは、耐性は、本願明細書に記載される耐性、特に好ましくは多剤耐性、細胞増殖抑止剤および／または放射線に対する多剤耐性である。さらなる形態において、薬剤は、細胞増殖抑止剤および／または放射線に対する細胞の感度を回復するためであり、それによって、細胞は、好ましくは、細胞増殖抑止剤および／または放射線に対して耐性を示す腫瘍細胞である。感度の回復は、「薬感度の回復」と英語で呼ばれる過程である。
【０１５１】
なお更なる実施態様において、薬剤は、さらに、少なくとも一つの薬学的に活性な化合物を含む。
【０１５２】
好適な一実施態様では、薬学的に活性な化合物は、サイトカイン、メタロプロテイナーゼ阻害剤、血管新生阻害剤、結腸癌に対するイリノテカンやＣＰＴ−１１および白血病に対するダウノルビシン、ＣＤＫ２／サイクリンＥキナーゼ活性を阻害して結腸癌に対して使用可能なＣＹＣ２０２などの細胞周期阻害剤（McClue SJ, Int. J. Cancer 2002, 102, 463-468）Ｒａｆ−１を阻害して、例えば、乳癌に効果的なＢＡＹ４３−９００６（Wilhelm SMら、Cancer Res.2004, 64, 7099-7109）、２６Ｓプロテアソーム活性を阻害して扁平上皮癌に対して使用されるＰＳ−３４１などのプロテアソーム阻害剤（Fribley Aら、Mol Cell Biol 2004 Nov; 24(22): 9695-704）、ＥＧＦ受容体に対する組換え抗体（Herceptin for breast carcinoma and prostate tumor; H.G. van der Poel, European Urology 2004, 1-17; Erbitux against head and neck tumors; Bauman Mら、Radiother. Oncol., 2004, 72, 257-266）、特にｃ−ｋｉｔを抑制して胃腸腫瘍に対して使用可能なＳＴＩ５７１などのシグナル伝達系の阻害剤（H.G. van der Poel, European Urology 2004, 45, 1-17）、特に前立腺癌に対して使用可能なエンドセリン阻害剤であるＡＢＴ−６２７（H.G. van der Poel, European Urology 2004, 45, 1-17）、ＶＥＧＦチロシンキナーゼ受容体のリン酸化を阻害して膠芽細胞腫や前立腺癌に対して使用可能なＳＵ５４１６（Bischof Mら、Int. J Radiat. Oncol. Biol. Phys. 2004; 60(4): 1220-32）、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性を阻害して、特に前立腺癌に対して使用可能なＺＤ１８３９（H.G. van der Poel, European Urology 2004, 45, 1-17）、ｍＴＯＲを阻害して前立腺癌に対して使用可能なＣＣＩ−７７９やＲＡＤ００１などのラパマイシン誘導体である。本明細書に記載の様々なアデノウイルスや本発明に従って使用されるアデノウイルスが原理上これと関連して記載される各適用および任意の適応に対する上記の各化合物および任意の化合物と共に使用可能であることは本発明の範囲内である。特に好適な一実施態様では、適応は過去に記載された薬学的に活性な化合物または薬剤に対して記載された適応である。
【０１５３】
本発明者はさらに驚くべきことに、少なくとも２つの化合物の併用によって本明細書に記載のウイルスおよび特に本発明に従って使用されるウイルスの有効性を高めることが可能であることを見出しており、少なくとも２つの化合物のそれぞれは細胞増殖抑制剤を含むグループから個別および無関係に選択される。化合物は、好ましい実施態様において、薬学的に活性な化合物である。
【０１５４】
本明細書の好適な一実施態様において使用されているように、細胞増殖抑制剤は特に化学的化合物または生物学的化合物であり、これらは細胞または該細胞を含む生物への投与中または投与後に、細胞分裂および（または）細胞増殖を停止させる、および（または）細胞分裂および（または）細胞増殖を停止または減速させる。細胞増殖抑制剤は、細胞または該細胞を含む生物においてのみ上記の意味で細胞増殖抑制性となる化合物または薬剤も含む。この範囲において、細胞増殖抑制剤という用語は、細胞増殖抑制前も含む。
【０１５５】
細胞増殖抑制剤は作用機序に従ってグループ分けされる。原理上、全てが本発明の範囲内で使用可能な以下のグループは区別される：
【０１５６】
−アルキル化剤、即ち、タンパク質の他、核酸のリン酸基、アミノ基、スルフヒドリル基、カルボキシ基、ヒドロキシ基のアルキル化によって細胞毒性作用を生じる化合物。該化合物はそれ自体が発癌性を有する場合が多い。細胞増殖抑制剤のこのグループの典型例は、シスプラチンおよびプラチン誘導体であるシクロホスファミド、ダカルバジン、マイトマイシン、プロカルバジンである。
【０１５７】
−代謝拮抗産物、即ち、構造的類似性または結合能に起因して、代謝過程を遮断する、またはそれに影響を与える化合物。代謝拮抗産物のグループ内では、構造的に類似した代謝拮抗産物、構造を変化させる代謝拮抗産物、間接的に作用する代謝拮抗産物間で区別される。構造的に類似している代謝拮抗産物は、化学的類似性に起因して、その機能を発揮することなく競合する。構造を変化させる代謝産物は、機能または吸収を妨げる、もしくは代謝産物を化学的に修飾する代謝産物に結合する。間接的に作用する代謝拮抗産物は、例えば、イオンの結合によって代謝産物の機能を妨げる。このグループの典型例は、メトトレキセートなどの葉酸拮抗剤、フルオロウラシルなどのピリミジン類似物質、アザチオプリンやメルカプトプリンなどのプリン類似物質である。
【０１５８】
−有糸分裂阻害剤、即ち、細胞分裂を阻害する化合物。有糸分裂阻害剤のグループ内では、細胞分裂毒、紡錘体毒、染色体毒間で区別される。このグループの典型例はタキサンおよびビンカアルカロイドである。タキサンは次にタキソールとタキソテールの2つの主なグループに分けることができ、特に好ましいタキソールはパクリタキセルであり、特に好ましいタキソテールはドセタキセルである。
【０１５９】
−ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対する抑制効果を有する抗生物質。典型例は、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、マイトマイシンなどのアントラサイクリンである。
【０１６０】
−トポイソメラーゼ阻害剤、特にトポイソメラーゼＩ阻害剤。トポイソメラーゼ阻害剤は、３段階の過程でＤＮＡのねじれ数の変化を触媒することでＤＮＡの三次構造を決定する化合物である。本質的に、２つの型のトポイソメラーゼが区別される。Ｉ型トポイソメラーゼは、ＤＮＡ鎖のみを切断して、ＡＴＰ非依存性であるが、ＩＩ型トポイソメラーゼはＤＮＡの両方の鎖を切断し、ＡＴＰ依存性である。トポイソメラーゼＩ阻害剤の典型例はイリノテカンおよびトポテカンであり、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤の典型例はエトポシドおよびダウノルビシンである。
【０１６１】
本発明の範囲内で、少なくとも１つおよび好ましくは２つの薬剤が上記のグループから選択される。一方、特に３、４、５つの異なる薬剤が選択されることも本発明の範囲内である。１つだけ、好ましくは２つの薬剤をウイルスと併用する、本発明の実施態様と関して以下のコメントがなされた。これらの考察は基本的に１つ以上の薬剤が使用される実施態様にも適用可能である。
【０１６２】
好ましくは、薬剤は、それらが異なる標的分子を対象とする、もしくは異なる分子を標的とする、と文献中に記載されているように互いに異なる。薬剤が、同じ標的分子に結合する２つ以上の異なる薬剤を含むことは本発明の範囲内である。該薬剤が標的分子の第一部位に結合して、次に該薬剤が標的分子の第二部位に結合することも本発明の範囲内である。
【０１６３】
少なくとも２つの薬剤が異なる作用機序で活性であることも本発明の範囲内である。「活性である」とは、好適な一実施態様では、化合物の作用を阻害する、もしくは遅らせる細胞増殖および／または細胞分裂が異なる作用機序により媒介されることを意味する。特に好適な一態様の場合、「活性である」という用語は、１つおよび／または両方の薬剤が使用されない場合と比較して、ウイルス、特に本発明のウイルス、本明細書に記載のウイルスおよび本発明に従って使用されるウイルスの複製効率が増大することを意味する。ウイルス複製の効率測定値として、好ましくは細胞溶解に必要なウイルス数を使用し、好ましくはｐｆｕ／細胞で表す。
【０１６４】
特に好適な実施態様では、少なくとも２つの薬剤の内、少なくとも１つが、ウイルス複製を生じる、好ましくは選択的に生じる、好ましくは本明細書に記載のウイルスおよび／または本明細書に従って使用されるウイルスによる細胞の感染性を増大させる薬剤である。これは、例えば、細胞によるウイルスの取り込みによって実施可能である。ウイルス、特にアデノウイルスの取り込みは、例えば、コクサッキーウイルスアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）によって媒介される（Mizuguchi und Hayakawa, GENE 285, 69-77, 2002）。ＣＡＲの発現上昇は、例えば、トリコスタチンＡによって生じる（Vigushinら、Clinical Cancer Research, 7, 971-976, 2001）。
【０１６５】
別の一実施態様では、少なくとも２つの薬剤の内、１つは細胞内成分の有効性を増大させ、該成分は、ウイルス、本明細書に記載のウイルスおよび／または本発明に従って使用されるウイルスの複製を増大させる薬剤である。
【０１６６】
別の一実施態様では、少なくとも２つの薬剤の内１つはＹＢ−１の核内への輸送を媒介する薬剤である。該薬剤は、トポイソメラーゼ阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、有糸分裂阻害剤を含むグループから選択される。好ましいトポイソメラーゼ阻害剤は、カンプトテシン、イリノテカン、エトポシド、そしてこれらの類似物質である。好ましい有糸分裂阻害剤は、ダウノルビシン、ドキソルビシン、パクリタキセル、ドセタキセルである。好ましいアルキル化剤はシスプラチンおよびその類似物質である。好ましい代謝拮抗剤はフルオロウラシルおよびメトトレキサートである。
【０１６７】
特に好適な一実施態様では、少なくとも２つの薬剤の内１つは、細胞の感染性、特にＣＡＲの発現を増大させる薬剤であり、少なくとも２つの薬剤の２番目はＹＢ−１の核内輸送を増大させる薬剤であり、好ましくは化合物として、好ましくは上記の必要な各特性を示す化合物が使用される。ＣＡＲの発現を増やしている化合物のクラスの例は、ヒストンデアセチラーゼインヒビターであり、そして、核内へのＹＢ−１の輸送を増やしている化合物のクラスの例は、トポイソメラーゼインヒビターである。
【０１６８】
さらなる実施態様において、少なくとも二つの薬剤のうちの一つはヒストンデアシラーゼインヒビターであり、そして、少なくとも二つの薬剤の他の一つはトポイソメラーゼインヒビターである。
【０１６９】
別の一実施態様では、少なくとも２つの薬剤の内１つはヒストンデアセチラーゼ阻害剤である。好ましいヒストンデアセチラーゼ阻害剤は、トリコスタチンＡ、ＦＲ９０１２２８、ＭＳ−２７−２７５、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４、ＰＸＤ１０１を含むグループから選択される。トリコスタチンＡは、例えば、Vigushinら、Clinical Cancer Research, 7, 971-976, 2001に記載されている。ＦＲ９０１２２８は、例えば、Kitazonoら、Cancer Res., 61, 6328-6330, 2001に記載されている。ＭＳ−２７−２７５は、Jaboin ら、Cancer Res., 62, 6108-6115, 2002に記載されている。ＰＸＤ１０１は、Plumbら、Mol. Cancer Ther., 8, 721-728, 2003に記載されている。ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４は、Atadjaら、Cancer Res., 64, 689-695, 2004に記載されている。
【０１７０】
一実施態様では、少なくとも１つの薬剤は、トリコスタチンＡ（膠芽細胞腫に対する；Kim JHら、Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 2004, 59, 1174-1180）、ＦＲ９０１２２８（膵臓腫瘍に対する：Sato Nら、Int. J. Oncol. 2004, 24, 679-685）、ＭＳ−２７−２７５（前立腺癌に対する；Camphausen Kら、Clinical Cancer Research 2004, 10, 6066-6071）、ＮＶＰ−ＬＡＱ８２４（白血病に対する；Nimmanapalli Rら、Cancer Res. 2003, 63, 5126-5135）、ＰＸＤ１０１（卵巣癌に対する；Plumb JAら、Mol. Cancer Ther. 2003, 2, 721-728）、スクリプタイド（乳癌に対する；Keen JCら、Breast Cancer Res. Treat. 2003, 81, 177-186）、アピシジン（黒色腫に対する；Kim SH ら、Biochm. Biophys. Res. Commun. 2004, 315, 964-970）、ＣＩ−９９４（多様な腫瘍に対する；Nemunaitis JJら、Cancer J. 2003, 9, 58-66）を含むグループから選択される。ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の作用機序は特に、Lindemann RKら、Cell Cycle 2004, 3, 77-86に記載されている。これらと関連する、本明細書に記載の各適応および任意の適応に対して、原理上、本明細書に記載の様々なアデノウイルスおよび本発明に従って使用されるアデノウイルスを上記の化合物と併用できることは本発明の範囲内である。特に好適な一実施態様では、適応は、上記の薬学的に活性な各化合物および任意の化合物に関して記載されている適応である。
【０１７１】
さらに別の一実施態様では、少なくとも２つの薬剤の内１つはトポイソメラーゼ阻害剤、好ましくはトポイソメラーゼＩ阻害剤である。好ましいトポイソメラーゼ阻害剤は、カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン、ＳＮ−３８、９−アミノカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシン、ＤＸ−８９５Ｉｆ、ダウノルビシンを含むグループから選択される阻害剤である。イリノテカンおよびＳＮ−３８は、例えば、Gilbertら、Clinical Cancer Res., 9, 2940-2949, 2003に記載されている。ＤＸ−８９５ＩＦは、van Hattumら、British Journal of Cancer, 87, 665-672, 2002に記載されている。カンプトテシンは、Avemannら、Mol. Cell. Biol., 8, 3026-3034, 1988に記載されている。９−アミノカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシンは、Rajendraら、Cancer Res., 63, 3228-3233, 2003に記載されている。ダウノルビシンは、M. Binaschiら、Mol. Pharmacol., 51, 1053-1059に記載されている。
【０１７２】
好適な一実施態様では、トポイソメラーゼ阻害剤は、カンプトテシン、イリノテカン、トポテカン、ＤＸ−８９５Ｉｆ、ＳＮ−３８、９−アミノカンプトテシン、９−ニトロカンプトテシン、エトポシド、ダウノルビシンを含むグループから選択される。これらは様々な腫瘍、例えば、結腸腫瘍、膵臓腫瘍、卵巣癌、前立腺癌に対して使用可能である。適用の範囲は、特に、Recchia Fら、British J. Cancer 2004, 91, 1442-1446, Cantore Mら、Oncology 2004, 67, 93-97、Maurel J.ら、Gynecol. Oncol 2004, 95, 114-119、Amin A.ら、Urol. Oncol. 2004, 22, 398-403、Kindler HLら、Invest. New Drugs 2004, 22, 323-327、Ahmad T.ら、Expert Opin. Pharmacother. 2004, 5, 2333-2340、Azzariti A.ら、Biochem Pharmacol. 2004, 68, 135-144、Le QTら、Clinical Cancer Res. 2004, 10, 5418-5424に記載されている。これらと関連する、本明細書に記載の各適応および任意の適応に対して、原理上、本明細書に記載の様々なアデノウイルスおよび本発明に従って使用されるアデノウイルスを上記の化合物と併用できることは本発明の範囲内である。特に好適な一実施態様では、適応は、上記の薬学的に活性な各化合物および任意の化合物に関して記載されている適応である。
【０１７３】
本発明の各態様および任意の態様の好適な実施態様では、さらに薬学的に活性な化合物が、サイトカイン、メタロプロテイナーゼ阻害剤、血管形成抑制剤、結腸癌に対するイリノテカンやＣＰＴ−１１および白血病に対するダウノルビシン、ＣＤＫ２／サイクリンＥキナーゼ活性を阻害して結腸癌に対して使用可能なＣＹＣ２０２などの細胞周期阻害剤（McClue SJ, Int. J. Cancer 2002, 102, 463-468）Ｒａｆ−１を阻害して、例えば、乳癌に効果的なＢＡＹ４３−９００６（Wilhelm SMら、Cancer Res.2004, 64, 7099-7109）、２６Ｓプロテアソーム活性を阻害して脳腫瘍に対して使用されるＰＳ−３４１などのプロテアソーム阻害剤（Yin D.ら、Oncogene 2004）、ＥＧＦ受容体に対する組換え抗体（Herceptin for breast carcinoma and prostate tumor; H.G. van der Poel, European Urology 2004, 1-17; Erbitux against head and neck tumors; Bauman Mら、Radiother. Oncol., 2004, 72, 257-266）、特にｃ−ｋｉｔを抑制して胃腸腫瘍に対して使用可能なＳＴＩ５７１などのシグナル伝達系の阻害剤（H.G. van der Poel, European Urology 2004, 45, 1-17）、特に前立腺癌に対して使用可能なエンドセリン阻害剤であるＡＢＴ−６２７（H.G. van der Poel, European Urology 2004, 45, 1-17）、ＶＥＧＦチロシンキナーゼ受容体のリン酸化を阻害して頭頸部腫瘍に対して使用可能なＳＵ５４１６（Cooneyら、Cancer Chemother. Pharmacol 2004）、ＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性を阻害して、特に前立腺腫瘍に対して使用可能なＺＤ１８３９（H.G. van der Poel, European Urology 2004, 45, 1-17）、ｍＴＯＲを阻害して前立腺腫瘍に対して使用可能なＣＣＩ−７７９やＲＡＤ００１（H.G. van der Poel, European Urology 2004, 45, 1-17）などのラパマイシン誘導体である。本明細書に記載の様々なアデノウイルスおよび本発明に従って使用されるアデノウイルスが、原理上これらと関連して記載される各適用および任意の適応に対する上記の各化合物および任意の化合物と共に使用可能であることは本発明の範囲内である。特に好適な一実施態様では、適応は過去に記載された薬学的に活性な化合物または薬剤に対して記載された適応である。
【０１７４】
一実施態様では、本発明に従った方法および／または本発明に従って調製された方法は、本発明のウイルスと併用または同時投与される少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つの薬剤の１つ以上から分離されたウイルスを含んでいる。ウイルスが、ウイルスと併用される任意の薬剤から分離されることが好ましい。好ましくは、分離は空間的分離である。空間的分離は、ウイルスが薬剤とは異なるパッケージに存在させることができる。好ましくは、パッケージは１単位用量、即ち、ウイルスおよび薬剤は１用量としてパックされている。次に１単位用量を合わせて、パッケージを形成できる。一方、ウイルス１用量を１つ以上の薬剤の１以上の単位用量と合わせる、もしくはパックすることも本発明の範囲内である。
【０１７５】
パッケージの種類は、当業者には既知の投与方法に左右される。好ましくは、ウイルスは凍結乾燥状態または適当な液相に存在する。好ましくは、薬剤は固形状、例えば、錠剤またはカプセルで存在するが、これらに限定されるわけではない。代わりに、薬剤は液状でも存在できる。
【０１７６】
ウイルスを全身または局所投与することは本発明の範囲内である。ウイルスと併用される薬剤は、個別に、また互いに別々に、もしくは共に全身または局所投与されることも本発明の範囲内である。他の投与方法は当業者には既知である。
【０１７７】
ウイルスおよびウイルスと併用される薬剤は、経時的に異なる方法または同時に投与されることは本発明の範囲内である。経時的な方法と関連して、ウイルス投与前に薬剤を投与することが好ましい。ウイルスより前にどのくらいの期間、薬剤が投与されるかは、使用される薬剤の種類に左右され、使用される薬剤の作用機序から当業者には明らかである。また、少なくとも２つの薬剤の投与は、同じ、または異なる時間点で起こることが可能である。経時的に異なる投与と関連して、時間点はここでも薬剤の作用機序に起因しており、これに基づいて、当業者が判断できる。
【０１７８】
本明細書において薬学的組成物とも呼ばれる、本発明に従った薬剤と関連する上記の考察は、概して、ウイルス複製、好ましくは本発明に従ったインビトロでのウイルス複製で使用可能な組成物を含む任意の組成物にも適用可能である。上記の考察は、本発明に従ったキットおよび本発明に従って使用されるキットのそれぞれにも適用可能であり、キットは本明細書に記載のウイルスおよび本明細書に従って使用されるウイルスとは別に、本明細書に記載の薬剤または薬剤の併用も含みうる。該キットは、ウイルスおよび／または使える状態の１つ以上の薬剤、そして好ましくは使用説明書を含む。さらに、上記の考察は、本明細書で開示される核酸、本明細書に従って使用される核酸、本発明に従った複製系およびこれをコード化する核酸、本発明に従って使用される複製系および本発明に従って使用されるこれをコード化する核酸にも適用され、また、逆も同様である。
【０１７９】
本明細書で開示されるアデノウイルスが本発明に従って使用される製品と関連する、もしくは製品用である薬剤は、通常、全身投与を目的としているが、局所投与またはデリバリーも本発明の範囲内である。適用では、特にこれらの細胞にアデノウイルスを感染させることを目的としているが、ここでは特にアデノウイルスの複製が起こることを目的としており、好ましくは因果関係において状態、通常は疾患に関与しており、発明の薬剤はその診断および／または予防および／または治療に使用される。
【０１８０】
該薬剤は、好ましくは腫瘍疾患の治療用である。これらの腫瘍は、腫瘍疾患の発症機序、特に病理学的機序に起因して、ＹＢ−１が核内に既に位置するか、もしくは細胞核内のＹＢ−１の存在が外因的処置によって生じており、該外因的処置はＹＢ−１の核内移行に適しているか、もしくは核内でＹＢ−１を誘導または発現させる場合に特に好ましい。腫瘍または腫瘍疾患という用語は、本明細書においては良性腫瘍の他に悪性腫瘍、そして各疾患を含める。一実施態様では、薬剤は少なくとも1つの医薬的にさらに活性な化合物を含む。医薬的にさらに活性な化合物または薬剤の性質または量は、薬剤が使用される適応の種類に左右される。薬剤が腫瘍疾患の治療および／または予防に使用される場合、通常、シスプラチンおよびタキソールなどの細胞増殖抑制剤、ダウノブラスチン、ダウノルビシン、アドリアマイシンおよび／またはミトキサントロンまたは他の細胞増殖抑制剤、または本明細書に記載の細胞増殖抑制剤群が使用される。
【０１８１】
本発明に従った薬剤は、様々な剤形、好ましくは液状で存在できる。さらに、薬剤は、剤形の技術分野における当業者には既知の安定剤、緩衝剤、保存剤などのアジュバントを含む。
【０１８２】
本発明者は、驚くべきことに本発明のウイルスを細胞周期とは無関係に核内にＹＢ−１を含むこれらの腫瘍および調節解除されたＹＢ−１を含む該腫瘍に対して高い成功率で使用可能であることを見出している。通常、ＹＢ−１は細胞質、特に核周囲の細胞質にも存在している。ＹＢ−１は細胞周期のＳ期において腫瘍細胞の他、正常細胞の核内にも存在している。しかし、これは該改変アデノウイルスの使用時にウイルス性の腫瘍崩壊をもたらすには不十分である。先行技術において報告される該弱毒化アデノウイルスの比較的低い効率は、最終的にはその誤った適用に基づいている。換言すると、該アデノウイルス系は、本明細書に記載の弱毒化アデノウイルスまたは改変アデノウイルスを使用したウイルス性の腫瘍崩壊での分子生物学的な必要条件が満たされる条件下において特に高い有効性で使用可能である。該必要条件は、その細胞が細胞周期とは無関係に核内にＹＢ−１を含む、もしくは調節解除されたＹＢ−１を含む腫瘍疾患において与えられる。この形式の核局在化は、腫瘍自体の性質によって起こるか、もしくは本明細書に記載の本発明に従った薬剤または本明細書に記載の方法の適用によって起こりうる。したがって、本発明はそれぞれ腫瘍および腫瘍疾患の新しいグループ、ひいては本発明のウイルス、特に選考技術において既に記載されている弱毒化または改変アデノウイルスを使用して治療可能な患者も定義している。
【０１８３】
下記に結び付けられることを望まずに、「調節解除された」ＹＢ−１は、過剰発現するかリン酸化されたＹＢ−１であるようである。これは、下記の事実に基づく。セリン／トレオニンキナーゼであるＡｋｔは、転写因子及び細胞周期タンパク質のリン酸化によって、腫瘍細胞の成長を促進する（Nicholson KM and Anderson NG, Cell. Signal., 14, 381-395, 2002）。加えて、活性化されたＡｋｔ（リン酸化Ａｋｔ）が、ＹＢ−１とポジティブな様式で関連し、及び、ＡｋｔがＹＢ−１に結合しており、及び、低温ショックドメインの位置１０２のセリンでリン酸化することを発見した。これは、ＹＢ−１の細胞内の局在化、及び、それ自体で直ちにその機能を変えるシグナル伝達経路があることを示している。加えて、このリン酸化は、ＭＤＲ及びＭＲＰのようなタンパク質の産生を増やし、そして、それはストレス応答、細胞増殖及び癌化に関与する（Evdokimova Vら、Molecular and Cellular Biology, 26, 277-292, 2006）。ＡｋｔによるＹＢ−１のリン酸化は、しかしながら、そのＣａｐ結合能を弱め、それによって、サイレントｍＲＮＡ種の翻訳活性化がより容易になる（Evdokimova Vら、Molecular and Cellular Biology, 26, 277-292, 2006）。Ａｋｔは正常細胞において活性ではないことから、ＹＢ−１はリン酸化された形態で存在しないが、ＹＢ−１は調節解除されている、すなわち、該細胞において、リン酸化および／または過剰発現する。
【０１８４】
本発明のウイルスを使用して治療可能な腫瘍及び腫瘍疾患の患者の別のグループは、本発明のウイルスの使用を含め、特定の条件を適用または実現させた際にＹＢ−１が核内へ移動する、核内へ誘導される、もしくは核内へ輸送されることの確かな患者である。この患者グループと関連する本発明のウイルスの使用は、この範囲においてウイルス複製の誘導がＹＢ−１の核局在化およびそれに続くＹＢ−１のＥ２後期プロモーターへの結合に基づくとの知見に基づいている。このことは、ＹＢ−１核陽性細胞および／またはＹＢ−１が本適用の意味において調節解除されたの状態で存在する細胞にも適用される。この範囲において、本発明のアデノウイルスは、これらの特性を有する細胞を含む、特にこれらの細胞が治療される各疾患の成立に関与する場合、疾患および患者グループの治療において本発明に従って使用可能である。本発明のウイルス、特にアデノウイルスを使用して治療可能な別の患者グループは、後述の処理の結果としてＹＢ−１核陽性である患者および／または好ましくは治療の意味で、本明細書に記載の処置の１つを施された患者、本発明のウイルス投与を経験した患者、もしくは本発明のウイルス投与と共にこれらを経験した患者である。ＹＢ−１核陽性の患者とは細胞周期とは無関係にＹＢ−１を核内、特に多数の腫瘍形成細胞内に有する患者であることは本明細書の範囲内である。これらの処置は、本明細書に大まかに記載されている、および／または腫瘍の治療と関連して使用される該細胞増殖抑制剤の投与を含む。さらにこの処置グループは、放射線照射、特に腫瘍の治療と関連する使用される放射線照射を含む。放射線照射は、特に高エネルギー放射線照射、好ましくは放射能による放射線照射、好ましくは腫瘍の治療と関連して使用される放射線照射を意味する。別の処置は、温熱療法および温熱療法の適用、好ましくは腫瘍の治療と関連して使用される温熱療法である。特に好適な態様の場合、温熱療法は局所的に適用される。  最後に、別の処置はホルモン療法、特に腫瘍の治療と関連して使用されるホルモン療法である。該ホルモン療法と関連して、抗エストロゲンおよび（または）抗アンドロゲンが使用される。これと関連して、タモキシフェンなどの抗エストロゲンが、特に乳癌の治療において使用され、抗アンドロゲン、例えばフルタミドおよび酢酸シプロテロンは、前立腺癌の治療に使用される。
【０１８５】
本発明の開示の意味で、核内に内在的にＹＢ−１を含む、または誘導および核内への能動的な導入後に核内にＹＢ−１を含む、もしくは調節解除されたＹＢ−１を含む腫瘍形成細胞の一部は本発明の範囲内である。好ましくは、腫瘍形成細胞の約５％またはそれ以上（即ち、６％、７％、８％など）がＹＢ−１核陽性の細胞または調節解除されたＹＢ−１の存在する細胞である。乳癌、骨肉腫、卵巣癌、滑膜癌、肺癌などの他の腫瘍の場合、調節解除されたＹＢ−１を含む腫瘍細胞または細胞周期とは無関係に核局在を示す腫瘍細胞の割合は、約３０−５０％でありうる［Kohno K.ら、BioAssays 2003, 25, 691-698］。該腫瘍は、好ましくは、本発明のアデノウイルスを使用して処置可能である。ＹＢ−１の核局在化は、外部ストレスおよび局所的に加えられたストレスのそれぞれによって誘導できる。この誘導は照射、特にＵＶ照射、特に本明細書で開示される細胞増殖抑制剤の投与、温熱療法によって起こりうる。温熱療法と関連して、非常に特異的な方法、特に局所的な方法で実現可能であり、ひいてはＹＢ−１の特異的な核内輸送も起こり、このためにアデノウイルスの複製のための必要条件ひいては細胞および腫瘍の溶解のための必要条件が与えられ、これは好ましくは局所に限定されることが重要である（Stein U, Jurchott K, Walther W, Bergmann, S, Schlag PM, Royer HD. J Biol Chem. 2001, 276(30): 28562-9; Hu Z, Jin S, Scotto KW. J Biol Chem. 2000 Jan 28; 275(4): 2979-85; Ohga T, Uchiumi T, Makino Y, Koike K, Wada M, Kuwano M, Kohno K. J Biol Chem. 1998, 273(11): 5997-6000）。
【０１８６】
本明細書に記載のアデノウイルスが本発明に従って使用される溶解用の細胞の特性に関して、一実施態様では、これらが耐性、好ましくは多剤耐性またはポリ耐性であることが予想される。本明細書で使用される耐性とは、本明細書に記載の細胞増殖抑制剤および（または）放射線照射に対する耐性を示す。この多剤耐性は、好ましくは、同じおよび対応する患者グループが示す、各細胞ひいては腫瘍の判定マーカーである膜結合型輸送タンパク質である、Ｐ糖タンパク質の発現、好ましくは過剰発現と同時に起こる。本明細書で使用される耐性という用語は、非典型的な耐性も示しているＭＲＰなどのＰ糖タンパク質以外が媒介する耐性の他、典型的な耐性も示しているＰ糖タンパク質が媒介する耐性を含む。本明細書で言及され、腫瘍および患者それぞれに特徴的な、治療すべき別の耐性は、以下の遺伝子によって媒介されるが、これらに限定されるわけではない：ＭＤＲ、ＭＲＰ、トポイソメラーゼ、ＢＣＬ２、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）。細胞増殖抑制剤の作用は特にアポトーシス誘導に基づいているため、アポトーシス関連遺伝子の発現は耐性成立に重要な役割を果たしており、この範囲において、以下の因子も関連する：Ｆａｓ、ＢＣＬ２ファミリー、ＨＳＰ７０、ＥＧＦＲ［Kimら、Cancer Chemther. Pharmacol. 2002, 50, 343-352］。ＹＢ−１発現と相関関係のある別のマーカーはトポイソメラーゼＩＩαである。この範囲において、核内のＹＢ−１の測定ではなく、もしくは測定に加えて、トポイソメラーゼＩＩαの発現または本明細書に記載の他のマーカーいずれかを、成功を期待して、本発明のアデノウイルスで患者の治療が可能であるか否かを判断するためのスクリーニング方法において使用可能である。原理上、Ｐ糖タンパク質と同様に使用可能な別のマーカーはＭＲＰである。少なくとも結腸癌細胞または結腸癌患者が侵される程度の別のマーカーはＰＣＮ（増殖性細胞核抗原）（Hasan S.ら、Nature, 15, 387-391, 2001）であり、例えばＳｈｉｂａｏによって記載されている（Shibao Kら、Int. Cancer, 83, 732-737, 1999）。最後に、少なくとも乳癌および骨肉腫の細胞において、ＭＤＲ（英語：多剤耐性）の発現は、上記の意味でマーカーである（Oda Yら、Clin. Cancer Res., 4, 2273-2277）。本発明に従って使用可能な別のマーカーはｐ７３である（Kamiya, M., Nakazato, Y., J Neurooncology 59, 143-149 (2002); Stieweら、J. Biol. Chem., 278, 14230-14236, 2003）。
【０１８７】
医薬・臨床の意味において本来ならもはや治療できず、そのため成功を期待しての先行技術の方法を利用した腫瘍疾患のさらなる治療はもはや不可能であり、特に細胞増殖抑制剤および放射線照射がもはやまず不可能であり、腫瘍に影響を及ぼす、または縮小させるという意味においてもはや成功裏に実施することは不可能な場合、これらの患者も本明細書に記載のアデノウイルスを本発明に従って使用する処置法の対象にできることは本発明の特に有利な点である。本明細書において、腫瘍という用語は、内因性に、好ましくは細胞周期とは無関係に、もしくは本明細書で開示される外的処置によって細胞核内にＹＢ−１を含む、および／または調節解除されたＹＢ−１を含む腫瘍または癌疾患も一般に示す。
【０１８８】
さらに、本明細書に記載のウイルスは原理上、腫瘍の治療のために使用可能である。
【０１８９】
本明細書に記載のウイルスによって特に治療可能な腫瘍は、好ましくは神経系腫瘍、眼腫瘍、皮膚腫瘍、軟組織腫瘍、胃腸腫瘍、呼吸器系腫瘍、骨格腫瘍、内分泌系腫瘍、女性生殖器系腫瘍、乳線腫瘍、男性生殖器系腫瘍、尿排泄系腫瘍、混合腫瘍および胚芽腫を含む造血系腫瘍を含むグループから選択される腫瘍である。これらの腫瘍は、特に本明細書で定義される特に耐性な腫瘍である。
【０１９０】
神経系の腫瘍グループは好ましくは以下を含む：
１．脳（頭蓋内）腫瘍の他、頭部腫瘍、好ましくは星膠腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、節神経腫、脳室上衣腫、神経鞘腫、神経線維腫、血管芽細胞腫、脂肪腫、頭蓋咽頭腫、奇形腫および軟骨腫
２．脊髄腫瘍および脊柱管腫瘍、好ましくは膠芽腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、神経線維腫、骨肉腫、軟骨肉腫、血管肉腫、線維肉腫および多発性骨髄腫
３．末梢神経腫瘍、好ましくは神経鞘腫、神経線維腫、神経線維肉腫および神経周囲の線維芽細胞腫
【０１９１】
眼腫瘍のグループは、好ましくは以下を含む：
１．眼瞼腫瘍および眼瞼腺腫瘍、好ましくは腺腫、腺癌、乳頭腫、組織球腫、肥満細胞腫、基底細胞腫、黒色腫、扁平上皮癌、線維腫および線維肉腫
２．結膜腫瘍および瞬膜腫瘍、好ましくは扁平上皮癌、血管腫、血管肉腫、腺腫、腺癌、線維肉腫、黒色腫および乳頭腫
３．眼窩腫瘍、視神経腫瘍、眼球腫瘍、好ましくは網膜芽細胞腫、骨肉腫、肥満細胞腫、髄膜腫、細網細胞腫、膠腫、神経鞘腫、軟骨腫、腺癌、扁平上皮癌、形質細胞腫、リンパ腫、横紋筋肉腫および黒色腫
【０１９２】
皮膚腫瘍のグループは好ましくは以下を含む：
組織球腫、脂肪腫、線維肉腫、線維腫の腫瘍、肥満細胞腫、悪性黒色腫、乳頭腫 、基底細胞腫、角化性棘細胞腫、血管周囲細胞腫、毛包腫、汗腺腫瘍、脂腺腺腫、血管腫、血管肉腫、脂肪腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、形質細胞腫およびリンパ管腫
【０１９３】
軟部組織腫瘍のグループは、好ましくは以下を含む：
胞巣状軟組織肉腫、類上皮細胞肉腫、軟組織の軟骨肉腫、軟組織の骨肉腫、軟組織のユーイング肉腫、原始神経外胚葉腫瘍（ＰＮＥＴ）、線維肉腫、線維腫、平滑筋肉腫、平滑筋腫、脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫、悪性血管外皮細胞腫、血管腫、血管肉腫、悪性間葉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍（ＭＰＮＳＴ、悪性神経鞘腫、悪性メラニン細胞神経鞘腫、横紋筋肉腫、滑膜肉腫、リンパ管腫およびリンパ管肉腫
【０１９４】
胃腸腫瘍のグループは、好ましくは以下を含む：
１．口腔腫瘍および舌腫瘍、好ましくは扁平上皮癌、線維肉腫、メルケル細胞腫瘍、誘導性の繊維性エナメル上皮腫 、線維腫、線維肉腫、ウイルス性乳頭腫、特発性乳頭腫、鼻咽頭ポリープ、平滑筋肉腫、筋原細胞腫およびマスト細胞腫瘍
２．唾液腺腫瘍、好ましくは腺癌
３．食道腫瘍、好ましくは扁平上皮癌、平滑筋肉腫、線維肉腫、骨肉腫、バレット癌および食道周囲腫瘍
４．外分泌膵臓腫瘍、好ましくは腺癌
５．胃腫瘍、好ましくは腺癌、平滑筋腫、平滑筋肉腫および線維肉腫
【０１９５】
呼吸器系腫瘍のグループは、好ましくは以下を含む：
１．鼻および鼻腔の腫瘍、咽頭および気管の腫瘍、好ましくは扁平上皮癌、線維肉腫、線維腫、リンパ肉腫、リンパ腫、血管腫、血管肉腫、黒色腫、肥満細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、膨大細胞腫（横紋筋肉腫）、腺癌および筋原細胞腫
２．肺腫瘍、好ましくは扁平上皮癌、線維肉腫、線維腫、リンパ肉腫、リンパ腫、血管腫、血管肉腫、黒色腫、肥満細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、膨大細胞腫（横紋筋肉腫）、腺癌、筋原細胞腫、小細胞癌、非小細胞癌、気管支腺癌、気管支肺胞腺癌および胞巣状腺癌
【０１９６】
骨格腫瘍のグループは、好ましくは以下を含む：
骨肉腫、軟骨肉腫、傍骨性骨肉腫、血管肉腫、滑膜細胞肉腫、血管肉腫、線維肉腫、悪性間葉腫、巨大細胞腫、骨腫および多小葉骨腫
【０１９７】
内分泌系腫瘍のグループは、好ましくは以下を含む：
１．甲状腺/副甲状腺、好ましくは腺腫および腺癌
２．副腎、好ましくは腺腫、腺癌および褐色細胞腫（副腎髄質腫）
３．視床下部/脳下垂体腫瘍、好ましくは腺腫および腺癌
４．内分泌膵臓腫瘍、好ましくは膵島細胞腫（β細胞腫、ＡＰＵＤｏｍ）およびゾリンジャー・エリソン症候群（膵δ細胞のガストリン分泌腫瘍）
５．多発性内分泌腫瘍（ＭＥＮ）と非クロム親和性傍神経節腫
【０１９８】
女性生殖器系腫瘍のグループは、好ましくは以下を含む：
１．卵巣腫瘍、好ましくは腺腫、腺癌、嚢胞腺腫および未分化癌
２．子宮腫瘍、好ましくは平滑筋腫、平滑筋肉腫、腺腫、腺癌、線維腫、線維肉腫および脂肪腫
３．頚管腫瘍、好ましくは腺癌、腺腫、 平滑筋肉腫および平滑筋腫
４．腟および外陰の腫瘍、好ましくは平滑筋腫、平滑筋肉腫、線維平滑筋腫、線維腫、線維肉腫、ポリープおよび扁平上皮癌
【０１９９】
乳腺腫瘍のグループは、好ましくは以下を含む：
線維腺腫、腺腫、腺癌、間葉系腫瘍、癌腫、癌肉腫
【０２００】
男性生殖器系腫瘍のグループは、好ましくは以下を含む：
１．睾丸腫瘍、好ましくは精上皮腫、間質細胞腫瘍およびセルトリ細胞腫
２．前立腺腫瘍、好ましくは腺癌、未分化癌、扁平上皮癌、平滑筋肉腫および移行上皮癌
３．陰茎および外性器の腫瘍、好ましくは肥満細胞腫および扁平上皮癌
【０２０１】
尿排泄系腫瘍のグループは、好ましくは以下を含む：
１．腎腫瘍、好ましくは腺癌、移行上皮癌（上皮性腫瘍）、線維肉腫、軟骨肉腫（間葉系腫瘍）、ウィルムス腫瘍、腎芽細胞腫および腺肉腫（胎児性多能性芽腫）
２．輸尿管腫瘍、好ましくは平滑筋腫、平滑筋肉腫、線維乳頭腫、移行上皮癌
３．膀胱腫瘍、好ましくは移行上皮癌、扁平上皮癌、腺癌、ぶどう状（胎児性横紋筋肉腫）、線維腫、線維肉腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、乳頭腫および血管肉腫
４．尿道腫瘍、好ましくは移行上皮癌、扁平上皮癌および平滑筋肉腫
【０２０２】
造血系腫瘍のグループは、好ましくは以下を含む：
１．リンパ腫、リンパ性白血病、非リンパ性白血病、骨髄増殖性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫
【０２０３】
混合腫瘍および胎児性腫瘍のグループは、好ましくは以下を含む：
血管肉腫、胸腺腫および中皮腫
【０２０４】
特に好適な実施態様では、これらの腫瘍は乳癌、卵巣癌、前立腺癌、骨肉腫、膠芽腫、黒色腫、小細胞肺癌および大腸癌を含むグループから選択される。さらなる腫瘍は、本明細書に記載される耐性の腫瘍、好ましくは多剤耐性の腫瘍、また特に上記のグループの腫瘍である。特に好ましい腫瘍は、乳房腫瘍、骨腫瘍、胃腫瘍、腸腫瘍、胆嚢腫瘍、膵臓腫瘍、肝臓腫瘍、腎臓腫瘍、脳腫瘍、卵巣腫瘍、皮膚および皮膚付属器の腫瘍、頭頸部腫瘍、子宮腫瘍、滑膜腫瘍、咽頭腫瘍、食道腫瘍、舌腫瘍と前立腺腫瘍を含むグループから選択される腫瘍である。腫瘍は、それらの徴候に関して本明細書で開示される腫瘍であることが好ましい。
【０２０５】
本発明のウイルスを使用して治療可能な別の腫瘍は、白血病腫瘍および転移性腫瘍、特に前述の腫瘍の転移性腫瘍である。本発明に従って治療可能なさらなる腫瘍は、原発腫瘍、二次性腫瘍、三次性腫瘍、転移性腫瘍を含むグループから選択される。以下の特徴、即ち、理由を問わず、腫瘍が細胞周期とは無関係に核内にＹＢ−１を有する、および／または腫瘍が調節解除されたＹＢ−１を含む、少なくとも１つを腫瘍が有することが好ましい。本発明のウイルスを使用して治療可能なさらなる腫瘍グループは、本明細書で開示される耐性の1つ以上を有するという条件で、上記の腫瘍および本発明のウイルスを使用して治療可能であると記載されている腫瘍の全てである。
【０２０６】
好ましくは細胞周期とは無関係に核内にＹＢ−１を含まない、または調節解除されたＹＢ−１を含まない、該腫瘍が本発明のウイルスを使用して治療可能であることもさらに本発明の範囲内である。これは特にウイルス自体がＹＢ−１をコード化する場合に実現される。ＹＢ−１の特異的発現、ひいては特異的ウイルス複製の理由で、好適な実施態様では、ウイルスの発現は好ましくは高度に調節されたプロモーターの制御下に置かれる。該プロモーターは、ウイルスが目的細胞内でのみ複製可能なように、特異的な活性化が可能な任意のプロモーターでありうる。特に好適なプロモーターは、特に当業者には既知の腫瘍特異的プロモーターおよび組織特異的プロモーターである。さらにまた、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＭＬＰ）が発現されるように、ウィルスゲノム内にＹＢ−１をコードする配列をクローニングすることは可能である。このプロモーターは、大部分はアデノウイルス複製の開始後に活性である（Tollefson A. E.ら、Journal of Virology 66, 3633-3642, 1992; Bauzon M.ら、Molecular Therapy 7, 526-534, 2003）。
【０２０７】
ＹＢ−１は、逆方向ＣＡＡＴ配列、いわゆるＹボックスに結合する高度に保存されたグループに属する。これらは転写および翻訳の両レベルで調節的に活性化できる（Wolffe, A.P. Trends in Cell Biology 8, 318-323, 1998）。
【０２０８】
本発明に従って使用されるウイルスの一実施態様では、ウイルスの一部となるＹＢ−１をコードする核酸は、ＹＢ−１の核内輸送を媒介する核酸配列も含むことができる。例えばＯｎｙｘ−０１５、ＡｄΔ２４、ｄｌ９２２−９４７、ＥｌＡｄ／０１／０７、ＣＢ０１６、ｄｌ５２０などの先行技術において既知のアデノウイルスおよび特許ＥＰ  ０  ９３１  ８３０に記載のアデノウイルスの他、本発明に従った核酸、ウイルス、ウイルス系は、単独使用、もしくはアデノウイルスおよびアデノウイルス系、ひいては対応する核酸として、これと関連して本発明に従ったこれらの核酸との併用が可能である。核酸輸送に適した核酸配列は当業者には既知であり、例えば（Whittaker, G.R.ら、Virology, 246, 1-23, 1998; Friedberg, E.C., TIBS 17, 347,1992; Jans, D.A.ら、Bioessays 2000 Jun; 22(6): 532-44; Yoneda, Y., J. Biocehm. (Tokyo)1997 May; 121(5): 811-7; Boulikas, T., Crit. Rev. Eukaryot Gene Expr. 1993; 3(3): 193-227; Lyons RH, Mol. Cell Biol., 7, 2451-2456, 1987）に記載されている。核輸送を媒介する核酸配列と関連して、異なる原理を利用できる。該原理は、例えば、ＹＢ−１がシグナルペプチドとの融合タンパク質として形成され、そして核内に導入されて、これによって本発明のアデノウイルス複製が起こりうる。
【０２０９】
本発明に従って使用されるアデノウイルスの設計において実現可能な別の原理は、好ましくは細胞質内での合成から始まり、細胞核内にＹＢ−１を導入する、もしくは細胞核内にＹＢ−１を転位させ、そこでウイルス複製を促進させるトランスポーター配列によってもらすことが可能である。核輸送を媒介する特に効果的な核酸配列の一例は、ＨＩＶのＴＡＴ配列であり、これはEfthymiadis,A., Briggs, LJ, Jans, DA., JBC 273, 1623-1628, 1998に記載されている種類の他の適当な核酸配列の１つである。本発明に従って使用されるアデノウイルスが、核輸送をコード化しているペプチドをコード化する核酸配列を含むことは本発明の範囲内である。
【０２１０】
ＹＢ−１が全長で、特に野生型ＹＢ−１と一致する形で存在することは本発明の範囲内である。ＹＢ−１が、例えば短縮化または切断された誘導体として使用される、もしくは存在することは本発明の範囲内である。本発明において使用される、もしくは存在するＹＢ−１の誘導体は、Ｅ２後期プロモーターに結合可能であり、ひいてはアデノウイルスのＥ２領域の遺伝子発現を活性化するＹＢ−１である。該誘導体は特に本明細書で開示されるＹＢ−１を含む。別の誘導体は、Ｎ末端、Ｃ末端、またはアミノ酸配列の範囲内の１つ以上のアミノ酸の欠失によって作成可能である。ＹＢ−１断片が、本発明の意味において、ＹＢ−１タンパク質として使用される、およびＹＢ−１タンパク質を示すことも本発明の範囲内である。様々なＹＢ−１断片が、Jurchott Kら［JBC 2003, 278, 27988-27996］の論文において開示されており、これらはＣ末端およびＮ末端の欠失を特徴とする。様々なＹＢ−１断片の分布は、Ｃ末端の他、コールドショックドメイン（ＣＳＤ）が細胞周期によって制御されるＹＢ−１の核内輸送において重要であることを示した。このため切断ＹＢ−１（本明細書においてはＹＢ−１タンパク質とも呼ばれる）が、本発明に従ったＥ１Ｂ５５ｋおよびＥ４ｏｒｆ６の発現との組み合わせで、より良好に核内に移動して、ひいては野生型ＹＢ−１と比較して必ずしもＥ２後期プロモーターにより良好に結合することなくＣＰＥをより強力に誘導することも本発明の範囲内であり、ここでは切断ＹＢ−１もより良好に核内に移動して、両活性、つまりＣＰＥの誘導およびＥ２後期プロモーターへの結合を示すことは除外できない。最後に、該切断ＹＢ−１断片もより良好に核内に移動して、より良好にＣＰＥを誘導することなくＥ２後期プロモーターにより良好に結合可能である。切断ＹＢ−１タンパク質または断片が、完全長ＹＢ−１と関連して本明細書に記載の別の配列、特に核局在化シグナル配列（ＮＬＳ）などを含むことも本発明の範囲内である。
【０２１１】
本発明は、別の態様において、好ましくは腫瘍または腫瘍疾患を患う、もしくは腫瘍または腫瘍疾患を患うことが疑われる患者、および本発明のウイルスを使用して治療可能な患者のスクリーニング方法と関連しており、方法は以下の段階を含む：
−  患者の検体、好ましくは腫瘍組織の検体の分析。
−  ＹＢ−１が細胞周期とは無関係に核内に局在するか否か、または細胞が、検体の１つ以上の細胞において調節解除された／過剰発現ＹＢ−１を含むか否かの判定。
【０２１２】
ＹＢ−１の代わりに、もしくはＹＢ−１に加えて、好ましくは代理マーカーとして機能する、もしくは機能することが知られている上記のマーカーの存在も評価可能である。
【０２１３】
本発明に従った方法の一実施態様では、ＹＢ−１に対するアンチカリンの他、抗ＹＢ−１抗体、ＹＢ−１特異的に結合するペプチド、ＹＢ−１に対するアプタマー、ＹＢ−１に対するスピーゲルマー（spiegelmer）を含むグループから選択される薬剤による腫瘍組織の分析が検討される。原理上、各マーカーに対して同じ種類の薬剤も製造・使用できる。抗体、特にモノクローナル抗体の製造は、当業者には既知である。ＹＢ−１またはマーカーの特異的検出用の別の薬剤は、高い親和性で標的構造に結合するペプチドであり、本発明の場合にはＹＢ−１または該マーカーである。先行技術において、該ペプチドを作成するための方法は、例えばファージディスプレイなどが知られている。該目的のために、個々のペプチドの長さが約８−２０アミノ酸であり、ライブラリーサイズが約１０２−１０１８、好ましくは１０８−１０１５の異なるペプチドである、ペプチドライブラリーから始める。ポリペプチドに結合する標的分子の特定構造はいわゆるアンチカリンとよばれ、これは例えばドイツ特許出願ＤＥ１９７  ４２  ７０６に記載されている。
【０２１４】
ＹＢ−１または本明細書で開示される対応する代替マーカーへの特異的結合、ひいては細胞周期とは無関係なＹＢ−１の核局在化の検出のための別の薬剤は、いわゆるアプタマー、即ち、ＲＮＡまたはＤＮＡに基づき、一本鎖または二本鎖のいずれかで存在して、標的分子に特異的に結合するＤ核酸である。アプタマーの作成は、例えば欧州特許ＥＰ  ０  ５３３  ８３８に記載されている。アプタマーの特別な実施態様は、いわゆるアプタザイムであり、例えば、Piganeau, N.ら (2000), Angew. Chem. Int. Ed., 39, no. 29, pp 4369-4373に記載されている。これらがアプタマーの構成成分とは別にリボザイムの構成成分からなり、結合またはアプタマー構成成分へ結合する標的分子の放出時にリボザイムが触媒活性を有し、シグナル発生に伴って核酸基質を切断する限りにおいて、これらはアプタマーの特別な実施態様である。
【０２１５】
アプタマーの別の形態は、いわゆるスピーゲルマー、即ち、Ｌ−核酸を含む標的分子に結合する核酸である。該スピーゲルマーの作成方法は、例えば、ＷＯ９８／０８８５６に記載されている。
【０２１６】
腫瘍組織の検体は、穿刺または外科手術によって採取される。細胞周期とは無関係にＹＢ−１が核内に位置するか否かに関しては、顕微鏡技術および（または）通常抗体または上記の別の薬剤のいずれかを使用した免疫組織解析の利用によって評価される場合が多い。核内のＹＢ−１およびその核局在化が細胞周期と無関係であること別の検出方法は、当業者には既知である。例えば、ＹＢ−１の局在化は、ＹＢ−１染色された組織切片のスキャニング時に容易に検出可能である。ＹＢ−１が核内に存在する頻度は、核局在化が細胞周期とは無関係であることを既に示唆している。核内における細胞周期非依存的なＹＢ−１の検出のさらなる可能性は、ＹＢ−１染色、ＹＢ−１が核内に局在するか否かの評価、そして細胞分裂の相の判定である。一方、上記およびＹＢ−１の検出はそれぞれＹＢ−１に対する前述の薬剤を使用しても実施可能である。薬剤は当業者には既知の方法によって検出される。該薬剤はＹＢ−１に特異的であり、この範囲において分析される検体中の他の構造、特に細胞の他の構造には結合しないため、薬剤の適当な標識およびそれらのＹＢ−１に対する特異的結合に起因する該薬剤の局在化およびＹＢ−１の局在化はいずれも適宜に検出・評価できる。薬剤の標識方法は当業者には既知である。
【０２１７】
本明細書に記載のウイルスは、本発明のウイルスか否か、もしくは本発明に従って使用されるか否かを問わず、疾患、特に腫瘍疾患、より好ましくは腫瘍細胞の少なくとも一部が多剤耐性、特に多剤耐性を示す腫瘍疾患と関連して使用可能であることも本発明の範囲内であり、ここでＹＢ−１は調節解除された型として存在する。これは、細胞および疾患が、ＹＢ−１が核内に、好ましくは細胞周期とは無関係に存在する場合での細胞および疾患を示しているという条件で、細胞および腫瘍と関連して本明細書に記載の他の各態様および任意の態様にも適用される。
【０２１８】
本発明に従った、および本明細書で開示されるウイルスは、好ましくはアデノウイルスであるが、洞察、方法および使用、核酸、タンパク質、複製系などはアデノウイルスに限定されず、他のウイルスおよびウイルス系に適用される。
【０２１９】
アデノウイルスおよびアデノウイルス系の作成の他、任意の使用を含む、当該考察は、これをコード化する核酸、ひいてはその逆の場合にも適用される。
【０２２０】
本発明と関連して、本発明に従って使用されるアデノウイルスおよびこれをコード化する核酸は、それぞれそれ自体で、もしくは別の核酸配列との組み合わせで複製を起こす、対応する任意のアデノウイルス核酸とすることが可能である。本明細書で説明されているように、ヘルパーウイルスによって、複製に必要な配列および（または）遺伝子産物を供給可能である。コード核酸配列が言及される範囲、およびそれらが既知の核酸である範囲において、同一の配列だけでなく、それに派生する配列も使用されることは本発明の範囲内である。派生する配列は、特に、派生ではない配列の機能の１つに対応する機能を有する核酸またはポリペプチドを問わず、依然として遺伝子産物をもたらす配列である。これは、当業者には既知の簡単な通常の試験によって判定可能である。派生する核酸配列の一例は、同じ遺伝子産物、特に同じアミノ酸配列をコード化するが、遺伝暗号の縮重に起因して異なる塩基配列を示す核酸配列である。
【０２２１】
ヘルパーウイルスの有無を問わず、本発明のウイルスが複製系として存在することは、本発明の範囲内である。
【０２２２】
本発明に従った該アデノウイルス複製系の場合、アデノウイルス核酸および／または核酸が、複製可能なベクターとして存在することは、さらに本発明の範囲内である。
【０２２３】
本発明に従って使用されるアデノウイルスをコード化する核酸が、発現ベクター内に存在すること、および該発現ベクターが本発明に従って使用されることは、さらに本発明の範囲内である。
【０２２４】
さらなる態様では、本発明は少なくとも２つのベクターを含むベクターグループとも関連しており、該ベクターグループはその全体で本明細書に記載のアデノウイルス複製系を構成しており、該ベクターグループは本発明に従って使用される。アデノウイルス複製系の各成分が、別のベクター、好ましくは発現ベクターに存在することは本発明の範囲内である。
【０２２５】
最後に、本発明は、さらなる態様において、本発明に従って使用されるウイルスをコードする１つ以上の核酸を含む細胞の使用と関連しており、該細胞は、様々なアデノウイルスに関して本明細書に記載される全く同じ目的のために、本発明に従った対応するウイルス複製系および／または対応するベクターおよび／またはベクターグループに関する本発明に従って使用される。
【０２２６】
上記のウイルスの構築、特にこれらの核酸およびこれらをコード化する核酸は、細胞内、好ましくは腫瘍細胞内に複数で導入することも可能であり、これによって様々な個々の成分の存在に起因して、個々の成分が１つの核酸および１つ以上のウイルスからそれぞれ派生したかのように共に行動する。
【０２２７】
本発明に従って使用され、ウイルス、ウイルス系、これらの部分をコードする核酸は、ベクターとしても存在できる。好ましくは、これらのベクターはウイルスベクターである。核酸がウイルスの核酸を含む場合、好ましくは、ウイルス粒子はベクターである。一方、該核酸がプラスミドベクター内に存在することも本発明の範囲内である。いずれの場合にも、ベクターは、挿入された核酸の増殖、即ち、挿入された核酸の複製および選択的発現を可能にするエレメントを含む。適当なベクター、好ましくは発現ベクター、および各エレメントは、当業者には既知であり、例えばGrunhaus, A., Horwitz, M.S., 1994に記載されており、クローニングベクターとしてのアデノウイルスは、Rice, C., editor, Seminars in Virology, London: Saunders, Scientific Publicationsに記載されている。
【０２２８】
ベクターグループと関連する態様では、該核酸の様々なエレメントが必ずしも１つのベクターのみに含まれないという前述の実施態様を考慮に入れている。これに応じて、ベクターグループは少なくとも２つのベクターを含む。これとは別に、ベクターに関する記載は、ベクターおよびベクターグループにもそれぞれ適用可能である。
【０２２９】
本発明に従って使用されるウイルス、特にアデノウイルスは、本明細書において開示される様々な核酸および遺伝子産物によって特徴付けられ、その他の点では、好ましくは当業者には既知であり、野生型アデノウイルスに固有の全てのエレメントを含むことができる（Shenk, T.: Adenoviridae: The virus and their replication. Fields Virology, vol. 3, editors Fields, B.N., Knipe, D.M., Howley, P.M.ら、Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996, chapter 67）。
【０２３０】
別の態様では、本発明は、本発明のウイルス投与、該核酸、ベクター、複製系、薬剤、薬学的組成物を含む腫瘍疾患の処置法と関連している。腫瘍疾患は本明細書に記載の腫瘍疾患である。患者には該治療が必要であり、好ましくは本明細書で開示される患者のグループから選択される患者である。
【０２３１】
異論がない場合、各ウイルス、核酸、ベクター、複製系、薬剤、薬学的組成物に関して開示される特徴および実施態様は、それぞれ本発明に従って、本発明の範囲内であり、また、本発明によって使用されるウイルス、核酸、ベクター、複製システム、薬剤及び医薬組成物は、各々及び他の本発明の態様及びその逆のいずれにおいても適用可能である。
【０２３２】
図１は、Ｅ２Ｆ及びＹＢ−１によるＥ２後期及びＥ２初期プロモーターによるアデノウイルスのＥ２領域レギュレーションの概略図である。図１中、関与するプロモーター、すなわち、Ｅ２初期及びＥ２後期プロモーターをそれぞれ、Ｅ２Ｆ及びＹＢ−１による結合性及び活性化に関して示す。野生型Ｅ１Ａタンパク質は、Ｅ２Ｆの網膜芽細胞腫タンパク質Ｒｂへの結合を妨げる。こうして遊離したＥ２Ｆは、Ｅ２初期プロモーターに結合し、これによりアデノウイルス複製を誘導する。８〜１２時間後に、いわゆるスイッチがＥ２後期プロモーターに生じる。これは、細胞質から核へのＹＢ−１の移行のときのみ可能である。核移行の後、ＹＢ−１は、Ｅ２後期プロモーターへの結合によりＥ２遺伝子発現を活性化する。
【０２３３】
Ｅ２Ｆ／ＲＢの結合メカニズム及びＥ２ＦのＥ１Ａに媒介された遊離は、本発明の基礎をなしているメカニズムと実質的に異なる。Ｒｂタンパク質からのＥ２Ｆの遊離は、アデノウイルス複製の決定的な工程とは言わないまでも、ヒト転写因子ＹＢ−１の核局在化を除き、従来技術で想定されていたほど重要ではない。この転写因子は、大部分の細胞周期にわたる正常細胞中、細胞質にのみ存在する。これは、アデノウイルスでの感染後、特定の条件下で核内に誘導されるか、あるいは、異なる腫瘍疾患、すなわち、乳癌、卵巣の癌腫、前立腺癌、骨肉腫、グリア芽細胞腫、黒色腫、小細胞肺癌、及び、大腸癌を含むがこれらに限定されない、のような異なる細胞メカニズム中の核内にすでに存在する。
【０２３４】
実施例１：
アデノウイルスを発現している様々なタンパク質IXの設計
図２に示された野生型アデノウイルスのウイルス核酸のデザインから出発して、ＹＢ−１に依存する様式で複製するアデノウイルスによるタンパク質ＩＸの発現について、本願明細書において開示される様々なデザイン原理を具現化し、図３、４、５及び５ａに示した。全てのデザインが、野生型中に自然に存在するＥ１Ａプロモーターによってそれぞれコントロールされないという意味において、一般にＥ１Ａ１３Ｓ−マイナス及びＥ１Ａ１２Ｓ−マイナスである。
【０２３５】
図３に図示するように、アデノウイルスＸｖｉｒ  ０５／プロモーターは、さらに、タンパク質ＩＸが野生型中に存在する調節性コンテキストに含まれず、タンパク質ＩＸが発現していないという意味において、Ｅ１Ｂ１９Ｋ−マイナス及びタンパク質ＩＸ−マイナスである。むしろ、発現はＥ２後期プロモーターによってコントロールされる。しかしながら、タンパク質ＩＸはＥ３領域内にクローニングされ、原則として、Ｅ４領域内にもクローニングされる。Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ４及びＭＬＰのための遺伝子は依然として存在し、また発現しうる。Ｅ４ｏｒｆ６及びＥ１Ｂ５５Ｋからなるトランスポーターは、ＣＭＶプロモーターのコントロール下にあるカセットＥ４ｏｒｆ６−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂ５５Ｋにより形成される。しかしながら、それぞれのカセットは、Ｅ１領域内にクローニングされ、また、他の領域、例えばＥ３またはＥ４領域内にクローニングすることができる。
【０２３６】
図４に図示するように、アデノウイルスＸｖｉｒ０５／Ｅ１Ａ１２Ｓのアデノウイルスはさらに、タンパク質ＩＸが野生型中に存在する調節性コンテキスト中に存在せず、タンパク質ＩＸが発現していないという意味において、Ｅ１Ｂ１９Ｋ−マイナス及びタンパク質ＩＸ−マイナスである。むしろ、発現は、Ｅ２後期プロモーターによりコントロールされるＥ１Ａ１２Ｓによって起こり、結果としてＥ１Ｂ５５Ｋコード領域に含まれるタンパク質ＩＸの読み枠が活性化される。しかしながら、タンパク質Ｅ１Ａ１２ＳはＥ３領域内にクローニングされるが、Ｅ４領域内にもクローニングすることができる。Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ４、及びＭＬＰのための遺伝子は、依然として存在し、また発現されうる。Ｅ４ｏｒｆ６及びＥ１Ｂ５５Ｋからなるトランスポーターは、ＣＭＶプロモーターのコントロール下にあるカセットＥ４ｏｒｆ６−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂ５５Ｋにより形成される。しかしながら、それぞれのカセットはＥ１領域内にクローニングされ、また、Ｅ３またはＥ４領域内のような異なる領域内にクローニングすることができる。
【０２３７】
図５に図示するように、アデノウイルスＸｖｉｒ  ０５／Ｅ１Ｂ１９Ｋのアデノウイルスはさらに、タンパク質ＩＸが野生型中に存在するような調節性コンテキスト中に含まれないという意味において、Ｅ１Ｂ１９Ｋ−マイナス及びタンパク質ＩＸ−マイナスである。むしろ、ＣＭＶプロモーターのコントロール下で発現し、Ｅ１Ｂ５５Ｋ読み枠中に含まれるタンパク質ＩＸの読み枠の発現を可能にするタンパク質Ｅ１Ｂ１９Ｋにより、発現がコントロールされる。Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ３、Ｅ４、及びＭＬＰのための遺伝子は、依然として存在し、また発現されうる。Ｅ４ｏｒｆ６及びＥ１Ｂ５５Ｋからなるトランスポーターは、ＣＭＶプロモーターのコントロール下にあるカセットＥ４ｏｒｆ６−ＲＳＶ−プロモーター−Ｅ１Ｂ領域により形成される。しかしながら、それぞれのカセットは、Ｅ１領域内にクローニングされ、また、異なる領域内、例えばＥ３またはＥ４領域内にクローニングすることができる。
【０２３８】
図５ａに図示するように、アデノウイルスＸｖｉｒ０５／Ｅ３−ＩＸのアデノウイルスはさらに、タンパク質Ｅ１Ｂ１９Ｋが野生型の調節性コンテキスト中に含まれず、タンパク質ＩＸが発現していないという意味において、Ｅ１Ｂ１９Ｋ−マイナス及びタンパク質ＩＸ−マイナスである。むしろ、発現は、天然のＥ３プロモーターによりコントロールされる。Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂ、Ｅ４、及びＭＬＰのための遺伝子は、依然として存在し、また、発現されうる。Ｅ４ｏｒｆ６及びＥ１Ｂ５５Ｋからなるトランスポーターは、ＣＭＶプロモーターのコントロール下にあるカセットＥ４ｏｒｆ６−ＩＲＥＳ−Ｅ１Ｂ５５Ｋにより形成される。しかしながら、それぞれのカセットはＥ１領域内にクローニングされ、また、他の領域内、例えばＥ３またはＥ４領域内にクローニングすることができる。
【０２３９】
図６〜９は、本発明のアデノウイルスのさらなる実施態様を示す。
【０２４０】
図６中に図示されるウイルスは、図５に図示するアデノウイルスＸｖｉｒ  ０５／Ｅ１Ｂ１９Ｋのさらなる発展である。Ｘｖｉｒ０５／Ｅ１Ｂ１９Ｋに加えて、このウイルスは、Ｅ２後期プロモーターのコントロール下にありかつＥ１Ａ１２Ｓ、ＹＢ−１及びそれぞれを独立してコードする核酸をそれぞれ含むカセットを含み、これにより、両読み枠をＩＲＥＳにより互いに分離する。実施態様において、ＹＢ−１コード核酸はカセットに含まれない。ウイルスにより発現されるＹＢ−１のための核酸は、結果として調節解除されたＹＢ−１で細胞中により顕著な複製を行う。
【０２４１】
図８に図示するアデノウイルスは、図６に図示するアデノウイルスのさらなる発展であり、Ｅ２後期プロモーターのコントロール下にあるカセットがＥ１Ａ１２Ｓ、ＹＢ−１、及びそれぞれを独立してコードする核酸をそれぞれ含み、これがＥ４領域内にクローニングされ、様々なトランスジーンが、アポトーシス誘導遺伝子、プロドラッグ遺伝子、ｓｉＲＮＡ、腫瘍サプレッサー遺伝子、及びサイトカインなどのＥ３プロモーターのコントロール下にあるＥ３領域にクローニングされる。あるいは、本願明細書において、開示される様々なトランスジーンは、この領域内にクローニングすることができる。
【０２４２】
最後に、図９に図示するように、本発明のアデノウイルスは図８に図示するアデノウイルスのさらなる発展であり、ここでさらに、ウイルスのターゲティングのために有利なＲＧＤモチーフがクローニングにより組み込まれた。それは、アデノウイルスゲノム中の繊維タンパク質中、およそ位置３２６７５−３２６８５に見つけることができる。特定の位置詳細におけるこれらの変異は、野生型アデノウイルスの配列とは異なり、種々のデータバンクまたはデータバンクエントリー内で異なる長さを有するという事実により生じる。
【０２４３】
図７に図示する本発明のアデノウイルスは、図３に図示するウイルスに基づく。それに対して、このアデノウイルスは、しかしながら、Ｅ４ｏｒｆ６及びＥ１Ｂ５５Ｋからなるカセットを含まないが、両方とも別々のプロモーター、すなわち、ＣＭＶプロモーター及びＲＳＶプロモーターによりコントロールされる。クローニングは、Ｅ１領域内に行われた。加えて、アデノウイルスは、タンパク質ＩＸをコードしかつＩＲＥＳ  によりＥ１Ａ１２Ｓの一つから分離されるＥ２後期プロモーター、いまだ核酸のコントロール下にあるＥ１Ａ１２Ｓをコードする核酸から離れて含む。また、このカセットは、タンパク質ＩＸをコードする核酸なしで、原則として設計されうる。さらなる実施態様において、カセットはＥ４領域内にクローニングされる。最後に、このウイルスはまた、Ｅ３またはＥ４領域中に、図８に図示するウイルスと関連して説明したように、トランスジーンを含みうる。このアデノウイルスのさらなる実施態様において、ＲＧＤモチーフが含まれる。
【０２４４】
実施例２：
タンパク質ＩＸ発現の検出
この実験を、ＹＢ−１媒介複製において、効果的な粒子形成のためのタンパク質ＩＸの発現の関連性を確認するために行った。この目的のために、従来技術に記載され、図１１に図示する腫瘍溶解性ＹＢ−１依存性複製アデノウイルスＸｖｉｒ  ０３−０３′ＵＴＲを使用した。
【０２４５】
実験を行う際、以下の通りに進めた：１０cm皿につき、１０６の２９３及び２５７ＲＤＢ細胞をプレートした。翌日、細胞を図１１に図示するように、感染無し（Ｋ）、あるいは野生型アデノウイルスまたはＸｖｉｒ０３で感染させた。無血清ＤＭＥＭ培地１．５ｍｌ中３７℃で１時間感染させた。その後、感染培地を取り除き、１０mlの完全培地（１０％のＦＣＳ／ＤＭＥＭ）に置き換えた。２４〜４８時間後に、ＲＮＡを単離した。その後、ノーザンブロット分析を実行した。この目的のために、各１０μgのＲＮＡを３％のホルムアルデヒドを含むアガロースゲル中で電気泳動により分離し、その後ナイロン膜上へブロットし、３８６ｂｐプローブにハイブリダイズさせた。ＰＣＲにより発生したプローブとして、Ｐ３２でラベルしたプローブを、ターゲットタンパク質ＩＸに使用した。下記のプライマーを、ＰＣＲ用に使用した：５′−ＴＡＴＴＴＧＡＣＡＡＣＧＣＧ、５′−ＴＴＴＴＡＡＡＣＣＧＣＡＴＴＧＧＧ。野生型のアデノウイルスゲノム中のプローブの位置は、位置３６４８〜４０３３の間にある。使用されるウイルスは、タンパク質ＩＸの発現を示さないＸｖｉｒ  ０３である。
【０２４６】
この実験の結果を図１０に図示する。
【０２４７】
図１１から分かるように、ウイルスＸｖｉｒ０３−０３′ＵＴＲは、野生型アデノウイルスと比較して腫瘍細胞２５７ＲＤＢ中において発現の低減を示す。Ｅ１Ａ、及び、Ｅ１Ｂタンパク質、特にまた、Ｅ１Ｂ１９Ｋタンパク質を発現する２９３の細胞において、充分なタンパク質ＩＸが発現される。
【０２４８】
実施例３：
組換えアデノウイルスＸｖｉｒ０５、Ｘｖｏｒ０５／タンパク質ＩＸ、Ｘｖｉｒ０５／０１、及びＸｖｉｒ０５／０２のデザイン
ベクターＸｖｉｒ０５において、特にウイルスタンパク質Ｅ４ｏｒｆ６及びＥ１Ｂ５５ｋの発現は、発現カセットＣＭＶ−Ｅ４ｏｒｆ６及びＲＳＶ−Ｅ１Ｂ−領域により起こる。これにより、核内へのＹＢ−１の転位がもたらされる。Ｅ１Ａ１２Ｓ遺伝子産物、加えてＹＢ−１遺伝子産物は、Ｅ２後期プロモーターのコントロール下、さらにウイルス複製を促進する。加えて、ウイルスは、ＡＢＣトランスポーターＭＲＰ及びＭＤＲ１の発現を阻害できる。加えて、タンパク質Ｅ１Ｂ１９Ｋ及びタンパク質ＩＸは、カセットＲＳＶ−Ｅ１Ｂ領域の一部として発現する。
【０２４９】
ベクターＸｖｉｒ０５−タンパク質ＩＸは、さらなるベクター発展である。そこで、発現カセットＥ２ｌａｔｅ−Ｅ１Ａ１２Ｓ−ＩＲＥＳ−タンパク質ＩＸに存在するアデノウイルス・タンパク質ＩＸの発現が確実になる。ベクターは、全部のＥ１Ｂ領域ではなく、Ｅ１Ｂ５５ｋの読み取り枠のみを含む。
【０２５０】
完全なＥ１Ｂ領域、すなわち、Ｅ１Ｂ１９ｋ、Ｅ１Ｂ５５ｋ及びタンパク質ＩＸは、ベクターＸｖｉｒ０５／０１、例えばＲＳＶプロモーターの場合には、ウイルスの非アデノウイルスプロモーターによりコントロールされる。発現カセットＥ２−後期−Ｅ１Ａ１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１は、Ｅ４領域中に存在する。このように、特定の治療用トランスジーンは、Ｅ３領域内にクローニングすることができる。Ｅ３欠失は、アデノウイルスＡＤＰタンパク質「アデノウイルス死亡タンパク質」が依然として発現されうるようなものである。加えて、Ｅ１Ａ１２Ｓ及びＥ１Ｂ１９ｋの発現は、結果としてタンパク質ＩＸの発現となる。
【０２５１】
ベクターＸｖｉｒ０５／０２はさらに、より良好な感染率を提供するために、ファイバーノブのＨループ中のＲＧＤモチーフを含む。
【０２５２】
ウイルスの調製は、以下の通りである：
【０２５３】
レスキュープラスミドｐＡｄＥＡＳＹ（Qbiogene）の改変
ΔＥ３Ｅ４シャトルベクターの調製用シャトルベクター  ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＡｄＥＡＳＹの使用
最初に、ＣＭＶプロモーターを、利用可能なベクターｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＡｄＥＡＳＹに導入し、次いでウシ成長ホルモン・ポリアデニル化シグナルをその中にクローニングした。この目的のために、プラスミドをＥｃｏＲＩにより消化し、末端をＴ４ポリメラーゼ及びｄＮＴＰｓで装填して平滑末端にし、骨格を脱リン酸化し、結果として生じる２個の切断生成物を再結合した。この手順により、ＥｃｏＲＩのための制限認識配列を破壊した。こうして得られたプラスミドをｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＥｃｏＲＩ）−ＡｄＥＡＳＹと称した。
【０２５４】
その後、カセットＣＭＶ−ＭＣＳ−ｐｏｌｙＡをＣｌｏｎｔｅｃｈのｐＳｈｕｔｔｌｅからＭｆｅＩ及びＥｃｏＲＩを用いて切除し、末端を平滑末端にして、ＸｂａＩで線形にされたベクターｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＥｃｏＲＩ）−ＡｄＥＡＳＹ内にクローニングし、平滑末端にし、このような目的のために脱リン酸化した。プラスミドＣＭＶ−ＭＣＳ−ＰｏｌｙＡ−ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＡｄＥＡＳＹは、このようにして作成した。
【０２５５】
Ｅ３及びＥ４領域の操作のために、プラスミドｐＡｄＥＡＳＹのΔＥ３Ｅ４領域を、ＳｐｅＩ及びＰａｃＩでプラスミドＣＭＶ−ＭＣＳ−ＰｏｌｙＡ−ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＡｄＥＡＳＹ内にクローニングし、こうしてプラスミドΔＥ３Ｅ４  ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＡｄＥＡＳＹを調製した。ＮｄｅＩでの制限及び再結合により、２つのＮｄｅＩ切断部位のうちの１つ、及びプラスミドからの多重クローニング部位も欠失した。この手順によりプラスミドΔＥ３Ｅ４−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹが得られた。
【０２５６】
Ｅ４操作
ポテンシャル治療用トランスジーンのためのスペースを供給し、望ましくない相同組み換えを回避するために、プラスミドΔＥ３Ｅ４−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹ中のＥ４領域を特に欠失させた。この目的のために、Ｅ４ｏｒｆ６領域は、ＰｓｔＩでの切断及び再結合により、約６３４ｂｐでトランケートされた＝ΔＥ３Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹ。それぞれの欠失は、当業者により組換えアデノウイルスの作成のための他のシステムでなされうる。
【０２５７】
ΔＥ３Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹ中のＲＧＤモチーフのクローニング
改良された感染性のために、Dmitrievら1998（An Adenovirus Vector with Genetically Modified Fibers Demonstrates Expanded Tropism via Utilization of a Coxsackievirus and Adenovirus Receptor-Independent Cell Entry Mechanism）を参照し、ファイバーノブドメインのＨＩループを改変した：それぞれの領域を、プライマーＲＧＤ−Ｈｐａ  ｆｗ  （５′−ＧＡＧｇｔｔａａｃＣＴＡＡＧＣＡＣＴＧＣＣＡＡＧ−３′）、ＲＧＤ−ＥｃｏＲＶ  ｒｅｖ（５′−ＣＡＴＡＧＡＧＴＡＴＧＣＡＧＡＴＡＴＣＧＴＴＡＧＴＧＴＴＡＣＡＧＧＴＴＴＡＧＴＴＴＴＧ−３′）、同様にＲＧＤ−ＥｃｏＲＶ  ｆｗ  （５′−ＧＴＡＡＣＡＣＴＡＡＣＧＡＴＡＴＣＴＧＣＡＴＡＣＴＣＴＡＴＧＴＣＡＴＴＴＴＣＡＴＧＧ−３′）及びＲＧＤ−ＢｆｒＩ  ｒｅｖ（５′−ＣＡＧＣＧＡＣＡＴＧＡＡｃｔｔａａｇＴＧＡＧＣＴＧＣ−３′）を使用して増幅し、これによりＥｃｏＲＶ切断部位を作成した。この切断部位に、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチドをコードする一対のオリゴヌクレオチドを、クローニングした：ＲＧＤ−オリゴ１（５′−ＣＡＣＡＣＴＡＡＡＣＧＧＴＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＧＡＧＡＣＡＣＡＡＣＴＴＧＴＧＡＣＴＧＣＣＧＣＧＧＡＧＡＣＴＧＴＴＴＣＴＧＣＣＣ−３′）、及びＲＧＤ−オリゴ２（５′−ＧＧＧＣＡＧＡＡＡＣＡＧ  ＴＣＴＣＣＧＣＧＧＣＡＧＴＣＡ  ＣＡＡＧＴＴＧＴＧＴＣＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＴＧＴＧＴＡＣＣＧＴＴＴＡＧＴＧＴＧ−３′）。ΔＥ３Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹ内の切断部位内のＨｐａＩ及びＢｆｒＩへのクローニングにより、ΔＥ３−ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹを作成した。ＲＧＤモチーフは、ファイバーノブドメインのＨＩループに存在する。
【０２５８】
ΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹのΔＥ３領域内へのＥ３ａ領域のクローニング。
この目的のために、インビトロゲンのベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）を、ＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩにより消化し、これによりＣＭＶプロモーターを取り除き、ベクターを再結合した（ＣＭＶのないｐｃＤＮＡ３．１（＋）＝ｏＣＭＶ）。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｏＣＭＶベクターのＳｐｅＩ、及び、ＸｈｏＩ制限部位に、野生型ウイルスＤＮＡからのＳｐｅＩ（２７０８３ｂｐ）及びＸｈｏＩ（２９７９２ｂｐ）により切開かれた２７０９ｂｐ断片を、（ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｏＣＭＶ／Ｅ３ａＸｈｏＩ）にクローニングした。あるいは、ＸｈｏＩよりむしろＨｐａＩ（３０５７０ｂｐ）で３′端末で切ることができる。この目的のために、ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｏＣＭＶを、次にＳｐｅＩ及びＥｃｏＲＶにより消化し、アデノウイルスＳｐｅＩ−ＨｐａＩ−断片を、（ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｏＣＭＶ／Ｅ３ａＨｐａＩ）にクローニングした。さらなるオプションは、ＥｃｏＲＩを使用して開いたｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｏＣＭＶにクローニングされたアデノウイルス野生型ＤＮＡ（位置２７３３２ｂｐ及び３００５０ｂｐ）からの２７１８ｂｐ  ＥｃｏＲＩ断片により提供される（ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｏＣＭＶ／Ｅ３ａＥｃｏＲＩ）。
【０２５９】
ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｏＣＭＶ／Ｅ３ａを使用して、Ｅ３ａ領域をベクターΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹにクローニングすることができた：シャトルベクターΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹを、この目的のためにＮｈｅＩにより消化し、末端を平滑末端とし、ＳｐｅＩによりさらに消化された。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｏＣＭＶ／Ｅ３ａＸｈｏＩからのインサートを、この部位にクローニングした：このプラスミドをこのような目的のためにＸｈｏＩにより消化し、末端を平滑末端とし、ＳｐｅＩによりさらに消化した。こうして切り出された断片を、あらかじめ切開したプラスミドΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹにクローニングした。
【０２６０】
断片ＳｐｅＩ−ＨｐａＩ（位置３０５７０ｂｐ〜２７０８３ｂｐ）及びＥｃｏＲＩ（位置３００５０ｂｐ〜２７３３２ｂｐ）を、それぞれのｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｏＣＭＶ／Ｅ３ａ構築物から同様の方法で調製し、クローニングすることができる。
【０２６１】
あるいは、Ｅ３ａ領域をプライマーＥ３ａフォワード（ＳｐｅＩ）５′−ＣＴＴＡＡＧＧＡＣＴＡＧＴＴＴＣＧＣＧＣ−３′及びＥ３ａリバース（ＸｈｏＩ、ＮｈｅＩ）５′−ＣＡＡＧＣＴＡＧＣＴＣＧＡＧＧＡＡＴＣＡＴＧ−３′を使用して、アデノウイルス５型野生型ＤＮＡをテンプレートとして使用して、ＰＣＲにより増幅することができる。Ｅ３ａリバースプライマーでＮｈｅＩ切断部位を作成する。この増幅物をＳｐｅＩ及びＮｈｅＩにより制限し、ＳｐｅＩ及びＮｈｅＩにより消化したベクターΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹにクローニングする。
【０２６２】
ＳｐｅＩ−ＨｐａＩ断片について
あるいは、Ｅ３ａ領域はプライマーＥ３ａフォワード（ＳｐｅＩ）５′−ＣＴＴＡＡＧＧＡＣＴＡＧＴＴＴＣＧＣＧＣ−３′及びＥ３ａ  リバース（ＨｐａＩ、ＮｈｅＩ）５′−ＣＡＣＧＣＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＣＣＡＴＧＴＣＴＴＧＧ−３′を使用して、アデノウイルス５型野生型ＤＮＡをテンプレートとして使用して、ＰＣＲにより増幅することができる。Ｅ３ａリバースプライマーを使用して、ＮｈｅＩ切断部位をこうして作成する。この増幅物を、ＳｐｅＩ及びＮｈｅＩにより制限し、ＳｐｅＩ及びＮｈｅＩにより開かれベクターΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹにクローニングする。
【０２６３】
ＥｃｏＲＩ断片について
あるいは、Ｅ３ａ領域をプライマーＥ３ａフォワード（ＥｃｏＲＩ）５′−ＧＡＡＡＣＣＧＡＡＴＴＣＴＣＴＴＧＧＡＡＣ−３′及びＥ３ａリバース（ＮｈｅＩ、ＥｃｏＲＩ）５′−ＧＡＡＴＴＣＴＡＧＣＴＡＧＣＴＣＡＧＣＴＡＴＡＧ−３′を使用して、アデノウイルス５型野生型ＤＮＡをテンプレートとして使用して、ＰＣＲにより増幅することができる。Ｅ３ａリバースプライマーを使用して、ＮｈｅＩ切断部位をこのように作成する。この増幅物を、ＥｃｏＲＩ及びＮｈｅＩにより制限し、ＥｃｏＲＩ及びＮｈｅＩにより切開したベクターΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹにクローニングする。
【０２６４】
ΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹ中のｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｏＣＭＶ／Ｅ３ａからのＥ３ａ領域のクローニングで、Ｅ３ａΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹを作成した。
【０２６５】
こうしてクローニングした領域は、Ｅ３  ＡＤＰ（位置２９７７２ｂｐ）のための読み取り枠の後までＥ３領域、このようなＥ３プロモーター、ポリアデニル化シグナルを有する完全なＥ３Ａ領域、転写開始、１２．５Ｋ、６．７Ｋ  Ｅ３、Ｅ３  ｇｐ１９  Ｋ及びＥ３  ＡＤＰの読み取り枠を含む。
【０２６６】
アデノウイルス５型ＤＮＡ配列と比較して、Ｅ３領域はＳｐｅＩ−ＸｈｏＩクローニングの場合には位置２９７９６〜３１５０９ｂｐ（＝１７１３ｂｐ）から欠失する。
【０２６７】
Ｅ３プロモーター及びＡＤＰのための読み取り枠との間のさらなる欠失は、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）ｏＣＭＶ／Ｅ３ａにより可能である：位置２７５９６ｂｐ及び２９３５５ｂｐとの間のさらなる制限により、例えばＥｃｏＲＩＩ、ＢｓｉＷＩ、ＤｒａＩ、ＭｕｎＩで、６．７Ｋの読み取り枠及び中間にあるｇｐ１９  Ｋを取り除くことができ、こうしてさらなるトランスジーン取り込みのための最大１．８ｋｂの追加スペースを提供する。それぞれの制限により上記のＥ３Ａの増幅物をトランケートすることができ、前述したようにクローニングすることができる。
【０２６８】
Ｅ２後期プロモーターのコントロール下における第２の発現カセットＥ１ａ  １２Ｓのクローニング。
第一に、Ｅ２後期プロモーターを、一対のオリゴヌクレオチドとしてＰｒｏｍｅｇａ（ｐＧＬ３−Ｅ２Ｌａｔｅ）のｐＧＬ３−エンハンサープラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ及びＢｇｌＩＩ切断部位にクローニングした。上流プライマー５′−ＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧＣＡＴＴＴＧＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡＴＴＧＧＴＣＴＴＣＧＴＡＧＡＡＣＣＴＡＡＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＧＴＧＧＴＡＧＴＣＣＴＣＡＧＧＴＡＣＡＡＡＴ−３′及び下流プライマー５′−ＡＧＣＴＴＡＴＴＴＧＴＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＴＡＣＣＡＣＧＣＣＣＡＣＧＡＧＡＴＴＡＧＧＴＴＣＴＡＣＧＡＡＧＡＣＣＡＡＴＣＣＣＧＣＣＣＧＣＣＡＡＡＴＧＣＧＧＡＧＣ−３′。
【０２６９】
その後、ルシフェラーゼ遺伝子を、ＮｃｏＩ及びＸｂａＩにより切除し、末端を平滑末端とし、Ｔ末端を加えた。このように開かれた部位で、プライマーＥ１ａ１２Ｓフォワード５′−ＡＴＧＧＣＣＧＣＣＡＧＴＣＴＴＴＴＧ−３′及びＥ１ａ  １２Ｓリバース５′−ＴＴＡＴＧＧＣＣＴＧＧＧＧＣＧＴＴＴＡＣ−３′を使用してＲＴ−ＰＣＲにより増幅されたトランスジーンＥ１Ａ  １２Ｓを、ＴＡクローニングにより導入した。
【０２７０】
こうすることにより、カセットは、ベクターｐＧＬ３のＥ２後期プロモーター、読み取り枠Ｅ１ａ−１２Ｓ及びＳＶ−４０後期のポリアデニル化シグナルを含む。
【０２７１】
このカセットをＰｖｕＩ及びＣｌａＩにより切除し、末端を平滑末端とし、ここであるいは、ＥｃｏＲＩＩ、ＢｓｉＷＩ、ＤｒａＩ、ＭｕｎＩにより欠失したＥ３ａ領域にクローニングでき（上記のようにＥ３  ６、７  Ｋ及びｇｐ１９  Ｋの読み取り枠の除去後）、あるいは、たとえば平滑末端のリン酸化ＢｆｒＩ切断部位のＥ４ＯＲＦ６の欠失部分にクローニングすることができる。
【０２７２】
こうして作られた構築物は、Ｅ３ａ／Ｅ２Ｌａｔｅ−Ｅ１ａ−１２Ｓ／ΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹまたはＥ３ａΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６／Ｅ２Ｌａｔｅ−Ｅ１ａ−１２Ｓ−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹである。
【０２７３】
Ｅ２後期プロモーターのコントロール下でＹＢ−１を有する１２Ｓ第２の発現カセットＥ１ａのクローニング
この増幅物Ｅ１ａ１２Ｓ（上記）及びＩＲＥＳ要素（テンプレートとしてのＮｏｖａｇｅｎのｐＣＩＴＥ−４ａ（＋）、ＩＲＥＳフォワード＝５′−ＴＣＣＧＧＴＴＡＴＴＴＴＣＣＡＣＣＡＴＡＴＴＧＣ−３′及びＩＲＥＳリバース＝５′−ＴＴＡＴＣＡＴＣＧＴＧＴＴＴＴＴＣＡＡＡＧＧ−３′）を、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（インビトロゲン）の多重クローニング部位に連続してクローニングした。この目的のために、Ｅ１ａ−１２Ｓ増幅物を、ＴＡクローニングにより平滑末端とされたＢａｍＨＩ切断部位に導入した。その後、プラスミドＥ１ａ−１２Ｓを、ＥｃｏＲＶでｐｃＤＮＡ３．１（＋）に線形にし、Ｔ末端を加え、ＩＲＥＳ要素の増幅物をクローニングにより導入した。こうして得られた構築物Ｅ１ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ｐｃＤＮＡ３．１（＋）を、ＮｏｔＩにより線形にし、末端を平滑末端とした。また、プラスミドｐＨＶａｄ２ｃ  ＣＭＶ／Ｓ４０＋ＹＢ−１  ｓ（ステファン・バーグマン）からのＹＢ−１−ＥｃｏＲＩ切断生成物を平滑末端とし、脱リン酸化されたベクターＥ１Ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ｐｃＤＮＡ３．１（＋）に導入した。あるいは、タンパク質ＩＸの読み取り枠のためのＰＣＲ増幅物を、Ｔ末端の添加後にベクターＥ１ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ｐｃＤＮＡ３．１（＋）の平滑末端としたＮｏｔＩ切断部位に導入し、より詳細にはプライマーＩＸフォワード５′−ＡＴＧＡＧＣＡＣＣＡＡＣＴＣＧＴＴＴＧ−３′及びＩＸリバース５′−ＧＴＴＴＴＡＡＡＣＣＧＣＡＴＴＧＧＧＡＧＧ−３′を使用した。
【０２７４】
カセットＥ１Ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１またはＥ１Ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳタンパク質ＩＸをＰｍｅＩにより切り出し、ＮｃｏＩ及びＸｂａＩを有するルシフェラーゼ遺伝子の除去後、上記のプラスミドｐＧＬ３−Ｅ２Ｌａｔｅにクローニングし、平滑末端とし、脱リン酸化した。
【０２７５】
このカセットＥ２ｌａｔｅ−Ｅ１Ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１はＰｖｕＩ及びＣｌａＩにより切り出し、末端を平滑末端とし、ここであるいは、ＥｃｏＲＩＩ、ＢｓｉＷＩ、ＤｒａＩ、ＭｕｎＩ欠失Ｅ３ａ領域にクローニングし（Ｅ３  ６、７  Ｋ及びｇｐ１９  Ｋのための読み取り枠の除去後、上記参照）、あるいはＥ４ＯＲＦ６の欠失部分、たとえば平滑末端とし脱リン酸化したＢｆｒＩ切断部位にクローニングした。
【０２７６】
こうして得られた構築物は、Ｅ３ａ／Ｅ２Ｌａｔｅ−Ｅ１ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１／ΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹまたはＥ３ａΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６／Ｅ２Ｌａｔｅ−Ｅ１ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹである。
【０２７７】
レスキュープラスミドＥ３ａ／Ｅ２Ｌａｔｅ−Ｅ１ａ−１２Ｓ／ΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＡｄＥＡＳＹまたはＥ３ａΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６／Ｅ２Ｌａｔｅ−Ｅ１ａ−１２Ｓ−ｐＡｄＥＡＳＹまたはＥ３ａ／Ｅ２Ｌａｔｅ−Ｅ１ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１／ΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＡｄＥＡＳＹまたはＥ３ａΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６／Ｅ２Ｌａｔｅ−Ｅ１ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１−ｐＡｄＥＡＳＹそれぞれの作成
Ｅ３ａまたはＥ４ΔＯＲＦ６内の第２の発現カセットＥ２Ｌａｔｅ−Ｅ１ａ−１２ＳまたはＥ２Ｌａｔｅ−Ｅ１ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１を有するＥ３ａΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６領域を、対応するｐＳｈｕｔｔｌｅプラスミドＥ３ａΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＳｈｕｔｔｌｅ（−ＮｄｅＩ）−ＡｄＥＡＳＹからＳｐｅＩ及びＰａｃＩで切り出し、対応する開かれたベクターｐＡｄＥＡＳＹにクローニングし、これにより、新規なレスキュー・ベクターＥ３ａ／Ｅ２Ｌａｔｅ−Ｅ１ａ−１２Ｓ／ΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＡｄＥＡＳＹまたはＥ３ａΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６／Ｅ２Ｌａｔｅ−Ｅ１ａ−１２Ｓ−ｐＡｄＥＡＳＹまたはＥ３ａ／Ｅ２Ｌａｔｅ−Ｅ１ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１／ΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＡｄＥＡＳＹまたはＥ３ａΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６／Ｅ２Ｌａｔｅ−Ｅ１ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１−ｐＡｄＥＡＳＹをそれぞれ作成した。
【０２７８】
Ｅ３ａΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＡｄＥＡＳＹはＥ３ａ領域、ＲＧＤモチーフ及び欠失Ｅ４ＯＲＦ６を含み、第２の発現カセットとして、Ｅ２Ｌａｔｅ−Ｅ１ａ−１２ＳあるいはＥ２Ｌａｔｅ−Ｅ１ａ−１２Ｓ−ＩＲＥＳ−ＹＢ−１がＥ３ａまたはＥ４ΔＯＲＦ６中に存在する。この構築物は、シャトルのプラスミドによりさらなるトランスジーンをＥ１領域に導入するためのレスキュー・プラスミドである。
【０２７９】
Ｅ１領域のためのトランスジーンカセットの調製
Ｅ１Ｂ領域のクローニング
Ｅ１Ｂ領域のために、アデノウイルス・ゲノムをＸｂａＩ（位置１３４０ｂｐ）及びＭｕｎＩ（位置３９２５ｂｐ）で制限し、２５８５ｂｐ断片をこうして完全なＥ１Ｂ範囲（ｐＳｈｕｔｔｌｅ／Ｅ１Ｂ）を含むＸｂａＩ及びＭｕｎＩクローニング部位のＡｄＥＡＳＹのｐＳｈｕｔｔｌｅにクローニングした。
【０２８０】
あるいは、Ｅ１Ｂ領域を、テンプレートとしてアデノウイルス５型野生型ＤＮＡを使用してプライマーＥ１Ｂフォワード５′−ＧＴＧＴＣＴＡＧＡＧＡＡＴＧＣＡＡＴＡＧＴＡＧ−３′及びＥ１Ｂリバース５′−ＧＴＣＡＡＡＧＡＡＴＣＣＡＡＴＴＧＴＧＣ−３′を有するＰＣＲにより増幅し、ＸｂａＩ及びＭｕｎＩにより制限し、ＡｄＥＡＳＹのｐＳｈｕｔｔｌｅのＸｂａＩ及びＭｕｎＩ切断部位にクローニングすることができる。
【０２８１】
こうして、ｐＳｈｕｔｔｌｅ／Ｅ１Ｂは、Ｅ１Ｂプロモーター、Ｅ１Ｂ１９Ｋ、Ｅ１Ｂ５５Ｋ及びタンパク質ＩＸのための読み取り枠及び自然のポリＡパートを含む。Ｅ１ＢプロモーターをＸｂａＩ及びＨｐａＩにより取り除き、ベクターの末端を平滑末端とし、ＭｌｕＩ及びＸｈｏＩにより切断されたインビトロゲンのｐｃＤＮＡ３．１（＋）からのＣＭＶプロモーターにより置き換え、これも末端を平滑末端とした。あるいは、ＣＭＶプロモーターよりむしろＲＳＶプロモーターまたは腫瘍−特異的及び、ウイルスプロモーター、例えば特許中に言及されたプロモーターがそれぞれ、Ｅ１Ｂ領域の発現をコントロールすることができる。
【０２８２】
カセットＲＳＶ−Ｅ４ＯＲＦ６−ｐｏｌｙＡの調製用ＲＳＶプラスミドの調製
インビトロゲンのプラスミドｐＲｃ／ＲＳＶを、ＸｈｏＩ、ＳｐｅＩ及びＸｂａＩにより切断した。こうして得られた２８１０ｂｐ及び２７８ｂｐ断片を再結合し、こうすることによりＦ１開始点及びネオマイシン耐性遺伝子（ｏＮｅｏ）を取り除いた。
【０２８３】
こうして得られたベクターｐＲｃ／ＲＳＶ（ｏＮｅｏ）は、DobbelsteinからのプラスミドＣＧＮからのＥ４ＯＲＦ６のための読み取り枠がクローニングした１つのＢａｍＨＩ切断部位のみを含む。あるいは、プライマーＥ４ＯＲＦ６−フォワード５′−ＡＴＧＡＣＴＡＣＧＴＣＣＧＧＣＧＴＴＣＣ−３′及びＥ４ＯＲＦ６リバース５′−ＣＴＡＣＡＴＧＧＧＧＧＴＡＧＡＧＴＣ−３′を使用するＰＣＲの増幅物を、Ｔ末端（ＴＡクローニング）を加えた後に、ベクターｐＲｃ／ＲＳＶ（ｏＮｅｏ）のＥｃｏＲＶ切断部位に導入することができる。あるいは、ＲＳＶプロモーター（ＭｌｉＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを使用する切除による）ではなく、むしろ、ＣＭＶプロモーター（ＭｌｕＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを使用する切除によりｐｃＤＮＡ３．１（＋）から得る）または、腫瘍特異的及びウイルス・プロモーター、例えば特許中に記載されたプロモーターも、それぞれ、Ｅ４ｏｒｆ６の発現をコントロールすることができる。
【０２８４】
カセットＲＳＶ−Ｅ４ＯＲＦ６−ｐｏｌｙＡ（ウシ成長ホルモン・ポリアデニル化シグナルはプラスミドｐＲＣ／ＲＳＶに由来する）を、ＭｕｎＩで切断され、末端を平滑末端とし、さらにプラスミドからＸｈｏＩにより切り出した。この発現カセットを、その後ＮｏｔＩにより切断されたベクターｐＳｈｕｔｔｌｅ／Ｅ１Ｂにクローニングし、平滑末端とし、その後ＸｈｏＩにより切断した。このベクターから、ＲＳＶ−Ｅ４ＯＲＦ６−ｐｏｌｙＡ／Ｅ１Ｂ−ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＡｄＥＡＳＹを得た。
【０２８５】
トランスジーンのカセットのレスキュー・ベクターへの導入
Ｅ１−ＢｅｒｅｉｃｈのためのベクターＲＳＶ−Ｅ４ＯＲＦ６−ｐｏｌｙＡ／Ｅ１Ｂ−ｐＳｈｕｔｔｌｅ−ＡｄＥＡＳＹを、Ｂｓｔ１１０７Ｉ及びＭｒｏＩを使用して線形にし、レスキュー・プラスミド（上記参照）と共にエレクトロポレーションによりＢＪ５１８３（ＥＣ）バクテリアに導入した。アデノウイルス・プラスミドＲＳＶ−Ｅ４ＯＲＦ６−ｐｏｌｙＡ／Ｅ１Ｂ−Ｅ３ａ／Ｅ２Ｌａｔｅ−Ｅ１ａ−１２Ｓ／ΔＥ３ＲＧＤ−Ｅ４ΔＯＲＦ６−ｐＡｄＥＡＳＹを、相同組み換えにより（または他の上述したレスキュー・ベクター変種を有する対応する方法により）作成し、結果としてＨＥＫ２９３細胞中にトランスフェクションした後にウイルスを産生した。
【０２８６】
他のシステム、例えば、Clontech/BD BiosciencesのpAdenoX-SystemまたはMicrobixのシステムが本発明（特に個々におよび／またはいかなる組合せにおける上記の発現カセットを含む）によりアデノウイルス（好ましくは組換えアデノウイルス）の製造のために使用されることが本発明中及び当業者により明らかである。
【０２８７】
前記の特徴、請求項及び図は、その各種実施態様において、本発明を実行するためには個々にあるいはいかなる組合せにおいても重要である。
【図面の簡単な説明】
【０２８８】
以下に、本発明を、新たな機能、実施態様、及び効果を取りうる図及び実施例を参照することによりさらに例示する。
【図１】Ｅ２Ｆ及びＹＢ−１によるＥ２後期及びＥ２初期プロモーターによるアデノウイルスのＥ２領域レギュレーションの概略図である。
【図２】野生型のアデノウイルスの設計の概略図である。
【図３】Ｅ２後期プロモーターのコントロール下でタンパク質ＩＸを発現する本発明のアデノウイルスＸｖｉｒ  ０５／プロモーターの概略図である。
【図４】Ｅ１Ａ１２Ｓのコントロール下でＥ１Ｂ５５Ｋ読み枠の一部としてタンパク質ＩＸを発現する本発明のアデノウイルスＸｖｉｒ  ０５／Ｅ１Ａ１２Ｓの概略図である。
【図５】Ｅ１Ｂ１９Ｋのコントロール下でタンパク質ＩＸを発現する本発明のアデノウイルスＸｖｉｒ  ０５／Ｅ１Ｂ１９Ｋの概略図である。
【図５ａ】Ｅ３プロモーターのコントロール下でタンパク質ＩＸを発現する本発明のアデノウイルスＸｖｉｒ  ０５／Ｅ３−ＩＸの概略図である。
【図６】野生型アデノウイルス及びウイルスＸｖｉｒ  ０５／Ｅ１Ｂ１９Ｋの実施態様である本発明のアデノウイルスＸｖｉｒ  ０５の概略図である。
【図７】野生型アデノウイルス及びウイルスＸｖｉｒ  ０５／Ｅ１Ａ１２Ｓの実施態様である本発明のアデノウイルスＸｖｉｒ  ０５／タンパク質ＩＸの概略図である。
【図８】野生型アデノウイルス及びウイルスＸｖｉｒ  ０５／タンパク質ＩＸの実施態様である本発明のアデノウイルスＸｖｉｒ  ０５／０１の概略図である。
【図９】野生型アデノウイルス及びウイルスＸｖｉｒ  ０５／タンパク質ＩＸのさらなる実施態様である本発明のアデノウイルスＸｖｉｒ  ０５／０２の概略図である。
【図１０】タンパク質ＩＸの検出のためのノーザンブロット分析の結果である。
【図１１】腫瘍溶解アデノウイルスＸｖｉｒ０３−３′ＵＴＲのデザインの概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図５ａ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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