(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ペプチド性リンカーによってポリペプチド薬物との結合体を製造するためのキャリアとしての、ＩｇＧ  Ｆｃ断片の使用（ただし、該結合体は、組換え的な方法によって製造された融合蛋白質でない。）であり、
上記ＩｇＧ  Ｆｃ断片が配列番号８、１０または２３のアミノ酸配列を有するＦｃ断片である、ＩｇＧ  Ｆｃ断片の使用。
【請求項２】
前記ＩｇＧ  Ｆｃ断片が非糖鎖化されたものである請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ＩｇＧ  Ｆｃ断片がＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４ドメインよりなる群から選択される１〜４個のドメインから構成される請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記ＩｇＧ  Ｆｃ断片がヒンジ領域をさらに含む請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記ＩｇＧ  Ｆｃ断片がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、これらの組み合わせ及びこれらのハイブリッドのＦｃ断片よりなる群から選択される請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記ＩｇＧ  Ｆｃ断片がＩｇＧ４  Ｆｃ断片である請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記ＩｇＧ  Ｆｃ断片がヒト非糖鎖化ＩｇＧ４  Ｆｃ断片である請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記ＩｇＧ  Ｆｃ断片が配列番号４、９または２２の塩基配列によってコードされる請求項１に記載の使用。
【請求項９】
前記ＩｇＧ  Ｆｃ断片が原核細胞宿主を使用して製造した組換え型ＩｇＧ  Ｆｃ断片であり、前記ポリペプチド薬物が真核細胞宿主を使用して製造した組換え型ポリペプチド薬物である請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
前記ＩｇＧ  Ｆｃ断片が非糖鎖化されたものであり、前記ポリペプチド薬物が糖鎖化されたものである請求項１に記載の使用。
【請求項１１】
前記ＩｇＧ  Ｆｃ断片がポリペプチド薬物に対して１：１〜１：１０のモル比で使用される請求項１に記載の使用。
【請求項１２】
前記非ペプチド性リンカーがポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン及びヒアルロン酸よりなる群から選択される請求項１に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物のキャリアとして有用なＩｇＧ Ｆｃ断片に関するものであり、より具体的には、ＩｇＧ２ Ｆｃ並びにＩｇＧ４ Ｆｃ断片、この組み合わせ(combination)およびこのハイブリッド(hybrid)に関するものである。また、本発明は、前記ＩｇＧ Ｆｃ断片を発現させるための発現ベクター、前記発現ベクターによって形質転換された形質転換体および前記形質転換体を培養して免疫グロブリンＦｃ断片を製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
過去、数多くの薬学者および化学者は、天然的に存在する生理活性分子の生体活性を化学的に変化および／または修飾しようと努力した。このような努力の大部分は、生理活性物質の特定の生体活性を増加させたり、生体活性を持続させたり、毒性を減少させたり、副作用を除去または減少させたり、特定の生理活性を修飾することであった。生理活性物質が化学的に修飾される場合、大部分は生理活性が除去されるかあるいは相当減少するが、場合によっては生理活性が増加または変化することもある。したがって、目的とするところに応じて生理活性を変化させることが可能な化学修飾についての研究が多く行われており、大部分の研究は、生理活性物質（薬物）を生理学的に許容可能なキャリアと共有結合させることであった。
【０００３】
国際特許公開公報第ＷＯ０１／９３９１１号には、多数の酸性残基を持つ重合体が薬物のキャリアとして用いられた例が開示されており、国際特許公開第ＷＯ０３／００７７８号には、陰イオン基を含有する両親媒性ブロック共重合体をキャリアとして用いて陽イオン性薬物の安定性を増加させた例が開示されており、ヨーロッパ特許第０６８１４８１号には、シクロデキストリンと酸をキャリアとして塩基性薬物の特性を改善させる技術が開示されている。一方、疎水性薬物の場合、生体内での安定性の低下は、主に疎水性薬物の低い水溶解特性に起因する。このような疎水性薬物の低い水溶解特性を改善させるために、脂質(Lipid)をキャリアとして用いた技術が国際特許公開第ＷＯ０４／０６４７３１号に開示されている。ところが、今まで免疫グロブリンＦｃ断片を薬物のキャリアとして用いた例は、公知となっていない。
【０００４】
一方、一般的に、ポリペプチドは、安定性が低くて変性し易く、血液内蛋白質加水分解酵素によって分解されて腎臓または肝臓を介して容易に除去されるため、薬理成分としてポリペプチドを含む蛋白質医薬品の血中濃度および力価を保つためには、蛋白質薬物を患者に頻繁に投与する必要がある。ところが、大部分注射剤の形態で患者に投与される蛋白質医薬品の場合、活性ポリペプチドの血中濃度を保つために頻繁に注射を打つことは、患者に夥しい苦痛を引き起こす。このような問題点を解決するために、蛋白質薬物の血中安定性を増加させ、血中薬物濃度を長期間高く持続させて薬効を最大化しようという努力が続けられてきた。このような蛋白質薬物の持続性製剤は、蛋白質薬物の安定性を高めると同時に薬物自体の力価が十分高く維持されなければならず、患者に免疫反応を誘発してはならない。
【０００５】
蛋白質を安定化させ、蛋白質加水分解酵素との接触および腎臓による消失を抑制するための方法として、従来では、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol：以下「ＰＥＧ」という）のように溶解度の高い高分子を蛋白質薬物の表面に化学的に付加させる方法が使用された。ＰＥＧは、目的蛋白質の特定の部位または様々な部位に非特異的に結合して溶解度を高めることにより、蛋白質を安定化させ且つ蛋白質の加水分解を防止するのに効果があり、しかも、深刻な副作用を起こさないものとして知られている（Sada et al., J. Fermentation Bioengineering 71: 137-139, 1991）。ところが、ＰＥＧの結合により、蛋白質の安定性は増加できるが、生理活性蛋白質の力価が著しく低くなるという問題を生じる。さらに、ＰＥＧの分子量が増加するほど蛋白質との反応性が低くなり、その結果、収率が減少するという問題を生じる。
【０００６】
最近は、ＰＥＧの両末端に同一の蛋白質薬物を結合させた二重体を作って活性の増加を図ったり（米国特許第５，７３８，８４６号）、あるいはお互い異なる種類の蛋白質薬物をＰＥＧの両末端に結合させて同時に２種の活性を示す蛋白質（国際出願公開第ＷＯ９２／１６２２１号）も開発されたが、これらは蛋白質薬物の活性を持続させる面では明確な効果を示していない。
【０００７】
一方、Ｋｉｎｓｔｌｅｒ等は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）とヒトアルブミンとをＰＥＧに結合させた融合蛋白質が、増加した安定性を示すと報告した（Kinstler et al., Pharmaceutical Research 12(12): 1883-1888, 1995）。ところが、Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−アルブミン構造を有する前記文献の修飾された薬物は、体内残留時間が天然型薬物を単独で投与した場合に比べて約４倍増加するに止まり、血中半減期の増加が微々であって、蛋白質薬物の効果的な持続性製剤として実用化されていない。
【０００８】
生理活性蛋白質の生体内安定性を高める別の方法として、遺伝子組み換えにより血中安定性の高い蛋白質遺伝子と生理活性蛋白質遺伝子を連結した後、前記組み換え遺伝子で形質転換された動物細胞などを培養して融合蛋白質を生産する方法が開発されている。例えば、現在まで蛋白質の安定性の増加に最も効果が高いものと知られているアルブミンまたはその断片を、遺伝子組み換えによって目的の生理活性蛋白質に結合させて生産した融合蛋白質が報告されている（国際出願公開第ＷＯ９３／１５１９９号および第ＷＯ９３／１５２００号、ヨーロッパ特許公開第ＥＰ４１３，６２２号）。
【０００９】
また、ヒューマンゲノムサイエンス(Human Genome Science)社が酵母で生産したインターフェロンアルファとアルブミンの融合蛋白質（製品名：AlbuferonTM）は、猿でインターフェロンの半減期を５時間から９３時間に増加させたが、修飾していないインターフェロンに比べて生体活性度が５％未満に著しく減少するという問題がある（Osborn et al., J. Phar. Exp. Ther. 303(2): 540-548, 2002）。すなわち、今まで蛋白質薬物の生体内持続性と安定性を増加させながら生体内活性を同時に維持することが可能な技術は、未だ開示されたことがない。
【００１０】
一方、免疫グロブリンおよびこの断片を用いて蛋白質薬物の安定性を高めようとする試みも多く行われた。例えば、米国特許第５，０４５，３１２号では、架橋剤を用いてヒトの成長ホルモンに血清アルブミンまたはラットの免疫グロブリンを結合させることにより、修飾していない成長ホルモンに比べて成長ホルモンの活性を増加させることができることを開示している。
【００１１】
また、蛋白質薬物と免疫グロブリンＦｃを融合させようとする試みも行われた。例えば、インターフェロン（大韓民国特許公開第２００３−９４６４号）、およびインターロイキン−４受容体、インターロイキン−７受容体または赤血球生成因子受容体（大韓民国特許登録第２４９５７２号）を免疫グロブリンのＦｃ断片と融合している形態で哺乳動物で発現させた。国際特許公開第ＷＯ０１／０３７３７号では、サイトカインまたは成長因子をペプチド結合によって免疫グロブリンのＦｃ断片に結合させた融合蛋白質を製造した。また、米国特許第５，１１６，９６４号では、免疫グロブリンＦｃ断片のアミノ末端またはカルボキシル末端に遺伝子組み換え方法によって融合させた蛋白質を開示しており、米国特許第５，３４９，０５３号では、ＩＬ−２を免疫グロブリンＦｃ断片にペプチド結合によって融合させた融合蛋白質を開示している。
【００１２】
その他にも、遺伝子組み換えによって製造されたＦｃ融合蛋白質の例として、インターフェロン−βまたはその誘導体と免疫グロブリンＦｃ断片の融合蛋白質（国際特許公開第ＷＯ００／２３４７２号）、ＩＬ−５受容体と免疫グロブリンＦｃ断片の融合蛋白質（米国特許第５，７１２，１２１号）が開示されている。ところが、免疫グロブリンＦｃ断片を用いて生理活性ポリペプチド薬物の持続性を改善させようとする技術は、大部分、免疫グロブリンＦｃ断片を融合パートナーとして用いた技術に焦点が合わせられており、免疫グロブリンＦｃ断片をキャリアとして用いる技術は未だ報告されていない。
【００１３】
一方、免疫グロブリンＦｃ断片のアミノ酸を修飾する技術も公知になっているが、米国特許第５，６０５，６９０号では、免疫グロブリンＦｃ断片で特に補体結合部位または受容体結合部位のアミノ酸を改変させたＦｃを用いて遺伝子組み換え方法によって製造されたＴＮＦＲ−ＩｇＧ１ Ｆｃ融合蛋白質を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際特許公開ＷＯ０１／９３９１１号
【特許文献２】国際特許公開ＷＯ０３／００７７８号
【特許文献３】ヨーロッパ特許０６８１４８１号
【特許文献４】国際特許公開ＷＯ０４／０６４７３１号
【特許文献５】米国特許第５，７３８，８４６号
【特許文献６】国際出願公開ＷＯ９２／１６２２１号
【特許文献７】国際出願公開ＷＯ９３／１５１９９号
【特許文献８】国際出願公開ＷＯ９３／１５２００号、
【特許文献９】ヨーロッパ特許公開ＥＰ４１３，６２２号
【特許文献１０】米国特許第５，０４５，３１２号
【特許文献１１】大韓民国特許公開２００３−９４６４号
【特許文献１２】大韓民国特許登録第２４９５７２号
【特許文献１３】国際特許公開ＷＯ０１／０３７３７号
【特許文献１４】米国特許第５，１１６，９６４号
【特許文献１５】米国特許第５，３４９，０５３号
【特許文献１６】国際特許公開ＷＯ００／２３４７２号
【特許文献１７】米国特許第５，７１２，１２１号
【特許文献１８】米国特許第５，６０５，６９０号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Sada et al., J. Fermentation Bioengineering 71: 137-139, 1991
【非特許文献２】Kinstler et al., Pharmaceutical Research 12(12): 1883-1888, 1995
【非特許文献３】Osborn et al., J. Phar. Exp. Ther. 303(2): 540-548, 2002
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
ところが、このような遺伝子組み換え方法によって生産されたＦｃ融合蛋白質は、免疫グロブリンＦｃ領域の特定の部位、すなわちアミノ末端またはカルボキシル末端でのみ蛋白質融合が可能であり、同種二量体の形態でのみ発現され、単量体の形態では生産が不可能であり、糖鎖化蛋白質間の融合または非糖鎖化蛋白質間の融合のみが可能であって、糖鎖化蛋白質と非糖鎖化蛋白質との融合は不可能であるという欠点がある。また、融合によって新たに発生したアミノ酸配列により免疫反応が誘発されるおそれがあるだけでなく、リンカー部位に対する蛋白質加水分解酵素の敏感性が増加するおそれがあるという問題点を持っている。
【００１７】
このような問題を解決するために、本発明者は、前記融合技術の欠点を克服しながら薬物の生体内持続性を向上させ且つ生体内活性の減少を最小化するための方法を研究し、ＩｇＧ Ｆｃ断片、より具体的にはＩｇＧ２またはＩｇＧ４ Ｆｃ断片が薬物と結合する場合、薬物の生体内持続性を向上させかつ生体内活性の減少を最小化することができることを見出し、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の一目的は、薬物のキャリアとして有用な免疫グロブリンＧ断片を提供することにある。
【００１９】
本発明の他の目的は、免疫グロブリンＧ断片を製造するための組み換えベクターを提供することにある。
【００２０】
本発明の別の目的は、免疫グロブリンＧ断片を製造するための組み換えベクターで形質転換された形質転換体を提供することにある。
【００２１】
本発明の別の目的は、免疫グロブリンＧ断片を製造するための組み換えベクターで形質転換された形質転換体を培養して免疫グロブリンＧ断片を製造する方法を提供することにある。
【００２２】
本発明の別の目的は、免疫グロブリンＧ断片を含む薬剤学的組成物を提供することにある。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、免疫グロブリンＦｃを大腸菌で発現させた後、非還元条件でウエスタンブロットによって分析した結果である。
【図２】図２は、免疫グロブリンＦｃを１５％クライテリオンゲル（Criterion gel、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて非還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルと還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに展開させた結果である。
【図３】図３は、免疫グロブリンＦｃを１５％クライテリオンゲル（Criterion gel、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて非還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルと還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに展開させた結果である。
【図４】図４は、免疫グロブリンをパパインで切断して得た免疫グロブリンＦｃ断片をクロマトグラフィで精製した結果である。
【図５】図５は、精製された免疫グロブリンＦｃ断片をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である。
【図６】図６は、カップリング反応後に生成されたＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ（Ａ）、１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−Ｆｃ（Ｂ）およびＥＰＯ−ＰＥＧ−Ｆｃ（Ｃ）結合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である。
【図７】図７は、カップリング反応後に精製されたＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体をサイズ排除クロマトグラフィで分析した結果である。
【図８】図８は、ＥＰＯ−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器で分析した結果である。
【図９ａ】天然型免疫グロブリンＦｃと脱糖鎖化免疫グロブリンＦｃ(deglycosylated Fc：ＤＧ Ｆｃ)のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器で分析した結果である。
【図９ｂ】天然型免疫グロブリンＦｃと脱糖鎖化免疫グロブリンＦｃ(deglycosylated Fc：ＤＧ Ｆｃ)のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である。
【図１０】図１０は、ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体およびＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ結合体をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器で分析した結果である。
【図１１】図１１は、ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体、ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ ＦｃおよびＩＦＮα−ＰＥＧ−組み換えＡＧ Ｆｃ誘導体結合体を逆相ＨＰＬＣで分析した結果である。
【図１２】図１２は、天然型ＩＦＮα、ＩＦＮα−４０Ｋ ＰＥＧ、ＩＦＮα−ＰＥＧ−アルブミン結合体およびＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体の薬物動態解析グラフである。
【図１３】図１３は、天然型ＥＰＯ、高糖鎖化ＥＰＯ、ＥＰＯ−ＰＥＧ−ＦｃおよびＥＰＯ−ＰＥＧ−ＡＧ Ｆｃ結合体の薬物動態を分析したグラフである。
【図１４】ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体、ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ ＦｃおよびＩＦＮα−ＰＥＧ−組み換えＡＧ Ｆｃ誘導体結合体の薬物動態を分析したグラフである。
【図１５】図１５は、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−Ｓ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体、Ｆａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ結合体およびＦａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ結合体の薬物動態を分析したグラフである。
【図１６】図１６は、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−Ｓ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体、Ｆａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ結合体およびＦａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ結合体の細胞内活性を分析したグラフである。
【図１７】図１７は、ヒトＩｇＧサブクラスにおける補体Ｃｌｑの結合活性を比較分析したグラフである。
【図１８】図１８は、糖鎖化Ｆｃ、酵素を用いて糖を除去したＤＧ Ｆｃ、および大腸菌で生産したＡＧ Ｆｃをキャリアとして用いたインターフェロン−ＰＥＧ−キャリア結合体における補体Ｃｌｑの結合活性を比較分析したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
一つの様態として、本発明は、薬物のキャリアとして有用な免疫グロブリンＧ Ｆｃ断片に関し、より好ましくはＩｇＧ２ ＦｃおよびＩｇＧ４ Ｆｃ断片に関するものである。
本発明において、「キャリア」とは、薬物と共に結合する物質を意味し、一般に薬物に結合して薬物の生理活性を増減または除去する。ところが、本発明におけるキャリアは、本発明の目的上、結合する薬物の生理活性減少を最小化すると同時に薬物の生体内安定性は増加させるためのものである。
【００２５】
このような薬物のキャリアとして、従来から脂質(Lipid)や重合体(polymer)など多くの物質が研究されてきたが、免疫グロブリンＦｃ断片を用いた技術は未だ公知となっていない。すなわち、本発明は、結合する薬物の生体内持続性の増進と生体内活性減少の最小化のためのキャリアとして、使用可能な物質の中でも特にＩｇＧ Ｆｃ断片を提供することを特徴とし、より好ましくはＩｇＧ２ ＦｃおよびＩｇＧ４ Ｆｃ断片を提供することを特徴とする。
【００２６】
本発明において、「免疫グロブリンＧ（以下、「ＩｇＧ」と混用する）とは、抗原に選択的に作用して生体免疫に関与する蛋白質の総称であって、ヒトおよび動物から起源することができる。このような免疫グロブリンの一般構造を考察すると、免疫グロブリンは重鎖と軽鎖からなっており、重鎖不変領域はガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）、エプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）およびアルファ２（α２）を有する。軽鎖の不変領域はカッパ（κ）およびラムダ（λ）タイプを有する（Coleman et al., Fundamental Immunology, 2nd Ed., 1989, 55-73）。これらにより、免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭの亜型(isotype)に分けられる。ＩｇＧはさらにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に分けられる。
【００２７】
また、免疫グロブリンは構造的にいろいろの断片が知られているが、その例としてＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、Ｆｃなどがある。この中でも、免疫グロブリン断片Ｆａｂは、軽鎖および重鎖の可変領域、軽鎖の不変領域および重鎖の第１不変領域（ＣＨ１）を持つ構造であって、１つの抗原結合部位を持つ。免疫グロブリン断片Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域(hinge region)を持つという点でＦａｂとは差異がある。断片Ｆ（ａｂ’）２は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合を成しながら生成される。Ｆｖは、重鎖可変部位および軽鎖可変部位のみを持っている最小の抗体断片であり、ｓｃＦｖは、重鎖可変部位および軽鎖可変部位のみがペプチドリンカーで連結された単一ポリペプチド鎖である。また、Ｆｄ断片は、重鎖可変領域およびＣＨ１ドメインのみから構成された断片である。
【００２８】
すなわち、前記のような公知の様々な免疫グロブリンのタイプおよびその機能的、構造的断片の中でも、本発明は、薬物のキャリアとして有用なＩｇＧ Ｆｃ断片を提供し、特にＩｇＧ２ ＦｃおよびＩｇＧ４ Ｆｃ断片を提供することを特徴とする。
【００２９】
本発明の免疫グロブリンＧ Ｆｃ断片（以下、「ＩｇＧ Ｆｃ断片」または「本発明のＦｃ断片」と混用する）は、免疫グロブリンＧの重鎖と軽鎖可変領域、重鎖不変領域１（ＣＨ１）と軽鎖不変領域１（ＣＬ１）を除いた、重鎖不変領域２（ＣＨ２）および重鎖不変領域３（ＣＨ３）部分を意味し、重鎖不変領域にヒンジ(hinge)部分を含むこともある。また、本発明のＩｇＧ Ｆｃ領域は、天然型と実質的に同等あるいはより向上した効果を持つ限り、ＩｇＧの重鎖と軽鎖可変領域のみを除き、一部または全体重鎖不変領域１（ＣＨ１）および／または軽鎖不変領域１（ＣＬ１）を含んだ、拡張されたＦｃ断片であり、あるいはＣＨ２および／またはＣＨ３に該当する相当長い一部のアミノ酸配列が除去された断片である。
【００３０】
このような本発明のＦｃ断片は、天然型アミノ酸配列だけでなく、この配列誘導体(mutant)も含む。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列中の一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保全的または保全的置換、またはこれらの組み合わせによって相異なる配列を持つものを意味する。例えば、ＩｇＧ Ｆｃの場合、結合に重要であると知られている２１４〜２３８、２９７〜２９９、３１８〜３２２または３２７〜３３１番のアミノ酸残基が、修飾のための適当な部位として利用できる。また、ジスルフィド結合を形成することが可能な部位が除去されるか、あるいは天然型ＦｃからＮ末端の幾つかのアミノ酸が除去されるか、あるいは天然型ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加されることもあるなど様々な種類の誘導体が可能である。また、エフェクター機能を無くすために、補体結合部位、例えばＣｌｑ結合部位またはＡＤＣＣ部位が除去されることがある。このような免疫グロブリンＦｃ領域の配列誘導体を製造する技術は、国際特許公開第ＷＯ９７／３４６３１号、国際特許公開第ＷＯ９６／３２４７８号などに開示されている。
【００３１】
分子の活性を全体的に変更させない蛋白質およびペプチドにおけるアミノ酸交換は、当該分野に公知となっている（H. Neurath, R. L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979）。最も通常的に起こる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。
【００３２】
場合によっては、リン酸化(phosphorylation)、硫化(sulfation)、アクリル化(acrylation)、糖化(glycosylation)、メチル化(methylation)、ファルネシル化(farnesylation)、アセチル化(acetylation)、アミド化(amidation)などで修飾(modification)されることもできる。
【００３３】
前述したＦｃ誘導体は、本発明のＦｃ断片と同一の生物学的活性を示すが、熱やｐＨなどに対するＦｃ断片の構造的安定性を増大させた誘導体である。
【００３４】
また、このようなＦｃ断片は、ヒト、および牛や山羊、豚、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物の生体内から分離して得られた天然型であり、あるいは形質転換された動物細胞または微生物から得られた組み換え型またはその誘導体である。ここで、天然型から得る方法では、全体免疫グロブリンをヒトまたは動物の生体から分離した後、蛋白質分解酵素を処理して得ることができる。パパインを処理する場合にはＦａｂおよびＦｃに切断され、ペプシンを処理する場合にはｐＦ’ｃおよびＦ（ａｂ’）２に切断される。これらの断片からサイズ排除クロマトグラフィ(size-exclusion chromatography)などを用いてＦｃまたはｐＦ’ｃを分離することができる。好ましくは、ヒト由来のＦｃ断片は微生物から収得した組み換え型ＩｇＧ Ｆｃ断片である。すなわち、本発明は、微生物から収得したヒト由来の組み換え型ＩｇＧ２ ＦｃおよびＩｇＧ４ Ｆｃ断片が好ましい。
【００３５】
また、本発明のＦｃ断片は、天然型糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖、または糖鎖が除去された形態である。このようなＦｃ断片の糖鎖の増減または除去には、化学的方法、酵素学的方法および微生物を用いた遺伝工学的方法などの当該分野における通常の方法が利用できる。ここで、Ｆｃから糖鎖が除去されたＦｃ断片は、補体（Ｃｌｑ）への結合力が著しく低下し、抗体依存性細胞毒性または補体依存性細胞毒性が減少または除去されるので、生体内で不要な免疫反応を誘発しない。このような点において、薬物のキャリアとしての本来の目的にさらに符合する形態は、脱糖鎖化免疫グロブリンＦｃ断片、または非糖鎖化免疫グロブリンＦｃ断片である。
【００３６】
図１８からも明らかなように、糖鎖化Ｆｃは、非糖鎖化ＦｃよりＣＤＣの活性が高くて免疫反応を誘発する危険が高いと言えるので、本発明の目的上、非糖鎖化Ｆｃ断片あるいは脱糖鎖化Ｆｃ断片が好ましく、非糖鎖化ＩｇＧ２ ＦｃおよびＩｇＧ４ Ｆｃ断片、この組み合わせおよびこのハイブリッドがより好ましい。
【００３７】
本発明において、「脱糖鎖化(Deglycosylation)」はＦｃ断片から酵素によって糖を除去することを意味し、「非糖鎖化(Aglycosylation)」はＦｃ断片を糖鎖化されていない形態で原核細胞、好ましくは大腸菌で生産することを意味する。
【００３８】
一方、本発明において、「組み合わせ(combination)」とは、二量体または多量体を形成するとき、同一起源の単鎖免疫グロブリンＦｃ断片を暗号化するポリペプチドが相異なる起源の単鎖ポリペプチドと結合を形成することを意味する。すなわち、ＩｇＧ１ Ｆｃ、ＩｇＧ２ Ｆｃ、ＩｇＧ３ ＦｃおよびＩｇＧ４ Ｆｃ断片よりなる群から選択された２つ以上の断片から二量体または多量体の製造が可能である。
【００３９】
本発明において、「ハイブリッド(hybrid)」とは、単鎖の免疫グロブリンＦｃ断片内に、相異なる起源の２つ以上の免疫グロブリンＦｃ断片に該当する配列が存在することを意味する用語である。本発明の場合、様々な形態のハイブリッドが可能である。すなわち、ＩｇＧ１ Ｆｃ、ＩｇＧ２ Ｆｃ、ＩｇＧ３ ＦｃおよびＩｇＧ４ ＦｃのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４よりなる群から選択された１〜４つのドメインからなるドメインのハイブリッドが可能であり、ヒンジ領域を含むことができる。
【００４０】
一方、本発明の図１７および図１８から分かるように、ＩｇＧのいろいろなサブクラスのうち、特にＩｇＧ４は、補体（Ｃｌｑ）に対する結合力が最も低い。このように補体に対する結合力が低下すると、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ、Antibody-dependent cell cytotoxicity）および補体依存性細胞毒性(ＣＤＣ、Complement-dependent cytotoxicity)が減少または除去されるので、生体内で不要な免疫反応を誘発しなくなる。このようなＣｌｑに対する結合力は、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４ Ｆｃ断片がＩｇＧ１より低く、この中でもＩｇＧ４ Ｆｃ断片が最も低いことを確認することができる。したがって、薬物のキャリアとして用いるためには、結合するＦｃ断片の抗体依存性細胞毒性および補体依存性細胞毒性のようなエフェクター(effector)機能がより低いものを使用することが好ましいので、本発明の目的上、ＩｇＧ２ ＦｃおよびＩｇＧ４ Ｆｃ断片が好ましく、より好ましくはＩｇＧ４ Ｆｃ断片であり、最も好ましくは配列番号８、１０および２３のアミノ酸配列を持つＦｃ断片である。
【００４１】
本発明の別の様態として、本発明は、ＩｇＧ Ｆｃ断片、好ましくはＩｇＧ２ ＦｃおよびＩｇＧ４ Ｆｃ断片をコードする遺伝子に関するもので、より好ましくは配列番号８、１０および２３のアミノ酸をコードする遺伝子に関するものである。このような本発明のＦｃをコードする遺伝子は、天然型核酸配列だけでなく、この配列誘導体も含む。核酸配列誘導体とは、天然核酸配列中の一つ以上の核酸残基が欠失、挿入、非保全的または保全的置換、またはこれらの組み合わせによって相異なる配列を持つものを意味する。
【００４２】
本発明の配列番号８のアミノ酸配列をもつＦｃ断片をコードする遺伝子は、好ましくは配列番号４の核酸配列を持つ遺伝子であり、配列番号１０のアミノ酸配列を持つＦｃ断片をコードする遺伝子は、好ましくは配列番号９の核酸配列を持つ遺伝子であり、配列番号２３のアミノ酸配列を持つＦｃ断片をコードする遺伝子は、好ましくは配列番号２２の核酸配列を持つ遺伝子である。本発明のＦｃ断片をコードする核酸配列は、一つ以上の塩基が置換、欠失、挿入またはこれらの組み合わせによって変異できる。前記核酸配列は、天然から分離するか、あるいは人為的に合成または遺伝子組み換え方法によって製造することができる。
【００４３】
本発明のＦｃ断片をコードする核酸配列は、これを発現するベクターによって提供される。
【００４４】
別の様態として、本発明は、ＩｇＧ Ｆｃ断片を含む組み換えベクターを提供する。
【００４５】
本発明において、「ベクター」は、宿主細胞にＤＮＡを導入して抗体または抗体断片を発現させるための手段であって、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター、およびアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターのようなウイルスベクターなどがあり、プラスミドベクターが好ましい。本発明の目的上、発現ベクターは、プロモータ、開始コドン、終結コドン、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーなどの発現調節エレメントの他にも膜標的化または分泌のためのシグナル配列を含むことができる。
【００４６】
本発明において、「シグナル配列(signal sequence)」は、蛋白質の細胞質の外への輸送および分泌を可能とする特定のアミノ酸配列を意味する。このようなシグナル配列には、様々な形態が当該分野において公知となっているが、本発明では、好ましくは大腸菌を宿主細胞として用いるため、本発明のシグナル配列は大腸菌で分泌される蛋白質が持つ大腸菌由来のシグナル配列であることが好ましい。一方、大腸菌由来のシグナル配列にはアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、熱安定性エンテロトキシンＩＩ、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡまたはマルトース結合蛋白質などがあるが、最も好ましくは熱安定性エンテロトキシンＩＩである。
【００４７】
一方、開始コドンおよび終結コドンは、一般に免疫原性標的蛋白質をコードするヌクレオチド配列の一部と見なされ、遺伝子作製物が投与されたとき、個体において必ず作用を示さなければならず、コーディング配列とインフレーム(in frame)になければならない。
【００４８】
一般なプロモータは、構成的または誘導性である。原核細胞にはｌａｃ、ｔａｃ、Ｔ３およびＴ７プロモータがあるが、これに制限されない。真核細胞には、サルウイルス４０（ＳＶ４０）プロモータ、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモータ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモータ（例えば、ＨＩＶの長い末端反復部（ＬＴＲ）プロモータ）、モロニーウイルスプロモータ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモータ、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモータだけでなく、ヒトβ−アクチン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、ヒトメタロチオネインなどヒト遺伝子由来のプロモータがあるが、これに制限されない。
【００４９】
また、発現ベクターは、ベクターを含有する宿主細胞を選択するための選択性マーカーを含み、複製可能な発現ベクターの場合、複製起点を含む。抗生剤または薬物耐性を与える生成物をコードする遺伝子が普遍的な選択性マーカーとして用いられるが、原核細胞の場合、β−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性）およびＴｅｔ遺伝子（テトラサイクリン耐性）が使用でき、真核細胞の場合、ネオマイシン（Ｇ４１８またはジェネティシン）、ｇｐｔ（ミコフェノール酸）、アンピシリン、およびハイグロマイシン耐性遺伝子が使用できる。ジヒドロ葉酸還元酵素マーカー遺伝子は、様々な宿主でメトトレキサートによって選択できる。宿主の栄養要求性マーカーの遺伝子生成物をコードする遺伝子、例えばＬＥＵ２、ＵＲＡ３およびＨＩＳ３は酵母において選択性マーカーとして度々使用される。そして、ウイルス（例えば、バキュロウイルス）またはファージベクター、およびレトロウイルスベクターのような宿主細胞のゲノム内に挿入できるベクターも使用可能である。
【００５０】
本発明の目的に符合するＩｇＧ Ｆｃ断片を製作するために、配列番号８、１０および２３のアミノ酸をコードする遺伝子が挿入されたベクターを用いる。本発明では、ｐＴ１４Ｓ１ＳＨ−４Ｔ２０Ｖ２２Ｑ（大韓民国特許第３８０６１号）を出発ベクターとして用いて、配列番号２３のアミノ酸をコードする配列番号２２の遺伝子が挿入されたｐＳＴＩＩｄＣＧ２Ｆｃを製作し、配列番号８のアミノ酸をコードする配列番号４の遺伝子が挿入されたｐＳＴＩＩｄＣＧ４Ｆｃを製作し、前記ｐＳＴＩＩｄＣＧ４Ｆｃプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行うことにより、前記ＰＣＲによって増幅された遺伝子のうち、二量体の形成に必要なヒンジ領域が除去された配列番号１０のアミノ酸配列をコードする配列番号９の遺伝子が挿入されたｐＳＴＩＩＧ４Ｍｏを製作した。
【００５１】
別の様態として、本発明は、前記組み換えベクターで形質転換された形質転換体に関するものである。
【００５２】
宿主細胞に応じて蛋白質の発現量と修飾などが異なるので、目的に最も適した宿主細胞を選択して使用すればよい。宿主細胞としては、大腸菌(Escherichia coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、ストレプトミセス (Streptomyces)、シュードモナス(Pseudomonas)、プロテウスミラビリス(Proteus mirabilis)またはスタヒロコッカス(Staphylococcus)のような原核宿主細胞があるが、これに制限されない。また、真菌（例えば、アスペルギルス(Aspergillus)）、酵母（例えば、ピキアパストリス(Pichia pastoris)、サッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces), アカパンカビ(Neurospora crassa)などの下等真核細胞、昆虫細胞、植物細胞、哺乳動物などを含む高等真核生物由来の細胞を宿主細胞として使用することができる。ところが、本発明の目的上、免疫グロブリンＦｃ断片が糖鎖化されないことが有利なので、原核細胞を使用することが好ましく、特に大腸菌を使用することが最も好ましい。
【００５３】
本発明において、宿主細胞への「形質転換」および／または「トランスフェクション（transfection）」は、核酸を有機体、細胞、組織または器官に導入するいずれの方法も含まれるもので、当該分野で公知となっているように、宿主細胞に応じて適切な標準技術を選択して行うことができる。このような方法には、エレクトロポレーション(electroporation)、原形質融合、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）沈殿、炭化珪素繊維を用いた攪拌、アグロバクテリアを介した形質転換、ＰＥＧ、硫酸デキストラン、リポフェクトアミンおよび乾燥／抑制を介した形質転換方法などが含まれるが、これに制限されない。
【００５４】
例えば、塩化カルシウムを用いるカルシウム処理またはエレクトロポレーションは、一般に原核細胞に対して使用される（(Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press))。アグロバクテリウムツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)を用いたトランスフェクションは、特定の植物細胞の形質転換に使用される（Shaw et al., 1983, Gene, 23:315)；国際公開特許ＷＯ８９／０５８５９）。細胞壁がない哺乳動物細胞の場合、リン酸カルシウム沈殿法を用いることができる（Graham et al, 1978, Virology, 52:456-457）。哺乳動物宿主細胞への形質転換の一般的な方法および特徴は、米国特許第４，３９９，２１６号に記載されている。酵母内への形質転換は、一般にＶａｎ Ｓｏｌｉｎｇｅｎなどの文献（J. Bact., 1977, 130:946）およびＨｓｉａｏなどの文献（Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1979, 76:3829）の方法によって行われる。
【００５５】
前記本発明に係る発現ベクターが宿主細胞に形質転換された本発明の形質転換体は、ＨＭ１０９３２（ｐＳＴＩＩｄＣＧ４Ｆｃ導入形質転換体）、ＨＭ１０９３３（ｐＳＴＩＩＧ４Ｍｏ導入形質転換体）およびＨＭ１０９３６（ｐＳＴＩＩｄＣＧ２Ｆｃ導入形質転換体）である。
【００５６】
別の様態としては、本発明は、ＩｇＧ Ｆｃ断片、好ましくはＩｇＧ２ Ｆｃ、ＩｇＧ４ Ｆｃ断片、この組み合わせおよびこのハイブリッドを発現することが可能なベクターで形質転換された形質転換体を適切な条件で培養して本発明の免疫グロブリン断片を製造する方法を提供する。
【００５７】
前記免疫グロブリン断片の製造において、形質転換体の培養は、当該分野に知られている適当な培地と培養条件に応じて行われる。このような培養過程は、当業者であれば、選択される菌株に応じて容易に調整して使用することができる。
【００５８】
形質転換体を培養して得た本発明の免疫グロブリン断片は、精製していない状態で使用でき、さらに様々な通常の方法、例えば透析、塩沈殿およびクロマトグラフィなどを用いて高純度に精製して使用できる。その中でもクロマトグラフィを用いる方法が最も多用されている。カラムの種類と順序の選択にはいずれの場合にも適用できる法則はなく、目的蛋白質である抗体の特性、培養方法などに応じてイオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、親和性クロマトグラフィ、プロテインＡ親和カラムなどから選択することができる。本発明では、プロテインＡ親和カラム(protein-A affinity column)、ＳＰセファロースＦＦカラムなどを用いて精製した。
【００５９】
こうして得られるＦｃ断片が遊離体の場合には、自体公知の方法またはこれに準ずる方法によって塩に変換することができ、逆にＦｃ断片が塩の場合には、自体公知の方法またはこれに準ずる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。そして、組み換え体が生産するＦｃ断片に、精製前または精製後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えるか、あるいはポリペプチドを部分的に除去することができる。蛋白質修飾酵素としては、例えばトリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが使用される。
【００６０】
このように製造された本発明のＦｃ断片は、薬物のキャリアとして作用して薬物と結合体を形成する。
【００６１】
本発明において、「薬物結合体」または「結合体」は、一つ以上の薬物が一つ以上の免疫グロブリンＦｃとお互い連結されているものを意味する。
本発明において、「薬物」は、ヒトまたは動物に投与される場合、治療的活性を示す物質を意味し、ポリペプチド、化合物、抽出物、核酸などを含むが、これに制限されない。薬物は、好ましくはポリペプチド薬物である。
【００６２】
本発明において、「生理活性ポリペプチド薬物」、「ポリペプチド薬物」および「蛋白質薬物」は同一の意味で使われており、生体内で様々な生理的現象に生理作用を示す生理活性型であることを特徴とする。
【００６３】
このようなポリペプチド薬物は、変性し易い、あるいは生体内に存在する蛋白質分解酵素によってよく分解されるといった理由によって、長時間にわたって生理学的活性を持続することができないという欠点がある。しかし、本発明の免疫グロブリンＦｃ断片とポリペプチドを結合させた結合体の場合、薬物の構造的安定性が増加し、分解半減期が増加する。そのうえ、Ｆｃ領域の結合によるポリペプチドの生理学的活性の減少は、その他に公知となっている他のポリペプチド薬物製剤に比べて非常に軽微であるといえる。したがって、既存のポリペプチド薬物の生体内利用率に比べて、本発明のポリペプチドおよび本発明のＦｃ断片の結合体は、生体内利用率が著しく増加したことを特徴とする。これは、下記本発明の実施例によっても明白に開示されているところであるが、本発明のＦｃ断片が結合したＩＦＮα、Ｇ−ＣＳＦ、ｈＧＨなどが、ＰＥＧのみが結合しあるいはＰＥＧとアルブミンが結合した既存の製剤に比べて約２〜６倍程度増加したことを確認することができる（表８、表９および表１０）。
【００６４】
一方、本発明のＦｃ断片と蛋白質の結合は、従来の組み換え的な方法による融合ではないことを特徴とする。免疫グロブリンＦｃ領域と薬物として用いられる活性ポリペプチドが組み換え的な方法によって融合している形態は、Ｆｃ領域のＮ末端またはＣ末端にポリペプチドがペプチド結合によって連結された形態であって、これをコードする核酸配列において一つのポリペプチドとして発現されて折りたたまれる。
【００６５】
蛋白質の生理学的機能体としての活性が構造によって決定されるという点に基づくとき、これは融合蛋白質活性の急激な減少をもたらす。したがって、ポリペプチド薬物がＦｃと組み換え的な方法によって融合する場合、構造的安定性が増加したとしても、生体内利用率の面で効果がない。また、このような融合蛋白質は、誤って折りたたまれ(misfolding)て凝集体の形態で発現される傾向があるので、蛋白質の製造、分離の収率面で不経済である。また、活性型ポリペプチドが糖鎖化された形態の場合、真核細胞で発現させなければならず、このような場合、Ｆｃも糖鎖化されるので、生体内で不適切な免疫反応を引き起こすおそれもある。
【００６６】
すなわち、本発明によってこそ始めて、糖鎖化された活性型ポリペプチドを非糖鎖化された免疫グロブリンＦｃ領域に連結させた結合体を製造することが可能となり、最上のシステムでそれぞれが製造、分離されるので、蛋白質獲得の収率を高めることができるなど、前記の問題点を全て克服することができる。
【００６７】
本発明の免疫グロブリンＦｃ断片に連結可能な蛋白質薬物の例としては、ヒト成長ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ペプチド、インターフェロン類とインターフェロン受容体類（例えば、インターフェロン−α、−βおよび−γ、水溶性タイプＩインターフェロン受容体など）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、グルカゴン様ペプチド類（例えば、ＧＬＰ−１など）、Ｇ蛋白質共役型受容体(G-protein-coupled receptor)、インターロイキン類（例えば、ＩＬ−１受容体、ＩＬ−４受容体など）、酵素類（例えば、グルコセレブロシダーゼ(glucocerebrosidase)、イズロネート−２−スルファターゼ(iduronate-2-sulfatase)、α−ガラクトシダーゼ−Ａ(alpha-galactosidase-A)、アガルシダーゼα(agalsidase alpha)、アガルシダーゼβ、α−Ｌ−イズロニダーゼ(alpha-L-iduronidase)、ブチリルコリンエステラーゼ(butyrylcholinesterase)、キチナーゼ(chitinase)、グルタミン酸デカルボキシラーゼ(glutamate decarboxylase)、イミグルセラーゼ(imiglucerase)、リパーゼ(lipase)、 ウリカーゼ(uricase)、血小板−活性因子アセチルハイドロラーゼ(platelet-activating factor acetylhydrolase)、中性エンドペプチダーゼ(neutral endopeptidase)、ミエロペルオキシダーゼ(myeloperoxidase)など）、インターロイキンおよびサイトカイン結合蛋白質類（例えば、ＩＬ−１８ｂｐ、ＴＮＦ−結合蛋白質など）、マクロファージ活性因子、マクロファージペプチド、Ｂ細胞因子、Ｔ細胞因子、プロテインＡ、アレルギー抑制因子、細胞壊死糖蛋白質、免疫毒素、リンホトキシン、腫瘍壊死因子、腫瘍抑制因子、転移成長因子、アルファ−１アンチトリプシン、アルブミン、α−ラクトアルブミン(alpha-lactalbumin)、アポリポ蛋白質−Ｅ、赤血球生成因子、高糖鎖化赤血球生成促進因子、アンジオポエチン類(angiopoietin)、ヘモグロビン、トロンビン(thrombin)、トロンビン受容体活性ペプチド、トロンボモジュリン(thrombomodulin)、血液因子ＶＩＩ、血液因子ＶＩＩａ、血液因子ＶＩＩＩ、血液因子ＩＸ、血液因子ＸＩＩＩ、プラスミノゲン活性因子、フィブリン−結合ペプチド、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、ヒルジン(hirudin)、プロテインＣ、Ｃ−反応性蛋白質、レニン抑制剤、コラゲナーゼ抑制剤、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、表皮細胞成長因子、アンギオスタチン(angiostatin)、アンギオテンシン(angiotensin)、骨形成成長因子、骨形成促進蛋白質、カルシトニン、インスリン、アトリオペプチン、軟骨誘導因子、エルカトニン(elcatonin)、結合組織活性因子、組織因子経路抑制剤(tissue factor pathway inhibitor)、卵胞刺激ホルモン、黄体形成ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、神経成長因子類（例えば、神経成長因子、毛様体神経栄養因子(cilliary neurotrophic factor)、アキソジェネシス因子−１(axogenesis factor-1）、脳−ナトリウム利尿ペプチド(brain-natriuretic peptide)、神経膠由来神経栄養因子(glial derived neurotrophic factor)、ネトリン(netrin)、好中球抑制因子(neurophil inhibitor factor)、神経栄養因子、ニューチュリン(neuturin)など)、 副甲状腺ホルモン、レラキシン、セクレチン、ソマトメジン、インスリン様成長因子、副腎皮質ホルモン、グルカゴン、コレシストキニン、膵臓ポリペプチド、ガストリン放出ペプチ��、コルチコトロピン放出因子、甲状腺刺激ホルモン、オートタキシン(autotaxin)、ラクトフェリン(lactoferrin)、ミオスタチン(myostatin)、受容体類（例えば、ＴＮＦＲ（Ｐ７５）、ＴＮＦＲ（Ｐ５５）、ＩＬ−１受容体、ＶＥＧＦ受容体、Ｂ細胞活性因子受容体など）、受容体拮抗物質（例えば、ＩＬ１−Ｒａなど）、細胞表面抗原（例えば、ＣＤ２、３、４、５、７、１１ａ、１１ｂ、１８、１９、２０、２３、２５、３３、４０、４５、６９など）、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片類（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｄ）、ウイルス由来ワクチン抗原など様々な種類を含み、前記例示された種類に限定されない。抗体断片は、特定の抗原に結合することが可能な能力をもったＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｄまたはｓｃＦｖであり、好ましくはＦａｂ’である。
【００６８】
特に好ましい生理活性ポリペプチドは、疾病の治療または予防の目的で人体に投与されるとき、投与頻度の高いヒト成長ホルモン、インターフェロン類（インターフェロン−α、−β、−γなど）、顆粒球コロニー刺激因子、赤血球生成因子（ＥＰＯ）および抗体断片類などである。また、前記生理活性ポリペプチドの天然型と実質的に同等或いはより増加した機能、構造、活性または安定性を有する限り、任意の誘導体または誘導体も本発明の生理活性ポリペプチドの範囲に含まれる。本発明の最も好適なポリペプチドの薬物はインターフェロン−アルファである。
【００６９】
本発明では、ポリペプチド薬物以外に他の薬物も使用可能であり、テトラサイクリン、ミノサイクリン、ドキシサイクリン、オフロキサシン、レボフロキサシン、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、エリスロマイシン、セファクロール、セフォタキシム、イミペネム、ペニシリン、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、バンコマイシンなどの誘導体および混合物から選択される抗生剤；メトトレキサート、カルボプラチン、タクソール、シスプラチン、５−フルオロウラシル、ドキソルビシン、エトポシド、パクリタキセル、カンプトセシン、シトシンアラビノシドなどの誘導体および混合物から選択される抗癌剤；インドメタシン、イブプロフェン、ケトプロフェン、ピロキシカム、フルルビプロフェン、ジクロフェナクなどの誘導体および混合物から選択される抗炎症剤；アシクロビル、ロバビンなどの誘導体よび混合物から選択される抗ウイルス剤；およびケトコナゾール、イトラコナゾール、フルコナゾール、アンホテリシン−Ｂ、グリセオフルビンなどの誘導体および混合物から選択される抗菌剤を例示することができるが、これに限定されない。
【００７０】
一方、本発明のＦｃ断片は、リンカーを媒介として薬物に連結された結合体を形成することができる。
【００７１】
このようなリンカーは、ペプチド性リンカーまたは非ペプチド性リンカーを含むが、好ましくは非ペプチド性リンカーであり、より好ましくは非ペプチド性重合体である。ここで、ペプチド性リンカーとは、アミノ酸、好ましくはペプチド結合で連結された１〜２０個のアミノ酸を意味し、糖鎖化された形態であってもよい。このようなペプチド性リンカーは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ反復単位を持つペプチドであって、Ｔ細胞に対して免疫学的に不活性のペプチドを使用することが好ましい。非ペプチド性重合体の例としては、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、エチレングリコールとプロピレングリコールの共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、多糖類、デキストラン、ポリビニルエーテル、ＰＬＡ(poly(lactic acid))およびＰＬＧＡ(poly(lactic-glycolic acid))のような生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸などを挙げることができ、最も好ましくはポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）などがある。
【００７２】
本発明のＦｃ断片−薬物または本発明のＦｃ断片−リンカー−薬物は、様々なモル比の結合が可能である。すなわち、一つのポリペプチド薬物に結合するＦｃ断片および／またはリンカーの数は制限されない。ところが、好ましくは本発明の薬物結合体において薬物とＦｃ断片は、１：１〜１０：１、好ましくは１：１〜２：１のモル比で結合できる。
【００７３】
また、本発明のＦｃ断片、任意のリンカーおよび薬物の結合は、遺伝子組み換え方法によってＦｃ断片とポリペプチド薬物が融合蛋白質の形態で発現される場合のペプチド結合(peptide bond)を除いた全ての共有結合と、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用のような全ての種類の非共有結合を含む。しかし、薬物の生理活性の面で共有結合であることが好ましい。
【００７４】
また、本発明のＦｃ断片、任意のリンカーおよび薬物は、薬物の任意の部位(site)との結合が可能である。一方、本発明のＦｃ断片およびポリペプチド薬物の場合は、Ｎ末端、Ｃ末端の結合も可能であるが、遊離基と結合することがより好ましく、特にこれらのアミノ末端、リジンのアミノ残基、ヒスチジンのアミノ残基または遊離システイン残基で共有結合がよく形成される。
【００７５】
一方、本発明のＦｃ断片、任意のリンカーおよび薬物の結合は、任意の方向に結合できる。すなわち、リンカーと免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端、Ｃ末端または遊離基との結合が可能であり、リンカーと蛋白質薬物のＮ末端、Ｃ末端または遊離基との結合が可能である。リンカーがペプチドリンカーの場合、任意の結合部位における結合が可能である。
また、本発明の結合体は、いろいろの架橋剤(coupling agent)で結合可能である。このような架橋剤の種類は、当該分野に公知となっており、例えば１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸とのエステル、イミドエステル、例えばジスクシンイミジルエステル、例えば３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）および二官能性(bifunctional)マレイミド、例えばビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンを含むが、これに制限されない。
【００７６】
一方、本発明に係る新規のＦｃ断片および薬物の結合体は、様々な薬剤学的組成物を製造することができる。
【００７７】
本発明において、「投与」はある適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味し、前記結合体は薬物が目的の組織に到達することができる限り、いずれの一般的な経路を介しても投与できる。例えば、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与が可能であるが、これに制限されない。しかしながら、経口投与の際、ペプチドは消化されるため、経口用組成物は活性薬剤をコートするか、或いは胃における分解から保護するために剤形化することが好ましい。好ましくは、注射剤の形態で投与できる。また、製薬組成物は、活性物質が標的細胞に移動することが可能な任意の装置によって投与できる。
【００７８】
本発明の結合体を含んだ薬剤学的組成物は、薬剤学的に許容可能な担体を含むことができる。薬剤学的に許容される担体は、経口投与の場合には結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを使用することができ、注射剤の場合には緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などを混合して使用することができ、局所投与の場合には基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを使用することができる。本発明の薬剤学的組成物の剤形は、上述したような薬剤学的に許容される担体と混合して様々に製造できる。例えば、経口投与の場合には錠剤、トローチ剤、カプセル、エリキシル剤(elixir)、サスペンション、シロップ、ウェーハなどの形態で製造することができ、注射剤の場合には、単位投薬アンプルまたは多数回投薬の形態で製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、カプセル、徐方形製剤などに剤形化することができる。
【００７９】
一方、製剤化に適した担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、珪酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシ安息香酸、タルク、ステアリン酸マグネシウムまたは鉱物油などが使用できる。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などをさらに含むことができる。
【００８０】
本発明において、Ｆｃ断片がキャリアとして用いられた薬物の実際投与量は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別並びに体重、および疾患の重症度などのいろいろの関連因子とともに、活性成分である薬物の種類によって決定される。本発明の薬剤学的組成物は、生体内持続性に非常に優れるので、本発明の薬剤学的製剤の投与回数および頻度を著しく減少させることができる。
【００８１】
以下、下記の実施例によって本発明をより詳細に説明する。但し、下記の実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００８２】
免疫グロブリンＦｃ断片の製造実施例
（実施例１）ヒト免疫グロブリンＩｇＧ４ Ｆｃ発現ベクターの製作
（１−１）二量体ＩｇＧ４ Ｆｃ発現ベクターの製作
ヒト免疫グロブリンＩｇＧ４のＦｃ遺伝子をクローニングするために、ヒトの血液から収得した血球細胞のＲＮＡを鋳型として次のようにＲＴ−ＰＣＲを行った。まず、Ｑｉａｍｐ ＲＮＡ血液キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて約６ｍＬの血液から全体ＲＮＡを分離した後、このＲＮＡを鋳型とし、Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて遺伝子を増幅した。この際、前記遺伝子配列を収得するために配列番号１と配列番号２で表わされるプライマー対を使用した。配列番号１は、ＩｇＧ４ヒンジ領域の１２個（Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｇｌｙ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ｐｒｏ、配列番号：３）のアミノ酸配列のうち１０番目のアミノ酸配列であるセリンから始まる配列であり、配列番号２は、終結コドンを含むＢａｍＨＩ制限酵素認識部位を挿入したものである。前記プライマー対で増幅された遺伝子は、配列番号４で表わされる塩基配列を持つことが確認され、全体ＩｇＧ４ Ｆｃ中のヒンジ領域のセリン−システイン−プロリンで始まるアミノ末端とＣＨ２およびＣＨ３ドメインから構成される。
【００８３】
前記増幅されたＩｇＧ４ Ｆｃ遺伝子配列を、大腸菌シグナル配列を含む発現ベクターにクローニングするために、本発明者によって開発された発現ベクターｐＴ１４Ｓ１ＳＨ−４Ｔ２０Ｖ２２Ｑ（大韓民国特許第３８０６１号）を出発ベクターとして用いた。前記発現ベクターは、配列番号５で表わされる塩基配列を持つ大腸菌熱安定性エンテロトキシンシグナル配列誘導体を含む。クローニングを容易にするため、ｐＴ１４Ｓ１ＳＨ−４Ｔ２０Ｖ２２Ｑプラスミドの大腸菌熱安定性エンテロトキシンシグナル配列誘導体に配列番号６および７のプライマー対を使用した特定部位の置換突然変異法(site-directed mutagenesis)を行い、シグナル配列の最後のアミノ酸をコードする遺伝子配列を突然変異誘発(mutagenesis)してＳｔｕＩ制限酵素認識部位を挿入した。塩基配列分析法によって、正確にＳｔｕＩ制限酵素認識部位が生成されたことを確認した。ｐＴ１４Ｓ１ＳＨ−４Ｔ２０Ｖ２２ＱプラスミドにＳｔｕＩ制限酵素認識部位が生成されたプラスミドをｐｍＳＴＩＩと命名した。前記のように製作されたプラスミドｐｍＳＴＩＩをＳｔｕＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で処理した後、アガロースゲル電気泳動を行い、大腸菌熱安定性エンテロトキシンシグナル配列誘導体を含む大きい断片（４．７ｋｂ）を回収した。前記増幅されたＩｇＧ４ Ｆｃ遺伝子断片をＢａｍＨＩ制限酵素で処理した後、前記で回収された発現ベクターの断片に挿入してプラスミドｐＳＴＩＩｄＣＧ４Ｆｃを製作した。このベクターによって発現される蛋白質は、配列番号８のアミノ酸配列を持ち、ヒンジ領域のシステイン残基によるジスルフィド結合によって二量体の形態で存在する。前記製作された発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させて大腸菌形質転換体ＢＬ２１／ｐＳＴＩＩｄＣＧ４Ｆｃ（ＨＭ１０９３２）を製造し、これらを韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２００４年９月１５日付で寄託した（寄託番号：ＫＣＣＭ−１０５９７）。
【００８４】
（１−２）単量体ＩｇＧ４ Ｆｃ発現ベクターの製作
単量体の形態で発現されるＩｇＧ４ Ｆｃ断片をクローニングするために、配列番号９および２を用いて、前記実施例（１−１）で製作したｐＳＴＩＩｄＣＧ４Ｆｃプラスミドを鋳型としてＰＣＲを行った。前記のＰＣＲによって増幅された遺伝子は、ＩｇＧ４ Ｆｃ配列で二量体の形成に必要なヒンジ領域が除去されたまま、ＩｇＧ４ ＣＨ２−３遺伝子のみが増幅されて単量体の形態で存在する。前記（１−１）と同一の発現ベクターｐｍＳＴＩＩに同一の過程でクローニングしてプラスミドｐＳＴＩＩＧ４Ｍｏを製作した。前記発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させて大腸菌形質転換体ＢＬ２１／ｐＳＴＩＩＧ４Ｍｏ（ＨＭ１０９３３）を製造し、これを韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２００４年９月１５日付で寄託した（寄託番号：ＫＣＣＭ−１０５９８）。前記発現ベクターによって発現される蛋白質は、配列番号１０のアミノ酸配列を持ち、ヒンジ領域がないため、ＣＨ２ドメインから発現されて単量体の形態で存在する。
【００８５】
（実施例２）ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１ Ｆｃ発現ベクターの製作
（２−１）二量体ＩｇＧ１ Ｆｃ発現ベクターの製作
ＩｇＧ１のＦｃ遺伝子をクローニングするために、前記実施例（１−１）で行った方法と同様に、ヒトの血液から収得した血球細胞のＲＮＡを鋳型としてＯｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。この際、前記遺伝子配列を収得するために、配列番号１１と配列番号１２で表わされるプライマー対を使用した。
【００８６】
配列番号１１は、１５個のアミノ酸配列（Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｌｙｓ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ；配列番号：１３）からなるヒンジ領域蛋白質配列のうち１３番目のアミノ酸配列であるプロリンから始まる配列であり、配列番号１１および１２のプライマー対で増幅された遺伝子は、全体ＩｇＧ１ Ｆｃ遺伝子配列中のヒンジ領域のプロリン−システイン−プロリンで始まるアミノ末端とＣＨ２、ＣＨ３ドメインからなり、配列番号１４の遺伝子配列を持つ。
【００８７】
前記増幅されたＩｇＧ１ Ｆｃ遺伝子配列を大腸菌シグナル配列を含む発現ベクターにクローニングするために、前述したｐｍＳＴＩＩベクターを使用した。前記実施例（１−１）で行ったクローニング過程と類似の方法で、プラスミドｐｍＳＴＩＩをＳｔｕＩ／ＢａｍＨＩ制限酵素で処理した後、アガロースゲルに電気泳動を行い、大腸菌熱安定性エンテロトキシンシグナル配列誘導体を含む大きい断片（４．７ｋｂ）を回収した。前記で増幅されたＩｇＧ１ Ｆｃ遺伝子をＢａｍＨＩ制限酵素で処理した後、前記で回収された発現ベクターの断片に挿入してｐＳＴＩＩｄＣＧ１Ｆｃを製作した。このように製作された発現ベクターを介して発現される産物は、宿主細胞で発現するときに配列番号１５のアミノ酸配列を持ち、ヒンジ領域のシステイン残基間のジスルフィド結合によって二量体を形成することができる。製作された発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させて大腸菌形質転換体ＢＬ２１／ｐＳＴＩＩｄＣＧ１Ｆｃ（ＨＭ１０９２７）を製造し、これらを韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２００４年９月１５日付で寄託した（寄託番号：ＫＣＣＭ−１０５８８）。
【００８８】
（２−２）単量体ＩｇＧ１ Ｆｃ発現ベクターの製作
単量体の形態で発現されるＩｇＧ１ Ｆｃを製造するために、配列番号１６および１２のプライマー対を用いて、前記実施例（２−１）で製作したプラスミドｐＳＴＩＩｄＣＧ４Ｆｃを鋳型として遺伝子を増幅した。増幅された遺伝子の断片を実施例（２−１）と同様の方法で発現ベクターｐｍＳＴＩＩに挿入し、配列番号１７で表わされる塩基配列を含有するＰＳＴＩＩＧ１Ｍｏを製作した。前記発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させて大腸菌形質転換体ＢＬ２１／ｐＳＴＩＩＧ１Ｍｏ（ＨＭ１０９３０）を製造し、これを韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２００４年９月１５日付で寄託した（寄託番号：ＫＣＣＭ−１０５９５）。前記発現ベクターによって発現される蛋白質は、二量体の形成を可能とするシステイン残基を含有するヒンジ領域が除去されたため、ＣＨ２ドメインから発現されて単量体の形態で存在し、配列番号１８で表わされるアミノ酸配列を持つ。
【００８９】
（実施例３）ヒト免疫グロブリンＩｇＧ２ Ｆｃ発現ベクターの製作
ヒトＩｇＧ２のＦｃ遺伝子をクローニングするために、前記実施例（１−１）で行った方法と同様に、ヒトの血液から収得した血球細胞のＲＮＡを鋳型としてＯｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いてＲＴ−ＰＣＲを行った。この際、前記遺伝子配列を収得するために、配列番号１９と配列番号２０で表わされるプライマー対を使用した。配列番号１９は１２個のアミノ酸配列（Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｌｙｓ Ｃｙｓ Ｃｙｓ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｐｒｏ；配列番号：２１）からなるヒンジ領域蛋白質配列のうち１０番目のアミノ酸配列であるプロリンから始まる配列であり、配列番号１９および２０のプライマー対で増幅された遺伝子は、全体ＩｇＧ２ Ｆｃ遺伝子配列中のヒンジ領域のプロリン−システイン−プロリンで始まるアミノ末端とＣＨ２、ＣＨ３ドメインからなり、配列番号２２の遺伝子配列を持つ。前記増幅されたＩｇＧ２ Ｆｃ遺伝子配列を大腸菌シグナル配列を含む発現ベクターにクローニングするために、前述したｐｍＳＴＩＩベクターを使用した。前記実施例（１−１）で行ったクローニング過程と類似の方法で、プラスミドｐｍＳＴＩＩをＳｔｕＩ／ＢａｍＨＩ制限酵素で処理した後、アガロースゲル電気泳動を行い、大腸菌熱安定性エンテロトキシンシグナル配列誘導体を含む大きい断片（４．７ｋｂ）を回収した。前記増幅されたＩｇＧ２ Ｆｃ遺伝子をＢａｍＨＩ制限酵素で処理した後、前記回収された発現ベクターの断片に挿入してｐＳＴＩＩｄＣＧ２Ｆｃを製作した。このように製作された発現ベクターによって発現される産物は、宿主細胞で発現するときに配列番号２３のアミノ酸配列を持ち、ヒンジ領域のシステイン残基間のジスルフィド結合によって二量体を形成することができる。それぞれ製作された発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換させて大腸菌形質転換体ＢＬ２１／ｐＳＴＩＩｄＣＧ２Ｆｃ（ＨＭ１０９３６）を製造した。
【００９０】
（実施例４）免疫グロブリンＦｃの発現および精製
（４−１）免疫グロブリンＦｃの発現の確認
前記実施例１、２および３で収得した微生物形質転換体を発酵器（Ｍａｒｕｂｉｓｈｉ社）に接種して発酵させた後、免疫グロブリンＦｃ断片の発現の有無を確認した。
まず、ＬＢ培地１００ｍＬに前記形質転換体をそれぞれ一晩中振盪培養した後、発酵器に接種して本培養を行った。発酵器の温度は、３５℃あるいは３０℃を維持し、嫌気性状態になることを防止するために、空気を２０ｖｖｍで投入しながら５００ｒｐｍで攪拌した。発酵の間、微生物の成長のために足りないエネルギー源を補うために、葡萄糖(glucose)と酵母抽出液(yeast extract)とを微生物の発酵状態に応じて投与した。吸光度６００ｎｍでＯＤ値が８０〜１１０となる時期に誘導物質(inducer)ＩＰＴＧを２０μＭ〜４ｍＭとなるように投与して発現を誘導した。これを、さらに４０〜４５時間高濃度で培養して吸光度６００ｎｍでのＯＤ値が１００〜１２０となるようにした。
【００９１】
前記大腸菌形質転換体から免疫グロブリンＦｃの発現の有無、発現場所、水溶性および二量体形成の有無を確認するために、下記のような試験を行った。発現産物が前記発現ベクターに融合しているシグナル配列によって発酵液またはペリプラスム空間に発現されるかを確認するために、発酵液を遠心分離して、細胞を除去した発酵液溶液を収得し、且つ細胞を回収した。前記細胞を除去した発酵液溶液と、前記回収した細胞に浸透圧ショック(osmotic shock)をかけることによって得られたペリプラスム空間溶液とをウエスタンブロットによって解析し、免疫グロブリンＦｃの発現の有無を確認したが、その量は極めて少量であった。前記細胞をウルトラ−ソニケーション（Ｍｉｓｏｎｉｘ社）を用いて破砕して細胞溶解液(cell lysate)を得、その細胞溶解液を遠心分離して水溶性物質と不溶性物質を分離した後、水溶性物質を次のような方法でウエスタンブロットした。前記水溶性物質をＤＴＴまたはβ−メルカプトエタノールのような還元剤を含まない蛋白質サンプルバッファと混ぜた後、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ Ｇｅｌ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）に電気泳動した。電気泳動済みのゲルをニトロセルロース(nitro-cellulose)膜に転写した後、ＨＲＰが融合している抗ヒトＦｃ抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いて検出(detect)を行った。図１に示すように、免疫グロブリンＦｃは、大腸菌の細胞質内に水溶性の状態で過量に発現されることが分かるとともに、ヒンジ領域の一部が挿入された形質転換体から発現された産物は二量体を形成することが分かる。図１のレーン１、２、３はそれぞれ形質転換体ＨＭ１０９２７、ＨＭ１０９３２、ＨＭ１０９３６で発現された産物であり、レーン４は動物細胞で生産された免疫グロブリンをパパイン処理して生成されたＦｃであって、糖が存在するため、大腸菌で生成されたものよりやや大きく展開されることが分かる。
【００９２】
（４−２）Ｎ末端配列の確認
前記実施例において大腸菌の細胞質内で水溶性二量体の形態で発現されるＦｃは、シグナル配列が融合しているために分泌されず、細胞質内に存在するとき、シグナル配列のプラセシングなしで融合したままで存在するかを確認するために、Ｎ末端アミノ酸配列の分析を基礎科学支援研究所のソウル分所に依頼した。分析する試料は下記のように準備した。
【００９３】
まず、ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）をメタノールに約２〜３秒間浸漬して活性化させた後、ブロッキングバッファ（１７０ｍＭグリシン、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、２０％メタノール）に十分濡らした。実施例（４−１）で展開した非還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、前記のように準備されたＰＶＤＦ膜に、ブロッティングキット（Ｈｏｅｆｅｒ Ｓｅｍｉ−Ｄｒｙ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｕｎｉｔ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて約１時間の転写を行った。ＰＶＤＦ膜に転写された蛋白質を蛋白質染色薬であるＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ Ｒ−２５０（Ａｍｎｅｓｃｏ社）を用いてしばらく（３〜４秒間）染色した後、脱色溶液（水：酢酸：メタノールが５：１：４）で洗浄した。洗浄済みの膜から、蛋白質が含まれている部位をハサミで切断してＮ末端配列の分析を依頼した。
【００９４】
ＩｇＧ１ Ｆｃ蛋白質のＮ末端配列はＰｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙであり、ＩｇＧ４ Ｆｃ蛋白質のＮ末端配列はＳｅｒ−Ｃｙｓｌ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙである。また、ＩｇＧ２ Ｆｃ蛋白質のＮ末端配列はＰｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏと確認された。以上のようなアミノ酸配列の分析結果から明らかなように、本発明の大腸菌形質転換体から発現されるＦｃ断片は、正確なＮ末端配列を持つものと確認された。また、シグナル配列を融合させて発現させる際に、細胞外膜またはペリプラスムに分泌されず、細胞質内に過発現されてもシグナル配列が正確にプロセシングされて水溶性の形態で存在するという新しい事実が確認された。
【００９５】
（４−３）免疫グロブリンＦｃの精製
免疫グロブリンに強い親和性があると知られているプロテインＡ親和性カラム(protein-A affinity column)を用いて下記のような方法で精製した。
【００９６】
遠心分離によって発酵液から回収された大腸菌細胞をＭｉｃｒｏｆｌｕｉｚｅｒ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｄｉｃｓ社）を用いて破砕して細胞溶解液(cell lysate)を得、細胞質内に存在する組み換え免疫グロブリンＦｃ断片を２段階カラムクロマトグラフィによって精製した。プロテインＡ親和性カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）５ｍＬをＰＢＳで平衡化させた後、細胞溶解液を５ｍＬ／分の流速で負荷した。結合していない分画はＰＢＳで洗浄した後、１００ｍＭのクエン酸溶液（ｐＨ３．０）で溶出させた。溶出した分画を脱塩カラム（desalting column Ｈｉｐｒｅｐ ２６／１０、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で交換した。Ｑ ＨＰ ２６／１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）５０ｍＬを用いて２次陰イオン交換カラムクロマトグラフィを行った。１次精製された組み換え免疫グロブリンＦｃ分画を前記カラムに結合させた後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）条件下で直線濃度勾配（塩化ナトリウムの濃度０Ｍ→０．２Ｍ）法によって溶出し、高純度の分画を得ることができた。各産物をプロテインＡカラムを用いて部分精製した後、組み換え免疫グロブリンＦｃ断片の発現量が下記に示したように決定された。
【００９７】
【化１】
0005425150.tif 000002
【００９８】
前記のように収得された免疫グロブリンＦｃは、重鎖の二量体あるいは単量体の形態なので、還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥと非還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて蛋白質の移動様相が異なる。発現された産物を精製した後、純度を確認するために行ったＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を、図２および図３に示した。
【００９９】
図２および図３は、このように精製された二量体の形態と単量体の形態の免疫グロブリンＦｃ蛋白質を１５％クライテリオンゲル（criterion gel、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて非還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルと還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに展開させてその移動様相を比較したものである。図２のＡは非還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに展開したもので、Ｂは還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに展開したものである。レーンＭは予め染色された低範囲標準蛋白質マーカー（prestained low-range standard marker、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）であり、レーン１〜４はそれぞれ形質転換体ＨＭ１０９２７、ＨＭ１０９２８（韓国微生物保存センターに２００４年９月１５日付で寄託した。寄託番号：ＫＣＣＭ−１０５８９）、ＨＭ１０９２９（韓国微生物保存センターに２００４年９月１５日付で寄託した。寄託番号：ＫＣＣＭ−１０５９４）およびＨＭ１０９３２によって生産された免疫グロブリンＦｃ試料である。図２に示すように、還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、免疫グロブリンＦｃ断片は、ヒンジ領域のシステイン残基によるジスルフィド結合が還元されて、それぞれ単量体の形態で存在するので、単量体の大きさだけ移動した。一方、非還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、免疫グロブリンＦｃ断片は、それぞれの単量体がジスルフィド結合で連結された二量体の形態で存在し、その結果、約４２ｋＤａの移動距離を持つことを確認した。
【０１００】
図３のＡは、非還元条件で、蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに展開したものであり、Ｂは還元条件で、蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに展開したものである。レーンＭは、前記標準蛋白質マーカーであり、レーン１および２は、形質転換体ＨＭ１０９３０およびＨＭ１０９３３によって生産された免疫グロブリンＦｃ試料である。図３に示すように、還元条件と非還元条件とにおける移動距離はあまり差異がなく、分子内ジスルフィド結合の還元有無によって移動距離に若干の差異があることを確認した。
【０１０１】
免疫グロブリンＦｃおよび薬物の結合体製造
（実施例５）インターフェロンアルファ（ＩＦＮα）−ＰＥＧ−免疫グロブリンＦｃ領域（Ｆｃ）結合体の製造Ｉ
（段階１）免疫グロブリンを用いた免疫グロブリンＦｃ領域の製造
免疫グロブリンＦｃ領域を製造するために、１０ｍＭのリン酸塩緩衝液に溶解された分子量１５０ｋＤａの免疫グロブリンＧ（Immunoglobulin G；ＩｇＧ、緑十字）２００ｍｇを、蛋白質加水分解酵素パパイン（Papain、Ｓｉｇｍａ社）２ｍｇを用い、３７℃で２時間徐々に攪拌しながら処理した。酵素反応後、生成された免疫グロブリンＦｃ領域を精製するために、Ｓｕｐｅｒｄｅｘカラム、プロテインＡカラムおよび陽イオン交換樹脂カラムクロマトグラフィを順次行った。具体的には、反応液を、１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．３）によって平衡化させたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に滴下し、同一の緩衝液を用いて１ｍＬ／分の流速で溶出させた。免疫グロブリンＦｃ領域より分子量が相対的に大きい未反応免疫グロブリン（ＩｇＧ）やＦ（ａｂ’）２などは、早く溶出するので、これを先に除去した。免疫グロブリンＦｃ領域と類似の分子量を持つＦａｂは、次のように、プロテインＡカラムクロマトグラフィを行って除去した（図４）。２０ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させたプロテインＡカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）にＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムから溶出した免疫グロブリンＦｃ領域含有分画を５ｍＬ／分の流速で負荷した後、カラムに結合していない蛋白質を除去するために同一の緩衝液で十分洗浄した。次に、１００ｍＭのクエン酸ナトリウム（Na citrate、ｐＨ３．０）緩衝液を流して高純度の免疫グロブリンＦｃ領域を溶出させた。最後に、プロテインＡカラムで精製されたＦｃ分画を陽イオン交換樹脂カラム（ｐｏｌｙＣＡＴ、ＰｏｌｙＬＣ社）を用いて精製した。プロテインＡカラムで精製されたＦｃ分画を滴下した前記陽イオン交換樹脂カラムは、１０ｍＭの酢酸塩緩衝液（ｐＨ４．５）を用いた直線濃度勾配（塩化ナトリウムの濃度０．１５Ｍ→０．４Ｍ）法によって溶出し、高純度のＦｃ分画を得た。前記高純度のＦｃ分画を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した（図５のレーン２）。
【０１０２】
（段階２）ＩＦＮα−ＰＥＧ連結体の製造
両末端にアルデヒド反応基を持つ分子量３．４ｋＤａのポリエチレングリコールＡＬＤ−ＰＥＧ−ＡＬＤ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ社）を、ヒトインターフェロンアルファ−２ｂ（ｈＩＦＮα−２ｂ、分子量２０ｋＤａ）が５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解された１００ｍＭのリン酸塩緩衝液に、ＩＦＮα：ＰＥＧのモル比が１：１、１：２．５、１：５、１：１０および１：２０となるように添加した。ここに還元剤のナトリウムシアノボロハイドライド（ＮａＣＮＢＨ３、Ｓｉｇｍａ社）を最終濃度が２０ｍＭとなるように添加し、４℃で徐々に攪拌しながら３時間反応させた。インターフェロンアルファのアミノ末端部位に選択的にＰＥＧを連結され、ＰＥＧとインターフェロンアルファが１：１で結合した連結体を得るために、前記反応混合物をＳｕｐｅｒｄｅｘＲカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いたサイズ排除(size exclusion)クロマトグラフィにかけた。溶出液として１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６.０）を用いてＩＦＮα−ＰＥＧ連結体を精製し、ＰＥＧと結合していないインターフェロンアルファ、未反応ＰＥＧおよび２つのインターフェロンアルファがＰＥＧと連結された二量体副産物を除去した。精製されたＩＦＮα−ＰＥＧ連結体を５ｍｇ／ｍＬの濃度に濃縮した。これより、反応性が最も良くて二量体などの副産物が少ないＩＦＮα：ＰＥＧの最適反応モル比は１：２．５〜１：５であることを確認した。
【０１０３】
（段階３）ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体の形成
前記段階２で精製されたＩＦＮα−ＰＥＧ連結体に免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端に結合させるために、段階１で準備された免疫グロブリンＦｃ領域（約５３ｋＤａ）を１０ｍＭのリン酸塩緩衝液に溶解させた後、ＩＦＮα−ＰＥＧ連結体：Ｆｃのモル比がそれぞれ１：１、１：２、１：４および１：８となるように、ＩＦＮα−ＰＥＧ連結体と混合して反応させた。反応液を１００ｍＭのリン酸塩緩衝液に調製し、還元剤としてＮａＣＮＢＨ３を最終濃度が２０ｍＭとなるように添加し、４℃で２０時間徐々に攪拌しながら反応させた。これにより、反応性が最も良くて二量体などの副産物が少ないＩＦＮα−ＰＥＧ連結体：Ｆｃの最適反応モル比は１：２であることを確認した。
【０１０４】
（段階４）ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体の分離および精製
前記段階３の結合反応後、未反応物質および副産物を除去し、生成されたＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ蛋白質結合体を精製するためにＳｕｐｅｒｄｅｘサイズ排除クロマトグラフィを行った。反応混合物を濃縮した後、１０ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．３）を用いて流速２．５ｍＬ／分でカラムを通過させ、結合していないＦｃおよび未反応物質を除去し、ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ蛋白質結合体分画を得た。得られたＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ蛋白質結合体分画には不純物として少量の未反応Ｆｃおよびインターフェロンアルファ二量体が混在しているので、これを除去するためにさらに陽イオン交換樹脂クロマトグラフィを行った。ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ蛋白質結合体分画を１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）で平衡化させたＰｏｌｙＣＡＴ ＬＰカラム（ＰｏｌｙＬＣ社）に仕込み、１Ｍの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）緩衝液を用いた直線濃度勾配（塩化ナトリウムの濃度０Ｍ→０．５Ｍ）法で溶出してさらに精製した。最後に、陰イオン交換カラムを用いてＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ蛋白質結合体を精製した。ＰｏｌｙＷＡＸ ＬＰカラム（ＰｏｌｙＬＣ社）を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液で平衡化させた後、精製されたＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ蛋白質結合体分画を負荷し、１Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液を用いた直線濃度勾配（塩化ナトリウムの濃度０Ｍ→０．３Ｍ）法で溶出して純粋なＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ蛋白質結合体を精製した。
【０１０５】
（実施例６）ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体の製造ＩＩ
（段階１）Ｆｃ−ＰＥＧ連結体の製造
両末端にアルデヒド反応基を持つ分子量３．４ｋＤａのポリエチレングリコールＡＬＤ−ＰＥＧ−ＡＬＤ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ社）を、前記実施例５の段階１で準備された免疫グロブリンＦｃ領域が１５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解された１００ｍＭのリン酸塩緩衝液に、免疫グロブリンＦｃ：ＰＥＧのモル比がそれぞれ１：１、１：２．５、１：５、１：１０および１：２０となるように添加した。還元剤のＮａＣＮＢＨ３を最終濃度が２０ｍＭとなるように添加した後、４℃で徐々に攪拌しながら３時間反応させた。免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ末端部位に選択的にＰＥＧ：Ｆｃが１：１で結合した連結体を得るために、前記反応混合物を持ってＳｕｐｅｒｄｅｘ（SuperdexR、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）サイズ排除クロマトグラフィを行った。溶出液として１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６.０）を用いてＦｃ−ＰＥＧ連結体を精製し、ＰＥＧと結合していない免疫グロブリンＦｃ領域、未反応ＰＥＧおよび２つの免疫グロブリンＦｃ領域がＰＥＧに連結された二量体副産物を除去した。精製されたＦｃ−ＰＥＧ連結体を約１５ｍｇ／ｍＬの濃度で濃縮した。これより、反応性が最も良くて二量体などの副産物が少ないＦｃ：ＰＥＧの最適反応モル比は１：３〜１：１０であることを確認した。
【０１０６】
（段階２）Ｆｃ−ＰＥＧ連結体とインターフェロンアルファの結合体の形成および精製
前記段階１で精製されたＦｃ−ＰＥＧ連結体をＩＦＮαのＮ末端に結合させるために、１０ｍＭのリン酸塩緩衝液に溶解されたインターフェロンアルファを使用し、Ｆｃ−ＰＥＧ連結体：ＩＦＮαのモル比がそれぞれ１：１、１：１．５、１：３および１：６となるように添加して反応させた。反応液を１００ｍＭのリン酸塩緩衝液に調製し、還元剤としてＮａＣＮＢＨ３を最終濃度が２０ｍＭとなるように添加した後、４℃で２０時間徐々に攪拌しながら反応させた。反応後、実施例５の段階４と同一の方法で精製して未反応物質および副産物を除去し、これから生成されたＦｃ−ＰＥＧ−ＩＦＮα蛋白質結合体を純粋に分離した。
【０１０７】
（実施例７）ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体の製造
インターフェロンアルファの代わりにヒト成長ホルモン（ｈＧＨ、分子量２２ｋＤａ）を使用し、ｈＧＨ：ＰＥＧのモル比を１：５とする以外は、実施例５と同一の方法でｈＧＨ−ＰＥＧ−Ｆｃ蛋白質結合体を製造および精製した。
【０１０８】
（実施例８）ヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体の製造
インターフェロンアルファの代わりにヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を使用し、Ｇ−ＣＳＦ：ＰＥＧのモル比を１：５とする以外は、実施例５と同一の方法でＧ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−Ｆｃ蛋白質結合体を製造および精製した。
【０１０９】
一方、天然型Ｇ−ＣＳＦの１７番目のアミノ酸がセリンで置換された誘導体（１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ）を用いて前記と同一の方法で１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−Ｆｃ蛋白質結合体を製造および精製した。
【０１１０】
（実施例９）ヒト赤血球生成因子（ＥＰＯ）−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体の製造
インターフェロンアルファの代わりにヒト赤血球生成因子（Erythropoietin；ＥＰＯ）を使用し、ＥＰＯ：ＰＥＧのモル比を１：５とする以外は、実施例５と同一の方法でＥＰＯ−ＰＥＧ−Ｆｃ蛋白質結合体を製造および精製した。
【０１１１】
（実施例１０）反応基の種類を異にするＰＥＧを用いた蛋白質結合体の製造
両末端の反応基が全てスクシンイミジルプロピオネート（Succinimidyl propionate；ＳＰＡ）であるＰＥＧを用いてＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ蛋白質結合体を次のように製造した。インターフェロンアルファ１０ｍｇが溶解された１００ｍＭのリン酸塩緩衝液に、両末端にＳＰＡ反応基を持つ分子量３．４ｋＤａのポリエチレングリコールＳＰＡ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ社）をＩＦＮα：ＰＥＧのモル比がそれぞれ１：１、１：２．５、１：５、１：１０および１：２０となるように添加し、常温で徐々に攪拌しながら２時間反応させた。インターフェロンアルファのリジン残基のアミノ基部位に選択的にＰＥＧが１：１で結合したＰＥＧ−ＩＦＮα連結体を得るために、反応混合物をもってＳｕｐｅｒｄｅｘサイズ排除クロマトグラフィを行った。溶出液として１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６.０）を用いてＩＦＮα−ＰＥＧ連結体を精製し、ＰＥＧと結合していないインターフェロンアルファ、未反応ＰＥＧ、およびＰＥＧの両末端に２つのインターフェロンアルファが連結された二量体副産物を除去した。ＩＦＮα−ＰＥＧ連結体を免疫グロブリンＦｃのリジン残基のアミノ基部位に結合させるために精製されたＩＦＮα−ＰＥＧ連結体を約５ｍｇ／ｍＬの濃度で濃縮した後、実施例５の段階３および４と同一の方法でＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体を製造および精製した。これより、反応性が最も良くて二量体などの副産物が少ないインターフェロンアルファ：ＰＥＧの最適反応モル比は１：２．５〜１：５であることを確認した。
【０１１２】
一方、前記と同一の方法を行うが、両末端の反応基が全てＮ−ヒドロキシスクシンイミジル（N-hydroxysuccinimidyl；ＮＨＳ）であるＰＥＧ（ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳ；Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ社)、または両末端の反応基が全てブチルアルデヒド(buthyl aldehyde)であるＰＥＧ（ＢＵＡ−ＰＥＧ−ＢＵＡ；Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ社）を用いてＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体の生成を確認した。
【０１１３】
（実施例１１）分子量の異なるＰＥＧを用いた蛋白質結合体の製造
両末端にアルデヒド反応基を持つ分子量１０ｋＤａのポリエチレングリコールＡＬＤ−ＰＥＧ−ＡＬＤ（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ社）を用いて実施例５の段階２と同一の方法でＩＦＮα−１０Ｋ ＰＥＧ連結体を製造および精製した。この際、反応性が最も良くて二量体などの副産物が少ないインターフェロンアルファ：１０Ｋ ＰＥＧの最適モル比は１：２．５〜１：５であることが確認された。精製されたＩＦＮα−ＰＥＧ連結体を約５ｍｇ／ｍＬとなるように濃縮した後、これを用いて実施例５の段階３および４と同一の方法によってＩＦＮα−１０Ｋ ＰＥＧ−Ｆｃ蛋白質結合体を製造および精製した。
【０１１４】
（実施例１２）Ｆａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ結合体の製造（−ＳＨ基）
（段階１）Ｆａｂ’の発現および精製
抗腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’を発現する大腸菌形質転換体ＢＬ２１／ｐｏＤＬＨＦ（寄託番号：ＫＣＣＭ−１０５１１）をＬＢ培地１００ｍＬに接種して一晩中振盪培養した後、５Ｌの発酵器（Ｍａｒｕｂｉｓｈｉ）に接種して温度３０℃、空気投入量２０ｖｖｍ、攪拌速度５００ｒｐｍの条件下で培養した。発酵が進むにつれて、微生物の成長のために足りないエネルギー源を補うために、葡萄糖(glucose)と酵母抽出液(yeast extract)とを微生物の発酵状態に応じて投与し、吸光度６００ｎｍでのＯＤ値が８０となる時期にＩＰＴＧを投与して蛋白質の発現を誘導した。これを４０〜４５時間高濃度で培養して吸光度６００ｎｍでのＯＤ値が１２０〜１４０となるようにした。得られた発酵液を遠心分離（２０，０００ｇ、３０分）して沈殿物は捨て、上澄み液のみを取った。
【０１１５】
得られた上澄み液から次の３段階のカラムクロマトグラフィを経て抗腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’を純粋に精製した。２０ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させたＨｉＴｒａｐ蛋白質Ｇカラム（５ｍＬ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に前記上澄み液を滴下した後、１００ｍＭのグリシン（Glycine、ｐＨ３．０）緩衝液を用いて溶出させた。溶出したＦａｂ’分画を１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）で平衡化させたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（Superdex 200, Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に滴下し、同一の緩衝液で溶出させた。溶出したＦａｂ’分画をｐｏｌｙＣＡＴ ２１×２５０カラム（ＰｏｌｙＬＣ社）を用いて最終精製したが、１０ｍＭの酢酸塩緩衝液（ｐＨ４．５）を用いた直線濃度勾配（塩化ナトリウムの濃度０．１５Ｍ→０．４Ｍ）法で溶出して純粋な抗腫瘍壊死因子−アルファＦａｂ’分画を得た。
【０１１６】
（段階２）Ｆｃ−ＰＥＧ連結体の製造および精製
免疫グロブリンＦｃのＮ末端のアミノ基にリンカーＰＥＧを結合させるために、前記実施例５の段階１と同一の方法で製造された免疫グロブリンＦｃを１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させ、ここにＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬ（３．４ｋＤａ、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ社）をＦｃ：ＰＥＧのモル比が１：１０となるように添加した後、４℃で徐々に攪拌しながら１２時間反応させた。
【０１１７】
反応終了後、反応緩衝液を２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で交換しながら、反応していないＮＨＳ−ＰＥＧ−ＭＡＬを除去した。緩衝液の交換後、反応物をｐｏｌｙＣＡＴカラム（ＰｏｌｙＬＣ社）に負荷し、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を直線濃度勾配（塩化ナトリウムの濃度０．１５Ｍ→０．５Ｍ）方法で流して免疫グロブリンＦｃ−ＰＥＧ連結体を先に溶出させて得た後、反応していない免疫グロブリンＦｃを溶出させて除去した。
【０１１８】
（段階３）Ｆａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ結合体（−ＳＨ基）の製造および精製
Ｆａｂ’の遊離システイン基に免疫グロブリンＦｃ−ＰＥＧ連結体を結合させるために、段階１で精製されたＦａｂ’を１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）に２ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させた後、同一の緩衝液に段階２で準備された免疫グロブリンＦｃ−ＰＥＧ連結体をＦａｂ’：連結体のモル比が１：５となるように入れた。最終蛋白質の濃度が５０ｍｇ／ｍＬとなるように濃縮し、４℃で徐々に攪拌しながら２４時間反応させた。
【０１１９】
カップリング反応の終了後、反応液を１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）で平衡化させたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（Superdex 200、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に滴下し、同一の緩衝液を１ｍＬ／分の流速で流して溶出させた。カップリングされたＦａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ結合体は、分子量が大きいので先に溶出し、反応していない免疫グロブリンＦｃ−ＰＥＧ連結体およびＦａｂ’は後で溶出するため、除去することができた。残存する未反応免疫グロブリンＦｃを完全に除去するために、溶出したＦａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ結合体分画をさらにｐｏｌｙＣＡＴ ２１×２５０カラム（ＰｏｌｙＬＣ社）に滴下し、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用いた直線濃度勾配（塩化ナトリウムの濃度０．１５Ｍ→０．５Ｍ）法で溶出し、Ｆｃ−ＰＥＧ連結体がＦａｂ’のＣ末端付近の−ＳＨ基に連結されたＦａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ結合体を純粋に得た。
【０１２０】
（実施例１３）Ｆａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ結合体の製造（Ｎ末端）
（段階１）Ｆａｂ’−ＰＥＧ連結体（Ｎ末端）の製造および精製
前記実施例１２の段階１で得た、精製されたＦａｂ’４０ｍｇを１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させた後、ブチルＡＬＤ−ＰＥＧ−ブチルＡＬＤ（３．４ｋＤａ、Ｎｅｋｔａｒ社）をＦａｂ’：ＰＥＧのモル比が１：５となるように添加した。還元剤としてＮａＣＮＢＨ３を最終濃度が２０ｍＭとなるように添加した後、４℃で徐々に攪拌しがら２時間反応させた。
【０１２１】
反応終了後、反応緩衝液を２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で交換した。緩衝液の交換後、反応物をｐｏｌｙＣＡＴカラム（ＰｏｌｙＬＣ社）に負荷し、２０ｍＭの酢酸塩緩衝液（ｐＨ４．５）を用いた直線濃度勾配（塩化ナトリウムの濃度０．１５Ｍ→０．４Ｍ）法で溶出し、Ｆａｂ’のＮ末端にリンカーＰＥＧが結合したＦａｂ’−ＰＥＧ連結体分画を先に溶出させて得た後、反応していないＦａｂ’を溶出させて除去した。
【０１２２】
（段階２）Ｆａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ結合体の製造および精製
段階１で精製されたＦａｂ’−ＰＥＧ連結体を免疫グロブリンＦｃのＮ末端に結合させるために、１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させた後、同一の緩衝液に溶解された免疫グロブリンＦｃをＦａｂ’−ＰＥＧ連結体：Ｆｃのモル比が１：５となるように入れた。最終蛋白質の濃度が５０ｍｇ／ｍＬとなるように濃縮し、還元剤としてＮａＣＮＢＨ３を最終濃度が２０ｍＭとなるように添加した後、４℃で徐々に攪拌しながら２４時間反応させた。
【０１２３】
カップリング反応の終了後、反応液を１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）で平衡化させたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（Superdex 200、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に滴下し、同一の緩衝液を１ｍＬ／分の流速で流して溶出させた。カップリングされたＦａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ結合体は、分子量が大きいので先に溶出し、反応していない免疫グロブリンＦｃおよびＦａｂ’−ＰＥＧ連結体は後で溶出するため除去することができた。残存する未反応免疫グロブリンＦｃを完全に除去するために、溶出したＦａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ結合体分画をさらにｐｏｌｙＣＡＴ ２１×２５０カラム（ＰｏｌｙＬＣ社）に負荷し、２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を用いた直線濃度勾配（塩化ナトリウムの濃度０．１５Ｍ→０．５Ｍ）法で溶出し、免疫グロブリンＦｃ−ＰＥＧ連結体がＦａｂ’のＮ末端に連結されたＦａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ結合体を純粋に得た。
【０１２４】
（実施例１４）脱糖鎖化免疫グロブリンＦｃの製造および精製
前記実施例５と同一の方法で製造した免疫グロブリンＦｃ２００ｍｇを、１００ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．５）に２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように溶解した後、脱糖鎖化酵素ＰＮＧａｓｅ Ｆ（ＮＥＢ社）を３００Ｕ／ｍｇとなるように添加した。反応混合物を３７℃で２４時間徐々に攪拌しながら反応させた。反応終了後、脱糖鎖化免疫グロブリンＦｃを精製するために、反応物をＳＰセファロースＦＦカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に負荷し、１０ｍＭの酢酸塩緩衝液（ｐＨ４．５）条件で１ＭのＮａＣｌを使用した直線濃度勾配（０．１Ｍ→０．６Ｍ）法で溶出させ、天然型免疫グロブリンＦｃ分画を先に溶出させた後、脱糖鎖化免疫グロブリンＦｃ（deglycosylated FC：ＤＧ Ｆｃ）を溶出させて得た。
【０１２５】
（実施例１５）ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ結合体の製造
前記実施例５の段階２で精製されたＩＦＮα−ＰＥＧ連結体に、前記実施例１４で製造された脱糖鎖化免疫グロブリンＦｃを結合させるために、ＩＦＮα−ＰＥＧ連結体を１０ｍＭのリン酸塩緩衝液に溶解されたＤＧ ＦｃにＩＦＮα−ＰＥＧ連結体：ＤＧ Ｆｃのモル比がそれぞれ１：１、１：２、１：４および１：８となるように添加して反応させた。反応液を１００ｍＭのリン酸塩緩衝液に調製し、還元剤としてＮａＣＮＢＨ３を最終濃度が２０ｍＭとなるように添加した後、４℃で２０時間徐々に攪拌しながら反応させた。
【０１２６】
これにより、反応性が最も良くて二量体などの副産物が少ないＩＦＮα−ＰＥＧ連結体：ＤＧ Ｆｃの最適反応モル比は、１：２であることを確認した。
【０１２７】
結合反応後、未反応物質および副産物を除去し、生成されたＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ蛋白質結合体を精製するために、反応混合物を用いてＳｕｐｅｒｄｅｘ（SuperdexR、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）サイズ排除クロマトグラフィを行った。リン酸塩緩衝液（ｐＨ７．３）を用いて流速２．５ｍＬ／分でカラムに通過させ、結合していないＤＧ Ｆｃおよび未反応物質を除去し、ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ蛋白質結合体分画を精製した。
【０１２８】
得られたＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ蛋白質結合体分画には、不純物として少量の未反応ＤＧ ＦｃおよびＩＦＮα−ＰＥＧ連結体が混在しているので、これを除去するためにさらに陽イオン交換樹脂クロマトグラフィを行った。ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ蛋白質結合体分画を１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）で平衡化させたＰｏｌｙＣＡＴ ＬＰカラム（ＰｏｌｙＬＣ社）に仕込み、１ＭのＮａＣｌを含んだ１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）を用いた直線濃度勾配（塩化ナトリウムの濃度０Ｍ→０．６Ｍ）法で溶出してさらに精製し、最後に陰イオン交換カラムを用いてＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ蛋白質結合体を純粋に獲得した。ＰｏｌｙＷＡＸ ＬＰカラム（ＰｏｌｙＬＣ社）を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化させた後、精製されたＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ蛋白質結合体分画を負荷し、１Ｍの塩化ナトリウムを含んだ１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を用いた直線濃度勾配（塩化ナトリウムの濃度０Ｍ→０．３Ｍ）法で溶出して純粋なＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ蛋白質結合体を精製した。
【０１２９】
（実施例１６）ＩＦＮα−ＰＥＧ連結体と組み換えＡＧ Ｆｃ誘導体の結合体の製造
前記実施例５および１５と同一の方法により、実施例１で製造されたＡＧ Ｆｃ誘導体であるＩｇＧ４ ｄｅｌｔａ−ＣｙｓのＮ末端にＩＦＮα−ＰＥＧ連結体を結合させた。実施例１で製造されたＡＧ Ｆｃ誘導体であるＩｇＧ４ ｄｅｌｔａ−ＣｙｓをＩＦＮα−ＰＥＧ連結体と結合させた。結合反応後、未反応物質および副産物を除去し、生成されたＩＦＮα−ＰＥＧ−ＡＧ Ｆｃ蛋白質結合体（Ｉ）を精製するために、Ｑ ＨＰ ２６／１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）５０ｍＬを用いて１次精製した後、高圧カラムのｐｏｌｙＣＡＴ ２１．５×２５０カラム（ＰｏｌｙＬＣ社）で高純度の結合体を精製した。カップリング反応液を脱塩カラムＨｉＰｒｅｐ ２６／１０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いて１０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）で交換した後、Ｑ ＨＰ２６／１０ ５０ｍＬカラムに８ｍＬ／分の流速で負荷して結合させた後、直線濃度勾配（塩化ナトリウムの濃度０Ｍ→０．２Ｍ）法によって所望の分画を得た。溶出した分画を１０ｍＭの酢酸塩緩衝液（ｐＨ５．２）で平衡化されたｐｏｌｙＣＡＴ２１．５×２５０カラムに１５ｍＬ／分の流速でさらに結合させた後、直線濃度勾配（塩化ナトリウムの濃度０．１Ｍ→０．３Ｍ）法で溶出させて高純度の分画を得ることができた。同一の方法により、実施例１２で製造された別のＡＧ Ｆｃ誘導体であるＩｇＧ４単量体を用いてＩＦＮα−ＰＥＧ−ＡＧ Ｆｃ蛋白質結合体（ＩＩ）を製造した。
【０１３０】
（実施例１７）ヒト赤血球生成因子（ＥＰＯ）−ＰＥＧ−組み換えＡＧ Ｆｃ誘導体の結合体の製造
前記実施例１６と同一の方法により、ＥＰＯ−ＰＥＧ連結体とＡＧ Ｆｃ誘導体であるＩｇＧ４ ｄｅｌｔａ−Ｃｙｓとが連結された結合体を製造した。
【０１３１】
（比較例１）ＩＦＮα−４０Ｋ ＰＥＧ連結体の製造
１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）にインターフェロンアルファ５ｍｇを溶解して最終体積が５ｍＬとなるように調製した後、ＰＥＧの分子量４０ｋＤａの活性化メトキシ−ＰＥＧ−アルデヒド（Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ社）をインターフェロンアルファ：４０Ｋ ＰＥＧのモル比が１：４となるように前記溶液に添加した。前記反応溶液に還元剤ＮａＣＮＢＨ３を最終濃度が２０ｍＭとなるように添加した後、４℃で１８時間徐々に攪拌させながら反応させた。インターフェロンアルファに反応していないＰＥＧを不活性化させるために、エタノールアミンを最終濃度が５０ｍＭとなるように添加した。
【０１３２】
未反応ＰＥＧの分離および緩衝液の交替のためにＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いた。まず、２カラム体積（column volume；ＣＶ）の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を用いてカラムを平衡化させた後、反応混合物を滴下した。溶出画分は、紫外部吸光計により波長２６０ｎｍの吸収を測定することによって検出した。前記カラムを同一の緩衝液で溶出させると、大きさが更に大きいＰＥＧによって（Ｎ末端に：挿入ＫＹＭ）修飾されたインターフェロンアルファが先に溶出し、未反応ＰＥＧは時差をおいて後で溶出するため、ＩＦＮα−４０Ｋ ＰＥＧのみを分離することができる。
【０１３３】
前記で得た溶出液からＩＦＮα−４０Ｋ ＰＥＧ連結体をさらに純粋に分離、精製するために、次のようにクロマトグラフィを行った。３ｍＬのＰｏｌｙＷＡＸ ＬＰカラム（Ｐｏｌｙｗａｘ社）を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化させた。ＰＥＧ−ＩＦＮα連結体を含有する溶出液を１ｍＬ／分の流速でカラムに負荷した後、１５ｍＬの平衡緩衝液で洗浄した。３０ｍＬの１Ｍ ＮａＣｌ緩衝液を用いた０〜１００％の塩濃度勾配法を用いてトリ−、ジ−およびモノ−ＰＥＧが結合したインターフェロンアルファを順序とおりに溶出させた。
【０１３４】
さらに純粋なモノ−ＰＥＧ結合インターフェロンアルファを分離するために、前記で収得したモノ−ＰＥＧとインターフェロンアルファとの連結体溶出分画をサイズ排除クロマトグラフィにかけた。１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化させたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（Superdex 200、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に前記溶出液を濃縮して滴下した後、同一の緩衝液で溶出させた。この際、１ｍＬ／分の流速で緩衝液を流した。トリ−およびジ−ＰＥＧが結合したインターフェロンアルファは、モノ−ＰＥＧが結合したインターフェロンアルファより溶出時間が相対的に早いので、これを除去して、モノ−ＰＥＧが結合したインターフェロンアルファのみを純粋に分離した。
同一の方法により、ヒト成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子およびその誘導体のアミノ末端に４０Ｋ ＰＥＧが結合したｈＧＨ−４０Ｋ ＰＥＧ、Ｇ−ＣＳＦ−４０Ｋ ＰＥＧおよび４０Ｋ ＰＥＧ−１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体の連結体を製造した。
【０１３５】
（比較例２）ＩＦＮα−ＰＥＧ−アルブミン結合体の製造
実施例１の段階２で精製されたＩＦＮαＦ−ＰＥＧ連結体をアルブミンのアミノ末端に結合させるために、１０ｍＭのリン酸塩緩衝液に溶解されたヒトアルブミン（human serum albumin、ＨＳＡ、約６７ｋＤａ、緑十字）をＩＦＮα−ＰＥＧ連結体：アルブミンのモル比が１：１、１：２、１：４および１：８となるように添加した後、反応させた。反応液を１００ｍＭのリン酸塩緩衝液に調製し、還元剤としてＮａＣＮＢＨ３を最終濃度が２０ｍＭとなるように添加した後、４℃で２０時間徐々に攪拌しながら反応させた。これにより、反応性が最も良くて二量体などの副産物が少ないＩＦＮα−ＰＥＧ連結体：アルブミンの最適反応モル比は、１：２であることを確認した。
【０１３６】
結合反応の後、未反応物質および副産物を除去し、生成されたＩＦＮα−ＰＥＧ−アルブミン蛋白質結合体を精製するために、Ｓｕｐｅｒｄｅｘサイズ排除クロマトグラフィを行った。各反応混合物を濃縮した後、１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液を２．５ｍＬ／分の流速でカラムに通過させ、結合していないアルブミンおよび未反応物質を除去し、ＩＦＮα−ＰＥＧ−アルブミン蛋白質結合体のみを精製した。得られたＩＦＮα−ＰＥＧ−アルブミン蛋白質結合体分画には、不純物として少量の未反応アルブミンおよびインターフェロンアルファ二量体が混在しているので、これを除去するためにさらに陽イオン交換樹脂クロマトグラフィを行った。ＩＦＮα−ＰＥＧ−アルブミン蛋白質結合体分画を１０ｍＭの酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．５）で平衡化させたカラム（ＳＰ５ＰＷ、Ｗａｔｅｒｓ社）に負荷し、１Ｍの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含んだ１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）を用いた直線濃度勾配（塩化ナトリウムの濃度０Ｍ→０．５Ｍ）法で溶出してさらに精製し、ＩＦＮα−ＰＥＧ−アルブミン蛋白質結合体を純粋に獲得した。
【０１３７】
同一の方法により、ヒト成長ホルモン、Ｇ−ＣＳＦおよびその誘導体にそれぞれアルブミンが結合したｈＧＨ−ＰＥＧ−アルブミン、Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−アルブミンおよび１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−アルブミン結合体を製造した。
【０１３８】
（比較例３）Ｆａｂ’−Ｓ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体の製造
実施例８の段階１で精製されたＦａｂ’に存在する遊離システイン基を活性化させるために、活性化緩衝液（２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）、０．２ｍＭのＤＴＴ）に１時間放置した。ＰＥＧ修飾緩衝液である５０ｍＭのリン酸カリウム（ｐＨ６．５）で緩衝液を交換した後、マレイミド−ＰＥＧ（分子量４０ｋＤａ、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ社）をＦａｂ’：４０Ｋ ＰＥＧのモル比が１：１０となるように添加した後、４℃で徐々に攪拌しながら２４時間反応させた。
【０１３９】
反応終了後、反応液を１０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．３）で平衡化させたＳｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（Superdex 200、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に滴下し、同一の緩衝液を１ｍＬ／分の流速で流して溶出させた。４０Ｋ ＰＥＧが修飾されたＦａｂ’−４０Ｋ ＰＥＧ連結体は、分子量が大きいので、反応していないＦａｂ’よりも早く溶出し、Ｆａｂ’は後で溶出するため、除去することができた。完全に除去されていないＦａｂ’を除去するために、溶出したＦａｂ’−４０Ｋ ＰＥＧ連結体分画をｐｏｌｙＣＡＴ ２１×２５０カラム（ＰｏｌｙＬＣ社）を用いて最終精製した。２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）を用いた直線濃度勾配（塩化ナトリウムの濃度０．１５Ｍ→０．５Ｍ）法で溶出し、Ｆａｂ’の−ＳＨ基に４０Ｋ ＰＥＧが連結されたＦａｂ’−Ｓ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体を純粋に得た。
【０１４０】
（実験例１）蛋白質結合体の確認および定量
（１−１）蛋白質結合体の確認
前記実施例で製造した蛋白質結合体は、４〜２０％の濃度勾配ゲルおよび１２％のゲルを用いた非還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ社）法で確認した。
【０１４１】
図６に示すように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から、生理活性ポリペプチド、非ペプチド性重合体であるＰＥＧおよび免疫グロブリンＦｃ領域のカップリング反応によって、ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体（Ａ）、１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体（Ｂ）およびＥＰＯ−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体（Ｃ）が生成されたことを確認した。
【０１４２】
また、前記実施例１０で製造したＤＧ Ｆｃを確認するために非還元性１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果、図９ｂに示すように、天然型Ｆｃに比べて除去された糖鎖分子量だけ減少した位置でＤＧ Ｆｃバンドが検出された。
【０１４３】
（１−２）蛋白質結合体の定量
前記実施例で製造したそれぞれの蛋白質結合体の量は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘカラム（ＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）と１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を溶出液として用いるサイズ排除クロマトグラフィでのピーク面積を対照と比較して換算する方法によって計算した。既に定量されているＩＦＮα、ｈＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯおよびＦｃを用いてそれぞれサイズ排除クロマトグラフィを行った後、濃度とピーク面積間の換算係数を測定した。各蛋白質結合体の一定量を使用して同一のサイズ排除クロマトグラフィを行い、ここから得られたピーク面積から免疫グロブリンＦｃ領域に該当するピーク面積を差し引いた値を、各蛋白質結合体に存在する生理活性蛋白質の定量値として決定した。図７は精製されたＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体のサイズ排除クロマトグラフィカラムの分析結果を示すもので、二量体以上の多量体不純物がない単一ピークを確認した。
【０１４４】
Ｆｃが生理活性ポリペプチドに結合すると、生理活性ポリペプチドの抗体でその量を定量するとき、抗体と前記ポリペプチドとの結合が阻害され、クロマトグラフィによって計算される実際値より少なく定量される。ＥＬＩＳＡ分析の結果から、ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃの場合には、ＥＬＩＳＡによって測定された値が大略実際値の約３０％程度であると確認された。
【０１４５】
（１−３）蛋白質結合体の純度および質量確認
それぞれの実施例で得た蛋白質結合体に対してサイズ排除クロマトグラフィを行い、２８０ｎｍの吸光を測定した。その結果、ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ、ｈＧＨ−ＰＥＧ−Ｆｃ、Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−Ｆｃおよび１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−Ｆｃは、分子量７０〜８０ｋＤａの物質の滞留時間帯で単一ピークを示した。
【０１４６】
一方、実施例５、１５および１６で獲得した蛋白質結合体ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ、ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ ＦｃおよびＩＦＮα−ＰＥＧ−組み換えＡＧ Ｆｃ誘導体試料の純度を分析するために、逆相ＨＰＬＣを行った。逆相カラム（Ｖｙｄａｃ社、２５９ ＶＨＰ５４カラム）を用いて分析し、０．５％ＴＦＡの存在下のアセトニトリル溶媒を用いた濃度勾配（４０〜１００％）法によって溶出した。純度は、２８０ｎｍの吸収を測定することによって解析された。その結果、図１１から分かるように、結合していないインターフェロンまたは免疫グロブリンＦｃは存在しておらず、ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体（Ａ）、ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ結合体（Ｂ）およびＩＦＮα−ＰＥＧ−組み換えＡＧ Ｆｃ誘導体結合体（Ｃ）のいずれも９６％以上の純度で純粋に精製された。
【０１４７】
各精製された試料の正確な分子量を確認するために、各試料の質量をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ−ＳＴＲ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）超高速質量分析器を用いて分析した。マトリックスとしてはシナピン酸(sinapinic acid)を使用し、それぞれの試験用試料０．５μＬを試料スライドに塗布して自然乾燥させた後、同量のマトリックス溶液を添加し、その後さらに自然乾燥させてイオン源(ion source)に導入した。検出はポジティブ方式でリニアモードＴＯＦ方式の装置を用いて行った。イオンは、遅延したイオン抽出（ＤＥ）を用いる分割抽出供給源で、遅延した抽出時間を７５０ｎｓｅｃ／１５００ｎｓｅｃとして、約２．５ｋＶの全体電位差によって加速化した。
【０１４８】
表１は前記実施例で得たそれぞれのＦｃ蛋白質結合体のＭＬＡＤＩ−ＴＯＦ質量分析結果を数値化して示したものであり、図８はＥＰＯ−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体、図１０はＩＦＮα−ＰＥＧ−ＦｃおよびＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ結合体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析結果を示したものである。その結果、収得されたＥＰＯ−ＰＥＧ−Ｆｃ蛋白質結合体の純度は９５％以上であり、理論値と非常に近い分子量を示した。また、免疫グロブリンＦｃ領域に赤血球生成因子（ＥＰＯ）が１：１で結合した形態であると確認された。
【０１４９】
【表１】
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【０１５０】
また、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により、実施例１４で製造されたＦｃおよびＤＧ Ｆｃの分子量を測定した結果、ＤＧ Ｆｃの分子量は天然型Ｆｃより３ｋＤａ程度小さい５０ｋＤａと確認された（図９ａ）。減少した３ｋＤａは理論的糖鎖サイズに該当する分子量であって、糖鎖が完全に除去されたことを確認することができた。
【０１５１】
下記表２は、前記実施例１１で製造されたＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ結合体と、実施例１６で製造されたＩＦＮα−ＰＥＧ−組み換えＡＧ Ｆｃ誘導体結合体（ＩおよびＩＩ）のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析結果を示したものである。ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体の分子量（７５．９ｋＤａ）と比較したとき、ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ結合体は約３ｋＤａ程度小さい分子量を示し、ＩＦＮα−ＰＥＧ−組み換えＡＧ Ｆｃ誘導体結合体（Ｉ）は約３〜４ｋＤａ程度小さい分子量を示した。Ｆｃ単量体に連結されたＩＦＮα−ＰＥＧ−組み換えＡＧ Ｆｃ誘導体結合体（ＩＩ）は、Ｆｃ単量体分子量に該当する２４．５ｋＤａが減少した分子量を示した。
【０１５２】
【表２】
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【０１５３】
（実験例２）薬物動態学的な調査Ｉ
各群当たり５匹のＳＤラットにおいて、天然型生理活性蛋白質（対照群）と前記実施例および比較例で製造した−４０Ｋ ＰＥＧ連結体、−ＰＥＧ−アルブミン結合体、−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体、−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ結合体、および−ＰＥＧ−組み換えＡＧ Ｆｃ誘導体結合体の血液内安定性および薬物動態学的係数(pharmacokinetic parameters)を比較した。対照群および−４０Ｋ ＰＥＧ連結体、−ＰＥＧ−アルブミン結合体、−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体、−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ結合体、および−ＰＥＧ−組み換えＡＧ Ｆｃ誘導体結合体（試験群）を各１００μｇ／ｋｇずつ皮下注射した後、対照群は注射してから０．５．１、２、４、６、１２、２４、３０、４８、７２および９６時間後に採血し、試験群は注射してから１、６、１２、２４、３０、４８、７２、９６、１２０、２４０および２８８時間後に採血した。ヘパリンを含有するチューブに血液試料を集めて凝固を防止し、エッペンドルフ高速マイクロ遠心分離機で５分間遠心分離して細胞を除去した。血漿内の蛋白質量は、各生理活性蛋白質に対する抗体を用いてＥＬＩＳＡ方法によって測定した。
ＩＦＮα、ｈＧＨ、Ｇ−ＣＳＦまたはＥＰＯの天然型蛋白質、これらの−４０Ｋ ＰＥＧ連結体、−ＰＥＧ−アルブミン結合体、−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体、および−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ結合体の薬物動態の分析結果を下記表３〜表７に示した。下記表において、Ｔｍａｘは最高薬物濃度に到達する時間を、Ｔ１／２は薬物の血中半減期を、ＭＲＴ(mean residence time)は薬物分子の平均的な体内滞留時間をそれぞれ意味する。
【０１５４】
【表３】
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【０１５５】
【表４】
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【０１５６】
【表５】
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【０１５７】
【表６】
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【０１５８】
【表７】
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【０１５９】
前記表３および図１２の薬物動態グラフから分かるように、ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ蛋白質結合体の場合、血中半減期は９０．４時間であって天然型に比べて約５０倍増加した。これは比較例１で製造したＩＦＮα−４０Ｋ ＰＥＧの半減期である３５．８時間より約２．５倍増加したものである。また、ＩＦＮα−ＰＥＧ−アルブミンの半減期である１７．１時間に比べても、本発明のＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ蛋白質結合体が著しく優れた血中半減期を示すことを確認した。
【０１６０】
一方、表３および図１４に示すように、ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ結合体の場合には、血中半減期が７１．０時間であって、ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体とほぼ同等なので、糖鎖がなくても生体内安定性には大きい影響がなく、組み換え方法で生産された組み換えＡＧ Ｆｃ誘導体を用いた結合体も天然型由来のＤＧ Ｆｃと同一の効果を示すことを確認した。ところが、Ｆｃ単量体を使用した結合体の場合には、正常的なＦｃ二量体の結合体と比較したとき、約半分に減少した血中半減期を示した。
【０１６１】
ヒト成長ホルモンの場合も、表４に示すように、本発明の蛋白質結合体が示す血中半減期の増加効果を確認することができる。すなわち、天然型（１．１時間）に比べてｈＧＨ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体およびｈＧＨ−ＰＥＧ−アルブミン結合体の半減期が７．７時間および５．９時間と多少増加した反面、本発明のｈＧＨ−ＰＥＧ−Ｆｃ蛋白質結合体の場合には血中半減期が１１．８時間と画期的に増加した。
【０１６２】
表５および表６における顆粒球コロニー刺激因子とその誘導体に対する薬物動態の分析結果においても、天然型、−４０Ｋ ＰＥＧ連結体および−ＰＥＧ−アルブミン結合体に比べて本発明のＧ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−Ｆｃおよび１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体が一層長い血中半減期を示した。蛋白質の血中持続性を増加させる免疫グロブリンＦｃ領域の効果は、天然型生理活性蛋白質だけでなく、一部のアミノ酸を変形させた誘導体においても天然型とほぼ同一の程度であることを確認することができ、このような結果により、本発明の方法が他の蛋白質の誘導体においても類似の効果を示すことを容易に予想することができる。
【０１６３】
表７および図１３に示すように、糖鎖化されている天然型蛋白質としての赤血球生成因子に対しても本発明の蛋白質結合体の血中半減期増加効果が確認された。すなわち、天然型赤血球生成因子の血中半減期が９．４時間であり、ＥＰＯを高糖鎖化させて血中安定性を高めたダーベポエチン−α（Darbepoetin-α、Ａｒａｎｅｓｐ、Ａｍｇｅｎ社）の場合は半減期が１８．４時間と増加することが分かる。赤血球生成因子に免疫グロブリンＦｃ領域を結合させた本発明のＥＰＯ−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体の場合には、血中半減期がおおよそ６１．５時間と画期的に増加し、糖鎖が除去された大腸菌由来の組み換えＡＧ Ｆｃ誘導体を使用した結合体の場合には８７．９時間まで半減期の増加を示し、糖鎖が除去されても、血中安定性には影響を及ぼすことなく、抗体機能がない結合体を製造することができることを確認した。
【０１６４】
前記結果から分かるように、本発明によって免疫グロブリンＦｃ領域および非ペプチド性重合体と共有結合した蛋白質結合体は、天然型蛋白質に比べて数倍〜数十倍以上増加した血中半減期を示した。また、免疫グロブリンＦｃを遺伝子組み換え法によって大腸菌で生産し、あるいは酵素処理によって糖鎖を除去しても、これを用いて製造された蛋白質結合体における血中半減期の増加効果はほぼ同様に維持された。
【０１６５】
特に、既存の蛋白質血中持続性を増加させるためのＰＥＧ剤形のうち持続性が最も高い４０ｋＤａ ＰＥＧを修飾した蛋白質との比較においても、免疫グロブリンＦｃ蛋白質結合体が著しく高い血中安定性を示した。また、免疫グロブリンＦｃの代わりにアルブミンを結合させた蛋白質結合体との比較試験においても、本発明の蛋白質結合体が、卓越した血中安定性を示すことから、本発明の蛋白質結合体が持続型蛋白質薬物製剤の開発に効果的であることを確認することができた。点突然変異(point mutation)によるコロニー刺激因子誘導体まで広範囲な範囲の蛋白質において従来のＰＥＧ結合蛋白質またはアルブミン蛋白質結合体より卓越した血中安定性と平均滞留時間（ＭＲＴ）を示す結果からみて、本発明の蛋白質結合体による安定性および持続性増加効果は他の生理活性ポリペプチドにも適用可能であることが分かる。
【０１６６】
一方、非ペプチド性重合体として１０ｋＤａ ＰＥＧを使用したＩＦＮα−１０Ｋ ＰＥＧ−Ｆｃ蛋白質結合体（実施例１１）を用いて前記と同一の方法で血中半減期を測定したとき、血中半減期は４８．８時間であって、分子量３．４ｋＤａのＰＥＧを使用した蛋白質結合体の血中半減期である７９．７時間より多少減少した。
【０１６７】
また、非ペプチド性重合体ＰＥＧの分子量の増加に伴って血中半減期はむしろ多少減少したが、このような結果から、蛋白質結合体の血中安定性および持続性の増加の主な要因が非ペプチド性重合体の分子量よりは結合した免疫グロブリンＦｃ領域による効果であることが確認できる。
【０１６８】
ＰＥＧの反応基をアルデヒド反応基以外の反応基に変化させた場合でも、見掛け分子量と血中半減期が、アルデヒド反応基を持つＰＥＧを使用した場合と類似の様相を示した。
【０１６９】
（実験例３）薬物動態学的な調査ＩＩ
実施例１２および１３で製造されたＦａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ、Ｆａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ結合体および比較例３で製造されたＦａｂ’−Ｓ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体の血中半減期を測定するために、Ｆａｂ’を対照群として前記結合体または連結体を用いて実験例２と同一の方法で薬物動態学的な調査を行い、その結果を図１５に示した。
図１５より、Ｆａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−ＦｃおよびＦａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ結合体が、Ｆａｂ’またはＦａｂ’−Ｓ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体に比べて２〜３倍延長された血中半減期を示すことが分かる。
【０１７０】
（実験例４）細胞内活性の測定
（４−１）インターフェロンアルファ蛋白質結合体の細胞内活性比較
インターフェロンアルファ蛋白質結合体の細胞内活性比較のために、ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ（実施例５）、ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ（実施例１５）、ＩＦＮα−ＰＥＧ−組み換えＡＧ Ｆｃ誘導体（実施例１６）、ＩＦＮα−４０Ｋ  ＰＥＧ（比較例１）およびＩＦＮα−ＰＥＧ−アルブミン（比較例２）の抗ウイルス活性を水泡性口内炎ウイルスで飽和させたＭＤＢＫ（Madin Darby Bovine Kidney、ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２２）を使用する細胞培養生検で測定した。この際、ＰＥＧが結合していないインターフェロンアルファ−２ｂ（ＮＩＢＳＣ国際標準品）を標準物質として使用した。
【０１７１】
ＭＤＢＫ細胞を、ＭＥＭ（minimum essential medium：ＪＢＩ社）に１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンが添加された培地で３７℃、５％ＣＯ２の条件で培養した。測定しようとする試料および標準物質を一定の濃度で細胞培養培地に希釈して９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬずつ分注した。前記培養された細胞を回収し、試料が分注されているプレートに１００μＬずつ加えた後、３７℃、５％ＣＯ２の条件で約１時間程度培養した。１時間後、ウイルスの濃度が５〜７×１０３ＰＦＵとなるように調節されたＶＳＶ(Vesilculer stomatitis virus)を５０μＬずつプレートに添加し、３７℃、５％ＣＯ２の条件で約１６〜２０時間さらに培養した。試料および標準物質を入れないで細胞とウイルスのみを入れたウェルを陰性対照群として使用し、ウイルス希釈溶液を入れないで細胞のみを入れたウェルを陽性対照群として使用した。
【０１７２】
培養液を除去し、生きている細胞を染色するために、ニュートラルレッド(neutral red)溶液を１００μＬずつ添加した後、３７℃、５％ＣＯ２の条件で２時間培養した。上澄み液を除去した後、１００％のエタノールと１％の酢酸とを１：１の比率で混ぜた溶液１００μＬを各ウェルに入れた。染色された細胞をよく振って溶解させた後、５４０ｎｍで吸光度を測定した。陰性対照群をブランク(blanｋ)とし、陽性対照群を細胞成長１００％と見なして５０％細胞成長時の濃度（ＥＤ５０）を計算した。
【０１７３】
【表８】
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【０１７４】
その結果、図８に示すように、ＩＦＮα−４０Ｋ ＰＥＧは、その活性度が天然型の４．８％水準に低下することが確認できる。特に、修飾されたＰＥＧの大きさが大きいほど、血中安定性は増加し、相対的に活性度は徐々に減少したが、インターフェロンアルファの場合、１２ｋＤａ ＰＥＧが修飾された場合には２５％、４０ｋＤａ ＰＥＧが修飾された場合には約７％程度の試験管内活性を持つと報告されたことがある（P. Bailon et al., Bioconjugate Chem. 12: 195-202, 2001）。すなわち、ＰＥＧの分子量が増加すると、血中半減期は長くなるが、相対的に活性は急激に減少するので、血中半減期が長いながら活性も優れた蛋白質結合体の開発が要求されている。また、ＩＦＮα−ＰＥＧ−アルブミン結合体も天然型に比べて約５．２％程度と低い活性を示したが、本発明のＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体およびＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧ Ｆｃ結合体は、天然型に比べて相対的活性度が２８．１％および２５．７％と画期的に高くなることを確認することができ、組み換えＡＧ Ｆｃ誘導体を使用した結合体においても類似の活性増加効果を示した。このような結果から、血中半減期の画期的増加に伴ってインターフェロンアルファと免疫グロブリンＦｃ領域の結合体の生体内薬効が非常に優れるものと期待される。
【０１７５】
（４−２）ヒト成長ホルモン蛋白質結合体の細胞内活性比較
ヒト成長ホルモン蛋白質結合体の細胞内活性を比較するために、ｈＧＨ−ＰＥＧ−Ｆｃ、ｈＧＨ−４０Ｋ ＰＥＧおよびｈＧＨ−ＰＥＧ−アルブミンの細胞内活性を比較試験した。
【０１７６】
ヒト成長ホルモン依存的に分裂を行う細胞としてのラット結節リンパ腫(rat node lymphoma)細胞株であるＮｂ２細胞（European Collection of Cell Cultures (ECACC) #97041101）を用いて細胞内活性度を試験管内の分析によって確認した。
【０１７７】
Ｎｂ２細胞を、培養液（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）に１０％の牛胎児血清（ＦＢＳ、fetal bovine serum）、０．０７５％のＮａＣＯ３、０．０５ｍＭの２−メルカプトエタノールおよび２ｍＭのグルタミンを添加した培地で培養した後、１０％の牛胎児血清を除いた同一の培地で２４時間さらに培養した。培養液で培養された細胞の数を数えて約２×１０４個の細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに入れた後、ｈＧＨ−ＰＥＧ−Ｆｃ、ｈＧＨ−４０Ｋ ＰＥＧ、ｈＧＨ−ＰＥＧ−アルブミン、対照群である国際標準品（National Institute for Biological Standards and Controls、ＮＩＢＳＣ）および天然型ヒト成長ホルモン（ＨＭ−ｈＧＨ）をそれぞれ希釈して濃度別に添加した。その後、３７℃、ＣＯ２の培養器で４８時間培養した。その後、細胞の成長程度（各ウェルの細胞数）を測定するために、細胞染色薬（Cell Titer 96 Aqueous One Solution、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を各ウェルに２５μＬずつ入れた後、４時間培養した。その後、４９０ｎｍの吸光度を測定して各試料の力価を計算し、その結果を下記表９に示した。
【０１７８】
【表９】
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【０１７９】
表９から分かるように、ヒト成長ホルモンの場合も、ｈＧＨ−４０Ｋ ＰＥＧの活性度は天然型の約７．６％と低下し、ｈＧＨ−ＰＥＧ−アルブミン結合体の試験管内活性は天然型に比べて約５．２％程度と低い活性を示した。ところが、本発明のｈＧＨ−ＰＥＧ−Ｆｃ結合体は、相対的活性度が天然型に比べて２８％以上画期的に増加した。このような結果より、血中半減期の画期的増加に伴ってヒト成長ホルモンと免疫グロブリンＦｃ領域の蛋白質結合体の生体内薬効が非常に優れるものと期待することができる。また、本発明の免疫グロブリンＦｃ蛋白質結合体の活性増加は、免疫グロブリンＦｃによる血中安定性の増加および受容体との結合力保存、または非ペプチド性重合体によって形成された空間的余裕によるものと把握される。このような作用は、他の生理活性蛋白質の免疫グロブリンＦｃ蛋白質結合体においても類似であるものと期待される。
【０１８０】
（４−３）顆粒球コロニー刺激因子蛋白質結合体の細胞内活性比較
顆粒球コロニー刺激因子誘導体の蛋白質結合体の細胞内活性を比較するために、天然型Ｇ−ＣＳＦ（Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ、第一薬品（株））、１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体、２０Ｋ ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｌａｓｔａ社）、４０Ｋ ＰＥＧ−１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ、１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−アルブミンおよび１７Ｓ−Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−Ｆｃの細胞内活性を測定した。
【０１８１】
まず、ヒト骨髄由来の細胞株であるＨＬ−６０（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２４０、Promyelocytic leukemia patient/36 yr old Caucasian female）を１０％の牛胎児血清を含むＲＰＭＩ１６４０倍地で培養してから、細胞の数を約２．２×１０５細胞／ｍＬとなるように調整した後、ＤＭＳＯ（dimethylsulfoxide、ｃｕｌｔｕｒｅ ｇｒａｄｅ、Ｓｉｇｍａ社）を最終１．２５％（ｖ／ｖ）となるように添加した。前記の細胞株を９６ウェルプレート(Corning/low evaporation 96 well plate)に９０μＬずつ入れてウェル当たり細胞が約２×１０４個となるようにした後、５％のＣＯ２が供給される３７℃の培養器で約７２時間培養した。
【０１８２】
Ｇ−ＣＳＦ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて、濃度が決定された各試料を同一の濃度となるようにＲＰＭＩ１６４０で希釈し、最終濃度が１０μｇ／ｍＬとなるようにし、これをさらにＲＰＭＩ１６４０で１／２に希釈することを１９回繰り返し行った。こうして作られた試料を培養中のＨＬ−６０細胞株の各ウェルに１０μＬずつ加え、最終濃度が１μｇ／ｍＬから連続的に半減するようにした。前記で製造した蛋白質試料を処理した細胞株は、３７℃の培養器で７２時間、さらに培養した。
【０１８３】
培養後、細胞株の増加程度を調べるために、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６ＴＭ（Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｇ４１００、Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて分析し、増加した細胞株の数は、６７０ｎｍ波長における吸光度を測定することによって決定した。
【０１８４】
【表１０】
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【０１８５】
その結果、表１０から分かるように、Ｇ−ＣＳＦのアミノ酸を置換させた１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体の免疫グロブリンＦｃ蛋白質結合体も天然型蛋白質の蛋白質結合体と類似の効果を示した。１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧの場合には、ＰＥＧで修飾されていないものに比べて、血中半減期は増加するが活性度は低下すると既に報告されたことがある（大韓民国特許公開第２００４−８３２６８号）。特に、修飾されたＰＥＧの大きさが大きいほど、血中安定性は増加するが、相対的に活性度は徐々に低下することが分かり、１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ−４０Ｋ ＰＥＧは天然型に比べて約１０％以下の非常に低い活性度を示した。すなわち、ＰＥＧの分子量が増加すると、血中半減期は長くなるが相対的に活性は急激に減少するので、血中半減期が長くて活性も優れた蛋白質結合体の開発が要求されている。１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−アルブミンも天然型に比べて約２３％程度と低い活性を示したが、１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ−ＰＥＧ−Ｆｃは天然型に比べて相対的活性度が５１％以上と高くなることを確認することができた。これにより、血中半減期の画期的増加に伴って免疫グロブリンＦｃ領域と１７Ｓｅｒ−Ｇ−ＣＳＦ誘導体の結合体の生体内薬効が非常に優れるものと期待することができる。
【０１８６】
（４−４）Ｆａｂ’結合体の細胞毒性中和試験
実施例８および９で製造されたＦａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ、Ｆａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ結合体、および比較例３で製造されたＦａｂ’−Ｓ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体の試験管内活性実験を行った。マウス繊維亜細胞株Ｌ９２９（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２１４８）を用いてＴＮＦαの細胞毒性を測定する実験を基本骨格として、Ｆａｂ’がＴＮＦαの細胞壊死活性をどれくらい中和させるかを測定した。
【０１８７】
Ｆａｂ’−Ｓ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ、Ｆａｂ’−Ｎ−ＰＥＧ−Ｎ−Ｆｃ結合体およびＦａｂ’−Ｓ−４０Ｋ ＰＥＧ連結体をそれぞれ２倍ずつ順次希釈して９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬずつ分注した後、ｒｈＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）およびＲＮＡ合成の阻害剤として用いられるアクチノマイシンＤ（actinomycin D、Ｓｉｇｍａ社）をそれぞれ最終濃度が１０ｎｇ／ｍＬおよび１μｇ／ｍＬとなるように添加し、３７℃、５％ＣＯ２で３０分間反応させた後、分析用マイクロプレートに移した。プレートの各ウェルにＬ９２９細胞株を５×１０４個／５０μＬ培地となるように添加し、３７℃、５％ＣＯ２の培養器で２４時間培養した。マイクロプレート内の培養液を除去した後、ＰＢＳに５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶けているＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ社）を５０μＬずつ入れた。約４時間３７℃、５％ＣＯ２の培養器で培養した。１５０μＬのＤＭＳＯを添加した後、５４０ｎｍの吸光度を測定して細胞毒性中和の度合いを確認した。対照群としては、実施例８の段階１で精製したＦａｂ’を使用した。
【０１８８】
その結果、図１６に示すように、実験に使用した全ての蛋白質結合体は、Ｆａｂ’と類似の力価を示しており、このような結果から、Ｆａｂ’のＮ末端またはＣ末端近くの遊離システイン残基にＰＥＧを介して免疫グロブリンＦｃを結合させた蛋白質結合体は、Ｆａｂ’の血中半減期を画期的に増加させることは勿論のこと、生体内活性度も高く維持させることが分かる。
【０１８９】
（４−５）ＣＤＣ活性の測定
前記実施例で製造した誘導体と大腸菌形質転換体から発現されて精製された免疫グロブリン不変領域蛋白質とがヒトＣｌｑに結合するか否かを確認するために、下記のように固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）を行った。実験群として、形質転換体ＨＭ１０９３２およびＨＭ１０９２７から生産された免疫グロブリン不変領域試料と前記実施例で製造した誘導体とを使用し、比較群として、糖が結合している免疫グロブリン（ＩＶＩＧ−グロブリンＳ、緑十字ＰＢＭ）を始めとして、商業化されて治療用抗体として使われているいろいろの抗体を使用した。前記実験群と比較群の試料を１０ｍＭのカーボネート緩衝液（ｐＨ９．６）に１μｇ／ｍＬの濃度で調製した。準備された試料を９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）にウェル当たり２００ｎｇの量で分注した後、４℃で一晩中コートし、その後ウェルプレートをＰＢＳ−Ｔ溶液（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．０５％のツイン２０）で３回洗浄した。牛血清アルブミンを１％の濃度でＰＢＳ−Ｔ溶液に溶解させて準備したブロッキングバッファ２５０μＬを各ウェルに添加した後、常温で１時間放置し、同一のＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した。標準液と試料を適切な濃度でＰＢＳ−Ｔ溶液によって希釈した後、抗体がコートされたウェルに加えて常温で１時間放置させて反応させ、その後さらにＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した。ブロッキング反応が完了したプレートに２μｇ／ｍＬのＣｌｑ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社、米国）を添加した後、２時間常温で反応させ、反応済みのプレートを前記ＰＢＳ−Ｔ溶液で６回洗浄した。ヒトの抗ヒトＣｌｑ抗体とペルオキシダーゼとの結合体（Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ社、米国）をブロッキングバッファに１０００：１に希釈して各ウェルに２００μＬずつ加えた後、１時間常温で反応させた。反応が完了した後、各ウェルをＰＢＳ−Ｔ溶液で３回洗浄した後、発色溶液ＡとＢ（カラーＡ−安定化ペルオキシダーゼ[Color A-Stabilized peroxide]溶液およびカラーＢ−安定化クロモゲン[Color B-stabilized chromogen]溶液、ＤＹ９９９、Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ社）を同量で混合し、当該混合液を各ウェルに２００μＬずつ添加し、３０分間放置した。その後、反応停止溶液である２Ｍの硫酸を５０μＬずつ添加して反応を停止させた。反応済みのウェルプレートは、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社）を用い、標準液と検液の４５０ｎｍの波長の吸光度を測定し、その結果を図１７、図１８にそれぞれ示した。
【０１９０】
免疫グロブリンのＦｃ領域における補体活性をサブクラスによって比較した結果、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）、ＩｇＧ２（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）、ＩｇＧ４（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ）の順にＣｌｑに対する高い結合力を持っていることが確認でき、これにより補体活性もサブクラス間に差異があることが分かった。前記実験に使用したＩＶＩＧの場合、ＩｇＧサブクラスの集合体であるが、ＩｇＧ１がほぼ大部分を占めているので、分離精製されたＩｇＧ１とほぼ類似の親和度を示した。このような対照群と比較するとき、非糖鎖化によるＣｌｑの親和度の変化は、補体活性が最も強いＩｇＧ１ Ｆｃで著しく減少することが分かり、既に補体反応がないものと知られているＩｇＧ４ ＦｃではＣｌｑに対する結合力が殆どないので、補体活性のない優れた組み換えキャリアであることが分かった（図１７）。
【０１９１】
Ｃｌｑ親和度が除去されたキャリアの特性が生理活性ペプチドと結合体を作った後にも依然として維持されるか否かを調べるために、ＩＦＮαをモデルとして、糖鎖化Ｆｃ、酵素を用いた脱糖鎖Ｆｃおよび非糖鎖化組み換えＦｃをキャリアとして用いて各結合体を作った後、Ｃｌｑに対する結合力を検討した。糖鎖化ＦｃとＩＦＮα結合体（ＩＦＮα−ＰＥＧ−Ｆｃ：Glycosylated IgG1Fc）は、Ｃｌｑに対して依然として高い親和度を維持するが、ここにＰＮＧａｓｅＦなどを用いて脱糖鎖化させたインターフェロン結合体（ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＤＧＦｃ：Deglycosylated IgG1Fc）は、結合力が著しく低くなることを確認し、その程度は大腸菌由来の非糖鎖化Ｆｃ結合体と同様の水準のＣｌｑに対する結合力を示した。それだけでなく、ＩｇＧ１の非糖鎖化Ｆｃを用いたインターフェロン結合体（ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＡＧＦｃＧ１：Aglycosylated IgG1Fc）をＩｇＧ１からＩｇＧ４に変えたインターフェロン結合体（ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＦｃＧ４誘導体１：Aglycosylated IgG4Fc）の場合、Ｃｌｑに対する親和度が完全に除去されることを確認することができ、結合体を非糖鎖化ＩｇＧ４ Ｆｃ単量体に変えた結合体（ＩＦＮα−ＰＥＧ−ＦｃＧ４誘導体２：Aglycosylated IgG4Fc）の場合にも、やはりＣｌｑに対する結合能力は完全に除去されることからみて、抗体断片のエフェクター(effector)機能がない良いキャリアであることを確認することができた（図１８）。
【０１９２】
本発明は、以下の態様でも提供され得る：
［１］非ペプチド性リンカーを使用して薬物との結合体を形成するための薬物キャリアとして、薬物とは独立的に組換え的な方法によって製造されたものである、ＩｇＧ  Ｆｃ断片。
［２］前記ＩｇＧがＩｇＧ２またはＩｇＧ４である１に記載のＦｃ断片。
［３］前記ＩｇＧがＩｇＧ４である２に記載のＦｃ断片。
［４］非糖鎖化された１に記載のＦｃ断片。
［５］非糖鎖化されたＩｇＧ４ Ｆｃ断片である４に記載のＦｃ断片。
［６］ヒト由来の非糖鎖化されたＩｇＧ４Ｆｃ断片である５に記載のＦｃ断片。
［７］配列番号８、１０または２３のアミノ酸配列を持つ１に記載のＦｃ断片。
［８］１のＦｃ断片をコードする遺伝子。
［９］配列番号４、９または２２である８に記載の遺伝子。
［１０］９の遺伝子の中から選択される配列を持つ組み換えベクター。
［１１］１０の組み換えベクターで形質転換された形質転換体。
［１２］１１の形質転換された組み換え微生物を培養してＦｃ蛋白質を収得する方法。
［１３］１のＦｃ断片をキャリアとして含む薬剤学的組成物。
【産業上の利用可能性】
【０１９３】
本発明のＩｇＧ Ｆｃ断片は、キャリアとして用いられる場合、薬物の血中半減期を増加させ、薬物の生体内活性を維持させる。特にポリペプチド薬物の場合、ポリペプチド薬物の血中半減期の増加が、従来報告されていたいずれの修飾蛋白質よりも高く、既存の持続型製剤（long-acting formulation）の最も大きい欠点である力価の減少を克服することにより、従来最も効果が良いものと知られているアルブミンを用いた場合よりも著しい血中持続性と生体内活性を有する。しかも免疫反応誘発の危険が殆どないため、蛋白質薬物の持続型製剤の開発に有用に利用できる。また、本発明に係る蛋白質薬物の持続型製剤は、頻繁な注射による患者の苦痛を減少させることができ、活性ポリペプチドの血中濃度を持続的に維持して薬効を安定的に示すことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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