(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１５４で示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド２９７１〜３１４０を標的とする、STAT3をコードする核酸分子と特異的にハイブリダイズし、STAT3の発現を阻害することができる長さが15〜30核酸塩基であるアンチセンス化合物。
【請求項２】
(a)配列番号１５４で示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド２９８３〜３１２７、または(b)配列番号１５４で示されるヌクレオチド配列のヌクレオチド２９８３〜３０６６を標的とする、請求項１に記載のアンチセンス化合物。
【請求項３】
STAT3をコードする核酸分子と100％相補的である請求項1または2記載のアンチセンス分子。
【請求項４】
少なくとも一つの修飾されたヌクレオシド間結合を有する請求項１〜3のいずれかに記載のアンチセンス化合物。
【請求項５】
修飾されたヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である請求項4記載のアンチセンス化合物。
【請求項６】
少なくとも一つの置換された糖部分を含む請求項1〜5のいずれかに記載のアンチセンス化合物。
【請求項７】
置換された糖部分が２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）部分または二環式糖部分である請求項6に記載のアンチセンス化合物。
【請求項８】
少なくとも一つの修飾核酸塩基を含む請求項1〜7のいずれかに記載のアンチセンス化合物。
【請求項９】
修飾核酸塩基が５−メチルシトシンである請求項8に記載のアンチセンス化合物。
【請求項１０】
キメラオリゴヌクレオチドである請求項1〜9のいずれかに記載のアンチセンス化合物。
【請求項１１】
ギャップマーである請求項10に記載のアンチセンス化合物。
【請求項１２】
デオキシヌクレオチドを含む第1領域と、少なくとも一つの２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチドを含む、該第1領域と隣接する第2および第3領域を有するキメラオリゴヌクレオチドである請求項11に記載のアンチセンス化合物。
【請求項１３】
該第1領域の長さが10デオキシヌクレオチドであり、該第2および第3領域の長さがそれぞれ5ヌクレオチドである請求項12に記載のアンチセンス化合物。
【請求項１４】
請求項1〜13のいずれかに記載のアンチセンス化合物と医薬的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項１５】
治療または予防に用いるための請求項1〜13のいずれかに記載のアンチセンス化合物。
【請求項１６】
異常な炎症状態または炎症性疾患を治療または予防するのに用いるための請求項15に記載のアンチセンス化合物。
【請求項１７】
リウマチ性関節炎を治療または予防するのに用いるための請求項16に記載のアンチセンス化合物。
【請求項１８】
癌を治療または予防するのに用いるための請求項15に記載のアンチセンス化合物。
【請求項１９】
乳癌、前立腺癌、脳もしくは頭部および頸部の癌、骨髄腫、黒色腫、白血病、またはリンパ腫からなる群より選択される癌を治療または予防するのに用いるための請求項18に記載のアンチセンス化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然に存在する、シグナル伝達及び転写活性に関与するＤＮＡ結合タンパク質をコード化し、また疾患と関係するヒトＳＴＡＴ３遺伝子の発現を調節するための組成物及び方法に関する。本発明はまた、ＳＴＡＴ３が介在するシグナル伝達及び転写活性を抑制する方法にも関し、これらの方法は診断的又は治療的に使用することができる。更に、本発明はヒトＳＴＡＴ３遺伝子の発現に関連した状態の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＳＴＡＴ（シグナルトランスデューサー及び転写活性化因子）タンパク質は、シグナル伝達及び転写活性において二重の役割を有するＤＮＡ結合タンパク質である。現在、ＳＴＡＴファミリーには６種類の独立したメンバー（ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５、及びＳＴＡＴ６）、並びに数種のアイソフォーム（ＳＴＡＴ１−α、ＳＴＡＴ１−β、ＳＴＡＴ３−α及びＳＴＡＴ３−β）が存在している。ＳＴＡＴの活性は、種々のサイトカイン及び有糸分裂刺激によって調節される。サイトカインがその受容体に結合すると、その受容体と関連したＪａｎｕｓタンパク質チロシンリン酸化酵素（ＪＡＫ）が活性化される。活性化されたＪａｎｕｓタンパク質チロシンリン酸化酵素は次にＳＴＡＴをリン酸化し、その結果ＳＴＡＴが核へ転位し、ＳＴＡＴ反応性遺伝子の転写が活性化される。ＳＴＡＴ上の特定のチロシン残基のリン酸化によりＳＴＡＴが活性化し、その結果ＳＴＡＴのホモ二量体及び／又はヘテロ二量体が形成され、それが特定の遺伝子プロモーター配列に結合する。サイトカインがＳＴＡＴ活性化を介して介在する出来事には、細胞の増殖及び分化、並びにアポトーシスの予防が含まれる。
【０００３】
ＳＴＡＴ活性化の特異性は、サイトカインの特異性を原因とする。即ち、各ＳＴＡＴは、少数の特定のサイトカインと反応する。例えば成長因子のような他の非サイトカインシグナル伝達分子も、ＳＴＡＴを活性化することが知られている。これらの因子がタンパク質チロシンリン酸化酵素と関連した細胞表面の受容体に結合すると、やはりＳＴＡＴがリン酸化される。
【０００４】
ＳＴＡＴ３［急性期応答因子（ＡＰＲＦ）、ＳＴＡＴ３−αも同様］は特に、インターロイキン−６（ＩＬ−６）及び上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）に反応することが知られている（Ｄａｒｎｅｌｌ、Ｊｒ．、Ｊ．Ｅ．等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９４、２６４、１４１５−１４２１）。加えて、ＳＴＡＴ３はインターフェロンによるシグナル伝達に重要な役割を果たすことが知られている（Ｙａｎｇ、Ｃ．−Ｈ．等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８、９５、５５６８−５５７２）。ＳＴＡＴ３がＭＡＰＫ経路によって調節されている可能性を示す証拠が存在する。ＥＲＫ２はセリンのリン酸化を誘導し、またＳＴＡＴ３とも関連している（Ｊａｉｎ、Ｎ．等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１９９８、１７、３１５７−３１６７）。
【０００５】
ＳＴＡＴ３は殆どの種類の細胞内で発現している（Ｚｈｏｎｇ、Ｚ．等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９４、９１、４８０６−４８１０）。ＳＴＡＴ３は、創傷及び炎症に対する反応に関与する遺伝子の発現を誘導する。またＳＴＡＴ３は、ｂｃｌ−２の発現を通じてアポトーシスを予防することが示されている（Ｆｕｋａｄａ、Ｔ．等、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１９９６、５、４４９−４６０）。
【０００６】
ＳＴＡＴ３の異常な、又は恒常的な発現は、多くの疾患過程に関与している。ＳＴＡＴ３は、細胞の形質転換に関与していることが示されている。ＳＴＡＴ３はｖ−ｓｒｃによって形質転換した細胞にて恒常的に活性化されている（Ｙｕ、Ｃ．−Ｌ．等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９５、２６９、８１−８３）。また恒常的に活性化されたＳＴＡＴ３は、ＳＴＡＴ３が介在する遺伝子発現を誘導し、ｓｒｃによる細胞の形質転換に必須である（Ｔｕｒｋｓｏｎ、Ｊ．等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９８、１８、２５４５−２５５２）。またＳＴＡＴ３は、ヒトＴ細胞好性ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）によって形質転換された細胞において恒常的に活性化されている（Ｍｉｇｏｎｅ、Ｔ．−Ｓ．等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９５、２６９、７９−８３）。
【０００７】
ＳＴＡＴ３の恒常的な活性化及び／又は過剰発現は、骨髄腫、乳癌、前立腺癌、脳腫瘍、頭頸部癌、黒色腫、白血病及びリンパ腫、特に慢性骨髄性白血病及び多発性骨髄腫を含む癌いくつかの形態に関与していると思われる（Ｎｉｕ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９９９、５９、５０５９−５０６３）。ＥＧＦＲを過剰に発現する乳癌細胞ラインにおいては、リン酸化されたＳＴＡＴ３が恒常的に発現している（Ｓａｒｔｏｒ、Ｃ．Ｉ．等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９９７、５７、９７８−９８７、Ｇａｒｃｉａ、Ｒ．等、Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、１９９７、８、１２６７−１２７６）。低分化膠芽腫及び髄芽腫においても、活性化されたＳＴＡＴ３の値が増加していることが判っている（Ｃａｔｔａｎｅｏ、Ｅ．等、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９９８、１８、２３８１−２３８７）。
【０００８】
ラット及びヒト前立腺癌の双方に由来する細胞は、恒常的に活性化されたＳＴＡＴ３を有し、ＳＴＡＴ３の活性化は細胞の悪性度と相関することが示されている。ドミナントネガティブ（ｄｏｍｉｎａｎｔ−ｎｅｇａｔｉｖｅ）なＳＴＡＴ３の発現は、ヒト前立腺細胞の増殖を有意に抑制することが判っている（Ｎｉ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、２０００、６０、１２２５−１２２８）。
【０００９】
またＳＴＡＴ３は、数種の急性白血病及びＴ細胞リンパ腫において恒常的に活性化されていることが判っている（Ｙｕ、Ｃ．−Ｌ．等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７、１５９、５２０６−５２１０）。興味深いことに、慢性リンパ性白血病において、ＳＴＡＴ３はそのセリン残基において恒常的にリン酸化されていることが判っている（Ｆｒａｎｋ、Ｄ．Ａ．等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９７、１００、３１４０−３１４８）。加えて、ＳＴＡＴ３に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、非小細胞肺癌の細胞（Ｓｏｎｇ等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２２：４１５０、２００３）及び前立腺癌の細胞（Ｍｏｒａ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２：６６５９、２００２）のアポトーシスを促進することが示されている。
【００１０】
ＳＴＡＴ３は、培養液内及び骨髄腫患者から得られた骨髄の単核球内いずれにおいても、骨髄腫の腫瘍細胞内で恒常的に活性化されていることが見出されている。これらの細胞は、Ｆａｓ介在性のアポトーシスに対して抵抗性を有し、またＢｃｌ−ｘＬを高いレベルで発現している。ＳＴＡＴ３のシグナル伝達は、アポトーシスに抵抗性を付与することを介して、骨髄腫の腫瘍細胞の生存に必須であることが示されている（Ｃａｔｌｅｔｔ−Ｆａｌｃｏｎｅ、Ｒ．等、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１９９９、１０、１０５−１１５）。恒常的に活性化されたＳＴＡＴ３は、慢性骨髄性白血病とも関連している。従ってＳＴＡＴ３は、多発性骨髄腫、及び活性化されたＳＴＡＴ３のシグナル伝達を伴うその他の癌の、治療的介入の標的となり得る。多発性骨髄腫の患者の治療の選択肢は、必ずしも満足できるものではない。ベルケードは、評価可能な１８８人の患者を対象とした、生存率ではなく腫瘍の縮小率に基づく中心的な試験により２００３年５月に認可された。患者の２８％のみが一部反応した。データは現在、ＦＤＡにより再評価されている。化学療法に抵抗性を有する骨髄腫の新規な治療法に対する医学的必要性が存在することは明らかである。
【００１１】
ＳＴＡＴ３のドミナントネガティブな変異体を用いて、活性化ＳＴＡＴ３を生体内で抑制するための、同系マウスの腫瘍モデルシステムにおける遺伝子治療的アプローチが行われた。活性化ＳＴＡＴ３のシグナル伝達はＢ１６黒色腫の成長を抑制し、生体内でＢ１６腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することが分かった。興味深いことに、アポトーシス細胞の数（９５％）は形質移入細胞の数を上回った。これは炎症反応（急性及び慢性の炎症細胞による腫瘍組織の浸潤）が、残存する腫瘍細胞の殺傷に関与し得る抗腫瘍「傍観者効果（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ  ｅｆｆｅｃｔ）」の可能性を示している。
【００１２】
またＳＴＡＴ３は、関節リウマチを含む炎症性疾患でも役割を有する可能性がある。関節リウマチ患者の滑液（Ｓｅｎｇｕｐｔａ、Ｔ．Ｋ．等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９５、１８１、１０１５−１０２５）、及び炎症を起こした関節から得られた細胞（Ｗａｎｇ、Ｆ．等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９５、１８２、１８２５−１８３１）内にて、活性化ＳＴＡＴ３が発見されている。
【００１３】
交互のスプライシングがＳＴＡＴ３βを形成し、該ＳＴＡＴ３βは、そのＣ末端に存在する５５アミノ酸残基が欠損している特徴を有する。この領域はトランス活性化領域含み、従ってＳＴＡＴ３βは、ＳＴＡＴ３の機能の負の制御因子として働く可能性がある。ＳＴＡＴ３βはＳＴＡＴ３と比較して安定しており、より強力なＤＮＡ結合活性を有するのに対し、ＳＴＡＴ３は転写活性が高いことが分かっている。ＳＴＡＴ３βは、ＳＴＡＴ３同様、ホモ二量体を形成し、またＳＴＡＴ及びＳＴＡＴ３βは結合してヘテロ二量体を形成することもできる（Ｃａｌｄｅｎｈｏｖｅｎ、Ｅ．等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９６、２７１、１３２２１−１３２２７）。
【００１４】
現在、ＳＴＡＴ３の発現を抑制するためのアプローチがいくつか存在している。共にＡｋｉｒａ、Ｓ．及びＫｉｓｉｈｍｏｔｏ、Ｔに発行された米国特許第５、７１９、０４２号及び米国特許第５、８４４、０８２号は、炎症性疾患、白血病及び癌等のＩＬ−６に関連した疾患の治療に、抗体、アンチセンス核酸及びリボザイムを含む、ＡＰＲＦを抑制する物質を用いることを示している。Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ、Ｒ．Ｄ．等は、米国特許第５、７３１、１５５号、米国特許第５、５８２、９９９号、及び米国特許第５、４６３、０２３号において、ｐ９１に結合する短いペプチドを用いて転写の活性化を抑制する方法を開示している。Ｄａｒｎｅｌｌ、Ｊ．Ｅ．等は、米国特許第５、７１６、６２２号において、ＳＴＡＴのＤＮＡ結合領域を含むペプチド、ＤＮＡ結合領域を含むキメラタンパク質、及びＳＴＡＴの転写活性を抑制するための抗体を開示している。
【００１５】
ヒトのＳＴＡＴ３の翻訳開始領域を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用が開示されている（Ｇｒａｎｄｉｓ、Ｊ．Ｒ．等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９８、１０２、１３８５−１３９２）。この報告によれば、ＳＴＡＴ３の翻訳開始領域に対して相補的なホスホロチオエートオリゴヌクレオチドが、上皮細胞成長因子受容体（ＥＧＦＲ）が介在するＴＧＦ−β刺激による細胞増殖を抑制している。これはＳＴＡＴ３がＥＧＦＲシグナル伝達経路の構成要素であることを示唆している。ＳＴＡＴ３の発現、及びＳＴＡＴ３に関連した疾患過程を標的とした治療的組成物、及び治療法に対する必要性は未だ満たされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許第５、７３１、１５５号
【特許文献２】米国特許第５、５８２、９９９号
【特許文献３】米国特許第５、４６３、０２３号
【特許文献４】米国特許第５、７１６、６２２号
【特許文献５】米国特許第５、６６３、１５３号
【特許文献６】米国特許第３、６８７、８０８号
【特許文献７】米国特許第４、４６９、８６３号
【特許文献８】米国特許第４、４７６、３０１号
【特許文献９】米国特許第５、０２３、２４３号
【特許文献１０】米国特許第５、１７７、１９６号
【特許文献１１】米国特許第５、１８８、８９７号
【特許文献１２】米国特許第５、２６４、４２３号
【特許文献１３】米国特許第５、２７６、０１９号
【特許文献１４】米国特許第５、２７８、３０２号
【特許文献１５】米国特許第５、２８６、７１７号
【特許文献１６】米国特許第５、３２１、１３１号
【特許文献１７】米国特許第５、３９９、６７６号
【特許文献１８】米国特許第５、４０５、９３９号
【特許文献１９】米国特許第５、４５３、４９６号
【特許文献２０】米国特許第５、４５５、２３３号
【特許文献２１】米国特許第５、４６６、６７７号
【特許文献２２】米国特許第５、４７６、９２５号
【特許文献２３】米国特許第５、５１９、１２６号
【特許文献２４】米国特許第５、５３６、８２１号
【特許文献２５】米国特許第５、５４１、３０６号
【特許文献２６】米国特許第５、５５０、１１１号
【特許文献２７】米国特許第５、５６３、２５３号
【特許文献２８】米国特許第５、５７１、７９９号
【特許文献２９】米国特許第５、５８７、３６１号
【特許文献３０】米国特許第５、１９４、５９９号
【特許文献３１】米国特許第５、５６５、５５５号
【特許文献３２】米国特許第５、５２７、８９９号
【特許文献３３】米国特許第５、７２１、２１８号
【特許文献３４】米国特許第５、６７２、６９７号
【特許文献３５】米国特許第５、６２５、０５０号
【特許文献３６】米国特許第５、０３４、５０６号
【特許文献３７】米国特許第５、１６６、３１５号
【特許文献３８】米国特許第５、１８５、４４４号
【特許文献３９】米国特許第５、２１４、１３４号
【特許文献４０】米国特許第５、２１６、１４１号
【特許文献４１】米国特許第５、２３５、０３３号
【特許文献４２】米国特許第５、２６４、５６２号
【特許文献４３】米国特許第５、２６４、５６４号
【特許文献４４】米国特許第５、４０５、９３８号
【特許文献４５】米国特許第５、４３４、２５７号
【特許文献４６】米国特許第５、４６６、６７７号
【特許文献４７】米国特許第５、４７０、９６７号
【特許文献４８】米国特許第５、４８９、６７７号
【特許文献４９】米国特許第５、５４１、３０７号
【特許文献５０】米国特許第５、５６１、２２５号
【特許文献５１】米国特許第５、５９６、０８６号
【特許文献５２】米国特許第５、６０２、２４０号
【特許文献５３】米国特許第５、６１０、２８９号
【特許文献５４】米国特許第５、６０２、２４０号
【特許文献５５】米国特許第５、６０８、０４６号
【特許文献５６】米国特許第５、６１８、７０４号
【特許文献５７】米国特許第５、６２３、０７０号
【特許文献５８】米国特許第５、６６３、３１２号
【特許文献５９】米国特許第５、６３３、３６０号
【特許文献６０】米国特許第５、６７７、４３７号
【特許文献６１】米国特許第５、７９２、６０８号
【特許文献６２】米国特許第５、６４６、２６９号
【特許文献６３】米国特許第５、６７７、４３９号
【特許文献６４】米国特許第５、５３９、０８２号
【特許文献６５】米国特許第５、７１４、３３１号
【特許文献６６】米国特許第５、７１９、２６２号
【特許文献６７】米国特許第５、５３９、０８２号
【特許文献６８】米国特許第５、７１９、２６２号
【特許文献６９】米国特許第５、０３４、５０６号
【特許文献７０】ＷＯ９８／３９３５２号
【特許文献７１】ＷＯ９９／１４２２６号
【特許文献７２】ＷＯ９８−ＤＫ３９３１９９８０９１４号
【特許文献７３】米国特許第５、８７４、５５３号
【特許文献７４】米国特許第６、１２７、３４６号
【特許文献７５】米国特許第４、９８１、９５７号
【特許文献７６】米国特許第５、１１８、８００号
【特許文献７７】米国特許第５、３１９、０８０号
【特許文献７８】米国特許第５、３５９、０４４号
【特許文献７９】米国特許第５、３９３、８７８号
【特許文献８０】米国特許第５、４４６、１３７号
【特許文献８１】米国特許第５、４６６、７８６号
【特許文献８２】米国特許第５、５１４、７８５号
【特許文献８３】米国特許第５、５１９、１３４号
【特許文献８４】米国特許第５、５６７、８１１号
【特許文献８５】米国特許第５、５７６、４２７号
【特許文献８６】米国特許第５、５９１、７２２号
【特許文献８７】米国特許第５、５９７、９０９号
【特許文献８８】米国特許第５、６１０、３００号
【特許文献８９】米国特許第５、６２７、０５３号
【特許文献９０】米国特許第５、６３９、８７３号
【特許文献９１】米国特許第５、６４６、２６５号
【特許文献９２】米国特許第５、６５８、８７３号
【特許文献９３】米国特許第５、６７０、６３３号
【特許文献９４】米国特許第５、７９２、７４７号
【特許文献９５】米国特許第５、７００、９２０号
【特許文献９６】米国特許第６、１４７、２００号
【特許文献９７】米国特許第３、６８７、８０８号
【特許文献９８】米国特許出願第１０／１５５、９２０号
【特許文献９９】米国特許出願第１０／０１３、２９５号
【特許文献１００】米国特許第６、０２８、１８３号
【特許文献１０１】米国特許第６、００７、９９２号
【特許文献１０２】米国特許第４、８４５、２０５号
【特許文献１０３】米国特許第５、１３０、３０２号
【特許文献１０４】米国特許第５、１３４、０６６号
【特許文献１０５】米国特許第５、１７５、２７３号
【特許文献１０６】米国特許第５、３６７、０６６号
【特許文献１０７】米国特許第５、４３２、２７２号
【特許文献１０８】米国特許第５、４３４、２５７号
【特許文献１０９】米国特許第５、４５７、１８７号
【特許文献１１０】米国特許第５、４５９、２５５号
【特許文献１１１】米国特許第５、４８４、９０８号
【特許文献１１２】米国特許第５、５０２、１７７号
【特許文献１１３】米国特許第５、５２５、７１１号
【特許文献１１４】米国特許第５、５５２、５４０号
【特許文献１１５】米国特許第５、５８７、４６９号
【特許文献１１６】米国特許第５、５９４、１２１号
【特許文献１１７】米国特許第５、５９６、０９１号
【特許文献１１８】米国特許第５、６１４、６１７号
【特許文献１１９】米国特許第５、６４５、９８５号
【特許文献１２０】米国特許第５、６４６、２６９号
【特許文献１２１】米国特許第５、７５０、６９２号
【特許文献１２２】米国特許第５、８３０、６５３号
【特許文献１２３】米国特許第５、７６３、５８８号
【特許文献１２４】米国特許第６、００５、０９６号
【特許文献１２５】米国特許第５、６８１、９４１号
【特許文献１２６】米国特許出願第０９／９９６、２９２号
【特許文献１２７】ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６号
【特許文献１２８】米国特許出願公開第０９／３３４、１３０号
【特許文献１２９】米国特許第４、８２８、９７９号
【特許文献１３０】米国特許第４、９４８、８８２号
【特許文献１３１】米国特許第５、２１８、１０５号
【特許文献１３２】米国特許第５、５２５、４６５号
【特許文献１３３】米国特許第５、５４１、３１３号
【特許文献１３４】米国特許第５、５４５、７３０号
【特許文献１３５】米国特許第５、５５２、５３８号
【特許文献１３６】米国特許第５、５７８、７１７号
【特許文献１３７】米国特許第５、５８０、７３１号
【特許文献１３８】米国特許第５、５９１、５８４号
【特許文献１３９】米国特許第５、１０９、１２４号
【特許文献１４０】米国特許第５、１１８、８０２号
【特許文献１４１】米国特許第５、１３８、０４５号
【特許文献１４２】米国特許第５、４１４、０７７号
【特許文献１４３】米国特許第５、４８６、６０３号
【特許文献１４４】米国特許第５、５１２、４３９号
【特許文献１４５】米国特許第５、５７８、７１８号
【特許文献１４６】米国特許第５、６０８、０４６号
【特許文献１４７】米国特許第４、５８７、０４４号
【特許文献１４８】米国特許第４、６０５、７３５号
【特許文献１４９】米国特許第４、６６７、０２５号
【特許文献１５０】米国特許第４、７６２、７７９号
【特許文献１５１】米国特許第４、７８９、７３７号
【特許文献１５２】米国特許第４、８２４、９４１号
【特許文献１５３】米国特許第４、８３５、２６３号
【特許文献１５４】米国特許第４、８７６、３３５号
【特許文献１５５】米国特許第４、９０４、５８２号
【特許文献１５６】米国特許第４、９５８、０１３号
【特許文献１５７】米国特許第５、０８２、８３０号
【特許文献１５８】米国特許第５、１１２、９６３号
【特許文献１５９】米国特許第５、２１４、１３６号
【特許文献１６０】米国特許第５、０８２、８３０号
【特許文献１６１】米国特許第５、１１２、９６３号
【特許文献１６２】米国特許第５、２４５、０２２号
【特許文献１６３】米国特許第５、２５４、４６９号
【特許文献１６４】米国特許第５、２５８、５０６号
【特許文献１６５】米国特許第５、２６２、５３６号
【特許文献１６６】米国特許第５、２７２、２５０号
【特許文献１６７】米国特許第５、２９２、８７３号
【特許文献１６８】米国特許第５、３１７、０９８号
【特許文献１６９】米国特許第５、３７１、２４１号
【特許文献１７０】米国特許第５、３９１、７２３号
【特許文献１７１】米国特許第５、４１６、２０３号
【特許文献１７２】米国特許第５、４５１、４６３号
【特許文献１７３】米国特許第５、５１０、４７５号
【特許文献１７４】米国特許第５、５１２、６６７号
【特許文献１７５】米国特許第５、５１４、７８５号
【特許文献１７６】米国特許第５、５６５、５５２号
【特許文献１７７】米国特許第５、５６７、８１０号
【特許文献１７８】米国特許第５、５７４、１４２号
【特許文献１７９】米国特許第５、５８５、４８１号
【特許文献１８０】米国特許第５、５８７、３７１号
【特許文献１８１】米国特許第５、５９５、７２６号
【特許文献１８２】米国特許第５、５９７、６９６号
【特許文献１８３】米国特許第５、５９９、９２３号
【特許文献１８４】米国特許第５、５９９、９２８号
【特許文献１８５】米国特許第５、６８８、９４１号
【特許文献１８６】ＷＯ９７／２６２７０号
【特許文献１８７】ＷＯ０３／００４６０２号
【特許文献１８８】米国特許第５、０１３、８３０号
【特許文献１８９】米国特許第５、１４９、７９７号
【特許文献１９０】米国特許第５、２２０、００７号
【特許文献１９１】米国特許第５、２５６、７７５号
【特許文献１９２】米国特許第５、３６６、８７８号
【特許文献１９３】米国特許第５、４０３、７１１号
【特許文献１９４】米国特許第５、４９１、１３３号
【特許文献１９５】米国特許第５、５６５、３５０号
【特許文献１９６】米国特許第５、６２３、０６５号
【特許文献１９７】米国特許第５、６５２、３５５号
【特許文献１９８】米国特許第５、６５２、３５６号
【特許文献１９９】米国特許第５、７００、９２２号
【特許文献２００】米国特許第５、７６０、２０９号
【特許文献２０１】米国特許第５、６１４、６２１号
【特許文献２０２】米国特許第６、０５１、６９９号
【特許文献２０３】米国特許第６、０２０、４７５号
【特許文献２０４】米国特許第６、３２６、４７８号
【特許文献２０５】米国特許第６、１６９、１７７号
【特許文献２０６】米国特許第６、１２１、４３７号
【特許文献２０７】米国特許第６、４６５、６２８号
【特許文献２０８】米国特許第５、１０８、９２１号
【特許文献２０９】米国特許第５、３５４、８４４号
【特許文献２１０】米国特許第５、４１６、０１６号
【特許文献２１１】米国特許第５、４５９、１２７号
【特許文献２１２】米国特許第５、５２１、２９１号
【特許文献２１３】米国特許第５、５４３、１５８号
【特許文献２１４】米国特許第５、５４７、９３２号
【特許文献２１５】米国特許第５、５８３、０２０号
【特許文献２１６】米国特許第５、５９１、７２１号
【特許文献２１７】米国特許第４、４２６、３３０号
【特許文献２１８】米国特許第４、５３４、８９９号
【特許文献２１９】米国特許第５、０１３、５５６号
【特許文献２２０】米国特許第５、１０８、９２１号
【特許文献２２１】米国特許第５、２１３、８０４号
【特許文献２２２】米国特許第５、２２７、１７０号
【特許文献２２３】米国特許第５、２６４、２２１号
【特許文献２２４】米国特許第５、３５６、６３３号
【特許文献２２５】米国特許第５、３９５、６１９号
【特許文献２２６】米国特許第５、４１７、９７８号
【特許文献２２７】米国特許第５、４６２、８５４号
【特許文献２２８】米国特許第５、４６９、８５４号
【特許文献２２９】米国特許第５、５１２、２９５号
【特許文献２３０】米国特許第５、５２７、５２８号
【特許文献２３１】米国特許第５、５３４、２５９号
【特許文献２３２】米国特許第５、５４３、１５２号
【特許文献２３３】米国特許第５、５５６、９４８号
【特許文献２３４】米国特許第５、５８０、５７５号
【特許文献２３５】米国特許第５、５９５、７５６号
【特許文献２３６】ＷＯ９３／２４５１０号
【特許文献２３７】ＷＯ９４／２６７６４号
【特許文献２３８】米国特許第５、７７０、７１３号
【特許文献２３９】米国特許第５、７０５、１８８号
【特許文献２４０】ＷＯ９７／３０７３１号
【特許文献２４１】米国特許第４、８３７、０２８号
【特許文献２４２】ＷＯ８８／０４９２４号
【特許文献２４３】米国特許第Ｎｏ．５、５４３、１５２号
【特許文献２４４】ＷＯ９７／１３４９９号
【特許文献２４５】米国特許第４、４２６、３３０号
【特許文献２４６】米国特許第４、５３４、８９９号
【特許文献２４７】米国特許第５、０１３、５５６号
【特許文献２４８】米国特許第５、３５６、６３３号
【特許文献２４９】米国特許第Ｎｏ．５、２１３、８０４
【特許文献２５０】欧州特許第ＥＰ０４９６８１３Ｂ１号
【特許文献２５１】ＷＯ９１／０５５４５号
【特許文献２５２】米国特許第５、２２５、２１２号
【特許文献２５３】ＷＯ９４／２００７３号
【特許文献２５４】ＷＯ９６／１０３９１号
【特許文献２５５】米国特許第５、５４０、９３５号
【特許文献２５６】米国特許第５、５５６、９４８号
【特許文献２５７】ＷＯ９６／４００６２号
【特許文献２５８】米国特許第５、２６４、２２１号
【特許文献２５９】ＷＯ９７／０４７８７号
【特許文献２６０】ＷＯ９２／２０８２３号
【特許文献２６１】米国特許第５、０３４、５０６号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｄａｒｎｅｌｌ、Ｊｒ．、Ｊ．Ｅ．等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９４、２６４、１４１５−１４２１
【非特許文献２】Ｙａｎｇ、Ｃ．−Ｈ．等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８、９５、５５６８−５５７２
【非特許文献３】Ｊａｉｎ、Ｎ．等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１９９８、１７、３１５７−３１６７
【非特許文献４】Ｚｈｏｎｇ、Ｚ．等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９４、９１、４８０６−４８１０
【非特許文献５】Ｆｕｋａｄａ、Ｔ．等、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１９９６、５、４４９−４６０
【非特許文献６】Ｙｕ、Ｃ．−Ｌ．等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９５、２６９、８１−８３
【非特許文献７】Ｔｕｒｋｓｏｎ、Ｊ．等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９８、１８、２５４５−２５５２
【非特許文献８】Ｍｉｇｏｎｅ、Ｔ．−Ｓ．等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９５、２６９、７９−８３
【非特許文献９】Ｓａｒｔｏｒ、Ｃ．Ｉ．等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９９７、５７、９７８−９８７
【非特許文献１０】Ｇａｒｃｉａ、Ｒ．等、Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、１９９７、８、１２６７−１２７６
【非特許文献１１】Ｃａｔｔａｎｅｏ、Ｅ．等、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９９８、１８、２３８１−２３８７
【非特許文献１２】Ｙｕ、Ｃ．−Ｌ．等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９７、１５９、５２０６−５２１０
【非特許文献１３】Ｆｒａｎｋ、Ｄ．Ａ．等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９７、１００、３１４０−３１４８
【非特許文献１４】Ｓｏｎｇ等、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２２：４１５０、２００３
【非特許文献１５】Ｍｏｒａ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２：６６５９、２００２
【非特許文献１６】Ｃａｔｌｅｔｔ−Ｆａｌｃｏｎｅ、Ｒ．等、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、１９９９、１０、１０５−１１５
【非特許文献１７】Ｓｅｎｇｕｐｔａ、Ｔ．Ｋ．等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９５、１８１、１０１５−１０２５
【非特許文献１８】Ｗａｎｇ、Ｆ．等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９５、１８２、１８２５−１８３１
【非特許文献１９】Ｃａｌｄｅｎｈｏｖｅｎ、Ｅ．等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９６、２７１、１３２２１−１３２２７
【非特許文献２０】Ｇｒａｎｄｉｓ、Ｊ．Ｒ．等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１９９８、１０２、１３８５−１３９２
【非特許文献２１】Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２、２９５、６９４−６９７
【非特許文献２２】Ｎｉｅｌｓｅｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１、２５４、１４９７−１５００
【非特許文献２３】Ｄｗａｉｎｅ  Ａ．Ｂｒａａｓｃｈ及びＤａｖｉｄ  Ｒ．Ｃｏｒｅｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００２、４１（１４）、４５０３−４５１０
【非特許文献２４】Ｗａｎｇ等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０００、１２２、８５９５−８６０２
【非特許文献２５】Ｗｏｕｔｅｒｓ及びＨｅｒｄｅｗｉｊｎ、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、１９９９、９、１５６３−１５６６
【非特許文献２６】Ｓｉｎｇｈ等、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９９８、４、４５５−４５６
【非特許文献２７】Ｗｅｎｇｅｌ等、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９９、１８、１３６５−１３７０
【非特許文献２８】Ｋｏｓｈｋｉｎ等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９８、１２０、１３２５２−１３２５３
【非特許文献２９】Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２０００、９７、５６３３−５６３８
【非特許文献３０】Ｋｏｓｈｋｉｎ等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９８、５４、３６０７−３６３０
【非特許文献３１】Ｋｕｍａｒ等、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、１９９８、８、２２１９−２２２２
【非特許文献３２】Ｓｉｎｇｈ等、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９８、６３、１００３５−１００３９
【非特許文献３３】Ｓｔｅｆｆｅｎｓ等、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９９７、８０、２４２６−２４３９
【非特許文献３４】Ｓｔｅｆｆｅｎｓ等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９９、１２１、３２４９−３２５５
【非特許文献３５】Ｒｅｎｎｅｂｅｒｇ等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２００２、１２４、５９９３−６００２
【非特許文献３６】Ｍａｒｔｉｎ等、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９９５、７８、４８６−５０４
【非特許文献３７】Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８５８−８５９、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ、Ｊ．Ｉ．、ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９０
【非特許文献３８】Ｓａｎｇｈｖｉ、Ｙ．Ｓ．、Ｃｈａｐｔｅｒ１５、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２８９−３０２、Ｃｒｏｏｋｅ、Ｓ．Ｔ．及びＬｅｂｌｅｕ、Ｂ．、ｅｄ．、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３
【非特許文献３９】Ｓａｎｇｈｖｉ、Ｙ．Ｓ．、Ｃｒｏｏｋｅ、Ｓ．Ｔ．及びＬｅｂｌｅｕ、Ｂ．、ｅｄｓ．、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、１９９３、ｐｐ．２７６−２７８
【非特許文献４０】Ｋｕｒｃｈａｖｏｖ、等、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９７、１６、１８３７−１８４６
【非特許文献４１】Ｌｉｎ、Ｋ．−Ｙ．、Ｊｏｎｅｓ、Ｒ．Ｊ．、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、Ｍ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９５、１１７、３８７３−３８７４
【非特許文献４２】Ｗａｎｇ、Ｊ．、Ｌｉｎ、Ｋ．−Ｙ．、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、Ｍ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９８、３９、８３８５−８３８８
【非特許文献４３】Ｌｉｎ、Ｋ．−Ｙ．、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、Ｍ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８、１２０、８５３１−８５３２
【非特許文献４４】Ｆｌａｎａｇａｎ、Ｗ．Ｍ．、Ｗｏｌｆ、Ｊ．Ｊ．、Ｏｌｓｏｎ、Ｐ．、Ｇｒａｎｔ、Ｄ．、Ｌｉｎ、Ｋ．−Ｙ．、Ｗａｇｎｅｒ、Ｒ．Ｗ．、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、Ｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９９、９６、３５１３−３５１８
【非特許文献４５】Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８９、８６、６５５３−６５５６
【非特許文献４６】Ｍａｎｏｈａｒａｎ等、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．、１９９４、４、１０５３−１０６０
【非特許文献４７】Ｍａｎｏｈａｒａｎ等、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９２、６６０、３０６−３０９
【非特許文献４８】Ｍａｎｏｈａｒａｎ等、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．、１９９３、３、２７６５−２７７０
【非特許文献４９】Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９２、２０、５３３−５３８
【非特許文献５０】Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ等、ＥＭＢＯＪ．、１９９１、１０、１１１１−１１１８
【非特許文献５１】Ｋａｂａｎｏｖ等、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、１９９０、２５９、３２７−３３０
【非特許文献５２】Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ等、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、１９９３、７５、４９−５４
【非特許文献５３】Ｍａｎｏｈａｒａｎ等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、１９９５、３６、３６５１−３６５４
【非特許文献５４】Ｓｈｅａ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９０、１８、３７７７−３７８３
【非特許文献５５】Ｍａｎｏｈａｒａｎ等、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９５、１４、９６９−９７３
【非特許文献５６】Ｍｉｓｈｒａ等、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１９９５、１２６４、２２９−２３７
【非特許文献５７】Ｒｏｏｋｅ等、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、１９９６、２７７、９２３−９３７
【非特許文献５８】Ｂｅａｕｃａｇｅ及びＴｙｅｒ、１９９３、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ４９、１９２５
【非特許文献５９】Ｇａｌｌｏ等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（２００１）、５７、５７０７−５７１３
【非特許文献６０】Ｈａｒｒｙ−Ｏ’ｋｕｒｕ等、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、（１９９７）、６２（６）、１７５４−１７５９
【非特許文献６１】Ｔａｎｇ等、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）、６４、７４７−７５４
【非特許文献６２】Ｋａｗａｓａｋｉ等、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）、３６、８３１−８４１
【非特許文献６３】Ｇｕｉｌｌｅｒｍ等、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９５）、５、１４５５−１４６０
【非特許文献６４】Ｏｗｅｎ等、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９７６）、４１、３０１０−３０１７
【非特許文献６５】Ｊａｃｏｂｓｏｎ等、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．（２０００）、４３、２１９６−２２０３
【非特許文献６６】Ｌｅｅ等、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００１）、１１、１３３３−１３３７
【非特許文献６７】Ｓｉｎｇｈ等、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９８）、４、４５５−４５６
【非特許文献６８】Ｍｏｒｉｔａ等、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００２）、１２、７３−７６
【非特許文献６９】Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｖｏｌ  １−３、ｅｄ．ＬｅｒｏｙＢ．Ｔｏｗｎｓｅｎｄ、１９８８、Ｐｌｅｎｕｍｐｒｅｓｓ
【非特許文献７０】Ａｒｎｏｔｔ及びＨｕｋｉｎｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１９７０、４７、１５０４
【非特許文献７１】Ｓａｎｇｅｒ等、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、１９８４、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ．
【非特許文献７２】Ｌｅｓｎｉｋ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９５、３４、１０８０７−１０８１５
【非特許文献７３】Ｃｏｎｔｅ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９７、２５、２６２７−２６３４
【非特許文献７４】Ｓｅａｒｌｅ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９３、２１、２０５１−２０５６
【非特許文献７５】Ｅｇｌｉ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９６、３５、８４８９−８４９４
【非特許文献７６】Ｂｅｒｇｅｒ等によるＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９８、２６、２４７３−２４８０
【非特許文献７７】Ｓｅａｒｌｅ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９３、２１、２０５１−２０５６
【非特許文献７８】Ｌａｎｅ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９３、２１５、２９７−３０６
【非特許文献７９】Ｆｅｄｏｒｏｆｆ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９３、２３３、５０９−５２３
【非特許文献８０】Ｇｏｎｚａｌｅｚ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９５、３４、４９６９−４９８２
【非特許文献８１】Ｈｏｒｔｏｎ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９６、２６４、５２１−５３３
【非特許文献８２】Ｂａｋｅｒ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９７、２７２、１１９４４−１２０００
【非特許文献８３】Ｍａｒｔｉｎ、Ｐ．、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９９５、７８、４８６−５０４
【非特許文献８４】Ａｌｔｍａｎｎ等、Ｃｈｉｍｉａ、１９９６、５０、１６８−１７６
【非特許文献８５】Ａｌｔｍａｎｎ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．、１９９６、２４、６３０−６３７
【非特許文献８６】Ａｌｔｍａｎｎ等、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９７、１６、９１７−９２６
【非特許文献８７】Ｂｅｒｇｅ等、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ、」Ｊ．ｏｆ  Ｐｈａｒｍａ  Ｓｃｉ．、１９７７、６６、１−１９
【非特許文献８８】ＤｉＳａｎｔｏ、Ｃｈａｐｔｅｒ７６Ｉｎ：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈＥｄ．、Ｇｅｎｎａｒｏ、ｅｄ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０、１４５１−１４５８
【非特許文献８９】Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９０、７、１
【非特許文献９０】Ｈａｒｖｅｙ、Ｃｈａｐｔｅｒ３５Ｉｎ：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ  Ｅｄ．、Ｇｅｎｎａｒｏ、ｅｄ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０、７１１
【非特許文献９１】Ｈｉｒａｈａｔａ等、ＧａｎＴｏＫａｇａｋｕＲｙｏｈｏ、１９９２、１９（１０Ｓｕｐｐｌ．）、１５９１
【非特許文献９２】Ｓｏｍｏｇｙｉ等、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、１９９５、１２、１４９
【非特許文献９３】Ａｋａｍｏ等、ＪａｐａｎｅｓｅＪ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、１９９４、８５、６５２
【非特許文献９４】Ｉｎｏｕｅ等、Ａｒｔｉｆ．Ｏｒｇａｎｓ、１９９７、２１、２８
【非特許文献９５】Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ等、ＡｉｌｍｅｎｔＰｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１９９５、９、４７１
【非特許文献９６】Ｂｅｎｅｔ等、Ｃｈａｐｔｅｒ１  Ｉｎ：Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、９ｔｈ  Ｅｄ．、Ｈａｒｄｍａｎ等、ｅｄｓ．、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９６
【非特許文献９７】Ｌｅｅ等、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２
【非特許文献９８】Ｔａｋａｈａｓｈｉ等、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｍａｃｏｌ．、１９８８、４０、２５２
【非特許文献９９】Ｅｌ−Ｈａｒｉｒｉ等、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９９２、４４、６５１
【非特許文献１００】Ｂｒｕｎｔｏｎ、Ｃｈａｐｔｅｒ３８  Ｉｎ：Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、９ｔｈ  Ｅｄ．、Ｈａｒｄｍａｎ等、ｅｄｓ．、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９６、９３４−９３５
【非特許文献１０１】Ｓｗｉｎｙａｒｄ、Ｃｈａｐｔｅｒ３９  Ｉｎ：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ  Ｅｄ．、Ｇｅｎｎａｒｏ、ｅｄ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０、７８２−７８３
【非特許文献１０２】Ｌｅｅ等、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、８、９１
【非特許文献１０３】Ｙａｍａｍｏｔｏ等、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、１９９２、２６３、２５
【非特許文献１０４】Ｙａｍａｓｈｉｔａ等、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、１９９０、７９、５７９
【非特許文献１０５】Ｊａｒｒｅｔｔ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、１９９３、６１８、３１５
【非特許文献１０６】Ｂｕｕｒ等、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ．、１９９０、１４、４３
【非特許文献１０７】Ｙａｍａｓｈｉｔａ等、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９８７、３９、６２１
【非特許文献１０８】Ｉｄｓｏｎ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、ｖｏｌｕｍｅ  １、ｐ．１９９
【非特許文献１０９】Ｒｏｓｏｆｆ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、Ｖｏｌｕｍｅ  １、ｐ．２４５
【非特許文献１１０】Ｂｌｏｃｋ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、ｖｏｌｕｍｅ２、ｐ．３３５
【非特許文献１１１】Ｈｉｇｕｃｈｉ等、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９８５、ｐ．３０１
【非特許文献１１２】Ｒｉｅｇｅｒ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、ｖｏｌｕｍｅ  １、ｐ．２８５
【非特許文献１１３】Ｌｅｕｎｇ  ａｎｄ  Ｓｈａｈ、：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｏｓｏｆｆ、Ｍ．、Ｅｄ．、１９８９、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１８５−２１５
【非特許文献１１４】Ｓｃｈｏｔｔ、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９８５、ｐ．２７１
【非特許文献１１５】Ｂｌｏｃｋ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、ｖｏｌｕｍｅ  １、ｐ．３３５
【非特許文献１１６】Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ等、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４、１１、１３８５−１３９０
【非特許文献１１７】Ｒｉｔｓｃｈｅｌ、Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９９３、１３、２０５
【非特許文献１１８】Ｌｅｅ等、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒａｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、ｐ．９２
【非特許文献１１９】Ｗａｎｇ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９８７、１４７、９８０−９８５
【非特許文献１２０】Ｚｈｏｕ等、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、１９９２、１９、２６９−２７４
【非特許文献１２１】Ｗｅｉｎｅｒ等、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、１９９２、２、４０５−４１０
【非特許文献１２２】ｄｕＰｌｅｓｓｉｓ等、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９２、１８、２５９−２６５
【非特許文献１２３】Ｈｕ等、Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．、１９９４、４、６、４６６
【非特許文献１２４】Ａｌｌｅｎ等、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９８７、２２３、４２、Ｗｕｅｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９３、５３、３７６５
【非特許文献１２５】Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ等、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９８７、５０７、６４
【非特許文献１２６】Ｇａｂｉｚｏｎ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９８８、８５、６９４９
【非特許文献１２７】Ｓｕｎａｍｏｔｏ等、Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．、１９８０、５３、２７７８
【非特許文献１２８】Ｋｌｉｂａｎｏｖ等、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、１９９０、２６８、２３５
【非特許文献１２９】Ｂｌｕｍｅ等、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、１９９０、１０２９、９１
【非特許文献１３０】Ｉｌｌｕｍ等、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、１９８４、１６７、７９
【非特許文献１３１】Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１５ｔｈ  Ｅｄ．１９８７、ｐｐ．１２０６−１２２８、Ｂｅｒｋｏｗ等、ｅｄｓ．、Ｒａｈｗａｙ、Ｎ．Ｊ．
【非特許文献１３２】Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１５ｔｈ  Ｅｄ．、Ｂｅｒｋｏｗ等、ｅｄｓ．、１９８７、Ｒａｈｗａｙ、Ｎ．Ｊ．、２４９９−２５０６及び４６−４９
【非特許文献１３３】Ｋａｗａｓａｋｉ等、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９３、３６、８３１−８４１
【非特許文献１３４】Ｍａｒｔｉｎ、Ｐ．、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １９９５、７８、４８６−５０６
【非特許文献１３５】Ｓａｎｇｈｖｉ等、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９３、２１、３１９７−３２０３
【非特許文献１３６】Ｄｅ  Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ等（Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９５、２８、３６６−３７４
【非特許文献１３７】Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎｅｔａｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９１、２５４、１４９７−１５００
【非特許文献１３８】Ｃｈｉａｎｇ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１、２６６、１８１６２
【非特許文献１３９】Ｋａｒｒａｓ、Ｊ．Ｇ．等、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９７、１８５、１０３５−１０４２
【非特許文献１４０】Ｋａｒｒａｓ、Ｊ．Ｇ．等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５７、２２９９
【非特許文献１４１】Ｄ．Ａ．等、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９５、７、１５１−１６１
【非特許文献１４２】Ｆａｒｉｓ、Ｍ．等、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９７、９０、３５０−３５７
【非特許文献１４３】Ｓｃａｒｉｎｇｅ、Ｓ．Ａ．Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｌｏｒａｄｏ、１９９６
【非特許文献１４４】Ｓｃａｒｉｎｇｅ、Ｓ．Ａ等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９８、１２０、１１８２０−１１８２１
【非特許文献１４５】Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、Ｍ．Ｄ．及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｍ．Ｈ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９８１、１０３、３１８５−３１９１
【非特許文献１４６】Ｂｅａｕｃａｇｅ、Ｓ．Ｌ．及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｍ．Ｈ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、１９８１、２２、１８５９−１８６２
【非特許文献１４７】Ｄａｈｌ、Ｂ．Ｊ．、等、Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ、．１９９０、４４、６３９−６４１
【非特許文献１４８】Ｒｅｄｄｙ、Ｍ．Ｐ．等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｍ  Ｌｅｔｔ．、１９９４、２５、４３１１−４３１４
【非特許文献１４９】Ｗｉｎｃｏｔｔ、Ｆ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９５、２３、２６７７−２６８４
【非特許文献１５０】Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ｂ．Ｅ等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９６７、２３、２３０１−２３１３
【非特許文献１５１】Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ｂ．Ｅ等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９６７、２３、２３１５−２３３１
【非特許文献１５２】Ｇｌｅａｖｅ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：１５９８−１６０５、１９９２
【非特許文献１５３】Ｃｈｉａｒｌｅ、等、Ｂｌｏｏｄ、２００３、１０１、１９１９−１９２７
【非特許文献１５４】Ｂｒｏｍｂｅｒｇ、Ｊ．Ｆ．等、Ｃｅｌｌ、１９９９、９８、２９５−３０３
【非特許文献１５５】Ｒｉｃｋｅｒｔ等、Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．、１９９７、２５、１３１７
【非特許文献１５６】Ｃｈｉａｒｌｅ等、Ｂｌｏｏｄ、２００３、１０１、１９１９−１９２７
【非特許文献１５７】Ｍｏｒａ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２：６６５９、２００２
【非特許文献１５８】Ｒａｚ等、ＰＮＡＳ、１９９９、９６、２８４６−２８５１
【非特許文献１５９】Ｈｏ等、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、１９９６、８５、１３８−１４３
【非特許文献１６０】Ａｋｉｒａ、Ｓ．等（Ｃｅｌｌ、１９９４、７７、６３−７１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本発明は、ＳＴＡＴ３をコードする核酸を標的とし、ＳＴＡＴ３の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドを提供する。また本発明は、ヒトのＳＴＡＴ３をコードする核酸を標的とするキメラのオリゴヌクレオチドを提供する。
【００１９】
また本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドを用いて、細胞内及び組織内においてヒトのＳＴＡＴ３の発現を調節する方法を含む。
更に本発明は、炎症性疾患、特に関節リウマチ、並びに乳腺、前立腺、頭部及び頸部並びに脳のものを含む癌、骨髄腫、黒色腫、白血病、及びリンパ腫の診断及び治療方法を含む。これらの方法は本発明のオリゴヌクレオチドを用いる。本発明のオリゴヌクレオチド及び方法は、治療的にも予防的にも有用であると思われる。更に本発明のオリゴヌクレオチド及び方法は、臨床研究及び診断のための手段として、また種々の細胞機能及び生理学的過程及び状態におけるＳＴＡＴ３の役割を検出及び確認するための手段として、並びにＳＴＡＴ３の発現と関連した状態の診断のための手段として有用であると思われる。
【００２０】
ＳＴＡＴ３はサイトカインシグナル伝達にて重要な役割を有している。ＳＴＡＴ３の過剰発現、及び／又は恒常的な活性化は、多数の炎症性疾患及び癌と関連している。従って、このＤＮＡ結合タンパク質は、これらの疾患を治療するための魅力的な目標である。より詳細には、ＳＴＡＴ３発現の調節は、例えば関節リウマチ、乳癌、前立腺癌、脳腫瘍、頭頸部癌、骨髄腫、黒色腫、白血病及びリンパ腫のような疾患の治療に有用であり得る。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は、ＳＴＡＴ３をコードする核酸分子の機能を調節し、最終的には生成されるＳＴＡＴ３の量を調節するためにアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチドを使用する。このことは、ＳＴＡＴ３をコードする、好ましくはｍＲＮＡである核酸分子と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供することによって、達成される。
【００２２】
例えばオリゴヌクレオチドのようなアンチセンス化合物と、該アンチセンス化合物がハイブリダイズする、該アンチセンス化合物の逆相補的核酸分子標的との間の関係は、通常、「アンチセンス」と称されている。本発明の文脈において、オリゴヌクレオチドを選択された核酸標的に対して「標的にする」ことは複数のプロセスからなる。このプロセスは通常、調節するべき機能を有する核酸配列を同定することから開始される。これはその発現が特定の疾病状態と関連する、例えば細胞遺伝子（又はその遺伝子から形成されたｍＲＮＡ）や、感染物質由来の外来核酸であり得る。本発明では、標的はＳＴＡＴ３をコードする核酸、換言すればＳＴＡＴ３をコードする遺伝子であるか、又はＳＴＡＴ３遺伝子から発現されたｍＲＮＡである。ＳＴＡＴ３をコードするｍＲＮＡは、現在の所、好ましい標的である。標的プロセスはまた、アンチセンス相互作用が発生し、その結果遺伝子発現が調節されるように、核酸配列内の部位（一つ又は複数）を決定することも含む。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明によれば、当業者はメッセンジャーＲＮＡが、３文字遺伝子コードを使用するタンパク質のコード情報のみならず、当業者に周知の５’−未翻訳領域、３’−未翻訳領域、５’−キャップ領域及びイントロン／エクソン接合部リボヌクレオチド領域を形成する関連リボヌクレオチドを含むことが理解されよう。従って、本発明によれば、これら関連リボヌクレオチドと、情報リボヌクレオチドとを完全に、又は部分的に標的とするオリゴヌクレオチドを調製し得る。従って、オリゴヌクレオチドは、転写開始部位領域、翻訳開始コドン領域、５’−キャップ領域、イントロン／エクソン接合部、コード配列、翻訳終結コドン領域、又は５’−若しくは３’−未翻訳領域内の配列と特異的にハイブリダイズすることが可能であり得る。当該技術分野で公知なように、翻訳開始コドンは通常、５’−ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡ分子、対応するＤＮＡ分子の５’−ＡＴＧ）であり、翻訳開始コドンは通常、「ＡＵＧコドン」、「スタートコドン」、又は「ＡＵＧスタートコドン」とも称されている。少数の遺伝子が、５’−ＧＵＧ、５’−ＵＵＧ又は５’−ＣＵＧ、及び５’−ＡＵＡのＲＮＡ配列を含む翻訳開始コドンを有し、５’−ＡＣＧ及び５’−ＣＵＧは、インビボにて機能することが証明されている。従って、用語「翻訳開始コドン」及び「スタートコドン」は、各場合の開始アミノ酸が通常メチオニン（真核生物において）、又はホルミルメチオニン（原核生物において）であっても、多数のコドン配列を包含し得る。当該技術分野にて、真核生物及び原核生物の遺伝子は、二種又は三種以上の代替的なスタートコドンを有し、これらのいずれもが特定の細胞型若しくは組織内で、又は特定の状況の組合せの下で翻訳開始に優位に使用され得ることも公知である。本発明の文脈では、「スタートコドン」及び「翻訳開始コドン」は、それらコドンの配列（一つ又は複数）に関わらず、インビボで、ＳＴＡＴ３をコードする遺伝子から転写されたｍＲＮＡ分子の翻訳を開始するのに使用されるコドン（一つ又は複数）を意味する。当該技術分野にて、遺伝子の翻訳終結コドン（又は「停止コドン」）は３種の配列、即ち５’−ＵＡＡ、５’−ＵＡＧ及び５’−ＵＧＡ（対応するＤＮＡ配列は、各々５’−ＴＡＡ、５’−ＴＡＧ及び５’−ＴＧＡ）のうちの１種を有し得る。用語「スタートコドン領域」「ＡＵＧ領域」及び「翻訳開始コドン領域」は、翻訳開始コドンからいずれかの方向（即ち、５’又は３’）に、連続的な約２５〜５０個のヌクレオチドを包含するｍＲＮＡ又は遺伝子部分を意味する。この領域は、好ましい標的領域である。同様に、用語「停止コドン領域」「翻訳終結コドン領域」は、翻訳終結コドンからいずれかの方向（即ち、５’又は３’）に、連続的な約２５〜５０個のヌクレオチドを包含するｍＲＮＡ又は遺伝子部分を意味する。この領域は、好ましい標的領域である。当該技術分野にて、翻訳開始コドンと翻訳終結コドンとの間の領域を意味することが周知のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）又は「コード領域」も、効果的に標的とし得る領域である。他の好ましい標的領域は、当該技術分野にて翻訳開始コドンから５’方向のｍＲＮＡ部分を意味することが周知の５’未翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含み、従って５’キャップ部位とｍＲＮＡの翻訳開始コドンの間のヌクレオチド、又は遺伝子上の対応するヌクレオチドを含み、また、当該技術分野にて翻訳終結コドンから３’方向のｍＲＮＡ部分を意味することが周知の３’未翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含み、従って翻訳終結コドンとｍＲＮＡ３’末端の間のヌクレオチド、又は遺伝子上の対応するヌクレオチドを含む。ｍＲＮＡの５’キャップは、５’−５’トリホスフェート連鎖を介してｍＲＮＡの最も５’側の残基に結合したＮ７−メチル化グアノシン残基からなる。ｍＲＮＡの５’キャップ領域は、５’キャップ構造自体と、該キャップに隣接した最初の５０のヌクレオチドを含むものと考慮される。５’キャップ領域もまた、好ましい標的領域であり得る。
【００２４】
真核生物のｍＲＮＡの転写産物のいくつかは直接翻訳されるが、多くは「イントロン」として周知の一つ又は二つ以上の領域を含み、該領域はプレｍＲＮＡ転写産物から切除されて一つ又は二つ以上の成熟ｍＲＮＡを与える。残りの（即ち翻訳された）領域は「エクソン」として周知であり、スプライスされて一緒になり連続するｍＲＮＡ配列を形成する。ｍＲＮＡスプライス部位、即ちエクソン−エクソン又はイントロン−エクソン接合部もまた、好ましい標的領域であり得、疾病に異常なスプライシングが関与している場合や、疾病に特定のｍＲＮＡスプライス生成物の過剰生成が関与している場合に、特に有用である。再配列又は欠失を原因とする異常な融合接合部もまた、好ましい標的である。別の方法でスプライスされた特定のエクソンを標的にすることも好ましいといえる。イントロンもまた、例えばＤＮＡ又はプレｍＲＮＡを標的とするアンチセンス化合物に対して効果的であり、それゆえ好ましい標的領域であり得ることが分かっている。
【００２５】
標的部位（一つ又は複数）が特定されたら、該標的に対して十分相補的な、即ち十分な特異性を有して十分にハイブリダイズし、所望の調節が得られるオリゴヌクレオチドを選択する。
【００２６】
「ハイブリダイゼーション」とは、翻訳の文脈において、通常、向かい合った核酸鎖上の、又は一本の核酸鎖の二領域における相補的な塩基間のワトソン−クリック型塩基対として知られる水素結合を意味する。その間に三つの水素結合を形成することで周知のグアニンとシトシンは、相補的な塩基の例である。アデニンとチミンはその間に二つの水素結合を形成する相補的な塩基の例である。
【００２７】
「特異的にハイブリダイズ可能な」及び「相補的」は、ＤＮＡ又はＲＮＡとオリゴヌクレオチド間に安定した特異的な結合が生じるに十分な相補性の程度を示すのに使用されている。
【００２８】
オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸配列に対して１００％の相補性を有する必要はないことが理解される。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの標的に対する結合が、標的分子の通常の役割を妨害してその機能又は活性を損失させる場合に、特異的にハイブリダイズ可能であり、特異的な結合が所望される条件下、即ちインビボでのアッセイ若しくは治療的処置の生理的条件下で、又はインビトロでのアッセイの場合にはアッセイが実施される条件下で、オリゴヌクレオチドの標的としない配列への非特異的な結合が回避されるに十分な相補性の程度を有する。
【００２９】
アンチセンスオリゴヌクレオチドのｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションは、ｍＲＮＡの通常の機能の一つ又は二つ以上と干渉する。干渉されるべきｍＲＮＡの機能は、例えばＲＮＡのタンパク質翻訳の部位への転位、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、一つ又は二つ以上のｍＲＮＡの種を与えるＲＮＡのスプライシング、及びＲＮＡが関与し得る触媒作用のような任意の生体機能である。特定のタンパク質（一種又は複数）のＲＮＡに対する結合も、アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮＡに対するハイブリダイゼーションによって妨げられる。
【００３０】
以下、好ましいアンチセンス化合物がハイブリダイズする標的核酸の位置を、「標的セグメント」と称する。本願明細書で使用されるように、用語「標的セグメント」は、活性アンチセンス化合物が標的とする標的領域の、少なくとも８個の核酸塩基からなる部分として定義する。理論に裏付けされている訳ではないが、現在、これら標的セグメントは、ハイブリダイゼーションのために接近可能な標的核酸の部分を表すと信じられている。
【００３１】
ある標的セグメントの特定の配列を本願明細書に記述するが、当業者はこれらが本発明の範囲に含まれる特定の実施態様を例示及び説明するものであることを認識されよう。当業者は更なる標的セグメントを確認することができる。
例示的な好ましい標的セグメントから選択された８個の連続的な核酸ストレッチを少なくとも一つ含む、８〜８０個の核酸塩基の長さを有する標的セグメントは、ターゲティングに適していると考えられる。
【００３２】
標的セグメントは、例示的な標的セグメントのうちの一つの５’末端にて少なくともその８個の連続的な核酸塩基を含む、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列を含み得る（残りの核酸塩基は同一のＤＮＡ又はＲＮＡの連続したストレッチであり、標的セグメントの５’末端のすぐ上流から開始して、該ＤＮＡ又はＲＮＡが約８〜約８０個の核酸塩基を含む迄連続する）。同様に、標的セグメントは、例示的な好ましい標的セグメントのうちの一つの３’末端にて少なくともその８個の連続的な核酸塩基を含む、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列で表される（残りの核酸塩基は同一のＤＮＡ又はＲＮＡの連続したストレッチであり、標的セグメントの３’末端のすぐ下流から開始して、該ＤＮＡ又はＲＮＡが約８〜約８０個の核酸塩基を含む迄連続する）。アンチセンス標的セグメントが例示的な好ましい標的セグメントの中央部にて少なくとも８個の連続的な核酸塩基を含み、そのオリゴヌクレオチドが約８〜約８０個の核酸塩基を含む迄いずれか一方、又は両方の方向へ延び得るＤＮＡ又はＲＮＡ配列で表され得ることも想定される。本願明細書にて記述される標的セグメントに関して経験を積んだ当業者は、必要以上の実験を行うことなく、更なる好ましい標的セグメントを同定し得るであろう。
【００３３】
一つ又は二つ以上の標的領域、セグメント又は部位が確認された後、該標的に十分相補的な、即ち十分な特異性を有して十分にハイブリダイズし、所望の効果を与えるアンチセンス化合物が選択される。
【００３４】
本願明細書に開示される低重合体のアンチセンス化合物も、標的核酸塩基配列の領域を標的とし得る。低重合体のアンチセンス化合物が標的とし得る、８個以上、８０個以下の核酸塩基を含む核酸塩基配列の全領域を、以下のように説明する。
【００３５】
Ｒ（ｎ、ｎ＋ｍ−１）を標的核酸塩基配列からの領域とし、ここで「ｎ」は該領域中で最も５’側に存在する核酸塩基の位置であり、「ｎ＋ｍ−１」は該領域中で最も３’側に存在する核酸塩基の位置であり、「ｍ」は、該領域の長さである。「ｍ」の長さを有する領域のセット「Ｓ（ｍ）」は、ｎが１〜Ｌ−ｍ＋１の範囲内にあり、ここでＬは標的核酸塩基配列の長さであり、Ｌ＞ｍである領域として定義する。全領域中のセット「Ａ」は、ｍが８以上であり、８０以下である各長さの領域の組合せの和集合として構成され得る。
【００３６】
この領域のセットは、以下の数学的表記を用いて表すことができる。
0005507617.tif 000002
式中、
0005507617.tif 000003
である。
及び
0005507617.tif 000004
式中、数学的演算子｜は、「例えば」を示し、
数学的演算子 は「セットのメンバー」を示し（例、ｙ ｚは、要素ｙが組合せｚのメンバーであることを示す）、
ｘは変数を示し、
Ｎは、正の整数として定義される全自然数を示し、
そして、数学的演算子
0005507617.tif 000005
は、「セットの和集合」を示す。
【００３７】
例えば、ｍが８、２０、及び８０の領域のセットは、以下のように構成することができる。標的核酸塩基配列の位置１（ｎ＝１）より開始する、１００個の核酸塩基の長さ（Ｌ＝１００）の標的核酸塩基配列内の、各々８個の核酸塩基の長さを有するＳ（ｍ＝８）領域の組合せは、以下の式を用いて構成され得、
0005507617.tif 000006
また、１−８、２−９、３−１０、４−１１、５−１２、６−１３、７−１４、８−１５、９−１６、１０−１７、１１−１８、１２−１９、１３−２０、１４−２１、１５−２２、１６−２３、１７−２４、１８−２５、１９−２６、２０−２７、２１−２８、２２−２９、２３−３０、２４−３１、２５−３２、２６−３３、２７−３４、２８−３５、２９−３６、３０−３７、３１−３８、３２−３９、３３−４０、３４−４１、３５−４２、３６−４３、３７−４４、３８−４５、３９−４６、４０−４７、４１−４８、４２−４９、４３−５０、４４−５１、４５−５２、４６−５３、４７−５４、４８−５５、４９−５６、５０−５７、５１−５８、５２−５９、５３−６０、５４−６１、５５−６２、５６−６３、５７−６４、５８−６５、５９−６６、６０−６７、６１−６８、６２−６９、６３−７０、６４−７１、６５−７２、６６−７３、６７−７４、６８−７５、６９−７６、７０−７７、７１−７８、７２−７９、７３−８０、７４−８１、７５−８２、７６−８３、７７−８４、７８−８５、７９−８６、８０−８７、８１−８８、８２−８９、８３−９０、８４−９１、８５−９２、８６−９３、８７−９４、８８−９５、８９−９６、９０−９７、９１−９８、９２−９９、９３−１００の核酸塩基からなる領域の組合せを記述する。
【００３８】
標的核酸塩基配列の位置１から開始する、１００個の核酸塩基の長さを有する標的配列内の、２０個の核酸塩基の長さを有する領域の更なるセットは、以下の式を用いて記述され得、
0005507617.tif 000007
また、１−２０、２−２１、３−２２、４−２３、５−２４、６−２５、７−２６、８−２７、９−２８、１０−２９、１１−３０、１２−３１、１３−３２、１４−３３、１５−３４、１６−３５、１７−３６、１８−３７、１９−３８、２０−３９、２１−４０、２２−４１、２３−４２、２４−４３、２５−４４、２６−４５、２７−４６、２８−４７、２９−４８、３０−４９、３１−５０、３２−５１、３３−５２、３４−５３、３５−５４、３６−５５、３７−５６、３８−５７、３９−５８、４０−５９、４１−６０、４２−６１、４３−６２、４４−６３、４５−６４、４６−６５、４７−６６、４８−６７、４９−６８、５０−６９、５１−７０、５２−７１、５３−７２、５４−７３、５５−７４、５６−７５、５７−７６、５８−７７、５９−７８、６０−７９、６１−８０、６２−８１、６３−８２、６４−８３、６５−８４、６６−８５、６７−８６、６８−８７、６９−８８、７０−８９、７１−９０、７２−９１、７３−９２、７４−９３、７５−９４、７６−９５、７７−９６、７８−９７、７９−９８、８０−９９、８１−１００の核酸塩基からなる領域のセットを記述する。
【００３９】
標的核酸塩基配列の位置１から開始する、１００個の核酸塩基の長さを有する標的配列内の、８０個の核酸塩基の長さを有する領域の更なるセットは、以下の式を用いて記述され得、
0005507617.tif 000008
また、１−８０、２−８１、３−８２、４−８３、５−８４、６−８５、７−８６、８−８７、９−８８、１０−８９、１１−９０、１２−９１、１３−９２、１４−９３、１５−９４、１６−９５、１７−９６、１８−９７、１９−９８、２０−９９、２１−１００の核酸塩基からなる領域のセットを記述する。
従って、この例では、Ａは１−８、２−９、３−１０…９３−１００、１−２０、２−２１、３−２２…８１−１００、１−８０、２−８１、３−８２…２１−１００の領域を含む。
【００４０】
前述した例のセットと、１０〜１９及び２１〜７９の長さを有する他のセットとの和集合は、数式
0005507617.tif 000009
を用いて記述することができる。
【００４１】
式中、
0005507617.tif 000010
は全セットの全メンバーを組み合わせて得られるセットの和集合を表す。
本願明細書に記載する数式は、任意長Ｌを有する標的核酸塩基配列中の全ての可能な標的領域を定義する。ここで領域の長さはｍであり、ｍは８個以上かつ８０個以下の核酸塩基長を有し、またｍはＬより小さく、ｎはＬ−ｍ＋１より小さい。
【００４２】
ｍＲＮＡの機能を妨げる総合的効果は、ＳＴＡＴ３の発現を調節する。本発明の文脈において、「調節」とは阻害又は刺激のいずれか、即ち発現を低下させるか、又は増加させることを意味する。調節は、例えばｍＲＮＡ発現のノーザンブロットアッセイ、又は本願明細書の実施例にて教授される逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、又はタンパク質発現のウエスタンブロット若しくはＥＬＩＳＡアッセイ、又はタンパク質発現の免疫沈降アッセイのような慣例的方法によって測定することができる。細胞増殖又は腫瘍細胞増殖上の効果も、本願明細書の実施例に教授されるように測定することができる。目下の例においては、阻害が好ましい。
【００４３】
よく知られているオリゴヌクレオチドのアンチセンス効果に加え、少なくとも一つのホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチド類似体は、局所免疫応答の刺激を誘発できることが見出されている。このことは米国特許第５、６６３、１５３号に記載されており、その全容は参照して本願明細書に組み入れられる。この免疫刺激効果は、これらオリゴヌクレオチド類似体が所有し得るアンチセンス効果のいずれとも関連しないものと想定される。これらオリゴヌクレオチド類似体は、単独で、又は例えばその効力を増大させる特に抗感染薬及び抗癌薬薬物のような薬物、及び外科的処置のような他の治療様式と組み合わせて、免疫賦活薬として有用である。また、あるアンチセンスオリゴヌクレオチドが既に所有する抗感染及び抗癌効果は、そのような免疫刺激を介して向上される。
【００４４】
少なくとも一つのホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチド類似体は、全身性又は体液免疫応答の刺激を誘発するために使用され得る。従って、これらオリゴヌクレオチドは、単独又は他の治療様式と組み合わせて、抗体応答の免疫賦活薬としても有用である。このことは、米国特許第５、６６３、１５３号に記載されている。
【００４５】
従って、現在、ＳＴＡＴ３を標的とするオリゴヌクレオチドのアンチセンス効果に加えて、少なくとも一つのホスホロチオエートのバックボーン連鎖を有するオリゴヌクレオチドは、ＳＴＡＴ３のシグナル伝達のドミナントネガティブな阻害剤によって既に観察されている抗腫瘍「バイスタンダー効果」に追加され得る免疫応答を引き出す際に有用であり得ると想定されている（Ｎｉｕ等、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、１９９９、５９、５０５９−５０６３）。この効果は、残存腫瘍細胞の殺滅に関与し得る急性及び慢性炎症細胞による腫瘍浸潤に関係していると信じられている。従って、ＳＴＡＴ３を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの治療的効果は、そのオリゴヌクレオチド自体の免疫刺激特性によって増強され得る。これに代わって、ＳＴＡＴ３を標的とし得ないが、少なくとも一つのホスホロチオエートバックボーン連鎖を有するオリゴヌクレオチドを、アンチセンス又は他のＳＴＡＴ３の阻害剤との組合せにおいて補助剤として使用し得る。
【００４６】
本発明のオリゴヌクレオチドは、診断、治療、予防、及び研究用の試薬として、及びキット中で使用することができる。本発明のオリゴヌクレオチドはＳＴＡＴ３をコードする核酸にハイブリダイズするため、この事実を利用したサンドイッチ、非色及び他のアッセイを容易に構成することができる。オリゴヌクレオチドのＳＴＡＴ３遺伝子又はｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションを検出する手段の調製は、慣習的に行うことができる。その調製には、酵素結合、放射標識、又は任意の他の適切な検出システムが含まれる。ＳＴＡＴ３の存在又は不在を検出するキットを調製することもできる。
【００４７】
本発明はまた、関節リウマチのような炎症性疾患、又は乳癌、脳腫瘍、又は頭部及び頸部の癌、メラノーマ(黒色腫)、骨髄腫、白血病及びリンパ腫のような癌を疑われる患者由来の組織若しくは他の標本中の異常な炎症状態、又は特定の癌の診断にも適している。本発明を用いて多数のアッセイを考案し得る。これらアッセイは通常、阻害を検出及び通常定量可能なように選択された条件下で、組織標本を本発明のオリゴヌクレオチドと接触させることを含む。本発明の文脈では、組織又は細胞をオリゴヌクレオチド（一つ又は複数）と「接触」させるとは、インビトロ又はエクスビボにて、通常液体担体であるオリゴヌクレオチド（一つ又は複数）を、細胞懸濁液又は組織標本に添加するか、又はオリゴヌクレオチド（一つ又は複数）を動物の細胞又は組織に対して投与することを意味する。
【００４８】
本発明のオリゴヌクレオチドはまた、研究目的に使用され得る。このように、オリゴヌクレオチドが示す特異的なハイブリダイゼーションは、当業者が認識し得る及び他の方法体系に使用され得る。
【００４９】
本発明の文脈において、用語「オリゴヌクレオチド」は、リボ核酸又はデオキシリボ核酸のオリゴマー又はポリマーを意味する。この用語には、天然に存在する核酸塩基、糖類及び共有結合する糖間（バックボーン）連鎖から構成されているオリゴヌクレオチドと、同様に機能する天然に存在しない部分を有するオリゴヌクレオチドとが含まれる。このような修飾又は置換オリゴヌクレオチドは、例えば細胞取り込みの向上、標的への結合の向上、及びヌクレアーゼ存在下での安定性の向上のような所望の特性により、天然型よりも好ましい場合が多い。
【００５０】
本発明によるアンチセンス化合物は、約８〜８０個の核酸塩基（即ち、約８〜８０個の結合したヌクレオシド）からなることが好ましい。当業者は本発明が８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、又は８０個の核酸塩基長の化合物を具体化することを理解するであろう。
【００５１】
一実施態様において、本発明のアンチセンス化合物は１２〜５０の核酸塩基長を有する。一当業者は、本実施態様の化合物が１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０の核酸塩基長を有することを理解するであろう。
【００５２】
一実施態様において、本発明のアンチセンス化合物は１３〜４０の核酸塩基長を有する。一当業者は、本実施態様の化合物が１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０の核酸塩基長を有することを理解するであろう。
【００５３】
別の一実施態様において、本発明のアンチセンス化合物は１５〜３０の核酸塩基長を有する。一当業者は本実施態様の化合物が１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０の核酸塩基長を有することを理解するであろう。
【００５４】
一実施態様において、本発明のアンチセンス化合物は１９〜２５個の核酸塩基長を有する。一当業者によって１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５の核酸塩基長を有する化合物が具体化されることが理解されるであろう。
【００５５】
別の一実施態様において、本発明のアンチセンス化合物は１９〜２１個の核酸塩基長を有する。一当業者によって１９、２０又は２１の核酸塩基長を有する化合物が具体化されるこということが理解されるであろう。
本願明細書に使用されている用語「オリゴマー化合物」は、実質的に核酸ベースの単量体からなる高分子化合物として定義する。オリゴマー化合物には、オリゴヌクレオチド、及びその類似体、疑似体又は模倣体が含まれる。
【００５６】
アンチセンス化合物の好ましい形態は、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであるが、多くの種において例えば二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子のような二本鎖構造の導入によって、遺伝子又はそれに関連する遺伝子産物の機能の、アンチセンス仲介による強力かつ特異的な低下が誘導されることが見出されている。この現象は植物及び動物の両方にて発生し、ウイルス防御及びトランスポゾンのサイレンシングと進化的に関係があると信じられている。
【００５７】
ｄｓＲＮＡが動物において遺伝子サイレンシングを生じ得ることの最初の証拠は、１９９５年の、線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ（Ｇｕｏ及びＫｅｍｐｈｅｕｓ、Ｃｅｌｌ、１９９５、８１、６１１−６２０）の研究にて示された。Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ等は、ｄｓＲＮＡの最初の干渉効果は転写後であることを示した（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９８、９５、１５５０２−１５５０７）。以来、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）に対する暴露から生じるＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ中にて明らかにされた転写後アンチセンス機構は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と称されている。この用語は、内因的に標的とされたｍＲＮＡレベルの配列特異的な低下を誘導するｄｓＲＮＡの導入に関係した、アンチセンス仲介遺伝子サイレンシングを意味するよう一般化された（Ｆｉｒｅ等、Ｎａｔｕｒｅ、１９９８、３９１、８０６−８１１）。最近、ｄｓＲＮＡのアンチセンス極性を有する一本鎖ＲＮＡオリゴマーは、実際に、ＲＮＡｉの強力な誘導物質であることが証明されている（Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００２、２９５、６９４−６９７）。これら二本鎖ＲＮＡ分子を使用してＳＴＡＴ３の発現を標的とし、また阻害することも想定される。二本鎖ＲＮＡ分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチドが標的とする領域と同様の領域を標的とし、同様の効果を呈する。二本鎖ＲＮＡ分子は、通常１９〜２１個の塩基対の長さを有するが、８〜５０個の核酸塩基の長さ範囲に亘り得る。ｓｉＲＮＡ分子の作成を、一般的な意味において以下の実施例に記載するが、ＳＴＡＴ３を標的とする任意の所望のｓｉＲＮＡが従来のオリゴヌクレオチド合成法により合成され得ることを認識されよう。アンチセンス鎖の配列が分かれば、相補的なセンス鎖が合成される。その後、センス及びアンチセンス鎖を組み合わせて、ｓｉＲＮＡを形成する。
【００５８】
（オリゴマー及びモノマーの修飾）
公知のように、ヌクレオシドは塩基と糖との組合せである。ヌクレオシドの塩基部分は通常、複素環塩基である。この複素環塩基の最も普遍的なクラスはプリン及びピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基を更に含むヌクレオシドである。ペントフラノシルを含むヌクレオシドに関しては、リン酸基は糖の２’、３’又は５’のいずれかのヒドロキシル部分に結合し得る。オリゴヌクレオチドを形成する際、リン酸基は隣接するヌクレオシド同士を互いに共有結合して線状の高分子化合物を形成する。続いて、この線状高分子化合物の各末端は更に連結されて、環状化合物を形成し得るが、一般に線状化合物が好ましい。更に、線状化合物は内部の核酸塩基層相補正性を有する場合があり、従って完全に又は部分的に二本鎖の化合物を生成するように折り重なり得る。リン酸基は、通常、オリゴヌクレオチド内でヌクレオシド間結合を形成するか、又は糖と共にオリゴヌクレオチドのバックボーンを形成する。ＲＮＡ及びＤＮＡのバックボーンを形成する通常のヌクレオシド間結合は、３’−５’ホスホジエステル結合である。
【００５９】
（修飾ヌクレオシド間結合）
本発明に有用な、好ましいアンチセンスオリゴマー化合物の特定の例としては、修飾された、例えば天然に存在しないヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドがある。本明細書に定義されるように、修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドは、リン原子を保持するヌクレオシド間結合と、リン原子を有さないヌクレオシド間結合とを含む。本明細書の、及び当該技術分野にて時折引用されるように、ヌクレオシドのバックボーン内にリン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチドも、オリゴヌクレオチドであると見なされ得る。
【００６０】
Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ系では、ヌクレオチド間結合の修飾（ホスホロチオエート）はＲＮＡｉ活性に対して有意に干渉しなかった。その観察に基づき、本発明のある好ましいオリゴマー化合物は、一つ又は二つ以上の修飾ヌクレオシド間結合も含み得ることが示唆される。好ましい硫黄含有修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートのヌクレオシド間結合である。
【００６１】
内部にリン原子を含む好ましい修飾オリゴヌクレオチドのバックボーンは、例えばホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含むメチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、通常の３’−５’結合を有するチオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート及びボラノホスフェート、２’−５’結合を有するこれらの類似体、及び一つ又は二つ以上のヌクレオチド間結合が３’−３’、５’−５’、２’−２’結合である逆転した極性を有するものを含む。逆転極性を有する好ましいオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド間結合の最も３’側に一つの３’−３’結合、即ち一つの逆位ヌクレオシド残基を有し、該ヌクレオシド残基は脱塩基（核酸塩基が存在しないか、又はその位置に水酸基が存在する）であり得る。様々な塩、混合塩、及び遊離酸の形態も含まれる。
【００６２】
上記のリン含有結合の調製を教授する代表的な米国特許は、米国特許第３、６８７、８０８号、米国特許第４、４６９、８６３号、米国特許第４、４７６、３０１号、米国特許第５、０２３、２４３号、米国特許第５、１７７、１９６号、米国特許第５、１８８、８９７号、米国特許第５、２６４、４２３号、米国特許第５、２７６、０１９号、米国特許第５、２７８、３０２号、米国特許第５、２８６、７１７号、米国特許第５、３２１、１３１号、米国特許第５、３９９、６７６号、米国特許第５、４０５、９３９号、米国特許第５、４５３、４９６号、米国特許第５、４５５、２３３号、米国特許第５、４６６、６７７号、米国特許第５、４７６、９２５号、米国特許第５、５１９、１２６号、米国特許第５、５３６、８２１号、米国特許第５、５４１、３０６号、米国特許第５、５５０、１１１号、米国特許第５、５６３、２５３号、米国特許第５、５７１、７９９号、米国特許第５、５８７、３６１号、米国特許第５、１９４、５９９号、米国特許第５、５６５、５５５号、米国特許第５、５２７、８９９号、米国特許第５、７２１、２１８号、米国特許第５、６７２、６９７号及び米国特許第５、６２５、０５０号を含むが、これらに限定されるものではなく、またこれら各々は参照して本願明細書に組み入れられる。
【００６３】
本発明のより好ましい実施態様において、オリゴマー化合物は一つ又は二つ以上のホスホロチオエート及び／又はヘテロ原子ヌクレオシド間結合、特に−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−（メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩバックボーンとして公知である）、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−及び−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−（本来のホスホジエステルヌクレオチド間結合は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−ＣＨ２−で表される）を有する。ＭＭＩ型のヌクレオシド間結合は、上記に引用した米国特許第５、４８９、６７７号に開示されている。好ましいアミドヌクレオシド間結合は、上記に引用した米国特許第５、６０２、２４０号に開示されている。
【００６４】
内部にリン原子を含まない好ましい修飾オリゴヌクレオチドバックボーンは、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子、及びアルキル若しくはシクロアルキルのヌクレオシド間結合、又は一つ若しくは二つ以上の短鎖ヘテロ原子若しくは複素環のヌクレオシド間結合で形成されたバックボーンを有する。これらには、モルホリノ結合（一部がヌクレオシドの糖部分から形成された）、シロキサンバックボーン、スルフィド、スルホキシド及びスルホンのバックボーン、ホルムアセチル及びチオホルムアセチルのバックボーン、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチルのバックボーン、リボアセチルバックボーン、アルケン含有バックボーン、スルファメートバックボーン、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノのバックボーン、スルホネート及びスルホンアミドのバックボーン、アミドバックボーン、及び他の混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２構成部分を有するものが含まれる。
【００６５】
上記のオリゴヌクレオシドの調製を教授する代表的な米国特許は、米国特許第５、０３４、５０６号、米国特許第５、１６６、３１５号、米国特許第５、１８５、４４４号、米国特許第５、２１４、１３４号、米国特許第５、２１６、１４１号、米国特許第５、２３５、０３３号、米国特許第５、２６４、５６２号、米国特許第５、２６４、５６４号、米国特許第５、４０５、９３８号、米国特許第５、４３４、２５７号、米国特許第５、４６６、６７７号、米国特許第５、４７０、９６７号、米国特許第５、４８９、６７７号、米国特許第５、５４１、３０７号、米国特許第５、５６１、２２５号、米国特許第５、５９６、０８６号、米国特許第５、６０２、２４０号、米国特許第５、６１０、２８９号、米国特許第５、６０２、２４０号、米国特許第５、６０８、０４６号、米国特許第５、６１０、２８９号、米国特許第５、６１８、７０４号、米国特許第５、６２３、０７０号、米国特許第５、６６３、３１２号、米国特許第５、６３３、３６０号、米国特許第５、６７７、４３７号、米国特許第５、７９２、６０８号、米国特許第５、６４６、２６９号及び米国特許第５、６７７、４３９号を含むが、これらに限定されるものではなく、またこれら各々は参照して本願明細書に組み入れられる。
【００６６】
（オリゴヌクレオチド模倣体）
本発明の別の一化合物群は、オリゴヌクレオチド模倣体を含む。オリゴヌクレオチドに適用される用語「模倣体」は、フラノース環のみ、又はフラノース環及びヌクレオチド間結合の双方が、新規な基で代替されているオリゴマー化合物を含むことを意図し、フラノース環のみの代替は、当該技術分野にて糖代用物（ｓｕｇａｒ  ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）とも称されている。複素環塩基部分又は修飾複素環塩基部分は、適当な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために保持されている。このようなオリゴマー化合物の一つである、卓越したハイブリダイゼーション特性を有することが証明されているオリゴヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称されている。ＰＮＡオリゴマー化合物にて、オリゴヌクレオチドの糖バックボーンは、アミド含有バックボーン、詳細にはアミノエチルグリシンのバックボーンで代替されている。核酸塩基は保持され、バックボーンのアミド部分のアザ窒素原子に対して直接的又は間接的に結合している。ＰＮＡオリゴマー化合物の調製を教授する代表的な米国特許は、米国特許第５、５３９、０８２号、米国特許第５、７１４、３３１号、及び米国特許第５、７１９、２６２号を含むが、これらに限定されるものではなく、またこれら各々は参照して本願明細書に組み入れられる。ＰＮＡオリゴマー化合物の更なる教授は、Ｎｉｅｌｓｅｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１、２５４、１４９７−１５００に見出すことができる。
【００６７】
卓越したハイブリダイゼーション特性を有すると報告されているオリゴヌクレオチド模倣体の一つは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＰＮＡ化合物のバックボーンは、結合した二つ又は三つ以上のアミノエチルグリシン単位からなり、これはＰＮＡにアミド含有バックボーンを付与する。バックボーンのアミド部分のアザ窒素原子に対して複素環塩基部分が直接的に、又は間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の調製について教授する代表的な米国特許は、米国特許第５、５３９、０８２号、及び米国特許第５、７１９、２６２号を含むが、これらに限定されるものではなく、またこれら各々は参照して本願明細書に組み入れられる。ＰＮＡ化合物の更なる教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９１、２５４、１４９７−１５００に見出すことができる。
【００６８】
基本のＰＮＡ構造が最初に調製されて以来、ＰＮＡは非常に多くの修飾部を組み込むよう修飾されてきた。基本構造を以下に示す。
0005507617.tif 000011
式中、
Ｂｘは、複素環塩基部分であり、
Ｔ４は水素、アミノ保護基、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、置換又は非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、置換又は非置換Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、置換又は非置換Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、化学官能基、レポーター基、共役基、α−カルボキシル基を介して結合したＤ若しくはＬα−アミノ酸、又は任意にて、アミノ酸がアスパラギン酸若しくはグルタミン酸の場合にω−カルボキシル基を介して結合したＤ若しくはＬα−アミノ酸、又はカルボキシル基を介して結合したＤ、Ｌ若しくはＤ及びＬアミノ酸の混合物から誘導されたペプチドであり、ここで置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルから選択され、
【００６９】
Ｔ５は、−ＯＨ、−Ｎ（Ｚ１）Ｚ２、Ｒ５、α−アミノ基を介して結合したＤ若しくはＬα−アミノ酸、又は任意にて、アミノ酸がリジン若しくはオルニチンの場合にω−アミノ基を介して結合したＤ若しくはＬα−アミノ酸、又はカルボキシル基を介して結合したＤ、Ｌ若しくはＤ及びＬアミノ酸の混合物から誘導されたペプチド、化学官能基、レポーター基、又は共役基であり、
Ｚ１は、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、又はアミノ保護基であり、
【００７０】
Ｚ２は、水素、Ｃ１−Ｃ６アルキル、アミノ保護基、−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｊ−Ｚ３、α−カルボキシル基を介して結合したＤ若しくはＬα−アミノ酸、又は任意にて、アミノ酸がアスパラギン酸若しくはグルタミン酸の場合にω−カルボキシル基を介して結合したＤ若しくはＬα−アミノ酸、又はカルボキシル基を介して結合したＤ、Ｌ若しくはＤ及びＬアミノ酸の混合物から誘導されたペプチドであり、
Ｚ３は、水素、アミノ保護基、−Ｃ１−Ｃ６アルキル、−Ｃ（＝Ｏ）−ＣＨ３、ベンジル、ベンゾイル、又は−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（Ｈ）Ｚ１であり、
各Ｊは、Ｏ、Ｓ又はＮＨ−であり、
Ｒ５はカルボニル保護基であり、そして
ｎは、２〜約５０である。
【００７１】
研究されているオリゴヌクレオチド模倣体の別のクラスは、結合したモルホリノ単位（モルホリノ核酸）を基本とし、同モルホリノ単位はモルホリノ環に結合した複素環塩基を有する。モルホリノ核酸内のモルホリノモノマー単位を結合する多数の結合基が報告されている。非イオン性オリゴマー化合物を形成するために、結合基の好ましいクラスが選択されている。非イオン性のモルホリノベースのオリゴマー化合物は、細胞タンパク質と望ましくない相互作用を起こさないと思われる。
【００７２】
モルホリノベースのオリゴマー化合物は、細胞タンパク質と望ましくない相互作用を起こさないと思われ、オリゴヌクレオチドの非イオン性疑似体である（Ｄｗａｉｎｅ  Ａ．Ｂｒａａｓｃｈ及びＤａｖｉｄ  Ｒ．Ｃｏｒｅｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００２、４１（１４）、４５０３−４５１０）。
【００７３】
モルホリノベースのオリゴマー化合物は、１９９１年７月２３日発行の米国特許第５、０３４、５０６号に開示されている。オリゴマー化合物のモルホリノ種は、モノマーサブユニットを結合する多様な異なる結合基を有するように調製されている。
モルホリノ核酸は、モノマーサブユニットを結合する多様な異なる結合基（Ｌ２）を有するように調製されている。基本の式を以下に示す。
0005507617.tif 000012
式中、
Ｔ１は、ヒドロキシル又は保護されたヒドロキシルであり、
Ｔ５は、水素又はリン酸若しくはリン酸誘導体であり、
Ｌ２は、結合基であり、そして
ｎは、２〜約５０である。
【００７４】
オリゴヌクレオチド模倣体の更なるクラスは、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）と称される。通常ＤＮＡ／ＲＮＡ分子内に存在するフラノース環は、シクロヘニル環で代替されている。ＣｅＮＡＤＭＴ保護ホスホロアミデートモノマーが調製されており、古典的なホスホロアミデート化学に従ってオリゴマー化合物の合成に使用される。完全に修飾されたＣｅＮＡオリゴマー化合物、及び特定の位置がＣｅＮＡで修飾されたオリゴヌクレオチドが調製かつ研究されている（Ｗａｎｇ等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２０００、１２２、８５９５−８６０２参照）。一般に、ＣｅＮＡモノマーをＤＮＡ鎖に組み込むと、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの安定性が高まる。ＣｅＮＡオリゴアデニレートは、ＲＮＡ及びＤＮＡ補完と複合体を形成する本来の複合体に同様の安定性を有するする。天然の核酸構造にＣｅＮＡ構造を組み込む研究は、ＮＭＲ及び円二色性分光法により、立体配座の容易な適合性の下で進行することが示された。更にＣｅＮＡを標的ＲＮＡ配列内への組み込みは、血清に対して安定性を示し、Ｅ．ＣｏｌｉＲＮａｓｅを活性化して標的ＲＮＡ鎖を切断する。
【００７５】
ＣｅＮＡの一般式を以下に示す。
0005507617.tif 000013
式中、
各Ｂｘは、複素環塩基部分であり、
Ｔ１は、ヒドロキシル又は保護されたヒドロキシルであり、そして
Ｔ２は、ヒドロキシル又は保護されたヒドロキシルである。
【００７６】
オリゴヌクレオチド模倣体の別の一種（アンヒドロヘキシトール核酸）は、一つ又は二つ以上のアンヒドロヘキシトールヌクレオシドから調製され得（Ｗｏｕｔｅｒｓ及びＨｅｒｄｅｗｉｊｎ、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、１９９９、９、１５６３−１５６６参照）、一般式
0005507617.tif 000014
を有すると思われる。
【００７７】
更なる好ましい修飾には、糖環の４’炭素原子に２’−ヒドロキシル基が結合して２’−Ｃ、４’−Ｃ−オキシメチレン結合を形成し、それにより二環式糖部分を形成している、Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）が含まれる。結合は２’酸素原子と４’炭素原子を架橋するメチレン（−ＣＨ２−）ｎ基が好ましく、ここでｎは１又は２である（Ｓｉｎｇｈ等、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９９８、４、４５５−４５６）。ＬＮＡ及びＬＮＡ類似体は、相補的なＤＮＡ及びＲＮＡと共に非常に高い二重鎖熱安定性（Ｔｍ＝＋３〜＋１０℃）、３’−エキソヌクレオリティックな（ｅｘｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ）分解に対する安定性、及び良好な溶解特性を示す。二環式の環系を有するＬＮＡの塩基構造を、以下に示す。
0005507617.tif 000015
【００７８】
２ＤＮＭＲ分光法で測定したＬＮＡの立体配座において、ロックされたＬＮＡヌクレオチドの向きは、一本鎖及び二本鎖ＬＮＡの双方とも、リン酸バックボーンがより高度のＮ型立体配座固体群を導入するように仕向けている（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．、２０００、１３、４４−５３）。これらの配座は、改善された核酸塩基の積み重ねと関連している（Ｗｅｎｇｅｌ等、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９９、１８、１３６５−１３７０）。
【００７９】
ＬＮＡは、極めて安定したＬＮＡ：ＬＮＡ二重鎖を形成することが示されている（Ｋｏｓｈｋｉｎ等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９８、１２０、１３２５２−１３２５３）。ＬＮＡ：ＬＮＡハイブリダイゼーションは、最も熱的に安定な核酸タイプの二重鎖システムであることが示され、ＬＮＡのＲＮＡ疑似性が二重鎖レベルで確立された。３つのＬＮＡモノマーの導入（Ｔ又はＡ）により、ＤＮＡ相補体に向けて融点が有意に上昇した。ＬＮＡ仲介ハイブリダイゼーションの普遍性は、極めて安定なＬＮＡ：ＬＮＡ二重鎖の形成によって増強されている。ＬＮＡのＲＮＡ疑態は、モノマーのＮ−型立体配座の制限、及びＬＮＡ：ＲＮＡ二重鎖の二次構造の結果としてもたらされた。
【００８０】
ＬＮＡはまた、相補的なＤＮＡ、ＲＮＡ又はＬＮＡと、高い熱親和性を有する二重鎖を形成する。円二色（ＣＤ）スペクトルでは、完全修飾ＬＮＡを含む二重鎖（特に、ＬＮＡ：ＲＮＡ）は、Ａ−型ＲＮＡ：ＲＮＡ二重鎖と構造的に類似することが示される。ＬＮＡ：ＤＮＡ二重鎖の核磁気共鳴（ＮＭＲ）検査では、ＬＮＡモノマーの３’末端の立体配座を確認した。ＬＮＡによるストランドインベージョン（ｓｔｒａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｏｎ）を示唆する二本鎖ＤＮＡも認められた。ミスマッチ配列の研究では、ＬＮＡはワトソン−クリック型の塩基対法則に従い、対応する未修飾基準鎖と比較して選択性が向上されていることが示される。
【００８１】
ＬＮＡオリゴマー化合物の新規な型、及びＬＮＡは、幅広い診断的及び治療的用途にて有用である。中でも、アンチセンス用途、ＰＣＲ用途、鎖置換オリゴマー、核酸ポリメラーゼのための基質、及び概してヌクレオチドを基板とする薬物として有用である。ＬＮＡを含む強力かつ無毒なアンチセンスオリゴヌクレオチドに記載なされている（Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２０００、９７、５６３３−５６３８）。著者等は、ＬＮＡがアンチセンス薬剤にいくつかの望ましい性質を付与することを示している。ＬＮＡ／ＤＮＡコポリマーは、血清及び細胞抽出物中で容易に分解されない。ＬＮＡ／ＤＮＡコポリマーは、生きたラットの脳におけるＧタンパク共役受容体シグナル伝達と、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおけるレポーター遺伝子の検出ほどにアッセイ系内で異なる強力なアンチセンス活性を示した。ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）に仲介される、ＬＮＡの生きているヒト肺癌細胞内への送達も達成されている。
【００８２】
ＬＮＡモノマーであるアデニン、シトシン、グアニン、５’−メチル−シトシン、チミン及びウラシルの合成及び調製は、それらのオリゴマー化、及び核酸認識特性と共に、記述されている（Ｋｏｓｈｋｉｎ等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９９８、５４、３６０７−３６３０）。ＬＮＡ及びその調製は、国際特許出願公開第ＷＯ９８／３９３５２号及び国際特許出願公開第ＷＯ９９／１４２２６号にも記述されている。
【００８３】
ＬＮＡの第一の類似体、ホスホロチオエートＬＮＡ及び２’−チオ−ＬＮＡが調製されている（Ｋｕｍａｒ等、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、１９９８、８、２２１９−２２２２）。核酸ポリメラーゼのための、基質としてオリゴデオキシリボヌクレオチド二重鎖を含むロックされている（ｌｏｃｋｅｄ）ヌクレオチド類似体の調製も、記述されている（Ｗｅｎｇｅｌ等、国際特許出願公開第ＷＯ９８−ＤＫ３９３１９９８０９１４号）。更に、立体配座的に制限された、柄（ｈａｎｄｌｅ）を伴う高親和性オリゴヌクレオチド類似体である２’−アミノ−ＬＮＡの合成は、当該技術分野にて記述されている（Ｓｉｎｇｈ等、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、１９９８、６３、１００３５−１００３９）。加えて、２’−アミノ−及び２’−メチルアミノ−ＬＮＡも調製されており、相補的なＲＮＡ及びＤＮＡ鎖とのそれらの二重鎖の熱安定性については、以前に報告されている。
【００８４】
式（アミダイトモノマーを示す）
0005507617.tif 000016
を有する二環及び三環ヌクレオシド類似体を含む、更なるオリゴヌクレオチド模倣体も調製されている（Ｓｔｅｆｆｅｎｓ等、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９９７、８０、２４２６−２４３９、Ｓｔｅｆｆｅｎｓ等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９９、１２１、３２４９−３２５５、及びＲｅｎｎｅｂｅｒｇ等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２００２、１２４、５９９３−６００２参照）。これら修飾オリゴヌクレオシド類似体はホスホロアミデート手法を用いてオリゴマー化され、得られた三環ヌクレオシドを含むオリゴマー化合物は、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びそれ自体とハイブリダイズされた場合、熱安定性（Ｔｍ）が向上することが示されている。二環ヌクレオシド類似体を含むオリゴマー化合物は、ＤＮＡ二重鎖のそれにほぼ等しい熱安定性を示している。
【００８５】
オリゴヌクレオチド模倣体の別の一種はホスホノモノエステル核酸と称され、バックボーン内にリン基を組み込んでいる。この種のオリゴヌクレオチド模倣体は、遺伝子発現抑制の分野にて、核酸検出のためのプローブとして、また分子生物学にて使用される補助物として、有用な物理的及び生物学的、並びに薬理学的特性を有することが報告されている（アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、センスオリゴヌクレオチド及び三重形成オリゴヌクレオチド）。
以下に一般式（マーカッシュ変数の定義については、全容が参照して本願明細書に組み入れられる米国特許第５、８７４、５５３号及び米国特許第６、１２７、３４６号を参照）を示す。
0005507617.tif 000017
【００８６】
別のオリゴヌクレオチド模倣体の一つが報告されており、該模倣体ではフラノシル環がシクロブチル部分に代替されている。
【００８７】
（修飾された糖）
本発明のオリゴマー化合物は、一つ又は二つ以上の置換された糖部分を含むこともできる。好ましいオリゴマー化合物は、ＯＨ、Ｆ、Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アルキル、Ｏ−、Ｓ−、又はＮ−アルケニル、Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルキニル、又はＯ−アルキル−Ｏ−アルキルから選択された糖置換基を含む。アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換又は非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキル又はＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであり得る。特にＯ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３］２が好ましく、ここでｎ及びｍは、１〜約１０である。他の好ましいオリゴヌクレオチドは、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル又はＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を改善するための基、又はオリゴヌクレオチドの薬力学的性質を改善するための基、及び同様の性質を有する他の置換基から選択された糖置換基を含む。好ましい修飾には、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−（２−メトキシエトキシ）又は２’−ＭＯＥとしても知られる２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、）（Ｍａｒｔｉｎ等、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９９５、７８、４８６−５０４）即ちアルコキシアルコキシ基がある。更なる好ましい修飾には、以下の実施例にて記述する２’−ＤＭＡＯＥとしても知られる２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、即ちＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、及び２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチル又は２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、即ち２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２がある。
【００８８】
他の好ましい糖置換基には、メトキシ（−Ｏ−ＣＨ３）、アミノプロポキシ（−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、アリル（−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、−Ｏ−アリル（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）及びフルオロ（Ｆ）がある。２’−糖置換基は、アラビノ（上）位又はリボ（下）位に存在し得る。好ましい２’−アラビノ修飾は２’−Ｆである。同様の修飾がオリゴマー化合物上の他の位置に、特に３’末端ヌクレオシド上、又は２’−５’結合されたオリゴヌクレオチド内の糖の３’位、及び５’末端ヌクレオチドの５’位になされ得る。オリゴマー化合物は、ペントフラノシル糖に代わって例えばシクロブチル部分のような糖模倣体も含み得る。これら修飾された糖構造の調製を教授する代表的な米国特許は、米国特許第４、９８１、９５７号、米国特許第５、１１８、８００号、米国特許第５、３１９、０８０号、米国特許第５、３５９、０４４号、米国特許第５、３９３、８７８号、米国特許第５、４４６、１３７号、米国特許第５、４６６、７８６号、米国特許第５、５１４、７８５号、米国特許第５、５１９、１３４号、米国特許第５、５６７、８１１号、米国特許第５、５７６、４２７号、米国特許第５、５９１、７２２号、米国特許第５、５９７、９０９号、米国特許第５、６１０、３００号、米国特許第５、６２７、０５３号、米国特許第５、６３９、８７３号、米国特許第５、６４６、２６５号、米国特許第５、６５８、８７３号、米国特許第５、６７０、６３３号、米国特許第５、７９２、７４７号、及び米国特許第５、７００、９２０号を含むが、これらに限定されるものではなく、またこれら各々は参照して本願明細書に組み入れられる。
【００８９】
更なる代表的な糖置換基には、式Ｉａ又は式ＩＩａの基がある。
0005507617.tif 000018
式中、
Ｒｂは、Ｏ、Ｓ又はＮＨであり、
Ｒｄは、単結合、Ｏ、Ｓ又はＣ（＝Ｏ）であり、
Ｒｅは、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｎ（Ｒｋ）（Ｒｍ）、Ｎ（Ｒｋ）（Ｒｎ）、Ｎ＝Ｃ（Ｒｐ）（Ｒｑ）、Ｎ＝Ｃ（Ｒｐ）（Ｒｒ）又は式ＩＩＩａ
0005507617.tif 000019
を有し、
Ｒｐ及びＲｑは、各々独立して、水素又はＣ１−Ｃ１０アルキルであり、
Ｒｒは、−Ｒｘ−Ｒｙであり、
Ｒｓ、Ｒｔ、Ｒｕ及びＲｖの各々は、独立して、水素、Ｃ（Ｏ）Ｒｗ、置換又は非置換のＣ１−Ｃ１０アルキル、置換又は非置換のＣ２−Ｃ１０アルケニル、置換又は非置換のＣ２−Ｃ１０アルキニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、化学官能基又は共役基であり、ここで置換基は水素、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルから選択されるか、
又は任意にて、Ｒｕ及びＲｖが一緒になって、それらが結合する窒素原子と共にフタルイミド部分を形成し、
各Ｒｗは、独立して、置換又は非置換のＣ１−Ｃ１０アルキル、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシ、アリルオキシ、９−フルオレニルメトキシ、２−（トリメチルシリル）−エトキシ、２、２、２−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソ−ブチリル、フェニル又はアリール、
Ｒｋは、水素、窒素保護基又は−Ｒｘ−Ｒｙであり、
Ｒｐは、水素、窒素保護基又は−Ｒｘ−Ｒｙであり、
Ｒｘは、結合又は結合部分であり、
Ｒｙは、化学官能基、共役基又は固体支持媒体であり、
Ｒｍ及びＲｎの各々は、独立して、Ｈ、窒素保護基、置換又は非置換のＣ１−Ｃ１０アルキル、置換又は非置換のＣ２−Ｃ１０アルケニル、置換又は非置換のＣ２−Ｃ１０アルキニルであり、ここで置換基はヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、ＮＨ３＋、Ｎ（Ｒｕ）（Ｒｖ）、グアニジノ及びアシルから選択され、ここでアシルは酸アミド又はエステルであるか、
又はＲｍ及びＲｎが一緒になって、窒素保護基であり、連結してＮ及びＯから選択される更なるへテロ原子を任意にて含む環構造を形成し、又は化学官能基であり、
Ｒｉは、ＯＲｚ、ＳＲｚ、又はＮ（Ｒｚ）２であり、
各Ｒｚは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ８アルキル、Ｃ１−Ｃ８ハロアルキル、Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ｒｕ、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒｕ又はＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒｕであり、
Ｒｆ、Ｒｇ及びＲｈは、約４〜約７個の炭素原子、又は約３〜約６個の炭素原子及び１又は２個のヘテロ原子を含む環系を構成し、ここでヘテロ原子は酸素、窒素及び硫黄から選択され、環系は脂肪族、不飽和脂肪族、芳香族、又は置換若しくは非置換の複素環であり、
Ｒｊは、１〜約１０個の炭素原子を有するアルキル又はハロアルキル、２〜約１０個の炭素原子を有するアルケニル、２〜約１０個の炭素原子を有するアルキニル、６〜約１４個の炭素原子を有するアリール、Ｎ（Ｒｋ）（Ｒｍ）ＯＲｋ、ハロ、ＳＲｋ又はＣＮであり、
ｍａは、１〜約１０であり、
各ｍｂは、独立して、０又は１であり、
ｍｃは、０又は１〜１０の整数であり、
ｍｄは、１〜１０の整数であり、
ｍｅは、０、１又は２であるが、
但しｍｃが０のとき、ｍｄは１より大きい。
【００９０】
式Ｉの代表的な置換基は、「Ｃａｐｐｅｄ  ２’−Ｏｘｙｅｔｈｏｘｙ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」と題された１９９８年８月７日出願の米国特許出願第０９／１３０９７３号に開示されており、その全容は参照して本願明細書に組み入れられる。
式ＩＩの代表的な環式置換基は、「ＲＮＡ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ２’−Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｐｒｅｏｒｇａｎｉｚｅｄ」と題された１９９８年７月２７日出願の米国特許出願第０９／１２３１０８号に開示されており、その全容は参照して本願明細書に組み入れられる。
【００９１】
特に好ましい糖置換基には、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２があり、ここでｎ及びｍは１〜約１０である。
式ＩＩＩ及び式ＩＶに示す代表的なグアニジノ置換基は、「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ」と題された１９９９年７月７日出願の共有の米国特許出願公開第０９／３４９、０４０号に開示されており、その全容は参照して本願明細書に組み入れられる。
【００９２】
代表的なアセトアミド置換基は、米国特許第６、１４７、２００号に開示されており、その全容は参照して本願明細書に組み入れられる。
代表的なジメチルアミノエチルオキシエチル置換基は、「２’−Ｏ−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌｏｘｙｅｔｈｙｌ−Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」と題された１９９９年８月６日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７８９５号に開示されており、その全容は参照して本願明細書に組み入れられる。
【００９３】
修飾された核酸塩基／天然に存在する核酸塩基
オリゴマー化合物は、核酸塩基（当該技術分野にて度々、単に「塩基」又は「複素環塩基部分」と称される）が修飾されたもの、又は置換されたものをも含み得る。本願で使用されているように、「非修飾」又は「天然」の核酸塩基には、プリン塩基のアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）が含まれる。本願明細書にて複素環塩基部分とも称される修飾核酸塩基は、例えば５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、６−メチル及びアデニン及びグアニンの他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニル（−ＣＣ−ＣＨ３）ウラシル及びシトシン並びにピリミジン塩基の他のアルキル誘導体、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン及び３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンのような他の合成及び天然核酸塩基を含む複素環塩基部分も指す。
【００９４】
複素環塩基部分には、プリン又はピリミジン塩基が、例えば７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン及び２−ピリドンのような他の複素環で代替されたものも含まれる。更なる核酸塩基は、米国特許第３、６８７、８０８号に開示されたもの、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、８５８−８５９ページ、Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ、Ｊ．Ｉ．、ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、１９９０に開示されたもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ等、Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、１９９１、３０、６１３に開示されたもの、Ｓａｎｇｈｖｉ、Ｙ．Ｓ．、Ｃｈａｐｔｅｒ１５、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、２８９−３０２ページ、Ｃｒｏｏｋｅ、Ｓ．Ｔ．及びＬｅｂｌｅｕ、Ｂ．、ｅｄ．、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９３に開示されたものを含む。これら核酸塩基のあるものは、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を向上させるために特に有用である。それらには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、並びに２−アミノプロピル−アデニン、５−プロピニルウラシル及び５−プロピニルシトシンを含むＮ−２、Ｎ−６及びＯ−６置換プリンが含まれる。５−メチルシトシン置換は、核酸の二重鎖の安定性を０．６〜１．２℃だけ上昇させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ、Ｙ．Ｓ．、Ｃｒｏｏｋｅ、Ｓ．Ｔ．及びＬｅｂｌｅｕ、Ｂ．、ｅｄｓ．、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、１９９３、ｐｐ．２７６−２７８）、現在、特に２’−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わせて更に好ましい塩基置換である。
【００９５】
本発明の一局面にて、オリゴマー化合物は、一つ又は二つ以上の複素環塩基部分の代わりに多環式複素環化合物を有するよう調製される。これ迄、多数の三環式複素環化合物が報告されてきた。これらの化合物は、修飾された鎖の標的の鎖への結合特性を向上させるために、アンチセンス用途にて慣例的に使用されている。最も研究された修飾はグアノシンを標的とし、そのためにＧ−クランプ又はシチジン類似体と称されている。これらの多環式複素環化合物の多数は、一般式
0005507617.tif 000020
を有する。
【００９６】
第二の鎖内のグアノシンと３つの水素結合を形成する代表的なシトシン類似体は、１、３−ジアザフェノキサジン−２−オン（Ｒ１０＝Ｏ、Ｒ１１−Ｒ１４＝Ｈ）［Ｋｕｒｃｈａｖｏｖ、等、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９７、１６、１８３７−１８４６］、１、３−ジアザフェノチアジン−２−オン（Ｒ１０＝Ｓ、Ｒ１１−Ｒ１４＝Ｈ）、［Ｌｉｎ、Ｋ．−Ｙ．、Ｊｏｎｅｓ、Ｒ．Ｊ．、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、Ｍ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９５、１１７、３８７３−３８７４］及び６、７、８、９−テトラフルオロ−１、３−ジアザフェノキサジン−２−オン（Ｒ１０＝Ｏ、Ｒ１１−Ｒ１４＝Ｆ）［Ｗａｎｇ、Ｊ．、Ｌｉｎ、Ｋ．−Ｙ．、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、Ｍ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９８、３９、８３８５−８３８８］を含む。オリゴヌクレオチド内に組み込まれ、これら塩基修飾は相補的なグアニンとハイブリダイズすることが示されており、該グアニンはアデニンとハイブリダイズし、また積み重ね相互作用が拡大する結果、螺旋の熱安定性が向上されることも示された（“Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ”と題された２００２年５月２４日出願の米国特許出願第１０／１５５、９２０号、及び「Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」と題された２００２年５月２４日出願の米国特許出願第１０／０１３、２９５号も参照。これら両方はその全容が参照して本願明細書に組み入れられる）。
【００９７】
シトシン類似体／置換が、堅い１、３−ジアザ−フェノキサジン−２−オン骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄ）（Ｒ１０＝Ｏ、Ｒ１１＝−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ２、Ｒ１２−１４＝Ｈ）に結合したアミノエトキシ部分を有する場合、更なる螺旋構造の安定化特性が観察されている［Ｌｉｎ、Ｋ．−Ｙ．、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、Ｍ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８、１２０、８５３１−８５３２］。結合の研究により、単一の組込みがモデルオリゴヌクレオチドの、その相補的な標的ＤＮＡ又はＲＮＡに対する結合親和性を、５−メチルシトシン（ｄＣｍｅ）に関して１８°迄のΔＴｍをもって向上させることが示され、これは周知の単一修飾による親和性向上のうちで尚最も高い。その一方、螺旋構造安定性の獲得によって、オリゴヌクレオチドの特異性は損われない。Ｔｍのデータは、ｄＣ５ｍｅと比較して、完全一致配列とミスマッチ配列との間で大きな違いがあることを示す。繋いだアミノ基が更なる水素結合ドナーとして働き、相補的なグアニンのＨｏｏｇｓｔｅｅｎ面、即ち０６と相互作用して、４つの水素結合を形成することが示唆される。このことは、Ｇ−クランプの増大された親和性が、拡大された塩基の積み重ねと、更なる特定の水素結合との組合せによって仲介されていることを意味する。
【００９８】
本発明に従った更なる三環式複素環化合物、及びそれらを使用する方法は、２０００年５月２２発行の米国特許第６、０２８、１８３号、及び米国特許第６、００７、９９２号に開示されており、その全容は本願明細書に組み入れられる。
【００９９】
フェノキサジン誘導体の結合親和力の増大と、その損なわれていない配列特異性とは、フェノキサジン誘導体をより強力なアンチセンスベースの薬物の開発のための価値ある核酸塩基にする。事実、フェノキサジン置換体を含むヘプタヌクレオチドは、ＲＮａｓｅＨを活性化し、細胞取り込みを向上させ、アンチセンス活性を増大させることが可能であるという、インビトロでの実験からの将来有望なデータが得られている［Ｌｉｎ、Ｋ−Ｙ、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、Ｍ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８、１２０、８５３１−８５３２］。単一の置換がインビトロにおいて２０ｍｅｒ２’−デオキシホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの効力を有意に改善することが示されたことから、活性化の向上は、Ｇ−クランプの場合、より顕著である［Ｆｌａｎａｇａｎ、Ｗ．Ｍ．、Ｗｏｌｆ、Ｊ．Ｊ．、Ｏｌｓｏｎ、Ｐ．、Ｇｒａｎｔ、Ｄ．、Ｌｉｎ、Ｋ．−Ｙ．、Ｗａｇｎｅｒ、Ｒ．Ｗ．、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、Ｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９９、９６、３５１３−３５１８］。それでも、オリゴヌクレオチド設計を最適にし、またこれら複素環修飾の生物学的活性への影響をより深く理解するために、オリゴマーのヌクレアーゼ安定性に対する効果を評価することが大切である。
【０１００】
複素環塩基として有用な更なる修飾多環式複素環化合物は、上記した米国特許第３、６８７、８０８号、並びに米国特許第４、８４５、２０５号、米国特許第５、１３０、３０２号、米国特許第５、１３４、０６６号、米国特許第５、１７５、２７３号、米国特許第５、３６７、０６６号、米国特許第５、４３２、２７２号、米国特許第５、４３４、２５７号、米国特許第５、４５７、１８７号、米国特許第５、４５９、２５５号、米国特許第５、４８４、９０８号、米国特許第５、５０２、１７７号、米国特許第５、５２５、７１１号、米国特許第５、５５２、５４０号、米国特許第５、５８７、４６９号、米国特許第５、５９４、１２１号、米国特許第５、５９６、０９１号、米国特許第５、６１４、６１７号、米国特許第５、６４５、９８５号、米国特許第５、６４６、２６９号、米国特許第５、７５０、６９２号、米国特許第５、８３０、６５３号、米国特許第５、７６３、５８８号、米国特許第６、００５、０９６号、及び米国特許第５、６８１、９４１号、並びに２００１年１１月２８日出願の米国特許出願第０９／９９６、２９２号に開示されているが、これらに限定されるものではなく、またこれら各々は参照して本願明細書に組み入れられる
【０１０１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド内の一つ又は二つ以上のヌクレオチド位置に、異なる塩基が存在する変異体も含む。例えば、第一のヌクレオチドがアデノシンの場合、この位置にチミジン、グアノシン又はシチジンを含む変異体を作成し得る。これはオリゴヌクレオチドの任意の位置にて実施することができる。次いでこれらオリゴヌクレオチドを、本願明細書において記述する方法を用いて、そのＳＴＡＴ３の発現抑制能を決定するために試験する。
【０１０２】
複合物
本発明のオリゴマー化合物に追加し得る更なる好ましい置換は、一つ又は二つ以上の部分を結合又は複合させることを含み、それにより得られたオリゴマー化合物の活性、細胞分布又は細胞取り込みを改善する。一実施態様において、この修飾オリゴマー化合物は、複合基を例えばヒドロキシル又はアミノ基のような官能基に共有結合させて調製される。本発明の複合基は、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学特性を高める基、及びオリゴマーの薬物動態学的特性を高める基を含む。典型的な複合物は、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩又はエステル、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及び染料を含む。本発明の文脈にて、薬力学特性を高める基は、オリゴマー取り込みを改善し、オリゴマーの分解耐性を高め、かつ／又はＲＮＡとの配列特異性ハイブリダイゼーションを強化する基を含む。本発明の文脈にて、薬物動態学的特性を高める基は、オリゴマー取り込み、分布、代謝又は分泌を改善する基を含む。代表的な複合基は、１９９２年１０月２３日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６号に開示されており、その開示全体は参照して本願明細書に組み入れられる。複合体部分は、例えばコレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８９、８６、６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ等、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．、１９９４、４、１０５３−１０６０）のような脂質部分、例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ等、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９２、６６０、３０６−３０９、Ｍａｎｏｈａｒａｎ等、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．、１９９３、３、２７６５−２７７０）のようなチオエーテル、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９２、２０、５３３−５３８）、例えばドデカンジオール又はウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ等、ＥＭＢＯＪ．、１９９１、１０、１１１１−１１１８、Ｋａｂａｎｏｖ等、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、１９９０、２５９、３２７−３３０、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ等、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ、１９９３、７５、４９−５４）のような脂肪鎖、例えばジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチルアンモニウム１、２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、１９９５、３６、３６５１−３６５４、Ｓｈｅａ等、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９０、１８、３７７７−３７８３）のようなリン脂質、ポリアミン又はポリエチレングリセロール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ等、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９５、１４、９６９−９７３）、又はアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、１９９５、３６、３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ等、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔ��、１９９５、１２６４、２２９−２３７）、又はオクタデシルアミン若しくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｒｏｏｋｅ等、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、１９９６、２７７、９２３−９３７）を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１０３】
本発明のオリゴマー化合物は、活性薬物成分、例えば、アスピリン、ワーファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カープロフェン、ダンシルサルコシン（ｄａｎｓｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ）、２、３、５−トリヨード安息香酸、フルフェナム酸、ホリニン酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメタシン、バルビツレート、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌薬又は抗生物質にも複合し得る。オリゴヌクレオチド−薬物複合体及びその調製は、その全容が参照して本願明細書に組み入れられる米国特許出願公開第０９／３３４、１３０号（１９９９年６月１５日出願）に記載されている。
【０１０４】
これらオリゴヌクレオチド複合体の調製を教授する代表的な米国特許は、米国特許第４、８２８、９７９号、米国特許第４、９４８、８８２号、米国特許第５、２１８、１０５号、米国特許第５、５２５、４６５号、米国特許第５、５４１、３１３号、米国特許第５、５４５、７３０号、米国特許第５、５５２、５３８号、米国特許第５、５７８、７１７号、米国特許第５、５８０、７３１号、米国特許第５、５８０、７３１号、米国特許第５、５９１、５８４号、米国特許第５、１０９、１２４号、米国特許第５、１１８、８０２号、米国特許第５、１３８、０４５号、米国特許第５、４１４、０７７号、米国特許第５、４８６、６０３号、米国特許第５、５１２、４３９号、米国特許第５、５７８、７１８号、米国特許第５、６０８、０４６号、米国特許第４、５８７、０４４号、米国特許第４、６０５、７３５号、米国特許第４、６６７、０２５号、米国特許第４、７６２、７７９号、米国特許第４、７８９、７３７号、米国特許第４、８２４、９４１号、米国特許第４、８３５、２６３号、米国特許第４、８７６、３３５号、米国特許第４、９０４、５８２号、米国特許第４、９５８、０１３号、米国特許第５、０８２、８３０号、米国特許第５、１１２、９６３号、米国特許第５、２１４、１３６号、米国特許第５、０８２、８３０号、米国特許第５、１１２、９６３号、米国特許第５、２１４、１３６号、米国特許第５、２４５、０２２号、米国特許第５、２５４、４６９号、米国特許第５、２５８、５０６号、米国特許第５、２６２、５３６号、米国特許第５、２７２、２５０号、米国特許第５、２９２、８７３号、米国特許第５、３１７、０９８号米国特許第、５、３７１、２４１号、米国特許第５、３９１、７２３号、米国特許第５、４１６、２０３号、米国特許第５、４５１、４６３号、米国特許第５、５１０、４７５号、米国特許第５、５１２、６６７号、米国特許第５、５１４、７８５号、米国特許第５、５６５、５５２号、米国特許第５、５６７、８１０号、米国特許第５、５７４、１４２号、米国特許第５、５８５、４８１号、米国特許第５、５８７、３７１号、米国特許第５、５９５、７２６号、米国特許第５、５９７、６９６号、米国特許第５、５９９、９２３号、米国特許第５、５９９、９２８号及び米国特許第５、６８８、９４１号を含むが、これらに限定されるものではなく、またこれら各々は参照して本願明細書に組み入れられる。
【０１０５】
本発明の組成物に使用されるオリゴマー化合物は、例えばヌクレアーゼ安定性等の性質を高めるために、一般にオリゴマー化合物の片方又は双方の末端に結合した安定化基を有するようにも修飾され得る。安定化基には、キャップ構造が含まれる。「キャップ構造、又は末端キャップ部分」は、オリゴヌクレオチドの両末端に組み込まれた化学修飾を意味する（例えば、参照して本願明細書に組み入れられるＷｉｎｃｏｔｔ等、ＷＯ９７／２６２７０号を参照のこと）。この末端修飾は、末端核酸分子を有するオリゴマー化合物をエキソヌクレアーゼによる分解から保護し、細胞内での送達及び／又は局在化を補助し得る。キャップは５’−末端（５’−キャップ）、３’−末端（３’−キャップ）、又は双方の末端に存在し得る。非限定的な例において、５’−キャップは、逆位脱塩基残査（部分）４’、５’−メチレンヌクレオチド、１−（β−Ｄ−エリトロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環ヌクレオチド、１、５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、α−ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、ホスホロジチオエート結合、トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環式３’、４’−セコヌクレオチド、非環式３、４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、非環式３、５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、３’−３’−逆位ヌクレオチド部分、３’−３’−逆位脱塩基部分、３’−２’−逆位ヌクレオチド部分、３’−２’−逆位脱塩基部分、１、４−ブタンジオールホスフェート、３’−ホスホロアミデート、ヘキシルホスフェート、アミノヘキシルホスフェート、３’−ホスフェート、３’−ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、又は架橋若しくは非架橋のメチルホスホネート部分（より詳細については、参照して本願明細書に組み入れられるＷｉｎｃｏｔｔ等による国際特許出願公開第ＷＯ９７／２６２７０号を参照）を含む。
【０１０６】
特に好ましい本発明の３’−キャップ構造は、例えば４’、５’−メチレンヌクレオチド、１−（β−Ｄ−エリトロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環ヌクレオチド、５’−アミノアルキルホスフェート、１、３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート、３−アミノプロピルホスフェート、６−アミノヘキシルホスフェート、１、２−アミノドデシルホスフェート、ヒドロキシプロピルホスフェート、１、５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチド、α−ヌクレオチド、修飾塩基ヌクレオチド、ホスホロジチオエート、トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド、非環式３’、４’−セコヌクレオチド、３、４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド、３、５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−逆位ヌクレオチド部分、５’−５’−逆位脱塩基部分、５’−ホスホロアミデート、５’−ホスホロチオエート、１、４−ブタンジオールホスフェート、５’−アミノ、架橋及び／又は非架橋の５’−ホスホロアミデート、ホスホロチオエート及び／又はホスホロジチオエート、架橋又は非架橋のメチルホスホネート及び５’−メルカプト部分（詳細については、参照して本願明細書に組み入れられているＢｅａｕｃａｇｅ及びＴｙｅｒ、１９９３、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ４９、１９２５、を参照）を含む。
【０１０７】
オリゴマー化合物の片方又は双方をキャップして、ヌクレアーゼ安定性を付与するのに使用され得る更なる３’及び５’−安定化基は、２００３年１月１６日発行のＷＯ０３／００４６０２号に開示されている。
【０１０８】
キメラオリゴマー化合物
オリゴマー化合物の全ての位置を一様に修飾する必要はなく、事実、１個のオリゴマー化合物内に前述した修飾の二種以上を組み込む、又は例えばオリゴマー化合物内のヌクレオシドのようなモノマーサブユニット内にさえも組み込むことができる。本発明は、キメラのオリゴマー化合物であるオリゴマー化合物も含む。本発明の文脈において、「キメラの」オリゴマー化合物又は「キメラ」とは、各々が少なくとも一つのモノマー単位から構成される二つ又は三つ以上の化学的に異なる領域を含むオリゴマー化合物を指す。即ち核酸ベースのオリゴマーの場合ではヌクレオチドである。
【０１０９】
キメラのオリゴマー化合物は一般に、ヌクレアーゼ分解耐性を増大させ、細胞取り込みを高め、及び／又は標的核酸への結合親和性を高めるように修正された少なくとも一つの領域を有している。オリゴマー化合物の更なる領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡ又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断可能な酵素のための基質として働き得る。例示として、ＲＮａｓｅＨは細胞エンドヌクレアーゼであり、ＲＮＡ：ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を切断する。従って、ＲＮａｓｅＨを活性化させることによってＲＮＡ標的が切断され、遺伝子発現の抑制効率が非常に向上される。従って、キメラを使用した場合、例えば同一標的領域へのホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイズと比較して、より短いオリゴマー化合物によって同等の結果が得られる場合が多い。ＲＮＡ標的の開裂は、日常的にゲル電気泳動によって、また、必要ならば、当分野で公知の関連核酸ハイブリダイゼーション技法によって検出できる。
【０１１０】
本発明によるキメラのオリゴマー化合物は、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオシド、及び／又は上述したオリゴヌクレオチド模倣体の二つ又は三つ以上の要素を含む複合３本構造として形成され得る。このようなオリゴマー化合物は、当該技術分野においてハイブリッドヘミマー（ｈｅｍｉｍｅｒ）、ギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）又は逆位ギャップマーとも称される。このハイブリッド構造の調製を教授する代表的な米国特許は、米国特許第５、０１３、８３０号、米国特許第５、１４９、７９７号、米国特許第５、２２０、００７号、米国特許第５、２５６、７７５号、米国特許第５、３６６、８７８号、米国特許第５、４０３、７１１号、米国特許第５、４９１、１３３号、米国特許第５、５６５、３５０号、米国特許第５、６２３、０６５号、米国特許第５、６５２、３５５号、米国特許第５、６５２、３５６号、及び米国特許第５、７００、９２２号を含むが、これらに限定されるものではなく、またこれら各々は参照して本願明細書に組み入れられている。
【０１１１】
３’末端の修飾
本発明の一局面において、オリゴマー化合物は、３’末端の糖立体配座を導入するように合成的に修飾されたヌクレオシドを含む。ヌクレオシドは、合成的に修飾された複素環塩基、糖部分、又はそれら両方を組み込み、所望の３’末端の糖立体配座を誘導し得る。これら修飾ヌクレオシドは、オリゴマー化合物の所望の３’末端の立体配座構造を保持する一方、オリゴマー化合物の特定の性質を向上し得るように、ＲＮＡ状ヌクレオシドを疑似するよう使用される。ＲＮＡ干渉の必要条件（例、誘因）により、ＲＮＡ型二重鎖には明らかな優位性が存在しており（Ａ型螺旋、３’末端が優位）、これは２’−デオキシ−２’−Ｆ−ヌクレオシドからなる二重殻がＣ．ｅｌｅｇａｎｓ系内でのＲＮＡｉ応答の誘因に有効であるとの事実に一部支持されている。より安定な３’末端のヌクレオシドを使用して向上される性質としては、タンパク質結合、タンパク質オフレート、吸着及び排除（ｃｌｅａｒａｎｃｅ）の調節を介した薬物動態学的性質の調節、ヌクレアーゼ安定性及び化学的安定性の調節、結合親和性及びオリゴマーの特異性の調節（酵素及び相補的配列の親和性及び特異性）、並びにＲＮＡ切断効率の増大があるが、これらに限定されるものではない。本発明は、Ｃ３’末端型立体配座に有利なように修飾された一つ又は二つ以上のヌクレオシドを有する、ＲＮＡｉを誘因するオリゴマーを提供する。
【０１１２】
スキーム１
0005507617.tif 000021
ヌクレオシドの立体配座は、ペントフラノシル糖の２’、３’又は４’位における置換を含む様々な要因の影響を受ける。電気的に陰性な置換基は、一般にアキシアル位を好み、その一方で、立体的に厳しい置換基は、エクアトリアル位を好む（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｗｏｌｆｇａｎｇ  Ｓａｎｇｅｒ、１９８４、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）。以下の図２に示すように、２’−ＯＨを認識要素として保持する一方、３’末端の立体配座に有利なように２’位を修飾することができる。（Ｇａｌｌｏ等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（２００１）、５７、５７０７−５７１３．Ｈａｒｒｙ−Ｏ’ｋｕｒｕ等、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、（１９９７）、６２（６）、１７５４−１７５９及びＴａｎｇ等、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９９９）、６４、７４７−７５４）。代替的に、２’デオキシ−２’Ｆ−ヌクレオシドに例示されるように、２’−ＯＨを排除することにより３’末端の立体配座を優先させることができる（Ｋａｗａｓａｋｉ等、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）、３６、８３１−８４１）。ここで３’末端の立体配座は、電気的に陰性なフッ素原子をアキシアル位に配置している。リボース環の他の修飾には、例えば４’位を置換した４’−Ｆ修飾ヌクレオシド（Ｇｕｉｌｌｅｒｍ等、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９５）、５、１４５５−１４６０及びＯｗｅｎ等、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９７６）、４１、３０１０−３０１７）、又は例えば、メタノカルバ修飾によってヌクレオシド類似体を得て（Ｊａｃｏｂｓｏｎ等、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．（２０００）、４３、２１９６−２２０３及びＬｅｅ等、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００１）、１１、１３３３−１３３７）３’末端の立体配座の優先が誘導される。同様のラインに沿って、ＲＮＡｉ応答の誘因となるオリゴマーは、立体配座をＣ３’末端型の立体配座にロックするよう修飾された、即ちＬｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（ＬＮＡ、Ｓｉｎｇｈ等、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９８）、４、４５５−４５６）、及びエチレン架橋された核酸（ＥＮＡ、Ｍｏｒｉｔａ等、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００２）、１２、７３−７６）の一つ又は二つ以上のヌクレオシドから構成され得る。本発明に従う修飾ヌクレオシドの例を、以下の表Ｉに示す。これらの例は例示を意味し、網羅的なものではない。
【０１１３】
表Ｉ
0005507617.tif 000022
【０１１４】
修飾ヌクレオシド、及びそのオリゴマーの好ましい立体配座は、分子動力学計算、核磁気共鳴分光法及びＣＤ測定等の様々な方法により判断し得る。このように、オリゴマーコンテクスト内に、ＲＮＡ状の立体配座、Ａ型二重鎖構造を誘導するよう予測された修飾が、本発明の修飾オリゴヌクレオチドに使用するために選択される。本発明に適用できる多数の修飾ヌクレオシド合成は、当該技術分野にて公知である（例えば、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｖｏｌ  １−３、ｅｄ．ＬｅｒｏｙＢ．Ｔｏｗｎｓｅｎｄ、１９８８、Ｐｌｅｎｕｍｐｒｅｓｓ、及び以下の実施例セクションを参照のこと）。ＲＮＡ依存型ＲＮＡポリメラーゼのための抑制剤／基質として知られるヌクレオシドには、例えばＨＣＶＮＳ５Ｂがある。
【０１１５】
一局面にて、本発明は、核酸標的に対抗する本来のＲＮＡと比較して向上した性質を有する、調製されたオリゴヌクレオチドに関する。標的が確認され、有効な長さと、標的配列の部分に相補的な配列とを有するオリゴヌクレオチドが選択される。選択された配列を有する各ヌクレオシドは、その性質を向上させる可能性のある修飾について吟味される。好ましい修飾は、一つ又は二つ以上のＲＮＡヌクレオシドを３’末端の立体配座の構造を有するヌクレオシドと代替することであろう。この修飾によって、本来のＲＮＡに関して化学的安定性とヌクレアーゼ安定性とが向上され得る。また同時に、合成及び／又はオリゴヌクレオチドへの組込みがより安価かつ容易である。選択配列は、更にいくつかの領域に分割され、各領域のヌクレオシドは、キメラコンフィギュレーションの結果であり得る修飾の改善について評価される。５’及び３’−末端についても、一つ又は二つ以上の末端ヌクレオチドが度々有利に修飾されるため考慮される。本発明のオリゴマー化合物は、一本鎖上に、又は二本鎖配列（一つ又は複数）の少なくとも一つの５’位上に、少なくとも一つの５’−修飾リン酸基を有し得る。ヌクレオシド間結合、複合基、置換糖若しくは塩基、一つ又は二つ以上のヌクレオシドのヌクレオシド模倣体との置換、及び意図する標的のために選択された配列を改善する任意の他の修飾のような、更なる修飾も考えられる。ＲＮＡのホモ二重鎖核酸の立体配座形態を表す用語は「Ａ型」であり、ＤＮＡでは“Ｂ型”である。ＲＮＡ及びＤＮＡ二重鎖の各々の立体配座形態は、核酸繊維のＸ線回折分析により決定される（Ａｒｎｏｔｔ及びＨｕｋｉｎｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．、１９７０、４７、１５０４）。一般に、ＲＮＡ：ＲＮＡ二重鎖は、ＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖と比較してより安定であり、より高い融点（Ｔｍ）を有する（Ｓａｎｇｅｒ等、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、１９８４、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ．、Ｌｅｓｎｉｋ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９５、３４、１０８０７−１０８１５、Ｃｏｎｔｅ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９７、２５、２６２７−２６３４）。ＲＮＡの安定性の増大は、数個の構造的特徴、最も顕著にはＡ型形態から生じる改善された塩基積み重ね相互作用を原因とする（Ｓｅａｒｌｅ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９３、２１、２０５１−２０５６）。ＲＮＡ内の２’ヒドロキシの存在が糖をＣ３’末端のパッカー、即ちノーザンパッカーとも称される方向に偏らせ、それにより二重鎖はＡ型形態を指示するようになる。加えて、ＲＮＡの２’−ヒドロキシル基は、ＲＮＡ二重鎖の安定化を助ける水素結合に仲介された水のネットワークを形成し得る（Ｅｇｌｉ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９６、３５、８４８９−８４９４）。他方で、デオキシ核酸はＣ２’末端の糖パッカー、即ちサザンパッカーとしても知られるパッカーへ好み、これは比較的不安定なＢ型形態を形成すると考えられる（Ｓａｎｇｅｒ、Ｗ．（１９８４）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）。本願明細書で使用されるように、Ｂ型形態は、Ｃ２’末端のパッカー及びＯ４’末端のパッカーの両方を含む。このことは、Ｂ型二重鎖を生じさせるフラノース立体配置を考慮すれば、Ｏ４’末端のパッカーの寄与も考慮に入れる必要があると指摘したＢｅｒｇｅｒ等によるＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９８、２６、２４７３−２４８０と一致する。
【０１１６】
しかしながら、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド二重鎖は、通常、純粋なＲＮＡ：ＲＮＡ二重鎖よりも安定性が低く、その配列に応じて、ＤＮＡ：ＤＮＡ二重鎖よりも安定性が高いか、又は低いかのいずれかであり得る（Ｓｅａｒｌｅ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９３、２１、２０５１−２０５６）。ハイブリッド二重鎖の構造は、Ａ型及びＢ型形態の中間であり、そのため結果として積み重ね相互作用が乏しい場合がある（Ｌａｎｅ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１９９３、２１５、２９７−３０６、Ｆｅｄｏｒｏｆｆ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９３、２３３、５０９−５２３、Ｇｏｎｚａｌｅｚ等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９５、３４、４９６９−４９８２、Ｈｏｒｔｏｎ等、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９９６、２６４、５２１−５３３）。標的ＲＮＡと合成配列との間に形成された二重鎖の安定性は、アンチセンス及びＲＮＡ干渉のような療法にとっては、これらの機構が合成オリゴヌクレオチド鎖のＲＮＡ標的鎖への結合を必要とするため重要である。アンチセンスの場合、ｍＲＮＡを効果的に抑制するには、アンチセンスＤＮＡがｍＲＮＡに対して非常に高い結合親和性を有する必要がある。さもなくば、所望の合成オリゴヌクレオチド鎖と標的ｍＲＮＡ鎖との間の相互作用の頻度が減少し、効力が低下する。
【０１１７】
糖パッカリングを修飾する慣例的に使用されている一方法では、糖の形態に影響を与える置換基を用いて、糖の２’−を置換する。環の立体配座への影響は、２’位の置換基の性質に依存する。多くの異なる置換基の試験により、糖のパッカリング効果が測定されている。例えば、２’−ハロゲンが研究され、２’−フルオロ誘導体ではＣ３’末端型の個体数が最も高くなり（６５％）、２’−ヨードでは最も低くなる（７％）ことが示された。アデノシン（２’−ＯＨ）及びデオキシアデノシン（２’−Ｈ）の個体数は、各々３６％及び１９％である。更に、アデノシン二量体（２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシン、２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシン）の２’−フルオロ基の効果は、更に、積み重ね立体配座の安定性に対応している。
【０１１８】
予想通り、相対的な二重鎖の安定性は、２’−ＯＨ基を２’−Ｆ基で置換して、Ｃ３’末端の集団を増大させることにより高められ得る。高い極性を有する２’ Ｆ結合の性質と、際立ったＣ３’末端のパッカリング優先性とは、Ａ型二重鎖の積み重ね立体配座を安定化し得ることが想定される。ＵＶ淡色効果、円二色性分光法、及び１ＨＮＭＲによるデータも、ハロ置換基の電気陰性度が低くなるにつれて、積み重ね度が低下することを示している。更に、糖部分の２’位の立体的な嵩高さは、Ｂ型二重鎖と比較するとＡ型二重鎖によく収容される。従って、ジヌクレオシドモノホスフェートの３’−末端上の２’−置換基は、積み重ね立体配座上に、立体的な反発、フラノースパッカリング優先性、静電気反発、疎水性による誘引、及び水素結合能などの多数の効果を付与すると思われる。これらの置換基効果は、置換基の分子サイズ、電気陰性度、及び疎水性により決定されると思われる。相補的な鎖の融点も、２’−置換により上昇する。立体配座の３’末端の優先性、又は置換基の存在が、結合の増加の原因であるか否かは明らかではない。しかしながら隣接する塩基の重なり（積重ね）の増加は、３’末端の立体配座により達成され得る。
【０１１９】
ヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増大させ、また結合親和性を非常に高くする合成２’−修飾の一つは、２−メトキシエトキシ（２’−ＭＯＥ、２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）側鎖である（Ｂａｋｅｒ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９７、２７２、１１９４４−１２０００）。２’−ＭＯＥ置換の直の利点の一つは、多数の同様の２’修飾、例えばＯ−メチル、Ｏ−プロピル、及びＯ−アミノプロピルと比較して高い、結合親和性における改善である。２’−Ｏ−メトキシエチル置換基を有するオリゴヌクレオチドも、遺伝子発現のアンチセンス抑制剤であることが示され、インビボでの未来における使用が期待されている（Ｍａｒｔｉｎ、Ｐ．、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９９５、７８、４８６−５０４、Ａｌｔｍａｎｎ等、Ｃｈｉｍｉａ、１９９６、５０、１６８−１７６、Ａｌｔｍａｎｎ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．、１９９６、２４、６３０−６３７、及びＡｌｔｍａｎｎ等、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、１９９７、１６、９１７−９２６）。ＤＮＡに関して、２’−ＭＯＥ修飾を有するオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ親和性の向上と、ヌクレアーゼ耐性の増大とをが示した。ウイングヌクレオシドと、デオキシ−ホスホロチオエートヌクレオチド（オリゴヌクレオチド又はギャップマーとも称される）の内部領域とに２’−ＭＯＥ置換基を有するキメラオリゴヌクレオチドは、動物モデルにおける腫瘍成長の低下に低用量で効果を示すことが証明されている。２’−ＭＯＥ置換オリゴヌクレオチドは、いくつかの疾病状態に対するアンチセンス薬剤として、抜群に有望であることが証明されている。そのようなＭＯＥ置換オリゴヌクレオチドの一つは、現在、ＣＭＶ網膜炎治療の臨床試験にて研究されている。
【０１２０】
化学的定義
本願明細書に別に定義されない限り、アルキルは、Ｃ１−Ｃ１２、好ましくはＣ１−Ｃ８、より好ましくはＣ１−Ｃ６の直鎖、又は（可能であれば）分岐鎖の脂肪族ヒドロカルビルを意味する。
【０１２１】
本願明細書に別に定義されない限り、ヘテロアルキルは、少なくとも１個、好ましくは約１〜約３個のヘテロ原子を、鎖の末端部を含む鎖内に含む、Ｃ１−Ｃ１２、好ましくはＣ１−Ｃ８、より好ましくはＣ１−Ｃ６の直鎖、又は（可能であれば）分岐鎖の脂肪族ヒドロカルビルを意味する。好ましいヘテロ原子は、Ｎ、ＯおよびＳを含む。本願明細書に別に定義されない限り、シクロアルキルは、Ｃ３−Ｃ１２、好ましくはＣ３−Ｃ８、より好ましくはＣ３−Ｃ６の脂肪族ヒドロカルビル環を意味する。
【０１２２】
本願明細書に別に定義されない限り、アルケニルは、直鎖、又は（可能であれば）分岐鎖のヒドロカルビル部分であってもよく、かつ少なくとも一つの炭素−炭素二重結合を含み得るＣ２−Ｃ１２、好ましくはＣ２−Ｃ８、より好ましくはＣ２−Ｃ６アルケニルを意味する。
【０１２３】
本願明細書に別に定義されない限り、アルキニルは、直鎖、又は（可能であれば）分岐鎖のヒドロカルビル部分であってもよく、かつ少なくとも一つの炭素−炭素三重結合を含むＣ２−Ｃ１２、好ましくはＣ２−Ｃ８、より好ましくはＣ２−Ｃ６アルキニルを意味する。
【０１２４】
本願明細書に別に定義されない限り、ヘテロシクロアルキルは、少なくとも３個の環員を含み、その少なくとも１個が炭素であり、また１、２又は３個の環員が炭素以外である環部分を意味する。好ましくは、炭素原子の数は、１〜約１２、好ましくは１〜約６の間で変動し、環員の全部の数は３〜約１５、好ましくは約３〜約８の間で変動する。好ましい環ヘテロ原子は、Ｎ、Ｏ及びＳである。好ましいヘテロシクロアルキル基は、モルホリノ、チオモルホリノ、ピリジニル、ピペラジニル、ホモピペリジニル、ホモピペラジニル、ホモモルホリノ、ホモチオモルホリノ、ピロロジニル、テトラヒドロオキサゾリル、テトラヒドロイミダゾリル、テトラヒドロチアゾリル、テトラヒドロイソキサゾリル、テトラヒドロピラゾリル、フラニル、ピラニル、及びテトラヒドロイソチアゾリルを含む。
【０１２５】
本願明細書に別に定義されない限り、アリールは、少なくとも一つのアリール環を含む任意の炭化水素環構造を意味する。好ましいアリール環は、約６〜約２０個の環炭素を有する。特に好ましいアリール環は、フェニル、ナフチル、アントラニル、及びフェナントレニルを含む。
【０１２６】
本願明細書に別に定義されない限り、ヘテロアリールは、少なくとも一つの完全不飽和環を含み、該環は炭素及び非炭素原子から構成される環部分を意味する。好ましくは、環系は約１〜約４個の環を含む。好ましくは、炭素原子の数は、１〜約１２個、好ましくは１〜約６個の間で変動し、環員の全部の数は、３〜約１５個、好ましくは約３〜約８個の間で変動する。好ましい環ヘテロ原子は、Ｎ、Ｏ及びＳである。好ましいヘテロアリール部分は、ピラゾリル、チオフェニル、ピリジル、イミダゾリル、テトラゾリル、ピリミジニル、プリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチオフェニル等を含む。
【０１２７】
本願明細書に別に定義されない限り、一つの部分が複合部分、例えばヘテロアリールアルキル（ヘテロアリール及びアルキル）、アラルキル（アリール及びアルキル）等として定義される場合、そのサブ部分の各々は本願明細書に定義したとおりである。
【０１２８】
本願明細書に別に定義されない限り、電子吸引基は、例えばシアノ又はイソシアナート基のような、それが結合する炭素から電子の電荷を吸引する基である。注目すべき他の電子吸引基は、その電子陰性度が炭素のそれを上回るグループ、例えば、ハロゲン、ニトロ、そのオルト又はパラ位が一つ又は二つ以上のシアノ、イソチオシアナート、ニトロ又はハロ基で置換された、又はフェニルを含む。
【０１２９】
本願明細書に別に定義しない限り、用語ハロゲン及びハロは、それらの通常の意味を有する。好ましいハロ（ハロゲン）置換基は、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩである。前述した任意の置換基は、本願明細書に別に定義しない限り、所望の性質に応じた適切な置換基である。それらには、ハロゲン（Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、アルキル、アルケニル、及びアルキニル部分、ＮＯ２、ＮＨ３（置換及び非置換）、酸部分（例、−ＣＯ２Ｈ、−ＯＳＯ３Ｈ２等）、ヘテロシクロアルキル部分、ヘテロアリール部分、アリール部分等が含まれる。前記の全ての式において、記号（〜）は、５’−ホスフェートの酸素又は硫黄に対する結合を示す。
【０１３０】
リン酸保護基（ホスフェート保護基）は、米国特許第５、７６０、２０９号、米国特許第５、６１４、６２１号、米国特許第６、０５１、６９９号、米国特許第６、０２０、４７５号、米国特許第６、３２６、４７８号、米国特許第６、１６９、１７７号、米国特許第６、１２１、４３７号、米国特許第６、４６５、６２８号に記載されているものを含み、これら各々はその全容が参照して明白に本願明細書に組み入れられる。
【０１３１】
本発明に従って使用されるオリゴヌクレオチドは、公知の固相合成法により利便性よく、また日常的に製造され得る。この合成法のための器具は、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓを含むいくつかの業者から販売されている。この合成法のための任意の他の手段を使用してもよい。オリゴヌクレオチドの実際の合成は、ルーチン作業者の技量で十分可能である。同様の技術を２’−Ｏ−メトキシエチルオリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド、例えばホスホロチオエート及び２’−アルコキシ又は２’−アルコキシアルコキシ誘導体（Ｍａｒｔｉｎ、Ｐ．、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ１９９５、７８、４８６−５０４）を製造するために使用することはよく知られている。また同様の技術、及び商業的に入手可能な修飾アミダイト、及び多孔質ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｐｏｒｅｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）製品、例えばビオチン、フルオレセイン、アクリジン又はソラレン修飾アミダイト及び／又はＣＰＧ（ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡから入手可能）を、蛍光ラベルした、ビオチン化又は他の複合オリゴヌクレオチドの合成に使用することもよく知られている。
【０１３２】
アンチセンス組成物及び製剤
本発明の化合物は、摂取、分布及び／又は吸収を助けるするために、例えば、リポソーム、受容体を標的とする分子、経口製剤、直腸経由の製剤、局所製剤又は他の製剤として他の分子、分子構造又は化合物の混合物とよく混合、封入、複合化、又は別様に関連され得る。これら分布及び／又は吸収を助ける製剤を教授している代表的な米国特許は、各々参照して本願明細書に組み入れられる米国特許第５、１０８、９２１号、米国特許第５、３５４、８４４号、米国特許第５、４１６、０１６号、米国特許第５、４５９、１２７号、米国特許第５、５２１、２９１号、米国特許第５、５４３、１５８号、米国特許第５、５４７、９３２号、米国特許第５、５８３、０２０号、米国特許第５、５９１、７２１号、米国特許第４、４２６、３３０号、米国特許第４、５３４、８９９号、米国特許第５、０１３、５５６号、米国特許第５、１０８、９２１号、米国特許第５、２１３、８０４号、米国特許第５、２２７、１７０号、米国特許第５、２６４、２２１号、米国特許第５、３５６、６３３号、米国特許第５、３９５、６１９号、米国特許第５、４１６、０１６号、米国特許第５、４１７、９７８号、米国特許第５、４６２、８５４号、米国特許第５、４６９、８５４号、米国特許第５、５１２、２９５号、米国特許第５、５２７、５２８号、米国特許第５、５３４、２５９号、米国特許第５、５４３、１５２号、米国特許第５、５５６、９４８号、米国特許第５、５８０、５７５号、及び米国特許第５、５９５、７５６号を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１３３】
本発明のアンチセンス化合物は、薬剤的に許容される任意の塩、エステル、若しくはそのようなエステルの塩、又はヒトを含む動物に投与された場合、その生物学的に活性な代謝産物若しくは残基を（直接的若しくは間接的に）提供し得る任意の他の化合物を包含する。従って、例えば、本開示は本発明の化合物のプロドラッグ及び薬剤的に許容される塩、そのようなプロドラッグの薬剤的に許容される塩、並びに他の生物学的同等物も含む。
【０１３４】
用語「プロドラッグ」は不活性形態にて製造されて、内因性酵素、又は他の化学物質及び／又は条件の作用によって身体又はその細胞内で活性形態（即ち、薬物）に変換される治療薬を示す。特に、本発明のオリゴヌクレオチドのプロドラッグの種類は、Ｇｏｓｓｅｌｉｎ等による１９９３年１２月９日発行のＷＯ９３／２４５１０号、又はＩｍｂａｃｈ等に付与されたＷＯ９４／２６７６４号及び米国特許第５、７７０、７１３号に開示された方法に従い、ＳＡＴＥ［（Ｓアセチル−２−チオエチル）ホスフェート］誘導体として製造される。
【０１３５】
用語「薬剤(医薬)的に許容される塩」は、本発明の化合物の生理学的及び薬剤的に許容される塩、即ち、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、望ましくない毒性効果をそれに与えない塩を意味する。
【０１３６】
薬剤的に許容される塩基付加塩は、金属又はアミン、例えばアルカリ及びアルカリ土類金属又は有機アミンと共に形成される。カチオンとして使用される金属の例は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、及び同様物が挙げられる。適切なアミンの例は、Ｎ、Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、及びプロカインが挙げられる（例えば、Ｂｅｒｇｅ等、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ、」Ｊ．ｏｆ  Ｐｈａｒｍａ  Ｓｃｉ．、１９７７、６６、１−１９を参照）。本願明細書に使用されるように、「薬剤的付加塩」は、本発明の組成物の一成分の酸形態の、薬剤的に許容される塩を含む。これらには、アミンの有機又は無機酸が含まれる。好ましい酸塩は、塩酸塩、酢酸塩、サリチル酸塩、硝酸塩及びリン酸塩である。薬剤的に許容される他の適切な塩は、当業者に周知であり、それらには様々な無機及び有機酸の塩基塩が含まれる。
【０１３７】
オリゴヌクレオチドについて、薬剤的に許容される塩の好ましい例には、（ａ）ナトリウム、カリウム、アンモニウム、マグネシウム、カルシウム、例えばスペルミン及びスペルミジン等のポリアミンのようなカチオンと共に形成される塩、（ｂ）例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸及び同様物のような無機酸と共に形成される酸付加塩、（ｃ）例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息公酸、タンニン酸、パルミチン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸、及び同様物のような有機酸と共に形成される塩、並びに（ｄ）例えば塩素、臭素、及びヨウ素のような元素アニオンから形成される塩が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１３８】
薬剤組成物、及び投与経路
本発明の薬剤組成物は、局所又は全身治療のいずれが望ましいかに応じて、及び治療するべき領域に応じて、多数の方法により投与することができる。投与は、局所的に（眼、並びに膣及び直腸送達を含む粘膜に）、肺に（例、ネブライザーによるものを含む粉末又はエアゾルの吸入又は通気）、気管内に、鼻腔内に、上皮に、及び経皮的に、経口的に又は非経口的に行われ得る。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、又は筋内注射若しくは点滴、又は頭蓋内、例、くも膜下腔内若しくは脳室内投与を含む。少なくとも一つの２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を含むオリゴヌクレオチドは、経口投与に特に有用であると思われる。
【０１３９】
局所投与のための薬剤組成物及び製剤は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、座薬、スプレー、液剤及び散剤を含み得る。従来の薬剤担体、水性、粉末状又は油状基材、増粘剤等が必要であるか、又は望ましい。被覆コンドーム、グローブ等も有用である。好ましい局所製剤は、本発明のオリゴヌクレオチドが、例えば脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化剤及び界面活性剤のような局所送達剤と混合されたものを含む。好ましい脂質及びリポソームは、中性（例、ジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルホスファチジルコリン）、負（例、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）及びカチオン性（例、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰ及びジオレイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）を含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、リポソーム内に封入されるか、又はリポソーム、特にカチオン性リポソームと複合体を形成し得る。代替的に、オリゴヌクレオチドは脂質、特にカチオン性脂質に複合されてもよい。好ましい脂肪酸及びエステルは、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸エステル、トリカプリン酸エステル、モノオレイン酸エステル、ジラウリングリセリル１−モノカプリン酸エステル、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、又はＣ１−１０アルキルエステル（例、イソプロピルミリステートＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド又はそれらの薬剤的に許容される塩を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１４０】
いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチドは、経口投与経路を介して対象者に投与され得る。本発明の対象者は、動物を含む。動物の対象者は、例えばマウス、ラット、イヌ、モルモット、サル、ヒト、ヒトではない霊長類、ネコ又はブタ等の哺乳類であり得る。ヒトではない霊長類には、サル及びチンパンジーが含まれる。適切な動物対象者は、例えばマウス、ラット、イヌ、ヒトではない霊長類、ネコ又はブタ等の実験動物であり得る。
【０１４１】
いくつかの実施態様において、対象者はヒトであり得る。所定の実施態様において、本願明細書により詳細に記述するように、対象者はヒトの患者であり得る。所定の実施態様では、ヒト患者の一つ又は二つ以上の遺伝子の発現を調節する必要があり得る。いくつかの特定の実施態様において、ヒト患者の一つ又は二つ以上の遺伝子の発現を抑制する必要があり得る。特定の実施態様において、本願明細書に記述する治療結果を得るためにＳＴＡＴ３を調節、即ち抑制又は増強する必要があり得る。
【０１４２】
いくつかの実施態様において、本発明による非経口でない（例、経口）オリゴヌクレオチド製剤は、オリゴヌクレオチドのバイオアベイラビリティを向上させる。この文脈にて、用語「バイオアベイラビリティ」は、薬物送達に特定の投与モードが使用された場合に、循環系（例、血液、詳細には血漿）に到達する投与薬物部分の量を意味する。高いバイオアベイラビリティは、他の一つの投与モードに関して、特定の投与モードが、対象者の抹消血液血漿にオリゴヌクレオチドを送達する能力を意味する。例えば、薬物を対象者に導入するのに非経口でない投与モード（例、経口モード）が使用される場合、その投与モードのバイオアベイラビリティは、異なる投与モード、例、ＩＶの投与モードと比較され得る。いくつかの実施態様において、非経口でない投与後の化合物の血漿濃度曲線（ＡＵＣ０）下の面積は、静脈内（ｉ．ｖ．）投与（ＡＵＣｉｖ）後の薬物血漿濃度曲線下の面積で除算されて、無次元量（相対バイオアベイラビリティ、ＲＢ）を提供し得る。これは、ＩＶ経路と比較した、非経口でない経路を介して吸収された化合物部分を表している。組成物のバイオアベイラビリティは、第一組成物の相対バイオアベイラビリティ（ＲＢ１）が第二の組成物の相対バイオアベイラビリティ（ＲＢ２）よりも大きい場合に、他の一組成物のバイオアベイラビリティと比較して高いと言われている。
【０１４３】
一般に、バイオアベイラビリティは、薬物の最終的な作用部位が細胞内であったとしても、化合物の治療的有効性が到達する血中濃度と関連する場合に、治療的有効性と相関する（ｖａｎＢｅｒｇｅ−Ｈｅｎｅｇｏｕｗｅｎ等、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、１９７７、７３、３００）。バイオアベイラビリティに関する研究は、経口投与後の薬物の抹消血中濃度の変化を測定することによって、薬物の腸管吸収の程度を測定するのに使用されている（ＤｉＳａｎｔｏ、Ｃｈａｐｔｅｒ７６Ｉｎ：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈＥｄ．、Ｇｅｎｎａｒｏ、ｅｄ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０、１４５１−１４５８ページ）。一般に、経口組成物（オリゴヌクレオチドを含む）のバイオアベイラビリティは、その相対バイオアベイラビリティが、実質的に純粋なオリゴヌクレオチド、即ち浸透促進剤を含まないオリゴヌクレオチドから構成されている組成物のバイオアベイラビリティよりも大きい場合に、”高い“と言われる。
【０１４４】
器官バイオアベイラビリティとは、器官内の化合物の濃度を意味する。試験対象者の器官バイオアベイラビリティは、多数の手段、例えば全身Ｘ線写真により測定され得る。器官バイオアベイラビリティは、本願明細書により詳細に記述するように、オリゴヌクレオチドに対する一つ又は二つ以上の修飾、一種又は二種以上の担体化合物又は賦形剤の使用等により調節、例えば高めることができる。一般には、バイオアベイラビリティが増大する結果、器官バイオアベイラビリティも増大する。
【０１４５】
本発明による経口オリゴヌクレオチド組成物は、「吸収促進剤」又は単に「浸透促進剤」としても周知の一種又は二種以上の「粘膜浸透促進剤」を含んでもよい。従って、本発明のいくつかの実施態様は、少なくとも一種の浸透促進剤と組み合わせた少なくとも一種のオリゴヌクレオチドを含む。一般に、浸透促進剤は、所望の投与モードに関連した粘膜（一つ又は複数）、（例えば腸管上皮膜）を通過する薬物の輸送を促進する物質のことである。従って、オリゴヌクレオチドの活性を妨害することなく、またオリゴヌクレオチドが副作用例えば有毒性、刺激作用又はアレルギー応答のような許容不可能な程度の副作用を生じることなく、動物の身体内に導入され得るように、オリゴヌクレオチドの取り込みを促進する一種又は二種以上の浸透促進剤を選択することが望ましい。
【０１４６】
本発明の実施態様は、非経口でない投与モードを介して投与されたオリゴヌクレオチドのバイオアベイラビリティを向上させる、一種又は二種以上の薬剤的に許容される浸透促進剤を含む組成物、及びそのような組成物を使用する方法を提供する。従来、特定の薬物のバイオアベイラビリティを向上させるために、特定の浸透促進剤が使用されてきた。Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９０、７、１及びＬｅｅ等、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、８、９１参照。オリゴヌクレオチドの取り込み及び送達は、非経口でない手段により投与される場合でも、多数の異なるクラス浸透促進剤の使用を介して非常に改善され得ることが分かっている。
【０１４７】
いくつかの実施態様において、非経口でない投与用の組成物は、天然に存在するオリゴヌクレオチド（即ち、完全−ホスホジエステルデオキシリボシル、又は完全ホスホジエステルリボシルオリゴヌクレオチド）の一つ又は二つ以上の修飾を含む。この修飾は、結合親和性、ヌクレアーゼ安定性、細胞若しくは組織浸透性、組織分布、又は他の生物学的若しくは薬物動態学的性質を向上させ得る。修飾は一般に、オリゴヌクレオチド化学（ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）に関して本願明細書により詳細に記述するように、塩基、リンカー又は糖に行われ得る。本発明のいくつかの実施態様にて、対象者に投与するための組成物、特に（ヒト又はヒトではない）動物対象者に投与するための経口組成物は、親和力、安定性、組織分布、又は他の生物学的性質を向上させるために一つ又は二つ以上の修飾を有する修飾オリゴヌクレオチドを含むと想定される。
【０１４８】
適切な修飾リンカーには、ホスホロチオエートリンカーがある。本発明のいくつかの実施態様にて、オリゴヌクレオチドは、少なくとも一つのホスホロチオエートリンカーを有する。ホスホロチオエートリンカーは、ヌクレアーゼ安定性、及び血漿タンパク質結合特性をオリゴヌクレオチドに付与する。ヌクレアーゼ安定性は、インビボにて、オリゴヌクレオチドの寿命を延長するのに有用である一方、血漿タンパク質結合は、オリゴヌクレオチドの腎排泄による初回通過クリアランスの速度を低下させる。本発明のいくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチドは少なくとも二つのホスホロチオエートリンカーを有する。オリゴヌクレオチドが正確にｎ個のヌクレオシドを有するいくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチドは、１〜ｎ−１個のホスホロチオエート結合を有する。オリゴヌクレオチドが正確にｎ個のヌクレオシドを有するいくつかの実施態様にて、オリゴヌクレオチドはｎ−１個のホスホロチオエート結合を有する。オリゴヌクレオチドが正確にｎ個のヌクレオシドを有し、ｎは偶数である他の実施態様において、オリゴヌクレオチドは１〜ｎ／２個のホスホロチオエート結合を有するか、又は、ｎが奇数である場合、１〜（ｎ−１）／２個のホスホロチオエート結合を有する。いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチドは、交互のホスホジエステル（ＰＯ）及びホスホロチオエート（ＰＳ）結合を有する。他の実施態様において、オリゴヌクレオチドは、二つ又は三つ以上の連続するＰＯ結合からなる少なくとも一つのストレッチ、及び二つ又は三つ以上のＰＳ結合からなる少なくとも一つのストレッチを有する。他の実施態様にて、オリゴヌクレオチドは、少なくとも一つのＰＳ結合で遮断された、ＰＯ結合からなる少なくとも二つのストレッチを有する。
【０１４９】
いくつかの実施態様において、ヌクレオシドの少なくとも一つは、ヌクレアーゼ安定性、結合親和性又は数個の他の有利な生物学的性質を糖に付与する修飾によって、リボース糖単位上が修飾されている。場合により、糖修飾は２’−修飾を含み、例えばリボース糖の２’−ＯＨが代替又は置換されている。２’−ＯＨの適切な置換には、２’−Ｆ及び２’−アラビノ−Ｆが含まれる。ＯＨの適切な置換には、２’−Ｏ−アルキル、例えば２−Ｏ−ｍエチル、及び２’−Ｏ−置換アルキル、例えば２’−Ｏ−メトキシエチル、２’−ＮＨ２、２’−Ｏ−アミノプロピル等が含まれる。いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも一つの２’−修飾を含む。いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも二つの２’−修飾を含む。いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチドは、少なくとも一つの２’−修飾を各末端（即ち、各々同一又は異なる２’−修飾を有する３’−及び５’−末端ヌクレオシド）に含む。いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチドは、同オリゴヌクレオチドの各末端に少なくとも二つの連続した２’−修飾を含む。いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチドは、更に少なくとも一つのデオキシヌクレオシドを含む。特定の実施態様にて、オリゴヌクレオチドはデオキシヌクレオシドのストレッチを含み、同ストレッチは該オリゴヌクレオチドがハイブリダイズ可能なＲＮＡのＲＮａｓｅ（例、ＲＮａｓｅＨ）切断を活性化することが可能である。いくつかの実施態様において、デオキシヌクレオシドのストレッチは、約６〜約１６個、例えば約８〜約１６個の連続的なデオキシヌクレオシドを含むＲＮＡのＲＮａｓｅ仲介切断を活性化することが可能である。更なる実施態様にて、オリゴヌクレオチドはＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドに対して作用するｄｓＲＮＡｓｅ酵素による切断を誘発することが可能である。
【０１５０】
本発明のオリゴヌクレオチド組成物は、錠剤、カプセル、液体シロップ、軟性ゲル、座薬、及び浣腸を含むが、これらに限定されない様々な剤形に調製され得る。用語「消化管送達」には、例えば経口、直腸経由、内視鏡投与、及び舌下／頬内投与が含まれる。これらの投与モードは、消化管の一部若しくは全体における吸収、及びそのように投与されたオリゴヌクレオチド又はその模倣物の十分な粘膜貫通を通常必要とする。
【０１５１】
頬内又は舌下投与のような口腔粘膜を介した薬物送達は、多くの場合、薬物の血漿濃度がより迅速に上昇する等の数個の所望の特徴を有する（Ｈａｒｖｅｙ、Ｃｈａｐｔｅｒ３５Ｉｎ：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ  Ｅｄ．、Ｇｅｎｎａｒｏ、ｅｄ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０、７１１ページ）。
【０１５２】
内視鏡は、消化管の内部に薬物を直接送達するのに使用され得る。例えば、内視鏡的逆行性膵管造影法（ＥＲＣＰ）は、延長した胃内視鏡検査を利用して、胆管及び膵管への選択的アクセスを可能にする（Ｈｉｒａｈａｔａ等、ＧａｎＴｏＫａｇａｋｕＲｙｏｈｏ、１９９２、１９（１０Ｓｕｐｐｌ．）、１５９１）。リポソーム製剤を含む薬剤組成物は、内視鏡的手段を介して、消化管の一部内、例えば十二指腸（Ｓｏｍｏｇｙｉ等、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．、１９９５、１２、１４９）又は胃粘膜下内に直接送達され得る（Ａｋａｍｏ等、ＪａｐａｎｅｓｅＪ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．、１９９４、８５、６５２）。胃洗浄装置（Ｉｎｏｕｅ等、Ａｒｔｉｆ．Ｏｒｇａｎｓ、１９９７、２１、２８）及び経皮内視鏡供給装置（Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ等、ＡｉｌｍｅｎｔＰｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１９９５、９、４７１）も薬剤組成物の直接的な消化管送達に使用することができる。
【０１５３】
いくつかの実施態様において、オリゴヌクレオチド製剤は、肛門経由で直腸又は腸管下部内に投与され得る。この目的のために直腸座薬、保持浣腸、又は直腸カテーテルが使用され得、患者のコンプライアンスを得ることが困難な場合に好ましいと思われる（例、小児及び老人用途、又は患者が嘔吐しているか、又は無意識下にある場合）。直腸投与は経口経路と比較して、より迅速かつ高い血中濃度が得られる（Ｈａｒｖｅｙ、Ｃｈａｐｔｅｒ３５Ｉｎ：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈＥｄ．、Ｇｅｎｎａｒｏ、ｅｄ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０、７１１ページ）。直腸から吸収された薬物の約５０％が肝臓を迂回すると想定されるため、この経路による投与は初回通過代謝の可能性を有意に低下させる（Ｂｅｎｅｔ等、Ｃｈａｐｔｅｒ１  Ｉｎ：Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、９ｔｈ  Ｅｄ．、Ｈａｒｄｍａｎ等、ｅｄｓ．、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９６）。
【０１５４】
経口オリゴヌクレオチド組成物に添加される他の賦形剤には、界面活性剤（即ち「表面−活性剤」）がある。これらは、水溶液中に溶解すると、溶液の表面張力、又は水溶液と他の一液体との間の界面張力を低下させ、その結果、消化管粘膜及び他の表皮膜を通過するオリゴヌクレオチドの吸収が促進される化学的な存在である。胆汁塩及び脂肪酸に加えて、界面活性剤には、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル及びポリオキシエチレン−２０−セチルエーテル（Ｌｅｅ等、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２ページ）、並びにパーフルオロヘミカル乳剤、例えばＦＣ−４３（Ｔａｋａｈａｓｈｉ等、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｍａｃｏｌ．、１９８８、４０、２５２）が含まれる。
【０１５５】
浸透促進剤として作用し、本発明の組成物に使用され得る脂肪酸及びその誘導体には、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカノン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプレート、トリカプレート、モノオレイン（１−モノオレイル）−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセリル１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、並びにモノ−及びジ−グリセリド、及び／又はそれらの生理学的に許容される塩（即ち、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、カプリン酸塩、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、リノール酸塩等）が含まれる（Ｌｅｅ等、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２ページ、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９０、７、１、Ｅｌ−Ｈａｒｉｒｉ等、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９９２、４４、６５１）。
【０１５６】
いくつかの実施態様において、経口送達用のオリゴヌクレオチド組成物は、粒子、カプセル、ゲルカプセル、微粒子等からなり得る少なくとも二つの別個の相を含み得る。各相は、一種又は二種以上のオリゴヌクレオチド、浸透促進剤、界面活性剤、生体接着剤、発泡剤、又は他の補助剤、賦形剤若しくは希釈剤を含み得る。いくつかの実施態様において、一つの相は少なくとも一種のオリゴヌクレオチドと、少なくとも一種の浸透促進剤とを含む。いくつかの実施態様において、第一の相は、少なくとも一種のオリゴヌクレオチドと、少なくとも一種の浸透促進剤とを含み、第二の相は少なくとも一種の浸透促進剤を含む。いくつかの実施態様において、第一の相は、少なくとも一種のオリゴヌクレオチドと、少なくとも一種の浸透促進剤とを含み、第二の相は少なくとも一種の浸透促進剤を含み、かつ実質的にオリゴヌクレオチドを含まない。いくつかの実施態様において、少なくとも一つの相は、相の内容物の放出を遅延させる例えば皮膜又はマトリクスのような少なくとも一つの分解遅延剤を混合されている。いくつかの実施態様において、少なくとも一つの相。いくつかの実施態様において、第一の相は少なくとも一種のオリゴヌクレオチドと、少なくとも一種の浸透促進剤を含み、第二の相は少なくとも一種の浸透促進剤と放出遅延剤とを含む。特定の実施態様にて、経口オリゴヌクレオチド組成物は、オリゴヌクレオチド及び浸透促進剤を含有する粒子からなる第一の相と、放出遅延剤で被覆され、かつ浸透促進剤を含有する粒子からなる第二の相とを含む。
【０１５７】
様々な胆汁塩もまた浸透促進剤として機能して、薬物の取り込み及びバイオアベイラビリティを改善する。胆汁の生理学的役割には、脂肪及び脂溶性ビタミンの分散及び吸収の促進が含まれる（Ｂｒｕｎｔｏｎ、Ｃｈａｐｔｅｒ３８  Ｉｎ：Ｇｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、９ｔｈ  Ｅｄ．、Ｈａｒｄｍａｎ等、ｅｄｓ．、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９９６、９３４−９３５ページ）。様々な天然胆汁塩、及びそれらの合成誘導体が浸透促進剤として働く。従って、用語「胆汁塩」には、天然に存在する任意の胆汁成分と、それらの任意の合成誘導体とが含まれる。本発明の胆汁塩には、例えば、コール酸（又はその薬剤的に許容されるナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリコール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケモデオキシコール酸（ＣＤＣＡ、ケモデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４、２５−ジヒドロ−フシデート（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、及びポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）（Ｌｅｅ等、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２ページ、Ｓｗｉｎｙａｒｄ、Ｃｈａｐｔｅｒ３９  Ｉｎ：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８ｔｈ  Ｅｄ．、Ｇｅｎｎａｒｏ、ｅｄ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０、７８２−７８３ページ、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９０、７、１、Ｙａｍａｍｏｔｏ等、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、１９９２、２６３、２５、Ｙａｍａｓｈｉｔａ等、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、１９９０、７９、５７９）が含まれる。
【０１５８】
いくつかの実施態様において、本発明の浸透促進剤は、浸透促進化合物の混合物である。この浸透促進混合物の一つは、カプリン酸及び／又はラウリン酸、又はそれらの塩、例えばナトリウム塩を伴うＵＤＣＡ（及び／又はＣＤＣＡ）である。この混合物は、生物学的に活性な物質の粘膜、特に腸粘膜を通過する送達を促進するのに有用である。他の浸透促進剤混合物は、約５〜９５％の胆汁酸、又は塩（一種又は複数種）、５〜９５％のカプリン酸及び／又はラウリン酸を伴うＵＤＣＡ及び／又はＣＤＣＡを含む。特定の浸透促進剤は、ＵＤＣＡのナトリウム塩、カプリン酸、及びラウリン酸を、各々約１：２：２の比にて含む混合物である。このような浸透促進剤の別の一つは、カプリン酸及びラウリン酸（又はその塩）を０．０１：１〜１：０．０１の比（モルベースで）にて含む混合物である。特定の実施態様にて、カプリン酸、及びラウリン酸は、例えば約０．１：１〜約１：０．１、詳細には約０．５：１〜約１：０．５のモル比で存在する。
【０１５９】
他の賦形剤にはキレート化剤、即ち金属イオンと共に複合体を形成して該金属イオンを除去し、その結果、消化管及び他の粘膜を介したオリゴヌクレオチドの吸収が促進される化合物が含まれる。本発明において、ＤＮＡ様オリゴヌクレオチドを含有する組成物中での浸透促進剤としてのそれらの使用に関しては、キレート化剤はＤＮａｓｅ抑制剤としても作用するという利点を追加し、このことはＤＮＡヌクレアーゼが触媒反応のために二価金属イオンを必要とし、従ってキレート化剤により抑制されるということで最もよく特徴付けられる（Ｊａｒｒｅｔｔ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．、１９９３、６１８、３１５）。本発明のキレート化剤には、エチレンジアミンテトラ酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチル酸塩（例、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチル酸塩、及びホモバニル酸塩）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、ラウレス−９及びβ−ジケトン（エナミン）のＮ−アミノアシル誘導体が含まれるが、これらに限定されるものではない（Ｌｅｅ等、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２ページ、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９０、７、１、Ｂｕｕｒ等、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ．、１９９０、１４、４３）。
【０１６０】
本願明細書で使用されているように、非キレート非界面活性剤浸透促進剤は、キレート化剤、又は界面活性剤としての有意でない活性を示す化合物として定義され得るにも関わらず、消化管及び他の粘膜を介したオリゴヌクレオチドの吸収を促進する（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９０、７、１）。この浸透促進剤のクラスには、不飽和環状尿素、１−アルキル−及び１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅ等、ＣｒｉｔｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、９２ページ）、並びに非ステロイド系抗炎症薬例えばジクロフェナクナトリウム、インドメタシン及びフェニルブタゾンが含まれるが、これらに限定されるものではない（Ｙａｍａｓｈｉｔａ等、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９８７、３９、６２１）。
【０１６１】
細胞レベルでオリゴヌクレオチドの取り込みを促進する薬剤を、本発明の薬剤的、治療的及び他の組成物に加えてもよい。例えば、カチオン性脂質、例えばＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭＪｕｎｉｃｈｉｅｔａｌ、米国特許第５、７０５、１８８号）、カチオン性グリセロール誘導体、及びポリカチオン性分子、例えばポリリシン（Ｌｏｌｌｏ等、国際特許出願公開第ＷＯ９７／３０７３１号）が使用され得る。
【０１６２】
「薬剤的担体」又は「賦形剤」は、一種又は二種以上の核酸を動物に送達するための、薬剤的に許容される溶媒、懸濁剤、又は任意の他の薬理学的に不活性なビヒクルであり得る。賦形剤は液体又は固体であり得、計画された投与方法を留意した上で、オリゴヌクレオチド、及び所定の薬剤組成物の他の成分と組み合わせた際に所望の塊、堅さ等を提供するように選択される。典型的な薬剤的担体には、結合剤（例、αとうもろこし澱粉、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース等）、充填剤（例、ラクトース及び他の糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート又は硫酸水素カルシウム、等）、滑沢剤（例、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、硬化ベジタブルオイル、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、等）、錠剤崩壊剤（例、澱粉、グリコール酸澱粉ナトリウム、ＥＸＰＬＯＴＡＢ）、及び湿潤剤（例、ラウリル硫酸ナトリウム、等）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０１６３】
経口オリゴヌクレオチド組成物は、更に薬剤組成物中に、当該技術分野で確立されている使用レベルにおいて、慣習的に見られる他の補助成分を含有してもよい。従って、例えば、組成物は、更なる、適合性を有する、薬剤的に活性な物質、例えば、痒み止め薬、アストリンゼン、局所麻酔薬、又は抗炎症薬を含有してもよいし、本発明の組成物を多様な剤形に物理的に調製する際に有用な、例えば色素、着香剤、保存剤、酸化防止剤、乳白剤、増粘剤、安定剤等の更なる材料を含有してもよい。しかしながら、これらの材料は、添加された場合に、本発明の組成物成分の生物学的活性を過度に妨害しない必要がある。
【０１６４】
非経口、くも膜内又は脳室内投与のための組成物及び製剤には、緩衝液、希釈剤、及び他の適切な添加剤、例えば浸透促進剤、担体化合物、及び他の薬剤的に許容される担体若しくは賦形剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。無菌水溶液が含まれ得る。
【０１６５】
本発明の薬剤組成物には、液剤、乳剤、及びリポソーム含有製剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。これら組成物は、プレフォームドリキッド（ｐｒｅｆｏｒｍｅｄ  ｌｉｑｕｉｄ）、自己乳化性固形物及び自己乳化性半固形物を含むが、これらに限定されない様々な成分から生成され得る。
【０１６６】
単位剤形で利便性よく存在し得る本発明の薬剤製剤は、薬剤工業の分野で周知の従来の技術に従って製造され得る。この技術は、活性成分を薬剤的担体（一種若しくは複数種）又は賦形剤（一種若しくは複数種）と関連させるステップを含む。一般に製剤は、均一かつ緊密に活性成分を液体担体、若しくは微粉化した固体担体、又はこれら双方と関連させた後、必要であれば製品を成形することによって製造される。
【０１６７】
本発明の組成物は、例えば錠剤、カプセル、ゲルカプセル、液体シロップ、軟性ゲル、座薬、及び浣腸を含むが、これらに限定されない多数の可能な剤形のうちのいずれかに調製され得る。本発明の組成物は、水性、非水性、又は混合媒体中の懸濁液として調製することもできる。水性懸濁液は更に、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストランを含む、懸濁液の粘土を高める物質を含有してもよい。懸濁液は、安定剤を含み得る。
【０１６８】
本発明の一実施態様にて、薬剤組成物は発泡体として調製及び使用されてもよい。薬剤発泡体には、例えば乳剤、マイクロエマルジョン、クリーム、ゼリー及びリポソームを含むがこれらに限定されない製剤が含まれる。これらの製剤は基本的に類似した性質を有するが、最終製品の成分及び堅さが異なる。これら組成物及び製剤の調製は、一般に薬剤及び製剤の分野の当業者に周知であり、本発明の組成物の製剤に適用することができる。
【０１６９】
乳剤
本発明の組成物は、乳剤として作成及び調製することができる。乳剤は、通常、一つの液体が他の一液体中に液滴の形態で分散した不均一系であり、該液滴は通常、直径が０．１μｍを超える（Ｉｄｓｏｎ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、ｖｏｌｕｍｅ  １、ｐ．１９９、Ｒｏｓｏｆｆ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、Ｖｏｌｕｍｅ  １、ｐ．２４５、Ｂｌｏｃｋ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、ｖｏｌｕｍｅ２、ｐ．３３５、Ｈｉｇｕｃｈｉ等、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９８５、ｐ．３０１）。乳剤は、多くの場合二相系であり、緊密に混合され、かつ互いに分散された二つの不混和性の液体相からなる。一般に、乳剤は、油中水型（ｗ／ｏ）又は水中油型（ｏ／ｗ）のいずれかであり得る。水相が小さい液滴として大きい油相中に微細化され、かつ分散される場合、得られた組成物は油中水型（ｗ／ｏ）乳剤と称される。代替的に、油相が小さい液滴として大きい水相中に微細化され、かつ分散される場合、得られた組成物は水中油型（ｗ／ｏ）乳剤と称される。乳剤は、分散した相と活性薬物に加えて更なる成分を含んでもよく、該成分は水相、油相又はそれ自体で別個の相として存在し得る。必要に応じて、乳剤中に薬剤賦形剤、例えば乳化剤、安定剤、色素、及び酸化防止剤が存在してもよい。薬剤乳剤は、三つ以上の相を含む複合乳剤、例えば油中水中油型（ｏ／ｗ／ｏ）及び水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）のような乳剤であってもよい。このような複合製剤は、多くの場合、単純な２成分乳剤が提供しない確かな利点を提供する。ｏ／ｗ乳剤の個々の油滴が小さい水滴を取り囲む複合乳剤は、ｗ／ｏ／ｗ乳剤を構成する。同様に、油滴が、油の連続の中に安定化している水の小球中に取り囲まれた系は、ｏ／ｗ／ｏ乳剤を提供する。
【０１７０】
多くの場合、乳剤の分散又は不連続相は、外部又は連続相中によく分散され、乳化剤手段又は製剤の粘度を介して該形態を保持している。乳剤スタイルの軟膏ベース及びクリームの場合のように、乳剤のいずれの相も半固体又は固体であってよい。乳剤を安定化させる他の手段には、乳剤のいずれの相に組み込んでもよい乳化剤の使用がある。乳化剤は大きく次の４つのカテゴリーに分類することができる。成界面活性剤、天然に存在する乳化剤、吸収ベース、及び微分散した固体（Ｉｄｓｏｎ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、ｖｏｌｕｍｅ  １、ｐ．１９９）。
表面活性剤としても周知の合成界面活性剤は、乳剤の調製に幅広く適用されており、文献にて概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、ｖｏｌｕｍｅ  １、ｐ．２８５、Ｉｄｓｏｎ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９８８、ｖｏｌｕｍｅ  １、ｐ．１９９）。界面活性剤は一般に、両親媒性であり、親水性部分と疎水性部分を含む。界面活性剤の疎水性の性質に対する親水性の性質の比は、親水／疎水バランス（ＨＬＢ）と称され、製剤の調製において界面活性剤を類別及び選択する際の有用な手段である。界面活性剤は、親水基の性質に基づき次の異なるクラスに分類され得る。非イオン性、アニオン性、カチオン性及び両性（Ｒｉｅｇｅｒ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、ｖｏｌｕｍｅ  １、ｐ．２８５）。
【０１７１】
乳剤製剤に使用される天然に存在する乳化剤は、ラノリン、蜜蝋、リン脂質（フォスファチド）、レシチン及びアカシアを含む。吸収ベースは、例えば無水ラノリン及び親水性ワセリンのように、親水性を有するため水を吸収してｗ／ｏ乳剤を形成することができるが、尚、半固体の堅さを保持する。微粉化した固体も、特に界面活性剤と組み合わせて、また粘性調合物中において良好な乳化剤として使用されている。これらには、例えば重金属水酸化物のような極性無機固体、例えばベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状ケイ酸アルミニウム及びコロイド状ケイ酸アルミニウムマグネシウムのような非膨潤粘土、顔料及び例えば炭素又はトリステアリン酸グリセリルのような無極性固体がある。
【０１７２】
乳剤の性質に寄与する非常に多様な非乳化材料を、乳剤製剤中に含むことができる。それらには、脂肪、油、蝋、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪エステル、保湿剤、親水コロイド、保存剤及び酸化防止剤が含まれる（Ｂｌｏｃｋ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、ｖｏｌｕｍｅ  １、ｐ．３３５、Ｉｄｓｏｎ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、ｖｏｌｕｍｅ  １、ｐ．１９９）。
【０１７３】
親水コロイドには、例えばポリサッカライド天然に存在するゴム、及び合成ポリマー、例えば多糖類（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラギナン、グアーガム、カラヤガム、及びトラガカント）、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース及びカルボキシプロピルセルロース）、及び合成ポリマー（例えば、カルボマー、セルロースエーテル、及びカルボキシビニルポリマー）が含まれる。これらは水中に分散、又は膨潤してコロイド状溶液を形成し、これが分散相の液滴の周囲に強力な界面薄膜を形成することによって、また外部の相の粘度を増大させることによって、乳剤を安定化させる。
【０１７４】
乳剤は多くの場合、微生物の増殖を容易に支持し得る、例えば炭水化物、タンパク質、ステロール及びリン脂質等の多数の成分を含有するため、これらの製剤は保存剤を組み込む場合がが多い。乳剤製剤に含まれる、通常使用されている保存剤には、メチルパラベン、プロピルパラベン、第四級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル、及びボロン酸が含まれる。酸化防止剤も、通常乳剤製剤に添加されて製剤の劣化を防止する。使用される酸化防止剤は、例えばトコフェロール、アルキルガレート、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンのようなフリーラジカルスカベンジャーであり得るか、又は例えばアスコルビン酸及びメタ重亜硫酸ナトリウムのような還元剤、及び例えばクエン酸、酒石酸、及びレシチンのような酸化防止剤協力剤であり得る。
【０１７５】
皮膚を介した、経口及び非経口経路による乳剤製剤の適用、並びにそれらの製造方法は、文献にて再考されている（Ｉｄｓｏｎ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、ｖｏｌｕｍｅ  １、ｐ．１９９）。経口送達用の乳剤製剤は、調製の容易性、吸収の有効性、及びバイオアベイラビリティ的見地から非常に幅広く使用されている（Ｒｏｓｏｆｆ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、ｖｏｌｕｍｅ  １、ｐ．２４５、Ｉｄｓｏｎ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、ｖｏｌｕｍｅ  １、ｐ．１９９）。鉱油ベースの下剤、油溶性ビタミン及び高脂肪栄養調製品は、ｏ／ｗ乳剤として一般に経口投与されている材料のうちに含まれる。
【０１７６】
本発明の一実施態様にて、オリゴヌクレオチドの組成物はマイクロエマルジョンとして調製される。マイクロエマルジョンは、単一の光学的等方性を有し、かつ熱力学的に安定な溶液である、水系、油系及び両親媒性の系として定義され得る（Ｒｏｓｏｆｆ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、ｖｏｌｕｍｅ  １、ｐ．２４５）。通常、マイクロエマルジョンは、最初に、油を水性の界面活性剤溶液中に分散し、次に、概して中間鎖長アルコールである第四の成分の十分量を加えて透明な系を形成することにより調製される系である。従って、マイクロエマルジョンはまた、表面活性分子の界面薄膜により安定化された、熱力学的に安定で、二つの不混和性液体から構成される等方的に透明な分散物であるとして記述されている（Ｌｅｕｎｇ  ａｎｄ  Ｓｈａｈ、：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｒｏｓｏｆｆ、Ｍ．、Ｅｄ．、１９８９、ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１８５−２１５ページ）。マイクロエマルジョンは、通常、油、水、界面活性剤、共界面活性剤及び電解質を含む３〜５種の成分を組み合わせて調製される。マイクロエマルジョンが油中水型（ｗ／ｏ）又は水中油型（ｏ／ｗ）のいずれであるかは、使用する油及び界面活性剤の性質と、界面活性剤分子の極性頭部及び炭化水素尾部の構造及び幾何学的な充填状態とに依存する（Ｓｃｈｏｔｔ、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９８５、ｐ．２７１）。
【０１７７】
相ダイアグラムを用いた現象論的アプローチは広範囲に研究されており、当業者にマイクロエマルジョンの調製方法についての包括的な知識を提供した（Ｒｏｓｏｆｆ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、ＲｉｅｇｅｒａｎｄＢａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、ｖｏｌｕｍｅ  １、ｐ．２４５、Ｂｌｏｃｋ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、ｖｏｌｕｍｅ  １、ｐ．３３５）。従来の乳剤と比較すると、マイクロエマルジョンは、自発的に形成された熱力学的に安定な液滴の製剤中の水不溶性の薬物を可溶化する利点を有する。
【０１７８】
マイクロエマルジョン調製品に使用される界面活性剤には、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレエート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレエート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセキオレエート（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレエート（ＤＡＯ７５０）、の単独、又は共界面活性剤との組み合わせが含まれるが、これらに限定されるものではない。通常、短鎖アルコール、例えばエタノール、１−プロパノール、及び１−ブタノールである共界面活性剤は、界面活性剤薄膜を貫通し、界面活性剤分子間に生成した空間による乱れた薄膜を形成することによって、界面流動性を高めるよう働く。しかしながら、マイクロエマルジョンは共界面活性剤を使用せずに調製することができ、アルコールを含有しない、自己乳化性のマイクロエマルジョン系が当該技術分野にて公知である。水相は、一般に水、薬物、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール及びエチレングリコール誘導体の水溶液であり得るが、これらに限定されるものではない。油相は、例えばＣａｐｔｅｘ３００、Ｃａｐｔｅｘ３５５、ＣａｐｍｕｌＭＣＭ、脂肪酸エステル、中間鎖（Ｃ８−Ｃ１２）モノ、ジ、及びトリ−グリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８−Ｃ１０グリセリド、ベジタブルオイル及びシリコーン油を含むが、これらに限定されるものではない。
【０１７９】
マイクロエマルジョンは、薬物可溶化、及び薬物吸収改善の見地から特に興味が持たれている。ペプチドを含む薬物の経口バイオアベイラビリティを向上させるために、脂質ベースのマイクロエマルジョン（ｏ／ｗ及びｗ／ｏの両方）が提案されている（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ等、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４、１１、１３８５−１３９０、Ｒｉｔｓｃｈｅｌ、Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、１９９３、１３、２０５）。マイクロエマルジョンは、薬物可溶性の改善、酵素加水分解からの薬物の保護、界面活性剤によって誘導される薄膜流動性、及び浸透性の変更による薬物吸収の改善の可能性、調製の容易性、固体剤形での経口投与の容易性、臨床的有効性の向上、及び毒性の低減といった利点を提供する（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ等、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４、１１、１３８５、Ｈｏ等、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、１９９６、８５、１３８−１４３）。マイクロエマルジョンは多くの場合、その成分が周囲温度で集まると自発的に形成される。このことは、熱不安定性の薬物、ペプチド又はオリゴヌクレオチドを調製する場合に特に有利であり得る。マイクロエマルジョンはまた、美容及び薬剤用途の双方にて、活性成分の経皮送達に有効である。本発明のマイクロエマルジョン組成物及び製剤は、胃腸管からのオリゴヌクレオチドの全身吸収を促進し、また胃腸管、膣、頬側口腔及び他の投与部位内での局所細胞によるオリゴヌクレオチド取り込みを促進することが期待される。
【０１８０】
本発明のマイクロエマルジョンはまた、更なる成分、及び添加剤、例えばスルビタンモノステアレート（Ｇｒｉｌｌ３）、Ｌａｂｒａｓｏｌ、及び浸透促進剤を含有して、製剤の性質を改良し、また本発明のオリゴヌクレオチド及び核酸の吸収を促進してもよい。本発明のマイクロエマルジョンに使用される浸透促進剤は、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート化剤、及び非キレート化剤非界面活性剤からなる５つの大きいカテゴリーの一つに属するよう分類され得る（Ｌｅｅ等、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒａｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９１、ｐ．９２）。これらの各クラスは、上記に記述されている。
【０１８１】
リポソーム
マイクロエマルジョンの他にも、研究され、薬物製剤に使用されている組織化された界面活性剤構造が存在する。それらには、単分子膜、ミセル、二分子膜及び小胞が含まれる。例えばリポソームのような小胞は、その特異性と、薬物送達の見地からそれらが提供する遅延作用により、多大な興味を集めている。本発明に使用されているように、用語「リポソーム」は球状の二分子膜（一つ又は複数）に配置された親水性脂質から構成される小胞を意味する。
【０１８２】
リポソームは、親油性材料から形成された膜と、水性の内部とを有する単層又は複層の小胞である。水性部分は、送達されるべき組成物を含んでいる。カチオン性リポソームは、細胞壁に融合できる利点を有する。非カチオン性リポソームは、細胞壁に同様に融合することができないが、インビボでマクロファージに吸収される。
【０１８３】
哺乳類の皮膚を損なわずに該皮膚を貫通するために、脂質小胞は、適切な経皮的勾配の影響の下で、各々直径５０ｎｍ未満の微細な孔の連続を通過する必要がある。従って、高度に変形可能で、これらの微細孔を通過し得るリポソームを使用することが望ましい。
リポソームの更なる利点としては、天然リン脂質から得られたリポソームが生体適合性、及び生分解性を有すること、多様な水溶性及び油溶性薬物を取り込むことができること、その内部区画に封入した薬物を代謝及び分解から保護することができる（Ｒｏｓｏｆｆ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ、Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．）、１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、ｖｏｌｕｍｅ  １、ｐ．２４５）ことが挙げられる。リポソーム製剤を調製する際に考慮するべき重要な点は、脂質表面の変化、小胞の寸法、及びリポソームの水性部分の容積である。
【０１８４】
リポソームは、活性成分を作用部位に移動及び送達する際に有用である。リポソーム膜は生物学的膜と構造的に類似するため、リポソームが組織に適用された場合、リポソームは細胞膜と融合し始める。リポソームと細胞との融合が進行するにつれ、リポソーム内容物が細胞内に排出されて、活性薬剤が作用し得る。
【０１８５】
リポソーム製剤は、多くの薬物の送達モードとして広く研究の焦点となっている。局所投与のために、リポソームは他の製剤を超える数個の利点を有するという証拠が増加している。これらの利点には、投与薬物の多大な全身吸収による副作用の低減、所望の標的における投与薬物の蓄積の増大、皮膚内へ親水性及び疎水性の両方の様々な薬物を投与できる能力等がある。
【０１８６】
数個の報告において、高分子量ＤＮＡを含む薬剤を皮膚に送達するリポソームの能力が詳細されている。鎮痛剤、抗体、ホルモン及び高分子量ＤＮＡを含む化合物が、皮膚に投与されている。これら用途の大部分は表皮上層を標的としていた。
【０１８７】
リポソームは大きい二つのクラスに分類され、またＤＮＡ、ＲＮＡ又は任意の核酸ベースの構成体の送達に有用である。カチオン性リポソームは正電荷を帯びたリポソームであり、負電荷を帯びたＤＮＡ分子と相互作用して、安定な複合体を形成する。正電荷を帯びたＤＮＡ／リポソーム複合体は、負電化を帯びた細胞表面に結合し、エンドソーム内に吸収される。エンドソーム内の酸性ｐＨを原因として、リポソームは破壊されて、その内容物が細胞原形質内に放出される（Ｗａｎｇ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１９８７、１４７、９８０−９８５）。
【０１８８】
ｐＨ感受性又は負電荷を帯びたリポソームは、ＤＮＡと複合体を形成せずにＤＮＡを封入する。ＤＮＡと脂質の両方が同様に帯電しているため、複合体を形成せずに反発が生じる。にも関わらず、いくつかのＤＮＡはこれらリポソームの水性内部に捕捉される。ｐＨ−感受性リポソームは、チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを培地内の細胞の単分子膜に送達するのに使用されている。標的細胞内で外来遺伝子の発現が検出された（Ｚｈｏｕ等、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、１９９２、１９、２６９−２７４）。
【０１８９】
リポソーム組成物の主な種類の一つには、天然物由来のホスファチジルコリン以外では、リン脂質が含まれる。天然のリポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）又はジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成され得る。アニオン性リポソーム組成物は、一般に、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成される一方、アニオン性融合性リポソームは、主としてジオレイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別の種類のリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、例えば大豆ＰＣ、及び卵ＰＣから形成される。別の種類のリポソーム組成物は、リン脂質及び／又はホスファチジルコリン及び／又はコレステロールの混合物から形成される。
【０１９０】
数個の研究がリポソーム薬物製剤の皮膚への局所送達について評価している。インターフェロンを含むリポソームをモルモットの皮膚に適用した所、皮膚ヘルペス疼痛が軽減したのに対し、他の手段を介してのインターフェロンの送達（例、溶液又は乳剤として）は無効であった（Ｗｅｉｎｅｒ等、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、１９９２、２、４０５−４１０）。また更なる研究にて、リポソーム製剤の一部として投与されたインターフェロンの、水性系を使用したインターフェロンの投与に対する効力を試験し、リポソーム製剤は水性投与と比較して優れているとの結論に達した（ｄｕＰｌｅｓｓｉｓ等、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９２、１８、２５９−２６５）。
【０１９１】
非イオン性リポソーム系、特に非イオン性界面活性剤及びコレステロールからなる系も試験され、薬物の皮膚への送達における有用性が測定された。ＮｏｖａｓｏｍｅＴＭＩ（グリセリルジラウレート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）及びＮｏｖａｓｏｍｅＴＭＩＩ（グリセリルジステアレート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤を使用して、シクロスポポリン−Ａをマウス皮膚の真皮内に送達した。結果は、このような非イオン性リポソーム系がシクロスポリン−Ａの皮膚の異なる層内での沈着を促進するのに有効であることを示した（Ｈｕ等Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．、１９９４、４、６、４６６）。
【０１９２】
リポソームはまた、「立体的に安定した」リポソームも含む。この用語は本願明細書に使用されているように、一種又は二種以上の特別な脂質を含むリポソームを意味し、該脂質はリポソームに組み込まれると、特別な脂質を含まないリポソームに関して循環寿命を高める。立体的に安定したリポソームの例には、リポソームの小胞形成脂質部分が（Ａ）一種又は二種以上の糖脂質を含むもの、例えばモノシアロガングリオシドＧＭ１、又は（Ｂ）例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分のような、一つ又は二つ以上の親水性ポリマーで誘導体化されたものが含まれる。特定の理論のいずれかに裏づけされている訳ではないが、当該技術分野では、少なくとも、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、又はＰＥＧ−誘導体化脂質を含む立体的に安定化したリポソームでは、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞内への取り込みが低下することから、これら立体的に安定化したリポソームの延長された循環寿命が誘導される（Ａｌｌｅｎ等、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９８７、２２３、４２、Ｗｕｅｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９３、５３、３７６５）。
【０１９３】
一つ又は二つ以上の糖脂質を含む様々なリポソームが公知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ等（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９８７、５０７、６４）は、モノシアルガングリオシドＧＭ１、硫酸ガラクトセレブロシド、及びホスファチジルイノシトールの、リポソームの血中半減期を延長する能力について報告した。これらの発見はＧａｂｉｚｏｎ等（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９８８、８５、６９４９）により詳細に解説された。Ａｌｌｅｎ等による米国特許第４、８３７、０２８号及びＷＯ８８／０４９２４号には、（１）スフィンゴミエリン及び（２）ガングリオシドＧＭ１又はａガラクトセレブロシド硫酸エステルを含むリポソームが開示されている。米国特許第Ｎｏ．５、５４３、１５２号（Ｗｅｂｂ等）には、スフィンゴミエリンを含むリポソームが開示されている。ＷＯ９７／１３４９９号（Ｌｉｍ等）に、１、２−ｓｎ−ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームも開示されている。
【０１９４】
一つ又は二つ以上の親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含む多数のリポソーム、及びそれらを調製する方法が公知である。Ｓｕｎａｍｏｔｏ等（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．、１９８０、５３、２７７８）は、ＰＥＧ部分を含む非イオン性洗浄剤２Ｃ１２１５Ｇを含むリポソームを記載した。Ｉｌｌｕｍ等（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、１９８４、１６７、７９）は、ポリスチレン粒子に重合体グリコールで親水性被覆を施すと、血中半減期が有意に延長することを示した。ポリアルキレングリコール（例、ＰＥＧ）のカルボキシル基を結合して修飾した合成リン脂質が、Ｓｅａｒｓ（米国特許第４、４２６、３３０号及び米国特許第４、５３４、８９９号）により記載されている。Ｋｌｉｂａｎｏｖ等（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、１９９０、２６８、２３５）は、ＰＥＧ又はＰＥＧステアレートで誘導体化したホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームが、血中循環半減期を有意に延長させたことを示す実験について記載している。Ｂｌｕｍｅ等（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、１９９０、１０２９、９１）は、この観察を、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）及びＰＥＧを組み合わせて形成される、例えばＤＳＰＥ−ＰＥＧのような他のＰＥＧ−誘導体化リン脂質に拡大した。共有結合したＰＥＧ部分を外部表面上に有するリポソームが、Ｆｉｓｈｅｒによる欧州特許第ＥＰ０４４５１３１Ｂ１号及びＷＯ９０／０４３８４号に記載されている。ＰＥＧで誘導体化されたＰＥを１−２０モルパーセント含むリポソーム組成物、及びその使用方法が、Ｗｏｏｄｌｅ等（米国特許第５、０１３、５５６号及び米国特許第５、３５６、６３３号）及びＭａｒｔｉｎ等（米国特許第Ｎｏ．５、２１３、８０４及び欧州特許第ＥＰ０４９６８１３Ｂ１号）により記述されている。多数の他の脂質−ポリマー接合体を含むリポソームがＷＯ９１／０５５４５号及び米国特許第５、２２５、２１２号（両方ともＭａｒｔｉｎ等による）並びにＷＯ９４／２００７３号（Ｚａｌｉｐｓｋｙ等）に開示されている。ＰＥＧ−修飾セラミド脂質を含むリポソームが、ＷＯ９６／１０３９１号（Ｃｈｏｉ等）に記載されている。米国特許第５、５４０、９３５号（Ｍｉｙａｚａｋｉ等）及び米国特許第５、５５６、９４８号（Ｔａｇａｗａ等）は、その表面が更に官能基部分で誘導体化され得るＰＥＧ−含有リポソームを記載している。
【０１９５】
Ｔｈｉｅｒｒｙ等による国際特許第ＷＯ９６／４００６２号は、高分子量核酸をリポソーム内に封入する方法を開示している。Ｔａｇａｗａ等による米国特許第５、２６４、２２１号は、タンパク質−結合リポソーを開示し、またこのリポソームの内容物はアンチセンスＲＮＡを含み得ることを主張している。Ｒａｈｍａｎ等による米国特許第５、６６５、７１０号は、オリゴデオキシヌクレオチドをリポソーム内に封入する特定の方法を記述している。Ｌｏｖｅ等による国際特許第ＷＯ９７／０４７８７号は、ｒａｆ遺伝子を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むリポソームを開示している。
【０１９６】
トランスファーソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅｓ）は、更に別のリポソームの一種類であり、高度に変形可能な脂質集合体であり、薬物送達ビヒクルの魅力的な候補である。トランスファーソームは脂質液滴と表現することができ、これらは高度に変形可能であるため、液滴よりも小さい孔を容易に貫通し得る。トランスファーソームは、それらが使用される環境に順応性を有し、例えばトファンスファーソームは自己最適化（皮膚内の孔の形状に適応）し、自己修復し、分解せずに高い頻度で標的に到着し、及び多くの場合、自己充填性を有する。トファンスファーソームを製造する場合、標準的なリポソーム組成物に、通常、界面活性剤であるサーフェスエッジ（ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｄｇｅ）活性剤を加えることが可能である。トファンスファーソームは血清アルブミンを皮膚に送達するのに使用されている。トファンスファーソームが仲介する血清アルブミンの送達は、血清アルブミンを含む溶液の皮下注射と同程度に有効であることが示されている。
【０１９７】
界面活性剤は、例えば乳剤（マイクロエマルジョンを含む）、及びリポソームのような製剤に幅広く適用されている。多数の異なる種類の界面活性剤（天然及び合成の双方）の性質を分類及び位置付けする最も通常の方法は、親水／疎水バランス（ＨＬＢ）を使用して行われる。親水性基（「頭部」としても周知）の性質は、製剤に使用される異なる界面活性剤を類別する際に最も有用な手段を提供する（Ｒｉｅｇｅｒ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９８８、ｐ．２８５）。
【０１９８】
界面活性剤分子がイオン化されていない場合、非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬製品及び美容製品に幅広い用途を有し、広いｐＨ値の範囲で使用可能である。一般に、そのＨＬＢ値は、その構造に応じて２〜約１８の範囲に亘る。非イオン性界面活性剤には、例えばエチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、及びエトキシル化エステルのような非イオン性エステルが含まれる。例えばエトキシル化脂肪アルコール、プロポキシル化アルコール、及びエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマーのような非イオン性アルカノールアミド及びエーテルも、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤のクラスで最も良く知られたメンバーである。
【０１９９】
界面活性剤分子が水中に溶解又は分散された際に負電荷を帯びる場合、界面活性剤は、アニオン性に分類される。アニオン性界面活性剤には、石鹸のようなカルボキシレート、アシルラクチレート、アミノ酸のアセトアミド、硫酸アルキルとしての硫酸エステル、及びエトキシル化アルキルスルフェート、アルキルベンゼンスルホネートのようなスルホネート、アシルイセチオネート、アシルタウレート及びスルホスクシネート、並びにホスフェートが含まれる。アニオン性界面活性剤のクラスで最も重要なメンバーは、アルキルスフホネート及び石鹸である。
【０２００】
界面活性剤分子が水中に溶解又は分散された際に正電荷を帯びる場合、界面活性剤は、カチオン性に分類される。カチオン性界面活性剤には、第四級アンモニウム塩、及びエトキシル化アミンが含まれる。第四級アンモニウム塩は、このクラスで最も使用されているメンバーである。
【０２０１】
界面活性剤分子が正電荷又は負電荷のいずれかを帯びる能力を有する場合、界面活性剤は両性に分類される。両性界面活性剤には、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン及びリン脂質が含まれる。
【０２０２】
薬物生成物、製剤及び乳剤中の界面活性剤の使用が再考されている（Ｒｉｅｇｅｒ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ、１９８８、ｐ．２８５）。
【０２０３】
非経口ではない投与に適切で、核酸との反応に有害性のない、薬剤的に許容される有機又は無機賦形剤もまた、本発明の組成物の調製に使用され得る。薬剤的に許容される適切な担体には、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン及び同様物が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２０４】
核酸の局所投与のための製剤には、滅菌及び非滅菌水溶液、例えばアルコールのような通常の溶媒中の非滅菌溶液、又は液体又は固体の油ベース中の核酸溶液が含まれる。溶液は緩衝液、希釈剤及び他の適切な添加剤を含んでもよい。非経口ではない投与に適切で、核酸との反応に有害性のない、薬剤的に許容される有機又は無機賦形剤を使用してもよい。
【０２０５】
薬剤的に許容される適切な賦形剤には、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン及び同様物が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【０２０６】
本発明の化合物は、パルス送達によっても投与され得る。“パルス送達”とは、薬物（例、アンチセンス化合物）と浸透促進剤との組み合わせの第一パルスと、薬物吸収を促進する浸透促進剤の第二パルスとを送達する医薬製剤を意味する。浸透促進剤の第一パルスの放出によって吸収されない。
【０２０７】
本発明の一実施態様は、腸の薬物吸収を促進する遅延放出経口製剤であり、該製剤は、
（ａ）前記薬物及び浸透促進剤を含む担体粒子の第一集団と、ここで薬物及び浸透促進剤は腸の第一部位に放出されることと、
（ｂ）浸透促進剤及び遅延放出皮膜又はマトリクスを含む担体粒子の第二集団と、ここで浸透促進剤は、第一部位の下流の腸内の第二部位に放出され、それにより薬物が第二部位に到達した際の薬物吸収が促進されることと、を含む。
【０２０８】
代替的に、（ａ）及び（ｂ）の浸透促進剤は異なっていてもよい。
このような促進は少なくとも担体粒子の二つの集団を封入することにより得られる。担体粒子の第一集団は、生物学的に活性な物質と浸透促進剤とを含み、担体粒子の第二（場合により追加の）集団は、浸透促進剤と遅延放出皮膜又はマトリクスとを含む。
【０２０９】
経口的に投与された薬物に適用される「初回通過効果」は、胃酸及び様々な消化酵素の作用による分解を意味する。初回通過クリアランス効果を緩和する手段の一つは、投与する薬物の用量を増加することにより、初回通過クリアランスで損失する割合を補償することを意味する。これは例えば、静脈内投与により、単に動物に対してより多量の薬物を提供することにより、例えば、動物に対して単純により多量の薬物を付与することにより容易に達成され得る。他の要因も、非経口ではない手段を介して投与された薬物のバイオアベイラビリティに影響を与える。例えば、薬物は消化管又は血流中で酵素的に、又は化学的に分解され得、及び／又は様々な粘膜に対して不浸透性又は半浸透性を有し得る。
【０２１０】
これら医薬組成物は、直腸、膣又は肺経由で投与された場合に、生物活性を有する物質の吸収を促進することが可能であると想定される。生物活性を有する物質の放出は、胃腸管の任意の部分で達成され得ることも想定される。
【０２１１】
オリゴヌクレオチドの液体の医薬組成物は、オリゴヌクレオチドと、例えば滅菌パイロジェンフリー（ｐｙｒｏｇｅｎ  ｆｒｅｅ）水、又は生理食塩水溶液のような適切なビヒクルとを組み合わせて調製され得る。他の治療的化合物も任意に含有し得る。
【０２１２】
本発明は固体微粒子組成物の使用も想定している。そのような組成物は、好ましくは呼吸に適したサイズのオリゴヌクレオチド粒子を含む。そのような粒子は、例えば、乾燥オリゴヌクレオチドを従来の手段、例えば乳鉢及び乳棒により粉砕した後、得られた粉末組成物を４００メッシュスクリーンに通して大きい粒子及び凝集体を分離する。活性オリゴヌクレオチドを含む固体微粒子組成物は、エアゾルの形成を容易にするよう働く分散剤、例えばラクトースを任意に含み得る。
【０２１３】
本発明によれば、オリゴヌクレオチド組成物はエアゾル化することもできる。液体粒子のエアゾルは、ネブライザー等、任意の適切な手段により製造することができる。例えば、米国特許第４、５０１、７２９号を参照されたい。ネブライザーは商業的に入手可能な装置であり、該装置は通常は空気又は酸素である圧縮ガスをベンチュリ（又は）オリフィスを通して推進するか、又は超音波撹拌のいずれかにより、溶液又は懸濁液を治療的なエアゾル噴霧に転換する。適切なネブライザーには、ＰＡＲＩＬＣＰＬＵＳ、ＰＡＲＩＤＵＲＡ−ＮＥＢ２０００、ＰＡＲＩ−ＢＡＢＹＳｉｚｅ、ＰＡＲＩＰＲＯＮＥＢＣｏｍｐｒｅｓｓｏｒｗｉｔｈＬＣＰＬＵＳ、ＰＡＲＩＷＡＬＫＨＡＬＥＲＣｏｍｐｒｅｓｓｏｒ／ネブライザー系、ＰＡＲＩＬＣＰＬＵＳＲｅｕｓａｂｌｅネブライザー、及びＰＡＲＩＬＣＪｅｔ＋（登録商標）ネブライザーの名称でＢｌａｉｒｅｘ（登録商標）により販売されているものを含む。
【０２１４】
ネブライザーに使用される製剤は、液体のオリゴヌクレオチドから構成されてもよく、例えば無菌、パイロジェンフリー水、又は生理食塩水溶液、ここでオリゴヌクレオチドは、製剤の約４０％ｗ／ｗを占める。オリゴヌクレオチドは２０％ｗ／ｗ未満を占めることが好ましい。所望であれば、例えば保存料（例えば、ヒドロキシ安息香酸メチル）酸化防止剤、及び着香剤等の更なる添加物を組成物に加えてもよい。
【０２１５】
オリゴヌクレオチドを含む固体粒子も、当該技術分野にて周知の任意の固体粒子医薬エアゾルを使用してエアゾル化され得る。このようなエアゾル発生器は、上述したような呼吸に適した粒子を生成し、更にエアゾルの単位容積当たり再現可能な一定量を生成する。適切な固体微粒子エアゾル発生器には、吸入器及び定量噴霧器が含まれる。定量噴霧器は当該技術分野にて使用されており、本発明に有用である。
【０２１６】
好ましくは、液体又は固体のエアゾルは、約１０〜１５０リットル／分の速度で製造され、より好ましくは約３０〜１５０リットル／分、最も好ましくは約６０リットル／分の速度で製造される。
生物活性物質の高いバイオアベイラビリティも、本発明の組成物の経口投与、及び方法を介して達成される。
【０２１７】
他の成分
本発明の組成物は、更に医薬組成物中に、当該技術分野で確立されている使用レベルで慣習的に見られる他の補助成分を含有してもよい。従って、例えば、組成物は、更なる、適合性を有する、薬剤的に活性な物質、例えば、痒み止め薬、アストリンゼン、局所麻酔薬又は抗炎症薬を含有してもよいし、本発明の組成物を多様な剤形に物理的に調製する際に有用な、例えば色素、着香剤、保存剤、酸化防止剤、乳白剤、増粘剤及び安定剤等の更なる材料を含有してもよい。しかしながら、これらの材料は、添加された場合に、本発明の組成物成分の生物学的活性を過度に妨害しない必要がある。製剤は滅菌されてもよく、また所望であれば、製剤中の核酸（一種又は複数種）と有害な相互作用を起こさない、例えば滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝液、着色剤、着香及び／又は芳香物質、及び同様物のような補助剤を混合してもよい。
【０２１８】
水性懸濁液は、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール及び／又はデキストラン等の、該懸濁液の粘度を増大させる物質を含んでもよい。懸濁液は安定剤も含んでよい。
【０２１９】
本発明の一実施態様は、（ａ）一つ又は二つ以上のアンチセンス化合物と、（ｂ）非アンチセンス機構により機能する一つ又は二つ以上の他の化学療法薬とを含有する医薬組成物を提供する。このような化学療法薬の例は、ダウノルビシン、ダウノマイシン、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、エソルビシン（ｅｓｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ブレオマイシン、マフォスファミド、イホスファミド、シトシンアラビノシド、ビス−クロロエチルニトロウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ブスルファン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ミトラマイシン、プレドニゾン、ヒドロキシプロゲステロン、テストステロン、タモキシフェン、ダカルバジン、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、ミトキサントロン、アムサクリン、クロラムブシル、メチルシクロヘキシルニトロウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ナイトロジェンマスタード、メルファラン、シクロホスホアミド、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−アザシチジン、ヒドロキシウレア、デオキシコホルマイシン、４−ヒドロキシペロキシシクロホスホロアミド、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、５−フルオロデオキシウリジン（５−ＦＵｄＲ）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、コルヒチン、タキソール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド（ＶＰ−１６）、トリメトレキサート、イリノテカン、トポテカン、ゲムシタビン、テニポシド、シスプラチン及びジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）を含むが、これらに限定されるものではない。一般的には、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１５ｔｈ  Ｅｄ．１９８７、ｐｐ．１２０６−１２２８、Ｂｅｒｋｏｗ等、ｅｄｓ．、Ｒａｈｗａｙ、Ｎ．Ｊ．を参照されたい。本発明の化合物と共に使用する場合、このような化学療法薬は、個別に（例、５−ＦＵ及びオリゴヌクレオチド）、連続的に（例、一定期間５−ＦＵ及びオリゴヌクレオチド、続いてＭＴＸ及びオリゴヌクレオチド）、又は一つ又は二つ以上の他のそのような化学療法薬と組み合わせて（例、５−ＦＵ、ＭＴＸ及びオリゴヌクレオチド、又は５−ＦＵ、放射線療法及びオリゴヌクレオチド）使用され得る。非ステロイド系抗炎症薬及び副腎皮質ステロイドを含むがこれらに限定されない抗炎症薬、及びリビビリン、ビダラビン、アシクリビル及びガンシクロビルを含むがこれらに限定されない抗ウイルス薬も、本発明の組成物と組み合わせることができる。Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１５ｔｈ  Ｅｄ．、Ｂｅｒｋｏｗ等、ｅｄｓ．、１９８７、Ｒａｈｗａｙ、Ｎ．Ｊ．、２４９９−２５０６及び４６−４９ページ、各々）を参照されたい。他の非アンチセンス化学療法薬も、本発明の範囲内に含まれる。二種又は三種以上の組み合わせた化合物を一緒に、又は連続的に使用し得る。
【０２２０】
別の関連する一実施態様にて、本発明の組成物は、第一の核酸及び第二の核酸標的を標的とする一種又は二種以上の更なるアンチセンス化合物、特にオリゴヌクレオチド。二種又は三種以上のアンチセンス化合物は、一緒に又は連続的に使用され得る。
【０２２１】
投薬
投薬は治療するべき疾病状態の重症度及び感応性に依存する。治療の期間が数日〜数ヶ月継続するか、又は治癒するか、又は疾病状態が縮小される迄、最適な投薬計画は患者の身体内の薬物蓄積測定値から計算され得る。当業者は最適な投薬、投薬方法及び反復率を容易に決定することができる。
【０２２２】
以下の実施例は、本発明の例示であり、本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例１】
【０２２３】
オリゴヌクレオチドの合成
非修飾オリゴデオキシヌクレオチドをヨウ素で酸化した標準的なホスホロアミデートを使用して、自動ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ｍｏｄｅｌ  ３８０Ｂ）上で合成した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）からβ−シアノエチルジイソプロピル−ホスホロアミデートを購入した。Ｆｏｒホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのために、標準的な酸化ボトルを０．２Ｍ溶液のアセトニトリル中の３Ｈ−１、２−ベンゾジチオール−３−オン１、１−ジオキシドの０．２Ｍ溶液と交換し、亜リン酸エステル結合を段階的にチエート化（ｔｈｉａｔｉｏｎ）した。チエート化サイクル待機ステップは、６８秒に増大され、キャッピングステップが続いた。シトシンは、５−メチルシトシンであり得る（５−メチルデオキシシチジンホスホロアミデート、ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡ、又はＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪから入手可能）。
【０２２４】
２’−メトキシβ−シアノエチルジイソプロピル−ホスホロアミデート（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ、Ｎｅｅｄｈａｍ、ＭＡ）を使用して、２’−メトキシオリゴヌクレオチドを合成した。非修飾オリゴヌクレオチドのための標準的なサイクルは、テトラゾールのパルス送達後の待機ステップを除き、ベースを３６０秒に増加した。例えばＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ．、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡから入手可能な適切な２’−修飾アミダイトを使用して、この方法の変更によって他の２’−アルコキシオリゴヌクレオチドを合成した。
【０２２５】
Ｋａｗａｓａｋｉ等（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９３、３６、８３１−８４１）に記載されているようにして、２’−フルオロオリゴヌクレオチドを合成した。簡単に言えば、商業的に入手可能な９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンを出発物質として使用し、手順を変更することによって、３’、５’−ジテトラヒドロピラニル（ＴＨＰ）中間体と同様の適度の収率にて２’−ａ−フルオロ原子をＳＮ２−置換により２’−β−Ｏ−トリチル（ｔｒｉｆｙｌ）基を導入して、保護ヌクレオシドＮ６−ベンゾイル−２’−デオキシ−２’−フルオロアデノシンを合成した。このようにＮ６−ベンゾイル−９−β−Ｄ−アラビノフラノシルアデニンを選択的に保護した。ＴＨＰ及びＮ６−ベンゾイル基の脱保護は、標準的な方法体系により行い、また標準的な方法を使用して５’−ジメトキシトリチル−（ＤＭＴ）及び５’−ＤＭＴ−３’−ホスホロアミデート中間体を得た。
【０２２６】
テトライソプロピルジシロキサニル（ＴＰＤＳ）保護９−β−Ｄ−アラビノフラノシルグアニンを出発物質として使用し、中間体ジイソブチリルアラビノフラノシルグアノシンに転換することにより２’−デオキシ−２’−フルオログアノシンを合成した。ＴＰＤＳ基を脱保護し、次いでヒドロキシル基をＴＨＰで保護してジイソブチリルジ−ＴＨＰ保護アラビノフラノシルグアニンを得た。選択的なＯ−脱アシル化及びトリフレーション（ｔｒｉｆｌａｔｉｏｎ）の後、粗生成物をフッ化物で処理し、次いでＴＨＰ基を脱保護した。標準的な方法体系を使用して、５’−ＤＭＴ−及び５’−ＤＭＴ−３’−ホスホロアミダイを得た。
【０２２７】
２、２’−アンヒドロ−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルウラシルが７０％フッ化水素−ピリジンで処理される公知の手順である修飾によって、２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンを合成した。標準的な手順を使用して５’−ＤＭＴ及び５’−ＤＭＴ−３’ホスホロアミデートを得た。
【０２２８】
２’−デオキシ−２’−フルオロウリジンのアミノ化と、続く選択的な保護によりＮ４−ベンゾイル−２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンを得て２’−デオキシ−２’−フルオロシチジンを合成した。標準的な手順を使用して、５’−ＤＭＴ及び５’−ＤＭＴ−３’ホスホロアミデートを得た。
【０２２９】
Ｍａｒｔｉｎ、Ｐ．（Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １９９５、７８、４８６−５０６）に従って、２’−（２−メトキシエチル）−修飾アミダイトを合成した。合成を容易にするために、最後のヌクレオチドはデオキシヌクレオチドであり得る。２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３−シトシンは、５−メチルシトシンであり得る。
【０２３０】
５−メチルシトシンモノマーの合成：
２、２’−アンヒドロ［１−（β−Ｄ−アラビノフラノシル）−５−メチルウリジン］：
５−メチルウリジン（リボシルチミン、Ｙａｍａｓａ、Ｃｈｏｓｈｉ、Ｊａｐａｎを介して商業的に入手可能な）（７２．０ｇ、０．２７９Ｍ）、ジフェニルカーボネート（９０．０ｇ、０．４２０Ｍ）及び重炭酸ナトリウム（２．０ｇ、０．０２４Ｍ）をＤＭＦ（３００ｍＬ）に加えた。混合物を攪拌しながら加熱還流して、発生した二酸化炭素を制御下で放出させた。１時間後、僅かに暗化した溶液を減圧濃縮した。得られたシロップを攪拌しながらジエチルエーテル（２．５Ｌ）中に注いだ。生成物はゴム状物を形成した。エーテルを傾けて除去し、残基を少量のメタノール中に溶解した（約４００ｍＬ）。溶液を新鮮なエーテル（２．５Ｌ）内に注いで、堅いゴム状物を得た。エーテルを傾けて除去し、ゴム状物をオーブン中で乾燥して（６０°Ｃで１ｍｍＨｇにて２４時間）固体を得、これは粉砕して明るい黄褐色粉末となった（５７ｇ、８５％粗収率。この材料をそのまま次の反応に使用した。
【０２３１】
２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン：
２、２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１９５ｇ、０．８１Ｍ）、トリス（２−メトキシエチル）ボレート（ｂｏｒａｔｅ）（２３１ｇ、０．９８Ｍ）及び２−メトキシエタノール（１．２Ｌ）を、２Ｌステンレス鋼の圧力容器に加え、１６０℃の予め加熱した油浴中に配置した。１５５〜１６０°Ｃで４８時間加熱した後、容器を開放して溶液を乾燥するまで蒸発させ、ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）で粉砕した。残留物を熱アセトン（１Ｌ）中に懸濁させた。不溶の塩をろ過し、アセトン（１５０ｍＬ）で洗浄し、ろ液を蒸発させた。残留物（２８０ｇ）をＣＨ３ＣＮ（６００ｍＬ）中に溶解し、蒸発させた。シリカゲルカラム（３ｋｇ）を、５％Ｅｔ３ＮＨを含有するＣＨ２Ｃｌ２／アセトン／ＭｅＯＨ（２０：５：３）中に充填した。残留物をＣＨ２Ｃｌ２（２５０ｍＬ）中に溶解し、カラムに充填する前にシリカ（１５０ｇ）上に吸着させた。生成物を溶媒で溶出して、１６０ｇ（６３％）の生成物を得た。
【０２３２】
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン：
２’−Ｏ−メトキシエチル−５−メチルウリジン（１６０ｇ、０．５０６Ｍ）をピリジン（２５０ｍＬ）と共蒸発させ、乾燥した残留物をピリジン（１．３Ｌ）中に溶解した。塩化ジメトキシトリチル（９４．３ｇ、０．２７８Ｍ）の第一のアリコートを加え、混合物を室温で１時間攪拌した。塩化ジメトキシトリチル（９４．３ｇ、０．２７８Ｍ）の第二のアリコートを加え、反応物を更に１時間攪拌した。次いでメタノール（１７０ｍＬ）を加えて反応を停止させた。ＨＰＬＣは約７０％の生成物の存在を示した。溶媒を蒸発させ、ＣＨ３ＣＮ（２００ｍＬ）で粉砕した。残留物をＣＨＣｌ３（１．５Ｌ）中に溶解し、２ｘ５００ｍＬの飽和ＮａＨＣＯ３及び２ｘ５００ｍＬの飽和ＮａＣｌで抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥し、ろ過し、蒸発させた。２７５ｇの残留物を得た。残留物をｐａｃｋした３．５ｋｇシリカゲルカラム上で、０．５％Ｅｔ３ＮＨを含有するＥｔＯＡｃ／ヘキサン／アセトン（５：５：１）で溶出して精製した純粋な画分を蒸発させて生成物１６４ｇを得た。不純な画分から更に約２０ｇを得、全収率は１８３ｇ（５７％）であった。
【０２３３】
３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−ウリジン：
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−ウリジン（１０６ｇ、０．１６７Ｍ）、ＤＭＦ／ピリジン（５６２ｍＬのＤＭＦ及び１８８ｍＬのピリジンから調製した７５０ｍＬの３：１混合物）及び無水酢酸（ａｃｅｔｉｃａｎｈｙｄｒｉｄｅ）（２４．３８ｍＬ、０．２５８Ｍ）を一緒にして、室温で２４時間攪拌した。最初にＭｅＯＨを加えることによってｔｌｃ標本をクエンチし、反応物をｔｌｃで監視した。ｔｌｃによる判断によって反応が完了したら、ＭｅＯＨ（５０ｍＬ）を加え、混合物を３５℃で蒸発させた。残留物をＣＨＣｌ３（８００ｍＬ）中に溶解し、２ｘ２００ｍＬの飽和中炭酸ナトリウム及び２ｘ２００ｍＬの飽和ＮａＣｌで抽出した。水層を２００ｍＬのＣＨＣｌ３で逆抽出した。一緒にした有機物を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発させて残留物１２２ｇ（約９０％生成物）を得た。残留物を３．５ｋｇシリカゲルカラム上で精製し、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（４：１）を使用して溶出した。純粋な生成物画分（画分ｓ）を蒸発させて、９６ｇ（８４％）を得た。
【０２３４】
３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン：
３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルウリジン（９６ｇ、０．１４４Ｍ）をＣＨ３ＣＮ（７００ｍＬ）中に溶解して第一の溶液を調製し、とっておいた。トリエチルアミン（１８９ｍＬ、１．４４Ｍ）ＣＨ３ＣＮ（１Ｌ）中のトリアゾール（９０ｇ、１．３Ｍ）溶液に加え、−５°Ｃに冷却し、オーバーヘッドスターラーを用いて０．５時間攪拌した。０−１０°Ｃに保持した攪拌溶液にＰＯＣｌ３を３０分間かけて滴加し、得られた混合物を更に２時間攪拌した。後者の溶液に、第一の溶液を４５分間かけて滴加した。得られた反応混合物を一夜、冷室内に貯蔵した。反応混合物から塩をろ過し、溶液を蒸発させた。残留物をＥｔＯＡｃ（１Ｌ）中に溶解し、不溶固体をろ過して除去した。ろ液を１ｘ３００ｍＬのＮａＨＣＯ３及び２ｘ３００ｍＬの飽和ＮａＣｌで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発させた。残留物をＥｔＯＡｃで粉砕して表題の化合物を得た。
【０２３５】
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン：
３’−Ｏ−アセチル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−４−トリアゾールウリジン（１０３ｇ、０．１４１Ｍ）のジオキサン（５００ｍＬ）及びＮＨ４ＯＨ（３０ｍＬ）溶液を、室温で２時間攪拌した。ジオキサン溶液を蒸発させ、残留物をＭｅＯＨ（２ｘ２００ｍＬ）と共沸させた。残留物をＭｅＯＨ（３００ｍＬ）中に溶解し、２リットルのステンレス鋼圧力容器に移動した。ＮＨ３ガスで飽和させたＭｅＯＨ（４００ｍＬ）を加え、容器を２時間かけて１００°Ｃに加熱した（ｔｌｃは完全な転換を示した。）。容器の内容物を乾燥するまで蒸発させ、残留物をＥｔＯＡｃ（５００ｍＬ）中に溶解し、飽和ＮａＣｌ（２００ｍＬ）で一回洗浄した。有機物を硫酸ナトリウム上で乾燥し、溶媒を蒸発させて８５ｇ（９５％）の表題の化合物を得た。
【０２３６】
Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−シチジン：
２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−シチジン（８５ｇ、０．１３４Ｍ）をＤＭＦ（８００ｍＬ）中に溶解し、無水安息香酸（３７．２ｇ、０．１６５Ｍ）を攪拌しながら加えた。３時間攪拌した後、ｔｌｃでは反応が約９５％完了したことが示された。溶媒を蒸発させ、残留物をＭｅＯＨ（２００ｍＬ）と共沸させた。残留物をＣＨＣｌ３（７００ｍＬ）中に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３（２ｘ３００ｍＬ）及び飽和ＮａＣｌ（２ｘ３００ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ４上で乾燥して残留物（９６ｇ）を得た。残留物を、０．５％Ｅｔ３ＮＨを含有するＥｔＯＡｃ／ヘキサン（１：１）で溶出する１．５ｋｇシリカゲルカラムのクロマトグラフィーにかけた。純粋な生成物画分を蒸発させて、９０ｇ（９０％）の表題の化合物を得た。
【０２３７】
Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチルシチジン−３’−アミダイト：
Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メトキシエチル−５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−５−メチル−シチジン（７４ｇ、０．１０Ｍ）を、ＣＨ２Ｃｌ２（１Ｌ）中に溶解した。テトラゾールジイソプロピルアミン（７．１ｇ）及び２−シアノエトキシ−テトラ−（イソプロピル）ホスファイト（４０．５ｍＬ、０．１２３Ｍ））を、窒素雰囲気下で攪拌しながら加えた。得られた混合物を室温で２０時間攪拌した（ｔｌｃでは反応が９５％完了したことが示された）。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ３（１ｘ３００ｍＬ）及び飽和ＮａＣｌ（３ｘ３００ｍＬ）で抽出した。水性洗浄物をＣＨ２Ｃｌ２（３００ｍＬ）で逆抽出し、抽出物を一緒にして、ＭｇＳＯ４上で乾燥し、濃縮した。得られた残留物を、ＥｔＯＡｃ：ヘキサン（３：１）を溶出溶媒として使用する１．５ｋｇシリカカラム上のクロマトグラフィーにかけた。純粋な画分を一緒にして、９０．６ｇ（８７％）の表題の化合物を得た。
【０２３８】
５−メチル−２’−デオキシシチジン（５−ｍｅ−Ｃ）を含むオリゴヌクレオチドを、商業的に入手可能なホスホロアミデート（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  ＶＡ又はＣｈｅｍ  Ｇｅｎｅｓ、Ｎｅｅｄｈａｍ  ＭＡ）を使用して、刊行された方法（Ｓａｎｇｈｖｉ等、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１９９３、２１、３１９７−３２０３）に従って合成した。
【０２３９】
２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイト
２’−（ジメチルアミノオキシエトキシ）ヌクレオシドアミダイト［２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）ヌクレオシドアミダイトとしても公知の］を以下のパラグラフに記述するように製造した。アミンを、アデノシン及びシチジンの場合はベンゾイル部分で、グアノシンの場合はイソブチリルで保護した以外は、チミジン（５−メチルウリジン）と同様にアデノシン、シチジン及びグアノシンヌクレオシドアミダイトを製造した。
【０２４０】
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｏ２−２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン
Ｏ２−２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（Ｐｒｏ．Ｂｉｏ．Ｓｉｎｔ．、Ｖａｒｅｓｅ、Ｉｔａｌｙ、１００．０ｇ、０．４１６ｍｍｏｌ）、ジメチルアミノピリジン（０．６６ｇ、０．０１３ｅｑ、０．００５４ｍｍｏｌ）を周囲温度にてアルゴン雰囲気下で、機械的に攪拌しながら乾燥ピリジン（５００ｍｌ）中に溶解した。ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルクロロシラン（１２５．８ｇ、１１９．０ｍＬ、１．１ｅｑ、０．４５８ｍｍｏｌ）を一度に加えた。反応物を１６時間、周囲温度にて攪拌した。ＴＬＣ（Ｒｆ０．２２、酢酸エチル）では、反応が完了したことが示された。溶液を減圧濃縮して、濃厚な油状物を得た。これをジクロロメタン（１Ｌ）及び飽和重炭酸ナトリウム（２ｘ１Ｌ）並びにブライン（１Ｌ）間に分割した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧濃縮して濃厚な油状物を得た。この油状物を酢酸エチル及びエチルエーテル（６００ｍＬ）の１：１混合物中に溶解し、溶液を−１０℃に冷却した。得られた結晶生成物をろ過して収集し、エチルエーテル（３ｘ２００ｍＬ）で洗浄し、乾燥して（４０℃、１ｍｍＨｇ、２４ｈ）１４９ｇ（７４．８％）の白色固体を得た。ＴＬＣ及びＮＭＲは、純粋な生成物と一致した。
【０２４１】
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５−メチルウリジン
２Ｌステンレス鋼内にて、非撹拌加圧反応器に、テトラヒドロフラン（１．０Ｍ、２．０ｅｑ、６２２ｍＬ）中のボランを加えた。ドラフト内で手動で撹拌して、最初にエチレングリコール（３５０ｍＬ、過剰量）を、水素ガスの発生が沈下するまで注意深く加えた。５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−Ｏ２−２’−アンヒドロ−５−メチルウリジン（１４９ｇ、０．３１１ｍｏｌ）及び重炭酸ナトリウム（０．０７４ｇ、０．００３ｅｑ）を手動で攪拌しながら加えた。反応器を密封し、内部温度が１６０℃に到達するまで、油浴中で加熱し、その後、１６時間保持した（圧力＜１００ｐｓｉｇ）。反応容器を周囲温度に冷却し、開放した。ＴＬＣ（所望の生成物のＲｆ０．６７、ａｒａ−Ｔｓｉｄｅ生成物のＲｆ０．８２、酢酸エチル）は、生成物の約７０％の転換を示した。更なる副生物の形成を回避するため、反応を停止させ、温浴中で、エチレングリコールを除去するより過酷な条件下で、減圧濃縮した（１０〜１ｍｍＨｇ）（４０〜１００℃）。［代表的に、低沸騰溶媒を除去した後、残留溶液を酢酸エチル及び水間に分割してもよい。生成物は有機相に移る。］残留物をカラムクロマトグラフィー（２ｋｇシリカゲル、酢酸エチル−ヘキサン勾配１：１〜４：１）で生成した。適切な画分を一緒にして、揮散させ、乾燥して生成物を白色の砕けやすい発泡体（８４ｇ、５０％）、不純物を含む出発物質（１７．４ｇ）及び純粋な再使用可能な出発物質２０ｇを得た。出発物質に基づく純粋な回収出発物質の収率は５８％であった。ＴＬＣ及びＮＭＲは９９％純粋な生成物と一致した。
【０２４２】
２’−Ｏ−（［２−フタルイミドキシ）エチル］−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジン
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−（２−ヒドロキシエチル）−５−メチルウリジン（２０ｇ、３６．９８ｍｍｏｌ）を、トリフェニルホスフィン（１１．６３ｇ、４４．３６ｍｍｏｌ）及びＮ−ヒドロキシフタルイミド（７．２４ｇ、４４．３６ｍｍｏｌ）と混合した。次いでこれを４０℃で２日間、高真空下でＰ２Ｏ５上にて乾燥した。反応混合物をアルゴンでフラッシュし、乾燥ＴＨＦ（３６９ｍＬ、Ａｌｄｒｉｃｈ、ｓｕｒｅｓｅａｌ  ｂｏｔｔｌｅ）を加えて透明な溶液を得た。反応混合物に、ジエチルアゾジカルボキシレート（６．９８ｍＬ、４４．３６ｍｍｏｌ）を滴加した。滴加の速度は、丁度次の滴加の前に暗赤色が消える速度で行われた。滴加が完了した後、反応物を４時間撹拌した。その時点でＴＬＣは反応の完了を示した（酢酸エチル：ヘキサン、６０：４０）。溶媒を真空蒸発させた。得られた残留物をフラッシュカラム上に配置し、酢酸エチル：ヘキサン（６０：４０）で溶出して、２’−Ｏ−（［２−フタルイミドオキシ）エチル］−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジンを白色発泡体（２１．８１９、８６％）として得た。
【０２４３】
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［（２−ホルムアドキシイミノオキシ（ｆｏｒｍａｄｏｘｉｍｉｎｏｏｘｙ））エチル］−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−（［２−フタルイミドオキシ）エチル］−５’−ｔ−ブチルジフェニルシリル−５−メチルウリジン（３．１ｇ、４．５ｍｍｏｌ）を乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（４．５ｍＬ）中に溶解し、メチルヒドラジン（３００ｍＬ、４．６４ｍｍｏｌ）を−１０℃〜０℃で滴加した。１時間後、混合物をろ過し、ろ液を氷冷ＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、一緒にした有機相を水、ブラインで洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥した。溶液を濃縮して２’−Ｏ−（アミノオキシエチル）チミジンを得、次いでこれをＭｅＯＨ（６７．５ｍＬ）中に溶解した。ここにホルムアルデヒド（２０％水溶液、ｗ／ｗ、１．１ｅｇ）を加え、混合物を１時間攪拌した。溶媒を真空除去し、残留物をクロマトグラフィーにかけて、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［（２−ホルムアドキシイミノオキシ）エチル］−５−メチルウリジンを白色発泡体（１．９５、７８％）として得た。
【０２４４】
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル］−５−メチルウリジン
５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［（２−ホルムアドキシイミノオキシ）エチル］−５−メチルウリジン（１．７７ｇ、３．１２ｍｍｏｌ）を、乾燥ＭｅＯＨ（３０．６ｍＬ）中の１Ｍピリジニウムｐ−トルエンスルホネート（ＰＰＴＳ）溶液中に溶解した。この溶液に、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（０．３９ｇ、６．１３ｍｍｏｌ）を１０℃にて不活性雰囲気下で加えた。反応混合物を１０℃で１０分間攪拌した。その後、反応容器を氷浴から除去し、室温で２時間攪拌し、反応物をＴＬＣ（５％ＭｅＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２中）で監視した。ＮａＨＣＯ３水溶液（５％、１０ｍＬ）を加え、酢酸エチル（２ｘ２０ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル相を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、乾燥するまで蒸発させた。残留物をＭｅＯＨ（３０．６ｍＬ）中の１ＭＰＰＴＳ溶液に溶解した。ホルムアルデヒド（２０％ｗ／ｗ、３０ｍＬ、３．３７ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で１０分間攪拌した。反応混合物を氷浴中で１０℃に冷却し、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（０．３９ｇ、６．１３ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を１０℃で１０分間攪拌した。１０分後、反応混合物を氷浴から除去し、室温で２時間攪拌した。この反応混合物に５％ＮａＨＣＯ３（２５ｍＬ）溶液を加え、酢酸エチル（２ｘ２５ｍＬ）で抽出した。酢酸エチル層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、乾燥するまで蒸発させた。得られた残留物をカラムクロマトグラフィーで精製し、ＣＨ２Ｃｌ２中の５％ＭｅＯＨで溶出して、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル］−５−メチルウリジンを白色発泡体（１４．６ｇ、８０％）として得た。
【０２４５】
２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン
トリエチルアミントリヒドロフルオライド（３．９１ｍＬ、２４．０ｍｍｏｌ）を乾燥ＴＨＦ及びトリエチルアミン（１．６７ｍＬ、１２ｍｍｏｌ、乾燥、ＫＯＨ上で保持）中に溶解した。次いでこのトリエチルアミン−２ＨＦ混合物を、５’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル−２’−Ｏ−［Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル］−５−メチルウリジン（１．４０ｇ、２．４ｍｍｏｌ）に加え、室温で２４時間攪拌した。反応物をＴＬＣ（５％ＭｅＯＨ、ＣＨ２Ｃｌ２中）で監視した。溶媒を減圧除去し、残留物をフラッシュカラム上に配置し、ＣＨ２Ｃｌ２中の１０％ＭｅＯＨで溶出して２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（７６６ｍｇ、９２．５％）を得た。
【０２４６】
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン
２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（７５０ｍｇ、２．１７ｍｍｏｌ）をＰ２Ｏ５上で、４０℃の高速真空下で乾燥した。次いでこれを無水ピリジン（２０ｍＬ）と共蒸発させた。得られた残留物を、アルゴン雰囲気下でピリジン（１１ｍＬ）中に溶解した。混合物に４−ジメチルアミノピリジン（２６．５ｍｇ、２．６０ｍｍｏｌ）、４、４’−ジメトキシトリチルクロリド（８８０ｍｇ、２．６０ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を出発物質が全て消失するまで室温で攪拌した。真空下でピリジンを除去し、残留物をクロマトグラフィーにかけ、ＣＨ２Ｃｌ２中の１０％ＭｅＯＨ（数滴のピリジンを含有する）で溶出して、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノ−オキシエチル）−５−メチルウリジン（１．１３ｇ、８０％）を得た。
【０２４７】
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミデート］
５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン（１．０８ｇ、１．６７ｍｍｏｌ）を、トルエン（２０ｍＬ）と共蒸発させた。残留物にＮ、Ｎ−ジイソプロピルアミンテトラｚｏｎｉｄｅ（０．２９ｇ、１．６７ｍｍｏｌ）を加え、Ｐ２Ｏ５上で、４０℃の高真空下で乾燥した。その後、反応混合物を無水アセトニトリル（８．４ｍＬ）中に溶解し、２−シアノエチル−Ｎ、Ｎ、Ｎ１、Ｎ１−テトライソプロピルホスホロアミデート（２．１２ｍＬ、６．０８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、不活性雰囲気下で、周囲温度にて４時間攪拌した。反応の進行はＴＬＣ（ヘキサン：酢酸エチル１：１）で監視した。溶媒を蒸発させた後、残留物を酢酸エチル（７０ｍＬ）中に溶解し、５％ＮａＨＣＯ３（４０ｍＬ）水溶液で洗浄した。酢酸エチル層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥し、濃縮した。得られた残留物をクロマトグラフィーにかけ（溶離液として酢酸エチルを使用）、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−（２−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノオキシエチル）−５−メチルウリジン−３’−［（２−シアノエチル）−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルホスホロアミデート］を白色発泡体（１．０４ｇ、７４．９％）として得た。
【０２４８】
メチレン（メチルイミノ）（ＭＭＩ）バックボーンを有するオリゴヌクレオチドを、本発明の譲受人に共譲渡され、全容が参照して本願明細書に組み入れられる米国特許第５、３７８、８２５号に従って合成した。合成を容易にするため、ＭＭＩ結合を含む様々なヌクレオシド二量体を合成し、オリゴヌクレオチドに組み入れた。他の窒素−含有バックボーンを、本発明の譲受人に共譲渡され、全容が参照して本願明細書に組み入れられるＷＯ９２／２０８２３号に従って合成した。
【０２４９】
アミドバックボーンを有するオリゴヌクレオチドを、Ｄｅ  Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ等（Ａｃｃ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９５、２８、３６６−３７４）に従って合成した。アミド部分は単純かつ周知の合成方法により容易に接近可能で、オリゴヌクレオチドの固相合成に必要な条件に適合性を有する。
【０２５０】
モルホリノバックボーンを有するオリゴヌクレオチドを、米国特許第５、０３４、５０６号（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ及びＷｅｌｌｅｒ）に従って合成した。
ペプチド−核酸（ＰＮＡ）オリゴマーをＰ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎｅｔａｌ（Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９１、２５４、１４９７−１５００）に従って合成した。
【０２５１】
多孔質ガラスカラム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から切断し、濃縮水酸化アンモニウム中で５５℃で１８時間脱保護した後、オリゴヌクレオチドを、２．５容量のエタノールを伴う０．５ＭＮａＣｌから沈殿させて精製した。合成したオリゴヌクレオチドを、変性ゲル上のポリアクリルアミドゲル電気泳動、又はキャピラリゲル電気泳動で分析し、材料の完全長の少なくとも８５％になる迄判定した。合成にて得られたホスホロチオエート及びホスホジエステル結合の相対量を、３１Ｐ核磁気共鳴分光法により周期的に調べ、Ｃｈｉａｎｇ等（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１、２６６、１８１６２）に記載されているような、いくつかの研究用にオリゴヌクレオチドをＨＰＬＣで精製した。得られたＨＰＬＣ−精製材料は、非−ＨＰＬＣ精製材料で得られたものと同様であった。
【０２５２】
代替的に、標準的な９６−ウエルフォーマット内で９６配列を同時に組立可能な自動合成機上で、固相Ｐ（ＩＩＩ）ホスホロアミデート化学を用いてオリゴヌクレオチドを９６−ウエルプレートのフォーマットにより合成した。水性ヨウ素で酸化して、ホスホジエステルヌクレオチド間結合を得た。ホスホロチオエートヌクレオチド間結合は、無水アセトニトリル中の３、Ｈ−１、２ベンゾジチオール−３−オン１、１ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ）を使用した硫化により生成した。標準的な塩基−保護β−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミデートは、販売者（例、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、又はＰｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から購入した。非標準的なヌクレオシドは、公表された方法を使用して合成した。これらを塩基保護β−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミデートとして使用した。
【０２５３】
オリゴヌクレオチドを担体から切断し、濃縮ＮＨ４ＯＨで高温にて（５５〜６０°Ｃ）１２〜１６時間、脱保護した後、解放した生成物を真空乾燥した。次いで乾燥生成物を無菌水中に再懸濁させてマスタープレートを得、これをロボットピペッターを用いて希釈して全分析及び試験プレート標本を得た。
【実施例２】
【０２５４】
ヒトＳＴＡＴ３オリゴデオキシヌクレオチド配列
アンチセンスオリゴヌクレオチドを、ヒトＳＴＡＴ３を標的とするよう設計した。標的配列のデータは、Ａｋｉｒａ、Ｓ．等（Ｃｅｌｌ、１９９４、７７、６３−７１）（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号Ｌ２９２７７、本願明細書に配列番号１として提供する。）から公表されたＡＰＲＦｃＤＮＡ配列から得た。ホスホロチオエート結合を有する一連のオリゴデオキシヌクレオチドを合成した。２’−デオキシシトシンは５−メチルシトシンであった。これらオリゴヌクレオチド配列を、表１に示す。オリゴヌクレオチドの更なるセットを、１０個の２’−デオキシヌクレオチドからなる中央「ギャップ」領域を含む２０個のヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）として合成した。同キメラオリゴヌクレオチドは、両側（５’及び３’方向）に５個のヌクレオチドの「ウイング」が存在する。「ウイング」は２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成されている。ヌクレオシド間（バックボーン）結合は、オリゴヌクレオチド全体を通してホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。２’−ＭＯＥシトシン及び２’−デオキシシトシンの全ては、５−メチル−シトシンであった。これらのオリゴヌクレオチド配列を表２に示す。
【０２５５】
インビトロでの研究により、ＳＴＡＴ３を高いレベルで発現する適切な細胞ラインを選択した。細胞培養条件は、その特定の細胞ラインに標準的なものである。オリゴヌクレオチド処理は４時間行い、ｍＲＮＡは通常最初の処理から２４〜４８時間後に単離された。ｍＲＮＡはＲＮＡＥＡＳＹ７キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ、ＣＡ）を使用して単離した。
【０２５６】
表１
ヒトＳＴＡＴ３ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドのヌクレオチド配列
【表１】
0005507617.tif 000023
【表２】
0005507617.tif 000024
【表３】
0005507617.tif 000025
【表４】
0005507617.tif 000026
１「Ｃ」残基は５−メチル−シトシンである、全結合はホスホロチオエート結合である。
２ ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号Ｌ２９２７７、遺伝子座名「ＨＵＭＡＰＲＦ」、配列番号１からコーディネート。
【０２５７】
表２
ヒトＳＴＡＴ３キメラ（デオキシギャップ）ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
【表５】
0005507617.tif 000027
【表６】
0005507617.tif 000028
【表７】
0005507617.tif 000029
【表８】
0005507617.tif 000030
１ 太字の残基は、２’−メトキシエトキシ残基である。２’−メトキシエトキシシトシン残基及び２’−ＯＨシトシン残基は、５−メチル−シトシンである。全結合はホスホロチオエート結合である。
２ ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号Ｌ２９２７７、遺伝子座名「ＨＵＭＡＰＲＦ」、配列番号１からコーディネート。
【０２５８】
オリゴヌクレオチド活性は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を使用したリアルタイムＰＣＲによって、製造業者の指示に従い、ＳＴＡＴ３  ｍＲＮＡレベルの定量によりアッセイした。これは閉鎖管、非ゲルベースの、蛍光検出システムであり、リアルタイムでポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成物を高スループット定量できる。ＰＣＲが完了した後に増幅精製物を定量する標準的なＰＣＲとは対照的に、リアルタイムＰＣＲ生成物を蓄積と同時に定量する。これはＰＣＲ反応に、フォワードとリバースＰＣＲプライマー間を特異的にアニールし、二種の蛍光色素を含有するオリゴヌクレオチドプローブを含めることによって達成される。レポーター色素（例、ＪＯＥ又はＦＡＭ、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）はプロ−ブの５’末端に取り付けられ、消光色素（例、ＴＡＭＲＡ又はＭＧＢ、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）はプロ−ブの３’末端に取り付けられる。プローブ及び色素が無傷（ｉｎｔａｃｔ）の場合、レポーター色素発光は、３’消光色素の近接によりクエンチされる。増幅中、プロ−ブの標的配列へのアニーリングにより、Ｔａｑポリメラーゼの５’−エキソヌクレアーゼ活性により切断され得る基質が形成される。ＰＣＲ増幅周期の延長期中、Ｔａｑポリメラーゼによるプローブの切断により、プロ−ブの残留部分から（従って消光部分から）レポーター色素が放出され、配列特異的な蛍光シグナルが生成される。各周期にて、更なるレポーター色素分子が各プローブから切断され、蛍光強度がＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  （登録商標）７７００Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ内に組み込まれたレーザー光学機械により、規則的（６秒）間隔で監視される。各アッセイでは、未処理対照標本からの一連の希釈ｍＲＮＡを含む一連のパラレル反応が、試験標本のアンチセンスオリゴヌクレオチド処理後の抑制パーセントの定量に使用される標準曲線を生成する。
【０２５９】
単離したＲＮＡを、最初に逆転写酵素反応にかけ、ＲＮＡから相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を調製する。得られたｃＤＮＡはリアルタイムＰＣＲのための基質である。逆転写酵素及びリアルタイムＰＣＲ試薬はＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡから得た。反応は２５μｌＰＣＲカクテル（１ｘＴＡＱＭＡＮ７緩衝液Ａ、５．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、各３００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ、６００μＭのｄＵＴＰ、各１００ｎＭのフォワードプライマー、リバースプライマー及びプロ−ブ、２０ＵＲＮＡｓｅインヒビター、１．２５単位のＡＭＰＬＩＴＡＱ  ＧＯＬＤ７、及び１２．５ＵＭｕＬＶ逆転写酵素）を、２５μｌｐｏｌｙ（Ａ）ｍＲＮＡ溶液を含む９６−ウエルプレートに加えることにより実施した。逆転写酵素反応は、９５℃で１０分間のインキュベーション、次いで４８℃で３０分間のインキュベーションによりＡＭＰＬＩＴＡＱ  ＧＯＬＤ７を活性化し、９５℃で１５秒（変性）、次いで６０℃で１．５分間（アニーリング／延長）の二ステップＰＣＲプロトコールの４０周期を実施した。
ＳＴＡＴ３ＰＣＲプライマー及びプロ−ブは、市販のソフトウエア（例、Ｏｌｉｇｏ５．０又はＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標））を使用して設計し得る。
【実施例３】
【０２６０】
マウスＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチド配列
アンチセンスオリゴヌクレオチドを、マウスＳＴＡＴ３を標的とするよう設計した。標的配列のデータは、Ｚｈｏｎｇ、Ｚ．、（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号Ｕ０６９２２、本願明細書に配列番号８２として提供する。）により提出されたＳＴＡＴ３ｃＤＮＡ配列から得た。オリゴヌクレオチド１０個の２’−デオキシヌクレオチドからなる中央「ギャップ」領域を含む２０個のヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー（ｇａｐｍｅｒｓ）」）として合成した。同キメラオリゴヌクレオチドは、両側（５’及び３’方向）に５個のヌクレオチドの「ウイング」が存在する。「ウイング」は２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成されている。ヌクレオシド間（バックボーン）結合は、オリゴヌクレオチド全体を通してホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全２’−ＭＯＥシトシンは、５−メチル−シトシンである。オリゴヌクレオチド配列を表３に示す。
【０２６１】
Ｂリンパ腫細胞ライン、ＢＣＬ１をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得た。ＢＣＬ１細胞をＲＰＭＩ１６４０培地にて標準的な条件下で培養した。
ＢＣＬ１細胞（ＰＢＳ中５Ｘ１０６細胞）にＢＴＸ  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ（登録商標）６００（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用した電気穿孔により、２００Ｖ、１０００μＦにて、オリゴヌクレオチドを移入した。最初のスクリーニングにて、ＢＣＬ１細胞は１０μＭオリゴヌクレオチドを電気穿孔され、２４時間後、ＲＮＡを収集した。オリゴヌクレオチドを含まない対照標本を、同一の電気穿孔条件にかけた。
【０２６２】
ＲＮＥＡＳＹ７（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ、ＣＡ）を使用して総細胞ＲＮＡを単離した。ＲＩＢＯＱＵＡＮＴ（登録商標）キット及びテンプレートのセットを使用して、製造業者の指示に従い（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）ＲＮＡｓｅ保護実験を行った。ｐｓｖｓｐｏｒｔ−１プラスミド（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）のＸｈｏＩ／ＳａｌＩ制限消化で調製されたラットｃＤＮＡプロ−ブを使用して、Ｃｈｉａｎｇ、Ｍ−Ｙ．等（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９１、２６６、１８１６２−１８１７１）に記載されたノーザンブロッティングを実行した。ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して、ｍＲＮＡレベルを定量した。
【０２６３】
表３
マウスＳＴＡＴ３キメラ（デオキシギャップ）ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドのヌクレオチド配列
【表９】
0005507617.tif 000031
１ 全２’−ＭＯＥシトシン残基は、５−メチル−シトシンである。全結合はホスホロチオエート結合である。
２ ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号Ｕ０６９２２、遺伝子座名「ＭＭＵ０６９２２」、配列番号８２からコーディネート。
【０２６４】
結果を表４に示す。オリゴヌクレオチド１７１３８（配列番号８５）、１７１３９（配列番号８６）、１７１４０（配列番号８７）、１７１４３（配列番号９０）、１７１４４（配列番号９１）、１７１５２（配列番号９９）、１７１５３（配列番号１００）、１７１５６（配列番号１０３）、及び１７１５７（配列番号１０４）は、このアッセイにて４５％を越える抑制を示した。
【０２６５】
表４
ＢＣＬ１細胞における、キメラ（デオキシギャップ）ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるマウスＳＴＡＴ３ｍＲＮＡ発現の抑制
【表１０】
0005507617.tif 000032
【実施例４】
【０２６６】
ＢＣＬ１細胞における、マウスＳＴＡＴ３タンパク質レベル上のアンチセンスキメラ（デオキシギャップ）ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの効果の用量応答
ＩＳＩＳ１７１５２（配列番号９９）を更なる研究のために選択した。このオリゴヌクレオチドのタンパク質レベル上の効果を、ウエスタンブロット法により測定した。ＩＳＩＳ２３１７７（配列番号１０６）、３塩基ミスマッチ、を対照として使用した。ＢＣＬ１細胞を増殖させ、本質的に実施例３に記載したように処理及び加工した。
【０２６７】
Ｋａｒｒａｓ、Ｊ．Ｇ．等（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９９７、１８５、１０３５−１０４２）に記載されているように、初期Ｂ細胞及びＢリンパ腫細胞ラインから核抽出物を調製した。
Ｋａｒｒａｓ、Ｊ．Ｇ．等（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６、１５７、２２９９）に記載されているように、ウエスタンブロッテッィングを実行した。ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ３抗体はＵＢＩ（ＬａｋｅＰｌａｃｉｄ、ＮＹ）から得た。
結果を表５に示す。ＩＳＩＳ１７１５２（配列番号９９）は、ミスマッチ対照と比較してＳＴＡＴ３タンパク質レベルを有意に低下させた。
【０２６８】
表５
ＳＴＡＴ３キメラ（デオキシギャップ）ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドに対するＢＣＬ１細胞の用量応答
【表１１】
0005507617.tif 000033
【実施例５】
【０２６９】
ＳＴＡＴ３アンチセンスキメラ（デオキシギャップ）ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるＢＣＬ１増殖の抑制
ＩＳＩＳ１７１５２（配列番号９９）のＢＣＬ１増殖上の効果を測定した。ＢＣＬ１細胞は、その増殖の原因と考えられる恒常的に活性化したＳＴＡＴ３を含んでいた。ＢＣＬ１細胞（１×１０５）に、本質的に実施例３に記載されたように、１０ｎｍ、１５ｎｍ又は２０ｎｍのＳＴＡＴ３（ＩＳＩＳ１７１５２）又はミスマッチ（ＩＳＩＳ２３１７７）オリゴヌクレオチドを電気穿孔した。電気穿孔から４８時間後、細胞を９６−ウエルプレート内で、２００μＬ完全ＲＰＭＩ中にてインキュベートした。培養物に１μＣｉの［３Ｈ］−チミジンを培養物中で最後の８時間にパルスした。細胞を回収して、Ｄ．Ａ．等（Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９５、７、１５１−１６１）に記載されているように、チミジン取り込みについて分析した。
結果を表６に示す。ＩＳＩＳ１７１５２（配列番号９９）はＢＣＬ１細胞増殖を約５０％低下させたのに対し、ミスマッチ対照は細胞増殖上の効果を有さなかった。
【０２７０】
表６
ＳＴＡＴ３キメラ（デオキシギャップ）ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるＢＣＬ１細胞増殖の抑制
【表１２】
0005507617.tif 000034
【実施例６】
【０２７１】
ＳＴＡＴ３アンチセンスキメラ（デオキシギャップ）ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるＢＣＬ１ＩｇＭ分泌の抑制
ＩＳＩＳ１７１５２（配列番号９９）の、ＢＣＬ１細胞内のＩｇＭ分泌レベル上の効果を測定した。ＳＴＡＴ３はＩｇＭ発現の調節に関与している（Ｆａｒｉｓ、Ｍ．等、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９７、９０、３５０−３５７）。ＢＣＬ１細胞（１×１０６）に、本質的に実施例３に記載されたように、５ｎｍ又は１５ｎｍのＳＴＡＴ３（ＩＳＩＳ１７１５２）又はミスマッチ（ＩＳＩＳ２３１７７）オリゴヌクレオチドを電気穿孔した。電気穿孔後、細胞を１２−ウエルプレート内で、２ｍＬの完全ＲＰＭＩ中にてインキュベートした。電気穿孔から２４時間後、培地を新鮮な培地と交換した。更に４８時間後、増殖培地を回収して、遠心分離により細胞を除去し、ＯＰＴ−ＥＩＡＴＭＥＬＩＳＡキット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用してマウスＩｇＭ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）を捕獲及び検出することにより、ＩｇＭ含有量をアッセイした。
結果を表７に示す。ＩＳＩＳ１７１５２（配列番号９９）は、ミスマッチ対照オリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ２３１７７）と比較して、ＩｇＭ分泌を有意に減少させた。
【０２７２】
表７
ＳＴＡＴ３キメラ（デオキシギャップ）ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるＢＣＬ１ＩｇＭ分泌の抑制
【表１３】
0005507617.tif 000035
【実施例７】
【０２７３】
ＳＴＡＴ３アンチセンスキメラ（デオキシギャップ）ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによる処理後のＢＣＬ１細胞内のケモイカイン誘導
ＩＳＩＳ１７１５２（配列番号９９）の、ＢＣＬ１細胞内のケモカインレベル上の効果を測定した。ＢＣＬ１細胞に、本質的に実施例３に記載されたように、５ｎｍ、１０ｎｍ又は２０ｎｍのＳＴＡＴ３（ＩＳＩＳ１７１５２）又はミスマッチ（ＩＳＩＳ２３１７７）オリゴヌクレオチドを電気穿孔した。電気穿孔から１６時間後、培地に１０ｕＭのＣｐＧ−含有オリゴヌクレオチドを加えて、電気穿孔したＢＣＬ１細胞内でケモカイン遺伝子発現を誘導した。ＣｐＧ−含有オリゴヌクレオチドは、免疫賦活性の分子である（Ｋｒｉｅｇ、Ａ．Ｍ．、等、Ｎａｔｕｒｅ、１９９５、３７４、５４６−５４９）。８時間後、マウスケモカインテンプレートセット、Ｍｃｋ−５（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、当業者周知の方法によって、ＲＮａｓｅ保護アッセイによりケモカインレベルを測定した。
結果を表８に示す。ＩＳＩＳ１７１５２（配列番号９９）は、ケモカインＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ−１−α及びＭＩＰ−１−βの発現を誘導することができたのに対し、ミスマッチ対照では効果が小さかった。
【０２７４】
表８
ＳＴＡＴ３キメラ（デオキシギャップ）ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによる処理後のＢＣＬ１細胞内のケモカイン誘導
【表１４】
0005507617.tif 000036
【実施例８】
【０２７５】
ヒトＳＴＡＴ３を標的とした更なるアンチセンスオリゴヌクレオチド
配列番号１を標的とした更なるオリゴヌクレオチドのセットを設計し、１０個の２’−デオキシヌクレオチドからなる中央「ギャップ」領域を含む２０個のヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）として合成した。同キメラオリゴヌクレオチドは、両側（５’及び３’方向）に５個のヌクレオチドの「ウイング」が存在する。「ウイング」は２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成されている（太字で示す）。ヌクレオシド間（バックボーン）結合は、オリゴヌクレオチド全体を通してホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。２’−ＭＯＥシトシン及び２’−デオキシシトシンの全ては、５−メチル−シトシンであった。これらのオリゴヌクレオチド配列を表９に示す。
【０２７６】
表９
ヒトＳＴＡＴ３を標的とした更なるキメラ（デオキシギャップ）ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列
【表１５】
0005507617.tif 000037
【表１６】
0005507617.tif 000038
【０２７７】
これらオリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドの２．５μＭの濃度において、Ｕ２６６細胞内でＳＴＡＴ３発現を低下させる能力について試験した。Ｕ２６６ヒト骨髄腫細胞ライン（当初Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手）は、ＲＰＭＩ１６４０培養液を補充した標準的な条件下で保持された。細胞（ＰＢＳ中１５×１０６細胞）にＢＴＸＥｌ  ｅｃｔｒｏ  Ｓｑｕａｒｅ  Ｐｏｒａｔｏｒ  Ｔ８２０（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）を使用して、２００Ｖで単一の６−ミリ秒パルスにてオリゴヌクレオチドを移入した。ＲＮＡ抽出前に、細胞を２４時間インキュベートした。
【０２７８】
ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒｉｔａ、ＣＡ）を使用して総細胞ＲＮＡを単離した。標準的なＲＴ−ＰＣＲと、続くネステッドプライマー反応によりＭＢ−ＭＤＡ４６８ＲＮＡから調製されたｃＤＮＡプロ−ブを使用して、１５μｇのＲＮＡに関してノーザンブロット分析を行った。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（登録商標）使用してシグナルを定量した。
【０２７９】
選択された化合物についての結果（対照のｍＲＮＡ発現のパーセント、及びｍＲＮＡ発現の抑制パーセントとして表す）を表１０に示す。
【０２８０】
表１０
Ｕ２６６細胞における、キメラ（デオキシギャップ）ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによるヒトＳＴＡＴ３ｍＲＮＡ発現の抑制
【表１７】
0005507617.tif 000039
【０２８１】
ＩＳＩＳ１１３１７６、１２９９８７、１１３１８７、１２９９９１、１１３２０９、１２９９９５、１１３２１０及び１２９９９９、並びにＩＳＩＳ１７１４８及びマウスＳＴＡＴ３オリゴＩＳＩＳ１１４０５４を使用して、用量応答実験を行った。一連のミスマッチオリゴヌクレオチド、ＩＳＩＳ１２９９８７、ＩＳＩＳ１１４５０５、ＩＳＩＳ１２９９９１、ＩＳＩＳ１２９９９５及びＩＳＩＳ１２９９９９を対照として使用した。結果を表１１に示す。
【０２８２】
表１１
アンチセンスオリゴヌクレオチドによるヒトＳＴＡＴ３ｍＲＮＡ発現の抑制パーセント−用量応答
【表１８】
0005507617.tif 000040
【０２８３】
ＩＳＩＳ１７１４８（ＳＥＱ  ＩＤ  ９５）、１１３１７６（ＳＥＱ  ＩＤ  １１５）、１１３１８７（ＳＥＱ  ＩＤ  １２６）、１１３２０９（ＳＥＱ  ＩＤ  １４８）及び１１３２１０（ＳＥＱ  ＩＤ  １４９）は、一つ又は二つ以上のオリゴヌクレオチド濃度においてＳＴＡＴ３発現を５０％越にて低下させた。従って、これらの化合物が好ましい。
【実施例９】
【０２８４】
マウス黒色腫細胞におけるアポトーシス細胞死を誘発するＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制
補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）の標準的な条件下で、マウスＢ１６黒色腫細胞を増殖させた。
【０２８５】
細胞をマウスＳＴＡＴ３を標的とするＩＳＩＳ１７１５２（ＳＥＱ  ＩＤ  ９９）、又は３−塩基ミスマッチ対照、ＩＳＩＳ２８０８４（ＡＡＡＡＡＧＡＧＧＣＣＴＧＡＴＴＧＣＣＣ、配列番号１５１）で処理した。細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（登録商標）ＰＬＵＳＪ試薬（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を使用して、オリゴヌクレオチドを移入した。オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドを１００ｕｌ血清フリーＲＰＭＩ１６４０培地と混合し、続いて６ｕｌＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（登録商標）ＰＬＵＳＪ試薬を加えることにより、Ｌｉｐｏｆｅｃｔ  ＡＭＩＮＥ（登録商標）ＰＬＵＳＪと予め複合体を形成した。標本をよく混合し、室温で１５分間インキュベートした。更なる４ｕｌのＬｉｐｏｆｅｃｔ  ＡＭＩＮＥ（登録商標）ＰＬＵＳＪ試薬を血清フリーＲＰＭＩ中にて１００μｌに希釈した。この希釈Ｌｉｐｏｆｅｃｔ  ＡＭＩＮＥ（登録商標）ＰＬＵＳＪを、予め複合体を形成しているオリゴヌクレオチド／Ｌｉｐｏｆｅｃｔ  ＡＭＩＮＥ（登録商標）ＰＬＵＳＪ混合物と混合し、室温で１５分間インキュベートした。８００μｌの血清フリーＲＰＭＩ１６４０を加え、得られたオリゴヌクレオチド−Ｌｉｐｏｆｅｃｔ  ＡＭＩＮＥＰＬＵＳＪ−培地混合物（約１ｍｌ）を、６−ウエルプレート内の細胞に加えた。インキュベートから３時間後、２０％ウシ胎児血清で補充したＲＰＭＩ１６４０１ｍｌを加えた。最終的なオリゴヌクレオチド濃度は２００ｎＭ又は３００ｎＭであった。
【０２８６】
移入から２４時間後、細胞を計数し、細胞生存率上のアンチセンス処理の効果を決定した。ウエスタンブロット分析のために、移入から２４時間後に細胞を回収し、移入から４８時間後にアポトーシスのＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ染色のために回収した。
オリゴヌクレオチドの細胞数に関する効果を、表１２に示す。
【０２８７】
表１２
細胞数に関するＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制の効果
【表１９】
0005507617.tif 000041
データはＳＴＡＴ３アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理がミスマッチ対照オリゴによる処理と比較して、細胞死を増大させることを示す。
【０２８８】
Ｂ１６細胞中のアポトーシスを、アンチセンス処理から４８時間後に、ＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＰＥ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＰａｌｏＡｌｔｏ、ＣＡ）による染色、続くフローサイトメトリー分析により測定した。Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ染色の陽性は、アポトーシスの指標である。偽移入（Ｍｏｃｋ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）細胞、及び対照オリゴヌクレオチド処理細胞は、各々１１％及び１０％Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ陽性細胞を有した。対照的に、３０％のＩＳＩＳ１７１５２−処理細胞はＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ陽性であり、これはアポトーシス細胞数がほぼ３倍増加したことを示す。この明らかな増加は、アポトーシスアッセイ中に死細胞が細胞の加工により洗い去られるため、ＳＴＡＴ３オリゴによる処理でアポトーシスを受けた細胞数が低く見積もられている可能性があることに留意するべきである。
【０２８９】
アンチセンス処理から２４時間後に回収した細胞に関して、当業者周知の方法を使用してウエスタンブロット分析を行い、ＳＴＡＴ３を検出した。抗ＳＴＡＴ３抗体はＫ１５、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡから購入した。２００ｎＭ又は３００ｎＭのＩＳＩＳ１７１５２は、Ｂ１６細胞内でＳＴＡＴ３タンパク質の生成を有意に低下させた。
【実施例１０】
【０２９０】
白血病大型顆粒リンパ球（ＬＧＬ）上のＳＴＡＴ３アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果
ＬＧＬ白血病は、自己免疫性のリンパ球増殖性疾患であり、ＬＧＬ細胞は、高いレベルのＦａｓ及びＦａｓＬ発現にも関わらず、Ｆａｓ−依存性アポトーシスを受けないことで知られている（Ｌａｍｙ等、Ｂｌｏｏｄ、１９９８、９２、４７７１−７）。ＳＴＡＴ３アンチセンスオリゴヌクレオチドのＬＧＬ細胞をアポトーシスシグナルに感作させる能力について試験した。
【０２９１】
高いＬＧＬ数及びクローナルＴＣＲ遺伝子再配列を伴うＴ細胞（ＣＤ３＋）ＬＧＬ白血病の臨床基準を満たす患者から、ＬＧＬ白血病細胞を得た。全患者が分析時に治療を必要としない慢性疾患を有していた。精製した白血病ＬＧＬ細胞（２×１０６）を、０．５ｍＬの完全培地（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤから入手したＲＰＭＩ−１６４０を補充）中にて、２４−ウエルプレート内にプレーティングした。細胞を、ＩＳＩＳ１７１４８アンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号９５）又は対照オリゴヌクレオチド、ＩＳＩＳ１６０９４（配列番号１５２）のいずれかと共にインキュベートした。ＬＧＬ白血病細胞に送達されたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、受動的に取込まれた。送達のためにトランスフェクション試薬は全く使用しなかった。
【０２９２】
各々、１ｕＭ用量のＳＴＡＴ３（ＩＳＩＳ１７１４８、ＳＥＱ  ＩＤ  ９５）又は対照ミスマッチアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれかで処置した３人の患者からのＬＧＬ細胞から、抽出物を調製した。ウエスタンブロットを行いＳＴＡＴ３タンパク質レベルを測定した。ＳＴＡＴ３タンパク質レベルは、ミスマッチオリゴで処理した対照と比較して２５〜４５％の範囲で低下した。
【０２９３】
用量１、２及び５ｕＭのＳＴＡＴ３（ＩＳＩＳ１７１４８、ＳＥＱ  ＩＤ  ９５）又は対照ミスマッチアンチセンスオリゴヌクレオチドで処置されたＬＧＬ細胞におけるアポトーシス誘導を、フローサイトメトリーで測定した。アポトーシスはＳＴＡＴ３アンチセンス処理細胞で有意に増大し、用量依存性を有していた。二重反応における特定のアポトーシスのパーセント測定値は、各々１、２、及び５ｕＭのＳＴＡＴ３アンチセンス処理細胞にて、アポトーシスが未処理細胞の約５％から６、１７及び２４％のレベルに増加したことを示した。対照オリゴヌクレオチド処理細胞におけるアポトーシスレベルは、全用量で約６％に留まった。アポトーシスはＦａｓ−介在経路を介して活性化されると思われる。
【実施例１１】
【０２９４】
ヒト骨髄腫細胞ラインＵ２６６における、ＳＴＡＴ３アンチセンスオリゴヌクレオチド処理後のアポトーシス誘導
多発性骨髄腫（ＭＭ）は、過剰増殖性疾患である。以前の研究にて、手付かずのトランス活性化ドメインを欠くドミナントネガティブなＳＴＡＴ３の発現に応答して、ＭＭ細胞ラインＵ２６６でアポトーシスが増大することが示された。
アンチセンスＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１７１４８（ＳＥＱ  ＩＤ  ９５）及びＩＳＩＳ１１３１７６（ＳＥＱ  ＩＤ  １１５）を、ミスマッチ対照オリゴヌクレオチドと比較して、Ｕ２６６細胞でアポトーシスを増大させる能力について試験した。様々な量のオリゴヌクレオチドを、移入により培養細胞へ送達した。細胞を移入から４８時間後に回収して、ＳＴＡＴ３ｍＲＮＡ及びタンパク質レベルを各々ノーザン及びウエスタンブロットにより測定した。両方のＳＴＡＴ３アンチセンスオリゴヌクレオチドの投与に応答して、ＳＴＡＴ３ｍＲＮＡ及びタンパク質の有意な用量依存的低下が見られた。ミスマッチ対照オリゴヌクレオチドは、ＳＴＡＴ３ｍＲＮＡ又はタンパク質レベル上に有意な効果を有さなかった。
【０２９５】
細胞はまた、上述したＡｎｎｅｘｉｎ５染色及びフローサイトメトリーによって、ＳＴＡＴ３アンチセンスオリゴヌクレオチドに応答したアポトーシスの増加についてもアッセイされた。ＩＳＩＳ１７１４８及びＩＳＩＳ１１３１７６を移入された細胞の両方に、アポトーシスの有意な増加が見られた。ミスマッチ対照オリゴヌクレオチドで処理した細胞では、アポトーシスの有意な変化は見られなかった。
【実施例１２】
【０２９６】
２’−ＭＯＥウイング及びデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによる、ヒトＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制
本発明によれば、公表された配列（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号Ｌ２９２７７、本願明細書に配列番号１として組み入れる、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号ＮＴ＿０１０７５５．１３のヌクレオチド配列４１８９２１３〜４２６３６３６の相補体、本願明細書に配列番号１５３として組み入れる、及びＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号ＮＭ＿１３９２７６．１、本願明細書に配列番号１５４として組み入れる）を使用して、ヒトＳＴＡＴ３の異なる領域を標的とする更なる一連のオリゴヌクレオチドを設計した。オリゴヌクレオチドを表１３に示す。“標的部位“は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列上の第一の（最も５’側）ヌクレオチドの番号を示す。表１３の全化合物は、１０個の２’−デオキシヌクレオチドからなる中央「ギャップ」領域を含む２０個のヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）であり、その両側（５’及び３’方向）には５個のヌクレオチド「ウイング」が存在する。ウイングは２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成されている。ヌクレオシド間（バックボーン）結合は、オリゴヌクレオチド全体を通してホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全シチジン残基は５−メチルシチジンである。
【０２９７】
化合物を、Ａ５４９細胞内で、そのＳＴＡＴ３ｍＲＮＡレベル上の効果について分析した。ヒト肺癌腫細胞ラインＡ５４９をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手した。Ａ５４９細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、１００単位／ｍＬペニシリン、及び１００ｕｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を補充したＤＭＥＭ基本培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で、慣習的に培養した。細胞は９０％の集密度に到達した際、トリプシン処理及び希釈によりルーチン的に継代した。
【０２９８】
ＩＳＩＳ１８０７８を対照オリゴヌクレオチドとして使用し、７５ｎＭで使用した。ＩＳＩＳ１８０７８（ＧＴＧＣＧＣＧＣＧＡＧＣＣＣＧＡＡＡＴＣ、配列番号１５５）は、９個の２’−デオキシヌクレオチドからなる中央「ギャップ」領域を含む２０個のヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）であり、同キメラオリゴヌクレオチドは、両側（５’及び３’方向）に、各々５個のヌクレオチド及び６個のヌクレオチドの「ウイング」が存在する。「ウイング」は２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成されている。ヌクレオシド間（バックボーン）結合は、オリゴヌクレオチド全体を通してホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全シチジン残基は５−メチルシチジンである。
【０２９９】
細胞が６５−７５％の集密度に到達したとき、これらをオリゴヌクレオチドで処理した。９６−ウエルプレート内で増殖させた細胞のために、ウエルを１００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１（登録商標）血清使用量低減培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で１回洗浄した後、３．７５μｇ／ｍＬＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含有する１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１（登録商標）、及び７５ｎＭの表１３の化合物で処理した。細胞を処理し、データを二重に獲得した。未処理細胞を対照として使用した。３７°Ｃで４〜７時間処理した後、培地を新鮮な培地と交換した。オリゴヌクレオチド処理から１６〜２４時間後、細胞を回収した。Ａ５４９細胞内のＳＴＡＴ３ｍＲＮＡレベルを、本願明細書の他の方法に記載したように、リアルタイムＰＣＲで定量した。
【０３００】
公表された配列情報（本願明細書に配列番号１として組み入れる）を使用して、ヒトＳＴＡＴ３へのプローブ及びプライマーを、ヒトＳＴＡＴ３配列とハイブリダイズするように設計した。プライマー−プローブセット１９９（ＰＰＳ１９９）では、ＰＣＲプライマーは、
【０３０１】
フォワードプライマー：ＡＣＡＴＧＣＣＡＣＴＴＴＧＧＴＧＴＴＴＣＡＴＡＡ（配列番号１５６）リバースプライマー：ＴＣＴＴＣＧＴＡＧＡＴＴＧＴＧＣＴＧＡＴＡＧＡＧＡＡＣ（配列番号１５７）であり、ＰＣＲプロ−ブは、ＦＡＭ−ＣＡＧＴＡＴＡＧＣＣＧＣＴＴＣＣＴＧＣＡＡＧＡＧＴＣＧＡＡ−ＴＡＭＲＡ（配列番号１５８）であり、ここでＦＡＭは蛍光レポーター色素であり、ＴＡＭＲＡは消光色素である。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで得られた遺伝子標的の量を、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を使用して総ＲＮＡを定量することにより標準化した。このアッセイでは、１７０μＬのＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）作業用試薬（１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ中に１：３５０に希釈したＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）試薬、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）を３０μＬの精製した、細胞ＲＮＡを含有する９６−ウエルプレート内にピペッティングした。プレートをＣｙｔｏＦｌｕｏｒ（登録商標）４０００（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）内で、４８５ｎｍの励起と５３０ｎｍの発光にて測定した。
アンチセンスオリゴヌクレオチド処理の結果は２つの実験の平均であり、表１３に示す。データは未処理対照細胞に関する抑制パーセントとして表される。
【０３０２】
表１３
２’−ＭＯＥウイング及びデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによる、ヒトＳＴＡＴ３ｍＲＮＡレベルの抑制
【表２０】
0005507617.tif 000042
【表２１】
0005507617.tif 000043
【表２２】
0005507617.tif 000044
【表２３】
0005507617.tif 000045
【０３０３】
表１３に示すように、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ  １５９、１６１、１６５、１６６、１６９、１７０、１７１、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１５、２１６、２１７、２２０、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２３２、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８及び２９９はヒトＳＴＡＴ３発現を少なくとも６０％抑制した。
【実施例１３】
【０３０４】
２’−ＭＯＥウイング及びデオキシギャップを有する、ヒトＳＴＡＴ３を標的とするキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
本発明によれば、公表された配列（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号Ｌ２９２７７、本願明細書に配列番号１として組み入れる、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号ＮＭ＿１３９２７６．１、本願明細書に配列番号１５４として組み入れる）を使用して、ヒトＳＴＡＴ３の異なる領域を標的とするように、更なる一連のオリゴヌクレオチドを設計した。オリゴヌクレオチドを表１４に示す。“標的部位“は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列上の第一の（最も５’側）ヌクレオチドの番号を示す。表１４の全化合物は１０個の２’−デオキシヌクレオチドからなる中央「ギャップ」領域を含む２０個のヌクレオチド長のキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）であり、その両側（５’及び３’方向）には５個のヌクレオチド「ウイング」が存在する。ウイングは２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成されている。ヌクレオシド間（バックボーン）結合は、オリゴヌクレオチド全体を通してホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全シチジン残基は５−メチルシチジンである。
【０３０５】
化合物を、Ａ５４９細胞内で、そのヒトＳＴＡＴ３発現上の効果について分析した。１．５μＬ／ｍｇＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）と共に混合した５０ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドで細胞を処理した。移入から約２０時間後、細胞を回収して、リアルタイムＰＣＲを使用してＳＴＡＴ３ｍＲＮＡ発現を測定した。データは２つの実験の平均値であり、未処理対照細胞に関する抑制パーセントとして表１４に示した。
【０３０６】
表１４
２’−ＭＯＥウイング及びデオキシギャップを有する、ヒトＳＴＡＴ３を標的としたキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
【表２４】
0005507617.tif 000046
【表２５】
0005507617.tif 000047
【表２６】
0005507617.tif 000048
【実施例１４】
【０３０７】
マウスＳＴＡＴ３を標的とする、２’−ＭＯＥウイング及びデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
本発明によれば、公表された配列（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号Ｕ０６９２２．１、本願明細書に配列番号８２として組み入れる、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号Ｕ３０７０９．１、本願明細書に配列番号３８２として組み入れる）を使用して、マウスＳＴＡＴ３ＲＮＡの異なる領域を標的とするように、オリゴヌクレオチドの更なる連続を設計した。そのオリゴヌクレオチドを表１５に示す。“標的部位“は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列の第一の（最も５’−側）ヌクレオチド番号を示す。表１５に示す全化合物は、キメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）２０個のヌクレオチドの長さを有する、から構成される１０個の２’−デオキシヌクレオチドからなる中央「ギャップ」領域から構成され、その両端には（５’及び３’方向）５個のヌクレオチド「ウイング」が存在する。ウイングは、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成されている。ヌクレオシド間（バックボーン）結合は、オリゴヌクレオチド全体を通してホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全シチジン残基は、５−メチルシチジンである。
【０３０８】
表１５
２’−ＭＯＥウイング及びデオキシギャップを有する、マウスＳＴＡＴ３を標的とするキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
【表２７】
0005507617.tif 000049
【０３０９】
更なる実施態様において、公表された配列（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号Ｕ０６９２２．１、本願明細書に配列番号８２として組み入れる）を使用して、オリゴヌクレオチドの更なる連続を、マウスＳＴＡＴ３ＲＮＡを標的とするように設計した。化合物を表１６に示す。“標的部位”は、化合物が結合する特定の配列の第一の（最も５’−側）ヌクレオチド番号を示す。表１６の全化合物は、１２個の２’−デオキシヌクレオチドからなる“ギャップ”領域から構成され、その両端には（５’及び３’方向）２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドからなる“ウイング”が存在するキメラオリゴヌクレオチドである。ギャップ内の２’−ＭＯＥヌクレオチドの数は、２〜５ヌクレオチド長の間で変動する。２’−デオキシヌクレオチドがプレイン（ｐｌａｉｎ）型であり、２’−ＭＯＥヌクレオチドはボールド（ｂｏｌｄ）型である。各オリゴヌクレオチドの正確な構造を、“ウイング”構造として表１６に設計してある。５〜１０〜５は、例えば最初及び最後の５ヌクレオチドが２’−ＭＯＥヌクレオチドで、中央の１０ヌクレオチドが２’デオキシヌクレオチドであることを示す。ヌクレオシド間（バックボーン）結合は、オリゴヌクレオチド全体を通してホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。下線を引いた非修飾シチジン残基は、他の全シチジン残基は５−メチルシチジンである。
【０３１０】
表１６
マウスＳＴＡＴ３を標的とする、２’−ＭＯＥウイング及びデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
【表２８】
0005507617.tif 000050
【０３１１】
本発明の更なる実施態様では、公表された配列（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号Ｕ０６９２２．１、本願明細書に配列番号８２として組み入れられる）を使用して、マウスＳＴＡＴ３ＲＮＡの異なる領域を標的とするように更なるオリゴヌクレオチドの連続を設計した。そのオリゴヌクレオチドを表１７に示す。“標的部位“は、そのオリゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列上の第一（最も５’側の）ヌクレオチドの数を示す。表１７中の全化合物は、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから一律に構成される。オリゴヌクレオチド全体にてヌクレオシド間（バックボーン）結合はホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）であり、全シチジン残基は５−メチルシチジンである。
【０３１２】
表１７
マウスＳＴＡＴ３を標的とする、ホスホロチオエート均一２’ＭＯＥオリゴヌクレオチド
【表２９】
0005507617.tif 000051
【実施例１５】
【０３１３】
２’−ＭＯＥウイング及びデオキシギャップを有するキメラオリゴヌクレオチドによる、ヒトＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制：用量反応
本発明によれば、ヒトＳＴＡＴ３を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドのサブセットを、用量反応試験で更に研究した。化合物を、そのＴ−２４細胞中のヒトＳＴＡＴ３ｍＲＮＡレベルに対する効果について分析した。
【０３１４】
移行細胞膀胱腫瘍細胞ラインＴ−２４をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  ＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から獲得した。Ｔ−２４細胞を慣例的に、１０％ウシ胎児、１００単位／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンで補充した完全ＭｃＣｏｙ５Ａ基本培地（培地及び補充物はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡから入手）内で培養した。細胞を、９０％集密度に到達した時、慣例的にトリプシン処理及び希釈により継代した。細胞を７０００細胞／ウエルの密度にて、９６−ウエルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ＃３８７２、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）内に播種して、アンチセンスオリゴヌクレオチド移入の実験に使用した。
【０３１５】
使用した対照オリゴヌクレオチドは、ＩＳＩＳ１２９６９５（ＴＴＣＴＡＣＣＴＣＧＣＧＣＧＡＴＴＴＡＣ，配列番号３９１）、ＩＳＩＳ１２９６９４（ＧＴＡＣＡＧＴＴＡＴＧＣＧＣＧＧＴＡＧＡ  配列番号３９２）、ＩＳＩＳ１２９６９０（ＴＴＡＧＡＡＴＡＣＧＴＣＧＣＧＴＴＡＴＧ  配列番号３９３）、ＩＳＩＳ１２９６８６（ＣＧＴＴＡＴＴＡＡＣＣＴＣＣＧＴＴＧＡＡ  配列番号３９４）、ＩＳＩＳ１１６８４７（ＣＴＧＣＴＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＴＧＡ，配列番号３９５）及びＩＳＩＳ１１３５２９（ＣＴＣＴＴＡＣＴＧＴＧＣＴＧＴＧＧＡＣＡ  配列番号３９６）であった。これらのオリゴヌクレオチドはＳＴＡＴ３を標的とするものではなく、負の対照として使用された。
【０３１６】
Ｔ−２４細胞を、本願明細書の他の実施例に記載するように、１００ｎＭオリゴヌクレオチドにつき３ｕｇ／ｍＬ  ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）を混合した１８．７５、３７．５、７５、又は１５０ｎＭのオリゴヌクレオチドで処理した。未処理細胞を対照として使用した。処理から１６時間後、その後のリアルタイムＰＣＲ分析のために、細胞からＲＮＡを調製した。
【０３１７】
ヒトＳＴＡＴ３ｍＲＮＡ発現レベルを、プライマープローブセットＰＰＳ１９９を使用したリアルタイムＰＣＲによって定量し、遺伝子標的の量を、本願明細書の他の実施例に記載するように、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）を使用して標準化した。２つの実験による平均のデータを、表１８に示す。“−”又は“＋”は、各々、未処理対照細胞に関するＳＴＡＴ３ｍＲＮＡ発現の減少又は増加を示す。
【０３１８】
表１８
２’−ＭＯＥウイング及びデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによる、ヒトＳＴＡＴ３のｍＲＮＡレベルの抑制：用量反応
【表３０】
0005507617.tif 000052
【０３１９】
表１８に示すように、試験した化合物は、ヒトＳＴＡＴ３ｍＲＮＡ発現を用量依存的に抑制する。
用量反応はＴ−２４細胞で繰り返され、本願明細書でＰＰＳ２０３３と称される異なるプライマー−プローブセットを使用して、遺伝子標的の量を測定した。ＰＰＳ２０３３はプローブを含み、ヒトＳＴＡＴ３に対するプライマーは、（配列番号１５４として本願明細書に組み入れた）配列情報を使用して、ヒトＳＴＡＴ３配列とハイブリダイズするように設計された。ＰＰＳ２０３３では、ＰＣＲプライマーは、フォワードプライマー：ＧＡＧＧＣＣＣＧＣＣＣＡＡＣＡ（配列番号３９７）リバースプライマー：ＴＴＣＴＧＣＴＡＡＴＧＡＣＧＴＴＡＴＣＣＡＧＴＴＴＴ（配列番号３９８）及びＰＣＲプローブは：ＦＡＭ−ＣＴＧＣＣＴＡＧＡＴＣＧＧＣ-ＭＧＢ（配列番号３９９）であり、ここでＦＡＭは、レポーターの蛍光色素であり、ＭＧＢは、消光色素である。リアルタイムＰＣＲで得られた遺伝子標的の量は、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標登録）ＴＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を使用して、全ＲＮＡを定量することによって正規化された。使用した対照オリゴヌクレオチドは、ＩＳＩＳ１２９６９５（配列番号３９１）、ＩＳＩＳ１２９６９４（配列番号３９２）、ＩＳＩＳ１２９６９０（配列番号３９３）、ＩＳＩＳ１２９６８６（配列番号３９４）、ＩＳＩＳ１１６８４７（配列番号３９５）及びＩＳＩＳ１１３５２９（配列番号３９６）であった。
【０３２０】
Ｔ−２４細胞を、本願明細書の他の実施例に記載するように、１００ｎＭオリゴヌクレオチドにつき３ｕｇ／ｍＬ  ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）を混合した１８．７５、３７．５、７５、又は１５０ｎＭのオリゴヌクレオチドで処理した。未処理細胞を対照として使用した。処理から１６時間後、その後のリアルタイムＰＣＲ分析のために、細胞からＲＮＡを調製した。
【０３２１】
ヒトＳＴＡＴ３ｍＲＮＡ発現レベルを、プライマープローブセットＰＰＳ２０３３を使用したリアルタイムＰＣＲによって定量し、遺伝子標的定量値を、本願明細書の他の実施例に記載するように、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）を使用して標準化した。２つの実験による平均のデータを、表１９に示す。“−”又は“＋”は、各々、未処理対照細胞に関するＳＴＡＴ３ｍＲＮＡ発現の減少又は増加を示す。
【０３２２】
表１９
２’−ＭＯＥウイング及びデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによる、ヒトＳＴＡＴ３ｍＲＮＡレベルの抑制：用量反応
【表３１】
0005507617.tif 000053
【０３２３】
表１９に示すように、ＰＰＳ２０３３を使用した標的遺伝子量の測定は、試験化合物がヒトＳＴＡＴ３ｍＲＮＡ発現を用量依存的に抑制することを示した。
Ａ５４９細胞にて、更なる用量反応実験を行った。Ａ５４９細胞を、本願明細書の他の実施例に記載するように、１００ｎＭオリゴヌクレオチドにつき３ｕｇ／ｍＬＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）を混合した１８．７５、３７．５、７５、又は１５０ｎＭのオリゴヌクレオチドで処理した。使用した対照オリゴヌクレオチドは、ＩＳＩＳ１２９６８６（配列番号３９４）及びＩＳＩＳ１２９６９０（配列番号３９３）であった。未処理細胞を対照として使用した。処理から１６時間後、その後のリアルタイムＰＣＲ分析のために、細胞からＲＮＡを調製した。
ヒトＳＴＡＴ３ｍＲＮＡ発現レベルを、プライマープローブセットＰＰＳ１９９を使用したリアルタイムＰＣＲによって定量し、遺伝子標的の量を、本願明細書の他の実施例に記載するように、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）を使用して標準化した。２つの実験による平均のデータを、表２０に示す。用量反応における“−”又は“＋”は、各々、未処理対照細胞に関するＳＴＡＴ３ｍＲＮＡ発現の減少又は増加を示す。
【０３２４】
表２０
２’−ＭＯＥウイング及びデオキシギャップを有するキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチドによる、ヒトＳＴＡＴ３ｍＲＮＡレベルの抑制：用量反応
【表３２】
0005507617.tif 000054
【０３２５】
表２０に示すように、試験した化合物は、Ａ５４９細胞においてヒトＳＴＡＴ３ｍＲＮＡ発現を用量依存的に抑制する。
【実施例１６】
【０３２６】
ＲＮＡの合成
一般に、ＲＮＡの合成化学は、戦略的中間段階（反応において、多様な保護基を選択的に組み込むことを基本とする。当業者は有機合成において保護基を使用することを理解するであろうが、有用な保護基のクラスはシリルエーテルを含む。詳細には、５´−ヒドロキシルの保護には、２´−ヒドロキシル上の酸に不安定なオルトエステル保護基と組み合わせて、嵩高いシリルエーテルが使用される。次にこの保護基のセットは、標準的な固相合成技術と共に使用される。他の全合成ステップの後、最終的に酸に不安定なオルトエステル保護基を除去することが重要である。更に、合成の早い段階でのシリル保護基の使用は、望ましくない２´−ヒドロキシルの脱保護を行うことなく、所望の際の容易な除去を確実にする。
【０３２７】
区別して除去され、かつ化学的不安定さが異なる保護基による、２´−ヒドロキシル保護と組み合わせた５´−ヒドロキシル保護の連続的な保護工程の後に、ＲＮＡオリゴヌクレオチドが合成された。
【０３２８】
ＲＮＡオリゴヌクレオチドは段階を追って合成される。各ヌクレオチドは固体担体に結合したオリゴヌクレオチドに連続して追加される（３´−から５´−の方向へ）。鎖の３’−末端の第一ヌクレオシドは、固体担体に対して共有結合されている。ヌクレオチド前駆体、リボヌクレオシドホスホロアミデート、及び活性化剤を加え、第一ヌクレオシドの５’−末端上に第二塩基をカップリングする。担体を洗浄し、未反応５’−ヒドロキシル基を全て無水酢酸でキャップして、５’−アセチル部分を得る。次いで結合を酸化してより安定な結合とし、最終的に所望のＰ（Ｖ）結合を得る。ヌクレオチド追加サイクルの終わりに、フッ化物を５’−シリル基で切断する。このサイクルを、続く各ヌクレオチドについて繰り返す。
【０３２９】
合成後、ＤＭＦ中の１Ｍ二ナトリウム−２−カルバモイル−２−シアノエチレン−１、１−ジチオレート三水和物（Ｓ２Ｎａ２）を使用して、リン酸上のメチル保護基を３０分で切断する。水を使用して、固体担体に結合したオリゴヌクレオチドから脱保護溶液を洗浄する。次いで、担体を５５°Ｃで１０分間、水中の４０％メチルアミンで処理する。これにより、ＲＮＡオリゴヌクレオチドが溶液中に解放され、環外アミンが脱保護され、２’−基が修飾される。この段階で、オリゴヌクレオチドは、アニオン交換ＨＰＬＣにより分析され得る。
【０３３０】
２´−オルトエステル基は、除去されるべき最後の保護基である。ＤｈａｒｍａｃｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ．（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）によって開発されたエチレングリコールモノアセテートオルトエステル保護基は、以下の重要な性質を有する便利なオルトエステル保護基の一例である。ヌクレオシドホスホロアミデート合成、及びオリゴヌクレオチド合成の条件に対して安定である。しかしながら、オリゴヌクレオチド合成後、オリゴヌクレオチドはメチルアミンで処理されるが、これによりオリゴヌクレオチドが固体担体から切断されるだけでなく、オルトエステルからアセチル基が除去される。得られたオルトエステル上の２−エチル−ヒドロキシル置換基は、アセチル化前駆体と比較すると電子吸引性が弱い。その結果、修飾オルトエステルは、酸触媒加水分解に対してより不安定となる。具体的には、アセチル基が除去された後、切断速度は約１０倍速くなる。従って、このオルトエステルは、オリゴヌクレオチド合成に適合し、尚かつ、次いで修飾された場合、最終的なＲＮＡオリゴヌクレオチド生成物に適合可能な比較的穏やかな水性条件下での脱保護が可能となるに十分な安定性を有する。
【０３３１】
これに加えて、ＲＮＡの合成方法は当該技術分野にて公知である。（Ｓｃａｒｉｎｇｅ、Ｓ．Ａ．Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｓｉｓ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｌｏｒａｄｏ、１９９６、Ｓｃａｒｉｎｇｅ、Ｓ．Ａ等、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９９８、１２０、１１８２０−１１８２１、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、Ｍ．Ｄ．及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｍ．Ｈ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１９８１、１０３、３１８５−３１９１、Ｂｅａｕｃａｇｅ、Ｓ．Ｌ．及びＣａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｍ．Ｈ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．、１９８１、２２、１８５９−１８６２、Ｄａｈｌ、Ｂ．Ｊ．、等、Ａｃｔａ  Ｃｈｅｍ．Ｓｃａｎｄ、．１９９０、４４、６３９−６４１、Ｒｅｄｄｙ、Ｍ．Ｐ．等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｍ  Ｌｅｔｔ．、１９９４、２５、４３１１−４３１４、Ｗｉｎｃｏｔｔ、Ｆ等、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９９５、２３、２６７７−２６８４、Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ｂ．Ｅ等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９６７、２３、２３０１−２３１３、Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ｂ．Ｅ等、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、１９６７、２３、２３１５−２３３１）。
【０３３２】
本発明のＲＮＡアンチセンス化合物（ＲＮＡオリゴヌクレオチド）は、本願明細書の方法により合成されるか、又はＤｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｎｃ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）から購入することができる。いったん合成された後、相補的なＲＮＡアンチセンス化合物は、当該技術分野にて公知の方法によりアニールされて、二本鎖（二重鎖）アンチセンス化合物が形成され得る。例えば、二重鎖は３０μｌのＲＮＡオリゴヌクレオチドの相補的な鎖の各々（５０ｕＭＲＮＡオリゴヌクレオチド溶液）と、１５μｌの５Ｘアニーリング緩衝液（１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．４、２ｍＭ酢酸マグネシウム）とを一緒にした後、９０°Ｃで１分間、次いで３７°Ｃで１時間加熱することによって形成され得る。得られた二重鎖アンチセンス化合物は、キット、アッセイ、選別、又は標的拡散の役割を研究する他の方法、又は診断的若しくは治療的目的のために使用することができる。
【実施例１７】
【０３３３】
ＳＴＡＴ３を標的とする二重鎖アンチセンス化合物の設計及びスクリーニング
本発明によれば、ＳＴＡＴ３を標的とするために、本発明のアンチセンス化合物と、その相補体とからなる一連の核酸二重鎖を設計し得る。二重鎖のアンチセンス鎖の核酸塩基配列は、本願明細書に開示するＳＴＡＴ３を標的とするオリゴヌクレオチドの少なくとも一部分を含む。鎖の末端は、天然又は修飾核酸塩基を追加することにより修飾されてオーバーハングを形成し得る。次いでアンチセンス鎖の相補体としてｄｓＲＮＡのセンス鎖が設計及び合成され、このセンス鎖は双方の末端に修飾又は付加物も含み得る。例えば、一実施態様にて、ｄｓＲＮＡ二重鎖の両方の鎖は、核酸塩基の中央全体において相補性を有し、各々片方又は両方の末端にオーバーハングを有するであろう。二重鎖のアンチセンス鎖及びセンス鎖は、約１７〜２５個のヌクレオチドを含むか、又は約１９〜２３個のヌクレオチドを含む。代替的に、アンチセンス鎖及びセンス鎖は、２０、２１又は２２ヌクレオチドを含む。
【０３３４】
例えば、配列ＣＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＡＣＣＧと、デオキシチミジン（ｄＴ）からなる２個の核酸塩基オーバーハングとを有するアンチセンス鎖を含む二重鎖は、以下の構造を有するであろう。
ｃｇａｇａｇｇｃｇｇａｃｇｇｇａｃｃｇＴＴ    アンチセンス鎖
｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜
ＴＴｇｃｔｃｔｃｃｇｃｃｔｇｃｃｃｔｇｇｃ        相補体
【０３３５】
オーバーハングは、２〜６個の範囲の核酸塩基からなり得、これら核酸塩基は、標的核酸に対して相補的であっても、相補的でなくてもよい。別の一実施態様では、二重鎖は、末端にオーバーハングを１個のみ有し得る。
【０３３６】
別の一実施態様にて、同一配列ＣＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＡＣＣＧを有するアンチセンス鎖を含む二重鎖は、以下に示すように、平滑末端（鎖を構成する１個のオーバーハング）を有するよう調製され得る。
ｃｇａｇａｇｇｃｇｇａｃｇｇｇａｃｃｇ        アンチセンス鎖
｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜
ｇｃｔｃｔｃｃｇｃｃｔｇｃｃｃｔｇｇｃ        相補体
【０３３７】
ＲＮＡ二重鎖は、単分子又は二分子であり得る。即ち、２つの鎖が一つの分子の一部であるか、又は別個の分子であり得る。
二重鎖のＲＮＡ鎖は、本願明細書に開示する方法によって合成されるか、又はＤｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）から購入することができる。いったん合成された後、相補的な鎖がアニールされる。一つの鎖がアリコートされ、濃度５０ｕＭに希釈される。いったん希釈した後、３０ｕＬの各鎖を、１５ｕＬの５Ｘアニーリング緩衝溶液と一緒にする。該緩衝液の最終濃度は、１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ  ｐＨ７．４、及び２ｍＭ酢酸マグネシウムである。最終容積は７５ｕＬである。この溶液を９０℃で１分間インキュベートした後、１５秒間遠心分離する。このチューブを３７℃で１時間静止させ、この間にｄｓＲＮＡ二重鎖を実験に使用する。ｄｓＲＮＡ二重鎖の最終濃度は、２０ｕＭである。この溶液は、５回まで冷凍貯蔵（−２０°Ｃ）及び解凍することができる。
【０３３８】
いったん調製した後、二重鎖を形成するアンチセンス化合物は、そのＳＴＡＴ３調節能を評価される。
集密度が８０％に到達したときに、細胞を本発明の二重鎖アンチセンス化合物で処理する。９６−ウエルプレート内で増殖した細胞に関しては、ウエルを２００μＬＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１（登録商標）低下させた−血清培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）で一回洗浄し、次いで、１２μｇ／ｍＬ  ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を含有する１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１（登録商標）と、最終濃度２００ｎＭ（１００ｎＭ二重鎖アンチセンス化合物につき６μｇ／ｍＬ  ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）の割合）の所望の二重鎖アンチセンス化合物で処理する。５時間の処理後、培地を新鮮な培地と交換する。処理から１６時間後、細胞を回収し、この時ＲＮＡを単離し、標的低下をＲＴ−ＰＣＲで測定する。
【０３３９】
本発明のアンチセンス化合物とその相補体とを含む一連の核酸二重鎖は、公表された配列（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号Ｌ２９２７７、本願明細書に配列番号１として組み入れる）を使用して、ＳＴＡＴ３ｍＲＮＡを標的とするように設計した。二重鎖のアンチセンス鎖の核酸塩基配列は、２０個のヌクレオチドの長さを有する。アンチセンス鎖の配列を、表２１に示す。ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、アンチセンス鎖に相補的であるように設計かつ合成される。
【０３４０】
表２１の全化合物はオリゴデオキシヌクレオチドであり、２１個のヌクレオチドの長さと、３’末端上にＴＴオーバーハングである２個のヌクレオチドとを有し、全体にホスホジエステルヌクレオシド間結合（バックボーン）を有する。これらの配列は、チミン（Ｔ）を含むよう示されているが、当業者は、一般にチミン（Ｔ）はＲＮＡ配列内でウラシル（Ｕ）と置き換え得ることを理解するであろう。
【０３４１】
表２１
ヒトＳＴＡＴ３を標的とするｄｓＲＮＡ
【表３３】
0005507617.tif 000055
【０３４２】
表２１の化合物を、そのＡ５４９細胞中にて、ヒトＳＴＡＴ３発現に対する効果を試験した。ＩＳＩＳ３３０２４９とその相補体とを含むｄｓＲＮＡは、アンチセンスオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１０６７３４（配列番号４５）と同一の部位を標的とし、ＩＳＩＳ３３０２４７とその相補体とを含むｄｓＲＮＡは、アンチセンスオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１１３１７６（配列番号１１５）と同一の部位を標的とする。従って、ＩＳＩＳ１０６７３４及びＩＳＩＳ１１３１７６もまた試験した。Ａ５４９細胞を、本願明細書に記載するように、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）と混合したオリゴヌクレオチドで処理した。使用したオリゴヌクレオチド濃度を、表２２に示す。使用した対照オリゴヌクレオチドは、ＩＳＩＳ１２９６９８（ＴＴＴＧＡＴＣＧＡＧＧＴＴＡＧＣＣＧＴＧ、配列番号４０２）であった。細胞をオリゴヌクレオチドで４時間処理し、更に１６時間後、回収した。未処理細胞を対照として使用した。
【０３４３】
本願明細書の他の実施例に記載したように、プライマープローブセットＰＰＳ１９９を使用したリアルタイムＰＣＲにより、ヒトＳＴＡＴ３ｍＲＮＡ発現レベルを定量し、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）を使用して遺伝子標的の量を標準化した。２種の実験から得られたデータの平均値を、表２２に示す。“−”又は“＋”は、各々、未処理対照細胞に関するＳＴＡＴ３ｍＲＮＡ発現の減少又は増加を示す。存在する場合、“Ｎ．Ｄ．”は、未測定であることを示す。
【０３４４】
表２２
ｄｓＲＮＡｓによるＳＴＡＴ３ｍＲＮＡレベルの抑制
【表３４】
0005507617.tif 000056
【実施例１８】
【０３４５】
ＬＮＣａＰマウスモデルでの腫瘍成長の抑制
前立腺癌腫
ヒト前立腺癌腫のＬＮＣａＰハツカネズミモデルは、参照して本願明細書に組み入れられるＫｉｙａｍａ等、ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．６３：３５７５−３５８４、２００３に記載されている。即ち、ＬＮＣａＰヒト前立腺癌腫細胞を、５％の熱不活性化ウシ胎児血清で補充したＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で培養保持した。６〜８週齢の雄の無胸腺ヌードマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、Ｉｎｃ．、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）の脇腹に、メトキシフルラン麻酔下で２７−ゲージ針を用いて、約１Ｘ１０６ＬＮＣａＰ細胞を、０．１ｍｌのＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）で皮下免疫した。３００〜５００ｍｍ３の容積の腫瘍を有するマウスは、陰嚢からのアプローチにより去勢され、１０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ１１３１７６（配列番号１１５）ヒトアンチセンス又はＩＳＩＳ１２９９８７（配列番号４０４）ヒトミスマッチ対照ＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドのいずれかによる、第一週目の５回／週、その後の３回／週の腹腔内処理にランダムに割り当てられた。去勢後、１日目に処理を開始した。腫瘍の容積及び血清前立腺に特異的な抗原（ＰＳＡ）測定を週に１回実行した。公式ＬＸＷＸＨＸ０．５２３６（Ｇｌｅａｖｅ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：１５９８−１６０５、１９９２）により腫瘍容積を計算した。マウスの尾の静脈を切開して血液標本を得て、血清ＰＳＡレベルを、感度の下限値が０．２μｇ／リットル（Ａｂｂｏｔｔ  ＩＭＸ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）である酵素イムノアッセイキットを使用して、製造業者のプロトコールに従って決定した。
【０３４６】
ＩＳＩＳ１１３１７６は、去勢したヌードマウス内のＬＮＣａＰ異種移植片モデルの血清ＰＳＡレベル及び腫瘍成長の誘導を抑制した。ミスマッチ対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１２９９８７でのマウスの同様の処理では、効果が見られなかった。観察されたＰＳＡ及び腫瘍容積に対するＳＴＡＴ３アンチセンスオリゴヌクレオチド−仲介効果は、ミスマッチオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１２９９８７又は生理食塩水で処理した対照と有意に異なっていた（学生試験、ｐ≦０．０５）。処理効果は、観察期間（去勢後１０週間）の終わりにて見られた。本アプローチの潜在的な標的−特異的な有毒性に対処するため、正常なマウスを、最適化されたハツカネズミＳＴＡＴ３アンチセンスオリゴヌクレオチド（５０ｍｇ／ｋｇ迄、３回／週で２週間、）で皮下処理し、血液、肝臓及び骨髄中の薬物動態学的及び毒性学的効果を評価した。ＳＴＡＴ３アンチセンスオリゴヌクレオチド処理により、骨髄の前単球亜集団の肝臓ｍＲＮＡが８５％減少し、ＳＴＡＴ３タンパク質が有意に抑制された。ＳＴＡＴ３アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された動物の全血球計算値、肝臓組織又は骨髄亜集団には、明白な変化は観察されなかった。ＳＴＡＴ３アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理により、ＳＴＡＴ３の肝臓及び骨髄発現は有意に低下した。従って、ＳＴＡＴ３へのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、前立腺癌の処置における治療的機会を表す。
【実施例１９】
【０３４７】
初代ヒト肝細胞における、ヒトＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制：用量反応
更なる実施態様において、ヒトＳＴＡＴ３を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒト肝細胞の用量反応研究のために選択された。初代ヒト肝細胞をＩｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ）から購入した。細胞を２４−ウエルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）内に、１０％ウシ胎児血清、１００単位ｓ／ｍＬペニシリン、及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンで補充した高グルコースＤＭＥＭ培地中に（培地及び補充物はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡから入手）、５０、０００細胞／ウエルの密度でプレーティングした。細胞を一夜吸着させ、翌日アンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した。
【０３４８】
このアッセイで試験したアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＩＳＩＳ１１３１９６、ＩＳＩＳ３３７３３２、ＩＳＩＳ３３７３３３、ＩＳＩＳ３４５７７８、ＩＳＩＳ３４５７８１、ＩＳＩＳ３４５７９４、ＩＳＩＳ３４５８１５及びＩＳＩＳ３４５８２３であった。細胞を、オリゴヌクレオチド１００ｎＭにつきＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）３μｇ／ｍＬの濃度にてＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）を混合した５、１０、２５、５０及び１５０ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した。未処理細胞を対照として使用し、そのデータを標準化した。４時間後、培地を交換し、細胞を更に２０時間培養した。ＲＮＡを単離し、本願明細書に記載するように、ＰＰＳ１９９を使用してリアルタイムＰＣＲによりＳＴＡＴ３ｍＲＮＡレベルを測定した。三組のデータが得られ、これを平均した。結果を表２３に、未処理対照に関するｍＲＮＡ発現のパーセントとして示す。試験した各アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＩＣ５０、ＳＴＡＴ３ｍＲＮＡ発現が５０％抑制されたアンチセンスオリゴヌクレオチド濃度を、表２４に示す。
【０３４９】
表２３
初代ヒト肝細胞における、ヒトＳＴＡＴ３ｍＲＮＡ発現の抑制
【表３５】
0005507617.tif 000057
【０３５０】
表２４
ＳＴＡＴ３アンチセンス抑制のＩＣ５０
【表３６】
0005507617.tif 000058
【０３５１】
表２３に示すように、ＩＳＩＳ１１３１９６、ＩＳＩＳ３３７３３２、ＩＳＩＳ３４５７９４、及びＩＳＩＳ３４５８２３は、初代肝細胞におけるヒトＳＴＡＴ３ｍＲＮＡレベルを用量依存的に低下させた。表２４に示すように、ＩＳＩＳ３４５７９４は、最低ＩＣ５０を示した。
【０３５２】
表２５に、上述した細胞内でのＳＴＡＴ１の発現レベルを示す。ＳＴＡＴ１発現レベルは、当該技術分野にて慣習的な、本願明細書に記載した方法で設計されたプライマー及びプローブを使用したリアルタイムＰＣＲにより測定された（例、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（登録商標）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）。
【０３５３】
表２５
ＳＴＡＴ３を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した初代ヒト肝細胞内におけるヒトＳＴＡＴ１ｍＲＮＡ発現
【表３７】
0005507617.tif 000059
【０３５４】
表２５に示すように、ＳＴＡＴ３を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＴＡＴ１発現の実質的又は用量依存的な抑制を起こさなかった。ＩＳＩＳ３４５７９４の公知のＡ  ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌｓ（ＢＬＡＳＴ）分析、遺伝子分析技術ではＳＴＡＴ３以外の核酸分子の相同性が明らかとならなかった。
【実施例２０】
【０３５５】
ＨｅｐＧ２細胞におけるヒトＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制：用量反応
更なる実施態様にて、ヒトＳＴＡＴ３を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＨｅｐＧ２細胞内での用量反応のために選択した。
【０３５６】
ヒト肝芽腫細胞ラインＨｅｐＧ２をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得た。ＨｅｐＧ２細胞を、１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを含有するように調製し、１０％ウシ胎児血清、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、及び１ｍＭピルビン酸ナトリウムを補充したＥａｇｌｅ’ｓＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）内でルーチン的に培養した。約９０％集密度に到達した際に、細胞をルーチン的にトリプシン処理及び希釈して継代した。リン酸緩衝生理食塩水中のタイプ１ラットテールコラーゲンの１：１００希釈物で被覆したマルチウエル培養プレートを、細胞培養用に調製した（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）。コラーゲン含有プレートを、３７°Ｃで約１時間インキュベーとした後、コラーゲンを除去し、ウエルをリン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄した。細胞を９６−ウエルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ＃３８７２、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）内に、密度約８、０００細胞／ウエルにて播種して、オリゴマー化合物移入実験に使用した。
【０３５７】
このアッセイで試験したアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＩＳＩＳ１１３１９６、ＩＳＩＳ３３７３３２、ＩＳＩＳ３３７３３３、ＩＳＩＳ３４５７７８、ＩＳＩＳ３４５７８１、ＩＳＩＳ３４５７９４、ＩＳＩＳ３４５８１５及びＩＳＩＳ３４５８２３であった。細胞を、１００ｎＭのオリゴヌクレオチドにつき３μｇ／ｍＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）の濃度にて、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）を混合した５、１０、２５、５０及び１５０ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドにより処理した。未処理細胞を対照として使用し、そのデータを標準化した。４時間後、培地を交換し、細胞を更に２０時間培養した。ＲＮＡを単離し、本願明細書に記載したように、プライマープローブセットＰＰＳ１９９を使用したリアルタイムＰＣＲにより、ＳＴＡＴ３ｍＲＮＡレベルを測定した。三組のデータが得られ、これを平均した。結果を表２６に、未処理対照に関するｍＲＮＡ発現のパーセントとして示す。ＳＴＡＴ３ｍＲＮＡ発現が５０％抑制されたアンチセンス化合物濃度ＩＣ５０も示す。
【０３５８】
表２６
ＨｅｐＧ２細胞におけるヒトＳＴＡＴ３ｍＲＮＡ発現の抑制
【表３８】
0005507617.tif 000060
【０３５９】
表２６に示すように、ＩＳＩＳ１１３９１６、ＩＳＩＳ３３７３３３、ＩＳＩＳ３４５７９４、ＩＳＩＳ３４５８１５、及びＩＳＩＳ３４５８２３は、ＨｅｐＧ２細胞にてＳＴＡＴ３ｍＲＮＡ発現を用量依存的に低下させた。
【０３６０】
表２７に、上述したＳＴＡＴ３を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した細胞内のＳＴＡＴ１の発現レベルを示す。ＳＴＡＴ１ｍＲＮＡレベルは、当該技術分野にて慣習的な、本願明細書に記載した方法で設計されたプライマー及びプローブを使用したリアルタイムＰＣＲにより測定された。
【０３６１】
表２７
ＳＴＡＴ３を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理したＨｅｐＧ２細胞内のヒトＳＴＡＴ１ｍＲＮＡ発現
【表３９】
0005507617.tif 000061
【０３６２】
表２７に示すように、ＳＴＡＴ３オリゴヌクレオチドは、ＳＴＡＴ１発現を実質的に、即ち用量依存的に抑制しなかった。
【０３６３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドをＨｅｐＧ２細胞に移入した後、ＳＴＡＴ３タンパク質レベルも測定した。細胞をＳＴＡＴ３を標的とした１０ｎＭ、５０ｎＭ又は１００ｎＭ用量のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理し、ＳＴＡＴ３タンパク質レベルを、商業的に入手可能なＳＴＡＴ３抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）を使用したウエスタンブロット法により測定した。ＳＴＡＴ３抗体はＥＣＬｐｌｕｓ（登録商標）試薬（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用して検出され、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ（登録商標）ＥＱＳｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して定量した。ハウスキーピング遺伝子Ｇ３ＰＤＨにより発現したタンパク質を使用して、標本間のタンパク質レベルの差異を標準化した。表２８に、未処理対照細胞に関するタンパク質発現パーセントとして芦原下データを示す。
【０３６４】
表２８
ＨｅｐＧ２細胞内でのＳＴＡＴ３タンパク質発現の抑制
【表４０】
0005507617.tif 000062
【０３６５】
表２８に示すように、ＩＳＩＳ１１３１９６、ＩＳＩＳ３３７３３２、ＩＳＩＳ３３７３３３、ＩＳＩＳ３４５７７８、ＩＳＩＳ３４５７８１、ＩＳＩＳ３４５７９４、ＩＳＩＳ３４５８１５、及びＩＳＩＳ３４５８２３による処理は、ＨｅｐＧ２細胞内でＳＴＡＴ３タンパク質レベルを用量依存的に低下させた。
【実施例２１】
【０３６６】
Ａ５４９細胞内でのヒトＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制：用量反応
ヒトＳＴＡＴ３標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドを、Ａ５４９細胞内での用量反応の研究にて試験した。細胞を、オリゴヌクレオチド１００ｎＭにつきＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）３μｇ／ｍＬの濃度にてＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）を混合したアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した。オリゴヌクレオチド濃度を、表２９及び表３０に示す。未処理細胞を対照として使用し、そのデータを標準化した。両方とも本願明細書に記載したＰＰＳ１９９及びＰＰＳ２０３３である二つの異なるプライマープローブセットを使用して、ＳＴＡＴ３ｍＲＮＡ発現レベルを二重に測定した。ＰＰＳ２０３３及びＰＰＳ１９９を使用したデータを、未処理対照に関する発現のパーセントとして、各々、表２９及び表３０に示す。
【０３６７】
表２９
ＰＰＳ２０３３を使用して測定した、Ａ５４９細胞内でのヒトＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制
【表４１】
0005507617.tif 000063
【０３６８】
表２９に示すように、ＰＰＳ２０３３を使用して測定した所、ヒトＳＴＡＴ３を標的とした全てのアンチセンスオリゴヌクレオチドが、Ａ４５９細胞内で発現を抑制した。
【０３６９】
表３０
ＰＰＳ１９９を使用して測定した、Ａ５４９細胞内でのヒトＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制
【表４２】
0005507617.tif 000064
【０３７０】
表３０に示すように、ＰＰＳ１９９を使用して測定した所、ヒトＳＴＡＴ３を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ａ５４９細胞内で発現を用量依存的に抑制した。
代替的なアンチセンスオリゴヌクレオチド濃度の範囲を使用して、更なる用量反応実験を同様に実行した。プライマープローブセットＰＰＳ２０３３及びＰＰＳ１９９を使用したデータを、未処理対照細胞に関するＳＴＡＴ３ｍＲＮＡ発現のパーセントとして、各々、表３１及び表３２に示す。
【０３７１】
表３１
ＰＰＳ２０３３を使用して測定した、Ａ５４９細胞内でのヒＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制
【表４３】
0005507617.tif 000065
表３１のデータは、試験した更なる濃度も、ヒトＳＴＡＴ３を用量依存的に抑制したことを示す。
【０３７２】
表３２
ＰＰＳ１９９を使用して測定した、Ａ５４９細胞内でのヒＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制
【表４４】
0005507617.tif 000066
【０３７３】
表３２のデータは、試験した更なる濃度も、ヒトＳＴＡＴ３を用量依存的に抑制したことを示す。
【実施例２２】
【０３７４】
Ｈｅｐ３Ｂ細胞内でのヒトＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制：用量反応
Ｈｅｐ３Ｂ細胞内での用量反応研究にて、ＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制を試験した。
ヒト肝細胞腫細胞ラインＨｅｐ３Ｂ（Ｈｅｐ３Ｂ２．１−７）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得た。この細胞ラインは、最初、８歳のＡｆｒｉｃａｎ−Ａｍｅｒｉｃａｎ雄の肝細胞の癌腫から誘導された。細胞は、ａｒｅ上皮形態を有し、ヌードマウスにて発癌性を有する。Ｈｅｐ３Ｂ細胞を、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地（ＭＥＭ）内でＥａｒｌｅの平衡塩類溶液、２ｍＭＬ−グルタミン、１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム（ＡＴＣＣ＃２０−２００３、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）及び１０％加熱不活性化したウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）と共に慣習的に培養した。９０％集密度に到達した際に、細胞を慣習的にトリプシン処理及び希釈して継代した。
【０３７５】
細胞を、１００ｎＭのオリゴヌクレオチドにつき３μｇ／ｍＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）の濃度にて、各々ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）を混合したアンチセンスオリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１２９６８８、ＩＳＩＳ１１３１９６、ＩＳＩＳ３３７３３３、ＩＳＩＳ３４５７９４、ＩＳＩＳ３４５８１５、又は対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１２９６８８（ＴＴＣＧＣＧＧＣＴＧＧＡＣＧＡＴＴＣＡＧ、本願明細書に配列番号４１１として組み入れる）、各々を混合したＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）で処理した。ＳＴＡＴ３を標的としないＩＳＩＳ１２９６８８は、その両端（５’及び３’方向）に、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成された５個のヌクレオチド”ウイングが存在する１０個の２’−デオキシヌクレオチドを含む、２０ヌクレオチドの“ギャップマー”である。ＩＳＩＳ１２９６８８は、オリゴヌクレオチド全体を通してホスホロチオエートバックボーンを有し、全シチジン残基は５−メチルシチジンである。
【０３７６】
オリゴヌクレオチド濃度は、６．２５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、及び１００ｎＭであった。未処理細胞を対照として使用し、そのデータを標準化した。ＰＰＳ２０３３を使用して、本願明細書に記載したようにリアルタイムＰＣＲにより、ＳＴＡＴ３ｍＲＮＡ発現レベルを二重に測定した。データを未処理対照に関する発現のパーセントとして、表３３に示す。
【０３７７】
表３３
Ｈｅｐ３Ｂ細胞内でのＳＴＡＴ３発現の抑制：用量反応
【表４５】
0005507617.tif 000067
【０３７８】
表３３に示すように、ＩＳＩＳ１１３９２６、ＩＳＩＳ３３７３３３、ＩＳＩＳ３４５８１５ｏｒＩＳＩＳ３４５８１５による処理は、Ｈｅｐ３Ｂ細胞内にてＳＴＡＴ３ｍＲＮＡ発現を用量依存的に低下させた。ＩＳＩＳ３４５７９４は、Ｈｅｐ３Ｂ細胞内にて５０ｎＭ用量でＳＴＡＴ３ｍＲＮＡ発現を低下させた。
【実施例２３】
【０３７９】
ＴＨＬＥ−２細胞内でのヒトＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制：用量反応
ＴＨＬＥ−２細胞内での用量反応研究にて、ＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制を試験した。
ＳＶ−４０で形質転換した肝臓上皮細胞ラインＴＨＬＥ−２を、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から得、供給者の指示に従って培養した。オリゴヌクレオチド移入実験で使用するために、細胞を９６−ウエルプレート内で約１０、０００細胞／ウエルの密度にてプレーティングした。
【０３８０】
細胞を、各々、オリゴヌクレオチド１００ｎＭにつきＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）３μｇ／ｍＬの濃度にてＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）を混合したアンチセンスオリゴヌクレオチドｓＩＳＩＳ１２９６８８、ＩＳＩＳ１１３１９６、ＩＳＩＳ３３７３３３、ＩＳＩＳ３４５７９４、ＩＳＩＳ３４５８１５、又は対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ１２９６８８で処理した。オリゴヌクレオチド濃度は、６．２５ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、及び１００ｎＭであった。未処理細胞を対照として使用し、そのデータを標準化した。ＰＰＳ２０３３を使用して、本願明細書に記載したようにリアルタイムＰＣＲにより、ＳＴＡＴ３ｍＲＮＡ発現レベルを二重に測定した。データを表３４に、未処理対照に関するｍＲＮＡ発現のパーセントとして示す。
【０３８１】
表３４
ＴＨＬＥ−２細胞内でのＳＴＡＴ３の抑制：用量反応
【表４６】
0005507617.tif 000068
【０３８２】
表３４に示すように、ＩＳＩＳ１１３９２６、ＩＳＩＳ３３７３３３、ｏｒＩＳＩＳ３４５８１５による処理は、ＴＨＬＥ−２細胞内でＳＴＡＴ３ｍＲＮＡ発現を用量依存的に低下させた。ＩＳＩＳ３５４７９４も、ＴＨＬＥ−２細胞内でＳＴＡＴ３ｍＲＮＡ発現を低下させた。
【実施例２４】
【０３８３】
ヒトＳＴＡＴ３を標的とするｄｓＲＮＡｓの設計及びスクリーニング
更なる実施態様にて、ＳＴＡＴ３ｍＲＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号ＮＭ＿１３９２７６．２、本願明細書に配列番号４１２として組み入れる）を標的とする一連の核酸二重鎖を設計した。これらを表３５に示す。表３５の全化合物は、１９ヌクレオチドの長さを有し、全体にホスホジエステルヌクレオシド間結合（バックボーン）を有するオリゴリボヌクレオチドである。化合物は、平滑末端を有するように調製（製造）された。表３５はｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖を示し、センス鎖はアンチセンス鎖の相補体として合成した。これらの配列はウラシル（Ｕ）を含んでいるが、当業者はウラシル（Ｕ）は一般に、ＤＮＡ配列においてはチミン（Ｔ）に代替されることを理解するであろう。「標的部位」は、化合物が結合する特定の標的配列上の第一（最も５’−側）ヌクレオチド番号を示す。
【０３８４】
表３５の化合物を、Ａ５４９細胞内でのＳＴＡＴ３ｍＲＮＡに対する効果について試験した。ＳＴＡＴ３を標的としないｄｓＲＮＡ対照は、ＩＳＩＳ３３５４４９（ＵＵＵＧＵＣＵＣＵＧＧＵＣＣＵＵＡＣＵＵ、本願明細書に配列番号４１３として組み入れる）とその相補体との二重鎖、及びＩＳＩＳ３５９６６１（ＵＵＡＵＣＧＣＵＵＣＵＣＧＵＵＧＣＵＵ、本願明細書に配列番号４１４として組み入れる）とその相補体との二重鎖を含んでいた。ＩＳＩＳ３３５４４９は、２０ヌクレオチドの長さを有し、化合物全体にてホスホジエステルヌクレオシド間結合（バックボーンｓ）を有するオリゴリボヌクレオチドである。ＩＳＩＳ３５９６６１は、オリゴリボヌクレオチド１９ヌクレオチドの長さを有し、化合物全体にてホスホジエステルヌクレオシド間結合（バックボーンｓ）を有するオリゴリボヌクレオチドである。ＩＳＩＳ３３５４４９及びＩＳＩＳ３５９６６１の両方とその相補体とは、平滑末端を有するよう調製された。ＳＴＡＴ３を標的としないＩＳＩＳ１２９７００（ＴＡＧＴＧＣＧＧＡＣＣＴＡＣＣＣＡＣＧＡ、本願明細書に配列番号４１５として組み入れる）は、対照の一本鎖オリゴヌクレオチドとして使用された。ＩＳＩＳ１２９７００は、５’及び３’末端上に５個のヌクレオチド“ウイング”が存在する、１０個の２’−デオキシヌクレオチドからなる中央“ギャップ”領域を含む、２０ヌクレオチドの長さを有するキメラオリゴヌクレオチド（“ギャップマー”）である。ウイングは、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成されている。ヌクレオシド間（バックボーン）結合は、オリゴヌクレオチド全体を通してホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全てのシチジンは５−メチルシチジンである。
【０３８５】
Ａ５４９細胞を、１５０ｎＭのｄｓＲＮＡ化合物を混合した１５μｇ／ｍＬＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、又は１５０ｎＭの一本鎖オリゴヌクレオチドを混合した１５μｇ／ｍＬＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）で４時間処理した後、通常の増殖培地内で２０時間培養した。
【０３８６】
ＰＰＳ２０３３を使用して、本願明細書の他の実施例に記載したようにヒトＳＴＡＴ３ｍＲＮＡ発現を測定した。結果を標準化した。ｄｓＲＮＡ化合物又は一本鎖オリゴヌクレオチドで処理されていない未処理対照細胞に対して標準化した。データは２つの実験の平均値であり、これらを表３５に示す。
【０３８７】
表３５
Ａ５４９細胞内におけるｄｓＲＮＡによるヒトＳＴＡＴ３の抑制
【表４７】
0005507617.tif 000069
【０３８８】
これらのデータは、ヒトＳＴＡＴ３を標的としたｄｓＲＮＡが、Ａ５４９細胞内でｍＲＮＡ発現を低下させたことを示す。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ４１７、４１８、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３１、４３２、４３３、４３５、４３６、４４０、４４１、４４３、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１及び４５２のアンチセンス鎖、及びその相補体を含むｄｓＲＮＡは、このアッセイではＳＴＡＴ３を少なくとも３０％抑制した。
【実施例２５】
【０３８９】
ヒトＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制に続く、肺癌腫細胞ラインにおけるアポトーシス
ヒトＳＴＡＴ３を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドを、両方とも肺癌腫細胞ラインであるＡ５４９及びＨ４６０細胞内でのアポトーシスに対する効果について試験した。
【０３９０】
Ａ５４９細胞を、本願明細書に記載したように獲得し、培養した。Ｈ−４６０肺癌腫細胞ラインを、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から獲得し、１０％ウシ胎児血清、１００単位／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（培地及び補充物はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡから入手）を補充したＲＰＭＩ培地内で培養した。両方の細胞タイプを、９６−ウエルプレート内で、１０、０００細胞／ウエルの密度にてプレーティングした。
【０３９１】
細胞を、１００ｎＭのオリゴヌクレオチドにつき３μｇ／ｍＬＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）の濃度にて、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）を混合したアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した。オリゴヌクレオチド濃度は、１０、２０、４０及び８０ｎＭであった。ＩＳＩＳ２９８４８（ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ、ここでＮ＝Ａ、Ｔ、ＣｏｒＧ、配列番号４５３）はランダム化した配列を有し、負の対照として使用した。未処理細胞を対照として使用し、そのデータを標準化した。細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを移入し、ＰＰＳ２０３３を使用したリアルタイムＰＣＲによる処理から２４時間後、ＳＴＡＴ３ｍＲＮＡレベルを測定した。
【０３９２】
アポトーシスに対するＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制の効果を評価するために、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理から２４及び４８時間後、カスパーゼアッセイを実行した。カスパーゼ−３活性を、ペプチド配列ＤＥＶＤ内のアスパラギン酸残基の後方の切断を検出する蛍光定量ＨＴＳカスパーゼ−３アッセイ（Ｃａｔａｌｏｇ＃ＨＴＳ０２、ＥＭＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）により評価した。ＤＥＶＤ基質を蛍光分子でラベルし、これはカスパーゼ−３による切断により、蛍光の青色から緑色へシフトする。このアッセイでは、製造業者の指示に従って、オリゴマー化合物で処理した細胞内の活性カスパーゼ−３を測定した。アンチセンスオリゴヌクレオチド処理の後、１０μＭジチオスレイトールを含有する５０μＬのアッセイ緩衝液を各ウエルに加え、続いて２０μＬのカスパーゼ−３蛍光基質コンジュゲートを加えた。蛍光プレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ（登録商標）ＧｅｍｉｎｉＸＳ（登録商標）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して、ウエル内の蛍光（励起／発光４００／５０５ｎｍ）を直ちに検出した。プレートをカバーして更に３時間、３７℃でインキュベートし、その後蛍光を再度測定した（励起／発光４００／５０５ｎｍ）。３時間後の測定値から、ゼロ時の値を減じた。未処理対照細胞から得た測定値を、１００％活性として指定した。オリゴマー化合物で処理した細胞内のカスパーゼ−３活性を、未処理対照細胞のそれに対して標準化した。１００％を超えるか、又は１００％未満のカスパーゼ活性値は、化合物が、各々、カスパーゼ活性を刺激するか、又は抑制する能力を有することを示す。
【０３９３】
６−ウエル内にて、２５０、０００細胞／ウエルの密度でプレーティングし、ヒトＳＴＡＴ３を標的とした１５０ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した、Ａ５４９及びＨ４６０細胞におけるポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の切断を検出することにより、アポトーシスを評価した。オリゴヌクレオチド処理から４８時間後、タンパク質を単離して、ウエスタンブロット分析を実施した。商業的に入手可能な抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）によりＰＡＲＰを検出し、次いでＥＣＬｐｌｕｓ（登録商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で検出した。シグナルは、Ｃｈｅｍｉｄｏｃ（登録商標）ＥＱＳｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で検出した。完全長ＰＡＲＰ及び切断されたＰＡＲＰを両方とも定量した。
【０３９４】
アポトーシスは、更にＡ５４９及びＨ４６０細胞内の低二倍体を測定することにより評価した。細胞は２４ウエルプレート内にて５０、０００細胞／ウエルの密度でプレーティングされ、ヒトＳＴＡＴ３を標的とした２０、８０及び１５０ｎＭのアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理された。ＩＳＩＳ２２６８４４（ＧＣＣＣＴＣＣＡＴＧＣＴＧＧＣＡＣＡＧＧ、配列番号４５４）はＳＴＡＴ３を標的とせず、負の対照として使用された。ＩＳＩＳ１８３８９１（ＣＣＧＡＧＣＴＣＴＣＴＴＡＴＣＡＡＣＡＧ、配列番号４５５）は、これを抑制することが細胞周期停止に繋がるキネシン様１を標的とし、用量１００ｎＭにて負の対照として使用された。細胞を処理から４８時間に回収し、フローサイトメトリー分析用の細胞を調製するために使用した。細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメーターを使用して細胞周期プロファイルを生成した。Ｍｏｄ  Ｆｉｔプログラム（Ｖｅｒｉｔｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｈｏｕｓｅ、Ｉｎｃ．、ＴｏｐｓｈａｍＭＥ）を使用して、細胞周期プロファイルを分析した。核ＤＮＡの分解（ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）はアポトーシスの顕著な特徴であり、細胞内の低二倍体ＤＮＡの含有量を増大させ、これは“ｓｕｂＧ１”と分類されている。細胞内でのＧ１相の延長は、Ｓ相に入る前の細胞周期停止を示し、細胞内でのＳ相の延長は、ＤＮＡ合成中の細胞周期停止を示し、細胞内でのＧ２／Ｍ相の延長は、有糸分裂の直前又は有糸分裂中の細胞周期停止を示している。異数体（Ａ）細胞は、二倍体細胞よりもＤＮＡ含有量が多い。オリゴマー化合物で処理した細胞の細胞周期プロファイルを未処理対照細胞のそれに対して標準化した。１００％を超えるか、又は１００％未満の値は、各々、指示される細胞周期のＤＮＡ含有量を有する、細胞の割合における増加又は減少を示すと考慮される。
【０３９５】
Ａ５４９細胞内のこれらアッセイから得られたデータを、以下の表に示す。Ａ５４９細胞内のＳＴＡＴ３ｍＲＮＡレベルを、未処理対照細胞に関するｍＲＮＡ発現のパーセントとして表３６に示す。オリゴヌクレオチド処理から２４時間及び４８時間後のカスパーゼ−３活性を、未処理対照細胞のパーセンテージとして表３７に示す。ＰＡＲＰ定量を、未処理対照細胞に関するパーセンテージとして表３８に示す。ＤＮＡプロファイルを、細胞周期の各相におけるパーセンテージとして、表３９に示す。
【０３９６】
表３６
Ａ５４９細胞内におけるＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制
【表４８】
0005507617.tif 000070
【０３９７】
表３７
Ａ５４９細胞内におけるＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制後のカスパーゼ−３活性
【表４９】
0005507617.tif 000071
【０３９８】
表３８
Ａ５４９細胞内におけるＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制後の完全長及び切断ＰＡＲＰ
【表５０】
0005507617.tif 000072
【０３９９】
表３９
Ａ５４９細胞内におけるＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制後のＤＮＡプロファイル
【表５１】
0005507617.tif 000073
【０４００】
三種の異なるアッセイにより測定された所によれば、これらのデータからＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制は、Ａ５４９細胞内でアポトーシスを引き起こすことが明らかである。例えば、２０ｎＭのＩＳＩＳ３４５７８１による処理では、ＳＴＡＴ３ｍＲＮＡ発現が９９％も抑制され（表３６）、４８時間におけるカスパーゼ−３活性は、未処理対照で観察されたものと比較して、約３０倍の水準まで劇的に増大した（表３７）。また、完全長ＰＡＲＰは対照の２％に減少し、切断ＰＡＲＰは対照の約８倍であった（表３８）。更に、ＩＳＩＳ３４５７８１で処理した細胞のサブＧ１集団は、対照の約２０倍であり（表３９）、ＤＮＡ分解が生じたことを示している。一般に、細胞周期のサブＧ１、Ｇ１／Ｓ及びＧ２／Ｍ以外の相では、細胞分布には顕著な変化が見られなかった。ＩＳＩＳ３３７３３２は、８０及び１５０ｎＭ用量にてＧ１集団を増大させ、これはＧ１細胞周期停止を示している。合わせて、これらのデータは、ＩＳＩＳ３４５７８１によるＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制が、Ａ５４９細胞内でアポトーシスを誘導したことを明らかに示している。他のアンチセンスオリゴヌクレオチド処理も同様に、アポトーシスの誘導に付随してＳＴＡＴ３発現を低下させた。
【０４０１】
Ｈ−４６０細胞内におけるリアルタイムＰＣＲ、カスパーゼ−３、ＰＡＲＰ及びＤＮＡプロファイルアッセイから得られたデータを、以下の表に示す。Ｈ−４６０細胞内のｍＲＮＡレベルを、未処理対照細胞に関するｍＲＮＡ発現のパーセントとして表４０に示す。オリゴヌクレオチド処理から２４時間及び４８時間後のカスパーゼ−３活性を、未処理対照細胞のパーセンテージとして表４１に示す。ＰＡＲＰ定量を、未処理対照細胞に関するパーセントとして表４２に示す。ＤＮＡプロファイルを、細胞周期の各相におけるパーセンテージとして、表４３に示す。
【０４０２】
表４０
Ｈ−４６０細胞内におけるＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制
【表５２】
0005507617.tif 000074
【０４０３】
表４１
Ｈ−４６０細胞内におけるＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制後のカスパーゼ−３活性
【表５３】
0005507617.tif 000075
【０４０４】
表４２
Ｈ−４６０細胞内におけるＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制後のＰＡＲＰ切断
【表５４】
0005507617.tif 000076
【０４０５】
表４３
Ｈ−４６０細胞内におけるＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制後のＤＮＡプロファイル
【表５５】
0005507617.tif 000077
【０４０６】
Ｈ−４６０細胞内でＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制は、アポトーシスを誘導した。例えば、２０ｎＭのＩＳＩＳ３４５７８５による処理は、ＳＴＡＴ３発現を約９２％抑制した（表４０）。この標的の発現における低下は、未処理対照に関してカスパーゼ−３活性の約２．４倍の増大を伴った（表４１）。完全長ＰＡＲＰは対照の４３％に減少し、一方、切断されたＰＡＲＰは対照の１４３％に増加した（表４２）。また、２０ｎＭのＩＳＩＳ３４５７８５で処理された細胞内の低二倍体は、対照細胞内のそれの約４倍に増加した（表４３）。このように、Ｈ−４６０細胞内でのＩＳＩＳ３４５６７８５によるＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制は、アポトーシス誘導を引き起こした。他のアンチセンスオリゴヌクレオチド処理も同様に、アポトーシスの誘導に付随してＳＴＡＴ３発現を低下させた。
【０４０７】
アポトーシスの誘導に加えて、ＩＳＩＳ１１３１７６によるＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制はＳ相停止を引き起こし、これはＤＮＡ複製が妨害されたことを示している。
【実施例２６】
【０４０８】
ＡＬＣＬモデルにおける、インビボでのＳＴＡＴ３及び腫瘍成長の抑制
ＮＰＭ−ＡＬＫトランスジェニックマウスは、自発的にＴ−細胞リンパ腫及び形質細胞腫瘍を発症する（Ｃｈｉａｒｌｅ、等、Ｂｌｏｏｄ、２００３、１０１、１９１９−１９２７）。従って、これらマウスを、両方ともＳＴＡＴ３活性化と関連した胞性リンパ腫（ＡＬＣＬ）及び多発性骨髄腫のインビボモデルとして使用した。加えて、Ｔ−細胞リンパ腫及び形質細胞腫瘍からの細胞をレシピエントマウスに注入すると、レシピエントマウスに皮下腫瘍が発症する。移植したＴ−細胞リンパ腫及び形質細胞腫瘍は、各々、ＡＬＣＬ及び多発性骨髄腫の動物モデルとして働く。
【０４０９】
ＳＴＡＴ３を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＡＬＣＬにおけるＳＴＡＴ３発現及び腫瘍成長に対する効果について、インビボで試験した。マウスＮＰＭ−ＡＬＫＴ−細胞腫瘍由来の約２Ｘ１０６細胞を、同系の（遺伝子的に同一の）マウスに注入した。腫瘍細胞の注入から７日後、マウスにＩＳＩＳ１７１５２（配列番号９９）又は３塩基ミスマッチ対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ２８０８４（配列番号１５１）を、用量２０ｍｇ／ｋｇにて毎日皮下注射した。オリゴヌクレオチドは、一オリゴヌクレオチド処理につき６匹の動物に、１４日間投与された。オリゴヌクレオチドは腫瘍の反対側から皮下注射された。腫瘍容積は毎日測定された。それを表４４に示す。
【０４１０】
表４４
ＡＬＣＬモデルにおける腫瘍容積：マウスＮＰＭ−ＡＬＫ細胞
【表５６】
0005507617.tif 000078
【０４１１】
ＩＳＩＳ１７１５２で処理した動物では、腫瘍の成長は最小であるか又は全く観察されなかった。逆に言えば、対照オリゴヌクレオチドによって処理された動物では、腫瘍細胞の注射から１４日以内に、５匹の動物全部が大きな腫瘍塊を発症した。ＳＴＡＴ３タンパク質は本願明細書に記載したように、モノクローナルＳＴＡＴ３抗体（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）を使用したウエスタンブロット法により測定された。モノクローナルＳＴＡＴ３抗体は化学発光システム（ＥＣＬ、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）により検出され、ＳＴＡＴ３タンパク質はＩＳＩＳ１７１５２で処理された動物の腫瘍及び肝臓内で減少した。更に、残留した腫瘍塊の組織検査により、ＩＳＩＳ１７１５２で処理された動物からの腫瘍の有意な範囲において壊死及び単一の細胞死が観察された。
【０４１２】
インビボでの同様の実験を実行し、免疫無防備状態のマウスに、約１Ｘ１０７ヒトＮＰＭ−ＡＬＫ腫瘍細胞（Ｄｒ．ＡＬｏｒｅｎｚａｎａ、Ｖａｎ  Ｅｓｌａｎｄｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｇｒｏｓｓ  Ｐｏｉｎｔｅ  Ｗｏｏｄｓ、ＭＩより提供）を注入した。この試験は、２０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ１１３１７６（配列番号１１５）又はミスマッチ対照オリゴヌクレオチド（１２９９８７、配列番号４０４）を使用するマウスＮＰＭ−ＡＬＫ細胞について記述した通りに実施した。オリゴヌクレオチドを腫瘍の反対側に皮下注射した。各々３匹の動物を含むグループに対してオリゴヌクレオチドを１４日間投与した。腫瘍容積を測定し、表４４に示した。
【０４１３】
表４４
ヒトＮＰＭ−ＡＬＫ細胞を使用した、ＡＬＣＬモデルにおける腫瘍容積
【表５７】
0005507617.tif 000079
【０４１４】
ＩＳＩＳ１１３１７６で処理した動物では、腫瘍の成長は最小であるか又は全く観察されなかった。逆に言えば、ミスマッチ対照オリゴヌクレオチドを注射された動物に腫瘍成長が観察された。これらのデータは、ＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制は腫瘍内のＳＴＡＴ３タンパク質発現を抑制して、ＡＬＣＬモデルにてインビボで腫瘍成長を抑制することを示す。これらの発見は、ＳＴＡＴ３抑制が、ヒトＡＬＣＬ治療における治療的アプローチの一つであることを示す。
【実施例２７】
【０４１５】
多発性骨髄腫モデルにおける腫瘍成長の抑制
恒常的に活性化されたＳＴＡＴ３の存在により特徴付けられる、ＮＰＭ−ＡＬＫトランスジェニックマウス由来の多発性骨髄腫細胞を、同系マウスに皮下注射した。マウスは、ＩＳＩＳ１７１５２（配列番号９９）又はミスマッチ対照オリゴヌクレオチド（配列番号１５１）を毎日皮下注射された。オリゴヌクレオチドを１４日間投与した。オリゴヌクレオチドは、腫瘍の反対側に皮下注射された。腫瘍容積を二日に一回測定し、表４５に示した。
【０４１６】
表４５
ヒトＮＰＭ−ＡＬＫ細胞を使用した、ＡＬＣＬモデルにおける腫瘍容積
【表５８】
0005507617.tif 000080
【０４１７】
表４５に示すように、このモデルにてＳＴＡＴ３を標的としたＩＳＩＳ１７１５２は、腫瘍の成長を抑制したのに対し、対照オリゴヌクレオチドは抑制しなかった。これらのデータは、ＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制が、多発性骨髄腫モデルにおいてインビボで腫瘍成長を防止することを示す。
【実施例２８】
【０４１８】
ＬＣＬ細胞ラインにおける、ヒトＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制の効果
ＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制を、そのヒトＡＬＣＬ細胞（ＴＳＡＬＣＬ細胞、又はＳＵ−ＤＨＬ細胞、Ｄｒ．Ａ．Ｌｏｒｅｎｚａｎａ、Ｖａｎ  Ｅｓｌａｎｄｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｇｒｏｓｓ  Ｐｏｉｎｔｅ  Ｗｏｏｄｓ、ＭＩより提供）における細胞の増殖及び生存に対する効果について評価した。ＴＳＡＬＣＬ細胞に、電気穿孔法により０．０２、０．３、１．５、３、６、１２及び１５μＭのＩＳＩＳ１１３１７６（配列番号１１５）、又は３−塩基ミスマッチＩＳＩＳ１２９９８７（配列番号４０４）を移入した。Ａｍａｘａ（登録商標）電気穿孔ユニット（ＡｍａｘａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して、製造業者の指示に従い２Ｘ１０６細胞に電気穿孔した。２４時間後、細胞を回収した。細胞生存率を不健康細胞又は死細胞のみによって取り上げられるトリパンブルー染色により評価した。ミスマッチ対照で処理した細胞内で、細胞生存率及びＳＴＡＴ３タンパク質は低下しなかった。しかしながら、ＩＳＩＳ１１３１７６で処理した細胞では細胞生存率の用量依存的な低下が見られ、用量０．０３、１．５、３、６及び１２μＭにおいて、対照の９７％、８７％、６７％、６０％及び２９％であった。細胞生存率は、１５μＭ用量のＩＳＩＳ１１３１７６を受容した細胞内では、対照の３６％に低下した。細胞生存率の低下に加えて、本願明細書に記載したように実施した、処理細胞のウエスタンブロッティングにて、ＳＴＡＴ３タンパク質発現が用量依存的に低下することが明らかとなった。
【０４１９】
新たに合成したＤＮＡ内への三重水素化チミジンの取り込みは、細胞増殖の基準として役立つ。ＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制後の細胞増殖は、ＩＳＩＳ１１３１７６（配列番号１１５）を移入された細胞内に取り込まれた三重水素化（３Ｈ）チミジンの量を測定することにより評価される。ＳＵ−ＤＨＬ細胞に、７μＭのＩＳＩＳ１１３１７６を移入した。細胞に、構成的に活性化されたＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ３ｃを移入し、これらはＳＴＡＴ３が自発的に二量化して、ＤＮＡに結合して転写を活性化させるアミノ酸置換を有している（Ｂｒｏｍｂｅｒｇ、Ｊ．Ｆ．等、Ｃｅｌｌ、１９９９、９８、２９５−３０３)。細胞を、培養の最後の１８時間に１μＣｉの３Ｈ−チミジンが存在する下で培養した。オリゴヌクレオチド処理から２４、４８及び７２時間後、細胞を回収した。３Ｈ−チミジンの取り込みを慣習的なシンチレーション計数法で測定し、総数／分（ＣＰＭ）として表４６に示した。ＳＴＡＴ３活性化又は抑制の影響を受けない細胞のための対照に、Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡから入手可能）を使用した。
【０４２０】
表４６
ヒトＡＬＣＬ細胞内におけるアンチセンス抑制後の細胞増殖の低下
【表５９】
0005507617.tif 000081
【０４２１】
表４６に示すように、ヒトＳＵ−ＤＨＬ細胞内でのアンチセンス抑制は、細胞増殖を顕著に抑制した。構成的に活性化されたＳＴＡＴ３を発現しないＪｕｒｋａｔ細胞は、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理の影響を受けない。従って、細胞増殖上の効果は、ＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制に特異的である。
【０４２２】
同様のアッセイにて、ＴＳＡＬＣＬ細胞に７μＭのＩＳＩＳ１１３１７６を移入した。オリゴヌクレオチド処理から２４、４８及び７２時間後、ＳＴＡＴ３発現及びＰＡＲＰ切断を、本願明細書に記載した手法を使用したウエスタンブロット法により評価した。ＳＴＡＴ３タンパク質発現は低下し、アポトーシスの指標であるＰＡＲＰの切断が観察された。これら双方は時間依存的に発生した。細胞増殖は、これら細胞に取り込まれた３Ｈ−チミジンを測定することにより評価された。
【０４２３】
表４７
ＴＳＡＬＣＬ細胞内におけるＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制後の細胞増殖の低下
【表６０】
0005507617.tif 000082
これらのデータは、ＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制が、未分化リンパ腫細胞内での細胞増殖を低下させたことを示す。
【実施例２９】
【０４２４】
正常なマウスにおける、ＳＴＡＴ３を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果：毒性スクリーニング
正常マウスにおける、ＳＴＡＴ３を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を評価した。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、５０ｍｇ／ｋｇ用量のオリゴヌクレオチドを４週間の間、週に２回皮下注射した。投与したＳＴＡＴ３アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＩＳＩＳ３３７３３２、ＩＳＩＳ３３７３３３、ＩＳＩＳ３４５７７８、ＩＳＩＳ３４５７８１、ＩＳＩＳ１１３１９６、ＩＳＩＳ３４５８１５、ＩＳＩＳ３４５７９４、又はＩＳＩＳ３４５８２３であった。ＩＳＩＳ３３５０９９（ＧＡＧＴＡＴＣＡＣＴＡＴＧＧＣＴＧＧＣＣ、配列番号４５６）はＳＴＡＴ３を標的とせず、対照オリゴヌクレオチドとして使用した。対照グループとして、生理食塩水を受容する動物も使用した。各処理グループは、５匹の動物を含んでいた。処理前（Ｗｋ０）及び処理から２週間後（Ｗｋ２）及び４週間後（Ｗｋ４）の血液標本を収集した。慣習的な臨床分析により、血糖、コレステロール及びトリグリセリドを測定した。これらのデータを表４８に示す。
【０４２５】
表４８
正常なマウスにおける、ＳＴＡＴ３を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドの血漿グルコース、トリグリセリド、及びコレステロールに対する効果
【表６１】
0005507617.tif 000083
【０４２６】
その上昇が毒性を示し得る、血中の肝臓トランスアミナーゼＡＬＴ及びＡＳＴを慣習的な臨床分析により測定した。これらのデータを表４９に示す。
【０４２７】
表４９
正常なマウスにおける、ＳＴＡＴ３を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドの肝臓トランスアミナーゼレベルに対する効果
【表６２】
0005507617.tif 000084
【０４２８】
処理から４週間後、動物を犠牲にして、肝臓組織からＲＮＡを調製した。ＳＴＡＴ３ｍＲＮＡ発現を、本願明細書に記載したようにリアルタイムＰＣＲにより測定した。データを、生理食塩水で処理した対照マウスに関するＲＮＡ発現の抑制パーセントとして、表５０に示す。
【０４２９】
表５０
肝臓におけるＳＴＡＴ３標的の減少
【表６３】
0005507617.tif 000085
【０４３０】
表５０に示すように、ＩＳＩＳ１１３９１６、ＩＳＩＳ３３７３３２、ＩＳＩＳ３３７３３３、ＩＳＩＳ３４５７７８、ＩＳＩＳ３４５７９４、及びＩＳＩＳ３４５８２３による処理は、肝臓においてＳＴＡＴ３ｍＲＮＡを減少させた。
試験の終わりに、肝臓、脾臓、脂肪パッド及び腎臓の重量を測定した。各処理グループにおける平均の肝臓重量を、表５１に示す。
【０４３１】
表５１
肝臓重量に対するＳＴＡＴ３アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果
【表６４】
0005507617.tif 000086
【０４３２】
生理食塩水処理動物の脂肪パッドの平均重量は、約０．３３ｇであった。ＩＳＩＳ３３７３３３、ＩＳＩＳ３４５７７８、ＩＳＩＳ３４５８１５、ＩＳＩＳ３４５７９４、又はＩＳＩＳ３４５８２３処理グループの脂肪パッドの平均重量は、約０．２９ｇ〜０．３６ｇの範囲にあり、生理食塩水処理グループで測定した重量と比較して有意な差異は見られなかった。ＩＳＩＳ３３７３３３、ＩＳＩＳ３４５７８１、及びＩＳＩＳ１１３１９６で処理した動物の脂肪パッドの平均重量は、生理食塩水−処理対照動物と比較して、各々約０．２３ｇ、０．２２ｇ、及び０．２６ｇだけ僅かに軽かった。
【０４３３】
ＩＳＩＳ３３７３３２、ＩＳＩＳ３３７３３３、ＩＳＩＳ３４５７７８、及びＩＳＩＳ１１３１９６で処理した動物の脾臓重量の測定値の平均は、約０．０９〜０．１ｇであり、生理食塩水処理動物の平均（約０．０９ｇ）と差異はなかった。ＩＳＩＳ３４５８１５、ＩＳＩＳ３４５７９４、又はＩＳＩＳ３４５８２３で処理した動物の平均脾臓重量は、各々約０．０８、０．０７、及び０．０８であった。従って、ＳＴＡＴ３を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理は、正常なマウスの脾臓重量を増加させなかった。
【０４３４】
処理グループで測定した平均腎臓重量は、約０．２９ｇ〜約０．３４ｇの範囲にあった。これらのデータは、生理食塩水処理対照で測定した平均腎臓重量（約０．３６ｇ）と比較して、ＳＴＡＴ３を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理が、正常なマウスの腎臓重量を増加させなかったことを示す。
【０４３５】
０、２及び４週間目に、体重を測定した。生理食塩水−処理対照動物で測定した平均体重は、約２４ｇ〜２７ｇの範囲にあり、動物の体重は時間と共に増加した。ＳＴＡＴ３を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理した動物では、時間と共に同様の体重増加が見られ、その平均重量は対照動物の平均体重と有意に異ならなかった。
正常マウスの、ヒトＳＴＡＴ３を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドによる処理は、有意な悪影響を与えなかった。
【実施例３０】
【０４３６】
ＳＴＡＴ３を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドの、癌治療としての評価
ＳＴＡＴ３の不適切な発現及び／又は活性化は、前立腺癌、頭頸部の扁平上皮細胞癌腫、非小細胞肺癌腫及び肝細胞癌腫、多発性骨髄腫、未分化大細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、並びに非ホジキンリンパ腫を含む様々な癌と関連している。従って、ＳＴＡＴ３を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、固形腫瘍又は血液悪性腫瘍の患者にて評価された。処理グループは約３０〜４０人の患者からなる。充填期間にて、第一週にアンチセンスオリゴヌクレオチドを３回静脈内投与し、その後、アンチセンスオリゴヌクレオチドを毎週投与した。用量は、２ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲であった。処理応答を評価し、またバイオマーカーを測定することにより、アンチセンスオリゴヌクレオチド処理による効果を評価した。多発性骨髄腫患者のバイオマーカーの例には、血清パラプロテイン、及び循環多発性骨髄腫細胞におけるアポトーシスがある。循環骨髄腫細胞にてＳＴＡＴ３タンパク質及びリン酸化も測定した。
【０４３７】
ＳＴＡＴ３を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、化学療法薬が効かない患者、又は癌の再発を経験している患者でも試験した。
【０４３８】
ＳＴＡＴ３を標的としたアンチセンスオリゴヌクレオチドを、単独で、又は例えば化学療法薬ベルケード（登録商標）のような他の薬剤と組み合わせて投与した。
【実施例３１】
【０４３９】
ヒトＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制後の、肺癌腫細胞ラインにおけるアポトーシス
サイトカインＩＬ６は、ＳＴＡＴ機能の上流制御因子であり、肺癌細胞においても上方制御されていることが知られている。ＳＴＡＴ３は腫瘍形成及び上皮細胞の生存と頻繁に関係するため、ＳＴＡＴ３のヒト非小細胞肺癌腫細胞における役割を描写することに興味が持たれていた。そのため、細胞増殖及びアポトーシス誘導におけるＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制の効果が試験された。アッセイは記述されているように実施された（Ｓｏｎｇ等、Ｏｎｃｏ遺伝子、２００３、２２、４１５０−４１６５）。
【０４４０】
Ａ５４９、Ｈ４６０、Ｈ３５８及びＨ１２９９細胞ライン（全てＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手可能）を、５％ウシ胎児血清、２ｍＭグルタミン及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンで補充したＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）内で増殖させた。Ａ５４９、Ｈ３５８及びＨ１２９９細胞は、構成的に活性化したＳＴＡＴ３を示した。
【０４４１】
オリゴヌクレオチドを、封入リポソーム、又は電気穿孔のいずれかを用いて、ヒト肺癌細胞内に移入した。Ａ５４９、Ｈ３５８及びＨ１２９９細胞（６０−ｍｍ皿内に１００、０００〜２００、０００個の細胞）に、１．５ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ（登録商標）培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中の１５ｍｇのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）と共に、５００ｎＭのオリゴヌクレオチドを移入した。細胞をオリゴヌクレオチドと共に４時間インキュベートし、混合物を除去し、５％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩで１回洗浄した後、培地内でインキュベートした。免疫ブロット、電気泳動移動度シフト解析、及び顕微鏡観察のために、移入から２４時間後、細胞を回収した。Ａｐｏ−ＢＲＤＵ（登録商標）アッセイのために、移入後４８時間にて細胞を回収した。
【０４４２】
Ｈ４６０細胞の電気穿孔のために、細胞を約２０−３０Ｘ１０６の数にまで増殖させ、トリプシン処理し、そして最終濃度１０μｍにてオリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。細胞を電気穿孔した。Ｂｉｏｒａｄ  電気穿孔器（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）内で、１０００μＦ及び２３０ＶのＯＰＴＩ−ＭＥＭ内で、全容積４００ｍＬのＥａｇｌｅ培地、その後、細胞を１０ｃｍ皿内にて５％ＦＢＳ及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ中にリプレーティングし、５％ＣＯ２及び３７°Ｃのインキュベーター内に一夜配置した。翌朝、細胞をＰＢＳで洗浄し、血清及び抗生物質を含む新しい培養液を加えた。
【０４４３】
Ａｐｏ−ＢＲＤＵ（登録商標）キット（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、製造業者の指示に従いアポトーシスをアッセイした。１０、０００細胞／実験的条件からデータを獲得し、ＣＥＬＬＱｕｅｓｔ（登録商標）ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＳａｎＪｏｓｅ、ＣＡ）を使用して、ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ上で蛍光を分析した。ＰＡＲＰ抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を使用して完全長、及び切断された大きい断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）を検出して、アポトーシスの指標であるポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の切断を測定することにより、アポトーシスも検出した。
【０４４４】
前述したように、ＳＴＡＴＤＮＡ結合アッセイを実施した（Ｙｕ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９５、２６９、８１−８３、Ｇａｒｃｉａ等、Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、１９９７、８、１２６７−１２７６）。タンパク質-ＤＮＡ複合体を非変性（非変性）ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分解し、オートラジオグラフィーにより検出した。電気泳動移動度シフト解析（ＥＭＳＡ）により特定のＳＴＡＴ３複合体を同定する際に使用される抗ＳＴＡＴ３（Ｃ−２０）ポリクローナル抗体を、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得た。スーパーシフトアッセイで使用するために、放射標識したプローブ（一種又は複数種）の添加、及び電気泳動に先立って、１μｇのＣ−２０抗体を核抽出物と共に室温で２０分間インキュベートした。
【０４４５】
以下のようにウエスタンブロットを実行した。細胞溶解物を全タンパク質含有量（５０ｍｇ）について標準化し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥにかけた。これら試験にて使用された一次抗体は、ＳＴＡＴ３（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＫＹ）、リン酸化ＳＴＡＴ３Ｙ７０５（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）ＰＡＲＰ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）、及びβアクチン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から構成されていた。タンパク質の検出は、西洋ワサビペルオキシダーゼ−複合二次抗体、及びＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）からのエンハンスト（ｅｎｈａｎｃｅｄ）化学発光システム（ＥＣＬ）キットを使用して実施した。
【０４４６】
Ａ５４９細胞にはオリゴヌクレオチド、アンチセンス、又はミスマッチオリゴヌクレオチドのいずれも移入されず、２４時間後に細胞が収集され、総タンパク質及び核抽出物が調製された。ウエスタンブロッッティングにより、ＩＳＩＳ１１３１７６によって細胞の総ＳＴＡＴ３タンパク質の含有量が低下したことが明らかとなった一方、ミスマッチ対照オリゴヌクレオチドで処理した細胞、又は未処理細胞内では低下が見られなかった。ＳＴＡＴ３レベルの低下は、移入から２４時間後といった早期の（ＰＡＲＰ）の切断により証明されるアポトーシスの活性化を伴っていたが、ミスマッチ対照で処理された細胞内、又は未処理細胞内ではＰＡＲＰの切断が見られなかった。ＥＭＳＡでアッセイされたように、ＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制は、ＳＴＡＴ３ＤＮＡ−結合活性をほぼ完全に抑制した一方、ミスマッチオリゴヌクレオチド処理は、ＳＴＡＴ３ＤＮＡ−結合活性に全く影響を及ぼさなかった。ＩＳＩＳ１１３１７６で４８時間処理した細胞の顕微鏡写真検査では、細胞数の減少、及び細胞の寸法及び形状の変化が観察され、それには細胞破片及び空胞化細胞の増加が伴っていた。反対に、ミスマッチ対照オリゴヌクレオチドで処理した細胞では、細胞の数、寸法、形状に変化が見られず、また細胞死を暗示する細胞破片も増加していなかった。Ａ５４９細胞内でのアポトーシス調整におけるＳＴＡＴ３の役割を支持する更なる証拠を得るため、細胞を収集して、Ａｐｏ−ＢｒｄＵを組み入れることによりＤＮＡフラグメンテーションをアッセイした。３つの独立した実験で得られた結果をプールして、Ａｐｏ−ＢｒｄＵを組み入れた細胞のパーセンテージにより、アポトーシス％を決定した。アンチセンスＳＴＡＴ３で処理した細胞は、ミスマッチ対照処理細胞の約１６倍、未処理細胞の約４８倍だけＡｐｏ−ＢｒｄＵの組み込みを増大させ、これらの結果はアポトーシスを示している。未処理及びミスマッチ対照処理細胞は、ニックＤＮＡの最小の痕跡を有した。従って、ＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制は、Ａ５４９肺癌腫細胞内でのＰＡＲＰ切断及びＤＮＡフラグメンテーションで示されるように、アポトーシスを誘導した。
Ａ５４９細胞での発見を拡大するために、同様の実験をＨ３５８及びＨ１２９９肺癌腫細胞にて実施した。ＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制は、ミスマッチ対照オリゴヌクレオチドでの処理と比較して、Ｈ３５８及びＨ１２９９細胞の両方でＳＴＡＴ３タンパク質を消失させた。Ｈ３５８細胞内で、ＩＳＩＳ１１３１７６で処理された該細胞内でのＰＡＲＰ切断を証拠としたアポトーシス経路の活性化が見られたが、ＳＴＡＴ３タンパク質の欠損にも関わらずＨ１２９９細胞内でアポトーシスの証拠は見られなかった。
【０４４７】
最小のＳＴＡＴ３ＤＮＡ結合活性を有するＨ４６０肺癌腫細胞内でも、ＳＴＡＴ３アンチセンスオリゴヌクレオチド処理の効果が評価された。Ｈ４６０細胞に、電気穿孔により１０μｍ迄のＩＳＩＳ１１３１７６又はＩＳＩＳ１２９９８７を移入した。ＥＭＳＡで測定した所、ＳＴＡＴ３活性は最小のＤＮＡ結合活性を示し、これはＳＴＡＴ３アンチセンス抑制によって低下されたが、ミスマッチ対照オリゴヌクレオチド処理では低下されなかった。細胞構造又は細胞数上に影響は認められず、アポトーシスは増加せず（ＩＳＩＳ１２９９８７及びＩＳＩＳ１１３１７６処理後、各々０．５３％及び０．２７％のアポトーシス細胞）Ａｐｏ−ＢｒｄＵの組み入れにおける増加は観察されなかった。これらのデータは、ＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制が特異的で、ＴＡＴ３活性が最小であるＨ４６０細胞内では細胞死を誘導しないという結論を支持している。
【０４４８】
これらのデータから、ＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制は、Ａ５４９及びＨ３５８細胞内ではアポトーシスを生じるが、１２９９又はＨ４６０細胞内ではアポトーシスは観察されないことが明らかである。これらの発見は、ＳＴＡＴ３の直接的な抑制がアポトーシス細胞死を引き起こすことを示し、特定のヒト肺癌細胞内でアポトーシス経路を制御することを示唆している。
【実施例３２】
【０４４９】
前立腺癌細胞内におけるヒトＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制
多発性骨髄腫の発病には、アポトーシスを妨げる、サイトカインＩＬ−６によるＳＴＡＴ３の活性化が関与している。前立腺癌にＩＬ−６を含むサイトカインが関与するため、前立腺癌細胞内におけるＳＴＡＴ３の機能が研究された。更なる実施態様にて、ＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制を実施したＤＵ１４５細胞のＳＴＡＴ３活性、アポトーシス及び増殖を評価した。これらのアッセイに使用した手法は、Ｍｏｒａ等（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００２、６２、６６５９−６６６６）に詳細に記述されている。
【０４５０】
ＤＵ１４５前立腺癌細胞をＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手し、１０％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ培地内で培養した。細胞を、２５０ｎＭのＩＳＩＳ１１３１７６（配列番号１１５）又はＳＴＡＴ３を標的としないミスマッチ対照オリゴヌクレオチドであるＩＳＩＳ１２９９８７（ＧＣＴＣＣＡＡＴＡＣＣＣＧＴＴＧＣＴＴＣ、配列番号４０４）で処理した。移入から１８時間前、細胞を１０ｃｍプレート内で２Ｘ１０６細胞の密度で播種した。細胞に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のみ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ及びＩＳＩＳ１１３１７６、又はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ及びＩＳＩＳ１２９９８７を３時間移入した。未処理細胞を対照として使用した。
【０４５１】
処理から２４時間後、タンパク質単離及び核抽出物調製のために細胞を回収した。ＳＴＡＴ３のＤＮＡ結合活性を、核抽出物内で電気泳動移動度シフト解析（ＥＭＳＡ）により評価した。５ｕｇの総細胞タンパク質を、活性化ＳＴＡＴ３タンパク質に対して結合する３２Ｐ−ラベルしたオリゴヌクレオチドプローブと共にインキュベートした。タンパク質−ＤＮＡ複合体を非変性ポリアクリルアミド電気泳動で分離し、オートラジオグラフィーで検出した。ＳＴＡＴ３タンパク質レベルは、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）からの抗体を使用して、ウエスタンブロットにより評価した。また移入細胞を収集して９５％エタノール中で固定し、ウサギヒトポリクローナル抗体（Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｔｙｒ７０５−Ｓｔａｔ３、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を使用して、リン酸化ＳＴＡＴ３の免疫組織化学的染色を行った。
【０４５２】
ＥＭＳＡは、対照細胞（ミスマッチ対照オリゴヌクレオチド、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）Ｐｌｕｓのみ、又は処理なし）と比較して、ＩＳＩＳ１１３１７６を移入したＤＵ１４５細胞内でＳＴＡＴ３ＤＮＡ結合活性が非常に低下されたことを示した。ＳＴＡＴ３に対する抗体が遮断され、このＤＮＡ−結合活性をスーパーシフトさせ、この活性がＳＴＡＴ３に対応することを確認した。ＳＴＡＴ３タンパク質発現は、対照細胞と比較して、ＩＳＩＳ１１３１７６を移入したＤＵ１４５細胞内で非常に低下した。また、リン酸化ＳＴＡＴ３の染色は移入ＤＵ１４５細胞内で停止された。これらのデータは、リン酸化ＳＴＡＴ３を含むＳＴＡＴ３タンパク質のレベル、及びＳＴＡＴ３ＤＮＡ−結合活性を低下させることを示す。
【０４５３】
対照細胞、及び移入ＤＵ１４５細胞内のアポトーシスを、活性化カスパーゼ−３に特異的な抗体を使用して、供給者プロトコール（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｐｈａｒ  Ｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に従ってカスパーゼ−３レベルを測定することにより評価した。フローサイトメトリーにより染色を分析した。細胞増殖を、血球計数器及びトリパンブルー染色排除法を使用して、生細胞の数を計数することにより測定した。活性化されたカスパーゼ−３は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）Ｐｌｕｓのみ、ＩＳＩＳ１２９９８７又はＩＳＩＳ１１３１７６を受容した細胞内で、各々、未処理対照の約５％、７％及び１８％であり、ＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制後のアポトーシスの増加が示された。細胞増殖も４８時間に亘り抑制され、ＩＳＩＳ１１３１７６−処理標本では細胞数は３Ｘ１０６を超えなかった。ミスマッチ対照、及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ−Ｐｌｕｓで処理した細胞の細胞数は、同じ４８時間中に各々約５Ｘ１０６及び９Ｘ１０６細胞に増加した。
【実施例３３】
【０４５４】
２’−ＭＯＥウイング及びデオキシギャップを有する、マウスＳＴＡＴ３を標的としたキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
本発明によれば、公表された配列（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号Ｕ０６９２２、本願明細書に配列番号８２として組み入れる、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号ＮＴ＿０３９５２１．２のヌクレオチド１２３６９４８４〜１２４２１４６４の相補体、本願明細書に配列番号４６１として組み入れる、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号ＮＭ＿２１３６５９．１、本願明細書に配列番号４６２として組み入れる、及びＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号ＮＭ＿０１１４８６．３、本願明細書に配列番号４６３として組み入れる）を使用して、マウスＳＴＡＴ３の異なる領域を標的とする更なる一連のオリゴヌクレオチドを設計した。そのオリゴヌクレオチドを、表５２に示す。“標的部位“は、オリゴヌクレオチドが結合する特定の標的配列上の第一（最も５’側）のヌクレオアチド番号を示す。表５２の全化合物は、両側（５’及び３’方向）上に５個のヌクレオチド”ウイング”が存在する、１０個の２’−デオキシヌクレオチドからなる中央”ギャップ”領域を含む、２０ヌクレオチドの長さを有するキメラオリゴヌクレオチド（「ギャップマー」）である。ウイングは、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）ヌクレオチドから構成される。ヌクレオシド間（バックボーン）結合は、オリゴヌクレオチド全体を通してホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）である。全シチジン残基は、５−メチルシチジンである。
【０４５５】
本願明細書の他の実施例に記載したように、定量的リアルタイムＰＣＲによって化合物のマウスＳＴＡＴ３ｍＲＮＡレベル上の効果について分析した。データは、ｂ．ＥＮＤ細胞が７５ｎＭの本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理される二つの実験の平均である。
【０４５６】
マウス脳血管内皮細胞ラインｂ．ＥＮＤを、Ｍａｘ  Ｐｌａｎｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｂａｄ  Ｎａｕｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のＤｒ．ＷｅｒｎｅｒＲｉｓａｕより入手した。ｂ．ＥＮＤ細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で補充した高グルコースＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で、慣習的に培養した。細胞が約９０％集密度に到達した際に、細胞をルーチン的にトリプシン処理及び希釈により継代した。細胞を９６−ウエルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ＃３８７２、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）内に、密度約３０００細胞／ウエルにて播種して、オリゴマー化合物移入実験に使用した。
【０４５７】
公表された配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受入番号ＮＭ＿２１３６５９．１、本願明細書に配列番号４６２として組み入れる）を使用して、マウスＳＴＡＴ３配列にハイブリダイズするようにプローブ及びプライマーを設計した。マウスＳＴＡＴ３のためのＰＣＲプライマーは、
【０４５８】
フォワードプライマー：ＧＣＣＡＣＧＴＴＧＧＴＧＴＴＴＣＡＴＡＡＴＣＴ（配列番号４６４）
リバースプライマー：ＧＡＴＡＧＡＧＧＡＣＡＴＴＧＧＡＣＴＣＴＴＧＣＡ（配列番号４６５）
及びＰＣＲプローブは、ＦＡＭ−ＴＴＧＧＧＴＧＡＡＡＴＴＧＡＣＣＡＧＣＡＡＴＡＴＡＧＣＣＧ−ＴＡＭＲＡ（配列番号４６６）であり、ここでＦＡＭは蛍光色素であり、ＴＡＭＲＡは消光色素である。
【０４５９】
表５２
２’−ＭＯＥウイング及びデオキシギャップを有する、マウスＳＴＡＴ３を標的とするキメラホスホロチオエートオリゴヌクレオチド
【表６５】
0005507617.tif 000087
【表６６】
0005507617.tif 000088
【実施例３４】
【０４６０】
多発性骨髄腫モデルにおける、細胞死及び腫瘍成長抑制を誘導するＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制
更なる実施態様にて、多発性骨髄腫発症と、多発性骨髄腫由来の腫瘍の成長とにおけるＳＴＡＴ３の必要性について研究した。トランスジェニックＮＰＭ−ＡＬＫ（ＮＰＭ−ＡＬＫ  Ｔｇ）マウスは、構成的に活性化されたＳＴＡＴ３によって特徴付けられる多発性骨髄腫を自発的に発症する。多発性骨髄腫の発症にＳＴＡＴ３が必要か否かを決定するために、ＮＰＭ−ＡＬＫ  ＴｇマウスのＢ細胞のＳＴＡＴ３遺伝子を破壊した。前述したように、マウスＳＴＡＴ３遺伝子座はＣｒｅリコンビナーゼ認識部位（ｌｏｘＰ部位）を含むように設計した（Ｒａｚ等、ＰＮＡＳ、１９９９、９６、２８４６−２８５１）。この改変ＳＴＡＴ３を持つマウスとＣｒｅリコンビナーゼ導入遺伝子を持つマウスと交雑させると、Ｃｒｅリコンビナーゼが、ｌｏｘＰ部位に隣接する遺伝子座部分を切除して、ＳＴＡＴ３遺伝子座を削除（ｄｅｌｅｔｅ）する。ＮＰＭ−ＡＬＫＴｇマウスは、条件的に破壊可能なＳＴＡＴ３遺伝子を導入するように育種された。次にこれらマウスを、Ｂ系統限定ＣＤ１９遺伝子の制御下でＣｒｅを発現する、ＣＤ１９＋特異的なＣｒｅ導入遺伝子を保有するマウスと交雑させた（Ｒｉｃｋｅｒｔ等、Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．、１９９７、２５、１３１７）。得られた子孫は、Ｂ−細胞特異的なＳＴＡＴ３遺伝子削除を有していた。Ｂ細胞はＣＤ１９抗原で確認することができ、多発性骨髄腫の原因となる形質細胞に成熟し、これはＣＤ１９及びＣＤ１３８抗原の両方の存在で確認される。
【０４６１】
マウスを前述したように交雑させ、子孫の遺伝子型の同定によって、全ＣＤ１９＋又はＣＤ１３８＋細胞の８０％超がＳＴＡＴ３削除を受けたことが明らかとなった（Ｃｈｉａｒｌｅ等、Ｂｌｏｏｄ、２００３、１０１、１９１９−１９２７に記載されているように以前に同定されている）。更に、検査した２３ＮＰＭ−ＡＬＫＴｇＳＴＡＴ３−欠損動物ではＳＴＡＴ３ネガティブな多発性骨髄腫細胞は検出されなかった。これらの細胞から、前述したように核抽出物を調製した（Ｍｏｒａ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２：６６５９、２００２）。本願明細書に記載したウエスタンブロッティングによる核抽出物中のリン酸化ＳＴＡＴ３の検出によって、これらマウスの全ＣＤ１３８＋多発性骨髄腫細胞が、検出可能な核リン酸化ＳＴＡＴ３を含むことが明らかとなった。（Ｒａｚ等、ＰＮＡＳ、１９９９、９６、２８４６−２８５１に記載されている）サザンブロッティングにより、これらの細胞中のＳＴＡＴ３遺伝子は無傷であると判定された。これらのデータは、形質細胞の変換はＳＴＡＴ３を絶対的に必要とすることを示す。
【０４６２】
ＳＴＡＴ３ポジティブなＣＤ１９＋細胞は多発性骨髄腫を発症させ、多発性骨髄腫細胞はレシピエントマウスに移植された。得られた腫瘍中の、ＳＴＡＴ３アンチセンス抑制の効果を試験した。多発性骨髄腫細胞を、ヌード又は同系マウス（Ｂａｌｂ／ｃマウス）に皮下注射（２Ｘ１０６細胞）又は静脈内注射した（１Ｘ１０７細胞）。測定可能な多発性骨髄腫腫瘍（約０．５ｍｍ３）を有する動物に、用量２０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ  １７１５２（配列番号９９）又は対照オリゴヌクレオチドＩＳＩＳ  ２８０８４（配列番号１５１）を１４日間毎日注射した。注射は腫瘍の反対側にて皮下に行われた。各処理グループは３〜９匹の動物を含んでいた。
【０４６３】
オリゴヌクレオチド処理から１５日後、ＩＳＩＳ  １７１５２−注入動物の腫瘍成長は、対照オリゴヌクレオチド−注入動物の１５％に低下した。慣習的な組織学的分析による判断では、ＩＳＩＳ  １７１５２で処理した腫瘍全体には、唯一つのアポトーシス形態が見られた対照オリゴヌクレオチド処理腫瘍と比較して、大きな壊死領域が見られた。加えて、商業的に入手可能なキット（例、ＯＰＴ−ＥＩＡ（登録商標）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用したＥＬＩＳＡ法により、多発性骨髄腫で増大する血清ＩｇＭレベルを測定した。その結果、血清ＩｇＭレベルは、対照オリゴヌクレオチド処理動物と比較して、ＩＳＩＳ  １７１５２処理動物で低下することが分かった。更に、ＩＳＩＳ  １７１５２処理を受けた動物の生存率は、対照動物に関して有意に増加した。
【０４６４】
１ｃｍ３腫瘍を発症したマウスにて同様の実験を実施して、確立した腫瘍に対するＳＴＡＴ３アンチセンス抑制の効果を試験した。マウスを、４０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ１７１５２又は対照オリゴヌクレオチドで１４日間毎日処理した。この実験において、ＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制の結果として腫瘍壊死、及び腫瘍細胞周期停止を観察した。
【０４６５】
腫瘍内のアポトーシスは、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ染色キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）を使用して、製造業者の指示に従ってＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ染色により評価した。簡単に言えば、細胞を０．２ｍＬの染色緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２）及び１０μＬのヨウ化プロピジウム（５０μｇ／ｍｌ）中に懸濁させ、５μＬのＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖ試薬を４℃で１０分間かけて加えた。次いで標本をＦａｃｓＦｌｏｗ緩衝液で希釈し、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）上で分析した。ＳＴＡＴ３を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを受容したマウスの腫瘍細胞中にて、対照と比較して約２倍のＡｎｎｅｘｉｎ−Ｖポジティブな腫瘍細胞の増加が観察された。商業的に入手可能なキット（例、ＡＰＯ−ＤＩＲＥＣＴ（登録商標）、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して、製造業者の指示に従ってＴＵＮＥＬ染色によりアポトーシスも評価した。ＩＳＩＳ１７１５２で処理したマウスの腫瘍細胞中では、対照オリゴヌクレオチド処理腫瘍とは対照的にＴＵＮＥＬ−ポジティブ細胞が広範囲に存在した。これらのデータは、アンチセンス抑制が移植された多発性骨髄腫腫瘍内にてアポトーシスを誘発したことを示す。
【０４６６】
細胞周期停止をフローサイトメトリーにより評価した。細胞を本願明細書に記載したように調製した。ＩＳＩＳ１７１５２−処理腫瘍（２０ｍｇ／ｋｇ用量）からの細胞は、対照処理腫瘍からの細胞と比較して、Ｓ相集団にて４５％減少した。従って、ＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制は、細胞周期のＧ１相において細胞周期停止を誘導した。
【０４６７】
原発性多発性骨髄腫腫瘍、及び移植された腫瘍のＳＴＡＴ３、リン酸化ＳＴＡＴ３、Ｂｃｌ−ｘＬ、サバイビン、ＥＲＫ、リン酸化ＥＲＫ及びｃ−ｍｙｃの発現についてウエスタンブロットにより評価した。タンパク質溶解物を調製し、商業的に入手可能な抗体（ＳＴＡＴ３及びリン酸化ＳＴＡＴ３抗体は本願明細書に記載した方法にて得た、他の抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡから入手可能）を使用して、ウエスタンブロット分析にかけた。原発性及び移植多発性骨髄腫腫瘍の両方にて、これら全タンパク質を高いレベルにて観察し、移植腫瘍細胞が原発性腫瘍細胞と同様の特徴を示すことが示された。
【０４６８】
多発性骨髄腫のマウスモデルにおいて、組合せ処理も試験した。移植された多発性骨髄腫細胞に由来する腫瘍を持つ動物を、ＩＳＩＳ１７１５２及びボルテゾミブ（Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標）として商業的に周知の、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）又はシクロホスファミド（Ｅｎｄｏｘａｎａ（登録商標）として商業的に周知の、Ａｓｔａ  Ｍｅｄｉｃａ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の組み合わせによって処理した。少なくとも１０匹の動物からなる一処理グループは、２０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ  １７１５２とボルテゾミブの組み合わせを、１４日間毎日皮下投与された。ボルテゾミブは０．０５ｍｇ／ｋｇ〜１．０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量にて、１４日の試験期間中、週に２回静脈内投与された。少なくとも１０匹の動物からなる更なる処理グループは、２２０ｍｇ／ｋｇのＩＳＩＳ  １７１５をシクロホスファミドと組み合わせて毎日皮下投与された。シクロホスファミドは、用量３５ｍｇ／ｋｇにて、１４日の試験期間中、週に２回腹腔内投与された。組み合わせ処理グループでは以下の項目、すなわち腫瘍成長、生存率、血清ＩｇＭレベル、アポトーシス、細胞周期停止、ＳＴＡＴ３及びリン酸化ＳＴＡＴ３タンパク質レベル、並びに腫瘍壊死を評価した。
【０４６９】
これらのデータは、ＳＴＡＴ３のアンチセンス抑制が、インビボにてＧ１相における細胞周期停止、細胞死及び腫瘍成長抑制を誘導することを示す。従って、ＳＴＡＴ３を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、多発性骨髄腫の治療に活用される治療薬である。
【配列表】
0005507617000001.app