(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ループ・メディエイテッド・イソサーマル・アンプリフィケイション（Ｌｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法によってビソクラミス（Byssochlamys）属の菌類、タラロマイセス（Talaromyces）属の菌類、ネオサルトリア（Neosartorya）属の菌類、ハミゲラ（Hamigera）属の菌類及びアスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）からなる群より選ばれる少なくとも１種の耐熱性菌類の遺伝子中の標的領域を含むＤＮＡ断片を、下記に示す各種プライマーセット（ａ）〜（ｈ）からなる群より選ばれる少なくとも１種を用いて増幅させ、増幅産物の有無を確認して同定を行い耐熱性菌類を検出する、耐熱性菌類の検出方法であって、
前記標的領域がβ−チューブリン遺伝子、２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域、又は内部転写スペーサー領域である、耐熱性菌類の検出方法。
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
を含むビソクラミス属の菌類検出用プライマーセット
（ｂ）配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
を含むネオサルトリア属の菌類及びアスペルギルス・フミガタス検出用プライマーセット
（ｃ）配列番号１１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号１２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号１３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号１４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
を含むアスペルギルス・フミガタス検出用プライマーセット
（ｄ）配列番号１６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号１７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号１８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号１９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
を含むハミゲラ属の菌類検出用プライマーセット
（ｅ）配列番号２２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号２３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号２４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号２５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
を含むタラロマイセス・フラバス（Talaromyces flavus）検出用プライマーセット
（ｆ）配列番号２７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号２８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号２９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号３０に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
を含むタラロマイセス・ウォルトマニー（Talaromyces wortmannii）検出用プライマーセット
（ｇ）配列番号３３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号３４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号３５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号３６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
を含むタラロマイセス・ルテウス（Talaromyces luteus）検出用プライマーセット
（ｈ）配列番号３８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号３９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号４０に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号４１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
を含むタラロマイセス・フラバス（Talaromyces flavus）及びタラロマイセス・トラキスパーマム（Talaromyces trachyspermus）検出用プライマーセット
【請求項２】
前記標的領域を含むＤＮＡ断片が、
配列番号４４に記載の塩基配列の一部であって当該塩基配列の４００〜６００位の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列、
配列番号４５に記載の塩基配列の一部であって当該塩基配列の１０〜２５０位及び／又は３５０〜５５９位の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列、
配列番号４６に記載の塩基配列の一部であって当該塩基配列の１０〜２５０位及び／又は３５０〜５５９位の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列、
配列番号４７に記載の塩基配列の一部であって当該塩基配列の３００〜５５０位の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列、
配列番号４８に記載の塩基配列の一部であって当該塩基配列の２００〜４５０位の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列、
配列番号４９に記載の塩基配列の一部であって当該塩基配列の１５０〜４２０位の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列、
配列番号５０に記載の塩基配列の一部であって当該塩基配列の１５０〜４５０位の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列、
配列番号５１に記載の塩基配列の一部であって当該塩基配列の２５０〜５５０位の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列、及び
配列番号５２に記載の塩基配列の一部であって当該塩基配列の２５０〜５５０位の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列、
からなる群より選ばれる塩基配列を含む、請求項１記載の検出方法。
【請求項３】
前記ビソクラミス属の菌類検出用プライマーセットを用いて２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域及び内部転写スペーサー領域中の標的領域を含むＤＮＡ断片を増幅する、請求項１又は２記載の検出方法。
【請求項４】
前記ネオサルトリア属の菌類及びアスペルギルス・フミガタス検出用プライマーセットを用いてβ−チューブリン遺伝子中の標的領域を含むＤＮＡ断片を増幅する、請求項１又は２記載の検出方法。
【請求項５】
前記ネオサルトリア属の菌類及びアスペルギルス・フミガタス検出用プライマーセットが、配列番号９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号１０に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーのうちの少なくとも一方をさらに含む、請求項１、２及び４のいずれか１項記載の検出方法。
【請求項６】
前記アスペルギルス・フミガタス検出用プライマーセットを用いてβ−チューブリン遺伝子中の標的領域を含むＤＮＡ断片を増幅する、請求項１又は２記載の検出方法。
【請求項７】
前記アスペルギルス・フミガタス検出用プライマーセットが、配列番号１５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーをさらに含む、請求項１、２及び６のいずれか１項記載の検出方法。
【請求項８】
前記ハミゲラ属の菌類検出用プライマーセットを用いてβ−チューブリン遺伝子中の標的領域を含むＤＮＡ断片を増幅する、請求項１又は２記載の検出方法。
【請求項９】
前記ハミゲラ属の菌類検出用プライマーセットが、配列番号２０に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号２１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーのうちの少なくとも一方をさらに含む、請求項１、２及び８のいずれか１項記載の検出方法。
【請求項１０】
前記タラロマイセス・フラバス検出用プライマーセットを用いてβ−チューブリン遺伝子中の標的領域を含むＤＮＡ断片を増幅する、請求項１又は２記載の検出方法。
【請求項１１】
前記タラロマイセス・フラバス検出用プライマーセットが、配列番号２６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーをさらに含む、請求項１、２及び１０のいずれか１項記載の検出方法。
【請求項１２】
前記タラロマイセス・ウォルトマニー検出用プライマーセットを用いてβ−チューブリン遺伝子中の標的領域を含むＤＮＡ断片を増幅する、請求項１又は２記載の検出方法。
【請求項１３】
前記タラロマイセス・ウォルトマニー検出用プライマーセットが、配列番号３１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号３２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーのうちの少なくとも一方をさらに含む、請求項１、２及び１２のいずれか１項記載の検出方法。
【請求項１４】
前記タラロマイセス・ルテウス検出用プライマーセットを用いてβ−チューブリン遺伝子中の標的領域を含むＤＮＡ断片を増幅する、請求項１又は２記載の検出方法。
【請求項１５】
前記タラロマイセス・ルテウス検出用プライマーセットが、配列番号３７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーをさらに含む、請求項１、２及び１４のいずれか１項記載の検出方法。
【請求項１６】
前記タラロマイセス・フラバス及びタラロマイセス・トラキスパーマム検出用プライマーセットを用いて２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域及び内部転写スペーサー領域中の標的領域を含むＤＮＡ断片を増幅する、請求項１又は２記載の検出方法。
【請求項１７】
前記タラロマイセス・フラバス及びタラロマイセス・トラキスパーマム検出用プライマーセットが、配列番号４２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号４３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーのうちの少なくとも一方をさらに含む、請求項１、２及び１６のいずれか１項記載の検出方法。
【請求項１８】
ビソクラミス（Byssochlamys）属の菌類をループ・メディエイテッド・イソサーマル・アンプリフィケイション（Ｌｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法で検出するのに用いるプライマーセットであって、
配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
を含むプライマーセット。
【請求項１９】
ネオサルトリア（Neosartorya）属の菌類及びアスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）をループ・メディエイテッド・イソサーマル・アンプリフィケイション（Ｌｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法で検出するのに用いるプライマーセットであって、
配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
を含むプライマーセット。
【請求項２０】
ネオサルトリア（Neosartorya）属の菌類及びアスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）をループ・メディエイテッド・イソサーマル・アンプリフィケイション（Ｌｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法で検出するのに用いるプライマーセットであって、
配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号１０に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
を含むプライマーセット。
【請求項２１】
アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）をループ・メディエイテッド・イソサーマル・アンプリフィケイション（Ｌｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法で検出するのに用いるプライマーセットであって、
配列番号１１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号１２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号１３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号１４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
を含むプライマーセット。
【請求項２２】
アスペルギルス・フミガタス（Aspergillus fumigatus）をループ・メディエイテッド・イソサーマル・アンプリフィケイション（Ｌｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法で検出するのに用いるプライマーセットであって、
配列番号１１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号１２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号１３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号１４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号１５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
を含むプライマーセット。
【請求項２３】
ハミゲラ（Hamigera）属の菌類をループ・メディエイテッド・イソサーマル・アンプリフィケイション（Ｌｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法で検出するのに用いるプライマーセットであって、
配列番号１６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号１７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号１８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号１９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
を含むプライマーセット。
【請求項２４】
ハミゲラ（Hamigera）属の菌類をループ・メディエイテッド・イソサーマル・アンプリフィケイション（Ｌｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法で検出するのに用いるプライマーセットであって、
配列番号１６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号１７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号１８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号１９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号２０に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号２１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
を含むプライマーセット。
【請求項２５】
タラロマイセス・フラバス（Talaromyces flavus）をループ・メディエイテッド・イソサーマル・アンプリフィケイション（Ｌｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法で検出するのに用いるプライマーセットであって、
配列番号２２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号２３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号２４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号２５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
を含むプライマーセット。
【請求項２６】
タラロマイセス・フラバス（Talaromyces flavus）をループ・メディエイテッド・イソサーマル・アンプリフィケイション（Ｌｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法で検出するのに用いるプライマーセットであって、
配列番号２２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号２３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号２４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号２５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号２６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
を含むプライマーセット。
【請求項２７】
タラロマイセス・ウォルトマニー（Talaromyces wortmannii）をループ・メディエイテッド・イソサーマル・アンプリフィケイション（Ｌｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法で検出するのに用いるプライマーセットであって、
配列番号２７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号２８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号２９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号３０に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
を含むプライマーセット。
【請求項２８】
タラロマイセス・ウォルトマニー（Talaromyces wortmannii）をループ・メディエイテッド・イソサーマル・アンプリフィケイション（Ｌｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法で検出するのに用いるプライマーセットであって、
配列番号２７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号２８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号２９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号３０に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号３１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号３２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
を含むプライマーセット。
【請求項２９】
タラロマイセス・ルテウス（Talaromyces luteus）をループ・メディエイテッド・イソサーマル・アンプリフィケイション（Ｌｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法で検出するのに用いるプライマーセットであって、
配列番号３３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号３４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号３５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号３６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
を含むプライマーセット。
【請求項３０】
タラロマイセス・ルテウス（Talaromyces luteus）をループ・メディエイテッド・イソサーマル・アンプリフィケイション（Ｌｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法で検出するのに用いるプライマーセットであって、
配列番号３３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号３４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号３５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号３６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号３７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
を含むプライマーセット。
【請求項３１】
タラロマイセス・フラバス（Byssochlamys flavus）及び／又はタラロマイセス・トラキスパーマム（Talaromyces trachyspermus）をループ・メディエイテッド・イソサーマル・アンプリフィケイション（Ｌｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法で検出するのに用いるプライマーセットであって、
配列番号３８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号３９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号４０に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号４１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
を含むプライマーセット。
【請求項３２】
タラロマイセス・フラバス（Byssochlamys flavus）及び／又はタラロマイセス・トラキスパーマム（Talaromyces trachyspermus）をループ・メディエイテッド・イソサーマル・アンプリフィケイション（Ｌｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法で検出するのに用いるプライマーセットであって、
配列番号３８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号３９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号４０に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号４１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、
配列番号４２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー、及び
配列番号４３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー
を含むプライマーセット。
【請求項３３】
請求項１８〜３２のいずれか１項記載のプライマーセットと、
ＤＮＡポリメラーゼと、
ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含むｄＮＴＰと
を含む耐熱性菌類検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、耐熱性菌類の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
耐熱性の菌類（真菌類）は自然界に広く分布し、野菜、果物等の農作物で繁殖し、これらの農作物を原材料とした飲食品を汚染する。しかも、菌類のうち耐熱性の菌類は通常の他の菌類に比べて高い耐熱性を有する。例えば酸性飲料の加熱殺菌処理を行ったとしても耐熱性を有する菌類が生存、増殖し、カビの発生原因となることがある。このため、耐熱性菌類は重大な事故を引き起こす重要危害菌として警戒されている。
【０００３】
加熱殺菌処理後の飲食品からも検出されることがある汚染事故の原因菌の主な耐熱性菌類として、ビソクラミス（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ）属、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属およびハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属に属する耐熱性菌類が知られている。子のう胞子を形成する他の耐熱性菌類と比べ、上記４属に属する菌類は耐熱性が突出して高く、加熱殺菌後に生存する可能性が高い。一方、上記４属以外の耐熱性菌類は、通常の殺菌条件で殺滅できるため、殺菌不良などが無い限りは事故を引き起こす可能性は低い。従って、飲食品およびこれらの原材料中の耐熱性菌類による事故防止のためには、これら４属に属する耐熱性菌類等の検出、識別が特に重要である。
さらに、危害事故発生時における事故原因究明及び対策のためには、事故原因菌の同定が必要となる。従って、上記４属の耐熱性菌類を識別することができれば、より迅速な事故原因菌の検出、識別が可能となる。
【０００４】
一方、従来の耐熱性の菌類を検出、識別する方法としては、検体をＰＤＡ培地等で培養して検出、識別する方法がある。しかし、この方法ではコロニーが確認されるまでに約７日間を要する。しかも、菌種の同定は、菌の特徴的な器官の形態に基づいて行うので、形態学的な特徴が認められるまでさらに約７日間の培養を必要としている。したがって、この方法によると、耐熱性菌類の検出、識別に約１４日間もの時間を要する。このように耐熱性菌類の検出、識別に長期間を要することは飲食品の衛生管理、原材料の鮮度確保、流通上の制約など観点から、必ずしも満足できるものではない。そのため、より迅速な耐熱性菌類の検出、識別方法の確立が求められている。
【０００５】
菌類の迅速な検出、識別方法としては、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を利用した検出方法が知られている（例えば、特許文献１〜４参照）。しかし、従来公知のプライマーでは擬陽性や擬陰性の結果が出る場合があるという問題がある。これは、耐熱性菌類の遺伝子のデータベースが脆弱であり、耐熱性菌類の属レベルで保存されている遺伝子領域が正確にわかっていないためである。そのため、特定の耐熱性菌類を特異的にかつ迅速に検出、識別するための高感度のプライマーの設計が困難となっている。
【０００６】
【特許文献１】特表平１１−５０５７２８号公報
【特許文献２】特開２００６−６１１５２号公報
【特許文献３】特開２００６−３０４７６３号公報
【特許文献４】特開２００７−１７４９０３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、飲食品汚染の主な原因菌である耐熱性菌類を特異的、簡便かつ迅速に検出、識別できる方法を提供することを目的とする。また、本発明の目的は、この方法に適用可能なプライマーセット、オリゴヌクレオチドおよび検出キットを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題に鑑み、本発明者等は、β−チューブリン遺伝子または２８Ｓ  ｒＤＮＡ中の特定の領域に着目して、鋭意検討を行った。その結果、耐熱性菌類のβ−チューブリン遺伝子、または２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域及びITS領域に、他の菌類のものとは明確に区別しうる、特異的な塩基配列を有する領域（以下、「可変領域」ともいう）が存在することを見い出した。また、この可変領域をターゲットとすることで、上記耐熱性特定の菌類を特異的かつ迅速に検出できることを見い出した。本発明はこの知見に基づき完成するに至った。
【０００９】
本発明は、Ｌｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法によって耐熱性菌類の遺伝子中の標的領域のＤＮＡ断片を増幅させ、増幅産物の有無を確認する工程を含む耐熱性菌類の検出方法に関する。
【００１０】
また、本発明は、ビソクラミス（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ）属の菌類、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属の菌類、ネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属の菌類、ハミゲラ（Ｈａｍｉｇｅｒａ）属の菌類および／またはアスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）の耐熱性菌類をＬｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法で検出するのに用いるプライマーセットに関する。
【００１１】
また、本発明は、前記耐熱性菌類を検出するのに用いるオリゴヌクレオチドに関する。
【００１２】
さらに、本発明は、前記プライマーセットまたはオリゴヌクレオチドと、
ＤＮＡポリメラーゼと、
ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含むｄＮＴＰと、
を含む耐熱性菌類検出キットに関する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、飲食品の汚染事故の主な原因菌である耐熱性菌類を特異的にかつ迅速に検出、識別できる方法を提供することができる。また、本発明によれば、この方法に適用可能なプライマーセット、オリゴヌクレオチドおよび検出キットを提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、Ｌｏｏｐ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法によって耐熱性菌類の遺伝子中の標的領域のＤＮＡ断片を増幅させ、増幅産物の有無を確認する工程を含む耐熱性菌類の検出方法である。本発明において、前記標的領域がβ−チューブリン遺伝子、または２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域及びITS（内部転写スペーサー、ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ  ｓｐａｃｅｒ）領域の塩基配列から選択されることが好ましい。ここで、「β−チューブリン」とはa-チューブリンとともに真核細胞の微小管を形成しているタンパク質であり、「β−チューブリン遺伝子」とは、β−チューブリンをコードする遺伝子である。また、「２８Ｓ  ｒＤＮＡ」とはタンパク質への変換の場であるリボゾームの遺伝情報をコードするＤＮＡである。
また、本発明の耐熱性菌類の検出方法において、遺伝子中の標的領域としてβ−チューブリン遺伝子または２８Ｓ  ｒＤＮＡの特定領域を増幅する。これは、β−チューブリン遺伝子と２８Ｓ  ｒＤＮＡは共に、コードする蛋白質自体は真菌に普遍的に存在するが、遺伝子中には塩基の変異が蓄積しやすく、属や種のレベルで保存されているため、遺伝子内の特定の領域に他属他種との識別に用いることができる塩基配列が存在する可能性が高いという共通点があるからである。
【００１５】
本発明において、標的領域のＤＮＡ断片の増幅はＬＡＭＰ（Loop  mediated  isothermal  amplification）法により行う。しかし、ＰＣＲ（Polymerase  Chain  Reaction）法、ＬＣＲ（Ligase  Chain  Reaction）法、ＳＤＡ（Strand  Displacement  Amplification）法、ＮＡＳＢＡ（Nucleic  Acid  Sequence-based  Amplification）法、ＲＣＡ（Rolling-circle  amplification）法など通常の方法を用いてもよい。標的領域のＤＮＡ断片をＬＡＭＰ法によって増幅させれば、ＰＣＲ法で不可欠とされる周期的な温度変化制御が不要となるため、等温での相補鎖合成反応を可能にする。このため、ＰＣＲ装置等の特殊な装置を用いることなく、検体中に含まれる特定の菌類を簡便かつ迅速に検出できる。
【００１６】
ＬＡＭＰ法は、ＰＣＲ法で不可欠とされる周期的な温度変化制御が不要なループ媒介等温増幅法（国際公開第００／２８０８２号パンフレット）であって、鋳型となるヌクレオチドにプライマーの３’側をアニールさせて相補鎖合成の起点とすると共に、このとき形成されるループにアニールするプライマーを組み合わせることにより、等温での相補鎖合成反応を可能にする。このＬＡＭＰ法では、鋳型となる核酸の６つの塩基配列領域を認識する少なくとも４つのプライマーが必要とされる。これらのプライマーは、３’側が常に鋳型となるヌクレオチドにアニールするように設計されるため、塩基配列の相補的結合によるチェック機構が繰り返し機能することになり、高感度でかつ特異性の高い核酸の増幅反応が可能となる。
【００１７】
ＬＡＭＰ法に用いられるプライマーが認識する６つの塩基配列領域は、鋳型となるヌクレオチドの５’側から順にＦ３、Ｆ２、Ｆ１と呼び、３’側から順にＢ３ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ１ｃと呼び、さらに、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３の相補的な塩基配列をそれぞれＦ１ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ３ｃと呼び、Ｂ１ｃ、Ｂ２ｃ、Ｂ３ｃの相補的な塩基配列をそれぞれＢ１、Ｂ２、Ｂ３と呼ぶ。
上記６つの塩基配列領域は、以下のように選定することができるが、本発明はこれに限定されるものではない。
検出対象となる菌種の塩基配列を用いてアライメントを行う。アライメントには、例えば、Clustal  X等のソフトを用いることができる。次いで、得られたアライメント情報をもとに、Primer  Explorer  V4（栄研化学株式会社社製）等のソフトを用いて上記６つの塩基配列領域を選定し、ＬＡＭＰ法のプライマーを設計する。
【００１８】
本発明の耐熱性菌類検出用のプライマーの設計は、まず、標的領域の塩基配列から上記の６つの塩基配列領域を決定し、その後、後述するインナープライマーＦ及びＢ並びにアウタープライマーＦ及びＢを設計する。
【００１９】
ＬＡＭＰ法に用いられる「インナープライマー」とは、標的塩基配列上のある特定のヌクレオチド配列領域を認識し、かつ合成起点を与える塩基配列を３’側に有し、同時にこのプライマーを起点とする核酸合成反応生成物の任意の領域に対して相補的な塩基配列を５’側に有するオリゴヌクレオチドのことをいう。このうち、前記Ｆ２領域を３’側に有し、前記Ｆ１ｃ領域を５’側に有する塩基配列を含むプライマーをインナープライマーＦ（以下、ＦＩＰ）と呼び、前記Ｂ２領域を３’側に有し、前記Ｂ１ｃ領域を５’側に有する塩基配列を含むプライマーをインナープライマーＢ（以下、ＢＩＰ）と呼ぶ。このインナープライマーは、Ｆ２領域とＦ１ｃ領域の間、またはＢ２領域とＢ１ｃ領域の間に、塩基数０〜５０のいずれかの長さの任意の塩基配列を有していてもよい。
一方、「アウタープライマー」とは、標的塩基配列上の『「ある特定のヌクレオチド配列領域」（例えば前記Ｆ２領域またはＢ２領域）の５'末端側に存在するある特定のヌクレオチド配列領域』を認識かつ合成起点を与える塩基配列を有するオリゴヌクレオチドであり、Ｆ３領域より選ばれた塩基配列を含むプライマーおよびＢ３領域より選ばれた塩基配列を含むプライマーが挙げられる。ここで、Ｆ３領域より選ばれた塩基配列を含むプライマーをアウタープライマーＦ（以下、Ｆ３プライマー）、Ｂ３領域より選ばれた塩基配列を含むプライマーをアウタープライマーＢ（以下、Ｂ３プライマー）と呼ぶ。
ここで、各プライマーにおけるＦとは、標的塩基配列のアンチセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供することを意味するプライマー表示であり、各プライマーにおけるＢとは、標的塩基配列のセンス鎖と相補的に結合し、合成起点を提供することを意味するプライマー表示である。
【００２０】
ＬＡＭＰ法における核酸の増幅では、インナープライマー及びアウタープライマーに加え、さらにループプライマー（以下、ＬＦ、ＬＢ）を好ましく用いることができる。ループプライマーは、ＬＡＭＰ法による増幅生成物の同一鎖上に生じる相補的配列が互いにアニールしてループを形成するとき、このループ内の配列に相補的な塩基配列をその３’側に含むプライマー（二本鎖を構成する各々について１つずつ）のことをいう。すなわち、ダンベル構造の５’側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的な塩基配列を持つプライマーである。このプライマーを用いれば、核酸合成の起点が増加するため、反応時間の短縮と検出感度の上昇が可能となる（国際公開第０２／２４９０２号パンフレット）。
ループプライマーの塩基配列は、上記ダンベル構造の５’側のループ構造の一本鎖部分の塩基配列に相補的であれば、標的領域の塩基配列又はその相補鎖から選択されてもよく、他の塩基配列でもよい。また、ループプライマーは１種類であっても、２種類であってもよい。
【００２１】
本発明のプライマーを用いて、標的領域のＤＮＡ断片を増幅すれば、当該ＤＮＡ断片を特異的かつ効率的に検出可能な量まで増幅することが可能である。このため、増幅産物の有無を確認することによって、特定の菌類を検出することができる。
【００２２】
本発明に用いることができるプライマーは、１５塩基以上であることが好ましく、２０塩基以上であることがさらに好ましい。また、各プライマーは、単一の塩基配列のオリゴヌクレオチドであってもよく、複数の塩基配列のオリゴヌクレオチドの混合物であってもよい。
【００２３】
各プライマーは、設計した配列を基にして化学合成したり、試薬メーカーから購入することができる。具体的には、オリゴヌクレオチド合成装置等を用いて合成することができる。また、合成後に吸着カラム、高速液体クロマトグラフィー、または電気泳動法を用いて精製したものを用いることもできる。また、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加された塩基配列を有するオリゴヌクレオチドについても、公知の方法を使用して合成できる。
【００２４】
さらに、ＬＡＭＰ法に用いることができるアウタープライマーは、標的領域のＤＮＡ断片を増幅するために、ＬＡＭＰ法のみでなく、ＰＣＲ法にも使用できる。ＰＣＲ法では、上記プライマーを用いて、検体中のβ−チューブリン遺伝子または２８Ｓ  ｒＤＮＡのＤ１／Ｄ２領域及びITS領域を鋳型に耐熱性のＤＮＡポリメラーゼでＰＣＲを行えば、目的とするＤＮＡ断片を増幅させることが可能である。
【００２５】
本発明によれば、ビソクラミス属の菌類、タラロマイセス属の菌類、ネオサルトリア属の菌類、ハミゲラ属の菌類、アスペルギルス  フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）等の菌類を検出することができる。
本明細書におけるビソクラミス属、タラロマイセス属、ネオサルトリア属およびハミゲラ属等の「耐熱性菌類」とは、マユハキタケ科（Ｔｒｉｃｈｏｃｏｍａｃｅａｅ）に属する不整子嚢菌類であり、７５℃、３０分間の加熱処理後であっても生存可能な耐熱性菌類である。ビソクラミス属の菌類の例として、ビソクラミス  ファルバ（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ  ｆｕｌｖａ）、ビソクラミス  ニベア（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ  ｎｉｖｅａ）が挙げられる。タラロマイセス属の菌類の例として、タラロマイセス  フラバス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｌａｖｕｓ）、タラロマイセス  ルテウス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｌｕｔｅｕｓ）、タラロマイセス  トラキスペルムス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｔｒａｃｈｙｓｐｅｒｍｕｓ）、タラロマイセス  ウォルトマニー（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ  ｗｏｒｔｍａｎｎｉｉ）が挙げられる。ネオサルトリア属の菌類の例として、ネオサルトリア  スピノサ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｓｐｉｎｏｓａ）、ネオサルトリア  フィシェリ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｆｉｃｈｅｒｉ）、ネオサルトリア  グラブラ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｇｌａｂｒａ）、ネオサルトリア  ヒラツカエ（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ  ｈｉｒａｔｓｕｋａｅ）が挙げられる。ハミゲラ属の菌類の例として、ハミゲラ  アベラネア（Ｈａｍｉｇｅｒａ  ａｖｅｌｌａｎｅａ）が挙げられる。
本発明における「アスペルギルス  フミガタス」とは、テレオモルフ（有性世代）が発見されていない不完全菌類の一種であり、ネオサルトリア  フィシェリとは、系統的に近縁である。
【００２６】
本発明の検出方法において、増幅される耐熱性菌類の遺伝子中の標的領域を含むＤＮＡ断片は、配列番号４４に記載の塩基配列の一部であって当該塩基配列の４００〜６００位の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列、配列番号４５に記載の塩基配列の一部であって当該塩基配列の１０〜２５０位及び／又は３５０〜５５９位の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列、配列番号４６に記載の塩基配列の一部であって当該塩基配列の１０〜２５０位及び／又は３５０〜５５９位の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列、配列番号４７に記載の塩基配列の一部であって当該塩基配列の３００〜５５０位の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列、配列番号４８に記載の塩基配列の一部であって当該塩基配列の２００〜４５０位の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列、配列番号４９に記載の塩基配列の一部であって当該塩基配列の１５０〜４２０位の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列、配列番号５０に記載の塩基配列の一部であって当該塩基配列の１５０〜４５０位の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列、配列番号５１に記載の塩基配列の一部であって当該塩基配列の２５０〜５５０位の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列、配列番号５２に記載の塩基配列の一部であって当該塩基配列の２５０〜５５０位の塩基配列の全部又は一部を含む塩基配列、またはこれらの塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列を含むことが好ましい。
【００２７】
次に、上記各菌類をＬＡＭＰ法により検出する場合に好ましく用いられるプライマーセットについて説明する。
【００２８】
ビソクラミス属の菌類のうち、ビソクラミス  ファルバの２８Ｓ  ｒＤＮＡのITS領域及びＤ１／Ｄ２領域の塩基配列を配列番号４４に示す。ビソクラミス属の菌類を特異的に検出するプライマーの設計するために、配列表の配列番号４４に記載の塩基配列のうち、配列表の塩基番号４００〜６００に含まれる範囲から上記の６つの塩基配列領域を決定するのが好ましい。具体的には、ビソクラミス属の菌類を特異的に検出するために、以下のプライマーセットを用いるのがより好ましい。
ビソクラミス属の菌類検出用プライマーセット（ＬＢ１プライマーセット）
LB1F3プライマー：CGGTCCTCGAGCGTATGG（配列番号１）
LB1B3プライマー：CCGTTACTGGGGCAATCC（配列番号２）
LB1FIPプライマー：AGTTAGGTGACCGTGAGGTCGTCTTTGTCACGCGCTCTGG（配列番号３）
LB1BIPプライマー：GGATCAGGTAGGGATACCCGCTGTTGGTTTCTTTTCCTCCGC（配列番号４）
図１に、ビソクラミス属の２８Ｓ  ｒＤＮＡのITS領域及びＤ１／Ｄ２領域の塩基配列における、上記プライマーが認識する塩基配列の位置関係を示す。
【００２９】
ネオサルトリア属の菌類のうち、ネオサルトリア  グラブラのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を配列番号４５に示す。アスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子の部分塩基配列を配列番号４６に示す。ネオサルトリア属の菌類およびアスペルギルス  フミガタスを特異的に検出するプライマーの設計するために、配列表の配列番号４５及び配列番号４６に記載の塩基配列のうち、それぞれ配列表の塩基番号３５０〜５５９および配列表の塩基番号１０〜２５０に含まれる範囲から上記の６つの塩基配列領域を決定するのが好ましい。具体的には、ネオサルトリア属の菌類およびアスペルギルス  フミガタスを特異的に検出するために、以下のプライマーセットを用いるのがより好ましい。
ネオサルトリア属の菌類およびアスペルギルス  フミガタス検出用プライマーセット（ＬＮ１プライマーセット）
LN1F3プライマー：GGCAACATCTCACGATCTGA（配列番号５）
LN1B3プライマー：CCCTCAGTGTAGTGACCCTT（配列番号６）
LN1FIPプライマー：ATGGTACCAGGCTCGAGATCGATACTAGGCCAACGGTGACA（配列番号７）
LN1BIPプライマー：GTCCCTTCGGCGAGCTCTTCGTTGTTACCAGCACCAGACT（配列番号８）
ネオサルトリア属の菌類およびアスペルギルス  フミガタスを検出するために、上記プライマーに加えてループプライマーを用いるのが好ましい。ループプライマーとしては、以下のプライマーを用いるのが好ましい。
ネオサルトリア属の菌類およびアスペルギルス  フミガタス検出用ループプライマー（ＬＮ１ループプライマー）
LN1LFループプライマー：ACGGCACGAGGAACATACT（配列番号９）
LN1LBループプライマー：CGATAACTTCGTCTTCGGCC（配列番号１０）
図２に、ネオサルトリア  グラブラと同じネオサルトリア属のネオサルトリア  フィシェリのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列における、上記プライマーが認識する塩基配列の位置関係を示す。
【００３０】
アスペルギルス  フミガタスを検出するために、上記プライマーセットの他に、以下のプライマーセットも用いることができる。
アスペルギルス  フミガタス検出用プライマーセット（ＬＡｆ２プライマーセット）
LAf2F3プライマー：GCCGCTTTCTGGTATGTCT（配列番号１１）
LAf2B3プライマー：CGCTTCTTCCTTGTTTTCCG（配列番号１２）
LAf2FIPプライマー：CCATGACAGTGAGGCTGAACCCCGGGTGATTGGGATCTCTCA（配列番号１３）
LAf2BIPプライマー：ACCATCTCTGGTGAGCATGGCTTTCCGCCGCTTTCTCAA（配列番号１４）
アスペルギルス  フミガタスを検出するために、上記プライマーに加えてループプライマーを用いるのが好ましい。ループプライマーとしては、以下のプライマーを用いるのが好ましい。
アスペルギルス  フミガタス検出用ループプライマー（ＬＡｆ２ループプライマー）
LAf2LBループプライマー：AGTAAGTTCGACCTATATCCTCCC（配列番号１５）
図３に、アスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列における、上記プライマーが認識する塩基配列の位置関係を示す。
なお、上記プライマーセットを用いた場合、アスペルギルス  フミガタスを特異的に検出することはできるが、ネオサルトリア属の菌類を検出することはできない。従って、前記ネオサルトリア属の菌類およびアスペルギルス  フミガタス検出用プライマーセット（ＬＮ１プライマーセット）と、上記アスペルギルス  フミガタス検出用プライマーセット（ＬＡｆ２プライマーセット）を組み合わせて用いることにより、ネオサルトリア属の菌類とアスペルギルス  フミガタスとを識別することができる。
【００３１】
ハミゲラ属の菌類のうち、ハミゲラ  アベラネアのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を配列番号４７に示す。ハミゲラ属の菌類を特異的に検出するプライマーの設計するために、配列表の配列番号４７に記載の塩基配列のうち、配列表の塩基番号３００〜５５０に含まれる範囲から上記の６つの塩基配列領域を決定するのが好ましい。具体的には、ハミゲラ属の菌類を特異的に検出するプライマーとして、以下のプライマーセットを用いるのがより好ましい。
ハミゲラ属の菌類検出用プライマーセット（ＬＨ２プライマーセット）
LH2F3プライマー：GGATCCGAATACGACGTGTC（配列番号１６）
LH2B3プライマー：CCCTCAGTGTAGTGACCCTT（配列番号１７）
LH2FIPプライマー：CATGGTGCCAGGCTCGAGATCCAGGCCAGCGGTAACAAG（配列番号１８）
LH2BIPプライマー：CCGGTCCTTTTGGCCAGCTCTGTTACCGGCACCAGACT（配列番号１９）
ハミゲラ属の菌類を検出するために、上記プライマーに加えてループプライマーを用いるのが好ましい。ループプライマーとしては、以下のプライマーを用いるのが好ましい。
ハミゲラ属の菌類検出用ループプライマー（ＬＨ２ループプライマー）
LH2LFループプライマー：ACGGCACGGGGGACATA（配列番号２０）
LH2LBループプライマー：TTCCGCCCAGACAACTTCG（配列番号２１）
図４に、ハミゲラ属のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列における、上記プライマーが認識する塩基配列の位置関係を示す。
【００３２】
タラロマイセス属の菌類のうち、タラロマイセス  フラバスのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を配列番号４８に示す。タラロマイセス  フラバスを特異的に検出するプライマーの設計するために、配列表の配列番号４８に記載の塩基配列のうち、配列表の塩基番号２００〜４５０に含まれる範囲から上記の６つの塩基配列領域を決定するのが好ましい。具体的には、タラロマイセス  フラバスを特異的に検出するために、以下のプライマーセットを用いるのがより好ましい。
タラロマイセス  フラバス検出用プライマーセット（ＬＴｆ２プライマーセット）
LTf2F3プライマー：CCAGTTGGAGCGTATGAACG（配列番号２２）
LTf2B3プライマー：CCCAGTTGTTACCAGCACCG（配列番号２３）
LTf2FIPプライマー：TTGTTGCCGGAGGCCTACACTTTACTTCAACGAGGTGCGT（配列番号２４）
LTf2BIPプライマー：CGACTTGGAGCCCGGTACCAAAAGTTGTCGGGACGGAAGA（配列番号２５）
タラロマイセス  フラバスを検出するために、上記プライマーに加えてループプライマーを用いるのが好ましい。ループプライマーとしては、以下のプライマーを用いるのが好ましい。
タラロマイセス  フラバス検出用ループプライマー（ＬＴｆ２ループプライマー）
LTf2LBループプライマー：GCTGGTCCCTTTGGTCAGC（配列番号２６）
図５に、タラロマイセス  フラバスのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列における、上記プライマーが認識する塩基配列の位置関係を示す。
【００３３】
タラロマイセス属の菌類のうち、タラロマイセス  ウォルトマニーのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を配列番号４９に示す。タラロマイセス  ウォルトマニーを特異的に検出するプライマーの設計するために、配列表の配列番号４９に記載の塩基配列のうち、配列表の塩基番号１５０〜４２０に含まれる範囲から上記の６つの塩基配列領域を決定するのが好ましい。具体的には、タラロマイセス  ウォルトマニーを特異的に検出するために、以下のプライマーセットを用いるのがより好ましい。
タラロマイセス  ウォルトマニー検出用プライマーセット（ＬＴｗ４−３プライマーセット）
LTw4F3プライマー：TGGCTCCGGAATGTGAGTT（配列番号２７）
LTw3B3プライマー：CAAATCGACGAGGACGGC（配列番号２８）
LTw4FIPプライマー：CGCTCCAACTGGAGGTCGGAAAATTTCGACATCCCACCCT（配列番号２９）
LTw3BIPプライマー：GGAATCTGCCCCGCGACATTCCGGGGGACGTACTTGTTG（配列番号３０）
タラロマイセス  ウォルトマニーを検出するために、上記プライマーに加えてループプライマーを用いるのが好ましい。ループプライマーとしては、以下のプライマーを用いるのが好ましい。
タラロマイセス  ウォルトマニー検出用ループプライマー（ＬＴｗ４−３ループプライマー）
LTw4LFループプライマー：GGTGCCATTGTAACTGGAAATGA（配列番号３１）
LTw3LBループプライマー：ACTCATATCGTATAGGCTAGCGG（配列番号３２）
図６に、タラロマイセス  ウォルトマニーのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列における、上記プライマーが認識する塩基配列の位置関係を示す。
【００３４】
タラロマイセス属の菌類のうち、タラロマイセス  ルテウスのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列を配列番号５０に示す。タラロマイセス  ルテウスを特異的に検出するプライマーの設計するために、配列表の配列番号５０に記載の塩基配列のうち、配列表の塩基番号１５０〜４５０に含まれる範囲から上記の６つの塩基配列領域を決定するのが好ましい。具体的には、タラロマイセス  ルテウスを特異的に検出するために、以下のプライマーセットを用いるのがより好ましい。
タラロマイセス  ルテウス検出用プライマーセット（ＬＴｌ１プライマーセット）
LTl1F3プライマー：CGAATCACCACTGATGGGAA（配列番号３３）
LTl1B3プライマー：GAAGAGCTGACCGAAAGGAC（配列番号３４）
LTl1FIPプライマー：TTCGTGCTGTCGGTCGGTAATGTTCCGACCTCCAGTTAGAGC（配列番号３５）
LTl1BIPプライマー：TAGGCTAGCGGCAACAAGTACGATAGTACCGGGCTCCAGATC（配列番号３６）
タラロマイセス  ルテウスを検出するために、上記プライマーに加えてループプライマーを用いるのが好ましい。ループプライマーとしては、以下のプライマーを用いるのが好ましい。
タラロマイセス  ルテウス検出用ループプライマー（ＬＴｌ１ループプライマー）
LTl1LFループプライマー：ACCTCGTTGAAATAGACGTTCA（配列番号３７）
図７に、タラロマイセス  ルテウスのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列における、上記プライマーが認識する塩基配列の位置関係を示す。
【００３５】
タラロマイセス属の菌類のうち、タラロマイセス  フラバスの２８Ｓ  ｒＤＮＡのITS領域及びＤ１／Ｄ２領域の塩基配列を配列番号５１に、タラロマイセス  トラキスパーマムの２８Ｓ  ｒＤＮＡのITS領域及びＤ１／Ｄ２領域の塩基配列を配列番号５２に示す。タラロマイセス  フラバスおよびタラロマイセス  トラキスパーマムを特異的に検出するプライマーの設計するために、配列表の配列番号５１および配列番号５２に記載の塩基配列のうち、それぞれ配列表の塩基番号２５０〜５５０に含まれる範囲から上記の６つの塩基配列領域を決定するのが好ましい。具体的には、タラロマイセス  フラバスおよびタラロマイセス  トラキスパーマムを特異的に検出するために、以下のプライマーセットを用いるのがより好ましい。
タラロマイセス  フラバスおよびタラロマイセス  トラキスパーマム検出用プライマーセット（ＬＴ１プライマーセット）
LT1F3プライマー：GCGTCATTTCTGCCCTCAA（配列番号３８）
LT1B3プライマー：AGTTCAGCGGGTAACTCCT（配列番号３９）
LT1FIPプライマー：TACGCTCGAGGACCAGACGGCGGCTTGTGTGTTGGGTG（配列番号４０）
LT1BIPプライマー：TCTGTCACTCGCTCGGGAAGGACCTGATCCGAGGTCAACC（配列番号４１）
タラロマイセス  フラバスおよびタラロマイセス  トラキスパーマムを検出するために、上記プライマーに加えてループプライマーを用いるのが好ましい。ループプライマーとしては、以下のプライマーを用いるのが好ましい。
タラロマイセス  フラバスおよびタラロマイセス  トラキスパーマム検出用ループプライマー（ＬＴ１ループプライマー）
LT1LFループプライマー：GCTGCCTTTTGGGCAGGTC（配列番号４２）
LT1LBループプライマー：TGGTCACACCACTATATTTTACCAC（配列番号４３）
図８、図９及び図９−１に、タラロマイセス  フラバスおよびタラロマイセス  トラキスパーマムの２８Ｓ  ｒＤＮＡのITS領域及びＤ１／Ｄ２領域の塩基配列における、上記プライマーが認識する塩基配列の位置関係を示す。
【００３６】
本発明のビソクラミス属の菌類検出用プライマーセットは、ＬＡＭＰ法で検出するのに用いるプライマーセットであって、配列番号１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーとを含むことを特徴とする。このプライマーセットを用いることにより、ビソクラミス属の菌類の２８Ｓ  ｒＤＮＡのITS領域及びＤ１／Ｄ２領域の標的領域のＤＮＡ断片をＬＡＭＰ法により特異的、迅速かつ高感度に増幅することができる。このため、当該ＤＮＡ断片の増幅が確認された場合には、検体中にビソクラミス属の菌類が存在すると判断できる。
【００３７】
本発明のネオサルトリア属の菌類およびアスペルギルス  フミガタス検出用プライマーセットは、ＬＡＭＰ法で検出するのに用いるプライマーセットであって、配列番号５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーとを含むことを特徴とし、このプライマーセットは、配列番号９及び配列番号１０に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーをさらに含むことが好ましい。このプライマーセットを用いることにより、ネオサルトリア属の菌類およびアスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子の標的領域のＤＮＡ断片をＬＡＭＰ法により特異的、迅速かつ高感度に増幅することができる。このため、当該ＤＮＡ断片の増幅が確認された場合には、検体中にネオサルトリア属の菌類および／またはアスペルギルス  フミガタスが存在すると判断できる。
【００３８】
本発明のアスペルギルス  フミガタス検出用プライマーセットは、ＬＡＭＰ法で検出するのに用いるプライマーセットであって、配列番号１１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号１２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号１３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号１４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーとを含むことを特徴とし、このプライマーセットは、配列番号１５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーをさらに含むことが好ましい。このプライマーセットを用いることにより、アスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子の標的領域のＤＮＡ断片をＬＡＭＰ法により特異的、迅速かつ高感度に増幅することができる。このため、当該ＤＮＡ断片の増幅が確認された場合には、検体中にアスペルギルス  フミガタスが存在すると判断できる。
【００３９】
本発明のハミゲラ属の菌類検出用プライマーセットは、ＬＡＭＰ法で検出するのに用いるプライマーセットであって、配列番号１６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号１７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号１８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号１９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーとを含むことを特徴とし、このプライマーセットは、配列番号２０及び配列番号２１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーをさらに含むことが好ましい。このプライマーセットを用いることにより、ハミゲラ属の菌類のβ−チューブリン遺伝子の標的領域のＤＮＡ断片をＬＡＭＰ法により特異的、迅速かつ高感度に増幅することができる。このため、当該ＤＮＡ断片の増幅が確認された場合には、検体中にハミゲラ属の菌類が存在すると判断できる。
【００４０】
本発明のタラロマイセス  フラバス検出用プライマーセットは、ＬＡＭＰ法で検出するのに用いるプライマーセットであって、配列番号２２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号２３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号２４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号２５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーとを含むことを特徴とし、このプライマーセットは、配列番号２６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーをさらに含むことが好ましい。このプライマーセットを用いることにより、タラロマイセス  フラバスのβ−チューブリン遺伝子の標的領域のＤＮＡ断片をＬＡＭＰ法により特異的、迅速かつ高感度に増幅することができる。このため、当該ＤＮＡ断片の増幅が確認された場合には、検体中にタラロマイセス  フラバスが存在すると判断できる。
【００４１】
本発明のタラロマイセス  ウォルトマニー検出用プライマーセットは、ＬＡＭＰ法で検出するのに用いるプライマーセットであって、配列番号２７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号２８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号２９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号３０に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーとを含むことを特徴とし、このプライマーセットは、配列番号３１および配列番号３２に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーをさらに含むことが好ましい。このプライマーセットを用いることにより、タラロマイセス  ウォルトマニーのβ−チューブリン遺伝子の標的領域のＤＮＡ断片をＬＡＭＰ法により特異的、迅速かつ高感度に増幅することができる。このため、当該ＤＮＡ断片の増幅が確認された場合には、検体中にタラロマイセス  ウォルトマニーが存在すると判断できる。
【００４２】
本発明のタラロマイセス  ルテウス検出用プライマーセットは、ＬＡＭＰ法で検出するのに用いるプライマーセットであって、配列番号３３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号３４に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号３５に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号３６に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーとを含むことを特徴とし、このプライマーセットは、配列番号３７に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーをさらに含むことが好ましい。このプライマーセットを用いることにより、タラロマイセス  ルテウスのβ−チューブリン遺伝子の標的領域のＤＮＡ断片をＬＡＭＰ法により特異的、迅速かつ高感度に増幅することができる。このため、当該ＤＮＡ断片の増幅が確認された場合には、検体中にタラロマイセス  ルテウスが存在すると判断できる。
【００４３】
本発明のタラロマイセス  フラバスおよびタラロマイセス  トラキスパーマム検出用プライマーセットは、ＬＡＭＰ法で検出するのに用いるプライマーセットであって、配列番号３８に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号３９に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号４０に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーと、配列番号４１に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーとを含むことを特徴とし、このプライマーセットは、配列番号４２および配列番号４３に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーをさらに含むことが好ましい。このプライマーセットを用いることにより、タラロマイセス  フラバスおよびタラロマイセス  トラキスパーマムの２８Ｓ  ｒＤＮＡのITS領域及びＤ１／Ｄ２領域の標的領域のＤＮＡ断片をＬＡＭＰ法により特異的、迅速かつ高感度に増幅することができる。このため、当該ＤＮＡ断片の増幅が確認された場合には、検体中にタラロマイセス  フラバスおよび／またはタラロマイセス  トラキスパーマムが存在すると判断できる。
【００４４】
上記プライマーセットを構成する各アウタープライマーは、標的領域のＤＮＡ断片を増幅するために、ＬＡＭＰ法のみでなく、ＰＣＲ法にも使用できる。ＰＣＲ法では、上記プライマーを用いて、検体中のβ−チューブリン遺伝子または２８Ｓ  ｒＤＮＡのITS領域及びＤ１／Ｄ２領域を鋳型に耐熱性のＤＮＡポリメラーゼでＰＣＲを行えば、目的とするＤＮＡ断片を増幅させることが可能である。
【００４５】
本発明で用いることができるプライマーは、配列番号１から４３のいずれかで示される塩基配列に対して７０％以上の相同性を有する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであってもよく、相同性が７５％以上であることがさらに好ましく、相同性が８０％以上であることがさらに好ましく、相同性が８５％以上であることがさらに好ましく、相同性が９０％以上であることがさらに好ましく、相同性が９５％以上であることが特に好ましい。また、本発明で用いることができるプライマーには、配列番号１から４３のいずれかで示される塩基配列において１または数個、好ましくは１から５個、より好ましくは１から４個、さらに好ましくは１から３個、よりさらに好ましくは１から２個、特に好ましくは１個の塩基の欠失、挿入あるいは置換といった変異や、修飾された塩基配列からなるオリゴヌクレオチドも包含される。また、配列番号１から４３のいずれかで示される塩基配列に、適当な塩基配列を付加してもよい。塩基配列の相同性については、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５，１９８５）等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ−Ｗｉｎ（ソフトウェア開発製）のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、パラメーターであるＵｎｉｔ  ｓｉｚｅ  ｔｏ  ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出することができる。
【００４６】
本発明の耐熱性菌類検出用オリゴヌクレオチドは、耐熱性菌類のβ−チューブリン遺伝子または２８Ｓ  ｒＤＮＡのITS領域及びＤ１／Ｄ２領域の塩基配列から選択される標的領域の５’側から、塩基配列領域としてＦ３、Ｆ２及びＦ１を選択し、前記標的領域の３’側から、塩基配列領域としてＢ３ｃ、Ｂ２ｃ及びＢ１ｃを選択し、前記Ｂ３ｃ、Ｂ２ｃ及びＢ１ｃの相補的塩基配列を、それぞれＢ３、Ｂ２及びＢ１とし、前記Ｆ３、Ｆ２及びＦ１に相補的な塩基配列を、それぞれＦ３ｃ、Ｆ２ｃ及びＦ１ｃとしたとき、以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれかに該当する塩基配列からなるオリゴヌクレオチドであることが好ましい。
（ａ）前記Ｂ２領域を３’側に有し、前記Ｂ１ｃ領域を５’側に有する塩基配列
（ｂ）前記Ｂ３領域を有する塩基配列
（ｃ）前記Ｆ２領域を３’側に有し、前記Ｆ１ｃ領域を５’側に有する塩基配列
（ｄ）前記Ｆ３領域を有する塩基配列
（ｅ）前記Ｂ１領域と前記Ｂ２領域の間の部分と相補的な配列を有する塩基配列
（ｆ）前記Ｆ１領域と前記Ｆ２領域の間の部分と相補的な配列を有する塩基配列
本発明のオリゴヌクレオチドは、ＬＡＭＰ法で用いられるプライマーとしてだけではなく、ＰＣＲ法等のプライマー、核酸検出用プローブなどとしても用いることができる。
【００４７】
上記プライマーまたはオリゴヌクレオチドの結合様式は、天然の核酸に存在するホスホジエステル結合だけでなく、例えばホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合等であってもよい。
【００４８】
標的領域のＤＮＡ断片の増幅に用いられる酵素は、通常用いられるものであれば特に制限はない。前記標的領域のＤＮＡ断片をＬＡＭＰ法によって増幅させる場合には、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素が好ましい。このような酵素としては、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）、Ｂｃａ（ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント等が挙げられ、好ましくはＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（ラージフラグメント）が挙げられる。本発明に用いることができる酵素は、ウイルスや細菌等から精製されたものでもよく、遺伝子組換え技術によって作製されたものでもよい。またこれらの酵素はフラグメント化やアミノ酸の置換等の改変をされたものでもよい。
【００４９】
標的領域のＤＮＡ断片を増幅させるときの温度に特に制限はないが、６０〜６５℃であることが好ましい。
【００５０】
本発明において使用される検体としては特に制限はなく、飲食品自体、飲食品の原材料、単離菌体、培養菌体等を用いることができる。
検体からＤＮＡを調製する方法としては、耐熱性菌類の検出を行うのに十分な精製度および量のＤＮＡが得られるのであれば特に制限されず、未精製の状態でも使用できるが、さらに分離、抽出、濃縮、精製等の前処理をして使用することもできる。例えば、フェノール及びクロロホルム抽出を行って精製したり、市販の抽出キットを用いて精製して、核酸の純度を高めて使用することができる。
【００５１】
標的領域のＤＮＡ断片の増幅は通常の方法により確認することができる。前記標的領域のＤＮＡ断片をＬＡＭＰ法によって増幅させる場合には、例えば、増幅された塩基配列を特異的に認識する標識オリゴヌクレオチドをプローブに用いてハイブリダイゼーションを行ったり、蛍光性インターカレーター法（特開２００１−２４２１６９号公報）で検出したり、あるいは、反応終了後の反応液をそのままアガロースゲルで電気泳動してバンドとして検出することもできる。アガロースゲル電気泳動では、ＬＡＭＰ増幅産物は、塩基長の異なる多数のバンドがラダー（はしご）状に検出される。
また、ＬＡＭＰ法では核酸の合成により基質が大量に消費され、副産物であるピロリン酸イオンが、共存するマグネシウムイオンと反応してピロリン酸マグネシウムが算出される。ピロリン酸マグネシウムが算出されると、反応液が肉眼で確認できる程度にまで白濁する。この白濁を指標として、反応終了後あるいは反応中の濁度上昇を経時的に光学的に観察できる測定機器を用いて検出できる。例えば、分光光度計を用いて４００ｎｍにおける吸光度の変化を確認することによって、核酸の増幅反応を検出することができる（国際公開第０１／８３８１７号パンフレット）。
【００５２】
本発明のプライマーを用いて標的領域のＤＮＡ断片の増幅を行う際に必要な各種の試薬類は、予めパッケージングしてキット化することができる。本発明のキットには、上記プライマーセットまたはオリゴヌクレオチドと、ＤＮＡポリメラーゼと、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含むｄＮＴＰとを含有する。好ましくは、本発明のプライマー、ループプライマーとして必要な各種のオリゴヌクレオチド、核酸合成の基質となる４種類のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ）、鎖置換活性を有する鋳型依存性核酸合成酵素などのＤＮＡポリメラーゼと、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、補助因子としての塩類（マグネシウム塩又はマンガン塩等）、酵素や鋳型を安定化する保護剤、さらに必要に応じて反応生成物の検出に必要な試薬類がキットとして含有される。本発明のキットには、本発明のプライマーによってＬＡＭＰ反応が正常に進行することを確認するための陽性対照（ポジティブコントロール）を含んでいてもよい。陽性対照としては、例えば、本発明のプライマーにより増幅される領域を含んだＤＮＡが挙げられる。
【００５３】
本発明の方法によれば、検体の調製工程から菌類の検出工程までを約６０〜１２０分という短時間で行うことが可能である。
【実施例】
【００５４】
以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００５５】
実施例１  ビソクラミス属の菌類の検出
（１）プライマーの設計及び合成
シークエンシング法により決定した各種菌類（パエシロマイセス  バリオッティー、ハミゲラ  アベラネラ、タラロマイセス  フラバス、タラロマイセス  ルテウス、タラロマイセス  トラキスパーマム、ビソクラミス  ニベア、ビソクラミス  フルバ、ネオサルトリア  フィシェリ）の２８ＳｒＤＮＡのITS領域及びＤ１／Ｄ２領域の塩基配列情報をもとに、ＤＮＡ解析ソフトウエア（商品名：ＤＮＡｓｉｓ  ｐｒｏ、日立ソフトウエア社製）を用いてアライメント解析を行い、ビソクラミス属の菌類に特異的な塩基配列を特定した。特定した塩基配列をもとに、配列番号１〜４の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを設計し、E  Genome  order(株式会社富士通システムソリューションズ、配列番号１，２；５ｐmolスケール、配列番号３，４；４０ｐmolスケール；全てカラム精製品)に合成依頼し、購入した。
【００５６】
（２）検体の調製
ビソクラミス属の菌類としては、ビソクラミス  ファルバおよびビソクラミス  ニベアを使用した。ビソクラミス属の菌類の２８ＳｒＤＮＡのITS領域及びＤ１／Ｄ２領域に対する配列番号１〜４の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーの特異性を確かめるために、表１に示す菌類も使用した。これらの菌類は千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管し、IFMナンバーなどにより管理されているものを入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて２５℃で７日間培養した。
【００５７】
【表１】
0005548345.tif 000002
【００５８】
（３）ゲノムＤＮＡの調製
ゲノムＤＮＡ調製用キット（商品名  ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ、アプライドバイオ社製）を用いて、菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。具体的には、各培地から数個のコロニーを採取し、キットの付属試薬２００μｌに菌体を懸濁し、１００℃、１０分間の加熱処理で菌体を溶解させ、１４８００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を回収した。得られたゲノムＤＮＡ溶液の濃度を５０ｎｇ/μｌに調製した。このゲノムＤＮＡ溶液を鋳型ＤＮＡとして、以下のＬＡＭＰ反応に用いた。
【００５９】
（４）ＬＡＭＰ反応のための反応液調製
２ｘ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）  ４０ｍＭ、ＫＣｌ  ２０ｍＭ、ＭｇＳＯ４  １６ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ２０ｍＭ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０、Ｂｅｔａｉｎｅ  １．６Ｍ、ｄＮＴＰｓ  ２．８ｍＭ：栄研化学株式会社製；Ｌｏｏｐａｍｐ  ＤＮＡ増幅試薬キット）１２．５μｌ、配列番号１で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＢ１Ｆ３プライマー：５ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号２で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＢ１Ｂ３プライマー：５ｐｏｍｌ／μｌ）１μｌ、配列番号３で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＢ１ＦＩＰプライマー：４０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号４で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＢ１ＢＩＰプライマー：４０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、Ｂｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（８Ｕ／２５μＬ、栄研化学株式会社製）１μｌ、および上記で調製した鋳型ＤＮＡ  １μｌを混合し、蒸留水を加えて全量２５μｌの反応液とした。
【００６０】
（５）ＬＡＭＰ反応
上記で調製した反応液を、リアルタイム濁度測定装置Ｌｏｏｐａｍｐ  ＲＴ−１６０Ｃ（栄研化学株式会社製）にて、６３±２℃で６０分間ＤＮＡの増幅反応を行った。同時に反応液の濁度を測定した（波長：４００ｎｍ）。
【００６１】
（６）ＤＮＡ増幅確認
ＤＮＡの増幅の有無は、反応液の濁度が上昇しているかによって判断した。反応液の濁度の測定結果を、図１０（ａ）及び図１０（ｂ）に示す。なお、図１０（ａ）は表１の試料番号１〜８、図１０（ｂ）は表１の試料番号９〜１６の結果を示す。
その結果、ビソクラミス属の菌類のゲノムＤＮＡを鋳型とした系のみで、反応開始３０分後から濁度の上昇、すなわちＤＮＡの合成・増幅反応が認められた。濁度の上昇は反応開始後６０〜７０分後にピークとなりその後穏やかに下降した。
一方、ビソクラミス属以外の菌類のゲノムＤＮＡを用いた系では、反応開始後９０分までの間、反応液の濁度の上昇は認められなかった。なお、反応開始１００分前後から、ビソクラミス属以外の菌類のゲノムＤＮＡを用いた系においても反応液の濁度上昇が観察されたが、これはプライマー同士が反応して増幅してしまうこと、または、反応時間が長くなるにつれて標的配列以外の配列にも少数のプライマーがアニールしてしまうこと等が原因であると考えられる。
以上の結果から、本発明の方法によれば、簡便、迅速かつ特異的にビソクラミス属の菌類を検出することが可能である。
【００６２】
実施例２  ネオサルトリア属の菌類及びアスペルギルス・フミガタスの検出
（１）プライマーの設計及び合成
シークエンシング法により決定した各種菌類（ネオサルトリア  フィシェリ、ネオサルトリア・グラブラ、パエシロマイセス  バリオッティー、ハミゲラ  アベラネラ、タラロマイセス  フラバス、タラロマイセス  ルテウス、タラロマイセス  トラキスパーマム、ビソクラミス  ニベア、ビソクラミス  フルバ）のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列情報をもとに、ＤＮＡ解析ソフトウエア（商品名：ＤＮＡｓｉｓ  ｐｒｏ、日立ソフトウエア社製）を用いてアライメント解析を行い、ネオサルトリア属の菌類およびアスペルギルス・フミガタスに特異的な塩基配列を特定した。特定した塩基配列をもとに、配列番号５〜１０の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを設計し、E  Genome  order(株式会社富士通システムソリューションズ、配列番号５，６；５ｐmolスケール、配列番号７，８；４０ｐmolスケール、配列番号９，１０；２０ｐmoｌスケール；全てカラム精製品)に合成依頼し、購入した。
【００６３】
（２）検体の調製
ネオサルトリア属の菌類およびアスペルギルス  フミガタスとしては、表２および表２−１に記載の菌類を使用した。これらの菌類のβ−チューブリン遺伝子に対する配列番号５〜１０の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーの特異性を確かめるために、表２および表２−１に示す菌類も使用した。これらの菌類は千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管し、IFMナンバーなどにより管理されているものを入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて２５℃で７日間培養した。
【００６４】
【表２】
0005548345.tif 000003
【００６５】
【表２−１】
0005548345.tif 000004
【００６６】
（３）ゲノムＤＮＡの調製
ゲノムＤＮＡ調製用キット（商品名  ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ、アプライドバイオ社製）を用いて、菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。具体的には、各培地から数個のコロニーを採取し、キットの付属試薬２００μｌに菌体を懸濁し、１００℃、１０分間の加熱処理で菌体を溶解させ、１４８００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を回収した。得られたゲノムＤＮＡ溶液の濃度を５０ｎｇ/μｌに調製した。このゲノムＤＮＡ溶液を鋳型ＤＮＡとして、以下のＬＡＭＰ反応に用いた。
【００６７】
（４）ＬＡＭＰ反応のための反応液調製
２ｘ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）  ４０ｍＭ、ＫＣｌ  ２０ｍＭ、ＭｇＳＯ４  １６ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ２０ｍＭ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０、Ｂｅｔａｉｎｅ  １．６Ｍ、ｄＮＴＰｓ  ２．８ｍＭ：栄研化学株式会社製；Ｌｏｏｐａｍｐ  ＤＮＡ増幅試薬キット）１２．５μｌ、配列番号５で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＮ１Ｆ３プライマー：５ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号６で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＮ１Ｂ３プライマー：５ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号７で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＮ１ＦＩＰプライマー：４０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号８で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＮ１ＢＩＰプライマー：４０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号９で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＮ１ＬＦループプライマー：２０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号１０で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＮ１ＬＢループプライマー：２０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、Ｂｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（８Ｕ／２５μＬ、栄研化学株式会社製）１μｌ、および上記で調製した鋳型ＤＮＡ  １μｌを混合し、蒸留水を加えて全量２５μｌの反応液とした。
【００６８】
（５）ＬＡＭＰ反応
上記で調製した反応液を、リアルタイム濁度測定装置Ｌｏｏｐａｍｐ  ＲＴ−１６０Ｃ（栄研化学株式会社製）にて、６３±２℃で６０分間ＤＮＡの増幅反応を行った。同時に反応液の濁度を測定した（波長：４００ｎｍ）。
【００６９】
（６）ＤＮＡ増幅確認
ＤＮＡの増幅の有無は、反応液の濁度が上昇しているかによって判断した。反応液の濁度の測定結果を、図１１および図１１−１に示す。
その結果、ネオサルトリア属の菌類（ネオサルトリア・スピノサ、ネオサルトリア・ヒラツカエ、ネオサルトリア・フィシェリ、ネオサルトリア・グラブラ）及びアスペルギルス・フミガタスのゲノムＤＮＡを鋳型とした系のみで、反応開始２０分前後から濁度の上昇、すなわちＤＮＡの合成・増幅反応が認められた。
一方、その他の菌類のゲノムＤＮＡを用いた系では、反応開始後５０分までの間、反応液の濁度の上昇は認められなかった。なお、反応開始６０分前後から、ネオサルトリア属の菌類及びアスペルギルス・フミガタス以外のゲノムＤＮＡを用いた系においても反応液の濁度上昇が観察されたが、これはプライマー同士が反応して増幅してしまうこと、または、反応時間が長くなるにつれて標的配列以外の配列にも少数のプライマーがアニールしてしまうこと等が原因であると考えられる。
以上の結果から、本発明の方法によれば、簡便、迅速かつ特異的にネオサルトリア属の菌類及びアスペルギルス・フミガタスを検出することが可能である。
【００７０】
実施例３  ハミゲラ属の菌類の検出
（１）プライマーの設計及び合成
シークエンシング法により決定した各種菌類（パエシロマイセス  バリオッティー、ハミゲラ  アベラネラ、タラロマイセス  フラバス、タラロマイセス  ルテウス、タラロマイセス  トラキスパーマム、ビソクラミス  ニベア、ビソクラミス  フルバ、ネオサルトリア  フィシェリ）のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列情報をもとに、ＤＮＡ解析ソフトウエア（商品名：ＤＮＡｓｉｓ  ｐｒｏ、日立ソフトウエア社製）を用いてアライメント解析を行い、ハミゲラ属の菌類に特異的な塩基配列を特定した。特定した塩基配列をもとに、配列番号１６〜２１の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを設計し、E  Genome  order(株式会社富士通システムソリューションズ、配列番号１６，１７；５ｐmolスケール、配列番号１８，１９；４０ｐmolスケール、配列番号２０，２１；２０ｐmoｌスケール；全てカラム精製品)に合成依頼し、購入した。
【００７１】
（２）検体の調製
ハミゲラ属の菌類としては、表３に記載のハミゲラ  アベラネア（Ｈａｍｉｇｅｒａ  ａｖｅｌｌａｎｅａ）を使用した。これらの菌類のβ−チューブリン遺伝子に対する配列番号１６〜２１の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーのハミゲラ属の菌類特異性を示すために、表３に示す他の菌類も使用した。これらの菌類は千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管し、IFMナンバーなどにより管理されているものを入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて２５℃で７日間培養した。
【００７２】
【表３】
0005548345.tif 000005
【００７３】
（３）ゲノムＤＮＡの調製
ゲノムＤＮＡ調製用キット（商品名  ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ、アプライドバイオ社製）を用いて、菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。具体的には、各培地から数個のコロニーを採取し、キットの付属試薬２００μｌに菌体を懸濁し、１００℃、１０分間の加熱処理で菌体を溶解させ、１４８００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を回収した。得られたゲノムＤＮＡ溶液の濃度を５０ｎｇ/μｌに調製した。このゲノムＤＮＡ溶液を鋳型ＤＮＡとして、以下のＬＡＭＰ反応に用いた。
【００７４】
（４）ＬＡＭＰ反応のための反応液調製
２ｘ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）  ４０ｍＭ、ＫＣｌ  ２０ｍＭ、ＭｇＳＯ４  １６ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ２０ｍＭ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０、Ｂｅｔａｉｎｅ  １．６Ｍ、ｄＮＴＰｓ  ２．８ｍＭ：栄研化学株式会社製；Ｌｏｏｐａｍｐ  ＤＮＡ増幅試薬キット）１２．５μｌ、配列番号１６で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＨ２Ｆ３プライマー：５ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号１７で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＨ２Ｂ３プライマー：５ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号１８で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＨ２ＦＩＰプライマー：４０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号１９で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＨ２ＢＩＰプライマー：４０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号２０で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＨ２ＬＦループプライマー：２０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号２１で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＨ２ＬＢループプライマー：２０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、Ｂｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（８Ｕ／２５μＬ、栄研化学株式会社製）１μｌ、および上記で調製した鋳型ＤＮＡ  １μｌを混合し、蒸留水を加えて全量２５μｌの反応液とした。
【００７５】
（５）ＬＡＭＰ反応
上記で調製した反応液を、リアルタイム濁度測定装置Ｌｏｏｐａｍｐ  ＲＴ−１６０Ｃ（栄研化学株式会社製）にて、６３±２℃で６０分間ＤＮＡの増幅反応を行った。同時に反応液の濁度を測定した（波長：４００ｎｍ）。
【００７６】
（６）ＤＮＡ増幅確認
ＤＮＡの増幅の有無は、反応液の濁度が上昇しているかによって判断した。反応液の濁度の測定結果を、図１２に示す。
その結果、ハミゲラ属の菌類（ハミゲラ  アベラネア）のゲノムＤＮＡを鋳型とした系のみで、反応開始２５分前後から濁度の上昇、すなわちＤＮＡの合成・増幅反応が認められた。
一方、ハミゲラ属以外の菌類のゲノムＤＮＡを用いた系では、反応開始後１００分までの間、反応液の濁度の上昇は認められなかった。なお、反応開始１１０分前後から、ハミゲラ属以外の菌類のゲノムＤＮＡを用いた系においても反応液の濁度上昇が観察されたが、これはプライマー同士が反応して増幅してしまうこと、または、反応時間が長くなるにつれて標的配列以外の配列にも少数のプライマーがアニールしてしまうこと等が原因であると考えられる。
以上の結果から、本発明の方法によれば、簡便、迅速かつ特異的にハミゲラ属の菌類を検出することが可能である。
【００７７】
実施例４  アスペルギルス・フミガタスの検出（ネオサルトリア属の菌類とアスペルギルス・フミガタスの識別）
（１）プライマーの設計及び調整
シークエンシング法により決定した各種菌類（アスペルギルス・フミガタス、ネオサルトリア  フィシェリ、ネオサルトリア  スピノサ）のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列情報をもとに、ＤＮＡ解析ソフトウエア（商品名：ＤＮＡｓｉｓ  ｐｒｏ、日立ソフトウエア社製）を用いてアライメント解析を行い、アスペルギルス・フミガタスに特異的な塩基配列を特定した。特定した塩基配列をもとに、配列番号１１〜１５の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを設計し、E  Genome  order(株式会社富士通システムソリューションズ、配列番号１１，１２；５ｐmolスケール、配列番号１３，１４；４０ｐmolスケール、配列番号１５；２０ｐmoｌスケール；全てカラム精製品)に合成依頼し、購入した。
【００７８】
（２）検体の調製
ネオサルトリア属に属する菌類およびアスペルギルス・フミガタスとしては、表４に記載の菌類を使用した。これらの菌類は千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管し、IFMナンバーなどにより管理されているものを入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて２５℃で７日間培養した。
【００７９】
【表４】
0005548345.tif 000006
【００８０】
（３）ゲノムＤＮＡの調製
ゲノムＤＮＡ調製用キット（商品名  ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ、アプライドバイオ社製）を用いて、菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。具体的には、各培地から数個のコロニーを採取し、キットの付属試薬２００μｌに菌体を懸濁し、１００℃、１０分間の加熱処理で菌体を溶解させ、１４８００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を回収した。得られたゲノムＤＮＡ溶液の濃度を５０ｎｇ/μｌに調製した。このゲノムＤＮＡ溶液を鋳型ＤＮＡとして、以下のＬＡＭＰ反応に用いた。
【００８１】
（４）ＬＡＭＰ反応のための反応液調製
２ｘ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）  ４０ｍＭ、ＫＣｌ  ２０ｍＭ、ＭｇＳＯ４  １６ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ２０ｍＭ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０、Ｂｅｔａｉｎｅ  １．６Ｍ、ｄＮＴＰｓ  ２．８ｍＭ：栄研化学株式会社製；Ｌｏｏｐａｍｐ  ＤＮＡ増幅試薬キット）１２．５μｌ、配列番号１１で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＡｆ２Ｆ３プライマー：５ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号１２で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＡｆ２Ｂ３プライマー：５ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号１３で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＡｆ２ＦＩＰプライマー：４０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号１４で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＡｆ２ＢＩＰプライマー：４０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号１５で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＡｆ２ＬＢループプライマー：２０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、Ｂｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（（８Ｕ／２５μＬ）栄研化学株式会社製）１μｌ、鋳型ＤＮＡ  １μｌ、及び蒸留水で全量を２５μｌに調製した。
【００８２】
（５）ＬＡＭＰ反応
上記で調製した反応液を、リアルタイム濁度測定装置Ｌｏｏｐａｍｐ  ＲＴ−１６０Ｃ（栄研化学株式会社製）にて、６３±２℃で６０分間ＤＮＡの増幅反応を行った。同時に反応液の濁度を測定した（波長：４００ｎｍ）。
【００８３】
（６）ＤＮＡ増幅確認
ＤＮＡの増幅の有無は、反応液の濁度が上昇しているかによって判断した。反応液の濁度の測定結果を、図１３に示す。
その結果、アスペルギルス・フミガタスのゲノムＤＮＡを鋳型とした系のみで、反応開始４５分前後から濁度の上昇、すなわちＤＮＡの合成・増幅反応が認められた。
一方、ネオサルトリア属の菌類のゲノムＤＮＡを用いた系では、反応開始後９０分までの間、反応液の濁度の上昇は認められなかった。なお、反応開始１００分前後から、ネオサルトリア属の菌類のゲノムＤＮＡを用いた系においても反応液の濁度上昇が観察されたが、これはプライマー同士が反応して増幅してしまうこと、または、反応時間が長くなるにつれて標的配列以外の配列にも少数のプライマーがアニールしてしまうこと等が原因であると考えられる。
以上の結果から、本発明の方法によれば、簡便、迅速かつ特異的にアスペルギルス・フミガタスを同定することが可能である。
また、本実施例のアスペルギルス・フミガタスの検出方法と、実施例２に示した配列番号５〜１０で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを用いた方法とを組合わせることで、ネオサルトリア属の菌類とアスペルギルス・フミガタスとを識別することも可能となる。
【００８４】
実施例５  タラロマイセス・フラバスの検出
（１）プライマーの設計及び合成
シークエンシング法により決定した各種菌類（パエシロマイセス  バリオッティー、ハミゲラ  アベラネラ、タラロマイセス  フラバス、タラロマイセス  ルテウス、タラロマイセス  トラキスパーマム、ビソクラミス  ニベア、ビソクラミス  フルバ、ネオサルトリア  フィシェリ）のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列情報をもとに、ＤＮＡ解析ソフトウエア（商品名：ＤＮＡｓｉｓ  ｐｒｏ、日立ソフトウエア社製）を用いてアライメント解析を行い、タラロマイセス・フラバスに特異的な塩基配列を特定した。特定した塩基配列をもとに、配列番号２２〜２６の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを設計し、E  Genome  order(株式会社富士通システムソリューションズ、配列番号２２，２３；５ｐmolスケール、配列番号２４，２５；４０ｐmolスケール、配列番号２６；２０ｐmoｌスケール；全てカラム精製品)に合成依頼し、購入した。
【００８５】
（２）検体の調製
表５に記載のタラロマイセス・フラバスを使用した。タラロマイセス・フラバスのβ−チューブリン遺伝子に対する配列番号２２〜２６の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーの特異性を示すために、表５に示す他の菌類も使用した。これらの菌類は千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管し、IFMナンバーなどにより管理されているものを入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて２５℃で７日間培養した。
【００８６】
【表５】
0005548345.tif 000007
【００８７】
（３）ゲノムＤＮＡの調製
ゲノムＤＮＡ調製用キット（商品名  ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ、アプライドバイオ社製）を用いて、菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。具体的には、各培地から数個のコロニーを採取し、キットの付属試薬２００μｌに菌体を懸濁し、１００℃、１０分間の加熱処理で菌体を溶解させ、１４８００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を回収した。得られたゲノムＤＮＡ溶液の濃度を５０ｎｇ/μｌに調製した。このゲノムＤＮＡ溶液を鋳型ＤＮＡとして、以下のＬＡＭＰ反応に用いた。
【００８８】
（４）ＬＡＭＰ反応のための反応液調製
２ｘ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）  ４０ｍＭ、ＫＣｌ  ２０ｍＭ、ＭｇＳＯ４  １６ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ２０ｍＭ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０、Ｂｅｔａｉｎｅ  １．６Ｍ、ｄＮＴＰｓ  ２．８ｍＭ：栄研化学株式会社製；Ｌｏｏｐａｍｐ  ＤＮＡ増幅試薬キット）１２．５μｌ、配列番号２２で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＴｆ２Ｆ３プライマー：５ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号２３で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＴｆ２Ｂ３プライマー：５ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号２４で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＴｆ２ＦＩＰプライマー：４０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号２５で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＴｆ２ＢＩＰプライマー：４０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号２６で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＴｆ２ＬＢループプライマー：２０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、Ｂｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（８Ｕ／２５μＬ、栄研化学株式会社製）１μｌ、および上記で調製した鋳型ＤＮＡ  １μｌを混合し、蒸留水を加えて全量２５μｌの反応液とした。
【００８９】
（５）ＬＡＭＰ反応
上記で調製した反応液を、リアルタイム濁度測定装置Ｌｏｏｐａｍｐ  ＲＴ−１６０Ｃ（栄研化学株式会社製）にて、６３±２℃で６０分間ＤＮＡの増幅反応を行った。同時に反応液の濁度を測定した（波長：４００ｎｍ）。
【００９０】
（６）ＤＮＡ増幅確認
ＤＮＡの増幅の有無は、反応液の濁度が上昇しているかによって判断した。反応液の濁度の測定結果を、図１４（ａ）及び図１４（ｂ）に示す。なお、図１４（ａ）は表５の試料番号１〜８、図１４（ｂ）は表５の試料番号９〜１６の結果を示す。
その結果、タラロマイセス・フラバスのゲノムＤＮＡを鋳型とした系のみで、反応開始３０分前後から濁度の上昇、すなわちＤＮＡの合成・増幅反応が認められた。
一方、タラロマイセス・フラバス以外の菌類のゲノムＤＮＡを用いた系では、反応開始後７０分までの間、反応液の濁度の上昇は認められなかった。なお、反応開始８０分前後から、タラロマイセス・フラバス以外の菌類のゲノムＤＮＡを用いた系においても反応液の濁度上昇が観察されたが、これはプライマー同士が反応して増幅してしまうこと、または、反応時間が長くなるにつれて標的配列以外の配列にも少数のプライマーがアニールしてしまうこと等が原因であると考えられる。
以上の結果から、本発明の方法によれば、タラロマイセス・フラバスのＤＮＡのみが増幅され、かつ増幅による濁度の上昇が顕著な反応開始６０分前後の時点までの反応液の濁度を計測することで、簡便かつ迅速にタラロマイセス・フラバスを検出することが可能である。
【００９１】
実施例６  タラロマイセス・ウォルトマニーの検出
（１）プライマーの設計及び合成
シークエンシング法により決定した各種菌類（タラロマイセス  ウォルトマンニー、パエシロマイセス  バリオッティー、ハミゲラ  アベラネラ、タラロマイセス  フラバス、タラロマイセス  ルテウス、タラロマイセス  トラキスパーマム、ビソクラミス  ニベア、ビソクラミス  フルバ、ネオサルトリア  フィシェリ）のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列情報をもとに、ＤＮＡ解析ソフトウエア（商品名：ＤＮＡｓｉｓ  ｐｒｏ、日立ソフトウエア社製）を用いてアライメント解析を行い、タラロマイセス・ウォルトマニーに特異的な塩基配列を特定した。特定した塩基配列をもとに、配列番号２７〜３２の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを設計し、E  Genome  order(株式会社富士通システムソリューションズ、配列番号２７，２８；５ｐmolスケール、配列番号２９，３０；４０ｐmolスケール、配列番号３１，３２；２０ｐmoｌスケール；全てカラム精製品)に合成依頼し、購入した。
【００９２】
（２）検体の調製
表６に記載のタラロマイセス・ウォルトマニーを使用した。タラロマイセス・ウォルトマニーのβ−チューブリン遺伝子に対する配列番号２７〜３２の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーの特異性を示すために、表６に示す他の菌類も使用した。これらの菌類は千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管し、IFMナンバーなどにより管理されているものを入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて２５℃で７日間培養した。
【００９３】
【表６】
0005548345.tif 000008
【００９４】
（３）ゲノムＤＮＡの調整
ゲノムＤＮＡ調製用キット（商品名  ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ、アプライドバイオ社製）を用いて、菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。具体的には、各培地から数個のコロニーを採取し、キットの付属試薬２００μｌに菌体を懸濁し、１００℃、１０分間の加熱処理で菌体を溶解させ、１４８００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を回収した。得られたゲノムＤＮＡ溶液の濃度を５０ｎｇ/μｌに調製した。このゲノムＤＮＡ溶液を鋳型ＤＮＡとして、以下のＬＡＭＰ反応に用いた。
【００９５】
（４）ＬＡＭＰ反応のための反応液調製
２ｘ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）  ４０ｍＭ、ＫＣｌ  ２０ｍＭ、ＭｇＳＯ４  １６ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ２０ｍＭ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０、Ｂｅｔａｉｎｅ  １．６Ｍ、ｄＮＴＰｓ  ２．８ｍＭ：栄研化学株式会社製；Ｌｏｏｐａｍｐ  ＤＮＡ増幅試薬キット）１２．５μｌ、配列番号２７で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＴｗ４Ｆ３プライマー：５ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号２８で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＴｗ３Ｂ３プライマー：５ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号２９で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＴｗ４ＦＩＰプライマー：４０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号３０で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＴｗ３ＢＩＰプライマー：４０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号３１で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＴｗ４ＬＦループプライマー：２０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号３２で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＴｗ３ＬＢループプライマー：２０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、Ｂｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（８Ｕ／２５μＬ、栄研化学株式会社製）１μｌ、および上記で調製した鋳型ＤＮＡ  １μｌを混合し、蒸留水を加えて全量２５μｌの反応液とした。
【００９６】
（５）ＬＡＭＰ反応
上記で調製した反応液を、リアルタイム濁度測定装置Ｌｏｏｐａｍｐ  ＲＴ−１６０Ｃ（栄研化学株式会社製）にて、６３±２℃で６０分間ＤＮＡの増幅反応を行った。同時に反応液の濁度を測定した（波長：４００ｎｍ）。
【００９７】
（６）ＤＮＡ増幅確認
ＤＮＡの増幅の有無は、反応液の濁度が上昇しているかによって判断した。反応液の濁度の測定結果を、図１５に示す。
その結果、タラロマイセス・ウォルトマニーのゲノムＤＮＡを鋳型とした系のみで、反応開始２０分前後から濁度の上昇、すなわちＤＮＡの合成・増幅反応が認められた。
一方、タラロマイセス・ウォルトマニー以外の菌類のゲノムＤＮＡを用いた系では、反応開始後４０分までの間、反応液の濁度の上昇は認められなかった。なお、反応開始５０分前後から、タラロマイセス・ウォルトマニー以外の菌類のゲノムＤＮＡを用いた系においても反応液の濁度上昇が観察されたが、これはプライマー同士が反応して増幅してしまうこと、または、反応時間が長くなるにつれて標的配列以外の配列にも少数のプライマーがアニールしてしまうこと等が原因であると考えられる。
以上の結果から、簡便、迅速かつ特異的にタラロマイセス・ウォルトマニーを検出することが可能である。
【００９８】
実施例７  タラロマイセス・ルテウスの検出
（１）プライマーの設計及び合成
シークエンシング法により決定した各種菌類（タラロマイセス  ルテウス、パエシロマイセス  バリオッティー、ハミゲラ  アベラネラ、タラロマイセス  フラバス、タラロマイセス  ウォルトマンニー、タラロマイセス  トラキスパーマム、ビソクラミス  ニベア、ビソクラミス  フルバ、ネオサルトリア  フィシェリ）のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列情報をもとに、ＤＮＡ解析ソフトウエア（商品名：ＤＮＡｓｉｓ  ｐｒｏ、日立ソフトウエア社製）を用いてアライメント解析を行い、タラロマイセス・ルテウスに特異的な塩基配列を特定した。特定した塩基配列をもとに、配列番号３３〜３７の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを設計し、E  Genome  order(株式会社富士通システムソリューションズ、配列番号３３，３４；５ｐmolスケール、配列番号３５，３６；４０ｐmolスケール、配列番号３７；２０ｐmoｌスケール；全てカラム精製品)に合成依頼し、購入した。
【００９９】
（２）検体の調製
表７に記載のタラロマイセス・ルテウスを使用した。タラロマイセス・ルテウスのβ−チューブリン遺伝子に対する配列番号３３〜３７の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーの特異性を示すために、表７に示す他の菌類も使用した。これらの菌類は千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管し、IFMナンバーなどにより管理されているものを入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて２５℃で７日間培養した。
【０１００】
【表７】
0005548345.tif 000009
【０１０１】
（３）ゲノムＤＮＡの調製
ゲノムＤＮＡ調製用キット（商品名  ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ、アプライドバイオ社製）を用いて、菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。具体的には、各培地から数個のコロニーを採取し、キットの付属試薬２００μｌに菌体を懸濁し、１００℃、１０分間の加熱処理で菌体を溶解させ、１４８００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を回収した。得られたゲノムＤＮＡ溶液の濃度を５０ｎｇ/μｌに調製した。このゲノムＤＮＡ溶液を鋳型ＤＮＡとして、以下のＬＡＭＰ反応に用いた。
【０１０２】
（４）ＬＡＭＰ反応のための反応液調製
２ｘ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）  ４０ｍＭ、ＫＣｌ  ２０ｍＭ、ＭｇＳＯ４  １６ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ２０ｍＭ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０、Ｂｅｔａｉｎｅ  １．６Ｍ、ｄＮＴＰｓ  ２．８ｍＭ：栄研化学株式会社製；Ｌｏｏｐａｍｐ  ＤＮＡ増幅試薬キット）１２．５μｌ、配列番号３３で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＴｌ１Ｆ３プライマー：５ｐｍｏｌ）１μｌ、配列番号３４で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＴｌ１Ｂ３プライマー：５ｐｍｏｌ）１μｌ、配列番号３５で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＴｌ１ＦＩＰプライマー：４０ｐｍｏｌ）１μｌ、配列番号３６で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＴｌ１ＢＩＰプライマー：４０ｐｍｏｌ）１μｌ、配列番号３７で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＴｌ１ＬＦループプライマー：２０ｐｍｏｌ）１μｌ、Ｂｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（８Ｕ／２５μＬ、栄研化学株式会社製）１μｌ、および上記で調製した鋳型ＤＮＡ  １μｌを混合し、蒸留水を加えて全量２５μｌの反応液とした。
【０１０３】
（５）ＬＡＭＰ反応
上記で調製した反応液を、リアルタイム濁度測定装置Ｌｏｏｐａｍｐ  ＲＴ−１６０Ｃ（栄研化学株式会社製）にて、６３±２℃で６０分間ＤＮＡの増幅反応を行った。同時に反応液の濁度を測定した（波長：４００ｎｍ）。
【０１０４】
（６）ＤＮＡ増幅確認
ＤＮＡの増幅の有無は、反応液の濁度が上昇しているかによって判断した。反応液の濁度の測定結果を、図１６（ａ）及び図１６（ｂ）に示す。なお、図１６（ａ）は表７の試料番号１〜８、図１６（ｂ）は表７の試料番号９〜１６の結果を示す。
その結果、タラロマイセス・ルテウスのゲノムＤＮＡを鋳型とした系のみで、反応開始２５分前後から濁度の急激な上昇、すなわちＤＮＡの合成・増幅反応が認められた。
一方、タラロマイセス・ルテウス以外の菌類のゲノムＤＮＡを用いた系では、反応開始後８０分までの間、反応液の濁度の上昇は認められなかった。なお、反応開始９０分前後から、タラロマイセス・ルテウス以外の菌類のゲノムＤＮＡを用いた系においても反応液の濁度上昇が観察されたが、これはプライマー同士が反応して増幅してしまうこと、または、反応時間が長くなるにつれて標的配列以外の配列にも少数のプライマーがアニールしてしまうこと等が原因であると考えられる。また、試料番号８では、反応開始１０分後から徐々に濁度の上昇が見られたが、これはゲノムＤＮＡの特異的な塩基配列に対応した遺伝子の増幅ではなく、プライマー同士が反応した緩慢な遺伝子増幅であることが理由であると考えられる。この緩慢な遺伝子増幅は濁度の測定結果に上昇ピークが見られない等、プライマーが鋳型ＤＮＡにアニールして増幅反応が起こる本来のＬＡＭＰ反応とは測定結果等において明らかに相違し、明確に区別することができる。
以上の結果から、本発明の方法によれば、簡便、迅速かつ特異的にタラロマイセス・ルテウスを同定することが可能である。
【０１０５】
実施例８  タラロマイセス・フラバスおよびタラロマイセス・トラキスパーマムの検出
（１）プライマーの設計及び合成
シークエンシング法により決定した各種菌類（タラロマイセス  フラバス、タラロマイセス  トラキスパーマム、パエシロマイセス  バリオッティー、ハミゲラ  アベラネラ、タラロマイセス  ウォルトマンニー、ビソクラミス  ニベア、ビソクラミス  フルバ、ネオサルトリア  フィシェリ）の２８ＳｒＤＮＡ遺伝子のITS領域及びＤ１／Ｄ２領域の塩基配列情報をもとに、ＤＮＡ解析ソフトウエア（商品名：ＤＮＡｓｉｓ  ｐｒｏ、日立ソフトウエア社製）を用いてアライメント解析を行い、タラロマイセス・フラバスおよびタラロマイセス・トラキスパーマムに特異的な塩基配列を特定した。特定した塩基配列をもとに、配列番号３８〜４３の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーを設計し、E  Genome  order(株式会社富士通システムソリューションズ、配列番号３８，３９；５ｐmolスケール、配列番号４０，４１；４０ｐmolスケール、配列番号４２，４３；２０ｐmoｌスケール；全てカラム精製品)に合成依頼し、購入した。
【０１０６】
（２）検体の調製
表８に記載のタラロマイセス・フラバスおよびタラロマイセス・トラキスパーマムを使用した。これらの菌類の２８ＳｒＤＮＡのITS領域及びＤ１／Ｄ２領域に対する配列番号３８〜４３の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマーの特異性を示すために、表８に示す他の菌類も使用した。これらの菌類は千葉大学医学部真菌医学研究センターが保管し、IFMナンバーなどにより管理されているものを入手し、使用した。
各菌体を至適条件下で培養した。培養条件についてはポテトデキストロース培地（商品名：パールコア  ポテトデキストロース寒天培地、栄研化学株式会社製）を用いて２５℃で７日間培養した。
【０１０７】
【表８】
0005548345.tif 000010
【０１０８】
（３）ゲノムＤＮＡの調製
ゲノムＤＮＡ調製用キット（商品名  ＰｒｅｐＭａｎ  ｕｌｔｒａ、アプライドバイオ社製）を用いて、菌体からゲノムＤＮＡ溶液を調製した。具体的には、各培地から数個のコロニーを採取し、キットの付属試薬２００μｌに菌体を懸濁し、１００℃、１０分間の加熱処理で菌体を溶解させ、１４８００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を回収した。得られたゲノムＤＮＡ溶液の濃度を５０ｎｇ/μｌに調製した。このゲノムＤＮＡ溶液を鋳型ＤＮＡとして、以下のＬＡＭＰ反応に用いた。
【０１０９】
（４）ＬＡＭＰ反応のための反応液調製
２ｘ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）  ４０ｍＭ、ＫＣｌ  ２０ｍＭ、ＭｇＳＯ４  １６ｍＭ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ２０ｍＭ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０、Ｂｅｔａｉｎｅ  １．６Ｍ、ｄＮＴＰｓ  ２．８ｍＭ：栄研化学株式会社製；Ｌｏｏｐａｍｐ  ＤＮＡ増幅試薬キット）１２．５μｌ、配列番号３８で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＴ１Ｆ３プライマー：５ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号３９で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＴ１Ｂ３プライマー：５ｐｏｍｌ／μｌ）１μｌ、配列番号４０で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＴ１ＦＩＰプライマー：４０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号４１で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＴ１ＢＩＰプライマー：４０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号４２で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＴ１ＬＦプライマー：２０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、配列番号４３で示される塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー（ＬＴ１ＬＢループプライマー：２０ｐｍｏｌ／μｌ）１μｌ、Ｂｓｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（８Ｕ／２５μＬ、栄研化学株式会社製）１μｌ、および上記で調製した鋳型ＤＮＡ  １μｌを混合し、蒸留水を加えて全量２５μｌの反応液とした。
【０１１０】
（５）ＬＡＭＰ反応
上記で調製した反応液を、リアルタイム濁度測定装置Ｌｏｏｐａｍｐ  ＲＴ−１６０Ｃ（栄研化学株式会社製）にて、６３±２℃で６０分間ＤＮＡの増幅反応を行った。同時に反応液の濁度を測定した（波長：４００ｎｍ）。
【０１１１】
（６）ＤＮＡ増幅確認
ＤＮＡの増幅の有無は、反応液の濁度が上昇しているかによって判断した。反応液の濁度の測定結果を、図１７に示す。
その結果、タラロマイセス・フラバスおよびタラロマイセス・トラキスパーマムのゲノムＤＮＡを鋳型とした系のみで、反応開始４０分前後から濁度の上昇、すなわちＤＮＡの合成・増幅反応が認められた。
一方、タラロマイセス・フラバスおよびタラロマイセス・トラキスパーマム以外の菌類のゲノムＤＮＡを用いた系では、反応開始後４５分までの間、反応液の濁度の上昇は認められなかった。なお、反応開始５０分後から、タラロマイセス・フラバスおよびタラロマイセス・トラキスパーマム以外の菌類のゲノムＤＮＡを用いた系においても反応液の濁度上昇が観察されたが、これはプライマー同士が反応して増幅してしまうこと、または、反応時間が長くなるにつれて標的配列以外の配列にも少数のプライマーがアニールしてしまうこと等が原因であると考えられる。
以上の結果から、本発明の方法によれば、簡便、迅速かつ特異的にタラロマイセス・フラバスおよびタラロマイセス・トラキスパーマムを検出することが可能である。
【０１１２】
実施例５〜８に示すように、タラロマイセス属の菌類に関しては、本発明の方法によれば種レベルでの菌類の検出が可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】ビソクラミス属の２８Ｓ  ｒＤＮＡのITS領域及びＤ１／Ｄ２領域の塩基配列における、ビソクラミス属検出用プライマーが認識する塩基配列の位置関係を示す。
【図２】ネオサルトリア属のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列における、ネオサルトリア属検出用プライマーが認識する塩基配列の位置関係を示す。
【図３】アスペルギルス  フミガタスのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列における、アスペルギルス  フミガタス検出用プライマーが認識する塩基配列の位置関係を示す。
【図４】ハミゲラ属のβ−チューブリン遺伝子の塩基配列における、ハミゲラ属検出用プライマーが認識する塩基配列の位置関係を示す。
【図５】タラロマイセス  フラバスのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列における、タラロマイセス  フラバス検出用プライマーが認識する塩基配列の位置関係を示す。
【図６】タラロマイセス  ウォルトマニーのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列における、タラロマイセス  ウォルトマニー検出用プライマーが認識する塩基配列の位置関係を示す。
【図７】タラロマイセス  ルテウスのβ−チューブリン遺伝子の塩基配列における、タラロマイセス  ルテウス検出用プライマーが認識する塩基配列の位置関係を示す。
【図８】タラロマイセス  フラバスの２８Ｓ  ｒＤＮＡのITS領域及びＤ１／Ｄ２領域の塩基配列における、タラロマイセス  フラバス検出用プライマーが認識する塩基配列の位置関係を示す。
【図９】タラロマイセス  トラキスパーマム及びタラロマイセス  フラバスの２８Ｓ  ｒＤＮＡのITS領域及びＤ１／Ｄ２領域の塩基配列における、タラロマイセス  トラキスパーマム及びタラロマイセス  フラバス検出用プライマーが認識する塩基配列の位置関係を示す。
【図９−１】タラロマイセス  トラキスパーマム及びタラロマイセス  フラバスの２８Ｓ  ｒＤＮＡのITS領域及びＤ１／Ｄ２領域の塩基配列における、タラロマイセス  トラキスパーマム及びタラロマイセス  フラバス検出用プライマーが認識する塩基配列の位置関係を示す（図９の続き）。
【図１０】実施例１における、リアルタイム濁度法によるビソクラミス属の菌類の２８Ｓ  ｒＤＮＡのITS領域及びＤ１／Ｄ２領域の検出感度を示す図である。１はByssochlamys  fulva  IFM48421株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、２はByssochlamys  nivea  IFM51244株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、４はTalaromyces  luteus  IFM53241株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、６はTalaromyces  wortmannii  IFM52262株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、７はNeosartorya  ficheri  IFM46945株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示す。
【図１１】実施例２における、リアルタイム濁度法によるネオサルトリア属の菌類のβ−チューブリン遺伝子の検出感度を示す図である。１はNeosartorya  ficheri  IFM46945株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、２はNeosartorya  spinosa  IFM46967株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、３はNeosartorya  glabra  IFM46949株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、４はNeosartorya  hiratsukae  IFM47036株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、５はTalaromyces  flavus  IFM42243株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、６はTalaromyces  luteus  IFM53242株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、７はTalaromyces  trachyspermus  IFM42247株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、９はByssochlamys  fulva  IFM48421株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、１１はAlternaria  alternate  IFM41348株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、１４はFusarium  oxysporium  IFM50002株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示す。
【図１１−１】実施例２における、リアルタイム濁度法によるネオサルトリア属およびアスペルギルス・フミガタスの菌類のβ−チューブリン遺伝子の検出感度を示す図である。
【図１２】実施例３における、リアルタイム濁度法によるハミゲラ属の菌類のβ−チューブリン遺伝子の検出感度を示す図である。１はHamigera  avellanea  IFM42323株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、２はHamigera  avellanea  IFM52241株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、３はHamigera  avellanea  IFM52957株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、４はByssochlamys  fulva  IFM51213株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、５はByssochlamys  nivea  IFM51245株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、６はPaecilomyces  variotii  IFM40913株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、７はPaecilomyces  variotii  IFM40915株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示す。
【図１３】実施例４における、リアルタイム濁度法によるアスペルギルス・フミガタスのβ−チューブリン遺伝子の検出感度を示す図である。１はAspergillus  fumigatus  Ａ２０９株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、２はAspergillus  fumigatus  Ａ２１３株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、３はAspergillus  fumigatus  Ａ２１５株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、６はNeosartorya  spinosa  IFM46967株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示す。
【図１４】実施例５における、リアルタイム濁度法によるタラロマイセス・フラバスのβ−チューブリン遺伝子の検出感度を示す図である。１はTalaromyces  flavus  IFM42243株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、２はTalaromyces  flavus  IFM52233株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、６はTalaromyces  trachyspermus  IFM52252株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、７はTalaromyces  wortmannii  IFM52255株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、９はByssochlamys  fulva  IFM48421株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示す。
【図１５】実施例６における、リアルタイム濁度法によるタラロマイセス・ウォルトマニーのβ−チューブリン遺伝子の検出感度を示す図である。１はTalaromyces  wortmannii  IFM52255株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、２はTalaromyces  wortmannii  IFM52262株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、３はTalaromyces  flavus  IFM42243株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、４はTalaromyces  luteus  IFM53241株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、５はTalaromyces  trachyspermus  IFM42247株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、７はByssochlamys  nivea  IFM51244株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、８はHamigera  avellanea  IFM42323株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示す。
【図１６】実施例７における、リアルタイム濁度法によるタラロマイセス・ルテウスのβ−チューブリン遺伝子の検出感度を示す図である。１はTalaromyces  luteus  IFM53242株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、２はTalaromyces  luteus  IFM53241株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、５はTalaromyces  wortmannii  IFM52262株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、８はNeosartorya  spinosa  IFM46967株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示す。
【図１７】実施例８における、リアルタイム濁度法によるタラロマイセス・フラバスおよびタラロマイセス・トラキスパーマムの２８Ｓ  ｒＤＮＡのITS領域及びＤ１／Ｄ２領域の検出感度を示す図である。１はTalaromyces  flavus  IFM42243株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、２はTalaromyces  flavus  IFM52233株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、３はTalaromyces  flavus  Ｔ３８株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、６はTalaromyces  trachyspermus  IFM42247株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、７はTalaromyces  trachyspermus  IFM52252株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、９はTalaromyces  wortmannii  IFM52255株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、１０はByssochlamys  fulva  IFM48421株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、１２はPenicillium  griseofulvum  IFM54313株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、１３はPenicillium  citirinum  IFM54314株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、１５はNeosartorya  ficheri  IFM46945株由来のゲノムＤＮＡを用いたサンプルの検出感度を示し、１６はネガティブコントロールとしてＤＷを用いたサンプルの検出感度を示す。
【図１】
0005548345.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図９−１】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１１−１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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