(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリカ粒子中に、蛍光波長が相異する二種以上の有機蛍光色素分子同士を連結して形成された連結分子を内包した有機蛍光色素内包シリカナノ粒子であって、
前記連結分子は、同一分子内に二種以上のアミノ基と、少なくとも一種の加水分解性置換基を含むシリル基とを有する下記一般式（１）で表されるシラン化合物と、アミノ基と反応する官能基を有し、かつ蛍光波長が相異する二種以上の有機蛍光色素分子とを反応させることで得られる反応生成物であり、
連結された前記二種以上の有機蛍光色素分子のうちの一種の有機蛍光色素部分（「第１有機蛍光色素部分」という。）が吸収した光エネルギーが、別種の有機蛍光色素部分（「第２有機蛍光色素部分」という。）に蛍光共鳴エネルギー移動により移動し、光吸収した前記第１有機蛍光色素部分とは異なる前記第２有機蛍光色素部分から蛍光が発し、
前記第１有機蛍光色素部分の吸収極大波長と第２有機蛍光色素部分の蛍光極大波長が、２０ｎｍ以上離れており、
前記連結分子がシリカナノ粒子と結合している、
ことを特徴とする有機蛍光色素内包シリカナノ粒子。
一般式（１）：ＮＨ２−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｍ−ＳｉＲｌ（ＯＲ１）ｋ
（式中、ｎおよびｍは１〜１２の整数を表し、互いに同一でも異なっていてもよい。ｌおよびｋはｌ＋ｋ＝３を満たし、ｌは０〜２の整数、ｋは１〜３の整数を表す。Ｒは非加水分解性の置換基を表し、ＯＲ１は加水分解性の炭素数１〜６のアルコキシ基を表し、複数ある場合、互いに同一でも異なっていてもよい。）
【請求項２】
前記シラン化合物は、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（６−アミノヘキシル）アミノメチルトリエトキシシラン、Ｎ−（６−アミノヘキシル）アミノプロピルトリエトキシシラン、またはＮ−（２−アミノエチル）−１１−アミノウンデシルトリメトキシシランであることを特徴とする、請求項１に記載の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子。
【請求項３】
請求項１または請求項２に記載の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子を製造する有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の製造方法であって、下記工程（ａ）及び工程（ｂ）を含んでなることを特徴とする有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の製造方法。
工程（ａ）：同一分子内に二種以上のアミノ基と、少なくとも一種の加水分解性置換基を含むシリル基とを有する下記一般式（１）で表されるシラン化合物と、当該アミノ基と反応する官能基を有し、かつ蛍光波長が相異する二種以上の有機蛍光色素とを反応させる工程、
工程（ｂ）：前記工程（ａ）で得られた反応生成物を含ケイ素アルコキシドと混合し、塩基性条件下加水分解反応を行う工程。
一般式（１）：ＮＨ２−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｍ−ＳｉＲｌ（ＯＲ１）ｋ
（式中、ｎおよびｍは１〜１２の整数を表し、互いに同一でも異なっていてもよい。ｌおよびｋはｌ＋ｋ＝３を満たし、ｌは０〜２の整数、ｋは１〜３の整数を表す。Ｒは非加水分解性の置換基を表し、ＯＲ１は加水分解性の炭素数１〜６のアルコキシ基を表し、複数ある場合、互いに同一でも異なっていてもよい。）
【請求項４】
前記工程（ｂ）では、前記有機蛍光色素内包シリカナノ粒子中の前記反応生成物の濃度が１×１０−６ｍｏｌ／Ｌ以上１×１０−２ｍｏｌ／Ｌ以下になるように、前記反応生成物を含ケイ素アルコキシドと混合することを特徴とする、請求項３に記載の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の製造方法。
【請求項５】
請求項１または請求項２に記載の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子を用いた生体物質標識剤であって、当該有機蛍光色素内包シリカナノ粒子と分子標識物質とが、有機分子を介して結合されていることを特徴とする生体物質標識剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シリカ粒子中に複数種の有機蛍光色素を内包したシリカナノ粒子、その製造方法、及びそれを用いた生体物質標識剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
疾病の診断あるいは病態の把握を目的に、血液などに含まれる特定の生体分子（バイオマーカー）の検出が注目されている。
【０００３】
現在、生体分子の検出のために抗原抗体反応を利用した免疫分析（イムノアッセイ）が主に用いられている。酵素反応を利用した化学発光法が高感度とされ、現在主流である。
【０００４】
しかしながら、生体物質である酵素を用いるため温度管理などを厳密にするなど煩雑な操作が要求され、より簡便なシステムが求められている。
【０００５】
その一つとして予め蛍光物質標識された生体物質標識剤を用いる蛍光イムノアッセイ法が知られている。蛍光物質としては、有機色素や、量子ドットを使用することができる。化学発光法に比べ、簡便な操作で行えるものの、用いる蛍光物質の蛍光強度が非常に小さいため、検出感度が十分でなかった。
【０００６】
近年、より超早期での疾病の診断を行うため、すなわち、極微量のバイオマーカーの検出を行うため、より高蛍光強度を有する蛍光物質で標識された生体物質標識剤が求められている。その一つとして複数の蛍光物質を一つのシリカナノ粒子に内包させる技術が開示されている（例えば特許文献１及び２参照）。
【０００７】
蛍光物質として、有機蛍光色素を内包したシリカナノ粒子用いて蛍光イムノアッセイを行った場合、一般に有機蛍光色素が吸収極大波長と蛍光極大波長の差（以下「ストークスシフト」という。）が１０〜２０ｎｍと小さいので、蛍光検出器へ励起光の一部が入りこんでしまう。入りこんだ励起光強度（Ｎ）が大きいと、本来検出すべき蛍光強度（Ｓ）との比（Ｓ／Ｎ比）を小さくなってしまい、所望とする高感度検出の妨げとなる。
【０００８】
これを解決するため特許文献２には、蛍光波長の異なる色素を内包し、それらの蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｒｅｓｏｎａｎｔ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ；以下「ＦＲＥＴ」と略す。）の利用が開示されている。すなわち、蛍光波長の短い第１の色素を励起し、励起された第１の色素からより蛍光波長の長い第２の色素へエネルギーが移動、そして第２の色素から蛍光が発することで、励起光と蛍光の波長が大きく離れ、擬似的にストークスシフトが大きい色素を内包したシリカナノ粒子を作るものである。
【０００９】
ところが、本発明者らが、特許文献２に開示されている方法により、第１の色素としてＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ（インビトロジェン社登録商標）、第２の色素としてテトラメチルローダミンそれぞれを別個に添加する方法により、共内包したシリカナノ粒子を作製し、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬを励起し、テトラメチルローダミンの蛍光の検出を試みたところ、テトラメチルローダミン由来の蛍光は微弱であった。このことは、第１の色素から第２の色素へのＦＲＥＴ効率が著しく低いことを意味しており、さらなる改善が必要であることが分かった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２００７／０７４７２２号
【特許文献２】特開２００９−３００３３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、上記問題・状況にかんがみてなされたものであり、その解決課題は、ストークスシフトが大きく、かつ発光強度の高い有機蛍光色素内包シリカナノ粒子及びその製造方法を提供することである。また、それを用いた生体物質標識剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討の結果、第１有機蛍光色素と、第１有機蛍光色素より蛍光波長の長い第２有機蛍光色素とを同一分子に共有結合により結合させ、さらにその分子がシリカ粒子と共有結合により結合した有機蛍光色素内包シリカナノ粒子を用いた場合、ＦＲＥＴ効率が向上することにより、第２有機蛍光色素由来の蛍光強度が飛躍的に向上し、高感度検出が可能となることを見出し、本発明に至った。
【００１３】
すなわち、本発明に係る上記課題は、以下の手段により解決される。
【００１４】
１．シリカ粒子中に、蛍光波長が相異する二種以上の有機蛍光色素分子同士を連結して形成された連結分子を内包した有機蛍光色素内包シリカナノ粒子であって、前記連結分子は、同一分子内に二種以上のアミノ基と、少なくとも一種の加水分解性置換基を含むシリル基とを有する下記一般式（１）で表されるシラン化合物と、アミノ基と反応する官能基を有し、かつ蛍光波長が相異する二種以上の有機蛍光色素分子とを反応させることで得られる反応生成物であり、連結された前記二種以上の有機蛍光色素分子のうちの一種の有機蛍光色素部分（「第１有機蛍光色素部分」という。）が吸収した光エネルギーが、別種の有機蛍光色素部分（「第２有機蛍光色素部分」という。）に蛍光共鳴エネルギー移動により移動し、光吸収した前記第１有機蛍光色素部分とは異なる前記第２有機蛍光色素部分から蛍光が発し、前記第１有機蛍光色素部分の吸収極大波長と第２有機蛍光色素部分の蛍光極大波長が、２０ｎｍ以上離れており、前記連結分子がシリカナノ粒子と結合している、ことを特徴とする有機蛍光色素内包シリカナノ粒子。
一般式（１）：ＮＨ２−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｍ−ＳｉＲｌ（ＯＲ１）ｋ
（式中、ｎおよびｍは１〜１２の整数を表し、互いに同一でも異なっていてもよい。ｌおよびｋはｌ＋ｋ＝３を満たし、ｌは０〜２の整数、ｋは１〜３の整数を表す。Ｒは非加水分解性の置換基を表し、ＯＲ１は加水分解性の炭素数１〜６のアルコキシ基を表し、複数ある場合、互いに同一でも異なっていてもよい。）
【００１５】
２．前記シラン化合物は、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（６−アミノヘキシル）アミノメチルトリエトキシシラン、Ｎ−（６−アミノヘキシル）アミノプロピルトリエトキシシラン、またはＮ−（２−アミノエチル）−１１−アミノウンデシルトリメトキシシランであることを特徴とする、前記第１項に記載の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子。
【００１７】
３．前記第１項または第２項に記載の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子を製造する有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の製造方法であって、下記工程（ａ）及び工程（ｂ）を含んでなることを特徴とする有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の製造方法。
工程（ａ）：同一分子内に二種以上のアミノ基と、少なくとも一種の加水分解性置換基を含むシリル基とを有する下記一般式（１）で表されるシラン化合物と、当該アミノ基と反応する官能基を有し、かつ蛍光波長が相異する二種以上の有機蛍光色素とを反応させる工程、
工程（ｂ）：前記工程（ａ）で得られた反応生成物を含ケイ素アルコキシドと混合し、塩基性条件下加水分解反応を行う工程。
一般式（１）：ＮＨ２−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｍ−ＳｉＲｌ（ＯＲ１）ｋ
（式中、ｎおよびｍは１〜１２の整数を表し、互いに同一でも異なっていてもよい。ｌおよびｋはｌ＋ｋ＝３を満たし、ｌは０〜２の整数、ｋは１〜３の整数を表す。Ｒは非加水分解性の置換基を表し、ＯＲ１は加水分解性の炭素数１〜６のアルコキシ基を表し、複数ある場合、互いに同一でも異なっていてもよい。）
【００１８】
４．前記工程（ｂ）では、前記有機蛍光色素内包シリカナノ粒子中の前記反応生成物の濃度が１×１０−６ｍｏｌ／Ｌ以上１×１０−２ｍｏｌ／Ｌ以下になるように、前記反応生成物を含ケイ素アルコキシドと混合することを特徴とする、前記第３項に記載の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の製造方法。
５．前記第１項または第２項に記載の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子を用いた生体物質標識剤であって、当該有機蛍光色素内包シリカナノ粒子と分子標識物質とが、有機分子を介して結合されていることを特徴とする生体物質標識剤。
【発明の効果】
【００１９】
本発明により、ストークスシフトが大きく、かつ発光強度の高い有機蛍光色素内包シリカナノ粒子及びその製造方法を提供することができる。また、それを用いた生体物質標識剤を提供することができる。
【００２０】
従来法の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子では、第１有機蛍光色素と第２有機蛍光色素をそれぞれ別個に添加することから、第１有機蛍光色素と第２有機蛍光色素を空間的に十分近づけることができないためＦＲＥＴ効率が低いと考えられる。これに対し、本発明では、第１有機蛍光色素と第２有機蛍光色素を空間的に十分近づけることができるためＦＲＥＴ効率が飛躍的に高いと考えられる。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子は、シリカ粒子中に、蛍光波長が相異する二種以上の有機蛍光色素分子同士を連結して形成された連結分子を内包した有機蛍光色素内包シリカナノ粒子であって、当該連結分子がシリカナノ粒子と結合していることを特徴とする。この特徴は、請求項１から請求項６までの請求項に係る発明に共通する技術的特徴である。
【００２２】
本発明の実施形態としては、本発明の効果発現の観点から、連結された前記二種以上の有機蛍光色素分子のうちの一種の有機蛍光色素部分（「第１有機蛍光色素部分」という。）が吸収した光エネルギーが、別種の有機蛍光色素部分（「第２有機蛍光色素部分」という。）に（蛍光共鳴エネルギー移動により）移動し、光吸収した当該第１有機蛍光色素部分とは異なる当該第２有機蛍光色素部分から蛍光が発することが好ましい。また、当該第１有機蛍光色素部分の吸収極大波長と当該第２有機蛍光色素部分の蛍光極大波長が、２０ｎｍ以上離れていることが好ましい。
【００２３】
本発明の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子を製造する有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の製造方法としては、前記工程（ａ）及び工程（ｂ）を含んでなる製造方法であることが好ましい。当該製造方法の場合、前記同一分子内に二種以上のアミノ基と、少なくとも一種の加水分解性置換基を有するシリル基を有する分子が前記一般式（１）であらわされるシラン化合物であることが好ましい。
【００２４】
本発明の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子は、当該シリカナノ粒子と分子標識物質とが、有機分子を介して結合されてなる生体物質標識剤に好適に用いることができる。
【００２５】
以下、本発明とその構成要素、及び発明を実施するための形態について詳細な説明をする。
【００２６】
〔複数種の有機蛍光色素の連結〕
本発明の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子は、シリカ粒子中に、蛍光波長が相異する二種以上の有機蛍光色素分子同士を連結して形成された連結分子を内包していることを特徴とする。
【００２７】
複数種の有機蛍光色素をシリカナノ粒子に内包させるにあたり、両者の距離を近づけるために複数種の有機蛍光色素を同一分子内に含むこと必要である。すなわち、それぞれの有機蛍光色素同士は、共有結合、イオン結合、水素結合などを介し連結してひとつの連結分子を形成していることを要するが、化学的安定性から共有結合を介して結合していることが好ましい。
【００２８】
また、複数種の有機蛍光色素を連結させた分子が、当該シリカナノ粒子と結合していることが必要である。結合の方法は、共有結合、イオン結合、水素結合などがあげられるが、化学的安定性から共有結合であるのが好ましい。当該色素を連結させた分子がシリカ粒子と結合していないと、本発明で得られる有機蛍光色素内包シリカナノ粒子を水分散液として保存しているうちに、徐々に当該色素を連結させた分子が漏洩するおそれがあり、生体物質標識剤としての応用上好ましくない。
【００２９】
本発明の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子に用いられる有機蛍光色素としては、２００〜７００ｎｍの範囲内の波長の紫外〜近赤外光により励起されたときに、４００〜９００ｎｍの範囲内の波長の可視〜近赤外光の発光を示す態様の有機蛍光色素であることが好ましい。
【００３０】
有機蛍光色素としては、フルオレセイン系色素分子、ローダミン系色素分子、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）系色素分子、カスケード系色素分子、クマリン系色素分子、エオジン系色素分子、ＮＢＤ系色素分子、ピレン系色素分子、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ系色素分子、シアニン系色素分子等を挙げることができる。
【００３１】
具体的には、５−カルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−フルオレセイン、５，６−ジカルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−２′，４，４′，５′，７，７′−ヘキサクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−２′，４，７，７′−テトラクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−４′，５′−ジクロロ−２′，７′−ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、５−カルボキシ−ローダミン、６−カルボキシ−ローダミン、５，６−ジカルボキシ−ローダミン、ローダミン  ６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン、及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ，ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ  ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ  ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ  ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ  ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ  ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５（以上Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、メトキシクマリン、エオジン、ＮＢＤ、ピレン、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７等を挙げることができる。
【００３２】
複数種の有機蛍光色素の組み合わせを選択するにあたり、特定の有機蛍光色素が吸収した光エネルギーが、別の一種以上の有機蛍光色素間を蛍光共鳴エネルギー移動により移動し、光吸収したし有機蛍光色素とは異なる有機蛍光色素から蛍光が発することが好ましい。
【００３３】
以下、二種の有機蛍光色素の組み合わせを例に具体例を説明するが、三種以上の有機蛍光色素の組み合わせの場合も同様である。
【００３４】
第１の有機蛍光色素が吸収した光励起エネルギーが、第２の有機蛍光色素へ蛍光共鳴エネルギー移動により移動し、第２の有機蛍光色素から蛍光を発するように選択するのが好ましい。選択にあたり第１の有機蛍光色素の蛍光スペクトルと、第２の有機蛍光色素の吸収スペクトルを測定し、両者の重なりが十分大きいことが好ましい。さらに第１の有機蛍光色素の吸収極大波長と第２の有機蛍光色素の蛍光極大波長が、２０ｎｍ以上離れていることが好ましく、２０ｎｍ以上、９０ｎｍ以下離れていることがより好ましい。２０ｎｍ以上とすることで、従来の単一の有機蛍光色素のストークスシフトより大きくなり、本発明の効果の発現の点でより好ましい。
【００３５】
具体的には、第１の有機蛍光色素として、蛍光極大波長が波長４９５ｎｍ付近にあるフルオレセインを選択した場合、蛍光共鳴エネルギー移動が可能な第２の有機蛍光色素としてはローダミン６Ｇが適用可能である。それぞれフルオレセイン、ローダミン６Ｇに限らず蛍光極大波長の近似した他の有機蛍光色素を用いてもよい。たとえば、フルオレセインの代わりに、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＡＬＥＸＡ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、ＤｙＬｉｇｈｔ  ４８８などが、ローダミン６Ｇの代わりには、ＴＡＭＲＡ、ローダミンＢなどがあげられる。
【００３６】
また、第１の有機蛍光色素としてローダミン６Ｇを選択した場合、第２の有機蛍光色素としてＴＡＭＲＡが適用可能である。
【００３７】
同一分子内に複数種の有機蛍光色素が連結した分子を作製する方法は、複数の反応性官能基と少なくとも一種の加水分解性置換基を有するシリル基を有する分子と前記反応性官能基と反応しうる官能基をもつ有機蛍光色素との反応を用いることができる。
【００３８】
前記反応性官能基としては、アミノ基、メルカプト基、マレイミド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、カルボキシル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基など活性エステル基があげられる。中でも安定性や反応性からアミノ基が好ましい。
【００３９】
複数のアミノ基と少なくとも一種の加水分解性置換基を有するシリル基を有する分子は、特に限定されるものではないが、二種の有機蛍光色素を用いる場合、下記一般式（１）であらわされる分子を用いるのが、有機蛍光色素間の距離、シリル基の加水分解反応性などの観点から好適である。
【００４０】
一般式（１）：ＮＨ２−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｍ−ＳｉＲｌ（ＯＲ１）ｋ
（式中、ｎ及びｍは１〜１２の整数を表し、互いに同一でも異なっていてもよい。ｌ及びｋはｌ＋ｋ＝３を満たし、ｌは０〜２の整数、ｋは１〜３の整数を表す。Ｒは非加水分解性の置換基を表し、ＯＲ１は加水分解性の炭素数１〜６のアルコキシ基を表し、複数ある場合、互いに同一でも異なっていてもよい。）
具体的には、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−（６−アミノヘキシル）アミノメチルトリエトキシシラン、Ｎ−（６−アミノヘキシル）アミノプロピルトリエトキシシラン、Ｎ−（２−アミノエチル）−１１−アミノウンデシルトリメトキシシラン（以上Ｇｅｌｅｓｔ社製）などをあげることができる。
【００４１】
一方前記反応性官能基と反応しうる官能基をもつ有機蛍光色素としては、アミノ基、メルカプト基、マレイミド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、カルボキシル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基など活性エステル基をもつものがあげられる。なかでも上述したようにアミノ基を用いた場合、有機蛍光色素もアミノ基と反応する官能基イソシアネート基、イソチオシアネート基、カルボキシル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基など活性エステル基が好適である。
【００４２】
同一分子内に複数種の有機蛍光色素が連結した分子は、複数の反応性官能基と少なくとも一種の加水分解性置換基を有するシリル基を有する分子を有機溶媒に溶解せたところに、前記反応性官能基と反応しうる官能基をもつ有機蛍光色素複数種とを、順次添加、混合することで作製できる。複数種の有機蛍光色素を順次反応させるため、複数の反応性官能基と少なくとも一種の加水分解性置換基を有するシリル基を有する分子に対し、官能基のモル等量あたり、１等量ずつ前記反応性官能基と反応しうる官能基をもつ有機蛍光色素を添加する。
【００４３】
反応時には必要により反応を促進させる添加剤、触媒などを用いてもよい、たとえば前記反応性官能基がアミノ基、有機蛍光色素がカルボキシル基を持つ場合、縮合剤を用いてもよい。
【００４４】
用いられる有機溶媒としては、シリル基上の加水分解性基との反応性がないものであればよく、たとえば、テトラヒドロフラン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミドなどをあげることができる。
【００４５】
反応温度は特に限定されるものではないが、−２０〜５０℃の間で行うことができる。反応温度を各段階でかえることで複数種有機蛍光色素を順次反応させることができる。
【００４６】
反応時間は、１時間以上５０時間以下であることが好ましい、これより短いと反応は完結しておらず、収率が低下する。またこれより長いと反応が進行しすぎて、不溶物が形成することがある。
【００４７】
反応終了後は、精製することなく次工程へ用いてもよい。必要に応じて、常法により再結晶、カラムクロマトグラフィーなどによる精製を行ってもよい。
【００４８】
〔シリカナノ粒子の製造方法〕
例えば、ジャーナル・オブ・コロイドサイエンス  ２６巻、６２ページ（１９６８年）に記載されている、アンモニア水などを用いたアルカリ性条件下でテトラエトキシシランなどの含ケイ素アルコキシド化合物の加水分解を行う「ストーバー法」と呼ばれる方法により製造することが好ましい。粒径は、添加する水、エタノール、アルカリ量などについて公知の反応条件を適用することで自在に調整でき、平均粒径３０〜８００ｎｍ程度にできる。また粒径のばらつきを示す変動係数は２０％以下とすることができる。
【００４９】
本発明において、平均粒径とは、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数の粒子について断面積を計測し、その計測値を相当する円の面積としたときの直径を粒径として求めた。本願においては、１０００個の粒子の粒径の算術平均を平均粒径とした。変動係数も、１０００個の粒子の粒径分布から算出した値とした。
【００５０】
〔有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の製造方法〕
本発明の蛍光体内包シリカナノ粒子は、公知の方法例えば、非特許文献（ラングミュア  ８巻、２９２１ページ（１９９２年））に記載されている方法を参考にすることができる。
【００５１】
工程（１）：複数の反応性官能基と少なくとも一種の加水分解性置換基を有するシリル基を有する分子と前記反応性官能基と反応しうる官能基をもつ有機蛍光色素とを混合反応する。
【００５２】
工程（２）：工程（１）で得られたものを、テトラエトキシシランなどの含ケイ素アルコキシド化合物を混合する。
【００５３】
工程（３）：エタノールなどの有機溶媒、水及び塩基を混合する。
【００５４】
工程（４）：工程（３）で作製した混合液を撹拌しているところに、工程（２）で得られた有機蛍光色素含有液を添加し、反応を進行させる。
【００５５】
工程（５）：反応混合物から生成した有機蛍光色素内包シリカナノ粒子を、ろ過もしくは遠心分離により回収する。
【００５６】
工程（６）：工程（５）で得られた有機蛍光色素内包シリカナノ粒子を分子標識物質と結合させ、生体物質標識剤を得る。
【００５７】
なお、上記工程（２）で用いられる含ケイ素アルコキシド化合物としては、テトラエトキシシラン、テトラメトキシシランといったテトラアルコキシドシラン、メチルトリメトキシシラン、メチルエトキシシラン、フェニルトリエトキシシランなどのトリアルコキシシランなどをあげることができる。また有機官能基を有する含ケイ素アルコキシド化合物をあげることができる。具体的にはメルカプトプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシランなどがあげられる。
【００５８】
含ケイ素アルコキシド化合物は上記の一種もしくは二種以上を併用することもできる。
【００５９】
含ケイ素アルコキシド化合物と工程１で得られる有機蛍光色素結合分子の混合比に制限はないが、最終的に得られるシリカナノ粒子中に１×１０−６ｍｏｌ／Ｌ以上１×１０−２ｍｏｌ／Ｌ以下になるように混合することが好ましい。濃度を１×１０−６ｍｏｌ／Ｌ以上とすることで十分な蛍光が得られる。また１×１０−２ｍｏｌ／Ｌ以下とすることで、シリカ内で均一に分散でき、かつ濃度消光を防止できる点で好ましい。
【００６０】
工程（３）で用いられる有機溶媒として、通常の含ケイ素アルコキシド化合物の加水分解反応で用いられるものであればよく、メタノール、エタノール、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどが用いられる。一種もしくは二種以上の混合としてもよい。
【００６１】
また工程（３）で用いられる塩基としては、通常の含ケイ素アルコキシド化合物の加水分解反応で用いられるものであればよく、アンモニア、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどを用いることができ、それぞれ水溶液として用いてもよい。
【００６２】
含ケイ素アルコキシド化合物としてテトラエトキシシラン、有機溶媒としてエタノール、塩基としてアンモニア水を用いた場合のそれぞれの仕込みモル比を以下にあげる。
【００６３】
テトラエトキシシランを１ｍｏｌとした場合、エタノールをａ  ｍｏｌ、水をｒ  ｍｏｌ、アンモニアをｂ  ｍｏｌとすると、ａは２０以上４００以下、ｒは１０以上２００以下、ｂは１０以上４０以下で混合する。具体的には、ジャーナル・オブ・コロイドサイエンス  ２６巻、６２ページ（１９６８年）に記載されている条件を適用することができる。
【００６４】
工程（４）において、反応温度は通常の含ケイ素アルコキシド化合物の加水分解反応で適用される条件でよく、室温から５０℃の間で行うことができる。
【００６５】
蛍光色素含有液を添加する方法としては、限定されるものはなくシリンジポンプ、滴下ロートなど用いればよい。
【００６６】
工程（４）における反応時間は、通常の含ケイ素アルコキシド化合物の加水分解反応で適用される条件でよく、１時間以上５０時間以下であることが好ましい、これより短いと反応は完結しておらず、収率が低下する。またこれより長いと反応が進行しすぎて、不溶物が形成することがある。
【００６７】
工程（５）における反応混合物から生成した蛍光物質内包シリカナノ粒子の回収方法は、通常ナノ粒子の回収で行われるろ過、もしくは遠心分離などを用いることができる。回収した蛍光色素内包シリカナノ粒子は必要に応じて、未反応原料などを除くため、有機溶媒もしくは水による洗浄をしてもよい。
【００６８】
〔有機蛍光色素内包シリカナノ粒子と分子標識物質とを結合する有機分子〕
本発明に係る生体物質標識剤は、有機分子修飾された有機蛍光色素内包シリカナノ粒子と、分子標識物質とが有機分子により結合されている態様であることが好ましい。上記結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着及び化学吸着等が挙げられる。結合の安定性から共有結合などの結合力の強い結合が好ましい。
【００６９】
有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の表面に結合し、分子標識物質とも結合しうる有機分子として、例えば、無機物と有機物を結合させるために広く用いられている化合物であるシランカップリング剤を用いることができる。このシランカップリング剤は、分子の一端に加水分解でシラノール基を与えるアルコキシシリル基を有し、他端に、カルボキシル基、アミノ基、エポキシ基、アルデヒド基などの官能基を有する化合物であり、上記シラノール基の酸素原子を介して無機物と結合する。具体的には、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシランなどがあげられる。
【００７０】
また、後述する生体物質標識剤として用いる場合、生体物質との非特異的吸着を抑制するためポリエチレングリコール鎖をもつシランカップリング剤（例えば、Ｇｅｌｅｓｔ社製ＰＥＧ−ｓｉｌａｎｅ  ｎｏ．ＳＩＭ６４９２．７）を用いることができる。
【００７１】
シランカップリング剤を用いる場合、二種以上を併用してもよい。
【００７２】
有機蛍光色素内包シリカナノ粒子とシランカップリング剤との反応手順は、公知の手法を用いることができる。例えば、得られた蛍光色素内包シリカナノ粒子を純水中に分散させ、アミノプロピルトリエトキシシランを添加し、室温で１２時間反応させる。反応終了後、遠心分離又はろ過により表面がアミノプロピル基で修飾された蛍光物質内包シリカナノ粒子を得ることができる。
【００７３】
〔生体物質標識剤〕
本発明に係る生体物質標識剤は、上述した有機蛍光色素内包シリカナノ粒子と、分子標識物質と有機分子を介して結合させて得られる。
【００７４】
本発明に係る生体物質標識剤は分子標識物質が目的とする生体物質と特異的に結合及び／又は反応することにより、生体物質の標識が可能となる。
【００７５】
当該分子標識物質としては例えば、ヌクレオチド鎖、タンパク質、抗体等が挙げられる。
【００７６】
具体例として、アミノプロピルトリエトキシシランで修飾した蛍光物質内包シリカナノ粒子のアミノ基と抗体中のカルボキシル基とを反応させることで、アミド結合を介し抗体を蛍光物質内包シリカナノ粒子と結合させることができる。必要に応じＥＤＣ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ］ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：Ｐｉｅｒｃｅ社製）のような縮合剤を用いることもできる。
【００７７】
必要により有機分子修飾された有機蛍光色素内包シリカナノ粒子と直接結合しうる部位と、分子標的物質と結合しうる部位とを有するリンカー化合物を用いることができる。具体例としてアミノ基と選択的に反応する部位とメルカプト基と選択的に反応する部位の両方をもつｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ４［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ：Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いると、アミノプロピルトリエトキシシランで修飾した有機蛍光色素内包シリカナノ粒子のアミノ基と、抗体中のメルカプト基を結合させることで、抗体結合した有機蛍光色素内包シリカナノ粒子ができる。
【実施例】
【００７８】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例において「部」あるいは「％」の表示を用いるが、特に断りがない限り「質量部」あるいは「質量％」を表す。
【００７９】
《蛍光物質内包シリカナノ粒子》
〔二種有機蛍光色素内包シリカナノ粒子１の作製〕
（シリカナノ粒子１：ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ／ＴＡＭＲＡ共内包シリカナノ粒子）
ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ及びＴＡＭＲＡを同一分子内にもち、かつ加水分解性基をもつシリル基をもつ分子を用いて、下記工程（１）〜（５）の方法により、シリカナノ粒子１を作製した。
【００８０】
工程（１）：ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製  ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ，ＳＥ）１．９ｍｇ（０．００４８ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド０．８ｍＬに溶解させたところに、氷冷下Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン（Ｇｅｌｅｓｔ社製）１μＬ（０．００４８ｍｍｏｌ）添加し、３０分間撹拌した。
【００８１】
ついで、室温下ＴＡＭＲＡのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製５（６）−ＴＡＭＲＡ−ＮＨＳ，ＳＥ）２．６ｍｇ（０．００４８ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド０．２ｍＬに溶解させたものを添加し、３０分間撹拌した。
【００８２】
工程（２）：工程（１）で得られたＤＭＦ溶液とテトラエトキシシラン４０μＬを混合した。
【００８３】
工程（３）：エタノール４０ｍＬ、１４％アンモニア水１０ｍＬを混合した。
【００８４】
工程（４）：工程３で作製した混合液を室温下撹拌しているところに、工程（２）で作製した混合液を添加した。添加開始から１２時間撹拌を行った。
【００８５】
工程（５）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。
【００８６】
得られたシリカナノ粒子１の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ；日立社製Ｓ−８００型）観察を行ったところ、平均粒径１１０ｎｍ、変動係数は１２％であった。なお、当該観察は、１０００個の粒子について断面積を計測し、その計測値を相当する円の面積としたときの直径を粒径として求め、１０００個の粒子の粒径の算術平均を平均粒径とした。また、変動係数も、１０００個の粒子の粒径分布から算出した値とした。
【００８７】
（シリカナノ粒子２：ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ／ＴＡＭＲＡ共内包シリカナノ粒子）
特許文献２にならい下記工程（１）〜（６）の方法により、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬとＴＡＭＲＡをそれぞれ連結せずに内包した、シリカナノ粒子２を作製した。
【００８８】
工程（１）：ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製  ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ，ＳＥ）１．９ｍｇ（０．００４８ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド０．５ｍＬに溶解させたところに、室温下３−アミノプロピルトリエトキシシラン（信越化学工業社製）１μＬ添加し、３０分撹拌した。
【００８９】
工程（２）：ＴＡＭＲＡのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製５（６）−ＴＡＭＲＡ−ＮＨＳ，ＳＥ）２．６ｍｇ（０．００４８ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド０．５ｍＬに溶解させた溶解させたところに、室温下３−アミノプロピルトリエトキシシラン（信越化学工業社製）１μＬ添加し、３０分間撹拌した。
【００９０】
工程（３）：工程（１）で得られたＤＭＦ溶液、工程（２）で得られたＤＭＦ溶液及びテトラエトキシシラン４０μＬを混合した。
【００９１】
工程（４）：エタノール４０ｍＬ、１４％アンモニア水１０ｍＬを混合した。
【００９２】
工程（５）：工程（４）で作製した混合液を室温下撹拌しているところに、工程（３）で作製した混合液を添加した。添加開始から１２時間撹拌を行った。
【００９３】
工程（６）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。
【００９４】
得られたシリカナノ粒子２のＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径１００ｎｍ、変動係数は１０％であった。
【００９５】
（シリカナノ粒子３：ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ／ＴＡＭＲＡ共内包シリカナノ粒子）
ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ及びＴＡＭＲＡを同一分子内にもつが、加水分解性基をもつシリル基をもたない分子を用いて、下記工程（１）〜（５）の方法により、シリカナノ粒子３を作製した。
【００９６】
工程（１）：ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製  ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ，ＳＥ）１．９ｍｇ（０．００４８ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド０．８ｍＬに溶解させたところに、氷冷下エチレンジアミン（和光純薬社製）０．３μＬ（（０．００４８ｍｍｏｌ）添加し、３０分間撹拌した。
【００９７】
ついで、室温下ＴＡＭＲＡのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製  ５（６）−ＴＡＭＲＡ−ＮＨＳ，ＳＥ）２．６ｍｇ（０．００４８ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド０．２ｍＬに溶解させたものを添加し、３０分間撹拌した。
【００９８】
工程（２）：工程（１）で得られたＤＭＦ溶液とテトラエトキシシラン４０μＬを混合した。
【００９９】
工程（３）：エタノール４０ｍＬ、１４％アンモニア水１０ｍＬを混合した。
【０１００】
工程（４）：工程（３）で作製した混合液を室温下撹拌しているところに、工程（２）で作製した混合液を添加した。添加開始から１２時間撹拌を行った。
【０１０１】
工程（５）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。
【０１０２】
得られたシリカナノ粒子３のＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径１１５ｎｍ、変動係数は１１％であった。
【０１０３】
ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬの吸収極大波長は、５０５ｎｍ、ＴＡＭＲＡの吸収極大波長は、５４６ｎｍである。したがって、波長４８８ｎｍの光では、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬのみが励起され、ＴＡＭＲＡは励起されない。
【０１０４】
また、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬの蛍光極大波長は５１１ｎｍであり、ＴＡＭＲＡの蛍光極大波長は５７６ｎｍである。したがって、波長５８０ｎｍの蛍光はＴＡＭＲＡ由来の発光に帰属できる。
【０１０５】
波長を４８８ｎｍの光によりＢＯＤＩＰＹ  ＦＬを励起したときに、波長５８０ｎｍに蛍光が観察された場合、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬからＴＡＭＲＡへの蛍光共鳴エネルギー移動が起こったといえ、その蛍光強度が高いほどエネルギー移動効率が高いといえる。
【０１０６】
（シリカナノ粒子４：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８／ローダミン６Ｇシリカナノ粒子）
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８及びローダミン６Ｇを同一分子内にもち、かつ加水分解性基をもつシリル基をもつ分子を用いて、下記工程（１）〜（５）の方法により、シリカナノ粒子４を作製した。
【０１０７】
工程（１）：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）３．１ｍｇ（０．００４８ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド０．８ｍＬに溶解させたところに、氷冷下Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン（Ｇｅｌｅｓｔ社製）１μＬ（０．００４８ｍｍｏｌ）添加し、３０分間撹拌した。
【０１０８】
ついで、室温下ローダミン６ＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製５（６）ＣＲ６ＧＳＥ）２．７ｍｇ（０．００４８ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド０．２ｍＬに溶解させたものを添加し、３０分間撹拌した。
【０１０９】
工程（２）：工程（１）で得られたＤＭＦ溶液とテトラエトキシシラン４０μＬを混合した。
【０１１０】
工程（３）：エタノール４０ｍＬ、１４％アンモニア水１０ｍＬを混合した。
【０１１１】
工程（４）：工程３で作製した混合液を室温下撹拌しているところに、工程（２）で作製した混合液を添加した。添加開始から１２時間撹拌を行った。
【０１１２】
工程（５）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。
【０１１３】
得られたシリカナノ粒子４のＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径１０５ｎｍ、変動係数は１２％であった。
【０１１４】
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８の吸収極大波長は、４９５ｎｍ、ローダミン６Ｇの吸収極大波長は、５２４ｎｍである。したがって、波長４８８ｎｍの光では、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８のみが励起され、ローダミン６Ｇは励起されない。
【０１１５】
また、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８の蛍光極大波長は５１９ｎｍであり、ローダミン６Ｇの蛍光極大波長は５５２ｎｍである。したがって、波長５８０ｎｍの蛍光はローダミン６Ｇ由来の発光に帰属できる。
【０１１６】
波長を４８８ｎｍの光によりＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８を励起したときに、波長５８０ｎｍに蛍光が観察された場合、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８からローダミン６Ｇへの蛍光共鳴エネルギー移動が起こったといえ、その蛍光強度が高いほどエネルギー移動効率が高いといえる。
【０１１７】
（シリカナノ粒子５：ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ４８８／ローダミン６Ｇシリカナノ粒子）
ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ４８８及びローダミン６Ｇを同一分子内にもち、かつ加水分解性基をもつシリル基をもつ分子を用いて、下記工程（１）〜（５）の方法により、シリカナノ粒子５を作製した。
【０１１８】
工程（１）：ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ４８８のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（ＡｎａＳｐｅｃ社製ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ４８８  ａｃｉｄ  ＳＥ）２．５ｍｇ（０．００４８ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド０．８ｍＬに溶解させたところに、氷冷下Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン（Ｇｅｌｅｓｔ社製）１μＬ（０．００４８ｍｍｏｌ）添加し、３０分間撹拌した。
【０１１９】
ついで、室温下ローダミン６ＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製５（６）ＣＲ６ＧＳＥ）２．７ｍｇ（０．００４８ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド０．２ｍＬに溶解させたものを添加し、３０分間撹拌した。
【０１２０】
工程（２）：工程（１）で得られたＤＭＦ溶液とテトラエトキシシラン４０μＬを混合した。
【０１２１】
工程（３）：エタノール４０ｍＬ、１４％アンモニア水１０ｍＬを混合した。
【０１２２】
工程（４）：工程３で作製した混合液を室温下撹拌しているところに、工程（２）で作製した混合液を添加した。添加開始から１２時間撹拌を行った。
【０１２３】
工程（５）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。
【０１２４】
得られたシリカナノ粒子５のＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径９８ｎｍ、変動係数は１６％であった。
【０１２５】
ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ４８８の吸収極大波長は、５０１ｎｍ、ローダミン６Ｇの吸収極大波長は、５２４ｎｍである。したがって、波長４８８ｎｍの光では、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ４８８のみが励起され、ローダミン６Ｇは励起されない。
【０１２６】
また、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ４８８の蛍光極大波長は５２７ｎｍであり、ローダミン６Ｇの蛍光極大波長は５５２ｎｍである。したがって、波長５８０ｎｍの蛍光はローダミン６Ｇ由来の発光に帰属できる。
【０１２７】
波長を４８８ｎｍの光によりＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ４８８を励起したときに、波長５８０ｎｍに蛍光が観察された場合、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ４８８からローダミン６Ｇへの蛍光共鳴エネルギー移動が起こったといえ、その蛍光強度が高いほどエネルギー移動効率が高いといえる。
【０１２８】
（シリカナノ粒子６：ＤｙＬｉｇｈｔ４８８／ＴＡＭＲＡ共内包シリカナノ粒子）
ＤｙＬｉｇｈｔ４８８及びＴＡＭＲＡを同一分子内にもち、かつ加水分解性基をもつシリル基をもつ分子を用いて、下記工程（１）〜（５）の方法により、シリカナノ粒子６を作製した。
【０１２９】
工程（１）：ＤｙＬｉｇｈｔ４８８のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製  ＤｙＬｉｇｈｔ４８８  ＮＨＳ  Ｅｓｔｅｒ）１．９ｍｇ（０．００４８ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド０．８ｍＬに溶解させたところに、氷冷下Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン（Ｇｅｌｅｓｔ社製）１μＬ（０．００４８ｍｍｏｌ）添加し、３０分間撹拌した。
【０１３０】
ついで、室温下ＴＡＭＲＡのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製  ５（６）−ＴＡＭＲＡ−ＮＨＳ，ＳＥ）２．６ｍｇ（０．００４８ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド０．２ｍＬに溶解させたものを添加し、３０分間撹拌した。
【０１３１】
工程（２）：工程（１）で得られたＤＭＦ溶液とテトラエトキシシラン４０μＬを混合した。
【０１３２】
工程（３）：エタノール４０ｍＬ、１４％アンモニア水１０ｍＬを混合した。
【０１３３】
工程（４）：工程３で作製した混合液を室温下撹拌しているところに、工程（２）で作製した混合液を添加した。添加開始から１２時間撹拌を行った。
【０１３４】
工程（５）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。
【０１３５】
得られたシリカナノ粒子６のＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径９８ｎｍ、変動係数は１６％であった。
【０１３６】
ＤｙＬｉｇｈｔ４８８の吸収極大波長は、４９３ｎｍ、ＴＡＭＲＡの吸収極大波長は、５４６ｎｍである。したがって、波長４８８ｎｍの光では、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８のみが励起され、ＴＡＭＲＡは励起されない。
【０１３７】
また、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８の蛍光極大波長は５１８ｎｍであり、ＴＡＭＲＡの蛍光極大波長は５７６ｎｍである。したがって、波長５８０ｎｍの蛍光はＴＡＭＲＡ由来の発光に帰属できる。
【０１３８】
波長を４８８ｎｍの光によりＤｙＬｉｇｈｔ４８８を励起したときに、波長５８０ｎｍに蛍光が観察された場合、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８からＴＡＭＲＡへの蛍光共鳴エネルギー移動が起こったといえ、その蛍光強度が高いほどエネルギー移動効率が高いといえる。
【０１３９】
（シリカナノ粒子７：ローダミン６Ｇ／ＴＡＭＲＡ共内包シリカナノ粒子）
ローダミン６Ｇ及びＴＡＭＲＡを同一分子内にもち、かつ加水分解性基をもつシリル基をもつ分子を用いて、下記工程（１）〜（５）の方法により、シリカナノ粒子７を作製した。
【０１４０】
工程（１）：ローダミン６ＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製５（６）ＣＲ６ＧＳＥ）２．７ｍｇ（０．００４８ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド０．８ｍＬに溶解させたところに、氷冷下Ｎ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリエトキシシラン（Ｇｅｌｅｓｔ社製）１μＬ（０．００４８ｍｍｏｌ）添加し、３０分間撹拌した。
【０１４１】
ついで、室温下ＴＡＭＲＡのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製５（６）−ＴＡＭＲＡ−ＮＨＳ，ＳＥ）２．６ｍｇ（０．００４８ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド０．２ｍＬに溶解させたものを添加し、３０分間撹拌した。
【０１４２】
工程（２）：工程（１）で得られたＤＭＦ溶液とテトラエトキシシラン４０μＬを混合した。
【０１４３】
工程（３）：エタノール４０ｍＬ、１４％アンモニア水１０ｍＬを混合した。
【０１４４】
工程（４）：工程３で作製した混合液を室温下撹拌しているところに、工程（２）で作製した混合液を添加した。添加開始から１２時間撹拌を行った。
【０１４５】
工程（５）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。
【０１４６】
得られたシリカナノ粒子７のＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径１００ｎｍ、変動係数は１１％であった。
【０１４７】
ローダミン６Ｇの吸収極大波長は、５２４ｎｍ、ＴＡＭＲＡの吸収極大波長は、５４６ｎｍである。したがって、波長４８８ｎｍの光では、ローダミン６Ｇのみが励起され、ＴＡＭＲＡは励起されない。
【０１４８】
また、ローダミン６Ｇの蛍光極大波長は５５２ｎｍであり、ＴＡＭＲＡの蛍光極大波長は５７６ｎｍである。したがって、波長５８０ｎｍの蛍光はＴＡＭＲＡ由来の発光に帰属できる。
【０１４９】
波長を４８８ｎｍの光によりローダミン６Ｇを励起したときに、波長５８０ｎｍに蛍光が観察された場合、ＤｙＬｉｇｈｔからＴＡＭＲＡへの蛍光共鳴エネルギー移動が起こったといえ、その蛍光強度が高いほどエネルギー移動効率が高いといえる。
【０１５０】
得られたシリカナノ粒子の１ｎＭＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）分散液をそれぞれ調製し、蛍光分光光度計Ｆ−７０００（商品名、日立ハイテクノロジーズ社製）を用いて、励起光波長を４８８ｎｍとし、波長５８０ｎｍの蛍光強度を測定した。作製したシリカナノ粒子１の５８０ｎｍでの蛍光強度を１００としたときの相対値として評価した。評価結果を表１に示す。
【０１５１】
【表１】
0005540867.tif 000002
【０１５２】
表１に示した結果から明らかなように、本発明のＢＯＤＩＰＹ  ＦＬとＴＡＭＲＡを連結かつ、シリカ粒子へ結合させたものの５８０ｎｍでの蛍光強度は、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬとＴＡＭＲＡを連結せず、それぞれ別個にシリカ粒子に内包、結合させる公知技術のものに比べ、著しく大きいことが分かる。このことはＢＯＤＩＰＹ  ＦＬとＴＡＭＲＡとを同一分子内に連結させたことにより、両者の距離を最適に近付けることができたと考える。
【０１５３】
同様にＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８とローダミン６Ｇとを連結させたもの、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ４８８とローダミン６Ｇとを連結させたもの、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８とＴＡＭＲＡとを連結させたものおよびローダミン６ＧとＴＡＭＲＡとを連結させたものをそれぞれシリカ粒子へ結合させたものも、高いエネルギー移動効率の結果として５８０ｎｍでの蛍光強度が極めて大きいことが分かる。
【０１５４】
また、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬとＴＡＭＲＡと連結させた分子を用いても、その分子が加水分解性基をもつシリル基をもたない場合、５８０ｎｍでの蛍光強度は本発明に比べ大きく低下した。このことは容易にシリカ粒子から漏えいしてしまい、洗浄により除去されたためと考えられる。
【０１５５】
《生体物質標識剤》
シリカナノ粒子１及び２を用い、分子修飾シリカナノ粒子Ａ及びＢを各々調製し、更にこれを用いて生体物質標識剤１、２及び３を調製して、生体物質標識剤の長期保存性を評価した。
【０１５６】
〔分子修飾シリカナノ粒子Ａの調製〕
（分子修飾シリカナノ粒子Ａ：アミノ基修飾したＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ／ＴＡＭＲＡ連結内包シリカナノ粒子）
シリカナノ粒子１  １ｍｇを純水５ｍＬに分散させた。アミノプロピルトリエトキシシラン水分散液１００μＬを添加し、室温で１２時間撹拌した。
【０１５７】
反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を行った。
【０１５８】
得られたアミノ基修飾したシリカナノ粒子ＡのＦＴ−ＩＲ測定を行ったところ、アミノ基に由来する吸収が観測でき、アミノ基修飾できたことを確認できた。
【０１５９】
〔分子修飾シリカナノ粒子Ｂの調製〕
（分子修飾シリカナノ粒子Ｂ：アミノ基修飾したＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ／ＴＡＭＲＡ共内包シリカナノ粒子）
シリカナノ粒子２について、分子修飾シリカナノ粒子Ａの調製と同様の手順で、アミノ基修飾を行った。
【０１６０】
得られたアミノ基修飾したシリカ被覆テトラメチルローダミン内包シリカナノ粒子のＦＴ−ＩＲ測定を行ったところ、アミノ基に由来する吸収が観測でき、アミノ基修飾できたことを確認できた。
【０１６１】
〔生体物質標識剤１の調製〕
（生体物質標識剤１：アミノ基修飾ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ／ＴＡＭＲＡ連結内包シリカナノ粒子への抗体結合体）
分子修飾シリカナノ粒子Ａの調製で得られたアミノ基修飾ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ／ＴＡＭＲＡ連結内包シリカナノ粒子０．５ｍｇを純水０．５ｍＬに分散させたもの０．１ｍＬをＤＭＳＯ２ｍＬに添加した。そこへ、ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）をいれ１時間反応させた。過剰のｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣなどを遠心分離により除去する、一方で、抗ｈＣＧ抗体を１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元処理を行い、ゲルろ過カラムにより過剰のＤＴＴを除去した。
【０１６２】
ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ処理したＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ／ＴＡＭＲＡ連結内包シリカナノ粒子と、ＤＴＴ処理した抗ｈＣＧ抗体を混合し、１時間反応させた。１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。ゲルろ過カラムにより未反応物を除去し、抗ｈＣＧ抗体が結合したＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ／ＴＡＭＲＡ連結内包シリカナノ粒子（生体物質標識剤１）を得た。
【０１６３】
〔生体物質標識剤２の調製〕
（生体物質標識剤２：アミノ基修飾ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ／ＴＡＭＲＡ共内包シリカナノ粒子への抗体結合体）
分子修飾シリカナノ粒子Ｂの調製で得られたアミノ基修飾シＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ／ＴＡＭＲＡ共内包シリカナノ粒子について、生体物質標識剤１の調製と同様の手順で、抗ｈＣＧ抗体が結合したＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ／ＴＡＭＲＡ共内包シリカナノ粒子（生体物質標識剤２）を得た。
【０１６４】
生体物質標識剤１及び２を用いたイムノアッセイを下記の手順で行った。
１）マイクロプレート上ウェル内にアンチ−ｈαサブニットを固定化した。
２）抗原であるｈＣＧを各ウェルに濃度を変えて入れた。
３）過剰のｈＣＧを洗浄により除去後、各ウェルに生体物質標識剤分散液を入れた。
４）過剰の生体物質標識剤を洗浄により除去した。
５）マイクロプレートリーダーフルオロスキャンアセントＦＬ（商品名、サーモフィッシャーサイエンティフック社製）により各ウェルの蛍光強度を測定した。
【０１６５】
生体物質標識剤１又は生体物質標識剤２を用いたところ、どちらも抗原濃度に応じて蛍光強度が上昇した。すなわち、本発明で得られた生体物質標識剤１及び生体物質標識剤２はいずれもＢ、抗原認識能を損なっていないことが言える。
【０１６６】
生体標識剤１を用い、ｈＣＧ抗体濃度が１ｎｇ／ｍＬの時の蛍光強度を１００としたときの、それぞれの生体標識剤について各ｈＣＧ抗体濃度で測定した蛍光強度を表２に示す。
【０１６７】
【表２】
0005540867.tif 000003
【０１６８】
表２に示した結果から明らかなように、本発明で得られたＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ／ＴＡＭＲＡ連結内包シリカナノ粒子からなる生体物質標識剤１は、公知技術で得られたＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ／ＴＡＭＲＡ共内包シリカナノ粒子からなる生体物質標識剤２に比べ、より低濃度のｈＣＧ抗体濃度を検出できることが分かる。すなわち、この結果により、本発明により高感度検出が可能な生体物質標識剤を提供することができることが分かる。