(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｍａｎ５ＧｌｃＮａｃ２構造を含んでなる均質なグリカンを有する糖タンパク質を産生することができる遺伝的に修飾された酵母であって、
前記酵母が下記の修飾：
ａ）抗生物質耐性遺伝子をコードする異種配列の相同組換えによる挿入による、α１，６−マンノシルトランスフェラーゼをコードするＯｃｈ１遺伝子の不活性化（Δ−Ｏｃｈ１株）、
ｂ）ｐＧＡＰ、ｐＧＡＬ１、ＰＧＫ、ＴＥＦ、ａｄｈ１、ｎｍｔ  １、ＳＶ４０、ＰＭＡ１、ＣａＭＶ、Ｓ．セレビシエまたはＳ．ポンベのｐｅｔ５６、およびＡＤＨ２（それぞれ配列番号１６〜２６の配列を有する）から選択されるプロモーターと、小胞体またはゴルジ体におけるターゲティング配列を含んでなるα−１−２−マンノシダーゼＩをコードする配列を含んでなるオープンリーディングフレームと、転写ターミネーターとを含んでなる発現カセットの、相同組換えによる栄養要求性マーカーへの組込み、
ｃ）ｐＧＡＰ、ｐＧＡＬ１、ＰＧＫ、ＴＥＦ、ａｄｈ１、ｎｍｔ  １、ＳＶ４０、ＰＭＡ１、ＣａＭＶ、Ｓ．セレビシエまたはＳ．ポンベのｐｅｔ５６、およびＡＤＨ２（それぞれ配列番号１６〜２６の配列を有する）から選択されるプロモーター（該ｃ）のプロモーターはｂ）のプロモーターとは異なる）と、生産される外因性糖タンパク質をコードする配列を含んでなるオープンリーディングフレームと、転写ターミネーターとを含んでなる発現カセットの、相同組換えによる栄養要求性マーカーへの組込み
を含んでなり、
前記酵母が、Ｓ．セレビシエまたはＳ．ポンベである、酵母。
【請求項２】
α−１−２マンノシダーゼＩが、Ｃ．エレガンスのα−１−２マンノシダーゼＩであり、該α−１−２マンノシダーゼＩが、配列番号１の配列を含んでなる、請求項１に記載の酵母。
【請求項３】
７５％を超えるグリカンがＧｌｃＮａｃＭａｎ５ＧｌｃＮａｃ２構造を有する糖タンパク質を産生することができ、さらに、ｐＧＡＰ、ｐＧＡＬ１、ＰＧＫ、ＴＥＦ、ａｄｈ１、ｎｍｔ  １、ＳＶ４０、ＰＭＡ１、ＣａＭＶ、Ｓ．セレビシエまたはＳ．ポンベのｐｅｔ５６、およびＡＤＨ２（それぞれ配列番号１６〜２６を有する）から選択されるプロモーターと、小胞体もしくはゴルジ体におけるターゲティング配列を含んでなるヒトＮ−アセチル−グルコサミニルトランスフェラーゼＩをコードする配列を含んでなるオープンリーディングフレームと、または転写ターミネーターを含んでなる発現カセットの、相同組換えによる栄養要求性マーカーへの組込みを含んでなる、請求項１または２に記載の酵母。
【請求項４】
ヒトＮ−アセチル−グルコサミニルトランスフェラーゼＩが、該酵素の細胞質部分を欠き、該タンパク質のゴルジ局在のためにｍｍｎ９（配列番号１３）の細胞質部分に置換されている配列番号２の配列を含んでなる、請求項３に記載の酵母。
【請求項５】
プロモーターｐＧＡＰ、ｐＧＡＬ１、ＰＧＫ、ＴＥＦ、ａｄｈ１、ｎｍｔ  １、ＳＶ４０、ＰＭＡ１、ＣａＭＶ、Ｓ．セレビシエまたはＳ．ポンベのｐｅｔ５６、およびＡＤＨ２（それぞれ配列番号１６〜２６の配列を有する）と、ヒトＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体をコードする配列を含んでなるオープンリーディングフレームと、転写ターミネーターとを含んでなる発現カセットの、相同組換えによる栄養要求性マーカーへの組込みをさらに含んでなる、請求項４に記載の酵母。
【請求項６】
ヒトＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体が配列番号３の配列を含んでなる、請求項５に記載の酵母。
【請求項７】
７５％を超えるグリカンがＧｌｃＮａｃＭａｎ３ＧｌｃＮａｃ２構造を有する糖タンパク質を産生することができ、さらに、ｐＧＡＰ、ｐＧＡＬ１、ＰＧＫ、ＴＥＦ、ａｄｈ１、ｎｍｔ  １、ＳＶ４０、ＰＭＡ１、ＣａＭＶ、Ｓ．セレビシエまたはＳ．ポンベのｐｅｔ５６、およびＡＤＨ２（それぞれ配列番号１６〜２６を有する）から選択されるプロモーターと、小胞体またはゴルジ体におけるターゲティング配列を含んでなるマンノシダーゼＩＩをコードする配列を含んでなるオープンリーディングフレームと、転写ターミネーターとを含んでなる発現カセットの、相同組換えによる栄養要求性マーカーへの組込みを含んでなる、請求項４〜６のいずれか一項に記載の酵母。
【請求項８】
マンノシダーゼＩＩがネズミマンノシダーゼＩＩであり、配列番号４の配列を含んでなる、請求項７に記載の酵母。
【請求項９】
７５％を超えるグリカンがＧｌｃＮａｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮａｃ２構造を有する糖タンパク質を産生することができ、さらに、ｐＧＡＰ、ｐＧＡＬ１、ＰＧＫ、ＴＥＦ、ａｄｈ１、ｎｍｔ
１、ＳＶ４０、ＰＭＡ１、ＣａＭＶ、Ｓ．セレビシエまたはＳ．ポンベのｐｅｔ５６、およびＡＤＨ２（それぞれ配列番号１６〜２６を有する）から選択されるプロモーターと、小胞体またはゴルジ体におけるターゲティング配列を含んでなるＮ−アセチル−グルコサミニルトランスフェラーゼＩＩをコードする配列を含んでなるオープンリーディングフレームと、転写ターミネーターとを含んでなる発現カセットの、相同組換えによる栄養要求性マーカーへの組込みを含んでなる、請求項７または８に記載の酵母。
【請求項１０】
Ｎ−アセチル−グルコサミニルトランスフェラーゼＩＩがヒトのものであり、配列番号５の配列を含んでなる、請求項９に記載の酵母。
【請求項１１】
７５％を超えるグリカンがＧａｌ２ＧｌｃＮａｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮａｃ２構造を有する糖タンパク質を産生することができ、さらに、ｐＧＡＰ、ｐＧＡＬ１、ＰＧＫ、ＴＥＦ、ａｄｈ１、ｎｍｔ  １、ＳＶ４０、ＰＭＡ１、ＣａＭＶ、Ｓ．セレビシエまたはＳ．ポンベのｐｅｔ５６、およびＡＤＨ２（それぞれ配列番号１６〜２６を有する）から選択されるプロモーターと、小胞体またはゴルジ体におけるターゲティング配列を含んでなるガラクトシルトランスフェラーゼＩをコードする配列を含むオープンリーディングフレームと、転写ターミネーターとを含んでなる発現カセットの、相同組換えによる栄養要求性マーカーへの組込みを含む、請求項９または１０に記載の酵母。
【請求項１２】
ガラクトシルトランスフェラーゼＩがヒトのものであり、ヒトターゲティング配列を欠いた配列番号６の配列を含んでなる、請求項１１に記載の酵母。
【請求項１３】
組込みマーカーが、ＵＲＡ３、ＡＤＥ２、ＬＹＳ２、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＣＡＮ１、ＡＤＯ１、ＨＩＳ５、ＨＩＳ３、ＡＲＧ３、ＭＥＴ１７、ＬＥＭ３、Ｍｎｎ１、Ｍｎｎ９、ｇｍａ１２から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の酵母。
【請求項１４】
α−１−２マンノシダーゼＩの発現カセットがＵＲＡ３遺伝子に組み込まれ、Ｎ−アセチル−グルコサミニルトランスフェラーゼＩの発現カセットがＡＤＥ１またはＡＤＥ２遺伝子に組み込まれ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体の発現カセットがＬＹＳ２遺伝子に組み込まれ、α−マンノシダーゼＩＩの発現カセットがＬＥＵ２遺伝子に組み込まれ、Ｎ−アセチル−グルコサミニルトランスフェラーゼＩＩの発現カセットがＣＹＨ１またはＴＲＰ１遺伝子に組み込まれる、請求項１３に記載の酵母。
【請求項１５】
小胞体またはゴルジ体におけるターゲティング配列が遺伝子Ｍｎｔ１の局在配列に由来し、配列番号１４の配列を含んでなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の酵母。
【請求項１６】
ターミネーターがＣＹＣ１遺伝子に由来し、配列番号１５の配列を含んでなる、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の酵母。
【請求項１７】
７５％を超えるグリカンが
【化１】
0005562647.tif 000042
から選択される構造を有する糖タンパク質を産生することができ、さらに、ｐＧＡＰ、ｐＧＡＬ１、ＰＧＫ、ＴＥＦ、ａｄｈ１、ｎｍｔ  １、ＳＶ４０、ＰＭＡ１、ＣａＭＶ、Ｓ．セレビシエもしくはＳ．ポンベのｐｅｔ５６、およびＡＤＨ２（それぞれ配列番号１６〜２６を有する）から選択されるプロモーターまたはＭｎｔ１遺伝子のプロモーターと、小胞体またはゴルジ体におけるターゲティング配列を含んでなる、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼＦＵＴ８をコードする配列を含んでなるオープンリーディングフレームと、配列番号１５の配列を含んでなる遺伝子ＣＹＣ１に由来する転写ターミネーターとを含んでなる発現カセットの、相同組換えによる栄養要求性マーカーへの組込みを含んでなる、請求項３〜１０のいずれか一項に記載の酵母。
【請求項１８】
α−１，６−フコシルトランスフェラーゼＦＵＴ８がヒトのものであり、配列番号７の配列を含んでなる、請求項１７に記載の酵母。
【請求項１９】
ｐＧＡＰ、ｐＧＡＬ１、ＰＧＫ、ＴＥＦ、ａｄｈ１、ｎｍｔ  １、ＳＶ４０、ＰＭＡ１、ＣａＭＶ、Ｓ．セレビシエもしくはＳ．ポンベのｐｅｔ５６、およびＡＤＨ２（それぞれ配列番号１６〜２６を有する）から選択されるプロモーター、またはプロモーターＳＶ４０と、配列番号８の配列を含んでなるＧＤＰ−フコース輸送体をコードする配列を含んでなるオープンリーディングフレームとを含んでなる発現カセットの、相同組換えによる栄養要求性マーカーへの組込みをさらに含んでなる、請求項１７または１８のいずれか一項に記載の酵母。
【請求項２０】
α−１−２マンノシダーゼＩがプロモーターｐＧＡＰの制御下で発現され、外因性タンパク質である糖タンパク質がプロモーターｐＧＡＬ１の制御下で発現される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の酵母。
【請求項２１】
７５％を超えるグリカンがＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮａｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮａｃ２（Ｆｕｃ）Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２から選択される構造を有する糖タンパク質を産生することができ、それがさらにｐＧＡＰ、ｐＧＡＬ１、ＰＧＫ、ＴＥＦ、ａｄｈ１、ｎｍｔ  １、ＳＶ４０、ＰＭＡ１、ＣａＭＶ、Ｓ．セレビシエもしくはＳ．ポンベのｐｅｔ５６、およびＡＤＨ２（それぞれ配列番号１６〜２６を有する）から選択されるプロモーター、または配列番号９の配列を含んでなるヘルペスウイルスのチミジンキナーゼのプロモーターと、α−２，３シアリルトランスフェラーゼをコードする配列を含んでなるオープンリーディングフレームと、配列番号１５の配列を含んでなるＣＹＣ１遺伝子に由来するターミネーターとを含んでなる発現カセットの、相同組換えによる栄養要求性マーカーへの組込みを含んでなる、請求項１１〜２０のいずれか一項に記載の酵母。
【請求項２２】
シアリルトランスフェラーゼがヒトＳＴ４ＧＡＬ４遺伝子であり、該遺伝子が、配列番号１０の配列を含んでなる、請求項２１に記載の酵母。
【請求項２３】
糖タンパク質が、サイトカイン、インターロイキン、成長ホルモン、増殖因子、酵素、およびにモノクローナル抗体、ワクチンタンパク質、可溶性受容体並びにあらゆる種類の組換えタンパク質などの、治療用糖タンパク質から選択される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の酵母。
【請求項２４】
糖タンパク質が、ＥＰＯであり、該ＥＰＯが、エピトープＶ５と精製のためのＮ末端ポリ−ＨＩＳ単位を含んでなる配列番号１２の配列を有する、請求項２３に記載の酵母。
【請求項２５】
酵母用培養培地の基本培養培地および請求項１〜２４のいずれか一項に記載の酵母を含んでなる発酵槽内の培養物。
【請求項２６】
７５％を超えるグリカンが
【化２】
0005562647.tif 000043
Gal2GlcNac3Man3GlcNAc2
NANA2Gal2GlcNac3Man3GlcNAc2
から選択される構造を有する均質なグリカン構造を有する糖タンパク質を生産するための方法であって、発酵槽での請求項１〜２４のいずれか一項に記載の酵母の培養および前記糖タンパク質の培養培地からの抽出を含んでなる、方法。
【請求項２７】
７５％を超えるグリカンが
【化３】
0005562647.tif 000044
Gal2GlcNac3Man3(Fuc)GlcNAc2
NANA2Gal2GlcNac3Man3(Fuc)GlcNAc2
から選択される構造を有する均質なグリカン構造を有する糖タンパク質を発酵槽で生産するための、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の酵母の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、最適かつ均質なグリカン構造を有する糖タンパク質を生産するための遺伝的に修飾された酵母に関する。これらの酵母は、Ｏｃｈ１遺伝子の不活性化；第一のプロモーターと、α−１−２マンノシダーゼＩをコードする配列を含んでなるオープンリーディングフレーム(phase ouverte de lecture)とを含んでなる発現カセットの、相同組換えによる栄養要求性マーカーへの組込み；ならびに第一のプロモーターとは異なる第二のプロモーターと、外因性糖タンパク質をコードする配列とを含んでなるカセットの組込みを含む。これらの酵母は、最適かつ９８％均質なグリコシル化を有するＥＰＯの生産を可能とする。
【０００２】
製薬業界において、複合体型、すなわち、ヒトにおいて翻訳後修飾の際に付加されるオリゴ糖と同一の構造のグリカンを有する糖タンパク質または糖ペプチドの生産が探求目標となったのは、ここ数年のことである。実際、多くの研究で、治療用糖タンパク質の活性を最適化するため、またはさらにひと度投与されれば、それらの半減期を改良するためのオリゴ糖の重要性が示されている。
【０００３】
例えば、ヒトエリスロポエチン（ＨｕＥＰＯ）は、Ａｓｎ−２４、Ａｓｎ−３８およびＡｓｎ−８３番に３つのＮ−グリコシル化部位、ならびにＳｅｒ−１２６番にムチン型のＯ−グリコシル化部位を含むアミノ酸１６６個の糖タンパク質である。ＥＰＯは、その分子量の４０％に相当するグリコシル化構造のために、Ｎ−グリコシル化の研究に特に関連するモデルである。天然型と考えられるＥＰＯ分子は尿型（ｕＨｕＥＰＯ）である(Takeuchi et al., 1988, Tusda 1988, Rahbeck-nielsen 1997)。組換え型ＥＰＯ（ｒＨｕＥＰＯ）は、現在、ＣＨＯ細胞(Sasaki H et al., Takeuchi et al., 1988)またはＢＨＫ細胞(Nimtz et al., 1993)で生産されている。細胞系統で発現されるｒＨｕＥＰＯは、ｕＨｕＥＰＯで見られる構造とは異なるＮ−グリカン構造を有する。これらの違いはin vitroでは間接的な影響を持ち得る(Higuchi et al, 1992; Takeuehi et al., 1990)が、in vivoにおいては、その脱グリコシル化型に対する活性の大幅な欠如により、また、この構造上に存在するシアル酸の数に相関した活性の増強により、より感受性が高いものと思われる(Higuchi M et al., 1992)。
【０００４】
最適なＮ−またはＯ−グリコシル化を有する糖タンパク質を生産するために、技術策が提案されている。種々のグリコシルトランスフェラーゼによりガラクトース、グルコース、フコースまたはさらにはシアル酸などの糖を付加すること、またはマンノースなどのある種の糖をマンノシダーゼで抑制することによるグリカン構造のin vitro修飾が挙げられる。この技術はＷＯ０３／０３１４６４(Neose)に記載されている。しかしながら、このような技術は、同じ糖タンパク質上に存在するいくつかの所与のオリゴ糖の一連の修飾のための多くの工程を含むので、どのようにすればこれを大規模に適用することができるのか疑うことができる。各工程で、反応の厳密な制御を行わなければならないし、均質なグリカン構造の生産も確保しなければならない。現在では、糖タンパク質上で多くのオリゴ糖を修飾しなければならない場合には、一連の反応が望ましくない、不均質な修飾をもたらす可能性がある。従って、この技術は生物薬剤の生産には適合しない。さらに、工業規模での生産に精製酵素を用いるのは、実行可能な経済的選択肢とは思えない。
【０００５】
文献ＷＯ２００６／１０６３４８およびＷＯ２００５／０００８６２に記載されているものなどの化学カップリング技術で同様の適用がある。これらの化学カップリング技術は、冗長な反応、保護／脱保護工程、複数の確認作業を含む。所与の糖タンパク質上で多くのオリゴ糖を修飾しなければならない場合には、一連の反応が望ましくない、不均質な修飾をもたらす可能性がある。
【０００６】
ＷＯ０１／７７１８１(LFB)に記載されているＹＢ２／０などの哺乳類細胞系統またはさらにＷＯ０３／０５５９９３(Kyowa)で遺伝的に修飾されているＣＨＯ系統を用いた他の技術では、抗体のＦｃ領域のわずかなフコシル化がＡＤＣＣ活性を１００倍向上させることが示されている。しかしながら、これらの技術は具体的には、抗体の生産に関するものである。
【０００７】
最後に、酵母または繊維状真菌における糖タンパク質の生産では、これらの微生物を、マンノシダーゼおよび種々のグリコシルトランスフェラーゼの発現を可能とするプラスミドで形質転換することによるものが提案されている。このアプローチはＷＯ０２／００８７９(Glycofi)に記載されている。しかしながら、これまでに、これらの微生物は、臨床バッチを生産するための高容量発光槽で時間が経っても安定であるということは証明されていない。また、この形質転換が望ましい、均質なグリカンを含む糖タンパク質の生産が可能であることは示されていない。
【０００８】
本発明者らは、in vivoで最適な活性が得られるＮ−グリカン構造を有するｒＨｕＥＰＯを生産する目的で、遺伝的に修飾されたＳ．セレビシエ(S. cerevisiae)およびＳ．ポンベ(S. pombe)酵母でｒＨｕＥＰＯを発現させた。これらの酵母は、均質かつよく特徴付けられたＮ−グリコシル化単位を有するｒＨｕＥＰＯの強い発現を示した。第二段階で、本発明者らは、遺伝的に修飾された酵母から出発し、それらのシアリル化レベルに応じて、より複雑なＮ−グリカン単位を生産するために他の修飾を組み込んだ。この酵母系は大量のタンパク質を迅速に生産する能力が知られているが、以下に記載されるこれらの修飾酵母はまた、「ヒト化され」かつ均質な形態で生産されたタンパク質のＮ−グリコシル化が可能である。さらに、これらの酵母は、大規模生産条件下でも安定であることが分かっている。最後に、遺伝子型復帰をもたらす突然変異の場合、これらの酵母を、等しく復帰させ得るように構築する（臨床バッチの生産という範囲内で必要とされる）。
【０００９】
よって、本発明の全体で用いられている特定の遺伝子座における標的化された組込み法、分断および選択されたゲノム領域を一ヌクレオチド内に制御することを可能とし、よって一時的ゲノム復帰の場合にはその分断の回復を可能とする方法を示す最初の例である。この方法は、酵母株を配列バンクで形質転換し、その後、ゲノム同定を行わずに最良のクローンを選択することからなるＷＯ０２／００８７９に記載のものとは対照的と言える。
【００１０】
実際、ＷＯ０２／００８７９では、組込みは無作為で、クローンはもっぱら生産されるタンパク質のＮ−グリカン構造の特性に基づいて選択され、突然変異の場合は、復帰または他のいずれかの遺伝子修飾、目的クローンの純然たる損失を含む。本発明の技術の利点は、遺伝子修飾の制御、追跡、および特に厳密に同じ能力を有するクローンの再構築の可能性を使用者に保証することにより、使用者に高い安全性を提供することである。
【００１１】
さらに、本発明者らは、後述するようなＡｍｅｌｉｅ株からの「グリカン−オン−デマンド」技術を初めて提供する。これらの条件下では、この構造の均質性は、哺乳類などのグリコシル化するＣＨＯ系の場合よりも重要である。実際、得られた結果（ＥＰＯスペクトルを参照）は、Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２型のグリカン構造がタンパク質上に存在するＮ−グリカンの約９８％に相当することを示す。よって、この系は、所望の単位を極めて大きな割合で得るためにグリコシル化を課すように設計される。
【００１２】
Ａｍｅｌｉｅ株は、得たいヒト化、ハイブリッドまたは複合型グリカンの生産を意図する他の任意の株を精緻化するための基礎として用いられるクローンである。この株の利点は、９８％のＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２糖タンパク質を生産する安定かつ均質な系であることが証明された出発点を形成することであり、所望の最終構造に従い、必要があればすぐＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ、フコシルトランスフェラーゼ、ガラクトシルおよび／またはシアリルトランスフェラーゼの導入などの付加的修飾向けに再加工することができる。
【００１３】
発明の概要
発現カセットの構築は、ＯＲＦの５’位にプロモーター配列を、そして３’位に終結配列を挿入することにより行われる。他方、これらのカセットの酵母ゲノムへの組込みは、それらの末端に、相同組換えによる組込みのために標的遺伝子座と相同な配列を付加することにより制御される。
【００１４】
各株および各ＯＲＦについて、糖タンパク質の均質なグリコシル化を可能とする種々の酵素の安定かつ最適な発現を得るためのプロモーター配列ならびに組込み配列が決定されている。発現カセットの構築は、図２に示されているこの一般モデル（ＯＲＦの発現カセットの構築のためのアセンブリＰＣＲ）に従い、数回のＰＣＲ工程で達成される。
【００１５】
ある特定のＯＲＦ配列は、その活性が最適化される（環境、ドナーの存在および基質の存在など）コンパートメントでタンパク質を発現させる（扱う）ために細胞下局在シグナルを組み込むことによって部分的に修飾されている。
【００１６】
よって、第１の態様において、本発明は、構造Ｍａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２を有する均質なグリカンを有する糖タンパク質を産生することができる遺伝的に修飾された酵母であって、前記酵母が下記の修飾：
ａ）抗生物質（カナマイシン）耐性遺伝子をコードする異種配列の相同組換えによる挿入によるα−１，６−マンノシルトランスフェラーゼをコードするＯｃｈ１遺伝子の不活性化（Δ−Ｏｃｈ１株）、
ｂ）ｐＧＡＰ、ｐＧＡＬ１、ＰＧＫ、ＴＥＦ、ａｄｈ１、ｎｍｔ  １、ＳＶ４０、ＰＭＡ１、ＣａＭＶ、Ｓ．セレビシエまたはＳ．ポンベのｐｅｔ５６、およびＡＤＨ２（それぞれ配列番号１６〜２６の配列を有する）から選択されるプロモーターと、小胞体またはゴルジ体におけるターゲティング配列を含んでなる、α−１−２−マンノシダーゼＩをコードする配列を含んでなるオープンリーディングフレームと、転写ターミネーターとを含んでなる発現カセットの、相同組換えによる栄養要求性マーカーへの組込み、
ｃ）ｐＧＡＰ、ｐＧＡＬ１、ＰＧＫ、ＴＥＦ、ａｄｈ１、ｎｍｔ  １、ＳＶ４０、ＰＭＡ１、ＣａＭＶ、Ｓ．セレビシエまたはＳ．ポンベのｐｅｔ５６、およびＡＤＨ２（それぞれ配列番号１６〜２６の配列を有する）から選択されるプロモーター（該ｃ）のプロモーターはｂ）のプロモーターとは異なる）と、生産される外因性糖タンパク質をコードする配列を含んでなるオープンリーディングフレームと、転写ターミネーターとを含んでなる発現カセットの、相同組換えによる栄養要求性マーカーへの組込み
を含んでなる酵母に関する。
【００１７】
好ましくは、上記の酵母には、Ｃ．エレガンス(C. Elegans)のα−１−２マンノシダーゼＩ、特に、配列番号１を含んでなる配列が組み込まれている。これらの酵母は９８％のＭａｎ５ＧｌｃＮａｃ２グリカン：
【化１】
0005562647.tif 000002
を有する糖タンパク質を産生することができることが分かっている。
【００１８】
有利には、α−１−２マンノシダーゼＩはプロモーターｐＧＡＰの制御下で発現され、外因性タンパク質である糖タンパク質はプロモーターｐＧＡＬ１の制御下で発現される。
【００１９】
下記では、Ｍａｎ＝マンノース、ＧｌｃＮａｃ＝Ｎ−アセチル−グルコサミン、Ｇａｌ＝ガラクトース、Ｆｕｃ＝フコース、およびシアル酸またはさらにはＮ−アセチル−ノイラミン酸を表すＮＡＮＡとして略号が用いられる。
【００２０】
第２の態様において、本発明の酵母は、７５％、または８０％またはさらには９５％または９８％を超えるＧｌｃＮａｃＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２構造：
【化２】
0005562647.tif 000003
を有する糖タンパク質を生産するための付加的修飾を含む。
【００２１】
この目的で、上記の株は、ｐＧＡＰ、ｐＧＡＬ１、ＰＧＫ、ＴＥＦ、ａｄｈ１、ｎｍｔ  １、ＳＶ４０、ＰＭＡ１、ＣａＭＶ、Ｓ．セレビシエまたはＳ．ポンベのｐｅｔ５６、およびＡＤＨ２（それぞれ配列番号１６〜２６の配列を有する）から選択されるプロモーターと、小胞体またはゴルジ体におけるターゲティング配列を含んでなる、ヒトＮ−アセチル−グルコサミニルトランスフェラーゼＩをコードする配列を含んでなるオープンリーディングフレームと、転写ターミネーターとを含んでなる発現カセットの、相同組換えによる栄養要求性マーカーへの組込みをさらに含む。好ましくは、ヒトＮ−アセチル−グルコサミニルトランスフェラーゼＩは、この酵素の細胞質部分を欠き、このタンパク質のゴルジ局在のためにＭｎｎ９の細胞質部分に置換されている配列番号２の配列を含む。この株は「Ａｒｉｅｌｌｅ」と呼ばれる。Ａｒｉｅｌｌｅは、この種のグリカンを合成するためのＧｌｃＮＡｃ  ＵＤＰ輸送体カセット（下記）もまた含むことができる。有利には、プロモーターｐＧＡＰが使用される。
Ｍｎｎ９
Atgtcactttctcttgtatcgtaccgcctaagaaagaacccgtgggttaac：細胞質部分（配列番号１３）
【００２２】
上記Ａｍｅｌｉｅ株は、プロモーターｐＧＡＰ、ｐＧＡＬ１、ＰＧＫ、ＴＥＦ、ａｄｈ１、ｎｍｔ  １、ＳＶ４０、ＰＭＡ１、ＣａＭＶ、Ｓ．セレビシエまたはＳ．ポンベのｐｅｔ５６、およびＡＤＨ２（それぞれ配列番号１６〜２６の配列を有する）と、ヒトＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体のカセットをコードする配列を含んでなるオープンリーディングフレームと、転写ターミネーターとを含んでなる発現カセットの、相同組換えによる栄養要求性マーカーへの組込みをさらに含むことができる。好ましくは、ヒトＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体は配列番号３の配列を含んでなる。好ましくは、このプロモーターはＰＧＫである。この株は「Ａｇａｔｈｅ」と呼ばれる。
【００２３】
第３の態様において、本発明の酵母は、７５％、または８０％またはさらには９５％または９８％を超えるＧｌｃＮａｃＭａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造：
【化３】
0005562647.tif 000004
を有する糖タンパク質を生産するための付加的修飾を含む。
【００２４】
上述のＡｒｉｅｌｌｅ酵母はそれ自体、ｐＧＡＰ、ｐＧＡＬ１、ＰＧＫ、ＴＥＦ、ａｄｈ１、ｎｍｔ  １、ＳＶ４０、ＰＭＡ１、ＣａＭＶ、Ｓ．セレビシエまたはＳ．ポンベのｐｅｔ５６、およびＡＤＨ２（それぞれ配列番号１６〜２６の配列を有する）から選択されるプロモーターと、小胞体またはゴルジ体におけるターゲティング配列を含んでなる、マンノシダーゼＩＩをコードする配列を含んでなるオープンリーディングフレームと、転写ターミネーターとを含んでなる発現カセットの、相同組換えによる栄養要求性マーカーへの組込みを含む。好ましくは、マンノシダーゼＩＩはマウスのものであり、特に、配列番号４を含んでなる配列である。好ましくは、プロモーターはＴＥＦである。この株は以下、「Ａｎａｉｓ」と呼ばれる。
【００２５】
第４の態様において、本発明の酵母は、７５％、または８０％またはさらには９５％または９８％を超えるＧｌｃＮａｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造：
【化４】
0005562647.tif 000005
を有する糖タンパク質を生産するための付加的修飾を含む。
【００２６】
この場合、上述のＡｎａｉｓ酵母は、ｐＧＡＰ、ｐＧＡＬ１、ＰＧＫ、ＴＥＦ、ａｄｈ１、ｎｍｔ  １、ＳＶ４０、ＰＭＡ１、ＣａＭＶ、Ｓ．セレビシエまたはＳ．ポンベのｐｅｔ５６、およびＡＤＨ２（それぞれ配列番号１６〜２６の配列を有する）から選択されるプロモーターと、小胞体またはゴルジ体におけるターゲティング配列を含んでなる、Ｎ−アセチル−グルコサミニルトランスフェラーゼＩＩをコードする配列を含んでなるオープンリーディングフレームと、転写ターミネーターとを含んでなる発現カセットの、相同組換えによる栄養要求性マーカーへの組込みを含んでなる。好ましくは、Ｎ−アセチル−グルコサミニルトランスフェラーゼＩＩはヒトのものであり、特に、配列番号５を含んでなる配列である。好ましくは、プロモーターはＰＭＡ１であり、この株は以下、「Ａｌｉｃｅ」と呼ばれる。
【００２７】
もう１つの実施形態では、本発明のＡｌｉｃｅ酵母は、７５％、または８０％またはさらには９５％または９８％を超えるＧａｌ２ＧｌｃＮａｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２構造：
【化５】
0005562647.tif 000006
を有する糖タンパク質を生産するための付加的修飾を含む。
【００２８】
この場合、上述のＡｌｉｃｅ酵母は、ｐＧＡＰ、ｐＧＡＬ１、ＰＧＫ、ＴＥＦ、ａｄｈ１、ｎｍｔ  １、ＳＶ４０、ＰＭＡ１、ＣａＭＶ、Ｓ．セレビシエまたはＳ．ポンベのｐｅｔ５６、およびＡＤＨ２（それぞれ配列番号１６〜２６の配列を有する）から選択されるプロモーター、好ましくは、プロモーターＣａＭＶと、小胞体またはゴルジ体におけるターゲティング配列を含んでなる、ガラクトシルトランスフェラーゼＩをコードする配列を含んでなるオープンリーディングフレームと、転写ターミネーターとを含んでなる発現カセットの、相同組換えによる栄養要求性マーカーへの組込みを含んでなる。好ましくは、ガラクトシルトランスフェラーゼＩはヒトのものであり、特に、ヒトターゲティング配列を欠いた配列番号６を含んでなる配列である。この株は「Athena」と呼ばれる。
【００２９】
有利には、上述の発現カセットの組込みは、ＵＲＡ３、ＡＤＥ２、ＬＹＳ２、ＬＥＵ２、ＴＲＰ１、ＣＡＮ１、ＡＤＯ１、ＨＩＳ５、ＨＩＳ３、ＡＲＧ３、ＭＥＴ１７、ＬＥＭ３、Ｍｎｎ１、Ｍｎｎ９、ｇｍａ１２から選択される組込みマーカー（栄養要求性マーカー）中で行われる。いっそうより有利には、α−１−２マンノシダーゼＩの発現カセットはＵＲＡ３遺伝子に組み込まれ、Ｎ−アセチル−グルコサミニルトランスフェラーゼＩの発現カセットはＡＤＥ１またはＡＤＥ２遺伝子に組み込まれ、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体の発現カセットはＬＹＳ２遺伝子に組み込まれ、α−マンノシダーゼＩＩの発現カセットはＬＥＵ２遺伝子に組み込まれ、Ｎ−アセチル−グルコサミニルトランスフェラーゼＩＩの発現カセットはＬＥＭ３またはＴＲＰ１遺伝子に組み込まれる。β−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼＩの発現カセットはＴＲＰ１またはＭＥＴ１７に組み込まれる。
【００３０】
さらに、これらの構築物においては、配列番号１４の配列を含んでなるＭｎｔ１遺伝子の局在配列および配列番号１５を含んでなるターミネーターＣＹＣ１に由来する、小胞体またはゴルジ体におけるターゲティング配列が好ましく用いられる。
【００３１】
もう１つの実施形態では、本発明の上記の酵母ＡｌｉｃｅおよびＡｔｈｅｎａは、７５％、または８０％またはさらには９５％または９８％を超える、
ＧｌｃＮａｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、
Ｇａｌ２ＧｌｃＮａｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２、および
ＧｌｃＮａｃ２Ｍａｎ３（Ｆｕｃ）ＧｌｃＮＡｃ２、Ａｓｈｌｅｙ株
Ｇａｌ２ＧｌｃＮａｃ２Ｍａｎ３（Ｆｕｃ）ＧｌｃＮＡｃ２、Ａｕｒｅｌ株
から選択される構造を有する糖タンパク質を生産するための付加的修飾を含む。
【００３２】
この場合、上述の酵母は、ｐＧＡＰ、ｐＧＡＬ１、ＰＧＫ、ＴＥＦ、ａｄｈ１、ｎｍｔ  １、ＳＶ４０、ＰＭＡ１、ＣａＭＶ、Ｓ．セレビシエまたはＳ．ポンベのｐｅｔ５６、およびＡＤＨ２（それぞれ配列番号１６〜２６の配列を有する）から選択されるプロモーターまたはｎｍｔ１遺伝子のプロモーターと、小胞体またはゴルジ体におけるターゲティング配列を含んでなる、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼＦＵＴ８をコードする配列を含んでなるオープンリーディングフレームと、転写ターミネーター、特に、ＣＹＣ１遺伝子に由来するターミネーターとを含んでなる発現カセットの、相同組換えによる栄養要求性マーカーへの組込みを含んでなる。これらの株は有利には、下記のＧＤＰ−フコース輸送体に相当するカセットを含む。このカセットはＣＡＮ１またはＨＩＳ５に組み込むことができる。
【００３３】
好ましくは、α−１，６−フコシルトランスフェラーゼＦＵＴ８はヒトのものであり、特に、配列番号７を含んでなる配列である。
【００３４】
さらに、この株は、プロモーターＳＶ４０と、ＧＤＰ−フコース輸送体をコードする配列、特に、配列番号８を含んでなる配列を含んでなるオープンリーディングフレームとを含んでなる発現カセットの、相同組換えによる栄養要求性マーカーへの組込みを含んでなることができる。このカセットはＴＲＰ１、ＡＲＧ３またはｇｍａ１２に組込むことができる。
【００３５】
もう１つの実施形態では、本発明の上記の酵母ＧｌｃＮａｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ａｔｈｅｎａ）およびＧａｌ２ＧｌｃＮａｃ２Ｍａｎ３（Ｆｕｃ）ＧｌｃＮＡｃ２（Ａｕｒｅｌ）は、７５％、または８０％またはさらには９５％または９８％を超える、
ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮａｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ａｅｒｏｎ株
ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮａｃ２Ｍａｎ３（Ｆｕｃ）ＧｌｃＮＡｃ２  Ａｖｒｅｌ株
【化６】
0005562647.tif 000007
から選択される構造を有する糖タンパク質を生産するための付加的修飾を含む。
【００３６】
この実施形態では、上述の酵母は、上述の中のプロモーターまたは配列番号９の配列を含んでなるヘルペスウイルスのチミジンキナーゼのプロモーターを含んでなる発現カセットの、相同組換えによる栄養要求性マーカーへの組込みを含んでなる。
【００３７】
オープンリーディングフレームはα−２，３−シアリルトランスフェラーゼをコードする配列（ＳＴ３ＧＡＬ４遺伝子）を含んでなる、転写ターミネーター、特に、ＣＹＣ１遺伝子に由来するターミネーターは配列番号１５の配列を含んでなる。好ましくは、シアリルトランスフェラーゼはヒトのものであり（ＮＭ＿００６２７８）、特に、配列番号１０の配列を含んでなる。
【００３８】
もう１つの実施形態では、本発明の上記の酵母Ｇａｌ２ＧｌｃＮａｃ２Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２（Ａｔｈｅｎａ）およびＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮａｃ２ＭＡＮ３ＧＬＣＮＡｃ２（Ａｅｒｏｎ）は、７５％、または８０％またはさらには９５％または９８％を超える、
Ｇａｌ２ＧｌｃＮａｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ａｚａｌｅｅ株
ＮＡＮＡ２Ｇａｌ２ＧｌｃＮａｃ３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ２  Ａ株
【化７】
0005562647.tif 000008
から選択される構造を有する糖タンパク質を生産するための付加的修飾を含む。
【００３９】
この実施形態では、上述の酵母は、上述のものからのプロモーターを含んでなる発現カセットの、相同組換えによる栄養要求性マーカーへの組込みを含んでなる。
【００４０】
オープンリーディングフレームはβ−１，４−ｎ−アセチル−グルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩをコードする配列を含んでなる、転写ターミネーター、特に、ＣＹＣ１遺伝子に由来するターミネーターは配列番号１５の配列を含んでなる。好ましくは、ＧＮＴＩＩＩはネズミのものであり、特に、配列番号２７の配列を含んでなる。
【００４１】
上記で示したように、本発明の酵母は、外因性糖タンパク質または糖ペプチドを発現させるためのカセットに組み込まれる。糖タンパク質は、サイトカイン、インターロイキン、成長ホルモン、増殖因子、酵素、およびモノクローナル抗体、ワクチンタンパク質、可溶性受容体およびあらゆる種類の組換えタンパク質などの、治療用糖タンパク質から選択することができる。これはＥＰＯ、特に、エピトープＶ５と精製のためのＮ末端ポリ−ＨＩＳ単位を含んでなる配列番号１２とともに、ＥＰＯをコードする配列番号１１を含むカセットであり得る。
【００４２】
本発明はまた、７５％、９０％、９５％またはさらには９８％を超える構造：
【化８】
0005562647.tif 000009
の均質なグリカン構造を有する糖タンパク質を含んでなる医薬組成物に関する。
【００４３】
本発明はまた、有効成分としてＥＰＯを含んでなる、該ＥＰＯが７５％、９０％、９５％またはさらには９８％を超える構造：
NANA2Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2、または 
NANA2Gal2GlcNac2Man3(Fuc)GlcNAc2
を有する、医薬組成物に関する。
【００４４】
本発明はまた、酵母用培養培地の基本培養培地を含んでなる発酵槽内の培養物および上記の酵母に関する。
【００４５】
さらに別の実施形態では、本発明は、７５％、９０％、９５％またはさらには９８％を超える構造：
【化９】
0005562647.tif 000010
を有する均質なグリカン構造を有する糖タンパク質を生産するための方法であって、発酵槽での上述の酵母の培養および該糖タンパク質の培養培地からの抽出を含んでなる方法に関する。この方法は精製工程を含むことができる。
【００４６】
最後に、本発明はまた、７５％、９０％、９５％またはさらには９８％を超える構造：
【化１０】
0005562647.tif 000011
を有する均質なグリカン構造を有する糖タンパク質を発酵槽で生産するための、上記の酵母の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【実施例】
【００４８】
実施例１：α−１，６−マンノシルトランスフェラーゼをコードするＯｃｈ１遺伝子に対する突然変異株（Δ−Ｏｃｈ１株）の作出
カナマイシン耐性遺伝子をＰＣＲにより増幅し、これらの両末端に、Ｓ．セレビシエまたはＳ．ポンベ酵母の各株に特異的な領域である遺伝子Ｏｃｈ１に対する相同フランキング領域を付加した（図１）。Ｏｃｈ１遺伝子は、この抗生物質カナマイシン耐性遺伝子の挿入により非機能的となる。この遺伝子の酵母ゲノムへの組み込みは、エレクトロポレーションおよび目的遺伝子を相同組換えにより組み込むことにより達成される。これらのフランキング領域は約４０塩基を有し、酵母ゲノムのＯｃｈ１遺伝子内にカナマイシン遺伝子の組込みを可能とする。
【００４９】
カナマイシン耐性遺伝子が組み込まれた株は、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有する培地上で選択する。本発明者らは、次に、Ｏｃｈ１遺伝子におけるカナマイシン耐性遺伝子の組込みをＰＣＲによって確認した。この培地中でカナマイシンの存在に対して耐性を有するクローンのゲノムＤＮＡを抽出した。一方でカナマイシン耐性遺伝子が存在すること、他方でこの遺伝子がＯｃｈ１遺伝子に実際に組み込まれていることを確認するためにオリゴヌクレオチドを選択した。野生株のゲノムＤＮＡも調べ、これらの株のＯｃｈ１遺伝子を増幅した。この遺伝子は１，１００ｂｐである。カナマイシンカセットが組み込まれている株では、見られたＯｃｈ１遺伝子の増幅は長かった（１，５００ｂｐ）。
【００５０】
実施例２：活性の試験
２．１  突然変異酵母株に対するＯｃｈ１マンノシルトランスフェラーゼ活性
別の検証レベル：酵母株のゲノムに組込まれている各遺伝子について、ほとんどの場合で自然突然変異による活性レベルにおけるあり得る変動を絶えず追跡するために酵素活性の体系的確認を行い、次に、新たなクローンの選択が必要になる。
Ｏｃｈ１酵素の活性は、in vitroアッセイによって検出することができる。これまでの研究で、Ｏｃｈ１酵素によるマンノース転移の最良のアクセプターはＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２であることが示されている。酵母のミクロソーム画分（１００μｇタンパク質）または全タンパク質の溶解液（２００μｇ）から、Ｍａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２構造上のα−１，６位におけるマンノースの転移活性を測定する。このため、アミノ−ピリジン基に結合されたＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２（Ｍ８ＧＮ２−ＡＰ）をアクセプターとして用い、［１４Ｃ］−マンノースで標識されたＧＤＰ−マンノースを放射性マンノースのドナー分子として用いる。ミクロソームまたはタンパク質を、ｐＨが制御された緩衝培地中、ドナー（放射性ＧＤＰ−マンノース）、アクセプター（Ｍａｎ８ＧｌｃＮ２−ＡＰ）およびデオキシマンノジリマイシン（マンノシダーゼＩの阻害剤）とともにインキュベートする。３０℃で３０分インキュベートした後、ＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ  ３：２：１（ｖ／ｖ／ｖ）となるようにクロロホルムおよびメタノールを反応媒体に加える。水相に相当する上相はＭａｎ８ＧｌｃＮＡｃ２−ＡＰ、放射性Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２−ＡＰおよびＧＤＰ−［１４Ｃ］−マンノースを含有する。乾燥したところで、これらのサンプルを１００μＬのＨ２Ｏ／１％酢酸に取り、生じた放射性Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２−ＡＰからＧＤＰ−マンノースを分離するために予め条件付けたＳｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ１８(Waters)カラムに通す（ＡＰ基はこの化合物をＣ１８カラム上に保持させる）。Ｈ２Ｏ／１％酢酸（２０ｍＬ）、次いで２０％メタノール／１％酢酸（４ｍＬ）で溶出することにより、種々の画分を回収し、シンチレーションカウンターで計数する。
【００５１】
２．２  マンノシダーゼ活性
マンノシダーゼ活性は、３７℃で４時間、４ｍＭのｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−マンノピラノシドを、０．１ＭのＰＢＳ、ｐＨ６．５＋／−１２０μＭ  ＤＭＪ（α−１，２−マンノシダーゼＩ阻害剤）＋／−１２μＭ  ＳＷ（マンノシダーゼＩＩの特異的阻害剤）中、１００〜２００μのタンパク質（全タンパク質または細胞下画分からのもの）とともにインキュベートすることにより測定する。４０５ｎｍで吸光度を測定する。
【００５２】
２．３  Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性
ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼ活性を酵母のミクロソーム画分で測定する。５０μｇのミクロソーム（ＢＣＡアッセイ）を最終５０μＬで、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ  ＭｎＣｌ２、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む媒体中、３０℃で２５分０．０１μＣｉのドナー（放射性ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）、その後、０．５ｍＭのアクセプター（３−Ｏ−α−Ｄ−マンノピラノシル−Ｄ−マンノピラノシド）とともにインキュベートする。この反応を４００μＬの１０ｍＭ  ＥＤＴＡで停止させた後、サンプルをＤｏｗｅｘ  ＡＧ−１Ｘ２カラムに通す。その後、放射性アクセプターを３Ｍギ酸を用いてカラムから溶出させ、放射能をシンチレーションカウンターで測定する。
【００５３】
実施例３：Ｃ．エレガンスのα−１−２マンノシダーゼＩの発現カセット
発現カセット構築の説明図：図２
３．１  工程１：ＯＲＦの取得
α−マンノシダーゼＩ：プラスミドｐＤＯＮＲ２０１(Open Biosystem)を有する細菌クローンからのＰＣＲ
プログラム：  ９４℃８分
３５サイクル：９４℃２０秒
６５℃３０秒
７２℃２分
７２℃１０分
１，６４４ｂｐ断片の増幅
【化１】
0005562647.tif 000012
0005562647.tif 000013
【００５４】
このＰＣＲ増幅物を抽出し、アガロースゲルからＳＢＩＯｇｅｎｅキットで精製し、ベクターＴＯＰＯ２．１に導入した。コンピテント細菌（ＴＯＰ１０、Invitrogen）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した（プラスミドｐＧＬＹ０２．００１）。
【００５５】
３．２  工程２：発現カセットのアセンブリング：
マンノシダーゼＩ発現カセットの組込みは、両株とも、栄養要求性マーカーＵＲＡ３内に局在される。この遺伝子の無効化は、有毒薬５−フルオロウラシルに対する耐性を誘発する。このカセットにより修飾された酵母はその後この薬剤に対して耐性となるだけでなく、ウラシル栄養要求性ともなる。
【００５６】
Ｓ．セレビシエ用発現カセット：
・野生型Ｓ．セレビシエのゲノムＤＮＡからのプロモーターｐＧＡＰの増幅
ＢＳ１６（フォワード）およびＢＳ１７’（リバース）
・プロモーターｐＧＡＰ（ＰＣＲ産物）およびＯＲＦ（ｐＧＬＹ０２．００１）のアセンブリング
ＢＳ１６（フォワード）およびＢＳ１９’（リバース）
・プラスミドｐＹＥＳ２．１からのターミネーターＣＹＣ１の増幅
ＢＳ４０ｂ（フォワード）およびＢＳ４１（リバース）
・ＯＲＦ（プラスミドｐＧＬＹ０２．００１）およびターミネーターＣＹＣ１（ＰＣＲ産物）のアセンブリング
ＢＳ１８（フォワード）およびＢＳ４１（リバース）
【００５７】
このＰＣＲ増幅物を抽出し、アガロースゲルからＱｉａｇｅｎキットで精製し、ベクターｐＴａｒｇｅｔに導入した。コンピテント細菌（ＪＭ１０９、Promega）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した（ｐＧＬＹ０２．００２）。
・プロモーター−ＯＲＦ（ＰＣＲ産物）およびＯＲＦ−ターミネーター（ｐＧＬＹ０２．００２）とＵＲＡ３と相同な領域（プライマーから）とのアセンブリング
ＢＳ４２（フォワード）
ＢＳ４３（リバース）
【００５８】
このＰＣＲ増幅物を抽出し、アガロースゲルからＱｉａｇｅｎキットで精製し、ベクターｐＴａｒｇｅｔに導入した。コンピテント細菌（ＪＭ１０９、Promega）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した（プラスミドｐＧＬＹ０２．００４）。
【００５９】
Ｓ．ポンベ用発現カセット：
・野生型Ｓ．ポンベのゲノムＤＮＡからのプロモーターａｄｈ１の増幅
ＢＳ２５およびＢＳ２６’（リバース）
・プロモーターａｄｈ１（ＰＣＲ産物）およびＯＲＦ（ｐＧＬＹ０２．００１）のアセンブリング
ＢＳ２５（フォワード）およびＢＳ２０（リバース）
【００６０】
このＰＣＲ増幅物を抽出し、アガロースゲルからＱｉａｇｅｎキットで精製し、ベクターＴＯＰＯ２．１に導入した。コンピテント細菌（ＴＯＰ１０、Invitrogen）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した（ｐＧＬＹ０２．００９）。
・産物プロモーター−ＯＲＦ（ｐＧＬＹ０２．００９）とＯＲＦ−ＣＹＣ１（ＰＣＲ産物）とのアセンブリング
ＢＳ２５（フォワード）およびＢＳ４１（リバース）
【００６１】
このＰＣＲ増幅物を抽出し、アガロースゲルからＱｉａｇｅｎキットで精製し、ベクターｐＴａｒｇｅｔに導入した。コンピテント細菌（ＪＭ１０９、Promega）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した（ｐＧＬＹ０２．０１１）。
・カセット（ｐＧＬＹ０２．０１１）とＵＲＡ３に相同なフランキング領域とのアセンブリング
ＢＳ７６（フォワード）およびＢＳ７７（リバース）
【００６２】
このＰＣＲ増幅物を抽出し、アガロースゲルからＱｉａｇｅｎキットで精製し、ベクターｐＴａｒｇｅｔに導入した。コンピテント細菌（ＪＭ１０９、Promega）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した。
【００６３】
３．３  工程３：酵母の形質転換
・コンピテント酵母の調製
Ｓ．セレビシエＡｄｅｌｅ：
手順：５００ｍｌの酵母をＯＤ＝０．１で植え込み、５．５＜ＯＤ＜６．５まで３０℃でインキュベートする。細胞を４℃にて１５００ｇで５分遠心分離し、５００ｍＬの冷無菌水に再懸濁させる。細胞を遠心分離し、２５０ｍＬの冷無菌水に再懸濁させる。細胞を遠心分離し、２０ｍＬの１Ｍソルビトールに再懸濁させる。細胞を遠心分離し、１ｍＬの１Ｍソルビトールに再懸濁させる。８０μＬアリコートとし、−８０℃で保存する。
【００６４】
Ｓ．ポンベＥｄｇａｒ：
手順：２００ｍＬの酵母をＯＤ＝０．１で植え込み、ＯＤ＝１．５まで３０℃でインキュベートする。２０℃にて３，０００ｒｐｍで５分遠心分離する。細胞を冷無菌水で洗浄し、遠心分離し、１ｍソルビトールで２回洗浄する。ＤＴＴを加えて最終２５ｍＭとするように（エレクトロコンピテンスを高めるため）１５分間インキュベートする。最終懸濁液として冷１Ｍソルビトールに再び取る（密度１〜５．１０９細胞／ｍＬ：約５ｍＬ）。４０μＬアリコートとし、約１０個のバイアルを−８０℃で保存する。
【００６５】
・エレクトロポレーションによる酵母の形質転換：
各発現カセットについて、酵母の形質転換に用いるＤＮＡは、示されたプラスミドを選択された制限酵素で消化したものからのものか、または直接的に、完全なアセンブリングの後に精製された、得られたＰＣＲ産物からのものである。
【００６６】
Ｓ．セレビシエカセット：ｐＧＬＹ０２．００４を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＳｍａＩで消化する。
コンピテント酵母を１μｇのＤＮＡで形質転換し、氷中で５分インキュベートする。Ｖ＝１，５００Ｖのパルスをかける。すぐに１ｍＬの氷冷無菌１Ｍソルビトールを加え、細胞をパスツールピペットでエッペンドルフ管に移した後、３０℃、Ｉｎｆｏｒｓデバイス内で少なくとも１時間弛緩させる。選択培地（１０ｍＭ  ５−フルオロウラシル、５−ＦＵを含有するＹＰＤ）のディッシュ上に酵母を拡げる。４〜６以内に形質転換体が現れる。
Ｓ．ポンベカセット：コンピテント酵母を１００ｎｇのＤＮＡ（ＰＣＲ産物）で形質転換し、氷中で５分間インキュベートする。細胞およびＤＮＡをエレクトロポレーションタンクに移す。Ｖ＝１，５００Ｖのパルスをかけ、すぐに０．９ｍＬの冷１Ｍソルビトールを加える。細胞をできる限り手早く好適な培地（１０ｍＭ  ５−ＦＵを含有するＹＰＤ）に拡げる。４〜６以内に形質転換体が現れる。
【００６７】
実施例４：ＡｍｅｌｉｅおよびＥｍｍａ株＋ヒトＮ−アセチル−グルコサミニルトランスフェラーゼＩの発現カセット
４．１  工程１：ＯＲＦの取得
市販のプラスミドＢｉｏｖａｌｌｅｙ（ヒトＯＲＦクローンＶ１．１）からのＰＣＲ
プログラム：
９４℃５分
３０サイクル：９４℃６０秒
５６℃６０秒
７２℃２分
７２℃５分
酵素の細胞質部分を欠いた１，３２７ｂｐ断片の増幅。それはタンパク質のゴルジ体局在のためにＭｎｎ９の細胞質部分に置換される。
Ｍｎｎ９細胞質領域：野生型Ｓ．セレビシエのゲノムＤＮＡからのＰＣＲ
９５℃８分
３０サイクル：９４℃２０秒
５８℃３０秒
７２℃１分
７２℃１０分
５１ｂｐ断片（ｍｎｎ９の細胞質部分）の増幅
【化１２】
0005562647.tif 000014
これら２つのＰＣＲ増幅から：
単一の断片を取得
【化１３】
0005562647.tif 000015
0005562647.tif 000016
【００６８】
このアセンブリングＰＣＲの増幅産物をアガロースゲルからＱＩＡＧＥＮキットで精製し、ベクターＴＯＰＯ２．１に導入した。コンピテント細菌（ＴＯＰ１０、Invitrogen）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した（ｐＧＬＹ０３．００１）。
【００６９】
４．２  工程２：発現カセットのアセンブリング
Ｓ．セレビシエ用発現カセット
酵母Ｓ．セレビシエ用ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ発現カセットの組込みは栄養要求性マーカーＡＤＥ２内に局在する。この遺伝子の無効化は酵母の色に変化をもたらし、赤くなり、また、アデニン栄養要求性となる。
・Ｓ．セレビシエのゲノムＤＮＡからのプロモーターａｄｈ１の増幅
ＢＳ２９（フォワード）およびＢＳ３０（リバース）
・プロモーターａｄｈ１（ＰＣＲ産物）およびＯＲＦ（ｐＧＬＹ０３．００１）のアセンブリング：
ＢＳ２９（フォワード）およびＢＳ５９
【００７０】
このＰＣＲ増幅物を抽出し、アガロースゲルからＱｉａｇｅｎキットで精製し、ベクターｐＴａｒｇｅｔに導入した。コンピテント細菌（ＪＭ１０９、Promega）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した（ｐＧＬＹ０３．００２）。
・ＯＲＦ（ｐＧＬＹ０３．００１）とターミネーターＣＹＣ１（ＰＣＲ産物）とのアセンブリング：
ＣＡ００５（フォワード）
ＢＳ４１（リバース）
【００７１】
このＰＣＲ増幅物を抽出し、アガロースゲルからＱｉａｇｅｎキットで精製し、ベクターｐＴａｒｇｅｔに導入した。コンピテント細菌（ＪＭ１０９、Promega）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した（ｐＧＬＹ０３．０１１）。
・プロモーター−ＯＲＦ（ｐＧＬＹ０３．００２）およびＯＲＦ−ターミネーター（ＰＣＲ産物）を、ＡＤＥ２に相同な延長部とともにアセンブリング
ＢＳ６７（フォワード）およびＢＳ６８（リバース）
【００７２】
このＰＣＲ増幅物を抽出し、アガロースゲルからＱｉａｇｅｎキットで精製し、ベクターｐＴａｒｇｅｔに導入した。コンピテント細菌（ＪＭ１０９、Promega）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した（ｐＧＬＹ０３．０１０）。
【００７３】
Ｓ．ポンベ用発現カセット
酵母Ｓ．ポンベ用ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ発現カセットの組込みは、栄養要求性マーカーＡＤＥ１内に局在する。この遺伝子の無効化は酵母の色に変化をもたらし、赤くなり、また、アデニン栄養要求性となる。
・プラスミドｐＣＤＮＡ３．１からのプロモーターｈＣＭＶの増幅
ＢＳ６２（フォワード）およびＢＳ５８（リバース）
【００７４】
このＰＣＲ増幅物を抽出し、アガロースゲルからＱｉａｇｅｎキットで精製し、ベクターｐＴａｒｇｅｔに導入した。コンピテント細菌（ＪＭ１０９、Promega）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した（ｐＧＬＹ０３．００４）。
・ｈＣＭＶ−ＯＲＦ（ｐＧＬＹ０３．００４）とターミネーターＣＹＣ１（ＰＣＲ産物）とのアセンブリング
ＢＳ６２（フォワード）およびＢＳ４１（リバース）
【００７５】
このＰＣＲ増幅物を抽出し、アガロースゲルからＱｉａｇｅｎキットで精製し、ベクターｐＴａｒｇｅｔに導入した。コンピテント細菌（ＪＭ１０９、Promega）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した（ｐＧＬＹ０３．００５）。
・発現カセット（ｐＧＬＹ０３．００５）とＡＤＥ１に相同な延長部とのアセンブリング：
ＢＳ６９（フォワード）およびＢＳ７０（リバース）
【００７６】
このＰＣＲ増幅物を抽出し、アガロースゲルからＱｉａｇｅｎキットで精製し、ベクターｐＴａｒｇｅｔに導入した。コンピテント細菌（ＪＭ１０９、Promega）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した（ｐＧＬＹ０３．００７）。
【００７７】
４．３  工程３：酵母の形質転換
・コンピテント酵母の調製：
ＡｍｅｌｉｅおよびＥｍｍａ株を、コンピテントとするために上記で示されたように調製した。
・酵母Ｓ．セレビシエおよびＳ．ポンベのエレクトロポレーション
手順：
Ｓ．セレビシエおよびＳ．ポンベ用発現カセットを含むプラスミド２０μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した。この線状化カセットをエレクトロポレーションにより酵母ＡｍｅｌｉｅおよびＥｍｍａに導入した。これらの酵母を必要なアミノ酸を含有するＹＮＢ培地で選択する。
【００７８】
実施例５：ＡｇａｔｈｅおよびＥｇｅｅ株＋ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体用発現カセット
５．１  工程１：ＯＲＦの取得
プログラム：
９４℃３分
３０サイクル：９４℃２０秒
５８℃３０秒
７２℃２分
７２℃１０分
９１６ｂｐ断片の増幅
【化１４】
0005562647.tif 000017
【００７９】
このＰＣＲ増幅物を抽出し、アガロースゲルからＱｉａｇｅｎキットで精製し、ベクターＴＯＰＯ２．１に導入した。コンピテント細菌（ＴＯＰ１０、Invitrogen）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した（ｐＧＬＹ０４．００１）。
【００８０】
５．２  工程２：発現カセットのアセンブリング：
Ｓ．セレビシエおよびＳ：ポンベ用カセット
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体発現カセットの組込みは、Ｓ．セレビシエおよびＳ．ポンベの両株とも、栄養要求性マーカーＬＹＳ２内に局在する。この遺伝子の無効化は有毒薬α−アミノアジピン酸に対する耐性を誘発する。従って、このカセットにより修飾された酵母はこの薬剤に対して耐性となるだけでなく、リシン栄養要求性ともなる。
【００８１】
・プラスミドｐＦＬ６１からのプロモーターＰＧＫの増幅
ＢＳ９５（フォワード）およびＢＳ９６（リバース）
・ＯＲＦ（ｐＧＬＹ０４．００１）とターミネーターＣＹＣ１（ＰＣＲ産物）とのアセンブリング
ＣＡ０１７（フォワード）およびＢＳ４１（リバース）
このＰＣＲ増幅物を抽出し、アガロースゲルからＱｉａｇｅｎキットで精製し、ベクターＴＯＰＯ２．１に導入した。コンピテント細菌（ＴＯＰ１０、Invitrogen）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した（ｐＧＬＹ０４．００２）。
【００８２】
・プロモーターＰＧＫ（ＰＣＲ産物）とＯＲＦ−ターミネーターＣＹＣ１断片（ｐＧＬＹ０４．００２）とのアセンブリング
ＢＳ９５（フォワード）およびＢＳ４１（リバース）
・発現カセットとＬＹＳ２に相同な延長部とのアセンブリング
Ｓ．セレビシエ：
ＢＳ９７（フォワード）およびＢＳ９８（リバース）
Ｓ．ポンベ
ＢＳ９９（フォワード）
ＢＳ１００（リバース）
このＰＣＲ増幅物を抽出し、アガロースゲルからＱｉａｇｅｎキットで精製し、ベクターｐＴａｒｇｅｔに導入した。コンピテント細菌（ＪＭ１０９、Promega）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した（Ｓ．セレビシエカセットではｐＧＬＹ０４．００６、Ｓ．ポンベカセットではｐＧＬｙ０４．００５）。
【００８３】
５．３  工程３：酵母の修飾
・コンピテント酵母の調製：
ＡｇａｔｈｅおよびＥｇｅｅ株を、コンピテントとするために上記で示されたように調製した。
・酵母のエレクトロポレーション
Ｓ．セレビシエ、Ｓ．ポンベ用発現カセットを含むプラスミド２０μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した。この線状化カセットをエレクトロポレーションにより酵母ＡｇａｔｈｅおよびＥｇｅｅに導入した。これらの酵母を必要なアミノ酸とα−アミノアジピン酸を含有するＹＮＢ培地で選択する。
【００８４】
実施例６：ＡｒｉｅｌｌｅおよびＥｒｉｋａ株＋α−マンノシダーゼＩＩ用発現カセット
６．１  工程１：ＯＲＦの取得
マウス肝臓のｃＤＮＡからのＰＣＲ
プログラム：
９４℃３分
３５サイクル：９４℃２０秒
５８℃３０秒
７２℃４分
７２℃１０分
３，４５３ｂｐ断片の増幅
【化１５】
0005562647.tif 000018
0005562647.tif 000019
0005562647.tif 000020
【００８５】
このＯＲＦの増幅は、マウス肝臓のｃＤＮＡに対するネストＰＣＲ（３，４５３ｂｐ）により得た後、フェノール／クロロホルム法により精製した。このＰＣＲ産物をベクターＴＯＰＯ−ＸＬに導入した。コンピテント細菌（ＴＯＰ１０、Invitrogen）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した（ｐＧＬＹ０５．００１）。
【００８６】
６．２  工程２：発現カセットのアセンブリング
Ｓ．セレビシエおよびＳ．ポンベカセット：
マンノシダーゼＩＩ発現カセットの組込みは、両株とも、栄養要求性マーカーＬＥＵ２内に局在する。この遺伝子の無効化は有毒薬トリフルオロロイシンに対する耐性を誘発する。従って、このカセットにより修飾された酵母はこの薬剤に対して耐性となるだけでなく、ロイシン栄養要求性ともなる。
・Ｓ．セレビシエのゲノムＤＮＡからのプロモーターＴＥＦの増幅
ＢＳ８３（フォワード）およびＢＳ８４（リバース）
・ＯＲＦ（ＰＣＲ産物）を含有するプロモーターＴＥＦ（ＰＣＲ産物）およびターミネーター（ＰＣＲ産物）のアセンブリング
Ｓ．セレビシエマーカーＬＥＵ２については、ＢＳ１１１（フォワード）およびＢＳ１１２（リバース）
Ｓ．ポンベマーカーＬＥＵ２については、ＢＳ１１３（フォワード）およびＢＳ１１４（リバース）
【００８７】
このＰＣＲ増幅物を抽出し、アガロースゲルからＱｉａｇｅｎキットで精製し、ベクターｐＴａｒｇｅｔに導入した。コンピテント細菌（ＪＭ１０９、Promega）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した（Ｓ．セレビシエカセットではｐＧＬｙ０５．００８、Ｓ．ポンベカセットではｐＧｌｙ０５．００９）。
【００８８】
６．３  工程３：酵母の修飾
・コンピテント酵母の調製：
ＡｒｉｅｌｌｅおよびＥｒｉｋａ株を、コンピテントとするために上記で示されたように調製した。
酵母のエレクトロポレーション
手順：Ｓ．セレビシエおよびＳ．ポンベ用発現カセットを含むプラスミド２０μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した。この線状化カセットをエレクトロポレーションにより酵母ＡｒｉｅｌｌｅおよびＥｒｉｋａに導入した。これらの酵母を必要なアミノ酸ならびにＳ．セレビシエおよびＳ．ポンベのトリフルオロロイシン（ＴＦＬ）を含有するＹＮＢ培地で選択する。
【００８９】
実施例７：ＡｎａｉｓおよびＥｎｒｉｑｕｅ株＋Ｎ−アセチ−グルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ発現カセット
６．１  工程１：ＯＲＦの取得：
ヒト繊維芽細胞の相補的ＤＮＡからのＰＣＲ−ＴａｑポリメラーゼＩｓｉｓ（商標）(Q-Biogene)の使用
プログラム：
９４℃３分
３０サイクル：９４℃３０秒
５８℃３０秒
６８℃１．３０分
１，３４４ｂｐ断片の増幅
【化１６】
0005562647.tif 000021
【００９０】
このＰＣＲ増幅物をフェノール／クロロホルム法により精製し、ベクターｐＴａｒｇｅｔ(Promega)に導入した。コンピテント細菌（ＪＭ１０９、Promega）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した（ｐＧＬＹ０８．００２）。
ｍｍｎ９の細胞質領域：野生型Ｓ．セレビシエのゲノムＤＮＡからのＰＣＲ
９４℃８分
３０サイクル：９４℃２０秒
６５℃３０秒
７２℃１分
７２℃１０分
５１ｂｐ断片（ｍｍｎ９の細胞質部分）の増幅＋ＧＮＴＩＩとの相同性
【化１７】
0005562647.tif 000022
Ｔａｑ  Ｐｌａｔｉｎｉｕｍを用いたＭｎｎ９（ＰＣＲ産物）およびＯＲＦ（ｐＧＬＹ０８．００２）のアセンブリング
ＣＡ００５（フォワード）およびＣＤ００５（リバース）
プログラム：
９５℃２分
３０サイクル：９５℃４５秒
５４℃４５秒
７２℃２分
７２℃１０分
【００９１】
このＰＣＲ増幅物をフェノール／クロロホルム法により精製し、ベクターｐＴａｒｇｅｔ(Promega)に導入した。コンピテント細菌（ＪＭ１０９、Promega）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した（ｐＧＬＹ０８．００７）。
【００９２】
７．２  工程２：Ｓ．セレビシエおよびＳ．ポンベ株用発現カセットのアセンブリング
ＧｌｃＮＡｃ−トランスフェラーゼＩＩ発現カセットの組込みは、Ｓ．セレビシエではＬｅｍ３マーカー内に、Ｓ．ポンベではＴＲＰ１マーカー内に挿入される。遺伝子Ｌｅｍ３の無効化は有毒薬ミルテホシンに対する耐性を誘発する。従って、このカセットにより修飾された酵母はこの薬剤に対して耐性となる。遺伝子ＴＲＰ１の無効化は有毒薬５−フルオロ−アントラニル酸に対する耐性を誘発する。従って、このカセットにより修飾された酵母はこの薬剤に対して耐性となるだけでなく、トリプトファン栄養要求性ともなる。
・プロモーターＰＭＡ１の増幅
ＣＤ００１（フォワード）aagcttcctgaaacggag
ＣＤ００８（リバース）acgatacaagagaaagtgacatattgatattgtttgataattaaat
Ｓ．セレビシエのゲノムＤＮＡからのＰＣＲ
プログラム：
９５℃２分
３０サイクル：９５℃４５秒
５４℃４５秒
７２℃２分
７２℃５分
プロモーターＰＭＡ１（ＰＣＲ産物）とＭｎｎ９−相同性ＯＲＦ（ｐＧＬＹ０８．００７）とのＴａｑエクスパンド(Roche)を用いたアセンブリング
ＣＤ００７  cgtttgtagatgcggaacctgttaacccacgggttcttt
ＣＤ００１  aagcttcctgaaacggag
９４℃２分
３０サイクル：９４℃４５秒
５５℃４５秒
６８℃１．１５分
６８℃５分
このＰＣＲ増幅物をフェノール／クロロホルム法により精製し、ベクターＴＯＰＯ２．１(Invitrogen)に導入した。コンピテント細菌（ＴＯＰ１０、Invitrogen）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した（ｐＧＬＹ０８．００５）。
【００９３】
・Ｍｎｎ９−ＯＲＦ（ｐＧＬＹ０８．００７）とターミネーターＣＹＣ１（ＰＣＲ産物）とのＴａｑポリメラーゼＰｈｕｓｉｏｎ（商標）(Ozyme)を用いたアセンブリング
プログラム
９８℃２分
３０サイクル：９８℃１０秒
５２℃３０秒
７２℃４０秒
プライマーを添加した後
３０サイクル：９８℃１０秒
６１℃３０秒
７２℃４０秒
７２℃５分
このＰＣＲ増幅物をフェノール／クロロホルム法により精製し、ベクターｐＴａｒｇｅｔ(Promega)に導入した。コンピテント細菌（ＪＭ１０９、Promega）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した（ｐＧＬＹ０８．０４）。
【００９４】
・プロモーターＰＭＡ１−Ｍｎｎ９（ｐＧＬＹ０８．００９）とＭｎｎ９−ＯＲＦ−ターミネーターＣＹＣ１（ＰＣＲ産物）（Ｓ．セレビシエではマーカーＬｅｍ３と相同な末端を有する）との、ＴａｑポリメラーゼＰｈｕｓｉｏｎ（商標）(Ozyme)を用いたアセンブリング
ＣＢ０５３：Atggtaaatttcgatttgggccaagttggtgaagtattccaagcttcctgaaacggag（フォワード）
ＣＢ０７０：Ttctaccgccgaagagccaaaacgttaataatatcaatggcagcttgcaaattaaagc（リバース）
プログラム
９８℃２分
３０サイクル：９８℃１０秒
５２℃３０秒
７２℃４分
プライマーを添加した後
３０サイクル：９８℃１０秒
６１℃３０秒
７２℃１分
７２℃５分
【００９５】
このＰＣＲ増幅物をフェノール／クロロホルム法により精製し、ベクターｐＴａｒｇｅｔ(Promega)に導入した。コンピテント細菌（ＪＭ１０９、Promega）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した（ｐＧＬＹ０８）。
・ｐＧＬＹ０８．０１２からのＳ．ポンベ用マーカーＴＲＰ１に相同な末端のアセンブリング
ＣＤ００９（フォワード）taaagttgattccgctggtgaaatcatacatggaaaagtttaagcttcctgaaacggag
ＣＤ０１０（リバース）atgtgaaatttccttggccacggacaagtccacttttcgtttggcagcttgcaaattaaagc
【００９６】
７．３  工程３：酵母の修飾
・コンピテント酵母の調製：
ＡｎａｉｓおよびＥｎｒｉｑｕｅ株を、コンピテントとするために上記で示されたように調製した。
酵母のエレクトロポレーション
手順：Ｓ．セレビシエおよびＳ．ポンベ用発現カセットを含むプラスミド２０μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した。この線状化カセットをエレクトロポレーションにより酵母ＡｎａｉｓおよびＥｎｒｉｑｕｅに導入した。次に、これらの酵母を必要な選択薬を含有するゲロースＹＮＢ培地に拡げる。
【００９７】
実施例８：ＡｌｉｃｅおよびＥｌｇａ株＋ガラクトシルトランスフェラーゼＩ発現カセット
８．１  工程１：ヒト局在配列を欠いたＯＲＦの取得
ヒトリンパ芽細胞のｃＤＮＡからのＰＣＲ
ＣＤ０２５（フォワード）ＣＤ０２６（リバース）
９４℃２分
３０サイクル：９４℃４５秒
５８℃４５秒
７２℃１．１５分
７２℃５分
１，０４７ｂｐ断片の増幅
【化１８】
0005562647.tif 000023
このＰＣＲ増幅物をフェノール／クロロホルム法により精製し、ベクターｐＴａｒｇｅｔ(Promega)に導入した。コンピテント細菌（ＪＭ１０９、Promega）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した（ｐＧＬＹ１１．００３）。
【００９８】
Ｍｎｔｌ局在：Ｓ．セレビシエのｇＤＮＡからのＰＣＲ
９４℃３分
３０サイクル：９４℃２０秒
５８℃３０秒
７２℃４５秒
７２℃１０分
２４６ｂｐ断片の増幅−配列番号１４
【化１９】
0005562647.tif 000024
【００９９】
このＰＣＲ増幅物をフェノール／クロロホルム法により精製し、ベクターｐＴａｒｇｅｔ(Promega)に導入した。コンピテント細菌（ＪＭ１０９、Promega）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した。
【０１００】
８．２：工程２：Ｓ．セレビシエおよびＳ．ポンベ株用発現カセットのアセンブリング
ガラクトシルトランスフェラーゼＩ発現カセットの組込みは、Ｓ．セレビシエＡｌｉｃｅでは、マーカーＴＲＰ１内に局在する。この遺伝子の無効化は有毒薬フルオロアントラニル酸に対する耐性を誘発する。従って、このカセットにより修飾された酵母はこの薬剤に対して耐性となる。ガラクトシルトランスフェラーゼＩ発現カセットの組込みは、Ｓ．セレビシエＡｓｈｌｅｙでは、マーカーＭｅｔ１７内に局在する。
・プラスミドｐＭＤＣからのプロモーターＣａＭＶの増幅
ＣＤ０３５（フォワード）
ＣＤ０３７（リバース）
プログラム
９４℃２分
３０サイクル：９４℃４５秒
６５℃４５秒
７２℃２分３０秒
７２℃５分
このＰＣＲ増幅物を抽出し、アガロースゲルからＱｉａｇｅｎキットで精製し、ベクターｐＴａｒｇｅｔに導入した。コンピテント細菌（ＪＭ１０９、Promega）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した（ｐＧＬＹ１１．００１）。
【０１０１】
・プロモーターＣａＭＶ（ｐＧＬＹ１１．００１）とＭｎｔ１局在配列（ＰＣＲ産物）とのアセンブリング：
ＣＤ０３５（フォワード）およびＣＤ０２８（リバース）
プログラム：
９４℃２分
３０サイクル：９４℃４５秒
５９℃４５秒
７２℃１分１５秒
７２℃３分
このＰＣＲ増幅物を抽出し、アガロースゲルからＱｉａｇｅｎキットで精製し、ベクターｐＴａｒｇｅｔに導入した。コンピテント細菌（ＪＭ１０９、Promega）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した（ｐＧＬＹ１１．００２）。
【０１０２】
・プロモーターＣａＭＶ−Ｍｎｔ１局在（ｐＧＬＹ０１１．００２）とＯＲＦ（ＰＣＲ産物）とのアセンブリング
ＣＤ０３５（フォワード）
ＣＤ０２９（リバース）
プログラム：
９４℃２分
３０サイクル：９４℃４５秒
５６℃４５秒
７２℃２分３０秒
７２℃３分
このＰＣＲ増幅物をフェノール／クロロホルム法により精製し、ベクターｐＴａｒｇｅｔ(Promega)に導入した。コンピテント細菌（ＪＭ１０９、Promega）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した（ｐＧＬＹ０１１．００４）。
【０１０３】
・プロモーターＣａＭＶ−局在Ｍｎｔ１−ＯＲＦ（ｐＧＬＹ０１１．００４）とターミネーターＣＹＣ１（ＰＣＲ産物）との、Ｔａｑエクスパンド(Roche)を用いたアセンブリング
ＣＤ０３５（フォワード）ＢＳ４１（リバース）
プログラム：
９５℃３分
３０サイクル：９５℃３０秒
５７℃３０秒
６８℃２分３０秒
６８℃１０分
このＰＣＲ増幅物をフェノール／クロロホルム法により精製し、ベクターｐＴａｒｇｅｔ(Promega)に導入した。コンピテント細菌（ＪＭ１０９、Promega）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した（ｐＧＬＹ０１１．００５）。
【０１０４】
・Ｓ．セレビシエ用組込みカセットの、Ｔａｑエクスパンド(Roche)を用いたアセンブリング
ＣＤ０６３（フォワード）agatgccagaaacaaagcttgttgcaggtggtgctgctcatgcctgcaggtcaacatggt
ＣＤ０６４（リバース）gtgtcgacgatcttagaagagtccaaaggtttgactggatgcagcttgcaaattaaagcc
プログラム
９５℃３分
３０サイクル：９５℃３０秒
５７℃３０秒
６８℃２分３０秒
６８℃１０分
このＰＣＲ増幅物をフェノール／クロロホルム法により精製し、ベクターＴＯＰＯ２．１(Invitrogen)に導入した。コンピテント細菌（ＴＯＰ１０、Invitrogen）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した（ｐＧＬＹ０１１．００８）。
【０１０５】
Ｓ．ポンベの場合の配列ＰＥＴ６への組込み
Ｔａｑエクスパンド(Roche)の使用
ＣＤ０３８（フォワード）およびＣＤ０３９（リバース）
【０１０６】
このＰＣＲ産物をベクターＴＯＰＯ−ＸＬに導入した。コンピテント細菌（ＴＯＰ１０、Invitrogen）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した（Ｓ．ポンベではｐＧＬＹ１１．００６、Ｓ．セレビシエではｐＧＬＹ１１．００７）。
【０１０７】
８．３  工程３：酵母の修飾
・コンピテント酵母の調製：
ＡｌｉｃｅおよびＥｌｇａ株を、コンピテントとするために上記で示されたように調製した。
酵母のエレクトロポレーション
手順：Ｓ．セレビシエおよびＳ．ポンベ用発現カセットを含むプラスミド２０μｇを制限酵素ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで消化した。この線状化カセットをエレクトロポレーションにより酵母ＡｌｉｃｅおよびＥｌｇａに導入した。次に、これらの酵母を必要な選択薬を含有するゲロースＹＮＢ培地に拡げる。
【０１０８】
実施例９：ＡｎａｉｓおよびＥｎｒｉｑｕｅ株＋フコシル化用発現カセット（α１，６−フコシルトランスフェラーゼＦＵＴ８およびＧＤＰ−フコース輸送体）：
９．１  ＦＵＴ８の発現カセット
９．１．１  工程１：ＯＲＦの取得
ヒト膵臓および肺のｃＤＮＡからのＰＣＲ
プログラム：
９４℃３分
３５サイクル：９４℃２０秒
５８℃３０秒
７２℃２分
７２℃１０分
１，８０１ｂｐ断片の増幅
【化２０】
0005562647.tif 000025
0005562647.tif 000026
【０１０９】
このＰＣＲ増幅物（ヒト肺および膵臓のｃＤＮＡからの１，８０１ｂｐ）を抽出し、アガロースゲルからＱＢＩＯｇｅｎｅキットで精製し、ベクターＴＯＰＯ２．１に導入した。コンピテント細菌（ＴＯＰ１０、Invitrogen）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した。
【０１１０】
９．１．２  工程２：Ｓ．セレビシエ用発現カセットのアセンブリング
・Ｓ．ポンベのゲノムＤＮＡからのプロモーターｍｎｔ１の増幅
ＢＳ８６（フォワード）およびＢＳ８４（リバース）
・プロモーターｍｎｔ１（ＰＣＲ産物）とＯＲＦ（ｐＧＬＹ０６．００１）とのアセンブリング
ＢＳ８６（フォワード）およびＢＳ８８（リバース）
このＰＣＲ増幅物を抽出し、アガロースゲルからＱｉａｇｅｎキットで精製し、ベクターｐＴａｒｇｅｔに導入した。コンピテント細菌（ＪＭ１０９、Promega）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した（ｐＧＬＹ０６．００３）。
【０１１１】
・ＯＲＦ（ｐＧＬＹ０６．００１）とターミネーターＣＹＣ１（ＰＣＲ産物）とのアセンブリング
ＣＡ０１１（フォワード）およびＢＳ４１（リバース）
このＰＣＲ増幅物を抽出し、アガロースゲルからＱｉａｇｅｎキットで精製し、ベクターｐＴａｒｇｅｔに導入した。コンピテント細菌（ＪＭ１０９、Promega）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した（ｐＧＬＹ０６．００２）。
【０１１２】
・ｎｍｔ１−ＯＲＦ（ｐＧＬＹ０６．００３）とＯＲＦ−ターミネーターＣＹＣ１（ＰＣＲ産物）とのアセンブリング
ＢＳ８６（フォワード）およびＢＳ４１（リバース）
・酵母の栄養要求性マーカーへの組込みのための末端のアセンブリング
【０１１３】
９．１．２．１  Ｓ．セレビシエ
ＦＵＴ８発現カセットの組込みは、Ｓ．セレビシエ株では、マーカーＣＡＮ１内に局在する。この遺伝子ＣＡＮ１の無効化はカナバニン栄養要求性を誘発する。
ＢＳ１４７（フォワード）およびＢＳ１４８（リバース）
【０１１４】
このＰＣＲ増幅物を抽出し、アガロースゲルからＱｉａｇｅｎキットで精製し、ベクターｐＴａｒｇｅｔに導入した。コンピテント細菌（ＪＭ１０９、Promega）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した（ｐＧＬＹ０６．００５）。
【０１１５】
９．１．２．２  Ｓ．ポンベ
フコシルトランスフェラーゼ８用発現カセットを、抗生物質フレオマイシン耐性用のカセットと縦列生産した。この二重カセットを単純な栄養要求性マーカーＨＩＳ５内に挿入する。このカセットのこの遺伝子座への挿入はフレオマイシン耐性ならびにヒスチジン栄養要求性を誘発する。
【０１１６】
従前に得られたＦＵＴ８発現カセットを、ＳＶ４０のプロモーターとフレオマイシン耐性のＯＲＦとターミネーターＴＥＦとを含んでなるフレオマイシン発現カセットとともにアセンブリングする。これらの縦列カセット（tandem cassettes）をマーカーＨＩＳ５に挿入する。
【０１１７】
９．１．３  工程３：酵母の修飾
・コンピテント酵母の調製：
ＡｎａｉｓおよびＥｎｒｉｑｕｅ株を、コンピテントとするために上記で示されたように調製した。
酵母のエレクトロポレーション
手順：Ｓ．セレビシエおよびＳ．ポンベ用発現カセットを含むプラスミド２０μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した。この線状化カセットをエレクトロポレーションにより酵母ＡｎａｉｓおよびＥｎｒｉｑｕｅに導入した。これらの酵母をゲロースＹＰＤ培地上に、制限希釈を用いて拡げられ、マーカーを欠くものは薬剤耐性が付与されない。クローンが遊離されたら、必要なアミノ酸無しではもはや増殖できないクローンを選択するために、最小培地上で複製を確立する。
【０１１８】
９．２  ＧＤＰ−フコース輸送体の発現カセット
９．２．１  ＯＲＦの取得：
ヒト肺のｃＤＮＡからのＰＣＲ
プログラム：
９４℃３分
３５サイクル：９４℃２０秒
５８℃３０秒
７２℃２分
７２℃１０分
１，１３６ｂｐ断片の増幅
【化２１】
0005562647.tif 000027
【０１１９】
このＰＣＲ増幅物を抽出し、アガロースゲルからＱＩＡＧＥＮキットで精製し、ベクターＴＯＰＯ２．１に導入した。コンピテント細菌（ＴＯＰ１０、Invitrogen）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した（ｐＧＬＹ０７．００１）。
【０１２０】
９．２．２  工程２：Ｓ．セレビシエおよびＳ．ポンベ用発現カセットのアセンブリング
ｐＴａｒｇｅｔからのプロモーターＳＶ４０の増幅
ＢＳ１０９（フォワード）およびＢＳ１１０（リバース）
・ＯＲＦ（ｐＧＬＹ０７．００１）とターミネーターＣＹＣ１（ＰＣＲ産物）とのアセンブリング
ＣＡ０１３（フォワード）およびＢＳ４１（リバース）
【０１２１】
このＰＣＲ増幅物を抽出し、アガロースゲルからＱｉａｇｅｎキットで精製し、ベクターｐＴａｒｇｅｔに導入した。コンピテント細菌（ＪＭ１０９、Promega）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した（ｐＧＬＹ０７．００２）。
【０１２２】
９．２．２．１  Ｓ．セレビシエ
ＧＤＰ−フコース輸送体発現カセットの組込みは、Ｓ．セレビシエ株では、栄養要求性マーカーＴＲＰ１内に局在する。遺伝子ＴＲＰ１の無効化は有毒薬５−フルオロ−アントラニル酸に対する耐性を誘発する。従って、このカセットにより修飾された酵母はこの薬剤に対して耐性となるだけでなく、トリプトファン栄養要求性ともなる。
【０１２３】
・プロモーターＳＶ４０カセット（ＰＣＲ産物）、ＯＲＦ（ＰＣＲ産物）およびターミネーターＣＹＣ１（ＰＣＲ産物）のアセンブリング
ＢＳ１３６（フォワード）およびＢＳ１３７（リバース）
このＰＣＲ増幅物を抽出し、アガロースゲルからＱｉａｇｅｎキットで精製し、ベクターｐＴａｒｇｅｔに導入した。コンピテント細菌（ＪＭ１０９、Promega）をこのベクターで形質転換した。形質転換をＰＣＲにより確認し、このベクターにＰＣＲ増幅物が挿入されていることを配列決定により確認した（ｐＧＬＹ０７．００３）。
【０１２４】
９．２．２．２  Ｓ．ポンベ
ＧＤＰ−フコース輸送体用発現カセットを、抗生物質ハイグロマイシン耐性用のカセットと縦列生産した。この二重カセットを、Ｓ．ポンベのＮ−グリカンの成熟に関与するタンパク質をコードする遺伝子ＧＭＡ１２内に挿入する。このカセットのこの遺伝子座への挿入はハイグロマイシン耐性だけでなく、遺伝子ｇｍａ１２の欠失を誘発する。
【０１２５】
従前に得られたＧＤＰ−フコース輸送体発現カセットを、ＳＶ４０のプロモーター、ハイグロマイシン耐性のＯＲＦならびにターミネーターＴＥＦを含んでなるハイグロマイシン耐性の発現カセットとともにアセンブリングする。これらの縦列カセットをマーカーｇｍａ１２に挿入する。
【０１２６】
９．２．３  工程３：酵母の修飾
・コンピテント酵母の調製：
ＡｐｏｌｌｉｎｅおよびＥｐｉｐｈａｎｉｅ株を、コンピテントとするために上記で示されたように調製した。
酵母のエレクトロポレーション
手順：Ｓ．セレビシエおよびＳ．ポンベ用発現カセットを含むプラスミド２０μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化した。この線状化カセットをエレクトロポレーションにより酵母ＡｐｏｌｌｉｎｅおよびＥｐｉｐｈａｎｉｅに導入した。これらのＳ．セレビシエ酵母を、５−フルオロ−アントラニル酸を含有するＹＰＤ培地上に拡げる。Ｓ．ポンベ酵母はゲロースＹＰＤ培地上に制限希釈を用いて拡げ、マーカーを欠くものは薬剤耐性が付与されない。クローンが遊離されたら、必要なアミノ酸無しではもはや増殖できないクローンを選択するために、最小培地上で複製を確立する。
【０１２７】
実施例１０：ＡｔｈｅｎａおよびＥｔｉｅｎｎｅ株＋Ｎ−アセチルグリコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ発現カセット
１０．１  ＯＲＦの取得
ネズミ脳の相補的ＤＮＡからのＰＣＲ
ＣＢ００７（フォワード）Atgaagatgagacgctacaa
ＣＢ０３６（リバース）ctagccctccactgtatc
プログラム：
９４℃２分
３０サイクル：９４℃４５秒
５６℃４５秒
７２℃２分
７２℃５分
酵素の細胞質部分を欠いたｂｐ断片の増幅：それはタンパク質のゴルジ体局在のためにＭｎｔ１の細胞質部分に置換される。
【０１２８】
１０．２  Ｓ．セレビシエおよびＳ．ポンベ株用発現カセットのアセンブリング
１０．２．１  Ｓ．セレビシエ用のアセンブリング
プロモーターｎｍｔ１の増幅
ＣＢ０１３：tatagtcgctttgttaaatcatatggccctctttctcagtaa
ＣＢ０１４：agcgaagactccgaagcccacttctttaagaccttatcc
ターミネーターＣＹＣ１の増幅
末端ＣＡＮ１を有する発現カセットの増幅
ＣＢ０３０（フォワード）：cagaaaatccgttccaagag
ＣＢ０３１（リバース）：tgccacggtatttcaaagct
１０．２．２  Ｓ．ポンベ用のアセンブリング
ハイグロマイシン耐性用カセットと縦列されたＧＮＴＩＩＩの発現カセット。
ＧＭＡ１２に挿入。
１０．３  酵母の形質転換
【０１２９】
実施例１１：Ｓ．セレビシエおよびＳ．ポンベにおける過剰マンノシル化に関与する遺伝子の欠失
１１．１  工程１：酵母Ａｍｅｌｉｅ、Ａｒｉｅｌｌｅ、Ａｎａｉｓ、Ａｌｉｃｅ、Ａｂｅｌ、Ａｓｈｌｅｙ、Ａｔｈｅｎａ、ＡｚａｌｅｅおよびＡｕｒｅｌの欠失
１１．１．１  ハイグロマイシン耐性遺伝子を含むカセットの構築およびＭｎｎ１遺伝子への挿入
【０１３０】
１１．１．１．１  発現カセットの構築
Ｍｎｎ１  ５’末端を有するプロモーターＣａＭＶの増幅
【化２２】
0005562647.tif 000028
プロモーターＣａＭＶおよびＭｎｎ１  ３’末端と相同性を有するハイグロマイシン−ターミネーターＴＥＦ増幅
【化２３】
0005562647.tif 000029
Ｓ．セレビシエにおけるＭｎｎ１遺伝子の欠失のための挿入カセットのアセンブリング
【化２４】
0005562647.tif 000030
【０１３１】
１１．１．１．２  酵母の形質転換
・コンピテント酵母の調製
これらの株を、コンピテントとするために上記で示されたように調製した。
・Ｓ．セレビシエ酵母のエレクトロポレーション
手順：
Ｓ．セレビシエ用発現カセットを含むプラスミド２０μｇを制限酵素で消化した。この線状化カセットをエレクトロポレーションにより酵母に導入した。これらの酵母をハイグロマイシンを含有するＹＰＤ培地で選択する。
１１．１．２  酵母Ａｍｅｌｉｅ、Ａｒｉｅｌｌｅ、Ａｎａｉｓ、Ａｌｉｃｅ、Ａｂｅｌ、Ａｓｈｌｅｙ、Ａｔｈｅｎａ、ＡｚａｌｅｅおよびＡｕｒｅｌにおけるＭｎｎ９遺伝子の欠失
１１．１．２．１  フレオマイシン耐性遺伝子を含むＭｎｎ９への組込みのためのカセットの構築
Ｍｎｎ９  ５’末端を有するプロモーターＳＶ４０の増幅
【化２５】
0005562647.tif 000031
プロモーターＳＶ４０と相同性を有するフレオマイシン−ターミネーターＴＥＦの増幅
【化２６】
0005562647.tif 000032
【０１３２】
１１．１．２．２  酵母の形質転換
・コンピテント酵母の調製：
これらの酵母を、コンピテントとするために上記で示されたように調製した。
・Ｓ．セレビシエ酵母のエレクトロポレーション
手順：
Ｓ．セレビシエ用発現カセットを含むプラスミド２０μｇを制限酵素で消化した。この線状化カセットをエレクトロポレーションにより酵母に導入した。これらの酵母をフレオマイシンを含有するＹＰＤ培地で選択する。
１１．２  工程２：酵母Ｓ．ポンベ、Ｅｍｍａ、Ｅｒｉｋａ、Ｅｎｒｉｑｕｅ、Ｅｌｇａ、ＥｔｉｅｎｎｅにおけるＧＭＡ１２遺伝子の欠失
１１．２．１  ハイグロマイシン耐性遺伝子を含む組込みカセットの構築
ｅｘｔ−ｇｍａ１２／ｐｒｏｍ−ＣａＭＶ／ｈｐｈ／Ｔｅｆ−ｔｅｒｍ／ｅｘｔ−ｇｍａ１２
【化２７】
0005562647.tif 000033
【０１３３】
１１．２．２  酵母の形質転換
・コンピテント酵母の調製：
これらの株を、コンピテントとするために上記で示されたように調製した。
・Ｓ．セレビシエ酵母のエレクトロポレーション
手順：
Ｓ．ポンベ用発現カセットを含むプラスミド２０μｇを制限酵素で消化した。この線状化カセットをエレクトロポレーションにより導入した。これらの酵母をハイグロマイシンを含有するＹＰＤ培地で選択する。
【０１３４】
実施例１２：株＋Ｓ．セレビシエおよびＳ．ポンベのＮ−グリカンのシアリル化のための発現カセット
Ｓ．セレビシエおよびＳ．ポンベにおいて産生されたタンパク質のＮ−グリカンの有効なシアリル化を得るためには、まず、同じ酵母にシアル酸生合成経路を導入しなければならない。これを行うため、本発明者らは酵母のゲノムに、髄膜炎菌(N. meningitidis)のＣＭＰ−シアル酸生合成経路である、サイトゾルに局在する酵素を導入した。
シアリル化のための縦列カセットの調製（Ａｔｈｅｎａ、ＡｕｒｅｌおよびＡｚａｌｅｅ株から）：
【０１３５】
１２．１  カセットＳ１：
プロモーターＰＥＴ５６、シアル酸シンターゼのＯＲＦ、ターミネーターＣＹＣ１、そしてプロモーターＰＥＴ５６５、ＣＭＰ−シアル酸シンターゼのＯＲＦおよびターミネーターＣＹＣ１からなる縦列カセットの構築
・ＯＲＦの取得：
シアル酸シンターゼ（１，０５０ｂｐ）
【化２８】
0005562647.tif 000034
ＣＭＰ−シアル酸シンターゼ（６８７ｂｐ）：
【化２９】
0005562647.tif 000035
・発現カセット：
プロモーターＰＥＴ５６
【化３０】
0005562647.tif 000036
【０１３６】
１２．２  カセットＳ２：
ＣＭＰ−シアル酸輸送体発現カセットは、抗生物質ハイグロマイシン耐性のためのカセットと縦列生産した。この二重カセットをｍｎｎ１遺伝子に挿入する。このカセットのこの遺伝子座への挿入はハイグロマイシン耐性だけでなく、ｍｎｎ１遺伝子の欠失も誘発する。
・ＯＲＦの取得
マウス(mus musculus)由来ＣＭＰ−シアル酸輸送体（１，０１１ｂｐ）
【化３１】
0005562647.tif 000037
【０１３７】
・発現カセットの構築：
ＣＭＰ−シアル酸輸送体（プロモーターＣａＭＶ、ＯＲＦ、ターミネーターＣＹＣ１）の発現カセットを、ＣａＭＶのプロモーター、ハイグロマイシン耐性ＯＲＦならびにターミネーターＴＥＦを含んでなるハイグロマイシン耐性発現カセットとともにアセンブリングする。これらの縦列カセットをマーカーｍｎｎ１に挿入する。
【０１３８】
１２．３  カセットＳ３：
シアリルトランスフェラーゼＳＴ３ＧＡＬ４のための発現カセットを、抗生物質フレオマイシン耐性のためのカセットと縦列生産した。この二重カセットをｍｎｎ９遺伝子に挿入する。このカセットのこの遺伝子座への挿入はハイグロマイシン耐性だけでなく、ｍｎｎ９遺伝子の欠失も誘発する。
【０１３９】
・ＯＲＦの取得
ヒトシアリルトランスフェラーゼＳＴ３ＧＡＬ４（９９０ｂｐ）
【化３２】
0005562647.tif 000038
【０１４０】
ネズミシアリルトランスフェラーゼＳＴ３ＧＡＬ４（１，００２ｂｐ）
【化３３】
0005562647.tif 000039
【０１４１】
ＣＭＰ−シアル酸輸送体発現カセット（プロモーターＣａＭＶ、ＯＲＦ、ターミネーターＣＹＣ１）を、ＣａＭＶのプロモーター、ハイグロマイシン耐性のＯＲＦならびにターミネーターＴＥＦを含んでなるハイグロマイシン耐性発現カセットとともにアセンブリングする。これらの縦列カセットをマーカーｍｎｎ１に挿入する。
【０１４２】
実施例１３：均質にグリコシル化されたＥＰＯの生産
１３．１  ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）のヌクレオチド配列の増幅
ヒトＥＰＯのヌクレオチド配列の増幅は、ヒト腎臓の相補的ＤＮＡから、好適なプライマーを用いて得た。
【０１４３】
１３．２  Ｓ．セレビシエの発現ベクターにおけるＥＰＯの配列のクローニング
その停止コドンの末端切断型ヒトｈｕＥＰＯのヌクレオチド配列（５８５塩基対）を酵母Ｓ．セレビシエの発現ベクターに組み込む。導入配列とプラスミドｐＳＣの配列の間のリーディングフレームの連続性（エピトープＶ５およびポリヒスチジンタグ）は、得られたプラスミド（ＰＳＣ−ＥＰＯ）の配列決定により確認された。タンパク質ＥＰＯの発現は、Ｓ．セレビシエ株のガラクトースにより誘導可能なプロモーターｐＧＡＬ１の制御下で見られる。このプラスミドを有する酵母の選択は、好ましくは、ウラシル栄養要求性の回復（プラスミドにおけるＵＲＡ３配列の存在）により行う。
【０１４４】
発現プラスミドにおいて得られた配列：
【化３４】
0005562647.tif 000040
【０１４５】
発現プラスミドにおいて配列決定されたＥＰＯのタンパク質配列（配列番号１２）
【化３５】
0005562647.tif 000041
エピトープＶ５  ポリ−ＨＴＳ
【０１４６】
１３．３  ＲＮＡの抽出：
酵母を１６０００ｇで５分間遠心分離する。上清を除去し、ペレットを５００μＬのＴＥＳバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５  １０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％ＳＤＳ）に再懸濁させる。２００μＬのフェノールおよび２００μＬのクロロホルムを加えた後、６５℃で２０分、５分おきにボルテックスにかけることによりインキュベートし、−８０℃で１時間インキュベートする。１３，２００ｒｐｍで２０分遠心分離した後、水相を回収し、３３５μＬのフェノールおよび６７μＬのクロロホルムを加える。ボルテックスにかけ、１１，０００ｒｐｍで５分遠心分離する。水相を回収し、３００μＬのクロロホルムを加える。ブルテックスにかけ、１３，２００ｒｐｍで２分遠心分離する。水相を回収し、３０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．２および６００μＬの無水エタノールを加える。−２０℃で１時間インキュベートする。１３，２００ｒｐｍで１５分遠心分離する。ペレットに注意しながら上清を除去する。それらを乾燥させ、１００μＬのＥＤＰＣ水に取った後、バイオレット・ヌクレオスピン（Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＲＶＡＩＩ）濾過ユニットの入った試験管に入れる。１１，０００ｇで１分遠心分離する。フィルターを取り出し、３５０μＬの７０％エタノールを加える。Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＲＮＡＩＩカラムを加える。８０００ｇで３０秒遠心分離する。このカラムを新しい試験管に入れ、３５０μＬの膜脱塩バッファーを加える。１１，０００ｇで１分遠心分離する。９５μＬのＤＮアーゼ溶液をカラムの中心に置いた後、室温で１５分インキュベートする。２００μＬのＲＡ２溶液を加え（ＤＮアーゼを不活性化する）、８，０００ｇで３０秒遠心分離する。６００μＬのＲＡ３溶液をカラムの中心に置く。８，０００ｇで３０秒遠心分離する。このカラムを新しい試験管に入れ、２５０μＬのＲＡ３溶液を加える。カラムを駆動するため、１１，０００ｇで２分遠心分離する。このカラムを１．５ｎＬ試験管に入れ、５０μＬのＤＥＰＣ水を加える。１１，０００ｇで１分遠心分離する。これらのサンプルを−８０℃で保存する。
【０１４７】
１３．４  逆転写：ＲＴ−ＰＣＲのためのスーパースクリプトＩＩＩ第一鎖合成系
５μｇのＲＮＡ                        ８μＬまで
ランダムヘキサマー  ５０ｎｇ／μＬ    １μＬ
ｄＮＴＰミックス  １０ｍＭ            １μＬ
ＤＥＰＣ水                            加えて１０μＬとする
６５℃で５分インキュベート
１０μＬの転写混合物添加：ＲＴバッファー      １０倍          ２μＬ
ＭｇＣｌ２              ２５ｍＭ        ４μＬ
ＤＴＴ                  ０．１Ｍ        ２μＬ
ＲＮアーゼアウト        ４０Ｕ／μＬ    １μＬ
スーパースクリプト      ２００Ｕ／μＬ  １μＬ
インキュベート        ２５℃で１０分
５０℃で５０分
８５℃で５分
【０１４８】
氷中に回収、１μＬのＲＮアーゼＨを加える。３７℃で２０分インキュベートした後、ｃＤＮＡを−２０℃で保存する。
【０１４９】
１３．５  タンパク質の抽出
４℃、１，５００ｇで５分遠心分離した後、細胞ペレットを５００μＬの無菌Ｈ２Ｏに取り、その後、４℃で３０秒、最大速度で遠心分離する。このペレットをリン酸ナトリウム５０ｍＭ溶解バッファーｐＨ７．４、５％グリセロール、１ｍＭ  ＰＭＳＦ  ５００μＬに取り、４℃にて１，５００ｇで１０分遠心分離する。次に、このペレットを５０〜１００の間のＯＤを得るのに必要な用量の溶解バッファーに取る。その後、これらのサンプルをガラスビーズとともに３０秒４回ボルテックスにかけ、ビーズおよび細胞残渣をタンパク質上清から分離するために最大速度で１０分遠心分離を行う。この上清に対してＢＣＡアッセイを行う。
【０１５０】
１３．６  ＥＰＯの精製：
まず、これらの全タンパク質を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌバッファー、ｐＨ６．０に対して透析する。陽イオン交換ＳＰ  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｃ５０カラムを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．０で平衡化した後、透析された全タンパク質をこのカラムにのせる。カラムを１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌバッファーｐＨ６．０ですすぎ、タンパク質を１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌバッファー  ｐＨ６．０、２５０ｍＭ  ＮａＣｌで溶出させる。各画分の吸光度を２８０ｎｍで測定するとともに、溶出したタンパク質の量をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイで測定する。その後、これらのタンパク質を１２％アクリルアミドゲルでのＳＤＳ  ＰＡＧＥ電気により分析する。
【０１５１】
１３．７  ＥＰＯタンパク質の検出−ウエスタンブロット
抗ＥＰＯ抗体(R&D Systems)による検出を用いて処理するために、全タンパク質をニトロセルロース膜に転写する。転写後、膜をブロッキング溶液（ＴＢＳ、１％ブロッキング溶液(Roche)）で１時間飽和させる。次に、膜を抗ＥＰＯ抗体溶液（１：５００希釈）と１時間接触させる。０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０−ＴＢＳで３回すすいだ後、化学発光（Roche検出溶液）による検出を用いて処理するために、膜を二次抗マウス−ＨＲＰ抗体と接触させる。
【０１５２】
１４１．結果：
１４．１：Ｏｃｈ１遺伝子にカナマイシンカセットが組み込まれたクローンの検証
Ｏｃｈ１活性の抑制に関し、酵母ゲノムにおいて影響を受けたゲノム領域をマッピングするため、導入カセットを、その組み込みの後に全配列決定した。そして、酵素活性の不在が達せられ、これまでの結果が補強され、その後、グリカンの構造を質量分析により決定する。
【０１５３】
培養培地におけるカナマイシンの存在に対して耐性を示したＳ．セレビシエクローンのゲノムＤＮＡから、ＰＣＲ反応の１％アガロース−ＴＢＥゲルに対する分析を行ったところ、カナマイシンカセットの特異的オリゴヌクレオチド対を有する２ｋｂ断片の増幅が示された。この断片の大きさはカナマイシンカセットの理論的大きさに相当する。カナマイシンカセット内部のオリゴヌクレオチドおよびＯｃｈ１遺伝子とハイブリダイズするカセットの外部のオリゴヌクレオチドによって第二の断片を増幅した。予想された断片の理論的大きさは１．５ｋｂであり、これは得られた断片の大きさに相当する。よって、本発明者らは、クローン１、２、３および４は実際にカナマイシンカセットが組み込まれており、これらはＯｃｈ１遺伝子に組み込まれていると結論付けた（図３参照）。
【０１５４】
培養培地におけるカナマイシンの存在に対して耐性を示したＳ．ポンベ株についても同じタイプのＰＣＲ反応を行った。そして、各株の２つの突然変異クローンを単離し、α１，６−マンノシルトランスフェラーゼ酵素活性の欠損を調べた。
【０１５５】
突然変異酵母株に対するマンノシルトランスフェラーゼＯｃｈ１活性の試験
Ｓ．セレビシエおよびＳ．ポンベ酵母における相同組換えにより得られた突然変異体Δｏｃｈ１におけるＯｃｈ１活性の欠損の検証：
野生型Ｓ．セレビシエおよび野生型Ｓ．ポンベ酵母におけるカナマイシン発現カセットの挿入のＰＣＲによる検証の後、この挿入に関して陽性のクローンをマンノシルトランスフェラーゼＯｃｈ１活性の欠損に関して調べた。Ｓ．セレビシエおよびＳ．ポンベ酵母のミクロソームに対してＯｃｈ１活性を調べた。図４は、ａ−Ｓ．セレビシエの野生株および選択クローンのミクロソーム画分、ｂ−Ｓ．ポンベの野生株および選択クローンのミクロソーム画分に対するＯｃｈ１活性試験を示す。図４によれば、Ｓ．セレビシエ（ａ）およびＳ．ポンベ（ｂ）の選択クローンにおけるＯｃｈ１酵素活性の欠損が見られる。
【０１５６】
Ｎ−グリカンの分析による株の検証：
両修飾株からの全タンパク質を還元およびアルキル化した後、トリプシンで消化した。ＳｅｐＰａｋ  Ｃ１８を通すことで遊離の多糖類を除去する。回収されたペプチドおよび糖ペプチドにＰＮＧアーゼ処理を施す。ＳｅｐＰａｋ  Ｃ１８でグリカンを精製し、その後、メチル化した後にＭａｌｄｉ−Ｔｏｆ様式での質量分析により分析する。図５は、ＡｄｅｌｅおよびＥｄｇａｒ株からのＮ−グリカンに対して行った質量スペクトルを示す。
酵母の呼称：
Ｓ．セレビシエΔＯｃｈ１＝Ａｄｅｌｅ
Ｓ．ポンベΔＯｃｈ１＝Ｅｄｇａｒ
【０１５７】
両株とも、Ｍａｎ７〜Ｍａｎ１０のオリゴマンノシド形態を有するＮ−グリカンを含み、サッカロミセス・セレビシエ野生株のものよりも短い形態であり、野生型ポリマンノシル化形態の欠損を示す。
【０１５８】
Ｅｄｇａｒ株（Δｏｃｈ１）の主要構造はＭａｎ９およびＭａｎ８であり、これは哺乳類において新生タンパク質が小胞体に移行した後に通常見られる構造である。これは、酵素Ｏｃｈ１がα１，６位で結合したマンノースをグラフトしたグリカンにだけマンノースをグラフトするゴルジ体マンノシルトランスフェラーゼの作用が不能であるためにグリコシル化を遮断することを示唆する。
【０１５９】
１４．２：ＵＲＡ３遺伝子にマンノシダーゼＩカセットが組み込まれたクローンの検証
遺伝子ＵＲＡ３におけるマンノシダーゼＩの発現カセットの挿入に関して陽性であるＡｄｅｌｅおよびＥｄｇａｒ酵母のマンノシダーゼＩ生化学活性を調べる。図６は、Ｓ．セレビシエおよびＳ．ポンベ酵母のミクロソームにおけるマンノシダーゼ活性のアッセイを示す。野生型Ｓ．セレビシエおよびＳ．ポンベ株では、マンノシダーゼ活性はＤＭＪにより阻害されないことが認められる。これに対して、選択株では、ＤＭＪ処置の際にマンノシダーゼ活性の有意な阻害が測定された。さらに、測定されるマンノシダーゼＩ活性が酵母のミクロソームに存在することから、この酵素が分泌経路のシス−ゴルジ／小胞体で発現することが推論され、このタンパク質のＣ末端に組み込まれたＨＤＥＬ保持シグナルが細胞系により十分認識されることを示唆する。
酵母の呼称：
Ｓ．セレビシエＡｄｅｌｅ＋マンノシダーゼＩ＝Ａｍｅｌｉｅ
Ｓ．ポンベＥｄｇａｒ＋マンノシダーゼＩ＝Ｅｍｍａ
【０１６０】
１４．３  修飾酵母においてＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ）カセットが組み込まれたクローンの検証
図７は、野生型および修飾酵母のミクロソームにおけるＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性を示す。
【０１６１】
Ａｍｅｌｉｅ−ＧｌｃＮａｃＴＩおよびＥｍｍａ−ＧｌｃＮａｃＴＩ酵母のミクロソームまたは画分において、対照酵母（野生型および／またはΔｏｃｈ１−ＭｄｓｅＩ酵母）で見られる標識と比較して、放射性ＧｌｃＮＡｃ基の転移によるアクセプターの標識に増加が見られる。この転移はＧｌｃＮＡｃＴＩの発現により修飾された酵母におけるＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ活性の存在を含む。
修飾酵母の呼称：
Ｓ．セレビシエＡｍｅｌｉｅ＋ＧｌｃＮＡｃＴＩ＝Ａｇａｔｈｅ
Ｓ．ポンベＥｍｍａ＋ＧｌｃＮＡｃＴＩ＝Ｅｇｅｅ
【０１６２】
１４．４  修飾酵母においてＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体のカセットが組み込まれたクローンの検証
ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体の発現は、親酵母または修飾酵母培養物に対するＲＴ−ＰＣＲにより分析した。全抽出ＲＮＡに対する逆転写工程の後、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体の特異的プライマーを用いることによるＰＣＲ（ネストＰＣＲ）によってこれらのｃＤＮＡを分析した。よって、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体発現カセットによって修飾された酵母では、この輸送体のｍＲＮＡの発現が見られる（図８）。
修飾酵母の呼称：
Ｓ．セレビシエＡｇａｔｈｅ＋ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体＝Ａｒｉｅｌｌｅ
Ｓ．ポンベＥｇｅｅ＋ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体＝Ｅｒｉｋａ
【０１６３】
１４．５  修飾酵母におけるマンノシダーゼＩＩカセットが組み込まれたクローンの検証
ａ−ＰＣＲ増幅による検証
酵母ゲノムにおいてマンノシダーゼＩＩの発現カセットの存在を確認するために、Ｓ．セレビシエおよびＳ．ポンベの選択クローンをＰＣＲにより調べた。
【０１６４】
ｂ−マンノシダーゼＩＩの発現
マンノシダーゼＩＩの発現は、親酵母または修飾酵母培養物に対するＲＴ−ＰＣＲにより分析した。抽出ＲＮＡに対する逆転写工程の後、マンノシダーゼＩＩの特異的プライマーを用いることによるＰＣＲ（ネストＰＣＲ）によってこれらのｃＤＮＡを分析した。よって、マンノシダーゼＩＩ発現カセットにより修飾された酵母では、このタンパク質のｍＲＮＡの発現が見られる。
【０１６５】
ｃ−マンノシダーゼＩＩの活性の測定
マンノシダーゼＩＩの発現カセットの挿入に関して陽性のＡｄｅｌｅおよびＥｄｇａｒ酵母をそれらのマンノシダーゼＩＩ生化学活性に関して調べる。
図９によれば、親Ｓ．セレビシエおよびＳ．ポンベ株では、スウェインソニン(swainsonine)の阻害作用に非感受性のマンノシダーゼ活性が見られる。これに対し、選択株はスウェインソニンで処理した際に有意なマンノシダーゼＩＩ活性阻害が測定された。さらに、ゴルジ体酵母画分でも測定マンノシダーゼ活性が検出されるので、この酵素は分泌経路のゴルジ体系で適切に発現されると推測できる。
修飾酵母の呼称：
Ｓ．セレビシエＡｒｉｅｌｌｅ＋マンノシダーゼＩＩ＝Ａｎａｉｓ
Ｓ．ポンベＥｒｉｋａ＋マンノシダーゼＩＩ＝Ｅｎｒｉｑｕｅ
【０１６６】
１４．６  修飾酵母におけるＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩカセット（ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ）が組込まれたクローンの検証
ａ−ＰＣＲ増幅による検証
酵母ゲノムにおいてＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩの発現カセットの存在を確認するために、Ｓ．セレビシエおよびＳ．ポンベの選択クローンをＰＣＲにより調べた（結果は示さず）。
【０１６７】
ｂ−ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩの発現
ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩの発現は、親酵母または修飾酵母培養物に対するＲＴ−ＰＣＲにより分析した。抽出ＲＮＡに対する逆転写工程の後、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩの特異的プライマーを用いることによるＰＣＲ（ネストＰＣＲ）によってこれらのｃＤＮＡを分析した。よって、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ発現カセットにより修飾された酵母では、転写されたｍＲＮＡの発現が見られる（結果は示さず）。
修飾酵母の呼称：
Ｓ．セレビシエＡｎａｉｓ＋ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ＝Ａｌｉｃｅ
Ｓ．ポンベＥｎｒｉｑｕｅ＋ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ＝Ｅｌｇａ
【０１６８】
１４．７  ガラクトシルトランスフェラーゼＩカセットが組込まれたクローンの検証
ａ−ＰＣＲ増幅による検証
酵母ゲノムにおいてＧａｌＴＩの発現カセットの存在を確認するために、Ｓ．セレビシエおよびＳ．ポンベの選択クローンをＰＣＲにより調べた（結果は示さず）。
ｂ−ガラクトシルトランスフェラーゼＩの発現
ＧａｌＴＩの発現は、親酵母または修飾酵母培養物に対するＲＴ−ＰＣＲにより分析した。抽出ＲＮＡに対する逆転写工程の後、ＧａｌＴＩの特異的プライマーを用いることによるＰＣＲ（ネストＰＣＲ）によってこれらのｃＤＮＡを分析した。よって、ＧａｌＴＩ発現カセットにより修飾された酵母では、転写されたｍＲＮＡの発現が見られる（結果は示さず）。
ｃ−ＧａｌＴＩの活性
修飾酵母の全タンパク質の抽出後、２μｇのタンパク質をニトロセルロース膜にのせる。次に、この膜をビオチンと結合されたエリスリナ・クリスタガリー(erythrina cristagalli)レクチン（糖タンパク質のグリカン上に存在するＧａｌ−β−１，４−ＧｌｃＮＡｃ単位のガラクトースを特異的に認識するレシチン）とともにインキュベートする。化学発光による検出（Roche検出溶液）を用いて進行させるために、この膜をホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）と結合されたストレプトアビジンと接触させる。
【０１６９】
１４．８  ＧＤＰ−フコース輸送体のカセットが組み込まれたクローンの検証
ａ−ＰＣＲ増幅による検証
酵母ゲノムにおいてＧＤＰ−フコース輸送体の発現カセットの存在を確認するために、Ｓ．セレビシエおよびＳ．ポンベの選択クローンをＰＣＲにより調べた。
ｂ−ＧＤＰ−フコース輸送体の発現
ＧＤＰ−フコース輸送体の発現は、親または修飾酵母培養物に対するＲＴ−ＰＣＲにより分析した。抽出ＲＮＡに対する逆転写工程の後、ＧＤＰ−フコース輸送体の特異的プライマーを用いることによるＰＣＲ（ネストＰＣＲ）によってこれらのｃＤＮＡを分析した。よって、ＧＤＰ−フコース輸送体発現カセットにより修飾された酵母では、転写されたｍＲＮＡの発現が見られる（図１０）。
修飾酵母の呼称：
Ｓ．セレビシエＡｎａｉｓ＋ＧＤＰ−フコース輸送体＝Ａｐｏｌｌｉｎｅ
Ｓ．ポンベＥｎｒｉｑｕｅ＋ＧＤＰ−フコース輸送体＝Ｅｐｉｐｈａｎｉｅ
【０１７０】
１４．９  フコシルトランスフェラーゼ８（ＦＵＴ８）のカセットが組み込まれたクローンの検証
ａ−ＰＣＲ増幅による検証
酵母ゲノムにおいてＦＵＴ８の発現カセットの存在を確認するために、Ｓ．セレビシエおよびＳ．ポンベの選択クローンをＰＣＲにより調べた。
ｂ−ＦＵＴ８の発現
ＦＵＴ８の発現は、親酵母または修飾酵母培養物に対するＲＴ−ＰＣＲにより分析した。抽出ＲＮＡに対する逆転写工程の後、ＦＵＴ８の特異的プライマーを用いることによるＰＣＲ（ネストＰＣＲ）によってこれらのｃＤＮＡを分析した。よって、ＦＵＴ８発現カセットにより修飾された酵母では、転写されたｍＲＮＡの発現が見られる（結果は示ず）。
修飾酵母の呼称：
Ｓ．セレビシエＡｐｏｌｌｉｎｅ＋ＦＵＴ８＝Ａｓｈｌｅｙ
Ｓ．ポンベＥｐｉｐｈａｎｉｅ＋ＦＵＴ８＝Ｅｓｔｈｅｒ
【０１７１】
１４．１０  Ａｍｅｌｉｅ株におけるＥＰＯ発現の特定の場合
Ａｍｅｌｉｅ株は、哺乳類に見られる、単純型のグリカンと言われている構造Ｎ−グリカンＭａｎ５ＧｌｃＮＡｃ２（図１１）を排他的に産生する能力を有し、ガラクトース、フコースまたはシアル酸を有するより複雑なグリカンを構成する基礎として用いられる。この株における各ゲノム修飾の存在は上記されている。これらの各ステップは、最良の生産クローンを選択することと利用可能なクローンを得るために変異率（％）を最大化することからなる「一括の（package）」確認作業に入る。使用される方法はゲノム修飾手順の完全な制御を可能とし、組み込まれる配列は、将来の組み込みの標的ゲノム領域と同様、完全に既知である。この部位についてさらに可能性のある破断の影響に関して詳細な検討を行うのであるが、これはなぜその標的全体が最終的にそれらの破断後に得られた表現型への影響の不在に関して選択されるかという理由である。
【０１７２】
生産クローンのゲノム安定性を追跡する全手順を行い、各生産の後、これらのクローンをそれらの選択に最初に用いた強力な培地上に定期的に移植し、検証手順を再開する。総ての発現カセットをクローニングし、ある株のゲノム再配列の場合には、その生物の遺伝的改良で進めることができるようにする。カセットを組み込む手順は標準化せず、使用者が指示した通りの特定のグリコシル化を達成するために、「オンデマンド」株の生産を推測することができる。
【０１７３】
Ａｍｅｌｉｅ株は、ヒト化ハイブリッドまたは複合体グリカンを生産することを意図した他の任意の株を生産するための基礎として使用すべきクローンである。
【０１７４】
修飾酵母におけるＥＰＯの発現に用いられるプラスミドは、プロモーターＧａｌ１を含む。このプロモーターはＳ．セレビシエにおいて知られている最も強力なプロモーターの１つであり、現在、組換えタンパク質を生産するために用いられている。このプロモーターはガラクトースにより誘導され、グルコースにより抑制される。実際、グリセロール中でのＳ．セレビシエ酵母の培養では、ガラクトースを添加すると、ＧＡＬ遺伝子が約１，０００倍誘導される。ガラクトースの存在下でこの培養物にグルコースを添加すれば、ＧＡＬ遺伝子はもはや誘導されず、ガラクトース単独で得られるレベルの１％のみとなる(Johnston, M. (1987) Microbiol. Rev.)。本発明者らのプラスミドではヒトＥＰＯの組込み配列は、５’において、エピトープＶ５ならびに産生されたタンパク質の検出および精製を容易にするためのポリヒスチジンタグを付加することによって修飾された。
【０１７５】
ヒトＥＰＯを生産するために用いられる酵母は、まず、ウラシルを除いたＹＮＢ培地、２％グルコース中で、ＯＤ＞１２となるまで培養する。培養２４〜４８時間後、本発明者らの目的タンパク質の生産を誘発するため、培養物に２％ガラクトースを加える。誘導０、６、２４および４８時間後にサンプルを採取する。
【０１７６】
修飾酵母におけるＥＰＯのｍＲＮＡの発現
全抽出ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析は、ガラクトースによる誘導を欠いた修飾酵母において見られるもの（図１２のバンド２および４）とは異なり、ガラクトースによる誘導後に形質転換した酵母のクローンでは、メッセンジャーＲＮＡまたはＥＰＯの発現を示す（図１２のバンド１および３）。よって、ガラクトースの存在はＥＰＯ遺伝子の転写を誘発する。この増幅断片の配列決定により、適正なｍＲＮＡの産生が確認される。
【０１７７】
修飾酵母において発現されたＥＰＯタンパク質の精製
次に、ガラクトースによるｒｈｕＥＰＯタンパク質の発現の誘導の後に得られた全タンパク質を、ｐＨ６に平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｃ５０樹脂にのせる。カラムの出口において２８０ｎｍの吸光度を測定する（図１３）。カラムから溶出したタンパク質を１２％アクリルアミドゲル上のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により分析する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの泳動後、クーマシーブルー染色（図１４）かウエスタンブロットによりタンパク質の分析を行う。この場合、抗ＥＰＯ抗体(R&D Systems)による検出を行うために、タンパク質をニトロセルロース膜に転写する。
【０１７８】
図１５は、約３５ｋＤａにタンパク質が存在することを示している。このタンパク質はクーマシーブルー染色の主要タンパク質であり、ウエスタンブロット分析における抗ＥＰＯ抗体によっても明らかである（カラム出口での試験管２９）。
【０１７９】
よって、これら総ての結果は遺伝的に修飾された酵母によるＥＰＯタンパク質の生産を示す。
【図１】
0005562647.tif 000045
【図２】
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【図５】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
0005562647.tif 000054
【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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