(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
樹状細胞をトランスフェクトする方法であって、以下：
トランスフェクション剤を提供する工程であって、該トランスフェクション剤は、ポリヌクレオチドおよび微粒子を含み、該微粒子は、生分解性ポリマーおよびカチオン性界面活性剤を含む、工程；
該ポリヌクレオチドを該微粒子上に吸着させる工程；ならびに
該樹状細胞およびトランスフェクション剤を、該樹状細胞を該ポリヌクレオチドでトランスフェクトするのに十分な時間インキュベートする工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記樹状細胞が、骨髄に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記樹状細胞が、血液に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記樹状細胞が、脊椎動物被験体に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記樹状細胞が、ヒト被験体に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記カチオン性界面活性剤が、ＣＴＡＢを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記カチオン性界面活性剤が、セトリミドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリマーが、ポリ（α−ヒドロキシ酸）である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリマーが、ポリ（ラクチド）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリマーが、Ｄ，Ｌ−ラクチドとグリコリドまたはグリコール酸とのコポリマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリマーが、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリマーが、Ｄ，Ｌ−ラクチドとカプロラクトンとのコポリマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記樹状細胞が、トランスフェクションの前に約５日間培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記樹状細胞が、トランスフェクションの前に約１０日間培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記樹状細胞およびトランスフェクション剤が、約２４時間インキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリヌクレオチドが、プラスミドの形態で提供される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドが、ウイルスに関連する抗原または腫瘍に関連する抗原をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗原が、ＨＩＶ、髄膜炎Ａ、髄膜炎Ｂまたは髄膜炎Ｃに関連する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
免疫応答を生成するための組成物であって、
請求項１７に記載の方法によって産生された樹状細胞の有効量
を含む、組成物。
【請求項２０】
前記樹状細胞が、脊椎動物被験体に由来する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記樹状細胞が、前記脊椎動物被験体に対してＭＨＣ適合性の健常な脊椎動物被験体に由来する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
前記樹状細胞が、非経口的に投与するために適していることを特徴とする、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２３】
前記樹状細胞が、罹患組織内への直接注入によって投与するために適していることを特徴とする、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２４】
免疫応答を必要とする脊椎動物被験体において免疫応答を生成するための組成物であって、
Ｔ細胞
を含み、該Ｔ細胞が、請求項１７に記載の方法によって産生された樹状細胞に供することによって活性化されることを特徴とする、組成物。
【請求項２５】
前記樹状細胞およびＴ細胞が、前記脊椎動物被験体に由来する、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記樹状細胞およびＴ細胞が、前記脊椎動物被験体に対してＭＨＣ適合性の健常な脊椎動物被験体に由来する、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
前記Ｔ細胞が、非経口的に投与するために適していることを特徴とする、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２８】
前記Ｔ細胞が、罹患組織内への直接注入によって投与するために適していることを特徴とする、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２９】
請求項１７に記載の方法によって作製された、抗原提示樹状細胞。
【請求項３０】
前記トランスフェクション剤が、約１ミクロンの直径を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記トランスフェクション剤が、約１％  ｗ／ｗのポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、特許出願番号６０／１４６３９１（１９９９年７月２９日出願）に関する。この出願は本明細書中でその全体が参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、例えば、ウイルスまたは腫瘍と共に免疫治療のための樹状細胞を提供する組成物および方法に関する。詳細には、本発明は、ウイルスおよび腫瘍に対する養子細胞免疫治療において使用するため、例えば、多数のウイルスまたは腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の活性化および拡大を可能にするトランスフェクションによって、抗原提示樹状細胞を生成するための方法に関する。
【０００３】
（発明の背景）
免疫応答の発生は、抗原提示細胞との相互作用による、ヘルパー（ＣＤ４＋）（ＴH）および細胞傷害性（ＣＤ８＋）（ＣＴＬ）Ｔ細胞サブセットの感作を包含する。抗原提示細胞は、抗原性フラグメント（すなわち、細胞表面上における提示のためのＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩに結合する抗原由来の特異的アミノ酸配列）に関連する主要な組織適合性（ＭＨＣ）クラスＩまたはクラスＩＩ分子を発現する。ヒトにおけるＭＨＣはまた、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）複合体と称される。感作ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｂ細胞および様々なＴ細胞サブセットの活性化に関与するリンホカインを産生する。感作ＣＤ８＋Ｔ細胞は、リンホカインに対する応答数を増加し、そして適合性ＭＨＣコード化クラスＩ分子に関連する特定の抗原性フラグメントを発現する細胞を破壊するように作用する。腫瘍またはウイルス感染の過程において、細胞傷害性Ｔ細胞は、腫瘍またはウイルス関連抗原を発現する細胞を根絶する。
【０００４】
樹状細胞（ＤＣ）は、免疫系の最も強力な抗原提示細胞であると考えられる（Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｒ．Ｍ．１９９１，Ｔｈｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：２７１；Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，Ｊ．Ｂ．およびＲ．Ｍ．Ｓｔｅｉｎｍａｎ．１９９８．Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ、３９２：２４５に総説される）。抗原の内部移行およびプロセシング、リンパ系器官への転移、サイトカインの分泌、およびリンパ球シグナル伝達のために必要な同時刺激性分子の発現による免疫応答の開始における役割のそれらの広範なスペクトルを考慮すると、樹状細胞は臨床的用途のための理論的法的であることは、驚くべきことではない（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，Ｊ．Ｂ．およびＲ．Ｍ．Ｓｔｅｉｎｍａｎ．１９９８，Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｎａｔｕｒｅ．３９２：２４５）。抗原をインビボで樹状細胞に標的化するか、またはエキソビボで樹状細胞を抗原に曝露することによって、予防的適用のためのヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞、抗体ならびにＩＬ−１２を誘発することによるワクチンの免疫原性を増強することが可能であるか、または癌免疫治療のためのＴ細胞媒介性抗腫瘍応答を誘導することが可能である。Ａｋｂａｒｉらは、樹状細胞のトランスフェクションおよび活性化は、マウスモデルにおいて、耳皮膚の乱切によるＤＮＡワクチン接種後の免疫性に重要な現象であることを示唆している（Ｏ．Ａｋｂａｒｉ，Ｎ．Ｐ．、Ｓ．Ｇａｒｃｉａ、Ｒ．Ｔａｓｃｏｎ、Ｄ．ＬｏｗｒｉｅおよびＢ．Ｓｔｏｃｋｉｎｇｅｒ、１９９９、ＤＮＡ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ：Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ｋｅｙ  ｅｖｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：１６９）。マウスモデルにおける抗腫瘍ＣＴＬ活性および致死的腫瘍チャレンジに対する保護は、腫瘍関連ペプチド（Ｊ．I．Ｍａｙｏｒｄｏｍｏ，Ｔ．Ｚ．，Ｗ．Ｊ．Ｓｔｏｒｋｕｓ．１９９５．Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｐｕｌｓｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｔｕｍｏｕｒ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｅｌｉｃｉｔ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｔｕｍｏｕｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１：１２９７）、および皮下経路により転移された全腫瘍溶解物（Ｒ．Ｃ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｋ．Ｓ．およびＪ．Ｊ．Ｍｕｌｅ’，１９９８．Ｍｕｒｉｎｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｐｕｌｓｅｄ  ｗｉｔｈ  ｗｈｏｌｅ  ｔｕｍｏｒ  ｌｙｓａｔｅｓ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：９４８２）でパルス化されたサイトカイン駆動性骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を使用して実証されている。
【０００５】
樹状細胞のインビトロ産生は、樹状細胞の受動的転移に基づく遺伝子免疫治療が開発に魅力的な標的となるように、十分に最適化されている（Ｎ．Ｒｏｍａｎｉ，Ｓ．Ｇ．，Ｄ．Ｂｒａｎｇ．１９９４．Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｌｏｏｄ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：８３）。しかしながら、非ウイルス方法による樹状細胞のインビトロのトランスフェクション効率は、非常に乏しく（Ｊ．Ｆ．Ａｒｔｈｕｒ，Ｌ．Ｈ．Ｂ．，Ｍ．Ｄ．Ｒｏｔｈ，Ｌ．Ａ．Ｂｕｉ，Ｓ．Ｍ．Ｋｉｅｒｔｓｃｈｅｒ，Ｒ．Ｌａｕ，Ｓ．Ｄｕｂｉｎｅｔｔ，Ｊ．Ｇｒａｓｐｙ，Ｗ．Ｈ．ＭｃＢｒｉｄｅおよびＪ．Ｓ．Ｅｃｏｎｏｍｏｕ．１９９７、Ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：１７）、そして有効な樹状細胞ベースの免疫治療への進歩を制限してきた。エレクトロポレーションの使用によって進歩が進んできたが、トランスフェクションの効率は非常に低く、そして細胞生育可能力の実質的な損失を生じる（Ｖ．Ｆ．I．Ｖａｎ  Ｔｅｎｄｅｌｏｏ，Ｈ．−Ｗ．Ｓ．，Ｆ．Ｌａｒｄｏｎ，ＧＬＥＥ  Ｖａｎｈａｍ，Ｇ．Ｎｉｊｓ，Ｍ．Ｌｅｎｊｏｕ，Ｌ．Ｈｅｎｄｒｉｋｓ，Ｃ．Ｖａｎ  Ｂｒｏｅｃｋｈｏｖｅｎ，Ａ．Ｍｏｕｌｉｊｎ，Ｉ．Ｒｏｄｒｉｇｕｓ，Ｐ，Ｖｅｒｄｏｎｋ，Ｄ．Ｒ．Ｖａｎ  Ｂｏｃｋｓｔａｅｌｅ，およびＺ．Ｎ．Ｂｅｒｎｅｍａｎ．１９９８．Ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ：ｈｉｇｈ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ−ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：７００）。現在まで、純粋に化学的方法は有効であることが示されていない。
【０００６】
粒子性キャリアは、治療的化合物の制御された非経口送達を達成するために使用されている。このようなキャリアは、長時間送達系に活性剤を保持するよう設計される。粒子性キャリアの例としては、ポリメチルメタクリレートポリマーから誘導されるキャリア、ならびにポリ（ラクチド）（例えば、米国特許第３，７７３，９１９号を参照のこと）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧとして公知、例えば、米国特許第４，７６７，６２８号を参照のこと）、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧとして公知、例えば、米国特許第５，６４８，０９５号を参照のこと）から誘導される微粒子が挙げられる。ポリメチルメタクリレートポリマーは、非分解性であり、一方、ＰＬＧ粒子は、エステル結合のランダム非酵素的加水分解によって生分解して乳酸およびグリコール酸になり、これらは通常の代謝経路によって排出される。
【０００７】
例えば、米国特許第５，６４８，０９５は、鼻腔送達、経口送達、肺送達および経口送達のための薬物送達システムとして、カプセル化された薬剤と共にマイクロスフェアを使用することを記載する。様々なポリペプチド成長因子を含む遅延放出処方物もまた記載されている。例えば、国際公開ＷＯ９４／１２１５８、米国特許第５，１３４，１２２号および国際公開ＷＯ９６／３７２１６を参照のこと。
【０００８】
粒子性キャリアはまた、適切な免疫応答を引き起こすための試みにおいて、吸着された抗原または捕捉された抗原と共に使用されている。このようなキャリアは、免疫系に対する選択された抗原の複数のコピーを提示し、そして局所リンパ節における抗原の捕捉および保持を促進する。この粒子は、マクロファージによって貪食され得、そしてサイトカイン放出によって抗原提示を増強し得る。例えば、同一人に譲渡された同時係属中の出願第０９／０１５，６５２（１９９８年１月２９日出願）は、細胞媒介性免疫学的応答を刺激するための抗原吸着微粒子および抗原カプセル化微粒子の使用、ならびにこの微粒子を作製する方法を記載する。
【０００９】
例えば、同一人に譲渡された仮特許出願６０／０３６，３１６において、微粒子を形成する方法が開示され、この方法は、ポリマーと有機溶媒を合わせる工程、次いで、乳濁液安定剤（例えば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ））を添加する工程、次いで、この有機溶媒をエバポレートし、これにより微粒子を形成する工程を包含する。微粒子の表面は、ポリマーおよび安定剤を含む。ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ、ポリペプチドおよび抗原）は、次いで、これらの表面に吸着される。ＰＣＴ  ＵＳ９９／１７３０８もまた参照のこと。
【００１０】
同一人に譲渡された仮出願第６０／１４６３９１は、ポリヌクレオチドを含む様々な高分子を吸収し得る吸着表面を有する微粒子を形成する方法を開示する。一実施形態において、この微粒子は、ポリマーおよび界面活性剤の両方からなる。微粒子はポリマー（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、好ましくは、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリシアノアクリレートなど）から誘導され、そして界面活性剤（例えば、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤）を用いて形成され、これらの界面活性剤は組み合わせて使用され得る。開示されるカチオン性界面活性剤は、セトリミド（ＣＴＡＢ）、ベンザルコニウムクロリド、ＤＤＡ（ジメチルジオクトデシルアンモニウムブロミド）、ＤＯＴＡＰなどである。これらの微粒子は、ＰＶＡのみを使用するプロセスにより形成される微粒子と比較して、ウイルス性抗原の改良された吸着を生じ、そして優れた免疫応答を提供することが示される。
【００１１】
樹状細胞は、膜ラフリング（ｒｕｆｆｌｉｎｇ）を使用してマクロピノサイトーシスを介して周辺部位において抗原を捕捉するか、またはレセプター媒介性プロセス（ＦｃγＩＩＩ、マンノースレセプター、またはＣ型レクチンＤＥＣ−２０５を含む）によって抗原を内部移行し得る（Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ，Ａ．１９９６．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｕｐｔａｋｅ  ｆｏｒ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：３４８）。従って、樹状細胞は、貪食作用により、大きな（２５０ｎｍより大きい）粒状の抗原の捕捉により標的化され得る。生分解性ポリマーマイクロスフェア（例えば、ポリ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド（ＰＬＧ））は、貧食細胞によって５μｍの直径まで容易に内部移行され（Ｉｋａｄａ，Ｙ．Ｔ．ら、１９９０．Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ｂｙ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ａｄｖ．Ｐｏｌｙｍｅｒ．Ｓｃｉ．９４：１０７）、そして薬物送達系のためのキャリアとして使用されている。
【００１２】
最近、Ｎｅｗｍａｎらは、マウス腹膜マクロファージにおける貪食作用に従うＰＬＧＡマイクロスフェアにカプセル化されたＴｅｘａｓレッドで標識したデキストランの細胞質送達を報告した（Ｋ．Ｄ．Ｎｅｗｍａｎ，Ｇ．Ｋ．Ｊ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｖ．Ｃｈｌｕｍｅｃｋｙ，Ｊ．Ｓａｍｕｅｌ．１９９９．Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅ  ｂｙ  ｐｏｌｙ（Ｄ，Ｌ−ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ，  １９９９  ＡＡＰＳ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  Ｏｎｌｉｎｅ，第１巻）。
【００１３】
核酸送達のための合成生体ポリマーの適用は、ＤＮＡをヌクレアーゼ分解から保護し、そして細胞取込みを増加させることによる利点を証明した（Ｃ．Ｃｈａｖａｎｙ，Ｔ．Ｓ．−Ｂ．，Ｔ．Ｌｅ  Ｄｏａｎ，Ｆ．Ｐｕｉｓｉｅｕｘ，Ｐ．Ｃｏｕｖｒｅｕｒ，およびＣ．Ｈｅｌｅｎｅ．１９９４．Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｏｎｔｏ  ｐｏｌｙｉｓｏｈｅｘｙｌｃｙａｎｏａｃｒｙｌａｔｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｔｈｅｍ  ａｇａｉｎｓｔ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｅｉｒ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｕｐｔａｋｅ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１１：１３７０）。
【００１４】
ＰＬＧにより媒介される専用ではない抗原提示細胞の直接トランスフェクションについての証拠は、最近、ＣｉｆｔｃｉおよびＳｕにより報告され、彼らは、ＤＮＡ：ポリカチオン複合体を含むＰＬＧ微粒子は、ＤＮＡの制御された放出、および界面活性剤で増強された取込み、ならびに２９３およびＭＣＦ−７細胞における遺伝子発現を提供することを見出した（Ｋ．Ｃｉｆｔｃｉ，Ｊ．Ｓ．１９９９．ＤＮＡ−ＰＬＧＡ  ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ：ａ  ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．１９９９  ＡＡＰＳ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  Ｏｎｌｉｎｅ，第１巻）。
【００１５】
ポリアルキルシアノアクリレートナノ粒子は、ＣＴＡＢ−オリゴヌクレオチド複合体を結合して、マクロファージ細胞株にインビトロでアンチセンスオリゴヌクレオチドを送達するために使用されてきた（Ｃ．Ｃｈａｖａｎｙ，Ｔ．Ｓ．−Ｂ．，Ｔ．Ｌｅ  Ｄｏａｎ，Ｆ．Ｐｕｉｓｉｅｕｘ，Ｐ．Ｃｏｕｖｒｅｕｒ，およびＣ．Ｈｅｌｅｎｅ．１９９４．Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｏｎｔｏ  ｐｏｌｙｉｓｏｈｅｘｙｌｃｙａｎｏａｃｒｙｌａｔｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｔｈｅｍ  ａｇａｉｎｓｔ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｅｉｒ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｕｐｔａｋｅ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１１：１３７０；Ｅ．Ｆａｔｔａｌ，Ｃ．Ｖ．，Ｉ．Ａｙｎｉｅ，Ｙ．Ｎａｋａｄａ，Ｇ．Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｃ．Ｍａｌｖｙ，およびＰ．Ｃｏｕｖｒｅｕｒ．１９９８．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙａｌｋｙｌｃｙａｎｏａｃｒｙｌａｔｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ５３：１３７）が、これらのビヒクルは、組換え遺伝子を有するプラスミドで樹状細胞をトランスフェクトすることが示されなかった。
【００１６】
従って、樹状細胞のトランスフェクションのための有効な非ウイルス性技術の必要性が、当該分野において存在する。微粒子技術は、これまでにポリヌクレオチドを細胞に導入するために使用されてきたが、出願人らは、このような技術は、トランスフェクションに対して明白に耐性である樹状細胞のトランスフェクションのために使用されていないことを見出した。
【００１７】
（発明の要旨）
本発明は、非ウイルス方法による樹状細胞のトランスフェクションのための有効な方法を提供する。本発明は、樹状細胞をインキュベートすることによるこの利点、および特定のトランスフェクション剤を提供する。このトランスフェクション剤は、ポリヌクレオチドおよび微粒子を含み、この微粒子は、生分解性ポリマーおよびカチオン性界面活性剤からなる。樹状細胞およびトランスフェクション剤は、ポリヌクレオチドでこの樹状細胞をトランスフェクトするのに十分な時間インキュベートされる。
【００１８】
トランスフェクション剤について、カチオン性界面活性剤は、好ましくは、ＣＴＡＢまたはセトリミドを含み、一方、ポリマーは、好ましくは、ポリ（α−ヒドロキシ酸）（例えば、ポリ（ラクチド））、Ｄ，Ｌ−ラクチドとカプロラクトンとのコポリマー、またはＤ，Ｌ−ラクチドとグリコリドまたはグリコール酸とのコポリマー（例えば、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド））である。さらに好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、ウイルスに関連する抗原（例えば、ＨＩＶ、髄膜炎Ａ、髄膜炎Ｂまたは髄膜炎Ｃ、あるいは腫瘍）をコードする。
【００１９】
樹状細胞は、任意の入手可能な供給源（例えば、脊椎動物被験体、好ましくはヒト被験体の骨髄または血液）由来であり得る。樹状細胞は、トランスフェクションの前に、例えば、約５〜約１０日の間、適切な成長因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）の存在下で培養され得る。
【００２０】
樹状細胞およびトランスフェクション剤は、好ましくは、適切な条件下で、約２４時間インキュベートされる。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明のトランスフェクトされた有効量の樹状細胞は、それを必要とする脊椎動物被験体に投与される。他の実施形態において、Ｔ細胞は、本発明の樹状細胞によってまず活性化され、次いで、それを必要とする脊椎動物被験体に投与される。樹状細胞および／またはＴ細胞は、例えば、脊椎動物被験体またはこの脊椎動物被験体とＭＨＣ適合性の健康な脊椎動物被験体由来であり得る。樹状細胞および／またはＴ細胞は、脊椎動物被験体に非経口的に投与され得る。
【００２２】
本発明の１つの利点は、ポリヌクレオチドが樹状細胞によって有効に内在化され得ることである。
【００２３】
本発明の別の利点は、遺伝子発現が樹状細胞内で有効であり得ることである。
【００２４】
本発明のなお別の利点は、抗原が処理され、そして樹状細胞の表面でＭＨＣ分子と関係して存在し得ることである。
【００２５】
本発明の別の利点は、ポリヌクレオチドが迅速に内在化され、そして抗原提示を伴って発現され得ることである。
【００２６】
本発明のなお別の利点は、本発明の方法が、例えば、遺伝子免疫治療またはワクチン接種において、比較的安全に使用され得ることである。例えば、カチオン性界面活性剤（例えば、ＣＴＡＢ）および生分解性ポリマー（例えば、ＰＬＧ）の両方は、生物医学的適用において利用された。さらに、生きたウイルスベクターの使用に関する明確な安全性は、避けられ得る（Ｒｏｃｋ，Ｓ．Ｒ．ら、１９９８．「Ｆｕｌｌｙ  ｍｏｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｈｏｓｔ  ｄｅｆｅｎｓｅ：ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｂｅｔｔｅｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：１０２５を再検討されている）。
【００２７】
これらおよび他の実施形態および利点は、本明細書および下記の特許請求の範囲の精査に基づいて、当業者に容易に明らかとなる。
【００２８】
（本発明の詳細な説明）
本発明の実施は、他に示されない限り、化学、ポリマー化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の当該分野の技術内の通常の方法を使用する。このような技術は、文献に十分に記載されている。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  および  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｄ  Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｂｉｒｄｉ，Ｋ．Ｓ．編、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７）およびＳｅｙｍｏｕｒ／Ｃａｒｒａｈｅｒ’ｓ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第４版、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．，１９９６を参照されたい）。
【００２９】
上記または下記のいずれかで本明細書に引用された全ての刊行物、特許および特許出願は、その全体が参考として本明細書によって引用されている。
【００３０】
（Ａ．定義）
本発明を記載する際に、以下の用語が使用され、そして以下に例示されるように定義されることを意図する。
【００３１】
用語「樹状細胞」は、それらの特定の樹状形態および複数の薄膜突起物によって、およびクラスＩＩ  ＭＨＣ分子の高度の密度によって特徴付けられる抗原を提示する細胞を言及するために本明細書中で使用される。樹状細胞としては、皮膚のランゲルハンス細胞、輸入リンパ管の「ベール細胞」、小胞樹状細胞、脾臓の樹状細胞、およびリンパ器官の指状突起細胞が挙げられる。樹状細胞は、皮膚、脾臓、骨髄、リンパ節、他のリンパ器官、および末梢血臍帯血から得られ得る。好ましくは、樹状細胞は、本発明に使用するために血液または骨髄から得られる。
【００３２】
本明細書中で使用される用語「微粒子」は、約１００ｎｍから約１５０μｍの直径、より好ましくは、約２００ｎｍから約３０μｍの直径、最も好ましくは、約５００ｎｍから約１０μｍの直径の粒子を意味する。微粒子のサイズは、光子相関分光法、レーザー回折および／または走査電子顕微鏡法のような、当該分野で周知の技術によって容易に決定される。
【００３３】
本明細書中で使用するための微粒子は、好ましくは、好ましく滅菌可能であり、非毒性であり、そして生分解性である材料から形成される。このような材料としては、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ＰＡＣＡおよびポリシアノアクリレートが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明に使用するための微粒子は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、特に、ポリ（ラクチド）（「ＰＬＡ」）またはＤ，Ｌ−ラクチドとグリコリドもしくはグリコール酸とのコポリマー（例えば、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（「ＰＬＧ」もしくは「ＰＬＧＡ」）、またはＤ，Ｌ−ラクチドとカプロラクトンとのコポリマー）から誘導される。この微粒子は、種々の分子量を有し、例えば、ＰＬＧのようなコポリマーの場合には、種々のコモノマー（ラクチド：グリコリド）比を有する任意の種々のポリマーの出発物質から誘導される。
【００３４】
本明細書中で使用される場合、用語「カチオン性界面活性剤」は、カチオン性界面活性剤およびエマルジョン安定剤を含む。カチオン性界面活性剤としては、セトリミド、ＣＴＡＢ、ベンザルコニウムクロリド、ＤＤＡ（ジメチルジオクトデシルアンモニウムブロミド）、ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
「ポリヌクレオチド」は、核酸ポリマーである。本発明に従うポリヌクレオチドは、好ましくは、最小のトランスフェクションユニット長であり、これは、約１ｋｂのオーダーである。さらに、「ポリヌクレオチド」は、二本鎖配列および一本鎖配列の両方を含み得、そして天然から誘導されたＤＮＡ配列および合成ＤＮＡ配列を含み得る。この用語はまた、ＤＮＡおよびＲＮＡの任意の公知の塩基アナログを含み、そして天然配列に対する改変（例えば、欠失、付加および置換（一般に天然で保存的））を含む配列を含む。
【００３６】
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを意味し、そしてこの産物の最小の長さに限定されない。従って、ペプチド、オリゴペプチド、ダイマー、マルチマーなどは、定義内に含まれる。全長タンパク質およびそのフラグメントの両方は、定義に含まれる。この用語はまた、天然配列に対する改変（例えば、欠失、付加および置換（一般に天然で保存的））を含む。
【００３７】
「抗原」は、抗原が本発明に従う樹状細胞表面に示される場合、免疫応答を刺激し得る１以上のエピトープを含む分子を意味する。通常、エピトープは、約３〜１５個、一般に、約５〜１５個の間のアミノ酸を含む。所与のタンパク質のエピトープは、当該分野で周知の任意の数のエピトープマッピング技術を使用して同定され得る。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第６６巻（Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ編、１９９６）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙを参照のこと。例えば、リニアエピトープは、例えば、固体支持体上で多数のペプチド（タンパク質分子の部分に対応するペプチド）を同時に合成することによって、そしてこのペプチドが支持体にまだ結合している間に、抗体とペプチドを反応させることによって決定され得る。このような技術は、当該分野で公知であり、そして例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８−４００２；Ｇｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：７０９−７１５（本明細書中でこれらの全ては、参考として援用される）に記載される。同様に、高次構造エピトープは、アミノ酸の空間的な高次構造を、例えば、Ｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴などにより決定することによって容易に同定される。例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（上述）を参照のこと。
【００３８】
本発明の目的のために、抗原が任意の種々の公知のウイルス、細菌、寄生虫および真菌ならびに任意の種々の腫瘍から誘導され得る。さらに、本発明の目的のために、「抗原」は、免疫応答を惹起する能力が維持される限り、天然配列に対する改変（例えば、欠失、付加および置換（一般に天然で保存的））を含むタンパク質を意味する。これらの改変は、部位特異的変異誘発を介して意図され得るか、または抗原を産生する宿主の変異などを介して偶発的であり得る。
【００３９】
「免疫学的応答」または「免疫応答」は、目的の組成物中に存在する分子に応答する、体液性免疫応答および／または細胞免疫応答の被験体中での発達である。本発明の目的のために、「体液性免疫応答」は、抗体分子によって媒介される免疫応答を意味するが、「細胞免疫応答」は、Ｔ−リンパ球および／またはその他の白血球によって媒介されるものである。従って、本明細書中に記載されるような免疫学的応答は、細胞傷害Ｔ細胞の産生および／またはヘルパーＴ細胞の産生または活性化を刺激するものであり得る。このような応答は、当該分野で周知の標準的なイムノアッセイおよび中和アッセイを使用して決定され得る。
【００４０】
ワクチンおよび免疫学的組成物の両方は、本発明と関連して考慮される。
【００４１】
「脊椎動物被験体」とは、亜門ｃｏｒｄａｔａの任意のメンバーを意味し、これには、限定しないが、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウマ、およびヒトのような哺乳動物；イヌおよびネコのような家畜；およびニワトリ、シチメンチョウ、および他の家禽のトリを含む雄鳥および雌鳥のような飼いならされたトリ、野生のトリおよび狩猟鳥を含むトリが挙げられる。この用語は、特定の年齢を示さない。従って、成体の動物と新生仔の動物との両方がカバーされることを意図する。
【００４２】
「薬学的に受容可能」または「薬理学的に受容可能」とは、生物学的またはそれ以外で望ましくないことはない物質（すなわち、この物質は、任意の望ましくない生物学的効果を引き起こさず、その物質が含まれる組成物の任意の成分と有害な様式で相互作用しないで個体に投与され得る）を意味する。
【００４３】
（Ｂ．微粒子の処方）
本発明において、目的の抗原を含むポリヌクレオチドは、ポリマーおよびカチオン性界面活性剤から形成される微粒子に吸収される。吸収剤の微粒子の表面へのポリヌクレオチドの吸収は、結合−相互作用機構（限定しないが、イオン結合、水素結合、共有結合、ファンデルワールス結合、および親水性／疎水性相互作用を介する結合を含む）によって生じる。当業者は、本発明のために適切なカチオン性界面活性剤を容易に選択し得る。上記のように、公知のカチオン性界面活性剤としては、限定しないが、セチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）、セトリミド（少量のドデシルトリメチルアンモニウムブロマイドおよびＣＴＡＢと一緒に、主にテトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイドからなる混合物）、ベンザルコニウムクロライド、ＤＤＡ（ジメチルジオクトデシルアンモニウムブロマイド）、ＤＯＴＡＰなどが挙げられる。ＣＴＡＢが特に好ましい。カチオン性界面活性剤（例えば、ＣＴＡＢ）を用いて製造される微粒子（例えば、ＣＴＡＢ−ＰＬＧ微粒子）は、陰性に荷電したポリヌクレオチドを容易に吸収する。
【００４４】
本発明とともに使用するための微粒子を製造するための生分解性ポリマーは、例えば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，ＧｅｒｍａｎｙおよびＢｉｒｍｉｎｇｈａｍ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬから容易に商業的に入手可能である。例えば、本明細書中で微粒子を形成するのに有用なポリマーとしては、ポリヒドロキシ酪酸から誘導されるもの；ポリカプロラクトン；ポリオルトエステル；ポリ無水物；ならびにポリ（α−ヒドロキシ酸）（例えば、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（両方とも本明細書中において「ＰＬＡ」として公知））、ポリ（ヒドロキシブチレート）、Ｄ，Ｌ−ラクチドおよびグリコリドのコポリマー（例えば、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（本明細書中において、「ＰＬＧ」または「ＰＬＧＡ」と名付けられる）またはＤ，Ｌ−ラクチドおよびカプロラクトンのコポリマーが挙げられる。本明細書中でおける使用に特に好ましいポリマーは、ＰＬＡおよびＰＬＧポリマーである。これらのポリマーは、種々の分子量で入手可能であり、所与の用途について、適切な分子量が、当業者によって容易に決定される。従って、例えば、ＰＬＡについて、適切な分子量は、約２０００〜５０００のオーダーである。ＰＬＧについて、適切な分子量は、一般的に約１０，０００〜約２００，０００、好ましくは約１５，０００〜１５０，０００、そして最も好ましくは、約５０，０００〜約１００，０００の範囲である。
【００４５】
ＰＬＧのようなコポリマーが微粒子を形成するために使用される場合、種々のラクチド：グリコリド比が本明細書中での用途を見出す。種々のラクチド：グリコリド比および分子量を有するＰＬＧコポリマーは、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ  ａｎｄ  Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬを含む多くの供給源から商業的に容易に入手可能である。これらのポリマーはまた、当該分野で周知の技術（例えば、Ｔａｂａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．（１９８８）２２：８３７−８５８に記載される）を使用して乳酸成分の単純な重縮合によって合成され得る。
【００４６】
ポリヌクレオチド／微粒子は、当該分野において周知のいくつかの方法のいずれかを使用して調製される。例えば、二重乳濁液／溶媒エバポレーション技術（例えば、米国特許第３，５２３，９０７号およびＯｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（１９８８）３６：１０９５−１１０３に記載される）は、微粒子を作製するために本明細書中で使用され得る。
【００４７】
水中油中水（ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ）（ｗ／ｏ／ｗ）溶媒蒸発系を使用して、Ｏ’Ｈａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９３）１１：９６５−９６９およびＪｅｆｆｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２によって記載されるような微粒子を形成し得る。この技術において、特定のポリマーが、有機溶媒（例えば、酢酸エチル、ジメチルクロライド（メチレンクロライドおよびジクロロメタンとも呼ばれる）、アセトニトリル、アセトン、クロロホルムなど）と組み合わされる。ポリマーは、有機溶媒中において約１〜３０％、好ましくは約２〜１５％、より好ましくは約３〜１０％、そして最も好ましくは約４％の溶液で提供される。ポリマー溶液を、例えば、ホモジナイザーを使用して乳化する。次いで、この乳濁液は、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドンのような乳化安定剤、および界面活性剤（特に、カチオン性界面活性剤）の大量の水溶液と組み合わせられる。乳濁液は、１つより多くの乳化安定剤および／または界面活性剤（例えば、ＰＶＡおよびカチオン性界面活性剤の組み合わせ）で組み合わせられ得る。特定のポリヌクレオチドは、安定剤および／または界面活性剤の組み合わせを有する微粒子に、より容易に吸収され得る。乳化安定化剤が使用される場合、典型的に、約２〜１５％の溶液、より典型的には、約４〜１０％溶液で提供される。一般的に、約０．００００１：１〜約０．１：１の範囲の界面活性剤対ポリマーの重量対重量比が使用され、より好ましくは、約０．０００１：１〜約０．０１：１、より好ましくは、約０．００１：１〜約０．０１、そしてなおより好ましくは約０．００５：１〜約０．０１：１で使用される。次いで、この混合物は、安定なｗ／ｏ／ｗ二重乳濁液を作製するように均質化される。次いで、有機溶媒が蒸発される。
【００４８】
処方物のパラメーターは、０．０５μｍ（５０ｎｍ）のオーダーの小さな微粒子から５０μｍの大きな微粒子またはさらに大きな微粒子の調製を可能にするように操作され得る。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２−３６８；ＭｃＧｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐ．（１９９６）を参照のこと。例えば、撹拌の減少は、大きな微粒子を生じ、内部相容積の増加を生じる。小さな粒子は、高濃度の乳濁液安定化剤を有する低い水相容積によって作製される。
【００４９】
微粒子はまた、Ｔｈｏｍａｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ（１９９６）４１：１３１；米国特許第２，８００，４５７号；Ｍａｓｔｅｒｓ，Ｋ．（１９７６）Ｓｐｒａｙ  Ｄｒｙｉｎｇ  ２ｎｄ  Ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されるようなスプレー乾燥およびコアセルベーション；Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８０）Ｔｈｅ  「Ｗｕｒｓｔｅｒ  Ｐｒｏｃｅｓｓ」  ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｔｈｅｏｒｙ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａ．Ｆ．Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ，ｅｄ．），Ｖｏｌ．２，ｐｐ．１３３−１５４  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ  ａｎｄ  Ｄｅａｓｙ，Ｐ．Ｂ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．（１９８８）Ｓ（２）：９９−１３９に記載される、パン（ｐａｎ）コーティングおよびＷｕｒｓｔｅｒコーティングのような空気−懸濁液コーティング技術；および例えば、Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８０）２１０：９０８−９１０によって記載されるようなイオンゲル化を使用して形成され得る。
【００５０】
粒子サイズは、例えば、ヘリウム−ネオンレーザーを組み込むスペクトロメーターを使用する、例えば、レーザー光散乱によって決定され得る。一般的に、粒子サイズは、室温で決定され、そして粒子直径の平均値を得るために、問題のサンプルの複数分析（例えば、５〜１０回）を含む。粒子サイズはまた、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用して容易に決定される。
【００５１】
調製に続いて、微粒子は、将来の使用のために、そのまま、または凍結乾燥されて保存され得る。
【００５２】
（Ｃ．樹状細胞の単離）
樹状細胞は、それらが存在する任意の組織（皮膚の表皮（ランゲルハンス細胞）のような非リンパ組織ならびに脾臓、骨髄、リンパ節および胸腺のようなリンパ組織、ならびに血液（血液樹状細胞）、例えば、末梢血および臍帯血、およびリンパ（ベール細胞（ｖｅｉｌｅｄ  ｃｅｌｌ））を含む循環系を含む）から得られる。
【００５３】
例えば、器官培養物に配置されるマウス（Ｌａｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１４８３−１４９３（１９９０））またはヒト皮膚（Ｒｉｃｈｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．（１９９４））の外植片は、この外植片を囲う培地への樹状細胞の選択的な移動を可能にする。
【００５４】
最近の研究は、ヒト末梢血由来を含むヒト樹状細胞の単離および増殖のための方法（Ｍａｃａｔｏｎｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｉｍｍｕｎｏｌ．７４：３９９−４０６；Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：１０６７−１０７８（単離）；およびＭａｒｋｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８５：９５５−９６１；Ｒｏｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：８３−９３；Ｓａｌｌｕｓｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１１０９−１１１８；Ｂｅｒｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．５５：１０９９−１１０４（増殖））を記載している。
【００５５】
Ｖａｎ  Ｔｅｎｄｅｌｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：７００−７０７は、骨髄および臍帯血から得られるＣＤ３４＋前駆細胞からそして末梢血由来の単核細胞から樹状細胞（ランゲルハンス細胞を含む）を誘導するための技術を開示する。
【００５６】
樹状細胞はまた、例えば、好ましくは、特定の増殖因子または刺激因子（単数または複数）の存在下で培養することによって、成熟または活性化を誘導するために処理され得る。以下の例において、樹状細胞を、ＧＭ−ＣＳＦと培養することによって改変する。
【００５７】
樹状細胞の調製に関連するさらなる技術は、例えば、米国特許第５，７８８，９６３号、同第５，９６２，３１８号および同第５，８５１，７５６号（これらの開示は、本明細書中で参考として援用される）に見い出され得る。
【００５８】
本発明の好ましい実施形態に従って、樹状細胞は、処置される患者から得られる。この樹状細胞を使用して、免疫療法のために、インビトロまたはインビボのいずれかで、患者のＴ細胞を活性化する。
【００５９】
代替的実施形態に従って、樹状細胞は、健常な個体から得られる。例えば、個体の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）上の関連するＨＬＡ抗原（クラスＩおよびＩＩの両方（例えば、ＨＬＡ−Ａ、Ｂ、ＣおよびＤＲ））を同定し、そしてＨＬＡ抗原に関してこの患者に適合する樹状細胞を、上記のように単離および拡大する。例えば、特定の例において、放射線および／または化学療法剤で処置した後期癌患者は、十分な樹状細胞も、効果的な樹状細胞も提供し得ない。従って、健常なＨＬＡ適合性の個体（例えば、同胞）由来の樹状細胞が、上記の方法のいずれかを使用して獲得および拡大され得る。
【００６０】
（Ｄ．抗原）
発現され得る選択された抗原としては、脊椎動物の感染因子または癌の、１以上の選択された抗原が含まれ、そしてこれらは、構造タンパク質または非構造タンパク質のいずれかに対応することができる。本明細書中に記載される本発明は、このような抗原の、樹状細胞の表面のＭＨＣ分子との会合を提供し、その結果、目的の抗原に対する免疫応答が、マウントされ得る。
【００６１】
例えば、本発明は、以下を含むヘルペスウイルスファミリー由来の広範な種々の抗原に対する免疫応答を刺激するために有用である：単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型および２型由来のタンパク質（例えば、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２糖タンパク質ｇＢ、ｇＤおよびｇＨ）；水痘−帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来の抗原（ＣＭＶ  ｇＢおよびｇＨを含む）；ならびに他のヒトヘルペスウイルス（例えば、ＨＨＶ６およびＨＨＶ７）由来の抗原。（例えば、Ｃｈｅｅら、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｊ．Ｋ．ＭｃＤｏｕｇａｌｌ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  １９９０）１２５−１６９頁（サイトメガロウイルスのタンパク質をコードする内容の総説について）；ＭｃＧｅｏｃｈら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６９：１５３１−１５７４（種々のＨＳＶ−１コードタンパク質の考察について）；米国特許第５，１７１，５６８号（ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２のｇＢおよびｇＤタンパク質、ならびにそれらをコードする遺伝子の考察について）；Ｂａｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１０．２０７−２１１（ＥＢＶゲノムにおけるタンパク質コード配列の同定について）；およびＤａｖｉｓｏｎおよびＳｃｏｔｔ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）６７：１７５９−１８１６（ＶＺＶの総説について）を参照のこと。）
【００６２】
肝炎ファミリーのウイルス（Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、デルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）およびＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）を含む）由来の抗原もまた、本明細書中に記載の技術において都合よく使用され得る。例えば、ＨＣＶのウイルスゲノム配列は公知であり、その配列を得るための方法もまた公知である。例えば、国際公開番号ＷＯ８９／０４６６９；ＷＯ９０／１１０８９；およびＷＯ９０／１４４３６を参照のこと。ＨＣＶゲノムは、いくつかのウイルスタンパク質をコードする。これらのタンパク質としては、Ｅ１（Ｅとしても公知である）およびＥ２（Ｅ２／ＮＳ１としても公知である）、ならびにＮ末端ヌクレオキャプシドタンパク質（「コア」と呼ばれる）が挙げられる（Ｅ１およびＥ２を含むＨＣＶタンパク質の考察については、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９１）１４：３８１−３８８を参照のこと）。これらのタンパク質の各々、ならびにそれらの抗原性フラグメントは、本発明の組成物および方法における用途を見い出す。
【００６３】
同様に、ＨＤＶ由来のδ抗原の配列が、公知であり（例えば、米国特許第５，３７８，８１４号を参照のこと）、そしてこの抗原もまた、本発明の組成物および方法において都合よく使用され得る。さらに、以下のような、ＨＢＶ由来の抗原が、本発明における用途を見い出す：コア抗原、表面抗原（ｓＡｇ）、ならびに前表面（ｐｒｅｓｕｒｆａｃｅ）配列（ｐｒｅ−Ｓ１およびｐｒｅ−Ｓ２（以前は、ｐｒｅ−Ｓと呼ばれていた））、ならびに上記の組み合わせ（例えば、ｓＡｇ／ｐｒｅ−Ｓ１、ｓＡｇ／ｐｒｅ−Ｓ２、ｓＡｇ／ｐｒｅ−Ｓ１／ｐｒｅ−Ｓ２、およびｐｒｅ−Ｓ１／ｐｒｅ−Ｓ２）。例えば、「ＨＢＶ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ−ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｔｏ  ｌｉｃｅｎｓｅ：ａ  ｃａｓｅ  ｓｔｕｄｙ」Ｍａｃｋｅｔｔ，Ｍ．およびＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ、１５９−１７６頁（ＨＢＶ構造の考察について）；および米国特許第４，７２２，８４０号、同第５，０９８，７０４号、同第５，３２４，５１３号（それらの全体が、本明細書中で参考として援用される）；Ｂｅａｍｅｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９５）６９：６８３３−６８３８、Ｂｉｒｎｂａｕｍら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９０）６４：３３１９−３３３０；およびＺｈｏｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９１）６５：５４５７−５４６４を参照のこと。
【００６４】
他のウイルス由来の抗原もまた、特許請求の範囲に記載の組成物および方法における用途を見い出す。これらの抗原には、例えば、以下の科のメンバー由来のタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない：ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイルスなど）；カルシウイルス科；トガウイルス科（例えば、風疹ウイルス、デング熱ウイルスなど）；フラビウイルス科；コロナウイルス科；レオウイルス科；ビルナウイルス科；ラブドウイルス科（例えば、狂犬病ウイルスなど）；フィロウイルス科；パラミクソウイルス科（例えば、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルスなど）；オルソミクソウイルス科（例えば、インフルエンザＡ型、Ｂ型およびＣ型など）；ブンヤウイルス科；アレナウイルス科；レトロウイルス科（例えば、ＨＴＬＶ−Ｉ；ＨＴＬＶ−ＩＩ；ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、ＡＲＶ、ｈＴＬＲなどとしても公知））（とりわけ、分離体ＨＩＶIIIb、ＨＩＶSF2、ＨＩＶLAV、ＨＩＶLAI、ＨＩＶMN）；ＨＩＶ−１CM235、ＨＩＶ−１US4；ＨＩＶ−２；サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）由来の抗原が挙げられるが、これらに限定されない）。さらに、抗原はまた、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）およびダニ媒介脳炎ウイルス由来でもあり得る。これらおよび他のウイルスの説明については、例えば、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，第３版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ編、１９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，編、１９９１）を参照のこと。
【００６５】
より詳細には、上記ＨＩＶ分離物（ＨＩＶの種々の遺伝的サブタイプのメンバーを含む）のいずれか由来のｇｐ１２０エンベロープタンパク質が、公知でありそして報告されており（種々のＨＩＶ分離物のエンベロープ配列の比較については、例えば、Ｍｙｅｒｓら、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ，Ｎｅｗ  Ｍｅｘｉｃｏ（１９９２）；Ｍｙｅｒｓら、Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ａｉｄｓ、１９９０、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ，Ｎｅｗ  Ｍｅｘｉｃｏ：Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；およびＭｏｄｒｏｗら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８７）６１：５７０−５７８を参照のこと）、そしてこれらの分離物のいずれか由来の抗原は、本発明の方法における用途を見い出す。さらに、本発明は、種々のＨＩＶ分離物のいずれか由来の他の免疫原性タンパク質（任意の種々のエンベロープタンパク質（例えば、ｇｐ１６０およびｇｐ４１）、ｇａｇ抗原（例えば、ｐ２４ｇａｇおよびｐ５５ｇａｇ）ならびにｐｏｌ領域由来のタンパク質を含む）に等価的に適用可能である。
【００６６】
インフルエンザウイルスは、本発明が特に有用なウイルスの別の例である。詳細には、インフルエンザＡのエンベロープ糖タンパク質ＨＡおよびＮＡは、免疫応答を生じるために特に重要である。インフルエンザＡの多くのＨＡサブタイプが、同定されている（Ｋａｗａｏｋａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９０）１７９：７５９−７６７；Ｗｅｂｓｔｅｒら、「Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ａｍｏｎｇ  ｔｙｐｅ  Ａ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓｅｓ」、１２７−１６８頁：Ｐ，ＰａｌｅｓｅおよびＤ．Ｗ．Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ（編）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓｅｓ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。従って、これらの分離物のいずれか由来のタンパク質もまた、本明細書中に記載の組成物および方法において使用され得る。
【００６７】
髄膜炎Ａ、髄膜炎Ｂ、髄膜炎Ｃおよび他の関連するウイルス由来の抗原もまた、本発明の組成物および方法における用途を見い出す。髄膜炎Ｂ抗原の例については、例えば、ＰＣＴ９９／００６９５（１９９９年４月７日出願）；ＰＣＴ  ＩＢ９８／０１６６５（１９９８年１０月９日出願）およびＰＣＴ  ＵＳ９９／０９３４６（１９９９年４月３０日出願）を参照のこと。
【００６８】
Ｔ細胞免疫応答によって制御される非ウイルス生物としては、以下が挙げられる：病原性の原生動物（例えば、ニューモシスティスカリニ（Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ）、トリパノソーマ属（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、リーシュマニア属（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、プラスモディウム属（ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）およびトキソプラスマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ））；細菌（例えば、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）およびレジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｉｅｌｌａ））ならびに真菌（例えば、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）およびＣｏｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｕｓ）。従って、これらの生物由来の抗原もまた、本発明に関連して有用である。
【００６９】
本発明における使用のための腫瘍抗原としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：黒色腫抗原（Ｋａｗａｋａｍｉら、Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３５１５−３５１９（１９９４）；Ｋａｗａｋａｍｉら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０：３４７−３５２（１９９４）；Ｋａｗａｋａｍｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５４：３１２４−３１２６（１９９４）（ＭＡＲＴ−１（Ｃｏｕｌｉｅら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０：３５−４２（１９９１）、ｇｐ１００（Ｗｉｃｋら、Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．４：２０１−２０７（１９８８））、ならびにＭＡＧＥ抗原、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２およびＭＡＧＥ−３（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５４：１６４３−１６４７（１９９１）を含む）；ＣＥＡ、ＴＲＰ−１、Ｐ−１５およびチロシナーゼ（Ｂｒｉｃｈａｒｄら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：４８９（１９９３））；ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子産物（米国特許第４，９６８，６０３号）；エストロゲンレセプター、乳脂肪グロブリン、ｐ５３腫瘍サプレッサータンパク質（Ｌｅｖｉｎｅ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：６２３（１９９３））；ムチン抗原（Ｔａｙｌｏｒ−Ｐａｐｄｉｍｉｔｒｉｏｕ，国際公開番号ＷＯ９０／０５１４２））；テロメラーゼ；核基質タンパク質；前立腺酸性ホスファターゼ；パピローマウイルス抗原；および以下の癌に関連する抗原：黒色腫、転移癌、腺癌、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、結腸癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌および他の癌（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４７：４８１−９１（１９９６）。
【００７０】
（Ｅ．ポリヌクレオチド）
本発明に従って、１以上のポリヌクレオチドが、樹状細胞にエキソビボで挿入され、その結果、１以上の選択された抗原が、その樹状細胞の表面上に有効量で提示される。「有効量」によって、提示が、樹状細胞に免疫応答を誘発させ得るのに十分であることを意味する。
【００７１】
核酸操作のための技術は、周知である。このような技術における適用に有用な試薬（例えば、制限酵素など）は、当該分野で広範に公知であり、多くの供給者から市販されている。
【００７２】
本発明の樹状細胞における発現のための選択された抗原をコードする多量のヌクレオチド配列は、適切な宿主細胞におけるその配列を保持するベクターの分子クローニングおよび操作についての公知の手順を使用して得られ得る。本発明における使用のための核酸配列は、化学合成によって部分的または全体的に生成され得、そしてこれは、市販の自動オリゴヌクレオチド合成機で行われ得る。
【００７３】
樹状細胞における提示のための所望の抗原をコードするポリヌクレオチドは、好ましくは、組換え発現ベクターであり、ここで、高レベルの発現が生じ得、そしてこれらのベクターは、挿入された核酸配列の転写および翻訳のための適切な調節配列を含む。これらのベクターはまた、選択されたクラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ分子、同時刺激分子および他の免疫調節分子、ＡＢＣトランスポータータンパク質（ＴＡＰ１およびＴＡＰ２タンパク質を含む）をコードする、ポリヌクレオチド配列を含む。従って、ポリヌクレオチド配列の種々の組み合わせが、適切な発現ベクター（単数または複数）に挿入され得る。ベクターは、その後の複製に必要なさらなるエレメント（例えば、複製起点）を含み得る。ベクターはまた、その挿入された核酸を保持する樹状細胞の選択を可能にする、少なくとも１つの陽性マーカーを含み得る。
【００７４】
本発明に好ましい組換え発現ベクターとしては、プラスミドベクターが挙げられる。好ましいプラスミド発現ベクターとしては、ｐＣＭＶ（例えば、米国特許第５，６８８，６８８号（この全体の開示は、本明細書によって参考として援用される）を参照のこと）が挙げられる。
【００７５】
所望の抗原（単数または複数）をコードするポリヌクレオチドは、以下に議論する本発明のトランスフェクション方法を使用して樹状細胞に導入される。
【００７６】
（Ｆ．ポリヌクレオチドとの微粒子の会合）
目的のポリヌクレオチドを目的の微粒子と会合させるために、微粒子を、例えば、適切な緩衝液中で、ポリヌクレオチドを単純に混合する。得られた処方物は、使用前に凍結乾燥化し得る。一般に、ポリヌクレオチドは、約０．０００１：１〜０．２５：１のポリヌクレオチド：微粒子、好ましくは、０．００１：１〜０．１、より好ましくは、０．０１〜０．０５の重量比を有する、吸着されたポリヌクレオチドを有する微粒子を生じるように、微粒子に添加される。微粒子のポリヌクレオチド含量は、標準的な技術を使用して決定され得る。
【００７７】
本発明の微粒子は、その中に捕捉またはカプセル化されたポリヌクレオチド、ならびにその上に吸着されたポリヌクレオチドを有し得る。
【００７８】
ポリヌクレオチドとの微粒子の会合物は、本明細書中で代替的に、「ポリヌクレオチド／微粒子」、「トランスフェクト剤」および「トランスフェクション剤」と呼ばれる。
【００７９】
（Ｇ．樹状細胞のトランスフェクション）
一旦、樹状細胞およびポリヌクレオチド／微粒子を調製すると、これらを、トランスフェクションが生じるに十分な時間および温度で、溶液中でインキュベートする。好ましい実施形態に従って、樹状細胞およびポリヌクレオチド／微粒子は、加湿ＣＯ2インキュベーター中で、３７℃で２４時間インキュベートする。
【００８０】
樹状細胞へのトランスフェクション後の目的のポリヌクレオチドの発現は、免疫アッセイまたは生物学的アッセイによって確かめられ得る。例えば、細胞内に導入されたポリヌクレオチドの発現は、目的の抗原に特異的な標識された抗体の、細胞への結合を検出することによってか（当該分野で周知のアッセイ（例えば、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別）またはＥＬＩＳＡ（酵素連結イムノソルベントアッセイ））を使用して）、または単に細胞を染色（例えば、β−ｇａｌで）しそして細胞数をカウントすることによって、確かめられ得る。
【００８１】
Ｔ細胞活性化は、種々の公知の方法によって検出され得る。これらの方法としては、Ｔ細胞の増殖における変化の測定、標的細胞の殺傷、および特定の調節因子（例えば、リンホカイン）の分泌、特定の免疫調節分子のｍＲＮＡの発現、またはこれらの組み合わせが挙げられる。
【００８２】
（Ｈ．インビトロおよびインビボで抗原を提示するための樹状細胞の使用）
本発明の実施形態に従って、本明細書中に記載の方法のいずれかを使用してポリヌクレオチド／微粒子でトランスフェクトした樹状細胞を使用して、Ｔ細胞をインビトロで活性化する。Ｔ細胞またはＴ細胞のサブセットは、種々のリンパ組織から得られ得る。このような組織としては、脾臓、リンパ節および末梢血が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
これらの細胞を、混合Ｔ細胞集団または精製Ｔ細胞サブセットとして、トランスフェクトした樹状細胞と同時培養し得る。例えば、精製ＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗原をトランスフェクトした樹状細胞と共に培養することが所望され得る。なぜなら、ＣＤ４＋Ｔ細胞の早期の排除が、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の両方の混合培養物中でのＣＤ４＋細胞の過剰増殖を妨げ得るからである。Ｔ細胞の精製は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５およびＣＤ８に対する抗体の使用を含むが、これらに限定されない、陽性選択または陰性選択によって達成され得る。一方、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の混合集団を使用して、細胞傷害性およびＴH免疫応答を含む、特定の応答を誘発することが所望され得る。
【００８４】
インビトロでの活性化後、本発明の樹状細胞によって発現された、その選択された抗原に対する免疫応答を誘発または増強するのに十分な用量で、Ｔ細胞を、患者に投与する。
【００８５】
Ｔ細胞、および以下に記載の樹状細胞は、治療剤の当該分野で公知の多くの投与方法のうちの１つを使用することによって、その処置される被験体に導入され得る。例えば、細胞を、（アジュバントを用いてかまたは用いずに）非経口的に投与し得る（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮内および皮下投与を含む）。あるいは、細胞を、腫瘍または感染組織内への直接注入によって局所的に投与し得る。アジュバントとしては、任意の公知の薬学的に受容可能なキャリアが挙げられる。薬学的キャリアとしての使用のための非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲル溶液デキストロース（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ  ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、デキストロースおよび塩化ナトリウム、ならびに乳酸化リンゲル溶液（ｌａｃｔａｔｅｄ  Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ）が挙げられる。他のアジュバントが、所望の場合に添加され得る（例えば、抗微生物剤）。
【００８６】
例として、Ｔ細胞は、１ｍ2の体表面積あたり約１０8〜１０9細胞の用量で、静脈内注入によって投与され得る（Ｒｉｄｅｌｌら、１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：２３８−２４１を参照のこと）。注入は、所望の間隔（例えば、毎月）で繰り返され得る。レシピエントは、任意の有害反応の証拠について、Ｔ細胞注入の間または注入後にモニターされる。
【００８７】
好ましい実施形態に従って、Ｔ細胞は、樹状細胞を得た患者と同じ患者から得られる。
【００８８】
別の実施形態に従って、Ｔ細胞は、患者から得られ、そして樹状細胞（これは、Ｔ細胞を刺激するために使用される）は、ＨＬＡ適合性の健常なドナー（例えば、同胞）から得られるか、またはその逆である。
【００８９】
なお別の実施形態に従って、Ｔ細胞および樹状細胞の両方は、ＨＬＡ適合性の健常ドナーから得られる。この実施形態は、例えば、患者が、放射線および／または化学療法剤で処置した後期癌患者であり、そしてこの患者が、樹状細胞もＴ細胞も、十分にも効率的にも提供することが可能でないかもしれない場合に、特に有利であり得る。
【００９０】
本発明の別の実施形態に従って、患者から単離された樹状細胞を、培養し、インビトロでトランスフェクトし、そして患者に投与し戻して、免疫応答（Ｔ細胞活性化を含む）を刺激する。それ自体で、樹状細胞は、ワクチンおよび／または免疫療法剤を構成する。例として、抗原を提示する樹状細胞は、例えば、約１０6〜１０8細胞の用量で、静脈内注入を介して投与される。患者の免疫応答は、モニターされ得る。注入は、患者の免疫応答に基づいて、所望の間隔で繰り返され得る。
【００９１】
以下は、本発明を行うための特定の実施形態の実施例である。これらの実施例は、例示目的でのみ提供され、本発明の範囲を限定することはいかようにも意図されない。
【００９２】
使用した数（例えば、量、温度など）に関して正確性を確実にするように努力がなされたが、いくらかの実験誤差および偏差は、もちろん、許容されるべきである。
【００９３】
（実施例）
（実施例１）
（プラスミドおよびＤＮＡ処方物）ＨＩＶｐ５５ｇａｇタンパク質をコードするｐＣＭＶｇａｇプラスミドをサイトメガロウイルス初期プロモーターの制御下でＱｉａｇｅｎ  Ｅｎｄｏ  Ｆｒｅｅ  Ｇｉｇａ  Ｋｉｔを使用してイオン交換クロマトグラフィーにより精製し、そしてエンドとキシンがない（＜２．５ＥＵ／ｍｌ）ことを決定した。取り込みおよびレセプター遺伝子発現実験のために、ＢガラクトシダーゼをコードするローダミンＰＮＡクランププラスミドをＧｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。
【００９４】
カチオン性微粒子を改変された溶媒エバポレーションプロセスを使用して調製した。微粒子は、１ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩液）とともに１０ｍｌの５％ｗ／ｖポリマー（ＲＧ  ５０４  ＰＬＧ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ））のメチレンクロライド溶液をＩＫＡホモジェナイザーを使用して高速で乳化することにより調製した。次に最初の乳化液をセチルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＣＴＡＢ）（０．５％ｗ／ｖ）を含む蒸留水５０ｍＬに添加した。これは、ｗ／ｏ／ｗ乳化液の形成を生じ、これを室温で１２時間６０００ｒｐｍで攪拌し、メチレンクロライドを蒸発させた。生じた微粒子を１０，０００ｇでの遠心分離により蒸留水で２回洗浄し、凍結乾燥した。
【００９５】
プラスミドＤＮＡを、１％ｗ／ｗ装填を目標に微粒子上に吸着した（４℃で６時間、１ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ溶液中のカチオン性微粒子１００ｍｇをインキュベートすることにより）。粒子を遠心分離により分離し、ＴＥ緩衝液で洗浄し、使用まで凍結乾燥した。ＰＬＧ−ＣＴＡＢ微粒子の大きさの分布を粒子サイズアナライザー（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｕ．Ｋ．）を使用して決定した；本研究において利用される処方物は、平均約１μｍの大きさを有した。操作の任意の特定の理論に固執することを望むことなく、カチオン性界面活性剤の使用は、ローダミン標識化プラスミドＤＮＡの吸着のための正味の表面正電荷を生じると考えられる。実際のＤＮＡ装填を、上清中の遊離ＤＮＡ含量をアッセイし、ＤＮＡの総投入量から差し引くことにより定量した。本実施例で使用されるＰＬＧ−ＣＴＡＢ−ＤＮＡ処方物は、実際には０．６４〜０．８１％（ｗ／ｗ）の範囲のＤＮＡ装填を有した。
【００９６】
（細胞培養）本研究で使用される全ての細胞を、１０％熱不活化ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および０．０５ｍＭ  ２メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ−１６４０（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で、７％ＣＯ2の加湿したインキュベーター中３７℃で培養した。マウスＴ細胞ハイブリドーマ１２．２は、ＨＩＶｇａｇタンパク質のｐ７ｇペプチドを認識するＭＨＣクラスＩ、ｄ制限株である（Ｇｉｌｌｉｓ  Ｏｔｔｅｎ，Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．により提供された）。
【００９７】
（骨髄単離）雌Ｂａｌｂ／ｃマウス６〜８週齢をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｏｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）から入手した。骨髄を大腿骨および脛骨から流し、洗浄しそして１０％細胞培養グレードＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を追加した熱不活化ウシ胎仔血清中２×１０7細胞／ｍｌの濃度で凍結（−８０℃）した。
【００９８】
（骨髄由来の樹状細胞（ＢＭＤＣ）の産生）凍結した細胞アリコートを迅速に解凍し、ＤＭＳＯを取り除くために洗浄した。細胞を２００単位／ｍｌマウスＧＭ−ＣＳＦ（Ｐｒｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加した補充されたＲＰＭＩ（上記参照）２０ｍｌを含む１５０ｍｍの懸濁培養皿にプレートした。培養３日目に、細胞にマウスＧＭ−ＳＣＦを再度補充し、そして５日目に、培養物容量の半分を遠心分離し、ＧＭ−ＣＳＦを含む新しい培地に交換した。ＢＭＤＣを緩やかなピペッティングにより回収した。示されない限り、骨髄由来の樹状細胞を、６日目に抗原をコードする遺伝子とともに培養し、そしてさらに２４時間培養した。ＢＭＤＣをＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞ソーター）により細胞表面マーカーについて分析し、そしてＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ、Ｈ−ｄＫd、Ｉ−Ａd(low)、ＣＤ８０(low)、およびＣＤ８６(low)（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）に対して染色ポジティブであることにより未成熟として特徴付けた。
【００９９】
（細胞取り込みおよび蛍光顕微鏡検査）ＢＭＤＣを培地２ｍｌ中１×１０6の細胞濃度で６ウエルの培養皿にプレートした。ローダミンでラベルした裸（ｎａｋｅｄ）のプラスミド形態のＤＮＡまたはＰＬＧ−ＣＴＡＢ微粒子上で処方されたＤＮＡを１μｇＤＮＡ／ｍｌでウエルに加えた。一晩インキュベーションした後、細胞を洗浄し、サイトスピン（ｃｙｔｏｓｐｉｎ）（４０００ｒｐｍ×５分）によりＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ顕微鏡スライド（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に適用した。スライドを風乾し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）に取り付け、ローダミンフィルター（Ｃｈｒｏｍａ，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ）を備えるＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｐｈｏｔ蛍光顕微鏡を使用して可視化した。画像をＫｏｄａｋ  ＥｌｉｔｅＣｈｒｏｍｅフィルム（１００ＡＳＡ）上に記録し、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐにスキャンした。
【０１００】
裸のプラスミドＤＮＡは、エンドソームと考えられる点状アラインメントに迅速に内部移行された。対照的に、ＰＬＧ−ＣＴＡＢ−ＤＮＡ微粒子上に処方されたローダミン標識化プラスミドＤＮＡの細胞分布は、ローダミンシグナルのより散在性の分布を示唆した。内部移行の同様のパターンが、ＤｉＩ標識化微粒子およびカプセル化されたＦＩＴＣ標識化ウシ血清アルブミンを含むＰＬＧ−ＣＴＡＢ微粒子で観察されている。任意の特定の理論に固執することを望むことなく、カチオン性界面活性剤が核へのＤＮＡの局在化を可能にするエンドソームのコンパートメントを壊し得るかのようである。
【０１０１】
（実施例２）
（ＲＮＡ単離およびＲＴ−ＰＣＲ）ＢＭＤＣを培養の６日目でＲＰＭＩ＋ＧＭ−ＣＳＦ中０．５×１０6細胞／ｍｌの濃度でプレートした。細胞をネガティブコントロールとして未処理のまま残すか、または１μｇ／ｍｌ  ｐＣＭＶ−ｇａｇＤＮＡ（単独（裸の）またはＰＬＧ−ＣＴＡＢ微粒子上に処方されるかのいずれか）の存在下で培養するかのいずれかとした。２４時間のインキュベーション後、２×１０5の細胞を取り除き、冷たいＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で２回洗浄し、次いでｍＲＮＡ  Ｃａｐｔｕｒｅキット（Ｒｏｃｈｅ）についての製造者の説明書により溶解し、−８０℃で凍結した。サンプルをＲＮａｓｅを含有しないＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅインヒビター（Ｒｏｃｈｅ）を添加して氷上で解凍した。次に、ストレプトアビジンＰＣＲチューブ中のビオチンハイブリダイズｍＲＮＡの単離のためにｍＲＮＡ単離プロトコルに従った。プロメガ逆転写システム（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を製造者の説明書に従ってｃＤＮＡ合成のために利用し、そして反応を４５℃で４５分間行い、次に９９℃で５分間、熱不活化した。ＰＣＲ制御チューブを上記のように処理するが、続く混入プラスミドＤＮＡ存在決定のためにＡＭＶ逆転写酵素は添加しなかった。ＰＣＲ増幅のために、サンプルをＨＩＶｇａｇ遺伝子の３００ｂｐ領域、またはＢアクチンをポジティブコントロールとして一般的なＰＣＲ条件を使用して増幅するようにセットした。
【０１０２】
産物をアガロース電気泳動により分析した（図１）。レーンの名称は以下のようである：１）５００ｂｐのＤＮＡラダー、２〜４）未処理のＢＭＤＣ、プラスミドＤＮＡ処理したＢＭＤＣ、およびＰＬＧ−ＣＴＡＢ−ＤＮＡ処理したＢＭＤＣからのβアクチンコントロールＲＴ−ＰＣＲ反応、５）１００ｂｐのＤＮＡラダー、６）ｐＣＭＶ−ｇａｇＤＮＡのコントロールスパイクを有する未処理のｍＲＮＡｐｒｅｐ、８〜１０）未処理のＢＭＤＣ、プラスミドＤＮＡ処理したＢＭＤＣ、およびＰＬＧ−ＣＴＡＢ−ＤＮＡ処理したＢＭＤＣからのｐ５５ｇａｇＲＴ−ＰＣＲ、１１〜１３）未処理のＢＭＤＣ、プラスミドＤＮＡ処理したＢＭＤＣ、およびＰＬＧ−ＣＴＡＢ−ＤＮＡ処理したＢＭＤＣからのＰＣＲネガティブコントロール、１４）ｐＣＭＶ−ｇａｇＤＮＡ  ＰＣＲポジティブコントロール。図１に示されるように、遺伝子産物は、ＰＬＧ−ＣＴＡＢ−ＤＮＡ調製物のＲＴ−ＰＣＲによってのみ検出され、コントロールＰＣＲのみの反応により示されるようにｍＲＮＡ調整物においてプラスミドＤＮＡ混入物の結果ではなかった。それ故、ＰＬＧ−ＣＴＡＢ−ＤＮＡ微粒子は、ＢＭＤＣ中の遺伝子発現を容易にする。しかし、ＢＭＤＣ細胞溶解物中のリポーター遺伝子産物であるルシフェラーゼおよびβガラクトシダーゼの両方をそれぞれ照度計および比色基質により検出しようという試みが不成功であったことは注目すべき興味あることである。
【０１０３】
（実施例３）
（Ｔ細胞刺激）６日間ＧＭ−ＣＳＦの存在下で分化した骨髄細胞を、細胞表面表現型（ＣＤ１１ｃ+、ＣＤ１１ｂ+、Ｈ−ｄＫd+、Ｉ−Ａd(low)、ＣＤ８０(low)、およびＣＤ８６(low)）のＦＡＣＳ分析により決定して未成熟と分類し、そして９日目で成熟と分類した（ＣＤ１１ｃ+、ＣＤ１１ｂ+、Ｈ−２Ｋd+、Ｉ−Ａd(bright)、ＣＤ８０+、ＣＤ８６+）。（Ｒ．Ｃ．Ｆｉｅｌｄｓ，Ｊ．Ｊ．Ｏ．、Ｊ．Ａ．Ｆｕｌｌｅｒ、Ｅ．Ｋ．Ｔｈｏｍａｓ、Ｐ．Ｊ．Ｇｅｒａｇｈｔｙ、およびＪ．Ｊ．Ｍｕｌｅ’、１９９８。Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｓｐｌｅｅｎ  ａｎｄ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２１：３２３）。未熟のＢＭＤＣおよび成熟ＢＭＤＣの両方をＰＬＧ−ＣＴＡＢ−ｐＣＭＶｇａｇＤＮＡまたは裸のｐＣＭＶｇａｇＤＮＡで２４時間刺激した。コントロールは、未処理の細胞、微粒子のみ、または非特異的プラスミドＤＮＡ（ｐＣＭＶルシフェラーゼ）で処方された微粒子、および非特異的裸のＤＮＡで処方された微粒子を含む。Ｔ細胞ハイブリドーマ１２．２（ＨＩＶｐ５５ｇａｇのｐ７ｇエピトープ（ＡＭＱＭＬＫＥＴＩ）に特異的なｄ制限Ｔ細胞ハイブリドーマ）をＵ底マイクロタイタープレートの９６ウェルのウエル毎に１×１０5細胞でプレートした。変化させた数のＢＭＤＣを、培養物総容量２００μｌ中のハイブリドーマとともにプレートした。個々の各実験を２連で行った。２４時間の培養期間後、プレートを遠心分離し、上清を取り除き、そしてＩＬ−２産生についてのさらなるアッセイまで−８０℃で保存した。培地中に分泌されたＩＬ−２レベルについてアッセイするために、培養上清を室温で解凍し、前処理したマウスＩＬ−２ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレート上にプレートし、製造者の説明書（Ｅｎｄｏｇｅｎ）によって分析した。比色基質の顕色に続いて、マイクロタイタープレートをＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  νｍａｘキネティクプレートリーダーにより読み、ＳｏｆｔＭａｘソフトウェアで解析した。
【０１０４】
図２に示すように、ＰＬＧ−ＣＴＡＢ−ｐＣＭＶ−ｇａｇ処理したＢＭＤＣのみが、バックグラウンドを超えるＩＬ−２産生レベルを刺激した。抗原の内在化に有効と考えられる未成熟細胞は、ＩＬ−２のレベルをバックグラウンドレベルよりも５５％を超えて上昇させるが、より成熟したＢＭＤＣは、これらの細胞表面上でより高いレベルのＭＨＣ分子を発現し、抗原提示により有効であると考えられ、ＩＬ−２のレベルをバックグラウンドレベルよりも７７％超えて上昇させることに注目すべきことは重要である。さらに、ＩＬ−２産生のＰＬＧ−ＣＴＡＢ−ＤＮＡ媒介刺激は、ＰＬＧ−ＣＴＡＢ−ＤＮＡで処理されたハイブリドーマのみがＥＬＩＳＡにより決定される検出可能なＩＬ−２レベルを生じなかったので、抗原提示細胞の存在に依存する。遊離ＣＴＡＢの存在下の裸のＤＮＡはまた、抗原提示を生じなかった。ＰＬＧ−ＣＴＡＢ−ＤＮＡ処理は、インビトロで樹状細胞のトランスフェクションを生じたが、ＩＬ−２産生は、ウイルス技術（すなわち、ｇａｇ遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルスを使用する）を介して観察されたより２桁少なかった。
【０１０５】
ＨＩＶｐ５５ｇａｇ抗原のｄ−制限エピトープに対して特異的な抗原であることに加えて、本研究で使用されるＴ細胞ハイブリドーマは、ＩＬ−２遺伝子の活性化されたＴ細胞（ＮＦＡＴ）エンハンサーエレメントの核因子の制御下でＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｌａｃＺレポーター遺伝子を含むｌａｃＺ誘導可能ＢＷＺ．３６融合パートナー（Ｎ．Ｓｈａｓｔｒｉ、Ｕ．Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｂｅｒｋｅｌｅｙにより提供された）を使用して作製された（Ｓｈａｓｔｒｉ，Ｓ．Ｓ．ら、１９９４．ＬａｃＺ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ，ａｎｔｉｇｅｎ／ＭＨＣ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｈｙｂｒｉｄｓ．Ｉｎｔｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：３９６）。ＩＬ−２  ＥＬＩＳＡによって得られた結果を確認するために、Ｂ−ガラクトシダーゼ（βガラクトシダーゼ染色キット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）について比色アッセイによりによりハイブリドーマ細胞をアッセイした。顕微鏡視野からの代表的な細胞計数は、ＰＬＧ−ＣＴＡＢ−ｐＣＭＶｇａｇ処理したＢＭＤＣにおけるバックグラウンドを超えて青く染まった細胞の顕著な増加を示す（それぞれ、平均計数で２９に対して１２８）。
【０１０６】
ＭＨＣクラスＩ分子の状況において提示された抗原のＴ細胞認識によるＩＬ−２産生刺激は、時間依存性であることが、見出された。実験（データは含まれない）は、ＩＬ−２産生のレベルが、時間が経てば最終的に減少することを示した。しかし、ＩＬ−２の顕著なレベルを７日後に生じる（２４時間のＩＬ−２産生レベルの約１５％）。
【０１０７】
ＭＨＣクラスＩ分子の状況において提示された抗原のＴ細胞認識によるＩＬ−２産生刺激は、用量依存性であることが、見出された。図３において、ＩＬ−２産生レベルは、ＢＭＤＣに対して提示された用量とともに増加する；しかし、毒性（より低い生存可能性％）において対応する増加も観察されることを注目すべきことは重要である。しかし、この有害な効果は、ＰＬＧ−ＣＴＡＢ−ＤＮＡ処方物の明らかなアジュバンド活性により排除され得る。
【０１０８】
図４に示されるように、ナイーブＢＭＤＣおよびＰＬＧ−ＣＴＡＢ−ｐＣＭＶｇａｇＤＮＡで処理したＢＭＤＣを、過剰の合成ｐ７ｇペプチドエピトープ（１ｎｇ／ｍｌ）でパルスし、そして連続的に希釈し、そして１×１０5ｇａｇ特異的ＭＨＣクラスＩハイブリドーマＴ細胞でプレートした。それ故に、抗原提示細胞に対する種々のＴ細胞比が、一定に保たれているＴ細胞の数とともに提供された。刺激をＩＬ−２  ＥＬＩＳＡにより決定した。図４に見られるように、このように処理された細胞は、未処理の細胞よりもＴ細胞刺激でより効率的となる。Ｔ細胞ハイブリドーマによるＩＬ−２産生の刺激は、用量依存性であり、１００００：１のＴ：ＡＰＣ比になるまで検出可能であった。合成ペプチドエピトープでパルスする表面ＭＣＨクラスＩ分子は、未処理のＢＭＤＣにおいてさえ、Ｔ細胞応答刺激に非常に効率的であることが示されたが、異種交配した集団におけるＭＨＣクラスＩエピトープの多型性に起因して、容易な遺伝子免疫治療へのアプローチであることは期待されていない。しかし、これらのデータは、ＰＬＧ／ＣＴＡＢ処方物による活性化の部分的表れである樹状細胞表面上のＭＨＣクラスＩのアップレギュレーションを実証する。この活性化は、受動的に転移された樹状細胞の、本発明のプロセスによりトラスンフェクトされる有効度を顕著に増加することが予想される。
【０１０９】
上記から見られるように、ＰＬＧ−ＣＴＡＢ−ＤＮＡ微粒子は、樹状細胞によって効率的に内在化し得る。任意の特定の理論に固執することを望まずに、表面上のカチオン性界面活性剤の存在は、エンドソーム破壊および細胞質への局在化および核への局在化に寄与し得る。遺伝子発現はまた、逆転写酵素ＰＣＲにより観察され、インビトロでのＢＭＤＣの直接的なトランスフェクションを示した。強力な抗原取り込みおよび樹状細胞の提示能力を活用するために、発現された抗原がプロセスされ、そしてＭＨＣ分子上で提示され得るか否かを決定することは重要であった。ＨＩＶｇａｇタンパク質をコードするｐＣＭＶｇａｇプラスミドで処方されたＰＬＧ−ＣＴＡＢ微粒子とともにインキュベートしたＢＭＤＣが、抗原特異的Ｔ細胞ハイブリドーマを特異的に刺激し、ＩＬ−２の産生を生じることが見られた。さらに、このような微粒子が、未改変のプラスミドＤＮＡより高いトランスフェクションを可能にすることが、Ｔ細胞ハイブリドーマに基づく読み出しを使用して示された。ＰＬＧ−ＣＴＡＢ−ＤＮＡとともに樹状細胞をパルスすることが、インビトロでの迅速な内在化、標的遺伝子の発現、および抗原提示についての効率的なメカニズムであることがまた実証された。
【０１１０】
本発明の好ましい実施形態は、幾分詳細に記載されてきたが、添付された特許請求の範囲により規定されるように本発明の精神および範囲から逸脱することなく明白な変更がなされ得ることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】
図１は、標的遺伝子発現の検出のためのＲＴ−ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動を示す。レーンの命名は、以下の通りである：１）５００ｂｐ  ＤＮＡラダー、２−４）未処理のプラスミドＤＮＡ、およびＰＬＧ−ＣＴＡＢ−ＤＮＡで処理した骨髄由来の樹状細胞（ＢＭＤＣ）由来のβアクチンコントロールＲＴ−ＰＣＲ反応物、５）１００ｂｐのＤＮＡラダー、６）ｐＣＭＶ−ｇａｇ  ＤＮＡのコントロールスパイクで調製した未処理のｍＲＮＡ、８−１０）未処理のプラスミドＤＮＡ、およびＰＬＧ−ＣＴＡＢ−ＤＮＡで処理したＢＭＤＣ由来のｐ５５ｇａｇ  ＲＴ−ＰＣＲ、１１−１３）未処理のプラスミドＤＮＡ、およびＰＬＧ−ＣＴＡＢ−ＤＮＡで処理したＢＭＤＣ由来のＰＣＲネガティブコントロール、１４）ｐＣＭＶ−ｇａｇＤＮＡ  ＰＣＲポジティブコントロール。
【図２】
図２は、骨髄由来の樹状細胞（ＢＭＤＣ）を用いてＭＨＣクラスＩ  Ｔ細胞ハイブリドーマを刺激した後、ＩＬ−２の産生レベルを例示する。未成熟（６日）ＢＭＤＣおよび成熟（９日）ＢＭＤＣの両方を、試験した。各成熟群内でのＢＭＤＣ処理は、以下（左から右）の通りである：未処理、ＰＬＧ−ＣＴＡＢで処理、ＰＬＧ−ＣＴＡＢ−ｐＣＭＶ  ｇａｇ  ＤＮＡで処理、ＰＬＧ−ＣＴＡＢ−ｌｕｃ  ＤＮＡで処理、裸のｐＣＭＶ  ｇａｇ  ＤＮＡで処理、および裸のｌｕｃＤＮＡで処理。
【図３】
図３は、ＰＬＧ−ＣＴＡＢ微粒子上で形成された種々の濃度のｐＣＭＶ−ｇａｇプラスミドＤＮＡとともにインキュベートした、ＢＭＤＣを用いてＴ細胞ハイブリドーマを刺激した後のＩＬ−２産生レベル（左  ｙ−軸、バーシリーズ）を例示する。図３はまた、ＰＬＧ−ＣＴＡＢ微粒子上で形成された種々の濃度のｐＣＭＶ−ｇａｇプラスミドＤＮＡとともにインキュベートした、ＢＭＤＣの生存％（右  ｙ−軸、ラインシリーズ）を例示する。適切なデータポイントは、２つ組サンプルの平均値および標準誤差を示す。
【図４】
図４は、ナイーブ（未処理）のＢＭＤＣまたはＰＬＧ−ＣＴＡＢ−ｐＣＭＶｇａｇＤＮＡで処理したＢＭＤＣのいずれかを用いてｇａｇ特異的Ｔ細胞ハイブリドーマを刺激した後、および過剰の合成ペプチドエピトープを用いてパルスした後のＩＬ−２の生成レベルを例示する。抗原提示細胞（すなわち、ＢＭＤＣ）に対するＴ細胞の比を変えて、全ての場合においてＴ細胞の数を一定に保持したままで研究した。データポイントは、一連の希釈によりアッセイされた２つ組サンプルの平均値±誤差を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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