(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
胃粘液除去剤の投与とその後の胃粘液の洗浄除去により露出された胃粘膜を洗浄することにより得られる胃粘膜洗浄液を含む、癌関連遺伝子、H. Pyloriおよびその関連遺伝子、ＥＢＶおよびその関連遺伝子、ＣＭＶおよびその関連遺伝子からなる群から選択される疾患関連マーカーを検出することにより疾患を診断するための検体。
【請求項２】
５μｇ以上の核酸を含む、請求項１に記載の検体。
【請求項３】
キレート剤および／またはｐＨ調整剤をさらに含む、請求項１または２に記載の検体。
【請求項４】
ｐＨが３〜１１である、請求項１〜３のいずれかに記載の検体。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載の検体を採取するための前処置剤であって、胃粘液除去剤と、検体のｐＨを３〜１１とすることができる量のｐＨ調整剤とを含む、前記前処置剤。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれかに記載の検体から核酸を抽出する工程を含む、癌関連遺伝子、H. Pyloriおよびその関連遺伝子、ＥＢＶおよびその関連遺伝子、ＣＭＶおよびその関連遺伝子からなる群から選択される疾患関連マーカーを検出する方法。
【請求項７】
検体のｐＨを３〜１１に調整する工程をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
請求項６または７に記載の方法により疾患関連マーカーを検出する工程を含む、薬剤および／または治療方法の治療効果を検査する方法。
【請求項９】
キレート剤および／またはｐＨ調整剤を含み、内視鏡装置の吸引管路に接続可能な、請求項１〜４のいずれかに記載の検体を採取するための検体採取容器であって、該検体採取容器がスコープ側接続部と吸引器側接続部とを備え、吸引器側接続部が内視鏡装置の吸引ボトルのスコープ側接続部に接続するためのものである、前記検体採取容器。
【請求項１０】
請求項９に記載の検体採取容器が、吸引ボトルのスコープ側接続部に接続された、請求項１〜４のいずれかに記載の検体を採取するための内視鏡装置。
【請求項１１】
請求項６または７に記載の方法により疾患関連マーカーを検出する工程を含む、疾患の再発を検査する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患関連マーカーを検出するための方法、より具体的には胃粘膜洗浄液を利用した上記方法、胃粘膜洗浄液を含む検体、該方法に用いる前処置剤および該方法に用いる器具に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、ここ２０年程わが国における死因の第一位であり続けている。死因となった癌を部位別に見た場合には、胃癌が一貫して上位を占めているが、胃癌罹患症例の内訳については明らかな変化が見られ、かつては、進行胃癌に代表される、StageＩＩＩ、ＩＶが主たる患者層を占めていたのに対し、現在では、５０％以上がStageＩで占められている。StageＩはStageＩａ、Ｉｂからなるが、いずれも癌が粘膜下層にとどまることが特徴であり、いわゆる早期癌に分類される。
かかる癌の治療方針としては、身体への影響の大きい、広範な所属リンパ節郭清と比べて比較的低侵襲性の治療法、例えば、内視鏡的な局所切除、開腹部分胃切除、腹腔鏡下部分胃切除等が一般的である。しかし、早期胃癌が台頭してくる以前に主たる治療法であった胃全摘術と異なり、上記治療法では胃の一部が残存するために、残胃における再発に注意を払う必要がある。また、上記のような早期癌においては、現在、肉眼診断による術前評価が１００％の診断能を持たないため、完全切除率は１００％とはならず、癌遺残に対する判定、評価が非常に重要となってきているところ、定期的な内視鏡検査による肉眼診断と、スポット生検組織検査のみに頼っているのが現状である。【０００３】
通常、胃内視鏡検査では、胃内を洗浄しながら粘膜異常の拾い上げが肉眼的に行われる。場合によっては、色素散布（インジゴカルミン液）によるコントラスト法により、表面の異常を検索することもある。そして、疑わしい部位を見つけた場合、その一部をスポットで生検採取し、ホルマリン固定後に顕微鏡下で組織像を評価することになる。
しかしながら、従来の胃内視鏡検査では、肉眼的に疑うことのできない微小な癌の拾い上げは当然不可能であるうえに、スポット生検も組織を「点」で評価できるにすぎず、これを「面」に広げていくには物理的限界がある。しかも、内視鏡治療、腹腔鏡下治療などによる治療後の影響を来した部位は、線維化、熱凝固変性などの修飾により、肉眼的評価が困難な場合がほとんどである。このため、遺残が確定された時点では、すでに進行癌となっていることが少なくない。
今後、上記のような低侵襲治療の増加が予想されることからも、かかる治療法に対応した術後の確かな診断方法の構築が急務である。【０００４】
一方、消化器疾患の診断において、生検とその後の組織学的評価を補完する、またはこれに代替する方法として、対象疾患特有の核酸やタンパク質などの疾患マーカーを検出する試みが近年行われている。例えば、非特許文献１および２には、便ＤＮＡを用いて大腸癌を診断する方法が一定の成果を示したことが記載されている。また、非特許文献３〜５には、腹水ＤＮＡや血清ＤＮＡを胃癌の診断に利用し得ることが、非特許文献６には胃粘液ＤＮＡをピロリ菌感染症の診断に利用し得ることが、そして、非特許文献７には、内視鏡による胃洗浄液に含まれるＤＮＡがリンパ腫の治療後評価に利用し得ることがそれぞれ記載されている。しかしながら、例えば、非特許文献７に記載の方法では、約半数の試料において診断に必要なサザンブロット法を行うのに十分な量のＤＮＡが抽出できないなど、上記いずれの方法も診断可能性や診断精度に問題があり、実用化にはほど遠い水準にとどまっている。【０００５】
【非特許文献１】Ahlquist DA et al., Gastroenterology. 2000 Nov;119(5):1219-27
【非特許文献２】Osborn NK et al., Gastroenterology. 2005 Jan;128(1):192-206
【非特許文献３】To EM et al., Diagn Mol Pathol. 2003 Jun;12(2):88-95
【非特許文献４】Leung WK et al., Br J Cancer. 2005 Jun 20;92(12):2190-4
【非特許文献５】Marutsuka T et al., Clin Cancer Res. 2003 Feb;9(2):678-85
【非特許文献６】Furuta T et al., J Clin Microbiol. 1996 Oct;34(10):2421-5
【非特許文献７】Chen B et al., Hum Pathol. 2004 May;35(5):582-6
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、本発明は、上記のような欠点を有しない、新規な疾患マーカーの検出方法の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行ったところ、対象の胃から検体を採取する前に、胃粘液を除去する処置を行うことにより、これまで採取困難であった粘液層以深の粘膜表層細胞を確実に採取できるとともに、核酸の損傷を最小限にするｐＨ環境を構築でき、かつ、胃粘液の吸引除去後に胃粘膜表面を直接洗浄することにより得られる胃粘膜洗浄液が、核酸検出用の試料として極めて良好な特性を有すること、そして、この洗浄液から抽出した核酸を分析することにより、疾患関連遺伝子が高い頻度で検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち、本発明は、胃粘液除去処置を受けた対象から採取された胃粘膜洗浄液を含む、疾患関連マーカー検出用の検体に関する。
本発明はまた、５μｇ以上の核酸を含む、前記検体に関する。
また、本発明は、キレート剤および／またはｐＨ調整剤をさらに含む、前記検体に関する。
さらに、本発明は、ｐＨが３〜１１である、前記検体に関する。
本発明はさらに、胃粘液除去剤を含む、胃粘膜洗浄液採取の前処置剤に関する。
本発明はさらにまた、前記検体から核酸を抽出する工程を含む、疾患関連マーカーを検出する方法に関する。
また、本発明は、検体のｐＨを３〜１１に調整する工程をさらに含む、前記方法に関する。
本発明はまた、前記検出方法により疾患関連マーカーを検出する工程を含む、薬剤および／または治療方法の治療効果を評価する方法に関する。
さらに、本発明は、キレート剤および／またはｐＨ調整剤を含み、内視鏡装置の吸引管路に接続可能な、胃粘膜洗浄液採取用の検体採取容器に関する。
さらにまた、本発明は、前記検体採取容器が接続された内視鏡装置に関する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の検体や方法は、対象の胃粘膜に付着している粘液を除去したうえで胃粘膜面を洗浄することにより得られる胃粘膜洗浄液を用いるものであり、非特許文献７等に記載の、胃液を多量に含む、単なる内視鏡検査に伴う胃洗浄液を用いる方法とは根本的に異なるものである。単なる胃洗浄液を検体に用いた場合には、非特許文献７が示すとおり、約２割のケースでＰＣＲに十分なＤＮＡ量が得られず、サザンブロット法に至っては約４割のケースで実施不能であるところ、内視鏡の施行には、対象にある程度の肉体的、経済的負担を要することからも、検体の採り直し頻度が極めて高い胃洗浄液を用いる従来法は、臨床の現場で到底利用できるものではなかった。しかしながら、胃粘膜洗浄液を用いる本発明の方法によれば、良質のマーカーを含む検体が容易に得られるため、内視鏡検査由来の廃液を検体材料として利用することが可能となり、これに伴い以下のような種々の有益な効果が得られる。【００１０】
すなわち、本発明による検体や方法は、今まで廃棄してきた洗浄液を材料とするために、内視鏡を利用した他の検査方法によって生じ得る様々なリスク（出血の危険性（生検法）、アレルギー、腎障害の発生（色素散布法）、検査時間の延長（拡大内視鏡）、高価な設備（拡大内視鏡、ＮＢＩ））が新たに発生することもなく、検体の採取が簡便なため、内視鏡施行医、介助看護師にほとんど負担をかけることがない。さらに、本発明の方法においては、内視鏡装置の閉鎖回路の途中に検体採取管を装着するため、検体のコンタミネーションを回避することができ、しかも市販の内視鏡装置がそのまま利用できるため、新たな設備投資が不要である。【００１１】
また、本発明の方法により、疑わしい粘膜面全体を洗浄するだけで「面」での評価が可能となり、しかも生検のように組織に傷を作らないため、止血機能や創傷治癒能力などが減退している対象においても、また、抗血小板薬、抗凝固薬等の止血や創傷治癒に影響する薬剤を内服したままでも検査を行うことができる。内視鏡検査を必要とする対象に高齢者が比較的多く、したがってかかる薬剤を常用する者の割合も多いため、かかる利点の意義は極めて大きい。さらに、ジェネティックまたはエピジェネティックな異常のＤＮＡ検索や、胃癌のリスクとなり得るH. PyloriやＥＢウイルス等の同時評価が可能である。特にH. Pyloriの同定に関しては、萎縮粘膜、癌部などの菌存在率が低い部位からの診断ではなく、胃全体の評価が可能となるうえ、従来の単なる胃粘液の回収では、H. Pyloriの死菌からのマーカーを検出する可能性が高く、偽陽性率も高値であり、除菌療法の判定手段として全く不向きであったところ、本発明の方法では胃粘液が除外されるため、粘膜表面の細胞に陥入した生菌を拾い上げる能力に優れている。
さらに、本発明による方法で採取した検体を用い、抗癌剤を包含する様々な薬剤の感受性を検討することもできる。
さらにまた、本発明の検体や方法により、検体中の核酸量に基づいて疾患の有無、例えば胃内腫瘍の存否を判定できるため、疾患を有する対象をより簡便かつ安価にスクリーニングすることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】検体採取容器の構造を示した図である。
【図２】各種試料中のＤＮＡの状態を示した電気泳動図である。
【図３】各種試料中のＤＮＡ量を分光光度法で評価した図である。横軸は試料の種類、縦軸はＤＮＡ量（μｇ）をそれぞれ表す。横軸の記号の意味は次のとおりである。Ｔ：癌対象の腫瘍部生検試料、Ｎ：癌対象の正常部位生検試料、Ｗ：癌対象の胃粘膜洗浄液、ＥＮ：内視鏡診断下正常対象の生検試料、ＥＷ：内視鏡診断下正常対象の胃粘膜洗浄液。また、*は、２群間の有意差がStudentのt検定でＰ＜０．０００１、**は、Ｐ＜０．００１であることをそれぞれ意味する。なお、図中の水平線は平均値を示す。
【図４】各種試料中のメチル化ＤＮＡを評価した図である（増幅プロット）。
【図５】各種試料中のメチル化ＤＮＡを評価した図である（マルチコンポーネントプロット）。
【図６】胃粘膜洗浄液試料および生検試料中のｈｐｕ遺伝子の存否を示した電気泳動図である。図上部の記号は、Ｔが腫瘍部生検、Ｗが胃粘膜洗浄液をそれぞれ意味し、記号後の番号は実施例５に記載の対象番号を示す。
【図７】異なるｐＨ条件で３時間インキュベートした試料中のＤＮＡ量を示した図である。
【図８】異なるｐＨ条件で２４時間インキュベートした試料中のＤＮＡ量を示した図である。
【図９】異なるｐＨ条件で３または２４時間インキュベートした試料中のＤＮＡの状態を示した電気泳動図である。
【図１０】異なるｐＨ条件で３または２４時間インキュベートした試料中のメチル化ＤＮＡを評価した図である（マルチコンポーネントプロット）。
【符号の説明】
【００１３】
１・・・検体採取容器
２・・・検体採取容器上部
３・・・検体採取容器下部
４・・・スコープ側接続部
５・・・吸引器側接続部
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明の好適な態様について詳細に説明する。
本発明は、胃粘液除去処置を受けた対象から採取された胃粘膜洗浄液を含む、疾患関連マーカー検査用の検体に関する。
本発明において、「対象」とは、胃を有する任意の生物個体を意味し、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコなどのコンパニオンアニマル、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタなどの産業動物など、そして特に好ましくはヒトである。本発明において、対象は健常であっても、何らかの疾患に罹患していても、また疾患の治療中もしくは治療後であってもよいものとする。【００１５】
本発明において、「胃粘液除去処置」とは、胃粘膜に通常付着している胃粘液を意図的に除去するあらゆる処置を包含し、典型的には胃粘液除去剤の対象への投与を含むが、内視鏡装置等を介して対象胃内へ単なる水や生理食塩水を導入し、これにより物理的に剥離した粘液を吸引するなどの純粋に物理的な方法をも包含する。胃粘液除去処置は、胃粘液被覆部分を最小化できるものが好ましく、例えば、限定することなく、対象に粘液溶解除去剤を投与し、対象の体位を変換することなどにより胃全体になじませるといった処置や、より簡便なものとして、対象に比較的多量の溶媒（例えば、プロナーゼ（登録商標）ＭＳ  ２万単位、重曹１ｇおよびガスコン（登録商標）ドロップ４ｍｌ（ジメチコン８０ｍｇ含有）に対し、常水１００ｍｌ以上）に溶解した粘液溶解除去剤を対象に投与し、所定の期間、例えば１０〜１５分間座位安静を保つ処置などを挙げることができる。【００１６】
胃粘液除去処置に用いる胃粘液除去剤は、胃粘液の洗浄除去を容易にする性質を有していればいずれであってもよく、例えば、胃粘液中のタンパク質、糖類、糖タンパク質などの、胃粘液の粘性の原因物質を分解する物質等を挙げることができる。本発明においては、胃粘液除去効率の高さや、対象に対する安全性などの観点から、タンパク質分解酵素製剤であるプロナーゼ（登録商標）が好ましい。プロナーゼ（登録商標）を成人に用いる場合は、典型的には、２万単位を約５０〜８０ｍｌの水に溶解して経口投与する。酵素活性を高めるため、炭酸水素ナトリウム（重曹）を合わせて投与するのが好ましい。炭酸水素ナトリウムの用量は、典型的には成人１人あたり１ｇである。また、胃粘膜洗浄液の吸引を効率よく行えるよう、ジメチコン（ジメチルポリシロキサン）などの消泡剤を合わせて投与するのも好ましい。消泡剤としてのジメチコンの用量は、典型的には成人１人あたり４０〜８０ｍｇである。【００１７】
胃粘液除去処置は、胃粘膜洗浄液採取前の任意の時点で行うことができるが、胃粘液が絶えず産生されることから採取の直前に行うことが好ましい。しかしながら、胃粘液除去剤などを用いる場合は、同剤が胃粘液に作用する時間を確保する必要があるため、好ましくは採取前１時間以内、より好ましくは３０分以内、さらに好ましくは２０分以内に行う。胃粘液除去剤は、胃粘液除去作用等の所望の効果を発揮し得る任意の経路で投与することができ、かかる経路としては、例えば、経口投与、内視鏡装置の給水機能や胃カテーテル（経口、経鼻を含む）もしくは胃瘻等を介した投与などが含まれる。【００１８】
本発明において、対象は、胃酸分泌抑制処置をさらに施されたものであってもよい。ここで胃酸分泌抑制処置とは、対象に、胃粘膜洗浄液採取前、例えば採取の約１週間前からＰＰＩ(プロトンポンプ阻害剤)、Ｈ２受容体拮抗剤等の胃酸分泌抑制剤を投与することを含む。本発明においては、胃内ｐＨ上昇効果の維持（ｐＨホールディング）に優れるＰＰＩが好ましい。ＰＰＩの例としては、オメプラゾール、ランソプラゾール、ラベプラゾール等が、そして、Ｈ２受容体拮抗剤の例としては、シメチジン、ファモチジン、ラニチジン、ロキサチジン等が挙げられるが、これらに限定されない。胃酸分泌抑制剤は通常の治療用量を投与する。例えば、オメプラゾールであれば、成人で２０ｍｇ／日である。胃酸分泌抑制剤の投与経路は特に限定されず、内服製剤の経口投与や、注射製剤などの非経口投与などを適宜選択することができる。【００１９】
本発明において、「胃粘膜洗浄液（gastric mucosal washing liquid）」とは、胃粘液除去処置により露出された胃粘膜を、洗浄液の水流で洗浄することにより得られる液である。したがって、胃粘液除去処置を行わずに、胃粘液が付着したままの胃粘膜を単に洗浄して得られるいわゆる「胃洗浄液（gastric washing）」とは異なる。
本発明において、胃粘膜洗浄液は分析を行うのに十分な量の核酸を含んでいることが好ましい。ここで、分析を行うのに十分な量とは、例えば、液中の核酸量が好ましくは５μｇ以上、より好ましくは１０μｇ以上、さらに好ましくは５０μｇ以上、最も好ましくは１００μｇ以上であることをいう。胃粘膜洗浄液中の核酸量の測定は、例えば、分光光度法などの公知の方法により行うことができる。また、検査用の良質の核酸を確保するために、前記液は胃粘液を実質的に含まないことが好ましい。ここで、胃粘液を実質的に含まないとは、例えば、胃粘膜洗浄液が、対象の胃粘膜における胃粘液の付着が内視鏡肉眼的に１カ所／１視野以下、好ましくは１カ所／２視野以下、より好ましくは１カ所／３視野以下、そして最も好ましくは全視野に胃粘液の付着がない状況で採取されることをいう。【００２０】
胃粘膜洗浄液は、内視鏡装置の洗浄／吸引機能や、胃カテーテルなどを利用した公知の任意の方法で採取することができる。胃内の状態を画像によりモニターしながら吸引操作を行うことができることから、内視鏡装置による採取が好ましい。ここで、「内視鏡装置」とは、市販されている任意の内視鏡装置を指すが、少なくとも１つの送水チャンネルと吸引チャンネルとを有するスコープと、これを操作・駆動するためのプロセッサと、吸引器とを少なくとも備えたものが好ましい。かかる内視鏡装置の例としては、例えば、オリンパス株式会社製EVIS200シリーズ、EVIS240シリーズ、LUCERAシリーズ、FTS（フジノン東芝ESシステム株式会社）製FTS200システム、FTS400システム、PENTAX社製内視鏡システムなどが挙げられる。【００２１】
胃粘膜洗浄液を採取する際には、胃液や胃粘膜から除去された胃粘液を比較的多く含む初期の吸引液を廃棄し、これらの成分の含量が十分に少なくなった吸引液を胃粘膜洗浄液として採取することが好ましい。ここで、「含量が十分に少なくなった吸引液」とは、対象の胃粘膜における胃粘液の付着が、内視鏡肉眼的に１カ所／１視野以下、好ましくは１カ所／２視野以下、より好ましくは１カ所／３視野以下、そして最も好ましくは全視野に胃粘液の付着がない状況になるまで胃内を洗浄した後の吸引液のことをいう。【００２２】
本発明の検体は、核酸を安定化するために、キレート剤および／またはｐＨ調整剤をさらに含んでいてもよい。キレート剤および／またはｐＨ調整剤は、胃粘膜洗浄液を採取する前、例えば胃粘液除去処置の際に対象に投与してもよいし、同液を容器に採取してから添加してもよく、また、採取容器に事前に添加してあってもよい。採取容器に事前に添加しておく場合、キレート剤および／またはｐＨ調整剤は、例えば、容器中に固体（粉末、顆粒、錠剤、カプセル等）や液体（溶液、懸濁液、乳液等）の形態で存在してもよく、または容器の壁面に付着していてもよい。あるいは、キレート剤および／またはｐＨ調整剤を、採取操作中に吸引液と接触しない容器内部の部分、例えば容器頂部の裏面に付着させておき、採取後に転倒混和等により吸引液と接触させてもよい。また、内視鏡装置に接続されている検体採取容器上部と、胃粘膜洗浄液を受ける容器下部とが分離可能である場合には、容器下部に装着可能であり、かつ、内側面にキレート剤および／またはｐＨ調整剤を有するキャップを別途用意し、検体採取後に容器下部のみを内視鏡装置から取り外し、前記キャップを装着して転倒混和等することにより、これに備えられたキレート剤および／またはｐＨ調整剤を胃粘膜洗浄液中に導入してもよい。
添加時の温度は、検体中の疾患マーカーが変性しない範囲であれば特に限定されないが、マーカー保護の観点から冷蔵（４℃前後）が好ましい。【００２３】
キレート剤は公知の任意のもの、例えばＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）系（例えばＥＤＴＡ４Ｈ、ＥＤＴＡ２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ、ＥＤＴＡ３Ｎａ・２Ｈ２Ｏ、ＥＤＴＡ３Ｎａ・３Ｈ２Ｏ、ＥＤＴＡ４Ｎａ・４Ｈ２Ｏ、ＥＤＴＡ４Ｎａ・ｌｉｑｕｉｄなど）、ＨＥＤＴＡ（ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸）系（例えばＨＥＤＴＡ３Ｎａ・３Ｈ２Ｏ、ＨＥＤＴＡ３Ｎａ・Ｌｉｑｕｉｄなど）、ＤＨＥＤＤＡ（ジヒドロキシエチルエチレンジアミン）系（例えばＤＨＥＤＤＡ２Ｎａなど）、１，３ＰＤＴＡ（１，３−プロパンジアミン四酢酸）系（例えば１，３ＰＤＴＡ４Ｈなど）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）系（例えばＤＴＰＡ５Ｈ、ＤＴＰＡ５Ｎａ、ＤＴＰＡ・ＦｅＡＭなど）、ＴＴＨＡ（トリエチレンテトラミン六酢酸）系（例えばＴＴＨＡ６Ｎａなど）、ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）系（例えばＮＴＡ３Ｎａ・Ｈ２Ｏなど）、グルコン酸系（例えばグルコン酸Ｎａなど）、ＨＩＭＤＡ（ヒドロキシエチルイミノ二酢酸）系（例えばＨＩＭＤＡ２Ｎａなど）、ＡＳＤＡ（Ｌ−アスパラギン酸−Ｎ，Ｎ−二酢酸）系（例えばＡＳＤＡ４Ｎａなど）、ＮＴＭＰ（アミノトリメチレンホスホン酸）系（例えばＮＴＭＰなど）、ＨＥＤＰ（ヒドロキシエタンホスホン酸）系（例えばＨＥＤＰなど）の各種キレート剤、ＥＤＴＡ混合体、ＥＤＴＡ誘導体、ＥＤＴＡ金属塩、非水系キレート剤などを使用することができるが、ｐＨを中性から微アルカリ性にし、ＤＮＡ分解酵素を活性化する二価金属イオンを除くキレート試薬として必要となるという観点から、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）系キレート剤が好ましい。キレート剤の添加量は特に限定されないが、０．５Ｍ  ＥＤＴＡ  ｐＨ８であれば、採取液５０ｍｌあたり好ましくは０．１〜５．０ｍｌ、より好ましくは０．２〜２．０ｍｌ、特に好ましくは０．２〜１．０ｍｌである。【００２４】
ｐＨ調整剤も公知のものを使用することができるが、ｐＨ７よりも酸性の環境下もしくは極端なアルカリ性環境下で、ＤＮＡの損傷を回避できるものが好ましく、例として炭酸水素ナトリウム（重曹）、ＮａＯＨ、ＨＣｌなどが挙げられる。ｐＨ調整剤の添加量は、検体のｐＨを好ましくは３〜１１、より好ましくは５〜１１、特に好ましくは７〜１１、最も好ましくは９〜１１とすることができる量であり、例えば炭酸水素ナトリウム（重曹）の場合には、好ましくは検体５０ｍｌあたり０．５〜２．０ｇ、より好ましくは０．７〜１．５ｇ、特に好ましくは１．０ｇである。また、採取前に対象に投与する場合は、成人であれば、好ましくは０．５〜２．０ｇ、より好ましくは０．７〜１．５ｇ、特に好ましくは１．０ｇである。【００２５】
胃粘膜洗浄液の回収方法は特に限定されないが、内視鏡装置を利用する場合は、例えば、吸引管路中の操作部、コネクタ部、吸引タンク、吸引器またはこれらの間の部分等に、少なくとも１個の密封可能な検体採取容器を接続する方法を挙げることができる。洗浄・滅菌の簡便性、コンタミネーションのリスクなどを考慮すると、検体採取容器はコネクタ部と吸引タンクとの間に取り付けるのが好ましい。また、操作性や洗浄の簡便性などの観点から、検体採取容器は脱着可能に取り付けることが好ましい。典型的には、例えば、コネクタと吸引タンクとをつなぐ吸引チューブを、吸引タンク側で取り外し、これを検体採取容器に設けた流入側接続部に接続し、検体採取容器に設けた流出側接続部を吸引タンクに接続する。内視鏡装置は、検体採取容器を保持する部材を備えていることが好ましい。上記検体採取容器は、１個のみを接続してもよいし、複数個を直列または並列に接続してもよい。【００２６】
本発明における疾患関連マーカーは、当該技術分野において知られている任意のものを含むが、例えば、その存否や存在量が特定の疾患と相関する核酸が挙げられる。かかるマーカーは胃粘膜洗浄液中に存在し得るものが好ましく、例えば、ＡＰＣ、Ｋ−ＲＡＳ、Ｈ−ＲＡＳ、Ｎ−ＲＡＳ、ｐ５３、Ｐ１６、ＣＨＦＲ、ＲＡＳＳＦファミリー、ＳＦＲＰファミリー、ＭＩＮＴファミリー、ＭＧＭＴ、ＲＵＮＸファミリー、ＳＭＡＤファミリー、ＰＲＤＭファミリーなど癌関連遺伝子や、H. Pyloriおよびその関連遺伝子（ＣａｇＡ、ｈｐｕ、ｃａｇＰＡＩ、ＢａｂＡ、ＡｌｐＡ／Ｂ、ＨｏｐＺ、ｉｃｅＡ、ＶａｃＡなど）、ＥＢＶおよびその関連遺伝子、ＣＭＶおよびその関連遺伝子等が挙げられるが、これらに限定されず、現在は知られていないが、将来において発見される様々なマーカーをも含むものとする。
また、本発明における疾患関連マーカーとして、核酸量自体を用いることができる。すなわち、本発明の方法において、検体中のＤＮＡ量および／またはＲＮＡ量を疾患、例えば胃に存在する腫瘍、特に胃癌の存否を判定する指標として利用することができる。具体的には、検体中のＤＮＡ量によって胃に存在する腫瘍の存否を判定する場合、例えば、本発明の検体中のＤＮＡ量が所定量以上か、または非癌対象検体におけるＤＮＡ量より所定割合以上多いときに胃に腫瘍が存在する可能性が高いと判定することができる。かかる所定量または所定割合の具体的数値（カットオフ値）は、所定の検体調製・検出プロトコルについて患者対照研究を行うことなどにより適宜設定することができる。【００２７】
本発明はまた、胃粘液除去剤を含む、胃粘膜洗浄液採取の前処置剤に関する。本剤に含まれる胃粘液除去剤としては、上記の任意のものを用いることができる。本剤は、ｐＨ調整剤、消泡剤およびキレート剤からなる群から選択される１種または２種以上の成分をさらに含むことができる。これらの成分の具体例および用量は上記のとおりである。本剤は経口投与に適した任意の剤形、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、シロップ剤などの形態であることができ、この場合、各剤形に適した種々の添加剤、例えば、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、溶媒などをさらに含むことができる（例えば、標準薬剤学、渡辺喜照ら編、南江堂、２００３年等参照）。本剤は、上記各成分を単一の製剤中に含んでもよいし、２個以上の別個の製剤に含んでもよい。後者の場合においては、各製剤を別々に投与してもよいし、投与前に混合してから投与してもよい。胃全体に迅速に拡散することが有利であるため、投与時に液状となる剤形、例えば液剤、懸濁剤、乳剤、シロップ剤などが好ましい。また、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤等の固形剤形であっても、投与前に水などの液体に溶解または懸濁することにより液状剤形と同様の効果を達成することができるため、これらの剤形も好ましい。【００２８】
本発明の前処置剤は、好ましくは１回の投与で胃粘液除去や核酸安定化などの所定の効果を達成し得る用量の各成分を含む。典型的には、成人でプロナーゼ（登録商標）が２万単位、炭酸水素ナトリウムが１ｇ、また、ジメチコンが４０〜８０ｍｇである。なお、各成分の量は個々の対象の条件、例えば、対象の一般健康状態、年齢、体重、胃粘膜の状態、胃粘液の量、投与のタイミング、併用医薬、治療歴などを考慮して適宜調節することができる。
本剤は、胃粘液除去作用、ｐＨ調整作用、キレート作用等の所望の効果を発揮し得る任意の経路で投与することができ、かかる経路としては、例えば、経口投与、内視鏡装置の給水機能や胃カテーテル（経口、経鼻を含む）もしくは胃瘻等を介した投与などが含まれる。【００２９】
本発明はさらに、本発明の検体から核酸を抽出する工程を含む、疾患関連マーカーを検出する方法に関する。
本発明の方法において、検体からの疾患関連マーカーの抽出には公知の任意の方法を用いることができる。典型的には検体を遠心分離し、得られたペレットを適切な媒体、例えばＰＢＳや生理食塩水などに再懸濁してから、プロテイナーゼＫなどのタンパク溶解剤等で消化し、フェノール、クロロホルム等の有機溶媒で除蛋白し、エタノール等で核酸を沈殿することにより、核酸を抽出することができる。具体的なプロトコルに関しては、遺伝子工学に関する種々の文献（例えば、Chomczynski,P., Sacchi, N.:Anal. Biochem., 162: 156-159, 1987、村松正實、山本雅編、新遺伝子工学ハンドブック、改訂第４版、羊土社、2003年10月、20〜29頁等）に記載されているので、ここに詳細は記載しない。
検体は採取後直ちに抽出処理に供することが好ましいが、抽出処理まで一定時間、例えば１２時間程度、さらには２４時間程度にわたって保存することができる。好ましい保存温度は、疾患関連マーカー保護の観点から、好ましくは−８０℃〜２０℃、より好ましくは−８０℃〜１０℃、特に好ましくは−８０℃〜４℃である。検体を保存する場合は、遠心分離後、上記適切な媒体中に再懸濁した状態で保存することが好ましい。【００３０】
抽出された核酸は、その後、標的疾患マーカーに対応した種々の検出方法、例えば、ＰＣＲ法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification）法、ＴＭＡ（Transcription Mediated Amplification）法、ＬＣＲ（Ligase Chain Reaction）法、ＳＤＡ（Strand displacement amplification）法、ＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal amplification）法、ＩＣＡＮ（Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids）法、branched DNA法などの各種核酸増幅法、サザンブロット法、ノザンブロット法、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイ、マイクロアレイ法、ドットブロットまたはスロットブロット法等により検出することができる。
特に、マーカーがエピジェネティックなメチル化ＤＮＡである場合は、例えばbisulfiteシーケンス法、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳ−ＰＣＲ）、Combined bisulfite restriction assay（ＣＯＢＲＡ）、ＭＳ−ＳＮｕＰＥ、bisulfite−ＳＳＣＰ、ＤＭＨ（differential methylation hybridization）法、MethyLight法、Pyrosequencing法等の手法で検出することができる。
また、核酸の定量には、２６０ｎｍ前後の吸収極大波長における吸光度を測定する分光光度法や、核酸を染色する種々の試薬、例えば、エチジウムブロマイド、ＤＡＰＩ（４，６−ジアミジン−２−フェニールインドール）、アクリジンオレンジ、Mupid（登録商標）-STAIN eye（株式会社アドバンス）、ジフェニルアミン試薬、ヘキスト３３２５８（Ｈ３３２５８）、Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent（Invitrogen）、Quant-iT RiboGreen（登録商標）RNA Reagent（Invitrogen）、Gel Indicator RNA Staining Solution（フナコシ株式会社）、SYBR（登録商標）Green IまたはII、SYBR（登録商標）Gold、GelRed等を用いた方法を含む、任意の既知の方法を利用することができる。【００３１】
被験検体の検出結果は、所定の対照検体の検出結果、例えば、標的疾患を有していないことが明らかな時期、もしくは標的疾患を有していたが、それが現時点より進行していなかった時期に同様に採取した検体による結果や、標的疾患を有していないことが明らかな別の対象から同様に得た検体による結果等と比較し、標的疾患マーカーのレベルが、標的疾患の存在もしくは進行にともなって上昇する場合は、被験検体におけるマーカーレベルが対照検体におけるものより高ければ標的疾患の存在もしくは進行の指標となり、逆に低ければ標的疾患の非存在もしくは消退の指標となる。また、同様に、標的疾患マーカーのレベルが、標的疾患の存在もしくは進行にともなって低下する場合は、被験検体におけるマーカーレベルが対照検体におけるものより低ければ標的疾患の存在もしくは進行の指標となり、逆に高ければ標的疾患の非存在もしくは消退の指標となる。したがって、本発明の方法は、疾患の診断に利用することができ、かかる診断方法も本発明に含まれる。【００３２】
また、本発明の方法により特定の薬剤や治療法の治療効果を評価することもできる。例えば、治療前のマーカーレベルと治療後のマーカーレベルとの比較、または、治療中のある時点でのマーカーレベルと、その時点より後の治療中の別の時点でのマーカーレベルとの比較により、標的疾患の進行が減速もしくは停止するか、標的疾患が消退していれば、治療効果ありと、あるいは、標的疾患の進行に影響を与えない場合には治療効果なしと評価することができる。特に、疾患が癌であり、治療法が摘出術である場合には、癌遺残の有無を容易に確認することができるため、この態様は極めて有用である。
本発明の方法はまた、治療終了後の疾患再発の有無をモニターすることに利用することができる。この場合、治療終了後に対象から定期的に検体を採取し、マーカーレベルをもとに上記と同様の手法で疾患の存否を検査する。【００３３】
本発明はまた、キレート剤および／またはｐＨ調整剤を含み、内視鏡装置の吸引管路に接続可能な、胃粘膜洗浄液の採取に使用する検体採取容器に関する。
本発明の容器の構造は、内視鏡装置の吸引管路から洗浄液を受けることができるものであれば特に限定されないが、採取作業の効率性やコンタミネーションのリスクなどの観点から、該吸引管路と閉鎖回路を構成するものが好ましい。かかる検体採取容器の例としては、例えば、検体採取容器の上部が、スコープ側の吸引チューブまたは吸引チャネルが気密的に接続される少なくとも１つの接続部と、これとは別の、吸引器側の吸引チューブまたは吸引チャネルが気密的に接続される少なくとも１つの接続部とを有するものが挙げられるが、これに限定されない。なお、上記の態様においては、容器上部がキャップ構造を有しており、容器下部と脱着可能であることが好ましい。また、容器上部と下部とは、例えば螺合により、または締結具等により気密的に接合されることが好ましい。さらにまた、検体採取容器は、少なくとも容器下部が直接遠心分離器に設置することができるものが好ましい。【００３４】
接続部は、中空の部材であれば特に限定されないが、内視鏡装置に付属のチューブが接続可能であり、胃腸液などに耐性のものが好ましい。同部材は硬性であっても、可撓性であってもよく、容器上部に接着されていても、容器上部と一体成形されていてもよい。接続部の長さも特に限定されないが、同部材が可撓性チューブの形態を有する場合は、内視鏡装置側の接続部に到達可能な長さを有することが好ましい。このような検体採取容器の例として、Argyle Speciment Collection Container（Type O、トラップ容量５０ｍｌ、Tyco Healthcare Group LP、医療用具承認番号16200BZZ00045、Cat No. 2583-50）などを挙げることができる。
前記接続部は、コック、バルブ、弁、三方活栓などの開閉手段、および／または検体採取容器をバイパスして吸引管路のスコープ側と吸引器側とを接続するバイパス手段を備えていてもよい。かかる手段は、前記接続部もしくは容器上部と一体成形されていても、または脱着可能な別部材として設けてもよい。また、かかる手段は、内視鏡装置に組み込まれていても、脱着可能な別部材として設けられていてもよい。【００３５】
本発明の容器は、キレート剤および／またはｐＨ調整剤を検体採取前に予め含んでいる。このため、検体採取後に検体にこれらの薬剤を添加する必要はない。本発明の容器に含まれるキレート剤および／またはｐＨ調整剤の例や存在形態は前記のとおりであるが、検体採取容器中の洗浄液の水位に応じて所定量の薬剤が放出される態様が好ましい。具体的には、例えば、前記薬剤が容器内壁に付着しているもの、前記薬剤を、容器の高さに相当する長さを有する柱状に成形したもの、もしくはそのような柱状に成形した媒体に含浸もしくはコーティングしたものが、内部に配置されたものなどが挙げられる。あるいは、採取操作中に吸引液と接触しない容器内部の部分、例えば容器頂部の裏面に、前記薬剤または該薬剤を含むリザーバ、例えば水溶性のパックもしくはカプセルなどが備えられ、検体採取後に容器を転倒するなどして液を接触させることにより前記薬剤を液中に導入する構造であってもよい。あるいはまた、内視鏡装置に接続されている検体採取容器上部と、胃粘膜洗浄液を受ける容器下部とが分離可能である場合には、容器下部に装着可能であり、かつ、内側面にキレート剤および／もしくはｐＨ調整剤自体またはかかる剤を含むリザーバを有するキャップを別途用意し、検体採取後に容器下部のみを取り外し、前記キャップを装着して転倒混和等することにより、前記剤を胃粘膜洗浄液中に導入する構造であってもよい。本発明においては、操作性、製造の容易性等の観点から前記薬剤が容器内壁に付着しているもの、またはキャップ内側面に備えられたものが好ましい。前者の場合、前記薬剤は、スプレーコート法などの公知の任意の方法で付着させることができる。【００３６】
検体採取容器の容量は特に限定されないが、作業性や設置スペースなどの観点から、好ましくは１０〜１００ｍｌ、より好ましくは３０〜５０ｍｌ、特に好ましくは５０ｍｌである。
本発明の容器の材質も特に限定されず、既知の任意の材料で製造することができるが、強度や、経済性などの観点から、ポリプロピレン製が好ましい。【００３７】
本発明はまた、前記検体採取容器を備えた内視鏡装置にも関する。使用可能な内視鏡装置の例や、同装置への検体採取容器の設置方法などについては上記のとおりである。
【実施例】
【００３８】
以下、実施例に基づいて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００３９】
実施例１：検体採取容器
図１に本発明の検体採取容器の一例を示す。本検体採取容器（１）は、キャップ状の検体採取容器上部（２）と、５０ｍｌの容量を有する検体採取容器下部（３）とからなり、両者は螺合により気密的に接合されている。検体採取容器上部（２）には、２つの接続部、すなわちスコープ側接続部（４）および吸引器側接続部（５）が設けられており、内視鏡装置の吸引管路と気密的に接続可能である。さらに、検体採取容器（１）には、０．５ＭのＥＤＴＡ（和光純薬工業Ｋ．Ｋ．特級品）０．５ｍｌが封入されている。【００４０】
実施例２：検体の調製
内視鏡装置（EVIS LUCERA、オリンパス株式会社）の吸引ボトルから、コネクタにつながる吸引チューブを取り外し、これを上記検体採取容器のスコープ側接続部に接続すると共に、検体採取容器の吸引器側接続部と吸引ボトルのスコープ側接続部を接続し、閉鎖回路を形成した。
種々の胃疾患を有するヒト対象に、ジメチコン（ガスコン（登録商標）ドロップ、キッセイ薬品工業株式会社）４ｍｌ（ジメチルポリシロキサン８０ｍｇ含有）を５０〜１００ｍｌの常水に希釈した液に、プロナーゼ（登録商標）（プロナーゼ（登録商標）ＭＳ、科研製薬株式会社）２万単位と重曹１ｇとを溶解した前処置剤を投与し、１０〜１５分後に対象を臥位の状態で体軸を中心に２〜３回転させてから通常内視鏡検査を行い、その際、最初に吸引された液を、内視鏡肉眼的に胃粘液の付着が１カ所／１視野以下となるまで廃棄した後、約５０ｍｌの胃粘膜洗浄液を検体採取容器に回収した。回収後に検体採取容器を外し、分析に供するまで４℃で保存した。検体のｐＨは、いずれも７．５〜１０．０の範囲であった。
また、比較のために、上記対象から病変部位および非病変部位の生検試料と、血清試料とを採取し、それぞれ同様に４℃で保存した。【００４１】
ＤＮＡを抽出するために、各検体を２７００ｒｐｍ、４℃で１５分遠心分離し、上清を除去後、ペレットを４．５ｍｌのＳＥＤＴＡ中に再懸濁した。これに、１０％のＳＤＳを０．５ｍｌおよび２０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（タカラバイオ株式会社、Code No.9033）を５０ｍｌそれぞれ加え、５５℃で１時間インキュベートした。フェノール（UltraPure Buffer-Saturated Phenol、Invitrogen life technologies）を５ｍｌ加え、転倒混和後、２７００ｒｐｍ、４℃で１５分遠心分離し、上清を新しいチューブへ移した。この操作をさらに１〜２回繰り返し、溶媒を同量のクロロホルム（和光純薬工業株式会社）に変えてさらに１〜２回繰り返した。グリコーゲン５ｍｌ（Ambion、Cat#9510）および１００％エタノール９ｍｌを加え、転倒混和後、４℃にて１２時間インキュベートした。その後、検体を２７００ｒｐｍ、４℃で１５分遠心分離して上清を捨て、ペレットを７０％エタノール１０ｍｌに懸濁後、２７００ｒｐｍ、４℃で１５分遠心分離し、上清を捨て、精製水２００ｍｌに溶解し、ＤＮＡ分析用試料を得た。【００４２】
実施例３：ＤＮＡの品質および量の評価
ｉ）ＤＮＡ品質の評価
胃癌を有するヒト対象に由来する上記試料中に含まれるＤＮＡの品質を、電気泳動法により評価した。電気泳動法は、ＤＮＡ試料１〜２μｇを１０μｌのＨ２Ｏに希釈し、１％アガロースゲル中、１００Ｖで３０分間電気泳動を行った。電気泳動法による評価結果を図２に示す。同図中、左レーンは陽性対照（1Kb DNA Extension Ladder、Cat.No. 10511-012、Invitrogen）、中央レーンは血清試料、右レーンは胃粘膜洗浄液である。いずれの結果も、胃粘膜洗浄液試料が、血清試料よりも良質で、生検試料に匹敵する品質のＤＮＡを含むことを示している。【００４３】
ｉｉ）ＤＮＡ量の評価
胃癌を有するヒト対象に由来する試料中に含まれるＤＮＡの回収量を、分光光度法により評価した。試料としては、胃癌対象から実施例２に記載の方法で採取した、胃粘膜洗浄液試料（Ｗ：約５０〜約１００ｍｌ、ｎ＝２０）、病変部位生検試料（Ｔ：ｎ＝２０）および非病変部位生検試料（Ｎ：ｎ＝１７）（それぞれ、６×６ｍｍ大を２個）、または内視鏡的に癌病変が認められない胃炎対象（内視鏡診断下正常患者）から同様に採取した、胃粘膜洗浄液試料（ＥＷ：約５０〜約１００ｍｌ、ｎ＝４８）および胃粘膜生検試料（ＥＮ：胃体中部、６×６ｍｍ大を２個、ｎ＝４８）を用いた。分光光度法は、NanoDrop ND-1000分光光度計（旭テクノグラス株式会社）を用い、製造者のマニュアルに従って行った。すなわち、試料１μｌを測定台座に配置し、測定を行った。分光光度法による評価結果を図３に示す。なお、群間の統計学的有意差の評価には、対応のないスチューデントｔ検定を用いた（GraphPad PRISMを利用）。
図３から明らかなように、胃癌対象において、胃粘膜洗浄液試料に含まれるＤＮＡ量が、病変部位および非病変部位生検試料に比べて有意に多いことが分かる（Ｐ＜０．０００１）。また、非癌対象においても、胃粘膜洗浄液試料の方が、生検試料より有意に多い量のＤＮＡを含んでいた（Ｐ＜０．０００１）。しかも、上記胃粘膜洗浄液試料のいずれについても、ＰＣＲ法により所定のバンドを得ることができ、Pyrosequencing法によるＤＮＡのメチル化解析が可能であった。このように、本発明の検体が、量的にも質的にも核酸の検出に好適であることが確認された。
さらに、胃癌対象からの胃粘膜洗浄液試料に含まれるＤＮＡ量は、非癌対象に比べ有意に多いことが判明した（Ｐ＜０．００１）。このことは、胃粘膜洗浄液中のＤＮＡ量自体を、胃における腫瘍の存否を判定するための指標として利用できることを意味する。これに対し、生検試料においては、胃癌対象と非癌対象との間で統計学的な有意差は認められなかった。また、このように胃癌対象からＤＮＡを多く回収できることにより、特異的ＤＮＡマーカーの検出をより高感度かつ高精度に行うことが可能となる。【００４４】
実施例４：メチル化ＤＮＡの検出
胃癌を有するヒト対象に由来する試料中の特定のメチル化ＤＮＡを、リアルタイムＰＣＲを応用したMethyLight法により評価した。測定対象の疾患関連マーカーとしては、ＰＲＤＭ５を用いた。この遺伝子は、癌細胞において高頻度にメチル化されていることが知られている（Deng.Q., Haung.S. Oncogene;23, 4903-4910, 2004参照）。まず、実施例２で抽出したＤＮＡ試料（生検試料については生検２箇所分を使用した）を亜硫酸水素ナトリウム処理した。すなわち、２μｇのＤＮＡを５０μｌのＨ２Ｏに混和し、これに５．５ｍｌの２Ｍ  ＮａＯＨを添加して３７℃で１０分間インキュベートした。次いで、３０μｌのハイドロキノンおよび５２０μｌの亜硫酸水素ナトリウムを加えてから、ミネラルオイルを上清に加え、５０℃で１６時間インキュベートした。その後、反応液を新たなマイクロチューブに移し、１０００μｌのWizard（登録商標）Resin（Promega）を加え、フィルターを介してドレナージ後、２ｍｌの８０％イソプロパノールで再ドレナージした。これに５．５μｌの３Ｍ  ＮａＯＨ、１μｌのグリコーゲン（２０ｍｇ／ｍｌ）、６６μｌの５Ｍ酢酸アンモニウムおよび３１０μｌの１００％エタノールを加え、−８０℃で１時間インキュベートした後、３０分遠心分離し、得られたペレットに７０％エタノールを加えて、さらに５分遠心分離した。得られたペレットを２０μｌのＨ２Ｏに溶解したものをＰＣＲに供した。【００４５】
ＰＣＲは以下のようにして行った。まず、亜硫酸水素ナトリウム処理後のＤＮＡ試料１μｌ、TaqMan（登録商標）mix２５μｌ、プライマー（センス／アンチセンス）１μｌ、TaqMan（登録商標）プローブ２μｌおよびＨ２Ｏ  ２１μｌからなる反応混合液（計５０μｌ）を、各試料について作製した。プライマーおよびプローブは、以下のものを使用した。
センスプライマー：TAGCGTTTAGGTTCGCGTTTTTCGC（配列番号１）
アンチセンスプライマー：TACCGATTCCAAAATCCCCCGCGA（配列番号２）
プローブ：TCGGGTCGAGTTCGATTCGGG-MGB（配列番号３）【００４６】
Applied Biosystems 7900 FastリアルタイムＰＣＲシステムを用いて、上記反応混合液を下表の条件にてＰＣＲ増幅し、蛍光を検出した。
【表１】
0005562554.tif 000002
結果を図４および５に示す。これらの図より、血清試料ではメチル化ＤＮＡを検出できないが、胃粘膜洗浄液試料は生検試料に匹敵する感度でメチル化ＤＮＡを検出できることがわかる。【００４７】
実施例５：ｈｐｕ（H. pyloriウレアーゼ）遺伝子の検出
種々の胃疾患を有する５名のヒト対象に由来する胃粘膜洗浄液および生検試料中のｈｐｕ遺伝子の存在をＰＣＲ法で評価した。上記５名の内訳は下表のとおりである。なお、迅速ウレアーゼ試験（ＲＵＴ）は、ヘリコチェック（登録商標）（大塚製薬株式会社）を用い、製造者の説明書に従って行った。具体的には、尿素２０ｍｇとフェノールレッド４μｇとを２．５ｍｌの溶解液に溶解した基質試薬液を調製し、この５滴（約０．２ｍｌ）と、適量の生検試料とを反応カップ中で混和し、室温で２時間静置後、試薬液の色調の変化を肉眼で観察した。
【表２】
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【００４８】
ｈｐｕ遺伝子は、胃癌、胃潰瘍などの胃疾患に関連の深い病原性H. pyloriのマーカーの１つである（例えば、Clayton CL et al. J Clin Microbiol. 1992 Jan;30(1):192-200参照）。ＰＣＲ法は以下のとおりに行った。すなわち、ＤＮＡ試料１μｌ、１０×バッファー５μｌ、ｄＮＴＰ  ０．８５μｌ、プライマー１μｌ、ＨＳ−Ｔａｑ  ０．２μｌおよびＨ２Ｏ  ４２μｌからなる反応混合液を上記各試料について作製し、下記条件でＰＣＲを行い、増幅産物を２．５％のアガロースゲルでの電気泳動に供した。なお、プライマーは以下のものを用いた。
センスプライマー（HPU-1）: 5'-GCCAATGGTAAATTAGTT-3'（配列番号４）
アンチセンスプライマー（HPU-2）: 5'-CTCCTTAATTGTTTTTAC-3'（配列番号５）
【表３】
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結果を図６に示す。同図より、胃粘膜洗浄液試料において、生検試料では検出できなかったｈｐｕ遺伝子の検出が可能であることが分かる。また、従来法である生検試料によるＲＵＴでは、全て陽性となるべき５検体のうち２検体が陰性と判定されてしまったが、胃粘膜洗浄液試料による検査ではこのような取りこぼしがなかった。これは、胃粘膜洗浄液試料が、高い感度、特異度を有し、診断能に優れることを示すものである。【００４９】
実施例６：検体ｐＨがＤＮＡ回収量に与える影響
大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６を用いて、検体ｐＨの違いによるＤＮＡ損傷の程度を、ＤＮＡの回収可能量を指標に検討した。具体的には、培養中のＨＣＴ１１６細胞を回収し、ＮａＯＨおよびＨＣｌにてｐＨ１、３、５、７、９、１１および１３にそれぞれ調整したＳＥＤＴＡに３または２４時間暴露させた。なお、３時間の暴露は、検体採取直後にＤＮＡを抽出するまでの最長胃液暴露時間、また２４時間の暴露は、検体採取後に検体を未処理のまま検査場所に輸送してからＤＮＡを抽出する場合における最長胃液暴露時間を想定したものである。
それぞれのｐＨ、時間設定でインキュベート後、ＮａＯＨおよびＨＣｌにて試料のｐＨを７に戻してから、フェノール・クロロホルム法にてＤＮＡを抽出し（実施例２参照）、採取ＤＮＡ量をNanoDrop ND-1000分光光度計により測定した（実施例３参照）。結果を図７および８に示す。３時間の暴露では、試料のｐＨが５〜１１の範囲にある場合、そして、２４時間の暴露では、試料のｐＨが７〜１１の範囲にある場合に相当量のＤＮＡが抽出可能であることがわかる。試料のｐＨが９〜１１の範囲にある場合に、特に安定して多量のＤＮＡが抽出可能であった。【００５０】
実施例７：検体ｐＨがＤＮＡ品質に与える影響
検体のｐＨが回収したＤＮＡの品質に与える影響を調べるために、ＤＮＡの断片化およびＤＮＡ修飾の耐久性を検討した。
（１）ＤＮＡの断片化
実施例６にて抽出した各ＤＮＡ試料を、１％アガロースゲルでの電気泳動に供した（図９）。暴露時間にかかわらず、ｐＨ３〜１１の条件に暴露された試料においてバンドを検出することができた。また、断片化はより塩基性の条件でより少なくなることが分かった。
（２）ＤＮＡ修飾の耐久性
回収されたＤＮＡが、メチル化ＤＮＡの検出に用いる亜硫酸水素塩（bisulfite）処置に耐えられるだけの品質を有するか否かを検討した。具体的には、実施例６にて抽出した各ＤＮＡ試料を、実施例４と同様に亜硫酸水素ナトリウム処理およびMethyLight法によるメチル化ＤＮＡの検出に供し、蛍光強度曲線が立ち上がっているものをメチル化陽性と判断した（図１０）。上記（１）の結果と同様に、暴露時間にかかわらず、ｐＨ３〜１１の条件に暴露された試料においてメチル化ＤＮＡを検出することができた。また、ｐＨ７〜９の条件に暴露された試料においては、より安定してメチル化ＤＮＡを検出することができた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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