(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
オクロモナス（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ）属由来のβ１，３−グルカンホスホリラーゼを用いて，グルコース−１−リン酸を基質とし，ラミナリオリゴ糖をプライマーとした重合反応を行うことにより，直鎖状のβ１，３−グルカンを製造することを特徴とするβ１，３−グルカンの製造方法。
【請求項２】
オクロモナス属が，オクロモナス・ダニカ（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ  ｄａｎｉｃａ）であることを特徴とする請求項１に記載のβ１，３−グルカンの製造方法。
【請求項５】
β１，３−グルカンホスホリラーゼは，オクロモナス属の無細胞抽出液または，当該抽出液から粗精製若しくは高純度精製されたものであることを特徴とする請求項１または２に記載のβ１，３−グルカンの製造方法。
【請求項６】
オクロモナス（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ）属由来のβ１，３−グルカンホスホリラーゼを用いて，グルコース−１−リン酸を基質とした重合反応を行うことにより，直鎖状のβ１，３−グルカンを製造する方法であって，前記β１，３−グルカンホスホリラーゼは，β１，３−グルカンの製造に際してプライマー不要の程度の粗精製度のβ１，３−グルカンホスホリラーゼを使用することによりプライマーとしてラミナリオリゴ糖を添加せずにグルコース−１−リン酸のみを原料とすることを特徴とするβ１，３−グルカンの製造方法。
【請求項９】
製造されるβ１，３−グルカンの重合度が３０〜７０であることを特徴とする請求項１，２，５または６のいずれか一つに記載のβ１，３−グルカンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，β1,3-グルカンの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
β1,3-グルカンは，グルコースがβ1,3-型の結合で連なった多糖を意味している。β1,3-グルカンは，菌類，藻類，高等植物，細菌などにより合成され，その分子量は数千から数百万まで広く分布している。この物質には，抗菌・抗ウイルス作用，血液凝固作用，抗ガン作用，免疫調節作用などが認められることから，研究開発が進んでいる。β1,3-グルカンの作用の強さは，構造や分子量によって異なることが知られており，菌類などから抽出されるβ1,3-グルカンは，そのままでは目的とする作用を発揮させられないことがある。【０００３】
このため，適当な分子量のβ1,3-グルカンやラミナリオリゴ糖を製造するための研究開発が行われている。例えば後者については，特許文献１に，ミドリムシ属由来の細胞から抽出された酵素を用いてラミナリオリゴ糖（2〜20個の重合物）を製造する方法が開示されている。特許文献２には，バチルス属由来の菌から抽出された酵素を用いて，グルコースと，グルコース−1−リン酸（G1P）を反応させることにより，ラミナリオリゴ糖（高々，数個の重合物）を製造する方法が開示されている。特許文献３には水可溶化β-1,3-グルカンにユーグレナ藻体および／またはユーグレナ藻体抽出物を作用させることを特徴とするラミナリオリゴ糖の製造方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平４−０６６０９２号公報
【特許文献２】特開２００１−２９９３３８号公報
【特許文献３】特開平６−１１３８７４号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】The Plant Journal, 1995, Vol.8(2), pp.213-225
【非特許文献２】The Journal of Biological Chemistry, Vol.277, No.33, Issue of August 16, pp.30102-30111(2002)
【非特許文献３】Cancer research, 38, 379-383 (1978)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
非特許文献１には，β1,3-グルカンシンターゼを用いたβ1,3-グルカン（重合度1,500）の製造方法が開示されている。この方法は，天然のβ1,3-グルカンの製造工程を模したものであるが，基質として用いるUDPグルコースが高価であり，β1,3-グルカンシンターゼが膜タンパクであるため，扱いが難しいという欠点がある。
また，非特許文献２には，有機化学反応と加水分解酵素を利用したグライコシンターゼ反応によるβ1,3-グルカン（重合度30〜34）の合成方法が開示されている。しかし，原料となるラミナリビオース（グルコース2分子がβ1,3結合した二糖類の一種）は高価であることに加え，重合反応に用いるフッ化ラミナリビオースを得るために煩雑な手順を要するという欠点がある。
一方，非特許文献３には，重合度50〜120の直鎖β-1,3グルカンは重合度30以下のラミナリオリゴ糖や，土壌細菌 Agrobacterium が産生するカードランと比較して，抗腫瘍活性が高いというデータが報告されている。しかしながら，重合度50〜120の直鎖β-1,3グルカンは天然には存在せず，カードランを加水分解するなどの方法では，これらのβ-1,3グルカンを大量に調製することは困難である。
本発明は，上記した事情に鑑みてなされたものであり，その目的は，数十個のグルコースが重合したβ1,3-グルカンを簡易に製造できる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は，オクロモナス（Ochromonas）属由来のβ1,3-グルカンホスホリラーゼ (EC 2.4.1.97) を用いて，グルコース−1−リン酸（G1P）を基質とした重合反応により，β1,3-グルカンを製造できることを見出し，基本的には本発明を完成するに至った。
こうして，本発明に係るβ1,3-グルカンの製造方法は，オクロモナス（Ochromonas）属由来のβ1,3-グルカンホスホリラーゼを用いて，G1Pを基質とした重合反応を行うことを特徴とする。
上記発明においては，オクロモナス属が，オクロモナス・ダニカ（Ochromonas danica）であることが好ましい。
また，重合反応時のpHが，4〜8であることが好ましい。
また，重合反応時のG1Pの濃度が，0.01 M〜0.6 M （好ましくは、0.1 M〜0.5 M）であることが好ましい。
また，β1,3-グルカンホスホリラーゼは，オクロモナス属の細胞から抽出されたものであり，β1,3-グルカンの製造に際してプライマーの添加が不要である程度の粗精製度であることが好ましい。プライマーとは，β1,3-グルカンホスホリラーゼが，G1Pを基質とした重合反応によりβ1,3-グルカンを製造する際に最初に用いられる物質であり，例えばラミナリビオースをはじめとするラミナリオリゴ糖などが使用できる。
また，重合反応時の温度が，20℃〜45℃であることが好ましい。本発明の方法では，反応時の温度を制御することにより，生成物のグルコース重合度を適当に変化させられる。例えば，グルコース重合度は，低温域（20℃〜25℃）では50〜60，中間域（26℃〜37℃）では60〜70，高温域（38℃〜45℃）では40〜60程度となる。このため，反応時の温度を制御することにより，適当な重合度の生成物を得られる。【０００８】
オクロモナスは，不等毛植物門・黄金色藻綱に属する微細藻類であり，１本または２本の不等長の鞭毛を持ち単独で遊泳する。形は，球形，卵形，楕円形などであり，細胞表面には剛毛などの目立つ構造は認められない。また，細胞は殻を持たず，黄色・黄褐色・褐色・暗黄緑色などの葉緑体を持っている。オクロモナス属には，オクロモナス・ダニカ（Ochromonas danica），オクロモナス・ツベルクラタ（Ochromonas tuberculata），オクロモナス・マルハメンシス（Ochromonas malhamensis）などの種が存在する。本発明では，いずれの種を用いることもできるが，オクロモナス・ダニカを用いることが好ましい。【０００９】
β1,3-グルカンホスホリラーゼは，β1,3-グルカンの非還元末端から，β-（1→3）結合で結合したグルコース残基（G1P）を遊離させる加リン酸分解反応を触媒する酵素である。この反応は，可逆的であることから，G1Pの濃度が一定以上であると，β1,3-グルカンが製造され得る。但し，供給源となる生物が生産するβ1,3-グルカンホスホリラーゼの特性により，G1Pからβ1,3-グルカンを製造する際の至適条件（pH，温度，G1P濃度など）は異なるので，個々に検討することが必要である。【００１０】
本発明に用いるβ1,3-グルカンホスホリラーゼは， (1)細胞を破砕した懸濁液の状態（無細胞抽出液），(2)細胞を破砕した後，酵素を粗精製した状態（粗精製酵素），更に(3)高度に精製した状態（高純度酵素），のいずれの状態でも用いることができる。このうち，上記(2)または(3)の状態の酵素を用いることが好ましい。酵素を精製するには，(A)細胞を破砕する細胞破砕工程，(B)細胞片などを沈殿させて取り除く遠心分離工程，(C)上清に含まれるタンパク質に塩（例えば，硫酸アンモニウム）を加えて沈殿させ，この沈殿を適当な緩衝液で溶解した後，透析処理するタンパク精製工程，(D)透析後の溶液を適当なクロマトグラフィー（カラムクロマトグラフィー，薄層クロマトグラフィー，ＨＰＬＣ，超臨界流体クロマトグラフィー，イオンクロマトグラフィー，アフィニティクロマトグラフィー，ペーパークロマトグラフィーなど；分配クロマトグラフィー，吸着クロマトグラフィー，分子排斥クロマトグラフィー，イオン交換クロマトグラフィー，ゲル濾過など）により分離精製するクロマトグラフィー工程を行うことが好ましい。【００１１】
本発明で得られるβ1,3-グルカンホスホリラーゼが，上記(2)粗精製したもの（粗精製酵素）を用いる場合には，G1Pを基質とした合成反応のプライマーとなるラミナリオリゴ糖を添加しなくてもβ1,3-グルカンを生成できる程度の状態とすることが好ましい。粗精製酵素にはG1Pと混合した際にプライマーを合成する成分が含まれると考えられるため，予めこの物質を含むことにより，プライマーとしてラミナリオリゴ糖を添加せずに，容易にβ1,3-グルカンを製造できる。但し，粗精製酵素を用いる場合には，他の夾雑物により，β1,3-グルカンが着色する（褐変化）ことがある。このため，粗精製酵素を用いる場合には，適当な還元剤を用いることが好ましい。そのような還元剤として，例えばジチオスレイトール（DTT），2-メルカプトエタノール，Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)，グルタチオン，アスコルビン酸などが例示される。
また，β1,3-グルカンホスホリラーゼが，上記(3)高度に精製したもの（高純度酵素）を用いる場合には，重合反応時にプライマーとして，ラミナリビオースをはじめとするラミナリオリゴ糖などを用いることが好ましい。【００１２】
また，重合反応に用いられる緩衝液としては，限定されず，例えば，クエン酸緩衝液，酢酸緩衝液，ＭＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液，ＰＩＰＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液，ＭＯＰＳ−水酸化ナトリウム緩衝液，ＨＥＰＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液，トリス−塩酸緩衝液，などから適当に選択できる。これらのうち，好ましくは，クエン酸緩衝液，酢酸緩衝液，ＭＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液を用いることができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば，数十個（約30個〜70個程度）のグルコースが重合したβ1,3-グルカンを容易に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】粗精製酵素を用いたときに沈殿が形成される様子を確認したときの写真図である。左側(A)は，反応前の反応液を示し，右側(B)は，24時間経過後の反応液を示す。(B)では，多糖類の沈殿が観察された。
【図２】部分メチル化アルジトールアセテートのGC-MSクロマトグラムである。メチル化した糖質を酸加水分解した後，アセチル化し，GC-MSに供したときの結果を示した。上側(A)は，標準品としてのラミナリビオースの結果を，下側(B)は，沈殿物の結果を示す。
【図３】部分メチル化アルジトールアセテートのマススペクトルである。  最上段(A)は，標準品としての 1,3,5-トリ- O -アセチル-2,4,6-トリ- O -メチルヘキシトール (GC-MSライブラリ）のスペクトルを，中段(B)は，図２(A)の22.0分のピーク（ラミナリビオースをメチル化分析した試料）のスペクトルを，下段(C)は，図２(B)の22.0分のピーク（沈殿物をメチル化分析した試料）のスペクトルを示す。
【図４】13C-NMR スペクトルである。上段(A)は，カードラン（β-1,3-グルコシド結合を有する多糖）の結果を，下段(B)は，沈殿物の結果を示す。
【図５】高純度酵素を用いたときに沈殿が形成される様子を確認したときの写真図である。左側(A)は，プライマー（ラミナリペンタオース）非添加の反応液を示し，右側(B)は，プライマー（ラミナリペンタオース）添加の反応液を示す。(B)では，多糖類の沈殿が観察された。
【図６】酵素量の変化が生成物収率に与える影響を確認した結果を示すグラフである。酵素量が少量の場合には，プライマー非添加（○）では沈澱が得られなかったが，プライマー添加（●）では沈澱の形成が確認された。
【図７】プライマー濃度の変化が生成物収率に与える影響を確認した結果を示すグラフである。0.1 mg/mL（終濃度）以上のプライマーを添加することで，少量の酵素でも高収率で沈澱の形成が確認された。
【図８】プライマー添加時にG1P濃度が与える影響を確認した結果を示すグラフである。0.05 M〜0.6 M G1P の範囲内で，β-1,3グルカンの合成が観察され，とくに0.1 M〜0.5 M G1P の範囲内でβ-1,3グルカンの合成収率が高いことが確認された。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
次に，本発明の実施形態について，図表を参照しつつ説明するが，本発明の技術的範囲は，これらの実施形態によって限定されるものではなく，発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また，本発明の技術的範囲は，均等の範囲にまで及ぶものである。
【００１６】
＜実験材料および方法＞
1. Ochromonas danicaの培養
Ochromonas danicaは国立環境研究所の微生物系統保存施設から分譲された。
1 g/L ポリペプトン（ナカライテスク），1 g/L 乾燥酵母エキス（ナカライテスク），0.5 g/L 肉エキス（Remel），1 g/L グルコースを含む培地250 mLに，O. danicaの懸濁液を加え，静置下，22℃，12時間明期/12時間暗期のサイクルで種培養を行った。この培養液（250 mL） を 5 g/L ペプトン（ミクニ化学産業），2 g/L 乾燥酵母エキス，15 g/L グルコースを含む培地 5.0 Lに加え，30℃，120 rpmで3日間振とう培養した。光照射は行わなかった。
培養後，遠心分離（6,000×g，10分間，4℃）を行い，細胞を回収した。これを250 mLの蒸留水（4℃）で懸濁したのち，遠心分離（6,000×g，10分間，4℃）を行い，上清を除去した。この洗浄操作をさらに3回繰り返した後，使用するまで-30℃で保存した。
【００１７】
2. β-1,3グルカンホスホリラーゼの精製
上記1で得られた細胞を，250 mLの緩衝液A（20 mM Tris, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, pH 8.0）で懸濁したのち，超音波発生機（UD-201, トミー精工）を用いて破砕した。OUTPUT 4, DUTY 40，5分間の条件で，氷水で冷却しながら破砕を行った（菌体破砕工程）。その後，遠心分離（40,000×g, 30分間，4℃）を行い，上清を回収した（遠心分離工程）。
得られた上清に対して，30% 飽和濃度となるように硫酸アンモニウムを加えた。4℃で1時間放置し，遠心分離（10,000×g, 15分，4℃）を行い，上清を回収した。これに対して70% 飽和濃度となるように硫酸アンモニウムを加えた。4℃で1時間放置し，遠心分離（10,000×g, 15分，4℃）を行い，上清を取り除いた。得られた沈殿を 10 mLの緩衝液Aで溶解したのち，1 Lの緩衝液Aで4℃，16時間透析を行った（タンパク精製工程）。
【００１８】
透析後の溶液を緩衝液Aで平衡化したQ Sepharose Fast Flow（φ1.6 cm×20 cm，GEヘルスケア）に供した。試料添加後，緩衝液Aで十分に洗浄したのち，0 M - 1 M 塩化ナトリウムの直線濃度勾配（120分）でタンパク質を溶出した。操作は全て流速5 mL/分 で行い，5 mLずつ分画した（クロマトグラフィー工程）。得られた画分の一部を用いて活性測定を行った。活性の高い画分を回収し，粗精製酵素と定義した。粗精製酵素は液体窒素で凍結し，使用するまで-80℃で保存した。
精製度の高い酵素を得るために，さらに以下の精製操作を行った。粗精製酵素に対して30%飽和濃度となるように硫酸アンモニウムを加えた。この溶液を30% 飽和硫安を含む緩衝液Aで平衡化したHiTrap Phenyl HP (5 mL, GEヘルスケア）に供した。試料添加後，カラムを同緩衝液で十分に洗浄したのち，30-0% 硫酸アンモニウムの直線濃度勾配（250 mL）および50 mLの緩衝液Aでタンパク質を溶出した。操作は全て流速5 mL/分で行い，5 mLずつ分画した。
酵素活性の高い画分を回収し，2 L の緩衝液B（20 mM Tris, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, pH 7.5）を用いて4℃，16時間透析を行った。透析後の溶液を緩衝液Bで平衡化したRESOURCE Q（1 mL，GEヘルスケア）に供した。試料添加後，カラムを緩衝液Bで十分に洗浄したのち，0-190 mM 塩化ナトリウム（10 mL）および190-230 mM 塩化ナトリウム（200 mL）の直線濃度勾配でタンパク質を溶出した。操作は全て流速1 mL/分で行い，1 mLずつ分画した。酵素活性の高い画分を回収し，高純度酵素と定義した。高純度酵素は使用するまで4℃で保存した。
【００１９】
3. β-1,3-グルカンホスホリラーゼの活性測定
50μL 0.2 M クエン酸ナトリウム緩衝液 （pH 5.5），10μL 100 mM グルコース-1-リン酸（G1P, 和光純薬工業），20μL 5 mM ラミナリペンタオース（生化学バイオビジネス）を混合した。30℃で10分間予備保温した後，20μL 酵素溶液を添加し，30℃で10分間保持した。生じた無機リン酸量を調べるために，この反応液に対して，1000μLモリブデン試薬［15 mM モリブデン酸アンモニウム，100 mM 酢酸亜鉛（pH 5.0）］と250μL アスコルビン酸試薬［10% （w/v） アスコルビン酸（pH 5.0）］を加え，30℃で15分保持した後，分光光度計でOD850 を測定した。1分間に1μmol の無機リン酸を生成する酵素量を1 U と定義した．また，タンパク質濃度をBradford, Analytical Biochemistry, 72, 248-254 (1976) の方法にしたがって決定した。
【００２０】
4. 多糖の酵素合成
250μL 0.2 M クエン酸緩衝液 （pH 5.5），100μL 0.5 M G1P, 150μL 粗精製酵素（3.45 U/mg, 2.13 U/mL），0.5μL 1 M ジチオスレイトールを混合し，30℃，24時間保持した。この際，ラミナリオリゴ糖等のプライマーは添加しなかった。反応終了後，遠心分離（5000×g, 5分間）を行い，沈殿を回収した。これを1 mLの蒸留水で懸濁したのち，遠心分離（5000×g, 5分間）を行い，上清を除去した。この洗浄操作をさらに2回繰り返したのち，凍結乾燥によって水分を除去した。
【００２１】
5. 沈殿物の解析
全糖量の測定はフェノール硫酸法（Dubois et al., Analytical Chemistry, 28, 350-356 (1956)）にしたがって行った。
生成沈殿物の分子量分布はサイズ排除クロマトグラフィーにより解析した。カラムはTSKgel α-3000（φ0.78 cm×30 cm，東ソー）を用いた。80% ジメチルスルホキシド (DMSO) に溶解した沈殿試料をカラムに供した。溶離液は10 mM硝酸ナトリウムを含む80% DMSOを使用し，流速0.3 mL/分，カラム温度40℃で分離を行い，示差屈折検出器によって検出を行った。HPLCシステムはAgilent 1100（アジレント・テクノロジー）を使用した。また，分子量スタンダードとしてプルラン（昭和電工）を用いた。
【００２２】
沈殿物の糖組成分析はBlakeney et al., Carbohydrate Research, 113, 291-299 (1983) の方法にしたがって行った。
単糖間の結合様式はメチル化分析と核磁気共鳴分析 (NMR分析) によって決定した。メチル化分析はCiucanu and Kerek, Carbohydrate Research, 131, 209-217 (1984) とHarris et al., Carbohydrate Research, 127, 59-73 (1984)の方法にしたがって行った。部分メチル化アルジトールアセテートの分離・分析には，GC-MS（GCMS-QP2010, 島津製作所）を使用した。カラムはSP-2380 (30 m×0.25 mm×0.2 μm，SUPELCO) を使用した。ヘリウムをキャリアガスとして用い，圧力を150 kPa，スプリット比を100とした。気化室温度を275℃とし，1 μLの試料を注入した。カラムオーブン温度を70℃で4分間保持した後，25℃/分の勾配で150℃まで上昇させた。その後，4℃/分の勾配で220℃まで上昇させ，220℃で5分間保持した。続いて，25℃/分の勾配で270℃まで上昇させ，270℃で5分間保持した。マススペクトルはEIモードで記録した。イオン源温度を200℃，インターフェイス温度を250℃，スキャン開始時間を10分，終了時間を34.7分，m/zのスキャン範囲を35から350とした。また，10 mg/mLとなるように沈殿をDMSO-d6に溶解させ，核磁気共鳴装置（日本電子，JNM-A500）で13Cの核磁気共鳴スペクトルを観測した。積算回数は15,000回とし，内部標準にDMSO-d6 (39.5 ppm)を用いた。また，β-1,3グルコシド結合を有するカードランの核磁気共鳴スペクトルも同様の方法で観測した。
【００２３】
6. 高純度酵素を用いたβ-1,3グルカンの合成
200μL 1 M クエン酸緩衝液 （pH 5.5），100μL 0.5 M G1P, 600μL 高純度酵素（15.3 U/mg, 0.46 U/mL），5μL 1 M ジチオスレイトールを混合した。さらに，100μLの蒸留水あるいは10 mM ラミナリペンタオース（プライマー）を加え，30℃，24時間保持した。
7. 反応温度が与える影響に関する解析
250μL 0.2 M クエン酸緩衝液 （pH 5.5），100μL 0.5 M G1P, 150μL 粗精製酵素（4.82 U/mg, 1.35 U/mL），2.5μL 1 M ジチオスレイトールを混合し，20℃〜55℃の範囲内の適当な温度で24時間保持した。この際，ラミナリオリゴ糖等のプライマーは添加しなかった。反応終了後，遠心分離（5000×g, 5分間）を行い，沈殿を回収した。これを1 mLの蒸留水で懸濁したのち，遠心分離（5000×g, 5分間）を行い，上清を除去した。この洗浄操作をさらに2回繰り返した。沈殿として得られたβ1,3-グルカンの重量をフェノール硫酸法で決定し，生成物の収率を計算した。
また，生成したβ-1,3-グルカンをサイズ排除クロマトグラフィーに供し，溶出ピークの位置から分子量を推定した。なお，サイズ排除クロマトグラフィーの条件は，＜5.沈殿物の解析＞に記載のものと同様とした。
【００２４】
8. pHが与える影響に関する解析
250μL の0.2 M クエン酸緩衝液（3.9〜7.3の範囲内の適当なpHに調整したもの），100μL 0.5 M G1P, 150μL 粗精製酵素（4.82 U/mg, 1.35 U/mL），2.5μL 1 M ジチオスレイトールを混合し，30℃で24時間保持した。この際，ラミナリオリゴ糖等のプライマーは添加しなかった。反応終了後，遠心分離（5000×g, 5分間）を行い，沈殿を回収した。これを1 mLの蒸留水で懸濁したのち，遠心分離（5000×g, 5分間）を行い，上清を除去した。この洗浄操作をさらに2回繰り返した。沈殿として得られたβ1,3-グルカンの重量をフェノール硫酸法で決定し，生成物の収率を計算した。
また，生成したβ-1,3-グルカンをサイズ排除クロマトグラフィーに供し，溶出ピークの位置から分子量を推定した。なお，サイズ排除クロマトグラフィーの条件は，＜5.沈殿物の解析＞に記載されたものと同様とした。
【００２５】
9. G1P濃度が与える影響に関する解析
50μL 1 M クエン酸緩衝液 （pH 5.5），250μL のG1P（20 mM〜800 mMの範囲内の適当な濃度）, 150μL 粗精製酵素（4.82 U/mg, 1.35 U/mL），2.5μL 1 M ジチオスレイトールを混合し，30℃，24時間保持した。この際，ラミナリオリゴ糖等のプライマーは添加しなかった。反応終了後，遠心分離（5000×g, 5分間）を行い，沈殿を回収した。これを1 mLの蒸留水で懸濁したのち，遠心分離（5000×g, 5分間）を行い，上清を除去した。この洗浄操作をさらに2回繰り返した。沈殿として得られたβ1,3-グルカンの重量をフェノール硫酸法で決定し，生成物の収率を計算した。
また，生成したβ-1,3-グルカンをサイズ排除クロマトグラフィーに供し，溶出ピークの位置から分子量を推定した。なお，サイズ排除クロマトグラフィーの条件は，＜5.沈殿物の解析＞に記載のものと同様とした。
【００２６】
10. 酵素量が与える影響に関する解析
100μL 1 M 酢酸緩衝液 （pH 5.5），100μL 0.5 M G1P, 粗精製酵素（2.56 U/mg, 1.28 U/mLを0.02 U 〜1.0 U の範囲内の適当量）を混合した。さらに，10μLの蒸留水あるいは50 mg/mL ラミナリオリゴ糖（プライマー）を加え，蒸留水で総量が500μLとなるように調整した。ラミナリオリゴ糖はラミナリン（ナカライテスク）を Zymolyase 20T（生化学バイオビジネス）を用いて加水分解することにより調製した。上記の反応液を30℃で48時間保持した。反応終了後，遠心分離（5000×g, 5分間）を行い，沈殿を回収した。これを1 mLの蒸留水で懸濁したのち，遠心分離（5000×g, 5分間）を行い，上清を除去した。この洗浄操作をさらに2回繰り返した。沈殿として得られたβ1,3-グルカンの重量をフェノール硫酸法で決定し，生成物の収率を計算した。
【００２７】
11. プライマー量が与える影響に関する解析
100μL 1 M 酢酸緩衝液 （pH 5.5），100μL 0.5 M G1Pおよび0.02 Uの粗精製酵素（2.56 U/mg, 1.28 U/mL）を混合した。さらに，0〜2 mg/mL の範囲内の適当量のラミナリオリゴ糖（プライマー）を加え，蒸留水で総量が500μLとなるように調整した。上記の反応液を30℃で48時間保持した。反応終了後，遠心分離（5000×g, 5分間）を行い，沈殿を回収した。これを1 mLの蒸留水で懸濁したのち，遠心分離（5000×g, 5分間）を行い，上清を除去した。この洗浄操作をさらに2回繰り返した。沈殿として得られたβ1,3-グルカンの重量をフェノール硫酸法で決定し，生成物の収率を計算した。
12. プライマー添加時にG1P濃度が与える影響に関する解析
1 mg/mL ラミナリオリゴ糖（プライマー）と0.05 M〜0.6 Mの範囲内の適当量のG1Pおよび1 U/g-ds の粗精製酵素（2.56 U/mg, 1.28 U/mL）を混合し，0.25 M酢酸緩衝液 （pH 5.5）で総量が500μLとなるように調整した。この反応液を30℃で48時間保持した。反応終了後，遠心分離（5000×g, 5分間）を行い，沈殿を回収した。これを1 mLの蒸留水で懸濁したのち，遠心分離（5000×g, 5分間）を行い，上清を除去した。この洗浄操作をさらに2回繰り返した。沈殿として得られたβ1,3-グルカンの重量をフェノール硫酸法で決定し，生成物の収率を計算した。
【００２８】
＜実験結果＞
1. 沈殿物の生成
クエン酸緩衝液 (pH 5.5) 中で粗精製酵素とG1Pを反応させたところ，図１に示すように，沈殿が形成された。酵素あるいはG1Pのいずれかを除いて同様の反応を行ったところ，沈殿は形成されなかった。また，あらかじめ100℃で5分間加熱し，失活させた酵素を用いて同様の反応を行っても沈殿は形成されなかった。したがって，この沈殿形成の現象はG1Pに依存した酵素反応であることが推察された。
【００２９】
2. 沈殿の性質
沈殿は冷水，エタノール，アセトン，1 M 塩酸には溶解しなかった。また，目視観察によれば，1 M 水酸化ナトリウムや80% DMSOには溶解した。熱水 (100℃）には溶解したが，冷却すると，再び沈殿が生じた。これらのことから，沈殿は水不溶の多糖によく見られる性質があることが明らかとなった。
0.5 mLの系で反応を行った際，沈殿の重量は 6.1±0.2 mgであった。また，フェノール硫酸法で測定した沈殿の全糖量は 6.0±0.2 mg（グルコース換算）であった。このことから，沈殿の大部分は糖質で構成されていることが明らかとなった。また，反応系に加えた糖質は9.0 mg（グルコース換算）であるため，沈殿の収率は60%以上であると計算された。
【００３０】
3. 沈殿の分子量分布
沈殿を80% DMSOに溶解させ，サイズ排除クロマトグラフィーで分析したところ，溶出位置はプルラン P-10（推定分子量12,200）とP-5（推定分子量5,800）の間であった（表１）。分子量と溶出時間の近似式から，沈殿を構成する試料は分子量約11,400付近（グルコース重合度約70）をピークとする分子量分布であると推定された。したがって，沈殿の主成分は多糖であると考えられた。
【００３１】
【表１】
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【００３２】
4. 糖組成と結合様式
沈殿物の糖組成分析を行ったところ，多糖を構成する単糖はグルコースのみであった。したがって，沈殿物はグルコースのポリマーであることが明らかとなった。
沈殿物（酵素合成多糖）の単糖間の結合様式を決定するため，メチル化分析を行った。沈殿物から得られた部分メチル化アルジトールアセテートをGC-MSに供したところ，保持時間22.0分の位置にピークが観察された（図2）。また，β-1,3結合を有し，構成糖をグルコースとするラミナリビオースから得られた部分メチル化アルジトールアセテートをGC-MSに供したところ，同じ保持時間にピークが観察された。これらのマススペクトルはGC-MSライブラリの1,3,5-トリ- O -アセチル-2,4,6-トリ- O -メチルヘキシトールと一致した（図3）。したがって，沈殿物には1,3グルコシド結合が存在していることが明らかとなった。沈殿物から得られた試料では，上記の22.0分のピーク以外には，大きなピークは観察されなかった。ラミナリビオースで検出された非還元末端由来の1,5-ジ- O -アセチル-2,3,4,6-テトラ- O -メチルヘキシトール（保持時間 18.8分）についても沈殿物由来試料ではほとんど検出されなかった。したがって，沈殿物は直鎖，かつ高重合度の1,3-グルカンであると考えられた。
また，沈殿物とβ-1,3グルコシド結合を有する多糖であるカードランの13C-NMRスペクトルは同一であった（図4）。したがって，沈殿物は直鎖のβ-1,3グルカンであることが明らかとなった。
【００３３】
5. 高純度酵素を用いたβ-1,3グルカンの合成
図5には，高純度酵素を用いたβ-1.3グルカンの合成試験の結果を示した。上述のように，粗精製酵素を用いた場合はプライマーを添加することなく，β-1,3グルカンを合成することが可能である。しかし，図5に示すように，高純度酵素を用いた場合は，プライマー非添加ではβ-1,3グルカンが合成されなかった。一方，プライマー（この場合，ラミナリペンタオース）を添加した反応液では，β-1,3グルカンの合成が観察された。このように，高度に精製したβ1,3-グルカンホスホリラーゼを用いる場合は，反応時にプライマーを添加することが必要であると考えられた。
6. 反応温度が与える影響
表２に示すように，反応温度20℃から50℃の間でβ1,3グルカンの合成が確認された。沈殿収率は温度によって異なったが，45℃以下では，30%から60%の間であった。反応温度によって，分子量の分布が異なり，40℃以上の高温では比較的低分子である分子量6,000から6,500の間（グルコース重合度は35から40程度）にピークが観察された。
【００３４】
【表２】
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【００３５】
7. pHが与える影響
表３に示すように，反応終了時のpHが4.4から7.8の間でβ1,3グルカンの合成が確認された。沈殿収率はpHによって異なったが，pH5〜7で高収率であった。反応pHによって，分子量の分布が異なり，低pHでは比較的低分子の位置にピークが観察された。
【００３６】
【表３】
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【００３７】
8. G1P濃度が与える影響
表４に示すように，終濃度10 mM以上のG1Pを基質とした時，β1,3グルカンの合成が確認された。沈殿収率はG1P濃度によって異なったが，分子量の分布はほぼ同一であった。
【００３８】
【表４】
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【００３９】
9. 酵素量が与える影響
酵素量が与える影響に関する解析結果を図６に示した。ラミナリオリゴ糖（プライマー）非添加の場合，酵素量 0.1 U/mL （終濃度）以上で沈殿の形成が観察された。このように，粗精製酵素を用いた場合，プライマーを添加することなくβ-1,3グルカンを合成することが可能であった。酵素量 0.04 U/mL以下では沈殿の形成が見られなかった。一方，少量のラミナリオリゴ糖（プライマー）を添加した場合，酵素量 0.04 U/mLでも高収率で沈殿が生成されることが観察された。また，さらに低い濃度の酵素を用いた場合でも沈殿の形成が認められた。このように，ラミナリオリゴ糖（プライマー）を添加した場合，少ない酵素量でもβ-1,3グルカンを合成できることが明らかとなった。
【００４０】
10. プライマー量が与える影響
プライマー量が与える影響に関する解析結果を図７に示した。反応系には少量の酵素しか加えていないため，＜９. 酵素量が与える影響＞の結果に示すように，プライマー非添加では沈殿物は生じなかった。一方，0.1 mg/mL（終濃度）のプライマーを添加することにより，高収率で沈殿が生成されることが確認された。このように，少量の酵素を用いた場合，少量のプライマーの添加でβ-1,3グルカンの収率が飛躍的に増加することが明らかとなった。
11. プライマー添加時にG1P濃度が与える影響
プライマー添加時にG1P濃度が与える影響に関する解析結果を図８に示した。少量のラミナリオリゴ糖（プライマー）の存在下，G1Pの濃度を変化させてβ-1,3グルカンの合成を行った。0.05 M〜0.6 M G1P の範囲内で，β-1,3グルカンの合成が観察された。とくに，0.1 M〜0.5 M G1P の範囲内でβ-1,3グルカンの合成収率が高いことが明らかとなった。
このように，本実施形態によれば，重合度が数十個（30から70程度）のβ-1,3グルカンを簡易に製造できることが分かった。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１】
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【図５】
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