(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料（４６）を検査するための共焦点レーザー走査顕微鏡（２０）において、
照明光線（２４）を発生させる光源（２２）と、
前記照明光線（２４）が試料（４６）を光学式に走査するように該照明光線（２４）を転向させるスキャンユニット（３８）と、
前記照明光線（２４）を試料（４６）から出る検出光（４８）から切り離すメインビームスプリッター（３４）と、
前記照明光線（２４）から切り離された前記検出光（４８）を少なくとも部分的に透過させる検出用ピンホールアパーチャー（５０）と、
前記検出用ピンホールアパーチャー（５０）を透過した前記検出光（４８）を検出する少なくとも２つの検出ユニット（１０２，１０４，１０６）と、
放射方向において前記検出用ピンホールアパーチャー（５０）と前記検出ユニット（１０２，１０４，１０６）との間に配置され、前記検出光（４８）を少なくとも２つの光束（７０，７２，７４）に分断して前記光束（７０，７２，７４）内部でスペクトル分割する光学要素（６２）と、
を備え、
前記光学要素（６２）が少なくとも２つの異なる表面を有し、これらの表面からそれぞれ前記光束（７０，７２，７４）の１つが放出される、
共焦点レーザー走査顕微鏡。
【請求項２】
前記光学要素（６２）がプリズム機構（６４，６６，６８）を含んでいる、請求項１に記載の共焦点レーザー走査顕微鏡（２０）。
【請求項３】
前記光束（７０，７２，７４）の少なくとも１つの波長範囲（８０，８２，８４）が、検出前にスペクトル境界付け要素によりスペクトル境界付けされる、請求項１または２に記載の共焦点レーザー走査顕微鏡（２０）。
【請求項４】
前記スペクトル境界付け要素が絞り（８６，８８，９０）および／または光誘導ファイバー（１１０，１１２，１１４）を含んでいる、請求項３に記載の共焦点レーザー走査顕微鏡（２０）。
【請求項５】
前記検出光の、スペクトル境界付けされた前記波長範囲（８０，８２，８４）に相当する部分（９２，９４，９６）が、その波長に関し可変である、請求項３または４に記載の共焦点レーザー走査顕微鏡（２０）。
【請求項６】
前記スペクトル境界付け要素が変位可能に配置されることで、前記部分（９２，９４，９６）がその波長に関し可変である、請求項５に記載の共焦点レーザー走査顕微鏡（２０）。
【請求項７】
前記光束（７０，７２，７４）を前記スペクトル境界付け要素へ誘導し、前記スペクトル境界付けされた検出光の前記部分（９２，９４，９６）の波長を変化させるために変位可能および／または回転可能に配置される少なくとも１つの検出ミラー（１２０，１２２，１２４）が設けられている、請求項５または６に記載の共焦点レーザー走査顕微鏡（２０）。
【請求項８】
前記部分（９２，９４，９６）の波長を変化させるため、前記光学要素（６２）が回転可能および／または変位可能に配置されている、請求項５から７までのいずれか一つに記載の共焦点レーザー走査顕微鏡（２０）。
【請求項９】
前記光学要素（６２）が前記検出光（４８）を少なくとも３つまたはそれ以上の光束（７０，７２，７４）に分断し、該光束（７０，７２，７４）内部でスペクトル分割させる、請求項１から８までのいずれか一つに記載の共焦点レーザー走査顕微鏡（２０）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、共焦点レーザー走査顕微鏡に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
共焦点レーザー走査顕微鏡は顕微試料の検査に適している。このため、試料の構造と結合されるか、或いは、試料内での個々の現象に関与する要素と結合される蛍光マーカーが試料に挿入される。蛍光マーカーは、蛍光を励起させるように、および／または、励起されて蛍光を発するように、励起光により動作させることができ、これによって試料の構造および／または試料内での個々の現象を視覚化させる。試料から出る蛍光光線（この関連で検出光とも呼ばれる）は照明光から切り離され、検出用ピンホールアパーチャーを介して検出ユニットへ方向づけられる。
【０００３】
スキャンユニットにより、照明光線は試料を光学式に走査する。検出光はスキャンユニットの位置に依存して検出され、その結果検出中のどの時点でも、試料のどの領域から現時点で検出光が出ているのかがわかり、その結果検出したデータに基づいて試料の像を作成することができる。
【０００４】
蛍光光線の波長範囲は蛍光マーカーに依存している。換言すれば、異なる蛍光マーカーは、励起されて蛍光を発した時に異なる色で照明する。個々の蛍光マーカーおよびこれと結合されている試料の構造および／または試料内の個々の現象とを互いに独立に検査するために、所定の波長範囲の照明光だけで試料を照射し、その結果特定のタイプの蛍光マーカーのみが励起されて蛍光を発することは公知であり、或いは、１つまたはわずかな蛍光マーカーの検出光のみが検出ユニット側へ到達するようにカラーフィルタを用いて検出光をフィルタリングしてもよい。
【０００５】
特許文献１からは、光線の少なくとも２つのスペクトル範囲を選別、検出するための装置において、光線をスペクトル分割するようにしたものが知られている。分割された光線はミラーアパーチャーに当たり、該ミラーアパーチャーは光の一部分をして第１の検出ユニットを透過させ、残りの光をして第２の検出ユニット側で反射させる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】独国特許第４３３０３４７Ｃ２号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、共焦点レーザー走査顕微鏡において、検出光の異なるスペクトル範囲を簡単に検査できるようにすることである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この課題は、独立請求項に記載の構成によって解決される。有利な構成は従属項に記載されている。
【０００９】
本発明は、第１の特徴によれば、試料を検査するための共焦点レーザー走査顕微鏡に関わる。本発明によるレーザー走査顕微鏡は、照明光線を発生させる光源を有している。スキャンユニットは、照明光線を、試料を光学式に走査するように転向させる。メインビームスプリッターは、照明光線を、試料から出る検出光から切り離す。照明光から切り離された検出光は、検出用ピンホールアパーチャーを透過する。検出装置は、検出用ピンホールアパーチャーを透過した検出光を検出する。
【００１０】
本発明は、放射方向において検出用ピンホールアパーチャーと検出ユニットとの間に光学要素が配置され、該光学要素が、検出光を少なくとも２つの光束に分断して該光束内部でスペクトル分割することを特徴としている。
【００１１】
光学要素を検出光線方向において検出用ピンホールアパーチャーの後方に配置することにより、検出光の２つまたはそれ以上の波長範囲を２つまたはそれ以上の光束の形態で検出することが可能になる。これにより、検出すべき波長範囲を特に精密に互いに分離させ、特定および／または検出することが可能になる。この場合、光束の波長は、よって検出光の検出すべきスペクトル範囲は自由に選定でき、および／または、自動的に選定できる。他の利点は、レーザー走査顕微鏡の特に堅固な構成が可能になること、透過率が優れていることである。また、このように構成されたレーサー走査顕微鏡はＦＬＩＭ(Fluorescence Live Time Microscopy)、ＦＣＳ(Fluoreszenz Korrelationsspektroskopie)、ＦＲＥＴ(Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer)での使用にも適している。
【００１２】
本発明によれば、前記光学要素は少なくとも２つの異なる表面を有し、これらの表面からそれぞれ前記光束の１つが放出される。これにより、検出光を異なる光束に分割することが容易になる。これに関連して、前記表面が異なっているということは、これら表面がたとえばエッジまたは屈曲部によって互いに分離されているということを意味している。
【００１３】
有利な実施態様によれば、前記光学要素はプリズム機構を含んでいる。プリズム機構は２つ、３つ、またはそれ以上の異なるプリズムを有していてよい。たとえば、プリズム機構は各光束に対し１つのプリズムを有していてよい。
【００１４】
他の構成によれば、すでに光束に分解された検出光をスペクトル境界付けするため、個々の光束の波長範囲が境界付けされる。これは、好ましくは、たとえば絞りおよび／または光誘導ファイバーを含んでいるスペクトル境界付け要素を用いて行なわれる。これに関連して、１つの光束の、スペクトル境界付けされた前記波長範囲に相当する部分が、その波長に関し可変であれば特に有利である。換言すれば、光束の内部で検出光のより小さな部分を可変に選定してこれを目的に応じて検出することが可能になる。前記部分をその波長に関して可変性にすることは、たとえばスペクトル境界付け要素を変位可能にすること、可動ミラーを設けること、および／または、前記光学要素を回転または変位させることによって確保されている。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
次に、本発明のいくつかの実施形態を添付の図面を用いて説明する。
【図１】共焦点レーザー走査顕微鏡の図である。
【図２】レーザー走査顕微鏡の検出装置の第１実施形態を示す図である。
【図３】検出装置の第２実施形態を示す図である。
【図４】検出装置の第３実施形態を示す図である。
【図５】検出装置の第４実施形態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
図面において、同一の構成および機能の構成要素は同一の参照符号で表わしている。
【００１８】
図１は共焦点レーザー走査顕微鏡２０を示している。レーザー走査顕微鏡２０は光源２２を有し、該光源は照明光線２４を発生させる。光源２２は少なくとも１つのレーザーを有し、該レーザーが発生させる光は特定の波長、小さな波長範囲または大きな波長範囲を有している。たとえば光源２２は、白色光とも呼ばれる広帯域のレーザー光を発生させる白色光レーザーを含んでいてよい。これとは択一的に、２つまたはそれ以上のレーザーが設けられていてもよい。レーザー走査顕微鏡２０は蛍光顕微鏡の分野で多くの適用例に適しており、特に蛍光光線を検出するのに適している。とりわけレーザー走査顕微鏡２０が適しているのは、異なる蛍光マーカーの蛍光光線を別々に検出することである。さらに、レーザー走査顕微鏡２０は前記ＦＬＩＭ，ＦＣＳ，ＦＲＥＴを実施するために適している。
【００１９】
照明光線２４はレーザー光線源２２から出て、転向ミラー２６とフィルタ２８とを介して第１のレンズ３０へ誘導される。照明光線２４は第１のレンズ３０を通過した後、照明用ピンホールアパーチャー３２を通過し、メインビームスプリッター３４に当たる。メインビームスプリッター３４は照明光線２４を第２のレンズ３６を介してスキャンユニット３８へ誘導する。スキャンユニット３８は好ましくは１つまたは複数のミラーを有しており、該ミラーは、制御信号に反応して移動方向４０に位置調整可能であるように位置調整要素と連結されている。スキャンユニット３８は照明光線２４を、対物レンズを形成している第３のレンズ４２および第４のレンズ４４を介して試料４６へ誘導する。試料は、照明光線２４がスキャンユニット３８によって転向されることにより、照明光線２４を用いて光学式に走査される。
【００２０】
試料４６から出る検出光４８は、第３および第４のレンズ４２，４４を介してスキャンユニット３８に達し、そして第２のレンズ３６を通ってメインビームスプリッター３４に達する。メインビームスプリッター３４は検出光４８を検出用ピンホールアパーチャー５０を介して検出装置６０へ供給する。検出光４８は好ましくは蛍光光線である。これとは択一的に、検出光４８は、試料４６から反射した光をも含んでいてよく、或いは、透過照明のケースでは透過光をも含んでいてよい。検出光４８はスキャンユニット３８の位置に依存して検出され、その結果検出を行なっているどの時点でも、試料４６のどの領域から検出光４８が出ているのかがわかり、試料４６の像の作成を可能にする。
【００２１】
図２は検出装置６０の第１実施形態を示す。検出装置６０は光学要素６２を含み、該光学要素は好ましくはプリズム機構として構成されている。光学要素６２は第１のプリズム６４と、第２のプリズム６６と、第３のプリズム６８とを含んでいる。光学要素６２は検出光４８を複数の光束７０，７２，７４に分割する。特に、第１の光束７０は第１のプリズム６４の第１の表面７１から出る。第２の光束７２は第２のプリズム６６の第２の表面７３から出る。第３の光束７４は第３のプリズム６８の第３の表面７５から出る。第１の光束７０は第１の波長範囲８０の波長を備えた光を含み、第２の光束７２の検出光４８は第２の波長範囲８２の検出光４８を含み、第３の光束７４の検出光４８は第３の波長範囲８４の検出光４８を含んでいる。光学要素６２は、たとえば米国特許第４０８４１８０Ａ１明細書に示されたプリズム機構に従って構成されていてよい。
【００２２】
調整絞り８６により第１の光束７０から第１のスペクトル部分９２が切り取られる。第２の調整絞り８８により第２の光束７２から検出光４８の第２のスペクトル部分９４が切り取られる。第３の調整絞り９０により第３の光束７４から検出光４８の第３のスペクトル部分９６が切り取られる。スペクトル部分９２，９４，９６は対応する光束７０，７２，７４の帯域幅部分とも呼ばれる。従ってスペクトル部分９２，９４，９６は、光束７０，７２，７４の対応する波長範囲８０，８２，８４から切り取られた小さな波長部分の光を含んでいる。この場合、光束７０，７２，７４はスペクトル分断された検出光４８に対応している。換言すれば、プリズム機構を用いて検出光４８を光束７０，７２，７４に粗分断することが行われ、光束７０，７２，７４の内部では、検出光４８をスペクトル部分９２，９４，９６に特に微細に精密に分割することが行われる。調整絞り８６，８８，９０を対応する絞り調整方向９８へ変位させることにより、スペクトル部分９２，９４，９６の波長を変化させることが可能になる。スペクトル部分９２，９４，９６の波長を変化させることにより、検出すべき検出光４８を試料４６で使用される蛍光マーカーの種々の蛍光最大値に適合させることが可能になる。
【００２３】
スペクトル部分９２，９４，９６の形態で残った検出光４８は、フォーカスレンズ１００を介して対応する検出ユニット１０２，１０４，１０６へ誘導され、特に第１の光束７０に付設されている第１の検出ユニット１０２、第２の光束７２に付設されている第２の検出ユニット１０４、第３の光束７４に付設されている第３の検出ユニット１０６へ誘導される。検出ユニット１０２，１０４，１０６は、たとえば、検出した検出光４８を電気信号に変換して制御ユニット（図示せず）に供給するＰＭＴダイオード、ＡＰＤダイオード、またはフォトダイオードを含んでいる。
【００２４】
図３は検出装置６０の第２実施形態を示す。この第２実施形態は、光学要素６２の点、検出光４８を光束７０，７２，７４に分断する点、光束７０，７２，７４に付設される検出ユニット１０２，１０４，１０６の点で図１に図示した第１実施形態に対応している。第１実施形態と異なるのは、調整絞り８６，８８，９０の代わりに光導波路１１０，１１２，１１４が設けられていることにより、光束７０，７２，７４がスペクトル境界付けされることである。光導波路１１０，１１２，１１４としては光誘導ファイバー（たとえばガラスフィバー）を使用することができる。特に、第１の光束７０は第１の光導波路１１０へカップリングされ、第２の光束７２は第２の光導波路１１２へカップリングされ、第３の光束７４は第３の光導波路１１４へカップリングされる。。光導波路１１０，１１２，１１４の横断面は対応する光束７０，７２，７４の横断面よりも小さく、これが光束７０，７２，７４の検出光４８のスペクトル境界付けを生じさせる。検出光４８の、光導波路１１０，１１２，１１４から出る部分９２，９４，９６は、対応する検出ユニット１０２，１０４，１０６へ当たる。部分９２，９４，９６と特にこれら部分９２，９４，９６の波長とは、光導波路１１０，１１２，１１４を光導波路調整方向１１６に沿って移動させることで変化させることができる。このため、光導波路１１０，１１２，１１４は対応する位置調整装置と連結されている。
【００２５】
図４は検出装置の第３実施形態を示している。この実施形態は、プリズム機構６２の形状と、光導波路１１０，１１２，１１４を設けた点とで図３の第２実施形態に対応している。図を簡潔にするため、図４では検出装置１０２，１０４，１０６と部分９２，９４，９６との図示を省略した。第２実施形態の検出装置６０と異なるのは、第３実施形態の場合、光導波路１１０，１１２，１１４は可動に配置されておらず、プリズム機構が回転可能に配置されている点である。特に光学要素６２は、特にプリズム機構は、その検出光４８側がまず参照線１１８に対し平行になるように、そしてプリズム機構の回転後に参照線１１８に対し角度αを成すように回転させることができる。プリズム機構の回転により、光束７０，７２，７４は異なる方向に放射される。光束７０，７２，７４のスペクトル分割のために、回転角に依存して、光束７０，７２，７４の異なる波長範囲が光導波路１１０，１１２，１１４に入射し、これによって、この図には図示していない部分９２，９４，９６の波長を変化させることができる。
【００２６】
図５は検出装置６０の第４実施形態を示すもので、この実施形態は実質的に図４の実施形態に対応しており、すなわち第３実施形態に対応している。図５では、部分９２，９４，９６および検出ユニット１０２，１０４，１０の図示は省略した。第４実施形態のプリズム機構が回転可能であったこととは異なり、プリズム機構は固定されている。しかし、光束７０，７２，７４の放射方向には、プリズム機構と光導波路１１０，１１２，１１４との間に第１のミラー１２０、第２のミラー１２２、または第３のミラー１２４が配置されている。ミラー１２０，１２２，１２４はミラー調整方向１２６に沿って移動可能および／またはこれに対し回転可能に配置され、その結果ミラー１２０，１２２，１２４の位置に依存して光束７０，７２，７４の異なるスペクトル範囲を光導波路１１０，１１２，１１４にカップリング可能であり、このことはこの図には図示していない部分９２，９４，９６の波長に影響する。さらに、ミラー１２０，１２２，１２４の回転により、部分９２，９４，９６の光スペクトルが伸縮し、これによって、検出すべき光の帯域幅を調整することができる。
【００２７】
検出装置６０のこれら図示した実施形態により、検出光４８を検出用ピンホールアパーチャー５０の背後で光束７０，７２，７４の形態でスペクトル分離検出することが可能になる。これは、使用者に対し、検出光４８の検出すべき波長範囲をさらに微細に部分９２，９４，９６の形態で分離させて検出することを可能にさせる。この場合、図示していない実施形態では、部分９２，９４，９６の形態での分離を省略して、光束７０，７２，７４全体を検出してもよい。さらに、これとは択一的に、検出ユニット１０２，１０４，１０６のセンサ感知面を制限することによって部分９２，９４，９６のセパレーションを行なってもよい。特に、センサ感知面は光束７０，７２，７４の横断面よりも小さくてよく、その結果光束７０，７２，７４の部分９２，９４，９６のみが検知される。これを回転可能なプリズム機構と組み合わせると、部分９２，９４，９６の波長を特に簡単に変更させることができる。さらに、図示した実施形態を互いに組み合わせてもよい。
【符号の説明】
【００２８】
２０          レーザー走査顕微鏡
２２          光源
２４          照明光線
２６          転向ミラー
２８          フィルタ
３０          第１のレンズ
３２          照明用ピンホールアパーチャー
３４          メインビームスプリッター
３６          第２のレンズ
３８          スキャンユニット
４０          移動方向
４２          第３のレンズ
４４          第４のレンズ
４６          試料
４８          検出光
５０          検出用ピンホールアパーチャー
６０          検出装置
６２          光学要素
６４          第１のプリズム
６６          第２のプリズム
６８          第３のプリズム
７０          第１の光束
７１          第１の表面
７２          第２の光束
７３          第２の表面
７４          第３の光束
７５          第３の表面
８０          第１の波長範囲
８２          第２の波長範囲
８４          第３の波長範囲
８６          第１の調整絞り
８８          第２の調整絞り
９０          第３の調整絞り
９２          第１の部分
９４          第２の部分
９６          第３の部分
９８          絞り調整方向
１００        フォーカスレンズ
１０２        第１の検出ユニット
１０４        第２の検出ユニット
１０６        第３の検出ユニット
１１０        第１の光導波路
１１２        第２の光導波路
１１４        第３の光導波路
１１６        光導波路調整方向
１１８        参照線
１２０        第１の検出ミラー
１２２        第２の検出ミラー
１２４        第３の検出ミラー
１２６        ミラー調整方向
【図１】
0005623654.tif 000002
【図２】
0005623654.tif 000003
【図３】
0005623654.tif 000004
【図４】
0005623654.tif 000005
【図５】
0005623654.tif 000006