(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
−  Ｃ型肝炎ウイルスのポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコード化するヌクレオチド配列及びＣ型肝炎ウイルスのポリペプチドＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列を含む発現ベクター；及び
−  Ｃ型肝炎ウイルスのポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコード化するヌクレオチド配列ならびにその発現に必要な手段を含む発現ベクターと、Ｃ型肝炎ウイルスのポリペプチドＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列ならびにその発現に必要な手段を含む発現ベクター；
からなる群より選択される治療的有効量の活性成分の、ＨＣＶに関連する病理の処置のための薬物の調製のための使用であって、
処置が、３から１０日まで変動する期間により互いに隔てられる該活性成分の少なくとも３連続投与を含み、
ここで少なくとも３連続投与が１週間間隔で実施される、
使用。
【請求項２】
−  Ｃ型肝炎ウイルスのポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコード化するヌクレオチド配列及びＣ型肝炎ウイルスのポリペプチドＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列を含む発現ベクター；及び
−  Ｃ型肝炎ウイルスのポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコード化するヌクレオチド配列ならびにその発現に必要な手段を含む発現ベクターと、Ｃ型肝炎ウイルスのポリペプチドＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列ならびにその発現に必要な手段を含む発現ベクター；
からなる群より選択される治療的有効量の活性成分の、Ｃ型肝炎ウイルスに関連する一又は複数の病理の処置において被験者の生物反応を持続するためのＨＣＶ感染被験者への投与のための薬物の調製のための使用であって、該投与パターンが、
（ａ）１日の期間にわたり連続又は少なくとも１日１回、
（ｂ）次に、処置の断続的欠如、又は、３から１０日の期間にわたる連日の処置の欠如により該投与を中止すること、及び
（ｃ）被験者において持続的な生物反応を達成又は維持するために、（ａ）投与及び（ｂ）投与の中止のパターンを少なくとも２回繰り返すことであり、それが治療的有効量の該活性成分への暴露を提供すること
であり、
ここで該投与パターンの繰り返しが、３から１０日まで変動する期間により互いに隔てられる、該治療有効量の該活性成分の少なくとも３連続投与に対応し、
ここで少なくとも３連続投与が１週間間隔で実施される、
使用。
【請求項３】
−  Ｃ型肝炎ウイルスのポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコード化するヌクレオチド配列及びＣ型肝炎ウイルスのポリペプチドＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列を含む発現ベクター；及び
−  Ｃ型肝炎ウイルスのポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコード化するヌクレオチド配列ならびにその発現に必要な手段を含む発現ベクター、Ｃ型肝炎ウイルスのポリペプチドＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列ならびにその発現に必要な手段を含む発現ベクター；
からなる群より選択される治療的有効量の活性成分の、Ｃ型肝炎ウイルスに関連する一又は複数の病理の処置において被験者のＨＣＶに対して特異的な細胞免疫反応を刺激するためのＨＣＶ感染被験者への投与のための薬物の調製における使用であって、該投与パターンが、
（ａ）１日の期間にわたり連続又は少なくとも１日１回、
（ｂ）次に、処置の断続的欠如、又は、３から１０日の期間にわたる連日の処置の欠如により該投与を中止すること、及び
（ｃ）被験者において持続的な細胞免疫反応を達成又は維持するために、（ａ）投与及び（ｂ）投与の中止のパターンを少なくとも２回繰り返すことであり、
それが治療的有効量の該活性成分への暴露を提供すること
であり、
ここで該投与パターンの繰り返しが、３から１０日まで変動する期間により互いに隔てられる、該治療有効量の該活性成分の少なくとも３連続投与に対応し、
ここで少なくとも３連続投与が１週間間隔で実施される、
使用。
【請求項４】
−  Ｃ型肝炎ウイルスのポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコード化するヌクレオチド配列及びＣ型肝炎ウイルスのポリペプチドＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列を含む発現ベクター；及び
−  Ｃ型肝炎ウイルスのポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコード化するヌクレオチド配列ならびにその発現に必要な手段を含む発現ベクターと、Ｃ型肝炎ウイルスのポリペプチドＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列ならびにその発現に必要な手段を含む発現ベクター；
からなる群より選択される治療的有効量の活性成分を含む、Ｃ型肝炎ウイルスに関連する一又は複数の病理の処置のための使用のための治療的有効量の該活性成分の連続投与のための薬学的組成物であって、
該治療的有効量の該活性成分が、少なくとも３回投与のために調整されており、
少なくとも３連続投与が１週間間隔で実施される、
薬学的組成物。
【請求項５】
Ｃ型肝炎ウイルスに対する予防的及び治療的なワクチン接種の分野において、治療的有効量の活性成分の少なくとも３回投与用のために調整されていることを特徴とする、薬学的キットであって、ここで該活性成分が
−  Ｃ型肝炎ウイルスのポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコード化するヌクレオチド配列及びＣ型肝炎ウイルスのポリペプチドＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列を含む発現ベクター；及び
−  Ｃ型肝炎ウイルスのポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコード化するヌクレオチド配列ならびにその発現に必要な手段を含む発現ベクターと、Ｃ型肝炎ウイルスのポリペプチドＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列ならびにその発現に必要な手段を含む発現ベクター；
からなる群より選択され、
ここで少なくとも３回投与が１週間間隔で実施される、薬学的キット。
【請求項６】
ＮＳ３及び／又はＮＳ４及び／又はＮＳ５ｂが同じＨＣＶ遺伝子型に由来する、又は、ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及びポリペプチドＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列が同じＨＣＶ遺伝子型に由来する、請求項４記載の薬学的組成物。
【請求項７】
遺伝子型が遺伝子型１ｂである、請求項６記載の薬学的組成物。
【請求項８】
ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４が配列番号２に示すアミノ酸配列を含む、請求項７記載の薬学的組成物。
【請求項９】
ポリペプチドＮＳ５ｂが配列番号４に示すアミノ酸配列を含む、請求項７又は８記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
発現ベクターがポックスウイルスである、請求項４又は６から９のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
ポックスウイルスがＭＶＡである、請求項１０記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
発現ベクターが、発現カセットｐｈ５ｒ−ＮＳ３−ＮＳ４を挿入し、及び、発現カセットｐ７．５−ＮＳ５ｂを挿入するように改変されるＭＶＡゲノムを含む、請求項１１記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
ＭＶＡゲノムが、同じ方向で、及び、欠失ＩＩＩにおいて、発現カセットｐｈ５ｒ−ＮＳ３−ＮＳ４を挿入し、及び、発現カセットｐ７．５−ＮＳ５ｂを挿入するように改変される、請求項１２記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
活性成分が１０６から１０８pfuのポックスウイルス又はＭＶＡベクターを含む、請求項１０から１３のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
使用又は投与パターンが、一連の連続投与の最後から少なくとも４週間後に実施する少なくとも１つのリコール投与をさらに含む、請求項４又は６から１４のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
連続投与及びリコール投与が同じ活性成分を使用する、請求項１５記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
リコール投与が、一連の連続投与の最後から４ヶ月後に実施される、請求項１５又は１６記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
リコール投与が、一連の連続投与の最後から６ヶ月後に実施される、請求項１５又は１６記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
使用又は投与パターンが、１週間間隔での３つの投与、及び、一連の連続投与の最後から４ヶ月後又は６ヶ月後のいずれかの１つのリコール投与を含む、請求項１５から１８のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
使用又は投与パターンが、１週間間隔での３つの投与、及び、一連の連続投与の最後から４ヶ月後又は６ヶ月後のいずれかの２つのリコール投与を含む、請求項１５から１８のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
連続投与及びリコール投与が、同じ投与経路により実施される、請求項１５から２０のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
連続投与及びリコール投与が、異なる投与経路により実施される、請求項１５から２０のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
投与経路が、筋肉内、皮下、経皮、経口、舌下、及び局所的経路から成る群より選択される、請求項２１又は２２記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
薬学的に適当な賦形剤も含むことを特徴とする、請求項４又は６から２３のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
使用又は投与パターンが、ペグ化ＩＦＮ−α２ａ及び／又はリバビリンでの宿主生物の処置との併用で実施される、請求項４又は６から２４のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
刺激免疫反応が、ＣＤ８＋Ｔ細胞反応、ＣＤ４＋Ｔ細胞反応又はＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞反応の両方である、請求項３記載の使用。
【請求項２７】
刺激免疫反応が、ＮＳ３及び／又はＮＳ４及び／又はＮＳ５Ｂタンパク質中に位置するエピトープに向けられる、請求項２６記載の使用。
【請求項２８】
エピトープがＨＬＡ−Ｂ７制限であり、感染肝炎ウイルスのＮＳ３ポリペプチド中に位置する、請求項２７記載の使用。
【請求項２９】
エピトープがＨＬＡ−Ａ２制限であり、感染肝炎ウイルスのＮＳ３及び／又はＮＳ５ｂタンパク質中に位置する、請求項２７記載の使用。
【請求項３０】
感染Ｃ型肝炎ウイルスが遺伝子型１ｂである、請求項４又は６から２４のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
感染Ｃ型肝炎ウイルスが遺伝子型１ａである、請求項４又は６から２４のいずれか一項記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
使用又は投与パターンが、一連の連続投与の最後から少なくとも４週間後に実施する少なくとも１つのリコール投与をさらに含む、請求項３記載の使用。
【請求項３３】
連続投与及びリコール投与が同じ活性成分を使用する、請請求項３又は３２のいずれか一項記載の使用。
【請求項３４】
投与経路が、筋肉内、皮下、経皮、経口、舌下、及び局所的経路からなる群より選択される、請求項３又は３２から３３のいずれか一項記載の使用。
【請求項３５】
使用又は投与パターンが、ペグ化ＩＦＮ−α２ａ及び／又はリバビリンでの宿主生物の処置との併用で実施される、請求項３、又は３２から３４のいずれか一項記載の使用。
【請求項３６】
感染Ｃ型肝炎ウイルスが遺伝子型１ａ又は１ｂである、請求項３、又は３２から３５のいずれか一項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に対する予防的及び治療的なワクチン接種の分野に関する。それは、特に、２つの同一線上タンパク質ＮＳ３及びＮＳ４（以下、ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４と呼ぶ）に対応するポリタンパク質及びＮＳ５ｂによって構成されたポリペプチドを含む新規組成物、この組成物を発現できるアデノウイルス又はポックスウイルスなどのベクター、及びワクチンとしてのそれらの使用に関する。
【０００２】
Ｃ型肝炎は、輸血による肝炎の主な原因である。Ｃ型肝炎は、他の経皮経路、例えば静脈経路による薬物の注射によっても感染されうる。医療従事者での汚染リスクはさらに無視できない。性行為伝染が記載されている。
【０００３】
Ｃ型肝炎は、Ａ、Ｂ、又はＤ型肝炎などのウイルスに関連する他の形状の肝疾患とは異なる。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ又はＨＣＶ）による感染は大部分が慢性であり、多くの症例（５から２０%）において肝炎、肝硬変、及び癌などの肝疾患を招き、先進国における肝移植の３０%を占める。
【０００４】
輸血によるウイルス伝染リスクは１９９０年代のスクリーニング試験の導入により緩和されたが、新しいＨＣＶ感染の頻度は高いままである。例として、最近の研究では、フランスにおいては依然として年間１０，０００から１５，０００の新しい感染例があることが示されている（S. Deuffic et al., Hepatology 1999; 29: 1596-1601）。現在、世界中の約１億７０００万人がＨＣＶにより慢性感染している（Hepatitis C: Global prevalence (update), 2000, Weekly Epidemiological Record, Vol 75(3)）。高リスク集団は主に病院職員及び静注薬物使用者であるが、しかし、これらの高リスク群に属さず、循環抗ＨＣＶ抗体が見いだされた無症状の献血者が存在する。後者については、感染経路はまだ同定されていない。従って、散発的感染として知られるＨＣＶ感染が存在し（５と１０%の間と推定される）、その病因は未知であり、抑制できない。
【０００５】
ＨＣＶは、分子生物学的技術を用いて分離された最初の肝指向性ウイルスであった。ウイルス粒子を可視化する前に、ウイルスゲノム配列がクローン化された。
【０００６】
ＨＣＶは、フラビウイルス科の新属、ヘパシウイルス属に属する。それは９．５kbのプラス一本鎖ＲＮＡウイルスであり、相補的なＲＮＡコピーにより複製され、その翻訳産物は約３，０００のアミノ酸のポリタンパク質前駆体である。ＨＣＶゲノムの５’末端は、構造タンパク質、ヌクレオキャプシドのコアタンパク質、２つの外被糖タンパク質Ｅ１及びＥ２、ならびにｐ７と呼ばれる低分子タンパク質をコード化する遺伝子に隣接する非翻訳領域に対応する。５’非翻訳領域及び遺伝子コアは、異なる遺伝子型において比較的よく保存されている。外被タンパク質Ｅ１及びＥ２は、分離株ごとにより可変的である領域によりコード化される。タンパク質ｐ７は極めて疎水性のタンパク質であり、イオンチャンネルを構成しうる。ＨＣＶゲノムの３’末端は、非構造タンパク質（ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５）及びよく保存されたドメインを持つ３’非コード化領域をコード化する遺伝子を含む（Major ME, Feinstone SM, Hepatology, June 1997, 25 (6): 1527-1538）。
【０００７】
現在、Ｃ型肝炎の処置のための最も有効な治療では、ペグ化インターフェロン及びリバビリンを併用する（Manns MP et al., The Lancet, 22nd September 2001, Vol. 358, 958-965）。この治療は、遺伝子型２及び３に属するウイルス株により感染した患者の場合において特に有効であり、それは依然として遺伝子型１ａ、１ｂ、及び４に限られた効果のみを有する（Manns MP、前掲書中）。処置された患者の５０%未満が「長期反応者」となる。さらに、この治療は高額な治療介入であり（１０，０００から１５，０００ユーロ／患者／年）、毒性効果と関連する。実際に、患者の５から１０%が終了前に処置中止を強いられる。
【０００８】
従って、全ての遺伝子型を標的とするワクチン組成物の開発が必要である。
【０００９】
ここで、いくつかの研究によって、自然に（自然溶解）、又は、処置（治療回復）後のいずれかで、ＨＣＶを原因とする感染の制御が、Ｔ−ＣＤ４＋及びＴ−ＣＤ８＋リンパ球を含む細胞性免疫反応の誘導又は相乗作用と関連することが示されている（例えば、LECHNER, F. et al., Eur. J. Immunol., 30; 2479-2487 (2000)及びThimme R et al., 2001, J. Exp. Med., 194 (10): 1395-1406において記載される通り）。
【００１０】
主要組織適合複合体（ＭＨＣ、ヒトにおけるＨＬＡとしても知られる）の分子は、クラスＩ又はクラスＩＩと呼ばれる。クラスＩ分子は、実質的に全ての有核細胞上に発現され、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）にエピトープ又はペプチドを提示できる。クラスＩＩ分子はＣＤ４＋Ｔ細胞にエピトープを提示できるが、しかし、それらの発現は抗原提示細胞に制限される。
【００１１】
現在想定されるＣ型肝炎ウイルスに対するワクチンは、アジュバント組み換えタンパク質、ペプチド、発現ベクターの使用に基づき、それらの中で、ウイルスもしくは細菌由来の、又はネイキッドＤＮＡの言及したベクターが存在できる。この場合において、一つ又は複数のウイルスタンパク質又はこれらのウイルスタンパク質をコード化する一つ又は複数の遺伝子が使用される。
【００１２】
いくつかのウイルスタンパク質又はこれらのウイルスタンパク質をコード化する一つ又は複数の遺伝子が選択される場合、後者は構造タンパク質の一部又は全てのいずれかにより（Makimura et al., 1996, Vaccine, 14: 28-34; Fournilier A. et al., 1999, J. Virology, 73: 7497-7504）、又は個々の非構造タンパク質もしくは少なくとも２つの連続タンパク質を含むことにより（Brinster et al., 2001, Hepatology, 34: 1206-1217）、又は構造及び非構造タンパク質の混合物により（Pancholi et al., 2003, J. Virology, 77: 382-390）構成されることが多い。
【００１３】
特許出願国際公開広報第９９／３８８８０号には、ワクチン組成物中で３つのタンパク質ＮＳ３、ＮＳ４、及びＮＳ５（ａ及びｂ）を別々にコード化する３つの遺伝子の使用について記載しており、それぞれ別々にこれら３つのタンパク質を発現する３つのＤＮＡワクチンを含む。著者は、マウスにおける３つの抗原に特異的なＴリンパ球の誘導を示す。ＮＳ５ａ及びｂを発現するワクチンのみが、防御試験においてインビボで試験されている。
【００１４】
特許出願国際公開広報第０１／３０８１２号には、必要に応じて非構造タンパク質ＮＳ５ｂとの併用で、非構造タンパク質ＮＳ３、ＮＳ４、及びＮＳ５ａにより構成される融合タンパク質の使用が記載されている。著者は、この併用によってＨＣＶ特異的Ｔ細胞を活性化できたことを示している。本特許出願には、融合タンパク質ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５ａ、又はタンパク質ＮＳ５ａを発現して特定のＴリンパ球により媒介される特異的免疫反応を誘発するワクチン製剤（ネイキッドＤＮＡ、組み換えアデノウイルス、又は組み換えワクシニアウイルス型）の能力について簡単に記載されている。
【００１５】
国際公開広報第０４／１１１０８２号には、同一線上で発現される非構造タンパク質ＮＳ３、ＮＳ４及びＮＳ５ｂ、ＮＳ３及びＮＳ４の特定の併用が、より良好な免疫力、及び、これらの非構造タンパク質以外に、タンパク質ＮＳ５ａ及び／又はコア、Ｅ１又はＥ２などのＨＣＶの他の構造タンパク質も含むワクチンで得られるものより優れた防御力を有し、ウイルス株を感染させた患者に由来する細胞が特異的免疫反応を誘導する能力に効果を有したことが記載されている。
【００１６】
ここで、本発明は、抗ＨＣＶ免疫反応の有効な刺激及びＨＣＶに関連する病理の処置のための持続的生物反応を提供するためのＨＣＶ感染被験体への投与のための国際公開広報第０４／１１１０８２号に記載の特定の併用の最適化した使用を特定している。
【００１７】
このように、本発明の目的は、
−  Ｃ型肝炎ウイルスのポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４ならびにＣ型肝炎ウイルスのポリペプチドＮＳ５ｂを含むペプチド組成物；
−  Ｃ型肝炎ウイルスのポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコード化するヌクレオチド配列及びＣ型肝炎ウイルスのポリペプチドＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列を含む発現ベクター；及び
−  Ｃ型肝炎ウイルスのポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコード化するヌクレオチド配列を含む発現ベクターならびにその発現に必要な手段と、Ｃ型肝炎ウイルスのポリペプチドＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列を含む発現ベクターならびにその発現に必要な手段；
からなる群より選択される治療的有効量の活性成分の、Ｃ型肝炎ウイルスに関連する一つ又は複数の病理の処置において被験体の生物反応を持続するためのＨＣＶ感染被験体への投与のための薬剤の調製のための使用であって、該投与が、
（ａ）１日の期間にわたり連続又は少なくとも１日１回、
（ｂ）次に、処置の断続的欠如、又は、３から１０日の期間にわたる連日の処置の欠如により該投与を中止すること、及び
（ｃ）被験体において持続的な生物反応を達成又は維持するために、（ａ）投与及び（ｂ）投与の中止のパターンを少なくとも２回繰り返すことであり、
それが治療的有効量の該活性物質への暴露を提供し、
該投与及び投与の中止のパターンの繰り返しが、好ましくは３から１０日まで変動する期間により互いに隔てられる、好ましくは少なくとも３連続投与に対応する。
【００１８】
本発明の目的は、
−  Ｃ型肝炎ウイルスのポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４ならびにＣ型肝炎ウイルスのポリペプチドＮＳ５ｂを含むペプチド組成物；
−  Ｃ型肝炎ウイルスのポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコード化するヌクレオチド配列及びＣ型肝炎ウイルスのポリペプチドＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列を含む発現ベクター；及び
−  Ｃ型肝炎ウイルスのポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコード化するヌクレオチド配列を含む発現ベクターならびにその発現に必要な手段と、Ｃ型肝炎ウイルスのポリペプチドＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列を含む発現ベクターならびにその発現に必要な手段；
からなる群より選択される治療的有効量の活性成分の、ＨＣＶに関連する病理の処置のための薬剤の調製のための使用であって、処置は、３から１０日まで変動する期間により互いに隔てられる該活性成分の少なくとも３連続投与を含む。
【００１９】
本発明の目的は、
−  Ｃ型肝炎ウイルスのポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４ならびにＣ型肝炎ウイルスのポリペプチドＮＳ５ｂを含むペプチド組成物；
−  Ｃ型肝炎ウイルスのポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコード化するヌクレオチド配列及びＣ型肝炎ウイルスのポリペプチドＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列を含む発現ベクター；及び
−  Ｃ型肝炎ウイルスのポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコード化するヌクレオチド配列を含む発現ベクターならびにその発現に必要な手段、Ｃ型肝炎ウイルスのポリペプチドＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列を含む発現ベクターならびにその発現に必要な手段；
からなる群より選択される治療的有効量の活性成分の、Ｃ型肝炎ウイルスに関連する一つ又は複数の病理の処置において被験体のＨＣＶに対して特異的な細胞免疫反応を刺激するためのＨＣＶ感染被験体への投与のための薬剤の調製における使用でもあって、該投与が、
（ａ）１日の期間にわたり連続又は少なくとも１日１回、
（ｂ）次に、処置の断続的欠如、又は、３から１０日の期間にわたる連日の処置の欠如により該投与を中止すること、及び
（ｃ）被験体において持続的な細胞免疫反応を達成又は維持するために、（ａ）投与及び（ｂ）投与の中止のパターンを少なくとも２回繰り返すことであり、
それが、治療的有効量の該活性物質への暴露を提供し、該投与及び投与の中止のパターンの繰り返しが、好ましくは３から１０日まで変動する期間により互いに隔てられる、好ましくは少なくとも３連続投与に対応する。
【００２０】
本発明の目的は、Ｃ型肝炎ウイルスに関連する一つ又は複数の病理の処置において被験体のＨＣＶに対して特異的な細胞免疫反応を刺激するための、本明細書において定義する治療的有効量の１つの活性成分の使用でもあって、処置は、３から１０日まで変動する期間により互いに隔てられる該活性成分の少なくとも３連続投与を含む。
【００２１】
本発明の目的は、最後に、
−  Ｃ型肝炎ウイルスのポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４ならびにＣ型肝炎ウイルスのポリペプチドＮＳ５ｂを含むペプチド組成物；
−  Ｃ型肝炎ウイルスのポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコード化するヌクレオチド配列及びＣ型肝炎ウイルスのポリペプチドＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列を含む発現ベクター；及び
−  Ｃ型肝炎ウイルスのポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコード化するヌクレオチド配列を含む発現ベクターならびにその発現に必要な手段と、Ｃ型肝炎ウイルスのポリペプチドＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列を含む発現ベクターならびにその発現に必要な手段；
からなる群より選択される治療的有効量の活性成分を含む、特に、３から１０日まで変動する期間により互いに隔てられる少なくとも３連続投与の形での、Ｃ型肝炎ウイルスに関連する一つ又は複数の病理を処置する際の治療的有効量の該活性成分の連続投与のための薬学的組成物であって、治療的有効量の該活性成分が、好ましくは３回投与のために、より好ましくは３つの異なるバイアルにおいて調整されており、該投与が、好ましくは、３から１０日まで変動する期間により互いに隔てられる。
【００２２】
本願の全体を通じて本明細書において使用される「ａ」及び「ａｎ」という用語は、文脈によって別段の指示がない場合、それらが「少なくとも１つ」、「少なくとも第１」、「１又は複数」、又は「複数」の言及される化合物又は工程を意味するという意味において使用される。例えば、「ａ  ｃｅｌｌ（細胞）」という用語は、その混合物を含む一つ又は複数の細胞を含む。
【００２３】
「及び／又は」という用語は、本明細書において使用する限り、「及び」、「又は」、及び「該用語により連結される要素の全て又は任意の他の組み合わせ」の意味を含む。
【００２４】
本明細書において使用される「ａｂｏｕｔ（約）」又は「ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ（約）」は、所定の値又は範囲の２０%以内、好ましくは１０%以内、より好ましくは５%以内を意味する。
【００２５】
産物、組成物、及び方法を定義するために使用する場合、本明細書において使用される「含む」という用語は、産物、組成物、及び方法が、言及される成分又は工程を含むが、しかし、他を除外しないことを意味することを意図する。「本質的に成る」は、本質的重要物の他の成分又は工程を除外することを意味するものとする。このように、列挙した成分から本質的に成る組成物は、微量混入物質及び薬学的に許容可能な担体を除外しない。「成る」は、他の成分又は工程の微量元素以上を除外することを意味するものとする。例えば、ポリペプチドは、ポリペプチドが列挙したアミノ酸配列以外の任意のアミノ酸を含まない場合、アミノ酸配列から「成る」。ポリペプチドは、そのようなアミノ酸配列が、数個のみの追加アミノ酸残基、典型的には約１から約５０程度の追加残基と一緒に存在する場合、アミノ酸配列から「本質的に成る」。ポリペプチドは、アミノ酸配列がポリペプチドの最後のアミノ酸配列の少なくとも一部である場合、アミノ酸配列を「含む」。そのようなポリペプチドは数個から数百の追加アミノ酸残基を有することができる。そのような追加アミノ酸残基はポリペプチド輸送において役割を果たし、ポリペプチド産生又は精製を容易し；とりわけ、半減期を延長しうる。同じことがヌクレオチド配列に適用できる。
【００２６】
本発明は、従って、ＨＣＶのポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及びポリペプチドＮＳ５ｂにより構成される治療的有効量のペプチド組成物又はその発現ベクターを含む新規使用及び新規薬学的組成物を提案し、その使用又は組成物はＨＣＶに対して特異的な細胞性免疫反応の刺激能を有し、Ｃ型肝炎ウイルスに対する予防的及び治療的なワクチン接種の分野において有用となる。
【００２７】
本発明において使用するペプチド組成物のポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４は、タンパク質ＮＳ３ならびにタンパク質ＮＳ４ａ及びｂにより構成され、天然ポリタンパク質中と同様に、ペプチド配列中に中断はない。実際に、先に示した通り、ＨＣＶゲノムはポリタンパク質に転写される単一のオープンリーディングフレームを含む。このＨＣＶポリタンパク質は、ＮＨ２−Ｃｏｒｅ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４ａ−ＮＳ４ｂ−ＮＳ５ａ−ＮＳ５ｂ−ＣＯＯＨの順番において、少なくとも１０の異なる部分を産生するために切断できる。
【００２８】
一般的ガイダンスでは、タンパク質ＮＳ３は６３０のアミノ酸のタンパク質であり、それはおよそポリタンパク質のアミノ酸１０２７からアミノ酸１６５７までと思われる。タンパク質ＮＳ４は、３１４のアミノ酸のタンパク質であり、およそアミノ酸１６５８からアミノ酸１９７２までと思われる（ＨＣＶ−１に関するナンバリング）（Choo et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci., vol 88: 2451-2455）。ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４は、従って、およそアミノ酸１０２７からアミノ酸１９７２までと思われる。
【００２９】
本発明において使用する組成物中にも含まれるポリペプチドＮＳ５ｂに関して、それは５９０のアミノ酸により構成され、ポリタンパク質のおよそアミノ酸２４２１からアミノ酸３０１１までと思われる（Choo et al., 1991、前掲書中）。
【００３０】
明確さのために、ＮＳ３、ＮＳ４、及びＮＳ５Ｂタンパク質に関連して本明細書において参照するアミノ酸ストレッチが、ＨＣＶ−１ポリタンパク質前駆体中のそれらの位置に関して与えられる（Chao et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2451-2455により記載、又はＧｅｎＢａｎｋでの受入番号Ｍ６２３２１）。しかし、本発明は、他のＨＣＶ株及び分離株のＮＳ３、ＮＳ４、及びＮＳ５Ｂタンパク質ならびにそのアナログ又はムテインも包含する。
【００３１】
タンパク質ＮＳ３は、２つの異なる構造ドメイン、即ち、ウイルスポリタンパク質の成熟に関与する活性セリンプロテアーゼ活性を付与するＮ末端ドメイン、及びウイルスゲノムの複製において役割を果たすＮＴＰａｓｅ活性に関連するヘリカーゼ活性を含むＣ末端ドメインを含む。
【００３２】
「ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４」及び「ポリペプチドＮＳ５ｂ」は、無論、任意のＨＣＶ株及び分離株ならびにそのアナログ、ムテイン、及びホモログに由来する天然アミノ酸配列を有するポリタンパク質及びポリペプチドを意味する。
【００３３】
ポリタンパク質及びポリペプチドの「アナログ」又は「ムテイン」は、所望の活性、即ち、上で定義する細胞性免疫反応の刺激能を有する言及した分子の生物活性のある派生物を意味する。
【００３４】
一般的に、「アナログ」という用語は、修飾によって免疫活性が破壊されない程度に、天然分子と比べて、一つ又は複数の付加、置換（一般的に、性質の点で保存されている）、及び／又はアミノ酸欠失を有する天然ポリペプチドの配列及び構造を有する化合物を指す。「ムテイン」という用語は、特許出願ＰＣＴ国際公開広報第９１／０４２８２号において記載されるものなど、ペプチド（ペプトイド）を模倣した一つ又は複数のエレメントを有するペプチドを意味する。好ましくは、アナログ又はムテインは、少なくとも天然分子と同じ免疫活性を有する。ポリペプチドのアナログ及びムテインを調製するための方法は、当業者に公知であり、以下に記載する。
【００３５】
特に好ましいアナログとしては、性質の保存された置換、即ち、アミノ酸ファミリーにおいて起こる置換が挙げられる。具体的には、アミノ酸は一般的に、４ファミリー、即ち、（１）アスパラギン酸及びグルタミン酸などの酸性アミノ酸、（２）リシン、アルギニン、及びヒスチジンなどの塩基性アミノ酸、（３）アラニン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、及びトリプトファンなどの非極性アミノ酸、ならびに（４）グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、及びチロシンなどの極性非荷電アミノ酸に分けられる。フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンは芳香族アミノ酸に分類される場合がある。例えば、イソロイシン又はバリンによるロイシンの、グルタミン酸によるアスパラギン酸の、セリンによるスレオニンの単独置換、又は構造関係を有する別のアミノ酸による１アミノ酸の同様の保存的置換は、生物活性に大きな効果を有さないと合理的に予測できる。当業者は、当技術分野において周知のホップ−ウッズ（Ｈｏｐｐ−Ｗｏｏｄｓ）及びカイト−ドゥーリトル（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）プロットを参照することにより、変化を許容できる、目的のペプチド分子の領域を容易に決定する。
【００３６】
「相同性」は、ポリタンパク質及びポリペプチドなどの２つのペプチド分子間の同一性のパーセンテージを意味する。配列がペプチド分子の定義された長さにわたり少なくとも６０%、好ましくは少なくとも７５%、またより好ましくは少なくとも８０−８５%、またより好ましくは少なくとも９０%、さらにより好ましくは少なくとも９５−９８%以上の同一性を有する場合、２つのアミノ酸配列は互いに「ほぼ相同」である。
【００３７】
一般的に、「同一性」という用語は、２つのペプチド配列の正確なアミノ酸とアミノ酸の一致を指す。同一性のパーセンテージは、配列を整列させ、２つの整列した配列間での正確なミスマッチ数を数え、より短い配列の長さにより割り、結果を１００倍することによる２つの分子間の配列情報の直接比較により決定できる。同一性のパーセンテージは、Dayhoff, M. O.の“Atlas of Protein Sequence and Structure M. O. Dayhoffed., 1981, 5 Suppl., 3: 482-489”におけるＡＬＩＧＮなどのコンピュータプログラムを使用して決定することもできる。
【００３８】
一定数のＨＣＶ株及び分離株、特にタンパク質ＮＳ３の、タンパク質ＮＳ４の、及びポリペプチドＮＳ５ｂの核酸及びアミノ酸配列は既に決定されている。
【００３９】
例えば、分離株ＨＣＶ−Ｊ１は“Okamoto H. et al.,1992, Nucleic Acids Res., 20: 6410-6410”において記載されている。２つの独立したＨＣＶ分離株、即ち分離株ＨＣＶ−Ｊ及び−ＢＫの完全なコード配列は、“Kato et al., 1990, Proc. Natl. Acad., Sci., 87: 9524-9528”及び“Takamizawa et al., 1991, J. Virol., 65: 1105-1113”においてそれぞれ記載されている。分離株ＨＣＶ−１に関して、それは“Choo et al., 1990, Brit. Med. Bull., 46: 423-441”及び“Choo et al., 1991、前掲書中”において記載されている。分離株ＨＶＣ−Ｈは、“Inchauspe G. et al.;, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 10292-10296”において記載されている。分離株ＨＣＶ−Ｇ９は、“Okamoto H., et al., 1994, J. Gen. Virol., 45: 629-635”において記載されている。分離株ＨＣＶ−Ｊ６及び−Ｊ８は、“Okamoto H., et al., 1991, J. Gen. Virol., 72: 2697-2704”及び“Okamoto H., et al., 1992, Virology, 188: 331-341”においてそれぞれ記載されている。分離株ＨＶＣ−ＢＥＢＥ１は、“Nako H., et al., 1996, J. Gen. Virol., 141: 701-704”において記載されており、分離株ＨＣＶ−ＮＺＬ１は、“Sakamoto M., et al., 1994, J. Gen. Virol., 75: 1761-1768”において記載されている。分離株ＨＣＶ−Ｔｒに関して、それは“Chayama K., et al., 1994, J. Gen. Virol., 75: 3623-3628”において記載されている。分離株ＨＣＶ−ＥＤ４３及び−ＥＵＨ１４８０は、“Chamberlain R. W., et al., 1997, J. Gen. Virol., 78: 1341-1347”及び“Chamberlain R. W., et al., 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun., 236: 44-49”においてそれぞれ記載されている。分離株ＨＣＶ−ＥＵＨＫ２は、“Adams A., et al., 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun., 234: 393-396”において記載されている。分離株ＨＣＶ−ＶＮ２３５、−ＶＮ４０５、及び−ＶＮ００４は、“Tokita H., et al., 1998, J. Gen. Virol., 79: 1847”において記載されている。最後に、分離株ＨＣＶ−ＪＫ０４９及び−ＪＫ０４６に関して、それらは“Tokita H. et al., 1996, J. Gen. Virol., 77: 293-301”において記載されている。
【００４０】
ＨＣＶ株及び分離株は、上で例証する通り、異なる遺伝子型、即ち遺伝子型１ａ（分離株ＨＣＶ−１、−Ｊ１及び−Ｈ）、１ｂ（分離株ＨＣＶ−Ｊ及びＢＫ）、１ｃ（分離株ＨＣＶ−Ｇ９）、２ａ（分離株ＨＣＶ−Ｊ６）、２ｂ（分離株ＨＣＶ−Ｊ８）、２ｃ（分離株ＨＣＶ−ＢＥＢＥ１）、３ａ（分離株ＨＣＶ−ＮＺＬ１）、３ｂ（分離株ＨＣＶ−Ｔｒ）、４ａ（分離株ＨＣＶ−ＥＤ４３）、５ａ（分離株ＨＣＶ−ＥＵＨ１４８０）、６ａ（分離株ＨＣＶ−ＥＵＨＫ２）、７ｂ（分離株ＨＣＶ−ＶＮ２３５）、８ｂ（分離株ＨＣＶ−ＶＮ４０５）、９ａ（分離株ＨＣＶ−ＶＮ００４）、１０ａ（分離株ＨＣＶ−ＪＫ０４９）及び１１ａ（分離株ＨＣＶ−ＪＫ０４６）を有しうる。
【００４１】
有利なことに、ＮＳ３及び／又はＮＳ４及び／又はＮＳ５ｂは異なる遺伝子型のウイルスに由来する。例えば、ＮＳ３／ＮＳ４ポリタンパク質及びＮＳ５ｂポリペプチドは、異なる遺伝子型、例えば遺伝子型１ｂに由来するＮＳ３／ＮＳ４及び遺伝子型４からのＮＳ５ｂもしくはその逆、又は、代わりに遺伝子型１ａに由来するＮＳ３／ＮＳ４及び遺伝子型１ｂからのＮＳ５ｂもしくはその逆のウイルスに由来しうる。
【００４２】
別の代替法によると、ＮＳ３及び／又はＮＳ４及び／又はＮＳ５ｂは同じ遺伝子型、好ましくは遺伝子型１ｂのウイルスに由来する。本発明の好ましい態様では、遺伝子型１ｂ  ＨＣＶ  ＪＡ株に由来するポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４ならびにポリペプチドＮＳ５ｂを含むペプチド組成物を使用する（Kato et al., 1990, Proc. Natl. Acad., Sci. 87, 9524-9528）。より好ましくは、ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４は、配列番号２において示すアミノ酸配列を含む、又は、代わりに本質的に成る、又は、代わりに成り、及び／又は、ＮＳ５ｂポリペプチドは、配列番号４において示すアミノ酸配列を含む、又は、代わりに本質的に成る、又は、代わりに成る。
【００４３】
本発明において使用するペプチド組成物中に含まれるポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及びポリペプチドＮＳ５ｂは、天然由来又は組み換え由来のいずれかでありうる。
【００４４】
天然由来のポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及びポリペプチドＮＳ５ｂは、標的ウイルス遺伝子型により感染された患者の血清から、又は、例えば患者の血液もしくは肝臓から、のいずれかに由来する既に精製されたウイルスＲＮＡから、又は、遊離の、もしくは、事前に発現ベクター中にクローニングされた相補ＤＮＡから、又は、生物サンプルもしくはインビトロ増殖系から精製したウイルス粒子からのいずれかより、天然ウイルス配列の増幅に役立ちうる合成オリゴヌクレオチドプライマーの使用により、ＨＣＶ株又は分離株から入手される。
【００４５】
本発明において使用するポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及びポリペプチドＮＳ５ｂは組み換え由来で、遺伝子工学技術により得ることもでき、それは以下の工程を含む：
−  該ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４又は該ポリペプチドＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列を使用した微生物又は真核細胞の培養、及び
−  該微生物又は該真核細胞により産生されるペプチドの回収。
【００４６】
この技術は当業者に周知である。これに関する詳細については、以下の研究を参照できる：Recombinant DNA Technology I, Editors Ales Prokop, Raskesh K Bajpai;Annals of the New-York Academy of Sciences, Volume 646, 1991。
【００４７】
ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及びポリペプチドＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列は、当業者に周知であり、例えば、“Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1989”において記載の技術を使用して、遺伝子工学的アプローチを併用した化学合成により、又は、遺伝子工学のみにより調製できる。
【００４８】
ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及びポリペプチドＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列は、本発明に従って使用されるペプチド組成物又は発現ベクターを提供するために、適切な発現系に挿入できる。
【００４９】
本明細書において使用する“発現ベクター”という用語は、染色体外ベクター（例、多コピープラスミド）及び宿主染色体に組み入れられるように設計された組み込みベクターを含む、ウイルスならびに非ウイルスのベクターを指す。本発明との関連で特に重要なのは、ＮＳ３／ＮＳ４及びＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列を宿主生物に送達できる遺伝子治療において使用するためのベクターならびに様々な発現系において使用するための発現ベクターである。“ウイルスベクター”を指す場合、この用語は、以下に記載する完全ウイルスゲノム、その一部、又は改変ウイルスゲノムならびに生成されたそのウイルス粒子（例、感染性ウイルス粒子を産生するためにウイルスキャプシド中にパッケージしたウイルスベクター）を含む、ウイルス由来の少なくとも１つのエレメントを含む任意のベクターを包含する。
【００５０】
無論、ヌクレオチド配列を単一の発現ベクター又は２つの異なる発現ベクター中に挿入できる。後者の場合、ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコード化する配列は２つのベクターの内の１つに挿入され、ポリペプチドＮＳ５ｂをコード化する配列は他のベクターに挿入され、これら２つのベクターは性質において同じ、又は、異なる、のいずれかである。
【００５１】
好ましくは、本発明に従って使用する発現ベクターは、ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコード化するヌクレオチド配列及びポリペプチドＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列、ならびにそれらの発現に必要な手段を含む。
【００５２】
ペプチドの発現に必要な手段は、ペプチドという用語がタンパク質、ポリタンパク質、ポリペプチドなどの任意のペプチド分子のために使用されており、特にプロモーター、転写ターミネーター、複製起点、及び選択マーカーなどのペプチドを得ることを可能にする任意の手段を意味する。
【００５３】
ペプチドの発現に必要な手段は、目的のペプチドをコード化するヌクレオチド配列に機能的に連結される。“機能的に連結される”は、発現に必要な該エレメント及び目的のペプチドをコード化する遺伝子の近位を意味し、それらは、それらが期待される様式で機能可能であるような関係にある。例えば、追加塩基が、プロモーターとヌクレオチド配列の間で、それらの機能的関係が保存される範囲で存在できる。
【００５４】
ペプチドの発現に必要な手段は、同種の手段、即ち、使用するベクターのゲノム中に含まれる、又は異種でありうる。後者の場合、該手段は、発現させる目的のペプチドと共にクローン化する。
【００５５】
異種プロモーターの例としては、（ｉ）ＳＶ４０プロモーター（サルウイルス４０）、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ−ＨＳＶ−１）のプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のＬＴＲ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期プロモーター（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｆｉｒｓｔ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、アデノウイルスの主要後期プロモーター（ＭＬＰ：ｍａｊｏｒ  ｌａｓｔ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）などのウイルスプロモーター、ならびに（ｉｉ）ジホスホグリセレートキナーゼ遺伝子（ＰＧＫ）の構成的プロモーター（Adra et al., 1987, Gene, 60: 65-74）、肝特異的アルファ−１アンチトリプシン及びＦＩＸ遺伝子のプロモーター、及び平滑筋細胞に特異的なＳＭ２２プロモーター（Moessler et al., 1996, Development, 122: 2415-2425）などの上位真核生物においてペプチドをコード化する遺伝子の転写を制御する任意の細胞プロモーターが挙げられる。
【００５６】
１つの代替法によると、該ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及び該ポリペプチドＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列は、異なる遺伝子型に由来する。
【００５７】
別の代替法によると、該ポリタンパク質及び該ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列は、同じ遺伝子型、好ましくは遺伝子型１ｂに由来する。好ましい態様において、ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコード化するヌクレオチド配列は、配列番号１において示す配列を含む、又は、代わりに本質的に成る、又は代わりに成り、及び、ポリペプチドＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列は、配列番号３において示す配列を含む、又は、代わりに本質的に成る、又は、代わりに成る。
【００５８】
ここでも、“ヌクレオチド配列”は、天然ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及び天然ポリペプチドＮＳ５ｂ、ならびに先に定義したそれらのアナログ、ムテイン、及びホモログをコード化する全ての配列を意味する。
【００５９】
発現ベクター中に含まれる該配列は、単一のプロモーター及び／又は単一の発現調節エレメントの制御下で直接連結できる、又は、それらは別々でよく、各々が、独立した、同一の、もしくは、異なる発現プロモーター及び／又はレギュレーターに依存する。
【００６０】
本発明の目的のために適切である発現ベクターとして、例えば、プラスミド、アデノウイルス型ウイルスベクター、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、サルモネラ型細菌ベクター、ＢＣＧに言及できる。
【００６１】
アデノウイルスは多数の動物種において検出されており、組み込まれず、病原性は弱い。それらは様々な細胞型、分裂中の細胞、及び静止中の細胞に感染できる。それらは気管支上皮への自然指向性を持つ。さらに、それらは長年にわたり安全プロファイルの優れた腸内生ワクチンとして使用されてきた。最後に、それらは簡単に増殖させ、大量に精製できる。これらの特性は、アデノウイルスが、発現ベクターとして、特に治療目的のための遺伝子治療用ベクターとして、及び、ワクチンのための使用に特に適当であることを意味してきた。
【００６２】
好ましい態様によると、本発明において使用するベクターはアデノウイルスである。
【００６３】
本発明において使用するアデノウイルスの例は、ヒト又は動物由来、特にイヌ由来（例えば、ＣＡＶ−１又はＣＡＶ−２；それぞれ参照Ｇｅｎｂａｎｋ  ＣＡＶ１ＧＥＮＯＭ及びＣＡＶ７７０８２）、トリ由来（参照Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＡＶＥＤＳＤＮＡ）、ウシ由来（ＢＡＶ３など、Seshidhar Reddy et al., 1998, J. Virol., 72: 1394-1402）、ヒツジ、ネコ、ブタ由来、サル由来、又はそれらの雑種由来の任意の源に由来してよい。任意の血清型を使用できる。しかし、ヒト由来のアデノウイルスが好ましく、特にアデノウイルス５（Ａｄ５）、アデノウイルス２（Ａｄ２）、及びアデノウイルス３５（Ａｄ３５）である。
【００６４】
一般的に、言及したウイルスはＡＴＣＣコレクションから入手可能であり、それらの配列、それらの組織、及びそれらの生物学について記載した多数の論文の主題であり、それよって当業者はこれらを容易に使用できる。例えば、アデノウイルス５型の配列はＧｅｎｂａｎｋデータベース（Ｍ７３２６０及びＭ２９９７８）において記載されており、参照により本明細書に組み入れられる。
【００６５】
アデノウイルスのゲノムは、ウイルスサイクルを終結させるために必要な約３０を超える遺伝子を持つ約３６kbの二本鎖の直鎖ＤＮＡ分子により構成される。第１の遺伝子は、アデノウイルスのゲノム中に分散する４つの領域に分けられる（Ｅ１からＥ４）。Ｅ１、Ｅ２、及びＥ４の領域はウイルス複製に必須である。Ｅ３領域は、変異ウイルスが自然に現れる、又は、このＥ３領域を失った雑種ウイルスが培養細胞中で野生型ウイルスと同様に複製を続ける、との観察に基づき、非必須領域と見なされる（Kelly and Lewis, 1973, J. Virol., 12: 643-652）。後期遺伝子（Ｌ１からＬ５）は大部分がウイルスキャプシドを構成する構造タンパク質をコード化する。それらは第１の転写単位と少なくとも部分的に重なり、単一プロモーターから転写される（主要後期プロモーターはＭＬＰ）。さらに、アデノウイルスゲノムは、ＤＮＡ複製に必須のシス作用領域の２つの末端に、それぞれ５’及び３’逆位末端配列（ＩＴＲ）及びパッキング配列を持つ。
【００６６】
遺伝子治療プロトコールにおいて現在使用されるアデノウイルスは、Ｅ１領域の大部分が取り除かれており、それによって、環境及び宿主生物におけるそれらの播種を回避するために、それらの複製レベルで欠損したウイルスが与えられる。さらに、アデノウイルスの大半が、それらのクローン化能を増大するために、Ｅ３領域も取り除かれている。これらのベクターを使用した遺伝子移入の実行可能性は、様々な組織においてインビボで実証されている（例えば、Yei et al., 1994, Hum. Gene Ther., 5: 731-744; Dai et al., 1995, Proc. Natl. Acad Sci. USA, 92: 1401-1405; US6,099,831; 及びUS6,013,638を参照）。
【００６７】
好ましくは、発現ベクターとしてアデノウイルスにおいて使用するプロモーターは、ＣＭＶ及びＳＶ４０プロモーターなどの異種プロモーターである。
【００６８】
また好ましくは、ＣＭＶプロモーターは、ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４のプロモーターであり、発現ベクターは該ポリタンパク質をコード化するヌクレオチド配列として発現カセットＣＭＶ−ＮＳ３／ＮＳ４を含む。
【００６９】
“発現カセット”は、ベクター中に挿入する、目的のペプチドの発現のためのプロモーター及びオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ配列を意味する。
【００７０】
また好ましくは、ＳＶ４０プロモーターは、ポリペプチドＮＳ５ｂのプロモーターであり、発現ベクターは該ポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列として発現カセットＳＶ４０−ＮＳ５ｂを含む。
【００７１】
本発明の一態様によると、アデノウイルスのゲノムは、Ｅ１領域を発現カセットＣＭＶ−ＮＳ３／ＮＳ４により置換し、Ｅ３領域を発現カセットＳＶ４０−ＮＳ５ｂにより置換するために改変する。
【００７２】
抑制及び発現ベクター中へのＤＮＡ配列の挿入の方法は、当業者に広く知られており、特に酵素消化及びライゲーション又は相同組み換えの工程から成る（Chartier et al., 1996, J. Virol. 70, 4805-4810）。
【００７３】
本発明の目的のために特に適当な別の発現ベクターはポックスウイルスであり、それは本発明の別の態様を構成する。
【００７４】
ポックスウイルスはエンベロープ糖タンパク質複合ウイルス（ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ）群を構成し、主にそれらの異常な形態、それらの大きなＤＮＡゲノム、及びそれらの細胞質複製部位において異なる。ワクシニアウイルス（ＶＶ）のコペンハーゲン株（Goebel et al., 1990, Virol. 179: 247-266, 517-563）及び改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）株（Antoine et al., 1998, Virol., 244: 635-396）を含む、ポックスウイルスのいくつかのエレメントのゲノムが、マッピングされ、配列決定されている。ＶＶ株は、約２００のタンパク質をコード化する約１９２ｋｐの二本鎖ＤＮＡゲノムを持ち、その内の約１００がウイルスの組立に関与する。ＭＶＡ株はワクシニアウイルスの高度弱毒化株であり、ニワトリ胚線維芽細胞上での一連のワクシニアウイルスアンカラ株（ＣＶＡ）における５００を超える継代により生成される（Mayr et al., 1975, Infection, 3: 6-16）。ＭＶＡウイルスはCollection Nationale de Cultures de Microorganismes（ＣＮＣＭ）においてＮｕｍｂｅｒ１−７２１で寄託されている。ＭＶＡゲノムの完全配列の決定及びＶＶのそれとの比較によって、ウイルスゲノム中に現れた変化の正確な同定ならびに７つの欠失（ＩからＶＩＩ）及び断片化したオープンリーディングフレームを導く多数の突然変異の定義が可能になる（Antoine et al., 1998, Virology, 244: 365-396）。
【００７５】
本発明の目的のために適当であるポックスウイルスの他の例として、アヒル痘（ｄｕｃｋ  ｐｏｘ）、鶏痘、牛痘、昆虫痘（ｅｎｔｏｍｏｐｏｘ）、サル痘、豚痘、及びペンギン痘（ｐｅｎｇｕｉｎ  ｐｏｘ）が挙げられる。
【００７６】
ポックスウイルスは、細胞内成熟ウイルス（ＩＭＶ）及びエンベロープ細胞外ウイルス（ＥＥＶ）と呼ばれる２つの形態学的に異なる形状で見いだされる。
【００７７】
本発明の発現ベクターとして使用されるポックスウイルスは、以下の特性の少なくとも１つを、単独又は組み合わせで有する：
（ｉ）ポックスウイルスがＭＶＡウイルスである、
（ｉｉ）ポックスウイルスがＩＭＶ形態学的形状である、ならびに、
（ｉｉｉ）ポックスウイルスのゲノムが、発現カセットＮＳ３／ＮＳ４を挿入し、及び、発現カセットＮＳ５ｂを挿入するように改変される。
【００７８】
好ましくは、発現ベクターとしてのポックスウイルスベクター中で使用するプロモーターは、相同プロモーター（例、ポックスウイルス由来）である。代表例として、限定されないが、ワクシニアプロモーター７．５Ｋ、Ｈ５Ｒ、ＴＫ、ｐ２８、ｐ１１、及びＫ１Ｌ、初期及び後期ポックスウイルスプロモーターの間のキメラプロモーターならびにChakrabarti et al.（1997, Biotechniques 23, 1094-1097）、Hammond et al.（1997, J. Virological Methods 66, 135-138）、及びKumar and Boyle（1990, Virology 179, 151-158）において記載されるものなどの合成プロモーターが挙げられる。ポックスウイルスのゲノムが、目的の２つのカセットを挿入するように改変される場合、それらの発現に必要な手段はいずれも同種である。このように、ＭＶＡウイルスを使用する場合、ＮＳ３／ＮＳ４の発現は、例えば、対応する発現カセットがｐｈ５ｒ−ＮＳ３／ＮＳ４であるようにプロモーターｐｈ５ｒの制御下でよく、ＮＳ５ｂの発現は、例えば、対応する発現カセットがｐ７．５−ＮＳ５ｂであるようにプロモーターｐ７．５の制御下でよく、及び、その逆でよい。発現カセットをポックスウイルスゲノム中の同じ又は異なる位置に挿入できる。好ましい態様において、ｐｈ５ｒ−ＮＳ３／ＮＳ４及びｐ７．５−ＮＳ５ｂ発現カセットのいずれも、ＭＶＡゲノムの欠失ＩＩ中又は欠失ＩＩＩ中、特に好ましくは欠失ＩＩＩに挿入する。
【００７９】
特定の態様によると、ポックスウイルスのゲノムは、目的の２つのカセットを挿入するように改変し、２つの該発現カセットは同じ方向に向ける。
【００８０】
別の特定の態様によると、それらは反対方向に向ける。
【００８１】
ここでも、発現カセットは、先に示した通り、当業者に公知の方法でポックスウイルスのゲノム中に挿入する。
【００８２】
本発明において使用するベクターは、特定の細胞コンパートメントに向けたペプチドを標的とするために必要な配列も含んでよい。標的の例は、アデノウイルスのタンパク質Ｅ３に由来するリーダー配列型のアドレス配列を使用して得られる小胞体に向けた標的化でよい（Ciernik I. F., et al., The Journal of Immunology, 1999, 162, 3915-3925）。
【００８３】
それらは、樹状細胞に向けた標的化及び細胞の膜への標的化のために必要な配列を含んでもよい。
【００８４】
発現ベクターにより形質転換した微生物及び真核細胞は、例えば、本発明の使用において活性成分を提供するために使用できる。
【００８５】
本発明の目的に適する微生物の例として、以下の属のものなどの酵母に言及できる：サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クリベロミセス属（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、ハンセルナ属（Ｈａｎｓｅｌｕｎａ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、シワントミセス属（Ｓｃｈｗａｎｔｏｍｙｃｅｓ）、チゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ポンベ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、及びクルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）が好ましい；大腸菌及び以下の属のものなどの細菌：ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、及びストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）。
【００８６】
真核細胞の例として、哺乳動物、爬虫類、昆虫、及び同等のものなどの動物に由来する細胞に言及できる。それらは、唯一の細胞型又は異なる細胞型の群であり、培養細胞株、初代細胞、及び増殖細胞を包含する。好ましい真核細胞は、チャイニーズハムスター（ＣＨＯ細胞）、サル（ＣＯＳ及びＶｅｒｏ細胞）、ハムスター乳児腎臓（ＢＨＫ細胞）、ブタ腎臓（ＰＫ１５細胞）、及びウサギ腎臓（ＲＫ１３細胞）、ヒト骨肉腫細胞株（１４３Ｂ）、ＨｅＬａヒト細胞株、及びヒトヘパトーマ細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２型細胞）、ならびに昆虫細胞株（例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ））に由来する細胞である。
【００８７】
宿主細胞は、浮遊又はフラスコ中の培養物、組織培養、器官培養、及び同等のものにおいて提供できる。宿主細胞はトランスジェニック動物でもよい。
【００８８】
有利なことに、ＮＳ３／ＮＳ４及び／又はＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列は、特定の宿主細胞、例えば、哺乳動物、酵母、又は細菌宿主細胞において高レベルの発現を提供するために独立的に最適化できる。１を超えるコドンを所定のアミノ酸をコード化するために利用可能な場合、生物のコドン使用パターンは高度に非ランダムであり（例えば、Wada et al., 1992, Nucleic Acids Res.20, 2111-2118を参照）、異なる宿主間で顕著に異なりうる（例えば、Nakamura et al., 1996, Nucleic Acids Res. 24, 214-215を参照）ことが実際に観察されている。このように、ウイルス（ＨＣＶ）由来のヌクレオチド配列は、宿主細胞、特に細菌又は酵母の細胞における効率的な発現のために不適当なコドン使用パターンを有しうる。典型的に、コドン最適化は、この特定の宿主細胞において稀に使用されるコドンに対応する一つ又は複数の“天然”（例、ＨＣＶ）コドンを、より頻繁に使用される同じアミノ酸をコード化する一つ又は複数のコドンにより置換することにより実施する。これは、従来の突然変異誘発により、又は、化学合成技術（例、合成核酸分子をもたらす）により達成できる。稀に使用されるコドンに対応する全ての天然コドンを置換する必要はなく、発現増大は部分置換でも達成できるためである。さらに、最適化したコドン使用への厳密な順守からの一部の逸脱が、結果として得られるヌクレオチド配列中への制限酵素部位の導入に対応するために作られうる。
【００８９】
コドン使用の最適化に加えて、宿主細胞中での発現は、追加の改変を通じてさらに改善できる。例えば、ＮＳ３／ＮＳ４及び／又はＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列は、集中領域中に存在する稀な非最適コドンのクラスターを妨げ、及び／又は、発現レベルにネガティブに影響すると予想される少なくとも部分的にネガティブな配列エレメントを抑制又は修飾するように改変できる（例、ＡＴリッチ又はＧＣリッチ配列ストレッチ；不安定な直接又は逆方向反復配列；ＲＮＡ二次構造；及び／又は内部ＴＡＴＡボックス、カイ部位（ｃｈｉ−ｓｉｔｅ）、リボソーム侵入部位、及び／又はスプライシングドナー／アクセプター部位などの内部の潜在性調節エレメント）。
【００９０】
一態様によると、ペプチド組成物、発現ベクター、及び本明細書において定義する該ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及び該ポリペプチドＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列は、ＨＣＶウイルスを持つ患者の感染の阻害、予防、及び抑制のために特に有効であり、薬剤の調製のためのそれらの使用は本発明の別の目的を構成する。
【００９１】
本発明は、本明細書において定義するペプチド組成物から成る群より選択される治療的有効量の活性成分、又は本明細書において定義する発現ベクター、又は、ペプチドの構成的及び／又は誘導的な発現に必要なエレメントの制御下に置かれたポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコード化するヌクレオチド配列を含む発現ベクターとポリペプチドＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む薬学的組成物、特にワクチン；Ｃ型肝炎ウイルスに関連する一つ又は複数の病理の処置における治療的有効量の該活性成分の連続投与、特に３から１０日間まで変動する期間により互いに隔てられた少なくとも３連続投与に関する。
【００９２】
ペプチドの構成的な発現に必要なエレメントは、真核細胞に偏在する、又は、特異的であるプロモーターを意味する。
【００９３】
ペプチドの誘導的な発現に必要なエレメントとして、テトラサイクリン耐性のための大腸菌オペロンの調節エレメントに言及できる（Gossen M. et al., Proc Natl Acad Sci USA, 89: 5547-5551 (1992)）。
【００９４】
本発明の特定の態様によると、薬学的組成物は薬学的に適当な賦形剤も含む。無論、当業者は、薬学的に適当な賦形剤の性質及び薬学的組成物の構成物の機能として使用される活性成分の量を容易に決定できる。
【００９５】
薬学的に適当な賦形剤の量及び性質は、当業者により容易に決定できる。それらは、所望の薬学的形状及び投与の方法に従って選ばれる。
【００９６】
加えて、本発明によると、活性成分は、ヒトにおいて全身又は粘膜適用に適した一つ又は複数のアジュバントと併用できる。好ましくは、アジュバントは、ＨＣＶタンパク質又は１つのエピトープに対する免疫、特にＴ細胞媒介性免疫を刺激できる。特に本発明のペプチド組成物との併用のために適したアジュバントの代表例として、ミョウバン、フロイント完全及び不完全（ＩＦＡ）などの鉱油乳剤、リポ多糖類又はその派生物（Ribi et al., 1986, Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins, Plenum Publ. Corp., NY, p407-419）、ＱＳ２１などのサポニン（Sumino et al., 1998, J.Virol.72, 4931-4939；国際公開広報第９８／５６４１５号）、イミキモド（Suader, 2000, J.Am Acad Dermatol 43, 86-811）及び関連化合物Ｓ−２７６０９（Smorlesi, 2005, Gene Ther.12, 1324-1332）などのイミダゾキノリン化合物、ＣｐＧ（Chu et al., 1997, J. Exp. Med. 186: 1623; Tritel et al., 2003, J. Immunol. 171: 2358-2547）などのシトシングアノシンリン酸オリゴデオキシヌクレオチド、及びＩＣ−３１（Kritsch et al., 2005, J. Chromatogr Anal. Technol Biomed Life Sci 822, 263-270）などのカチオン性ペプチドが挙げられる。
【００９７】
本発明によると、活性成分は好ましくは経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、局所、局所的、気管内、鼻腔内、経皮的、直腸、眼内、耳介内投与により投与され、該活性成分は単位用量の投与形態で投与できる。
【００９８】
単位用量の投与形態は、例えば、錠剤、ゼラチンカプセル、粒剤、粉剤、液剤又は注射剤、経口懸濁剤、経皮貼剤、舌下、舌下錠、気管内、眼内、鼻腔内、耳介内の形状、又は吸入投与により、局所、経皮、皮下、筋肉内又は静脈内投与の形態、直腸内投与の形態、又はインプラントでよい。局所投与では、クリーム剤、ゲル剤、軟膏剤、ローション剤、又は洗眼剤を想定できる。
【００９９】
これらの調剤形態は、考察する分野の通常の方法により調製される。
【０１００】
通常の実施によると、各患者に適当な本発明において使用する活性成分の投与量は、様々なパラメーター、特に投与の方法、患者の年齢、体重、及び反応；用いる活性成分；症状の性質及び程度；併用処置の種類；処置の頻度；及び／又は予防又は治療の必要性の関数として医師により決定される。一般的にガイダンスでは、アデノウイルス含有組成物及びアデノウイルスベクターを、約１０５から約１０１３iu（感染単位）、望ましくは約１０７から約１０１２iu、及び好ましくは約１０8から約１０11iuを含む用量中で使用できる。ポックスウイルス含有組成物又はポックスウイルスベクターでの適切な投与量は、約１０４から約１０１０pfu（プラーク形成単位）、望ましくは約１０５から約１０９、及び好ましくは約１０６から約１０８pfuまで変動する。１０７pfu、５ｘ１０７pfu、又は１０８pfuの用量が１回の投与には好ましい。ベクタープラスミドは、１０μgと２０mgの間、有利には約１００μgから約２mgまでの用量で投与できる。ペプチド組成物は、１０ngと２０mgの間の一つ又は複数の用量、特に好ましくは体重１kg当たり約０．１μgから約２mgまでの活性成分の投与量で投与できる。投与は、単回投与又は一定の時間間隔後での複数回の反復投与で起こりうる。投与の好ましいパターンは、
（ａ）１日の期間にわたり連続、又は少なくとも１日１回、
（ｂ）次に、処置の断続的欠如、又は、３から１０日の期間にわたる連日の処置の欠如により該投与を中止すること、及び
（ｃ）被験体において持続的な生物反応を達成又は維持するために、（ａ）投与及び（ｂ）投与の中止のパターンを少なくとも２回繰り返すことであり、
それによって治療的有効量の活性成分への暴露が提供され、
該投与及び投与の中止のパターンの繰り返しが、好ましくは３から１０日まで変動する期間により互いに隔てられる、好ましくは少なくとも３連続投与に対応する。
【０１０１】
好ましくは、本発明は、活性成分として、本明細書において定義するベクターの１つ、又は、ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコード化するヌクレオチド配列を含む発現ベクターとポリペプチドＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む発現ベクターを使用し、それらが予防的及び治療的なワクチン接種において有用となる。
【０１０２】
予防的及び治療的なワクチン接種は、発現ベクター又はベクターが活性成分としてポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及びポリペプチドＮＳ５ｂを最終的にコード化する程度に、本明細書において定義する一つ又は複数の発現ベクターの注射により実施でき、該注射には追加免疫が続く、又は、続かない。それは、最初に宿主の免疫反応を初回刺激するためのアデノウイルス、次に初回刺激した免疫反応に追加免疫するためのポックスウイルスを同時に、又は、異なる時間に、及びその逆（例、初回刺激としてポックスウイルスベクター及び追加免疫としてアデノウイルスベクター）により、本明細書において定義する２つの異なる種類の発現ベクターの１又は複数の用量を注射することによっても実施できる。
【０１０３】
これらのベクターは薬学的キット中に含まれてよい。
【０１０４】
また、本発明の別の目的は、薬学的キット、特にワクチンであり、それは、好ましくは、本明細書において定義する治療的有効量の活性成分の少なくとも３回投与用、より好ましくは少なくとも３つの異なるバイアル中に調整されており、該投与が好ましくは３から１０日間まで変動する期間により互いに隔てられている。
【０１０５】
一態様によると、本発明の薬学的キットは、活性成分として先に定義したアデノウイルス型の発現ベクターを含む少なくとも３つのバイアルを含む。
【０１０６】
別の態様によると、本発明の薬学的キットは、活性成分として先に定義したポックスウイルス型の発現ベクターを含む少なくとも３つのバイアルを含む。
【０１０７】
別の態様によると、本発明の薬学的キットは、活性成分として、ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコード化するヌクレオチド配列を含む発現ベクターと、ポリペプチドＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む少なくとも３つのバイアルを含む。
【０１０８】
予防的及び治療的なワクチン接種は、好ましくは、本発明において使用する少なくとも１つの発現ベクター、又は、ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコード化するヌクレオチド配列を含む発現ベクターと、ポリペプチドＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列を含む発現ベクター、及び、本発明において使用するペプチド組成物により構成される本発明の少なくとも１つの薬学的組成物に基づくワクチンの注射により実施される。
【０１０９】
また、本発明の別の目的は、本明細書において定義する有効量の活性成分を含む少なくとも４つの異なるバイアルを含む薬学的キットであり、ここで３つのバイアルが３から１０日間まで変動する期間により互いに隔てられる３連続投与用であり、第４のバイアルが３連続投与の最後から少なくとも４週間後に実施されるリコール投与用である。
【０１１０】
また、本発明の別の目的は、本明細書において定義する有効量の活性成分を含む少なくとも５つの異なるバイアルを含む薬学的キットであり、ここで３つのバイアルが３から１０日間まで変動する期間により互いに隔てられる３連続投与用であり、第４及び第５のバイアルは３連続投与の最後から少なくとも４週間後に実施されるリコール投与用である。
【０１１１】
好ましい態様によると、活性成分は、本発明において使用する発現ベクター、又はポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコード化するヌクレオチド配列を含む発現ベクターと、ポリペプチドＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列を含む発現ベクターである。
【０１１２】
別の好ましい態様によると、３連続投与は、約１週間間隔により隔てられる。
【０１１３】
別の好ましい態様によると、リコール投与は、３連続投与の最後から少なくとも６週間後、例えば、約２ヶ月、約３ヶ月、約３．５ヶ月、約４ヶ月、約４．５ヶ月、約５ヶ月、約５．５ヶ月又は約６ヶ月、好ましくは最初の連続から約２ヶ月後から約６ヶ月後、特に好ましくは約４ヶ月に対して、適切に実施される。２回のリコール投与が実施される場合は、第１及び第２の投与は上記の通りに適当に実施される。好ましくは、第１のリコールは、最初の連続から約２ヶ月後から約４ヶ月後までに実施され、第２は好ましくは最初の連続から約４ヶ月後から約６ヶ月後までである。
【０１１４】
本発明の別の目的は、Ｃ型肝炎ウイルスに関連する一つ又は複数の病理の処置の方法に関し、それは、宿主生物への有効量の上記の活性成分（本発明のペプチド組成物、ベクター、抗体、及び／又は薬学的組成物）のいずれか、又は、その任意の組み合わせの少なくとも１回投与を含む。本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスに関連する一つ又は複数の病理を処置するための薬剤の調製のための上記の活性成分の少なくとも１つ又はその任意の組み合わせの使用も提供する。本明細書において使用する“処置”又は“処置する”という用語は、Ｃ型肝炎ウイルスに感染した宿主生物の予防的及び治療的なワクチン接種を包含する。“宿主生物”という用語は、任意のマウス、ラット、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ウマ、サル、又はヒトの被験体、例えば、ＨＣＶに感染したヒトなどの任意の哺乳動物を包含することを意図する。
【０１１５】
本発明の方法又は使用は、ＨＣＶ感染患者におけるＨＣＶ持続感染及び肝臓癌を処置するために特に有用である。“癌”という用語は、びまん性又は限局性の腫瘍、転移、癌性ポリープならびに前癌病変（例、肝硬変）を含む任意の癌状態を包含する。望ましくは、有効量の本発明のペプチド組成物、ベクター、薬学的組成物、及び／又は抗体は、それは、それが投与された宿主生物に治療的恩典を提供する。治療的恩典は、多くの方法、例えば、処置前と比較した、処置済み生物の血液、血漿、又は血清中において検出されるＨＣＶウイルス血症の低下により、及び／又は、抗ＨＣＶ抗体免疫反応（例、抗ＨＣＶ抗体の産生及び／又は細胞免疫）の検出により、又は、ＨＣＶ感染に関連する症状の遅延（例、肝硬変又は癌の発生における遅延）、又は、典型的にＨＣＶ感染に関連する肝臓の炎症／脂肪症／線維症の状態の低下又は減速により、又は、従来の治療への個人の反応の改善により証明できる。
【０１１６】
好ましくは、本発明において使用するペプチド組成物、発現ベクターにより、及び／又は、本発明の薬学的組成物中に含まれる、又は、コード化されるＮＳ３／ＮＳ４ポリタンパク質及び最終的にＮＳ５ｂポリペプチドは、遺伝子型１ｂに由来し、遺伝子型１ｂのＣ型肝炎ウイルスに関連する病理を処置するために本明細書において記載する様式に従って使用する。あるいは、それは、遺伝子型１ｂに由来し、遺伝子型１ａ、３、又は４のＣ型肝炎ウイルスなどの１ｂ以外の遺伝子型、特に好ましくは遺伝子型１ａに関連する病理を処置するために、本明細書に記載のモダリティに従って使用する。
【０１１７】
適宜、本発明の方法又は使用は、一つ又は複数の従来の治療様式（例、放射線、化学療法、及び／又は外科手術）との併用で実施できる。一態様において、本発明の方法又は使用は、ＨＣＶ感染、ＨＣＶ関連の病理を処置又は予防するために従来使用される一つ又は複数の薬物での化学療法と関連する。ＨＣＶ薬物の代表例として、限定はされないが、プロテアーゼインヒビター（例、ＶｅｒｔｅｘのＶＸ９５０などのセリンプロテアーゼインヒビター）、ポリメラーゼインヒビター、ヘリカーゼインヒビター、抗線維化剤（ａｎｔｉｆｉｂｒｏｔｉｃ）、ヌクレオシドアナログ、ＴＬＲアゴニスト、Ｎ−グリコシル化インヒビター、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、免疫調節剤（ｉｍｍｕｎｅ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）、治療用ワクチン、及びＨＣＶに関連する肝細胞癌の処置において通常使用される抗腫瘍剤（例、肝動脈中の化学塞栓術により通常投与されるアドリアマイシン又はアドリアマイシン・リピオドールの混合物及びスポンゼル（ｓｐｏｎｇｅｌ））が挙げられる。そのようなＨＣＶ薬物は、数時間、数日、及び／又は数週間にわたり標準的なプロトコール、投与量、及び計画に従って単回用量、又は、代わりに複数回用量で提供できる。それらの投与は、活性成分として本明細書において定義するペプチド組成物、発現ベクター、及び／又は薬学的組成物の投与のための本発明の使用に先行しうる、併用されうる、又は続きうる。好ましい併用には、最終的に２４から４８週間にわたるリバビリン（例、８００から１２００mg/日）との併用で、本発明の方法又は使用の前、並行して、又は続く、ペグ化ＩＦＮ−α２ａ又はＩＦＮ−α２ｂ（例、１０μg/週の用量）での宿主生物の処置が挙げられる。本発明において使用する活性成分は、免疫反応を増強するようにデザインされた他の処置との併用で、例えば、当技術分野において周知のアジュバント又はサイトカイン（又はサイトカインをコード化するベクター）との同時投与により投与することもできる。
【０１１８】
別の態様において、本発明の方法又は使用は、本明細書において定義するペプチド組成物、発現ベクター、又は薬学的組成物の少なくとも３（例、３から１０）連続投与を含む強化免疫スケジュールに従って実施する。好ましくは、少なくとも３連続投与は、３日から１０日まで変動するが、１５日以内の期間により独立的に隔てられる。本発明の方法又は使用は、好ましくは、それぞれ約１週間間隔での、本明細書において定義する１つの活性成分の３連続投与を含む。さらにより好ましくは、本発明の方法又は使用は、上で定義するポックスウイルス発現ベクター（例、ＮＳ３／ＮＳ４及びＮＳ５Ｂをコード化するＭＶＡ）又はそのようなベクターを含む薬学的組成物の約１週間間隔での筋肉内又は皮下経路による３連続投与を含む。あるいは、本発明の方法又は使用は、上で定義するアデノウイルス発現ベクター（例、ＮＳ３／ＮＳ４及びＮＳ５Ｂを発現するＥ１及びＥ３欠失アデノウイルスベクター）又はそのようなベクターを含む薬学的組成物の約１週間間隔での筋肉内又は皮下経路による３連続投与を含む。
【０１１９】
さらに別の態様において、本発明の方法又は使用は、少なくとも３連続投与の終了時での少なくとも１回の“リコール”投与をさらに含んでよい。リコール投与の回数は１から１０まで変動でき、連続投与の第１の連続の最後と第１のリコール投与の間の期間は、少なくとも約４週間程度である。リコール投与は、連続投与の第１の連続の最後から約６週間後、約２ヶ月後、約３ヶ月後、約３．５ヶ月後、約４ヶ月後、約４．５ヶ月後、約５ヶ月後、約５．５ヶ月後、約６ヶ月後、又はさらにそれ以上の後に適当に実施できる。有利なことに、方法及び使用は、約１週間間隔での３連続投与、及び、少なくとも３連続投与の最後から約２ヶ月後から約６ヶ月後まで、好ましくは約４ヶ月に対して起こる１回のリコール投与を含む。あるいは、本発明の方法又は使用は、２回のリコール投与を含み、連続投与の第１の連続の最後から、第１は約２ヶ月後から約４ヶ月後まで、第２は約４ヶ月後から約６ヶ月後まであり、特に好ましくは第１のリコールは約４ヶ月、第２のリコールは約６ヶ月である。リコール投与では、連続投与の第１の連続と同じ、又は、異なる活性成分を使用でき、同じ、又は、異なる投与経路を使用できる。一局面によると、リコール投与は、連続投与の第１の連続と同じ活性成分及び同じ経路を使用してなされる。この局面の好ましい方法又は使用は、約１週間間隔での３連続投与、及び第３の連続投与から約４ヶ月及び／又は約６ヶ月後の１又は２回のリコール投与を含み、全てが皮下経路により、及び、上で定義するポックスウイルスベクター（例、ＮＳ３／ＮＳ４及びＮＳ５Ｂをコード化するＭＶＡ）又はそのようなベクターを含む薬学的組成物による。
【０１２０】
別の局面によると、連続投与及びリコール投与では、異なる活性成分及び／又は異なる投与経路を使用できる。例えば、少なくとも３連続投与は、ポックスウイルスベクター（例、ＮＳ３／ＮＳ４及びＮＳ５Ｂをコード化するＭＶＡ）又は先に定義するベクターを含む薬学的組成物での皮下又は筋肉内経路によりなされ、リコール投与は欧州特許出願第Ｎ°  ＥＰ  ０６  ３６  ００１４．２号において記載されるポリペプチドなどのＮＳ３、ＮＳ４、及び／又はＮＳ５ｂを含む任意の先行技術のポリペプチドでの皮下又は筋肉内経路による。
【０１２１】
本発明の目的は、３から１０日まで変動する期間により互いに隔てられる該活性成分の少なくとも３連続投与を含む、本明細書において定義する治療的有効量の１つの活性成分の使用も包含し、該活性成分の少なくとも３連続投与は一組の投与に対応し、該一組の投与は少なくとも１回反復される傾向があり、各組の投与は４週間から６ヶ月間まで変動する期間により互いに隔てられる。
【０１２２】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスに関連する一つ又は複数の病理の処置において該被験体のＨＣＶに対して特異的な細胞免疫反応を刺激するための、ＨＣＶ感染被験体への投与のための薬剤の調製において、本明細書において定義する治療的有効量の１つの活性成分を使用した使用又は方法も提供し、
該投与が、
（ａ）１日の期間にわたり連続又は少なくとも１日１回、
（ｂ）次に、処置の断続的欠如、又は、３から１０日の期間にわたる連日の処置の欠如により該投与を中止すること、及び
（ｃ）被験体において持続的な細胞免疫反応を達成又は維持するために、（ａ）投与及び（ｂ）投与の中止のパターンを少なくとも２回繰り返すことであり、それが治療的有効量の該活性物質への暴露を提供し、
該投与及び投与の中止のパターンの繰り返しが、好ましくは３から１０日まで変動する期間により互いに隔てられる、好ましくは少なくとも３連続投与に対応する。
【０１２３】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスに関連する一つ又は複数の病理の処置において該被験体のＨＣＶに対して特異的な細胞免疫反応を刺激するための、ＨＣＶ感染被験体への本明細書において定義する治療的有効量の活性成分の投与による治療方法も提供し、該投与が、
（ａ）１日の期間にわたり連続又は少なくとも１日１回、
（ｂ）次に、処置の断続的欠如、又は、３から１０日の期間にわたる連日の処置の欠如により該投与を中止すること、及び
（ｃ）被験体において持続的な細胞免疫反応を達成又は維持するために、（ａ）投与及び（ｂ）投与の中止のパターンを少なくとも２回繰り返すことであり、それが治療的有効量の該活性物質への暴露を提供し、
該投与及び投与の中止のパターン繰り返しが、好ましくは３から１０日まで変動する期間により互いに隔てられる、好ましくは少なくとも３連続投与に対応する。
【０１２４】
本発明の別の目的は、Ｃ型肝炎ウイルスに関連する一つ又は複数の病理の処置において該被験体のＨＣＶに対して特異的な細胞免疫反応を刺激するための、本明細書において定義する治療的有効量の１つの活性成分を使用した使用又は方法であり、ここで該処置は、３から１０日まで変動する期間により互いに隔てられる該活性成分の少なくとも３連続投与を含む。
【０１２５】
好ましい態様によると、本発明の使用又は方法は、約１週間間隔での３連続投与、及び、本明細書において定義する同じ、又は、異なる活性成分での、同じ、又は、異なる投与経路による１又は２回のリコール投与を含む。好ましい使用では、ポックスウイルス発現ベクター（例、ＮＳ３／ＮＳ４及びＮＳ５Ｂを発現するＭＶＡ）又は上で定義するベクターを含む薬学的組成物の１週間間隔での３連続皮下投与、それに続く、３回目の注射から約２ヶ月後から約６ヶ月後まで、特に好ましくは３回目の注射から約４ヶ月に対して、皮下経路による同じ活性成分の１回のリコール投与を実施する。
【０１２６】
刺激免疫反応は、好ましくは、Ｔ細胞媒介性免疫反応、及び、特にＣＤ８＋Ｔ細胞反応、ＣＤ４＋Ｔ細胞反応又はＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞反応である。望ましくは、本発明の方法又は使用により刺激したＴ細胞媒介性免疫反応によって、感染Ｃ型肝炎ウイルス中に存在するＮＳ３及び／又はＮＳ４及び／又はＮＳ５Ｂ中に位置する少なくとも１つのエピトープを標的にできる。好ましくは、本発明の方法又は使用により提供されるＴ細胞媒介性免疫反応は、少なくとも１つのＨＬＡ−Ｂ制限エピトープ、及び、特に感染肝炎ウイルスのＮＳ３ポリペプチド中に位置する少なくとも１つのＨＬＡ−Ｂ７エピトープに特異的である。あるいは、又は、組み合わせで、刺激されたＴ細胞媒介性免疫反応は、少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ２制限エピトープ、及び、特に感染肝炎ウイルスのＮＳ３及び／又はＮＳ５ｂタンパク質中に位置する少なくとも１つのＨＬＡ−Ａ２エピトープに特異的である。
【０１２７】
好ましい態様において、本発明による方法又は使用は、上に記載する強化免疫スケジュールに従って宿主生物に提供され、本明細書において定義する活性成分の少なくとも３連続投与及び任意に１又は２回のリコール投与を含む。
【０１２８】
望ましくは、刺激された免疫反応は持続性であり、活性成分の最後の投与後の少なくとも１ヶ月間、処置した宿主生物において検出できる。好ましくは、刺激された免疫反応は、少なくとも２ヶ月間、望ましくは少なくとも３ヶ月間、好ましくは少なくとも６ヶ月間、検出できる。
【０１２９】
抗ＨＣＶ細胞免疫反応を刺激するための本発明の方法又は使用の能力は、当技術分野において標準である様々なアッセイを使用してインビトロ又はインビボのいずれかで評価できる。免疫反応の開始及び活性化を評価するために利用可能な技術の一般的な記載については、例えば、Coligan et al.（1992 and 1994, Current Protocols in Immunology; ed J Wiley & Sons Inc, National Institute of Health）を参照すること。細胞免疫の測定は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するものを含む活性化エフェクター細胞により分泌されるサイトカインプロファイルの測定により（例、ＥＬＩｓｐｏｔによるＩＬ−１０又はＩＦＮｇ産生細胞の定量）、免疫エフェクター細胞の活性化状態の測定により（例、典型的な［３Ｈ］チミジン取り込みによるＴ細胞増殖アッセイ）、感作された被験体における抗原特異的Ｔリンパ球についてアッセイ（例、細胞傷害性アッセイにおけるペプチド特異的溶解）により実施できる。本発明の方法は、適当な感染病原体（例、ＨＣＶ遺伝子を発現する細菌又はワクシニアウイルス）で攻撃した動物モデルにおいてさらに検証することもでき、感染病原体の中和及び最終的に関連する症状に対する部分耐性を判断し、それは抗ＨＣＶ細胞免疫反応の誘導又は増強を反映する。本発明のベクター組成物の試験及び検証は、添付の実施例の項においても説明する。
【０１３０】
本発明は、３から１０日まで変動する期間により互いに隔てられる該活性成分の少なくとも３連続投与を含む、本明細書において定義する治療的有効量の１つの活性成分の使用も包含し、該活性成分の少なくとも３連続投与は一組の投与に対応し、該一組の投与は少なくとも１回反復される傾向があり、各組の投与は４週間から６ヶ月間まで変動する期間により互いに隔てられる。
【０１３１】
本発明は、説明としてのみ与えられ、非限定的である以下の実施例を使用して、ならびに、添付の図１から１６を使用してより良く理解される：
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１Ａ】図１Ａから１Ｋは、本発明のアデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために使用される異なるプラスミドのマップを表し、ここには異なる制限酵素の部位及びＮＳ３／ＮＳ４ならびにＮＳ５ｂをコード化する配列断片の位置が示されている。
【図１Ｂ】図１Ａから１Ｋは、本発明のアデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために使用される異なるプラスミドのマップを表し、ここには異なる制限酵素の部位及びＮＳ３／ＮＳ４ならびにＮＳ５ｂをコード化する配列断片の位置が示されている。
【図１Ｃ】図１Ａから１Ｋは、本発明のアデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために使用される異なるプラスミドのマップを表し、ここには異なる制限酵素の部位及びＮＳ３／ＮＳ４ならびにＮＳ５ｂをコード化する配列断片の位置が示されている。
【図１Ｄ】図１Ａから１Ｋは、本発明のアデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために使用される異なるプラスミドのマップを表し、ここには異なる制限酵素の部位及びＮＳ３／ＮＳ４ならびにＮＳ５ｂをコード化する配列断片の位置が示されている。
【図１Ｅ】図１Ａから１Ｋは、本発明のアデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために使用される異なるプラスミドのマップを表し、ここには異なる制限酵素の部位及びＮＳ３／ＮＳ４ならびにＮＳ５ｂをコード化する配列断片の位置が示されている。
【図１Ｆ】図１Ａから１Ｋは、本発明のアデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために使用される異なるプラスミドのマップを表し、ここには異なる制限酵素の部位及びＮＳ３／ＮＳ４ならびにＮＳ５ｂをコード化する配列断片の位置が示されている。
【図１Ｇ】図１Ａから１Ｋは、本発明のアデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために使用される異なるプラスミドのマップを表し、ここには異なる制限酵素の部位及びＮＳ３／ＮＳ４ならびにＮＳ５ｂをコード化する配列断片の位置が示されている。
【図１Ｈ】図１Ａから１Ｋは、本発明のアデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために使用される異なるプラスミドのマップを表し、ここには異なる制限酵素の部位及びＮＳ３／ＮＳ４ならびにＮＳ５ｂをコード化する配列断片の位置が示されている。
【図１Ｉ】図１Ａから１Ｋは、本発明のアデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために使用される異なるプラスミドのマップを表し、ここには異なる制限酵素の部位及びＮＳ３／ＮＳ４ならびにＮＳ５ｂをコード化する配列断片の位置が示されている。
【図１Ｊ】図１Ａから１Ｋは、本発明のアデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために使用される異なるプラスミドのマップを表し、ここには異なる制限酵素の部位及びＮＳ３／ＮＳ４ならびにＮＳ５ｂをコード化する配列断片の位置が示されている。
【図１Ｋ】図１Ａから１Ｋは、本発明のアデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために使用される異なるプラスミドのマップを表し、ここには異なる制限酵素の部位及びＮＳ３／ＮＳ４ならびにＮＳ５ｂをコード化する配列断片の位置が示されている。
【図２Ａ】図２Ａから２Ｈは、本発明のポックスウイルスＭＶＡ  ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために使用される異なるプラスミドのマップを表し、ここには異なる制限酵素の部位ならびにＮＳ３／ＮＳ４及びＮＳ５ｂをコード化する配列断片の位置が示されている。
【図２Ｂ】図２Ａから２Ｈは、本発明のポックスウイルスＭＶＡ  ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために使用される異なるプラスミドのマップを表し、ここには異なる制限酵素の部位ならびにＮＳ３／ＮＳ４及びＮＳ５ｂをコード化する配列断片の位置が示されている。
【図２Ｃ】図２Ａから２Ｈは、本発明のポックスウイルスＭＶＡ  ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために使用される異なるプラスミドのマップを表し、ここには異なる制限酵素の部位ならびにＮＳ３／ＮＳ４及びＮＳ５ｂをコード化する配列断片の位置が示されている。
【図２Ｄ】図２Ａから２Ｈは、本発明のポックスウイルスＭＶＡ  ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために使用される異なるプラスミドのマップを表し、ここには異なる制限酵素の部位ならびにＮＳ３／ＮＳ４及びＮＳ５ｂをコード化する配列断片の位置が示されている。
【図２Ｅ】図２Ａから２Ｈは、本発明のポックスウイルスＭＶＡ  ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために使用される異なるプラスミドのマップを表し、ここには異なる制限酵素の部位ならびにＮＳ３／ＮＳ４及びＮＳ５ｂをコード化する配列断片の位置が示されている。
【図２Ｆ】図２Ａから２Ｈは、本発明のポックスウイルスＭＶＡ  ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために使用される異なるプラスミドのマップを表し、ここには異なる制限酵素の部位ならびにＮＳ３／ＮＳ４及びＮＳ５ｂをコード化する配列断片の位置が示されている。
【図２Ｇ】図２Ａから２Ｈは、本発明のポックスウイルスＭＶＡ  ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために使用される異なるプラスミドのマップを表し、ここには異なる制限酵素の部位ならびにＮＳ３／ＮＳ４及びＮＳ５ｂをコード化する配列断片の位置が示されている。
【図２Ｈ】図２Ａから２Ｈは、本発明のポックスウイルスＭＶＡ  ＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂを得るために使用される異なるプラスミドのマップを表し、ここには異なる制限酵素の部位ならびにＮＳ３／ＮＳ４及びＮＳ５ｂをコード化する配列断片の位置が示されている。
【図３Ａ】図３は、エピトープＧＬＬが培養中の脾細胞を刺激するため、及び、ＣＴＬ標的を負荷するために使用され、その結果がエフェクター／標的の比率の関数としての特異的溶解パーセンテージとして表わされるＣＴＬ試験（図３Ａ）に従って、又は、結果がスポット／１０６個細胞の数に与えられる、エピトープＧＬＬに特異的なＥＬＩＳＰＯＴ試験（図３Ｂ）に従ってのいずれかで、アデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４により誘導される細胞反応を与える。
【図３Ｂ】図３は、エピトープＧＬＬが培養中の脾細胞を刺激するため、及び、ＣＴＬ標的を負荷するために使用され、その結果がエフェクター／標的の比率の関数としての特異的溶解パーセンテージとして表わされるＣＴＬ試験（図３Ａ）に従って、又は、結果がスポット／１０６個細胞の数に与えられる、エピトープＧＬＬに特異的なＥＬＩＳＰＯＴ試験（図３Ｂ）に従ってのいずれかで、アデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４により誘導される細胞反応を与える。
【図４】図４は、エピトープＡＬＹ及びＫＬＱに特異的な試験ＥＬＩＳＰＯＴに従って、アデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４により誘導される細胞反応を与える。
【図５】図５は、エピトープＤＬＭを培養中の脾細胞を刺激するため、及び、ＣＴＬの標的を負荷するために使用し、その結果がエフェクター／標的の比率の関数としての特異的溶解パーセンテージとして表わされるＣＴＬ試験に従って、アデノウイルスＡｄＣＥ１Ｅ２により誘導される細胞反応を与える。
【図６】図６は、異なる組み合わせのアデノウイルスにより免疫したマウス８匹の４群についてのトライアル試験に起因する、pfu/ml/mg卵巣での組み換えワクシニアウイルスの力価を与える：ＡｄＮＳ３ＮＳ４＋ＡｄＮＳ５ｂ（第１群）、アデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４＋ＡｄＮＳ５ｂ＋ＡｄＮＳ５ａ（第２群）、アデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４＋ＡｄＮＳ５ｂ＋ＡｄＣＥ１Ｅ２（第３群）、及びアデノウイルスＡｄβＧａｌ（第４群）、ならびに
【図７】図７は、以下の異なる組み合わせのアデノウイルスにより免疫したマウス８匹の３群についてのトライアル試験に起因する、pfu/ml/mg卵巣での組み換えワクシニアウイルスの力価を与える：ＡｄＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂ（第１群）、ＡｄＮＳ３ＮＳ４＋ＡｄＮＳ５ｂ（第２群）、及びＡｄβＧａｌ（第３群）。
【図８】図８は、ＭＶＡ  ＮＳ３／４−ＮＳ５ＢによるＨｕｈ−７感染後のフローサイトメトリーによるＮＳ３、ＮＳ４、及びＮＳ５ｂ発現のインビトロ分析を説明する。ＭＶＡ  ＮＳ３／４−ＮＳ５ｂ感染Ｈｕｈ−７細胞は、ＭＯＩの１での感染から２４時間後に回収し、マウスモノクローナル抗ＮＳ３（８Ｄ８Ｅ１）、抗ＮＳ４Ｂ（１Ｂ１２Ａ３）、及び抗ＮＳ５Ｂ（５Ｂ１２Ｂ７）抗体を使用して染色する。結果は、ＭＶＡ  Ｎ３３（ＭＶＡ野生型）感染細胞と比較した陽性細胞のパーセンテージとして表わす。太線：ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ感染細胞、細線：ＭＶＡ  Ｎ３３感染細胞、影付きヒストグラム：非感染細胞。ＭＦＩ：平均蛍光強度
【図９Ａ】図９は、ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂでの２つの異なる免疫スケジュール後にＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスにおいて誘導されるＮＳ３  ＨＬＡ−Ａ２制限エピトープに特異的なＩＦＮγ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の比較を提供する。スケジュール１：１、４、７週目に実施した３回の皮下（ｓｃ）注射。スケジュール２：１、２、３、及び６週目に実施した４回のｓｃ注射。（Ａ）６週目（スケジュール１）又は５週目（スケジュール２）に実施したＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ。（Ｂ）９週目（スケジュール１）又は８週目（スケジュール２）に実施したＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ。ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、材料及び方法において記載の通りに実施した。Ｍ１、Ｍ２、及びＭ３は、ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂで免疫した３匹のマウスを表す。Ｎ３３は、代表的なＭＶＡ  Ｎ３３注射対照マウスである。ＮＳ３  ＨＬＡ−Ａ２制限エピトープＧＬＬ及びＫＬＴ又は無関係ペプチドを再刺激のために使用した。各バーは単回免疫マウスの反応を表す。水平破線はカットオフを表し、それ以上ではＩＦＮγ産生Ｔ細胞の頻度は陽性と見なされる。
【図９Ｂ】図９は、ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂでの２つの異なる免疫スケジュール後にＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスにおいて誘導されるＮＳ３  ＨＬＡ−Ａ２制限エピトープに特異的なＩＦＮγ産生ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の比較を提供する。スケジュール１：１、４、７週目に実施した３回の皮下（ｓｃ）注射。スケジュール２：１、２、３、及び６週目に実施した４回のｓｃ注射。（Ａ）６週目（スケジュール１）又は５週目（スケジュール２）に実施したＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ。（Ｂ）９週目（スケジュール１）又は８週目（スケジュール２）に実施したＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ。ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、材料及び方法において記載の通りに実施した。Ｍ１、Ｍ２、及びＭ３は、ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂで免疫した３匹のマウスを表す。Ｎ３３は、代表的なＭＶＡ  Ｎ３３注射対照マウスである。ＮＳ３  ＨＬＡ−Ａ２制限エピトープＧＬＬ及びＫＬＴ又は無関係ペプチドを再刺激のために使用した。各バーは単回免疫マウスの反応を表す。水平破線はカットオフを表し、それ以上ではＩＦＮγ産生Ｔ細胞の頻度は陽性と見なされる。
【図１０Ａ】図１０は、２つの異なる免疫スケジュールに従ったＭＶＡ  ＮＳ３／４−ＮＳ５Ｂの投与後にＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスにおいて誘導されるＮＳ３又はＮＳ５Ｂ  ＨＬＡ−Ａ２制限エピトープに特異的な細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を説明する。スケジュール１：１、４、７週目に実施した３回のｓｃ注射。スケジュール２：１、２、３、及び６週目に実施した４回のｓｃ注射。（Ａ）６週目（スケジュール１）又は５週目（スケジュール２）に実施したＣＴＬアッセイ。（Ｂ）９週目（スケジュール１）又は８週目（スケジュール２）に実施したＣＴＬアッセイ。ＣＴＬアッセイは材料及び方法において記載の通りに実施した。データは、異なるエフェクター対標的細胞（Ｅ／Ｔ）の比率で得られる特異的溶解の%を表す。標的細胞をパルスするために使用するＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドは、各グラフの上に示す：ＮＳ３はＧＬＬ、ＮＳ５ＢはＡＬＹ。各バーは単回免疫マウスの反応を表す。
【図１０Ｂ】図１０は、２つの異なる免疫スケジュールに従ったＭＶＡ  ＮＳ３／４−ＮＳ５Ｂの投与後にＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスにおいて誘導されるＮＳ３又はＮＳ５Ｂ  ＨＬＡ−Ａ２制限エピトープに特異的な細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を説明する。スケジュール１：１、４、７週目に実施した３回のｓｃ注射。スケジュール２：１、２、３、及び６週目に実施した４回のｓｃ注射。（Ａ）６週目（スケジュール１）又は５週目（スケジュール２）に実施したＣＴＬアッセイ。（Ｂ）９週目（スケジュール１）又は８週目（スケジュール２）に実施したＣＴＬアッセイ。ＣＴＬアッセイは材料及び方法において記載の通りに実施した。データは、異なるエフェクター対標的細胞（Ｅ／Ｔ）の比率で得られる特異的溶解の%を表す。標的細胞をパルスするために使用するＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドは、各グラフの上に示す：ＮＳ３はＧＬＬ、ＮＳ５ＢはＡＬＹ。各バーは単回免疫マウスの反応を表す。
【図１１Ａ】図１１は、強化免疫スケジュールに従ったＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスにおけるＭＶＡ  ＮＳ３／４−ＮＳ５Ｂ投与後のＩＣＳ及びＣＴＬアッセイにより特徴付けられるＣＤ８＋Ｔ細胞反応を説明する。（Ａ）ＩＣＳアッセイ。図の左部分は、ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ免疫動物及びＭＶＡ  Ｎ３３免疫動物の代表的なＩＦＮγ＋ＣＤ８＋細胞ドットプロット、及びそれに続く、材料及び方法において記載した通りに実施したＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞でのゲーティングを表す。ＧＬＬペプチド又はＴＴ（無関係刺激）を再刺激のために使用した。右のヒストグラムは、ＧＬＬ再刺激後の４匹のＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ免疫マウス及び２匹のＭＶＡ  Ｎ３３免疫マウスで検出されたＩＦＮγ＋ＣＤ８＋細胞のパーセンテージを表す。空白バー：単回免疫マウスの反応、黒バー：中央値。（Ｂ）インビボＣＴＬアッセイ。ＧＬＬパルスＣＦＳＥｈｉｇｈ及び未パルスＣＦＳＥｌｏｗ標的細胞を材料及び方法において記載の通りにレシピエントマウスに注射した。２４時間後、殺された標的細胞のパーセンテージを膵臓において評価した。特異的溶解のパーセンテージを各ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂマウス（Ｍ１からＭ４）について示す。
【図１１Ｂ】図１１は、強化免疫スケジュールに従ったＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスにおけるＭＶＡ  ＮＳ３／４−ＮＳ５Ｂ投与後のＩＣＳ及びＣＴＬアッセイにより特徴付けられるＣＤ８＋Ｔ細胞反応を説明する。（Ａ）ＩＣＳアッセイ。図の左部分は、ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ免疫動物及びＭＶＡ  Ｎ３３免疫動物の代表的なＩＦＮγ＋ＣＤ８＋細胞ドットプロット、及びそれに続く、材料及び方法において記載した通りに実施したＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞でのゲーティングを表す。ＧＬＬペプチド又はＴＴ（無関係刺激）を再刺激のために使用した。右のヒストグラムは、ＧＬＬ再刺激後の４匹のＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ免疫マウス及び２匹のＭＶＡ  Ｎ３３免疫マウスで検出されたＩＦＮγ＋ＣＤ８＋細胞のパーセンテージを表す。空白バー：単回免疫マウスの反応、黒バー：中央値。（Ｂ）インビボＣＴＬアッセイ。ＧＬＬパルスＣＦＳＥｈｉｇｈ及び未パルスＣＦＳＥｌｏｗ標的細胞を材料及び方法において記載の通りにレシピエントマウスに注射した。２４時間後、殺された標的細胞のパーセンテージを膵臓において評価した。特異的溶解のパーセンテージを各ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂマウス（Ｍ１からＭ４）について示す。
【図１２】図１２は、強化免疫スケジュールに従ったＨＬＡ−Ｂ７トランスジェニックマウスにおけるＭＶＡ  ＮＳ３／４−ＮＳ５ｂ投与後のＩＦＮγ産生Ｔ細胞反応を説明する。ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、材料及び方法において記載の通りに実施した。Ｍ１−５はＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂで免疫した５匹のマウス、Ｍ６−７はＭＶＡ  Ｎ３３で免疫した２匹のマウスを表す。斜線、点、及び空白のバーは、個々のマウスについて得られた値を表し、それぞれＨＬＡ−Ｂ７制限ＷＰＡ１０、ＬＳＰ１０、又は無関係ペプチドのエピトープに特異的である。中央値は、ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ注射マウスについて、黒色（ＷＰＡ１０ペプチド）及び灰色（ＬＳＰ１０ペプチド）のバーで示す。水平破線はカットオフを表し、それ以上ではＩＦＮγ産生Ｔ細胞の頻度は陽性と見なされる。
【図１３】図１３は、強化免疫スケジュールに従ったＢａｌｂ／ＣマウスにおけるＭＶＡ  ＮＳ３／４−ＮＳ５Ｂ投与後のＮＳ３、ＮＳ４、及びＮＳ５Ｂ抗原に特異的なＩＦＮγ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞反応を説明する。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、個々のＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ免疫マウス又はＭＶＡ  Ｎ３３免疫マウスの脾臓からポジティブ選択した。全脾細胞、ＣＤ４＋画分、及び溶出画分を生成し、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを材料及び方法において記載の通りに個々のマウスの各画分について実施した。ＨＣＶ  ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ５Ｂ組み換え抗原又はＴＴ（無関係刺激）を再刺激のために使用した。結果は、４匹のＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ（斜線バー）免疫マウス又は２匹のＭＶＡ  Ｎ３３（空白バー）免疫マウスの群について得られた、１０６個の脾細胞についての中央スポット値を表すバーとして示す。バー内において、各マウスについて得られた結果を黒色点として表わす。水平破線はカットオフを表し、それ以上ではＩＦＮγ産生Ｔ細胞の頻度は陽性と考えられる。
【図１４】図１４は、強化免疫スケジュールに従ったＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスにおけるＭＶＡ  ＮＳ３／４−ＮＳ５Ｂ投与後のＣＴＬ反応の寿命を説明する。マウスは１、２、３、及び２７週目に４回のＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ注射を受け、ＣＴＬアッセイを材料及び方法において記載の通りに５、１０、２７、及び２９週目に実施した。４匹のＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ注射マウス及び２匹のＭＶＡ  Ｎ３３注射マウスを分析する各時間点で殺した。斜線バー：ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ注射マウスについての溶解値の中央値%、白色バー：異なるエフェクター対標的（Ｅ／Ｔ）の比率でのＭＶＡ  Ｎ３３注射マウスについての溶解値の中央値%。
【図１５Ａ】図１５は、強化免疫スケジュールに従ったＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ投与後のＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスにおけるＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ反応の寿命を説明する。マウスは１、２、３、及び２７週目に４回のＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ注射を受け、Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを材料及び方法において記載の通りに５、１０、２７、及び２９週目に実施した。４匹のＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ及び２匹のＭＶＡ  Ｎ３３注射マウスを分析する各時間点で殺した。ＮＳ３  ＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドＧＬＬ（Ａ）、ＣＶＮ（Ｂ）、もしくはＫＬＴ（Ｃ）又は無関係ペプチドを再刺激のために使用した。斜線及び白色のバーは、それぞれ特異的及び無関係のペプチドについて個々のマウスで得られた値を表す。中央値は、ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ注射マウスについて、黒色（特異的ペプチド）及び点線のバー（無関係ペプチド）で表す。水平破線はカットオフを表し、それ以上ではＩＦＮγ産生が陽性と見なされる。
【図１５Ｂ】図１５は、強化免疫スケジュールに従ったＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ投与後のＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスにおけるＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ反応の寿命を説明する。マウスは１、２、３、及び２７週目に４回のＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ注射を受け、Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを材料及び方法において記載の通りに５、１０、２７、及び２９週目に実施した。４匹のＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ及び２匹のＭＶＡ  Ｎ３３注射マウスを分析する各時間点で殺した。ＮＳ３  ＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドＧＬＬ（Ａ）、ＣＶＮ（Ｂ）、もしくはＫＬＴ（Ｃ）又は無関係ペプチドを再刺激のために使用した。斜線及び白色のバーは、それぞれ特異的及び無関係のペプチドについて個々のマウスで得られた値を表す。中央値は、ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ注射マウスについて、黒色（特異的ペプチド）及び点線のバー（無関係ペプチド）で表す。水平破線はカットオフを表し、それ以上ではＩＦＮγ産生が陽性と見なされる。
【図１５Ｃ】図１５は、強化免疫スケジュールに従ったＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ投与後のＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスにおけるＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ反応の寿命を説明する。マウスは１、２、３、及び２７週目に４回のＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ注射を受け、Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを材料及び方法において記載の通りに５、１０、２７、及び２９週目に実施した。４匹のＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ及び２匹のＭＶＡ  Ｎ３３注射マウスを分析する各時間点で殺した。ＮＳ３  ＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドＧＬＬ（Ａ）、ＣＶＮ（Ｂ）、もしくはＫＬＴ（Ｃ）又は無関係ペプチドを再刺激のために使用した。斜線及び白色のバーは、それぞれ特異的及び無関係のペプチドについて個々のマウスで得られた値を表す。中央値は、ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ注射マウスについて、黒色（特異的ペプチド）及び点線のバー（無関係ペプチド）で表す。水平破線はカットオフを表し、それ以上ではＩＦＮγ産生が陽性と見なされる。
【図１６】図１６は、ＴＣ−ＬＮＳ３細菌で攻撃したＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ免疫マウスの脾臓及び肝臓における残留細菌力価を説明する。（Ａ）ワクチン接種済みＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスにおける細菌力価。４匹のマウスを、攻撃の１５日前に、”強化”ワクチン接種スケジュールに従ってＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５ＢもしくはＭＶＡ  Ｎ３３（陰性対照）、又は、低免疫用量（０．０５から０．１  ＬＤ５０）（陽性対照）を使用して２週間間隔での２回のＴＣ−ＬＮＳ３のいずれかで免疫した。攻撃は１  ＬＤ５０用量のＴＣ−ＬＮＳ３細菌で実施し、マウスは２日後に殺した。残留細菌力価は、肝臓及び脾臓の連続希釈の滴定により評価した。各群の個々のマウスは円記号により表わし、各群について得られた中央値は黒色の太線により表わす。Ｐ値はマンホイットニーのノンパラメトリック検定に従って算出し、ｐ＜０．０５の場合、値が統計的に異なると見なす。（Ｂ）ワクチン接種済みＢａｌｂ／ｃマウスにおける細菌力価。攻撃は、６匹のマウスが各動物群に含まれたことを除き、（Ａ）に記載の通りに実施した。
【０１３３】
実施例１：本発明のタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及びＮＳ５ｂの発現を可能にするアデノウイルスの調製
１．アデノウイルス
組み換えアデノウイルスは、ＰａｃＩによるゲノムの線形化後に相補系統２９３（Graham, Smiley, et al., 1977）のトランスフェクション（ＣａＰＯ３）により生成する。組み換えウイルスは、この同じ系統で増殖及び増幅し、それらの精製は感染細胞から実施する。細胞を遠心分離（１５００rpm、１０分間）により回収し、３回の凍結／融解サイクルにより溶解する。細胞ライセートを２回の遠心分離（２０００rpm、１０分間；８０００rpm、１５分間）により浄化し、次に２回連続の超遠心分離により精製する。１回目は塩化セシウム勾配（密度１．４及び１．２５）で３０，０００rpm、１時間実施する。２回目は塩化セシウムクッション（密度１．３４）で３５，０００rpm、１８時間実施する。ビリオンを含む相を除去し、６０%サッカロース緩衝液中で半分に希釈する。ウイルス浮遊液は次に製剤緩衝液（１０リットルに対して：３４２３g  サッカロース；１２．１１g  Ｔｒｉｓ；２．０３３g  ＭｇＣｌ２；８７．７g  ＮａＣｌ）に対して透析し、次に分注する。それらの滴定は、異なるウイルス希釈液による２９３細胞での間接免疫蛍光法により実施し、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質（α７２Ｋ  Ｂ６−８）に特異的な抗体により標識する（Reich, Sarnow, et al., 1983）。
【０１３４】
２．アデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４の調製
このアデノウイルスによって、ＣＭＶプロモーターの制御下でポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコード化する遺伝子（配列番号１及び２）の発現が可能になる。
【０１３５】
２．１  ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコード化するヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅
これを行うために、以下のオリゴヌクレオチドを使用した：
【表１】
0005507265.tif 000002
ならびに以下の試薬：Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＰＣＲ緩衝液、１．５mM  ＭｇＣｌ2、及び１０mM  ｄＮＴＰ（Invitrogen）。ＰＣＲ条件は以下であった：
９４℃で５分間、次に
連続の３０サイクル：９４℃で４５秒間、６２℃で４５秒間、及び７２℃で１分間、次に
７２℃で１０分間
【０１３６】
２．２  トランスファープラスミドｐＴＧ１３３８７中へのＰＣＲ断片ＮＳ３／ＮＳ４の挿入
以下の工程を実施した：
−  ＮｈｅＩ／ＭｌｕＩ（Ｒｅａｃｔ  ４  Ｂｕｆｆｅｒ（Invitrogen）中のＮｈｅＩ及びＲｅａｃｔ  ３  Ｂｕｆｆｅｒ（Invitrogen）中のＭｌｕＩ）によるプラスミドｐＴＧ１３３８７（図１Ａ、Transgene）の酵素消化
−  ＮｈｅＩ／ＭｌｕＩによる断片ＮＳ３／ＮＳ４の酵素消化
−  ライゲーション（反応緩衝液（Invitrogen）中のＴ４ＤＮＡリガーゼ（Invitrogen））
−  細菌の形質転換（５Ｋ株（Transgene））
−  ＬＢ培地（Difco）＋アンピシリン（１００μg/ml、Duchefa）での細菌クローンの選択
−  制限酵素分析後の陽性クローンのプラスミドｍａｘｉ調製（Qiagen、製造業者のプロトコールによる）
−  制限酵素分析：ＳｍａＩ（Invitrogen、Ｒｅａｃｔ  ４  Ｂｕｆｆｅｒ）による消化及び断片の入手：５４５０、２１６４、９０９、２１４、及び１８０pb
−  そのＥ１領域から欠失させ、ＣＭＶプロモーターの制御下の配列ＮＳ３／ＮＳ４を含むプラスミドｐＩＶ３１５の入手（図１Ｂ）
【０１３７】
２．３  プラスミドｐＴＧ６６２４中に含まれる、そのＥ３領域から欠失された完全アデノウイルスゲノムとの相同組み換え
以下の工程を実施した：
−  ＰａｃＩ／ＰｖｕＩ（ＮＥＢ１  ｂｕｆｆｅｒ（Biolabs）中のＰａｃＩ及びＲｅａｃｔ  ７  Ｂｕｆｆｅｒ（Invitrogen）中のＰｖｕＩ）による上で得られたプラスミドｐＩＶ３１５の酵素消化；カセットｐＣＭＶ−ＮＳ３−ＮＳ４を含む断片のアガロースゲルでの単離
−  ＣｌａＩ（Ｒｅａｃｔ  １  Ｂｕｆｆｅｒ、Invitrogen）によるプラスミドｐＴＧ６６２４（図１Ｃ）の酵素消化
−  細菌の形質転換（２つのプラスミド断片の間で相同組み換えを実施するためのＢＪ株（Transgene））
−  ＬＢ培地＋アンピシリン（１００μg/ml）での細菌クローンの選択
−  制限酵素分析後の陽性クローンのプラスミドｍａｘｉ調製（Qiagen）
−  制限酵素分析：ＳｍａＩによる消化及び断片の入手：２２６３、６２１、３８１４、２１４、２１６４、９０９、１８０、２４６３、６４８０、１３９８、４４５６、１４５５、３５４０、３３８６、２３０、及び３６８５pb
−  そのＥ３及びＥ１領域から欠失させた完全アデノウイルスゲノムアデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４の入手、後者は発現カセットｐＣＭＶ−ＮＳ３−ＮＳ４（ＰＩＶ３１７、図１Ｄ）により置換されている。
【０１３８】
３．アデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂの調製
このアデノウイルスによって、ＣＭＶプロモーターの制御下でポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコード化する遺伝子の発現及びＳＶ４０プロモーターの制御下でポリペプチドＮＳ５ｂをコード化する遺伝子の発現が可能になる。
【０１３９】
３．１  アデノウイルスのＥ３領域中へのＣＭＶプロモーターの制御下のコード配列のクローニングを可能にするトランスファープラスミドの構築
以下の工程を実施した：
−  ＢｇｌＩＩ（Ｒｅａｃｔ  ３  Ｂｕｆｆｅｒ中、Invitrogen）によるプラスミドｐＴＧ４６６４（図１Ｅ、Transgene）の酵素消化
−  ＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ（Ｒｅａｃｔ  ３  Ｂｕｆｆｅｒ中、Invitrogen）によるプラスミドｐＴＧ３０７４（図１Ｆ、Transgene）の酵素消化
−  ライゲーション（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ）、細菌の形質転換（５Ｋ株）
−  ＬＢ培地＋アンピシリン（１００μg/ml）での細菌クローンの選択
−  制限酵素分析後の陽性クローンのプラスミドｍａｘｉ調製（Qiagen）
−  制限酵素分析：ＳｍａＩによる消化及び断片の入手：４９４０、１３０５、及び２３０pb
−  プラスミドｐＩＶ２６７の入手（図１Ｇ）
−  このようにして得られたプラスミドｐＩＶ２６７のＣｌａＩ／ＭｕｎＩ（Ｒｅａｃｔ  １  Ｂｕｆｆｅｒ中、Invitrogen）による消化
−  ＤＮＡ  ポリメラーゼ  Ｉ、ラージ（Ｋｌｅｎｏｗ）フラグメント（Ｒｅａｃｔ  ２  Ｂｕｆｆｅｒ中、Invitrogen）による処置
−  ライゲーション（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ）
−  細菌の形質転換（５Ｋ株）
−  ＬＢ培地＋アンピシリン（１００μg/ml）での細菌クローンの選択
−  プラスミドｍａｘｉ調製（Qiagen）
−  制限酵素分析：ＳｍａＩによる消化及び断片の入手：４６９２、１３０５、及び２３０pb
−  プラスミドｐＩＶ２７０、アデノウイルスのＥ３領域中へのＣＭＶプロモーターの制御下のコード配列のクローニングを可能にするトランスファープラスミドの入手（図１Ｈ）
【０１４０】
３．２  ｐＩＶ２７０中のＣＭＶプロモーターのＳＶ４０プロモーターによる置換
以下の工程を実施した：
−  以下のオリゴヌクレオチドを使用した、市販プラスミドｐｃＤＮＡＨｙｇｒｏ（Clonetech）からのＳＶ４０プロモーターに対応するヌクレオチド断片のＰＣＲ増幅：
【表２】
0005507265.tif 000003
６２℃の代わりに温度５８℃を使用することを除き、上のポイント２．１において記載する手順に従う。
−  ＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩ（Ｒｅａｃｔ  １０  Ｂｕｆｆｅｒ中、Invitrogen）によるｐＩＶ２７０の酵素消化
−  ＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩによるＰＣＲ断片の酵素消化
−  ライゲーション（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ）、細菌の形質転換（５Ｋ株）
−  ＬＢ培地＋アンピシリン（１００μg/ml）での細菌クローンの選択
−  制限酵素分析後の陽性クローンのプラスミドｍａｘｉ調製（Qiagen）
−  制限酵素分析：ＳｍａＩによる消化及び断片の入手：４６９２、７１９、８０、及び２３０pb
−  プラスミドｐＩＶ３３０、アデノウイルスのＥ３領域中へのＳＶ４０プロモーターの制御下のコード配列のクローニングを可能にするトランスファープラスミドの入手（図１Ｉ）
【０１４１】
３．３  トランスファープラスミドｐＩＶ３３０中へのＰＣＲ断片ＮＳ５ｂの挿入
以下の工程を実施した：
−  以下のオリゴヌクレオチドを使用したタンパク質ＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列（配列番号３及び４）のＰＣＲ増幅：
【表３】
0005507265.tif 000004
６２℃の代わりに温度６０℃を使用したことを除き、上のポイント２．１において記載する手順に従う。
−  ＸｂａＩ（Ｒｅａｃｔ  ２  Ｂｕｆｆｅｒ中、Invitrogen）による上で得られたプラスミドｐＩＶ３３０の酵素消化
−  ＸｂａＩによるＰＣＲ断片の酵素消化
−  ライゲーション（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ）、細菌の形質転換（５Ｋ株）
−  ＬＢ培地＋アンピシリン（１００μg/ml）での細菌クローンの選択
−  制限酵素分析後の陽性クローンのプラスミドｍａｘｉ調製（Qiagen）
−  制限酵素分析：ＳｍａＩによる消化及び断片の入手：４６９２、１５０５、７６０、７１９、及び２３０pb
−  プラスミドｐＩＶ３３６、Ｅ３欠失中にＳＶ４０プロモーターの制御下の配列ＮＳ５ｂを含むトランスファープラスミドの入手（図１Ｊ）
【０１４２】
３．４  表題のアデノウイルスを得るための、組み換えアデノウイルスゲノムｐＩＶ３１７との相同組み換え
以下の工程を実施した：
−  ＳｒｆＩ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｂｕｆｆｅｒ中、Stratagene）による上のポイント２．３において得られたプラスミドｐＩＶ３１７の消化
−  ＮｈｅＩ／ＳａｃＩＩ（Ｂｕｆｆｅｒ  Ｔ中、Amersham Pharmacia Biotech）によるポイント３．３において得られたプラスミドｐＩＶ３３６の消化及びカセットｐＳＶ４０
−ＮＳ５ｂを含む断片のアガロースゲルでの単離
−  ２つのプラスミド断片の間で相同組み換えを実施するための細菌の形質転換（ＢＪ株）
−  ＬＢ培地＋アンピシリン（１００μg/ml）での細菌クローンの選択
−  制限酵素分析後の陽性クローンのプラスミドｍａｘｉ調製（Qiagen）
−  制限酵素分析：ＳｍａＩによる消化及び断片の入手：６４８０、４４５６、３８１４、３５４０、３３８６、２７３９、２４６３、２２６３、２１６４、１４５５、１３９８、１１０５、９０９、７６０、７１９、６２１、２３０、２１４、及び１８０pb
−  Ｅ１領域から欠失され、後者が発現カセットｐＣＭＶ−ＮＳ３−ＮＳ４により置換されている、及び、Ｅ３領域から欠失され、後者が発現カセットｐＳＶ４０−ＮＳ５Ｂにより置換されている、所望の完全アデノウイルスゲノムの入手（プラスミドＰＩＶ３４２、図１Ｋ）。
【０１４３】
４．異なるアデノウイルス中に挿入された抗原の発現の確認
アデノウイルスＡｄＮＳ３ＮＳ４、ＡｄＮＳ５ｂ、及びＡｄＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂによりコード化されるＨＣＶ抗原の発現は、Ｈｕｈ７細胞の感染後にウェスタンブロットにより検証した。予想通り、全ての抗原が発現された。
【０１４４】
実施例２：本発明のタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及びＮＳ５ｂの発現を可能にするポックスウイルスの調製
１．ＭＶＡポックスウイルス
改変ウイルス  Ａｎｋａｒａ  ＭＶＡＴＯ  Ｎ３３株はTRANSGENE S. A.（Strasbourg, France）により供給された。
【０１４５】
２．ｐｈ５ｒプロモーターの制御下で遺伝子ＮＳ３／ＮＳ４の発現を可能にするトランスファープラスミドの調製
２．１  ＭＶＡの組み換えアームＢＲＧ２及びＢＲＤ２、ならびにプロモーターｐｈ５ｒ（ＭＶＡ）の制御下にある選択遺伝子ＧＰＴ、それに続く目的の遺伝子の発現を可能にするための第２プロモーターｐｈ５ｒを含むｐＩＶ２５０ベクターの構築
この時点で、断片ｐｈ５ｒ−ＧＰＴ−ＢＲＧ３−ｐｈ５ｒ（プラスミドｐＴＧ９９９７（Transgene）に由来する）の組み換えアームＢＲＧ２及びＢＲＤ２を含むプラスミドｐＴＧ６０１８（Transgene）への挿入が望まれる。
【０１４６】
これを行うために、以下の工程を実施した：
−  ベクターｐＴＧ６０１８（図２Ａ）のＢａｍＨＩ／ＳａｃＩ（Ｒｅａｃｔ  ２  Ｂｕｆｆｅｒ中、Invitrogen）による酵素消化
−  プラスミドｐＴＧ９９９７（図２Ｂ）のＢａｍＨＩによる酵素消化、次にＳａｃＩによる部分消化
−  ｐｈ５ｒ−ＧＰＴ−ＢＲＧ３−ｐｈ５ｒをコード化する配列を含む１０４７pbの制限酵素断片のQiagenプロトコールによる精製
−  ライゲーション（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ）、細菌の形質転換（ＴＧ１株（Statagene））
−  アンピシリン（１００μg/ml）での細菌クローンの選択
−  制限酵素分析（ＥｃｏＲＶ  ＋  ＨｉｎｄＩＩＩ  （Ｒｅａｃｔ  ２  Ｂｕｆｆｅｒ中、Invitrogen）後の陽性クローンのプラスミドｍａｘｉ調製（Qiagen）：２４６、４３９、４７６、８２６、及び２７８９  ｐｂの断片；ＳａｃＩ：９１５及び３８６１  ｐｂの断片。
−  ｐＩＶ２５０（図２Ｃ）を目的としたプラスミドの入手
【０１４７】
２．２  ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコード化するヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅
以下のオリゴヌクレオチドを使用した：
【表４】
0005507265.tif 000005
６２℃の代わりに温度５２℃を使用することを除き、実施例１、上のポイント２．１において記載する手順に従う。
【０１４８】
２．３  プラスミドｐＩＶ２５０におけるＰＣＲ  ＮＳ３−ＮＳ４断片の挿入
これを行うために、以下の工程を実施した：
−  ＰｓｔＩ（Ｒｅａｃｔ  ２  Ｂｕｆｆｅｒ中、Invitrogen）／ＸｂａＩによる上のポイント２．１で得られたプラスミドｐＩＶ２５０の酵素消化
−  ＰｓｔＩ／ＸｂａＩによるＰＣＲ断片ＮＳ３／ＮＳ４の酵素消化
−  ライゲーション（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ）、細菌の形質転換（ＴＧ１株）
−  アンピシリン（１００μg/ml）での細菌クローンの選択
−  制限酵素分析後の陽性クローンのプラスミドｍａｘｉ調製（Qiagen）：（ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｒｅａｃｔ  ２  Ｂｕｆｆｅｒ中、Invitrogen）：４７６３及び２７８９pbの断片；ＳｐｈＩ（Ｒｅａｃｔ  ６  Ｂｕｆｆｅｒ中、Invitrogen）：１５３４及び５９９１pb；ＮｃｏＩ（Ｒｅａｃｔ  ３  Ｂｕｆｆｅｒ中、Invitrogen）：２７６４及び４７６１pb）。
−  プロモーターｐｈ５ｒの制御下でポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコード化する配列を含むトランスファープラスミドの入手（ｐＩＶ３２７、図２Ｄ）
【０１４９】
３．  ｐ７．５プロモーターの制御下でタンパク質ＮＳ５ｂの発現を可能にするプラスミドｐＩＶ３２８の調製
３．１  タンパク質ＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅
以下のヌクレオチドを使用した：
【表５】
0005507265.tif 000006
６２℃の代わりに温度５２℃を使用することを除き、実施例１、上のポイント２．１において記載する手順に従う。
【０１５０】
３．２  プラスミドの入手
以下の工程を実施した：
−  ＳａｌＩ／ＳｐｈＩによるＮＳ５ｂをコード化するＰＣＲ断片の酵素消化
−  ＳａｌＩ／ＳｐｈＩによるｐＴＧ１８６（図２Ｅ、Transgene）の酵素消化
−  ベクターｐＴＧ１８６の脱リン酸化（ROCHEアルカリフォスファターゼ）
−  ライゲーション（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ）、細菌の形質転換（ＴＧ１株）
−  アンピシリン（１００μg/ml）での細菌クローンの選択
−  制限酵素分析後の陽性クローンのプラスミドｍａｘｉ調製（Qiagen）：（ＨｉｎｄＩＩＩ：１９８４、２６２７、及び４４３７pbの断片；ＢｇｌＩＩ：３２１、５５７、１３６１、１４５１、２２３７、及び３１２１pbの断片；ＫｐｎＩ（Ｒｅａｃｔ  ４  Ｂｕｆｆｅｒ中、Invitrogen）：２７８７及び６２６１pbの断片）。
−  ｐ７．５プロモーターの制御下でポリペプチドＮＳ５ｂをコード化する配列を含むトランスファープラスミドの入手（ｐＩＶ３２８、図２Ｆ）
【０１５１】
４．ｐｈ５ｒプロモーターの制御下のポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコード化する遺伝子及びｐ７．５プロモーターの制御下のポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４をコード化する遺伝子の発現を可能にするトランスファープラスミドｐＩＶ３２９及びｐＩＶ３４４の調製
これを行うために、以下の工程を実施した：
−  以下のオリゴヌクレオチドを使用した、上のポイント３．２において得られたプラスミドｐＩＶ３２８からの、タンパク質ＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列のＰＣＲ増幅：
【表６】
0005507265.tif 000007
６２℃の代わりに温度５２℃を使用することを除き、実施例１、上のポイント２．１において記載する手順に従う。
−  ＸｂａＩによるＰＣＲ断片の酵素消化
−  ＸｂａＩによる上のポイント２．３において得られたプラスミドｐＩＶ３２７の酵素消化
−  ライゲーション（Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ）、細菌の形質転換（ＴＧ１株）
−  アンピシリン（１００μg/ml）での細菌クローンの選択
−  制限酵素分析後の２つの陽性クローンのプラスミドｍａｘｉ調製（Qiagen）：（ＰｓｔＩ：ｐＩＶ３２９：３０３３及び６４６６pbの断片、ｐＩＶ３４４：４６４１及び４８５８pb；ＡｐａＩ（Ｒｅａｃｔ  ４  Ｂｕｆｆｅｒ中、Invitrogen）：ｐＩＶ３２９：４５４、９６０、及び８０８５pb、ｐＩＶ３４４：４５４、１４１８、及び７６２７pb；ＮｃｏＩ：ｐＩＶ３２９：４２６９、４６９及び４７６１pb、ｐＩＶ３４４：３０５３、１６８５、及び４７６１pb；ＳｍａＩ：ｐＩＶ３２９：２１４、２１６４、１４４４、及び５６７７pb、ｐＩＶ３４４：２１４、２１６４、９２８、及び６１９３pb）。
−  ｐｈ５ｒプロモーターの制御下のポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及びｐ７．５プロモーターの制御下のタンパク質ＮＳ５ｂの発現を可能にする、２つの発現カセットが同じ方向に向いているトランスファープラスミド（ｐＩＶ３２９、図２Ｇ）、又は、ｐｈ５ｒプロモーターの制御下のポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及びｐ７．５プロモーターの制御下のタンパク質ＮＳ５ｂの発現を可能にする、２つの発現カセットが反対の方向に向いているトランスファープラスミド（ｐＩＶ３４４、図２Ｈ）のいずれかの入手。
【０１５２】
５．異なるポックスウイルスに挿入された抗原の発現の確認
該当するポックスウイルスでのＨｕｈ７細胞の感染後、ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及びポリペプチドＮＳ５ｂをコード化する配列を含むポックスウイルスｐＩＶ３２９及びｐＩＶ３４４が該ＨＣＶ抗原を発現することを、ウェスタンブロットにより検証した。
【０１５３】
実施例３：ＮＳ３／ＮＳ４及びＮＳ５ｂの併用の免疫原性の実証
１．マウスの免疫
ＨＬＡ−Ａ２．１トランスジェニックマウスを以下のアデノウイルスから選ばれる少なくとも１つのアデノウイルスの筋肉内注射により１回免疫した：
−  上の実施例１（ポイント２．３）において調製したＡｄＮＳ３ＮＳ４、
−  上の実施例１（ポイント３．３）において調製したＡｄＮＳ５、
−  ポリペプチドＮＳ５ｂをコード化するヌクレオチド配列（配列番号５及び６）を増幅するために以下のヌクレオチドプライマーを使用したことを除き、実施例１、ポイント２の手順に従って調製したＡｄＮＳ５ａ：
【表７】
0005507265.tif 000008
ＰＣＲにおいて、温度６２℃を５６℃により置換し、ｐＴＧ１３３８７及び断片ＮＳ５ａの酵素消化をＫｐｎＩ／ＸｂａＩにより実施し、ｐＴＧ１３３８７のＳｍａＩによる消化による制限酵素分析は１８０及び７２５１pbの断片を産生し、ｐＴＧ６６２４では２２６３、６２１、５６１５、１８０、２４６３、６４８０、１３９８、４４５６、１４５５、３５４０、３３８６、２３０、及び３６８５pbの断片を産生した。
−  コアＥ１−Ｅ２ポリタンパク質（別名ＣＥ１ＣＥ２）をコード化するヌクレオチド配列（配列番号７及び８）を増幅するために以下のヌクレオチドプライマーを使用したことを除き、実施例１、ポイント２の手順に従ったＡｄＣＥ１Ｅ２：
【表８】
0005507265.tif 000009
ＰＣＲにおいて、温度６２℃を５６℃により置換し、ｐＴＧ１３３８７及び断片ＣＥ１ＣＥ２の酵素消化をＮｈｅＩ／ＸｂａＩにより実施し、ｐＴＧ１３３８７のＳｍａＩによる消化による制限酵素分析は１６３、４３５、２２７０、１８０、及び５２５４pbの断片を産生し、ｐＴＧ６６２４では２２６３、６２１、３６１８、１６３、４３５、２２７０、１８０、２４６３、６４８０、１３９８、４４５６、１４５５、３５４０、３３８６、２３０、及び３６８５pbの断片を産生した。
−  上の実施例１（ポイント３）において調製したＡｄＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂ、及び
−  ＡｄβＧａｌ（Transgene）、
以下のプロトコールに従った：
−  １０９pfuのＡｄＮＳ３ＮＳ４又は
−  １０９pfuのＡｄＮＳ５ｂ又は
−  １０９pfuのＡｄＣＥ１Ｅ２又は
−  １０９pfuのＡｄＮＳ３ＮＳ４及び１０９pfuのＡｄＮＳ５ｂ又は
−  １０９pfuのＡｄＮＳ３ＮＳ４、１０９pfuのＡｄＮＳ５ｂ、及び１０９pfuのＡｄＮＳ５ａ
−  １０９pfuのＡｄＮＳ３ＮＳ４、１０９pfuのＡｄＮＳ５ｂ、及び１０９pfuのＡｄＣＥ１Ｅ２
−  １０９pfuのＡｄＮＳ３ＮＳ４  ＮＳ５ｂ又は
−  対照として１０９pfuのＡｄβ−Ｇａｌ
【０１５４】
免疫前に、免疫のために使用した異なるアデノウイルスによるＨＣＶ及びβ−Ｇａｌ抗原の発現をウェスタンブロットにより検証した。
【０１５５】
２．ＣＴＬ及びＥＬＩＳＰＯＴ試験
注射から１５日後、細胞反応を、マウスの脾臓細胞（脾細胞）を単離することにより分析し、ＣＴＬ試験及びＥＬＩＳＰＯＴ試験を以下の通りに実施した：
【０１５６】
ＣＴＬ試験では、これらの脾細胞を以下の存在下で、２４ウェルプレートで培養した：
−  ＡｄＮＳ３ＮＳ４を受けたマウスに由来する脾細胞の場合の５μMのエピトープＧＬＬ（ＧＬＬＧＣＩＩＴＳＬ、配列番号２４）、ＡｄＮＳ５ｂを受けたマウスに由来する脾細胞の場合の５μMのエピトープＡＬＹ（ＡＬＹＤＶＶＳＴＬ、配列番号２５）又は５μMのエピトープＫＬＱ（ＫＬＱＤＣＴＭＬＶ、配列番号２６）、又はＡｄＣＥ１Ｅ２を受けたマウスに由来する脾細胞の場合の５μMのエピトープＤＬＭ（ＤＬＭＧＹＩＰＬＶ、配列番号２７）、該エピトープが合成ペプチド型（Eurogentex）であり、及び、
−  アルファ最小必須培地（αＭＥＭ）１ml当たり１０Uのマウス組み換えインターロイキン２（Brinster et al., Hepatology 2001）で５日間。５日目、再刺激工程を実施し、これは該エピトープの存在下での２日間にわたる天然マウス脾細胞の培養中の脾細胞への添加からなる。７日目、ＣＴＬ試験を実施し、これは培養７日後の免疫マウスからの脾細胞（エフェクター細胞）と、１０μMの該エピトープを負荷し、Ｃｒ５１で標識したＥＬ４  Ｓ３−Ｒｏｂ  ＨＤＤ細胞（標的細胞）を接触させることからなる。エフェクター細胞の特異的細胞傷害性は、標的細胞との４時間のインキュベーション後、γ−Ｃｏｂｒａ  ＩＩ計数装置（packard, Rungis, France）を使用して標的細胞の溶解後に放出されるＣｒ５１を測定することにより決定した。培地のみ又は溶解緩衝液（１N  ＨＣｌ）のいずれかを含むウェルからの最高自然放出量を決定した。細胞傷害性の特異的パーセンテージは、以下の式により算出した：
（試験における放出量−自然放出量）／（最高放出量−自然放出量）×１００。
エピトープ特異的溶解は、該エピトープの存在下又は非存在下で得られた特異的溶解のパーセンテージの間の差により決定した。
【０１５７】
ＥＬＩＳＰＯＴ試験は、先に抗インターフェロンガンマ抗体（ＩＦＮγ）（最終１０μg/ml）でコーティングしたマルチスクリーン９６ウェルプレート（Millipore）中で４８時間脾細胞を培養することにより実施した。脾細胞は、上に示した通りに、αＭＥＭ中で、１ml当たり１０μMの適当なエピトープ及び１０Uのマウス組み換えインターロイキン２の存在下で培養した。陽性対照では、脾細胞はコンカナバリンＡ（５μg/ml）の存在下で培養した。陰性対照では、脾細胞は、ＨＣＶのキャプシドタンパク質に属する配列ＤＬＭＧＹＩＰＬＶの非特異的ペプチド（別名、無関係ペプチド）の存在下、又は、エピトープなしの培地のみのいずれかにおいて培養した。ウェルは、０．０５%  ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ、次にＰＢＳでそれぞれ３回洗浄し、この操作の後にビオチン化マウスからの抗ＩＦＮγ抗体での２時間のインキュベーションが続く。洗浄後、ウェルをストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ抱合体と１時間インキュベートし、酵素活性はＡＥＣ（アミノエチルカルバゾール）基質の分解により発生した。得られたスポットは、Ｚｅｉｓｓ  ＥＬＩＳｐｏｔリーダー（ＫＳ−ＥＬＩＳｐｏｔソフトウェアを併用したＺｅｉｓｓ顕微鏡）を使用して計数した。
【０１５８】
結果を図３から５において示し、ここでＭはマウスに対応し、Ｍｎｅｇは対照マウスに対応する。
【０１５９】
これらの結果は以下を実証する。
−  ＡｄＮＳ３ＮＳ４は発現抗原に特異的な細胞性反応を明らかに誘導したが、ＮＳ３中に含まれるエピトープＧＬＬに特異的なＴリンパ球の検出により図３Ａ及び３Ｂにおいて説明される通りである。
−  ＡｄＮＳ５ｂは発現抗原に特異的な細胞性反応を明らかに誘導したが、ＮＳ５ｂ中に含まれるエピトープＡＬＹ及びＫＬＱに特異的なＴリンパ球の検出により図４において説明される通りである。
−  ＡｄＣＥ１Ｅ２は発現抗原に特異的な細胞性反応を明らかに誘導したが、コアタンパク質中に含まれるエピトープＤＬＭに特異的なＴリンパ球の検出により図５において説明される通りである。
【０１６０】
３．組み換えワクシニアウイルスを使用したインビボでのトライアル試験
異なるアデノウイルスにより誘導される特異的免疫反応が感染性疾患トライアルに対する防御（“インビボ防御”）を誘導できるか否かを評価するために、我々はワクチン接種マウスをそのようなトライアルに供した。
【０１６１】
マウスはＨＣＶにより直接感染できないため、特異的免疫反応の誘導と感染に対する耐性を関連付けるために、我々はＨＣＶの非構造タンパク質（ＮＳ２からＮＳ５ｂ）をコード化する組み換えワクシニアウイルス（ＷＲ株）を使用して、このトライアルを実施した。この組み換えワクシニアウイルスは、マウスにおける１０７pfuの腹腔内注射後、動物において複製する。このウイルスの複製はワクシニア抗原及びＨＣＶ抗原のいずれにも特異的免疫反応を誘導するが、それがＨＣＶのＮＳタンパク質も発現するためである。ＨＣＶ抗原に対するこの特異的反応は、一層有効で、活発であるが、マウスがＨＣＶ抗原を発現するワクチンを既に受けているためであろう。換言すると、ワクチン接種（この場合、組み換えアデノウイルスで実施される）が有効であるほど（即ち、マウスの免疫系がワクチンにより有効に“初回刺激”される）、トライアル後に組み換えワクシニアウイルスにより生成する抗ＨＣＶ反応は強くなり、結果的に、マウスはこのトライアルに対してより“防御”される。実際に、マウスにおける残留ワクシニアウイルス数が低いほど、ワクチン接種に起因する防御又は中和はより有効であった。ワクシニアウイルスの中和は、ＨＣＶタンパク質により、及び、ワクシニアウイルスにより誘導される両方の細胞反応を反映する。
【０１６２】
中和は、以下の通りに、動物の卵巣からの残留ワクシニアウイルスの滴定により評価した：卵巣を治験後４日目に除去し、超音波処理し、３回凍結融解し、次に遠心分離後、上精の連続希釈液をＨｕｔｋ−細胞上で溶解プラーク技術（Murata et al., PNAS, vol.100, p. 6753-6758）に従って滴定した。ウイルス力価は卵巣のpfu/ml/mgで決定する。
【０１６３】
４．ポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及びポリペプチドＮＳ５ｂの併用によるワクチン接種の優れた防御の実証
ワクチンの組み換えウイルス力価を、以下のアデノウイルスの組み合わせにより免疫したマウス８匹の４群について決定した：ＡｄＮＳ３ＮＳ４＋ＡｄＮＳ５ｂ（第１群）、ＡｄＮＳ３ＮＳ４＋ＡｄＮＳ５ｂ＋ＡｄＮＳ５ａ（第２群）、ＡｄＮＳ３ＮＳ４＋ＡｄＮＳ５ｂ＋ＡｄＣＥ１Ｅ２（第３群）、及びＡｄβＧａｌ（第４群）。
【０１６４】
図６に与えた結果は、ウイルコクソン・マンホイットニー・ノンパラメトリック検定（Methodes Statistiques a I'usage des medecins et des biologistes, Collection Statistique en Biologie et en Medecine, Flammarion Medecine Sciences, (D. Schwarz), 1977）に基づいて統計的に処置し、それは平均値の比較に基づき、２つの独立したサンプルｘ及びｙの値の比較を可能にする。
【０１６５】
この試験は以下の通りに実施する：比較する２群ｘ及びｙの値の全てを漸増様式で分類する。順位を次に各値に割り当て、順位和を算出する。Ｗｘ及びＷｙを次に得る。（Ｗｘ）ｔと呼ばれる参照値（ＷｘがＷｙと異ならない帰無仮説における理論値）を次に算出し、以下の比率により関連付けた：ｎ（Ｎ＋１）／２、ｎ＝ｘ群において試験したマウスの数及びＮ＝ｘ及びｙ群において試験したマウスの数。
【０１６６】
Ｗｘが（Ｗｘ）ｔ（マウスにおけるワクシニアウイルスの低残留レベル）未満である場合、ワクチン接種に起因する中和が有意に有効であると結論付けることができる。
【０１６７】
我々が、ｙと表示するＡｄβＧａｌ群と比較し、ｘと表示するＡｄＮＳ３ＮＳ４Ｓ５ｂ群の例を取る場合、我々は以下の値を得る：
Ｗｘ＝１＋２＋４＋６＋８＋１１＋１３＋１４＝５９（試験した８匹のマウス）
Ｗｙ＝３＋５＋７＋９＋１０＋１２＋１５＋１６＝７７（試験した８匹のマウス）
【０１６８】
帰無仮説の下で、ＷｘはＷｙと違わず、期待値は：（Ｗｘ）ｔ＝（１／２）＊８＊１７＝６８である。
【０１６９】
Ｗｘ＜（ＷＸ）ｒは、ＡｄＮＳ３ＮＳ４ＮＳ５ｂ群において得られる値がＡｄβＧａｌ群において得られるものより小さく、ワクチン接種に起因する中和が有意に有効であることを意味する。
【０１７０】
他のマウス群での統計値を下表１において示す：
【表９】
0005507265.tif 000010
【０１７１】
上表１の値は、アデノウイルスＮＳ３ＮＳ４及びアデノウイルスＮＳ５ｂの併用によるマウスのワクチン接種のみが、ＡｄβＧａｌによりワクチン接種した対照マウス群に関して、トライアルにおいて使用したワクシニアウイルスの複製の有意な中和を誘導できることを示す。（ＡｄＮＳ３ＮＳ４＋ＡｄＮＳ５ｂ＋ＡｄＮＳ５ａ）又は（ＡｄＮＳ３ＮＳ４＋ＡｄＮＳ５ｂ＋ＡｄＣＥ１Ｅ２）を含む組み合わせを使用して実施するワクチン接種は、ＡｄβＧａｌにより免疫した対照マウス群と比較して有意差をもたらさない。
【０１７２】
これらの結果は、従って、ポリタンパク質ＮＳ３ＮＳ４及びポリペプチドＮＳ５ｂを併用したワクチン接種の予想外に優れた防御を実証可能である。
【０１７３】
５．同じベクターにより結合させて発現させたポリタンパク質ＮＳ３ＮＳ４及びポリペプチドＮＳ５ｂを併用したワクチン接種の防御の確認
組み換えワクシニアウイルスの力価を、以下のアデノウイルスの組み合わせにより免疫したマウス８匹の３群について決定した：ＡｄＮＳ３ＮＳ４ＡｄＮＳ５ｂ（第１群）、ＡｄＮＳ３ＮＳ４＋ＡｄＮＳ５ｂ（第２群）、及びＡｄβＧａｌ（第３群）。
【０１７４】
図７に与える結果は、先の実験において記載したウイルコクソン・マンホイットニー・ノンパラメトリック検定に基づいて統計的に処置する。
【０１７５】
対照群ＡｄβＧａｌと比較した１及び２群での統計値を下表２において示す：
【表１０】
0005507265.tif 000011
【０１７６】
上表２の値は、アデノウイルスＮＳ３ＮＳ４及びアデノウイルスＮＳ５ｂの併用と同様に、３つの抗原ＮＳ３、ＮＳ４、及びＮＳ５ｂのいずれもコード化するアデノウイルスによるマウスのワクチン接種が、ＡｄｅｎｏβＧａｌによりワクチン接種した対照マウス群に関して、トライアルにおいて使用したワクシニアウイルスの複製の有意な中和を誘導できることを示す。この結果によって、同じベクターにより結合させて発現されたポリタンパク質ＮＳ３／ＮＳ４及びポリペプチドＮＳ５ｂを併用したワクチン接種の防御が確認される。
【０１７７】
実施例４：強化免疫スケジュールによって、強力で持続的な交差防御Ｔ細胞反応が誘導される
実施例２において記載する３つのウイルス抗原を発現するＭＶＡベクターワクチンの候補を、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のＣＤ８＋及びＣＤ４＋媒介性反応の刺激能について、ＨＬＡクラスＩトランスジェニックマウスモデルにおいて評価した。強化（３週間）ワクチン接種によって、２つのエフェクター機能（細胞溶解活性  −  インビトロ及びインビボでのＩＦＮ−γ産生）を持つ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞ならびに３つ全てのウイルス抗原を認識する特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が誘導された。反応は持続性（６ヶ月間）であり、４回目のＭＶＡワクチン接種により追加免疫でき、代替リステリアを用いた攻撃アッセイにおいて実証された通り、交差防御性を有する。
【０１７８】
１．序論
世界人口の約３%がＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に感染しており（Shepard et al., 2005, Lancet 5558-5567）、感染者の約８０%が慢性感染症を発症し、４%の症例において肝不全を招く。インターフェロンα（ＩＦＮα）及びリバビリンを併用した標準的処置は、処置された患者の約半数において有効であるが、しかし、相当な毒性及び費用に関連し、無視できない症例数において依然として禁忌を示す。新規治療法が開発中であり、主にウイルスプロテアーゼ又はポリメラーゼを標的とする（Dev et al., 2004, Current Gastroenterology Reports 677-686）。しかし、予備臨床データでは、これらの新しい抗ウイルス剤が、単剤治療として使用される場合には低効率を呈することが示されており、ＨＣＶ治療分野が複数の費用のかかる薬物の複雑な関連に向けて動いているのが明らかになりつつある。抗ウイルス分子候補により現在活用されるものの補完機構に依存する代替治療戦略の必要性が十分に認識されている。
【０１７９】
ヒト及びチンパンジーにおける研究によって、感染急性期中での広範な持続性のＨＣＶ特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球媒介性免疫反応の生成の失敗は、慢性化の発生と相関することが示されている（Shoukry et al., 2004, Annual Review of Microbiology, 58391-58424）。反対に、成熟した多機能エフェクターＣＤ８＋Ｔリンパ球の増大に関連する、機能的な維持されたＴｈ１  ＣＤ４＋Ｔリンパ球媒介性反応を呈する患者は、ウイルス血症のより効率的な制御を発揮し、回復に発展する傾向がある（Lauer et al., 2004, Gastroenterology 127(3), 924-936); Urbani et al., 2001, Hepatology 33, 1533-1543; Lechner et al., 2000, J. Exp. Med. 191, 499-512; Thimme et al., 2001, J. Exp. Med. 194, 1395-406; Bowen et al., 2005, Nature 436, 946-52; Cox et al., 2005, Hepatology 42, 104-112）。複数の研究によって、非構造抗原、特にＮＳ３は、自然又は治療的なウイルスクリアランスに関連する反応の優先的な標的であることが確証されている（Vertuani et al., 2002, Eur. J. Immunol. 32, 144-54; Diepolder et al., 1997, J. Virol. 71, 6011-9; Smyk-Pearson et al., 2006, J. infect. Dis. 194, 454-63）。対照的に、この分野は最近開発された新規アッセイのために急速に動いているが、感染の転帰における抗ＨＣＶ抗体の寄与には依然として議論の余地があり、これらの抗体が典型的に進行中の慢性化に直面して存在するためである（Bartosch et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 14199-204; Logvinoff et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 10149-54; Maunier et al., 2005, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102,4560-5）。
【０１８０】
過去１０年間にわたり、多種多様なＨＣＶワクチンの試みが追及されてきた。古典的なアジュバント組み換えタンパク質から樹状細胞を用いたワクチンまで、様々な製剤がマウス、マカク、及び、数例では、チンパンジーにおいて試験されてきた（Martin et al., 2006, Drug Discovery Today 3206-9）。組み換えＤＮＡ（Foms et al., 1999, Vaccines 17, 1992-2002; Rollier et al., 2004 J. Virol.78, 187-96）、組み換え細菌（Wedemeyer et al., 2001, Gastroenterology 121, 1158-66)、又はアデノウイルス(Arribillaga et al., 2002, Vaccine 21, 202-210; Folgori et al., 2006, Nature Medicine 12, 1907）など、少数のベクターを用いたワクチンしか今までに評価されていないことを観察することは印象的である。最も驚くべきことに、診療所において今まで使用されている最も安全な既知のワクチンベクターの１つ、即ち、改変非複製ワクシニアウイルスアンカラ（Ａｎｋａｒａ）株（ＭＶＡ）が、ＨＣＶワクチンの開発に向けてほとんど評価されていない。ワクシニアウイルスのこの高度弱毒化株は、天然痘の根絶のためのキャンペーンにおいて使用されており、１００，０００を超える人において安全性プロファイルが実証されている（Mayr et al., 1978, Zentralbl. Bakteriol. 167, 375-90; Mahnel et al., 1994, Bert. Muench. Tieraerztl. Wochenschr. 107, 2536）。ＨＣＶの場合において、わずか２例のＭＶＡワクチンに基づく前臨床試験が今までに報告されている：１例は、野生型又は膜標的のいずれかの免疫原として、ＨＣＶ外被糖タンパク質Ｅ１及びＥ２を発現するＭＶＡ候補について記載しており（Abraham et al., 2004, Vaccine 22, 3917-28）、他は、３つの構造タンパク質（コア、Ｅ１、及びＥ２）ならびに非構造タンパク質３を発現する２つのＭＶＡを併用したワクチンについて報告している（Rollier et al., 2004, J. Virol 78, 187-96）。しかし、ＭＶＡを用いたワクチンでの励みとなる結果が観察されており、例えば、ＨＩＶ又はマラリアのワクチン開発の分野において、ここでは多数の研究に、単剤又はプライムブースト併用のいずれかで使用されるＭＶＡワクチン候補が含まれる（Hanke et al., 1998, J. Gen. Virol; 79, 83-90; Gilbert et al., 2002, Vaccine 20, 1039-45; Prieur et al., 2004, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 290-5）。これらの研究では、ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスモデルから小型の非ヒト霊長類において実施された評価から、臨床試験まで実行されている（Hanke et al., 2007, J. Gen. Virol. 88, 1-12; Webster et al., 2005, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 4836-41）。ＨＣＶワクチン分野において試験されてきた別のポックスウイルスは、強力なＴ細胞免疫反応を誘導することが報告されているＨＣＶ組み換えカナリアポックスウイルスであるが、もっとも、この候補はＤＮＡプライム‐カナリアポックスウイルス追加免疫計画においてのみ試験されてきた（Pancholi et al., 2000, J. Infect. Dis. 182, 18-27）。その強力な免疫原性と組み合わせたＭＶＡの優れた安全性プロファイルでは、予防及び治療の両方の用途のための、強力なＨＣＶ  ＭＶＡを用いたワクチンの開発に明白に賛成して議論された。
【０１８１】
安全なポリ抗原Ｔ細胞に基づくＨＣＶワクチンを開発する目的で、我々は、ＨＣＶ非構造（ＮＳ）タンパク質ＮＳ３、ＮＳ４、及びＮＳ５Ｂをコード化する組み換えＭＶＡワクチン候補を操作し、前臨床的に評価した。我々は、本明細書において、このワクチンを使用した強化ワクチン接種スケジュールによって、３つ全てのワクチン免疫原を標的とし、自然感染中に認識されるクラスＩ  Ｔ細胞エピトープを認識するＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球媒介性反応を誘導できることを報告する。強力で特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性反応は持続性があり（最長６ヶ月間まで検出可能）、その後の時間での元のＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂでの追加免疫時に効率的にリコール（recall）できる。肝臓に感染できるＨＣＶ組み換えリステリア・モノサイトゲネスに基づく攻撃モデルを使用して、我々は、ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂでの強化ワクチン接種スケジュールがインビボでの交差防御反応をもたらすことを示す。
【０１８２】
２．材料及び方法
２．１．合成ペプチド及び組み換えタンパク質
使用する全ての合成ペプチド及び組み換えタンパク質は、遺伝子型１ｂ配列（ＨＣＶ−ＪＡ）に由来した（Kato et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9524-8）。ペプチド（Eurogentec）はＮＳ３に由来した：ＣＶＮＧＶＣＷＴＶ（ＣＶＮと呼び、ＨＣＶポリタンパク質のアミノ酸１０７３から１０８１に対応する；配列番号２８）、ＧＬＬＧＣＩＩＴＳＬ（ＧＬＬ、アミノ酸１０３８から１０４７；配列番号２４）、ＫＬＴＧＬＧＬＮＡＶ（ＫＬＴ、アミノ酸１４０６から１４１５；配列番号２９）、ＷＰＡＰＰＧＡＲＳＭ（ＷＰＡ１０、アミノ酸１１１１から１１２１：配列番号３０）、ＬＳＰＲＰＶＳＹＬＫ（ＬＳＰ１０、アミノ酸１１５２から１１６２；配列番号３１）又はＮＳ５Ｂ：ＡＬＹＤＶＶＳＴＬ（ＡＬＹ、アミノ酸２５９４から２６０２；配列番号２５）抗原。ＨＣＶ  コアに由来するペプチド：ＤＬＭＧＹＩＰＬＶ  （ＤＬＭ、アミノ酸１３２から１４０；配列番号２７）は、無関係ペプチドとして使用した。ペプチドを１００%  ＤＭＳＯ中に１０mMの濃度で溶解し、使用まで−２０℃で保存した。組み換えＮＳ３ヘリカーゼ（アミノ酸１１９２から１４５７）及びＮＳ５Ｂ（アミノ酸２４２０から２９８９）タンパク質は、社内で大腸菌において発現させ、エンドトキシンを含まず純度＞９５%で産生された。組み換えＮＳ４タンパク質はMikrogenから入手した。破傷風トキソイド（TI, Sanofi Pasteur）は無関係タンパク質として使用した。
【０１８３】
２．２．組み換えＭＶＡＮＳ３４−ＮＳ５Ｂの構築
ＭＶＡゲノムのいわゆる欠失ＩＩＩ対応部位における相同組み換えのために使用するプラスミドは、プラスミドｐＴＧＩＥに基づく（Braun et al., 2000, Gene Ther. 7, 1447-57）。欠失ＩＩＩを囲む隣接配列（ＢＲＧ３及びＢＲＤ３）は、ＭＶＡ  Ｎ３３  ＤＮＡからＰＣＲにより増幅した（Sutter and Moss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847-51）。トランスファープラスミドは、オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ遺伝子、ｐＥＧＰ−Ｃ１から単離（Clontech））及び初期／後期ワクシニアウイルス合成プロモーターｐ１１Ｋ７．５（R. Wittek, University of Lausanneより供与）の制御下にある大腸菌キサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ遺伝子）の間に融合物も含んだ。キサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼの合成によって、ＧＰＴ＋組み換えＭＶＡが、ミコフェノール酸、キサンチン、及びヒポキサンチンを含む選択培地中でプラークを形成でき、ｅＧＦＰによって組み換えＭＶＡプラークの可視化が可能になる。クローン選択が達成された場合、２つの相同配列間に同じ方向で置いた選択マーカーｅＧＦＰ−ＧＰＴを、選択なしに、数継代により除去した。ＨＣＶ遺伝子型１ｂ  ＨＣＶ−ＪＡ株からのＮＳ３ＮＳ４及びＮＳ５Ｂ遺伝子をコード化する配列をＰＣＲにより増幅した。ＮＳ３ＮＳ４遺伝子をトランスファープラスミド中のｐＨ５Ｒプロモーター（Rosel et al., 1986, J. Virol. 60 436-49）の下流に挿入し、ｐＴＧ１６６３９を生じた。ＮＳ５Ｂ遺伝子を、ｐＴＧ１６６３９中のＮＳ３ＮＳ４遺伝子と同じ方向でｐ７．５Ｋプロモーター（Cochran el al., 1985, J. Virol. 54, 30-7）の下流に挿入し、最終的なトランスファープラスミドｐＴＧ１６６４３を生じた。ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ（ＭＶＡＴＧ１６６４３）の生成は、初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）中での相同組み換えにより実施した。ｐＴＧ１６６４３は、標準的リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿法に従い、先にＭＯＩの０．１pfu／細胞でＭＶＡ  Ｎ３３に感染させたＣＥＦ上にトランスフェクトした。ウイルス選択は、ＣＥＦ上で、ミコフェノール酸、キサンチン、及びヒポキサンチンを含む選択培地の存在下における３回のプラーク精製により実施し、次に選択マーカーを非選択培地中での継代により除去した。親ＭＶＡによる汚染の非存在をＰＣＲにより検証した。
【０１８４】
２．３．インビトロでの発現研究
ＮＳ３、ＮＳ４、及びＮＳ５Ｂ抗原の発現は、ヒトＨｕｈ−７ヘパトーマ細胞のＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５８感染後の免疫蛍光及びフローサイトメトリーにより調べた。免疫蛍光分析では、ガラスカバースリップを、Ｈｕｈ−７細胞（１０6個／ウェル）をウェル中にプレーティングする前に０．２%ゼラチンで１０分間処置した６ウェルプレート中に置いた。細胞単層は、ＭＯＩの０．３３でＭＶＡベクター（ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ又は陰性対照としてＭＶＡ  Ｎ３３）に感染させた。２４時間後、カバースリップをＰＢＳ中で洗浄し、４%ＰＦＡで固定し、ＰＢＳ中０．１%Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で透過処理した。一次抗体を１時間室温で適用した（ウサギポリクローナル抗ＮＳ４Ｂ血清及びマウスモノクローナル抗ＮＳ５Ｂ抗体５Ｂ１２ｂ７、それぞれR. Bartenschlager及びD. Moradpourが供与した）。Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ  ４８８ニワトリ抗マウスＩｇＧ（Molecular Probes）及びＣｙ３抱合抗ウサギＩｇＧヒツジ（Ｆａｂ）２（Sigma）を次に３０分間添加した。カバースリップを１０μg/ml  Ｈｏｅｃｈｓｔの存在下で８０%グリセロール中に乗せ、ストライプをＣａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｌａｎ顕微鏡で観察した。画像はＡｘｉｏＣａｍ  Ｃｏｌｏｒデジタルカメラで撮った。フローサイトメトリー分析では、１ウェル当たり１０６個のＨｕｈ−７細胞を６ウェルプレート中にプレーティングし、ＭＯＩの１でＭＶＡベクターと感染させた。２４時間後、細胞を回収し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ試薬（Becton Dickinson）で１０分間固定し、ＰｅｒｍＷａｓｈ試薬（Becton Dickinson）で洗浄した。染色は、２．１０５個の細胞に３０分間室温で添加したモノクローナル抗ＮＳ３抗体８Ｄ８Ｅ１（bioMerieux）、抗ＮＳ４Ｂ抗体１Ｂ１２Ａ３（bioMerieux）、及び抗ＮＳ５Ｂ抗体５Ｂ１２ｂ７（D. Moradpourより供与）を使用して実施した。ＲＰＥ抱合ウサギ抗マウスＩｇＧ（Dako）を次に３０分間室温で添加した。細胞を１%ＦＣＳ−ＰＢＳ中に再懸濁し、ＦａｃｓＣａｌｉｂｕｒ血球計算器（Becton Dickinson）を使用してフローサイトメトリーにより分析した。
【０１８５】
２．４．マウス
市販のＢａｌｂ／ｃ（Charles River）ならびにＨ−２クラスＩノックアウトＨＬＡ−Ａ２．１及びＨＬＡ−Ｂ７．２トランスジェニックマウスを使用した。ＨＬＡ−Ａ２．１マウスはトランスジェニック単鎖組織適合性クラスＩ分子を発現したが、その中でヒトβ２ｍのＣ末端はキメラ重鎖のＮ末端（ＨＬＡ−Ａ２．１  α１−α２、Ｈ−２Ｄｂ  α３膜貫通及び細胞質内ドメイン）に共有結合する（Pascolo et al., 1997, J. Expo Med. 185, 2043-51）。ＨＬＡ−Ｂ７．２マウスは、ヒトＨＬＡ−Ｂ＊０７０２  α１−α２ドメインとマウスＨ−２Ｄｂ  α３ドメインから成るキメラＨＬＡ−Ｂ＊０７０２重鎖を発現した（Rohrlich et al., 2003, International Immunol. 15, 765-72）。マウスはＰＢＥＳ（Plateau de Biologie Experimentale de la Souris, Lyon）で適当な動物飼育施設において飼育し、動物での実験に必要とされる国際ガイドラインに従って扱った。
【０１８６】
２．５．免疫プロトコール
６から８週齢のマウス（２から６匹／群）を各実験において使用した。最初に、２つのＭＶＡ免疫スケジュールを比較した。マウスは、３週間間隔での３回の注射（スケジュール１）、又は、４回の注射、即ち１週間間隔での３回及び３週間後の４回目（スケジュール２）のいずれかで１０７pfuのＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ又はＭＶＡ  Ｎ３３での皮下（ｓｃ）注射を尾基部に受けた。１週間間隔での３回の注射を含むスケジュールを次に追加実験において選択した。リコール記憶反応の分析では、マウスは最初の免疫から６ヶ月後（２７週目）に４回目のＭＶＡ注射を受けた。
【０１８７】
２．６．ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
脾細胞（２ｘ１０５個細胞／ウェル）は、赤血球溶解緩衝液（Sigma）で処置し、陰性対照として１０U/mlのマウス組み換えＩＬ−２（Pedro-Tech EC LTD）のみ、又は、陽性対照として１０μMのペプチドもしくは２μg/mlのタンパク質もしくは５μg/mlのコンカナバリンＡを添加した完全αＭＥＭ培養液（GIBCO BRL）中で、抗マウスＩＦＮγモノクローナル抗体（Pharmingen）でコーティングしたマルチスクリーンニトロセルロース支持プレート（Millipore）において４０時間３個のウェル中で培養した。ＩＦＮγ産生細胞は、先に記載した通り、ＩＦＮγ特異的な酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ：ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ  ａｓｓａｙ）により定量した（Martin et al., 2004, J. Med. Virol. 74, 397-405）。ＣＤ４＋Ｔ細胞のポジティブ選択は、製造者の使用説明書に従い、ＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）マイクロビーズ（Myltenyi Biotech）を使用して磁気細胞分離により実施し、ポジティブ選択の効率はフローサイトメトリーにより評価し、ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージは常に８８%を上回り、ＣＤ８＋Ｔ細胞は２．１%未満であることが見出された。全画分、ＣＤ４＋画分、及び溶出画分は別々に分析した。ＩＦＮ（産生Ｔ細胞に対応する、陰性対照ウェル中で検出されたスポット数を、実験ウェル中で検出されたスポット数から引いた。結果は、３個のウェルについて得られた平均値として示す。反応は、スポット数が４０スポット／１０６個細胞よりも高い場合、陽性と見なした。
【０１８８】
２．７．細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）
ＩＣＳは、個々の動物からの脾細胞で実施した。簡単に説明すると、赤血球の溶解後、平底９６ウェルプレートの１ウェル当たり２ｘ１０６個の細胞を、陰性対照として１０U/mlのマウス組み換えＩＬ−２のみ、又は、１０μMのペプチドもしくは２μg/mlのタンパク質を添加した完全（ＭＥＭ培養液中でインキュベートした。一晩インキュベーション後、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（Becton Dickinson）を０．６７μl/mlの最終濃度で６時間加えた。細胞を次にＶ底９６ウェルプレート中に回収し、１%  ＦＣＳ−ＰＢＳで洗浄した。染色は、１%  ＦＣＳ−ＰＢＳ中のＣＤ３（ハムスターＭＡｂ抗ＣＤ３ｅ−ＰＥ）及びＣＤ８（ラットＭＡｂ抗ＣＤ８ａ−ＡＰＣ）に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）（全てBecton Dickinsonから）を室温で１５分間使用して実現した。洗浄後、細胞はＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（Becton Dickinson）で固定及び透過処理し、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ溶液で２回洗浄した。抗マウスＩＦＮ（−Ａｌｅｘａ４８８抗体（Becton Dickinson）を室温で１５分間加え、洗浄後、細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、フローサイトメトリーにより分析した。ＣＤ３ｅ＋、ＣＤ８ａ＋細胞をゲーティングし、ＩＦＮ（−サイドスキャッタードットプロット上に表し、ＩＦＮ（＋ＣＤ８＋Ｔ細胞集団のパーセンテージを決定した。
【０１８９】
２．８．インビトロ及びインビボ細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）アッセイ
インビトロＣＴＬアッセイでの条件は先に記載されている（Brinster et al., 2001, Hepatology 34, 1206-17）。簡単に説明すると、５日目の再刺激後、ＣＴＬアッセイは、エフェクターとして刺激細胞を使用して、７日目に実施した。標的細胞として、５１Ｃｒ染色ＥＬ４Ｓ３−Ｒｏｂ  ＨＨＤ細胞を、１０μMの選択ペプチドを負荷又は無負荷（陰性対照）のいずれかで使用した。自然溶解及び全溶解は、それぞれ培地のみ又は溶解緩衝液（１N  ＨＣｌ）のいずれかにおいてペプチド負荷又は無負荷の標的細胞を含むウェルから決定した。特異的な細胞傷害性は以下の式を使用して算出した：（アッセイ中の放出量−自然放出量）／（全溶解量−自然放出量）×１００。エフェクター／標的の各比率について、データは２回の結果の平均として表わした。反応は、特異的溶解のパーセンテージがＭＶＡＮ３３免疫マウスで得られたものよりも２０%高く、少なくとも１０%上回る場合、陽性と見なした。
【０１９０】
インビボＣＴＬアッセイは、微修正し、記載の通りに（Beloeil et al., 2003, J. Immunol. 171, 2995-02）実施した。簡単に説明すると、脾細胞浮遊液をシンジェニックマウスから得て、赤血球の溶解後に２０ｘ１０６個細胞/mlに調整した。細胞の半分を最終濃度１０μMのＧＬＬペプチドと共に３７℃で１時間インキュベートしたが、第２の画分は未パルスで放置した。５（６）−カルボキシフルオレセイン・ジアセテート・サクシニミジル・エステル（ＣＦＳＥ）（Molecular Probes）を次に未パルス細胞に１μM（ＣＦＳＥｌｏｗ）で、ペプチドパルス細胞に１０μM（ＣＦＳＥｈｉｇｈ）で１０分間加えた。洗浄後、両方の集団を混合し、２０ｘ１０６個の全細胞を眼窩後（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂｉｔａｌ）静脈内注射によりマウスに移した。このように、ＣＦＳＥｈｉｇｈ集団はＣＴＬにより溶解されると思われる特異的標的を表し、ＣＦＳＥｌｏｗ集団はアッセイの標準化を可能にする内部基準であった。レシピエントマウスからの脾細胞は、フローサイトメトリーにより２４時間後に分析し、ＣＦＳＥ標識標的細胞を検出した。所与のマウスにおける注射されたペプチドパルス標的と未パルス標的の間の比率（比率Ｒ＝ＣＦＳＥｈｉｇｈ細胞数／ＣＦＳＥｌｏｗ細胞数）を算出した。ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ免疫マウスとＭＶＡ  Ｎ３３免疫マウス（対照）の間での細胞溶解活性を標準化する特異的溶解のパーセンテージは、以下の式により決定した：特異的溶解の%＝［１−（Ｒ免疫／Ｒ対照）］ｘ１００%、ここでＲ対照は２匹のＭＶＡ  Ｎ３３注射マウスで得られた最高比率Ｒである。
【０１９１】
２．９．代替攻撃モデルにおける防御免疫
防御は、遺伝子型１ａ配列（ＨＣＶ−１分離株）に由来するＨＣＶ  ＮＳ３タンパク質を産生する組み換えリステリア・モノサイトゲネス株に基づく代替攻撃モデルを使用して評価した。ＴＣ−ＬＮＳ３（Simon et al., 2003, Infection and Immunity 71, 6372-80）ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ免疫マウスは、最後のＭＶＡ免疫後２週間、１００μlのＰＢＳ中の１  ＬＤ５０（ＨＬＡ−Ａ２マウスと同様のＣ５７ＢＬ６バックグラウンドを伴うマウスでは９．１０７コロニー形成単位（CFU）、Ｂａｌｂ／ｃマウスでは３．１０７CFU）のＴＣ−ＬＮＳ３での静脈内注射を受けた。陰性対照としてＭＶＡ  Ｎ３３免疫マウスを使用し、陽性対照として我々は２週間隔で１又は２回、０．０５から０．１  ＬＤ５０のＴＣ−ＬＮＳ３（免疫用量）で免疫したマウスを使用した。細菌攻撃から２日後、脾臓及び肝臓を個々のマウスから除去し、重量を量り、ホモジナイズし、ＰＢＳ／０．１%Ｔｒｉｔｏｎ中で連続希釈した。これらの希釈物をブレインハートインフュージョン寒天培地上にプレーティングした。室温で２から３日後、ＣＦＵ数を算出し、結果は、個々のマウスからの組織値のLog CFU/mgで与えた。
【０１９２】
２．１０．統計分析
ＣＴＬ反応、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ反応、及び防御効果の分析は、マンホイットニー検定を使用して実施した。
【０１９３】
３．結果
３．１．ＨＣＶ  ＮＳ３、ＮＳ４、及びＮＳ５Ｂタンパク質をコード化する単一の組み換えＭＶＡのデザイン及びインビトロ発現
ｐｈ５ｒプロモーター下のＨＣＶ  ＮＳ３ＮＳ４タンパク質及びｐ７．５プロモーター下のＮＳ５Ｂタンパク質をそれぞれコード化する２つの組み換えＭＶＡベクターをデザインした。両方の発現カセットを、同じ又は反対いずれかの方向で、ＭＶＡ骨格の欠失ＩＩＩ中にクローニングした。ウェスタンブロット分析によって、２つの発現カセットが同じ方向で挿入された場合、３つ全てのクローン化抗原の発現増強が明らかにされた（データ未掲載）。このように、同じ方向で両方の発現カセットを含むＭＶＡベクターは、ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂと呼び、さらなる研究のために選択した。インビトロでのＮＳ３、ＮＳ４、及びＮＳ５Ｂ抗原の発現は、Ｈｕｈ−７細胞のＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ感染後のフローサイトメトリー及び免疫蛍光分析により特性付けした。フローサイトメトリー分析によって、３つの抗原の明確な発現が示された（図８）。感染後の発現細胞のパーセンテージは３つのコード化抗原について同じに思われたが、平均蛍光強度（ＭＦＩ）の測定値は、恐らくはｐｈ５ｒプロモーターと比較したｐ７．５プロモーターのより低い強度のため、ＮＳ５Ｂのより弱い発現を示唆した。感染細胞の細胞質における発現抗原の共局在が、抗原の既知の特性に基づいて予測され（Penin et al., 2004, Hepatology 39, 5-19）、免疫蛍光分析において実際に確認された。
【０１９４】
３．２．ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂでの強化ワクチン接種スケジュールによって、より長い古典的なスケジュールに従って得られるものと同程度の２つのエフェクター機能を呈する特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞が誘導された
ＭＶＡを用いたワクチン接種後の免疫反応の開始は、典型的に、２−４週間離して実施される候補ワクチンの２−３回の注射後に分析されてきた（Gilbert et al., 2002, Vaccine 20, 1039-45; Vazquez-Blomquist et al., 2004, Biotechnol. Applied Biochem. 39, 313-8）。しかしながら、特異的免疫反応を実際に迅速に開始して、ベクター開発抗免疫の影響を最小限し、ならびに、治療用ワクチン接種の場合におけるウイルス負荷に及ぼすより迅速な影響及び／又は疾患の進行を有するように試みることは価値がありうる。強化スケジュール（Transgene Abstract, EUROGIN 2006）に従って投与したＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）を用いたＭＶＡで、診療所において得られた最近の非常に励みとなるデータに基づき、我々は最初に２つの異なるワクチン接種スケジュールを並べて比較することを決めた。ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスは、皮下で、１０７pfuのＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ又はＭＶＡ  Ｎ３３（陰性対照として使用する野生型ウイルス）の３週間間隔での３回注射（スケジュール１）又は１週間間隔での３回注射、それに続く３週間後の４回目の注射（スケジュール２）のいずれかを受けた。誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、各スケジュールについて２つの時間点でインビトロＣＴＬ及びＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより、スケジュール１では２回目及び３回目の注射から２週間後（６及び９週目）又はスケジュール２では３回目及び４回目の注射から２週間後（５及び８週目）のいずれかに調べた（図９）。図９Ａに示す通り、両方の注射スケジュールによって、ＮＳ３タンパク質中に位置し、自然感染中に認識されることが知られている２つのＨＬＡ−Ａ２制限エピトープ（ＧＬＬ及びＫＬＴ）に特異的なＩＦＮγ産生細胞の誘導がもたらされた（Martin et al., 2004, J. Moo. Virol. 74, 397-405; Ward et al., 2002, Clin. Exp. Immunol. 128, 195-203）。同様のスポット数が両方のスケジュールで観察された：個数の上昇がＧＬＬエピトープで観察され（１０００スポットまで）、ＨＬＡ−Ａ２マウスにおけるドミナントエピトープとしてＧＬＬを記載した観察と一致する（Martin et al., 2004, J. Med. Viral. 74, 397-405、反応はＫＬＴエピトープに対してより弱かった（２００スポットまで））。ＧＬＬ特異的な陽性細胞の頻度は、両方のスケジュールで時間と共に衰退し、最後の注射から２週間後に低くなっていることが見出されたが（スケジュール１では９週目及びスケジュール２では８週目、図９Ｂ）、観察された総スポット数は両方のスケジュールで依然として同程度であった。ＫＬＴ特異的反応は、その時に失われた（データ未掲載）。高い細胞傷害活性が、両方のスケジュールを使用して、試験した最初の時間点で、ＧＬＬペプチドに対して検出されたが（スケジュール１では６週目及びスケジュール２では５週目）（図１０Ａ）、より低いパーセンテージの特異的溶解が最後の追加免疫後に観察された（９及び８週目）（図１０Ｂ）。サブドミナントなＮＳ５Ｂ  ＡＬＹエピトープを標的とした弱いが、しかし、特異的な細胞傷害活性が、２匹のマウスでは３回の注射後（図１０Ａ）、１匹のマウスではスケジュール２後の４回の注射後に検出された（図１０Ｂ）。全体的に、これらの結果は、３週間間隔での２回の注射が、１週間間隔での３回の注射により得られた��のと同様のＮＳ３特異的な細胞傷害活性及びＩＦＮγ産生Ｔ細胞の頻度を誘導したことを示唆する。スケジュールとは独立した追加ブースター注射（スケジュール１では３回目の注射又はスケジュール２では４回目）では、これらの反応は増強されなかった。さらなる実験を、次に、“強化”免疫スケジュールと呼ばれるワクチン接種スケジュール２に基づいて実施した。
【０１９５】
３．３．ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂでの強化ワクチン接種によって、ＩＦＮγを産生し、強力なインビボでの溶解活性を呈する有意なパーセンテージのＣＤ８＋Ｔ細胞が誘導される
強化ワクチン接種スケジュールの免疫原をさらに特性付けするために、我々は、ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスにおいて、細胞内ＩＦＮγサイトカイン染色（ＩＣＳ）による誘導ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮγ産生能ならびにそれらのインビボでの細胞傷害能を調べた。３回目の注射から２週間後に実施したＩＣＳ分析（図１１Ａ）では、４匹全ての免疫動物が高いパーセンテージのＩＦＮγを産生するＧＬＬ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を呈することが示された（１．１３から２．３%の範囲、中央値パーセンテージ１．７%）。我々は、ＧＬＬペプチドでパルスしたＣＦＳＥ標識標的脾細胞を、３回目の注射から２週間後にＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ又はＭＶＡ  Ｎ３３免疫マウスに移入することにより、特異的エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞のインビボでの殺傷能力を検証した。移入後、ＧＬＬパルス標的は、２０時間アッセイにおいて、ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ免疫マウスにおいて効率的に除去されたが（図１１Ｂ、各マウスについてそれぞれ１５%、４５%、６５%、及び７８%の溶解）、ＣＴＬ活性は対照マウスにおいて検出不可能であった（未掲載）。全体的に、これらの結果によって、週１回、ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂで免疫したマウスにおいて誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＩＦＮγを産生し、インビボでの細胞溶解活性を呈するための有意な能力を獲得していることが確認される。
【０１９６】
３．４．ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂでの強化ワクチン接種は、ＨＬＡ−Ｂ７制限エピトープを標的とする反応を誘導できる
ＨＬＡ−Ｂ制限免疫反応が、ＨＩＶ及びＥＢＶについて記載されたこと（Frahm et al., 2005, J. Virol. 79, 10218-25; Kiepiela et al., 2004, Nature 432, 769-75; Bihl et al., 2006, J. Immunol. 176, 4094-101）と同様に、ＨＣＶ感染の転帰において主要な役割を果たしうることが最近報告された（Neumann-Haefelin et al., 2006, Hepatology 43, 563-72）。ＨＬＡ−Ｂ分子により制限される細胞性免疫反応をインビボで初回刺激するＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂの能力に取り組むために、ＨＬＡ−Ｂ７トランスジェニックマウスを強化スケジュール後に免疫し、ＣＤ８＋Ｔ細胞反応をＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用して調べた。図１２に示す通り、ワクチンは、ＨＣＶ感染においてこれまでに記載されたＮＳ３  ＨＬＡ−Ｂ７エピトープのみ、即ちＷＰＡ１０及びＬＳＰ１０である、２つのＨＬＡ−Ｂ７制限エピトープに特異的な有意なＩＦＮγ産生Ｔ細胞を初回刺激できた（Martin et al., 2004, J. Med. Virol. 74, 397-405）。免疫動物５匹中４匹（ＷＰＡ１０）から５匹（ＬＳＰ１０）において、ＩＦＮγ産生Ｔ細胞が、ＷＰＡ１０では高頻度で（中央値：３０５スポット／１０６個の脾細胞）、ＬＳＰ１０では弱い頻度で（中央値：１６０スポット／１０６個の脾細胞）検出された。これらの結果によって、ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂが、ＨＬＡ−Ａ２制限反応に加えて、ＨＣＶ自然感染において認識されるエピトープに特異的なＨＬＡ−Ｂ７制限反応を誘導する能力が実証される。
【０１９７】
３．５．ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂにより発現される３つ全ての免疫原に特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞反応が、強化免疫後に誘導される
ＨＣＶ感染の転帰を決定する際のＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性反応の重大な役割のため、ＨＣＶワクチン候補がそのような反応を生成する能力を持つことは明らかに重要である。我々は、投与の“強化”スケジュール後に、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞反応を誘導する能力を評価したが、そのような反応が、いずれもＣ５７Ｂ１６遺伝的バックグラウンドを呈するＨＬＡ−Ａ２又は−Ｂ７マウスにおいて検出することが困難であったためである（データ未掲載）。ＣＤ４＋Ｔ細胞反応は、ＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴによる３回目の免疫から２週間後に評価し、ＩＣＳ分析は、全脾細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞陽性画分ならびにポジティブ選択後に得られる溶出画分について実施した。図１３に示す通り、各ＮＳ３、ＮＳ４、及びＮＳ５ｂタンパク質に特異的なＩＦＮγ産生細胞は、免疫マウスから得られる精製ＣＤ４＋Ｔ細胞画分を使用して検出されたが、シグナルは対照動物においては認められなかった。ＮＳ４に特異的な弱いＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ反応も、全脾細胞画分を使用して検出された。ＩＣＳ分析は同様の結果をもたらした（データ未掲載）。全体的に、これらのデータは、ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂの週１回投与が３つ全ての発現抗原に特異的なＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導できることを明らかにする。
【０１９８】
３．６．ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂでの強化ワクチン接種後に誘導されるＣＤ８＋Ｔ細胞反応は、持続性があり、追加免疫できる
強力なワクチンに共通する重要な特性は、持続性の記憶反応を誘導するその能力である。強化ワクチン接種後に誘導されるＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ  ＣＤ８＋Ｔ細胞反応の寿命を評価するために、２工程実験を実施した。第１工程では、初回注射後１ヶ月目（５週目）、２ヶ月目（１０週目）、及び６ヶ月目（２７週目）にＣＴＬ及びＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを実施することにより反応の寿命を評価した。第２工程において、４回目のＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ注射が記憶反応をリコールする能力を、同じアッセイを使用し、初回ワクチン接種後６ヶ月目（２９週目）に実施したリコール注射から２週間後に探索した。５、１０、２７、及び２９週目に誘導したＣＴＬ反応を図１４において表す。ＧＬＬペプチドに特異的な強いＣＴＬ反応が、研究した各時間点で、低いエフェクター／標的の比率（Ｅ：Ｔ比率１１／１での中央値：５週目での溶解６８%、１０週目で７３%、２７週目で４７%）でさえ、全てのマウスにおいて検出された。４回目のＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ注射から２週間後に検出された反応は、この注射前に測定したものと依然として同様であった（Ｅ：Ｔ比率１１／１での中央値：溶解５１%）。明らかな既往反応は認められなかった。５、１０、２７、及び２９週目に誘導されるＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ反応を図１５において表す。ワクチンは、全ての注射マウスにおいて、研究した各時間点で、ＧＬＬペプチドに特異的な高頻度のＩＦＮγ産生Ｔ細胞を誘導できた（図１５Ａ）。特異的細胞の数は、５週目から１０週目の間で依然として統計的に同様であり（ｐ＞０．０５）、減少が２７週目に観察されたが（ｐ＜０．０５）、反応はその時間では依然として明確に検出可能であった（中央値：５週目で６５５スポット／１０６個の脾細胞、１０週目で５２９、２７週目で２３０）。初回注射後６ヶ月目に実施した４回目の注射は、ＩＦＮγ産生細胞の頻度の強い増強をもたらした（中央値：２９週目で１０４９スポット／１０６個の脾細胞）。加えて、ＮＳ３の２つの他のＨＬＡ−Ａ２制限ペプチド（ＣＶＮ及びＫＬＴ）に特異的なＩＦＮγ産生Ｔ細胞が、マウス４匹中２匹において２７週目に検出された（図１５Ｂ及び１５Ｃ）。弱いが、これらの反応は、４回目の注射後に非常に同程度のレベルに維持された（ＣＶＮでの中央値：２７週目で１１２スポット／１０６個の脾細胞、２９週目で１４５；ＫＬＴでの中央値：２７週目で６３スポット／１０６個の脾細胞、２９週目で１５６）。これらの結果は、ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂでの週１回のワクチン接種によって、最長６ヶ月まで検出可能な持続性のＣＴＬ及びＩＦＮγ産生Ｔ細胞が誘導されることを明らかにする。加えて、６ヶ月目に実施した４回目の免疫は、ＩＦＮγ産生Ｔ細胞の有意なリコールをもたらす。
【０１９９】
リコール注射を実施するための最適な時間スケジュールを、ＨＬＡ−Ａ２−１トランスジェニックマウスにおいてさらに評価した。動物は、１週間間隔（０、１、及び２週目）での１０７pfuのＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ又はＭＶＡＴＧＮ３３（対照群）の３回の皮下（ｓｃ）注射、及び、３回目の注射から４ヶ月後又は６ヶ月後のいずれかでの４回目の注射（リコール注射）を尾基部に受けた。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞反応は、最初の注射後の様々な時間点で、４匹のＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ注射動物（及び２匹のＭＶＡＴＧＮ３３注射動物）において評価した：４回目の注射から１ヶ月後、４ヶ月後、及び６ヶ月後ならびに２週間後。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、２．７において記載の通りに、ＮＳ３又は無関係タンパク質の存在下において培養した脾細胞で実施したＩＣＳアッセイにより分析した。反応は、ＩＦＮｇ陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージが、培地のみで得られたパーセンテージの３標準偏差よりも大きく、０．０５%を超える場合に陽性と見なした。ＣＤ８反応は、先に記載した通りに、ＩＦＮｇ  ＥＬＩＳＰＯＴ及びＣＴＬアッセイによりモニターした。
【０２００】
結果は、４ヶ月目又は６ヶ月目のいずれかの４回目の注射によってＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞反応のいずれも増強できたことを実証する。しかし、ＩＦＮγ  ＣＤ８＋Ｔ細胞反応は、リコールが４ヶ月目対６ヶ月目に実施される場合に最適であったが、ＩＦＮγ  ＣＤ４＋Ｔ細胞反応は、リコールが４ヶ月目又は６ヶ月目である場合に同等であった。
【０２０１】
３．７．ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂでの強化ワクチン接種は、代替攻撃アッセイにおいてインビボでの防御反応を誘導する
肝細胞はＨＣＶでの主な複製部位を表すため、ＨＣＶワクチンの目的の１つは、肝臓に移動できるＴ細胞を誘導し、抗原発現細胞を破壊することである。我々は、ＨＣＶ感染をある程度模倣する代替攻撃モデルを使用して、そのような所望の反応を生成するＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂワクチンの能力を調べた。攻撃剤、ＨＣＶ遺伝子型１ａ株からＮＳ３タンパク質を発現する組み換えリステリア・モノサイトゲネス（ＴＣ−ＬＮＳ３と呼ぶ（Simon et al., 2003, Infection and Immunity 71, 6372-80））を使用したが、それはこれらの細菌が肝細胞内に感染し、複製できるためである（Jiang et al., 1997, 158, 287-93）。多数の研究によって、強い抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応がＬ．モノサイトゲネス感染に対する防御のために必要であることが示されている（Simon et al., 2003, Infection and Immunity 71,6372-80; Baldridge et al., 1990, Infection and Immunity 58, 654-58）。ＨＬＡ−Ａ２トランスジェニックマウスは、強化免疫スケジュールに従って、ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ又はＭＶＡＮ３３で免疫した。２週間間隔で１又は２回、低免疫用量（０．０５から０．１  ＬＤ５０）のＴＣ−ＬＮＳ３（高攻撃用量のＴＣ−ＬＮＳ３でのさらなる感染に対してマウスを防御できる（Simon et al., 2003, Infection and Immunity 71. 6372-80）で免疫したマウス群を、陽性対照免疫マウスとして含めた。ＭＶＡワクチン接種マウスは、３回目のＭＶＡ注射から２週間後に高攻撃用量のＴＣ−ＬＮＳ３（１  ＬＤ５０）で静脈内攻撃した。陽性対照群では、攻撃は、報告された通り、低ＴＣ−ＬＮＳ３用量の２回目の注射から１週間後に実施した（Simon et al., 2003, Infection and Immunity 71, 6372-80）。攻撃から２日後、各マウスの脾臓及び肝臓中の生菌数を決定した。実験は２系統のマウス、ＨＬＡ−Ａ２及びＢａｌｂ／ｃマウスにおいて実施した。図１６Ａにおいて提示した結果は、ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ免疫マウスが、攻撃後の脾臓において、ＭＶＡ  Ｎ３３免疫マウス（５．１７Log CFU/mg）よりも有意に低い細菌負荷を呈した（中央値：３．８３Log CFU/mg，ｐ＝０．０２）ことを示す。これらのデータは、４回の独立した実験を代表する。示した実験において、細菌数は、ＭＶＡ  Ｎ３３免疫動物のそれ（５．６２Log CFU/mg）と比較して、ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ注射マウスの肝臓においても有意に減少していたが（４．５３Log CFU/ml，ｐ＝０．０２）、この臓器における減少はより低く、常に統計的に有意なわけではなく、即ち実験に左右された（データ未掲載）。ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ  Ｂａｌｂ／ｃ免疫マウスでは、ＭＶＡ  Ｎ３３免疫マウスと比較して、脾臓における細菌負荷の有意な減少は実証されなかった（中央値：２．２８対２．８９Log CFU/mg，ｐ＝０．００６）。この代表的な実験において、マウスのこの系統において典型的に観察される通り、細菌数の減少は肝臓においても認められたが、しかし、差は統計的に有意ではなかった（ｐ＞０．０５）。これらの元のデータによって、ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂの週１回の投与が、２匹の異なるマウス種においてＨＣＶ  ＮＳ３タンパク質を発現する組み換えＬ．モノサイトゲネスでのその後の攻撃に対する免疫防御を付与できる免疫反応を初回刺激できることが実証される。このモデルにおける防御機構にはエフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞が含まれることが示されているため（Baldridge et al., 1990, Infection and Immunity 58, 654-58）、これらのデータによって、我々は、ＭＶＡワクチンがそのような細胞、特に移動して動物の肝臓においてその機能を発揮する能力を呈する細胞を誘導できると結論付ける。使用した攻撃細菌は遺伝子型１ａ  ＮＳ３を含むが、ＭＶＡワクチンは遺伝子型１ｂのタンパウ質を発現しており、このように、交差防御反応はワクチンによって生成できることが実証される。
【０２０２】
４．考察
本研究において、我々は、遺伝子型１ｂのウイルス株からの３つのＨＣＶ抗原であるＮＳ３、ＮＳ４、及びＮＳ５Ｂを発現するワクチン株ＭＶＡに基づいて、ＨＣＶワクチン候補をデザインした（ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ）。様々なＨＬＡトランスジェニック又は市販マウスモデルにおいて１週間離して実施した３回の注射に基づく“強化”免疫スケジュールに従って注射し、我々は、この候補ワクチンによって、ＩＦＮγを産生し、細胞を溶解できる特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞ならびに特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞が同時に誘導されることを示す。我々は、誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞反応が持続性の反応であり、初回ワクチン接種から６ヶ月まで検出可能であり、４回目の免疫で追加免疫できることを示す。最後に、ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ誘導反応の交差防御効果が、組み換えＨＣＶ  ＮＳ３リステリア・モノサイトゲネスに基づく代替攻撃アッセイを使用して２つのマウス種において実証された。
【０２０３】
ＨＣＶワクチンのデザイン及び開発のための我々の戦略は、広範で有効な持続性のＴ細胞を用いた免疫が、自然又は治療のいずれかにより誘導される感染の好ましい転帰に関連するとの基本的な観察に基づいた（Bowen and Walker, 2005, Nature 436, 946-52）。３つの重要な要素が我々のアプローチを導いた：複数のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞制限エピトープを含むワクチン免疫原の選択、安全で効率的なベクタープラットフォームの選択、及び効率的なＴ細胞免疫を急速に開始できるワクチン接種スケジュールの選択。
【０２０４】
我々のワクチンによりコード化される３つの免疫原は、異なる基準で選択される。ＮＳ３は必須抗原として現れたが、それは、回復した感染において見出されるＨＣＶ特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞反応の全体の大きさへのその寄与が不可欠のものであると思われるためである（Diepolder et al., 1997, J. Virol.71, 6011-9; Smyk-Pearson et al., 2006, J. Infect. Dis. 194, 454-63）。少なくとも１つのワクチン研究によって、チンパンジーモデルにおけるＨＣＶウイルス血症のワクチン媒介性の抑制におけるＮＳ３特異的Ｔｈ１反応が果たす重要な役割が報告されている（Roilier et al., 2004, J. Virol. 78, 187-96）。ＮＳ３を単独免疫原として含む、ＮＳ３を用いたワクチン試験の大半（Arribillaga, 2002, Vaccine 21, 202-10; Wedemeyer et al., 2001, Gastroenterology 121, 1158-66; Jiao et al., 2003, Hepatology 37, 452-60; Wuest et al., 2004, Vaccine 22, 2717-21）とは対照的に、我々は、本レポートにおいて、２つの他の非構造タンパク質であるＮＳ４及びＮＳ５Ｂに関連してＮＳ３を発現する単一の安定な組み換えＭＶＡ（安定性が６継代まで観察された）のデザインに成功している。ＮＳ３はＮＳ４と同時発現させたが、ＮＳ４Ａの中央部分が適切なＮＳ３のフォールディングに必須であることが記録されているからである（Penin et al., 2004, Hepatology 39, 5-19）。これは維持することが重要な特性であり、我々が、そのような同時発現がＮＳ３の免疫原性にポジティブに影響することを先に示した通りである（Himoudi et al., 2002, J. Virol. 76, 12735-46）。我々の配置において、ＮＳ５Ｂは野生型抗原として、ＮＳ５Ａの非存在下で発現させた。この選択は、ＮＳ５Ａではなく、ＮＳ５Ｂが、高度に免疫原性のＨＬＡ−Ａ２制限Ｔ細胞エピトープを含むことを示す我々の過去の観察に基づいた（Himoudi et al., 2002, J. Virol. 76, 12735-46）。
【０２０５】
ＭＶＡは、様々な理由で、臨床的に使用される他のベクターから選択した。宿主ＤＮＡ中のウイルスゲノムの組み込みが不可能であるが、ワクシニアウイルスの生活環が完全に細胞の細胞質中で起こるためである（Moss, 2001, pp 2849-83 in Fields Virology 4th ed. Lippincott-Raven Press）。ＭＶＡはニワトリ胚繊維芽細胞中での５７０を超える継代により弱毒化され、そのゲノムの約１５%の喪失を招く（Meyer et al., 1991 J. Gen. Virol. 72, 1031-38）。結果的に、ＭＶＡは、ビリオン形成工程でのブロックに起因して、大半の哺乳動物細胞において成熟ビリオンの産生ができなくなり（Sutter and Moss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847-51）、それは、播種リスクの減少（Carroll and Moss, 1997, Virol. 244, 365-96）、及び、いくつかの抗免疫防御遺伝子の喪失に起因する免疫原の増大をもたらす（Sutter and Moss, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847-51）。論議を呼ぶデータが、ＭＶＡを用いたワクチンの有効性に及ぼす、既存の抗ワクシニアウイルス免疫の影響に関して報告されている（Wedemeyer et al., 2001, Gastroenterology 121, 1158-66; Ramirez et al., 2000, J. Virol. 74, 923-33; Belyakov et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96,4512-7）。しかし、既存の免疫が実際にＭＶＡワクチンの有効性に有害な影響を有する場合、これは、アデノウイルスベクターの場合に観察されるものと比較して最小限に思われる。広く臨床的に使用されるＡｄ５ベクターに対する既存の抗アデノウイルス免疫は、実際に、Ａｄ５を用いたワクチンの有効性に相当な影響を与えることが周知である（Casimoro et al., 2003, J. Virol. 77, 6305-13）。
【０２０６】
我々は、本明細書で、異なる議論に基づき、ワクチン接種の元の“強化”スケジュールを評価している。最初に、最近の非常に励みとなる臨床データが、週１回（３回）投与した治療用のＨＰＶを用いたＭＶＡワクチンで得られている。この第ＩＩ相治験では、ウイルスＥ６及びＥ７タンパク質を発現するＭＶＡでのワクチン接種から１２ヶ月後までグレード２／３の異形成を伴う女性におけるＨＰＶウイルスＲＮＡのクリアランスが報告されている（Transgene Abstract, EUROGIN 2006）。これらの新規データは、それが、治療用ワクチン開発という観点から、長期にわたりそれを開始するよりむしろ、迅速に有効な反応を開始することが重要となりうることを示唆する。ＨＣＶ  ＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂの週１回の注射後、我々は、マウスモデルにおいて、強力なＣＤ８＋Ｔ細胞反応の明瞭な開始を示し、ＨＣＶ複製の制御において役割を果たすと考えられる２つのエフェクター機能（ＩＦＮγを産生し、標的細胞を溶解する能力）を提示している。加えて、これらの反応、少なくともＩＦＮγを産生する能力が、最後の週１回の注射から６ヶ月後に追加免疫できることを観察したことは特に興味深く、持続的な免疫学的記憶状態が３回の接近したＭＶＡ免疫を含むスケジュールにより発生できることを確認している。この特性は、予防及び治療の両方のためのワクチンの開発のための重要な要素である。それは、抗ＭＶＡ免疫が“強化”ワクチン接種後に開始し、時間と共に衰退した、又は、ワクチン免疫に影響を与えるに十分な程度にはまだ開始されていなかった、のいずれかを示唆する。特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞反応と一緒に、持続性ＣＤ８＋反応を誘導する我々のワクチンの能力、及び、誘導される全反応が脾臓又は肝臓でのＨＣＶ抗原の発現を制御できるとの事実は、極めて励みになる。実際に、チンパンジーモデルにおいて実施された最近の研究では、ＮＳ３−ＮＳ４−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ抗原を発現するＡｄ５  Ｔ細胞を用いたワクチンによって、攻撃された動物５匹中４匹において非無菌性であるが、防御的な免疫を誘発できた（Folgori et al., 2006 Nature Medicine 12, 190-7）。本試験における防御は、Ｔ細胞反応の開始、特にＮＳ３及びＮＳ５抗原に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の肝臓内での存在と相関した。興味深いことに、その研究における免疫計画は、３回のアデノウイルスワクチン接種が最初に実施され、その後に３回のＤＮＡワクチン注射が続くという意味において非定型的であったが、この後者のワクチンは、明らかに、Ａｄ５ワクチン接種後に酷く弱い特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞反応の開始を改善するために加えられた。我々の観察と同様に、このＡｄ５ワクチンは、遺伝子型１交差防御反応を誘導することも示された。Folgoriら（Folgori et al., 2006 Nature Medicine 12, 190-7）及び我々の候補ワクチンのいずれもサブタイプ１ｂ配列を含み、明らかにサブタイプ１ａ決定基と交差反応する反応を誘導でき、それは、我々の研究及びFolgoriの研究において使用された攻撃株がサブタイプ１ａ配列を含むためである。この特性も非常に励ましとなるが、明らかに、追加評価を実施して、誘導される交差反応性の程度をより正確に測定する必要がある。
【０２０７】
結論として、我々は、高く、広く認識された安全性プロファイルを呈する臨床的に承認されたＭＶＡワクチンベクターに基づくＨＣＶ候補ワクチンをデザイン及び産生した。このワクチンは、強力で、持続性があり、交差防御性のＴ細胞媒介性免疫反応を開始でき、現在は第Ｉ相治験に入っている。前臨床試験によって、１週間間隔（１、２、及び３週目）でのＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂ（Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３ＮＳ４及びＮＳ５Ｂタンパク質をコード化する）の３回の皮下注射が、ＨＣＶ特異的なＩＦＮγ産生Ｔ細胞及び細胞傷害性Ｔリンパ球を誘導するための最適化プロトコールを表すことが実証される。
【０２０８】
最初の連続から３週間後のＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂのリコール注射は、ＮＳ３特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞反応を増強しなかった。
【０２０９】
しかし、最初の連続から数ヶ月後（４ヶ月目又は６ヶ月目のいずれか）に実施したリコール注射では、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞反応のいずれも増強できた。特に、ＩＦＮγ  ＣＤ８＋Ｔ細胞反応は、リコールが４ヶ月目対６ヶ月目に実施される場合に最適であったが、ＩＦＮγ  ＣＤ４＋Ｔ細胞反応は両方の場合において同等であった。
【０２１０】
ＣＤ８＋Ｔ細胞反応はＨＣＶ感染の回復のために優先的に必要になると思われるため、最適なプロトコールは１、２、及び３週目でのＭＶＡ  ＮＳ３４−ＮＳ５Ｂの３回の皮下注射、それに続く３回目の注射から約４ヶ月後の４回目の皮下注射を含む。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図１Ｋ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【配列表】
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