(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（１）〜（４）から選択される少なくとも１種を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤。
（１）［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）β１］の二糖単位が２つ結合した４糖からなるオリゴ糖またはその塩。
（２）［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）β１］の二糖単位が３つ結合した６糖からなるオリゴ糖またはその塩。
（３）［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）β１］の二糖単位が２つ結合した４糖からなるオリゴ糖またはその塩。
（４）［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）β１］の二糖単位が３つ結合した６糖からなるオリゴ糖またはその塩。
【請求項２】
ヒアルロニダーゼがエンド−β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（ＥＣ３．２．１．３５）である請求項１記載の阻害剤。
【請求項３】
阻害対象とするヒアルロニダーゼの活性が糖鎖加水分解活性および／または糖転移活性である請求項２記載の阻害剤。
【請求項４】
下記の（５）〜（６）から選択される少なくとも１種を有効成分とするエンド−β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（ＥＣ３．２．１．３５）の糖転移活性の阻害剤。
（５）［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１］の二糖単位が２つ結合した４糖からなるオリゴ糖またはその塩。
（６）［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１］の二糖単位が３つ結合した６糖からなるオリゴ糖またはその塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品、化粧品、食品などの分野において、また、糖鎖工学技術上における反応制御ツールなどとして有用なヒアルロニダーゼ阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸を分解する酵素であり、加水分解酵素である動物由来の酵素と、脱離酵素である微生物由来の酵素に大別され、動物由来の酵素は、その作用部位（基質特異性）により、さらにエンド−β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（ＥＣ３．２．１．３５）や、エンド−β−グルクロニダーゼ（ＥＣ３．２．１．３６）などに分類される。哺乳動物のヒアルロニダーゼは、生体内においてヒアルロン酸を分解することで、加齢を含む種々の生命現象、感染、がんの転移、早産・流産などに関与していることが知られている。従って、その阻害剤は、がんや早産・流産などに対する医薬品の有効成分として期待される他、化粧品成分や食品素材などとしても期待される。また、エンド−β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼは、糖鎖加水分解活性に加えて糖転移活性を有することが知られており、糖鎖工学技術上においてアクセプターの糖鎖を伸張するために利用することができる。従って、その糖転移活性を阻害する物質は、糖鎖伸張反応の停止や伸張させる糖鎖長の制御を目的とした利用性なども期待される。
【０００３】
ヒアルロニダーゼ阻害剤の探索はこれまでにも数多くなされており、種々の化学構造を有するヒアルロニダーゼ阻害剤が提案されている。多糖やオリゴ糖を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤についての報告もいくつか存在し、例えば、特許文献１には、コンドロイチン硫酸などが早産や流産を防止するためのヒアルロニダーゼ阻害剤として有用であることが記載されている。また、特許文献２には、所定の生物学的活性を有する硫酸化多糖を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤が記載されている。特許文献３には、化学合成や、コンドロイチン硫酸などを出発原料として調製することができる硫酸基を持たない２〜８個の構成単糖からなるオリゴ糖誘導体が抗炎症・抗アレルギー作用を有するヒアルロニダーゼ阻害剤として有用であることが記載されている。
【０００４】
以上のように、コンドロイチン硫酸などの硫酸化多糖がヒアルロニダーゼ阻害活性を有することは特許文献１や特許文献２などから既に知られているところであるが、その医薬品としての利用を考えた場合、長鎖のコンドロイチン硫酸などはエンド−β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼの基質となることから、生体内で酵素活性を阻害する側面と酵素の基質として作用する側面を併せ持つので、目的とする薬理効果を十分に発揮させることができないという問題がある。加えて、硫酸化多糖は、その構成糖に対する硫酸基の結合位置や結合数、立体構造などの点において著しい多様性を有していることから、医薬品の有効成分たる化学物質としての均一性を担保することが困難であるという問題がある。また、従来技術においては、ヒアルロニダーゼに対する阻害活性とは、その糖鎖加水分解活性に対する阻害活性を意味しており、エンド−β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼが有する糖転移活性に対して多糖やオリゴ糖がどのような活性を有するかは、特許文献１〜特許文献３を含め、従来技術からは全く推し量ることができない状況にある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０００−３０９５４４号公報
【特許文献２】特開２０００−１７８１９６号公報
【特許文献３】特開平５−１７８８７６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで本発明は、医薬品の有効成分たる化学物質としての均一性を担保することが可能であり、糖鎖加水分解活性および／または糖転移活性に対して阻害活性を有するオリゴ糖を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記の点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、エンド−β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼであるウシ精巣性ヒアルロニダーゼの基質となるコンドロイチン４−硫酸、コンドロイチン６−硫酸、ヒアルロン酸のそれぞれを構成するオリゴ糖の中に、当該酵素の糖鎖加水分解活性および／または糖転移活性に対する阻害活性を有するものを見出した。
【０００８】
上記の知見に基づいてなされた本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤は、請求項１記載の通り、下記の（１）〜（４）から選択される少なくとも１種を有効成分とすることを特徴とする。
（１）［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）β１］の二糖単位が２つ結合した４糖からなるオリゴ糖またはその塩。
（２）［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）β１］の二糖単位が３つ結合した６糖からなるオリゴ糖またはその塩。
（３）［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）β１］の二糖単位が２つ結合した４糖からなるオリゴ糖またはその塩。
（４）［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）β１］の二糖単位が３つ結合した６糖からなるオリゴ糖またはその塩。
また、請求項２記載の阻害剤は、請求項１記載の阻害剤において、ヒアルロニダーゼがエンド−β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼであることを特徴とする。
また、請求項３記載の阻害剤は、請求項２記載の阻害剤において、阻害対象とするヒアルロニダーゼの活性が糖鎖加水分解活性および／または糖転移活性であることを特徴とする。
また、本発明のエンド−β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ（ＥＣ３．２．１．３５）の糖転移活性の阻害剤は、請求項４記載の通り、下記の（５）〜（６）から選択される少なくとも１種を有効成分とすることを特徴とする。
（５）［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１］の二糖単位が２つ結合した４糖からなるオリゴ糖またはその塩。
（６）［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１］の二糖単位が３つ結合した６糖からなるオリゴ糖またはその塩。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、医薬品の有効成分たる化学物質としての均一性を担保することが可能であり、糖鎖加水分解活性および／または糖転移活性に対して阻害活性を有するオリゴ糖を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例の（Ａ）における（１）および（２）において規定されるオリゴ糖（Ｃｈ４Ｓ−４およびＣｈ４Ｓ−６）を得るためのプロトコルである。
【図２】同、（３）および（４）において規定されるオリゴ糖（Ｃｈ６Ｓ−４およびＣｈ６Ｓ−６）を得るためのプロトコルである。
【図３】同、（５）および（６）において規定されるオリゴ糖（ＨＡ４およびＨＡ６）を得るためのプロトコルである。
【図４】実施例の（Ｂ）の実験１における被験オリゴ糖のヒアルロニダーゼが有する糖鎖加水分解活性に対する阻害活性を示すグラフである。
【図５】同、各種濃度のＣｈ４Ｓ−６を添加した場合と添加しなかった場合の実験結果をまとめた代表的なクロマトグラムチャートである。
【図６】実施例の（Ｂ）の実験２における被験オリゴ糖のヒアルロニダーゼが有する糖鎖加水分解活性に対する阻害活性を示すグラフである。
【図７】同、各種濃度のＣｈ４Ｓ−６を添加した場合と添加しなかった場合の実験結果をまとめた代表的なクロマトグラムチャートである。
【図８】実施例の（Ｃ）における被験オリゴ糖のヒアルロニダーゼが有する糖転移活性に対する阻害活性を示すグラフである。
【図９】同、各種濃度のＨＡ６を添加した場合と添加しなかった場合の実験結果をまとめた代表的なクロマトグラムチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤は、下記の（１）〜（６）から選択される少なくとも１種を有効成分とすることを特徴とするものである。
（１）［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）β１］の二糖単位が２つ結合した４糖からなるオリゴ糖またはその塩。
（２）［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）β１］の二糖単位が３つ結合した６糖からなるオリゴ糖またはその塩。
（３）［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）β１］の二糖単位が２つ結合した４糖からなるオリゴ糖またはその塩。
（４）［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）β１］の二糖単位が３つ結合した６糖からなるオリゴ糖またはその塩。
（５）［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１］の二糖単位が２つ結合した４糖からなるオリゴ糖またはその塩。
（６）［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１］の二糖単位が３つ結合した６糖からなるオリゴ糖またはその塩。
本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤の阻害対象となるヒアルロニダーゼとしては、例えば、糖鎖加水分解活性および糖転移活性を有するエンド−β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼが挙げられる。
【００１２】
上記の（１）において規定される［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）β１］の二糖単位が２つ結合した４糖からなるオリゴ糖は、コンドロイチン４−硫酸の構成オリゴ糖として公知の物質であり、下記の化学構造式で表される（還元末端のＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）の１β位と非還元末端のＧｌｃＵＡの４α位はいずれも水酸基である）。
【化１】
0005548979.tif 000002
【００１３】
上記の（２）において規定される［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）β１］の二糖単位が３つ結合した６糖からなるオリゴ糖は、コンドロイチン４−硫酸の構成オリゴ糖として公知の物質であり、下記の化学構造式で表される（還元末端のＧａｌＮＡｃ（４Ｓ）の１β位と非還元末端のＧｌｃＵＡの４α位はいずれも水酸基である）。
【化２】
0005548979.tif 000003
上記の（３）において規定される［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）β１］の二糖単位が２つ結合した４糖からなるオリゴ糖は、コンドロイチン６−硫酸の構成オリゴ糖として公知の物質であり、下記の化学構造式で表される（還元末端のＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）の１β位と非還元末端のＧｌｃＵＡの４α位はいずれも水酸基である）。
【化３】
0005548979.tif 000004
【００１４】
上記の（４）において規定される［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）β１］の二糖単位が３つ結合した６糖からなるオリゴ糖は、コンドロイチン６−硫酸の構成オリゴ糖として公知の物質であり、下記の化学構造式で表される（還元末端のＧａｌＮＡｃ（６Ｓ）の１β位と非還元末端のＧｌｃＵＡの４α位はいずれも水酸基である）。
【化４】
0005548979.tif 000005
【００１５】
上記の（５）において規定される［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１］の二糖単位が２つ結合した４糖からなるオリゴ糖は、ヒアルロン酸の構成オリゴ糖として公知の物質であり、下記の化学構造式で表される（還元末端のＧｌｃＮＡｃの１β位と非還元末端のＧｌｃＵＡの４α位はいずれも水酸基である）。
【化５】
0005548979.tif 000006
【００１６】
上記の（６）において規定される［４ＧｌｃＵＡβ１−３ＧｌｃＮＡｃβ１］の二糖単位が３つ結合した６糖からなるオリゴ糖は、ヒアルロン酸の構成オリゴ糖として公知の物質であり、下記の化学構造式で表される（還元末端のＧｌｃＮＡｃの１β位と非還元末端のＧｌｃＵＡの４α位はいずれも水酸基である）。
【化６】
0005548979.tif 000007
【００１７】
上記の（１）〜（６）において規定されるオリゴ糖の塩としては、例えば、ナトリウム塩やカリウム塩などのアルカリ金属塩、マグネシウム塩やカルシウム塩などのアルカリ土類金属塩などが挙げられる。
【００１８】
（１）〜（６）において規定されるオリゴ糖は、それぞれコンドロイチン４−硫酸、コンドロイチン６−硫酸、ヒアルロン酸の構成オリゴ糖として公知の物質であり、例えば、ウシ精巣性ヒアルロニダーゼを用いたこれらの多糖の酵素分解と、各種のクロマトグラフィーを用いた精製を行うことによって調製することができる（必要であればＢｉｏｃｅｍｉｓｔｒｙ，３３（１９９４），６５０３−６５０７などを参照のこと）。出発原料として使用することができる多糖の由来は特段限定されるものではなく、コンドロイチン４−硫酸およびコンドロイチン６−硫酸は、例えば、ウシ、クジラ、サメ、サケなどの動物（魚類を含む）の皮、骨、軟骨などに多く含まれていることは周知の通りである。ヒアルロン酸の由来は動物であっても微生物であってもよく（動物由来のヒアルロン酸としては例えばニワトリのトサカに含まれているものなどがよく知られている）、市販されているものを使用することができる。また、（１）〜（６）において規定されるオリゴ糖は、化学合成によっても調製することができる（必要であればＣｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．，１３（２００７），５２９−５４０やＡｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，４３（２００４），５２２１−５２２４などを参照のこと）。
【００１９】
本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤をがんや早産・流産などに対する医薬品の有効成分として利用する場合、（１）〜（６）において規定されるオリゴ糖またはその塩を、自体公知の方法で各種の製剤形態（錠剤、顆粒剤、カプセル剤、注射剤など）に製剤化し、経口的または非経口的に投与すればよい。その投与量は、患者の年齢や体重、症状の程度、健康状態などの条件によって適宜設定されるべきものである。また、例えばアンチエイジングのための化粧品成分などとして利用する場合、自体公知の基材や配合成分などとともにクリーム剤やローション剤などに製剤化して投与することができる。また、本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤は、食品素材として利用することも可能であり、種々の形態の食品（サプリメントを含む）にヒアルロニダーゼ阻害作用を発揮するに足る有効量を添加して食してもよい。
【００２０】
さらに、本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤は、生化学分野における研究試薬などとしても利用することができ、とりわけエンド−β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼが有する糖転移活性に対して阻害活性を有する本発明のヒアルロニダーゼ阻害剤は、アクセプターに対する糖鎖伸張反応の停止剤や伸張させる糖鎖長の制御剤などとしての新たな用途を提供するものであり、糖鎖工学技術上における反応制御ツールとなる。
【実施例】
【００２１】
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。
【００２２】
（Ａ）（１）〜（６）において規定されるオリゴ糖の調製
ウシ精巣性ヒアルロニダーゼ（シグマアルドリッチ社、Ｔｙｐｅ１−Ｓ）を用いた出発原料とする多糖の酵素分解と、クロマトグラフィーを用いた精製を行うことによって得た。具体的には、（１）および（２）において規定されるオリゴ糖は、イワシクジラ軟骨由来のコンドロイチン４−硫酸（特許第３７３１１５０号公報に記載の方法によって得たプロテオグリカンからＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７（２００２），１８３９７−１８４０３に記載の方法によって調製したもの、分子量：約３２０００）から図１に示すプロトコルに従って得た。（３）および（４）において規定されるオリゴ糖は、サメ軟骨由来のコンドロイチン６−硫酸（上記のイワシクジラ軟骨由来のコンドロイチン４−硫酸の調製方法と同様の方法で調製したもの、分子量：約６４０００）から図２に示すプロトコルに従って得た。（５）および（６）において規定されるオリゴ糖は、微生物由来のヒアルロン酸（フードケミファ社、分子量：約８００００）から図３に示すプロトコルに従って得た。得られたオリゴ糖の純度は、Ｂｉｏｃｅｍｉｓｔｒｙ，３３（１９９４），６５０３−６５０７、Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  Ｔｉｓｓｕｅ，２６（１９９４），１５３−１５９、Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．，９（１９９２），１７４−１７９、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，８（１９９８），７１９−７２４、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３２５（２００４），３５−４０などに記載の方法に従った高速液体クロマトグラフィーおよびイオンスプレー式質量分析計（パーキンエルマー社、ＰＥ−Ｓｃｉｅｘ  ＡＰＩ−１００）を用いて分析し、標準品との同一性を確認した。定量にはカルバゾール硫酸法を用いた。得られたオリゴ糖の性状はすべて白色粉末であり、分子量は以下の通りである（ただしＮａ塩の分子量については保有するＮａ原子の数によってバリエーションがある）。
（１）において規定されるオリゴ糖（以下「Ｃｈ４Ｓ−４」と略称することもある）
分子量：９６３．８（Ｎａ塩：１０２４．８）
（２）において規定されるオリゴ糖（以下「Ｃｈ４Ｓ−６」と略称することもある）
分子量：１３９６．２（Ｎａ塩：１５２８．２）
（３）において規定されるオリゴ糖（以下「Ｃｈ６Ｓ−４」と略称することもある）
分子量：９６３．８（Ｎａ塩：１０２４．８）
（４）において規定されるオリゴ糖（以下「Ｃｈ６Ｓ−６」と略称することもある）
分子量：１３９６．２（Ｎａ塩：１５２８．２）
（５）において規定されるオリゴ糖（以下「ＨＡ４」と略称することもある）
分子量：７７６．８（Ｎａ塩：８２０．８）
（６）において規定されるオリゴ糖（以下「ＨＡ６」と略称することもある）
分子量：１１５６．２（Ｎａ塩：１２２２．２）
【００２３】
（Ｂ）（１）〜（６）において規定されるオリゴ糖のヒアルロニダーゼ阻害活性の評価（その１：糖鎖加水分解活性に対する阻害活性）
（実験１：方法）
ウシ精巣性ヒアルロニダーゼ（シグマアルドリッチ社、Ｔｙｐｅ１−Ｓ）のヒアルロン酸（フードケミファ社、分子量：約８００００）を基質とする糖鎖加水分解活性に対する阻害活性によって評価した。反応緩衝液として１００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）−１５０ｍＭ塩化ナトリウムを用い、各種濃度の被験オリゴ糖を添加し、３７℃で１時間反応させた。被験オリゴ糖を添加しない場合における糖鎖加水分解生成物の４糖と６糖の生成量を高速液体クロマトグラフィーで検出されたピーク面積からそれぞれ求め、その総和を糖鎖加水分解活性が１００％とし、同様にして求めた被験オリゴ糖を添加した場合における糖鎖加水分解生成物の４糖と６糖の生成量の総和からその糖鎖加水分解活性を被験オリゴ糖を添加しない場合における糖鎖加水分解活性に対する相対値として算出し、被験オリゴ糖を添加しない場合における糖鎖加水分解活性（１００％）から被験オリゴ糖を添加した場合における糖鎖加水分解活性を差し引いた数値を糖鎖加水分解活性に対する阻害活性（％）とした。なお、高速液体クロマトグラフィーによる反応生成物の分析は以下の条件で行った。
・  カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  ＩＩカラム（ワイエムシー社、ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）
・  溶出液：５０ｍＭ−２４６ｍＭのリン酸二水素ナトリウムの直線勾配
・  流速：１．０ｍＬ／分
・  検出：２１５ｎｍにおける吸光度による
（実験１：結果）
図４に示す。なお、図４には、コンドロイチン４−硫酸（（Ａ）において調製した分子量が約３２０００のもの）とヒアルロン酸（フードケミファ社、分子量：約８００００）のそれぞれを出発原料として、化学処理（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１０（１９８４），１４３−１５１）によって調製した、２糖からなるＮ−アセチルコンドロシン（Ｃｈ２：硫酸基は脱離によって持たない）とヒアロビウロン酸（ＨＡ２）の糖鎖加水分解活性に対する阻害活性もあわせて示す。図４から明らかなように、Ｃｈ４Ｓ−４，Ｃｈ４Ｓ−６，Ｃｈ６Ｓ−４，Ｃｈ６Ｓ−６は、ヒアルロニダーゼが有する糖鎖加水分解活性を濃度依存的に阻害したが、ＨＡ４，ＨＡ６は阻害活性を有していなかった。また、Ｃｈ２，ＨＡ２も阻害作用を有していなかった。各種濃度のＣｈ４Ｓ−６を添加した場合と添加しなかった場合の実験結果をまとめた代表的なクロマトグラムチャートを図５に示す。図中の４〜１２の数値はそれぞれ糖鎖加水分解生成物の構成糖の数とその溶出位置を意味し、添加したＣｈ４Ｓ−６の濃度が高くなるにつれて、糖鎖加水分解生成物の生成量の減少（ヒアルロニダーゼが有する糖鎖加水分解活性に対する濃度依存的な阻害活性）が見て取れる。
【００２４】
（実験２：方法）
ヒアルロン酸（フードケミファ社、分子量：約８００００）にかわりに、ヒアルロン酸に由来する８糖からなるオリゴ糖（（Ａ）における（１）〜（６）において規定されるオリゴ糖の調製の際に得られたもの）を基質として用いること以外は実験１と同様の実験を行った。
（実験２：結果）
図６に示す。図６から明らかなように、この実験２によっても、実験１とほぼ同様の結果が得られた。各種濃度のＣｈ４Ｓ−６を添加した場合と添加しなかった場合の実験結果をまとめた代表的なクロマトグラムチャートを図７に示す。
【００２５】
（Ｃ）（１）〜（６）において規定されるオリゴ糖のヒアルロニダーゼ阻害活性の評価（その２：糖転移活性に対する阻害活性）
（方法）
６糖からなるピリジルアミノ（ＰＡ）化ヒアルロン酸構成オリゴ糖（（Ａ）において得られたＨＡ６をＪ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１１０（１９９１），１３２−１３５に記載の方法でピリジルアミノ化したもの）をアクセプターとし、ヒアルロン酸（フードケミファ社、分子量：約８００００）をドナーとする、ウシ精巣性ヒアルロニダーゼ（シグマアルドリッチ社、Ｔｙｐｅ１−Ｓ）の糖転移活性に対する阻害活性によって評価した。反応緩衝液として１００ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用い、各種濃度の被験オリゴ糖を添加し、３７℃で１時間反応させた。被験オリゴ糖を添加しない場合における糖転移生成物（６糖〜２０糖の偶数糖からなるＰＡ化ヒアルロン酸構成オリゴ糖）の生成量を高速液体クロマトグラフィーで検出されたピーク面積からそれぞれ求め、その総和を糖転移活性が１００％とし、同様にして求めた被験オリゴ糖を添加した場合における糖転移生成物の生成量の総和からその糖転移活性を被験オリゴ糖を添加しない場合における糖転移活性に対する相対値として算出し、被験オリゴ糖を添加しない場合における糖転移活性（１００％）から被験オリゴ糖を添加した場合における糖転移活性を差し引いた数値を糖転移活性に対する阻害活性（％）とした。なお、高速液体クロマトグラフィーによる反応生成物の分析は以下の条件で行った。
・  カラム：ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  Ｐｏｌｙａｍｉｎｅ  ＩＩカラム（ワイエムシー社、ＩＤ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ）
・  溶出液：５０ｍＭ−２４６ｍＭのリン酸二水素ナトリウムの直線勾配
・  流速：１．０ｍＬ／分
・  検出：３２０ｎｍの励起波長と４００ｎｍの蛍光波長でのＰＡのモニタリングによる
（結果）
図８に示す。なお、図８には、コンドロイチン４−硫酸（（Ａ）において調製した分子量が約３２０００のもの）とヒアルロン酸（フードケミファ社、分子量：約８００００）のそれぞれを出発原料として、化学処理（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１０（１９８４），１４３−１５１）によって調製した、２糖からなるＮ−アセチルコンドロシン（Ｃｈ２：硫酸基は脱離によって持たない）とヒアロビウロン酸（ＨＡ２）の糖転移活性に対する阻害活性もあわせて示す。図８から明らかなように、Ｃｈ４Ｓ−４，Ｃｈ４Ｓ−６，Ｃｈ６Ｓ−４，Ｃｈ６Ｓ−６に加え、ＨＡ４，ＨＡ６も、ヒアルロニダーゼが有する糖転移活性を濃度依存的に阻害したが、Ｃｈ２，ＨＡ２は阻害作用をほとんど有していなかった。各種濃度のＨＡ６を添加した場合と添加しなかった場合の実験結果をまとめた代表的なクロマトグラムチャートを図９に示す。図中の６〜２０の数値はそれぞれ糖転移生成物の構成糖の数とその溶出位置を意味し、添加したＨＡ６の濃度が高くなるにつれて、糖転移生成物の生成量の減少（ヒアルロニダーゼが有する糖転移活性に対する濃度依存的な阻害活性）が見て取れる。
【００２６】
（Ｄ）まとめ
以上の結果から、ヒアルロニダーゼが有する糖鎖加水分解活性と糖転移活性のいずれに対しても阻害活性を有する物質として、初めてＣｈ４Ｓ−４，Ｃｈ４Ｓ−６，Ｃｈ６Ｓ−４，Ｃｈ６Ｓ−６が見出された。また、ＨＡ４，ＨＡ６は、糖転移活性に対してのみ選択的に阻害活性を有することがわかった。例えばＣｈ４Ｓ−６とＨＡ６は、化学構造上、ヘキソサミンの４位の置換基とその立体配置の相違しかないにもかかわらず、ヒアルロニダーゼが有する酵素活性に対する阻害活性に大きな相違があることは、予想をはるかに超える事実であった。
【００２７】
製剤例１：錠剤
以下の組成で各成分を混合し、打錠して、（１）において規定されるオリゴ糖のナトリウム塩を５０ｍｇ含む５００ｍｇの錠剤４００個を製造した。
（１）において規定されるオリゴ糖のナトリウム塩    ・・・    ２０ｇ
馬鈴薯澱粉                                        ・・・      ６ｇ
ステアリン酸タルク                                ・・・      ４ｇ
６％ＨＰＣ乳糖                                    ・・・  １７０ｇ
（合計２００ｇ）
【００２８】
製剤例２：顆粒剤
以下の組成で各成分を混合し、圧縮成形し、粉砕し、整粒して、２０〜５０メッシュの５％顆粒剤を製造した。
（４）において規定されるオリゴ糖のナトリウム塩    ・・・    １０ｇ
乳糖                                              ・・・  １８７ｇ
ステアリン酸マグネシウム                          ・・・      ３ｇ
（合計２００ｇ）
【００２９】
製剤例３：注射剤
（５）において規定されるオリゴ糖のナトリウム塩１．５ｇを生理食塩水１００ｍＬに溶解し（合計１．５ｇ／１００ｍＬ）、バイアルに充填した後、加熱殺菌を行って、静注用注射剤を製造した。
【産業上の利用可能性】
【００３０】
本発明は、医薬品の有効成分たる化学物質としての均一性を担保することが可能であり、糖鎖加水分解活性および／または糖転移活性に対して阻害活性を有するオリゴ糖を有効成分とするヒアルロニダーゼ阻害剤を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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