(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
パピローマウイルスの少なくとも２つの単離体に由来する少なくとも２つのパピローマウイルスＬ２相同免疫原性ペプチドを含む単離ポリペプチド組成物であって、第１の免疫原性ペプチドが、パピローマウイルスの第２の単離体に由来する第２の相同免疫原性ペプチドに機能可能に結合された単離ポリペプチド組成物。
【請求項２】
免疫原性ペプチドが直線状に配置された、請求項１に記載のポリペプチド組成物。
【請求項３】
免疫原性ペプチドがリンカー部分を介して機能可能に結合された、請求項１に記載のポリペプチド組成物。
【請求項４】
融合タンパク質である、請求項１に記載のポリペプチド組成物。
【請求項５】
融合タンパク質が免疫原性ペプチドと連結したペプチドリンカーを含む、請求項４に記載のポリペプチド組成物。
【請求項６】
免疫原性ペプチドの複数のコピーを含む、請求項１に記載のポリペプチド組成物。
【請求項７】
パピローマウイルスが、α、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ、ι、κ、λ、μ、ν、ξ、ο、及びπパピローマウイルスから選択されるパピローマウイルス属に属する、請求項１に記載のポリペプチド組成物。
【請求項８】
パピローマウイルスがヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）である、請求項１に記載のポリペプチド組成物。
【請求項９】
ＨＰＶが皮膚感染型ＨＰＶである、請求項８に記載のポリペプチド組成物。
【請求項１０】
ＨＰＶが粘膜感染型高リスクＨＰＶである、請求項８に記載のポリペプチド組成物。
【請求項１１】
免疫原性ペプチドが、ＨＰＶ１、ＨＰＶ２、ＨＰＶ３、ＨＰＶ４、ＨＰＶ５、ＨＰＶ６、ＨＰＶ７、ＨＰＶ８、ＨＰＶ９、ＨＰＶｌ０、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１２、ＨＰＶ１３、ＨＰＶ１４、ＨＰＶ１５、 ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１７、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ１９、ＨＰＶ２０、ＨＰＶ２１、ＨＰＶ２２、ＨＰＶ２３、ＨＰＶ２４、ＨＰＶ２５、ＨＰＶ２６、ＨＰＶ２７、ＨＰＶ２８、ＨＰＶ２９、ＨＰＶ３０、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３２、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３４、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３６、ＨＰＶ３７、ＨＰＶ３８、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４０、ＨＰＶ４１、ＨＰＶ４２、ＨＰＶ４３、ＨＰＶ４４、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ４６、ＨＰＶ４７、ＨＰＶ４８、ＨＰＶ４９、ＨＰＶ５０、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５３、ＨＰＶ５４、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５７、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６０、ＨＰＶ６１、ＨＰＶ６２、ＨＰＶ６３、ＨＰＶ６４、ＨＰＶ６５、ＨＰＶ６６、ＨＰＶ６７、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ６９、ＨＰＶ７０、ＨＰＶ７１、ＨＰＶ７２、ＨＰＶ７３、ＨＰＶ７４、ＨＰＶ７５、ＨＰＶ７６、ＨＰＶ７７、ＨＰＶ７８、ＨＰＶ７９、ＨＰＶ８０、ＨＰＶ８１、ＨＰＶ８２、ＨＰＶ８３、ＨＰＶ８４、ＨＰＶ８５、ＨＰＶ８６、ＨＰＶ８７、ＨＰＶ８８、ＨＰＶ８９、ＨＰＶ９０、ＨＰＶ９１、ＨＰＶ９２、ＨＰＶ９３、ＨＰＶ９４、ＨＰＶ９５、ＨＰＶ９６、ＨＰＶ９７、ＨＰＶ９８、ＨＰＶ９９、及びＨＰＶ１００ポリペプチドのうちから選択される１又は２以上の免疫原性ＨＰＶペプチドである、請求項８に記載のポリペプチド組成物。
【請求項１２】
免疫原性ペプチドが、ＨＰＶ１、ＨＰＶ２、ＨＰＶ５、ＨＰＶ６、ＨＰＶ８、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ７３及びＨＰＶ８２ペプチドのうちから選択される１又は２以上の免疫原性ＨＰＶペプチドである、請求項８に記載のポリペプチド組成物。
【請求項１３】
免疫原性ペプチドが、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５６及びＨＰＶ７３ポリペプチドのうちから選択される１又は２以上の免疫原性ＨＰＶペプチドである、請求項８に記載のポリペプチド組成物。
【請求項１４】
免疫原性ペプチドが、ＨＰＶ１、ＨＰＶ５、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１６、及びＨＰＶ１８ポリペプチドのうちから選択される１又は２以上の免疫原性ＨＰＶペプチドである、請求項８に記載のポリペプチド組成物。
【請求項１５】
免疫原性ペプチドが、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１６、及びＨＰＶ１８ペプチドのうちから選択される１又は２以上の免疫原性ＨＰＶペプチドである、請求項８に記載のポリペプチド組成物。
【請求項１６】
免疫原性ペプチドが、配列番号１のアミノ酸位置１３〜４５、１７〜３６、１〜８８、１１〜８８、又は１１〜２００に相当する、請求項１１に記載のポリペプチド組成物。
【請求項１７】
少なくとも１つの免疫原性ペプチドがＨＰＶ１６ Ｌ２ペプチドである、請求項８に記載のポリペプチド組成物。
【請求項１８】
少なくとも１つの免疫原性ペプチドがＨＰＶ１８ Ｌ２ペプチドである、請求項８に記載のポリペプチド組成物。
【請求項１９】
少なくとも１つの免疫原性ペプチドがＨＰＶ６ Ｌ２ペプチドである、請求項８に記載のポリペプチド組成物。
【請求項２０】
少なくとも１つの免疫原性ペプチドがＨＰＶ４５ Ｌ２ペプチドである、請求項８に記載のポリペプチド組成物。
【請求項２１】
少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、又は２３個以上の免疫原性ペプチドを含む、請求項８に記載のポリペプチド組成物。
【請求項２２】
少なくとも３つの免疫原性ペプチドを含む、請求項８に記載のポリペプチド組成物。
【請求項２３】
少なくとも５つの免疫原性ペプチドを含む、請求項８に記載のポリペプチド組成物。
【請求項２４】
少なくとも２０個の免疫原性ペプチドを含む、請求項８に記載のポリペプチド組成物。
【請求項２５】
少なくとも１つの免疫原性ペプチドがＨＰＶ１６ Ｌ２ペプチドである、請求項２２に記載のポリペプチド組成物。
【請求項２６】
少なくとも１つの免疫原性ペプチドがＨＰＶ１８ Ｌ２ペプチドである、請求項２２に記載のポリペプチド組成物。
【請求項２７】
少なくとも１つの免疫原性ペプチドがＨＰＶ６ Ｌ２ペプチドである、請求項２２に記載のポリペプチド組成物。
【請求項２８】
少なくとも１つの免疫原性ペプチドがＨＰＶ４５ Ｌ２ペプチドである、請求項２２に記載のポリペプチド組成物。
【請求項２９】
第１の免疫原性ペプチドがＨＰＶ１６ Ｌ２ペプチドであり、第２の免疫原性ペプチドがＨＰＶ１８ Ｌ２ペプチドである、請求項２２に記載のポリペプチド組成物。
【請求項３０】
第１の免疫原性ペプチドがＨＰＶ１６ Ｌ２ペプチドであり、第２の免疫原性ペプチドがＨＰＶ６ Ｌ２ペプチドである、請求項２２に記載のポリペプチド組成物。
【請求項３１】
第１の免疫原性ペプチドがＨＰＶ１８ Ｌ２ペプチドであり、第２の免疫原性ペプチドがＨＰＶ６ Ｌ２ペプチドである、請求項２２に記載のポリペプチド組成物。
【請求項３２】
第１の免疫原性ペプチドがＨＰＶ１６ Ｌ２ペプチドであり、第２の免疫原性ペプチドがＨＰＶ１８ Ｌ２ペプチドであり、第３の免疫原性ペプチドがＨＰＶ６ Ｌ２ペプチドである、請求項２２に記載のポリペプチド組成物。
【請求項３３】
免疫原性ペプチドが配列番号７１〜９２、９４〜１０６、及び１１０〜１１２から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項８に記載のポリペプチド組成物。
【請求項３４】
パピローマウイルスの少なくとも２つの単離体に由来する少なくとも２つのパピローマウイルスＬ２相同免疫原性ペプチドを含む単離ポリペプチド組成物であって、第１の免疫原性ペプチドが、パピローマウイルスの第２の単離体に由来する第２の相同免疫原性ペプチドに機能可能に結合され、前記Ｌ２ペプチドが、配列番号９３、１０７、１０８、１０９、１１３、又は１１４のアミノ酸配列を含む、単離ポリペプチド組成物。
【請求項３５】
ＨＰＶ Ｌ２でないペプチドをさらに含む、請求項８に記載のポリペプチド組成物。
【請求項３６】
ＨＰＶ Ｌ２でないペプチドが、ＨＰＶ Ｌ１ペプチド又はＨＰＶ Ｌ１タンパク質である、請求項３５に記載のポリペプチド組成物。
【請求項３７】
ＨＰＶ Ｌ２でないペプチドが、Ｔｈ活性化エピトープ、担体タンパク質、又はアジュバントである、請求項３５に記載のポリペプチド組成物。
【請求項３８】
請求項１に記載のポリペプチド組成物を含むキット。
【請求項３９】
請求項１に記載のポリペプチド組成物をコードする核酸。
【請求項４０】
請求項１に記載の単離ポリペプチド組成物を含む、パピローマウイルスに対する免疫応答の誘導用製剤。
【請求項４１】
免疫応答が液性免疫応答である、請求項４０に記載の製剤。
【請求項４２】
請求項１に記載のポリペプチド組成物を含む、パピローマウイルス感染症の予防用製剤。
【請求項４３】
請求項１に記載の複数型ポリペプチド組成物を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００７年１１月２日出願の米国仮特許出願第６１／００１，６３０号及び第６１／００１，６２９号の優先権を主張し、これらの仮出願全体が参照によって本明細書に組み込まれている。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）による助成金番号Ｐ５０ ＣＡ ０９８２５２の交付を受け、米国政府の支援を得てなされた。米国政府は本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
本発明の実施形態は全般的に、生物学及び医学に関する。本発明は特定の実施形態において、複数種ＨＰＶポリペプチドを用いた組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
生殖器親和性ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染症は、米国で最も一般的な性感染症であるとみなされている（CDC Report to Congress, Prevention of Genital Human Papillomavirus Infection, January 2004）。肛門生殖器ＨＰＶの主要な症状は、外陰部、子宮頸部、肛門、又は陰茎の生殖器疣贅（尖圭コンジローマ）及びそれら部位の上皮内癌を含む。高リスクな持続性ＨＰＶ感染はほんのわずかなものでも、治療せずに放置すれば癌化する（例えば、子宮頸癌、時に頭頸部癌、ある種の非黒色腫皮膚癌）。世界の子宮頚癌の９９．７％でＨＰＶ ＤＮＡの存在が報告されており、ＨＰＶ感染がこの癌の必要原因であること及び、予防的ＨＰＶ感染ワクチン接種によりこの疾患を予防できることが示唆される（Walboomers et al., 1999）。
【０００５】
生殖器疣贅に加えて、ＨＰＶ感染により尋常性疣贅、足底疣贅、又は扁平疣贅を発症しうる。疣贅は、原因となるＨＰＶ型及び感染する上皮に応じて異なる形で存在しうる。尋常性疣贅（verruca vulgaris）は通常手に、肌色ないし茶色の外方増殖性の角化性丘疹として発症する。足底疣贅（verruca plantaris）は足の裏に発症し、かなりの疼痛を生じうる。これらの疣贅は、その表面層を取り除き血栓を生じた毛細血管を露出させることで胼胝と区別しうる。平ら、すなわち扁平な疣贅（verruca plana）は、小児に最もよく見られ、顔、首、胸、並びに、前腕及び脚の屈側面に発症しうる。
【０００６】
１００を超えるＨＰＶ亜型のうち約３５の亜型が肛門生殖器上皮に特異的であり、多様な悪性形質転換の可能性を秘めている（Munoz et al., 2003）。１５の発癌性生殖器ＨＰＶ型のうち、ＨＰＶ１６が最も一般的であり、ＨＰＶ１８及びＨＰＶ４５がそれに続く（それぞれ、〜５０％、〜２０％、〜１０％の子宮頸癌症例の原因となっている）。子宮頸部細胞診スクリーニングプログラムの実施による、子宮頸癌の発症率及び死亡率を減少させる公衆衛生上の取組みの成功にもかかわらず、浸潤性癌患者のほとんどが定期的にスクリーニングを受けない女性であり（Hoffman and Cavanagh, 1995）、子宮頸癌は依然として、女性のがんによる死亡原因として世界で第２位であり、サハラ以南のアフリカ、中央アメリカ、南・中央アジアとメラネシア（西太平洋西部からアラフラ海、オーストラリア北部及び北東部にまで広がるオセアニアの小地域（subregion）；この用語は最初は、ポリネシア及びミクロネシアと区別される民族的・地理的諸島群を指すのに用いられた）の女性に最も高頻度にみられる癌である（Parkin, 2001）。毎年約４７１０００の症例が浸潤性子宮頸癌と診断されている（Parkin, 2001）。
【０００７】
ＨＰＶゲノムは６０ｎｍの非エンベロープ型正二十面体カプシドに被覆されており（Baker et al., 1991）、このカプシドにはメジャーカプシドタンパク質Ｌ１及びマイナーカプシドタンパク質Ｌ２という２つの遺伝的関係のないタンパク質が含まれる。組換え型Ｌ１はウイルス様粒子（ＶＬＰ）へと自己集成し、それら粒子は形態学的及び免疫学的に、天然型のビリオンと類似する（Kirnbauer et al., 1992）。Ｌ１ ＶＬＰに基づくワクチンは、免疫原を得るために用いられたパピローマウイルス型に対応する感染症に対し高い防御性を示す（同種ワクチン）が、きわめて近縁なＨＰＶ型以外には効果がない（Roden et al., 2000）。認可されているＨＰＶワクチンはこの障害を、多価ワクチン製剤の設計により回避する；CERVARIX（商標）はＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８に由来するＬ１ ＶＬＰを含有し、一方でGARDASIL（商標）もまた、良性の生殖器疣贅の予防のためにＨＰＶ６及びＨＰＶ１１のＬ１ ＶＬＰを含有する。残念ながら、これらＬ１ ＶＬＰワクチンの費用及び冷凍の必要性のため、現在のところ、それらワクチンが最も必要とされる、発展途上地域及び遠隔地での使用は非現実的である。さらに、これらのワクチンはかなりの割合の発癌性ＨＰＶ型に対して効果がないため、依然として高価な細胞診スクリーニングプログラムが必要とされる。ＨＰＶ予防可能性を世界的に最大限実現するためには、ワクチンは安全かつ効果的であり、遠隔地への輸送を容易にするため常温で安定し、製造が安価に済み、針なしに投与され、好ましくは単回投与製剤で入手可能であることが望まれる。多様なＨＰＶ型から生じる疾患の重荷は、広範な防御性を持つワクチンの必要性を示唆する。したがって、さらなる交差中和ＨＰＶワクチンが必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Walboomers et al., J. Pathol., 189:12-19, 1999.
【非特許文献２】Munoz et al., N. Engl. J. Med., 348(6):518-27, 2003.
【非特許文献３】Hoffman and Cavanagh, Cancer Control, 2:503-509, 1995.
【非特許文献４】Parkin, Lancet. Oncol., 2:533-543, 2001.
【非特許文献５】Baker et al., Biophys. J., 60:1445-1456, 1991.
【非特許文献６】Kirnbauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89(24):12180-4, 1992.
【非特許文献７】Roden et al., Virology, 270:254-257, 2000.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の実施形態は、複数型ペプチド組成物に関する。本発明の他の実施形態は、免疫原やワクチンとしてのこれらの複数型ペプチド組成物の使用に関する。本発明の複数型ペプチド組成物は２つ以上のペプチド（免疫原性ペプチド、すなわち、患者の免疫応答を誘導するペプチド）を含有し、これらのペプチドは、病原性生物のアイソタイプ若しくは型を表すペプチドであるか、又は、生物が持つ固有の免疫原性ペプチドである。これら生物は、標的生物の型若しくは変異体、生物の１属、又は生物の１科でありうる。他の態様において、これらペプチドは特定の病原性生物（例えば、ＨＰＶ及びＨＳＶ）に由来するものでありうる。いくつかの態様において、これら特定の病原性生物は、感染方法（例えば、性感染症（ＳＴＤ））、又は、感染臓器若しくは感染器官系（例えば、生殖器系、皮膚等）により関連付けられる。ある態様において、前記複数型ペプチド組成物は、生物の多様な変異体や型に由来する多数のペプチドを含むものでありえ、広範な交差中和免疫応答を付与する。複数のＨＰＶ型の交差中和は、そうした交差中和複数型ペプチド組成物の１例であると言える。別の態様において、複数型ペプチド組成物は多様な病原体に由来するペプチドを含有しうる。かかる病原体とは、性感染症ウイルス、細菌、又は真菌などであり、パピローマウイルス（ＰＶ）、ＨＰＶ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス、Ｂ型肝炎、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ／ＡＩＤＳ）、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ/ＨＨＶ８）、軟性下疳（ヘモフィルス・デュクレイ（Haemophilus ducreyi））、ドノヴァン症（鼠径肉芽腫（Granuloma inguinale）又はカリマトバクテリウム・グラヌロマティス（Calymmatobacterium granulomatis））、淋病（ナイセリア・ゴノレエ（Neisseria gonorrhoeae））、鼠径リンパ肉芽腫（ＬＧＶ）（クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）） 、非淋菌性尿道炎（ＮＧＵ）（
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（Ureaplasma urealyticum）又はマイコプラズマ・ホミニス（Mycoplasma hominis））、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、梅毒（トレポネーマ・パリダム（Treponema pallidum））などを含むが、これに限られるものではない。
【００１０】
ＨＰＶは、本明細書に記載された複数型ペプチド組成物を使用することにより、標的となりうる生物の１例である。ＨＰＶ感染は、世界のヒト癌の５％の原因である。細胞診（Ｐａｐ）スクリーニングは、子宮頸癌の切除可能な前駆病変を同定する。認可ワクチンGARDASIL（商標）（Merck社製）及びCERVARIX（商標）（GSK社製）に関して記載されたように、ＨＰＶ感染予防によってＨＰＶ関連癌とその前駆病変が除外される。しかしながら、これら認可ワクチンはＬ１カプシドタンパク質に由来し、発癌性ＨＰＶ型のサブセットのみを標的とする（したがって、Ｐａｐスクリーニングプログラムが依然として必要とされる）。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、複数型ＨＰＶ Ｌ２ペプチド組成物の投与に基づく、広く良性及び発癌性ＨＰＶ感染性並びにそれらの続発症（sequelae）を予防するための組成物及び方法について述べる。この複数型ＨＰＶ Ｌ２ペプチド組成物は、２つ以上のＨＰＶ型に由来するポリペプチド断片を複数含む。これら断片又はペプチドは、相同ポリペプチド（すなわち、あるポリペプチドと機能的に等価な、別の型又は変異体生物に由来するポリペプチド）の対応領域に由来するか、或いは、相同ポリペプチドの別の断片に由来するか、或いは、別の型の別のポリペプチドに由来しうる。これらポリペプチド断片（又はペプチド）は、融合タンパク質、リポソーム、ナノ粒子、ポリマー、又はペプチドデンドリマー（分岐ポリペプチド）として連結又は製造することによって  複数型ペプチド組成物として構成される。
【００１２】
特定の実施形態において、単離ポリペプチド組成物は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、又は２００以上の特定の単離体若しくは型又は感染生物に由来する対応ポリペプチド又は相同ポリペプチドの、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、又は２００個以上の免疫原性ペプチドを含み、第１のポリペプチドの第１のペプチドのアミノ酸配列を含む第１の免疫原性ペプチドが、第２のポリペプチドに由来する第２の対応又は相同免疫原性ペプチドに機能可能に結合される。「機能可能に結合される」とは、あるペプチドを第２のペプチドと直接的又は間接的に連結することを意味する。たとえば、官能基が、かかる官能基の一部分で直接的に第１のペプチド又は表面に結合され、前記一部分がまた第２のポリペプチドにも結合されるということは可能である（例えば、ペプチド結合）。また官能基が、かかる官能基とペプチド又は表面とを結合する中間成分を経由して、ペプチド又は表面と結合されるということも可能である。このような中間成分はリンカーと呼ばれることが多い。リンカーは二官能性分子であり、第１のペプチドと化学的に結合する部分及び官能基と化学的に結合する第２の部分を持ちうる。任意の数の中間成分が本発明に包含され、それらは当業者に公知である。
【００１３】
一実施形態において、本発明者らは多様なＰＶ型による感染性の予防のための複数型ＰＶペプチド組成物について述べる。特定の態様において、複数型ＰＶペプチド組成物は、別々のＰＶ型に由来する２つ以上のＰＶタンパク質断片又は免疫原性ペプチドが、直線（コンカテマー）又は分岐ポリペプチド構造として構成されたものを含む非天然ポリペプチドであり、複数型ＰＶ Ｌ２ポリペプチドである。このＰＶ Ｌ２ペプチドは、パポバウイルス科、ポリオーマウイルス科、パピローマウイルス科のウイルス、並びに／或いは、α、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ、ι、κ、λ、μ、ν、ξ、ο、又はπ属のパピローマウイルス（de Villiers et al., Classification of papillomaviruses. Virology. 2004 Jun 20;324(1):17-27参照）、並びに／或いは、ヒトパピローマウイルスであるＨＰＶ１、ＨＰＶ２、ＨＰＶ３、ＨＰＶ４、ＨＰＶ５、ＨＰＶ６、ＨＰＶ７、ＨＰＶ８、ＨＰＶ９、ＨＰＶｌ０、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１２、ＨＰＶ１３、ＨＰＶ１４、ＨＰＶ１５、 ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１７、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ１９、ＨＰＶ２０、ＨＰＶ２１、ＨＰＶ２２、ＨＰＶ２３、ＨＰＶ２４、ＨＰＶ２５、ＨＰＶ２６、ＨＰＶ２７、ＨＰＶ２８、ＨＰＶ２９、ＨＰＶ３０、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３２、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３４、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３６、ＨＰＶ３７、ＨＰＶ３８、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４０、ＨＰＶ４１、ＨＰＶ４２、ＨＰＶ４３、ＨＰＶ４４、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ４６、ＨＰＶ４７、ＨＰＶ４８、ＨＰＶ４９、ＨＰＶ５０、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５３、ＨＰＶ５４、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５７、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６０、ＨＰＶ６１、ＨＰＶ６２、ＨＰＶ６３、ＨＰＶ６４、ＨＰＶ６５、ＨＰＶ６６、ＨＰＶ６７、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ６９、ＨＰＶ７０、ＨＰＶ７１、ＨＰＶ７２、ＨＰＶ７３、ＨＰＶ７４、ＨＰＶ７５、ＨＰＶ７６、ＨＰＶ７７、ＨＰＶ７８、ＨＰＶ７９、ＨＰＶ８０、ＨＰＶ８１、ＨＰＶ８２、ＨＰＶ８３、ＨＰＶ８４、ＨＰＶ８５、ＨＰＶ８６、ＨＰＶ８７、ＨＰＶ８８、ＨＰＶ８９、ＨＰＶ９０、ＨＰＶ９１、ＨＰＶ９２、ＨＰＶ９３、ＨＰＶ９４、ＨＰＶ９５、ＨＰＶ９６、ＨＰＶ９７、ＨＰＶ９８、ＨＰＶ９９、ＨＰＶ１００、ＨＰＶ１０１、ＨＰＶ１０２、ＨＰＶ１０３、ＨＰＶ１０４、ＨＰＶ１０５、ＨＰＶ１０６、ＨＰＶ１０７、ＨＰＶ１０８、ＨＰＶ１０９、ＨＰＶ１１０、ＨＰＶ１１１、並びに／或いは、動物パピローマウイルスであるウシパピローマウイルス１型（ＢＰＶ１）、ウシパピローマウイルス２型（ＢＰＶ２）、ウシパピローマウイルス４型（ＢＰＶ４）、ワタオウサギパピローマウイルス（ＣＲＰＶ）、シカパピローマウイルス（ＤＰＶ）、ヨーロッパオオシカパピローマウイルス（ＥＥＰＶ）、イヌ口腔パピローマウイルス（ＣＯＰＶ）、アカゲザルパピローマウイルス（ＲｈＰＶ）及びウサギ口腔パピローマウイルス（ＲＯＰＶ）のＬ２タンパク質のアミノ酸配列の全部または一部を含みうる。
【００１４】
本発明のＰＶ抗原、エピトープ、ペプチド、ポリペプチド断片は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０ 、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０及び５００並びに、これらの値の間の全ての値及び範囲を含む個数の、パピローマウイルスＬ２ポリペプチドの連続したアミノ酸（例えば、配列番号１〜７０）を含みうる。
【００１５】
さらなる態様において、ポリペプチド断片は最多、最少、又は概数で、Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸位置１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１８９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２８９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３８９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４８９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、又は４９０以上から、アミノ酸位置１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、８９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１８９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２８９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３８９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４８９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、又は５００以上までを含みうる（例えば、配列番号１〜７０）。
【００１６】
さらに他の態様において、Ｌ２ペプチドは最多、最小、又は概数で、本願配列番号１に開示されているＬ２ポリペプチドのアミノ酸位置１７〜３６、１３〜４５、１１〜８８若しくは１１〜２００、又は配列番号２〜７０におけるそれらの対応領域、或いはそれらのコンセンサス配列を含む。各アミノ酸位置はおおよそのアミノ酸位置でありえ、±１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０以上のアミノ酸位置だけ変化しうる。これらのアミノ酸位置は、ＨＰＶ１６ Ｌ２タンパク質（配列番号１）の番号に基づいて特定されている。他のＨＰＶ型のＬ２タンパク質のアミノ酸位置は異なりうるが、当業者は任意のＬ２アミノ酸配列をＨＰＶ １６と整列させ、ＨＰＶ１６ Ｌ２のアミノ酸位置に対応するペプチド配列を同定することができる。
【００１７】
ある実施形態において、本Ｌ２ペプチドはＨＰＶ１６ Ｌ２タンパク質（配列番号１）、ＨＰＶ１８ Ｌ２タンパク質（配列番号２）、ＨＰＶ４５ Ｌ２タンパク質（配列番号３）、ＨＰＶ６ Ｌ２タンパク質（配列番号９）、ＨＰＶ１ Ｌ２タンパク質（配列番号４）、ＨＰＶ２ Ｌ２タンパク質（配列番号５）、ＨＰＶ６３ Ｌ２タンパク質（配列番号６２）、ＨＰＶ５ Ｌ２タンパク質（配列番号８）、ＨＰＶ８ Ｌ２タンパク質（配列番号１１）、ＨＰＶ１１ Ｌ２タンパク質（配列番号１４）、ＨＰＶ３１ Ｌ２タンパク質（配列番号３２）、ＨＰＶ３３ Ｌ２タンパク質（配列番号３４）、ＨＰＶ３５ Ｌ２タンパク質（配列番号３６）、ＨＰＶ３９ Ｌ２タンパク質（配列番号４０）、ＨＰＶ５１ Ｌ２タンパク質（配列番号５０）、ＨＰＶ５２  Ｌ２タンパク質（配列番号５１）、ＨＰＶ５６ Ｌ２タンパク質（配列番号５５）、ＨＰＶ５８ Ｌ２タンパク質（配列番号５７）、ＨＰＶ５９ Ｌ２タンパク質（配列番号５８）、ＨＰＶ６８ Ｌ２タンパク質（配列番号６６）、ＨＰＶ７３ Ｌ２タンパク質（配列番号６９）、及び／又は、ＨＰＶ８２ Ｌ２タンパク質（配列番号７０）の断片である。
【００１８】
ある態様において、複数型ポリペプチドは以下の一般式を有する。
【００１９】
［エピトープＸ（ａ）−Ｌ−エピトープＸ＋１（ｂ）−Ｌ−エピトープＸ＋ｎ（ｃ）］（ｄ）
【００２０】
式中、ａ及び／又はｂ及び／又はｃ及び／又はｄはそれぞれ独立に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、 １８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５であり、ｎは独立に１〜９８であり、ペプチドＸ、ペプチドＸ＋１、ペプチドＸ＋ｎは、１以上の性感染生物から選択される別個の免疫原性エピトープであり、（Ｌ）はリンカー、化学結合、ペプチド結合を表しうる。本式のペプチドは、同一の生物又は病原体に由来する同一のタンパク質又は異なるタンパク質に由来しうるか、或いは、これらペプチドは異なる病原性生物に由来する同種タンパク質又は異種タンパク質に由来しうる。一実施形態において、ペプチドＸはＨＰＶポリペプチドであり、ペプチドＸ＋１は異なるＨＰＶペプチド又は他の病原性生物に由来するペプチドであり、ペプチドＸ＋ｎは任意のＨＰＶ型又は他の病原性生物に由来する１以上の他の別個のペプチドである。「−Ｌ−」はリンカー、化学的リンカー、ペプチドリンカー、化学結合、若しくはポリペプチド融合におけるペプチド結合、或いはペプチドをペプチド若しくは基質に結合又は連結する、当分野で公知の他の方法を表す。
【００２１】
本発明の実施形態は、配列番号７１〜９２、９４〜１０６、及び／又は１１０〜１１２のうち２以上のペプチド配列のうち、最大、最小、又は概数で、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、又は５００個以上を含む。他の態様において、本発明のペプチドは、配列番号１〜７０及び他のＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドの対応配列を含む。ある態様において、Ｌ２ポリペプチド断片は、配列番号７１〜９２、９４〜１０６、１１０〜１１２との少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％以上の同一性を有するか、及び／又は配列番号１〜７０の対応配列であるか、及び／又は配列番号１〜７０の断片であり、及び／又は他のＰＶ Ｌ２ポリペプチド若しくはその断片である。
【００２２】
１以上の本ポリペプチドが、パピローマウイルス感染症の防止、治療、又は予防のためのワクチン組成物として有用でありうる。ある態様において、本組成物は医薬担体と組み合わせることができる。本ワクチン組成物は、パピローマウイルス感染症を最小化又は予防するため、パピローマウイルスに曝露される前に個体に投与されるか、或いは、感染の重症度を軽減し、疾患の進行を遅滞／停止させるために、患者の感染後に投与されるか、或いは、感染宿主からパピローマウイルスに感染していない他個体へのパピローマウイルスの伝染を予防するために投与される。
【００２３】
本明細書において、「抗原」又は「免疫原性ペプチド」なる用語は、抗体又はＴ細胞受容体が結合可能な分子を指す。抗原はさらに、Ｂリンパ球及び／又はＴリンパ球の産生をもたらす液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答を誘導可能である。本明細書において、生物学的応答をもたらす抗原の構造的特徴を「抗原決定基」と呼ぶ。Ｂリンパ球は抗体産生を介して外来抗原決定基に応答し、一方でＴリンパ球は細胞性免疫のメディエーターである。したがって抗原決定基又はエピトープとは、抗体により認識される抗原の部分、或いは、ＭＨＣの場合ではＴ細胞受容体により認識される抗原の部分である。典型的には、抗原とは病原性生物（例えばＨＰＶ）に発現するタンパク質に由来するペプチドである。抗原決定基がタンパク質の近接する配列又は断片である必要はなく、互いに直接隣接しない様々な配列を含みうる。ある態様において、抗原決定基はＰＶポリペプチド断片、ＰＶペプチドである。
【００２４】
ある特定のアミノ酸配列に関して、「エピトープ」とは、特定の免疫グロブリンによる認識に関与するアミノ酸残基のセット、或いは、Ｔ細胞の場合では、Ｔ細胞受容体タンパク質及び／又は主要組織適合複合体（ＭＨＣ）受容体による認識に必要なアミノ酸残基である。本エピトープのアミノ酸残基が近接している必要はない。インビボ又はインビトロの免疫系環境では、エピトープとは、一次、二次及び三次ペプチド構造並びに電荷等の、分子が持つ集合的特徴であり、それらの特徴がまとまって免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体、又はＨＬＡ分子が認識する部位を形成する。本明細書では多くの場合、「エピトープ」及び「ペプチド」を互いに置換可能なものとして用いる。
【００２５】
本明細書において、「Ｂ細胞エピトープ」又は「標的エピトープ」とは、抗原を含むペプチド（例えばＨＰＶ Ｌ２断片又はその小領域）に対する免疫原性応答において、Ｂ細胞受容体により認識される、ペプチド又はタンパク質の特徴を指す。
【００２６】
本明細書において、「ＨＰＶ」及び「ヒトパピローマウイルス」とは、人間が感染しうるパピローマウイルス（ＰＶ）属のメンバーを指す。２つの主要なＨＰＶ群（生殖器感染群と皮膚感染群）が存在し、それぞれの群が複数のウイルス「型」又は「株」（例えば、ＨＰＶ １６、ＨＰＶ １８、ＨＰＶ ３１、ＨＰＶ ３２等）を含む。本発明において特に重要なのは、生殖器感染症及び生殖器悪性腫瘍に関連するＨＰＶ型である。
【００２７】
「ワクチン」なる用語は、本発明の複数型ＨＰＶペプチド組成物を１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０以上含む製剤を指す。本複数型ＨＰＶペプチド組成物は典型的には、患者に投与可能であり、かつ、感染症を予防及び／又は寛解する免疫、及び／又は感染症の少なくとも１症状を軽減する免疫、及び／又は別の抗ＨＰＶ治療の効果を高める免疫、及び／又はＨＰＶ感染を減じる免疫、及び／又はＨＰＶ伝染性を減じる免疫を誘導するのに十分な防御的若しくは治療的免疫応答を誘導する形式で提供される。典型的には本ワクチンは、本発明の組成物を懸濁又は溶解させる通常の生理食塩水又は緩衝水溶液溶媒を含む。他の態様において、本ワクチンは固体でありうる（例えば、粉末又は凍結乾燥製剤）。本発明の組成物は、感染症の予防、寛解、又は治療に有用でありうる。宿主への導入により、本組成物は免疫応答を惹起することが可能であり、かかる免疫応答には抗体及び／又はサイトカイン産生、並びに／或いは、細胞傷害性Ｔ細胞、抗原提示細胞、ヘルパーＴ細胞、樹状細胞、及び／又はその他の細胞性応答の活性化が含まれるが、それに限定されるものではない。
【００２８】
本明細書において、「防止」及び「予防」ワクチン又は組成物とは、病原性生物、特にＨＰＶにより引き起こされる若しくはそれと関連する感染症、疾患、及び／又はあらゆる関連続発症を予防するために設計及び投与される組成物である。
【００２９】
本明細書において、「治療」ワクチン又は組成物とは、少なくとも１つのＨＰＶ株等の病原性生物に既に感染している患者のために設計され、かかる患者に投与される組成物である。治療ワクチン（例えば、治療ＨＰＶワクチン）は、これら感染個体における良性又は悪性腫瘍の発生を予防及び／又は治療するために用いられる。
【００３０】
「抑制する」、「軽減する」、若しくは「予防」なる用語、又はこれらの用語の変型は、本願請求項及び／又は本明細書において用いられる際には、所望の結果を達成するためのあらゆる測定可能な減少又は完全な抑制を含む。
【００３１】
本願請求項及び／又は本明細書において「含む」なる用語と共に用いられる単数を用いた表記は、「１つの」を意味しうるが、「１以上の」、「少なくとも１つの」、及び「１つ又は１つを超える」という意味とも矛盾しない。
【００３２】
本明細書を通じて、「約」なる用語は、ある値が、その値を決定するために用いられる装置又は方法の誤差の標準偏差を含むことを示すために用いられる。
【００３３】
本明細書の開示は、本願請求項における「又は」なる用語の使用について、代替となる選択肢のみ、及び「及び／又は」を指す定義を裏付けているが、代替となる選択肢のみを指すと明確に示されている場合、或いは、代替となる選択肢同士が相互に排他的である場合を除いて、「及び／又は」を意味するものとして用いられる。また、「又は」なる用語を用いて列挙されるものはいずれも、明確にに除外されることもありうることが考慮されている。
【００３４】
本明細書及び請求項において、「含んでいる」（並びに、「含む」及び「含み」等のこの語のあらゆる変化形）、「有している」（並びに、「有する」及び「有し」等のこの語のあらゆる変化形）、「含有している」（並びに、「含有する」及び「含有し」等のこの語のあらゆる変化形）、又は、「包含している」（並びに、「包含する」、「包含し」等のこの語のあらゆる変化形）なる語は、包括的又は非限定的であり、付加的で言及されていない要素又は工程を排除しない。
【００３５】
本明細書において列挙された構成員の１以上が、本件請求項記載の発明から明確に除去される又は包含されることもありうることが考慮されている。
【００３６】
本発明の他の実施形態は、本願を通じて論じられている。本発明のある態様に関して論じられた任意の実施形態が、本発明の他の態様にも適用され、逆もまた真である。実施例における実施形態は、本発明のあらゆる態様に適用可能な本発明の実施形態であると理解される。本発明の他の目的、特徴、及び利点は、以下の詳細な記載により明らかとなる。しかし、この詳細な記載及び具体的な実施例は、本発明の具体的な実施形態を示す一方で、例証のためにのみ与えられるものと理解されるべきである。なぜなら、本発明の趣旨と範囲を超えることのない様々な変更と修正が、本願の発明を実施するための形態から当業者にとって明らかとなるであろうからである。
【００３７】
以下の図面は本明細書の一部を成し、本発明のある態様をさらに示すために添付される。本発明は、本明細書で提示されている特定の実施形態の詳細な記載と１又は２以上のこれら図面とを組み合わせて参照することによってより良く理解される。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】マウスへの複数型Ｌ２ワクチンの接種は、モノマーＬ２ワクチン又はＬ１ ＶＬＰよりも交差中和抗体をより広範に誘導する。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、０、１５、３０日目に、ＰＢＳ、又は、ＧＰＩ‐０１００（５０μｇ）アジュバント中の様々なＬ２モノマー構築物及び複数型構築物２５μｇ、又は、アジュバントを伴わないＨＰＶ１６ Ｌ１ ＶＬＰ若しくはＨＰＶ４５ Ｌ１ ＶＬＰの皮下ワクチン接種を受けた。最終接種２週間後のマウスから収集された抗血清の２倍希釈液について、図に示された遺伝子型のＨＰＶ偽ウイルスを使用してインビトロ中和アッセイが行われた。５０％中和を達成した終点力価がプロットされている。
【００３９】
【図２】複数型Ｌ２タンパク質のみが免疫原性であり、広範な中和抗体応答のために特定のアジュバントは必要ない。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、０、１５、及び３０日目に、ミョウバンのみ（１．３ｍｇ）、又は、ＩＳＳ１０１８のみ（１０μｇ／マウス）、又は、ＰＢＳ、又は、１１‐２００ｘ３（配列番号１１３）２５μｇのみ、又は、１１‐２００ｘ３（配列番号１１３）２５μｇがミョウバン（１．３ｍｇ）、若しくはＩＳＳ１０１８（１０μｇ／マウス）、若しくはＧＰＩ‐０１００（５０μｇ／マウス又は２００μｇ／マウス）、若しくはＧＰＩ‐０１００（５０μｇ／マウス）＋Tween 40（１ｍｇ／マウス）、若しくはミョウバン及びＩＳＳ１０１８（１０μｇ／マウス）と共に調製されたものの皮下接種を受けた。図に示された遺伝子型のＨＰＶ偽ウイルスを用いて、最終接種２週間後に収集されたマウスの抗血清の２倍希釈液についてインビトロ中和滴定が行われた。５０％中和の終点力価がプロットされている。
【００４０】
【図３】様々なアジュバントの組合せ中のＬ２ １１‐２００ｘ３（配列番号１１３）の接種４ヶ月後のマウスに対するインビボＨＰＶ１６偽ウイルスの投与。マウスは３回、２週間の間隔を置いて、ＰＢＳ、又は、様々なアジュバントと組み合わせたＬ２ １１‐２００ｘ３（配列番号１１３）２５μｇ、又は、アジュバントのみの接種を受けた。個々の群は左から右に以下に列挙した通りである。ＰＢＳのみ、ミョウバンのみ（１．３ｍｇ）、ＩＳＳ１０１８のみ（１０μｇ／マウス）、１１‐２００ｘ３（配列番号１１３）のみ、１１‐２００ｘ３（配列番号１１３）＋ＩＳＳ１０１８（１０μｇ／マウス）、１１‐２００ｘ３（配列番号１１３）＋ミョウバン（１．３ｍｇ）、１１‐２００ｘ３（配列番号１１３）＋ＧＰＩ‐０１００（５０μｇ／マウス）、１１‐２００ｘ３（配列番号１１３）＋ＧＰＩ‐０１００（２００μｇ／マウス）、１１‐２００ｘ３（配列番号１１３）＋ＧＰＩ‐０１００（５０μｇ／マウス）＋Tween 40（１ｍｇ／マウス）、１１‐２００ｘ３（配列番号１１３）＋ミョウバン＋１０１８（１０μｇ／マウス）。約４ヶ月後に、麻酔された各ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹部の接種パッチが、上皮を傷つけることなく電気かみそりで剃られた。次にマウスに、ルシフェラーゼレポーター構築物を担持する０．６％カルボキシメチルセルロース１０μｌ中の３ｘ１０９ＨＰＶ１６偽ウイルス粒子（１００ｎｇ）が投与された。３日後、マウスは麻酔されてルシフェリンを注射され、Xenogen社製IVIS 200を用いて１０分間画像を取得した。接種部位を含む同じ大きさの領域が、Living Image 2.20ソフトウェアを用いて分析され、投与前にＨＰＶ１６ Ｌ１を接種したマウスと比較した相対発光単位がプロットされている。
【００４１】
【図４】マウスへのＬ２ １１‐２００ｘ３（配列番号１１３）又は１１‐８８ｘ５（配列番号１０８）の接種は、GARDASIL（商標）と比較して、低い程度ではあるが、より広範な交差中和抗体を誘導する。マウスは３回、０、１５、及び３０日目に、ヒトの用量の５分の１のGARDASIL（商標）、又は、ＧＰＩ‐０１００（５０μｇ）アジュバント中のＬ２ １１‐２００ｘ３（配列番号１１３）若しくは１１‐８８ｘ５（配列番号１０８）２５μｇの接種を受けた。図に示されたＨＰＶ遺伝子型の偽ウイルスを用いて、最終接種２週間後に収集されたマウスの抗血清の２倍希釈液についてインビトロ中和アッセイが行われた。５０％中和の終点力値がプロットされている。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
第１世代ＨＰＶ Ｌ１ウイルス様粒子ワクチンの高コスト及び型限定的な防御ゆえに、さらなる広範な防御を行う第２世代組成物及びワクチンの開発が必要とされる。マイナーカプシドタンパク質Ｌ２は、中和抗体誘導により動物をパピローマウイルス感染から防御する。Ｌ２が多様なパピローマウイルス型を交差中和する抗体を誘導する一方で、本発明者らが注目するのは、Ｌ２特異的抗体が典型的には進化的に近縁でない型よりも近縁な型をより効果的に中和するということである。交差保護効果を高めるため、様々なＨＰＶ型の既知の交差中和エピトープから成るＬ２融合タンパク質が設計された。残基番号１７〜３６、１〜８８又は１１〜２００を含むＨＰＶ１６ Ｌ２ポリペプチドの接種が、１１‐２００ｘ３（配列番号１１３）型（ＨＰＶ６、１６、１８）、１１‐８８ｘ５（配列番号１０８）型（ＨＰＶ１、５、６、１６、１８）、１７‐３６ｘ２２型（５皮膚感染型、２粘膜感染低リスク型及び１５発癌型）という３つの複数型Ｌ２融合タンパク質を用いて比較された。マウスは３回、ＧＰＩ‐０１００アジュバント中の抗原２５μｇの皮下接種を受けた。全ての単一型ポリペプチドのうち、１１〜２００が最も高いＨＰＶ１６中和力価を生じさせた。しかし、１１‐２００ｘ３は他の複数型及び単一型融合タンパク質と比較して、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ６のみならず、ＨＰＶ４５及びＨＰＶ５８に対しても最も高い中和力価を誘導した。免疫マウスに、ルシフェラーゼを発現するＨＰＶ１６偽ウイルスを投与した。１１‐２００ｘ３（配列番号１１３）の接種は、ＨＰＶ１６ Ｌ１ ＶＬＰのみならずＨＰＶ１６感染に対してもマウスを防御した。接種を行い次第、ＨＰＶ中和抗体の誘導が、１１‐２００ｘ３（配列番号１１３）タンパク質２５μｇのみ、又は、１１‐２００ｘ３（配列番号１１３）タンパク質２５μｇにミョウバンを加えたもの、又はＧＰＩ‐０１００を５０μｇ若しくは２００μｇ加えたもの、又はＧＰＩ‐０１００を５０μｇ及びTween-40を加えたものについて比較された。アジュバントの存在下では１１‐２００ｘ３に対する液性応答が有意に上昇したが、アジュバント間で有意差はなかった。本発明者らは、大腸菌（E. coli）において作製され、アジュバントと共に調製される、ＨＰＶ６ Ｌ２ １１‐２００（配列番号９６）、ＨＰＶ１６ Ｌ２ １１‐２００（配列番号１００）、及びＨＰＶ１８ Ｌ２ １１‐２００（配列番号１０１）を含む単一の融合タンパク質の接種は防御力が高く、広範な交差中和抗体を誘導すると結論付ける。
【００４３】
前記複数型ＨＰＶ組成物が、他の病原性生物、特にＨＰＶと同様の方法で伝染する疾患、例えば性感染症に関連する病原性生物と関連させて用いられるか、或いは、それらの病原性生物に関するモデルとして用いられうるということも考慮される。したがって、ＨＰＶに関する本願の教示は、かかるＨＰＶに関する教示のみ、又は複数型ＨＰＶ Ｌ２ペプチドと組み合わせて、他の病原性生物へと拡張されうる。
［Ｉ．治療及び予防組成物］
【００４４】
本発明の実施形態は、２以上のＨＰＶ型に由来する２以上のＨＰＶポリペプチド断片を含むＨＰＶペプチド組成物を含む。ある態様において、かかるＨＰＶ型は、本組成物を投与される特定の生物、動物、又はヒト対象に対して病原性を有するＨＰＶ型の全部又は一部を含む。ある実施形態において、かかるＨＰＶポリペプチドは少なくとも２つのＬ２エピトープ又はペプチドを含む。さらに別の態様において、かかるＨＰＶポリペプチドは少なくとも２つのＨＰＶ型に由来するＬ２エピトープを含む。ＨＰＶポリペプチド断片は本明細書において詳細に記述されている。
【００４５】
本発明の方法は、パピローマウイルス感染性（例えば、ＨＰＶ感染性）によって引き起こされる若しくはそれに関連する疾患又は病態の治療を含む。免疫原性複数型ＨＰＶペプチド組成物及び／若しくはそれに結合する抗体は、ＨＰＶに感染した、又はＨＰＶに曝露したことが疑われる、又はＨＰＶに感染する若しくは曝露する危険性のある人において、治療的応答を誘導又は提供するために与えられうる。方法は、ＨＰＶ若しくは他の性感染症曝露について陽性と判定された人、又は曝露の可能性若しくは将来の曝露により感染の危険性があると考えられる人に関して用いられうる。特に、本発明はＨＰＶ感染症の治療方法を包含する。
【００４６】
ある実施形態において、かかる治療はアジュバントの存在下、或いは担体の存在下、或いはＨＰＶ抗原に由来する又はＨＰＶ曝露危険性と関連する若しくは同時に生じる曝露危険性を有する他の病原体に由来する抗原である、他の抗原の存在下で行われる。さらにある例において、治療は１以上の抗ウイルス剤等の、ウイルス感染症に対して通常用いられる他の薬剤の投与を含む。
【００４７】
本発明のある態様において、本発明のペプチドは、複数ペプチドが、互いに近接して免疫系の構成要素に提示されるように設計されている。各ペプチドは、免疫系の複数の構成要素（２以上のエフェクター細胞）又は免疫系の単一の構成要素（ペプチドの複数型又は変異体を認識する傾向を有するエフェクター細胞）を刺激しうる。かかるペプチドは、直線コンカテマーとして、分岐コンカテマー（デンドリマー）として、担体又は基盤（例えば、ナノ粒子、リポソーム、ポリマー等）からの突起として設計されうる。実体（entity）において提示される認識部位又はペプチドの数、及びそれらの間隔が、かかるペプチドのオリゴマー化の度合いを決定する。例えば、ストレプトアビジン等の４価の実体は、テトラマーとなる。とはいえ、より大きな価数が可能である。好ましくは、ペプチドの数は２、３、４、 ５、６、７、８、９、１０〜１０、２０、２５、５０以上までの範囲で、これらの値の間の範囲も全て含まれる。
【００４８】
ある実施形態において、複数型ペプチド組成物は、タンパク質、分岐ポリペプチド（デンドリマー）、マルチマータンパク質、又はそれらをコードする核酸等の、天然ポリマー又はその誘導体である。複数のペプチドを、デキストラン、デンプン、セルロース、ヒアルロン酸、キチン又はアルギニン酸等の多糖、或いはこれら多糖の誘導体、並びに、ポリプロピレングリコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の合成ポリマー、並びに、小胞又はリポソーム等のリン脂質膜、並びに、ポリスチレン又はアクリルビーズ又は磁気ビーズ等の無機粒子と結合させうる。
【００４９】
ある態様において、複数型ポリペプチドはデンドリマーである。これらのデンドリマーは、例えば、Weng and Peter, White Eds., "Fmoc solid phase peptide synthesis, A Practical Approach" Oxford University Press (2000) 第１１章の「化学選択的及び直交的連結技術」、及び参照により本明細書に組み込まれる米国公開特許公報第２００８０２０７４８５号において開示されている手順に従い作製されうる。いくつかの他の分岐ポリペプチド合成方法が当業者によく知られている。分岐ポリペプチドは、２以上の分枝の所定の部位に組み込まれたペプチドを有する。かかるペプチドの各分枝は所望の長さを有しうる。好ましくは、各分枝は２４アミノ酸長よりも短い。かかるペプチドの分岐は、合成の際にＬｙｓ残基において既知の方法でペプチドを分岐させることにより達成されうる。かかる方法では、ペプチドは第１リシン残基において２つの分枝へと分岐させられ、別のリシン残基においてさらに分岐させることで四価の実体が形成される。オクタマー等の他の価数は、より多い又は少ない分岐工程を経ることで達成されうる。合成ペプチドを部分的にのみ分岐することで、奇数価数もまた達成可能である。
【００５０】
ある実施形態において、ポリペプチドの１以上の末端が、担体又は基盤に結合され、例えばある態様において、担体から延長するポリペプチドループを形成する。本発明のペプチドは、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）又はリポソーム等の様々な送達媒体又は方式中に、或いは、生分解性粒子表面上に、或いは、ビーズ又は微粒子又はナノ粒子の表面上に構成されうる。
［Ａ．感染因子］
【００５１】
本明細書において、「感染」又は「感染症」とは、感染性生物の宿主への、表面、局所、若しくは全身への侵入により生じる疾患を指す。感染性生物には、細菌、ウイルス、寄生虫、真菌、及び原生動物が含まれる。
【００５２】
細菌にはグラム陰性菌及びグラム陽性菌が含まれる。グラム陽性菌の例には、パスツレラ属の諸種、スタフィロコッカス・アウレウスを含むブドウ球菌属の諸種、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）Ａ群、ストレプトコッカス・ヴィリダンス（Streptococcus viridans）群、ストレプトコッカス・アガラクティエ（ Streptococcus agalactiae）Ｂ群、ストレプトコッカス・ボヴィス（ Streptococcus bovis）、嫌気性レンサ球菌の諸種、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）、及びストレプトコッカス・フェカリス（Streptococcus faecalis）を含むレンサ球菌属の諸種、バシラス・アンスラシス（Bacillus anthracis）を含むバシラス属の諸種、コリネバクテリウム・ジフセリエ（Corynebacterium diphtheriae）、好気性コリネバクテリウムの諸種、及び嫌気性コリネバクテリウムの諸種を含むコリネバクテリウム属の諸種、類ジフテリア属の諸種、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）を含むリステリア属の諸種、エリシペロスリックス・ルジオパシエ（Erysipelothrix rhusiopathiae）を含むエリシペロスリックス属の諸種、並びに、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、クロストリジウム・テタニ（Clostridium tetani）、及びクロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）を含むクロストリディウム属の諸種が含まれるが、これに限定されるものではない。
【００５３】
グラム陰性菌の例には、ナイセリア・ゴノレエ及びナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）を含むナイセリア属の諸種、ブランハメラ・カタラーリスを含むブランハメラ属の諸種、大腸菌（Escherichia coli）を含む大腸菌属の諸種、エンテロバクター属の諸種、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）を含むプロテウス属の諸種、シュードモナス・エルジノーサ（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・マレイ（Pseudomonas mallei）及びシュードモナス・シュードマレイ（Pseudomonas pseudomallei）を含むシュードモナス属の諸種、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）を含む肺炎桿菌属の諸種、サルモネラ属の諸種、赤痢菌属の諸種、セラチア属の諸種、アシネトバクター属の諸種、ヘモフィルス・インフルエンゼ（Haemophilus influenzae）及びヘモフィルス・デュクレイを含むヘモフィルス属の諸種、ブルセラ属の諸種、エルシニア・ペスティス（Yersinia pestis）及びエルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）を含むエルシニア属の諸種、フランシセラ・ツラレンシス（Francisella tularensis）を含むフランシセラ属の諸種、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）を含むパスツレラ属の諸種、ビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae）、フラボハクテリウム・メニンゴセプチカム（Flavobacterium meningosepticum）を含むフラボバクテリウム属の諸種、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）を含むカンピロバクター属の諸種、バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）を含むバクテロイデス属の諸種（口腔感染型、咽頭感染型）、フソバクテリウム・ヌクレアトゥム（Fusobacterium nucleatum）を含む紡錘菌属の諸種、カリマトバクテリウム・グラヌロマティス、ストレプトバシラス・モニリフォルミス（Streptobacillus moniliformis）を含むストレプトバシラス属の諸種、並びに、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）を含むレジオネラ属の諸種が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５４】
他の種類の細菌には、抗酸菌、スピロヘータ及び放線菌が含まれる。抗酸菌の例には、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Mycobacterium tuberculosis）及びマイコバクテリウム・レプレ（Mycobacterium leprae）を含むマイコバクテリウム属の諸種が含まれる。スピロヘータの例には、トレポネーマ・パリダム及びトレポネーマ・ペルテニュ（Treponema pertenue）を含むトレポネーマ属の諸種、ボレリア・ブルグドルフェリ（Borrelia burgdorferi） （ライム病）及びボレリア・レカレンチス（Borrelia recurrentis）を含むボレリア属の諸種、並びに、レプトスピラ属の諸種が含まれる。放線菌の例には、アクチノマイセス・イスラエリ（Actinomyces israelii）を含むアクチノマイセス属の諸種、並びに、ノカルディア・アステロイデス（Nocardia asteroides）を含むノカルディア属の諸種が含まれる。
【００５５】
ウイルスの例には、レトロウイルス、ＨＩＶ‐１、ＨＤＴＶ‐III、 ＬＡＶＥ、 ＨＴＬＶ‐III／ＬＡＶ、 ＨＩＶ‐III、 ＨＩＶ‐ＬＰを含むヒト免疫不全ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ピコルナウイルス、ポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス、カリシウイルス、トガウイルス、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス、フラビウイルス、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス、フィロウイルス、エボラウイルス、パラミクソウイルス、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、オルトミクソウイルス、インフルエンザウイルス、ブニヤウイルス、ハンターンウイルス、フレボウイルス、ナイロウイルス、アレナウイルス、出血熱ウイルス、レオウイルス、オルビウイルス、ロタウイルス、ビルナウイルス、ヘパドナウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス科、乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス１型及び２型を含むヘルペスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ポックスウイルス、天然痘ウイルス、ワクシニアウイルス、イリドウイルス、アフリカ豚コレラウイルス、デルタ肝炎ウイルス, 非Ａ型及び非Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ノーウォークウイルス、アストロウイルス、並びに、未分類のウイルスが含まれるが、これに限定されるものではない。
【００５６】
真菌の例には、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Crytococcus neoformans）を含むクリプトコッカス属の諸種、ヒストプラスマ・カプスラツーム（Histoplasma capsulatum）を含むヒストプラズマ属の諸種、コクシジオイデス・イミチス（Coccidiodes immitis）を含むコクシジオイデス属の諸種、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス（Paracoccidioides brasiliensis）を含むパラコクシジオイデス属の諸種、ブラストマイセス・デルマチチジス（Blastomyces dermatitidis）を含むブラストマイセス属の諸種、クラミジア・トラコマチスを含むクラジミア属の諸種、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）を含むカンジダ属の諸種、スポロトリクス・シェンキィ（Sporothrix schenckii）を含むスポロトリクス属の諸種、コウジカビ属の諸種、並びに、ムコール症真菌が含まれるが、これに限定されるものではない。
【００５７】
他の感染性生物には寄生虫が含まれる。寄生虫には、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、四日熱マラリア原虫（Plasmodium malariae）、卵形マラリア原虫（Plasmodium ovale）及び三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）を含むプラスモディウム属の諸種、並びに、トキソプラズマ・ゴンヂ（Toxoplasma gondii）が含まれる。血液感染性寄生虫及び／又は組織寄生虫には、プラスモディウム属の諸種、バベシア・ミクロチ（Babesia microti）及びバベシア・ディバーゲンス（Babesia divergens）を含むバベシア属の諸種、熱帯リーシュマニア（Leishmania tropica）、ブラジルリーシュマニア（Leishmania braziliensis）及びドノバンリーシュマニア（Leishmania donovani）を含むリーシュマニア属の諸種、並びに、ガンビアトリパノソーマ（Trypanosoma gambiense）、ローデシアトリパノソーマ（Trypanosoma rhodesiense）（アフリカ睡眠症）及びトリパノソーマ・クルージ（Trypanosoma cruzi）（シャーガス病）を含むトリパノソーマ属の諸種が含まれる。
【００５８】
他の医学的関連のある微生物は、当該分野文献に広範に記載されてきた。例えば、Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Great Britain 1983 and Murray, Medical Microbiology (ISBN 0323033032), 2005参照。この文献の全体が参照により本願に組み込まれる。
［Ｂ．ＨＰＶワクチン］
【００５９】
本発明は、ＨＰＶ感染症の予防又は寛解のための組成物を含む。したがって本発明は、能動免疫法及び受動免疫法の両方の実施形態において使用するワクチンを意図する。ワクチンとしての使用に適するものとして提唱される免疫原性組成物は、ＨＰＶ  Ｌ２タンパク質の断片を含む複数型ＨＰＶポリペプチドから調製されうる。別の実施形態において、複数型ＨＰＶ Ｌ２ ポリペプチドは、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８、及び／又はＬ１タンパク質等の、他のＨＰＶタンパク質やその断片と組み合わせて使用されうる。例えば、米国特許第７，４２５，４３８号、第７，４１６，８４６号、第７，４１６，７３２号、第７，４０７，８０７号、第７，３７４，７６７号、第７，２０１，９０８号、第７，１８９，５１３号、及び第７，２８８，２５８号参照。これらの文献の全部が、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６０】
典型的には、ワクチンは  ワクチン製剤に適合する形で、治療に有効となる及び／又は免疫原性となる分量で投与される。投与量は、個体の免疫系が抗体を合成する能力及び所望の防御の程度を含め、治療されるべき患者に依存する。投与される必要のある有効成分の正確な量は、治療の実施者の判断に依存する。典型的には、接種又は投与当たり０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０〜１００ ｎｇ、μｇ、又は ｍｇが投与されうる。初回投与及び追加接種に関する適切な計画もまた不定であるが、典型的には、初回投与後に引き続き接種又は他の投与が続く。
［１．ＨＰＶポリペプチド及びポリペプチド断片］
【００６１】
本発明のある態様において、多様なＨＰＶポリペプチド断片が、複数型ＨＰＶポリペプチドワクチンを構成するＨＰＶペプチドとして用いられる。ある態様において、かかるＨＰＶポリペプチドはＬ２ポリペプチドである。さらなる態様において、かかるＬ２ポリペプチドは、ＨＰＶ１、ＨＰＶ２、ＨＰＶ３、ＨＰＶ４、 ＨＰＶ５、ＨＰＶ６、ＨＰＶ７、ＨＰＶ８、ＨＰＶ９、ＨＰＶ１０、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１２、ＨＰＶ１３、ＨＰＶ１４、ＨＰＶ１５、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１７、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ１９、ＨＰＶ２０、ＨＰＶ２１、ＨＰＶ２２、ＨＰＶ２３、ＨＰＶ２４、ＨＰＶ２５、ＨＰＶ２６、ＨＰＶ２７、ＨＰＶ２８、ＨＰＶ２９、ＨＰＶ３０、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３２、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３４、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３６、ＨＰＶ３７、ＨＰＶ３８、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４０、ＨＰＶ４１、ＨＰＶ４２、ＨＰＶ４３、ＨＰＶ４４、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ４６、ＨＰＶ４７、ＨＰＶ４８、ＨＰＶ４９、ＨＰＶ５０、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５３、ＨＰＶ５４、ＨＰＶ５５、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５７、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９、ＨＰＶ６０、ＨＰＶ６１、ＨＰＶ６２、ＨＰＶ６３、ＨＰＶ６４、ＨＰＶ６５、ＨＰＶ６６、ＨＰＶ６７、ＨＰＶ６８、ＨＰＶ６９、ＨＰＶ７０、ＨＰＶ７１、ＨＰＶ７２、ＨＰＶ７３、ＨＰＶ７４、ＨＰＶ７５、ＨＰＶ７６、ＨＰＶ７７、ＨＰＶ７８、ＨＰＶ７９、ＨＰＶ８０、ＨＰＶ８１、ＨＰＶ８２、ＨＰＶ８３、ＨＰＶ８４、ＨＰＶ８５、ＨＰＶ８６、ＨＰＶ８７、ＨＰＶ８８、ＨＰＶ８９、ＨＰＶ９０、ＨＰＶ９１、ＨＰＶ９２、ＨＰＶ９３、ＨＰＶ９４、ＨＰＶ９５、ＨＰＶ９６、ＨＰＶ９７、ＨＰＶ９８、ＨＰＶ９９、ＨＰＶ１００ 、又はそれ以外のＨＰＶ（配列番号１〜７０を参照）、及び、動物パピローマウイルス、すなわちウシパピローマウイルス１型（ＢＰＶ１）、ウシパピローマウイルス２型（ＢＰＶ２）、ウシパピローマウイルス４型（ＢＰＶ４）、ワタオウサギパピローマウイルス（ＣＲＰＶ）、シカパピローマウイルス（ＤＰＶ）、ヨーロッパオオシカパピローマウイルス（ＥＥＰＶ）、イヌ口腔パピローマウイルス（ＣＯＰＶ）、アカゲザルパピローマウイルス（ＲｈＰＶ）又はウサギ口腔パピローマウイルス（ＲＯＰＶ）のＬ２ペプチドエピトープである。ヒトパピローマウイルス概要オンライン（The Human Papillomaviruses Compendium On Line）は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）及び関連する動物パピローマウイルスに関する関連分子データを収集及び公開している。この概要には、インターネット上（hpv-web.lanl.gov/stdgen/viras/hpv/compendium/htdocs/HTML_FILES/HPVcompintro4.html）でアクセスでき、本願優先日及び出願日の時点で参照により本願に組み込まれる。
【００６２】
Ｌ２ポリペプチドの例は、ＧｅｎＢａｎｋ（ｇｂ）、ＳｗｉｓｓＰｒｏ（ｓｐ）、ＥＭＢＬ等の公開タンパク質データベースに見出されうる。代表的なデータベースエントリをＨＰＶ型毎に丸括弧内に受託番号で示すと、ＨＰＶ２（ｇｂ／ＡＡＹ８６４８９、ｇｂ／ＡＢＮ４９４６１、ｇｂ／ＡＢＮ４９４６９、ｇｂ／ＡＢＯ１４９２５、ｇｂ／ＮＰ_０７７１２１）、ＨＰＶ３（ｓｐ／Ｐ３６７４４）、ＨＰＶ７（ｇｂ／ＮＰ_０４１８５８．１）、ＨＰＶ１０（ｇｂ／ＮＰ_０４１７４５）、ＨＰＶ１６（ｇｂ／ＡＡＯ８５４１４、ｇｂ／ＡＡＯ１５７０３、ｇｂ／ＡＡＯ１５７１１、ｇｂ／ＡＡＱ１０７２６、ｇｂ／ＡＡＶ９１６５０）、ＨＰＶ１８（ｇｂ／ＡＡＦ１４００９、ｇｂ／ＡＢＰ９９７１０、ｇｂ／ＡＢＰ９９７１８、ｇｂ／ＡＢＰ９９７２６、ｇｂ／ＡＢＰ９９７４２、ｇｂ／ＡＢＰ９９７６６、ｇｂ／ＡＢＰ９９７７４、ｇｂ／ＡＢＰ９９７８２、ｇｂ／ＡＢＰ９９７９０、ｇｂ／ＡＢＰ９９７９８、ｇｂ／ＡＢＰ９９８０６、ｇｂ／ＮＰ_０４０３１６）、ＨＰＶ２６（ｇｂ／ＮＰ_０４１７８６．１）、ＨＰＶ２７（ｄｂｊ／ＢＡＥ１６２６８、ｓｐ／Ｐ３６７５５）、ＨＰＶ２８（ｓｐ／Ｐ５０７９９）、ＨＰＶ２９（ｓｐ／Ｐ５０８００）、ＨＰＶ３０（ｓｐ／Ｐ３６７５６）、ＨＰＶ３３（ｓｐ／Ｐ０６４１８）、ＨＰＶ３９（ｇｂ／ＡＡＡ４７０５５）、ＨＰＶ４０（ｓｐ／Ｐ３６７６０）、ＨＰＶ４３（ｓｐ／Ｑ７０５Ｈ５）、ＨＰＶ４５（ｇｂ／ＡＡＹ８６４９３）、ＨＰＶ４５（ｇｂ／ＡＢＰ９９８１４、ｇｂ／ＡＢＰ９９８５４、ｇｂ／ＡＢＰ９９８６２、ｇｂ／ＡＢＰ９９８７０、ｇｂ／ＡＢＰ９９８７８、ｇｂ／ＡＢＰ９９８９４、ｇｂ／ＡＢＰ９９９０２、ｓｐ／Ｐ３６７６１）、ＨＰＶ５１（ｓｐ／Ｐ２６５３９）、ＨＰＶ５２（ｓｐ／Ｐ３６７６３）、ＨＰＶ５３（ｇｂ／ＡＢＵ５４１０３、ｇｂ／ＡＢＵ５４１１７、ｇｂ／ＡＢＵ５４１３１、ｇｂ／ＡＢＵ５４１５２、ｇｂ／ＡＢＵ５４１５９、ｇｂ／ＡＢＵ５４１７３、ｇｂ／ＮＰ_０４１８４７）、ＨＰＶ５６（ｇｂ／ＡＢＯ７６８０８、ｇｂ／ＡＢＯ７６８１５、ｇｂ／ＡＢＯ７６８２２、ｇｂ／ＡＢＯ７６８２９、ｓｐ／Ｐ３６７６５）、ＨＰＶ５７（ｄｂｊ／ＢＡＦ８０４８５、ｓｐ／Ｐ２２１６４）、ＨＰＶ５８（ｓｐ／Ｐ２６５３８）、ＨＰＶ５９（ｅｍｂ／ＣＡＡ５４８５５）、ＨＰＶ６１（ｒｅｆ／ＮＰ_０４３４４９）、ＨＰＶ６２（ｓｐ／Ｑ６７６Ｕ７）、ＨＰＶ６６（ｇｂ／ＡＢＯ７６８３６、ｇｂ／ＡＢＯ７６８４３、ｇｂ／ＡＢＯ７６８５７、ｇｂ／ＡＢＯ７６８６４、ｇｂ／ＡＢＯ７６８８５、ｇｂ／ＡＢＯ７６８９２、ｇｂ／ＡＢＯ７６８９９、ｓｐ／Ｑ８０９６０）、ＨＰＶ６８ａ（ｇｂ／ＡＡＺ３９４９７）、ＨＰＶ６９（ｓｐ／Ｑ９ＪＨ４５）、ＨＰＶ７０（ｇｂ／ＡＡＣ５４８５６）、ＨＰＶ７１（ｇｂ／ＡＡＱ９５１８２、ｇｂ／ＡＡＱ９５１８９、ｇｂ／ＡＡＱ９５２０３、ｒｅｆ／ＮＰ_５９７９３７）、ＨＰＶ７２（ｅｍｂ／ＣＡＡ６３８７８）、ＨＰＶ７７（ｅｍｂ／ＣＡＡ７５４６７）、ＨＰＶ８１（ｅｍｂ／ＣＡＦ０５６９７）、ＨＰＶ８２（ｇｂ／ＡＡＫ２８４５５、ｓｐ／Ｑ９ＩＲ５３）、ＨＰＶ８３（ｇｂ／ＡＡＤ３８９７３）、ＨＰＶ８４（ｇｂ／ＡＡＫ０９２７６���、ＨＰＶ８５（ｇｂ／ＡＡＤ２４１８７）、ＨＰＶ８６（ｇｂ／ＡＡＬ０６７４０）、ＨＰＶ８７（ｅｍｂ／ＣＡＣ１７７１７）、ＨＰＶ８９（ｇｂ／ＡＡＭ９２１５６）、ＨＰＶ９０（ｒｅｆ／ＮＰ_６７１５０８）、ＨＰＶ９１（ｇｂ／ＡＡＭ８９１３５）、ＨＰＶ９４（ｄｂｊ／ＢＡＤ８９１７８、ｅｍｂ／ＣＡＦ０５７１４）、ＨＰＶ９７（ｇｂ／ＡＡＺ３９５０５、ｇｂ／ＡＢＯ２７０８２）、ＨＰＶ１０２（ｇｂ／ＡＡＺ３９５２５）、又はＨＰＶ１０６（ｇｂ／ＡＡＺ３９５１８）が含まれるが、これに限られるものではない。前記受託番号で示されている各アミノ酸配列は、本願出願日の時点で参照により本願に組み込まれる。ある態様において、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２以上のＨＰＶ型に由来する、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個以上のＬ２ペプチドが連結されて、共に複数型ＨＰＶポリペプチドを形成する（配列番号９４、１０８、１０９、及び１１３を参照）。これら断片の連結は、融合タンパク質の発現若しくは合成によるもの、又は、これらペプチドを互いに化学結合させたことによるもの、又は、共通の基質若しくはポリマーにこれらペプチドを化学結合させたことによるものでありうる。
【００６３】
本発明のペプチドは、ＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸番号１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、又はこれらの値の間のあらゆる値から始まる、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、又はこれらの値の間のあらゆる値及び範囲の個数の連続するアミノ酸を含みうる。ある実施形態において、ＨＰＶ Ｌ２ポリペプチドは配列番号１〜７０を含むが、これに限られるものではない。
【００６４】
ある態様において、本複数型ＨＰＶポリペプチドは、ＨＰＶ Ｌ２ １７‐３６− DIYPSCKISNTCPPDIQNKI （配列番号７２）、ＨＰＶ  Ｌ２  １７‐３６− DLYRTCKQAGTCPPDIIPRV （配列番号７３）、ＨＰＶ  Ｌ２  １７‐３６− DIYPACKVANNCPPDIQNKI （配列番号７４）、ＨＰＶ  Ｌ２  １７‐３６− HIYQTCKQAGTCPPDVINKV （配列番号７５）、ＨＰＶ  Ｌ２  １７‐３６− HIYQTCKQAGTCPPDVINKV （配列番号７６）、ＨＰＶ  Ｌ２  １７‐３６− QLYQTCKLTGTCPPDVIPKV （配列番号７７）、ＨＰＶ  Ｌ２  １７‐３６− QLYQTCKATGTCPPDVIPKV （配列番号７８）、ＨＰＶ  Ｌ２  １７‐３６−  QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV （配列番号７１）、ＨＰＶ  Ｌ２  １７‐３６−  DLYKTCKQSGTCPPDVVPKV （配列番号７９）、ＨＰＶ  Ｌ２  １７‐３６−  QLYQTCKAAGTCPSDVIPKI （配列番号８０）、ＨＰＶ  Ｌ２  １７‐３６− QLYQTCKATGTCPPDVIPKV （配列番号８１）、ＨＰＶ  Ｌ２  １７‐３６− QLYRTCKAAGTCPPDVIPKV （配列番号８２）、ＨＰＶ  Ｌ２  １７‐３６− DLYRTCKQSGTCPPDVVDKV （配列番号８３）、ＨＰＶ  Ｌ２  １７‐３６− DLYRTCKQSGTCPPDVINKV （配列番号８４）、ＨＰＶ  Ｌ２  １７‐３６− QLYSTCKAAGTCPPDVVNKV （配列番号８５）、ＨＰＶ  Ｌ２  １７‐３６− QLYQTCKASGTCPPDVIPKV （配列番号８６）、ＨＰＶ  Ｌ２  １７‐３６− QLYKTCKLSGTCPEDVVNKI （配列番号８７）、ＨＰＶ  Ｌ２  １７‐３６− QLYQTCKASGTCPPDVIPKV （配列番号８８）、ＨＰＶ  Ｌ２  １７‐３６− DLYKTCKQAGTCPSDVINKV （配列番号８９）、ＨＰＶ  Ｌ２  １７‐３６− DLYKTCKQSGTCPSDVINKV （配列番号９０）、ＨＰＶ  Ｌ２  １７‐３６− QLYKTCKQAGTCPPDVIPKV （配列番号９１）、及び／又は、 QLYSTCKAAGTCPPDVIPKV （配列番号９２）から選択される２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５以上のペプチドを、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、６０、７０、８０、９０、１００、又は２００個以上含む。
【００６５】
さらに別の態様において、本複数型ＨＰＶポリペプチドは、ＨＰＶ Ｌ２ １７‐３６ｘ２２アミノ酸配列− DIYPSCKISNTCPPDIQNKIDLYRTCKQAGTCPPDIIPRVDIYPACKVANNCPPDIQNKIHIYQTCKQAGTCPPDVINKVHIYQTCKQAGTCPPDVINKVQLYQTCKLTGTCPPDVIPKVQLYQTCKATGTCPPDVIPKVQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVDLYKTCKQSGTCPPDVVPKVQLYQTCKAAGTCPSDVIPKIQLYQTCKATGTCPPDVIPKVQLYRTCKAAGTCPPDVIPKVDLYRTCKQSGTCPPDVVDKVDLYRTCKQSGTCPPDVINKVQLYSTCKAAGTCPPDVVNKVQLYQTCKASGTCPPDVIPKVQLYKTCKLSGTCPEDVVNKIQLYQTCKASGTCPPDVIPKVDLYKTCKQAGTCPSDVINKVDLYKTCKQSGTCPSDVINKVQLYKTCKQAGTCPPDVIPKVQLYSTCKAAGTCPPDVIPKV （配列番号９３）を含む。
【００６６】
さらに別の態様において、本複数型ＨＰＶポリペプチドは、ＨＰＶ  Ｌ２  １１‐８８−KRASATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKTIADQILQYGSMGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPTATDTLAP （配列番号９４）、ＨＰＶ  Ｌ２  １１‐８８−KRASVTDLYKTCKQSGTCPPDVVPKVEGTTLADKILQWSSLGIFLGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGGRSNTVVDVGPT （配列番号９５）、ＨＰＶ  Ｌ２  １１‐８８−KRAAPKDIYPSCKISNTCPPDIQNKIEHTTIADKILQYGSLGVFLGGLGIGTARGSGGRIGYTPLGEGGGVRVATRPT （配列番号９６）、ＨＰＶ  Ｌ２  １１‐８８−KRDSVTHIYQTCKQAGTCPPDVINKVEQTTVADNILKYGSAGVFFGGLGISTGRGTGGATGYVPLGEGPGVRVGGTPT （配列番号９７）、ＨＰＶ  Ｌ２  １１‐８８−KRASATQLYQTCKLTGTCPPDVIPKVEHNTIADQILKWGSLGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYVPLGTSAKPSITSGPM （配列番号９８)、ＨＰＶ  Ｌ２  １１‐８８−SATQLYQTCKLTGTCPPDVIPKVEHNTIADQILKWGSLGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYVPLQTSAKPSITSGPMAKRA （配列番号９９）、ＨＰＶ  Ｌ２  １１‐８８−SATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKTIADQILQYGSMGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPTATDTLAPRA （配列番号１００）、ＨＰＶ  Ｌ２  １１‐８８−SVTDLYKTCKQSGTCPPDVVPKVEGTTLADKILQWSSLGIFLGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGGRSNTVVDVGPTRKRA （配列番号１０１）、ＨＰＶ  Ｌ２  １１‐８８−SATQLYQTCKAAGTCPSDVIPKIEHTTIADQILRYGSMGVFFGGLGIGSGSGTGGRTGYVPLSTRPSTVSEASIPRA （配列番号１０２）、ＨＰＶ  Ｌ２  １１‐８８−SATDLYRTCKQSGTCPPDVVDKVEGTTLADKILQWTSLGIFLGGLGIGTGTGTGGRTGYIPLGGRPNTVVDVSPARRA （配列番号１０３）、ＨＰＶ  Ｌ２  １１‐８８−SVTQLYSTCKAAGTCPPDVVNKVEGTTLADKILQWSGLGIFLGGLGIGTGSGSGGRTGYIPLGGGGRPGVVDIAPARA （配列番号１０４）、ＨＰＶ  Ｌ２  １１‐８８−SATQLYKTCKLSGTCPEDVVNKIEQKTWADKILQWGSLFTYFGGLGIGTGTGSGGRAGYVPLGSRPSTIVDVTPARKKRA （配列番号１０５）、及び／又はＨＰＶ  Ｌ２  １１‐８８―SATQLYKTCKQAGTCPPDVIPKVEGSTIADNILKYGSIGVFFGGLGIGSGSGSGGRTGYVPLSTGTPSKPVEIP （配列番号１０６） から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５以上のペプチドを、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、６０、７０、８０、９０、１００、又は２００個以上含む。
【００６７】
ある実施形態において、複数型ＨＰＶポリペプチドは、ＨＰＶ  Ｌ２  １１‐８８ｘ５のアミノ酸−KRASATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKTIADQILQYGSMGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPTATDTLAPKRASVTDLYKTCKQSGTCPPDVVPKVEGTTLADKILQWSSLGFLGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGGRSNTVVDVGPTKRAAPKDIYPSCKISNTCPPDIQNKIEHTTIADKILQYGSLGVFLGGLGIGTARGSGGRIGYTPLGEGGGVRVATRPTKRDSVTHIYQTCKQAGTCPPDVINKVEQTTVADNILKYGSAGVFFGGLGISTGRGTGGATGYVPLGEGPGVRVGGTPTKRASATQLYQTCKLTGTCPPDVIPKVEHNTIADQILKWGSLGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGVPLGTSAKPSITSGPM （配列番号１０７）を含む。
【００６８】
さらに別の実施形態において、複数型ＨＰＶポリペプチドは、ＨＰＶ  Ｌ２  １１‐８８ｘ８のアミノ酸−SATQLYQTCKLTGTCPPDVIPKVEHNTIADQILKWGSLGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYVPLQTSAKPSITSGPMAKRASATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKTIADQILQYGSMGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPTATDTLAPRASVTDLYKTCKQSGTCPPDVVPKVEGTTLADKILQWSSLGIFLGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGGRSNTVVDVGPTRKRASATQLYQTCKAAGTCPSDVIPKIEHTTIADQILRYGSMGVFFGGLGIGSGSGTGGRTGYVPLSTRPSTVSEASIPRASATDLYRTCKQSGTCPPDVVDKVEGTTLADKILQWTSLGIFLGGLGIGTGTGTGGRTGYIPLGGRPNTVVDVSPARRASVTQLYSTCKAAGTCPPDVVNKVEGTTLADKILQWSGLGIFLGGLGIGTGSGSGGRTGYIPLGGGGRPGVVDIAPARASATQLYKTCKLSGTCPEDVVNKIEQKTWADKILQWGSLFTYFGGLGIGTGTGSGGRAGYVPLGSRPSTIVDVTPARKKRASATQLYKTCKQAGTCPPDVIPKVEGSTIADNILKYGSIGVFFGGLGIGSGSGSGGRTGYVPLSTGTPSKPVEIP （配列番号１０８）を含む。
【００６９】
さらに別の実施形態において、複数型ＨＰＶポリペプチドはＨＰＶ６ｂ、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５６及びＨＰＶ７３のＬ２由来の相同領域を含む。かかるＨＰＶ  Ｌ２  １１‐８８ｘ８のアミノ酸は、 MASATQLYQTCKLTGTCPPDVIPKVEHNTIADQILKWGSLGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYVPLQTSAKPSITSGPMAKRASATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKTIADQILQYGSMGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPTATDTLAPRASVTDLYKTCKQSGTCPPDVVPKVEGTTLADKILQWSSLGIFLGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGGRSNTVVDVGPTRKRASATQLYQTCKAAGTCPSDVIPKIEHTTIADQILRYGSMGVFFGGLGIGSGSGTGGRTGYVPLSTRPSTVSEASIPRASATDLYRTCKQSGTCPPDVVDKVEGTTLADKILQWTSLGIFLGGLGIGTGTGTGGRTGYIPLGGRPNTVVDVSPARRASVTQLYSTCKAAGTCPPDVVNKVEGTTLADKILQWSGLGIFLGGLGIGTGSGSGGRTGYIPLGGGGRPGVVDIAPARASATQLYKTCKLSGTCPEDVVNKIEQKTWADKILQWGSLFTYFGGLGIGTGTGSGGRAGYVPLGSRPSTIVDVTPARKKRASATQLYKTCKQAGTCPPDVIPKVEGSTIADNILKYGSIGVFFGGLGIGSGSGSGGRTGYVPLSTGTPSKPVEIP （配列番号１０９）である。
【００７０】
さらに別の実施形態において、複数型ＨＰＶポリペプチドは、ＨＰＶ  Ｌ２  １１‐２００−KRASATQLYQTCKASGTCPPDIIAKVEQNTLADKILKWGSLGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYVPVQTAPRPAIPFGPTARPPIIVDTVGPSDSSIVSLVEDSTIINSAASDFVPPIREGFEISTSETTTPAILDVSVTTHNTTSTSIFKNPAFAEPSIVQSQPSVEASGHVLTSTYTSTISSHSVEDIPLDT （配列番号１１０）、ＨＰＶ  Ｌ２  １１‐２００−KRASATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKTIADQILQYGSMGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPTATDTLAPVRPPLTVDPVGPSDPSIVSLVEETSFIDAGAPTPVPSIPPDVSGFSITTSTDTTPAILDINNTVFTTVTTHNNPTFTDPSVLQPPTPAETGGHFTLSSSTISTHNYEEIPMDT （配列番号１１１）、及び／又はＨＰＶ  Ｌ２  １１‐２００−KRASVTDLYKTCKQSGTCPPDVVPKVEGTTLADKILQWSSLGIFLGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGGRSNTVVDVGPTRPPVVIEPVGPTDPSIVTLIEDSSVVTSGAPRPTFTGTSGFIDITSAGTTTPAVLDITPSSTSVSISTTNFTNPAFSDPSIIEVPQTGEVAGNVFVGTPTSGTHGYEEIPLQT （配列番号１１２） から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０以上のペプチドを、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、６０、７０、８０、９０、１００、又は２００個以上含む。ある実施形態において、複数型ＨＰＶポリペプチドは、アミノ酸配列ＨＰＶ  Ｌ２  １１‐２００ｘ３−KRASATQLYQTCKASGTCPPDIIAKVEQNTLADKILKWGSLGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYVPVQTAPRPAIPFGPTARPPIIVDTVGPSDSSIVSLVEDSTIINSAASDFVPPIREGFEISTSETTTPAILDVSVTTHNTTSTSIFKNPAFAEPSIVQSQPSVEASGHVLTSTYTSTISSHSVEDIPLDTKMSATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGIADQILQYGSMGVFFGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGTRPPTATDTLAPVRPPLTVDPVGPSDPSIVSLVEETSFIDAGAPTPVPSIPPDVSGFSITTSTDTTPAILDINNTVTTVTTHNNPTFTDPSVLQPPTPAETGGHFTLSSSTISTHNYEEIPMDTKRASVTDLYKTCKQSGTCPPDVVPKVEGTLADKILQWSSLGIFLGGLGIGTGSGTGGRTGYIPLGGRSNTVVDVGPTRPPVVIEPVGPTDPSIVTLIEDSSVVTSGAPRPTFTGTSGFDITSAGTTTPAVLDITPSSTSVSISTTNFTNPAFSDPSIIEVPQTGEVAGNVFVGTPTSGTHGYEEIPLQT （配列番号１１３）を含む。 
【００７１】
ある実施形態において、複数型ポリペプチド「ＦｕｒｉｎＤＫＩＬＫｘ１５」は、ＨＰＶ６ｂ、ＨＰＶ１１、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３、ＨＰＶ３５、ＨＰＶ３９、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５１、ＨＰＶ５２、ＨＰＶ５６、ＨＰＶ５８、ＨＰＶ５９及びＨＰＶ７３に由来するＬ２タンパク質配列を含む。ＦｕｒｉｎＤＫＩＬＫｘ１５のアミノ酸配列は、 MASATQLYQTCKLTGTCPPDVIPKVEHNTIADQILKASATQLYQTCKATGTCPPDVIPKVEHTTIADQILKASATQLYKTCKQAGTCPPDIIPKVEGKTIADQILQASVTDLYKTCKQSGTCPPDVVPKVEGTTLADKILQASATQLYQTCKAAGTCPSDVIPKIEHTTIADQILRASATQLYQTCKATGTCPPDVIPKVEGSTIADQILKASATQLYRTCKAAGTCPPDVIPKVEGNTVADQILKASATDLYRTCKQSGTCPPDVVDKVEGTTLADKILQASATDLYRTCKQSGTCPPDVINKVEGTTLADKILQASVTQLYSTCKAAGTCPPDVVNKVEGTTLADKILQASATQLYQTCKASGTCPPDVIPKVEGTTIADQLLKASATQLYKTCKLSGTCPEDVVNKIEQKTWADKILQASATQLYQTCKASGTCPPDVIPKVEGTTIADQILRASATDLYKTCKQAGTCPSDVINKVEGTTLADKILQASATQLYKTCKQAGTCPPDVIPKVEGSTIADNILK （配列番号１１４）である。
【００７２】
本発明のペプチドは典型的には、当業者に公知のペプチド合成方法を用いて合成されるもの、及び／又は、当業者に公知のペプチド化学を用いて連結されるものである。他の態様において、本発明のペプチド及びポリペプチドは、当業者に公知の組換え技術を用いて発現させられ、精製されうる。
［２．リンカー］
【００７３】
本発明には、多数のペプチドを含むオリゴマー又は融合タンパク質が包含されている。かかるオリゴマーは、ダイマー、トリマー、又はさらに大きいオリゴマーを含む、共有結合又は非共有結合によるマルチマーの形を取りうる。本発明のある態様において、かかるオリゴマーは免疫応答刺激能力を維持する。本発明の一実施形態は、共有結合又は非共有結合によるペプチド間リンカーを介して結合された複数のペプチドを含むオリゴマーに関する。かかるリンカーは、ペプチドリンカー（スペーサー）又はオリゴマー化を促進する特性を有するペプチドでありうる。結合したペプチドのオリゴマー化を促進できるペプチドには、ロイシンジッパー及び抗体に由来するある種のポリペプチドがある。適切なペプチドリンカーには、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，７５１，１８０号及び第４，９３５，２３３号に記載のものがある。ある実施形態において、本発明のペプチドはペプチド間の識別可能なリンカーなしに、ペプチド結合により結合しうる。
［３．送達媒体］
【００７４】
既知のワクチン用製剤には、哺乳動物の免疫系に抗原を提示し、病原体に対する防御的又は治療的免疫応答を励起するために、様々な送達媒体が用いられてきた。かかる「送達媒体」には、ワクチン薬剤として、熱により又は化学的に不活化された全ウイルス、かかる全ウイルスのタンパク質粒子、アデノウイルスやワクシニア等のウイルスベクターが挙げられ、他には特にＤＮＡを用いたベクター又はプラスミドが挙げられる。
【００７５】
ウイルス様粒子。ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、ワクチン薬剤として研究されてきた。一般にカプシドに包まれたウイルスは、ウイルス核酸を収容するために構築されるタンパク質の外被、すなわち「カプシド」を含む。多くのウイルスが、個別に発現するカプシドタンパク質からＶＬＰを形成するよう「自己構築」可能なカプシドを有し、それはかかるカプシドが発現する細胞内（「インビボ構築」）及び単離精製後の細胞外（「インビトロ構築」）の両方で可能である。
【００７６】
ウイルス様粒子は、感染性物質を包含する必要なしにウイルス粒子の全体構造を模倣する。ＶＬＰは、ウイルスＤＮＡ又はＲＮＡゲノムを有していない場合があるが、れっきとしたウイルスの３次元構造を維持している。ＶＬＰは、Ｂ細胞介在性応答、ＣＤ４増殖性応答及び細胞障害性Ｔリンパ球応答を刺激する能力を有する。Schirmbeck et al. (1996) Intervirology 39, 111-119、Paliard et al. (2000) AIDS Res. Hum. Retroviruses 16, 273-282、Murata et al. (2000) PNAS USA 100, 6753-6758参照。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国公開特許公報第２００７００４１９９９号も参照のこと。
【００７７】
ＶＬＰは、ノーウォーク、Ｂ型及びＣ型肝炎、パピローマウイルス、パルボウイルス及びインフルエンザＡ型を含む、ヒト及び他の動物に感染する３０を超える異なるウイルスに関して作製されている。
【００７８】
ウイルス様粒子はまた、他の病原体に由来するエピトープの送達のための担体分子としても機能するよう操作されうる。Noad et al. (2003) Trends in Microbiology 11(9), 438-444、Sadeyen et al. (2003) Virology 309:32-40、ＷＯ２００５／００５６１４、米国公開特許公報第２００４／００３３５８５号及び第２００５／００４８０８２号、米国特許公報第６，４４８，０７０号、第６，１１０，４６６号、第６，１７１，５９１号、Brinkman et al. (2004) Lett. Drug Des. & Disc. 1:137-147参照。抗原性ペプチドを含むようにカプシドタンパク質を修飾し、組換えウイルスカプシドタンパク質‐抗原性ペプチド融合物を作製しうる。かかる融合カプシドタンパク質‐抗原性ペプチド製造物は、宿主細胞において発現し、組換えウイルス粒子又はウイルス様粒子を形成するようインビボ又はインビトロで構築され、免疫応答を誘発するために宿主に投与されうる。
【００７９】
ナノ粒子。一態様において、ペプチドは、例えばナノ粒子や他の基質等の非タンパク質物質と連結されうる。ナノ粒子は、典型的には直径約１ｎｍ〜２００ｎｍであり、免疫原性ペプチドを患者に送達するために用いられうる。１つ以上のペプチドが、共有結合相互作用又は非共有化学的相互作用によりナノ粒子に結合されうる。非共有化学的相互作用には、親和性相互作用（例えば、アビジン／ビオチン、抗原／抗体、受容体／リガンド）、イオン性相互作用、及び／又は、疎水性相互作用が含まれうる。ペプチドをナノ粒子等の固相担体に結合する方法は、例えば、米国公開特許公報第２００４／０２５８６９８号に記載されている。約５０ｎｍ〜約２００ｎｍの直径を有するナノ粒子は、全身に送達されうる。本願において、「ナノ粒子」なる用語は、ナノメートルの粒度範囲（約１ｎｍ〜５００ｎｍ）の、規定の係留分子が規則的に配列された表面を有するよう形成されうる、ポリマー球体又は球状体を意味する。好ましくは、ナノ粒子を形成するために自己構築モノマーが利用される。さらに、ナノ粒子なる用語には、重合リポソーム及び非重合リポソームの両方、バイセル及びミセル、並びにウイルスカプシド構造の使用が包含されている。本発明の組成物及び方法にはナノ粒子が好ましいとはいえ、当業者に公知であるデンドリマー等の他の枠組、足場、及び他の「プレゼンター」が、本発明に従ってリガンドを提示するのに適したものとして用いられうる。多価ナノ粒子が米国公開特許公報第２００３０２２３９３８号に記載されている。
【００８０】
本発明のペプチドは、リポソーム組成物に含有されて投与されうる。本発明のリポソームは、多重膜小胞（ＭＬＶ）でありうる。かかるリポソームは、親水性の尾部及び極性部位すなわち化学反応性部位を有するリポソーム形成脂質を含み、かかる極性部位は酸、アルコール、アルデヒド、アミン又はエステルを含む。かかるリポソームはさらに、炭化水素鎖又はステロイドの尾部及び極性の頭部により特徴付けられうる。リポソーム形成脂質はリン脂質を含む。適切なリン脂質の例には、ホスファチジン酸、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール及びスフィンゴミエリンが含まれるが、これに限定されるものではない。
【００８１】
本発明のリポソームに被包又は連結されうる物質には、タンパク質及びペプチドが含まれる。ある実施形態において、かかる物質には２つ以上の化合物が含まれる。本発明のペプチドは、ペプチドを脂質表面に局在させる親油性成分を含むこと、又はそれと結合されることがありうる。複数型ペプチドはリポソーム表面に局在させられうる。米国公開特許公報第２００６００３５８５３号参照。
［Ｃ．アジュバント及び他の免疫刺激性又は免疫促進性成分］
【００８２】
ポリペプチド又はペプチド又は複数型ＨＰＶペプチド組成物の免疫原性は、アジュバントとして知られる付加的な、免疫応答の非特異的刺激物質の使用により高めることができる。適切なアジュバントには、サイトカイン、トキシン又は合成組成物等の許容可能なあらゆる免疫刺激物質成分が含まれる。
【００８３】
多くのアジュバントが  複数型ＨＰＶポリペプチド又は本明細書に記載のあらゆる他の組成物に対する抗体応答を高めるために用いられうる。アジュバントは、（１）体内で抗原を閉じ込め、抗原放出を遅らせる、（２）免疫応答に関与する細胞を投与箇所に誘引する、（３）免疫系細胞の増殖又は活性化を誘導する、或いは（４）患者の全身への抗原の拡散を促進するために用いられうる。
【００８４】
アジュバント製剤には、水中油エマルション、油水中エマルション、無機塩、ポリヌクレオチド、及び天然物質が含まれるが、これに限られるものではない。使用されうる具体的なアジュバントには、ＩＬ‐１、ＩＬ‐２、ＩＬ‐４、ＩＬ‐７、ＩＬ‐１２、γ‐インターフェロン、ＧＭＣＳＰ、ＢＣＧ、水酸化アルミニウムやその他のアルミニウム化合物等のアルミニウム塩、ｔｈｕｒ‐ＭＤＰ及びｎｏｒ‐ＭＤＰ等のＭＤＰ化合物、ＣＧＰ（ＭＴＰ‐ＰＥ）、リピドＡ、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、２％スクアレン／Tween 80エマルション中にＭＰＬと、トレハロースジミコール酸（ＴＤＭ）と、細胞壁骨格（ＣＷＳ）という、細菌から抽出された３成分を含有するＲＩＢＩ、ＣｐＧ１０１８、及び／又はＧＰＩ‐０１００、並びにこれらの様々な組合せが含まれる。ある態様において、アジュバントは、TWEEN（商標）又はミョウバン又はこれらの組合せのうちの１つ以上と組み合わされたＣｐＧ １０１８又はＧＰＩ‐０１００である。ＭＨＣ抗原も用いられうる。他のアジュバント又は方法は、米国特許公報第６，８１４，９７１号、第５，０８４，２６９号、第６，６５６，４６２号に例示されており、これら公報は参照により本明細書に組み込まれる。
【００８５】
ワクチンのためのアジュバント効果を達成する様々な方法には、通常はリン酸緩衝生理食塩水中約０．０５〜０．１％の溶液として用いられる、水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム（ミョウバン）等の物質、或いは、約０．２５％の溶液として用いられる糖の合成ポリマー（CARBOPOL（登録商標））の混合物、或いは、約７０℃〜約１０１℃の温度での３０秒〜２分間の加熱処理で得られるワクチン中のタンパク質凝集の使用がそれぞれ含まれる。ペプシン処理（Ｆａｂ）されたアルブミンに対する抗体で再活性化することによる凝集、或いは、細菌細胞（例えば、
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（C. parvum））、エンドトキシン、又はグラム陰性菌のリポ多糖成分の混合物、或いは、生理学的に許容可能な油溶媒（例えば、モノオレイン酸マンニド（Aracel A））中のエマルション、或いは、代用血液（block substitute）として用いられるパーフルオロカーボンの２０％溶液（FLUOSOL-DA（登録商標））がまた、アジュバント効果をもたらすために用いられる。典型的なアジュバントは、不完全フロイントアジュバント（死滅したマイコバクテリウム・ツベルクローシスを含有）、不完全フロイントアジュバント、及び水酸化アルミニウムである。
【００８６】
アジュバントに加えて、免疫応答を高めるために生物応答修飾物質（ＢＲＭ）の併用が望ましいと考えられる。ＢＲＭは、Ｔ細胞免疫を上方制御すること、又は、サプレッサー細胞活性を下方制御することが示されてきた。かかるＢＲＭには、シメチジン（ＣＩＭ、１２００ ｍｇ／ｄ）（Smith/Kline社製, PA）、並びに、少用量シクロホスファミド（ＣＹＰ、 ３００ ｍｇ/ｍ２） （Johnson/Mead社製, NJ）、並びに、γ‐インターフェロン、ＩＬ‐２又はＩＬ‐１２等のサイトカイン、並びに、Ｂ‐７等の免疫ヘルパー機能に関与するタンパク質をコードする遺伝子が含まれるが、これに限られるものではない。
【００８７】
Ｔヘルパーエピトープ。ＣＤ８＋細胞障害性リンパ球（ＣＴＬ）及びＣＤ４ヘルパー細胞（Ｔｈ細胞）という主要な２つの型のＴリンパ球が記述されてきた。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して、クラスＩＭＨＣ分子により例えばウイルスや細菌が感染した細胞上に提示される外来抗原を認識するエフェクター細胞である。外来抗原を認識すると、ＣＤ８＋細胞は、活性化、成熟及び増殖プロセスを経る。この分化プロセスにより、外来抗原を提示する標的細胞を破壊する能力を有するＣＴＬクローンがもたらされる。一方でＴヘルパー細胞は、液性及び細胞介在性の両方の形のエフェクター免疫応答に関与する。液性又は抗体免疫応答に関しては、Ｔｈ細胞との相互作用を通してＢリンパ球により抗体が作られる。具体的には、循環微生物等の細胞外抗原が、特化した抗原提示細胞（ＡＰＣ）により取り込まれ、処理され、クラスＩＩ主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子を介してＣＤ４＋Ｔｈ細胞に提示される。次にこれらＴｈ細胞がＢリンパ球を活性化し、抗体産生に至る。対照的に、細胞介在性又は細胞性免疫応答は、標的細胞への感染成功後等、細胞内に生息する微生物を中和するよう機能する。例えば微生物抗原等の外来抗原は、感染細胞内で合成され、かかる細胞の表面にクラスＩＭＨＣ分子を介して提示される。かかるエピトープの提示は、上記のＣＤ８＋ＣＴＬの刺激をもたらし、このプロセスはまたＣＤ４＋Ｔｈ細胞によっても刺激される。Ｔｈ細胞は、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞と呼ばれる少なくとも２つの別個の亜細胞から成る。Ｔｈ１及びＴｈ２亜型は、抗原への曝露後に共通の前駆体から分化する偏向したＴｈ細胞集団を表す。
【００８８】
ある態様において、複数型ＨＰＶポリペプチドはまた、Ｔｈ１型又はＴｈ２型のいずれかの応答の選択的誘導因子を含む。高レベルのＴｈ１型サイトカインは、所与の抗原に対する細胞介在性免疫応答を誘導する傾向にあり、一方で高レベルのＴｈ２型サイトカインは、抗原に対する液性免疫応答を誘導する傾向にある。
【００８９】
Ｔｈ１型及びＴｈ２型免疫応答の区別は、絶対的なものではない。現実には個人は、Ｔｈ１が支配的である、又はＴｈ２が支配的であると記述される免疫応答を裏付ける。しかし、サイトカインのファミリーをMosmannとCoffmanにより記述されたマウスＣＤ４＋Ｔ細胞クローンにおけるサイトカインファミリーの観点から検討することがしばしば有用である（Mosmann and Coffman, 1989）。従来Ｔｈ１型応答は、Ｔリンパ球によるＩＮＦ‐γ及びＩＬ‐２サイトカインの産生と関連付けられる。Ｔｈ１型免疫応答の誘導に直接関与することの多い他のサイトカインは、ＩＬ‐１２等のように、Ｔ細胞によっては産生されない。対照的にＴｈ２型応答は、ＩＬ‐４、ＩＬ‐５、ＩＬ‐６、ＩＬ‐１０の分泌と関連する。
【００９０】
ある態様において、Ｔｈエピトープには、テタヌストキシン及びジフテリアトキシン等の細菌タンパク質又はトキシンに由来するＴ細胞エピトープが含まれるが、これに限られるものではない。例を挙げれば、テタヌストキシンに由来するＰ２及びＰ３０エピトープ、Ｂ型肝炎コア抗原、結核菌、マイコバクテリウム・ツベルクローシスＲＡ１２（ＭＴＢ３２Ａの部分配列（アミノ酸残基番号１９２〜３２３）（Skeiky et al. 1999））、モルビリウイルス／イヌジステンパーウイルスのｐ２５タンパク質：KLIPNASLIENCTKAEL（配列番号１１７）、 ＰＶ（ポリオウイルス）配列１０３〜１１５：KLFAVWKITYKDT（配列番号１１８）、Ｍ５：NKLIAYPAVEALS（配列番号１１９）、ＴＴ（テタヌストキシン）８３０〜８４４：QYIKANSKFIGITEL（配列番号１２０）、ＰＡＤＲＥ：aKXVMWTLKAAa (a=D-Ala, X=L-cyclohexyl-Ala)（配列番号１２１）、Ｅ７ ｐ２０〜２９：TDLYCYEQLN（配列番号１２２）、Ｅ７ ｐ４５〜５４：AEPDRAHYNI（配列番号１２３）、Ｅ７ ｐ６０〜７９：KCDSTLRLCVQSTHVIRTL（配列番号１２４）、Ｅ７ ｐ８５〜９４：GTLGIVGPIC（配列番号１２５）、ｒａｓ ｐ５〜１７：KLVVVGARGVGKS（配列番号１２６）、ｎｅｕ ｐ４２〜５６：HLDMLRHLYQGGQVV（配列番号１２７）、ｎｅｕ ｐ７８３〜７９７：SRLLGICLTSTVQLV（配列番号１２８）、及びＭＡＧＥ‐３１２１〜１３４：LLKYRAREPVTKAE（配列番号１２９）である。
【００９１】
Ｔｏｌｌ様受容体。防御的免疫の生成は、抗原への曝露のみならず、抗原に遭遇する状況にも依存することが現在では広く認識されている。炎症との関連では、新規抗原の宿主への導入が、長期的免疫ではなく免疫寛容をもたらし、一方で催炎物質（アジュバント）の存在下での抗原への曝露が免疫を誘導するという数多くの例が存在する（Mondino et al., 1996; Pulendran et al., 1998; Jenkins et al., 1994; and Keamey et al., Immunity 1:327, 1994）。このことは寛容と免疫との間の差異を意味しうるので、抗原提示の適切な免疫原性状況の創出に関与する分子経路を刺激する、感染因子内に存在する「アジュバント」を発見するための多くの努力がなされてきた。かかるアジュバント活性の大部分が、微生物及びウイルス産物と、免疫細胞に発現する様々なＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）との間の相互作用によることが現在では知られている（Beutler et al., 2004; Kaisho, 2002; Akira et al., 2003; and Takeda and Akira, 2004）。ＴＬＲは、ショウジョウバエの発生において機能し、抗微生物免疫に関与するＴｏｌｌと呼ばれるショウジョウバエの分子との相同性から命名された（Lernaitre et al., 1996; and Hashimoto et al., 1988）。
【００９２】
初期の研究が示したのは、Ｔｏｌｌ及びＴｏｌｌ経路分子の哺乳類ホモログが、生得免疫系細胞が微生物感染及び微生物の副産物に応答する能力にとって非常にに重要であるということである（Medzhitov et al., 1997; Medzhitov et al., 1998; Medzhitov et al., 2000; Medzhitov et al., 2000; and Janeway et al., 2002）。ＬＰＳがＴＬＲ４アゴニストとして同定されて以来（Poltorok et al., 1998）、トリアシル複数型ＨＰＶポリペプチド（ＴＬＲ１）、並びに、ペプチドグリカン、リポタイコ酸及びＰａｍ３Ｃｙｓ（ＴＬＲ２）、並びに、ｄｓＲＮＡ（ＴＬＭ）、並びに、フラジェリン（ＴＬＲＳ）、並びに、Ｍａｌｐ‐２等のジアシル複数型ＨＰＶポリペプチド（ＴＬＲ６）、並びに、イミダゾキノリン及び一本鎖ＲＮＡ（ＴＬＲ７、８）、並びに、細菌ＤＮＡ、非メチル化ＣｐＧ ＤＮＡ配列及びヒトゲノムＤＮＡ抗体複合体（ＴＬＲ９）等の数多くの他のＴＬＲアゴニストが記録されてきた（Takeuchi et al., 2001; Edwards et al., 2002; Hayashi et al., 2003; Nagase et al., 2003）。
【００９３】
ある態様において、ＴＬＲ２リガンドには、リポタイコ酸、マンヌロン酸、ペプチドグリカン、非定型ＬＰＳ、ＭＡＬＰ‐２及びＭＡＬＰ‐４０４（リポタンパク質）、ＯｓｐＡ、ポリン、ＬｃｒＶ、リポマンナン、ＧＰＩアンカー、リゾホスファチジルセリン、
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（ＬＰＧ）、グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）、ザイモサン、ヘマグルチニン、並びに、これらの類似体又は誘導体が含まれるが、これに限定されるものではない。さらなる態様において、ＴＬＲ２アゴニストには、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、ボレリア・ブルグドルフェリ又はトレポネーマ・パリダムに由来する細菌リポペプチド、スタフィロコッカス・アウレウスを含む諸種に由来するペプチドグリカン、ナイセリアポリン、細菌線毛、エルシニア病原性因子、ＣＭＶビリオン、麻疹ヘマグルチニン、並びに、酵母由来ザイモサンが含まれる。
【００９４】
ある態様において、ＴＬＲアゴニストは脂質の一部である。脂質の一部には、パルミトイル基、ミリストイル基、ステアロイル基及びデカノイル基等の脂肪酸、或いは、より一般的には、Ｃ２〜Ｃ３０の任意の飽和、モノ不飽和又はポリ不飽和脂肪アシル基が含まれるが、これに限られるものではない。ある態様において、かかる脂質の一部は、Ｐａｍ２Ｃｙｓ［Ｓ‐［２，３‐ビス（パルミトイルオキシ）プロピル］システイン］又はＰａｍ３Ｃｙｓ［Ｎ‐パルミトイル ‐Ｓ‐［２，３‐ビス（パルミトイルオキシ）プロピル］システイン］部分である。Ｐａｍ３Ｃｙｓ又は Ｐａｍ３Ｃｙｓ‐ＯＨ（Wiesmuller et al., 1983）は、グラム陰性菌の内膜及び外膜にまたがるBraunのリポタンパク質のＮ末端部分が合成された型である（例えば、米国特許公報第５，７００，９１０号。この公報は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。さらなるＴＬＲアゴニストが、米国公開特許公報第２００８０１４５３７５号に記載されており、この公報は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
［Ｄ．脂質成分及び脂質部分］
【００９５】
ある実施形態において、本発明は複数型ＨＰＶペプチドと非共有結合する１つ以上の脂質を含む組成物に関する。脂質は、水に不溶性であり、有機溶媒で抽出可能な物質である。具体的に本明細書に記載されている以外の化合物が、当業者により脂質として理解されるのであり、本発明の組成物及び方法に包含される。
【００９６】
脂質は、天然脂質又は合成脂質でありうる。しかしながら、脂質は通常は生体物質である。生体脂質は当該の技術分野において良く知られており、例えば、中性脂肪、リン脂質、ホスホグリセリド、ステロイド、テルペン、リゾ脂質、スフィンゴ糖脂質、糖脂質、硫酸化糖脂質（sulphatide）、エーテル結合及びエステル結合脂肪酸を有する脂質、重合性脂質、並びに、これらの組合せを含む。
【００９７】
脂質と会合した複数型ＨＰＶペプチドは、脂質を含有する溶液中で分散させても、脂質で溶解させても、脂質で乳化させても、脂質と混合させても、脂質と組み合わせても、脂質中に懸濁として含有させても、又は、その他の方法で脂質と会合させてもよい。本発明の脂質会合組成物は、任意の特定の構造に限定されない。例えば、かかるペプチドを単に溶液中に散在させ、おそらくは大きさ又は形において一様でない凝集を形成させることも考えられる。また別の例では、かかるペプチドが、二重膜構造で、ミセルとして、又は「崩壊した」構造で存在することも考えられる。また別の例では、Lipofectamine（Gibco BRL社製）又はSuperfect（Qiagen社製）複合体も考慮されるが、これに限定されるものではない。
【００９８】
ある実施形態において、組成物は約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、約１５％、約１６％、約１７％、約１８％、約１９％、約２０％、約２１％、約２２％、約２３％、約２４％、約２５％、約２６％、約２７％、約２８％、約２９％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約４１％、約４２％、約４３％、約４４％、約４５％、約４６％、約４７％、約４８％、約４９％、約５０％、約５１％、約５２％、約５３％、約５４％、約５５％、約５６％、約５７％、約５８％、約５９％、約６０％、約６１％、約６２％、約６３％、約６４％、約６５％、約６６％、約６７％、約６８％、約６９％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％重量パーセントの脂質、又はこれらの間の任意の範囲若しくは値の重量パーセントの特定の脂質、脂質型、又は、アジュバント、糖、核酸等の非脂質成分、或いは本明細書願において開示されている物質又は当業者に公知の他の物質を含みうる。したがって、本発明の組成物が、脂質、脂質型又は他の成分のうち任意のものを、任意の組合せ又は任意の比率で含みうることが考慮される。
［ＩＩ．ポリペプチド及びその断片の作製］
［Ａ．ポリペプチド合成及び／又は結合］
【００９９】
ある態様において、前記ポリペプチドは、従来の方法を特定のアミノ酸配列に関して修正して用いて合成することができる。かかる技術には、ペプチド合成の分野に通じた当業者に良く知られた方法、例えば、溶相合成法（Finn and Hoffman, 1976参照）、又は固相合成法（Barany and Merrifield, 1979参照）、又はMerrifield (1963) に報告されている段階的固相合成法が含まれるが、これに限られるものではない。これら文献の内容は参照により本明細書に組み込まれる。他のペプチド合成技術に関する文献としては、Lu et al. (1981) により開示されているＦｍｏｃ‐ポリアミド法による固相ペプチド合成により合成されたペプチド、並びに、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ法を用いて合成されたペプチド（Atherton and Sheppard, 1989）に関するものが含まれる。Ｆｍｏｃアミノ酸は、例えば、Chem-Impex International社（Wood Dale, Ill., USA）、Merck Biosciences社（Nottingham, UK）、及び Bachem UK Ltd.社 （St. Helens, UK） 等、様々なメーカーから入手可能である。
【０１００】
合成後又は合成中にペプチドは、スペーサー、アミノ酸、ポリマー又は脂質と結合される。ある態様において、リシン又はリシン類似体の末端側鎖基（例えば、内部リシンのイプシロンアミノ基）は、多数の保護基のうちの１つにより保護されている。ブロッキング基又は保護基又はマスキング基とは、結合反応に関与する活性化カルボキシル基を有するアミノ酸のアミノ基を保護するため、或いは、結合反応に関与するアシル化アミノ基を有するアミノ酸のカルボキシル基を保護するために用いられる。結合が生じるには、ブロッキング基は、ペプチド結合又はペプチドの他の部分に結合する保護基を破壊することなく除去されなければならない。ペプチドは、当該技術分野に良く知られた方法により脂質付加されうる。標準的な縮合、付加、置換又は酸化（例えば、内部リシン又はリシン類似体上の末端アミノ基と、新たに加わるアミノ酸又はペプチド又はリポアミノ酸のカルボキシル末端基との間のジスルフィド架橋形成又はアミド結合形成）反応が、ペプチドへの脂質の付加をもたらす。
［Ｂ．発現系］
【０１０１】
本発明のポリペプチド及び断片の発現、単離及び精製は、任意の適切な技術により達成可能であると考えられる。
【０１０２】
本発明はまた、ＤＮＡを含む組換えクローニング及び発現ベクターを提供し、またかかる組換えベクターを含む宿主細胞を提供する。ＤＮＡを含む発現ベクターは、かかるＤＮＡによりコードされる本発明のポリペプチド又は断片を調製するのに用いられうる。ポリペプチド作製方法は、かかるポリペプチドをコードする組換え発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を、かかるポリペプチドの発現を促進する条件下で培養し、その後に発現ポリペプチドを培地から回収することを含む。当業者は、使用される宿主細胞の型、並びに、かかるペプチドが膜結合ペプチドであるか、又は、宿主細胞から分泌される可溶性ペプチドであるか等の要因により、かかる発現ポリペプチドの精製法が変化することを認識すると考えられる。本発明のポリペプチドは、精製の際に直接の輸送やその補助を行う各種のリーダー配列を含みうる。
【０１０３】
あらゆる適切な発現系が用いられうる。前記ベクターは、哺乳動物、微生物、ウイルス又は昆虫の遺伝子等に由来する適切な転写又は翻訳制御ヌクレオチド配列と機能可能に連結された、本発明のポリペプチド又は断片をコードするＤＮＡを含む。制御配列の例には、転写プロモーター、オペレーター又はエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、並びに、転写及び翻訳の開始及び終止を制御する適切な配列が含まれる。ヌクレオチド配列が機能可能に結合されているのは、かかる制御配列がＤＮＡ配列と機能的に関係する場合である。したがって、プロモーターヌクレオチド配列がＤＮＡ配列の転写を制御するのであれば、かかるプロモーターヌクレオチド配列はかかるＤＮＡ配列と機能可能に結合されている。所望の宿主細胞に複製能を付与する複製起点、並びに、形質転換体を同定する選択遺伝子は、一般に前記発現ベクターに組み込まれている。
【０１０４】
加えて、適切なシグナルペプチドをコードする配列（天然型又は異種）が、発現ベクターに組み込まれうる。シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡ配列は、本発明の核酸配列とインフレーム融合され、そのＤＮＡが最初に転写され、そのｍＲＮＡが翻訳され、シグナルペプチドを含む融合タンパク質となりうる。目的の宿主細胞内で機能するシグナルペプチドは、ポリペプチドの細胞外への分泌を促進する。かかるシグナルペプチドは、細胞からポリペプチドが分泌された際にポリペプチドから切断される。
【０１０５】
前記シグナルペプチドが切断される位置が、コンピュータプログラムの予測と異なりうること、並びに、組換えポリペプチドの発現に用いられる宿主細胞の型等の要因により異なりうることも、当業者は認識すると考えられる。タンパク質調製には、２箇所以上のシグナルペプチドの切断による、様々なＮ末端アミノ酸を有するタンパク質分子の混合物が含まれる。
【０１０６】
ポリペプチド発現に適した宿主細胞には、原核細胞、酵母又は高等真核細胞が含まれる。哺乳動物又は昆虫の細胞が、一般的に宿主細胞としての使用に好ましい。細菌、真菌、酵母及び哺乳動物の細胞宿主と共に用いるのに適切なクローニング及び発現ベクターが、例えばPouwels et al. (1985) に記述されている。無細胞翻訳系もまた、本明細書に開示のＤＮＡコンストラクトに由来するＲＮＡを用いたポリペプチドの作製のために用いられうる。
［１．原核細胞系］
【０１０７】
原核生物には、グラム陰性又はグラム陽性生物が含まれる。形質転換に適した原核宿主細胞には、例えば、大腸菌、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）、サルモネラ・チフィムリウム（Salmonella typhimurium）、並びに、シュードモナス属、ステレプトマイセス（Streptomyces）属及びブドウ球菌属に属する他の多様な種が含まれる。大腸菌等の原核宿主細胞内でポリペプチドは、かかる原核宿主細胞内での組換えポリペプチド発現を促進するためにＮ末端メチオニン残基を含みうる。かかるＮ末端Ｍｅｔは、発現組換えポリペプチドから切断されうる。
【０１０８】
原核宿主細胞内で用いられる発現ベクターは、一般に１つ以上の表現型選択可能マーカー遺伝子を含む。表現型選択可能マーカー遺伝子とは、例えば、抗生物質耐性を付与するタンパク質、又は、独立栄養要件を供給するタンパク質をコードする遺伝子である。有用な原核宿主細胞用発現ベクターの例には、pBR322クローニングベクター（ＡＴＣＣ ３７０１２）等の市販プラスミドに由来するものが含まれる。pBR322は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、それゆえ形質転換細胞同定のための簡便な手段を提供する。適切なプロモーター及びＤＮＡ配列がpBR322ベクターに挿入されうる。他の市販のベクターには、例えば、pKK223-3（Pharmacia Fine Chemicals社製, Uppsala, Sweden）及び pGEM1（Promega Biotec社製, Madison, Wis., USA）が含まれる。
【０１０９】
組換え原核宿主細胞発現ベクターに通常用いられるプロモーター配列には、β‐ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（Chang et al., 1978; Goeddel et al., 1979）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Goeddel et al., 1980; 欧州公開特許公報第３６７７６号）及びｔａｃプロモーター（Maniatis, 1982）が含まれる。特に有用な原核宿主細胞発現系には、ファージλＰＬプロモーター及びｃＩ８５７ｔｓ熱不安定性リプレッサー配列が用いられる。米国培養細胞系統保存機関（the American Type Culture Collection）より入手可能な、かかるλＰＬプロモーターの誘導体を組み込んだプラスミドベクターには、pHUB2（大腸菌ＪＭＢ９株に定住、ＡＴＣＣ ３７０９２）及びpPLc28（大腸菌ＲＲ１に定住、 ＡＴＣＣ ５３０８２）プラスミドが含まれる。
［２．酵母系］
【０１１０】
他の選択肢として、前記ポリペプチドを酵母宿主細胞内、好ましくはサッカロミセス（Saccharomyces）属（例えば、サッカロミセス・セレビジエ（S. cerevisiae））に由来する酵母宿主細胞内で発現させることも考えられる。ピキア（Pichia）属又はクルイベロマイセス（Kluyveromyces）属等の他の酵母の属も用いられうる。酵母ベクターはしばしば、２μ酵母プラスミドに由来する複製起点配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニレーション配列、転写終止配列及び選択マーカー遺伝子を含む。酵母ベクターに適したプロモーター配列には、特に、メタロチオネイン、３‐ホスホグリセリン酸キナーゼ（Hitzeman et al., 1980）、或いは、エノラーゼ、グリセルアルデヒド‐３‐リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース‐６‐リン酸イソメラーゼ、３‐ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、グルコースリン酸イソメラーゼ及びグルコキナーゼ等の他の糖分解酵素（Hess et al., 1968，Holland et al., 1978）に対するプロモーターが含まれる。酵母発現における使用に適した他のベクター及びプロモーターは、欧州特許出願第７３，６５７号にさらに記載されている。また別の選択肢であるのは、Russell et al. (1982) 及びBeier et al. (1982) 記載のグルコース抑制ＡＤＨ２プロモーターである。酵母及び大腸菌の両方において複製可能なシャトルベクターが、pBR322に由来する、大腸菌における選択と複製のためのＤＮＡ配列（Ａｍｐｒ遺伝子及び複製起点）を、上記の酵母ベクターに挿入することで構築されうる。
【０１１１】
酵母α因子リーダー配列は、前記ポリペプチドの直接分泌に用いられうる。α因子リーダー配列はしばしば、プロモーター配列と構造遺伝子配列との間に挿入される。例えば、Kurjan et al., 1982及びBitter et al., 1984参照。酵母宿主からの組換えポリペプチドの分泌促進に適した他のリーダー配列は、当業者に公知である。リーダー配列は、１以上の制限部位を含むよう３’末端付近で修飾されうる。このことは、リーダー配列が構造遺伝子と融合することを容易にする。
【０１１２】
酵母形質転換プロトコルは、当業者に公知である。かかるプロトコルの１つとしては、Hinnen et al., 1978に記載されている。Hinnen et al.のプロトコルは、０．６７％酵母窒素塩基、０．５％カザミノ酸、２％グルコース、１０ｍｇ／ｍｌアデニン及び２０ｍｇ／ｍｌウラシルから成る選択培地上でＴｒｐ＋形質転換体を選択する。
【０１１３】
ＡＤＨ２プロモーター配列を含むベクターにより形質転換された酵母宿主細胞は、発現誘導のため「富栄養」培地上で培養されうる。富栄養培地の一例は、１％酵母エキス、２％ペプトン及び１％グルコースに８０ｍｇ／ｍｌアデニン及び８０ｍｇ／ｍｌウラシルを添加したものである。ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除は、かかる培地のグルコースが尽きた際に生じる。
［３．哺乳動物系又は昆虫系］
【０１１４】
哺乳動物又は昆虫宿主細胞培養系もまた、組換えポリペプチドを発現させるために用いられうる。昆虫における異種タンパク質作製のためのバキュロウイルス系が、Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988) により概説されている。哺乳動物由来の確立された細胞株もまた用いられる。適切な哺乳動物宿主細胞系の例には、ＣＯＳ‐７サル腎細胞系（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Gluzman et al., 1981）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞系、及びMcMahan et al. (1991) 記載のアフリカミドリザル腎細胞系ＣＶ１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）に由来するＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞系が含まれる。
【０１１５】
ＤＮＡを哺乳動物細胞に導入する確立された方法が記載されてきた（Kaufman, 1990）。Lipofectamine脂質試薬（Gibco/BRL社製）又はLipofectamine-Plus脂質試薬等の市販試薬を用いたさらなるプロトコルが、細胞に形質移入するために用いられうる（Felgner et al., 1987）。加えて、エレクトロポレーションが、Sambrook et al. (1989) 等に記載の従来の方法を用いて哺乳動物細胞に形質移入するために用いられうる。安定形質転換体の選択が、例えば、細胞障害性薬物への耐性等の当該技術分野に既知の方法を用いて実施されうる。Kaufman et al., 1990は、 ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）耐性等の複数の選択スキームを記述している。ＤＨＦＲ選択に適した宿主株として、ＤＨＦＲを欠くＣＨＯ株ＤＸ‐Ｂ１１を挙げることができる（Urlaub and Chasin, 1980）。ＤＨＦＲ ｃＤＮＡを発現するプラスミドがＤＸ‐Ｂ１１株へと導入され、かかるプラスミドを含む細胞のみが適切な選択培地上で生育しうる。発現ベクターに組み込まれうる選択マーカーの他の例には、G418及びヒグロマイシンＢ等の抗生物質に対する耐性を付与するｃＤＮＡが含まれる。かかるベクターを宿す細胞が、これら化合物に対する耐性に基づき選択されうる。
【０１１６】
哺乳動物宿主細胞発現ベクター用の転写及び翻訳制御配列は、ウイルスゲノムから切り取ることができる。通常用いられるプロモーター配列及びエンハンサー配列は、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）及びヒトサイトメガロウイルスに由来する。ＳＶ４０ウイルスゲノムに由来するＤＮＡ配列、例えば、ＳＶ４０由来の初期及び後期プロモーター、エンハンサー、スプライス並びにポリアデニレーション部位は、哺乳動物宿主細胞における構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝的要素を提供するために用いられうる。ウイルスの初期及び後期プロモーターは特に有用である。なぜなら、どちらのプロモーターもウイルスゲノムから断片として容易に得られ、かかる断片はまた、ウイルスの複製起点も含むからである（Fiers et al., 1978; Kaufman, 1990）。
【０１１７】
哺乳動物発現ベクターからの異種遺伝子発現を高めることが示されているさらなる制御配列には、ＣＨＯ細胞に由来する発現増強配列因子（expression augmenting sequence element、ＥＡＳＥ）（Morris et al., Animal Cell Technology, 1997, pp. 529-534; ＰＣＴ出願ＷＯ９７／２５４２０）及びアデノウイルス２に由来する三連リーダー（tripartite leader、ＴＰＬ）及びＶＡ遺伝子ＲＮＡ（Gingeras et al., J. Biol. Chem. 257:13475-13491, 1982）等の因子が含まれる。ウイルス由来の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列は、バイシストロン性ｍＲＮＡが効率的に翻訳されることを可能とする（Oh and Sarnow, 1993; Ramesh et al., 1996）。バイシストロン性ｍＲＮＡの一部としての異種ｃＤＮＡの発現と、続く選択可能マーカー遺伝子（例えば、ＤＨＦＲ）の発現は、宿主の形質移入可能性及び異種ｃＤＮＡの発現を向上させることが示されてきた（Kaufman, 1990）。バイシストロン性ｍＲＮＡを用いた発現ベクターの例は、Mosser et al. (1997) 記載のpTR-DC/GFP及びMorris et al. (1997) 記載のp2A5Iである。
【０１１８】
有用な高発現ベクターであるpCAVNOTがMosley et al. (1989) に記載されている。哺乳動物宿主細胞における使用のための他の発現ベクターは、Okayama and Berg (1983) に開示の通り構築されうる。Cosman et al. (1986) 記載の通り、Ｃ１２７マウス乳房上皮細胞における哺乳動物ｃＤＮＡの有用な安定高レベル発現系が実質的に構築されうる。Cosman et al. (1984) に記載の有用な高発現ベクターPMLSV N1/N4が、ＡＴＣＣ ３９８９０として寄託されている。さらなる有用な哺乳動物発現ベクターは、欧州公開特許公報第０３６７５６６号及びＷＯ９１／１８９８２に記載されており、これら公報は本明細書に参照により組み込まれる。さらに別の選択肢としては、ベクターはレトロウイルスに由来しうる。
【０１１９】
さらなる有用な発現ベクターとして、pFLAG（登録商標）及びpDC311も使用されうる。ＦＬＡＧ（登録商標）技術は、低分子量（１ｋＤ）で親水性のＦＬＡＧ（登録商標）マーカーペプチドを、pFLAG（登録商標）発現ベクターにより発現させられる組換えタンパク質のＮ末端に融合することに主眼を置いている。pDC311は、ＣＨＯ細胞内でタンパク質を発現させるために用いられるまた別の特化ベクターである。pDC311は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）翻訳のための内部リボソーム結合部位、発現増強配列因子（ＥＡＳＥ）、ヒトＣＭＶプロモーター、三連リーダー配列及びポリアデニレーション部位と共に、所望の遺伝子及びＤＨＦＲ遺伝子を含むバイシストロン性配列を特徴とする。
【０１２０】
使用されうるシグナルペプチドに関しては、必要であれば、天然型シグナルペプチドは異種シグナルペプチド又はリーダー配列に置き換えられうる。シグナルペプチド又はリーダーの選択は、組換えポリペプチドが産生される宿主細胞の型等の要因に依存しうる。例示するならば、哺乳動物宿主細胞において機能する異種シグナルペプチドには、米国特許公報第４，９６５，１９５号記載のインターロイキン‐７（ＩＬ‐７）のシグナル配列、Cosman et al., Nature 312:768 (1984) 記載のインターロイキン‐２受容体のシグナル配列、欧州特許公報第３６７，５６６号記載のインターロイキン‐４受容体シグナルペプチド、米国特許公報第４，９６８，６０７号記載のI型インターロイキン‐１受容体シグナルペプチド、及び、欧州特許公報第４６０，８４６号記載のII型インターロイキン‐１受容体シグナルペプチドが挙げられる。
［Ｃ．単離及び精製］
【０１２１】
本発明はまた、ポリペプチド及びその断片の単離及び精製方法を含む。
【０１２２】
ある実施形態において、組換えポリペプチド又は断片の精製は、本発明のポリペプチド又は断片を、本発明のポリペプチド又は断片の精製に有用な他のポリペプチドと融合させたものを用いて達成されうる。かかる融合パートナーには、ポリ‐Ｈｉｓ又は上記の他の抗原性同定ペプチドが、Ｆｃ部分と共に含まれる。
【０１２３】
宿主細胞のあらゆる型に関して、当業者に公知であるように、組換えポリペプチド又は断片の精製方法は、用いられる宿主細胞の型、或いは、組換えポリペプチド又は断片が培地に分泌されるのかどうか等の要因によって変化する。
【０１２４】
概して、前記組換えポリペプチド又は断片は、分泌されない場合には宿主細胞から、可溶性であったり分泌されたりする場合には培地又は上清から単離され、それに、濃縮、塩析、イオン交換、疎水性相互作用、親和性精製、又はサイズ排除クロマトグラフィーのうち１つ以上の工程が続きうる。これらの工程を達成する具体的な方法に関しては、最初に、例えばAmicon又はMillipore Pellicon限外濾過装置等の市販のタンパク質濃縮フィルターを用いて培地が濃縮されうる。濃縮工程後に、濃縮物に対してゲル濾過培地等の精製マトリックスが用いられうる。他の選択肢としては、例えば、ペンダントジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックス又は基質等の、陰イオン交換樹脂が用いられうる。かかるマトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース又はタンパク質精製に通常用いられる他の型のものでありうる。また別の選択として、陽イオン交換の工程が適用されうる。適切な陽イオン交換体には、スルホプロピル基又はカルボキシルメチル基を含む様々な不溶性マトリックスが含まれる。加えて、クロマトフォーカシングの工程が適用されうる。また別の選択として、疎水性相互作用クロマトグラフィーの工程が適用されうる。適切なマトリックスは、樹脂に結合されたフェニル部分又はオクチル部分でありうる。さらに、組換えタンパク質に選択的に結合するマトリックスを用いたアフィニティークロマトグラフィーが用いられうる。用いられるかかる樹脂の例は、レクチンカラム、色素カラム及び金属キレートカラムである。最後に、１つ以上の逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ‐ＨＰＬＣ）工程が、疎水性ＲＰ‐ＨＰＬＣ媒質（例えば、メチル基、オクチル基、オクチルデシル基、又は他の脂肪族基をペンダント基として有するシリカゲル又はポリマー樹脂）が、さらに前記ポリペプチドを精製するために用いられうる。以上の精製工程の一部又は全部が、様々な組合せで良く知られており、単離及び精製組換えタンパク質を提供するために用いられうる。
【０１２５】
発現ポリペプチドを親和性精製するために、本発明のポリペプチドに対して生じるモノクローナル抗体等のポリペプチド結合タンパク質を含むアフィニティーカラムを利用することも可能である。これらのポリペプチドを、従来技術を用いて、例えば高塩溶離緩衝液を用い、その後使用のためにより低い塩濃度の緩衝液へと透析するか、又は、使用されるアフィニティーマトリックスに応じてｐＨ若しくは他の要素を変化させることで、アフィニティーカラムから除去可能であり、或いは、本発明で得られるポリペプチド等の親和性部分の天然基質を用いることで競合的に除去可能である。
【０１２６】
本発明のこの態様において、本発明の抗ポリペプチド抗体等のポリペプチド結合タンパク質又は本発明のポリペプチドと相互作用しうる他のタンパク質は、カラムクロマトグラフィーマトリックス、或いは、表面上で本発明のポリペプチドを発現する細胞の同定、分離又は精製するのに適した類似の基質等の固相担体に結合させうる。本発明のポリペプチド結合タンパク質の固相接着表面への固着は、任意の手段によって達成されうる。ポジティブに選択された細胞を固相から除去する方法は当該技術分野で公知であり、例えば、酵素の使用を包含する。かかる酵素は好ましくは細胞に対して非毒性及び非傷害性であり、好ましくは細胞表面の結合領域の切断に関与する。
【０１２７】
所望の純度は、タンパク質の使用目的に依存する。相対的に高純度が望まれるのは、例えば、ポリペプチドがインビボ投与されるべき場合である。かかる場合にはポリペプチドは、ＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ）による分析で、他のタンパク質に相当するタンパク質バンドが検出されないように精製される必要がある。グリコシル化の違い、翻訳後プロセッシングの違い等により、前記ポリペプチドに相当する複数のバンドがＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより可視化されうることは、当業者により認められると考えられる。最も好ましくは、本発明のポリペプチドは、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥによる分析の際に単一のタンパク質バンドで示されるように、実質的均一性を達成するまで精製される。前記タンパク質バンドは、銀染色法、クーマシーブルー染色法又は（タンパク質の放射性標識が可能な場合には）オートラジオグラフィーにより可視化される。
［ＩＩＩ．製剤及び投与］
【０１２８】
本明細書に記載の本組成物の投与方法は多様でありうる。あらゆる従来のワクチン投与方法が適用可能である。これらの方法には、生理学的に許容可能な固体基剤又は生理学的に許容可能な分散液による経口適用、注射による非経口適用、粉末の吸入、経皮パッチ経由、膣注入経由等が含まれると考えられる。ワクチン用量は、投与経路に依存し、患者の体格及び健康状態によって変化する。
【０１２９】
有効成分としてポリペプチド又はペプチド配列を含有するワクチンの調製は、米国特許公報第４，６０８，２５１号、第４，６０１，９０３号、第４，５９９，２３１号、第４，５９９，２３０号、第４，５９６，７９２号及び第４，５７８，７７０号に示されるように、一般に当該技術分野において良く理解されている。これら公報は本明細書に参照により組み込まれる。典型的にはかかるワクチンは、溶液又は懸濁液の注射剤として調製される。注射前に液体中に溶解又は懸濁するのに適した固形ワクチンもまた調製されうる。かかる調製物はまた、乳化されうる。有効免疫原性成分はしばしば、薬理学的に許容可能であり、かかる有効成分と適合する賦形剤と混合される。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノール等及びそれらの組合せである。加えて、必要であれば前記ワクチンは、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝剤、或いは、ワクチンの効果を高めるアジュバント等の補助物質を一定量含有しうる。特定の実施形態において、ワクチンは米国特許公報第６，７９３，９２３ 号及び第６，７３３，７５４号に記載の物質と組み合わせて調剤されるのであり、これら公報は本願に参照により組み込まれる。
【０１３０】
ワクチンは吸入により投与されうる。ある実施形態において、ワクチンはエアロゾルとして投与されうる。本明細書において、「エアロゾル」又は「エアロゾル化された組成物」なる用語は、気体中の固体粒子又は液体粒子浮遊物を指す。かかる用語は一般に、固体又は液体の形式から、浮遊固体薬剤粒子又は浮遊液体薬剤粒子を含む吸入可能な形式へと、気化、霧状化又はその他の方法で変換された組成物を指すのに用いられうる。かかるエアロゾルは、ワクチンを呼吸器系を経由して送達するために用いられうる。本明細書において、「呼吸器系」とは、酸素の吸入及び二酸化炭素の吐出に関与する身体の器官系を指す。かかる器官系には一般に、鼻から肺胞に至る気道全体が含まれる。哺乳動物において、かかる器官系には一般に、肺、気管支、細気管支、気管、鼻孔及び横隔膜が含まれる。本開示の目的に沿えば、ワクチンの呼吸器系への送達とは、薬剤が１つ以上の呼吸器系の気道、特に肺へと送達されることを意味する。
【０１３１】
他の投与方法に適したさらなる製剤には、坐剤（肛門又は膣に適用）が挙げられ、経口製剤が適する場合もある。坐剤に関しては、従来の結合剤及び担体には、例えば、ポリアルキレングリコール又はトリグリセライドが含まれうる。かかる坐剤は、約０．５％〜約１０％、好ましくは約１％〜約２％の範囲の有効成分を含有する混合物から形成されうる。経口製剤には、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等の通常用いられる賦形剤が含まれる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤又は粉末剤の形をとり、約１０％〜約９５％、好ましくは約２５％〜約７０％の有効成分を含有する。
【０１３２】
ポリペプチド、ペプチド及びリポペプチド組成物は、中性又は塩の形でワクチンへと製剤されうる。薬学的に許容可能な塩には、酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基で形成される）が含まれ、例えば、塩酸若しくはリン酸等の無機酸、又は、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸で形成されるものが含まれる。遊離カルボキシル基で形成される塩もまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は水酸化鉄等の無機塩基、並びに、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２‐エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基に由来しうる。
【０１３３】
多くの場合、ワクチンの複数回投与は、通常は最大若しくは最小で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５回以上、又はこれを超えない回数のワクチン接種が好ましく、これらの値の間の全ての範囲も含まれる。かかるワクチン接種は、通常は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２週間／月間／年間の間隔で、これらの間の値及び範囲も全て含めた間隔で、より一般には３週間から５週間の間隔で行われる。典型的には、定期的な追加接種が１年間〜１５年間の間隔で、通常は１０年間の間隔で、抗体の防御レベルを維持するために行われるのが望ましい。免疫化の過程に続き、抗原に対する抗体のアッセイが、上記記載、米国特許公報第３，７９１，９３２号、第４，１７４，３８４号及び第３，９４９，０６４号の記載の通り行われ、これらはこうした種類のアッセイを例示する。
［Ａ．複合治療］
【０１３４】
本発明の組成物及び関連の方法、特に、ＨＰＶ  Ｌ２タンパク質のポリペプチド又はペプチドを含むＨＰＶエピトープの患者／対象への投与は、従来のＨＰＶスクリーニング及び／又はワクチンの投与との組合せでも用いられうる。これらスクリーニング及び／又はワクチン投与には、抗体又は抗体断片、パパニコロー塗抹、ＰＣＲ法、サザンブロッティング法、Cervarix（商標）投与、GARDASIL（商標）投与、ＨＰＶ又は他の感染因子のためのワクチン投与、ＨＰＶ病変の切除治療等が含まれるが、これに限られるものではない。
【０１３５】
一態様においては、ＨＰＶペプチド組成物及び／又は治療が、ＨＰＶスクリーニング及び／又は他の治療と共に用いられるということが考慮される。また別の選択肢として、かかる治療は、分単位から週単位までの間隔を置いて他の治療の前後に行われうる。他の薬剤が別に投与される実施形態において、薬剤及び抗原性組成物が依然として患者に有益な複合作用を及ぼすことができるよう、一般それぞれの送達間隔が長い期間を越えないようにする。かかる場合には、両方の様式がそれぞれ互いに約１２〜２４時間以内に、より好ましくは約６〜１２時間以内に投与されうることが考慮される。ある状況では、しかしながら、それぞれの投与間隔が数日間（２、３、４、５、６又は７日間）から、数ヶ月間（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２ヶ月間）、又は数年間（２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２年間）となるよう、各投与の投与間隔を大幅に拡張させることが望ましい場合がある。
【０１３６】
様々な組合せが用いられうる。例えば、複数型ＨＰＶペプチド治療を「Ａ」、治療法として提供される他のワクチン又は抗体又は処置を「Ｂ」とすると、以下の組合わが考えられる。
【０１３７】
Ａ／Ｂ／Ａ、Ｂ／Ａ／Ｂ、Ｂ／Ｂ／Ａ、Ａ／Ａ／Ｂ、Ａ／Ｂ／Ｂ、Ｂ／Ａ／Ａ、Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ、Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ。
【０１３８】
Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ、Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ、Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ、Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ、Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ、Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ。
【０１３９】
Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ、Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ、Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ、Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ、Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ、Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ。
【０１４０】
患者／対象に対する本発明の免疫原性組成物の投与は、かかる化合物の投与のための一般的なプロトコルに従い、複数型ＨＰＶポリペプチド組成物又は本明細書に記載のその他のあらゆる抗原若しくは抗原の組合せの組成物に仮に毒性があるとすれば、その毒性を考慮に入れて行われる。必要であれば、治療サイクルを反復することが期待される。水分補給等の様々な標準的治療が、本明細書記載の治療と組み合わせて用いられるということもまた考慮される。
［Ｂ．予防及び／又は治療方法］
【０１４１】
ある実施形態では、医薬組成物が患者に投与される。本発明の別の態様には、患者に組成物を有効量投与することが含まれる。本発明のある実施形態では、少なくとも１以上のＨＰＶ病原体による感染症の防御又はその治療のために、複数型ＨＰＶペプチド組成物が患者に投与される。かかる組成物は一般に、薬学的に許容可能な担体又は水媒質に溶解又は分散される。
【０１４２】
本明細書において、「薬学的に許容可能」又は「薬理学的に許容可能」なる用語は、適切な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答又は他の問題となる合併症なしに、妥当な利益／危険性の比率に見合った、人間及び動物の組織との接触に適した化合物、物質、組成物及び／又は投薬形態を指す。「薬学的に許容可能な担体」なる用語は、脂質若しくは固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶剤又はカプセル化物質等の、化学薬剤の担持又は運搬に関与する薬学的に許容可能な物質、組成物又は媒体を意味する。薬学的に許容可能な担体には、あらゆる溶剤、分散液媒質、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収持続剤等が含まれる。薬学的有効成分のためにかかる媒質及び薬剤を使用することは、当該技術分野において良く知られている。何らかの従来の媒質又は薬剤が有効成分との併用に適切でないということのない限り、それらを免疫原性及び治療組成物において使用することは考慮される。
【０１４３】
本発明の有効化合物は、非経口与、例えば、静脈内、筋内、皮下又は腹腔内経路の注射用にさえ製剤されうる。エアロゾル又は、静脈注射若しくは筋内注射等の非経口投与のために製剤された化合物に加え、他の薬理的に許容可能な形態には、例えば、錠剤又は他の経口投与用固体、或いは、持続放出型カプセルが含まれる。
【０１４４】
遊離塩基又は薬学的に許容可能な塩としての有効化合物の溶液が、ヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤と適切に混合され、水中で調製されうる。分散液もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びこれらの混合物中、並びに、油中で調製されうる。通常の状態での貯蔵及び使用下で、これらの調製物は微生物の成長を阻害する保存剤を含有する。
【０１４５】
注射での使用に適した薬学的形態には、無菌水溶液又は水分散液、並びに、ゴマ油、ラッカセイ油又は含水プロピレングリコールを含む製剤、並びに、無菌注射溶液又は分散液の即時調製のための無菌粉末が含まれる。どの場合でも、かかる形態は無菌でなければならず、注射が容易でありうる程度に液体でなければならない。かかる形態はまた、製造及び保存条件下で安定であるべきであり、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用に抗して保存されなければならない。
【０１４６】
前記複数型ＨＰＶポリペプチド組成物は、中性又は塩の形で製剤されうる。薬学的に許容可能な塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成される）が含まれ、例えば、塩酸若しくはリン酸等の無機酸、又は、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等の有機酸で形成されるものが含まれる。遊離カルボキシル基で形成される塩もまた、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は水酸化第２鉄等の無機塩基、並びに、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等の等の有機塩基に由来しうる。
【０１４７】
担体もまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等）、適切なそれらの混合物及び植物油を含有する溶剤又は分散液溶媒でありうる。例えば、レシチン等のコーティングの使用、分散の際に必要な粒度の維持、界面活性剤の使用等により適切な流動性が維持されうる。微生物作用の予防は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等の様々な抗細菌剤及び抗真菌剤によりもたらされうる。多くの場合、例えば、糖又は塩化ナトリウム等の等張剤を含有することが望ましい。注射組成物の吸収持続は、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン等の、組成物中の吸収遅延薬の使用によりもたらされうる。
【０１４８】
無菌注射溶液が、上記に挙げた様々な成分を必要に応じて有する適切な溶剤に必要量の有効化合物を、濾過滅菌後に組み込むことで調製される。一般に分散液は、様々な滅菌有効成分を、基剤分散液媒質及び上記に挙げた他の成分から必要なものを滅菌媒体に組み込むことで調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、元々濾過滅菌溶液であったものから、有効成分及び任意の所望の成分の粉末をもたらす真空乾燥及び冷凍乾燥技術である。
【０１４９】
本発明の組成物の投与は、典型的には通常の経路を経るものである。かかる経路には、経口投与、軽鼻投与又は口腔投与が含まれるが、これに限られるものではない。また別の選択肢として、投与は同所投与（orthotopic administration）、皮内投与、皮下投与、筋内投与、腹腔内投与、肛門坐剤投与、膣内投与、呼吸器投与又は静脈内投与によるものでありうる。ある実施形態では、ワクチン組成物は吸入されうる（例えば、本明細書に参照により特に組み込まれる米国特許公報第６，６５１，６５５号）。かかる組成物は通常は、生理学的に許容可能な担体、緩衝剤又は他の賦形剤を含む、薬学的に許容可能な組成物として投与される。
【０１５０】
水溶液による非経口投与では、例えば、かかる溶液は必要であれば適切に緩衝されるべきであり、かかる液体希釈剤は最初に十分な生理食塩水又はグルコースで等張性のものとされるべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内投与、筋内投与、皮下投与及び腹腔内投与に特に適している。これに関して、用いられうる無菌水媒質は、本明細書の開示に照らして当業者に知られると考えられる。例えば、１回用量を等張ＮａＣｌ溶液に溶解し、皮下点滴液への付加又は注入に適した部位への注射が可能である（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 1990参照）。用量のある程度の違いは、患者の状況に応じて必然的に生じる。いずれにせよ投与責任者が、各患者に適した用量を決定すると考えられる。
【０１５１】
治療又は予防組成物の有効量は、意図する目的に応じて決定される。「単位用量」又は「用量」なる用語は、患者における使用に適した物理的に区分された単位を指し、各単位は、組成物の投与すなわち適切な投与経路及び投与計画と関連して上記に論じられた所望の応答を生むために計算された所定量の組成物を含む。投与されるべき量は、治療回数及び単位用量のどちらで見ても、所望の防御に依存する。
【０１５２】
組成物の正確な量もまた、実施者の判断に依存し、各個体で異なる。用量に影響を与える要因には、患者の身体的及び臨床的状態、投与経路、意図する治療目的（症状の緩和か、治癒か）、並びに、特定の組成物の効力、安定性及び毒性がある。
【０１５３】
製剤に際して、溶液は、剤形に適合した形で、治療又は予防に有効な量で投与されると考えられる。かかる製剤は、上記の注射溶液の形態等、様々な剤形で容易に投与される。
［１．インビトロ、エクスビボ、又はインビボ投与］
【０１５４】
本明細書において、インビトロ投与なる用語は、動物内又は動物の表面から取り出した細胞上で行われる操作を指し、かかる細胞は培地上のものを含むが、これに限られるものではない。エクスビボ投与なる用語は、インビトロで操作され、その後に生体動物に投与された細胞を指す。インビボ投与なる用語は、動物内で行われるあらゆる操作を含む。
【０１５５】
本発明のある態様において、組成物はインビトロ、エクスビボ、又はインビボのいずれでも投与されうる。あるインビトロ実施形態において、自己Ｂリンパ球細胞株又は樹状細胞が複数型ＨＰＶ組成物と共にインキュベートされる。かかる活性化細胞が、続いてインビトロ分析、又は別の選択肢としてはエクスビボ投与に用いられうる。
［２．抗体及び受動免疫］
【０１５６】
本発明のまた別の態様は、本発明のワクチンでレシピエントを免疫する工程、レシピエントから免疫グロブリン若しくは抗体を単離する工程、及び／又は、かかる免疫グロブリン若しくはその断片を組換えで作製する工程を含む、ＨＰＶ感染症の予防又は治療における使用のための免疫グロブリンの調製方法である。本方法により調製される免疫グロブリンは、本発明のさらなる態様の１つである。本発明の免疫グロブリン及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物は、ＨＰＶ感染症の治療又は予防のための薬剤の製造に用いられうる本発明のさらなる態様の１つである。有効量の本発明の医薬調製物を患者に投与する工程を含むＨＰＶ感染症の治療又は予防方法は、本発明のさらなる態様の１つである。
【０１５７】
ポリクローナル抗体作製のための接種材料は典型的には、抗原性組成物を、生理食塩水又はヒトへの使用に適した他のアジュバント等の生理学的に許容可能な希釈剤に分散させ、水性組成物を形成することで調製される。免疫活性化量の接種材料が、例えばヒト等の哺乳動物に投与され、接種を受けた患者は、抗原性組成物が防御抗体を誘導するのに十分な時間維持される。かかる抗体は、アフィニティークロマトグラフィー等の良く知られた技術により所望量が単離されうる（Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual 1988）。
【０１５８】
抗体には、例えばヤギ、霊長類、ロバ、ブタ、ウマ、モルモット、ラット、又はヒト等の様々な通常使用される動物に由来する抗血清調製物が含まれうる。これら動物から採血され、血清が回収される。
【０１５９】
本発明に従って作製される免疫グロブリンは、全抗体、抗体断片、又は抗体小断片を含みうる。抗体は、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、若しくはＩｇＥ等のあらゆるクラスの免疫グロブリン全体、キメラ抗体、又は本発明の２つ以上の抗原に対して二重特異性を有するハイブリッド抗体でありうる。かかる免疫グロブリンはまた、例えばＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ等の断片であってもよく、これにはハイブリッド断片も含まれる。免疫グロブリンはまた、特定の抗原と結合して複合体を形成することにより抗体のように作用する、天然タンパク質、合成タンパク質、又は遺伝子操作されたタンパク質も含みうる。
【０１６０】
本発明のＨＰＶ組成物又はワクチンは、レシピエントに投与され、かかるレシピエントはその後、かかるＨＰＶ組成物の投与に対する応答により産生する免疫グロブリンの供給源として働く。このように処置された対象は、従来の血漿分画法により高度免疫グロブリンが採取される血漿を供与する。かかる高度免疫グロブリンは、ＨＰＶ感染症に対する抵抗付与、又はＨＰＶ感染症の治療のために、別の対象に投与されると考えられる。本発明の高度免疫グロブリンは、幼児、免疫低下個体、或いは、治療が必要だが、個体がワクチン接種に対する応答により抗体を産生する時間がない場合において、ＨＰＶ感染症の治療又は予防に特に有用である。
【０１６１】
本発明のさらに別の態様は、本発明の免疫原性組成物の成分に反応する１つ以上のモノクローナル抗体（又はその断片、好ましくはヒト若しくはヒト化モノクローナル抗体又はその断片）を含む医薬組成物であり、かかる組成物は複数のＨＰＶ型による感染症の治療又は予防に用いられうる。
【０１６２】
モノクローナル抗体作製方法は、当該技術分野において良く知られており、脾細胞の骨髄種細胞との融合を含みうる（Kohler and Milstein, 1975; Harlow and Lane, 1988）。また別の選択肢としては、モノクローナルＦｖ断片が、適切なファージディスプレイライブラリをスクリーニングすることで得られる（Vaughan et al., 1998）。モノクローナル抗体は、ヒト抗体又は公知の方法によりヒト化若しくは部分的にヒト化された抗体でありうる。
［ＩＶ．キット］
【０１６３】
本発明のまた別の態様は、本発明のワクチン接種用又は治療用のキットである。ある実施形態において、かかるキットは、本発明の方法による投与のための複数型ＨＰＶポリペプチド組成物又はワクチンを含むバイアルを含み、また、投与法の説明のある添付文書を任意で含む。
【０１６４】
本明細書に記載の任意の組成物が、キットに含まれうる。例として、複数型ＨＰＶポリペプチド調製用、複数型ＨＰＶポリペプチド製剤用、及び／又は、複数型ＨＰＶポリペプチドの投与用試薬がキットに含まれうるものとして挙げられるが、これに限られるものではない。かかるキットにはさらに、インビトロ及びインビボの両方でリポペプチド活性を評価するための試薬が含まれうる。したがってかかるキットは、適切な容器手段（container means）に収められた複数型ＨＰＶポリペプチド組成物を含む。ある態様において、かかるキットには、投与のための試薬、及び／又は、例えば吸入器若しくは噴霧器等の投与装置が含まれうる。かかるキットにはまた、投与用組成物を調製するための１つ以上の緩衝剤、化合物、又は装置が含まれうる。
【０１６５】
本発明のキットの構成要素は、水媒質中又は凍結乾燥形態のいずれにもパッケージされうる。かかるキットの容器には一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリンジ、又は他の容器手段が含まれ、かかる容器に構成要素が入れられ、好ましくは適切に一定量が入れられている（aliquoted）。前記キットに２つ以上の構成要素がある場合、かかるキットがまた一般に、追加の構成要素を別々に入れられる第２、第３、又は他の追加の容器を含むことも考えられる。しかしながら、様々な組合せの構成要素が、１つのバイアルに含まれてもよい。本発明のキットにはまた、典型的には、かかる容器を市販のため厳重に密封した収容手段が含まれる。かかる収容体には、所望のバイアルが内部に保持された、射出成形又は中空成形プラスチック容器が含まれうる。
【０１６６】
前記キットの構成要素が１つ以上の溶液として提供される場合、かかる溶液は水溶液であり、特に好ましくは無菌水溶液である。しかしながら、前記キットの構成要素は、乾燥粉末としても提供されうる。試薬及び／又は構成要素が乾燥粉末として提供される場合、かかる粉末は適切な溶剤の付加により再構成されうる。かかる溶剤もまた、別の容器手段で提供されうるということが考慮される。
【０１６７】
他の態様において、キット又は装置には、本発明のポリペプチドに対するポリクローナル又はモノクローナル抗体が含まれうる。かかるキット又は装置は、様々な試料又は患者において、ウイルスを検出、同定、又は精製するために用いられうる。
【０１６８】
キットにはまた、キットの構成成分の利用及びかかるキットに含まれないその他の任意の試薬の使用に関する使用説明書が含まれている。使用説明書には、実施できるバリエーションが含まれている。
【０１６９】
かかる試薬が本発明のキットの実施形態であるということが考慮される。しかしながら、かかるキットは、上記の特定の品目に限られず、複数型ＨＰＶポリペプチドワクチンの調製及び／又は投与のために用いられる任意の試薬を含みうる。
［Ｖ．実施例］
【０１７０】
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を例証する目的で記載されるのであり、本発明をいかなる仕方でも限定することは意図されていない。本実施例に内在的な目標、目的及び利点と共に、本実施例に言及されている目標を実行し、目的と利点を達成するために本発明が適切に構成されているということを、当業者は容易に認識する。本実施例は、本明細書記載の方法と共に、好ましい実施形態の現在の代表例であり、典型例であって、本発明の範囲の限定を意図するものではない。特許請求の範囲により定義される本明細書の趣旨に包含される本実施例の改変及び他の使用法を、当業者は認識する。
［Ａ．結果］
【実施例１】
【０１７１】
文献の研究で用いられた残基番号１１〜２００及び１〜８８を含むＬ２ワクチンが、免疫原性の考察に基づいてではなく、便利なため、制限部位に基づいて選択された（Campo and Jarrett, 1994; Roden et al., 1994）。したがって、これらＬ２ワクチンは、関連中和エピトープの全てを含まない（not contain all of）、或いは、最適な免疫原性及び安定性を有しない可能性がある。しかしながら、これらの研究は、Ｌ２特異的中和抗体の存在が防御免疫に十分であることを示す（Embers et al., 2002; Gambhira et al., 2007）。実際に、Ｌ２  １１‐２００の接種により、ＢＰＶ４、ＣＲＰＶ及びＲＯＰＶ曝露モデルにおいて交差中和抗体及び防御が誘発される（Gambhira et al., 2007; Campo and Jarrett, 1994）。Ｌ２  １〜８８ペプチド接種もまた防御をもたらしたが、Ｌ２  １１‐２００を接種した動物と比較して、交差中和及び交差防御が効果的でない可能性があるという示唆もあった（Gambhira et al., 2007）。こうした見解に一致して、残基番号９４〜１１２及び１０７〜１２２に由来するＬ２ペプチドの接種はどちらも、同種の曝露に対する防御をもたらした（Embers et al., 2002）。したがって、これらの領域をＬ２ワクチンに含めることの利益を評価するため、残基番号８８、１０７、又は２００を終点とするワクチン研究用Ｎ末端Ｌ２ポリペプチドを作製した（表１）。
【０１７２】
【表１】
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【０１７３】
感染させるためにはＬ２が必要であり（Roden et al., 2001）、これは複数の異なる機能を有する場合がある（Richards et al., 2006; Bossis et al., 2005; Kamper et al., 2006）。感染中、Ｌ２は残基番号１〜１３を除去するためフューリンにより切断されなければならず（Richards et al., 2006）、このことによって保存された中和エピトープ（残基番号１７〜３６の間）にモノクローナル抗体ＲＧ‐１が接触しやすくなる（Day et al., 2008）。さらに、Ｌ２  １〜８８又は１１〜２００ポリペプチドに対する抗血清は、皮膚感染型のみならず粘膜感染型のパピローマウイルスも中和する（Pastrana et al., 2005）。したがって、残基番号１、１１、１３又は８９を始点とするＮ末端Ｌ２ポリペプチドをワクチン研究用に作製した（表１）。
【実施例２】
【０１７４】
モノマー及び複数型Ｌ２ポリペプチドを接種したウサギにおける応答
交差中和エピトープのマッピングのため、ワクチン研究用に７つのＨＰＶ１６  Ｌ２ポリペプチド（表１）を６‐Ｈｉｓタグを付けて大腸菌内で発現させ、アフィニティー精製した。全てのポリペプチドが容易に精製された一方で、ＨＰＶ１６  Ｌ２  １３〜８８及び８９〜２００は貯蔵中に不安定だった。ウサギに５回、初回接種ではＣＦＡ中、追加接種ではＩＦＡ中で、各ポリペプチドを３００μｇ接種した。各回の接種の成功が、まずＨＰＶ１６  Ｌ２全長ＥＬＩＳＡ及びＨＰＶ  １６  Ｌ１／Ｌ２偽ウイルス粒子ＥＬＩＳＡで高度免疫血清をテストすることで検証された。各ＨＰＶ１６  Ｌ２ポリペプチドについて高力価の血清抗体が産生していたが、Ｌ２  １３〜８８及び８９〜２００という２つの不安定抗原に対する抗血清で、ＨＰＶ１６偽ウイルス粒子に対する力価が低かった。次に、ＨＰＶ１６中和力価並びにＨＰＶ６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ４５、及びＨＰＶ５８交差中和力価が、Ｌ２ポリペプチドにより誘導された各ウサギ抗血清について決定された。文献の研究（Gambhira et al., 2007）と一致して、ＨＰＶ１６  Ｌ２  １１〜２００及び１〜８８ペプチドは、ＨＰＶ１６中和抗体の強力価を誘導した。同様に、強いＨＰＶ１６中和抗体力価が、ＨＰＶ１６ Ｌ２   １３〜２００、１〜１０７、及び１３〜１０７に対する抗血清で観察された。ＨＰＶ１６  Ｌ２  ８９〜２００の接種では、かなり弱い中和応答が生じたが、２匹のウサギのうち１匹では高いＬ２  ＥＬＩＳＡ力価で抗体が誘導された。様々なＨＰＶ１６  Ｌ２ペプチドにより誘導されたＬ２特異的抗血清は、ＨＰＶ１６のみならず、発癌性であるＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ４５、及びＨＰＶ５８を含む、テストされた多様な異種パピローマウイルス型を中和した（表２）。しかしながら、力価とＨＰＶ１６からの進化的距離との間に明確な相関はなかったものの、ＨＰＶ１６に対する中和抗体力価は、他の型に対するよりも有意に高かった。
【０１７５】
【表２】
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【０１７６】
代替のどのＨＰＶ１６  Ｌ２ペプチドでも、異種ウイルスに対する中和力価が実質的に上昇しなかったので、様々な医学的に重要なＨＰＶ遺伝子型に由来する複数の相同Ｌ２ペプチドからなる連結融合タンパク質を検討した。本研究及び先行研究の結果に基づき、ＨＰＶ１６  Ｌ２  １７〜３６、１１〜８８、及び１１〜２００に相当するＬ２ポリペプチドが融合コンストラクトのために選択された。サイズの大きい組換えタンパク質はしばしば細菌での作製効率が低いので、複数型コンストラクトを、表２に示すように、１１〜２００のコピーを３個含むもの（１１〜２００ｘ３と呼ぶ）、１１〜８８のコピーを５個含むもの（１１〜８８ｘ５と呼ぶ）、及び１７〜３６のコピーを２２個含むもの（１７〜３６ｘ２２と呼ぶ）についてテストした。これらは各々、医学的関連のある様々なＨＰＶ遺伝子型に由来する（de Villiers et al., 2004）。かかるタンパク質をＨＰＶ１６  Ｌ２ポリペプチドについて記載したのと同様に、大腸菌内で発現させ、変成条件下でアフィニティー精製し、ウサギへの接種に用いた。ＣＦＡ／ＩＦＡアジュバント中の各複数型Ｌ２融合タンパク質（１１〜２００ｘ３、１１〜８８ｘ５、及び１７〜３６ｘ２２）のウサギへの接種により、ＨＰＶ１６中和力価を損なうことなく、単一型Ｌ２ペプチド（表１Ａ）と比較して、より強い中和力価（表１Ｂ）が誘導された。特に１１〜８８ｘ５により、この融合タンパク質を得るのに用いられなかった３つ（ＨＰＶ３１、４５、及び５８）を含む、全てのテストされたＨＰＶ型に対する著しく高い中和抗体力価が誘導された。
【実施例３】
【０１７７】
Gardasil（商標）を接種したウサギにおける応答
Ｌ１  ＶＬＰの接種により、例えばＨＰＶ１８及びＨＰＶ４５等の極めて近縁なパピローマウイルス型を交差中和する抗体を誘導することができる（Smith et al., 2007; Lin et al., 1992; Richards et al., 2006）。したがって、２つ異なる濃度のGardasil（商標）（ミョウバン中に調製）の接種により生じる交差中和抗体レベルを、ＣＦＡ／ＩＦＡ中に調製された複数型Ｌ２タンパク質と比較することを試みた（表３）。Gardasil（商標）の接種により、このワクチンに含まれる発癌性ＨＰＶであるＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８に対する高い中和抗体力価が生じた。Ｌ２融合タンパク質によりＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８に対するさらに高い力価が生じているが、これは抗原量が多かったことと、より強力なアジュバントを用いたことで生じたものである。Gardasil（商標）を接種したウサギの血清は、一様に有意なレベルのＨＰＶ４５中和抗体を含み、ＨＰＶ３１中和抗体を含むこともあるが、ＨＰＶ５８中和抗体力価は検出できなかった。このように、Gardasil（商標）に含まれないＨＰＶ型に対する中和抗体力価は、Gardasil（商標）接種後にはるかに低いか、散発的であるか、又は検出不能である。
【０１７８】
【表３】
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【実施例４】
【０１７９】
モノマー及び複数型Ｌ２ポリペプチドを接種したマウスの応答
マウスをＨＰＶ偽ウイルス粒子に曝露し、感染をルシフェラーゼ等のレポーターの送達により定量化できる（Gambhira et al., 2007; Roberts et al., 2007）。マウスに３回、各回に２週間の間隔を置いて、残基番号１７〜３６、１〜８８、又は１１〜２００を含むＨＰＶ１６  Ｌ２ポリペプチド、或いは、１１〜２００ｘ３、１１〜８８ｘ５又は１７〜３６ｘ２２の３つの連結複数型Ｌ２融合タンパク質のうちの１つを、サポニン基剤のＧＰＩ‐０１００アジュバントを用いて接種した（Marciani et al., 2000）。２週間後にマウスの血清を回収し、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ４５、ＨＰＶ５８（４つの一般的な発癌性ＨＰＶ型）、及びＨＰＶ６（良性陰部疣贅に見られる最も一般的な型）についてインビトロ中和力価を決定した。ウサギで観察されたように、ＨＰＶ１６  Ｌ２  １〜８８又はＨＰＶ１６  Ｌ２  １１〜２００の接種により、同種ウイルス型であるＨＰＶ１６に対する中和抗体の有意な力価が誘導された。しかしながら、ＨＰＶ  Ｌ２  １７〜３６の残基を含む合成ペプチドの接種によって、中和抗体又はＬ２特異的抗体（図示せず）は誘導されなかった。おそらく、かかるペプチドがこのマウス系統のＴヘルパーエピトープを欠いているためであると考えられる（Alphs et al., 2008）。陽性対照であるアジュバント非在下のＨＰＶ１６  Ｌ１  ＶＬＰの接種は、ＨＰＶ１６  Ｌ２コンストラクトよりもさらに高い力価を誘導した。対照的に、ＨＰＶ４５  Ｌ１  ＶＬＰの接種によってＨＰＶ１６中和抗体は誘導されず、これはＬ１  ＶＬＰワクチンの型限定的応答と整合的である（図１）。Ｌ２  １１〜８８ｘ５コンストラクトにより、ＨＰＶ１６  Ｌ２  １〜８８よりも高いＨＰＶ１６中和抗体力価が生じたが、同じことはＨＰＶ１６  Ｌ２  １１〜２００対１１〜２００ｘ３については見られなかった。１７〜３６ｘ２２はさらに効果が低く（図１）、これはおそらくＴ細胞のヘルプが弱い結果である（Alphs et al., 2008）。驚くべきことに、ＨＰＶ１６  Ｌ２ポリペプチドを接種したマウスにおいて観察される交差中和抗体応答は、同じワクチンを接種したウサギにおいて生じるものより弱い。しかしながら、複数型Ｌ２をＨＰＶ１６  Ｌ２  １１〜２００及び１〜８８コンストラクトと比較する場合、１１〜２００ｘ３及び１１〜８８ｘ５の接種は、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ４５、及びＨＰＶ５８に対する中和抗体をはるかに効果的に誘導する（図１）。注目すべきは、１１〜２００ｘ３及び１１〜８８ｘ５ポリペプチドが、ＨＰＶ４５又はＨＰＶ５８由来のいずれの配列も含まないにもかかわらず、有意な交差中和が観察された点である。
【実施例５】
【０１８０】
アジュバント化Ｌ２複数型ポリペプチド
例えば、免疫活性化配列（ＩＳＳ）１０１８、Ｔｏｌｌ様受容体９を活性化するオリゴヌクレオチド（Halperin et al., 2005; Halperin et al., 2003）、及びサポニン基剤のアジュバントＧＰＩ‐０１００（Marciani et al., 2003; Slovin et al., 2005）等の、ミョウバンよりも効果的である、又はそれを補完する可能性を持つ、複数のアジュバントがワクチン臨床試験において有望であることが示された。特定のアジュバントが、複数型Ｌ２ワクチンと共に調製された際にＨＰＶ中和抗体をより効果的に誘導するかどうかを検討するため、様々なアジュバント及びそれらの組合せの中で調製された２５μｇの１１〜２００ｘ３に対する免疫応答を突き合わせて比較した。３回目の接種の２週間後にマウスから血清を得て、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ４５、及びＨＰＶ５８のインビトロ中和力価が測定された（図２）。インビトロ中和力価は、各アジュバント群を通して互いに著しく類似しており、この時点でミョウバン中の１１〜２００ｘ３の調製物より顕著に優れた調製物は存在しなかった。
【実施例６】
【０１８１】
最高力価を高めることに加えて、アジュバントは抗体応答の存続時間も延長することができる。液性応答が弱まるにつれてアジュバント間の違いがより明確になる可能性を評価するため、マウスを接種４ヶ月後にＨＰＶ１６偽ウイルス粒子に曝露した。ルシフェラーゼレポーターを担持するＨＰＶ１６偽ウイルス粒子の投与の３日後に、ルシフェラーゼの基質であるルシフェリンを曝露マウスに注射し、生物発光シグナルとして皮膚感染を検出した。一元配置分散分析（one-way analysis of variance）（ボンフェローニ比較法を用いたＡＮＯＶＡ）によって、１１〜２００ｘ３のみによるＨＰＶ１６感染からの防御とＰＢＳ対照接種による防御との間に有意差があることが示された（Ｐ＜０．０５、表４）。テストされたどのアジュバント中の１１〜２００ｘ３の接種も、ＰＢＳ対照接種との間の有意差がさらに大きかった（Ｐ＜０．００１、表４）。特に、１１〜２００ｘ３にミョウバン＋ＩＳＳ１０１８を加えて調製されたものは、１１〜２００ｘ３のみよりも効果的だった（Ｐ＜０．０１）。１１〜２００ｘ３と共にテストされたＧＰＩ‐０１００調製物は、１１〜２００ｘ３のみ（Ｐ＜０．００１）又はミョウバンと組み合わされた１１〜２００ｘ３（Ｐ＜０．０１）よりも効果的だった。ミョウバンのみ又はＩＳＳ１０１８のみを１１〜２００ｘ３と共に使用した場合、かかるタンパク質のみの場合と比較して統計的有意差は観察されなかった。
【実施例７】
【０１８２】
ＨＰＶ１６  Ｌ１  ＶＬＰのみの接種でも、１１〜２００ｘ３にミョウバン＋ＩＳＳ１０１８又はＧＰＩ‐０１００を加えたものを接種した場合と同様のレベルの防御が与えられるが、ＨＰＶ４５  Ｌ１  ＶＬＰのみではそれは与えられない（Ｐ＜０．００１、図示せず）。そこで、マウスへのGardasil（商標）の接種により誘導されるインビトロ中和抗体力価を、アジュバントＧＰＩ‐０１００中の１１〜２００ｘ３又は１１〜８８ｘ５のいずれかのマウスへの接種により誘導される力価と比較することを試みた。Gardasil（商標）にはＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８のためにＬ１  ＶＬＰが含まれており、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８に対して生じるインビトロ中和力価は、どの複数型Ｌ２コンストラクトを接種したマウスと比較しても、Gardasil（商標）を接種したマウスの血清中の力価の方が有意に高かった。しかしながら、Gardasil（商標）を接種したマウスの血清中には、ＨＰＶ４５又はＨＰＶ５８中和抗体は一切検出されなかった（図４）。対照的に、１１〜２００ｘ３又は１１〜８８ｘ５のいずれを接種したマウスの血清中にも、どちらのコンストラクトもＨＰＶ４５又はＨＰＶ５８に由来するＬ２配列を含まないにもかかわらず、強い中和抗体力価が検出された。
【実施例８】
【０１８３】
ミョウバン、ＧＰＩ‐０１００、及び免疫活性化配列１０１８（Ｔｏｌｌ様受容体９を活性化するＣｐＧオリゴヌクレオチド）を含む複数のアジュバントが臨床試験でテストされ、有効かつ安全であると示されてきた。ポリマーＬ２ワクチンが特定のアジュバントを必要とするかどうか、並びに、アジュバントがポリマーＬ２ワクチンにより生じる中和抗体応答をどの程度後押しするのかを検討するため、複数のアジュバントを突き合わせて検討した。このため、マウスに様々なアジュバント中のＬ２  １１〜２００ｘ３の２５１４又はアジュバントのみを接種した。各群は以下の通りである。（１）ミョウバンのみ（１．３ｍｇ／マウスの水酸化アルミニウム、Sigma社製A-8222）、（２）ＣｐＧ１０１８のみ（１０μｇ／マウス）、（３）ＰＢＳ、（４）１１〜２００ｘ３のみ、（５）１１〜２００ｘ３＋ミョウバン（５０％スラリー）、（６）１１〜２００ｘ３＋ＣｐＧ１０１８（１０μｇ／マウス、Dynavax社製, Berkley, CA）、（７）１１〜２００ｘ３＋ＧＰＩ‐０１００（５０μｇ／マウス、Hawaii Biotech社製, Maui, HI）、（８）１１〜２００ｘ３＋ＧＰＩ‐０１００（２００μｇ／マウス）、（９）１１〜２００ｘ３＋ＧＰＩ‐０１００（５０μｇ／マウス）＋Tween 40（１ｍｇ／マウス、Sigma社製P-1504）、（１０）１１〜２００ｘ３＋ミョウバン＋ＣｐＧ１０１８（１０μｇ／マウス）。最終回の接種２週間後に血清を採取して、ＨＰＶ６、ＨＰＶ１６、及びＨＰＶ１８に関してインビトロ中和をテストした。インビトロ中和力価は、タンパク質のみと比較して、各アジュバント群を通して互いに顕著に類似しており、ポリマーＬ２タンパク質のみで免疫原性であること、並びに、どの特定のアジュバントもワクチン接種後すぐの広範な中和抗体応答には必要とされないことを示唆する。
【０１８４】
【表４】
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［Ｂ．方法］
【実施例９】
【０１８５】
抗原調製
ＨＰＶ１６  Ｌ２ポリペプチド発現コンストラクトは、文献の記載に従いＰＣＲ法により作製された（Pastrana et al., 2005）。複数型Ｌ２コンストラクトは、最低自由エネルギー計算により大腸菌発現のためにコドン最適化され、クローニングを容易にするため5’ BamHI部位及び3’ XhoI部位と共にBlue Heron Inc.社により合成された。Ｌ２遺伝子はpET28aベクター（Novagen社製）へとサブクローニングされ、大腸菌BL21（Rosetta cells, Novagen社製）中でヘキサヒスチジン（６‐Ｈｉｓ）タグ化組換えポリペプチドを発現させた（Pastrana et al., 2005）。組換えＬ２ポリペプチドを、８Ｍ尿素中でニッケルニトリロ三酢酸（Ｎｉ‐ＮＴＡ）カラム（Qiagen社製）に結合させることで（変性条件用のQiaExpressionist標準精製プロトコルを用いて）アフィニティー精製し、Dulbeccoのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に対しカセット（Pierce社製）中で透析した。純度はＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより観察され、タンパク質濃度はウシ血清アルブミン標準を用いてビシンコニン酸試験（Pierce社製）により決定された。
【実施例１０】
【０１８６】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
イモビロンプレート（Nune社製）を４℃で一晩、大腸菌内で調製された１００ｎｇ／ウェルの６Ｈｉｓ‐ＨＰＶ１６  Ｌ２又は２９９ＴＴ細胞内で作製されＰＢＳで希釈されたＨＰＶ１６  Ｌ１／Ｌ２偽ウイルス粒子でコーティングした。その後ウェルを１時間室温で、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）‐ＰＢＳでブロッキングし、さらに１時間室温で、抗血清の２倍希釈液で培養した。ＰＢＳ‐０．０１％（ｖ／ｖ）Tween 20による洗浄工程の後、１％ＢＳＡ‐ＰＢＳ中で１：５０００に希釈されたペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（KPL Inc社製, Gaithersburg, MD）を１時間にわたって加えた。その後プレートを再び洗浄し、２，２’‐アジノ‐ビス（３‐エチルベンズチアゾリン‐６‐スルホン酸）溶液（Roche社製）で１０分間展開した（Viscidi et al., 2005）。４０５ｎｍの吸光度（Ａ４０５）をＥＬＩＳＡプレートリーダー（Bio-rad社製Benchmark Plus）で測定した。
【実施例１１】
【０１８７】
中和アッセイ
パピローマウイルス偽ウイルス粒子インビトロ中和アッセイが文献の記載に従って行われ（Pastrana et al., 2004）、精製上清中の分泌アルカリホスファターゼ活性が、ジエタノールアミン中に溶解されたｐ‐ニトロフェニルリン酸（Sigma社製, St. Louis, MO）及び４０５ｎｍの吸光度測定を用いて決定された。偽ウイルス粒子調製のためのコンストラクト及び詳細なプロトコルは、インターネット上（home.ccr.cancer.gov/lco/）で見ることができる。力価は、Ａ４０５の５０％減少を引き起こした最大希釈率の逆数として定義され、５０を下回る力価は有意とみなされなかった。
【０１８８】
動物実験
実験は、Jphons Hopkins動物実験委員会、及び施設内動物倫理委員会（ＩＡＥＣ、インド）の承認を得て、委員会の方針にしたがって実施された。Ｂａｌｂ／ｃマウス（NCI Frederick製）を５匹ごとのグループに分け、２週間の間隔で３回、記載されたアジュバント中２５μｇの抗原（又は化学合成により調製したＨＰＶ１６ Ｌ２ １７〜３６ペプチド（Sigma社製））を皮下注射により接種した。最終免疫から２週間後、尾静脈採血により血液試料を得た。ウサギに対し、初回は完全フロイントアジュバント中、次回からは不完全フロイントアジュバント中、３００μｇのＬ２ポリペプチドを、１、２８、４２、６０、及び７６日目に接種した。１２μｇ又は３０μｇのGARDASIL（商標）の接種は、１、２１、３５、及び５６日目に実施した。最終追加免疫の１週間後にウサギから採血した。
【０１８９】
皮膚のＨＰＶ曝露
麻酔したＢＡＬＢ／ｃマウスの胴体腹側の皮膚の一部分を、上皮を傷つけないように電気カミソリで剃毛した。かかる剃毛した皮膚の一部分に、０．６％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ、Sigma社製）１０μｌ中、ｐＹＬＵＣを含む偽ウイルス粒子３×１０９（１００ｎｇ）を適用することにより曝露を実施した。３日後、再度マウスを麻酔し、ルシフェリン（７ｍｇ／ｍｌのもの１０μｌ）を注射し、その画像をIVIS 200 生物発光画像システム（Xenogen社製、Cranbury NJ）を用いて１０分間の画像を取得した。ウイルス接種部位を含む同じ大きさの領域を、Living Image 2.20ソフトウェア（Xenogen社製）を用いて分析し、Ｌ２を欠如する非感染性ＨＰＶ偽ウイルスでの曝露による、バックグラウンドの生物発光を測定した。
【０１９０】
統計的方法
マウスモデルにおける力価及び感染レベルのグループ間比較は、ボンフェローニ比較法を用いた一元配置ＡＮＯＶＡによって実施した（グラフパッドプリズム、バージョン４）。
【０１９１】
（参考文献）
以下の参考文献は、本明細書の記載を補完する例示的な方法又はその他の詳細を提供する範囲で、具体的に本明細書に参照により組み込まれる。
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