(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎｅｆまたはその免疫原性断片、ｐ１７ Ｇａｇおよびｐ２４ Ｇａｇまたはその免疫原性断片を含んでなるポリペプチドであって、ｐ１７ Ｇａｇおよびｐ２４ Ｇａｇの間に少なくとも１つのＨＩＶ抗原または免疫原性断片が存在し、ポリペプチドが更にＲＴまたはその免疫原性断片を含んでなり、かつ以下のもの：
１．    ｐ２４ Ｇａｇ−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７ Ｇａｇ
２．    ｐ２４ Ｇａｇ−ＲＴ＊−Ｎｅｆ−ｐ１７ Ｇａｇ
３．    ｐ２４ Ｇａｇ−ｐ５１ ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７ Ｇａｇ
４．    ｐ２４ Ｇａｇ−ｐ５１ ＲＴ＊−Ｎｅｆ−ｐ１７ Ｇａｇ
＊はＲＴのメチオニン５９２のリジンへの突然変異を表す、
のうち１つより選択され、上記免疫原性断片が天然の抗原に対する免疫応答を生じさせる能力を有するものである、上記ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドと、製薬上許容される担体もしくはアジュバントとを含んでなる、医薬組成物。
【請求項３】
前記アジュバントが、ＱＳ２１もしくは３Ｄ−ＭＰＬまたはＱＳ２１および３Ｄ−ＭＰＬの配合物等のＴｈ１誘導性アジュバントである、請求項２に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ＨＩＶポリペプチド構築物、医薬におけるその使用、それらを含む医薬組成物およびその製造方法に関する。本発明はまた、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにも関する。具体的には、本発明は、ＨＩＶ−１ ＮｅｆおよびＨＩＶ−１ Ｇａｇまたはその断片を含む融合タンパク質、ならびにそれらをコードするポリヌクレオチドに関する。より具体的には、本発明は、ＨＩＶ−１ Ｎｅｆ、ＨＩＶ−１ ＰｏｌおよびＨＩＶ−１ Ｇａｇタンパク質またはその断片を含む融合タンパク質ならびにそれらをコードするポリヌクレオチドに関する。
【０００２】
ＨＩＶ−１は世界の主要な健康問題の一つであるとみなされている後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の主な原因である。ＨＩＶ感染の予防および／または治療のためのワクチンに対する必要性が存在する。
【背景技術】
【０００３】
ＨＩＶ−１はレトロウイルスファミリーのＲＮＡウイルスである。ＨＩＶゲノムは少なくとも９個のタンパク質をコードし、これらは３つのクラス：主要な構造タンパク質Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＥｎｖ、調節タンパク質ＴａｔおよびＲｅｖ、ならびに補助タンパク質Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、ＶｉｆおよびＮｅｆに分類される。ＨＩＶゲノムは全てのレトロウイルスの５’ＬＴＲ−ｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ−ＬＴＲ３’編成を示す。
【０００４】
ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０は、宿主細胞への付着に用いられるウイルスタンパク質である。この付着は、ＣＤ４および２つのケモカイン受容体ＣＣＲ−５またはＣＸＣＲ−４の１つとして知られる、ヘルパーＴ細胞およびマクロファージの２種類の表面分子への結合により媒介される。ｇｐ１２０タンパク質はまず、より大きい前駆体分子（ｇｐ１６０）として発現され、次いで、翻訳後に切断されてｇｐ１２０およびｇｐ４１になる。ｇｐ１２０タンパク質はｇｐ４１分子への連結によりビリオンの表面上に保持され、ウイルス膜中に挿入される。
【０００５】
ｇｐ１２０タンパク質は中和抗体の主な標的であるが、不幸なことに、このタンパク質の最も免疫原性の高い領域（Ｖ３ループ）は、このタンパク質の最も可変性の高い部分でもある。従って、中和抗体を引き出すためのワクチン抗原としてのｇｐ１２０（またはその前駆体ｇｐ１６０）の使用は、幅広く保護的なワクチンのための使用が制限されると考えられる。ｇｐ１２０タンパク質はまた、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）により認識されるエピトープをも含む。これらのエフェクター細胞はウイルス感染した細胞を排除することができ、従って、第２の主要な抗ウイルス免疫機構を構成する。中和抗体の標的領域とは対照的に、いくつかのＣＴＬエピトープは異なるＨＩＶ株間で比較的保存されているようである。このことから、ｇｐ１２０およびｇｐ１６０は、細胞媒介性免疫応答（特に、ＣＴＬ）を引き出すのを助けるワクチンでは有用な抗原性成分である。
【０００６】
ＨＩＶ−１の非エンベロープタンパク質としては、例えば、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子の産物などの内部構造タンパク質ならびにＲｅｖ、Ｎｅｆ、ＶｉｆおよびＴａｔなどの他の非構造タンパク質が挙げられる（Greenら、New England J. Med, 324, 5, 308以下参照(1991)およびBryantら(Pizzo編), Pediatr. Infect. Dis. J., 11, 5, 390以下参照(1992)）。
【０００７】
ＨＩＶ Ｎｅｆは初期タンパク質であり、感染の初期に、かつ構造タンパク質の非存在下で発現される。
【０００８】
Ｎｅｆ遺伝子は、初期補助ＨＩＶタンパク質をコードし、いくつかの活性を有することが示された。例えば、Ｎｅｆタンパク質は細胞表面からのＣＤ４（ＨＩＶ受容体）、およびＭＨＣクラスＩ分子のダウンレギュレーションを引き起こすことが知られているが、これらの機能の生物学的重要性が議論されている。さらに、ＮｅｆはＴ細胞のシグナル経路と相互作用し、活性状態を誘導し、次いで、より効率的な遺伝子発現を促進することができる。いくつかのＨＩＶ単離体がこの領域に突然変異を有し、これらは機能的タンパク質をコードしないようにし、ｉｎ ｖｉｖｏでのその複製および病因に重篤な障害が生じる。
【０００９】
Ｇａｇ遺伝子は、前駆体ポリタンパク質として翻訳され、プロテアーゼにより切断されて、マトリックスタンパク質（ｐ１７）、キャプシド（ｐ２４）、ヌクレオキャプシド（ｐ９）、ｐ６ならびに２つの間隔ペプチド、ｐ２およびｐ１を含む産物を生じる。
【００１０】
Ｇａｇ遺伝子はｐ５５とも呼ばれる５５キロダルトン（ｋＤ）のＧａｇ前駆体タンパク質を生じ、スプライスされていないウイルスｍＲＮＡから発現される。翻訳中に、ｐ５５のＮ末端はミリストイル化され、細胞膜の細胞質面とのその結合が生じる。膜に結合したＧａｇポリタンパク質は、感染細胞の表面からのウイルス粒子の発芽を誘発する他のウイルスタンパク質および細胞タンパク質と共に、２コピーのウイルスゲノムＲＮＡを集合させる。発芽後、ｐ５５は、ウイルス成熟のプロセス中に、ウイルスにコードされるプロテアーゼ（ｐｏｌ遺伝子の産物）により、ＭＡ（マトリックス[ｐ１７]、ＣＡ（キャプシド[ｐ２４]）、ＮＣ（ヌクレオキャプシド[ｐ９]）、およびｐ６と呼ばれる４つのより小さいタンパク質に切断される。
【００１１】
３つの主要なＧａｇタンパク質に加えて、全てのＧａｇ前駆体はいくつかの他の領域を含み、これらは切り出され、様々な大きさのペプチドとしてビリオン中に保持される。これらのタンパク質は異なる役割を有し、例えば、ｐ２タンパク質は前記プロテアーゼの活性を調節する提案された役割を有し、タンパク質分解プロセスの正確なタイミングに寄与する。
【００１２】
ｐ１７（ＭＡ）ポリペプチドはｐ５５のＮ末端、すなわちミリストイル化された末端から誘導される。多くのＭＡ分子はビリオンの脂質二重層の内部表面に付着されたままであり、粒子を安定化させる。ＭＡのサブセットはビリオンの深い方の層の内部に集合させられ、ここでそれはウイルスＤＮＡを核に送り届ける複合体の一部となる。ＭＡ上の核親和性シグナルは細胞の核の取り込み機構により認識されるため、これらのＭＡ分子はウイルスゲノムの核輸送を容易にする。この現象により、ＨＩＶは非分裂細胞に感染することができ、これはレトロウイルスに関して普通でない特性である。
【００１３】
ｐ２４（ＣＡ）タンパク質はウイルス粒子の円錐状コアを形成する。シクロフィリンＡは、ｐ５５のｐ２４領域と相互作用して、ＨＩＶ粒子へのその取り込みを誘導することが証明されている。ＧａｇとシクロフィリンＡとの相互作用は、シクロフィリンＡによるこの相互作用の破壊がウイルスの複製を阻害するため、必須である。
【００１４】
ＧａｇのＮＣ領域は、いわゆるＨＩＶのパッケージングシグナルの特異的な認識を担う。このパッケージングシグナルはウイルスＲＮＡの５’末端の近くに位置する４つのステムループ構造からなり、これはＨＩＶ−１ビリオンへの異種ＲＮＡの取り込みを媒介するのに十分である。ＮＣは２つのジンクフィンガーモチーフにより媒介される相互作用を介してパッケージングシグナルに結合する。ＮＣはまた、逆転写を促進する。
【００１５】
ｐ６ポリペプチド領域は、ｐ５５ Ｇａｇと補助タンパク質Ｖｐｒとの相互作用を媒介し、集合するビリオンへのＶｐｒの取り込みを誘導する。ｐ６領域はまた、感染細胞からの発芽ビリオンの効率的な放出にとって必要であるいわゆる後期ドメインをも含む。
【００１６】
Ｐｏｌ遺伝子は、感染初期においてウイルスにより必要とされる２つの活性を含む２つのタンパク質、ＲＴおよびウイルスＤＮＡの細胞ＤＮＡへの組込みにとって必要とされるインテグラーゼタンパク質をコードする。Ｐｏｌの主要産物はビリオンプロテアーゼにより切断されて、ＤＮＡ合成にとって必要な活性を含むアミノ末端ＲＴペプチド（ＲＮＡおよびＤＮＡ依存的ＤＮＡポリメラーゼ活性ならびにＲＮａｓｅ Ｈ機能）ならびにカルボキシ末端インテグラーゼタンパク質を生じる。ＨＩＶ ＲＴは、完全長ＲＴ（ｐ６６）とカルボキシ末端ＲＮａｓｅ Ｈドメインを欠く切断産物（ｐ５１）とのヘテロ二量体である。
【００１７】
ＲＴはレトロウイルスゲノムによりコードされる最も高度に保存されたタンパク質の１つである。ＲＴの２つの主要な活性はＤＮＡ ＰｏｌおよびリボヌクレアーゼＨである。ＲＴのＤＮＡ Ｐｏｌ活性は、鋳型として互換的にＲＮＡとＤＮＡを使用し、全ての公知のＤＮＡポリメラーゼと同様、ｄｅ ｎｏｖｏでＤＮＡ合成を開始することができず、プライマー（ＲＮＡ）として働く予め存在する分子を必要とする。
【００１８】
全てのＲＴタンパク質において固有のＲＮａｓｅ Ｈ活性は、ＤＮＡ合成が進行するにつれてＲＮＡゲノムを除去する複製の初期に必須の役割を果たす。それは全てのＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド分子からＲＮＡを選択的に分解する。構造的には、ポリメラーゼおよびリボＨは、別々の、重複しないドメインを占有し、ＰｏｌはＰｏｌのアミノ酸の３分の２をカバーする。
【００１９】
ｐ６６触媒サブユニットは５つの異なるサブドメインに折り畳まれる。これらのアミノ末端２３はＲＴ活性を含む部分を有する。これらのカルボキシ末端はＲＮａｓｅ Ｈドメインである。
【００２０】
ＷＯ ０３／０２５００３は、ＨＩＶ−１ ｐ１７／２４ Ｇａｇ、ＮｅｆおよびＲＴをコードするＤＮＡ構築物を記載しており、ここで、このＤＮＡ配列をコドン最適化して、高度に発現されるヒト遺伝子に類似させることができる。これらの構築物はＤＮＡワクチンにおいて有用である。
【００２１】
複数のＨＩＶ抗原を含む融合タンパク質がＨＩＶのためのワクチン候補として提唱されており、例えば、ＷＯ ９９／１６８８４に記載のようなＮｅｆ−Ｔａｔ融合体が挙げられる。しかしながら、融合タンパク質は製造するのが容易ではない；それらは天然のタンパク質と一致しないため、それらを発現させることが難しい場合がある。転写レベルで、またはさらに下流に困難が存在する場合もある。また、それらは製薬上許容し得る組成物に製剤化するのが容易ではない。注目すべきことに、複数の抗原を一緒に融合することを含むＨＩＶワクチンに対する多くの手法は、ポリペプチド融合タンパク質よりもむしろＤＮＡまたは生ベクター手法である。
【特許文献１】ＷＯ ０３／０２５００３
【特許文献２】ＷＯ ９９／１６８８４
【非特許文献１】Greenら、New England J. Med, 324, 5, 308 (1991)
【非特許文献２】Bryantら(Pizzo編), Pediatr. Infect. Dis. J., 11, 5, 390 (1992)
【発明の概要】
【００２２】
本発明は、ＨＩＶ感染およびＡＩＤＳの予防および治療のためのワクチンにおける使用のための新規構築物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７の発現誘導について示す。
【図１Ｂ】ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７の可溶性アッセイを示す。
【図２】ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７組換えタンパク質についてのクマシーブルー染色およびウェスタンブロットによる検出を表す。
【図３】ＲＴタンパク質のアライメントを示す。
【図４】ＲＴ（コドン最適化）の発現について示す。
【図５】ＲＴの可溶性アッセイを示す。
【図６】リンカーを含むか含まないＮｅｆ−ｐ１７およびｐ１７−Ｎｅｆの発現について示す。
【図７】Ｎｅｆ−ｐ１７およびｐ１７−Ｎｅｆの可溶性アッセイを示す。
【図８】Ｆ４＊の発現について示す。
【図９】Ｆ３の発現について示す。
【図１０】Ｆ３＊の発現について示す。
【図１１】Ｆ４（ｐ５１）の発現について示す。
【図１２】Ｂ８３４(ＤＥ３)細胞におけるＦ４(ｐ５１)＊の発現について示す。
【図１３】Ｆ４の精製について示す。
【図１４】Ｆ４（ｐ５１）＊の精製について示す。
【図１５】Ｆ４＊の精製について示す。
【図１６】Ｆ４、Ｆ４＊、Ｆ４（５１）＊の精製度について示す。
【図１７】Ｆ４ｃｏおよびカルボキシアミド化Ｆ４ｃｏの精製についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥでの追跡を示す。
【図１８】方法Ｉおよび方法ＩＩに従い精製されたＦ４、Ｆ４ｃｏおよびＦ４ｃｏｃａについてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図１９】マウスにおけるＦ４の免疫原性を示すグラフである。
【図２０】各マウス系統についてのＣＤ４＋ＩＬ−２＋およびＣＤ４＋ＩＦＮγ＋応答を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
一態様においては、本発明はＮｅｆまたはその免疫原性断片もしくは誘導体、ならびにｐ１７ Ｇａｇおよび／もしくはｐ２４ Ｇａｇまたはその免疫原性断片もしくは誘導体を含むポリペプチドであって、ｐ１７ Ｇａｇとｐ２４ Ｇａｇの両方が存在する場合、それらの間には少なくとも１つのＨＩＶ抗原またはその免疫原性断片が存在する、前記ポリペプチドを提供する。
【００２５】
本明細書に記載の本発明による構築物および組成物においては、Ｎｅｆは完全長Ｎｅｆであるのが好ましい。
【００２６】
本発明による構築物においては、ｐ１７ Ｇａｇおよびｐ２４ Ｇａｇは、それぞれ完全長のｐ１７およびｐ２４であるのが好ましい。
【００２７】
一実施形態においては、前記ポリペプチドはｐ１７およびｐ２４の両方のＧａｇまたはその免疫原性断片を含む。そのような構築物においては、ｐ２４ Ｇａｇ成分とｐ１７ Ｇａｇ成分は、少なくとも１つのさらなるＨＩＶ抗原またはその免疫原性断片、例えば、Ｎｅｆおよび／もしくはＲＴまたはその免疫原性断片もしくは誘導体により分離されている。
【００２８】
あるいは、ｐ１７またはｐ２４のＧａｇを別々に提供する。かくして、本発明はまた、(ｉ)Ｎｅｆまたはその免疫原性断片もしくは誘導体およびｐ１７ Ｇａｇまたはその免疫原性断片もしくは誘導体を含むポリペプチド、ならびに(ｉｉ)ｐ２４ Ｇａｇまたはその免疫原性断片もしくは誘導体；または(ｉ)Ｎｅｆまたはその免疫原性断片もしくは誘導体およびｐ２４ Ｇａｇまたはその免疫原性断片もしくは誘導体を含むポリペプチド、ならびに(ｉｉ)ｐ１７ Ｇａｇまたはその免疫原性断片もしくは誘導体を含む組成物も提供する。
【００２９】
別の実施形態においては、本発明によるポリペプチド構築物は、ＰｏｌまたはＰｏｌの誘導体、例えば、ＲＴまたはその免疫原性断片もしくは誘導体をさらに含む。本発明における使用にとって好適であるＲＴの特定の断片は、好ましくは、これらがカルボキシ末端ＲＮａｓｅ Ｈドメインを欠くように、ＲＴをＣ末端で切断した断片である。カルボキシ末端ＲＮａｓｅ Ｈドメインを欠く１つのそのような断片は、本明細書に記載のｐ５１断片である。
【００３０】
好ましくは、本明細書に記載の融合タンパク質中のＲＴまたはその免疫原性断片はｐ６６ ＲＴまたはｐ５１ ＲＴである。
【００３１】
本発明による融合タンパク質または組成物のＲＴ成分は、必要に応じて、メチオニンを、リジン等の別の残基への突然変異により除去するような、位置５９２での突然変異、またはＨＸＢ２以外の株における等価な突然変異を含む。この突然変異の目的は、原核発現系における内部開始部位として働く部位を除去することである。
【００３２】
ＲＴ成分はまた、またはあるいは、酵素活性(逆転写酵素)を除去するための突然変異を含む。かくして、Ｋ２３１がＷの代わりに存在してもよい。
【００３３】
ｐ２４およびＲＴを含む本発明による融合タンパク質においては、抗原を大腸菌において単独で発現させる場合、ＲＴよりもｐ２４の方がより良好な発現が観察されるため、ｐ２４は前記構築物中でＲＴの前に配置されるのが好ましい。
【００３４】
本発明による好ましい構築物としては、以下のもの：
１．    ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７
２．    ｐ２４−ＲＴ＊−Ｎｅｆ−ｐ１７
３．    ｐ２４−ｐ５１ ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７
４．    ｐ２４−ｐ５１ ＲＴ＊−Ｎｅｆ−ｐ１７
５．    ｐ１７−ｐ５１ ＲＴ−Ｎｅｆ
６．    ｐ１７−ｐ５１ ＲＴ＊−Ｎｅｆ
７．    Ｎｅｆ−ｐ１７
８．    Ｎｅｆ−ｐ１７（リンカーあり）
９．    ｐ１７−Ｎｅｆ
１０．  ｐ１７−Ｎｅｆ（リンカーあり）
（＊はＲＴのメチオニン５９２のリジンへの突然変異を表す。）
が挙げられる。
【００３５】
上記構築物に含まれるリンカーは、それが連結する２つの融合パートナー間での相互作用の可能性を減少させるための任意の短いアミノ酸配列であってよい。このリンカーは、例えば、４〜１０アミノ酸の長さであってよい。例えば、それは実施例中、本明細書に記載のＧＳＧＧＧＰ配列などの６アミノ酸の配列であってよい。
【００３６】
本発明の別の態様においては、Ｎｅｆ、ＰｏｌおよびＧａｇから誘導される、少なくとも４つのＨＩＶ抗原またはその免疫原性断片を含むＨＩＶ抗原の融合タンパク質を提供する。Ｇａｇは、前記融合体において少なくとも１つの他の抗原により隔てられている２つの別個の成分として存在するのが好ましい。Ｎｅｆは完全長Ｎｅｆであるのが好ましい。Ｐｏｌは、ｐ６６またはｐ５１ＲＴであるのが好ましい。Ｇａｇは、ｐ１７およびｐ２４  Ｇａｇであるのが好ましい。本発明のこの態様における前記融合体の抗原成分の他の好ましい特徴および特性は、本明細書に記載の通りである。
【００３７】
本発明のこの態様の好ましい実施形態は、上記に既に列挙された４つの成分の融合体である：
１．    ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７
２．    ｐ２４−ＲＴ＊−Ｎｅｆ−ｐ１７
３．    ｐ２４−ｐ５１ ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７
４．    ｐ２４−ｐ５１ ＲＴ＊−Ｎｅｆ−ｐ１７。
【００３８】
本発明に含まれるＨＩＶ抗原に関する用語「から誘導される」または「誘導体」とは、該抗原がその天然の対応物と比較して限定された方法で変更されていることを意味する。これは、例えば、原核系における発現を改良するか、または望ましくない酵素活性などの望ましくない活性を除去することにより、該タンパク質の特性を変化させ得る点突然変異を含む。ＲＴに関する本明細書に記載の点突然変異を、これらの事象を達成するために設計する。しかしながら、前記抗原は、それらがワクチンにおいて望ましい抗原特性を保持し、かくして、それらが天然の抗原に対する免疫応答を生じる能力を保持するように、該天然の抗原と十分に類似したままでなければならない。特定の誘導体がそのような免疫応答を生じるかどうかを、ＥＬＩＳＡ(抗体応答について)または細胞マーカーおよびサイトカインのための好適な染色を用いるフローサイトメトリー(細胞応答について)などの好適な免疫学的アッセイにより測定することができる。
【００３９】
本発明によるＨＩＶ抗原のポリペプチド構築物を、大腸菌などの原核系などのｉｎ ｖｉｔｒｏ系で発現させることができる。有利には、これらを従来の精製方法により精製することができる。
【００４０】
本明細書に記載の融合体は、選択された発現系において発現される場合、可溶性である、すなわち、それらが該発現系からの粗抽出物の上清中に実質的な量で存在するのが好ましい。該粗抽出物中の融合タンパク質の存在を、ＳＤＳゲル上での泳動、クマシー染色および密度測定による好適なバンドのチェックなどの従来の手段により測定することができる。本発明による融合タンパク質は、実施例中、本明細書に記載の技術により測定した場合、好ましくは少なくとも５０％可溶性、より好ましくは少なくとも７０％可溶性、より好ましくは９０％以上可溶性である。組換え発現されたタンパク質の可溶性を改善するための技術は公知であり、例えば、原核発現系においては、遺伝子発現を誘導する温度を低下させることにより、可溶性が改善する。
【００４１】
本明細書に記載の融合タンパク質を精製することができる。具体的には、それらを、可溶性であるか、または顕著に可溶性であるまま精製することができる。
【００４２】
本明細書に記載の免疫原性断片は、前記抗原の少なくとも１つのエピトープを含み、ＨＩＶ抗原性を示し、また、例えば、他のＨＩＶ抗原に融合されるか、または担体上に存在する場合など、好適な構築物中に存在する場合、前記天然の抗原に対する免疫応答を生じる能力を有するであろう。典型的には、前記免疫原性断片は、ＨＩＶ抗原に由来する、少なくとも２０個、好ましくは５０個、より好ましくは１００個の連続したアミノ酸を含む。
【００４３】
本発明は、さらなる態様において、本発明によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００４４】
本発明によるポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチドワクチンとして用いることができる。このポリヌクレオチドを、プラスミドＤＮＡ、細菌およびウイルス発現系などの核酸発現系などの、当業者には公知の様々な送達系のいずれかの中に存在させることができる。Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15: 143-198, 1998およびそこに引用された参考文献により記載されたものなどの、いくつかの遺伝子送達技術が当分野でよく知られている。好適な核酸発現系は、患者における発現のための必須ＤＮＡ配列(好適なプロモーターおよび終結シグナルなど)を含む。この発現系が、ウイルスまたは細菌などの組換え生微生物である場合、目的の遺伝子を、生の（live）組換えウイルスまたは細菌のゲノム中に挿入することができる。この生ベクターを用いる接種およびｉｎ ｖｉｖｏでの感染は、前記抗原のｉｎ ｖｉｖｏでの発現および免疫応答の誘導をもたらすであろう。この目的のために用いられるウイルスおよび細菌は、例えば、ポックスウイルス(例えば、ワクシニアウイルス、鶏痘ウイルス、カナリア痘ウイルス、改変ポックスウイルス、例えば、改変ウイルスアンカラ(ＭＶＡ))、アルファウイルス(シンドビスウイルス、セムリキフォレストウイルス、ベネズエラ馬脳炎ウイルス)、フラビウイルス(黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス)、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ピコルナウイルス(ポリオウイルス、ライノウイルス)、ヘルペスウイルス(水痘帯状疱疹ウイルスなど)、麻疹ウイルス(例えば、麻疹)、リステリア菌、サルモネラ菌、シゲラ菌、ナイセリア菌、ＢＣＧである。これらのウイルスおよび細菌は毒性のものであってもよいし、または生ワクチンを取得するために様々な方法で弱毒化されたものであってもよい。そのような生ワクチンも本発明の一部を形成する。
【００４５】
本発明による生ベクターとしての使用のための好ましい麻疹ベクターは、Ｓｃｈｗａｒｔｚ株またはそれから誘導された株である。
【００４６】
生ベクターとしての使用のための好ましいアデノウイルスは、Ａｄ５もしくはＡｄ３５などの低い血清陽性率のヒトアデノウイルスか、またはサルアデノウイルスなどの非ヒト霊長類アデノウイルスなどの非ヒト起源のアデノウイルスである。そのような低い血清陽性率のヒトまたは類似のアデノウイルスは、集団中で６０％未満、典型的には５０％未満の血清陽性率を有するであろう。このベクターは複製欠損性であるのが好ましい。典型的には、これらのウイルスは、Ｅ１欠失を含み、Ｅ１遺伝子で形質転換された細胞株で増殖させることができる。好ましいサルアデノウイルスは、チンパンジーから単離されたウイルスである。特に、Ｃ６８(Ｐａｎ９としても知られる)(米国特許第６，０８３，７１６号を参照)ならびにＰａｎ５、６およびＰａｎ７(ＷＯ ０３／０４６１２４)が本発明における使用にとって好ましい。これらのベクターを操作して、本発明によるポリペプチドが発現されるように、本発明による異種性ポリヌクレオチドを挿入することができる。そのような組換えアデノウイルスベクターの使用、製剤および製造はＷＯ ０３／０４６１４２に詳細に記載されている。
【００４７】
かくして、本発明による好ましいワクチンのＮｅｆ、ｐ１７およびｐ２４ ＧａｇならびにＲＴを、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの形態で提供することができる。
【００４８】
本発明によるポリヌクレオチドを用いて、選択された発現系において、コードされたポリペプチドを発現させることができる。少なくとも１つのＨＩＶ抗原、例えば、ＲＴを、ポリヌクレオチド中のコドン最適化された配列によりコードさせることができる。すなわち、この配列を、大腸菌などの選択された組換え発現系における発現のために最適化することができる。
【００４９】
本発明の別の態様においては、好ましくは、好適な発現系、特に、大腸菌などの原核生物系における発現のためにコドン最適化された、ｐ５１ ＲＴポリペプチドもしくはその誘導体またはそれをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００５０】
ｐ５１ ＲＴポリペプチドもしくはポリヌクレオチドを、単独で、または本発明によるポリペプチドもしくはポリヌクレオチド構築物と組合わせて用いることができる。かくして、本発明のさらなる態様においては、(ｉ)ＮｅｆまたはＮｅｆエピトープを含む断片ならびにｐ１７ Ｇａｇおよび／もしくはｐ２４ Ｇａｇを含むポリペプチドであって、ｐ１７およびｐ２４の両方のＧａｇが存在する場合、それらの間に少なくとも１つのＨＩＶ抗原または免疫原性断片が存在するポリペプチド、ならびに(ｉｉ)ｐ５１ ＲＴポリペプチドを含む組成物を提供する。本発明はさらに、これらをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００５１】
この実施形態に従えば、(ｉ)を、例えば、
１．    Ｎｅｆ−ｐ１７
２．    Ｎｅｆ−ｐ１７（リンカーあり）
３．    ｐ１７−Ｎｅｆ
４．    ｐ１７−Ｎｅｆ（リンカーあり）
から選択することができる。
【００５２】
好ましくは、Ｎｅｆは完全長のＮｅｆである。好ましくは、ｐ１７は完全長のｐ１７である。
【００５３】
本発明によるポリペプチドおよびポリヌクレオチドを、他の抗原または他の抗原をコードするポリヌクレオチドと組合わせることができる。特に、これはＨＩＶのｅｎｖタンパク質またはその断片もしくは誘導体を含んでもよい。ｅｎｖの好ましい形態はｇｐ１２０、ｇｐ１４０およびｇｐ１６０である。このｅｎｖは、例えば、Ｒ２として知られるＨＩＶ−１のクレードＢエンベロープクローンに由来する、ＷＯ ００／０７６３１に記載のエンベロープタンパク質、またはその断片もしくは誘導体であってよい。かくして、本発明はさらに、ＨＩＶ ｅｎｖタンパク質またはその断片もしくは誘導体と共に、本発明によるポリペプチド群のいずれかを含む組成物またはポリペプチド組成物を提供する。同様に、本発明は、本発明によるポリペプチドもしくはポリペプチド群をコードするポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド群およびＨＩＶのｅｎｖタンパク質またはその断片もしくは誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。
【００５４】
本発明はさらに、本明細書に記載のポリペプチドを調製する方法であって、好適な発現系、特に、大腸菌などの原核生物系において前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させること、および発現されたポリペプチドを回収することを含む前記方法を提供する。発現を低温、すなわち、３７℃より低い温度で誘導して、前記ポリペプチドの可溶性を促進するのが好ましい。
【００５５】
本発明はさらに、本明細書に記載のポリペプチドの精製方法であって、
ｉ）    未精製ポリペプチドを含む組成物を用意すること；
ｉｉ）  該組成物を少なくとも２つのクロマトグラフィー工程に供すること；
ｉｉｉ）必要に応じて、該ポリペプチドをカルボキシアミド化すること；
ｉｖ）  製剤化に適したバッファー中に該タンパク質を提供するためにバッファー交換工程を行うこと、
を含む方法を提供する。
【００５６】
カルボキシアミド化を、２つのクロマトグラフィー工程の間に行ってもよい。カルボキシアミド化を、ヨードアセトイミドを用いて行ってもよい。
【００５７】
１つの例においては、本発明による方法は２つ以下のクロマトグラフィー工程を用いる。
【００５８】
本発明はさらに、本発明によるポリペプチドおよびポリヌクレオチドと、製薬上許容し得るアジュバントまたは担体とを含む医薬組成物および免疫原性組成物およびワクチンを提供する。
【００５９】
本発明によるワクチンを、ＨＩＶに対する予防的または治療的な免疫付与に用いることができる。
【００６０】
本発明はさらに、ＨＩＶに対する予防的または治療的な免疫付与のためのワクチンの製造における、本明細書に記載のポリペプチドおよびポリペプチド組成物ならびにポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド組成物の使用を提供する。
【００６１】
本発明のワクチンは、免疫保護的もしくは免疫治療的な量のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド抗原を含み、これを従来の技術により調製することができる。
【００６２】
ワクチンの調製は、New Trends and Developments in Vaccines, Vollerら(編), University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978に一般的に記載されている。リポソーム内へのカプセル封入は、例えば、Fullertonの米国特許第４，２３５，８７７号に記載されている。巨大分子へのタンパク質の結合は、例えば、Likhiteの米国特許第４，３７２，９４５号およびArmorらの米国特許第４，４７４，７５７号により開示されている。
【００６３】
ワクチン用量中のタンパク質の量を、典型的なワクチンにおいて、顕著な有害副作用を示すことなく免疫保護応答を誘導する量として選択する。そのような量は、どの特異的免疫原を用いるか、およびどのワクチン接種計画を選択するかに依存して変化するであろう。一般的には、各用量は１〜１０００μｇの各タンパク質、好ましくは２〜２００μｇ、最も好ましくは４〜４０μｇのポリペプチド融合体を含むと予想される。特定のワクチンにとって最適な量を、被験体における抗体力価および他の免疫応答の観察を含む標準的な試験により確認することができる。初回のワクチン接種の後、被験体は約４週間以内に追加免疫を受けてもよく、続いて、２回目の追加免疫を受けてもよい。
【００６４】
本発明のタンパク質を、本発明のワクチン製剤中でアジュバント化するのが好ましい。アジュバントは、「ワクチンの設計-サブユニットおよびアジュバント手法(Vaccine Design - the Subunit and Adjuvant Approach)」、PowellおよびNewman(編), Plenum Press, New York, 1995に一般的に記載されている。
【００６５】
好適なアジュバントとしては、水酸化アルミニウムもしくはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩が挙げられるが、カルシウム、鉄もしくは亜鉛の塩であってもよく、またはアシル化されたチロシン、もしくはアシル化された糖、陽イオンもしくは陰イオン的に誘導体化された多糖、もしくはポリホスファゼンの不溶性懸濁液であってもよい。
【００６６】
本発明の製剤においては、前記アジュバント組成物は優先的にＴｈ１応答を誘導するのが好ましい。しかしながら、他の体液性応答などの他の応答も排除されないことが理解されるであろう。
【００６７】
免疫応答を、抗原と、免疫系の細胞との相互作用を介して、該抗原に対して生じさせる。得られる免疫応答を、体液性免疫応答または細胞媒介性免疫応答の２つの極端なカテゴリー(通常は、それぞれ抗体および防御の細胞性エフェクター機構を特徴とする)に広く区別することができる。応答のこれらのカテゴリーは、Ｔｈ１型応答(細胞媒介性応答)、およびＴｈ２型免疫応答(体液性応答)と呼ばれてきた。
【００６８】
極端なＴｈ１型免疫応答は、抗原特異的な、ハプロタイプにより制限された細胞傷害性Ｔリンパ球、およびナチュラルキラー細胞応答の生成を特徴とする。マウスにおいては、Ｔｈ１型応答は、ＩｇＧ２ａサブタイプの抗体の生成を特徴とすることが多いが、ヒトにおいては、これらはＩｇＧ１型抗体に対応する。Ｔｈ２型免疫応答は、マウスのＩｇＧ１、ＩｇＡ、およびＩｇＭなどの広範囲の免疫グロブリンアイソタイプの生成を特徴とする。
【００６９】
これらの２つの型の免疫応答の発達を助ける駆動力はサイトカインであり、いくつかの同定されたタンパク質メッセンジャーは免疫系の細胞を助けるように働き、Ｔｈ１またはＴｈ２応答のいずれかに対して結果として起こる免疫応答を制御すると考えられる。かくして、高レベルのＴｈ１型サイトカインは、所与の抗原に対する細胞媒介性免疫応答を誘導しやすい傾向があるが、高レベルのＴｈ２型サイトカインは該抗原に対する体液性免疫応答を誘導しやすい傾向がある。
【００７０】
Ｔｈ１型およびＴｈ２型の免疫応答の区別が絶対的なものではないことを覚えておくことが重要である。実際には、個体は、主にＴｈ１または主にＴｈ２として表される免疫応答を支持するであろう。しかしながら、マウスＣＤ４＋Ｔ細胞クローンにおいてMosmannおよびCoffman (Mosmann, T.R.およびCoffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties., Annual Review of Immunology, 7, p145-173)により記載されたという点で、サイトカインのファミリーであると考えるのが都合が良いことが多い。通常は、Ｔｈ１型応答は、Ｔリンパ球によるＩＮＦ−γおよびＩＬ−２サイトカインの産生と関連する。他のサイトカインは、ＩＬ−１２などのＴ細胞により産生されないＴｈ１型免疫応答の誘導と直接関連することが多い。対照的に、Ｔｈ２型応答は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０および腫瘍壊死因子−β(ＴＮＦ−β)の分泌と関連する。
【００７１】
特定のワクチンアジュバントが、Ｔｈ１またはＴｈ２型のサイトカイン応答の刺激にとって特に好適であることが知られている。伝統的には、ワクチン接種または感染後の免疫応答のＴｈ１：Ｔｈ２の平衡の最良の指示因子としては、抗原による再刺激後のｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴリンパ球によるＴｈ１もしくはＴｈ２サイトカインの産生の直接的測定、および／または抗原特異的抗体応答のＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比の測定が挙げられる。
【００７２】
かくして、Ｔｈ１型アジュバントは、単離されたＴ細胞集団を刺激して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗原により再刺激された場合、高レベルのＴｈ１型サイトカインを産生し、かつＴｈ１型アイソタイプと関連する抗原特異的免疫グロブリン応答を誘導するものである。
【００７３】
本発明における使用にとって好適なアジュバントを製造するために製剤化することができる好ましいＴｈ１型免疫刺激因子としては、限定されるものではないが、以下のものが挙げられる。モノホスホリルリピドＡ、特に、３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡ(３Ｄ−ＭＰＬ)が、本発明における使用にとって好ましいＴｈ１型免疫刺激因子である。３Ｄ−ＭＰＬはRibi Immunochem, Montanaにより製造されるよく知られたアジュバントである。化学的には、それは３−デ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡと、４、５、または６アシル化鎖との混合物として供給されることが多い。それを、ＧＢ２１２２２０４Ｂに教示された方法により精製および調製することができ、この参考文献はジホスホリルリピドＡ、およびその３−Ｏ−デアシル化変種の調製も開示している。他の精製されたリポ多糖および合成リポ多糖が記載されている(米国特許第６，００５，０９９号およびＥＰ ０ ７２９ ４７３ Ｂ１；Hilgersら、1986, Int.Arch.Allergy.Immunol., 79(4):392-6；Hilgersら、1987, Immunology, 60(1):141-6;およびＥＰ ０ ５４９ ０７４ Ｂ１)。３Ｄ−ＭＰＬの好ましい形態は、直径０．２μｍ未満の小さい粒径を有する粒子状製剤の形態にあり、その製造方法はＥＰ ０ ６８９ ４５４に開示されている。
【００７４】
サポニンも、本発明に従う好ましいＴｈ１免疫刺激因子である。サポニンはよく知られたアジュバントであり、Lacaille-Dubois, MおよびWagner H (1996. A review of the biological and pharmacological activities of saponins., Phytomedicine vol 2 pp 363-386)に教示されている。例えば、Ｑｕｉｌ Ａ(南アメリカの樹木キラヤ(Quillaja Saponaria Molina)の樹皮に由来する)、およびその画分が、米国特許第５，０５７，５４０号および”Saponins as vaccine adjuvants.” Kensil, C.R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12(1-2):1-55;ならびにＥＰ ０ ３６２ ２７９ Ｂ１に記載されている。溶血性サポニンＱＳ２１およびＱＳ１７(Ｑｕｉｌ ＡのＨＰＬＣ精製された画分)が強力な全身性アジュバントとして記載されており、その製造方法は米国特許第５，０５７，５４０号およびＥＰ ０ ３６２ ２７９ Ｂ１に開示されている。また、これらの参考文献には、全身性ワクチンのための強力なアジュバントとして働くＱＳ７(Ｑｕｉｌ Ａの非溶血性画分)の使用も記載されている。ＱＳ２１の使用は、Kensilら(1991. J. Immunology vol 146, 431-437)にさらに記載されている。ＱＳ２１とポリソルベートまたはシクロデキストリンとの組合せも公知である（ＷＯ ９９／１０００８）。ＱＳ２１およびＱＳ７などのＱｕｉｌ Ａの画分を含む粒子状アジュバント系はＷＯ ９６／３３７３９およびＷＯ ９６／１１７１１に記載されている。１つのそのような系はＩｓｃｏｒｎとして公知であり、１種以上のサポニンを含んでもよい。
【００７５】
別の好ましい免疫刺激因子は、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド(「ＣｐＧ」)を含む免疫刺激性オリゴヌクレオチドである。ＣｐＧはＤＮＡ中に存在するシトシン−グアノシンジヌクレオチドモチーフの省略形である。ＣｐＧは、全身経路および粘膜経路の両方により投与される場合のアジュバントとして当分野で公知である(ＷＯ ９６／０２５５５、ＥＰ ４６８５２０、Davisら、J.Immunol, 1998, 160(2):870-876; McCluskieおよびDavis, J.Immunol., 1998, 161(9):4463-6)。歴史的には、ＢＣＧのＤＮＡ画分が抗腫瘍作用を示し得ることが観察された。さらなる研究において、ＢＣＧ遺伝子配列から誘導された合成オリゴヌクレオチドが、免疫刺激作用を誘導することができる(ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方において)ことが示された。これらの研究の著者らは、中央のＣＧモチーフなどの、特定のパリンドローム配列がこの活性を有すると結論付けた。免疫刺激におけるＣＧモチーフの中心的な役割はKrieg, Nature 374, p546 1995による刊行物において後に解明された。詳細な分析により、ＣＧモチーフが特定の配列の前後関係の中になければならず、そのような配列は細菌のＤＮＡにおいて一般的であるが、脊椎動物のＤＮＡにおいては稀であることが示された。免疫刺激性配列は多い：プリン、プリン、Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジン；ここで、ＣＧモチーフはメチル化されていないが、他の非メチル化ＣｐＧ配列も免疫刺激性であることが知られており、本発明において用いることができる。
【００７６】
６つのヌクレオチドの特定の組合せ中に、パリンドローム配列が存在する。これらのモチーフのいくつか、１つのモチーフの繰り返しまたは異なるモチーフの組合せのいずれかが、同じオリゴヌクレオチド中に存在してもよい。これらの免疫刺激性配列を含む１つ以上のオリゴヌクレオチドの存在は、ナチュラルキラー細胞(インターフェロンγを産生し、細胞溶解活性を有する)およびマクロファージ(Wooldrigeら、Vol 89 (no. 8), 1977)などの様々な免疫サブセットを活性化することができる。この共通配列を含まない他の非メチル化ＣｐＧを含む配列も、現在では免疫刺激性であることが示されている。
【００７７】
ワクチン中で製剤化する場合、一般的には、ＣｐＧを、遊離の抗原と共に遊離の溶液中で投与するか(ＷＯ ９６／０２５５５；McCluskieおよびDavis,上掲)、または抗原に共有結合させるか(ＷＯ ９８／１６２４７)、または水酸化アルミニウムなどの担体と共に製剤化する((肝炎表面抗原) Davisら、上掲; Brazolot-Millanら、Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 1998, 95(26), 15553-8)。
【００７８】
上記のような免疫刺激因子を、例えば、リポソーム、水中油型乳濁液、および／またはアルミニウム塩(水酸化アルミニウムなど)などの金属塩などの担体と一緒に製剤化することができる。例えば、３Ｄ−ＭＰＬを、水酸化アルミニウム（ＥＰ ０ ６８９ ４５４）または水中油型乳濁液（ＷＯ ９５／１７２１０）と共に製剤化することができる；有利には、ＱＳ２１を、コレステロールを含有するリポソーム（ＷＯ ９６／３３７３９）、水中油型乳濁液（ＷＯ ９５／１７２１０）またはミョウバン（ＷＯ ９８／１５２８７）と共に製剤化することができる；ＣｐＧを、ミョウバンと共に（Davisら、上掲; Brazolot-Millan、上掲）または他の陽イオン性担体と共に製剤化することができる。
【００７９】
免疫刺激因子の組合せ、特に、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体の組合せ（ＷＯ  ９４／００１５３；ＷＯ ９５／１７２１０；ＷＯ ９６／３３７３９；ＷＯ ９８／５６４１４；ＷＯ ９９／１２５６５；ＷＯ ９９／１１２４１）、より具体的には、ＷＯ ９４／００１５３に開示されたようなＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬの組合せも好ましい。あるいは、ＣｐＧとＱＳ２１などのサポニンの組合せも、本発明における使用のための強力なアジュバントを形成する。あるいは、サポニンをリポソーム中で、またはＩｓｃｏｒｎ中で製剤化し、免疫刺激性オリゴヌクレオチドと組合わせることもできる。
【００８０】
かくして、好適なアジュバント系としては、例えば、モノホスホリルリピドＡ、好ましくは３Ｄ−ＭＰＬと、アルミニウム塩との組合せが挙げられる。増強された系は、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体の組合せ、特に、ＷＯ ９４／００１５３に開示されたようなＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬの組合せ、またはＷＯ ９６／３３７３９に開示されたようなコレステロールを含有するリポソーム(ＤＱ)中でＱＳ２１をクエンチする低反応性組成物を含む。この組合せはさらに、免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含んでもよい。
【００８１】
水中油型乳濁液中にＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬおよびトコフェロールを含む特に強力なアジュバント製剤がＷＯ ９５／１７２１０に記載されており、本発明における使用にとって別の好ましい製剤である。
【００８２】
別の好ましい製剤は、ＣｐＧオリゴヌクレオチドのみ、またはＣｐＧオリゴヌクレオチドとアルミニウム塩とを含む。
【００８３】
本発明のさらなる態様においては、本発明によるポリペプチドを、好適なアジュバントと混合することを含む、本明細書に記載のワクチン製剤の製造方法を提供する。
【００８４】
本発明による製剤における使用にとって特に好ましいアジュバントの組合せは以下の通りである：
ｉ）      ３Ｄ−ＭＰＬ＋ＱＳ２１(リポソーム中)
ｉｉ）    ミョウバン＋３Ｄ−ＭＰＬ
ｉｉｉ）  ミョウバン＋ＱＳ２１(リポソーム中)＋３Ｄ−ＭＰＬ
ｉｖ)    ミョウバン＋ＣｐＧ
ｖ)      ３Ｄ−ＭＰＬ＋ＱＳ２１＋水中油型乳濁液
ｖｉ)    ＣｐＧ。
【００８５】
医薬組成物の投与は、例えば、同じポリペプチドを含む組成物の反復用量として、または異種性の「初回−追加」ワクチン接種計画中での、１もしくは２回以上の個々の用量の形態を取ってもよい。異種性の初回−追加計画は、初回および追加において異なる形態のワクチンの投与を使用し、その各々はそれ自身、２回以上の投与を含んでもよい。初回用組成物および追加用組成物は、一般的には少なくとも１種の抗原を有するが、それは同一の形態の抗原である必要はなく、同じ抗原の異なる形態であってもよい。
【００８６】
本発明による初回−追加免疫を、タンパク質およびＤＮＡに基づく製剤の組合せを用いて実施することができる。そのような戦略は、広範な免疫応答を誘導するのに有効であると考えられる。アジュバント化されたタンパク質ワクチンは、主に抗体およびＴヘルパー免疫応答を誘導するが、プラスミドまたは生ベクターとしてのＤＮＡの送達は強力な細胞傷害性Ｔリンパ球(ＣＴＬ)応答を誘導する。かくして、タンパク質およびＤＮＡワクチン接種の組合せは幅広い免疫応答を提供するであろう。中和抗体およびＣＴＬは両方ともＨＩＶに対する免疫防御にとって重要であると考えられるため、これはＨＩＶとの関連において特に適切である。
【００８７】
本発明に従えば、ワクチン接種のためのスケジュールは、ポリペプチド抗原および該ポリペプチドをコードするＤＮＡの連続的(「初回−追加」)または同時的な投与を含んでもよい。このＤＮＡを、プラスミドＤＮＡなどの裸のＤＮＡとして、または、例えば、ポックスウイルスベクター、アデノウイルスベクター、麻疹ウイルスベクターもしくは任意の他の好適な生ベクターなどの組換え生ベクターの形態で送達することができる。タンパク質抗原を、１回もしくは数回注入した後、１回以上、ＤＮＡを投与してもよいし、またはＤＮＡを最初に１回以上の投与に用いた後、１回以上のタンパク質による免疫付与に用いてもよい。
【００８８】
本発明による初回−追加免疫の特定例は、改変ポックスウイルスベクター、例えば、改変ウイルスアンカラ(ＭＶＡ)もしくはアルファウイルス、例えば、ベネズエラ馬脳炎ウイルス、またはアデノウイルスベクター、または麻疹ウイルスベクターなどの組換え生ベクターの形態のＤＮＡを用いて初回免疫した後、タンパク質、好ましくはアジュバント化されたタンパク質を用いて追加免疫することを含む。
【００８９】
かくして、本発明はさらに、以下のもの：
ａ）Ｎｅｆまたはその免疫原性断片もしくは誘導体ならびにｐ１７および／もしくはｐ２４  Ｇａｇまたはその免疫原性断片もしくは誘導体を含むポリペプチドであって、ｐ１７およびｐ２４の両方のＧａｇが存在する場合、それらの間に少なくとも１つのＨＩＶ抗原またはその免疫原性断片もしくは誘導体が存在するポリペプチドと、製薬上許容し得る賦形剤とを含む組成物；ならびに
ｂ）１つ以上のＮｅｆおよびＧａｇをコードするポリヌクレオチドまたはａ)のポリペプチド中に存在するＮｅｆもしくはＧａｇエピトープを含むＮｅｆもしくはＧａｇの免疫原性断片もしくは誘導体と、製薬上許容し得る賦形剤とを含む組成物、
を含む医薬キットを提供する。
【００９０】
好ましくは、ａ）のポリペプチドは、ＲＴまたはその免疫原性断片もしくは誘導体、例えば、ｐ５１ＲＴなどをさらに含む。
【００９１】
代替的な実施形態においては、前記医薬キットは、
ａ）Ｎｅｆまたはその免疫原性断片もしくは誘導体ならびにｐ１７および／もしくはｐ２４ Ｇａｇまたはその免疫原性断片もしくは誘導体を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、ｐ１７およびｐ２４の両方のＧａｇが存在する場合、それらの間に少なくとも１つのＨＩＶ抗原またはその免疫原性断片もしくは誘導体が存在するポリヌクレオチドと、製薬上許容し得る賦形剤とを含む組成物；ならびに
ｂ）１つ以上のＮｅｆおよびＧａｇを含むポリペプチドまたはａ）のポリペプチド中に存在するＮｅｆもしくはＧａｇエピトープを含むＮｅｆもしくはＧａｇの免疫原性断片もしくは誘導体と、製薬上許容し得る賦形剤とを含む組成物、
を含む。
【００９２】
好ましくは、ａ）のポリヌクレオチドは、ＲＴまたはその免疫原性断片もしくは誘導体、例えば、ｐ５１ＲＴなどをさらに含むポリペプチドをコードする。
【００９３】
本発明による初回／追加キットにおける使用にとって好ましいポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、本明細書に記載のポリペプチドおよびポリヌクレオチドである。かくして、タンパク質／ＤＮＡ型の初回−追加手法のタンパク質成分は、本明細書に記載の好ましい融合タンパク質のいずれかであってよい。同様に、ＤＮＡ成分は好ましいタンパク質のいずれかをコードするポリヌクレオチドであってよい。
【００９４】
かくして、例えば、本明細書に記載のｐ２４-ＲＴ-Ｎｅｆ-ｐ１７、ｐ２４-ＲＴ＊-Ｎｅｆ-ｐ１７、ｐ２４-ｐ５１ＲＴ-Ｎｅｆ-ｐ１７、ｐ２４-ｐ５１ＲＴ＊-Ｎｅｆ-ｐ１７、ｐ１７-ｐ５１ＲＴ-Ｎｅｆもしくはｐ１７-ｐ５１ＲＴ＊-Ｎｅｆ融合体またはｐ１７−Ｎｅｆ融合体のいずれかを、初回用組成物が融合タンパク質を含み、追加用組成物が該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むか、または初回用組成物が該ポリヌクレオチドを含み、追加用組成物が該融合タンパク質を含む、初回−追加キット中で提供することができる。
【００９５】
初回用組成物および追加用組成物は両方とも、２回以上の用量中で送達することができる。さらに、最初の初回および追加用量に、例えば、ＤＮＡプラスミドによる初回／タンパク質による追加／さらなるＤＮＡプラスミド用量／さらなるタンパク質用量をもたらすように変化させてもよいさらなる用量を続けることができる。
【００９６】
コドン最適化とは、ポリヌクレオチド配列を、所望の発現系、例えば、大腸菌などの原核生物系における遺伝子のコドン使用頻度に類似するように最適化することを意味する。特に、該配列におけるコドン使用頻度を、高度に発現される大腸菌遺伝子のものと類似するように最適化する。
【００９７】
本発明による組換え系における発現のためのコドン最適化の目的は２つである：組換え産物の発現レベルを改善すること、および発現産物をより均質にさせること(より均質な発現パターンを取得すること)である。改善された均質性とは、切断型などの無関係の発現産物があまり存在しないことを意味する。大腸菌発現へのコドン使用頻度の利用により、推定「フレームシフト」配列ならびに早期終結および／または内部開始部位を排除することもできる。
【００９８】
ＤＮＡコードは４文字(Ａ、Ｔ、ＣおよびＧ)を有し、これらを用いて、生物の遺伝子中にコードされるタンパク質中のアミノ酸を表す、３文字の「コドン」を綴る。ＤＮＡ分子に沿ったコドンの直線状配列を、これらの遺伝子によりコードされるタンパク質中のアミノ酸の直線状配列に翻訳する。このコードは非常に縮重性が高く、６１種類のコドンが２０種類の天然アミノ酸をコードし、３種類のコドンは「停止」シグナルを表す。かくして、多くのアミノ酸は２種類以上のコドンによりコードされ、実際、いくつかのものは４種類以上の異なるコドンによりコードされる。
【００９９】
所与のアミノ酸をコードさせるのに２種類以上のコドンが利用可能である場合、生物のコドン使用パターンが非常に非無作為的であることが観察された。異なる種は、そのコドン選択において異なる偏りを示し、さらに、コドンの使用頻度は高レベルおよび低レベルで発現される遺伝子間で、１つの種において顕著に異なっていてもよい。この偏りは、ウイルス、植物、細菌および哺乳動物細胞中で異なっており、いくつかの種は他のものよりも無作為なコドン選択から離れてより強い偏りを示す。例えば、ヒトおよび他の哺乳動物は特定の細菌またはウイルスよりもあまり強く偏っていない。これらの理由から、大腸菌中で発現される哺乳動物ウイルス由来のウイルス遺伝子、または哺乳動物細胞中で発現される外来遺伝子もしくは組換え遺伝子が、効率的な発現のためには不適当なコドンの分布を有するかなり大きな可能性が存在する。コドンのクラスターの異種ＤＮＡ配列中での存在、または発現を起こさせる宿主中で稀に観察されるコドンが多く含まれることは、その宿主における低い異種性発現レベルを予測させる。
【０１００】
かくして、本発明のポリヌクレオチドにおいては、コドン使用パターンを、典型的なヒト免疫不全ウイルスのものから変化させて、標的生物、例えば、大腸菌のコドンの偏りにより近づけることができる。
【０１０１】
コドン最適化にとって有用な様々な公共的に利用可能なプログラムが存在し、例えば、「ＣａｌｃＧｅｎｅ」(HaleおよびThompson, Protein Expression and Purification 12: 185-189 (1998))が挙げられる。
【実施例１】
【０１０２】
ＨＩＶ−１ ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７融合体Ｆ４およびコドン最適化されたＦ４（ｃｏ）の構築および発現
１．コドン最適化されていないＦ４
ＨＩＶ−１ ｇａｇ ｐ２４(キャプシドタンパク質)およびｐ１７(マトリックスタンパク質)、逆転写酵素およびＮｅｆタンパク質を、バクテリオファージＴ７プロモーター(ｐＥＴ発現系)の制御下で、大腸菌Ｂ８３４株(Ｂ８３４(ＤＥ３)はＢＬ２１(ＤＥ３)のメチオニン要求性の親株である)で発現させた。
【０１０３】
これらを、４つのタンパク質の完全な配列を含む１個の融合タンパク質として発現させた。成熟ｐ２４コード配列はＨＩＶ−１ ＢＨ１０分子クローンに由来し、成熟ｐ１７配列およびＲＴ遺伝子はＨＸＢ２に由来し、かつＮｅｆ遺伝子はＢＲＵ単離体に由来する。
【０１０４】
誘導後、組換え細胞は総タンパク質の１０％の量の顕著なレベルのｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７融合体を発現した。
【０１０５】
細胞を２２℃で増殖および誘導した場合、ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７融合タンパク質は主に細菌ライセートの可溶性画分に確認された(凍結／解凍の後でも)。３０℃で増殖させた場合、約３０％の組換えタンパク質が不溶性画分に存在した。
【０１０６】
融合タンパク質ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７は１１３６個のアミノ酸からなり、約１２９ｋＤａの分子量を有する。完全長タンパク質はＳＤＳゲル上で約１３０ｋＤａに移動する。このタンパク質は、そのアミノ酸配列に基づいて７．９６の理論等電点(ｐＩ)を有し、これは２Ｄ−ゲル電気泳動により確認された。
【０１０７】
組換えプラスミドの詳細
名称：      ｐＲＩＴ１５４３６（または研究室における名称ｐＥＴ２８ｂ／ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７）
宿主ベクター：ｐＥＴ２８ｂ
レプリコン：ｃｏｌＥ１
選択：      カナマイシン
プロモーター：Ｔ７
インサート：ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７融合遺伝子。
【０１０８】
組換えタンパク質の詳細
ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７融合タンパク質：１１３６アミノ酸
Ｎ末端−ｐ２４：２３２ａ．ａ．−ヒンジ：２ａ．ａ．−ＲＴ：５６２ａ．ａ．−ヒンジ：２ａ．ａ．−Ｎｅｆ：２０６ａ．ａ．−Ｐ１７：１３２ａ．ａ．−Ｃ末端
【０１０９】
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列：
ヌクレオチド配列
【表１】
0005629647.tif 000002
0005629647.tif 000003
［配列番号１］
ｐ２４配列を太字で示す。
Ｎｅｆ配列を下線付きで示す。
囲み：遺伝子構築により導入されたヌクレオチド。
【０１１０】
アミノ酸配列
【表２】
0005629647.tif 000004
［配列番号２］
Ｐ２４配列：アミノ酸１−２３２(太字)
ＲＴ配列：アミノ酸２３５−７９５
Ｎｅｆ配列：アミノ酸７９８−１００２
Ｐ１７配列：アミノ酸１００５−１１３６
囲み：遺伝子構築により導入されたアミノ酸
Ｋ(リジン)：トリプトファン(Ｗ)の代わり。酵素活性を除去するために導入された突然変異。
【０１１１】
組換えタンパク質の発現：
ｐＥＴプラスミドにおいては、標的遺伝子(ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７)は強力なバクテリオファージＴ７プロモーターの制御下にある。このプロモーターは大腸菌ＲＮＡポリメラーゼにより認識されず、宿主細胞中のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの起源に依存する。Ｂ８３４(ＤＥ３)宿主細胞は、ｌａｃＵＶ５の制御下のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の染色体コピーを含み、その発現は細菌培養物へのＩＰＴＧの添加により誘導される。
【０１１２】
前培養物を、振とうフラスコ中、３７℃で中間対数増殖期(Ａ６２０：０．６)まで増殖させた後、４℃で一晩保存した(静止期培養を避けるため)。培養物を、１％グルコースおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシンを添加したＬＢＴ培地中で増殖させた。増殖培地へのグルコースの添加は、基底状態での組換えタンパク質発現を減少させる利点を有する(ｌａｃＵＶ５プロモーターのｃＡＭＰ媒介性抑制を回避する)。
【０１１３】
４℃で一晩保存した１０ｍｌの培養物を用いて、カナマイシンを含む２００ｍｌのＬＢＴ培地(グルコースを含まない)に植菌した。培養物を３０℃および２２℃で増殖させ、Ｏ．Ｄ．６２０が０．６に達した時、ＩＰＴＧを添加した(最終濃度１ｍＭ)。培養物をさらに３、５および１８時間(一晩)インキュベートした。サンプルを、誘導前と、誘導の３、５および１８時間後に回収した。
【０１１４】
抽出物の調製は以下の通りであった：
細胞ペレットをブレーキングバッファー＊中に懸濁し(１０の理論的Ｏ．Ｄ．で)、フレンチプレス(２０,０００ｐｓｉまたは１２５０バール)に４回の通すことにより破壊した。粗抽出物(Ｔ)を２０,０００ｇで３０分間遠心分離して、可溶性画分(Ｓ)と不溶性画分(Ｐ)とを分離した。
【０１１５】
＊ブレーキングバッファー：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ＋プロテアーゼインヒビターカクテル(Complete/Boerhinger)。
【０１１６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析：
不溶性ペレット(Ｐ)、上清(Ｓ)および粗抽出物(Ｔ)に対応する画分を、１０％の還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した。ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７組換え体を、クマシーブルー染色により、およびウェスタンブロット(ＷＢ)で検出した。
【０１１７】
クマシー染色：ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７タンパク質は以下のように現れる：
１３０ｋＤａ付近(算出されたＭＷに適合する)の１本のバンド
ＭＷ理論値：１２８，９７０ダルトン
ＭＷ見かけ：１３０ｋＤａ
ウェスタンブロット分析：
試薬＝  ・ＲＴ(ｐ６６／ｐ５１)に対するモノクローナル抗体
ＡＢＩ(Advanced Biotechnologies)から購入
希釈率：１／５０００
・アルカリホスファターゼコンジュゲート抗マウス抗体
希釈率：１／７５００
発現レベル：  ２２℃で２０時間の誘導後の非常に強力なｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７特異的バンド、総タンパク質の最大１０％にあたる(図１Ａを参照)。
【０１１８】
組換えタンパク質の「可溶性」：
「新鮮な」細胞抽出物(Ｔ、Ｓ、Ｐ画分)：２２℃で２０時間の増殖／誘導を用いた場合、ほとんど全てのｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７融合タンパク質が細胞抽出物の可溶性画分中に回収される(図１Ａ)。３０℃で２０時間の増殖／誘導を用いた場合、約３０％のｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７タンパク質が不溶性画分に存在する(図１Ａ)。
【０１１９】
「凍結／解凍」(Ｓ２、Ｐ２画分)：
可溶性画分(Ｓ１)(２２℃で２０時間の誘導)を−２０℃で保存した。解凍および２０,０００ｇ／３０分間で遠心分離：Ｓ２およびＰ２(１／１０容量中に再懸濁)。
【０１２０】
ＤＴＴを含むブレーキングバッファー：ほとんど全てのｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７融合タンパク質が可溶性のままであった(１〜５％のみが沈降)(図１Ｂを参照)。
【０１２１】
ＤＴＴを含まないブレーキングバッファー：８５〜９０％のｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７が可溶性のままであった(図１Ｂ)。
【０１２２】
図面：
図１Ａ−クマシー染色およびウェスタンブロット
図１Ｂ−ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７可溶性アッセイ。
【０１２３】
Ｆ４タンパク質を、実施例７の精製方法Ｉを用いて精製した。
【０１２４】
以下の実施例のための細胞の増殖および誘導条件ならびに細胞抽出物の調製は、他の条件(例えば、温度、ブレーキングバッファーの組成)を特定しない限り、実施例１に記載の通りである。
【０１２５】
２．コドン最適化されたＦ４
以下のポリヌクレオチド配列は、そのコドン使用頻度が大腸菌で多く発現される遺伝子におけるコドン使用頻度と類似するようにコドン最適化されている。アミノ酸配列は、コドン最適化されていないＦ４について上記に示したものと同一である。
【０１２６】
Ｆ４ｃｏのヌクレオチド配列：
【表３】
0005629647.tif 000005
0005629647.tif 000006
［配列番号３］
ｐ２４配列を太字で示す。
Ｎｅｆ配列を下線付きで示す。
囲み：遺伝子構築により導入されたヌクレオチド。
コドン最適化されていないＦ４に関して用いた手順を、コドン最適化された配列に適用した。
【０１２７】
組換えプラスミドの詳細：
名称：        ｐＲＩＴ１５５１３(研究室での名称：ｐＥＴ２８ｂ／ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７)
宿主ベクター：ｐＥＴ２８ｂ
レプリコン：  ｃｏｌＥ１
選択：        カナマイシン
プロモーター：Ｔ７
インサート：  コドン最適化された、ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７融合遺伝子。
【０１２８】
Ｆ４のコドン最適化された遺伝子を、Ｂ８３４(ＤＥ３)株のｒｅｃＡ−誘導体である大腸菌ＢＬＲ(ＤＥ３)細胞中で発現させた。ＲｅｃＡ突然変異は推定されるλファージの産生を防止する。
【０１２９】
前培養物を、振とうフラスコ中、３７℃にて、中間対数増殖期(Ａ６２０：０．６)まで増殖させた後、４℃で一晩保存した(静止期培養を避けるため)。
【０１３０】
培養物を、１％グルコースおよび５０μｇ／ｍｌカナマイシンを添加したＬＢＴ培地中で増殖させた。増殖培地へのグルコースの添加は基底状態での組換えタンパク質発現を減少させる利点を有する(ｌａｃＵＶ５プロモーターのｃＡＭＰ媒介性抑制を回避する)。
【０１３１】
４℃で一晩保存した１０ｍｌの培養物を用いて、カナマイシンを含む２００ｍｌのＬＢＴ培地(グルコースを含まない)に植菌した。培養物を３７℃で増殖させ、Ｏ．Ｄ．６２０が０．６に達した時、ＩＰＴＧを添加した(最終濃度１ｍＭ)。培養物をさらに１９時間(一晩)、２２℃にてインキュベートした。サンプルを、誘導前および誘導１９時間後に回収した。
【０１３２】
抽出物の調製は以下の通りであった：
細胞ペレットをサンプルバッファー中に再懸濁し(１０の理論的Ｏ．Ｄ．で)、ボイルし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに直接ロードした。
【０１３３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析：
粗抽出物サンプルを１０％の還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した。
【０１３４】
ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７組換えタンパク質をクマシーブルー染色により、およびウェスタンブロットで検出する(図２)。
【０１３５】
クマシー染色：ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７タンパク質は以下のように現れる：
１３０ｋＤａ付近(算出されたＭＷと適合する)の１本のバンド
ＭＷ理論値：１２８．９６７ダルトン
ＭＷ見かけ：１３０ｋＤａ
ウェスタンブロット分析：
試薬＝  ・ウサギポリクローナル抗ＲＴ(ウサギＰＯ３Ｌ１６)
希釈率：１／１０,０００
・ウサギポリクローナル抗Ｎｅｆ−Ｔａｔ(ウサギ３８８)
希釈率：１／１０,０００
・アルカリホスファターゼコンジュゲート抗ウサギ抗体
希釈率：１／７５００。
【０１３６】
２２℃で１９時間の誘導の後、組換えＢＬＲ(ＤＥ３)細胞は、総タンパク質の１０〜１５％の範囲の非常に高いレベルでＦ４融合体を発現した。
【０１３７】
ネイティブな遺伝子由来のＦ４と比較して、コドン最適化された遺伝子に由来するＦ４組換え産物のプロフィールはわずかに単純化されている。６０ｋＤａの主要なＦ４関連バンド、ならびにそれ以下の小さいバンドは消失した(図２を参照)。Ｆ４を発現するＢ８３４(ＤＥ３)組換え株と比較して、Ｆ４ｃｏを産生するＢＬＲ(ＤＥ３)株は以下の利点を有する：Ｆ４完全長タンパク質のより高い産生、組換え産物のより複雑性の低いバンドパターン。
【実施例２】
【０１３８】
Ｐ５１ＲＴ(切断型、コドン最適化されたＲＴ)の構築および発現
アミノ酸４２８〜４４８の間のＲＴ／ｐ６６領域は大腸菌プロテアーゼに対して感受性である。Ｐ５１構築物はＬｅｕ ４２７で終結し、ＲＮａｓｅＨドメインの排除をもたらす(図３中のＲＴ配列アライメントを参照)。
【０１３９】
ＲＴのネイティブな遺伝子配列中で特定された推定上の大腸菌「フレームシフト」配列も排除された(ｐ５１遺伝子のコドン最適化により)。
【０１４０】
ｐ５１合成遺伝子の設計／構築
合成ｐ５１遺伝子の配列を、大腸菌のコドン使用頻度に従って設計した。かくして、それは、そのコドン使用頻度が大腸菌中で多く発現される遺伝子におけるコドン使用頻度に類似するようにコドン最適化された。合成遺伝子を以下のように構築した：３２個のオリゴヌクレオチドを単一工程ＰＣＲ中で組み立てた。２回目のＰＣＲにおいて、完全長集合体を末端プライマーを用いて増幅し、得られたＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ中間プラスミド中にクローニングした。遺伝子合成の間に導入されたポイントエラーの補正後、ｐ５１合成遺伝子をｐＥＴ２９ａ発現プラスミド中にクローニングした。この組換えプラスミドを用いて、Ｂ８３４(ＤＥ３)細胞を形質転換した。
【０１４１】
組換えタンパク質の特性：
ｐ５１  ＲＴヌクレオチド配列
【表４】
0005629647.tif 000007
0005629647.tif 000008
［配列番号４］
囲み：遺伝子構築により導入されたアミノ酸。
【０１４２】
アミノ酸配列：
【表５】
0005629647.tif 000009
［配列番号５］
囲み：遺伝子構築により導入されたアミノ酸。
Ｋ(リジン)：トリプトファン(Ｗ)の代わり。酵素活性を除去するために導入された突然変異。
【０１４３】
長さ、分子量、等電点(ＩＰ)：
４３３ＡＡ、ＭＷ：５０．３ｋＤａ、ＩＰ：９．０８
Ｂ８３４(ＤＥ３)細胞中でのｐ５１の発現
Ｐ５１の発現レベルおよび組換えタンパク質の可溶性を、ＲＴ／ｐ６６産生株と並行して評価した。
【０１４４】
ｐ５１の発現レベル：
誘導条件：５時間、３７℃(＋１ｍＭ ＩＰＴＧ)で細胞を増殖／誘導
ブレーキングバッファー：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ：７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、＋／−１ｍＭ ＤＴＴ
ウェスタンブロット分析：
試薬：ウサギポリクローナル抗ＲＴ(ウサギＰＯ３Ｌ１６)(希釈率：１／１０，０００)
アルカリホスファターゼコンジュゲート抗ウサギ抗体(希釈率：１／７５００)
粗抽出物(Ｔ)、不溶性ペレット(Ｐ)および上清(Ｓ)に対応する細胞画分を、１０％の還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動した。
【０１４５】
クマシー染色されたゲルおよびウェスタンブロット(図４)に示されるように、非常に高いＰ５１の発現(総タンパク質の１５〜２０％)が観察され、これはＰ６６について観察されたものよりも高かった。
【０１４６】
ｐ５１およびｐ６６タンパク質の両方について(３７℃で５時間の誘導後)、８０％の組換え産物を、細胞抽出物の可溶性画分(Ｓ１)中に回収した(図４を参照)。３０℃で発現させた場合、９９％の組換えタンパク質が可溶性画分に存在していた(データは示していない)。
【０１４７】
ｐ５１のウェスタンブロットパターンは複数のバンドであったが、Ｐ６６について観察されたものよりも複雑性は低かった。
【０１４８】
可溶性アッセイ
可溶性アッセイ：還元的条件(ＤＴＴを含むブレーキングバッファー)および非還元的条件下で調製された可溶性(Ｓ１)画分(５時間の誘導、３７℃)の凍結／解凍。解凍後、Ｓ１サンプルを２０，０００ｇで３０分間遠心分離し、Ｓ２およびＰ２(ｐ２を１／１０容量に再懸濁する)を生成した。
【０１４９】
還元的ならびに非還元的条件で調製された、可溶性画分(Ｓ１)の凍結／解凍後、９９％のｐ５１およびｐ６６が依然として可溶性(Ｓ２)画分中に回収される。１％のみが沈降物(Ｐ２)中に認められる。これを図５に示す。
【実施例３】
【０１５０】
リンカーを含むか、または含まないｐ１７−ＮｅｆおよびＮｅｆ−ｐ１７の構築および発現
二重融合タンパク質を、リンカーを用いて、および用いずに構築した。このリンカーは、２つの融合パートナー間の相互作用の可能性を減少させるためのものであり、以下の通りである：
0005629647.tif 000010
組換えプラスミドの構築：
・ｐＥＴ２９ａ／Ｎｅｆ−ｐ１７発現ベクター：
Ｎｅｆ−ｐ１７融合遺伝子を、Ｆ４組換えプラスミドからＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ中間クローニングベクター中にクローニングした後、続いてｐＥＴ２９ａ発現ベクター中にクローニングした。
【０１５１】
・ｐＥＴ２８ｂ／ｐ１７−Ｎｅｆ発現ベクター：
Ｎｅｆ遺伝子を、Ｆ４組換えプラスミドからＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ中間クローニングベクター中にクローニングした後、続いてｐ１７遺伝子とのＣ末端インフレーム融合体として、ｐＥＴ２８ｂ／ｐ１７発現ベクター中にクローニングした。
【０１５２】
・ｐＥＴ２９a／Ｎｅｆ−リンカー−ｐ１７およびｐＥＴ２８ｂ／ｐ１７−リンカー−Ｎｅｆ発現ベクター：
ヘキサペプチドリンカー(ＧＳＧＧＧＰ)をコードする１８ｂｐのＤＮＡ断片を、部位特異的突然変異誘発により(「ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒ部位特異的突然変異誘発システム」、Invitrogenを用いて)、Ｎｅｆとｐ１７融合パートナーの間に挿入した。
【０１５３】
組換えタンパク質の特性：
・長さ、分子量、等電点(ＩＰ)
0005629647.tif 000011
・アミノ酸配列およびポリヌクレオチド配列：
Ｎｅｆ−ｐ１７ヌクレオチド配列
【表６】
0005629647.tif 000012
［配列番号６］
Ｎｅｆ−ｐ１７(ＮＰ)
【表７】
0005629647.tif 000013
0005629647.tif 000014
［配列番号７］
囲み：遺伝子構築により導入されたアミノ酸。
Ｎｅｆ配列を太字で示す。
【０１５４】
Ｐ１７−Ｎｅｆヌクレオチド配列：
【表８】
0005629647.tif 000015
［配列番号８］
Ｐ１７−Ｎｅｆ(ＰＮ)
【表９】
0005629647.tif 000016
［配列番号９］
囲み：遺伝子構築により導入されたアミノ酸。
ｐ１７配列を太字で示す。
【０１５５】
Ｎｅｆ−リンカー−ｐ１７ヌクレオチド配列：
【表１０】
0005629647.tif 000017
［配列番号１０］
Ｎｅｆ−リンカー−ｐ１７(ＮＬＰ)
【表１１】
0005629647.tif 000018
［配列番号１１］
ヘキサペプチドリンカー
囲み：遺伝子構築により導入されたアミノ酸。
【０１５６】
Ｐ１７−リンカー−Ｎｅｆヌクレオチド配列：
【表１２】
0005629647.tif 000019
0005629647.tif 000020
［配列番号１２］
Ｐ１７−リンカー−Ｎｅｆ(ＰＬＮ)
【表１３】
0005629647.tif 000021
［配列番号１３］
ヘキサペプチドリンカー
囲み：遺伝子構築により導入されたアミノ酸。
【０１５７】
リンカーを含む、および含まないＮｅｆ−ｐ１７、ｐ１７−Ｎｅｆ融合体の発現の比較
４種類の組換え株を、Ｆ４およびＮｅｆ産生株と並行して、３０℃で３時間に渡って誘導した。粗抽出物を調製し、クマシー染色ゲルおよびウェスタンブロッティングにより分析した。
【０１５８】
ウェスタンブロット分析：
試薬：ウサギポリクローナル抗ＲＴ(ウサギＰＯ３Ｌ１６)(希釈率：１／１０，０００)
アルカリホスファターゼコンジュゲート抗ウサギ抗体(希釈率：１／７５００)。
【０１５９】
図６に示されるように、リンカーを含む、および含まないＮｅｆ−ｐ１７およびｐ１７−Ｎｅｆ融合体は高レベルで発現される(総タンパク質の１０％)。
【０１６０】
ウェスタンブロット分析においては、４種類の二重融合構築物は複数のバンドパターンを示すが、Ｆ４について観察されたものよりも複雑性が低かった。単独で発現させた場合、Ｎｅｆおよびｐ１７タンパク質は単一のバンドパターンを示す。
【０１６１】
リンカーペプチドを含まない、Ｎｅｆ−ｐ１７(ＮＰ)およびｐ１７−Ｎｅｆ(ＰＮ)融合体を発現する株を、さらに分析した(可溶性アッセイ、以下を参照)。
【０１６２】
Ｎｅｆ−ｐ１７およびｐ１７−Ｎｅｆの可溶性アッセイ：
Ｎｅｆ−ｐ１７およびｐ１７−Ｎｅｆタンパク質を、Ｆ４およびＮｅｆ産生株と並行して誘導した。
【０１６３】
誘導条件：３０℃(＋１ｍＭ ＩＰＴＧ)で３時間に渡る細胞増殖／誘導
ブレーキングバッファー：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ：８、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ。
【０１６４】
新鮮な細胞抽出物：
細胞抽出物を調製し(非還元的条件下で)、粗抽出物(Ｔ)、不溶性ペレット(Ｐ)、および上清(Ｓ１)に対応する画分をクマシー染色ゲルおよびウェスタンブロット上で分析した。
【０１６５】
クマシー染色ゲルおよびウェスタンブロットで図７に示されるように、ほとんど全てのＮｅｆ−ｐ１７、ｐ１７−Ｎｅｆ、ならびにＮｅｆタンパク質は、細胞抽出物の可溶性画分(Ｓ)中に回収される。Ｆ４構築物については、５〜１０％の組換えタンパク質がペレット画分中に回収されている。
【０１６６】
結論：
試験した全ての二重融合構築物は強く発現される(総タンパク質の１０％を超える)。Ｐ１７−ＮｅｆおよびＮｅｆ−ｐ１７融合タンパク質はＦ４よりも可溶性が高い。両方とも複雑性の低いＷＢパターンを示す。
【実施例４】
【０１６７】
ｐ２４−ＲＴ＊−Ｎｅｆ−ｐ１７(Ｆ４＊)の構築および発現
Ｆ４＊は、５９２位のメチオニンをリジンに置き換えたＦ４(ｐ２４−ＲＴ／ｐ６６−Ｎｅｆ−ｐ１７)融合体の突然変異体である。このメチオニンは、Ｆ４精製実験のＱセファロース溶出物サンプルについて行ったＮ末端配列決定により支持されるように、推定上の内部転写「開始」部位である。実際、Ｑ溶出物サンプル中に存在する、主要なＦ４に対応する６２ｋＤａの小さいバンドは、メチオニン５９２から始まる。
【０１６８】
メチオニンを、リジンに置き換える：ＲＭＲ→ＲＫＲ。ＲＫＲモチーフはクレードＡのＲＴ配列中に天然に存在する。
【０１６９】
ＣＤ４−ＣＤ８エピトープに対するこの突然変異の影響を評価した：
・１個のＨＬＡ−Ａ３ ＣＴＬエピトープ(Ａ＊３００２)が失われるが、他の９個のＨＬＡ−Ａ３エピトープがＲＴ配列中に存在する。
【０１７０】
・ヘルパーエピトープはこの領域中で同定されなかった。
【０１７１】
組換えタンパク質の特性：
0005629647.tif 000022
・長さ、分子量、等電点(ＩＰ)：
１１３６ＡＡ、１２９ｋＤａ、ＩＰ：８．０７
【０１７２】
・ヌクレオチド配列：
【表１４】
0005629647.tif 000023
0005629647.tif 000024
0005629647.tif 000025
［配列番号１４］
ｐ２４配列を太字で示す。
Ｎｅｆ配列に下線を付す。
囲み：遺伝子構築により導入されたヌクレオチド。
【０１７３】
・アミノ酸配列
【表１５】
0005629647.tif 000026
0005629647.tif 000027
［配列番号１５］
Ｐ２４配列：アミノ酸１−２３２(太字)
ＲＴ配列：アミノ酸２３５−７９５
Ｎｅｆ配列：アミノ酸７９８−１００２
Ｐ１７配列：アミノ酸１００５−１１３６
囲み：遺伝子構築により導入されたアミノ酸
Ｋ(リジン)５９２：メチオニンの代わり(内部「開始」コドン)
Ｋ(リジン)４６４：トリプトファン(Ｗ)の代わり。酵素活性を除去するために導入された突然変異。
【０１７４】
Ｂ８３４(ＤＥ３)細胞中でのＦ４＊の発現
Ｆ４＊組換え株を、Ｆ４非突然変異構築物と並行して、１８時間、２２℃で誘導した。粗抽出物を調製し、クマシー染色ゲルおよびウェスタンブロッティングにより分析した。
【０１７５】
図８に示されるように、Ｆ４＊は高レベルで発現され(総タンパク質の１０％)、これはＦ４と比較してわずかに高く、小さい６２ｋＤａのバンドは消失した。
【０１７６】
ウェスタンブロット分析：
試薬：プールした３種類のＭａｂ抗ｐ２４（ＪＣ１３．１、ＪＣ１６．１、ＩＧ８．１．１）（希釈率：１／５０００）
ウサギポリクローナル抗ＲＴ（ウサギＰＯ３Ｌ１６）（希釈率：１／１００００）
ウサギポリクローナル抗Ｎｅｆ−Ｔａｔ（ウサギ３８８）（希釈率：１／１００００）
アルカリホスファターゼコンジュゲート抗ウサギ抗体（希釈率：１／７５００）
アルカリホスファターゼコンジュゲート抗マウス抗体（希釈率：１／７５００）。
【実施例５】
【０１７７】
Ｆ３およびＦ３＊(突然変異型Ｆ３)の構築および発現
Ｆ３(ｐ１７−ｐ５１−Ｎｅｆ)およびＦ３＊(ｐ１７−ｐ５１＊−Ｎｅｆ)中の推定上の内部メチオニン開始部位をリジンで置き換えた。
【０１７８】
Ｆ３およびＦ３＊融合体をｐ２４と組合わせて用いることができた。
【０１７９】
組換えプラスミド構築物：
Ｆ３：ｐ５１をコードする配列をｐＥＴ２９ａ／ｐ５１発現プラスミドから切り出し(ＳｃａＩおよびＳｔｕＩ ＤＮＡ断片として)、ｐＥＴ２８ｂ／ｐ１７−Ｎｅｆプラスミド中、ＳｔｕＩ部位(ｐ１７とＮｅｆ遺伝子の間に位置する)に、ｐ１７およびＮｅｆ配列とインフレームの融合体として連結した。得られた融合構築物ｐ１７−ｐ５１−ＮｅｆをＦ３と命名する。
【０１８０】
Ｆ３＊：推定上の内部メチオニン開始部位の突然変異を、「Ｇｅｎｅ Ｔａｉｌｏｒ部位特異的突然変異誘発システム」(Invitrogen)を用いて行い、Ｆ３＊構築物を作製した。
【０１８１】
Ｆ３およびＦ３＊プラスミドを用いて、Ｂ８３４(ＤＥ３)細胞を形質転換した。
【０１８２】
組換えタンパク質の特性：
0005629647.tif 000028
・長さ、分子量、等電点(ＩＰ)
７７０ＡＡ、８８．５ｋＤａ、ＩＰ：８．５８
【０１８３】
・ヌクレオチド配列(Ｆ３＊について)
【表１６】
0005629647.tif 000029
0005629647.tif 000030
［配列番号１６］
Ｐ１７：配列を太字で示す。
Ｐ５１：配列を大文字で示す。
Ｎｅｆ：配列を小文字で示す。
囲み：遺伝子構築物により導入されたヌクレオチド。
【０１８４】
・アミノ酸配列(Ｆ３について)
【表１７】
0005629647.tif 000031
［配列番号１７］
Ｐ１７配列：アミノ酸１−１３４(太字)
Ｐ５１配列：アミノ酸１３７−５６２
Ｎｅｆ配列：アミノ酸５６５−７７０
囲み：遺伝子構築により導入されたアミノ酸
Ｆ３＊構築物においてはメチオニン４９４をリジン(Ｋ)に置き換えた。
Ｋ(リジン)３６６：トリプトファン(Ｗ)の代わり。酵素活性を除去するために導入された突然変異。
【０１８５】
Ｂ８３４(ＤＥ３)細胞におけるＦ３の発現：
Ｆ３の発現レベルおよび組換えタンパク質の可溶性を、Ｆ４(ｐ２４−ｐ６６−Ｎｅｆ−ｐ１７)およびｐ１７−Ｎｅｆ(Ｆ２)産生株と並行して評価した。
【０１８６】
誘導条件：３７℃で細胞増殖／３０℃(＋１ｍＭ ＩＰＴＧ)で３時間誘導
ブレーキングバッファー：Ｆ４：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ：８．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、＋／− １ｍＭ ＤＴＴ
Ｆ２：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ：８．０、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ＤＴＴを含まない
Ｆ３：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ：７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、＋／− １ｍＭ ＤＴＴ
ウェスタンブロット分析：
試薬    ウサギポリクローナル抗ＲＴ（ウサギＰＯ３Ｌ１６）（希釈率：１／１００００）
ウサギポリクローナル抗Ｎｅｆ−Ｔａｔ（ウサギ３８８）（希釈率：１／１００００）
アルカリホスファターゼコンジュゲート抗ウサギ抗体（希釈率：１／７５００）。
【０１８７】
「新鮮な」細胞抽出物
粗抽出物(Ｔ)、不溶性ペレット(Ｐ)および上清(Ｓ)に対応する細胞画分を、１０％還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。図９に示されるように、Ｆ３融合タンパク質は高レベルで発現される(総タンパク質の１０％)。ほとんど全てのＦ３が細胞抽出物の可溶性画分(Ｓ)中に回収されるが、５〜１０％のＦ４産物は既にペレット画分に存在している。ＷＢパターンはＦ４と比較して単純である。
【０１８８】
Ｂ８３４(ＤＥ３)細胞におけるＦ３＊の発現：
Ｆ３＊組換え株を、Ｆ３非突然変異構築物と並行して、３時間に渡って３７℃で誘導した。粗細胞抽出物を調製し、クマシー染色ゲルおよびウェスタンブロッティングにより分析した。図１０に示されるように、Ｆ３＊融合タンパク質は非常に高レベルで発現される(総タンパク質の１０〜２０％)。Ｆ３と比較して単純なＷＢパターンであり、３２ｋＤａ付近(ＷＢのみで検出された)の非常に弱いバンドが消失した。
【実施例６】
【０１８９】
Ｆ４(ｐ５１)およびＦ４(ｐ５１)＊の構築および発現
ＲＴ／ｐ５１を、Ｆ４融合構築物中で(ＲＴ／ｐ６６の代わりに)用いた。
【０１９０】
Ｆ４(ｐ５１)＝ｐ２４−ｐ５１−Ｎｅｆ−ｐ１７
Ｆ４(ｐ５１)＊＝ｐ２４−ｐ５１＊−Ｎｅｆ−ｐ１７（突然変異型Ｆ４(ｐ５１)）：推定上の内部メチオニン開始部位(ＲＴ部分に存在する)をリジンに置き換えて、抗原パターンをさらに単純化する。
【０１９１】
組換えプラスミドの構築：
Ｆ４(ｐ５１)：ｐ５１をコードする配列を、ｐＥＴ２９ａ／ｐ５１発現プラスミドからＰＣＲにより増幅した。制限部位をＰＣＲプライマー中に組み入れた(コード配列の５’末端にＮｄｅＩおよびＳｔｕＩ部位、３’末端にＡｖｒＩＩ部位)。ＰＣＲ産物をｐＧｅｍ−Ｔ中間プラスミド中にクローニングし、配列決定した。ｐＧｅｍ−Ｔ／ｐ５１中間プラスミドをＮｄｅＩおよびＡｖｒＩＩにより制限処理し、ｐ５１断片を、ＮｄｅＩおよびＮｈｅＩにより制限処理された(ＲＴ／ｐ６６配列が切り出される)ｐＥＴ２８ｂ／ｐ２４−ＲＴ／ｐ６６−Ｎｅｆ−ｐ１７発現プラスミド中に連結した。連結を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼの存在下で、好適な濃度で消化反応と組合わせることにより行った。連結産物を用いて、ＤＨ５α大腸菌細胞を形質転換した。正しい翻訳読み枠へのｐ５１の挿入(ｆ４融合体中、ＲＴ／ｐ６６の代わり)の確認を、ＤＮＡ配列決定により行った。得られた融合構築物ｐ２４−ＲＴ／ｐ５１−Ｎｅｆ−ｐ１７をＦ４(ｐ５１)と命名する。
【０１９２】
Ｆ４(ｐ５１)＊：推定上の内部メチオニン開始部位(ＲＴ／ｐ５１中に存在)の突然変異を、「ＧｅｎｅＴａｉｌｏｒ部位特異的突然変異誘発システム」(Invitrogen)を用いて行い、Ｆ４(ｐ５１)＊構築物を作製した。
【０１９３】
Ｆ４(ｐ５１)およびＦ４(ｐ５１)＊発現プラスミドを用いて、Ｂ８３４(ＤＥ３)細胞を形質転換した。
【０１９４】
組換えタンパク質の特性：
0005629647.tif 000032
・長さ、分子量、等電点(ＩＰ)：
１００５ＡＡ、１１４．５ｋＤａ、ＩＰ：８．４７
【０１９５】
・ヌクレオチド配列(Ｆ４(ｐ５１)＊について)
【表１８】
0005629647.tif 000033
0005629647.tif 000034
0005629647.tif 000035
［配列番号１８］
Ｐ２４：配列を太字で示す。
Ｐ５１：配列を大文字で示す。
Ｎｅｆ：配列を小文字で示す。
Ｐ１７：配列に下線を付す。
囲み：遺伝子構築物により導入されたヌクレオチド。
【０１９６】
・アミノ酸配列(Ｆ４(ｐ５１)＊について)
【表１９】
0005629647.tif 000036
［配列番号１９］
Ｐ２４：アミノ酸１−２３２
Ｐ５１：アミノ酸２３７−６６２
Ｎｅｆ：アミノ酸６６６−８７１
Ｐ１７：アミノ酸８７４−１００５
Ｋ(リジン)５９４：メチオニンの代わり(内部「開始コドン」)
Ｋ(リジン)４６６：トリプトファン(Ｗ)の代わり。酵素活性を除去するために導入された突然変異。
【０１９７】
Ｂ８３４(ＤＥ３)細胞におけるＦ４(ｐ５１)の発現：
Ｆ４(ｐ５１)の発現レベルおよび組換えタンパク質の可溶性を、Ｆ４発現株と並行して評価した。
【０１９８】
誘導条件：３７℃で細胞増殖／２２℃(＋１ｍＭ ＩＰＴＧ)で１９時間に渡って誘導
ブレーキングバッファー：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ：７．５、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ
ウェスタンブロット分析：
試薬    ウサギポリクローナル抗ＲＴ（ウサギＰＯ３Ｌ１６）（希釈率：１／１００００）
ウサギポリクローナル抗Ｎｅｆ−Ｔａｔ（ウサギ３８８）（希釈率：１／１００００）
アルカリホスファターゼコンジュゲート抗ウサギ抗体（希釈率：１／７５００）
粗抽出物(Ｔ)、不溶性ペレット(Ｐ)および上清(Ｓ)に対応する細胞画分を、１０％還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析した。
【０１９９】
図１１に示されるように、Ｆ４(ｐ５１)は、Ｆ４と同様、高レベルで発現された(総タンパク質の１０％)。ほとんど全てのＦ４(ｐ５１)は細胞抽出物の可溶性画分(Ｓ)中に回収される。抗Ｎｅｆ−ｔａｔ試薬を用いる検出に際しては、Ｆ４(ｐ５１)のＷＢパターンが単純化されることが示された(６０ｋＤａ付近より小さい切断された産物の減少)。
【０２００】
Ｂ８３４(ＤＥ３)細胞におけるＦ４(ｐ５１)＊の発現：
Ｆ４(ｐ５１)＊組換え株を、Ｆ４(ｐ５１)非突然変異型構築物、Ｆ４およびＦ４＊と並行して、２２℃で１８時間に渡って誘導した。粗細胞抽出物を調製し、クマシー染色ゲルおよびウェスタンブロッティングにより分析した。図１２に示されるように、Ｆ４(ｐ５１)およびＦ４(ｐ５１)＊融合体の高い発現が観察され、それは総タンパク質の少なくとも１０％であった。ＷＢパターン：６０ｋＤａ付近より小さい切断された産物の減少。さらに、Ｆ４(ｐ５１)＊構築物については、４７ｋＤａのバンド(内部開始部位に起因する)が消失した。
【実施例７】
【０２０１】
Ｆ４、Ｆ４(ｐ５１)＊およびＦ４＊の精製−精製方法Ｉ
４つのＨＩＶ抗原ｐ２４−ＲＴ−Ｎｅｆ−ｐ１７を含む融合タンパク質Ｆ４を、以下の基本工程：
・Ｆ４の硫酸アンモニウム沈殿
・ＳＯ３フラクトゲル陽イオン交換クロマトグラフィー(ポジティブモード)
・オクチルセファロース疎水性相互作用クロマトグラフィー(ポジティブモード)
・ＱセファロースＦＦ陰イオン交換クロマトグラフィー(ポジティブモード)
・ＳＤＳの存在下でのＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ゲル濾過クロマトグラフィー
・透析および濃縮
を含む精製方法Ｉに従って、大腸菌細胞のホモジネートから精製した。
【０２０２】
さらに、Ｆ４(ｐ５１)＊融合タンパク質(追加の突然変異Ｍｅｔ５９２Ｌｙｓを有するコドン最適化されたｐ５１により置換されたＲＴ)およびＦ４＊タンパク質(追加のＭｅｔ５９２Ｌｙｓ突然変異を有するＦ４)を、同じ精製方法Ｉを用いて精製した。
【０２０３】
タンパク質の定量
・総タンパク質をＬｏｗｒｙアッセイを用いて測定した。タンパク質濃度を測定する前に、全てのサンプルをＰＢＳ、０．１％ＳＤＳに対して一晩透析して、干渉物質（尿素、ＤＴＴ）を除去する。ＢＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）を標準として用いた。
【０２０４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット
・サンプルを還元的または非還元的ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー(＋／−β−メルカプトエタノール)中で調製し、９５℃で５分間加熱した。
・プレキャストＮｏｖｅｘ Ｔｒｉｓ−グリシンゲルまたはＣｒｉｔｅｒｉｏｎゲル（Bio-Rad）（１ｍｍの厚さ）を用いて、２００Ｖで７５分間、４−２０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで、タンパク質を分離した。
・タンパク質を、クマシーブルーＲ２５０を用いて可視化した。
・ウェスタンブロット(ＷＢ)のために、タンパク質を、４℃にて、１００Ｖで１．５時間、または３０Ｖで一晩、ＳＤＳゲルからニトロセルロース膜（Bio-Rad）にトランスファーした。
・Ｆ４を、種々の抗原に対するモノクローナル抗体（抗ｐ２４、抗Ｎｅｆ−Ｔａｔ、抗ＲＴ）を用いて検出した(時には抗ｐ２４と抗Ｎｅｆ−Ｔａｔの混合物を用いて、最大数のタンパク質バンドを検出した)。
・アルカリホスファターゼコンジュゲート抗マウスまたは抗ウサギ抗体を一次抗体に結合させ、タンパク質バンドをＢＣＩＰおよびＮＢＴを基質として用いて可視化した。
【０２０５】
抗大腸菌ウェスタンブロット
・５μｇのタンパク質（Ｌｏｗｒｙ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、上記のようにニトロセルロース膜にトランスファーした。
・残りの宿主細胞タンパク質を、ポリクローナル抗大腸菌抗体を用いて検出した。タンパク質バンドを、上記のようにアルカリホスファターゼ反応を用いて可視化した。
【０２０６】
精製方法Ｉ
方法Ｉは、硫酸アンモニウムによる沈殿および４つのクロマトグラフィー工程を含む：
・大腸菌細胞を、１０ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１ｍＭ ＥＤＴＡの存在下、ＯＤ５０で、５０ｍＭ ＴｒｉｓバッファーｐＨ８．０中でホモジナイズした（〜３６０ｍｌ）。２回のＲａｎｎｉｅでのパッセージを１０００バールで行った。
・細胞破片および不溶性物質を、１４４００×ｇで２０分間の遠心分離により除去した。
・清澄化した上清に硫酸アンモニウム（ＡＳ）を３．８Ｍストック溶液から１．２Ｍの最終濃度で添加した。タンパク質を約２時間、室温（ＲＴ）にて沈殿させた後、遠心分離（１４４００×ｇで１０分間）によりペレット化した。ペレットを、１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０中の８Ｍ尿素、１０ｍＭ ＤＴＴ中に再懸濁した。
・抗原を、リン酸バッファー中の８Ｍ尿素および１０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．０の存在下で、ＳＯ３フラクトゲルカラム（Merck）で捕捉した。カラムを洗浄して未結合のタンパク質を溶出させた後、１７０ｍＭ ＮａＣｌを用いて予備溶出工程を行って、結合した宿主細胞タンパク質(ＨＣＰ)を除去した。次いで、Ｆ４を、リン酸バッファーｐＨ７．０中の４６０ｍＭ ＮａＣｌ、８Ｍ尿素、１０ｍＭ ＤＴＴを用いて溶出させた。
・ＳＯ３溶出液を、１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ７を用いて２倍希釈し、リン酸バッファーｐＨ７．０中の４Ｍ尿素、１ｍＭ ＤＴＴ、２３０ｍＭ ＮａＣｌの存在下でオクチルセファロースカラム(Amersham Biosciences)にロードした。洗浄工程(平衡化バッファー)の後、結合したＦ４を、２５ｍＭ ＴｒｉｓバッファーｐＨ８．０中の８Ｍ尿素、１ｍＭ ＤＴＴを用いて溶出させた。
・オクチル溶出液を希釈し、ｐＨ９．０に調整した後、Ｆ４を、８Ｍ尿素ｐＨ９．０(２５ｍＭ Ｔｒｉｓ)の存在下でＱセファロースカラム(Amersham Bioscience)に結合させた。未結合のタンパク質を洗浄除去し(８Ｍ尿素、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０)、予備溶出工程(８Ｍ尿素、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ９．０中の９０ｍＭ ＮａＣｌ)によりＨＣＰおよびＦ４分解産物を除去した。Ｆ４を、Ｔｒｉｓバッファー、ｐＨ９．０中の２００ｍＭ ＮａＣｌ、８Ｍ尿素を用いてカラムから脱離させた。
・Ｑ溶出液のアリコートに１％ＳＤＳを加え、０．１％ＳＤＳおよび１ｍＭ ＤＴＴを含むＰＢＳバッファーに対して透析して、尿素を除去した後、サンプルをゲル濾過カラム(調製グレードのＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００、横に接続した２本の１６×６０ｃｍカラム)に注入した。対応する画分を、工程途中のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析後にプールした。
・サンプルを、１１０．５Ｍアルギニン、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５ｍＭグルタチオン、ｐＨ８．５に対して一晩、透析膜(１２−１４ｋＤａカットオフ)中でＲＴにて２回透析した。
【０２０７】
一連の精製工程を以下のフローチャートに示す。
精製フローチャート
３６０ｍｌホモジネートＯＤ５０(Ｒａｎｎｉｅ)
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１ｍＭ ＰＭＳＦ、１０ｍＭ ＤＴＴ、２ｍＭ ＥＤＴＡ
↓
清澄化
１４４００×ｇでの２０分間の遠心分離
↓
硫酸アンモニウム沈殿
１．２Ｍ ＡＳ、ＲＴで２時間、１４４００×ｇ、１０分間の遠心分離
↓
ペレットを、８Ｍ尿素、１０ｍＭ ＰＯ４、１０ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．０に再懸濁
↓
(＋)ＳＯ３フラクトゲルＥＭＤ６５０(Ｍ)クロマトグラフィー
ｐＨ７．０、８Ｍ尿素、１０ｍＭ ＤＴＴ、１７０ｍＭ ＮａＣｌでの予備溶出、溶出４６０ｍＭ ＮａＣｌ
↓
ｐＨ７．０、４Ｍ尿素、５ｍＭ ＤＴＴ、２３０ｍＭ ＮａＣｌに２倍希釈
↓
(＋)オクチルセファロースクロマトグラフィー
ｐＨ７．０、４Ｍ尿素、２３０ｍＭ ＮａＣｌ、溶出８Ｍ尿素、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０
↓
約２倍希釈、ｐＨ９．０に調整(ＮａＯＨ)
↓
(＋)ＱセファロースＦＦクロマトグラフィー
Ｔｒｉｓ ｐＨ９．０、８Ｍ尿素、予備溶出９０ｍＭ ＮａＣｌ、溶出２００ｍＭ ＮａＣｌ
↓
１％ＳＤＳの添加
↓
透析
→ＴＢＳ、０．１％ＳＤＳ、ｐＨ８．５
↓
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ゲル濾過クロマトグラフィー１６×１２０ｃｍ
ＴＢＳ、０．１％ＳＤＳ、ｐＨ８．５
↓
ＩＰＡ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
↓
プール／濃縮／透析
→製剤適合性バッファー
ＩＰＡ−工程途中の分析（in process analysis）
全てのバッファーは、特に指摘しない限り、１ｍＭ ＤＴＴを含む。
【０２０８】
Ｆ４の精製の結果
精製プロセスのＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンブロットによる追跡
図１３は、Ｆ４の精製中に回収されたＦ４を含有する画分のＳＤＳゲルおよび抗ｐ２４／抗Ｎｅｆ−Ｔａｔウェスタンブロットを示す。
【０２０９】
大腸菌ホモジネートを図１３、レーン２に示すが、Ｆ４は総タンパク質の約１０％に相当すると見積もられる(クマシーブルー染色されたＳＤＳゲルの密度スキャン)。遠心分離後、Ｆ４の可溶性画分は、清澄化された上清(レーン３)中に回収された。硫酸アンモニウム沈殿工程により多くの不純物を除去し(レーン４)、その後のクロマトグラフィー工程のためにタンパク質電荷を低下させた。さらに、８Ｍ尿素を用いて沈殿を懸濁して、Ｆ４とＨＣＰとの複合体を解離させ、ＳＯ３樹脂によるＦ４の完全な捕捉および同樹脂からの定量的溶出の両方を可能にした。レーン５に示されるＳＯ３溶出物においては、かなりＦ４が富化されているが、異種性パターンは基本的に未変化のままであった。疎水性オクチルセファロースカラムは主に低分子量(ＬＭＷ)のＨＣＰおよびＦ４分解産物を除去し(レーン６)、それによってＦ４パターンを単純化した。ＱセファロースクロマトグラフィーはさらにＦ４パターンを単純化し、多くの不純物を除去した(レーン７)。大腸菌の不純物の点での最終的な純度がこの工程後に得られた。実際、抗大腸菌ウェスタンブロット分析によっては、Ｑ溶出物中に宿主細胞タンパク質は検出されなかった。かくして産生された精製済みＦ４をＦ４Ｑと呼ぶ。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムは完全長Ｆ４からＬＭＷ Ｆ４分解産物を分離し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００溶出物中でのＦ４の均質性を改善した(レーン８)。用語Ｆ４Ｓを、方法Ｉの完全なスキームに従って精製されたＦ４について用いる。
【０２１０】
抗大腸菌ウェスタンブロットを、Ｆ４の精製中に回収された同じ画分について行った。抗大腸菌ウェスタンブロット上に可視的バンドがないことは、Ｑ溶出物およびＳｕｐｅｒｄｅｘ溶出物中に存在するＨＣＰ夾雑物が１％未満であることを示していた。
【０２１１】
Ｆ４およびタンパク質の回収
精製プロセスの各工程でのＦ４の回収を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析から評価した。ＳＤＳゲルからのＦ４の回収を評価するために、ＳＤＳゲル上に載せられるサンプル容量は、精製中に回収されるそれぞれの画分の容量に対応させる。
【０２１２】
表１は、Ｆ４を含有する画分中でのタンパク質の回収を示す。
【表２０】
0005629647.tif 000037
【０２１３】
この表は、清澄化工程の後に上清中に回収された、ホモジネートおよび可溶性物質、Ｆ４を含めたタンパク質の量を示す。ＡＳ沈殿工程は大量のＨＣＰを除去し、Ｆ４のわずかな損失のみがＳＤＳゲルで観察された。ＳＯ３クロマトグラフィーはさらに多くの不純物を除去し、ＳＤＳゲルはＦ４の高い回収を示した。対照的に、オクチルセファロースおよびＱセファロースカラムの両方では、測定された約５０％のタンパク質の回収は、Ｆ４の損失も伴っていた。ゲル濾過クロマトグラフィー後のタンパク質の回収は約５０％であった。ＳＤＳゲルは、Ｆ４回収の減少に付随して、多くのＬＭＷタンパク質バンド(Ｆ４分解バンド)が除去されたことを示している。
【０２１４】
Ｆ４の収率
上記の表１は、約３６ｍｇの精製されたＦ４がＯＤ５０の３６０ｍｌのホモジネートから得られたことを示している。従って、ＯＤ５０の１Ｌのホモジネートは約１００ｍｇの精製されたＦ４をもたらすはずである。７０〜９０のＯＤが発酵プロセス中に達成されたため、１Ｌの発酵装置あたりの収率は従って１４０〜１８０ｍｇの範囲のＦ４である。
【０２１５】
Ｆ４(ｐ５１)＊の精製の結果
Ｆ４(ｐ５１)＊融合構築物を、改変せずに上記の精製方法Ｉを用いて精製した。
【０２１６】
精製プロセスのＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンブロットによる追跡
図１４は、Ｆ４(ｐ５１＊)の精製中に回収されたＦ４(ｐ５１)＊を含有する画分のＳＤＳゲルおよび抗ｐ２４／抗Ｎｅｆ−Ｔａｔウェスタンブロットを示す。
【０２１７】
ＳＤＳゲルおよびウェスタンブロットは、Ｆ４(ｐ５１)＊融合タンパク質が、全体的には、硫酸アンモニウム沈殿工程において、ならびにクロマトグラフィー工程中にＦ４と同様に振舞ったことを示している。精製されたＦ４(ｐ５１)＊は精製されたＦ４と類似する均質なパターンを有していた。
【０２１８】
抗大腸菌ウェスタンブロットは、Ｑ溶出物およびＳｕｐｅｒｄｅｘ溶出物の両方におけるＨＣＰ夾雑物が１％未満であることを示していた。
【０２１９】
収率
約２５％のＦ４(ｐ５１)＊がホモジネートの不溶性画分中から失われた。さらに、この精製方法はこのタンパク質には適合しないため、クロマトグラフィー工程において損失が観察された。従って、Ｆ４(ｐ５１)＊の全体の回収はホモジネート１リットル(ＯＤ５０)あたり約２５ｍｇに減少した。ＯＤ１７７で１リットルの培養物を想定した場合、収率は従って８５ｍｇ程度のＦ４(ｐ５１)＊となる。
【０２２０】
Ｆ４＊の精製の結果
Ｆ４＊融合構築物を、改変せずに上記の精製方法Ｉを用いて精製した。
【０２２１】
精製プロセスのＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウェスタンブロットによる追跡
図１５は、Ｆ４＊の精製中に回収されたＦ４＊含有画分のＳＤＳゲルおよび抗ｐ２４／抗Ｎｅｆ−Ｔａｔウェスタンブロットを示す。
【０２２２】
Ｆ４(ｐ５１)＊と同様、Ｆ４＊は全体的に精製手順中にＦ４と全く同様に振舞ったことにも気づくであろう。このタンパク質は、ＳＤＳゲルおよびウェスタンブロットにより示された予想される画分中に回収された。抗大腸菌ウェスタンブロットはまた、多くのＨＣＰがＱセファロースカラム後に既に排除されたことを示していた。
【０２２３】
収率
全体の回収は、ＯＤ５０の４６５ｍｌのホモジネートから得られた約１７ｍｇの精製されたＦ４＊であった。ＯＤ１４０の１Ｌの培養物を想定した場合、収率は従って１００ｍｇ程度のＦ４＊となる。
【０２２４】
まとめると、３種類の融合タンパク質Ｆ４、Ｆ４(ｐ５１)＊およびＦ４＊を、精製方法Ｉを用いて精製した。図１６中のＳＤＳゲルは、Ｑセファロース工程後、およびＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムによるＬＭＷバンドの排除後の３種類の精製されたタンパク質を比較し、前記構築物の異なるレベルの均質性を示す。
【実施例８】
【０２２５】
Ｆ４およびＦ４ｃｏ(コドン最適化)の精製−精製方法ＩＩ
精製方法ＩＩ
方法Ｉと比較して単純化された精製手順である方法ＩＩも開発した。方法ＩＩは、２つのクロマトグラフィー工程およびバッファー交換のための最終的な透析／ダイアフィルトレーションのみからなる。注目すべきことに、ＣＭハイパーＺクロマトグラフィーカラム(BioSepra)を導入して、方法Ｉの清澄化工程、硫酸アンモニウム沈殿およびＳＯ３クロマトグラフィー(実施例７)を置換した。方法ＩＩを用いて、Ｆ４および完全にコドン最適化されたＦ４(「Ｆ４ｃｏ」)の両方を精製した。Ｆ４ｃｏについては、１つはカルボキシアミド化を含み、１つはそれを含まない、２つの異なる形態の方法ＩＩを実施した。カルボキシアミド化工程の目的は、タンパク質の酸化的凝集を防止することであった。このカルボキシアミド化を、１回目のクロマトグラフィー工程の後に実施する(ＣＭハイパーＺ)。
【０２２６】
・大腸菌細胞(Ｆ４またはＦ４ｃｏを発現する)を、ＯＤ９０で、１０ｍＭ ＤＴＴの存在下で５０ｍＭ ＴｒｉｓバッファーｐＨ８．０中でホモジナイズした。２回のＲａｎｎｉｅでのパッセージを１０００バールで行った。
・８Ｍ尿素をホモジネートに添加した後、ホモジネートをｐＨ７のリン酸バッファー中の８Ｍ尿素で平衡化させたＣＭハイパーＺ樹脂(BioSepra)に用いた。抗原の捕捉をバッチ様式で行った。次いで、この樹脂をカラム中に充填し、未結合のタンパク質を平衡化バッファーを用いて洗浄除去し、結合した宿主細胞タンパク質(ＨＣＰ)を、１２０ｍＭ ＮａＣｌを用いる前溶出工程により除去した。次いで、Ｆ４ｃｏを、ｐＨ７．０のリン酸バッファー中の３６０ｍＭ ＮａＣｌ、８Ｍ尿素、１０ｍＭ ＤＴＴを用いて溶出させた。
・融合タンパク質の酸化的凝集を抑えるために、Ｆ４ｃｏのシステイン基をヨードアセトアミドを用いてカルボキシアミド化することができる。従って、必要に応じて、５０ｍＭのヨードアセトアミドをＣＭハイパーＺ溶出物に添加し、暗室中、室温にて３０分間、カルボキシアミド化を行った。
・次いで、ＣＭハイパーＺ溶出物を十分に希釈し(約５〜８倍)、ｐＨ９．０に調整した。次いで、Ｆ４ｃｏまたはＦ４ｃｏｃａを、ＴｒｉｓバッファーｐＨ９．０中の８Ｍ尿素の存在下でＱセファロースカラム(Amersham Bioscience)に結合させた。未結合のタンパク質を平衡化バッファーを用いて洗浄除去し、同じバッファー中の９０ｍＭ ＮａＣｌ(非カルボキシアミド化タンパク質についてのみ)を用いる前溶出工程により結合したＨＣＰを除去した。Ｆ４ｃｏをＴｒｉｓバッファーｐＨ９．０中の２００ｍＭ ＮａＣｌ、８Ｍ尿素を用いて、カラムから脱離させた。
・サンプルを、１Ｌの０．５Ｍアルギニン、１０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー、１０ｍＭグルタチオン(非カルボキシアミド化タンパク質についてのみ添加)、ｐＨ８．５に対して一晩、透析膜(１２−１４ｋＤａカットオフ)中、ＲＴにて２回透析した。あるいは、バッファー交換を、３０または５０ｋＤａのカットオフを有する接線流膜（tangential flow membrane）を用いて、１０倍サンプル容量の同じバッファーに対するダイアフィルトレーションにより行った。
・最後に、透析産物を０．２２μｍの膜を通して滅菌濾過した。
【０２２７】
一連の精製工程を以下のフローチャートに示す。
精製フローチャート
ホモジネートＯＤ９０(Ｒａｎｎｉｅ)
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＤＴＴ
↓
８Ｍ尿素の添加、ｐＨ７．０に調整
↓
(＋)ＣＭハイパーＺクロマトグラフィー
ｐＨ７．０、８Ｍ尿素、１０ｍＭ ＤＴＴ、１２０ｍＭ ＮａＣｌで前溶出、溶出３６０ｍＭ ＮａＣｌ
↓
必要に応じたカルボキシアミド化：５０ｍＭヨードアセトアミドの添加、ＲＴにて３０分間
↓
希釈およびｐＨ９．０に調整、８Ｍ尿素
↓
(＋)ＱセファロースＦＦクロマトグラフィー
Ｔｒｉｓ ｐＨ９．０、８Ｍ尿素、ＮａＣｌ＊で前溶出、溶出
↓
透析／ダイアフィルトレーション
→リン酸バッファー、０．５Ｍアルギニン、ｐＨ８．５(１０ｍＭグルタチオン)
↓
滅菌濾過
全てのバッファーは、Ｆ４ｃｏがカルボキシアミド化されていない場合にはＤＴＴおよび精製されたバルク中にグルタチオンを含んでいた。一度、タンパク質がカルボキシアミド化されれば、還元剤を除去した。＊ＮａＣｌ：Ｆ４ｃｏについては、これは２００ｍＭ ＮａＣｌであり、Ｆ４ｃｏｃａについては、溶出はＮａＣｌの勾配によるものであった。この工程を、Ｆ４ｃｏｃａについては６０ｍＭ ＮａＣｌを用いる前溶出および１００ｍＭ ＮａＣｌを用いる溶出により；ならびにＦ４ｃｏについては１００ｍＭ ＮａＣｌを用いる溶出(前溶出工程は必要ない)によりさらに最適化することができる。
【０２２８】
結果：Ｆ４ｃｏの精製
図１７は、Ｆ４ｃｏの精製およびカルボキシアミド化されたＦ４ｃｏ(「Ｆ４ｃｏｃａ」)の精製中に回収されたＦ４を含む画分のＳＤＳゲルを示す。
【０２２９】
ＣＭハイパーＺ樹脂は、８Ｍ尿素の存在下で粗ホモジネート(レーン１)からＦ４ｃｏを完全に捕捉し、３６０ｍＭ ＮａＣｌを用いて定量的溶出を達成した。レーン２に示されたＣＭハイパーＺ溶出物はＦ４ｃｏ中でかなり富化されていた。好適な希釈およびサンプルのｐＨ９への調整の後、Ｆ４ｃｏまたはＦ４ｃｏｃａをＱセファロースカラムに結合させた。次いで、Ｆ４ｃｏまたはＦ４ｃｏｃａを、レーン３に示されるように２００ｍＭ ＮａＣｌを用いて特異的に溶出させた。このクロマトグラフィーは残存する宿主細胞タンパク質だけでなく、ＤＮＡおよびエンドトキシンをも除去した。製剤適合性バッファー中に精製された物質を入れるために、Ｑセファロース溶出物を、１２〜１４ｋＤａのカットオフを有する透析膜中の１０ｍＭ Ｔｒｉｓバッファー、０．５Ｍアルギニン、１０ｍＭグルタチオンｐＨ８．５に対して透析した。グルタチオンはカルボキシアミド化されたタンパク質については省略した。
【０２３０】
Ｆ４ｃｏおよびＦ４ｃｏｃａの両方の精製により、ＯＤ１３０の培養物１Ｌあたり約５００ｍｇの精製された物質が得られた。これはコドン最適化されていないＦ４を用いる前に観察されたものと類似する範囲にあった。
【０２３１】
上記のように、２つの異なる精製方法(ＩおよびＩＩ)を、異なるＦ４構築物を精製するために開発した。図１８は、得られた異なる精製バルクを比較するものである。
【０２３２】
図１８中のＳＤＳゲルは、２つの異なるタンパク質、Ｆ４およびＦ４ｃｏの識別パターンを明確に図示するものである。Ｆ４はいくつかの強い低分子量(ＬＭＷ)のバンドを示したが、コドン最適化されたＦ４ｃｏについてはかすかなバンドのみが可視的であった。方法Ｉおよび方法ＩＩは非常に類似するＦ４ｃｏパターンをもたらした。抗大腸菌ウェスタンブロット分析により、精製されたタンパク質の純度を確認したところ、全ての調製物中で１％未満の宿主細胞タンパク質夾雑物を示した。
【実施例９】
【０２３３】
マウスにおけるＦ４の免疫原性
製剤：
アジュバント製剤１Ｂ：
アジュバント製剤１Ｂを調製するために、有機溶媒中の脂質(卵黄由来もしくは合成由来のホスファチジルコリンなど)およびコレステロールおよび３Ｄ−ＭＰＬの混合物を減圧下で(またはあるいは、不活性ガス流下で)乾燥する。次いで、水性溶液(リン酸緩衝生理食塩水など)を加え、全ての脂質が懸濁されるまで容器を攪拌する。次いで、この懸濁液を、リポソームの大きさが約１００ｎｍに減少するまで微小流体化した後、０．２μｍフィルターを通して滅菌濾過する。押出しまたは超音波処理をこの工程の代わりに行ってもよい。
【０２３４】
典型的には、コレステロール：ホスファチジルコリン比は１：４(ｗ／ｗ)であり、水性溶液を添加して５〜５０ｍｇ／ｍｌの最終コレステロール濃度を得る。
【０２３５】
リポソームは１００ｎｍの規定の大きさを有し、ＳＵＶ(小型単層小胞)と呼ばれる。この溶液を繰り返し凍結／解凍すると、小胞は融合して、５００ｎｍ〜１５μｍの範囲の大きさの大きな多層構造物(ＭＬＶ)を形成する。リポソーム自体は長時間に渡って安定であり、融合能力を有さない。
【０２３６】
水性溶液中のＱＳ２１をリポソームに添加して、１００μｇ／ｍｌの最終３Ｄ−ＭＰＬおよびＱＳ２１濃度を達成する。
【０２３７】
製剤２Ａ：水中油型乳濁液中の３−脱アシル化モノホスホリルリピドＡおよびＱＳ２１：
水中油型乳濁液の調製は、ＷＯ９５／１７２１０に記載のプロトコルに従うことにより行うことができる。詳細には、この乳濁液は５％スクアレン、５％トコフェロール、２．０％ｔｗｅｅｎ ８０を含み、その粒径は１８０ｎｍである。
【０２３８】
水中油型乳濁液の調製(２倍濃縮物)
Ｔｗｅｅｎ ８０をリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)中に溶解して、ＰＢＳ中の２％溶液を得る。１００ｍｌの２倍濃縮乳濁液を得るために、５ｇのＤＬαトコフェロールおよび５ｍｌのスクアレンをボルテックスして完全に混合する。９０ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液を添加し、完全に混合する。次いで、得られた乳濁液をシリンジに通し、Ｍ１１０Ｓ微小流体装置を用いることにより最終的に微小流体化する。得られる油滴は約１８０ｎｍの大きさを有する。
【０２３９】
滅菌バルク乳濁液をＰＢＳに添加して、１ｍｌあたり５００μｌの乳濁液の最終濃度(ｖ／ｖ)を達成する。次いで、３Ｄ−ＭＰＬを添加して、１００μｇの最終濃度を達成する。次いで、ＱＳ２１を添加して、１００μｇ／ｍｌの最終濃度を達成する。成分のそれぞれの添加の間に、中間生成物を５分間攪拌する。
【０２４０】
精製方法Ｉに従って精製された、コドン最適化されていないＦ４Ｑを、リン酸／アルギニンバッファーｐＨ６．８中で希釈した。この希釈液を２つの異なる濃度のアジュバント(アジュバント２Ａおよび１Ｂ)と混合して、２９０(アジュバント２Ａについて)−３００(アジュバント１Ｂについて)ｍＭのアルギニン、５０μｇのＭＰＬおよび５０μｇのＱＳ２１の存在下で、５００μｌのＦ４の４０μｇ／用量の最終製剤を取得した。１００μｌの各製剤をマウスに注入した。
【０２４１】
マウスの免疫原性試験を実施して、Ｆ４内に認められる４つの抗原(ｐ２４、ｐ１７、ＲＴおよびＮｅｆ)に対する細胞性および体液性免疫応答を評価した。
【０２４２】
Ｆ４抗原の複雑性に起因して、それぞれ異なる遺伝的背景を有する８系統のマウスを、１００μｌの容量中、上記のように調製された８μｇのアジュバント化されたＦ４タンパク質を用いて、０日目および２１日目に２回免疫した。血清および脾臓サンプルを、Ｆ４の４つの成分の各々(ｐ２４、ｐ１７、ＲＴおよびＮｅｆ)、ならびにＦ４に対する体液性および細胞性応答の分析のために、最後の免疫(３５日目)の１４日後に回収した。
【０２４３】
総抗体応答を、ｐ２４、ｐ１７、ＲＴ、ＮｅｆおよびＦ４にとって特異的なＥＬＩＳＡにより特性評価した。以下の表２は、抗原特異的体液性応答が各系統において観察された場合をまとめたものである。この結果は、アジュバントのみで免疫された対照動物と比較した抗体の存在または不在を示す。示した結果は、２回の別々であるが同一の実験からのまとめである。表中、２Ａは水中油型乳濁液中で３Ｄ−ＭＰＬおよびＱＳ２１を用いて製剤化された抗原を指し、１Ｂは３Ｄ−ＭＰＬ、ＱＳ２１およびコレステロールを含むリポソームを用いて製剤化された抗原を指す。
【表２１】
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【０２４４】
ＯＦ１マウスでは４つ全てのＦ４成分に対する抗体応答を増加していた。観察された応答を図１９に示す。＋／−は、観察された応答が弱いか、または２つのアジュバントの１つについてのみ観察されたことを示す。例えば、Ｂ６Ｄ２Ｆ１マウスのｐ１７応答：全体として＋／−であり、＋２Ａおよび−１Ｂとは、２Ａについての応答(弱くない)が存在し、１Ｂについての応答が存在しないことを意味する。Ｂａｌｂ／ｃマウスのｐ１７応答：全体としては−であり、＋／−２Ａおよび−１Ｂとは、この場合＋／−はアジュバント２Ａについての応答が弱かったことを意味する。
【０２４５】
細胞性応答を、１１ｍｅｒの重複を有する１５ｍｅｒのペプチドライブラリープールを用い、ｐ２４、ｐ１７、ＲＴまたはＮｅｆに特異的なペプチドを用いた脾臓細胞の再刺激後に、ＣＤ４およびＣＤ８、ＩＦＮγおよびＩＬ−２発現についてのフローサイトメトリー染色(ＩＦＮγおよびＩＬ−２発現についての細胞内サイトカイン染色)により特性評価した。ＣＤ４応答は主要な細胞応答であることが観察された。以下の表３は、抗原特異的ＣＤ４＋ＩＬ−２＋応答が各マウス系統について観察された場合をまとめたものである。ここでも、これは応答の存在または不在として示されるものである。
【表２２】
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【０２４６】
ＤＢＡマウスでは４つ全てのＦ４成分に対するＣＤ４応答を増加していた。このマウス系統について観察されたＣＤ４＋ＩＬ−２＋およびＣＤ４＋ＩＦＮγ＋応答を、図２０に示す。
【０２４７】
まとめると、２つのアジュバント製剤のいずれかにおいて製剤化されたＦ４は、ｐ２４、ｐ１７、ＲＴおよびＮｅｆに対する体液性および細胞性応答を促進することができる。これは、Ｆ４の各領域がｉｎ ｖｉｖｏ状況において免疫原性であることを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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