(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アラビノース（ａｒａｂｉｎｏｓｅ）代謝経路関連遺伝子を含む下記の１）〜３）の遺伝子発現カセット全てをカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄｉａ  ｓｐ．）菌株に導入することで作製された、アラビトール生成が抑制されたキシリトール生産菌株：
１）プロモーター、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ（Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｓｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）をコードするポリヌクレオチド及びターミネーターからなる遺伝子発現カセット、
２）プロモーター、Ｌ−リブロキナーゼ（Ｌ−ｒｉｂｕｌｏｋｉｎａｓｅ）をコードするポリヌクレオチド及びターミネーターからなる遺伝子発現カセット、及び
３）プロモーター、Ｌ−リブロース−５−ホスフェート  ４−エピメラーゼ（Ｌ−ｒｉｂｕｌｏｓｅ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）をコードするポリヌクレオチド及びターミネーターからなる遺伝子発現カセット。
【請求項２】
前記カンジダ属菌株が、カンジダ・グイリエルモンジ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉ）、カンジダ・パラプシロシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）及びカンジダ・トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載のアラビトール生成が抑制されたキシリトール生産菌株。
【請求項３】
前記カンジダ属菌株が、キシリトール脱水素酵素（ｘｙｌｉｔｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を不活性化させたカンジダ・トロピカリスであることを特徴とする、請求項１に記載のアラビトール生成が抑制されたキシリトール生産菌株。
【請求項４】
キシリトール生産菌株が、受託番号：ＫＣＴＣ  １１７６１ＢＰで寄託された菌株であることを特徴とする、請求項１に記載のアラビトール生成が抑制されたキシリトール生産菌株。
【請求項５】
前記カンジダ・トロピカリス菌株が、受託番号：ＫＣＴＣ  １１１３７ＢＰで寄託された菌株であることを特徴とする、請求項３に記載のアラビトール生成が抑制されたキシリトール生産菌株。
【請求項６】
１）プロモーター、Ｌ−アラビノースイソメラーゼをコードするポリヌクレオチド及びターミネーターからなる遺伝子発現カセットを作製する工程、
２）プロモーター、Ｌ−リブロキナーゼをコードするポリヌクレオチド及びターミネーターからなる遺伝子発現カセットを作製する工程、
３）プロモーター、Ｌ−リブロース−５−ホスフェート  ４−エピメラーゼをコードするポリヌクレオチド及びターミネーターからなる遺伝子発現カセットを作製する工程、及び
４）前記の１）〜３）で作製された遺伝子発現カセット全てをカンジダ属菌株に導入する工程
を含む、アラビトール生成が抑制されたキシリトール生産菌株の作製方法。
【請求項７】
前記カンジダ属菌株が、カンジダ・グイリエルモンジ、カンジダ・パラプシロシスまたはカンジダ・トロピカリスからなる群より選択されることを特徴とする、請求項６に記載のアラビトール生成が抑制されたキシリトール生産菌株の作製方法。
【請求項８】
前記カンジダ属菌株が、キシリトール脱水素酵素を不活性化させたカンジダ・トロピカリスであることを特徴とする、請求項６に記載のアラビトール生成が抑制されたキシリトール生産菌株の作製方法。
【請求項９】
キシリトール生産菌株が、受託番号：ＫＣＴＣ  １１７６１ＢＰで寄託された菌株であることを特徴とする、請求項６に記載のアラビトール生成が抑制されたキシリトール生産菌株の作製方法。
【請求項１０】
前記カンジダ・トロピカリス菌株が、受託番号：ＫＣＴＣ  １１１３７ＢＰで寄託された菌株であることを特徴とする、請求項８に記載のアラビトール生成が抑制されたキシリトール生産菌株の作製方法。
【請求項１１】
１）請求項１に記載のキシリトール生産菌株をバイオマス加水分解物及び炭素源を含んだ培地中で培養する工程、
２）培養された菌株からキシリトールを生産する工程、及び
３）培養液からキシリトールを分離する工程
を含む、キシリトールの大量生産方法。
【請求項１２】
工程１）のバイオマス加水分解物が、トウモロコシ穂軸の加水分解物、サトウキビの加水分解物、ココナッツ副産物、及びカバノキの加水分解物からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１１に記載のキシリトールの大量生産方法。
【請求項１３】
工程１）の炭素源が、ブドウ糖、グリセロール、果糖、ガラクトース、ショ糖、マンノース、マルトース、セロビオース及びこれらの混合物からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１１に記載のキシリトールの大量生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アラビノース（ａｒａｂｉｎｏｓｅ）代謝経路が新たに導入されたキシリトール（ｘｙｌｉｔｏｌ）生産菌株及びそれを用いた効率的なキシリトール生産方法に関するものであり、詳細には、アラビノース代謝経路を導入することで、キシリトールの精製及び結晶化を妨害するアラビトール（ａｒａｂｉｔｏｌ）の生成を抑制するとともに、アラビノースを細胞成長に用いるキシリトール生産菌株、ならびに、それを用いてキシリトールを高生産性で生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
キシリトールは、五炭糖糖アルコールであり高い甘味度を有していて砂糖を代替する機能性甘味料として広く用いられている。キシリトールは、甘味度が砂糖と似ているが、体内摂取後の代謝過程がインスリンと無関係であるため、糖尿病患者の砂糖代用甘味料として使用されている。特に、虫歯誘発菌であるストレプトコッカスムータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）の生育を抑制する特性を有していて、虫歯抑制成分としても産業的に広く用いられている。
【０００３】
このようなキシリトールは、現在、トウモロコシの穂軸やサトウキビの茎などのキシロース（ｘｙｌｏｓｅ）を多く含んだヘミセルロース（ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）加水分解物を化学的に還元させる方法で生産されている。しかし、このような化学的方法は、キシロースをアラビノース、ブドウ糖などの他の五炭糖及び六炭糖構成物から分離及び精製がしにくくて費用が多くかかり、この過程で、キシロースの回収率が５０〜６０％程度と低い。また、水素ガス及びニッケル触媒を用いた高温、高圧の工程なので、危険性及び環境的問題が存在するという短所がある。
【０００４】
最近は、このような短所を補うための生物学的な方法によるキシリトール生産方法が活発に研究されている。生物学的方法は、化学的方法に比べて原料物質として、相対的に低い純度のキシロースを用いることができ、工程自体が常温及び常圧で行なわれるので、安全で環境に配慮した生産工程である。そして、高生産性、高収率のキシリトール生産のために多様な細菌と酵母菌株、組換え酵母を用いたキシリトール生産研究が進行されている（非特許文献１、非特許文献２）。しかし、細菌と組換え酵母菌株は、キシロースを用いた代謝経路が弱いかまたは効率が良くないので、産業的なキシリトールの生産に相応しくないことが分かった。しかし、酵母菌株の中でカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐ．）菌株は、他の微生物に比べてキシロースを利用する能力に優れていて、キシリトールの生産性および収率が高いので、生物学的キシリトールの生産に相応しい菌株である。
【０００５】
今までの研究によると、カンジダ・グイリエルモンジ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉ）、カンジダ・パラプシロシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃ．  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）などのカンジダ属菌株は、細胞外部から吸収されたキシロースをキシロース還元酵素（ｘｙｌｏｓｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）によってキシリトールに変換して、それをキシリトール脱水素酵素（ｘｙｌｉｔｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）によってキシルロース（ｘｙｌｕｌｏｓｅ）に転換させて、キシルロースはまたキシルロースリン酸化酵素（ｘｙｌｕｌｏｋｉｎａｓｅ）によってキシルロース−五リン酸（ｘｙｌｕｌｏｓｅ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）に転換されて、これは続いてペントースリン酸化過程（ｐｅｎｔｏｓｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐａｔｈｗａｙ）を通じて、細胞成長と維持に用いられることが知られている（非特許文献３、非特許文献４）。
【０００６】
ここで、キシロース還元酵素は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ；Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ  ａｄｅｎｉｎｅ  ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を補助因子（ｃｏｆａｃｔｏｒ）に用いて、キシリトール脱水素酵素は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）を補助因子として用いる。キシロース還元酵素によってキシロースから転換されたキシリトールはまた、キシリトール脱水素酵素によってキシルロースに転換されるが、培地内に酸素の供給が制限されて溶存酸素の濃度が０．５％〜２．０％に低く維持されると細胞内の酸化還元力の不均衡が誘発されてキシリトール脱水素酵素が必要とする補助因子であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）の供給が不足して、キシリトールがキシルロースに転換される過程が抑制される。その結果、キシリトールが細胞及び培地に蓄積されるようになって、５０〜６０％の収率でキシロースからキシリトールが生産される。すなわち、キシリトール生産菌株を用いてキシリトールを生産する従来の技術では、酸素供給を制限することによって、低い溶存酸素濃度に調節することが必須である。そして、培地内の酸素供給を制限して、溶存酸素濃度を低く維持して細胞内の酸化還元力の不均衡を意図的に誘発させることによって、キシリトールの生産性と収率を高める研究が活発に行なわれている（非特許文献５、特許文献１）。
【０００７】
特許文献２によると、濃縮されたカンジダ・パラプシロシス菌株を用いて、溶存酸素濃度を０．８％〜１．２％に調節してキシリトールを生産する方法が開示されている。しかし、産業的規模の大容量の発酵器を用いてキシリトールを生産する場合、溶存酸素濃度を上記のように低く調節することは事実上不可能であり、たとえ調節することができたとしても生産収率が５０〜６０％程度に過ぎない。また、特許文献３で、培地酸素条件をＤＯＴ（培地内酸素濃度を百分率で示した数値）１％未満に調節するための撹拌速度を提示しているが、工程上の煩わしさが依然存在する。そして、特許文献４には、カンジダ・パラプシロシスの自然種から誘発させた突然変異種を用いたキシリトール生産方法であって、キシリトール最適化が培地内の酸素分圧の調節によって達成されるキシリトール生産方法に関して開示しており、特許文献５には、前記突然変異株のキシリトール生産のための最適培地及び培養条件に関して開示しているが、このような最適の条件でも、キシリトール収率は７０％を超えなかった。そこで、本発明者等は、カンジダ属菌株で生成されたキシリトールがキシリトール脱水素酵素によって再びキシルロースに転換されて減少するという点に着眼して、キシリトール脱水素酵素の活性を完全に不活性化させたカンジダ・トロピカリス変異株を開発した（特許文献６）。以前は、キシリトールをキシルロースに転換するキシリトール脱水素酵素の作用抑制のために、細胞内の酸化還元力の不均衡を誘発させるために培地内の酸素供給の制限が必要だったが、キシリトール脱水素酵素の活性が完全に不活性化された変異株は、キシロースから生産されたキシリトールがそれ以上細胞成長に用いられないようにするため、酸化還元力の不均衡を誘発させる必要性がない。この方法で、９７％〜９８％の収率でキシロースをキシリトールに生物転換することができる。
【０００８】
しかし、キシロースに対するキシリトールの収率は最大化されたが、実際のキシリトール生産の原料になるバイオマス加水分解物は、キシロースだけではなく相当量のアラビノースを含んでいる。キシリトール生産菌株のキシロース還元酵素は、アラビノースに対する活性も有しているので、バイオマス加水分解物を直接基質として使用する場合、アラビトールが生成される。アラビトールは、キシリトールと同様に五炭糖糖アルコールであり、分子構造及び物性がキシリトールと類似であり、キシリトール生産時の精製及び結晶化過程を妨害して生産収率を低下させる副産物である。したがって、キシロースとアラビノースの混合培地を用いてキシリトールを生産する時、アラビトールを生成させないキシリトール生産技術を開発する必要がある。
【０００９】
それで、本発明者等は、アラビノース代謝経路に関与する酵素、すなわち、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ（Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｓｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ；ａｒａＡ）、Ｌ−リブロキナーゼ（Ｌ−ｒｉｂｕｌｏｋｉｎａｓｅ；ａｒａＢ）、Ｌ−リブロース−５−ホスフェート  ４−エピメラーゼ（Ｌ−ｒｉｂｕｌｏｓｅ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ；ａｒａＤ）をカンジダ属菌株で効率的に発現させるために、コドンの最適化（ｃｏｄｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ）を遂行した後、それぞれの遺伝子をグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）のプロモーター及び選択マーカーであるＵＲＡ３を含むカセットに挿入して、カンジダ属菌株に導入することで、キシリトール生産時の精製及び結晶化過程を妨害するアラビトール生成を抑制して、キシリトールを高生産性で生産することができることを明らかにして本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】韓国特許第１９９６−０３０５７７号
【特許文献２】韓国特許第１０−０１６９０６１号
【特許文献３】韓国特許第１０−０２５９４７０号
【特許文献４】韓国特許出願第９５−３７５１６号
【特許文献５】韓国特許出願第９５−１３６３８号
【特許文献６】韓国特許第１０−０７３０３１５号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｗｉｎｋｅｌｈａｕｓｅｎ，Ｅ．等，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ，Ｂｉｏｅｎｇ．１９９８年，第８６巻，ｐ．１−１４
【非特許文献２】Ｇｒａｎｓｔｒｏｍ，Ｔ．Ｂ．等，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７年，第７４巻，ｐ．２７７−２８１
【非特許文献３】Ｌａｐｌａｃｅ，Ｊ．Ｍ．等，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９１年，第３６巻，ｐ．１５８−１６２
【非特許文献４】Ｈａｈｎ−Ｈａｇｅｒｄａｌ、Ｂ．等，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９９４年，第１６巻，ｐ．９３３−９４３
【非特許文献５】Ｋｉｍ，Ｓ．Ｙ．等，Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．１９９７年，第８３（３）巻，ｐ．２６７−２７０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、アラビトールの生成を抑制し、かつアラビノースを細胞成長に用いるように、アラビノース代謝経路を誘導することによって、キシリトール生産収率を最大化させた、キシリトール生産菌株を提供することである。
【００１３】
本発明の別の目的は、前記キシリトール生産菌株の生産方法を提供することである。
【００１４】
本発明のさらに別の目的は、前記キシリトール生産菌株を用いてブドウ糖またはグリセロールを炭素源とする培地で、キシリトールを高生産性で生産する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
前記目的を達成するために、本発明は、アラビノース代謝経路関連遺伝子を含む遺伝子発現カセットをカンジダ属菌株に導入することで作製された、アラビトール生成が抑制されたキシリトール生産菌株を提供する。
【００１６】
また、本発明は、アラビノース代謝経路関連遺伝子を含む遺伝子発現カセットをカンジダ属菌株に導入することで作製された、アラビトール生成が抑制されたキシリトール生産菌株を作製する方法を提供する。
【００１７】
また、本発明は、
１）前記キシリトール生産菌株をバイオマス加水分解物及び炭素源を含んだ培地中で培養する工程、
２）培養された菌株からキシリトールを生産する工程、及び
３）培養液からキシリトールを分離する工程
を含む、キシリトールの大量生産方法を提供する。
【発明の効果】
【００１８】
本発明は、キシロースとアラビノースの混合培地中で、副産物であるアラビトールの生成を抑制させ、かつアラビノースを細胞代謝に用いるように、アラビノース代謝経路を新たに導入したキシリトール生産菌株を用いることによる、効率的なキシリトール生産方法に関するものである。本方法は、キシリトール生産時の精製及び結晶化過程を妨害するアラビトール生成を抑制して、高生産性でキシリトールを生産するのに有用に用いることができる。
[本発明1001]
アラビノース（ａｒａｂｉｎｏｓｅ）代謝経路関連遺伝子を含む遺伝子発現カセットをカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄｉａ  ｓｐ．）菌株に導入することで作製された、アラビトール生成が抑制されたキシリトール生産菌株。
[本発明1002]
前記遺伝子発現カセットが下記の1）〜3）のうちの1つであることを特徴とする、本発明1001のアラビトール生成が抑制されたキシリトール生産菌株：
1）プロモーター、Ｌ−アラビノースイソメラーゼ（Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｓｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）をコードするポリヌクレオチド及びターミネーターからなる遺伝子発現カセット、
2）プロモーター、Ｌ−リブロキナーゼ（Ｌ−ｒｉｂｕｌｏｋｉｎａｓｅ）をコードするポリヌクレオチド及びターミネーターからなる遺伝子発現カセット、及び
3）プロモーター、Ｌ−リブロース−5−ホスフェート  4−エピメラーゼ（Ｌ−ｒｉｂｕｌｏｓｅ−5−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  4−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）をコードするポリヌクレオチド及びターミネーターからなる遺伝子発現カセット。
[本発明1003]
前記カンジダ属菌株が、好ましくは、カンジダ・グイリエルモンジ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉ）、カンジダ・パラプシロシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）及びカンジダ・トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）からなる群より選択されることを特徴とする、本発明1001のアラビトール生成が抑制されたキシリトール生産菌株。
[本発明1004]
前記カンジダ属菌株が、キシリトール脱水素酵素（ｘｙｌｉｔｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を不活性化させたカンジダ・トロピカリスであることを特徴とする、本発明1001のアラビトール生成が抑制されたキシリトール生産菌株。
[本発明1005]
キシリトール生産菌株が、受託番号：ＫＣＴＣ  11761ＢＰで寄託された菌株であることを特徴とする、本発明1001のアラビトール生成が抑制されたキシリトール生産菌株。
[本発明1006]
前記カンジダ・トロピカリス菌株が、受託番号：ＫＣＴＣ  11137ＢＰで寄託された菌株であることを特徴とする、本発明1004のアラビトール生成が抑制されたキシリトール生産菌株。
[本発明1007]
アラビノース代謝経路関連遺伝子を含む遺伝子発現カセットをカンジダ属菌株に導入することで作製された、アラビトール生成が抑制されたキシリトール生産菌株の作製方法。
[本発明1008]
下記の1）〜3）の遺伝子発現カセットをカンジダ属菌株に導入する工程を含むことを特徴とする、本発明1007のアラビトール生成が抑制されたキシリトール生産菌株の作製方法：
1）プロモーター、Ｌ−アラビノースイソメラーゼをコードするポリヌクレオチド及びターミネーターからなる遺伝子発現カセット、
2）プロモーター、Ｌ−リブロキナーゼをコードするポリヌクレオチド及びターミネーターからなる遺伝子発現カセット；及び
3）プロモーター、Ｌ−リブロース−5−ホスフェート  4−エピメラーゼをコードするポリヌクレオチド及びターミネーターからなる遺伝子発現カセット。
[本発明1009]
前記カンジダ属菌株が、好ましくは、カンジダ・グイリエルモンジ、カンジダ・パラプシロシスまたはカンジダ・トロピカリスからなる群より選択されることを特徴とする、本発明1007のアラビトール生成が抑制されたキシリトール生産菌株の作製方法。
[本発明1010]
前記カンジダ属菌株が、キシリトール脱水素酵素を不活性化させたカンジダ・トロピカリスであることを特徴とする、本発明1007のアラビトール生成が抑制されたキシリトール生産菌株の作製方法。
[本発明1011]
キシリトール生産菌株が、受託番号：ＫＣＴＣ  11761ＢＰで寄託された菌株であることを特徴とする、本発明1007のアラビトール生成が抑制されたキシリトール生産菌株の作製方法。
[本発明1012]
前記カンジダ・トロピカリス菌株が、受託番号：ＫＣＴＣ  11137ＢＰで寄託された菌株であることを特徴とする、本発明1010のアラビトール生成が抑制されたキシリトール生産菌株の作製方法。
[本発明1013]
1）本発明1001のキシリトール生産菌株をバイオマス加水分解物及び炭素源を含んだ培地中で培養する工程、
2）培養された菌株からキシリトールを生産する工程、及び
3）培養液からキシリトールを分離する工程
を含む、キシリトールの大量生産方法。
[本発明1014]
工程1）のバイオマス加水分解物が、好ましくは、トウモロコシ穂軸の加水分解物、サトウキビの加水分解物、ココナッツ副産物、及びカバノキの加水分解物からなる群より選択されることを特徴とする、本発明1013のキシリトールの大量生産方法。
[本発明1015]
工程1）の炭素源が、好ましくは、ブドウ糖、グリセロール、果糖、ガラクトース、ショ糖、マンノース、マルトース、セロビオース及びこれらの混合物からなる群より選択されることを特徴とする、本発明1013のキシリトールの大量生産方法。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、キシリトール生産菌株による、キシロース及びアラビノースの代謝経路を示した図である。
【図２】図２は、ＣｏＡｒａＡ、ＣｏＡｒａＢ及びＣｏＡｒａＤ発現カセットの遺伝子地図を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００２１】
本発明は、アラビノース代謝経路関連遺伝子を含む遺伝子発現カセットをカンジダ属菌株に導入することで作製された、アラビトール生成が抑制されたキシリトール生産菌株を提供する。
【００２２】
また、本発明は、下記１）ないし３）の遺伝子発現カセットをカンジダ属菌株に導入することで作製された、アラビトール生成が抑制されたキシリトール生産菌株を提供する。
１）プロモーター、Ｌ−アラビノースイソメラーゼをコードするポリヌクレオチド及びターミネーターからなる遺伝子発現カセット、
２）プロモーター、Ｌ−リブロキナーゼをコードするポリヌクレオチド及びターミネーターからなる遺伝子発現カセット、及び
３）プロモーター、Ｌ−リブロース−５−ホスフェート  ４−エピメラーゼをコードするポリヌクレオチド及びターミネーターからなる遺伝子発現カセット。
【００２３】
前記プロモーターは、配列番号１で表わされる塩基配列を有するプロモーター、前記Ｌ−アラビノースイソメラーゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号７で表わされる塩基配列を有するポリヌクレオチド、前記Ｌ−リブロキナーゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号８で表わされる塩基配列を有するポリヌクレオチド、前記Ｌ−リブロース−５−ホスフェート  ４−エピメラーゼ（Ｌ−ｒｉｂｕｌｏｓｅ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ）をコードするポリヌクレオチドは、配列番号９で表わされる塩基配列を有するポリヌクレオチド及び、前記ターミネーターは、配列番号２で表わされる塩基配列を有することが好ましいが、これに限定されるのではない。
【００２４】
また、本発明は、受託番号：ＫＣＴＣ  １１７６１ＢＰ（寄託機関：韓国生命工学研究院、寄託日：２０１０．０９．０８）で寄託された、アラビトール生成が抑制されたキシリトール生産菌株を提供する。
【００２５】
前記アラビトール生成が抑制されたキシリトール生産菌株ＰＢＤＡＵ、ＬＢＤＡＵまたはＥＢＤＡＵは、配列番号１で表わされる塩基配列を有するプロモーター、配列番号７で表わされる塩基配列を有するポリヌクレオチド及び配列番号２で表わされる塩基配列を有するターミネーターからなる遺伝子発現カセットを作製する工程と、配列番号１で表わされる塩基配列を有するプロモーター、配列番号８で表わされる塩基配列を有するポリヌクレオチド及び配列番号２で表わされる塩基配列を有するターミネーターからなる遺伝子発現カセットを作製する工程と、配列番号１で表わされる塩基配列を有するプロモーター、配列番号９で表わされる塩基配列を有するポリヌクレオチド及び配列番号２で表わされる塩基配列を有するターミネーターからなる遺伝子発現カセットを作製する工程、及び前記遺伝子発現カセットをカンジダ属菌株に導入することで作製することができるが、これに限定されない。
【００２６】
前記カンジダ属菌株は、カンジダ・グイリエルモンジ（Ｃ．ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉ）、カンジダ・パラプシロシス（Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）及びカンジダ・トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）からなる群より選択されることが好ましいが、これに限定されるのではない。
【００２７】
前記カンジダ・トロピカリスは、キシリトール脱水素酵素が不活性化されたカンジダ・トロピカリスであることが好ましいが、これに限定されるのではない。
【００２８】
キシリトール脱水素酵素が不活性化された前記カンジダ・トロピカリスは、受託番号：ＫＣＴＣ  １１１３７ＢＰで寄託された菌株であることが好ましいが、これに限定されるのではない。
【００２９】
キシリトール脱水素酵素を完全に不活性化させた前記カンジダ・トロピカリスは、キシリトール生産の原料になるバイオマスの加水分解物に含まれているアラビノースに対する活性も同時に有している。また、前記カンジダ・トロピカリスは、アラビノースを炭素源として用いる代謝経路を有していない。アラビノースは、細胞内に入って来た後、キシロース還元酵素の非特異的活性によってアラビトールに転換された後、それ以上代謝することができずに細胞外に放出される。したがって、バイオマス加水分解物を直接基質として使用する場合、アラビトールが生成される。アラビトールは、キシリトールと同じ五炭糖糖アルコールであり、分子構造及び物性がキシリトールと類似であり、キシリトール生産時の精製及び結晶化過程を妨害して生産収率を低下させる副産物である。したがって、キシロースとアラビノースの混合培地を用いてキシリトールを生産する場合、アラビトールを生成させないキシリトール生産技術を開発する必要がある。
【００３０】
本発明者等は、細菌菌株のアラビノース代謝経路［Ｌ−アラビノースイソメラーゼ（Ｌ−ａｒａｂｉｎｏｓｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ；ａｒａＡ）、Ｌ−リブロキナーゼ（Ｌ−ｒｉｂｕｌｏｋｉｎａｓｅ；ａｒａＢ）、及びＬ−リブロース−５−ホスフェート  ４−エピメラーゼ（Ｌ−ｒｉｂｕｌｏｓｅ−５−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ４−ｅｐｉｍｅｒａｓｅ；ａｒａＤ）］をカンジダ・トロピカリスＢＳＸＤＨ−３に導入して、アラビノースがキシルロース−５−リン酸に転換されてペントースリン酸経路及び解糖経路を通じて細胞代謝に用いることができるようにした。
【００３１】
本発明者等は、キシリトール生産菌株（ＰＢＤＡＵ、ＬＢＤＡＵ及びＥＢＤＡＵ）のアラビノース代謝経路が、キシリトール生産時の精製及び結晶化を妨害するアラビトールの生成を抑制することを確認するため、構築された菌株をアラビノース最少培地で培養して経時的な乾燥菌体濃度、アラビノース消費量及びアラビトール生成量を確認した（表１、表２及び表３参照）。
【００３２】
その結果、対照群である野生型カンジダ・トロピカリスは、炭素源としてアラビノースのみが存在する最少培地で増殖することができなかったことを確認し、キシリトール生産菌株ＬＢＤＡＵは、６０時間の間１．６ｇ／ｌ程度の乾燥菌体濃度に増殖して、４．３ｇ／ｌのアラビノースを消費したので、アラビノースはアラビトールに転換されないですべて細胞代謝に用いられたことを確認することができた。また、対照群であるキシリトール脱水素酵素を不活性化させたＢＳＸＤＨ−３は、炭素源としてアラビノースのみが存在する最少培地で乾燥菌体は増殖せず、アラビノースは消費せず、アラビトールも生成しない一方、キシリトール生産菌株ＰＢＤＡＵは、６０時間の間２．１ｇ／ｌ程度の乾燥菌体濃度に増殖して、５．４ｇ／ｌのアラビノースを消費し、アラビノースはアラビトールに転換されないですべて細胞代謝に用いられたことを確認することができた。また、対照群である野生型カンジダ・パラプシロシスは、炭素源にアラビノースのみが存在する最少培地で増殖することができないことを確認し、キシリトール生産菌株ＥＢＤＡＵは、６０時間の間１．４ｇ／ｌ程度の乾燥菌体濃度に増殖して、４．１ｇ／ｌのアラビノースを消費したので、アラビノースはアラビトールに転換されないですべて細胞代謝に用いられたことを確認することができた。
【００３３】
このことから、本発明のアラビノース代謝経路が新たに導入されたキシリトール生産菌株は、アラビトール生成を抑制して高生産性でキシリトールを生産するのに有用に使用できることを確認した。
【００３４】
また、本発明は、アラビノース代謝経路関連遺伝子を含む遺伝子発現カセットをカンジダ属菌株に導入することで作製された、アラビトール生成が抑制されたキシリトール生産菌株の作製方法を提供する。
【００３５】
また、本発明は、下記１）ないし３）の遺伝子発現カセットをカンジダ属菌株に導入する工程を含む、アラビトール生成が抑制されたキシリトール生産菌株の作製方法を提供する。
１）プロモーター、Ｌ−アラビノースイソメラーゼをコードするポリヌクレオチド及びターミネーターからなる遺伝子発現カセット、
２）プロモーター、Ｌ−リブロキナーゼをコードするポリヌクレオチド及びターミネーターからなる遺伝子発現カセット、及び
３）プロモーター、Ｌ−リブロース−５−ホスフェート  ４−エピメラーゼをコードするポリヌクレオチド及びターミネーターからなる遺伝子発現カセット。
【００３６】
前記プロモーターは配列番号１で表わされる塩基配列を有するプロモーター、前記Ｌ−アラビノースイソメラーゼをコードするポリヌクレオチドは配列番号７で表わされる塩基配列を有するポリヌクレオチド、前記Ｌ−リブロキナーゼをコードするポリヌクレオチドは配列番号８で表わされる塩基配列を有するポリヌクレオチド、前記Ｌ−リブロース−５−ホスフェート  ４−エピメラーゼをコードするポリヌクレオチドは配列番号９で表わされる塩基配列を有するポリヌクレオチド及び、前記ターミネーターは配列番号２で表わされる塩基配列を有することが好ましいが、これに限定されるのではない。
【００３７】
また、本発明は、受託番号：ＫＣＴＣ  １１７６１ＢＰ（寄託機関：韓国生命工学研究院、寄託日：２０１０．０９．０８）で寄託された、アラビトール生成が抑制されたキシリトール生産菌株の作製方法を提供する。
【００３８】
前記カンジダ属菌株は、カンジダ・グイリエルモンジ、カンジダ・パラプシロシス及びカンジダ・トロピカリスからなる群より選択されることが好ましいが、これに限定されるのではない。
【００３９】
前記カンジダ・トロピカリスは、キシリトール脱水素酵素が不活性化されたカンジダ・トロピカリスであることが好ましいが、これに限定されるのではない。
【００４０】
前記キシリトール脱水素酵素が不活性化されたカンジダ・トロピカリスは、受託番号：ＫＣＴＣ  １１１３７ＢＰで寄託された菌株であることが好ましいが、これに限定されるのではない。
【００４１】
本発明の一つの実施態様として、前記配列番号７、８及び９の遺伝暗号（コドン）を最適化するために、コドン使用頻度データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）のデータを用いてバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＬ−アラビノースイソメラーゼ（ａｒａＡ）、大腸菌のＬ−リブロキナーゼ（ａｒａＢ）、Ｌ−リブロース−５−ホスフェート  ４−エピメラーゼ（ａｒａＤ）のコドンをカンジダ属菌株に好適なコドンに入れ替えて遺伝子ＣｏＡｒａＡ（配列番号：７）、ＣｏＡｒａＢ（配列番号：８）、ＣｏＡｒａＤ（配列番号：９）を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ、ドイツ）。最適化された遺伝子をグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）のプロモーターと選択マーカーであるＵＲＡ３遺伝子、選択マーカーの除去のための反復配列（ｇｌｕまたはａｒｇ遺伝子）を含むカセットにクローニングして、ＰＧｔｒｐｆｓ２−ＣｏＡｒａＡ、ＰＡＨｆｓ−ＣｏＡｒａＢ、ＰＡＨｆｓ２−ＣｏＡｒａＤをそれぞれ得た後、カンジダ属菌株に導入して、ＣｏＡｒａＡ、ＣｏＡｒａＢ、及びＣｏＡｒａＤを発現する変異株カンジダ・トロピカリスＰＢＤＡＵ、カンジダ・トロピカリスＬＢＤＡＵ及び変異株カンジダ・パラプシロシスＥＢＤＡＵを得た。
【００４２】
併せて、本発明は、本発明による前記形質転換体ＰＢＤＡＵ、ＬＢＤＡＵまたはＥＢＤＡＵを用いて、ブドウ糖またはグリセロールを炭素源とする培地でキシリトールを高生産性で生産する方法を提供する。
【００４３】
具体的には、本発明によるキシリトール生産方法は、下記の工程を含む方法で遂行することが好ましいが、これに限定されない。
１）本発明の形質転換体をバイオマス加水分解物及び炭素源を含んだ培地中で培養する工程、
２）培養された菌株からキシリトールを生産する工程、及び
３）培養液からキシリトールを分離する工程。
【００４４】
前記方法において、工程１）のバイオマス加水分解物は、トウモロコシ穂軸の加水分解物、サトウキビの加水分解物、ココナッツ副産物、及びカバノキの加水分解物からなる群より選択されたいずれか一つであることが好ましいが、これに限定されず、キシロースを含むすべてのバイオマスが使用可能である。
【００４５】
前記方法において、工程１）の炭素源は、ブドウ糖またはグリセロールであることが好ましいが、これに限定されず、菌株培養に使用するすべての炭素源が使用可能である。
【００４６】
本発明者等は、ＰＢＤＡＵ、ＬＢＤＡＵまたはＥＢＤＡＵのキシリトール生産性を確認するため、経時的なキシロース、キシリトール、アラビノース、アラビトール濃度を測定した（表４、表５、表６及び表７、表８、表９及び表１０参照）。その結果、ＰＢＤＡＵのキシリトール生産性は、ＢＳＸＤＨ−３が０．５５ｇ／ｌ／ｈ、ＰＢＤＡＵが０．６３ｇ／ｌ／ｈであることが示され、ＰＢＤＡＵは対照群であるＢＳＸＤＨ−３に比べて１５％高いキシリトール生産性があることを確認し、ＢＳＸＤＨ−３は６０時間の間１１．４ｇ／ｌのアラビトールを生成するのに比べて、ＰＢＤＡＵは副産物であるアラビトールを生成せずにキシリトールのみを生産することを確認した。また、ＬＢＤＡＵのキシリトール生産性は、野生型菌株が０．５１ｇ／ｌ／ｈ、ＬＢＤＡＵが０．５９ｇ／ｌ／ｈであることが示され、ＬＢＤＡＵは対照群である野生型菌株に比べて１５％高いキシリトール生成性があることを確認し、野生型菌株は６０時間の間１０．３ｇ／ｌのアラビトールを生成するのに比べて、ＬＢＤＡＵは副産物であるアラビトールを生成せずにキシリトールのみを生産することを確認した。また、ＥＢＤＡＵのキシリトール生産性は、野生型菌株が０．４４ｇ／ｌ／ｈ、ＥＢＤＡＵが０．４９ｇ／ｌ／ｈであることが示され、ＥＢＤＡＵは対照群である野生型菌株に比べて１２％高いキシリトール生産性があることを確認し、野生型菌株は６０時間の間９．８ｇ／ｌのアラビトールを生成するのに比べて、ＥＢＤＡＵは副産物であるアラビトールを生成せずにキシリトールのみを生産することを確認した。併せて、ＰＢＤＡＵのバイオマス加水分解物を用いた発酵槽で大量生産した場合のキシリトール生産性は、ＢＳＸＤＨ−３が２．１６ｇ／ｌ／ｈ、ＰＢＤＡＵが２．２８ｇ／ｌ／ｈであることを確認し、ＢＳＸＤＨ−３は７２時間の間６．４ｇ／ｌのアラビトールを生成したのに比べて、ＰＢＤＡＵは副産物であるアラビトールを全く生成せずにキシリトールのみを純粋に生産することを確認した。
【００４７】
このことから、アラビノース代謝経路が新たに導入された本発明のキシリトール生産菌株は、アラビトール生成を抑制して高生産性でキシリトールのみを純粋に生産するのに有用に使用することができ、またバイオマス加水分解物を用いた大量生産時にもアラビトール生成抑制を通じて、高濃度、高生産性でキシリトールを生産することができることを確認した。
【実施例】
【００４８】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。
【００４９】
但し、下記の実施例は、本発明を例示するだけのものであって、本発明の内容が下記の実施例に限定されるのではない。
【００５０】
＜実施例１＞グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素のプロモーターとターミネーター配列のクローニング
カンジダ・トロピカリスのグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）のプロモーターとターミネーターをクローニングするため、カンジダ・トロピカリスのゲノムＤＮＡと下記のプライマー対を用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を遂行して、１４５５ｂｐのプロモーター配列（配列番号：１）と３０９ｂｐのターミネーター配列（配列番号：２）を得た。
【００５１】
プロモーターＰＣＲ［９４℃３０秒、３０サイクル（９４℃３０秒、５５℃１分、７２℃１分３０秒）、７２℃７分］：
ＰＧＡＰ−Ｆ（ＢｇｌＩＩ）：５'−ａｇａｔｃｔａａｃｇｔｇｇｔａｔｇｇｔｔｇｔａａｇａａａｃ−３'（配列番号：３）；及び
ＰＧＡＰ−Ｒ（ＸｂａＩ＿ＢａｍＨＩ）：５'−ｇｇａｔｃｃｇｃｇｔｃｔａｇａｔｇｔｔｔａａａｔｔｃｔｔｔａａｔｔｇ−３'（配列番号：４）。
【００５２】
ターミネーターＰＣＲ［９４℃３０秒、３０サイクル（９４℃３０秒、５５℃１分、７２℃１分）、７２℃７分］：
ＴＧＡＰ−Ｆ（ＸｂａＩ＿Ｘｈｏ）：５'−ｔｃｔａｇａｔｔｇｃｔｃｇａｇｃｔａｔｃｃａａｃａａａｃｔｃｔａｇ−３'（配列番号：５）；及び
ＴＧＡＰ−Ｒ（ＢａｍＨＩ）：５'−ｇｇａｔｃｃｔｃｔｇｇｔｔｔａｇａａｇｔａｇｇｇａｃｔｇｔａｔｇ−３'（配列番号：６）。
【００５３】
＜実施例２＞ａｒａＡ、ａｒａＢ、ａｒａＤのコドン最適化
コドン使用頻度データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）のデータを根拠にして、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）のＬ−アラビノースイソメラーゼ（ａｒａＡ）、大腸菌のＬ−リブロキナーゼ（ａｒａＢ）、Ｌ−リブロース−５−ホスフェート  ４−エピメラーゼ（ａｒａＤ）のコドンをカンジダ・トロピカリスに好適なコドンに入れ替えて遺伝子配列番号：７で表わされる塩基配列で構成されたＣｏＡｒａＡ、配列番号：８で表わされる塩基配列からなるＣｏＡｒａＢ及び配列番号：９で表わされる塩基配列からなるＣｏＡｒａＤを合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ、ドイツ）。
【００５４】
＜実施例３＞ＣｏＡｒａＡ、ＣｏＡｒａＢ及びＣｏＡｒａＤの発現カセット及び発現菌株の構築
前記＜実施例２＞で合成した最適化された遺伝子をグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）のプロモーターと選択マーカーの除去のための反復配列（ｇｌｕまたはａｒｇ遺伝子）とを含むカセットにクローニングして、ＰＧｔｒｐｆｓ２−ＣｏＡｒａＡ、ＰＡＨｆｓ−ＣｏＡｒａＢ及びＰＡＨｆｓ２−ＣｏＡｒａＤをそれぞれ得た（図２）。
【００５５】
＜３−１＞キシロース脱水素酵素の発現が抑制された、形質転換されたカンジダ・トロピカリスの構築
カンジダ・トロピカリスのゲノムＤＮＡを鋳型にして、下記のプライマーを用いたＰＣＲ（９４℃１分、２５サイクル（９４℃３０秒、５８℃３０秒、７２℃３０秒）及び７２℃３分）を遂行して、カンジダ・トロピカリスのキシリトール脱水素酵素の遺伝子を増幅して、前記増幅されたカンジダ・トロピカリスのキシリトール脱水素酵素の遺伝子をｐＧＥＭ−Ｔ  ｅａｓｙベクター（ＢＩＯＮＥＸ、韓国）にクローニングした後、前記キシリトール脱水素酵素の遺伝子の中間にＢａｍＨＩ座位を導入して、前記導入されたＢａｍＨＩ座位にｕｒａ３遺伝子を導入して、４．７ｋｂの形質転換ベクターｐＸＹＬ２−Ｕｒａ３を得た。
【００５６】
プライマーＦ：５'−ａａｔｇｇｔｃｔｔｇｇｇｔｃａｃｇａａｔｃｃ−３'（配列番号：１０）
プライマーＲ：５'−ｇｃｔｃｔｇａｃｃａａｇｔｃｇｔａｇｇｃｔｔｃ−３'（配列番号：１１）
【００５７】
前記で得たベクターｐＸＹＬ２−Ｕｒａ３をカンジダ・トロピカリスに導入して、それをウラシル（ｕｒａｃｉｌ）が欠乏した固形選択培地（酵母窒素ベース（無アミノ酸）６．７ｇ／ｌ、ブドウ糖２０ｇ／ｌ、寒天粉１５ｇ／ｌ）に塗抹して３０℃で２日間静置培養した。その後、固形培地で形成されたコロニーを、キシロースが含まれた固形培地（酵母窒素ベース（無アミノ酸）６．７ｇ／ｌ、キシロース２０ｇ／ｌ、寒天粉１５ｇ／ｌ）とブドウ糖が含まれた固形培地（酵母窒素ベース（無アミノ酸）６．７ｇ／ｌ、ブドウ糖２０ｇ／ｌ、寒天粉１５ｇ／ｌ）にそれぞれ播種して３０℃で２日間静置培養して、キシロースが含まれた固形培地では育つことができずに、ブドウ糖が含まれた固形培地でのみ育つ菌株を選択して、キシリトール脱水素酵素が除去されたカンジダ・トロピカリスを得た。
【００５８】
＜３−２＞カンジダ・パラプシロシスのウラシル栄養要求体（Ｕｒａｃｉｌ  ａｕｘｏｔｒｏｐｈ）構築
ＵＲＡ３遺伝子を菌株構築のための選択マーカーとして使用するために、カンジダ・パラプシロシス菌株を突然変異を誘発するアルキル化剤であるＥＭＳ（メタンスルホン酸エチル）で処理してウラシル栄養要求体を構築した。
【００５９】
カンジダ・パラプシロシス菌株をＹＭ培地（ブドウ糖２０ｇ／ｌ、酵母抽出物３ｇ／ｌ、麦芽抽出物３ｇ／ｌ、ペプトン５ｇ／ｌ）４ｍｌに播種して、１２時間の間３０℃、１５０ｒｐｍで振とう培養した。続いて前記培養液をＹＭ培地５０ｍｌに播種して、３０℃、２００ｒｐｍで１２時間の間振とう培養した後、前記培養液３０ｍｌを５０ｍｌチューブ（ｔｕｂｅ）に移した後、３０ｍｌミニマル（Ｍｉｎｉｍａｌ）Ａバッファー（リン酸水素二カリウム（Ｋ２ＨＰＯ４）１０．５ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）４．５ｇ／ｌ、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）１．０ｇ／ｌ及びクエン酸ナトリウム０．５ｇ／ｌ）で細胞を二度洗浄して、細胞を再び１５ｍｌミニマル（Ｍｉｎｉｍａｌ）Ａバッファーで再懸濁させた後、ＥＭＳ４５０μｌを添加した。その後、３０℃、２００ｒｐｍで振とう培養させながら９０分間反応させた後、細胞を５ｍｌミニマルＡバッファーで二回洗浄してそれを１ｍｌミニマルＡバッファーで再懸濁して、５−ＦＯＡ固形培地（酵母窒素ベース６．７ｇ／ｌ、ブドウ糖２０ｇ／ｌ、５−ＦＯＡ０．８ｇ／ｌ、ウラシル０．１ｇ／ｌ、寒天粉１５ｇ／ｌ）に塗抹して、３０℃で２日間静置培養した。固形培地で形成されたコロニーは、ＵＲＡ３遺伝子が不活性化した菌株であり、このようにウラシル栄養要求性カンジダ・パラプシロシス菌株を得た。
【００６０】
＜３−３＞野生型カンジダ・トロピカリスからの、ＣｏＡｒａＡ、ＣｏＡｒａＢ及びＣｏＡｒａＤ遺伝子を発現する菌株の構築
前記カセットＰＧｔｒｐｆｓ２−ＣｏＡｒａＡを野生型カンジダ・トロピカリス菌株に導入して、それをウラシルが欠乏した固形選択培地（酵母窒素ベース６．７ｇ／ｌ、ブドウ糖２０ｇ／ｌ、寒天粉１５ｇ／ｌ）に塗抹して、３０℃で２日間静置培養した。固形培地で形成されたコロニーはカセットが導入された菌株であり、それをＹＭ培地（ブドウ糖２０ｇ／ｌ、酵母抽出物３ｇ／ｌ、麦芽抽出物３ｇ／ｌ、ペプトン５ｇ／ｌ）４ｍｌに播種して、１２時間の間３０℃、１５０ｒｐｍで振とう培養した。続いて前記培養液を５−ＦＯＡ固形培地（酵母窒素ベース６．７ｇ／ｌ、ブドウ糖２０ｇ／ｌ、５−ＦＯＡ０．８ｇ／ｌ、ウラシル０．１ｇ／ｌ、寒天粉１５ｇ／ｌ）に塗抹して、３０℃で２日間静置培養した。
【００６１】
固形培地で形成されたコロニーは、導入されたＵＲＡ３遺伝子が除去された菌株であり、同一な方法でＰＡＨｆｓ−ＣｏＡｒａＢ、ＰＡＨｆｓ２−ＣｏＡｒａＤを順に導入して、ＣｏＡｒａＡ、ＣｏＡｒａＢ及びＣｏＡｒａＤを発現する変異株カンジダ・トロピカリス  ＬＢＤＡＵを得た。
【００６２】
＜３−４＞キシリトール脱水素酵素が除去されたカンジダ・トロピカリスからの、ＣｏＡｒａＡ、ＣｏＡｒａＢ及びＣｏＡｒａＤ遺伝子を発現する菌株の構築
前記で得たカセットＰＧｔｒｐｆｓ２−ＣｏＡｒａＡをキシリトール脱水素酵素が不活性化されたカンジダ・トロピカリスＢＳＸＤＨ−３（受託番号：ＫＣＴＣ  １１１３７ＢＰ）に導入して、それをウラシルが欠乏した固形選択培地（酵母窒素ベース６．７ｇ／ｌ、ブドウ糖２０ｇ／ｌ及び寒天粉１５ｇ／ｌ）に塗抹して、３０℃で２日間静置培養した。固形培地で形成されたコロニーはカセットが導入された菌株であり、それをＹＭ培地（ブドウ糖２０ｇ／ｌ、酵母抽出物３ｇ／ｌ、麦芽抽出物３ｇ／ｌ及びペプトン５ｇ／ｌ）４ｍｌに播種した後、１２時間の間３０℃、１５０ｒｐｍで振とう培養した。続いて前記培養液を５−ＦＯＡ固形培地（酵母窒素ベース６．７ｇ／ｌ、ブドウ糖２０ｇ／ｌ、５−ＦＯＡ０．８ｇ／ｌ、ウラシル０．１ｇ／ｌ及び寒天粉１５ｇ／ｌ）に塗抹して、３０℃で２日間静置培養した。
【００６３】
固形培地で形成されたコロニーは、導入されたＵＲＡ３遺伝子が除去された菌株であり、前記のような方法でＰＡＨｆｓ−ＣｏＡｒａＢ及びＰＡＨｆｓ２−ＣｏＡｒａＤを順番に導入して、ＣｏＡｒａＡ、ＣｏＡｒａＢ及びＣｏＡｒａＤを発現する変異株カンジダ・トロピカリスＰＢＤＡＵを得た。
【００６４】
＜３−５＞カンジダ・パラプシロシスからの、ＣｏＡｒａＡ、ＣｏＡｒａＢ及びＣｏＡｒａＤ遺伝子を発現する菌株の構築
前記で得たカセットＰＧｔｒｐｆｓ２−ＣｏＡｒａＡをＵＲＡ３遺伝子が不活性化されたカンジダ・パラプシロシス菌株に導入して、それをウラシルが欠乏した固形選択培地（酵母窒素ベース６．７ｇ／ｌ、ブドウ糖２０ｇ／ｌ、寒天粉１５ｇ／ｌ）に塗抹して、３０℃で２日間静置培養した。固形培地で形成されたコロニーはカセットが導入された菌株であり、それをＹＭ培地（ブドウ糖２０ｇ／ｌ、酵母抽出物３ｇ／ｌ、麦芽抽出物３ｇ／ｌ、ペプトン５ｇ／ｌ）４ｍｌに播種して、１２時間の間３０℃、１５０ｒｐｍで振とう培養した。続いて前記培養液を５−ＦＯＡ固形培地（酵母窒素ベース６．７ｇ／ｌ、ブドウ糖２０ｇ／ｌ、５−ＦＯＡ０．８ｇ／ｌ、ウラシル０．１ｇ／ｌ、寒天粉１５ｇ／ｌ）に塗抹して、３０℃で２日間静置培養した。
【００６５】
固形培地で形成されたコロニーは、導入されたＵＲＡ３遺伝子が除去された菌株であり、同様な方法でＰＡＨｆｓ−ＣｏＡｒａＢ、ＰＡＨｆｓ２−ＣｏＡｒａＤを順番に導入して、ＣｏＡｒａＡ、ＣｏＡｒａＢ及びＣｏＡｒａＤを発現する変異株カンジダ・パラプシロシス  ＥＢＤＡＵを得た。
【００６６】
＜実施例４＞導入されたアラビノース代謝経路の作動有無の確認
前記＜実施例３＞で得たカンジダ・トロピカリスＰＢＤＡＵ、ＬＢＤＡＵ及びカンジダ・パラプシロシスＥＢＤＡＵのアラビノース代謝経路が正常に作動するかどうかを確認するために、構築された菌株をアラビノース最少培地で培養した。
【００６７】
＜４−１＞野生型カンジダ・トロピカリスＬＢＤＡＵのアラビノース代謝経路の作動有無の確認
ＬＢＤＡＵをＹＭ培地（ブドウ糖２０ｇ／ｌ、酵母抽出物３ｇ／ｌ、麦芽抽出物３ｇ／ｌ及びペプトン５ｇ／ｌ）４ｍｌに播種して、１２時間の間３０℃、１５０ｒｐｍで振とう培養した。続いて、前記培養液をアラビノース最少培地（アラビノース２０ｇ／ｌ、酵母窒素ベース６．７ｇ／ｌ、寒天粉１５ｇ／ｌ）５０ｍｌに播種して、６０時間の間３０℃、２００ｒｐｍで振とう培養した。
【００６８】
試料を分光光度計を用いて６００ｎｍで吸光度を測定して、あらかじめ分析した標準曲線で換算して算出した。また、経時的なアラビノース、アラビトール濃度を測定した。測定方法は下記のとおりである。まず、試料を遠心分離して上澄液を０．２μｍフィルターでろ過した後、ＨＰＬＣシステム［Ｓｕｇａｒ−Ｐａｋ  Ｉカラム、ＨＰＬＣポンプ、屈折率検出器（Ｗａｔｅｒｓ、米国）、移動相：水、０．５ｍｌ／分、温度：９０℃］で分析した。
【００６９】
（表１）アラビノース最少培地での細胞成長及びアラビノース消費量とアラビトール生成量分析
0005496356.tif 000002
【００７０】
その結果、表１にみられるようにように、対照群である野生型カンジダ・トロピカリスは、炭素源としてアラビノースのみ存在する最少培地では増殖することができないことを確認し、したがってアラビノースを消費することもできずアラビトールを生成することもできないことを確認した。一方、ＬＢＤＡＵは、６０時間の間に１．６ｇ／ｌ程度の乾燥菌体濃度に増殖し、４．３ｇ／ｌのアラビノースを消費した。アラビノースはアラビトールに転換されないですべて細胞代謝に用いられたことを確認することができた。
【００７１】
したがって、ＬＢＤＡＵに導入されたアラビノース代謝経路が十分に作動していることを確認することができた。
【００７２】
＜４−２＞変異株カンジダ・トロピカリスＰＢＤＡＵのアラビノース代謝経路の作動有無の確認
ＰＢＤＡＵをＹＭ培地（ブドウ糖２０ｇ／ｌ、酵母抽出物３ｇ／ｌ、麦芽抽出物３ｇ／ｌ及びペプトン５ｇ／ｌ）４ｍｌに播種した後、１２時間の間３０℃、１５０ｒｐｍで振とう培養した。続いて、前記培養液をアラビノース最少培地（アラビノース２０ｇ／ｌ、酵母窒素ベース６．７ｇ／ｌ及び寒天粉１５ｇ／ｌ）５０ｍｌに播種して、６０時間の間３０℃、２００ｒｐｍで振とう培養した。
【００７３】
試料を分光光度計を用いて６００ｎｍで吸光度を測定し、あらかじめ分析した標準曲線で換算して算出して、経時的な乾燥菌体濃度を測定した。また、経時的なアラビノース、アラビトール濃度を測定した。測定方法は次のとおりである。まず、試料を遠心分離して上澄液を０．２μｍフィルターでろ過した後、ＨＰＬＣシステム［Ｓｕｇａｒ−Ｐａｋ  Ｉカラム、ＨＰＬＣポンプ、屈折率検出器（Ｗａｔｅｒｓ、米国）、移動相（ｍｏｂｉｌｅ  ｐｈａｓｅ）：水、０．５ｍｌ／分、温度：９０℃］で分析した。経時的な細胞乾燥菌体濃度（Ｄｒｖ  ｃｅｌｌ  ｗｅｉｇｈｔ）及びアラビノース消費量とアラビトール生産量は次のとおりである。
【００７４】
（表２）アラビノース最少培地での細胞成長及びアラビノース消費量とアラビトール生産量分析
0005496356.tif 000003
【００７５】
その結果、表２にみられるようにように、対照群であるＢＳＸＤＨ−３は、炭素源にアラビノースのみ存在する最少培地では増殖することができず、アラビノースを消費することもできずアラビトールを生成させることもできないことを確認した。一方、ＰＢＤＡＵは、６０時間の間に２．１ｇ／ｌ程度の乾燥菌体濃度に増殖して、５．４ｇ／ｌのアラビノースを消費し、アラビノースはアラビトールに転換されないですべて細胞代謝に用いられたことを確認した。
【００７６】
したがって、ＰＢＤＡＵに導入されたアラビノース代謝経路が十分に作動していることを確認することができた。
【００７７】
＜４−３＞カンジダ・パラプシロシスＥＢＤＡＵのアラビノース代謝経路の作動有無の確認
ＥＢＤＡＵをＹＭ培地（ブドウ糖２０ｇ／ｌ、酵母抽出物３ｇ／ｌ、麦芽抽出物３ｇ／ｌ、ペプトン５ｇ／ｌ）４ｍｌに播種した後、１２時間の間３０℃、１５０ｒｐｍで振とう培養した。続いて、前記培養液をアラビノース最少培地（アラビノース２０ｇ／ｌ、酵母窒素ベース６．７ｇ／ｌ、寒天粉１５ｇ／ｌ）５０ｍｌに播種して、６０時間の間３０℃、２００ｒｐｍで振とう培養した。
【００７８】
試料を分光光度計を用いて６００ｎｍで吸光度を測定し、あらかじめ分析した標準曲線で換算して算出して経時的な乾燥菌体濃度を測定した。また、経時的なアラビノース、アラビトール濃度を測定した。測定方法は次のとおりである。まず、試料を遠心分離して上澄液を０．２フィルターでろ過した後、ＨＰＬＣシステム［Ｓｕｇａｒ−Ｐａｋ  Ｉカラム、ＨＰＬＣポンプ、屈折率検出器（Ｗａｔｅｒｓ、米国）、移動相：水、０．５ｍｌ／分、温度：９０℃］で分析した。経時的な細胞乾燥菌体濃度及びアラビノース消費量及びアラビトール生成量は、次のとおりである。
【００７９】
（表３）アラビノース最少培地での細胞成長及びアラビノース消費量とアラビトール生成量分析
0005496356.tif 000004
【００８０】
その結果、表３にみられるようにように、対照群である野生型カンジダ・パラプシロシスは、炭素源にアラビノースのみ存在する最少培地では増殖することができず、アラビノースを消費することもできずアラビトールを生成させることもできなかった。一方、ＥＢＤＡＵは、６０時間の間に１．４ｇ／ｌ程度の乾燥菌体濃度に増殖して、４．１ｇ／ｌのアラビノースを消費した。アラビノースは、アラビトールに転換されないですべて細胞代謝に用いられたことを確認することができた。
【００８１】
したがって、ＥＢＤＡＵに導入されたアラビノース代謝経路が十分に作動していることを確認することができた。
【００８２】
＜実施例５＞形質転換体を用いたキシリトールの生産
＜５−１＞形質転換体ＰＢＤＡＵと補助基質にブドウ糖を用いたキシリトールの生産
構築された形質転換体ＰＢＤＡＵをＹＭ培地（ブドウ糖２０ｇ／ｌ、酵母抽出物３ｇ／ｌ、麦芽抽出物３ｇ／ｌ、ペプトン５ｇ／ｌ）４ｍｌに播種して、１２時間の間３０℃、１５０ｒｐｍで振とう培養した。その後、前記培養液をキシロース及びアラビノースを含んだ生産培地（キシロース３０ｇ／ｌ、アラビノース３０ｇ／ｌ、ブドウ糖２０ｇ／ｌ、酵母抽出物１０ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）５ｇ／ｌ及び硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ）０．２ｇ／ｌ）５０ｍｌに播種した後、６０時間の間３０℃、２００ｒｐｍで振とう培養し、培養開始１４時間後、２０時間後、２６時間後及び３２時間後にそれぞれブドウ糖２．５ｇ／ｌずつ添加した。
【００８３】
経時的なキシロース、キシリトール、アラビノース、アラビトール濃度を測定した。測定方法は次のように遂行した。まず、試料を遠心分離して上澄液を０．２μｍフィルターでろ過した後、ＨＰＬＣシステム［Ｓｕｇａｒ−Ｐａｋ  Ｉカラム、ＨＰＬＣポンプ、屈折率検出器（Ｗａｔｅｒｓ、米国）、移動相：水、０．５ｍｌ／分、温度：９０℃］で分析した。経時的なキシロース、キシリトール、アラビノース及びアラビトールの濃度は、下記のとおりである。
【００８４】
（表４）培養時間によるキシリトール及びアラビトールの濃度変化
0005496356.tif 000005
【００８５】
その結果、キシリトール生産性は、ＢＳＸＤＨ−３  ０．５５ｇ／ｌ／ｈ、ＰＢＤＡＵ  ０．６３ｇ／ｌ／ｈであることが示され、ＰＢＤＡＵは対照群であるＢＳＸＤＨ−３に比べて１５％高いキシリトール生産性を示した。また、ＢＳＸＤＨ−３は、６０時間の間に１１．４ｇ／ｌのアラビトールを生成したのに比べて、ＰＢＤＡＵは副産物であるアラビトールを生成せずにキシリトールのみを生産することを確認することができた。
【００８６】
したがって、ＰＢＤＡＵを通じたキシリトール生産方法は、キシリトール生産時の精製及び結晶化過程を妨害するアラビトールを生産しないので、キシリトール生産収率を顕著に高めることができることを確認することができた。
【００８７】
＜５−２＞形質転換体ＰＢＤＡＵと補助基質にグリセロールを用いたキシリトールの生産
構築された形質転換体ＰＢＤＡＵをＹＭ培地（ブドウ糖２０ｇ／ｌ、酵母抽出物３ｇ／ｌ、麦芽抽出物３ｇ／ｌ、ペプトン５ｇ／ｌ）４ｍｌに播種して、１２時間の間３０℃、１５０ｒｐｍで振とう培養した。その後、前記培養液をキシロースとアラビノース及びグリセロールを含んだ生産培地（キシロース３０ｇ／ｌ、アラビノース３０ｇ／ｌ、グリセロール２０ｇ／ｌ、酵母抽出物１０ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）５ｇ／ｌ及び硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ）０．２ｇ／ｌ）５０ｍｌに播種して、３６時間の間３０℃、２００ｒｐｍで振とう培養した。
【００８８】
経時的なキシロース、キシリトール、アラビノース、アラビトール濃度を測定した。測定方法は次のように遂行した。まず、試料を遠心分離して上澄液を０．２μｍフィルターでろ過した後、ＨＰＬＣシステム［Ｓｕｇａｒ−Ｐａｋ  Ｉカラム、ＨＰＬＣポンプ、屈折率検出器（Ｗａｔｅｒｓ、米国）、移動相：水、０．５ｍｌ／分、温度：９０℃］で分析した。経時的なキシロース、キシリトール、アラビノース、アラビトールの濃度変化は、下記のとおりである。
【００８９】
（表５）培養時間によるキシリトール及びアラビトールの濃度変化
0005496356.tif 000006
【００９０】
その結果、キシリトール生産性は、ＢＳＸＤＨ−３が０．６５ｇ／ｌ／ｈ、ＰＢＤＡＵが０．７４ｇ／ｌ／ｈであることが示され、ＰＢＤＡＵは対照群であるＢＳＸＤＨ−３に比べて１４％高いキシリトール生産性を示した。また、ＢＳＸＤＨ−３は、４２時間の間に６．４ｇ／ｌのアラビトールを生成したのに比べて、ＰＢＤＡＵは副産物であるアラビトールを生成せずにキシリトールのみを生産することを確認することができた。
【００９１】
したがって、ＰＢＤＡＵを通じたシリトール生産方法は、キシリトール生産時の精製及び結晶化過程を妨害するアラビトールを生産しないので、キシリトール生産収率を顕著に高めることができることを確認することができた。
【００９２】
＜５−３＞形質転換体ＬＢＤＡＵと補助基質にブドウ糖を用いたキシリトールの生産
構築された形質転換体ＬＢＤＡＵをＹＭ培地（ブドウ糖２０ｇ／ｌ、酵母抽出物３ｇ／ｌ、麦芽抽出物３ｇ／ｌ、ペプトン５ｇ／ｌ）４ｍｌに播種して、１２時間の間３０℃、１５０ｒｐｍで振とう培養した。その後、前記培養液をキシロースとアラビノース及びブドウ糖を含んだ生産培地（キシロース３０ｇ／ｌ、アラビノース３０ｇ／ｌ、ブドウ糖２０ｇ／ｌ、酵母抽出物１０ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）５ｇ／ｌ及び硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ）０．２ｇ／ｌ）５０ｍｌに播種して、６０時間の間３０℃、２００ｒｐｍで振とう培養し、１４時間後、２０時間後、２６時間後及び３２時間後にブドウ糖２．５ｇ／ｌずつ添加した。
【００９３】
経時的なキシロース、キシリトール、アラビノース、アラビトール濃度を測定した。測定方法は次のとおりである。まず、試料を遠心分離して上澄液を０．２μｍフィルターでろ過した後、ＨＰＬＣシステム［Ｓｕｇａｒ−Ｐａｋ  Ｉカラム、ＨＰＬＣポンプ、屈折率検出器（Ｗａｔｅｒｓ、米国）、移動相：水、０．５ｍｌ／分、温度：９０℃］で分析した。経時的なキシロース、キシリトール、アラビノース、アラビトールの濃度変化は、下記のとおりである。
【００９４】
（表６）培養時間によるキシリトール及びアラビトールの濃度変化
0005496356.tif 000007
【００９５】
その結果、キシリトール生産性は、野生型菌株が０．５１ｇ／ｌ／ｈ、ＬＢＤＡＵが０．５９ｇ／ｌ／ｈであることが示され、ＬＢＤＡＵは対照群である野生型菌株に比べて１５％高いキシリトール生産性を示した。また、野生型菌株は、６０時間の間に１０．３ｇ／ｌのアラビトールを生成したのに比べて、ＬＢＤＡＵは副産物であるアラビトールを生成せずにキシリトールのみを生産することを確認することができた。
【００９６】
＜５−４＞形質転換体ＬＢＤＡＵと補助基質にグリセロールを用いたキシリトールの生産
構築された形質転換体ＬＢＤＡＵをＹＭ培地（ブドウ糖２０ｇ／ｌ、酵母抽出物３ｇ／ｌ、麦芽抽出物３ｇ／ｌ、ペプトン５ｇ／ｌ）４ｍｌに播種して、１２時間の間３０℃、１５０ｒｐｍで振とう培養した。その後、前記培養液をキシロースとアラビノース及びグリセロールを含んだ生産培地（キシロース３０ｇ／ｌ、アラビノース３０ｇ／ｌ、グリセロール２０ｇ／ｌ、酵母抽出物１０ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）５ｇ／ｌ及び硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ）０．２ｇ／ｌ）５０ｍｌに播種して、３６時間の間３０℃、２００ｒｐｍで振とう培養した。
【００９７】
経時的なキシロース、キシリトール、アラビノース、アラビトール濃度を測定した。測定方法は下記のとおりである。まず、試料を遠心分離して上澄液を０．２μｍフィルターでろ過した後、ＨＰＬＣシステム［Ｓｕｇａｒ−Ｐａｋ  Ｉカラム、ＨＰＬＣポンプ、屈折率検出器（Ｗａｔｅｒｓ、米国）、移動相：水、０．５ｍｌ／分、温度：９０℃］で分析した。経時的なキシロース、キシリトール、アラビノース、アラビトールの濃度変化は、下記のとおりである。
【００９８】
（表７）培養時間によるキシリトール及びアラビトールの濃度変化
0005496356.tif 000008
【００９９】
その結果、キシリトール生産性は、野生型菌株が０．５８ｇ／ｌ／ｈ、ＬＢＤＡＵが０．６３ｇ／ｌ／ｈであることが示され、ＬＢＤＡＵは対照群である野生型菌株に比べて１０％高いキシリトール生産性を示した。また、野生型菌株は、４２時間の間に６．７ｇ／ｌのアラビトールを生成したのに比べて、ＬＢＤＡＵは副産物であるアラビトールを生成せずにキシリトールのみを生産することを確認することができた。
【０１００】
＜５−５＞形質転換体ＥＢＤＡＵと補助基質にブドウ糖を用いたキシリトールの生産
構築された形質転換体ＥＢＤＡＵをＹＭ培地（ブドウ糖２０ｇ／ｌ、酵母抽出物３ｇ／ｌ、麦芽抽出物３ｇ／ｌ、ペプトン５ｇ／ｌ）４ｍｌに播種して、１２時間の間３０℃、１５０ｒｐｍで振とう培養した。その後、前記培養液をキシロースとアラビノース及びブドウ糖を含んだ生産培地（キシロース３０ｇ／ｌ、アラビノース３０ｇ／ｌ、ブドウ糖２０ｇ／ｌ、酵母抽出物１０ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）５ｇ／ｌ及び硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ）０．２ｇ／ｌ）５０ｍｌに播種して、６０時間の間３０℃、２００ｒｐｍで振とう培養し、１４時間後、２０時間後、２６時間後、３２時間後にブドウ糖２．５ｇ／ｌずつ添加した。
【０１０１】
経時的なキシロース、キシリトール、アラビノース、アラビトール濃度を測定した。測定方法は下記のとおりである。まず、試料を遠心分離して上澄液を０．２フィルターでろ過した後、ＨＰＬＣシステム［Ｓｕｇａｒ−Ｐａｋ  Ｉカラム、ＨＰＬＣポンプ、屈折率検出器（Ｗａｔｅｒｓ、米国）、移動相：水、０．５ｍｌ／分、温度：９０℃］で分析した。経時的なキシロース、キシリトール、アラビノース、アラビトールの濃度変化は、下記のとおりである。
【０１０２】
（表８）培養時間によるキシリトール及びアラビトールの濃度変化
0005496356.tif 000009
【０１０３】
その結果、キシリトール生産性は、野生型菌株が０．４４ｇ／ｌ／ｈ、ＥＢＤＡＵが０．４９ｇ／ｌ／ｈであることが示され、ＥＢＤＡＵは対照群である野生型菌株に比べて１２％高いキシリトール生産性を示した。また、野生型菌株は、６０時間の間に９．８ｇ／ｌのアラビトールを生成したのに比べて、ＥＢＤＡＵは副産物であるアラビトールを生成せずにキシリトールのみを生産することを確認することができた。
【０１０４】
したがって、ＥＢＤＡＵを通じたキシリトール生産方法は、キシリトール生産時の精製及び結晶化過程を妨害するアラビトールを生産しないので、キシリトール生産収率を顕著に高めることができることを確認することができた。
【０１０５】
＜５−６＞形質転換体ＥＢＤＡＵと補助基質にグリセロールを用いたキシリトールの生産
構築された形質転換体ＥＢＤＡＵをＹＭ培地（ブドウ糖２０ｇ／ｌ、酵母抽出物３ｇ／ｌ、麦芽抽出物３ｇ／ｌ、ペプトン５ｇ／ｌ）４ｍｌに播種して、１２時間の間３０℃、１５０ｒｐｍで振とう培養した。その後、前記培養液をキシロースとアラビノース及びグリセロールを含んだ生産培地（キシロース３０ｇ／ｌ、アラビノース３０ｇ／ｌ、グリセロール２０ｇ／ｌ、酵母抽出物１０ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）５ｇ／ｌ及び硫酸マグネシウム（ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ）０．２ｇ／ｌ）５０ｍｌに播種して、３６時間の間３０℃、２００ｒｐｍで振とう培養した。
【０１０６】
経時的なキシロース、キシリトール、アラビノース、アラビトール濃度を測定した。測定方法は下記のとおりである。試料を遠心分離して上澄液を０．２μｍフィルターでろ過した後、ＨＰＬＣシステム［Ｓｕｇａｒ−Ｐａｋ  Ｉカラム、ＨＰＬＣポンプ、屈折率検出器（Ｗａｔｅｒｓ、米国）、移動相：水、０．５ｍｌ／分、温度：９０℃］で分析した。経時的なキシロース、キシリトール、アラビノース、アラビトールの濃度変化は、下記のとおりである。
【０１０７】
（表９）培養時間によるキシリトール及びアラビトールの濃度変化
0005496356.tif 000010
【０１０８】
その結果、キシリトール生産性は、野生型菌株が０．４９ｇ／ｌ／ｈ、ＥＢＤＡＵが０．５６ｇ／ｌ／ｈであることが示され、ＥＢＤＡＵは対照群である野生型菌株に比べて１３％高いキシリトール生産性を示した。また、野生型菌株は、４２時間の間に５．２ｇ／ｌのアラビトールを生成したのに比べて、ＥＢＤＡＵは副産物であるアラビトールを生成せずにキシリトールのみを生産することを確認することができた。
【０１０９】
したがって、ＥＢＤＡＵを通じたキシリトール生産方法は、キシリトール生産時の精製及び結晶化過程を妨害するアラビトールを生産しないので、キシリトール生産収率を顕著に高めることができることを確認することができた。
【０１１０】
＜実施例６＞形質転換体ＰＢＤＡＵとバイオマス加水分解物を用いたキシリトールの大量生産
形質転換体を用いてキシリトールを大量生産するために、糖成分がキシロース８２．９％、アラビノース１１．４％、ブドウ糖５．７％であるトウモロコシ穂軸の加水分解物を基質として用い、グリセロールを補助基質として用いた。これはトウモロコシ穂軸、サトウキビ、ココナッツ副産物、カバノキなどのバイオマスには、キシロース、アラビノース、ブドウ糖などからなるヘミセルロースが豊かであり、特にキシロースの含有量が高いので、それを加水分解した物質をキシリトール生産に直接用いることができるからである。
【０１１１】
構築された形質転換体ＰＢＤＡＵをＹＭ培地（ブドウ糖２０ｇ／ｌ、酵母抽出物３ｇ／ｌ、麦芽抽出物３ｇ／ｌ、ペプトン５ｇ／ｌ）５０ｍｌに播種して、１２時間の間３０℃、２００ｒｐｍで振とう培養した。その後、前記培養液をバイオマス加水分解物を用いたキシリトール生産培地（キシロース５０ｇ／ｌ、ブドウ糖３．５ｇ／ｌ、アラビノース６．９ｇ／ｌ、グリセロール１５ｇ／ｌ、酵母抽出物１０ｇ／ｌ、リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）５ｇ／ｌ及び硫酸マグネシウムＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ）０．２ｇ／ｌ）１ｌが入った発酵槽に播種して、３０℃、ｐＨ４．０、５００〜８００ｒｐｍで撹拌させながら培養した。培養開始の１２時間後から栄養溶液（ｆｅｅｄｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（キシロース５０３ｇ／ｌ、ブドウ糖３４．７ｇ／ｌ、アラビノース６９．２ｇ／ｌ、グリセロール１５０ｇ／ｌ）を添加して培地内のキシロース濃度が１００ｇ／ｌ以下になるように調節して７２時間の間流加式培養を遂行した。
【０１１２】
経時的な乾燥菌体濃度は、分光光度計を用いて６００ｎｍで吸光度を測定し、あらかじめ分析した標準曲線で換算して算出した。また、キシロース、キシリトール、アラビノース、アラビトール濃度を測定した。測定方法は下記のとおりである。まず、試料を遠心分離して上澄液を０．２μｍフィルターでろ過した後、ＨＰＬＣシステム［Ｓｕｇａｒ−Ｐａｋ  Ｉカラム、ＨＰＬＣポンプ、屈折率検出器（Ｗａｔｅｒｓ、米国）、移動相：水、０．５ｍｌ／分、温度：９０℃］で分析した。経時的な乾燥菌体濃度、キシロース、キシリトール、アラビノース、アラビトールの濃度は、下記のとおりである。
【０１１３】
（表１０）培養時間によるキシリトール及びアラビトールの濃度変化
0005496356.tif 000011
【０１１４】
その結果、キシリトール生産性は、ＢＳＸＤＨ−３が２．１６ｇ／ｌ／ｈ、ＰＢＤＡＵが２．２８ｇ／ｌ／ｈであることが示され、ＰＢＤＡＵは対照群であるＢＳＸＤＨ−３に比べて５．６％高いキシリトール生産性を示した。また、ＢＳＸＤＨ−３は、７２時間の間に６．４ｇ／ｌのアラビトールを生成したのに比べて、ＰＢＤＡＵは副産物であるアラビトールを生成せずにキシリトールのみを生産することを確認することができた。
【０１１５】
したがって、本発明のＰＢＤＡＵ菌株は、実際にバイオマス加水分解物を用いた大量生産において副産物であるアラビトールは生成せずに、高濃度、高生産性でキシリトールを生産することができることを確認することができた。
【０１１６】
0005496356.tif 000012
【図１】
0005496356.tif 000013
【図２】
0005496356.tif 000014
【配列表】
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