(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者から採取した骨髄液、骨膜、脂肪等に由来する細胞を培地内で培養することにより間葉系幹細胞を培養する一次培養工程と、多孔質擬似骨顆粒があらかじめ投入された深底容器に培養された間葉系幹細胞を培養液とともに投入し、前記多孔質擬似骨顆粒を一時的に浮揚状態とさせつつ播種する播種工程と、播種された間葉系幹細胞を多孔質擬似骨顆粒とともに培地内で培養することにより培養骨芽細胞様細胞へ分化させる分化培養工程を備え、
深底容器は、底部より上部開口に至る誘導溝を備え、容器の中に滅菌された多孔質擬似骨顆粒が入っていることを特徴とする顆粒型培養骨の製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、播種工程に用いられる間葉系幹細胞が初代培養および／または１継代の培養細胞であることを特徴とする顆粒型培養骨の製造方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法において、分化培養工程における分化培養期間が２週間であることを特徴とする顆粒型培養骨の製造方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の方法において、多孔質擬似骨顆粒は乾燥時みかけ比重が培養液よりも小さく、培養液中で該培養液を吸液し、沈降する多孔質体であることを特徴とする顆粒型培養骨の製造方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の方法において、多孔質擬似骨顆粒は深底容器の培養液中を３０分以下で沈降する多孔質体であることを特徴とする顆粒型培養骨の製造方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載の方法において、多孔質擬似骨顆粒がβ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）、ハイドロキシアパタイト、乾燥骨粉を含む多孔質生体吸収性顆粒より選択される一種または二種以上であることを特徴とする顆粒型培養骨の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の方法において、播種工程における培養液投入の際に振動を加えて多孔質擬似骨顆粒を沈降させた後、回転を与えることを特徴とする顆粒型培養骨の製造方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の方法において、播種工程における培養液投入の際に付加する振動が２０〜１２０Ｈｚであることを特徴とする顆粒型培養骨の製造方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の方法において、播種工程における５０ｍｇの多孔質擬似骨顆粒に対する播種細胞濃度が20,000cells/mL〜3,000,000cells/mLであることを特徴とする顆粒型培養骨の製造方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の方法において、深底容器が、チューブ立てに立てられている容器であることを特徴とする顆粒型培養骨の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、２００８年１２月３日付け出願の日本国特許出願２００８−３０９０６４号の優先権を主張しており、ここに折り込まれるものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明は顆粒型培養骨の製造方法において、収率および骨再生確率を改良することのできる顆粒型培養骨の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
従来、骨腫瘍摘出、外傷等により骨欠損が生じた場合には、自家骨移植等が行われている。しかしながら、自家骨の移植では、自己の正常組織に傷をつけて骨組織等を採取する必要性から、採取部に痛みや腫れなどの症状を起こすことや手術時間が長くなることが問題であった。また、自家骨採取による患者への侵襲を低減させるために、骨欠損部にハイドロキシアパタイトやβ−リン酸三カルシウム等の骨補填材を補填して骨を修復することが行われているが、手術後の骨欠損部の修復には多くの時間がかかることや、骨再生が不確実で大きさも限定されるという問題があった。【０００４】
一方、骨欠損部の修復速度を高めるために、骨補填材とともに、患者から採取した骨髄由来間葉系幹細胞を培養することにより製造される培養骨が提案されている。このような培養骨を骨欠損部に補填する方法では、骨補填材の内部の間葉系幹細胞からも骨形成作用が生じるため、骨補填剤のみを補填する方法に比べ、骨形成が促進され、自家骨に置換されるまでの日数を短縮することが可能となった。
このような培養骨の製造方法としては、患者から採取した骨髄細胞をフラスコ内で一次培養した後、トリプシンのようなタンパク質分解酵素を用いて細胞をフラスコから剥離し、これを骨補填材に付着させて培地内に置き二次培養を行うことにより製造される（非特許文献１）。このような従来の培養骨製造方法では、二次培養の際に、培地内に担体（骨補填剤）を置き、後から細胞播種を行っている。しかしながら、これは用いられる担体が多孔質の場合には比較的有効であるが、担体の形状が顆粒状である場合には、効率的に骨を再生することが困難であることが明らかとなってきた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】吉川、「骨髄間葉系細胞による培養真皮、培養骨−骨髄間葉系細胞による再生医療−」、バイオインダストリー、第１８巻、第７号（２００１）、４６〜５３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は上記従来技術に鑑み行われたものであり、その解決すべき課題は、従来の方法では効率的な骨再生が困難であった顆粒状の担体を用いて、収率が高く、骨再生確率に優れた顆粒型培養骨の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
前記課題を解決するために本発明者らが鋭意研究を行った結果、間葉系幹細胞を擬似骨顆粒に播種させる際の手法改善により、収率および骨再生確率の改良が可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち本発明の顆粒型培養骨の製造方法は、患者から採取した骨髄液、骨膜、脂肪等に由来する細胞を培地内で培養することにより間葉系幹細胞を培養する一次培養工程と、多孔質擬似骨顆粒があらかじめ投入された深底容器に培養された間葉系幹細胞を培養液とともに投入し、前記多孔質擬似骨顆粒を一時的に浮揚状態とさせつつ播種する播種工程と、播種された間葉系幹細胞を多孔質擬似骨顆粒とともに培地内で培養することにより培養骨芽細胞様細胞へ分化させる分化培養工程を備えることを特徴とする。
前記製造方法において、播種工程に用いられる間葉系幹細胞が初代培養および／または１継代の培養細胞であることが好適である。
前記製造方法において、分化培養工程における分化培養期間が２週間であることが好適である。
前記製造方法において、多孔質擬似骨顆粒は乾燥時みかけ比重が培養液よりも小さく、培養液中で該培養液を吸液し、沈降する多孔質体であることが好適である。
前記製造方法において、多孔質擬似骨顆粒は深底容器の培養液中を３０分以下で沈降する多孔質体であることが好適である。
前記製造方法において、多孔質擬似骨顆粒がβ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）、ハイドロキシアパタイト、乾燥骨粉を含む多孔質生体吸収性顆粒より選択される一種または二種以上であることが好適である。
前記製造方法において、播種工程における培養液投入の際に振動を加えて多孔質擬似骨顆粒を沈降させた後、回転を与えることが好適である。
前記製造方法において、播種工程における培養液投入の際に付加する振動が２０〜１２０Ｈｚであることが好適である。
前記製造方法において、播種工程における５０ｍｇの多孔質擬似骨顆粒に対する播種細胞濃度が20,000cells/mL〜3,000,000cells/mLであることが好適である。
前記製造方法において、多孔質擬似骨顆粒があらかじめ投入された深底容器が、チューブ立てに立てられている容器であって、該容器は底部より上部開口に至る誘導溝を備え、容器の中に滅菌された多孔質擬似骨顆粒が入っていることが好適である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、擬似骨顆粒が浮揚状態となるように間葉系幹細胞を播種することで、収率が高く、骨再生確率に優れた顆粒型培養骨を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】顆粒型培養骨製造方法の概略工程図。
【図２】深底容器の概略図。
【図３】各細胞播種法による移植組織像。
【図４】本細胞播種法による骨再生確率（４週間後）。
【図５】播種細胞濃度を変化させた場合の分化培養後細胞数を示した図：条件１  20,000cells/mL、条件２  100,000cells/mL、条件３  100,000cells/mL。
【図６】クリスタルバイオレット染色結果（播種細胞数：５０ｍｇのβ−ＴＣＰ顆粒に対し５×１０５、高濃度播種（5×105cells/mL））：（Ａ）回転を行った場合（条件１）、（Ｂ）回転を行わなかった場合（条件５）。
【符号の説明】
【００１１】
１０…骨髄液
１２…細胞培養用フラスコ
１４…多孔質擬似骨顆粒
１６…深底容器
１８…チューブ立て
２０…誘導溝
２２…チューブ用キャップ
２４…再生骨
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の好適な実施形態について説明する。
本発明の顆粒型培養骨は、骨髄液の採取、骨髄由来間葉系幹細胞の培養（一次培養工程）、該間葉系幹細胞の播種（播種工程）、培養骨芽細胞様細胞への分化誘導（分化培養工程）を行うことにより製造することができる。これらの工程について、図１を参照しつつ説明する。
なお、以下の工程は、細胞源として骨髄液を用いた形態を示しているが、本発明は骨髄以外にも、骨膜、脂肪、皮膚、末梢血等から分離培養が可能で、同様の方法で培養骨芽細胞様細胞へと分化誘導することによって顆粒型培養骨を得ることができるが、これらの中でも骨髄由来間葉系幹細胞を用いることが好適である。
【００１３】
自己血清の調製
本発明の顆粒型培養骨を製造するための細胞培養の増殖因子として、自己血清、牛胎児血清のいずれも使用することができるが、自己血清を使用する際の調整方法を以下に示す。
まず、骨髄液採取時または骨髄液採取前１週間以内に被験者の上腕より４００mLを採血する。採取後約３０分間４℃で静置する。さらに、１０分間３０００ｒｐｍで遠心分離し、無菌的に上清の血清を分取することによって得ることができる。調製した血清は、−２０℃で保管する。
【００１４】
骨髄液の採取
骨髄液は、手術の約１ヶ月前に、後上腸骨陵から下記の方法で無菌的に吸引して回収する。
まず、骨髄液採取部に麻酔を行う。麻酔は局所麻酔、全身麻酔のいずれも使用することができるが、局所麻酔が好ましい。後上腸骨陵より骨髄液を採取する。
【００１５】
骨髄由来間葉系幹細胞の培養（一次培養工程）
細胞培養用培地で４倍希釈した骨髄液１０を細胞培養用フラスコ１２に播いて、図１（Ａ）のように炭酸ガス培養を始め、培養開始後４日目に全量培地替えを行う。なお、細胞培養用培地には、一次培養、分化培養ともに、血清入りαＭＥＭ（α改変イーグル最小必須培地）または無血清培地のいずれも使用できるが、血清入りαＭＥＭを使用することが好ましい。
培養過程における一般細菌および真菌に感染していないことの確認は、培地交換毎の培地の観察（感染していれば培地が濁る）により行うとともに、培養開始時、分化誘導前および培養骨芽細胞様細胞の回収時に無菌試験（日本薬局方の基準を満たすかどうか）で確認する。
その後、週２回全量培地交換を行う。継代のタイミングは細胞の状態を見て判断するが、培養開始から２１〜２８日後を目安に行うことが好適である。継代時には生細胞数および細胞数を計測する。
【００１６】
間葉系幹細胞の播種（播種工程）
継代は以下のように行う。フラスコの培地を吸い取った後、ダルベコリン酸バッファー（Ｄ−ＰＢＳ）にて洗浄し、その後、Ｄ−ＰＢＳを吸い取り、細胞解離剤を加え、３７℃で１０分間培養する。細胞がはがれていることを確認したのち、Ｄ−ＰＢＳまたは培地を加え細胞を回収した後、遠心する。培地に再サスペンドして細胞数を計測する。計測後、図１（Ｂ）のような多孔質擬似骨顆粒１４があらかじめ投入された深底容器１６に培養した骨髄液１０を投入する。この場合、初代培養の細胞を担体上に播種し、１継代目の細胞を移植することになる。
本発明者らの研究から３継代以降の細胞では骨形成能は著しく低くなることが明らかとなっている。このため、播種工程には、初代培養から３継代までの間葉系幹細胞を用いることができるが、初代培養および１継代の細胞を用いることが好適であり、特に初代培養の細胞を用いることが好適である。
【００１７】
本発明にかかる顆粒型培養骨の製造方法において、５０ｍｇの多孔質擬似骨顆粒１４に対し、100,000〜3,000,000の細胞を播種するが、特に500,000程度の細胞を播種することが好ましい。
また、播種工程において、高濃度の細胞を播種することが好適である。濃度20,000cells/mL〜3,000,000cells/mLで播種を行うことが好適であり、500,000cells/mL〜1,000,000cells/mL程度で播種を行うことが特に好適である。高濃度の細胞を播種することにより、播種効率を上げることが可能である。
【００１８】
本実施形態においては、乾燥時みかけ比重が培養液よりも小さい多孔質擬似骨顆粒１４を好適に使用することができる。すなわち、多孔質擬似骨顆粒１４はβ−リン酸三カルシウム（β−ＴＣＰ）、ハイドロキシアパタイト、乾燥骨粉を含む多孔質生体吸収性顆粒ないしこれらの混合物等が好適に使用できるが、β−ＴＣＰを特に好適に使用することができる。
【００１９】
多孔質擬似骨顆粒１４としてβ−ＴＣＰを用いた場合、β−ＴＣＰは、深底容器１６内ではあらかじめ滅菌され、乾燥状態で入れられている。ここに培養した骨髄液１０を投入すると、図１（Ｃ）に示すように、多孔質体であるβ−ＴＣＰが培養液中に浮揚する。その後、β−ＴＣＰは培養液を吸液し、徐々に沈降し、図１（Ｄ）に示すように沈殿する。このように、多孔質擬似骨顆粒１４を一時的に浮揚状態とし、その後沈降させることにより、多孔質擬似骨顆粒１４への細胞付着が極めて効率的に行われ、培養骨の収率および骨再生確率の大幅な向上が可能となる。
この原因に関してはまだ不明な点も多いが、骨形成に関与する間葉系幹細胞は付着指向性があり、長時間にわたる浮遊状態は細胞活性を低下させる。一方、培養した骨髄液１０を深底容器１６に投入した状態では、これらの骨形成幹細胞は浮遊状態にあり、これらの細胞を吸着、担持しつつβ−ＴＣＰを沈降させることにより、良好な細胞担持状態が早期に得られると考えられる。
【００２０】
なお、β−ＴＣＰに浮遊状態の幹細胞を高密度で担持させるため、深底容器１６は７０ｍｍ以上の深さを有することが好適である。また、多孔質擬似骨顆粒１４は、培養液中を３０分以内で沈降する多孔質体であることが好ましい。沈降速度があまりに速いと、細胞担持が十分に行われない場合がある。また、沈降速度があまりに遅いと、長時間の浮遊による細胞活性の低下が大きくなる場合がある。したがって、細胞の沈降速度に応じた多孔質擬似骨顆粒１４の沈降速度を設定することが重要である。
【００２１】
上記のことから、多孔質擬似骨顆粒１４の沈降速度を調整するために、培養液投入の際には、深底容器１６に緩やかな振動を与えることが好適である。深底容器１６に振動を与えることにより多孔質擬似骨顆粒１４の沈降が促進され、沈降の速度は振動が速くなるほど、振幅が大きくなるほど速くなる。細胞の沈降は振動の有無に関わらず比較的早期に達成されるが、この場合は細胞の上に擬似骨顆粒が堆積することとなり、適度に擬似骨顆粒と細胞とを混和することは困難である。また、沈降させた擬似骨顆粒上に細胞を播種した場合には、細胞は上方のみに堆積するか、あるいは下方に沈降してしまい、やはり適切な混和は達成されない。
【００２２】
このため、深底容器１６に加える振動を調整することにより、細胞と擬似骨顆粒との沈降速度を適合させ、擬似骨顆粒上に細胞が適切に播種されることが好適である。
本発明にかかる顆粒型培養骨の製造方法において、播種工程において振動を加えて多孔質擬似骨顆粒を沈降させた後、回転を与えることが好適である。回転を与えることにより、むらなくきれいに細胞の播種が可能となる。
【００２３】
また、骨髄由来培養骨芽細胞様細胞を用いた検討では、特に２０〜１２０Ｈｚ程度の振動をバイオシェーカー等により与えることが好適であるが、その他の機器や徒手によって同等の振幅を与えてもよい。ここで、多孔質擬似骨顆粒によって沈降速度は異なるため、それぞれの擬似骨顆粒に応じて適度な振動を設定することで、効率的な細胞の播種が可能となる。全く振動を与えないと、多孔質擬似骨顆粒１４が培養した骨髄液１０と分離してしまい、沈降に長い時間を有する場合がある。
【００２４】
本発明にかかる顆粒型培養骨の製造方法における播種工程では、多孔質擬似骨顆粒があらかじめ投入された深底容器が使用される。
すなわち、本発明で使用される深底容器１６は、チューブ立て１８に立てられている容器であって、該容器は底部より上部開口に至る誘導溝２０を備え、容器の中に滅菌された多孔質擬似骨顆粒１４が入っていることが好適である。図２は本発明に用いられる好適な深底容器を詳細に説明した図である。
【００２５】
図２に示すように、深底容器１６は円筒状深底容器であり、その容量は１０〜２０mL、高さは７０ｍｍ〜１５０ｍｍであることが好適である。高さがあまりに低いと擬似骨顆粒による細胞担持が十分に行われない場合がある。また、高さがあまりに高いと取り扱い性が悪く、特に培養終了時に培養骨の取り出しが困難となる場合がある。
【００２６】
また、深底容器１６は、その側壁内面に底部より上部開口に至る誘導溝２０を有することが好ましい。誘導溝２０の幅は擬似骨顆粒の量により左右されるが、５０ｍｇの擬似骨顆粒では３〜５ｍｍであることが好適である。
この深底容器１６は、播種工程のみではなく、後の分化培養工程にも引き続き使用することができるが、培養終了時には、培養骨は骨芽細胞等が出す細胞間物質（膠原線維等）により粘着性を有しており、過度の撹拌は細胞にストレスを与えることとなる。また、取り出し後の培養骨塊は、そのまま施術に用いられるよう、塊状を維持していることが好ましい。このため、培養骨塊をばらけさせることなく取り出しやすいように、誘導溝２０を設けているのである。
【００２７】
また、チューブ立て１８は、深底容器１６の形状に合わせて作ることが好適である。この時、深底容器１６を固定することができ、培養液投入の際の振動を均等に与えることも可能であるし、静置も容易にすることができる。また、チューブ立てには、チューブ立て用フタを設けることが好ましい。
【００２８】
なお、培養骨塊が塊状の形態となり、担体周囲を密な細胞層が覆うようになった場合には、内部への栄養供給が阻害される可能性があり、それにより内部の担体上の細胞が生存できなくなり、結果として内部の担体部分には骨が形成されにくくなる場合もある。取り出しやすさよりも均一に細胞が播種され、それぞれの担体が確実に骨化することを重視する場合には、培養細胞への栄養供給が阻害されないよう細胞播種後に深底容器１６からシャーレ等へと取りだしてさらに培養および分化誘導を続けることも可能である。
【００２９】
培養骨芽細胞様細胞への分化誘導（分化培養工程）
多孔質擬似骨顆粒１４に細胞を播種してから翌日までは細胞の回復に必要な期間と考えられる。播種１日後には、図１（Ｄ）のように骨形成に関与する細胞等の細胞および多孔質擬似骨顆粒１４は深底容器１６の下部に沈んでいる。このことを確認した後、培地を分化誘導培地に交換する。培地交換は週２回行うことが好適である。分化誘導期間は１〜３週間であることが好適であるが、２週間であることが特に好適である。分化誘導が進んでいくと、図１（Ｅ）のように、多孔質擬似骨顆粒１４のまわりに培養骨芽細胞様細胞が集まっていく。
分化確認試験（ＡＬＰ活性測定）を行い、分化していることを確認して、培養骨芽細胞様細胞を得る。また、分化確認試験において、培養骨芽細胞様細胞１×１０７個における１分間あたりのＡＬＰ活性が２μｍｏｌ以上であることが好適である。
【００３０】
上記の方法で作成した顆粒型培養骨は、例えば、以下の方法により歯槽骨を再生することができる。
まず、術野相当部に局所麻酔薬で浸潤麻酔をする。次に、術野相当部に切開を入れ、粘膜骨弁膜を作成し、歯槽骨萎縮部あるいは欠損部を明示する。萎縮部あるいは欠損部に培養骨を移植した後、歯槽堤形態を保持するために、移植骨をゴアテックス等の膜で被覆し、必要に応じてマイクロスクリューで固定する。必要に応じて骨膜に減張切開を加えた後、粘膜骨膜弁を復位、縫合する。
【００３１】
また、本発明の顆粒型培養骨を歯槽骨に使用する場合、歯槽骨再生手術後、２４週前後でデンタルインプラントの埋入を行うことができる。
【実施例】
【００３２】
次に実施例をあげて本発明を具体的に説明する。本発明はこれによって限定されるものではない。【００３３】
＜実施例１＞
局所麻酔（０．５％キシロカイン、藤沢薬品社）下で、片側の後上腸骨陵に穿刺針を刺入し、骨髄液を１０mLのシリンジを用いて５mL採取し、深さや方向を変え５mLをさらに１回採取した（５mL×２回、計１０mL）。採取した骨髄液を４倍量の細胞培養用培地（血清入りαＭＥＭ）に懸濁し、フラスコに播いた。血清には、骨髄液採取時に調製した自己血清を使用した。【００３４】
次に、培地で４倍希釈した骨髄液を細胞培養用フラスコ（４枚）に播種して炭酸ガスで骨髄由来間葉系幹細胞の培養（３７℃、炭酸濃度５％、以下培養条件は同じ）を始めた。なお、細胞培養用フラスコには、減菌されたβ−ＴＣＰがあらかじめ投入されていた。培養開始後４日目に全量培地替えを行った。各培養過程における細菌および真菌がないことは、培地の観察および無菌試験で確認した。
培養開始後４日目以降は、週２回全量培地交換を行った。継代は培養開始から２８日後に行った。継代時にはトリパンブルー溶液を用いて生細胞数を計測し、細胞数も同時に数えた。
次に、フラスコの培地を吸い取った後、Ｄ−ＰＢＳ（インビトロジェン社）にて１回洗浄した。洗浄後、Ｄ−ＰＢＳを吸い取り、３７℃に加温した組換え型細胞解離剤であるTryple select（インビトロジェン社）を加え、３７℃で１０分間培養した。細胞がはがれていることを確認したのち、培地を加え細胞を回収した。遠心管に回収した後、遠心した。培地に再サスペンドして細胞数を計測した。
計測後、５０ｍｇのβ−ＴＣＰ顆粒に対し、100,000〜500,000の細胞を播種した。分化の確認試験用として、2×104/wellの細胞密度で12well plateに播種した。【００３５】
顆粒に細胞を播種してから１日後、培地を分化誘導培地に交換した。分化誘導培地は、自己血清入りαＭＥＭにデキサメタゾン、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩ｎ−水和物（和光純薬社）を加えたものであった。培地交換は週２回行った。
さらに２週間後、分化確認試験としてパラニトロフォスフェートを基質に用いてアルカリホスファターゼ活性（ＡＬＰ活性）を測定した。この結果、ＡＬＰ活性の上昇を確認し、分化が進んでおり、培養骨芽細胞様細胞が得られたことがわかった。【００３６】
＜実施例２＞
実施例１の方法で作製した顆粒型培養骨を細胞播種条件を変えてヌードマウス皮下へ移植した。各条件を表１に示す。なお、表１の条件以外は実施例１の方法で作製を行った。遠心操作には、ＴＳ−多本架遠心機ＥＸ−１２５（トミー精工社、ローター：ＴＳ−３８ＬＢ）を用いて行った。各条件における骨再生能の有無（それぞれ＋、−）を表２に、各条件における顕微鏡で撮影した移植組織像を図３に示す。また、ＰＤＬとは細胞分裂回数の概算である。【００３７】
【表１】
0005565587.tif 000002
【００３８】
【表２】
0005565587.tif 000003
【００３９】
細胞数１×１０５で骨再生能を確認したところ、条件Ｂにおいて優れた骨再生能が確認できた。このことから、本発明にかかる方法で、深底容器で培養を行い、分化誘導前に細胞を播種し、細胞播種の際に遠心分離を行わず作製した顆粒型培養骨において、優れた骨再生能が得られることがわかった。
この条件Ｂにおいて、細胞数を５×１０５に増やして作製したところ、さらに優れた骨再生能が確認できた。【００４０】
本発明にかかる条件Ｂで作製した顆粒型培養骨を５名の被験者で確認を行った際の骨再生確率を図４に示す。この結果、細胞数１×１０５の場合、２名の骨再生が確認されたが、細胞数５×１０５では、１００％の確率で骨再生が成功したことがわかる。【００４１】
＜実施例３＞
実施例１の方法と、下記方法Ｘで作成した培養骨芽細胞様細胞の分化誘導２週間後の細胞数について測定を行った。なお、以下の実施例における細胞数の測定には、ＷＳＴ−８を発色基質として採用しているCell Counting Kit-8（同仁化学研究所社）を用いた。
ここでは、播種する細胞数は５０ｍｇのβ−ＴＣＰ顆粒に対し、１×１０５個で行った。細胞数の割合は、試料の吸光度を基に算出した細胞数の割合である（下記方法Ｘで製造された細胞数を１００％としている）。結果を表３に示す。【００４２】
方法Ｘ
実施例１では乾燥した担体（β−ＴＣＰ顆粒）上に培地に懸濁した細胞を直接播種し、振動を加えていたが、方法Ｘでは、あらかじめ培地中に浸漬し、沈降したβ−ＴＣＰ顆粒に細胞懸濁液を加えて播種を行った。その他の製法は、実施例１と同様に行った。【００４３】
【表３】
0005565587.tif 000004
【００４４】
表３より、本発明にかかる実施例１の方法で製造された場合、方法Ｘと比較し、２８％ほど培養骨芽細胞様細胞が多く得られることがわかる。
したがって、本発明にかかる顆粒型培養骨の製造方法において、播種工程において、乾燥した多孔質擬似骨顆粒があらかじめ投入された深底容器に培養された間葉系幹細胞を培養液とともに投入し播種することが必要である。さらに、この播種工程において、振動を加えることが好適である。【００４５】
＜実施例４＞
次に、播種工程において、播種する細胞の濃度を変化させた時の、細胞の分化への影響について検討を行った。
本発明にかかる下記顆粒型培養骨の製造方法Ａにおいて、下記条件１〜３のように、播種する細胞の濃度（懸濁させる培地の量）を変化させ、分化誘導培地に添加１日後および２週間後の細胞数の測定を行った。なお、骨髄細胞は、ラットの大腿骨より採取した。
実験は３回行い、測定値は３回の平均値を示した。以下、細胞数はＷＳＴ−８による吸光度（ＯＤ値）として表示し、測定値からブランクの値を引くことにより求めた。結果を図５に示す。【００４６】
顆粒型培養骨の製造方法Ａ
基本的な工程は、上記実施例１と同様の方法で行った。変更した箇所は以下の通りである。
一次培養工程において、骨髄細胞は、実験によりヒト骨髄液あるいはラットの大腿骨より採取した。ヒト骨髄を用いる場合、採取した骨髄液を４倍量の細胞培養用培地（血清入りβＭＥＭ）に懸濁した。ラットを用いる場合、Ficollを用いた密度勾配遠心法により単核球分画を分離し、それを細胞培養用培地に懸濁して播種を行った。血清には、ＦＢＳ（牛胎児血清）を使用した。
播種工程において、５０ｍｇのβ−ＴＣＰ顆粒に対し、100,000〜2,500,000の細胞を播種した。
分化培養工程において、分化誘導培地は、ＦＢＳ入りβＭＥＭにデキサメタゾン、アスコルビン酸２−リン酸、β−グリセロリン酸を加えたものを使用した。【００４７】
条件１：播種細胞数100,000（細胞１×１０５を５mLに懸濁）、播種細胞濃度20,000cells/mL
条件２：播種細胞数100,000（細胞１×１０５を１mLに懸濁）、播種細胞濃度100,000cells/mL
条件３：細胞播種数500,000（細胞５×１０５を５mLに懸濁）、播種細胞濃度100,000cells/mL【００４８】
図５によると、播種細胞数が同じであるが、濃度が異なる条件１、条件２において、分化誘導後の細胞数に差異が生じることが明らかになった。
高濃度播種を行っている条件２において、条件１と比較し、分化誘導１日後、２週間後の両方で、細胞数が多かった。
また、播種細胞数は条件１、条件２の５倍であるが、高濃度播種でない条件３において、試料は分化誘導培地に添加１日後の細胞数がそれほど多くなく、また２週間後の細胞数は大幅に減少してしまった。
したがって、高濃度で細胞の播種を行った方が、播種効率が良いことがわかった。このため、本発明にかかる顆粒型培養骨の製造方法において、高濃度播種を行うことが好適である。【００４９】
＜実施例５＞
次に、播種工程において、深底容器に培養液を投入する際、回転を加えた時の細胞の分化への影響について検討を行った。
本発明にかかる顆粒型培養骨の製造方法Ａにおいて、下記条件４〜７のように、播種する細胞の数および回転の有無および分化誘導培地の添加の有無を変化させ、分化誘導培地（もしくは通常培地）に添加２週間後の細胞数およびＡＬＰ活性の測定を行い、ＡＬＰ値／細胞数を算出した。なお、骨髄細胞は、ヒト骨髄液より採取した。ＡＬＰ活性の測定には、上記したCell Counting Kit-8およびｐ−ニトロフェニルホスフェート錠剤セット(Sigma-Aldrich社)を用いて行った。以下、回転は、播種工程において、培養液を投入し、多孔質擬似骨顆粒が沈降した後ローテーターを用いて与えた。
実験は３回行い、測定値は３回の平均値を示した。細胞数とＡＬＰ値は、測定値からブランクの値を引くことにより求めた。結果を表４に示す。【００５０】
条件４：播種細胞数500,000（5×105cells/mLを１mL使用）回転数１．３ｒｐｍ（３０分）、骨分化誘導（＋）
条件５：播種細胞数500,000（5×105cells/mLを１mL使用）回転数１．３ｒｐｍ（３０分）、骨分化誘導（−）
条件６：播種細胞数2,500,000（5×105cells/mLを５mL使用）回転なし、骨分化誘導（＋）
条件７：播種細胞なし
条件８：細胞播種数500,000（5×105cells/mLを１mL使用）回転なし、骨分化誘導（＋）【００５１】
【表４】
0005565587.tif 000005
【００５２】
表４によると、試験例５−１において、細胞数は若干少ないものの、ＡＬＰ値が高く、ＡＬＰ値／細胞数が大きいため、骨分化の程度が非常に高いことがわかる。
試験例５−２では、細胞数は多いものの、ＡＬＰ値が低いため、顆粒型培養骨製造は成功しづらい可能性があると予測できる。
一方、回転を加えていない試験例５−３では、細胞数が多いものの、試験例５−１と比べるとＡＬＰ値／細胞数がやや小さいことがわかる。
したがって、本発明にかかる顆粒型培養骨の製造方法において、播種工程において、深底容器に培養された間葉系幹細胞を培養液とともに投入した後、回転を加えることが好適である。【００５３】
＜実施例６＞
次に、播種工程における回転を加えた時の細胞への影響についてさらに詳細に検討を行った。
本発明にかかる顆粒型培養骨の製造方法Ａにおいて、上記条件４、７、８のように、播種工程における回転の有無を変化させた。そして、分化誘導１７日後に、細胞数の測定およびクリスタルバイオレットで染色を行った。なお、骨髄細胞は、ヒト骨髄液より採取した。
なお、実験は３回行い、測定値は３回の平均値を示した。細胞数の測定結果を表５に、細胞の染色結果を図６に示す。【００５４】
【表５】
0005565587.tif 000006
【００５５】
表５によると、高濃度播種および回転を行った試験例６−１では、高濃度播種を行ったが回転を与えていない試験例６−２に比べ、細胞数は減少することがわかった。
しかしながら、図６（Ｂ）によると、回転を与えていない試料は、右側に細胞が十分に播種されていない部分が認められた。
一方、図６（Ａ）によると、高濃度播種および回転を行った試料は細胞がむらなく播種されていることがわかる。
したがって、播種工程において回転を加えることは、細胞数を若干減少させる可能性を有するが、むらなくきれいに細胞の播種が可能であることが明らかとなった。【００５６】
＜実施例７＞
次に、播種工程において好適な回転数および回転時間について検討を行った。
本発明にかかる顆粒型培養骨の製造方法Ａにおいて、播種工程の際に与える回転数、回転時間を下記条件９〜１３のように変化させ、分化誘導２週間後の細胞数の測定を行った。なお、骨髄細胞は、ラットの大腿骨より採取した。ここでは、播種する細胞数は５０ｍｇのβ−ＴＣＰ顆粒に対し、100,000(１×１０５cells/mL)で行った。
なお、実験は３回行い、測定値は３回の平均値を示した。結果を表６に示す。【００５７】
条件９：回転数１．３ｒｐｍ（３０分）
条件１０：回転数１．３ｒｐｍ（１時間）
条件１１：回転数２ｒｐｍ（３０分）
条件１２：回転なし（静置）
条件１３：培地のみ【００５８】
【表６】
0005565587.tif 000007
【００５９】
表６によると、回転数１．３ｒｐｍで３０分、１時間回転、回転数２ｒｐｍで３０分回転、回転なしの群を比較したところ、１日後の細胞数には大きな違いを認めていないが、２週間後においては回転数１．３ｒｐｍで３０分回転させた試験例７−１が最も多い細胞数であった。
以上のことから、本発明にかかる顆粒型培養骨の製造方法の播種工程において、培養液を投入し、多孔質擬似骨顆粒が沈降した後、回転数１．３ｒｐｍ程度で３０分〜１時間、好ましくは３０分程度回転を加えることが好適であることが明らかになった。
【図１】
0005565587.tif 000008
【図２】
0005565587.tif 000009
【図３】
0005565587.tif 000010
【図４】
0005565587.tif 000011
【図５】
0005565587.tif 000012
【図６】
0005565587.tif 000013