(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨ２〜８の条件下で式（ＸＩＸ）の試薬と接触させることを含む、式（Ｉ）のアミノ酸を含むポリペプチドの誘導体化方法：
ここで式（Ｉ）は、
【化１】
0005425398.tif 000245
（式中、
Ａはフェニレンであり、
Ｊは、
【化２】
0005425398.tif 000246
であり、
Ｒは、アルキルであり、
Ｒ１はＨ又はアミノ酸であり、
Ｒ２はＯＨ又はアミノ酸であり、
各Ｒ３及びＲ４はＨである）
で表され、
式（ＸＩＸ）は、
【化３】
0005425398.tif 000247
（式中、
Ｘはポリエチレングリコールであり、
Ｌは、任意であり、存在するときには、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−（アルキレン又は置換アルキレン）ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｏ−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり、
Ｌ１は任意であり、存在するときには、−Ｃ（Ｒ’）ｐ−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−（ｐは０、１又は２である。）であり、
Ｗは−ＯＮ（Ｒ１）２であり、ここで各Ｒ１はＨであり、
ｎは１である）
で表される。
【請求項２】
試薬が式（ＸＸＶＩＩ）で表される、請求項１の方法。
【化４】
0005425398.tif 000248
【請求項３】
誘導体化されたポリペプチドが、式（ＸＩ）の構造を有する少なくとも１個のオキシム含有アミノ酸を含む、請求項１の方法。
【化５】
0005425398.tif 000249
（式中、
Ａはフェニレンであり、
Ｒは、アルキルであり、
Ｒ１はＨ又はアミノ酸であり、及び
Ｒ２はＯＨ又はアミノ酸であり、
各Ｒ３及びＲ４はＨであり、
Ｒ５はＬ−Ｘであり、ここで
Ｘはポリエチレングリコールであり、
Ｌは任意であり、存在するときには、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーである。）
【請求項４】
ポリペプチドが、
【化６】
0005425398.tif 000250
からなる群から選択される促進剤の存在下で式（ＸＩＸ）の試薬と接触される、請求項１の方法。
【請求項５】
Ｌが存在しない、請求項１の方法。
【請求項６】
Ｒ１がＨである、請求項１の方法。
【請求項７】
ポリエチレングリコールの一方の末端がヒドロキシ基又はメトキシ基である、請求項１の方法。
【請求項８】
ポリエチレングリコールの分子量が１００Ｄａ〜１０００００Ｄａである、請求項１の方法。
【請求項９】
ポリエチレングリコールの分子量が１０００Ｄａ〜４００００Ｄａである、請求項８の方法。
【請求項１０】
ポリエチレングリコールの分子量が１００００Ｄａ〜４００００Ｄａである、請求項９の方法。
【請求項１１】
Ｌが−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−であり、各Ｒ’が独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである、請求項１の方法。
【請求項１２】
Ｌが−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−であり、Ｒ’がＨである、請求項１１の方法。
【請求項１３】
ポリエチレングリコールの一方の末端がメトキシ基である、請求項７の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
非遺伝的にコードされたアミノ酸（すなわち、「非天然アミノ酸」）をタンパク質に組み込むことが可能であると、リジンのイプシロン−ＮＨ２、システインのスルフヒドリル−ＳＨ、ヒスチジンのイミノ基などの天然の官能基に対する貴重な代替物となり得る化学官能基を導入することができる。ある種の化学官能基は、２０種類の一般的な遺伝的にコードされたアミノ酸中の官能基に対して不活性であるが、非天然アミノ酸上に組み込むことができる官能基とは容易かつ効率的に反応して安定なリンケージを形成することが知られている。
【０００２】
タンパク質中に存在せず、２０種類の一般的な遺伝的にコードされたアミノ酸中の官能基の全部に対して化学的に不活性であり、ある種の官能基を含む試薬と効率的かつ選択的に反応して安定な共有結合を形成するのに使用することができる化学官能基を選択的に導入する方法が今回利用可能になる。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、特徴付け、使用するための方法、組成物、技術及び戦略を本明細書に記載する。一態様においては、非天然アミノ酸及び／又は非天然アミノ酸ポリペプチドを誘導体化するための方法、組成物、技術及び戦略である。一実施形態においては、かかる方法、組成物、技術及び戦略は、化学誘導体化を含み、他の実施形態においては生物学的誘導体化、他の実施形態においては物理的誘導体化、他の実施形態においては誘導体化の組み合わせを含んだ。さらなる又は追加の実施形態においては、かかる誘導体化は位置選択的である。さらなる又は追加の実施形態においては、かかる誘導体化は位置特異的である。さらなる又は追加の実施形態においては、かかる誘導体化は周囲温度で迅速である。さらなる又は追加の実施形態においては、かかる誘導体化は水溶液中で起こる。さらなる又は追加の実施形態においては、かかる誘導体化はｐＨ約４から約１０で起こる。さらなる又は追加の実施形態においては、促進剤の添加によって、かかる誘導は、非天然アミノ酸含有試薬と誘導試薬の両方において、化学量論的、ほぼ化学量論的又は化学量論様（ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｉｃ−ｌｉｋｅ）である。さらなる又は追加の実施形態においては、促進剤の添加と併せて、非天然アミノ酸ポリペプチド上への所望の基の化学量論的な、ほぼ化学量論的な、又は化学量論様の組み込みを可能にする方法を提供する。さらなる又は追加の実施形態においては、促進剤の添加と併せて、非天然アミノ酸ポリペプチド上への所望の基の化学量論的な、ほぼ化学量論的な、又は化学量論様の組み込みを可能にする戦略、反応混合物、合成条件を提供する。
【０００４】
一態様においては、オキシムリンケージに基づく、ペプチド及びタンパク質の化学誘導体化用非天然アミノ酸である。さらなる又は追加の実施形態においては、非天然アミノ酸をポリペプチドに組み込む。すなわち、かかる実施形態は非天然アミノ酸ポリペプチドである。さらなる又は追加の実施形態においては、誘導分子との反応によってオキシムリンケージが生成するように、非天然アミノ酸の側鎖に官能性を持たせる。さらなる又は追加の実施形態においては、誘導分子と反応してオキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドを生成することができる非天然アミノ酸ポリペプチドである。さらなる又は追加の実施形態においては、非天然アミノ酸は、カルボニル、ジカルボニル、アセタール、ヒドロキシルアミン又はオキシム側鎖を有するアミノ酸から選択される。さらなる又は追加の実施形態においては、非天然アミノ酸は、保護された又はマスクされた、カルボニル、ジカルボニル、ヒドロキシルアミン又はオキシム側鎖を有するアミノ酸から選択される。さらなる又は追加の実施形態においては、非天然アミノ酸は、オキシムでマスクされた側鎖を含む。さらなる又は追加の実施形態においては、非天然アミノ酸は、カルボニル又はジカルボニル側鎖を含む。ここで、カルボニル又はジカルボニルは、ケトン又はアルデヒドから選択される。別の実施形態においては、適切に官能性を持たせた共反応物（ｃｏ−ｒｅａｃｔａｎｔ）で処理するとオキシムを形成することができる官能基を含む非天然アミノ酸である。さらなる又は追加の実施形態においては、非天然アミノ酸は、天然アミノ酸と構造が類似しているが、上記官能基の１個を含む。別の又はさらなる実施形態においては、非天然アミノ酸はフェニルアラニン又はチロシン（芳香族アミノ酸）に類似しているが、別の実施形態においては、非天然アミノ酸はアラニン及びロイシン（疎水性アミノ酸）に類似している。一実施形態においては、非天然アミノ酸は、天然アミノ酸の諸性質とは異なる諸性質を有する。一実施形態においては、かかる異なる諸性質は、側鎖の化学反応性である。さらなる実施形態においては、この異なる化学反応性によって、ポリペプチド中の天然アミノ酸単位の側鎖が反応を起こさない場合でも、非天然アミノ酸の側鎖は、同じポリペプチドの単位でありながら、上記反応を起こすことができる。さらなる実施形態においては、非天然アミノ酸の側鎖は、天然アミノ酸の化学的性質と直交する化学的性質を有する。さらなる実施形態においては、非天然アミノ酸の側鎖は、求電子体含有部分を含む。さらなる実施形態においては、非天然アミノ酸の側鎖上の求電子体含有部分は、求核攻撃を受けて、オキシム誘導体化タンパク質を生成することができる。この段落中の上記実施形態のいずれかにおいて、非天然アミノ酸は、別個の分子として存在することができ、又は任意の長さのポリペプチドに組み込むことができる。後者の場合には、ポリペプチドは、天然又は非天然のアミノ酸をさらに組み込むことができる。
【０００５】
別の態様においては、オキシムリンケージに基づく誘導体化非天然アミノ酸ポリペプチド生成用のヒドロキシルアミン置換分子である。さらなる実施形態においては、誘導分子とカルボニル含有又はジカルボニル含有非天然アミノ酸ポリペプチドとのオキシムリンケージの形成を介して、カルボニル含有又はジカルボニル含有非天然アミノ酸ポリペプチドを誘導体化するのに使用するヒドロキシルアミン置換分子である。さらなる実施形態においては、上記カルボニル含有又はジカルボニル含有非天然アミノ酸ポリペプチドはケト含有非天然アミノ酸ポリペプチドである。さらなる又は追加の実施形態においては、カルボニル含有又はジカルボニル含有非天然アミノ酸は、ケトン又はアルデヒドから選択される側鎖を含む。さらなる又は追加の実施形態においては、ヒドロキシルアミン置換分子は、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコール誘導体；光架橋剤；細胞傷害性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質又はポリペプチド又はポリペプチドアナログ；抗体又は抗体断片；金属キレート剤；補因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；糖類、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；フルオロフォア、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的又は非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；化学線放射によって励起可能な部分、リガンド、光異性化可能部分；ビオチン；ビオチンアナログ；重原子を組み込んだ部分；化学開裂可能な基；光開裂可能な基；長い側鎖；炭素連結糖；レドックス活性薬剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識部分；生物物理学的プローブ；リン光基；化学発光基；高電子密度基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能標識；小分子；抑制性リボ核酸、放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチン誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質（ｎａｎｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ）；放射性伝達物質（ｒａｄｉｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒ）；アブザイム、活性錯体活性化物質、ウイルス、アジュバント、アグリカン（ａｇｌｙｃａｎ）、アレルガン（ａｌｌｅｒｇａｎ）、アンギオスタチン、抗ホルモン、抗酸化剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、巨大分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｍｉｃｅｌｌｅ）及びこれらの任意の組み合わせから選択される基を含む。さらなる又は追加の実施形態においては、ヒドロキシルアミン置換分子は、ヒドロキシルアミン置換ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子である。さらなる実施形態においては、非天然アミノ酸の側鎖は、非天然アミノ酸をヒドロキシルアミン置換分子と選択的に反応させることができる、天然アミノ酸の化学的性質と直交する化学的性質を有する。さらなる実施形態においては、非天然アミノ酸の側鎖は、ヒドロキシルアミン含有分子と選択的に反応する求電子体含有部分を含む。さらなる実施形態においては、非天然アミノ酸側鎖上の求電子体含有部分は、求核攻撃を受けて、オキシム誘導体化タンパク質を生成することができる。この段落に記載の実施形態���関係するさらなる態様においては、誘導分子と非天然アミノ酸ポリペプチドとの反応によって生成する修飾非天然アミノ酸ポリペプチドである。さらなる実施形態は、すでに修飾された非天然アミノ酸ポリペプチドのさらなる任意の修飾を含む。
【０００６】
別の態様においては、オキシムリンケージに基づく誘導体化非天然アミノ酸ポリペプチド生成用のカルボニル置換又はジカルボニル置換分子である。さらなる実施形態においては、誘導分子とオキシム含有ペプチド又はタンパク質とのオキシム交換反応を介して、オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドを誘導体化するために使用するカルボニル置換又はジカルボニル置換分子である。さらなる実施形態においては、約４から約８のｐＨ範囲においてオキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドとオキシム交換を行うことができるカルボニル置換又はジカルボニル置換分子である。さらなる実施形態においては、誘導分子とオキシム含有（すなわち、交換型反応によって新しいオキシムリンケージを形成する。）又はヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドとのオキシムリンケージの形成を介して、オキシム含有又はヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドを誘導体化するために使用するカルボニル置換又はジカルボニル置換分子である。さらなる実施形態においては、カルボニル置換又はジカルボニル置換分子はアルデヒド置換分子である。さらなる実施形態においては、カルボニル置換又はジカルボニル置換分子は、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコール誘導体；光架橋剤；細胞傷害性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質又はポリペプチド又はポリペプチドアナログ；抗体又は抗体断片；金属キレート剤；補因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；糖類、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；フルオロフォア、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的又は非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；化学線放射によって励起可能な部分、リガンド、光異性化可能部分；ビオチン；ビオチンアナログ；重原子を組み込んだ部分；化学開裂可能な基；光開裂可能な基；長い側鎖；炭素連結糖；レドックス活性薬剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識部分；生物物理学的プローブ；リン光基；化学発光基；高電子密度基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能標識；小分子；抑制性リボ核酸、放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチン誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；アブザイム、活性錯体活性化物質、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルガン、アンギオスタチン、抗ホルモン、抗酸化剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、巨大分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル及びこれらの任意の組み合わせから選択される基を含む。さらなる又は追加の実施形態においては、アルデヒド置換分子は、アルデヒド置換ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子である。さらなる実施形態においては、非天然アミノ酸の側鎖は、非天然アミノ酸をカルボニル置換又はジカルボニル置換分子と選択的に反応させることができる、天然アミノ酸の化学的性質と直交する化学的性質を有する。さらなる実施形態においては、非天然アミノ酸の側鎖は、カルボニル含有又はジカルボニル含有分子と選択的に反応する部分、例えばオキシム又はヒドロキシルアミン基を含む。さらなる実施形態においては、非天然アミノ酸側鎖上の求核部分は、求電子攻撃を受けて、オキシム誘導体化タンパク質を生成することができる。この段落に記載の実施形態に関係するさらなる態様においては、誘導分子と非天然アミノ酸ポリペプチドとの反応によって生成する修飾非天然アミノ酸ポリペプチドである。さらなる実施形態は、すでに修飾された非天然アミノ酸ポリペプチドのさらなる任意の修飾を含む。
【０００７】
別の態様においては、オキシムリンケージに基づく誘導体化非天然アミノ酸ポリペプチド生成用の単官能、二官能及び多官能リンカーである。一実施形態においては、カルボニル含有又はジカルボニル含有非天然アミノ酸ポリペプチドを他の分子と連結するのに使用することができる（二官能及び多官能）分子リンカーである。別の実施形態においては、オキシム含有又はヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドを他の分子と連結するのに使用することができる（二官能及び多官能）分子リンカーである。別の実施形態においては、カルボニル含有又はジカルボニル含有非天然アミノ酸ポリペプチドはケトン及び／又はアルデヒド側鎖を含む。オキシム含有又はヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドを利用する一実施形態においては、分子リンカーは、その末端の１つにカルボニル又はジカルボニル基を含む。さらなる実施形態においては、カルボニル又はジカルボニル基はアルデヒド基又はケトン基から選択される。さらなる又は追加の実施形態においては、ヒドロキシルアミン置換リンカー分子は、ヒドロキシルアミン置換ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー分子である。さらなる又は追加の実施形態においては、カルボニル置換又はジカルボニル置換リンカー分子は、カルボニル置換又はジカルボニル置換ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー分子である。さらなる実施形態においては、「他の分子」という句は、単なる例として、タンパク質、他のポリマー及び小分子を含む。さらなる又は追加の実施形態においては、ヒドロキシルアミン含有分子リンカーは、全末端上に同じ基又は等価な基を含む。その結果、カルボニル含有又はジカルボニル含有非天然アミノ酸ポリペプチドと反応すると、得られる生成物はカルボニル含有又はジカルボニル含有非天然アミノ酸ポリペプチドのホモ多量体化である。さらなる実施形態においては、ホモ多量体化はホモ２量体化である。さらなる又は追加の実施形態においては、カルボニル含有又はジカルボニル含有分子リンカーは、全末端上に同じ基又は等価な基を含む。その結果、オキシム含有又はヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドと反応すると、得られる生成物はオキシム含有又はヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドのホモ多量体化である。さらなる実施形態においては、ホモ多量体化はホモ２量体化である。さらなる実施形態においては、非天然アミノ酸の側鎖は、非天然アミノ酸をヒドロキシルアミン置換リンカー分子と選択的に反応させることができる、天然アミノ酸の化学的性質と直交する化学的性質を有する。さらなる実施形態においては、非天然アミノ酸の側鎖は、非天然アミノ酸をカルボニル置換又はジカルボニル置換リンカー分子と選択的に反応させることができる、天然アミノ酸の化学的性質と直交する化学的性質を有する。さらなる実施形態においては、非天然アミノ酸の側鎖は、ヒドロキシルアミン含有リンカー分子と選択的に反応する求電子体含有部分を含む。さらなる実施形態においては、非天然アミノ酸側鎖上の求電子体含有部分は、ヒドロキシルアミン含有リンカー分子による求核攻撃を受けて、オキシム誘導体化タンパク質を生成することができる。この段落に記載の実施形態に関係するさらなる態様においては、リンカー分子と非天然アミノ酸ポリペプチドとの反応によって生成する連結「修飾又は非修飾」非天然アミノ酸ポリペプチドである。さらなる実施形態は、すでに連結された「修飾又は非修飾」非天然アミノ酸ポリペプチドのさらなる任意の修飾を含む。
【０００８】
一態様においては、カルボニル又はジカルボニルとヒドロキシルアミン反応物との縮合によってタンパク質を誘導体化してオキシム系生成物を生成させる方法である。カルボニル含有又はジカルボニル含有反応物とヒドロキシルアミン含有反応物との縮合に基づいてタンパク質を誘導体化してオキシム誘導体化タンパク質付加体を生成させる方法もこの態様に含まれる。追加の又はさらなる実施形態においては、ヒドロキシルアミン官能性を持たせたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を用いてケト含有タンパク質を誘導体化する方法である。さらに追加の又はさらなる態様においては、カルボニル含有又はジカルボニル含有誘導分子とオキシム含有ペプチド又はタンパク質とのオキシム交換反応によってオキシム含有タンパク質を誘導体化する方法である。さらに追加の又はさらなる態様においては、ヒドロキシルアミン置換分子は、タンパク質、他のポリマー及び小分子を含むことができる。
【０００９】
別の態様においては、ケト置換タンパク質の誘導体化用ヒドロキシルアミン置換分子の化学合成方法である。別の態様においては、アルデヒド置換タンパク質の誘導体化用ヒドロキシルアミン置換分子の化学合成方法である。一実施形態においては、ヒドロキシルアミン置換分子は、ペプチド、他の（非分枝及び分枝）ポリマー及び小分子を含むことができる。一実施形態においては、単なる例としてケト含有非天然アミノ酸ポリペプチドを含めて、カルボニル含有又はジカルボニル含有非天然アミノ酸ポリペプチドの誘導体化に適切なヒドロキシルアミン置換分子の調製方法である。さらなる又は追加の実施形態においては、非天然アミノ酸は、タンパク質のインビボ翻訳中に部位特異的に組み込まれる。さらなる又は追加の実施形態においては、ヒドロキシルアミン置換分子は、カルボニル又はジカルボニル基の求核攻撃によって、このカルボニル含有又はジカルボニル含有非天然アミノ酸を部位特異的に誘導体化して、オキシム誘導体化ポリペプチドを部位特異的に形成することができる。さらなる又は追加の実施形態においては、ヒドロキシルアミン置換分子の調製方法によって、部位特異的に誘導体化された多種多様なポリペプチドを得ることができる。さらなる又は追加の実施形態においては、ヒドロキシルアミン官能性を持たせたポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を合成する方法である。
【００１０】
別の態様においては、オキシム置換非天然アミノ酸ポリペプチドの誘導体化用カルボニル置換又はジカルボニル置換分子を化学合成する方法である。一実施形態においては、カルボニル置換又はジカルボニル置換分子はケト置換分子である。一実施形態においては、カルボニル置換又はジカルボニル置換分子はアルデヒド置換分子である。別の実施形態においては、カルボニル置換又はジカルボニル置換分子は、タンパク質、（非分枝及び分枝）ポリマー及び小分子を含む。さらなる又は追加の実施形態においては、かかる方法は、タンパク質のインビボ翻訳中に非天然アミノ酸を部位特異的に組み込むことができる技術を補完するものである。さらなる又は追加の実施形態においては、オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドとの反応によって、部位特異的に誘導体化された非天然アミノ酸ポリペプチドを生成するのに適切なカルボニル置換又はジカルボニル置換分子の一般的調製方法である。さらなる又は追加の実施形態においては、カルボニル置換又はジカルボニル置換ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を合成する方法である。
【００１１】
別の態様においては、ヒドロキシルアミン含有二官能リンカーを用いた、カルボニル置換又はジカルボニル置換非天然アミノ酸ポリペプチドの化学誘導体化方法である。一実施形態においては、縮合反応によってヒドロキシルアミン置換リンカーをカルボニル置換又はジカルボニル置換タンパク質と連結させてオキシムリンケージを生成する方法である。さらなる又は追加の実施形態においては、カルボニル置換又はジカルボニル置換非天然アミノ酸はケト置換非天然アミノ酸である。さらなる又は追加の実施形態においては、非天然アミノ酸ポリペプチドは、ヒドロキシルアミン含有二官能リンカーを用いて、部位特異的に、及び／又は３次元構造を正確に制御して、誘導体化される。一実施形態においては、かかる方法を用いて、（単官能  二官能及び多官能リンカーを含めて、但しこれらだけに限定されない）分子リンカーを（ケト含有及びアルデヒド含有を含めて、但しこれらだけに限定されない）カルボニル含有又はジカルボニル含有非天然アミノ酸ポリペプチドと連結する。ここで、リンカー末端の少なくとも１個は、オキシムリンケージを介してカルボニル含有又はジカルボニル含有非天然アミノ酸ポリペプチドと結合することができるヒドロキシルアミン基を含む。さらなる又は追加の実施形態においては、これらのリンカーを用いて、カルボニル含有又はジカルボニル含有非天然アミノ酸ポリペプチドを、例としてタンパク質、他の（分枝及び非分枝）ポリマー及び小分子を含めた、他の分子と連結する。
【００１２】
一部の実施形態においては、非天然アミノ酸ポリペプチドは水溶性ポリマーと連結されている。一部の実施形態においては、水溶性ポリマーはポリエチレングリコール部分を含む。一部の実施形態においては、ポリエチレングリコール分子は二官能ポリマーである。一部の実施形態においては、二官能ポリマーは第２のポリペプチドと連結されている。一部の実施形態においては、第２のポリペプチドは第１のポリペプチドと同一であり、他の実施形態においては、第２のポリペプチドは異なるポリペプチドである。一部の実施形態においては、非天然アミノ酸ポリペプチドは、ポリ（エチレングリコール）部分を含む水溶性ポリマーと連結された少なくとも２個のアミノ酸を含む。
【００１３】
一部の実施形態においては、非天然アミノ酸ポリペプチドは、受容体に対する非天然アミノ酸ポリペプチドの親和性を増加させる置換、付加又は欠失を含む。一部の実施形態においては、非天然アミノ酸ポリペプチドは、非天然アミノ酸ポリペプチドの安定性を増加させる置換、付加又は欠失を含む。一部の実施形態においては、非天然アミノ酸ポリペプチドは、非天然アミノ酸ポリペプチドの水溶性を増加させる置換、付加又は欠失を含む。一部の実施形態においては、非天然アミノ酸ポリペプチドは、宿主細胞中で産生される非天然アミノ酸ポリペプチドの溶解性を増加させる置換、付加又は欠失を含む。一部の実施形態においては、非天然アミノ酸ポリペプチドは、置換、付加又は欠失のないアミノ酸ポリペプチドと比較して、プロテアーゼ耐性、血清半減期、免疫原性及び／又は発現を変える置換、付加又は欠失を含む。
【００１４】
一部の実施形態においては、非天然アミノ酸ポリペプチドは、作動物質、部分作動物質、拮抗物質、部分拮抗物質又は逆作動物質である。一部の実施形態においては、作動物質、部分作動物質、拮抗物質、部分拮抗物質又は逆作動物質は、水溶性ポリマーと連結された非天然アミノ酸を含む。一部の実施形態においては、水ポリマー（ｗａｔｅｒ  ｐｏｌｙｍｅｒ）はポリエチレングリコール部分を含む。一部の実施形態においては、例えば水溶性ポリマーと連結された非天然アミノ酸を含むポリペプチドは、対応する受容体の２量体化を防止し得る。一部の実施形態においては、水溶性ポリマーと連結された非天然アミノ酸を含むポリペプチドは、結合パートナー、リガンド又は受容体とのポリペプチドの結合を変化させる。一部の実施形態においては、水溶性ポリマーと連結された非天然アミノ酸を含むポリペプチドは、ポリペプチドの１つ以上の性質又は活性を変化させる。
【００１５】
一部の実施形態においては、選択コドンは、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン（ｕｎｉｑｕｅ  ｃｏｄｏｎ）、レアコドン、異常コドン、５塩基コドン及び４塩基コドンからなる群から選択される。
【００１６】
水溶性ポリマーと連結された非天然アミノ酸ポリペプチドを製造する方法も本明細書に記載する。一部の実施形態においては、この方法は、非天然アミノ酸を含む単離ポリペプチドを、非天然アミノ酸と反応する部分を含む水溶性ポリマーと接触させることを含む。一部の実施形態においては、組み込まれた非天然アミノ酸は、２０種類の一般的アミノ酸のいずれに対しても非反応性である水溶性ポリマーに対して反応性である。一部の実施形態においては、水ポリマーはポリエチレングリコール部分を含む。水溶性ポリマーの分子量は、これだけに限定されないが、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａ以上の広範囲とすることができる。水溶性ポリマーの分子量は、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ及び１００Ｄａを含めて、但しこれらだけに限定されない約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａであり得る。一部の実施形態においては、水溶性ポリマーの分子量は約１００Ｄａから５０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、水溶性ポリマーの分子量は約１００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、水溶性ポリマーの分子量は約１，０００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、水溶性ポリマーの分子量は約５，０００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、水溶性ポリマーの分子量は約１０，０００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、ポリエチレングリコール分子は分枝ポリマーである。分枝鎖ＰＥＧの分子量は、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ及び１，０００Ｄａを含めて、但しこれらだけに限定されない約１，０００Ｄａから約１００，０００Ｄａであり得る。一部の実施形態においては、分枝鎖ＰＥＧの分子量は約１，０００Ｄａから５０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、分枝鎖ＰＥＧの分子量は約１，０００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、分枝鎖ＰＥＧの分子量は約５，０００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、分枝鎖ＰＥＧの分子量は約５，０００Ｄａから２０，０００Ｄａである。
【００１７】
本明細書に記載の非天然アミノ酸の少なくとも１個を含むポリペプチドと薬剤として許容される担体とを含む組成物も本明細書に記載する。一部の実施形態においては、非天然アミノ酸は水溶性ポリマーと連結されている。薬剤として許容される担体と、少なくとも１個のアミノ酸が非天然アミノ酸で置換されているポリペプチドとを含む薬剤組成物も本明細書に記載する。一部の実施形態においては、非天然アミノ酸は糖質部分を含む。一部の実施形態においては、水溶性ポリマーは、糖質部分を介してポリペプチドと連結されている。非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドのプロドラッグも本明細書に記載する。かかるプロドラッグと薬剤として許容される担体とを含む組成物もさらに本明細書に記載する。非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドの代謝産物も本明細書に記載する。かかる代謝産物は、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドの活性を補完する、又はその活性と相乗作用を示す、所望の活性を有することができる。かかる代謝産物を必要とする患者を含めて、生物に所望の代謝産物を提供するための本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドの使用も本明細書に記載する。
【００１８】
選択コドンを含む、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞も本明細書に記載する。一部の実施形態においては、細胞は、非天然アミノ酸をポリペプチドに代入する直交（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）ＲＮＡシンセターゼ及び／又は直交ｔＲＮＡを含む。一部の実施形態においては、細胞は、細胞培養物中に存在するのに対して、他の実施形態においては、両生類、は虫類、トリ及び哺乳動物を含めて、多細胞生物の一部の細胞である。細胞の実施形態のいずれかにおいては、さらなる実施形態は、非天然アミノ酸ポリペプチドを産生するポリヌクレオチドの発現を含む。他の実施形態においては、本明細書に記載の非天然アミノ酸を利用して、修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを含めて、非天然アミノ酸ポリペプチドを産生することができる生物である。他の実施形態においては、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び／又は修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを含む生物である。かかる生物としては、両生類、は虫類、トリ及び哺乳動物を含めて、単細胞及び多細胞生物が挙げられる。一部の実施形態においては、非天然アミノ酸ポリペプチドはインビトロで産生される。一部の実施形態においては、非天然アミノ酸ポリペプチドは細胞溶解物中で産生される。一部の実施形態においては、非天然アミノ酸ポリペプチドはリボソーム翻訳によって産生される。
【００１９】
非天然アミノ酸を含むポリペプチドを製造する方法も本明細書に記載する。一部の実施形態においては、この方法は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、直交ＲＮＡシンセターゼ及び／又は直交ｔＲＮＡを含む細胞を、ポリペプチドの発現が可能な条件下で培養すること、並びに細胞及び／又は培地からポリペプチドを精製することを含む。
【００２０】
本明細書に記載の非天然アミノ酸のライブラリー、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドのライブラリー、本明細書に記載の修飾非天然アミノ酸ポリペプチドのライブラリー又はその組み合わせライブラリーも本明細書に記載する。少なくとも１個の非天然アミノ酸、少なくとも１個の非天然アミノ酸ポリペプチド及び／又は少なくとも１個の修飾非天然アミノ酸を含むアレイも本明細書に記載する。選択コドンを含む、ポリペプチドをコードする少なくとも１個のポリヌクレオチドを含むアレイも本明細書に記載する。本明細書に記載のアレイは、（ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写を検出することによって、又はポリペプチドの翻訳を検出することによって）非天然アミノ酸ポリペプチドが生物中で産生されるかどうかをスクリーニングするのに使用することができる。
【００２１】
本明細書に記載のライブラリーを所望の活性についてスクリーニングする方法、又は本明細書に記載のアレイを使用して本明細書に記載のライブラリーをスクリーニングする方法、又は化合物及び／又はポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドの他のライブラリーを所望の活性についてスクリーニングする方法も本明細書に記載する。新しい治療薬を開発及び発見するための、ライブラリースクリーニングから得られるかかる活性データの使用、並びに治療薬自体も本明細書に記載する。
【００２２】
ポリペプチドの治療上の半減期、血清半減期又は循環時間を延長する方法も本明細書に記載する。一部の実施形態においては、この方法は、天然ポリペプチド中の１個以上の任意のアミノ酸を少なくとも１個の非天然アミノ酸で置換すること及び／又はポリペプチドを水溶性ポリマーとカップリングさせることを含む。
【００２３】
非天然アミノ酸を含むポリペプチドと薬剤として許容される担体とを含む薬剤組成物の有効量を用いて、かかる治療を必要とする患者を治療する方法も本明細書に記載する。一部の実施形態においては、非天然アミノ酸は水溶性ポリマーとカップリングされている。
【００２４】
さらなる又は代替の実施形態においては、障害、症状又は疾患を治療する方法である。この方法は、オキシム含有非天然アミノ酸、カルボニル含有非天然アミノ酸、ジカルボニル含有非天然アミノ酸及びヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸からなる群から選択される少なくとも１個の非天然アミノ酸を含む非天然アミノ酸ポリペプチドの治療有効量を投与することを含む。他の実施形態においては、かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載のポリペプチドに生合成的に組み込まれている。さらなる又は代替の実施形態においては、かかる非天然アミノ酸ポリペプチドは、式Ｉ−ＸＶＩＩＩ、ＸＸＸ−ＸＸＸＩＶ（Ａ＆Ｂ）又はＸＸＸＸ−ＸＸＸＸＩＩＩのアミノ酸から選択される少なくとも１個の非天然アミノ酸を含む。
【００２５】
さらなる又は代替の実施形態においては、障害、症状又は疾患を治療する方法である。この方法は、少なくとも１個のオキシム含有非天然アミノ酸を含む非天然アミノ酸ポリペプチドの治療有効量を投与することを含む。生成する生合成オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、相同の天然アミノ酸ポリペプチドと比較して、ポリペプチドの生物学的利用能を増大させる。
【００２６】
さらなる又は代替の実施形態においては、障害、症状又は疾患を治療する方法である。この方法は、少なくとも１個のオキシム含有非天然アミノ酸を含む非天然アミノ酸ポリペプチドの治療有効量を投与することを含む。生成する生合成オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、相同の天然アミノ酸ポリペプチドと比較して、ポリペプチドの安全性プロファイルを増大させる。
【００２７】
さらなる又は代替の実施形態においては、障害、症状又は疾患を治療する方法である。この方法は、少なくとも１個のオキシム含有非天然アミノ酸を含む非天然アミノ酸ポリペプチドの治療有効量を投与することを含む。生成する生合成オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、相同の天然アミノ酸ポリペプチドと比較して、ポリペプチドの水溶性を増大させる。
【００２８】
さらなる又は代替の実施形態においては、障害、症状又は疾患を治療する方法である。この方法は、少なくとも１個のオキシム含有非天然アミノ酸を含む非天然アミノ酸ポリペプチドの治療有効量を投与することを含む。生成する生合成オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、相同の天然アミノ酸ポリペプチドと比較して、ポリペプチドの治療上の半減期を延長する。
【００２９】
さらなる又は代替の実施形態においては、障害、症状又は疾患を治療する方法である。この方法は、少なくとも１個のオキシム含有非天然アミノ酸を含む非天然アミノ酸ポリペプチドの治療有効量を投与することを含む。生成する生合成オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、相同の天然アミノ酸ポリペプチドと比較して、ポリペプチドの血清半減期を延長する。
【００３０】
さらなる又は代替の実施形態においては、障害、症状又は疾患を治療する方法である。この方法は、少なくとも１個のオキシム含有非天然アミノ酸を含む非天然アミノ酸ポリペプチドの治療有効量を投与することを含む。生成する生合成オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、相同の天然アミノ酸ポリペプチドと比較して、ポリペプチドの循環時間を延長する。
【００３１】
さらなる又は代替の実施形態においては、障害、症状又は疾患を治療する方法である。この方法は、少なくとも１個のオキシム含有非天然アミノ酸を含む非天然アミノ酸ポリペプチドの治療有効量を投与することを含む。生成する生合成オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、相同の天然アミノ酸ポリペプチドと比較して、ポリペプチドの生物活性を変化させる。
【００３２】
さらなる又は代替の実施形態においては、障害、症状又は疾患を治療する方法である。この方法は、少なくとも１個のオキシム含有非天然アミノ酸を含む非天然アミノ酸ポリペプチドの治療有効量を投与することを含む。生成する生合成オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、相同の天然アミノ酸ポリペプチドと比較して、ポリペプチドの免疫原性を変化させる。
【００３３】
本明細書の方法及び組成物は、本明細書に記載の特定の方法、プロトコル、細胞系、構築体及び試薬に限定されず、したがって変動し得ることを理解されたい。本明細書において使用する用語は、特定の実施形態を記述するためのものにすぎず、本明細書の方法及び組成物の範囲を限定するものではなく、本明細書の方法及び組成物の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されたい。
【００３４】
本明細書及び添付の特許請求の範囲では、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に明示しない限り、複数形を含む。
【００３５】
特に断らない限り、本明細書で使用する全ての技術用語及び科学用語は、本明細書に記載する発明が属する分野の当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似した、又は等価なあらゆる方法、装置及び材料を本明細書に記載する発明の実施又は試験に使用することができるが、好ましい方法、装置及び材料を以下に記載する。
【００３６】
本明細書に記載する発明に関連して使用し得る、例えば、刊行物に記載の構築体及び方法を記述及び開示する目的で、本明細書に挙げる全ての刊行物及び特許を参照によりその全体を本明細書に組みこむ。本明細書で考察する刊行物は、本願の出願日前の開示目的のためだけに提供される。本明細書に記載の本発明者らが、先行発明の効力によって、又は任意の他の理由のために、かかる開示に先行する権利がないことを認めるものと解釈すべきではない。
【００３７】
本明細書では「親和性標識」という用語は、別の分子に可逆的又は不可逆的に結合し、該分子を改変する、破壊する、又は該分子と化合物を形成する、標識を指す。親和性標識の例としては、酵素とその基質又は抗体とその抗原が挙げられる。
【００３８】
「アルコキシ」、「アルキルアミノ」及び「アルキルチオ」という用語は、その従来の意味で使用され、それぞれ酸素原子、アミノ基、硫黄原子を介して分子と結合しているアルキル基を指す。
【００３９】
「アルキル」という用語は、それ自体で、又は別の分子の一部として、別段の記載がないかぎり、指定の炭素原子数を有し（すなわちＣ１−Ｃ１０は１から１０個の炭素を意味する。）、完全飽和、一不飽和又は多価不飽和であり得、２価及び多価の基を含み得る、直鎖、分枝鎖若しくは環式の炭化水素基又はそれらの組み合わせを意味する。飽和炭化水素基の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、その同族体及び異性体、例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルなどの基が挙げられるが、これらだけに限定されない。不飽和アルキル基は、１個以上の二重結合又は三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例としては、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−及び３−プロピニル、３−ブチニル並びに高級同族体及び異性体が挙げられるが、これらだけに限定されない。「アルキル」という用語は、他に断らない限り、「ヘテロアルキル」、「ハロアルキル」、「ホモアルキル」などの本明細書にさらに詳細に定義するアルキル誘導体も含むものとする。
【００４０】
「アルキレン」という用語は、（−ＣＨ２−）ｎ（式中、ｎは１から約２４とすることができる。）によって例示されるように、それ自体で、又は別の分子の一部として、アルカンから誘導される二価の基を意味する。単なる例として、かかる基としては、構造体−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−などの１０個以下の炭素原子を有する基が挙げられるが、これらだけに限定されない。「低級アルキル」又は「低級アルキレン」は、一般に８個以下の炭素原子を有する短鎖アルキル又はアルキレン基である。「アルキレン」という用語は、他に断らない限り、「ヘテロアルキレン」として本明細書に記載する基も含むものとする。
【００４１】
「アミノ酸」という用語は、天然及び非天然アミノ酸並びに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物を指す。天然にコードされたアミノ酸は、２０種類の一般的アミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリン）並びにピロリジン（ｐｙｒｏｌｙｓｉｎｅ）及びセレノシステインである。アミノ酸類似体とは、天然アミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、単なる例として、水素、カルボキシル基、アミノ基及びＲ基と結合したα−炭素を有する化合物を指す。かかる類似体は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持しつつ、修飾Ｒ基を有することができ（例としてノルロイシン）、又は修飾ペプチド骨格を有することができる。アミノ酸類似体の非限定的例としては、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムが挙げられる。
【００４２】
アミノ酸は、その名称、その一般に知られている３文字記号によって、又はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される１文字記号によって、本明細書では表記することができる。さらに、ヌクレオチドは、一般に容認されている単一文字コードによって表記することができる。
【００４３】
「アミノ末端修飾基」とは、末端アミン基に結合することができる任意の分子を指す。例として、かかる末端アミン基は重合体分子の末端に存在し得る。かかる重合体分子としては、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、多糖などが挙げられるが、これらだけに限定されない。末端修飾基としては、種々の水溶性ポリマー、ペプチド、タンパク質などが挙げられるが、これらだけに限定されない。単なる例として、末端修飾基としては、ポリエチレングリコール又は血清アルブミンが挙げられる。末端修飾基を使用して、ペプチドの血清半減期の延長を含めて、但しこれだけに限定されない、重合体分子の治療上の特性を改変することができる。
【００４４】
「抗体断片」とは、完全長型以外の任意の抗体型を意味する。本明細書の抗体断片としては、完全長抗体内に存在する、より小さな成分である抗体、操作された抗体などが挙げられる。抗体断片としては、Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆａｂ及び（Ｆａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、三重特異性抗体、四重特異性抗体、二官能ハイブリッド抗体、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲの組み合わせ、可変領域、枠組み領域、定常領域、重鎖、軽鎖及び可変領域、及び代替のスキャフォールド非抗体（ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｎｏｎ−ａｎｔｉｂｏｄｙ）分子、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）などが挙げられるが、これらだけに限定されない（Ｍａｙｎａｒｄ  ＆  Ｇｅｏｒｇｉｏｕ，  ２０００，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．  ２：３３９−７６；  Ｈｕｄｓｏｎ，  １９９８，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ９：３９５−４０２）。別の機能的部分構造（ｓｕｂｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）は、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域を含みペプチドリンカーが共有結合した単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である（Ｓ−ｚ  Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ５６，  ３０５５−３０６１）。これらの小さな（Ｍｒ  ２５，０００）タンパク質は、一般に単一ポリペプチド中の抗原に対して特異性及び親和性を保持し、より大きな抗原特異的分子に対して好都合な構成要素となり得る。特に断らない限り、「抗体」という用語を使用する記載及び特許請求の範囲は、「抗体断片」を明確に含む。
【００４５】
本明細書では「芳香族」又は「アリール」という用語は、共役π電子系を有する少なくとも１個の環を含む閉環構造を指し、炭素環式アリール基と複素環式アリール（又は「ヘテロアリール」又は「複素環式芳香族」）基の両方を含む。炭素環式又は複素環式芳香族基は、５から２０個の環原子を含むことができる。この用語は、共有結合した単環式環又は縮合多環式（すなわち、隣接する炭素原子対を共有する環）基を含む。芳香族基は、非置換でも、置換されていてもよい。「芳香族」又は「アリール」基の非限定的例としては、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、アントラセニル及びフェナントラセニルが挙げられる。上記アリール環構造及びヘテロアリール環構造の各々に対する置換基は、本明細書に記載の許容される置換基の群から選択される。
【００４６】
簡略のため、（アリールオキシ、アリールチオキシ、アラルキルを含めて、但しこれらだけに限定されない）他の用語と組み合わせて使用するときの「芳香族」又は「アリール」という用語は、上記アリール環とヘテロアリール環の両方を含む。したがって、「アラルキル」又は「アルカリール」という用語は、アリール基が、（メチレン基を含めて、但しこれだけに限定されない）炭素原子がヘテロ原子で、すなわち、単なる例として酸素原子で、置換されたアルキル基を含めたアルキル基と結合した基（ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなどを含め、但しこれらだけに限定されない。）を含むものとする。かかるアリール基の例としては、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００４７】
本明細書では「アリーレン」という用語は、二価のアリール基を指す。「アリーレン」の非限定的例としては、フェニレン、ピリジニレン、ピリミジニレン及びチオフェニレンが挙げられる。アリーレン基の置換基は、本明細書に記載の許容される置換基の群から選択される。
【００４８】
「二官能リンカー」とも称する「二官能ポリマー」とは、他の部分と特異的に反応して、共有結合又は非共有結合を形成することができる２個の官能基を含むポリマーを指す。かかる部分としては、天然又は非天然のアミノ酸の側基、かかる天然又は非天然アミノ酸を含むペプチドの側基などが挙げられるが、これらだけに限定されない。単なる例として、二官能リンカーは、第１のペプチド上の基と反応性である官能基と、第２のペプチド上の基と反応性である別の官能基とを有し、それによって第１のペプチドと、二官能リンカーと、第２のペプチドとを含む複合物を形成し得る。種々の化合物をペプチドと連結する多数の手順及びリンカー分子が公知である。例えば、欧州特許出願第１８８，２５６号、米国特許第４，６７１，９５８号、同４，６５９，８３９号、同４，４１４，１４８号、同４，６９９，７８４号、同４，６８０，３３８号及び同４，５６９，７８９号を参照されたい。これらを参照によりその全体を本明細書に組みこむ。「多官能リンカー」とも称する「多官能ポリマー」とは、他の部分と反応することができる２個以上の官能基を含むポリマーを指す。かかる部分としては、共有結合又は非共有結合を形成する（アミノ酸側基を含めて、但しこれだけに限定されない）、天然又は非天然のアミノ酸の側基、かかる天然又は非天然アミノ酸を含むペプチドの側基などが挙げられるが、これらだけに限定されない。二官能ポリマー又は多官能ポリマーは、任意の所望の長さ又は分子量とすることができ、化合物に結合した１個以上の分子と、二官能ポリマー若しくは多官能ポリマーが結合した分子、又は化合物との、特定の所望の空間的配置又は高次構造をもたらすように選択することができる。
【００４９】
本明細書では「生物学的利用能」という用語は、物質又はその活性部分が薬剤剤形から送達され、作用部位又は全身循環において利用可能となる、速度及び程度を指す。生物学的利用能の増大は、物質又はその活性部分が薬剤剤形から送達され、作用部位又は全身循環において利用可能となる、速度及び程度の増加を意味する。例として、生物学的利用能の増大は、他の物質又は活性部分と比較して、血中の物質又はその活性部分の濃度増加として示され得る。生物学的利用能の増大を評価する方法の非限定的例を実施例８８−９２に示す。この方法は、あらゆるポリペプチドの生物学的利用能の評価に使用することができる。
【００５０】
本明細書において使用する「生物活性分子」、「生物活性部分」又は「生物活性剤」という用語は、生物系の任意の物理的又は生化学的性質、ウイルス、細菌、バクテリオファージ、トランスポゾン、プリオン、昆虫、真菌、植物、動物及びヒトを含めて、但しこれらだけに限定されない生物に関係する経路、分子又は相互作用に影響を及ぼし得る任意の物質を意味する。特に、本明細書では、生物活性分子としては、ヒト又は他の動物における疾患の診断、治癒、緩和、処置又は予防用の任意の物質、ヒト又は動物の身体的又は精神的な幸福を向上させる任意の物質などが挙げられるが、これらだけに限定されない。生物活性分子の例としては、ペプチド、タンパク質、酵素、小分子薬物、強い薬物、弱い薬物、炭水化物、無機原子又は分子、色素、脂質、ヌクレオシド、放射性核種、オリゴヌクレオチド、毒素、細胞、ウイルス、リポソーム、微粒子及びミセルが挙げられるが、これらだけに限定されない。本明細書の方法及び組成物と併用するのに適切である生物活性剤のクラスとしては、薬物、プロドラッグ、放射性核種、造影剤、ポリマー、抗生物質、殺真菌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗腫よう剤、心血管作動薬、抗不安薬、ホルモン、成長因子、ステロイド剤、微生物由来の毒素などが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００５１】
「生物活性を変化させる」とは、ポリペプチドの反応性の増減、ポリペプチドの選択性の変化、ポリペプチドの基質選択性の増減を意味する。生物活性の変化は、非天然ポリペプチドの生物活性を天然ポリペプチドの生物活性と比較することによって分析することができる。
【００５２】
本明細書では「生体材料」という用語は、バイオリアクター及び／又は組換え方法及び技術から得られる材料を含めて、但しこれらだけに限定されない、生物由来の材料を指す。
【００５３】
本明細書では「生物物理学的プローブ」という用語は、分子の構造変化を検出又はモニターすることができるプローブを指す。かかる分子としては、タンパク質が挙げられるが、これだけに限定されない。「生物物理学的プローブ」を使用して、タンパク質と他の巨大分子との相互作用を検出又はモニターすることができる。生物物理学的プローブの例としては、スピン標識、フルオロフォア及び光活性化可能な基が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００５４】
本明細書では「生合成的に」という用語は、以下の成分、すなわち、ポリヌクレオチド、コドン、ｔＲＮＡ及びリボソームの少なくとも１種類の使用を含めて、（細胞又は非細胞の）翻訳系を利用する任意の方法を指す。例として、非天然アミノ酸は、セクションＶＩＩＩ「非天然アミノ酸を含むポリペプチドのインビボ産生」及び非限定的実施例１４の方法及び技術によって、非天然アミノ酸ポリペプチドに「生合成的に組み込む」ことができる。さらに、非天然アミノ酸ポリペプチドに「生合成的に組み込む」ことができる有用な非天然アミノ酸の選択方法を非限定的実施例１５−１６に記載する。
【００５５】
本明細書では「ビオチン模倣物」とも称する「ビオチンアナログ」という用語は、アビジン及び／又はストレプトアビジンに高親和性で結合する、ビオチン以外の任意の分子である。
【００５６】
本明細書では「カルボニル」という用語は、少なくとも１個のケトン基及び／又は少なくとも１個のアルデヒド基及び／又は少なくとも１個のエステル基及び／又は少なくとも１個のカルボン酸基及び／又は少なくとも１個のチオエステル基を含む基を含めて、但しこれらだけに限定されない、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−及び−Ｃ（Ｓ）−からなる群から選択される部分を含む基を指す。かかるカルボニル基としては、ケトン、アルデヒド、カルボン酸、エステル、チオエステルなどが挙げられる。また、かかる基は、線状、分枝又は環式分子の一部であり得る。
【００５７】
「カルボキシ末端修飾基」という用語は、末端カルボキシ基に結合することができる任意の分子を指す。例として、かかる末端カルボキシ基は重合体分子の末端に存在し得る。かかる重合体分子としては、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、多糖などが挙げられるが、これらだけに限定されない。末端修飾基としては、種々の水溶性ポリマー、ペプチド、タンパク質などが挙げられるが、これらだけに限定されない。単なる例として、末端修飾基としては、ポリエチレングリコール又は血清アルブミンが挙げられる。末端修飾基は、ペプチドの血清半減期の延長を含めて、但しこれだけに限定されない、重合体分子の治療上の特性を改変するのに使用することができる。
【００５８】
本明細書では「化学的に不安定な」とも表される「化学開裂可能な基」という用語は、酸、塩基、酸化剤、還元剤、化学開始剤又はラジカル開始剤に曝されると破断又は開裂する基を指す。
【００５９】
本明細書では「化学発光基」という用語は、熱を加えずに、化学反応の結果として発光する基を指す。単なる例として、ルミノール（５−アミノ−２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン）は、塩基及び金属触媒の存在下で過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）のような酸化剤と反応して、励起状態の生成物（３−アミノフタレート、３−ＡＰＡ）を生成する。
【００６０】
本明細書では「発色団」という用語は、可視波長、ＵＶ波長又はＩＲ波長の光を吸収する分子を指す。
【００６１】
本明細書では「補因子」という用語は、大分子の作用に必須である原子又は分子を指す。補因子としては、無機イオン、補酵素、タンパク質、酵素活性に必要な他の因子などが挙げられるが、これらだけに限定されない。例としては、ヘモグロビン中のヘム、葉緑素中のマグネシウム及びタンパク質用金属イオンが挙げられる。
【００６２】
本明細書では「共同的折り畳み（ｃｏｆｏｌｄｉｎｇ）」は、相互作用する少なくとも２個の分子を使用して、折り畳まれていない分子又は不適当に折り畳まれた分子を適切に折り畳まれた分子に転換する、再折り畳みプロセス、反応又は方法を指す。単なる例として、「共同的折り畳み」は、相互作用し、折り畳まれていないポリペプチド又は不適当に折り畳まれたポリペプチドを自然の適切に折り畳まれたポリペプチドに転換する、少なくとも２個のポリペプチドを使用する。かかるポリペプチドは、天然アミノ酸及び／又は少なくとも１個の非天然アミノ酸を含み得る。
【００６３】
本明細書では「比較窓」は、ある配列と、同じ数の隣接位置の基準配列とを最適に整列させた後に、２つの配列を比較するのに使用する隣接位置のいずれか１つのセグメントを指す。かかる隣接位置としては、約５０から約２００個の配列単位及び約１００から約１５０個の配列単位を含めて、約２０から約６００個の配列単位からなる基などが挙げられるが、これらだけに限定されない。単なる例として、かかる配列としては、ポリペプチド及び非天然アミノ酸を含むポリペプチドが挙げられる。配列単位としては、天然及び非天然のアミノ酸などが挙げられるが、これらだけに限定されない。また、単なる例として、かかる配列としては、ヌクレオチドが対応する配列単位である、ポリヌクレオチドが挙げられる。比較のための配列のアラインメント方法は当分野で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、これらだけに限定されないが、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９７０）  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２ｃの局所的相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似度検索（ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ処理（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）によって、又は手操作によるアラインメント及び目視検査（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５  補足）を参照されたい。）によって、実施することができる。
【００６４】
例として、配列同一性割合及び配列類似度を求めるのに使用することができるアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムである。これらは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３８９−３４０２及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０にそれぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実施するソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公的に利用可能である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ及びＸによって、アラインメントの感度及び速度が決まる。（ヌクレオチド配列用）ＢＬＡＳＴＮプログラムは、初期設定として、語長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）又は１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両方の鎖の比較を用いる。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、初期設定として、語長３、期待値（Ｅ）１０及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：１０９１５参照）アラインメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４及び両方の鎖の比較を用いる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、典型的には、「低複雑度」フィルターを解除して実施される。
【００６５】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似度の統計解析も実施する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７を参照されたい。）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似度の一尺度は、最小合計確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ  ｓｕｍ  ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））である。これは、２つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列が偶然に一致する確率の指標を与えるものである。例えば、試験核酸と基準核酸の比較における最小合計確率が約０．２未満、約０．０１未満又は約０．００１未満である場合には、試験核酸は基準配列に類似していると見なされる。
【００６６】
「保存的に改変された変異体」という用語は、天然及び非天然アミノ酸、天然及び非天然核酸配列並びにこれらの組み合わせに適用される。特定の核酸配列に関して、「保存的に改変された変異体」とは、同一若しくは本質的に同一な天然及び非天然アミノ酸配列をコードする天然及び非天然核酸を指し、又は天然及び非天然核酸が天然及び非天然アミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列を指す。例として、遺伝コードの縮重のために、機能上同一な多数の核酸が任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＣＵは全てアミノ酸のアラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンによって指定される全ての位置において、コドンは、コードされたポリペプチドを変えずに、その対応するコドンのいずれかに変更することができる。かかる核酸変異は、保存的に改変された変異の一種である「サイレントな変異」である。したがって、例として、天然又は非天然ポリペプチドをコードする本明細書の全ての天然又は非天然核酸配列は、天然又は非天然核酸の可能なサイレントな全ての変異も表す。天然又は非天然核酸中の（通常はメチオニンの唯一のコドンであるＡＵＧ及び通常はトリプトファンの唯一のコドンであるＴＧＧを除く）各コドンは、機能上同一な分子を得るために改変できることを当業者は理解されたい。したがって、天然及び非天然ポリペプチドをコードする天然及び非天然核酸のサイレントな各変異は、記述する各配列に潜在的に含まれる。
【００６７】
アミノ酸配列に関して、コードされた配列中の単一の天然及び非天然アミノ酸又はわずかの天然及び非天然アミノ酸を変化、付加又は欠失させる、核酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質配列の個々の置換、欠失又は付加は、「保存的に改変された変異体」である。変化は、アミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、又は化学的に類似したアミノ酸による天然及び非天然アミノ酸の置換をもたらす。機能上類似した天然アミノ酸を与える保存的置換の表は当分野で周知である。かかる保存的に改変された変異体は、本明細書の方法及び組成物の多形変異体、種間ホモログ及び対立遺伝子に追加され、除外されない。以下の８つのグループは、互いに保存的置換であるアミノ酸を各々含む。
【００６８】
１）  アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、
２）  アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、
３）  アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、
４）  アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、
５）  イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、
６）  フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、
７）  セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）及び
８）  システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  （Ｗ  Ｈ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．；  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ  （Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １９９３）を参照されたい。
【００６９】
「シクロアルキル」及び「ヘテロシクロアルキル」という用語は、それ自体で、又は他の用語と組み合わせて、別段の記載がないかぎり、それぞれ環式「アルキル」及び環式「ヘテロアルキル」を表す。したがって、シクロアルキル又はヘテロシクロアルキルは、飽和、部分不飽和及び完全不飽和環リンケージを含む。さらに、ヘテロシクロアルキルの場合には、ヘテロ原子は、複素環が分子の残部に結合した位置を占めることができる。ヘテロ原子としては、酸素、窒素、硫黄などが挙げられるが、これらだけに限定されない。シクロアルキルの例としては、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、シクロヘプチルなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。ヘテロシクロアルキルの例としては、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。さらに、この用語は、二環式及び三環式の環構造を含めて、但しこれらだけに限定されない多環構造を包含する。同様に、「ヘテロシクロアルキレン」という用語は、それ自体で、又は別の分子の一部として、ヘテロシクロアルキルから誘導される二価の基を意味する。「シクロアルキレン」という用語は、それ自体で、又は別の分子の一部として、シクロアルキルから誘導される二価の基を意味する。
【００７０】
本明細書では「シクロデキストリン」という用語は、環形成体（ｒｉｎｇ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）中の少なくとも６から８個のグルコース分子からなる環式炭水化物を指す。環の外側部分は水溶性基を含み、環の中央は、小分子を収容することができる比較的非極性の空洞である。
【００７１】
本明細書では「細胞傷害性」という用語は、細胞を害する化合物を指す。
【００７２】
本明細書では「変性薬」又は「変性剤」は、ポリマーの可逆的なアンフォールディングを引き起こす任意の化合物又は材料を指す。単なる例として、「変性薬」又は「変性剤」は、タンパク質の可逆的なアンフォールディングを引き起こし得る。変性薬又は変性剤の強度は、特定の変性薬又は変性剤の諸性質と濃度の両方によって決まる。例として、変性薬又は変性剤としては、カオトロープ、洗浄剤、有機水溶性溶媒、リン脂質又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらだけに限定されない。カオトロープの非限定的例としては、尿素、グアニジン及びチオシアン酸ナトリウムが挙げられるが、これらだけに限定されない。洗浄剤の非限定的例としては、ドデシル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンエーテル（例えばＴｗｅｅｎ又はＴｒｉｔｏｎ洗浄剤）などの強い洗浄剤、サルコシル、弱い非イオン洗浄剤（例えば、ジギトニン）、Ｎ−＞２，３−（ジオレイオキシ）−プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムなどの弱い陽イオン洗剤、弱イオン洗浄剤（例えばコール酸ナトリウム又はデオキシコール酸ナトリウム）又はスルホベタイン（両性洗浄剤）、３−（３−クロロアミドプロピル（ｃｈｌｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ））ジメチルアンモニオ−１−プロパンスルファート（ＣＨＡＰＳ）及び３−（３−クロロアミドプロピル）ジメチルアンモニオ−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホナート（ＣＨＡＰＳＯ）を含めて、但しこれらだけに限定されない双性イオン洗浄剤などが挙げられるが、これらだけに限定されない。有機水溶性溶媒の非限定的例としては、アセトニトリル、低級アルカノール（特にエタノール、イソプロパノールなどのＣ２−Ｃ４アルカノール）などが挙げられるが、これらだけに限定されない。又は低級アルカンジオール（エチレングリコールなどのＣ２−Ｃ４アルカンジオール）を変性剤として使用することができる。リン脂質の非限定的例としては、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトールなどの天然リン脂質又はジヘキサノイルホスファチジルコリン、ジヘプタノイルホスファチジルコリンなどの合成リン脂質誘導体若しくは変異体が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００７３】
本明細書では「検出可能標識」という用語は、蛍光、化学発光、電子スピン共鳴、紫外／可視吸光度分光法（ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、質量分析法、核磁気共鳴、磁気共鳴及び電気化学的方法を含めて、但しこれらだけに限定されない分析技術によって観察可能である標識を指す。
【００７４】
本明細書では「ジカルボニル」という用語は、１，２−ジカルボニル基、１，３−ジカルボニル基及び１，４−ジカルボニル基並びに少なくとも１個のケトン基及び／又は少なくとも１個のアルデヒド基及び／又は少なくとも１個のエステル基及び／又は少なくとも１個のカルボン酸基及び／又は少なくとも１個のチオエステル基を含む基を含めて、但しこれらだけに限定されない、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−及び−Ｃ（Ｓ）−からなる群から選択される少なくとも２個の部分を含む基を指す。かかるジカルボニル基としては、ジケトン、ケトアルデヒド、ケト酸、ケトエステル、ケトチオエステルなどが挙げられる。また、かかる基は、線状、分枝又は環式分子の一部であり得る。ジカルボニル基中の２個の部分は、同じでも異なっていてもよく、２個の部分のどちらかにおいて、単なる例として、エステル、ケトン、アルデヒド、チオエステル又はアミドを生成する置換基を含み得る。
【００７５】
本明細書では「薬物」という用語は、疾患又は症状の予防、診断、軽減、処置又は治癒に使用する任意の物質を指す。
【００７６】
本明細書では「色素」という用語は、発色団を含む可溶な着色物質を指す。
【００７７】
本明細書では「有効量」という用語は、治療する疾患又は症状の症候の１つ以上をある程度軽減する、投与薬剤又は化合物の十分な量を指す。その結果、疾患の徴候、症候若しくは原因が軽減及び／又は緩和され、又は生物系の任意の他の所望の変化が起こり得る。例として、投与する薬剤又は化合物としては、天然アミノ酸ポリペプチド、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾天然アミノ酸ポリペプチド又は修飾非アミノ酸ポリペプチドが挙げられるが、これらだけに限定されない。かかる天然アミノ酸ポリペプチド、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾天然アミノ酸ポリペプチド又は修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを含む組成物は、予防処置、増強（ｅｎｈａｎｃｉｎｇ）処置及び／又は治療処置のために投与することができる。個々の症例に適切な「有効」量は、用量漸増試験などの技術によって決定することができる。
【００７８】
本明細書では「高電子密度基」という用語は、電子ビームを照射すると電子を散乱する基を指す。かかる基としては、モリブデン酸アンモニウム、次硝酸ビスマス  ヨウ化カドミウム、９９％、カルボヒドラジド、塩化鉄（ＩＩＩ）六水和物、ヘキサメチレンテトラミン、９８．５％、無水三塩化インジウム、硝酸ランタン、酢酸鉛三水和物、クエン酸鉛三水和物、硝酸鉛、過ヨウ素酸、ホスホモリブデン酸、ホスホタングステン酸、フェリシアン化カリウム、フェロシアン化カリウム、ルテニウムレッド、硝酸銀、銀タンパク化合物（Ａｇ含有率：８．０−８．５％）「強」、銀テトラフェニルポルフィン（Ｓ−ＴＰＰＳ）、塩化金酸ナトリウム、タングステン酸ナトリウム、硝酸タリウム、チオセミカルバジド（ＴＳＣ）、酢酸ウラニル、硝酸ウラニル、硫酸バナジルなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００７９】
本明細書では「エネルギー伝達剤」という用語は、別の分子にエネルギーを供与することができる、又は別の分子からエネルギーを受容することができる、分子を指す。単なる例として、蛍光共鳴エネルギー伝達（ＦＲＥＴ）は、蛍光ドナー分子の励起状態エネルギーが、基底状態の受容体分子に無放射で移動し、次いで、供与されたエネルギーがより長波長において蛍光発光される、双極子−双極子カップリングプロセスである。
【００８０】
「増強」又は「増強すること」という用語は、所望の効果を効力又は期間において増加又は延長することを意味する。例として、治療薬の効果を「増強すること」とは、疾患、障害又は症状の処置中に対する治療薬の効果を、効力又は期間において、増加又は延長させる能力を指す。本明細書では「増強有効量」とは、疾患、障害又は症状の処置において治療薬の効果を増強するのに十分な量を指す。患者に使用するときに、この使用に有効な量は、疾患、障害又は症状の重症度及び経過、前治療、患者の健康状態及び薬物応答性並びに処置を行う医師の判断に応じて決まる。
【００８１】
本明細書では「真核生物」という用語は、（哺乳動物、昆虫、は虫類、トリなどを含めて、但しこれらだけに限定されない）動物、繊毛虫類、（単子葉植物、双子葉植物及び藻類を含めて、但しこれらだけに限定されない）植物、真菌、酵母、鞭毛虫、微胞子虫及び原生生物を含めて、但しこれらだけに限定されない系統学的真核生物ドメインに属する生物を指す。
【００８２】
本明細書では「脂肪酸」という用語は、約Ｃ６以上の炭化水素側鎖を有するカルボン酸を指す。
【００８３】
本明細書では「フルオロフォア」という用語は、励起されると光子を放出し、それによって蛍光を発する分子を指す。
【００８４】
本明細書では「官能基」、「活性部分」、「活性化基」、「脱離基」、「反応部位」、「化学反応基」及び「化学反応部分」という用語は、分子の化学反応が起こる部分又は単位を指す。この用語は、化学技術においてある程度同義であり、ある機能又は活性を果たし、他の分子と反応性である、分子の部分を表すのに本明細書では使用する。
【００８５】
「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、ヨウ素及び臭素を含む。
【００８６】
本明細書では「ハロアシル」という用語は、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３などを含めて、但しこれらだけに限定されないハロゲン部分を含むアシル基を指す。
【００８７】
本明細書では「ハロアルキル」という用語は、−ＣＦ３、−ＣＨ２ＣＦ３などを含めて、但しこれらだけに限定されないハロゲン部分を含むアルキル基を指す。
【００８８】
本明細書では「ヘテロアルキル」という用語は、アルキル基と、Ｏ、Ｎ、Ｓｉ及びＳからなる群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子とからなる、直鎖、分枝鎖、環状炭化水素基又はこれらの組み合わせを指す。ここで、窒素及び硫黄原子は酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は四級化されていてもよい。ヘテロ原子Ｏ、Ｎ及びＳ及びＳｉは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置又はアルキル基が分子の残部に結合する位置に存在し得る。例としては、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２，−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３及び−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が挙げられるが、これらだけに限定されない。また、例として、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３、−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３など２個までのヘテロ原子が連続することができる。
【００８９】
本明細書では「ヘテロアルキレン」という用語は、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−など、但しこれらだけに限定されない、ヘテロアルキルから誘導される二価の基を指す。（アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ、アミノオキシアルキレンなどを含めて、但しこれらだけに限定されない）ヘテロアルキレン基の場合には、同じ又は異なるヘテロ原子が鎖末端の一方又は両方を占めることもできる。さらに、アルキレン及びヘテロアルキレン連結基の場合、連結基の向きは、連結基の式を記述する方向とは無関係である。例として、式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−は、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−と−Ｒ’Ｃ（Ｏ）２−の両方を表す。
【００９０】
本明細書では「ヘテロアリール」又は「複素環式芳香族」という用語は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含むアリール基を指す。ここで、窒素及び硫黄原子は酸化されていてもよく、窒素原子は四級化されていてもよい。ヘテロアリール基は、置換されていても、非置換でもよい。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介して分子の残部に結合し得る。ヘテロアリール基の非限定的例としては、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンゾイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル及び６−キノリルが挙げられる。
【００９１】
本明細書では「ホモアルキル」という用語は、炭化水素基であるアルキル基を指す。
【００９２】
本明細書では「同一の」という用語は、同じである２つ以上の配列又は部分配列を指す。また、本明細書では「実質的に同一」という用語は、比較アルゴリズムを用いて測定して、又は手操作によるアラインメント及び目視検査によって測定して、比較窓又は指定領域にわたって比較し、最大一致で整列したときに、同じである配列単位のある割合を有する２つ以上の配列を指す。単なる例として、２つ以上の配列は、指定領域にわたって配列単位が約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一又は約９５％同一である場合に「実質的に同一」となり得る。２つ以上の配列の「同一割合」を記述するかかる割合。配列の同一性は、長さが少なくとも約７５−１００配列単位である領域にわたって、長さが約５０配列単位である領域にわたって、又は指定しない場合には、配列全体にわたって、存在し得る。この定義は、試験配列の相補物（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）も表す。単なる例として、２つ以上のポリペプチド配列は、アミノ酸残基が同じであるときには、同一である。一方、２つ以上のポリペプチド配列は、アミノ酸残基が指定領域にわたって約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一又は約９５％同一である場合には、「実質的に同一」である。同一性は、少なくとも約７５−１００アミノ酸長である領域にわたって、約５０アミノ酸長である領域にわたって、又は指定しない場合には、ポリペプチド配列全体にわたって、存在し得る。また、単なる例として、２つ以上のポリヌクレオチド配列は、核酸残基が同じであるときには、同一である。一方、２つ以上のポリヌクレオチド配列は、核酸残基が指定領域にわたって約６０％同一、約６５％同一、約７０％同一、約７５％同一、約８０％同一、約８５％同一、約９０％同一又は約９５％同一である場合には、「実質的に同一」である。同一性は、少なくとも約７５−１００個の核酸の長さである領域にわたって、約５０個の核酸の長さである領域にわたって、又は指定しない場合には、ポリヌクレオチド配列全体にわたって、存在し得る。
【００９３】
配列を比較する場合、典型的には１つの配列は、試験配列と比較する基準配列となる。配列比較アルゴリズムを用いるときには、試験配列と基準配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用することができ、又は代替パラメータを指定することができる。次いで、配列比較アルゴリズムは、基準配列に対する試験配列の配列同一割合をプログラムパラメータに基づいて計算する。
【００９４】
本明細書では「免疫原性」という用語は、治療薬の投与に対する抗体応答を指す。治療用非天然アミノ酸ポリペプチドに対する免疫原性は、体液中の抗非天然アミノ酸ポリペプチド抗体を検出する定量アッセイ及び定性アッセイによって得ることができる。かかるアッセイとしては、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）が挙げられるが、これらだけに限定されない。治療用非天然アミノ酸ポリペプチドに対する免疫原性の分析は、治療用非天然アミノ酸ポリペプチド投与後の抗体応答と治療用天然アミノ酸ポリペプチド投与後の抗体応答との比較を含む。
【００９５】
本明細書では「挿入基」とも称する「挿入剤」という用語は、分子内空間又は分子間空間に挿入することができる化学薬品を指す。単なる例として、挿入剤又は挿入基は、ＤＮＡ二重らせんの積み重なった塩基に挿入される分子であり得る。
【００９６】
本明細書では「単離された」という用語は、目的成分を目的外の成分から分離し、取り出すことを指す。単離された物質は、乾燥状態でも、半乾燥状態でも、又は水溶液を含めて、但しこれらだけに限定されない溶液でもよい。単離された成分は、均一状態であり得る。又は単離された成分は、薬剤として許容される追加の担体及び／又は賦形剤を含む薬剤組成物の一部であり得る。純度及び均一性は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーを含めて、但しこれらだけに限定されない分析化学技術によって求めることができる。また、目的成分が単離され、それが調製物中の支配的な種であるときには、その成分は、本明細書では実質的に精製されたと記述される。本明細書では「精製」という用語は、少なくとも純度８５％、少なくとも純度９０％、少なくとも純度９５％、少なくとも純度９９％以上である目的成分を指す。単なる例として、核酸若しくはタンパク質は、かかる核酸若しくはタンパク質が、天然状態で付随する細胞成分の少なくとも一部を含まないときには「単離され」ており、又は核酸若しくはタンパク質が、そのインビボ若しくはインビトロでの産生濃度よりも高いレベルに濃縮されたときには「単離され」ている。また、例として、遺伝子は、該遺伝子に隣接し、目的遺伝子以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離されたときには単離されている。
【００９７】
本明細書では「標識」という用語は、化合物に組み込まれ、容易に検出され、それによってその身体的分布を検出及び／又はモニターすることができる物質を指す。
【００９８】
本明細書では「リンケージ」という用語は、リンカーの官能基と別の分子との化学反応から形成される結合又は化学部分を指す。かかる結合としては、共有結合及び非共有結合が挙げられるが、これらだけに限定されない。かかる化学部分としては、エステル、カルボナート、イミン  リン酸エステル、ヒドラゾン、アセタール、オルトエステル、ペプチドリンケージ及びオリゴヌクレオチドリンケージが挙げられるが、これらだけに限定されない。加水分解的に安定なリンケージとは、リンケージが、水中で実質的に安定であり、生理条件下を含めて、但しこれだけに限定されない有用ｐＨ値で水と長期間、おそらくは無期限でも、反応しないことを意味する。加水分解的に不安定なリンケージ又は加水分解性リンケージとは、リンケージが水中又は、例えば血液を含めて、水溶液中で分解性であることを意味する。酵素的に不安定なリンケージ又は酵素分解性リンケージとは、リンケージが１種類以上の酵素によって分解し得ることを意味する。単なる例として、ＰＥＧ及び関係するポリマーは、ポリマー骨格中に、又はポリマー骨格とポリマー分子の末端官能基の１個以上との間のリンカー基中に、分解性リンケージを含むことができる。かかる分解性リンケージとしては、ＰＥＧカルボン酸又は活性ＰＥＧカルボン酸と生物活性剤上のアルコール基との反応によって形成されるエステルリンケージが挙げられるが、これだけに限定されない。かかるエステル基は、一般に生理条件下で加水分解して生物活性剤を放出する。他の加水分解性リンケージとしては、カルボナートリンケージ、アミンとアルデヒドの反応から得られるイミンリンケージ、アルコールとリン酸基の反応によって形成されるリン酸エステルリンケージ、ヒドラジドとアルデヒドの反応生成物であるヒドラゾンリンケージ、アルデヒドとアルコールの反応生成物であるアセタールリンケージ、ホルマートとアルコールの反応生成物であるオルトエステルリンケージ、ＰＥＧなどのポリマーの一端にあるアミン基を含めて、但しこれだけに限定されないアミン基とペプチドのカルボキシル基とによって形成されるペプチドリンケージ、及びポリマーの最後にあるホスホアミダイト基を含めて、但しこれだけに限定されないホスホアミダイト基とオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基とによって形成されるオリゴヌクレオチドリンケージが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【００９９】
本明細書では「培地」という用語は、細胞及び／又はかかる細胞によって発現及び／又は分泌された生成物の増殖及び収集に使用する任意の培地を指す。かかる「培地」としては、溶液、固体、半固体又は例として細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞、植物宿主細胞、真核生物宿主細胞、哺乳動物宿主細胞、ＣＨＯ細胞、原核生物宿主細胞、Ｅ．コリ（Ｅ．  ｃｏｌｉ）若しくはシュードモナス宿主細胞を含めて、任意の宿主細胞を支持若しくは含有することができる堅い担体、細胞内容物などが挙げられるが、これらだけに限定されない。かかる「培地」としては、増殖段階前又は後の培地を含めて、宿主細胞が増殖し、ポリペプチドが分泌された、培地が挙げられるが、これだけに限定されない。かかる「培地」としては、宿主細胞溶解物、例として細胞内で産生されたポリペプチドを含む、緩衝剤又は試薬も挙げられるが、これらだけに限定されない。宿主細胞は、溶解又は破壊されて、該ポリペプチドを放出する。
【０１００】
本明細書では「代謝産物」という用語は、化合物の誘導体、例として、化合物、例として天然アミノ酸ポリペプチド、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾天然アミノ酸ポリペプチド又は修飾非天然アミノ酸ポリペプチドが代謝されたときに形成される、天然アミノ酸ポリペプチド、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾天然アミノ酸ポリペプチド又は修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを指す。本明細書では「薬剤として活性な代謝物」又は「活性代謝物」という用語は、化合物の生物活性誘導体、例として、かかる化合物、例として天然アミノ酸ポリペプチド、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾天然アミノ酸ポリペプチド又は修飾非天然アミノ酸ポリペプチドが代謝されたときに形成される、天然アミノ酸ポリペプチド、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾天然アミノ酸ポリペプチド又は修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを指す。
【０１０１】
本明細書では「代謝された」という用語は、特定の物質が生体によって変化を受けるプロセスの総体を指す。かかるプロセスとしては、加水分解反応及び酵素によって触媒される反応が挙げられるが、これらだけに限定されない。代謝に関するさらなる情報は、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（１９９６）から得ることができる。単なる例として、天然アミノ酸ポリペプチド、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾天然アミノ酸ポリペプチド若しくは修飾非天然アミノ酸ポリペプチドの代謝産物は、天然アミノ酸ポリペプチド、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾天然アミノ酸ポリペプチド若しくは修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを宿主に投与し、宿主から得られる組織試料を分析することによって、又は天然アミノ酸ポリペプチド、非天然アミノ酸ポリペプチド、修飾天然アミノ酸ポリペプチド若しくは修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを肝細胞と一緒にインビトロでインキュベートし、生成する化合物を分析することによって、特定することができる。
【０１０２】
本明細書では「金属キレート剤」という用語は、金属イオンと金属錯体を形成する分子を指す。例として、かかる分子は、中心金属イオンと２個以上の配位結合を形成することができ、環構造を形成し得る。
【０１０３】
本明細書では「金属含有部分」という用語は、金属イオン、原子又は粒子を含む基を指す。かかる部分としては、シスプラチン、（ニッケル、鉄、白金などの）キレート化金属イオン及び（ニッケル、鉄、白金などの）金属ナノ粒子が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０１０４】
本明細書では「重原子を組み込んだ部分」という用語は、通常炭素よりも重い原子のイオンを組み込んだ基を指す。かかるイオン又は原子としては、ケイ素、タングステン、金、鉛及びウランが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０１０５】
本明細書では「修飾」という用語は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸ポリペプチド又は非天然アミノ酸ポリペプチドに対する変化が存在することを指す。かかる変化又は修飾は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸ポリペプチド若しくは非天然アミノ酸ポリペプチドの合成後修飾によって、共翻訳によって、又は天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸ポリペプチド若しくは非天然アミノ酸ポリペプチドの翻訳後修飾によって得ることができる。「修飾又は非修飾」という形態は、考察する天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸ポリペプチド又は非天然アミノ酸ポリペプチドが場合によっては修飾されていてもよい、すなわち、考察する天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸ポリペプチド又は非天然アミノ酸ポリペプチドが修飾されていても、非修飾でもよいことを意味する。
【０１０６】
本明細書では「血清半減期の変化」という用語は、その非改変形態と比較した、改変生物活性分子の循環半減期の正又は負の変化を指す。例として、改変生物活性分子としては、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸ポリペプチド又は非天然アミノ酸ポリペプチドが挙げられるが、これらだけに限定されない。例として、血清半減期は、生物活性分子又は改変生物活性分子の投与後の種々の時点において血液試料を採取し、各試料中の該分子の濃度を求めることによって測定される。血清中濃度と時間との相関によって、血清半減期を計算することができる。例として、血清半減期の変化は、血清半減期の増加であり得る。血清半減期の増加によって、投与計画を改善し、又は毒性作用を回避することができる。かかる血清中の増加は、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍又は少なくとも約１０倍であり得る。血清半減期の増加を評価する方法の非限定的例を実施例８８−９２に示す。この方法は、任意のポリペプチドの血清半減期の評価に使用することができる。
【０１０７】
本明細書では「治療上の半減期の変化」という用語は、その非改変形態と比較した、改変生物活性分子の治療有効量の半減期の正又は負の変化を指す。例として、改変生物活性分子としては、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、天然アミノ酸ポリペプチド、非天然アミノ酸ポリペプチドなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。例として、治療上の半減期は、投与後の種々の時点において分子の薬物動態学的及び／又は薬力学的諸性質を測定することによって測定される。治療上の半減期の増加によって、特定の有利な投与計画、特定の有利な全量が可能になり、又は望ましくない効果が回避される。例として、治療上の半減期の増加は、効力の増大、改変分子とその標的との結合の増加若しくは減少、非改変分子の別の作用パラメータ若しくは作用機序の増加若しくは減少、又は単なる例としてプロテアーゼなどの酵素による分子の分解の増加若しくは減少からもたらされ得る。治療上の半減期の増加を評価する方法の非限定的例を実施例８８−９２に示す。この方法は、任意のポリペプチドの治療上の半減期の評価に使用することができる。
【０１０８】
本明細書では「ナノ粒子」という用語は、約５００ｎｍから約１ｎｍの粒径を有する粒子を指す。
【０１０９】
本明細書では「ほぼ化学量論的」という用語は、化学反応に関与する化合物のモル比が約０．７５から約１．５であることを指す。
【０１１０】
本明細書では「非真核生物」という用語は、非真核の生物を指す。例として、非真核生物は、（エシェリキア  コリ、サーマス  サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）又はバチルス  ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、シュードモナス  フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス  エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス  プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）などを含めて、但しこれらだけに限定されない）真正細菌、系統学的ドメイン又はメタノコッカス  ジャナシー（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）、メタノバクテリウム  サーモオートトロフィカム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）、アルカエグロブス  フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ）、パイロコッカス  フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、パイロコッカス  ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）、アエロパイラム  ペルニックス（Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ）若しくはハロフェラックス  ボルカニ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ）、ハロバクテリウム種ＮＲＣ−１などのハロバクテリウムを含めて、但しこれらだけに限定されない古細菌、又は系統学的ドメインに属し得る。
【０１１１】
「非天然アミノ酸」とは、２０種類の一般的アミノ酸の１種類でも、ピロリジンでも、セレノシステインでもないアミノ酸を指す。「非天然アミノ酸」という用語と同義で使用することができる他の用語は、「非天然的にコードされたアミノ酸」、「異常アミノ酸」、「非天然アミノ酸」、様々にハイフンで連結されたこれらの変形物、及びハイフンで連結されていないこれらの変形物である。「非天然アミノ酸」という用語は、（２０種類の一般的アミノ酸又はピロリシン（ｐｙｒｒｏｌｙｓｉｎｅ）及びセレノシステインを含めて、但しこれらだけに限定されない）天然にコードされたアミノ酸の修飾によって天然に存在するが、それ自体が翻訳複合体によって成長ポリペプチド鎖に組み込まれないアミノ酸を含むが、これだけに限定されない。天然にコードされない天然アミノ酸の例としては、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−トレオニン及びＯ−ホスホチロシンが挙げられるが、これらだけに限定されない。さらに、「非天然アミノ酸」という用語は、天然に存在しないが、合成によって得ることができる、又は非天然アミノ酸の修飾によって得ることができる、アミノ酸を含むが、これだけに限定されない。
【０１１２】
本明細書では「核酸」という用語は、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド又はリボヌクレオチド及びこれらの一本鎖又は二本鎖のポリマーを指す。単なる例として、かかる核酸及び核酸ポリマーとしては、（ｉ）基準核酸と類似した結合特性を有し、天然ヌクレオチドと同様に代謝される、天然ヌクレオチドアナログ、（ｉｉ）アンチセンス技術に使用されるＤＮＡアナログであるＰＮＡ（ペプチド核酸（ｐｅｐｔｉｄｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ））を含めて、但しこれだけに限定されないオリゴヌクレオチドアナログ（ホスホロチオエート、ホスホロアミダート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏａｍｉｄａｔｅ）など）、（ｉｉｉ）（縮重コドン置換を含めて、但しこれだけに限定されない）保存的に改変されたその変異体及び相補配列及び明示される配列が挙げられるが、これらだけに限定されない。例として、縮重コドン置換は、１個以上の選択（又は全ての）コドンの第３の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することによって実施することができる（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  １９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６０：２６０５−２６０８（１９８５）及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。
【０１１３】
本明細書では「酸化剤」という用語は、酸化された化合物から電子を取り出すことができる化合物又は材料を指す。例として、酸化剤としては、酸化型グルタチオン、シスチン、シスタミン、酸化型ジチオスレイトール、酸化型エリスリトール（ｅｒｙｔｈｒｅｉｔｏｌ）及び酸素が挙げられるが、これらだけに限定されない。多種多様な酸化剤が、本明細書の方法及び組成物に適切である。
【０１１４】
本明細書では「薬剤として許容される」という用語は、化合物の生物活性又は諸性質を阻害せず、比較的無毒である、塩、担体又は希釈剤を含めて、但しこれらだけに限定されない材料を指す。すなわち、これらの材料は、望ましくない生物学的効果を引き起こさず、材料が含まれる組成物の成分のいずれとも有害な相互作用を起こさずに、個体に投与することができる。
【０１１５】
本明細書では「光親和性標識」という用語は、光に曝されると、標識が親和性を有する分子とリンケージを形成する基を有する標識を指す。単なる例として、かかるリンケージは共有結合性でも非共有結合性でもよい。
【０１１６】
本明細書では「フォトケージド部分」という用語は、ある波長の照明によって、他のイオン又は分子と共有結合又は非共有結合する基を指す。
【０１１７】
本明細書では「光開裂可能な基」という用語は、光に曝されると分解する基を指す。
【０１１８】
本明細書では「光架橋剤」という用語は、光に曝されると、反応性であり、２個以上の単量体分子又は重合体分子と共有結合又は非共有結合を形成する、２個以上の官能基を含む化合物を指す。
【０１１９】
本明細書では「光異性化可能部分」という用語は、光による照明によって１つの異性体から別の異性体に変わる基を指す。
【０１２０】
本明細書では「ポリアルキレングリコール」という用語は、線状又は分枝状の重合体ポリエーテルポリオールを指す。ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール及びこれらの誘導体を含めて、但しこれらだけに限定されないかかるポリアルキレングリコール。他の例示的な実施形態は、例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏのカタログ”Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”（２００１）などの供給業者のカタログに記載されている。単なる例として、かかる重合体ポリエーテルポリオールは平均分子量が約０．１ｋＤａから約１００ｋＤａである。例として、かかる重合体ポリエーテルポリオールは、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａ以上を含むが、これだけに限定されない。ポリエーテルポリオールの分子量は、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ及び１００Ｄａを含めて、但しこれらだけに限定されない約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａであり得る。一部の実施形態においては、ポリエーテルポリオールの分子量は約１００Ｄａから５０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、ポリエーテルポリオールの分子量は約１００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、ポリエーテルポリオールの分子量は約１，０００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、ポリエーテルポリオールの分子量は約５，０００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、ポリエーテルポリオールの分子量は約１０，０００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、ポリ（エチレングリコール）分子は分枝ポリマーである。分枝鎖ＰＥＧの分子量は、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ及び１，０００Ｄａを含めて、但しこれらだけに限定されない約１，０００Ｄａから約１００，０００Ｄａであり得る。一部の実施形態においては、分枝鎖ＰＥＧの分子量は約１，０００Ｄａから５０，���００Ｄａである。一部の実施形態においては、分枝鎖ＰＥＧの分子量は約１，０００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、分枝鎖ＰＥＧの分子量は約５，０００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、分枝鎖ＰＥＧの分子量は約５，０００Ｄａから２０，０００Ｄａである。
【０１２１】
本明細書では「ポリマー」という用語は、繰り返しサブユニットで構成される分子を指す。かかる分子としては、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、多糖又はポリアルキレングリコールが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０１２２】
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを表すのに本明細書では区別なく使用される。すなわち、ポリペプチドを対象とする記述は、ペプチドの記述及びタンパク質の記述に等しく当てはまり、その逆も同様である。これらの用語は、天然アミノ酸ポリマー並びに１個以上のアミノ酸残基が非天然アミノ酸であるアミノ酸ポリマーに適用される。さらに、かかる「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」としては、完全長タンパク質を含めて、任意の長さのアミノ酸鎖が挙げられる。ここで、アミノ酸残基は、共有結合性ペプチド結合によって連結されている。
【０１２３】
「翻訳後修飾」という用語は、天然又は非天然アミノ酸が翻訳によってポリペプチド鎖に組み込まれた後に起こる、かかるアミノ酸の任意の修飾を指す。かかる修飾としては、共翻訳インビボ修飾、（無細胞翻訳系中などの）共翻訳インビトロ修飾、翻訳後インビボ修飾及び翻訳後インビトロ修飾が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０１２４】
本明細書では「プロドラッグ」又は「薬剤として許容されるプロドラッグ」という用語は、薬物の生物活性又は諸性質を阻害せず、比較的無毒であり、親薬物にインビボ又はインビトロで転化される薬剤を指す。すなわち、この材料は、望ましくない生物学的効果を引き起こさず、この材料が含まれる組成物の成分のいずれとも有害な相互作用を起こさずに、個体に投与することができる。プロドラッグは、一般に、対象に投与され、それに続いて吸収された後に、代謝経路による転化などのあるプロセスによって、活性な種又はより活性な種に転化される、薬物前駆体である。一部のプロドラッグは、プロドラッグ上に存在する、プロドラッグをより低活性にする化学基及び／又は溶解性若しくは何らかの他の特性を薬物に付与する化学基を有する。この化学基がプロドラッグから開裂及び／又は改変されると、活性な薬物が生成する。プロドラッグは、酵素反応又は非酵素反応によって体内で活性な薬物に転化される。プロドラッグは、溶解性の増大などの生理化学的諸性質を改善し、特定の細胞、組織、器官又はリガンドに対する特異的ターゲティングなどの送達特性を向上させ、薬物の治療学的価値を改善し得る。かかるプロドラッグの利点としては、（ｉ）親薬物よりも投与が容易、（ｉｉ）プロドラッグは、親薬物がそうでない場合でも、経口投与によって生物が利用可能になり得る、（ｉｉｉ）プロドラッグは、薬剤組成物への溶解性が親薬物よりも高くなり得る、などが挙げられるが、これらだけに限定されない。プロドラッグは、活性な薬物の薬理学的に不活性な誘導体又は低活性誘導体を含む。プロドラッグは、生理化学的諸性質、生物薬剤的諸性質、薬物動態学的諸性質などの薬物の諸性質を操作することによって、所望の作用部位に到達する薬物又は生物活性分子の量を調節するように設計することができる。プロドラッグの非限定的例は、エステル（「プロドラッグ」）として投与されて、水溶性が易動度には不利である細胞膜を通した送達を容易にし、次いで水溶性が有利である細胞内部に入ると活性体であるカルボン酸に代謝的に加水分解される、非天然アミノ酸ポリペプチドである。プロドラッグは、部位特異的組織への薬物輸送を促進する改質剤（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）として使用するために、可逆的薬物誘導体として設計することができる。
【０１２５】
本明細書では「予防的有効量」という用語は、患者に予防的に適用され、処置する疾患、症状又は障害の症候の１つ以上をある程度軽減する、少なくとも１個の非天然アミノ酸ポリペプチド又は少なくとも１個の修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを含む組成物の量を指す。かかる予防的適用例においては、かかる量は、患者の健康状態、体重などに応じて決まり得る。用量漸増臨床試験を含めて、但しこれだけに限定されない定常的な実験法によって、かかる予防的有効量を決定することは、当分野の技術範囲内であると考えられる。
【０１２６】
本明細書では「保護された」という用語は、ある反応条件下で化学反応性官能基の反応を防止する「保護基」又は部分の存在を指す。保護基は、保護される化学反応基のタイプに応じて変わる。単なる例として、（ｉ）化学反応基がアミン又はヒドラジドである場合には、保護基は、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）及び９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）から選択することができ、（ｉｉ）化学反応基がチオールである場合には、保護基は、オルトピリジルジスルフィドとすることができ、（ｉｉｉ）化学反応基が、ブタン酸、プロピオン酸などのカルボン酸又はヒドロキシル基である場合には、保護基はベンジル又はメチル、エチル、ｔｅｒｔ−ブチルなどのアルキル基とすることができる。
【０１２７】
単なる例として、ブロッキング基／保護基は、
【０１２８】
【化６２】
0005425398.tif 000002
から選択することもできる。
【０１２９】
さらに、保護基としては、Ｎｖｏｃ、ＭｅＮｖｏｃなどの感光性基及び当分野で公知の他の保護基が挙げられるが、これらだけに限定されない。他の保護基は、参照によりその全体を本明細書に組みこむ、Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ，  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ３ｒｄ  Ｅｄ．，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  １９９９に記載されている。
【０１３０】
本明細書では「放射性部分」という用語は、その核がアルファ、ベータ、ガンマ粒子などの核放射線を自発的に放出する基を指す。ここで、アルファ粒子はヘリウム核であり、ベータ粒子は電子であり、ガンマ粒子は高エネルギー光子である。
【０１３１】
本明細書では「反応性化合物」という用語は、適切な条件下で別の原子、分子又は化合物に対して反応性である化合物を指す。
【０１３２】
「宿主細胞」とも称する「組換え宿主細胞」という用語は、外来ポリヌクレオチドを含む細胞を指す。外来ポリヌクレオチドを細胞に挿入するのに使用する方法としては、直接取り込み、形質導入、ｆ−交配、又は組換え宿主細胞を作製するための当分野で公知の他の方法が挙げられるが、これらだけに限定されない。単なる例として、かかる外来ポリヌクレオチドは、プラスミドを含めて、但しこれだけに限定されない非組み込みベクターとすることができ、又は宿主ゲノムに組み込むことができる。
【０１３３】
本明細書では「レドックス活性薬剤」という用語は、別の分子を酸化又は還元する分子を指す。これによって、レドックス活性薬剤は還元又は酸化される。レドックス活性薬剤の例としては、フェロセン、キノン、Ｒｕ２＋／３＋複合体、Ｃｏ２＋／３＋複合体及びＯｓ２＋／３＋複合体が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０１３４】
本明細書では「還元剤」という用語は、還元された化合物に電子を付加することができる化合物又は材料を指す。例として、還元剤としては、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、ジチオエリスリトール、システイン、システアミン（２−アミノエタンチオール）及び還元型グルタチオンが挙げられるが、これらだけに限定されない。かかる還元剤は、単なる例として、還元状態のスルフヒドリル基を維持するために、また、分子内又は分子間のジスルフィド結合を還元するために、使用することができる。
【０１３５】
本明細書では「再折り畳み」は、不適当に折り畳まれた状態又は折り畳まれていない状態を自然な立体配座又は適切に折り畳まれた立体配座に転換する、任意のプロセス、反応又は方法を表す。単なる例として、再折り畳みは、ジスルフィド結合を含むポリペプチドを、ジスルフィド結合に関して、不適当に折り畳まれた状態又は折り畳まれていない状態から自然な立体配座又は適切に折り畳まれた立体配座に転換する。かかるジスルフィド結合含有ポリペプチドは、天然アミノ酸ポリペプチドでも非天然アミノ酸ポリペプチドでもよい。
【０１３６】
本明細書では「樹脂」という用語は、高分子量不溶性ポリマービーズを指す。単なる例として、かかるビーズは、固相ペプチド合成用担体として、又は精製前の分子の付着部位として、使用することができる。
【０１３７】
本明細書では「糖類」という用語は、糖、単糖、オリゴ糖及び多糖を含めて、但しこれらだけに限定されない一連の炭水化物を指す。
【０１３８】
本明細書では「安全性」又は「安全性プロファイル」という用語は、薬物投与回数と比較して薬物投与に関係し得る副作用を指す。例として、多数回投与しても、ほんの軽い副作用しか生じない、又は副作用を生じない薬物は、優れた安全性プロファイルを有すると言える。安全性プロファイルを評価する方法の非限定的例を実施例９２に示す。この方法は、あらゆるポリペプチドの安全性プロファイルの評価に使用することができる。
【０１３９】
本明細書では「と選択的にハイブリッドを形成する」又は「と特異的にハイブリッドを形成する」という句は、全細胞又はライブラリーのＤＮＡ又はＲＮＡを含めて、但しこれらだけに限定されない複合混合物中に特定のヌクレオチド配列が存在するときに、厳密なハイブリダイゼーション条件下における、分子と特定のヌクレオチド配列との結合、二重化（ｄｕｐｌｅｘｉｎｇ）又はハイブリッド形成を指す。
【０１４０】
本明細書では「スピン標識」という用語は、電子スピン共鳴分光法によって検出することができ、別の分子と結合することができる、不対電子スピンを有する原子又は原子群を含む分子（すなわち、安定な常磁性基）を指す。かかるスピン標識分子としては、ニトリル基及び窒素酸化物が挙げられるが、これらだけに限定されない。かかるスピン標識分子は、単一のスピン標識でも、二重のスピン標識でもよい。
【０１４１】
本明細書では「化学量論的」という用語は、化学反応に関与する化合物のモル比が約０．９から約１．１であることを指す。
【０１４２】
本明細書では「化学量論様」という用語は、反応条件の変化によって、又は添加剤の存在下で、化学量論的又はほぼ化学量論的になる化学反応を指す。かかる反応条件の変化としては、温度上昇又はｐＨの変化が挙げられるが、これらだけに限定されない。かかる添加剤としては、促進剤が挙げられるが、これだけに限定されない。
【０１４３】
「厳密なハイブリダイゼーション条件」という句は、低イオン強度及び高温の条件下でのＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ若しくは他の核酸模倣物の配列又はこれらの組み合わせのハイブリダイゼーションを指す。例として、厳密な条件下では、プローブは、（全細胞又はライブラリーのＤＮＡ又はＲＮＡを含めて、但しこれらだけに限定されない）核酸の複合混合物中のその標的部分配列とハイブリッドを形成するが、複合混合物中の他の配列とはハイブリッドを形成しない。厳密な条件は、配列依存性であり、状況に応じて変わる。例として、より長い配列は、より高温で特異的にハイブリッド形成する。厳密なハイブリダイゼーション条件としては、（ｉ）規定のイオン強度及びｐＨにおいて特定の配列の融点（Ｔｍ）よりも約５−１０℃低い、（ｉｉ）塩濃度はｐＨ約７．０からｐＨ約８．３において約０．０１Ｍから約１．０Ｍであり、温度は（１０から５０ヌクレオチドを含めて、但しこれだけに限定されない）短いプローブでは少なくとも約３０℃であり、（５０を超えるヌクレオチドを含めて、但しこれだけに限定されない）長いプローブでは少なくとも約６０℃である、（ｉｉｉ）ホルムアミドを含めて、但しこれだけに限定されない不安定化剤（ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）の添加、（ｉｖ）５０％ホルムアミド、５Ｘ  ＳＳＣ及び１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベート、又は５Ｘ  ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベート、０．２Ｘ  ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳを用いて６５℃で約５分間から約１２０分間洗浄などが挙げられるが、これらだけに限定されない。単なる例として、選択的又は特異的ハイブリダイゼーションの検出としては、バックグラウンドの少なくとも２倍の正の信号が挙げられるが、これだけに限定されない。核酸ハイブリダイゼーションの広範な入門書は、Ｔｉｊｓｓｅｎ，  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ｐｒｏｂｅｓ，  ”Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙｓ”（１９９３）である。
【０１４４】
本明細書では「対象」という用語は、処置、観察又は実験の対象となる動物を指す。単なる例として、対象は、ヒトを含めて、但しこれだけに限定されない哺乳動物であるが、これだけに限定されない。
【０１４５】
本明細書では「実質的に精製された」という用語は、精製前に目的成分に通常付随する、又は目的成分と相互作用する他の成分を実質的又は本質的に含まないこともある目的成分を指す。単なる例として、目的成分の調製物が、汚染成分を（乾燥重量で）約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満又は約１％未満しか含まないときに、目的成分は「実質的に精製された」と考えられる。したがって、「実質的に精製された」目的成分は、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％以上の純度レベルを有し得る。単なる例として、天然アミノ酸ポリペプチド又は非天然アミノ酸ポリペプチドは、自然の細胞から、又は組換え産生された天然アミノ酸ポリペプチド若しくは非天然アミノ酸ポリペプチドの場合には宿主細胞から、精製することができる。例として、天然アミノ酸ポリペプチド又は非天然アミノ酸ポリペプチドの調製物が、汚染材料を（乾燥重量で）約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満又は約１％未満しか含まないときに、調製物は「実質的に精製された」と考えられる。例として、天然アミノ酸ポリペプチド又は非天然アミノ酸ポリペプチドが宿主細胞によって組換え産生されるときには、天然アミノ酸ポリペプチド又は非天然アミノ酸ポリペプチドは、細胞の乾燥重量の約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％又は約１％未満で存在し得る。例として、天然アミノ酸ポリペプチド又は非天然アミノ酸ポリペプチドが宿主細胞によって組換え産生されるときには、天然アミノ酸ポリペプチド又は非天然アミノ酸ポリペプチドは、細胞の乾燥重量の約５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約７５０ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ又は約１ｍｇ／Ｌ未満で培地中に存在し得る。例として、「実質的に精製された」天然アミノ酸ポリペプチド又は非天然アミノ酸ポリペプチドは、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ及びキャピラリー電気泳動法を含めて、但しこれらだけに限定されない適切な方法で求めて、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％以上の純度レベルを有し得る。
【０１４６】
「非干渉置換基」とも称する「置換基」という用語は、分子上の別の基の置換に使用することができる基を指す。かかる基としては、ハロ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ１−Ｃ１０アルコキシ、Ｃ５−Ｃ１２アラルキル、Ｃ３−Ｃ１２シクロアルキル、Ｃ４−Ｃ１２シクロアルケニル、フェニル、置換フェニル、トルオリル（ｔｏｌｕｏｌｙｌ）、キシレニル、ビフェニル、Ｃ２−Ｃ１２アルコキシアルキル、Ｃ５−Ｃ１２アルコキシアリール、Ｃ５−Ｃ１２アリールオキシアルキル、Ｃ７−Ｃ１２オキシアリール、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルフィニル、Ｃ１−Ｃ１０アルキルスルホニル、−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）（式中、ｍは１から８である。）、アリール、置換アリール、置換アルコキシ、フルオロアルキル、複素環式基、置換複素環式基、ニトロアルキル、−ＮＯ２、−ＣＮ、−ＮＲＣ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、Ｃ２−Ｃ１０アルクチオアルキル（ａｌｋｔｈｉｏａｌｋｙｌ）、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、−ＯＨ、−ＳＯ２、＝Ｓ、−ＣＯＯＨ、−ＮＲ２、カルボニル、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）−ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）−ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−（Ｃ１−Ｃ１０アリール）−Ｓ−（Ｃ６−Ｃ１０アリール）、−Ｃ（Ｏ）−（Ｃ６−Ｃ１０アリール）、−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）（式中、各ｍは１から８である。）、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ２、−ＳＯ２ＮＲ２、−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ２、−ＮＲＣ（Ｓ）ＮＲ２、これらの塩などが挙げられるが、これらだけに限定されない。上記リストの各Ｒ基としては、Ｈ、アルキル若しくは置換アルキル、アリール若しくは置換アリール又はアルカリールが挙げられるが、これらだけに限定されない。置換基をその従来の化学式によって明記し、左から右に記述する場合には、置換基は、その構造を右から左に記述して得られる化学的に同一である置換基を等しく包含する。例えば、−ＣＨ２Ｏ−は−ＯＣＨ２−と等価である。
【０１４７】
単なる例として、（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル及びヘテロシクロアルケニルと称する基を含めて）アルキル及びヘテロアルキル基の置換基としては、−ＯＲ、＝Ｏ、＝ＮＲ、＝Ｎ−ＯＲ、−ＮＲ２、−ＳＲ、−ハロゲン、−ＳｉＲ３、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−ＣＯ２Ｒ、−ＣＯＮＲ２、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ、−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ２、−ＮＲ（Ｏ）２Ｒ、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ２）＝ＮＲ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−ＮＲＳＯ２Ｒ、−ＣＮ及び−ＮＯ２が挙げられるが、これらだけに限定されない。上記リストの各Ｒ基としては、水素、置換又は非置換ヘテロアルキル、１−３個のハロゲンで置換されたアリールを含めて、但しこれらだけに限定されない置換若しくは非置換アリール、置換若しくは非置換アルキル、アルコキシ若しくはチオアルコキシ基又はアラルキル基が挙げられるが、これらだけに限定されない。２個のＲ基が同じ窒素原子に結合しているときには、これらは窒素原子と一緒に５、６又は７員環を形成し得る。例えば、−ＮＲ２は、これらだけに限定されないが、１−ピロリジニル及び４−モルホリニルを含むものとする。
【０１４８】
例として、アリール及びヘテロアリール基の置換基としては、ゼロから芳香族環構造上の空き原子価（ｏｐｅｎ  ｖａｌｅｎｃｅ）の総数までの範囲の数の、−ＯＲ、＝Ｏ、＝ＮＲ、＝Ｎ−ＯＲ、−ＮＲ２、−ＳＲ、−ハロゲン、−ＳｉＲ３、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−ＣＯ２Ｒ、−ＣＯＮＲ２、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ２、−ＮＲＣ（Ｏ）Ｒ、−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ２、−ＮＲ（Ｏ）２Ｒ、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ２）＝ＮＲ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ２、−ＮＲＳＯ２Ｒ、−ＣＮ、−ＮＯ２、−Ｒ、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ及びフルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルが挙げられるが、これらだけに限定されない。上記リストの各Ｒ基としては、水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリール及びヘテロアリールが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０１４９】
本明細書では「治療有効量」という用語は、疾患、症状又は障害に既に罹患した患者に投与される、処置する疾患、障害又は症状の症候の１つ以上を回復させ、又は少なくとも部分的に抑止し、又はある程度軽減するのに十分な、少なくとも１個の非天然アミノ酸ポリペプチド及び／又は少なくとも１個の修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを含む組成物の量を指す。かかる組成物の有効性は、疾患、障害又は症状の重症度及び経過、前治療、患者の健康状態及び薬物応答性並びに処置を行う医師の判断に応じて決まる。単なる例として、治療有効量は、用量漸増臨床試験を含めて、但しこれだけに限定されない定常的な実験法によって求めることができる。
【０１５０】
本明細書では「チオアルコキシ」という用語は、分子に酸素原子を介して結合した硫黄含有アルキル基を指す。
【０１５１】
「融点」又はＴｍという用語は、標的と相補的であるプローブの５０％が平衡において標的配列とハイブリッドを形成する（規定のイオン強度、ｐＨ及び核濃度下での）温度である。
【０１５２】
本明細書では「毒性部分」という用語は、害又は死をもたらし得る化合物を指す。
【０１５３】
本明細書では「処置する」、「処置すること」又は「処置」という用語は、疾患又は症状の症候の軽減、緩和又は寛解、追加の症候の防止、症候の根底にある代謝的原因の改善又は防止、疾患又は症状の抑制、例えば、疾患又は症状の発生の抑止、疾患又は症状の軽減、疾患又は症状の後退、疾患又は症状によって引き起こされる症状の軽減、疾患又は症状の症候の停止などを含む「処置する」、「処置すること」又は「処置」という用語は、予防処置及び／又は治療処置を含むが、これらだけに限定されない。
【０１５４】
本明細書では「水溶性ポリマー」という用語は、水系溶媒に可溶である任意のポリマーを指す。かかる水溶性ポリマーとしては、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、モノＣ１−Ｃ１０アルコキシ若しくはそのアリールオキシ誘導体（参照により本明細書に組みこむ米国特許第５，２５２，７１４号に記載のもの。）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ジビニルエーテル無水マレイン酸、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、デキストラン、デキストラン硫酸を含めたデキストラン誘導体、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ヘパリン、ヘパリン断片、多糖、オリゴ糖、グリカン、セルロース、メチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースを含めて、但しこれらだけに限定されないセルロース誘導体、血清アルブミン、デンプン及びデンプン誘導体、ポリペプチド、ポリアルキレングリコール及びその誘導体、ポリアルキレングリコールコポリマー及びその誘導体、ポリビニルエチルエーテル、アルファ−ベータ−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルトアミドなど、又はこれらの混合物が挙げられるが、これらだけに限定されない。単なる例として、かかる水溶性ポリマーと天然アミノ酸ポリペプチド又は非天然ポリペプチドとのカップリングは、水溶性の増加、血清半減期の延長又は変化、非修飾体と比較した治療上の半減期の延長又は変化、生物学的利用能の増加、生物活性の調節、循環時間の延長、免疫原性の調節、凝集及び多量体の形成を含めて、但しこれらだけに限定されない物理的会合（ｐｈｙｓｉｃａｌ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）特性の変化、受容体結合の変化、１個以上の結合パートナーとの結合の変化並びに受容体２量体化又は多量体化の変化を含めて、但しこれらだけに限定されない変化をもたらし得る。また、かかる水溶性ポリマーは、それ自体の生物活性を有しても、有さなくてもよい。
【０１５５】
別段の記載がないかぎり、当分野の技術範囲内にある、質量分析、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、タンパク質化学反応、生化学、組換えＤＮＡ技術及び薬理学の従来の方法を使用する。
【０１５６】
（非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチド並びに前記化合物を生成する試薬を含めて、但しこれらだけに限定されない）本明細書の化合物は、天然に通常存在する原子質量又は質量数とは異なる原子質量又は質量数を有する原子で１個以上の原子が置換されているということを除いて、本明細書に記載の多様な式及び構造において列挙したものと同一である同位体的標識化合物を含む。本化合物に組み込むことができる同位体の例としては、２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、３５Ｓ、１８Ｆ、３６Ｃｌなど、それぞれ水素、炭素、窒素、酸素、フッ素及び塩素の同位体が挙げられる。本明細書に記載のある種の同位体的標識化合物、例えば３Ｈ、１４Ｃなどの放射性同位体が組み込まれた同位体的標識化合物は、薬物及び／又は基質の組織分布アッセイに有用である。また、重水素、すなわち、２Ｈなどの同位体置換は、代謝的安定性の増大に起因する治療上のある種の利点、例えばインビボでの半減期の延長又は投与要件の緩和をもたらし得る。
【０１５７】
（非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチド並びに前記化合物を生成する試薬を含めて、但しこれらだけに限定されない）本明細書の化合物の一部は、不斉炭素原子を有し、したがって鏡像異性体又はジアステレオマーとして存在し得る。ジアステレオマー混合物は、その物理的化学的相違に基づいて、公知方法、例えば、クロマトグラフィー及び／又は分別結晶によって、その個々のジアステレオマーに分離することができる。鏡像異性体は、適切な光学活性化合物（例えば、アルコール）との反応によって鏡像異性混合物をジアステレオマー混合物に転化し、各ジアステレオマーを分離し、個々のジアステレオマーを対応する純粋な鏡像異性体に転化（例えば、加水分解）することによって、分離することができる。ジアステレオマー、鏡像異性体及びこれらの混合物を含めて、かかる全異性体を、本明細書に記載の組成物の一部と見なす。
【０１５８】
追加の又はさらなる実施形態においては、（非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチド並びに前記化合物を生成する試薬を含めて、但しこれらだけに限定されない）本明細書の化合物をプロドラッグの形成に使用する。追加の又はさらなる実施形態においては、（非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチド並びに前記化合物を生成する試薬を含めて、但しこれらだけに限定されない）本明細書の化合物は、必要としている生物に投与すると代謝によって代謝産物を産生する。次いで、代謝産物を、所望の治療効果を含めて、所望の効果を得るために使用する。さらなる又は追加の実施形態においては、非天然アミノ酸及び「修飾又は非修飾」非天然アミノ酸ポリペプチドの活性代謝物である。
【０１５９】
本明細書の方法及び処方は、Ｎ−酸化物、（多形体としても知られる）結晶体（ｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  ｆｏｒｍ）、又は非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドの薬剤として許容される塩の使用を含む。ある実施形態においては、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドは互変異性体として存在し得る。全ての互変異性体は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドの範囲内に含まれる。また、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドは、非溶媒和物としても、水、エタノールなどの薬剤として許容される溶媒との溶媒和物としても、存在し得る。本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドの溶媒和物も、本明細書に開示されているとみなす。
【０１６０】
（非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチド並びに前記化合物を生成する試薬を含めて、但しこれらだけに限定されない）本明細書の化合物の一部は、幾つかの互変異性型として存在し得る。全てのかかる互変異性型を、本明細書に記載の組成物の一部とみなす。また、例えば、本明細書に記載の（非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチド並びに前記化合物を生成する試薬を含めて、但しこれらだけに限定されない）任意の化合物の全エノール−ケト形も本明細書に記載の組成物の一部とみなす。
【０１６１】
（非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチド並びに上記化合物のいずれかを生成する試薬を含めて、但しこれらだけに限定されない）本明細書の化合物の一部は、酸性であり、薬剤として許容される陽イオンと塩を形成し得る。（非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチド並びに前記化合物を生成する試薬を含めて、但しこれらだけに限定されない）本明細書の化合物の一部は、塩基性であり得、したがって、薬剤として許容される陰イオンと塩を形成し得る。二塩（ｄｉ−ｓａｌｔ）を含めて、全てのかかる塩は、本明細書に記載の組成物の範囲内であり、従来の方法によって調製することができる。例えば、塩は、酸性の物質と塩基性の物質を水溶液、非水系媒体又は一部水系の媒体中で接触させることによって調製することができる。塩は、以下の技術、すなわち、ろ過、非溶媒による沈殿とそれに続くろ過、溶媒蒸発、又は水溶液の場合には凍結乾燥の少なくとも１つを用いて回収される。
【０１６２】
本明細書に開示する非天然アミノ酸ポリペプチドの薬剤として許容される塩は、親非天然アミノ酸ポリペプチド中に存在する酸性プロトンが金属イオン、例としてアルカリ金属イオン、アルカリ土類イオン若しくはアルミニウムイオンで置換されたときに、又は有機塩基と配位結合したときに、形成され得る。また、開示する非天然アミノ酸ポリペプチドの塩は、出発材料又は中間体の塩を用いて調製することができる。本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドは、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドの遊離塩基型を薬剤として許容される無機酸又は有機酸と反応させることによって、（薬剤として許容される塩の一タイプである）薬剤として許容される酸付加塩として調製することができる。或いは、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドは、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドの遊離酸型を薬剤として許容される無機塩基又は有機塩基と反応させることによって、（薬剤として許容される塩の一タイプである）薬剤として許容される塩基付加塩として調製することができる。
【０１６３】
薬剤として許容され塩のタイプとしては、（１）塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸又は酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、シクロペンタンプロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、乳酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、３−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、１，２−エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、４−メチルビシクロ−［２．２．２］オクタ−２−エン−１−カルボン酸、グルコヘプトン酸、４，４’−メチレンビス−（３−ヒドロキシ−２−エン−１−カルボン酸）、３−フェニルプロピオン酸、トリメチル酢酸、第三級ブチル酢酸、ラウリル硫酸、グルコン酸、グルタミン酸、ヒドロキシナフトエ酸、サリチル酸、ステアリン酸、ムコン酸などの有機酸と一緒に形成される酸付加塩、（２）親化合物中に存在する酸性プロトンが、金属イオン、例えば、アルカリ金属イオン、アルカリ土類イオン若しくはアルミニウムイオンで置換されたときに、又は有機塩基と配位結合したときに、形成される塩などが挙げられるが、これらだけに限定されない。許容される有機塩基としては、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎ−メチルグルカミンなどが挙げられる。許容される無機塩基としては、水酸化アルミニウム、水酸化カルシウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウムなどが挙げられる。
【０１６４】
非天然アミノ酸ポリペプチドの薬剤として許容される塩の対応する対イオンは、イオン交換クロマトグラフィー、イオンクロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動法、誘導結合プラズマ、原子吸光分析法、質量分析法又はこれらの任意の組み合わせを含めて、但しこれらだけに限定されない種々の方法によって、分析し、同定することができる。また、かかる非天然アミノ酸ポリペプチドの薬剤として許容される塩の治療活性は、実施例８７−９１に記載の技術及び方法によって試験することができる。
【０１６５】
塩という表記は、その溶媒付加型又は結晶型、特に溶媒和化合物又は多形体を含むことを理解すべきである。溶媒和化合物は、化学量論的又は非化学量論的な量の溶媒を含み、水、エタノールなど薬剤として許容される溶媒を用いた結晶化プロセス中に形成されることが多い。水和物は、溶媒が水であるときに形成される。アルコラートは、溶媒がアルコールであるときに形成される。多形体は、化合物の同じ元素組成の異なる結晶充填配置を含む。多形体は、通常、異なるＸ線回折パターン、赤外スペクトル、融点、密度、硬度、結晶形、光学的性質、電気的性質、安定性及び溶解性を有する。再結晶溶媒、結晶化速度、保存温度などの種々の要因によって、ある単結晶体が支配的になり得る。
【０１６６】
非天然アミノ酸ポリペプチドの薬剤として許容される塩の多形体及び／又は溶媒和化合物のスクリーニング及びキャラクタリゼーションは、熱分析、ｘ線回折、分光法、蒸気収着及び顕微鏡法を含めて、但しこれらだけに限定されない種々の技術によって実施することができる。熱分析法は、熱化学分解又は多形転移を含めて、但しこれだけに限定されない熱物理プロセスを扱う。かかる方法を用いて、多形体間の関係を分析し、重量減少を測定し、ガラス転移温度を見つけ、又は賦形剤の相溶性を試験する。かかる方法としては、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、変調型示差走査熱量測定（ＭＤＣＳ）、熱重量分析（ＴＧＡ）及び熱重量赤外分析（ＴＧ／ＩＲ）が挙げられるが、これらだけに限定されない。Ｘ線回折方法は、単結晶及び粉末回折計及びシンクロトロン放射光源を含むが、これらだけに限定されない。使用される種々の分光学的技術としては、ラマン、ＦＴＩＲ、ＵＶＩＳ及びＮＭＲ（液体及び固体）が挙げられるが、これらだけに限定されない。種々の顕微鏡法技術としては、偏光顕微鏡法、エネルギー分散型Ｘ線分析（ＥＤＸ）を備えた走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、ＥＤＸを備えた環境制御型走査電子顕微鏡（気体又は水蒸気雰囲気）、ＩＲ顕微鏡法及びラマン顕微鏡法が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０１６７】
本発明の方法及び組成物の特徴及び利点は、本発明者らの方法、組成物、デバイス及び装置の原理を利用した、説明のための実施形態を記載する以下の詳細な説明並びに添付図面を参照してさらに理解されよう。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１６８】
Ｉ．  序
最近、タンパク質科学における全く新しい技術が報告された。この技術は、タンパク質の部位特異的な修飾に関連する制約の多くを克服する見込みがある。具体的には、新しい成分が、原核生物エシェリキア  コリ（Ｅ．コリ）（例えば、Ｌ．  Ｗａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，（２００１），  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００）及び真核生物サッカロミセス  セレビシエ（Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｓ．セレビシエ）（例えば、Ｊ．  Ｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：９６４−７（２００３））のタンパク質生合成機構に追加された。この成分は、非天然アミノ酸をタンパク質にインビボで組み込むことができる。光親和性標識並びに光異性化可能なアミノ酸、ケトアミノ酸及びグリコシル化アミノ酸を含めて、新規な化学的、物理的又は生物学的諸性質を有する幾つかの新しいアミノ酸が、この方法を用いて、アンバーコドンＴＡＧに応じて、Ｅ．コリ及び酵母中のタンパク質に高い忠実度で効率的に組み込まれる。例えば、（参照によりその全体を本明細書に組みこむ）Ｊ．Ｗ．  Ｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２），  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２４：９０２６−９０２７、（参照によりその全体を本明細書に組みこむ）Ｊ．Ｗ．  Ｃｈｉｎ，  ＆  Ｐ．Ｇ．  Ｓｃｈｕｌｔｚ，  （２００２），  ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ３（１１）：１１３５−１１３７、（参照によりその全体を本明細書に組みこむ）Ｊ．Ｗ．  Ｃｈｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２），  ＰＮＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９９（１７）：１１０２０−１１０２４及び（参照によりその全体を本明細書に組みこむ）Ｌ．  Ｗａｎｇ，  ＆  Ｐ．Ｇ．  Ｓｃｈｕｌｔｚ，  （２００２），  Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍ．  １−１１を参照されたい。これらの研究によれば、タンパク質中に存在せず、２０種類の一般的な遺伝的にコードされたアミノ酸中の官能基の全部に対して化学的に不活性であり、効率的かつ選択的に反応して安定な共有結合を形成するのに使用することができる、化学官能基を常法に従って選択的に導入することができる。
【０１６９】
ＩＩ．  概要
図１は、本明細書に記載の組成物、方法及び技術の概要である。一レベルにおいて、少なくとも１個の非天然アミノ酸又はカルボニル、ジカルボニル、オキシム若しくはヒドロキシルアミン基を有する修飾非天然アミノ酸を含むポリペプチドを生成し、使用するツール（方法、組成物、技術）を本明細書に記載する。かかる非天然アミノ酸は、さらに、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコール誘導体；光架橋剤；細胞傷害性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質又はポリペプチド又はポリペプチドアナログ；抗体又は抗体断片；金属キレート剤；補因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；糖類、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；フルオロフォア、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的又は非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；化学線放射によって励起可能な部分；リガンド；光異性化可能部分；ビオチン；ビオチンアナログ；重原子を組み込んだ部分；化学開裂可能な基；光開裂可能な基；長い側鎖；炭素連結糖；レドックス活性薬剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識部分；生物物理学的プローブ；リン光基；化学発光基；高電子密度基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤（この場合、生物活性剤は治療活性を有する薬剤を含むことができ、非天然アミノ酸ポリペプチド又は修飾非天然アミノ酸は、付属の治療薬の同時治療（ｃｏ−ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）薬として、又は治療薬を生物内の所望の部位に送達する手段として役立ち得る。）；検出可能標識；小分子；抑制性リボ核酸；放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチン誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；アブザイム、活性錯体活性化物質、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルガン、アンギオスタチン、抗ホルモン、抗酸化剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、巨大分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル及びこれらの任意の組み合わせを含めて、但しこれらだけに限定されない官能基を含むことができる。種々の上記官能基は、１つの官能性の構成要素を別の官能性の構成要素として分類することができないということを意味しないことに留意されたい。実際、特定の状況に応じて重複がある。単なる例として、水溶性ポリマーはポリエチレングリコール誘導体と範囲が重複するが、この重複は不完全であり、したがって両方の官能基を上に示した。
【０１７０】
図１に示すように、一態様においては、本明細書の方法、組成物及び技術によって修飾されるポリペプチドを選択及び設計する方法である。新しいポリペプチドは、単なる例として、ハイスループットスクリーニングプロセス（この場合、多数のポリペプチドを設計し、合成し、特徴付け、及び／又は試験することができる。）の一部として、又は研究者の興味に基づいて、新規に設計することができる。新しいポリペプチドは、公知の、又はある程度特徴付けられた、ポリペプチドの構造に基づいて設計することもできる。単なる例として、成長ホルモン遺伝子スーパーファミリー（下記参照）は、科学界によって熱心に研究されている対象である。新しいポリペプチドは、この遺伝子スーパーファミリーの構成要素の構造に基づいて設計することができる。置換及び／又は修飾するアミノ酸を選択する原理を本明細書に別個に記載する。使用する修飾の選択も本明細書に記載されており、実験者又はエンドユーザーの要望に合致するように使用することができる。かかる要望としては、ポリペプチドの治療有効性の操作、ポリペプチドの安全性プロファイルの改善、単なる例として、水溶性の増大、生物学的利用能、血清半減期の延長、治療上の半減期の延長、免疫原性の調節、生物活性の調節、循環時間の延長などのポリペプチドの薬物動態学、薬理学及び／又は薬力学の調節が挙げられるが、これらだけに限定されない。また、かかる修飾としては、単なる例として、ポリペプチドへの追加の官能基の付与、ポリペプチドへのタグ、標識又は検出可能シグナルの組み込み、ポリペプチドの単離特性の容易化、及び前記修飾の任意の組み合わせが挙げられる。
【０１７１】
オキシム、カルボニル、ジカルボニル又はヒドロキシルアミン基を含むように修飾された、又は修飾することができる、非天然アミノ酸も本明細書に記載する。かかる非天然アミノ酸を製造し、精製し、特徴付け、使用する方法は、この態様に含まれる。本明細書に記載の別の態様においては、少なくとも１個のかかる非天然アミノ酸をポリペプチドに組み込む方法、戦略及び技術である。少なくとも１個のかかる非天然アミノ酸を含むかかるポリペプチドを製造し、精製し、特徴付け、使用する方法もこの態様に含まれる。少なくとも１個の非天然アミノ酸を含むポリペプチドを少なくとも部分的に製造するのに使用することができる、（ＤＮＡ及びＲＮＡを含めた）オリゴヌクレオチドの組成物及び該オリゴヌクレオチドを製造し、精製し、特徴付け、使用する方法もこの態様に含まれる。少なくとも１個の非天然アミノ酸を含むポリペプチドを少なくとも部分的に製造するのに使用することができる、かかるオリゴヌクレオチドを発現することができる細胞の組成物及び該細胞を製造し、精製し、特徴付け、使用する方法もこの態様に含まれる。
【０１７２】
したがって、少なくとも１個の非天然アミノ酸又はカルボニル、ジカルボニル、オキシム若しくはヒドロキシルアミン基を有する修飾非天然アミノ酸を含むポリペプチドを提供し、本明細書に記載する。ある実施形態においては、少なくとも１個の非天然アミノ酸又はカルボニル、ジカルボニル、オキシム若しくはヒドロキシルアミン基を有する修飾非天然アミノ酸を含むポリペプチドは、ポリペプチド上のある位置において少なくとも１つの翻訳後修飾を含む。一部の実施形態においては、共翻訳又は翻訳後修飾は、細胞機構を介して起こる（例えば、グリコシル化、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミチン酸付加、リン酸化、糖脂質リンケージ修飾など。）。多くの場合、かかる細胞機構に基づく共翻訳又は翻訳後修飾は、ポリペプチド上の天然アミノ酸部位で起こる。しかし、ある実施形態においては、細胞機構に基づく共翻訳又は翻訳後修飾は、ポリペプチド上の非天然アミノ酸部位で起こる。
【０１７３】
他の実施形態においては、翻訳後修飾は、細胞機構を利用しないが、代わりに、本明細書に記載の化学反応方法、又は特定の反応基に適切な他の方法を利用した、第２の反応基を含む（標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコール誘導体；光架橋剤；細胞傷害性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質又はポリペプチド又はポリペプチドアナログ；抗体又は抗体断片；金属キレート剤；補因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；糖類、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；フルオロフォア、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的又は非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；化学線放射によって励起可能な部分；リガンド；光異性化可能部分；ビオチン；ビオチンアナログ；重原子を組み込んだ部分；化学開裂可能な基；光開裂可能な基；長い側鎖；炭素連結糖；レドックス活性薬剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識部分；生物物理学的プローブ；リン光基；化学発光基；高電子密度基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能標識；小分子；抑制性リボ核酸、放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチン誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；アブザイム、活性錯体活性化物質、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルガン、アンギオスタチン、抗ホルモン、抗酸化剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、巨大分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル及びこれらの任意の組み合わせを含めて、但しこれらだけに限定されない）分子と（ケトン、アルデヒド、アセタール、ヘミアセタール、オキシム又はヒドロキシルアミン官能基を含む非天然アミノ酸を含めて、但しこれらだけに限定されない）第１の反応基を含む少なくとも１個の非天然アミノ酸との結合によって官能性が付与される。ある実施形態においては、共翻訳又は翻訳後修飾は、真核細胞又は非真核細胞においてインビボでなされる。ある実施形態においては、翻訳後修飾は、細胞機構を利用しないでインビトロでなされる。少なくとも１個のかかる共翻訳修飾又は翻訳後修飾非天然アミノ酸を含むかかるポリペプチドを製造し、精製し、特徴付け、使用する方法もこの態様に含まれる。
【０１７４】
ポリペプチドの一部である（カルボニル基、ジカルボニル基、オキシム基、ヒドロキシルアミン基又はこれらのマスク若しくは保護された基を含む）非天然アミノ酸と反応して、上記翻訳後修飾のいずれかを生じることができる試薬も本明細書の方法、組成物、戦略及び技術の範囲内である。一般に、生成した翻訳後修飾非天然アミノ酸は、少なくとも１個のオキシム基を含む。生成した修飾オキシム含有非天然アミノ酸は、それに続いて修飾反応を受けることがある。かかる非天然アミノ酸の任意のかかる翻訳後修飾が可能であるかかる試薬を製造し、精製し、特徴付け、使用する方法もこの態様に含まれる。
【０１７５】
ある実施形態においては、ポリペプチドは、１つの宿主細胞によってインビボでなされる少なくとも１つの共翻訳又は翻訳後修飾を含む。ここで、翻訳後修飾は、通常、別の宿主細胞タイプによってなされない。ある実施形態においては、ポリペプチドは、真核細胞によってインビボでなされる少なくとも１つの共翻訳又は翻訳後修飾を含む。ここで、翻訳後修飾は、通常、非真核細胞によってなされない。かかる共翻訳又は翻訳後修飾の例としては、グリコシル化、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミチン酸付加、リン酸化、糖脂質リンケージ修飾などが挙げられるが、これらだけに限定されない。一実施形態においては、共翻訳又は翻訳後修飾は、（オリゴ糖が（ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ）２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃなどを含む場合を含めて、但しこれだけに限定されない）オリゴ糖とアスパラギンとのＧｌｃＮＡｃ−アスパラギンリンケージによる結合を含む。別の実施形態においては、共翻訳又は翻訳後修飾は、（Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃなどを含めて、但しこれらだけに限定されない）オリゴ糖とセリン又はトレオニンとのＧａｌＮＡｃ−セリン、ＧａｌＮＡｃ−トレオニン、ＧｌｃＮＡｃ−セリン又はＧｌｃＮＡｃ−トレオニンリンケージによる結合を含む。ある実施形態においては、タンパク質又はポリペプチドは、分泌又は局在性配列、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴ融合などを含むことができる。少なくとも１つのかかる共翻訳修飾又は翻訳後修飾を含むかかるポリペプチドを製造し、精製し、特徴付け、使用する方法もこの態様に含まれる。他の実施形態においては、グリコシル化非天然アミノ酸ポリペプチドは、非グリコシル化型で生成する。グリコシル化非天然アミノ酸のかかる非グリコシル化型は、単離された、若しくは実質的に精製された、若しくは未精製のグリコシル化非天然アミノ酸ポリペプチドからのオリゴ糖基の化学若しくは酵素除去と、かかる非天然アミノ酸ポリペプチドをグリコシル化しない宿主中での非天然アミノ酸の産生（かかる宿主は、かかるポリペプチドをグリコシル化しないように操作又は変異された原核生物又は真核生物を含む。）と、かかる非天然アミノ酸ポリペプチドを通常グリコシル化する真核生物によってかかるポリペプチドが産生されている細胞培地へのグリコシル化阻害剤の導入とを含む方法、又は任意のかかる方法の組み合わせによって生成し得る。通常グリコシル化される非天然アミノ酸ポリペプチドのかかる非グリコシル化型も本明細書に記載する（通常グリコシル化されるとは、天然のポリペプチドがグリコシル化される条件下で産生されたときにグリコシル化されるポリペプチドを意味する。）。通常グリコシル化される非天然アミノ酸ポリペプチド（又は実際は本明細書に記載の任意のポリペプチド）のかかる非グリコシル化型は、未精製型でも、実質的精製型でも、単離型でもよいことは言うまでもない。
【０１７６】
ある実施形態においては、非天然アミノ酸ポリペプチドは、促進剤の存在下でなされる少なくとも１つの翻訳後修飾を含む。ここで、翻訳後修飾は、化学量論的、化学量論様、又はほぼ化学量論的である。他の実施形態においては、ポリペプチドを促進剤の存在下で式（ＸＩＸ）の試薬と接触させる。他の実施形態においては、促進剤は、
【０１７７】
【化６３】
0005425398.tif 000003
からなる群から選択される。
【０１７８】
非天然アミノ酸含有ポリペプチドは、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個又は１０個以上のカルボニル基、ジカルボニル基、オキシム基、ヒドロキシルアミン基又はこれらの保護された基を含む非天然アミノ酸を含み得る。非天然アミノ酸は、同じでも異なっていてもよい。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上の異なる非天然アミノ酸を含むタンパク質中には１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上の異なる部位が存在し得る。ある実施形態においては、タンパク質の天然種中に存在する少なくとも１個の、但し全部よりは少ない、特定のアミノ酸は、非天然アミノ酸で置換されている。
【０１７９】
本明細書で提供し、記載する方法及び組成物は、カルボニル基、ジカルボニル基、オキシム基、ヒドロキシルアミン基又はこれらの保護若しくはマスクされた基を含む少なくとも１個の非天然アミノ酸を含むポリペプチドを含む。少なくとも１個の非天然アミノ酸をポリペプチドに導入することによって、一般に存在する２０種類のアミノ酸とは反応しないが、１種類以上の非天然アミノ酸との反応を含めて、但しこれだけに限定されない特異的化学反応を含む共役化学反応（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｉｅｓ）を適用することができる。非天然アミノ酸側鎖は、組み込み後、本明細書に記載の化学反応方法、又は天然にコードされたアミノ酸中に存在する特定の官能基若しくは置換基に適切な化学反応方法を利用して、修飾することもできる。
【０１８０】
本明細書に記載の非天然アミノ酸の方法及び組成物は、多種多様な官能基、置換基又は部分を有する物質と、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコール誘導体；光架橋剤；細胞傷害性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質又はポリペプチド又はポリペプチドアナログ；抗体又は抗体断片；金属キレート剤；補因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；糖類、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；フルオロフォア、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的又は非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；化学線放射によって励起可能な部分；リガンド；光異性化可能部分；ビオチン；ビオチンアナログ；重原子を組み込んだ部分；化学開裂可能な基；光開裂可能な基；長い側鎖；炭素連結糖；レドックス活性薬剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識部分；生物物理学的プローブ；リン光基；化学発光基；高電子密度基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能標識；小分子；抑制性リボ核酸、放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチン誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；アブザイム、活性錯体活性化物質、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルガン、アンギオスタチン、抗ホルモン、抗酸化剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、巨大分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル及びこれらの任意の組み合わせを含めて、但しこれらだけに限定されない他の物質との複合物を与える。
【０１８１】
ある実施形態においては、式（Ｉ）−（ＸＸＸＩＩＩ）の化合物を含めて、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、リンカー及び試薬は、（ｐＨ２から８を含めて、但しこれらだけに限定されない）弱酸性条件下の水溶液中で安定である。他の実施形態においては、かかる化合物は弱酸性条件下で少なくとも１ヵ月間安定である。他の実施形態においては、かかる化合物は弱酸性条件下で少なくとも２週間安定である。他の実施形態においては、かかる化合物は弱酸性条件下で少なくとも５日間安定である。
【０１８２】
本明細書に記載の組成物、方法、技術及び戦略の別の態様においては、上記「修飾又は非修飾」非天然アミノ酸ポリペプチドのいずれかを試験又は使用する方法である。単なる例として、「修飾又は非修飾」非天然アミノ酸ポリペプチド又はタンパク質を含むポリペプチドから利点を得る、治療、診断、アッセイ、工業、美容、植物生物学、環境、エネルギー生成、消費者製品及び／又は軍事の各用途はこの態様に含まれる。
【０１８３】
ＩＩＩ．  ポリペプチド中の非天然アミノ酸の位置
本明細書の方法及び組成物は、ポリペプチドへの１個以上の非天然アミノ酸の組み込みを含む。１個以上の非天然アミノ酸を、ポリペプチドの活性を乱さない１箇所以上の特定の位置に組み込むことができる。これは、疎水性アミノ酸を非天然又は天然疎水性アミノ酸で、かさ高いアミノ酸を非天然又は天然のかさ高いアミノ酸で、親水性アミノ酸を非天然又は天然の親水性アミノ酸で置換することを含めて、但しこれらだけに限定されない「保存的」置換をすること）及び／又は活性に不要である位置に非天然アミノ酸を挿入することによって実施することができる。
【０１８４】
種々の生化学的及び構造的手法を使用して、ポリペプチド中の非天然アミノ酸による置換に対して所望の部位を選択することができる。ポリペプチド鎖のあらゆる位置が非天然アミノ酸を組み込むための選択に適切である。選択は、合理的設計に基づくことができ、又は任意の特定の所望の目的で、若しくは特定の所望の目的なしに、無作為な選択によることができる。所望の部位の選択は、作動物質、スーパーアゴニスト、部分作動物質、逆作動物質、拮抗物質、受容体結合調節物質、受容体活性調節物質、結合剤パートナーに対する結合調節物質、結合パートナー活性調節物質、結合パートナー立体配座調節物質、２量体若しくは多量体形成、未変性分子と比較して活性若しくは特性に変化がないこと、又は溶解性、凝集、安定性などポリペプチドの任意の物理的若しくは化学的性質を操作することを含めて、但しこれらだけに限定されない任意の所望の特性又は活性を有する（さらに修飾することができる、又は未修飾のままにすることができる）非天然アミノ酸ポリペプチドの産生に基づくことができる。例えば、ポリペプチドの生物活性に必要なポリペプチド中の位置は、点変異分析、アラニンスキャンニング又はホモログスキャンニング方法を含めて、但しこれらだけに限定されない方法によって特定することができる。アラニン又はホモログスキャンニング変異誘発を含めて、但しこれらだけに限定されない方法によって生物活性に極めて重要であると確認された残基以外の残基は、ポリペプチドに求められる所望の活性に応じて、非天然アミノ酸による置換の良好な候補となり得る。或いは、生物活性に極めて重要であると確認された部位も、やはりポリペプチドに求められる所望の活性に応じて、非天然アミノ酸による置換の良好な候補となり得る。別の選択肢は、ポリペプチド鎖上の各位置において、非天然アミノ酸で単に連続置換し、ポリペプチドの活性に対する効果を観察することである。任意のポリペプチド中への非天然アミノ酸による置換に対する位置を選択する任意の手段、技術又は方法は、本明細書の方法、技術及び組成物における使用に適切である。
【０１８５】
欠失を含むポリペプチドの天然変異体の構造及び活性を検討して、非天然アミノ酸による置換が許容される可能性があるタンパク質の領域を決定することもできる。非天然アミノ酸による置換を許容しない可能性がある残基が除去された後に、残りの位置の各々において計画される置換の影響は、関連するポリペプチド及び任意の会合したリガンド又は結合タンパク質の３次元構造を含めて、但しこれだけに限定されない方法によって検討することができる。多数のポリペプチドのＸ線結晶学的構造及びＮＭＲ構造は、タンパク質及び核酸の大分子の３次元構造データを含む集中データベースであるＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ、ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）において利用可能である。このデータベースを用いて、非天然アミノ酸で置換することができるアミノ酸位置を特定することができる。また、３次元構造データを利用できない場合には、ポリペプチドの二次及び三次構造を検討するモデルを作成することができる。したがって、非天然アミノ酸で置換することができるアミノ酸位置を容易に特定することができる。
【０１８６】
非天然アミノ酸の例示的な組み込み部位としては、受容体結合領域候補から除外される部位が挙げられるが、これらだけに限定されない。又は結合タンパク質若しくはリガンドとの結合領域は、完全に、若しくは部分的に、溶媒に曝すことができ、近傍の残基と最小限の水素結合相互作用をし、若しくは水素結合相互作用をせず、近傍の反応性残基への暴露が最小限に抑えられ、及び／又は特定のポリペプチドとその会合受容体、リガンド若しくは結合タンパク質の３次元結晶構造によって予測されるように極めて柔軟である領域であり得る。
【０１８７】
多種多様な非天然アミノ酸は、ポリペプチド中の所与の位置を置換することができ、又は所与の位置に組み込むことができる。例として、特定の非天然アミノ酸は、ポリペプチドとその会合リガンド、受容体及び／又は結合タンパク質の３次元結晶構造の検討、保存的置換の優先度に基づいて、組み込み用に選択することができる。
【０１８８】
一実施形態においては、本明細書の方法は、ポリペプチドに非天然アミノ酸（ここで、該非天然アミノ酸は第１の反応基を含む。）を組み込むことと、ポリペプチドを、第２の反応基を含む（標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコール誘導体；光架橋剤；細胞傷害性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質又はポリペプチド又はポリペプチドアナログ；抗体又は抗体断片；金属キレート剤；補因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；糖類、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；フルオロフォア、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的又は非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；化学線放射によって励起可能な部分；リガンド；光異性化可能部分；ビオチン；ビオチンアナログ；重原子を組み込んだ部分；化学開裂可能な基；光開裂可能な基；長い側鎖；炭素連結糖；レドックス活性薬剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識部分；生物物理学的プローブ；リン光基；化学発光基；高電子密度基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能標識；小分子；抑制性リボ核酸、放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチン誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；アブザイム、活性錯体活性化物質、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルガン、アンギオスタチン、抗ホルモン、抗酸化剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、巨大分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル及びこれらの任意の組み合わせを含めて、但しこれらだけに限定されない）分子と接触させることとを含む。ある実施形態においては、第１の反応基はカルボニル又はジカルボニル部分であり、第２の反応基はヒドロキシルアミン部分であり、それによってオキシムリンケージが形成される。ある実施形態においては、第１の反応基はヒドロキシルアミン部分であり、第２の反応基はカルボニル又はジカルボニル部分であり、それによってオキシムリンケージが形成される。ある実施形態においては、第１の反応基はカルボニル又はジカルボニル部分であり、第２の反応基はオキシム部分であり、それによってオキシム交換反応が起こる。ある実施形態においては、第１の反応基はオキシム部分であり、第２の反応基はカルボニル又はジカルボニル部分であり、それによってオキシム交換反応が起こる。
【０１８９】
非天然アミノ酸の置換又は組み込みは、ポリペプチド内の他の付加、置換又は欠失と一緒に、他の化学的、物理的、薬理的及び／又は生物学的形質に影響を及ぼす場合がある。他の付加、置換又は欠失は、ポリペプチドの（耐タンパク質分解性を含めて、但しこれだけに限定されない）安定性を増大させることができ、又はその適切な受容体、リガンド及び／又は結合タンパク質に対するポリペプチドの親和性を増大させることができる場合がある。他の付加、置換又は欠失は、ポリペプチドの（Ｅ．コリ又は他の宿主細胞中で発現されるときを含めて、但しこれだけに限定されない）溶解性を増大させることができる場合がある。一部の実施形態においては、部位は、Ｅ．コリ又は他の組換え宿主細胞中の発現後のポリペプチド溶解性を増大させる目的で、非天然アミノ酸を組み込む別の部位に加えて、天然にコードされたアミノ酸又は非天然アミノ酸との置換用に選択される。一部の実施形態においては、ポリペプチドは、会合リガンド、結合タンパク質及び／又は受容体に対する親和性を変化させる、受容体２量体化を（増加又は減少を含めて、但しこれらだけに限定されない）変化させる、受容体２量体を安定化する、循環半減期を変化させる、放出若しくは生物学的利用能を変化させる、精製を促進する、又は特定の投与経路を改善若しくは変更する、別の付加、置換若しくは欠失を含む。同様に、非天然アミノ酸ポリペプチドは、化学若しくは酵素切断配列、プロテアーゼ切断配列、反応基、（ＦＬＡＧ又はｐｏｌｙ−Ｈｉｓを含めて、但しこれらだけに限定されない）抗体−結合ドメイン、（ＦＬＡＧ、ｐｏｌｙ−Ｈｉｓ、ＧＳＴなどを含めて、但しこれらだけに限定されない）他の親和性に基づく配列、又はポリペプチドの（ＧＦＰを含めて、但しこれだけに限定されない）検出、精製、組織若しくは細胞膜を通した輸送、プロドラッグの放出若しくは活性化、サイズ縮小、若しくは他の形質を改善する（ビオチンを含めて、但しこれだけに限定されない）連結分子を含むことができる。
【０１９０】
ＩＶ．  代表例としての成長ホルモンスーパー遺伝子ファミリー
本明細書の方法、組成物、戦略及び技術は、ポリペプチド又はタンパク質の特定のタイプ、クラス又はファミリーに限定されない。実際、実質的にあらゆるポリペプチドを、設計することができ、又は本明細書に記載の少なくとも１個の「修飾又は非修飾」非天然アミノ酸を含むように修飾することができる。単なる例として、ポリペプチドは、アルファ−１抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、抗体断片、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学走化性タンパク質−１、単球化学走化性タンパク質−２、単球化学走化性タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１アルファ、単球炎症性タンパク質−１ベータ、ＲＡＮＴＥＳ、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン、上皮性好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮性好中球活性化ペプチド、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、剥脱性毒素、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、４本ヘリックスバンドルタンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、性腺刺激ホルモン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１受容体、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールツリン、好中球抑制因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、癌遺伝子産物、パラシトニン（ｐａｒａｃｉｔｏｎｉｎ）、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン、Ａタンパク質、Ｇタンパク質、ｐｔｈ、発熱性外毒素Ａ、発熱性外毒素Ｂ、発熱性外毒素Ｃ、ｐｙｙ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、小さな生合成タンパク質、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ��、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群毒素、チモシンアルファ１、組織プラスミノゲンアクチベーター、腫よう成長因子（ＴＧＦ）、腫よう壊死因子、腫よう壊死因子アルファ、腫よう壊死因子ベータ、腫よう壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４タンパク質、ＶＣＡＭ−１タンパク質、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体及びコルチコステロンからなる群から選択される治療用タンパク質と相同であり得る。
【０１９１】
したがって、成長ホルモン（ＧＨ）スーパー遺伝子ファミリーの以下の記述は、説明のための単なる例であり、本明細書の方法、組成物、戦略及び技術の範囲を限定するものではない。また、本願においてＧＨポリペプチドという表記は、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーの任意の構成要素の一例としての総称を使用するものである。したがって、ＧＨポリペプチド又はタンパク質に関連して本明細書に記載する修飾及び化学反応は、本明細書に具体的に記載する構成要素を含めて、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーのあらゆる構成要素に等しく適用することができると理解される。
【０１９２】
以下のタンパク質は、成長ホルモン（ＧＨ）スーパー遺伝子ファミリーの遺伝子によってコードされるタンパク質（Ｂａｚａｎ，  Ｆ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １１：  ３５０−３５４（１９９０）；Ｂａｚａｎ，  Ｊ．Ｆ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：４１０−４１１（１９９２）；Ｍｏｔｔ，  Ｈ．Ｒ．  ａｎｄ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，  Ｉ．Ｄ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５：１１４−１２１（１９９５）；Ｓｉｌｖｅｎｎｏｉｎｅｎ，  Ｏ．  ａｎｄ  Ｉｈｌｅ，  Ｊ．Ｎ．，  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ（１９９６））：成長ホルモン、プロラクチン、胎盤性ラクトーゲン、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２（ｐ３５サブユニット）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、オンコスタチンＭ、毛様体神経栄養因子、白血病抑制因子、アルファインターフェロン、ベータインターフェロン、イプシロンインターフェロン、ガンマインターフェロン、オメガインターフェロン、タウインターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）及びカルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）を含む（「ＧＨスーパー遺伝子ファミリー」）。この遺伝子ファミリーの追加の構成要素は、遺伝子クローニング及び配列決定によって将来確認されると予測される。ＧＨスーパー遺伝子ファミリーの各構成要素は、一般にアミノ酸又はＤＮＡの配列同一性が限られているにもかかわらず、類似の二次及び三次構造を有する。構造上の特徴を共有することによって、遺伝子ファミリーの新しい構成要素を容易に特定することができ、本明細書に記載の非天然アミノ酸の方法及び組成物を同様に適用することができる。
【０１９３】
Ｇ−ＣＳＦ（Ｚｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ３１４：４３５（１９９２）；Ｚｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：８４５３（１９９４）；Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：５１６７（１９９３））、ＧＭ−ＣＳＦ（Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓ，  Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５４：１７７９−１７８２（１９９１）；Ｗａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２４：１０７５−１０８５（１９９２））、ＩＬ−２（Ｂａｚａｎ，  Ｊ．Ｆ．  ａｎｄ  ＭｃＫａｙ，  Ｄ．Ｂ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：４１０−４１３（１９９２）；ＩＬ−４（Ｒｅｄｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１１０２９−１１０３５（１９９１）；Ｐｏｗｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１６７３−１６７７（１９９２））及びＩＬ−５（Ｍｉｌｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：１７２−１７６（１９９３））を含めて、幾つかのサイトカインの構造は、Ｘ線回折及びＮＭＲ測定によって求められ、有意な一次配列相同性がないにもかかわらず、ＧＨ構造と共に顕著に保存されている。ＩＦＮは、モデリング及び他の研究（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．  １５：３４１（１９９５）；Ｍｕｒｇｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １７：６２（１９９３）；Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４：１４５３（１９９６）；Ｋｌａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２７４：６６１（１９９７））に基づいてこのファミリーの構成要素であると考えられる。毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、トロンボポイエチン（ＴＰＯ）、オンコスタチンＭ、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５及び顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）並びにアルファ、ベータ、オメガ、タウ、イプシロン及びガンマインターフェロンなどのＩＦＮを含めて、多数の追加のサイトカイン及び成長因子がこのファミリーに属する（Ｍｏｔｔ  ａｎｄ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５：１１４−１２１（１９９５）；Ｓｉｌｖｅｎｎｏｉｎｅｎ  ａｎｄ  Ｉｈｌｅ（１９９６）  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓに概説されている。）。上記サイトカイン及び成長因子の全てが、１つの大きい遺伝子ファミリーを構成すると現在は考えられている。
【０１９４】
類似の二次及び三次構造を共有することに加えて、このファミリーの各構成要素は、細胞表面受容体をオリゴマー化して、細胞内シグナル伝達経路を必ず活性化する特性を共有する。ＧＨ及びＥＰＯを含めて、但しこれらだけに限定されない一部のＧＨファミリー構成要素は、単一の受容体タイプと結合し、ホモ２量体を形成する。ＩＬ−２、ＩＬ４及びＩＬ−６を含めて、但しこれらだけに限定されない他のファミリー構成要素は、１つを超える受容体タイプと結合し、ヘテロ２量体又はより高次の集合を形成する（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：１８０５−１８０８；Ｐａｏｎｅｓｓａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １４：１９４２−１９５１；Ｍｏｔｔ  ａｎｄ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５：１１４−１２１（１９９５））。変異誘発試験によれば、ＧＨ同様、これらの他のサイトカイン及び成長因子は、複数、典型的には２箇所の受容体結合部位を含み、その同族の受容体と逐次結合する（Ｍｏｔｔ  ａｎｄ  Ｃａｍｐｂｅｌｌ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５：１１４−１２１（１９９５）；Ｍａｔｔｈｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：９４７１−９４７６）。ＧＨ同様、これらの他のファミリー構成要素の一次受容体結合部位は、４本のアルファヘリックス及びＡ−Ｂループ中に主に存在する。受容体結合に関与するヘリックスバンドル中の特定のアミノ酸は、ファミリー構成要素間で異なる。ＧＨスーパー遺伝子ファミリーの構成要素と相互作用する細胞表面受容体の大部分は、構造的に関係し、第２の大きい多重遺伝子族を構成する。例えば、参照によりその全体を本明細書に組みこむ米国特許第６，６０８，１８３号を参照されたい。
【０１９５】
ＧＨスーパー遺伝子ファミリーの種々の構成要素の変異研究から得られる一般的結論は、アルファヘリックスを連結するループは、一般に、受容体結合に関与しない傾向にあるということである。特に、短いＢ−Ｃループは、全部と言わないまでも大部分のファミリー構成要素において受容体結合には不必要であると考えられる。このため、Ｂ−Ｃループは、ＧＨスーパー遺伝子ファミリーの構成要素において、本明細書に記載の非天然アミノ酸で置換し得る。Ａ−Ｂループ、Ｃ−Ｄループ（及びＧＨスーパーファミリーのインターフェロン／ＩＬ−１０様構成要素のＤ−Ｅループ）も非天然アミノ酸で置換し得る。ヘリックスＡの近位のアミノ酸及び最終ヘリックスの遠位のアミノ酸も受容体結合に関与しない傾向にあり、やはり非天然アミノ酸を導入する部位になり得る。一部の実施形態においては、非天然アミノ酸は、Ａ−Ｂ、Ｂ−Ｃ、Ｃ−Ｄ又はＤ−Ｅループの最初の１、２、３、４、５、６、７以上のアミノ酸を含めて、但しこれらだけに限定されない、ループ構造内の任意の位置において置換される。一部の実施形態においては、非天然アミノ酸は、Ａ−Ｂ、Ｂ−Ｃ、Ｃ−Ｄ又はＤ−Ｅループの最後の１、２、３、４、５、６、７以上のアミノ酸内で置換される。
【０１９６】
ＥＰＯ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＦＮ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２  ｐ３５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５及びベータインターフェロンを含めて、但しこれらだけに限定されない、ＧＨファミリーのある構成要素は、Ｎ連結及び／又はＯ連結糖を含む。タンパク質中のグリコシル化部位は、殆どループ領域中だけに存在し、アルファヘリックスバンドル中には存在しない。ループ領域は、一般に、受容体結合に関与せず、また、糖基の共有結合用部位であるので、非天然アミノ酸置換基をタンパク質に導入する有用部位となり得る。タンパク質中のＮ及びＯ連結グリコシル化部位を構成するアミノ酸は、表面に露出しているので、非天然アミノ酸置換用部位となり得る。したがって、天然タンパク質は、これらの部位においてタンパク質に結合するかさ高い糖基を許容することができ、グリコシル化部位は、受容体結合部位から離れて位置する傾向にある。
【０１９７】
ＧＨ遺伝子ファミリーの追加の構成要素は、将来発見される可能性がある。ＧＨスーパー遺伝子ファミリーの新しい構成要素は、予測タンパク質配列のコンピュータ支援二次及び三次構造解析によって、また、特定の標的に結合する分子を特定するように設計された選択技術によって、特定することができる。ＧＨスーパー遺伝子ファミリーの構成要素は、典型的には、非らせん状アミノ酸（ループ領域）によって連結される４本又は５本の両親媒性らせんを有する。これらの構成要素は、そのＮ末端に疎水性シグナル配列を含み、細胞からの分泌を促進する。将来発見されるＧＨスーパー遺伝子ファミリーのかかる構成要素も、本明細書の方法及び組成物に含まれる。
【０１９８】
Ｖ．  非天然アミノ酸
本明細書の方法及び組成物に使用する非天然アミノ酸は、以下の４つの性質のうち少なくとも１つを有する：（１）非天然アミノ酸側鎖上の少なくとも１個の官能基は、２０種類の一般的な遺伝的にコードされたアミノ酸（すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリン）の化学反応性と直交する、又は非天然アミノ酸を含むポリペプチド中に存在する天然アミノ酸の化学反応性と少なくとも直交する、少なくとも１つの特性及び／又は活性及び／又は反応性を有する、（２）導入された非天然アミノ酸は、２０種類の一般的な遺伝的にコードされたアミノ酸に対して実質的に化学的に不活性である、（３）非天然アミノ酸は、好ましくは天然アミノ酸と同等の安定性で、又は典型的な生理条件下で、ポリペプチドに安定に組み込むことができ、さらに好ましくは、かかる組み込みはインビボの系を介して起こり得る、（４）非天然アミノ酸は、オキシム官能基を含み、又は好ましくは（言うまでもないが、生物学的諸性質の破壊が修飾／転換の目的でない限り）非天然アミノ酸を含むポリペプチドの生物学的諸性質を破壊しない条件下で、若しくは転換がｐＨ約４から約８の水系条件下で起こり得る条件下で、若しくは非天然アミノ酸上の反応部位が求電子性部位である条件下で、試薬と反応させることによってオキシム基に転換することができる官能基を含む。本明細書に記載の組成物及び方法と一緒に使用することができる非天然アミノ酸のこれら４つの諸性質を満たすアミノ酸の、説明のための非限定的例を図２、３、３５及び４０−４３に示す。任意の数の非天然アミノ酸をポリペプチドに導入することができる。非天然アミノ酸は、保護若しくはマスクされたオキシムも含むことができ、又は保護された基の脱保護後に、若しくはマスクされた基の脱マスク後に、オキシム基に転換することができる、保護若しくはマスクされた基も含むことができる。非天然アミノ酸は、保護された基の脱保護後に、又はマスクされた基の脱マスク後に、カルボニル又はジカルボニル基に転換することができ、それによってヒドロキシルアミン又はオキシムと反応してオキシム基を形成し得る、保護又はマスクされたカルボニル又はジカルボニル基も含むことができる。
【０１９９】
本明細書の方法及び組成物に使用することができる非天然アミノ酸としては、光活性化可能な架橋剤を含むアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光性アミノ酸、金属結合アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規官能基を有するアミノ酸、他の分子と共有結合的又は非共有結合的に相互作用するアミノ酸、フォトケージドアミノ酸及び／又は光異性可能なアミノ酸、ビオチン又はビオチンアナログを含むアミノ酸、糖で置換されたセリンなどのグリコシル化アミノ酸、他の炭水化物で修飾されたアミノ酸、ケト含有アミノ酸、アルデヒド含有アミノ酸、ポリエチレングリコール又は他のポリエーテルを含むアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学開裂可能なアミノ酸及び／又は光開裂可能なアミノ酸、約５を超える炭素又は約１０を超える炭素を含めて、但しこれらだけに限定されない、ポリエーテル又は長鎖炭化水素を含めて、但しこれらだけに限定されない、天然アミノ酸と比較して長い側鎖を有するアミノ酸、炭素連結糖含有アミノ酸、レドックス活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸、１個以上の毒性部分を含むアミノ酸などが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０２００】
一部の実施形態においては、非天然アミノ酸は糖質部分を含む。かかるアミノ酸の例としては、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−ガラクトサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−トレオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−アスパラギン及びＯ−マンノサミニル−Ｌ−セリンが挙げられる。かかるアミノ酸の例は、アミノ酸と糖類の天然Ｎ−又はＯ−リンケージが、アルケン、オキシム、チオエーテル、アミドなどを含めて、但しこれらだけに限定されない、一般に天然に存在しない共有結合性リンケージで置換された例も含む。かかるアミノ酸の例は、２−デオキシ−グルコース、２−デオキシガラクトースなどの、天然タンパク質中に一般に存在しない糖類も含む。
【０２０１】
ポリペプチドへの非天然アミノ酸の組み込みによってポリペプチドに組み込まれる化学部分は、ポリペプチドの種々の利点及び操作を与える。例えば、（ケト又はアルデヒド官能基を含めて）カルボニル又はジカルボニル官能基の独特の反応性によって、幾つかのヒドラジン含有又はヒドロキシルアミン含有試薬のいずれかを用いてインビボ及びインビトロでのタンパク質の選択的修飾が可能になる。例えば、重原子非天然アミノ酸は、ｘ線構造データを同期させる（ｐｈａｓｉｎｇ）のに有用となり得る。非天然アミノ酸を用いた重原子の部位特異的な導入によって、重原子の位置を選択する際の選択性及び柔軟性ももたらされる。例えば、（ベンゾフェノン及び（フェニルアジドを含めて、但しこれだけに限定されない）アリールアジド側鎖を含むアミノ酸を含めて、但しこれだけに限定されない）光反応性非天然アミノ酸は、ポリペプチドの効率的なインビボ及びインビトロでの光架橋を可能にする。光反応性非天然アミノ酸の例としては、ｐ−アジド−フェニルアラニン及びｐ−ベンゾイル−フェニルアラニンが挙げられるが、これらだけに限定されない。次いで、光反応性非天然アミノ酸を含むポリペプチドは、光反応基の励起がもたらす時間的制御によって随意に架橋することができる。非限定的例においては、非天然アミノのメチル基は、これらだけに限定されないが核磁気共鳴及び振動分光法を使用した、局所的構造及び動力学のプローブとして、メチル基を含めて、但しこれらだけに限定されない、同位体標識で置換することができる。
【０２０２】
Ａ．  非天然アミノ酸の構造及び合成：カルボニル、カルボニル様、マスクされたカルボニル及び保護されたカルボニル基
求電子性反応基を有するアミノ酸によって、求核付加反応を含めて、但しこれだけに限定されない種々の化学反応によって分子を連結する種々の反応が可能になる。かかる求電子性反応基としては、（ケト又はアルデヒド基を含めた）カルボニル又はジカルボニル基、（カルボニル又はジカルボニル基と類似の反応性を有し、カルボニル又はジカルボニル基と構造的に類似している）カルボニル様又はジカルボニル様基、（カルボニル又はジカルボニル基に容易に転化することができる）マスクされたカルボニル又はマスクされたジカルボニル基、（脱保護によってカルボニル又はジカルボニル基と類似の反応性を有する）保護されたカルボニル又は保護されたジカルボニル基などが挙げられる。かかるアミノ酸は、式（Ｉ）の構造を有するアミノ酸を含む。
【０２０３】
【化６４】
0005425398.tif 000004
式中、
Ａは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換アルカリーレン、アラルキレン又は置換アラルキレンであり、
Ｂは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり、
Ｊは、
【０２０４】
【化６５】
0005425398.tif 000005
であり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり、
各Ｒ”は独立にＨ、アルキル、置換アルキル若しくは保護基であり、又は１個を超えるＲ”基が存在するときには、２個のＲ”はヘテロシクロアルキルを形成していてもよく、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ３及びＲ４の各々は独立にＨ、ハロゲン、低級アルキル若しくは置換低級アルキルであり、又はＲ３とＲ４若しくは２個のＲ３基はシクロアルキル若しくはヘテロシクロアルキルを形成していてもよく、
又は−Ａ−Ｂ−Ｊ−Ｒ基は合わせて、ジカルボニル基を含めたカルボニル基、保護されたジカルボニル基を含めた保護されたカルボニル基若しくはマスクされたジカルボニル基を含めたマスクされたカルボニル基を少なくとも１個含む、二環若しくは三環のシクロアルキル若しくはヘテロシクロアルキルを形成し、
又は−Ｊ−Ｒ基は合わせて、ジカルボニル基を含めたカルボニル基、保護されたジカルボニル基を含めた保護されたカルボニル基若しくはマスクされたジカルボニル基を含めたマスクされたカルボニル基を少なくとも１個含む、単環若しくは二環のシクロアルキル若しくはヘテロシクロアルキルを形成し、
但し、Ａがフェニレンであり、各Ｒ３がＨであるときには、Ｂが存在し、Ａが−（ＣＨ２）４−であり、各Ｒ３がＨであるときには、Ｂは−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨ２）−ではなく、ＡもＢも存在せず、各Ｒ３がＨであるときには、Ｒはメチルではない。）かかる非天然アミノ酸は塩の形態とすることができ、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０２０５】
ある実施形態においては、式（Ｉ）の化合物は弱酸性条件下の水溶液中で少なくとも１ヵ月間安定である。ある実施形態においては、式（Ｉ）の化合物は弱酸性条件下で少なくとも２週間安定である。ある実施形態においては、式（Ｉ）の化合物は弱酸性条件下で少なくとも５日間安定である。ある実施形態においては、かかる酸性条件はｐＨ２から８である。
【０２０６】
式（Ｉ）の化合物のある実施形態においては、Ｂは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）（アルキレン又は置換アルキレン）−又は−Ｓ（Ｏ）２（アルキレン又は置換アルキレン）−である。式（Ｉ）の化合物のある実施形態においては、Ｂは、−Ｏ（ＣＨ２）−、−ＣＨ＝Ｎ−、−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ−、−ＮＨＣＨ２−、−ＮＨＣＯ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）−、−ＣＯＮＨ−（ＣＨ２）−、−ＳＣＨ２−、−Ｓ（＝Ｏ）ＣＨ２−又は−Ｓ（Ｏ）２ＣＨ２−である。式（Ｉ）の化合物のある実施形態においては、ＲはＣ１−６アルキル又はシクロアルキルである。式（Ｉ）の化合物のある実施形態においては、Ｒは、−ＣＨ３、−ＣＨ（ＣＨ３）２又はシクロプロピルである。式（Ｉ）の化合物のある実施形態においては、Ｒ１は、Ｈ、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、Ｎ−アセチル、テトラフルオロアセチル（ＴＦＡ）又はベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）である。式（Ｉ）の化合物のある実施形態においては、Ｒ１は樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドである。式（Ｉ）の化合物のある実施形態においては、Ｒ２はＯＨ、Ｏ−メチル、Ｏ−エチル又はＯ−ｔ−ブチルである。式（Ｉ）の化合物のある実施形態においては、Ｒ２は樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドである。式（Ｉ）の化合物のある実施形態においては、Ｒ２はポリヌクレオチドである。式（Ｉ）の化合物のある実施形態においては、Ｒ２はリボ核酸（ＲＮＡ）である。式（Ｉ）の化合物のある実施形態においては、Ｒ２はｔＲＮＡである。式（Ｉ）の化合物のある実施形態においては、ｔＲＮＡは選択コドンを特異的に認識する。式（Ｉ）の化合物のある実施形態においては、選択コドンは、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン、異常コドン、５塩基コドン及び４塩基コドンからなる群から選択される。式（Ｉ）の化合物のある実施形態においては、Ｒ２はサプレッサーｔＲＮＡである。
【０２０７】
式（Ｉ）の化合物のある実施形態においては、
【０２０８】
【化６６】
0005425398.tif 000006
は、
（ｉ）Ａは、置換低級アルキレン、Ｃ４−アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換アルカリーレン、アラルキレン又は置換アラルキレンであり、
Ｂは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ’）、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−からなる群から選択される二価のリンカーである、
（ｉｉ）Ａは任意であり、存在するときには、置換低級アルキレン、Ｃ４−アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換アルカリーレン、アラルキレン又は置換アラルキレンであり、
Ｂは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ’）、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−からなる群から選択される二価のリンカーである、
（ｉｉｉ）Ａは低級アルキレンであり、
Ｂは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ’）、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−からなる群から選択される二価のリンカーである、並びに
（ｉｖ）Ａはフェニレンであり、
Ｂは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）−、−Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ’）、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−からなる群から選択される二価のリンカーである
からなる群から選択され、
Ｊは、
【０２０９】
【化６７】
0005425398.tif 000007
【０２１０】
各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルであり、
Ｒ１は任意であり、存在するときには、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２は任意であり、存在するときには、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
各Ｒ３及びＲ４は独立にＨ、ハロゲン、低級アルキル又は置換低級アルキルであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルである。
【０２１１】
また、式（ＩＩ）の構造を有するアミノ酸も含まれる。
【０２１２】
【化６８】
0005425398.tif 000008
式中、
Ａは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換アルカリーレン、アラルキレン又は置換アラルキレンであり、
Ｂは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルである。
【０２１３】
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
但し、Ａがフェニレンであるときには、Ｂが存在し、Ａが−（ＣＨ２）４−であるときには、Ｂは−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨ２）−ではなく、ＡもＢも存在しないときには、Ｒはメチルではない。）かかる非天然アミノ酸は塩の形態とすることができ、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０２１４】
また、式（ＩＩＩ）の構造を有するアミノ酸も含まれる。
【０２１５】
【化６９】
0005425398.tif 000009
式中、
Ｂは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
各Ｒａは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは１、２又は３である。）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’及び−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から独立に選択される。かかる非天然アミノ酸は塩の形態とすることができ、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０２１６】
また、以下のアミノ酸も含まれる。
【０２１７】
【化７０】
0005425398.tif 000010
【０２１８】
かかる非天然アミノ酸は、アミノ保護基であってもよく、カルボキシルで保護されていてもよく、及び／又は塩の形態でもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０２１９】
また、式（ＩＶ）の構造を有する以下のアミノ酸も含まれる。
【０２２０】
【化７１】
0005425398.tif 000011
式中、
−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−は任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
各Ｒａは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは１、２又は３である。）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、及び−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から独立に選択され、ｎは０から８であり、
但し、Ａが−（ＣＨ２）４−であるときには、Ｂは−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨ２）−ではない。かかる非天然アミノ酸は塩の形態とすることができ、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０２２１】
また、以下のアミノ酸も含まれる。
【０２２２】
【化７２】
0005425398.tif 000012
【０２２３】
ここで、かかる化合物は、アミノ保護されていてもよく、カルボキシル保護されていてもよく、アミノ保護及びカルボキシル保護されていてもよく、若しくはその塩であり、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０２２４】
また、式（ＶＩＩＩ）の構造を有する以下のアミノ酸も含まれる。
【０２２５】
【化７３】
0005425398.tif 000013
式中、
Ａは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換アルカリーレン、アラルキレン又は置換アラルキレンであり、
Ｂは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドである。
【０２２６】
かかる非天然アミノ酸は塩の形態とすることができ、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０２２７】
また、式（ＩＸ）の構造を有する以下のアミノ酸も含まれる。
【０２２８】
【化７４】
0005425398.tif 000014
式中、
Ｂは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
各Ｒａは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは１、２又は３である。）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’及び−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から独立に選択される。
【０２２９】
かかる非天然アミノ酸は塩の形態とすることができ、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０２３０】
また、以下のアミノ酸も含まれる。
【０２３１】
【化７５】
0005425398.tif 000015
【０２３２】
ここで、かかる化合物は、アミノ保護されていてもよく、カルボキシル保護されていてもよく、アミノ保護及びカルボキシル保護されていてもよく、若しくはその塩であり、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０２３３】
また、式（Ｘ）の構造を有する以下のアミノ酸も含まれる。
【０２３４】
【化７６】
0005425398.tif 000016
式中、
Ｂは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
各Ｒａは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは１、２又は３である。）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、及び−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から独立に選択され、ｎは０から８である。
【０２３５】
かかる非天然アミノ酸は塩の形態とすることができ、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０２３６】
また、以下のアミノ酸も含まれる。
【０２３７】
【化７７】
0005425398.tif 000017
【０２３８】
ここで、かかる化合物は、アミノ保護されていてもよく、カルボキシル保護されていてもよく、アミノ保護及びカルボキシル保護されていてもよく、若しくはその塩であり、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０２３９】
本明細書に記載の非天然アミノ酸は、モノカルボニル構造に加えて、ジカルボニル、ジカルボニル様、マスクされたジカルボニル、保護されたジカルボニル基などの基を含むことができる。例えば、式（Ｖ）の構造を有する以下のアミノ酸が含まれる。
【０２４０】
【化７８】
0005425398.tif 000018
式中、
Ａは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換アルカリーレン、アラルキレン又は置換アラルキレンであり、
Ｂは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドである。
【０２４１】
かかる非天然アミノ酸は塩の形態とすることができ、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０２４２】
また、式（ＶＩ）の構造を有する以下のアミノ酸も含まれる。
【０２４３】
【化７９】
0005425398.tif 000019
式中、
Ｂは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
各Ｒａは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは１、２又は３である。）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’及び−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から独立に選択される。
【０２４４】
かかる非天然アミノ酸は塩の形態とすることができ、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０２４５】
また、以下のアミノ酸も含まれる。
【０２４６】
【化８０】
0005425398.tif 000020
【０２４７】
かかる化合物は、アミノ保護及びカルボキシル保護されていてもよく、又はその塩であってもよい。かかる非天然アミノ酸は塩の形態とすることができ、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０２４８】
また、式（ＶＩＩ）の構造を有する以下のアミノ酸も含まれる。
【０２４９】
【化８１】
0005425398.tif 000021
式中、
Ｂは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
各Ｒａは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは１、２又は３である。）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、及び−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から独立に選択され、ｎは０から８である。
【０２５０】
かかる非天然アミノ酸は塩の形態とすることができ、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０２５１】
また、以下のアミノ酸も含まれる。
【０２５２】
【化８２】
0005425398.tif 000022
【０２５３】
かかる化合物は、アミノ保護及びカルボキシル保護されていてもよく、若しくはその塩でもよく、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０２５４】
また、式（ＸＸＸ）の構造を有する以下のアミノ酸も含まれる。
【０２５５】
【化８３】
0005425398.tif 000023
式中、
Ａは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換アルカリーレン、アラルキレン又は置換アラルキレンであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｘ１はＣ、Ｓ又はＳ（Ｏ）であり、Ｌはアルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）又はＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）（式中、Ｒ’はＨ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルである。）である。
【０２５６】
かかる非天然アミノ酸は塩の形態とすることができ、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０２５７】
また、式（ＸＸＸ−Ａ）の構造を有する以下のアミノ酸も含まれる。
【０２５８】
【化８４】
0005425398.tif 000024
式中、
Ａは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換アルカリーレン、アラルキレン又は置換アラルキレンであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｌはアルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）又はＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）（式中、Ｒ’はＨ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルである。）である。
【０２５９】
かかる非天然アミノ酸は塩の形態とすることができ、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０２６０】
また、式（ＸＸＸ−Ｂ）の構造を有する以下のアミノ酸も含まれる。
【０２６１】
【化８５】
0005425398.tif 000025
式中、
Ａは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換アルカリーレン、アラルキレン又は置換アラルキレンであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｌはアルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）又はＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）（式中、Ｒ’はＨ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルである。）である。
【０２６２】
かかる非天然アミノ酸は塩の形態とすることができ、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０２６３】
また、式（ＸＸＸＩ）の構造を有する以下のアミノ酸も含まれる。
【０２６４】
【化８６】
0005425398.tif 000026
式中、
Ａは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換アルカリーレン、アラルキレン又は置換アラルキレンであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｘ１はＣ、Ｓ又はＳ（Ｏ）であり、ｎは０、１、２、３、４又は５であり、各ＣＲ８Ｒ９基上の各Ｒ８及びＲ９は、Ｈ、アルコキシ、アルキルアミン、ハロゲン、アルキル、アリールからなる群から独立に選択され、又は任意のＲ８とＲ９は一緒に＝Ｏ若しくはシクロアルキルを形成することができ、又は隣接Ｒ８基に対するいずれかは一緒にシクロアルキルを形成し得る。
【０２６５】
かかる非天然アミノ酸は塩の形態とすることができ、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０２６６】
また、式（ＸＸＸＩ−Ａ）の構造を有する以下のアミノ酸も含まれる。
【０２６７】
【化８７】
0005425398.tif 000027
式中、
Ａは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換アルカリーレン、アラルキレン又は置換アラルキレンであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
ｎは０、１、２、３、４又は５であり、各ＣＲ８Ｒ９基上の各Ｒ８及びＲ９は、Ｈ、アルコキシ、アルキルアミン、ハロゲン、アルキル、アリールからなる群から独立に選択され、又は任意のＲ８とＲ９は一緒に＝Ｏ若しくはシクロアルキルを形成することができ、又は隣接Ｒ８基に対するいずれかは一緒にシクロアルキルを形成し得る。
【０２６８】
かかる非天然アミノ酸は塩の形態とすることができ、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０２６９】
また、式（ＸＸＸＩ−Ｂ）の構造を有する以下のアミノ酸も含まれる。
【０２７０】
【化８８】
0005425398.tif 000028
式中、
Ａは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換アルカリーレン、アラルキレン又は置換アラルキレンであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
ｎは０、１、２、３、４又は５であり、各ＣＲ８Ｒ９基上の各Ｒ８及びＲ９は、Ｈ、アルコキシ、アルキルアミン、ハロゲン、アルキル、アリールからなる群から独立に選択され、又は任意のＲ８とＲ９は一緒に＝Ｏ若しくはシクロアルキルを形成することができ、又は隣接Ｒ８基に対するいずれかは一緒にシクロアルキルを形成し得る。
【０２７１】
かかる非天然アミノ酸は塩の形態とすることができ、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０２７２】
また、式（ＸＸＸＩＩ）の構造を有する以下のアミノ酸も含まれる。
【０２７３】
【化８９】
0005425398.tif 000029
式中、
Ａは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換アルカリーレン、アラルキレン又は置換アラルキレンであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｘ１はＣ、Ｓ又はＳ（Ｏ）であり、Ｌはアルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）又はＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）（式中、Ｒ’はＨ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルである。）である。
【０２７４】
かかる非天然アミノ酸は塩の形態とすることができ、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０２７５】
また、式（ＸＸＸＩＩ−Ａ）の構造を有する以下のアミノ酸も含まれる。
【０２７６】
【化９０】
0005425398.tif 000030
式中、
Ａは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換アルカリーレン、アラルキレン又は置換アラルキレンであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｌはアルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）又はＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）（式中、Ｒ’はＨ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルである。）である。
【０２７７】
かかる非天然アミノ酸は塩の形態とすることができ、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０２７８】
また、式（ＸＸＸＩＩ−Ｂ）の構造を有する以下のアミノ酸も含まれる。
【０２７９】
【化９１】
0005425398.tif 000031
式中、
Ａは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換アルカリーレン、アラルキレン又は置換アラルキレンであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｌはアルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）又はＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）（式中、Ｒ’はＨ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルである。）である。
【０２８０】
かかる非天然アミノ酸は塩の形態とすることができ、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０２８１】
また、式（ＸＸＸＸ）の構造を有するアミノ酸も含まれる。
【０２８２】
【化９２】
0005425398.tif 000032
式中、
Ａは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換アルカリーレン、アラルキレン又は置換アラルキレンであり、
Ｍは−Ｃ（Ｒ３）−、
【０２８３】
【化９３】
0005425398.tif 000033
であり、
（ａ）はＡ基との結合を表し、（ｂ）はそれぞれのカルボニル基との結合を表し、Ｒ３及びＲ４はＨ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル若しくは置換シクロアルキルから独立に選択され、又はＲ３とＲ４、２個のＲ３基若しくは２個のＲ４基はシクロアルキル若しくはヘテロシクロアルキルを形成していてもよく、
ＲはＨ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり、
Ｔ３は結合、Ｃ（Ｒ）（Ｒ）、Ｏ又はＳであり、ＲはＨ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドである。
【０２８４】
かかる非天然アミノ酸は塩の形態とすることができ、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０２８５】
また、式（ＸＸＸＸＩ）の構造を有するアミノ酸も含まれる。
【０２８６】
【化９４】
0005425398.tif 000034
式中、
Ｍは−Ｃ（Ｒ３）−、
【０２８７】
【化９５】
0005425398.tif 000035
であり、
（ａ）はＡ基との結合を表し、（ｂ）はそれぞれのカルボニル基との結合を表し、Ｒ３及びＲ４はＨ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル若しくは置換シクロアルキルから独立に選択され、又はＲ３とＲ４、２個のＲ３基若しくは２個のＲ４基はシクロアルキル若しくはヘテロシクロアルキルを形成していてもよく、
ＲはＨ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり、
Ｔ３は結合、Ｃ（Ｒ）（Ｒ）、Ｏ又はＳであり、ＲはＨ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
各Ｒａは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは１、２又は３である。）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’及び−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から独立に選択される。
【０２８８】
かかる非天然アミノ酸は塩の形態とすることができ、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０２８９】
また、式（ＸＸＸＸＩＩ）の構造を有するアミノ酸も含まれる。
【０２９０】
【化９６】
0005425398.tif 000036
式中、
ＲはＨ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり、
Ｔ３はＯ又はＳである。
【０２９１】
かかる非天然アミノ酸は塩の形態とすることができ、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０２９２】
また、式（ＸＸＸＸＩＩＩ）の構造を有するアミノ酸も含まれる。
【０２９３】
【化９７】
0005425398.tif 000037
式中、
ＲはＨ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルである。
【０２９４】
また、式（ＸＸＸＸＩＩＩ）の構造を有する以下のアミノ酸も含まれる。
【０２９５】
【化９８】
0005425398.tif 000038
【０２９６】
かかる非天然アミノ酸は塩の形態とすることができ、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０２９７】
カルボニル又はジカルボニル官能基は、ヒドロキシルアミン含有試薬と水溶液中で穏和な条件下で選択的に反応して、生理条件下で安定である、対応するオキシムリンケージを形成し得る。例えば、Ｊｅｎｃｋｓ，  Ｗ．Ｐ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ８１，  ４７５−４８１（１９５９）；Ｓｈａｏ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｔａｍ，  Ｊ．Ｐ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１７（１４）：３８９３−３８９９（１９９５）を参照されたい。さらに、カルボニル又はジカルボニル基の独特の反応性によって、他のアミノ酸側鎖の存在下で選択的修飾が可能になる。例えば、Ｃｏｒｎｉｓｈ，  Ｖ．Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１８：８１５０−８１５１（１９９６）；Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ，  Ｋ．Ｆ．  ＆  Ｓｔｒｏｈ，  Ｊ．Ｇ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．  ３：１３８−１４６（１９９２）；Ｍａｈａｌ，  Ｌ．Ｋ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：１１２５−１１２８（１９９７）を参照されたい。
【０２９８】
ｐ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニン及びｍ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニンの合成は、参照により組みこむＺｈａｎｇ，  Ｚ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：６７３５−６７４６（２００３）に記載されている。他のカルボニル含有又はジカルボニル含有アミノ酸も同様に調製することができる。また、本明細書に含まれる非天然アミノ酸の非限定的な例示的な合成を図４、２４−３４及び３６−３９に示す。
【０２９９】
一部の実施形態においては、非天然アミノ酸を含むポリペプチドを化学修飾して、反応性カルボニル又はジカルボニル官能基を生成する。例えば、共役反応に有用であるアルデヒド官能基は、隣接アミノ及びヒドロキシル基を有する官能基から生じ得る。例えば、生物活性分子がポリペプチドである場合には、（通常存在し得る、又は化学的消化若しくは酵素消化によって露出され得る）Ｎ末端セリン又はトレオニンを使用して、過ヨウ素酸塩を用いた穏和な酸化的開裂条件下でアルデヒド官能基を生成することができる。例えば、Ｇａｅｒｔｎｅｒ，  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．  ３：  ２６２−２６８（１９９２）；Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ，  Ｋ．  ＆  Ｓｔｒｏｈ，  Ｊ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．  ３：１３８−１４６（１９９２）；Ｇａｅｒｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９：７２２４−７２３０（１９９４）を参照されたい。しかし、当分野で公知の方法は、ペプチド又はタンパク質のＮ末端アミノ酸に限られている。
【０３００】
さらに、例として、隣接ヒドロキシル及びアミノ基を有する非天然アミノ酸を「マスクされた」アルデヒド官能基としてポリペプチドに組み込むことができる。例えば、５−ヒドロキシリジンは、イプシロンアミンに隣接するヒドロキシル基を有する。アルデヒドを生成するための反応条件は、典型的には、ポリペプチド内の他の部位における酸化を回避するために、過剰モルのメタ過ヨウ素酸ナトリウムを穏和な条件下で添加することを含む。酸化反応のｐＨは典型的には約７．０である。典型的な反応は、約１．５モル過剰のメタ過ヨウ素酸ナトリウムをポリペプチド緩衝溶液に添加し、続いて暗所で約１０分間インキュベートすることを含む。例えば米国特許第６，４２３，６８５号を参照されたい。
【０３０１】
Ｂ．  非天然アミノ酸の構造及び合成：ヒドロキシルアミン含有アミノ酸
（アミノオキシとも呼ばれる）ヒドロキシルアミン基を含む非天然アミノ酸によって、種々の求電子基と反応し、（ＰＥＧ又は他の水溶性ポリマーとを含めて、但しこれだけに限定されない）複合物を形成することが可能になる。ヒドラジン、ヒドラジド及びセミカルバジド同様、アミノオキシ基の高い求核性によって、ケトン、アルデヒド又は類似の化学反応性を有する他の官能基を含めて、但しこれらだけに限定されないカルボニル又はジカルボニル基を含む種々の分子と効率的かつ選択的に反応することができる。例えば、Ｓｈａｏ，  Ｊ．  ａｎｄ  Ｔａｍ，  Ｊ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１７：３８９３−３８９９（１９９５）；Ｈ．  Ｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｃ．  Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，  Ａｃｃ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．  ３４（９）：７２７−７３６（２００１）を参照されたい。ヒドラジン基との反応の結果が、対応するヒドラゾンであるのに対して、オキシムは、アミノオキシ基と、例として、ケトン、アルデヒド、類似の化学反応性を有する他の官能基などのカルボニル含有又はジカルボニル含有基との反応から一般に生成する。
【０３０２】
したがって、本明細書に記載のある実施形態においては、ヒドロキシルアミン基、（ヒドロキシルアミン基と類似の反応性を有し、ヒドロキシルアミン基と構造的に類似している）ヒドロキシルアミン様基、（ヒドロキシルアミン基に容易に転化することができる）マスクされたヒドロキシルアミン基又は（脱保護によってヒドロキシルアミン基と類似の反応性を有する）保護されたヒドロキシルアミン基を含む側鎖を有する非天然アミノ酸である。かかるアミノ酸は、次式の構造を有するアミノ酸を含む。
【０３０３】
【化９９】
0005425398.tif 000039
式中、
Ａは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換アルカリーレン、アラルキレン又は置換アラルキレンであり、
Ｂは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり、
Ｋは−ＮＲ６Ｒ７又は−Ｎ＝ＣＲ６Ｒ７であり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ３及びＲ４の各々は独立にＨ、ハロゲン、低級アルキル若しくは置換低級アルキルであり、又はＲ３とＲ４若しくは２個のＲ３基はシクロアルキル若しくはヘテロシクロアルキルを形成していてもよく、
Ｒ６及びＲ７の各々は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリール、置換アルカリール、アラルキル及び置換アラルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ”、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ”、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）２からなる群から独立に選択され、各Ｒ”は独立に水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、アルカリール、置換アルカリール、アラルキル若しくは置換アラルキルであり、又はＲ６若しくはＲ７はＬ−Ｘであり、
Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコール誘導体；光架橋剤；細胞傷害性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質若しくはポリペプチド若しくはポリペプチドアナログ；抗体又は抗体断片；金属キレート剤；補因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；糖類、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；フルオロフォア、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的若しくは非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；光異性化可能部分；ビオチン；ビオチンアナログ；重原子を組み込んだ部分；化学開裂可能な基；光開裂可能な基；長い側鎖；炭素連結糖；レドックス活性薬剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識部分；生物物理学的プローブ；リン光基；化学発光基；高電子密度基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能標識及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、
Ｌは任意であり、存在するときには、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーである。
【０３０４】
かかる非天然アミノ酸は塩の形態とすることができ、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０３０５】
式（ＸＩＶ）の化合物のある実施形態においては、Ａはフェニレン又は置換フェニレンである。式（ＸＩＶ）の化合物のある実施形態においては、Ｂは−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−又は−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−である。式（ＸＩＶ）の化合物のある実施形態においては、Ｂは−Ｏ（ＣＨ２）２−、−Ｓ（ＣＨ２）２−、−ＮＨ（ＣＨ２）２−、−ＣＯ（ＣＨ２）２−又は−（ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎは１から４である。）である。式（ＸＩＶ）の化合物のある実施形態においては、Ｒ１は、Ｈ、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、Ｎ−アセチル、テトラフルオロアセチル（ＴＦＡ）又はベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）である。式（ＸＩＶ）の化合物のある実施形態においては、Ｒ１は樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドである。式（ＸＩＶ）の化合物のある実施形態においては、Ｒ２はＯＨ、Ｏ−メチル、Ｏ−エチル又はＯ−ｔ−ブチルである。式（ＸＩＶ）の化合物のある実施形態においては、Ｒ２は樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドである。式（ＸＩＶ）の化合物のある実施形態においては、Ｒ２はポリヌクレオチドである。式（ＸＩＶ）の化合物のある実施形態においては、Ｒ２はリボ核酸（ＲＮＡ）である。式（ＸＩＶ）の化合物のある実施形態においては、Ｒ２はｔＲＮＡである。式（ＸＩＶ）の化合物のある実施形態においては、ｔＲＮＡは選択コドンを特異的に認識する。式（ＸＩＶ）の化合物のある実施形態においては、選択コドンは、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン、異常コドン、５塩基コドン及び４塩基コドンからなる群から選択される。式（ＸＩＶ）の化合物のある実施形態においては、Ｒ２はサプレッサーｔＲＮＡである。式（ＸＩＶ）の化合物のある実施形態においては、Ｒ６及びＲ７の各々は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリール、置換アルカリール、アラルキル及び置換アラルキルからなる群から独立に選択される。式（ＸＩＶ）の化合物のある実施形態においては、Ｒ６及びＲ７の各々は、Ｈ、メチル、フェニル及び−［（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｏ−（水素、アルキル又は置換アルキル）］ｘ（式中、×は１−５０である。）からなる群から独立に選択される式（ＸＩＶ）の化合物のある実施形態においては、Ｋは−ＮＲ６Ｒ７である。
【０３０６】
式（ＸＩＶ）の化合物のある実施形態においては、Ｘは、ペプチド、タンパク質、酵素、抗体、薬物、色素、脂質、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、細胞、ウイルス、リポソーム、微粒子及びミセルからなる群から選択される生物活性剤である。式（ＸＩＶ）の化合物のある実施形態においては、Ｘは、抗生物質、殺真菌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗腫よう剤、心血管作動薬、抗不安薬、ホルモン、成長因子及びステロイド剤からなる群から選択される薬物である。式（ＸＩＶ）の化合物のある実施形態においては、Ｘは、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ及びグルコースオキシダーゼからなる群から選択される酵素である。式（ＸＩＶ）の化合物のある実施形態においては、Ｘは、蛍光、リン光、化学発光、キレート、高電子密度、磁性、挿入、放射性、色素産生及びエネルギー伝達部分からなる群から選択される検出可能標識である。
【０３０７】
ある実施形態においては、式（ＸＩＶ）の化合物は弱酸性条件下の水溶液中で少なくとも１ヵ月間安定である。ある実施形態においては、式（ＸＩＶ）の化合物は弱酸性条件下で少なくとも２週間安定である。ある実施形態においては、式（ＸＩＶ）の化合物は弱酸性条件下で少なくとも５日間安定である。ある実施形態においては、かかる酸性条件はｐＨ２から８である。
【０３０８】
かかるアミノ酸は、式（ＸＶ）の構造を有するアミノ酸を含む。
【０３０９】
【化１００】
0005425398.tif 000040
式中、
Ａは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換アルカリーレン、アラルキレン又は置換アラルキレンであり、
Ｂは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ３及びＲ４の各々は独立にＨ、ハロゲン、低級アルキル若しくは置換低級アルキルであり、又はＲ３とＲ４若しくは２個のＲ３基はシクロアルキル若しくはヘテロシクロアルキルを形成していてもよい。
【０３１０】
かかる非天然アミノ酸は塩の形態とすることができ、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０３１１】
非限定的な代表的なアミノ酸は、以下の構造を有する。
【０３１２】
【化１０１】
0005425398.tif 000041
【０３１３】
かかる非天然アミノ酸は塩の形態とすることができ、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０３１４】
アミノオキシ含有アミノ酸は、容易に利用可能なアミノ酸前駆体（ホモセリン、セリン及びトレオニン）から調製することができる。例えば、Ｍ．  Ｃａｒｒａｓｃｏ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｂｒｏｗｎ，  Ｊ．  Ｏｒｇ．  Ｃｈｅｍ．  ６８：  ８８５３−８８５８（２００３）を参照されたい。Ｌ−２−アミノ−４−（アミノオキシ）酪酸）などのある種のアミノオキシ含有アミノ酸は、自然源から単離される（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．  ６０：１６３５−１６４１（１９９７）。他のアミノオキシ含有アミノ酸も同様に調製することができる。また、本明細書に記載の非天然アミノ酸の非限定的な例示的な合成を図５に示す。
【０３１５】
Ｃ．  非天然アミノ酸の化学合成：オキシム含有アミノ酸
オキシム基を含む非天然アミノ酸によって、新しいオキシム基を含む新しい非天然アミノ酸を形成する、（ケトン、アルデヒド又は類似の反応性を有する他の基を含めて、但しこれらだけに限定されない）ある種の反応性カルボニル又はジカルボニル基を含む種々の試薬との反応が可能になる。かかるオキシム交換反応によって、非天然アミノ酸ポリペプチドをさらに官能化することができる。また、オキシム基を含む元の非天然アミノ酸は、オキシムリンケージが、アミノ酸をポリペプチドに組み込むのに必要な条件下（例えば、本明細書に記載のインビボ、インビトロ及び化学合成方法。）で安定である限り、それ自体で有用であり得る。
【０３１６】
したがって、本明細書に記載のある実施形態においては、オキシム基、（オキシム基と類似の反応性を有し、オキシム基と構造的に類似している）オキシム様基、（オキシム基に容易に転化することができる）マスクされたオキシム基又は（脱保護によってオキシム基と類似の反応性を有する）保護されたオキシム基を含む側鎖を有する非天然アミノ酸である。かかるアミノ酸は、式（ＸＩ）の構造を有するアミノ酸を含む。
【０３１７】
【化１０２】
0005425398.tif 000042
式中、
Ａは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換アルカリーレン、アラルキレン又は置換アラルキレンであり、
Ｂは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ３及びＲ４の各々は独立にＨ、ハロゲン、低級アルキル若しくは置換低級アルキルであり、又はＲ３とＲ４若しくは２個のＲ３基はシクロアルキル若しくはヘテロシクロアルキルを形成していてもよく、
Ｒ５は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリール、置換アルカリール、アラルキル、置換アラルキル、−（アルキレン又は置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ”）２、−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ”、−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリール又は置換アリール）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ”、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ”又は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）２であり、各Ｒ”は独立に水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、アルカリール、置換アルカリール、アラルキル又は置換アラルキルであり、
又はＲ５はＬ−Ｘであり、
Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコール誘導体；光架橋剤；細胞傷害性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質若しくはポリペプチド若しくはポリペプチドアナログ；抗体又は抗体断片；金属キレート剤；補因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；糖類、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；フルオロフォア、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的若しくは非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；光異性化可能部分；ビオチン；ビオチンアナログ；重原子を組み込んだ部分；化学開裂可能な基；光開裂可能な基；長い側鎖；炭素連結糖；レドックス活性薬剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識部分；生物物理学的プローブ；リン光基；化学発光基；高電子密度基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能標識及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、Ｌは任意であり、存在するときには、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり、
但し、ＡもＢも存在しないときには、Ｒはメチルではない。
【０３１８】
かかる非天然アミノ酸は塩の形態とすることができ、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０３１９】
式（ＸＩ）の化合物のある実施形態においては、Ｂは−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−である。式（ＸＩ）の化合物のある実施形態においては、Ｂは−Ｏ（ＣＨ２）−である。式（ＸＩ）の化合物のある実施形態においては、ＲはＣ１−６アルキルである。式（ＸＩ）の化合物のある実施形態においては、Ｒは−ＣＨ３である。式（ＸＩ）の化合物のある実施形態においては、Ｒ１はＨ、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、Ｎ−アセチル、テトラフルオロアセチル（ＴＦＡ）又はベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）である。式（ＸＩ）の化合物のある実施形態においては、Ｒ１は樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドである。式（ＸＩ）の化合物のある実施形態においては、Ｒ２はＯＨ、Ｏ−メチル、Ｏ−エチル又はＯ−ｔ−ブチルである。式（ＸＩ）の化合物のある実施形態においては、Ｒ２は樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドである。式（ＸＩ）の化合物のある実施形態においては、Ｒ２はポリヌクレオチドである。
【０３２０】
式（ＸＩ）の化合物のある実施形態においては、Ｒ２はリボ核酸（ＲＮＡ）である。式（ＸＩ）の化合物のある実施形態においては、Ｒ２はｔＲＮＡである。式（ＸＩ）の化合物のある実施形態においては、ｔＲＮＡは選択コドンを特異的に認識する。式（ＸＩ）の化合物のある実施形態においては、選択コドンは、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン、異常コドン、５塩基コドン及び４塩基コドンからなる群から選択される。式（ＸＩ）の化合物のある実施形態においては、Ｒ２はサプレッサーｔＲＮＡである。式（ＸＩ）の化合物のある実施形態においては、Ｒ５はアルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド又は−Ｃ（Ｏ）２Ｒ”である。式（ＸＩ）の化合物のある実施形態においては、Ｒ５は−［（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｏ−（水素、アルキル又は置換アルキル）］ｘ（式中、ｘは１−５０である。）である。式（ＸＩ）の化合物のある実施形態においては、Ｒ５は−（ＣＨ２ＣＨ２）−Ｏ−ＣＨ３又は−ＣＯＯＨである。
【０３２１】
ある実施形態においては、式（Ｉ）の化合物は弱酸性条件下の水溶液中で少なくとも１ヵ月間安定である。ある実施形態においては、式（Ｉ）の化合物は弱酸性条件下で少なくとも２週間安定である。ある実施形態においては、式（Ｉ）の化合物は弱酸性条件下で少なくとも５日間安定である。ある実施形態においては、かかる酸性条件はｐＨ２から８である。
【０３２２】
式（ＸＩ）のアミノ酸は、式（ＸＩＩ）の構造を有するアミノ酸を含む。
【０３２３】
【化１０３】
0005425398.tif 000043
式中、
Ｂは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ５は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリール、置換アルカリール、アラルキル、置換アラルキル、−（アルキレン又は置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ”）２、−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ”、−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリール又は置換アリール）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ”、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ”又は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）２であり、各Ｒ”は独立に水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、アルカリール、置換アルカリール、アラルキル又は置換アラルキルであり、
又はＲ５はＬ−Ｘであり、
Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコール誘導体；光架橋剤；細胞傷害性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質若しくはポリペプチド若しくはポリペプチドアナログ；抗体又は抗体断片；金属キレート剤；補因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；糖類、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；フルオロフォア、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的若しくは非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；光異性化可能部分；ビオチン；ビオチンアナログ；重原子を組み込んだ部分；化学開裂可能な基；光開裂可能な基；長い側鎖；炭素連結糖；レドックス活性薬剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識部分；生物物理学的プローブ；リン光基；化学発光基；高電子密度基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能標識及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、Ｌは任意であり、存在するときには、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーである。
【０３２４】
かかる非天然アミノ酸は塩の形態とすることができ、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０３２５】
かかるアミノ酸は、式（ＸＩＩＩ）の構造を有するアミノ酸を含む。
【０３２６】
【化１０４】
0005425398.tif 000044
式中、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ５は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリール、置換アルカリール、アラルキル、置換アラルキル、−（アルキレン又は置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ”）２、−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ”、−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリール又は置換アリール）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ”、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ”又は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）２であり、各Ｒ”は独立に水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、アルカリール、置換アルカリール、アラルキル又は置換アラルキルであり、
又はＲ５はＬ−Ｘであり、
Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコール誘導体；光架橋剤；細胞傷害性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質若しくはポリペプチド若しくはポリペプチドアナログ；抗体又は抗体断片；金属キレート剤；補因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；糖類、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；フルオロフォア、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的若しくは非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；光異性化可能部分；ビオチン；ビオチンアナログ；重原子を組み込んだ部分；化学開裂可能な基；光開裂可能な基；長い側鎖；炭素連結糖；レドックス活性薬剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識部分；生物物理学的プローブ；リン光基；化学発光基；高電子密度基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能標識及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、Ｌは任意であり、存在するときには、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーである。
【０３２７】
かかる非天然アミノ酸は塩の形態とすることができ、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０３２８】
かかるアミノ酸のさらなる非限定的例としては、以下の構造を有するアミノ酸が挙げられる。
【０３２９】
【化１０５】
0005425398.tif 000045
【０３３０】
かかる非天然アミノ酸は塩の形態とすることができ、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０３３１】
また、かかるアミノ酸は、式（ＸＩＶ）の構造を有するアミノ酸も含む。
【０３３２】
【化１０６】
0005425398.tif 000046
式中、
Ａは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換アルカリーレン、アラルキレン又は置換アラルキレンであり、
Ｂは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり、
Ｋは−ＮＲ６Ｒ７又は−Ｎ＝ＣＲ６Ｒ７であり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ３及びＲ４の各々は独立にＨ、ハロゲン、低級アルキル若しくは置換低級アルキルであり、又はＲ３とＲ４若しくは２個のＲ３基はシクロアルキル若しくはヘテロシクロアルキルを形成していてもよく、
Ｒ６及びＲ７の各々は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリール、置換アルカリール、アラルキル及び置換アラルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ”、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ”、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）２からなる群から独立に選択され、各Ｒ”は独立に水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、アルカリール、置換アルカリール、アラルキル若しくは置換アラルキルであり、又はＲ６若しくはＲ７はＬ−Ｘであり、
Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコール誘導体；光架橋剤；細胞傷害性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質又はポリペプチド又はポリペプチドアナログ；抗体又は抗体断片；金属キレート剤；補因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；糖類、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；フルオロフォア、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的又は非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；光異性化可能部分；ビオチン；ビオチンアナログ；重原子を組み込んだ部分；化学開裂可能な基；光開裂可能な基；長い側鎖；炭素連結糖；レドックス活性薬剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識部分；生物物理学的プローブ；リン光基；化学発光基；高電子密度基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能標識及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、Ｌは任意であり、存在するときには、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーである。
【０３３３】
かかる非天然アミノ酸は塩の形態とすることができ、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０３３４】
かかるアミノ酸は、さらに、式（ＸＶＩ）の構造を有するアミノ酸を含む。
【０３３５】
【化１０７】
0005425398.tif 000047
式中、
Ａは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換アルカリーレン、アラルキレン又は置換アラルキレンであり、
Ｂは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ３及びＲ４の各々は独立にＨ、ハロゲン、低級アルキル若しくは置換低級アルキルであり、又はＲ３とＲ４若しくは２個のＲ３基はシクロアルキル若しくはヘテロシクロアルキルを形成していてもよく、
Ｒ６及びＲ７の各々は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリール、置換アルカリール、アラルキル及び置換アラルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ”、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ”、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）２からなる群から独立に選択され、各Ｒ”は独立に水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、アルカリール、置換アルカリール、アラルキル若しくは置換アラルキルであり、又はＲ６若しくはＲ７はＬ−Ｘであり、
Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコール誘導体；光架橋剤；細胞傷害性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質又はポリペプチド又はポリペプチドアナログ；抗体又は抗体断片；金属キレート剤；補因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；糖類、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；フルオロフォア、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的又は非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；光異性化可能部分；ビオチン；ビオチンアナログ；重原子を組み込んだ部分；化学開裂可能な基；光開裂可能な基；長い側鎖；炭素連結糖；レドックス活性薬剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識部分；生物物理学的プローブ；リン光基；化学発光基；高電子密度基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能標識及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、Ｌは任意であり、存在するときには、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーである。
【０３３６】
かかる非天然アミノ酸は塩の形態とすることができ、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０３３７】
また、かかるアミノ酸は、式（ＸＶＩＩ）の構造を有するアミノ酸も含む。
【０３３８】
【化１０８】
0005425398.tif 000048
式中、
Ｂは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ６及びＲ７の各々は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリール、置換アルカリール、アラルキル及び置換アラルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ”、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ”、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）２からなる群から独立に選択され、各Ｒ”は独立に水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、アルカリール、置換アルカリール、アラルキル若しくは置換アラルキルであり、又はＲ６若しくはＲ７はＬ−Ｘであり、
Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコール誘導体；光架橋剤；細胞傷害性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質又はポリペプチド又はポリペプチドアナログ；抗体又は抗体断片；金属キレート剤；補因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；糖類、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；フルオロフォア、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的又は非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；光異性化可能部分；ビオチン；ビオチンアナログ；重原子を組み込んだ部分；化学開裂可能な基；光開裂可能な基；長い側鎖；炭素連結糖；レドックス活性薬剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識部分；生物物理学的プローブ；リン光基；化学発光基；高電子密度基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能標識及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、Ｌは任意であり、存在するときには、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーである。
【０３３９】
かかるアミノ酸の非限定的例としては、以下の構造を有するアミノ酸が挙げられる。
【０３４０】
【化１０９】
0005425398.tif 000049
【０３４１】
かかる非天然アミノ酸は塩の形態とすることができ、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０３４２】
さらに、かかるアミノ酸は、式（ＸＶＩＩＩ）の構造を有するアミノ酸も含む。
【０３４３】
【化１１０】
0005425398.tif 000050
式中、
Ｂは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ６及びＲ７の各々は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリール、置換アルカリール、アラルキル及び置換アラルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ”、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ”、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）２からなる群から独立に選択され、各Ｒ”は独立に水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、アルカリール、置換アルカリール、アラルキル若しくは置換アラルキルであり、又はＲ６若しくはＲ７はＬ−Ｘであり、
Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコール誘導体；光架橋剤；細胞傷害性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質又はポリペプチド又はポリペプチドアナログ；抗体又は抗体断片；金属キレート剤；補因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；糖類、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；フルオロフォア、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的又は非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；光異性化可能部分；ビオチン；ビオチンアナログ；重原子を組み込んだ部分；化学開裂可能な基；光開裂可能な基；長い側鎖；炭素連結糖；レドックス活性薬剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識部分；生物物理学的プローブ；リン光基；化学発光基；高電子密度基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能標識及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、Ｌは任意であり、存在するときには、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり、
各Ｒａは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ｋは１、２又は３である。）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、及び−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から独立に選択され、ｎは０から８である。
【０３４４】
かかる非天然アミノ酸は塩の形態とすることができ、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０３４５】
かかるアミノ酸の非限定的例としては、以下の構造を有するアミノ酸が挙げられる。
【０３４６】
【化１１１】
0005425398.tif 000051
【０３４７】
かかる非天然アミノ酸は塩の形態とすることができ、又は非天然アミノ酸ポリペプチド、ポリマー、多糖若しくはポリヌクレオチドに組み込まれていてもよく、翻訳後修飾されていてもよい。
【０３４８】
オキシム系非天然アミノ酸は、（ａ）ヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸とカルボニル含有若しくはジカルボニル含有試薬との反応、（ｂ）カルボニル含有若しくはジカルボニル含有非天然アミノ酸とヒドロキシルアミン含有試薬との反応又は（ｃ）オキシム含有非天然アミノ酸とある種のカルボニル含有若しくはジカルボニル含有試薬、例として、ケトン含有試薬若しくはアルデヒド含有試薬との反応を含めて、当分野では既に記述されている方法又は本明細書の方法によって合成することができる。図５及び６は、これらの合成方法の代表的な非限定的例である。
【０３４９】
Ｄ．  細胞による非天然アミノ酸の取り込み
真核細胞による非天然アミノ酸の取り込みは、タンパク質への組み込みの場合を含めて、但しこれだけに限定されない、非天然アミノ酸を設計及び選択するときに典型的に検討される一課題である。例えば、α−アミノ酸の高電荷密度は、この化合物が細胞透過性である可能性が高いことを示唆している。天然アミノ酸は、タンパク質を主体とする輸送系の集団を介して、真核細胞に吸収される。非天然アミノ酸が細胞によって吸収されるとすればどの非天然アミノ酸が吸収されるかを評価する迅速スクリーニングを実施することができる（本明細書に記載の実施例１５及び１６は、非天然アミノ酸に対して実施することができる試験の非限定的例を示す。）。例えば、参照によりその全体を本明細書に組みこむ米国特許公開第２００４／１９８６３７号”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｒｒａｙｓ”及びＬｉｕ，  Ｄ．Ｒ．  ＆  Ｓｃｈｕｌｔｚ，  Ｐ．Ｇ．（１９９９）  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｔｏｗａｒｄ  ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒｇａｎｉｓｍ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ．  ＰＮＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ９６：４７８０−４７８５に記載の毒性アッセイを参照されたい。取り込みは種々のアッセイによって容易に分析されるが、細胞による取り込み経路に適している非天然アミノ酸を設計する代替法は、インビボでアミノ酸を産生する生合成経路を提供することである。
【０３５０】
典型的には、本明細書に記載の細胞による取り込みによって産生される非天然アミノ酸は、天然の細胞の量を含めて、但しこれだけに限定されない、タンパク質の効率的生合成に十分な濃度で、但し、他のアミノ酸の濃度に影響を及ぼさない、又は細胞源を消耗しない程度に、産生される。このようにして産生される典型的な濃度は、約１０ｍＭから約０．０５ｍＭである。
【０３５１】
Ｅ．  非天然アミノ酸の生合成
アミノ酸及び他の化合物を産生するための多数の生合成経路が細胞には既に存在する。特定の非天然アミノ酸の生合成方法は、細胞中を含めて、但しこれだけに限定されない天然に存在しない場合もあり得るが、本明細書の方法及び組成物はかかる方法を提供する。例えば、非天然アミノ酸の生合成経路は、新しい酵素を添加することによって、又は既存の宿主細胞経路を改変することによって、宿主細胞中で作製することができる。追加の新しい酵素としては、天然酵素、人工酵素などが挙げられる。例えば、（国際公開第２００２／０８５９２３号”Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ”の実施例にある）α−アミノフェニルアラニンの生合成は、他の生物由来の公知酵素の組み合わせを添加することに依拠する。これらの酵素の遺伝子は、該遺伝子を含むプラスミドで真核細胞を形質転換することによって細胞に導入することができる。遺伝子は、細胞中で発現すると、所望の化合物を合成する酵素経路を与える。添加してもよい酵素タイプの例を本明細書に記載する。追加の酵素配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋにある。人工酵素も同様に細胞に添加することができる。このようにして、非天然アミノ酸を産生するように細胞機構及び細胞源を操作する。
【０３５２】
生合成経路用の新規酵素を生成し、又は既存の経路を進化させるのに、種々の方法が利用可能である。例えば、（ｗｗｗ．ｍａｘｙｇｅｎ．ｃｏｍのワールドワイドウェブ上で利用可能な）Ｍａｘｙｇｅｎ，  Ｉｎｃ．によって開発されたものを含めて、但しこれだけに限定されない再帰的（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ）組換えを新規の酵素及び経路の開発に使用することができる。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４），  Ｒａｐｉｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３７０（４）：３８９−３９１及びＳｔｅｍｍｅｒ，（１９９４），  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｂｙ  ｒａｎｄｏｍ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．，  ９１：１０７４７−１０７５１を参照されたい。同様に、Ｇｅｎｅｎｃｏｒによって開発された（ｇｅｎｅｎｃｏｒ．ｃｏｍのワールドワイドウェブ上で利用可能な）ＤｅｓｉｇｎＰａｔｈ（商標）を、細胞中で非天然アミノ酸を産生するように経路を操作することを含めて、但しこれだけに限定されない代謝経路操作に使用してもよい。この技術は、機能ゲノム科学、分子進化及び設計によって確認されるものを含めて、但しこれだけに限定されない新しい遺伝子の組み合わせを用いて、宿主生物中の既存の経路を再構築する。（ｄｉｖｅｒｓａ．ｃｏｍのワールドワイドウェブ上で利用可能な）Ｄｉｖｅｒｓａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎも、非天然アミノ酸を生合成的に産生する新しい経路を作製することを含めて、但しこれだけに限定されない、遺伝子及び遺伝子経路のライブラリーを迅速にスクリーニングする技術を提供している。
【０３５３】
典型的には、本明細書に記載の操作された生合成経路によって産生される非天然アミノ酸は、天然の細胞の量を含めて、但しこれだけに限定されない、タンパク質の効率的生合成に十分な濃度で、但し、他のアミノ酸の濃度に影響を及ぼさない、又は細胞源を消耗しない程度に、産生される。このようにしてインビボで産生される典型的な濃度は、約１０ｍＭから約０．０５ｍＭである。細胞が、特異的経路に要求される酵素の生成に使用される遺伝子を含むプラスミドで形質転換され、非天然アミノ酸が産生された後、インビボでの選択を使用して、リボソームタンパク質合成と細胞増殖の両方に対して非天然アミノ酸の産生をさらに最適化してもよい。
【０３５４】
Ｆ．  追加の合成方法
本明細書に記載の非天然アミノ酸は、当分野で記述されている方法、本明細書に記載の技術又はこれらの組み合わせによって合成することができる。補足として、以下の表に、組み合わせて所望の官能基を生成することができる種々の出発求電子剤と求核剤を示す。記載した情報は、説明のためのものであって、本明細書に記載の合成技術を限定するものではない。
表１：共有結合及びその前駆体の例
【０３５５】
【表１】
0005425398.tif 000052
【０３５６】
一般に、炭素求電子剤は、炭素求核剤を含めて相補的な求核剤による攻撃を受けやすい。攻撃する求核剤は、求核剤と炭素求電子剤との新しい結合を形成するために、電子対を炭素求電子剤に運ぶ。
【０３５７】
炭素求核剤の非限定的例としては、アルキル、アルケニル、アリール及びアルキニルグリニヤール、有機リチウム、有機亜鉛、アルキルスズ、アルケニルスズ、アリールスズ及びアルキニルスズ試薬（有機水素化スズ）、アルキルボラン、アルケニルボラン、アリールボラン及びアルキニルボラン試薬（有機ボラン及び有機ボロナート）が挙げられるが、これらだけに限定されない。これらの炭素求核剤は、水又は極性有機溶媒中で動力学的に安定である利点を有する。炭素求核剤の他の非限定的例としては、リンイリド（ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ  ｙｌｉｄ）、エノール及びエノラート試薬が挙げられる。これらの炭素求核剤は、合成有機化学の当業者に周知である前駆体から比較的容易に生成される利点を有する。炭素求核剤は、炭素求電子剤と併用すると、炭素求核剤と炭素求電子剤との新しい炭素−炭素結合を生じる。
【０３５８】
炭素求電子剤とのカップリングに適切である非炭素求核剤の非限定的例としては、第一級及び第二級アミン、チオール、チオラート及びチオエーテル、アルコール、アルコキシド、アジド、セミカルバジドなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。これらの非炭素求核剤は、炭素求電子剤と併用すると、典型的にはヘテロ原子リンケージ（Ｃ−Ｘ−Ｃ）を生成する。ここで、Ｘは、酸素、硫黄又は窒素を含めて、但しこれらだけに限定されないヘテロ原子である。
【０３５９】
ＶＩ．  非天然アミノ酸を含むポリペプチド
便宜上、本セクションに記載する化合物の形態、諸性質及び他の諸特性を一般的に、及び／又は具体例によって、記述した。しかし、本セクションに記載の形態、諸性質及び他の諸特性を、本セクションの一般的記述又は具体例だけに限定すべきではない。そうではなく、本セクションに記載の形態、諸性質及び他の諸特性は、本発明の明細書、特許請求の範囲及び図に記載した式Ｉ−ＸＶＩＩＩ、ＸＸＸ−ＸＸＸＩＶ（Ａ＆Ｂ）及びＸＸＸＸ−ＸＸＸＸＩＩＩの範囲内にあるあらゆる下位式又は特定の化合物を含めて、式Ｉ−ＸＶＩＩＩ、ＸＸＸ−ＸＸＸＩＶ（Ａ＆Ｂ）及びＸＸＸＸ−ＸＸＸＸＩＩＩの範囲内にある全ての化合物に等しく申し分なく適用される。
【０３６０】
本明細書に記載の組成物及び方法は、ポリペプチドへの少なくとも１個の非天然アミノ酸の組み込みを可能にする。非天然アミノ酸は、ポリペプチドの任意の末端位置又は任意の内部位置を含めて、ポリペプチド上の任意の位置に存在し得る。好ましくは、非天然アミノ酸は、活性及び／又は三次構造の破壊が、非天然アミノ酸をポリペプチドに組み込む目的の１つでない限り、同族の天然アミノ酸ポリペプチドと比較して、ポリペプチドの活性及び／又は三次構造を破壊しない。また、ポリペプチドへの非天然アミノ酸の組み込みは、同族の天然アミノ酸ポリペプチドと比較して、活性及び／又は三次構造の破壊を全く生じずに、活性（例えば、ポリペプチドの治療有効性の操作、ポリペプチドの安全性プロファイルの改善、ポリペプチドの薬物動態学、薬理学及び／又は薬力学の調節（例えば、水溶性の増大、生物学的利用能、血清半減期の延長、治療上の半減期の延長、免疫原性の調節、生物活性の調節又は循環時間の延長）、ポリペプチドへの追加の官能性の付与、ポリペプチドへのタグ、標識又は検出可能シグナルの組み込み、ポリペプチドの単離特性の容易化並びに上記改変の任意の組み合わせ）及び／又はポリペプチドの三次構造をある程度改変し得る。活性及び／又は三次構造のかかる改変は、かかる組み込みを行う目的の１つであることが多いが、ポリペプチドへの非天然アミノ酸の組み込みは、同族の天然アミノ酸ポリペプチドと比較して、ポリペプチドの活性及び／又は三次構造に対して殆ど効果を持たないこともある。それに対応して、非天然アミノ酸ポリペプチド、非天然アミノ酸ポリペプチドを含む組成物、かかるポリペプチド及びポリペプチド組成物を製造する方法、かかるポリペプチド及びポリペプチド組成物を精製し、単離し、特徴付ける方法並びにかかるポリペプチド及びポリペプチド組成物を使用する方法は、本開示の範囲内と考えられる。また、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドは、（例として、非天然アミノ酸ポリペプチド又は天然アミノ酸ポリペプチドを含めて）別のポリペプチドと連結することもできる。
【０３６１】
本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドは、生合成的にも非生合成的にも生成することができる。生合成的にとは、以下の成分、すなわち、ポリヌクレオチド、コドン、ｔＲＮＡ及びリボソームの少なくとも１種類の使用を含めて、（細胞又は非細胞の）翻訳系を利用する任意の方法を意味する。非生合成的にとは、翻訳系を利用しない任意の方法を意味する。この手法は、固体ペプチド合成方法を利用する方法、固相ペプチド合成方法、少なくとも１種類の酵素を利用する方法及び少なくとも１種類の酵素を利用しない方法にさらに分類することができる。また、これらの下位分類は重複してもよく、多数の方法が、これらの下位分類の組み合わせを利用することができる。
【０３６２】
本明細書の方法、組成物、戦略及び技術は、ポリペプチド又はタンパク質の特定のタイプ、クラス又はファミリーに限定されない。実際、実質的にあらゆるポリペプチドが、本明細書に記載の少なくとも１個の非天然アミノ酸を含むことができる。単なる例として、ポリペプチドは、アルファ−１抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学走化性タンパク質−１、単球化学走化性タンパク質−２、単球化学走化性タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１アルファ、単球炎症性タンパク質−１ベータ、ＲＡＮＴＥＳ、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン、上皮性好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮性好中球活性化ペプチド、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、剥脱性毒素、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、４本ヘリックスバンドルタンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、性腺刺激ホルモン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１受容体、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールツリン、好中球抑制因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン、Ａタンパク質、Ｇタンパク質、ｐｔｈ、発熱性外毒素Ａ、発熱性外毒素Ｂ、発熱性外毒素Ｃ、ｐｙｙ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、小さな生合成タンパク質、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群毒素、チモシンア���ファ１、組織プラスミノゲンアクチベーター、腫よう成長因子（ＴＧＦ）、腫よう壊死因子、腫よう壊死因子アルファ、腫よう壊死因子ベータ、腫よう壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４タンパク質、ＶＣＡＭ−１タンパク質、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体及びコルチコステロンからなる群から選択される治療用タンパク質と相同であり得る。関係する実施形態又はさらなる実施形態においては、非天然アミノ酸ポリペプチドは、成長ホルモンスーパー遺伝子ファミリーの任意のポリペプチドメンバーとも相同であり得る。
【０３６３】
非天然アミノ酸ポリペプチドは、本開示に記載するようにさらに修飾することができ、又は非天然アミノ酸ポリペプチドはさらに修飾せずに使用することができる。ポリペプチドへの非天然アミノ酸の組み込みは、タンパク質構造及び／又は機能の変化、サイズ変化、酸性度、求核性、水素結合、疎水性、プロテアーゼ標的部位の接触性、（ポリペプチドアレイ用を含めて、但しこれだけに限定されない）部分へのターゲティングなどを調整することを含めて、但しこれらだけに限定されない種々の目的で実施することができる。非天然アミノ酸を含むポリペプチドは、触媒作用的又は生物物理学的な諸性質を向上させることができ、さらには全く新しい触媒作用的又は生物物理学的な諸性質を有することさえできる。単なる例として、以下の諸性質は、非天然アミノ酸をポリペプチドに含めることによって改変することができる：毒性、体内分布、構造上の性質、分光学的性質、化学的及び／又は光化学的性質、触媒作用能力、（血清半減期を含めて、但しこれだけに限定されない）半減期、共有結合的又は非共有結合的を含めて、但しこれらだけに限定されない他の分子と反応する能力など。少なくとも１個の非天然アミノ酸を含むポリペプチドを含む組成物は、新規の治療学、診断学、触媒酵素、産業用酵素、（抗体を含めて、但しこれだけに限定されない）結合タンパク質並びにタンパク質構造及び機能の研究を含めて、但しこれだけに限定されない研究を含めて、但しこれらだけに限定されないものに有用である。例えば、Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，  （２０００）  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｓ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ４：６４５−６５２を参照されたい。
【０３６４】
また、ポリペプチドの非天然アミノ酸成分の側鎖は、広範囲な追加の官能性をポリペプチドに与えることができる。非限定的な単なる例として、ポリペプチドの非天然アミノ酸部分の側鎖としては、以下のものが挙げられる：標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコール誘導体；光架橋剤；細胞傷害性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質又はポリペプチド又はポリペプチドアナログ；抗体又は抗体断片；金属キレート剤；補因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；糖類、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；フルオロフォア、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的又は非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；化学線放射によって励起可能な部分；リガンド；光異性化可能部分；ビオチン；ビオチンアナログ；重原子を組み込んだ部分；化学開裂可能な基；光開裂可能な基；長い側鎖；炭素連結糖；レドックス活性薬剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識部分；生物物理学的プローブ；リン光基；化学発光基；高電子密度基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能標識；小分子；抑制性リボ核酸、放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチン誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；アブザイム、活性錯体活性化物質、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルガン、アンギオスタチン、抗ホルモン、抗酸化剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、巨大分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル及びこれらの任意の組み合わせ。
【０３６５】
一態様においては、組成物は、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個又は少なくとも１０個以上の非天然アミノ酸を含めて、但しこれらだけに限定されない、少なくとも１個の非天然アミノ酸を含む少なくとも１個のポリペプチドを含む。かかる非天然アミノ酸は、同じでも異なっていてもよい。また、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上の異なる、又は同じ非天然アミノ酸を含むポリペプチド中には１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上の異なる部位が存在し得る。別の態様においては、組成物は、非天然アミノ酸で置換された、ポリペプチド中に存在する少なくとも１個の、但し全部よりは少ない、特定のアミノ酸を含むポリペプチドを含む。１個を超える非天然アミノ酸を含む所与のポリペプチドの場合、非天然アミノ酸は同一でも異なっていてもよい（単なる例として、ポリペプチドは、異なるタイプの２個以上の非天然アミノ酸を含むことができ、又は２個の同じ非天然アミノ酸を含むことができる）。２個を超える非天然アミノ酸を含む所与のポリペプチドの場合、非天然アミノ酸は同じでも、異なっていても、複数の同種の非天然アミノ酸と少なくとも１個の異なる非天然アミノ酸との組み合わせでもよい。
【０３６６】
本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドの実施形態は、（単なる例として、固体樹脂上などでの）固相ペプチド合成方法を介して、溶液相ペプチド合成方法によって、及び／又は酵素を使用せずに、化学合成され得るが、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドの他の実施形態は、細胞膜、細胞抽出物若しくは溶解物系を介して、又は単なる例として原核細胞若しくは真核細胞の細胞機構を用いるなどのインビボ系を介して、合成することができる。さらなる又は追加の実施形態においては、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドの重要な特徴の１つは、非天然アミノ酸ポリペプチドがリボソームを利用して合成され得ることである。本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドのさらなる又は追加の実施形態においては、非天然アミノ酸ポリペプチドは、固体樹脂の組み合わせ、酵素を使用しない方法、リボソームを使用する方法及び／又はインビボ系を介する方法を含めて、但しこれらだけに限定されない方法の組み合わせによって合成され得る。
【０３６７】
リボソーム及び／又はインビボ系を介した非天然アミノ酸ポリペプチドの合成は、固体樹脂上で、又は酵素を使用せずに合成された非天然アミノ酸ポリペプチドに由来する明確な利点及び特性を有する。これらの利点又は特性としては、異なる不純物プロファイルなどが挙げられる。リボソームを利用した系及び／又はインビボ系は、宿主細胞タンパク質、膜部分及び脂質を含めて、利用した生物系に由来する不純物を含むのに対して、固体樹脂を利用した系及び／又は酵素を使用しない系から得られる不純物プロファイルは、合成手順において使用する有機溶媒、保護基、樹脂材料、カップリング試薬及び他の化学物質を含み得る。また、リボソームの使用及び／又はインビボ系を介して合成された非天然アミノ酸ポリペプチドの同位体パターンは、細胞に利用した原材料の同位体パターンを反映し得る。一方、固体樹脂上で、及び／又は酵素を使用せずに合成された非天然アミノ酸ポリペプチドの同位体パターンは、合成に利用したアミノ酸の同位体パターンを反映し得る。また、リボソームの使用及び／又はインビボ系を介して合成された非天然アミノ酸は、アミノ酸のＤ異性体を実質的に含まないことがあり、及び／又は内部システインアミノ酸をポリペプチド構造に容易に組み込むことができ、及び／又は内部アミノ酸欠失ポリペプチド（ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）をめったにもたらすことがない。一方、固体樹脂を介して、及び／又は酵素を使用せずに合成された非天然アミノ酸ポリペプチドは、アミノ酸のＤ異性体を高含量で含み、及び／又は内部システインアミノ酸を低含量で含み、及び／又は内部アミノ酸欠失ポリペプチドを高い割合で含み得る。また、当業者は、リボソーム及び／又はインビボ系を使用して合成された非天然アミノ酸ポリペプチドを、固体樹脂を介して、及び／又は酵素を使用せずに合成された非天然アミノ酸ポリペプチドから区別することができる。
【０３６８】
ＶＩＩ．  核酸及びオリゴヌクレオチドを含む組成物及び方法
Ａ．  本明細書で使用する一般的組換え核酸方法
本明細書の方法及び組成物の多数の実施形態においては、（例としてＧＨポリペプチドを含めて）目的ポリペプチドをコードする核酸は、単離され、クローン化され、しばしば組換え方法によって改変される。かかる実施形態は、タンパク質発現のために、又はポリペプチドに由来する変異体、誘導体、発現カセット若しくは他の配列の生成中を含めて、但しこれらだけに限定されないで使用される。一部の実施形態においては、ポリペプチドをコードする配列は、異種プロモーターに作動可能に連結されている。
【０３６９】
非天然アミノ酸を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、親ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて合成し、次いで関連するアミノ酸残基を導入（すなわち、組み込み又は置換）又は除去（すなわち、欠失又は置換）するようにヌクレオチド配列を変えることができる。ヌクレオチド配列は、従来の方法に従って部位特異的変異誘発によって都合よく改変することができる。或いは、ヌクレオチド配列は、オリゴヌクレオチド合成装置を用いること（ここで、オリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計される。）、及び好ましくは組換えポリペプチドが産生される宿主細胞において好まれるコドンを選択することを含めて、但しこれらだけに限定されない化学合成によって調製することができる。例えば、所望のポリペプチドの一部をコードする幾つかの小さいオリゴヌクレオチドを合成することができ、ＰＣＲ、連結又は連結連鎖反応（ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）によって組み立てることができる。例えば、参照により本明細書に組みこむＢａｒａｎｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８８：１８９−１９３（１９９１）；米国特許第６，５２１，４２７号を参照されたい。
【０３７０】
本明細書に記載の非天然アミノ酸の方法及び組成物は、組換え遺伝学の分野における定常的な技術を利用する。本明細書に記載の非天然アミノ酸の方法及び組成物に使用される一般的方法を開示した基本的な教科書としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄ．  ２００１）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  １９９４））などが挙げられる。
【０３７１】
分子生物学的技術を記載した一般的な教科書としては、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄ．），  Ｖｏｌ．  １−３，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８９（”Ｓａｍｂｒｏｏｋ”）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｆ．Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，（１９９９年を通して補遺）（”Ａｕｓｕｂｅｌ”））などが挙げられる。これらの教科書は、変異誘発、ベクターの使用、プロモーター、並びに非天然アミノ酸を含むタンパク質の産生用選択コドンを含む遺伝子又はポリヌクレオチド、直交ｔＲＮＡ、直交シンセターゼ及びこれらの組み合わせの生成を含めて、但しこれらだけに限定されない多数の他の関連する項目を記載している。
【０３７２】
種々のタイプの変異誘発は、新規のシンセターゼ又はｔＲＮＡの生成、ｔＲＮＡ分子の変異、シンセターゼをコードするポリヌクレオチド、ｔＲＮＡのライブラリーの変異、シンセターゼのライブラリーの作成、選択コドンの生成、目的タンパク質又はポリペプチド中への非天然アミノ酸をコードする選択コドンの挿入を含めて、但しこれらだけに限定されない種々の目的で、本明細書に記載の非天然アミノ酸の方法及び組成物に使用される。種々のタイプの変異誘発としては、部位特異的変異誘発、無作為な点変異誘発、相同組換え、ＤＮＡシャフリング又は他の再帰的変異誘発方法、キメラの構築、ウラシル含有テンプレートを用いた変異誘発、オリゴヌクレオチド特異的変異誘発、ホスホロチオエート型修飾ＤＮＡ変異誘発、ギャップのある（ｇａｐｐｅｄ）二本鎖ＤＮＡを用いた変異誘発など、又はこれらの任意の組み合わせなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。追加の適切な方法としては、点ミスマッチ（ｐｏｉｎｔ  ｍｉｓｍａｔｃｈ）修復、修復欠損（ｒｅｐａｉｒ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ）宿主系統を用いた変異誘発、制限−選択及び制限−精製、欠失変異誘発、全遺伝子合成による変異誘発、二本鎖切断修復などが挙げられる。キメラ構築体が関与するものを含めて、但しこれだけに限定されない変異誘発も、本明細書に記載の非天然アミノ酸の方法及び組成物に含まれる。一実施形態においては、変異誘発は、配列比較、物性、結晶構造などを含めて、但しこれらだけに限定されない、天然分子又は変化若しくは変異した天然分子の既知の情報によって誘導することができる。
【０３７３】
本明細書に記載の教科書及び実施例は、これらの手順及び他の関連する手順を記述している。追加の情報は、以下の刊行物及びその引用文献に記載されている：Ｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：  ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ，  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２５４（２）：１５７−１７８（１９９７）；  Ｄａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｍｅｔｈｏｄ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５７：３６９−３７４（１９９６）；  Ｓｍｉｔｈ，  Ｉｎ  ｖｉｔｉｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．  １９：４２３−４６２（１９８５）；  Ｂｏｔｓｔｅｉｎ  ＆  Ｓｈｏｒｔｌｅ，  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１１９３−１２０１（１９８５）；  Ｃａｒｔｅｒ，  Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ２３７：１−７（１９８６）；  Ｋｕｎｋｅｌ，  Ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，  Ｆ．  ａｎｄ  Ｌｉｌｌｅｙ，  Ｄ．Ｍ．Ｊ．  ｅｄｓ．，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  Ｂｅｒｌｉｎ））（１９８７）；  Ｋｕｎｋｅｌ，  Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２（１９８５）；  Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５４，  ３６７−３８２（１９８７）；  Ｂａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｕｔａｎｔ  Ｔｒｐ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｎｅｗ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：２４０−２４５（１９８８）；  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １００：４６８−５００（１９８３）；  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５４：３２９−３５０（１９８７）；  Ｚｏｌｌｅｒ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ：  ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｎｙ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １０：６４８７−６５００（１９８２）；  Ｚｏｌｌｅｒ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｃｌｏ���ｅｄ  ｉｎｔｏ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １００：４６８−５００（１９８３）；  Ｚｏｌｌｅｒ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：  ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｕｓｉｎｇ  ｔｗｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ａｎｄ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ｔｅｍｐｌａｔｅ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５４：３２９−３５０（１９８７）；  Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｐｒｅｐａｒｅ  ｎｉｃｋｅｄ  ＤＮＡ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １３：８７４９−８７６４（１９８５）；  Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ｒａｐｉｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １３：８７６５−８７８５（１９８５）；  Ｎａｋａｍａｙｅ  ＆  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｎｃｉ  Ｉ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｂｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｇｒｏｕｐｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４：９６７９−９６９８（１９８６）；  Ｓａｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ５’−３’  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：７９１−８０２（１９８８）；  Ｓａｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｒａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ，（１９８８）  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：８０３−８１４；  Ｋｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２：９４４１−９４５６（１９８４）；  Ｋｒａｍｅｒ  ＆  Ｆｒｉｔｚ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｖｉａ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５４：３５０−３６７（１９８７）；  Ｋｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ａｐｐｒｏ��ｃｈ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：７２０７（１９８８）；  Ｆｒｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：  ａ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：６９８７−６９９９（１９８８）；  Ｋｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｏｉｎｔ  Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｒｅｐａｉｒ，  Ｃｅｌｌ  ３８：８７９−８８７（１９８４）；  Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒｓ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １３：４４３１−４４４３（１９８５）；  Ｃａｒｔｅｒ，  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １５４：３８２−４０３（１９８７）；  Ｅｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｈ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｔｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｌａｒｇｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４：５１１５（１９８６）；  Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ，  Ｐｈｉｌ．  Ｔｒａｎｓ．  Ｒ．  Ｓｏｃ．  Ｌｏｎｄ．  Ａ  ３１７：４１５−４２３（１９８６）；  Ｎａｍｂｉａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９−１３０１（１９８４）；  Ｓａｋｍａｒ  ａｎｄ  Ｋｈｏｒａｎａ，  Ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  α−ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｒｏｄ  ｏｕｔｅｒ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ），  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １４：６３６１−６３７２（１９８８）；  Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：  ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｉｔｅｓ，  Ｇｅｎｅ  ３４：３１５−３２３（１９８５）；  Ｇｒｕｎｄｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ  ’ｓｈｏｔ−ｇｕｎ’  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １３：３３０５−３３１６（１９８５）；  Ｍａｎｄｅｃｋｉ，  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔ��ｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：  ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８３：７１７７−７１８１（１９８６）；  Ａｒｎｏｌｄ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｕｎｕｓｕａｌ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：４５０−４５５（１９９３）；  Ｓｉｅｂｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １９：４５６−４６０（２００１）．  Ｗ．Ｐ．Ｃ．  Ｓｔｅｍｍｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ  ３７０，  ３８９−９１（１９９４）及びＩ．Ａ．  Ｌｏｒｉｍｅｒ，  Ｉ．  Ｐａｓｔａｎ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２３，  ３０６７−８（１９９５）。多数のかかる方法についてのさらなる詳細は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌｕｍｅ  １５４に見出すことができる。これも、種々の変異誘発方法に関する問題を解決するのに有用な調節法について記載している。
【０３７４】
本明細書の方法及び組成物は、真核生物宿主細胞、非真核生物宿主細胞、及び直交ｔＲＮＡ／ＲＳ対を介して非天然アミノ酸をインビボで組み込むための生物の使用も含む。宿主細胞は、本明細書に記載のポリペプチドに対応するポリヌクレオチドによって、又は例えばクローニングベクター若しくは発現ベクターであり得る、本明細書に記載のポリペプチドに対応するベクターを含めて、但しこれらだけに限定されない、本明細書に記載のポリペプチドに対応するポリヌクレオチドを含む構築体によって、（形質転換、形質導入又は形質移入を含めて、但しこれらだけに限定されない）遺伝子改変される。例えば、直交ｔＲＮＡ、直交ｔＲＮＡシンセターゼ及び誘導体化しようとするタンパク質のコード領域を、所望の宿主細胞中で機能する遺伝子発現調節領域に作動可能に結合させる。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又は複合ポリヌクレオチドの形態とすることができる。ベクターは、電気穿孔法（Ｆｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２，  ５８２４（１９８５））、ウイルスベクター感染、小ビーズ又は粒子のマトリックス内又は表面に核酸を有する小粒子による高速弾道貫入（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３２７，  ７０−７３（１９８７））などを含めた標準方法によって、細胞及び／又は微生物に導入される。
【０３７５】
操作された宿主細胞は、例えば、スクリーニング段階、プロモーターの活性化、形質転換体の選択などの行為のために適宜改変された従来の栄養培地中で培養することができる。操作された宿主細胞は、培養してトランスジェニック生物にすることもできる。細胞の単離及び培養（例えば、後続の核酸の単離）を含めて、但しこれらだけに限定されないものに有用である他の参考文献としては、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  （１９９４）  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，  ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，  ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ及びその引用文献；Ｐａｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ；  Ｇａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（ｅｄｓ）（１９９５）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ａｔｌａｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｓ（ｅｄｓ）  Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ  （１９９３）  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，  ＦＬなどが挙げられる。
【０３７６】
標的核酸を細胞に導入する幾つかの周知の方法が利用可能であり、そのいずれも本明細書の方法及び組成物に使用することができる。この方法には、レシピエント細胞とＤＮＡを含む細菌のプロトプラストとの融合、電気穿孔法、微粒子銃（ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、（本明細書でさらに考察する）ウイルスベクター感染などが含まれる。細菌細胞は、本明細書に記載のポリペプチドに対応するＤＮＡ構築体を含むプラスミドの数を増大させるのに使用することができる。細菌は対数増殖し、細菌内のプラスミドは、当分野で公知の種々の方法によって単離することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ参照）。また、プラスミドを細菌から精製する多数のキットが市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製ＥａｓｙＰｒｅｐ（商標）、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐ（商標）；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製ＳｔｒａｔａＣｌｅａｎ（商標）及びＱｉａｇｅｎ製ＱＩＡｐｒｅｐ（商標）を参照されたい。）。次いで、単離・精製したプラスミドを、他のプラスミドを産生するようにさらに操作し、細胞の形質移入に使用し、又は生物を感染させるために関係するベクターに組み込む。典型的なベクターは、転写及び翻訳ターミネーター、転写及び翻訳開始配列、並びに特定の標的核酸の発現調節に有用であるプロモーターを含む。ベクターは、少なくとも１個の独立したターミネーター配列、（シャトルベクターを含めて、但しこれだけに限定されない）真核生物若しくは原核生物又はその両方におけるカセットの複製を可能にする配列、及び原核生物系と真核生物系の両方に対する選択マーカーを含む一般的な発現カセットを含んでいてもよい。ベクターは、原核生物、真核生物又は好ましくは両方における複製及び組み込みに適切である。Ｇｉｌｌａｍ  ＆  Ｓｍｉｔｈ，  Ｇｅｎｅ  ８：８１（１９７９）；  Ｒｏｂｅｒｔｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２８：７３１（１９８７）；  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，  Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ．  ６（１）：１０−１４（１９９５）；  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｂｅｒｇｅｒ（全て上記）を参照されたい。クローニングに有用である細菌及びバクテリオファージの一覧は、例えば、ＡＴＣＣによって、例えば、ＡＴＣＣによって刊行されたＴｈｅ  ＡＴＣＣ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  （１９９２）  Ｇｈｅｒｎａ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ）によって提供されている。配列決定、クローニング並びに分子生物学及び根本的な理論的考察の他の側面についてのさらなる基本的手順は、Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，  ＮＹにも記載されている。また、本質的にあらゆる核酸（及び標準でも非標準でも、実質的にあらゆる標識核酸）は、Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，  ＴＸ  ｍｃｒｃ．ｃｏｍ）、Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒａｍｏｎａ，  ＣＡ  ｇｅｎｃｏ．ｃｏｍのワールドワイドウェブ上で利用可���）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｃａｇｏ，  ＩＬ  ｅｘｐｒｅｓｓｇｅｎ．ｃｏｍのワールドワイドウェブ上で利用可能）、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，  ＣＡ）などの種々の商業供給源のいずれかから特別注文又は標準注文することができる。
【０３７７】
Ｂ．  選択コドン
本明細書の方法及び組成物に包含される選択コドンは、タンパク質生合成機構の遺伝子コドンの枠組みを拡張したものである。例えば、選択コドンとしては、一義的な３塩基コドン、アンバーコドン（ＵＡＧ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）を含めて、但しこれらだけに限定されない終止コドンなどのナンセンスコドン、異常コドン、４塩基以上のコドン、レアコドンなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。所望の遺伝子又はポリヌクレオチドに導入することができる選択コドンの数は、目的ポリペプチドの少なくとも一部をコードする単一のポリヌクレオチド中の１個以上、２個以上、３個以上、４、５、６、７、８、９、１０個以上を含めて、但しこれらだけに限定されずに、広範囲にある。
【０３７８】
一実施形態においては、本明細書の方法は、１個以上の非天然アミノ酸をインビボで組み込むために、終止コドンである選択コドンの使用を含む。例えば、ＵＡＧを含めて、但しこれだけに限定されない終止コドンを認識するＯ−ｔＲＮＡが作製され、所望の非天然アミノ酸を含むＯ−ＲＳによってアミノアシル化される。このＯ−ｔＲＮＡは、天然の宿主のアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼによって認識されない。従来の部位特異的変異誘発によって、ＵＡＧを含めて、但しこれだけに限定されない終止コドンを目的ポリペプチド中の目的部位に導入することができる。例えば、Ｓａｙｅｒｓ，  Ｊ．Ｒ．，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８），  ５’，３’  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  １６（３）：７９１−８０２を参照されたい。Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ及び目的ポリペプチドをコードする核酸をインビボで組み合わせると、非天然アミノ酸がＵＡＧコドンに応じて組み込まれて、指定位置に非天然アミノ酸を含むポリペプチドが産生される。
【０３７９】
非天然アミノ酸は、真核生物宿主細胞をさほど混乱させずにインビボで組み込むことができる。例えば、ＵＡＧコドンの抑制効率は、アンバーサプレッサーｔＲＮＡを含めて、但しこれだけに限定されないＯ−ｔＲＮＡと（終止コドンに結合して、成長中のペプチドのリボソームからの放出を惹起する）（ｅＲＦを含めて、但しこれだけに限定されない）真核生物終結因子との競合に応じて決まるので、Ｏ−ｔＲＮＡ及び／又はサプレッサーｔＲＮＡの発現レベルの増大を含めて、但しこれだけに限定されないものによって調節することができる。
【０３８０】
選択コドンは、４、５、６塩基以上のコドンなどの４塩基以上のコドンを含めて、但しこれらだけに限定されない拡張コドンも含む。４塩基コドンの例としては、ＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、ＣＣＣＵなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。５塩基コドンの例としては、ＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、ＵＡＧＧＣなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。本明細書の方法及び組成物の特徴は、フレームシフト抑圧に基づく拡張コドンの使用を含む。４塩基以上のコドンは、１個以上の非天然アミノ酸を含めて、但しこれだけに限定されない非天然アミノ酸を同じタンパク質に挿入することができる。例えば、アンチコドンループ、例えば、少なくとも８−１０ｎｔのアンチコドンループを有する、特別なフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡを含めて、但しこれだけに限定されない変異Ｏ−ｔＲＮＡの存在下で、４塩基以上のコドンは、単一のアミノ酸として読まれる。他の実施形態においては、アンチコドンループは、少なくとも４塩基コドン、少なくとも５塩基コドン又は少なくとも６塩基以上のコドンを含めて、但しこれらだけに限定されないコドンをデコードすることができる。可能な４塩基コドンは２５６種類存在するので、同じ細胞中で４塩基以上のコドンを用いて複数の非天然アミノ酸をコードすることができる。Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｌｉｍｉｔｓ  ｏｆ  Ｃｏｄｏｎ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｃｏｄｏｎ  Ｓｉｚｅ，  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ９：２３７−２４４；  Ｍａｇｌｉｅｒｙ，  （２００１）  Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ：  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｏｆ  Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  Ｃｏｄｏｎｓ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ”Ｓｈｉｆｔｙ”  Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  Ｃｏｄｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３０７：７５５−７６９を参照されたい。
【０３８１】
例えば、４塩基コドンを用いて、インビトロ生合成方法によって非天然アミノ酸がタンパク質中に組み込まれた。例えば、Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９３）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３２：７９３９−７９４５及びＨｏｈｓａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １２１：３４−４０を参照されたい。ＣＧＧＧとＡＧＧＵを使用して、化学的にアシル化された２種類のフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡを用いて２−ナフチルアラニンとＮＢＤ誘導体又はリジンがストレプトアビジンにインビトロで同時に組み込まれた。例えば、Ｈｏｈｓａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １２１：  １２１９４−１２１９５を参照されたい。インビボ試験において、Ｍｏｏｒｅらは、ＮＣＵＡアンチコドンを有するｔＲＮＡＬｅｕ誘導体のＵＡＧＮコドン抑制能力を調べ（ＮはＵ、Ａ、Ｇ又はＣであり得る。）、４塩基（ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ）ＵＡＧＡが、ＮＣＵＡアンチコドンを有するｔＲＮＡＬｅｕによって１３から２６％の効率でデコードすることができ、０又は−１フレームにおいては殆どデコードされないことを見出した。Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２９８：  １９５−２０５を参照されたい。一実施形態においては、レアコドン又はナンセンスコドンに基づく拡張コドンを、本明細書の方法及び組成物に使用することができる。この拡張コドンは、他の望ましくない部位におけるミスセンスリードスルー及びフレームシフト抑圧を低減することができる。
【０３８２】
所与の系では、選択コドンとして、天然３塩基コドンの１種類も挙げることができる。内因性の系は、天然塩基コドンを使用しない（又はめったに使用しない。）。例えば、この系としては、天然３塩基コドンを認識するｔＲＮＡを欠く系及び／又は３塩基コドンがレアコドンである系が挙げられる。
【０３８３】
選択コドンは、異常塩基対を含んでいてもよい。これらの異常塩基対は、既存の遺伝子アルファベットをさらに拡張する。１個の余分な塩基対によって、トリプレットコドンの数は６４から１２５に増加する。第３の塩基対の性質としては、安定で選択的な塩基対形成、ポリメラーゼによるＤＮＡへの高忠実度の効率的な酵素的組み込み、新生異常塩基対の合成後の効率的連続プライマー伸長などが挙げられる。方法及び組成物に適合し得る異常塩基対は、例えば、Ｈｉｒａｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）  Ａｎ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ  ｆｏｒ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２０：１７７−１８２に記載されている。Ｗｕ，  Ｙ．，  ｅｔ．  ａｌ．  （２００２）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２４：１４６２６−１４６３０も参照されたい。．他の関連する刊行物を本明細書に列挙する。
【０３８４】
インビボで使用する場合、異常ヌクレオシドは、膜透過性であり、リン酸化されて対応する三リン酸塩を形成する。また、増加した遺伝情報は安定であり、細胞酵素によって破壊されない。Ｂｅｎｎｅｒらの以前の取組みは、標準的なワトソン−クリック対における水素結合パターンとは異なる水素結合パターンを利用したものであり、その最も注目に値する例はｉｓｏ−Ｃ：ｉｓｏ−Ｇ対である。例えば、Ｓｗｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １１１：８３２２−８３２２及びＰｉｃｃｉｒｉｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｎａｔｕｒｅ，  ３４３：３３−３７；  Ｋｏｏｌ，  （２０００）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．，  ４：６０２−６０８を参照されたい。これらの塩基は、一般に、天然塩基とある程度誤対合し、酵素によって複製することができない。Ｋｏｏｌと共同研究者は、塩基間の疎水性パッキング相互作用が、水素結合を置換して、塩基対の形成をもたらし得ることを示した。Ｋｏｏｌ，  （２０００）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．，  ４：６０２−６０８及びＧｕｃｋｉａｎ  ａｎｄ  Ｋｏｏｌ，  （１９９８）  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ，  ３６（２４）：  ２８２５−２８２８を参照されたい。上記全要件を満たす異常塩基対を開発する取組みにおいて、Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ及び共同研究者は、一連の異常疎水性塩基を系統的に合成し、試験した。ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ自己対（ｓｅｌｆ−ｐａｉｒ）は、天然塩基対よりも安定であることが判明し、エシェリキア  コリＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片（ＫＦ）によってＤＮＡに効率的に組み込むことができる。例えば、ＭｃＭｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １２１：１１５８５−１１５８６及びＯｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １２２：３２７４−３２７８を参照されたい。３ＭＮ：３ＭＮ自己対は、生物学的機能に十分な効率及び選択性でＫＦによって合成することができる。例えば、Ｏｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １２２：８８０３−８８０４を参照されたい。しかし、どちらの塩基もさらなる複製のための連鎖停止剤として働く。ＰＩＣＳ自己対の複製に使用することができる変異ＤＮＡポリメラーゼが最近開発された。また、７ＡＩ自己対は複製することができる。例えば、Ｔａｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １２３：７４３９−７４４０を参照されたい。新規金属塩基対Ｄｉｐｉｃ：Ｐｙも開発された。これは、Ｃｕ（ＩＩ）と結合すると、安定な対を形成する。Ｍｅｇｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （２０００）  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １２２：１０７１４−１０７１５を参照されたい。拡張コドン及び異常コドンは天然コドンと本質的に直交するので、本明細書に記載の非天然アミノ酸法は、この特性を利用して、その直交ｔＲＮＡを作製することができる。
【０３８５】
非天然アミノ酸を所望のポリペプチドに組み込むのに翻訳バイパス（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｂｙｐａｓｓｉｎｇ）系を使用することもできる。翻訳バイパス系では、大きい配列が遺伝子に組み込まれるが、タンパク質には翻訳されない。大きい配列は、リボソームが、大きい配列を飛び越し、その下流で翻訳を再開する合図（ｃｕｅ）として役立つ構造を含む。
【０３８６】
ある実施形態においては、本明細書の方法及び／又は組成物における目的タンパク質又はポリペプチド（又はその部分）は、核酸によってコードされる。典型的には、核酸は、少なくとも１個の選択コドン、少なくとも２個の選択コドン、少なくとも３個の選択コドン、少なくとも４個の選択コドン、少なくとも５個の選択コドン、少なくとも６個の選択コドン、少なくとも７個の選択コドン、少なくとも８個の選択コドン、少なくとも９個の選択コドン、１０個以上の選択コドンを含む。
【０３８７】
目的タンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を、当業者に周知の方法及び「変異誘発及び他の分子生物学技術」の下に本明細書の方法によって、例えば、非天然アミノ酸を組み込むための１個以上の選択コドンを含むように変異誘発することができる。例えば、目的タンパク質の核酸を、１個以上の非天然アミノ酸の組み込みを可能にする１個以上の選択コドンを含むように変異誘発する。本明細書の方法及び組成物は、例えば少なくとも１個の非天然アミノ酸を含む、任意のタンパク質の変異体を含めて、但しこれだけに限定されない任意のかかる変異体を含む。同様に、本明細書の方法及び組成物は、対応する核酸、すなわち、１個以上の非天然アミノ酸をコードする、又はそのインビボでの組み込みを可能にする、１個以上の選択コドンを有する任意の核酸を含む。
【０３８８】
単なる例としてＧＨポリペプチドを含めて、目的ポリペプチドをコードする核酸分子は、容易に変異させて、ポリペプチドの任意の所望の位置にシステインを導入することができる。システインは、反応性分子、水溶性ポリマー、タンパク質又は多種多様な他の分子を目的タンパク質上に導入するのに広く用いられている。ポリペプチドの所望の位置にシステインを組み込むのに適切な方法は、参照によりその全体を本明細書に組みこむ米国特許第６，６０８，１８３号の方法、標準変異誘発技術など、当分野で周知である。かかるシステイン導入・利用技術を、本明細書に記載の非天然アミノ酸導入・利用技術と併せて使用することができる。
【０３８９】
ＶＩＩＩ．  非天然アミノ酸を含むポリペプチドのインビボ産生
便宜上、本セクションに記載する非天然アミノ酸を含むポリペプチドのインビボ産生を、一般的に、及び／又は具体例を用いて、記述した。しかし、本セクションに記載の非天然アミノ酸を含むポリペプチドのインビボ産生を、本セクションの一般的記述又は具体例だけに限定すべきではない。そうではなく、本セクションに記載の非天然アミノ酸を含むポリペプチドのインビボ産生は、本発明の明細書、特許請求の範囲及び図に記載した式Ｉ−ＸＶＩＩＩ、ＸＸＸ−ＸＸＸＩＶ（Ａ＆Ｂ）及びＸＸＸＸ−ＸＸＸＸＩＩＩの範囲内にあるあらゆる下位式又は特定の化合物を含めて、式Ｉ−ＸＶＩＩＩ、ＸＸＸ−ＸＸＸＩＶ（Ａ＆Ｂ）及びＸＸＸＸ−ＸＸＸＸＩＩＩの範囲内にある全ての化合物に等しく申し分なく適用される。
【０３９０】
本明細書に記載のポリペプチドは、天然の系ではコードされないアミノ酸に付加することができる、又は天然の系ではコードされないアミノ酸を置換することができる、改変ｔＲＮＡ及びｔＲＮＡシンセターゼを用いて、インビボで産生することができる。
【０３９１】
天然の系ではコードされないアミノ酸を用いてｔＲＮＡ及びｔＲＮＡシンセターゼを生成する方法は、例えば、参照によりその全体を本明細書に組みこむ、米国特許公開第２００３／００８２５７５号（出願番号１０／１２６，９２７）及び同２００３／０１０８８８５号（出願番号１０／１２６，９３１）に記載されている。これらの方法は、翻訳系に内在するシンセターゼ及びｔＲＮＡとは無関係に機能する翻訳機構を生じるものである（したがって、「直交」と記述することがある。）。一実施形態においては、翻訳系は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドは、対応するＤＮＡから転写されたｍＲＮＡとすることができる。又は、ｍＲＮＡは、ＲＮＡウイルスベクターから生成することができる。また、ポリヌクレオチドは、非天然アミノ酸を組み込むあらかじめ指定した部位に対応する選択コドンを含む。翻訳系は、さらに、非天然アミノ酸用のｔＲＮＡ、及び適切なときには非天然アミノ酸を含むｔＲＮＡを含む。該ｔＲＮＡは、上記選択コドンに特異的であり、又は上記選択コドンを特異的に認識する。さらなる実施形態においては、非天然アミノ酸はアミノアシル化されている。非天然アミノ酸としては、本明細書に記載の式Ｉ−ＸＶＩＩＩ、ＸＸＸ−ＸＸＸＩＶ（Ａ＆Ｂ）及びＸＸＸＸ−ＸＸＸＸＩＩＩのいずれか１つの構造を有する非天然アミノ酸などが挙げられる。さらなる又は追加の実施形態においては、翻訳系は、ｔＲＮＡに特異的なアミノアシルシンセターゼを含む。他の又はさらなる実施形態においては、翻訳系は、直交ｔＲＮＡ及び直交アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼを含む。さらなる又は追加の実施形態においては、翻訳系は、（単なる例として、ＤＮＡの形態などの）上記ポリヌクレオチドを含むプラスミド、（単なる例として、ＤＮＡの形態などの）上記ポリヌクレオチドを含むゲノムＤＮＡ、又は上記ポリヌクレオチドが組み込まれたゲノムＤＮＡ（さらなる実施形態においては、組み込みは安定な組み込みである。）の少なくとも１つを含む。翻訳系のさらなる又は追加の実施形態においては、選択コドンは、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン、異常コドン、５塩基コドン及び４塩基コドンからなる群から選択される。翻訳系のさらなる又は追加の実施形態においては、ｔＲＮＡはサプレッサーｔＲＮＡである。さらなる又は追加の実施形態においては、非天然アミノ酸ポリペプチドはリボソームによって合成される。
【０３９２】
さらなる又は追加の実施形態においては、翻訳系は、直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及び直交アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む。典型的には、Ｏ−ＲＳは、翻訳系中の少なくとも１個の非天然アミノ酸を用いてＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化し、Ｏ−ｔＲＮＡは、翻訳系中の他のｔＲＮＡによっては認識されない少なくとも１個の選択コドンを認識する。したがって、翻訳系は、コードされた選択コドンに応じて、系中で産生されたポリペプチドに非天然アミノ酸を挿入し、それによって、コードされたポリペプチド中のある位置に非天然アミノ酸を「代入」する。
【０３９３】
多種多様な直交ｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼが、特定の合成アミノ酸をポリペプチドに挿入するために当分野で記述されており、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドを産生する本明細書の方法に一般に適切である。例えば、ケト特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼは、Ｗａｎｇ，  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ．ＵＳＡ  １００（１）：５６−６１（２００３）及びＺｈａｎｇ，  Ｚ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ４２（２２）：６７３５−６７４６（２００３）に記載されている。例示的なＯ−ＲＳ又はその一部は、ポリヌクレオチド配列によってコードされ、各々参照によりその全体を本明細書に組みこむ、米国特許公開第２００３／００８２５７５号及び同２００３／０１０８８８５号に開示されたアミノ酸配列を含む。Ｏ−ＲＳと併用される対応するＯ−ｔＲＮＡ分子も、参照によりその全体を本明細書に組みこむ米国特許公開第２００３／００８２５７５号（出願番号１０／１２６，９２７）及び同２００３／０１０８８８５号（出願番号１０／１２６，９３１）に記載されている。また、参照によりその全体を本明細書に組みこむＭｅｈｌ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ２００３；１２５：９３５−９３９及びＳａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００２  Ｏｃｔ；２０：１０４４−１０４８は、ｐ−アミノフェニルアラニンをポリペプチドに組み込むための、スクリーニング方法、アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ及びｔＲＮＡ分子を考察している。
【０３９４】
本明細書の方法における使用に適切な例示的Ｏ−ｔＲＮＡ配列としては、参照により本明細書に組みこむ米国特許公開第２００３／０１０８８８５号（出願番号１０／１２６，９３１）に開示されたヌクレオチド配列配列番号１−３などが挙げられるが、これらだけに限定されない。特定の非天然アミノ酸に特異的なＯ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼペアの他の例は、参照によりその全体を本明細書に組みこむ米国特許公開第２００３／００８２５７５号（出願番号１０／１２６，９２７）に記載されている。ケト含有アミノ酸とアジド含有アミノ酸の両方をＳ．セレビシエに組み込むＯ−ＲＳ及びＯ−ｔＲＮＡは、Ｃｈｉｎ，  Ｊ．Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：９６４−９６７（２００３）に記載されている。
【０３９５】
Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼの使用は、非天然アミノ酸をコードする特異的コドンの選択を伴う。任意のコドンを使用することができるが、Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼが発現される細胞中でめったに又はまったく使用されないコドンを選択することが一般に望ましい。単なる例として、例示的なコドンとしては、終止コドン（アンバー、オーカー及びオパール）などのナンセンスコドン、４塩基以上のコドン及びめったに又はまったく使用されない他の天然３塩基コドンが挙げられる。
【０３９６】
特異的選択コドンは、（部位特異的変異誘発、カセット変異誘発、制限選択変異誘発などを含めて、但しこれらだけに限定されない）当分野で公知の変異誘発方法によってポリヌクレオチドコード配列中の適切な位置に導入することができる。
【０３９７】
非天然アミノ酸を組み込むために使用することができるＯ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ、直交Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアなどのタンパク質生合成機構の成分を生成する方法は、Ｗａｎｇ，  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００（２００１）；Ｃｈｉｎ，  Ｊ．Ｗ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２４：９０２６−９０２７（２００２）；Ｚｈａｎｇ，  Ｚ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：６７３５−６７４６（２００３）に記載されている。非天然アミノ酸をインビボで組み込む方法及び組成物は、参照によりその全体を本明細書に組みこむ米国特許公開第２００３／００８２５７５号（出願番号１０／１２６，９２７）に記載されている。生物のインビボ翻訳系に使用される直交ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンセターゼペアを選択する方法も、参照によりその全体を本明細書に組みこむ米国特許公開第２００３／００８２５７５号（出願番号１０／１２６，９２７）及び同２００３／０１０８８８５号（出願番号１０／１２６，９３１）に記載されている。また、参照によりその全体を本明細書に組みこむ国際公開第０４／０３５７４３号”Ｓｉｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｋｅｔｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓは、ケトアミノ酸を組み込むための直交ＲＳとｔＲＮＡのペアを記載している。参照によりその全体を本明細書に組みこむ国際公開第０４／０９４５９３号”Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ”は、非天然的にコードされたアミノ酸を真核生物宿主細胞に組み込むための直交ＲＳとｔＲＮＡのペアを記載している。
【０３９８】
少なくとも１種類の組換え直交アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）を生成する方法は、（ａ）単なる例として、メタノコッカス  ジャナシー、メタノバクテリウム  サーモオートトロフィカム、ハロバクテリウム、エシェリキア  コリ、Ａ．フルギダス、Ｐ．フリオサス、Ｐ．ホリコシイ、Ａ．ペルニックス、Ｔ．サーモフィラスなどの原核生物又は真核生物を含めて、但しこれらだけに限定されない第１の生物から得られる少なくとも１種類のアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＲＳ）から誘導される（変異体でもよい）ＲＳのライブラリーを作製すること、（ｂ）非天然アミノ酸及び天然アミノ酸の存在下で直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化する構成要素を（変異ＲＳでもよい）ＲＳのライブラリーから選択（及び／又はスクリーニング）し、それによって活性な（変異体でもよい）ＲＳのプールを用意すること及び／又は（ｃ）非天然アミノ酸の非存在下でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する（変異ＲＳを含めて、但しこれだけに限定されない）活性なＲＳをそのプールから選択し（場合によってはネガティブ選択でもよい。）、それによって少なくとも１個の組換えＯ−ＲＳを用意することを含み、少なくとも１種類の組換えＯ−ＲＳは、非天然アミノ酸によってＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。
【０３９９】
一実施形態においては、ＲＳは不活性ＲＳである。不活性ＲＳは、活性ＲＳを変異させることによって生成することができる。単なる例として、不活性ＲＳは、少なくとも約１個、少なくとも約２個、少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも約５個、少なくとも約６個又は少なくとも約１０個以上のアミノ酸を、アラニンを含めて、但しこれだけに限定されない種々のアミノ酸に変異させることによって生成することができる。
変異ＲＳのライブラリーは、タンパク質３次元ＲＳ構造に基づく合理的設計、又は無作為若しくは合理的設計技術におけるＲＳヌクレオチドの変異誘発を含めて、但しこれらだけに限定されない当分野で公知の多様な技術を用いて作製することができる。単なる例として、変異ＲＳは、部位特異的変異、無作為変異、組換え変異をもたらす多様性、キメラ構築体、合理的設計及び本明細書に記載の、又は当分野で公知の他の方法によって生成することができる。
【０４００】
一実施形態においては、非天然アミノ酸及び天然アミノ酸の存在下で直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化する構成要素を含めて、但しこれらだけに限定されない活性な構成要素を（変異ＲＳでもよい）ＲＳのライブラリーから選択（及び／又はスクリーニング）することは、抗生物質耐性遺伝子などを含めて、但しこれだけに限定されないポジティブ選択又はスクリーニングマーカー及び（変異体でもよい）ＲＳのライブラリーを複数の細胞に導入することと（ここで、ポジティブ選択及び／又はスクリーニングマーカーは、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン、異常コドン、５塩基コドン及び４塩基コドンを含めて、但しこれらだけに限定されない少なくとも１個の選択コドンを含む。）、選択剤（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）の存在下で複数の細胞を増殖させることと、ポジティブ選択又はスクリーニングマーカー中の少なくとも１個の選択コドンを抑制することによって、選択剤及び／又はスクリーニング剤の存在下で生存する（又は特異的応答を示す）細胞を特定し、それによって活性な（変異体でもよい）ＲＳのプールを含むポジティブ選択された細胞のサブセットを用意することとを含むが、これらだけに限定されない。場合によっては、選択剤及び／又はスクリーニング剤の濃度を変更することができる。
【０４０１】
一態様においては、ポジティブ選択マーカーはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子であり、選択コドンはＣＡＴ遺伝子中のアンバー終止コドンである。場合によっては、ポジティブ選択マーカーはβ−ラクタマーゼ遺伝子であり、選択コドンはβ−ラクタマーゼ遺伝子中のアンバー終止コドンでもよい。別の態様においては、ポジティブスクリーニングマーカーは、蛍光若しくは発光スクリーニングマーカー又は（細胞表面マーカーを含めて、但しこれだけに限定されない）親和性に基づくスクリーニングマーカーを含む。
【０４０２】
一実施形態においては、非天然アミノ酸の非存在下でＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化するものを含めて、但しこれらだけに限定されない活性な（変異体でもよい）ＲＳをプールからネガティブ選択又はスクリーニングすることは、ポジティブ選択又はスクリーニングから得られた活性な（変異体でもよい）ＲＳのプールと一緒にネガティブ選択又はスクリーニングマーカーを第２の生物の複数の細胞に導入することと（ここで、ネガティブ選択又はスクリーニングマーカーは、（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を含めて、但しこれだけに限定されない抗生物質耐性遺伝子を含めて、但しこれだけに限定されない）少なくとも１個の選択コドンを含む。）、非天然アミノ酸及びスクリーニング剤若しくは選択剤を補充した第１の培地中で生存するが、又は特異的スクリーニング応答を示すが、非天然アミノ酸及び選択剤若しくはスクリーニング剤を補充していない第２の培地中では生存しない細胞、又は特異的応答を示さない細胞を特定し、それによって生存細胞若しくはスクリーニングした細胞に少なくとも１個の組換えＯ−ＲＳを供給することを含むが、これらだけに限定されない。単なる例として、ＣＡＴ特定プロトコルは、適切なＯ−ＲＳ組換えを決定する際に、場合によってはポジティブ選択及び／又はネガティブスクリーニングとして働くことができる。例えば、クローンのプールは、１個以上の非天然アミノ酸を用いても用いなくても、（少なくとも１個の選択コドンを含む）ＣＡＴを含む増殖プレート上で場合によっては複製することができる。したがって、非天然アミノ酸を含むプレート上でもっぱら増殖するコロニーは、組換えＯ−ＲＳを含むと考えられる。一態様においては、選択（及び／又はスクリーニング）剤の濃度を変える。一部の態様においては、第１の生物と第２の生物は異なる。したがって、第１の生物及び／又は第２の生物は、原核生物、真核生物、哺乳動物、エシェリキア  コリ、真菌、酵母、古細菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物などを含んでいてもよい。他の実施形態においては、スクリーニングマーカーは、蛍光若しくは発光スクリーニングマーカー又は親和性に基づくスクリーニングマーカーを含む。
【０４０３】
別の実施形態においては、活性な（変異体でもよい）ＲＳをプールからスクリーニング又は（ネガティブ選択を含めて、但しこれだけに限定されない）選択することは、ポジティブ選択段階（ｂ）から活性な変異ＲＳのプールを単離することと、ネガティブ選択又はスクリーニングマーカー（ネガティブ選択又はスクリーニングマーカーは、（少なくとも１個の選択コドンを含む、リボヌクレアーゼバーナーゼ遺伝子を含めて、但しこれだけに限定されない毒性標識遺伝子を含めて、但しこれだけに限定されない）少なくとも１個の選択コドンを含む。）及び活性な（変異体でもよい）ＲＳのプールを第２の生物の複数の細胞に導入することと、非天然アミノ酸を補充していない第１の培地中で生存するが、又は特異的スクリーニング応答を示すが、非天然アミノ酸を補充した第２の培地中で生存しない細胞、又は特異的スクリーニング応答を示さない細胞を特定し、それによって生存細胞若しくはスクリーニングした細胞に少なくとも１個の組換えＯ−ＲＳを供給すること（ここで、少なくとも１個の組換えＯ−ＲＳは、非天然アミノ酸に特異的である。）を含むが、これらだけに限定されない。一態様においては、少なくとも１個の選択コドンは約２個以上の選択コドンを含む。かかる実施形態は、場合によっては、少なくとも１個の選択コドンが２個以上の選択コドンを含み、第１の生物と第２の生物が異なってもよい（これらだけに限定されないが、各生物は、場合によっては、これらだけに限定されないが原核生物、真核生物、哺乳動物、エシェリキア  コリ、真菌、酵母、古細菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物などでもよい。）。また、幾つかの態様では、ネガティブ選択マーカーは（少なくとも１個の選択コドンを含む）リボヌクレアーゼバーナーゼ遺伝子を含む。他の態様では、スクリーニングマーカーは、蛍光若しくは発光スクリーニングマーカー又は親和性に基づくスクリーニングマーカーを場合によっては含むことができる。本発明の実施形態においては、スクリーニング及び／又は選択は、スクリーニング及び／又は選択の厳密性が変化してもよい。
【０４０４】
別の実施形態においては、少なくとも１個の組換え直交アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）を生成する方法は、さらに、（ｄ）少なくとも１個の組換えＯ−ＲＳを単離すること、（ｅ）少なくとも１個の組換えＯ−ＲＳから誘導される（変異体でもよい）Ｏ−ＲＳの第２のセットを生成すること、及び（ｆ）Ｏ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する能力を有する変異Ｏ−ＲＳが得られるまで段階（ｂ）と（ｃ）を繰り返すことを含むことができる。場合によっては、段階（ｄ）−（ｆ）を、これだけに限定されないが少なくとも約２回繰り返してもよい。一態様においては、少なくとも１個の組換えＯ−ＲＳから誘導される変異Ｏ−ＲＳの第２のセットは、無作為変異誘発、部位特異的変異誘発、組換え又はそれらの組み合わせを含めて、但しこれらだけに限定されない変異誘発によって生成することができる。
上記方法において、ポジティブ選択／スクリーニング段階（ｂ）、ネガティブ選択／スクリーニング段階（ｃ）又はポジティブ選択／スクリーニング段階（ｂ）とネガティブ選択／スクリーニング段階（ｃ）の両方を含めて、但しこれらだけに限定されない選択／スクリーニング段階の厳密性は、選択／スクリーニングの異なる厳密性を場合によっては含む。別の実施形態においては、ポジティブ選択／スクリーニング段階（ｂ）、ネガティブ選択／スクリーニング段階（ｃ）又はポジティブ選択／スクリーニング段階（ｂ）とネガティブ選択／スクリーニング段階（ｃ）の両方は、レポーターの使用を含む。ここで、レポーターは蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって検出され、又は発光によって検出される。場合によっては、レポーターは、細胞表面、ファージディスプレイなどに表示され、非天然アミノ酸又はアナログを含む親和性又は触媒活性に基づいて選択することができる。一実施形態においては、変異シンセターゼは、細胞表面、ファージディスプレイなどに表示される。
【０４０５】
組換え直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を生成する方法は、（ａ）サプレッサーｔＲＮＡを含めて、但しこれだけに限定されない、第１の生物から得られる少なくとも１個のｔＲＮＡから誘導される変異ｔＲＮＡのライブラリーを作製すること、（ｂ）第１の生物から得られるＲＳの非存在下で、第２の生物から得られるアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＲＳ）によってアミノアシル化された（変異体でもよい）ｔＲＮＡを、ライブラリーから（ネガティブ選択を含めて、但しこれだけに限定されない）選択又はスクリーニングし、それによって（変異体でもよい）ｔＲＮＡのプールを用意すること、及び（ｃ）導入された直交ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によってアミノアシル化された構成要素を（変異体でもよい）ｔＲＮＡのプールから選択又はスクリーニングし、それによって少なくとも１個の組換えＯ−ｔＲＮＡを提供すること（ここで、少なくとも１個の組換えＯ−ｔＲＮＡは選択コドンを認識し、第２の生物から得られるＲＳによって効率的に認識されず、Ｏ−ＲＳによって優先的にアミノアシル化される。）を含むが、これらだけに限定されない。一部の実施形態においては、少なくとも１個のｔＲＮＡは、サプレッサーｔＲＮＡであり、及び／又は天然塩基及び／又は異常塩基のユニーク３塩基コドンを含み、又はナンセンスコドン、レアコドン、異常コドン、少なくとも４個の塩基を含むコドン、アンバーコドン、オーカーコドン若しくはオパール終止コドンである。一実施形態においては、組換えＯ−ｔＲＮＡは、直交性が改善されている。一部の実施形態においては、Ｏ−ｔＲＮＡは、改変する必要なしに、第２の生物から第１の生物に場合によっては移入されてもよいことを理解されたい。種々の実施形態においては、第１の生物と第２の生物は同じか、又は異なっており、これらだけに限定されないが（メタノコッカス  ジャナシー、メタノバクテリウム  サーモオートトロフィカム、エシェリキア  コリ、ハロバクテリウムなどを含めて、但しこれらだけに限定されない）原核生物、真核生物、哺乳動物、真菌、酵母、古細菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物などから場合によっては選択することができる。また、組換えｔＲＮＡは、非天然アミノ酸によってアミノアシル化されていてもよい。ここで、非天然アミノ酸は天然に、又は遺伝子操作によって、インビボで生合成される。非天然アミノ酸を、少なくとも第１の生物又は第２の生物の増殖培地に添加してもよい。ここで、非天然アミノ酸は、非天然アミノ酸ポリペプチドへの組み込みを可能にする適切な細胞内濃度を達成することができる。
【０４０６】
一態様においては、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼによってアミノアシル化された（変異体でもよい）ｔＲＮＡをライブラリーから（ネガティブ選択を含めて、但しこれだけに限定されない）選択又はスクリーニングすること（段階（ｂ））は、毒性標識遺伝子（毒性標識遺伝子は、選択コドン（又は毒剤若しくは静的剤（ｓｔａｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）の産生をもたらす遺伝子又は生物に必須の遺伝子（かかる標識遺伝子は少なくとも１個の選択コドンを含む。））の少なくとも１個を含む。）及び（変異体でもよい）ｔＲＮＡのライブラリーを第２の生物から得られる複数の細胞に導入すること、並びに生存細胞を選択すること（生存細胞は、少なくとも１個の直交ｔＲＮＡ又は非機能的ｔＲＮＡを含む（変異体でもよい）ｔＲＮＡのプールを含む。）を含む。例えば、生存細胞は、対照比細胞密度（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｒａｔｉｏ  ｃｅｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）アッセイによって選択することができる。
【０４０７】
別の態様においては、毒性標識遺伝子は２個以上の選択コドンを含むことができる。本明細書に記載する方法の別の実施形態においては、毒性標識遺伝子はリボヌクレアーゼバーナーゼ遺伝子であり、リボヌクレアーゼバーナーゼ遺伝子は少なくとも１個のアンバーコドンを含む。場合によっては、リボヌクレアーゼバーナーゼ遺伝子は、２個以上のアンバーコドンを含むことができる。
【０４０８】
一実施形態においては、導入した直交ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によってアミノアシル化された構成要素を（変異体でもよい）ｔＲＮＡのプールから選択又はスクリーニングすることは、ポジティブ選択又はスクリーニング標識遺伝子（ポジティブ標識遺伝子は、（少なくとも１個のアンバー終止コドンなどの選択コドンの少なくとも１個を含む、β−ラクタマーゼ遺伝子を含めて、但しこれだけに限定されない）薬剤耐性遺伝子又は生物に必須の遺伝子を含む。）又はＯ−ＲＳと一緒に毒剤の解毒をもたらす遺伝子及び（変異体でもよい）ｔＲＮＡのプールを第２の生物から得られる複数の細胞に導入することと、抗生物質を含めて、但しこれだけに限定されない選択剤又はスクリーニング剤の存在下で増殖した、生存細胞又はスクリーニングされた細胞を特定し、それによって少なくとも１個の組換えｔＲＮＡを有する細胞のプールを提供すること（少なくとも１個の組換えｔＲＮＡは、Ｏ−ＲＳによってアミノアシル化され、少なくとも１個の選択コドンに応じて、ポジティブ標識遺伝子によってコードされた翻訳産物にアミノ酸を挿入する。）とを含むことができる。別の実施形態においては、選択剤及び／又はスクリーニング剤の濃度を変更する。
【０４０９】
特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアを生成する方法を提供する。方法は、（ａ）第１の生物から得られる少なくとも１個のｔＲＮＡから誘導される変異ｔＲＮＡのライブラリーを作製すること、（ｂ）第１の生物から得られるＲＳの非存在下で、第２の生物から得られるアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＲＳ）によってアミノアシル化された（変異体でもよい）ｔＲＮＡをライブラリーからネガティブ選択又はスクリーニングし、それによって（変異体でもよい）ｔＲＮＡのプールを用意すること、及び（ｃ）導入した直交ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によってアミノアシル化された構成要素を（変異体でもよい）ｔＲＮＡのプールから選択又はスクリーニングし、それによって少なくとも１個の組換えＯ−ｔＲＮＡを用意することを含むが、これらだけに限定されない。少なくとも１個の組換えＯ−ｔＲＮＡは、選択コドンを認識し、第２の生物から得られるＲＳによって効率的に認識されず、Ｏ−ＲＳによって優先的にアミノアシル化される。この方法は、（ｄ）第３の生物から得られる少なくとも１個のアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＲＳ）から誘導される（変異体でもよい）ＲＳのライブラリーを作製すること、（ｅ）非天然アミノ酸及び天然アミノ酸の存在下で少なくとも１個の組換えＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する構成要素を変異ＲＳのライブラリーから選択又はスクリーニングし、それによって活性な（変異体でもよい）ＲＳのプールを用意すること、並びに（ｆ）非天然アミノ酸の非存在下で少なくとも１個の組換えＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性な（変異体でもよい）ＲＳをプールからネガティブ選択又はスクリーニングし、それによって少なくとも１個の特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアを用意すること（少なくとも１個の特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアは、非天然アミノ酸に特異的である少なくとも１個の組換えＯ−ＲＳと少なくとも１個の組換えＯ−ｔＲＮＡとを含む。）も含む。本明細書の方法によって生成される特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアは、本明細書に記載の範囲及び方法に含まれる。例えば、特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアとしては、ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ−ＳＳ１２ＴｙｒＲＳペアなどのｍｕｔＲＮＡＴｙｒ−ｍｕｔＴｙｒＲＳペア、ｍｕｔＲＮＡＬｅｕ−ｍｕｔＬｅｕＲＳペア、ｍｕｔＲＮＡＴｈｒ−ｍｕｔＴｈｒＲＳペア、ｍｕｔＲＮＡＧｌｕ−ｍｕｔＧｌｕＲＳペアなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。さらに、かかる方法は、第１の生物と第３の生物が（メタノコッカス  ジャナシーを含めて、但しこれだけに限定されない）同じ場合を含む。
【０４１０】
第２の生物のインビボでの翻訳系に使用される直交ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンセターゼペアを選択する方法も本明細書の方法に含まれる。この方法は、標識遺伝子、ｔＲＮＡ及び第１の生物から単離又は誘導されるアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＲＳ）を第２の生物から得られる細胞の第１のセットに導入すること、標識遺伝子及びｔＲＮＡを第２の生物から得られる２つ組の細胞セットに導入すること、並びに２つ組の細胞セット中に生存しない第１のセット中の生存細胞を選択すること、又は２つ組の細胞セット中では特異的スクリーニング応答を示さない、特異的スクリーニング応答を示す細胞をスクリーニングすることを含むが、これらだけに限定されない。ここで、第１のセット及び２つ組の細胞セットは、選択剤又はスクリーニング剤の存在下で増殖し、生存細胞又はスクリーニングした細胞は、第２の生物のインビボ翻訳系に使用する直交ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンセターゼペアを含む。一実施形態においては、比較及び選択又はスクリーニングは、インビボでの相補性アッセイを含む。選択剤又はスクリーニング剤の濃度は変更することができる。
【０４１１】
本明細書に記載の生物は、種々の生物及び種々の組み合わせを含む。一実施形態においては、生物は、メタノコッカス  ジャナシー、メタノバクテリウム  サーモオートトロフィカム、ハロバクテリウム、エシェリキア  コリ、Ａ．フルギダス、Ｐ．フリオサス、Ｐ．ホリコシイ、Ａ．ペルニックス、Ｔ．サーモフィラスなどを含めて、但しこれらだけに限定されない原核生物であってもよい。或いは、生物は、（単子葉植物、双子葉植物などの複雑な植物を含めて、但しこれらだけに限定されない）植物、藻類、原生生物、（酵母などを含めて、但しこれだけに限定されない）真菌、（哺乳動物、昆虫、節足動物などを含めて、但しこれらだけに限定されない）動物などを含めて、但しこれらだけに限定されない真核生物である。
【０４１２】
Ａ．  非真核生物及び真核生物中での発現
本セクションで開示する技術は、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドの非真核生物及び真核生物中での発現に適用することができる。
【０４１３】
ポリヌクレオチドクローンを高レベルで発現させるために、一般に、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、強力なプロモーターを含む発現ベクターにサブクローニングして、転写、転写／翻訳ターミネーターを誘導し、タンパク質をコードする核酸の場合には翻訳開始用リボソーム結合部位を誘導する。適切な細菌プロモーターは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．に記載されている。
【０４１４】
ポリペプチドを発現する細菌発現系は、これらだけに限定されないが、Ｅ．コリ、バチルス種、シュードモナス  フルオレッセンス、シュードモナス  エルジノーサ、シュードモナス  プチダ及びサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）において利用可能である（Ｐａｌｖａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  ２２：２２９−２３５（１９８３）；Ｍｏｓｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３０２：５４３−５４５（１９８３））。かかる発現系のキットは市販されている。哺乳動物細胞、酵母及び昆虫細胞用の真核生物発現系が市販されている。（本明細書に記載の）直交ｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンセターゼをポリペプチドの発現に使用する場合には、発現用宿主細胞は、直交成分を使用するその能力に基づいて選択される。例示的な宿主細胞としては、（Ｂ．ブレビス（ｂｒｅｖｉｓ）、Ｂ．サブチリス（ｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）を含めて、但しこれらだけに限定されない）グラム陽性菌及びグラム陰性菌（Ｅ．コリ又はシュードモナス  フルオレッセンス、シュードモナス  エルジノーサ、シュードモナス  プチダ）並びに酵母及び他の真核細胞が挙げられる。Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアを含む細胞は、本明細書に記載するとおりに使用することができる。
【０４１５】
本明細書に記載の真核生物宿主細胞又は非真核生物宿主細胞によって、非天然アミノ酸を含むポリペプチドを多量に有用な量で合成することができる。一態様においては、組成物は、非天然アミノ酸を含むポリペプチドの少なくとも１０マイクログラム、少なくとも５０マイクログラム、少なくとも７５マイクログラム、少なくとも１００マイクログラム、少なくとも２００マイクログラム、少なくとも２５０マイクログラム、少なくとも５００マイクログラム、少なくとも１ミリグラム、少なくとも１０ミリグラム、少なくとも１００ミリグラム、少なくとも１グラム以上、又はインビボでのポリペプチド産生方法によって実施することができる量を含めて、但しこれらだけに限定されない量を含んでいてもよい（組換えタンパク質産生及び精製の詳細を本明細書に記載する。）。別の態様においては、ポリペプチドは、（約１ｎｌから約１００Ｌの体積を含めて、但しこれらだけに限定されない）細胞溶解物、緩衝剤、薬剤緩衝剤又は他の懸濁液（これらだけに限定されない。）中のポリペプチド少なくとも１０マイクログラム／リットル、ポリペプチド少なくとも５０マイクログラム／リットル、ポリペプチド少なくとも７５マイクログラム／リットル、ポリペプチド少なくとも１００マイクログラム／リットル、ポリペプチド少なくとも２００マイクログラム／リットル、ポリペプチド少なくとも２５０マイクログラム／リットル、ポリペプチド少なくとも５００マイクログラム／リットル、ポリペプチド少なくとも１ミリグラム／リットル又はポリペプチド少なくとも１０ミリグラム／リットル以上を含めて、但しこれらだけに限定されない濃度で組成物中に存在してもよい。少なくとも１個の非天然アミノ酸を含む真核細胞における（インビトロでの翻訳を含めて、但しこれだけに限定されない他の方法によって典型的には可能である量よりも多量を含めて、但しこれだけに限定されない）多量のタンパク質の産生は、本明細書の方法、技術及び組成物の特徴である。
【０４１６】
本明細書に記載の真核生物宿主細胞又は非真核生物宿主細胞によって、非天然アミノ酸を含むタンパク質を多量に有用な量で生合成することができる。例えば、非天然アミノ酸を含むポリペプチドは、細胞抽出物、細胞溶解物、培地、緩衝剤などの中のポリペプチドの少なくとも１０μｇ／リットル、少なくとも５０μｇ／リットル、少なくとも７５μｇ／リットル、少なくとも１００μｇ／リットル、少なくとも２００μｇ／リットル、少なくとも２５０μｇ／リットル、少なくとも５００μｇ／リットル、少なくとも１ｍｇ／リットル、少なくとも２ｍｇ／リットル、少なくとも３ｍｇ／リットル、少なくとも４ｍｇ／リットル、少なくとも５ｍｇ／リットル、少なくとも６ｍｇ／リットル、少なくとも７ｍｇ／リットル、少なくとも８ｍｇ／リットル、少なくとも９ｍｇ／リットル、少なくとも１０ｍｇ／リットル、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００ｍｇ／リットル、１ｇ／リットル、５ｇ／リットル、１０ｇ／リットル以上を含めて、但しこれらだけに限定されない濃度で産生することができる。
【０４１７】
１．  発現系、培養及び単離
本セクションで開示する技術は、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドの発現系、培養及び単離に適用することができる。非天然アミノ酸ポリペプチドは、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞及び細菌を含めて、但しこれらだけに限定されない、任意の数の適切な発現系において発現させることができる。例示的な発現系を本明細書に記載する。
【０４１８】
酵母  本明細書では「酵母」という用語は、非天然アミノ酸ポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能である種々の酵母のいずれをも含む。かかる酵母としては、有子嚢胞子酵母（エンドミセス（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ））、有担子胞子（ｂａｓｉｄｉｏｓｐｏｒｏｇｅｎｏｕｓ）酵母、不完全菌類（ブラストミセス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ））群に属する酵母などが挙げられるが、これらだけに限定されない。有子嚢胞子酵母は、スパーモフソラ科（Ｓｐｅｒｍｏｐｈｔｈｏｒａｃｅａｅ）とサッカロミセス科の２つの科に分類される。後者は、シゾサッカロミセス亜科（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ）（例えば、シゾサッカロミセス属）、ナドソニア亜科（Ｎａｄｓｏｎｉｏｉｄｅａｅ）、リポミセス亜科（Ｌｉｐｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ）及びサッカロミセス亜科（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ）（例えば、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属及びサッカロミセス属）の４つの亜科からなる。有担子胞子酵母は、ロイコスポリジウム（Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、スポリジオボラス（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）、フィロバシジウム（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ）及びフィロバシジエラ（Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ）属を含む。不完全菌類（ブラストミセス）群に属する酵母は、スポロボロミケス科（Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ）（例えば、スポロボロミケス属及びブレラ（Ｂｕｌｌｅｒａ）属）とクリプトコッカス科（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ）（例えば、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属）の２つの科に分類される。
【０４１９】
ある実施形態においては、Ｐ．パストリス（ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Ｐ．ギレリモンジイ（ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ）、Ｓ．セレビシエ、Ｓ．カールスベルゲンシス（ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、Ｓ．ジアスタチカス（ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、Ｓ．ダグラシー（ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、Ｓ．クルイベリ（ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、Ｓ．ノルベンシス（ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、Ｓ．オビフォルミス（ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｋ．ラクチス（ｌａｃｔｉｓ）、Ｋ．フラギリス（ｆｒａｇｉｌｉｓ）、Ｃ．アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｃ．マルトーサ（ｍａｌｔｏｓａ）及びＨ．ポリモルファ（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）を含めて、但しこれらだけに限定されない、ピキア属、クルイベロミセス属、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ハンゼヌラ属、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）属及びカンジダ属に属する種を、本明細書の方法、技術及び組成物に使用する。
【０４２０】
非天然アミノ酸ポリペプチドの発現に適切な酵母の選択は、当業者の技能の範囲内である。発現用の酵母宿主を選択する際に、適切な宿主としては、例として、良好な分泌能力、低タンパク質分解活性及び全体の堅牢性を有することが判明した宿主などが挙げられるが、これらだけに限定されない。酵母は、Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  （Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，  ＣＡ）及びＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）（Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ）を含めて、但しこれらだけに限定されない多様なソースから一般に入手可能である。
【０４２１】
「酵母宿主」又は「酵母宿主細胞」という用語は、組換えベクター又は他の転移ＤＮＡ用のレシピエントとして使用することができる酵母、又は使用されている酵母を含む。この用語は、組換えベクター又は他の転移ＤＮＡを受け取った元の酵母宿主細胞の後代を含む。単一の親細胞の後代は、形態又は元の親に相補的なゲノムＤＮＡ若しくは全ＤＮＡが、偶発的若しくは意図的変異のために、完全に同一である必要はないことを理解されたい。非天然アミノ酸ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在など、関連する特性によって特徴付けられる親と十分に類似した親細胞の後代は、この定義によって意図される後代に含まれる。
【０４２２】
染色体外レプリコン又は組み込み型ベクターを含めた発現ベクター及び形質転換ベクターが、多数の酵母宿主への形質転換用に開発された。例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓｉｋｏｒｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＧＥＮＥＴＩＣＳ（１９９８）１１２：１９；Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．（１９８３）１５３：１６３；Ｈｉｎｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＲＯＣ．  ＮＡＴＬ．  ＡＣＡＤ．  ＳＣＩ．  ＵＳＡ（１９７８）７５：１９２９）；Ｃ．アルビカンス（Ｋｕｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ＭＯＬ．  ＣＥＬＬ．  ＢＩＯＬ．（１９８６）６：１４２）；Ｃ．マルトーサ（Ｋｕｎｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ＢＡＳＩＣ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．（１９８５）２５：１４１）；Ｈ．ポリモルファ（Ｇｌｅｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ＧＥＮ．  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．（１９８６）１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，  ＭＯＬ．  ＧＥＮ．  ＧＥＮＥＴ．（１９８６）２０２：３０２）；Ｋ．フラギリス（（Ｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．（１９８４）１５８：１１６５）；Ｋ．ラクチス（Ｄｅ  Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．（１９８３）１５４：７３７；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ（１９９０）８：１３５）；Ｐ．ギレリモンジイ（Ｋｕｎｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ＢＡＳＩＣ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．（１９８５）２５：１４１）；Ｐ．パストリス（米国特許第５，３２４，６３９号、同４，９２９，５５５号及び同４，８３７，１４８号；Ｃｒｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ＭＯＬ．  ＣＥＬＬ．  ＢＩＯＬ．（１９８５）５：３３７６）；シゾサッカロミセス  ポンベ（Ｂｅａｃｈ  ａｎｄ  Ｎｕｒｓｅ，  ＮＡＴＵＲＥ（１９８１）３００：７０６）及びＹ．リポリチカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（Ｄａｖｉｄｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  ＣＵＲＲ．  ＧＥＮＥＴ．（１９８５）１０：３８０（１９８５）；Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＣＵＲＲ．  ＧＥＮＥＴ．（１９８５）１０：４９）；Ａ．ニドゥランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）（Ｂａｌｌａｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＩＯＣＨＥＭ．  ＢＩＯＰＨＹＳ．  ＲＥＳ．  ＣＯＭＭＵＮ．（１９８３）１１２：２８４−８９；Ｔｉｌｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＧＥＮＥ（１９８３）２６：２０５−２２１及びＹｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＲＯＣ．  ＮＡＴＬ．  ＡＣＡＤ．  ＳＣＩ．  ＵＳＡ（１９８４）８１：１４７０−７４）；Ａ．ニガー（ｎｉｇｅｒ）（Ｋｅｌｌｙ  ａｎｄ  Ｈｙｎｅｓ，  ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８５）４：４７５−４７９）；Ｔ．リーシア（ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ  ０  ２４４  ２３４）及び例えばニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）などの糸状菌（国際公開第９１／００３５７号）用の発現ベクターが開発された。各々を参照によりその全体を本明細書に組みこむ。
【０４２３】
酵母ベクターの制御配列は、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（ＥＰ  ０  ２８４  ０４４）、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ又はＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）（ＥＰ  ０  ３２９  ２０３）などの遺伝子由来のプロモーター領域などを含むが、これらだけに限定されない。酸性ホスファターゼをコードする酵母ＰＨＯ５遺伝子も、有用なプロモーター配列を与えることができる（Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＲＯＣ．  ＮＡＴＬ．  ＡＣＡＤ．  ＳＣＩ．  ＵＳＡ（１９８３）８０：１）。酵母宿主と一緒に使用される他の適切なプロモーター配列としては、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ用（Ｈｉｔｚｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ＢＩＯＬ．  ＣＨＥＭ．（１９８０）２５５（４）：１２０７３−１２０８０）及びピルビン酸デカルボキシラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼなどの他の糖分解酵素用（Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ（１９７８）１７（２３）：４９００−４９０７；Ｈｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ＡＤＶ．  ＥＮＺＹＭＥ  ＲＥＧ．（１９６９）７：１４９−１６７）のプロモーターなどが挙げられる。増殖条件によって制御される転写のさらなる利点を有する誘導性酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２；イソチトクロムＣ；酸性ホスファターゼ；メタロチオネイン；グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ；窒素代謝に関連する分解酵素並びにマルトース及びガラクトースの利用をもたらす酵素用のプロモーター領域を含むことができる。酵母発現に使用するのに適切なベクター及びプロモーターは、さらに、ＥＰ  ００７３６５７にも記載されている。
【０４２４】
酵母エンハンサーも酵母プロモーターと一緒に使用することができる。また、合成プロモーターは酵母プロモーターとしても機能し得る。例として、酵母プロモーターの上流活性化配列（ＵＡＳ）は、別の酵母プロモーターの転写活性化領域と一緒に合成ハイブリッドプロモーターを形成し得る。かかるハイブリッドプロモーターの例としては、ＧＡＰ転写活性化領域に連結されたＡＤＨ制御配列が挙げられる。参照によりその全体を本明細書に組みこむ、米国特許第４，８８０，７３４号及び第４，８７６，１９７号を参照されたい。ハイブリッドプロモーターの他の例としては、ＧＡＰ、ＰｙＫなどの糖分解酵素遺伝子の転写活性化領域と組み合わされた、ＡＤＨ２、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０又はＰＨＯ５遺伝子の制御配列からなるプロモーターが挙げられる。ＥＰ  ０  １６４  ５５６を参照されたい。また、酵母プロモーターとしては、酵母ＲＮＡポリメラーゼに結合し、転写を開始する能力を有する非酵母起源の天然のプロモーターなどが挙げられる。
【０４２５】
酵母発現ベクターの一部を含むことができる他の調節領域としては、例えば、ＧＡＰＤＨ又はエノラーゼ遺伝子由来のターミネーターが挙げられる（Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ＢＩＯＬ．  ＣＨＥＭ．（１９８１）２５６：１３８５）。また、２μプラスミド起源の複製開始点は、酵母に適切である。酵母に使用するのに適切な選択遺伝子は、酵母プラスミド中に存在するｔｒｐｌ遺伝子である。Ｔｓｃｈｕｍｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＧＥＮＥ（１９８０）１０：１５７；Ｋｉｎｇｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＧＥＮＥ（１９７９）７：１４１を参照されたい。ｔｒｐｌ遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母変異体系統用の選択マーカーを与える。同様に、Ｌｅｕ２欠失酵母系統（ＡＴＣＣ２０，６２２又は３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する公知のプラスミドによって補完される。
【０４２６】
外因性ＤＮＡを酵母宿主に導入する方法としては、スフェロプラスト又はアルカリ陽イオンで処理した完全な酵母宿主細胞の形質転換が挙げられるが、これだけに限定されない。例として、酵母の形質転換は、Ｈｓｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＲＯＣ．  ＮＡＴＬ．  ＡＣＡＤ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ（１９７９）７６：３８２９及びＶａｎ  Ｓｏｌｉｎｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ＢＡＣＴ．（１９７７）１３０：９４６の方法に従って実施することができる。しかし、核注入、電気穿孔法、原形質体融合などＤＮＡを細胞中に導入する他の方法も、ＳＡＭＢＲＯＯＫ  ＥＴ  ＡＬ．，  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢ．  ＭＡＮＵＡＬ（２００１）に概説されたように使用することができる。次いで、酵母宿主細胞を当業者に公知の標準技術によって培養することができる。
【０４２７】
酵母宿主細胞中で異種タンパク質を発現させる他の方法は、米国特許公開第２００２００５５１６９号、米国特許第６，３６１，９６９号、同６，３１２，９２３号、同６，１８３，９８５号、同６，０８３，７２３号、同６，０１７，７３１号、同５，６７４，７０６号、同５，６２９，２０３号、同５，６０２，０３４号及び同５，０８９，３９８号；米国再審査特許第３７，３４３号及び同３５，７４９号；国際公開第９９／０７８６２号、同９８／３７２０８号、同９８／２６０８０号；欧州特許出願ＥＰ  ０  ９４６  ７３６、同ＥＰ  ０  ７３２  ４０３、同ＥＰ  ０  ４８０  ４８０、ＷＯ  ９０／１０２７７、ＥＰ  ０  ４６０  ０７１、ＥＰ  ０  ３４０  ９８６、ＥＰ  ０  ３２９  ２０３、ＥＰ  ０  ３２４  ２７４及びＥＰ  ０  １６４  ５５６に記載されている。Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＡＮＴＯＮＩＥ  ＶＡＮ  ＬＥＥＵＷＥＮＨＯＥＫ（１９９２）６２（１−２）：７９−９３；Ｒｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＹＥＡＳＴ（１９９２）８（６）：４２３−４８８；Ｇｏｅｄｄｅｌ，  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（１９９０）１８５：３−７も参照されたい。各々を参照によりその全体を本明細書に組みこむ。
【０４２８】
酵母宿主系統は、発酵槽中で増幅段階中に標準フィードバッチ発酵方法によって増殖させることができる。発酵方法は、特定の酵母宿主の炭素利用経路又は発現制御方式の差を埋め合わせる（ａｃｃｏｕｎｔ  ｆｏｒ）ように改良することができる。単なる例として、サッカロミセス酵母宿主の発酵は、単一グルコースの供給、複雑な窒素源（例えば、カゼイン加水分解物）及び複数のビタミン補充を必要とし得る。これに対して、メチロトローフィック酵母Ｐ．パストリスは、グリセリン、メタノール及び微量の鉱物供給を必要とし得るが、最適な成長及び発現には単純なアンモニウム（窒素）塩しか必要としない。例えば、参照によりその全体を本明細書に組みこむ、米国特許第５，３２４，６３９号；Ｅｌｌｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＣＨＥＭ．（１９９０）９：９５及びＦｉｅｓｃｈｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＩＯＴＥＣＨ．  ＢＩＯＥＮＧ．（１９８７）２９：１１１３を参照されたい。
【０４２９】
しかし、かかる発酵方法は、使用する酵母宿主系統とは無関係にある共通の特徴を有し得る。例として、増殖制限栄養素、一般に炭素を、増幅時期に発酵槽に添加して、増殖を最大にすることができる。また、発酵方法は、一般に、炭素、窒素、基礎的な塩、リン及び他の微量栄養素（ビタミン、微量のミネラル、塩など）の適切な量を含むように設計された発酵培地を使用する。ピキアと一緒に使用するのに適切な発酵培地の例は、参照によりその全体を本明細書に組みこむ米国特許第５，３２４，６３９号及び同５，２３１，１７８号に記載されている。
【０４３０】
バキュロウイルス感染昆虫細胞  「昆虫宿主」又は「昆虫宿主細胞」という用語は、組換えベクター又は他の転移ＤＮＡ用レシピエントとして使用することができる昆虫、又は使用されている昆虫を指す。この用語は、形質移入された元の昆虫宿主細胞の後代を含む。単一の親細胞の後代は、形態又は元の親に相補的なゲノムＤＮＡ若しくは全ＤＮＡが、偶発的若しくは意図的変異のために、完全に同一である必要はないことを理解されたい。非天然アミノ酸ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在など、関連する特性によって特徴付けられる親と十分に類似した親細胞の後代は、この定義によって意図される後代に含まれる。
【０４３１】
ポリペプチドの発現に適切な昆虫細胞の選択は当業者に周知である。ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）及びイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）を含めて幾つかの昆虫種は当分野で十分に記述されており、市販されている。発現用の昆虫宿主を選択する際に、適切な宿主としては、なかでも、良好な分泌能力、低タンパク質分解活性及び全体の堅牢性を有することが判明した宿主などが挙げられるが、これらだけに限定されない。昆虫は、一般に、Ｉｎｓｅｃｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）及びＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を含めて、但しこれらだけに限定されない多様な出所から入手可能である。
【０４３２】
一般に、バキュロウイルス感染昆虫発現系の成分としては、導入ベクター、通常は、バキュロウイルスゲノムの断片と、発現される異種遺伝子の挿入に好都合な制限酵素切断部位との両方を含む細菌プラスミド、導入ベクター中のバキュロウイルス特異的断片に相同な配列を有する野生型バキュロウイルス（これは、バキュロウイルスゲノム中への異種遺伝子の相同組換えを可能にする。）、適切な昆虫宿主細胞及び増殖培地などが挙げられる。ベクターの構築、細胞の形質移入、プラークの採集、細胞の培養増殖などに使用する材料、方法及び技術は当分野で公知であり、これらの技術を記載したマニュアルが利用可能である。
【０４３３】
異種遺伝子を導入ベクターに挿入した後、ベクターと野生型ウイルスゲノムを昆虫宿主細胞に形質移入し、そこでベクターとウイルスゲノムを再結合させる。パッケージ化した組換えウイルスを発現させ、組換えプラークを確認し、精製する。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系用の材料及び方法は、キットの形で、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）から市販されている。説明的な技法は、参照により本明細書に組みこむＳＵＭＭＥＲＳ  ＡＮＤ  ＳＭＩＴＨ，  ＴＥＸＡＳ  ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ  ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴ  ＳＴＡＴＩＯＮ  ＢＵＬＬＥＴＩＮ  ＮＯ．  １５５５（１９８７）に記載されている。ＲＩＣＨＡＲＤＳＯＮ，  ３９  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ：  ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ（１９９５）；  ＡＵＳＵＢＥＬ  ＥＴ  ＡＬ．，  ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  １６．９−１６．１１（１９９４）；  ＫＩＮＧ  ＡＮＤ  ＰＯＳＳＥＥ，  ＴＨＥ  ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ  ＳＹＳＴＥＭ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＧＵＩＤＥ（１９９２）及びＯ’ＲＥＩＬＬＹ  ＥＴ  ＡＬ．，  ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＶＥＣＴＯＲＳ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（１９９２）も参照されたい。
【０４３４】
バキュロウイルス／昆虫細胞発現系を用いた種々の異種タンパク質の生成は、以下の参考文献に記載されている。かかる技術を、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドの生成に適合させることができる。例えば、参照によりその全体を本明細書に組みこむ、米国特許第６，３６８，８２５号、同６，３４２，２１６号、同６，３３８，８４６号、同６，２６１，８０５号、同６，２４５，５２８号、同６，２２５，０６０号、同６，１８３，９８７号、同６，１６８，９３２号、同６，１２６，９４４号、同６，０９６，３０４号、同６，０１３，４３３号、同５，９６５，３９３号、同５，９３９，２８５号、同５，８９１，６７６号、同５，８７１，９８６号、同５，８６１，２７９号、同５，８５８，３６８号、同５，８４３，７３３号、同５，７６２，９３９号、同５，７５３，２２０号、同５，６０５，８２７号、同５，５８３，０２３号、同５，５７１，７０９号、同５，５１６，６５７号、同５，２９０，６８６号、国際公開第０２／０６３０５号、同０１／９０３９０号、同０１／２７３０１号、同０１／０５９５６号、同００／５５３４５号、同００／２００３２号  同９９／５１７２１号、同９９／４５１３０号、同９９／３１２５７号、同９９／１０５１５号、同９９／０９１９３号、同９７／２６３３２号、同９６／２９４００号、同９６／２５４９６号、同９６／０６１６１号、同９５／２０６７２号、同９３／０３１７３号、同９２／１６６１９号、同９２／０３６２８号、同９２／０１８０１号、同９０／１４４２８号、同９０／１００７８号、同９０／０２５６６号、同９０／０２１８６号、同９０／０１５５６号、同８９／０１０３８号、同８９／０１０３７号、同８８／０７０８２号を参照されたい。
【０４３５】
バキュロウイルス／昆虫細胞発現系に有用であるベクターとしては、ヘルパー非依存性ウイルス発現ベクターであるバキュロウイルスオートグラファカリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）由来の昆虫発現・導入ベクターなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。この系に由来するウイルス発現ベクターは、通常、異種遺伝子の発現をもたらす強力なウイルス多角体遺伝子プロモーターを使用する。一般に、Ｒｅｉｌｌｙ  ＥＴ  ＡＬ．，  ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＶＥＣＴＯＲＳ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ（１９９２）を参照されたい。
【０４３６】
外来遺伝子をバキュロウイルスゲノムに挿入する前に、プロモーター、（必要に応じて）リーダー、目的コード配列及び転写終結配列を含む上記成分を典型的には集めて、中間体置換構築体（ｔｒａｎｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）（導入ベクター）を構築する。中間体置換構築体は、細菌などの宿主中に安定に維持することができる染色体外要素（例えば、プラスミド）などのレプリコン中に維持されることが多い。レプリコンは、複製系を有し、したがってクローニング及び増幅に適切な宿主中に維持することができる。より具体的には、プラスミドは、多角体ポリアデニレーションシグナル（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＡＮＮ．  ＲＥＶ．  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ．（１９８８）４２：１７７）、原核生物アンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子並びにＥ．コリ中での選択及び増殖用の複製開始点を含むことができる。
【０４３７】
外来遺伝子をＡｃＮＰＶに導入するのに一般に使用される１つの導入ベクターはｐＡｃ３７３である。当業者に周知の多数の他のベクターは、例えば、ｐＶＬ９８５を含むようにも設計されている。ｐＶＬ９８５は、多角体開始コドンをＡＴＧからＡＴＴに変え、ＢａｍＨＩクローニング部位をＡＴＴから３２塩基対下流に導入する。Ｌｕｃｋｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ，  ＶＩＲＯＬＯＧＹ  １７０：３１−３９（１９８９）を参照されたい。他の市販ベクターとしては、例えば、ＰＢｌｕｅＢａｃ４．５／Ｖ５−Ｈｉｓ、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、ｐＭｅｌＢａｃ、ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）が挙げられる。
【０４３８】
異種遺伝子の挿入後、導入ベクターと野生型バキュロウイルスゲノムを昆虫細胞宿主に同時形質移入する。異種ＤＮＡをバキュロウイルス中の所望の部位に導入する説明的な方法は、ＳＵＭＭＥＲＳ  ＡＮＤ  ＳＭＩＴＨ，  ＴＥＸＡＳ  ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ  ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴ  ＳＴＡＴＩＯＮ  ＢＵＬＬＥＴＩＮ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ＭＯＬ．  ＣＥＬＬ．  ＢＩＯＬ．（１９８３）３：２１５６；Ｌｕｃｋｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ，  ＶＩＲＯＬＯＧＹ（１９８９）１７：３１−３９に記載されている。例として、相同二重交叉型組換え（ｄｏｕｂｌｅ  ｃｒｏｓｓｏｖｅｒ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）によって多角体遺伝子などの遺伝子中に挿入することができる。所望のバキュロウイルス遺伝子中に設計された制限酵素切断部位中に挿入することもできる。Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＩＯＥＳＳＡＹＳ（１９８９）４：９１を参照されたい。
【０４３９】
形質移入は、ＴＲＯＴＴＥＲ  ＡＮＤ  ＷＯＯＤ，  ３９  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（１９９５）；  Ｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｋｉｎｇ，  Ｊ．  ＧＥＮ．  ＶＩＲＯＬ．（１９８９）７０：３５０１の方法を用いた電気穿孔法によって実施することができる。或いは、リポソームを使用して、組換え発現ベクターとバキュロウイルスを昆虫細胞に形質移入することができる。例えば、Ｌｉｅｂｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ（１９９９）２６（１）：３６；Ｇｒａｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ（１９９８）３７：６０５０；Ｎｏｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ＢＩＯＬ．  ＣＨＥＭ．（１９９８）２７３（２２）：１３５７０；Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＡＮＤ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ（１９９８）１２：３２３；Ｓｉｆｆｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ＮＡＴＵＲＥ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ（１９９８）１８：４５；ＴＩＬＫＩＮＳ  ＥＴ  ＡＬ．，  ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬＯＧＹ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ  １４５−１５４（１９９８）；Ｃａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ  ＡＮＤ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ（１９９７）１０：２６３；Ｄｏｌｐｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＮＡＴＵＲＥ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ（１９９７）１７：４９１；Ｋｏｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ＧＥＮＥ（１９９７）１９０：１３９；Ｊａｋｏｂｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ＢＩＯＬ．  ＣＨＥＭ．（１９９６）２７１：２２２０３；Ｒｏｗｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ＢＩＯＬ．  ＣＨＥＭ．（１９９６）２７１（３７）：２２３７６；Ｒｅｖｅｒｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．ＢＩＯＬ．  ＣＨＥＭ．  （１９９６）２７１（３９）：２３６０７−１０；Ｓｔａｎｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ＢＩＯＬ．  ＣＨＥＭ．（１９９５）２７０：４１２１；Ｓｉｓｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ＶＩＲＯＬ．（１９９４）６８（２）：７６６及びＰｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＩＯＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ（１９９３）１４．２：２７４を参照されたい。市販リポソームとしては、例えば、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（登録商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）が挙げられる。また、リン酸カルシウム形質移入を使用することもできる。ＴＲＯＴＴＥＲ  ＡＮＤ  ＷＯＯＤ，  ３９  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ（１９９５）；Ｋｉｔｔｓ，  ＮＡＲ（１９９０）１８（１９）：５６６７及びＭａｎｎ  ａｎｄ  Ｋｉｎｇ，  Ｊ．  ＧＥＮ．  ＶＩＲＯＬ．（１９８９）７０：３５０１を参照されたい。
【０４４０】
バキュロウイルス発現ベクターは、通常、バキュロウイルスプロモーターを含む。バキュロウイルスプロモーターは、バキュロウイルスＲＮＡポリメラーゼに結合することができ、ｍＲＮＡへのコード配列（例えば、構造遺伝子）の下流（３’）転写を惹起することができる任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、コード配列の５’末端近くに通常は位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は、典型的には、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位及び転写開始点を含む。バキュロウイルスプロモーターは、エンハンサーと呼ばれる第２のドメインを有することもできる。エンハンサーは、存在する場合には、通常、構造遺伝子の遠位にある。さらに、発現は、調節することができ、又は恒常的とすることができる。
【０４４１】
感染サイクルの後期に多量に転写される構造遺伝子は、特に有用なプロモーター配列を与える。例としては、ウイルス多角体タンパク質をコードする遺伝子（ＦＲＩＥＳＥＮ  ＥＴ  ＡＬ．，  Ｔｈｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ＴＨＥ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ  ＯＦ  ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳＥＳ（１９８６）；ＥＰ  ０  １２７  ８３９及び同０  １５５  ４７６）及びｐ１０タンパク質をコードする遺伝子（Ｖｌａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ＧＥＮ．  ＶＩＲＯＬ．（１９８８）６９：７６５）に由来する配列が挙げられる。
【０４４２】
新規に形成されたバキュロウイルス発現ベクターは、感染性組換えバキュロウイルスにパッケージ化され、続いて増殖したプラークは、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＢＩＯＥＳＳＡＹＳ（１９８９）４：９１；  ＳＵＭＭＥＲＳ  ＡＮＤ  ＳＭＩＴＨ，  ＴＥＸＡＳ  ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ  ＥＸＰＥＲＩＭＥＮＴ  ＳＴＡＴＩＯＮ  ＢＵＬＬＥＴＩＮ  ＮＯ．１５５５（１９８７）に記載の技術などの技術によって精製することができる。
【０４４３】
組換えバキュロウイルス発現ベクターは、幾つかの昆虫細胞への感染用に開発された。例えば、組換えバキュロウイルスは、とりわけ、ネッタイシマカ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−１２５）、カイコ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−８９１０）、キイロショウジョウバエ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．１９６３）、ツマジロクサヨトウ及びイラクサギンウワバ用に開発された。国際公開第８９／０４６，６９９号；Ｗｒｉｇｈｔ，  ＮＡＴＵＲＥ（１９８６）３２１：７１８；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ＶＩＲＯＬ．（１９８５）５６：１５３；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ＭＯＬ．  ＣＥＬＬ．  ＢＩＯＬ．（１９８３）３：２１５６を参照されたい。一般には、Ｆｒａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＩＮ  ＶＩＴＲＯ  ＣＥＬＬ．  ＤＥＶ．  ＢＩＯＬ．（１９８９）２５：２２５を参照されたい。より具体的には、バキュロウイルス発現ベクター系に使用される細胞系としては、通常、Ｓｆ９（ツマジロクサヨトウ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１７１１）、Ｓｆ２１（ツマジロクサヨトウ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｃａｔ．Ｎｏ．１１４９７−０１３（Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ））、Ｔｒｉ−３６８（イラクサギンウワバ）、Ｈｉｇｈ−Ｆｉｖｅ（商標）ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（イラクサギンウワバ）などが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０４４４】
バキュロウイルス／発現における異種ポリペプチドの直接発現及び融合発現のための細胞及び培地は市販されている。
【０４４５】
細菌  細菌発現技術は当分野で周知である。多種多様なベクターが細菌宿主に使用するのに利用可能である。ベクターは、単一コピー又は少数回若しくは多数回の多コピーベクターとすることができる。ベクターは、クローニング及び／又は発現に使用することができる。ベクターに関する豊富な文献、多数のベクターの市販入手性、さらにはベクターを記載したマニュアル並びにそれらの制限酵素地図及び諸特性を考慮すると、詳細な考察は本明細書では不要である。周知のとおり、ベクターは、通常、選択を可能にするマーカーを含む。このマーカーは、細胞毒性薬耐性、原栄養性又は免疫をもたらし得る。異なる特性をもたらす複数のマーカーが存在することが多い。
【０４４６】
細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼに結合して、ｍＲＮＡへのコード配列（例えば、構造遺伝子）の下流（３”）転写を惹起することができる任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、コード配列の５’末端近くに通常は位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は、典型的には、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位及び転写開始点を含む。細菌プロモーターは、オペレーターと呼ばれる第２のドメインを有することもできる。オペレーターは、ＲＮＡ合成が始まる隣接ＲＮＡポリメラーゼ結合部位と重複してもよい。遺伝子リプレッサータンパク質はオペレーターと結合し、それによって特定の遺伝子の転写を阻害し得るので、オペレーターによって、ネガティブに調節された（誘導性）転写が可能になる。恒常的な発現は、オペレーターなどの負の調節配列の非存在下で起こり得る。また、正の調節は、遺伝子活性化タンパク質結合配列によって実施することができる。遺伝子活性化タンパク質結合配列は、存在する場合には、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列の近位（５’）にある。遺伝子活性化タンパク質の例は、カタボライト活性化タンパク質（ＣＡＰ）である。これは、エシェリキア  コリ（Ｅ．コリ）中でｌａｃオペロンの転写開始を助ける［Ｒａｉｂａｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，  ＡＮＮＵ．  ＲＥＶ．  ＧＥＮＥＴ．（１９８４）１８：１７３］。したがって、調節発現は、正でも負でもよく、それによって転写を促進又は抑制することができる。
【０４４７】
代謝経路の酵素をコードする配列は、特に有用なプロモーター配列を与える。例としては、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）［Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ＮＡＴＵＲＥ（１９７７）１９８：１０５６］、マルトースなどの糖代謝酵素に由来するプロモーター配列が挙げられる。追加の例としては、トリプトファン（ｔｒｐ）などの生合成酵素に由来するプロモーター配列が挙げられる（Ｇｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃ．ＡＣＩＤＳ  ＲＥＳ．（１９８０）８：４０５７；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＮＵＣＬ．  ＡＣＩＤＳ  ＲＥＳ．（１９８１）９：７３１；米国特許第４，７３８，９２１号；ＩＦＮＰｕｂ．  Ｎｏｓ．０３６  ７７６及び１２１  ７７５）。これらを参照によりその全体を本明細書に組みこむ。β−ガラクトシダーゼ（ｂｌａ）プロモーター系［Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ（１９８１）”Ｔｈｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｍｉｓｔａｋｅｓ．”  Ｉｎ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ３（Ｅｄ．  Ｉ．  Ｇｒｅｓｓｅｒ）］、バクテリオファージラムダＰＬ［Ｓｈｉｍａｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ＮＡＴＵＲＥ（１９８１）２９２：１２８］及びＴ５［米国特許第４，６８９，４０６号］（これらを参照によりその全体を本明細書に組みこむ。）プロモーター系も有用なプロモーター配列を提供する。本明細書に包含される好ましい方法は、ポリペプチド産生を高レベルで誘導するためのＴ７プロモーターなどの強力なプロモーターを利用する。かかるベクターの例としては、Ｎｏｖａｇｅｎ製ｐＥＴ２９シリーズ及び国際公開第９９／０５２９７号に記載のｐＰＯＰベクターが挙げられるが、これらだけに限定されない。これらを参照によりその全体を本明細書に組みこむ。かかる発現系は、宿主細胞の生存又は増殖パラメータを損なわずに、宿主中で高レベルのポリペプチドを産生する。
【０４４８】
また、天然にはない合成プロモーターも細菌プロモーターとして機能する。例えば、１つの細菌プロモーター又はバクテリオファージプロモーターの転写活性化配列は、別の細菌プロモーター又はバクテリオファージプロモーターのオペロン配列と一緒に、合成ハイブリッドプロモーターを形成し得る［米国特許第４，５５１，４３３号］。例えば、ｔａｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーターと、ｌａｃリプレッサーによって調節されるｌａｃオペロン配列との両方からなるハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターである［Ａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＧＥＮＥ（１９８３）２５：１６７；ｄｅ  Ｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＲＯＣ．  ＮＡＴＬ．  ＡＣＡＤ．  ＳＣＩ．（１９８３）８０：２１］。また、細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼと結合し、転写を惹起する能力を有する非細菌起源の天然のプロモーターを含み得る。非細菌起源の天然プロモーターは、適合するＲＮＡポリメラーゼと連結して、原核生物中で一部の遺伝子を高レベルで発現させることもできる。バクテリオファージ（ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｓｅ）Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、連結プロモーター系の一例である［Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ＭＯＬ．  ＢＩＯＬ．（１９８６）１８９：１１３；Ｔａｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（１９８５）８２：１０７４］。また、ハイブリッドプロモーターは、バクテリオファージプロモーターとＥ．コリオペレーター領域からなることもできる（ＩＦＮＰｕｂ．Ｎｏ．２６７  ８５１）。
【０４４９】
機能性プロモーター配列に加えて、効率的リボソーム結合部位も原核生物における外来遺伝子の発現に有用である。Ｅ．コリでは、リボソーム結合部位は、シャイン−ダルガルノ（ＳＤ）配列と呼ばれ、開始コドン（ＡＴＧ）と、開始コドンの３−１１ヌクレオチド上流に位置する３−９ヌクレオチド長の配列とを含む［Ｓｈｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ＮＡＴＵＲＥ（１９７５）２５４：３４］。ＳＤ配列は、ＳＤ配列とＥ．コリ１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端（３’  ａｎｄ）との塩基対形成によって、ｍＲＮＡとリボソームの結合を促進すると考えられる［Ｓｔｅｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．  ”Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｉｇｎａｌｓ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ”，  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｅｄ．  Ｒ．Ｆ．  Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ，  １９７９）］。弱いリボソーム結合部位によって真核生物遺伝子及び原核生物遺伝子を発現すること［Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．  ”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ”，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９８９］。
【０４５０】
「細菌宿主」又は「細菌宿主細胞」という用語は、組換えベクター若しくは他の転移ＤＮＡ用レシピエントとして使用することができる細菌、又は使用されている細菌を指す。この用語は、形質移入された元の細菌宿主細胞の後代を含む。単一の親細胞の後代は、形態又は元の親に相補的なゲノムＤＮＡ若しくは全ＤＮＡが、偶発的若しくは意図的変異のために、完全に同一である必要はないことを理解されたい。所望のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在など、関連する特性によって特徴付けられる親と十分に類似した親細胞の後代は、この定義によって意図される後代に含まれる。
【０４５１】
所望のポリペプチドの発現に適切な宿主細菌の選択は当業者に周知である。発現用の細菌宿主を選択する際に、適切な宿主としては、以下の諸特性のうち少なくとも１つ、及び好ましくは以下の諸特性のうち少なくとも２つを有することが判明した宿主が挙げられるが、これらだけに限定されない：とりわけ、良好な封入体形成能力、低タンパク質分解活性、良好な分泌能力、良好な可溶性タンパク質産生能力及び全体の堅牢性。細菌宿主は、一般に、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，  ＣＡ）及びＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）（Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ）を含めて、但しこれらだけに限定されない多様な出所から利用可能である。工業／医薬の発酵は、一般に、Ｋ系統由来の細菌（例えば、Ｗ３１１０）又はＢ系統由来の細菌（例えば、ＢＬ２１）を使用する。これらの系統は、その増殖パラメータが極めてよく知られており堅牢であるので特に有用である。また、これらの系統は、非病原性であり、安全及び環境上の理由のために商業的に重要である。本明細書に記載され、包含される方法の一実施形態においては、Ｅ．コリ宿主としては、ＢＬ２１系統、ＤＨ１０Ｂ系統又はこれらの誘導体が挙げられるが、これらだけに限定されない。本明細書に記載され、包含される方法の別の実施形態においては、Ｅ．コリ宿主は、ＯＭＰ−及びＬＯＮ−を含めて、但しこれらだけに限定されないプロテアーゼマイナス系統である。別の実施形態においては、細菌宿主は、Ｐ．フルオレッセンス、Ｐ．エルジノーサ、Ｐ．プチダなどのシュードモナス種である。シュードモナス発現系統の例は、Ｐ．フルオレッセンス次亜種Ｉ、ＭＢ１０１系統（Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）である。
【０４５２】
組換え宿主細胞系統を樹立した（すなわち、発現構築体を宿主細胞に導入し、適切な発現構築体を含む宿主細胞を単離する。）後、組換え宿主細胞系統を、ポリペプチド産生に適切な条件下で培養する。組換え宿主細胞系統の培養方法は、利用する発現構築体の性質及び宿主細胞の特性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）に応じて決まる。組換え宿主系統は、通常、当分野で周知の方法を用いて培養される。組換え宿主細胞は、典型的には、炭素、窒素及び無機塩の同化可能源を含む液体培地であって、ビタミン、アミノ酸、増殖因子及び当分野で周知の他のタンパク質培養サプリメントを場合によっては含んでもよい液体培地中で培養される。宿主細胞の培養用液体培地は、発現ベクターを含む宿主細胞を選択する抗生物質を含めて、但しこれだけに限定されない、望ましくない微生物及び／又は化合物の増殖を防止する抗生物質又は抗真菌薬を含んでいてもよい。
【０４５３】
組換え宿主細胞は、バッチ又は連続形式で培養し、バッチ又は連続形式で、（所望のポリペプチドが細胞内に蓄積する場合には）細胞収集、又は培養上清収集することができる。原核生物宿主細胞における産生の場合には、バッチ培養と細胞収集が好ましい。
【０４５４】
一実施形態においては、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドを、組換え系における発現後に精製する。ポリペプチドは、当分野で公知の多様な方法によって宿主細胞又は培地から精製することができる。通常、細菌宿主細胞中で産生される多くのポリペプチドは、（封入体の形で）難溶性又は不溶性である。一実施形態においては、組換え産生されたポリペプチドの溶解性を高めるために選択されるアミノ酸置換は、ポリペプチドにおいて、本明細書に開示する方法及び当分野で公知の方法を利用して容易に実施することができる。不溶性ポリペプチドの場合には、ポリペプチドを宿主細胞溶解物から遠心分離又はろ過によって収集することができ、続いて細胞を均質化することができる。難溶性ポリペプチドの場合には、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含めて、但しこれだけに限定されない化合物を添加して、部分可溶性ポリペプチドを沈殿させることができる。次いで、沈澱したポリペプチドを遠心分離又はろ過によって都合良く収集することができる。組換え宿主細胞は、当業者に周知の多様な方法によって、分断又は均質化して、封入体を細胞内から遊離させることができる。宿主細胞の分断又は均質化は、酵素による細胞分断、超音波処理、ダウンス型均質化又は高圧放出分断（ｈｉｇｈ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ）を含めて、但しこれらだけに限定されない周知技術を用いて実施することができる。本明細書に記載され、包含される方法の一実施形態においては、高圧放出技術を使用して、Ｅ．コリ宿主細胞を分断し、ポリペプチドの封入体を放出させる。封入体の形の不溶性ポリペプチドの収率は、Ｅ．コリ宿主細胞をホモジナイザーに１回通すだけで増加し得ることが見出された。ポリペプチド封入体を扱うときには、可溶化、機械的せん断、タンパク質分解などの要因による損失なしに封入体収率を最大にするために、反復均質化時間を最少にすることが有利である。
【０４５５】
次いで、不溶性又は沈殿ポリペプチドを、当分野で公知である幾つかの適切な可溶化剤のいずれかを用いて可溶化することができる。例として、ポリペプチドを尿素又は塩酸グアニジンによって可溶化する。可溶化ポリペプチドの体積は、都合良く操作できるバッチサイズで大きいバッチを製造することができるように、最小限とすべきである。この要素は、組換え宿主を体積が数千リットルのバッチで増殖することができる大規模商用設定において重要となり得る。また、ポリペプチドを特にヒトの薬剤用に大規模商用設定で製造するときには、機械及び容器又はポリペプチド製品自体を損なう恐れがある不快な化学物質を回避することはできるだけ回避すべきである。弱い変性剤である尿素を不快な変性剤であるグアニジン塩酸塩の代わりに使用して、ポリペプチド封入体を可溶化できることが、本明細書に記載され、包含される方法において判明した。尿素を使用すると、ポリペプチド封入体を効率的に可溶化しつつ、ポリペプチドの製造及び精製プロセスに利用されるステンレススチール装置に損傷を与えるリスクがかなり減少する。
【０４５６】
可溶性ポリペプチドの場合には、ペプチドは細胞膜周辺腔又は培地中に分泌され得る。また、可溶性ペプチドは、宿主細胞の細胞質中に存在し得る。可溶性ペプチドは、精製段階を実施する前に濃縮することができる。本明細書に記載の技術を含めて、但しこれらだけに限定されない標準技術を使用して、例として細胞溶解物又は培地から、可溶性ペプチドを濃縮することができる。また、本明細書に記載の技術を含めて、但しこれらだけに限定されない標準技術を使用して、宿主細胞を分断し、宿主細胞の細胞質又は細胞膜周辺腔から可溶性ペプチドを遊離させることができる。
【０４５７】
ポリペプチドが融合タンパク質として産生されるときには、融合配列は好ましくは除去される。融合配列は、酵素切断又は化学切断を含めて、但しこれらだけに限定されない方法によって除去することができる。酵素切断が好ましい。酵素による融合配列の除去は、当業者に周知の方法を用いて実施することができる。融合配列を除去するための酵素の選択は、融合の特性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）によって決定される。反応条件は、酵素を選択することによって規定される。化学切断は、臭化シアン、ＴＥＶプロテアーゼ及び他の試薬を含めて、但しこれらだけに限定されない試薬を用いて実施することができる。切断されたポリペプチドを、切断された融合配列から周知の方法によって精製することもできる。かかる方法は、融合配列及びポリペプチドの特性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）及び諸性質に応じて決まる。精製方法としては、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、透析又はこれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０４５８】
ポリペプチドを精製して、タンパク質溶液からＤＮＡを除去してもよい。ＤＮＡは、沈殿又はイオン交換クロマトグラフィーを含めて、但しこれらだけに限定されない、当分野で公知の任意の適切な方法によって除去することができる。一実施形態においては、硫酸プロタミンなど、但しこれだけに限定されない核酸沈殿剤を用いた沈殿によってＤＮＡを除去する。ポリペプチドは、遠心分離又はろ過を含めて、但しこれらだけに限定されない周知の標準方法によって沈澱ＤＮＡから分離することができる。宿主核酸分子の除去は、ポリペプチドをヒトの治療に使用し、本明細書の方法によって宿主細胞ＤＮＡを薬剤として許容されるレベルにまで減少させる設定においては、重要な要素である。
【０４５９】
発酵槽、振とうフラスコ、流動層バイオリアクター、中空繊維バイオリアクター、ローラーボトル培養システム及び撹拌タンクバイオリアクターシステムを含めて、但しこれらだけに限定されない小規模又は大規模発酵方法を、タンパク質発現に使用することもできる。これらの方法の各々は、バッチ、流加又は連続方式プロセスで実施することができる。
【０４６０】
本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドのヒト用の形態（Ｈｕｍａｎ  ｆｏｒｍ）は、一般に、当分野で標準の方法によって回収することができる。例えば、培地又は細胞溶解物は、遠心分離又はろ過して、細胞片を除去することができる。上清は、所望の体積に濃縮若しくは希釈し、又は適切な緩衝剤で透析ろ過して、さらなる精製用の調製物を用意することができる。本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドのさらなる精製としては、ポリペプチド変異体の脱アミド形態及び短縮形態を、対応する完全な形態から分離することが挙げられるが、これだけに限定されない。
【０４６１】
以下の例示的な手順のいずれかを、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドの精製に使用することができる：アフィニティークロマトグラフィー；（ＤＥＡＥ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥの使用を含めて、但しこれだけに限定されない）陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー；シリカクロマトグラフィー；逆相ＨＰＬＣ；（ＳＥＰＨＡＤＥＸ  Ｇ−７５の使用を含めて、但しこれだけに限定されない）ゲルろ過；疎水性相互作用クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー、金属−キレートクロマトグラフィー；限外ろ過／透析ろ過；エタノール沈殿；硫安塩析；等電点電気泳動；置換クロマトグラフィー；（調製用等電点電気泳動を含めて、但しこれらだけに限定されない）電気泳動手順、（硫安塩析を含めて、但しこれらだけに限定されない）示差溶解性（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、抽出又はこれらの任意の組み合わせ。
【０４６２】
非天然アミノ酸を含むポリペプチド、非天然アミノ酸を含むポリペプチドに対する抗体、非天然アミノ酸を含むポリペプチドに対する結合パートナーを含めて、但しこれらだけに限定されない、本明細書の方法及び組成物に包含されるポリペプチドは、当業者に周知の標準手順及び使用されている標準手順に従って、部分的に、又は実質的に、均一になるまで精製することができる。すなわち、本明細書に記載のポリペプチドは、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸又は塩基抽出、カラムクロマトグラフィー、親和性カラムクロマトグラフィー、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、ゲル電気泳動及びこれらの任意の組み合わせを含めて、但しこれらだけに限定されない、当分野で周知の幾つかの方法のいずれかによって回収及び精製することができる。タンパク質再折り畳み段階は、正確に折り畳まれた成熟タンパク質を製造するのに所望のとおり使用することができる。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、アフィニティークロマトグラフィー又は他の適切な方法を、高純度が望まれる最終精製段階に使用することができる。一実施形態においては、非天然アミノ酸（又は非天然アミノ酸を含むポリペプチド）に対して作製される抗体を、１個以上の非天然アミノ酸を含むポリペプチドの親和性に基づく精製用を含めて、但しこれだけに限定されない精製試薬として使用する。部分的に、又は均一になるまで、所望のとおり精製した後、ポリペプチドを、アッセイ成分、治療、予防、診断、研究試薬及び／又は抗体産生用免疫原を含めて、但しこれらだけに限定されない多種多様な用途に使用してもよい。
【０４６３】
本明細書に記載の他の参考文献に加えて、Ｒ．  Ｓｃｏｐｅｓ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  Ｎ．Ｙ．（１９８２）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．  Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｓａｎｄａｎａ（１９９７）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．；Ｂｏｌｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ（１９９６）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＪ，  Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｇａｌ（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｈａｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ａｎｇａｌ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｃｏｐｅｓ（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，  ＮＹ；Ｊａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒｙｄｅｎ（１９９８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，  Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，  ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ（１９９８），  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｎ  ＣＤ−ＲＯＭ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＪ及びその引用文献に示された方法を含めて、但しこれらだけに限定されない多様な精製／タンパク質折り畳み方法が当分野で周知である。
【０４６４】
真核生物宿主細胞又は非真核生物宿主細胞中で少なくとも１個の非天然アミノ酸を含むポリペプチドを産生する１つの利点は、典型的には、ポリペプチドがその自然の高次構造で折り畳まれる点にある。しかし、本明細書の方法及び組成物のある実施形態においては、合成、発現及び／又は精製後、ポリペプチドは、関連するポリペプチドの所望の高次構造とは異なる高次構造を有し得る。本明細書の方法及び組成物の一態様においては、発現タンパク質を変性し、次いで再生してもよい。この必須でない変性及び再生は、シャペロニンを目的ポリペプチドに付加すること、及びグアニジンＨＣｌを含めて、但しこれだけに限定されないカオトロピック剤中にポリペプチドを溶解することを含めて、但しこれだけに限定されない、当分野で公知の方法を利用して、また、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼを利用して実施される。
【０４６５】
一般に、発現ポリペプチドを変性及び還元し、次いでポリペプチドを好ましい高次構造に再び折り畳むことが望ましい場合がある。例として、かかる再折り畳みは、グアニジン、尿素、ＤＴＴ、ＤＴＥ及び／又はシャペロニンを目的翻訳産物に付加して実施することができる。タンパク質を還元し、変性し、再生する方法は、当業者に周知である（上記参考文献及びＤｅｂｉｎｓｋｉ，  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６８：１４０６５−１４０７０；Ｋｒｅｉｔｍａｎ  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ（１９９３）  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．，  ４：５８１−５８５及びＢｕｃｈｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２０５：２６３−２７０を参照されたい。）。例えば、Ｄｅｂｉｎｓｋｉ等は、グアニジン−ＤＴＥにおける封入体タンパク質の変性及び還元を記述している。タンパク質は、これらだけに限定されないが酸化型グルタチオン及びＬ−アルギニンを含むレドックス緩衝剤中で再折り畳みすることができる。再折り畳み試薬は、流動又は移動させて１種類以上のポリペプチド又は他の発現産物と接触させることができ、その逆も同様である。
【０４６６】
非天然アミノ酸ポリペプチドを原核生物によって産生する場合には、かくして製造されたポリペプチドは、誤って折り畳まれることがあり、したがって生物活性が失われ、又は低下する。タンパク質の生理活性は「再折り畳み」によって回復し得る。一実施形態においては、誤って折り畳まれたポリペプチドは、（ポリペプチドが不溶性である場合も）溶解し、ポリペプチド鎖をほどき、１種類以上の（尿素及び／又はグアニジンを含めて、但しこれらだけに限定されない）カオトロピック剤及びジスルフィド結合を還元することができる（ジチオスレイトールＤＴＴ又は２−メルカプトエタノール２−ＭＥを含めて、但しこれらだけに限定されない）還元剤を例えば用いて、還元することによって、再び折り畳まれる。次いで、カオトロープの中程度の濃度において（酸素、シスチン又はシスタミンを含めて、但しこれらだけに限定されない）酸化剤を添加すると、ジスルフィド結合を再形成することができる。折り畳まれていないポリペプチド又は誤って折り畳まれたポリペプチドは、参照によりその全体を本明細書に組みこむ米国特許第４，５１１，５０２号、同４，５１１，５０３号及び同４，５１２，９２２号の方法など当分野で公知の標準方法によって再び折り畳むことができる。ポリペプチドを他のタンパク質と共同的に折り畳んで（ｃｏｆｏｌｄ）ヘテロ２量体又はヘテロ多量体を形成することもできる。再折り畳み又は共同的折り畳み後に、ポリペプチドをさらに精製してもよい。
【０４６７】
非天然アミノ酸ポリペプチドの精製は、本明細書に記載の技術、例として疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなど又はこれらの任意の組み合わせを含めて、但しこれらだけに限定されない多様な技術を用いて実施することができる。追加の精製は、精製タンパク質の乾燥又は沈殿の段階を含むこともできる。
【０４６８】
精製後、非天然アミノ酸ポリペプチドは、透析ろ過及び透析を含めて、但しこれらだけに限定されない、当分野で公知の種々の方法のいずれかによって、異なる緩衝剤に移すことができ、及び／又は濃縮することができる。単一の精製タンパク質として提供されるｈＧＨを凝集及び沈殿に供することができる。ある実施形態においては、精製非天然アミノ酸ポリペプチドは、（逆相高速液体クロマトグラフィーＲＰ−ＨＰＬＣ又はドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定して）少なくとも純度９０％であり得る。他のある実施形態においては、精製非天然アミノ酸ポリペプチドは、少なくとも純度９５％、少なくとも純度９８％又は少なくとも純度９９％以上であり得る。非天然アミノ酸ポリペプチドの正確な純度にかかわらず、非天然アミノ酸ポリペプチドは、医薬品としての使用に、又はＰＥＧなどの水溶性ポリマーとの連結を含めて、但しこれだけに限定されないさらなる処理に、十分な純度である。
【０４６９】
ある実施形態においては、非天然アミノ酸ポリペプチド分子は、（賦形剤、担体及び安定剤、血清アルブミンなどを除く）他の活性成分又はタンパク質の非存在下で、治療薬として使用することができる。ある実施形態においては、非天然アミノ酸ポリペプチド分子を別のポリペプチド又はポリマーと複合化することができる。
【０４７０】
２．  非天然アミノ酸ポリペプチドの精製
一般的精製方法  本セクションで開示する技術は、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドの一般的精製に適用することができる。
【０４７１】
種々の単離段階のいずれか１つを、細胞溶解物抽出物、培地、封入体、宿主細胞の細胞膜周辺腔、宿主細胞の細胞質若しくは所望のポリペプチドを含む他の材料に対して、又はアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）、逆相ＨＰＬＣ（「ＲＰ−ＨＰＬＣ」）、膨張床型吸着（ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｂｅｄ  ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）、それらの任意の組み合わせ及び／又は反復を含めて、但しこれらだけに限定されない任意の単離段階から得られる任意のポリペプチド混合物に対して、任意の適切な順序で実施することができる。
【０４７２】
本明細書に記載の技術を実施するのに使用する装置及び他の必要な材料は市販されている。ポンプ、フラクションコレクター、モニター、記録計及びシステム全体を、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ），Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｉｎｃ．（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）及びＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）から入手することができる。交換マトリックス材料、媒体及び緩衝剤を含めて、但しこれらだけに限定されないクロマトグラフィー材料もかかる会社から利用可能である。
【０４７３】
洗浄、溶出など本明細書に記載のカラムクロマトグラフィープロセスにおける平衡及び他の段階は、ポンプなどの特殊な装置を用いてより迅速に実施することができる。市販ポンプとしては、ＨＩＬＯＡＤ（登録商標）Ｐｕｍｐ  Ｐ−５０、Ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ  Ｐｕｍｐ  Ｐ−１、Ｐｕｍｐ  Ｐ−９０１及びＰｕｍｐ  Ｐ−９０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）などが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０４７４】
フラクションコレクターの例としては、ＲｅｄｉＦｒａｃ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ、ＦＲＡＣ−１００及びＦＲＡＣ−２００  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ及びＳＵＰＥＲＦＲＡＣ（登録商標）Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）が挙げられる。撹拌機もｐＨ及び線状濃度勾配を形成するために利用可能である。市販撹拌機としては、Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｍｉｘｅｒ  ＧＭ−１、Ｉｎ−Ｌｉｎｅ  Ｍｉｘｅｒｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）などが挙げられる。
【０４７５】
クロマトグラフィープロセスは、任意の市販モニターを用いてモニターすることができる。かかるモニターを使用して、ＵＶ、蛍光、ｐＨ及び伝導率のような情報を収集することができる。検出器の例としては、Ｍｏｎｉｔｏｒ  ＵＶ−１、ＵＶＩＣＯＲＤ（登録商標）Ｓ  ＩＩ、Ｍｏｎｉｔｏｒ  ＵＶ−Ｍ  ＩＩ、Ｍｏｎｉｔｏｒ  ＵＶ−９００、Ｍｏｎｉｔｏｒ  ＵＰＣ−９００、Ｍｏｎｉｔｏｒ  ｐＨ／Ｃ−９００及びＣｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍｏｎｉｔｏｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）が挙げられる。実際には、システム全体が、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）からの種々のＡＫＴＡ（登録商標）システムを含めて、市販されている。
【０４７６】
本明細書の方法及び組成物の一実施形態においては、例えば、ポリペプチドは、得られた精製ポリペプチドを尿素中でまず変性し、続いて適切なｐＨにおいて（ＤＴＴなどの）還元剤を含むＴＲＩＳ緩衝剤で希釈することによって、還元し、変性することができる。別の実施形態においては、ポリペプチドを約２Ｍから約９Ｍの濃度範囲の尿素中で変性し、続いて約５．０から約８．０の範囲のｐＨにおいてＴＲＩＳ緩衝剤で希釈する。次いで、この実施形態の再折り畳み混合物をインキュベートすることができる。一実施形態においては、再折り畳み混合物を室温で４から２４時間インキュベートする。次いで、還元及び変性したポリペプチド混合物をさらに単離し、又は精製することができる。
【０４７７】
本明細書に記載するように、第１のポリペプチド混合物のｐＨを、任意の後続の単離段階の前に調節することができる。また、第１のポリペプチド混合物又は後続のその任意の混合物を、当分野で公知の技術によって濃縮することができる。さらに、第１のポリペプチド混合物又はその後続の任意の混合物を含む溶出緩衝剤を、当業者に周知の技術を用いて、次の単離段階に適切な緩衝剤と交換することができる。
【０４７８】
イオン交換クロマトグラフィー  本セクションで開示する技術は、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドのイオンクロマトグラフィーに適用することができる。
【０４７９】
一実施形態及び任意に選択される追加の段階においては、イオン交換クロマトグラフィーを第１のポリペプチド混合物に対して実施することができる。一般には、ＩＯＮ  ＥＸＣＨＡＮＧＥ  ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１８−１１１４−２１，  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ））を参照されたい。市販イオン交換カラムとしては、ＨＩＴＲＡＰ（登録商標）、ＨＩＰＲＥＰ（登録商標）、ＨＩＬＯＡＤ（登録商標）Ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）などが挙げられる。かかるカラムは、Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ＸＬなどの強力な陰イオン交換体；ＳＰ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＳＰ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、ＳＰ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）ＸＬなどの強力な陽イオン交換体；ＤＥＡＥ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗなどの弱い陰イオン交換体及びＣＭ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗなどの弱い陽イオン交換体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）を利用する。陰イオン又は陽イオン交換カラムクロマトグラフィーをポリペプチドに対して精製プロセスの任意の段階において実施して、精製ポリペプチドを実質的に単離することができる。陽イオン交換クロマトグラフィー段階は、任意の適切な陽イオン交換マトリックスを用いて実施することができる。陽イオン交換マトリックスとしては、繊維状、多孔質、非多孔質、微顆粒状、ビーズ状又は架橋型の陽イオン交換マトリックス材料などが挙げられるが、これらだけに限定されない。かかる陽イオン交換マトリックス材料としては、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリラート、ポリビニル、ポリスチレン、シリカ、ポリエーテル、上述のいずれかの複合体などが挙げられるが、これらだけに限定されない。陽イオン交換マトリックスへのポリペプチドの吸着に続いて、実質的に精製されたポリペプチドは、マトリックスを十分に高いｐＨ又はイオン強度を有する緩衝剤と接触させて、ポリペプチドをマトリックスから移動させることによって、溶出させることができる。実質的に精製されたポリペプチドの高ｐＨ溶出に使用するのに適切な緩衝剤としては、少なくとも約５ｍＭから少なくとも約１００ｍＭの濃度のクエン酸塩、リン酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ緩衝剤などが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０４８０】
逆相クロマトグラフィー  本セクションで開示する技術は、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドの逆相クロマトグラフィーに適用することができる。
【０４８１】
ＲＰ−ＨＰＬＣは、当業者に公知の適切なプロトコルに従って精製タンパク質に対して実施することができる。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ＡＮＡＬ  ＢＩＯＣＨＥＭ．（１９８２）１２４：２１７−２３０（１９８２）；Ｒｉｖｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．ＣＨＲＯＭ．（１９８３）２６８：１１２−１１９；Ｋｕｎｉｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  ＣＨＲＯＭ．（１９８６）３５９：３９１−４０２を参照されたい。ＲＰ−ＨＰＬＣをポリペプチドに対して実施して、精製ポリペプチドを実質的に単離することができる。この点で、少なくとも約Ｃ３から少なくとも約Ｃ３０、少なくとも約Ｃ３から少なくとも約Ｃ２０又は少なくとも約Ｃ３から少なくとも約Ｃ１８を含めて、但しこれらだけに限定されない多種多様な長さのアルキル官能基を有するシリカ変性樹脂、樹脂を使用することができる。或いは、重合体樹脂を使用することができる。例えば、スチレンポリマー樹脂であるＴｏｓｏＨａａｓ  Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍｅ  ＣＧ１０００ｓｄ樹脂を使用することができる。多種多様なアルキル鎖長を有するシアノ又は重合体樹脂も使用することができる。また、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムは、エタノールなどの溶媒で洗浄することができる。イオン対形成剤及びメタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、エタノールなどの有機改質剤を含む適切な溶出緩衝剤を使用して、ポリペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣカラムから溶出させることができる。最も一般的に使用されるイオン対形成剤としては、酢酸、ギ酸、過塩素酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、ヘプタフルオロ酪酸、トリエチルアミン、テトラメチルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム、酢酸トリエチルアンモニウムなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。溶出は、１つ以上の勾配又は無勾配条件を用いて実施することができる。分離時間を短縮し、ピーク幅を減少させるために勾配条件が好ましい。別の方法は、異なる溶媒濃度範囲の２つの勾配を使用するものである。本発明での使用に適切な溶出緩衝剤の例としては、酢酸アンモニウム、アセトニトリル溶液などが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０４８２】
疎水性相互作用クロマトグラフィー精製技術  本セクションで開示する技術は、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドの疎水性相互作用クロマトグラフィー精製に適用することができる。
【０４８３】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、ポリペプチドに対して実施することができる。一般には、参照により本明細書に組みこむＨＹＤＲＯＰＨＯＢＩＣ  ＩＮＴＥＲＡＣＴＩＯＮ  ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＹ  ＨＡＮＤＢＯＯＫ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ（Ｃａｔ．  Ｎｏ．１８−１０２０−９０，  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）を参照されたい。適切なＨＩＣマトリックスとしては、アガロース、架橋アガロース、セファロース、セルロース、シリカ、デキストラン、ポリスチレン、ポリ（メタクリラート）マトリックスを含むブチル、ヘキシル、オクチル、フェニル置換マトリックスなどのアルキル又はアリール置換マトリックス、ポリエチレンアミン樹脂又はブチル若しくはフェニル置換ポリ（メタクリラート）マトリックスを含めて、但しこれらだけに限定されない混合型樹脂などが挙げられるが、これらだけに限定されない。疎水性相互作用カラムクロマトグラフィーの市販源としては、ＨＩＴＲＡＰ（登録商標）、ＨＩＰＲＥＰ（登録商標）、ＨＩＬＯＡＤ（登録商標）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）などが挙げられるが、これらだけに限定されない。手短に述べると、ＨＩＣカラムは、装填前に、酢酸／塩化ナトリウム溶液、硫酸アンモニウム含有ＨＥＰＥＳなどの当業者に公知の標準緩衝剤を用いて平衡にすることができる。硫酸アンモニウムはＨＩＣカラムに添加する緩衝剤として使用することができる。ポリペプチドを充填後、カラムを標準緩衝剤及び標準条件によって洗浄して、ポリペプチドをＨＩＣカラム上に保持する一方で望ましくない材料を除去することができる。ポリペプチドは、とりわけ、ＥＤＴＡと平衡緩衝剤よりも低い硫酸アンモニウム濃度とを含むＨＥＰＥＳ緩衝剤、酢酸／塩化ナトリウム緩衝剤などの標準緩衝剤の約３から約１０カラム体積で溶出させることができる。例えばリン酸カリウム勾配を用いた、漸減線状塩勾配を使用して、ポリペプチド分子を溶出させることができる。次いで、溶離剤を、例えば透析ろ過、限外ろ過などのろ過によって、濃縮することができる。透析ろ過を利用して、ポリペプチドの溶出に使用した塩を除去することができる。
【０４８４】
他の精製技術  本セクションで開示する技術は、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドの他の精製技術に適用することができる。
【０４８５】
例えば、ゲルろ過（参照によりその全体を本明細書に組みこむ（ＧＥＬ  ＦＩＬＴＲＡＴＩＯＮ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ（Ｃａｔ．  Ｎｏ．１８−１０２２−１８，  Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（適切なマトリックスとしては、ＨＡ−Ｕｌｔｒｏｇｅｌ、Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ＣＨＴ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ（ＢｉｏＲａｄ）、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  ＨＴＰ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ（ＢｉｏＲａｄ）などが挙げられるが、これらだけに限定されない。）、ＨＰＬＣ、膨張床吸着、限外ろ過、透析ろ過、凍結乾燥などを用いたさらに別の単離段階を、第１のポリペプチド混合物又はその後続の任意の混合物に対して実施して、あらゆる過剰の塩を除去し、緩衝剤を次の単離段階に、さらには薬剤製品の処方に適切な緩衝剤で置換することができる。実質的に精製されたポリペプチドを含めて、ポリペプチドの収率は、本明細書に記載の各段階において、本明細書に記載の技術を含めて、但しこれだけに限定されない多様な技術によって、モニターすることができる。かかる技術は、最終単離段階に続いて、実質的に精製されたポリペプチドの収率を評価するのに使用することもできる。例として、ポリペプチドの収率は、シアノＲＰ−ＨＰＬＣ、Ｃ１８ＲＰ−ＨＰＬＣなどの多様なアルキル鎖長を有する幾つかの逆相高圧液体クロマトグラフィーカラム並びに陽イオン交換ＨＰＬＣ及びゲルろ過ＨＰＬＣのいずれかを用いてモニターすることができる。
【０４８６】
純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの標準技術によって、又はウエスタンブロット及びＥＬＩＳＡアッセイを用いてポリペプチドを測定することによって、決定することができる。例えば、ポリクローナル抗体は、負の対照の酵母発酵及び陽イオン交換回収から単離されるタンパク質に対して産生され得る。抗体を使用して、汚染宿主細胞タンパク質の存在を探索することもできる。
【０４８７】
ある実施形態においては、各精製段階後のポリペプチドの収率は、各精製段階に対して、出発材料中のポリペプチドの少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％又は少なくとも約９９．９９％であり得る。
【０４８８】
ＲＰ−ＨＰＬＣ材料Ｖｙｄａｃ  Ｃ４（Ｖｙｄａｃ）は、表面にＣ４アルキル鎖を有するシリカゲル粒子からなる。タンパク質不純物からのポリペプチドの分離は、疎水性相互作用の強度差に基づく。溶出は、希釈トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル勾配を用いて実施される。分取用ＨＰＬＣは、（Ｖｙｄａｃ  Ｃ４シリカゲル２．８から３．２リットルを充填した）ステンレスカラムを用いて実施される。Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  Ｕｌｔｒｏｇｅｌ溶出物を、トリフルオロ酢酸を添加することによって酸性化し、Ｖｙｄａｃ  Ｃ４カラム上に添加する。洗浄及び溶出には、希釈トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル勾配を使用する。画分を収集し、リン酸緩衝剤ですぐに中和する。ＩＰＣ限界内のポリペプチド画分をプールする。
【０４８９】
ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）材料は、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ表面に共有結合したジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基からなる。ＤＥＡＥ基とポリペプチドの結合は、イオン性相互作用によって媒介される。アセトニトリル及びトリフルオロ酢酸は、保持されずにカラムを通過する。これらの物質を洗浄除去した後、カラムを低ｐＨの酢酸緩衝剤で洗浄することによって、微量の不純物を除去する。次いで、カラムを中性リン酸緩衝剤で洗浄する。ポリペプチドを高イオン強度の緩衝剤で溶出させる。このカラムは、ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗが充填されている。ポリペプチド充填量がポリペプチド３−１０ｍｇ／ｍｌゲルの範囲に確実になるようにカラム体積を調節する。カラムを水及び平衡緩衝剤（リン酸ナトリウム／カリウム）で洗浄する。ＨＰＬＣ溶出物のプール画分を添加し、カラムを平衡緩衝剤で洗浄する。次いで、カラムを洗浄緩衝剤（酢酸ナトリウム緩衝剤）で洗浄し、続いて平衡緩衝剤で洗浄する。続いて、ポリペプチドを、溶出緩衝剤（塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム／カリウム）を用いてカラムから溶出させ、基本溶出プロファイルに従って単一画分として収集する。ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムの溶出物を、指定の伝導率に調節する。生成した薬物をテフロン（登録商標）ボトル中に無菌ろ過し、−７０℃で保存する。
【０４９０】
Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを含めて、但しこれだけに限定されない）質量分析法及び当業者に公知の他のタンパク質分析方法を含めて、但しこれらだけに限定されない多種多様な方法及び手順を使用して、ポリペプチド１個以上の非天然アミノ酸の収率及び純度を評価することができる。
【０４９１】
さらなる方法としては、内毒素を除去する段階が挙げられるが、これだけに限定されない。内毒素は、例えばエシェリキア  コリなどのグラム陰性宿主細胞の外膜にあるリポ多糖（ＬＰＳ）である。内毒素レベルを低下させる方法としては、シリカ担体、ガラス粉末又はヒドロキシアパタイトを用いた精製技術、逆相、親和性、サイズ排除、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、これらの方法の組み合わせなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。改変又はさらなる方法は、目的ポリペプチドからのタンパク質の共移動（ｃｏ−ｍｉｇｒａｔｉｎｇ）など、汚染物質を除去する必要があり得る。内毒素レベルを測定する方法は、当業者に公知であり、カブトガニの血球抽出成分（Ｌｉｍｕｌｕｓ  Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ）（ＬＡＬ）アッセイが挙げられるが、これだけに限定されない。
【０４９２】
さらなる方法及び手順としては、タンパク質染色方法と組み合わせたＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫ブロット、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化−質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）、液体クロマトグラフィー／質量分析法、等電点電気泳動、分析的な陰イオン交換、クロマトフォーカシング及び円偏光二色性が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０４９３】
ある実施形態においては、式Ｉ−ＸＶＩＩＩ、ＸＸＸ−ＸＸＸＩＶ（Ａ＆Ｂ）及びＸＸＸＸ−ＸＸＸＸＩＩＩの範囲内にある任意の下位式又は特定の化合物を含めて、式Ｉ−ＸＶＩＩＩ、ＸＸＸ−ＸＸＸＩＶ（Ａ＆Ｂ）及びＸＸＸＸ−ＸＸＸＸＩＩＩのアミノ酸をポリペプチドに生合成的に組み込み、それによって非天然アミノ酸ポリペプチドを生成することができる。他の実施形態においては、かかるアミノ酸をポリペプチド内の特定の部位に組み込む。他の実施形態においては、かかるアミノ酸を、翻訳系を用いてポリペプチドに組み込む。他の実施形態においては、かかる翻訳系は、（ｉ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドは、上記アミノ酸の予め指定した組み込み部位に対応する選択コドンを含む。）及び（ｉｉ）アミノ酸を含むｔＲＮＡ（ｔＲＮＡは選択コドンに特異的である。）を含む。かかる翻訳系の他の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、翻訳系において生成されるｍＲＮＡである。かかる翻訳系の他の実施形態においては、翻訳系は、ポリヌクレオチドを含む、プラスミド又はファージを含む。かかる翻訳系の他の実施形態においては、翻訳系は、ポリヌクレオチドを含むゲノムＤＮＡを含む。かかる翻訳系の他の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡに安定に組み込まれる。かかる翻訳系の他の実施形態においては、翻訳系は、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン、異常コドン、５塩基コドン及び４塩基コドンからなる群から選択される選択コドンに特異的なｔＲＮＡを含む。かかる翻訳系の他の実施形態においては、ｔＲＮＡはサプレッサーｔＲＮＡである。かかる翻訳系の他の実施形態においては、翻訳系は、上記アミノ酸にアミノアシル化されたｔＲＮＡを含む。かかる翻訳系の他の実施形態においては、翻訳系は、ｔＲＮＡに特異的なアミノアシルシンセターゼを含む。かかる翻訳系の他の実施形態においては、翻訳系は、直交ｔＲＮＡと直交アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼを含む。かかる翻訳系の他の実施形態においては、ポリペプチドは、リボソームによって合成される。さらなる実施形態においては、翻訳系は、細菌細胞、古細菌細胞及び真核細胞からなる群から選択される細胞を含むインビボ翻訳系である。他の実施形態においては、細胞は、エシェリキア  コリ細胞、酵母細胞、シュードモナス種由来の細胞、哺乳動物細胞、植物細胞又は昆虫細胞である。かかる翻訳系の他の実施形態においては、翻訳系は、細菌細胞、古細菌細胞又は真核細胞からの細胞抽出物を含むインビトロ翻訳系である。他の実施形態においては、細胞抽出物は、エシェリキア  コリ細胞、シュードモナス種由来の細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞又は昆虫細胞から得られる。他の実施形態においては、ポリペプチドの少なくとも一部は、固相若しくは溶液相ペプチド合成又はこれらの組み合わせによって合成される一方、他の実施形態においては、ポリペプチドを別のポリペプチドに連結することをさらに含む。他の実施形態においては、式Ｉ−ＸＶＩＩＩ、ＸＸＸ−ＸＸＸＩＶ（Ａ＆Ｂ）及びＸＸＸＸ−ＸＸＸＸＩＩＩの範囲内にある任意の下位式又は特定の化合物を含めて、式Ｉ−ＸＶＩＩ��、ＸＸＸ−ＸＸＸＩＶ（Ａ＆Ｂ）及びＸＸＸＸ−ＸＸＸＸＩＩＩのアミノ酸を、ポリペプチドに生合成的に組み込むことができる。ここで、ポリペプチドは、アルファ−１抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学走化性タンパク質−１、単球化学走化性タンパク質−２、単球化学走化性タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１アルファ、単球炎症性タンパク質−１ベータ、ＲＡＮＴＥＳ、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン、上皮性好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮性好中球活性化ペプチド、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、剥脱性毒素、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、４本ヘリックスバンドルタンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、性腺刺激ホルモン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１受容体、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールツリン、好中球抑制因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン、Ａタンパク質、Ｇタンパク質、ｐｔｈ、発熱性外毒素Ａ、発熱性外毒素Ｂ、発熱性外毒素Ｃ、ｐｙｙ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、小さな生合成タンパク質、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群毒素、チモシンアルファ１、組織プラスミノゲンアクチベーター、腫よう成長因子（ＴＧＦ）、腫よう壊死因子、腫よう壊死因子アルファ、腫よう壊死因子ベータ、腫よう壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４タンパク質、ＶＣＡＭ−１タンパク質、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体及びコルチコステロンからなる群から選択される治療用タンパク質と相同であるタンパク質である。
【０４９４】
Ｂ．  インビボ翻訳後修飾
少なくとも１個の非天然アミノ酸を含む目的ポリペプチドを真核細胞中で産生することによって、かかるポリペプチドは、真核生物の翻訳後修飾を含み得る。ある実施形態においては、タンパク質は、少なくとも１個の非天然アミノ酸と、真核細胞によってインビボでなされた少なくとも１つの翻訳後修飾とを含む。ここで、翻訳後修飾は、原核細胞によってはなされない。例として、翻訳後修飾としては、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミチン酸付加、リン酸化、糖脂質リンケージ修飾、グリコシル化などが挙げられるが、これらだけに限定されない。一態様においては、翻訳後修飾は、（（ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ）２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ）を含めて、但しこれだけに限定されない）オリゴ糖とアスパラギンとのＧｌｃＮＡｃ−アスパラギンリンケージによる結合を含む。真核生物タンパク質のＮ連結オリゴ糖の幾つかの例を示した表１を参照されたい（追加の残基も存在し得るが、示していない。）。別の態様においては、翻訳後修飾は、（Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃなどを含めて、但しこれらだけに限定されない）オリゴ糖とセリン又はトレオニンとのＧａｌＮＡｃ−セリン若しくはＧａｌＮＡｃ−トレオニンリンケージ又はＧｌｃＮＡｃ−セリン若しくはＧｌｃＮＡｃ−トレオニンリンケージによる結合を含む。
表１：ＧｌｃＮＡｃリンケージを介したオリゴ糖の例
【０４９５】
【表２】
0005425398.tif 000053
【０４９６】
さらに別の態様においては、翻訳後修飾は、（カルシトニン前駆体、カルシトニン遺伝子関連ペプチド前駆体、プレプロ副甲状腺ホルモン、プレプロインスリン、プロインスリン、プレプロオピオメラノコルチン、プロオピオメラノコルチンなどを含めて、但しこれらだけに限定されない）前駆体のタンパク質分解性プロセシング、多サブユニットタンパク質又は巨大分子アセンブリへのアセンブリ、（小胞体、ゴルジ体、核、リソソーム、ペルオキシソーム、ミトコンドリア、葉緑体、空胞などの細胞小器官、分泌性経路経由などを含めて、但しこれらだけに限定されない）細胞中の別の部位への移行を含む。ある実施形態においては、タンパク質は、分泌又は局在性配列、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴ融合などを含む。
【０４９７】
非天然アミノ酸の一利点は、さらに別の分子を追加するために使用することができるさらに別の化学的部分を提供する点にある。これらの修飾は、真核又は非真核細胞中でインビボで、又はインビトロで行うことができる。したがって、ある実施形態においては、翻訳後修飾は非天然アミノ酸を介する。例えば、翻訳後修飾は、求核性求電子反応によることができる。タンパク質の選択的修飾に現在使用されている大部分の反応は、α−ハロケトンとヒスチジン又はシステインの側鎖との反応を含めて、但しこれだけに限定されない求核性反応パートナーと求電子反応パートナーとの共有結合の形成を含む。これらの例における選択性は、タンパク質中の求核性残基の数及び接近性（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）によって決定される。本明細書に記載のポリペプチド又は本明細書の方法を用いて産生されるポリペプチドにおいては、非天然ケトアミノ酸とヒドラジド又はアミノオキシ化合物との反応を含めて、但しこれだけに限定されない他のより選択的な反応をインビトロ及びインビボで使用することができる。例えば、Ｃｏｒｎｉｓｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １１８：８１５０−８１５１；Ｍａｈａｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２７６：１１２５−１１２８；Ｗａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００；Ｃｈｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２４：９０２６−９０２７；Ｃｈｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ９９：１１０２０−１１０２４；Ｗａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  １００：５６−６１；Ｚｈａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ４２：６７３５−６７４６及びＣｈｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００：９６４−９６７を参照されたい。これによって、フルオロフォア、架橋剤、糖誘導体及び細胞傷害性分子を含めて、試薬のホストを用いて実質的にあらゆるタンパク質を選択的に標識することができる。参照により本明細書に組みこむ２００３年１月１６日に出願された米国特許出願第１０／６８６，９４４号「Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」も参照されたい。アジドアミノ酸によるものを含めて、但しこれだけに限定されない翻訳後修飾は、（トリアリールホスフィン試薬を含めて、但しこれだけに限定されない）Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ連結によって行うこともできる。例えば、Ｋｉｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００２）Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｚｉｄｅｓ  ｉｎｔｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ  ｌｉｇａｔｉｏｎ，  ＰＮＡＳ  ９９（１）：１９−２４を参照されたい。
【０４９８】
ＩＸ．  非天然アミノ酸ポリペプチドを産生する代替系
幾つかの戦略を使用して、非組換え宿主細胞、変異誘発宿主細胞中の、又は無細胞系中のタンパク質に非天然アミノ酸を導入した。本セクションで開示する代替系は、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドの産生に適用することができる。例として、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒなどの反応性側鎖を有するアミノ酸を誘導体化すると、リジンはＮ２−アセチル−リジンに転化される。化学合成も、非天然アミノ酸を組み込む直接的な方法である。ペプチド断片の酵素的連結及び天然の化学的連結の最近の発展につれ、より大きなタンパク質を調製することが可能になった。例えば、Ｐ．Ｅ．  Ｄａｗｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓ．Ｂ．Ｈ．  Ｋｅｎｔ，  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ６９：９２３（２０００）を参照されたい。化学ペプチド連結及び天然の化学的連結は、米国特許第６，１８４，３４４号、米国特許公開第２００４／０１３８４１２号、米国特許公開第２００３／０２０８０４６号、国際公開第０２／０９８９０２号及び同０３／０４２２３５号に記載されている。これらを参照によりその全体を組みこむ。所望の非天然アミノ酸を用いて化学的にアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを、タンパク質生合成を支援することができるインビトロ抽出物に添加する一般のインビトロ生合成方法は、実質的にあらゆるサイズの種々のタンパク質に１００個を超える非天然アミノ酸を部位特異的に組み込むために使用されてきた。例えば、Ｖ．Ｗ．  Ｃｏｒｎｉｓｈ，  Ｄ．  Ｍｅｎｄｅｌ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．  Ｓｃｈｕｌｔｚ，  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．，  １９９５，  ３４：６２１−６３３（１９９５）；Ｃ．Ｊ．  Ｎｏｒｅｎ，  Ｓ．Ｊ．  Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，  Ｍ．Ｃ．  Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，  Ｐ．Ｇ．  Ｓｃｈｕｌｔｚ，  Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１８２−１８８（１９８９）及びＪ．Ｄ．  Ｂａｉｎ，  Ｃ．Ｇ．  Ｇｌａｂｅ，  Ｔ．Ａ．  Ｄｉｘ，  Ａ．Ｒ．  Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ，  Ｅ．Ｓ．  Ｄｉａｌａ，  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｉｎｔｏ  ａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １１１  ８０１３−８０１４（１９８９）を参照されたい。多様な官能基が、タンパク質安定性、タンパク質折り畳み、酵素機序及びシグナル伝達の研究のためにタンパク質に導入された。
【０４９９】
選択圧組み込み（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と称するインビボでの方法は、野生型シンセターゼの無差別な混合を利用するために開発された。例えば、Ｎ．  Ｂｕｄｉｓａ，  Ｃ．  Ｍｉｎｋｓ，  Ｓ．  Ａｌｅｆｅｌｄｅｒ，  Ｗ．  Ｗｅｎｇｅｒ，  Ｆ．Ｍ．  Ｄｏｎｇ，  Ｌ．Ｍｏｒｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｒ．Ｈｕｂｅｒ，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，  １３：４１−５１（１９９９）を参照されたい。栄養要求性系統は、特定の天然アミノ酸を細胞に供給する関連代謝経路が切断されており、限られた濃度の天然アミノ酸を含む最少培地中で、標的遺伝子の転写が抑制されながら、増殖する。定常増殖相の開始時には、天然アミノ酸は使い果たされ、非天然アミノ酸アナログに取って代わられる。組換えタンパク質の発現を誘導すると、非天然アナログを含むタンパク質が蓄積する。例えば、この戦略を用いて、ｏ、ｍ及びｐ−フルオロフェニルアラニンがタンパク質に組み込まれ、ＵＶスペクトルにおいて容易に確認することができる２つの特徴的なショルダーを示す。例えば、Ｃ．  Ｍｉｎｋｓ，  Ｒ．  Ｈｕｂｅｒ，  Ｌ．  Ｍｏｒｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｎ．  Ｂｕｄｉｓａ，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２８４：２９−３４（２０００）を参照されたい。トリフルオロメチオニンは、キトオリゴ糖リガンドとのその相互作用を１９Ｆ  ＮＭＲによって研究するために、バクテリオファージＴ４リゾチーム中のメチオニンを置換するのに使用された。例えば、Ｈ．  Ｄｕｅｗｅｌ，  Ｅ．  Ｄａｕｂ，  Ｖ．  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｆ．  Ｈｏｎｅｋ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３６：３４０４−３４１６（１９９７）を参照されたい。トリフルオロロイシンはロイシンの代わりに組み込まれ、ロイシン−ジッパータンパク質の熱的及び化学的安定性が増大した。例えば、Ｙ．  Ｔａｎｇ，  Ｇ．  Ｇｈｉｒｌａｎｄａ，  Ｗ．Ａ．  Ｐｅｔｋａ，  Ｔ．  Ｎａｋａｊｉｍａ，  Ｗ．Ｆ．  ＤｅＧｒａｄｏ  ａｎｄ  Ｄ．Ａ．  Ｔｉｒｒｅｌｌ，  Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  Ｅｎｇｌ．，  ４０（８）：１４９４−１４９６（２００１）を参照されたい。さらに、セレノメチオニン及びテルロメチオニンは、種々の組換えタンパク質に組み込まれ、Ｘ線結晶学において各相の溶解を促進する。例えば、Ｗ．Ａ．  Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ，  Ｊ．Ｒ．  Ｈｏｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．  Ｌｅｍａｓｔｅｒ，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ９（５）：１６６５−１６７２（１９９０）；Ｊ．Ｏ．  Ｂｏｌｅｓ，  Ｋ．  Ｌｅｗｉｎｓｋｉ，  Ｍ．  Ｋｕｎｋｌｅ，  Ｊ．Ｄ．  Ｏｄｏｍ，  Ｂ．  Ｄｕｎｌａｐ，  Ｌ．  Ｌｅｂｉｏｄａ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｈａｔａｄａ，  Ｎａｔ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．，  １：２８３−２８４（１９９４）；Ｎ．  Ｂｕｄｉｓａ，  Ｂ．  Ｓｔｅｉｐｅ，  Ｐ．  Ｄｅｍａｎｇｅ，  Ｃ．  Ｅｃｋｅｒｓｋｏｒｎ，  Ｊ．  Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｈｕｂｅｒ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２３０：７８８−７９６（１９９５）及びＮ．  Ｂｕｄｉｓａ，  Ｗ．  Ｋａｒｎｂｒｏｃｋ，  Ｓ．  Ｓｔｅｉｎｂａｃｈｅｒ，  Ａ．  Ｈｕｍｍ，  Ｌ．  Ｐｒａｄｅ，  Ｔ．  Ｎｅｕｅｆｅｉｎｄ，  Ｌ．  Ｍｏｒｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｈｕｂｅｒ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２７０：６１６−６２３（１９９７）を参照されたい。アルケン又はアルキン官能基を有するメチオニンアナログも効率的に組み込まれ、化学的手段によってタンパク質をさらに修飾することができた。例えば、参照によりその全体を本明細書に組みこむ、Ｊ．Ｃ．Ｍ．  ｖａｎＨｅｓｔ  ａｎｄ  Ｄ．Ａ．  Ｔｉｒｒｅｌｌ，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  ４２８：６８−７０（１９９８）；Ｊ．Ｃ．Ｍ．  ｖａｎ  Ｈｅｓｔ，  Ｋ．Ｌ．  Ｋｉｉｃｋ  ａｎｄ  Ｄ．Ａ．  Ｔｉｒｒｅｌｌ，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １２２：１２８２−１２８８（２０００）及びＫ．Ｌ．  Ｋｉｉｃｋ  ａｎｄ  Ｄ．Ａ．  Ｔｉｒｒｅｌｌ，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，  ５６：９４８７−９４９３（２０００）；米国特許第６，５８６，２０７号；米国特許公開第２００２／００４２０９７号を参照されたい。
【０５００】
この方法の成否は、非天然アミノ酸アナログが、タンパク質翻訳の忠実度を保証するために高い選択性を一般に必要とするアミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼによって認識されるかどうかにかかっている。この方法の範囲を拡大する１つの方法は、アミノアシル−ｔＲＮＡシンセターゼの基質特異性を緩和することであり、これは限られた数の例においてしか達成されていない。単なる例として、エシェリキア  コリのフェニルアラニル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＰｈｅＲＳ）中のＡｌａ２９４をＧｌｙで置換すると、基質結合ポケットのサイズが増大し、ｔＲＮＡＰｈｅがｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン（ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ）によってアシル化される。Ｍ．  Ｉｂｂａ，  Ｐ．  Ｋａｓｔ  ａｎｄ  Ｈ．  Ｈｅｎｎｅｃｋｅ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３３：７１０７−７１１２（１９９４）を参照されたい。この変異ＰｈｅＲＳを含むエシェリキア  コリ系統は、フェニルアラニンの代わりにｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン又はｐ−Ｂｒ−フェニルアラニンを組み込むことができる。例えば、Ｍ．  Ｉｂｂａ  ａｎｄ  Ｈ．  Ｈｅｎｎｅｃｋｅ，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  ３６４：２７２−２７５（１９９５）及びＮ．  Ｓｈａｒｍａ，  Ｒ．  Ｆｕｒｔｅｒ，  Ｐ．  Ｋａｓｔ  ａｎｄ  Ｄ．Ａ．  Ｔｉｒｒｅｌｌ，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，  ４６７：３７−４０（２０００）を参照されたい。同様に、エシェリキア  コリのチロシル−ｔＲＮＡシンセターゼのアミノ酸結合部位近くの点変異Ｐｈｅ１３０Ｓｅｒによって、アザチロシンをチロシンよりも効率的に組み込むことができることが判明した。Ｆ．  Ｈａｍａｎｏ−Ｔａｋａｋｕ，  Ｔ．  Ｉｗａｍａ，  Ｓ．  Ｓａｉｔｏ−Ｙａｎｏ，  Ｋ．  Ｔａｋａｋｕ，  Ｙ．  Ｍｏｎｄｅｎ，  Ｍ．  Ｋｉｔａｂａｔａｋｅ，  Ｄ．  Ｓｏｌｌ  ａｎｄ  Ｓ．  Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７５（５１）：４０３２４−４０３２８（２０００）を参照されたい。
【０５０１】
非天然アミノ酸をタンパク質にインビボで組み込む別の戦略は、校正機序を有するシンセターゼを改変することである。このシンセターゼは識別することができず、したがって同族天然アミノ酸に構造的に類似したアミノ酸を活性化する。この誤りは離れた部位において修正され、誤って付加したアミノ酸をｔＲＮＡから脱アシル化して、タンパク質翻訳の忠実度を維持する。シンセターゼの校正作用が働かない場合には、誤って活性化された構造アナログは編集機能を逃れ、組み込まれることがある。この手法は、バリル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＶａｌＲＳ）を用いて最近実証された。Ｖ．  Ｄｏｒｉｎｇ，  Ｈ．Ｄ．  Ｍｏｏｔｚ，  Ｌ．Ａ．  Ｎａｎｇｌｅ，  Ｔ．Ｌ．  Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ，  Ｖ．ｄｅ  Ｃｒｅｃｙ−Ｌａｇａｒｄ，  Ｐ．  Ｓｃｈｉｍｍｅｌ  ａｎｄ  Ｐ．  Ｍａｒｌｉｅｒｅ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２９２：５０１−５０４（２００１）を参照されたい。ＶａｌＲＳは、ｔＲＮＡＶａｌをＣｙｓ、Ｔｈｒ又はアミノ酪酸塩（Ａｂｕ）で誤ってアミノアシル化し得る。これらの非同族アミノ酸は、続いて編集ドメインによって加水分解される。エシェリキア  コリ染色体の無作為変異誘発後、ＶａｌＲＳの編集部位中に変異を有する変異エシェリキア  コリ系統が選択された。この編集に欠陥のあるＶａｌＲＳによって、ｔＲＮＡＶａｌにＣｙｓが不正確に付加する。ＡｂｕはＣｙｓに立体的に類似しているので（Ｃｙｓの−ＳＨ基は、Ａｂｕでは−ＣＨ３で置換される。）、変異ＶａｌＲＳは、この変異エシェリキア  コリ系統がＡｂｕの存在下で増殖すると、Ａｂｕもタンパク質に組み込む。質量分析によれば、バリンの約２４％は、未変性タンパク質中の各バリン位置においてＡｂｕで置換されている。
【０５０２】
固相合成及び半合成方法によっても、新規アミノ酸を含む幾つかのタンパク質の合成が可能になる。例えば、以下の刊行物及びその引用文献を参照されたい：Ｃｒｉｃｋ，  Ｆ．Ｊ．Ｃ．，  Ｂａｒｒｅｔｔ，  Ｌ．  Ｂｒｅｎｎｅｒ，  Ｓ．  Ｗａｔｔｓ−Ｔｏｂｉｎ，  Ｒ．  Ｇｅｎｅｒａｌ  ｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．  Ｎａｔｕｒｅ，  １９２：１２２７−１２３２（１９６１）；Ｈｏｆｍａｎｎ，  Ｋ．，  Ｂｏｈｎ，  Ｈ．  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ．  ＸＸＸＶＩ．  Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｙｒａｚｏｌｅ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｓ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ａｎ  Ｓ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ，  Ｊ．  Ａｍ  Ｃｈｅｍ，  ８８（２４）：５９１４−５９１９（１９６６）；Ｋａｉｓｅｒ，  Ｅ．Ｔ．  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｅｎｙｚｍｅｓ，  Ａｃｃ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ，  ２２（２）：４７−５４（１９８９）；Ｎａｋａｔｓｕｋａ，  Ｔ．，  Ｓａｓａｋｉ，  Ｔ．，  Ｋａｉｓｅｒ，  Ｅ．Ｔ．  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ  ｔｈｉｏｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ，  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，  １０９，  ３８０８−３８１０（１９８７）；Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，  Ｍ．，  Ｋｅｎｔ，  Ｓ  Ｂ  Ｈ．  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｄｏｖｅｔａｉｌｉｎｇ  ｕｎｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：  ｂａｃｋｂｏｎｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＨＩＶ  ｐｒｏｔｅａｓｅ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５６：２２１−２２５（１９９２）；Ｃｈａｉｋｅｎ，  Ｉ．Ｍ．  Ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  ２５５−３０１（１９８１）；Ｏｆｆｏｒｄ，  Ｒ．Ｅ．  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｙ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅａｎｓ？  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，  １（３）：１５１−１５７（１９８７）及びＪａｃｋｓｏｎ，  Ｄ．Ｙ．，  Ｂｕｒｎｉｅｒ，  Ｊ．，  Ｑｕａｎ，  Ｃ．，  Ｓｔａｎｌｅｙ，  Ｍ．，  Ｔｏｍ，  Ｊ．，  Ｗｅｌｌｓ，  Ｊ．Ａ．  Ａ  Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｓｅ  ｆｏｒ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ａ  ｗｉｔｈ  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２６６：２４３−２４７（１９９４）。
【０５０３】
化学修飾は、補因子、スピン標識及びオリゴヌクレオチドを含めて種々の天然側鎖をタンパク質にインビトロで導入するのに使用されてきた。例えば、Ｃｏｒｅｙ，  Ｄ．Ｒ．，  Ｓｃｈｕｌｔｚ，  Ｐ．Ｇ．  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｙｂｒｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３８：１４０１−１４０３（１９８７）；Ｋａｉｓｅｒ，  Ｅ．Ｔ．，  Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｄ．Ｓ．，  Ｒｏｋｉｔａ，  Ｓ．Ｅ．  Ｔｈｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  ５４：５６５−５９５（１９８５）；Ｋａｉｓｅｒ，  Ｅ．Ｔ．，  Ｌａｗｒｅｎｃｅ，  Ｄ．Ｓ．  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｙｚｍｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅｓ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２６：５０５−５１１（１９８４）；Ｎｅｅｔ，  Ｋ．Ｅ．，  Ｎａｎｃｉ  Ａ，  Ｋｏｓｈｌａｎｄ，  Ｄ．Ｅ．  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｉｏｌ−ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ，  Ｊ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ，  ２４３（２４）：６３９２−６４０１（１９６８）；Ｐｏｌｇａｒ，  Ｌ．Ｂ．，  Ｍ．Ｌ．  Ａ  ｎｅｗ  ｅｎｚｙｍｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃａｌｌｙ  ｆｏｒｍｅｄ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ．  Ｔｈｉｏｌ−ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ．  Ｊ．  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，  ８８（１３）３１５３−３１５４（１９６６）及びＰｏｌｌａｃｋ，  Ｓ．Ｊ．，  Ｎａｋａｙａｍａ，  Ｇ．  Ｓｃｈｕｌｔｚ，  Ｐ．Ｇ．  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅｓ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎｔｏ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １（２４２）：１０３８−１０４０（１９８８）を参照されたい。
【０５０４】
或いは、化学修飾アミノアシル−ｔＲＮＡを用いる生合成方法は、インビトロで合成されたタンパク質に幾つかの生物物理学的プローブを組み込むのに使用されてきた。以下の刊行物及びその引用文献を参照されたい：Ｂｒｕｎｎｅｒ，  Ｊ．  Ｎｅｗ  Ｐｈｏｔｏｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，  ４８３−５１４（１９９３）及びＫｒｉｅｇ，  Ｕ．Ｃ．，  Ｗａｌｔｅｒ，  Ｐ．，  Ｈｏｈｎｓｏｎ，  Ａ．Ｅ．  Ｐｈｏｔｏｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｎａｓｃｅｎｔ  ｐｒｅｐｒｏｌａｃｔｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ５４−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ，  ８３：８６０４−８６０８（１９８６）。
【０５０５】
化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを、所望のアンバーナンセンス変異を含む遺伝子でプログラムされたタンパク質合成反応に追加することによって、非天然アミノ酸をタンパク質にインビトロで部位特異的に組み込むことができることが以前に判明している。これらの手法を用いると、特定のアミノ酸に対して栄養要求性である系統を用いて、一般的な２０種類のアミノ酸の幾つかを構造的に近い相同体で、例えばフェニルアラニンをフルオロフェニルアラニンで、置換することができる。例えば、Ｎｏｒｅｎ，  Ｃ．Ｊ．，  Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，  Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，  Ｍ．Ｃ．，  Ｓｃｈｕｌｔｚ，  Ｐ．Ｇ．  Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４４：１８２−１８８（１９８９）；Ｍ．Ｗ．  Ｎｏｗａｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：４３９−４２（１９９５）；Ｂａｉｎ，  Ｊ．Ｄ．，  Ｇｌａｂｅ，  Ｃ．Ｇ．，  Ｄｉｘ，  Ｔ．Ａ．，  Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ，  Ａ．Ｒ．，  Ｄｉａｌａ，  Ｅ．Ｓ．  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｉｎｔｏ  ａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，  Ｊ．  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，  １１１：８０１３−８０１４（１９８９）；Ｎ．  Ｂｕｄｉｓａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  １３：４１−５１（１９９９）；Ｅｌｌｍａｎ，  Ｊ．Ａ．，  Ｍｅｎｄｅｌ，  Ｄ．，  Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，  Ｓ．，  Ｎｏｒｅｎ，  Ｃ．Ｊ．，  Ｓｃｈｕｌｔｚ，  Ｐ．Ｇ．  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚ．，  ２０２，  ３０１−３３６（１９９２）及びＭｅｎｄｅｌ，  Ｄ．，  Ｃｏｒｎｉｓｈ，  Ｖ．Ｗ．＆Ｓｃｈｕｌｔｚ，  Ｐ．Ｇ．  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ．  ２４，  ４３５−６２（１９９５）を参照されたい。
【０５０６】
例えば、終止コドンＵＡＧを認識し、非天然アミノ酸で化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡが調製された。従来の部位特異的変異誘発は、タンパク質遺伝子中の目的部位に終止コドンＴＡＧを導入するのに使用された。例えば、Ｓａｙｅｒｓ，  Ｊ．Ｒ．，  Ｓｃｈｍｉｄｔ，  Ｗ．  Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，  Ｆ．  ５’，３’  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｎｏｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｓｉｓ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，  １６（３）：７９１−８０２（１９８８）を参照されたい。アシル化サプレッサーｔＲＮＡと変異体遺伝子をインビトロ転写／翻訳系において組み合わせると、非天然アミノ酸が、該アミノ酸を指定位置に含むタンパク質を与えるＵＡＧコドンに応じて、組み込まれた。［３Ｈ］−Ｐｈｅを用いた実験及びα−ヒドロキシ酸を用いた実験によれば、所望のアミノ酸のみが、ＵＡＧコドンによって指定された位置に組み込まれ、タンパク質中の他の部位には組み込まれないことが判明した。例えば、Ｎｏｒｅｎ，ｅｔ  ａｌ，  同上；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０（６）：４２５−４３２及びＥｌｌｍａｎ，  Ｊ．Ａ．，  Ｍｅｎｄｅｌ，Ｄ．，  Ｓｃｈｕｌｔｚ，  Ｐ．Ｇ．  Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５５：１９７−２００（１９９２）を参照されたい。
【０５０７】
非天然アミノ酸をタンパク質に組み込むのに微量注入技術も使用された。例えば、Ｍ．Ｗ．  Ｎｏｗａｋ，  Ｐ．Ｃ．  Ｋｅａｒｎｅｙ，  Ｊ．Ｒ．  Ｓａｍｐｓｏｎ，  Ｍ．Ｅ．  Ｓａｋｓ，  Ｃ．Ｇ．  Ｌａｂａｒｃａ，  Ｓ．Ｋ．  Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，  Ｗ．Ｇ．  Ｚｈｏｎｇ，  Ｊ．  Ｔｈｏｒｓｏｎ，  Ｊ．Ｎ．  Ａｂｅｌｓｏｎ，  Ｎ．  Ｄａｖｉｄｓｏｎ，  Ｐ．Ｇ．  Ｓｃｈｕｌｔｚ，  Ｄ．Ａ．  Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ  ａｎｄ  Ｈ．Ａ．  Ｌｅｓｔｅｒ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２６８：４３９−４４２（１９９５）及びＤ．Ａ．  Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．，  ４：６４５（２０００）を参照されたい。アフリカツメガエル卵母細胞に、インビトロで調製された２つのＲＮＡ種、すなわち、標的タンパク質をコードし、目的アミノ酸位置にＵＡＧ終止コドンを有するｍＲＮＡと、所望の非天然アミノ酸でアミノアシル化されたアンバーサプレッサーｔＲＮＡとが同時に注射された。次いで、卵母細胞の翻訳機構によって、ＵＡＧによって指定された位置に非天然アミノ酸が挿入される。この方法によって、インビトロ発現系には一般に適していない内在性膜タンパク質のインビボでの構造−機能研究が可能になった。例としては、蛍光共鳴エネルギー伝達によって距離を測定するための、タキキニン  ニューロキニン−２受容体への蛍光アミノ酸の組み込み（例えば、Ｇ．  Ｔｕｒｃａｔｔｉ，  Ｋ．  Ｎｅｍｅｔｈ，  Ｍ．Ｄ．  Ｅｄｇｅｒｔｏｎ，  Ｕ．  Ｍｅｓｅｔｈ，  Ｆ．  Ｔａｌａｂｏｔ，  Ｍ．  Ｐｅｉｔｓｃｈ，  Ｊ．  Ｋｎｏｗｌｅｓ，  Ｈ．  Ｖｏｇｅｌ  ａｎｄ  Ａ．  Ｃｈｏｌｌｅｔ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７１（３３）：１９９９１−１９９９８（１９９６）を参照されたい。）、イオンチャネル中の表面露出残基を特定するためのビオチン化アミノ酸の組み込み（例えば、Ｊ．Ｐ．  Ｇａｌｌｉｖａｎ，  Ｈ．Ａ．  Ｌｅｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｄ．Ａ．  Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．，  ４（１０）：７３９−７４９（１９９７）を参照されたい。）、イオンチャネル中の高次構造変化を実時間でモニターするためのケージ化チロシンアナログの使用（例えば、Ｊ．Ｃ．  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｓ．Ｋ．  Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，  Ｐ．Ｍ．  Ｅｎｇｌａｎｄ，  Ｄ．Ａ．  Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ  ａｎｄ  Ｈ．Ａ．  Ｌｅｓｔｅｒ，  Ｎｅｕｒｏｎ，  ２０：６１９−６２４（１９９８）を参照されたい。）、及びイオンチャネル骨格のゲート開閉機序を探索するためにイオンチャネル骨格を変化させるアルファヒドロキシアミノ酸の使用（例えば、Ｐ．Ｍ．  Ｅｎｇｌａｎｄ，  Ｙ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｄ．Ａ．  Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ  ａｎｄ  Ｈ．Ａ．  Ｌｅｓｔｅｒ，  Ｃｅｌｌ，  ９６：８９−９８（１９９９）及びＴ．  Ｌｕ，  Ａ．Ｙ．  Ｔｉｎｇ，  Ｊ．  Ｍａｉｎｌａｎｄ，  Ｌ．Ｙ．  Ｊａｎ，  Ｐ．Ｇ．  Ｓｃｈｕｌｔｚ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｙａｎｇ，  Ｎａｔ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ４（３）：２３９−２４６（２００１）を参照されたい。）が挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０５０８】
非天然アミノ酸をタンパク質にインビボで直接組み込むことができることによって、変異タンパク質の高収率、技術的容易さ、細胞中又はことによると生物中の変異タンパク質を研究する潜在的可能性及び治療処置におけるこれらの変異タンパク質の使用の利点がもたらされる。多様なサイズ、酸性度、求核性、疎水性及び他の諸特性を有する非天然アミノ酸をタンパク質に含ませることができることによって、タンパク質機能の探索と新規特性を有する新しいタンパク質又は生物の創造との両方のために、タンパク質構造を合理的かつ系統的に操作する本発明者らの能力を大いに拡張することができる。
【０５０９】
ｐａｒａ−Ｆ−Ｐｈｅを部位特異的に組み込もうとする際には、酵母アンバーサプレッサーｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡ／フェニルアラニル−ｔＲＮＡシンセターゼペアが、ｐ−Ｆ−Ｐｈｅ抵抗性、Ｐｈｅ栄養要求性エシェリキア  コリ系統において使用された。例えば、Ｒ．  Ｆｕｒｔｅｒ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，  ７：４１９−４２６（１９９８）を参照されたい。
【０５１０】
所望のポリヌクレオチドを無細胞（インビトロ）翻訳系によって発現させることもできる。これらの系においては、テンプレートとしてｍＲＮＡ（インビトロ翻訳）又はＤＮＡ（インビトロ転写と翻訳の組み合わせ）を含むことができ、インビトロ合成はリボソームによって誘導される。無細胞タンパク質発現系の開発にはかなりの努力が払われてきた。例えば、参照によりその全体を組みこむＫｉｍ，  Ｄ．−Ｍ．  ａｎｄ  Ｊ．Ｒ．  Ｓｗａｒｔｚ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ７４（４）：３０９−３１６（２００１）；  Ｋｉｍ，  Ｄ．−Ｍ．  ａｎｄ  Ｊ．Ｒ．  Ｓｗａｒｔｚ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ２２，  １５３７−１５４２，（２０００）；  Ｋｉｍ，  Ｄ．−Ｍ．，  ａｎｄ  Ｊ．Ｒ．  Ｓｗａｒｔｚ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，  １６，  ３８５−３９０，（２０００）；  Ｋｉｍ，  Ｄ．−Ｍ．，  ａｎｄ  Ｊ．Ｒ．  Ｓｗａｒｔｚ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  ６６（３）：１８０−１８８，（１９９９）及びＰａｔｎａｉｋ，  Ｒ．  ａｎｄ  Ｊ．Ｒ．  Ｓｗａｒｔｚ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４（５）：８６２−８６８，（１９９８）；米国特許第６，３３７，１９１号；米国特許公開第２００２／００８１６６０号；国際公開第００／５５３５３号；同９０／０５７８５号を参照されたい。非天然アミノ酸を含むポリペプチドの発現に適用することができる別の手法としては、ｍＲＮＡ−ペプチド融合技術などが挙げられるが、これだけに限定されない。例えば、Ｒ．  Ｒｏｂｅｒｔｓ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｓｚｏｓｔａｋ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９４  １２２９７−１２３０２（１９９７）；Ａ．  Ｆｒａｎｋｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０，  １０４３−１０５０（２００３）を参照されたい。この手法では、ピューロマイシンに連結されたｍＲＮＡテンプレートがリボソーム上でペプチドに翻訳される。１個以上のｔＲＮＡ分子が改変された場合には、非天然アミノ酸も同様にそのペプチドに組み込むことができる。最終ｍＲＮＡコドンが読まれた後に、ピューロマイシンは、ペプチドのＣ末端を捕捉する。生成したｍＲＮＡ−ペプチド複合体がインビトロアッセイにおいて興味深い諸特性を有することが見出された場合には、その性質（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）をｍＲＮＡ配列から容易に明らかにすることができる。このようにして、１個以上の非天然アミノ酸を含むポリペプチドのライブラリーをスクリーニングして、所望の特性を有するポリペプチドを特定することができる。より最近では、非天然アミノ酸で置換されたペプチドの合成を可能にする精製成分を用いたインビトロでのリボソーム翻訳が報告された。例えば、Ａ．  Ｆｏｒｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１００（１１）：６３５３−６３５７（２００３）を参照されたい。
【０５１１】
Ｘ．  ポリペプチドの非天然アミノ酸成分の翻訳後修飾
便宜上、本セクション（ＸＡからＸＪ）に記載するポリペプチドの非天然アミノ酸成分の翻訳後修飾を、一般的に、及び／又は具体例によって、記述した。しかし、本セクションに記載のポリペプチドの非天然アミノ酸成分の翻訳後修飾を、本セクションの一般的記述又は具体例だけに限定すべきではない。そうではなく、本セクションに記載のポリペプチドの非天然アミノ酸成分の翻訳後修飾は、本発明の明細書、特許請求の範囲及び図に記載した式Ｉ−ＸＶＩＩＩ、ＸＸＸ−ＸＸＸＩＶ（Ａ＆Ｂ）及びＸＸＸＸ−ＸＸＸＸＩＩＩの範囲内にあるあらゆる下位式又は特定の化合物を含めて、式Ｉ−ＸＶＩＩＩ、ＸＸＸ−ＸＸＸＩＶ（Ａ＆Ｂ）及びＸＸＸＸ−ＸＸＸＸＩＩＩの範囲内にある全ての化合物に等しく申し分なく適用される。
【０５１２】
タンパク質のインビボ翻訳中に非天然アミノ酸を部位特異的に組み込む方法、組成物、技術及び戦略を開発した。この技術は、天然アミノ酸の側鎖の化学的性質と直交する側鎖の化学的性質を有する非天然アミノ酸を組み込むことによって、組換えタンパク質の部位特異的な誘導体化を可能にする。その結果、本明細書の方法、組成物、技術及び戦略の主要な利点は、誘導体化されたタンパク質を規定の均一な生成物として今回調製することができる点にある。しかし、本明細書の方法、組成物、反応混合物、技術及び戦略は、インビボでのタンパク質翻訳技術によって形成された非天然アミノ酸ポリペプチドに限定されず、単なる例として、発現されたタンパク質の連結、化学合成、リボザイムに基づく技術を含めて、任意の技術によって形成された非天然アミノ酸ポリペプチドを含む（例えば、本明細書のセクション「代替系における発現」を参照されたい。）。
【０５１３】
非天然アミノ酸を組換えタンパク質に組み込むことができることによって、翻訳後の誘導体化のために実施することができる化学反応が拡大する。ここで、かかる誘導体化は、インビボでも、インビトロでも起こる。より具体的には、ポリペプチドの非天然アミノ酸部分にオキシムリンケージを形成するタンパク質誘導体化は、幾つかの利点をもたらす。第１に、天然アミノ酸は、一般に、オキシムリンケージを形成せず、したがってオキシムリンケージを形成するように設計された試薬は、ポリペプチドの非天然アミノ酸成分と部位特異的に反応し（非天然アミノ酸と対応する試薬とがオキシムリンケージを形成するように設計されていることを前提とすることは言うまでもない。）、したがってタンパク質を部位選択的に誘導体化する能力によって、従来技術を用いて産生された誘導体化タンパク質の混合物とは対照的に、単一の均一な生成物が得られる。第２に、オキシム付加体は生物学的条件下で安定であり、オキシム交換によって誘導体化されたタンパク質が治療への応用に有効な候補であることが示唆される。第３に、生成したオキシムリンケージの安定性は、オキシムリンケージが形成された非天然アミノ酸の特性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）（すなわち、官能基及び／又は構造）に基づいて操作することができる。すなわち、実施例１６に示すように、非天然アミノ酸とのオキシムリンケージのｐＨ安定性は、１時間未満から１週間をかなり超えるまで変わり得る。したがって、一部の実施形態においては、非天然アミノ酸ポリペプチドとのオキシムリンケージは、分解半減期が１時間未満であり、他の実施形態においては１日未満、他の実施形態においては２日未満、他の実施形態においては１週間未満であり、他の実施形態においては１週間を超える。さらに他の実施形態においては、生成したオキシムは、弱酸性条件下で少なくとも２週間安定であり、他の実施形態においては、生成したオキシムは、弱酸性条件下で少なくとも５日間安定である。他の実施形態においては、非天然アミノ酸ポリペプチドはｐＨ約２から約８で、他の実施形態においてはｐＨ約２から約６で、他の実施形態においてはｐＨ約２から約４で、少なくとも１日安定である。他の実施形態においては、本明細書に記載の戦略、方法、組成物及び技術を用いて、当業者は、当業者の要求（例えば、徐放性などの治療用、診断用、工業用又は軍事用）に応じて調節された分解半減期を有する、非天然アミノ酸ポリペプチドとのオキシムリンケージを合成することができる。
【０５１４】
上記非天然アミノ酸ポリペプチドは、新規の治療学、診断学、触媒酵素、産業用酵素、（抗体及び抗体断片を含めて、但しこれだけに限定されない）結合タンパク質並びにタンパク質構造及び機能の研究を含めて、但しこれだけに限定されないものを含めて、但しこれらだけに限定されないものに有用である。例えば、Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，  （２０００）  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｓ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ４：６４５−６５２を参照されたい。上記非天然アミノ酸ポリペプチドの他の用途としては、単なる例として、アッセイ、美容、植物生物学、環境、エネルギー生成及び／又は軍事の用途が挙げられる。しかし、上記非天然アミノ酸ポリペプチドは、ポリペプチドの治療有効性の操作、ポリペプチドの安全性プロファイルの改良、ポリペプチドの薬物動態学、薬理学及び／又は薬力学の調節（例えば、水溶性の増大、生物学的利用能、血清半減期の延長、治療上の半減期の延長、免疫原性の調節、生物活性の調節又は循環時間の延長）、ポリペプチドへの追加の官能性の付与、ポリペプチドへのタグ、標識又は検出可能シグナルの組み込み、ポリペプチドの単離特性の容易化並びに上記改変の任意の組み合わせを含めて、新しい官能基又は改変された官能基を組み入れるようにさらに修飾することができる。
【０５１５】
ある実施形態においては、オキシム含有非天然アミノ酸、カルボニル含有非天然アミノ酸及びヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸からなる群から選択される少なくとも１個の非天然アミノ酸を含む相同の生合成非天然アミノ酸ポリペプチドを利用することを含む、ポリペプチドの単離特性を容易にする方法である。他の実施形態においては、かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載のポリペプチドに生合成的に組み込まれている。さらなる又は代替の実施形態においては、かかる非天然アミノ酸ポリペプチドは、式Ｉ−ＸＶＩＩＩ、ＸＸＸ−ＸＸＸＩＶ（Ａ＆Ｂ）又はＸＸＸＸ−ＸＸＸＸＩＩＩのアミノ酸から選択される少なくとも１個の非天然アミノ酸を含む。
【０５１６】
本明細書の方法、組成物、戦略及び技術は、ポリペプチドの特定のタイプ、クラス又はファミリーに限定されない。実際、実質的にあらゆるポリペプチドが、本明細書に記載の少なくとも１個の非天然アミノ酸を含むことができる。単なる例として、ポリペプチドは、アルファ−１抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学走化性タンパク質−１、単球化学走化性タンパク質−２、単球化学走化性タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１アルファ、単球炎症性タンパク質−１ベータ、ＲＡＮＴＥＳ、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン、上皮性好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮性好中球活性化ペプチド、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、剥脱性毒素、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、４本ヘリックスバンドルタンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、性腺刺激ホルモン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１受容体、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールツリン、好中球抑制因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン、Ａタンパク質、Ｇタンパク質、ｐｔｈ、発熱性外毒素Ａ、発熱性外毒素Ｂ、発熱性外毒素Ｃ、ｐｙｙ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、小さな生合成タンパク質、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群毒素、チモシンアルファ１、組織���ラスミノゲンアクチベーター、腫よう成長因子（ＴＧＦ）、腫よう壊死因子、腫よう壊死因子アルファ、腫よう壊死因子ベータ、腫よう壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４タンパク質、ＶＣＡＭ−１タンパク質、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体及びコルチコステロンからなる群から選択される治療用タンパク質と相同であり得る。非天然アミノ酸ポリペプチドは、成長ホルモンスーパー遺伝子ファミリーの任意のポリペプチドメンバーとも相同であり得る。
【０５１７】
かかる改変としては、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコール誘導体；光架橋剤；細胞傷害性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質又はポリペプチド又はポリペプチドアナログ；抗体又は抗体断片；金属キレート剤；補因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；糖類、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；フルオロフォア、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的又は非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；化学線放射によって励起可能な部分；リガンド；光異性化可能部分；ビオチン；ビオチンアナログ；重原子を組み入れた部分；化学開裂可能な基；光開裂可能な基；長い側鎖；炭素連結糖；レドックス活性薬剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識部分；生物物理学的プローブ；リン光基；化学発光基；高電子密度基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能標識；小分子；抑制性リボ核酸、放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチン誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；アブザイム、活性錯体活性化物質、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルガン、アンギオスタチン、抗ホルモン、抗酸化剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、巨大分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル及びこれらの任意の組み合わせを含めて、但しこれらだけに限定されない、ポリペプチドの非天然アミノ酸成分上へのさらなる官能基の組み込みなどが挙げられる。
【０５１８】
さらに、非天然アミノ酸ポリペプチドは、単なる例として、カルボニル、ジカルボニル、ヒドロキシルアミンなど、他の官能基に転化し得る部分を含み得る。図６３Ａは、カルボニル含有又はジカルボニル含有非天然アミノ酸ポリペプチドへの非天然アミノ酸ポリペプチドの化学転化を示す。図６３Ｂは、ヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドへの非天然アミノ酸ポリペプチドの化学転化を示す。生成したカルボニル含有又はジカルボニル含有非天然アミノ酸ポリペプチド及びヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、特徴付け、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又は組み入れることができる。単なる例として、カルボニル、ジカルボニル、ヒドロキシルアミンなどの他の官能基への化学部分の化学転化は、例えば、（参照によりその全体を組みこむ）Ｍａｒｃｈ，  ＡＤＶＡＮＣＥＤ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ５ｔｈ  Ｅｄ．，（Ｗｉｌｅｙ  ２００１）及びＣａｒｅｙ  ａｎｄ  Ｓｕｎｄｂｅｒｇ，  ＡＤＶＡＮＣＥＤ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ４ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｖｏｌｓ．  Ａ  ａｎｄ  Ｂ（Ｐｌｅｎｕｍ  ２０００，  ２００１）に記載のものなど、当業者に公知の技術及び材料を用いて実施することができる。
【０５１９】
したがって、単なる例として、以下のアミノ酸のいずれか１個を含む非天然アミノ酸ポリペプチドは、本明細書の方法及び組成物によってさらに修飾することができる。
（ａ）
【０５２０】
【化１１２】
0005425398.tif 000054
式中、
Ａは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換アルカリーレン、アラルキレン又は置換アラルキレンであり、
Ｂは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり、
Ｊは、
【０５２１】
【化１１３】
0005425398.tif 000055
であり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり、
各Ｒ”は独立にＨ、アルキル、置換アルキル若しくは保護基であり、又は１個を超えるＲ”基が存在するときには、２個のＲ”はヘテロシクロアルキルを形成していてもよく、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂であり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂であり、
Ｒ３及びＲ４の各々は独立にＨ、ハロゲン、低級アルキル若しくは置換低級アルキルであり、又はＲ３とＲ４若しくは２個のＲ３基はシクロアルキル若しくはヘテロシクロアルキルを形成していてもよく、
又は−Ａ−Ｂ−Ｊ−Ｒ基は合わせて、ジカルボニル基を含めたカルボニル基、保護されたジカルボニル基を含めた保護されたカルボニル基若しくはマスクされたジカルボニル基を含めたマスクされたカルボニル基を少なくとも１個含む、二環若しくは三環のシクロアルキル若しくはヘテロシクロアルキルを形成し、
又は−Ｊ−Ｒ基は合わせて、ジカルボニル基を含めたカルボニル基、保護されたジカルボニル基を含めた保護されたカルボニル基若しくはマスクされたジカルボニル基を含めたマスクされたカルボニル基を少なくとも１個含む、単環若しくは二環のシクロアルキル若しくはヘテロシクロアルキルを形成する。
（ｂ）
【０５２２】
【化１１４】
0005425398.tif 000056
式中、
Ａは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換アルカリーレン、アラルキレン又は置換アラルキレンであり、
Ｂは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂であり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂であり、
Ｒ３及びＲ４の各々は独立にＨ、ハロゲン、低級アルキル若しくは置換低級アルキルであり、又はＲ３とＲ４若しくは２個のＲ３基はシクロアルキル若しくはヘテロシクロアルキルを形成していてもよく、
Ｒ５は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリール、置換アルカリール、アラルキル、置換アラルキル、−（アルキレン又は置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ”）２、−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ”、−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリール又は置換アリール）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ”、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ”又は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）２であり、各Ｒ”は独立に水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、アルカリール、置換アルカリール、アラルキル又は置換アラルキルであり、
又はＲ５はＬ−Ｘであり、Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコール誘導体；光架橋剤；細胞傷害性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質若しくはポリペプチド若しくはポリペプチドアナログ；抗体又は抗体断片；金属キレート剤；補因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；糖類、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；フルオロフォア、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的若しくは非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；化学線放射によって励起可能な部分；リガンド；光異性化可能部分；ビオチン；ビオチンアナログ；重原子を組み込んだ部分；化学開裂可能な基；光開裂可能な基；長い側鎖；炭素連結糖；レドックス活性薬剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識部分；生物物理学的プローブ；リン光基；化学発光基；高電子密度基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能標識；小分子；抑制性リボ核酸、放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチン誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；アブザイム、活性錯体活性化物質、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルガン、アンギオスタチン、抗ホルモン、抗酸化剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、巨大分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、Ｌは任意であり、存在するときには、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーである。
（ｃ）
【０５２３】
【化１１５】
0005425398.tif 000057
式中、
Ａは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換アルカリーレン、アラルキレン又は置換アラルキレンであり、
Ｂは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり、
Ｋは−ＮＲ６Ｒ７又は−Ｎ＝ＣＲ６Ｒ７であり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂であり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂であり、
Ｒ３及びＲ４の各々は独立にＨ、ハロゲン、低級アルキル若しくは置換低級アルキルであり、又はＲ３とＲ４若しくは２個のＲ３基はシクロアルキル若しくはヘテロシクロアルキルを形成していてもよく、
Ｒ６及びＲ７の各々は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリール、置換アルカリール、アラルキル及び置換アラルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ”、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ”、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）２からなる群から独立に選択され、各Ｒ”は独立に水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、アルカリール、置換アルカリール、アラルキル若しくは置換アラルキルであり、又はＲ６若しくはＲ７はＬ−Ｘであり、
Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコール誘導体；光架橋剤；細胞傷害性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質若しくはポリペプチド若しくはポリペプチドアナログ；抗体又は抗体断片；金属キレート剤；補因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；糖類、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；フルオロフォア、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的若しくは非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；化学線放射によって励起可能な部分；リガンド；光異性化可能部分；ビオチン；ビオチンアナログ；重原子を組み込んだ部分；化学開裂可能な基；光開裂可能な基；長い側鎖；炭素連結糖；レドックス活性薬剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識部分；生物物理学的プローブ；リン光基；化学発光基；高電子密度基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能標識；小分子；抑制性リボ核酸、放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチン誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；アブザイム、活性錯体活性化物質、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルガン、アンギオスタチン、抗ホルモン、抗酸化剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、巨大分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、Ｌは任意であり、存在するときには、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーである。
（ｄ）
【０５２４】
【化１１６】
0005425398.tif 000058
（式中、
Ａは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換アルカリーレン、アラルキレン又は置換アラルキレンであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｘ１はＣ、Ｓ又はＳ（Ｏ）であり、Ｌはアルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）又はＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。又は、
（ｅ）
【０５２５】
【化１１７】
0005425398.tif 000059
式中、
Ａは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換アルカリーレン、アラルキレン又は置換アラルキレンであり、
Ｍは−Ｃ（Ｒ３）−、
【０５２６】
【化１１８】
0005425398.tif 000060
であり、
（ａ）はＡ基との結合を表し、（ｂ）はそれぞれのカルボニル基との結合を表し、Ｒ３及びＲ４はＨ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル若しくは置換シクロアルキルから独立に選択され、又はＲ３とＲ４、２個のＲ３基若しくは２個のＲ４基はシクロアルキル若しくはヘテロシクロアルキルを形成していてもよく、
ＲはＨ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり、
Ｔ３は結合、Ｃ（Ｒ）（Ｒ）、Ｏ又はＳであり、ＲはＨ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドである。
【０５２７】
本明細書の方法及び組成物の一態様においては、組成物は、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個又は少なくとも１０個以上を含めて、但しこれらだけに限定されない、少なくとも１個の翻訳後修飾された非天然アミノ酸を含む少なくとも１個のポリペプチドを含む組成物である。翻訳後修飾された非天然アミノ酸は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上の翻訳後修飾された異なる非天然アミノ酸を含むポリペプチド中には１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上の異なる部位が存在し得ることを含めて、但しこれらだけに限定されずに、同じでも異なっていてもよい。  別の態様においては、組成物は、翻訳後修飾された非天然アミノ酸で置換された、ポリペプチド中に存在する少なくとも１個の、但し全部よりは少ない、特定のアミノ酸を含むポリペプチドを含む。１個を超える翻訳後修飾された非天然アミノ酸を含む所与のポリペプチドの場合、翻訳後修飾された非天然アミノ酸は、（ポリペプチドは、異なるタイプの２個以上の翻訳後修飾された非天然アミノ酸を含むことができ、又は２個の同じ非天然アミノ酸を含むことができることを含めて、但しこれらだけに限定されずに）同一でも異なっていてもよい。２個を超える翻訳後修飾された非天然アミノ酸を含む所与のポリペプチドの場合、翻訳後修飾された非天然アミノ酸は同じでも、異なっていても、複数の同種の翻訳後修飾された非天然アミノ酸と、異なる少なくとも１個の翻訳後修飾された非天然アミノ酸との組み合わせでもよい。
【０５２８】
Ａ．  非天然アミノ酸ポリペプチドの翻訳後修飾方法：カルボニル含有非天然アミノ酸とヒドロキシルアミン含有試薬の反応
天然アミノ酸の側鎖は、高求電子性部位を欠く。したがって、単なる例として、ケトン、アルデヒドなどのカルボニル又はジカルボニル基を含むアミノ酸を含めて、求電子基（ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｉｌｅ）含有側鎖を有する非天然アミノ酸を組み込むことによって、カルボニル又はジカルボニル基の求核攻撃によるこの側鎖の部位特異的な誘導体化が可能になる。攻撃する求核剤がヒドロキシルアミンである場合には、オキシム誘導体化タンパク質が生成する。誘導体化方法及び／又はさらなる修飾方法は、誘導体化段階前又は誘導体化段階後に精製したポリペプチドを用いて実施することができる。また、誘導体化方法及び／又はさらなる修飾方法は、かかる改変の前又は後に精製した合成ポリマー、多糖又はポリヌクレオチドを用いて実施することができる。また、誘導体化段階は、例としてｐＨ約２−８又はｐＨ約４−８を含めて、弱酸性からわずかに塩基性の条件下で実施することができる。
【０５２９】
カルボニル含有又はジカルボニル含有ポリペプチドとヒドロキシルアミン置換分子との反応に基づくポリペプチド誘導体化方法は、明確な利点を有する。第１に、ヒドロキシルアミンは、カルボニル含有又はジカルボニル含有化合物とｐＨ２−８で（さらなる実施形態においてはｐＨ４−８で）縮合してオキシム付加体を生成する。これらの条件下で、天然アミノ酸の側鎖は非反応性である。第２に、かかる選択的化学反応によって、組換えタンパク質の部位特異的な誘導体化が可能になる。これによって、誘導体化タンパク質を規定の均一な生成物として調製することができる。第３に、本明細書に記載のヒドロキシルアミンを本明細書に記載のカルボニル含有又はジカルボニル含有ポリペプチドと反応させるのに必要な穏和な条件は、一般に、ポリペプチドの三次構造を不可逆的に破壊しない（反応の目的がかかる三次構造を破壊することである場合を除くことは言うまでもない。）。最後に、ヒドロキシルアミン基アミノはＥ．コリによって代謝されると考えられるが、ヒドロキシルアミンとカルボニル含有又はジカルボニル含有分子との縮合によって、生物学的条件下で安定であるオキシム付加体が生成する。
【０５３０】
単なる例として、以下の非天然アミノ酸は、カルボニル含有又はジカルボニル含有非天然アミノ酸ポリペプチドをさらに修飾するのに使用することができる、本明細書に記載のヒドロキシルアミン含有試薬と反応し易いタイプのカルボニル含有又はジカルボニル含有アミノ酸である。
【０５３１】
【化１１９】
0005425398.tif 000061
式中、
Ａは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換アルカリーレン、アラルキレン又は置換アラルキレンであり、
Ｂは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり、
Ｊは、
【０５３２】
【化１２０】
0005425398.tif 000062
であり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり、
各Ｒ”は独立にＨ、アルキル、置換アルキル若しくは保護基であり、又は１個を超えるＲ”基が存在するときには、２個のＲ”はヘテロシクロアルキルを形成していてもよく、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂であり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂であり、
Ｒ３及びＲ４の各々は独立にＨ、ハロゲン、低級アルキル若しくは置換低級アルキルであり、又はＲ３とＲ４若しくは２個のＲ３基はシクロアルキル若しくはヘテロシクロアルキルを形成していてもよく、
又は−Ａ−Ｂ−Ｊ−Ｒ基は合わせて、ジカルボニル基を含めたカルボニル基、保護されたジカルボニル基を含めた保護されたカルボニル基若しくはマスクされたジカルボニル基を含めたマスクされたカルボニル基を少なくとも１個含む、二環若しくは三環のシクロアルキル若しくはヘテロシクロアルキルを形成し、
又は−Ｊ−Ｒ基は合わせて、ジカルボニル基を含めたカルボニル基、保護されたジカルボニル基を含めた保護されたカルボニル基若しくはマスクされたジカルボニル基を含めたマスクされたカルボニル基を少なくとも１個含む、単環若しくは二環のシクロアルキル若しくはヘテロシクロアルキルを形成する。
【０５３３】
ある実施形態においては、式（Ｉ）の化合物は、弱酸性条件下でヒドロキシルアミン水溶液と反応し易い。ある実施形態においては、かかる酸性条件はｐＨ２から８である。
【０５３４】
単なる例として、上記目的のために、式（Ｉ）の化合物は、以下の構造を有する化合物を含む。
【０５３５】
【化１２１】
0005425398.tif 000063
式中、
Ａは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換アルカリーレン、アラルキレン又は置換アラルキレンであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｘ１はＣ、Ｓ又はＳ（Ｏ）であり、Ｌは結合、アルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）又はＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）である。
【０５３６】
さらなる単なる例として、上記目的のために、式（Ｉ）の化合物は、式（ＸＸＸＸ）の構造を有する化合物を含む。
【０５３７】
【化１２２】
0005425398.tif 000064
式中、
Ａは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換アルカリーレン、アラルキレン又は置換アラルキレンであり、
Ｍは−Ｃ（Ｒ３）−、
【０５３８】
【化１２３】
0005425398.tif 000065
であり、
（ａ）はＡ基との結合を表し、（ｂ）はそれぞれのカルボニル基との結合を表し、Ｒ３及びＲ４はＨ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル若しくは置換シクロアルキルから独立に選択され、又はＲ３とＲ４、２個のＲ３基若しくは２個のＲ４基はシクロアルキル若しくはヘテロシクロアルキルを形成していてもよく、
ＲはＨ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり、
Ｔ３は結合、Ｃ（Ｒ）（Ｒ）、Ｏ又はＳであり、ＲはＨ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドである。
【０５３９】
かかるカルボニル含有又はジカルボニル含有非天然アミノ酸を含むポリペプチドのタイプは、実際には、ヒドロキシルアミン試薬がカルボニル又はジカルボニル基と反応することができるように、また、ポリペプチドの三次構造を破壊する修飾非天然アミノ酸を生成しないように（かかる破壊が反応の目的である場合を除くことは言うまでもない。）、カルボニル含有又はジカルボニル含有非天然アミノ酸がポリペプチド上に位置する限り限定されない。
【０５４０】
単なる例として、以下のヒドロキシルアミン含有試薬は、本明細書に記載のカルボニル含有又はジカルボニル含有非天然アミノ酸と反応し易いタイプであって、カルボニル含有又はジカルボニル含有非天然アミノ酸ポリペプチドをさらに修飾するのに使用することができるタイプのヒドロキシルアミン含有試薬である。
【０５４１】
【化１２４】
0005425398.tif 000066
式中、
各Ｘは独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリール、置換アルカリール、アラルキル、置換アラルキル、−（アルキレン又は置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ”）２、−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ”、−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリール又は置換アリール）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ”、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ”又は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）２であり、各Ｒ”は独立に水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、アルカリール、置換アルカリール、アラルキル又は置換アラルキルであり、
又は、各Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコール誘導体；光架橋剤；細胞傷害性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質若しくはポリペプチド若しくはポリペプチドアナログ；抗体又は抗体断片；金属キレート剤；補因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；糖類、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；フルオロフォア、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的若しくは非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；化学線放射によって励起可能な部分、リガンド、光異性化可能部分；ビオチン；ビオチンアナログ；重原子を組み入れた部分；化学開裂可能な基；光開裂可能な基；長い側鎖；炭素連結糖；レドックス活性薬剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識部分；生物物理学的プローブ；リン光基；化学発光基；高電子密度基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能標識；小分子；抑制性リボ核酸、放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチン誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；アブザイム、活性錯体活性化物質、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルガン、アンギオスタチン、抗ホルモン、抗酸化物、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、巨大分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル及びこれらの任意の組み合わせからなる群から独立に選択され、
各Ｌは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−（アルキレン又は置換アルキレン）ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｏ−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−からなる群から独立に選択され、
Ｌ１は任意であり、存在するときには、−Ｃ（Ｒ’）ｐ−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−（式中、ｐは０、１又は２である。）であり、
各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルであり、
Ｗは−Ｎ（Ｒ８）２であり（各Ｒ８は独立にＨ又はアミノ保護基である。）、ｎは１から３であり、
但し、Ｌ−Ｌ１−Ｗは合わせて、非天然アミノ酸又は「修飾又は非修飾」非天然アミノ酸ポリペプチド上の（ジカルボニルを含めた）カルボニル基と反応することができる少なくとも１個のヒドロキシルアミン基である。
【０５４２】
式（ＸＩＸ）の化合物のある実施形態においては、Ｘは、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリール、置換アルカリール、アラルキル又は置換アラルキルを含むポリマーである。式（ＸＩＸ）の化合物のある実施形態においては、Ｘは、ポリアルキレンオキシド又は置換ポリアルキレンオキシドを含むポリマーである。式（ＸＩＸ）の化合物のある実施形態においては、Ｘは、−［（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｏ−（水素、アルキル又は置換アルキル）］ｘ（式中、ｘは２０−１０，０００である。）を含むポリマーである。式（ＸＩＸ）の化合物のある実施形態においては、Ｘは、分子量２から４０ＫＤａのｍ−ＰＥＧである。式（ＸＩＸ）の化合物のある実施形態においては、Ｘは、ペプチド、タンパク質、酵素、抗体、薬物、色素、脂質、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、細胞、ウイルス、リポソーム、微粒子及びミセルからなる群から選択される生物活性剤である。式（ＸＩＸ）の化合物のある実施形態においては、Ｘは、抗生物質、殺真菌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗腫よう剤、心血管作動薬、抗不安薬、ホルモン、成長因子及びステロイド剤からなる群から選択される薬物である。式（ＸＩＸ）の化合物のある実施形態においては、Ｘは、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ及びグルコースオキシダーゼからなる群から選択される酵素である。式（ＸＩＸ）の化合物のある実施形態においては、Ｘは、蛍光、リン光、化学発光、キレート、高電子密度、磁性、挿入、放射性、色素産生及びエネルギー伝達部分からなる群から選択される検出可能標識である。式（ＸＩＸ）の化合物のある実施形態においては、Ｌは、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｏ−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−及び−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−からなる群から選択される。
【０５４３】
式（ＸＩＸ）の化合物のある実施形態においては、式（ＸＸ）の構造を有する化合物である。
【０５４４】
【化１２５】
0005425398.tif 000067
式（ＸＸ）の化合物のある実施形態においては、
【０５４５】
【化１２６】
0005425398.tif 000068
からなる群から選択される化合物である。
【０５４６】
ここで、他の実施形態においては、かかるｍ−ＰＥＧ又はＰＥＧ基は、５から３０ｋＤａの分子量を有する。
【０５４７】
式（ＸＩＸ）の化合物のある実施形態においては、式（ＸＸＩ）の構造を有する化合物である。
【０５４８】
【化１２７】
0005425398.tif 000069
式（ＸＸＩ）の化合物のある実施形態においては、
【０５４９】
【化１２８】
0005425398.tif 000070
からなる群から選択される化合物である。
【０５５０】
式（ＸＩＸ）の化合物のある実施形態においては、式（ＸＸＩＩ）の構造を有する化合物である。
【０５５１】
【化１２９】
0005425398.tif 000071
【０５５２】
式（ＸＸＩＩ）の化合物のある実施形態においては、Ｌは−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−である。式（ＸＸＩＩ）の化合物のある実施形態においては、式（ＸＸＩＩＩ）の構造を有する化合物である。
【０５５３】
【化１３０】
0005425398.tif 000072
【０５５４】
ここで、式（ＸＸＩＩ）の化合物の他の実施形態においては、かかるｍ−ＰＥＧ基は５から３０ｋＤａの分子量を有する。
【０５５５】
式（ＸＩＸ）の化合物のある実施形態においては、式（ＸＸＩＶ）の構造を有する化合物である。
【０５５６】
【化１３１】
0005425398.tif 000073
【０５５７】
式（ＸＸＩＶ）の化合物のある実施形態においては、Ｌは−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−又は−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−である。式（ＸＸＩＶ）の化合物のある実施形態においては、式（ＸＸＶ）の構造を有する化合物である。
【０５５８】
【化１３２】
0005425398.tif 000074
【０５５９】
ここで、式（ＸＸＩＶ）の化合物の他の実施形態においては、かかるｍ−ＰＥＧ基は５から３０ｋＤａの分子量を有する。
【０５６０】
式（ＸＩＸ）の化合物のある実施形態においては、式（ＸＸＶＩ）の構造を有する化合物である。
【０５６１】
【化１３３】
0005425398.tif 000075
式中、各Ｒ１０は独立にＨ又はアミノ保護基である。
【０５６２】
式（ＸＸＶＩ）の化合物のある実施形態においては、ポリアルキレンオキシドはＰＥＧである。式（ＸＸＶＩ）の化合物の他の実施形態においては、ＰＥＧ基は、５から３０ｋＤａの分子量を有する。式（ＸＸＶＩ）の化合物の別の実施形態においては、
【０５６３】
【化１３４】
0005425398.tif 000076
に対応する化合物である。
【０５６４】
ヒドロキシルアミンをポリペプチド上のカルボニル含有非天然アミノ酸とカップリングさせる方法の説明のための３つの実施形態を図７に示す。これらの説明のための実施形態においては、ヒドロキシルアミン誘導体化試薬をカルボニル含有非天然アミノ酸ポリペプチドの緩衝溶液（ｐＨ２−８）に添加する。反応は、周囲温度で数時間から数日進行する。複合化を促進するために、図８に示す添加剤などの添加剤を添加する。かかる化合物は、本明細書では促進剤としても知られる。ある実施形態においては、促進剤又は添加剤は、塩基触媒作用能がある。生成したオキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドをＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ又はサイズ排除クロマトグラフィーによって精製する。
【０５６５】
一実施形態においては、複数のリンカーケミストリー（ｌｉｎｋｅｒ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）がカルボニル置換又はジカルボニル置換非天然アミノ酸ポリペプチドと部位特異的に反応し得る。一実施形態においては、本明細書に記載のリンカー方法は、（単官能、二官能又は多官能の）少なくとも１つのリンカー末端上のヒドロキシルアミン官能基を含むリンカーを利用する。ヒドロキシルアミンによって誘導体化されたリンカーとケト置換タンパク質との縮合によって安定なオキシムリンケージが生成する。二官能及び／又は多官能リンカー（例えば、ヒドロキシルアミンと１個、又はそれ以上の、他のリンキングケミストリー（ｌｉｎｋｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ））によって、異なる分子（例えば、他のタンパク質、ポリマー又は小分子）と非天然アミノ酸ポリペプチドとの部位特異的な連結が可能になる一方、（全末端上でヒドロキシルアミン置換された）単官能リンカーによって、非天然アミノ酸ポリペプチドの部位特異的な２量体化又はオリゴマー化が容易になる。このリンカー戦略を本明細書に記載のインビボ翻訳技術と組み合わせることによって、化学的に生成した（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｅｌａｂｏｒａｔｅｄ）タンパク質の３次元構造を特定することが可能になる。
【０５６６】
ある実施形態においては、式Ｉ−ＸＶＩＩＩ、ＸＸＸ−ＸＸＸＩＶ（Ａ＆Ｂ）又はＸＸＸＸ−ＸＸＸＸＩＩＩの範囲内にある任意の下位式又は特定の化合物を含めて、式Ｉ−ＸＶＩＩＩ、ＸＸＸ−ＸＸＸＩＶ（Ａ＆Ｂ）又はＸＸＸＸ−ＸＸＸＸＩＩＩのアミノ酸を含むポリペプチドを誘導体化する方法である。この方法は、式Ｉ−ＸＶＩＩＩ、ＸＸＸ−ＸＸＸＩＶ（Ａ＆Ｂ）又はＸＸＸＸ−ＸＸＸＸＩＩＩの少なくとも１個のアミノ酸を含むポリペプチドを式（ＸＩＸ）の試薬と接触させることを含む。ある実施形態においては、式（ＸＩＸ）の試薬と接触させる前に、又は接触させた後に、ポリペプチドを精製する。他の実施形態においては、生成した誘導体化ポリペプチドは、式（ＸＩ）に対応する少なくとも１個のオキシム含有アミノ酸を含む。一方、他の実施形態においては、かかる誘導体化ポリペプチドは弱酸性条件下の水溶液中で少なくとも１ヵ月間安定である。他の実施形態においては、かかる誘導体化ポリペプチドは弱酸性条件下で少なくとも２週間安定である。他の実施形態においては、かかる誘導体化ポリペプチドは弱酸性条件下で少なくとも５日間安定である。他の実施形態においては、かかる条件はｐＨ２から８である。ある実施形態においては、誘導体化ポリペプチドの三次構造は保存される。他の実施形態においては、ポリペプチドのかかる誘導体化は、さらに、誘導体化ポリペプチドを別のポリペプチドに連結することを含む。他の実施形態においては、誘導体化されるかかるポリペプチドは、アルファ−１抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学走化性タンパク質−１、単球化学走化性タンパク質−２、単球化学走化性タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１アルファ、単球炎症性タンパク質−１ベータ、ＲＡＮＴＥＳ、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン、上皮性好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮性好中球活性化ペプチド、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、剥脱性毒素、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、４本ヘリックスバンドルタンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、性腺刺激ホルモン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１受容体、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールツリン、好中球抑制因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン、Ａタンパク質、Ｇタンパク質、ｐｔｈ、発熱性外毒素Ａ、発熱性外毒素Ｂ、発熱性外毒素Ｃ、ｐｙｙ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、小さな生合成タンパク質、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群毒素、チモシンアルファ１、組織プラスミノゲンアクチベーター、腫よう成長因子（ＴＧＦ）、腫よう壊死因子、腫よう壊死因子アルファ、腫よう壊死因子ベータ、腫よう壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４タンパク質、ＶＣＡＭ−１タンパク質、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体及びコルチコステロンからなる群から選択される治療用タンパク質と相同である。
【０５６７】
ある実施形態においては、ポリペプチド２量体を生成する方法であり、この方法は、
（ｉ）式（Ｉ）のアミノ酸を含む第１のポリペプチドを式（ＸＸＶＩ）の試薬で誘導体化すること、及び
（ｉｉ）段階（ｉ）の生成した誘導体化タンパク質を式（Ｉ）のアミノ酸を含む第２のタンパク質と接触させ、それによって第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを含む２量体を形成することを含む。他の実施形態においては、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドが式（ＩＩ）に対応するアミノ酸を含む、ポリペプチド２量体を生成する方法である。ある実施形態においては、式（ＸＸＶＩ）の試薬と接触させる前に、又は接触させた後に、ポリペプチドを精製する。他の実施形態においては、段階（ｉ）の生成した誘導体化タンパク質は、式（ＸＸＶＩＩＩ）に対応する少なくとも１個のオキシム含有アミノ酸を含む。
【０５６８】
【化１３５】
0005425398.tif 000077
【０５６９】
Ｂ．  非天然アミノ酸ポリペプチドの翻訳後修飾方法：オキシム含有非天然アミノ酸とカルボニル含有試薬の反応
オキシム含有タンパク質とカルボニル置換又はジカルボニル置換分子との交換反応に基づくタンパク質誘導体化方法は、明確な利点を有する。第１に、研究によれば、アミノ酸を主体とするオキシム付加体は、元のオキシムを生成するために使用した化合物よりも反応性の高いカルボニル又はジカルボニル含有化合物と平衡化することによってオキシム交換する。この交換反応は、ｐＨ４−８で起こる。これらの条件下では、天然アミノ酸の側鎖は非反応性である。したがって、オキシム含有タンパク質との反応に適切なカルボニル置換又はジカルボニル置換分子の一般的調製方法によって、多種多様な部位特異的に誘導体化されたタンパク質を利用することが可能になる。このインビボ翻訳技術に関連して、（単なる例として、ポリエチレングリコールなどの親水性ポリマーを含めて）タンパク質の誘導体化に典型的に使用される分子のカルボニル置換又はジカルボニル置換体を調製する一般的方法は、貴重であり、多種多様な部位特異的に誘導体化された非天然アミノ酸ポリペプチドの利用を可能にする。第２に、かかる選択的化学反応によって、組換えタンパク質の部位特異的な誘導体化が可能になる。これで、誘導体化タンパク質を規定の均一な生成物として調製することができる。第３に、本明細書に記載の交換反応に影響を及ぼすのに必要な穏和な条件は、一般に、ポリペプチドの三次構造を不可逆的に破壊しない（反応の目的がかかる三次構造を破壊することである場合を除くことは言うまでもない。）。最後に、交換反応によって、生物学的条件下で安定である新しいオキシム付加体が生成する。
【０５７０】
単なる例として、以下の非天然アミノ酸は、新しいオキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドを生成するのに使用することができる、本明細書に記載のカルボニル含有又はジカルボニル含有試薬と反応し易いタイプのオキシム含有アミノ酸である。
【０５７１】
【化１３６】
0005425398.tif 000078
式中、
Ａは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換アルカリーレン、アラルキレン又は置換アラルキレンであり、
Ｂは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり、
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル又は置換シクロアルキルであり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ３及びＲ４の各々は独立にＨ、ハロゲン、低級アルキル若しくは置換低級アルキルであり、又はＲ３とＲ４若しくは２個のＲ３基はシクロアルキル若しくはヘテロシクロアルキルを形成していてもよく、
Ｒ５は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリール、置換アルカリール、アラルキル、置換アラルキル、−（アルキレン又は置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ”）２、−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ”、−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリール又は置換アリール）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ”、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ”又は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）２であり、各Ｒ”は独立に水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、アルカリール、置換アルカリール、アラルキル又は置換アラルキルであり、
又はＲ５はＬ−Ｘであり、
Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコール誘導体；光架橋剤；細胞傷害性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質若しくはポリペプチド若しくはポリペプチドアナログ；抗体又は抗体断片；金属キレート剤；補因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；糖類、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；フルオロフォア、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的若しくは非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；化学線放射によって励起可能な部分；リガンド；光異性化可能部分；ビオチン；ビオチンアナログ；重原子を組み込んだ部分；化学開裂可能な基；光開裂可能な基；長い側鎖；炭素連結糖；レドックス活性薬剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識部分；生物物理学的プローブ；リン光基；化学発光基；高電子密度基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能標識；小分子；抑制性リボ核酸、放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチン誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；アブザイム、活性錯体活性化物質、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルガン、アンギオスタチン、抗ホルモン、抗酸化剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、巨大分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、Ｌは任意であり、存在するときには、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｏ−Ｎ＝ＣＲ’−、−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｓ（Ｏ）ｋ−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｓ−、−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーである。
【０５７２】
さらなる単なる例として、以下の非天然アミノ酸も、新しいオキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドを生成するのに使用することができる、本明細書に記載のカルボニル含有又はジカルボニル含有試薬と反応し易いタイプのオキシム含有アミノ酸である。
【０５７３】
【化１３７】
0005425398.tif 000079
式中、
Ａは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換アルカリーレン、アラルキレン又は置換アラルキレンであり、
Ｂは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ３及びＲ４の各々は独立にＨ、ハロゲン、低級アルキル若しくは置換低級アルキルであり、又はＲ３とＲ４若しくは２個のＲ３基はシクロアルキル若しくはヘテロシクロアルキルを形成していてもよく、
Ｒ６及びＲ７の各々は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリール、置換アルカリール、アラルキル及び置換アラルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ”、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ”、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）２からなる群から独立に選択され、各Ｒ”は独立に水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、アルカリール、置換アルカリール、アラルキル若しくは置換アラルキルであり、又はＲ６若しくはＲ７はＬ−Ｘであり、
Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコール誘導体；光架橋剤；細胞傷害性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質若しくはポリペプチド若しくはポリペプチドアナログ；抗体又は抗体断片；金属キレート剤；補因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；糖類、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；フルオロフォア、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的若しくは非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；化学線放射によって励起可能な部分；リガンド；光異性化可能部分；ビオチン；ビオチンアナログ；重原子を組み込んだ部分；化学開裂可能な基；光開裂可能な基；長い側鎖；炭素連結糖；レドックス活性薬剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識部分；生物物理学的プローブ；リン光基；化学発光基；高電子密度基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能標識；小分子；抑制性リボ核酸、モノヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチン誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；アブザイム、活性錯体活性化物質、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルガン、アンギオスタチン、抗ホルモン、抗酸化剤、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、巨大分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、Ｌは任意であり、存在するときには、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーである。
【０５７４】
単なる例として、以下のカルボニル含有又はジカルボニル含有試薬は、本明細書に記載のオキシム含有非天然アミノ酸と反応し易いタイプであって、交換反応を起こして新しいオキシムリンケージを形成し、したがってオキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドを修飾するのに使用することができるタイプのカルボニル含有又はジカルボニル含有試薬である。
【０５７５】
【化１３８】
0005425398.tif 000080
式中、
各Ｘは独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリール、置換アルカリール、アラルキル、置換アラルキル、−（アルキレン又は置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ”）２、−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ”、−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリール又は置換アリール）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ”、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ”又は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）２であり、各Ｒ”は独立に水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、アルカリール、置換アルカリール、アラルキル又は置換アラルキルであり、
又は、各Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコール誘導体；光架橋剤；細胞傷害性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質若しくはポリペプチド若しくはポリペプチドアナログ；抗体又は抗体断片；金属キレート剤；補因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；糖類、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；フルオロフォア、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的若しくは非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；化学線放射によって励起可能な部分、リガンド、光異性化可能部分；ビオチン；ビオチンアナログ；重原子を組み入れた部分；化学開裂可能な基；光開裂可能な基；長い側鎖；炭素連結糖；レドックス活性薬剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識部分；生物物理学的プローブ；リン光基；化学発光基；高電子密度基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能標識；小分子；抑制性リボ核酸、放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチン誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；アブザイム、活性錯体活性化物質、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルガン、アンギオスタチン、抗ホルモン、抗酸化物、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、巨大分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル及びこれらの任意の組み合わせからなる群から独立に選択され、
各Ｌは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−（アルキレン又は置換アルキレン）ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｏ−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−からなる群から独立に選択され、
Ｌ１は任意であり、存在するときには、−Ｃ（Ｒ’）ｐ−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−（式中、ｐは０、１又は２である。）であり、
各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルであり、
Ｗは−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ９であり（Ｒ９はＨ又はＯＲ’である。）、ｎは１から３であり、
又はＬ−Ｌ１−Ｗは合わせて、ジカルボニル基を含めたカルボニル基、保護されたジカルボニル基を含めた保護されたカルボニル基若しくはマスクされたジカルボニル基を含めたマスクされたカルボニル基を少なくとも１個含む、単環若しくは二環のシクロアルキル若しくはヘテロシクロアルキルを形成し、
但し、Ｌ−Ｌ１−Ｗは合わせて、非天然アミノ酸又は「修飾又は非修飾」非天然アミノ酸ポリペプチド上のオキシム基とオキシム交換反応することができる少なくとも１個の（ジカルボニル基を含めた）カルボニル基である。
【０５７６】
ポリペプチド上のオキシム含有アミノ酸とカルボニル含有試薬とのオキシム交換反応を起こす方法の説明のための２つの実施形態を図９に示す。これらの説明のための実施形態においては、カルボニル含有試薬をオキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドの緩衝溶液（ｐＨ２−８）に添加する。反応は、周囲温度で数時間から数日進行する。修飾オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドをＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ又はサイズ排除クロマトグラフィーによって精製する。
【０５７７】
一実施形態においては、複数のリンカーケミストリーがオキシム置換非天然アミノ酸ポリペプチドと部位特異的に反応し得る。一実施形態においては、本明細書に記載のリンカー方法は、（単官能、二官能又は多官能の）少なくとも１つのリンカー末端上のカルボニル又はジカルボニル官能基を含むリンカーを利用する。カルボニル又はジカルボニル誘導体化されたリンカーとオキシム置換非天然アミノ酸ポリペプチドとの縮合によって、新しい安定なオキシムリンケージが生成する。二官能及び／又は多官能リンカー（例えば、カルボニル又はジカルボニルと１個、又はそれ以上の、他のリンキングケミストリー）によって、異なる分子（例えば、他のタンパク質、ポリマー又は小分子）と非天然アミノ酸ポリペプチドとの部位特異的な連結が可能になる一方、（全末端上でカルボニル置換又はジカルボニル置換された）単官能リンカーによって、非天然アミノ酸ポリペプチドの部位特異的な２量体化又はオリゴマー化が容易になる。このリンカー戦略を本明細書に記載のインビボ翻訳技術と組み合わせることによって、化学的に生成したタンパク質の３次元構造を特定することが可能になる。
【０５７８】
Ｃ．  非天然アミノ酸ポリペプチドの翻訳後修飾方法：ヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸とカルボニル含有試薬の反応
上記翻訳後修飾技術及び組成物は、カルボニル含有又はジカルボニル含有試薬と反応して修飾オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドを生成するヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸と一緒に使用することもできる。
【０５７９】
ヒドロキシルアミン含有タンパク質とカルボニル置換又はジカルボニル置換分子との反応に基づくタンパク質誘導体化方法は、明確な利点を有する。第１に、ヒドロキシルアミンは、カルボニル含有又はジカルボニル含有化合物とｐＨ４−８で縮合してオキシム付加体を生成する。これらの条件下で、天然アミノ酸の側鎖は非反応性である。第２に、かかる選択的化学反応によって、組換えタンパク質の部位特異的な誘導体化が可能になる。これで、誘導体化タンパク質を規定の均一な生成物として調製することができる。第３に、本明細書に記載のカルボニル含有又はジカルボニル含有試薬を本明細書に記載のヒドロキシルアミン含有ポリペプチドと反応させるのに必要な穏和な条件は、一般に、ポリペプチドの三次構造を不可逆的に破壊しない（反応の目的がかかる三次構造を破壊することである場合を除くことは言うまでもない。）。最後に、ヒドロキシルアミン基アミノはＥ．コリによって代謝されると考えられるが、カルボニル含有又はジカルボニル含有試薬とヒドロキシルアミン含有アミノ酸との縮合によって、生物学的条件下で安定であるオキシム付加体が生成する。
【０５８０】
単なる例として、以下の非天然アミノ酸は、ヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドをさらに修飾するのに使用することができる、本明細書に記載のカルボニル含有又はジカルボニル含有試薬と反応し易いタイプのヒドロキシルアミン含有アミノ酸である。
【０５８１】
【化１３９】
0005425398.tif 000081
式中、
Ａは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換アルカリーレン、アラルキレン又は置換アラルキレンであり、
Ｂは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり、
Ｋは−ＮＲ６Ｒ７又は−Ｎ＝ＣＲ６Ｒ７であり、
Ｒ１はＨ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２はＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ３及びＲ４の各々は独立にＨ、ハロゲン、低級アルキル若しくは置換低級アルキルであり、又はＲ３とＲ４若しくは２個のＲ３基はシクロアルキル若しくはヘテロシクロアルキルを形成していてもよい。
【０５８２】
式（ＸＩＶ）の化合物のある実施形態においては、ＫはＮＨ２である。
【０５８３】
かかるヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸を含むポリペプチドのタイプは、実際には、カルボニル含有又はジカルボニル含有試薬がヒドロキシルアミン基と反応することができるように、また、ポリペプチドの三次構造を破壊する修飾非天然アミノ酸を生成しないように（かかる破壊が反応の目的である場合を除くことは言うまでもない。）、ヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸がポリペプチド上に位置する限り限定されない。
【０５８４】
単なる例として、以下のカルボニル含有又はジカルボニル含有試薬は、本明細書に記載のヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸と反応し易いタイプであって、ヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドをさらに修飾するのに使用することができるタイプのカルボニル含有又はジカルボニル含有試薬である。
【０５８５】
【化１４０】
0005425398.tif 000082
式中、
各Ｘは独立に、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルキルアルコキシ、置換アルキルアルコキシ、ポリアルキレンオキシド、置換ポリアルキレンオキシド、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルカリール、置換アルカリール、アラルキル、置換アラルキル、−（アルキレン又は置換アルキレン）−ＯＮ（Ｒ”）２、−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｃ（Ｏ）ＳＲ”、−（アルキレン又は置換アルキレン）−Ｓ−Ｓ−（アリール又は置換アリール）、−Ｃ（Ｏ）Ｒ”、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ”又は−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ”）２であり、各Ｒ”は独立に水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、アルカリール、置換アルカリール、アラルキル又は置換アラルキルであり、
又は、各Ｘは、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコール誘導体；光架橋剤；細胞傷害性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質若しくはポリペプチド若しくはポリペプチドアナログ；抗体又は抗体断片；金属キレート剤；補因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；糖類、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；フルオロフォア、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的若しくは非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；化学線放射によって励起可能な部分、リガンド、光異性化可能部分；ビオチン；ビオチンアナログ；重原子を組み入れた部分；化学開裂可能な基；光開裂可能な基；長い側鎖；炭素連結糖；レドックス活性薬剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識部分；生物物理学的プローブ；リン光基；化学発光基；高電子密度基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能標識；小分子；抑制性リボ核酸、放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチン誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；アブザイム、活性錯体活性化物質、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルガン、アンギオスタチン、抗ホルモン、抗酸化物、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、巨大分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル及びこれらの任意の組み合わせからなる群から独立に選択され、
各Ｌは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−（アルキレン又は置換アルキレン）ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｏ−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−からなる群から独立に選択され、
Ｌ１は任意であり、存在するときには、−Ｃ（Ｒ’）ｐ−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−（式中、ｐは０、１又は２である。）であり、
各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルであり、
Ｗは−Ｊ−Ｒであって、Ｊは
【０５８６】
【化１４１】
0005425398.tif 000083
であり、
ＲはＨ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル若しくは置換シクロアルキルであり、各Ｒ”は独立にＨ、アルキル、置換アルキル若しくは保護基であり、又は１個を超えるＲ”基が存在するときには、２個のＲ”は、ヘテロシクロアルキルを形成していてもよく、ｎは１から３であり、
但し、Ｌ−Ｌ１−Ｗは合わせて、非天然アミノ酸又は「修飾又は非修飾」非天然アミノ酸ポリペプチド上のヒドロキシルアミン基と反応することができる少なくとも１個の（ジカルボニル基を含めた）カルボニル基である。
【０５８７】
式（ＸＩＸ）の化合物のある実施形態においては、式（ＸＸＩ）の構造を有する化合物である。
【０５８８】
【化１４２】
0005425398.tif 000084
【０５８９】
カルボニル含有試薬をポリペプチド上のヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸とカップリングさせる方法の説明のための実施形態を図１０に示す。この説明のための実施形態においては、カルボニル誘導体化試薬をヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドの緩衝溶液（ｐＨ２−８）に添加する。反応は、周囲温度で数時間から数日進行する。複合化を促進するために、図８に示す添加剤などの添加剤を添加する。生成したオキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドをＨＰＬＣ、ＦＰＬＣ又はサイズ排除クロマトグラフィーによって精製する。
【０５９０】
一実施形態においては、複数のリンカーケミストリーがヒドロキシルアミン置換非天然アミノ酸ポリペプチドと部位特異的に反応し得る。一実施形態においては、本明細書に記載のリンカー方法は、（単官能、二官能又は多官能の）少なくとも１つのリンカー末端上のカルボニル又はジカルボニル官能基を含むリンカーを利用する。カルボニル又はジカルボニルによって誘導体化されたリンカーとヒドロキシルアミン置換タンパク質との縮合によって安定なオキシムリンケージが生成する。二官能及び／又は多官能リンカー（例えば、カルボニル又はジカルボニルと１個、又はそれ以上の、他のリンキングケミストリー）によって、異なる分子（例えば、他のタンパク質、ポリマー又は小分子）と非天然アミノ酸ポリペプチドとの部位特異的な連結が可能になる一方、（全末端上でカルボニル置換又はジカルボニル置換された）単官能リンカーによって、非天然アミノ酸ポリペプチドの部位特異的な２量体化又はオリゴマー化が容易になる。このリンカー戦略を本明細書に記載のインビボ翻訳技術と組み合わせることによって、化学的に生成したタンパク質の３次元構造を特定することが可能になる。
【０５９１】
ある実施形態においては、式ＸＩＶ−ＸＶＩの範囲内にある任意の下位式又は特定の化合物を含めて、式ＸＩＶ−ＸＶＩのアミノ酸を含むポリペプチドを誘導体化する方法である。この方法は、式ＸＩＶ−ＸＶＩの少なくとも１個のアミノ酸を含むポリペプチドを式（ＸＩＸ）の試薬と接触させることを含む。ある実施形態においては、式（ＸＩＸ）の試薬と接触させる前に、又は接触させた後に、ポリペプチドを精製する。他の実施形態においては、生成した誘導体化ポリペプチドは、式（ＸＸＩＸ）に対応する少なくとも１個のオキシム含有アミノ酸を含む。
【０５９２】
【化１４３】
0005425398.tif 000085
式中、
Ａは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリーレン、置換アルカリーレン、アラルキレン又は置換アラルキレンであり、
Ｂは任意であり、存在するときには、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−ＮＳ（Ｏ）２−、−ＯＳ（Ｏ）２−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から選択されるリンカーであり、
Ｌは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−（アルキレン又は置換アルキレン）ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｏ−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルである。）からなる群から独立に選択されるリンカーであり、
Ｒ１は任意であり、存在するときには、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
Ｒ２は任意であり、存在するときには、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり、
各Ｒ３及びＲ４は独立にＨ、ハロゲン、低級アルキル又は置換低級アルキルであり、
Ｘは独立に検出可能標識、生物活性剤又はポリマーである。
【０５９３】
他の実施形態においては、かかる誘導体化ポリペプチドは弱酸性条件下の水溶液中で少なくとも１ヵ月間安定である。他の実施形態においては、かかる誘導体化ポリペプチドは弱酸性条件下で少なくとも２週間安定である。他の実施形態においては、かかる誘導体化ポリペプチドは弱酸性条件下で少なくとも５日間安定である。他の実施形態においては、かかる条件はｐＨ２から８である。ある実施形態においては、誘導体化ポリペプチドの三次構造は保存される。他の実施形態においては、ポリペプチドのかかる誘導体化は、さらに、誘導体化ポリペプチドを別のポリペプチドに連結することを含む。他の実施形態においては、誘導体化されるかかるポリペプチドは、アルファ−１抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学走化性タンパク質−１、単球化学走化性タンパク質−２、単球化学走化性タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１アルファ、単球炎症性タンパク質−１ベータ、ＲＡＮＴＥＳ、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン、上皮性好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮性好中球活性化ペプチド、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、剥脱性毒素、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、４本ヘリックスバンドルタンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、性腺刺激ホルモン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１受容体、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールツリン、好中球抑制因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン、Ａタンパク質、Ｇタンパク質、ｐｔｈ、発熱性外毒素Ａ、発熱性外毒素Ｂ、発熱性外毒素Ｃ、ｐｙｙ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、小さな生合成タンパク質、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群毒素、チモシンアルファ１、組織プラスミノゲンアクチベーター、腫よう成長因子（ＴＧＦ）、腫よう壊死因子、腫よう壊死因子アルファ、腫よう壊死因子ベータ、腫よう壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４タンパク質、ＶＣＡＭ−１タンパク質、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体及びコルチコステロンからなる群から選択される治療用タンパク質と相同である。
【０５９４】
Ｄ．  官能基を付加する例：非天然アミノ酸ポリペプチドと結合した巨大分子ポリマー
本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドに対する種々の改変を、本明細書に記載の組成物、方法、技術及び戦略を用いて実施することができる。これらの改変としては、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコール誘導体；光架橋剤；細胞傷害性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質又はポリペプチド又はポリペプチドアナログ；抗体又は抗体断片；金属キレート剤；補因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；糖類、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；フルオロフォア、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的又は非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；化学線放射によって励起可能な部分；リガンド；光異性化可能部分；ビオチン；ビオチンアナログ；重原子を組み入れた部分；化学開裂可能な基；光開裂可能な基；長い側鎖；炭素連結糖；レドックス活性薬剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識部分；生物物理学的プローブ；リン光基；化学発光基；高電子密度基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能標識；小分子；抑制性リボ核酸、放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチン誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質；アブザイム、活性錯体活性化物質、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルガン、アンギオスタチン、抗ホルモン、抗酸化物、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、巨大分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル及びこれらの任意の組み合わせを含めて、但しこれらだけに限定されない、ポリペプチドの非天然アミノ酸成分上へのさらなる官能基の組み込みなどが挙げられる。本明細書に記載する組成物、方法、技術及び戦略の説明のための非限定的な例として、以下の記述は、巨大分子ポリマーを非天然アミノ酸ポリペプチドに付加することに焦点を合わせる。本明細書に記載の組成物、方法、技術及び戦略は、上記官能基を含めて、但しこれらだけに限定されない他の官能基を付加するためにも（必要に応じ、かつ当業者が本明細書の開示によって成し得る適切な改変によって）適用できることを理解されたい。
【０５９５】
多種多様な巨大分子ポリマー及び他の分子を本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドとカップリングさせて、非天然アミノ酸ポリペプチド（又は対応する天然アミノ酸ポリペプチド）の生物学的諸性質を調節し、及び／又は新しい生物学的諸性質を非天然アミノ酸ポリペプチド（又は対応する天然アミノ酸ポリペプチド）に付与することができる。これらの巨大分子ポリマーは、非天然アミノ酸、非天然アミノ酸の任意の官能性置換基、又は非天然アミノ酸に付加した任意の置換基若しくは官能基を介して、非天然アミノ酸ポリペプチドとカップリングさせることができる。
【０５９６】
水溶性ポリマーは、本明細書に記載の（天然又は合成）ポリペプチド、ポリヌクレオチド、多糖類又は合成ポリマーに組み込まれた非天然アミノ酸とカップリングさせることができる。水溶性ポリマーは、ポリペプチド中に組み込まれた非天然アミノ酸、非天然アミノ酸の任意の官能基若しくは置換基、又は非天然アミノ酸に付加した任意の官能基若しくは置換基を介して、カップリングさせることができる。本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドは、水溶性ポリマーとカップリングした１個以上の非天然アミノ酸及び水溶性ポリマーと連結された１個以上の天然アミノ酸を含む。親水性ポリマーと生物活性分子の共有結合は、タンパク質、ペプチド及び特に疎水性分子を含めて、生物活性分子の（生理学的環境などにおける）水溶性の増大、生物学的利用能、血清半減期の延長、治療上の半減期の延長、免疫原性の調節、生物活性の調節又は循環時間の延長のための一手法である。かかる親水性ポリマーのさらなる重要な特徴としては、生体適合性、無毒性、非免疫原性などが挙げられる。最終製品を治療に使用するために、ポリマーは薬剤として許容されるものであることが好ましい。
【０５９７】
親水性ポリマーの例としては、ポリアルキルエーテル及びアルコキシの付加したその類似体（例えば、ポリオキシエチレングリコール、ポリオキシエチレン／プロピレングリコール、及びメトキシ又はエトキシの付加したその類似体、特にポリオキシエチレングリコール。ポリオキシエチレングリコールはポリエチレングリコール又はＰＥＧとしても知られる。）；ポリビニルピロリドン；ポリビニルアルキルエーテル；ポリオキサゾリン、ポリアルキルオキサゾリン及びポリヒドロキシアルキルオキサゾリン；ポリアクリルアミド、ポリアルキルアクリルアミド及びポリヒドロキシアルキルアクリルアミド（例えば、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド及びその誘導体）；ポリヒドロキシアルキルアクリラート；ポリシアル酸及びその類似体；親水性ペプチド配列；多糖並びにデキストラン及びデキストラン誘導体、例えば、カルボキシメチルデキストラン、デキストラン硫酸、アミノデキストランを含めたその誘導体；セルロース及びその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース；キチン及びその誘導体、例えば、キトサン、スクシニルキトサン、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルキトサン；ヒアルロン酸及びその誘導体；デンプン；アルギン酸塩；コンドロイチン硫酸；アルブミン；プルラン及びカルボキシメチルプルラン；ポリアミノ酸及びその誘導体、例えば、ポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリアスパラギン酸、ポリアスパルトアミド；スチレン無水マレイン酸コポリマー、ジビニルエチルエーテル無水マレイン酸コポリマーなどの無水マレイン酸コポリマー；ポリビニルアルコール；これらのコポリマー；これらのターポリマー；これらの混合物及びこれらの誘導体が挙げられるが、これらだけに限定されない。水溶性ポリマーは、線状、叉状又は分枝状を含めて、但しこれらだけに限定されない任意の構造形態とすることができる。一部の実施形態においては、２から約３００個の末端を有する水溶性ポリマー骨格は特に有用である。多官能ポリマー誘導体としては、同じでも異なっていてもよい官能基に結合した２個の末端を有する線状ポリマーなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。一部の実施形態においては、水ポリマーはポリ（エチレングリコール）部分を含む。ポリマーの分子量は、これだけに限定されないが、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａ以上の広範囲とすることができる。ポリマーの分子量は、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ及び１００Ｄａを含めて、但しこれらだけに限定されない約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａとすることができる。一部の実施形態においては、ポリマーの分子量は約１００Ｄａから５０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、ポリマーの分子量は約１００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、ポリマーの分子量は約１，０００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、ポリマーの分子量は約５，０００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、ポリマーの分子量は約１０，０００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、ポリ（エチレングリコール）分子は分枝ポリマーである。分枝鎖ＰＥＧの分子量は、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ及び１，０００Ｄａを含めて、但しこれらだけに限定されない約１，０００Ｄａから約１００，０００Ｄａであり得る。一部の実施形態においては、分枝鎖ＰＥＧの分子量は約１，０００Ｄａから５０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、分枝鎖ＰＥＧの分子量は約１，０００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、分枝鎖ＰＥＧの分子量は約５，０００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、分枝鎖ＰＥＧの分子量は約５，０００Ｄａから２０，０００Ｄａである。当業者は、実質的に水溶性である骨格の上記リストが決して網羅的なものではなく、単に説明のためのものであって、上記性質を有する全てのポリマー材料が本明細書の方法及び組成物における使用に適切であると企図されることを認識されたい。
【０５９８】
上述したように、親水性ポリマーの一例はＰＥＧと略記されるポリ（エチレングリコール）である。ＰＥＧは、薬剤、人工移植片並びに生体適合性、無毒性及び非免疫原性が重要である他の用途で広範に使用されている。本明細書に記載のポリマー：ポリペプチド（ｐｏｌｙｅｐｔｉｄｅ）の実施形態は、他の親水性ポリマーもかかる実施形態においては同様に利用し得ることを理解した上で、親水性ポリマーの例としてＰＥＧを使用する。
【０５９９】
ＰＥＧは、市販されている、又は当分野で周知の方法に従ってエチレングリコールの開環重合によって調製することができる、周知の水溶性ポリマーである（Ｓａｎｄｌｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｒｏ，  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｖｏｌ．３，  ｐａｇｅｓ  １３８−１６１）。ＰＥＧは、一般に、透明、無色、無臭、水溶性で、熱に対して安定であり、多数の化学薬品に対して不活性であり、加水分解されず、又は劣化せず、一般に無毒である。ポリ（エチレングリコール）は生体適合性であると考えられる。すなわち、ＰＥＧは、害を及ぼさずに生組織又は生物と共存することができる。より具体的には、ＰＥＧは、実質的に非免疫原性である。すなわち、ＰＥＧは、体内で免疫応答を生じる傾向にはない。ＰＥＧは、生物活性剤など体内である望ましい機能を有する分子に結合すると、その剤をマスクする傾向にあり、あらゆる免疫応答を軽減又は排除することができ、その結果、生物は、その剤の存在に寛容になり得る。ＰＥＧ複合体は、実質的な免疫応答を生じる傾向にはなく、凝固又は他の望ましくない効果を起こす傾向にもない。
【０６００】
「ＰＥＧ」という用語は、サイズ又はＰＥＧ末端の修飾にかかわらず広義に用いられあらゆるポリエチレングリコール分子を包含し、次式によって非天然アミノ酸ポリペプチドに連結して表すことができる。
【０６０１】
ＸＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｙ
式中、ｎは２から１０，０００であり、ＸはＨ又はＣ１−４アルキル、保護基又は末端官能基を含めて、但しこれらだけに限定されない末端修飾である。
ＰＥＧという用語は、二官能ＰＥＧ、複数の腕を有するＰＥＧ、誘導体化されたＰＥＧ、叉状ＰＥＧ、分枝ＰＥＧ（各鎖は、約１ｋＤａから約１００ｋＤａ、約１ｋＤａから約５０ｋＤａ又は約１ｋＤａから約２０ｋＤａの分子量を有する。）、懸垂ＰＥＧ（すなわち、ポリマー骨格に懸垂した１個以上の官能基を有するＰＥＧ又は関係するポリマー）、又はその中に分解性リンケージを含むＰＥＧを含めた形態のいずれかのポリ（エチレングリコール）などを含むが、これらだけに限定されない。一実施形態においては、ｎが約２０から約２０００であるＰＥＧは、本明細書の方法及び組成物に使用するのに適切である。一部の実施形態においては、水ポリマーはポリ（エチレングリコール）部分を含む。ＰＥＧポリマーの分子量は、これだけに限定されないが、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａ以上の広範囲とすることができる。ＰＥＧポリマーの分子量は、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ及び１００Ｄａを含めて、但しこれらだけに限定されない約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａとすることができる。一部の実施形態においては、ＰＥＧポリマーの分子量は約１００Ｄａから５０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、ＰＥＧポリマーの分子量は約１００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、ＰＥＧポリマーの分子量は約１，０００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、ＰＥＧポリマーの分子量は約５，０００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、ＰＥＧポリマーの分子量は約１０，０００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、ポリ（エチレングリコール）分子は分枝ポリマーである。分枝鎖ＰＥＧの分子量は、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ及び１，０００Ｄａを含めて、但しこれらだけに限定されない約１，０００Ｄａから約１００，０００Ｄａであり得る。一部の実施形態においては、分枝鎖ＰＥＧの分子量は約１，０００Ｄａから５０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、分枝鎖ＰＥＧの分子量は約１，０００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、分枝鎖ＰＥＧの分子量は約５，０００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、分枝鎖ＰＥＧの分子量は約５，０００Ｄａから２０，０００Ｄａである。種々のＰＥＧ分子が、参照により本明細書に組みこむＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，  Ｉｎｃ．カタログ、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓカタログを含めて、但しこれだけに限定されないカタログに記載されている。
【０６０２】
文献中の末端官能基の具体例としては、Ｎ−スクシンイミジルカルボナート（例えば、米国特許第５，２８１，６９８号、同５，４６８，４７８号を参照されたい。）、アミン（例えば、Ｂｕｃｋｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍａｋｒｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １８２：１３７９（１９８１）、Ｚａｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．  Ｊ．  １９：１１７７（１９８３）を参照されたい。）、ヒドラジド（例えば、Ａｎｄｒｅｓｚ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍａｋｒｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １７９：３０１（１９７８）を参照されたい。）、スクシンイミジルプロピオナート及びスクシンイミジルブタノアート（例えば、Ｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  ｉｎ  Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  ｐｐ  １７０−１８１，  Ｈａｒｒｉｓ  ＆  Ｚａｌｉｐｓｋｙ  Ｅｄｓ．，  ＡＣＳ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．，  １９９７を参照されたい。米国特許第５，６７２，６６２号も参照されたい。）、スクシンイミジルスクシナート（例えば、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ７：１７５（１９８４）及びＪｏｐｐｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍａｃｒｏｌｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  １８０：１３８１（１９７９）を参照されたい。、スクシンイミジルエステル（例えば、米国特許第４，６７０，４１７号を参照されたい。）、ベンゾトリアゾールカルボナート（例えば、米国特許第５，６５０，２３４号を参照されたい。）、グリシジルエーテル（例えば、Ｐｉｔｈａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｕｒ．  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ９４：１１（１９７９）、Ｅｌｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １３：３５４（１９９１）を参照されたい。、オキシカルボニルイミダゾール（例えば、Ｂｅａｕｃｈａｍｐ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  １３１：２５（１９８３）、Ｔｏｎｄｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １：２５１（１９８５）を参照されたい。）、ｐ−ニトロフェニルカルボナート（例えば、Ｖｅｒｏｎｅｓｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  １１：１４１（１９８５）及びＳａｒｔｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，  ２７：４５（１９９１）を参照されたい。）、アルデヒド（例えば、Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｐｏｌｙｍ．  Ｓｃｉ．  Ｃｈｅｍ．  Ｅｄ．  ２２：３４１（１９８４）、米国特許第５，８２４，７８４号、同５，２５２，７１４号を参照されたい。）、マレイミド（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：３４３（１９９０）、Ｒｏｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ２：２９（１９８４））及びＫｏｇａｎ，  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｍ．  ２２：２４１７（１９９２）を参照されたい。）、オルトピリジルジスルフィド（例えば、Ｗｏｇｈｉｒｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｏｎｊ．  Ｃｈｅｍ．  ４：３１４（１９９３）を参照されたい。）、アクリロール（例えば、Ｓａｗｈｎｅｙ  ���ｔ  ａｌ．，  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  ２６：５８１（１９９３）を参照されたい。）、ビニルスルホン（例えば、米国特許第５，９００，４６１号を参照されたい。）などが挙げられるが、これらだけに限定されない。上記参考文献及び特許の全てを参照によりその全体を本明細書に組みこむ。
【０６０３】
ＰＥＧは、一端がヒドロキシ又はメトキシで終結している、すなわち、ＸがＨ又はＣＨ３（「メトキシＰＥＧ」）である場合もある。或いは、ＰＥＧは反応基で終結し、それによって二官能ポリマーを形成し得る。典型的な反応基としては、（マレイミド基、（ｐ−ニトロフェニルエステルを含めて、但しこれだけに限定されない）活性カルボナート、（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルエステルを含めて、但しこれらだけに限定されない）活性エステル及びアルデヒドを含めて、但しこれらだけに限定されない）２０種類の一般的アミノ酸中に存在する官能基との反応に、及び（オキシム、カルボニル又はジカルボニル及びヒドロキシルアミン基を含めて、但しこれらだけに限定されない）２０種類の一般的アミノ酸に対して不活性であるが、非天然アミノ酸中に存在する相補的官能基と特異的に反応する官能基との反応に、一般に使用される反応基などが挙げられる。
【０６０４】
上式でＹで示されるＰＥＧのもう一方の末端は、非天然アミノ酸を介して、（合成又は天然）ポリペプチド、ポリヌクレオチド、多糖又は合成ポリマーに直接的又は間接的に結合することに留意されたい。Ｙがヒドロキシルアミン基であるときには、ヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬は、ポリペプチド中のカルボニル含有又はジカルボニル含有非天然アミノ酸と反応して、オキシムリンケージを介してポリペプチドと連結されたＰＥＧ基を形成することができる。Ｙがカルボニル又はジカルボニル基であるときには、カルボニル含有又はジカルボニル含有ＰＥＧ試薬は、ポリペプチド中のヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸と反応して、オキシムリンケージを介してポリペプチドと連結されたＰＥＧ基を形成することができる。Ｙがカルボニル又はジカルボニル基であるときには、カルボニル含有又はジカルボニル含有ＰＥＧ試薬は、ポリペプチド中のオキシム含有非天然アミノ酸と反応して、新しいオキシムリンケージを介してポリペプチドと連結されたＰＥＧ基を形成することができる。適切な反応条件、精製方法及び試薬の例を本明細書及び添付の図を通して記述する。例えば、図７は、カルボニル含有非天然アミノ酸ポリペプチドとヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬が反応して、ＰＥＧ基に連結されたオキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドを形成する３つの例である。また、図９は、オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドとカルボニル含有ＰＥＧ試薬が反応して、ＰＥＧ基に連結された新しいオキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドを形成する２つの例である。また、図１０は、ヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドとカルボニル含有ＰＥＧ試薬が反応して、ＰＥＧ基に連結されたオキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドを形成する一例である。
【０６０５】
本明細書に記載の組成物、方法、技術及び戦略と併用することができるＰＥＧ試薬のタイプ又はクラスに対する限定としてではなく、単なる例として、図１１も、カルボニル含有非天然アミノ酸ポリペプチドと反応して、ＰＥＧ基に連結したオキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドを形成することができるヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬の説明例であり、また、オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチド又はヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドと反応して、ＰＥＧ基に連結した新しいオキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドを形成することができるカルボニル含有ＰＥＧ試薬の例である。図１２は、ヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬、ヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬の保護された形態又はヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬のマスクされた形態を形成する合成方法の説明のための４つの例である。図１３は、アミド連結ヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬、アミド連結ヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬の保護された形態又はアミド連結ヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬のマスクされた形態を形成する合成方法の説明例である。図１４及び１５は、カルバマート連結ヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬、カルバマート連結ヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬の保護された形態又はカルバマート連結ヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬のマスクされた形態を形成する合成方法の説明例である。図１６は、単純なヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬、単純なヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬の保護された形態又は単純なヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬のマスクされた形態を形成する合成方法の説明例である。また、図１７は、複数の枝分かれした連結ＰＥＧ基を有するヒドロキシルアミン含有試薬の説明例であり、さらに、かかる複数のＰＥＧ分枝を有するヒドロキシルアミン含有試薬１種類とカルボニル含有非天然アミノ酸ポリペプチドが反応して、複数のＰＥＧ分枝基が連結したオキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドを形成することを示す。
【０６０６】
ヘテロ二官能誘導体は、ポリマーの各末端に異なる分子を結合させたいときにも特に有用である。例えば、オメガ−Ｎ−アミノ−Ｎ−アジドＰＥＧは、アルデヒド、ケトン、活性エステル、活性カルボナートなどの活性求電子基を有する分子をＰＥＧの一端に結合させ、アセチレン基を有する分子をＰＥＧのもう一端に結合させることができる。
【０６０７】
一部の実施形態においては、（ヒドロキシルアミンを含めて、但しこれだけに限定されない）強力な求核剤は、非天然アミノ酸中に存在するアルデヒド又はケトン基と反応して、オキシムを形成することができる。オキシムは、適切な還元剤で処理することによってさらに還元できる場合がある。或いは、強力な求核剤を、非天然アミノ酸を介してポリペプチドに組み込むことができ、それを使用して、水溶性ポリマー中に存在するケトン又はアルデヒド基と優先的に反応させることができる。一般に、ＰＥＧ分子の少なくとも一方の末端は、非天然アミノ酸との反応に利用可能である。
【０６０８】
したがって、一部の実施形態においては、非天然アミノ酸を含むポリペプチドを、非天然アミノ酸の側鎖を介して、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの水溶性ポリマーと連結する。本明細書に記載の非天然アミノ酸の方法及び組成物は、タンパク質をＰＥＧ誘導体で選択的に修飾する効率の高い方法を提供する。この方法は、天然に組み込まれた２０種類のアミノ酸には存在しない官能基又は置換基を含むアミノ酸を含めて、但しこれらだけに限定されない非天然アミノ酸を、選択コドンに応じてタンパク質に選択的に組み込み、続いてこれらのアミノ酸を適切には反応性のＰＥＧ誘導体で修飾することを含む。多種多様な公知の化学反応方法は、水溶性ポリマーをタンパク質に組み込むために、本明細書に記載の非天然アミノ酸の方法及び組成物と併用するのに適切である。
【０６０９】
ポリマー骨格は線状でも分枝状でもよい。分枝ポリマー骨格は、一般に当分野で公知である。一般に、分枝ポリマーは、中心の枝の核部分と、中心の枝の核部分に連結された複数の線状ポリマー鎖を有する。ＰＥＧは、グリセリン、グリセリンオリゴマー、ペンタエリスリトール、ソルビトールなどの種々のポリオールにエチレンオキシドを付加することによって調製することができる分枝形態で使用される。中心の枝部分は、リジンなど幾つかのアミノ酸から誘導することもできる。分枝ポリ（エチレングリコール）は、Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｍ（式中、Ｒはグリセリン、グリセリンオリゴマー、ペンタエリスリトールなどの核部分から誘導され、ｍは腕の数である。）の一般的形態で表すことができる。その各々を参照によりその全体を本明細書に組みこむ米国特許第５，９３２，４６２号  同５，６４３，５７５号、同５，２２９，４９０号、同４，２８９，８７２号、米国特許公開第２００３／０１４３５９６号、国際公開第９６／２１４６９号及び国際公開第９３／２１２５９号に記載のものなど複数の腕を有するＰＥＧ分子もポリマー骨格として使用することができる。
【０６１０】
分枝ＰＥＧは、ＰＥＧ（−ＹＣＨＺ２）ｎ（式中、Ｙは連結基であり、Ｚは規定の長さの原子鎖によってＣＨに連結された活性末端基である。）で表される叉状ＰＥＧの形態とすることもできる。さらに別の分枝形態である懸垂ＰＥＧは、ＰＥＧ鎖の末端ではなくＰＥＧ骨格に沿ってカルボキシルなどの反応基を有する。
【０６１１】
ＰＥＧのこれらの形態に加えて、骨格中に弱いリンケージ又は分解性リンケージを有するポリマーも調製することができる。例えば、ポリマー骨格中に加水分解され易いエステルリンケージを有するＰＥＧを調製することができる。本明細書に示すように、この加水分解によって、ポリマーはより低分子量の断片に開裂する。
【０６１２】
−ＰＥＧ−ＣＯ２−ＰＥＧ−＋Ｈ２Ｏ  −＞  −ＰＥＧ−ＣＯ２Ｈ＋ＨＯ−ＰＥＧ−
ポリエチレングリコール、すなわちＰＥＧという用語は、本明細書に開示するものを含めて、但しこれらだけに限定されない当分野で公知の全ての形態を表し、又は含むことを当業者は理解されたい。ＰＥＧの分子量は、これだけに限定されないが、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａ以上の広範囲とすることができる。ＰＥＧの分子量は、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ及び１００Ｄａを含めて、但しこれらだけに限定されない約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａとすることができる。一部の実施形態においては、ＰＥＧの分子量は約１００Ｄａから５０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、ＰＥＧの分子量は約１００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、ＰＥＧの分子量は約１，０００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、ＰＥＧの分子量は約５，０００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、ＰＥＧの分子量は約１０，０００Ｄａから４０，０００Ｄａである。
【０６１３】
ＰＥＧの所望の諸性質を最大限に活用するために、生物活性分子と結合したＰＥＧポリマーの全分子量及び水和状態は、親分子の生理活性に悪影響を及ぼさずに、水溶性及び循環半減期の増加など、ＰＥＧポリマーの結合に典型的に付随する有利な諸特性を付与するために十分高くなければならない。
【０６１４】
本明細書の方法及び組成物を使用して、実質的に均一なポリマー：タンパク質複合体調製物を製造することができる。本明細書では「実質的に均一」とは、ポリマー：タンパク質複合体分子が総タンパク質の半分よりも多いと認められることを意味する。ポリマー：タンパク質複合体は生物活性を有し、本明細書に記載の「実質的に均一」なＰＥＧ化ポリペプチド調製物は、均一調製物の利点（例えば、ロットごとの薬物動態学を予測するのに臨床的に容易に応用できる。）を示すのに十分均一である調製物である。
【０６１５】
ポリマー：タンパク質複合体分子の混合物を調製するようにしてもよい。本明細書において提供される利点は、モノポリマー：タンパク質複合体の比率を、混合物に含むように選択できることである。したがって、必要に応じて、種々のタンパク質と様々な数の結合ポリマー部分（すなわち、ジ、トリ、テトラなど）との混合物を調製することができ、前記複合体を、本明細書の方法によって調製されたモノポリマー：タンパク質複合体と組み合わせることができ、所定比率のモノポリマー：タンパク質複合体を含む混合物を得ることができる。
【０６１６】
ポリエチレングリコール分子とタンパク質分子の比率は変動し、反応混合物中のそれらの濃度も変動する。一般に、（過剰の未反応タンパク質又はポリマーが最少となる反応効率の点での）最適比は、選択したポリエチレングリコールの分子量及び利用可能な反応基の数によって決定することができる。分子量に関して、典型的には、ポリマー分子量が高いほど、タンパク質に結合し得るポリマー分子の数は少なくなる。同様に、これらのパラメータを最適化するときには、ポリマーの分枝を考慮すべきである。一般に、分子量が高いほど（又は分枝が多いほど）ポリマー：タンパク質比は高くなる。
【０６１７】
本明細書では、親水性ポリマー：ポリペプチド／タンパク質複合体を企図するときには、「治療有効量」という用語は、さらに、所望の利点の増大を患者にもたらす量を指す。この量は、個体ごとに変動し、患者の全体的体調及び治療すべき疾患、障害又は症状の根本的原因を含めて幾つかの要因に左右される。本組成物の治療有効量は、公的に利用可能な材料及び手順を用いて当業者が容易に確認することができる。
【０６１８】
本明細書に記載の「修飾又は非修飾」非天然アミノ酸ポリペプチドに連結された水溶性ポリマーの数（すなわち、ＰＥＧ化又はグリコシル化の程度）は、インビボでの半減期などの薬理的、薬物動態学的又は薬力学的特性を（増加又は減少を含めて、但しこれらだけに限定されない）変更するために調節することができる一部の実施形態においては、ポリペプチドの半減期は、無修飾ポリペプチドの少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０パーセント、２倍、５倍、１０倍、５０倍又は少なくとも約１００倍増加する。
【０６１９】
一実施形態においては、カルボニル含有又はジカルボニル含有非天然アミノ酸を含むポリペプチドは、ＰＥＧ骨格に直接連結された末端ヒドロキシルアミン部分を含むＰＥＧ誘導体で修飾されている。
【０６２０】
一部の実施形態においては、ヒドロキシルアミン末端ＰＥＧ誘導体は以下の構造を有する。
【０６２１】
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
式中、Ｒは簡単なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、ｎは１００−１，０００である（すなわち、平均分子量は５−４０ｋＤａである。）。ポリマーの分子量は、これだけに限定されないが、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａ以上の広範囲とすることができる。ポリマーの分子量は、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ及び１００Ｄａを含めて、但しこれらだけに限定されない約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａとすることができる。一部の実施形態においては、ポリマーの分子量は約１００Ｄａから５０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、ポリマーの分子量は約１００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、ポリマーの分子量は約１，０００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、ポリマーの分子量は約５，０００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、ポリマーの分子量は約１０，０００Ｄａから４０，０００Ｄａである。
【０６２２】
別の実施形態においては、カルボニル含有又はジカルボニル含有アミノ酸を含むポリペプチドは、アミドリンケージによってＰＥＧ骨格に連結された末端ヒドロキシルアミン部分を含むＰＥＧ誘導体で修飾されている。
【０６２３】
一部の実施形態においては、ヒドロキシルアミン末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造を有する。
【０６２４】
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
式中、Ｒは簡単なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２−１０であり、ｎは１００−１，０００である（すなわち、平均分子量は５−４０ｋＤａである。）。ポリマーの分子量は、これだけに限定されないが、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａ以上の広範囲とすることができる。ポリマーの分子量は、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ及び１００Ｄａを含めて、但しこれらだけに限定されない約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａとすることができる。一部の実施形態においては、ポリマーの分子量は約１００Ｄａから５０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、ポリマーの分子量は約１００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、ポリマーの分子量は約１，０００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、ポリマーの分子量は約５，０００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、ポリマーの分子量は約１０，０００Ｄａから４０，０００Ｄａである。
【０６２５】
別の実施形態においては、カルボニル含有又はジカルボニル含有アミノ酸を含むポリペプチドは、末端ヒドロキシルアミン部分を含む分枝ＰＥＧ誘導体で修飾され、分枝ＰＥＧの各鎖は１０−４０ｋＤａ、他の実施形態においては５−２０ｋＤａのＭＷを有する。分枝ポリマーの分子量は、これだけに限定されないが、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａ以上の広範囲とすることができる。ポリマーの分子量は、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ及び１００Ｄａを含めて、但しこれらだけに限定されない約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａとすることができる。一部の実施形態においては、ポリマーの分子量は約１００Ｄａから５０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、ポリマーの分子量は約１００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、ポリマーの分子量は約１，０００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、ポリマーの分子量は約５，０００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、ポリマーの分子量は約１０，０００Ｄａから４０，０００Ｄａである。
【０６２６】
別の実施形態においては、非天然アミノ酸を含むポリペプチドは、分枝構造を有する少なくとも１個のＰＥＧ誘導体で修飾されている。一部の実施形態においては、ヒドロキシルアミン基を含むＰＥＧ誘導体は、以下の構造を有する。
【０６２７】
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２］２ＣＨ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
式中、Ｒは簡単なアルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、Ｘは、場合によっては、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）でも存在しなくてもよく、ｍは２−１０であり、ｎは１００−１，０００である。ポリマーの分子量は、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ及び１，０００Ｄａを含めて、但しこれらだけに限定されない約１，０００Ｄａから約１００，０００Ｄａであり得る。一部の実施形態においては、分枝鎖ＰＥＧの分子量は約１，０００Ｄａから５０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、分枝鎖ＰＥＧの分子量は約１，０００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、分枝鎖ＰＥＧの分子量は約５，０００Ｄａから４０，０００Ｄａである。一部の実施形態においては、分枝鎖ＰＥＧの分子量は約５，０００Ｄａから２０，０００Ｄａである。
【０６２８】
ＰＥＧの官能化及び複合化についての幾つかの総説及びモノグラフが利用可能である。例えば、Ｈａｒｒｉｓ，  Ｍａｃｒｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  Ｐｈｙｓ．  Ｃ２５：３２５−３７３（１９８５）；Ｓｃｏｕｔｅｎ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １３５：３０−６５（１９８７）；Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  １４：８６６−８７４（１９９２）；Ｄｅｌｇａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ９：２４９−３０４（１９９２）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ６：１５０−１６５（１９９５）を参照されたい。
【０６２９】
ポリマーを活性化する方法は、国際公開第９４／１７０３９号、米国特許第５，３２４，８４４号、国際公開第９４／１８２４７号、国際公開第９４／０４１９３号、米国特許第５，２１９，５６４号、米国特許第５，１２２，６１４号、国際公開第９０／１３５４０号、米国特許第５，２８１，６９８号及び国際公開第９３／１５１８９号にも記載されている。活性化ポリマーと、凝固第ＶＩＩＩ因子（国際公開第９４／１５６２５号）、ヘモグロビン（国際公開第９４／０９０２７号）、酸素運搬分子（米国特許第４，４１２，９８９号）、リボヌクレアーゼ及びスーパーオキシドジスムターゼ（Ｖｅｒｏｎｅｓｅ  ａｔ  ａｌ．，  Ａｐｐ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １１：１４１−１５２（１９８５））を含めて、但しこれらだけに限定されない酵素とを連結する方法も記載されている。これら全てを参照によりその全体を本明細書に組みこむ。
【０６３０】
必要に応じて、疎水性クロマトグラフィーから得られた、本明細書に記載のＰＥＧ化非天然アミノ酸ポリペプチドは、アフィニティークロマトグラフィー；（ＤＥＡＥ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥの使用を含めて、但しこれだけに限定されない）陰イオン若しくは陽イオン交換クロマトグラフィー；シリカクロマトグラフィー；逆相ＨＰＬＣ；（ＳＥＰＨＡＤＥＸ  Ｇ−７５の使用を含めて、但しこれだけに限定されない）ゲルろ過；疎水性相互作用クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー、金属−キレートクロマトグラフィー；限外ろ過／透析ろ過；エタノール沈殿；硫安塩析；等電点電気泳動；置換クロマトグラフィー；（調製用等電点電気泳動を含めて、但しこれだけに限定されない）電気泳動手順、（硫安塩析を含めて、但しこれだけに限定されない）示差溶解性又は抽出を含めて、但しこれらだけに限定されない当業者に公知の１つ以上の手順によってさらに精製することができる。見掛け分子量は、ＧＰＣによって、球状タンパク質標準と比較して推定することができる（Ｐｒｅｎｅｔａ  ＡＺ，  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＭＥＴＨＯＤＳ，  Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｈａｒｒｉｓ  ＆  Ａｎｇａｌ，  Ｅｄｓ．）ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９，  ２９３−３０６）。非天然アミノ酸ポリペプチド：ＰＥＧ複合体の純度は、（トリプシン切断を含めて、但しこれだけに限定されない）タンパク質分解とそれに続く質量分析法によって評価することができる。Ｐｅｐｉｎｓｋｙ  ＲＢ．，  ｅｔ．ａｌ，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ＆  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．  ２９７（３）：１０５９−６６（２００１）。
【０６３１】
本明細書に記載のポリペプチドの非天然アミノ酸に連結された水溶性ポリマーは、制限なくさらに誘導体化又は置換することができる。
【０６３２】
Ｅ．  血清アルブミンに対する親和性の増大
種々の分子を本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドと融合させて血清中の半減期を調節することもできる。一部の実施形態においては、分子を本明細書に記載の「修飾又は非修飾」非天然アミノ酸ポリペプチドと連結又は融合させて、動物における内因性血清アルブミンに対する親和性を増大させる。
【０６３３】
例えば、ポリペプチドとアルブミン結合配列の組換え融合を行う。例示的なアルブミン結合配列としては、連鎖球菌Ｇタンパク質から得られるアルブミン結合ドメイン（例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．  ２７７（１）：５３４−５４２（１９９６）及びＳｊｏｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１：１１５−１２３（１９９７）を参照されたい。）又は例えばＤｅｎｎｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７７（３８）：３５０３５−３５０４３（２００２）に記載のものなどのアルブミン結合ペプチドが挙げられるが、これらだけに限定されない。
【０６３４】
他の実施形態においては、本明細書に記載の「修飾又は非修飾」非天然アミノ酸ポリペプチドは脂肪酸でアシル化されている。脂肪酸は、血清アルブミンとの結合を促進する場合がある。例えば、Ｋｕｒｔｚｈａｌｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．  ３１２：７２５−７３１（１９９５）を参照されたい。
【０６３５】
他の実施形態においては、本明細書に記載の「修飾又は非修飾」非天然アミノ酸ポリペプチドを（ヒト血清アルブミンを含めて、但しこれだけに限定されない）血清アルブミンと直接融合させる。当業者は、多種多様な他の分子を本明細書に記載の修飾又は非修飾の非天然アミノ酸ポリペプチドと連結させて、血清アルブミン又は他の血清成分との結合を調整することもできることを認識されたい。
【０６３６】
Ｆ．  本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドのグリコシル化
本明細書の方法及び組成物は、糖残基を有する１個以上の非天然アミノ酸を組み込んだポリペプチドを含む。糖残基は、（Ｎ−アセチルグルコサミンを含めて、但しこれだけに限定されない）天然でも（３−フルオロガラクトースを含めて、但しこれだけに限定されない）非天然でもよい。糖は、（Ｎ−アセチルガラクトース−Ｌ−セリンを含めて、但しこれだけに限定されない）Ｎ若しくはＯ連結グリコシドリンケージ又は（オキシム又は対応するＣ若しくはＳ連結グリコシドを含めて、但しこれらだけに限定されない）非天然リンケージによって非天然アミノ酸に連結することができる。
【０６３７】
（グリコシルを含めて、但しこれだけに限定されない）糖部分を、インビボでもインビトロでも非天然アミノ酸ポリペプチドに付加させることができる。一部の実施形態においては、カルボニル含有又はジカルボニル含有非天然アミノ酸を含むポリペプチドを、アミノオキシ基を用いて誘導体化した糖で修飾して、オキシムリンケージによって連結された対応するグリコシル化ポリペプチドを生成する。糖は、非天然アミノ酸と結合した後、糖転移酵素及び他の酵素で処理することによってさらに手を加えて、非天然アミノ酸ポリペプチドと結合したオリゴ糖を生成することができる。例えば、Ｈ．  Ｌｉｕ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  １２５：１７０２−１７０３（２００３）を参照されたい。
【０６３８】
Ｇ．  ポリペプチド２量体及び多量体を含めた連結基の使用並びに適用例
非天然アミノ酸ポリペプチドに官能基を直接付加させることに加えて、ポリペプチドの非天然アミノ酸部分をまず多官能（例えば、二官能、三官能、四官能）リンカー分子で修飾することができ、続いてさらに修飾する。すなわち、多官能リンカー分子の少なくとも１個の末端をポリペプチド中の少なくとも１個の非天然アミノ酸と反応させ、多官能リンカーの少なくとも１個の他の末端をさらなる官能化に利用することができる。多官能リンカーの全末端が同一である場合には、（化学量論的条件に応じて）非天然アミノ酸ポリペプチドのホモ多量体を形成し得る。多官能リンカーの末端が異なる化学反応性を有する場合には、多官能リンカー基の少なくとも１個の末端を非天然アミノ酸ポリペプチドと結合させ、続いて他の末端を、単なる例として以下を含めて、異なる官能基と反応させることができる：標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコール誘導体；光架橋剤；細胞傷害性化合物；薬物；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質又はポリペプチド又はポリペプチドアナログ；抗体又は抗体断片；金属キレート剤；補因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；糖類、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、生体材料；ナノ粒子；スピン標識；フルオロフォア、金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合的又は非共有結合的に相互作用する基；フォトケージド部分；化学線放射によって励起可能な部分；リガンド；光異性化可能部分；ビオチン；ビオチンアナログ；重原子を組み込んだ部分；化学開裂可能な基；光開裂可能な基；長い側鎖；炭素連結糖；レドックス活性薬剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識部分；生物物理学的プローブ；リン光基；化学発光基；高電子密度基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達剤；生物活性剤；検出可能標識；小分子；抑制性リボ核酸、放射性ヌクレオチド；中性子捕獲剤；ビオチン誘導体；量子ドット；ナノ伝達物質；放射性伝達物質、アブザイム、活性錯体活性化物質、ウイルス、アジュバント、アグリカン、アレルガン、アンギオスタチン、抗ホルモン、抗酸化物、アプタマー、ガイドＲＮＡ、サポニン、シャトルベクター、巨大分子、ミモトープ、受容体、逆ミセル及びこれらの任意の組み合わせ。
【０６３９】
多官能リンカー基は、以下の一般構造を有する。
【０６４０】
【化１４４】
0005425398.tif 000086
式中、
各Ｘは独立にＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ９、−ＳＲ’又は−Ｊ−Ｒであり、Ｒ９はＨ又はＯＲ’であり、Ｊは
【０６４１】
【化１４５】
0005425398.tif 000087
であり、
ＲはＨ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル若しくは置換シクロアルキルであり、各Ｒ”は独立にＨ、アルキル、置換アルキル若しくは保護基であり、又は１個を超えるＲ”基が存在するときには、２個のＲ”はヘテロシクロアルキルを形成していてもよく、
各Ｒ’は独立にＨ、アルキル又は置換アルキルであり、
各Ｌは、アルキレン、置換アルキレン、アルケニレン、置換アルケニレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ｋは１、２又は３である。）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−（アルキレン又は置換アルキレン）ＮＲ’Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｏ−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−（アルキレン又は置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−からなる群から独立に選択され、
Ｌ１は任意であり、存在するときには、−Ｃ（Ｒ’）ｐ−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（アルキレン又は置換アルキレン）−（式中、ｐは０、１又は２である。）であり、
ＷはＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ９、−ＳＲ’又は−Ｊ−Ｒであり、ｎは１から３であり、
但し、Ｘ及びＬ−Ｌ１−Ｗは独立に各々、（ａ）非天然アミノ酸又は「修飾又は非修飾」非天然アミノ酸ポリペプチド上の（ジカルボニルを含めた）カルボニル基と反応することができるヒドロキシルアミン基、（ｂ）非天然アミノ酸又は「修飾又は非修飾」非天然アミノ酸ポリペプチド上のヒドロキシルアミン基と反応することができる（ジカルボニル基を含めた）カルボニル基、又は（ｃ）非天然アミノ酸又は「修飾又は非修飾」非天然アミノ酸ポリペプチド上のオキシム基と交換反応することができる（ジカルボニル基を含めた）カルボニル基の少なくとも１個である。
【０６４２】
図１８は、二官能ホモリンカーの合成の説明のための非限定的例である。ここで、リンカーは、２個の同一の末端、すなわち、ヒドロキシルアミン基を有する。かかるリンカーを使用して、カルボニル含有又はジカルボニル含有非天然アミノ酸ポリペプチドのホモ２量体を形成して、２個のオキシムリンケージを形成することができる。或いは、かかるリンカーの一方の末端が保護されている場合には、かかる部分的に保護されたリンカーを使用して、非保護ヒドロキシルアミン末端をカルボニル含有又はジカルボニル含有非天然アミノ酸ポリペプチドにオキシムリンケージを介して結合させ、もう一方の保護された末端を、脱保護後のさらなる連結反応に備えて利用可能なままにしておくことができる。或いは、試薬の化学量論を慎重に操作して、所望のヘテロ２量体があるホモ２量体で汚染される可能性はあるが、類似の結果（ヘテロ２量体）を得ることができる。
【０６４３】
図１９は、２個の多官能ヘテロリンカーの説明のための非限定的例である。ここで、各リンカーは、１個を超えるタイプの末端反応基、すなわち、ヒドロキシルアミン、オキシム及びチオエステル基を有する。かかるリンカーを使用して、本明細書を通して考察するオキシムを用いた化学反応によって、非天然アミノ酸ポリペプチドのヘテロ２量体を形成することができる。
【０６４４】
図２０は、多段階合成においてＰＥＧ基を非天然アミノ酸ポリペプチドに結合させるヘテロ二官能リンカーの使用の概略の説明のための非限定的例である。第一段階においては、この説明図に示すように、カルボニル含有非天然アミノ酸ポリペプチドはヒドロキシルアミン含有二官能リンカーと反応して、修飾オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドを形成する。しかし、二官能リンカーは、（ある形状の物体によってここでは示される）官能基を依然として保持し、（合致する形状の物体（ｍａｔｃｈｉｎｇ  ｓｈａｐｅｄ  ｏｂｊｅｃｔ）として図示される）適切な反応性を有する試薬と反応して、官能性を有する修飾オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドを形成することができる。この特定の説明図においては、官能化はＰＥＧ基であるが、上記官能基のいずれかを含むこともでき、又は三官能若しくは四官能リンカーの場合、１つを超えるタイプの官能性若しくは複数のタイプの同じ官能性を含むことができる。図２１は、ヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドをＰＥＧ基に連結するのに使用するリンカー基の４タイプの説明例である。上述同様、ＰＥＧ官能基は単なる説明のためのものである。したがって、本明細書に記載のリンカー基によって、非天然アミノ酸ポリペプチドを部位選択的にさらに修飾する追加の手段がもたらされる。
【０６４５】
本明細書の方法及び組成物は、ホモ２量体、ヘテロ２量体、ホモ多量体、ヘテロ多量体（すなわち、３量体、４量体など）などのポリペプチドの組み合わせも規定する。単なる例として、以下の記述は、ＧＨスーパー遺伝子ファミリー構成要素に焦点を合わせる。しかし、本セクションの方法、技術及び組成物は、単なる例として以下のものを含めて、２量体及び多量体の形で利点をもたらし得る、実質的にあらゆる他のポリペプチドに適用することができる：アルファ−１抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学走化性タンパク質−１、単球化学走化性タンパク質−２、単球化学走化性タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１アルファ、単球炎症性タンパク質−１ベータ、ＲＡＮＴＥＳ、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン、上皮性好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮性好中球活性化ペプチド、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、剥脱性毒素、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、４本ヘリックスバンドルタンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、性腺刺激ホルモン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１受容体、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールツリン、好中球抑制因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン、Ａタンパク質、Ｇタンパク質、ｐｔｈ、発熱性外毒素Ａ、発熱性外毒素Ｂ、発熱性外毒素Ｃ、ｐｙｙ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、小さな生合成タンパク質、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原、ブドウ球菌エンテロトキ���ン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群毒素、チモシンアルファ１、組織プラスミノゲンアクチベーター、腫よう成長因子（ＴＧＦ）、腫よう壊死因子、腫よう壊死因子アルファ、腫よう壊死因子ベータ、腫よう壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４タンパク質、ＶＣＡＭ−１タンパク質、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体及びコルチコステロン。
【０６４６】
したがって、別のＧＨスーパー遺伝子ファミリー構成要素若しくはその変異体又は非ＧＨスーパー遺伝子ファミリー構成要素である任意の他のポリペプチド若しくはその変異体に、その骨格に直接、又はリンカーを介して結合した、１個以上の非天然アミノ酸を含むＧＨスーパー遺伝子ファミリー構成要素のポリペプチドは、本明細書の方法、技術及び組成物に包含される。ＧＨスーパー遺伝子ファミリー構成要素の２量体又は多量体複合体は、単量体よりも分子量が増加しているので、単量体のＧＨスーパー遺伝子ファミリー構成要素と比較して、異なる薬理学的半減期、薬物動態学的半減期、薬力学的半減期、変化した治療上の半減期、又は変化した血しょう半減期を含めて、但しこれらだけに限定されない新しい諸特性又は望ましい諸特性を示し得る。一部の実施形態においては、本明細書に記載のＧＨスーパー遺伝子ファミリー構成要素の２量体は、ＧＨスーパー遺伝子ファミリー構成要素の受容体の２量体化を調節する。他の実施形態においては、本明細書に記載のＧＨスーパー遺伝子ファミリー構成要素の２量体又は多量体は、ＧＨスーパー遺伝子ファミリー構成要素の受容体の拮抗物質、作動物質又は調節物質として働く。
【０６４７】
一部の実施形態においては、ＧＨスーパー遺伝子ファミリー構成要素のポリペプチドは、これらだけに限定されないがＡｓｎ−Ｌｙｓアミド結合又はＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合を介して直接連結される。一部の実施形態においては、連結されたＧＨスーパー遺伝子ファミリー構成要素のポリペプチド及び／又は連結された非ＧＨスーパー遺伝子ファミリー構成要素は、ヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸を含む第２のＧＨスーパー遺伝子ファミリー構成要素のポリペプチドと複合化された、第１のＧＨスーパー遺伝子ファミリー構成要素及び／又は連結された非ＧＨスーパー遺伝子ファミリー構成要素、ケトン含有非天然アミノ酸を含むポリペプチドを含めて、但しこれらだけに限定されない、２量体化を容易にする異なる非天然アミノ酸を含む。ポリペプチドは、対応するオキシムの形成を介して反応する。
【０６４８】
或いは、２個のＧＨスーパー遺伝子ファミリー構成要素のポリペプチド、及び／又は連結された非ＧＨスーパー遺伝子ファミリー構成要素は、リンカーによって連結される。任意のヘテロ又はホモ二官能リンカーを使用して、一次配列が同じでも異なっていてもよい、２個のＧＨスーパー遺伝子ファミリー構成要素、及び／又は連結された非ＧＨスーパー遺伝子ファミリー構成要素、ポリペプチドを連結することができる。ＧＨスーパー遺伝子ファミリー構成要素及び／又は連結された非ＧＨスーパー遺伝子ファミリー構成要素、ポリペプチドの連結に使用するリンカーは、場合によっては二官能ＰＥＧ試薬とすることができる。
【０６４９】
一部の実施形態においては、本明細書の方法及び組成物は、ａ）ポリマー骨格の少なくとも第１の末端上のアジド、アルキン、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン又はカルボニル含有若しくはジカルボニル含有部分、及びｂ）ポリマー骨格の第２の末端上の少なくとも第２の官能基を含む亜鈴構造を有する水溶性二官能リンカーを与える。第２の官能基は第１の官能基と同じでも異なっていてもよい。一部の実施形態においては、第２の官能基は第１の官能基と反応性ではない。本明細書の方法及び組成物は、一部の実施形態においては、分枝分子構造の少なくとも１本の腕を含む水溶性化合物を与える。例えば、分枝分子構造は樹状とすることができる。
【０６５０】
一部の実施形態においては、本明細書の方法及び組成物は、下記構造を有する水溶性活性化ポリマーとの反応によって形成される１個以上のＧＨスーパー遺伝子ファミリー構成要素を含む多量体を与える。
【０６５１】
Ｒ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｘ
式中、ｎは約５から３，０００であり、ｍは２−１０であり、Ｘはアジド、アルキン、ヒドラジン、ヒドラジド、アミノオキシ基、ヒドロキシルアミン、アセチル又はカルボニル含有若しくはジカルボニル含有部分とすることができ、Ｒは、Ｘと同じでも異なっていてもよい、キャッピング基、官能基又は脱離基である。Ｒは、例えば、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、アルコキシル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル、１−ベンゾトリアゾリルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルカルボナート、１−ベンゾトリアゾリルカルボナート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリラート、メタクリラート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護されたアミン、ヒドラジド、保護されたヒドラジド、保護されたチオール、カルボン酸、保護されたカルボン酸、イソシアナート、イソチオシアナート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシラート、トシラート、トレシラート、アルケン及びケトンからなる群から選択される官能基とすることができる。
【０６５２】
図２２は、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドのホモ２量体を形成するための本明細書に記載のリンカー基の使用の説明のための非限定的例である。この説明例において、カルボニル含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、連結されたホモ２量体オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドの形成に適切な条件下で、２個の利用可能なヒドロキシルアミン基を有する二官能リンカー基と反応する。図に示す方法は、ヒドロキシルアミン含有二官能リンカーとカップリングしたカルボニル含有非天然アミノ酸ポリペプチドに限定されない。非天然アミノ酸ポリペプチドは、（カルボニル含有多官能リンカー基と交換反応を起こして、複数のオキシム基を含む構造が連結したホモ多量体を形成することができる）オキシム基をさらに含み得る。又は非天然アミノ酸ポリペプチドは、（カルボニル含有多官能リンカー基と反応して、複数のオキシム基を含む構造が連結したホモ多量体を形成することができる）ヒドロキシルアミン基をさらに含み得る。言うまでもないが、ホモ多量体は、ホモ２量体、ホモ３量体又はホモ４量体であり得る。
【０６５３】
図２３は、ポリペプチドのヘテロ２量体を形成するヘテロ官能リンカー基の使用の説明のための非限定的例である。ヘテロ２量体の構成要素の少なくとも一方は本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドであり、もう一方の構成要素は、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチド、他のタイプの非天然アミノ酸ポリペプチド又は天然アミノ酸ポリペプチドであってもよい。この図に示す例では、リンカー基は、２個の同一のヒドロキシルアミン基からなる。反応の化学量論、温度及び他のパラメータを制御することによって、リンカーとカルボニル含有非天然アミノ酸ポリペプチドとの反応の主生成物は、利用可能なヒドロキシルアミン基を有するリンカーに結合した修飾オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドである。ヒドロキシルアミン基は、さらに、別のカルボニル又はジカルボニル含有非天然アミノ酸ポリペプチドと反応して、オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドの二官能ヘテロ２量体を形成し得る。言うまでもないが、リンカーの官能基は、同一である必要はなく、ヒドロキシルアミン基である必要もない。本明細書を通して詳述する化学反応を用いて、当業者は、少なくとも一方の官能基が非天然アミノ酸ポリペプチドとオキシム基を形成することができ、リンカーのもう一方の官能基が、求核剤／求電子剤を用いた有機化学分野で周知の化学反応を含めて、他の公知の化学反応を利用することができる、リンカーを設計することができる。
【０６５４】
Ｈ．  官能基を付加する例：ポリペプチドの単離特性の容易化
天然又は非天然アミノ酸ポリペプチドは、ポリペプチドの溶解性又は結合特性を含めて、但しこれらだけに限定されない幾つかの理由のために、試料からの単離が困難な場合がある。例えば、治療用のポリペプチド調製物においては、かかるポリペプチドを、ポリペプチドを過剰産生するように操作された組換え系から単離し得る。しかし、ポリペプチドの溶解性又は結合特性のために、所望の純度を得ることが困難であると判明する場合が多い。本明細書の方法、組成物、技術及び戦略は、この状況を解決するものである。
【０６５５】
本明細書の方法、組成物、技術及び戦略を用いて、当業者は、所望のポリペプチドと相同であるオキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドを製造することができる。ここで、オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、単離特性が改善されている。一実施形態においては、相同の非天然アミノ酸ポリペプチドを生合成的に製造する。さらなる又は追加の実施形態においては、非天然アミノ酸は、その構造中に本明細書に記載の非天然アミノ酸の１個を含む。さらなる又は追加の実施形態においては、非天然アミノ酸は、末端又は内部の位置に組み込まれ、さらに部位特異的に組み込まれる。
【０６５６】
一実施形態においては、生合成的に製造した非天然アミノ酸は、所望の改善された単離特性をすでに有する。さらなる又は追加の実施形態においては、非天然アミノ酸は、改善された単離特性をもたらす基へのオキシムリンケージを含む。さらなる又は追加の実施形態においては、非天然アミノ酸をさらに修飾して修飾オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドを形成する。この修飾によって、改善された単離特性をもたらす基にオキシムリンケージが付与される。一部の実施形態においては、かかる基は非天然アミノ酸に直接連結され、他の実施形態においては、かかる基はリンカー基を介して非天然アミノ酸に連結される。ある実施形態においては、かかる基は、単一の化学反応によって非天然アミノ酸と結合し、他の実施形態においては、かかる基を非天然アミノ酸に結合するには一連の化学反応が必要である。改善された単離特性を付与する基は、非天然アミノ酸ポリペプチド中の非天然アミノ酸に部位特異的に連結され、利用する反応条件下では天然アミノ酸に連結されないことが好ましい。
【０６５７】
さらなる又は追加の実施形態においては、生成した非天然アミノ酸ポリペプチドは、ＧＨスーパー遺伝子ファミリー構成要素と相同である。しかし、本セクションの方法、技術及び組成物は、単なる例として以下のものを含めて、改善された単離特性から利点を得ることができる実質的にあらゆる他のポリペプチドに適用することができる：アルファ−１抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学走化性タンパク質−１、単球化学走化性タンパク質−２、単球化学走化性タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１アルファ、単球炎症性タンパク質−１ベータ、ＲＡＮＴＥＳ、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン、上皮性好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮性好中球活性化ペプチド、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、剥脱性毒素、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、４本ヘリックスバンドルタンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、性腺刺激ホルモン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１受容体、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールツリン、好中球抑制因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン、Ａタンパク質、Ｇタンパク質、ｐｔｈ、発熱性外毒素Ａ、発熱性外毒素Ｂ、発熱性外毒素Ｃ、ｐｙｙ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、小さな生合成タンパク質、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシ���ジスムターゼ、毒素性ショック症候群毒素、チモシンアルファ１、組織プラスミノゲンアクチベーター、腫よう成長因子（ＴＧＦ）、腫よう壊死因子、腫よう壊死因子アルファ、腫よう壊死因子ベータ、腫よう壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４タンパク質、ＶＣＡＭ−１タンパク質、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体及びコルチコステロン。
【０６５８】
さらなる又は追加の実施形態においては、改善された単離特性を付与する基は、ポリペプチドの水溶性を改善する。他の実施形態においては、この基はポリペプチドの結合特性を改善する。他の実施形態においては、この基は、ポリペプチドに（単なる例として、ビオチン基又はビオチン結合基を含めて）新しい結合特性を与える。基がポリペプチドの水溶性を改善する実施形態においては、基は、単なる例として本明細書に記載のＰＥＧポリマー基のいずれかを含めて、本明細書に記載の水溶性ポリマーから選択される。
【０６５９】
Ｉ．  官能基を付加する例：ポリペプチドの存在の検出
天然又は非天然アミノ酸ポリペプチドは、ポリペプチドに容易に結合することができる試薬又は標識の欠如を含めて、但しこれだけに限定されない幾つかの理由のために、（インビボ試料及びインビトロ試料を含めて）試料中で検出することが困難な場合がある。本明細書の方法、組成物、技術及び戦略は、この状況を解決するものである。
【０６６０】
本明細書の方法、組成物、技術及び戦略を用いて、当業者は、所望のポリペプチドと相同であるオキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドを製造することができる。ここで、該オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、インビボ試料及びインビトロ試料中で検出することができる。一実施形態においては、相同の非天然アミノ酸ポリペプチドを生合成的に製造する。さらなる又は追加の実施形態においては、非天然アミノ酸は、その構造中に本明細書に記載の非天然アミノ酸の１個を含む。さらなる又は追加の実施形態においては、非天然アミノ酸は、末端又は内部の位置に組み込まれ、さらに部位特異的に組み込まれる。
【０６６１】
一実施形態においては、生合成的に製造した非天然アミノ酸ポリペプチドは、所望の検出特性をすでに有する。さらなる又は追加の実施形態においては、非天然アミノ酸ポリペプチドは、オキシム含有非天然アミノ酸、カルボニル含有非天然アミノ酸及びヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸からなる群から選択される少なくとも１個の非天然アミノ酸を含む。他の実施形態においては、かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載のポリペプチドに生合成的に組み込まれている。さらなる又は代替の実施形態においては、非天然アミノ酸ポリペプチドは、式Ｉ−ＸＶＩＩＩ、ＸＸＸ−ＸＸＸＩＶ（Ａ＆Ｂ）又はＸＸＸＸ−ＸＸＸＸＩＩＩのアミノ酸から選択される少なくとも１種類の非天然アミノ酸を含む。さらなる又は追加の実施形態においては、非天然アミノ酸は、改善された検出特性をもたらす基へのオキシムリンケージを含む。さらなる又は追加の実施形態においては、非天然アミノ酸をさらに修飾して修飾オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドを形成する。この修飾によって、改善された検出特性をもたらす基にオキシムリンケージが付与される。一部の実施形態においては、かかる基は非天然アミノ酸に直接連結され、他の実施形態においては、かかる基はリンカー基を介して非天然アミノ酸に連結される。ある実施形態においては、かかる基は、単一の化学反応によって非天然アミノ酸と結合し、他の実施形態においては、かかる基を非天然アミノ酸に結合するには一連の化学反応が必要である。好ましくは、改善された検出特性を付与する基は、非天然アミノ酸ポリペプチド中の非天然アミノ酸に部位特異的に連結され、利用する反応条件下では天然アミノ酸に連結されない。
【０６６２】
さらなる又は追加の実施形態においては、生成した非天然アミノ酸ポリペプチドは、ＧＨスーパー遺伝子ファミリー構成要素と相同である。しかし、本セクションの方法、技術及び組成物は、単なる例として以下のものを含めて、インビボ試料及びインビトロ試料中で検出することが必要である、実質的にあらゆる他のポリペプチドに適用することができる：アルファ−１抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学走化性タンパク質−１、単球化学走化性タンパク質−２、単球化学走化性タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１アルファ、単球炎症性タンパク質−１ベータ、ＲＡＮＴＥＳ、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン、上皮性好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮性好中球活性化ペプチド、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、剥脱性毒素、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、４本ヘリックスバンドルタンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、性腺刺激ホルモン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１受容体、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールツリン、好中球抑制因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン、Ａタンパク質、Ｇタンパク質、ｐｔｈ、発熱性外毒素Ａ、発熱性外毒素Ｂ、発熱性外毒素Ｃ、ｐｙｙ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、小さな生合成タンパク質、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体���スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群毒素、チモシンアルファ１、組織プラスミノゲンアクチベーター、腫よう成長因子（ＴＧＦ）、腫よう壊死因子、腫よう壊死因子アルファ、腫よう壊死因子ベータ、腫よう壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４タンパク質、ＶＣＡＭ−１タンパク質、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体及びコルチコステロン。
【０６６３】
さらなる又は追加の実施形態においては、改善された検出特性を付与する基は、標識；色素；親和性標識；光親和性標識；スピン標識；フルオロフォア；放射性部分；重原子を組み入れた部分；同位体標識部分；生物物理学的プローブ；リン光基；化学発光基；高電子密度基；磁性基；発色団；エネルギー伝達剤；検出可能標識及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【０６６４】
Ｊ．  官能基を付加する例：ポリペプチドの治療上の諸性質の改善
天然又は非天然アミノ酸ポリペプチドは、特定の障害、疾患又は症状を有する患者にある種の治療上の利点をもたらすことができる。かかる治療上の利点は、単なる例として、ポリペプチドの安全性プロファイル並びにポリペプチドの薬物動態学、薬理学及び／又は薬力学（例えば、水溶性、生物学的利用能、血清半減期、治療上の半減期、免疫原性、生物活性又は循環時間）を含めて、幾つかの要因に左右される。また、付加された細胞傷害性化合物、薬物などポリペプチドに追加の官能性を付与することが有利である場合がある。又は、追加のポリペプチドを付加して、本明細書に記載のホモ及びヘテロ多量体を形成することが望ましい場合がある。かかる修飾は、元のポリペプチドの活性及び／又は三次構造を破壊しないことが好ましい。本明細書の方法、組成物、技術及び戦略は、これらの問題を解決するものである。
【０６６５】
本明細書の方法、組成物、技術及び戦略を用いて、当業者は、所望のポリペプチドと相同であるオキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドを製造することができる。ここで、オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、治療上の諸性質が改善されている。一実施形態においては、相同の非天然アミノ酸ポリペプチドを生合成的に製造する。さらなる又は追加の実施形態においては、非天然アミノ酸は、その構造中に本明細書に記載の非天然アミノ酸の１個を含む。さらなる又は追加の実施形態においては、非天然アミノ酸は、末端又は内部の位置に組み込まれ、さらに部位特異的に組み込まれる。
【０６６６】
一実施形態においては、生合成的に製造した非天然アミノ酸は、所望の治療上の改善された諸性質をすでに有する。さらなる又は追加の実施形態においては、非天然アミノ酸は、治療上の改善された諸性質をもたらす基へのオキシムリンケージを含む。さらなる又は追加の実施形態においては、非天然アミノ酸をさらに修飾して修飾オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドを形成する。この修飾によって、治療上の改善された諸性質をもたらす基がオキシムリンケージに付与される。一部の実施形態においては、かかる基は非天然アミノ酸に直接連結され、他の実施形態においては、かかる基はリンカー基を介して非天然アミノ酸に連結される。ある実施形態においては、かかる基は、単一の化学反応によって非天然アミノ酸と結合し、他の実施形態においては、かかる基を非天然アミノ酸に結合するには一連の化学反応が必要である。好ましくは、治療上の改善された諸性質を付与する基は、非天然アミノ酸ポリペプチド中の非天然アミノ酸に部位特異的に連結され、利用する反応条件下では天然アミノ酸に連結されない。
【０６６７】
さらなる又は追加の実施形態においては、生成した非天然アミノ酸ポリペプチドは、ＧＨスーパー遺伝子ファミリー構成要素と相同である。しかし、本セクションの方法、技術及び組成物は、単なる例として以下のものを含めて、治療上の改善された諸性質から利点を得ることができる実質的にあらゆる他のポリペプチドに適用することができる：アルファ−１抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学走化性タンパク質−１、単球化学走化性タンパク質−２、単球化学走化性タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１アルファ、単球炎症性タンパク質−１ベータ、ＲＡＮＴＥＳ、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５ａ、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン、上皮性好中球活性化ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮性好中球活性化ペプチド、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、剥脱性毒素、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、４本ヘリックスバンドルタンパク質、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、性腺刺激ホルモン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１受容体、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールツリン、好中球抑制因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン、Ａタンパク質、Ｇタンパク質、ｐｔｈ、発熱性外毒素Ａ、発熱性外毒素Ｂ、発熱性外毒素Ｃ、ｐｙｙ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、小さな生合成タンパク質、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ  １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原、ブドウ球菌エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパー���キシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群毒素、チモシンアルファ１、組織プラスミノゲンアクチベーター、腫よう成長因子（ＴＧＦ）、腫よう壊死因子、腫よう壊死因子アルファ、腫よう壊死因子ベータ、腫よう壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４タンパク質、ＶＣＡＭ−１タンパク質、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体及びコルチコステロン。
【０６６８】
さらなる又は追加の実施形態においては、治療上の改善された諸性質を付与する基は、ポリペプチドの水溶性を改善する。他の実施形態においては、この基はポリペプチドの結合特性を改善する。他の実施形態においては、この基は、ポリペプチドに（単なる例として、ビオチン基又はビオチン結合基を含めて）新しい結合特性を与える。基がポリペプチドの水溶性を改善する実施形態においては、基は、単なる例としてＰＥＧポリマー基を含めて、本明細書に記載の水溶性ポリマーから選択される。さらなる又は追加の実施形態においては、基は細胞傷害性化合物であり、他の実施形態においては、基は薬物である。さらなる実施形態においては、連結された薬物又は細胞傷害性化合物を、非天然アミノ酸ポリペプチドから開裂させて、所望の治療箇所に送達することができる。他の実施形態においては、基は、例として、オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドを含めて、さらに、例として、第１の非天然アミノ酸ポリペプチドと同じアミノ酸構造を有するポリペプチドを含めて、第２のポリペプチドである。
【０６６９】
さらなる又は追加の実施形態においては、オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドは修飾オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドである。さらなる又は追加の実施形態においては、オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、相同の天然アミノ酸ポリペプチドと比較して、ポリペプチドの生物学的利用能を増大させる。さらなる又は追加の実施形態においては、オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、相同の天然アミノ酸ポリペプチドと比較して、ポリペプチドの安全性プロファイルを向上させる。さらなる又は追加の実施形態においては、オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、相同の天然アミノ酸ポリペプチドと比較して、ポリペプチドの水溶性を増大させる。さらなる又は追加の実施形態においては、オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、相同の天然アミノ酸ポリペプチドと比較して、ポリペプチドの治療上の半減期を延長する。さらなる又は追加の実施形態においては、オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、相同の天然アミノ酸ポリペプチドと比較して、ポリペプチドの血清半減期を延長する。さらなる又は追加の実施形態においては、オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、相同の天然アミノ酸ポリペプチドと比較して、ポリペプチドの循環時間を延長する。さらなる又は追加の実施形態においては、オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、相同の天然アミノ酸ポリペプチドと比較して、ポリペプチドの活性を調節する。さらなる又は追加の実施形態においては、オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドは、相同の天然アミノ酸ポリペプチドと比較して、ポリペプチドの免疫原性を調節する。
【０６７０】
ＸＩ．  治療上の修飾ポリペプチドの使用
便宜上、本セクションに記載する「修飾又は非修飾」非天然ポリペプチドを、一般的に、及び／又は具体例を用いて、記述した。しかし、本セクションに記載の「修飾又は非修飾」非天然ポリペプチドを、本セクションの一般的記述又は具体例だけに限定すべきではない。そうではなく、本セクションに記載の「修飾又は非修飾」非天然ポリペプチドは、本発明の明細書、特許請求の範囲及び図に記載した式Ｉ−ＸＶＩＩＩ、ＸＸＸ−ＸＸＸＩＶ（Ａ＆Ｂ）及びＸＸＸＸ−ＸＸＸＸＩＩＩの範囲内にあるあらゆる下位式又は特定の化合物を含めて、式Ｉ−ＸＶＩＩＩ、ＸＸＸ−ＸＸＸＩＶ（Ａ＆Ｂ）及びＸＸＸＸ−ＸＸＸＸＩＩＩの範囲内にある、少なくとも１個のアミノ酸を含む全ての「修飾又は非修飾」非天然ポリペプチドに等しく申し分なく適用される。
【０６７１】
本明細書に記載の「修飾又は非修飾」非天然アミノ酸ポリペプチドは、そのホモ及びヘテロ多量体を含めて、治療、診断、アッセイ、産業、美容、植物生物学、環境、エネルギー生成及び／又は軍事用途を含めて、但しこれらだけに限定されない複数の用途で使用される。非限定的説明として、「修飾又は非修飾」非天然アミノ酸ポリペプチドは、治療上以下のように使用される。
【０６７２】
本明細書に記載の「修飾又は非修飾」非天然アミノ酸ポリペプチドは、広範な障害、症状又は疾患の治療に有用である。本明細書に記載の「修飾又は非修飾」非天然アミノ酸ポリペプチド生成物を投与すると、ヒトにおいて市販ポリペプチド製剤によって実証される活性のいずれかがもたらされる。「修飾又は非修飾」非天然アミノ酸ポリペプチド生成物の平均量は変動し得るが、特に認定医の推奨及び処方箋に基づくべきである。「修飾又は非修飾」非天然アミノ酸ポリペプチドの正確な量は、治療する症状の正確なタイプ、治療を受ける患者の症状、組成物中の他の成分などの要因に左右される優先度の問題である。投与量は、「修飾又は非修飾」非天然アミノ酸ポリペプチドを用いた療法に基づいて当業者が容易に決定することができる。
【０６７３】
Ａ．  投与及び薬剤組成物
本明細書に記載の「修飾又は非修飾」非天然アミノ酸ポリペプチドは、そのホモ及びヘテロ多量体を含めて、治療、診断、アッセイ、産業、美容、植物生物学、環境、エネルギー生成及び／又は軍事用途を含めて、但しこれらだけに限定されない複数の用途で使用される。非限定的説明として、「修飾又は非修飾」非天然アミノ酸ポリペプチドは、治療上以下のように使用される。
【０６７４】
本明細書に記載の「修飾又は非修飾」非天然アミノ酸ポリペプチドは、広範な障害の治療に有用である。本明細書に記載の「修飾又は非修飾」非天然アミノ酸ポリペプチド生成物を投与すると、ヒトにおいて市販ポリペプチド製剤によって実証される活性のいずれかがもたらされる。「修飾又は非修飾」非天然アミノ酸ポリペプチド生成物の平均量は変動し得るが、特に認定医の推奨及び処方箋に基づくべきである。「修飾又は非修飾」非天然アミノ酸ポリペプチドの正確な量は、治療する症状の正確なタイプ、治療を受ける患者の症状、組成物中の他の成分などの要因に左右される優先度の問題である。投与量は、「修飾又は非修飾」非天然アミノ酸ポリペプチドを用いた療法に基づいて当業者が容易に決定することができる。
【０６７５】
（１個以上の非天然アミノ酸を含むシンセターゼ、タンパク質などを含めて、但しこれらだけに限定されない）本明細書に記載の修飾又は非修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを、これだけに限定されないが、適切な薬剤担体と組み合わせて、治療に使用してもよい。かかる組成物は、例えば、本明細書に記載の修飾又は非修飾非天然アミノ酸ポリペプチドの治療有効量と、薬剤として許容される担体又は賦形剤とを含む。かかる担体又は賦形剤としては、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセリン、エタノール及び／又はこれらの組み合わせなどが挙げられるが、これらだけに限定されない。処方は投与方法に合わせてなされる。一般に、タンパク質を投与する方法は、当分野で周知であり、本明細書に記載の修飾又は非修飾非天然アミノ酸ポリペプチドの投与に適用することができる。
【０６７６】
本明細書に記載の修飾又は非修飾非天然アミノ酸ポリペプチドの１種類以上を含む治療用組成物は、当分野で周知の方法に従って、１種類以上の適切なインビトロ及び／又はインビボの疾患動物モデルにおいて試験して、効力、組織代謝を確認し、投与量を推定してもよい。特に、投与量は、（１個以上の非天然アミノ酸を含むように修飾されたポリペプチドと天然アミノ酸ポリペプチドとの比較を含めて、但しこれらだけに限定されない）非天然と天然のアミノ酸の相同体の活性、安定性又は他の適切な尺度によって、すなわち、比較（ｒｅｌｅｖａｎｔ）アッセイにおいて最初に決定することができる。
【０６７７】
投与は、分子を血液又は組織細胞と最終的に接触させるのに通常使用される経路のいずれかによる。本明細書に記載の修飾又は非修飾非天然アミノ酸ポリペプチドは、薬剤として許容される１種類以上の担体と場合によっては一緒に、任意の適切な方法で投与される。本明細書に記載の修飾又は非修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを患者に投与する適切な方法を利用することができる。特定の組成物を投与するのに２つ以上の経路を使用することができるが、特定の経路は、別の経路よりも迅速で有効な作用又は反応をもたらすことが多い。
【０６７８】
薬剤として許容される担体は、投与する特定の組成物、及び組成物の投与に用いる特定の方法によってある程度決まる。したがって、本明細書に記載の薬剤組成物の適切な処方は多種多様である。
【０６７９】
本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチド、及びかかるポリペプチドを含む組成物は、非経口的、例えば（皮下、静脈内、又は注射若しくは注入の任意の他の形態を含めて、但しこれらだけに限定されない）注射を含めて、但しこれらだけに限定されない、タンパク質又はペプチドに適切な任意の従来の経路によって投与することができる。（本明細書に記載の種々の非天然アミノ酸ポリペプチドを含む）ポリペプチド薬剤組成物は、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、皮下、局所、舌下又は直腸手段を含めて、但しこれらだけに限定されない幾つかの経路によって投与することができる。本明細書に記載の修飾又は非修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを含む組成物は、リポソームによって投与することもできる。かかる投与経路及び適切な処方は、一般に当業者に公知である。本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドは、単独で、又は薬剤担体を含めて、但しこれだけに限定されない他の適切な成分と組み合わせて、使用することができる。
【０６８０】
本明細書に記載の修飾又は非修飾非天然アミノ酸ポリペプチドは、単独でも、他の適切な成分との組み合わせでも、エアゾール剤（すなわち、それらは「噴霧する」ことができる。）にして吸入投与することもできる。エアゾール剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの許容される加圧噴霧剤中に置くことができる。
【０６８１】
例えば、関節内（関節中）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下経路などによる非経口投与に適切な製剤としては、（抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤を対象レシピエントの血液と等張性にする溶質を含むことができる）水系及び非水系等張性無菌注射液、並びに（懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤及び防腐剤を含むことができる）水系及び非水系無菌懸濁液が挙げられる。パッケージ化された核酸製剤は、アンプル、バイアルなどの１回量又は複数回量の密封容器中に入れることができる。
【０６８２】
非経口投与及び静脈内投与は、好ましい投与方法である。特に、（ＥＰＯ、ＩＦＮ、ＧＨ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ、インターロイキン、抗体及び／又は任意の他の薬剤として産生されるタンパク質に典型的に使用されるものを含めて、但しこれらだけに限定されない）天然アミノ酸相同体治療にすでに使用されている投与経路は、現在使用されている処方と一緒に、本明細書に記載の修飾又は非修飾非天然アミノ酸ポリペプチドの好ましい投与経路及び処方である。
【０６８３】
本明細書に記載の組成物及び方法において、患者に投与する用量は、患者においてある期間にわたって有益な治療反応をもたらすのに十分である。用量は、特定の処方の効力、使用する修飾又は非修飾非天然アミノ酸ポリペプチドの活性、安定性又は血清半減期、患者の状態、及び治療を受ける患者の体重又は表面積に応じて決まる。用量サイズは、特定の患者において特定の処方の投与などに付随するあらゆる有害な副作用の有無、性質及び程度に応じても決まる。
【０６８４】
（癌、遺伝性疾患、糖尿病、ＡＩＤＳなどを含めて、但しこれらだけに限定されない）疾患の治療又は予防において投与する製剤の有効量を決定する際には、医師は、循環血しょう中濃度、処方の毒性、疾患の進行、及び／又は関連する場合には抗非天然アミノ酸ポリペプチド抗体の産生を検査する。
【０６８５】
例えば、７０キログラムの患者に投与する用量は、典型的には、現行の治療タンパク質の投与量と等しい範囲であり、関連する組成物の活性又は血清半減期の変化に対して調節される。本明細書に記載の薬剤は、抗体投与、ワクチン投与、細胞毒性薬、天然アミノ酸ポリペプチド、核酸、ヌクレオチドアナログ、生物学的応答調節物質などの投与を含めて、任意の公知の従来療法による治療状態を補うことができる。
【０６８６】
本明細書に記載の薬剤は、投与する場合、関連製剤のＬＤ−５０又はＥＤ−５０によって、及び／又は患者の体重（ｍａｓｓ）及び全体的健康状態に適用されるものを含めて、但しこれらだけに限定されない種々の濃度における修飾又は非修飾非天然アミノ酸ポリペプチドのあらゆる副作用の観察によって決定される速度で投与される。投与は単一又は分割用量で実施することができる。
【０６８７】
製剤を注入した患者が発熱、悪寒又は筋痛を生じた場合には、彼／彼女は、アスピリン、イブプロフェン、アセトアミノフェン又は他の鎮痛薬／解熱薬の適切な用量を服用する。発熱、筋痛、悪寒など注入に対する反応を経験した患者には、さらなる注入の３０分前に、アスピリン、アセトアミノフェン又はこれだけに限定されないがジフェンヒドラミンを前投薬する。メペリジンは、解熱薬及び抗ヒスタミン薬に素早く応答しないより重度の悪寒及び筋痛に対して使用される。細胞注入は、反応の激しさに応じて、減速され、又は中止される。
【０６８８】
本明細書に記載の修飾又は非修飾非天然アミノ酸ポリペプチドは、哺乳動物対象に直接投与することができる。投与は、ポリペプチドを対象に導入するのに通常使用する経路のいずれかによる。本明細書に記載の修飾又は非修飾非天然アミノ酸ポリペプチドは、経口、直腸、局所、（エアゾール剤を含めて、但しこれだけに限定されない）吸入、（舌下を含めて、但しこれだけに限定されない）頬、膣、（皮下、筋肉内、皮内、関節内、胸膜内、腹腔内、脳内、動脈内又は静脈内を含めて、但しこれらだけに限定されない）非経口、局所（すなわち、気道表面を含めて皮膚表面と粘膜表面の両方）及び経皮投与に適切なポリペプチドを含む。但し、任意の所与の症例において最も適切な経路は、治療する症状の性質及び重症度に応じて決まる。投与は、局所的でも全身的でもよい。製剤は、アンプル、バイアルなどの１回量又は複数回量の密封容器中に入れることができる。本明細書に記載の修飾又は非修飾非天然アミノ酸ポリペプチドは、薬剤として許容される担体と一緒に、（溶液、懸濁液又は乳濁液を含めて、但しこれらだけに限定されない）注射用単位剤形の混合物として調製することができる。本明細書に記載の修飾又は非修飾非天然アミノ酸ポリペプチドは、（浸透圧ポンプなどのミニポンプを含めて、但しこれらだけに限定されないものを使用した）連続注入、単一ボーラス又は徐放性デポー製剤によって投与することもできる。
【０６８９】
投与に適切な製剤としては、（抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤を等張性にする溶質を含むことができる）水系及び非水系等張性無菌溶液、並びに（懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤及び防腐剤を含むことができる）水系及び非水系無菌懸濁液が挙げられる。溶液及び懸濁液は、先に記載した種類の無菌粉体、顆粒剤及び錠剤から調製することができる。
【０６９０】
目的のタンパク質調製物を脱水するのに役立つフリーズドライイングは、タンパク質を与えるのに一般に用いられる技術である。フリーズドライイング、すなわち凍結乾燥は、乾燥させる材料をまず凍結させ、次いで氷又は凍結溶媒を減圧環境中で昇華によって除去するプロセスである。凍結乾燥前の製剤に賦形剤を添加して、フリーズドライイングプロセス中の安定性を高め、及び／又は貯蔵中の凍結乾燥生成物の安定性を改善することができる。Ｐｉｋａｌ，  Ｍ．  Ｂｉｏｐｈａｒｍ．  ３（９）２６−３０（１９９０）及びＡｒａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  ８（３）：２８５−２９１（１９９１）。
【０６９１】
薬剤の噴霧乾燥も当業者に公知である。例えば、Ｂｒｏａｄｈｅａｄ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．，  ”Ｔｈｅ  Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｙｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，”  ｉｎ  Ｄｒａｇ  Ｄｅｖ．  Ｉｎｄ．  Ｐｈａｒｍ，  １８（１１＆１２），  １１６９−１２０６（１９９２）を参照されたい。小分子薬剤に加えて、種々の生体材料が噴霧乾燥されている。この生体材料としては、酵素、血清、血しょう、微生物、酵母などが挙げられる。噴霧乾燥は、液体薬剤を１段階プロセスで微細な、粉塵のない、又は凝集した、散剤に転化することができるので有用な技術である。基本技術は以下の４段階を含む：ａ）供給溶液をしぶき状に噴霧、ｂ）しぶきと空気の接触、ｃ）しぶきの乾燥、及びｄ）乾燥空気から乾燥生成物を分離。参照によりその全体を本明細書に組みこむ米国特許第６，２３５，７１０号及び同６，００１，８００号は、噴霧乾燥による組換えエリスロポイエチンの調製を記載している。
【０６９２】
本明細書に記載の薬剤組成物は、薬剤として許容される担体、賦形剤又は安定剤を含み得る。薬剤として許容される担体は、投与する特定の組成物、及び組成物の投与に用いる特定の方法によってある程度決まる。したがって、本明細書に記載の修飾又は非修飾非天然アミノ酸ポリペプチドに適切な（任意に選択される、薬剤として許容される担体、賦形剤又は安定剤を含む）薬剤組成物処方は多種多様である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  Ｎｉｎｅｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄ  （Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．：  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  １９９５）；  Ｈｏｏｖｅｒ，  Ｊｏｈｎ  Ｅ．，  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  １９７５；  Ｌｉｂｅｒｍａｎ，  Ｈ．Ａ．  ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎ，  Ｌ．，  Ｅｄｓ．，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｎ．  Ｙ．，  １９８０及びＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｅｄ．  （Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  １９９９）を参照されたい。適切な担体としては、コハク酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ＨＥＰＥＳ、クエン酸塩、イミダゾール、酢酸塩、炭酸水素塩及び他の有機酸を含む緩衝剤；アスコルビン酸を含めて、但しこれだけに限定されない抗酸化剤；約１０残基未満の低分子量ポリペプチドを含めて、但しこれだけに限定されない低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンを含めて、但しこれらだけに限定されないタンパク質；ポリビニルピロリドンを含めて、但しこれだけに限定されない親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、ヒスチジン若しくはヒスチジン誘導体、メチオニン、グルタミン酸又はリジンを含めて、但しこれらだけに限定されないアミノ酸；トレハロース、スクロース、グルコース、マンノース又はデキストリンを含めて、但しこれらだけに限定されない単糖類、二糖類及び他の炭水化物；ＥＤＴＡを含めて、但しこれだけに限定されないキレート化剤；亜鉛、コバルト又は銅を含めて、但しこれらだけに限定されない二価の金属イオン；マンニトール又はソルビトールを含めて、但しこれらだけに限定されない糖アルコール；ナトリウムを含めて、但しこれだけに限定されない塩形成対イオン及び／又は（Ｔｗｅｅｎ  ８０（ポリソルベート８０）及びＴｗｅｅｎ  ２０（ポリソルベート２０）を含めて、但しこれらだけに限定されないＴｗｅｅｎ（商標）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）、及びプルロニック酸（ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）Ｆ６８（ポロクサマー１８８）を含めて、但しこれらだけに限定されない他のプルロニック酸を含めて、但しこれらだけに限定されない他のプルロニック酸、又はＰＥＧを含めて、但しこれらだけに限定されない非イオン界面活性剤などが挙げられる。適切な界面活性剤としては、例えば、ポリ（エチレンオキシ���）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）、すなわち（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）若しくはポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）、すなわち（ＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯ）を主成分とするポリエーテル又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらだけに限定されない。ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ及びＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯは、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）、Ｒ−Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）、Ｔｅｔｒｏｎｉｃｓ（商標）及びＲ−Ｔｅｔｒｏｎｉｃｓ（商標）（ＢＡＳＦ  Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ  Ｃｏｒｐ．，  Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ，  Ｍｉｃｈ．）の商品名で市販されており、参照によりその全体を本明細書に組みこむ米国特許第４，８２０，３５２号にさらに記載されている。他のエチレン／ポリプロピレンブロックポリマーも適切な界面活性剤であり得る。界面活性剤又は界面活性剤の組み合わせを使用して、撹拌に起因する応力を含めて、但しこれだけに限定されない１種類以上の応力に対して、ＰＥＧ化非天然アミノ酸ポリペプチドを安定化することができる。上記の一部は「増量剤（ｂｕｌｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）」とも称する。一部は「張性調節剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）」とも称する。
【０６９３】
ＰＥＧなどの水溶性ポリマーに連結されたものを含めて、本明細書に記載の修飾又は非修飾非天然アミノ酸ポリペプチドは、徐放性システムによって、又は徐放性システムの一部として、投与することもできる。徐放性組成物は、フィルム又はマイクロカプセルを含めて、但しこれらだけに限定されない成形品の形の半透性ポリマーマトリックスを含むが、これらだけに限定されない。徐放性マトリックスとしては、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．，  １５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，  Ｃｈｅｍ．  Ｔｅｃｈ．，  １２：９８−１０５（１９８２）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，同上）又はポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）、ポリラクチド（ポリ乳酸）（米国特許第３，７７３，９１９号；ＥＰ５８，４８１）、ポリグリコリド（グリコール酸のポリマー）、ポリ乳酸コ−グリコリド（乳酸とグリコール酸のコポリマー）ポリ無水物、Ｌ−グルタミン酸とガンマ−エチル−Ｌ−グルタマートのコポリマー（Ｕ．  Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，  ２２，  ５４７−５５６（１９８３）、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖、核酸、ポリアミノ酸、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシンなどのアミノ酸、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドン、シリコーンなどの生体適合性材料由来のものなどが挙げられる。徐放性組成物としては、リポソームに閉じ込められた化合物も挙げられる。化合物を含むリポソームは、それ自体公知の方法によって調製される：ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号及び同４，５４４，５４５号及びＥＰ１０２，３２４。
【０６９４】
リポソームに閉じこめられたポリペプチドは、例えば、ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米国特許第４，４８５，０４５号及び同４，５４４，５４５号及びＥＰ１０２，３２４の方法によって調製することができる。リポソームの組成及びサイズは周知であり、又は当業者が経験的に容易に決定することができる。例えば、Ｐａｒｋ  ＪＷ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２：１３２７−１３３１（１９９５）；Ｌａｓｉｃ  Ｄ  ａｎｄ  Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ  Ｄ（ｅｄｓ）：ＭＥＤＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＬＩＰＯＳＯＭＥＳ（１９９８）；Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ＤＣ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，  ｉｎ  Ｔｅｉｃｈｅｒ  Ｂ（ｅｄ）：ＣＡＮＣＥＲ  ＤＲＵＧ  ＤＩＳＣＯＶＥＲＹ  ＡＮＤ  ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ（２００２）；Ｐａｒｋ  ＪＷ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ８：１１７２−１１８１（２００２）；Ｎｉｅｌｓｅｎ  ＵＢ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  １５９１（１−３）：１０９−１１８（２００２）；Ｍａｍｏｔ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６３：３１５４−３１６１（２００３）に記載のリポソームの幾つかの例。
【０６９５】
本明細書に記載の組成物、処方及び方法に関連して患者に投与する用量は、対象においてある期間にわたって有益な応答を引き起こすのに十分なものとすべきである。一般に、非経口的に投与される本明細書に記載の修飾又は非修飾非天然アミノ酸ポリペプチドの１回当たりの全薬剤有効量は、約０．０１μｇ／ｋｇ患者体重／日から約１００μｇ／ｋｇ患者体重又は約０．０５ｍｇ／ｋｇ患者体重から約１ｍｇ／ｋｇ患者体重である。但し、これは治療上の自由裁量によって決まる。投薬頻度も治療上の自由裁量によって決まり、ヒトにおける使用に承認されている市販品よりも多くても少なくてもよい。一般に、単なる例としてＰＥＧ化ポリペプチドを含めて、本明細書に記載のポリマー：ポリペプチド複合体は、上記投与経路のいずれかによって投与することができる。
実施例
【実施例１】
【０６９６】
この実施例は、図４に示すカルボニル含有アミノ酸の合成を詳述するものである。カルボニル含有非天然アミノ酸を、図４に記載のように製造した。
【実施例２】
【０６９７】
この実施例は、図５ａに示す保護されたヒドロキシルアミン含有アミノ酸の合成を詳述するものである。保護されたヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸を、図５ａに記載のように製造した。
【実施例３】
【０６９８】
この実施例は、図５ｂに示すヒドロキシルアミン含有アミノ酸の合成を詳述するものである。ヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸を、図５ｂに記載のように製造した。
【実施例４】
【０６９９】
この実施例は、図５ｃに示すヒドロキシルアミン含有アミノ酸の合成を詳述するものである。ヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸を、図５ｃに記載のように製造した。
【実施例５】
【０７００】
この実施例は、図５ｄに示すオキシム含有アミノ酸の合成を詳述するものである。オキシム含有非天然アミノ酸を、図５ｄに記載のように製造した。
【実施例６】
【０７０１】
この実施例は、図６ａに示すオキシム含有アミノ酸の合成を詳述するものである。オキシム含有非天然アミノ酸を、図６ａに記載のように製造した。
【実施例７】
【０７０２】
この実施例は、図６ｂに示すオキシム含有アミノ酸の合成を詳述するものである。オキシム含有非天然アミノ酸を、図６ｂに記載のように製造した。
【実施例８】
【０７０３】
この実施例は、図６ｃに示すオキシム含有アミノ酸の合成を詳述するものである。オキシム含有非天然アミノ酸を、図６ｃに記載のように製造した。
【実施例９】
【０７０４】
この実施例は、図２４に示すカルボニル含有アミノ酸の合成を詳述するものである。
【０７０５】
【化１４６】
0005425398.tif 000088
の合成
【０７０６】
ＮａＯＨ溶液（４０ｍＬ、２５％ｖｏｌ．）にエーテル（６０ｍＬ）を０℃で添加した。爆発遮蔽物を反応フラスコの前に配置した。得られた混合物に、Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチル尿素（６．０ｇ、５７．９ｍｍｏｌ）を３分割して３分間で添加した。反応物を０℃で１０分間撹拌した。次いで、ジエチルエーテル層と水酸化ナトリウム層を分離させた。有機層を、Ｎ−Ｂｏｃ−４−ヒドロキシメチルフェニルアラニン（７．５ｇ、２５．４ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）溶液に、出発材料が（ＴＬＣでモニターして）完全に消失するまで５分間で（約６分割）添加した。次いで、氷酢酸５滴を添加して反応をクエンチした。有機溶媒をロータリーエバポレーターによって除去した後、酢酸エチルを添加した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ３溶液、Ｈ２Ｏ及び塩水で連続洗浄し、次いで無水ＭｇＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮して、生成物（５．９ｇ、７５％）を白色粉末として得た。
【０７０７】
【化１４７】
0005425398.tif 000089
の合成
【０７０８】
アルコール（６．０ｇ、１９．４ｍｍｏｌ）とピリジン（１２ｍＬ、１５０ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（４００ｍＬ）撹拌溶液にＤｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎペルヨージナン（１４．２ｇ、３３．４ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。混合物を室温で終夜撹拌した。次いで、反応物をＮａ２Ｓ２Ｏ３−ＮａＨＣＯ３飽和水溶液（１：１、３００ｍＬ）でクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を混合し、Ｈ２Ｏ及び塩水で洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、１：１００−１：１  へキサン：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、アルデヒド生成物（５．４８ｇ、９２％）を白色固体として得た。
【０７０９】
【化１４８】
0005425398.tif 000090
の合成
【０７１０】
アルデヒド（３．０７ｇ、１０ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（４０ｍＬ）溶液に酢酸ヒドラジド（ａｃｅｔｉｃ  ｈｙｄｒａｚｉｄｅ）（１．７ｇ、２０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で３０分間撹拌し、濃縮した。残渣にＨ２Ｏ（２００ｍＬ）、続いてＣＨ２Ｃｌ２を添加した。有機層を分離し、減圧濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、３：７−１：９  へキサン：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、生成物（３．２９ｇ、９０％）を白色固体として得た。
【０７１１】
【化１４９】
0005425398.tif 000091
の合成
【０７１２】
上記メチルエステル（３．２９ｇ、９．１ｍｍｏｌ）のジオキサン（１０ｍＬ）溶液にＬｉＯＨ（１０ｍＬ、１Ｎ）を０℃で添加した。混合物を同じ温度で１時間撹拌し、次いでクエン酸（５ｇ）を添加してクエンチし、Ｈ２Ｏで希釈した。混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をＨ２Ｏ及び塩水で連続洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮して、白色固体（３．０５ｇ、９６％）を得た。
【０７１３】
【化１５０】
0005425398.tif 000092
の合成
【０７１４】
上記酸（３．０２ｇ、８．６ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（２０ｍＬ）を０℃で添加した。反応混合物を０℃で２時間撹拌し、濃縮した。残渣にＭｅＯＨ（１ｍＬ）を添加し、続いてＨＣｌ（２．０ｍＬ、４Ｎジオキサン溶液）を添加した。次いで、エーテル（２００ｍＬ）を添加すると、生成物（２．０７ｇ、８３％）が黄色固体として沈殿した。
【実施例１０】
【０７１５】
この実施例は、図２５に示すジカルボニル含有アミノ酸の合成を詳述するものである。
【０７１６】
【化１５１】
0005425398.tif 000093
の合成
【０７１７】
アミン（１０ｇ、３４ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（７０ｍＬ）撹拌溶液にピルビン酸（ｐｙｒｕｖａｔｅ  ａｃｉｄ）（５ｍＬ、７２ｍｍｏｌ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ｈｙｄｒｏｃｈｏｒｉｄｅ）（ＥＤＣ、２０ｇ、１０４ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ、８５ｇ、７１ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、３５ｍＬ、２００ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。混合物を室温で６時間撹拌し、次いでクエン酸水溶液（５％、５００ｍＬ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）で抽出した。有機層をＨ２Ｏ及び塩水で連続洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、３：１−１：１  へキサン：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、生成物を固体として得た（４．７８ｇ、４０％）。
【０７１８】
【化１５２】
0005425398.tif 000094
の合成
【０７１９】
上記メチルエステル（２．９６ｇ、８．１ｍｍｏｌ）のジオキサン（１０ｍＬ）溶液にＬｉＯＨ（１０ｍＬ、１Ｎ）を０℃で添加した。混合物を同じ温度で３時間撹拌した。次いで、反応物をクエン酸水溶液（５％）でクエンチし、ＥｔＯＡｃで希釈した。有機層を分離し、Ｈ２Ｏ及び塩水で連続洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮して、生成物を黄色固体として得た（２．８７ｇ、１００％）。
【０７２０】
【化１５３】
0005425398.tif 000095
の合成
【０７２１】
上記酸（２．０５ｇ、５．９ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）を０℃で添加した。混合物を２時間撹拌し、減圧濃縮した。残渣にＨＣｌ（１ｍＬ、４Ｎジオキサン溶液）、続いてエーテル（４００ｍＬ）を添加した。沈殿を白色固体（１．３８ｇ、８２％）として収集した。
【実施例１１】
【０７２２】
この実施例は、図２６に示すジカルボニル含有アミノ酸の合成を詳述するものである。
【０７２３】
【化１５４】
0005425398.tif 000096
の合成
【０７２４】
４’−メチルプロピオフェノン（２０ｇ、１２２ｍｍｏｌ）とＮ−ブロモスクシンイミド（ｂｒｏｍｏｓｕｃｃｉｎｉｍｄｅ）（ＮＢＳ、２３ｇ、１３０ｍｍｏｌ）のベンゼン（３００ｍＬ）溶液に２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ、０．６ｇ、３．６ｍｍｏｌ）を９０℃で添加した。生成溶液を終夜加熱還流させた。次いで、反応物を室温に冷却した。褐色溶液をＨ２Ｏ及び塩水で連続洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。残渣をへキサンから結晶化させて、生成物を淡黄色固体として得た（２７ｇ、８７％）。
【０７２５】
【化１５５】
0005425398.tif 000097
の合成
【０７２６】
ＥｔＯＮａ（１４．５ｇ、２０３ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（４００ｍＬ）溶液にアセトアミドマロン酸ジエチル（３９ｇ、１８０ｍｍｏｌ）、続いて上記臭化物（２７ｇ、１１９ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（１００ｍＬ）溶液を０℃で添加した。生成した混合物を１時間加熱還流し、クエン酸（３０ｇ）でクエンチし、Ｈ２Ｏ（３００ｍＬ）で希釈した。大部分の溶媒を減圧除去した後、残渣をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をＨ２Ｏ及び塩水で連続洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、１０：１−３：１  へキサン：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、生成物（３７ｇ、８８％）を黄色固体として得た。
【０７２７】
【化１５６】
0005425398.tif 000098
の合成
【０７２８】
上記ケトン（５ｇ、１３．８ｍｍｏｌ）のエーテル（１００ｍＬ）溶液にＢｒ２（０．８ｍＬ、１５．６ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。混合物を室温で３時間撹拌し、次いでＮａＨＣＯ３飽和水溶液でクエンチした。混合物をＥｔ２Ｏで抽出した。有機層をＨ２Ｏ及び塩水で連続洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮して、生成物を黄色固体として得た（５．４ｇ、８８％）。この生成物をさらに精製して次の段階に直接使用した。
【０７２９】
【化１５７】
0005425398.tif 000099
の合成
【０７３０】
α−ブロモケトン（５．４ｇ、１２．２ｍｍｏｌ）とＮａ２ＣＯ３（２．０ｇ、１８．９ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（２０ｍＬ）溶液にＫＩ（２．１ｇ、１３．２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を窒素雰囲気下で９０℃で２８時間撹拌した。次いで、反応物をＨ２Ｏでクエンチし、ＥｔＯＡｃで希釈した。有機層を分離し、Ｈ２Ｏ及び塩水で連続洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、６：１−１：１０  へキサン：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、生成物を固体として得た（１．１２ｇ、２４％）。
【０７３１】
【化１５８】
0005425398.tif 000100
の合成
【０７３２】
ジケトン（１．１２ｇ、３．０ｍｍｏｌ）の濃ＨＣｌ（１０ｍＬ）とジオキサン（１０ｍＬ）の溶液を終夜加熱還流させた。溶媒を減圧除去した後、ＭｅＯＨ（３ｍＬ）を添加して残渣を溶解させた。次いで、エーテル（３００ｍＬ）を添加すると、生成物（３０２ｍｇ、４２％）が淡黄色固体として沈殿した。
【実施例１２】
【０７３３】
この実施例は、図２７に示すジカルボニル含有アミノ酸の合成を詳述するものである。
【０７３４】
【化１５９】
0005425398.tif 000101
の合成
【０７３５】
Ｃ３Ｈ７ＭｇＣｌ（２Ｍ、５０ｍｍｏｌ）のエーテル（２５ｍＬ）溶液にベンズアルデヒド（５ｍＬ、４２．５ｍｍｏｌ）のエーテル（５０ｍＬ）溶液を０℃で添加した。生成溶液を０℃で３０分間撹拌した。次いで、反応物を飽和ＮＨ４Ｃｌでクエンチし、エーテルで希釈した。有機層を分離し、Ｈ２Ｏ及び塩水で連続洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮して、粗生成物（７．２ｇ）を得た。この粗生成物を精製せずに次の反応に直接使用した。
【０７３６】
【化１６０】
0005425398.tif 000102
の合成
【０７３７】
上記アルコール（７．２ｇ、４３．９ｍｍｏｌ）とピリジン（７ｍＬ、８６．７ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（３００ｍＬ）溶液にＤｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎペルヨージナン（１９．２ｇ、４５．３ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。生成した混合物を終夜撹拌し、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３飽和水溶液とＮａＨＣＯ３飽和水溶液（１：１）でクエンチした。有機層をＨ２Ｏ及び塩水で連続洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、８：１−４：１  へキサン：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、生成物を無色オイルとして得た（２段階で６．２８ｇ、９１％）。
【０７３８】
【化１６１】
0005425398.tif 000103
の合成
【０７３９】
上記ケトン（４．４３ｇ、２７．３ｍｍｏｌ）とＮ−ブロモスクシンイミド（ｂｒｏｍｏｓｕｃｃｉｎｉｍｄｅ）（ＮＢＳ、５．５ｇ、３０．９ｍｍｏｌ）のベンゼン（１５０ｍＬ）溶液に２，２’−アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ、０．２ｇ、１．２ｍｍｏｌ）を９０℃で添加した。生成溶液を終夜加熱還流し、次いで室温に冷却した。褐色溶液をＨ２Ｏ及び塩水で連続洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。残渣をへキサンから結晶化させて、生成物を白色固体として得た（６．２１ｇ、９５％）。
【０７４０】
【化１６２】
0005425398.tif 000104
の合成
【０７４１】
ＥｔＯＮａ（２．５ｇ、３４．９ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（２００ｍＬ）溶液にアセトアミドマロン酸ジエチル（６．７ｇ、３０．９ｍｍｏｌ）、続いて上記臭化物（６．２ｇ、２５．８ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（１００ｍＬ）溶液を０℃で添加した。生成した混合物を１時間加熱還流し、次いでクエン酸（９ｇ）でクエンチし、Ｈ２Ｏで希釈した。大部分の溶媒を除去した後、残渣をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をＨ２Ｏ及び塩水で連続洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、４：１−２：１  へキサン：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、生成物を淡黄色固体として得た（８．９２ｇ、９２％）。
【０７４２】
【化１６３】
0005425398.tif 000105
の合成
【０７４３】
上記ケトン（１．４ｇ、３．７１ｍｍｏｌ）のＨＯＡｃ（５０ｍＬ）溶液にＢｒ２（０．７ｍＬ、１３．６ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で終夜撹拌し、次いでＮａＨＣＯ３飽和水溶液でクエンチした。混合物をＥｔ２Ｏで抽出した。有機層をＨ２Ｏ及び塩水で連続洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、５：１−３：２  へキサン：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、生成物を黄色固体として得た（１．２３ｇ、７３％）。
【０７４４】
【化１６４】
0005425398.tif 000106
の合成
【０７４５】
α−ブロモケトン（１．１２ｇ、２．４６ｍｍｏｌ）とＮａ２ＣＯ３（０．４ｇ、３．７７ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ（３０ｍＬ）溶液にＫＩ（０．４５ｇ、１３．２ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を９０℃で終夜撹拌し、次いでクエン酸（２ｇ）及びＨ２Ｏ（２００ｍＬ）でクエンチした。混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をＨ２Ｏ及び塩水で連続洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、６：１−１：１０  へキサン：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、α−ヒドロキシルケトンをオイルとして得た（０．６２ｇ、６４％）。
【０７４６】
上記アルコール（０．６２ｇ、１．５８ｍｍｏｌ）とピリジン（０．５ｍＬ、６．１９ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）溶液にＤｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎペルヨージナン（０．９ｇ、２．１２ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。生成した混合物を終夜撹拌し、次いでＮａ２Ｓ２Ｏ３飽和水溶液とＮａＨＣＯ３飽和水溶液（１：１）でクエンチした。有機層をＨ２Ｏ及び塩水で連続洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、９：１−３：２  へキサン：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、生成物を黄色オイルとして得た（２段階で２８７ｍｇ、３０％）。
【０７４７】
【化１６５】
0005425398.tif 000107
の合成
【０７４８】
上記ジケトン（２７２ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）の濃ＨＣｌ（１０ｍＬ）とジオキサン（１０ｍＬ）の混合物溶液を終夜加熱還流させた。溶媒を減圧除去した後、ＭｅＯＨ（１ｍＬ）を添加して残渣を溶解させた。次いで、エーテル（２００ｍＬ）を添加すると、生成物が黄色固体（１６２ｍｇ、８１％）として沈殿した。
【実施例１３】
【０７４９】
この実施例は、図２８に示すジカルボニル含有アミノ酸の合成を詳述するものである。この化合物を図２８に示すように合成した。
【実施例１４】
【０７５０】
この実施例は、Ｅ．コリにおける修飾ポリペプチドのクローニング及び発現を詳述するものである。直交ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）と直交アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ（Ｏ−ＲＳ）とを含む、導入された翻訳系を使用して、非天然アミノ酸を含むポリペプチドを発現させる。Ｏ−ＲＳは、非天然アミノ酸を用いてＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する。翻訳系は、コードされた選択コドンに応じて、非天然アミノ酸をポリペプチドに挿入する。アミノ酸並びに非天然アミノ酸の組み込みに有用であるＯ−ｔＲＮＡ及びＯ−ＲＳのポリヌクレオチド配列は、参照により本明細書に組みこむ米国特許出願第１０／１２６，９２７号”Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ”及び米国特許出願第１０／１２６，９３１号”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ｔＲＮＡ−Ａｍｉｎｏａｃｙｌ  ｔＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  Ｐａｉｒｓ”に記載されている。以下のＯ−ＲＳ及びＯ−ｔＲＮＡの配列も使用することができる。
【０７５１】
【表３】
0005425398.tif 000108
0005425398.tif 000109
【０７５２】
改変遺伝子と直交アミノアシルｔＲＮＡシンセターゼ／ｔＲＮＡペア（所望の非天然アミノ酸に特異的な）とを含むプラスミドでＥ．コリを形質転換することによって、非天然アミノ酸をポリペプチドに部位特異的に組み込むことができる。形質転換され、特定の非天然アミノ酸０．０１−１００ｍＭを含む倍地中で３７℃で増殖されたＥ．コリは、修飾ポリペプチドを高い忠実度及び効率で発現する。非天然アミノ酸を含むＨｉｓタグ付きポリペプチドは、Ｅ．コリ宿主細胞によって封入体又は凝集体として産生される。凝集体を可溶化し、６ＭグアニジンＨＣｌ中で変性条件下で親和性精製する。再折り畳みを透析法によって５０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、４０μＭ  ＣｕＳＯ４及び２％（ｗ／ｖ）サルコシル中で４℃で終夜実施する。次いで、材料を２０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２に対して透析し、続いてＨｉｓタグを除去する。Ｂｏｉｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  （１９９３）  ２６８：１５９８３−９３を参照されたい。ポリペプチドの精製方法は当分野で周知であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット分析、エレクトロスプレーイオン化イオントラップ質量分析法などによって確認される。
【実施例１５】
【０７５３】
非天然アミノ酸の試験
この実施例は、非天然アミノ酸ポリペプチドへの組み込みのために諸性質を予測する助けとして、説明のためのある種の非天然アミノ酸に対して実施した４つの試験の結果である。
【０７５４】
【表４】
0005425398.tif 000110
0005425398.tif 000111
0005425398.tif 000112
【実施例１６】
【０７５５】
非天然アミノ酸の試験
この実施例は、非天然アミノ酸ポリペプチドへの組み込みのために諸性質を予測する助けとして、説明のためのある種の非天然アミノ酸に対して実施したｐＨ安定性試験の結果である。
【０７５６】
【表５】
0005425398.tif 000113
0005425398.tif 000114
【実施例１７】
【０７５７】
この実施例は、図２９に示すジカルボニル含有アミノ酸の合成を詳述するものである。
【０７５８】
【化１６６】
0005425398.tif 000115
の合成
【０７５９】
アミノ酸ｐＡＦ（１０ｇ、４１．１ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ−ジオキサン（３００ｍＬ、１：１）溶液にＮａＨＣＯ３（１２ｇ、１４２．９ｍｍｏｌ）及びＢｏｃ２Ｏ（１２ｇ、５５．０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で７時間撹拌し、次いでクエン酸でクエンチした。混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をＨ２Ｏ及び塩水で連続洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮して、Ｎ−Ｂｏｃ−ｐＡＦを白色固体として得た（１３．７ｇ、定量）。
【０７６０】
【化１６７】
0005425398.tif 000116
の合成
【０７６１】
ＮａＯＨ（４０ｍＬ、２５体積％）にエーテル（６０ｍＬ）を０℃で添加した。爆発遮蔽物を反応フラスコの前に配置した。得られた混合物に、Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチル尿素（６．０ｇ、５７．９ｍｍｏｌ）を３分割して３分間で添加した。反応物を０℃で１０分間撹拌した。次いで、ジエチルエーテル層と水酸化ナトリウム層を分離させた。有機層を、Ｎ−Ｂｏｃ−ｐＡＦ（５．０ｇ、１６．２ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）溶液に、出発材料が（ＴＬＣでモニターして）完全に消失するまで５分間で分割（約６分割）添加した。次いで、氷酢酸５滴を添加して反応をクエンチした。有機溶媒をロータリーエバポレーターによって除去した後、酢酸エチルを添加した。有機層を飽和ＮａＨＣＯ３溶液、Ｈ２Ｏ及び塩水で連続洗浄し、次いで無水ＭｇＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮して、白色粉末（４．１ｇ、８０％）を得た。
【０７６２】
【化１６８】
0005425398.tif 000117
の合成
【０７６３】
ｔ−ＢｕＯＫ（６０ｍＬ、１．０Ｍ  ＴＨＦ溶液）に、新たに蒸留したプロピオン酸メチル（２０ｍＬ、２０８ｍｍｏｌ）中の保護されたｐＡＦ（３．８２ｇ、１１．９ｍｍｏｌ）の溶液を徐々に添加した。生成した混合物を室温で３０分間撹拌し、クエン酸溶液（１０％、３００ｍＬ）でクエンチした。混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をＨ２Ｏ及び塩水で連続洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、４：１−１：１  へキサン：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、生成物を白色固体として得た（３．８９ｇ、８７％）。
【０７６４】
【化１６９】
0005425398.tif 000118
の合成
【０７６５】
上記メチルエステル（１．１２ｇ、２．９７ｍｍｏｌ）のジオキサン（４ｍＬ）溶液にＬｉＯＨ（４ｍＬ、１Ｎ）を０℃で添加した。混合物を０℃で３時間撹拌し、クエン酸水溶液（５％、２００ｍＬ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃで希釈した。有機層を分離し、Ｈ２Ｏ及び塩水で連続洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮して、白色固体（１．０２ｇ、９４％）を得た。
【０７６６】
【化１７０】
0005425398.tif 000119
の合成
【０７６７】
上記酸（１．０ｇ、２．７５ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）を０℃で添加した。混合物を０℃で２時間撹拌し、次いで濃縮した。残渣にＭｅＯＨ（１ｍＬ）、続いてＨＣｌ（１．５ｍＬ、４Ｎジオキサン溶液）を添加した。次いで、エーテル（２００ｍＬ）を添加すると、生成物（７０１ｍｇ、９６％）が白色固体として沈殿した。
【実施例１８】
【０７６８】
この実施例は、図３０に示すジカルボニル含有アミノ酸の合成を詳述するものである。
【０７６９】
【化１７１】
0005425398.tif 000120
の合成
【０７７０】
ｔ−ＢｕＯＫ（１５ｍＬ、１．０Ｍ  ＴＨＦ溶液）に、保護されたｐＡＦ（１．０９ｇ、３．４ｍｍｏｌ）のジフルオロ酢酸メチル（６ｍＬ、６８．７ｍｍｏｌ）溶液を徐々に添加した。生成した混合物を室温で３０分間撹拌し、クエン酸（５ｇ、２５．４ｍｍｏｌ）でクエンチし、Ｈ２Ｏで希釈した。混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をＨ２Ｏ及び塩水で連続洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、２０：１−３：２  へキサン：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、生成物を淡褐色固体として得た（１．２７ｇ、９４％）。
【０７７１】
【化１７２】
0005425398.tif 000121
の合成
【０７７２】
上記メチルエステル（１．２６ｇ、３．１７ｍｍｏｌ）のジオキサン（３０ｍＬ）溶液にＬｉＯＨ（３０ｍＬ、１Ｎ）を０℃で添加した。混合物を０℃で０．５時間撹拌し、クエン酸（１０ｇ、５１ｍｍｏｌ）でクエンチし、Ｈ２Ｏで希釈した。混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をＨ２Ｏ及び塩水で連続洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、１００：１−１０：１  ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ、０．５％ＨＯＡｃ）によって精製して褐色のオイル（１．１９ｇ、９８％）を得た。
【０７７３】
【化１７３】
0005425398.tif 000122
の合成
【０７７４】
上記酸（１．１９ｇ、３．１ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（１５ｍＬ）を０℃で添加した。混合物を０．５時間撹拌し、濃縮した。残渣にＭｅＯＨ（２ｍＬ）、続いてＨＣｌ（２ｍＬ、４Ｎジオキサン溶液）を添加した。次いで、エーテル（２００ｍＬ）を添加すると、生成物（０．８２ｍｇ、８２％）が白色固体として沈殿した。
【実施例１９】
【０７７５】
この実施例は、図１２ａに示すヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬の合成を詳述するものである。ヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬を、図１２ａに記載のように製造した。
【実施例２０】
【０７７６】
この実施例は、図１２ｂに示すヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬の合成を詳述するものである。ヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬を、図１２ｂに記載のように製造した。
【実施例２１】
【０７７７】
この実施例は、図１２ｃに示すヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬の合成を詳述するものである。ヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬を、図１２ｃに記載のように製造した。
【実施例２２】
【０７７８】
この実施例は、図１２ｄに示すヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬の合成を詳述するものである。ヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬を、図１２ｄに記載のように製造した。
【実施例２３】
【０７７９】
この実施例は、図１３に示すヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬の合成を詳述するものである。ヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬を、図１３に記載のように製造した。
【実施例２４】
【０７８０】
この実施例は、図１４に示すヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬の合成を詳述するものである。ヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬を、図１４に記載のように製造した。
【実施例２５】
【０７８１】
この実施例は、図１５に示すヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬の合成を詳述するものである。ヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬を、図１５に記載のように製造した。
【実施例２６】
【０７８２】
この実施例は、図１６ａに示すヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬の合成を詳述するものである。ヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬を、図１６ａに記載のように製造した。
【実施例２７】
【０７８３】
この実施例は、図１６ｂに示すヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬の合成を詳述するものである。ヒドロキシルアミン含有ＰＥＧ試薬を、図１６ｂに記載のように製造した。
【実施例２８】
【０７８４】
この実施例は、図１８に示すヒドロキシルアミン含有リンカー試薬の合成を詳述するものである。ヒドロキシルアミン含有リンカー試薬を、図１８に記載のように製造した。
【実施例２９】
【０７８５】
この実施例は、図３６に示す１，２−ビス（４−（ブロモメチル）フェニル）ジスルファン（１）の合成を詳述するものである。オーブン乾燥した、撹拌棒を備えた丸底フラスコに窒素ガス圧下でｐ−トリルジスルフィド（５．０ｇ、２０．３ｍｍｏｌ）、Ｎ−ブロモスクシンイミド（８．６ｇ、４８．４ｍｍｏｌ）及び無水ベンゼン６０ｍＬを添加した。溶液を９５℃に加熱した。アゾビスイソブチルニトリル（ａｚｏｂｉｓｉｓｏｂｕｔｙｌｎｉｔｒｉｌｅ）（．１０６ｇ、．６４ｍｍｏｌ）を一括添加した。反応物を１６時間還流させた。溶媒をロータリーエバポレーターによって除去し、褐色固体を酢酸エチル１００ｍＬに溶解させた。反応混合物を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（２×５０ｍＬ）、脱イオン水（１×５０ｍＬ）及び塩水（１×５０ｍＬ）で連続洗浄した。有機層を分離し、無水硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。粗生成物を、Ｂｉｏｔａｇｅ  Ｉｎｃ．  ＨＯＲＩＺＯＮ（商標）クロマトグラフィーシステムを用いたシリカクロマトグラフィーによって精製し、適切な画分を濃縮し、微量の溶媒を除去して（真空ポンプ）、１，２−ビス（４−（ブロモメチル）フェニル）ジスルファン（２．１ｇ、２５％）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルデータ及び質量スペクトルを得た。反応を繰り返して、生成物（２．０ｇ、２３％）を得た。
【実施例３０】
【０７８６】
この実施例は、図３６に示す１，２−ビス（４−ジエチル−２−アセトアミドマロナート）フェニルジスルファン（２）の合成を詳述するものである。オーブン乾燥した、撹拌棒を備えた丸底フラスコに窒素ガス圧下でアセトアミドマロン酸ジエチル（６．４８ｇ、３０ｍｍｏｌ）及び無水ＥｔＯＨ５０ｍＬを添加した。溶液にナトリウムエトキシド（２．６ｇ、３８ｍｍｏｌ）を一括添加した。反応物を０℃に冷却した。１，２−ビス（４−（ブロモメチル）フェニル）ジスルファン（４．１ｇ、１０．１ｍｍｏｌ）を１：１  ＥｔＯＨ／ＴＨＦ  ２０ｍＬに溶解させ、添加漏斗を用いて冷たい溶液に１時間添加した。氷浴を取り外し、反応物を室温で６時間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターによって除去し、赤色固体を酢酸エチル１００ｍＬに溶解させた。反応混合物を５％クエン酸溶液（２×５０ｍＬ）、脱イオン水（１×５０ｍＬ）及び塩水（１×５０ｍＬ）で連続洗浄した。有機層を分離し、無水硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。粗生成物を、Ｂｉｏｔａｇｅ  Ｉｎｃ．  ＨＯＲＩＺＯＮ（商標）クロマトグラフィーシステムを用いたシリカクロマトグラフィーによって精製し、適切な画分を濃縮し、微量の溶媒を除去して（真空ポンプ）、１，２−ビス（４−ジエチル−２−アセトアミドマロナート）フェニルジスルファン（５．０ｇ、７３％）を黄色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルデータ、ＨＰＬＣパターン及び質量スペクトルを得た。
【実施例３１】
【０７８７】
この実施例は、図３６に示す１，２−ビス（４−（２−アミノ−３−プロパン酸）フェニルジスルファン（３）の合成を詳述するものである。オーブン乾燥した、撹拌棒を備えた丸底フラスコに窒素ガス圧下で１，２−ビス（４−ジエチル−２−アセトアミドマロナート）フェニルジスルファン（１．０ｇ、１．４ｍｍｏｌ）、ＨＣｌ（８ｍＬ、１２Ｍ）及び１，４ジオキサン８ｍＬを添加した。反応物を還流させながら１６時間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターと真空ポンプによって除去して、粗製１，２−ビス（４−（２−アミノ−３−プロパン酸）フェニルジスルファン（０．７５ｇ、１３５％）を透明なオイルとして得た。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルデータ及び質量スペクトルを得た。
【実施例３２】
【０７８８】
この実施例は、図３６に示すＮ，Ｎ’−ジＢｏｃ−１，２−ビス（４−（２−アミノ−３−プロパン酸）フェニルジスルファン（４）の合成を詳述するものである。乾燥丸底フラスコ中の１，２−ビス（４−（２−アミノ−３−プロパン酸）フェニルジスルファン（０．７５ｇ、１．９ｍｍｏｌ）に１，４ジオキサン５ｍＬ、脱イオン水５ｍＬ、ジ−ｔ−ブチルジカルボナート（．６５ｇ、３．０ｍｍｏｌ）及び炭酸水素ナトリウム（０．９８ｇ、１２ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で１６時間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターによって除去し、透明オイルを酢酸エチル１００ｍＬに溶解させた。反応混合物を５％クエン酸溶液（５ｍＬ×２）、脱イオン水（５０ｍＬ）及び塩水（５０ｍＬ）で連続洗浄した。有機層を分離し、無水硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。粗生成物を、Ｂｉｏｔａｇｅ  Ｉｎｃ．  ＨＯＲＩＺＯＮ（商標）クロマトグラフィーシステムを用いたシリカクロマトグラフィーによって精製し、適切な画分を濃縮し、微量の溶媒を除去して（真空ポンプ）、Ｎ，Ｎ’−ジＢｏｃ−１，２−ビス（４−（２−アミノ−３−プロパン酸）フェニルジスルファン（０．５ｇ、粗生成物から４４％、２段階で５２％）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルデータ、ＨＰＬＣパターン及び質量スペクトルを得た。
【実施例３３】
【０７８９】
この実施例は、図３６に示すＮ−ＢＯＣ−２−アミノ−３−（４−メルカプトフェニル）プロパン酸（５）の合成を詳述するものである。オーブン乾燥した、撹拌棒を備えた丸底フラスコに窒素ガス圧下でＮ，Ｎ’−ジＢｏｃ−１，２−ビス（４−（２−アミノ−３−プロパン酸）フェニルジスルファン（０．５ｇ、０．８４ｍｍｏｌ）、ｎ−ブチルホスフィン（０．６ｍＬ、２．４４ｍｍｏｌ）及び無水ＴＨＦ１５ｍＬを添加した。反応物を室温で２時間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターによって除去し、透明オイルを酢酸エチル５０ｍＬに溶解させた。反応混合物を５％クエン酸溶液（２×２５ｍＬ）、脱イオン水（２５ｍＬ）及び塩水（２５ｍＬ）で連続洗浄した。有機層を分離し、無水硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。粗生成物を、Ｂｉｏｔａｇｅ  Ｉｎｃ．  ＨＯＲＩＺＯＮ（商標）クロマトグラフィーシステムを用いたシリカクロマトグラフィーによって精製し、適切な画分を濃縮し、微量の溶媒を除去して（真空ポンプ）、Ｎ−ＢＯＣ−２−アミノ−３−（４−メルカプトフェニル）プロパン酸（０．５ｇ、１００％）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルデータ、ＨＰＬＣパターン及び質量スペクトルを得た。
【実施例３４】
【０７９０】
この実施例は、図３６に示す２−アミノ−３−（４−メルカプトフェニル）プロパン酸塩酸塩（６）の合成を詳述するものである。オーブン乾燥した、撹拌棒を備えた丸底フラスコにＮ−ＢＯＣ−２−アミノ−３−（４−メルカプトフェニル）プロパン酸（．５ｇ、１．６ｍｍｏｌ）、無水ジクロロメタン１０ｍＬ及びトリフルオロ酢酸３ｍＬを添加した。反応物を室温で２時間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターによって除去し、４．０Ｍ塩化水素の１，４−ジオキサン溶液１ｍＬを添加した。丸底フラスコを短時間旋回させ、次いで無水ジエチルエーテル１００ｍＬを添加すると、２−アミノ−３−（４−メルカプトフェニル）プロパン酸塩酸塩（０．３９ｇ、１００％）が白色固体として沈殿した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルデータ、ＨＰＬＣパターン及び質量スペクトルを得た。
【実施例３５】
【０７９１】
この実施例は、図３７に示すジエチル２−（４−（２−オキソプロピルチオ）ベンジル）−２−アセトアミドマロナート（７）の合成を詳述するものである。オーブン乾燥した、撹拌棒を備えた丸底フラスコに窒素ガス圧下で（２）（１．１ｇ、１．６ｍｍｏｌ）、ｎ−Ｂｕ３Ｐ（１．２ｍＬ、４．８ｍｍｏｌ）及び無水ＴＨＦ（２５ｍＬ）２５ｍＬを添加した。反応物を室温で２時間撹拌した。反応物にクロロアセトン（０．１６ｍＬ、２．０ｍｍｏｌ）及びＮａＨＣＯ３（０．９８ｇ、１２ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温で２時間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターによって除去し、白色固体を酢酸エチル１００ｍＬに溶解させた。反応混合物を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（５０ｍＬ×２）、脱イオン水（５０ｍＬ）及び塩水（５０ｍＬ）で連続洗浄した。有機層を分離し、無水硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。粗生成物を、Ｂｉｏｔａｇｅ  Ｉｎｃ．  ＨＯＲＩＺＯＮ（商標）クロマトグラフィーシステムを用いたシリカクロマトグラフィーによって精製し、適切な画分を濃縮し、微量の溶媒を除去して（真空ポンプ）、ジエチル２−（４−（２−オキソプロピルチオ）ベンジル）−２−アセトアミドマロナート（０．６２ｇ、９８％）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルデータ、ＨＰＬＣパターン及び質量スペクトルを得た。
【実施例３６】
【０７９２】
この実施例は、図３７に示す３−（４−（２−オキソプロピルチオ）フェニル）−２−アミノプロパン酸（８）の合成を詳述するものである。オーブン乾燥した、撹拌棒を備えた丸底フラスコに窒素ガス圧下で７（０．６２ｇ、１．５ｍｍｏｌ）、１，４−ジオキサン１０ｍＬ及び１２Ｍ  ＨＣｌ  １０ｍＬを添加した。反応物を還流させ、終夜撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターによって除去して、３−（４−（２−オキソプロピルチオ）フェニル）−２−アミノプロパン酸（粗製０．４０ｇ、９９％）を得た。
【実施例３７】
【０７９３】
この実施例は、図３７に示すＮ−ＢＯＣ−３−（４−（２−オキソプロピルチオ）フェニル）−２−アミノプロパン酸（９）の合成を詳述するものである。オーブン乾燥した、撹拌棒を備えた丸底フラスコ中の８（０．３５ｇ、１．３ｍｍｏｌ）に窒素ガス圧下でジ−ｔ−ブチルジカルボナート（０．６３ｇ、３．０ｍｍｏｌ）、炭酸水素ナトリウム（０．９８ｇ、１２ｍｍｏｌ）、１，４−ジオキサン８ｍＬ及び脱イオン水８ｍＬを添加した。反応物を室温で１６時間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターによって除去し、透明オイルを酢酸エチル１００ｍＬに溶解させた。反応混合物を５％クエン酸溶液（５０ｍＬ×２）、脱イオン水（５０ｍＬ）及び塩水（５０ｍＬ）で連続洗浄した。有機層を分離し、無水硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。粗生成物を、Ｂｉｏｔａｇｅ  Ｉｎｃ．  ＨＯＲＩＺＯＮ（商標）クロマトグラフィーシステムを用いたシリカクロマトグラフィーによって精製し、適切な画分を濃縮し、微量の溶媒を除去して（真空ポンプ）、Ｎ−ＢＯＣ−３−（４−（２−オキソプロピルチオ）フェニル）−２−アミノプロパン酸（０．３０ｇ、粗生成物から６６％）を白色固体として得た。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルデータ、ＨＰＬＣパターン及び質量スペクトルを得た。
【実施例３８】
【０７９４】
この実施例は、図３７に示すＮ−ＢＯＣ−３−（４−（２−オキソプロピルスルフィニル）フェニル）−２−アミノプロパン酸（１０）の合成を詳述するものである。オーブン乾燥した、撹拌棒を備えた丸底フラスコに窒素ガス圧下で９（１５０ｍｇ、．４ｍｍｏｌ）、氷酢酸８ｍＬ及び３０％ｖ／ｖ過酸化水素水溶液２ｍＬを添加した。反応物を室温で２時間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターによって除去し、透明オイルを酢酸エチル５０ｍＬに溶解させた。反応混合物を５％クエン酸溶液（２５ｍＬ×２）、脱イオン水（２５ｍＬ）及び塩水（２５ｍＬ）で連続洗浄した。有機層を分離し、無水硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。粗生成物を、Ｂｉｏｔａｇｅ  Ｉｎｃ．  ＨＯＲＩＺＯＮ（商標）クロマトグラフィーシステムを用いたシリカクロマトグラフィーによって精製し、適切な画分を濃縮し、微量の溶媒を除去して（真空ポンプ）、Ｎ−ＢＯＣ−３−（４−（２−オキソプロピルスルフィニル）フェニル）−２−アミノプロパン酸（０．１３ｇ、粗生成物から８６％）を得た。ＨＰＬＣパターン及び質量スペクトルを得た。
【実施例３９】
【０７９５】
この実施例は、図３７に示す３−（４−（２−オキソプロピルスルフィニル）フェニル）−２−アミノプロパン酸（１１）の合成を詳述するものである。オーブン乾燥した、撹拌棒を備えた丸底フラスコにＮ−ＢＯＣ−３−（４−（２−オキソプロピルスルフィニル）フェニル）−２−アミノプロパン酸１０（０．１３ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）、無水ジクロロメタン１０ｍＬ及びトリフルオロ酢酸３ｍＬを添加した。反応物を室温で２時間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターによって除去し、４．０Ｍ塩化水素の１，４−ジオキサン溶液１ｍＬを添加した。丸底フラスコを短時間旋回させ、次いで無水ジエチルエーテル１００ｍＬを添加すると、３−（４−（２−オキソプロピルスルフィニル）フェニル）−２−アミノプロパン酸（０．０７２ｇ、粗生成物から７４％）が白色固体として沈殿した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルデータ、ＨＰＬＣパターン及び質量スペクトルを得た。
【実施例４０】
【０７９６】
この実施例は、図３７に示すＮ−ＢＯＣ−３−（４−（２−オキソプロピルスルフォニル）フェニル）−２−アミノプロパン酸（１２）の合成を詳述するものである。オーブン乾燥した、撹拌棒を備えた丸底フラスコに窒素ガス圧下で９（１５０ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）、氷酢酸８ｍＬ及び３０％ｖ／ｖ過酸化水素水溶液２ｍＬを添加した。反応物を室温で２４時間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターによって除去し、透明オイルを酢酸エチル５０ｍＬに溶解させた。反応混合物を５％クエン酸溶液（２５ｍＬ×２）、脱イオン水（２５ｍＬ）及び塩水（２５ｍＬ）で連続洗浄した。有機層を分離し、無水硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。粗生成物を、Ｂｉｏｔａｇｅ  Ｉｎｃ．  ＨＯＲＩＺＯＮ（商標）クロマトグラフィーシステムを用いたシリカクロマトグラフィーによって精製し、適切な画分を濃縮し、微量の溶媒を除去して（真空ポンプ）、Ｎ−ＢＯＣ−３−（４−（２−オキソプロピルスルホニル）フェニル）−２−アミノプロパン酸（１２）（０．１３ｇ、粗生成物から８６％）を得た。ＨＰＬＣパターン及び質量スペクトルを得た。
【実施例４１】
【０７９７】
この実施例は、図３７に示す３−（４−（２−オキソプロピルスルホニル）フェニル）−２−アミノプロパン酸（１３）の合成を詳述するものである。オーブン乾燥した、撹拌棒を備えた丸底フラスコにＮ−ＢＯＣ−３−（４−（２−オキソプロピルスルホニル）フェニル）−２−アミノプロパン酸１２（０．１３ｇ、０．３５ｍｍｏｌ）、無水ジクロロメタン１０ｍＬ及びトリフルオロ酢酸３ｍＬを添加した。反応物を室温で２時間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターによって除去し、４．０Ｍ塩化水素の１，４−ジオキサン溶液１ｍＬを添加した。丸底フラスコを短時間旋回させ、次いで無水ジエチルエーテル１００ｍＬを添加すると、３−（４−（２−オキソプロピルスルホニル）フェニル）−２−アミノプロパン酸（０．０６７ｇ、粗生成物から６５％）が白色固体として沈殿した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルデータ、ＨＰＬＣパターン及び質量スペクトルを得た。
【実施例４２】
【０７９８】
この実施例は、図３７に示す３−（４−（２−オキソプロピルチオ）フェニル）−２−アミノプロパン酸（１４）の合成を詳述するものである。オーブン乾燥した、撹拌棒を備えた丸底フラスコにＮ−ＢＯＣ−３−（４−（２−オキソプロピルチオ）フェニル）−２−アミノプロパン酸９（０．１０ｇ、．２８ｍｍｏｌ）、無水ジクロロメタン１０ｍＬ及びトリフルオロ酢酸３ｍＬを添加した。反応物を室温で２時間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターによって除去し、４．０Ｍ塩化水素の１，４−ジオキサン溶液１ｍＬを添加した。丸底フラスコを短時間旋回させ、次いで無水ジエチルエーテル１００ｍＬを添加すると、３−（４−（２−オキソプロピルチオ）フェニル）−２−アミノプロパン酸（０．０６２ｇ、粗生成物から８５％）が白色固体として沈殿した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルデータ、ＨＰＬＣパターン及び質量スペクトルを得た。
【実施例４３】
【０７９９】
この実施例は、図３８に示すＮ−ＢＯＣ−３−（４−（２−オキソシクロペンチルチオ）フェニル）−２−アミノプロパン酸（１５）の合成を詳述するものである。オーブン乾燥した、撹拌棒を備えた丸底フラスコに窒素ガス圧下で５（０．１５ｇ、０．７６ｍｍｏｌ）、２−クロロシクロペンタノン（０．１２ｍＬ、１．２５ｍｍｏｌ）、炭酸水素ナトリウム（０．９８ｇ、１２ｍｍｏｌ）、無水ＴＨＦ１５ｍＬを添加した。反応物を室温で１６時間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターによって除去し、白色固体を酢酸エチル１００ｍＬに溶解させた。反応混合物を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（５０ｍＬ×２）、脱イオン水（５０ｍＬ）及び塩水（５０ｍＬ）で連続洗浄した。有機層を分離し、無水硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。粗生成物を、Ｂｉｏｔａｇｅ  Ｉｎｃ．  ＨＯＲＩＺＯＮ（商標）クロマトグラフィーシステムを用いたシリカクロマトグラフィーによって精製し、適切な画分を濃縮し、微量の溶媒を除去して（真空ポンプ）、Ｎ−ＢＯＣ−３−（４−（２−オキソシクロペンチルチオ）フェニル）−２−アミノプロパン酸（０．１５ｇ、５１％）を白色固体として得た。ＨＰＬＣパターン及び質量スペクトルを得た。
【実施例４４】
【０８００】
この実施例は、図３８に示す３−（４−（２−オキソシクロペンチルチオ）フェニル）−２−アミノプロパン酸（１６）の合成を詳述するものである。オーブン乾燥した、撹拌棒を備えた丸底フラスコにＮ−ＢＯＣ−３−（４−（２−オキソシクロペンチルチオ）フェニル）−２−アミノプロパン酸１５（０．１５ｇ、０．３９ｍｍｏｌ）、無水ジクロロメタン１０ｍＬ及びトリフルオロ酢酸３ｍＬを添加した。反応物を室温で２時間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターによって除去し、４．０Ｍ塩化水素の１，４−ジオキサン溶液１ｍＬを添加した。丸底フラスコを短時間旋回させ、次いで無水ジエチルエーテル１００ｍＬを添加すると、３−（４−（２−オキソシクロペンチルチオ）フェニル）−２−アミノプロパン酸（０．１０８ｇ、１００％）が白色固体として沈殿した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルデータ、ＨＰＬＣパターン及び質量スペクトルを得た。
【実施例４５】
【０８０１】
この実施例は、図３８に示すＮ−ＢＯＣ−３−（４−（２−オキソブチルチオ）フェニル）−２−アミノプロパン酸（１８）の合成を詳述するものである。オーブン乾燥した、撹拌棒を備えた丸底フラスコに窒素ガス圧下で５（０．１５ｇ、０．７６ｍｍｏｌ）、１−ブロモ−２−ブタノン（０．１２ｍＬ、１．２５ｍｍｏｌ）、炭酸水素ナトリウム（０．９８ｇ、１２ｍｍｏｌ）、無水ＴＨＦ１５ｍＬを添加した。反応物を室温で１６時間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターによって除去し、白色固体を酢酸エチル１００ｍＬに溶解させた。反応混合物を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（５０ｍＬ×２）、脱イオン水（５０ｍＬ）及び塩水（５０ｍＬ）で連続洗浄した。有機層を分離し、無水硫酸マグネシウムで脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。粗生成物を、Ｂｉｏｔａｇｅ  Ｉｎｃ．  ＨＯＲＩＺＯＮ（商標）クロマトグラフィーシステムを用いたシリカクロマトグラフィーによって精製し、適切な画分を濃縮し、微量の溶媒を除去して（真空ポンプ）、Ｎ−ＢＯＣ−３−（４−（２−オキソブチルチオ）フェニル）−２−アミノプロパン酸（０．１５ｇ、５１％）を白色固体として得た。ＨＰＬＣパターン及び質量スペクトルを得た。
【実施例４６】
【０８０２】
この実施例は、図３８に示す化合物１９−２２の合成を詳述するものである。化合物１９−２２を、化合物１０−１４に対して記述した方法と類似の方法によって合成する。
【実施例４７】
【０８０３】
この実施例は、図３８に示す３−（４−（２−オキソブチルチオ）フェニル）−２−アミノプロパン酸（２３）の合成を詳述するものである。オーブン乾燥した、撹拌棒を備えた丸底フラスコにＮ−ＢＯＣ−３−（４−（２−オキソブチルチオ）フェニル）−２−アミノプロパン酸１８（０．１５ｇ、．５６ｍｍｏｌ）、無水ジクロロメタン１０ｍＬ及びトリフルオロ酢酸３ｍＬを添加した。反応物を室温で２時間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターによって除去し、４．０Ｍ塩化水素の１，４−ジオキサン溶液１ｍＬを添加した。丸底フラスコを短時間旋回させ、次いで無水ジエチルエーテル１００ｍＬを添加すると、３−（４−（２−オキソブチルチオ）フェニル）−２−アミノプロパン酸（０．１４９ｇ、１００％）が白色固体として沈殿した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルデータ、ＨＰＬＣパターン及び質量スペクトルを得た。
【実施例４８】
【０８０４】
この実施例は、図３９に示す化合物２４−２７の合成を詳述するものである。化合物２４−２７を、化合物１０−１４に対して記述した方法と類似の方法によって合成する。
【実施例４９】
【０８０５】
この実施例は、図３１に示すジカルボニル含有アミノ酸の合成を詳述するものである。
【０８０６】
【化１７４】
0005425398.tif 000123
の合成
【０８０７】
ｔ−ＢｕＯＫ（１５ｍＬ、１．０Ｍ  ＴＨＦ溶液）に、保護されたｐＡＦ（１．０ｇ、３．１ｍｍｏｌ）のトリフルオロ酢酸メチル（５ｍＬ、５０ｍｍｏｌ）溶液を徐々に添加する。反応混合物を室温で３０分間撹拌し、クエン酸（５ｇ、２５．４ｍｍｏｌ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃで希釈する。有機層をＨ２Ｏ及び塩水で連続洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮する。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、２０：１−３：２  へキサン：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、生成物（１．０７ｇ、８３％）を淡褐色固体として得る。
【０８０８】
【化１７５】
0005425398.tif 000124
の合成
【０８０９】
上記メチルエステル（１．０ｇ、２．４ｍｍｏｌ）のジオキサン（３０ｍＬ）溶液にＬｉＯＨ（３０ｍＬ、１Ｎ）を０℃で添加する。混合物を０℃で０．５時間撹拌し、クエン酸（１０ｇ、５１ｍｍｏｌ）でクエンチし、Ｈ２Ｏで希釈する。混合物をＥｔＯＡｃで抽出する。有機層をＨ２Ｏ及び塩水で連続洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮する。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、１００：１−１０：１  ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ、０．５％ＨＯＡｃ）によって精製して褐色のオイル（０．８７ｇ、９８％）を得る。
【０８１０】
【化１７６】
0005425398.tif 000125
の合成
【０８１１】
上記酸（１．０ｇ、２．５ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（１５ｍＬ）を０℃で添加する。生成した混合物を０．５時間撹拌し、減圧濃縮する。残渣にＭｅＯＨ（２ｍＬ）、続いてＨＣｌ（２ｍＬ、４Ｎジオキサン溶液）を添加した。次いで、エーテル（２００ｍＬ）を添加すると、生成物（０．５６ｇ、７５％）が白色固体として沈殿した。
【実施例５０】
【０８１２】
この実施例は、図３２に示すジカルボニル含有アミノ酸の合成を詳述するものである。
【０８１３】
【化１７７】
0005425398.tif 000126
の合成
【０８１４】
ｔ−ＢｕＯＫ（１５ｍＬ、１．０Ｍ  ＴＨＦ溶液）に、保護されたｐＡＦ（１．０ｇ、３．１ｍｍｏｌ）のペンタフルオロプロピオン酸メチル（８ｍＬ、６２ｍｍｏｌ）溶液を徐々に添加する。生成した混合物を室温で１時間撹拌し、クエン酸（５ｇ、２５．４ｍｍｏｌ）でクエンチし、Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）で希釈する。大部分の溶媒を除去した後、残渣をＥｔＯＡｃで抽出する。有機層をＨ２Ｏ及び塩水で連続洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮する。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、２０：１−３：２  へキサン：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、生成物（１．１ｇ、７６％）を淡褐色固体として得る。
【０８１５】
【化１７８】
0005425398.tif 000127
の合成
【０８１６】
上記メチルエステル（１．０ｇ、２．１ｍｍｏｌ）のジオキサン（３０ｍＬ）溶液にＬｉＯＨ（３０ｍＬ、１Ｎ）を０℃で添加する。生成した混合物を０℃で０．５時間撹拌し、クエン酸（１０ｇ、５１ｍｍｏｌ）及びＨ２Ｏでクエンチする。混合物をＥｔＯＡｃで抽出する。有機層をＨ２Ｏ及び塩水で連続洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮する。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、１００：１−１０：１  ＣＨ２Ｃｌ２：ＭｅＯＨ、０．５％ＨＯＡｃ）によって精製して、生成物（０．８ｇ、８４％）を黄色固体として得る。
【０８１７】
【化１７９】
0005425398.tif 000128
の合成
【０８１８】
上記酸（０．７ｇ、２．５ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（１５ｍＬ）を０℃で添加する。混合物を同じ温度で０．５時間撹拌し、濃縮する。残渣にＭｅＯＨ（２ｍＬ）、続いてＨＣｌ（２ｍＬ、４Ｎジオキサン溶液）を添加する。次いで、エーテル（２００ｍＬ）を添加して、生成物（０．６２ｇ、７０％）を白色固体として沈殿させる。
【実施例５１】
【０８１９】
この実施例は、図３３に示すジカルボニル含有アミノ酸の合成を詳述するものである。
【０８２０】
【化１８０】
0005425398.tif 000129
の合成
【０８２１】
アルコール１（２．３５ｇ、７．６ｍｍｏｌ）とピリジン（１．５ｍＬ、１８．６ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１５０ｍＬ）撹拌溶液にＤｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎペルヨージナン（３．５ｇ、８．３ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。混合物を室温で終夜撹拌し、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３−ＮａＨＣＯ３飽和水溶液（１：１、１００ｍＬ）でクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で希釈した。有機層を分離し、Ｈ２Ｏ及び塩水で洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、２０：１−３：１  へキサン：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、アルデヒド２を白色固体として得た（２．１５ｇ、９２％）。ＥＳＩ−ＭＳ、ｍ／ｚ：２９２（Ｍ＋−ＯＨ）、２３２、２０４、１７５、１３１、１１５（１００）。
【０８２２】
【化１８１】
0005425398.tif 000130
の合成
【０８２３】
ジイソプロピルアミン（０．３３ｍＬ、２．３３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（６０ｍＬ）撹拌溶液にｎ−ブチルリチウム（１．４６ｍＬ、２．３４ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。混合物を０℃で２０分間撹拌し、−７８℃に冷却し、次いでシクロペンタノンを添加した。混合物を−７８℃で２０分間撹拌した後、アルデヒド２（０．５ｇ、１．６３ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２０ｍＬ、２０ｍＬで洗浄）溶液を添加した。生成した混合物を−７８℃で１．０時間撹拌し、ＮＨ４Ｃｌ飽和水溶液でクエンチした。溶媒の大部分を除去した後、残渣をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をＨ２Ｏ及び塩水で洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、１０：１−１：１  へキサン：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、３を無色オイルとして得た（４８２ｍｇ、８０％）。
【０８２４】
【化１８２】
0005425398.tif 000131
の合成
【０８２５】
アルコール３（０．４４ｇ、１．１３ｍｍｏｌ）とピリジン（０．６ｍＬ、７．４４ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１５０ｍＬ）撹拌溶液にＤｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎペルヨージナン（０．６ｇ、１．４１ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。混合物を室温で終夜撹拌した。反応物をＮａ２Ｓ２Ｏ３−ＮａＨＣＯ３飽和水溶液（１：１、１００ｍＬ）でクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を混合し、Ｈ２Ｏ及び塩水で洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、２０：１−２：１  へキサン：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、ジケトン４（３４２ｍｇ、７８％）を無色オイルとして得た。ＥＳＩ−ＭＳ、ｍ／ｚ：４１２（Ｍ＋＋Ｎａ）、３５６、３１２、２３０、２１２、１８４、１４６（１００）。
【０８２６】
【化１８３】
0005425398.tif 000132
の合成
【０８２７】
メチルエステル４（３３０ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）のジオキサン（４ｍＬ）溶液にＬｉＯＨ（４ｍＬ、１Ｎ）を０℃で添加した。生成した混合物を０℃で３０分間撹拌し、クエン酸水溶液（５％、１００ｍＬ）でクエンチした。混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をＨ２Ｏ及び塩水で連続洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮して、白色固体（３１０ｍｇ、９７％）を得た。ＥＳＩ−ＭＳ、ｍ／ｚ：３４２、３３０（Ｍ＋−ＣＯＯＨ）、２９８、２３０、１８５、１１９（１００）。
【０８２８】
【化１８４】
0005425398.tif 000133
の合成
【０８２９】
酸５（３１０ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（４ｍＬ）を０℃で添加した。混合物を０℃で３０分間撹拌し、減圧濃縮した。残渣にＭｅＯＨ（１ｍＬ）、続いてＨＣｌ（１ｍＬ、４Ｎジオキサン溶液）を添加した。次いで、エーテル（１００ｍＬ）を添加すると、生成物（２４１ｍｇ、９４％）が白色固体として沈殿した。ＥＳＩ−ＭＳ、ｍ／ｚ：２９８（Ｍ＋＋Ｎａ）、２７６（Ｍ＋＋１）、２３０（Ｍ＋−ＣＯＯＨ）、１８４、１１９（１００）。
【実施例５２】
【０８３０】
この実施例は、図３４に示すジカルボニル含有アミノ酸の合成を詳述するものである。
【０８３１】
【化１８５】
0005425398.tif 000134
の合成
【０８３２】
アルコール（６．０ｇ、１９．４ｍｍｏｌ）とピリジン（１２ｍＬ、１５０ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（４００ｍＬ）撹拌溶液にＤｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎペルヨージナン（１４．２ｇ、３３．４ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。混合物を室温で終夜撹拌した。反応物をＮａ２Ｓ２Ｏ３−ＮａＨＣＯ３飽和水溶液（１：１、３００ｍＬ）でクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を混合し、Ｈ２Ｏ及び塩水で洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、１：１００−１：１  へキサン：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、アルデヒド（５．４８ｇ、９２％）を白色固体として得た。
【０８３３】
【化１８６】
0005425398.tif 000135
の合成
【０８３４】
上記アルデヒド（３．４１ｇ、１１．１ｍｍｏｌ）のアセトン（７０ｍＬ）溶液にＫＭｎＯ４（２．５ｇ、１５．８ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ（１０ｍＬ）溶液を添加した。生成した混合物を室温で終夜撹拌した。大部分の溶媒を除去した後、残渣をクエン酸水溶液（５％、３００ｍＬ）に溶解し、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を混合し、Ｈ２Ｏ及び塩水で洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮して、生成物を白色固体として得た（２．８３ｇ、７９％）。この生成物をさらに精製せずに次の段階に直接使用した。
【０８３５】
【化１８７】
0005425398.tif 000136
の合成
【０８３６】
上記酸（２．８３ｇ、８．７６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（６０ｍＬ）溶液に１−アミノ−２−プロパノール（１．４ｍＬ、１７．９ｍｍｏｌ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ｈｙｄｒｏｃｈｏｒｉｄｅ）（ＥＤＣ、４．１ｇ、２１．４ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ、２．２ｇ、１８．５ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、９ｍＬ、５１．６ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。混合物を室温で終夜撹拌し、次いでクエン酸水溶液（５％、２００ｍＬ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を混合し、Ｈ２Ｏ及び塩水で洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、１０：１−１：１  へキサン：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、生成物（２．４５ｇ、７４％）を白色発泡体として得た。
【０８３７】
【化１８８】
0005425398.tif 000137
の合成
【０８３８】
上記アルコール（２．４４ｇ、６．４ｍｍｏｌ）とピリジン（４ｍＬ、４９．６ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）溶液にＤｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎペルヨージナン（４．１ｇ、９．７ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。混合物を室温で終夜撹拌した。反応物をＮａ２Ｓ２Ｏ３−ＮａＨＣＯ３飽和水溶液（１：１、３００ｍＬ）でクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層をＨ２Ｏ及び塩水で洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、１：１−１：３  へキサン：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、生成物（１．８４ｇ、７６％）を黄色固体として得た。
【０８３９】
【化１８９】
0005425398.tif 000138
の合成
【０８４０】
上記メチルエステル（１．７２ｇ、４．６ｍｍｏｌ）のジオキサン（１０ｍＬ）溶液にＬｉＯＨ（１０ｍＬ、１Ｎ）を０℃で添加した。混合物を同じ温度で３時間撹拌し、クエン酸水溶液（５％）でクエンチした。混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をＨ２Ｏ及び塩水で連続洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮して、生成物（１．７ｇ）を固体として得た。この生成物を精製せずに次の段階に直接使用した。
【０８４１】
上記酸（１．７ｇ、４．７ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（１５ｍＬ）を０℃で添加した。混合物を同じ温度で２時間撹拌し、減圧濃縮した。残渣にＨＣｌ（１．５ｍＬ、４Ｎジオキサン溶液）、続いてエーテル（４００ｍＬ）を添加した。沈殿生成物（２段階で１．５２ｇ、９０％）を白色固体として収集した。
【実施例５３】
【０８４２】
この実施例は、図４４に示すヒドラジド含有アミノ酸の合成を詳述するものである。
【０８４３】
【化１９０】
0005425398.tif 000139
の合成
【０８４４】
アルデヒド（４１０ｍｇ、１．３４ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（１５ｍＬ）溶液にギ酸ヒドラジド（ｆｏｒｍｉｃ  ｈｙｄｒａｚｉｄｅ）（１７０ｍｇ、２．８３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１時間撹拌した。大部分の溶媒を除去した後、残渣をＣＨ２Ｃｌ２で抽出した。有機層を混合し、減圧濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、１：６−１：１  へキサン：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、白色固体（３９０ｍｇ、８３％）を得た。
【０８４５】
【化１９１】
0005425398.tif 000140
の合成
【０８４６】
上記メチルエステル（３４９ｍｇ、１ｍｍｏｌ）のジオキサン（７ｍＬ）溶液にＬｉＯＨ（７ｍＬ、１Ｎ）を０℃で添加した。混合物を同じ温度で１０分間撹拌し、クエン酸（２．５ｇ）でクエンチし、Ｈ２Ｏで希釈した。混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をＨ２Ｏ及び塩水で連続洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮して、白色固体（２９０ｍｇ、８７％）を得た。
【０８４７】
【化１９２】
0005425398.tif 000141
の合成
【０８４８】
上記酸（２９０ｍｇ、０．８７ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（２０ｍＬ）を０℃で添加した。混合物を２０分間撹拌し、濃縮した。残渣にＭｅＯＨ（１ｍＬ）、続いてＨＣｌ（１．０ｍＬ、４Ｎジオキサン溶液）を添加した。次いで、エーテル（２００ｍＬ）を添加すると、生成物（１９５ｍｇ、８３％）が淡黄色固体として沈殿した。
【実施例５４】
【０８４９】
この実施例は、図４５に示すヒドラジド含有アミノ酸の合成を詳述するものである。
【０８５０】
【化１９３】
0005425398.tif 000142
の合成
【０８５１】
Ｎ−Ｂｏｃ−４−ヒドロキシメチルフェニルアラニン（１１．７３ｇ、３９．８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１００ｍＬ）溶液にアラニンメチルエステル塩酸塩（９．０ｇ、６４．５ｍｍｏｌ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、１５．４ｇ、８０．３ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、３０ｍＬ、１７２ｍｍｏｌ）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物（ＨＯＢｔ、８．４ｇ、７０．６ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で終夜撹拌し、次いでＥｔＯＡｃで希釈した。有機層を分離し、Ｈ２Ｏ、クエン酸（５％）、Ｈ２Ｏ、ＮａＨＣＯ３、Ｈ２Ｏ及び塩水で連続洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮して、保護されたジペプチドを白色固体として得た（１３．７４ｇ、９１％）。
【０８５２】
【化１９４】
0005425398.tif 000143
の合成
【０８５３】
上記保護されたジペプチド（１０．３３ｇ、２７．２ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（３００ｍＬ）溶液にピリジン（８ｍＬ、９９．１ｍｍｏｌ）及びＤｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎペルヨージナン（１４ｇ、３３．０ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応混合物を終夜撹拌し、次いでＮａＨＣＯ３／Ｎａ２Ｓ２Ｏ３（１：１）飽和水溶液でクエンチした。有機層をＨ２Ｏ、クエン酸、Ｈ２Ｏ及び塩水で連続洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、９：１−１：１  へキサン：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、生成物（１０．１２ｇ、９８％）を白色固体として得た。
【０８５４】
【化１９５】
0005425398.tif 000144
の合成
【０８５５】
ジペプチドアルデヒド（１０．１ｇ、２６．７ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（２００ｍＬ）溶液に酢酸ヒドラジド（３．７ｇ、４５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で３０分間撹拌し、濃縮した。残渣にＨ２Ｏ（１Ｌ）及びＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍＬ）を添加した。有機層を分離し、濃縮して、白色固体（１１．２１ｇ、９７％）を得た。
【０８５６】
【化１９６】
0005425398.tif 000145
の合成
【０８５７】
上記メチルエステル（１１．１ｇ、２５．６ｍｍｏｌ）のジオキサン（５０ｍＬ）溶液にＬｉＯＨ（５０ｍＬ、１Ｎ）を０℃で添加した。混合物を同じ温度で３０分間撹拌し、次いでクエン酸（２０ｇ）でクエンチし、Ｈ２Ｏ（２００ｍＬ）で希釈した。混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をＨ２Ｏ及び塩水で連続洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮して、白色固体（９．５２ｇ、８８％）を得た。
【０８５８】
【化１９７】
0005425398.tif 000146
の合成
【０８５９】
上記酸（９．５ｇ、２２．６ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（５０ｍＬ）を０℃で添加した。混合物を０℃で１時間撹拌し、減圧濃縮した。残渣にＨＣｌ（７ｍＬ、４Ｎジオキサン溶液）、続いてエーテル（５００ｍＬ）を添加した。沈殿を白色固体（７．２５ｇ、９０％）として収集した。
【実施例５５】
【０８６０】
この実施例は、図４６Ａに示すオキシム含有アミノ酸の合成を詳述するものである。
【０８６１】
【化１９８】
0005425398.tif 000147
の合成
【０８６２】
アルデヒド（３．０ｇ）のＭｅＯＨ／Ｈ＋溶液にヒドロキシルアミン塩酸塩２当量を添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、濃縮した。残渣にＨ２Ｏ（２００ｍＬ）、続いてＣＨ２Ｃｌ２を添加した。有機層を分離し、減圧濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、３：７−１：９  へキサン：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、生成物（９６％）を固体として得た。
【０８６３】
【化１９９】
0005425398.tif 000148
の合成
【０８６４】
上記メチルエステル（３．０ｇ）のジオキサン（１０ｍＬ）溶液にＬｉＯＨ（１０ｍＬ、１Ｎ）を０℃で添加した。混合物を同じ温度で３時間撹拌し、次いでクエン酸（５ｇ）を添加してクエンチし、Ｈ２Ｏで希釈した。混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をＨ２Ｏ及び塩水で連続洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮して、固体を得た。次いで、生成した酸のＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（２０ｍＬ）を０℃で添加した。反応混合物を０℃で１時間撹拌し、濃縮した。残渣にＭｅＯＨ（１ｍＬ）を添加し、続いてＨＣｌ（２．０ｍＬ、４Ｎジオキサン溶液）を添加した。次いで、エーテル（２００ｍＬ）を添加すると、生成物（８７％）が固体として沈殿した。
【実施例５６】
【０８６５】
この実施例は、図４６Ｂに示すオキシム含有アミノ酸の合成を詳述するものである。
【０８６６】
【化２００】
0005425398.tif 000149
の合成
【０８６７】
アルデヒド（３．０ｇ）のＭｅＯＨ／Ｈ＋溶液にメトキシアミン塩酸塩２当量を添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、濃縮した。残渣にＨ２Ｏ（２００ｍＬ）、続いてＣＨ２Ｃｌ２を添加した。有機層を分離し、減圧濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、３：７−１：９  へキサン：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、生成物（９３％）を固体として得た。
【０８６８】
【化２０１】
0005425398.tif 000150
の合成
【０８６９】
上記メチルエステル（３．０ｇ）のジオキサン（１０ｍＬ）溶液にＬｉＯＨ（１０ｍＬ、１Ｎ）を０℃で添加した。混合物を同じ温度で３時間撹拌し、次いでクエン酸（５ｇ）を添加してクエンチし、Ｈ２Ｏで希釈した。混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をＨ２Ｏ及び塩水で連続洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮して、固体を得た。次いで、生成した酸のＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（２０ｍＬ）を０℃で添加した。反応混合物を０℃で１時間撹拌し、濃縮した。残渣にＭｅＯＨ（１ｍＬ）を添加し、続いてＨＣｌ（２．０ｍＬ、４Ｎジオキサン溶液）を添加した。次いで、エーテル（２００ｍＬ）を添加すると、生成物（８９％）が固体として沈殿した。
【実施例５７】
【０８７０】
この実施例は、図４６Ｃに示すヒドラジン含有アミノ酸の合成を詳述するものである。
【０８７１】
【化２０２】
0005425398.tif 000151
の合成
【０８７２】
アルデヒド（３．０ｇ）のＭｅＯＨ／Ｈ＋溶液にメチルヒドラジン２当量を添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌し、濃縮した。残渣にＨ２Ｏ（２００ｍＬ）、続いてＣＨ２Ｃｌ２を添加した。有機層を分離し、減圧濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、３：７−１：９  へキサン：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、生成物（９３％）を固体として得た。
【０８７３】
【化２０３】
0005425398.tif 000152
の合成
【０８７４】
上記メチルエステル（３．０ｇ）のジオキサン（１０ｍＬ）溶液にＬｉＯＨ（１０ｍＬ、１Ｎ）を０℃で添加した。混合物を同じ温度で３時間撹拌し、次いでクエン酸（５ｇ）を添加してクエンチし、Ｈ２Ｏで希釈した。混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層をＨ２Ｏ及び塩水で連続洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮して、固体を得た。次いで、生成した酸のＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（２０ｍＬ）を０℃で添加した。反応混合物を０℃で１時間撹拌し、濃縮した。残渣にＭｅＯＨ（１ｍＬ）を添加し、続いてＨＣｌ（２．０ｍＬ、４Ｎジオキサン溶液）を添加した。次いで、エーテル（２００ｍＬ）を添加すると、生成物（８９％）が固体として沈殿した。
【実施例５８】
【０８７５】
この実施例は、図４８Ａに示すｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミンの合成を詳述するものである。
【０８７６】
【化２０４】
0005425398.tif 000153
の合成
【０８７７】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）−ＯＨ（１．０ｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液にクロロギ酸ｐ−ニトロフェノール（６０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１５時間撹拌した。エーテル（２００ｍＬ）を添加した。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、生成物（１．０ｇ、１００％）を白色粉末として得た。
【０８７８】
【化２０５】
0005425398.tif 000154
の合成  
【０８７９】
ｔ−ブチル３−ヒドロキシエチルカルバマート（１．７５ｇ、１０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（６０ｍＬ）溶液にＮ−ヒドロキシフタルイミド（３．２ｇ、２０ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（２．０ｇ、１５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１０分間撹拌し、次いで０℃に冷却した。アゾジカルボン酸ジイソプロピル（ＤＩＡＤ、２．０ｍＬ、１０．５ｍｍｏｌ）をシリンジを用いて１時間滴下した。氷浴を取り外し、混合物を終夜撹拌し、濃縮した。白色固体を酢酸エチル（１００ｍＬ）に溶解させた。反応混合物を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（１００ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）及び塩水（１００ｍＬ）で連続洗浄し、次いで無水ＭｇＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、１００：１−１０：１  へキサン：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、標記化合物（２．６ｇ、８１％）を白色固体として得た。
【０８８０】
【化２０６】
0005425398.tif 000155
の合成
【０８８１】
Ｂｏｃで保護したリンカー（２．０ｇ、９．１ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（５ｍＬ）を添加した。生成した混合物を室温で１時間撹拌し、濃縮した。残渣にＨＣｌ（４Ｎジオキサン溶液、１．５ｍＬ）を添加し、続いてＥｔ２Ｏ（１５０ｍＬ）を添加した。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、アミンリンカー（１．１ｇ、８５％）を白色固体として得た。
【０８８２】
【化２０７】
0005425398.tif 000156
の合成
【０８８３】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）ｐ−ニトロフェノールカルボナート（１．０ｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）とアミンリンカー（５３ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）の混合物のＤＭＦ−ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ、１：２）溶液にジイソプロピルエチルアミン（５０μＬ、０．２８ｍｍｏｌ）及びＤＭＡＰ（５ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）を添加した。生成した混合物を室温で１５時間撹拌した。エーテル（２００ｍＬ）を添加した。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、生成物（０．８３ｇ、８３％）を白色粉末として得た。
【０８８４】
【化２０８】
0005425398.tif 000157
の合成
【０８８５】
ｍＰＥＧフタルイミド（３０Ｋ、０．８ｇ、０．０２６６ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（５ｍＬ）溶液にヒドラジン（８．５μＬ、０．２７ｍｍｏｌ）を添加した。生成した混合物を４５℃で１．０時間撹拌した。反応物を室温に冷却した後、ＣＨ２Ｃｌ２（１５０ｍＬ）を添加し、溶液をＨＣｌ水溶液（０．１Ｎ、１００ｍＬ）で洗浄した。水層をＣＨ２Ｃｌ２（１５０ｍＬ）で抽出した。有機層を混合し、Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）で洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）に溶解した。エーテル（２００ｍＬ）を添加すると、ヒドロキシルアミン生成物（０．７２ｇ、９０％）が白色粉末として沈殿した。
【実施例５９】
【０８８６】
この実施例は、図４８Ｂに示すｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミンの合成を詳述するものである。
【０８８７】
【化２０９】
0005425398.tif 000158
の合成
【０８８８】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）−ＯＨ（１．０ｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液にクロロギ酸ｐ−ニトロフェノール（６０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１５時間撹拌した。エーテル（２００ｍＬ）を添加した。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、生成物（１．０ｇ、１００％）を白色粉末として得た。
【０８８９】
【化２１０】
0005425398.tif 000159
の合成
【０８９０】
ｔ−ブチル２−ヒドロキシエチルカルバマート（２．８ｍＬ、１８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（６０ｍＬ）溶液にＮ−ヒドロキシフタルイミド（５．８ｇ、３６ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（３．６ｇ、２７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１０分間撹拌し、次いで０℃に冷却した。アゾジカルボン酸ジイソプロピル（ＤＩＡＤ、３．６ｍＬ、１９ｍｍｏｌ）をシリンジを用いて１時間滴下した。氷浴を取り外し、混合物を終夜撹拌し、濃縮した。白色固体を酢酸エチル（１００ｍＬ）に溶解させた。反応混合物を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（２×５０ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ）及び塩水（５０ｍＬ）で連続洗浄し、次いで無水ＭｇＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。粗生成物を、Ｂｉｏｔａｇｅ  Ｉｎｃ．  ＨＯＲＩＺＯＮ（商標）クロマトグラフィーシステムを用いたフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、不純物を含む標記化合物（１２ｇ、２０６％）を白色固体として得た。
【０８９１】
【化２１１】
0005425398.tif 000160
の合成
【０８９２】
Ｂｏｃで保護した粗製リンカー（１２ｇ）のＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（５ｍＬ）を添加した。生成した混合物を室温で１時間撹拌し、濃縮した。残渣にＨＣｌ（４Ｎジオキサン溶液、１．５ｍＬ）を添加し、続いてＥｔ２Ｏ（１５０ｍＬ）を添加した。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、アミンリンカー（２段階で３．０ｇ、６８％）を白色固体として得た。
【０８９３】
【化２１２】
0005425398.tif 000161
の合成
【０８９４】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）ｐ−ニトロフェノールカルボナート（１．０ｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）とアミンリンカー（５０ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）の混合物のＤＭＦ−ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ、１：２）溶液にジイソプロピルエチルアミン（５０μＬ、０．２８ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（４ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）を添加した。生成した混合物を室温で１５時間撹拌した。エーテル（２００ｍＬ）を添加した。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、生成物（０．８１ｇ、８１％）を白色粉末として得た。
【０８９５】
【化２１３】
0005425398.tif 000162
の合成
【０８９６】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）フタルイミド（０．８ｇ、０．０２６６ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（５ｍＬ）溶液にヒドラジン（８．５μＬ、０．２７ｍｍｏｌ）を添加した。生成した混合物を４５℃で１．０時間撹拌した。反応物を室温に冷却した後、ＣＨ２Ｃｌ２（１５０ｍＬ）を添加し、溶液をＨＣｌ水溶液（０．１Ｎ、１００ｍＬ）で洗浄した。水層をＣＨ２Ｃｌ２（１５０ｍＬ）で抽出した。有機層を混合し、Ｈ２Ｏ（１００ｍＬ）で洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）に溶解した。エーテル（２００ｍＬ）を添加すると、ヒドロキシルアミン生成物（０．６８ｇ、８５％）が白色粉末として沈殿した。
【実施例６０】
【０８９７】
この実施例は、図４９Ａに示すｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミンの合成を詳述するものである。
【０８９８】
【化２１４】
0005425398.tif 000163
の合成
【０８９９】
Ｎ−（３−ブロモプロピル）フタルイミド（４．０ｇ、１５．０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（５０ｍＬ）溶液にＫ２ＣＯ３（１０ｇ、７３ｍｍｏｌ）及びｔ−ブチルＮ−ヒドロキシカルバマート（２．５ｇ、１８．８ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌した。混合物をＨ２Ｏ（２００ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で抽出した。有機層をＨ２Ｏ及び塩水で洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、２０：１−３：１  へキサン：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、生成物（３．５ｇ、７２％）を無色オイルとして得た。
【０９００】
【化２１５】
0005425398.tif 000164
の合成
【０９０１】
上記フタルイミド（５００ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（１０ｍＬ）溶液にヒドラジン（０．２５ｍＬ、８．０ｍｍｏｌ）を添加した。生成した混合物を室温で３時間撹拌した。沈殿を除去した後、ろ液を濃縮した。残渣を高真空中で終夜放置した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、３：１−１：１  ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ）によって精製して、アミンリンカー（２５２ｍｇ、８５％）を白色固体として得た。
【０９０２】
【化２１６】
0005425398.tif 000165
の合成
【０９０３】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）−ＯＨ（１．０ｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液にクロロギ酸ｐ−ニトロフェノール（６０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１５時間撹拌した。エーテル（２００ｍＬ）を添加した。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、生成物（１．０ｇ、１００％）を白色固体として得た。
【０９０４】
【化２１７】
0005425398.tif 000166
の合成
【０９０５】
上記活性化ｍＰＥＧ（３０Ｋ）（３．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）溶液にジイソプロピルエチルアミン（８８μＬ、０．５ｍｍｏｌ）及びアミンリンカー（７６ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を添加した。生成した混合物を室温で１５時間撹拌した。エーテル（７００ｍＬ）を反応混合物に添加した。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、白色粉末（２．８ｇ、９３％）を得た。
【０９０６】
【化２１８】
0005425398.tif 000167
の合成
【０９０７】
Ｂｏｃで保護したｍＰＥＧ（３０Ｋ）（２．０ｇ、０．０６７ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）を０℃で添加した。生成した混合物を室温で５時間撹拌した。エーテル（５００ｍＬ）を反応混合物に添加した。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、白色粉末（１．８ｇ、９０％）を得た。
【実施例６１】
【０９０８】
この実施例は、図４９Ｂに示すｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミンの合成を詳述するものである。
【０９０９】
【化２１９】
0005425398.tif 000168
の合成
【０９１０】
ｔ−ブチルＮ−ヒドロキシカルバマート（５．０ｇ、３７．６ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（３０ｍＬ）溶液にＫ２ＣＯ３（１２ｇ、８７．６ｍｍｏｌ）及びＮ−（２−ブロモエチル）フタルイミド（１０．０ｇ、３９．７ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。反応混合物を室温で３時間撹拌した。混合物をＨ２Ｏ（２００ｍＬ）で希釈し、ＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で抽出した。有機層をＨ２Ｏ及び塩水で洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、２０：１−１：１  へキサン：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、生成物（５．２ｇ、５５％）を白色固体として得た。
【０９１１】
【化２２０】
0005425398.tif 000169
の合成
【０９１２】
上記フタルイミド（５００ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）のＥｔＯＨ（１０ｍＬ）溶液にヒドラジン（０．２５ｍＬ、８．０ｍｍｏｌ）を添加した。生成した混合物を室温で３時間撹拌した。沈殿を除去した後、ろ液を濃縮した。残渣を高真空中で終夜放置した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、３：１−１：１  ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ）によって精製して、アミンリンカー（３０１ｍｇ、８６％）を白色固体として得た。
【０９１３】
【化２２１】
0005425398.tif 000170
の合成
【０９１４】
上記活性化ｍＰＥＧ（３０Ｋ）（１．０ｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液にジイソプロピルエチルアミン（５８μＬ、０．３３ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（４ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）及び上記アミンリンカー（６４ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）を添加した。生成した混合物を室温で１５時間撹拌した。エーテル（２００ｍＬ）を反応混合物に添加した。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、白色粉末（０．８５ｇ、８５％）を得た。
【０９１５】
【化２２２】
0005425398.tif 000171
の合成
【０９１６】
Ｂｏｃで保護したｍＰＥＧ（３０Ｋ）（０．８５ｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（１０ｍＬ）を０℃で添加した。生成した混合物を室温で５時間撹拌した。エーテル（２００ｍＬ）を反応混合物に添加した。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、白色粉末（０．６８ｇ、８０％）を得た。
【実施例６２】
【０９１７】
この実施例は、図５０Ａに示すｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミンの合成を詳述するものである。
【０９１８】
【化２２３】
0005425398.tif 000172
の合成
【０９１９】
モノＢｏｃフタルイミド（２．１ｇ、６．９ｍｍｏｌ）のピリジン（５０ｍＬ）溶液にＢｏｃ２Ｏ（３．３ｇ、１５．１ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。生成した混合物を６０℃に終夜加熱した。溶媒を減圧除去した後、残渣をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で希釈し、クエン酸（５％、２００ｍＬ）、水（２００ｍＬ）及び塩水（２００ｍＬ）で洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、２０：１−３：１  へキサン：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、生成物（２．３７ｇ、８５％）を黄色オイルとして得た。
【０９２０】
【化２２４】
0005425398.tif 000173
の合成
【０９２１】
ジＢｏｃフタルイミド（１．２１ｇ、２．９８ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（１５ｍＬ）溶液にアンモニアのＭｅＯＨ溶液（１５ｍＬ、７Ｎ、１０５ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。生成した混合物を室温で終夜撹拌した。沈殿をろ過除去し、ろ液を減圧濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、１０：１−６：４  ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ）によって精製して、アミンリンカー（０．６１ｇ、７４％）を白色固体として得た。
【０９２２】
【化２２５】
0005425398.tif 000174
の合成
【０９２３】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）−ＯＨ（１．０ｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液にクロロギ酸ｐ−ニトロフェノール（６０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１５時間撹拌した。エーテル（２００ｍＬ）を添加すると、ｍＰＥＧ（３０Ｋ）生成物が沈殿した。生成物をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させた（１．０ｇ、１００％）。
【０９２４】
【化２２６】
0005425398.tif 000175
の合成
【０９２５】
上記活性化ｍＰＥＧ（３０Ｋ）（１．０ｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液にジイソプロピルエチルアミン（５８μＬ、０．３３ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（５ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）及び上記ジＢｏｃアミンリンカー（９０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）を添加した。生成した混合物を室温で１５時間撹拌した。エーテル（２００ｍＬ）を反応混合物に添加した。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、白色粉末（０．８２ｇ、８２％）を得た。
【０９２６】
【化２２７】
0005425398.tif 000176
の合成
【０９２７】
Ｂｏｃで保護したｍＰＥＧ（３０Ｋ）（０．８２ｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（８ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（８ｍＬ）を０℃で添加した。生成した混合物を室温で５時間撹拌した。エーテル（２００ｍＬ）を反応混合物に添加した。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、白色粉末（０．５７ｇ、７０％）を得た。
【実施例６３】
【０９２８】
この実施例は、図５０Ｂに示すｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミンの合成を詳述するものである。
【０９２９】
【化２２８】
0005425398.tif 000177
の合成
【０９３０】
モノＢｏｃフタルイミド（１．５ｇ、４．７ｍｍｏｌ）のピリジン溶液にＢｏｃ２Ｏ（２．２ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。生成した混合物を６０℃に終夜加熱した。溶媒を減圧除去した後、残渣をＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）で希釈し、クエン酸（５％、２００ｍＬ）、水（２００ｍＬ）及び塩水（２００ｍＬ）で洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、２０：１−３：１  へキサン：ＥｔＯＡｃ）によって精製して、生成物（１．６ｇ、８１％）をオイルとして得た。
【０９３１】
【化２２９】
0005425398.tif 000178
の合成
【０９３２】
ジＢｏｃフタルイミド（１．５ｇ、３．６ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（１５ｍＬ）溶液にアンモニアのＭｅＯＨ溶液（１５ｍＬ、７Ｎ、１０５ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。生成した混合物を室温で終夜撹拌した。沈殿をろ過除去し、ろ液を減圧濃縮した。残渣をフラッシュクロマトグラフィー（シリカ、１０：１−６：４  ＥｔＯＡｃ：ＭｅＯＨ）によって精製して、アミンリンカー（０．８５ｇ、８２％）を白色固体として得た。
【０９３３】
【化２３０】
0005425398.tif 000179
の合成
【０９３４】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）−ＯＨ（１．０ｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液にクロロギ酸ｐ−ニトロフェノール（６０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１５時間撹拌した。エーテル（２００ｍＬ）を添加した。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、生成物（１．０ｇ、１００％）を白色粉末として得た。
【０９３５】
【化２３１】
0005425398.tif 000180
の合成
【０９３６】
上記活性化ｍＰＥＧ（３０Ｋ）（１．０ｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液にジイソプロピルエチルアミン（５８μＬ、０．３３ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（５ｍｇ、０．０４１ｍｍｏｌ）及び上記ジＢｏｃアミンリンカー（１００ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）を添加した。生成した混合物を室温で１５時間撹拌した。エーテル（２００ｍＬ）を反応混合物に添加した。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、白色粉末（０．８９ｇ、８９％）を得た。
【０９３７】
【化２３２】
0005425398.tif 000181
の合成
【０９３８】
Ｂｏｃで保護したｍＰＥＧ（３０Ｋ）（０．８９ｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（８ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（８ｍＬ）を０℃で添加した。生成した混合物を室温で５時間撹拌した。エーテル（２００ｍＬ）を反応混合物に添加した。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、白色粉末（０．６５ｇ、７３％）を得た。
【実施例６４】
【０９３９】
この実施例は、図５１Ａに示すｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミンの合成を詳述するものである。
【０９４０】
【化２３３】
0005425398.tif 000182
の合成
【０９４１】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）プロピオンアルデヒド（０．５ｇ、０．０１６６ｍｍｏｌ）とアミンリンカー（７３ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）の混合物のＭｅＯＨ（１０ｍＬ）溶液にＮａＣＮＢＨ３（２０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）を添加した。生成した混合物を室温で４８時間撹拌した。大部分の溶媒を除去した後、エーテル（２００ｍＬ）を添加した。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、白色粉末（０．４３ｇ、８６％）を得た。
【０９４２】
【化２３４】
0005425398.tif 000183
の合成
【０９４３】
ジＢｏｃで保護したｍＰＥＧ（３０Ｋ）（０．４２ｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（４ｍＬ）を０℃で添加した。生成した混合物を室温で８時間撹拌した。エーテル（１００ｍＬ）を反応混合物に添加した。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、白色粉末（０．３５ｇ、８３％）を得た。
【実施例６５】
【０９４４】
この実施例は、図５１Ｂに示すｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミンの合成を詳述するものである。
【０９４５】
【化２３５】
0005425398.tif 000184
の合成
【０９４６】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）（６．０ｇ、０．２ｍｍｏｌ）とピリジン（０．１ｍＬ、１．２ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（６０ｍＬ）撹拌溶液にＤｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎペルヨージナン（０．２ｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を０℃で添加する。混合物を室温で終夜撹拌する。次いで、反応物をＮａ２Ｓ２Ｏ３−ＮａＨＣＯ３飽和水溶液（１：１、１００ｍＬ）でクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍＬ×２）で抽出する。有機層を混合し、Ｈ２Ｏ及び塩水で洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮する。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）に溶解する。エーテル（１Ｌ）を溶液に添加する。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、白色粉末（４．９ｇ、８２％）を得る。
【０９４７】
【化２３６】
0005425398.tif 000185
の合成
【０９４８】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）アルデヒド（０．５ｇ、０．０１６６ｍｍｏｌ）とアミンリンカー（７３ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）の混合物のＭｅＯＨ（１０ｍＬ）溶液にＮａＣＮＢＨ３（２０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）を添加する。生成した混合物を室温で４８時間撹拌する。大部分の溶媒を除去した後、エーテル（２００ｍＬ）を添加する。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、白色粉末（０．４３ｇ、８５％）を得る。
【０９４９】
【化２３７】
0005425398.tif 000186
の合成
【０９５０】
ジＢｏｃで保護したｍＰＥＧ（３０Ｋ）（０．４２ｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（４ｍＬ）を０℃で添加する。生成した混合物を室温で８時間撹拌する。エーテル（１００ｍＬ）を反応混合物に添加する。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、白色粉末（０．３５ｇ、８３％）を得る。
【実施例６６】
【０９５１】
この実施例は、図５２Ａに示すｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミンの合成を詳述するものである。
【０９５２】
【化２３８】
0005425398.tif 000187
の合成
【０９５３】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）−ＮＨ２（６．０ｇ、０．２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（６０ｍＬ）溶液にＢｏｃ−Ｓｅｒ−ＯＨ（２０５ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、１９０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（０．１７ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を室温で１０時間撹拌し、ＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）で希釈する。生成した混合物をＮａＨＣＯ３飽和水溶液（３００ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（３００ｍＬ）及び塩水（３００ｍＬ）で連続洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮する。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）に溶解する。エーテル（７００ｍＬ）を添加する。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、白色粉末（５．１ｇ、８２％）を得る。
【０９５４】
【化２３９】
0005425398.tif 000188
の合成
【０９５５】
上記ｍＰＥＧ（３０Ｋ）（３．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（１５ｍＬ）を０℃で添加する。生成した混合物を室温で３時間撹拌し、濃縮する。残渣にＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）を添加し、続いてＨＣｌ（４Ｎジオキサン溶液、２ｍＬ）を添加する。エーテル（４００ｍＬ）を添加すると、ジヒドロキシルアミン（２．６ｇ、８５％）が白色固体として沈殿する。
【０９５６】
【化２４０】
0005425398.tif 000189
の合成
【０９５７】
上記ｍＰＥＧ（３０Ｋ）（２．０ｇ、０．０６７ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ−ＣＨ３ＣＮ（１：１、２０ｍＬ）溶液にＮａＩＯ４（１５ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を室温で４時間撹拌し、ＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍＬ）で希釈する。生成した混合物をＨ２Ｏ（１００ｍＬ）及び塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮する。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）に溶解する。エーテル（７００ｍＬ）を添加する。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、白色粉末（１．８ｇ、９０％）を得る。
【０９５８】
【化２４１】
0005425398.tif 000190
の合成
【０９５９】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）アルデヒド（０．５ｇ、０．０１６６ｍｍｏｌ）とアミンリンカー（７３ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）の混合物のＭｅＯＨ（１０ｍＬ）溶液にＮａＣＮＢＨ３（２０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）を添加する。生成した混合物を室温で４８時間撹拌する。大部分の溶媒を除去した後、エーテル（２００ｍＬ）を添加した。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、白色粉末（０．４３ｇ、８６％）を得る。
【０９６０】
【化２４２】
0005425398.tif 000191
の合成
【０９６１】
ジＢｏｃで保護したｍＰＥＧ（３０Ｋ）（０．４２ｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（４ｍＬ）を０℃で添加する。生成した混合物を室温で８時間撹拌した。エーテル（１００ｍＬ）を反応混合物に添加する。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、白色粉末（０．３５ｇ、８３％）を得る。
【実施例６７】
【０９６２】
この実施例は、図５２Ｂに示すｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミンの合成を詳述するものである。
【０９６３】
【化２４３】
0005425398.tif 000192
の合成
【０９６４】
ｍＰＥＧプロピオンアルデヒド（３０Ｋ、０．５ｇ、０．０１６６ｍｍｏｌ）とアミンリンカー（７０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）の混合物のＭｅＯＨ（１０ｍＬ）溶液にＮａＣＮＢＨ３（２０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）を添加した。生成した混合物を室温で４８時間撹拌した。大部分の溶媒を除去した後、エーテル（２００ｍＬ）を添加した。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、白色粉末（０．４０ｇ、８０％）を得た。
【０９６５】
【化２４４】
0005425398.tif 000193
の合成
【０９６６】
ジＢｏｃで保護したｍＰＥＧ（３０Ｋ）（０．４０ｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（４ｍＬ）を０℃で添加した。生成した混合物を室温で８時間撹拌した。エーテル（１００ｍＬ）を反応混合物に添加した。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、白色粉末（０．３５ｇ、８７％）を得た。
【実施例６８】
【０９６７】
この実施例は、図５３Ａに示すｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミンの合成を詳述するものである。
【０９６８】
【化２４５】
0005425398.tif 000194
の合成
【０９６９】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）（６．０ｇ、０．２ｍｍｏｌ）とピリジン（０．１ｍＬ、１．２ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（６０ｍＬ）撹拌溶液にＤｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎペルヨージナン（０．２ｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を０℃で添加する。混合物を室温で終夜撹拌する。次いで、反応物をＮａ２Ｓ２Ｏ３−ＮａＨＣＯ３飽和水溶液（１：１、１００ｍＬ）でクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍＬ×２）で抽出する。有機層を混合し、Ｈ２Ｏ及び塩水で洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮する。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）に溶解する。エーテル（１Ｌ）を溶液に添加した。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、白色粉末（４．９ｇ、８２％）を得た。
【０９７０】
【化２４６】
0005425398.tif 000195
の合成
【０９７１】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）アルデヒド（０．５ｇ、０．０１６６ｍｍｏｌ）とアミンリンカー（７０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）の混合物のＭｅＯＨ（１０ｍＬ）溶液にＮａＣＮＢＨ３（２０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）を添加する。生成した混合物を室温で４８時間撹拌する。大部分の溶媒を除去した後、エーテル（２００ｍＬ）を添加する。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、白色粉末（０．４０ｇ、８０％）を得る。
【０９７２】
【化２４７】
0005425398.tif 000196
の合成
【０９７３】
ジＢｏｃで保護したｍＰＥＧ（３０Ｋ）（０．４０ｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（４ｍＬ）を０℃で添加する。生成した混合物を室温で８時間撹拌する。エーテル（１００ｍＬ）を反応混合物に添加する。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、白色粉末（０．３５ｇ、８７％）を得る。
【実施例６９】
【０９７４】
この実施例は、図５３Ｂに示すｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミンの合成を詳述するものである。
【０９７５】
【化２４８】
0005425398.tif 000197
の合成
【０９７６】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）−ＮＨ２（６．０ｇ、０．２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（６０ｍＬ）溶液にＢｏｃ−Ｓｅｒ−ＯＨ（２０５ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、１９０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（０．１７ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を室温で１０時間撹拌し、ＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）で希釈する。生成した混合物をＮａＨＣＯ３飽和水溶液（３００ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（３００ｍＬ）及び塩水（３００ｍＬ）で連続洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮する。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）に溶解する。エーテル（７００ｍＬ）を添加する。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、白色粉末（５．１ｇ、８２％）を得る。
【０９７７】
【化２４９】
0005425398.tif 000198
の合成
【０９７８】
上記ｍＰＥＧ（３０Ｋ）（３．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（１５ｍＬ）を０℃で添加する。生成した混合物を室温で３時間撹拌し、濃縮する。残渣にＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）を添加し、続いてＨＣｌ（４Ｎジオキサン溶液、２ｍＬ）を添加する。エーテル（４００ｍＬ）を添加すると、ジヒドロキシルアミン（２．６ｇ、８５％）が白色固体として沈殿する。
【０９７９】
【化２５０】
0005425398.tif 000199
の合成
【０９８０】
上記ｍＰＥＧ（３０Ｋ）（２．０ｇ、０．０６７ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ−ＣＨ３ＣＮ（１：１、２０ｍＬ）溶液にＮａＩＯ４（１５ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を室温で４時間撹拌し、ＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍＬ）で希釈する。生成した混合物をＨ２Ｏ（１００ｍＬ）及び塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮する。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）に溶解する。エーテル（７００ｍＬ）を添加する。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、白色粉末（１．８ｇ、９０％）を得る。
【０９８１】
【化２５１】
0005425398.tif 000200
の合成
【０９８２】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）アルデヒド（０．５ｇ、０．０１６６ｍｍｏｌ）とアミンリンカー（７０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）の混合物のＭｅＯＨ（１０ｍＬ）溶液にＮａＣＮＢＨ３（２０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）を添加する。生成した混合物を室温で４８時間撹拌する。大部分の溶媒を除去した後、エーテル（２００ｍＬ）を添加する。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、白色粉末（０．４０ｇ、８０％）を得る。
【０９８３】
【化２５２】
0005425398.tif 000201
の合成
【０９８４】
ジＢｏｃで保護したｍＰＥＧ（３０Ｋ）（０．４０ｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（４ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（４ｍＬ）を０℃で添加する。生成した混合物を室温で８時間撹拌する。エーテル（１００ｍＬ）を反応混合物に添加する。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、白色粉末（０．３５ｇ、８７％）を得る。
【実施例７０】
【０９８５】
この実施例は、図５４Ａに示すｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミンの合成を詳述するものである。
【０９８６】
【化２５３】
0005425398.tif 000202
の合成
【０９８７】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）プロピオンアルデヒド（０．５ｇ、０．０１６６ｍｍｏｌ）とアミンリンカー（４０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）の混合物のＭｅＯＨ（１０ｍＬ）溶液にＮａＣＮＢＨ３（１２ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を添加した。生成した混合物を室温で６０時間撹拌した。大部分の溶媒を除去した後、残渣をＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）に溶解し、クエン酸（５％、１００ｍＬ）で洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４を用いて脱水し、ろ過し、減圧濃縮して、白色固体（０．４２ｇ、８４％）を得た。
【０９８８】
【化２５４】
0005425398.tif 000203
の合成
【０９８９】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）フタルイミド（０．４ｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（４ｍＬ）混合物にＨ２ＮＮＨ２（４．２μＬ、０．１３ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を４５℃で１．０時間撹拌し、濃縮した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）に溶解し、ＨＣｌ（０．１Ｎ、１００ｍＬ）で洗浄した。水層をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）で抽出した。
【０９９０】
有機層を混合し、Ｈ２Ｏで洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮した。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）に溶解した。エーテル（２００ｍＬ）を添加すると、ヒドロキシルアミン生成物（０．３４ｇ、８５％）が白色粉末として沈殿した。
【実施例７１】
【０９９１】
この実施例は、図５４Ｂに示すｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミンの合成を詳述するものである。
【０９９２】
【化２５５】
0005425398.tif 000204
の合成
【０９９３】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）（６．０ｇ、０．２ｍｍｏｌ）とピリジン（０．１ｍＬ、１．２ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（６０ｍＬ）撹拌溶液にＤｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎペルヨージナン（０．２ｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を０℃で添加する。混合物を室温で終夜撹拌する。次いで、反応物をＮａ２Ｓ２Ｏ３−ＮａＨＣＯ３飽和水溶液（１：１、１００ｍＬ）でクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍＬ×２）で抽出する。有機層を混合し、Ｈ２Ｏ及び塩水で洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮する。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）に溶解する。エーテル（１Ｌ）を溶液に添加する。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、白色粉末（４．９ｇ、８２％）を得る。
【０９９４】
【化２５６】
0005425398.tif 000205
の合成
【０９９５】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）アルデヒド（０．５ｇ、０．０１６６ｍｍｏｌ）とアミンリンカー（４０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）の混合物のＭｅＯＨ（１０ｍＬ）溶液にＮａＣＮＢＨ３（１２ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を添加する。生成した混合物を室温で６０時間撹拌する。大部分の溶媒を除去した後、残渣をＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）に溶解し、クエン酸（５％、１００ｍＬ）で洗浄する。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４を用いて脱水し、ろ過し、減圧濃縮して、白色固体（０．４２ｇ、８４％）を得る。
【０９９６】
【化２５７】
0005425398.tif 000206
の合成
【０９９７】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）フタルイミド（０．４ｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（４ｍＬ）混合物にＨ２ＮＮＨ２（４．２μＬ、０．１３ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を４５℃で１．０時間撹拌し、濃縮する。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）に溶解し、ＨＣｌ（０．１Ｎ、１００ｍＬ）で洗浄する。水層をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）で抽出する。有機層を混合し、Ｈ２Ｏで洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮する。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）に溶解する。エーテル（２００ｍＬ）を添加すると、ヒドロキシルアミン生成物（０．３４ｇ、８５％）が白色粉末として沈殿する。
【実施例７２】
【０９９８】
この実施例は、図５５に示すｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミンの合成を詳述するものである。
【０９９９】
【化２５８】
0005425398.tif 000207
の合成
【１０００】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）−ＮＨ２（６．０ｇ、０．２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（６０ｍＬ）溶液にＢｏｃ−Ｓｅｒ−ＯＨ（２０５ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、１９０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（０．１７ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を室温で１０時間撹拌し、ＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）で希釈する。生成した混合物をＮａＨＣＯ３飽和水溶液（３００ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（３００ｍＬ）及び塩水（３００ｍＬ）で連続洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮する。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）に溶解する。エーテル（７００ｍＬ）を添加する。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、白色粉末（５．１ｇ、８２％）を得る。
【１００１】
【化２５９】
0005425398.tif 000208
の合成
【１００２】
上記ｍＰＥＧ（３０Ｋ）（３．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（１５ｍＬ）を０℃で添加する。生成した混合物を室温で３時間撹拌し、濃縮する。残渣にＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）を添加し、続いてＨＣｌ（４Ｎジオキサン溶液、２ｍＬ）を添加する。エーテル（４００ｍＬ）を添加すると、ジヒドロキシルアミン（２．６ｇ、８５％）が白色固体として沈殿する。
【１００３】
【化２６０】
0005425398.tif 000209
の合成
【１００４】
上記ｍＰＥＧ（３０Ｋ）（２．０ｇ、０．０６７ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ−ＣＨ３ＣＮ（１：１、２０ｍＬ）溶液にＮａＩＯ４（１５ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を室温で４時間撹拌し、ＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍＬ）で希釈する。生成した混合物をＨ２Ｏ（１００ｍＬ）及び塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮する。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）に溶解する。エーテル（７００ｍＬ）を添加する。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、白色粉末（１．８ｇ、９０％）を得る。
【１００５】
【化２６１】
0005425398.tif 000210
の合成
【１００６】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）アルデヒド（０．５ｇ、０．０１６６ｍｍｏｌ）とアミンリンカー（４０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）の混合物のＭｅＯＨ（１０ｍＬ）溶液にＮａＣＮＢＨ３（１２ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を添加する。生成した混合物を室温で６０時間撹拌する。大部分の溶媒を除去した後、残渣をＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）に溶解し、クエン酸（５％、１００ｍＬ）で洗浄する。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４を用いて脱水し、ろ過し、減圧濃縮して、白色固体（０．４２ｇ、８４％）を得る。
【１００７】
【化２６２】
0005425398.tif 000211
の合成
【１００８】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）フタルイミド（０．４ｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（４ｍＬ）混合物にＨ２ＮＮＨ２（４．２μＬ、０．１３ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を４５℃で１．０時間撹拌し、濃縮する。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）に溶解し、ＨＣｌ（０．１Ｎ、１００ｍＬ）で洗浄する。水層をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）で抽出する。有機層を混合し、Ｈ２Ｏで洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮する。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）に溶解する。エーテル（２００ｍＬ）を添加すると、ヒドロキシルアミン生成物（０．３４ｇ、８５％）が白色粉末として沈殿する。
【実施例７３】
【１００９】
この実施例は、図５６Ａに示すｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミンの合成を詳述するものである。
【１０１０】
【化２６３】
0005425398.tif 000212
の合成
【１０１１】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）プロピオンアルデヒド（０．５ｇ、０．０１６６ｍｍｏｌ）とアミンリンカー（４０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）の混合物のＭｅＯＨ（１０ｍＬ）溶液にＮａＣＮＢＨ３（１２ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を添加する。生成した混合物を室温で６０時間撹拌する。大部分の溶媒を除去した後、残渣をＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）に溶解し、クエン酸（５％、１００ｍＬ）で洗浄する。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４を用いて脱水し、ろ過し、減圧濃縮して、白色固体（０．４１ｇ、８２％）を得る。
【１０１２】
【化２６４】
0005425398.tif 000213
の合成
【１０１３】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）フタルイミド（０．４ｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（４ｍＬ）混合物にＨ２ＮＮＨ２（４．２μＬ、０．１３ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を４５℃で１．０時間撹拌し、濃縮する。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）に溶解し、ＨＣｌ（０．１Ｎ、１００ｍＬ）で洗浄する。水層をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）で抽出する。有機層を混合し、Ｈ２Ｏで洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮する。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）に溶解した。エーテル（２００ｍＬ）を添加すると、ヒドロキシルアミン生成物（０．３４ｇ、８３％）が白色粉末として沈殿する。
【実施例７４】
【１０１４】
この実施例は、図５６Ｂに示すｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミンの合成を詳述するものである。
【１０１５】
【化２６５】
0005425398.tif 000214
の合成
【１０１６】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）（６．０ｇ、０．２ｍｍｏｌ）とピリジン（０．１ｍＬ、１．２ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（６０ｍＬ）撹拌溶液にＤｅｓｓ−Ｍａｒｔｉｎペルヨージナン（０．２ｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を０℃で添加する。混合物を室温で終夜撹拌する。次いで、反応物をＮａ２Ｓ２Ｏ３−ＮａＨＣＯ３飽和水溶液（１：１、１００ｍＬ）でクエンチし、ＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍＬ×２）で抽出する。有機層を混合し、Ｈ２Ｏ及び塩水で洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮する。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）に溶解する。エーテル（１Ｌ）を溶液に添加する。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、白色粉末（４．９ｇ、８２％）を得る。
【１０１７】
【化２６６】
0005425398.tif 000215
の合成
【１０１８】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）アルデヒド（０．５ｇ、０．０１６６ｍｍｏｌ）とアミンリンカー（４０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）の混合物のＭｅＯＨ（１０ｍＬ）溶液にＮａＣＮＢＨ３（１２ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を添加する。生成した混合物を室温で６０時間撹拌する。大部分の溶媒を除去した後、残渣をＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）に溶解し、クエン酸（５％、１００ｍＬ）で洗浄する。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４を用いて脱水し、ろ過し、減圧濃縮して、白色固体（０．４１ｇ、８２％）を得る。
【１０１９】
【化２６７】
0005425398.tif 000216
の合成
【１０２０】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）フタルイミド（０．４ｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（４ｍＬ）混合物にＨ２ＮＮＨ２（４．２μＬ、０．１３ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を４５℃で１．０時間撹拌し、濃縮する。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）に溶解し、ＨＣｌ（０．１Ｎ、１００ｍＬ）で洗浄する。水層をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）で抽出する。有機層を混合し、Ｈ２Ｏで洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮する。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）に溶解する。エーテル（２００ｍＬ）を添加すると、ヒドロキシルアミン生成物（０．３４ｇ、８３％）が白色粉末として沈殿する。
【実施例７５】
【１０２１】
この実施例は、図５７に示すｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミンの合成を詳述するものである。
【１０２２】
【化２６８】
0005425398.tif 000217
の合成
【１０２３】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）−ＮＨ２（６．０ｇ、０．２ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（６０ｍＬ）溶液にＢｏｃ−Ｓｅｒ−ＯＨ（２０５ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、１９０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（０．１７ｍＬ、１．０ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を室温で１０時間撹拌し、ＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）で希釈する。生成した混合物をＮａＨＣＯ３飽和水溶液（３００ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（３００ｍＬ）及び塩水（３００ｍＬ）で連続洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮する。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）に溶解する。エーテル（７００ｍＬ）を添加する。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、白色粉末（５．１ｇ、８２％）を得る。
【１０２４】
【化２６９】
0005425398.tif 000218
の合成
【１０２５】
上記ｍＰＥＧ（３０Ｋ）（３．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（１５ｍＬ）を０℃で添加する。生成した混合物を室温で３時間撹拌し、濃縮する。残渣にＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）を添加し、続いてＨＣｌ（４Ｎジオキサン溶液、２ｍＬ）を添加する。エーテル（４００ｍＬ）を添加すると、ジヒドロキシルアミン（２．６ｇ、８５％）が白色固体として沈殿する。
【１０２６】
【化２７０】
0005425398.tif 000219
の合成
【１０２７】
上記ｍＰＥＧ（３０Ｋ）（２．０ｇ、０．０６７ｍｍｏｌ）のＨ２Ｏ−ＣＨ３ＣＮ（１：１、２０ｍＬ）溶液にＮａＩＯ４（１５ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を室温で４時間撹拌し、ＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍＬ）で希釈する。生成した混合物をＨ２Ｏ（１００ｍＬ）及び塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮する。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）に溶解する。エーテル（７００ｍＬ）を添加する。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、白色粉末（１．８ｇ、９０％）を得る。
【１０２８】
【化２７１】
0005425398.tif 000220
の合成
【１０２９】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）アルデヒド（０．５ｇ、０．０１６６ｍｍｏｌ）とアミンリンカー（４０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）の混合物のＭｅＯＨ（１０ｍＬ）溶液にＮａＣＮＢＨ３（１２ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を添加する。生成した混合物を室温で６０時間撹拌する。大部分の溶媒を除去した後、残渣をＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）に溶解し、クエン酸（５％、１００ｍＬ）で洗浄する。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４を用いて脱水し、ろ過し、減圧濃縮して、白色固体（０．４１ｇ、８２％）を得る。
【１０３０】
【化２７２】
0005425398.tif 000221
の合成
【１０３１】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）フタルイミド（０．４ｇ、０．０１３ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（４ｍＬ）混合物にＨ２ＮＮＨ２（４．２μＬ、０．１３ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を４５℃で１．０時間撹拌し、濃縮する。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）に溶解し、ＨＣｌ（０．１Ｎ、１００ｍＬ）で洗浄する。水層をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）で抽出する。有機層を混合し、Ｈ２Ｏで洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、濃縮する。残渣をＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）に溶解する。エーテル（２００ｍＬ）を添加すると、ヒドロキシルアミン生成物（０．３４ｇ、８３％）が白色粉末として沈殿する。
【実施例７６】
【１０３２】
この実施例は、図５８Ａに示すｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミンの合成を詳述するものである。
【１０３３】
ｍＰＥＧ（５Ｋ）−ＯＭｓの合成
ｍＰＥＧ（５Ｋ）−ＯＨ（１．０ｇ、０．２ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍＬ）溶液にトリエチルアミン（１１０μＬ、０．７９ｍｍｏｌ）及びＭｓＣｌ（５０μＬ、０．６４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１０時間撹拌し、濃縮した。粗生成物（１．０ｇ）を精製せずに次の段階に直接使用した。
【１０３４】
ｍＰＥＧ（５Ｋ）−Ｏ−ＮＨＢｏｃの合成
粗製ｍＰＥＧ（５Ｋ）−ＯＭｓ（１．０ｇ、０．２ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液にｔ−ブチル−Ｎ−ヒドロキシカルバマート（０．３ｇ、２．２ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（０．４ｍＬ、２．９ｍｍｏｌ）を添加した。生成した混合物を４５℃で１０時間撹拌し、室温に冷却した。エーテル（２００ｍＬ）を添加した。沈殿をろ過し、洗浄し、減圧乾燥させて、生成物（０．４２、４２％）を白色固体として得た。
【１０３５】
ｍＰＥＧ（５Ｋ）−Ｏ−ＮＨ３＋Ｃｌ−の合成
ｍＰＥＧ（５Ｋ）−ＯＮＨＢｏｃ（０．２ｇ、０．０４ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（３ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（７ｍＬ）を℃で添加した。生成した混合物を室温で１時間撹拌し、濃縮した。残渣にＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）を添加し、続いてＨＣｌ（４Ｎジオキサン溶液、２ｍＬ）を添加する。エーテル（３００ｍＬ）を添加すると、ＰＥＧジヒドロキシルアミン誘導体（１７０ｍｇ、８５％）が白色固体として沈殿する。
【実施例７７】
【１０３６】
この実施例は、図５８Ｂに示すｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミンの合成を詳述するものである。
【１０３７】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）−ＯＴｆの合成
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）−ＯＨ（３．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）溶液に２，６−ルチジン（６０μＬ、０．５ｍｍｏｌ）及びＴｆ２Ｏ（６５μＬ、０．４ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を室温で１０時間撹拌する。エーテル（４００ｍＬ）を混合物に添加する。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、白色粉末（２．７ｇ、９０％）を得る。
【１０３８】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）−Ｏ−ＮＨＢｏｃの合成
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）−ＯＴｆ（２．５ｇ、０．０８３ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）溶液にｔ−ブチルＮ−ヒドロキシカルバマート（１１０ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（０．２ｍＬ、１，１ｍｍｏｌ）を添加する。混合物を室温で終夜撹拌する。エーテル（２００ｍＬ）を添加すると、生成物（２．２ｇ、８８％）が白色粉末として沈殿する。
【１０３９】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）−Ｏ−ＮＨ３＋Ｃｌ−の合成
上記ｍＰＥＧ（３０Ｋ）−ＯＮＨＢｏｃ（２．０ｇ、０．０６７ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（１５ｍＬ）を０℃で添加する。生成した混合物を室温で３時間撹拌し、濃縮する。残渣にＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）を添加し、続いてＨＣｌ（４Ｎジオキサン溶液、２ｍＬ）を添加する。エーテル（３００ｍＬ）を添加すると、ＰＥＧジヒドロキシルアミン誘導体（１．７２ｇ、８６％）が白色固体として沈殿する。
【実施例７８】
【１０４０】
この実施例は、図５９Ａに示すｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミンの合成を詳述するものである。
【１０４１】
【化２７３】
0005425398.tif 000222
の合成
【１０４２】
２−（２−ヒドロキシエトキシ）フタルイミド（０．５ｇ、２．４ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）溶液にホスゲン（２０％トルエン溶液、８．０ｍＬ、１５．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１０時間撹拌し、減圧濃縮した。残渣（０．４５ｇ、７０％）を精製せずに次の反応に直接使用した。
【１０４３】
【化２７４】
0005425398.tif 000223
の合成
【１０４４】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）−ＮＨ２（３ｇ、０．１ｍｍｏｌ）とクロロギ酸リンカー（０．２７ｇ、１．０ｍｍｏｌ）の混合物のＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）溶液にジイソプロピルエチルアミン（０．２ｍＬ、１．１ｍｍｏｌ）を添加した。生成した混合物を室温で１５時間撹拌した。エーテル（５００ｍＬ）を混合物に添加した。沈殿をろ過し、洗浄し、減圧乾燥させて、生成物（２．７ｇ、９０％）を白色固体として得た。
【１０４５】
【化２７５】
0005425398.tif 000224
の合成
【１０４６】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）フタルイミド（２．１ｇ、０．０７ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（１５ｍＬ）溶液にアンモニア（７Ｎメタノール溶液、１５ｍＬ）を添加した。生成した混合物を室温で１５時間撹拌し、濃縮した。残渣にＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）を添加し、続いてＨＣｌ（４Ｎジオキサン溶液、１ｍＬ）を添加した。エーテル（２００ｍＬ）を添加すると、生成物（２．４ｇ、８９％）が白色固体として沈殿した。
【実施例７９】
【１０４７】
この実施例は、図５９Ｂに示すｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミンの合成を詳述するものである。
【１０４８】
【化２７６】
0005425398.tif 000225
の合成
【１０４９】
（Ｂｏｃ−アミノオキシ）酢酸（３．０ｇ、１６ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（８０ｍＬ）溶液にＮ−Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ、１．３ｍＬ、８ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１時間撹拌し、減圧濃縮した。粗生成物（４．９ｇ、８４％）をさらに精製せずに次の段階に直接使用した。
【１０５０】
【化２７７】
0005425398.tif 000226
の合成
【１０５１】
無水物（７．３ｇ、２０ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２０ｍＬ）溶液にｍＰＥＧ（５Ｋ）−ＮＨ２（２０ｇ、４ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１０時間撹拌し、Ｈ２Ｏ（２００ｍＬ）で希釈した。混合物をＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍＬ）で抽出した。有機層をＨ２Ｏ及び塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。残渣にＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）、続いてエーテル（５００ｍＬ）を添加した。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、生成物（１９．８ｇ、９９％）を白色粉末として得た。
【１０５２】
【化２７８】
0005425398.tif 000227
の合成
【１０５３】
Ｂｏｃで保護したｍＰＥＧ（５Ｋ）（１．０ｇ、０．２ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（５ｍＬ）を添加した。生成した混合物を室温で１時間撹拌し、濃縮した。残渣にＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）を添加し、続いてＨＣｌ（４Ｎジオキサン溶液、０．１ｍＬ）及びエーテル（４０ｍＬ）を添加した。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、生成物（０．７５ｇ、７５％）を得た。
【実施例８０】
【１０５４】
この実施例は、図６０Ａに示すｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミンの合成を詳述するものである。
【１０５５】
【化２７９】
0005425398.tif 000228
の合成
【１０５６】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）−ＯＨ（４．５ｇ、０．１５ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）溶液にホスゲン（２０％トルエン溶液、１．６ｍＬ、３．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１０時間撹拌し、減圧濃縮した。残渣（４．２ｇ、９３％）を精製せずに次の反応に直接使用した。
【１０５７】
【化２８０】
0005425398.tif 000229
の合成
【１０５８】
上記活性化ｍＰＥＧ（３０Ｋ）ＩＩ（４．２ｇ、０．１４ｍｍｏｌ）とアミンリンカーＶＩＩＩ（６７ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）の混合物のＤＭＦ−ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ、１：２）溶液にジイソプロピルエチルアミン（７５μＬ、０．４２ｍｍｏｌ）を添加した。生成した混合物を室温で１５時間撹拌した後、エーテル（２００ｍＬ）を添加した。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、生成物（３．８ｇ、９０％）を白色粉末として得た。
【１０５９】
【化２８１】
0005425398.tif 000230
の合成
【１０６０】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）フタルイミドＩＩＩ（３．５ｇ、０．１２ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（１５ｍＬ）溶液にアンモニア（７Ｎメタノール溶液、１５ｍＬ）を添加した。生成した混合物を室温で１５時間撹拌し、濃縮した。残渣にＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）を添加し、続いてＨＣｌ（４Ｎジオキサン溶液、１ｍＬ）を添加した。エーテル（２００ｍＬ）を添加すると、生成物（３．０ｇ、８６％）が白色固体として沈殿した。
【１０６１】
【化２８２】
0005425398.tif 000231
の合成
【１０６２】
ｔ−ブチル２−ヒドロキシエチルカルバマート（２．８ｍＬ、１８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（６０ｍＬ）溶液にＮ−ヒドロキシフタルイミド（５．８ｇ、３６ｍｍｏｌ）、トリフェニルホスフィン（３．６ｇ、２７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で１０分間撹拌し、次いで０℃に冷却した。アゾジカルボン酸ジイソプロピル（ＤＩＡＤ、３．６ｍＬ、１９ｍｍｏｌ）をシリンジを用いて１時間滴下した。氷浴を取り外し、混合物を終夜撹拌し、濃縮した。白色固体を酢酸エチル（１００ｍＬ）に溶解させた。反応混合物を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液（２×５０ｍＬ）、脱イオン水（５０ｍＬ）及び塩水（５０ｍＬ）で連続洗浄し、次いで無水ＭｇＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。粗生成物を、Ｂｉｏｔａｇｅ  Ｉｎｃ．  ＨＯＲＩＺＯＮ（商標）クロマトグラフィーシステムを用いたフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、不純物を含む標記化合物（１２ｇ、２０６％）を白色固体として得た。
【１０６３】
【化２８３】
0005425398.tif 000232
の合成
【１０６４】
Ｂｏｃで保護された粗製リンカー（１２ｇ）のＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（５ｍＬ）を添加した。生成した混合物を室温で１時間撹拌し、濃縮した。残渣にＨＣｌ（４Ｎジオキサン溶液、１．５ｍＬ）を添加し、続いてＥｔ２Ｏ（１５０ｍＬ）を添加した。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、アミンリンカー（２段階で３．０ｇ、６８％）を白色固体として得た。
【実施例８１】
【１０６５】
この実施例は、図６０Ｂに示すｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミンの合成を詳述するものである。
【１０６６】
【化２８４】
0005425398.tif 000233
の合成
【１０６７】
ｍＰＥＧ（５Ｋ）−ＯＨ（１０ｇ、２．０ｍｍｏｌ）、Ｐｈ３Ｐ（７９０ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシフタルイミド（０．４９ｇ、３．０ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２−ＴＨＦ（２：３、４５ｍＬ）溶液にアゾジカルボン酸ジイソプロピル（ＤＩＡＤ、４０９μＬ、２．０ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。混合物を室温で１５時間撹拌した後、エーテル（１Ｌ）を混合物に添加した。沈殿をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、ｍＰＥＧ（５Ｋ）−フタルイミド（９．８ｇ、９８％）を白色粉末として得た。
【１０６８】
ｍＰＥＧ（５Ｋ）−Ｏ−ＮＨ２の合成
ｍＰＥＧ（５Ｋ）フタルイミド（３ｇ、０．６ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（２５ｍＬ）溶液にアンモニア（７Ｎメタノール溶液、２５ｍＬ）を添加した。生成した混合物を室温で１５時間撹拌し、濃縮した。残渣にＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）を添加し、続いてＨＣｌ（４Ｎジオキサン溶液、１ｍＬ）を添加した。エーテル（３００ｍＬ）を添加すると、ヒドロキシルアミン（２．５ｇ、８３％）が白色固体として沈殿した。
【１０６９】
【化２８５】
0005425398.tif 000234
の合成
【１０７０】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）−ＯＨ（６ｇ、０．２ｍｍｏｌ）、Ｐｈ３Ｐ（８０ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシフタルイミド（４９ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２−ＴＨＦ（２：３、４５ｍＬ）溶液にアゾジカルボン酸ジイソプロピル（ＤＩＡＤ、４１μＬ、０．２ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。混合物を室温で１５時間撹拌した。エーテル（２００ｍＬ）を混合物に添加した。沈殿をエーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、ｍＰＥＧ（３０Ｋ）−フタルイミド生成物（５．８ｇ、９６％）を白色粉末として得た。
【１０７１】
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）−Ｏ−ＮＨ２の合成
ｍＰＥＧ（３０Ｋ）フタルイミド（３ｇ、０．１ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（２０ｍＬ）溶液にアンモニア（７Ｎメタノール溶液、２０ｍＬ）を添加した。生成した混合物を室温で１５時間撹拌し、濃縮した。残渣にＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）を添加し、続いてＨＣｌ（４Ｎジオキサン溶液、１ｍＬ）を添加した。エーテル（３００ｍＬ）を添加すると、ｍＰＥＧ（３０Ｋ）−ＯＮＨ２（２．６ｇ、８７％）が白色固体として沈殿した。
【実施例８２】
【１０７２】
この実施例は、図６１Ａに示すｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミンの合成を詳述するものである。
【１０７３】
【化２８６】
0005425398.tif 000235
の合成
【１０７４】
２−（２−（２−アミノエトキシ）エトキシ）エタナミン（５．０ｇ、３３．８ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１００ｍＬ）溶液に（Ｂｏｃ−アミノオキシ）酢酸（１４．２ｇ、７４．２ｍｍｏｌ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、２８．５ｇ、０．１５ｍｏｌ）及びＮ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（２６ｍＬ、０．１５ｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で１０時間撹拌し、ＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）で希釈した。生成した混合物をＮａＨＣＯ３飽和水溶液（３００ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（３００ｍＬ）及び塩水（３００ｍＬ）で連続洗浄し、次いで無水Ｎａ２ＳＯ４で脱水し、ろ過し、減圧濃縮した。粗生成物（１４．２ｇ、８５％）を精製せずに次の段階に直接使用した。
【１０７５】
【化２８７】
0005425398.tif 000236
の合成
【１０７６】
上記ジＢｏｃリンカー（３．０ｇ、６．１ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）溶液にトリフルオロ酢酸（１５ｍＬ）を０℃で添加した。生成した混合物を室温で３時間撹拌し、濃縮した。残渣にＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）を添加し、続いてＨＣｌ（４Ｎジオキサン溶液、２ｍＬ）を添加した。エーテル（４００ｍＬ）を添加すると、ジヒドロキシルアミン（１．４７ｇ、８２％）が白色固体として沈殿した。
【実施例８３】
【１０７７】
この実施例は、図６１Ｂに示すｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミンの合成を詳述するものである。
【１０７８】
【化２８８】
0005425398.tif 000237
の合成
【１０７９】
トリ（エチレングリコール）（１．５ｇ、１０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１００ｍＬ）溶液にＰｈ３Ｐ（８．０ｇ、３０ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシルフタルイミド（４．９ｇ、３０ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。混合物にアゾジカルボン酸ジイソプロピル（ＤＩＡＤ、４．０８ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）を徐々に添加した。生成した混合物を０℃で４時間、室温で２日間撹拌した。エーテル（２５ｍＬ）を反応混合物に添加した。沈殿をエーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、ジフタルイミド生成物（３．７２ｇ、８２％）を白色粉末として得た。
【１０８０】
【化２８９】
0005425398.tif 000238
の合成
【１０８１】
ジフタルイミド（２．２ｇ、５．０ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（２０ｍＬ）溶液にアンモニア（７Ｎメタノール溶液、２０ｍＬ）を添加した。生成した混合物を室温で１５時間撹拌し、濃縮した。残渣にＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）を添加し、続いてＨＣｌ（４Ｎジオキサン溶液、１ｍＬ）を添加した。エーテル（３００ｍＬ）を添加すると、トリ（エチレングリコール）ジヒドロキシルアミンリンカー（１．１ｇ、８７％）が白色固体として沈殿した。
【実施例８４】
【１０８２】
この実施例は、図６１Ｃに示すｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミンの合成を詳述するものである。
【１０８３】
【化２９０】
0005425398.tif 000239
の合成
【１０８４】
テトラ（エチレングリコール（１．９４ｇ、１０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１００ｍＬ）溶液にＰｈ３Ｐ（８．０ｇ、３０ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシルフタルイミド（４．９ｇ、３０ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。混合物にアゾジカルボン酸ジイソプロピル（ＤＩＡＤ、４．０８ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）を徐々に添加した。生成した混合物を０℃で４時間、室温で２日間撹拌した。エーテル（２５ｍＬ）を反応混合物に添加した。沈殿をエーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、ジフタルイミド生成物（３．５８ｇ、７４％）を白色粉末として得た。
【１０８５】
【化２９１】
0005425398.tif 000240
の合成
【１０８６】
ジフタルイミド（２．４２ｇ、５．０ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（２０ｍＬ）溶液にアンモニア（７Ｎメタノール溶液、２０ｍＬ）を添加した。生成した混合物を室温で１５時間撹拌し、濃縮した。残渣にＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）を添加し、続いてＨＣｌ（４Ｎジオキサン溶液、１ｍＬ）を添加した。エーテル（３００ｍＬ）を添加すると、テトラ（エチレングリコール）ジヒドロキシルアミンリンカー（１．２７ｇ、８５％）が白色固体として沈殿した。
【実施例８５】
【１０８７】
この実施例は、図６２Ａに示すｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミンの合成を詳述するものである。
【１０８８】
【化２９２】
0005425398.tif 000241
の合成
【１０８９】
ヘキサ（エチレングリコール（２．８２ｇ、１０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１００ｍＬ）溶液にＰｈ３Ｐ（８．０ｇ、３０ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシルフタルイミド（４．９ｇ、３０ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。混合物にアゾジカルボン酸ジイソプロピル（ＤＩＡＤ、４．０８ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）を徐々に添加した。生成した混合物を０℃で４時間、室温で２日間撹拌した。エーテル（２５ｍＬ）を反応混合物に添加した。沈殿をエーテルで洗浄し、減圧乾燥させて、ジフタルイミド生成物（４．４０ｇ、７７％）を白色粉末として得た。
【１０９０】
【化２９３】
0005425398.tif 000242
の合成
【１０９１】
ジフタルイミド（２．８６ｇ、５．０ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（２０ｍＬ）溶液にアンモニア（７Ｎメタノール溶液、２０ｍＬ）を添加した。生成した混合物を室温で１５時間撹拌し、濃縮した。残渣にＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）を添加し、続いてＨＣｌ（４Ｎジオキサン溶液、１ｍＬ）を添加した。エーテル（３００ｍＬ）を添加すると、ヘキサ（エチレングリコール）ジヒドロキシルアミンリンカー（１．６８ｇ、８７％）が白色固体として沈殿した。
【実施例８６】
【１０９２】
この実施例は、図６２Ｂに示すｍＰＥＧ化合物の合成を詳述するものである。
【１０９３】
【化２９４】
0005425398.tif 000243
の合成
【１０９４】
ｍＰＥＧ−ＯＨ（３０Ｋ、３．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ）の無水ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）溶液にジホスゲン（６３μＬ、０．５ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で終夜撹拌した。エーテル（７００ｍＬ）を添加してｍＰＥＧを沈殿させた。生成物をろ過し、エーテルで洗浄し、減圧乾燥させた（３．０ｇ、１００％）。
【１０９５】
以下の実施例は、治療上有効な修飾非天然アミノ酸ポリペプチドのインビトロ及びインビボでの活性と、治療上有効な天然アミノ酸ポリペプチドのインビトロ及びインビボでの活性とを測定し、比較する方法について記述する。
【実施例８７】
【１０９６】
細胞結合アッセイ
細胞（３×１０６）を２つ組でＰＢＳ／１％ＢＳＡ（１００μｌ）中で種々の濃度（体積：１０μｌ）の非標識ＧＨ、ｈＧＨ又はＧＭ−ＣＳＦの非存在下又は存在下で、かつ１２５Ｉ−ＧＨ（約１００，０００ｃｐｍ又は１ｎｇ）の存在下で０℃で９０分間インキュベートする（総容積：１２０μｌ）。次いで、細胞を再懸濁させ、３５０μｌプラスチック遠心管中の２００μｌ氷冷ＦＣＳ上に積層し、遠心分離する（１０００ｇ；１分）。遠心管の末端を切り落としてペレットを収集し、ペレットと上清を別々にγ線計数器（Ｐａｃｋａｒｄ）でカウントする。
【１０９７】
特異的結合（ｃｐｍ）を、競合物の非存在下での全結合量（２つ組の平均）  −  １００倍過剰の非標識ＧＨの存在下での結合（ｃｐｍ）（非特異的結合）として求める。使用した細胞タイプの各々について、非特異的結合を測定する。実験を１２５Ｉ−ＧＨの同じ調製物を用いて別々の日に実施する。実験は、内部で一貫しているべきである。１２５Ｉ−ＧＨは、ＧＨ受容体産生細胞に結合する。結合は、非標識天然ＧＨ又はｈＧＨの用量に依存して阻害されるが、ＧＭ−ＣＳＦ及び他の負の対照には阻害されない。ｈＧＨは、天然ＧＨに類似した天然１２５Ｉ−ＧＨの結合を競合することができることから、受容体は、両方の形態を等しく十分に認識することが示唆される。
【実施例８８】
【１０９８】
ＰＥＧ化ｈＧＨのインビボ試験
ＰＥＧ−ｈＧＨ、非修飾ｈＧＨ及び緩衝液をマウス又はラットに投与する。その結果、かなりの体重増加によって示されるように、本発明のＰＥＧ化ｈＧＨは非修飾ｈＧＨよりも活性が高く、半減期が長い。
【実施例８９】
【１０９９】
複合化及び非複合化ｈＧＨ並びにこれらの変異体のインビボでの半減期の測定
全ての動物実験は、ＡＡＡＬＡＣによって認定された施設において、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙによって承認されたプロトコルの下で実施される。ラットを個々に、１２時間の明／暗サイクル室内のおりに入れる。ラットに、認可されたＰｕｒｉｎａ  ｒｏｄｅｎｔ  ｃｈｏｗ  ５００１と水を自由に与える。下垂体切除したラットの場合には、飲料水はさらに５％グルコースを含む。
【実施例９０】
【１１００】
薬物動態試験
動物実験を開始する前に、各ＰＥＧ化変異ｈＧＨの品質を３つのアッセイで評価した。ＰＥＧ−ｈＧＨの純度を、ＭＥＳ  ＳＤＳ泳動緩衝剤を用いて４−１２％アクリルアミドＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルを非還元条件下で泳動させて調べた（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）。ゲルをクーマシーブルーで染色した。ＰＥＧ−ｈＧＨバンドは、濃度測定スキャンに基づいて９５％を超える純度であった。各ＰＥＧ−ｈＧＨの内毒素レベルを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  ＭＡ）製ＫＴＡ２キットを用いた動力学的ＬＡＬアッセイによって試験した。内毒素レベルは、１回の投与当たり５ＥＵ未満であった。ＰＥＧ−ｈＧＨの生物活性をＩＭ−９  ｐＳＴＡＴ５バイオアッセイによって評価し、ＥＣ５０値が１５ｎＭ未満であることを確認した。
【１１０１】
ＰＥＧ修飾成長ホルモン化合物の薬物動態学的性質を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手したオスのスプレーグドーリーラット（２６１−４２５ｇ）において、相互に比較し、また、非ＰＥＧ化成長ホルモンと比較した。血液を採取するために、カテーテルを頚動脈中に外科的に装着した。カテーテルを首尾よく装着した後、投薬前に動物を投与群に割り当てた（１群当たり３から６匹）。ラットに用量０．４１−０．５５ｍｌ／ｋｇ中の化合物１ｍｇ／ｋｇを皮下投与した。血液試料を、留置カテーテルを介して、ＥＤＴＡを塗布した微量遠心管に種々の時点で収集した。遠心分離後に血しょうを収集し、分析するまで−８０℃で保存した。化合物濃度を、ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，  ＣＡ）又はＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｅｂｓｔｅｒ，  ＴＸ）製抗体サンドイッチ成長ホルモンＥＬＩＳＡキットを用いて測定した。投与した類似体に対応する標準を用いて濃度を計算した。薬物動態パラメータを、モデリングプログラムＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．１）によって推定した。直線状に上昇し、指数的に下降する（ｌｉｎｅａｒ−ｕｐ／ｌｏｇ−ｄｏｗｎ）台形積分を用いたノンコンパートメント解析を使用し、濃度データを均一に重み付けした。
【１１０２】
ラットに１回皮下投与した後、規則的な間隔で血しょう中濃度を得た。ラット（ｎ＝３−６／群）に１ｍｇ／ｋｇタンパク質のボーラスを１回投与した。ｈＧＨ野生型タンパク質（ＷＨＯ  ｈＧＨ）、Ｈｉｓタグ付きｈＧＨポリペプチド（ｈｉｓ−ｈＧＨ）、又は６つの異なる位置の各々において３０ｋＤａのＰＥＧに共有結合した非天然アミノ酸ｐ−アセチルフェニルアラニンを含むＨｉｓタグ付きｈＧＨポリペプチドを、ＷＨＯ  ｈＧＨ及び（ｈｉｓ）−ｈＧＨと比較した。血しょう試料を規則的な時間間隔で採取し、上記注射化合物について分析した。下表は、種々のｈＧＨポリペプチドの単回投与に対する薬物動態パラメータ値である。濃度対時間曲線をノンコンパートメント解析（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．１）によって評価した。示した値は平均（＋／−標準偏差）である。Ｃｍａｘ：最大濃度；消失ｔ１／２：消失半減期；ＡＵＣ０−＞ｉｎｆ：無限大に外挿した濃度−時間曲線下面積；ＭＲＴ：平均滞留時間；Ｃｌ／ｆ：見掛けの全血しょうクリアランス；Ｖｚ／ｆ：消失期の見掛けの分布容積。３０ＫＰＥＧ−ｐＡＦ９２（ｈｉｓ）ｈＧＨは、対照ｈＧＨよりも、循環を劇的に拡張し、血清半減期を延長し、生物学的利用能を増大させることが認められた。
表：正常なオスのスプレーグドーリーラットにおける単回の１ｍｇ／ｋｇボーラスｓ．ｃ．投与に対する薬物動態パラメータ値
【１１０３】
【表６】
0005425398.tif 000244
【実施例９１】
【１１０４】
薬力学試験
下垂体切除したオスのスプレーグドーリーラットをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。下垂体は３−４週齢で外科的に除去された。ラットを３週間順応させ、その間の体重をモニターした。試験開始前の７日間で０−８ｇ体重増加したラットを使用し、無作為化して投与群とした。ラットに大量瞬時投与量又は１日量を皮下投与した。試験を通して、ラットを毎日順次計量し、麻酔し、採血し、（可能なときには）投与した。血液を眼か静脈叢からヘパリン処置した毛管を用いて収集し、ＥＤＴＡを塗布した微量遠心管に入れた。血しょうを遠心分離によって収集し、分析するまで−８０℃で保存した。平均（＋／−Ｓ．Ｄ．）血しょう中濃度を時間間隔に対してプロットした。
【１１０５】
ペプチドＩＧＦ−１は、ソマトメジンファミリー、すなわちインスリン様成長因子ファミリーの一員である。ＩＧＦ−１は、成長ホルモンの成長促進効果の多くを媒介する。ＩＧＦ−１濃度を、用意したラット／マウスＩＧＦ−１標準（Ｄｉａｇｎｏｓｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）について競合結合酵素免疫測定キットを用いて測定した。下垂体切除したラット。ラット（ｎ＝５−７／群）に単回用量又は１日量を皮下投与した。ラットを毎日順次計量し、麻酔し、採血し、（可能なときには）投与した。プラセボ処置、野生型ｈＧＨ（ｈＧＨ）、Ｈｉｓタグ付きｈＧＨ（（ｈｉｓ）ｈＧＨ）、並びに位置３５及び９２において３０ｋＤａのＰＥＧに共有結合したｐ−アセチルフェニルアラニンを含むｈＧＨポリペプチドについて体重測定結果を得る。３０ＫＰＥＧ−ｐＡＦ３５（ｈｉｓ）ｈＧＨ化合物の場合の９日目の体重増加は、より大きな体重増加が得られた点で、３０ＫＰＥＧ−ｐＡＦ９２（ｈｉｓ）ｈＧＨ化合物とは統計的に異なる（ｐ＜０．０００５）。循環血しょうＩＧＦ−１に対する効果は、非天然的にコードされたアミノ酸を含むＰＥＧ化ｈＧＨポリペプチドの単回投与後に一様になり、両側分布を用いた、対応のない、等分散のｔ検定によって求めて有意差がある。
【実施例９２】
【１１０６】
非天然的にコードされたアミノ酸を含むＰＥＧ化ｈＧＨの安全性及び／又は効力のヒト臨床試験
目的  皮下投与した、非天然的にコードされたアミノ酸を含むＰＥＧ化組換えヒトｈＧＨの安全性及び薬物動態学を、（Ｈｕｍａｔｒｏｐｅ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ＆  Ｃｏ．）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ（商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（商標）（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｇｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（商標）（Ｐｆｉｚｅｒ）及びＳａｉｚｅｎ／Ｓｅｒｏｓｔｉｍ（商標）（Ｓｅｒｏｎｏ）を含めて、但しこれらだけに限定されない）市販ｈＧＨ製品の１個以上と比較すること。
【１１０７】
患者  ２０−４０歳の体重６０−９０ｋｇの１８名の健康なボランティアが試験に参加する。被検者は、血液学又は血清の化学的性質について臨床的に有意な異常検査値を示さず、尿の毒物学的スクリーニング、ＨＩＶスクリーニング及びＢ型肝炎表面抗原も陰性である。被検者は以下の証拠を有するべきではない：高血圧；原発性の血液疾患の病歴；著しい肝臓、腎臓、心血管、胃腸、尿生殖器、代謝、神経疾患の病歴；貧血又は発作性疾患の病歴；細菌若しくは哺乳動物由来の産物、ＰＥＧ又はヒト血清アルブミンに対する既知の感受性；カフェイン飲料の習慣的な重度の消費者；任意の他の臨床試験への関与又は試験に参加する３０日以内に輸血を受けた、若しくは献血した；試験に参加する３ヵ月以内にｈＧＨに曝された；試験に参加する７日以内に疾病に罹った；及び試験に参加する１４日以内の試験前（ｐｒｅ−ｓｔｕｄｙ）理学的検査又は臨床検査評価でかなりの異常を示した。全被検者は安全性の評価を受ける。薬物動態学的分析のために収集する全血液を予定通りに採取する。全ての試験は、施設の倫理委員会の承認と患者の同意を得て実施される。
【１１０８】
試験設計  試験設計は、健康な男性ボランティアにおける、フェーズＩ、単一施設、オープンラベル、無作為化、２期交差試験である。１８名の被検者を、２つの処置配列群の１つに無作為に割り当てる（９被検者／群）。ＧＨを２つの別々の投薬期間にわたって、非天然的にコードされたアミノ酸を含むＰＥＧ化ｈＧＨと選択した市販品の等用量を、上部大腿にボーラスｓ．ｃ．注射として投与する。市販品の投与用量及び回数は、包装容器のラベルに記載されたとおりである。市販品を用いた、追加の投薬、投薬回数又は所望の他のパラメータは、追加の被検者群を加えることによって試験に追加することができる。各投薬期間は、１４日の休薬期間によって分離されている。被検者は、２つの投薬期間の各々について、投薬前少なくとも１２時間及び投薬後７２時間は試験施設に拘束される。但し、各投薬期間の間は拘束されない。ＰＥＧ化ｈＧＨについて同様に試験すべき追加の投薬、回数又は他のパラメータが存在する場合には、被検者群を追加することができる。ヒト用に承認された複数のＧＨ製剤をこの試験で使用することができる。Ｈｕｍａｔｒｏｐｅ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ＆  Ｃｏ．）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ（商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（商標）（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｇｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（商標）（Ｐｆｉｚｅｒ）及びＳａｉｚｅｎ／Ｓｅｒｏｓｔｉｍ（商標）（Ｓｅｒｏｎｏ））はヒト用に承認された市販ＧＨ製品である。実験用ｈＧＨ製剤は、非天然的にコードされたアミノ酸を含むＰＥＧ化ｈＧＨである。
【１１０９】
血液試料採取  ｈＧＨの投与前後に静脈穿刺によって連続的に血液を抜き取る。血清中ＧＨ濃度を求めるための静脈血試料（５ｍＬ）を、投薬前約３０、２０及び１０分（３個のベースライン試料）並びに投薬後ほぼ３０分、１、２、５、８、１２、１５、１８、２４、３０、３６、４８、６０及び７２時間で採取する。各血清試料を２つの一定分量に分割する。全血清試料を−２０℃で保存する。血清試料をドライアイスと一緒に輸送する。空腹時の臨床検査（血液学、血清の化学的性質及び尿検査）を１日目の初回量の直前、４日目の朝、１６日目の投薬直前、及び１９日目の朝に実施する。
【１１１０】
生化学分析方法  ＥＬＩＳＡキット手順（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ［ＤＳＬ］，  Ｗｅｂｓｔｅｒ  ＴＸ）を使用して、血清中ＧＨ濃度を測定する。
【１１１１】
安全性の判定  生命徴候を、各投薬直前（１及び１６日目）並びに各投薬後６、２４、４８及び７２時間に記録する。安全性の判定は、有害事象の発生率及びタイプ並びにベースラインからの臨床検査の変化に基づく。また、血圧を含めた生命徴候の測定及び理学的検査結果における予備試験（ｐｒｅ−ｓｔｕｄｙ）からの変化を評価する。
【１１１２】
データ解析  投薬後の血清中濃度値を、投薬の３０、２０及び１０分前に収集した３個の試料から得られるＧＨレベルを平均して求められる平均ベースラインＧＨ濃度を投薬後の値の各々から差し引くことによって、投薬前のベースラインＧＨ濃度に対して補正する。投薬前血清中ＧＨ濃度は、アッセイの定量レベル未満である場合には、平均値の計算に含めない。薬物動態パラメータは、ベースラインＧＨ濃度に対して補正した血清中濃度データから求められる。薬物動態パラメータは、最新バージョンのＢＩＯＡＶＬソフトウエアを用いたＤｉｇｉｔａｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ＶＡＸ  ８６００コンピュータシステムを用いて、モデルインディペンデント方法によって計算される。以下の薬物動態パラメータを求める：最高血清中濃度（Ｃｍａｘ）、最高血清中濃度到達時間（ｔｍａｘ）、線形台形公式を用いて計算される、時間ゼロから最終血液試料採取時間までの濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ）（ＡＵＣ０−７２）及び排出速度定数から計算される消失（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）半減期（ｔ１／２）。排出速度定数は、対数線形濃度−時間プロットの末端線形領域における連続データ点の線形回帰によって推定される。薬物動態パラメータの平均、標準偏差（ＳＤ）及び変動係数（ＣＶ）を各処置に対して計算する。パラメータ平均の比（保存製剤／非保存製剤）を計算する。
【１１１３】
安全性の結果  有害事象の発生は、投与群全体に一様に分布する。ベースライン又は試験前臨床検査又は血圧からの臨床的に有意な変化はなく、理学的検査結果及び生命徴候の測定値における予備試験からの注目すべき変化もない。２つの投与群の安全性プロファイルは、ほぼ同等であるべきである。
【１１１４】
薬物動態学的結果  （Ｈｕｍａｔｒｏｐｅ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ＆  Ｃｏ．）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ（商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（商標）（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｇｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（商標）（Ｐｆｉｚｅｒ）及びＳａｉｚｅｎ／Ｓｅｒｏｓｔｉｍ（商標）（Ｓｅｒｏｎｏ）を含めて、但しこれらだけに限定されない）市販ｈＧＨ製品の１個以上の単回投与を受けた後の全１８被検者における（ベースラインＧＨレベルに対して補正していない）平均血清中ＧＨ濃度−時間プロファイルを、非天然的にコードされたアミノ酸を含むＰＥＧ化ｈＧＨと各測定時点で比較する。全被検者は、正常な生理学的範囲内の投薬前ベースラインＧＨ濃度を有するべきである。薬物動態パラメータを、投薬前平均ベースラインＧＨ濃度に対して補正した血清データから求め、Ｃｍａｘ及びｔｍａｘを求める。選択した臨床比較（Ｈｕｍａｔｒｏｐｅ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ＆  Ｃｏ．）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ（商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（商標）（Ｎｏｖｏ−Ｎｏｒｄｉｓｋ）、Ｇｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（商標）（Ｐｆｉｚｅｒ）及びＳａｉｚｅｎ／Ｓｅｒｏｓｔｉｍ（商標）（Ｓｅｒｏｎｏ））の平均ｔｍａｘは、非天然的にコードされたアミノ酸を含むＰＥＧ化ｈＧＨのｔｍａｘよりもかなり短い。消失半減期値は、試験した市販ｈＧＨ製品が、非天然的にコードされたアミノ酸を含むＰＥＧ化ｈＧＨの消失半減期よりもかなり短い。
【１１１５】
今回の試験は健康な男性被検者において実施されるが、類似の吸収特性及び安全性プロファイルは、癌又は慢性腎不全の男性又は女性患者、小児の腎不全患者、術前貯血（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｅｄｅｐｏｓｉｔ）プログラム患者、待期的手術予定の患者などの他の患者集団においても予測される。
【１１１６】
要するに、非天然的にコードされたアミノ酸を含むＰＥＧ化ｈＧＨの単一用量の皮下投与は、安全であり、健康な男性被検者では耐容性が良好である。有害事象の比較発生率、臨床検査値、生命徴候及び理学的検査結果に基づいて、ｈＧＨの市販品と非天然的にコードされたアミノ酸を含むＰＥＧ化ｈＧＨの安全性プロファイルは同じである。非天然的にコードされたアミノ酸を含むＰＥＧ化ｈＧＨは、患者及び医療提供者に臨床上極めて有用である。
【実施例９３】
【１１１７】
ＰＥＧ化ｈＧＨと非ＰＥＧ化ｈＧＨの水溶性比較
ｈＧＨ野生型タンパク質（ＷＨＯ  ｈＧＨ）、Ｈｉｓタグ付きｈＧＨポリペプチド（ｈｉｓ−ｈＧＨ）、又は位置９２において３０ｋＤａのＰＥＧに共有結合した非天然アミノ酸ｐ−アセチルフェニルアラニンを含むＨｉｓタグ付きｈＧＨポリペプチドの水溶性を、水１００μＬに溶解し得るそれぞれのポリペプチドの量を測定することによって求める。ＰＥＧ化ｈＧＨの量は、ＷＨＯ  ｈＧＨ及びｈＧＨの量よりも大きい。これは、非天然アミノ酸ポリペプチドのＰＥＧ化によって水溶性が増加することを示している。
【実施例９４】
【１１１８】
治療上有効な修飾非天然アミノ酸ポリペプチドのインビボ試験
前立腺癌腫ようの異種移植片をマウスに移植し、次いで、マウスを２群に分ける。一方の群を治療上有効な修飾非天然アミノ酸ポリペプチドで毎日処置し、もう一方の群を治療上有効な天然アミノ酸ポリペプチドで毎日処置する。腫ようサイズを毎日測定する。治療上有効な修飾非天然アミノ酸ポリペプチドは、治療上有効な天然アミノ酸ポリペプチドよりも治療有効性が改善される。これは、治療上有効な修飾非天然アミノ酸ポリペプチド処置群では腫ようサイズが減少することによって示される。
【実施例９５】
【１１１９】
治療上有効な修飾非天然アミノ酸ポリペプチドのインビボ試験
前立腺癌腫ようの異種移植片をマウスに移植し、次いで、マウスを２群に分ける。一方の群を治療上有効な修飾非天然アミノ酸ポリペプチドで毎日処置し、もう一方の群を治療上有効な天然アミノ酸ポリペプチドで毎日処置する。腫ようサイズを毎日測定する。治療上有効な修飾非天然アミノ酸ポリペプチドは、治療上有効な天然アミノ酸ポリペプチドよりも治療有効性が改善される。これは、治療上有効な修飾非天然アミノ酸ポリペプチド処置群では腫ようサイズが減少することによって示される。
【１１２０】
本明細書に記載の実施例及び実施形態は、単なる説明のためのものであって、それに照らして種々の改変又は変更が当業者には示唆されるが、それらは本願の精神及び範囲並びに添付の特許請求の範囲に含まれると理解される。本明細書で引用する全ての刊行物、特許及び特許出願を参照によりそれら全体を組みこむ。
【図面の簡単な説明】
【１１２１】
【図１】本明細書の方法、組成物、戦略及び技術のある態様の関係の概略図である。
【図２】本明細書に記載の非天然アミノ酸のタイプの説明のための非限定的例を示す図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図３】本明細書に記載の非天然アミノ酸のタイプの説明のための非限定的例を示す図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図４】本明細書に記載の非天然アミノ酸の製造に使用する合成方法の説明のための非限定的例を示す図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図５】本明細書に記載の非天然アミノ酸の製造に使用する合成方法の説明のための非限定的例を示す図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図６】本明細書に記載の非天然アミノ酸の製造に使用する合成方法の説明のための非限定的例を示す図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図７】修飾オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドを形成するための、ヒドロキシルアミン含有試薬を用いたカルボニル含有非天然アミノ酸ポリペプチドの翻訳後修飾の説明のための非限定的例を示す図である。かかる非天然アミノ酸ポリペプチドは、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図８】カルボニル含有非天然アミノ酸ポリペプチドとヒドロキシルアミン含有試薬との反応を促進して、修飾オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドを形成するために使用することができる添加剤の説明のための非限定的例を示す図である。
【図９】修飾オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドを形成するための、カルボニル含有試薬を用いたオキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドの翻訳後修飾の説明のための非限定的例を示す図である。かかる非天然アミノ酸ポリペプチドは、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図１０】修飾オキシム含有非天然アミノ酸ポリペプチドを形成するための、カルボニル含有試薬を用いたヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドの翻訳後修飾の説明のための非限定的例を示す図である。かかる非天然アミノ酸ポリペプチドは、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図１１】非天然アミノ酸ポリペプチドを修飾して、ＰＥＧ含有オキシム結合非天然アミノ酸ポリペプチドを形成するために使用することができるＰＥＧ含有試薬の説明のための非限定的例を示す図である。
【図１２】非天然アミノ酸ポリペプチドを修飾して、ＰＥＧ含有オキシム結合非天然アミノ酸ポリペプチドを形成するために使用することができるＰＥＧ含有試薬の合成の説明のための非限定的例を示す図である。
【図１３】非天然アミノ酸ポリペプチドを修飾して、ＰＥＧ含有オキシム結合非天然アミノ酸ポリペプチドを形成するために使用することができるアミド系ＰＥＧ含有試薬の合成の説明のための非限定的例を示す図である。
【図１４】非天然アミノ酸ポリペプチドを修飾して、ＰＥＧ含有オキシム結合非天然アミノ酸ポリペプチドを形成するために使用することができるカルバマート系アミド系ＰＥＧ含有試薬の合成の説明のための非限定的例を示す図である。
【図１５】非天然アミノ酸ポリペプチドを修飾して、ＰＥＧ含有オキシム結合非天然アミノ酸ポリペプチドを形成するために使用することができるカルバマート系アミド系ＰＥＧ含有試薬の合成の説明のための非限定的例を示す図である。
【図１６】非天然アミノ酸ポリペプチドを修飾して、ＰＥＧ含有オキシム結合非天然アミノ酸ポリペプチドを形成するために使用することができる簡単なＰＥＧ含有試薬の合成の説明のための非限定的例を示す図である。
【図１７】非天然アミノ酸ポリペプチドを修飾して、ＰＥＧ含有オキシム結合非天然アミノ酸ポリペプチドを形成するために使用することができる分枝ＰＥＧ含有試薬、及びカルボニル系非天然アミノ酸ポリペプチドを修飾するための１種類のかかる試薬の使用の説明のための非限定的例を示す図である。
【図１８】非天然アミノ酸ポリペプチドの修飾及び結合に使用することができる二官能リンカー基の合成の説明のための非限定的例を示す図である。
【図１９】非天然アミノ酸ポリペプチドの修飾及び結合に使用することができる多官能リンカー基の説明のための非限定的例を示す図である。
【図２０】非天然アミノ酸ポリペプチドを修飾し、ＰＥＧ基と連結するための二官能リンカー基の使用の説明のための非限定的な図である。
【図２１】非天然アミノ酸ポリペプチドを修飾し、ＰＥＧ基と連結する二官能リンカー基の使用の説明のための非限定的例を示す図である。
【図２２】２個の非天然アミノ酸ポリペプチドを連結してホモ２量体を形成するための二官能リンカー基の使用の説明のための非限定的な図である。
【図２３】２個の異なる非天然アミノ酸ポリペプチドを連結してヘテロ２量体を形成するための二官能リンカー基の使用の説明のための非限定的な図である。
【図２４】カルボニル含有非天然アミノ酸の合成の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図２５】ジカルボニル含有非天然アミノ酸の合成の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図２６】ジカルボニル含有非天然アミノ酸の合成の説明のための非限定的な図である。
【図２７】ジカルボニル含有非天然アミノ酸の合成の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図２８】ジカルボニル含有非天然アミノ酸の合成の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図２９】ジカルボニル含有非天然アミノ酸の合成の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図３０】ジカルボニル含有非天然アミノ酸の合成の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図３１】ジカルボニル含有非天然アミノ酸の合成の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図３２】ジカルボニル含有非天然アミノ酸の合成の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図３３】ジカルボニル含有非天然アミノ酸の合成の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図３４】ジカルボニル含有非天然アミノ酸の合成の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図３５】カルボニル含有及びジカルボニル含有非天然アミノ酸の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図３６】非天然アミノ酸の合成の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図３７】カルボニル含有及びジカルボニル含有非天然アミノ酸の合成の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図３８】カルボニル含有及びジカルボニル含有非天然アミノ酸の合成の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図３９】カルボニル含有及びジカルボニル含有非天然アミノ酸の合成の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図４０】ジカルボニル含有非天然アミノ酸の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図４１】ジカルボニル含有非天然アミノ酸の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図４２】ジカルボニル含有非天然アミノ酸の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図４３】（ａ）保護又は非保護１，３−ケトアルデヒド含有非天然アミノ酸及び（ｂ）１，３−ケトカルボキシルイル（チオ）エステル含有非天然アミノ酸の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図４４】ヒドラジド含有非天然アミノ酸の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図４５】ヒドラジド含有非天然アミノ酸の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図４６】図４６Ａ及び４６Ｂは、オキシム含有非天然アミノ酸の説明のための非限定的な図である。図４６Ｃは、ヒドラジン含有非天然アミノ酸の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図４７】非天然アミノ酸ポリペプチドとの１段階連結及び非天然アミノ酸ポリペプチドとの２段階連結の説明のための非限定的な図である。例として、かかる連結としては、非天然アミノ酸ポリペプチドのＰＥＧ化が挙げられる。
【図４８】ｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミン化合物の合成の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図４９】ｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミン化合物の合成の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図５０】ｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミン化合物の合成の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図５１】ｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミン化合物の合成の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図５２】ｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミン化合物の合成の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図５３】ｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミン化合物の合成の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図５４】ｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミン化合物の合成の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図５５】ｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミン化合物の合成の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図５６】ｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミン化合物の合成の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図５７】ｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミン化合物の合成の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図５８】ｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミン化合物の合成の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図５９】ｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミン化合物の合成の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図６０】ヒドロキシルアミン化合物の合成の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図６１】ｍＰＥＧ−ヒドロキシルアミン化合物の合成の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図６２】図６２Ａは、ヒドロキシルアミン化合物の合成の説明のための非限定的な図である。図６２Ｂは、ｍＰＥＧ化合物の合成の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図６３】（Ａ）非天然アミノ酸ポリペプチドの（ジカルボニル含有を含めた）カルボニル含有非天然アミノ酸ポリペプチドへの化学転化による改変及び（Ｂ）非天然アミノ酸ポリペプチドのヒドロキシルアミン含有非天然アミノ酸ポリペプチドへの化学転化による改変の説明のための非限定的例を示す図である。かかる非天然アミノ酸ポリペプチドは、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図６４】ＰＥＧ−ヒドロキシルアミン化合物の合成の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図６５】ＰＥＧ−ヒドロキシルアミン化合物の合成の説明のための非限定的な図である。かかる非天然アミノ酸は、本明細書に記載の非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド及び修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを製造し、精製し、分析し、使用するための方法、組成物、技術及び戦略のいずれかに使用することができ、又はそのいずれかに組み込むことができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【配列表】
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