(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
位相が揃った平行光を測定試料に照射するコヒーレント平行光源と、
前記測定試料を透過した平行光を含み、前記測定試料に関する位相情報を含む被測定光を、第１の偏光と、前記第１の偏光とは偏光方向が異なる第２の偏光とに分離する偏光分離素子と、
前記第１及び第２の偏光のそれぞれを集光する片側テレセントリックな第１の光学系と、
前記第１の光学系により集光された第１の偏光から第１の映写光を形成する第１のピンホールと、前記第１の光学系により集光された第２の偏光から第２の映写光を形成する第２のピンホールとが設けられたピンホール板と、
前記第１の映写光と、前記第２の映写光とを傾いた光軸で重ね合わせることにより干渉縞画像を形成する第２の光学系と、
前記干渉縞画像から前記測定試料の定量微分位相画像を算出する演算部と、
を備え、
前記第１のピンホールの中心位置と前記第２のピンホールの中心位置の間の距離が、前記偏光分離素子と前記第１の光学系の距離と、前記第１の偏光の光軸と前記第２の偏光の光軸がなす角度から数学的に求められる距離と、０．２ｍｍ〜０．５ｍｍの範囲で異なる、三次元形状測定装置。
【請求項２】
前記ピンホール板が偏光縦スリットにより構成されている、請求項１に記載の三次元形状測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、三次元形状測定装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、間葉系幹細胞などの研究が進むにつれて、培養細胞の三次元形状を、培養細胞を生かしたまま、培養細胞に前処理することなく測定したいというニーズが生じている。このような方法としては、例えば、多数の共焦点顕微鏡画像や、多数のインターフェログラム画像などを取得し、それらの画像から培養細胞の三次元形状を再構築する方法が知られている。しかしながら、この方法では、三次元形状を再構築するために多数の画像を取得する必要がある。従って、三次元形状の測定工程が煩雑であるという問題がある。
【０００３】
この問題に対して、デジタルホログラフィック顕微鏡と呼ばれる技術が開発されている。その一例である特許文献１に記載の定量位相顕微鏡を用いれば、１枚の干渉縞画像を取得するのみで培養細胞の三次元形状を測定することができる。
【０００４】
図３に特許文献１に記載の定量位相顕微鏡１００の模式的構成図を示す。図３に示すように、定量位相顕微鏡１００は、測定試料Ｓと撮像装置１０１との間にこの順番で配された、対物レンズ１０２、全反射型ミラー１０３、透過型偏光分離素子１０４、集光レンズ１０５、空間フィルタ１０６、半波長板１０７及び合成レンズ１０８を備えている。
【０００５】
定量位相顕微鏡１００では、測定試料Ｓを透過した被測定光Ｈ１０１は、対物レンズ１０２によって平行光Ｈ１０２に変換される。光Ｈ１０２は、全反射型ミラー１０３によって透過型偏光分離素子１０４側に反射される。
【０００６】
光Ｈ１０２は、透過型偏光分離素子１０４において、そのまま直進して透過する光Ｈ１０３ａと、光Ｈ１０３ａに対して屈折した光Ｈ１０３ｂとに分離される。これら光Ｈ１０３ａと光Ｈ１０３ｂとは、偏光方向が互いに直交した直線偏光の光である。
【０００７】
次に、直線偏光Ｈ１０３ａと直線偏光Ｈ１０３ｂとは、集光レンズ１０５によって、それぞれ、集束光Ｈ１０４（Ｈ１０４ａ、Ｈ１０４ｂ）に変換され、空間フィルタ１０６の開口１０６ａ及びピンホール１０６ｂに集光される。
【０００８】
開口１０６ａを通過する集束光Ｈ１０４ａは、被測定光Ｈ１０１と同じ位相情報を保持したままの物体光Ｈ１０５として出射される。
【０００９】
一方、ピンホール１０６ｂを通過する集束光Ｈ１０４ｂは、測定試料Ｓに含まれる細胞等の被測定物を透過する際に微小角散乱した光を含まず、これとは別の細胞等の被測定物を透過しなかった一様な位相情報を有する透過光を支配的に含む参照光Ｈ１０６となる。参照光Ｈ１０６は、空間フィルタ１０６の後方に設置された半波長板１０７によって物体光Ｈ１０５と偏光方向が等しくなるように偏光方向が回転される。
【００１０】
物体光Ｈ１０５と参照光Ｈ１０６とは、合成レンズ１０８において重なり合わされ、干渉縞が形成される。撮像装置１０１は、この干渉縞を撮像する。撮像された干渉縞について、情報処理装置において、フーリエ変換法などの縞解析法を用いることにより、被測定光の位相情報の定量化が行われる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２００８−２９２９３９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
定量位相顕微鏡１００では、細胞などの被測定物にダメージを与えることなく、一枚の干渉縞画像から、測定試料に含まれる被測定物の厚みなどを測定することができる。
【００１３】
しかしながら、定量位相顕微鏡１００では、空間フィルターの開口部に結ばれる実像を合成レンズで位相分布を伴う空間周波数画像（平行光）とした物体光Ｈ１０５を撮像装置に投影しており、これと参照光Ｈ１０６を干渉させたホログラムとしての干渉縞を生成しているため、被測定物である培養細胞が演算後に得られる定量位相画像の視野の中央に入っているかどうかを一見して判別し難いという問題がある。
対物レンズ等による実像と参照光を干渉させるならば、この問題は避けられそうに見える。しかしながら、定量位相差は２π毎の周期性をもつために、演算途上で得られる擬似位相画像には不連続な特異点が多数存在する。このため、実像と参照光を干渉させる方法では、被測定物の厚みが数ミクロン程度と比較的小さい場合には周囲の状況から特異点における周期ずれ量を正しく補正して精密な定量位相画像の測定が行えるものの、被測定物の厚みが数十ミクロン程度と比較的大きい場合には、疑似位相画像に特異点が多すぎるため、疑似位相画像から正しい定量位相画像を得ることは難しい。
【００１４】
本発明は、被測定物が実際に視野に入っているかどうかを容易に判別できる三次元形状測定装置を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明に係る三次元形状測定装置は、コヒーレント平行光源と、偏光分離素子と、片側テレセントリックな第１の光学系と、ピンホール板と、第２の光学系と、演算部とを備える。コヒーレント平行光源は、位相が揃った平行光を測定試料に照射する。偏光分離素子は、測定試料を透過した平行光を含み、測定試料に関する位相情報を含む被測定光を、第１の偏光と、第１の偏光とは偏光方向が異なる第２の偏光とに分離する。第１の光学系は、第１及び第２の偏光のそれぞれを集光する。ピンホール板には、第１のピンホールと、第２のピンホールとが設けられている。第１のピンホールは、第１の光学系により集光された第１の偏光から第１の映写光を形成する。第２のピンホールは、第１の光学系により集光された第２の偏光から第２の映写光を形成する。第２の光学系は、第１の映写光と、第２の映写光とを傾いた光軸で重ね合わせることにより干渉縞画像を形成する。演算部は、干渉縞画像から測定試料の定量微分位相画像を算出する。
【００１６】
第１のピンホールの中心位置と第２のピンホールの中心位置の間の距離が、偏光分離素子と第１の光学系の距離と、第１の偏光の光軸と第二の偏光の光軸がなす角度から数学的に求められる距離と、０．２ｍｍ〜０．５ｍｍの範囲で異なる。
【００１７】
ピンホール板が偏光縦スリットにより構成されていることが好ましい。
【発明の効果】
【００１８】
本発明によれば、被測定物が実際に視野に入っているかどうかを容易に判別できる三次元形状測定装置を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、本発明の一実施形態における三次元形状測定装置の略図的構成図である。
【図２】図２は、干渉縞画像の模式的平面図である。
【図３】図３は、特許文献１に記載の定量位相顕微鏡の模式的構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を実施した好ましい形態の一例について説明する。但し、下記の実施形態は、単なる例示である。本発明は、下記の実施形態に何ら限定されない。
【００２１】
また、実施形態等において参照する各図面において、実質的に同一の機能を有する部材は同一の符号で参照することとする。また、実施形態等において参照する図面は、模式的に記載されたものであり、図面に描画された物体の寸法の比率などは、現実の物体の寸法の比率などとは異なる場合がある。図面相互間においても、物体の寸法比率等が異なる場合がある。具体的な物体の寸法比率等は、以下の説明を参酌して判断されるべきである。
【００２２】
図１は、本実施形態における三次元形状測定装置１の略図的構成図である。三次元形状測定装置１は、例えば、細胞などの光を透過させる微小な被測定物の厚みなどの立体形状を非接触で光学的に測定することができる装置である。被測定物は、測定試料に含まれる。通常、測定試料には被測定物以外に既知の屈折率の液体も含む。三次元形状測定装置１によれば、例えば、生物細胞試料を生きた環境のまま前処理なしにリアルタイムで分析することができる。従って、三次元形状測定装置１は、例えば、創薬、健康管理、国家安全保障、食品産業あるいは花粉アレルギー、パンデミック感染症の予防、バイオテロ監視、あるいはバクテリア汚染検知の各分野において有効に利用される。
【００２３】
三次元形状測定装置１は、コヒーレント平行光源９と、測定試料設置台１２と、偏光分離素子１３と、片側テレセントリックな第１の光学系１４と、ピンホール板１５と、第２の光学系と、被投影面２０ａを有する撮像素子２０と、演算部２１とを備えている。コヒーレント平行光源９と、測定試料設置台１２と、偏光分離素子１３と、片側テレセントリックな第１の光学系１４と、ピンホール板１５とは、コヒーレント平行光源９と撮像素子２０との間の光路上に、コヒーレント平行光源９側から撮像素子２０側に向けてこの順番で配置されている。以下の説明において、部材等の配置関係は、コヒーレント平行光源９から撮像素子２０への光路における配置関係である。コヒーレント平行光源９から撮像素子２０への光路において、コヒーレント平行光源９側を「上流側」とし、撮像素子２０側を「下流側」とする。ここでテレセントリックとは、光軸と主光線が平行とみなせるという意味で用いている。
【００２４】
コヒーレント平行光源９は、定量位相測定に使用する位相が揃った平行光Ｌ１を測定試料設置台１２の上に配された測定試料Ｓに対して照射する。
【００２５】
コヒーレント平行光源９は、例えば、レーザー等のコヒーレント光を起源とする点光源１０とコリメート光学系１１により構成される。コリメート光学系１１は、点光源１０から出射された発散光Ｌ１を平行光Ｌ２に変換する。コリメート光学系１１は、複数のレンズを有していてもよいし、単一のレンズにより構成されていてもよい。
【００２６】
測定試料設置台１２には、図示しない開口が形成されている。測定試料Ｓは、この開口の少なくとも一部の上に配されている。通常は、開口の全体が測定試料Ｓにより覆われるように測定試料Ｓが配されている。典型的には、測定試料Ｓは、培養プレートに載せられた接着細胞などの被測定物を含む試料であり、被測定物は液体に浸漬されている。測定試料Ｓを透過した被測定光Ｌ３は、測定試料設置台１２を経由して下流側に進行する。
【００２７】
なお、被測定光Ｌ３は、測定試料Ｓに関する位相情報を含んでいる。即ち、被測定光Ｌ３は、平行光Ｌ２が測定試料Ｓを透過することにより、位相が変化した光である。具体的には、被測定光Ｌ３は、測定試料Ｓ中の液体や被測定物の屈折率と厚みとに応じた分だけ、平行光Ｌ２から位相が変化した光である。
【００２８】
測定試料設置台１２の下流側には、偏光分離素子１３が配されている。偏光分離素子１３は、被測定光Ｌ３を、第１の偏光Ｌ４−１と、第１の偏光Ｌ４−１とは偏光方向が異なる第２の偏光Ｌ４−２とに分離する。第１の偏光Ｌ４−１と、第２の偏光Ｌ４−２とは、偏光方向が互いに９０°異なっていることが好ましい。例えば、第１の偏光Ｌ４−１をＰ偏光及びＳ偏光の一方とし、第２の偏光Ｌ４−２をＰ偏光及びＳ偏光の他方とすることができる。なお、図１において、第１の偏光Ｌ４−１を一点破線で示しており、第２の偏光Ｌ４−２を破線で示している。
【００２９】
偏光分離素子１３の下流側には、片側テレセントリックな第１の光学系１４とピンホール板１５が配されている。第１の光学系１４は、例えば少なくとも１枚のレンズにより構成することができる。ピンホール板１５には、第１のピンホール１５ａと、第２のピンホール１５ｂとが設けられている。
【００３０】
片側テレセントリックな第１の光学系１４は、第１の偏光Ｌ４−１及び第２の偏光Ｌ４−２のそれぞれをピンホール板１５上の第１のピンホール１５ａと第２ピンホール１５ｂの近傍に集光する。ピンホール板１５は、第１の偏光Ｌ４−１と第２の偏光Ｌ４−２とから、測定試料Ｓにより微小角散乱された光を通過させず、測定試料Ｓを真っ直ぐに透過した光のみを選択的に通過させる。具体的には、第１のピンホール１５ａには、第１の光学系１４により投影された第１の偏光Ｌ４−１のうち、被測定物により微小角散乱しなかった成分が透過する。第１のピンホール１５ａを通過した光は第１の映写光Ｌ５−１となる。第２のピンホール１５ｂには、第１の光学系１４により投影された第２の偏光Ｌ４−２のうち、被測定物により微小角散乱された成分が透過する。第２のピンホール１５ｂを通過した光は第２の映写光Ｌ５−２となる。
【００３１】
第１のピンホール１５ａの中心位置と第２のピンホール１５ｂの中心位置の間隔は、偏光分離素子１３と第１の光学系１４の距離と、偏光分離素子１３による第１の偏光Ｌ４−１の光軸と第２の偏光Ｌ４−２の光軸がなす角度から数学的に求められる距離と、０．２ｍｍ〜０．５ｍｍ程度の範囲で異なる。
【００３２】
これにより、第１のピンホール１５ａを通過する第１の偏光Ｌ４−１と第２のピンホール１５ｂを通過する第２の偏光Ｌ４−２は、僅かに測定試料Ｓの異なる部位を透過したものとなる。
【００３３】
最適なピンホール直径（ｍｍ）は、おおむね、０．０３６７９×（焦点距離（ｍｍ））１／２となる。
【００３４】
例えば、焦点距離が８０ｍｍの場合は、概算される最適なピンホール直径が０．３３ｍｍとなる。
【００３５】
例えば、焦点距離が５０ｍｍの場合は、概算される最適なピンホール直径が０．２６ｍｍとなる。
【００３６】
例えば、焦点距離が３０ｍｍの場合は、概算される最適なピンホール直径が０．２０ｍｍとなる。
【００３７】
ここでいう焦点距離は、片側テレセントリックな第１の光学系のテレセントリック側の焦点距離のことである。また、実際のピンホールの直径は、概算される最適なピンホール直径よりも小さくてもよい。
【００３８】
本発明は、この構成に限定されない。例えば、ピンホール板１５は、偏光縦スリットにより構成されていてもよい。偏光縦スリットは、具体的には、例えば、異方性軸の直交する２つの１／４波長板を一体化したフォトニック結晶波長板アレイを用いて構成することができる。
【００３９】
ピンホール板１５の下流側には、第２の光学系１６と被投影面２０ａを有する撮像素子２０が配されている。第２の光学系１６は、例えば少なくとも一枚のレンズにより構成することができる。第２の光学系１６は、第１の映写光Ｌ５−１による像と第２の映写光Ｌ５−２による像を、撮像素子２０の被投影面２０ａ上において互いに傾いた光軸でそれぞれの像の位置をぴったり合わせて重ね合わせる機能を果たす。また、第１の映写光Ｌ５−１と第２の映写光Ｌ５−２の偏光方向を揃える目的で、第１のピンホールもしくは第２のピンホールのいずれかに半波長板を加えるなどしてもよい。
【００４０】
被投影面２０ａ上には、第１のピンホール１５ａを通過した第１の映写光Ｌ５−１と第２のピンホール１５ｂを通過した第２の映写光Ｌ５−２とが第２の光学系１６により重ねあわされて生成された、図２に示されるような干渉縞画像Ｇが投影される。
【００４１】
撮像素子２０に接続された演算部２１は、干渉縞画像Ｇから測定試料Ｓの面内定量微分位相差分布を表す定量微分位相画像を算出する。更に定量微分位相画像に基づいて積分計算により定量位相画像を求め、既知の液体の屈折率の影響を除去して、測定試料Ｓに含まれる被測定物の厚み分布として三次元形状を算出する。
【００４２】
次に、三次元形状測定装置１の動作について説明する。
【００４３】
まず、コヒーレントな点光源１０から出射された発散光Ｌ１は、コリメート光学系１１によってコヒーレント平行光Ｌ２に変換される。コヒーレント平行光Ｌ２は、測定試料Ｓに入射する。これにより、測定試料Ｓに関する位相情報を含む被測定光Ｌ３が生成する。
【００４４】
被測定光Ｌ３は、偏光分離素子１３によって、偏光方向が互いに異なる第１の偏光Ｌ４−１及び第２の偏光Ｌ４−２に分離される。第１の偏光Ｌ４−１と第２の偏光Ｌ４−２とは、それぞれ、第１の光学系１４によってピンホール板１５に集光される。
【００４５】
第１の光学系１４によってピンホール板１５に集光された第１の偏光Ｌ４−１のうち測定試料Ｓで微小角散乱されずに測定試料Ｓを真っ直ぐに透過した光だけが第１のピンホール１５ａを透過する。測定試料Ｓで微小角散乱した光はピンホール板１５により妨げられる。これにより、第１のピンホール１５ａによる第１の映写光Ｌ５−１が生成する。一方、第１の光学系１４によってピンホール板１５に集光された第２の偏光Ｌ４−２のうち測定試料Ｓで微小角散乱された光が第２のピンホール１５ｂを透過する。測定試料Ｓで微小角散乱されなかった光はピンホール板１５により妨げられる。これにより、第２のピンホール１５ｂによる第２の映写光Ｌ５−２が生成する。
【００４６】
ここで、第１及び第２のピンホール１５ａ、１５ｂの中心位置の間の距離が、偏光分離素子１３と第１の光学系１４の距離と、偏光分離素子１３による第１の偏光Ｌ４−１の光軸と第二の偏光Ｌ４−２の光軸がなす角度から数学的に求められる距離と、０．２ｍｍ〜０．５ｍｍの範囲で異なる。このため、第１のピンホール１５ａを透過する第１の偏光Ｌ４−１が透過した測定試料Ｓの部位と、第２のピンホール１５ｂを透過する第２の偏光Ｌ４−２が透過した測定試料Ｓの部位とが微妙に異なる。よって、第１のピンホール１５ａを透過する第１の偏光Ｌ４−１が透過した位置における測定試料Ｓに含まれる被測定物の厚みと、第２のピンホール１５ｂを透過する第２の偏光Ｌ４−２が透過した位置における測定試料Ｓに含まれる被測定物の厚みとの差分に応じた大きさの位相差が、第１の映写光Ｌ５−１と第２の映写光Ｌ５−２との間には存在する。そして、第１の映写光Ｌ５−１と第２の映写光Ｌ５−２を傾いた光軸で偏光方向を合わせてそれぞれの像を重ね合わせて干渉させることで、設計されたピッチのキャリア縞に測定試料Ｓの微分位相差に応じた擾乱が重畳した干渉縞画像Ｇが形成される。演算部２１は、この干渉縞画像Ｇから、フーリエ変換等を使用したデジタルフィルタ技術を用いてキャリア縞成分を消去し、測定試料Ｓの面内定量微分位相差分布を表す定量微分位相画像を算出する。さらに、その定量微分位相画像を積分計算することにより定量位相画像を求める。次いで既知の液体の屈折率による影響を除去して、測定試料Ｓに含まれる被測定物の高さ情報等の三次元形状を算出する。
【００４７】
本実施形態の三次元形状測定装置１によれば、蛍光色素や、金粒子など細胞の性質を損なわせる標識物質、構造的な損傷を与える機械的プローブ等を使わない非侵襲測定を行うことができる。このため、三次元形状測定装置１を用いることにより、細胞等の被測定物を損傷することなく、測定試料Ｓに含まれる被測定物の厚み分布すなわち立体形状を測定することができる。また、三次元形状測定装置１を用いることにより、生きている細胞の運動の様子を可視化できる。従って、三次元形状測定装置１は、細胞の動的形態変化の観察に役立つ。
【００４８】
また、三次元形状測定装置１では、第１の偏光Ｌ４−１と第２の偏光Ｌ４−２とが殆ど同じ環境を通過する。このため、振動や空気の揺らぎ等の外乱が第１の偏光Ｌ４−１と第２の偏光Ｌ４−２とに及ぼす影響がほぼ等しく、干渉縞画像Ｇが形成される際に、それらの影響が相殺される。従って、三次元形状測定装置１では、外乱によって測定精度が低下しにくい。
【００４９】
本実施形態では、被測定光は、片側テレセントリックな第１の光学系１４により、ピンホール板１５に集光される。測定試料Ｓにより微小角散乱した光はピンホール板１５により妨げられる。測定試料Ｓを真っ直ぐに通過した光だけが第１のピンホール１５ａを透過し、測定試料Ｓにより微小角散乱された光は第２のピンホール１５ｂを通過するように構成されている。微妙に異なる部位を透過した第１及び第２の映写光Ｌ５−１，Ｌ５−２が傾いた光軸で合成投影されて干渉縞画像が形成される。したがって、干渉縞画像Ｇは、設計された一定幅のキャリア縞に微分位相差による擾乱が重畳された縞となる。この縞模様と被測定物の微分位相差像との位置関係は一見して明らかである。したがって、本実施形態によれば、フーリエ変換像と参照光を干渉させるデジタルホログラフィック顕微鏡技術と異なり、測定試料Ｓに含まれる被測定物の視野中での位置を一見して判別できる。また、定量微分位相画像は、定量位相画像を微分した関係にある。このため、数十ミクロンの厚みの被測定物であっても定量微分位相差は狭い数値範囲に納まる。よって、より厚い被測定物をより広い範囲で（つまり低倍率で）測定しても特異点はそれほど増えない。従って、本実施形態では、実像と参照光を干渉させる方法と比較して、光学系をより低倍率にすることができる。
【符号の説明】
【００５０】
１…三次元形状測定装置
９…コヒーレント平行光源
１０…点光源
１１…コリメート光学系
１２…測定試料設置台
１３…偏光分離素子
１４…第１の光学系
１５…ピンホール板
１５ａ…第１のピンホール
１５ｂ…第２のピンホール
１６…第２の光学系
２０…撮像素子
２０ａ…被投影面
２１…演算部
【図１】
0005590692.tif 000002
【図２】
0005590692.tif 000003
【図３】
0005590692.tif 000004