(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ移入のためのプラスミドベクターであって、プラスミドが、キメラｐ１８５neuタンパク質をコードする配列番号１０の配列を含む、プラスミドベクター。
【請求項２】
転写プロモーターをさらに含む、請求項１に記載のプラスミドベクター。
【請求項３】
前記プロモーターがＣＭＶプロモーターである、請求項２に記載のプラスミドベクター。
【請求項４】
哺乳動物、特にヒトにおける使用に適した、請求項１から２に記載のプラスミドベクター。
【請求項５】
医薬的に許容されるビヒクルおよび賦形剤と共に請求項１から３のいずれか一項に記載のプラスミドベクターを含む、医薬組成物。
【請求項６】
非経口投与に適した、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
注射可能な溶液の形態である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
ＤＮＡワクチンの形態である、請求項５に記載の組成物。
【請求項９】
ｐ１８５neu陽性腫瘍を発症する危険のある対象、または原発性腫瘍、転移もしくはｐ１８５neu陽性腫瘍の再発を保有する患者の、予防または治療において使用する治療剤の調製のための、請求項１から４のいずれか一項に記載のプラスミドベクターの使用。
【請求項１０】
ＤＮＡワクチンの調製のための、請求項９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｐ１８５neuタンパク質の短縮形態およびキメラ形態をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドベクター、およびｐ１８５neuタンパク質を発現するＨｅｒ−２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）陽性腫瘍に対するＤＮＡワクチン接種におけるその使用に関する。本発明に従うプラスミドは、ｐ１８５neuタンパク質発現腫瘍に対する抗体および／またはＴリンパ球誘導に基づく防御免疫応答を惹起できる。本発明はさらに、このようなプラスミドを含む医薬組成物およびｐ１８５neu陽性腫瘍の予防的処置または治療的処置におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
新生物細胞はしばしば、いくつかのタンパク質を異常に発現する点で正常細胞とは異なる。この異常な発現に起因して、あるタンパク質は腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）として作用し得る。これは、宿主免疫系がこれらの異常を認識し、腫瘍の発生および発症から宿主を防御し得る免疫応答を惹起できるからである。抗腫瘍免疫療法の標的となるには、ＴＡＡは以下でなければならない：
・新生物増殖の特定の段階で病原的な役割を有する；
・主要組織適合複合体（ＨＬＡ）糖タンパク質をもはや発現しないクローン性バリアントを腫瘍が生じさせた場合であっても免疫系によって検出可能である；
・抗体およびＴリンパ球の両方によって認識される。
【０００３】
いくつかのＴＡＡが近年ヒト癌腫において発見されている。その中で、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ２）オンコジーンのタンパク質産物であるｐ１８５neuは、免疫療法に特に適した標的である（Ｌｏｌｌｉｎｉ  ａｎｄ  Ｆｏｒｎｉ，２００３，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：６２）。ｐ１８５neuは、細胞の増殖および分化において重要な役割を果たす上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦ−ＲまたはＥｒｂＢ−１）および他の関連レセプター（ＥｒｂＢ−３、ＥｒｂＢ−４）もまた包含する、クラスＩレセプターチロシンキナーゼファミリーの膜レセプターである（Ｈｙｎｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔｅｒｎ，１９９４，ＢＢＡ  １１９８：１６５）。
【０００４】
ｐ１８５neuレセプタータンパク質は、３つのドメイン：細胞外ドメイン（ＥＣドメイン）、膜貫通ドメイン（ＴＭドメイン）および細胞質内ドメイン（ＩＣドメイン）に細分化できる。最近、ヒトおよびラットのｐ１８５neuタンパク質のＥＣドメインの結晶学的構造が公開された。このドメインは、全部で約６３０アミノ酸にわたる４つのサブドメイン（Ｉ／Ｌ１、ＩＩ／ＣＲ１、ＩＩＩ／Ｌ２およびＩＶ／ＣＲ２）からなると記載されている。ｐ１８５neuタンパク質は、他のＥｒｂＢレセプターと相互作用し、二量体化し、このタンパク質がリガンドに直接結合していなくても増殖シグナルの伝達を誘導することを可能にする、硬いコンフォメーションを有することがさらに示されている（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｎａｔｕｒｅ  ４２１：７５６）。
【０００５】
Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ２）オンコジーンは、胚の器官形成および上皮増殖の正常な過程に関与するが、成体においては僅かなレベルでのみ発現される（Ｐｒｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ５：９５３）。ヒトにおいて、このオンコジーンの過剰発現は主に遺伝子の増幅によって引き起こされる。Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ２）オンコジーンは、約３０％の乳癌において過剰発現され、このような過剰発現は、より迅速な腫瘍の進行に関連する（Ｓｌａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：７０７）。提案されてきた異なる戦略の中で、ＤＮＡワクチン接種は、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ陽性腫瘍に対する免疫応答を惹起する有効な方法であるように思われる。ｐ１８５neuタンパク質が「自己」抗原、すなわち身体中に通常存在するタンパク質である場合でさえ、ｐ１８５neu陽性乳癌を有する患者はしばしば、細胞性および体液性の両方の免疫応答を示す（Ｓｉｇｎｏｒｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．２３：１９１８；Ｄｉｓｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：１６；Ｐｅｏｐｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：４３２）。ｐ１８５neuタンパク質に対する抗腫瘍免疫療法の目的の１つは、既存の免疫応答を有する患者において応答の強度を増大させること、またはこの応答が検出できない患者において免疫応答を生じさせることである。ｐ１８５neuタンパク質が「自己」抗原であるという事実は、ワクチンが免疫寛容状態を克服できるはずであるということを伴う。
【０００６】
本特許出願の発明者らは、自然発症乳癌および移植可能なＨｅｒ−２／ｎｅｕ陽性腫瘍の両方に対する免疫防御を惹起することにおけるＤＮＡワクチン接種の効力を最初に使用し確認した。これらの研究により、前新生物病変の予防および治療が到達可能なゴールであることが証明されている。特に、ラットＨｅｒ−２／ｎｅｕオンコジーンに起因するトランスジェニックマウス（ＦＶＢ／ｎｅｕＴマウスおよびＢＡＬＢ−ｎｅｕＴマウス）において生じる自然発症乳癌の発症を予防することを目的とした実験において、全長ｐ１８５neuタンパク質をコードするプラスミドまたはそのＥＣドメインのみ（分泌抗原）をコードするプラスミドと比較して、ラットｐ１８５neuタンパク質のＥＣドメインおよびＴＭドメインをコードするプラスミドが、より有効な防御を惹起できることが示されている（Ａｍｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：７０３；Ｒｏｖｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：５１３３）。Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：１９６５）によって類似のデータが報告されている。さらに、ＤＮＡプラスミドによるワクチン接種の効力は、プラスミドが筋内接種される場合、非常に短い電気パルスをその後に行った場合に強く増大されることが示されている（Ｑｕａｇｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４：２８５８）。他の著者らは、チロシンキナーゼ活性を有さないように必要に応じて変異させた全長ｐ１８５neuタンパク質をコードするプラスミドが、ｐ１８５neu陽性癌細胞の移植後の腫瘍の発生を予防するのに有効であることを示している（Ｗｅｉ−Ｚｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８１：７４８）。同じプラスミドが、小胞体におけるタンパク質プロセシングを担うリーダーシグナルを除いた場合でさえも同様に有効であることが証明されており、これらは、ｐ１８５neu抗原の細胞質局在をもたらす。リーダーシグナルの存在のおかげで膜に局在するｐ１８５neuタンパク質をコードするプラスミドが使用される場合、防御は、抗体に頼る免疫応答に依存する。対照的に、Ｔリンパ球媒介性の免疫応答は、ワクチンがリーダーシグナルを含まない場合、したがって、ｐ１８５neuタンパク質が、トランスフェクトされた細胞の細胞膜上ではなく細胞質中に局在する場合に観察される（Ｐｉｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：３２０１）。さらに、リーダーシグナルを有するプラスミドおよびリーダーシグナルが欠失されたプラスミドの両方を使用することによって得られる組合せワクチン接種は、腫瘍増殖に対する防御においてより有効である（Ｐｉｅｃｈｏｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：３３６７）。このことは、ｐ１８５neu陽性癌腫の予防において、体液性応答と細胞性応答との間に相乗効果が存在することを実証している（Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：８８０）。
【０００７】
ＥＣドメインおよびＴＭドメインをコードするプラスミド（ＥＣ−ＴＭプラスミド）を用いたワクチン接種は、腫瘍拒絶に協調して寄与するある範囲のエフェクター免疫系機構（Ｔヘルパー細胞およびＴキラー細胞、抗体、マクロファージ、好中球、ナチュラルキラー細胞、Ｆｃレセプター、ＩＦＮ−γ、ならびにパーフォリン）を関与させることによって、自然発症ｐ１８５neu陽性癌腫の発症を予防することだけでなく、直径２ｍｍの腫瘍塊を治療することにおいても有効であることが証明されている（Ｃｕｒｃｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１１：１１６１）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
発明の説明
ラットｐ１８５neuタンパク質の全長ＴＭドメインおよび除々に減らした部分のＥＣドメインをコードするプラスミドがいくつか構築されている。ＮＨ2末端の２４０塩基対（ｂｐ）またはこの長さの倍数を欠失させることによって得られた短縮型プラスミドを、移植可能なラットｐ１８５neuタンパク質過剰発現腫瘍細胞（ＴＵＢＯ細胞）の増殖を予防することを目的とした実験において使用した。さらに、キメラｐ１８５neuタンパク質形態をコードする一連のプラスミドを、ラットタンパク質の短縮形態をコードする配列にヒトＥｒｂＢ２  ｃＤＮＡのＮＨ2末端部分を付加して全タンパク質配列を再構築することによって作製した。
【０００９】
全長ＥＣドメインおよびＴＭドメインをコードするプラスミドを用いたワクチン接種の後に達成される防御は、主に抗体産生に起因するが、ラットｐ１８５neuタンパク質の短縮形態をコードするプラスミドを使用することによって得られる防御は、多くの場合有意な抗体産生とは関連しない。
【００１０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験の結果に基づいて、抗体媒介性およびＴリンパ球媒介性の両方の強力な免疫応答を誘導できるプラスミドを選択した。
【００１１】
第１の局面において、本発明は、ｐ１８５neuタンパク質フラグメントのコード配列（この配列は、配列番号１〜５からなる群から選択される）；または、キメラｐ１８５neuタンパク質をコードする配列（この配列は、配列番号６〜１２からなる群から選択される）を含むプラスミドに関する（ヒトおよびラットのｐ１８５neuタンパク質をコードする遺伝子についての参照配列は、それぞれ、登録番号Ｍ１１７３０およびＸ０３３６２でＧｅｎｅ  Ｂａｎｋに寄託されている）。
【００１２】
本発明に従うｐ１８５neuタンパク質の短縮形態およびキメラ形態をコードするＤＮＡ配列は、哺乳動物、特にヒトにおける使用に適した任意のプラスミドベクター中に挿入することができる。上記コード配列とは別に、プラスミドは、コード配列、転写開始および停止配列の上流に位置する、転写を制御する機能的エレメント、特にプロモーター、好ましくはＣＭＶプロモーター；選択マーカー、好ましくはアンピシリンまたはカナマイシン耐性遺伝子；ＣｐＧモチーフ；ポリアデニル化部位；および場合によってエンハンサーまたは転写アクチベーターを含み得る。転写を制御するためのエレメントは、哺乳動物、特にヒトにおけるベクターの使用に適したものでなければならない。
【００１３】
別の局面において、本発明は、医薬的に許容されるビヒクルおよび賦形剤と共に、上記で規定したＤＮＡプラスミドを含む医薬組成物に関する。あるいは、この組成物は、短縮形態およびキメラ形態の両方のｐ１８５neuタンパク質をコードする２つ以上の異なるプラスミドの混合物を含み得る。非経口投与に適した形態の、好ましくは注射可能な溶液の形態の医薬組成物が、ＤＮＡワクチン接種に好ましく使用される。ＤＮＡワクチン接種のための原理および方法は当業者に知られており、例えば、Ｌｉｕ，２００３；Ｊ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．２５３：４０２中に記載されている。
【００１４】
ｐ１８５neu陽性（Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ陽性、ＥｒｂＢ−２陽性）腫瘍に対して予防的および治療的にワクチン接種するための、ｐ１８５neuの短縮形態およびキメラ形態をコードするプラスミドの利用は、その効力を改善する種々の利点を有する。短縮形態をコードするプラスミドについて、これらの利点とは以下である：
１）免疫応答を発生させることが所望される明確なＴＡＡ部分のみをコードするワクチンを得る可能性；このワクチンは、自己免疫現象を惹起する可能性が低い。
【００１５】
２）免疫応答の特定の選択された形態、すなわち抗体媒介性形態またはＴリンパ球媒介性形態の、排他的誘導。
【００１６】
３）連続的である必要はないが、異なる短縮形態をコードするｃＤＮＡフラグメントを互いに結合することによって規定された免疫原性を有する複数のエピトープを組み合わせるワクチンを製造する可能性。
【００１７】
異なる動物種由来のｐ１８５neuの短縮形態の組合せによって作製されたキメラプラスミドの使用は、以下を可能にする：
ａ）特異的な高い親和性の応答を惹起できる、免疫すべき同じ種（例えばヒト）のタンパク質決定基をコードするプラスミドを用いてワクチン接種すること；
ｂ）他の種由来の抗原決定基をコードするｃＤＮＡ配列と、免疫すべき同じ種の抗原決定基をコードするプラスミドを組み合わせること（これらの抗原決定基は、他の種由来の抗原決定基と実質的な類似性を示すが、他の種由来の抗原決定基がより強い免疫応答を惹起する点で異なっており、したがって、寛容状態を克服する）。部分的に外来と認識されるこれらの同種決定基は、より強力な応答およびサイトカイン放出の誘導を促進するヘルパー決定基として作用する；
ｃ）別の種の決定基をコードすることによって、ある個体において、ＨＬＡ分子に対してより高い親和性で結合し、より高い親和性を有するより強力な免疫応答を誘導する異種決定基を生じ得るｃＤＮＡ配列と、同じ種の抗原決定基をコードするプラスミドを組み合わせること；
ｄ）ａ）からの利点をｂ）およびｃ）からの利点と組み合わせたワクチンを得ること。
【００１８】
本発明に従う適切に処方されたＤＮＡプラスミドは、ｐ１８５neu陽性癌腫を発症する危険が高いヒトもしくは動物、またはｐ１８５neu陽性原発性腫瘍、それらの再発もしくは転移を保有する患者の、予防的処置または治療的処置において使用される。予防は、腫瘍がまだ明白でない場合には一次的であり；腫瘍が前新生物病変として初期段階にある場合には二次的であり；または腫瘍の再発もしくは転移の過程が観察される場合には三次的であることが可能である。
【００１９】
本発明のプラスミドまたは組成物によって治療可能な腫瘍は主に、上皮起源の腫瘍、特に、肺、卵巣および乳房の腺癌；頭頸部扁平上皮癌、およびより一般にはｐ１８５neuタンパク質発現腫瘍である。
【００２０】
発明の詳細な説明
ラットｐ１８５neuタンパク質の短縮形態をコードするプラスミドの構築
プラスミド骨格ｐＣＭＶ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｍｉｌａｎ，ＩｔａｌｙのｐｃＤＮＡ３．１から出発して本発明者らの研究室で得た）を使用して、ラットｐ１８５neuタンパク質の全長ＴＭドメインおよび減少する部分のＥＣドメインをコードするＤＮＡプラスミドを生成した。ｐＣＭＶ３．１は、ラットＨｅｒ−２／ｎｅｕの５’ＵＴＲのヌクレオチド配列（転写されるが翻訳されない）およびリーダー配列（ｎｅｕＬ）を含む。ラットｐ１８５neuタンパク質の分泌シグナルのＤＮＡフラグメントは、ｐＣＭＶ−ＥＣ−ＴＭベクター（Ａｍｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，７：７０３；Ｒｏｖｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６５：５１３３）をテンプレートとして、Ｔ７プライマーをセンスオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド＃１）として、末端ＥｃｏＲＩ部位を有するオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド＃２）をアンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用した、ＤＮＡの酵素的増幅によって得た。精製ならびにＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素による消化の後、増幅したフラグメントを同じ酵素で消化しておいたｐＣＭＶ３．１プラスミド中にクローニングし、こうしてｐＣＭＶ３．１−ｎｅｕＬを得た。続いて、ラットｐ１８５neuタンパク質のＥＣドメインの欠失フラグメントおよび全長ＴＭドメインをコードする７つの異なる配列を、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ制限酵素で消化したｐＣＭＶ３．１−ｎｅｕＬベクター中にインフレームで挿入した。こうして得た新たなプラスミドを、ｐＣＭＶ３．１−ｎｅｕＬ−ｒＥＣ１−ＴＭ（−７０アミノ酸）（図１）、ｐＣＭＶ３．１−ｎｅｕＬ−ｒＥＣ２−ＴＭ（−１５０アミノ酸）（図２）、ｐＣＭＶ３．１−ｎｅｕＬ−ｒＥＣ３−ＴＭ（−２３０アミノ酸）（図３）、ｐＣＭＶ３．１−ｎｅｕＬ−ｒＥＣ４−ＴＭ（−３１０アミノ酸）（図４）、ｐＣＭＶ３．１−ｎｅｕＬ−ｒＥＣ５−ＴＭ（−３９０アミノ酸）（図５）、ｐＣＭＶ３．１−ｎｅｕＬ−ｒＥＣ６−ＴＭ（−４７０アミノ酸）（図６）およびｐＣＭＶ３．１−ｎｅｕＬ−ｒＥＣ７−ＴＭ（−５５０アミノ酸）（図７）と名づけた。これらのプラスミドの第１のものがコードするフラグメントは、７０アミノ酸短く、分泌シグナルのアミノ酸配列を含む。他の全てのフラグメントは、８０アミノ酸ずつ徐々に短くなっている。
【００２１】
これらのフラグメントは、末端ＥｃｏＲＩ制限部位を全てが有する７つの異なるセンスオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド＃３〜＃９）、およびｐＣＭＶ３．１のマルチクローニングサイトの３’末端にある「ｐｃＤＮＡ３．１／ＢＧＨ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｉｎｇ  Ｓｉｔｅ」と呼ばれる部位（８３０〜８５０ｎｔ）を認識できるアンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド＃１０）を使用した、ＤＮＡの酵素的増幅によって生成されている。ＰＣＲ用のＤＮＡテンプレートとして、ｐＣＭＶ−ＥＣ−ＴＭベクター（Ａｍｉｃｉ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：７０３；Ｒｏｖｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５：５１３３）を使用した。ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ制限酵素による酵素的消化の後、増幅産物をｐＣＭＶ３．１−ｎｅｕＬプラスミド中にクローニングした。
【００２２】
ｐＣＭＶ３．１−ｎｅｕＬ−ｒＥＣ４−ＴＭプラスミドによるワクチン接種ならびに全長ＥＣドメインおよびＴＭドメインをコードするｐＣＭＶ３．１−ｎｅｕＬ−ｒＥＣ−ＴＭプラスミドによるワクチン接種は、ＴＵＢＯ細胞の接種によって誘導される腫瘍の発症から１００％のＢＡＬＢ／ｃマウスを保護する。一方、ｐ１８５neuタンパク質の最初の３つの短縮形態をコードするｐＣＭＶ３．１−ｎｅｕＬ−ｒＥＣ１−ＴＭプラスミド、ｐＣＭＶ３．１−ｎｅｕＬ−ｒＥＣ２−ＴＭプラスミドおよびｐＣＭＶ３．１−ｎｅｕＬ−ｒＥＣ３−ＴＭプラスミドによるワクチン接種は、７０〜８０％のＢＡＬＢ／ｃマウスを保護する。５番目の短縮形態をコードするｐＣＭＶ３．１−ｎｅｕＬ−ｒＥＣ５−ＴＭプラスミドは、５０％のＢＡＬＢ／ｃマウスを保護するが、６番目および７番目の短縮形態をコードするｐＣＭＶ３．１−ｎｅｕＬ−ｒＥＣ６−ＴＭプラスミドおよびｐＣＭＶ３．１−ｎｅｕＬ−ｒＥＣ７−ＴＭプラスミドは保護を誘導しない。得られた結果は、細胞質に局在するｐ１８５neuタンパク質の短縮形態によって活性化される細胞性応答が、抗腫瘍予防において充分であることを実証している。しかし、細胞性応答および体液性応答の同時活性化は、より有効な治療を得ることを可能にする（Ｒｉｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６１：８８０）。抗体産生を達成するために、ｐ１８５neuタンパク質の全長ＥＣドメインおよびＴＭドメインをコードするプラスミドを用いてワクチン接種を実施しなければならない。アミノ酸１〜３１０を欠く４番目の短縮型ｐ１８５neu形態をコードするｐＣＭＶ３．１−ｎｅｕＬ−ｒＥＣ４−ＴＭプラスミドによるワクチン接種はなおも完全な防御を付与できるが、抗体応答はｐＣＭＶ３．１−ｎｅｕＬ−ｒＥＣ−ＴＭプラスミドと比較して１０分の１の低さであった（表１）。
【００２３】
【表１】
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【００２４】
７つの異なる融合形態のｐ１８５neuタンパク質（ＨｕＲＴ１〜７）をコードできるキメラヒト−ラットプラスミドの構築
ＨＬＡによって提示されるエピトープの大多数は、ｐ１８５neuタンパク質の最初のサブドメイン（Ｉ／Ｌ１）上に位置する。したがって、ＮＨ2末端（ＥＣドメインの最も外側の部分）から開始して次第に長くなるヒトＥｒｂＢ２タンパク質の配列をコードするキメラプラスミドを、これらのエピトープに対する特異的免疫応答を誘導するために構築した。ＨｕＲＴ（ヒトラット膜貫通）と命名したこれらの新たなプラスミドは、ラットｐ１８５neuタンパク質の短縮形態をコードする配列に、ヒトＥｒｂＢ２  ｃＤＮＡの欠けた部分を付加することによって作製した。
【００２５】
ラットｐ１８５neuタンパク質の全長ＴＭドメインおよびＥＣドメインの減少するフラグメントをコードする最初の５つの短縮型プラスミドを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素で消化した。ＰＣＲによって得られ、その末端で消化された５つの異なるヒトｃＤＮＡフラグメントを、リーディングフレームが維持されるように、これらの５つの短縮プラスミド内にクローニングした。５’ＵＴＲ領域および小胞体を通過するための分泌シグナルを含む、挿入すべきヒトｐ１８５neuタンパク質の部分をコードするｃＤＮＡフラグメントを、ｐｃＤＮＡ３．１ｅｒｂＢ２プラスミドをテンプレートとして使用した増幅によって生成した。６つのオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した。センスオリゴヌクレオチドは、６つ全てのプライマーについて同じであり、Ｔ７プライマーに対応するが（オリゴヌクレオチド＃１）、その配列の徐々に前進する位置においてヒトＥｒｂＢ２オンコジーンのｃＤＮＡを認識し、それらの３’末端にＥｃｏＲＩ制限部位を有するように、５つのアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計した（オリゴヌクレオチド＃１１〜＃１５）。精製ならびにＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素による消化の後、増幅したフラグメントを、同じ制限酵素で予め消化しておいた対応するプラスミド（ｐＣＭＶ３．１−ｒＥＣ１−ＴＭ、ｐＣＭＶ３．１−ｒＥＣ２−ＴＭ、ｐＣＭＶ３．１−ｒＥＣ３−ＴＭ、ｐＣＭＶ３．１−ｒＥＣ４−ＴＭ、ｐＣＭＶ３．１−ｒＥＣ５−ＴＭ）中に挿入した。このようにして、５つの新たなプラスミド（ｐＣＭＶ３．１−ＨｕＲＴ１〜５）を得た。これらのプラスミドは、６８９アミノ酸長のキメラタンパク質をコードし、その２アミノ酸（Ｇｌｕ−Ｐｈｅ）は、ヒトおよびラットのＤＮＡを連結するために使用したＥｃｏＲＩ制限部位に属する。これらのキメラプラスミドがコードするタンパク質は、ヒトｐ１８５neuタンパク質の増大する部分およびラットｐ１８５neuタンパク質の減少する部分により、互いに異なる。
【００２６】
ＥｃｏＲＩ制限部位は、ヒトＥｒｂＢ２遺伝子配列中の１４５０位に存在するので、ラットｐ１８５neuタンパク質の６番目および７番目の短縮形態をコードするキメラプラスミドを得るために、ＥｃｏＲＩ以外のクローニング部位が使用できる２つの新たなプラスミドを構築した。ｐＣＭＶ３．１を、センスオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド＃１６）およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド＃１７）からなる合成配列を使用することによって改変して、ＰｍｅＩ酵素の２つの制限部位のうち１つを欠失させ、マルチクローニングサイト中に位置するＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩ制限酵素の制限部位を反転させた。こうして得た新たなプラスミド骨格をｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎと命名した。ラットｐ１８５neuタンパク質の６番目および７番目の短縮形態のフラグメントは、ｐＣＭＶ−ＥＣ−ＴＭプラスミド（Ａｍｉｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，７：７０３；Ｒｏｖｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６５：５１３３）をテンプレートとして使用し、その末端にＮｈｅＩ制限部位を有する２つの異なるセンスオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド＃１８および＃１９）およびアンチセンスオリゴヌクレオチド＃１０を使用した増幅によって、生成した。
【００２７】
制限酵素ＮｈｅＩおよびＰｍｅＩによる酵素的消化の後、増幅産物をｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎプラスミド中にクローニングし、こうして新たなｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−ｒＥＣ６−ＴＭプラスミドおよびｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−ｒＥＣ７−ＴＭプラスミドを得た。キメラｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−ＨｕＲＴ６プラスミドおよびｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−ＨｕＲＴ７プラスミドを生成するために挿入すべきヒトｐ１８５neuタンパク質の部分をコードするｃＤＮＡフラグメントを、ｐｃＤＮＡ３．１ｅｒｂＢ２プラスミドをテンプレートとして、Ｔ７プライマーをセンスオリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド＃１）として使用し、適切な位置でヒトｃＤＮＡを認識し、その末端にＮｈｅＩ制限部位を有するように設計した２つのプライマー（オリゴヌクレオチド＃２０および＃２１）をアンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用した増幅によって得た。
【００２８】
精製ならびにＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｈｅＩ制限酵素での消化の後、増幅フラグメントを、同じ制限酵素で予め消化しておいた対応するプラスミド（ｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−ｒＥＣ６−ＴＭ；ｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−ｒＥＣ７−ＴＭ）中に挿入した。このように、２つの新たなキメラｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−ＨｕＲＴ６プラスミドおよびｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−ＨｕＲＴ７プラスミドを得た。これらのプラスミドは、６８９アミノ酸長のタンパク質をコードし、その２アミノ酸（Ｖａｌ−Ｓｅｒ）は、ヒトおよびラットのＤＮＡを連結するために使用したＮｈｅＩ制限部位に属する。
【００２９】
これらの操作により以下のプラスミドを導いた：
・ｐＣＭＶ３．１−ＨｕＲＴ１プラスミド（図８）、これは、ヒトｐ１８５neuタンパク質のＥＣドメインの７０アミノ酸、ＥｃｏＲＩ部位に属する２アミノ酸、およびラットｐ１８５neuタンパク質の６１８アミノ酸をコードする
・ｐＣＭＶ３．１−ＨｕＲＴ２プラスミド（図９）、これは、ヒトｐ１８５neuタンパク質のＥＣドメインの１５０アミノ酸およびラットｐ１８５neuタンパク質の５３８アミノ酸をコードする
・ｐＣＭＶ３．１−ＨｕＲＴ３プラスミド（図１０）、これは、ヒトｐ１８５neuタンパク質のＥＣドメインの２３０アミノ酸およびラットｐ１８５neuタンパク質の４５８アミノ酸をコードする
・ｐＣＭＶ３．１−ＨｕＲＴ４プラスミド（図１１）、これは、ヒトｐ１８５neuタンパク質のＥＣドメインの３１０アミノ酸およびラットｐ１８５neuタンパク質の３７８アミノ酸をコードする
・ｐＣＭＶ３．１−ＨｕＲＴ５プラスミド（図１２）、これは、ヒトｐ１８５neuタンパク質のＥＣドメインの３９０アミノ酸およびラットｐ１８５neuタンパク質の２９８アミノ酸をコードする
・ｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−ＨｕＲＴ６プラスミド（図１３）、これは、ヒトｐ１８５neuタンパク質のＥＣドメインの４７０アミノ酸およびラットｐ１８５neuタンパク質の２１８アミノ酸をコードする
・ｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−ＨｕＲＴ７プラスミド（図１４）、これは、ヒトｐ１８５neuタンパク質のＥＣドメインの５５０アミノ酸およびラットｐ１８５neuタンパク質の１３８アミノ酸をコードする。
【００３０】
これらのプラスミドがコードするキメラヒト−ラットタンパク質の膜発現の間接的証拠が、７つの新たなプラスミド（ｐＣＭＶ３．１−ＨｕＲＴ１〜５およびｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−ＨｕＲＴ６〜７）でマウスを免疫することによって得られている。ワクチン接種した全てのマウス由来の血清は、キメラヒトおよびラットｐ１８５neuタンパク質に対する特異的抗体を有する。さらに、７つの異なるキメラタンパク質をコードするプラスミドによりワクチン接種した動物は、ＴＵＢＯ細胞および／またはヒトｐ１８５neuタンパク質過剰発現腫瘍細胞（Ｄ２Ｆ２−Ｅ２細胞）の致死接種から保護される。
【００３１】
実施例
実施例１：ｐＣＭＶ３．１−ＨｕＲＴ５プラスミドの構築
ラットｐ１８５neuタンパク質の５番目の短縮形態をコードするｐＣＭＶ３．１−ｒＥＣ５−ＴＭプラスミドを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素（ＢｉｏＬａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で消化して、５’ＵＴＲ領域およびｎｅｕＬ配列を欠失させた。
【００３２】
５’ＵＴＲ領域およびｎｅｕＬ配列を欠くｐＣＭＶ３．１−ｒＥＣ５−ＴＭプラスミドに対応する４７９４ｂｐのＤＮＡバンドをアガロースゲル電気泳動によって分離し、Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｔａｌｙ）を使用して溶出させた。５’ＵＴＲ領域、リーダー配列およびヒトＥｒｂＢ２遺伝子の欠けた部分をコードする配列のｃＤＮＡを、ＰＣＲによって得た。ｐｃＤＮＡ３．１ＥｒｂＢ２プラスミドをテンプレートとして使用し、Ｔ７プライマー（オリゴヌクレオチド＃１）をセンスオリゴヌクレオチドとして使用し、ＥｃｏＲＩ制限部位をその５’末端に有するプライマー（オリゴヌクレオチド＃１５）をアンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用した。ＰＣＲ反応を実施するために、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ（ＣＥＬＢＩＯ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）の試薬およびプルーフリーディングＴａｑポリメラーゼを使用した。ＰＣＲ反応後、増幅したＤＮＡを、標準的な方法によって精製および沈殿させ、５０μｌのＨ2Ｏ中に再懸濁し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素で消化した。ヒトＥｒｂＢ２の適切な部分をコードするｃＤＮＡフラグメントおよび線状化したｐＣＭＶ３．１−ｒＥＣ５−ＴＭプラスミドを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＢｉｏＬａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）を使用したライゲーション反応によってクローニングした。
【００３３】
次いで、このライゲーション産物を使用して、塩化カルシウム技術によって、コンピテントにしたＤＨ５α株のＥ．ｃｏｌｉ細菌を形質転換した。
【００３４】
こうして得たクローンをアルカリ溶解によって分析して、キメラｐＣＭＶ３．１−ＨｕＲＴ５プラスミドを含むクローンを検出した。
【００３５】
次いで、ｐＣＭＶ３．１−ＨｕＲＴ５を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ自動シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）を使用してＳａｎｇｅｒ配列決定法によって分析して、ＥｒｂＢ２遺伝子をコードするヒト配列部分のラットｐ１８５neuタンパク質の５番目の短縮形態をコードするプラスミド中への挿入が正確かつリーディングフレームを変更せずに生じていることを確認した。
【００３６】
オリゴヌクレオチドのリスト：
＃１  Ｔ７プライマー（配列番号１３）
＃２  ｎｅｕリーダーアンチセンスＥｃｏＲＩ（配列番号１４）
＃３  ｒＥＣＤ１センスＥｃｏＲＩ（配列番号１５）
＃４  ｒＥＣＤ２センスＥｃｏＲＩ（配列番号１６）
＃５  ｒＥＣＤ３センスＥｃｏＲＩ（配列番号１７）
＃６  ｒＥＣＤ４センスＥｃｏＲＩ（配列番号１８）
＃７  ｒＥＣＤ５センスＥｃｏＲＩ（配列番号１９）
＃８  ｒＥＣＤ６センスＥｃｏＲＩ（配列番号２０）
＃９  ｒＥＣＤ７センスＥｃｏＲＩ（配列番号２１）
＃１０  ｐｃＤＮＡ３．１／ＢＧＨ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｓｉｔｅ（配列番号２２）
＃１１  Ｈｉｓ−ＭｙｃセンスＥｃｏＲＩ  ｍｕｔ（配列番号２３）
＃１２  Ｈｉｓ−ＭｙｃアンチセンスＥｃｏＲＩ（配列番号２４）
＃１３  ７０  ｅｒｂＢ２アンチセンスＥｃｏＲＩ（配列番号２５）
＃１４  １５０  ｅｒｂＢ２アンチセンスＥｃｏＲＩ（配列番号２６）
＃１５  ２３０  ｅｒｂＢ２アンチセンスＥｃｏＲＩ（配列番号２７）
＃１６  ３１０  ｅｒｂＢ２アンチセンスＥｃｏＲＩ（配列番号２８）
＃１７  ３９０  ｅｒｂＢ２アンチセンスＥｃｏＲＩ（配列番号２９）
＃１８  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｈｅＩセンス（配列番号３０）
＃１９  ＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｈｅＩアンチセンス（配列番号３１）
＃２０  ｒＥＣＤ６センスＨｈｅＩ（配列番号３２）
＃２１  ｒＥＣＤ７センスＨｈｅＩ（配列番号３３）
＃２２  ４７０  ｅｒｂＢ２アンチセンスＨｈｅＩ（配列番号３４）
＃２３  ５５０  ｅｒｂＢ２アンチセンスＨｈｅＩ（配列番号３５）
実施例２：ｉｎ  ｖｉｖｏ試験
動物
約７週齢のＢＡＬＢ／ｃ系統の雌性マウスを全ての実験に使用した。動物はＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｃａｌｃｏ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）由来であり、そこでは、動物は欧州共同体によって確立された規則に従って無菌的に繁殖されていた。
【００３７】
筋内投与とその後のｉｎ  ｖｉｖｏエレクトロポレーション
疼痛および脛骨筋肉の望まない収縮を回避するために、各マウスを３９．５ｍｌ脱イオンＨ2Ｏ中３００μｌのＡｖｅｒｔｉｎ（０．５８ｇのトリブロモエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）からなる溶液）および３１０μｌのＴｅｒｔ−Ａｍｙｌアルコール（Ａｌｄｒｉｃｈ）の腹腔内注射によって麻酔した。麻酔したマウスの脛骨筋肉を切り取り、２５μｇのＤＮＡを含む溶液２０μｌを各筋肉中に接種した。ＤＮＡ含有溶液を、Ｄｒ．Ｆ．Ｐｅｒｉｃｌｅの指示（Ｖａｌｅｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，Ｔｅｘａｓ，ＵＳＡ）に従って使用直前に調製した。この溶液は、１．２５ｍｇ／ｍｌの濃度のプラスミドＤＮＡ、６ｍｇ／ｍｌの濃度のポリ−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓ．ｒ．ｌ．，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）、１５０ｍＭの濃度の塩化ナトリウム（Ｆｌｕｋａ，ＢｉｏＣｈｅｍｉｋａ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）および１ｍｌの最終容量までのエンドトキシンを含まない蒸留水（Ｎｕｃｌｅａｒｅ  Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒ，Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含んでいた。接種の約５分後、Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｓｑｕａｒｅ  Ｐｏｒａｔｏｒエレクトロポレーター（Ｔ８２０，ＢＴＸ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって発生させた２回の電気パルス（各々、強度３７５Ｖ／ｃｍ2および持続時間２５ｍｓｅｃ）を、脚の側方に四角形の配置で３ｍｍ離れて位置づけた２つの鋼の電極を使用してマウスの両方の脛骨筋肉に印加した。エレクトロポレーションによる遺伝子免疫を各動物において２回実施し、その７日後および２１日後に腫瘍細胞を接種した。
【００３８】
腫瘍細胞の接種
マウスの左側に、２×１０5のＴＵＢＯ細胞を含む懸濁液０．２ｍｌを接種した。
【００３９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍増殖評価
腫瘍増殖を触診によって毎週評価し、腫瘍サイズを、ゲージを用いて２つの直行する直径に沿って測定した。１ミリメートルより大きいサイズの新生物塊を腫瘍とみなした。腫瘍増殖を、腫瘍接種から１００日間、または腫瘍サイズが直径１０ミリメートルを超えるまでモニタリングし、その時点で動物を犠牲にした。得られた結果は、キメラｐＣＭＶ３．１−ＨｕＲＴ５プラスミドが、ＴＵＢＯ細胞の致死接種から、ワクチン接種したＢＡＬＢ／ｃマウスの１００％を保護できることを実証している（表２）。
【００４０】
【表２】
0005597346.tif 000003
【００４１】
ワクチン接種した動物の血清中に存在する抗ｐ１８５neu抗体の評価
腫瘍細胞の接種の前の日に、キメラｐＣＭＶ３．１−ＨｕＲＴ５プラスミドでワクチン接種した動物から採血した。血清を分析して、ラット抗ｐ１８５neu抗体の存在を評価した。血清を、ラットｐ１８５neuを過剰発現する細胞と共に４℃で４５分間インキュベートした。０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，Ｓｉｇｍａ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）および０．１％アジ化ナトリウム（ＮａＮ3，Ｓｉｇｍａ，Ｍｉｌａｎ，Ｉｔａｌｙ）を含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）からなる、洗浄緩衝液と呼ばれる溶液で洗浄した後、サンプルを、抗マウス免疫グロブリンＦＩＴＣコンジュゲート化抗体と共に４℃で２０分間インキュベートし、洗浄緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳｃａｎサイトフルオロメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）によって分析した。同時に、サイトフルオロメーター分析によって得た蛍光強度と動物血清中の抗ｐ１８５neu抗体の濃度との間の関係を誘導できるように、同じ細胞を減少する濃度のモノクローナル抗ｃ−ＥｒｂＢ２／ｃ−ｎｅｕ抗体（Ａｂ４，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ）と共にインキュベートした。得られたデータは、ワクチン接種した全ての動物が高レベルの抗ラットｐ１８５neu抗体を示し、したがって、キメラｐＣＭＶ３．１−ＨｕＲＴ５プラスミドが、移植可能なｐ１８５neu陽性腫瘍の拒絶の誘導および特異的抗体応答の惹起において有効であることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】本発明に係るプラスミドｐＣＭＶ３．１−ｎｅｕＬ−ｒＥＣ１−ＴＭのコンストラクションである。
【図２】本発明に係るプラスミドｐＣＭＶ３．１−ｎｅｕＬ−ｒＥＣ２−ＴＭのコンストラクションである。
【図３】本発明に係るプラスミドｐＣＭＶ３．１−ｎｅｕＬ−ｒＥＣ３−ＴＭのコンストラクションである。
【図４】本発明に係るプラスミドｐＣＭＶ３．１−ｎｅｕＬ−ｒＥＣ４−ＴＭのコンストラクションである。
【図５】本発明に係るプラスミドｐＣＭＶ３．１−ｎｅｕＬ−ｒＥＣ５−ＴＭのコンストラクションである。
【図６】本発明に係るプラスミドｐＣＭＶ３．１−ｎｅｕＬ−ｒＥＣ６−ＴＭのコンストラクションである。
【図７】本発明に係るプラスミドＣＭＶ３．１−ｎｅｕＬ−ｒＥＣ７−ＴＭのコンストラクションである。
【図８】本発明に係るｐＣＭＶ３．１−ＨｕＲＴ１プラスミドのコンストラクションである。
【図９】本発明に係るｐＣＭＶ３．１−ＨｕＲＴ２プラスミドのコンストラクションである。
【図１０】本発明に係るｐＣＭＶ３．１−ＨｕＲＴ３プラスミドのコンストラクションである。
【図１１】本発明に係るｐＣＭＶ３．１−ＨｕＲＴ４プラスミドのコンストラクションである。
【図１２】本発明に係るｐＣＭＶ３．１−ＨｕＲＴ５プラスミドのコンストラクションである。
【図１３】本発明に係るｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−ＨｕＲＴ６プラスミドのコンストラクションである。
【図１４】本発明に係るｐＣＭＶ３．１Ｈ／Ｎ−ＨｕＲＴ７プラスミドのコンストラクションである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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