(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４３の配列を含む核酸配列によってコードされる重鎖可変領域、および配列番号４５の配列を含む核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む、組換え抗Ｍ２細胞外ドメイン（Ｍ２ｅ）抗体。
【請求項２】
前記配列番号４３の配列を含む核酸配列はｃＤＮＡであり、配列番号４５の配列を含む核酸配列はｃＤＮＡである、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記配列番号４３の核酸配列はｃＤＮＡであり、前記配列番号４５の核酸配列はｃＤＮＡである、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
配列番号４３の配列を含む核酸配列、および配列番号４５の配列を含む核酸配列を含む、ベクター。
【請求項５】
前記配列番号４３の配列を含む核酸配列がｃＤＮＡであり、前記配列番号４５の配列を含む核酸配列がｃＤＮＡである、請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
前記配列番号４３の核酸配列はｃＤＮＡであり、前記配列番号４５の核酸配列はｃＤＮＡである、請求項４に記載のベクター。
【請求項７】
前記ベクターは、前記核酸の発現に適切なベクターである、請求項４に記載のベクター。
【請求項８】
前記ベクターは、ウイルス、プラスミドまたはコスミドである、請求項６または７に記載のベクター。
【請求項９】
前記ウイルスは、組み換えウイルスである、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
前記ウイルスは、哺乳動物ゲノムから得られるプロモーターを含む、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
前記哺乳動物ゲノムはヒトゲノムである、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
前記ウイルスは、ウイルスまたはレトロウイルスのゲノムから得られるプロモーターを含む、請求項９に記載のベクター。
【請求項１３】
前記ウイルスまたはレトロウイルスは、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、またはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）である、請求項１２に記載のベクター。
【請求項１４】
配列番号４４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号４６の配列を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、組換え抗Ｍ２細胞外ドメイン（Ｍ２ｅ）抗体。
【請求項１５】
前記配列番号４４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域はｃＤＮＡによってコードされ、配列番号４６の配列を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域はｃＤＮＡによってコードされる、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
配列番号４４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードする核酸配列、および配列番号４６の配列を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む、ベクター。
【請求項１７】
前記配列番号４４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードする核酸配列がｃＤＮＡであり、前記配列番号４６の配列を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする核酸配列がｃＤＮＡである、請求項１６に記載のベクター。
【請求項１８】
前記配列番号４４の核酸配列はｃＤＮＡであり、前記配列番号４６の核酸配列はｃＤＮＡである、請求項１６に記載のベクター。
【請求項１９】
前記ベクターは、前記核酸の発現に適切なベクターである、請求項１６に記載のベクター。
【請求項２０】
前記ベクターは、ウイルス、プラスミドまたはコスミドである、請求項１８または１９に記載のベクター。
【請求項２１】
前記ウイルスは、組み換えウイルスである、請求項２０に記載のベクター。
【請求項２２】
前記ウイルスは、哺乳動物ゲノムから得られるプロモーターを含む、請求項２１に記載のベクター。
【請求項２３】
前記哺乳動物ゲノムはヒトゲノムである、請求項２２に記載のベクター。
【請求項２４】
前記ウイルスは、ウイルスまたはレトロウイルスのゲノムから得られるプロモーターを含む、請求項２１に記載のベクター。
【請求項２５】
前記ウイルスまたはレトロウイルスは、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、またはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）である、請求項２４に記載のベクター。
【請求項２６】
配列番号４９の配列を含む核酸配列によってコードされる重鎖可変領域、および配列番号５１の配列を含む核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域を含む、組換え抗Ｍ２細胞外ドメイン（Ｍ２ｅ）抗体。
【請求項２７】
前記配列番号４９の配列を含む核酸配列はｃＤＮＡであり、配列番号５１の配列を含む核酸配列はｃＤＮＡである、請求項２６に記載の抗体。
【請求項２８】
前記配列番号４９の核酸配列はｃＤＮＡであり、前記配列番号５１の核酸配列はｃＤＮＡである、請求項２６に記載の抗体。
【請求項２９】
配列番号４９の配列を含む核酸配列、および配列番号５１の配列を含む核酸配列を含む、ベクター。
【請求項３０】
前記配列番号４９の配列を含む核酸配列がｃＤＮＡであり、前記配列番号５１の配列を含む核酸配列がｃＤＮＡである、請求項２９に記載のベクター。
【請求項３１】
前記配列番号４９の核酸配列はｃＤＮＡであり、前記配列番号５１の核酸配列はｃＤＮＡである、請求項２９に記載のベクター。
【請求項３２】
前記ベクターは、前記核酸の発現に適切なベクターである、請求項２９に記載のベクター。
【請求項３３】
前記ベクターは、ウイルス、プラスミドまたはコスミドである、請求項３１または３２に記載のベクター。
【請求項３４】
前記ウイルスは、組み換えウイルスである、請求項３３に記載のベクター。
【請求項３５】
前記ウイルスは、哺乳動物ゲノムから得られるプロモーターを含む、請求項３４に記載のベクター。
【請求項３６】
前記哺乳動物ゲノムはヒトゲノムである、請求項３５に記載のベクター。
【請求項３７】
前記ウイルスは、ウイルスまたはレトロウイルスのゲノムから得られるプロモーターを含む、請求項３４に記載のベクター。
【請求項３８】
前記ウイルスまたはレトロウイルスは、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、またはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）である、請求項３７に記載のベクター。
【請求項３９】
配列番号５０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号５２の配列を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、組換え抗Ｍ２細胞外ドメイン（Ｍ２ｅ）抗体。
【請求項４０】
前記配列番号５０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域はｃＤＮＡによってコードされ、配列番号５２の配列を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域はｃＤＮＡによってコードされる、請求項３９に記載の抗体。
【請求項４１】
配列番号５０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードする核酸配列、および配列番号５２の配列を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする核酸配列を含む、ベクター。
【請求項４２】
前記配列番号５０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域をコードする核酸配列がｃＤＮＡであり、前記配列番号５２の配列を含むアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域をコードする核酸配列がｃＤＮＡである、請求項４１に記載のベクター。
【請求項４３】
前記配列番号５０の核酸配列はｃＤＮＡであり、前記配列番号５２の核酸配列はｃＤＮＡである、請求項４１に記載のベクター。
【請求項４４】
前記ベクターは、前記核酸の発現に適切なベクターである、請求項４１に記載のベクター。
【請求項４５】
前記ベクターは、ウイルス、プラスミドまたはコスミドである、請求項４３または４４に記載のベクター。
【請求項４６】
前記ウイルスは、組み換えウイルスである、請求項４５に記載のベクター。
【請求項４７】
前記ウイルスは、哺乳動物ゲノムから得られるプロモーターを含む、請求項４６に記載のベクター。
【請求項４８】
前記哺乳動物ゲノムはヒトゲノムである、請求項４７に記載のベクター。
【請求項４９】
前記ウイルスは、ウイルスまたはレトロウイルスのゲノムから得られるプロモーターを含む、請求項４６に記載のベクター。
【請求項５０】
前記ウイルスまたはレトロウイルスは、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、またはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）である、請求項４９に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の詳細な説明
（関連出願）
本願は、２００７年１１月１２日に出願された米国仮特許出願第６０／９８７，３５３号、２００７年１１月１２日に出願された米国仮特許出願第６０／９８７，３５５号、２００８年５月１６日に出願された米国仮特許出願第６１／０５３，８４０号、２００８年９月８日に出願された米国仮特許出願第６０／０９５，２０８号の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般に、インフルエンザ感染症の治療、診断および監視に関する。より詳細には、本発明は、インフルエンザマトリックス２タンパク質に特異的な抗体の同定方法ならびにその製造および使用に関する。そのような抗体は、インフルエンザを予防および治療するため、ならびにインフルエンザ感染症を診断および監視するための薬剤組成物において有用である。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
インフルエンザウイルスは米国において集団の５〜２０％に感染し、毎年３０，０００〜５０，０００件の死亡をもたらす。インフルエンザワクチンが主な感染予防方法であるが、４つの抗ウイルス薬、すなわち、アマンタジン、リマンタジン、オセルタミビルおよびザナミビルも米国において利用可能である。ウイルスのＭ２タンパク質中のアミノ酸置換の結果、アマンタジンおよびリマンタジン（ｒｉｍａｎｔｉｄｉｎｅ）に対するウイルスの耐性が増加しているため、２００５年１２月時点では、オセルタミビル（ＴＡＭＩＦＬＵ（商標））のみがインフルエンザＡの治療に推奨されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
インフルエンザＡウイルス感染症によって引き起こされる疾患は、その周期性の性質を特徴とする。抗原ドリフトおよびシフトにより、異なるＡ株が毎年出現することが可能となる。それに加えて、病原性の高い株が一般集団内に入ってしまう脅威により、インフルエンザ感染症の新規治療の必要性が重視されている。中和抗体の主要なものは、赤血球凝集素およびノイラミニダーゼタンパク質の多型領域に対するものである。したがって、そのような中和ＭＡｂは、１つまたは数種の株しか標的としないと推定される。近年、比較的不変のマトリックス２（Ｍ２）タンパク質が注目されている。潜在的には、Ｍ２に対する中和ＭＡｂがすべてのインフルエンザＡ株に対する適当な治療薬となるであろう。
【０００５】
Ｍ２タンパク質は、イオンチャネルを形成するホモ四量体の形で存在し、細胞内に入る際に、ウイルスの脱外被に寄与すると考えられている。感染後、Ｍ２は細胞表面で大量に見つけることができる。続いて、Ｍ２はビリオン外被内に取り込まれるが、ここではＭ２は全コートタンパク質の約２％しか構成しない。Ｍ２細胞外ドメイン（Ｍ２ｅ）は短く、アミノ末端の２〜２４個のアミノ酸が細胞外に表示される。現在までの抗Ｍ２  ＭＡｂは、この直鎖状配列に対するものである。したがって、抗Ｍ２  ＭＡｂは、ネイティブＭ２上のコンホメーション決定基を含めた、細胞によって発現されたＭ２に対する所望の結合特性を示さない場合がある。
【０００６】
したがって、当技術分野では長年にわたり、細胞によって発現されたＭ２に結合し、ネイティブＭ２上のコンホメーション決定基に結合する新しい抗体が必要性されている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、Ｍ２ｅに対して特異的である完全ヒトモノクローナル抗体を提供する。任意選択で、抗体は、ヒトドナーのＢ細胞から単離される。例示的なモノクローナル抗体には、本明細書中に記載の８ｉ１０、２１Ｂ１５および２３Ｋ１２が含まれる。あるいは、モノクローナル抗体は、８ｉ１０、２１Ｂ１５および２３Ｋ１２と同じエピトープに結合する抗体である。この抗体は、本明細書中でそれぞれｈｕＭ２ｅ抗体と呼ぶ。ｈｕＭ２ｅ抗体は、以下の特徴のうちの１つまたは複数を有する：ａ）インフルエンザウイルスのマトリックス２外部ドメイン（Ｍ２ｅ）ポリペプチドの細胞外ドメイン中のエピトープに結合する；ｂ）インフルエンザＡ感染細胞に結合する；またはｃ）インフルエンザＡウイルスに結合する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
以下の特徴を有する、単離された完全ヒトモノクローナル抗体：
ａ）インフルエンザウイルスのマトリックス２外部ドメイン（Ｍ２ｅ）ポリペプチドの細胞外ドメイン中のエピトープに結合する；
ｂ）インフルエンザＡ感染細胞に結合する；および
ｃ）インフルエンザＡウイルスに結合する。
（項目２）
ヒトドナーのＢ細胞から単離された、項目１に記載の抗体。
（項目３）
前記エピトープが非直鎖状である、項目１に記載の抗体。
（項目４）
前記エピトープが前記Ｍ２ｅポリペプチドのアミノ末端領域を含む、項目１に記載の抗体。
（項目５）
前記エピトープが前記Ｍ２ｅポリペプチドの２位、５位および６位のアミノ酸を含み、アミノ酸位置番号が配列番号１に従う、項目１に記載の抗体。
（項目６）
ａ）２位のアミノ酸がセリンであり；
ｂ）５位のアミノ酸がスレオニンであり；
ｃ）６位のアミノ酸がグルタミン酸である、
項目４に記載の抗体。
（項目７）
前記エピトープがアミノ酸配列ＳＬＬＴＥＶ（配列番号４２）を完全にまたは部分的に含む、項目１に記載の抗体。
（項目８）
８Ｉ１０、２１Ｂ１５または２３Ｋ１２である、項目１に記載の抗体。
（項目９）
８Ｉ１０、２１Ｂ１５または２３Ｋ１２と同じエピトープに結合する抗体。
（項目１０）
ＣＤＲ１およびＣＤＲ２を含む可変重鎖（ＶＨ）領域を含み、前記領域がヒトＩＧＨＶ４もしくはＩＧＨＶ３ＶＨ生殖系列配列、または前記ＶＨ生殖系列遺伝子配列と相同である核酸配列によってコードされる、単離された完全ヒトモノクローナル抗Ｍ２ｅ抗体またはその断片。
（項目１１）
前記生殖系列配列と相同である前記核酸配列が、前記生殖系列配列と少なくとも９０％相同である、項目１０に記載の抗体。
（項目１２）
ヒトＩＧＨＫ１ＶＬ生殖系列遺伝子配列、または前記ＶＬ生殖系列遺伝子配列と相同であるヌクレオチド酸配列によってコードされる可変軽鎖（ＶＬ）領域をさらに含む、項目１０に記載の抗体。
（項目１３）
前記ＩＧＨＶ１ＶＬ生殖系列配列と相同である前記核酸配列が、前記ＩＧＨＶ１ＶＬ生殖系列配列と少なくとも９０％相同である、項目１２に記載の抗体。
（項目１４）
ＮＹＹＷＳ（配列番号７２）、ＦＩＹＹＧＧＮＴＫＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号７４）、ＡＳＣＳＧＧＹＣＩＬＤ（配列番号７６）、ＳＮＹＭＳ（配列番号１０３）、ＶＩＹＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫ（配列番号１０５）、およびＣＬＳＲＭＲＧＹＧＬＤＶ（配列番号１０７）のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖、ならびにＲＡＳＱＮＩＹＫＹＬＮ（配列番号５９）、ＡＡＳＧＬＱＳ（配列番号６１）、ＱＱＳＹＳＰＰＬＴ（配列番号６３）、ＲＴＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号９２）、ＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦ（配列番号９４）、およびＱＱＳＹＳＭＰＡ（配列番号９６）のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖を有する、単離された抗マトリックス２外部ドメイン（Ｍ２ｅ）抗体。
（項目１５）
ＮＹＹＷＳ（配列番号７２）、ＦＩＹＹＧＧＮＴＫＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号７４）、ＡＳＣＳＧＧＹＣＩＬＤ（配列番号７６）、ＳＮＹＭＳ（配列番号１０３）、ＶＩＹＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫ（配列番号１０５）、およびＣＬＳＲＭＲＧＹＧＬＤＶ（配列番号１０７）のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖を有し、Ｍ２ｅに結合する、単離された抗マトリックス２外部ドメイン（Ｍ２ｅ）抗体。
（項目１６）
ＲＡＳＱＮＩＹＫＹＬＮ（配列番号５９）、ＡＡＳＧＬＱＳ（配列番号６１）、ＱＱＳＹＳＰＰＬＴ（配列番号６３）、ＲＴＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号９２）、ＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦ（配列番号９４）、およびＱＱＳＹＳＭＰＡ（配列番号９６）のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖を有し、Ｍ２ｅに結合する、単離された抗マトリックス２外部ドメイン（Ｍ２ｅ）抗体。
（項目１７）
ＮＹＹＷＳ（配列番号７２）、ＦＩＹＹＧＧＮＴＫＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号７４）、およびＡＳＣＳＧＧＹＣＩＬＤ（配列番号７６）のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖、ならびにＲＡＳＱＮＩＹＫＹＬＮ（配列番号５９）、ＡＡＳＧＬＱＳ（配列番号６１）、およびＱＱＳＹＳＰＰＬＴ（配列番号６３）のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖を有する、単離された抗マトリックス２外部ドメイン（Ｍ２ｅ）抗体。
（項目１８）
ＮＹＹＷＳ（配列番号７２）のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１領域；ＦＩＹＹＧＧＮＴＫＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号７４）のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２領域；ＡＳＣＳＧＧＹＣＩＬＤ（配列番号７６）のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３領域；ＲＡＳＱＮＩＹＫＹＬＮ（配列番号５９）のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１領域；ＡＡＳＧＬＱＳ（配列番号６１）のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２領域；ＱＱＳＹＳＰＰＬＴ（配列番号６３）のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３領域を含む、単離された抗マトリックス２外部ドメイン（Ｍ２ｅ）抗体。
（項目１９）
ＳＮＹＭＳ（配列番号１０３）、ＶＩＹＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫ（配列番号１０５）、およびＣＬＳＲＭＲＧＹＧＬＤＶ（配列番号１０７）のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する重鎖、ならびにＲＴＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号９２）、ＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦ（配列番号９４）、およびＱＱＳＹＳＭＰＡ（配列番号９６）のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する軽鎖を有する、単離された抗マトリックス２外部ドメイン（Ｍ２ｅ）抗体。
（項目２０）
ＳＮＹＭＳ（配列番号１０３）のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１領域；ＶＩＹＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫ（配列番号１０５）のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２領域、ＣＬＳＲＭＲＧＹＧＬＤＶ（配列番号１０７）のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１領域；ＲＴＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号９２）のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１領域；ＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦ（配列番号９４）のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２領域；およびＱＱＳＹＳＭＰＡ（配列番号９６）のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３領域を含む、単離された抗マトリックス２外部ドメイン（Ｍ２ｅ）抗体。
（項目２１）
（ａ）配列番号７２または１０３のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ１領域；
（ｂ）配列番号７４または１０５のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ２領域；および
（ｃ）配列番号７６または１０７のアミノ酸配列を含むＶＨＣＤＲ３領域
を含み、Ｍ２ｅに結合する、単離された抗マトリックス２外部ドメイン（Ｍ２ｅ）抗体またはその断片。
（項目２２）
（ａ）配列番号５９または９２のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ１領域；
（ｂ）配列番号６１または９４のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ２領域；および
（ｃ）配列番号６３または９６のアミノ酸配列を含むＶＬＣＤＲ３領域
をさらに含む、項目２１に記載の抗体。
（項目２３）
ａ）配列番号４４のアミノ酸配列を含む重鎖配列および配列番号４６のアミノ酸配列を含む軽鎖配列、または
ｂ）配列番号５０のアミノ酸配列を含む重鎖配列および配列番号５２のアミノ酸配列を含む軽鎖配列
を含む、単離された完全ヒトモノクローナル抗マトリックス２外部ドメイン（Ｍ２ｅ）抗体。
（項目２４）
項目１に記載の抗体を含む組成物。
（項目２５）
抗ウイルス薬、ウイルス進入阻害剤またはウイルス付着阻害剤をさらに含む、項目２４に記載の組成物。
（項目２６）
前記抗ウイルス薬が、ノイラミニダーゼ阻害剤、ＨＡ阻害剤、シアル酸阻害剤またはＭ２イオンチャネル阻害剤である、項目２５に記載の組成物。
（項目２７）
前記Ｍ２イオンチャネル阻害剤が、アマンタジンまたはリマンタジンである、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記ノイラミニダーゼ阻害剤が、ザナミビルまたはリン酸オセルタミビルである、項目２６に記載の方法。
（項目２９）
第２の抗インフルエンザＡ抗体をさらに含む、項目２４に記載の組成物。
（項目３０）
治療剤または検出可能な標識と作動可能に連結している、項目１に記載の抗体。
（項目３１）
患者に項目２４に記載の組成物を投与するステップを含む、被験体における免疫応答を刺激する方法。
（項目３２）
被験体に項目２４に記載の組成物を投与するステップを含む、前記被験体においてインフルエンザウイルス感染症を治療または予防する方法。
（項目３３）
抗ウイルス薬、ウイルス進入阻害剤またはウイルス付着阻害剤を投与するステップをさらに含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記抗ウイルス薬が、ノイラミニダーゼ阻害剤、ＨＡ阻害剤、シアル酸阻害剤またはＭ２イオンチャネルである、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
前記Ｍ２イオンチャネル阻害剤が、アマンタジンまたはリマンタジンである、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記ノイラミニダーゼ阻害剤が、ザナミビルまたはリン酸オセルタミビルである、項目３４に記載の方法。
（項目３７）
第２の抗インフルエンザＡ抗体をさらに含む、項目３２に記載の組成物。
（項目３８）
前記抗体を、インフルエンザウイルスに曝される前またはその後に投与する、項目３２に記載の方法。
（項目３９）
前記抗体を、ウイルス排除を促進する、またはインフルエンザＡ感染細胞を排除するために十分な用量で投与する、項目３２に記載の方法。
（項目４０）
患者においてインフルエンザウイルス感染の存在を決定する方法であって、
（ａ）前記患者から得た生物試料を項目１に記載の抗体と接触させるステップ；
（ｂ）前記生物試料に結合する前記抗体の量を検出するステップ；および
（ｃ）前記生物試料に結合する抗体の量を対照値と比較し、それから前記患者における前記インフルエンザウイルスの存在を決定するステップ
を含む方法。
（項目４１）
項目１に記載の抗体を含む診断キット。
【０００８】
ｈｕＭ２ｅ抗体が結合するエピトープは、Ｍ２ポリペプチドの非直鎖状エピトープである。好ましくは、エピトープは、Ｍ２ｅポリペプチドのアミノ末端領域を含む。より好ましくは、エピトープは、アミノ酸配列ＳＬＬＴＥＶ（配列番号４２）を完全にまたは部分的に含む。最も好ましくは、エピトープは、配列番号１に従う番号付けにより、Ｍ２ｅポリペプチドの２位、５位および６位のアミノ酸を含む。２位のアミノ酸はセリンであり、５位のアミノ酸はスレオニンであり、６位のアミノ酸はグルタミン酸である。
【０００９】
ｈｕＭ２ｅ抗体は、配列番号４４または５０のアミノ酸配列を有する重鎖可変および配列番号４６または５２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変を含む。好ましくは、３つの重鎖ＣＤＲは、ＮＹＹＷＳ（配列番号７２）、ＦＩＹＹＧＧＮＴＫＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号７４）、ＡＳＣＳＧＧＹＣＩＬＤ（配列番号７６）、ＳＮＹＭＳ（配列番号１０３）、ＶＩＹＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫ（配列番号１０５）、ＣＬＳＲＭＲＧＹＧＬＤＶ（配列番号１０７）（Ｋａｂａｔ方法によって決定）またはＡＳＣＳＧＧＹＣＩＬＤ（配列番号７６）、ＣＬＳＲＭＲＧＹＧＬＤＶ（配列番号１０７）、ＧＳＳＩＳＮ（配列番号１０９）、ＦＩＹＹＧＧＮＴＫ（配列番号１１０）、ＧＳＳＩＳＮ（配列番号１１１）、ＧＦＴＶＳＳＮ（配列番号１１２）、ＶＩＹＳＧＧＳＴＹ（配列番号１１３）（Ｃｈｏｔｈｉａ方法によって決定）のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含み、軽鎖は、ＲＡＳＱＮＩＹＫＹＬＮ（配列番号５９）、ＡＡＳＧＬＱＳ（配列番号６１）、ＱＱＳＹＳＰＰＬＴ（配列番号６３）、ＲＴＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号９２）、ＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦ（配列番号９４）、ＱＱＳＹＳＭＰＡ（配列番号９６）（Ｋａｂａｔ方法によって決定）またはＲＡＳＱＮＩＹＫＹＬＮ（配列番号５９）、ＡＡＳＧＬＱＳ（配列番号６１）、ＱＱＳＹＳＰＰＬＴ（配列番号６３）、ＲＴＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号９２）、ＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦ（配列番号９４）、ＱＱＳＹＳＭＰＡ（配列番号９６）（Ｃｈｏｔｈｉａ方法によって決定）のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一であるアミノ酸配列を含む３つのＣＤＲを有する。抗体はＭ２ｅに結合する。
【００１０】
Ｍ２ｅ抗体の重鎖は、例えばＩｇＨＶ４またはＩｇＨＶ３生殖系列遺伝子などの生殖系列Ｖ（可変）遺伝子に由来する。
【００１１】
本発明のＭ２ｅ抗体は、ヒトＩｇＨＶ４またはＩｇＨＶ３生殖系列遺伝子配列によってコードされる可変重鎖（ＶＨ）領域を含む。ＩｇＨＶ４生殖系列遺伝子配列は、例えば、受託番号Ｌ１００８８、Ｍ２９８１２、Ｍ９５１１４、Ｘ５６３６０およびＭ９５１１７として示される。ＩｇＨＶ３生殖系列遺伝子配列は、例えば、受託番号Ｘ９２２１８、Ｘ７０２０８、Ｚ２７５０４、Ｍ９９６７９およびＡＢ０１９４３７として示される。本発明のＭ２ｅ抗体は、ＩｇＨＶ４またはＩｇＨＶ３生殖系列遺伝子配列と少なくとも８０％相同である核酸配列によってコードされるＶＨ領域を含む。好ましくは、核酸配列は、ＩｇＨＶ４またはＩｇＨＶ３生殖系列遺伝子配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％相同であり、より好ましくは、ＩｇＨＶ４またはＩｇＨＶ３生殖系列遺伝子配列と少なくとも９８％、９９％相同である。Ｍ２ｅ抗体のＶＨ領域は、ＩｇＨＶ４またはＩｇＨＶ３  ＶＨ生殖系列遺伝子配列によってコードされるＶＨ領域のアミノ酸配列と少なくとも８０％相同である。好ましくは、Ｍ２ｅ抗体のＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＩｇＨＶ４またはＩｇＨＶ３生殖系列遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％相同であり、より好ましくは、ＩｇＨＶ４またはＩｇＨＶ３生殖系列遺伝子配列によってコードされる配列と少なくとも９８％、９９％相同である。
【００１２】
また、本発明のＭ２ｅ抗体は、ヒトＩｇＫＶ１生殖系列遺伝子配列によってコードされる可変軽鎖（ＶＬ）領域も含む。ヒトＩｇＫＶ１  ＶＬ生殖系列遺伝子配列は、例えば、受託番号Ｘ５９３１５、Ｘ５９３１２、Ｘ５９３１８、Ｊ００２４８、およびＹ１４８６５に示されている。あるいは、Ｍ２ｅ抗体は、ＩｇＫＶ１生殖系列遺伝子配列と少なくとも８０％相同である核酸配列によってコードされるＶＬ領域を含む。好ましくは、核酸配列は、ＩｇＫＶ１生殖系列遺伝子配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％相同であり、より好ましくは、ＩｇＫＶ１生殖系列遺伝子配列と少なくとも９８％、９９％相同である。Ｍ２ｅ抗体のＶＬ領域は、ＩｇＫＶ１生殖系列遺伝子配列によってコードされるＶＬ領域のアミノ酸配列と少なくとも８０％相同である。好ましくは、Ｍ２ｅ抗体のＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＩｇＫＶ１生殖系列遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％相同であり、より好ましくは、ＩｇＫＶ１生殖系列遺伝子配列によってコードされる配列と少なくとも９８％、９９％相同である。
【００１３】
別の態様では、本発明は、本発明によるｈｕＭ２ｅ抗体を含む組成物を提供する。様々な態様では、この組成物は、抗ウイルス薬、ウイルス進入阻害剤またはウイルス付着阻害剤をさらに含む。抗ウイルス薬は、例えば、ノイラミニダーゼ阻害剤、ＨＡ阻害剤、シアル酸阻害剤またはＭ２イオンチャネル阻害剤である。Ｍ２イオンチャネル阻害剤は、例えば、アマンタジンまたはリマンタジンである。ノイラミニダーゼ阻害剤は、例えば、ザナミビル、またはリン酸オセルタミビルである。さらなる態様では、この組成物は、第２の抗インフルエンザＡ抗体をさらに含む。
【００１４】
さらなる態様では、本発明によるｈｕＭ２ｅ抗体は、治療剤または検出可能な標識と作動可能に連結している。
【００１５】
さらに、本発明は、ｈｕＭ２ｅ抗体を被験体に投与することによって、免疫応答を刺激し、インフルエンザウイルス感染症の症状を治療し、予防し、または緩和する方法を提供する。
【００１６】
任意選択で、被験体に、それだけには限定されないが、インフルエンザウイルス抗体、抗ウイルス薬（ノイラミニダーゼ阻害剤、ＨＡ阻害剤、シアル酸阻害剤もしくはＭ２イオンチャネル阻害剤など）、ウイルス進入阻害剤またはウイルス付着阻害剤等の第２の薬剤をさらに投与する。Ｍ２イオンチャネル阻害剤は、例えば、アマンタジンまたはリマンタジンである。ノイラミニダーゼ阻害剤は、例えば、ザナミビル、またはリン酸オセルタミビルである。被験体は、例えば自己免疫疾患または炎症性障害など、インフルエンザウイルス感染症を患っているか、またはそれを発症する素因がある。
【００１７】
別の態様では、本発明は、インフルエンザウイルスに曝される前および／またはその後に、被験体に本発明のｈｕＭ２ｅ抗体を投与する方法を提供する。例えば、本発明のｈｕＭ２ｅ抗体を用いて、拒絶インフルエンザ感染症を治療または予防する。ｈｕＭ２ｅ抗体は、ウイルス排除を促進する、またはインフルエンザＡ感染細胞を排除するために十分な用量で投与する。
【００１８】
また、本発明は、患者から得た生物試料をｈｕｍＭ２ｅ抗体と接触させること；前記生物試料に結合する前記抗体の量を検出すること；前記生物試料に結合する抗体の量を対照値と比較することによる、患者中におけるインフルエンザウイルス感染の存在を決定する方法も含む。
【００１９】
本発明はさらに、ｈｕＭ２ｅ抗体を含む診断キットを提供する。
【００２０】
本発明の他の特長および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであり、それに包含される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】遊離のＭ２ペプチドの有無における、Ｍ２発現構築体または対照ベクターをトランスフェクトした２９３−ＨＥＫ細胞に対する本発明の３種の抗体、および対照ｈｕ１４Ｃ２抗体の結合を示す写真である。
【図２Ａ】インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３２に結合するヒトモノクローナル抗体を示すグラフである。
【図２Ｂ】インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３２に結合するヒトモノクローナル抗体を示すグラフである。
【図３Ａ】Ｍ２変異体の細胞外ドメインのアミノ酸配列を示す表である。
【図３Ｂ】図３Ａに示されるＭ２変異体に結合するヒトモノクローナル抗インフルエンザ抗体の結合を示す棒グラフである。
【図３Ｃ】図３Ａに示されるＭ２変異体に結合するヒトモノクローナル抗インフルエンザ抗体の結合を示す棒グラフである。
【図４Ａ】アラニンスキャニング突然変異誘発に供されたＭ２ペプチドに結合するヒトモノクローナル抗インフルエンザ抗体の結合を示す棒グラフである。
【図４Ｂ】アラニンスキャニング突然変異誘発に供されたＭ２ペプチドに結合するヒトモノクローナル抗インフルエンザ抗体の結合を示す棒グラフである。
【図５】ＣＨＯ細胞株であるＤＧ４４において安定に発現されたインフルエンザ株Ａ／ＨＫ／４８３／１９９７配列を表すＭ２タンパクへのＭＡｂ  ８ｉ１０および２３Ｋ１２の結合を示す一連の棒グラフである。
【図６Ａ】変異Ｍ２ペプチドへの抗Ｍ２抗体の交差反応結合を示す表である。
【図６Ｂ】短縮型Ｍ２ペプチドへのＭ２抗体の結合活性を示す表である。
【図７】ヒト抗インフルエンザモノクローナル抗体で処置されたインフルエンザ感染マウスの生存を示すグラフである。
【図８】抗Ｍ２抗体がＭ２ｅのＮ末端の高度に保存された領域に結合することを示す説明図である。
【図９】粗製上清からの抗Ｍ２ｒＨＭＡｂクローンがＥＬＩＳＡ上でインフルエンザに結合し、一方、対照の抗Ｍ２ｅ  ｍＡｂ  １４Ｃ２は容易にウイルスに結合しなかったことを示すグラフである。
【図１０】抗Ｍ２ｒＨＭＡｂがインフルエンザ感染細胞に結合したことを示す一連の写真である。ＭＤＣＫ細胞は、インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３２に感染させたかまたは感染させなかった。２４時間後に粗製上清からのＡｂ結合を試験した。データはＦＭＡＴプレートスキャナーから収集した。
【図１１】粗製上清からの抗Ｍ２ｒＨＭＡｂクローンがインフルエンザのサブタイプであるＨ３Ｎ２、ＨＫ４８３、およびＶＮ１２０３  Ｍ２タンパク質をトランスフェクトした細胞に結合したことを示すグラフである。インフルエンザ株であるＨ３Ｎ２、ＨＫ４８３、およびＶＮ１２０３に対応する完全長Ｍ２  ｃＤＮＡをコードするプラスミド、ならびに空の（モック）プラスミド対照を２９３細胞に一過性にトランスフェクトした。１４Ｃ２、８ｉ１０、２３Ｋ１２、および２１Ｂ１５  ｍＡＢはトランスフェクタントへの結合について試験され、ＡＦ６４７をコンジュゲートした抗ヒトＩｇＧ二次抗体を用いて検出された。ＦＡＣＳ分析後の特異的なｍＡＢ結合の平均蛍光強度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
（実施形態の説明）
（詳細な説明）
本発明は、マトリックス２（Ｍ２）ポリペプチドの細胞外ドメインに対して特異的な完全ヒトモノクローナル抗体を提供する。この抗体は、本明細書中でそれぞれｈｕＭ２ｅ抗体と呼ぶ。
【００２３】
Ｍ２とは、インフルエンザウイルスおよびウイルス感染した細胞の表面上にホモ四量体として存在する、９６個のアミノ酸の膜貫通タンパク質である。Ｍ２は、インフルエンザＡ株全体にわたって高度に保存されている２３個のアミノ酸の外部ドメイン（Ｍ２ｅ）を含む。１９１８年に流行した株以降はわずかなアミノ酸変化しか起こっておらず、したがって、Ｍ２ｅはインフルエンザ治療の魅力的な標的である。以前の研究では、Ｍ２ｅの直鎖状配列に対応するペプチドを用いて免疫化して、Ｍ２外部ドメイン（Ｍ２ｅ）に特異的なモノクローナル抗体を誘導していた。対照的に、本発明は、完全長Ｍ２を細胞系内で発現させ、これにより、この細胞によって発現されたＭ２ｅに結合したヒト抗体の同定が可能となる新規プロセスを提供する。ｈｕＭ２ｅ抗体は、Ｍ２をトランスフェクトした細胞上のコンホメーション決定基、ならびにインフルエンザ感染細胞上またはウイルス自体上のネイティブＭ２に結合することが示されている。ｈｕＭ２ｅ抗体は、直鎖状Ｍ２ｅペプチドには結合しなかったが、やはり細胞系内へのｃＤＮＡのトランスフェクトによって発現される、いくつかの天然のＭ２変異体には結合する。したがって、本発明は、非常に幅広い範囲のインフルエンザＡウイルス株に対して新規の特異性を示す、ヒトモノクローナル抗体の同定および産生を可能にする。これらの抗体は、インフルエンザＡ感染症を同定するために診断的に、かつインフルエンザＡ感染症を治療するために治療的に使用し得る。
【００２４】
本発明のｈｕＭ２ｅ抗体は、以下の特徴のうちの１つまたは複数を有する：ｈｕＭ２ｅ抗体は、ａ）インフルエンザウイルスのマトリックス２（Ｍ２）ポリペプチドの細胞外ドメイン中のエピトープに結合する；ｂ）インフルエンザＡ感染細胞に結合する；および／またはｃ）インフルエンザＡウイルス（すなわちバイロン（ｖｉｒｏｎ））に結合する。本発明のｈｕＭ２ｅ抗体は、ＡＤＣＣなどの免疫エフェクター機構によってインフルエンザ感染細胞を排除し、インフルエンザバイロンに結合することによって直接のウイルス排除を促進する。本発明のｈｕＭ２ｅ抗体は、Ｍ２ｅポリペプチドのアミノ末端領域に結合する。好ましくは、本発明のｈｕＭ２ｅ抗体は、Ｎ末端のメチオニン残基が存在しないＭ２ｅポリペプチドのアミノ末端領域に結合する。例示的なＭ２ｅ配列には、以下の表Ｉに記載の配列が含まれる。
【００２５】
【表１】
0005623332.tif 000002
一実施形態では、本発明のｈｕＭ２ｅ抗体、配列番号１に従う番号付けにより、Ｍ２ｅの２位〜７位のアミノ酸残基を完全にまたは部分的に含むＭ２ｅに結合する。例えば、本発明のｈｕＭ２ｅ抗体は、アミノ酸配列ＳＬＬＴＥＶＥＴ（配列番号４１）に完全にまたは部分的に結合し、最も好ましくは、本発明のｈｕＭ２ｅ抗体は、アミノ酸配列ＳＬＬＴＥＶ（配列番号４２）に完全にまたは部分的に結合し、好ましくは、本発明のｈｕＭ２ｅ抗体は、Ｍ２ｅタンパク質の非直鎖状エピトープに結合する。例えば、ｈｕＭ２ｅ抗体は、配列番号１に従う番号付けにより、Ｍ２ｅポリペプチドの２位、５位および６位を含むエピトープに結合し、ａ）２位のアミノ酸はセリンであり；ｂ）５位のアミノ酸はスレオニンであり；ｃ）６位のアミノ酸はグルタミン酸である。このエピトープに結合する例示的なｈｕＭ２ｅモノクローナル抗体は、本明細書中に記載の８Ｉ１０、２１Ｂ１５または２３Ｋ１２抗体である。
【００２６】
８Ｉ１０抗体は、以下の配列番号４３に示す核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号４４）、および配列番号４５に示す核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号４６）を含む。
【００２７】
以下の配列中で、Ｃｈｏｔｈｉａ，  Ｃ．ら（１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ、３４２巻：８７７〜８８３頁）によって定義されるＣＤＲを包含するアミノ酸に下線を引き、Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．ら（１９９１年、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、９１〜３２４２号、Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｔｈ  ａｎｄ
Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ．）によって定義されるＣＤＲを太字で強調する。
【００２８】
８Ｉ１０抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＮＹＹＷＳ（配列番号７２）、ＦＩＹＹＧＧＮＴＫＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号７４）およびＡＳＣＳＧＧＹＣＩＬＤ（配列番号７６）。８Ｉ１０抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＮＩＹＫＹＬＮ（配列番号５９）、ＡＡＳＧＬＱＳ（配列番号６１）およびＱＱＳＹＳＰＰＬＴ（配列番号６３）。
【００２９】
８Ｉ１０抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＧＳＳＩＳＮ（配列番号１０９）、ＦＩＹＹＧＧＮＴＫ（配列番号１１０）およびＡＳＣＳＧＧＹＣＩＬＤ（配列番号７６）。８Ｉ１０抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＮＩＹＫＹＬＮ（配列番号５９）、ＡＡＳＧＬＱＳ（配列番号６１）およびＱＱＳＹＳＰＰＬＴ（配列番号６３）。
【００３０】
＞８Ｉ１０  ＶＨヌクレオチド配列：（配列番号４３）
【００３１】
【化１】
0005623332.tif 000003
＞８Ｉ１０  ＶＨアミノ酸配列：（配列番号４４）
Ｋａｂａｔは太字、Ｃｈｏｔｈｉａは下線
【００３２】
【化２】
0005623332.tif 000004
＞８Ｉ１０  ＶＬヌクレオチド配列：（配列番号４５）
【００３３】
【化３】
0005623332.tif 000005
＞８Ｉ１０  ＶＬアミノ酸配列：（配列番号４６）
Ｋａｂａｔは太字、Ｃｈｏｔｈｉａは下線
【００３４】
【化４】
0005623332.tif 000006
２１Ｂ１５抗体は、以下の配列番号４７に示す核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号４４）、および配列番号４８に示す核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号４６）を含む抗体を含む。
【００３５】
以下の配列中で、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年によって定義されるＣＤＲを包含するアミノ酸に下線を引き、Ｋａｂａｔら、１９９１年によって定義されるＣＤＲを太字で強調する。
【００３６】
２１Ｂ１５抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＮＹＹＷＳ（配列番号７２）、ＦＩＹＹＧＧＮＴＫＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号７４）およびＡＳＣＳＧＧＹＣＩＬＤ（配列番号７６）。２１Ｂ１５抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＮＩＹＫＹＬＮ（配列番号５９）、ＡＡＳＧＬＱＳ（配列番号６１）およびＱＱＳＹＳＰＰＬＴ（配列番号６３）。
【００３７】
２１Ｂ１５抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＧＳＳＩＳＮ（配列番号１１１）、ＦＩＹＹＧＧＮＴＫ（配列番号１１０）およびＡＳＣＳＧＧＹＣＩＬＤ（配列番号７６）。２１Ｂ１５抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＲＡＳＱＮＩＹＫＹＬＮ（配列番号５９）、ＡＡＳＧＬＱＳ（配列番号６１）およびＱＱＳＹＳＰＰＬＴ（配列番号６３）。
【００３８】
＞２１Ｂ１５  ＶＨヌクレオチド配列：（配列番号４７）
【００３９】
【化５】
0005623332.tif 000007
＞２１Ｂ１５  ＶＨアミノ酸配列：（配列番号４４）
Ｋａｂａｔは太字、Ｃｈｏｔｈｉａは下線
【００４０】
【化６】
0005623332.tif 000008
＞２１Ｂ１５  ＶＬヌクレオチド配列：（配列番号４８）
【００４１】
【化７】
0005623332.tif 000009
＞２１Ｂ１５  ＶＬアミノ酸配列：（配列番号４６）
Ｋａｂａｔは太字、Ｃｈｏｔｈｉａは下線
【００４２】
【化８】
0005623332.tif 000010
２３Ｋ１２抗体は、以下の配列番号４９に示す核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号５０）、および配列番号５１に示す核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号５２）を含む抗体を含む。
【００４３】
以下の配列中で、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９年によって定義されるＣＤＲを包含するアミノ酸に下線を引き、Ｋａｂａｔら、１９９１年によって定義されるＣＤＲを太字で強調する。
【００４４】
２３Ｋ１２抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＳＮＹＭＳ（配列番号１０３）、ＶＩＹＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫ（配列番号１０５）およびＣＬＳＲＭＲＧＹＧＬＤＶ（配列番号１０７）。２３Ｋ１２抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ定義に従った以下の配列を有する：ＲＴＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号９２）、ＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦ（配列番号９４）およびＱＱＳＹＳＭＰＡ（配列番号９６）。
【００４５】
２３Ｋ１２抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＧＦＴＶＳＳＮ（配列番号１１２）、ＶＩＹＳＧＧＳＴＹ（配列番号１１３）およびＣＬＳＲＭＲＧＹＧＬＤＶ（配列番号１０７）。２３Ｋ１２抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ定義に従った以下の配列を有する：ＲＴＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号９２）、ＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦ（配列番号９４）およびＱＱＳＹＳＭＰＡ（配列番号９６）。
【００４６】
＞２３Ｋ１２  ＶＨヌクレオチド配列：（配列番号４９）
【００４７】
【化９】
0005623332.tif 000011
＞２３Ｋ１２  ＶＨアミノ酸配列：（配列番号５０）
Ｋａｂａｔは太字、Ｃｈｏｔｈｉａは下線
【００４８】
【化１０】
0005623332.tif 000012
＞２３Ｋ１２  ＶＬヌクレオチド配列：（配列番号５１）
【００４９】
【化１１】
0005623332.tif 000013
＞２３Ｋ１２  ＶＬアミノ酸配列：（配列番号５２）
Ｋａｂａｔは太字、Ｃｈｏｔｈｉａは下線
【００５０】
【化１２】
0005623332.tif 000014
また、本発明のｈｕＭ２ｅ抗体には、配列番号４４または４９のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超えて同一である重鎖可変アミノ酸配列、および／または配列番号４６または５２のアミノ酸配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれを超えて同一である軽鎖可変アミノ酸を含む抗体も含まれる。
【００５１】
あるいは、モノクローナル抗体は、８Ｉ１０、２１Ｂ１５または２３Ｋ１２と同じエピトープに結合する抗体である。
【００５２】
Ｍ２ｅ抗体の重鎖は、例えばＩｇＨＶ４またはＩｇＨＶ３生殖系列遺伝子などの生殖系列Ｖ（可変）遺伝子に由来する。
【００５３】
本発明のＭ２ｅ抗体は、ヒトＩｇＨＶ４またはＩｇＨＶ３生殖系列遺伝子配列によってコードされる可変重鎖（ＶＨ）領域を含む。ＩｇＨＶ４生殖系列遺伝子配列は、例えば、受託番号Ｌ１００８８、Ｍ２９８１２、Ｍ９５１１４、Ｘ５６３６０およびＭ９５１１７に示されている。ＩｇＨＶ３生殖系列遺伝子配列は、例えば、受託番号Ｘ９２２１８、Ｘ７０２０８、Ｚ２７５０４、Ｍ９９６７９およびＡＢ０１９４３７に示されている。本発明のＭ２ｅ抗体は、ＩｇＨＶ４またはＩｇＨＶ３生殖系列遺伝子配列と少なくとも８０％相同である核酸配列によってコードされるＶＨ領域を含む。好ましくは、核酸配列は、ＩｇＨＶ４またはＩｇＨＶ３生殖系列遺伝子配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％相同であり、より好ましくは、ＩｇＨＶ４またはＩｇＨＶ３生殖系列遺伝子配列と少なくとも９８％、９９％相同である。Ｍ２ｅ抗体のＶＨ領域は、ＩｇＨＶ４またはＩｇＨＶ３  ＶＨ生殖系列遺伝子配列によってコードされるＶＨ領域のアミノ酸配列と少なくとも８０％相同である。好ましくは、Ｍ２ｅ抗体のＶＨ領域のアミノ酸配列は、ＩｇＨＶ４またはＩｇＨＶ３生殖系列遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％相同であり、より好ましくは、ＩｇＨＶ４またはＩｇＨＶ３生殖系列遺伝子配列によってコードされる配列と少なくとも９８％、９９％相同である。
【００５４】
また、本発明のＭ２ｅ抗体は、ヒトＩｇＫＶ１生殖系列遺伝子配列によってコードされる可変軽鎖（ＶＬ）領域も含む。ヒトＩｇＫＶ１  ＶＬ生殖系列遺伝子配列は、例えば、受託番号Ｘ５９３１５、Ｘ５９３１２、Ｘ５９３１８、Ｊ００２４８、およびＹ１４８６５に示されている。あるいは、Ｍ２ｅ抗体は、ＩｇＫＶ１生殖系列遺伝子配列と少なくとも８０％相同である核酸配列によってコードされるＶＬ領域を含む。好ましくは、核酸配列は、ＩｇＫＶ１生殖系列遺伝子配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％相同であり、より好ましくは、ＩｇＫＶ１生殖系列遺伝子配列と少なくとも９８％、９９％相同である。Ｍ２ｅ抗体のＶＬ領域は、ＩｇＫＶ１生殖系列遺伝子配列によってコードされるＶＬ領域のアミノ酸配列と少なくとも８０％相同である。好ましくは、Ｍ２ｅ抗体のＶＬ領域のアミノ酸配列は、ＩｇＫＶ１生殖系列遺伝子配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％相同であり、より好ましくは、ＩｇＫＶ１生殖系列遺伝子配列によってコードされる配列と少なくとも９８％、９９％相同である。
【００５５】
別段に定義しない限りは、本発明に関連して使用する科学用語および技術用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を持つ。さらに、コンテキストによって別段に必要とされない限りは、単数形の用語には複数形も含まれ、複数形の用語には単数形も含まれる。一般に、本明細書中に記載の細胞や組織培養、分子生物学、およびタンパク質やオリゴ−またはポリヌクレオチド化学ならびにハイブリダイゼーションに関連して、またその技術に関連して利用する用語は、当技術分野で周知かつ一般的に使用されているものである。組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換（例えば、電気穿孔、リポフェクション）には標準の技術を用いる。酵素反応および精製技術は、製造者の仕様書に従って、または当技術分野で一般的に行うようにもしくは本明細書中に記載のように行う。本発明の実施では、そうでないと具体的に指定しない限りは、当技術分野の技術範囲内にあるウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学および組換えＤＮＡ技術の慣用方法を用い、その多くは、例示目的のために以下に記載されている。そのような技術は文献中に完全に記載されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９年）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２年）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、第ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．  Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．  Ｇａｉｔ編、１９８４年）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．  Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８５年）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．  Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．  Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６年）；Ｐｅｒｂａｌ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４年）を参照されたい。
【００５６】
本明細書中に記載の分析化学、合成有機化学、ならびに医薬および製薬化学に関連して、またその実験室手順および技術に関連して利用する用語は、当技術分野で周知かつ一般的に使用されているものである。化学合成、化学分析、製薬の調製、調合、および送達、ならびに患者の治療には標準の技術を用いる。
【００５７】
本発明の理解には以下の定義が有用である。
【００５８】
本明細書中で使用する用語「抗体」（Ａｂ）は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および所望の生物活性を示す限り抗体断片を含む。用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）とは、本明細書中で「抗体」と互換性があるように使用する。
【００５９】
「単離された抗体」は、その天然の環境の構成成分から分離および／または回収したものである。その天然の環境の夾雑物の構成成分は、抗体の診断的または治療的な使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質が含まれ得る。好ましい実施形態では、抗体は、（１）ローリー法によって決定して抗体の９５重量％より高くまで、最も好ましくは９９重量％より高くまで；（２）スピンカップ配列決定装置を使用することによってＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るために十分な度合まで；または（３）クマシーブルー、もしくは、好ましくは銀染色を用いた還元もしくは非還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで、精製する。単離された抗体には組換え細胞内におけるｉｎ  ｓｉｔｕの抗体が含まれる。なぜなら、当該抗体の天然環境の少なくとも１つの構成成分が存在しないためである。しかし、通常は、単離された抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製する。
【００６０】
基本的な４本鎖の抗体単位は、２本の同一の軽（Ｌ）鎖および２本の同一の重（Ｈ）鎖からなるヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＭ抗体は、５個の基本的なヘテロ四量体単位およびＪ鎖と呼ばれる追加のポリペプチドからなり、したがって１０個の抗原結合部位を含み、一方で、分泌型のＩｇＡ抗体は、重合して、２〜５個の基本的な４本鎖の単位およびＪ鎖を含む多価の集合体を形成することができる。ＩｇＧの場合、４本鎖の単位は、一般に約１５０，０００ダルトンである。それぞれのＬ鎖は１つの共有ジスルフィド結合によってＨ鎖と連結している一方で、２本のＨ鎖は、Ｈ鎖のアイソタイプに応じて１つまたは複数のジスルフィド結合によって互いに連結している。また、それぞれのＨおよびＬ鎖は、一定間隔の鎖内ジスルフィド架橋も有する。それぞれのＨ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、次いで、αおよびγ鎖のそれぞれについて３つの定常ドメイン（ＣＨ）、μおよびεアイソタイプには４つのＣＨドメインを有する。それぞれのＬ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＬ）、次いでその他方の末端に定常ドメイン（ＣＬ）を有する。ＶＬはＶＨとアラインメントされており、ＣＬは重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）とアラインメントされている。特定のアミノ酸残基が軽鎖および重鎖可変ドメインの間の界面を形成すると考えられている。ＶＨおよびＶＬが一緒になって対合することで、単一の抗原結合部位が形成される。様々な抗体クラスの構造および特性については、例えば、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第８版、Ｄａｎｉｅｌ  Ｐ．  Ｓｔｉｔｅｓ、Ａｂｂａ  Ｉ．  Ｔｅｒｒ  ａｎｄ  Ｔｒｉｓｔｒａｍ  Ｇ．  Ｐａｒｓｌｏｗ編、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ，  Ｃｏｎｎ．、１９９４年、７１頁、および第６章を参照されたい。
【００６１】
任意の脊椎動物種由来のＬ鎖は、その定常ドメイン（ＣＬ）のアミノ酸配列に応じて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なる型のうちの一方に割り当てることができる。その重鎖定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを様々なクラスまたはアイソタイプに割り当てることができる。５つの免疫グロブリンのクラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭが存在し、それぞれアルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）およびミュー（μ）と呼ばれる重鎖を有する。γおよびαクラスは、ＣＨ配列および機能の比較的軽微な差異に基づいてサブクラスへとさらに分割され、例えば、ヒトは、以下のサブクラスを発現する：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２。
【００６２】
用語「可変」は、Ｖドメインの特定のセグメントが抗体間で配列が大規模に異なることを指す。Ｖドメインは抗原結合を媒介し、特定の抗体の、その特定の抗原に対する特異性を定義する。しかし、可変性は、可変ドメインの１１０個のアミノ酸の範囲全体にわたって均等に分布しているわけではない。そうではなく、Ｖ領域は、それぞれ９〜１２個のアミノ酸の長さの「超可変領域」と呼ばれる可変性が非常に高いより短い領域によって隔てられている１５〜３０個のアミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変のストレッチ（複数）からなる。ネイティブの重鎖および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、大体はβ−シートの立体配置をとっている４つのＦＲを含み、これらは、β−シート構造を連結し、場合によってはその一部を形成するループを形成する、３つの超可変領域によって連結されている。それぞれの鎖中の超可変領域は、ＦＲによって非常に近接して形を保ち、他の鎖からの超可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．（１９９１年）参照）。定常ドメインは抗体の抗原への結合に直接関与していないが、抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）における抗体の関与など、様々なエフェクター機能を示す。
【００６３】
本明細書中で使用する用語「超可変領域」は、抗原結合を担っている抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」すなわち「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば、Ｋａｂａｔ付番システムに従って番号付けした場合に、ＶＬ中の約残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）付近、ＶＨ中の約３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）付近；Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．（１９９１年））；ならびに／または「超可変ループ」からの残基（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ付番システムに従って番号付けした場合に、ＶＬ中の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）、ＶＨ中の２６〜３２（Ｈ１）、５２〜５６（Ｈ２）および９５〜１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、１９６巻：９０１〜９１７頁（１９８７年））；ならびに／または「超可変ループ」／ＣＤＲからの残基（例えば、ＩＭＧＴ付番システムに従って番号付けした場合に、ＶＬ中の残基２７〜３８（Ｌ１）、５６〜６５（Ｌ２）および１０５〜１２０（Ｌ３）、ＶＨ中の２７〜３８（Ｈ１）、５６〜６５（Ｈ２）および１０５〜１２０（Ｈ３）；Ｌｅｆｒａｎｃ，  Ｍ．  Ｐ．ら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２７巻：２０９〜２１２頁（１９９９年）、Ｒｕｉｚ，  Ｍ．ら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２８巻：２１９〜２２１頁（２０００年））を含む。任意選択で、抗体は、以下の点の１つまたは複数で対称的な挿入物を有する：ＡＨｏに従って番号付けした場合に、ＶＬ中の２８、３６（Ｌ１）、６３、７４〜７５（Ｌ２）および１２３（Ｌ３）、ならびにＶＨ中の２８、３６（Ｈ１）、６３、７４〜７５（Ｈ２）および１２３（Ｈ３）；Ｈｏｎｎｅｇｅｒ，  Ａ．  ａｎｄ  Ｐｌｕｎｋｔｈｕｎ，  Ａ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、３０９巻：６５７〜６７０頁（２００１年））。
【００６４】
「生殖系列核酸残基」は、定常または可変領域をコードしている生殖系列遺伝子中で天然に存在する核酸残基を意味する。「生殖系列遺伝子」は、生殖細胞（すなわち、卵子となる運命の細胞または精子）中に見つかるＤＮＡである。「生殖系列突然変異」は、生殖細胞または単細胞段階の接合体に起こった特定のＤＮＡの遺伝性変化を指し、子孫に伝わる際、そのような突然変異は体内の全細胞に取り込まれる。生殖系列突然変異は、単一の体細胞が獲得する体細胞突然変異とは対照的である。一部の例では、可変領域をコードしている生殖系列ＤＮＡ配列中のヌクレオチドが突然変異しており（すなわち体細胞突然変異）、異なるヌクレオチドで置き換えられている。
【００６５】
本明細書中で使用する用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得た抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は少量存在し得る天然の突然変異の可能性以外は同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に対するものであり、特異性が高い。さらに、様々な決定基（エピトープ）に対するものである様々な抗体が含まれるポリクローナル抗体調製物とは対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体によって汚染されていない状態で合成し得るという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、抗体を任意の特定の方法によって産生することを要すると解釈されるべきでない。例えば、本発明で有用なモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６巻：４９５頁（１９７５年）によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって調製するか、または細菌、真核動物もしくは植物細胞中で組換えＤＮＡ方法を用いて作製し得る（例えば米国特許第４，８１６，５６７号参照）。また、「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２巻：６２４〜６２８頁（１９９１年）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ、２２２巻：５８１〜５９７頁（１９９１年）に記載の技術を用いて、ファージ抗体ライブラリから単離してもよい。
【００６６】
本明細書中のモノクローナル抗体には、重鎖および／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来するまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である一方で、鎖（複数可）の残りの部分が、別の種に由来するまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体、ならびに所望の生物活性を示す限りはそのような抗体の断片が含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８１巻：６８５１〜６８５５頁（１９８４年）参照）。本発明は、ヒト抗体に由来する可変ドメイン抗原結合配列を提供する。したがって、本明細書において主に対象とするキメラ抗体には、１つまたは複数のヒト抗原結合配列（例えばＣＤＲ）を有し、非ヒト抗体に由来する１つまたは複数の配列、例えば、ＦＲまたはＣ領域配列を含む抗体が含まれる。さらに、本明細書において主に対象とするキメラ抗体には、１つの抗体クラスまたはサブクラスのヒト可変ドメイン抗原結合配列と、別の抗体クラスまたはサブクラスに由来する別の配列、例えば、ＦＲまたはＣ領域配列とを含むものが含まれる。また、本発明の対象とするキメラ抗体には、本明細書中に記載したものに関連する、または非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）等の異なる種に由来する可変ドメイン抗原結合配列を含むものも含まれる。また、キメラ抗体には、霊長類化およびヒト化した抗体も含まれる。
【００６７】
さらに、キメラ抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体中には見つからない残基を含み得る。これらの修飾は、抗体の性能をさらに洗練するために行う。さらなる詳細には、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：５２２〜５２５頁（１９８６年）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３〜３２９頁（１９８８年）；およびＰｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．、２巻：５９３〜５９６頁（１９９２年）を参照されたい。
【００６８】
「ヒト化抗体」は、一般に、非ヒト源から１つまたは複数のアミノ酸残基がその中に導入されたヒト抗体とみなされる。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「輸入」残基と呼ばれ、典型的には「輸入」可変ドメインからとる。ヒト化は、従来より、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者らの方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：５２２〜５２５頁（１９８６年）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３〜３２７頁（１９８８年）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻：１５３４〜１５３６頁（１９８８年））に従って、輸入超可変領域配列でヒト抗体の対応する配列を置換することによって行う。したがって、そのような「ヒト化」抗体は、実質的にインタクトなヒト可変ドメイン未満の部分が非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている、キメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。
【００６９】
「ヒト抗体」は、ヒトによって天然に産生される抗体中に存在する配列のみを含む抗体である。しかし、本明細書中で使用するヒト抗体は、本明細書中に記載の修飾および変異配列を含めた、天然に存在するヒト抗体には見つからない残基または修飾を含み得る。これらは、典型的には、抗体性能をさらに洗練または増強するために行う。
【００７０】
「インタクトな」抗体は、抗原結合部位と、ＣＬならびに少なくとも重鎖定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３とを含むものである。定常ドメインは、ネイティブ配列定常ドメイン（例えばヒトネイティブ配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異体であり得る。好ましくは、インタクトな抗体は１つまたは複数のエフェクター機能を有する。
【００７１】
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部分、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合または可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）；直鎖状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号；Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、８巻（１０号）：１０５７〜１０６２頁［１９９５年］参照）；単鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成した多特異性抗体が含まれる。
【００７２】
語句、抗体の「機能的な断片または類似体」は、完全長抗体と共通の定性的な生物活性を有する化合物である。例えば、抗ＩｇＥ抗体の機能的な断片または類似体とは、ＩｇＥ免疫グロブリン分子が高親和性受容体のＦｃεＲＩに結合する能力を持つことを防止または実質的に減少するような様式で、ＩｇＥ免疫グロブリンに結合することができるものである。
【００７３】
抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片、および残りの「Ｆｃ」断片が生じ、この命名は、容易に結晶化する能力を反映している。Ｆａｂ断片は、Ｌ鎖の全長、ならびにＨ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）、および１つの重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）からなる。それぞれのＦａｂ断片は抗原結合に関して一価である、すなわち、これは、単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理により、２つのジスルフィド結合したＦａｂ断片に大ざっぱに対応する単一の大きなＦ（ａｂ’）２断片が得られ、これは、二価の抗原結合活性を有しているが、それでも抗原を架橋結合させることができる。Ｆａｂ’断片は、ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に、抗体ヒンジ領域からの１つまたは複数のシステインを含めた追加の数残基を有することによって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨとは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を保有するＦａｂ’の、本明細書中での命名である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、その間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として最初に産生された。抗体断片の他の化学的カップリングも知られている。
【００７４】
「Ｆｃ」断片は、ジスルフィドによって形を保った、両方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能はＦｃ領域中の配列によって決定され、この領域は、特定の種類の細胞上に見つかるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって認識される部分でもある。
【００７５】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この断片は、密に非共有会合している１つの重鎖可変領域ドメインと１つの軽鎖可変領域ドメインとの二量体からなる。これらの２個のドメインの折り畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に対する抗原結合特異性を与える６個の超可変ループ（ＨおよびＬ鎖からそれぞれ３個のループ）が生じる。しかし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえも、結合部位全体よりも低い親和性ではあるが抗原を認識してそれに結合する能力を有する。
【００７６】
「単鎖Ｆｖ」は、「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略記され、単一のポリペプチド鎖へと連結されたＶＨおよびＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨおよびＶＬドメインの間に、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓＦｖの総説には、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２６９〜３１５頁（１９９４年）；Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ、１９９５年、上記を参照されたい。
【００７７】
用語「二重特異性抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）」は、ＶＨおよびＶＬドメインの間に短いリンカー（約５〜１０個の残基）を有するｓＦｖ断片（前段落を参照）を構築することによって調製する、小さな抗体断片を指し、Ｖドメインの鎖内ではなく鎖間の対合が達成される結果、二価断片、すなわち２つの抗原結合部位を有する断片がもたらされる。二重特異性の二重特異性抗体は、２つの抗体のＶＨおよびＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する、２つの「クロスオーバー」ｓＦｖ断片のヘテロ二量体である。二重特異性抗体は、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０巻：６４４４〜６４４８頁（１９９３年）に、より完全に記載されている。
【００７８】
本明細書中で使用する「内部移行する」抗体は、哺乳動物細胞上の抗原（例えば、細胞表面ポリペプチドまたは受容体）に結合した際に、細胞によって取り込まれる（すなわち進入する）ものである。内部移行する抗体には、もちろん、抗体断片、ヒトまたはキメラ抗体、および抗体コンジュゲートが含まれる。特定の治療上の応用では、ｉｎ  ｖｉｖｏの内部移行が企図される。内部移行する抗体分子の数は、細胞、特に感染細胞を死滅させるまたはその成長阻害するために十分または適当となる数である。抗体または抗体コンジュゲートの効力に応じて、一部の例では、単一の抗体分子を細胞内に取り込むことが、抗体が結合する標的細胞を死滅させるために十分である。例えば、特定の毒素は死滅させることに関して非常に強力であり、抗体とコンジュゲートした毒素の分子１個の内部移行が、感染細胞を死滅させるために十分である。
【００７９】
本明細書中で使用する、抗体は、検出可能なレベル、好ましくは約１０４Ｍ−１以上、または約１０５Ｍ−１以上、約１０６Ｍ−１以上、約１０７Ｍ−１以上、もしくは１０８Ｍ−１以上の親和定数Ｋａで抗原と反応する場合に、「免疫特異的である」、抗原「に特異的である」または「に特異的に結合する」と言われる。また、抗体のその同類抗原に対する親和性は、一般的に解離定数ＫＤとして表され、特定の実施形態では、ＨｕＭ２ｅ抗体は、結合する場合、１０−４Ｍ以下、約１０−５Ｍ以下、約１０−６Ｍ以下、１０−７Ｍ以下、または１０ー８Ｍ以下のＫＤでＭ２ｅに特異的に結合する。抗体の親和性は、慣用技術、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄら（Ａｎｎ．  Ｎ．  Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．
ＵＳＡ、５１巻：６６０頁（１９４９年））に記載のものを用いて容易に決定することができる。
【００８０】
抗原、細胞またはその組織に対する抗体の結合特性は、一般に、例えば、免疫組織化学（ＩＨＣ）および／または蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）などの免疫蛍光に基づいたアッセイを含めた免疫検出方法を用いて決定および評価し得る。
【００８１】
指定した抗体の「生物学的特徴」を有する抗体とは、その抗体の生物学的特徴のうちの１つまたは複数を保有するものであり、これにより、それが他の抗体から区別される。例えば、特定の実施形態では、指定した抗体の生物学的特徴を有する抗体は、指定した抗体によって結合されるものと同じエピトープに結合するおよび／または指定した抗体と共通のエフェクター機能を有する。
【００８２】
用語「拮抗体」抗体は、最も広範な意味で使用し、それが特異的に結合するエピトープ、ポリペプチド、または細胞の生物活性を部分的または完全に遮断、阻害、または中和する抗体が含まれる。拮抗体抗体を同定する方法は、候補拮抗体抗体が特異的に結合したポリペプチドまたは細胞を候補拮抗体抗体と接触させること、およびポリペプチドまたは細胞に通常関連している１つまたは複数の生物活性の検出可能な変化を測定することを含み得る。
【００８３】
「感染細胞の成長を阻害する抗体」または「成長阻害」抗体は、抗体によって結合されるＭ２ｅエピトープを発現するまたは発現することができる感染細胞に結合し、その測定可能な成長阻害をもたらすものである。好ましい成長阻害抗体は、感染細胞の成長を、適切な対照と比較して２０％を超えて、好ましくは約２０％〜約５０％、さらにより好ましくは５０％を超えて（例えば約５０％〜約１００％）阻害し、対照は、典型的には、試験する抗体で処理していない感染細胞である。成長阻害は、細胞培養物中に約０．１〜３０μｇ／ｍｌまたは約０．５ｎＭ〜２００ｎＭの抗体濃度で測定することができ、成長阻害は、感染細胞を抗体に曝露した１〜１０日後に決定する。ｉｎ  ｖｉｖｏの感染細胞の成長阻害は、当技術分野で知られている様々な方法で決定することができる。抗体は、抗体を体重１ｋｇあたり約１μｇ〜約１００ｍｇで投与した際、抗体を最初に投与した約５日間〜３カ月以内、好ましくは約５〜３０日間以内に、感染細胞のパーセントまたは感染細胞の合計数の減少がもたらされた場合に、ｉｎ  ｖｉｖｏで成長阻害性である。
【００８４】
「アポトーシスを誘導する」抗体は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞の収縮、小胞体の拡張、細胞の断片化、および／または膜小胞（アポトーシス体と呼ばれる）の形成によって決定されるプログラム細胞死を誘導するものである。好ましくは、細胞は感染細胞である。アポトーシスに関連する細胞事象を評価するために様々な方法が利用可能である。例えば、ホスファチジルセリン（ＰＳ）転位はアネキシン結合によって測定することができ；ＤＮＡの断片化はＤＮＡラダリングによって評価することができ；ＤＮＡ断片化を伴う核／クロマチン凝縮は、低二倍体細胞が少しでも増加することによって評価することができる。好ましくは、アポトーシスを誘導する抗体は、アネキシン結合アッセイにおいて、未処理の細胞と比較して約２〜５０倍、好ましくは約５〜５０倍、最も好ましくは約１０〜５０倍の、アネキシン結合の誘導をもたらすものである。
【００８５】
抗体の「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（ネイティブ配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因し、抗体アイソタイプによって異なる生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；貪食；細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）のダウンレギュレーション；ならびにＢ細胞活性化が含まれる。
【００８６】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」は、特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した、分泌されたＩｇが、これらの細胞傷害エフェクター細胞が抗原保有標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒素を用いて標的細胞を死滅させることを可能にする、細胞傷害の形態を指す。抗体が細胞傷害性細胞を「武装」し、そのような死滅に必要とされる。ＡＤＣＣを媒介するための主要な細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上のＦｃＲの発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ、９巻：４５７〜９２頁（１９９１年）の４６４頁の表３に要約されている。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または米国特許第５，８２１，３３７号に記載のものなどのｉｎ  ｖｉｔｒｏＡＤＣＣアッセイを行い得る。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。その代わりまたはそれに加えて、対象とする分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、ＰＮＡＳ  （ＵＳＡ）、９５巻：６５２〜６５６頁（１９９８年）に開示されているものなどの動物モデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏで評価し得る。
【００８７】
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を表す。特定の実施形態では、ＦｃＲはネイティブ配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合するものであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体が含まれ、これらの受容体の対立遺伝子変異体、および選択的スプライシングされた形態も含まれる。ＦＣγＲＩＩ受容体には、類似のアミノ酸配列を有するが主にその細胞質ドメインが異なる、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）が含まれる。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメイン内に免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメイン内に免疫受容体チロシン阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（Ｄａｅｒｏｎ、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５巻：２０３〜２３４頁（１９９７年）の総説Ｍ．を参照）。ＦｃＲは、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ、Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ、９巻：４５７〜９２頁（１９９１年）；Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、４巻：２５〜３４頁（１９９４年）；およびｄｅ  Ｈａａｓら、Ｊ．  Ｌａｂ．  Ｃｌｉｎ．  Ｍｅｄ．、１２６巻：３３０〜４１頁（１９９５年）に総説されている。将来同定されるものを含めた他のＦｃＲが、本明細書における用語「ＦｃＲ」に包含される。また、この用語には、母性ＩｇＧを胎児に移行することを担っている新生児受容体ＦｃＲｎも含まれる（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１７巻：５８７頁（１９７６年）およびＫｉｍら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４巻：２４９頁（１９９４年））。
【００８８】
「ヒトエフェクター細胞」は、１つまたは複数のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を実行する白血球である。好ましくは、細胞は少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現してＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例には、ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞および好中球が含まれ、ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、ネイティブ源、例えば血液から単離し得る。
【００８９】
「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下における標的細胞の溶解を指す。古典補体経路の活性化は、補体系の第１構成成分（Ｃ１ｑ）が、その同類抗原に結合している（適切なサブクラスの）抗体に結合することによって開始される。補体の活性化を評価するためには、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０２巻：１６３頁（１９９６年）に記載のものなどのＣＤＣアッセイを行い得る。
【００９０】
用語「インフルエンザＡ」および「インフルエンザウイルスＡ」は、ウイルスのＯｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科の属を指す。インフルエンザウイルスＡには１種のみ、すなわちインフルエンザＡウイルスしか含まれず、これは、トリ、ヒト、ブタ、およびウマにおいてインフルエンザを引き起こす。インフルエンザＡウイルスのすべてのサブタイプの株が野鳥から単離されているが、疾患は一般的でない。インフルエンザＡウイルスの一部の分離株は、家禽および稀であるがヒトの両方において、重篤な疾患を引き起こす。
【００９１】
感染症を治療することを目的とした「哺乳動物」は、ヒト、家畜（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｆａｒｍ  ａｎｉｍａｌ）、ならびに、イヌ、ネコ、畜牛、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどの動物園、競技、またはペットの動物を含めた、任意の哺乳動物を指す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００９２】
「治療すること」もしくは「治療」または「緩和」は、治療処置および予防的または防御的手段をどちらも指し；その目的は、標的とした病理状態または障害を予防または減速（軽減）させることである。治療を必要とするものには、既に障害に罹患しているもの、および障害を罹患しやすいものまたは障害を予防すべきものが含まれる。被験体または哺乳動物は、治療的な量の本発明の方法による抗体を受けた後、患者が、以下のうちの１つまたは複数が観察可能かつ／もしくは測定可能に減少している、または存在しない場合に、感染症の「治療」が成功している：感染細胞の数の減少もしくは感染細胞が存在しないこと；全細胞中の感染細胞の割合が減少していること；および／または具体的な感染症に関連する症状のうちの１つもしくは複数がある程度まで緩和されていること；罹患率および死亡率が減少していること、ならびに生活の質の問題が改善されていること。治療の成功および疾患の改善を評価するための上記パラメータは、医師が精通したルーチン手順によって容易に測定可能である。
【００９３】
用語「治療上有効な量」は、被験体または哺乳動物における疾患または障害を「治療する」ために有効な抗体または薬物の量を指す。前述の「治療すること」の定義を参照されたい。
【００９４】
「連用」投与とは、急性の様式との対照として、最初の治療効果（活性）を長期間維持するために薬剤（複数可）を連続的な様式で投与することをいう。「断続的な」投与とは、中断なしに継続的に行わず、むしろ周期的な性質である治療である。
【００９５】
１つまたは複数の追加の治療剤「と組み合わせた」投与には、同時（同時）および任意の順序で継続的な投与することが含まれる。
【００９６】
本明細書中で使用する「担体」には、製薬上許容される担体、賦形剤、または安定化剤が含まれ、これらは、使用する用量および濃度で、それに曝す細胞または哺乳動物に対して無毒性である。しばしば、生理的に許容される担体は、ｐＨ緩衝化した水溶液である。生理的に許容される担体の例には、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸を含めた抗酸化剤；低分子量（約１０個未満の残基）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含めた単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
【００９７】
本明細書中で使用する用語「細胞傷害剤」は、細胞の機能を阻害もしくは阻止するおよび／または細胞の破壊を引き起こす物質を指す。この用語には、放射性同位体（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２およびＬｕの放射性同位体）、化学療法剤、例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤、酵素およびその断片、例えば核酸分解酵素（ｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ）、抗生物質、および細菌、真菌、植物もしくは動物起源の小分子毒素もしくは酵素活性毒素などの毒素（その断片および／または変異体を含む）、ならびに以下に開示する様々な抗腫瘍剤または抗癌剤が含まれることを意図する。他の細胞傷害剤を以下に記載する。
【００９８】
本明細書中で使用する「成長阻害性剤」は、細胞の成長を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのどちらかで阻害する化合物または組成物を指す。成長阻害性剤の例には、Ｇ１停止およびＭ期停止を誘導する薬剤などの、細胞周期の進行を遮断する薬剤が含まれる。古典的なＭ期遮断剤には、ビンカアルカロイド（ビンクリスチン、ビノレルビンおよびビンブラスチン）、タキサン、ならびにトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えば、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、およびブレオマイシンなどが含まれる。Ｇ１を停止させる薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキサート、５−フルオロウラシル、およびａｒａ−Ｃなどがある。さらなる情報は、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  ａｎｄ  Ｉｓｒａｅｌ編、第１章、題名「Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，  ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ，  ａｎｄ  ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ」、Ｍｕｒａｋａｍｉら（Ｗ  Ｂ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、１９９５年）、特に１３頁中に見つけることができる。タキサン（パクリタキセルおよびドセタキセル）は、どちらもイチイに由来する抗癌薬である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル（タキソテール（商標）、Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ）は、パクリタキセル（タキソール（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）の半合成類似体である。パクリタキセルおよびドセタキセルはチューブリン二量体からの微小管のアセンブリを促進し、脱重合を防止することによって微小管を安定化し、これは、細胞中の有糸分裂の阻害をもたらす。
【００９９】
本明細書中で使用する「標識」は、抗体と直接または間接的にコンジュゲートして「標識した」抗体を生じる、検出可能な化合物または組成物を指す。標識は、それ自体で検出可能であるか（例えば、放射性同位体標識もしくは蛍光標識）、または、酵素標識の場合は、検出可能な基質化合物もしくは組成物の化学変換を触媒し得る。
【０１００】
本明細書中で使用する用語「エピトープでタグ付けした」は、「タグポリペプチド」と融合したポリペプチドを含むキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、それに対する抗体を作製できるエピトープを提供できる程に十分な残基を有するが、それと融合させるポリペプチドの活性を妨害しない程に十分に短い。また、タグポリペプチドは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないように、かなり独特であることが好ましい。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６個のアミノ酸残基を有し、通常は約８〜５０個のアミノ酸残基（好ましくは約１０〜２０個のアミノ酸残基）を有する。
【０１０１】
「小分子」は、本明細書中で約５００ダルトン未満の分子量を有すると定義される。
【０１０２】
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書中で互換性があるように使用し、一本鎖または二本鎖のＲＮＡ、ＤＮＡ、または混合ポリマーを指す。ポリヌクレオチドには、ポリペプチドを発現する、または発現するように適応させ得る、ゲノム配列、ゲノム外およびプラスミド配列、ならびにより小さな操作した遺伝子セグメントが含まれ得る。
【０１０３】
「単離された核酸」は、他のゲノムＤＮＡ配列ならびにネイティブ配列に天然に付随するリボソームおよびポリメラーゼなどのタンパク質または複合体から実質的に分離された核酸である。この用語には、その天然に存在する環境から取り出された核酸配列が包含され、組換えまたはクローニングしたＤＮＡ単離物および化学合成した類似体または異種系によって生物学的に合成した類似体が含まれる。実質的に純粋な核酸には、単離された形の核酸が含まれる。もちろん、これは、最初に単離されたままの核酸のことをいい、単離された核酸に後に人為的に付加した遺伝子または配列を排除しない。
【０１０４】
用語「ポリペプチド」は、その慣用の意味、すなわち、アミノ酸の配列として使用する。ポリペプチドは、生成物の具体的な長さに限定されない。ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質がポリペプチドの定義内に含まれ、そのような用語は、具体的にそうでないと指定しない限りは、本明細書中で互換性があるように使用し得る。また、この用語は、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など、ならびに当技術分野で知られている他の修飾（天然に存在するものおよび天然に存在しないもの両方）を指さないかあるいは排除しない。ポリペプチドは、タンパク質全体、またはその部分配列であり得る。本発明のコンテキストにおける具体的な対象とするポリペプチドは、ＣＤＲを含み、抗原またはインフルエンザＡ感染細胞に結合することができるアミノ酸部分配列である。
【０１０５】
「単離ポリペプチド」は、その天然の環境の構成成分から同定ならびに分離および／または回収したものである。好ましい実施形態では、単離ポリペプチドは、（１）ローリー法によって決定してポリペプチドの９５重量％より高くまで、最も好ましくは９９重量％より高くまで、（２）スピンカップ配列決定装置を使用することによってＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るために十分な度合まで、または（３）クマシーブルー、もしくは、好ましくは銀染色を用いた還元もしくは非還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで、精製する。単離ポリペプチドには組換え細胞内にｉｎ  ｓｉｔｕのポリペプチドが含まれる。なぜなら、そのポリペプチドの天然環境の少なくとも１つの構成成分が存在しないためである。しかし、通常は、単離ポリペプチドは、少なくとも１つの精製ステップによって調製する。
【０１０６】
「ネイティブ配列」のポリヌクレオチドとは、天然に由来するポリヌクレオチドと同じヌクレオチド配列を有するものである。「ネイティブ配列」のポリペプチドとは、天然に由来する（例えば任意の種由来の）ポリペプチド（例えば抗体）と同じアミノ酸配列を有するものである。そのようなネイティブ配列のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、天然から単離することができるか、または組換えもしくは合成の手段によって産生することができる。
【０１０７】
本明細書中で使用する用語、ポリヌクレオチド「変異体」は、典型的には、１つまたは複数の置換、欠失、付加および／または挿入によって本明細書中に具体的に開示するポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチドである。そのような変異体は、天然に存在し得るか、または、例えば、本発明のポリヌクレオチド配列のうちの１つもしくは複数を修飾し、コードされるポリペプチドの１つもしくは複数の生物活性を、本明細書中に記載のように、および／もしくは当技術分野で周知の多くの技術のうちの任意のものを用いて評価することによって、合成によって作製し得る。
【０１０８】
本明細書中で使用する用語、ポリペプチド「変異体」は、典型的には、１つまたは複数の置換、欠失、付加および／または挿入によって本明細書中に具体的に開示するポリペプチドと異なるポリペプチドを指す。そのような変異体は、天然に存在し得るか、または、例えば、上記本発明のポリペプチド配列のうちの１つもしくは複数を修飾し、ポリペプチドの１つもしくは複数の生物活性を、本明細書中に記載のように、および／もしくは当技術分野で周知の多くのの技術のうちの任意のものを用いて評価することによって、合成によって作製し得る。
【０１０９】
修飾を本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造に行っても、依然として望ましい特徴を有する変異体または誘導体ポリペプチドをコードしている機能的分子が得られ得る。ポリペプチドのアミノ酸配列を変更して、等価、さらには改善された、本発明の変異体またはポリペプチドの一部分を作製することが所望される場合、当業者は、典型的には、コードＤＮＡ配列のコドンのうちの１つまたは複数を変化させるであろう。
【０１１０】
例えば、タンパク質構造において、他のポリペプチド（例えば抗原）または細胞に結合するその能力を感知できるほど損失させずに、特定のアミノ酸で他のアミノ酸を置換し得る。タンパク質の結合能力および性質がタンパク質の生物学的な機能的活性を決定するため、特定のアミノ酸配列置換を、タンパク質配列、および、もちろんその根底にあるＤＮＡコード配列にも行い、それでも同様の特性を有するタンパク質を得ることができる。したがって、その生物学的な有用性または活性を感知できるほど損失させずに、開示した組成物のペプチド配列、または前記ペプチドをコードしている対応するＤＮＡ配列に様々な変化を行い得ることが企図される。
【０１１１】
多くの場合、ポリペプチド変異体は１つまたは複数の保存的置換を含む。「保存的置換」は、ペプチド化学分野の技術者によってポリペプチドの二次構造およびヒドロパシーの性質が実質的に変化しないことが予想されるように、１つのアミノ酸で同様の特性を有する別のアミノ酸を置換するものである。
【０１１２】
そのような変化を行う際、アミノ酸のヒドロパシー指数を考慮し得る。タンパク質に相互作用性の生物学的機能を与えることにおけるヒドロパシーアミノ酸指数の重要性は、当技術分野で一般に理解されている（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２年）。アミノ酸の相対的ヒドロパシー特性が生じるタンパク質の二次構造に寄与し、ひいてはそれがタンパク質と他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などとの相互作用を定めることは、理解されている。それぞれのアミノ酸は、その疎水性および荷電特性に基づいてヒドロパシー指数が割り当てられている（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２年）。これらの値は、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸塩（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸塩（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。
【０１１３】
特定のアミノ酸を、類似のヒドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸によって置換してもよく、それでも類似の生物活性を有するタンパク質が得られ得る、すなわち、さらには生物学的機能として等価なタンパク質が得られることは、当技術分野で知られている。そのような変化を作製する際、ヒドロパシー指数が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものがさらに特に好ましい。また、当技術分野では、類似のアミノ酸の置換は、親水性に基づいて有効に行うことができることも理解されたい。米国特許４，５５４，１０１号は、その隣接アミノ酸の親水性によって支配されるタンパク質の最大局所的平均親水性は、タンパク質の生物学的特性と相関すると述べている。
【０１１４】
米国特許４，５５４，１０１号に詳述されるように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸塩（＋３．０±１）；グルタミン酸塩（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。あるアミノ酸で類似の親水性値を有する別のものを置換し、それでも生物学的に等価な、特に免疫学的に等価なタンパク質を得ることができることを理解されたい。そのような変化では、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものがさらに特に好ましい。
【０１１５】
したがって、上記に概要を示したように、アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似度、例えば、その疎水性、親水性、荷電、サイズなどに基づいている。様々な前述の特徴を考慮にいれた例示的な置換は当業者に周知であり、アルギニンおよびリシン；グルタミン酸塩およびアスパラギン酸塩；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンが含まれる。
【０１１６】
アミノ酸置換は、さらに、残基の極性、荷電、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性の性質の類似度に基づいて行ってもよい。例えば、負荷電アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ；正荷電アミノ酸には、リシンおよびアルギニンが含まれ；類似の親水性値を有する無荷電の極性頭部基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシンおよびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；ならびにセリン、スレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが含まれる。保存的変化を表し得る他のアミノ酸群には、（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓが含まれる。変異体は、非保存的変化も、またはそれに代えて含み得る。好ましい実施形態では、変異体ポリペプチドは、５個以下のアミノ酸の置換、欠失または付加によってネイティブ配列と異なる。変異体は、例えば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造およびヒドロパシー性質に最小限の影響しか与えないアミノ酸の欠失または付加によっても（またはそれに代えて）修飾し得る。
【０１１７】
ポリペプチドは、同時翻訳でまたは翻訳後にタンパク質の移動を指示する、タンパク質のＮ末端の端にシグナル（またはリーダー）配列を含んでいてもよい。また、ポリペプチドは、ポリペプチドの合成、精製もしくは同定を容易にするため（例えばポリ−Ｈｉｓ）、またはポリペプチドと固体担体との結合を強化するために、リンカーまたは他の配列とコンジュゲートさせてもよい。例えば、ポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃ領域とコンジュゲートさせ得る。
【０１１８】
ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの配列を比較する際、２つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列を、以下に記載するように最大一致についてアラインメントして、同じである場合に、２つの配列は「同一」であると言われる。２つの配列間の比較は、典型的には、配列を比較ウィンドウにわたって比較して、配列類似度の局所領域を同定および比較することによって行う。本明細書中で使用する「比較ウィンドウ」は、少なくとも約２０個の連続的な位置、通常は３０〜約７５、４０〜約５０のセグメントを指し、配列と同じ数の連続的な位置の参照配列との比較を、２つの配列の最適なアラインメントを行った後に行い得る。
【０１１９】
比較のための配列の最適なアラインメントは、生物情報学ソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）のＬａｓｅｒｇｅｎｅスート中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを用いて、初期設定パラメータを使用して実施し得る。このプログラムは、以下の参考文献に記載されているいくつかのアラインメントスキームを包含している：Ｄａｙｈｏｆｆ，  Ｍ．  Ｏ．（１９７８年）Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  −  Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．、Ｄａｙｈｏｆｆ，  Ｍ．  Ｏ．編、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ
Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ、５巻、補遺３、３４５〜３５８頁；Ｈｅｉｎ  Ｊ．（１９９０）Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ、６２６〜６４５頁、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８３巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，  Ｄ．Ｇ．  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，  Ｐ．Ｍ．（１９８９年）ＣＡＢＩＯＳ  ５巻：１５１〜１５３頁；Ｍｙｅｒｓ，  Ｅ．Ｗ．  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｅｒ  Ｗ．（１９８８年）ＣＡＢＩＯＳ  ４巻：１１〜１７頁；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，  Ｅ．Ｄ．（１９７１年）Ｃｏｍｂ．  Ｔｈｅｏｒ、１１巻：１０５頁；Ｓａｎｔｏｕ，  Ｎ．  Ｎｅｓ，  Ｍ．（１９８７年）Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｅｖｏｌ．  ４巻：４０６〜４２５頁；Ｓｎｅａｔｈ，  Ｐ．Ｈ．Ａ．  ａｎｄ  Ｓｏｋａｌ，  Ｒ．Ｒ．（１９７３年）Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  −  ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ、Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，  ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，  Ｗ．Ｊ．  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｄ．Ｊ．（１９８３年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．、Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８０巻：７２６〜７３０頁。
【０１２０】
あるいは、比較のための配列の最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１年）Ａｄｄ．  ＡＰＬ．  Ｍａｔｈ、２巻：４８２頁の局所的同一性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．
Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、４８巻：４４３頁の同一性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８５巻：２４４４頁の類似度検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行によって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．）、または検査によって、実施し得る。
【０１２１】
％配列同一性および配列類似度を決定するために適したアルゴリズムの好ましい一例は、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７年）Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻：３３８９〜３４０２頁およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２１５巻：４０３〜４１０頁に記載されている、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０を、例えば、本明細書中に記載のパラメータとともに用いて、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの％配列同一性を決定することができる。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、米国立バイオテクノロジー情報センターから公的に利用可能である。
【０１２２】
例示的な一例では、累積スコアは、ヌクレオチド配列には、パラメータＭ（マッチ残基対のリワードスコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基のペナルティスコア；常に＜０）を用いて計算することができる。それぞれの方向の単語ヒットの伸長は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘ低下した場合；１つもしくは複数の陰性スコアの残基アラインメントの蓄積により、累積スコアがゼロ以下になった場合；または配列のどちらかの末端に到達した場合に停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）では、初期設定として単語長（Ｗ）が１１および予測（Ｅ）が１０を使用し、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８９巻：１０９１５頁参照）アラインメントでは、（Ｂ）が５０、予測（Ｅ）が１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両方の鎖の比較を使用する。
【０１２３】
アミノ酸配列では、スコアマトリックスを用いて累積スコアを計算することができる。それぞれの方向の単語ヒットの伸長は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘ低下した場合；１つもしくは複数の陰性スコアの残基アラインメントの蓄積により、累積スコアがゼロ以下になった場合；または配列のどちらかの末端に到達した場合に停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。
【０１２４】
一手法では、「％配列同一性」は、２つの最適にアラインメントされた配列を、少なくとも２０個の位置の比較ウィンドウにわたって比較することによって決定し、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメント用の参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、２０％以下、通常は５〜１５％、または１０〜１２％の付加または欠失（すなわちギャップ）を含み得る。割合は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がどちらの配列中にも存在する位置の数を決定し、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を参照配列中の位置の合計数（すなわちウィンドウのサイズ）で除算し、結果を１００で乗算することによって計算して％配列同一性を得ることで、計算する。
【０１２５】
「相同性」は、最大％相同性をもたらすために配列のアラインメントを行い、必要な場合はギャップを導入した後に、非変異配列と同一であるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列変異体中の残基の割合を指す。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド変異体は、本明細書中に記載のポリヌクレオチドまたはポリペプチドと、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のポリヌクレオチドまたはポリペプチド相同性を有する。
【０１２６】
「ベクター」には、シャトルおよび発現ベクターが含まれる。典型的には、プラスミド構築体は、プラスミドを細菌内で複製および選択するために、それぞれ複製起点（例えばＣｏｌＥ１複製起点）および選択マーカー（例えば、アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性）も含む。「発現ベクター」は、本発明の抗体断片を含めた抗体を細菌または真核細胞内で発現させるために必要な制御配列または調節エレメントを含むベクターを指す。適切なベクターを以下に開示する。
【０１２７】
本明細書および添付の特許請求の範囲中で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、内容により明らかにそうでないと指示されない限りは、複数形が含まれる。
【０１２８】
本発明には、本発明のポリペプチドを含むＨｕＭ２ｅ抗体が含まれ、実施例１に記載のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドならびに実施例１および２に記載のアミノ酸配列、ならびにその断片および変異体が含まれる。一実施形態では、抗体は、本明細書中で８ｉ１０、２１Ｂ１５、または２３Ｋ１２と命名する抗体である。これらの抗体は、同じ細胞型の未感染の対照細胞と比較して、インフルエンザＡ感染細胞に優先的に結合する、または特異的に結合する。
【０１２９】
特定の実施形態では、本発明の抗体は、Ｍ２タンパク質に結合する。特定の実施形態では、本発明は、ネイティブコンホメーションでしか存在しない、すなわち、細胞中で発現されたままの、Ｍ２ｅ内のエピトープに結合するＨｕＭ２ｅ抗体を提供する。特定の実施形態では、これらの抗体は、単離されたＭ２ｅポリペプチド、例えば２３個のアミノ酸残基のＭ２ｅ断片に特異的に結合することができない。これらの抗体は、Ｍ２ペプチドの非直鎖状（すなわちコンホメーション）エピトープ（複数可）を認識することを理解されたい。
【０１３０】
Ｍ２タンパク質内、特にＭ２ｅ内のこれらの特異的コンホメーションのエピトープは、被験体におけるインフルエンザ感染症の発生を予防するためのワクチンとして使用し得る。
【０１３１】
当業者には理解されるように、本明細書の抗体の一般的な説明ならびにそれを調製および使用する方法は、個々の抗体ポリペプチドの構成要素および抗体断片にも適用される。
【０１３２】
本発明の抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。しかし、好ましい実施形態では、これらはモノクローナルである。特定の実施形態では、本発明の抗体は、完全ヒト抗体である。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の産生方法は当技術分野で知られており、一般に、例えば米国特許第６，８２４，７８０号に記載されている。典型的には、本発明の抗体は、以下にさらに記載する当技術分野で利用可能なベクターおよび方法を用いて、組換えによって産生する。ヒト抗体はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化Ｂ細胞によっても産生し得る（米国特許第５，５６７，６１０号および第５，２２９，２７５号参照）。
【０１３３】
ヒト抗体はまた、内在性免疫グロブリンの産生が存在しない場合に完全ヒト抗体のレパートリーを産生することができる、トランスジェニック動物（例えばマウス）中で産生させ得る。例えば、キメラおよび生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合性の欠失により、内在性抗体の産生の完全な阻害がもたらされることが記載されている。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイをこのような生殖系列突然変異体マウス内に移入することで、抗原誘発の際にヒト抗体の産生がもたらされる。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０巻：２５５１頁（１９９３年）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２巻：２５５〜２５８頁（１９９３年）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏ．、７巻：３３頁（１９９３年）；米国特許第５，５４５，８０６号、第５，５６９，８２５号、第５，５９１，６６９号（すべてＧｅｎＰｈａｒｍ）；米国特許第５，５４５，８０７号；およびＷＯ９７／１７８５２を参照されたい。そのような動物を遺伝子操作して、本発明のポリペプチドを含むヒト抗体を産生させ得る。
【０１３４】
特定の実施形態では、本発明の抗体は、ヒトおよび非ヒト源に由来する配列をどちらも含むキメラ抗体である。特定の実施形態では、これらのキメラ抗体は、ヒト化または霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）（商標）されている。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、一部の超可変領域残基および場合によっては一部のＦＲ残基がげっ歯類抗体の類似の部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
【０１３５】
本発明のコンテキストでは、キメラ抗体には、ヒト超可変領域または１つもしくは複数のＣＤＲが保持されているが、配列の１つまたは複数の他の領域が非ヒト動物からの対応する配列で置き換えられている、完全ヒト抗体も含まれる。
【０１３６】
キメラ抗体の作製に使用する、軽および重両方の非ヒト配列の選択は、抗体をヒト治療での使用に意図する場合に、抗原性およびヒトの抗非ヒト抗体応答を減少させるために重要である。キメラ抗体が抗原に対する高い結合親和性および他の望ましい生物学的特性を保持していることがさらに重要である。この目的を達成するために、好ましい一方法によれば、キメラ抗体は、親のヒトおよび非ヒト配列の三次元モデルを用いた、親配列および様々な概念的なキメラ生成物の分析プロセスによって調製する。三次元免疫グロブリンモデルは、一般的に利用可能であり、当業者が精通している。選択した候補免疫グロブリン配列の可能性のある三次元コンホメーション構造を例示および表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらの表示の検査により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の可能性のある役割の分析、すなわち、その抗原に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響を与える残基の分析が可能となる。このように、標的抗原（複数可）に対する親和性の増加などの所望の抗体特徴が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエントおよび輸入配列から選択して組み合わせることができる。一般に、超可変領域残基が、抗原結合の影響に直接かつ最も大きく関与している。
【０１３７】
上述のように、抗体（または免疫グロブリン）は、重鎖の定常領域中のアミノ酸配列の差異に基づいて、５つの異なるクラスに分類することができる。所定のクラス内のすべての免疫グロブリンは、非常に類似した重鎖定常領域を有する。これらの差異は、配列研究、またはより一般的には血清学的手段によって（すなわち、これらの差異に対するものである抗体を使用することによって）、検出することができる。本発明の抗体、またはその断片は、任意のクラスであってよく、したがって、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、またはイプシロン重鎖を有し得る。ガンマ鎖はガンマ１、ガンマ２、ガンマ３、またはガンマ４であってよく；アルファ鎖はアルファ１またはアルファ２であり得る。
【０１３８】
好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその断片は、ＩｇＧである。ＩｇＧは、免疫グロブリン分子の機能をすべて実行することができるため、最も多用途の免疫グロブリンであるとみなされている。ＩｇＧは血清中の主要なＩｇであり、胎盤を横断する唯一のＩｇクラスである。ＩｇＧは補体の固定も行うが、ＩｇＧ４サブクラスは行わない。マクロファージ、単球、ＰＭＮおよび一部のリンパ球は、ＩｇＧのＦｃ領域に対するＦｃ受容体を有する。すべてのサブクラスが同等に良好に結合するわけではなく、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４はＦｃ受容体に結合しない。ＰＭＮ、単球およびマクロファージ上のＦｃ受容体に結合することの結果は、これにより細胞がより良好に抗原の内部移行を行うことができることである。ＩｇＧは、貪食を増強するオプソニンである。ＩｇＧと他の細胞種上のＦｃ受容体との結合は、他の機能の活性化をもたらす。本発明の抗体は、任意のＩｇＧサブクラスのものであり得る。
【０１３９】
別の好ましい実施形態では、本発明の抗体またはその断片は、ＩｇＥである。ＩｇＥは、抗原と相互作用する前でさえも好塩基球および肥満細胞上のＦｃ受容体に非常に密に結合するため、最も一般的でない血清Ｉｇである。好塩基球、肥満細胞に結合する結果、ＩｇＥはアレルギー反応に関与している。アレルゲンが細胞上のＩｇＥに結合することにより、アレルギー性症状をもたらす様々な薬理学的媒介物質の放出がもたらされる。ＩｇＥはまた、寄生蠕虫疾患においても役割を果たす。好酸球はＩｇＥのＦｃ受容体を有しており、好酸球とＩｇＥでコーティングされた蠕虫との結合により、寄生生物の死滅がもたらされる。ＩｇＥは補体を固定しない。
【０１４０】
様々な実施形態では、本発明の抗体およびその断片は、カッパまたはラムダのどちらかである可変軽鎖を含む。ラムバ（ｌａｍｂａ）鎖は、例えば、ラムダ１、ラムダ２、ラムダ３、およびラムダ４を含めたサブタイプのうちの任意のものであり得る。
【０１４１】
上述のように、本発明は、本発明のポリペプチドを含む抗体断片をさらに提供する。特定の状況下では、抗体全体ではなく抗体断片を使用する利点が存在する。例えば、断片はサイズがより小さいため、急速なクリアランスを可能にし、また、固形腫瘍などの特定の組織への接近の改善がもたらされ得る。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片；二重特異性抗体；直鎖状抗体；単鎖抗体；ならびに抗体断片から形成した多特異性抗体が含まれる。
【０１４２】
様々な技術が抗体断片を産生するために開発されている。伝統的には、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解消化によって誘導していた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４巻：１０７〜１１７頁（１９９２年）；およびＢｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻：８１頁（１９８５年）参照）。しかし、これらの断片は、現在では組換え宿主細胞によって直接産生することができる。Ｆａｂ、ＦｖおよびＳｃＦｖ抗体断片は、すべてＥ．ｃｏｌｉ中で発現させ、それから分泌させることができ、したがって、大量のこれらの断片の産生が容易となる。Ｆａｂ’−ＳＨ断片をＥ．ｃｏｌｉから直接回収し、化学的にカップリングさせて、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成することができる（Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０巻：１６３〜１６７頁（１９９２年））。別の手法によれば、Ｆ（ａｂ’）２断片を組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含む、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期が増加したＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、米国特許第５，８６９，０４６号に記載されている。抗体断片を産生するための他の技術は、当業者に明らかであろう。
【０１４３】
他の実施形態では、選択した抗体は単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。ＷＯ９３／１６１８５；米国特許第５，５７１，８９４号；および第５，５８７，４５８号を参照されたい。定常領域を欠いたインタクトな結合部位を有する種は、ＦｖおよびｓＦｖだけである。したがって、これらは、ｉｎ  ｖｉｖｏ使用中における減少した非特異的結合に適している。ｓＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノまたはカルボキシ末端のどちらかにおけるエフェクタータンパク質の融合をもたらすために構築し得る。Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ編、上記を参照されたい。また、抗体断片は、例えば米国特許第５，６４１，８７０号などに記載されている「直鎖状抗体」であってもよい。そのような直鎖状抗体断片は、単一特異性または二重特異性（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）であり得る。
【０１４４】
特定の実施形態では、本発明の抗体は二重特異性または多重特異性である。二重特異性抗体とは、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。例示的な二重特異性抗体は、単一の抗原の２つの異なるエピトープに結合し得る。他のそのような抗体では、第１の抗原結合部位を、第２の抗原に対する結合部位と組み合わせ得る。あるいは、感染細胞に対する細胞防御機構を集中かつ局在化させるために、抗Ｍ２ｅアームを、Ｔ細胞受容体分子（例えばＣＤ３）などの白血球上の始動分子に結合するアーム、またはＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）およびＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）などのＩｇＧのＦｃ受容体（ＦｃγＲ）と組み合わせ得る。また、二重特異性抗体は、感染細胞に対する細胞傷害剤を局在化させるために用いてもよい。これらの抗体は、Ｍ２ｅ結合アームおよび細胞傷害剤（例えば、サポリン、抗インターフェロン−α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキサートまたは放射性同位体ハプテン）に結合するアームを保有する。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片（例えばＦ（ａｂ’）２二重特異性抗体）として調製することができる。ＷＯ９６／１６６７３は二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃγＲＩＩＩ抗体を記載しており、米国特許第５，８３７，２３４号は二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＦｃγＲＩ抗体を開示している。二重特異性抗ＥｒｂＢ２／Ｆｃα抗体は、ＷＯ９８／０２４６３に示されている。米国特許第５，８２１，３３７は二重特異性抗ＥｒｂＢ２／抗ＣＤ３抗体を教示している。
【０１４５】
二重特異性抗体を作製する方法は当技術分野で知られている。完全長の二重特異性抗体の伝統的な産生は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖の対の同時発現に基づいており、２本の鎖は異なる特異性を有する（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３０５巻：５３７〜５３９頁（１９８３年））。免疫グロブリンの重鎖および軽鎖のランダムな組合せが原因で、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は１０個の異なる抗体分子の潜在的な混合物を生じ、そのうちの１つだけが正しい二重特異性構造を有する。通常はアフィニティークロマトグラフィーステップによって行う正しい分子の精製は多少厄介であり、生成物の収率は低い。類似の手順がＷＯ９３／０８８２９およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１０巻：３６５５〜３６５９頁（１９９１年）に開示されている。
【０１４６】
異なる手法によれば、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。好ましくは、融合は、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む、Ｉｇ重鎖定常ドメインとである。軽鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）が、融合物の少なくとも１つ中に存在することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物、および所望する場合は免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別々の発現ベクター内に挿入し、適切な宿主細胞内に同時トランスフェクトする。これにより、構築に使用する３本のポリペプチド鎖の不等な比が最適な収率の所望の二重特異性抗体をもたらす実施形態において、３つのポリペプチド断片の相互比率を調節することに関してより高い柔軟性がもたらされる。しかし、等比の少なくとも２本のポリペプチド鎖の発現が高収率をもたらす場合、または比が所望の鎖の組合せの収率に有意な影響を与えない場合は、２本または３本すべてのポリペプチド鎖のコード配列を単一の発現ベクター内に挿入することが可能である。
【０１４７】
この手法の好ましい実施形態では、二重特異性抗体は、一方のアーム中に第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他方のアーム中のハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖の対（第２の結合特異性を提供する）からなる。二重特異性分子の半分にしか存在しない免疫グロブリン軽鎖が分離の容易な方法を提供するため、この非対称の構造が、所望の二重特異性化合物を所望しない免疫グロブリン鎖の組合せから分離することを容易にすることが見い出された。この手法はＷＯ９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体を作製するさらなる詳細には、例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２１巻：２１０頁（１９８６年）を参照されたい。
【０１４８】
米国特許第５，７３１，１６８号に記載の別の手法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して、組換え細胞培養物から回収されるヘテロ二量体の割合を最大限にすることができる。好ましい界面は、ＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１の抗体分子の界面からの１つまたは複数の小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）で置き換える。大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えば、アラニンまたはスレオニン）で置き換えることによって、大きな側鎖（複数可）と同一または類似のサイズの代償的な「空洞」が第２の抗体分子の界面上に作製される。これにより、ヘテロ二量体の収率を、ホモ二量体などの他の所望しない最終産物を超えて増加させる機構が提供される。
【０１４９】
二重特異性抗体には、架橋結合または「ヘテロコンジュゲート」抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲート中の抗体の一方をアビジンとカップリングさせ、他方をビオチンとカップリングさせることができる。そのような抗体は、例えば、免疫系の細胞を所望しない細胞に標的化するため（米国特許第４，６７６，９８０号）、ならびにＨＩＶ感染症を治療するため（ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／２００３７３、およびＥＰ０３０８９）に提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な架橋結合方法を用いて作製し得る。適切な架橋結合剤が当技術分野で周知であり、いくつかの架橋結合技術とともに米国特許第４，６７６，９８０号に開示されている。
【０１５０】
二重特異性抗体を抗体断片から作製する技術も、文献に記載されている。例えば、二重特異性抗体は、化学結合を用いて調製することができる。Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻：８１頁（１９８５年）は、インタクトな抗体をタンパク質分解によって切断して、Ｆ（ａｂ’）２断片を作製する手順を記載している。これらの断片は、ジチオール錯化剤、亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元して、隣接するジチオールを安定化し、分子間ジスルフィド形成を防止する。その後、作製されたＦａｂ’断片をチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に変換する。その後、Ｆａｂ’−ＴＮＢ誘導体のうちの１つを、メルカプトエチルアミンで還元することによってＦａｂ’−チオールへと再変換し、等モル量の他のＦａｂ’−ＴＮＢ誘導体と混合して、二重特異性抗体を形成する。生じる二重特異性抗体は、酵素の選択的固定剤として使用することができる。
【０１５１】
最近の進歩により、Ｆａｂ’−ＳＨ断片をＥ．ｃｏｌｉから直接回収することが容易となり、化学的にカップリングさせて二重特異性抗体を形成することができる。Ｓｈａｌａｂｙら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．、１７５巻：２１７〜２２５頁（１９９２年）は、完全ヒト化二重特異性抗体Ｆ（ａｂ’）２分子の産生を記載している。それぞれのＦａｂ’断片をＥ．ｃｏｌｉから別々に分泌させ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの定方向化学的カップリングに供して二重特異性抗体が形成された。そのようにして形成された二重特異性抗体は、ＥｒｂＢ２受容体を過剰発現する細胞および正常なヒトＴ細胞に結合することができ、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞傷害性リンパ球の溶解活性を始動させることができた。
【０１５２】
二重特異性抗体断片を組換え細胞培養物から直接作製および単離する様々な技術も記載されている。例えば、二重特異性抗体は、ロイシンジッパーを用いて作製されている。Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４８巻（５号）：１５４７〜１５５３頁（１９９２年）。ＦｏｓおよびＪｕｎタンパク質由来のロイシンジッパーペプチドを、２つの異なる抗体のＦａｂ’部分に、遺伝子融合によって連結させた。抗体のホモ二量体をヒンジ領域で還元して単量体を形成し、その後、再度酸化して抗体のヘテロ二量体を形成した。この方法は、抗体のホモ二量体の産生にも利用することができる。Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９０巻：６４４４〜６４４８頁（１９９３年）によって記載されている「二重特異性抗体」技術は、二重特異性抗体断片を作製するための代替機構を提供している。断片は、同じ鎖上の２つのドメイン間の対合を可能にするには短すぎるリンカーによってＶＬと連結したＶＨを含む。したがって、１つの断片のＶＨおよびＶＬドメインは、別の断片の相補的ＶＬおよびＶＨドメインと対合することが強いられ、したがって２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用することによって二重特異性抗体断片を作製する別の戦略も報告されている。Ｇｒｕｂｅｒら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５２巻：５３６８頁（１９９４年）を参照されたい。
【０１５３】
２価より高い結合価を有する抗体が企図される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Ｔｕｔｔら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７巻：６０頁（１９９１年）。多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞によって、二価抗体よりも速く内部移行（および／または異化）され得る。本発明の抗体は、抗体のポリペプチド鎖をコードしている核酸の組換え発現によって容易に産生することができる、３つ以上の抗原結合部位を有する多価抗体（例えば四価の抗体）であることができる。多価抗体は、二量体化ドメインおよび３つ以上の抗原結合部位を含むことができる。好ましい二量体化ドメインは、Ｆｃ領域もしくはヒンジ領域を含む（またはそれからなる）。このシナリオでは、抗体は、Ｆｃ領域およびＦｃ領域に対してアミノ末端にある３つ以上の抗原結合部位を含む。本明細書における好ましい多価抗体は、３〜約８個、好ましくは４個の抗原結合部位を含む（またはそれからなる）。多価抗体は、少なくとも１本のポリペプチド鎖（好ましくは２本のポリペプチド鎖）を含み、ポリペプチド鎖（複数可）は２個以上の可変ドメインを含む。例えば、ポリペプチド鎖（複数可）は、ＶＤ１−（Ｘ１）ｎ−ＶＤ２−（Ｘ２）ｎ−Ｆｃを含んでいてよく、ＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域の１本のポリペプチド鎖であり、Ｘ１およびＸ２はアミノ酸またはポリペプチドを表し、ｎは０または１である。例えば、ポリペプチド鎖（複数可）は、ＶＨ−ＣＨ１−柔軟なリンカー−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖；またはＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ領域鎖を含み得る。本明細書中の多価抗体は、好ましくは、少なくとも２個（好ましくは４個）の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに含む。本明細書中の多価抗体は、例えば、約２〜約８個の軽鎖可変ドメインポリペプチドを含み得る。ここで企図する軽鎖可変ドメインポリペプチドは、軽鎖可変ドメインを含み、任意選択でＣＬドメインをさらに含む。
【０１５４】
本発明の抗体には、単鎖抗体がさらに含まれる。
【０１５５】
特定の実施形態では、本発明の抗体は内部移行抗体である。
【０１５６】
本明細書中に記載する抗体のアミノ酸配列修飾（複数可）が企図される。例えば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、適切なヌクレオチド変化を、抗体もしくはその鎖をコードしているポリヌクレオチド内に導入することによって、またはペプチド合成によって調製し得る。そのような修飾には、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／またはそれへの挿入および／またはその置換が含まれる。欠失、挿入、および置換の任意の組合せを行って最終抗体に到達し得るが、ただし、最終の構築体は所望の特徴を保有することを前提とする。また、アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数または位置を変化させるなど、抗体の翻訳後プロセスも変更し得る。本発明のポリペプチドについて上述した変異および修飾のうちの任意のものを、本発明の抗体に含め得る。
【０１５７】
突然変異誘発に好ましい位置である抗体の特定の残基または領域を同定するための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻：１０８１〜１０８５頁（１９８９年）によって記載されている「アラニン走査突然変異誘発」と呼ばれる。ここでは、残基または標的残基の基を同定し（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、およびｇｌｕなどの荷電残基）、中性または負荷電アミノ酸（最も好ましくは、アラニンまたはポリアラニン）によって置き換えて、アミノ酸とＰＳＣＡ抗原との相互作用に影響を与える。その後、置換に対して機能的感度を実証するアミノ酸位置を、追加または他の変異を置換部位にまたはその部位のために導入することによって洗練する。したがって、アミノ酸配列変異を導入する部位は事前に決定されているが、突然変異の性質自体は事前に決定されていない。例えば、所定の部位における突然変異の性能を分析するために、ａｌａ走査またはランダム突然変異誘発を標的コドンまたは領域で実施し、発現された抗抗体変異体を所望の活性についてスクリーニングする。
【０１５８】
アミノ酸配列挿入には、１個の残基から百個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノおよび／またはカルボキシル末端の融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体または細胞傷害性ポリペプチドと融合した抗体が含まれる。他の抗体の挿入変異体には、抗体のＮまたはＣ末端に、酵素（例えばＡＤＥＰＴに対するもの）または抗体の血清半減期を増加させるポリペプチドを融合したものが含まれる。
【０１５９】
別の種類の変異体は、アミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗体分子中の少なくとも１つのアミノ酸残基が異なる残基によって置き換えられている。置換突然変異誘発の最も興味深い部位には超可変領域が含まれるが、ＦＲの変更も企図される。保存的および非保存的置換が企図される。
【０１６０】
抗体の生物学的特性の実質的な改変は、（ａ）置換領域中のポリペプチド主鎖の、例えば、シートもしくはヘリックスコンホメーションとしての構造、（ｂ）分子の標的部位での荷電もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のバルクを維持することに関してその効果が顕著に異なる置換を選択することによって達成される。
【０１６１】
また、抗体の正しいコンホメーションの維持に関与していない任意のシステイン残基は、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋結合を防止するために、一般にセリンで置換し得る。逆に、その安定性を改善するために（特に、抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合）、システイン結合（複数可）を抗体に付加し得る。
【０１６２】
置換変異体の一種は、親抗体の１つまたは複数の超可変領域残基を置換することを含む。一般に、さらなる開発のために選択する生じる変異体（複数可）は、それを作製した親抗体と比較して生物学的特性が改善されている。そのような置換変異体を作製する好都合な方法は、ファージディスプレイを用いた親和性成熟を含む。手短に述べると、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７個の部位）を突然変異させて、それぞれの部位のすべての可能なアミノ置換を作製する。そのようにして作製された抗体変異体を、それぞれの粒子内にパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ生産物との融合体として、一価の様式で線維状ファージ粒子からディスプレイされる。その後、本明細書中に開示したように、ファージディスプレイ変異体をその生物活性（例えば結合親和性）についてスクリーニングする。修飾の候補超可変領域部位を同定するために、アラニン走査突然変異誘発を行って、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定することができる。あるいは、またはそれに加えて、抗体と抗原または感染細胞との間の接触点を同定するために、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析することが有益であり得る。そのような接触残基および隣接残基は、本明細書中に詳述する技術に従った置換の候補である。そのような変異体を作製した後、変異体のパネルを本明細書中に記載のようにスクリーニングに供し、１つまたは複数の関連アッセイにおいて優れた特性を有する抗体を、さらなる開発のために選択し得る。
【０１６３】
抗体の別の種類のアミノ酸変異体は、抗体の元のグリコシル化パターンを変更する。変更するとは、抗体中に見つかる１つもしくは複数の炭水化物部分を欠失させる、および／または抗体中に存在しない１つもしくは複数のグリコシル化部位を付加することを意味する。
【０１６４】
抗体のグリコシル化は、典型的にはＮ結合またはＯ結合のどちらかである。Ｎ結合とは、炭水化物部分がアスパラギン残基の側鎖に結合することである。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニン（式中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）が、炭水化物部分がアスパラギン側鎖に酵素結合するための認識配列である。したがって、これらのトリペプチド配列のどちらかをポリペプチド中に存在させることで、潜在的なグリコシル化部位が作製される。Ｏ結合グリコシル化とは、糖のＮ−アセイルガラクトサミン（Ｎ−ａｃｅｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つが、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンに結合することをいうが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも用い得る。
【０１６５】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、上述のトリペプチド配列のうちの１つまたは複数を含むようにアミノ酸配列を変更することによって、好都合に達成される（Ｎ結合グリコシル化部位）。また、変更は、１つまたは複数のセリンまたはスレオニン残基を元の抗体の配列に付加する、またはそれを置換することによっても行い得る（Ｏ結合グリコシル化部位）。
【０１６６】
本発明の抗体は、エフェクター機能に関して、例えば、抗体の抗原依存性細胞媒介性細胞傷害（ａｎｔｉｇｅｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を増強するために、改変されている。これは、抗体のＦｃ領域中に１つまたは複数のアミノ酸置換を導入することによって達成し得る。あるいは、またはそれに加えて、システイン残基（複数可）をＦｃ領域内の導入し、それによりこの領域中に鎖間ジスルフィド結合の形成を可能にし得る。そのようにして作製されたホモ二量体抗体は、改善した内部移行能力および／または増加した補体媒介性細胞死滅および抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有し得る。Ｃａｒｏｎら、Ｊ．  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．、１７６巻：１１９１〜１１９５頁（１９９２年）およびＳｈｏｐｅｓ、Ｂ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８巻：２９１８〜２９２２頁（１９９２年）を参照されたい。Ｗｏｌｆｆら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３巻：２５６０〜２５６５頁（１９９３年）に記載のヘテロ二官能性架橋結合剤を用いて、増強した感染抑制活性を有するホモ二量体抗体も調製し得る。あるいは、二重Ｆｃ領域を有し、したがって増強した補体溶解およびＡＤＣＣ能力を有し得る抗体を操作することができる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３巻：２１９〜２３０頁（１９８９年）を参照されたい。
【０１６７】
抗体の血清半減期を増加させるために、例えば米国特許第５，７３９，２７７号に記載のように、抗体（特に抗体断片）内にサルベージ受容体結合エピトープを取り込み得る。本明細書中で使用する用語「サルベージ受容体結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子の増加するｉｎ  ｖｉｖｏ血清半減期を担っているＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す。
【０１６８】
本発明の抗体はまた、例えば精製または診断的用途で使用するためのエピトープタグまたは標識を含むように改変し得る。本発明はまた、細胞傷害剤または成長阻害性剤などの抗癌剤とコンジュゲートした抗体を含む免疫コンジュゲートを用いた治療にも関する。そのような免疫コンジュゲートの作製に有用な化学療法剤は上述した。
【０１６９】
抗体と、カリケアマイシン、マイタンシノイド、トリコテン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｎｅ）、およびＣＣ１０６５、ならびに毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体などの１つまたは複数の小分子毒素とのコンジュゲートも、本明細書中に企図される。
【０１７０】
好ましい一実施形態では、本発明の抗体（完全長または断片）は、１つまたは複数のマイタンシノイド分子とコンジュゲートしている。マイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害することによって作用する有糸分裂（ｍｉｔｏｔｏｔｉｃ）阻害剤である。マイタンシンは、東アフリカの低木Ｍａｙｔｅｎｕｓ  ｓｅｒｒａｔａから最初に単離された（米国特許第３，８９６，１１１号）。続いて、特定の微生物も、マイタンシノールおよびＣ−３マイタンシノールエステルなどのマイタンシノイドを産生することが発見された（米国特許第４，１５１，０４２号）。合成マイタンシノールならびにその誘導体および類似体は、例えば、米国特許第４，１３７，２３０号；第４，２４８，８７０号；第４，２５６，７４６号；第４，２６０，６０８号；第４，２６５，８１４号；第４，２９４，７５７号；第４，３０７，０１６号；第４，３０８，２６８号；第４，３０８，２６９号；第４，３０９，４２８号；第４，３１３，９４６号；第４，３１５，９２９号；第４，３１７，８２１号；第４，３２２，３４８号；第４，３３１，５９８号；第４，３６１，６５０号；第４，３６４，８６６号；第４，４２４，２１９号；第４，４５０，２５４号；第４，３６２，６６３号；および第４，３７１，５３３号に開示されている。
【０１７１】
その治療指数を改善する試みとして、マイタンシンおよびマイタンシノイドを、腫瘍細胞抗原に特異的に結合する抗体とコンジュゲートさせた。マイタンシノイドを含む免疫コンジュゲートおよびその治療上の使用は、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号、第５，４１６，０６４号および欧州特許ＥＰ０４２５２３５Ｂ１に開示されている。Ｌｉｕら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、９３巻：８６１８〜８６２３頁（１９９６年）は、ヒト結腸直腸癌に対して誘導されるモノクローナル抗体Ｃ２４２と連結した、ＤＭ１と命名されたマイタンシノイドを含む免疫コンジュゲートを記載している。このコンジュゲートは、培養結腸癌細胞に対して細胞傷害性が高いことが判明し、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍増殖アッセイにおいて抗腫瘍活性を示した。
【０１７２】
抗体−マイタンシノイドのコンジュゲートは、抗体またはマイタンシノイド分子のどちらの生物活性を顕著に減少させずに、抗体をマイタンシノイド分子と化学的に連結することによって調製する。抗体分子１個あたり平均して３〜４個のマイタンシノイド分子がコンジュゲートしたものが、抗体の機能または溶解度に負の影響を与えずに標的細胞の細胞傷害を増強することにおいて有効性が示されているが、１個の毒素／抗体の分子でさえも、裸の抗体を使用するよりも細胞傷害を増強させると予測される。マイタンシノイドは当技術分野で周知であり、既知の技術によって合成するか、天然源から単離することができる。適切なマイタンシノイドは、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号ならびに本明細書中で上記引用した他の特許および非特許刊行物中に開示されている。好ましいマイタンシノイドは、マイタンシノールおよびマイタンシノール分子の芳香環中または他の位置で修飾されたマイタンシノール類似体、例えば様々なマイタンシノールエステルである。
【０１７３】
例えば、米国特許第５，２０８，０２０号または欧州特許ＥＰ０４２５２３５Ｂ１、およびＣｈａｒｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５２巻：１２７〜１３１頁（１９９２年）に開示されているものを含めて、抗体コンジュゲートを作製するための多くの連結基が当技術分野で知られている。連結基には、上記同定した特許中に開示したジスルフィド基、チオエーテル基、酸に不安定な基、光に不安定な基、ペプチダーゼに不安定な基、またはエステラーゼに不安定な基が含まれ、ジスルフィドおよびチオエーテル基が好ましい。
【０１７４】
免疫コンジュゲートは、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣＬなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルエルデヒド（ｇｌｕｔａｒｅｄｅｈｙｄｅ）など）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６−ジイソシアネートなど）、およびビス−活性フッ素化合物（１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）などの、様々な二官能性タンパク質カップリング剤を用いて作製し得る。特に好ましいカップリング剤には、ジスルフィド結合を提供するＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．、１７３巻：７２３〜７３７頁［１９７８年］）およびＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）が含まれる。例えば、リシン免疫毒素を、Ｖｉｔｅｔｔａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３８巻：１０９８頁（１９８７年）に記載のように調製することができる。炭素−１４で標識した１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドを抗体とコンジュゲートさせるための例示的なキレート化剤である。ＷＯ９４／１１０２６を参照されたい。リンカーは、細胞傷害薬の細胞中での放出を促進する「切断可能リンカー」であり得る。例えば、酸に不安定なリンカー、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５２巻：１２７〜１３１頁（１９９２年）；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用し得る。
【０１７５】
別の目的免疫コンジュゲートは、１つまたは複数のカリケアマイシン分子とコンジュゲートした抗体を含む。抗生物質のカリケアマイシンファミリーは、ピコモル濃度以下で二本鎖ＤＮＡの切断を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製には、米国特許第５，７１２，３７４号、第５，７１４，５８６号、第５，７３９，１１６号、第５，７６７，２８５号、第５，７７０，７０１号、第５，７７０，７１０号、第５，７７３，００１号、第５，８７７，２９６号（すべてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｙａｎａｍｉｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を参照されたい。抗体がコンジュゲートすることができる別の薬物は、葉酸代謝拮抗剤であるＱＦＡである。カリケアマイシンおよびＱＦＡは、どちらも細胞内作用部位を有しており、形質膜を容易に横断しない。したがって、これらの薬剤の、抗体に媒介される内部移行による細胞取り込みは、その細胞傷害効果を大きく増強させる。
【０１７６】
本発明の抗体とコンジュゲートさせることができる他の薬剤の例には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｉｃｉｎ）、ビンクリスチンおよび５−フルオロウラシル、米国特許第５，０５３，３９４号、第５，７７０，７１０号に記載されているＬＬ−Ｅ３３２８８複合体として総合的に知られている薬剤ファミリー、ならびにエスペラミシン（米国特許第５，８７７，２９６号）が含まれる。
【０１７７】
使用できる酵素活性毒素およびその断片には、例えば、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ
ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンが含まれる。例えば、ＷＯ９３／２１２３２を参照されたい。
【０１７８】
本発明には、さらに、抗体と核溶解活性を有する化合物（例えば、リボヌクレアーゼまたはＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮａｓｅ）との間で形成した免疫コンジュゲートも含まれる。
【０１７９】
感染細胞を選択的に破壊するためには、抗体は放射性の高い原子を含む。様々な放射性同位体が、放射コンジュゲート抗ＰＳＣＡ抗体の生成に利用可能である。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｃ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２およびＬｕの放射性同位体が含まれる。コンジュゲートを診断のために使用する場合、シンチグラフィー研究のための放射性原子、例えば、Ｔｃ９９ｍもしくはＩ１２３、または核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（磁気共鳴画像法、ｍｒｉとしても知られる）のためのスピン標識、例えば、ヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガンもしくは鉄を含み得る。
【０１８０】
放射標識または他の標識は、既知の方法によってコンジュゲート内に取り込ませる。例えば、ペプチドを、例えば、水素の代わりにフッ素−１９を含む適切なアミノ酸前駆体を用いて、生合成または化学アミノ酸合成し得る。Ｔｃ９９ｍまたはＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８およびＩｎ１１１などの標識は、ペプチド中のシステイン残基を介して結合することができる。イットリウム−９０はリシン残基を介して結合することができる。ＩＯＤＯＧＥＮ方法（Ｆｒａｋｅｒら（１９７８年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．、８０巻：４９〜５７頁を用いて、ヨウ素−１２３を取り込むことができる。「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｇｒａｐｈｙ」（Ｃｈａｔａｌ，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年）は、他の方法を詳細に記載している。
【０１８１】
あるいは、抗体および細胞傷害剤を含む融合タンパク質を、例えば、組換え技術またはペプチド合成によって作製する。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの２つの部分を、互いに隣接して、またはコンジュゲートの所望の特性を破壊しないリンカーペプチドをコードしている領域によって隔てられてコードしている、それぞれの領域を含み得る。
【０１８２】
本発明の抗体は、抗体を、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法剤、ＷＯ８１／０１１４５参照）を活性のある抗癌薬へと変換するプロドラッグ活性化酵素とコンジュゲートさせることによる、抗体依存性酵素媒介性プロドラッグ療法（ＡＤＥＴ）でも使用する（例えば、ＷＯ８８／０７３７８および米国特許第４，９７５，２７８号参照）。
【０１８３】
ＡＤＥＰＴに有用な免疫コンジュゲートの酵素構成成分には、プロドラッグを、より活性のある細胞傷害性のあるその形態へと変換する様式でプロドラッグに作用することができる、任意の酵素が含まれる。本発明の方法において有用な酵素には、それだけには限定されないが、リン酸塩含有プロドラッグを遊離薬物に変換するために有用なアルカリフォスファターゼ；硫酸塩含有プロドラッグを遊離薬物に変換するために有用なアリールスルファターゼ；無毒性５−フルオロシトシンを抗癌薬５−フルオロウラシルに変換するために有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離薬物に変換するために有用なプロテアーゼ、例えば、ｓｅｒｒａｔｉａプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼならびにカテプシン（カテプシンＢおよびＬなど）等；Ｄ−アミノ酸置換基を含むプロドラッグを変換するために有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離薬物に変換するために有用な炭水化物切断酵素、例えば、β−ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼ；β−ラクタムで誘導体化した薬物を遊離薬物に変換するために有用なβ−ラクタマーゼ；そのアミン窒素をそれぞれフェノキシアセチルまたはフェニルアセチル基で誘導体化した薬物を遊離薬物に変換するために有用な、ペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼなどのペニシリンアミダーゼが含まれる。あるいは、当技術分野で「抗体酵素」としても知られている、酵素活性を有する抗体を使用して、本発明のプロドラッグを遊離活性薬物に変換することができる（例えば、Ｍａｓｓｅｙ、Ｎａｔｕｒｅ、３２８巻：４５７〜４５８頁（１９８７年）参照）。抗体−抗体酵素のコンジュゲートは、抗体酵素を感染細胞集団に送達するために、本明細書中に記載のように調製することができる。
【０１８４】
本発明の酵素は、上述のヘテロ二官能性架橋結合試薬を使用することなどの当技術分野で周知の技術によって、抗体と共有結合させることができる。あるいは、少なくとも本発明の酵素の機能的に活性のある部分に連結した少なくとも本発明の抗体の抗原結合領域を含む融合タンパク質を、当技術分野で周知の組換えＤＮＡ技術を用いて構築することができる（例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、３１２巻：６０４〜６０８頁（１９８４年）を参照されたい。
【０１８５】
抗体の他の修飾が本明細書中で企図される。例えば、抗体を、様々な非タンパク質ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーのうちの１つと連結させ得る。また、抗体は、例えば、コアセルベーション技術もしくは界面重合（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタシレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセル）によって調製したマイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系中（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）、またはマクロ乳濁液中に封入してもよい。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｏｓｌｏ，  Ａ．編、（１９８０年）に開示されている。
【０１８６】
また、本明細書中に開示した抗体は、免疫リポソームとしても調合する。「リポソーム」は、薬物を哺乳動物に送達するために有用な、様々な種類の脂質、リン脂質および／または界面活性剤からなる小さな小胞である。リポソームの構成成分は、一般的に、生体膜の脂質配置に類似の二重層の形態で配置されている。抗体を含むリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８２巻：３６８８頁（１９８５年）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、７７巻：４０３０頁（１９８０年）；米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号；ならびに１９９７年１０月２３日に公開のＷＯ９７／３８７３１などに記載されているように、当技術分野で知られている方法によって調製する。循環時間が増強されたリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【０１８７】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発方法によって作製することができる。リポソームを、定義された孔径のフィルターを通して押出して、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ’断片は、Ｍａｒｔｉｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２５７巻：２８６〜２８８頁（１９８２年）に記載のように、ジスルフィド交換反応によって、リポソームとコンジュゲートさせることができる。化学療法剤を任意選択でリポソーム内に含める。Ｇａｂｉｚｏｎら、Ｊ．  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．、８１巻（１９号）１４８４頁（１９８９年）を参照されたい。
【０１８８】
本発明の抗体またはその断片は、様々な生物学的または機能的特徴のうちの任意のものを保有し得る。特定の実施形態では、これらの抗体は、インフルエンザＡに特異的な抗体またはＭ２タンパク質に特異的な抗体であり、これは、これらの抗体が、正常な対照細胞と比較して、それぞれインフルエンザＡまたはそのＭ２タンパク質に特異的に結合する、または優先的に結合することを示す。特定の実施形態では、抗体はＨｕＭ２ｅ抗体であり、これは、これらの抗体が、正常な対照細胞と比較して、Ｍ２ｅタンパク質、好ましくは、Ｍ２タンパク質が細胞中で発現されている、またはウイルス上に存在する場合にのみ存在するＭ２ｅドメインのエピトープに特異的に結合することを示す。
【０１８９】
特定の実施形態では、本発明の抗体は、この抗体が特異的または優先的に結合するポリペプチドまたは細胞の生物活性を部分的または完全に遮断または阻害する、拮抗抗体である。他の実施形態では、本発明の抗体は、この抗体が結合する感染細胞の成長を部分的または完全に遮断または阻害する、成長阻害抗体である。別の実施形態では、本発明の抗体はアポトーシスを誘導する。さらに別の実施形態では、本発明の抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害または補体依存性細胞傷害を誘導または促進する。
【０１９０】
インフルエンザウイルスに特異的な抗体を同定および産生する方法
本発明は、実施例４に例示されるＨｕＭ２ｅ抗体の同定のための新規方法を提供する。これらの方法は、感染性病原体によって細胞表面に発現される他のポリペプチド、またはさらに感染性病原体それ自体の表面に発現されるポリペプチドに特異的な抗体を同定するために容易に適応され得る。
【０１９１】
全体として方法は、感染性病原体に感染したまたはそれに対するワクチン接種を受けた患者から血清試料を得ることを含む。これらの血清試料は、次いで感染性病原体に関連する特定のポリペプチド、例えば感染性病原体感染細胞の表面に特異的に発現されるが、未感染細胞ではされないポリペプチドなどに特異的な抗体を含有するものを同定するために選別される。具体的な実施形態において血清試料は、感染細胞の表面に発現されるポリペプチドを発現する発現ベクターをトランスフェクトした細胞を試料と接触させることによって選別される。
【０１９２】
目的の感染性病原体ポリペプチドに特異的な抗体を含有する血清を有すると患者が同定されると、同じ患者から得られた単核細胞および／またはＢ細胞は、本明細書に記載の任意の方法または当技術分野において利用可能な任意の方法を使用して抗体を産生する細胞またはそのクローンを同定するために、使用される。抗体を産生するＢ細胞が同定されると、抗体の可変領域またはその断片をコードするｃＤＮＡが、標準的ＲＴ−ＰＣＲベクターおよび保存された抗体配列に特異的なプライマーを使用してクローニングされ、目的の感染性病原体ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体の組換え産生のために使用される発現ベクターにサブクローニングされ得る。
【０１９３】
一実施形態において本発明は、インフルエンザＡ感染細胞に特異的に結合する抗体を同定するための方法であって、インフルエンザＡウイルスまたはＭ２タンパク質を発現する細胞を、インフルエンザＡに感染した患者から得た生物試料と接触させるステップ、細胞に結合する生物試料中の抗体の量を決定するステップ、および決定された量を対照値と比較するステップを含み、決定された値が対照値より少なくとも２倍を超えて大きい場合にインフルエンザＡ感染細胞に特異的に結合する抗体が示唆される方法を提供する。
【０１９４】
種々の実施形態においてＭ２タンパク質を発現する細胞は、インフルエンザＡウイルス感染細胞またはＭ２タンパク質を発現するポリヌクレオチドをトランスフェクトした細胞である。代替えとして細胞は、Ｍ２ｅドメインおよび、タンパク質が依然として細胞に会合し、かつ完全長Ｍ２タンパク質中に存在する場合と同様の様式でＭ２ｅドメインが細胞表面に存在する十分な追加的Ｍ２配列を含むＭ２タンパク質の一部を発現できる。Ｍ２発現ベクターを調製し、本明細書に記載のものを含む適切な細胞にトランスフェクトする方法は、Ｍ２配列が公的に入手可能であるという観点から容易に達成され得る。例えば、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＩＳＤ）、（Ｍａｃｋｅｎら、２００１年、「Ｔｈｅ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  ａ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｎ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ」ｉｎ  Ｏｐｔｉｏｎｓ
ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ＩＶ．  Ａ．Ｄ．Ｍ．Ｅ．、Ｏｓｔｅｒｈａｕｓ  ＆  Ｈａｍｐｓｏｎ（編）、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、１０３〜１０６頁に記載のワールドワイドウェブ上のｆｌｕ．ｌａｎ１．ｇｏｖ）およびＴｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＴＩＧＲ）のＭｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＭＳＣ）（ワールドワイドウェブ上のｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｍｓｃ／ｉｎｆｌ＿ａ＿ｖｉｒｕｓ．ｓｈｔｍｌ）を参照されたい。
【０１９５】
Ｍ２ｅ発現細胞または上に記載のウイルスは、インフルエンザＡに感染した患者から得た生物試料を、Ｍ２ポリペプチドを発現する細胞に選択的に結合する抗体の存在について標準的生物学的技術を使用して選別するために使用される。例えば、特定の実施形態において抗体は、標識されることができ、例えばＦＭＡＴまたはＦＡＣ分析を使用して、細胞に関連する標識の存在を検出し得る。具体的な実施形態において生物試料は、血液、血清、血漿、気管支洗浄物または唾液である。本発明の方法は、ハイスループットな技術を使用して実施され得る。
【０１９６】
同定されたヒト抗体は、次いでさらに特徴付けられ得る。例えば、抗体の結合のために必要または十分であるＭ２ｅタンパク質中の特定のコンホーメーションエピトープは、例えば発現されるＭ２ｅポリペプチドの部位特異的変異誘発を使用して決定され得る。これらの方法は、細胞表面に発現される任意のタンパク質に結合するヒト抗体を同定するために容易に適用され得る。さらにこれらの方法は、組換えＭ２ｅを発現する細胞またはウイルス感染細胞ではなく、ウイルス自体への抗体の結合を決定するためにも適用され得る。
【０１９７】
抗体、その可変領域またはその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド配列は、ＨｕＭ２ｅ抗体の組換え産生のための発現ベクターにサブクローニングされ得る。一実施形態においてこれは、同定されたＨｕＭ２ｅ抗体を含有する血清からの患者由来の単核細胞を得るステップ、単核細胞からＢ細胞クローンを産生するステップ、Ｂ細胞を抗体産生形質細胞になるように誘導するステップ、およびＨｕＭ２ｅ抗体を含有するかどうかを決定するために形質細胞によって産生された上清を選別するステップによって達成される。ＨｕＭ２ｅ抗体を産生するＢ細胞クローンが同定されると、ＨｕＭ２ｅ抗体の可変領域またはその一部をコードするＤＮＡをクローニングするために逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）が実施される。これらの配列は、次いでヒトＨｕＭ２ｅ抗体の組換え産生に適する発現ベクターにサブクローニングされる。結合特異性は、Ｍ２ｅポリペプチドを発現する細胞に結合する組換え抗体の能力を決定することによって確認され得る。
【０１９８】
本明細書に記載する方法の具体的な実施形態において、末梢血またはリンパ節から単離されたＢ細胞は、例えばそれらがＣＤ１９陽性であることに基づいて選別され、かつ例えば１ウェルあたり単一の細胞特異性ほどの少なさで、例えば９６、３８４または１５３６ウェルの構造（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）に蒔かれる。細胞は、抗体産生細胞、例えば形質細胞に分化するように誘導され、培養上清は回収され、例えばＦＭＡＴまたはＦＡＣＳ分析を使用して感染性病原体ポリペプチドをその表面に発現する細胞への結合について検査される。次いで、陽性ウェルを全ウェルＲＴ−ＰＣＲにかけて、クローン娘形質細胞によって発現されるＩｇＧ分子の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を増幅する。重鎖および軽鎖可変領域またはその一部をコードする得られたＰＣＲ産物は組換え発現のためのヒト抗体発現ベクターにサブクローニングされる。得られた組換え抗体は、次いでそれらの本来の結合特異性を確認するために検査され、かつ感染性病原体の種々の分離株にわたる全体の特異性についてさらに検査され得る。
【０１９９】
したがって一実施形態においてＨｕＭ２ｅ抗体を同定する方法は、以下の通り実施される。第１に、完全長またはほぼ完全長のＭ２  ｃＤＮＡをＭ２タンパク質発現のための細胞系にトランスフェクトする。第２に、個々のヒト血漿試料または血清試料を、細胞発現Ｍ２に結合する抗体について検査する。最後に、血漿陽性または血清陽性の個体由来のＭＡｂを同じ細胞発現Ｍ２への結合について特徴付ける。さらにＭＡｂの精密な特異性のさらなる定義付けは、この時点で実施することができる。
【０２００】
これらの方法は、（ａ）直鎖状Ｍ２ｅペプチド内のエピトープ、（ｂ）Ｍ２ｅの複数のバリアントにおける共通エピトープ、（ｃ）Ｍ２ホモ四量体のコンフォーメーション決定基、および（ｄ）Ｍ２ホモ四量体の複数のバリアントの共通コンフォーメーション決定基、に特異的な抗体を含む様々な異なるＨｕＭ２ｅ抗体を同定するために実施され得る。最後の分類が、この特異性がインフルエンザのすべてのＡ株についておそらく特異的であることから特に望ましい。
【０２０１】
本発明のＨｕＭ２ｅ抗体またはその一部をコードするポリヌクレオチドは、ヒト抗体ポリペプチドの保存領域に特異的なプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応による増幅を含む当技術分野において利用可能な方法および本明細書に記載の方法により、ＨｕＭ２ｅ抗体を発現する細胞から単離され得る。例えば、軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、ＷＯ９２／０２５５１、米国特許第５，６２７，０５２号、またはＢａｂｃｏｏｋら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３巻：７８４３〜４８頁（１９９６年）に記載の分子生物学的技術によりＢ細胞からクローニングされ得る。特定の実施形態において、ＨｕＭ２ｅ抗体を発現するクローン娘形質細胞によって発現されるＩｇＧ分子の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の両方の全体または一領域をコードするポリヌクレオチドは、サブクローニングされ、かつ配列決定される。コードされたポリペプチドの配列は、ポリヌクレオチド配列から容易に決定され得る。
【０２０２】
本発明のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドは、本発明の抗体およびポリペプチドを組換え的に産生するために、当技術分野において公知の手順および本明細書に記載の手順を使用して発現ベクターにサブクローニングされ得る。
【０２０３】
Ｍ２ｅまたは感染細胞もしくは組織への抗体（またはその断片の）結合特性は、一般に例えば、免疫蛍光に基づくアッセイ（免疫組織化学（ＩＨＣ）および／または蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）など）が挙げられる免疫検出法を使用して決定および評価され得る。免疫アッセイ法は、抗体がインフルエンザＡの１つまたは複数の特定の株由来のＭ２ｅに特異的に結合し、かつ正常対照細胞を認識しない、または交差反応しないかどうかを決定するための対照および手順を含むことができる。
【０２０４】
感染性病原体またはそのポリペプチド、例えばＭ２に対する抗体を産生する患者を同定するための血清の予備選別に続いて、本発明の方法は、典型的には患者または被験体からあらかじめ得た生物試料からのＢ細胞の単離または精製を含む。患者または被験体は、現在もしくは以前に特定の疾患または感染症であると診断されたもしくは疑われたもしくは有していたことがあってよく、または患者もしくは被験体は、特定の疾患または感染症を有さないと考えられてもよい。典型的には患者または被験体は、哺乳類であり、具体的な実施形態においてはヒトである。生物試料は、リンパ節もしくはリンパ節組織、胸水、末梢血、腹水、腫瘍組織、または脳脊髄液（ＣＳＦ）をこれだけに限らないが含むＢ細胞を含有する任意の試料であり得る。種々の実施形態においてＢ細胞は、特定の疾患または感染症に罹患した生物試料などの様々な種類の生物試料から単離される。しかし、Ｂ細胞を含む任意の生物試料が本発明の任意の実施形態について使用され得ることは理解される。
【０２０５】
単離されるとＢ細胞は、例えば、プラズマ細胞、形質芽細胞または形質細胞へのＢ細胞の増殖または発達を支持する条件下でＢ細胞を培養することによって抗体を産生するように誘導される。次いで抗体を、典型的にはハイスループットな技術を使用して、標的抗原、例えば特定の組織、細胞、感染性病原体またはポリペプチドに特異的に結合する抗体を同定するために選別される。特定の実施形態において、特異抗原、例えば抗体が結合する細胞表面ポリペプチドは、未知である一方で他の実施形態においては抗体が特異的に結合する抗原は既知である。
【０２０６】
本発明によりＢ細胞は、生物試料、例えば腫瘍、組織、末梢血またはリンパ節試料から当技術分野において公知かつ利用可能な任意の手段によって単離され得る。Ｂ細胞は、典型的にはＦＡＣＳによってそれらの表面のＢ細胞特異的マーカー、例えばＣＤ１９、ＣＤ１３８および／または表面ＩｇＧの存在に基づいて選別される。しかし当技術分野において既知の他の方法、例えばＣＤ１９磁性ビーズまたはＩｇＧ特異的磁性ビーズを使用するカラム精製に続くカラムからの溶出も使用できる。しかし、任意のマーカーを利用するＢ細胞の磁気分離は、特定のＢ細胞の損失を生じる場合がある。したがって特定の実施形態において、単離された細胞は選別されないが、しかし代わりに腫瘍から単離されたフィコール−精製単核細胞は、適切なまたは望ましい１ウェルあたりの特異性の数で直接蒔かれる。
【０２０７】
感染性病原体特異的抗体を産生するＢ細胞を同定するために、Ｂ細胞は典型的には低密度（例えば１ウェルあたり単一の細胞特異性、１ウェルあたり細胞１〜１０個、１ウェルあたり細胞１０〜１００個、１ウェルあたり細胞１〜１００個、１ウェルあたり細胞１０個未満、または１ウェルあたり細胞１００個未満）で、マルチウェルまたはマイクロタイタープレートに、例えば９６、３８４もしくは１５３６ウェルの構造に蒔かれる。Ｂ細胞が最初に１ウェルあたり細胞１個を超える密度で蒔かれる場合、次いで本発明の方法は、抗原特異的抗体を産生すると同定されたウェルにおいて、１ウェルあたり単一の細胞特異性が達成されるまで細胞を希釈する引き続きのステップを含むことができ、それにより抗原特異的抗体を産生するＢ細胞の同定を促進する。細胞上清またはその一部および／または細胞は、将来の検査のためおよび抗体ポリヌクレオチドの後の回収のために凍結および保存され得る。
【０２０８】
特定の実施形態においてＢ細胞は、Ｂ細胞による抗体の産生に有利な条件下で培養される。例えばＢ細胞は、抗体産生形質芽球、プラズマ細胞または形質細胞を得るためにＢ細胞の増殖および分化に有利な条件下で培養され得る。具体的な実施形態においてＢ細胞は、リポ多糖（ＬＰＳ）またはＣＤ４０リガンドなどのＢ細胞分裂促進因子の存在下で培養される。詳細な一実施形態においてＢ細胞は、それらをフィード細胞および／またはＣＤ４０リガンドなどの他のＢ細胞活性化因子とともに培養することによって抗体産生細胞に分化する。
【０２０９】
細胞培養上清またはそれらから得た抗体は、標的抗原に結合するそれらの能力について、本明細書に記載のものを含む当技術分野において利用可能な常法を使用して検査され得る。具体的な実施形態において培養上清は、標的抗原に結合する抗体の存在についてハイスループットな方法を使用して検査される。例えばＢ細胞は、複数の細胞上清を同時に採取し、かつ標的抗原に結合する抗体の存在について検査するためにロボットプレートハンドラーを使用できるようにマルチウェルマイクロタイターディッシュで培養され得る。具体的な実施形態において抗原は、ビーズ、例えば常磁性またはラテックスビーズ）に抗体／抗原複合体の捕捉を促進するために結合される。他の実施形態において抗原および抗体は、（異なる標識で）蛍光標識され、ＦＡＣＳ分析が標的抗原に結合する抗体の存在を同定するために実施される。一実施形態において抗体結合は、ＦＭＡＴ（商標）分析および装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用して決定される。ＦＭＡＴ（商標）は、生細胞またはビーズを使用する、混合および読取りの、非放射性アッセイである、ハイスループット選別のための蛍光マクロ共焦点プラットホームである。
【０２１０】
対照試料（例えば未感染細胞または異なる感染性病原体などの生物試料）と比較して、特定の標的抗原（例えば感染組織もしくは細胞、または感染性病原体などの生物試料）への抗体の結合を比較する場合における種々の実施形態において、対照試料に結合する量と比較して少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍または少なくとも１０倍多く抗体が特定の標的抗原に結合する場合に、抗体は特定の標的抗原に選択的に結合すると考えられる。
【０２１１】
抗体鎖、その可変領域またはその断片をコードするポリヌクレオチドは、当技術分野において利用可能な任意の手段を利用して細胞から単離され得る。一実施形態においてポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）例えば、重鎖または軽鎖をコードするポリヌクレオチド配列またはその相補物に特異的に結合するオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、当技術分野において利用可能な常法を使用する逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して単離される。一実施形態において陽性ウェルは、クローン娘形質細胞によって発現されるＩｇＧ分子の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を増幅するためにすべてのウェルがＲＴ−ＰＣＲにかけられる。これらのＰＣＲ産物は、配列決定され得る。
【０２１２】
重鎖可変領域および軽鎖可変領域またはその一部をコードする得られたＰＣＲ産物は、次いでヒト抗体発現ベクターにサブクローニングされ、当技術分野における常法により組換え的に発現される（例えば米国特許第７，１１２，４３９号を参照されたい）。本明細書に記載の腫瘍特異的抗体またはその断片をコードする核酸分子は、核酸切断、連結、形質転換およびトランスフェクションのための任意の種々の周知の手順により増殖または発現され得る。それにより特定の実施形態において抗体断片の発現は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉなどの原核宿主細胞においてが好ましい場合がある（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８巻：４９７〜５１５頁（１９８９年））。特定の他の実施形態において抗体またはその抗原結合断片の発現は、酵母（例えばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅおよびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、動物細胞（哺乳類細胞を含む）または植物細胞を含む真核宿主細胞においてが好ましい場合がある。適切な動物細胞の例として、これだけに限らないがミエローマ、ＣＯＳ、ＣＨＯ、またはハイブリドーマ細胞が挙げられる。植物細胞の例として、タバコ、トウモロコシ、ダイズおよびイネの細胞が挙げられる。当業者に公知の方法により、かつ本開示に基づいて、核酸ベクターは、具体的な宿主系における外来配列の発現のために設計されることができ、次いで腫瘍特異的抗体（またはその断片）をコードするポリヌクレオチド配列は挿入され得る。調節エレメントは、具体的な宿主に応じて変化する。
【０２１３】
可変領域および／または定常領域をコードするポリヌクレオチドを含有する１つまたは複数の複製可能な発現ベクターは、調製され、かつ抗体の産生が生じる例えばマウスＮＳＯ系などの非産生ミエローマ細胞系またはＥ．ｃｏｌｉなどの細菌である適切な細胞系を形質転換するために使用され得る。有効な転写および翻訳を得るために、各ベクターにおけるポリヌクレオチド配列は、適切な調節配列、とりわけ可変ドメイン配列に機能的に連結されたプロモーターおよびリーダー配列を含むべきである。このような抗体産生のための具体的な方法は、一般に十分に周知であり、かつ日常的に使用される。例えば分子生物学的手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８９年、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（２００１年）も参照されたい）によって記載されている。必要ではないが、特定の実施形態において組換え抗体をコードするポリヌクレオチドの領域は、配列決定され得る。ＤＮＡ配列決定は、Ｓａｎｇｅｒら、（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ
７４巻：５４６３頁（１９７７年））および、それへの改善を含むＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｐｌｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｈａｎｄｂｏｏｋに記載のとおり実施され得る。
【０２１４】
具体的な実施形態において得られた組換え抗体またはその断片は、次いでそれらの本来の特異性を確認するために検査され、例えば関連する感染性病原体での全体の特異性についてさらに検査され得る。具体的な実施形態において、本明細書に記載の方法により同定または産生された抗体は、抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）もしくはアポトーシスを介する細胞死滅、および／または巧みにその内部移行する能力について検査される。
【０２１５】
ポリヌクレオチド
本発明は、他の態様において、ポリヌクレオチド組成物を提供する。好ましい実施形態においてこれらのポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド、例えばインフルエンザＡ、Ｍ２またはＭ２ｅに結合する抗体の可変鎖の領域をコードする。本発明のポリヌクレオチドは、１本鎖（コードまたはアンチセンス）もしくは２本鎖（ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成）のＤＮＡまたはＲＮＡ分子である。ＲＮＡ分子として、これだけに限らないがイントロンを含有し、ＤＮＡ分子に１対１形式で対応するＨｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含まないｍＲＮＡ分子が挙げられる。代替としてまたは追加的に、コード配列または非コード配列は、本発明のポリヌクレオチド中に存在する。同様に代替としてまたは追加的にポリヌクレオチドは、他の分子および／または本発明の支持物質に連結される。本発明のポリヌクレオチドは、例えば生物試料中のインフルエンザＡ抗体の存在を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイにおいて、および本発明のポリペプチドの組換え産生において使用される。
【０２１６】
したがって本発明の他の態様により、実施例１に記載のいくつかまたはすべてのポリヌクレオチド配列、実施例１に記載のポリヌクレオチド配列の相補物、および実施例１に記載のポリヌクレオチド配列の縮重バリアントを含むポリヌクレオチド組成物が、提供される。特定の好ましい実施形態において本明細書に記載のポリヌクレオチド配列は、実施例１または２に記載の配列を有するポリペプチドを含む、正常な対照未感染細胞と比較してインフルエンザＡ感染細胞に選択的に結合できるポリペプチドをコードする。さらに本発明は、本発明の任意のポリペプチドをコードするすべてのポリヌクレオチドを含む。
【０２１７】
他の関連する実施形態において本発明は、図１に記載の配列に実質的な同一性を有する、例えば本明細書に記載の方法（例えば標準的パラメータを使用するＢＬＡＳＴ分析）を使用して決定される場合に、本発明のポリヌクレオチド配列と比較して少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％またはそれを超える配列同一性を備えるポリヌクレオチドバリアントを提供する。当業者は、これらの値がコドン縮重、アミノ酸類似性、読み枠位置などを考慮して２つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するために適切に調整され得ることを認める。
【０２１８】
典型的にはポリヌクレオチドバリアントは、１つまたは複数の置換、追加、欠損および／または挿入を、好ましくはバリアントポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの免疫原結合特性が、本明細書に明確に記載のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドと比較して実質的に減少しないように含有する。
【０２１９】
追加的な実施形態において本発明は、本明細書に開示の１つまたは複数の配列と同一またはそれに相補的な配列の種々の長さの近接ストレッチを含むポリヌクレオチド断片を提供する。例えば本明細書に開示の１つまたは複数の配列の少なくとも約１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００もしくは１０００またはそれを超える近接ヌクレオチドおよびそれらの間のすべての中間の長さを含むポリヌクレオチドが本発明によって提供される。本明細書で使用する用語「中間の長さ」は、１６、１７、１８、１９など、２１、２２、２３など、３０、３１、３２など、５０、５１、５２、５３など、１００、１０１、１０２、１０３など、１５０、１５１、１５２、１５３など、などの引用値の間の任意の長さを、２００〜５００、５００〜１，０００などの間のすべての整数を含んで表して意味する。
【０２２０】
本発明の他の実施形態において、中程度から高度なストリンジェンシーの条件下で本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列もしくはその断片またはその相補配列にハイブリダイズできるポリヌクレオチド組成物が提供される。ハイブリダイゼーション技術は、分子生物学の当技術分野において周知である。例示の目的のために、本発明のポリヌクレオチドと他のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを検査するための適切な中程度にストリンジェントな条件は、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中での前洗浄、５０℃〜６０℃、５×ＳＳＣでの一晩のハイブリダイゼーション、続く０．１％ＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×ＳＳＣでの６５℃、２０分間、それぞれ２回の洗浄を含む。当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション溶液の塩含有量および／またはハイブリダイゼーションが実施される温度を変更することなどによって容易に操作できることを理解する。例えば他の実施形態において、適切な高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションの温度を、例えば６０〜６５℃または６５〜７０℃に上昇させることを除き上に記載の条件を含む。
【０２２１】
好ましい実施形態においてポリヌクレオチドバリアントまたは断片によってコードされるポリペプチドは、天然ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと同様の結合特異性（すなわち同じエピトープまたはインフルエンザＡ株に特異的または選択的に結合する）を有する。特定の好ましい実施形態において、上に記載のポリヌクレオチド、例えばポリヌクレオチドバリアント、断片およびハイブリダイズする配列は、本明細書に明確に記載のポリペプチド配列でのレベルの少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％のレベルの結合活性を有するポリペプチドをコードする。
【０２２２】
本発明のポリヌクレオチドまたはその断片は、それ自体のコード配列の長さにかかわらず、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、追加的制限酵素部位、マルチクローニングサイト、他のコードセグメントなどの他のＤＮＡ配列と、それら全体の長さがかなり変化できるように組み合わせられ得る。ほぼ任意の長さの核酸断片が、好ましくは調製および目的の組換えＤＮＡ手順における使用の容易さによって完全長が制限されて使用される。例えば完全長約１０，０００、約５０００、約３０００、約２，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００、約５０塩基対の長さなど（すべての中間の長さを含む）を有する例示的ポリヌクレオチドセグメントは、本発明の多数の実施に含まれる。
【０２２３】
遺伝コードの縮重の結果として、本明細書に記載のポリペプチドをコードする複数のヌクレオチド配列があることは当業者に理解される。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列にわずかな相同性を保有する。それにもかかわらず、本発明のポリペプチドをコードするが、コドン使用における差異によって変化するポリヌクレオチドは、本発明によって明確に意図される。さらに本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内である。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠損、追加および／または置換などの１つまたは複数の変異の結果として変更される内在性遺伝子である。得られたｍＲＮＡおよびタンパク質は、必要ではないが、変化した構造または機能を有する。対立遺伝子は、標準的技術（ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較など）を使用して同定され得る。
【０２２４】
本発明の特定の実施形態において、開示されたポリヌクレオチド配列の変異誘発は、コードされるポリペプチドの結合特異性または結合強度などの１つまたは複数の特性を変化させるために実施される。変異誘発のための技術は、当技術分野において周知であり、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの両方でバリアントを作製するために広く使用される。部位特異的変異誘発などの変異誘発手法は、本明細書に記載のポリペプチドのバリアントおよび／または誘導体の調製のために使用される。この手法によって、ポリペプチド配列中の特異的な改変がそれらをコードする基となるポリヌクレオチドの変異誘発を通じて作製される。これらの技術は、例えば、１つまたは複数の前述の考慮すべき事柄を組み込んで１つまたは複数のヌクレオチド配列の変化をポリヌクレオチドに導入することによって、配列バリアントを調製および検査するためのストレートなアプローチを提供する。
【０２２５】
部位特異的変異誘発は、十分なサイズのプライマー配列および欠損接合部を超える両側での安定な二重鎖を形成するための配列の複雑性を提供するために、ヌクレオチド配列の所望の変異および十分な数の近接ヌクレオチドを含む特定のオリゴヌクレオチド配列の使用を通じて、変異体の産生を可能にする。変異は、選択されるポリヌクレオチド配列において、ポリヌクレオチド自体の特性を改善、変更、減少、改変もしくは他に変化させるため、および／またはコードされるポリペプチドの特性、活性、組成、安定性もしくは一次配列を変更するために使用される。
【０２２６】
本発明の他の実施形態において、本明細書で提供されるポリヌクレオチド配列は、核酸ハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして、例えばＰＣＲプライマーとして使用される。目的配列に特異的にハイブリダイズするそのような核酸プローブの能力は、所与の試料における相補配列の存在の検出を可能にする。しかし、変異種プライマーまたは、他の遺伝子構築体の調製における使用のためのプライマーの調製のための配列情報の使用などの他の使用も本発明によって包含される。そのように本明細書に開示の１５ヌクレオチド長の近接配列と同じ配列であるかまたは相補的である少なくとも約１５ヌクレオチド長の近接配列の配列領域を含む本発明の核酸セグメントは、特に有用である。より長い近接した同一のまたは相補的な配列、例えば完全長配列およびすべての間の長さを含む約２０、３０、４０、５０、１００、２００、５００、１０００の配列（すべての中間の長さを含む）も、特定の実施形態において使用される。
【０２２７】
本明細書に開示のポリヌクレオチド配列と同一またはそれに相補的な１０〜１４、１５〜２０、３０、５０もしくはさらに１００〜２００ヌクレオチドほどの（加えて中間の長さも含む）近接ヌクレオチドストレッチからなる配列領域を有するポリヌクレオチド分子は、例えばサザンおよびノーザンブロッティングにおける使用のためのハイブリダイゼーションプローブとして、ならびに／または例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）における使用のためのプライマーとして具体的に意図される。断片の全サイズおよび相補ストレッチ（複数可）のサイズは、最終的には目的の使用または具体的な核酸セグメントの適用に依存する。より小さな断片は、一般的に、近接相補領域の長さが約１５から約１００ヌクレオチドの間などで変化できるハイブリダイゼーション実施形態において使用されるが、より大きな近接相補性ストレッチは、検出しようとする長さの相補配列に応じて使用され得る。
【０２２８】
長さ約１５〜２５ヌクレオチドのハイブリダイゼーションプローブの使用は、安定かつ選択的な二本鎖分子の形成を可能にする。長さ１２塩基を超えるストレッチにわたる近接相補性配列を有する分子は、ハイブリッドの安定性および選択性を増大させるためには一般に好ましいが、それにより得られる特異的ハイブリッド分子の質および程度が改善される。１５から２５までの近接ヌクレオチドの遺伝子相補性ストレッチまたは所望によりさらに長いヌクレオチドの遺伝子相補性ストレッチを有する核酸分子は、一般的に好ましい。
【０２２９】
ハイブリダイゼーションプローブは、本明細書に開示の任意の配列の任意の部分から選択される。必要とされるのは、プローブまたはプライマーとして利用しようとする長さ約１５〜２５ヌクレオチドから完全長配列までのおよび完全長配列を含む本明細書に記載の配列または配列の任意の連続部分を精査することだけである。プローブおよびプライマー配列の選択は、種々の要因によって支配される。例えば、全配列の端から端へのプライマーの使用も期待できる。
【０２３０】
本発明のポリヌクレオチド、またはその断片もしくはバリアントは、例えば自動化オリゴヌクレオチド合成機を使用して一般に実施されているとおり化学的手段によって断片を直接合成するステップによって容易に調製される。さらに断片は、米国特許第４，６８３，２０２号のＰＣＲ（商標）技術などの核酸複製技術の応用によって、選択した配列を組換え産生のための組換えベクターに導入することによって、および分子生物学の当業者に一般に知られている他の組換えＤＮＡ技術によって得られる。
【０２３１】
ベクター、宿主細胞および組換え方法
本発明は、本発明の核酸を含むベクターおよび宿主細胞、ならびに本発明のポリペプチドの製造のための組換え技術を提供する。本発明のベクターは、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、およびミニ染色体を含むいかなる種類の細胞または生物においても複製可能であるものを含む。様々な実施形態において、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターは、ポリヌクレオチドの伝播または複製に適したベクター、または本発明のポリペプチドの発現に適したベクターである。このようなベクターは当技術分野において公知であり、市販されている。
【０２３２】
本発明のポリヌクレオチドは合成され、次いで全体または一部が組み合わされ、例えば、適切な制限部位および制限酵素を使用した線状化ベクター中へのポリヌクレオチドのサブクローニングなどを含む、慣用的な分子細胞生物学技術を使用してベクター中に挿入される。本発明のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのそれぞれの鎖に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応により増幅される。これらのプライマーもまた、ベクター中へのサブクローニングを容易にするための制限酵素切断部位を含む。複製可能なベクター成分は一般に、これらに限定されるわけではないが、以下のうち１つまたは複数を含む：シグナル配列、複製開始点、および１つまたは複数のマーカーまたは選択遺伝子。
【０２３３】
本発明のポリペプチドを発現させるために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはその機能的同等物は、適切な発現ベクター、すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要なエレメントを含むベクター中に挿入される。当業者に周知の方法が、対象とするポリペプチドをコードする配列および適切な転写および翻訳制御エレメントを含む、発現ベクターを構築するために使用される。これらの方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子組換えを含む。このような技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．ら、（１９８９年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，  Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．Ｍ．ら、（１９８９年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙに記述されている。
【０２３４】
様々な発現ベクター／宿主系が、ポリヌクレオチド配列を含むおよび発現させるために利用される。これらの系は、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌などの微生物；酵母発現ベクターで形質転換した酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系；または動物細胞系を含むがこれらに限定されるわけではない。一実施形態において、対象とするモノクローナル抗体を発現する遺伝子の可変領域が、ヌクレオチドプライマーを使用してハイブリドーマ細胞から増幅される。これらのプライマーは、当業者よって合成されるか、またはマウスおよびヒト可変領域増幅用のプライマーを販売している市販の供給源（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を参照）から購入してもよい。プライマーを使用して重鎖または軽鎖の可変領域を増幅し、次いでＩｍｍｕｎｏＺＡＰ（商標）ＨまたはＩｍｍｕｎｏＺＡＰ（商標）Ｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などのベクター中にそれぞれ挿入する。これらのベクターを、次いでＥ．ｃｏｌｉ、酵母、または哺乳類ベースの発現系中に導入する。ＶＨおよびＶＬドメインの融合物を含む多量の単鎖タンパク質が、これらの方法を使用して製造される（Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２巻：４２３〜４２６頁（１９８８年）を参照）。
【０２３５】
発現ベクター中に存在する「制御エレメント」または「調節配列」は、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写および翻訳を行うベクターの非翻訳領域、例えば、エンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域である。このようなエレメントは、その強度および特異性が異なり得る。利用されるベクター系および宿主に応じて、構成的および誘導可能なプロモーターを含む任意の数の適した転写エレメントおよび翻訳エレメントが使用される。
【０２３６】
原核生物宿主での使用に適したプロモーターの例は、ｐｈｏａプロモーター、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系、アルカリフォスファターゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ならびにｔａｃプロモーターなどのハイブリッドプロモーターを含む。しかしながら、他の既知の細菌プロモーターが適している。細菌系において使用するためのプロモーターもまた、通常、ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結されたシャイン−ダルガルノ配列を含む。ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）またはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）のハイブリッドｌａｃＺプロモーターなどの誘導可能なプロモーターが使用される。
【０２３７】
様々なプロモーター配列が真核生物に関して知られており、任意のものが本発明に従って使用される。事実上すべての真核生物遺伝子は、転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置するＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写開始点から７０〜８０塩基上流に見られる別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域（Ｎは任意のヌクレオチドであってよい）である。ほとんどの真核生物遺伝子の３’末端は、コード配列の３’末端へのポリＡテールの付加のためのシグナルであり得るＡＡＴＡＡＡ配列である。これらの配列はすべて、真核生物発現ベクター中に適当に挿入される。
【０２３８】
哺乳類細胞系において、哺乳類遺伝子由来または哺乳類ウイルス由来のプロモーターが一般に好ましい。哺乳類宿主細胞中のベクターのポリペプチド発現は、例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２型）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、および最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから、異種哺乳類プロモーター、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから、および熱ショックプロモーターから得られたプロモーターによって、ただしこのようなプロモーターが宿主細胞系に適合可能であるという条件で、制御される。ポリペプチドをコードする配列の複数のコピーを含む細胞株を作出する必要があれば、ＳＶ４０またはＥＢＶに基づくベクターが、適切な選択マーカーとともに有利に使用され得る。適した発現ベクターの一例は、ＣＭＶプロモーターを含むｐｃＤＮＡ−３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）である。
【０２３９】
多くのウイルスに基づく発現系が、ポリペプチドの哺乳類発現のために利用可能である。例えば、発現ベクターとしてアデノウイルスを使用する場合、対象とするポリペプチドをコードする配列は、後期プロモーターおよび三分節リーダー配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体中にライゲーションすることができる。ウイルスゲノムの非必須のＥ１またはＥ３領域における挿入を使用して、感染宿主細胞においてポリペプチドを発現可能な生存ウイルスを得ることができる（Ｌｏｇａｎ，  Ｊ．およびＳｈｅｎｋ，  Ｔ．（１９８４年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ８１巻：３６５５〜３６５９頁）。加えて、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーなどの転写エンハンサーを使用して、哺乳類宿主細胞中の発現を増加させることができる。
【０２４０】
細菌系において、発現されるポリペプチドのための意図された使用に応じて、多くの発現ベクターのいずれかが選択される。例えば、多量が所望される場合、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現を誘導するベクターが使用される。これらのベクターは、これらに限定されるわけではないが、ハイブリッドタンパク質が産生されるように、対象とするポリペプチドをコードする配列をアミノ末端Ｍｅｔおよびそれに続く７残基のβ−ガラクトシダーゼの配列とともにインフレームでベクター中にライゲーションすることができるＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ，  Ｇ．およびＳ．Ｍ．  Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４巻：５５０３〜５５０９頁）などの多機能Ｅ．ｃｏｌｉクローニングベクターおよび発現ベクターなどを含む。ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）もまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるために使用される。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン−アガロースビーズへの吸着に続く遊離グルタチオン存在下での溶出によって溶解細胞から容易に精製することができる。このような系において製造されたタンパク質は、クローニングされた対象とするポリペプチドがＧＳＴ部分から随意に遊離できるようにヘパリン、トロンビン、または第ＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
【０２４１】
酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおいて、アルファ因子、アルコールオキシダーゼ、およびＰＧＨなどの構成的または誘導可能なプロモーターを含む多くのベクターが使用される。酵母宿主とともに使用するための他の適したプロモーター配列の例は、３−ホスホグリセリン酸キナーゼまたは、エノラーゼなどの他の糖分解酵素、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼに対するプロモーターを含む。総説については、Ａｕｓｕｂｅｌら（上記）およびＧｒａｎｔら（１９８７年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３巻：５１６〜５４４頁を参照されたい。成長条件により制御される転写というさらなる利点を有する誘導可能なプロモーターである他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素に対するプロモーター領域を含む。酵母発現において使用するための適したベクターおよびプロモーターは、ＥＰ７３，６５７にさらに記述されている。酵母エンハンサーもまた、酵母プロモーターとともに有利に使用される。
【０２４２】
植物発現ベクターが使用される場合、ポリペプチドをコードする配列の発現は、多くのプロモーターのいずれかにより駆動される。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターなどのウイルスプロモーターは、単独でまたはＴＭＶ由来のオメガリーダー配列と組み合わせて使用される（Ｔａｋａｍａｔｓｕ，  Ｎ．（１９８７年）ＥＭＢＯ  Ｊ．（６巻：３０７〜３１１頁）。別法として、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットなどの植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターが使用される（Ｃｏｒｕｚｚｉ，  Ｇ．ら（１９８４年）ＥＭＢＯ  Ｊ．３巻：１６７１〜１６８０頁；Ｂｒｏｇｌｉｅ，  Ｒ．ら（１９８４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４巻：８３８〜８４３頁；およびＷｉｎｔｅｒ，  Ｊ．ら（１９９１年）Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．７７巻：８５〜１０５頁）。これらの構築体は、直接ＤＮＡ形質転換または病原体媒介トランスフェクションによって植物細胞中に導入することができる。このような技術は、多くの一般に利用可能な総説において記述されている（例えば、Ｈｏｂｂｓ，  Ｓ．またはＭｕｒｒｙ，  Ｌ．Ｅ．、ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ  Ｙｅａｒｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２年）ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．；１９１〜１９６頁を参照されたい）。
【０２４３】
昆虫系もまた、対象とするポリペプチドを発現させるために使用される。例えば、１つのこのような系において、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞においてまたはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ幼虫において外来遺伝子を発現させるためにベクターとして使用される。ポリペプチドをコードする配列は、ポリヘドリン遺伝子などのウイルスの非必須領域中にクローニングされ、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置かれる。ポリペプチドをコードする配列の挿入がうまくいくと、ポリヘドリン遺伝子が不活性になり、外被タンパク質を欠く組換えウイルスを産生する。次いで組換えウイルスを使用して、例えば、対象とするポリペプチドが発現されるＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ幼虫を感染させる（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，  Ｅ．Ｋ．ら（１９９４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１巻：３２２４〜３２２７頁）。
【０２４４】
特定の開始シグナルもまた、対象とするポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を達成するために使用される。このようなシグナルは、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。ポリペプチド、その開始コドン、および上流配列をコードする配列が適切な発現ベクター中に挿入される場合、さらなる転写制御シグナルまたは翻訳制御シグナルは必要とされない場合がある。しかしながら、コード配列、またはその一部のみが挿入される場合、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性の翻訳制御シグナルが提供される。さらに、挿入されたポリヌクレオチドを確実に正確に翻訳するために、開始コドンは正しいリーディングフレームにある。外因性翻訳エレメントおよび開始コドンは、天然および合成の様々な起源のものである。
【０２４５】
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増加される。例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテインおよびインスリンをコードする遺伝子において同定されたものなどを含む、多くのエンハンサー配列が知られている。しかしながら典型的には、真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーが使用される。例は、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ  １００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーを含む。また、真核生物プロモーターの活性化のためのエンハンサーエレメントに関するＹａｎｉｖ、Ｎａｔｕｒｅ  ２９７巻：１７〜１８頁（１９８２年）も参照されたい。エンハンサーは、ポリペプチドをコードする配列に対して５’または３’の位置でベクター中にスプライシングされるが、好ましくはプロモーターから５’側に位置する。
【０２４６】
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物由来の有核細胞）において使用される発現ベクターもまた、典型的に、転写終結のためおよびｍＲＮＡの安定化のために必要な配列を含む。このような配列は、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’、および場合により３’非翻訳領域から一般に利用可能である。これらの領域は、抗ＰＳＣＡ抗体をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分においてポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６およびそこに記載の発現ベクターを参照されたい。
【０２４７】
本明細書のベクターにおいてＤＮＡをクローニングまたは発現するために適した宿主細胞は、上述した原核生物、酵母、植物または高等真核生物の細胞である。この目的のために適した原核生物の例は、グラム陰性またはグラム陽性細菌などの真正細菌、例えば、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａなどのＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ（例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ（例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃａｎｓ）、およびＳｈｉｇｅｌｌａ、ならびにＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ（例えば、１９８９年４月１２日公開のＤＤ２６６，７１０に開示されているＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ４１Ｐ）などのＢａｃｉｌｌｉ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなどのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓを含む。１つの好ましいＥ．ｃｏｌｉクローニング宿主は、Ｅ．ｃｏｌｉ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）であるが、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）、およびＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）などの他の株も適する。これらの例は、限定するものではなく例示的なものである。
【０２４８】
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、または一般的なパン酵母は、下等真核生物宿主微生物の中で最もよく使用される。しかしながら、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ；例えば、Ｋ  ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ  ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、およびＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓなどのＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ宿主；ｙａｒｒｏｗｉａ（ＥＰ４０２，２２６）；Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＥＰ１８３，０７０）；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ（ＥＰ２４４，２３４）；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ；Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓなどのＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ；ならびに、例えば、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、ならびにＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓおよびＡ．ｎｉｇｅｒなどのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ宿主などの糸状菌類などの多くの他の属、種、および株が一般に利用可能であり、本明細書において使用される。
【０２４９】
特定の実施形態において、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節する、または発現されたタンパク質を所望の形に処理する能力について選択される。このようなポリペプチドの修飾は、これらに限定されるわけではないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化を含む。タンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセシングもまた、正確な挿入、フォールディングおよび／または機能を容易にするために使用される。そのような翻訳後活性について特殊な細胞機構および特徴的な機構を有する、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、およびＷＩ３８などの異なる宿主細胞が、外来タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にするために選択される。
【０２５０】
例えば、米国特許第４８１６５６７号および第６３３１４１５号に記載のものを含む、抗体またはその断片の発現に特に適合させた方法および試薬もまた当技術分野において知られており、利用可能である。様々な実施形態において、抗体重鎖および軽鎖、またはその断片は、同じまたは別個の発現ベクターから発現される。一実施形態において、両鎖は同じ細胞において発現され、それにより機能的抗体またはその断片の形成を容易にする。
【０２５１】
治療用抗体が細胞傷害剤（例えば、毒素）にコンジュゲートされている、および免疫コンジュゲート自体が感染細胞破壊において有効性を示す場合などの特にグリコシル化およびＦｃエフェクター機能が必要でない場合、完全長抗体、抗体断片、および抗体融合タンパク質が細菌において産生される。細菌における抗体断片およびポリペプチドの発現に関しては、例えば、発現および分泌を最適化するための翻訳開始領域（ＴＩＲ）およびシグナル配列を記載している米国特許第５，６４８，２３７号、第５，７８９，１９９号、および第５，８４０，５２３号を参照されたい。発現後、抗体は可溶性画分中のＥ．ｃｏｌｉ細胞ペーストから単離され、アイソタイプに応じて、例えば、プロテインＡまたはプロテインＧカラムによって精製することができる。最終的な精製は、例えば、ＣＨＯ細胞において発現した抗体を精製するために使用したのと同様のプロセスを使用して行うことができる。
【０２５２】
グリコシル化ポリペプチドおよび抗体の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物に由来する。無脊椎動物細胞の例は、植物細胞および昆虫細胞を含む。非常に多くのバキュロウイルス株および変異体ならびに、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（イモムシ）、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ（蚊）、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｉｕｓ（蚊）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ショウジョウバエ）、およびＢｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉなどの宿主由来の対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための様々なウイルス株、例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶのＬ−１変異体、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶのＢｍ−５株が公的に利用可能であり、このようなウイルスが、特にＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションのために、本発明に従って本明細書中でウイルスとして使用される。綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、およびタバコの植物細胞培養物もまた、宿主として利用される。
【０２５３】
培養物（組織培養物）中の脊椎動物細胞における抗体ポリペプチドおよびその断片の伝播の方法が、本発明に包含される。本発明の方法において使用される哺乳類宿主細胞株の例は、ＳＶ４０により形質転換したサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３または懸濁培養での成長のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６巻：５９頁（１９７７年））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７７巻：４２１６頁（１９８０年））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．２３巻：２４３〜２５１頁（１９８０年））；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲ１細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３巻：４４〜６８頁（１９８２年））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０２５４】
宿主細胞は、ポリペプチド産生のために上述の発現またはクローニングベクターで形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望の配列をコードする遺伝子の増幅に適するように改良した慣用的な栄養培地中で培養する。
【０２５５】
長期にわたる高収率の組換えタンパク質産生のために、安定な発現が一般に好ましい。例えば、対象とするポリヌクレオチドを安定して発現する細胞株が、同じまたは別個のベクター上にウイルスの複製開始点および／または外因性発現エレメントおよび選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを使用して形質転換される。ベクター導入後、細胞を富栄養培地中で１〜２日間成長させ、その後選択培地に切り替える。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を与え、その存在によって導入した配列を発現するのに成功する細胞の成長および回復を可能にすることである。安定に形質転換された細胞の耐性クローンを、細胞型に適切な組織培養技術を使用して増殖させる。
【０２５６】
形質転換した細胞株を回復させるために、複数の選択系が使用される。これらの選択系は、これらに限定されるわけではないが、ｔｋ−またはａｐｒｔ−細胞においてそれぞれ用いられる単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ，  Ｍ．ら（１９７７年）Ｃｅｌｌ  １１巻：２２３〜３２頁）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ，Ｉ．ら（１９９０年）Ｃｅｌｌ  ２２巻：８１７〜２３頁）遺伝子を含む。また、代謝拮抗物質、抗生物質または除草剤耐性も選択のための基準として使用される；例えば、メトトレキサートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ら（１９８０年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．７７巻：３５６７〜７０頁）；アミノグリコシド、ネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を与えるｎｐｔ（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，  Ｆ．ら（１９８１年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．１５０巻：１〜１４頁）；およびクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性をそれぞれ与えるａｌｓまたはｐａｔ（Ｍｕｒｒｙ、上記）。さらなる選択遺伝子が記述されている。例えば、ｔｒｐＢは細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にし、ｈｉｓＤは細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にする（Ｈａｒｔｍａｎ，  Ｓ．Ｃ．およびＲ．Ｃ．  Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．８５巻：８０４７〜５１頁）。可視マーカーの使用が普及しており、アントシアニン、ベータ−グルクロニダーゼおよびその基質ＧＵＳ、ならびにルシフェラーゼおよびその基質ルシフェリンのようなマーカーが形質転換体を同定するためだけでなく、特定のベクター系に起因する一過性または安定なタンパク質発現の量を定量化するために広く使用されている（Ｒｈｏｄｅｓ，  Ｃ．Ａ．ら（１９９５年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．５５巻：１２１〜１３１頁）。
【０２５７】
マーカー遺伝子発現の存在／非存在は対象とする遺伝子もまた存在することを示唆するが、その存在および発現が確認される。例えば、ポリペプチドをコードする配列がマーカー遺伝子配列中に挿入される場合、配列を含む組換え細胞はマーカー遺伝子機能がないことによって同定される。
【０２５８】
別法として、単一プロモーターの制御下で、マーカー遺伝子をポリペプチドをコードする配列とともにタンデムに配置する。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は、通常タンデム遺伝子の発現もまた示す。別法として、所望のポリヌクレオチド配列を含むおよび発現する宿主細胞は、当業者に公知の様々な手順によって同定される。これらの手順は、これらに限定されるわけではないが、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションおよびタンパク質バイオアッセイ、あるいは、例えば、核酸またはタンパク質の検出および／または定量のためのメンブレン、溶液、またはチップを用いた技術を含むイムノアッセイ技術を含む。
【０２５９】
ポリヌクレオチドにコードされる産物の発現を検出および測定するための、産物に特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかを使用した様々なプロトコールが当技術分野において知られている。非限定的な例は、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含む。所与のポリペプチド上の２つの非干渉エピトープに反応するモノクローナル抗体（複数）を利用した、２部位モノクローナルベースイムノアッセイがいくつかの用途に好ましいが、競合結合アッセイもまた利用することができる。これらのまたは別のアッセイが、他の場所では、Ｈａｍｐｔｏｎ，  Ｒ．ら（１９９０年；Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＡＰＳ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓｔ  Ｐａｕｌ．Ｍｉｎｎ．）およびＭａｄｄｏｘ，  Ｄ．Ｅ．ら（１９８３年；Ｊ．  Ｅｘｐ．
Ｍｅｄ．１５８巻：１２１１〜１２１６頁）に記載されている。
【０２６０】
様々な標識およびコンジュゲーション技術が当業者に公知であり、様々な核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにおいて使用される。ポリヌクレオチドに関連した配列を検出するための標識されたハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを製造するための手段は、オリゴ標識、ニックトランスレーション、末端標識または標識したヌクレオチドを使用したＰＣＲ増幅を含む。別法として、配列、またはその任意の部分をｍＲＮＡプローブ製造のためのベクター中にクローニングする。このようなベクターは当技術分野において公知であり、市販されており、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６などの適切なＲＮＡポリメラーゼおよび標識したヌクレオチドの添加によってＲＮＡプローブをｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成するために使用される。これらの手順は、様々な市販のキットを使用して行われる。使用される適したレポーター分子または標識は、これらに限定されるわけではないが、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、または発色剤に加えて基質、補因子、阻害剤、磁気粒子などを含む。
【０２６１】
組換え細胞により産生されるポリペプチドは、配列および／または使用されるベクターに応じて、分泌されるか、または細胞内に含まれる。本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核生物または真核生物の細胞膜からのコードされたポリペプチドの分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計される。
【０２６２】
特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは、可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをさらに含む融合ポリペプチドとして産生される。このような精製を容易にするドメインは、これらに限定されるわけではないが、固定された金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュールなどの金属キレートペプチド、固定された免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／親和性精製システム（Ａｍｇｅｎ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）において利用されるドメインを含む。第ＸＡ因子またはエンテロキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に特異的な配列などの切断可能なリンカー配列を精製ドメインとコードされるポリペプチドの間に含めることが、精製を容易にするために使用される。例示的な発現ベクターは、対象とするポリペプチドおよびチオレドキシンまたはエンテロキナーゼ切断部位の前の６個のヒスチジン残基をコードする核酸を含む融合タンパク質の発現を提供する。ヒスチジン残基は、Ｐｏｒａｔｈ，  Ｊ．ら（１９９２年、Ｐｒｏｔ．  Ｅｘｐ．  Ｐｕｒｉｆ．３巻：２６３〜２８１頁）に記載の通りＩＭＩＡＣ（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー）上での精製を容易にし、一方エンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質から所望のポリペプチドを精製するための手段を提供する。融合タンパク質を製造するために使用されるベクターの考察は、Ｋｒｏｌｌ，  Ｄ．Ｊ．ら（１９９３年；ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２巻：４４１〜４５３頁）に提供されている。
【０２６３】
特定の実施形態において、本発明のポリペプチドは異種ポリペプチドと融合しており、これはシグナル配列または成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドであってもよい。選択される異種シグナル配列は、好ましくは宿主細胞によって認識およびプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）配列である。原核生物宿主細胞に関して、シグナル配列は、例えば、アルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される。酵母分泌に関して、シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（ＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓおよびＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓα因子リーダーを含む）、または酸性ホスファターゼリーダー、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓグルコアミラーゼリーダー、またはＷＯ９０／１３６４６に記載のシグナルから選択される。哺乳類細胞発現において、哺乳類シグナル配列に加えてウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルが利用可能である。
【０２６４】
組換え技術を使用する場合、ポリペプチドまたは抗体は細胞内に、ペリプラズム空間に産生されるか、または直接培地中に分泌される。ポリペプチドまたは抗体が第１段階として細胞内に産生される場合、宿主細胞または溶解断片の微粒子破片は例えば、遠心分離または限外濾過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０巻：１６３〜１６７頁（１９９２年）は、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム空間に分泌される抗体を単離するための手順を記述している。手短に述べると、細胞ペーストを酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、およびフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）存在下において約３０分かけて融解する。細胞破片を遠心分離によって除去する。ポリペプチドまたは抗体が培地中に分泌される場合、そのような発現系の上清は一般に、まず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用して濃縮する。場合により、タンパク質分解を阻害するために前のステップのいずれかにおいてＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤が含まれ、外来汚染物質の成長を避けるために抗生物質が含まれる。
【０２６５】
細胞から調製したポリペプチドまたは抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、および親和性クロマトグラフィーを使用して精製され、親和性クロマトグラフィーが好ましい精製技術である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適性は、ポリペプチドまたは抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２またはγ４重鎖に基づく抗体またはその断片を精製するために使用される（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．６２巻：１〜１３頁（１９８３年））。プロテインＧは、すべてのマウスアイソタイプおよびヒトγ３（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．５巻：１５６７１５７５（１９８６年））に推奨される。親和性リガンドが結合する基質（ｍａｔｒｉｘ）は、最も一般的にはアガロースであるが、他の基質も利用可能である。制御孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定な基質は、アガロースで達成できるものよりも速い流速および短い処理時間を可能にする。ポリペプチドまたは抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）が精製のために有用である。イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換樹脂上でのクロマトグラフィー（ポリアスパラギン酸カラムなど）、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿などのタンパク質精製のための他の技術もまた、回収されるポリペプチドまたは抗体に応じて利用可能である。
【０２６６】
任意の予備精製段階（複数可）に続いて、対象とするポリペプチドまたは抗体および夾雑物質を含む混合物を、約ｐＨ２．５〜４．５の溶出緩衝液を使用して、好ましくは低塩濃度（例えば、約０〜０．０２５Ｍ塩）で行われる低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーにかける。
【０２６７】
医薬組成物
本発明は、所望の純度の本発明のポリペプチド、抗体、またはモジュレーター、および薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｉｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版、Ｏｓｏｌ，  Ａ．編（１９８０年））を含む医薬調合物をさらに含む。特定の実施形態において、医薬調合物は、例えば、凍結乾燥調合物または水性溶液の形態における保管中のポリペプチドまたは抗体の安定性を向上させるために調製される。
許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる用量および濃度で受容者に対して非毒性であり、例えば、酢酸塩、Ｔｒｉｓ、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール；ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリデンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシンなどのアミノ酸；単糖、二糖、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；ＥＤＴＡなどのキレート剤；トレハロースおよび塩化ナトリウムなどの等張化剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ポリソルベートなどの界面活性剤；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／あるいはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。特定の実施形態において、治療調合物は、５〜２００ｍｇ／ｍｌの間、好ましくは１０〜１００ｍｇ／ｍｌの間の濃度のポリペプチドまたは抗体を含むことが好ましい。
【０２６８】
本明細書の調合物はまた、特定の適応、例えば、治療中の感染症の治療に、または望ましくない副作用を防止するために適した１つまたは複数のさらなる治療薬を含む。好ましくは、さらなる治療薬は、本発明のポリペプチドまたは抗体の補足的な活性を有し、両者は互いに悪影響を及ぼさない。例えば、本発明のポリペプチドまたは抗体に加えて、さらなるまたは第２の抗体、抗ウイルス薬、抗感染症薬および／または心臓保護剤が調合物に添加される。このような分子は、意図される目的のために有効な量で医薬調合物中に適当に存在する。
【０２６９】
活性成分、例えば、本発明のポリペプチドおよび抗体および他の治療薬はまた、例えば、コアセルベーション技術によってまたは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリメチルメタサイレート（ｐｏｌｙｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ）マイクロカプセル中、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）中またはマクロエマルジョン中にも封入される。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｉｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  第１６版、Ｏｓｏｌ，  Ａ．編（１９８０年）に記載されている。
【０２７０】
徐放製剤が調製される。徐放製剤の適した例は、これらに限定されるわけではないが、マトリックスが成形品の形態、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルなどである、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスを含む。徐放マトリックスの非限定的な例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射用ミクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。
【０２７１】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与用に使用される調合物は、好ましくは無菌である。これは、滅菌濾過膜による濾過によって容易に達成される。
【０２７２】
診断用途
本発明の抗体およびその断片、ならびに治療用組成物は、正常な対照細胞および組織と比較して、感染した細胞または組織に特異的に結合または優先的に結合する。したがって、これらのＡ型インフルエンザ抗体は、本明細書中に記載のものを含む様々な診断および予後予測方法のいずれかを使用して、患者、生物試料、または細胞集団中の感染細胞または組織を検出するために使用される。抗Ｍ２ｅ特異的抗体の感染細胞を検出する能力は、その結合特異性に依存し、異なる患者から、および／またはＡ型インフルエンザの異なる株に感染した患者から得られた感染細胞または組織に結合する能力を試験することによって容易に決定することができる。診断方法は一般に、例えば、血液、血清、唾液、尿、痰、細胞スワブ試料、または組織生検などの患者から得られた生物試料をＡ型インフルエンザ、例えば、ＨｕＭ２ｅ抗体に接触させる段階と、対照試料または所定のカットオフ値と比較して抗体が試料に優先的に結合するかどうかを判定し、それにより感染細胞の存在を示す段階とを含む。特定の実施形態において、適切な対照正常細胞または組織試料と比較して少なくとも２倍、３倍、または５倍以上のＨｕＭ２ｅ抗体が感染細胞に結合する。所定のカットオフ値は、例えば、試験される生物試料の診断アッセイを行うために使用される同じ条件下でいくつかの異なる適切な対照試料に結合するＨｕＭ２ｅ抗体の量を平均化することによって決定される。
【０２７３】
結合抗体は、本明細書中に記載の、および当技術分野において公知の手順を使用して検出される。特定の実施形態において、本発明の診断方法は、結合抗体の検出を容易にするために、検出可能な標識、例えば、フルオロフォアにコンジュゲートされたＨｕＭ２ｅ抗体を使用して実践される。しかしながら、これらはまたＨｕＭ２ｅ抗体の二次検出方法を使用しても実践される。これらは例えば、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、沈殿、凝集、補体結合および免疫蛍光を含む。
【０２７４】
特定の手順において、ＨｕＭ２ｅ抗体は標識される。標識は直接検出される。直接検出される例示的な標識は、これらに限定されるわけではないが、放射性標識および蛍光色素を含む。別法として、または加えて、標識は酵素などの部分であり、これは検出されるために反応または誘導体化されなければならない。同位体標識の非限定的な例は、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、３２Ｐおよび３５Ｓである。使用される蛍光材料は、これらに限定されるわけではないが、例えば、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、オーラミン、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェリン（ｌｕｃｉｆｅｒｉａ）、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、リゾチーム、およびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼを含む。
【０２７５】
酵素標識は、現在利用されている比色技術、分光測光技術、蛍光分光測光技術、またはガス定量技術のうちのいずれかによって検出される。これらの手順において使用される多くの酵素が知られており、本発明の方法により利用される。非限定的な例は、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ＋ペルオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ＋ペルオキシダーゼ、および酸性ホスファターゼである。
【０２７６】
抗体は、既知の方法によってこのような標識にタグ付けされる。例えば、アルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、イミダート、スクシンイミド、ビス（ｂｉｄ）−ジアゾ化ベンザジンなどのカップリング剤が、上述の蛍光標識、化学発光標識、および酵素標識に抗体をタグ付けするために使用される。酵素は、典型的には、カルボジイミド、過ヨウ素酸塩、ジイソシアネート、グルタルアルデヒドなどの架橋分子を使用して抗体に結合される。様々な標識化技術が、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ３２ｂ巻、１０３頁（１９７４年）、Ｓｙｖａｎｅｎら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２８４巻、３７６２頁（１９７３年）ならびにＢｏｌｔｏｎおよびＨｕｎｔｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１３３巻、５２９頁（１９７３年）に記載されている。
【０２７７】
本発明のＨｕＭ２ｅ抗体は、本明細書中に記載の代表的なアッセイを使用して、Ａ型インフルエンザ感染を有する患者と有さない患者を識別すること、および患者が感染しているかどうかを判定することができる。１つの方法によると、Ａ型インフルエンザ感染にかかっている疑いのある、またはかかっていることが分かっている患者から生物試料を得る。好ましい実施形態において、生物試料は患者の細胞を含む。試料を、例えば、ＨｕＭ２ｅ抗体を試料中に存在する感染細胞に結合させるのに十分な時間および条件で、ＨｕＭ２ｅ抗体に接触させる。例えば、１０秒、３０秒、１分、５分、１０分、３０分、１時間、６時間、１２時間、２４時間、３日、またはこれらの中間の任意の時点の間、試料をＨｕＭ２ｅ抗体に接触させる。結合したＨｕＭ２ｅ抗体の量を測定し、例えば、所定の値または正常組織試料から測定した値であってもよい対照値と比較する。対照試料と比較して患者試料に結合した抗体の増加した量は、患者試料中の感染細胞の存在を示すものである。
【０２７８】
関連方法において、患者から得た生物試料を、抗体を感染細胞に結合させるのに十分な時間および条件で、ＨｕＭ２ｅ抗体に接触させる。結合抗体を次いで検出し、結合抗体の存在は試料が感染細胞を含むことを示す。本実施形態は特に、ＨｕＭ２ｅ抗体が正常細胞に検出可能なレベルで結合しない場合に有用である。異なるＨｕＭ２ｅ抗体は、異なる結合特性および特異性特性を有する。これらの特性に応じて、特定のＨｕＭ２ｅ抗体が、１つまたは複数のＡ型インフルエンザ株の存在を検出するために使用される。例えば、特定の抗体は、ただ１つのまたはいくつかのインフルエンザウイルス株に特異的に結合するが、他の抗体は異なるインフルエンザウイルスのすべてまたは大部分の株に結合する。ただ１つのＡ型インフルエンザ株に特異的な抗体は、感染株を同定するために使用される。
【０２７９】
特定の実施形態において、感染細胞に結合する抗体は、好ましくは、検出される感染を有する患者の少なくとも約２０％、より好ましくは患者の少なくとも約３０％において感染の存在を示すシグナルを発生する。別法としてまたは加えて、抗体は、検出される感染を有さない個体の少なくとも約９０％において、感染の非存在を示す陰性シグナルを発生する。抗体はそれぞれ上記の基準を満たすが、本発明の抗体は感度を高めるために組み合わせて使用される。
【０２８０】
本発明はまた、本発明の抗体を使用して診断アッセイおよび予後予測アッセイを行うのに有用なキットも含む。本発明のキットは、標識されたまたは標識されていない形態の本発明のＨｕＭ２ｅ抗体を含む適した容器を含む。加えて、抗体が間接的な結合アッセイに適した標識化形態で供給される場合、キットは、適切な間接アッセイを行うための試薬をさらに含む。例えば、キットは、標識の性質に応じて酵素基質または誘導化剤を含む１つまたは複数の適した容器を含む。対照試料および／または使用説明書もまた含まれる。
【０２８１】
治療的／予防的使用
受動免疫は、ウイルス疾患の予防および治療のための有効で安全な方法であることが分かっている（それぞれ参照により本明細書中に組み込まれるＫｅｌｌｅｒら、Ｃｌｉｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．１３巻：６０２〜１４頁（２０００年）；Ｃａｓａｄｅｖａｌｌ、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０巻：１１４頁（２００２年）；Ｓｈｉｂａｔａら、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．５巻：２０４〜１０頁（１９９９年）；およびＩｇａｒａｓｈｉら、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．５巻：２１１〜１６頁（１９９９年）を参照されたい）。ヒトモノクローナル抗体を使用した受動免疫は、インフルエンザの緊急の予防および治療のための迅速な治療方法を提供する。
【０２８２】
本発明のＨｕＭ２ｅ抗体およびその断片、ならびに治療用組成物は、正常な対照の非感染細胞および組織と比較して、感染した細胞に特異的に結合または優先的に結合する。したがって、これらのＨｕＭ２ｅ抗体は、患者、生物試料、または細胞集団中の感染細胞または組織を選択的に標的化するために使用される。これらの抗体の感染特異的結合特性を踏まえて、本発明は、感染細胞の成長を制御する（例えば、阻害する）方法、感染細胞を死滅させる方法、および感染細胞のアポトーシスを誘導する方法を提供する。これらの方法は、感染細胞を本発明のＨｕＭ２ｅ抗体に接触させる段階を含む。これらの方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ｅｘ  ｖｉｖｏで、およびｉｎ  ｖｉｖｏで実践される。
【０２８３】
様々な実施形態において、本発明の抗体はもともと治療的に活性である。別法として、または加えて、本発明の抗体は、細胞傷害剤または成長阻害剤、例えば、放射性同位体または毒素にコンジュゲートされ、この抗体に結合または接触した感染細胞を治療するのに使用される。
【０２８４】
一実施形態において、本発明は、Ａ型インフルエンザ感染であると診断された、発症するリスクがある、または有する疑いのある患者に本発明のＨｕＭ２ｅ抗体を提供する段階を含む、患者において感染を治療または予防する方法を提供する。本発明の方法は、感染症の第１線治療、継続治療において、または再発性もしくは難治性感染の治療において使用される。本発明の抗体による治療は、単独治療である。別法として、本発明の抗体を用いる治療は、１つまたは複数のさらなる治療薬もまた患者を治療するために使用される併用療法レジメンの１つの構成要素または相である。
【０２８５】
インフルエンザウイルス関連疾患または障害のリスクのある被験体は、感染した人と接触した患者、または別の何らかの方法でインフルエンザウイルスに曝露された患者を含む。予防薬の投与は、疾患または障害を予防する、またはそうでなければその進行を遅れさせるように、インフルエンザウイルス関連疾患または障害に特徴的な症状の徴候の前に行うことができる。
【０２８６】
様々な態様において、ｈｕＭ２ｅは被験体の感染と実質的に同時に、またはその後に投与される（すなわち治療的処置）。別の態様において、抗体は治療上の利益を提供する。様々な態様において、治療上の利益は、１つまたは複数のインフルエンザ感染の症状または合併症の進行、重症度、頻度、期間または確率、１つまたは複数のインフルエンザ株のウイルス力価、ウイルス複製あるいはウイルスタンパク質の量の低下または抑制を含む。さらに別の態様では、治療上の利益は、インフルエンザ感染からの被験体の回復の迅速化または促進を含む。
【０２８７】
被験体におけるインフルエンザウイルス力価、ウイルス複製、ウイルス増殖またはインフルエンザウイルスタンパク質の量の増加を防止するための方法が、さらに提供される。一実施形態において、方法は、被験体における、１つまたは複数のインフルエンザ株または分離株のインフルエンザウイルス力価、ウイルス複製またはインフルエンザウイルスタンパク質の量の増加を防止するための有効量のｈｕＭ２ｅ抗体を被験体に投与する段階を含む。
【０２８８】
１つまたは複数のインフルエンザ株／分離株または亜型による感染から被験体を保護する、または被験体の感染に対する感受性を減少させるための方法、すなわち、予防方法がさらに提供される。一実施形態において、方法は、１つまたは複数のインフルエンザ株／分離株または亜型による感染から被験体を保護するために有効な、または、被験体の感染に対する感受性を減少させるために有効な量のインフルエンザＭ２に特異的に結合するｈｕＭ２ｅ抗体を被験体に投与する段階を含む。
【０２８９】
場合により、被験体は、これらに限定されるわけではないが、インフルエンザウイルス抗体、抗ウイルス薬（ノイラミニダーゼ阻害剤、ＨＡ阻害剤、シアル酸阻害剤またはＭ２イオンチャンネル阻害剤など）、ウイルス進入阻害剤またはウイルス付着阻害剤などの第２の作用物質をさらに投与される。Ｍ２イオンチャンネル阻害剤は、例えば、アマンタジン、またはリマンタジンである。ノイラミニダーゼ阻害剤は、例えば、ザナミビルまたはリン酸オセルタミビルである。
【０２９０】
低下または減少させることができるインフルエンザ感染の症状または合併症は、例えば、悪寒、熱、咳、咽喉炎、鼻鬱血、副鼻腔鬱血、鼻感染症、副鼻腔感染症、体の痛み、頭痛、倦怠感、肺炎、気管支炎、耳感染症、耳痛または死亡を含む。
【０２９１】
ヒトおよび非ヒト患者のｉｎ  ｖｉｖｏ治療に関して、患者は通常、本発明のＨｕＭ２ｅ抗体を含む医薬調合物を投与または提供される。ｉｎ  ｖｉｖｏ療法において使用する場合、本発明の抗体は、治療的に有効な量（すなわち、患者のウイルス負荷量を除去するまたは減少させる量）で患者に投与される。抗体は、既知の方法に従って、例えば、ボーラスのような静脈内投与など、またはある期間にわたる持続注入によって、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液包内、髄腔内、経口、局所、または吸入経路によって、ヒト患者に投与される。抗体は、可能な場合は、標的細胞部位にまたは静脈内に非経口投与されてもよい。抗体の静脈内または皮下投与が、特定の実施形態において好ましい。本発明の治療用組成物は、患者または被験体に、全身に、非経口的に、または局所的に投与される。
【０２９２】
非経口投与では、抗体は、薬学的に許容される非経口ビヒクルを伴って単位用量の注射用形態（溶液、懸濁液、エマルジョン）に調合される。このようなビヒクルの例は、水、食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンである。固定油およびオレイン酸エチルなどの非水性ビヒクルもまた使用される。リポソームは担体として使用される。ビヒクルは、等張性および化学安定性を高める物質などの少量の添加剤、例えば、緩衝剤および防腐剤を含む。抗体は、典型的には上記のようなビヒクル中に約１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で調合される。
【０２９３】
用量および投薬レジメンは、感染の性質および抗体にコンジュゲートされた特定の細胞傷害剤または成長阻害剤（使用される場合）の特性などの、医師によって容易に判定される様々な因子、例えば、その治療指数、患者および患者の既往歴などに依存する。一般に、治療的に有効な量の抗体が患者に投与される。特定の実施形態において、投与される抗体の量は、患者体重の約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの範囲である。感染の種類および重症度に応じて、体重の約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．１〜１５ｍｇ／ｋｇ／用量）の抗体が、例えば、１つまたは複数の別個の投与による、または持続注入による患者への投与の最初の候補投薬量である。この療法の経過は、慣用的な方法およびアッセイによって、医師または他の当業者に公知の基準に基づいて、容易にモニターされる。
【０２９４】
１つの特定の実施形態において、細胞傷害剤にコンジュゲートした抗体を含む免疫コンジュゲートが患者に投与される。好ましくは、免疫コンジュゲートは細胞によって内部移行されて、免疫コンジュゲートの結合する細胞を死滅させる治療的有効性の増加をもたらす。一実施形態において、細胞傷害剤は感染細胞中の核酸を標的化または妨害する。このような細胞傷害剤の例は上述されており、これらに限定されるわけではないが、マイタンシノイド、カリケアマイシン、リボヌクレアーゼおよびＤＮＡエンドヌクレアーゼを含む。
【０２９５】
他の治療レジメンは、本発明のＨｕＭ２ｅ抗体の投与と併用される。併用投与は、別個の調合物または単一の医薬調合物を使用する同時投与、および好ましくは両方（またはすべて）の活性剤が生物学的活性を同時に発揮する間に一定期間が存在する、いずれかの順での逐次投与を含む。好ましくは、このような併用療法は相乗的な治療効果をもたらす。
【０２９６】
特定の実施形態において、本発明の抗体の投与を、感染病原菌に関連する別の抗原に対する別の抗体と併用投与することが望ましい。
【０２９７】
抗体タンパク質の患者への投与の他に、本発明は、遺伝子治療による抗体の投与方法を提供する。このような抗体をコードする核酸の投与は、「治療的有効量の抗体を投与すること」という表現に包含される。例えば、細胞内抗体を生じさせるための遺伝子治療の使用に関するＰＣＴ特許出願公開ＷＯ９６／０７３２１を参照されたい。
【０２９８】
別の実施形態において、本発明の抗Ｍ２抗体が、結合抗体の構造、例えば、コンフォーメーションエピトープを決定するために使用され、この構造を次に用いて、例えば、化学的モデリングおよびＳＡＲ法によってこの構造を有するまたは模倣するワクチンを開発するために後に使用される。このようなワクチンはその後、Ａ型インフルエンザ感染を予防する。
【０２９９】
本明細書において参照したおよび／または出願データシートに列挙した、すべての上記米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願公開および非特許刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０３００】
（実施例１）
組換えＭ２ｅタンパク質を発現する細胞を用いたヒト血漿に存在するＭ２ｅ特異的抗体のスクリーニングおよび特徴付け
Ｍ２に特異的であり、インフルエンザＡ感染細胞およびインフルエンザウイルス自体に結合することができる完全ヒトモノクローナル抗体が、以下に記載されるように、患者の血清において同定された。
【０３０１】
細胞株におけるＭ２の発現
インフルエンザサブタイプであるＨ３Ｎ２に見出される誘導されたＭ２配列に対応する、Ｍ２完全長ｃＤＮＡを含む発現構築体を２９３細胞にトランスフェクトした。
【０３０２】
Ｍ２  ｃＤＮＡは、下記のポリヌクレオチド配列および配列番号５３によってコードされる。
【０３０３】
【化１３】
0005623332.tif 000015
Ｍ２の細胞表面の発現が、抗Ｍ２ｅペプチドに特異的なＭＡｂ  １４Ｃ２を用いて確認された。Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／４８３／１９９７（ＨＫ４８３）およびＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（ＶＮ１２０３）由来の２つの他のＭ２変異体を次の分析のために用いた。それらの発現は、本発明のＭ２ｅ特異的モノクローナル抗体を用いて測定した。それは、１４Ｃ２結合が、Ｍ２ｅにおける様々なアミノ酸置換によって抑制される場合があるためである。
【０３０４】
末梢血における抗体のスクリーニング
Ｍ２に結合する抗体について、１２０を超える個体の血漿試料を試験した。それらのうちいずれも、Ｍ２ｅペプチドに対して特異的な結合を示さなかった。しかしながら、１０％の血漿試料は、２９３−Ｍ２  Ｈ３Ｎ２細胞株に特異的に結合する抗体を含んでいた。これは、抗体が、Ｍ２ホモ四量体のコンフォーメーション決定基への結合、Ｍ２ホモ四量体の多重変異体のコンフォーメーション決定基への結合として特徴付けることができ；それらは、直鎖状Ｍ２ｅペプチドに対して特異的ではあり得なかったことを示す。
【０３０５】
抗Ｍ２  ＭＡｂの特徴付け
このプロセスを介して同定されたヒトＭＡｂは、Ｍ２ホモ四量体上のコンフォーメーションエピトープに結合することが分かった。それらは、元の２９３−Ｍ２トランスフェクタント、ならびに２つの他の細胞発現Ｍ２変異体に結合した。１４Ｃ２  ＭＡｂは、Ｍ２ｅペプチドに結合することに加えて、Ｍ２変異体の配列に対してより感受性があることが分かった。さらに、１４Ｃ２は、インフルエンザビリオンに容易に結合しないが、コンフォーメーションに特異的な抗Ｍ２  ＭＡｂは結合した。
【０３０６】
これらの結果は、本発明の方法が、Ｍ２の特異的な免疫付与を必要とせずに、インフルエンザに対する正常なヒト免疫応答からＭ２  ＭＡｂの同定を可能にすることを示す。免疫療法のために用いられる場合、これらの完全ヒトＭＡｂは、ヒト化マウス抗体よりも患者によって良好に容認されるという潜在能力を有する。さらに、１４Ｃ２およびＧｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＭＡｂが直鎖状Ｍ２ｅペプチドに結合するのとは対照的に、本発明のＭＡｂはＭ２のコンフォーメーションエピトープに結合し、Ａ型インフルエンザ感染細胞に対してだけでなく、ウイルス自体に対しても特異的である。本発明のＭＡｂの別の利点は、いずれも、すでに試験されたＭ２変異体のすべてに結合することであり、したがって、それらが、特定の直鎖状アミノ酸配列に限定されないことが示される。
【０３０７】
（実施例２）
Ｍ２特異的抗体の同定
単核細胞または実施例１に記載されたヒト血清において同定されたＭＡｂのうちの３種を発現するＢ細胞は、クローン集団に希釈され、抗体を産生するように誘導された。抗体を含む上清は、インフルエンザ株であるインフルエンザサブタイプのＨ３Ｎ２由来の完全長Ｍ２Ｅタンパク質を安定にトランスフェクトした２９３ＦＴ細胞への結合に関してスクリーニングされた。陽性染色／結合を示した上清は、インフルエンザ株であるインフルエンザサブタイプのＨ３Ｎ２由来の完全長Ｍ２Ｅタンパク質を安定にトランスフェクトした２９３ＦＴ細胞上、ならびに対照としてのベクターを単独でトランスフェクトした細胞上で再度、再スクリーニングされた。
【０３０８】
次に、抗体の可変領域は、上清が陽性結合を示したＢ細胞のウェルからレスキュークローニングされた。一過性トランスフェクションを２９３ＦＴ細胞に行って、これらの抗体を再構成および産生した。再構成された抗体の上清は、レスキューされた抗Ｍ２Ｅ抗体を同定するために、上記で詳述された完全長Ｍ２Ｅタンパク質を安定にトランスフェクした２９３ＦＴ細胞への結合に関してスクリーニングされた。３つの異なる抗体：８ｉ１０、２１Ｂ１５、および２３Ｋ１２が同定された。第４の追加の抗体クローンである４Ｃ２は、レスキュースクリーニングによって単離された。しかしながら、それは唯一ではなく、それがクローン８ｉ１０とは異なるドナー由来であるとしても、クローン８ｉ１０とまったく同じ配列を有していた。
【０３０９】
これらの抗体のカッパおよびガンマ可変領域の配列を下記に示す。
【０３１０】
クローン８ｉ１０：
抗Ｍ２クローン８ｉ１０のカッパＬＣ可変領域は、ＨｉｎｄＩＩＩからＢｓｉＷ１に至る断片としてクローニングされたが（下記参照）、それは下記のポリヌクレオチド配列、配列番号５４（上段）および配列番号５５（下段）によってコードされる。
【０３１１】
【化１４】
0005623332.tif 000016
８ｉ１０カッパＬＣ可変領域の翻訳は、下記の通りであり、ポリヌクレオチド配列（上記、配列番号５４、上段）およびアミノ酸配列（下記、配列番号５６に対応する）である。
【０３１２】
【化１５】
0005623332.tif 000017
８ｉ１０カッパＬＣ可変領域のアミノ酸配列は、下記の通りであり、下記に同定された特定のドメイン（Ｋａｂａｔ法に従って定義されたＣＤＲ配列）を有する。
【０３１３】
【化１６】
0005623332.tif 000018
下記は、カッパＬＣ定常領域をすでに含む発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１にクローニングされた８ｉ１０のカッパＬＣ可変領域の例である（上段のポリヌクレオチド配列は配列番号６５に対応し、下段のポリヌクレオチド配列は配列番号６６に対応し、アミノ酸配列は上記で示された配列番号５６に対応する）。黒色の塩基は、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター配列を表し、青色の塩基は、クローニングされた抗体配列を表す。また、本明細書に記載される抗体は、発現ベクターであるｐＣＥＰ４にクローニングされた。
【０３１４】
【化１７】
0005623332.tif 000019
８ｉ１０ガンマＨＣ可変領域は、ＨｉｎｄＩＩＩからＸｈｏ１に至る断片としてクローニングされたが、それは下記のポリヌクレオチド配列、配列番号６７（上段）および配列番号６８（下段）によってコードされる。
【０３１５】
【化１８】
0005623332.tif 000020
８ｉ１０ガンマＨＣの翻訳は、下記の通りであり、ポリヌクレオチド配列（上述、配列番号６７、上段）およびアミノ酸配列（下記、配列番号６９に対応する）である。
【０３１６】
【化１９】
0005623332.tif 000021
８ｉ１０ガンマＨＣのアミノ酸配列は、下記の通りであり、下記に同定された特定のドメイン（Ｋａｂａｔ法に従って定義されたＣＤＲ配列）を有する。
【０３１７】
【化２０】
0005623332.tif 000022
下記は、ガンマＨＣ定常領域をすでに含む発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３．１にクローニングした８ｉ１０のガンマＨＣ可変領域の例である（上段のポリヌクレオチド配列は配列番号７８に対応し、下段のポリヌクレオチド配列は配列番号７９に対応し、アミノ酸配列は上記で示された配列番号６９に対応する）。黒色の塩基はｐｃＤＮＡ３．１ベクター配列を表し、青色の塩基はクローニングされた抗体配列を表す。
【０３１８】
【化２１】
0005623332.tif 000023
ガンマＨＣのフレームワーク４（ＦＲ４）領域は、通常、２つのセリン（ＳＳ）で終了し、その結果、完全なフレームワーク４領域は、ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号８０）であるべきである。ガンマＨＣ定常領域およびガンマＨＣ可変領域がクローニングされているベクターに受容しているＸｈｏ１部位およびそのＸｈｏ１部位の下流にある１つの付加的な塩基は、フレームワーク４のこの最終のアミノ酸をコードする最後の塩基を提供する。しかしながら、元のベクターは、Ｘｈｏ１部位（ＣＴＣＧＡＧ、配列番号８１）が作られ、機能するすべてのガンマＨＣクローンに存在するフレームワーク４の末端でのアミノ酸変化：セリンからアルギニン（ＳからＲ）への置換を引き起こすＸｈｏ１部位の下流の「Ａ」ヌクレオチドを含む場合になされるサイレントな突然変異に適応しなかった。このようにして、完全なフレームワーク４領域はＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＲ（配列番号８２）と読まれる。今後の構築体が作製されつつあり、そこでは、Ｘｈｏ１部位の下流の塩基は「Ｃ」ヌクレオチドである。したがって、代替の実施形態におけるガンマＨＣ可変領域配列のクローニングに使用されるＸｈｏ１部位の作製は、サイレントな突然変異であり、フレームワーク４のアミノ酸配列をその適切なＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号８０）に修復する。これは、本明細書に記載されるすべてのＭ２ガンマＨＣクローンについていえる。
【０３１９】
クローン２１Ｂ１５：
抗Ｍ２クローン２１Ｂ１５のカッパＬＣ可変領域は、ＨｉｎｄＩＩＩからＢｓｉＷ１に至る断片としてクローニングされたが、それは下記のポリヌクレオチド配列、配列番号８３および配列番号８４によってコードされる。
【０３２０】
【化２２】
0005623332.tif 000024
２１Ｂ１５カッパＬＣ可変領域の翻訳は、下記の通りであり、ポリヌクレオチド配列（上述、配列番号８３、上段）およびアミノ酸配列（下記、配列番号５６に対応する）である。
【０３２１】
【化２３】
0005623332.tif 000025
２１Ｂ１５カッパＬＣ可変領域のアミノ酸配列は、下記の通りであり、下記に同定された特定のドメイン（Ｋａｂａｔ法に従って定義されたＣＤＲ配列）を有する。
【０３２２】
【化２４−１】
0005623332.tif 000026
カッパＬＣ可変領域をクローニングするために用いられるプライマーは多様性の領域全体で伸長し、その設計ではウォッブル塩基位置を有していた。このようにして、フレームワーク４領域では、ＤまたはＥアミノ酸が生じ得た。ある場合には、レスキューされた抗体におけるこの位置のアミノ酸は、Ｂ細胞において産生された元の親アミノ酸でなくてもよい。大部分のカッパＬＣでは、この位置はＥである。上記のクローン（２１Ｂ１５）からすると、フレームワーク４
【０３２３】
【化２４−２】
0005623332.tif 000027
（配列番号８４）におけるＤが観察された。しかしながら、周囲のアミノ酸からすると、これは、プライマーの結果として起こった可能性があり、人為的な結果であり得る。Ｂ細胞由来の天然の抗体は、この位置にＥを有していた可能性がある。
【０３２４】
２１Ｂ１５ガンマＨＣ可変領域はＨｉｎｄＩＩＩからＸｈｏ１に至る断片としてクローニングされたが、それは下記のポリヌクレオチド配列、配列番号８５（上段）および配列番号８６（下段）によってコードされる。
【０３２５】
【化２５】
0005623332.tif 000028
２１Ｂ１５ガンマＨＣの翻訳は、下記の通りであり、ポリヌクレオチド配列（上述、配列番号８７、上段）およびアミノ酸配列（下記、配列番号６９に対応する）である。
【０３２６】
【化２６】
0005623332.tif 000029
２１Ｂ１５ガンマＨＣのアミノ酸配列は、下記の通りであり、下記に同定された特定のドメイン（Ｋａｂａｔ法に従って定義されたＣＤＲ配列）を有する。
【０３２７】
【化２７】
0005623332.tif 000030
クローン２３Ｋ１２：
抗Ｍ２クローン２３Ｋ１２のカッパＬＣ可変領域はＨｉｎｄＩＩＩからＢｓｉＷ１に至る断片（下記参照）としてクローニングされたが、それは下記のポリヌクレオチド配列の配列番号８８（上段）および配列番号８９（下段）によってコードされる。
【０３２８】
【化２８】
0005623332.tif 000031
２３Ｋ１２カッパＬＣ可変領域の翻訳は、下記の通りであり、ポリヌクレオチド配列（上記、配列番号９０、上段）およびアミノ酸配列（下記、配列番号９１に対応する）である。
【０３２９】
【化２９】
0005623332.tif 000032
２３Ｋ１２カッパＬＣ可変領域のアミノ酸配列は、下記の通りであり、下記に同定された特定のドメイン（Ｋａｂａｔ法に従って定義されたＣＤＲ配列）を有する。
【０３３０】
【化３０】
0005623332.tif 000033
２３Ｋ１２ガンマＨＣ可変領域は、ＨｉｎｄＩＩＩからＸｈｏ１に至る断片としてクローニングされたが、それは下記のポリヌクレオチド配列、配列番号９７（上段）および配列番号９８（下段）によってコードされる。
【０３３１】
【化３１】
0005623332.tif 000034
２３Ｋ１２ガンマＨＣ可変領域の翻訳は、下記の通りであり、ポリヌクレオチド配列（上記、配列番号９９、上段）およびアミノ酸配列（下記、配列番号１００に対応する）である。
【０３３２】
【化３２】
0005623332.tif 000035
２３Ｋ１２ガンマＨＣ可変領域のアミノ酸配列は、下記の通りであり、下記に同定された特定のドメイン（Ｋａｂａｔ法に従って定義されたＣＤＲ配列）を有する。
【０３３３】
【化３３】
0005623332.tif 000036
（実施例３）
保存された抗体可変領域の同定
３種の抗体カッパＬＣおよびガンマＨＣ可変領域のアミノ酸配列を整列させ、下記に示されるように、保存された領域および残基を同定した。
【０３３４】
３種のクローンのカッパＬＣ可変領域のアミノ酸配列の整列：
【０３３５】
【化３４】
0005623332.tif 000037
３種のクローンのガンマＨＣ可変領域のアミノ酸配列の整列：
【０３３６】
【化３５】
0005623332.tif 000038
クローン８Ｉ１０および２１Ｂ１５は２人の異なるドナーに由来したが、まったく同じ正確なガンマＨＣを有し、カッパＬＣにおいては、フレームワーク１領域の４位にあるたった１個のアミノ酸（アミノ酸Ｍ対Ｖ、上記参照）が異なる（カッパＬＣのフレームワーク４におけるＤ対Ｅウォッブル位置を除く）。
【０３３７】
抗体の可変領域の配列比較は、クローン８ｉ１０の重鎖が生殖細胞系列の配列ＩｇＨＶ４由来であり、軽鎖は生殖細胞系列の配列ＩｇＫＶ１由来であることを表した。
【０３３８】
抗体の可変領域の配列比較は、クローン２１Ｂ１５の重鎖が生殖細胞系列の配列ＩｇＨＶ４由来であり、軽鎖は生殖細胞系列の配列ＩｇＫＶ１由来であることを表した。
【０３３９】
抗体の可変領域の配列比較は、クローン２３Ｋ１２の重鎖が生殖細胞系列の配列ＩｇＨＶ３由来であり、軽鎖は生殖細胞系列の配列ＩｇＫＶ１由来であることを表した。
【０３４０】
（実施例４）
Ｍ２抗体の産生および特徴付け
上述された抗体は、２９３ＰＥＡＫ細胞におけるラージスケールの一過性トランスフェクションによって、ミリグラム量で産生された。粗製な未精製の抗体上清を用いて、ＥＬＩＳＡプレート上でインフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３２（ＰＲ８）ウイルスに結合する抗体を調べ、同様にラージスケールの一過性トランスフェクションによって産生された対照抗体１４Ｃ２の結合と比較した。抗Ｍ２組換えヒトモノクローナル抗体はインフルエンザに結合し、対照抗体は結合しなかった（図９）。
【０３４１】
また、ＰＲ８ウイルス感染ＭＤＣＫ細胞上での結合を試験した（図１０）。対照抗体１４Ｃ２、ならびに３種の抗Ｍ２Ｅクローン：８Ｉ１０、２１Ｂ１５および２３Ｋ１２はすべて、ＰＲ８感染細胞の表面上に発現したＭ２タンパク質への特異的な結合を示した。未感染細胞上では結合は観察されなかった。
【０３４２】
プロテインＡカラム上で上清から抗体を精製した。ＦＡＣｓ分析は、濃度が１μｇ／ｍｌである精製した抗体を用いて行い、細胞表面上にＭ２タンパク質を発現している一過性にトランスフェクトした２９３ＰＥＡＫ細胞への抗体の結合を調べた。モック（ｍｏｃｋ）トランスフェクトした細胞、およびインフルエンザサブタイプであるＨ３Ｎ２、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（ＶＮ１２０３）、またはＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／４８３／１９９７  ＨＫ４８３Ｍ２タンパク質を一過性にトランスフェクトした細胞への結合を調べることによって、結合を測定した。陽性対照として、抗体１４Ｃ２を用いた。未染色および二次抗体だけの対照は、バックグラウンドの決定に役立った。Ｍ２タンパク質をトランスフェクトした細胞の特異的な染色は、３種すべての細胞について観察された。さらに、３種すべてのクローンは、高病原性株Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４およびＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／４８３／１９９７のＭ２タンパク質に非常によく結合し、一方、Ｈ３Ｎ２  Ｍ２タンパク質に十分に結合した陽性対照１４Ｃ２は、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４のＭ２タンパク質に非常により弱く結合し、Ａ／Ｈｏｎｇ
Ｋｏｎｇ／４８３／１９９７のＭ２タンパク質には結合しなかった。図１１を参照されたい。
【０３４３】
抗体２１Ｂ１５、２３Ｋ１２、および８Ｉ１０は、Ｍ２タンパク質を安定に発現する２９３−ＨＥＫ細胞の表面に結合したが、ベクターをトランスフェクトした細胞には結合しなかった（図１を参照されたい）。さらに、これらの抗体の結合は、５ｍｇ／ｍｌの２４マーのＭ２ペプチドの存在によって競合せず、一方、直鎖状Ｍ２ペプチドに対して生じた、対照のキメラマウスＶ−領域／ヒトＩｇＧ１カッパ１４Ｃ２抗体（ｈｕ１４Ｃ２）の結合は、Ｍ２ペプチドによって完全に阻害された（図１を参照）。これらのデータは、これらの抗体が、直鎖状Ｍ２ｅペプチドとは対照的に、細胞またはウイルス表面に発現したＭ２ｅに存在するコンフォーメーションエピトープに結合することを裏付ける。
【０３４４】
（実施例５）
ヒト抗インフルエンザモノクローナル抗体のウイルス結合
ＵＶ不活性化したインフルエンザＡウイルス（Ａ／ＰＲ／８／３４）（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、ＰＢＳ中１．２μｇ／ｍｌ、２５μｌ／ウェルで３８４ウェルのＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）に播種され、４℃で一晩インキュベートされた。次に、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、５０μｌ／ウェルでＰＢＳ中の１％脱脂粉乳でブロッキングし、その後、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳによる２回目の洗浄後、指示された濃度のＭＡｂを３連で添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳを用いてさらに洗浄後、各ウェルに対して、ＰＢＳ／１％ミルク中に１／５０００に希釈したセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（Ｐｉｅｒｃｅ）の２５μｌを添加し、プレートを室温で１時間放置した。最終のＰＢＳ洗浄後、ＨＲＰ基質である１−Ｓｔｅｐ（商標）Ｕｌｔｒａ−ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）を２５μｌ／ウェルで添加し、暗所中、室温で反応を進行させた。２５μｌ／ウェルの１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４でアッセイを停止させ、４５０ｎｍの吸光度（Ａ４５０）をＳｐｅｃｔｒｏＭａｘ  Ｐｌｕｓプレートリーダーで読み取った。１０μｇ／ｍｌでのＭＡｂ８Ｉ１０結合の吸光度にデータを正規化する。結果を図２Ａおよび２Ｂに示す。
【０３４５】
（実施例６）
完全長Ｍ２変異体へのヒト抗インフルエンザモノクローナル抗体の結合
Ｍ２変異体（ｉｎ  ｖｉｖｏでの高い病原性表現型を有するものを含む）を分析のために選択した。配列については図３Ａを参照されたい。
【０３４６】
Ｍ２  ｃＤＮＡ構築体をＨＥＫ２９３細胞に一過性にトランスフェクトし、下記の通り分析した：ＦＡＣＳによる一過性トランスフェクタントを分析するために、１０ｃｍ組織培養プレート上の細胞を０．５ｍｌの細胞解離緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理し、回収した。１％ＦＢＳ、０．２％ＮａＮ３を含むＰＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）中で細胞を洗浄し、１００μｇ／ｍｌのウサギＩｇＧを補足した０．６ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。各々のトランスフェクタントは、０．２ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液中、１μｇ／ｍｌの指示されたＭＡｂと混合され、細胞５×１０５〜１０６個／試料であった。ＦＡＣＳ緩衝液で細胞を３回洗浄し、各試料は、１μｇ／ｍｌのａｌｅｘａｆｌｕｏｒ（ＡＦ）６４７−抗ヒトＩｇＧ  Ｈ＆Ｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む０．１ｍｌ中に再懸濁させた。再び細胞を洗浄し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏデバイス（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）でフローサイトメトリーを行った。データは、Ｍ２−Ｄ２０一過性トランスフェクタントの平均蛍光の割合として表される。変異体結合に関するデータは、２つの実験を代表している。アラニン突然変異体に関するデータは、標準誤差を含む３つの別々の実験からの平均の読み出しである。結果を図３Ｂおよび３Ｃに示す。
【０３４７】
（実施例７）
Ｍ２結合を評価するためのアラニンスキャニング突然変異誘発
抗体結合部位を評価するために、アラニンは、部位特異的突然変異誘発によって指示された個々のアミノ酸位置で置換された。
【０３４８】
Ｍ２  ｃＤＮＡ構築体をＨＥＫ２９３細胞に一過性にトランスフェクトし、実施例６において上述されるように分析した。結果を図４Ａおよび４Ｂに示す。図８は、エピトープがＭ２ポリペプチドのアミノ末端の高度に保存された領域にあることを示す。図４Ａ、４Ｂおよび図８に示されるように、エピトープは、Ｍ２ポリペプチドの２位のセリン、５位のスレオニン、および６位のグルタミン酸を含む。
【０３４９】
（実施例８）
エピトープブロッキング
ＭＡｂ  ８Ｉ１０および２３Ｋ１２が同じ部位に結合するかどうかを決定するために、インフルエンザ株Ａ／ＨＫ／４８３／１９９７配列を表すＭ２タンパク質をＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞株のＤＧ４４に安定に発現させた。細胞解離緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で細胞を処理し、回収した。１％ＦＢＳ、０．２％ＮａＮ３を含むＰＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）中で細胞を洗浄し、１００μｇ／ｍｌのウサギＩｇＧを補足したＦＡＣＳ緩衝液中、１０７細胞／ｍｌで再懸濁した。細胞は、１０μｇ／ｍｌのＭＡｂ（または２Ｎ９対照）で１時間４℃で予め結合され、次にＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。その後、直接的にコンジュゲートされたＡＦ６４７−８Ｉ１０または−２３Ｋ１２（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７タンパク質標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識されたを用いて、予めブロッキングされた３つの細胞試料を細胞１０６個／試料について１μｇ／ｍｌで染色した。フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳＣａｎｔｏを用いて前述の通りに進行させた。データは、標準誤差を含む３つの別々の実験からの平均の読み出しである。結果を図５に示す。
【０３５０】
（実施例９）
Ｍ２変異体および短縮型（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）Ｍ２ペプチドに対するヒト抗インフルエンザモノクローナル抗体の結合
他のＭ２ペプチド変異体に対するｍＡｂ  ８ｉ１０および２３Ｋ１２の交差反応性をＥＬＩＳＡによって評価した。ペプチド配列を図６Ａおよび６Ｂに示す。さらに、同様のＥＬＩＳＡアッセイを用いて、Ｍ２短縮型ペプチドに対する結合活性を測定した。
【０３５１】
要約すると、各々のペプチドは、２５μＬ／ウェルのＰＢＳ緩衝液中、一晩４℃で平底３８４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に２μｇ／ｍＬで被覆された。プレートを３回洗浄し、１時間室温で１％ミルク／ＰＢＳでブロッキングした。３回の洗浄後、ＭＡｂタイターが添加され、１時間室温でインキュベートされた。希釈されたＨＲＰコンジュゲートしたヤギ抗ヒト免疫グロブリンＦＣ特異的（Ｐｉｅｒｃｅ）が、３回の洗浄後に各ウェルに添加された。１時間室温でプレートをインキュベートし、３回洗浄した。１−Ｓｔｅｐ（商標）Ｕｌｔｒａ−ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）を２５μｌ／ウェルで添加し、暗所中、室温で反応を進行させた。２５μｌ／ウェルの１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４でアッセイを停止させ、４５０ｎｍの吸光度（Ａ４５０）をＳｐｅｃｔｒｏＭａｘ  Ｐｌｕｓプレートリーダーで読み取った。結果を図６Ａおよび６Ｂに示す。
【０３５２】
（実施例１０）
致命的なウイルス攻撃から保護するためのヒト抗インフルエンザモノクローナル抗体の能力のｉｎ  ｖｉｖｏ評価
高病原性のトリインフルエンザ株を用いた致命的なウイルス攻撃からマウスを保護するための抗体２３Ｋ１２および８Ｉ１０の能力を試験した。
【０３５３】
雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスは、各群１０匹からなる５群に無作為に選んだ。感染の１日前（第−１（マイナス１）日）、感染の２日後（第＋２（プラス２）日に、２００μｇの抗体を２００μｌの腹腔内注射を介して投与した。第０（ゼロ）日に、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４インフルエンザウイルスの約ＬＤ９０（致死量９０）を３０μｌの体積で鼻腔内に投与した。生存率は、感染後の第１日から第２８日を通じて観察した。結果を図７に示す。
【０３５４】
他の実施形態
本発明の特定の実施形態は説明を目的に本明細書に記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなしに種々の変更がされてもよい。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲に記載される場合を除いて、限定されない。
【０３５５】
本発明は、本発明の詳細な説明とともに記載されるが、先行する記載は、添付された特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を説明するためであって、限定することを意図していない。他の態様、利点、および変更は、下記の特許請求の範囲内にある。
【０３５６】
本明細書に言及されている特許および科学文献は、当業者に利用可能である知識を定着させる。本明細書において引用されたすべての米国特許および公開されたまたは公開されていない米国特許出願は参照により援用される。本明細書において引用されたすべての公開された外国特許および特許出願は参照により本明細書に援用される。本明細書において引用された受入番号によって指定されるＧｅｎｂａｎｋおよびＮＣＢＩ寄託は参照により本明細書に援用される。本明細書に引用されたすべての他の刊行された参考文献、資料、写本および科学文献は参照により本明細書に援用される。
【０３５７】
本発明は、その好ましい実施形態を参照して具体的に示され、記載されているが、形式および詳細における種々の変更は、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなしにその中でなされてもよいことは当業者によって理解されよう。
【図９】
0005623332.tif 000039
【図１】
0005623332.tif 000040
【図２Ａ】
0005623332.tif 000041
【図２Ｂ】
0005623332.tif 000042
【図３Ａ】
0005623332.tif 000043
【図３Ｂ】
0005623332.tif 000044
【図３Ｃ】
0005623332.tif 000045
【図４Ａ】
0005623332.tif 000046
【図４Ｂ】
0005623332.tif 000047
【図５】
0005623332.tif 000048
【図６Ａ】
0005623332.tif 000049
【図６Ｂ】
0005623332.tif 000050
【図７】
0005623332.tif 000051
【図８】
0005623332.tif 000052
【図１０】
0005623332.tif 000053
【図１１】
0005623332.tif 000054
【配列表】
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