(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸残基２１‐２６１からなる組換えＣＤ４０Ｌポリペプチドをコードするインビトロ転写ＲＮＡを含んでなる、樹状細胞。
【請求項２】
前記ＲＮＡがキャップ化および／またはポリアデニル化される、請求項１に記載の樹状細胞。
【請求項３】
前記樹状細胞が抗原をコードするＲＮＡによりトランスフェクトされるものである、請求項１または２に記載の樹状細胞。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の樹状細胞を含んでなる、ワクチン。
【請求項５】
ａ．ＩＦＮ‐γＲアゴニストシグナル化成熟樹状細胞を産生するために、インターフェロンガンマレセプター（ＩＦＮ‐γＲ）アゴニストおよびＴＮＦ‐αＲアゴニストを含んでなる第一シグナルにより単離未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）をシグナリングし、そして
ｂ．ＣＣＲ７＋成熟樹状細胞を産生するために、ＣＤ４０ＬポリペプチドをコードするＲＮＡにより前記ＩＦＮ‐γＲアゴニストシグナル化成熟樹状細胞をトランスフェクトする連続工程を含んでなり、
ここで、ＣＤ４０ＬポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸残基２１‐２６１からなる、
インビトロで成熟樹状細胞（ＤＣ）を作製するための方法。
【請求項６】
前記ＣＤ４０Ｌタンパク質が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０もしくはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３のｃＤＮＡ、またはコドン縮重により異なるバリアントに対応するＲＮＡによりコードされ、前記ＲＮＡが場合によりキャップ化および／またはポリアデニル化される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ｉＤＣおよび／または前記シグナル化ＤＣをＰＧＥ２と接触させることを更に含んでなる、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
工程（ａ）および（ｂ）が、前記細胞をＧＭ-ＣＳＦおよび、ＩＬ-４またはＩＬ-１３の少なくとも一方と接触させることを更に含んでなる、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
工程（ａ）における細胞がＴＮＦ‐αと接触させる、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ａ）における細胞をＰＧＥ２と接触させることを更に含んでなる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＩＦＮ‐γＲアゴニストがＩＦＮ‐γである、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
第一シグナルがＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、およびＰＧＥ２を含んでなる、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
ガラクトシルセラミド、グリコシルセラミド、ガラクトフラノシルセラミド、アラビノピラノシルセラミド、α‐Ｃ‐ガラクトシルセラミド、およびα‐Ｓ‐ガラクトシルセラミドからなる群より選択される化合物と、未成熟樹状細胞および／またはＩＦＮ‐γＲアゴニストシグナル化樹状細胞および／またはＣＣＲ７＋成熟樹状細胞とを接触させることを更に含んでなる、請求項５に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物がガラクトシルセラミドである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ガラクトシルセラミドが（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）‐１‐Ｏ‐（α‐Ｄ‐ガラクトピラノシル）‐２‐（Ｎ‐ヘキサコサノイルアミノ）‐１，３，４‐オクタデカントリオール（ＫＲＮ７０００）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
抗原をコードするＲＮＡにより前記樹状細胞をトランスフェクトすることを更に含む、請求項５〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
請求項５〜１６のいずれか一項に記載の方法により作製された、樹状細胞。
【請求項１８】
前記樹状細胞が抗原特異的Ｔ細胞の集団からＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＡ−メモリー／エフェクターＴ細胞の集団を優先的に誘導するものである、請求項１７に記載の樹状細胞。
【請求項１９】
請求項１８に記載の樹状細胞を含む、ワクチン。
【請求項２０】
前記ＣＤ４０ＬポリペプチドをコードするＲＮＡが、野生型ＣＤ４０Ｌの第一メチオニンをコードするＡＴＧコドンを欠くものである、請求項１または１７に記載の樹状細胞。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、トランケート化ＣＤ４０Ｌタンパク質および核酸、並びにワクチンの使用および成熟樹状細胞の作製のための方法に関する。
【０００２】
背景技術
細胞療法においては、患者において免疫応答を開始させるために、修飾された抗原提示細胞（ＡＰＣ）または免疫エフェクター細胞を利用する。抗原提示細胞は免疫応答を開始させるため、抗原提示細胞が細胞療法において重要である。実際、それらはＴリンパ球から一次免疫応答を誘導しうる唯一の細胞である。
【０００３】
樹状細胞（ＤＣ）は、適応免疫に関与する最も強力なＡＰＣである。それらはナイーブＴ細胞およびＢ細胞による免疫応答の開始を調整し、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の応答を誘導する。ＤＣは、ヘルパーＴ細胞およびキラーＴ細胞をインビボにおいて初回免疫する(prime)ために、数通りに専門化される。例えば、末梢組織に存在する未成熟ＤＣは、抗原を捕捉して、免疫原性ＭＨＣ‐ペプチド複合体を産生するように準備される。炎症性サイトカインのような成熟誘導刺激に応答して、未成熟ＤＣは接着および補助刺激分子を上方調節することにより強力なＴ細胞スティミュレーターへ進化する。同時に、それらは希少な抗原特異的Ｔ細胞を選択および刺激するために二次リンパ系器官へ移動する。しかしながら、Ｔ細胞の強い刺激は、応答Ｔ細胞のエフェクター機能を導く補助刺激分子に加えて、細胞表面においてＭＨＣ／ペプチド複合体の利用能を増す工程、ＤＣ成熟後のみに生じる。実際、未成熟ＤＣは免疫刺激よりむしろ免疫寛容を誘導しうることから、それらは抗腫瘍および他の免疫療法において有害かもしれない。
【０００４】
補助刺激は、クローン拡大を誘導する十分なサイトカインレベルを生じる上で、典型的にＴ細胞にとって必要である。自らを強力な抗原提示細胞にする樹状細胞の一つの特性は、それらがＴリンパ球において分子ＣＤ２８を活性化する免疫応答の補助刺激分子、例えば分子ＣＤ８０およびＣＤ８６に豊富なことである。代わりに、ＤＣにおいてＣＤ４０と結合するＣＤ４０ＬをＴヘルパー細胞は発現する。ＤＣとＴ細胞とのこれらの相互作用は、前者の‘成熟化’と後者においてエフェクター機能の獲得に至る。分子ＣＤ５４または分子ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８のような接着分子の発現は、樹状細胞とＴ細胞との協力を促す。樹状細胞の他の特性は、それらの分化段階に応じて異なる機能を展開することである。このように、抗原の捕捉とその変換が未成熟樹状細胞の二つの主要機能であり、一方Ｔ細胞を刺激するために抗原を提示するその能力は、樹状細胞が組織およびリンパ神経節へ移動すると増大する。この機能性変化が樹状細胞の成熟化に相当する。このように、未成熟樹状細胞から成熟樹状細胞への推移が免疫応答の開始に際して基礎工程に相当する。伝統的に、この工程に際してＤＣにおいて表面マーカーの変化を測定することによりこの成熟化が追跡された。樹状細胞の異なる成熟化段階で特徴的なより重要な細胞表面マーカーの一部が、下記表Ｉにおいて要約される。しかしながら、表面マーカーは成熟化工程に応じて変化しうる。
【表１】
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【０００５】
現在、成熟ＤＣは、免疫療法にとり未成熟ＤＣより好まれる。完全成熟ＤＣ子孫のみがＧＭ‐ＣＳＦレセプター（ＧＭ‐ＣＳＦ‐Ｒ）を欠き、ＧＭ‐ＣＳＦの除去／非存在下において安定的に成熟したままである。しかも、成熟ＤＣはＴ細胞応答をインビトロおよびインビボ誘導する上で優れていることが示されてきた。一方、未成熟ＤＣは、調節性Ｔ細胞を誘導することにより、インビトロ（Jonuleit et al.(2000)Exp.Med.192:1213）およびインビボ（Dhodapkar et al.(2001)Exp.Med.193:233）において寛容を誘導することが報告されている。成熟樹状細胞は、インビトロまたはインビボにおいて抗原を取り込みＴリンパ球へ提示するためにも有用である。修飾された抗原提示ＤＣおよび／またはこれらの修飾ＤＣから教育されたＴ細胞は、診断、療法、ワクチン接種、リサーチ、スクリーニング、および遺伝子輸送を含めた多くの適用例を有している。
【０００６】
白血球の１％未満が成熟樹状細胞のカテゴリーに属するにすぎないため、成熟樹状細胞を末梢血から単離することは困難である。成熟ＤＣは組織から抽出することも困難である。この困難性が、細胞療法におけるＤＣの潜在的治療利益とともに、別の供給源を用いて成熟樹状細胞を作製しようとする新たな方法に向けた研究および開発を強いることになった。未成熟樹状細胞から成熟ＤＣを作製するためにいくつかの方法が報告されている。
【０００７】
例えば、Jonuleitら（Eur.J.Immunol.(1997)12:3135-3142）は、サイトカインカクテル（ＩＬ‐１β、ＴＮＦ‐α、およびＰＧＥ２）を含有した培地においての培養による未成熟ヒトＤＣの成熟化について開示している。
【０００８】
ＷＯ９５／２８４７９号は、末梢血細胞を単離し、ＣＤ３４＋血液前駆細胞について富化させ、次いで造血成長因子およびサイトカインの組合せにより拡大させることによる、樹状細胞を作製するための工程について開示している。
【０００９】
欧州特許公開ＥＰ‐Ａ‐０９２２７５８号は、マクロファージまたは樹状細胞特性を発現しうるポテンシャルを有した多能性細胞由来の未成熟樹状細胞から成熟樹状細胞の産生について開示している。該方法では、ＩＦＮ‐γを含めた樹状細胞成熟化因子と未成熟樹状細胞とを接触させることを必要とする。
【００１０】
欧州特許公開ＥＰ‐Ｂ‐０６３３９３０号は、ＣＤ１ａ＋造血細胞の形成を誘導するために、最初にヒトＣＤ３４＋造血細胞を（ｉ）ＧＭ‐ＣＳＦ、（ii）ＴＮＦ‐αおよびＩＬ‐３、または(iii)ＧＭ‐ＣＳＦおよびＴＮＦ‐αと培養することによる、ヒト樹状細胞の産生について開示している。
【００１１】
特許公開第２００４／０１５２１９１号は、樹状細胞をＲＵ４１７４０と接触させることによる樹状細胞の成熟化について開示している。
【００１２】
米国特許公開第２００４／０１４６４９２号は、造血幹細胞を形質転換し、次いでＧＭ‐ＣＳＦ含有培地における培養により幹細胞を樹状細胞へ分化させることによる、組換え樹状細胞を作製するための工程について開示している。
【００１３】
米国特許公開第２００４／００３８３９８号は、哺乳動物の末梢血からＤＣおよび単球の実質的精製集団の作製のための方法について開示している。骨髄系細胞が哺乳動物から単離され、単球の単離サブ集団を得るためにＤＣがこの集団から分離される。ＤＣは次いで、Ｔ細胞を除去するために、抗ＣＤ２抗体でネガティブ選択により富化される。
【００１４】
成熟ＤＣは機能的に適格であり、したがって抗原特異的Ｔ細胞を誘導する上で有用であるが、すべての成熟ＤＣがこれらの応答を誘導する上で最適な訳ではない。一部の成熟ＤＣはＩＬ‐１２を分泌することによりＴヘルパー細胞も刺激しうることが示された。Macatonia et al.(1995)Immunol.154:507 1、Ahuja et al.(1998)Immunol.161:868、およびUnintford et al.(1999)Immunol.97:588。ＩＬ‐１２は、動物モデルにおいて抗原への抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を高めることも示された。Schmidt et al.(1999)Immunol.163:2561。
【００１５】
Mosca et al.(2000)Blood,96:3499においては、可溶性ＣＤ４０ＬトリマーおよびＩＦＮγ １ｂを双方とも含有するＡＩＭ Ｖ培地においてのＤＣの培養が、可溶性ＣＤ４０Ｌトリマーのみを含有する培地での培養と比較して、ＩＬ‐１２発現の増加をもたらすことを開示している。
【００１６】
Koya et al.(2003)J.Immunother.26(5):451においては、ＣＤ４０リガンドをコードするレンチウイルスベクターにおいて、ＩＦＮγの存在下、未成熟ＤＣの安定的形質導入により、ＩＬ‐１２発現が高められることを報告している。ＣＤ４０Ｌ形質導入ＤＣの９０％以上がそれらの細胞表面においてＣＤ８３を発現した。残念ながら、レンチウイルス形質導入細胞は治療目的に適さず、形質導入細胞のゲノムへのプロウイルス組込みは白血病を生じうる。更に、ＣＤ４０Ｌの永続的発現はＡＰＣ機能および生存能に有害効果を有することがある。
【００１７】
Koyaらの研究は、インビボにおいてＤＣは抗腫瘍免疫を生じるためにＣＤ４０による成熟化を要すると報告した、Mackey et al.(1998)J.Immunol.161:2094の初期研究を補足した。同様に、Kuniyoshi,J.S.et al.(1999)Cell Immunol.193:48は、可溶性トリマーＣＤ４０リガンド＋ＩＦＮ‐γにより処理されたＤＣが強力なＴ細胞増殖を刺激し、抗原特異的溶解性の増したＴ細胞を誘導することを示した。Kalady,M.F.et al.(2004)J.Surg.Res.116:24は、同時にまたは順次的に加えられる異なる成熟化刺激へ曝された、黒色腫抗原ＭＡＲＴ‐１またはインフルエンザＭ１マトリックスタンパク質をコードするｍＲＮＡにおいてトランスフェクトされたヒト単球由来ＤＣが、抗原提示、ＩＬ‐１２分泌、およびこれらＤＣの存在下において生じるエフェクターＴ細胞の免疫原性に変動性を示すことを報告した。最も重要なことは、ＩＬ‐１β、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐６、およびＰＧＥ２からなる‘サイトカインカクテル’に続く細胞外可溶性ＣＤ４０Ｌタンパク質の適用が全物質を同時に適用するよりも優れていることを、この研究が示したことである。しかしながら、これらの著者は連続工程において、ＩＦＮ‐γシグナリングと、一過性ＣＤ４０Ｌシグナリングとの組合せについては研究しなかった。更に、ＩＦＮ‐γおよびＣＤ４０Ｌが培地へ同時添加された場合におけるＩＬ‐１２の産生にもかかわらず、最近の先行技術は、トリプトファンを代謝した酵素の誘導が応答Ｔ細胞を枯渇させてその増殖を損なわせることから、得られるＤＣが前炎症性というより実際にはむしろ免疫抑制性であることを示している（Hwu et al.(2000)J.Immunol.164:3596、Munn et al.(2002)297:1867、およびGrohmann et al.(2003)Trends Immunol.24:242）。このように、現行の文献は、ＩＦＮ‐γおよびＣＤ４０Ｌの組合せが免疫力を増加させるはずはないことを示唆している。ＤＣ成熟化のための改良方法と免疫力増加の成熟ＤＣとを提供することが希求されており、本発明はそのことについて取り扱う。
【発明の概要】
【００１８】
本発明者らは、インターフェロンガンマレセプター（ＩＦＮ‐γＲ）アゴニストを含んでなる第一シグナルに続き、ＣＤ４０アゴニストを含んでなる第二シグナルにより未成熟樹状細胞が順次シグナリングされた場合に、強い免疫刺激が生じることを見出した。第二シグナルが与えられる時点で、ＤＣは未成熟でもまたは成熟でもよい。
【００１９】
一つの態様において、本発明は、（ａ）シグナル化樹状細胞を産生するためにインターフェロンガンマレセプター（ＩＦＮ‐γＲ）アゴニストおよび場合によりＴＮＦ‐αＲアゴニストを含んでなる第一シグナルにより単離未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）をシグナリングし、そして（ｂ）ＣＣＲ７＋成熟樹状細胞を産生するために有効量のＣＤ４０アゴニストを含んでなる第二の一過性シグナルにより前記シグナル化樹状細胞をシグナリングする連続工程を含んでなる成熟樹状細胞（ＤＣ）を作製するための方法を提供する。
【００２０】
好ましい態様において、未成熟ＤＣはＰＧＥ２および場合によりＴＮＦ‐αと更に接触させられる。一部の態様において、該方法は、ガラクトシルセラミド、グリコシルセラミド、ガラクトフラノシルセラミド、アラビノピラノシルセラミド、α‐Ｃ‐ガラクトシルセラミド、およびα‐Ｓ‐ガラクトシルセラミドからなる群より選択される化合物と、未成熟ＤＣ、シグナル化ＤＣおよび／またはＣＣＲ７＋成熟樹状細胞とを接触させることを更に含んでなる。好ましくは、前記化合物はガラクトシルセラミドである。最も好ましくは、ガラクトシルセラミドは（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）‐１‐Ｏ‐（α‐Ｄ‐ガラクトピラノシル）‐２‐（Ｎ‐ヘキサコサノイルアミノ）‐１，３，４‐オクタデカントリオール（ＫＲＮ７０００）である。
【００２１】
本発明の一部の態様において、ＩＦＮ‐γＲアゴニストは腫瘍壊死因子アルファレセプター（ＴＮＦ‐αＲ）アゴニストの代わりに用いても、またはＴＮＦ‐αＲアゴニストと併用されてもよい。例えば、一つの態様において、本発明は、腫瘍壊死因子アルファレセプター（ＴＮＦ‐αＲ）アゴニストを含んでなる第一シグナルに続きＣＤ４０アゴニストを含んでなる第二シグナルにより未成熟樹状細胞を順次シグナリングし、それにより成熟樹状細胞の富化集団を作製することを含んでなり、該シグナリングが有効量のＩＬ‐１βまたはＩＬ‐６の非存在下におけるものである、成熟樹状細胞（ＤＣ）の富化集団を作製するための方法を提供する。好ましくは、未成熟ＤＣは更にＰＧＥ２と接触させられる。
【００２２】
好ましいＩＦＮ‐γＲアゴニストは哺乳動物ＩＦＮ‐γ、好ましくはヒトＩＦＮ‐γおよびその活性断片である。好ましいＴＮＦ‐αＲアゴニストは哺乳動物ＴＮＦ‐α、好ましくはヒトＴＮＦ‐αおよびその活性断片である。好ましいＣＤ４０アゴニストは、哺乳動物ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、好ましくはヒトＣＤ４０Ｌとその活性断片およびバリアント、並びにＣＤ４０レセプターに対するアゴニスト抗体である。最も好ましくは、ＣＤ４０Ｌアゴニストは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸残基２１‐２６１からなるまたは本質的になる、ここで提供される新規ＣＤ４０Ｌポリペプチドである。新規ＣＤ４０Ｌポリペプチドをコードする核酸、トランスフェクトされたＤＣ、および関連ワクチンも提供される。
【００２３】
シグナリングは、シグナリングアゴニストを培地に供して、該アゴニストを細胞へ導入させることにより、および／またはアゴニストポリペプチドをコードするｍＲＮＡの樹状細胞内翻訳で開始される。該方法はインビボまたはエクスビボにおいて行える。本発明の方法に従いエクスビボにおいて成熟された樹状細胞は次いで、免疫応答を誘導または増強するために対象者へ投与される。
【００２４】
樹状細胞の各々は、ＤＣへの免疫原の投与により、更に修飾してもよい。ＤＣは免疫原を取込んでプロセッシングし、それをその細胞表面において提示する。免疫原はインビボまたはエクスビボにおいて輸送できる。成熟培養ＤＣが免疫応答を誘導または増強するために対象者へ投与される。更に別の態様において、抗原負荷成熟ＤＣはナイーブ免疫エフェクター細胞を教育するために用いられる。
【００２５】
他の態様において、本発明はＣＤ８３＋ＣＣＲ７−成熟ＤＣおよびＣＤ８３＋ＣＣＲ７＋成熟ＤＣのようなインビトロ成熟樹状細胞を含んでなる組成物を提供する。本発明の成熟樹状細胞は未成熟樹状細胞と比較して高レベルのＩＬ‐１２を発現し、および／または樹状細胞百万個当たり５００ｐｇ未満のＩＬ‐１０を発現する。
【００２６】
他の態様において、本発明は、抗原特異的Ｔ細胞の集団からＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＡ―メモリー／エフェクターＴ細胞の集団を優先的に誘導する樹状細胞を提供する。本発明の組成物は、有効量の集団を対象者へ投与することにより、対象者において免疫応答を生じさせるために有用である。
【００２７】
本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸残基２１‐２６１からなる、または本質的になる組換えトランケート化ＣＤ４０Ｌポリペプチドを更に提供する。他の態様において、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸残基２１‐２６１と少なくとも８０％アミノ酸相同性を有するポリペプチドからなる、または本質的になる、組換えＣＤ４０Ｌポリペプチドを提供する。他の態様において、本発明は、これらのトランケート化ＣＤ４０Ｌポリペプチドをコードする核酸、並びにこのような核酸を含んでなるベクター、樹状細胞、およびワクチンを提供する。
【００２８】
他の態様において、本発明は、ａ）ＩＦＮ‐γＲアゴニストシグナル化樹状細胞を産生するためにインターフェロンガンマレセプター（ＩＦＮ‐γＲ）アゴニストおよび場合によりＴＮＦ‐αＲアゴニストを含んでなる第一シグナルで単離未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）をシグナリングし、そしてｂ）ＣＣＲ７＋成熟樹状細胞を産生するために有効量のＣＤ４０Ｌポリペプチドを含んでなる第二の一過性シグナルにより前記ＩＦＮ‐γＲアゴニストシグナル化樹状細胞をシグナリングする連続工程を含んでなり、ＣＤ４０ＬポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸残基２１‐２６１から本質的になる、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸残基２１‐２６１と少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドである、成熟樹状細胞（ＤＣ）を作製するための方法を提供する。好ましくは、第一シグナルはＩＦＮ‐γ、ＴＮＦ‐α、およびＰＥＧ２を含んでなり、工程（ｂ）は該ＣＤ４０ＬポリペプチドをコードするＲＮＡで該樹状細胞をトランスフェクトすることを含んでなる。
【００２９】
配列リストの簡単な説明
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１はヒトＣＤ４０Ｌ ｃＤＮＡである。ヌクレオチド４０‐８２５は、ＡＴＧ翻訳開始コドンおよびＴＧＡ翻訳終止コドンを含むコーディング領域を表す。
【００３０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２は全長ヒトＣＤ４０Ｌタンパク質のアミノ酸配列である。
【００３１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３はヒトＣＤ４０ ｃＤＮＡである。ヌクレオチド６７‐５２２は、ＡＴＧ翻訳開始コドンおよびＴＡＧ翻訳終止コドンを含むコーディング領域を表す。
【００３２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４はヒトＣＤ４０（ＣＤ４０Ｌのレセプター）のアミノ酸配列である。
【００３３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５はヒトＩＦＮ‐γ ｃＤＮＡである。ヌクレオチド１０９‐６０９は、ＡＴＧ翻訳開始コドンおよび翻訳終止コドンを含むコーディング領域を表す。
【００３４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６はヒトＩＦＮ‐γのアミノ酸配列である。
【００３５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７はヒトＴＮＦ‐α ｃＤＮＡである。ヌクレオチド１７０‐９７１は、ＡＴＧ翻訳開始コドンおよびＴＧＡ翻訳終止コドンを含むコーディング領域を表す。
【００３６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８はヒトＴＮＦ‐αのアミノ酸配列である。
【００３７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９はマウスＣＤ４０Ｌ ｃＤＮＡである。ヌクレオチド１３‐７９５は、ＡＴＧ翻訳開始コドンおよびＴＧＡ翻訳終止コドンを含むコーディング領域を表す。
【００３８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０は全長マウスＣＤ４０Ｌタンパク質のアミノ酸配列である。
【００３９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１はＣＤ４０Ｌ ５′プライマーである。
【００４０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２はＣＤ４０Ｌ ３′プライマーである。
【００４１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３は、最適化ヒトＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡに対応するＤＮＡ配列である。
【００４２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４はＣＤ４０レセプター３′ＵＴＲである。
【００４３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５はヒトベータ‐アクチン３′ＵＴＲの最終エキソンの非翻訳領域である。
【００４４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６はヒトベータ‐アクチン３′ＵＴＲの最小機能要素である。
【００４５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７はサルロタウイルス遺伝子６ ３′ＵＴＲである。
【００４６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８はサルロタウイルス遺伝子６ ３′ＵＴＲの最小機能要素である。
【００４７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９はヒトＨｓｐ７０ ５′ＵＴＲ（ＨＳＰＡ１Ａ）である。
【００４８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０はマウスＶＥＧＦ ５′ＵＴＲである。
【００４９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１はマウスＶＥＧＦ ５′ＵＴＲの最小機能要素である。
【００５０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２は脾臓壊死ウイルスＬＴＲ ＲＵ５領域である。
【００５１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３はタバコエッチウイルス５′リーダー配列である。
【００５２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４〜２６は、各々ＨＬＡ‐Ａ２０１拘束性ＭＡＲＴ‐ＡＰＬペプチド、天然ペプチド、およびＰＳＡ‐１ペプチドである。
【００５３】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７はヒトα‐グロビン３′ＵＴＲである。
【００５４】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８はヒトβ‐グロビン３′ＵＴＲである。
【００５５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９はヒトβ‐グロビン３′ＵＴＲ、マイナスプリンリッチ要素３である。
【００５６】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０は、ポリアデニル化前に、ΔＸＥ‐ｍｅｔ１プラスミドから転写されたＣＤ４０Ｌ ＲＮＡに対応するｃＤＮＡ配列を示す。
【００５７】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０のＲＮＡから翻訳されたＣＤ４０Ｌポリペプチドの配列を示し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸残基２１‐２６１に相当する。
【００５８】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２は、ＣＤ４０Ｌ ΔＸＥ＋ロタウイルス遺伝子６ ３′ＵＴＲプラスミドから転写されたＲＮＡに対応するｃＤＮＡ配列を示す。
【００５９】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３は、ＣＤ４０Ｌ ΔＸＥ‐ｍｅｔ１＋ロタウイルス遺伝子６ ３′ＵＴＲプラスミドから転写されたＲＮＡに対応するｃＤＮＡ配列を示す。
【００６０】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４は、ｐＡＲＧ ＣＤ４０Ｌ ＭＥＴ１の配列を示す。ＣＤ４０Ｌ ＭＥＴ１ ＲＮＡの＋１は、ヌクレオチド残基３５６６位である。ＣＤ４０Ｌ ＭＥＴ１転写物の３′末端はヌクレオチド残基４４８０位である。翻訳開始コドンはヌクレオチド残基３６６６‐３６６８位である。
【発明の具体的説明】
【００６１】
この開示の全体にわたり、様々な文献、特許、公開特許明細書が具体的に引用されている。これら文献、特許、公開特許明細書の開示は、本発明が関係する技術水準を更に詳細に説明するために、引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
【００６２】
本発明の実施に際しては、別記されない限り、当業界の技術内に属する、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の常用技術を用いる。このような技術は文献において詳細に説明されている。これらの方法は次の文献において記載されている。例えば、Sambrook et al.,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,2nd edition(1989)、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel et al.eds.(1987))、the series METHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press,Inc.)、PCR:A PRACTICAL APPROACH(M.MacPherson et al.,IRL Press at Oxford University Press(1991))、PCR 2:A PRACTICAL APPROACH(MacPherson,Hames and Taylor eds.(1995))、ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL(Harlow and Lane eds.(1988))、USING ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL(Harlow and Lane eds.(1999))、ANIMAL CELL CULTURE(Freshney ed.(1987))参照。
【００６３】
定義
明細書および請求項において用いられている単数形“ａ”、“ａｎ”、および“ｔｈｅ”は、内容が明らかにそれ以外のことを記載していない限り、複数形の言及も含んでいる。例えば、“ａ  ｃｅｌｌ”という用語は、その混合物を含めて、複数の細胞を含む。
【００６４】
ここで用いられている“含んでなる”という用語は、組成物および方法が列挙された要素を含むが、その他を除外しないことを意味する。“から本質的になる”とは、組成物および方法を定義するために用いられている場合に、組合せに必須の重要な他の要素を除外する意味である。そのため、ここで定義されているような要素から本質的になる組成物は、単離および精製法からの微量汚染物、並びに薬学上許容される担体、例えばリン酸緩衝液、保存剤などを除外しない。所定アミノ酸配列“から本質的になる”ポリペプチドまたはタンパク質は、タンパク質またはポリペプチドのアミノ末端およびカルボキシ末端の一方または双方に、３以下、好ましくは２以下、最も好ましくは１以下、またはゼロの追加アミノ酸を含有している、とここでは定義される。例えば、配列Ｘから本質的になるポリペプチドはＮＮＮＸＮＮＮ、ＮＮＮＸ、ＸＮ、Ｘなどを含むが、それらに限定されず、ここでＮは何らかのアミノ酸である。所定核酸“から本質的になる”核酸またはポリヌクレオチドは、核酸配列の５′末端および３′末端の一方または双方に、１０、９、８、７以下、好ましくは６、５、４以下、更に好ましくは３、２以下、最も好ましくは１以下またはゼロの追加ヌクレオチドを含有している、とここでは定義される。“からなる”とは、本発明の組成物を投与するために他の成分および実質的な方法ステップの微量以上の要素を除外する意味である。これら遷移用語の各々により定義される態様は本発明の範囲内に属する。
【００６５】
すべての数値表現、例えばｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量は、範囲を含めて、０．１の増加で（＋）または（−）に変化する概数である。常に明確に言及されているわけではないが、ここで記載された試薬は単なる例示にすぎず、そのような相当物も当業界で知られている、と理解すべきである。
【００６６】
“抗原”という用語は当業界においてよく理解されており、免疫原性である物質、即ち免疫原を含んでいる。抗原の使用が本発明で使用上考えられており、そのため自己抗原（正常または病気関連）、感染性抗原（例えば、微生物抗原、ウイルス抗原など）、または一部他の外来抗原（例えば、食品成分、花粉など）に限定されないが、それらを含むことは明らかであろう。“抗原”または代わりに“免疫原”という用語は二種以上の免疫原の集合にも該当し、そのため複数の免疫原に対する免疫応答が同時に調節されることがある。更に、該用語は免疫原または抗原の様々な異なる処方を含む。
【００６７】
“天然”、“自然”、または“野生型”抗原は、対象者において、ＭＨＣ／ペプチド複合体として提示された場合に抗原レセプターと、特にＴ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）と特異的に結合しうる、天然生物源から単離された、エピトープを含有するポリペプチド、タンパク質、または断片である。
【００６８】
“腫瘍関連抗原”または“ＴＡＡ”という用語は、癌と関連した抗原に関する。周知ＴＡＡの例としては、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ、およびＭＡＧＥがある。
【００６９】
“主要組織適合遺伝子複合体”または“ＭＨＣ”という用語は、Ｔ細胞への抗原提示および急激な移植片拒絶に必要な細胞表面分子をコードする遺伝子の複合体に関する。ヒトでは、ＭＨＣは“ヒト白血球抗原”または“ＨＬＡ”複合体としても知られている。ＭＨＣによりコードされたタンパク質は“ＭＨＣ分子”として知られ、クラスＩおよびクラスII ＭＨＣ分子に分類される。クラスＩ ＭＨＣ分子は、β２‐ミクログロブリンと非共有結合されたＭＨＣでコードされるα鎖から構成されている膜ヘテロダイマータンパク質を含有する。クラスＩ ＭＨＣ分子はほぼ全ての有核細胞において発現され、ＣＤ８＋Ｔ細胞への抗原提示で機能することが示されていた。クラスＩ分子には、ヒトの場合においてＨＬＡ‐Ａ、Ｂ、およびＣがある。クラスII ＭＨＣ分子も、非共有会合αおよびβ鎖からなる膜ヘテロダイマータンパク質を含有する。クラスII ＭＨＣ分子はＣＤ４＋Ｔ細胞において機能することが知られ、ヒトの場合においてはＨＬＡ‐ＤＰ、-ＤＱ、および-ＤＲがある。
【００７０】
“抗原提示細胞（ＡＰＣ）”という用語は、免疫系の特異的エフェクターＴ細胞により認識されうるペプチド‐ＭＨＣ複合体の形で一種以上の抗原を提示し、それにより提示された抗原に対して有効な細胞性免疫応答を誘導しうる細胞のクラスに関する。ＡＰＣとしては、未処理の全細胞、例えばマクロファージ、Ｂ細胞、内皮細胞、活性化Ｔ細胞、および樹状細胞、または天然もしくは合成の他の分子、例えばβ２‐ミクログロブリンと複合化された精製ＭＨＣクラスＩ分子がある。多くの種類の細胞がＴ細胞認識のためにそれらの細胞表面において抗原を提示しうるが、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答へナイーブＴ細胞を活性化させるために有効な量で抗原を提示しうる能力は樹状細胞のみが有する。
【００７１】
“樹状細胞（ＤＣ）”という用語は、様々なリンパ系および非リンパ系組織でみられる形態学的に類似した細胞種の多様な集団に関する（Steinman(1991)Ann.Rev.Immunol.,9:271-296）。樹状細胞は、生物において最強の好ましいＡＰＣを構成している。樹状細胞は単球およびＣＤ３４＋細胞から分化できるが、それらは異なる表現型を有する。例えば、具体的な分化マーカーＣＤ１４抗原は、樹状細胞において見られないが、単球において有する。しかも、成熟樹状細胞は食細胞でなく、一方単球は強い食作用細胞である。成熟ＤＣはＴ細胞活性化および増殖に必要な全シグナルを発せることが示されていた。
【００７２】
“免疫エフェクター細胞”という用語は、抗原と結合でき、免疫応答を媒介する細胞に関する。これらの細胞にはＴ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、ＮＫ細胞、および細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、例えばＣＴＬ系、ＣＴＬクローン、および腫瘍、炎症または他の浸潤物からのＣＴＬがあるが、それらに限定されない。
【００７３】
“ナイーブ”免疫エフェクター細胞とは、その細胞を活性化しうる抗原へ曝されたことがない免疫エフェクター細胞である。ナイーブ免疫エフェクター細胞の活性化には、増殖して抗原特異的武装化エフェクターＴ細胞へ分化するために、ペプチド：ＭＨＣ複合体の認識とプロフェッショナルＡＰＣによる補助刺激シグナルの同時輸送との双方を必要とする。
【００７４】
“免疫応答”とは、広義において、外来物質に対するリンパ球の抗原特異的応答に関する。免疫応答を誘起しうる物質は“免疫原性”であると言われ、“免疫原”と称される。すべての免疫原は抗原であるが、しかしながら全ての抗原が免疫原性というわけではない。本発明の免疫応答は体液性（抗体活性による）または細胞性（Ｔ細胞活性化による）である。
【００７５】
ここで用いられている“教育された抗原特異的免疫エフェクター細胞”という用語は、既に抗原と出会った、上記のような免疫エフェクター細胞である。そのナイーブ対応物とは対照的に、教育された抗原特異的免疫エフェクター細胞の活性化には補助刺激シグナルを必要としない。ペプチド：ＭＨＣ複合体の認識は十分である。
【００７６】
“活性化された”とは、Ｔ細胞に関して用いられている場合、細胞がもはやＧ０期になく、細胞毒素、サイトカイン、および細胞種に特徴的な他の関連膜結合タンパク質（例えば、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋）の一種以上を産生し始め、表面において特定のペプチド／ＭＨＣ複合体を示す標的細胞を認識してそれと結合し、そのエフェクター分子を放出しうることを意味する。
【００７７】
ここで用いられている“対象者において免疫応答を誘導する”という用語は当業界において理解されている用語であり、対象者へ抗原（またはエピトープ）の導入前における免疫応答（もしあれば）と比較して、対象者へ抗原（またはエピトープ）の導入後に検出または測定されうる抗原（またはエピトープ）に対する免疫応答について、少なくとも約２倍、または代わりに少なくとも約５倍、または代わりに少なくとも約１０倍、または代わりに少なくとも約１００倍、または代わりに少なくとも約５００倍、または代わりに少なくとも約１０００倍またはそれ以上の増加に関する。抗原（またはエピトープ）に対する免疫応答としては、抗原特異的（またはエピトープ特異的）抗体の産生、および抗原（またはエピトープ）と特異的に結合する分子を表面上で発現する免疫細胞の産生があるが、それらに限定されない。所定の抗原（またはエピトープ）に対する免疫応答が誘導されたかどうかを調べる方法は、当業界において周知である。例えば、抗原特異的抗体は、例えば固定抗原（またはエピトープ）へのサンプル中抗体の結合が検出可能標識第二抗体（例えば、酵素標識マウス抗ヒトＩｇ抗体）で検出されるＥＬＩＳＡに限定されないが、それを含めた当業界で公知の様々な免疫アッセイを用いて検出される。
【００７８】
“補助刺激分子”は、抗原提示細胞およびＴ細胞の表面において発現されるレセプターリガンドペア間の相互作用にかかわる。過去数年かけて蓄積された研究は、休止Ｔ細胞がサイトカイン遺伝子発現および増殖の誘導に少なくとも二つのシグナルを要することを、納得のいくように証明してきた（Schwartz,R.H.(1990)Science 248:1349-1356およびJenkins,M.K.(1992）Immunol.Today 13:69-73）。一つのシグナル、特異性を付与するものは、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体と適切なＭＨＣ／ペプチド複合体との相互作用により生じうる。第二のシグナルは抗原特異性でなく、“補助刺激”シグナルと称される。このシグナルは、マクロファージおよび樹状細胞、いわゆる“プロフェッショナル”ＡＰＣのような骨髄由来アクセサリー細胞により得られる活性として、当初定義された。いくつかの分子は補助刺激活性を高めることが示されていた。これらは、熱安定抗原（ＨＳＡ）（Liu et al.(1992)J.Exp.Med.175:437-445）、コンドロイチン硫酸修飾ＭＨＣインバリアント鎖（li-ＣＳ）（Naujokas,M.F.et al.(1993)Cell 74:257-268）、細胞内接着分子１（ＩＣＡＭ‐１）（Van Seventer,G.A.(1990)J.Immunol.144:4579-4586）、Ｂ７-１およびＢ７-２／Ｂ７０（Schwartz,R.H.(1992)Cell 71:1065-1068）である。これらの分子は各々、Ｔ細胞でそれらのコグネイトリガンドと相互作用することにより、補助刺激を助けるようである。補助刺激分子は、ナイーブＴ細胞の完全活性化を行うために、正常生理的条件下において、必要な補助刺激シグナルを媒介する。一つの例示レセプター‐リガンドペアは、ＡＰＣ５の表面における補助刺激分子のＢ７ファミリーと、Ｔ細胞におけるそのカウンターレセプターＣＤ２８またはＣＴＬＡ‐４である（Freeman et al.(1993)Science 262:909-911、Young et al.(1992)J.Clin.Invest.90:229、およびNabavi et al.(1992)Nature 360:266-268）。他の重要な補助刺激分子はＣＤ４０およ
びＣＤ５４である。“補助刺激分子”という用語は、Ｔ細胞の表面においてＴＣＲにより結合されたＭＨＣ／ペプチド複合体と一緒に作用する場合、該ペプチドと結合したＴ細胞の活性化を行う補助刺激効果を発揮する、単一分子または分子の組合せを包含している。該用語はそのため、ＭＨＣ複合体と一緒に、コグネイトリガンドと結合して、Ｔ細胞の表面にあるＴＣＲが該ペプチドと特異的に結合した場合にＴ細胞の活性化を生じる、Ｂ７、またはＡＰＣのような抗原提示マトリックス上における他の補助刺激分子、その断片（単独、他の分子と複合化される、または融合タンパク質の一部として）を包含している。常に明確に言及されているわけではないが、野生型または精製補助刺激分子と同様の生物活性を有する分子（例えば、その組換え産生または突然変異タンパク質）も本発明の精神および範囲内で用いられることが、意図されている。
【００７９】
ここで用いられている“サイトカイン”という用語は、細胞において様々な効果を発揮する、例えば成長または増殖を誘導する、多数の因子のいずれか一つに関する。本発明の実施に際して単独でまたは組合せで用いられるサイトカインの例は、限定されないが、インターロイキン‐２（ＩＬ‐２）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン‐３（ＩＬ‐３）、インターロイキン‐６（ＩＬ‐６）、インターロイキン‐１２（ＩＬ‐１２）、Ｇ‐ＣＳＦ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）、インターロイキン‐１アルファ（ＩＬ‐１α）、インターロイキン‐１Ｌ（ＩＬ‐１ｌ）、ＭＩＰ‐１１、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ｃ‐ｋｉｔリガンド、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、およびｆｌｔ３リガンドがある。本発明の一つの態様は、有効量のＩＬ‐１βおよび／またはＩＬ‐６が培地から除外される培養条件を含む。サイトカインは、例えばGenzyme（Framingham,ＭＡ）、Genentech（South San Francisco,ＣＡ）、Amgen（Thousand Oaks,ＣＡ）、R&D Systems（Minneapolis,ＭＮ）、およびImmunex（Seattle,ＷＡ）のように、いくつかのベンダーから市販されている。常に明確に言及されているわけではないが、野生型または精製サイトカインと同様の生物活性を有する分子（例えば、その組換え産生または突然変異タンパク質）も本発明の精神および範囲内において用いられることが、意図されている。
【００８０】
“ポリヌクレオチド”、“核酸”、および“核酸分子”という用語は、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマー形に言及するために、互換的に用いられる。ポリヌクレオチドにはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはそれらのアナログを含んでもよい。ヌクレオチドは何らかの三次元構造を有してもよく、既知または未知の何らかの機能を発揮してもよい。“ポリヌクレオチド”という用語は、例えば一本鎖、二本鎖、および三重らせん分子、遺伝子または遺伝子断片、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、何らかの配列の単離ＤＮＡ、何らかの配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーを含んでいる。天然核酸分子に加えて、本発明の核酸分子には修飾核酸分子も含んでもよい。ここで用いられているｍＲＮＡは、樹状細胞において翻訳されうるＲＮＡに関する。このようなｍＲＮＡは典型的にはキャップされ、リボソーム結合部位（Kozak配列）および翻訳開始コドンを有する。
【００８１】
“ペプチド”という用語は、二以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸アナログ、またはペプチドミメティックの化合物に関する、最広義の意味で用いられている。サブユニットはペプチド結合でつながれていてもよい。他の態様において、サブユニットは他の結合、例えばエステル、エーテルなどでつながれてもよい。ここで用いられている“アミノ酸”という用語は、グリシンと両Ｄ‐およびＬ‐光学異性体、アミノ酸アナログおよびペプチドミメティックを含めた、天然および／または非天然または合成アミノ酸に関する。アミノ酸三個以上のペプチドは、そのペプチド鎖が短ければ、オリゴペプチドと通称されている。ペプチド鎖が長ければ、ペプチドはポリペプチドまたはタンパク質と通称されている。
【００８２】
“遺伝子修飾された”という用語は、細胞またはその子孫の遺伝子型または表現型を変えることになる、外来遺伝子または核酸配列を含有および／または発現することを意味している。換言すると、それは細胞の内在ヌクレオチドに対する何らかの付加、欠失、または分断に関する。
【００８３】
ここで用いられている“発現”とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写され、ｍＲＮＡがペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳される工程に関する。ポリヌクレオチドが適切な真核細胞宿主のゲノムＤＮＡから誘導されたものであれば、発現にはｍＲＮＡのスプライシングを含んでもよい。発現に必要な調節要素には、リボソーム結合のためにＲＮＡポリメラーゼと転写開始配列を結合させるプロモーター配列を含む。例えば、細菌発現ベクターは、プロモーター、例えばｌａｃプロモーター、転写開始用にはShine-Dalgarno配列、および開始コドンＡＵＧを含む（Sambrook et al.(1989)前掲）。同様に、真核細胞発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼII用の異種または同種プロモーター、下流ポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧ、およびリボソーム解離用の終止コドンを含む。このようなベクターは商業的に得られるか、または当業界で知られている方法、例えば一般的にベクターを構築する下記方法において記載された順序により組み立てられる。
【００８４】
“転写コントロール下”は当業界において理解されている用語であり、ポリヌクレオチド配列、通常ＤＮＡ配列の転写が、転写の開始に寄与する、またはそれを促進する要素へそれが作動的に結合されているか否かに依存することを示す。“作動的に結合される”とは、各要素がそれらを機能させうる位置関係にあるような配置に関する。
【００８５】
“遺伝子輸送ビヒクル”とは、挿入されるポリヌクレオチドを宿主細胞へ運べる分子として定義される。遺伝子輸送ビヒクルの例は、リポソーム、生体適合性ポリマー、例えば天然ポリマーおよび合成ポリマー、リポタンパク質、ポリペプチド、多糖、リポ多糖、人工ウイルスエンベロープ、金属粒子、細菌またはウイルス、例えばバキュロウイルス、アデノウイルスおよびレトロウイルス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクターと、様々な真核および原核宿主で発現に関して記載されてきた、遺伝子療法と簡単なタンパク質発現に用いられる、当業界において典型的に用いられてもよい他の組換えビヒクルである。
【００８６】
ここで用いられている“遺伝子輸送”、“遺伝子トランスファー”、“トランスフェクション”などは、導入に用いられる方法とかかわりのない、宿主細胞への外来ポリヌクレオチドの導入に関する用語である。トランスフェクションは細胞の内部への核酸の輸送に関する。遺伝子輸送は、宿主細胞のゲノムへ組み込まれる、または宿主細胞ゲノムとは別に複製してもよい、核酸の輸送に関する。遺伝子輸送または遺伝子トランスファーは細胞へのｍＲＮＡの導入に関するものではない。トランスフェクション法は、エレクトロポレーション、タンパク質ベース、脂質ベースおよび陽イオンベース核酸輸送複合体、ウイルスベクター、“遺伝子銃”輸送のような様々な技術、および当業者に知られている様々な他の技術を含む。導入されたポリヌクレオチドは宿主細胞で安定的に維持されるか、または一過性で発現されてもよい。好ましい態様では、ｍＲＮＡがＤＣへ導入されて、一過性で発現される。安定的な維持のためには、典型的には、導入ポリヌクレオチドが宿主細胞と適合する複製起点を含むか、あるいは宿主細胞のレプリコン、例えば染色体外レプリコン（例えば、プラスミド）または核もしくはミトコンドリア染色体へ組み込まれることを必要とする。いくつかのベクターは、当業界で知られ、ここで記載されているように、哺乳動物細胞への遺伝子のトランスファーを媒介しうる。
【００８７】
“ウイルスベクター”は、インビボ、エクスビボ、またはインビトロにおいて宿主細胞へ輸送されるポリヌクレオチドを含んでなる、組換え産生ウイルスまたはウイルス粒子として定義される。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスベクターなどがある。アルファウイルスベクター、例えばセムリキ森林(Semliki Forest)ウイルスベースベクターおよびシンドビス(Sindbis)ウイルスベースベクターも、遺伝子療法および免疫療法において使用するのために開発されてきた。Schlesinger and Dubensky(1999)Curr.Opin.Biotechnol.5:434-439およびZaks et al.(1999)Nat.Med.7:823-827参照。遺伝子トランスファーがレトロウイルスベクターで媒介される局面において、ベクター構築物はレトロウイルスゲノムまたはその一部と、治療遺伝子とを含んでなるポリヌクレオチドに関する。ここで用いられている“レトロウイルス媒介遺伝子トランスファー”または“レトロウイルス形質導入”という用語は同様の意味を有し、細胞へ入り、そのゲノムを宿主細胞ゲノムへ組み込むウイルスによって遺伝子または核酸配列が宿主細胞へ安定的に移される工程に関する。ウイルスはその通常の感染メカニズムにより宿主細胞へ入り込めるか、またはそれが異なる宿主細胞表面レセプターまたはリガンドと結合して細胞へ入り込めるように修飾される。ここで用いられている“レトロウイルスベクター”とは、ウイルスまたはウイルス様エントリーメカニズムにより外来核酸を細胞へ導入しうるウイルス粒子に関する。
【００８８】
レトロウイルスはＲＮＡの形態によりそれらの遺伝情報を伝える、しかしながら、ウイルスが細胞に感染すると、そのＲＮＡはＤＮＡ形へ逆転写されて、それが感染細胞のゲノムＤＮＡへ組み込まれる。組込みＤＮＡ形はプロウイルスと称される。
【００８９】
遺伝子トランスファーが、アデノウイルス（Ａｄ）、偽アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のようなＤＮＡウイルスベクターにより媒介される局面において、ベクター構築物はウイルスゲノムまたはその部分およびトランスジーンを含んでなるポリヌクレオチドに関する。アデノウイルス（Ａｄ）は、５０種以上の血清型を含む、ウイルスの比較的詳しく特徴づけられた均一な群である（例えば、ＷＯ９５／２７０７１号参照）。Ａｄは成長しやすく、宿主細胞ゲノムへの組み込みを必要としない。組換えＡｄ由来ベクター、特に野生型ウイルスの組換えおよび生成の可能性を減らしたものも構築されていた（ＷＯ９５／００６５５号およびＷＯ９５／１１９８４号参照）。野生型ＡＡＶは、宿主細胞ゲノムへ組み込まれる高い感染力および特異性を有している（Hermonat and Muzyczka(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6466-6470およびLebkowski et al.(1988)Mol.Cell.Biol.8:3988-3996参照）。
【００９０】
ポリヌクレオチドが作動的に結合されるプロモーターおよびクローニング部位を双方とも含有するベクターが当業界において知られている。このようなベクターはインビトロまたはインビボでＲＮＡを転写でき、Stratagene（La Jolla,ＣＡ）およびPromega Biotech（Madison,ＷＩ）のような供給元から市販されている。発現および／またはインビトロ転写を最適化するためには、クローンの５′および／または３′非翻訳部分を除去、付加、または変更して、転写または翻訳のレベルで発現を妨げるまたは減少させる可能性のある余分で不適切な代替の翻訳開始コドンまたは他の配列を除くことが必要かもしれない。一方、コンセンサスリボソーム結合部位も発現を高めるために開始コドンのすぐ５′側に挿入できる。
【００９１】
遺伝子輸送ビヒクルには、ＤＮＡ／リポソーム複合体および標的化ウイルスタンパク質‐ＤＮＡ複合体を含めた、数種の非ウイルスベクターも含む。標的化抗体またはその断片も含んでなるリポソームが本発明の方法において用いうる。細胞への輸送を高めるために、本発明の核酸またはタンパク質は細胞表面抗原、例えばＴＣＲ、ＣＤ３、またはＣＤ４と結合する抗体またはその結合断片へ接合させてもよい。
【００９２】
“ハイブリッド形成”は、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合により安定化された複合体を形成するように一以上のポリヌクレオチドが反応する反応に関する。水素結合はワトソン‐クリック塩基対合、ホーグスタイン結合により、またはいずれか他の配列特異的様式により生じてもよい。複合体は、二重らせん構造を形成する二本の鎖、マルチ鎖複合体を形成する三本以上の鎖、一本の自己ハイブリッド形成鎖またはこれらいずれかの組合せを含んでもよい。ハイブリッド形成反応は、より広範な工程における一つの工程、例えばＰＣＲ反応の開始またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的開裂を構成する。
【００９３】
ストリンジェントハイブリッド形成条件は次の通りである：対象の核酸を含有したフィルターのプレハイブリッド形成が、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０２％ Ficoll、０．０２％ＢＳＡ、および５００μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡから構成される緩衝液中、６５℃において８時間〜一晩かけて行われる。フィルターは、１００μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡおよび５〜２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ標識プローブを含有するプレハイブリッド形成混合液中、好ましいハイブリッド形成温度６５℃において、４８時間ハイブリッド形成される。その後で、フィルター洗浄が２×ＳＳＣ、０．０１％ Ficollおよび０．０１％ＢＳＡを含有する溶液中３７℃において１時間行われ、次いで５０℃において４５分間０．１×ＳＳＣで洗浄される。洗浄工程後、ハイブリッド形成プローブがオートラジオグラフィーにより検出される。このような方法は当業界で周知であり、Sambrook et al.,1989およびAusubel et al.,1989において挙げられている。
【００９４】
“配列同一性”という用語は、二つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列が比較ウインド(comparison window)で（即ち、ヌクレオチド対ヌクレオチドまたは残基対残基ベースで）同一であることを意味する。用語“配列同一性のパーセンテージ”（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％超）は、比較のウインドで二つの最適に整列された配列を比較し、同一の核酸塩基（例えばＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、またはＩ）または残基が両配列で生じる位置の数を求めて、合致位置の数を算出し、合致位置の数を比較ウインドにおける位置の総数（即ち、ウインドサイズ）で割り、結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを出すことにより計算される。最適なアライメント後、少なくとも２１の連続ヌクレオチドまたは７連続アミノ酸の比較ウインドで、多くは、少なくとも１５０の連続ヌクレオチドまたは５０連続アミノ酸の比較ウインドで配列がリファレンス配列と比較され、その際に比較ウインドでリファレンス配列の２０％以下に及ぶ欠失または付加を含む配列とリファレンス配列を比較することにより配列同一性のパーセンテージが計算される。
【００９５】
比較のための配列のアライメント法は当業界において周知である。比較ウインドを整列させるために最適の配列のアライメントは、Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)のローカルホモロジーアルゴリズム、Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)のホモロジーアライメントアルゴリズム、Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85,2444(1988)の類似度法のサーチ、これらアルゴリズム（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ（Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,Wis.）、GeneworkまたはMacVectorソフトウェアパッケージ）のコンピューター実装、またはマニュアルアライメントおよび視覚検査（例えば、Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel et al.,eds.1995 supplement)参照）により行われ、様々な方法で作られた最良アライメント（即ち、比較ウインドでホモロジーの最高パーセンテージを示す）が選択される。相同性または配列同一性のパーセントは、好ましくは、Altschul et al.,Nuc.Acids Res.25:3389-3402(1977)およびAltschul et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)において各々記載されている、周知ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムおよびデフォルトパラメーターを用いて求められる。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）においては、デフォルトとして、１１のwordlength（Ｗ）、１０のexpectation（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のwordlengthおよび１０のexpectation（Ｅ）と、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Henikoff & Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989)参照）、５０のalignment（Ｂ）、１０のexpectation（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較を用いる。これらプログラムおよびソフトウェアの詳細は、以下のワールドワイドウェブアドレスにおいて見られるNational Center for Biotechnology Informationから得られる：
ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST
【００９６】
“単離された”という用語は、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片が自然状態で通常会合している、細胞およびその他における諸成分から分離されることを意味する。例えば、ポリヌクレオチドに関して、単離されたポリヌクレオチドとは、それが染色体で通常会合している５′および３′配列から分離されたものをいう。当業者に明らかなように、非天然ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片は、それをその天然対応物から区別する上で“単離”を必要としない。加えて、“濃縮された”、“分離された”、または“希釈された”ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片は、容積当たり分子の濃度または数がその天然対応物の場合より“濃縮されている”または“分離されて”いないという点において、その天然対応物から区別しうる。その一次配列でまたは例えばそのグリコシル化パターンで天然対応物とは異なるポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片はその単離形で存在する必要がなく、なぜならそれはその一次配列でまたは他の特性、例えばそのグリコシル化パターンでその天然対応物から区別しうるからである。ここで開示されている発明の各々については断言できないが、以下でおよび適切な条件下で開示されている組成物の各々に関する上記態様のすべてが本発明により提供されている、と理解すべきである。そのため、非天然ポリヌクレオチドは単離天然ポリヌクレオチドとは別の態様として提供される。細菌細胞において産生されるタンパク質は、自然に産生されている真核細胞から単離された天然タンパク質とは別の態様として提供される。哺乳動物細胞、例えば樹状細胞は、それが生物でみられる解剖学的部位から除去されていれば、単離されている。
【００９７】
“宿主細胞”、“標的細胞”、または“レシピエント細胞”とは、外来核酸分子、ポリヌクレオチド、および／またはタンパク質の取込みのためのベクターのレシピエントであるまたはあった、個別の細胞または細胞培養物を含めた意味である。それは単一細胞の子孫も含めた意味であり、子孫は自然的、偶発的、または意図的突然変異により元々の親細胞とは必ずしも（形態的にまたはゲノムもしくは全ＤＮＡ相補性において）完全に同一でなくてよい。細胞は原核でもまたは真核でもよく、細菌細胞、酵母細胞、動物細胞、および哺乳動物細胞、例えばネズミ、ラット、サル、またはヒト細胞を含むが、それらに限定されない。
【００９８】
“対象者”は脊椎動物、好ましくは哺乳動物、更に好ましくはヒトである。哺乳動物には、ネズミ、サル、ヒト、家畜、スポーツアニマル、およびペットがあるが、それらに限定されない。
【００９９】
“コントロール”は比較目的のために実験で用いられる別の対象者またはサンプルである。コントロールは、“陽性”でもまたは“陰性”でもよい。例えば、実験の目的が免疫応答と具体的培養条件との相関性を調べることである場合、陽性コントロールおよび陰性コントロールを用いることが通常好ましい。
【０１００】
“癌”とは、癌細胞が細胞増殖制御の有意な喪失で特徴づけられる異常成長表現型を示すように、比較的自律した成長を示す細胞の異常な存在を意味する。癌性細胞は良性でもまたは悪性でもよい。様々な態様において、癌は膀胱、血液、脳、乳房、結腸、消化管、肺臓、卵巣、膵臓、前立腺、または皮膚の細胞に罹患する。癌細胞の定義には、ここで用いられているように、一次癌細胞のみならず、癌細胞原種に由来する細胞も含む。これには転移癌細胞と、癌細胞に由来するインビトロ培養物および細胞系を含む。癌には、固形腫瘍、液体腫瘍、血液悪性疾患、腎臓細胞癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌、精巣癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮頸癌、胃癌、食道癌、膵臓癌、肺癌、神経芽腫、神経膠芽腫、網膜芽腫、白血病（慢性リンパ性白血病を含む）、骨髄腫、リンパ腫、肝癌、腺腫、肉腫、癌腫、芽腫などがあるが、それらに限定されない。固形腫瘍として通常現れる癌の種類に言及する場合、“臨床的に検出しうる”腫瘍とは、例えばＣＡＴスキャン、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）、Ｘ線、超音波、または触診のような手法により、腫瘍マスに基づき検出しうるものである。生化学または免疫学的所見だけでは、この定義を満たす上で不十分かもしれない。
【０１０１】
“培養”という用語は、適切な培地における細胞のインビトロ維持、分化、および／または増殖に関する。“富化”とは、生物に存在する組織でみられるより、全細胞の多くの割合で存在する細胞を組成物が含んでなることを意味する。例えば、本発明の方法により得られるＣＤ８３＋ＣＣＲ７−ＤＣおよびＣＤ８３＋ＣＣＲ７＋ＤＣの富化培養物および調製物は、それらが生物で存在する組織中のそれらの割合と比較して、全細胞の高い割合で存在する（例えば、血液、皮膚、リンパ節など）。
【０１０２】
“組成物”とは、活性剤と、不活性（例えば、検出可能剤またはラベル）または活性（例えば、アジュバント）な他の化合物もしくは組成物との組合せを包含した意味である。
【０１０３】
“医薬組成物”とは、活性剤と、インビトロ、インビボ、またはエクスビボにおいて診断または治療用に組成物を適したものにする、不活性または活性な担体との組合せを包含した意味である。
【０１０４】
ここで用いられている“薬学上許容される担体”という用語は、あらゆる標準製薬担体、例えばリン酸緩衝液、水、およびエマルジョン、例えば油／水または水／油型エマルジョン、および様々な種類の湿潤剤を包含している。組成物は安定剤および保存剤も含有しうる。担体、安定剤、およびアジュバントの例に関しては、Martin REMINGTON’S PHARM.SCI.,18th Ed.(Mack Publ.Co.,Easton(1990))参照。
【０１０５】
“有効量”は、有益なまたは望ましい結果、例えば高い免疫応答、治療、予防、または病状（疾患、感染など）の改善を得るために十分な量である。有効量が一回以上の投与、塗布、または投薬により投与される。適切な投薬量は、体重、年齢、健康、治療される疾患または状態および投与経路に応じて様々である。
【０１０６】
ここで用いられている“シグナリング”とは、未成熟または成熟樹状細胞をＩＦＮ‐γレセプターアゴニスト、ＴＮＦ‐γレセプターアゴニスト、ＣＤ４０Ｌポリペプチド、または他のＣＤ４０アゴニストと接触させることを意味する。一つの態様において、このようなアゴニストは外部から（例えば、細胞培地に）供される。他の態様において、ポリペプチドアゴニストは、該ポリペプチドをコードする核酸で未成熟または成熟樹状細胞のトランスフェクションにより供される。一方、核酸アプタマーアゴニストは培地でまたはトランスフェクションにより供される。ポリペプチドをコードする核酸により樹状細胞をトランスフェクトすることによりポリペプチドが供される場合、核酸でトランスフェクト時よりもむしろポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳時にシグナリングが行われる。一つの態様において、本発明はインビボおよび／またはインビトロにおいて強い免疫刺激応答を誘導する成熟樹状細胞(ＤＣ)の富化集団を作製するための方法を提供する。ここで用いられている“成熟樹状細胞”という用語は、未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）と比較して、補助刺激分子ＣＤ８３の高い細胞表面発現を呈する樹状細胞を意味する。本発明の成熟ＤＣにはＣＤ８３＋ＣＣＲ７−ＤＣおよびＣＤ８３＋ＣＣＲ７＋ＤＣ双方を含む。第二シグナルＣＤ４０アゴニストは、未成熟ＣＤ８３−ＣＣＲ７−ＤＣまたはＣＤ８３＋ＣＣＲ７−成熟ＤＣに供される。
【０１０７】
文献（Schaft 2005，Bonehill 2004）は、抗原コードＲＮＡでＤＣの成熟化後エレクトロポレーションが、免疫応答を惹起させる効力の大きいＤＣを生じたことを示唆している。こうして、ＣＤ８３＋ＣＣＲ７−成熟ＤＣ（表現型成熟化後）へのＣＤ４０Ｌシグナリングのタイミングを変えることにより、‘ＣＤ４０Ｌベース工程’（ＣＤ８３−ｉＤＣの順次的なＩＦＮ‐γシグナリングに続くＣＤ４０Ｌシグナリング）を変える方法が開発された。この態様では、最初に‘炎症媒介物質’ＩＦＮ‐γおよびＴＮＦ‐α、および場合によりＰＧＥ２を培地へ加え、次いで約１２〜３０時間（好ましくは約１８時間）後にＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡおよび場合により抗原コードｍＲＮＡでエレクトロポレートすることにより、ＤＣが表現型で成熟化された。この新規工程は、ＣＤ８３＋ＣＣＲ７＋成熟ＤＣを産生するためのＣＤ４０ＬにおけるPost Maturation Electroporationの略記、‘ＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ’と命名された。エレクトロポレーション後に回収されてワクチンとして処方された細胞が、インビトロアッセイにおいて最大免疫力を媒介することが示された（実施例参照）。一つの態様において、細胞はエレクトロポレーション後、約５分間〜３日間、エレクトロポレーション後約２〜６時間、またはエレクトロポレーション後約４時間でワクチンに処方される。ＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ工程により作製された樹状細胞は従来の樹状細胞と表現型で異なる。例えば、ＤＣを作製するＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ工程は長期抗原特異的ＣＴＬエフェクター機能をサポートすることができ、しかも全重要事象において拡大し、サイトカインを産生し、標的細胞を殺して、頑強な長期ＣＴＬエフェクター機能を媒介しうる能力を留めたエフェクターメモリーＣＴＬの好ましい表現型を誘導することができる。このように、一つの態様において、本発明は抗原特異的Ｔ細胞の集団からＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＡ―メモリー／エフェクターＴ細胞の集団を優先的に誘導する樹状細胞を提供する。抗原特異的Ｔ細胞はナイーブＴ細胞でもまたは抗原経験Ｔ細胞でもよい。エフェクター／メモリーＴ細胞はＩＦＮ‐γ、ＩＬ‐２を産生し、標的細胞を殺す。エフェクターＴ細胞はＩＦＮ‐γを産生し、標的細胞を殺せるが、ＩＬ‐２は産生しない。メモリーＴ細胞はＩＦＮ‐γおよびＩＬ‐２を産生するが、標的細胞は殺さない。
【０１０８】
更なる増強として、エフェクター細胞のこの集団を免疫応答へリクルートするように、ＮＫＴ細胞のための活性化リガンド、即ちα‐ガラクトシルセラミドによりＤＣがパルスされる。ＮＫＴ細胞はＴヘルパーおよびＴ細胞傷害性細胞双方の側面を呈する：ＮＫＴ細胞はＩＦＮ‐γを分泌し、ＣＤ４０Ｌを呈し、グランザイムＢを分泌でき、後者は標的細胞でアポトーシスを誘導する。このように、ＮＫＴ細胞リクルートは追加ＮＫＴ細胞 ＣＤ４０Ｌ／ＤＣ‐ＣＤ４０相互作用によりＤＣ機能の増強に至るか、あるいはヘルパーサイトカインを分泌するおよび／または標的細胞において直接溶解効果に寄与することにより細胞性免疫応答を増幅させる。
【０１０９】
ｉＤＣへ第一シグナル（ＩＦＮ‐γレセプターアゴニストおよび／またはＴＮＦ‐αレセプターアゴニスト）およびＣＤ８３−ＣＣＲ７−ｉＤＣまたはＣＤ８３＋ＣＣＲ７−成熟ＤＣへ第二シグナル（ＣＤ４０アゴニスト）で順次シグナリング後、得られたＤＣはｉ）補助刺激分子ＣＤ８０、ＣＤ８３、およびＣＤ８６の高い細胞表面発現を示し、ii）ＣＣＲ７＋であり、(iii)ＩＬ‐１２ｐ７０ポリペプチドまたはタンパク質を分泌し、および／または有意な低レベル（例えば、０〜５００ｐｇ／ＤＣ百万個）のＩＬ‐１０を分泌する。好ましい態様において、本発明の成熟ＣＤ８３＋ＣＣＲ７＋ＤＣは少なくとも１０００ｐｇ ＩＬ‐１２／１０６ＤＣ、好ましくは少なくとも２０００、３０００、４０００、５０００、または６０００ｐｇ ＩＬ‐１２／１０６ＤＣ、更に好ましくは少なくとも７０００、８０００、９０００、または１０，０００ｐｇ ＩＬ‐１２／１０６ＤＣ、最も好ましくは少なくとも１２，０００、１５，０００、１７，０００、または２０，０００ｐｇ ＩＬ‐１２／１０６ＤＣを産生する。ＩＬ‐１０およびＩＬ‐１２レベルは、未成熟ＤＣからＤＣ成熟化の誘導後３６時間以内に集められた培養上澄のＥＬＩＳＡにより調べられる。Wierda et al.(2000)Blood 96:2917．Ajdary et al.(2000)Infection and Immunity 68:1760
【０１１０】
未成熟ＤＣはＤＣ前駆細胞を含有する適切な組織源から単離または調製され、未成熟ＤＣを産生するためにインビトロにおいて分化される。例えば、適切な組織源は骨髄細胞、末梢血始原細胞（ＰＢＰＣ）、末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）、および臍帯血細胞の一種以上である。好ましくは、組織源は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である。組織源は新鮮なものでもまたは凍結されたものでもよい。他の態様において、細胞または組織源は、対象の細胞から容易に分離されることになる、非幹または始原細胞の成長および分化を促す有効量の成長因子で前処理される。これらの方法は当業界において知られており、Romani et al.(1994)Exp.Med.180:83およびCaux,C.et al.(1996)Exp.Med.184:695において簡単に記載されている。一つの態様において、未成熟ＤＣが末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離される。好ましい態様において、ＰＢＭＣはインターロイキン４（ＩＬ‐４）および／またはＩＬ‐１３の存在または非存在下において有効量の顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）により処理され、こうしてＰＢＭＣが未成熟ＤＣへ分化する。最も好ましくは、未成熟ＤＣを産生するために、ＰＢＭＣがＧＭ‐ＣＳＦおよびＩＬ‐４の存在下で約４〜７日間、好ましくは約５〜６日間培養される。好ましい態様では、第一シグナルが４、５、６、または７日目、最も好ましくは５または６日目に与えられる。加えて、ＧＭ‐ＣＳＦ並びにＩＬ‐４および／またはＩＬ‐１３が第一および／または第二シグナリングの時点で培地に存在してもよい。
【０１１１】
ヒトを含めた動物で樹状前駆細胞の数を増加させるために、造血を刺激する物質で対象者を前処理しうる。このような物質としてはＧ‐ＣＳＦおよびＧＭ‐ＣＳＦがあるが、それらに限定されない。投与される造血因子の量は、該因子が投与されている個体の細胞差を測定することで、当業者により求められる。典型的には、Ｇ‐ＣＳＦおよびＧＭ‐ＣＳＦのような因子の用量は、細胞傷害剤での処理から回復するよう個体を処理するために用いられる用量と類似している。例として、ＧＭ‐ＣＳＦまたはＧ‐ＣＳＦは、樹状細胞前駆体の割合を増やすために、源組織の除去前に標準用量で４〜７日間投与される。米国特許第６，４７５，４８３号は、５〜１３日間にわたる１日３００μｇのＧ‐ＣＳＦの用量と４〜１９日間にわたる１日４００μｇのＧＭ‐ＣＳＦの用量が樹状細胞の有意な収量につながること開示している。
【０１１２】
本発明の方法は、強い免疫刺激剤である成熟ＣＤ８３＋ＣＣＲ７＋樹状細胞の富化集団を産生する。具体的には、本発明は：（ａ）ＩＦＮ‐γＲアゴニストシグナル化樹状細胞を産生するためにインターフェロンガンマレセプター（ＩＦＮ‐γＲ）アゴニストおよび場合によりＴＮＦ‐αＲアゴニストを含んでなる第一シグナルで単離未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）をシグナリングし、そして（ｂ）ＣＣＲ７＋成熟樹状細胞を産生するために有効量のＣＤ４０アゴニストを含んでなる第二の一過性シグナルで該ＩＦＮ‐γＲアゴニストシグナル化樹状細胞をシグナリングする連続工程を含んでなる、成熟樹状細胞（ＤＣ）を作製するための方法を提供する。本発明はＣＤ８３＋ＣＣＲ７−成熟ＤＣおよびＣＤ８３＋ＣＣＲ７＋成熟ＤＣを更に提供する。好ましい態様において、本発明のＣＤ８３＋ＣＣＲ７＋成熟ＤＣおよび／またはＣＤ８３＋ＣＣＲ７−成熟ＤＣはＣＤ４０Ｌポリペプチドを一過性により発現する。好ましくは、ＣＤ４０Ｌは細胞表面よりもむしろ細胞内で主に局在する。最も好ましくは、ＣＤ４０Ｌポリペプチドの少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％は細胞内に局在する。
【０１１３】
別な態様において、未成熟樹状細胞は有効量のＴＮＦ‐αレセプターアゴニストでシグナリングされ、次いでＣＤ４０アゴニストでシグナリングされる。このように、本発明は、腫瘍壊死因子アルファレセプター（ＴＮＦ‐αＲ）アゴニストを含んでなる第一シグナルに続きＣＤ４０アゴニストを含んでなる第二シグナルで単離未成熟樹状細胞を順次シグナリングすることを含んでなり、該シグナリングが有効量のＩＬ‐１βおよび／またはＩＬ‐６の非存在下におけるものである、成熟樹状細胞（ＤＣ）を作製するための方法を提供する。
【０１１４】
どちらの態様（第一シグナルとしてＩＦＮ‐γＲアゴニストまたはＴＮＦ‐αＲアゴニスト）でも、第二ＣＤ４０アゴニストシグナルがＣＤ８３−ＣＣＲ７−ｉＤＣまたはＣＤ８３＋ＣＣＲ７−成熟ＤＣへ与えられる。好ましい態様においては、未成熟ＤＣおよび／または成熟ＤＣがＰＧＥ２と接触させられる。好ましくは、細胞が第一シグナル（ＩＦＮ‐γＲアゴニストまたはＴＮＦ‐αＲアゴニスト）を受けるのとほぼ同時に、それらはＰＧＥ２と接触させられる。好ましい態様では、樹状細胞が第一および第二シグナルを受ける場合、ＧＭ‐ＣＳＦと、ＩＬ‐４またはＩＬ‐１３の少なくとも一方とが培地に存在する。別の態様において、本方法では、ＣＤ１ｄ拘束性ＮＫＴ細胞を活性化することで自然および養子免疫を高められるＮＫＴ細胞リガンドと、未成熟樹状細胞、シグナル化樹状細胞および／またはＣＣＲ７＋樹状細胞を更に接触させることを含む。好ましい態様において、ＮＫＴ細胞リガンドはα‐ガラクトシルセラミド、α‐グルコシルセラミド、α‐６‐デオキシガラクトシルセラミド、α‐６‐デオキシガラクトフラノシルセラミド、β‐６‐デオキシガラクトフラノシルセラミド、β‐アラビノシルセラミド、α‐Ｃ‐ガラクトシルセラミド、およびα‐Ｓ‐ガラクトシルセラミドからなる群より選択される化合物である。好ましい化合物は、ＫＲＮ７０００として知られるα‐ガラクトシルセラミド（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）‐１‐Ｏ‐（α‐Ｄ‐ガラクトピラノシル）‐２‐（Ｎ‐ヘキサコサノイルアミノ）‐１，３，４‐オクタデカントリオール）である。
【０１１５】
日本国特許第３０６８９１０号において開示されたアゲラスフィン類は、α‐ガラクトシルセラミド（α‐ＧａｌＣｅｒ）構造と免疫刺激および抗腫瘍活性を有する、海綿において最初に発見された化合物のクラスである。ＫＲＮ７０００は米国特許第５，７６７，０９２号において開示されたアゲラスフィン類の強力な合成アナログであり、そこでの内容は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。アゲラスフィン類の追加の有用なアナログが米国特許第５，９３６，０７６号において開示され、その内容は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。ＫＲＮ７０００の構造は以下で示される：
【化１】
0005425618.tif 000003
【０１１６】
ＫＲＮ７０００のグリコシルセラミドアナログ（例えば、α‐ガラクトシルセラミド、α‐グルコシルセラミド、α‐６‐デオキシガラクトシルセラミド、α‐６‐デオキシガラクトフラノシルセラミド、β‐６‐デオキシガラクトフラノシルセラミド、β‐アラビノシルセラミド）が米国特許第５，８４９，７１６号において開示され、その内容は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。米国特許第５，７８０，４４１は、その内容が参考のために組み込まれるが、ＫＲＮ７０００のオリゴ糖（二、三、四、五）誘導体について開示している。ＫＲＮ７０００抗原負荷ＤＣを産生して、ヒトＮＫＴ細胞を活性化するためにＫＲＮ７０００および関連アナログを用いる方法が、米国特許第０９／７２１，７６８号および米国特許第６，５３１，４５３号において開示されており、各々の内容は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
【０１１７】
米国特許第５，９３６，０７６号は、その内容は引用することにより本明細書の開示の一部とされるが、下記式で表されるα‐ガラクトシルセラミド化合物について開示している：
【化２】
0005425618.tif 000004
上記式中、脂肪酸鎖Ｒは以下を表し：
【化３】
0005425618.tif 000005
（Ｒ２はＨまたはＯＨを表し、Ｘは０〜２６の整数を表す）、またはＲは‐（ＣＨ２）７ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３を表し、Ｒ１は下記（ａ）〜（ｅ）において規定される置換基のいずれか一つを表す：
（ａ）‐ＣＨ２（ＣＨ２）ＹＣＨ３
（ｂ）‐ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）ＹＣＨ３
（ｃ）‐ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）ＹＣＨ（ＣＨ３）２
（ｄ）‐ＣＨ＝ＣＨ（ＣＨ２）ＹＣＨ
（ｅ）‐ＣＨ（ＯＨ）（ＣＨ２）ＹＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＨ３
Ｙは５〜１７の整数を表す。
【０１１８】
内容は引用することにより本明細書の開示の一部とされるＷＯ０３／１０５７６９号、米国特許第２００４／０１２７４２９号と、Shimieg J.et al.(2003)J.Exp.Med.198:1631-1641は、α‐グリコシルセラミド、例えばα‐ガラクトシルセラミドおよびα‐グルコシルセラミドのグリコシド結合における酸素原子が炭素原子で置き換えられた、α‐Ｃ‐糖脂質の構造について開示している。代表的化合物の構造が以下で示される。
【化４】
0005425618.tif 000006
【０１１９】
ＷＯ０３／０１６３２６号は、その内容は引用することにより本明細書の開示の一部とされるが、下記構造を有する“Ｃ４”または“ＯＣＨ”のような、トランケート化セラミドのＫＲＮ７０００アナログについて開示している：
【化５】
0005425618.tif 000007
【０１２０】
米国特許第６，６３５，６２２号は、その内容は引用することにより本明細書の開示の一部とされるが、ガラクトシルセラミドのグリコシド結合における酸素原子が‐（ＣＨ２）ａ‐ＣＨ＝ＣＨ‐（ＣＨ２）ａ′‐、‐（ＣＨ２）ａ‐Ｓ（Ｏ）０‐２‐ＣＨ２‐、または‐ＮＨＣＨ２‐(ａおよびａ′は各々０〜５の整数を示し、ａ＋ａ′は５以下である)で置き換えられた、α‐Ｃ‐、Ｎ、またはＳ‐糖脂質について開示している。
【０１２１】
好ましい態様において、ＩＦＮ‐γＲアゴニストはＩＦＮγまたはその生物活性断片である。好ましくはＩＦＮγは哺乳動物ＩＦＮγ、最も好ましくはヒトＩＦＮγである。ヒトＩＦＮγのｃＤＮＡおよびアミノ酸配列が各々ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５および６において示される。好ましくは、ＩＦＮγはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６において示された配列またはその断片を有している。一つの態様において、ＩＦＮ‐γＲはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６と少なくとも８０％配列同一性を有したポリペプチドを含んでなる。好ましくは、ＩＦＮ‐γＲアゴニストはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６と少なくとも８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％配列同一性を有している。ＩＦＮ‐γＲアゴニストの活性を試験するための方法は当業者に知られ、これら方法の一部が以下において記載されている。未成熟ＤＣは、ＩＦＮ‐γＲアゴニストを培地へ加えるか、またはＩＦＮ‐γＲアゴニストを樹状細胞において発現させることにより、シグナリングされる。一つの態様においては、ＩＦＮ‐γＲアゴニスト、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６またはその生物活性断片をコードするｍＲＮＡによりＤＣがトランスフェクトされる。シグナリングは樹状細胞内でｍＲＮＡの翻訳時に生じることになる。最も好ましくは、ＩＦＮ‐γＲアゴニストが未成熟ＤＣを含有する培地へ加えられる。好ましい態様において、培地は更にＰＧＥ２および／またはＧＭ‐ＣＳＦ＋ＩＬ‐４またはＩＬ‐１３を含んでなる。
【０１２２】
ＩＦＮ‐γのレセプターは二つのサブユニット：ＩＦＮ‐γＲ１、リガンド結合鎖（α鎖としても知られる）およびＩＦＮ‐γＲ２、シグナル伝達鎖（β鎖またはアクセサリー因子１としても知られる）を有している。これらのタンパク質は、異なる染色体に位置する別々の遺伝子（各々ＩＦＮＧＲ１およびＩＦＮＧＲ２）によりコードされている。リガンド結合（α）鎖がＩＦＮ‐γと相互作用すると、それらはダイマー化して、二本のシグナル伝達（β）鎖と会合するようになる。レセプターアセンブリーは、ヤヌスキナーゼＪＡＫ１およびＪＡＫ２の活性化と、ＩＦＮ‐γＲ１の細胞内ドメインでチロシン残基のリン酸化に至る。これは、ホモダイマーを形成し、核へ移転して広範囲のＩＦＮ‐γ応答遺伝子を活性化させる、（‘転写のシグナルトランスデューサーおよびアクチベーター’に関する）ＳＴＡＴ１のリクルートおよびリン酸化に至る。シグナリング後、リガンド結合鎖は内在化して、解離する。鎖は次いで細胞表面へリサイクルされる。Bach et al.(1997)Ann.Rev.Immunol.15,563-591およびLammas,Casanova and Kumararatne(2000)Clin.Exp.Immunol,121,417-425。ヒトＩＦＮ‐γと、ＩＦＮ‐γＲαの可溶性グリコシル化細胞外部分（ｓＩＦＮ‐γＲα）との複合体の結晶構造が、多波長異常回折法を用いて２．９Å分解能で調べられた。Thiel et al.Structure 8:927-936(2000)。
【０１２３】
あるアッセイにおいて、ＩＦＮ‐γレセプターアゴニスト、例えばＩＦＮ‐γは、ヒト腸上皮Ｃａｃｏ‐２細胞で時間依存的および濃度依存的にＮａ＋‐Ｋ＋‐ＡＴＰアーゼ活性を減少させる。Ｎａ＋‐Ｋ＋‐ＡＴＰアーゼ活性は全およびウアバイン感受性ＡＴＰアーゼ間の差異として調べられる。ＩＦＮ‐γでの処理は、ホスホＳＴＡＴ１の発現を増加させ、ｐ３８ＭＡＰＫの活性化を伴う。ｐ３８ＭＡＰキナーゼ活性はｐ３８ＭＡＰキナーゼ抗体を用いて（例えば、New England Biolabs市販のｐ３８ＭＡＰキナーゼアッセイキットを用いて）ウエスタンブロッティングにより解析できる。全およびリン酸化ＳＴＡＴ１タンパク質レベルはＳｔａｔ１抗体（例えば、New England BiolabsからPhosphoPlus Stat1 Antibody Kitで市販されているもの）を用いて検出できる。ＩＦＮ‐γ形質導入メカニズムは、ＰＫＣ下流ＳＴＡＴ１リン酸化およびＲａｆ‐１、ＭＥＫ、ＥＲＫ２、およびｐ３８ＭＡＰＫ経路の活性化を伴う。Magro et al.Br.J.Pharmacol.advance online publication,July 26,2004、doi:10.1038/sj.bjp.0705895参照、この内容は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
【０１２４】
説明の目的のために、ＩＦＮ‐γレセプターアゴニスト、ＴＮＦ‐αレセプターアゴニスト、および／またはＣＤ４０アゴニストでのシグナリングは、各々ＩＦＮ‐γポリペプチドおよび／またはタンパク質および／またはＴＮＦ‐αポリペプチドまたはタンパク質および／またはＣＤ４０アゴニストと直接細胞を接触させることにより行える。一方、ＩＦＮ‐γＲアゴニスト、ＴＮＦ‐αＲアゴニスト、またはＣＤ４０アゴニストで細胞のシグナリングは、樹状細胞内でこのようなポリペプチドまたはタンパク質をコードするｍＲＮＡの翻訳時に生じてもよい。その際、シグナリングはＩＦＮ‐γＲアゴニスト、ＴＮＦ‐αＲアゴニストおよびＣＤ４０アゴニストポリペプチドおよび／またはタンパク質の発現時に生じる。
【０１２５】
本発明の方法で用いられる第二シグナルは、ＣＤ４０アゴニストでの一過性シグナルである。ＣＤ４０アゴニストポリペプチドの永続的発現、例えばKoyaらの前掲で記載されているようなレンチウイルスベクターからのＣＤ４０Ｌの構成的発現は、一過性発現とみなされない。非限定的な例として、ＣＤ４０アゴニストを含有する媒体がＤＣから除去されれば、またはＣＤ４０アゴニストをコードするｍＲＮＡでＤＣが負荷されれば、シグナルは一過性とみなされるであろう。ＣＤ４０アゴニストをコードする発現ベクターでＤＣが負荷／トランスフェクトされても、１）ＣＤ４０アゴニスト発現を駆動するプロモーターがＤＣで構成性でない、または２）発現ベクターがＤＣゲノムへ組み込まれずまたはＤＣで複製されないという条件であれば、ＣＤ４０アゴニストシグナルは一過性とみなされる。
【０１２６】
好ましい態様において、ＣＤ４０アゴニストはＣＤ４０ＬポリペプチドまたはＣＤ４０アゴニスト抗体である。一般的に、ＣＤ４０と結合するリガンドはＣＤ４０アゴニストとして作用してもよい。本発明者らは、ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡで未成熟または成熟ＤＣのトランスフェクションによる細胞へのＣＤ４０Ｌを含んでなる第二シグナルの投与が、免疫抑制応答よりもむしろ免疫刺激応答を誘導する成熟ＤＣの産生をもたらすことを証明した。一つの態様では、ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡトランスフェクト樹状細胞が、有効量のＣＤ４０Ｌシグナルを生じさせるために、ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡのトランスフェクション直後でかつ翻訳前にＩＦＮγ（および好ましくはＰＧＥ２も）を含有する培地で培養される。この態様では、ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡでトランスフェクション後にＩＦＮγが加えられるが、樹状細胞はＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡの翻訳時に生じるシグナル前にＩＦＮγシグナルを受け取る。このように、物質が細胞へ輸送される順序は、ＣＤ４０ＬシグナリングがＩＦＮ‐γシグナリング後に起きねばならないという点のみで重要である。以下で更に詳細に記載されているように、ＤＣのシグナリングはインビボまたはエクスビボで行い、あるいは一以上のセットはエクスビボで行い、本方法の残りの工程はインビボで行ってもよい。
【０１２７】
一つの態様において、ＣＤ４０アゴニストはＣＤ４０と結合するアプタマーである。同様に、ＩＦＮ‐γおよびＴＮＦ‐αは、類似生物活性を有するアプタマー、抗体などで置き換えられる。最も好ましくは、ＣＤ４０アゴニストはＣＤ４０ＬをコードするｍＲＮＡとして輸送される。
【０１２８】
ここで用いられている“ＣＤ４０リガンド”（ＣＤ４０Ｌ）は、ＣＤ４０レセプターを特異的に認識および活性化して、その生物活性を活性化させる、あらゆるポリペプチドまたはタンパク質を包含している。該用語には貫膜および可溶形のＣＤ４０Ｌを含む。好ましい態様において、ＣＤ４０アゴニストは哺乳動物ＣＤ４０Ｌ、好ましくはヒトＣＤ４０Ｌである。ヒトおよびマウスｃＤＮＡおよびタンパク質のアライメントが図１６および１７で各々示されている。ヒトＣＤ４０Ｌ ｃＤＮＡおよび対応アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２で各々示されている。ＣＤ４０Ｌの読み取り枠はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド４０‐８２２で表され、一方ＴＧＡ終止コドンが８２３‐８２５位にある。本発明のＣＤ４０Ｌポリヌクレオチド配列のいずれでも、双方ともＬｙｓについてコードする、“ＡＡＡ”コドンを“ＡＡＧ”コドンへ変える、ＣＤ４０Ｌ配列で１０２番目コドン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド３４３‐３４５）のサイレント突然変異（コドン縮重によるバリアント）が用いられてもよい。本発明の方法では、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の残基４７‐２６１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド残基１７８‐８２５によりコードされる）、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド４３‐８２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の１８１‐８２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の１９３‐８２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の３７６‐８２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の３７９‐８２５、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の４００‐８２５によりコードされるＣＤ４０Ｌ断片に限定されないが、それらを含めたトランケート化ＣＤ４０Ｌリガンドも有用である。ある態様においては、ＣＤ４０Ｌポリペプチドは：ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を含んでなるポリペプチド、ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸残基４７‐２６１を含んでなるポリペプチド、ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸残基５１‐２６１を含んでなるポリペプチド、ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸残基１２０‐２６１を含んでなるポリペプチド、ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸残基１１３‐２６１を含んでなるポリペプチド、ｆ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸残基１１２‐２６１を含んでなるポリペプチド、ｇ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０を含んでなるポリペプチド、ｈ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸残基３５‐２６１を含んでなるポリペプチド、ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸残基３４‐２２５を含んでなるポリペプチド、ｊ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸残基１１３‐２２５を含んでなるポリペプチド、ｋ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸残基１２０‐２２５を含んでなるポリペプチド、およびｌ）（ａ）〜（ｋ）のいずれかのポリペプチドの断片（該断片はＣＤ４０と結合する）からなる群より選択される。最も好ましくは、ＣＤ４０ＬポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸残基２１‐２６１からなる、または本質的になる。他の態様において、ＣＤ４０ＬポリペプチドはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸残基と少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドからなる、または本質的になる。好ましい態様において、配列同一性は少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少��くとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％である。一部の態様において、ＣＤ４０Ｌポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸残基２１‐２６１と比較した場合、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のアミノ酸置換を有している。好ましくは、アミノ酸置換は保守的置換である。
【０１２９】
様々な態様において、ＣＤ４０Ｌポリペプチドは：ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のポリヌクレオチド、ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド４０‐８２２を含んでなるポリヌクレオチド、ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド１７８‐８２２を含んでなるポリヌクレオチド、ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド１９０‐８２２を含んでなるポリヌクレオチド、ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド３９７‐８２２を含んでなるポリヌクレオチド、ｆ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のヌクレオチド３７６‐８２２を含んでなるポリヌクレオチド、ｇ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９のポリヌクレオチド、ｈ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３のポリヌクレオチド、ｉ）（ａ）〜（ｈ）のいずれかのポリヌクレオチドと少なくとも８０％配列同一性を有するポリヌクレオチド、ｊ）（ａ）〜（ｈ）のいずれかのポリヌクレオチドとストリンジェント条件下においてハイブリッド形成するポリヌクレオチド、およびｋ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、１５、１６、１７、または１８の核酸からなる群より選択される３′非翻訳配列および／またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、２０、２１、２２、または２３の核酸からなる群より選択される５′非翻訳配列を更に含んでなる（ａ）〜（ｊ）のポリヌクレオチドからなる群より選択されるポリヌクレオチドを含んでなるｍＲＮＡによりコードされている。好ましくは、これらのＲＮＡはキャップ化およびポリアデニル化されている。
【０１３０】
一方、ＣＤ４０Ｌポリペプチドは：ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２を含んでなるポリペプチド、ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸残基４７‐２６１を含んでなるポリペプチド、ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸残基５１‐２６１を含んでなるポリペプチド、ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸残基１２０‐２６１を含んでなるポリペプチド、ｅ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸残基１１３‐２６１を含んでなるポリペプチド、ｆ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸残基１１２‐２６１を含んでなるポリペプチド、ｇ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０を含んでなるポリペプチド、ｈ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸残基３５‐２６１を含んでなるポリペプチド、ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸残基３４‐２２５を含んでなるポリペプチド、ｊ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸残基１１３‐２２５を含んでなるポリペプチド、ｋ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸残基１２０‐２２５を含んでなるポリペプチド、およびｌ）（ａ）〜（ｋ）のいずれかのポリペプチドの断片（該断片はＣＤ４０と結合する）からなる群より選択されるポリペプチドと少なくとも７７％配列同一性を有するポリペプチドである。
【０１３１】
最も好ましくは、ＣＤ４０Ｌポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸残基２１‐２６１からなるまたは本質的になる、ここで提供される新規ＣＤ４０Ｌポリペプチド、あるいはそれと少なくとも８０％、更に好ましくは少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、最も好ましくは少なくとも９９％相同性を有するポリペプチドである。好ましくは、ＣＤ４０Ｌポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３０またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３のｃＤＮＡ、またはコドン縮重により異なるバリアントに対応するＲＮＡによりコードされる。ここで用いられている、ｃＤＮＡ配列に対応するＲＮＡとは、ＤＮＡでチミン(Ｔ）塩基がＲＮＡでウラシル（Ｕ）塩基へ置き換わるように、ヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドの代わりにリボヌクレオチドであることを除き、ｃＤＮＡ配列と同様の配列を有するＲＮＡ配列に関する。好ましくは、ＲＮＡはキャップ化およびポリアデニル化されている。したがって、本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸残基２１‐２６１からなるまたは本質的になるＣＤ４０Ｌポリペプチドを提供する。他の態様において、本発明はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸残基２１‐２６１からなるまたは本質的になるＣＤ４０Ｌポリペプチドをコードする核酸を提供する。このような核酸でトランスフェクトされた樹状細胞も、このような樹状細胞を含んでなるワクチンと共に提供される。好ましくは、本発明のこれら新規ＣＤ４０ＬポリペプチドをコードするＲＮＡで樹状細胞が一過性にトランスフェクトされる。
【０１３２】
他の態様において、本発明は：（ａ）ＩＦＮ‐γＲアゴニストシグナル化樹状細胞を産生するためにインターフェロンガンマレセプター（ＩＦＮ‐γＲ）アゴニストおよび場合によりＴＮＦ‐αＲアゴニストを含んでなる第一シグナルで単離未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）をシグナリングし、および（ｂ）ＣＣＲ７＋成熟樹状細胞を産生するために有効量のＣＤ４０Ｌポリペプチドを含んでなる第二一過性シグナルにより該ＩＦＮ‐γＲアゴニストシグナル化樹状細胞をシグナリングする連続工程を含んでなり、ＣＤ４０ＬポリペプチドがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸残基２１‐２６１から本質的になる、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸残基２１‐２６１と少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドである、成熟樹状細胞（ＤＣ）を作製するための方法を提供する。
【０１３３】
ＣＤ４０はＢリンパ球で発現されるレセプターとして最初に特徴づけられた。Schonbeck and Libby(2001)Cell Mol.Life Sci.58:4。Ｂ細胞ＣＤ４０と活性化Ｔ細胞で発現されるＣＤ４０Ｌとのかみ合いがＴ細胞依存性Ｂ細胞活性化（即ち、増殖、免疫グロブリン分泌、およびクラススイッチ）に必須であることが、後に見出された。その後で、機能性ＣＤ４０はＢ細胞以外の様々な細胞の種類、例えば造血前駆細胞、Ｔリンパ球、好塩基球、好酸球、単球／マクロファージ、樹状細胞、上皮細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、ケラチン細胞、線維芽細胞、および癌腫で発現されることがわかった。Schonbeck and Libby(2001)前掲。
【０１３４】
ＣＤ４０リガンドは１９９３年にクローン化され、Gauchat et al.(1993)FEBS Lett.315-259により報告された。Grafらはそれを染色体Ｘｑ２６．３‐ｑ２７．１に地図化した（Graf et al.(1992)Eur.J.Immunol.22:3191-3194）。ＣＤ４０リガンドの細胞関連全長３９ｋＤａ型の短可溶型が３３ｋＤａおよび１８ｋＤａの分子量で記載されていた。Graf et al.(1995)Eur.J.Immunol.25:1749、Ludewig et al.(1996)Eur.J.Immunol.26:3137、Wykes et al.(1998)Eur.J.Immunol.28:548。細胞質テール、貫膜領域および細胞外ドメインの一部を欠くが、ＣＤ４０結合ドメインを保持した、細胞内タンパク質分解切断により得られる１８ｋＤａ可溶型は、ＣＤ４０レセプターと結合しうる能力を留めており、したがってＣＤ４０レセプターシグナリング物質の例である。Graf et al.(1995)前掲。
【０１３５】
米国特許第５，９８１，７２４号は、ヒトＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）をコードするＤＮＡ配列と、ＣＤ４０Ｌポリペプチドを産生する目的のためのベクターおよび形質転換宿主細胞について開示している。米国特許第５，９６２，４０６号は、ヒトＣＤ４０Ｌの可溶型をコードするＤＮＡ配列について開示している。
【０１３６】
ＣＤ４０Ｌとの哺乳動物ホモログの例示配列は次のGenbankアクセス番号を有している：ＮＭ ２０４７３３（Gallus gallus（ニワトリ））、ＤＱ０５４５３３（Ovis aries（ヒツジ））、Ｚ４８４６９（Bos taurus（ウシ））、ＡＹ３３３７９０（Canis familiaris（イヌ））、（Macaca nemestrina（ブタオザル））、ＡＦ３４４８４４（Callithrix jacchus（シロミミマーモセット））、ＡＦ３４４８１（Cercicebus torquatus atys（スーティマンガベイ））、ＡＦ３４４８６０（Aotus trivirgatus（ヨザル））、ＡＦ３４４８５９（Macaca mulatta（アカゲザル））、ＡＦ１１６５８２（Rattus nevegicus（ノルウェーラット））、およびＡＦ０７９１０５（Felus catus（ネコ））。
【０１３７】
ＣＤ４０レセプターは、ＣＤ４０アゴニスト抗体、抗体断片、誘導体、およびそれらのバリアントの使用においても活性化される。ＣＤ４０アゴニスト抗体はMabtech（Nacka，Sweden）のような商業ベンダーから購入される。これらの物質を作製するための例および方法も以下において示される。該文献はＣＤ４０アゴニスト抗体および抗体断片の例も示している。例えば、Osada et al.(2002)25(2):176およびLedbetter,J.A.et al.(1997)Crit.Reviews in Immunol.17:427参照。
【０１３８】
上記のように、ＣＤ４０Ｌの生物活性を有する物質には、ＣＤ４０Ｌをコードする外来ポリヌクレオチド（ｍＲＮＡまたはＤＮＡ）から翻訳されたポリペプチドがある。例えば、ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の配列を有している。一方、細胞は有効量のＣＤ４０Ｌタンパク質および／またはポリペプチド、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の配列を有するものでシグナリングされる。修飾ＣＤ４０Ｌも本発明の方法で用いられる。例えば、ＣＤ４０Ｌには、得られたタンパク質がＤＣの表面においてＣＤ４０と結合するという条件により、いくつかのアミノ酸の保守的または非保守的な付加、欠失、または置換により変えられた分子を含む。“保守的変更”とは、類似した電荷密度、親和性もしくは疎水性、大きさ、および／または立体配置の代替アミノ酸（例えば、Ｉｌｅに代わるＶａｌ）をもたらすものである。比較のために、“非保守的変更”とは、異なる電荷密度、親和性もしくは疎水性、大きさ、および／または立体配置の代替アミノ酸（例えば、Ｐｈｅに代わるＶａｌ）をもたらすものである。このような修飾を行う手段は当業界において周知であり、市販キットおよびベクター（例えば、New England Biolabs,Inc.,Beverly,Mass.；Clontech,Palo Alto,Calif.市販のもの）により遂行される。
【０１３９】
物質が該物質をコードするポリヌクレオチドまたは遺伝子として輸送される場合、有効量のポリヌクレオチドが当業界で知られているいずれかの方法により複製される。ＰＣＲ技術はＤＮＡを複製するための一手段であり、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，８００，１５９号、第４，７５４，０６５号、および第４，６８３，２０２号の主題であって、ＰＣＲ:THE POLYMERASE CHAIN REACTION（Mullis et al.eds,Birkhauser Press,Boston(1995)）およびそこで引用されたリファレンスにおいて記載されている。ポリヌクレオチドを作製する追加方法が以下において示されている。
【０１４０】
未成熟樹状細胞がＴＮＦ‐αレセプターのアゴニストで刺激されてからＣＤ４０アゴニストで刺激される本発明の態様において、該方法は有効量のインターロイキン１‐ベータ（ＩＬ‐１β）および／またはインターロイキン６（ＩＬ‐６）の非存在下において行われる。ＩＬ‐１βおよびＩＬ‐６のようなタンパク質の存在を検出するための方法は当業界において知られている。
【０１４１】
当業者であれば、ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡおよび／またはＣＤ４０Ｌポリペプチドを発現する成熟ＤＣの存在について、集団からＤＣの細胞または小集団をサンプリングすることにより、本発明の目的がいつ達成されたかを調べられる。別の態様において、本発明の成熟ＣＤ８３＋ＣＣＲ７＋ＤＣはインターロイキン１２（ＩＬ‐１２）ｐ３５タンパク質を発現する。別の態様において、成熟ＣＤ８３＋ＣＣＲ７＋ＤＣはＩＬ‐１２ｐ３５タンパク質を発現し、および／または限定されたＩＬ‐１０（５００ｐｇ／ｍＬ／１０６ＤＣ以下）を発現する。
【０１４２】
本方法の工程はインビボまたはエクスビボにおいて実施される。エクスビボで実施される場合、本方法は開放または閉鎖システムにおいて実施される。細胞集団を培養および富化するための方法およびシステムは当業界において知られている。米国特許公開第２００４／００７２３４７号の実施例１および２参照。細胞拡大のための閉鎖システムについて記載する米国特許公開第２００３／０２３５９０８号も参照。
【０１４３】
本発明の別の態様において、成熟ＤＣによりプロセッシングおよび提示されることになる有効量の抗原を未成熟または成熟ＤＣへ輸送することで、上記方法が更に変更される。このように、本発明の方法においては、抗原負荷ＣＣＲ７＋成熟ＤＣを産生するために、一種以上の抗原または一種以上の抗原をコードするポリヌクレオチドをｉＤＣ、シグナル化ＤＣまたはＣＣＲ７＋成熟ＤＣへ導入することを更に含んでなる。抗原または抗原コードポリヌクレオチドは上記第一シグナルの前に導入されうる。一方、抗原または抗原コードポリヌクレオチドは該第一シグナルの後で上記第二シグナルの前に輸送される。他の態様において、抗原またはポリヌクレオチドは該第二シグナルの後または該第二シグナルと実質上同時に輸送される。
【０１４４】
例えば、抗原としては病原体、病原体溶解産物、病原体抽出物、病原体ポリペプチド、ウイルス粒子、細菌、タンパク質、ポリペプチド、癌細胞、癌細胞溶解産物、癌細胞抽出物、癌細胞特異的ポリペプチドがあるが、それらに限定されない。抗原は天然でもまたは組換え産生でもよい。以下で簡単に記載されている当業界で公知の方法を用いて、ポリペプチド、タンパク質、または核酸として免疫原が細胞へ輸送される。好ましくは、一種以上の抗原をコードする一種以上のポリヌクレオチドがｉＤＣ、シグナル化ＤＣ、またはＣＣＲ７＋成熟ＤＣへ導入される。ポリヌクレオチドは当業者に公知の方法でＤＣへ導入しうる。好ましい態様において、ポリヌクレオチドはエレクトロポレーションにより導入される。最も好ましくは、ポリヌクレオチドはｍＲＮＡである。好ましい態様では、抗原または抗原コードｍＲＮＡが、ＣＤ４０アゴニストをコードするｍＲＮＡと一緒に、またはＣＤ４０アゴニストシグナリングと実質上同時に導入される。
【０１４５】
本方法は、有効量のサイトカインまたは補助刺激分子、例えばＧＭ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐４、およびＰＧＥ２と細胞を接触させることで、更に変更してもよい。未成熟ＤＣが（ＩＦＮγＲアゴニストの非存在下）ＴＮＦαＲアゴニストでシグナリングされ、次いでＣＤ４０アゴニストによりシグナリングされる態様においては、有効量のＩＬ‐１βおよび／またはＩＬ‐６が培養物から特に除外される。
【０１４６】
抗原はその“天然”形で、即ち抗原を作製する上でまたはそれがＡＰＣと出会う環境へ入るようそれを誘導する上でヒトの介入が加わらないように輸送されてもよい。一方または加えて、抗原は、例えば従来のアレルギーショットまたは腫瘍溶解産物で通常投与されている種類の、粗調製物を含んでもよい。抗原は一方で実質的に精製して、例えば少なくとも約９０％純粋でもよい。
【０１４７】
抗原がペプチドである場合、例えば単離タンパク質のタンパク質分解切断により、それが作製される。限定されないが、ペプシン、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシンなどを含めた様々な開裂剤が利用されてもよい。一方、ペプチドは、好ましくは当業界で利用しうるような自動シンセサイザーで、化学的に合成してもよい。対象のペプチドをコードする核酸を作製して、所望の条件下で該ペプチドを発現させるために、組換え技術も用いられてもよい。
【０１４８】
抗原は一方で、いかなる天然化合物とも異なる構造を有しうる。本発明のある態様において、抗原は、天然抗原のものと実質的に同一であるが、天然化合物の正確な構造と１以上の違いを含む構造を抗原が有している、“修飾抗原”である。例えば、天然抗原がタンパク質またはポリペプチド抗原である場合、修飾抗原は、そのタンパク質またはポリペプチド抗原と比較して、一以上のアミノ酸の付加、置換、または欠失で天然抗原のものと異なるアミノ酸配列を有している、および／またはアミノ酸に共有結合された一以上の化学部分の付加、置換、または欠失で天然抗原における対応アミノ酸と異なる一以上のアミノ酸を含有している。一つの態様において、天然および修飾抗原は、少なくとも約７５％同一である、少なくとも五つのアミノ酸の少なくとも一つの領域を共有している。当業者であれば理解できるように、二つのアミノ酸配列を比較してそれらの同一性の程度を調べる上で、同一アミノ酸のストレッチ（即ち、少なくとも二つの領域）間の間隔が常に正確に保たれている必要はない。天然および修飾タンパク質またはポリペプチド抗原は、少なくとも五つのアミノ酸の少なくとも一つの領域について、アミノ酸配列で少なくとも約８０％同一性、更には８５％、９０％、９５％、または９９％以上の同一性を示せる。多くは、アミノ酸配列の更に長い領域（例えば、１０、２０、５０、１００、またはそれ以上のアミノ酸）について、所定度の同一性を示すことが有用かもしれない。
【０１４９】
好ましい態様においては、遺伝子の発現が治療される個体（インビボにおいて輸送される場合）または細胞培養系（インビトロにおいて輸送される場合）で抗原産生をもたらすように、抗原をコードするポリヌクレオチドまたは遺伝子として抗原が輸送される。発現可能遺伝子を含有する核酸を作製して、該発現可能遺伝子によりコードされたタンパク質が産生される発現系へこのような核酸を導入するための技術は、当業界において知られており、以下で簡単に記載されている。好ましくは、抗原をコードするｍＲＮＡがＤＣへ導入される。
【０１５０】
一つの態様において、免疫原は上記第一シグナルの前に輸送されるが、ここで第一シグナルはＩＦＮγＲアゴニストまたはＴＮＦ‐αＲである。一方、免疫原は該第一シグナルの後で上記第二シグナルの前に輸送されるか、または免疫原は該第二シグナルの後に輸送される。他の態様において、免疫原は該第二シグナルと実質的に同時に輸送される。
【０１５１】
いずれか具体的な組成物または適用例において用いられる抗原の量は、当業者であれば直ちに明らかとなるように、具体的な抗原およびそれが用いられている適用例の性質に依存する。
【０１５２】
抗原負荷樹状細胞は、抗原に対する免疫応答を生じさせるために有用である。そのため、一つの態様において、本発明は、有効量の免疫原負荷ＣＣＲ７＋成熟ＤＣを対象者へ投与することを含んでなる、対象者で免疫応答を生じさせる方法を提供する。負荷ＤＣは対象者に対して、同種異系でもまたは自家でもよい。
【０１５３】
本発明は、刺激された免疫エフェクター細胞を産生するために、本発明の方法により産生された抗原負荷ＣＣＲ７＋成熟ＤＣの存在下において、該細胞を培養することを含んでなる、免疫エフェクター細胞を刺激する方法を更に提供する。他の態様において、本発明は、有効量のこのように刺激された免疫エフェクター細胞を対象者へ投与することを含んでなる、対象者において免疫を高める方法を提供する。
【０１５４】
本発明の別の態様においては、有効量のサイトカインおよび／または補助刺激分子がインビトロまたはインビボにおいて細胞または患者へ輸送される。これらの物質はポリペプチド、タンパク質として、または一方で、それらをコードするポリヌクレオチドまたは遺伝子として輸送される。サイトカイン、補助刺激分子、およびケモカインは、非純粋調製物（例えば、細胞にとり内在性または外在性のサイトカイン遺伝子を発現する細胞の単離物）としてまたは“精製”形で供される。精製調製物は、好ましくは少なくとも約９０％純粋、または一方で少なくとも約９５％純粋、または更には少なくとも約９９％純粋である。一方サイトカインまたは誘導剤をコードする遺伝子は、治療される個体または発現されたサイトカインもしくは誘導剤が個体への投与向けに得られる他の発現系（例えば、インビトロ転写／翻訳系または宿主細胞）において、遺伝子発現がサイトカインまたは誘導剤産生をもたらすように供されてもよい。
【０１５５】
サイトカインおよび抗原の双方が個体へ輸送される場合、それらは一緒にまたは別々に供されてもよい。それらがポリペプチドまたはタンパク質として輸送される場合、それらは通常の封入デバイスにより、または物理的会合、例えば共有結合、水素結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用などにより輸送される。別の態様においては、化合物が一緒に供され、即ち双方をコードする遺伝子が供される。例えば、双方に関する遺伝子が同一核酸分子の一部として供されてもよい。一部の態様においては、サイトカインおよび抗原がペプチド結合で互いに共有結合された融合タンパク質として、双方の因子が単一の隣接ポリヌクレオチドから発現されるように、この核酸分子が作製されてもよい。一方または加えて、双方の遺伝子が同一刺激に応答して個体内で発現されるように、該遺伝子が同一または相当制御配列へ結合されてもよい。異なる条件下において異なる宿主細胞で活性な様々な異なる制御配列が当業界で知られている。構成的制御配列、誘導性制御配列、および抑制性制御配列を含めたこれらの制御配列は本発明に従い用いられるが、遺伝子発現のタイミングについて追加コントロールが望まれる適用例では誘導性または抑制性配列が特に好ましい。
【０１５６】
サイトカインおよび／または抗原の投与が、いずれか他の望ましい免疫系調節因子、例えばアジュバントまたは他の免疫調節化合物の投与と場合により組み合わせうることは、当業者にとり明らかである。
【０１５７】
抗原は、該抗原をコードするポリヌクレオチドまたは遺伝子の形により輸送してもよい。抗原は、第一ポリペプチド（例えば、第一抗原）からの配列の一部を第二ポリペプチド（例えば、第二抗原、シグナル配列、貫膜ドメイン、精製ハンドルなど）からの配列の一部とペプチド結合により結合させることで修飾してもよい。当業者であれば、本発明による使用に際して、このような融合タンパク質の多様性を理解するであろう。組換え技術によれば、アミノ酸配列の置換、欠失、付加、または逆位により、ポリペプチドまたはタンパク質抗原のアミノ酸配列の簡単な修飾を更に行える。
【０１５８】
免疫原が抗原の断片である場合、例えば単離タンパク質のタンパク質分解切断により、それが作製されてもよい。限定されないが、ペプシン、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシンなどを含めた様々な開裂剤が利用されてもよい。一方、ペプチドは、好ましくは当業界において利用しうるような自動シンセサイザーにより、化学的に合成してもよい（例えば、Stewart et al.,Solid Phase Peptide Synthesis,2d.Ed.,Pierce Chemical Co.,1984参照）。対象のペプチドをコードする核酸を作製して、望ましい条件下において（例えば、宿主細胞でまたはそれが容易に精製されるインビトロ発現系で）、そのペプチドを発現させるために、組換え技術も用いられてもよい。
【０１５９】
好ましい態様において、抗原は癌細胞または病原体からのものである。好ましくは、新生物細胞は腎臓癌細胞、多発性骨髄腫細胞、または黒色腫細胞である。好ましい病原体はＨＩＶおよびＨＣＶである。好ましい態様において、抗原は新生物細胞または病原体から単離または誘導されたＲＮＡの形で抗原提示細胞へ輸送される。いずれかの細胞（例えば、新生物細胞または病原体細胞）から抽出されたＲＮＡのＲＴ‐ＰＣＲおよびインビトロ転写のための方法は同時係属のＷＯ２００６／０３１８７０号およびＷＯ２００５／０５２１２８号において開示されており、それらの内容は引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
【０１６０】
本発明に従い用いられる抗原は、天然化合物であっても、または一方でいかなる天然化合物とも異なる構造を有してもよい。本発明のある態様において、抗原は、天然抗原のものと実質的に同一であるが、天然化合物の正確な構造と一以上の違いを含む構造を抗原が有している、“修飾抗原”である。
【０１６１】
ここで記載された方法のいずれかで作製された成熟ＤＣの富化集団も本発明により提供される。本発明の方法で作製された成熟ＤＣは高い免疫刺激特性を有している。他の態様において、本発明は、適切な条件下において本発明の富化樹状細胞集団を適切な凍結保存剤と接触させることを含んでなる、成熟ＤＣの富化集団を保存するための方法を提供する。
【０１６２】
ここで記載された組成物は、細胞、例えばＤＣ、修飾ＤＣ、または教育された免疫エフェクター細胞の富化集団の有効量を対象者へ投与することにより、対象者において免疫応答を生じさせるために有用である。細胞は同種異系でもまたは自家でもよい。それらは、上記のような富化集団の有効量を対象者へ投与することにより対象者で免疫応答を惹起または誘導するために、対象者へ投与される。細胞は、対象者にとり同種異系でもまたは自家でもよい。それらは、本発明の成熟ＤＣの存在かつ活用下で免疫エフェクター細胞を培養することにより、Ｔ細胞のような免疫エフェクター細胞を教育するためにも用いられる。教育されたエフェクター細胞も、これら細胞の有効量を対象者へ輸送することにより、対象者において免疫を高めるために用いられる。
【０１６３】
ポリヌクレオチドを作製および輸送するための方法
本発明のある態様はポリヌクレオチドの使用を必要とする。これらは当業界において知られているいずれかの方法を用いて作製および複製され、例えば当業者であれば、ここで提供された配列と、ＤＮＡを複製するための市販ＤＮＡシンセサイザーを用いられる。一方、ポリヌクレオチドの線状配列、適切なプライマー分子、酵素のような化学物質、およびそれら複製のための説明書を用意し、ポリヌクレオチドを得るために適正な向きでヌクレオチドを化学的に複製または結合させることによっても、それらは得られる。別の態様においては、これらのポリヌクレオチドが更に単離される。更にそれとは別に、当業者であれば、ポリヌクレオチドを適切な複製ベクターへ挿入し、複製および増幅のための適切な宿主細胞（原核または真核細胞）へ該ベクターを挿入しうる。こうして増幅されたＤＮＡは、当業者に周知の方法により細胞から単離される。この方法でポリヌクレオチドを得るための工程が、こうして得られたポリヌクレオチドと共に、ここで更に提供される。
【０１６４】
一つの態様において、物質（例えば、ＣＤ４０Ｌ）はｍＲＮＡとして輸送される。ＲＮＡは、最初にＤＮＡポリヌクレオチドを適切な宿主細胞へ挿入することにより、または好ましくはインビトロ転写により得られる。該ＤＮＡはいずれか適切な方法で、例えば適切な遺伝子輸送ビヒクル（例えば、リポソーム、プラスミド、またはベクター）の使用により、またはエレクトロポレーションにより挿入される。細胞が複製して、ＤＮＡがＲＮＡへ転写される場合、該ＲＮＡは当業者に周知の方法を用いて、例えばSambrook et al.(1989)前掲で記載されているように単離される。例えば、ｍＲＮＡは、Sambrook et al.(1989)前掲で記載された操作に従い様々な溶解酵素または化学溶液を用いて単離されるか、または製造業者により用意される添付説明書に従い核酸結合樹脂により抽出される。
【０１６５】
好ましい態様において、ＣＤ４０Ｌ発現カセットはインビトロ転写に適したプロモーター、例えばＴ７プロモーターまたはＳＰ６プロモーターを含有している。好ましくは、インビトロ転写ＣＤ４０ＬまたはＣＤ４０アゴニストｍＲＮＡは翻訳の安定性および効率に関して最適化されている。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３は最適化ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡを表し、ここで５′非翻訳領域のＡＴＧコドンは翻訳の不正確な開始を避けるために改変されていた。一つの態様において、ＣＤ４０Ｌ ＲＮＡはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に対応する。対応リボヌクレオチドまたはそれらのアナログがデオキシリボヌクレオチドに代わる（例えば、リボアデニン（ｒＡ）がデオキシリボアデニン（ｄＡ）に代わり、リボグアニン（ｒＧ）がデオキシリボグアニン（ｄＧ）に代わり、リボシチジン（ｒＣ）がデオキシリボシチジン（ｄＣ）に代わり、および（リボ）ウラジン（ｒＵ）がデオキシチミジン（ｄＴ）に代わる）場合に、ここで用いられているＲＮＡはＳＥＱ ＩＤ ＮＯにおいて示されたＤＮＡ配列に“対応する”。
【０１６６】
ｍＲＮＡ安定性および／または翻訳効率は、ｍＲＮＡに３′ＵＴＲおよび／または５′ＵＴＲを含有させることによっても高められる。３′ＵＴＲの好ましい例には、ヒトＣＤ４０、β‐アクチン、およびロタウイルス遺伝子６からのものがある。５′ＵＴＲの好ましい例には、ＣＤ４０Ｌからのもの、およびＨｓｐ７０、ＶＥＧＦ、脾臓壊死ウイルスＲＵ５、およびタバコエッチウイルスの５′ＵＴＲにおける翻訳エンハンサーがある。
【０１６７】
例えば、ＣＤ４０Ｌ発現は一部が３′ＵＴＲ媒介ｍＲＮＡ不安定性により通常調節され、したがってＣＤ４０Ｌ ３′ＵＴＲの大部分は本ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡに含有されない。ＣＤ４０ＬはＤＣにおいて通常発現されない。対照的に、ＣＤ４０レセプターがＤＣで発現され、特にｍＲＮＡ安定性のレベルで、その発現が転写後に調節されることを示す証拠は、文献にない。ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡの３′末端または領域にＣＤ４０レセプター３′ＵＴＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４またはその活性断片）を含有させると、いかなる望ましくない調節活性も呈することなく、天然ＣＤ４０メッセージと類似したＲＮＡ３′非翻訳配列を得られるようになる。
【０１６８】
ベータ‐アクチンはヒト非筋肉細胞において豊富に発現される遺伝子である。ヒトベータ‐アクチンプロモーターは、哺乳動物細胞系およびトランスジェニックマウスで遺伝子発現を駆動するために広く用いられていた。ベータ‐アクチン３′ＵＴＲ＋フランキング領域の含有は、ベータ‐アクチンプロモーターを含有する遺伝子発現構築物からのｍＲＮＡ蓄積のレベルを更に高めることが証明されていた。Qin and Gunning(1997)Journal of Biochemical and Biophysical Methods 36,pp.63-72。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５はヒトベータ‐アクチン３′ＵＴＲの最終エキソンの非翻訳領域を表す。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６はこの３′ＵＴＲの最小領域を示す。
【０１６９】
サルロタウイルス遺伝子６ ｍＲＮＡの３′ＵＴＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１７）は、そのキャップ化された非ポリアデニル化ウイルス転写物において、翻訳のエンハンサーとして機能する。該３′ＵＴＲは、ウサギ網状赤血球溶解産物において、異種リポーターｍＲＮＡの翻訳も高めることが示された。Yang et al.(2004)Archives of Virology 149:303-321。この３′ＵＴＲの最小機能要素がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８において示される。
【０１７０】
ヒトｈｓｐ７０遺伝子の５′ＵＴＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）は、ストレス誘導の非存在下において、メッセージ安定性に劇的な影響を与えることなく、リポーターｍＲＮＡの翻訳を高めることが示されていた。エンハンサー機能がいくつかのヒト細胞系で証明されていた。Vivinus et al.(2001)European Journal of Biochemistry 268:1908-1917。
【０１７１】
マウスＶＥＧＦ５′ＵＴＲ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０）はモノシストロニックリポーターＲＮＡの翻訳を高め、ＩＲＥＳ（Internal Ribosome Entry Site）活性も有する。そのエンハンサー活性はラット、ハムスター、およびヒト細胞系において証明された。全長５′ＵＴＲは１０１４ヌクレオチドであるが、１６３ヌクレオチド変異体バージョン（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１）は更に活性であることが示された。Stein et al.(1998)Molecular Cellular Biology 18:3112-3119。
【０１７２】
脾臓壊死ウイルス（ＳＮＶ）はトリレトロウイルスである。ウイルス５′ＬＴＲのＲＵ５領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）は、ヒト２９３細胞で非ウイルスリポーターＲＮＡの翻訳効率を刺激する。Roberts and Boris-Lawrie(2000)Journal of Virology 74:8111-8118。
【０１７３】
タバコエッチウイルスＲＮＡの１４３ヌクレオチド５′リーダー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３）は、植物および動物細胞系でリポーターｍＲＮＡのキャップ非依存性翻訳を促進する。リーダー配列はキャップ化転写物の翻訳を更に高めることはないが、樹状細胞においてキャップ非依存性ＣＤ４０Ｌ発現はインビトロキャッピングに代わる非常に魅力的な選択肢である。Gallie et al.(1995)Gene 165:233-238．Niepel and Gallie(1999)Journal of Virology 73:9080-9088．Gallie,Journal of Virology(2001)75:12141-12152。
【０１７４】
ヒトグロビンｍＲＮＡは、１６〜２０時間の半減期で、赤血球前駆細胞において高度に安定である。α‐およびβ‐グロビンｍＲＮＡ安定性に必要なシス作用要素は明確にされており、各メッセージの３′非翻訳領域に位置していた。（Holcik and Liebehaber,1997,PNAS 94,2410-2414、Yu and Russell,2001,Molecular and cellular Biology 21(17)5879-5888）。ヒトα‐グロビン３′ＵＴＲの配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７において示される。ヒトβ‐グロビン３′ＵＴＲの配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２８において示される。ヒトβ‐グロビン３′ＵＴＲ−プリンリッチ要素３の配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２９において示される。
【０１７５】
樹状細胞は、リン酸カルシウム沈降法、マイクロインジェクション、またはエレクトロポレーションに限定されないが、それらを含めた当業界で知られる方法により、核酸によりトランスフェクトされる。それらは単独でまたは適切な担体、例えばリン酸緩衝液のような薬学上許容される担体と組み合わせて加えられる。一方または加えて、核酸は細胞への取込みのために発現または挿入ベクターへ組み込める。ポリヌクレオチドが作動的に結合されるクローニング部位およびプロモーターを双方とも含有したベクターが当業界で知られている。このようなベクターはインビトロまたはインビボにおいてＲＮＡを転写でき、Stratagene（La Jolla,ＣＡ）およびPromega Biotech（Madison,ＷＩ）のような供給元から市販されている。発現および／またはインビトロ転写を最適化するためには、クローンの５′および／または３′非翻訳部分を除去、付加、または変更して、転写または翻訳レベルにおいて発現を妨げるまたは減少させる可能性のある余分で不適切な代替の翻訳開始コドンまたは他の配列を除くことが必要かもしれない。一方、コンセンサスリボソーム結合部位も発現を高めるために開始コドンのすぐ５′側に挿入できる。ベクターの例はウイルス、例えばバキュロウイルスおよびレトロウイルス、バクテリオファージ、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、コスミド、プラスミド、真菌ベクターと、様々な真核および原核宿主で発現に関して記載されてきた、遺伝子療法と簡単なタンパク質発現に用いられる、当業界において典型的に用いられている他の組換えビヒクルである。
【０１７６】
これらの中には、ＤＮＡ／リポソーム複合体および標的化ウイルスタンパク質ＤＮＡ複合体を含めた、数種の非ウイルスベクターがある。細胞への輸送を高めるために、本発明の核酸またはタンパク質は細胞表面抗原と結合する抗体またはその結合断片へ接合させてもよい。標的化抗体またはその断片も含んでなるリポソームが本発明の方法で用いられる。本発明は、ここで開示された方法で使用の標的化複合体も提供する。
【０１７７】
ポリヌクレオチドは、当業界で知られている方法を用いて、ベクターゲノムへ挿入される。例えば、インサートとベクターＤＮＡが、互いに対合してリガーゼで一緒に結合される相補的末端を各分子で形成するために、制限酵素と適切な条件下において接触させられる。一方、合成核酸リンカーも制限ポリヌクレオチドの末端へ連結しうる。これらの合成リンカーは、ベクターＤＮＡで特定の制限部位に対応する核酸配列を含有している。加えて、終止コドンおよび適切な制限部位を含有するオリゴヌクレオチドが、例えば、次の一部または全部：選択マーカー遺伝子、例えば哺乳動物細胞で安定的または一過性トランスフェクタントの選択のためのネオマイシン遺伝子、高レベルの転写のためのヒトＣＭＶの即時型遺伝子からのエンハンサー／プロモーター配列、ｍＲＮＡ安定性のためのＳＶ４０からの転写終結およびＲＮＡプロセッシングシグナル、ＳＶ４０ポリオーマ複製起点および適正なエピソーム複製のためのＣｏｌＥ１、万能マルチクローニング部位、並びにセンスおよびアンチセンスＲＮＡのインビトロ転写のためのＴ７およびＳＰ６ ＲＮＡプロモーターを含有するベクターへ挿入のために連結しうる。他の手段も当業界で知られ、市販されている。
【０１７８】
タンパク質およびポリペプチドの作製および単離
ポリペプチドおよびタンパク質は本発明の様々な方法の必要成分である。タンパク質およびポリペプチドは、Perkin Elmer/Applied Biosystems,Inc.,Model 430Aまたは431A,Foster City,ＣＡ,ＵＳＡにより製造されているもののような市販自動ペプチドシンセサイザーを用いて、化学合成により得られる。合成されたタンパク質またはポリペプチドは沈降され、例えば高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で更に精製される。一方、タンパク質およびポリペプチドは、以下で記載されている宿主細胞およびベクター系を用いて、ここで記載されているような公知の組換え法により得てもよい。
【０１７９】
ペプチドに変化した性質をもたせるために修飾がペプチドに行われることは、当業者に周知である。ここで用いられている“アミノ酸”という用語は、グリシンと両Ｄ‐およびＬ‐光学異性体、アミノ酸アナログおよびペプチドミメティックを含めた、天然および／または非天然または合成アミノ酸に関する。アミノ酸が３個以上のペプチドは、そのペプチド鎖が短ければ、オリゴペプチドと通称されている。ペプチド鎖が長ければ、ペプチドはポリペプチドまたはタンパク質と通称される。本発明において使用されるペプチドは、非天然アミノ酸を含有するように修飾しうる。そのため、特別な性質をペプチドへもたせるために、ペプチドはＤ‐アミノ酸、Ｄ‐およびＬ‐アミノ酸の組合せおよび様々な“デザイナー”アミノ酸（例えば、β‐メチルアミノ酸、Ｃ‐α‐メチルアミノ酸、およびＮ‐α‐メチルアミノ酸など）を含有してもよい。加えて、特定のカップリング工程に特定のアミノ酸を割り当てることで、α‐ヘリックス、βターン、βシート、γ‐ターンのペプチドおよび環式ペプチドが作製される。別の態様では、有用な化学的および構造的性質を呈するペプチドのサブユニットが選択される。例えば、Ｄ‐アミノ酸を含んでなるペプチドは、インビボでＬ‐アミノ酸特異的プロテアーゼに耐性であってもよい。Ｄ‐アミノ酸による修飾化合物は、retro-inversoペプチドとして本発明のペプチドを産生するために、反対順に並べられたアミノ酸で合成してもよい。加えて、本発明では、新規性質のペプチドを作製するために、うまく確定された構造的性質を有するペプチドの作製と、ペプチドミメティックの使用およびエステル結合のようなペプチドミメティック結合も検討してもよい。他の態様では、還元ペプチド結合、即ちＲ１‐ＣＨ２ＮＨ‐Ｒ２（Ｒ１およびＲ２はアミノ酸残基または配列である）を取り込んだペプチドが作製されてもよい。還元ペプチド結合はジペプチドサブユニットとして導入してもよい。このような分子はペプチド結合加水分解、例えばプロテアーゼ活性に耐性である。このような分子は、特有の機能および活性、例えば代謝分解またはプロテアーゼ活性への耐性によりインビボ半減期の延びたペプチドをもたらすことになる。更に、ある系において拘束性ペプチドが高い機能活性を示すことは周知である（Hruby(1982)Life Sciences 31:189-199およびHruby et al.(1990)Biochem.3.268:249-262）、本発明はランダム配列を他の全位置に組み込んだ拘束性ペプチドを産生するための方法を提供する。
【０１８０】
幹細胞を単離するための方法
インビトロ拡大のためのＣＤ３４＋幹細胞の単離および拡大と樹状細胞への分化に関して、多くの方法が当業界において知られている。例えば、引用することにより本明細書の開示の一部とされる、米国特許第５，１９９，９４２号参照。以下の記載は説明のみの目的であり、決して本発明の範囲を限定するためのものではない。
【０１８１】
ＣＤ３４＋幹細胞は、骨髄細胞から、あるいは例えばＣＤ４＋およびＣＤ８＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４５＋（ｐａｎＢ細胞）、およびＧＲ‐１のような望まれていない細胞と結合する抗体で骨髄細胞または他の供給源をパンニングすることにより単離しうる。このプロトコールの詳細な記載に関しては、Inaba et al.(1992)J.Exp.Med.176:1693-1702参照。ヒトＣＤ３４＋細胞は、臍帯血、骨髄外植片、および動員(mobilized)末梢血を含めた、様々な供給源から得られる。ＣＤ３４＋細胞の精製は抗体アフィニティ操作により行える。例えば、Paczesny et al.(2004)J.Exp.Med.199:1503-11、Ho et al.(1995)Stem Cells 13(suppl.3):100-105、Brenner(1993)Journal of Hematotherapy 2:7-17、およびYu et al.(1995)PNAS 92:699-703参照。
【０１８２】
幹細胞を未成熟樹状細胞へ分化させる
ＣＤ３４＋幹細胞は、該細胞を適切なサイトカインとインキュベートすることにより、樹状細胞に分化させうる。Inaba et al.(1994)前掲は、幹細胞をネズミＧＭ‐ＣＳＦとインキュベートすることによる、樹状細胞へのネズミ幹細胞のインビトロ分化について記載していた。簡単に言えば、単離された幹細胞が、標準ＲＰＭＩ増殖培地において、１〜２００ｎｇ／ｍＬネズミＧＭ‐ＣＳＦ、好ましくは約２０ｎｇ／ｍＬ ＧＭ‐ＣＳＦとインキュベートされる。培地は一日おきに約１回新鮮な培地と換えられる。培養約５〜７日後に、表面マーカーの発現および細胞形態で評価すると、細胞の多くの割合が樹状である。樹状細胞は蛍光励起細胞分取（ＦＡＣＳ）または他の標準方法により単離される。
【０１８３】
ネズミＣＤ３４＋幹細胞は、該細胞をネズミＧＭ‐ＣＳＦと培養することにより、樹状細胞へ分化される。典型的には、培養物中ＧＭ‐ＣＳＦの濃度は少なくとも約０．２ｎｇ／ｍＬ、好ましくは少なくとも約１ｎｇ／ｍＬである。多くは、範囲が約２０ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬである。多くの好ましい態様において、用量は約１００ｎｇ／ｍＬである。ＩＬ‐４も、場合により、ネズミＤＣを作製するために類似範囲で加えられる。
【０１８４】
ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞は、好ましくは、該細胞をヒトＧＭ‐ＣＳＦおよびＴＮＦ‐αと培養することにより、インビトロにおいて分化される。例えば、Szabolcs et al.(1995)154:5851-5861参照。ヒトＧＭ‐ＣＳＦが類似範囲で用いられ、ＴＮＦ‐αも分化を促すために加えられる。ＴＮＦ‐αも典型的にはほぼ同様の範囲で加えられる。場合により、ＳＣＦまたは他の増殖リガンド（例えばＦｌｔ３）がヒトＤＣを分化させるために類似用量範囲で加えられる。
【０１８５】
当業者に明らかなように、幹細胞および単球を樹状細胞に分化させるための用量範囲は概算である。異なる供給者および同一供給者からの異なるロットのサイトカインは、サイトカインの活性に違いがある。具体的なサイトカインについて最適用量を決めるために用いられるスキルの一つで、各サイトカインについて容易に滴定しうる。
【０１８６】
樹状細胞への単球の分化
ＧＭ‐ＣＳＦおよびＩＬ‐４またはＧＭ‐ＣＳＦおよびＩＬ‐１３を含有した培地での培養により、末梢血中で頻出性但し非増殖性のＣＤ１４＋前駆体（単球）からＤＣが得られる（例えば、ＷＯ９７／２９１８２号参照）。この方法は、Sallusto and Lanzavecchia(1994)J.Exp.Med.179:1109およびRomani et al.(1994)J.Exp.Med.180:83において記載されている。簡単に言えば、（末梢血でＣＤ３４＋細胞およびよりコミットされた前駆体を増加させるために用いられる）Ｇ‐ＣＳＦのようなサイトカインによる患者の前処置がほとんどの症例で不要であると報告されているように、ＣＤ１４＋前駆体は豊富である（Romani et al.(1996)J.Immunol.Methods 196:137）。その他は、このアプローチで作製されるＤＣがどちらかといえば均一なようであり、未成熟状態または完全に分化したまたは成熟した状態で産生される、と報告していた。ＦＣＳ（ウシ胎児血清）のような非ヒトタンパク質を避けること、および成熟化刺激として自己単球ならし培地を用いることで完全かつ不可逆的な成熟および安定ＤＣを得ることは、可能であることが示された（Romani et al.(1996)Immunol.Methods 196:137、Bender et al.(1996)J.Immunol.Methods 196:121）。しかしながら、本発明とは対照的に、これらの研究では高レベルのＩＬ‐１２および／または低レベルのＩＬ‐１０を有する成熟ＤＣを生じなかった。
【０１８７】
抗原負荷
樹状細胞を抗原で負荷する方法は当業者に知られている。一つの態様において、樹状細胞は抗原を含有した培地で培養される。ＤＣは次いで抗原を取り込み、ＭＨＣ分子と会合状態にて細胞表面においてそれをプロセッシングする。好ましくは、抗原をコードする核酸でのトランスフェクションによりＤＣが抗原で負荷される。ＤＣをトランスフェクトする方法は当業者に知られている。
【０１８８】
Ｔ細胞の単離および拡大
本発明の一部方法において、Ｔ細胞は、それらが成熟修飾ＤＣによりインビトロで教育（または活性化）されるように、哺乳動物から単離される。一つの方法では、確立された操作に従い赤血球および好中球からＰＢＭＣを分離するために、Ficoll-Hypaque密度勾配遠心が用いられる。細胞が１％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）で補充された修正ＡＩＭ‐Ｖ（２ｍＭグルタミン、１０μｇ／ｍＬ硫酸ゲンタマイシン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン含有のＡＩＭ‐Ｖ（GIBCO）からなる）により洗浄される。Ｔ細胞が、標準技術に従いカラムまたは磁気ビーズへカップリングされた適切なモノクローナル抗体で、ネガティブまたはポジティブ選択により富化される。ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３、およびＣＤ１４を含めた細胞表面表現型に関して一部の細胞が解析される。説明のみの目的であるが、細胞が洗浄され、上記のように修正されて５％ＦＢＳおよび１００Ｕ／ｍＬ組換えＩＬ‐２（ｒＩＬ‐２）を含有するＡＩＭ‐Ｖ（補充ＡＩＭ‐Ｖ）のｍＬ当たり約５×１０５細胞の濃度で再懸濁される。細胞がＨＩＶ＋患者から単離される場合、２５ｎＭ ＣＤ４‐ＰＥ４０（トランスロケーションへ結合されたＨＩＶ‐１結合ＣＤ４ドメインおよびPseudomonas aeruginosa外毒素ＡのＡＤＰ‐リボシル化ドメインからなる組換えタンパク質）またはＨＩＶと選択的にハイブリッド形成する他の類似組換え細胞傷害性分子が、培養物からＨＩＶ感染細胞を選択的に除去するために細胞拡大の残部について細胞培養物へ加えられる。ＣＤ４‐ＰＥ４０は、ＨＩＶ感染細胞培養物においてｐ２４産生を阻害して、ＨＩＶ‐１感染細胞を選択的に殺すことが示された。
【０１８９】
増殖を刺激するために、ＯＫＴ３モノクローナル抗体（Ortho Diagnostics）が１０ｎｇ／ｍＬの濃度で加えられ、細胞が２４ウェルプレートへ０．５ｍｌ／ウェルで入れられる。細胞が５％ＣＯ２の保湿インキュベーター中約３７℃の温度で４８時間培養される。培地が細胞から吸引され、１ｍＬのベクター含有上澄（下記）が５μＬ／ｍＬの硫酸プロタミン、１００Ｕ／ｍＬ ｒＩＬ‐２、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、０．２５μｇ／ｍＬアンホテリシンＢ／ｍＬ、および追加の１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（２５ｎＭ ＣＤ４‐ＰＥ４０も加えられる）で補充される。
【０１９０】
細胞単離および特徴づけ
他の態様においては、本発明の方法を実施する上で必要な細胞を単離するために細胞表面マーカーが用いられる。例えば、ヒト幹細胞は典型的にはＣＤ３４抗原を発現し、一方でＤＣはＭＨＣ分子および補助刺激分子（例えば、Ｂ７‐１およびＢ７‐２）を発現するが、顆粒球、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、およびＴ細胞に特異的なマーカーを欠く。表面マーカーの発現はこれら細胞の同定および精製を容易にする。同定および単離のこれら方法としては、ＦＡＣＳ、カラムクロマトグラフィー、磁気ビーズでのパンニング、ウエスタンブロット、ラジオグラフィー、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、超拡散クロマトグラフィーなど、および様々な免疫学的方法、例えば流体またはゲル沈降反応、免疫拡散（単純または二重）、免疫電気泳動、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイなどがある。一般的な免疫学的および免疫アッセイ操作の総説に関しては、Stites and Terr(eds.)1991,Basic and Clinical Immunology(7th ed.)およびPaul前掲参照。選択された抗原に対する抗体をどのように作製するかという考察に関しては、Harlow and Lane(1989)前掲参照。
【０１９１】
細胞精製に際する細胞の検出のための細胞単離または免疫アッセイは、いくつかの方式のうちいずれかで、例えばMaggio(ed.)(1980)Enzyme Immunoassay,CRC Press,Boca Raton,Fla.、Tijan(1985)”Practice and Theory of Enzyme Immunoassays”,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,Elsevier Science Publishers B.V.,Amsterdam、Harlow and Lane,前掲、Chan(ed.)(1987)Immunoassay:A Practical Guide Academic Press,Orlando,Fla.、Price and Newman(eds.)(1991)Principles and Practice of Immunoassays,Stockton Press,NY、およびNgo(ed.)(1988)Non-isotopic Immunoassays,Plenum Press,NYで概説されているものにより行える。
【０１９２】
細胞はＦＡＣＳ解析のようなフローサイトメトリー法により単離および特徴づけされる。様々なフローサイトメトリー法が知られている。蛍光活性化フローサイトメトリーの一般的概説については、例えばAbbas et al.(1991)Cellular and Molecular immunology,W.B.Saunders Company,特にchapter 3およびKuby(1992)Immunology,W.H.Freeman and Company,特にchapter 6参照。ＦＡＣＳ機器は、例えばBecton Dickinsonから入手しうる。
【０１９３】
細胞抗原を標識するために用いられる標識剤には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、タンパク質、または他のポリマー、例えばアフィニティマトリックス、炭水化物、または脂質があるが、それらに限定されない。イムノブロット法、ウエスタンブロット解析、放射性または生物発光マーカーの追跡、キャピラリー電気泳動、あるいは大きさ、電荷または親和性に基づき分子を追跡する他の方法のような、いずれか公知の方法により検出が進められる。
【０１９４】
抗体
本方法のある態様は抗体の使用を必要とする。このような抗体はモノクローナルでもまたはポリクローナルでもよい。それらは抗体誘導体でもまたは抗体バリアントでもよい。それらはキメラ、ヒト化でも、または全部ヒトでもよい。当業界における技術の一つでタンパク質またはポリペプチドを用いれば、レセプターと特異的に結合する抗体を更に作製しうる。Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆａｂ２、Ｆａｂ′２および一本鎖可変領域を含めた、抗体の機能的断片または誘導体も用いられる。抗体は細胞培養、ファージまたは様々な動物、例えば限定されないが、ウシ、ウサギ、ヤギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ヒツジ、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、類人猿などで産生しうる。断片または誘導体がタンパク質またはその断片と結合する特異性を留めている限り、それも用いられる。一連の所定条件下において、適切な抗原との結合性を、無関係な抗原または抗原混合物との結合性と比較することにより、抗体が結合の特異性について試験される。抗体が無関係な抗原または抗原混合物より少なくとも２、５、７、好ましくは１０倍多く適切な抗原と結合するならば、それは特異的であると考えられる。
【０１９５】
このような部分的〜完全ヒト抗体を作製するための技術は当業界で公知であり、このようないかなる技術も用いられる。一つの態様によると、完全ヒト抗体配列はヒト重鎖抗体遺伝子および軽鎖抗体遺伝子を発現するように工学処理されたトランスジェニックマウスで作製される。異なるクラスの抗体を産生しうる多数のこのようなトランスジェニックマウス株が作製されていた。望ましい抗体を産生するトランスジェニックマウスからのＢ細胞は、望ましい抗体の連続産生のためのハイブリドーマ細胞系を作製するために融合させてもよい。例えば、Russel et al.(2000)Infection and Immunity,April 2000:1820-1826、Gallo et al.(2000)European J.of Immun.30:534-540、Green(1999)J.of Immun.Methods 231:11-23、Yang et al.(1999A)J.of Leukocyte Biology 66:401-410、Yang(1999B)Cancer Research 59(6):1236-1243、Jakobovits(1998)Advanced Drug Delivery Reviews 31:33-42、Green and Jakobovits(1998)Exp.Med.188(3):483-495、Jakobovits(1998)Exp.Opin.Invest.Drugs 7(4):607-614、Tsuda et al.(1997)Genomics 42:413-421、Sherman-Gold(1997)Genetic Engineering News 17:14、Mendez et al.(1997)Nature Genetics 15:146-156、Jakobovits(1996)WEIR’S HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY,THE INTEGRATED IMMUNE SYSTEM VOL.IV,194.1-194.7、Jakobovits(1995)Current Opinion in Biotechnology 6:561-566、Mendez et al.(1995)Genomics 26:294-307；Jakobovits(1994)Current Biology 4:761-763、Arbones et al.(1994)Immunity 1:247-260、Jakobovits(1993)Nature 362:255-258、Jakobovits et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551-2555、Kucherlapati et al.、米国特許第６，０７５，１８１号参照。
【０１９６】
抗体はファージディスプレイ技術を用いて作製してもよい。このような技術は初期抗体を単離するために、または特異性またはアビディティ特性が変化したバリアントを作製するために用いられる。一本鎖Ｆｖも便宜上用いられる。所望であれば、それらはワクチン接種トランスジェニックマウスから作製される。
【０１９７】
本発明の抗体はキメラ抗体を作製するために修飾してもよい。キメラ抗体とは、抗体重鎖および軽鎖の様々なドメインが二種以上からのＤＮＡでコードされているものをいう。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照。
【０１９８】
“抗体バリアント”という用語は、二つの抗原結合部位をもつ小さな抗体断片である“ダイアボディ”も含み、該断片は同一ポリペプチド鎖（ＶＨ ＬＬ）で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とつながれた重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含んでなる。例えば、ＥＰ４０４，０９７号、ＷＯ９３／１１１６１号、およびHollinger et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448参照。同一鎖の二つドメイン間で対合するには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインに他の鎖の相補的ドメインと対合させて、二つの抗原結合部位を作製させる。一以上のアミノ酸を親抗体の超可変領域へ挿入させた、抗原への親抗体の結合親和性より少なくとも約２倍強い標的抗原への結合親和性を有する、抗体バリアントについて開示する、Chenらの米国特許第６，６３２，９２６号も参照。該用語は、抗体または断片の線状ポリペプチド配列への翻訳後修飾も含む。“抗体バリアント”という用語は、更に“線状抗体”を含む。このようなバリアントを作製するための操作は当業界で知られ、Zapata et al.(1995)Protein Eng.8(10):1057-1062において記載されている。簡単に言えば、これらの抗体は、一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ〜ＣＨ１‐ＶＨ〜ＣＨ１）を含んでなる。線状抗体は二重特異性でもまたは単一特異性でもよい。
【０１９９】
核酸を検出するための方法
様々な方法が対象の遺伝子（例えば、ＣＤ４０Ｌおよび／またはＩＬ‐１２ｐ３５）の発現を定量するために知られており、ハイブリッド形成アッセイ（ノーザンブロット解析）およびＰＣＲベースハイブリッド形成アッセイがあるが、それらに限定されない。ＩＬ‐１２ｐ３５ ｍＲＮＡまたはＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡのようなｍＲＮＡレベルの変化についてアッセイする場合、サンプル中に含まれる核酸が最初に抽出される。例えば、ｍＲＮＡはSambrook et al.(1989)前掲において記載された操作に従い様々な溶解酵素または化学溶液を用いて単離されるか、または製造業者により用意される添付説明書に従い市販核酸結合樹脂により抽出される。次いで抽出核酸サンプル中に含まれるｍＲＮＡが、標準的な操作に従い核酸プローブおよび／またはプライマーを各々用いて、ハイブリッド形成（例えば、ノーザンブロット解析）および／または増幅操作により検出される。
【０２００】
少なくとも１０のヌクレオチドを有して、検出される核酸と配列相補性または相同性を示す核酸分子が、診断法でハイブリッド形成プローブまたはプライマーとして用いられる。“完全マッチ”プローブは特異的ハイブリッド形成に不要であることが、当業界で知られている。小数の塩基の置換、欠失、または挿入により得られるプローブ配列中のわずかな変化は、ハイブリッド形成特異性に影響を与えない。一般的に、（最適に整列されたときは）２０％塩基対ミスマッチでも許容される。例えば、ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡを検出する上で有用なプローブは、前記配列、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または３に含まれる匹敵サイズの相同的領域と少なくとも約８０％同一性である。一方、プローブは相同的領域のアライメント後に対応遺伝子配列と少なくとも８５％または更には少なくとも９０％同一性である。断片の全ての大きさと相補的ストレッチの大きさは、具体的な核酸セグメントで意図される使用または適用例に依存する。遺伝子の小さな断片は通常ハイブリッド形成態様で使い、その際に相補的領域の長さは検出したい相補配列に応じて様々であり、例えば約１０〜約１００ヌクレオチドであるか、または更には全長に及ぶ。
【０２０１】
長さが約１０ヌクレオチド以上のストレッチにわたり相補的配列を有するヌクレオチドプローブはハイブリッドの安定性および選択性を増加させ、それにより得られる具体的ハイブリッド分子の特異性を改善する。長さが約２５以上、更に好ましくは約５０ヌクレオチド以上、または所望であればそれ以上の遺伝子相補的ストレッチを有する核酸分子を設計してもよい。このような断片は、例えば化学的手段で該断片を直接合成することにより、米国特許第４，６０３，１０２号において記載されているような二つのプライミングオリゴヌクレオチドでのＰＣＲＴＭ技術のような核酸複製技術の適用により、または組換え産生のために組換えベクターへ選択配列を導入することにより、容易に作製されてもよい。
【０２０２】
ある態様においては、ハイブリッド形成、ひいては相補的配列を検出するために、ラベルのような適切な手段と組み合わせて本発明の核酸配列を用いることが有利であろう。検出可能なシグナルを生じうる蛍光、放射性、酵素、または他のリガンド、例えばアビジン／ビオチンを含めた、様々な適切な指示手段が当業界で知られている。蛍光ラベルまたは酵素タグ、例えばウレアーゼ、アリカリホスファターゼ、またはペルオキシダーゼも、放射性または他の環境上望ましくない試薬の代わりに用いられる。酵素タグの場合には、ヒトの目に見えるまたは分光光度測定による手段を用意して、相補的核酸含有サンプルとの特異的ハイブリッド形成を特定するために用いられる、比色指示基質が知られている。
【０２０３】
ハイブリッド形成反応は、異なる“ストリンジェンシー”の条件下において行われる。関連条件としては、温度、イオン強度、インキュベーションの時間、ホルムアミドのような反応混合液中の追加溶質の存在および洗浄操作がある。高いストリンジェンシー条件とは、安定なハイブリッド形成複合体を形成するためにハイブリッド形成要素間において高い最少相補性を必要とする、高い温度および低いナトリウムイオン濃度のような条件である。ハイブリッド形成反応のストリンジェンシーを増加させる条件は当業界において広く知られ、出版されている。Sambrook et al.(1989)前掲参照。Velculescu et al.(1995)Science 270:484-487において記載されているSerial Analysis of Gene Expression（ＳＡＧＥ）のようなハイスループット解析または定量的ＰＣＲを用いて、ｍＲＮＡレベルまたはその発現を検出および定量することもできる。簡単に言えば、該方法は、転写物を含有していると疑われる細胞または組織サンプルから多種のｍＲＮＡを単離することを含んでなる。場合により、遺伝子転写物がｃＤＮＡへ変換される。遺伝子転写物のサンプリングは配列特異的解析に付されて、定量される。これらの遺伝子転写物配列アバンダンスが、罹患および健常者のノーマルデータセットを含むリファレンスデータベース配列アバンダンスと比較される。患者は該患者のデータセットが最も近く相関する疾患を有していることになり、本出願の場合それには転写物の差異も含める。
【０２０４】
ある態様においては、遺伝子または遺伝子転写物の増幅または検出用のヌクレオチドプローブまたはプライマーとしてポリヌクレオチドを用いることが必要である。示差的に発現されるｍＲＮＡを検出するために有用なプライマーは、遺伝子またはポリヌクレオチドの匹敵サイズの相同性領域と少なくとも約８０％同一性である。本発明の目的にとり、増幅とは、妥当な忠実度で標的配列を複製しうるプライマー依存性ポリメラーゼを用いる方法を意味する。増幅は、天然または組換えＤＮＡポリメラーゼ、例えばＴ７ＤＮＡポリメラーゼ、E.coli ＤＮＡポリメラーゼのKlenow断片、および逆転写酵素により行われる。
【０２０５】
ＰＣＲの一般的操作は、MacPherson et al.,PCR:A PRACTICAL APPROACH（IRL Press at Oxford University Press(1991)）において開示されている。しかしながら、各適用反応に用いられるＰＣＲ条件は実験により調べられる。いくつかのパラメーターは反応の成功に影響を与える。それらの中には、アニーリング温度および時間、伸長時間、Ｍｇ２＋ＡＴＰ濃度、ｐＨおよびプライマー、テンプレート、およびデオキシリボヌクレオチドの相対濃度がある。
【０２０６】
増幅後、得られたＤＮＡ断片はアガロースゲル電気泳動、次いで臭化エチジウム染色および紫外線照射での視覚化により検出される。対象の示差発現遺伝子の特異的増幅は、増幅ＤＮＡ断片が予想サイズを有し、予想制限消化パターンを示し、および／または正確なクローン化ＤＮＡ配列とハイブリッド形成することを証明することで実証される。遺伝子発現を検出する他の方法も当業者に知られている。例えば、国際ＰＣＴ出願ＷＯ９７／１０３６５号、米国特許第５，４０５，７８３号、第５，４１２，０８７号、第５，４４５，９３４号、第５，４０５，７８３号、第５，４１２，０８７号、第５，４４５，９３４号、第５，５７８，８３２号、第５，６３１，７３４号、およびLABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY,Vol.24:Hybridization with Nucleic Acid Probes,Tijssen,ed.Elsevier,N.Y.(1993)参照。
【０２０７】
タンパク質またはポリペプチドを検出および定量するための方法
様々な技術がタンパク質解析のために当業界では利用でき、それにはラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノラジオメトリックアッセイ）、“サンドイッチ”イムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、in situ イムノアッセイ（例えば、コロイド金、酵素、または放射性同位元素標識を用いる）、ウエスタンブロット解析、免疫沈降アッセイ、免疫蛍光アッセイ、およびＰＡＧＥ‐ＳＤＳがあるが、それらに限定されない。
【０２０８】
エクスビボ療法
上記のように、本発明は本発明の方法により産生された樹状細胞または教育Ｔ細胞を用いるエクスビボ療法も提供する。例えば、免疫原で形質転換された樹状細胞が、インビトロにおいて細胞傷害性およびヘルパーＴ細胞を活性化するために用いられる。一方、形質転換された樹状細胞は、インビボでＴ細胞を活性化するために哺乳動物へ導入される。更には、インビトロで教育されたＴ細胞が哺乳動物へ導入されるが、そこではＴ細胞が活性化されてクラスＩ ＭＨＣ分子で認識するものと対応する抗原性ペプチドを担持した標的細胞に対してそれらは細胞傷害性である。これらの標的細胞は典型的には癌細胞、またはＭＨＣクラスＩ表面において特有の抗原性ペプチドを発現する感染細胞である。
【０２０９】
同様に、ＭＨＣクラスIIの関係で抗原性ペプチドを認識するヘルパーＴ細胞も、クラスＩおよびクラスII ＭＨＣ双方の関係で抗原性ペプチドを含んでなる本発明のＤＣにより刺激される。ヘルパーＴ細胞は標的細胞に対する免疫応答も刺激する。細胞傷害性Ｔ細胞の場合のように、ヘルパーＴ細胞がインビトロまたはインビボにおいて組換えＤＣにより刺激される。
【０２１０】
樹状細胞およびＴ細胞は、ＤＣおよび／または活性化Ｔ細胞が投与されるはずの哺乳動物から単離される。一方、細胞はドナーから同種異系で用意しても、または細胞バンク（例えば、血液バンク）に保存してもよい。
【０２１１】
インビボ療法
本発明の方法により産生されたＴ細胞または樹状細胞が、選択された免疫原に対して活性なＴ細胞を産生するために、対象者へ直接投与される。対象者の血液または組織細胞との最終的接触へ細胞をうまく運ぶための投与は、当業界において公知の方法による。
【０２１２】
多くは薬学上許容される担体と一緒に、細胞がいずれか適切な手法で投与される。本発明の関係で細胞を対象者へ投与する適切な方法が利用でき、二以上の経路が具体的な細胞組成物を投与するために用いられるが、特定の経路が他の経路よりも即効性の反応を多くの場合に呈する。好ましい投与経路には皮内および静脈内投与があるが、それらに限定されない。
【０２１３】
薬学上許容される担体は、投与される具体的な組成物と、組成物を投与するために用いられる具体的な方法により、一部は定められる。したがって、本発明の医薬組成物の適切な処方物には様々なものがある。最も典型的には、品質コントロール（微生物学的、クローン原性アッセイ、生存能力試験）が行われ、ジフェンヒドラミンおよびヒドロコルチゾンの投与を先行させてから、細胞が対象者へ逆に再注入される。例えば、Korbling et al.(1986)Blood 67:529-532およびHaas et al.(1990)Exp.Hematol.18:94-98参照。
【０２１４】
例えば関節内（関節部）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、リンパ節内、および皮下経路のような非経口投与に適した処方物には、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、および処方物を所定レシピエントの血液と等張にさせる溶質を含有しうる水性等張無菌注射液と、懸濁剤、溶解剤、増粘剤、安定剤、および保存剤を含有しうる水性および非水性無菌懸濁液がある。皮内および静脈内投与が本発明のＤＣまたはＴ細胞にとり好ましい投与方法である。
【０２１５】
対象者へ投与される細胞（例えば、活性化Ｔ細胞または樹状細胞）の用量は、経時的に対象者で望ましい有益な治療応答を発揮させ、癌細胞の成長を抑制し、または感染を抑制するために効果的な、有効量である。
【０２１６】
説明のみの目的であるが、後の解析および比較のために、注入前に対象者から血液サンプルを得て保管することにより、本方法が実施される。通常、少なくとも約１０４〜１０６、典型的には１×１０８〜１×１０１０細胞が約６０〜１２０分間かけて７０ｋｇ患者へ静脈内または腹腔内注入される。一つの態様において、投与は静脈内注入による。バイタルサインおよび酸素飽和がパルスオキシメトリーにより綿密に測定される。血液サンプルが注入後５分間および１時間で採取され、解析用に保管される。細胞再注入は、１年間にわたりほぼ毎月、全部で１０〜１２回の処理により繰り返される。初回治療後は、医者の裁量により外来患者ベースで注入が行われる。再注入が外来患者として行われるならば、参加者は治療後少なくとも４時間測定される。
【０２１７】
投与に際しては、対象者の大きさおよび総合健康度と合うように、有効用量、細胞タイプのＬＤ‐５０（または他の毒性尺度）および様々な濃度での細胞種の副作用により決められる割合により、本発明の細胞が投与される。投与は１回でまたは用量分割して行われる。本発明の細胞は、細胞傷害剤、ヌクレオチドアナログ、および生物応答調整剤を含めた、公知の従来療法による他の対症治療を補える。同様に、生物応答調整剤が本発明のＤＣまたは活性化Ｔ細胞による治療へ場合により加えられる。例えば、細胞は場合によりアジュバントまたはサイトカイン、例えばＧＭ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐１２、またはＩＬ‐２と一緒に投与される。
【０２１８】
インビトロアッセイおよびキット
本発明は、本発明の成熟化方法を実施するための商業上有用なキットを提供する。一つの態様において、該キットは、ＩＦＮγポリペプチドまたはインビボもしくはインビトロでＩＦＮγ ｍＲＮＡを発現させるための発現カセット、およびＣＤ４０ＬポリペプチドまたはＣＤ４０Ｌのインビボもしくはインビトロ発現でＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡを発現させるための発現カセットを含んでなる。他の態様において、該キットは、ＴＮＦαポリペプチドまたはインビボもしくはインビトロでＴＮＦα ｍＲＮＡを発現させるための発現カセット、およびＣＤ４０ＬポリペプチドまたはＣＤ４０Ｌのインビボもしくはインビトロ発現でＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡを発現させるための発現カセットを含んでなる。該キットはインビトロ転写のためのＲＮＡポリメラーゼを更に含んもよい。
【０２１９】
免疫原性を評価するための方法
本発明の方法により産生された抗原提示細胞または教育されたＴ細胞の免疫原性は、以下に限定されないが、それらを含めた周知の方法論により調べられる：
５１Ｃｒ‐放出溶解アッセイ．抗原特異的Ｔ細胞によるペプチド‐パルス５１Ｃｒ‐標識標的の溶解が比較される。“より活性な”組成物ほど時間の関数として標的の大きな溶解を示す。固定時点（例えば４時間）における溶解の動態と全体的標的溶解が、性能を評価するために用いられてもよい。Ware et al.(1983)J.Immunol.131:1312。
サイトカイン‐放出アッセイ．修飾ＡＰＣとの接触時にＴ細胞により分泌されるサイトカインの種類と量の解析が、機能活性の尺度となる。サイトカイン産生の速度および総量を調べるために、サイトカインがＥＬＩＳＡまたはＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定される。Fujihashi et al.(1993)J.Immunol.Meth.160:181、Tanquay and Killion(1994)Lymphokine Cytokine Res.13:259。
インビトロＴ細胞教育．本発明の組成物が、正常ドナーまたは患者由来ＰＢＭＣから反応性Ｔ細胞集団を誘起しうる能力に関してアッセイされる。この系では、誘起されたＴ細胞が、溶解活性、サイトカイン放出、多クローン性、および抗原エピトープに対する交差反応性について試験される。Parkhurst et al.(1996)Immunol.157:2539。
トランスジェニック動物モデル．ＨＬＡトランスジェニックマウスを本発明の組成物で接種して、誘導された免疫応答の性質および程度を調べることにより、免疫原性がインビボにおいて評価される。一方、ｈｕ‐ＰＢＬ‐ＳＣＩＤマウスモデルは、ヒトＰＢＬの適合移植(adoptive transfer)によりマウスでヒト免疫系の再構築を行える。これらの動物が本組成物で接種され、Shirai et al.(1995)J.Immunol.154:2733、Mosier et al.(1993)Proc.Natl Acad.Sci.USA 90:2443において以前に述べられたように免疫応答に関して解析される。
増殖アッセイ．Ｔ細胞が反応性組成物に応答して増殖する。増殖は、例えば３Ｈ‐チミジン取込みを測定することにより、定量的に測定される。Caruso et al.(1997)Cytometry 27:71。
霊長類モデル．非ヒト霊長類（チンパンジー）モデル系が、ＨＬＡ拘束性リガンドのインビボ免疫原性を測定するために利用しうる。チンパンジーはヒトＭＨＣ分子とオーバーラップするＭＨＣ‐リガンド特異性を共有し、そのため相対的インビボ免疫原性についてＨＬＡ拘束性リガンドを試験しうることが証明されていた。Bertoni et al.(1998)Immunol.161:4447。
ＴＣＲシグナル伝達事象のモニタリング．いくつかの細胞内シグナル伝達入事象（例えば、リン酸化）は、ＭＨＣ‐リガンド複合体によるうまいＴＣＲかみ合いと関連している。これら事象の定性および定量解析が、ＴＣＲかみ合いでエフェクター細胞を活性化させうる組成物の相対的能力と相関していた。Salazar et al.(2000)Tnt.J.Cancer 85:829、Isakov et al.(1995)J.Exp.Med.181:375。
【０２２０】
上記に従い、下記実施例が本発明の様々な態様を実証するためにあるが、本発明を限定するためのものではない。
【実施例】
【０２２１】
実験例
試薬
Histopaque １０７７およびＴｗｅｅｎ２０は、Sigma（St.Louis,ＭＯ）から購入した。ＰＢＳおよびＸ‐ＶＩＶＯ１５はCambrex（East Rutherford,Ｎｉ）から購入した。ＡＩＭ‐Ｖ培地、イスコフ改変ダルベッコ培地およびＲＰＭＩ１６４０培地は、トリパンブルーおよびウシ胎児血清（ＦＢＳ）と一緒に、Invitrogen（Carlsbad,ＣＡ）から購入した。Viaspanは、Dupont Pharma Labs（Wilmington,ＤＥ）から購入した。ＧＭ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐４、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐１β、ＩＬ‐６、およびＩＦＮ‐γはすべてR&D Systems（Minneapolis,ＭＮ）から購入した。ＰＧＥ２はCayman Chemicals（Ann Arbor,ＣＡ）から購入した。可溶性ＣＤ４０ＬはAlexis Biochemicals（San Diego,ＣＡ）から購入した。ヒトＡＢ血清はValley Biochemical（Winchester,ＶＡ）から購入した。
【０２２２】
ケモカインＣＣＬ１９およびＣＣＬ２１はPeprotech（Rocky Hill,ＮＪ）から購入した。フェノタイピング抗体（ＨＬＡ‐ＡＢＣ、ＨＬＡ‐ＤＲ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ１４、および陰性イソタイプコントロール）、ＥＬＩＳｐｏｔ抗体ペア（ＩＦＮ‐γおよびＩＬ‐２）ＥＬＩＳＡセット（ＩＬ‐１２およびＩＬ‐１０）およびストレプトアビジン‐ＨＲＰはすべて、ＢＤ Ｏｐｔ ＥＩＡ試薬Ｂ ｐＨ９．５と一緒に、ＢＤ Pharmingen（San Diego,ＣＡ）から購入した。ＡＥＣペルオキシダーゼ基質はVector labs（Vector Labs,Burlingame,ＣＡ）から購入した。遮断抗ＣＤ４０抗体はeBioscienceから購入した。ＣＤ１ｄ／α‐ガラクトシルセラミド（ＫＲＮ７０００）テトラマーおよび天然ＫＲＮ７０００はKirin Brewery,Pharmaceuticals Division,Tokyo,Japanからの贈与された。ＭＡＲＴ‐１／ＨＬＡ‐Ａ２０１テトラマーはBeckman-Coulter（Miami,ＦＬ）から購入した。
【０２２３】
ＤＣ作製
Life Blood（Memphis,Tennessee）により供給される健康ボランティアからの白血球搬出コレクションからヒトＰＢＭＣを単離した。ＰＢＭＣをFicoll-Histopaque密度遠心により調製し、室温にてＰＢＳにより４回洗浄した。２×１０８ＰＢＭＣを３０ｍＬ ＡＩＭ‐Ｖ培地へ再懸濁し、３７℃において２時間かけて１５０ｃｍ３プラスチックフラスコへ接着させた。非接着細胞を除去し、ＧＭ‐ＣＳＦ（１０００Ｕ／ｍＬ）およびＩＬ‐４（１０００Ｕ／ｍＬ）で補充されたＸ‐ＶＩＶＯ１５培地中３７℃、５％ＣＯ２で５〜６日間にわたり残留細胞を培養した。
【０２２４】
ＣＤ４０Ｌのクローニング
Ｔ細胞をＲＰＭＩ中ＰＭＡにより１時間刺激した。細胞を回収し、ＰＢＳで１回洗浄した。QIAGEN ＲＮeasy操作を用いて全ＲＮＡを抽出した。活性化Ｔ細胞からの１μｇの全ＲＮＡを、高忠実度アドバンテージポリメラーゼ（Clontech）を用いるGene Amp Goldキット（Applied Bioscience）を用いて、ワンチューブＲＴ‐ＰＣＴ反応へ入れた。ＣＤ４０Ｌ配列用の遺伝子特異的プライマーはＣＤ４０Ｌ配列の塩基４７‐８５９に相当する：ＣＤ４０Ｌ ５′プライマー：５′‐ＧＣＡＴＣＡＴＣＧＡＡＡＣＡＴＡＣＡＡＣＣ‐３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）およびＣＤ４０ ３′プライマー：５′‐ＧＴＡＴＴＡＴＧＡＡＧＡＣＴＣＣＣＡＧＣＧ‐３′（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２）。ＰＣＲ断片を精製し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Invitrogen）を用いてｐＣＲ２．１ベクターへサブクローニングした。ＣＤ４０Ｌ読み取り枠の配列解析およびGenBankコンセンサス配列とのアライメントでは、二つの突然変異の存在を示した。一つの突然変異は保守的であり、アミノ酸変化へ至らなかった。他のヌクレオチド置換はＡｓｎからＳｅｒへのアミノ酸変化を生じた。非保守的アミノ酸変化をアスパラギンへ逆補正するために、部位特異的変異を行った。簡単に言えば、１０〜４０ｎｇのＣＤ４０Ｌ ＰＣＲ２．１プラスミドＤＮＡを、カスタム５′リン酸化およびＨＰＬＣ精製プライマー（QIAGEN）、ＰＦＵ Ultra酵素と共に１０×ＰＣＲ緩衝液（Stratagene）およびｄＮＴＰ（Clontech）を用いて、部位特異的変異に用いた。ＰＣＲ反応後、ＤｐｎＩ制限酵素（Promega）を加え、親テンプレートを消化させるために３７℃で１時間インキュベートした。この反応液５μＬを次いでOneshot ＭＡＣＨ Ｔ１Ｒコンピテント細胞（Invitrogen）へトランスフォームし、調製したばかりのアンピシリン含有ＬＢプレートへ入れた。６個のコロニーを選択し、アンピシリン含有ＬＢ中３ｍＬ培養物として一晩増殖させた。プラスミドminiprep（QIAGEN）を用いてＤＮＡを単離した。Ｍ１３ＦおよびＭ１３Ｒプライマー（Invitrogen）を用いたＣＤ４０Ｌ読み取り枠の配列解析のために、各クローンについて精製ＤＮＡのアリコートをUniversity of North Carolina（ＵＮＣ）配列決定施設へ提出した。次いで、ＤＮＡＳＴＡＲ Seqman解析ソフトウェアを用いて、ＣＤ４０Ｌに関するコンセンサスGenBank配列とすべてのクローンを整列させてみた。クローン＃２（ＣＤ４０Ｌ ＷＴ ＰＣＲ２．１に改名）が正確に変異された塩基を含有することから選択された。
【０２２５】
ＤＣのトランスフェクションのためのｍＲＮＡの作製
ＳｐｅＩ制限酵素を用いてＣＤ４０Ｌ ＷＴ ＰＣＲ２．１プラスミドを線状化させ、フェノール／クロロホルム抽出に続いてエタノール沈降により精製した。線状テンプレートを水中において再構築させ、製造業者の説明に従いmMessage mMachine Ｔ７ Ultraキット（Ambion）を用いてインビトロ転写した。ポリアデニル化反応へ進む前に、最終解析のためにＲＮＡのアリコートを保管した。ＲＮＡクリーンアップのプロトコールに従いＲＮeasyカラム（QIAGEN）を用いてポリアデニル化ＲＮＡを精製した。ＲＮＡを水で溶出させ、−１５０℃以下において個別サイズアリコートとして保存した。ＲＮＡ Bioanalyzer ２１００を用いて非ポリアデニル化ＲＮＡおよび最終産物の比較解析によりポリＡテール長さを調べた。
【０２２６】
ＤＣのエレクトロポレーション
エレクトロポレーション前に、ＤＣを回収し、ＰＢＳにより洗浄し、次いで０．５ｍＬ中４×１０７／ｍＬまたは０．２ｍＬ中、２．５×１０７／ｍＬで冷却ViaSpan（Barr Laboratories）に再懸濁し、氷上に置いた。ＤＣをｍＲＮＡ（抗原をコードするｍＲＮＡの場合１または２μｇ／１０６およびＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡの場合４μｇ／１０６）と混合し、４ｍｍギャップエレクトロポレーションキュベットに入れ、Bio-Rad装置を用いてエレクトロポレートした。エレクトロポレーション直後に、ＤＣをＸ‐ＶＩＶＯ １５培地で洗浄し、最後にＧＭ‐ＣＳＦ（８００Ｕ／ｍＬ）およびＩＬ‐４（５００Ｕ／ｍＬ）で補充されたＸ‐ＶＩＶＯ １５に１×１０６／ｍＬで再懸濁し、低接着性６ウェルプレート（ＢＤ Biosciences,Franklin Lakes,ＮＪ）中、３７℃において４または２４時間培養した。下記の追加成熟化刺激もこの時点で加えた。
【０２２７】
ＤＣ成熟化‐サイトカインカクテル工程
未成熟ＤＣを場合により様々な抗原コードｍＲＮＡによりトランスフェクトし、次いでＴＮＦ‐α（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ‐１β（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ‐６（１００ｎｇ／ｍＬ）、およびＰＧＥ２（１μｇ／ｍＬ）含有の“サイトカインカクテル”で処理し、ＧＭ‐ＣＳＦおよびＩＬ‐４を含有する培地中、３７℃において一晩培養した。
【０２２８】
ＤＣ成熟化‐ＣＤ４０Ｌベース工程
エレクトロポレーション後、ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡでトランスフェクトされたＤＣをＩＦＮ‐γ（１０００Ｕ／ｍＬ）またはＴＮＦ‐α（１０ｎｇ／ｍＬ）またはＩＦＮ‐γおよびＰＧＥ２の組合せ（１μｇ／ｍＬ）により処理した。比較により、未成熟ＤＣを様々な抗原コードｍＲＮＡでトランスフェクトし、次いで１０００Ｕ／ｍＬ ＩＦＮ‐γの同時または順次添加により、ＴＮＦ‐α（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ‐１β（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ‐６（１００ｎｇ／ｍＬ）、およびＰＧＥ２（１μｇ／ｍＬ）または可溶性ＣＤ４０Ｌ（２００ｎｇ／ｍＬ）＋エンハンサー（１μｇ／ｍＬ）含有の“サイトカインカクテル”で処理した。
【０２２９】
ＤＣ成熟化‐ＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ工程
未成熟ＤＣを培養の５日目にＴＮＦ‐α（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＦＮ‐γ（１０００Ｕ／ｍＬ）、およびＰＧＥ２（１μｇ／ｍＬ）で表現型成熟させた。６日目に成熟ＤＣを回収し、前記のように抗原およびＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡでエレクトロポレーションし、ワクチン生産のための回収または処方前に４時間にわたり８００Ｕ／ｍＬ ＧＭ‐ＣＳＦおよび５００Ｕ／ｍＬ ＩＬ‐４含有のＸ‐ＶＩＶＯ １５培地で培養した。
【０２３０】
α‐ガラクトシルセラミド（ＫＲＮ７０００）と組み合わせた、ＣＤ４０Ｌベース工程でのＤＣ成熟化
２４時間の培養に際して、５００Ｕ／ｍＬ ＩＦＮ‐γおよび１μｇ／ｍＬ ＰＧＥ２と組み合わせて、エレクトロポレーション直後にＣＤ４０Ｌベース工程ＤＣに１００ｎｇ／ｍＬのＫＲＮ７０００でパルスした。
【０２３１】
ＤＣのフローサイトメトリー解析
１０６ＤＣを回収し、冷ＰＢＳ／１％ＦＣＳに再懸濁した。ＭＨＣ分子（ＨＬＡ‐ＡＢＣ、ＨＬＡ‐ＤＲ）、補助刺激分子（ＣＤ８０、ＣＤ８６）、成熟マーカー（ＣＤ８３）および単球マーカー（ＣＤ１４）に特異的なフィコエリトリン（ＰＥ）またはＦＩＴＣ複合化抗体を９６ウェルプレート（ＢＤ Biosciences）でウェル当たり１×１０５ＤＣと混合し、４℃において最少１５分間インキュベートした。イソタイプ適合抗体をコントロールとして用いた。よく洗浄後、CellQuestソフトウェア（ＢＤ Biosciences）を用いてＦＡＣＳcaliburフローサイトメーター（ＢＤ Biosciences）で蛍光解析を行った。
【０２３２】
ＣＤ４０Ｌの細胞内発現を次のように調べた：２×１０５ＤＣまたはＨｅＬａ細胞をＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡでトランスフェクション後様々な時点で回収し、４℃において最少１０分間から２時間にわたり２５０μＬのCytofix／Cytoperm溶液（ＢＤ Biosciences）に再懸濁した。細胞を２ｍＬ染色用緩衝液（ＰＢＳ、ＢＳＡ、ＮａＮ３、およびＥＤＴＡ）で２回洗浄し、０．５ｍＬ染色用緩衝液に再懸濁し、４℃において一晩保存した。細胞を１５分間にわたり２．０ｍＬ Perm／Wash溶液（ＢＤ Biosciences）に再懸濁し、遠心し、１００μＬ Perm／Wash溶液に再懸濁した。２０μＬのマウス抗ヒトＣＤ４０Ｌ ＰＥおよび抗ヒトＣＤ４０ ＡＰＣ（ＢＤ Biosciences）またはマウスＩｇＧ１ ＰＥおよびＩｇＧ１ ＡＰＣ（ＢＤ Biosciences）を、各時点で回収および膜透過処理された各ＤＣ調製物へ加え、暗所下４℃において３０分間インキュベートした。細胞を１ｍＬ Perm／Wash溶液で２回洗浄し、フローサイトメトリー解析前に染色用緩衝液に再懸濁した。
【０２３３】
細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）を次のように行った：１×１０６／ｍＬプライム化ＣＤ８＋Ｔ細胞を１９日目に同時培養物から取り出し、１μＬ／ｍＬでブレフェルジンＡ（ＢＤ GolgiPlug，Ｃａｔ Ｎｏ．５５５０２９）の添加前１時間にわたり３７℃、５％ＣＯ２において２００μＬ Ｒ１０培地中ＰＭＥ ＤＣ標的（ＲＣＣ、survivin、Ｇ２５０、ｈＴＥＲＴ、またはｅＧＦＰ）で再刺激した。細胞を３７℃で更に１６時間インキュベートした。細胞を洗浄し、５μＬ ＣＤ８／ＣＰ‐ｃｙ５．５（ＢＤ３４１０５１）含有の１５０μＬ ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、４℃においてインキュベートした。３０分間後に細胞を２回洗浄し、２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）に再懸濁した。その後細胞を１０分間後に洗浄し、次いで２μＬの遮断抗体、マウスＩｇＧ１ pure（ＢＤ３４９０４０）とのインキュベーション前に室温（ＲＴ）において１０分間にわたり０．１％サポニンで膜透過処理した。ＲＴで１０分間のインキュベーション後に、０．５μＬ ＩＦＮ‐γ‐ＡＰＣ（ＢＤ５５４６８１）、１０μＬ ＩＬ‐２‐ＦＩＴＣ（ＢＤ５５４７０２）、および１０μＬ ＣＤ６９‐ＰＥ（ＢＤ５５５５３１）抗体を各サンプルチューブへ加えた。サンプルを暗所下、ＲＴにて３０分間インキュベートした。細胞を０．１％サポニンで最終洗浄後に２％ＰＦＡへ再懸濁した。解析をＦＡＣＳサイトメトリーにより行い、１００，０００の事象を集めた。
【０２３４】
ＨｅＬａ細胞でｍＲＮＡから発現された場合のＣＤ４０Ｌ機能解析
ＨｅＬａ細胞を１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭで増殖させ、次いで回収し、４ｍｍキュベット中ＧＦＰおよびＣＤ４０ ＲＮＡ（各２０μｇ／５×１０６細胞）でエレクトロポレーションした。トランスフェクション後の回収率は〜７０％であり、細胞を６ウェル皿へ入れ、一晩増殖させた。一晩のインキュベーション後、トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞をスクレーピングにより回収し、ＣＤ４０Ｌの細胞表面発現を調べるためにマウスＩｇＧ１‐ＰＥまたは抗ヒトＣＤ４０Ｌ‐ＰＥ（双方ともＢＤ Biosciences,San Diego,ＣＡ）で染色した。２×１０５細胞／チューブを１％ＦＢＳ／ＰＢＳ中４℃で３０分間かけて１０μｇ／ｍＬの抗体で染色した。ＦＡＣＳcaliburフローサイトメーターおよびCellquestソフトウェア（ＢＤ Biosciences）を用いて細胞を解析した。ＨｅＬａ発現ＣＤ４０Ｌの機能を解析するために、１×１０６未成熟樹状細胞を６ウェル皿（２ｍＬ総容量）中１０００Ｕ／ｍＬ ＩＦＮ‐γ（R&D Systems,Minneapolis,ＭＮ）で補充された５％ｈｕＡＢ血清／ＲＰＭＩ中１×１０６ＨｅＬａ細胞と一晩同時培養した。タンパク質の細胞表面発現が樹状細胞を刺激するために必要であることを確認するために、遮断ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体（eBioscienceからの２４〜３１）を適合ウェルに１０μｇ／ｍＬで含有させた。培養上澄を１８〜２４時間後に回収し、サイトカインＩＬ‐１０およびＩＬ‐１２の発現をＥＬＩＳＡ（ＢＤ Biosciences）で解析した。
【０２３５】
移動アッセイ
ＤＣの走化性を２４ウェルトランスウェルチャンバー（corning Costar,Acton,ＭＡ）中で８μｍ孔径ポリカーボネートフィルター内の移動により測定した。３〜３００ｎｇ／ｍＬ ＣＣＬ１９、５〜２５０ｎｇ／ｍＬ ＣＣＬ２１を含有するイスコフ改変ダルベッコ培地またはＡＩＭ‐Ｖ培地、双方の組合せまたは培地単独中の５％ヒトＡＢ血清を下部チャンバーへ加えた。０．１ｍＬ中１〜５×１０５ＤＣを上部チャンバーへ加え、３７℃において２〜３時間インキュベートした。下部チャンバーを５ｍＬチューブ（ＢＤ Biosciences）に回収し、０．１ｍＬ ＰＢＳへ再懸濁し、トリパンブルーを用いて生存細胞数カウントを行った。
【０２３６】
ＥＬＩＳpot
ＰＶＤＦ膜ＥＬＩＳpotプレート（Millipore,Ballerica,ＭＡ）を５μｇ／ｍＬモノクローナル抗ＩＦＮ‐γまたは抗ＩＬ‐２捕捉抗体（ＢＤ Pharmingen,Sa Diego,ＣＡ）で被覆し、４℃において２４時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０により洗浄し、５％ヒトＡＢ血清／ＲＰＭＩ１６４０培地において１時間遮断した。ＰＢＭＣ、Ｔ細胞またはＣＤ８富化Ｔ細胞を１×１０５細胞／ウェルで、およびｍＲＮＡトランスフェクトされた抗原負荷ＤＣ標的を１０：１エフェクター：標的比の１×１０４細胞／ウェルで入れ、３７℃、５％ＣＯ２で最少１６時間インキュベートした。
【０２３７】
インキュベーション後、プレートを６回洗浄し、抗ＩＦＮ‐γ検出抗体（ＢＤ Pharmingen）または抗ＩＬ‐２検出抗体（ＢＤ Pharmingen）を１μｇ／ｍＬで適切なプレートへ２時間加えた。更に６回洗浄後、ストレプトアビジン‐ＨＲＰ（ＢＤ Pharmingen）を各ウェルへ１時間加えた。最後に、更に１回の洗浄サイクル後、発色をＡＥＣペルオキシダーゼ基質により５〜１５分間行い、水で停止させた。ＣＴＬ Immunospot Plate Reader（ＣＴＬ,Cleveland,ＯＨ）で解析前にプレートを風乾させた。
【０２３８】
ＥＬＩＳＡ
本方法は、ＢＤ Ｏｐｔ ＥＩＡ試薬セットＢ ｐＨ９．５を用いるＩＬ‐１２およびＩＬ‐１０ＥＬＩＳＡセット（ＢＤ Pharmingen）で、ＢＤ Pharmingenにより設計された。簡単に言えば、ＥＬＩＳＡプレート（ＢＤ Biosciences）を４℃において２４時間かけて被覆用緩衝液中抗ＩＬ‐１２ｐ７０または抗ＩＬ‐１０ＥＬＩＳＡ捕捉抗体で被覆した。１００μＬ／ウェルで二重に標準（ＢＤ Pharmingen）および上澄サンプルの添加前にプレートを２００μＬ／ウェル １０％ＦＣＳ／ＰＢＳで遮断し、室温において２時間インキュベートした。プレートを洗浄し、抗サイトカイン検出抗体を加え、１時間インキュベートし、プレートを洗浄し、溶液を１００μＬのストレプトアビジン‐ＨＲＰと入れ換え、更に室温において１時間インキュベートした。再びプレートを洗浄し、発色基質を１０〜２０分間適用し、次いで停止溶液で発色を止めた。ＫＣジュニアソフトウェア（Winooski,ＶＴ）装備のBio-Tek装置ＥＬｘ８００プレートリーダーを用いてプレート解析を行った。結果はｐｇ／１０６ＤＣの値を示す。１ｍＬが１０６ＤＣに相当するようにアッセイがセットアップされたため、結果はｐｇ／１０６ＤＣの値としても表示される。例えば、３０００ｐｇ／ｍＬ／１０６ＤＣは３０００ｐｇ／１０６ＤＣに相当する。
【０２３９】
ＣＴＬ誘導
ｍＲＮＡによりトランスフェクトされた成熟樹状細胞をＣＤ８精製Ｔ細胞と同時培養した。すべての同時培養はＲ‐１０培地（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、２ｍＭグルタミン酸ナトリウム、５５μＭ β‐メルカプトエタノールで補充された１０％ＦＢＳ、ＲＰＭＩ‐１６４０）で行った。すべての細胞培養試薬はInvitrogen（Carlsbad,ＣＡ）製であった。単球接着工程から回収された非接着細胞から、ＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（Miltenyi Biotec,Auburn,ＣＡ）を用いて、ＣＤ８＋細胞を精製した。ＣＤ８＋細胞を上記のように作製された樹状細胞と１０：１ ＣＤ８＋：ＤＣで混合する。初めの７日間は、細胞を０．２Ｕ／ｍＬ ＩＬ‐２（R&D Systems,Minneapolis,ＭＮ）で補充された培地で培養し、次いで２４ウェル組織培養皿へ１ｍＬ（１×１０６ＣＤ８＋細胞）／ウェルで等分した。この初期７日間のインキュベーション後にＣＤ８＋細胞を回収し、カウントし、５Ｕ／ｍＬ ＩＬ‐２で補充された培地中１０：１で新鮮ＤＣスティミュレーターと再培養した。再び細胞を１週間培養し、次いで新鮮ＤＣおよび２０Ｕ／ｍＬ ＩＬ‐２で再刺激した。ＣＴＬアッセイを３回目刺激後３または７日目に行った。
【０２４０】
ＣＴＬアッセイ
Ｔ２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ‐１９９２）をＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地中で一晩インキュベーションにより１０μｇ／ｍＬのＨＬＡ‐Ａ２０１拘束性ＭＡＲＴ‐ＡＰＬペプチド（ＬＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）、天然ペプチド（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５）、またはＰＳＡ‐１ペプチド（ＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）で予めパルスし、ＣＴＬ標的として使用前に洗浄した。樹状細胞標的を前記のようにＧＦＰ ｍＲＮＡ、ＭＡＲＴ‐１ ＡＰＬ ｍＲＮＡまたはＦｌｕ‐Ｍ１ ｍＲＮＡでトランスフェクトし、成熟化させずに一晩インキュベートした。パルスＴ２細胞を１００μＣｉのＮａ５１Ｃｒ（Perkin-Elmer Life and Analytical Sciences,Inc.,Boston,ＭＡ）と３７℃において９０分間インキュベートした。過剰５１Ｃｒを洗い落とし、５０００標識標的を様々なＥ：Ｔ比のＣＤ８＋細胞と４時間インキュベートした。非特異的溶解を２５，０００細胞／ウェルで非パルスＴ２細胞の添加により減少させた。放出５１Ｃｒをシンチレーションカウントにより上澄で測定した。全放出を標的への１％ Triton Ｘ‐１００の添加により計算し、一方で自発放出を培地単独の添加により計算した。式（放出サンプルｃｐｍ−自発ｃｐｍ）／（放出全ｃｐｍ−放出自発ｃｐｍ）を用いて溶解率を計算した。
【０２４１】
ＫＲＮ７０００パルスＣＤ４０Ｌベース工程成熟化ＤＣを用いるＭＡＲＴ‐１特異的ＣＴＬの誘導
‘ＣＤ４０Ｌベース工程’を用いてＤＣを前記のように作製し、ＭＡＲＴ‐１をコードするｍＲＮＡで負荷した。エレクトロポレーション後、ＤＣをＫＲＮ７０００、ＩＦＮ‐γおよびＰＧＥ２とインキュベートした。ＤＣおよびＰＢＭＣを２０Ｕ／ｍＬ ＩＬ‐２の存在下において１：１０比で同時培養した。ＰＢＭＣを同一条件下において３回再刺激し、ＣＴＬ誘導の頻度をＭＡＲＴ‐１／Ａ２テトラマーで染色により調べ、ＦＡＣＳによりＫＲＮ７０００／ＣＤ１ｄテトラマーを用いてＮＫＴ細胞の拡大を計測した。
【０２４２】
実験例の結果
インターフェロン‐γおよびＣＤ４０Ｌでの順次成熟化がＩＬ‐１２ｐ７０分泌を最適化する
ＧＭ‐ＣＳＦおよびＩＬ‐４を含むＸ‐ＶＩＶＯ１５培地中で接着細胞ＰＢＭＣの６日培養により未成熟ＤＣを作製した。ＤＣを６日目に回収し、ＤＣ百万個当たり２μｇのｅＧＦＰコードｍＲＮＡでエレクトロポレーションし、“サイトカインカクテル”で３６時間成熟化させた。一方、同時にまたは順次適用されるＩＦＮ‐γおよび可溶性ＣＤ４０Ｌの存在下においてＤＣを培養することにより成熟化を行った。ＤＣを補助刺激分子の発現増加について、但し最も重要なことにはＩＬ‐１２ｐ７０ vs.ＩＬ‐１０の分泌について測定した。図１は、サイトカインカクテルで成熟化されたＤＣが、３６時間の培養期間で培養上澄中へＩＬ‐１２ｐ７０と比較して過剰のＩＬ‐１０を分泌することを示す。対照的に、可溶性ＣＤ４０ＬおよびＩＦＮ‐γで同時に成熟化されたＤＣは、過剰のＩＬ‐１２ｐ７０を分泌している。しかしながら、培養物への直接的な１８時間にわたるＩＦＮ‐γの順次的な適用に続く可溶性ＣＤ４０Ｌの添加と、追加の１８時間培養期間は、有意に高レベルのＩＬ‐１２ｐ７０分泌を生じた。意外にも、可溶性ＣＤ４０Ｌに続くＩＦＮ‐γの適用はＩＬ‐１２ｐ７０の有意な分泌を妨げた。結論として、ＤＣ成熟化を“プライムする”自然刺激（ＩＦＮ‐γ）に続く可溶性ＣＤ４０Ｌにより輸送されるサロゲートＴヘルパー細胞シグナルの順次輸送は、ＩＬ‐１２ｐ７０分泌についてＤＣ成熟化を最適化させる。
【０２４３】
ＣＤ４０ＬをコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞と未成熟ＤＣとの同時培養はＤＣ由来ＩＬ‐１２ｐ７０の誘導をもたらす
図２は、ＣＤ４０ＬをコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞が、抗ＣＤ４０Ｌ抗体およびフローサイトメトリーにより調べられるように、２４時間の培養後にＣＤ４０Ｌタンパク質の有意な細胞表面発現を生じることを示す。ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡトランスフェクトＨｅＬａ細胞を１０００Ｕ／ｍＬ ＩＦＮ‐γの存在下において、未成熟ＤＣと同時培養した。表IIは、伸長ポリＡテール（＞１００‘Ａ’）でトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞が、１８時間の培養期間にわたり未成熟ＤＣと培養された場合に、有意なＩＬ‐１２ｐ７０分泌を誘導しうることを示す。重要なことに、遮断抗ＣＤ４０Ｌ抗体の含有はＩＬ‐１２ｐ７０分泌を妨げ、トランスフェクトｍＲＮＡ配列によりコードされたタンパク質の同一性および機能的重要性を確証させる。
【０２４４】
ＣＤ４０ＬコードｍＲＮＡでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞は、ＩＦＮ‐γの存在下で未成熟ＤＣと同時培養された場合に、ＩＬ‐１２ｐ７０の分泌をもたらす。培養物中で‘遮断’抗ＣＤ４０Ｌ抗体の含有はＩＬ‐１２ｐ７０の誘導を妨げる。
【表２】
0005425618.tif 000008
【０２４５】
ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡでトランスフェクトされて、ＩＦＮ‐γの存在下で培養された樹状細胞はＩＬ‐１２ｐ７０を分泌する
未成熟ＤＣをＧＭ‐ＣＳＦおよびＩＬ‐４含有の培地中で６日後に回収し、滴定量のＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡ（＞１００‐ポリＡ）でトランスフェクトし、直ちに１０００Ｕ／ｍＬ ＩＦＮ‐γの存在下において培養した。図３は、１８時間の培養後に回収された上澄がＩＬ‐１０より過剰のＩＬ‐１２ｐ７０を含有し、ＤＣ百万個当たり少なくとも４μｇのＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡが最良サイトカイン分泌にとり必要であることを示す。ＤＣ百万個当たり４μｇ超にＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡペイロードを増すと、成熟後のＤＣ収量で有意な減少を招く（データ示さず）。パラレル実験では、未成熟ＤＣを細胞百万個当たり４μｇのＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡでトランスフェクトし、滴定量のＩＦＮ‐γを直ちに培養物へ適用した。図４は、少なくとも１００Ｕ／ｍＬのＩＦＮ‐γがＩＬ‐１２ｐ７０の最良誘導をサポートするために必要であることを示す。図５ａは、ＩＬ‐１２ｐ７０がトランスフェクションおよびＩＦＮ‐γとの同時培養後６〜８時間の場合に検出可能レベルで出現し、培養上澄中で最大の蓄積が２０〜２４時間で記録されることを示す。対照的に、ＩＦＮ‐γに代わる１０ｎｇ／ｍＬ ＴＮＦ‐αの使用もＩＬ‐１２産生をサポートするが、低レベルである（図５ｂ）。更に、ＩＦＮ‐γはＴＮＦ‐αの場合より低レベルのＩＬ‐１０産生を付随的にもたらす（図５ｃ）。
【０２４６】
ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡでトランスフェクトされたＤＣによるＩＬ‐１２ｐ７０の誘導は、細胞‐細胞相互作用とは異なり、“細胞内シグナル”に依存する
図２は、ｍＲＮＡから翻訳されたＣＤ４０Ｌタンパク質がトランスフェクト細胞の細胞表面において発現され、該タンパク質がＤＣ上のその対応物、即ちＣＤ４０とのその相互作用の結果としてＩＬ‐１２ｐ７０分泌についてＤＣを適切にシグナリングしうる能力を留めていることを証明している。トランスフェクトＤＣ中、ＣＤ４０Ｌの細胞分布を調べ、その機能的同一性を確認するために、ＤＣをトランスフェクション後、様々な時点で回収し、細胞表面上におけるＣＤ４０Ｌの存在または細胞内区画を調べた。図６ａおよび６ｂは、ＣＤ４０Ｌの大部分が細胞内区画に局在し、有意なタンパク質発現（２７％ＤＣ ＣＤ４０Ｌ陽性）がトランスフェクション後６０分間までみられなかったことを示す。このように、ＩＦＮ‐γがトランスフェクション直後に適用されているが、成熟化事象の輸送は順次的であり、ＩＦＮ‐γシグナルがＣＤ４０Ｌの場合より先である。図１において示されているように、ＩＦＮ‐γおよびＣＤ４０ＬによるＤＣの順次成熟化がＩＬ‐１２ｐ７０分泌を最適化している。加えて、図７は、ＣＤ４０ＬトランスフェクトおよびＩＦＮ‐γ処理ＤＣが、トランスフェクション後１８時間にわたり過剰の遮断抗ＣＤ４０Ｌ抗体の存在下で培養された場合に、なお有意レベルのＩＬ‐１２ｐ７０を分泌していることを示す。このデータは、この系においてＩＬ‐１２ｐ７０産生に必要なＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０相互作用が細胞内区画で生じうることを示す。
【０２４７】
経時的なＣＤ４０Ｌ陽性細胞の出現頻度
未成熟ＤＣを１０６ＤＣ当たり４μｇ ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡでトランスフェクトし、１０００Ｕ／ｍＬ ＩＦＮ‐γで同時成熟化させた。一方、ＣＤ４０Ｌ染色の陰性コントロールとして、未成熟ＤＣを“サイトカインカクテル”で成熟化させた。最大の発現頻度はＣＤ４０Ｌ ＲＮＡでトランスフェクション後約３〜４時間で到達し（図６ｂ参照）、細胞が固定および膜透過処理された場合にＤＣの８０％がＣＤ４０Ｌを発現するが、細胞表面染色ではＤＣの約１５％を検出するにすぎない（図６ｃ）。このデータは、ＣＤ４０Ｌタンパク質の大半がＤＣ内に留められ、細胞表面において発現されないことを示す。ＣＤ４０Ｌタンパク質は一過性で発現され、ＤＣの大部分がトランスフェクション後２６時間でＣＤ４０Ｌ陰性になる。ＣＤ４０Ｌのコグネイトレセプター分子、ＣＤ４０の発現は、‘サイトカインカクテル’のみを受けたＤＣと比較して、ＣＤ４０ＬをコードするｍＲＮＡでＤＣのトランスフェクションにより変わらない。
【０２４８】
ＣＤ４０ＬおよびＩＦＮ‐γ成熟化でＤＣ移動を誘導するためにＰＧＥ２が必要である
高レベルの補助刺激分子、例えばＣＤ８０、ＣＤ８３、およびＣＤ８６を発現する細胞として典型的に規定される、ＩＬ‐１２ｐ７０を分泌して成熟表現型を示す能力に加えて（表III参照）、ＤＣがインビボにおいてリンパ節へホーミングしうるならば、それらは移動する能力を示すに違いない。ＰＧＥ２が、移動について成熟ＤＣをプライムするいくつかの研究により示されてきた（Luft et al.(2002)Blood 100:1362、Scandella et al.(2002)Blood 100:1354）。図８は、ＩＦＮ‐γに加えて１μｇ／ｍＬ ＰＧＥ２の含有が成熟ＤＣを移動させられ、この移動ポテンシャルの獲得がＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡペイロードと比例することを示す。このように、ＣＤ４０Ｌは成熟ＤＣ表現型および優性ＩＬ‐１２ｐ７０プロファイルのみならず（表II参照）、移動性のプライミングにも寄与する。対照的に、ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡでのトランスフェクションにより成熟化されて、ＩＦＮ‐γの存在下、但しＰＧＥ２の非存在下で培養されたＤＣは、ケモカインレセプターＣＣＲ７の有意な細胞表面発現を示すにもかかわらず、移動していない（データ示さず）。
【表３】
0005425618.tif 000009
【０２４９】
ＤＣを接着単球から作製し、ＧＭ‐ＣＳＦ／ＩＬ‐４中において、６日間培養した。回収後、ＤＣを様々なｍＲＮＡペイロードでトランスフェクトし、更に２４時間にわたり成熟化に付した。ＤＣを再び回収し、細胞を様々な細胞表面マーカー、特に増加した機能、即ち補助刺激および移動と関連するものについて染色した。成熟培養物からの上澄を集め、ＩＬ‐１２ｐ７０およびＩＬ‐１０サイトカイン解析に付した。
（ａ）細胞百万個当たり４μｇ ｅＧＦＰ ｍＲＮＡに加えて、抗原コードペイロードとして細胞百万個当たり２μｇ ｆｌｕ ｍＲＮＡでＤＣをトランスフェクトした。ｅＧＦＰ ｍＲＮＡは、ＦＡＣＳによるトランスフェクションの確認を可能にし、別の工程において細胞百万個当たり４μｇ ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡ成熟化ペイロードのための代替コントロールとして作用しうる。これらのｆｌｕ／ｅＧＦＰトランスフェクトＤＣを“サイトカインカクテル”の存在下で成熟化させた。
（ｂ）抗原コードペイロードとして細胞百万個当たり２μｇ ＭＡＲＴ‐ＡＰＬ ｍＲＮＡでＤＣをトランスフェクトし、“サイトカインカクテル”での成熟化に付した。
（ｃ）成熟化ペイロードとして細胞百万個当たり４μｇ ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡと共に、抗原コードペイロードとして細胞百万個当たり２μｇ ｆｌｕ ｍＲＮＡでＤＣをトランスフェクトした。これらの細胞を直ちに、物質および方法で記載されたように、ＩＦＮ‐γおよびＰＧＥ２含有培地へ入れた。
（ｄ）成熟化ペイロードとして細胞百万個当たり４μｇ ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡと共に、抗原コードペイロードとして細胞百万個当たり２μｇ ＭＡＲＴ‐ＡＰＬでＤＣをトランスフェクトした。これらの細胞を直ちに、物質および方法で記載されたように、ＩＦＮ‐γおよびＰＧＥ２含有培地へ入れた。
（ｅ）成熟化をうけたＤＣからのＩＬ‐１２ｐ７０分泌
（ｆ）成熟化をうけたＤＣからのＩＬ‐１０分泌
【０２５０】
ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡでのトランスフェクションおよびＩＦＮ‐γ／ＰＧＥ２により順次成熟化されたＤＣは強いＴ細胞リコール応答を引き起こす
ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡトランスフェクションおよびＩＦＮ‐γ／ＰＧＥ２で成熟化されたＤＣの“免疫力”を調べるために、ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡおよびＩＦＮ‐γ／ＰＧＥ２培養環境に加えて、ＤＣ百万個当たり２μｇ ｆｌｕマトリックスタンパク質コードｍＲＮＡでＤＣを同時トランスフェクトした。トランスフェクション後１８時間でＤＣを回収、洗浄し、ＩＦＮ‐γ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで自己Ｔ細胞と同時培養した。図９は、ＣＤ４０Ｌ／ＩＦＮ‐γ／ＰＧＥ２で成熟化されたＤＣが、アッセイでｆｌｕ特異的ＩＦＮ‐γスポットの出現頻度で示されるように、ｆｌｕ ｍＲＮＡでトランスフェクトされて‘サイトカインカクテル’で成熟化されたＤＣと比較して、高い免疫力を呈することを示す。
【０２５１】
ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡでのトランスフェクションおよびＩＦＮ‐γ／ＰＧＥ２により順次成熟化されたＤＣは一次応答を引き起こす
リコール応答、例えば図９において記載されたものは、最適化補助刺激分子を発現してサイトカイン環境をサポートするＤＣの存在にさほど依存しない。したがって、多くの健康ドナーが高ナイーブＴ細胞前駆体出現頻度を維持している黒色腫関連抗原ＭＡＲＴ‐１に対して一次免疫応答を引き起こす能力についてＤＣを試験した。ＨＬＡ‐Ａ２０１ドナーが優先的に用いられたため、Ａ２拘束性決定基が部位特異的変異誘発によるｍＲＮＡ配列の変異により最適化され、こうして２７位のアラニンがロイシンで置き換えられた、ここではＭＡＲＴ‐ＡＰＬと称される、ＭＡＲＴ‐１をコードするｍＲＮＡでＤＣをトランスフェクトした（Valmori ,D et al.(1998)J.Immunol.160:1750）。２μｇ ＭＡＲＴ‐ＡＰＬ ｍＲＮＡと４μｇ ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡで同時トランスフェクトされて直ちにＩＦＮ‐γ／ＰＧＥ２で１８時間パルスされたＤＣを、ＭＡＲＴ‐ＡＰＬ単独で負荷されて“サイトカインカクテル”において一晩成熟化されたＤＣと比較した。抗原負荷および成熟化ＤＣを精製自己ＣＤ８＋Ｔ細胞へ加え、０．２Ｕ／ｍＬ ヒトＩＬ‐２の存在下で７日間培養した。この期間後、Ｔ細胞を回収し、ＩＬ‐２ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで適宜に第二ラウンドの抗原負荷ＤＣスティミュレーターと同時培養した。図１０は、ＣＤ４０ＬおよびＩＦＮ‐γ／ＰＧＥ２で成熟化されたＤＣの存在下において培養されたＣＤ８＋Ｔ細胞が、ＭＡＲＴ‐ＡＰＬ ｍＲＮＡ配列内で当初コードされた最適化ＭＡＲＴ‐ＡＰＬエピトープへの特異的応答でＩＬ‐２分泌しうるＴ細胞について、高度に有意な増加をもたらすことを示す。結論として、ＩＦＮ‐γ／ＰＧＥ２およびＣＤ４０Ｌによる順次成熟化に曝されたＤＣは、現在認められている標準“サイトカインカクテル”で成熟化されたＤＣより、一次免疫応答の惹起が有意に強い。更に図１１は、‘サイトカインカクテル’成熟化されたＭＡＲＴ‐ＡＰＬ負荷ＤＣで生じたＣＴＬが、適切なＨＬＡ‐Ａ２拘束性ＭＡＲＴ‐ＡＰＬペプチドでパルスされたＴ２細胞に対して、ＣＤ４非依存性ＣＤ８媒介細胞傷害性を媒介しないことを示す（図１１ｂ）。対照的に、ＣＤ４０Ｌ／ＩＦＮ‐γ／ＰＧＥ２成熟化ＤＣで生じたＣＴＬが完全に活性であり、ＭＡＲＴ‐ＡＰＬペプチドパルスＴ２標的を殺す（図１１ａ）。
【０２５２】
ＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ工程下における成熟する未成熟ＤＣの表現型解析
ここで記載されたＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ工程で５日目にＤＣを成熟させた。未成熟ＣＤ８３−ＤＣを産生するために、特に単球を培地ＧＭ‐ＣＳＦおよびＩＬ‐４で５日間培養した。５日目に、未成熟ＤＣをＴＮＦα、ＩＦＮγ、およびＰＧＥ２（ＴＩＰ）含有培地に供した。６日目に、ＴＩＰ後表現型を調べた（表IV参照）。表IVで示されているように、細胞の大部分はＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、およびＣＤ２０９に関して陽性であった。これらのＤＣはＣＣＲ７陰性でもあった（データ示さず）。低率のＣＤ１４＋細胞は、樹状細胞へ分化しなかった単球を表す。６日目に、ＣＤ８３＋ＣＣＲ７−ＤＣを細胞百万個当たり１μｇ増幅腎臓細胞癌腫ＲＮＡ由来ｍＲＮＡおよび４μｇ ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡで（エレクトロポレーションにより）同時トランスフェクトした。ＣＤ４０Ｌ発現をトランスフェクション後４時間目に測定した。細胞をトランスフェクション後４時間目に液体窒素で凍結保存した。解凍後の回収率および生存率を解凍直後と解凍後２４時間目に測定した。みられるように、解凍後２４時間でＤＣの大部分はＣＣＲ７＋になった。ＣＣＲ７＋ＤＣはＣＤ８０、ＣＤ８３、およびＣＤ８６に関しても陽性であった。三回の別々なランの結果が表IVで示されている。
【表４】
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【０２５３】
ＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ工程において成熟化されたＤＣは、リンパ節ホーミングケモカインＣＣＬ１９および２１に応答して、高度に移動性である
ＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ成熟化ＤＣを、全増幅ＲＣＣ ＲＮＡおよびＣＤ４０Ｌ ＲＮＡで同時トランスフェクション後２４時間目に、ケモカインＣＣＬ１９および２１に応答する移動性についてアッセイした。図１２は、４例の独立ドナーを用いたところ、ＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ工程でエレクトロポレーション後２４時間目に達した非常に高レベルのＣＣＲ７発現と一致して、ＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ成熟化ＤＣが高度に移動性であることを示す（表IV参照）。
【０２５４】
ＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ工程において成熟化されたＤＣは、‘ＣＤ４０Ｌベース工程’において成熟化されたＤＣより有意に高い免疫力を示す
‘ＣＤ４０Ｌベース工程’による一次免疫応答の誘導にもかかわらず、ＤＣがＣＤ４０Ｌ＋抗原コードｍＲＮＡでエレクトロポレーション前に最初にＴＮＦ‐α、ＩＦＮ‐γおよびＰＧＥ２で成熟化される‘成熟化後エレクトロポレーション‐ＣＤ４０Ｌ’工程は、ＭＡＲＴ抗原モデル系を用いると、ＣＴＬ活性で有意な改善を呈する（図１３）。加えて、腎臓細胞癌腫患者から得られた完全自己由来物質を用いて、ＩＦＮ‐γおよびＩＬ‐２応答の誘導についてＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ工程を試験した：患者ＤＣをＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ工程のために前記のように調製し、自己全増幅ＲＣＣ腫瘍ＲＮＡでエレクトロポレートした。抗原負荷ＤＣを自己患者ＣＤ８Ｔ細胞と培養し、誘起ＤＣと、腫瘍関連抗原ｈＴＥＲＴ、SurvivinおよびＲＣＣ特異的抗原Ｇ２５０でトランスフェクトされた個別ＤＣに応答する細胞内サイトカイン染色により、得られる応答ＣＴＬを研究した。ｅＧＦＰコードｍＲＮＡでトランスフェクトされたＤＣを陰性コントロールスティミュレーターとして用いた。図１４は、患者Ｔ細胞が、ｅＧＦＰ ｍＲＮＡトランスフェクト陰性コントロールにより誘導された場合より高いＩＦＮ‐γおよびＩＬ‐２出現頻度で、全増幅ＲＣＣ ＲＮＡ負荷ＤＣと、三種の腫瘍関連抗原にも応答したことを示す（各ＲＣＣ関連ＤＣ標的への全応答からｅＧＦＰへの応答を差し引く）。
【０２５５】
‘ベースＣＤ４０Ｌ工程’で成熟化されてＫＲＮ７０００でパルスされたＤＣは、一次ＣＴＬの誘導を高めるＮＫＴ細胞をリクルートしうる
ＫＲＮ７０００でパルスされた、ＭＡＲＴ‐１ ｍＲＮＡ負荷、ＣＤ４０Ｌベース工程成熟化ＤＣは、ＣＤ１ｄ／ＫＲＮ７０００‐テトラマー染色で調べたところ、ＫＲＮ７０００の代わりにビヒクルでパルスされた同様の成熟ＲＮＡ負荷ＤＣと比べて、ＰＢＭＣ培養物でＮＫＴ細胞の出現頻度を増加させる（図１５ａ）。応答ＣＴＬ（ＭＡＲＴ‐１／ＨＬＡ‐Ａ２）に関するテトラマー解析を用いたところ、ＭＡＲＴ‐１ ｍＲＮＡトランスフェクトＤＣにパルスされるＫＲＮ７０００の存在はＭＡＲＴ反応性Ｔ細胞の出現頻度を有意に増加させている（図１５ｂ）。このように、ＰＢＭＣ培養物でＮＫＴ細胞の拡大は、一次ＣＤ８ＣＴＬ成長をサポートしうる、おそらくＮＫＴ細胞性‘ヘルプ’により得られる、増幅ループを提供している。
【０２５６】
ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡの最適化
好ましい成熟化手法を実証する原ＤＣ実験において用いられたＣＤ４０Ｌ ＲＮＡをプラスミドテンプレートｐＣＲ２．１ ＣＤ４０Ｌ ＷＴから転写した。好ましいＣＤ４０Ｌ ＲＮＡはＡＲＣＡキャップアナログおよびポリＡテールを含有している。プラスミドｐＣＲ２．１ ＣＤ４０Ｌ ＷＴを開始ＡＴＧコドンの５′側に位置するＸｂａＩ‐ＥｃｏＲＶ断片の除去により修飾した。該断片はベクター配列の３２ヌクレオチドを包含し、三つの潜在的開始ＡＴＧコドンを含有していた。この修飾の論理的理由(rational)は、これらの余分なＡＴＧが正しいＣＤ４０Ｌ翻訳開始部位と競合することでＣＤ４０Ｌ翻訳の効率的開始を妨げうるからであった。ＣＤ４０Ｌのコード配列はこれらの修飾により影響されないままであった。修飾プラスミドテンプレートから転写されたＣＤ４０Ｌ ＲＮＡは、ＩＬ‐１２発現の誘導により測定したところ、二つの独立ＤＣトランスフェクション実験において本ＣＤ４０Ｌリファレンス標準（ｐＣＲ２．１ ＣＤ４０Ｌ ＷＴ）より良く機能した。修飾プラスミドはｐＣＲ２．１ ＣＤ４０Ｌ ＷＴ Delta Ｘ‐Ｅと称される。
【０２５７】
加えて、ＣＤ４０Ｌ開始コドンのすぐ上流にＣＤ４０Ｌ ５′非翻訳領域を置くことでＣＤ４０Ｌ ＲＮＡの発現が更に最適化されるかどうか調べてみたい、と我々は思った。ＣＤ４０Ｌ翻訳開始部位のすぐ上流に位置させる３９ｂｐ ＣＤ４０Ｌ ５′非翻訳領域の挿入によりｐＣＲ２．１ ＣＤ４０Ｌ ＷＴ Delta Ｘ‐Ｅプラスミドを更に修飾し、構築物ｐＣＲ２．１ ＣＤ４０Ｌ＋５′ＵＴＲを得た。このプラスミド（ｐＣＲ２．１ ＣＤ４０Ｌ＋５′ＵＴＲ）から転写されたＲＮＡはＣＤ４０Ｌ ＷＴ Delta Ｘ‐Ｅから転写されたＲＮＡほど良く機能しなかったが、むしろｐＣＲ２．１ ＣＤ４０Ｌ ＷＴから転写された本ＣＤ４０Ｌと同様に機能した（図１８および１９）。ｐＣＲ２．１ ＣＤ４０Ｌ ＷＴ Delta Ｘ‐Ｅプラスミドから転写されたＣＤ４０Ｌ ＲＮＡに対応するＤＮＡ配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３において示されている。ＡＴＧ開始コドンはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３の４１位で始まる。
【０２５８】
ＣＤ４０Ｌタンパク質の短いイソ型
以下で記載されるＣＤ４０Ｌ ＲＮＡの各々１μｇを、トレーサー３５Ｓ標識メチオニンの存在下で麦芽エキス（Promega）を用いてインビトロにおいて翻訳した。５μＬの各翻訳混合物をＳＤＳ‐ＰＡＧＥ電気泳動により分離させ、ナイロン膜へ移した。膜をPhosphoimagerスクリーンへ曝し、Storm Imager（Amersham）を用いて走査した。結果が図２０で示されている。レーン１および２は、各々非キャップ化およびキャップ化されたｐＣＲ２．１ ＣＤ４０Ｌ ＷＴ ｍＲＮＡ（ＷＴ）からのインビトロ翻訳産物を表わす。レーン３および４〜５は、各々非キャップ化およびキャップ化されたｐＣＲ２．１ ＣＤ４０Ｌ ＷＴ Delta Ｘ‐Ｅ ｍＲＮＡ（ΔＸＥ）からのインビトロ翻訳産物を表わす。レーン６はキャップ化ｐＣＲ２．１ ＣＤ４０Ｌ＋５′ＵＴＲ ｍＲＮＡのインビトロ翻訳産物を表わす。放射線標識翻訳産物の試験においては、一部のＲＮＡが二種の主タンパク質を生じることを示す。ＣＤ４０Ｌコード領域の配列解析では、該コード領域内で二以上の枠内メチオニン残基が部分的ＣＤ４０Ｌタンパク質配列を生じうることを示す（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２参照）。トランケート化タンパク質は枠内にあるため、それは抗ＣＤ１５４抗体でなお陽性に染色される。天然ＣＤ４０Ｌ ５′ＵＴＲ（ｐＣＲ２．１ ＣＤ４０Ｌ＋５′ＵＴＲ）を含有する構築物からのインビトロ翻訳産物の解析では、一種のＣＤ４０Ｌタンパク質のみをコードしている（図２０）。しかしながら、この＋５′ＵＴＲ ＣＤ４０Ｌ構築物は最低のＩＬ‐１２増強も示す（図１９）。対照的に、ＷＴおよびDelta ＸＥ構築物は双方とも全長産物とほぼ等しい割合で短いタンパク質産物を産生し、最高ＩＬ‐１２誘導能を示すようである。
【０２５９】
低分子量タンパク質産物が内部メチオニンから始まり、ＩＬ‐１２サイトカインの誘導に関してより活性な形のＣＤ４０Ｌであろう、と我々は仮定した。この仮説は、ＡＴＧ開始コドンからＧＣＧへの部位特異的変異誘発により最アミノ末端メチオニンコドンを除去することにより、翻訳が野生型ＣＤ４０Ｌタンパク質の第二内部メチオニンで始まるような、次の実験セットにおいて試験した。この構築物をｐＣＤ４０Ｌ ΔＸＥ‐ＭＥＴ１（ＣＤ４０Ｌ ΔＸＥ−第一メチオニン開始コドン）と命名した。このプラスミドから転写されたｍＲＮＡがＳＥＱ ＩＤ  ＮＯ：３０において示されている。ＳＥＱ ＩＤ  ＮＯ：３０はＳＥＱ ＩＤ  ＮＯ：３１のポリペプチドをコードし、これはＳＥＱ ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸残基２１‐２６１に相当する。加えて、コンセンサスKozak配列でＡＴＧコドンを最適化することにより第一開始メチオニンからの翻訳開始が高められる他の構築物について我々は試験した。両修飾をDelta ＸＥプラスミドバックグラウンドで行ったが、このプラスミドテンプレートがＷＴプラスミドの場合より活性なＣＤ４０Ｌ ＲＮＡを一貫してコードしているからである。コントロールとしてこのアッセイで使用のために非修飾Delta ＸＥ ＲＮＡの新ロットを作製した。これら構築物からのＲＮＡを産生し、ポリアデニル化および精製した。ＲＮＡを３５Ｓ標識メチオニンの存在下でインビトロ翻訳し、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥにより解析した。図２１において示されているように、ＣＤ４０Ｌタンパク質のイソ型二種がＷＴおよびDelta ＸＥ ＣＤ４０Ｌ ＲＮＡから作製される、という当初の観察を我々は確認した。ＣＤ４０Ｌ ＷＴ ＲＮＡは２種のイソ型を産生し、低い方のイソ型は産生された全タンパク質の５０％をやや超えている（図２１、レーン１）。Delta ＸＥ（第二ロットのＲＮＡ）はやや高い比率で短い型をコードし、一方天然５′ＵＴＲ含有のＣＤ４０Ｌ ＲＮＡは長い型を主に生じる（図２１、レーン２および５）。予想通りに、最適化Kozak配列が第一ＡＴＧを取り囲んでいる新ＲＮＡは長い型を主に生じる（全体の７５％）（図２１、レーン４）。最も重要なことに、第一メチオニンを欠くＣＤ４０Ｌ ＲＮＡは短い型のタンパク質を専ら生じた（図２１、レーン６）。同時転写でキャップ化されたＲＮＡ（図２１、レーン２） vs.キャッピング酵素を用いて転写後にキャップ化されたＲＮＡ（ΔＸＥ（ｅｎｚ）、図２１、レーン３）から産生されたタンパク質で差異は見られなかった。
【０２６０】
我々は次いで、トランスフェクトＤＣで各構築物から産生されたＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）タンパク質の量を評価した。ＣＤ４０Ｌ陽性細胞の率（図２２、左パネル）は試験された全条件でほぼ同等であり、このことは各ＲＮＡについてトランスフェクション効率が類似していることを示す。平均蛍光強度（図２２、右パネル）は細胞で産生されたＣＤ４０Ｌタンパク質の量と比例している。我々が一貫して観察してきたように、ΔＸＥ ＲＮＡはこのアッセイで野生型コントロールより良く機能するようである。大きなＣＤ４０Ｌイソ型を主にコードするDeltaΔＸＥ＋Kozak ＲＮＡは意外にも最低量のＣＤ４０Ｌタンパク質を産生したが、その一方で短いイソ型をインビトロで専らコードするΔＸＥ‐Ｍｅｔ１ ＲＮＡはトランスフェクトＤＣで最高ＣＤ４０Ｌタンパク質レベルを生じている。
【０２６１】
ＣＤ４０Ｌタンパク質発現のレベルと長／短ＣＤ４０Ｌタンパク質イソ型の相対比が、ＩＬ‐１２分泌レベルと相関があるか否かを調べるために測定された。図２３は、このアッセイにおけるＩＬ‐１２発現のレベルが抗ＣＤ１５４抗体で染色された細胞の平均蛍光強度と相関していたことを示す。同データの詳細な観察が図２４において表されている。ＤＣトランスフェクションアッセイにおけるＩＬ‐１２発現の絶対量は、インビトロ翻訳アッセイにより産生された短ＣＤ４０Ｌタンパク質イソ型の量と比例している。（Ｒｏｔ６ ３′ＵＴＲ ΔＸＥプラスミドを産生するために）ΔＸＥ構築物へのロタウイルス遺伝子６の３′ＵＴＲの付加は、ΔＸＥ‐Ｍｅｔ１で観察されたものと類似するＩＬ‐１０およびＩＬ‐１２発現レベルを呈した（図２５）。Ｒｏｔ６ ３′ＵＴＲ ΔＸＥプラスミドから転写されたｍＲＮＡの配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２において示されている。ΔＸＥ‐ＭＥＴ１ロタウイルス遺伝子６ ３′ＵＴＲ構築物から転写されたＲＮＡをコードするｃＤＮＡがＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３において示されている。
【０２６２】
ＣＤ４０Ｌの第二内部メチオニン（即ち、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２のアミノ酸残基２１）で始まるＮ末端ＣＤ４０Ｌトランケート化タンパク質を産生するには、ΔＸＥ‐ＭＥＴ１ ＲＮＡの翻訳がＣＤ４０Ｌ ＣＤＳの第二ＡＴＧコドンで始まる、と仮定された。この仮説を確認するために、最初の２メチオニンコドン（ΔＸＥ‐ＭＥＴ１，２）、最初の３メチオニンコドン（ΔＸＥ‐ＭＥＴ１‐３）または最初の４メチオニンコドン（ΔＸＥ‐ＭＥＴ１‐４）を変える部位特異的変異誘発にΔＸＥ構築物を付した。これらの構築物で産生されたインビトロ翻訳産物が図２６において示されている。これらの修飾ＣＤ４０Ｌ ＲＮＡでトランスフェクトされた樹状細胞によるＩＬ‐１０およびＩＬ‐１２の分泌レベルが図２７において示されている。ΔＸＥ‐ＭＥＴ１構築物における第一メチオニンの欠失はこのＲＮＡでトランスフェクトされたＤＣから高ＩＬ‐１２分泌をもたらし、一方で最初の２、３または４メチオニンの欠失はＩＬ‐１２産生を生じない。したがって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１のＣＤ４０ＬポリペプチドをコードするＲＮＡでＤＣのトランスフェクションは、高レベルのＩＬ‐１２発現をもたらす。対照的に、３番目、４番目、または５番目内部ＡＴＧコドンで始まるＣＤ４０Ｌポリペプチドは、それらがＤＣで発現される場合に、ＩＬ‐１２分泌を誘導できない。
【０２６３】
ＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ工程により成熟化されたＤＣでトランスフェクション後、４時間目および２４時間目におけるＩＬ‐１０およびＩＬ‐１２発現
未成熟ＤＣを培養の５日目にＴＮＦ‐α（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＦＮ‐γ（１０００Ｕ／ｍＬ）、およびＰＧＥ２（１μｇ／ｍＬ）で表現型成熟させた。６日目にＤＣを回収し、前記のように抗原およびＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡでエレクトロポレーションし、４時間または２４時間にわたり８００Ｕ／ｍＬ ＧＭ‐ＣＳＦおよび５００Ｕ／ｍＬ ＩＬ‐４を含有するＸ‐ＶＩＶＯ １５培地で培養した。表Ｖは、トランスフェクション（ワクチン）後４時間で回収された上澄がＩＬ‐１２ｐ７０またはＩＬ‐１０をほとんどまたは全く産生せず、一方で該レベルはトランスフェクション後２４時間で増加することを示す。
【表５】
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【０２６４】
ＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ工程で成熟化されたＤＣは、‘ＣＤ４０Ｌベース工程’で成熟化されたＤＣと比較して、低レベルのＩＬ‐１２ｐ７０を分泌する
ＩＬ‐１０およびＩＬ‐１２分泌レベルを比較するために、標準ＣＤ４０Ｌベース工程またはＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ工程を用いてＤＣを調製し、培地中の分泌サイトカインをエレクトロポレーション後１８〜２４時間で測定した。結果を表VIに示す。‘ＣＤ４０Ｌベース工程’と比較して、‘成熟化後エレクトロポレーション‐ＣＤ４０Ｌ’工程（即ち、ＣＤ４０Ｌ＋抗原コードｍＲＮＡでエレクトロポレーション前に、ＤＣが最初にＴＮＦ‐α、ＩＦＮ‐γ、およびＰＧＥ２で成熟化される）は低レベルのＩＬ‐１２ｐ７０を呈し、一方でＩＬ‐１０のレベルは類似している。しかしながら、ＣＤ４０Ｌベース工程またはＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ工程で成熟化されたＤＣは、サイトカインカクテル工程（ＩＬ‐６、ＩＬ‐１β、ＴＮＦ‐α、およびＰＧＥ２）で成熟化されたＤＣと比較して、低レベルのＩＬ‐１０および高レベルのＩＬ‐１２を分泌する。
【表６】
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【０２６５】
細胞表面染色および細胞内サイトカイン産生の測定
ＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ工程を用いて前記のようにＤＣを作製し、またはＤＣをＣＤ４０Ｌ ＲＮＡおよびＭＡＲＴ‐１ ＲＮＡでエレクトロポレートして、ＩＦＮ‐γおよびＰＧＥ２と４時間培養し、またはＤＣをＴＮＦα、ＩＦＮγ、およびＰＧＥ２（ＴＩＰ）サントカインで一晩成熟させ、次いでＭＡＲＴ‐１ ＲＮＡでエレクトロポレートして、４時間培養し、または未成熟ＤＣをＭＡＲＴ‐１ ＲＮＡでエレクトロポレーションして、サイトカインカクテル（ＩＬ‐１β、ＩＬ‐６、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＰＧＥ２）と４時間同時培養した。ＤＣおよびＣＤ８Ｔ細胞を“ＣＴＬ誘導”について記載されたように同時培養した。指示された日にＣＴＬを回収し、ＦＢＳ／ＲＰＭＩ培地中において１時間インキュベーションにより１０μｇ／ｍＬのＨＬＡ‐Ａ２０１拘束性ＭＡＲＴ‐ＡＰＬペプチド（ＬＡＧＩＧＩＬＴＶ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４）またはＰＳＡ‐１ペプチド（ＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６）で予めパルスされたＴ２細胞で刺激し、洗浄し、ＣＴＬをＴ２細胞と１０：１比で刺激した。１時間の時点でブレフェルジンＡを加え、培養物を更に３時間インキュベートした。次いで、抗原特異的ＣＴＬの出現頻度を検出するために、ＣＤ８レセプターおよびＭＡＲＴ‐１／Ａ２ペンタマーに対する抗体でＣＴＬを表面染色した。次いでサイトカイン特異的抗体を用いてＩＬ‐２およびＩＦＮ‐γの細胞内産生を検出するために、ＣＴＬをサポニン緩衝液で膜透過処理した。一部の場合は、ＣＴＬを同時培養物から回収して、ＣＤ８レセプター、ＣＤ２８レセプター、ＣＤ４５ＲＡ分子およびＭＡＲＴ‐１／Ａ２ペンタマーに対するモノクローナル抗体で表面染色した。
【０２６６】
ＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ工程で成熟化されたＤＣは、‘ＣＤ４０Ｌベース工程’およびＤＣの成熟化を誘導する他の工程で成熟化されたＤＣより有意に高い免疫力を示した
図２８は、ＣＤ４０Ｌ ＲＮＡおよびＭａｒｔ‐１ ＲＮＡによりエレクトロポレーションされてＩＦＮ‐γおよびＰＧＥ２と４時間培養されたＤＣ（ＣＤ４０Ｌ）、またはサイトカイン（ＴＦＮα、ＩＦＮ‐γ、およびＰＧＥ２）により一晩成熟化され、次いでＭａｒｔ‐１ ＲＮＡでエレクトロポレーションされて４時間培養されたＤＣ（ＴＩＰ）、またはＭａｒｔ‐１ ＲＮＡによりエレクトロポレーションされてサイトカインカクテル（ＩＬ‐６、ＩＬ‐１β、ＴＦＮα、ＩＦＮγ、ＰＧＥ２）と４時間同時培養された未成熟ＤＣ（サイトカイン）のようなＤＣを作製する他の方法と比較した、ＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ工程で作製されたＤＣとの同時培養で２５日目におけるＭａｒｔ‐１反応性ＣＴＬの増加率について示す。Ｍａｒｔ‐１特異的ＣＴＬをＭＡＲＴ‐１／ＨＬＡ-Ａ２ペンタマーおよび抗ＣＤ８レセプター抗体での同時染色により同定した。図２８（下パネル）および図２９は、ＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ ＤＣの存在下において作製されたＭＡＲＴ‐１ ＣＴＬの大部分が、他のＤＣ調製物の存在下で作製されたＣＴＬとは対照的に、ＣＤ２８レセプターを発現することを示す。
【０２６７】
図２９において描かれたＣＤ２８レセプター発現の時間経過は、同時培養期間中で早くも１４日目に、ＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ ＤＣ同時培養物からのＭＡＲＴ‐１ ＣＴＬの８９％がＣＤ２８レセプターを発現することを示す。更にＣＴＬは同時培養期間中ずっとＣＤ２８レセプター発現を維持している。これは、ＣＤ２８発現が経時的に衰えるＴＩＰ ＤＣおよびサイトカインＤＣ双方の同時培養物と対照的である。ＣＤ２８レセプター陽性細胞は、ＣＤ４５ＲＡ分子に対する抗体との特異的染色の欠如に基づき、抗原経験ＭＡＲＴ‐１ ＣＴＬとみなされる。
【０２６８】
図３０は、培養の１０日目に、他のＤＣ工程ＴＩＰ（６．５％）、ＣＤ４０Ｌ（５０％）およびサイトカイン（１４％）と比較して、ＰＭＥ‐ＣＤ４０ＬがＩＦＮ‐γＨＩ／ＩＬ‐２ＨＩ産生ＣＴＬの最大値（６０％）を誘導できたことを示す。
【０２６９】
図３１は、Ｍａｒｔ‐１ ＣＴＬにより産生されているサイトカインの全体レベルの尺度として、ＩＦＮ‐γ陽性ＣＴＬの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。最高レベルのＩＦＮ‐γ産生はＭａｒｔ‐１ ＣＴＬ ＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ ＤＣ同時培養物で見られる。
【０２７０】
ＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ工程で成熟化されたＤＣは、抗原特異的エフェクター／メモリーＣＴＬの集団を優先的に誘導する
‘ＣＤ４０Ｌベース工程’による一次免疫応答の誘導にもかかわらず、ＤＣがＣＤ４０Ｌ＋抗原コードｍＲＮＡでエレクトロポレーション前に最初にＴＮＦ‐α、ＩＦＮ‐γおよびＰＧＥ２で成熟化される‘ＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ’工程は、ＭＡＲＴ抗原モデル系を用いると、ＣＴＬ活性で有意な改善を呈する（図１３）。これら抗原反応性ＣＴＬの更なる解析においては、ＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ工程で成熟化されたＤＣが、図２８で記載されたような他の方法を用いて成熟化されたＤＣより多数のＭＡＲＴ‐１反応性ＣＴＬを誘導することを明らかにした。更に、抗原経験ＭＡＲＴ‐１反応性ＣＴＬは、他のＤＣ同時培養物からアッセイされたＭＡＲＴ‐１ ＣＴＬとは対照的に、ＣＤ２８レセプターの発現を維持し続けている（図２８および２９）。これらの細胞はＣＤ４５ＲＡ分子発現の欠如により抗原経験ＣＴＬと規定されるが（Tomiyama et al.J.Immunol.(2002)168:5538-5550）、ＣＤ２８レセプターの発現とＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ ＤＣ同時培養物に存在するそれらの数の増加に基づくと最終分化エフェクターＣＴＬとはみなされない。これらのＣＴＬは、ウイルス特異的ＣＴＬがＣＤ２８陰性であり、かつほとんど増殖しない、文献で報告されていた他のエフェクター／メモリーＣＴＬとは異なる（Weekes et al.J.Immunol.(1999)162:7569-7577）。ＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ ＤＣは、抗原の存在下で増殖しうる能力を留めた抗原特異的ＣＴＬの新集団を誘導する。したがって、これらのＣＴＬはＤＣを作製する他の方法で作製されたＣＴＬの種類とは異なる。これは、ナイーブＴ細胞または抗原特異的Ｔ細胞の集団からＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＡ−メモリー／エフェクターＴ細胞の集団を優先的に誘導する樹状細胞について最初の報告である。
【０２７１】
ＣＭＶ（Topp et al.J.Exp.Med.(2003)198:947-955）およびＨＩＶ（Lieberman et al.2001,Blood 98:1667-1677）のようなあるウイルス感染症でみられるものと類似した長期抗原刺激に際して、ＣＤ２８の発現の喪失とＩＬ‐２を産生しうる能力の喪失がある。図３０は、ＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ作製ＤＣが、成熟ＤＣを作製する他の方法とは対照的に、ＩＬ‐２およびＩＦＮ‐γ双方を産生しうる能力を留めたＭＡＲＴ‐１特異的ＣＴＬを初回免疫しうることを示す。そこでは、ＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ ＤＣが、他のＤＣ工程ＴＩＰ（６．５％）、ＣＤ４０Ｌ（５０％）およびサイトカイン（１４％）と比較して、最高率のＩＦＮ‐γ／ＩＬ‐２ダブルポジティブＣＴＬ（６０％）を誘導できた。ＨＩＶ特異的ＣＴＬ上でＣＤ２８レセプターの喪失が漸増性ＨＩＶウイルス複製とパラレルであることが報告されていた（Gamberg et al.Immunology and Cell Biology(2004)82:38-46）。一方、ＩＦＮγ／ＩＬ‐２を産生するＨＩＶ特異的ＣＴＬはＨＩＶ特異的ＣＴＬの増殖をサポートしうる（Zimmerli et al.PNAS(2005)102:7239-7244）。これらのＩＦＮγ／ＩＬ‐２産生ＣＴＬはＣＤ４５ＲＡ陰性エフェクター表現型を有するが、それらはＣＤ２８レセプターを用いて特徴づけられなかった。Toppら（J.Exp.Med.(2003)198:947-955）は、ＣＤ２８レセプターをＣＤ２８陰性ＣＭＶまたはＨＩＶへ再導入することにより、特異的ＣＴＬがＩＬ‐２産生を復活させてＣＴＬ増殖を持続しうることを示した。ＤＣを作製するＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ工程は、ＤＣを作製する他の方法と異なり、ＣＤ２８陽性でありかつ高レベルのＩＬ‐２およびＩＦＮ‐γを産生しうる能力を留めた抗原特異的ＣＴＬを誘導しうる。このように、ＤＣを作製するＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ工程は、長期抗原特異的ＣＴＬエフェクター機能をサポートすることができ、しかも全重要事象において拡大し、サイトカインを産生し、標的細胞を殺して、頑強な長期ＣＴＬエフェクター機能を媒介しうる能力を留めたエフェクターメモリーＣＴＬの好ましい表現型を誘導することができる。
【０２７２】
ＣＤ４０Ｌ ＭＥＴ１インビトロ転写（ＩＶＴ）、転写後キャップ化およびポリアデニル化ｍＲＮＡの大規模作製
トランケート化ＣＤ４０Ｌインビトロ転写（ＩＶＴ）ｍＲＮＡの産生のためのプラスミドテンプレートを大規模で産生するために、ｐＣＤ４０Ｌ ΔＸＥ‐ＭＥＴ１の全配列を化学的に合成した。この合成構築物をｐＡＲＧ ＣＤ４０Ｌと命名した。ｐＡＲＧ ＣＤ４０Ｌの配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４で示されている。ＩＶＴ ＣＤ４０Ｌ‐ＭＥＴ１転写物（ポリアデニル化前）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４のヌクレオチド残基３５６６‐４４８０に相当する。ＣＤ４０Ｌ‐ＭＥＴ１の第一メチオニンコドンはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４のヌクレオチド残基３６６６‐３６６８に相当する。このＩＶＴ ｍＲＮＡから翻訳されたＣＤ４０Ｌ‐ＭＥＴ１タンパク質はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に相当する。
【０２７３】
第一工程においては、インビトロ転写用の最良テンプレートを産生するためにｐＡＲＧ ＣＤ４０Ｌを線状化させた。簡単に言えば、６０ｒｐｍの速度にセットされたPrecision Reciprocal Shaking Water Bath中３７℃にてＳｐｅＩ制限酵素（無ＢＳＡ）で１２．５ｍＬの全容量中における消化により２．５ｍｇのｐＡＲＧ ＣＤ４０Ｌを線状化させた。次いで、Qiagen ＲＮeasy Maxi Spinカラムを用いて線状プラスミドを精製した。特に、６２．５ｍＬのQiagen Buffer ＰＢを線状プラスミドへ加えた。Buffer ＰＢ中線状プラスミド７．５ｍＬを１０本のQiagen ＲＮeasy Maxi Spinカラムの各々へ加えた。スイングバケットローターおよび５０ｍＬチューブアダプター装備のSORVALL ＲＴ７遠心機中２５℃で３分間にわたり４０００ｒｐｍでカラムを遠心した。フロースルーを捨て、カラムをカラム当たり７．５ｍＬのQiagen Buffer ＰＢで洗浄し、２５℃において３分間４０００ｒｐｍで遠心し、次いでエタノール含有Buffer ＰＥ（１９２ｍＬの無ヌクレアーゼ１００％エタノールと混合された４８ｍＬ Buffer ＰＥ）１０ｍＬで洗浄し、２５℃において３分間４０００ｒｐｍ、次いで２５℃において１０分間４０００ｒｐｍで遠心した。各カラムへ０．８ｍＬ無ヌクレアーゼ水を加え、ドライインキュベーター中３０℃で５〜７分間インキュベートし、次いで２５℃で１０分間４０００ｒｐｍで遠心により溶出液を集めることにより、線状ｐＡＲＧ ＣＤ４０Ｌを溶出させた。線状ｐＡＲＧ ＣＤ４０Ｌを等分し、−８５±１０℃で保存した。
【０２７４】
第二工程においては、Epicentre Biotechnologies AmpliScribe Ｔ７-Flash Transcription Kitからの試薬を用いて線状ｐＡＲＧ ＣＤ４０ＬからインビトロでＣＤ４０Ｌ ＭＥＴ１ ＲＮＡを転写した。簡単に言えば、６．８ｍＬ無ヌクレアーゼ水中１０００μｇ線状ｐＡＲＧ ＣＤ４０Ｌを、２ｍＬ Ｔ７ １０×反応緩衝液、１．８ｍＬ １００ｍＭ ＡＴＰ、１．８ｍＬ １００ｍＭ ＣＴＰ、１．８ｍＬ １００ｍＭ ＧＴＰ、１．８ｍＬ １００ｍＭ ＵＴＰおよび２ｍＬ １００ｍＭ ＤＴＴと混合し、次いで２ｍＬのAmpliScribe Ｔ７-Flash Ｔ７酵素溶液の添加前に３７±１℃、振盪水浴中で１０分間加温した。この反応混合液を３７±１℃振盪水浴中６０ｒｐｍで６０分間インキュベートした。次いで１ｍＬの１ｍｇ／ｍＬ Pulmozyme Enzyme（dornase alpha、Genentech,Inc.）を加えることによりｐＡＲＧ ＣＤ４０Ｌ ＤＮＡをＩＶＴ ＲＮＡ調製物から消化させ、３７±１℃振盪水浴中６０ｒｐｍで３０〜３５分間インキュベートを続けた。６０ｍＬ無ヌクレアーゼ水を消化産物へ加え、次いでこれを３００ｍＬ ＲＬＴ緩衝液（Qiagen）および３ｍＬ ２‐メルカプトエタノールを含有した１０００ｍＬボトルへ移した。内容物をスワーリングで混合させ、次いで２２０ｍＬ無ヌクレアーゼ１００％エタノールを加え、スワーリングで混合させた。このＣＤ４０Ｌ ＭＥＴ１ ＩＶＴ ＲＮＡ溶液１５ｍＬを２０本のQiagen ＲＮeasy Maxiカラムの各々へ入れた。各カラムをスイングバケットローターおよび５０ｍＬチューブアダプター装備のSORVALL ＲＴ７遠心機中２５℃で３分間にわたり４０００ｒｐｍで遠心した。フロースルーを捨て、１２ｍＬの残留ＩＶＴ ＲＮＡを２０カラムの各々へ入れた。カラムを２５℃において３分間４０００ｒｐｍで再び遠心し、フロースルーを捨てた。カラムをカラム当たり１０ｍＬのエタノール含有Qiagen ＲＰＥ緩衝液（８５ｍＬ Qiagen ＲＰＥ緩衝液および３４０ｍＬの１００％無ヌクレアーゼエタノール）により２回洗浄し、１回目洗浄後２５℃で３分間４０００ｒｐｍで１回、および２回目洗浄後に２回遠心した。各カラムへ１．５ｍＬ無ヌクレアーゼ水を加え、ドライインキュベーター中３０±１℃で８〜１０分間インキュベートし、次いで２５℃において、３分間４０００ｒｐｍで遠心により溶出液を集めることにより、ＩＶＴ ＲＮＡを溶出させた。各カラムへ１．５ｍＬ無ヌクレアーゼ水を加え、ドライインキュベーター中３０±１℃において８〜１０分間インキュベートし、次いで２５℃で３分間４０００ｒｐｍで遠心により溶出液を集めることにより、ＩＶＴ ＲＮＡを２回目に溶出させた。ＣＤ４０Ｌ ＭＥＴ１ ＩＶＴ ＲＮＡをプールし、等分し、−８５±１０℃において保存した。収量は≧６５ｍｇ ＣＤ４０Ｌ ＭＥＴ１ ＩＶＴ ＲＮＡであった。
【０２７５】
第三工程においては、ＣＤ４０Ｌ ＭＥＴ１ ＩＶＴ ＲＮＡをインビトロでキャップ化およびポリアデニル化した。真核細胞中ＲＮＡ転写物で形成されたキャップから区別しえないタイプＩキャップ構造をもつＲＮＡを産生するために、ワクシニアウイルスキャッピング酵素および２′‐Ｏ‐メチルトランスフェラーゼを用いた。簡単に言えば、４０ｍｇ ＣＤ４０Ｌ ＭＥＴ１ ＩＶＴ ＲＮＡ、４７．５６６ｍＬ無ヌクレアーゼ水、６．７ｍＬ １０×キャッピング緩衝液（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、６０ｍＭ ＫＣｌおよび１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、Epicentre Biotechnologies ScriptCap Cap１ Capping Kitから）、６．７ｍＬ １０ｍＭ ＧＴＰおよび３３４μＬ ２０ｍＭ Ｓ‐アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）を２５０ｍＬフラスコ中で混合し、３７±１℃振盪水浴中で１５±２分間加温した。２．７ｍＬの１０，０００Ｕ／ｍＬ ScriptCapキャッピング酵素（ワクシニアウイルスキャッピング酵素）および２．７ｍＬの０．１ｍｇ／ｍＬ ScriptCap ２′‐Ｏ‐メチルトランスフェラーゼ（双方ともEpicentre Biotechnologies製）を加え、フラスコを６０ｒｐｍの速度にセットされた３７±１℃振盪水浴中において、６０±５分間インキュベートした。このインキュベート後、３３．８ｍＬ無ヌクレアーゼ水、１３．４ｍＬ １０×Ａ Plus反応緩衝液（０．５Ｍ Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２．５Ｍ ＮａＣｌ、および１００ｍＭ ＭｇＣｌ２）および１３．４ｍＬ １０ｍＭ ＡＴＰをフラスコへ加え、次いでこれを６０ｒｐｍの速度にセットされた３７±１℃振盪水浴中において、１５±２分間加温した。５．４ｍＬの４０００Ｕ／ｍＬ Ａ-Plusポリ（Ａ）ポリメラーゼ（Epicentre Biotechnologies）を加え、スラスコを６０ｒｐｍの速度にセットされた３７±１℃振盪水浴中で６０±５分間インキュベートした。次いでＲＮeasy Maxi Kit（Qiagen）を用いてキャップ化およびポリアデニル化ＲＮＡを精製した。特に、キャップ化およびポリアデニル化ＩＶＴ ＣＤ４０Ｌ ＭＥＴ１ ＲＮＡを含有するフラスコの内容物を５００ｍＬ ＲＬＴ緩衝液（Qiagen）および５ｍＬ ２‐メルカプトエタノール含有の１０００ｍＬボトルへ移し、スワーリングにより混合させた。３６７ｍＬ無ヌクレアーゼ１００％エタノールを加え、強いスワーリングで混合させた。この溶液１５ｍＬを１０本のＲＮeasy Maxiカラム（Qiagen）の各々へ適用した。各カラムをスイングバケットローターおよび５０ｍＬチューブアダプター装備のSORVALL ＲＴ７遠心機中２５℃で３分間にわたり４０００ｒｐｍで遠心した。フロースルーを捨て、１５ｍＬの残留ＩＶＴ ＲＮＡを２０カラムの各々へ入れた。カラムを２５℃において３分間４０００ｒｐｍで再び遠心し、フロースルーを捨てた。残留ＲＮＡのすべてがカラムへ結合されるまで、この工程を繰り返した。カラムを更に１回遠心し、次いでカラム当たり１０ｍＬのエタノール含有Qiagen ＲＰＥ緩衝液（８５ｍＬ Qiagen ＲＰＥ緩衝液および３４０ｍＬの１００％無ヌクレアーゼエタノール）により２回洗浄し、１回目洗浄後２５℃において３分間４０００ｒｐｍで１回、および２回目洗浄後に２回遠心した。各カラムへ１．３ｍＬ無ヌクレアーゼ水を加え、ドライインキュベーター中３０±１℃において８〜１０分間インキュベートし、次いで２５℃におい��３分間４０００ｒｐｍで遠心により溶出液を集めることにより、ＩＶＴキャップ化およびポリアデニル化ＣＤ４０Ｌ ＭＥＴ１ ＲＮＡを溶出させた。各カラムへ１．３ｍＬ無ヌクレアーゼ水を加え、ドライインキュベーター中３０±１℃において８〜１０分間インキュベートし、次いで２５℃において３分間４０００ｒｐｍで遠心により溶出液を集めることにより、ＲＮＡを更に２回溶出させた。ＩＶＴ ＲＮＡ溶出液をプールし、無菌１５０ｍＬ ＰＥＳ膜フィルター真空ユニットを用いて濾過し、等分し、樹状細胞のトランスフェクトに用いるまで≦−１５０℃において保存した。収量は≧４１ｍｇキャップ化およびポリアデニル化ＣＤ４０Ｌ ＭＥＴ１ ＩＶＴ ＲＮＡであった。ＨＩＶ抗原ＲＮＡを用いる好ましいトランスフェクションプロトコールでは、１μｇ ＣＤ４０Ｌ ＭＥＴ１ ＲＮＡが１０６樹状細胞当たり１μｇ ＨＩＶ Ｇａｇ ＲＮＡ、１μｇ ＨＩＶトランケート化Ｖｐｒ ＲＮＡ、１μｇ ＨＩＶ Ｒｅｖ ＲＮＡ、および０．２５μｇ ＨＩＶ Ｎｅｆ ＲＮＡと同時トランスフェクトされる。全腫瘍ＲＮＡを用いる好ましいトランスフェクションプロトコールでは、３μｇ ＣＤ４０Ｌ ＭＥＴ１ ＲＮＡが１０６樹状細胞当たり２μｇの全腫瘍ＲＮＡと同時トランスフェクトされる。
【０２７６】
ＲＮＡの翻訳を改善するためのロタウイルス遺伝子６ ３′ＵＴＲの使用
ロタウイルス遺伝子６ ３′ＵＴＲがＣＤ４０Ｌタンパク質の発現を高めるという当初の観察（前記）をいくつかの代替配列で試験した。肺炎抗原をコードするＯｍｌＡ ｃＤＮＡが、Vaccine and Infectious Disease Organization（ＶＩＤＯ）から親切にも提供された。３′ＵＴＲに３′Ｒｏｔ６配列含有または非含有のＲＮＡ発現ベクターｐＧＥＭ４Ｚ６４Ａ‐ＳｐｈＩへｃＤＮＡ配列をサブクローニングした。ＲＮＡを転写後反応でキャップ化し、ポリアデニル化させた。ＯｍｌＡまたはＯｍｌＡ Ｒｏｔ６ ＲＮＡからのインビトロ翻訳産物のウエスタンブロット解析では、特異的抗ＯｍｌＡ抗血清を用いるＯｍｌＡ ＲＮＡテンプレート含有反応において、予想分子量の特定バンドを検出した。ＯｍｌＡテンプレートと比較して、ＯｍｌＡ Ｒｏｔ６テンプレートからのバンド強度には少し増加がある（図３２）。
【０２７７】
黒色腫関連抗原をコードするＴｒｙｐ‐２コード配列をＲｏｔ６ ３′ＵＴＲ修飾含有または非含有のｐＧＥＭ４Ｚ６４Ａ‐ＳｐｈＩプラスミドへサブクローニングした。ＲＮＡをＡＲＣＡで同時転写的に転写かつキャップ化し、転写後にポリアデニル化した。３５Ｓ標識ＯｍｌＡまたはＯｍｌＡ Ｒｏｔ６のインビトロ翻訳研究においては、Ｔｒｙｐ‐２ Ｒｏｔ６からの発現レベルがＴｒｙｐ‐２ ＲＮＡの場合と比較して高いことを示した（図３３）。次いでより詳しい解析をＤＣで行った。様々なキャップ化ＲＮＡをＴｒｙｐ‐２またはＴｒｙｐ‐２ Ｒｏｔ６テンプレートから作製した。全ＡＲＣＡ ＲＮＡについて同時転写キャッピング法を用いた、全ｍ７Ｇキャップ（タイプ０またはタイプ１）について転写後キャッピング法を用いた。ＲＮＡをＤＣへトランスフェクトし、エレクトロポレーション後４時間または２４時間目に抗Ｔｒｙｐ‐２特異的抗体を用いて発現レベルを測定した。図３４は、研究されたキャップの全種類について、Ｒｏｔ６ ３′ＵＴＲで得られた発現レベルがＲｏｔ６ ３′ＵＴＲなしの相当対応物の場合よりやや高かったことを示す。例えば、Ｒｏｔ６ ３′ＵＴＲ含有のｍ７Ｇタイプ１キャップ化ＲＮＡは高レベルの染色強度および陽性細胞率を示した。この傾向は試験された全種類のキャップに当てはまる。
【０２７８】
ＩＬ‐４マウスｃＤＮＡをＲｏｔ６ ３′ＵＴＲ修飾含有または非含有のＲＮＡ転写ベクターへサブクローニングした。ＡＲＣＡ同時転写キャッピング法またはｍ７Ｇ（タイプ０またはタイプ１）転写後キャッピングを用いて様々なキャップ化ＲＮＡを合成した。全ＲＮＡを転写後ポリアデニル化反応でポリアデニル化した。ロタウイルス遺伝子６ ３′ＵＴＲ配列の効果は、４μｇ ＲＮＡ／ＤＣ百万個を用いてＡＲＣＡで同時転写的にＲＮＡがキャップ化された場合に特に顕著であった。該傾向は、４μｇ ＲＮＡがトランスフェクションに用いられた場合に試験された全種類のキャップにおいてみられる（図３５）。
【０２７９】
追加実験では、Ｒｏｔ６ ３′ＵＴＲ含有または非含有のｍ７Ｇタイプ１キャップ化およびポリアデニル化ＲＮＡからのＩＬ‐４の発現レベルを比較した。陽性細胞率、細胞内染色の強度（パネルＢ）およびＥＬＩＳＡにより測定されたＩＬ‐４サイトカインの分泌（パネルＣ）に及ぼすＩＬ‐４ ＲＮＡ中ロタウイルス遺伝子６ ３′ＵＴＲ配列の効果。図３６、パネルＡでみられるように、Ｒｏｔ６ ３′ＵＴＲ修飾ＲＮＡが用いられた場合にエレクトロポレーション後２１時間で陽性染色された細胞のパーセントには増加がある。パネルＢは、抗ＩＬ‐４抗体による細胞内染色の強度が、ＲＮＡがＲｏｔ６ ３′ＵＴＲで修飾されたときにエレクトロポレーション後４時間におて大きいことを示す。ロタウイルス遺伝子６ ３′ＵＴＲの効果は、ＩＬ‐４サイトカイン産生のレベルが４μｇＲＮＡ／ＤＣ百万個で測定された場合に最も顕著であり、その際にＩＬ‐４サイトカインレベル分泌の著しい増加があり、後の試験時点では更に一層顕著である（パネルＣ）。
【図面の簡単な説明】
【０２８０】
【図１】図１は、ＩＦＮ‐γに続く可溶性ＣＤ４０ＬにおいてＤＣの順次成熟化が最良ＩＬ‐１２ｐ７０分泌を生じることを示す。ＤＣはサイトカインカクテル、可溶性ＣＤ４０Ｌ単独、または可溶性ＣＤ４０Ｌ＋ＩＦＮ‐γにおいて成熟させた。１０００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ‐γで１８時間、次いで可溶性ＣＤ４０Ｌの添加で更に１８時間にわたる未成熟ＤＣのプレインキュベートで、最大ＩＬ‐１２ｐ７０放出を生じる。最初に可溶性ＣＤ４０Ｌ、次いでＩＦＮ‐γの適用が、ＩＬ‐１０に伴う最少ＩＬ‐１２ｐ７０放出で、陰性シグナルとして認められる。
【図２】図２は、ＣＤ４０Ｌをコードし、かつ＞１００ヌクレオチドのポリＡテールを有するｍＲＮＡでトランスフェクトされたＨＥＬＡ細胞が、抗ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）抗体によるＦＡＣＳ解析で調べたところ、細胞表面タンパク質を発現することを示す。
【図３】図３は、ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡトランスフェクト細胞からのＩＬ‐１２ｐ７０分泌がトランスフェクションペイロードの大きさと比例することを示す。ＤＣが、滴定量のＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡ直後に１０００Ｕ／ｍｌ ＩＦＮ‐γの添加によりトランスフェクトされた。有意レベルのＩＬ‐１２ｐ７０は、ＤＣ百万個当たり２μｇ〜４μｇのＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡを用いると放出された。
【図４】図４は、細胞百万個当たり４μｇ ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡでトランスフェクトされ、直後に表示量のＩＦＮ‐γとインキュベートされたＤＣによる、ＩＬ‐１２およびＩＬ‐１０分泌に及ぼすＩＦＮ‐γ濃度の効果について示す。ＩＬ‐１２ｐ７０およびＩＬ‐１０が２４時間後に培養上澄で測定された。約１００Ｕ／ｍｌおよびそれ以上の濃度のＩＦＮ‐γが、最大ＩＬ‐１２ｐ７０分泌を誘導する上で、ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡペイロードと相乗作用を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、ＣＤ４０Ｌ／ＩＦＮ‐γで誘導されたＩＬ‐１２ｐ７０分泌が、ＤＣのトランスフェクションおよびＩＦＮ‐γの存在下において、培養後に２０時間および２４時間の時点で生じていることを示す。ＤＣが細胞百万個当たり４μｇ ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡでトランスフェクトされ、直後に１０００Ｕ／ｍｌ ＩＦＮ‐γと培養された。上澄が表示時間にレプリカ培養物から集められ、ＩＬ‐１２ｐ７０およびＩＬ‐１０含有量についてアッセイされた。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡトランスフェクトＤＣへのＴＮＦ‐αの添加がＩＬ‐１２ｐ７０の産生をもたらすが、発現のレベルが補助成熟化物質としてＩＦＮ‐γで得られるよりも低いことを示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、補助成熟化因子としてＴＮＦ‐αの使用もＩＦＮ‐γの使用と比較して高レベルのＩＬ‐１０をもたらすことを示す。
【図６】図６Ａ〜Ｃは、ＣＤ４０ＬをコードするｍＲＮＡでトランスフェクトされたＤＣが、抗ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）抗体によりＦＡＣＳ解析で調べたところ、細胞発現を呈することを示す。ＤＣが細胞百万個当たり４μｇ ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡでトランスフェクトされ、様々な時点で解析された。図６Ａは、表面発現が著しく低い４時間の時点で調べたところ、ＣＤ４０Ｌの大部分が細胞内区画に局在することを示す。図６Ｂは、有意の細胞内発現が６０分間のとき２７％陽性ＤＣで明らかであり、３時間で７９％に増すことを示す。図６Ｃは、ｍＲＮＡをコードするＣＤ４０ＬでＤＣのトランスフェクション後における、ＣＤ４０Ｌタンパク質の一過性発現を示す。
【図７】図７は、ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡでトランスフェクトされ、かつＩＦＮ‐γの存在下において培養されたＤＣが、過剰の遮断抗ＣＤ４０Ｌ抗体の存在下にもかかわらず、ＩＬ‐１２ｐ７０を分泌し、そのことがＣＤ４０／ＣＤ４０相互作用が“細胞内”区画で働く示唆であることを示す。ＤＣが４μｇ ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡでトランスフェクトされ、直後に１０または５０μｇ／ｍｌの遮断抗ＣＤ４０Ｌ抗体の存在下において１０００Ｕ／ｍＬ ＩＦＮ‐γと培養された。ＩＬ‐１２ｐ７０放出は５０％減少するだけであり、このことは細胞対細胞シグナリングよりもむしろ細胞内シグナリングがＩＬ‐１２ｐ７０の誘導にとり主要経路であることを示す。
【図８】図８は、ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡでトランスフェクトされ、かつＩＦＮ‐γと同時培養されたＤＣが、ケモカイン依存性移動を行わせる上でＰＧＥ２の存在を必要とすることを示す。ＤＣが滴定量のＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡによりトランスフェクトされ、直後に１０００Ｕ／ｍＬ ＩＦＮ‐γおよび１μｇ／ｍｌ ＰＧＥ２とインキュベートされた。ｅＧＦＰによりトランスフェクトされかつＰＧＥ２を含有するサイトカインカクテルで成熟化されたＤＣが、陽性コントロールを表す。１８時間の成熟化後、各培養条件からのＤＣがリンパ節ホーミングケモカインＣＣＬ１９および２１に対する“トランスウェル”移動アッセイで試験された。ＤＣ移動はＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡペイロードのサイズと比例していた。
【図９】図９は、ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡでトランスフェクションにより成熟化され、かつＩＦＮ‐γおよびＰＧＥ２の存在下において培養されたＤＣが、“サイトカインカクテル”の存在下において成熟化されたＤＣと比較して、効率的なＴ細胞“リコール応答”を惹起することを示す。ＤＣが抗原ペイロードとして細胞百万個当たり２μｇ ｆｌｕ Ｍ１ ｍＲＮＡおよび４μｇ ｅＧＦＰ ｍＲＮＡコントロールで同時トランスフェクトされ、その後サイトカインカクテルで成熟化された。一方、ＤＣが抗原ペイロードとして細胞百万個当たり２μｇ ｆｌｕ Ｍ１ ｍＲＮＡおよび成熟化ペイロードとして４μｇ ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡで同時トランスフェクトされた。これらのうち後者の細胞は、成熟化工程を完了させるために、１０００Ｕ／ｍＬ ＩＦＮ‐γおよび１μｇ／ｍｌ ＰＧＥ２と直ちに培養された。２４時間後、ＩＦＮ‐γを分泌する応答Ｔ細胞の出現頻度により調べられるような、抗ｆｌｕ Ｍ１リコール応答をリクルートするために、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで各ＤＣ集団が用いられた。ＩＦＮ‐γおよびＰＧＥ２の存在下、ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡによりトランスフェクションにより成熟化されたＤＣの方が、強い抗ｆｌｕ応答を惹起した。
【図１０】図１０は、ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡでトランスフェクションにより成熟化されかつＩＦＮ‐γおよびＰＧＥ２の存在下において培養されたＤＣが、“サイトカインカクテル”の存在下において成熟化されたＤＣと比較して、効率的な“一次Ｔ細胞応答”を惹起することを示す。ＤＣが抗原ペイロードとして細胞百万個当たり２μｇ ＭＡＲＴ‐ＡＰＬ ｍＲＮＡでトランスフェクトされ、その後サイトカインカクテルで成熟化された。一方、ＤＣが抗原ペイロードとして細胞百万個当たり２μｇＭＡＲＴ‐ＡＰＬ ｍＲＮＡおよび成熟化ペイロードとして４μｇ ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡで同時トランスフェクトされた。これらのうち後者の細胞は、成熟化工程を完了させるために、１０００Ｕ／ｍＬ ＩＦＮ‐γおよび１μｇ／ｍｌ ＰＧＥ２と直ちに培養された。２４時間後、０．２Ｕ／ｍＬのＩＬ‐２の存在下において７日間にわたる自己ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞の同時培養により、トランスフェクトＭＡＲＴ‐ＡＰＬ ｍＲＮＡペイロードから作製されたＭＡＲＴ‐ＡＰＬペプチド配列に対してＴ細胞応答を生じさせるために、各ＤＣ集団が用いられた。この第一ラウンドの刺激後、Ｔ細胞がＩＬ‐２ ＥＬＩＳｐｏｔアッセイで回収および樹立され、適切な成熟化抗原負荷ＤＣにより再刺激された。ＩＦＮ‐γおよびＰＧＥ２の存在下、ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡでトランスフェクションにより成熟化されたＤＣの方が、ＩＬ‐２を分泌する応答ＣＤ８＋Ｔ細胞の出現頻度により調べたところ、強い抗ＭＡＲＴ‐ＡＰＬ応答を惹起した。
【図１１】図１１は、ＭＡＲＴ‐ＡＰＬ ｍＲＮＡを発現するＤＣによる、細胞傷害性Ｔ細胞の誘導について示す。図１１ａは可溶性インターフェロン‐γ／ＰＧＥ２の添加で抗原源としてＭＡＲＴ‐ＡＰＬ ｍＲＮＡおよびＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡでの同時トランスフェクションを用いたＤＣの成熟化が効果的ＣＴＬ応答を惹起することを示し、一方図１１ｂはＭＡＲＴ‐ＡＰＬ ｍＲＮＡでトランスフェクトされたが‘サイトカインカクテル’で成熟化されたＤＣがそうではないことを示す。Ｔ２‐ＰＳＡ：陰性コントロール標的として前立腺特異抗原（ＰＳＡ）からのＨＬＡ‐Ａ２拘束性ペプチドでパルスされたＴ２細胞。ＭＡＲＴ‐Ｔ２：天然配列のＨＬＡ‐Ａ２拘束性ＭＡＲＴエピトープでパルスされたＴ２細胞。ＭＡＲＴ‐ＡＰＬ‐Ｔ２：好ましい‘変更ペプチドリガンド’としてＨＬＡ‐Ａ２拘束性ＭＡＲＴエピトープでパルスされたＴ２細胞。
【図１２】図１２は、トランスウェルアッセイにおけるリンパ節ケモカインＣＣＬ１９および２１へのＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ成熟化ＤＣの移動能について示す。独立した健康なドナー４例が並行して試験されたが、各ＤＣ調製物はＤＣ百万個当たり４μｇ ＣＤ４０Ｌ ＲＮＡと一緒に１μｇ増幅全ＲＣＣ腫瘍ＲＮＡでトランスフェクトされた。移動アッセイはｍＲＮＡペイロードでトランスフェクション後に２４時間で行われた。
【図１３】図１３は、黒色腫関連抗原ＭＡＲＴ‐１に対する健康ドナーからのＣＴＬ応答の誘導について示す。ＤＣが調製され、ＭＡＲＴ‐１ ＲＮＡで負荷され、‘ＣＤ４０Ｌベース工程’で成熟化されたか、またはＤＣがＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ工程を用いて調製された。ＤＣおよび精製ＣＤ８ Ｔ細胞が１：１０比で同時培養され、ＩＬ‐２の存在下において３ラウンドの刺激を受けた。データは、ある範囲のエフェクター‐標的比でＭＡＲＴ‐１ペプチドパルスＴ２標的細胞を用いた、５１Ｃｒ放出細胞傷害アッセイについて示す。
【図１４】図１４は、全増幅ＲＣＣ腫瘍ＲＮＡで負荷されたＤＣ、ＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ成熟化ＤＣに対する完全自己ＣＴＬ応答の誘導について示す。ＤＣおよび精製ＣＤ８ Ｔ細胞が１：１０比で同時培養され、ＩＬ‐２の存在下において３ラウンドの刺激を受けた。最後の刺激後５日目に、ＣＤ８ Ｔ細胞が、全増幅ＲＣＣ ＲＮＡ、ｈＴＥＲＴ ＲＮＡ、Survivin ＲＮＡ、Ｇ２５０ ＲＮＡによりトランスフェクトされたＤＣまたはｅＧＦＰ ＲＮＡでトランスフェクトされた陰性コントロールＤＣで再刺激された。データは、活性化マーカーＣＤ６９の細胞表面染色と同時に細胞内ＩＦＮ‐γおよびＩＬ‐２の検出により、応答Ｔ細胞を同定することから得ている。細胞内サイトカイン応答は、ＩＦＮ‐γ／ＩＬ‐２ダブルポジティブ（メモリーＴ細胞）からＩＦＮ‐γシングルポジティブ（エフェクターＴ細胞）を同定するために細分化された。
【図１５】図１５は、ＫＲＮ７０００またはビヒクルでパルスされたＭＡＲＴ‐１ ＲＮＡトランスフェクトＣＤ４０Ｌベース工程成熟化ＤＣによる、ＮＫＴ細胞（ａ）およびＭＡＲＴ‐１反応性ＣＴＬ（ｂ）の拡大について示す。データは、ＫＲＮ７０００パルスＤＣがＣＤ１ｄ／ＫＲＮ７０００テトラマー染色でわかるようにＮＫＴ細胞を拡大でき、ＮＫＴ細胞の拡大集団の存在が、ＭＡＲＴ‐１／ＨＬＡ‐Ａ２テトラマーでテトラマー染色によりわかるように、ＭＡＲＴ‐１への一次ＣＴＬの同時リクルートを増加させうることを明らかに示す。
【図１６】図１６は、ヒト（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）およびマウス（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）ＣＤ４０Ｌ ｃＤＮＡのアライメントを示す。図１６Ａ、１６Ｂ、および１６Ｃは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および２のアライメントの３連続頁を表す。
【図１７】図１７は、ヒト（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）およびマウス（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０）ＣＤ４０Ｌタンパク質のアライメントを示す。
【図１８】図１８は、mMessage mMachine Ｔ７ Ultraキット（Ambion）を用いて１００μｇスケール（Delta Ｘ‐Ｅ１）または１ｍｇスケール（Delta Ｘ‐Ｅ２）転写反応でｐＣＲ２．１ ＣＤ４０Ｌ ＷＴ Delta Ｘ‐Ｅプラスミドから転写されたｍＲＮＡによりトランスフェクトされたＤＣによる、ＩＬ‐１２発現のレベルを示す。リファレンスＲＮＡはプラスミドｐＣＲ２．１ ＣＤ４０Ｌ ＷＴから転写された。転写ＣＤ４０Ｌ ＲＮＡが、Poly(Ａ)Plusキット（Epicentre）を用いて、ポリＡテールの添加により修飾された。ＲＮＡがＤＣへトランスフェクトされた。トランスフェクション後約２０時間で、ＥＬＩＳＡを用いて成熟ＤＣの上澄でＩＬ‐１２の量が測定された。陰性コントロール：ＣＤ４０Ｌ ＲＮＡなしでエレクトロポレーションされたＤＣの上澄で測定されたＩＬ‐１２発現。
【図１９】図１９は、様々なＲＮＡ構築物によりトランスフェクトされたＤＣ培養物の上澄におけるＩＬ‐１２のレベルを示す。ＣＤ４０Ｌタンパク質発現およびＩＬ‐１２サイトカインの誘導に及ぼす様々な５′ＵＴＲ配列の影響を評価するために、mMessage mMachine Ｔ７ Ultra転写キットを用いて、三種のＲＮＡが、プラスミドｐＣＲ２．１ ＣＤ４０Ｌ ＷＴ、ｐＣＲ２．１ ＣＤ４０Ｌ ΔＸＥ、およびｐＣＲ２．１ ＣＤ４０Ｌ＋５ＵＴＲから作製された。転写ＲＮＡがポリアデニル化され、ＲＮeasyキット（Qiagen）を用いて精製された。精製ＲＮＡが成熟ＤＣ中へトランスフェクトされた。ＤＣ培養物におけるＩＬ‐１２サイトカイン誘導は回収上澄においてＥＬＩＳＡにより測定された。
【図２０】図２０は、様々な５′ＵＴＲを含有するＲＮＡから誘導されたインビトロ翻訳〔３５Ｓ〕‐メチオニン標識ＣＤ４０Ｌタンパク質のＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分離について示す。
【図２１】図２１は、正常および変異開始コドンを含有するｍＲＮＡからインビトロ翻訳された〔３５Ｓ〕‐メチオニン標識ＣＤ４０Ｌタンパク質のＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分離について示す。
【図２２】図２２は、様々なＣＤ４０Ｌ ＲＮＡでトランスフェクトされかつ抗ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）抗体で染色された樹状細胞について示す。左パネル：４時間後におけるＣＤ４０Ｌ陽性細胞のパーセンテージ。右パネル：ＣＤ４０Ｌ染色の平均蛍光強度。原ＲＮＡ構築物ＣＤ４０Ｌ ＷＴは陽性コントロールとして働く。ＧＦＴ ＲＮＡトランスフェクト細胞は陰性コントロールとして働く。
【図２３】図２３は、様々なＣＤ４０Ｌ ＲＮＡでトランスフェクトされたＤＣにおける、ＩＬ‐１０およびＩＬ‐１２の発現プロファイルについて示す。
【図２４】図２４は、様々なＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡから誘導されたインビトロ翻訳産物のイソ型について示す。この図の表は、これらのＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡでトランスフェクトされた樹状細胞により発現されたＩＬ‐１２サイトカインの量を示す。
【図２５】図２５は、表示の修飾ＣＤ４０Ｌ ＲＮＡでトランスフェクトされた樹状細胞によるＩＬ‐１０およびＩＬ‐１２の分泌について示す。
【図２６】図２６は、表示のＣＤ４０Ｌ ＲＮＡから作製されたＣＤ４０Ｌポリペプチドの翻訳産物のＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分離について示す。
【図２７】図２７は、表示の修飾ＣＤ４０Ｌ ＲＮＡでトランスフェクトされた樹状細胞によるＩＬ‐１０およびＩＬ‐１２の分泌レベルについて示す。
【図２８】図２８は、ＣＤ４０Ｌ ＲＮＡおよびＭａｒｔ‐１ ＲＮＡによりエレクトロポレートされてＩＦＮ‐γおよびＰＧＥ２と４時間培養されたＤＣ（ＣＤ４０Ｌ）、またはサイトカイン（ＴＦＮα、ＩＦＮ‐γ、およびＰＧＥ２）により一晩成熟化されＭａｒｔ‐１ ＲＮＡでエレクトロポレーションされて４時間培養されたＤＣ（ＴＩＰ）、またはＭＡＲＴ‐１ ＲＮＡでエレクトロポレーションされサイトカインカクテル（ＩＬ‐６、ＩＬ‐１β、ＴＦＮα、ＩＦＮγ、ＰＧＥ２）と４時間同時培養された未成熟ＤＣ（サイトカイン）のようなＤＣを作製する他の方法と比較した、ＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ工程により作製されたＤＣとの同時培養で１０日目におけるＭａｒｔ‐１反応性ＣＴＬの増加率について示す。
【図２９】図２９は、ＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ工程、ＴＩＰ工程、ＣＤ４０Ｌベース工程、またはサイトカインカクテル工程により作製されたＤＣと同時培養されたＭＡＲＴ‐１ ＣＴＬにおける、ＣＤ２８レセプター発現の時間経過を示す。
【図３０】図３０は、ＰＭＥ‐ＣＤ４０Ｌ作製ＤＣが、成熟ＤＣを作製する他の方法とは対照的に、ＩＬ‐２およびＩＦＮ‐γ双方を産生する能力を留めたＭＡＲＴ‐１特異的ＣＴＬを初回免疫しうることを示す。
【図３１】図３１は、Ｍａｒｔ‐１ ＣＴＬにより産生されるサイトカインの全体レベルの尺度として、ＩＦＮ‐γ陽性ＣＴＬの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。
【図３２】図３２は、ＯｍｌＡまたはＯｍｌＡ ｒｏｔ６ ＲＮＡからのインビトロ翻訳産物のウエスタンブロット解析について示す。Ｍ：タンパク質マーカー，レーン１：ＯｍｌＡ ＲＮＡからの翻訳産物，レーン２：ＯｍｌＡ ｒｏｔ６ ＲＮＡからの翻訳産物，レーンＣ：無ＲＮＡテンプレートのコントロール反応。
【図３３】図３３は、Ｓ‐３５標識ＯｍｌＡまたはＯｍｌＡ Ｒｏｔ６のインビトロ翻訳研究について示す。レーン１：ＯｍｌＡをコードするＲＮＡから誘導された産物，レーン２：ＯｍｌＡ Ｒｏｔ６から誘導された産物，レーンＣ：無ＲＮＡテンプレートのコントロール反応。２０ｎｇまたは４０ｎｇの全タンパク質が、示されたようにＳＤＳ ＰＡＧＥで分離された。
【図３４】図３４は、上パネル：抗Ｔｒｙｐ‐２抗体で染色された陽性細胞％。下パネル：抗Ｔｒｙｐ‐２抗体による細胞の染色強度。
【図３５】図３５は、陽性細胞％（パネルＡ）、細胞内染色の強度（パネルＢ）およびＩＬ‐４サイトカインの分泌（パネルＣ）に及ぼす、ＩＬ‐４ ＲＮＡ中ロタウイルス遺伝子６ ３′ＵＴＲ配列の効果について示す。
【図３６】図３６は、陽性細胞％（パネルＡ）、細胞内染色の強度（パネルＢ）、およびＥＬＩＺＡにより測定されるＩＬ‐４サイトカインの分泌（パネルＣ）に及ぼす、ＩＬ‐４ ＲＮＡ中ロタウイルス遺伝子６ ３′ＵＴＲ配列の効果について示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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