(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)   RASQDVSTAVA(配列番号：７)である配列Ａ１-Ａ１１を含むＨＶＲ-Ｌ１
(ii)  SASFLYS (配列番号：８)である配列Ｂ１-Ｂ７を含むＨＶＲ-Ｌ２
(iii) QQSYTTPPT(配列番号：９)である配列Ｃ１-Ｃ９を含むＨＶＲ-Ｌ３
(iv)  GFTFSSYWIH(配列番号：１)である配列Ｄ１-Ｄ１０を含むＨＶＲ-Ｈ１
(v)   ARINPSNGSTNYADSVKG(配列番号：２)である配列Ｅ１-Ｅ１８を含むＨＶＲ-Ｈ２、及び、
(vi)  ARGSGFRWVMDY(配列番号：６)である配列Ｆ１-Ｆ１４を含むＨＶＲ-Ｈ３
を含んでなる、Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達を低減する単離された抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体であって、
該Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲは、配列番号：５６のアミノ酸残基１４４６から１７３５のアミノ酸配列を有するヒトＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲ、又は配列番号：５７のアミノ酸残基１４４６から１７２５のアミノ酸配列を有するマウスＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲである、抗体。
【請求項２】
(i)   配列番号：１の配列を含むＨＶＲ-Ｈ１配列、
(ii)  配列番号：２、３、４及び５から選択される配列を含むＨＶＲ-Ｈ２配列、
(iii) 配列番号：６の配列を含むＨＶＲ-Ｈ３配列、
(iv)  配列番号：７の配列を含むＨＶＲ-Ｌ１配列、
(v)  配列番号：８の配列を含むＨＶＲ-Ｌ２配列、及び
(vi)  配列番号：１０、１１及び１２から選択される配列を含むＨＶＲ-Ｌ３配列
を含んでなる、Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達を低減する単離された抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体であって、
該Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲは、配列番号：５６のアミノ酸残基１４４６から１７３５のアミノ酸配列を有するヒトＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲ、又は配列番号：５７のアミノ酸残基１４４６から１７２５のアミノ酸配列を有するマウスＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲである、抗体。
【請求項３】
ＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２及びＨＶＲ-Ｈ３を含み、これらは順に配列番号：７、８、１０、１、３、６を含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
ＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２及びＨＶＲ-Ｈ３を含み、これらは順に配列番号：７、８、１１、１、４、６を含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項５】
ＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２及びＨＶＲ-Ｈ３を含み、これらは順に配列番号：７、８、１２、１、５、６を含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項６】
Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲへの結合について、請求項３から５のいずれか一に記載の抗体と競合する抗体。
【請求項７】
フレームワーク配列の少なくとも一部がヒトのコンセンサスフレームワーク配列である、請求項１から５のいずれか一に記載の抗体。
【請求項８】
ヒトのκサブグループコンセンサスフレームワーク配列を含む、請求項１から５のいずれか一に記載の抗体。
【請求項９】
重鎖ヒトのサブグループIIIコンセンサスフレームワーク配列を含む、請求項１から５のいずれか一に記載の抗体。
【請求項１０】
コンセンサスフレームワーク配列における位置７１、７３又は７８の一又は複数に置換を含む、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
置換がコンセンサスフレームワーク配列におけるＲ７１Ａ、Ｎ７３Ｔ又はＮ７８Ａの一又は複数である、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１４】
発現ベクターである、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
請求項１３又は１４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１６】
原核生物である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
真核生物である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
哺乳動物細胞である、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
(a) 請求項１４に記載のベクターを好適な宿主細胞において発現させ、そして(b) 抗体を回収することを含む、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体の製造方法。  
【請求項２０】
宿主細胞が原核生物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
宿主細胞が真核生物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
医薬としての使用のための請求項１から１１のいずれか一に記載の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体。
【請求項２３】
Ｎｏｔｃｈ１のシグナル伝達又は発現の増加と関連する疾患を有する個体の治療方法における使用のための、請求項１から１１のいずれか一に記載の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体。
【請求項２４】
前記疾患が癌、腫瘍及び／又は細胞増殖性疾患である、請求項２３に記載の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体。
【請求項２５】
前記癌、腫瘍及び／又は細胞増殖性疾患が癌である、請求項２４に記載の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体。
【請求項２６】
前記疾患が神経変性疾患である、請求項２３に記載の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体。
【請求項２７】
疾患が血管新生と関連する病的状態を含む、請求項２３に記載の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体。
【請求項２８】
前記個体がヒトである、請求項２３から２７のいずれか一に記載の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体。
【請求項２９】
前記疾患が、個体におけるＮｏｔｃｈ１アミノ酸配列の活性化変異と関連している、請求項２３に記載の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体。
【請求項３０】
請求項１から１１のいずれか一に記載の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体と薬理学的な担体とを含有してなる組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の説明）
本出願は、２００７年６月４日に出願の米国仮特許出願第６０／９３３０７２号、及び２００７年９月２０日に出願の米国仮特許出願第６０／９９４６４６号の優先権を主張するものであり、これらの開示内容は出典明記によって本明細書中に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は概して分子生物学の分野に関する。特に、本発明は、抗Ｎｏｔｃｈ１ネガティブ制御領域(ＮＲＲ)抗体及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｎｏｔｃｈレセプターファミリーは、ウニやヒトと同じくらい多様な有機体の発達に作用するシグナルを伝達する、進化上保存された膜貫通型レセプターの一種である。Ｎｏｔｃｈレセプター及びリガンドＤｅｌｔａ及びＳｅｒｒａｔｅ(哺乳動物ではＪａｇｇｅｄとして知られる)のファミリーは、上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)様レセプターを含有する大きな細胞外ドメインを有する膜貫通型タンパク質である。Ｎｏｔｃｈパラログの数は種間で異なる。例えば、哺乳動物では４つ(Ｎｏｔｃｈ１−Ｎｏｔｃｈ４)、線虫では２つ(ＬＩＮ-１２及びＧＬＰ-１)、及びキイロショウジョウバエでは１つ(Ｎｏｔｃｈ)のＮｏｔｃｈレセプターがある。Ｎｏｔｃｈレセプターは、膜貫通ドメインに対して外側の部位Ｓ１でｆｕｒｉｎ様プロテアーゼによって細胞表面への運搬の間にタンパク分解性にプロセシングされ、細胞外Ｎｏｔｃｈ(ＥＣＮ)サブユニット及びＮｏｔｃｈ膜貫通サブユニット(ＮＴＭ)が生じる。これら２つのサブユニットは、非共有的に結合したままで、成熟したヘテロダイマー細胞表面レセプターを構成する。Ｎｏｔｃｈ１ ＥＣＮサブユニットは、３６のＮ末端ＥＧＦ様リピートの後に、Ｓ１部位に先行する３つのタンデムリピートＬｉｎ１２／Ｎｏｔｃｈリピート(ＬＮＲ)モジュールを含有する。各ＬＮＲモジュールは、カルシウムイオンを調整することが予測される３つのジスルフィド結合及び一群の保存された酸性かつ極性の残基を含有する。ＥＧＦリピート領域内に、活性化リガンドのための結合部位が位置する。Ｎｏｔｃｈレセプターの固有のドメインを含むＬＮＲモジュールは、リガンドが誘導する活性化の前に静止高次構造にＮｏｔｃｈを維持することに関与する。Ｎｏｔｃｈ１ ＮＴＭは、細胞外領域(Ｓ２切断部位を内部に持つ)、膜貫通部分(Ｓ３切断部位を内部に持つ)、及びＲＡＭドメイン、アンキリンリピート、トランスアクチベーションドメイン及びカルボキシ末端ＰＥＳＴ配列を含む大きな細胞内部分を含む。ＥＣＮ及びＮＴＭサブユニットの安定な結合は、ＥＣＮのカルボキシ終末端(ＨＤ−Ｃと称される)及びＮＴＭの細胞外アミノ末端(ＨＤ−Ｎと称される)を含むヘテロ二量体化ドメイン(ＨＤ)に依存している。ＥＣＮサブユニットへのＮｏｔｃｈリガンドの結合により、制御された細胞内タンパク質分解により生じる２つの連続的なタンパク質分解性切断が開始する。部位Ｓ２のメタロプロテアーゼによる第一切断によって、Ｎｏｔｃｈ膜貫通サブユニットの、原形質膜の内側の小葉の近くの部位Ｓ３での第二切断が起こりやすくなる。プレセニリンとニカストリンを含む多タンパク質複合体により触媒される部位Ｓ３切断は、Ｎｏｔｃｈ膜貫通サブユニットの細胞内部分を遊離し、核に転位させ、標的の遺伝子の転写を活性化する。
【０００４】
Ｊａｇｇｅｄ及びＤｅｌｔａ様クラスの５つのＮｏｔｃｈリガンドは、ヒト(Ｊａｇｇｅｄ1(Ｓｅｒｒａｔｅ１とも称される)、Ｊａｇｇｅｄ２(Ｓｅｒｒａｔｅ２とも称される)、Ｄｅｌｔａ様１(ＤＬＬ１とも称される)、Ｄｅｌｔａ様３(ＤＬＬ３とも称される)、及びＤｅｌｔａ様４(ＤＬＬとも称される))において同定された。各々のリガンドは、Ｎｏｔｃｈを結合するために必須の、保存されたN末端のＤｅｌｔａ、Ｓｅｒｒａｔｅ、ＬＡＧ−２(ＤＳＬ)モチーフを有するシングルパス膜貫通タンパク質である。ＤＳＬモチーフに対する一連のＥＧＦ様モジュールＣ末端は膜に拡がる(membrane-spanning)部分に先行する。Ｎｏｔｃｈレセプターとは異なり、リガンドは、Ｃ末端に７０−２１５アミノ酸の短い細胞質の尾部を有する。さらに、他のタイプのリガンドも報告されている(例えばＤＮＥＲ、ＮＢ３、及びＦ３／コンタクチン)。
Ｎｏｔｃｈ経路は、ハエ及び脊椎動物の神経発生に作用するプロセスなど、多様な発達上及び生理学上のプロセスに際に機能する。通常は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達は、側方抑制、系統決定及び複数の細胞群間の境界の形成に関与する(例としてBray, Molecular Cell Biology 7:678-679, 2006を参照)。癌及び神経変性障害を含む多様なヒトの疾患は、Ｎｏｔｃｈレセプター又はそのリガンドをコードする遺伝子の突然変異によるものであることが示されている(例としてNam et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 6:501-509, 2002を参照)。ヒトＮｏｔｃｈ１の切断された構造的に活性な変異体を造る反復性のｔ(７;９)(ｑ３４;ｑ３４.３)染色体転座がヒト急性リンパ性白血病(Ｔ−ＡＬＬ)のサブセットにおいて同定された時に、無制限のＮｏｔｃｈシグナル伝達と悪性腫瘍との関連が初めて認識された。マウスモデルでは、Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達はＴ細胞発達に必須であり、Ｎｏｔｃｈ１が媒介するシグナルがＢ細胞発達を犠牲にしてＴ細胞の発達を促すことが示された。また、マウスモデルでは、発達の間の過剰なＮｏｔｃｈシグナル伝達によりＴ細胞腫瘍形成が引き起こされる。
【０００５】
さらに、Ｎｏｔｃｈレセプターはヒトの癌及び腫瘍由来の細胞株の広い範囲で発現され、ヒトの胚性幹細胞の神経運命を促す。例えば、Ｎｏｔｃｈは、ヒトの子宮頸管、及びヒトの腎臓細胞カルシノーマ細胞の腫瘍性病変において高く発現される。多くのヒトの疾患にＮｏｔｃｈシグナル伝達が関与していることを考えると、治療薬としての開発に適する臨床上の特性を有するＮｏｔｃｈシグナル伝達を制御する薬剤が求められていることは明らかである。本明細書中に記載の本発明はこの要求を満たし、他の利点を提供する。
特許出願及び出版物を含む本明細書において引用されるすべての文献は出典明記によって本明細書中に援用される。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、様々なＮｏｔｃｈ１ネガティブ制御領域(ＮＲＲ)結合剤(例えば抗体及びその断片)の同定にある程度基づく。Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲは重要で有益な治療的標的を表し、本発明はＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲの結合に基づく組成物及び方法を提供する。本明細書に記載のように、本発明のＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲ結合剤は、Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達経路の発現及び／又は活性化と関係する病的状態を標的とする(ターゲティングする)際に使用するための、重要な治療薬剤及び診断用薬剤を提供する。したがって、本発明は、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ結合に関連する方法、組成物、キット及び製造品を提供する。
本発明は、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲに結合する抗体を提供する。一態様では、本発明はＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲを結合する単離された抗体を特徴とする。特定の態様では、本発明は、１×１０−７Ｋｄ以上の強さでＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲを結合する単離された抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を特徴とする。望ましい実施態様では、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体は１×１０−８Ｋｄ以上又は１×１０−９Ｋｄ以上の強さでＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲを結合する。他の態様では、本発明は単離された抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体であって、該抗体の完全長ＩｇＧ形態は１×１０−７Ｋｄ以上の強さでヒト及びマウスのＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲを結合する抗体を提供する。当分野で十分に確立されているように、そのレセプターに対するリガンドの結合親和性は、様々なアッセイを用いて決定し、様々な定量値で表すことができる。したがって、一実施態様では、結合親和性はＫｄ値として表され、本質的な結合親和性を(例えば、最小の結合活性効果によって)表す。一般に、そして好ましくは、無細胞環境又は細胞関連の環境のいずれであっても、結合親和性はインビトロで測定される。例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ、ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)及びＥＬＩＳＡなど、本明細書に記載のものを含め、当分野で公知の多くのアッセイの何れかを用いて、結合親和性測定値を得ることができる。
【０００７】
一態様では、本発明は、
(a) 
(i)   RASQDVSTAVA(配列番号：７)である配列Ａ１−Ａ１１を含むＨＶＲ−Ｌ１
(ii)  SASFLYS (配列番号：８)である配列Ｂ１−Ｂ７を含むＨＶＲ−Ｌ２
(iii) QQSYTTPPT(配列番号：９)である配列Ｃ１−Ｃ９を含むＨＶＲ−Ｌ３
(iv)  GFTFSSYWIH(配列番号：１)である配列Ｄ１−Ｄ１０を含むＨＶＲ−Ｈ１
(v)   ARINPSNGSTNYADSVKG(配列番号：２)である配列Ｅ１−Ｅ１８を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び
(vi)  ARGSGFRWVMDY(配列番号：６)である配列Ｆ１−Ｆ１４を含むＨＶＲ−Ｈ３から選択される少なくとも１、２、３、４又は５の高頻度可変領域(ＨＶＲ)配列と、
(b) 配列番号：１から１２に示す配列の少なくとも１の残基の修飾を含む少なくとも１の変異ＨＶＲ配列
とを含む、単離された抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を特徴とする。望ましくは修飾は置換、挿入又は欠失である。
望ましい実施態様では、ＨＶＲ−Ｌ３変異体は、１〜４(１、２、３又は４)の置換を、Ｃ３(Ｓ又はＦ)、Ｃ４(Ｙ又はＦ)、Ｃ５(Ｔ又はＳ)、及びＣ８(Ｐ又はＡ又はＳ)のいずれかの組合せの位置に含む。他の望ましい実施態様では、ＨＶＲ−Ｈ２変異体は、１〜４(１、２、３又は４)の置換を、Ｅ６(Ｓ又はＰ又はＡ)；Ｅ８(Ｇ又はＲ)；Ｅ１０(Ｔ又はＡ又はＮ)；及びＥ１１(Ｎ又はＨ又はＱ又はＲ)のいずれかの組合せの位置に含む。
他の態様では、本発明は、１、２、３、４、５又は６のＨＶＲを含む単離された抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体であって、このとき各ＨＶＲは配列番号１から１２から選択される配列を含むか、これらからなるか、又はこれらから基本的になり、配列番号：７はＨＶＲ−Ｌ１に対応し、配列番号：８はＨＶＲ−Ｌ２に対応し、配列番号：９、１０、１１又は１２はＨＶＲ−Ｌ３に対応し、配列番号：１はＨＶＲ−Ｈ１に対応し、配列番号：２、３、４又は５はＨＶＲ−Ｈ２に対応し、そして配列番号：６はＨＶＲ−Ｈ３に対応するものであることを特徴とする。
一態様では、本発明は、配列番号：１の配列を含むＨＶＲ−Ｈ１領域を含む抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号：２、３、４又は５の配列を含むＨＶＲ−Ｈ２領域を含む抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号：６の配列を含むＨＶＲ−Ｈ３領域を含む抗体を提供する。一態様では、本発明は、配列番号：１０、１１又は１２の配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。
【０００８】
一態様では、本発明は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、又は４つすべての
(i)  配列番号：１の配列を含むＨＶＲ−Ｈ１配列；
(ii) 配列番号：２、３、４又は５の配列を含むＨＶＲ−Ｈ２配列；
配列番号：６の配列を含むＨＶＲ−Ｈ３配列；
配列番号：１０、１１又は１２の配列を含むＨＶＲ−Ｌ３配列
を含む抗体を提供する。
望ましい実施態様では、抗体はＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２及びＨＶＲ-Ｈ３を含み、これらは順に配列番号：７、８、９、１、２、６を含む。他の望ましい実施態様では、抗体はＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２及びＨＶＲ-Ｈ３を含み、これらは順に配列番号：７、８、１０、１、３、６を含む。他の望ましい実施態様では、抗体はＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２及びＨＶＲ-Ｈ３を含み、これらは順に配列番号：７、８、１１、１、４、６を含む。更なる望ましい実施態様では、抗体はＨＶＲ-Ｌ１、ＨＶＲ-Ｌ２、ＨＶＲ-Ｌ３、ＨＶＲ-Ｈ１、ＨＶＲ-Ｈ２及びＨＶＲ-Ｈ３を含み、これらは順に配列番号：７、８、１２、１、５、６を含む。
配列番号：１から１２のアミノ酸配列は図１に示す個々のＨＶＲ(すなわち、Ｈ１、Ｈ２又はＨ３)について番号付けしたもので、この番号付けは以下に記載のカバット番号付けシステムと一致する。
【０００９】
ある特定の態様では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達を阻害する、低減する、及び／又は遮断する単離された抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を提供する。本発明の抗体の一部の実施態様は、下記の配列番号：５３に示すように、ヒト化４Ｄ５抗体(ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８)(ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ(登録商標)Genentech, Inc．、米国カリフォルニア州サウスサンフランシスコ)(米国特許第６４０７２１３号及びLee等、J． Mol． Biol (2004), 340(5):1073-93においても言及される)の軽鎖可変ドメインを含む。
0005623272.tif 000002
(ＨＶＲ残基を下線で示す)
一実施態様では、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８軽鎖可変ドメイン配列は、位置３０、６６及び９１の一又は複数(それぞれ、上記に太字／斜体で示されるＡｓｎ、Ａｒｇ及びＨｉｓ)において修飾される。特定の実施態様では、修飾ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８配列は、位置３０にＳｅｒ、位置６６にＧｌｙ及び／又は位置９１にＳｅｒを含む。したがって、一実施態様では、本発明の抗体は、以下の配列番号：５４に示される配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。
0005623272.tif 000003
(ＨＶＲ残基を下線で示す)
ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８に関する置換された残基を上記に太字／斜体で示す。
【００１０】
Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲに対する結合活性が実質的に保持されるならば、本発明の抗体はいかなる適切なフレームワーク可変ドメイン配列をも含むことができる。例えば、ある実施態様では、本発明の抗体は、ヒトサブグループIII重鎖フレームワークコンセンサス配列を含んでなる。これらの抗体の一実施態様では、フレームワークコンセンサス配列は、位置７１、７３及び／又は７８に置換を含む。これらの抗体のある実施態様では、位置７１はＡであり、７３はＴであり、及び／又は７８はＡである。一実施態様では、これらの抗体はｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８(ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ(登録商標)Genentech, Inc．、米国カリフォルニア州サウスサンフランシスコ)(米国特許第６４０７２１３号及び同第５８２１３３７号、及びLee等、J． Mol． Biol． (2004), 340(5):1073-93においても言及される)の重鎖可変ドメインフレームワーク配列を含む。一実施態様では、これらの抗体は、ヒトκＩ軽鎖フレームワークコンセンサス配列を更に含む。ある特定の実施態様では、これらの抗体は、米国特許第６４０７２１３号及び同第５８２１３３７号に記載のｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８の軽鎖ＨＶＲ配列を含む。一実施態様では、これらの抗体は、ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８(ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ(登録商標)Genentech, Inc．、米国カリフォルニア州サウスサンフランシスコ)(米国特許第６４０７２１３号及び同第５８２１３３７号、及びLee等、J． Mol． Biol． (2004), 340(5):1073-93においても言及されている)の軽鎖可変ドメイン配列を含む。
【００１１】
一実施態様では、本発明の抗体は重鎖可変ドメインを含み、このときフレームワーク配列は配列番号：１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６及び／又は３７の配列を含み、ＨＶＲ  Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３配列はそれぞれ配列番号：１、２及び／又は６である。他の実施態様では、フレームワーク配列は、配列番号：１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６及び／又は３７の配列を含み、ＨＶＲ  Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３配列はそれぞれ配列番号：１、３及び／又は６である。さらに他の実施態様では、フレームワーク配列は、配列番号：１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６及び／又は３７の配列を含み、ＨＶＲ  Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３配列はそれぞれ配列番号である：１、４及び／又は６である。更なる実施態様では、フレームワーク配列は、配列番号：１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６及び／又は３７の配列を含み、ＨＶＲ  Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３配列はそれぞれ配列番号：１、５及び／又は６である。
特定の実施態様では、本発明の抗体は軽鎖可変ドメインを含み、このときフレームワーク配列は配列番号：３８、３９、４０及び／又は４１の配列を含み、ＨＶＲ  Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３配列はそれぞれ配列番号：７、８及び／又は９である。他の実施態様では、本発明の抗体は軽鎖可変ドメインを含み、このときフレームワーク配列は配列番号：３８、３９、４０及び／又は４１の配列を含み、ＨＶＲ  Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３配列はそれぞれ配列番号：７、８及び／又は１０である。更なる実施態様では、本発明の抗体は、軽鎖可変ドメインを含み、このときフレームワーク配列は配列番号：３８、３９、４０及び／又は４１の配列を含み、ＨＶＲ  Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３配列はそれぞれ配列番号：７、８及び／又は１１である。更なる他の実施態様では、本発明の抗体は、軽鎖可変ドメインを含み、このときフレームワーク配列は配列番号：３８、３９、４０及び／又は４１の配列を含み、ＨＶＲ  Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３配列はそれぞれ配列番号：７、８及び／又は１２である。
【００１２】
他の実施態様では、本発明の抗体は、重鎖可変ドメインを含み、このときフレームワーク配列は配列番号：４２、４３、４４及び／又は４５の配列を含み、ＨＶＲ  Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３配列はそれぞれ配列番号：１、２及び／又は６である。更なる実施態様では、本発明の抗体は、重鎖可変ドメインを含み、このときフレームワーク配列は配列番号：４２、４３、４４及び／又は４５の配列を含み、ＨＶＲ  Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３配列はそれぞれ配列番号：１、３及び／又は６である。更なる実施態様では、本発明の抗体は、重鎖可変ドメインを含み、このときフレームワーク配列は配列番号：４２、４３、４４及び／又は４５の配列を含み、ＨＶＲ  Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３配列はそれぞれ配列番号である：１、４及び／又は６である。さらに他の実施態様では、本発明の抗体は、重鎖可変ドメインを含み、このときフレームワーク配列は配列番号：４２、４３、４４及び／又は４５の配列を含み、ＨＶＲ  Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３配列はそれぞれ配列番号：１、５及び／又は６である。
一実施態様では、本発明の抗体は、軽鎖可変ドメインを含み、このときフレームワーク配列は配列番号：１５、１６、１７及び／又は１８の配列を含み、ＨＶＲ  Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３配列はそれぞれ配列番号：７、８及び／又は９である。他の実施態様では、本発明の抗体は、軽鎖可変ドメインを含み、このときフレームワーク配列は配列番号：１５、１６、１７及び／又は１８の配列を含み、ＨＶＲ  Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３配列はそれぞれ配列番号：７、８及び／又は１０である。さらに他の実施態様では、本発明の抗体は、軽鎖可変ドメインを含み、このときフレームワーク配列は配列番号：１５、１６、１７及び／又は１８の配列を含み、ＨＶＲ  Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３配列はそれぞれ配列番号：７、８及び／又は１１である。更なる実施態様では、本発明の抗体は、軽鎖可変ドメインを含み、このときフレームワーク配列は配列番号：１５、１６、１７及び／又は１８の配列を含み、ＨＶＲ  Ｌ１、Ｌ２、及びＬ３配列はそれぞれ配列番号：７、８及び／又は１２である。
【００１３】
一実施態様では、本発明の抗体は、重鎖可変ドメインを含み、このときフレームワーク配列は配列番号：４２、４３、４７及び／又は４５の配列を含み、ＨＶＲ  Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３配列はそれぞれ配列番号である：１、２及び／又は６である。一実施態様では、本発明の抗体は、重鎖可変ドメインを含み、このときフレームワーク配列は配列番号：４２、４３、４７及び／又は４５の配列を含み、ＨＶＲ  Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３配列はそれぞれ配列番号である：１、３及び／又は６である。他の実施態様では、本発明の抗体は、重鎖可変ドメインを含み、このときフレームワーク配列は配列番号：４２、４３、４７及び／又は４５の配列を含み、ＨＶＲ  Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３配列はそれぞれ配列番号である：１、４及び／又は６である。さらなる態様では、本発明の抗体は、重鎖可変ドメインを含み、このときフレームワーク配列は配列番号：４２、４３、４７及び／又は４５の配列を含み、ＨＶＲ  Ｈ１、Ｈ２、及びＨ３配列はそれぞれ配列番号である：１、５及び／又は６である。
一実施態様では、本発明の抗体は、軽鎖可変ドメインを含み、このときフレームワーク配列は配列番号：１５、１６、４７及び／又は１８の配列を含み、ＨＶＲ  Ｌ１、Ｌ２及びＬ３配列はそれぞれ配列番号：７、８及び／又は９である。他の実施態様では、本発明の抗体は、軽鎖可変ドメインを含み、このときフレームワーク配列は配列番号：１５、１６、４７及び／又は１８の配列を含み、ＨＶＲ  Ｌ１、Ｌ２及びＬ３配列はそれぞれ配列番号：７、８及び／又は１０である。さらに他の実施態様では、本発明の抗体は、軽鎖可変ドメインを含み、このときフレームワーク配列は配列番号：１５、１６、４７及び／又は１８の配列を含み、ＨＶＲ  Ｌ１、Ｌ２及びＬ３配列はそれぞれ配列番号：７、８及び／又は１１である。更なる実施態様では、本発明の抗体は、軽鎖可変ドメインを含み、このときフレームワーク配列は配列番号：１５、１６、４７及び／又は１８の配列を含み、ＨＶＲ  Ｌ１、Ｌ２及びＬ３配列はそれぞれ配列番号：７、８及び／又は１２である。
【００１４】
更なる実施態様では、本発明の抗体は望まれる標的結合親和性を得るために親和性成熟される。ある例では、本発明の親和性成熟された抗体は、一又は複数のアミノ酸位Ｈ５３、Ｈ５５、Ｈ５７、Ｈ５８、Ｌ９１及びＬ９６に置換を含む。ある例では、本発明の親和性成熟された抗体は、以下の置換の一又は複数を含む。(ａ) 重鎖のＳ５３Ｐ、Ｓ５３Ａ、Ｇ５５Ｒ、Ｔ５７Ａ、Ｔ５７Ｎ、Ｎ５８Ｈ、Ｎ５８Ｑ、及びＮ５８Ｒ、又は(ｂ) 軽鎖のＳ９１Ｆ、Ｐ９６Ａ、及びＰ９６Ｓ。
他の態様では、本発明の抗体は、配列番号：５８の配列を含む重鎖可変ドメインを含む。一実施態様では、本発明の抗体は、配列番号：５９の配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。一実施態様では、本発明の抗体は、配列番号：５８の配列を含む重鎖可変ドメインと配列番号：５９の配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む。他の態様では、本発明の抗体は、配列番号：６０の配列を含む重鎖可変ドメインを含む。一実施態様では、本発明の抗体は、配列番号：６１の配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。一実施態様では、本発明の抗体は、配列番号：６０の配列を含む重鎖可変ドメインと配列番号：６１の配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む。他の態様では、本発明の抗体は、配列番号：６２の配列を含む重鎖可変ドメインを含む。一実施態様では、本発明の抗体は、配列番号：６３の配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。一実施態様では、本発明の抗体は、配列番号：６２の配列を含む重鎖可変ドメインと配列番号：６３の配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む。他の態様では、本発明の抗体は、配列番号：６４の配列を含む重鎖可変ドメインを含む。一実施態様では、本発明の抗体は、配列番号：６５の配列を含む軽鎖可変ドメインを含む。一実施態様では、本発明の抗体は、配列番号：６４の配列を含む重鎖可変ドメインと配列番号：６５の配列を含む軽鎖可変ドメインとを含む。
【００１５】
一態様では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲに結合するための上記いずれかの抗体と競合する抗体を提供する。一態様では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ上の、上記いずれかの抗体と同じか又は類似のエピトープに結合する抗体を提供する。
当分野で公知、そして、以下により詳細に記述されるように、(後述のような)当分野の様々な定義及び前後関係に従って、抗体の高頻度可変領域を表すアミノ酸位／境界は異なってもよい。可変ドメイン内のいくつかの位置は、ある判断基準の下では高頻度可変領域内にあると判断されるが、異なるある判定基準の下では高頻度可変領域の外にあると判断される、ハイブリッド高頻度可変位置と見られうる。また、これらの位置の一又は複数は、伸展した高頻度可変領域内にありうる(以下にさらに定義する)。
いくつかの実施態様では、抗体はモノクローナル抗体である。他の実施態様では、抗体はポリクローナル抗体である。いくつかの実施態様では、抗体は、キメラ抗体、親和性成熟抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体からなる群から選択される。ある実施態様では、抗体は抗体断片である。いくつかの実施態様では、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆａｂ'-ＳＨ、Ｆ(ａｂ')２又はｓｃＦｖである。
【００１６】
一実施態様では、抗体はキメラ抗体、例えば、異種性の非ヒト、ヒト又はヒト化配列(例えば、フレームワーク及び／又は定常ドメイン配列)に移植した非ヒトドナーの抗原結合配列を含有してなる抗体である。一実施態様では、非ヒトドナーはマウスである。更なる実施態様では、抗原結合配列は合成のもの、例えば突然変異誘発(例えばファージディスプレイスクリーニングなど)によって得られるものである。特定の実施態様では、本発明のキメラ抗体は、マウスＶ領域とヒトＣ領域を有する。一実施態様では、マウス軽鎖Ｖ領域はヒトカッパ軽鎖に融合される。一実施態様では、マウス重鎖Ｖ領域はヒトＩｇＧ１ Ｃ領域に融合される。
本発明のヒト化抗体は、融合したＣＤＲ内に変異を有する親和性成熟変異体及びＦＲ内にアミノ酸置換を有するものを含む。ＣＤＲ又はＦＲ内の置換されたアミノ酸は、ドナー又はレシピエントの抗体に存在するものに限らない。他の実施態様では、本発明の抗体はさらに、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣの機能及びＢ細胞の殺傷の亢進を含め、エフェクター機能の改善を生じるＦｃ領域内のアミノ酸残基に変異を含有する。本発明の他の抗体には、安定性を改善する特定の変化を有するものが含まれる。他の実施態様では、本発明の抗体は、エフェクター機能の低減、例えばＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ機能の低減及び／又はＢ細胞殺傷の低減を生じるＦｃ領域内のアミノ酸残基に変化を含有する。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞上のヒトＦｃレセプター及び／又はヒト補体因子Ｃ１ｑへの結合の減少(例えば結合の欠如)に特徴がある。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、ヒトのＦｃγＲI、ＦｃγＲIIＡ及び／又はＦｃγＲIIIＡへの結合の減少(例えば結合の欠如)に特徴がある。いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、ＩｇＧクラスのもの(例えばＩｇＧ１又はＩｇＧ４)であり、そしてＥ２３３、Ｌ２３４、Ｇ２３６、Ｄ２６５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ａ３２７、Ａ３３０、Ｐ３３１及び／又はＰ３２９(ＥＵインデックスに従った番号付け)の少なくとも一つの突然変異を含んでなる。いくつかの実施態様では、抗体は、突然変異Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ又はＤ２６５Ａ／Ｎ２９７Ａを含んでなる。
【００１７】
一態様では、本発明は、本明細書中に示されるいずれかの抗原結合配列を含み、このときＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲ、例えばヒト又はマウスのＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲに特異的に結合する抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲポリペプチドを提供する。 
本発明の抗体は、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲを結合し(例えば特異的に結合し)、ある実施態様では、Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達及び／又は任意の生物学的に関連するＮｏｔｃｈ１の破壊及び／又はＮｏｔｃｈ１リガンド生物学的経路、腫瘍、細胞増殖性疾患又は癌の治療及び／又は予防；及び／又はＮｏｔｃｈ１の発現及び／又は活性(例えばＮｏｔｃｈ１の発現及び／又は活性の増加)と関連する疾患の治療又は予防の一又は複数の態様を調節しうる。ある実施態様では、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体は、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲからなるかないしは基本的になるポリペプチドに特異的に結合する。ある実施態様では、抗体は１×１０−７Ｋｄ以上の強さでＮｏｔｃｈ１を特異的に結合する。ある実施態様では、本発明の抗体は、インビボ及び／又はインビトロでＮｏｔｃｈ１活性を低減する、阻害する、及び／又は遮断する。
【００１８】
一態様では、本発明は、癌、腫瘍及び／又は細胞増殖性疾患などの疾患の治療的及び／又は予防的な処置のための医薬の調製における本発明の抗体の使用を提供する。ある実施態様では、疾患は神経障害又は神経変性疾患である。さらに他の望ましい実施態様では、疾患は血管新生と関連する病的状態である。ある実施態様では、血管新生と関連する病的状態は腫瘍、癌、及び／又は細胞増殖性疾患である。ある実施態様では、血管新生と関係する病的状態は眼内新生血管疾患である。  
一態様では、本発明は、本発明の一又は複数の抗体と担体を含有してなる組成物を提供する。一実施態様では、担体は薬学的に許容可能である。
一態様では、本発明は、本発明の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体をコードする核酸を提供する。
一態様では、本発明は、本発明の核酸を含んでなるベクターを提供する。
更なる態様では、本発明は、本発明の一又は複数の核酸と担体を含有してなる組成物を提供する。一実施態様では、担体は薬学的に許容可能である。
一態様では、本発明は、本発明の核酸又はベクターを含んでなる宿主細胞を提供する。ベクターは、何れの型のもの、例えば発現ベクターなどの組換えベクターでもよい。任意の様々な宿主細胞が使われてもよい。一実施態様では、宿主細胞は、原核細胞、例えば大腸菌である。一実施態様では、宿主細胞は、真核細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞などの哺乳類細胞である。
【００１９】
一態様では、本発明は、本発明の抗体の作製方法を提供する。例えば、本発明は、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体(本明細書で定義されるように、完全長及びその断片を含む)の作製方法であって、適切な宿主細胞において、前記の抗体(又は抗体断片)をコードする本発明の組み換えベクターを発現させ、該抗体を回収することを含む作製方法を提供する。
一態様では、本発明は、容器、と容器内に包含される組成物を具備する製造品であって、該組成物が本発明の一又は複数の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を含有するものである、製造品を提供する。一実施態様では、組成物は本発明の核酸を含有する。一実施態様では、抗体を含有してなる組成物は、さらに担体を含有するものであって、いくつかの実施態様ではその担体は薬学的に許容可能なものである。一実施態様では、本発明の製造品は、被検体に組成物(例えば抗体)を投与するための指示書をさらに具備する(例えば、本明細書に記載の何れかの方法のための指示書)。
一態様では、本発明は、本発明の一又は複数の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を含有してなる組成物を包含する第一容器、と、バッファを包含する第二容器を具備するキットを提供する。一実施態様では、バッファは薬学的に許容可能なものである。一実施態様では、抗体を含有してなる組成物はさらに担体を含有するものであって、いくつかの実施態様ではその担体は薬学的に許容可能なものである。一実施態様では、キットは、個体に組成物(例えば抗体)を投与するための指示書をさらに具備する。
【００２０】
更なる態様では、本発明は、癌、腫瘍、及び／又は細胞増殖性疾患などの疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における本発明の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体の使用を提供する。いくつかの実施態様では、前記疾患は神経障害又は神経変性疾患である。他の望ましい実施態様では、前記疾患は、血管新生に関係する病的状態である。ある実施態様では、血管新生と関連する病的状態は腫瘍、癌、及び／又は細胞増殖性疾患である。ある実施態様では、血管新生と関係する病的状態は眼内新生血管疾患である。
ある態様では、本発明は、癌、腫瘍、及び／又は細胞増殖性疾患などの疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における本発明の核酸の使用を提供する。いくつかの実施態様では、前記疾患は神経障害又は神経変性疾患である。いくつかの実施態様では、前記疾患は、血管新生に関係する病的状態である。ある実施態様では、血管新生と関連する病的状態は腫瘍、癌、及び／又は細胞増殖性疾患である。ある実施態様では、血管新生と関係する病的状態は眼内新生血管疾患である。
【００２１】
他の態様では、本発明は、癌、腫瘍、及び／又は細胞増殖性疾患などの疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における本発明の発現ベクターの使用を提供する。いくつかの実施態様では、前記疾患は神経障害又は神経変性疾患である。いくつかの実施態様では、前記疾患は、血管新生に関係する病的状態である。ある実施態様では、血管新生と関連する病的状態は腫瘍、癌、及び／又は細胞増殖性疾患である。ある実施態様では、血管新生と関係する病的状態は眼内新生血管疾患である。
更なる他の態様では、本発明は、癌、腫瘍、及び／又は細胞増殖性疾患などの疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における本発明の宿主細胞の使用を提供する。いくつかの実施態様では、前記疾患は神経障害又は神経変性疾患である。いくつかの実施態様では、前記疾患は、血管新生に関係する病的状態である。ある実施態様では、血管新生と関連する病的状態は腫瘍、癌、及び／又は細胞増殖性疾患である。ある実施態様では、血管新生と関係する病的状態は眼内新生血管疾患である。
【００２２】
更なる態様では、本発明は、癌、腫瘍、及び／又は細胞増殖性疾患などの疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における本発明の製造品の使用を提供する。いくつかの実施態様では、前記疾患は神経障害又は神経変性疾患である。他の望ましい実施態様では、前記疾患は、血管新生に関係する病的状態である。ある実施態様では、血管新生と関連する病的状態は腫瘍、癌、及び／又は細胞増殖性疾患である。ある実施態様では、血管新生と関係する病的状態は眼内新生血管疾患である。
一態様では、本発明は、癌、腫瘍、及び／又は細胞増殖性疾患などの疾患の治療的及び／又は予防的処置のための医薬の調製における本発明のキットの使用を提供する。いくつかの実施態様では、前記疾患は神経障害又は神経変性疾患である。他の望ましい実施態様では、前記疾患は、血管新生に関係する病的状態である。ある実施態様では、血管新生と関連する病的状態は腫瘍、癌、及び／又は細胞増殖性疾患である。ある実施態様では、血管新生と関係する病的状態は眼内新生血管疾患である。
【００２３】
本発明は、Ｎｏｔｃｈ１の発現及び／又は活性、例として発現及び／又は活性の増加ないしは減少又は望ましくない発現及び／又はシグナル伝達と関係している疾患状態を調整するために有用な方法及び組成物を提供する。
また、本発明は、活性化されたＮｏｔｃｈ１レセプターと関係する疾患を調整するために有用な方法及び組成物を提供する。このような疾患は、Ｎｏｔｃｈ1アミノ酸配列の転座又は活性化する突然変異と関係しうる。活性化されたＮｏｔｃｈ１レセプターと関係する疾患の例にはＴ細胞急性リンパ芽球性白血病(Ｔ−ＡＬＬ)が含まれる。
一態様では、本発明は、個体のＮｏｔｃｈ１の発現及び／又は活性の増加と関連する腫瘍、癌及び／又は細胞増殖性疾患の治療方法であって、個体に有効量の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を投与することを含む方法を提供する。ある実施態様では、腫瘍、癌及び／又は細胞増殖性疾患はＮｏｔｃｈ１活性化突然変異を伴う。
一態様では、本発明は、個体の細胞(癌ないし腫瘍の細胞など)を殺傷するための方法であって、個体に有効量の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を投与することを含む方法を提供する。
他の態様では、本発明は、個体の腫瘍又は癌の増殖を低減、阻害、遮断又は予防するための方法であって、個体に有効量の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を投与することを含む方法を提供する。
他の態様では、本発明は、個体の血管新生を低減、阻害、遮断又は予防するための方法であって、個体に有効量の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を投与することを含む方法を提供する。
【００２４】
他の態様では、本発明は、個体の血管新生が関連する病的状態の治療方法であって、個体に有効量の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を投与することを含む方法を提供する。ある実施態様では、血管新生が関連する病的状態は腫瘍、癌、及び／又は細胞増殖性疾患である。ある実施態様では、血管新生が関連する病的状態は眼内血管新生疾患である。
更なる態様では、個体の神経障害又は神経変性疾患の治療又は予防、又は損傷神経細胞ないし軸索の離断及び／又は脱髄が生じる疾患の修復のための方法であって、個体に有効量の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を投与することを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、個体のニューロンの発達、増殖、維持又は再生の促進方法であって、個体に有効量の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を投与することを含む方法を提供する。
更なる態様では、本発明は、個体の抗原への免疫応答の増強方法であって、個体に有効量の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を投与することを含む方法を提供する。ある実施態様では、免疫応答が望まれる抗原は抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体と同時に投与される。他の実施態様では、本発明は、個体の抗原への免疫応答の増強方法であって、個体に抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲアゴニスト抗体を投与することを含み、このとき該抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲアゴニスト抗体が、抗原による免疫細胞(Ｔ細胞など)の刺激の間又は直後に個体の免疫細胞(Ｔ細胞など)に対して提示されるように組成物が個体に投与され、これによって免疫応答が増強される方法を提供する。いくつかの実施態様では、抗原は癌のものである。
【００２５】
更なる態様では、本発明は、個体の骨格又は心筋又は骨の再生のような組織再生及び／又は修復の促進方法であって、個体に有効量の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲアゴニスト抗体を投与することを含む方法を提供する。
更なる態様では、本発明は、個体の抗原に対する免疫応答を低減、阻害、遮断又は予防するための方法であって、個体に有効量の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲアゴニスト抗体を投与することを含む方法を提供する。一実施態様では、免疫応答は、異常なＴ細胞発達又は調節による免疫学的疾患である。
更なる態様では、本発明は、個体の自己免疫性疾患の治療方法であって、個体に有効量の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲアゴニスト抗体を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施態様では、自己免疫性疾患は、自己免疫性糖尿病、多発性硬化症、移植拒絶反応又は関節リウマチである。
【００２６】
本発明の方法は、任意の適切な病理学的状態に作用させるために用いることができる。例示的な疾患は本明細書中に記述され、小細胞肺癌、脳癌(例えば神経芽細胞腫又は髄膜腫)、皮膚癌(例えばメラノーマ、基底細胞癌又は扁平上皮癌)、乳癌、胃癌、結腸直腸癌(ＣＲＣ)、肝細胞癌、子宮頸癌、肺癌、膵癌、前立腺癌、及び血液学的な悪性腫瘍(例えば、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病(Ｔ−ＡＬＬ)、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病(Ｂ−ＡＬＬ)、急性骨髄性白血病(ＡＭＬ)、ホジキン性リンパ腫、及び多発性骨髄腫)からなる群から選択される癌が含まれる。
一実施態様では、本発明の方法でターゲットとする細胞は癌細胞である。例えば、癌細胞は、乳癌細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、乳頭カルシノーマ細胞、大腸癌細胞、膵臓癌細胞、卵巣癌細胞、頸部癌細胞、中枢神経系癌細胞、骨原性肉種細胞、腎臓カルシノーマ細胞、肝細胞癌細胞、膀胱癌細胞、胃カルシノーマ細胞、頭頸部扁平上皮癌細胞、メラノーマ細胞、白血病細胞及び大腸腺腫細胞からなる群から選択されうる。一実施態様では、本発明の方法でターゲットとする細胞は過剰増殖及び／又は過形成細胞である。他の実施態様では、本発明の方法でターゲットとする細胞は形成異常細胞である。さらに他の実施態様では、本発明の方法でターゲットとする細胞は転移性細胞である。
【００２７】
本発明の方法は、さらに付加的な処置工程を含んでもよい。例えば、一実施態様では、方法は、ターゲットとする細胞及び／又は組織(例えば、癌細胞)が放射線治療又は化学療法剤に曝される工程を更に含む。
一態様では、本発明は、有効量の他の治療薬(例えば、抗血管新生剤、他の抗体、化学療法剤、細胞障害性剤、免疫抑制剤、プロドラッグ、サイトカイン、細胞毒性放射線治療、副腎皮質ステロイド、制吐剤、癌ワクチン、鎮痛剤又は増殖抑制剤)と組み合わせた、有効量の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体の投与を含む方法を提供する。例えば、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体は、多様な腫瘍性又は非腫瘍性の状態を治療するために、抗癌剤又は抗血管新生剤と組み合わせて用いられる。特定の例では、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体は、タモキシフェン、レトロゾール、エキセメスタン、アナストロゾール、イリノテカン、セツキシマブ、フルベストラント、ビノレルビン、エルロチニブ、ベバシズマブ、ビンクリスチン、イマチニブ、ソラフェニブ、ラパチニブ又はトラスツズマブと組み合わせて用いられる。
抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体は、同じ組成物中で又は別々の組成物として、これらの目的のために有効である他の治療薬と組み合わせて、又は連続的に投与されうる。抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体及び他の治療薬(例えば、抗癌剤)の投与は、例えば単一の組成物として、又は、２以上の異なる組成物として、同じないしは異なる投与経路を使用して、同時になされうる。あるいは又はさらに、前記投与はいずれかの順序で経時的になされうる。あるいは又はさらに、前記工程はいずれかの順序で連続的及び同時的を組み合わせて行われうる。ある実施態様では、２以上の組成物の投与の間には数分から数日、数週から数か月の範囲の間隔がありうる。例えば、抗癌剤がまず投与され、その後抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体が投与されてもよい。しかしながら、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体の同時投与又は第一投与も考慮される。ある実施態様では、２以上の組成物の投与の間には数分から数日、数週から数か月の範囲の間隔がありうる。
【００２８】
特定の態様では、本発明は、有効量の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体及び／又は血管新生インヒビター(一又は複数)と一又は複数の化学療法剤を投与することによって、疾患(例として、腫瘍、癌及び／又は細胞増殖性疾患)の治療方法を提供する。様々な化学療法剤が本発明の併用治療方法で用いられてもよい。考慮される化学療法剤の例示的かつ非限定的な例は、本明細書中の「定義」の項目に示される。抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体と化学療法剤の投与は、例えば単一の組成物として、又は、２以上の異なる組成物として、同じないしは異なる投与経路を使用して、同時になされうる。あるいは又はさらに、前記投与はいずれかの順序で経時的になされうる。あるいは又はさらに、前記工程はいずれかの順序で連続的及び同時的を組み合わせて行われうる。ある実施態様では、２以上の組成物の投与の間には数分から数日、数週から数か月の範囲の間隔がありうる。例えば、化学療法剤がまず投与され、その後抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体が投与されてもよい。しかしながら、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体の同時投与又は第一投与も考慮される。したがって、一態様では、本発明は、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体の投与の後に、化学療法剤の投与を行うことを含む方法を提供する。ある実施態様では、２以上の組成物の投与の間には数分から数日、数週から数か月の範囲の間隔がありうる。
ある態様では、本発明は、試料中のＮｏｔｃｈ１-抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体複合体を検出することを含んでなる、Ｎｏｔｃｈ１の検出のための方法を提供する。本明細書中で使用する「検出」なる用語は、コントロールへの参照の有無にかかわらず、定性的及び／又は定量的な検出(例えば測定レベル)を含む。
【００２９】
他の態様では、本発明は、疾患を有する又は有すると思われる個体の生体試料において、Ｎｏｔｃｈ１-抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体複合体を検出することを含む、Ｎｏｔｃｈ１発現及び／又は活性と関連する疾患を診断するための方法を提供する。いくつかの実施態様では、Ｎｏｔｃｈ１発現は発現の増加又は異常な発現である。いくつかの実施態様では、疾患は癌、腫瘍、及び／又は細胞増殖性疾患である。
他の態様では、本発明は、個体に有効量の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を投与することによる、癌、腫瘍及び／又は細胞増殖性疾患を有する個体の治療方法であって、さらに抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体の投与の前、投与中又は投与後に、Ｎｏｔｃｈ１発現及び／又はＮｏｔｃｈ１リガンド発現が個体の生体試料中で検出されるものである方法を提供する。いくつかの実施態様では、生体試料は、癌、腫瘍及び／又は細胞増殖性疾患のものである。いくつかの実施態様では、Ｎｏｔｃｈ１過剰発現は、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体の投与の前、投与中及び／又は投与後に検出される。いくつかの実施態様では、Ｎｏｔｃｈ１リガンド発現は、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体の投与の前、投与中及び／又は投与後に検出される。発現は、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体の前、最中、後、前と最中、前と後、最中と後、又は前、最中及び後に検出されてもよい。
【００３０】
他の態様では、本発明は、個体に有効量の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を投与することによる、癌、腫瘍及び／又は細胞増殖性疾患を有する個体の治療方法であって、このとき癌、腫瘍及び／又は細胞疾患又は肝疾患の生体試料がＮｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ１リガンドを発現するものである方法を提供する。 
他の態様では、本発明は、個体のための治療の選択方法であって、(a) 個体の生体試料において、存在するならば、Ｎｏｔｃｈ１発現又はＮｏｔｃｈ１リガンド発現を検出し、そして、(b) 工程(a)の後に、個体のための治療を選択することを含み、このとき治療の選択が工程(a)において検出されたＮｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ１リガンド発現に基づいている方法を提供する。いくつかの実施態様では、参照値又はコントロール試料と比較して個体の生体試料におけるＮｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ１リガンド発現の増加が検出される。いくつかの実施態様では、参照値又はコントロール試料と比較して個体の生体試料におけるＮｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ１リガンド発現の減少が検出される。いくつかの実施態様では、Ｎｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ１リガンド発現が検出され、抗Ｎｏｔｃｈ１抗体による治療が選択される。いくつかの実施態様では、個体は、腫瘍、癌及び／又は細胞増殖性疾患を有する。
検出を伴ういくつかの実施態様では、Ｎｏｔｃｈ１の発現は、Ｎｏｔｃｈ１遺伝子欠失、遺伝子増殖及び／又は遺伝子突然変異の検出を含む。検出を伴ういくつかの実施態様では、Ｎｏｔｃｈ１リガンドの発現は、Ｎｏｔｃｈ１遺伝子欠失、遺伝子増殖及び／又は遺伝子突然変異の検出を含む。
生体試料は、本明細書中、例えば、生体試料の定義において記述される。いくつかの実施態様では、生体試料は、血清又は腫瘍のものである。
【００３１】
Ｎｏｔｃｈ１及び／又はＮｏｔｃｈ１リガンド(例えばＪａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、デルタ様１、デルタ様３、及び／又はデルタ様４)発現の検出を伴う実施態様では、Ｎｏｔｃｈ１及び／又はＮｏｔｃｈ１リガンドポリヌクレオチド発現、及び／又はＮｏｔｃｈ１及び／又はＮｏｔｃｈ１リガンドポリペプチド発現が検出されてもよい。Ｎｏｔｃｈ１及び／又はＮｏｔｃｈ１リガンド発現の検出を伴ういくつかの実施態様では、Ｎｏｔｃｈ１及び／又はＮｏｔｃｈ１リガンドｍＲＮＡ発現が検出されうる。他の実施態様では、Ｎｏｔｃｈ１及び／又はＮｏｔｃｈ１リガンドポリペプチド発現は、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ薬剤及び／又は抗Ｎｏｔｃｈ１リガンド薬剤を用いて検出される。いくつかの実施態様では、Ｎｏｔｃｈ１及び／又はＮｏｔｃｈ１リガンドポリペプチド発現は抗体を用いて検出される。モノクローナル及び／又はポリクローナルの抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、親和性成熟抗体、ヒト化抗体、及び／又は抗体断片を含め、任意の好適な抗体が検出及び／又は診断のために用いられてもよい。いくつかの実施態様では、本明細書中に記載の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体が検出のために用いられる。いくつかの実施態様では、Ｎｏｔｃｈ１及び／又はＮｏｔｃｈ１リガンドポリペプチド発現は、免疫組織化学(「ＩＨＣ」)を用いて検出される。いくつかの実施態様では、Ｎｏｔｃｈ１発現はＩＨＣアッセイを用いて２以上にスコア付けされる。
Ｎｏｔｃｈ１及び／又はＮｏｔｃｈ１リガンド発現の検出を伴ういくつかの実施態様では、Ｎｏｔｃｈ１及び／又はＮｏｔｃｈ１リガンド発現の存在及び／又は欠如及び／又はレベルが検出されうる。Ｎｏｔｃｈ１及び／又はＮｏｔｃｈ１リガンド発現は増加されうる。Ｎｏｔｃｈ１及び／又はＮｏｔｃｈ１リガンド発現の欠如はわずかなレベルを含むか、最少のレベルであると解釈される。いくつかの実施態様では、試験生体試料中のＮｏｔｃｈ１発現は、コントロール生体試料(又は、コントロール又は参照の発現レベル)について観察されるものより高い。いくつかの実施態様では、Ｎｏｔｃｈ１発現は、コントロール生体試料よりも試験生体試料において、少なくともおよそ２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍以上である。いくつかの実施態様では、Ｎｏｔｃｈ１ポリペプチド発現は、免疫組織化学(「ＩＨＣ」)アッセイにおいて決定され、染色強度について少なくとも２以上にスコア化される。いくつかの実施態様では、Ｎｏｔｃｈ１ポリペプチド発現は、ＩＨＣアッセイにおいて決定され、染色強度について少なくとも１以上又は少なくとも３以上にスコア化される。いくつかの実施態様では、試験生体試料では、コントロール生体試料(又は、コントロール発現レベル)で観察されるものより低い。
他の態様では、本発明は、本明細書中に記載のいずれかの抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体であって、該抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体が検出可能な標識を含むものである抗体を提供する。
他の態様では、本発明は、本明細書中に記載のいずれかの抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体とＮｏｔｃｈ１との複合体を提供する。いくつかの実施態様では、複合体はインビボ又はインビトロである。いくつかの実施態様では、複合体は癌細胞を含む。いくつかの実施態様では、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体は検出可能に標識されている。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体の重鎖及び軽鎖のＨＶＲループ配列。図は、重鎖ＨＶＲ配列、Ｈ１、Ｈ２及びＨ３と軽鎖ＨＶＲ配列、Ｌ１、Ｌ２及びＬ３を示す。配列番号は以下の通りである。抗体Ａ(ＨＶＲ-Ｈ１は配列番号：１であり、ＨＶＲ-Ｈ２は配列番号：２であり、ＨＶＲ-Ｈ３は配列番号：６であり、ＨＶＲ-Ｌ１は配列番号：７であり、ＨＶＲ-Ｌ２は配列番号：８であり、ＨＶＲ-Ｌ３は配列番号：９である)；抗体Ａ−１(ＨＶＲ-Ｈ１は配列番号：１であり、ＨＶＲ-Ｈ２は配列番号：３であり、ＨＶＲ-Ｈ３は配列番号：６であり、ＨＶＲ-Ｌ１は配列番号：７であり、ＨＶＲ-Ｌ２は配列番号：８であり、ＨＶＲ-Ｌ３は配列番号：１０である)；抗体Ａ−２(ＨＶＲ-Ｈ１は配列番号：１であり、ＨＶＲ-Ｈ２は配列番号：４であり、ＨＶＲ-Ｈ３は配列番号：６であり、ＨＶＲ-Ｌ１は配列番号：７であり、ＨＶＲ-Ｌ２は配列番号：８であり、ＨＶＲ-Ｌ３は配列番号：１１である)；そして、抗体Ａ−３(ＨＶＲ-Ｈ１は配列番号：１であり、ＨＶＲ-Ｈ２は配列番号：５であり、ＨＶＲ-Ｈ３は配列番号：６であり、ＨＶＲ-Ｌ１は配列番号：７であり、ＨＶＲ-Ｌ２は配列番号：８であり、ＨＶＲ-Ｌ３は配列番号：１２である)。以下に示すように、アミノ酸位はカバット番号付けシステムに従って番号付けした。
【図２】抗体Ａ、Ａ−１、Ａ−２及びＡ−３の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列(配列番号：５８−６５)を示す。
【図３】以下のように配列識別子を用いて本発明を実施する際に使用するための、例示的なアクセプターヒトコンセンサスフレームワーク配列を示す。可変重鎖(ＶＨ)コンセンサスフレームワーク(図２Ａ、Ｂ)。ヒトＶＨサブグループIコンセンサスフレームワークマイナスカバットＣＤＲ(配列番号：１９)。ヒトＶＨサブグループIコンセンサスフレームワークマイナス伸展した高頻度可変領域(配列番号：２０〜２２)。ヒトＶＨサブグループIIコンセンサスフレームワークマイナスカバットＣＤＲ(配列番号：２３)。ヒトＶＨサブグループIIコンセンサスフレームワークマイナス伸展した高頻度可変領域(配列番号：２４〜２６)。ヒトＶＨサブグループIIコンセンサスフレームワークマイナス伸展したヒトＶＨサブグループIIIコンセンサスフレームワークマイナスカバットＣＤＲ(配列番号：２７)。ヒトＶＨサブグループIIIコンセンサスフレームワークマイナス伸展した高頻度可変領域(配列番号：２８〜３０)。ヒトＶＨアクセプターフレームワークマイナスカバットＣＤＲ(配列番号：３１)。ヒトＶＨアクセプターフレームワークマイナス伸展した高頻度可変領域(配列番号：３２〜３３)。ヒトＶＨアクセプター２フレームワークマイナスカバットＣＤＲ(配列番号：３４)。ヒトＶＨアクセプター２フレームワークマイナス伸展した高頻度可変領域(配列番号：３５〜３７)。
【図４】以下のように配列識別子を用いて本発明を実施する際に使用するための、例示的なアクセプターヒトコンセンサスフレームワーク配列を示す。可変軽鎖(ＶＬ)コンセンサスフレームワーク(図４)。ヒトＶＬκサブグループIコンセンサスフレームワーク(配列番号：３８)。ヒトＶＬκサブグループIIコンセンサスフレームワーク(配列番号：３９)。ヒトＶＬκサブグループIIIコンセンサスフレームワーク(配列番号：４０)。ヒトＶＬκサブグループIVコンセンサスフレームワーク(配列番号：４１)。
【図５】ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８軽鎖(配列番号：１５〜１８)及び重鎖(配列番号：４２〜４５)のフレームワーク領域配列を表す。上付／太字の番号はカバットに従ったアミノ酸位を示す。
【図６】ｈｕＭＡｂ４Ｄ５-８軽鎖(配列番号：１５、１６、１８及び４６)及び重鎖(配列番号：４２、４３、４５及び４７)の修飾した／変異フレームワーク領域配列を表す。上付／太字の番号はカバットに従ったアミノ酸位を示す。
【図７】ルシフェラーゼレポーター遺伝子を用いて測定されるように、抗体ＡがＮｏｔｃｈ１インヒビターであることを示すグラフである。各列Ａ−Ｌでは、レセプター細胞がＮＩＨ−３Ｔ３−Ｎｏｔｃｈ１であった。Ａでは、リガンド細胞はＮＩＨ−３Ｔ３−親であり、Ｂ−Ｌでは、リガンドはＮＩＨ−３Ｔ３−Ｊａｇ１であった。Ａ、Ｂ及びＫでは、抗体又は化合物Ｅ(γ−分泌酵素インヒビター)は加えられなかった。Ｃでは、４００ｎｇ／ｍｌのアイソタイプコントロール抗体が加えられ、Ｄでは、抗体Ａは１６ｎｇ／ｍｌで加えられ、Ｅでは、抗体Ａは８０ｎｇ／ｍｌで加えられ、Ｆでは、抗体Ａは４００ｎｇ／ｍｌで加えられ、Ｇでは、抗体Ａは２０００ｎｇ／ｍｌで加えられ、Ｈでは、抗体Ａは４００ｎｇ／ｍｌで加えられ、Ｉでは、抗体Ａは４００ｎｇ／ｍｌで加えられ、Ｊでは、アイソタイプコントロール抗体は４００ｎｇ／ｍｌで加えられ、Ｋでは、０．０１％のＤＳＭＯが加えられ、そして、Ｌでは、化合物Ｅは、０．０１％ＤＳＭＯ中１μＭで加えられた。Ｈでは、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲタンパク質は５μｇ／ｍｌ(１００μｌ)で加えられ、Ｉでは、ＢＳＡ(ウシ血清アルブミン)タンパク質は６.５μｇ／ｍｌ(１００μｌ)で加えられ、Ｊでは、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲタンパク質は５μｇ／ｍｌ(１００μｌ)で加えられ、Ａ−Ｇ、Ｋ及びＬでは、タンパク質は加えられなかった。
【図８】ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて測定されるように、抗体Ａ、Ａ−１、Ａ−２及びＡ−３がＮｏｔｃｈ１を阻害することを示すグラフである。黒色バーは親抗体Ａを用いて得られた結果を示し、他のバーは抗体Ａ−１(平行線)、抗体Ａ−２(灰色)、及び抗体Ａ−３(斜線)を用いて得られた結果を示す。８０ｎｇ／ｍｌの抗体で明らかなように、抗体Ａ−１及びＡ−２は、抗体Ａより強いＮｏｔｃｈ１シグナルの遮断を示した。グラフのＸ軸は抗体濃度(ｎｇ／ｍｌ)を表し、グラフのＹ軸はホタル／ウミシイタケのルシフェラーゼ発光を表す。
【図９】抗体Ａが、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の活性化によって生じるマウスＣ２Ｃ１２筋細胞分化に対するブロックを軽減することを示すグラフである。Ａ−Ｆでは、培地は分化培地であった。Ａでは、マウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞はＮＩＨ−３Ｔ３ Ｊａｇｇｅｄ１リガンド発現細胞とともに培養しなかったのに対して、Ｂ−Ｆでは、マウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞をＮＩＨ−３Ｔ３ Ｊａｇｇｅｄ１リガンド発現細胞とともに培養した。細胞に加えた抗体／処置は以下の通りである。Ａ及びＢにはなし、Ｃにはアイソタイプコントロール、Ｄには２００ｎｇ／ｍｌの抗体Ａ、ＥにはＤＳＭＯ、及びＦには１μＭの化合物Ｅ。
【図１０】ＭＨＣ／Ａｌｅｘａ(登録商標)４８８(上列)又はＤＡＰＩ(４',６'-ジアミジノ-２-フェニルインドールハイドロクロライド；下列)にて染色したマウスＣ２Ｃ１２筋細胞の画像。Ａ−Ｆでは、培地は分化培地であった。Ａでは、マウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞はＮＩＨ−３Ｔ３ Ｊａｇｇｅｄ１リガンド発現細胞とともに培養しなかったのに対して、Ｂ−Ｆでは、マウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞をＮＩＨ−３Ｔ３ Ｊａｇｇｅｄ１リガンド発現細胞とともに培養した。細胞に加えた抗体／処置は以下の通りである。Ａ及びＢにはなし、Ｃにはアイソタイプコントロール、Ｄには２００ｎｇ／ｍｌの抗体Ａ、ＥにはＤＳＭＯ、及びＦには１μＭの化合物Ｅ。
【図１１】ヒト及びマウスのＮｏｔｃｈ１アミノ酸配列(配列番号：５６及び５７)のアラインメント。ＳＩＭアラインメントツール(ＥｘＰＡＳｙウェブサイト上で提供)を用いて、ヒト及びマウスのＮｏｔｃｈ１タンパク質の完全配列を整列させた。初期設定パラメータは、比較マトリクスとして１２のギャップオープンペナルティ、４の伸展ペナルティ及びBLOSUM62にて選択した。タンパク質ドメインに下線を付け印を付けた。シグナルペプチド、膜貫通及びＥＧＦドメインの境界は、Expasy.orgでのヒトＮｏｔｃｈ１についての結果に基づき、ＬＮＲ境界は、Vardar et al. (Biochemistry, 42:7061-7067, 2003)に基づき、ＨＤ−Ｎ及びＨＤ−Ｃ境界は、Malecki et al. (Mol. Cell Biol. 26:4642-4651, 2006)に基づいた。ネガティブ制御領域(ＮＲＲ)は、ＬＮＲ＿Ａで始まり、ＨＤ−Ｃの後で終わる配列に対応する。Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を作製するために用いたイムノゲン配列は、斜線を付けて示し、ＥＧＦリピート３４−３６とＮＲＲを含む。省略記号：アミノ酸は一文字コードで示す。ＴＭ、膜貫通；ＥＧＦ、上皮細胞増殖因子リピート；ＬＮＲ、Ｌｉｎ１２−Ｎｏｔｃｈリピート；ＨＤ−Ｎ、ヘテロ二量体化ドメイン−Ｓ１切断部位のアミノ末端側；ＨＤ−Ｃ、ヘテロ二量体化ドメイン−Ｓ１切断部位のカルボキシル末端側；Ｓ１、ｆｕｒｉｎプロテアーゼのためのＳ１切断部位；Ｓ２、ＡＤＡＭプロテアーゼ(ジスインテグリンと金属プロテアーゼファミリ)のためのＳ２切断部位。
【図１２】抗体Ａ(図１２Ａ)、抗体Ａ−１(図１２Ｂ)及び抗体Ａ−２(図１２Ｃ)についてのエピトープマッピング実験の結果を示すグラフである。
【図１３】抗Ｎｏｔｃｈ１-ＮＲＲ抗体が野生型及び変異型Ｎｏｔｃｈ１レセプターのシグナル伝達を阻害することを示すグラフである。黒色バーは２０００ｎｇ／ｍｌのコントロール抗体を用いて得られた結果を示し、荒いドットのバーは８０ｎｇ／ｍｌの抗体Ａを用いて得られた結果を示し、細かい縞のバーは４００ｎｇ／ｍｌの抗体Ａを用いて得られた結果を示し、荒い縞のバーは２０００ｎｇ／ｍｌの抗体Ａを用いて得られた結果を示し、斜交平行線のバーは１０μＭの化合物Ｅを用いて得られた結果を示し、細かいドットのバーはＤＭＳＯ(化合物Ｅのベヒクル)を用いて得られた結果を示す。各条件の結果は８回の実施で測定され、次いで標準偏差を示す誤差バーとともに平均値として表した。
【図１４Ａ】抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ及び抗Ｄｌｌ４処置により、ＨＵＶＥＣ(ヒト臍帯静脈内皮細胞)細胞出芽アッセイにおいて血管出芽と長さの顕著な増加が生じることを示す一連の画像である。コントロールとしてＰＢＳにて処理した細胞、又は抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体Ａ又はＡ−２により処理した細胞についての結果を示す。
【図１４Ｂ】角膜ポケットアッセイを用いた血管形成及び血管新生に対する抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体の作用を示す一連の画像である。抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ処置(抗体Ａ−２)は血管ネットワーク密度の有意な増加を示した。
【図１４Ｃ】角膜アッセイにおける血管によるフローに対する抗Ｄｌｌ４と抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体の処置の作用を示す一連の画像である。抗Ｄｌｌ４と抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲにて処理した血管による灌流が制限された。
【図１４Ｄ】血管新生のマウス網膜モデルにおける抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体の効果を示す一連の画像である。抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体の処置(抗体Ａ−２)により脈管構造密度が増加し、高出芽表現型となった。
【図１４Ｅ】血管新生のマウス網膜モデルにおいて、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ処置(抗体Ａ−２)により核の数が増加し、それは細胞増殖の増加と一致することを示す一連の画像である。
【図１５Ａ】インビボマウスモデルの腫瘍増殖に対する抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体の効果を示すグラフである。抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体Ａ−２による処置は腫瘍増殖を停止した。
【図１５Ｂ】様々な用量の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体Ａ−２がインビボマウスモデルの腫瘍増殖を停止したか又は遅くさせたことを示すグラフである。
【図１５Ｃ】インビボマウスモデルにおいて抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体Ａ−２が腫瘍体積を減少したことを示すグラフである。
【図１５Ｄ】インビボマウスモデルにおいて抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体Ａ−２が用量依存的な様式で体重減少を引き起こすことを示すグラフである。
【図１５Ｅ】免疫不全マウス(Ｂａｌｂ−Ｃ Ｎｕ／Ｎｕ)の血清における経時的な抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体Ａ−２のクリアランスを示すグラフである。
【図１６Ａ】１０ｍｇ／ｋｇの濃度のコントロール抗体(ベヒクル)又は抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体Ａ−２にて処置したマウスの小腸の腸の陰窩及び絨毛の例を示す一連の画像である。
【図１６Ｂ】１０ｍｇ／ｋｇの濃度のコントロール抗体(ベヒクル)又は抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体Ａ−２にて処置したマウスの大腸の腸の陰窩及び絨毛の例を示す一連の画像である。
【図１７】抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体とγセクレターゼインヒビターが特定の癌細胞株の生存率を低減することを示すグラフである。抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体Ａ−２及びγセクレターゼインヒビターＮ-[Ｎ-(３,５-ジフルオロフェンアセチル)-Ｌ-アラニル]-Ｓ-フェニルグリシンｔ-ブチルエステル(ＤＡＰＴ)及び化合物Ｅ(ＣｍｐＥ)を用いた。癌細胞株はｘ軸に示す。
【００３３】
（本発明の詳細な説明）
本明細書中の発明は、例えば、Ｎｏｔｃｈの発現及び／又は活性の増加又は望ましくない発現及び／又は活性などのＮｏｔｃｈの発現及び／又は活性に関連する疾患状態の治療又は予防に有用な、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を提供する。いくつかの実施態様では、本発明の抗体は、癌、腫瘍、及び／又は細胞増殖性疾患を治療するために用いられる。
他の態様では、本発明の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体は、様々な組織及び細胞型でのＮｏｔｃｈ１の検出などのＮｏｔｃｈ１の検出及び／又は単離のための試薬としての有用性を見出す。
さらに、本発明は、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体の作製方法、及び抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体をコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００３４】
一般的な技術
本明細書中に記載又は引用される技術及び手順は、一般に十分に理解されるものであり、当業者によって、従来の方法論を用いて共通して実施されるものである。その例として、以下の文献に記載される方法論が広く利用されている。Sambrook 等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, 等 編集, (2003))、the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson, B. D. Hames 及び G. R. Taylor 編集 (1995))、Harlow and Lane, 編集 (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL、及びANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, 編集 (1987))。
【００３５】
定義
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、抗体の診断又は治療的な使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、タンパク質は、(１)ローリー法で測定した場合９５％を越える抗体、最も好ましくは９９重量％を超えるまで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分なほど、あるいは、(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ(ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動)により均一になるまで充分なほど精製される。抗体の自然環境の少なくとも一の成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツでの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一の精製工程により調製される。
【００３６】
「単離された」核酸分子は、同定され、核酸の天然源に通常付随している少なくとも一の汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。故に、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在する核酸分子とは区別される。しかし、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞のものとは異なった染色体位置にある核酸(例えば抗体コード核酸)を通常発現する細胞に含まれる核酸分子を含む。
【００３７】
「Kabatに記載の可変ドメイン残基番号付け」又は「Kabatに記載のアミノ酸位番号付け」なる用語及びその異なる言い回しは、Kabat 等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)の抗体の編集の軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインに用いられる番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを用いると、実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＣＤＲ内の短縮又は挿入に相当する２、３のアミノ酸又は付加的なアミノ酸を含みうる。例えば、重鎖可変ドメインには、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基(例えばKabatによる残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど)と、Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸の挿入(Kabatによる残基５２ａ)を含んでもよい。残基のKabat番号は、「標準の」Kabat番号付け配列によって抗体の配列の相同領域でアライメントすることによって与えられる抗体について決定してもよい決定した。
【００３８】
ここで用いる「実質的に類似」又は「実質的に同じ」なる句は、当業者が２つの数値(一般的には、本発明の抗体に関連するものと参照／比較抗体に関連する他のもの)の差異に、該値(例えばＫｄ値)によって測定される生物学的性質上わずかに又は全く生物学的及び／又は統計学的有意差がないと認められるほど、２つの数値が十分に高く類似していることを意味する。前記２つの値間の差異は、参照／比較抗体の値の好ましくは約５０％未満、好ましくは約４０％未満、好ましくは約３０％未満、好ましくは約２０％未満、好ましくは約１０％未満である。
【００３９】
一般的に「結合親和性」は、分子(例えば抗体)の単一結合部位とその結合パートナー(例えば抗原)との間の非共有結合的な相互作用の総合的な強度を意味する。特に明記しない限り、「結合親和性」は、結合対のメンバー(例えば抗体と抗原)間の１：１相互作用を反映する内因性結合親和性を意味する。一般的に、分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、解離定数(Ｋｄ)として表される。望ましくは、Ｋｄは１×１０−７、１×１０−８、５×１０−８、１×１０−９、３×１０−９、５×１０−９、又はさらに１×１０−１０以上の強さである。親和性は、本明細書中に記載のものを含む当業者に公知の共通した方法によって測定することができる。低親和性抗体は抗原にゆっくり結合して素早く解離する傾向があるのに対し、高親和性抗体は抗原により密接により長く結合したままとなる。結合親和性の様々な測定方法が当分野で公知であり、それらの何れかを本発明のために用いることができる。以下に具体的な例示的実施態様を記載する。
【００４０】
一実施態様では、本発明の「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、段階的な力価の非標識抗原の存在下で、最小濃度の(１２５Ｉ)-標識抗原にてＦａｂを均衡化して、抗Ｆａｂ抗体コートプレートと結合した抗原を捕獲することによって抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性を測定する以下のアッセイで示されるような(Chen,等, (1999) J. Mol Biol 293:865-881)、所望の抗体のＦａｂ型(バージョン)とその抗原を用いて実行される放射性標識した抗原結合アッセイ(ＲＩＡ)で測定される。アッセイの条件を決めるために、ミクロタイタープレート(Dynex)を５μｇ／ｍｌの捕獲抗Ｆａｂ抗体(Cappel Labs)を含む５０ｍＭ炭酸ナトリウム(ｐＨ９．６)にて一晩コートして、その後２％(w/v)のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳにて室温(およそ２３℃)で２〜５時間、ブロックする。非吸着プレート(Nunc#269620)に、１００ｐＭ又は２６ｐＭの［１２５Ｉ］抗原を段階希釈した所望のＦａｂと混合する(例えば、Presta等, (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599の抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ-１２の評価と一致する)。ついで所望のＦａｂを一晩インキュベートする；しかし、インキュベーションは確実に平衡状態に達するまでに長時間(例えば６５時間)かかるかもしれない。その後、混合物を捕獲プレートに移し、室温で(例えば１時間)インキュベートする。そして、溶液を取り除き、プレートを０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳにて８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルの閃光物質(MicroScint-20; Packard)を加え、プレートをTopcountγ計測器(Packard)にて１０分間計測する。最大結合の２０％か又はそれ以下濃度のＦａｂを選択してそれぞれ競合結合測定に用いる。他の実施態様によると、〜１０反応単位(ＲＵ)の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のBIAcoreTM-2000又はBIAcoreTM-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)にて表面プラズモン共鳴アッセイを行ってＫｄ又はＫｄ値を測定する。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)及びＮ-ヒドロキシスクシニミド(ＮＨＳ)で活性化した。抗原を１０ｍＭ 酢酸ナトリウム(ｐＨ４．８)で５μｇ／ｍｌ(〜０．２μＭ)に希釈し、結合したタンパク質の反応単位(ＲＵ)がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入した。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、２倍の段階希釈したＦａｂ(０．７８ｎＭから５００ｎＭ)を２５℃、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０(ＰＢＳＴ)を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度(Ｋｏｎ)と解離速度(Ｋｏｆｆ)を算出した。平衡解離定数(Ｋｄ)をＫｏｆｆ／Ｋｏｎ比として算出した。例として、Chen, Y.,等, (1999) J. Mol Biol 293:865-881を参照。上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた8000シリーズSLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic)で測定さ��る、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ(ｐＨ７．２)、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体(Ｆａｂ型)の蛍光放出強度(励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ)における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定することができる。
【００４１】
また、本発明の「結合速度」又は「会合の速度」又は「会合速度」又は「ｋｏｎ」は、〜１０反応単位(ＲＵ)の固定した抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃のBIAcoreTM-2000又はBIAcoreTM-3000(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)を用いた前述と同じ表面プラズモン共鳴アッセイにて測定される。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5, BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)及びＮ-ヒドロキシスクシニミド(ＮＨＳ)で活性化した。抗原を１０ｍＭ 酢酸ナトリウム(ｐＨ４．８)で５μｇ／ｍｌ(〜０．２μＭ)に希釈し、結合したタンパク質の反応単位(ＲＵ)がおよそ１０になるように５μｌ／分の流速で注入した。その後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。抗原の注入後、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。動力学的な測定のために、２倍の段階希釈したＦａｂ(０．７８ｎＭから５００ｎＭ)を２５℃、およそ２５μｌ／分の流速で０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０(ＰＢＳＴ)を含むＰＢＳに注入した。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン3.2)を用いて、会合速度(Ｋｏｎ)と解離速度(Ｋｏｆｆ)を算出した。平衡解離定数(Ｋｄ)をＫｏｆｆ／Ｋｏｎ比として算出した。例として、Chen, Y.,等, (1999) J. Mol Biol 293:865-881を参照。しかし、上記の表面プラスモン共鳴アッセイによる結合速度が１０６Ｍ−１Ｓ−１を上回る場合、分光計、例えば、流動停止を備えた分光光度計(stop-flow equipped spectrophometer)(Aviv Instruments)又は撹拌キュベットを備えた8000シリーズSLM-Aminco分光光度計(ThermoSpectronic)で測定される、漸増濃度の抗原の存在下にて、ＰＢＳ(ｐＨ７．２)、２５℃の、２０ｎＭの抗抗原抗体(Ｆａｂ型)の蛍光放出強度(励起＝２９５ｎｍ；放出＝３４０ｎｍ、帯域通過＝１６ｎｍ)における増加又は減少を測定する蛍光消光技術を用いて結合速度を測定するのが好ましい。
【００４２】
ここで使用される「ベクター」という用語は、それが結合している他の核酸を輸送することのできる核酸分子を意味するものである。一つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは付加的なＤＮＡセグメントが結合されうる円形の二重鎖ＤＮＡループを意味する。他の型のベクターはファージベクターである。他の型のベクターはウイルスベクターであり、付加的なＤＮＡセグメントをウイルスゲノムへ結合させうる。所定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内において自己複製することができる(例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターとエピソーム哺乳動物ベクター)。他のベクター(例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター)は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、宿主ゲノムと共に複製する。更に、所定のベクターは、それらが作用可能に結合している遺伝子の発現を指令し得る。このようなベクターはここでは「組換え発現ベクター」(又は単に「組換えベクター」)と呼ぶ。一般に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形をとる。本明細書では、プラスミドが最も広く使用されているベクターの形態であるので、「プラスミド」と「ベクター」を相互交換可能に使用する場合が多い。
【００４３】
ここで交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを意味し、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類似体(アナログ)、又はＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼにより、もしくは合成反応によりポリマー中に取り込み可能な任意の基質とすることができる。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体を含み得る。存在するならば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立ての前又は後になされ得る。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。ポリヌクレオチドは合成後に、例えば標識との結合により、さらに修飾されてもよい。他のタイプの修飾には、例えば「キャップ(caps)」、類似体との自然に生じたヌクレオチドの一又は複数の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結(例えばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマート等)及び荷電連結(ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート等)を有するもの、ペンダント部分、例えばタンパク質(例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ply-L-リジン等)を含むもの、インターカレータ(intercalators)を有するもの(例えばアクリジン、ソラレン等)、キレート剤を含むもの(例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属等)、アルキル化剤を含むもの、修飾された連結を含むもの(例えばアルファアノマー核酸等)、並びにポリヌクレオチド(類)の未修飾形態が含まれる。さらに、糖類中に通常存在する任意のヒドロキシル基は、例えばホスホナート基、ホスファート基で置き換えられてもよく、標準的な保護基で保護されてもよく、又は付加的なヌクレオチドへのさらなる連結を調製するように活性化されてもよく、もしくは固体又は半固体支持体に結合していてもよい。５'及び３'末端のＯＨはホスホリル化可能であり、又は１〜２０の炭素原子を有するアミン又は有機キャップ基部分で置換することもできる。また他のヒドロキシルは標準的な保護基に誘導体化されてもよい。さらにポリヌクレオチドは当該分野で一般的に知られているリボース又はデオキシリボース糖類の類似形態のものをさらに含み、これらには例えば２'-Ｏ-メチル-、２'-Ｏ-アリル、２'-フルオロ又は２'-アジド-リボース、炭素環式糖の類似体、アルファ-アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース類又はリキソース類、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、及び非塩基性ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドが含まれる。一又は複数のホスホジエステル連結は代替の連結基で置き換えてもよい。これらの代替の連結基には、限定されるものではないが、ホスファートがＰ(Ｏ)Ｓ(「チオアート」)、Ｐ(Ｓ)Ｓ(「ジチオアート」)、「(Ｏ)ＮＲ２(「アミダート」)、Ｐ(Ｏ)Ｒ、Ｐ(Ｏ)ＯＲ'、ＣＯ又はＣＨ２(「ホルムアセタール」)と置き換えられた実施態様のものが含まれ、ここでそれぞれのＲ及びＲ'は独立して、Ｈ又は、エーテル(-Ｏ-)結合を含んでいてもよい置換もしくは未置換のアルキル(１-２０Ｃ)、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケ��ル又はアラルジル(araldyl)である。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。先の記述は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含むここで引用される全てのポリヌクレオチドに適用される。
【００４４】
ここで使用される場合、「オリゴヌクレオチド」とは、短く、一般的に単鎖であり、また必ずしもそうではないが、一般的に約２００未満のヌクレオチド長さの、一般的に合成のポリヌクレオチドを意味する。「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」なる用語は、相互に排他的なものではない。ポリヌクレオチドについての上述した記載はオリゴヌクレオチドと等しく、十分に適用可能である。
【００４５】
ここで同定したＧＤＭポリペプチド配列に関する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」とは、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、特定のＧＤＭポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を測定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ-２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ(ＤＮＡＳＴＡＲ)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、ＡＬＩＧＮ-２プログラム用の完全なソースコードが下記の表Ａに提供されている配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を使用することによって得られる。ＡＬＩＧＮ-２配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作成され、ソースコードは米国著作権庁, ワシントンD.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７で登録されている。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテック社、サウス サン フランシスコ, カリフォルニアから公的に入手可能であり、例えば国際公開２００７／００１８５１に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ＡＬＩＧＮ-２プログラムは、ＵＮＩＸ(登録商標)オペレーティングシステム、好ましくはデジタルＵＮＩＸ(登録商標)Ｖ４．０Ｄでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ＡＬＩＧＮ-２プログラムによって設定され変動しない。
【００４６】
アミノ酸配列比較にＡＬＩＧＮ-２が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Ａと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ｂと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムＡＬＩＧＮ-２のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
望ましくは、２以上のアミノ酸配列は、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％の同一性である。さらに望ましくは、２以上のアミノ酸配列は、少なくとも９５％、９７％、９８％、９９％又はさらに１００％の同一性である。特に断らない限りは、ここでの全ての％アミノ酸配列同一性値は、直ぐ上のパラグラフに示したようにＡＬＩＧＮ-２コンピュータプログラムを用いて得られる。
【００４７】
本願明細書において用いられるように、「Ｎｏｔｃｈ１」なる用語は、特別に又は文脈上別途示されない限り、任意の(天然に生じるもの又は合成のもののいずれにせよ)天然の又は変異形のＮｏｔｃｈ１ポリペプチドを指す。「天然の配列」なる用語は、特に天然に生じる切断型(例えば、細胞外ドメイン配列又は膜貫通サブユニット配列)、天然に生じる変異型(例えば、選択的スプライシング型)及び天然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。「野生型Ｎｏｔｃｈ１」なる用語は、一般に、天然に生じるＮｏｔｃｈ１タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。「野生型Ｎｏｔｃｈ１配列」なる用語は、一般に、天然に生じるＮｏｔｃｈ１においてみられるアミノ酸配列を指す。
本明細書中で使用する「Ｎｏｔｃｈ１リガンド」なる用語は、特別に又は文脈上別途示さない限り、任意の天然の又は変異体の(天然であっても合成であっても)Ｎｏｔｃｈ１リガンド(例えば、Ｊａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、デルタ様１、デルタ様３、及び／又はデルタ様４)ポリペプチドを指す。「天然の配列」なる用語は、具体的には、天然に生じた切断型(例えば、細胞外ドメイン配列又は膜貫通サブユニット配列)、天然に生じる変異型(例えば、オルタナティブスプライス型)及び天然に生じる対立遺伝子変異型を包含する。「野生型Ｎｏｔｃｈ１リガンド」なる用語は、一般に、天然に生じるＮｏｔｃｈ１リガンドタンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。「野生型Ｎｏｔｃｈ１リガンド配列」なる用語は、一般に、天然に生じるＮｏｔｃｈ１リガンドに見られるアミノ酸配列を指す。
【００４８】
本明細書中で使用する「Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ」なる用語は、特別に又は文脈上別途示さない限り、任意の天然の又は変異体の(天然であっても合成であっても)Ｎｏｔｃｈ１のポリペプチド領域であって、３つのＬＮＲモジュールと膜貫通ドメインに拡がるＬＮＲモジュールに対してカルボキシ末端のアミノ酸配列とからなるポリペプチド領域、例えばヒトＮｏｔｃｈ１アミノ酸配列(配列番号：５６)のアミノ酸番号およそ１４４６からおよそ１７３５、及びマウスＮｏｔｃｈ１アミノ酸配列(配列番号：５７)のアミノ酸番号およそ１４４６からおよそ１７２５を指す。「天然の配列」なる用語は、具体的には、天然に生じた切断型、天然に生じる変異型(例えば、オルタナティブスプライス型)及び天然に生じる対立遺伝子変異型を包含する。「野生型Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ」なる用語は、一般に、天然に生じるＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲのアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。いくつかの実施態様では、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲは配列番号：５６のアミノ酸１４４６から１７３５又は配列番号：５７のアミノ酸１４４６から１７２５を含むポリペプチドである。いくつかの実施態様では、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲは、例えば、Ｓ１、Ｓ２及び／又はＳ３部位(一又は複数)でプロセシングされたＮｏｔｃｈ１、又はプロセシングされていないＮｏｔｃｈ１のようなＮｏｔｃｈ１に含まれるものである。いくつかの実施態様では、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲは、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲアミノ酸配列の２以上の非共有結合した断片を含み、例えば配列番号：５６のアミノ酸１４４６から１６６４を含む断片は配列番号：５６のアミノ酸１６６５から１７３５を含む断片に非共有結合している。他の実施態様では、配列番号：５７のアミノ酸１４４６から１６５４を含む断片は、配列番号：５７のアミノ酸１６６５から１７２５を含む断片に非共有結合している。
【００４９】
本明細書中で用いる「Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達の増加」なる用語は、例えば実施例５及び６に記載されるルシフェラーゼアッセイを用いて、同一条件下でコントロールにおいて観察されるＮｏｔｃｈ１シグナル伝達のレベルを少なくとも２倍上回るＮｏｔｃｈ１シグナル伝達の増加を指す。望ましくは、Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達の増加は、コントロールで観察されるレベルの少なくとも３倍、４倍、５倍又はさらに１０倍(又はそれ以上)である。
本明細書中で用いる「Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達の減少」なる用語は、例えば実施例５及び６に記載されるルシフェラーゼアッセイを用いて、同一条件下でコントロールにおいて観察されるＮｏｔｃｈ１シグナル伝達のレベルを少なくとも２倍下回るＮｏｔｃｈ１シグナル伝達の減少を指す。望ましくは、Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達の減少は、コントロールで観察されるレベルの少なくとも３分の１、４分の１、５分の１又はさらに１０分の１(又はそれ以下)である。
「Ｎｏｔｃｈ１活性化変異」及び「Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達を活性化する変異」なる用語は、Ｎｏｔｃｈ１野生型アミノ酸配列と比較して一又は複数のアミノ酸の挿入、一又は複数のアミノ酸の欠失、又は一又は複数のアミノ酸の置換であって、これによって対応するＮｏｔｃｈ１野生型アミノ酸配列からのＮｏｔｃｈ１シグナル伝達と比較してＮｏｔｃｈ１シグナル伝達の増加が引き起こされるものであるか、又は、Ｎｏｔｃｈ１野生型核酸配列と比較して一又は複数のヌクレオチドの挿入、一又は複数のヌクレオチドの欠失、一又は複数のヌクレオチドの転位、又は一又は複数のヌクレオチドの置換であって、これによって対応するＮｏｔｃｈ１野生型核酸配列を含む細胞におけるＮｏｔｃｈ１シグナル伝達と比較して変異核酸配列を含む細胞におけるＮｏｔｃｈ１シグナル伝達の増加が引き起こされるものを指す。活性化突然変異を含むＮｏｔｃｈ１レセプターからのＮｏｔｃｈ１シグナル伝達はリガンド依存性でもリガンド非依存性でもよい。
【００５０】
「抗体」及び「イムノグロブリン」なる用語は互換性をもって広義な意味で使われ、モノクローナル抗体(例えば完全長又は無傷のモノクローナル抗体)、ポリクローナル抗体、単価抗体、多価抗体、多特異性抗体(例えば所望の生物学的活性を示す限りの二重特異性抗体)及び本明細書で記載される抗体断片が含まれる。抗体はヒト、ヒト化及び／又は親和性成熟したものであり得る。
【００５１】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の相補性決定領域(ＣＤＲ)又は高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つのＣＤＲにより連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖のＣＤＲは、ＦＲによって近接して結合され、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabat等, Sequence of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, BEthesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞性細胞毒性への抗体の関与を示す。
【００５２】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ')２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。二本鎖のＦｖ種において、この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖の可変ドメインの二量体からなる。一本鎖Ｆｖ種において、一つの重鎖及び一つの軽鎖の可変ドメインはフレキシブルなペプチドリンカーによって共有結合されて、軽鎖及び重鎖が「二量体」構造類似体内で二本鎖Ｆｖ種内のものに結合しうる。この配置において、各可変ドメインの３つのＣＤＲは相互に作用してＶＨ-ＶＬ二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６つのＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(ＣＨ１)を有する。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が一つの遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。また、抗体断片の他の化学結合も知られている。
【００５３】
任意の脊椎動物種からの抗体(イムノグロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
イムノグロブリンの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、イムノグロブリンは異なるクラスが割り当てられる。イムノグロブリンには５つの主なクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、更にそれらは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２等のサブクラス(アイソタイプ)に分かれる。イムノグロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。イムノグロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られている。
「抗体断片」は完全な抗体の一部のみを含んでなるものであり、その一部は、完全な(インタクトな)抗体に存在する場合のその一部に通常関連する機能の少なくとも一、好ましくはその機能のほとんどないしはすべてを保持することが好ましい。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２及びＦｖ断片；ダイアボディ；線形抗体；単鎖抗体分子；及び、抗体断片から形成される多特異性抗体が含まれる。一実施態様では、抗体断片は完全な抗体の抗原結合部位を含んでなるために、抗原結合能を有する。他の実施態様では、抗体断片は、例えばＦｃ領域を含んでなるものは、完全な抗体に存在する場合のＦｃ領域に通常関連する生物学的な機能、例えばＦｃＲｎ結合、抗体半減期の調節、ＡＤＣＣ機能及び補体結合の少なくとも一を保持する。一実施態様では、抗体断片は、完全な抗体と実質的に類似したインビボ半減期を有する一価性抗体である。例えば、このような抗体断片は、インビボ安定性を断片に与えることができるＦｃ配列に結合した抗原結合アームを含んでもよい。
【００５４】
本願明細書において、用いられる「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」なる用語は、配列中の高頻度に可変している及び／又は構造的に定義されたループを形成する抗体可変ドメインの領域を指す。通常、抗体は、ＶＨ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３)の３つと、ＶＬ(Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)の３つの計６つの高頻度可変領域を含んでなる。多くの高頻度可変領域が描写されており、本願明細書において、包含される。Kabat相補性決定領域(ＣＤＲ)は、配列多様性に基づいており、最も一般的に用いられるものである(Kabat 等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Chothiaは、代わりに構造的ループの位置を指す(Chothia 及びLesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。ＡｂＭ高頻度可変領域は、KabatＣＤＲとChothia構造ループとが組み合わさったものであり、Oxford Molecular's AbM抗体モデリングソフトウェアにより使用されている。「接触」高頻度可変領域は、利用できる複雑な結晶構造の分析に基づくものである。これら高頻度可変領域の残基を以下に示す。
【００５５】
カバットループ    ＡｂＭ       Chothia       接触
L1   L24-L34      L24-L34      L26-L32      L30-L36
L2   L50-L56      L50-L56      L50-L52      L46-L55
L3   L89-L97      L89-L97      L91-L96      L89-L96
H1   H31-H35B     H26-H35B     H26-H32      H30-H35B
(カバット番号付け)
H1   H31-H35      H26-H35      H26-H32      H30-H35 
(Chothia番号付け)
H2   H50-H65      H50-H58      H53-H55      H47-H58
H3   H95-H102     H95-H102     H96-H101     H93-H101
【００５６】
高頻度可変領域は、次のような「拡大高頻度可変領域」を含むことができる、即ち、ＶＬの２４−３６又は２４−３４(Ｌ１)、４６−５６又は５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７(Ｌ３)と、ＶＨの２６−３５(Ｈ１)、５０−６５又は４９−６５(Ｈ２)及び９３−１０２、９４−１０２、又は９５−１０２(Ｈ３)である。可変ドメイン残基には、これら各々を規定するために、上掲のKabat等に従って番号を付した。
本願明細書において、定められるように、「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は高頻度可変領域残基以外のその可変ドメイン残基である。
【００５７】
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、非ヒト免疫グロブリンから得られた最小配列を含むキメラ抗体である。多くの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類のような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、全て又はほとんど全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに一致し、全て又はほとんど全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列である、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、状況に応じて免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含む。さらなる詳細は、Jones等, Nature 321, 522-525(1986)；Riechmann等, Nature 332, 323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596(1992)を参照のこと。また、以下の概説文献及びここに挙げる引用文献も参照のこと：Vaswani及びHamilton, Ann. Allergy, Asthma &amp; Immunol. 1:105-115 (1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)；Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)。
【００５８】
「キメラ」抗体(免疫グロブリン)は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種由来の抗体あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同であり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体あるいは他の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である「キメラ」抗体、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りそれら抗体の断片を有する(アメリカ特許番号4,816,567、及び、Morrison 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。本明細書中で用いられるヒト化抗体は、キメラ抗体のサブセットである。
【００５９】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般的に、ｓｃＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
【００６０】
「抗原」は、抗体が選択的に結合しうる予め決められた抗原である。標的抗原は、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン又は他の天然に生じる化合物ないしは合成化合物であってもよい。標的抗原はポリペプチドであることが望ましい。
【００６１】
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を指し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ−ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合してなる。非常に短いために同一鎖上で二つのドメインの対形成が可能であるリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディーは、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；及びHollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。
「ヒト抗体」は、ヒトにより生成される抗体のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を有するもの、及び／又は本明細書中に開示したヒト抗体をつくるためのいずれかの技術を使用して、つくられたものである。この定義におけるヒト抗体は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特別に除く。
【００６２】
「親和性成熟」抗体は、その1つ以上のCDRに1つ以上の変更を有する抗体であって、そのような変更を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性を向上させる。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の、さらにはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当技術分野において既知の方法により生産できる。Marks他は、Bio/Technology, 10:779-783(1992年)において、ＶＨドメインとＶＬドメインのシャフリングによる親和成熟を開示している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、Barbas他、Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994)；Schier他、Gene, 169:147-155 (1995)；Yelton他、J. Immunol., 155:1994-2004 (1995)；Jackson他, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995)；及びHawkins他, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に開示されている。
【００６３】
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域(天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域)に帰する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイプにより変わる。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)；貪食作用；細胞表面レセプター(例えば、Ｂ細胞レセプター)のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。
【００６４】
「抗体依存性細胞媒介性細胞障害」又は「ＡＤＣＣ」とは、ある種の細胞障害細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球及びマクロファージ)上に存在するＦｃレセプター(ＦｃＲｓ)と結合した分泌Ｉｇにより、これらの細胞障害エフェクター細胞が抗原-担持標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒により標的細胞を死滅させることを可能にする細胞障害性の形態を意味する。抗体は細胞障害細胞を「備えて」おり、これはこのような死滅には絶対に必要なものである。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) の４６４頁の表３に要約されている。対象の分子のＡＤＣＣ活性をアッセイするために、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。このようなアッセイにおいて有用なエフェクター細胞には、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー細胞(ＮＫ細胞)が含まれる。代わりとして、もしくは付加的に、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes等, (USA) 95:652-656 (1998)において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価することが可能である。
【００６５】
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。その細胞が少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行することが望ましい。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球が含まれるが、ＰＢＭＣとＮＫ細胞が好適である。エフェクター細胞は天然源、例えば血液から単離してもよい。
【００６６】
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載するものである。好適なＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。さらに好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(ガンマレセプター)と結合するもので、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含み、これらのレセプターの対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされた形態のものも含まれる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ(「活性型レセプター」)及びＦｃγＲＩＩＢ(「阻害型レセプター」)が含まれ、主としてその細胞質ドメインは異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型レセプターＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター活性化モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motif ;ＩＴＡＭ)を含んでいる。阻害型レセプターＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター阻害性モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif ;ＩＴＩＭ)を含んでいる(Daeron, Annu. Rev. immunol. 15:203-234 (1997)を参照)。ＦｃＲsに関しては、 Ravetch and Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994); 及びde Haas等, J.Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に概説されている。将来的に同定されるものも含む他のＦｃＲsはここでの「ＦｃＲ」という言葉によって包含される。また、該用語には、母性ＩｇＧの胎児への移送を担い(Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976) Kim等, J. Immunol.24:249 (1994))、免疫グロブリンのホメオスタシスを調節する新生児性レセプターＦｃＲｎも含まれる。国際公開公報００／４２０７２(Presta) にＦｃＲへの結合を向上又は減弱させた抗体変異型が述べられている。この特許公開の内容はここに出典明記により具体的に組み込まれる。Shields等, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)も参照のこと。
ＦｃＲｎへの結合の測定方法は公知である(例としてGhetie 1997, Hinton 2004を参照)。インビボでのヒトＦｃＲｎへの結合とヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えばヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス又は形質転換されたヒト細胞株、又はＦｃ変異形ポリペプチドを投与された霊長類動物においてアッセイすることができる。
【００６７】
「補体依存性細胞障害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。典型的な補体経路の活性化は補体系(Ｃｌｑ)の第１補体が、同族抗原と結合した(適切なサブクラスの)抗体に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。
Ｆｃ領域アミノ酸配列を変更してＣ１ｑ結合能力が増大又は減少したポリペプチド変異体は、米特許第６１９４５５１号Ｂ１及び国際公開公報９９／５１６４２に記述される。それらの特許文献の内容は、出典明記によって、特別に本願明細書に組み込まれるものとする。またIdusogie 等 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)を参照のこと。
【００６８】
「Ｆｃ領域含有ポリペプチド」なる用語は、Ｆｃ領域を含む抗体もしくはイムノアドヘンシンのようなポリペプチドを指す。Ｆｃ領域のＣ末端リジン(ＥＵ番号付けシステムに従うと残基４４７)は、例えば、ポリペプチドの精製中又はポリペプチドをコードする核酸を組み換え操作することによって除去してもよい。したがって、本発明のＦｃ領域を有するポリペプチドを含んでなる組成物は、Ｋ４４７を有するポリペプチド集団、すべてのＫ４４７が除去されたポリペプチド集団、又はＫ４４７残基を有するポリペプチドとＫ４４７残基を有さないポリペプチドの混合集団を包含しうる。
【００６９】
「遮断(ブロッキング)」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害するか又は低減するものである。好適な遮断抗体又はアンタゴニスト抗体は、実質的又は完全に、抗原の生物学的活性を阻害する。望ましくは、生物学的活性は、１０％、２０％、３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又はさらに１００％減少される。
本明細書中で用いられる「アゴニスト抗体」は、対象のポリペプチドの機能的な活性の少なくとも一を擬態する抗体である。
【００７０】
本願明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから得られるＶＬ又はＶＨフレームワークのアミノ酸配列を含有するフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「から得られる」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含有するか、又は既存のアミノ酸配列変化を含有してもよい。既存のアミノ酸変化が存在する場合、好ましくは５つのみ、好ましくは４つ以下、又は３つ以下の既存のアミノ酸変化が存在する。既存のアミノ酸変化がＶＨ中に存在する場合、好ましくは、それらの変化は位置７１Ｈ、７３Ｈ及び７８Ｈの内の３つ、２つ又は１つのみである、例えば、それらの位置のアミノ酸残基は、７１Ａ、７３Ｔ及び／又は７８Ａであってよい。一実施態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
【００７１】
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選別において、最も共通して生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。通常、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列は、可変ドメイン配列のサブグループから選別する。通常、Kabat等によると、配列のサブグループはサブグループである。一実施態様では、ＶＬについて、Kabat等によると、前記サブグループはサブグループκIである。一実施態様では、ＶＨについて、Kabat等によると、前記サブグループはサブグループIIIである。
【００７２】
「ＶＨサブグループIIIコンセンサスフレームワーク」は、Kabat等の可変重鎖サブグループIIIのアミノ酸配列から得られるコンセンサス配列を含有する。一実施態様では、ＶＨサブグループIIIコンセンサスフレームワークアミノ酸配列は、以下の配列のそれぞれの少なくとも一部又は全部を含む。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (配列番号:42)-H1-WVRQAPGKGLEWV (配列番号:43)-H2-RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC (配列番号:44)-H3-WGQGTLVTVSS (配列番号:45)。
「ＶＬサブグループIコンセンサスフレームワーク」は、Kabat等の可変軽鎖κサブグループIのアミノ酸配列から得られたコンセンサス配列を含んでなる。一実施態様では、ＶＨサブグループIコンセンサスフレームワークアミノ酸配列は、以下の配列のそれぞれの少なくとも一部又は全部を含む。
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (配列番号:15)-L1-WYQQKPGKAPKLLIY (配列番号:16)-L2-GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (配列番号:17)-L3-FGQGTKVEIK (配列番号:18)。
【００７３】
「疾病」又は「疾患」は、本発明の物質／分子又は方法を用いた治療によって利益を得る任意の症状である。これには、問題とする疾患に哺乳動物がかかりやすくなる病理学的症状を含む慢性及び急性の疾病又は疾患を含む。限定的なものではなく、ここで治療する疾患の例には、悪性及び良性の腫瘍；癌腫、芽腫及び肉腫が含まれる。
「細胞増殖性疾患(障害)」及び「増殖性疾患(障害)」なる用語は、異常な細胞増殖にある程度関連している疾患を意味する。一実施態様では、細胞増殖性疾患は癌である。
本明細書中の「腫瘍」とは、悪性か良性かにかかわらず、すべての腫瘍性細胞成長及び増殖と、すべての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。「癌」」「癌性」「細胞増殖性疾患」、「増殖性疾患」及び「腫瘍」なる用語は、本明細書に参照されるように相互に限定的なものでない。
【００７４】
「癌」及び「癌性」なる用語は、一般的に調節不可能な細胞成長／増殖に特徴がある哺乳動物の生理学的状態を指すか又は表す。癌の例には、上皮癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病が含まれるが、これに限定されるものではない。このような癌のより具体的な例には、扁平細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞性癌、胃腸癌、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮上皮癌、唾液腺上皮癌、腎臓癌、肝癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝臓癌、胃癌、メラノーマ、及び様々なタイプの頭頸部癌が含まれる。血管新生の調節不全により、本発明の組成物及び方法により治療されうる多くの疾患が引き起こされうる。これらの疾患には、非腫瘍性及び腫瘍性の両方の状態が含まれる。腫瘍性のものには上記のものが含まれるが、これに限定されるものではない。非腫瘍性疾患には、限定するものではないが、例えば、望ましくない又は異常な肥大、関節炎、関節リウマチ(ＲＡ)、乾癬、乾癬のプラーク、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化、アテローム硬化性プラーク、未熟児の網膜症を含む糖尿病性及び他の増殖的な網膜症、水晶体後繊維増殖、血管新生緑内障、年齢関連性黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植片血管新生、角膜移植片拒絶、網膜／脈絡叢血管新生、角度(ルベオーシス)の血管新生、眼性新生血管疾患、血管再狭窄、動静脈奇形(ＡＶＭ)、髄膜腫、血管腫、血管線維腫、甲状腺の過形成(甲状腺機能亢進症を含む)、角膜及び他の組織移植、慢性の炎症、肺炎症、急性の肺損傷／ＡＲＤＳ、敗血症、原発性肺高血圧症、悪性の肺滲出、大脳浮腫(例えば、急性の脳卒中／非開放性頭部損傷／外傷と関係するもの)、滑液炎症、ＲＡのパンヌス形成、筋炎骨化(myositis)、肥大性骨形成、骨関節炎(ＯＡ)、抵抗性腹水、多嚢胞性卵巣疾患、子宮内膜症、体液疾患(膵炎、コンパートメント症候群、熱傷、腸疾患)の第３の間隔、子宮類線維腫、早産、ＩＢＤなどの慢性炎症(クローン病及び潰瘍性大腸炎)、腎臓同種異系移植片拒絶反応、炎症性腸疾患、ネフローゼ症候群、望ましくない又は異常な組織塊成長(非癌)、出血性関節、肥大性瘢痕、体毛成長の阻害、オスラー-ウェーバー症候群、化膿肉芽腫水晶体後繊維増殖、強皮症、トラコーマ、血管癒着、関節滑膜炎、皮膚炎、子癇前症、腹水、心嚢貯留液(心外膜炎と関係するものなど)及び胸水が含まれる。
【００７５】
「神経変性疾患」及び「神経変性障害」なる用語は、広義に用いられ、末梢神経障害に限らず、ニューロンの変性及び／又は機能不全を伴う病状を有するすべての疾患、運動神経疾患、例えば、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ、Lou Gehrig's病)、Bell's麻痺及び脊髄筋萎縮又は麻痺を伴う様々な症状、及び、他のヒト神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、癲癇、多発性硬化症、ハンチントン舞踏病、ダウン症候群、神経性難聴及びメニエール病が含まれる。
【００７６】
「末梢神経障害」は末梢神経に作用する神経変性疾患であり、多くの場合運動神経系、感覚神経系、感覚運動神経系、自律神経系の機能不全の一又は組合せとして現れる。末梢神経障害は、例えば、遺伝的に獲得されうるか、全身性疾患から生じうるか、毒性薬剤、例えば神経毒薬剤、例として抗腫瘍剤又は産業汚染物質ないし環境汚染物質により誘導されうる。「末梢感覚の神経障害」は、原因不明で起こりうる末梢感覚ニューロンの変性に特徴があり、例えば、糖尿病(糖尿病性神経障害)、癌の細胞増殖抑制薬物治療(例として、化学療法剤、例えばビンクリスチン、シスプラチン、メトトレキセート、3'-アジド-3'-デオキシチミジン又はタキサン、例えばパクリタキセル[TAXOL(登録商標), Bristol- Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.]及びドキセタキセル[TAXOTERE(登録商標), Rhone- Poulenc Rorer, Antony, France]による治療)、アルコール中毒、後天性免疫不全症候群(AIDS)又は遺伝子の素因の結果として生じうる。遺伝的に獲得した末梢神経障害は、例えば、レフサム病、クラッベ病、異染性白質ジストロフィー、ファブリー病、デジュリーヌ・ソッタ病、無βリポ蛋白血症、及びシャルコー・マリー・トゥース(ＣＭＴ)病(別名腓骨筋萎縮症又は遺伝性運動感覚神経障害(ＨＭＳＮ))を含む。末梢神経障害の多くのタイプは数か月又は数年の期間にわたってゆっくりと進行する。医療において、このような神経障害は慢性という。場合によって、末梢神経障害は、２、３日の期間で急速に進行する、急性と呼ばれるものもある。通常、末梢神経障害は感覚神経及び運動神経ともに影響して、混合性の感覚及び運動神経障害を起こすが、単なる感覚神経障害及び単なる運動神経障害も知られている。
【００７７】
本明細書中で用いる「自己免疫性疾患」は、個体の自己組織に対する免疫応答を伴う病態である任意の疾患を意味する。自己免疫性疾患には、関節リウマチ(ＲＡ)、喘息、慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)、炎症性腸疾患、セリアック病、アレルギー性鼻炎、アレルギー性蕁麻疹、クローン病、巨大結腸、グレーブス病、アジソン病、ギラン‐バレー症候群、橋本病、アレルギー性眼内炎症性疾患、強直性脊椎炎、アトピー性皮膚炎、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、ベーチェット病、コーガン症候群、接触皮膚炎、クッシング症候群、皮膚筋炎、真正糖尿病、円板状紅斑性狼瘡、ループス腎炎、好酸性筋膜炎、結節性紅斑、剥脱性皮膚炎、局所性又は分節性糸球体硬化症、巨細胞動脈炎、痛風、痛風の関節炎、手湿疹、ヘーノホ-シェーンライン紫斑病、妊娠ヘルペス、多毛症、特発性cerato-強膜炎、特発性血小板減少性紫斑病、炎症性皮膚病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、骨関節炎、膵炎、妊娠天疱瘡様、尋常性天疱瘡、歯周炎；結節性多発動脈炎、リウマチ性多発性筋痛、陰嚢掻痒症、掻痒症／炎症、乾癬、乾癬の関節炎、肺ヒストプラスマ症、再発性多発軟骨炎、酒さ、サルコイドーシス、強皮症、敗血症ショック症候群、肩腱炎又は滑液嚢炎、シェーグレン症候群、スティル病、スウィート病、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、高安動脈炎、側頭動脈炎、中毒性上皮性表皮壊死症、移植拒絶反応、結核、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎及びヴェゲナー肉芽腫症が含まれるがこれらに限定されるものではない。
本明細書中で用いる「免疫学的疾患」は、個体の免疫系の異常な発達や異常な制御を伴う病態である任意の疾患を意味する。望ましくは、免疫学的疾患は、異常なＴ細胞発達又は制御を伴う。
「医薬」は、問題の疾患ないしその症状、又は副作用を治療するために活性な薬剤である。
【００７８】
ここで使用されるところの「治療」は、治療されている個体又は細胞の天然の過程を改変するための臨床的介入を意味し、予防のため又は臨床的病理の過程中に実施することができる。治療の望ましい効果には、疾病の発生又は再発の防止、症状の寛解、疾病の任意の直接的又は間接的病理的結果の低減、転移の防止、疾病の進行速度の低減、疾病状態の回復又は緩和、及び寛解又は改善された予後が含まれる。ある実施態様では、本発明の抗体は疾患又は疾病の進行を遅らせるために用いられる。
「個体」は脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物には、限定するものではないが、家畜動物(ウシなど)、スポーツ用動物、愛玩動物(ネコ、イヌ及びウマ)、霊長類、マウス及びラットが含まれる。
治療の対象のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００７９】
「有効量」とは所望の治療又は予防結果を達成するために必要な用量及び時間での効果的な量を意味する。
本発明の物質／分子の「治療的有効量」は、例えば個体の疾病ステージ、年齢、性別、及び体重、並びに個体に所望の応答を誘発する物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの能力などの因子に従って変わりうる。また、治療的有効量は物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの任意の毒性又は有害な効果よりも治療的に恩恵のある効果が上回るものである。「予防的有効量」とは所望の予防結果を達成するために必要な用量及び時間での効果的な量を意味する。典型的には必ずではないが、予防的用量は疾患の初期ステージ又はその前の個体に用いるので、予防的有効量は治療的有効量よりも少ないであろう。
【００８０】
ここで用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体(例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体)、化学治療薬、例えばメトトレキセート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド(ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド)、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロランブシル、ダウノルビシン又はその他インターカレート剤、酵素及びその断片、例えば核溶解性酵素、抗生物質、及び毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素、そして下記に開示する種々の抗腫瘍又は抗癌剤を含むように意図されている。他の細胞障害性薬が下記に記載されている。殺腫瘍性剤は、腫瘍細胞の破壊を引き起こす。
【００８１】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びCYTOXAN(登録商標)シクロホスファミドのようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(特にブラタシン及びブラタシノン)；デルタ-９-テトラヒドロカナビノール(ドロナビノール、MARINOL(登録商標)；βラパチョーネ；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトセシン(合成アナログトポテカン(HYCAMTIN(登録商標)、CPT-11(イリノテカン、CAMPTOSAR(登録商標))、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン(scopolectin)及び９-アミノカンプトテシンを含む)；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む)；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；テニポシド；クリプトフィシン(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８)；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン(合成アナログ、ＫＷ-２１８９及びＣＢ１-ＴＭ１を含む)；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１(例えばAgnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186(1994)参照)；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン類(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ADRIAMYCIN(登録商標)ドキソルビシン(モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン、及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイ���ン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)；葉酸アナログ、例えばデノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリンアナログ、例えばフルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；アンドロゲン類、例えばカルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えばフロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エポシロン；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシノイド(maytansinoid)類、例えばメイタンシン(maytansine)及びアンサミトシン(ansamitocine)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類(特にＴ-２毒素、ベラクリン(verracurin)Ａ、ロリジン(roridine)Ａ及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン(ELDISINE(登録商標)、FILDESIN(登録商標))；ダカーバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ａｒａ-Ｃ」)；チオテパ；タキソイド類、例えばTAXOL(登録商標)パクリタキセル(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)、ABRAXANETMパクリタキセルのクレモフォー無添加アルブミン操作ナノ粒子製剤(American  Pharmaceutical  Partners, Schaumberg, Illinois)、及びTAXOTERE(登録商標)ドキセタキセル(Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)；クロランブシル；ゲムシタビン(GEMZAR(登録商標))；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナアナログ、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン(VELBAN(登録商標))；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；マイトキサントロン；ビンクリスチン(ONCOVIN(登録商標))；オキサリプラチン；ロイコボビン(leucovovin)；ビノレルビン(NAVELBINE(登録商標))；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノ���イシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸のようなレチノイド；カペシタビン(XELODA(登録商標))；上述したもののいずれかの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体：並びに上記のうち２以上の組み合わせ、例えば、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニソロン併用療法の略称であるＣＨＯＰ、及び5-FU及びロイコボビン(leucovovin)とオキサリプラチン(ELOXATINTM)を組み合わせた治療法の略称であるFOLFOXが含まれる。
【００８２】
またこの定義に含まれるものには、癌の成長を助けるホルモンの作用を調節、低減、遮断又は阻害するように働き、多くの場合全身処置の形態で使用される抗ホルモン剤がある。それらはそれ自体がホルモンであってもよい。それらは例えば抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体モジュレータ(ＳＥＲＭ)を含み、例えば、タモキシフェン(NOLVADEX(登録商標)タモキシフェンを含む)、ラロキシフェン(raloxifene)(EVISTA(登録商標))、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びトレミフェン(FARESTON(登録商標))；抗プロゲステロン；エストロゲンレセプター下方調節剤(ERD)；卵巣を抑止又は停止させる機能がある作用剤、黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)アゴニスト、例えば酢酸リュープロリド(LUPRON(登録商標)及びELIGARD(登録商標))、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリン及びトリプテレリン(tripterelin)；その他抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド；並びに副腎のエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４(５)-イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール(MEGASE(登録商標))、エキセメスタン(AROMASIN(登録商標))、フォルメスタニー(formestanie)、ファドロゾール、ボロゾール(RIVISOR(登録商標))、レトロゾール(FEMARA(登録商標))、及びアナストロゾール(ARIMIDEX(登録商標))である。加えて、このような化学療法剤の定義には、クロドロネート(例えばBONEFOS(登録商標)又はOSTAC(登録商標))、エチドロン酸(DIDROCAL(登録商標))、NE-58095、ゾレドロン酸／ゾレドロネート(ZOMETA(登録商標))、アレンドロネート(FOSAMAX(登録商標))、パミドロン酸(AREDIA(登録商標))、チルドロン酸(SKELID(登録商標))、又はリセドロン酸(ACTONEL(登録商標))、並びにトロキサシタビン(troxacitabine)(１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に接着細胞の増殖に結びつくシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ-α、Ｒａｆ、及びＨ-Ｒａｓ、及び上皮成長因子レセプター(EGF-R)；THERATOPE(登録商標)ワクチン及び遺伝子治療ワクチン等のワクチン、例えばALLOVECTIN(登録商標)ワクチン、LEUVECTIN(登録商標)ワクチン、及びVAXID(登録商標)ワクチン；トポイソメラーゼ１阻害剤(LURTOTECAN(登録商標))；ｒｍＲＨ(ABARELIX(登録商標))；ラパチニブ(lapatinib ditosylate)(GW572016としても知られるErbB-2及びEGFR二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤)；及び上記のもののいずれかの製薬的に許容される塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【００８３】
ここで用いられる際の「増殖阻害剤」は、細胞(例えばＮｏｔｃｈ１を発現する細胞)の成長をインビトロ又はインビボの何れかで阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、成長阻害剤は、Ｓ期で細胞(例えばＮｏｔｃｈ１を発現する細胞)の割合を有意に減少させるものである。成長阻害剤の例は、細胞周期の進行を(Ｓ期以外の位置で)阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキサン類、及びトポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びアラ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。タキサン類(パクリタキセル及びドセタキセル)は、共にイチイに由来する抗癌剤である。ヨーロッパイチイに由来するドセタキセル(TAXOTERE(登録商標)、ローン・プーラン ローラー)は、パクリタキセル(TAXOL(登録商標)、ブリストル-マイヤー スクウィブ)の半合成類似体である。パクリタキセル及びドセタキセルは、チューブリン二量体から微小管の集合を促進し、細胞の有糸分裂を阻害する結果となる脱重合を防ぐことによって微小管を安定化にする。
【００８４】
「ドキソルビシン」はアントラサイクリン抗生物質である。ドキソルビシンの完全な化学名は、(８Ｓ-シス)-１０-[(３-アミノ-２，３，６-トリデオキシ-α-Ｌ-リキソ-ヘキサピラノシル)オキシ]-７，８，９，１０-テトラヒドロ-６，８，１１-トリヒドロキシ-８-(ヒドロキシアセチル)-１-メトキシ-５，１２-ナフタセンジオンである。
【００８５】
「抗腫瘍性組成物」なる用語は、少なくとも一の活性な治療的作用剤、例えば「抗癌剤」を含む、癌を治療する際に有用な組成物を指す。治療的作用剤(抗癌剤、本明細書中で「抗腫瘍剤」とも称する)の例には、限定するものではないが、例えば、化学療法剤、増殖阻害性剤、細胞障害性剤、放射線療法に用いられる作用剤、抗血管新生剤、アポトーシス作用剤、抗チュービュリン剤、毒素、及び癌を治療するための他の作用剤、例えば、抗ＶＥＧＦ中和抗体、ＶＥＧＦアンタゴニスト、抗ＨＥＲ-２抗体、抗ＣＤ２０抗体、上皮性増殖因子レセプター(ＥＧＦＲ)アンタゴニスト(例えばチロシンキナーゼインヒビター)、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲインヒビター、エルロチニブ、ＣＯＸ-２インヒビター(例えばセレコキシブ)、インターフェロン、サイトカイン、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、又はＶＥＧＦレセプター(一又は複数)の一又は複数に結合するアンタゴニスト(例えば中和抗体)、血小板由来増殖因子(ＰＤＧＦ)及び／又は幹細胞因子(ＳＣＦ)のレセプターチロシンキナーゼのインヒビター(例えば、メシル酸イマチニブ(Ｇｌｅｅｖｅｃ(登録商標) Novartis)、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２、及び他の生理活性的で有機化学的作用剤などが含まれる。
【００８６】
この出願で用いられる用語「プロドラッグ」は、親薬剤に比較して腫瘍細胞に対する細胞障害性が低く、酵素的に活性化又はより活性な親形態に変換される製薬的活性物質の前駆体又は誘導体形態を意味する。例えば、Wilman, 「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」, Biochemical Society Transactions, 14, :375-382, 615th Meeting, Belfast (1986)、及びStella 等, 「Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」、Directed Drug Delivery, Borchardt等(編), 247-267項, Humana Press (1985)参照。本発明のプロドラッグは、限定するものではないが、ホスファート含有プロドラッグ、チオホスファート含有プロドラッグ、スルファート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ-アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β-ラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒のない薬剤に転換可能な５-フルオロシトシン及び他の５-フルオロウリジンプロドラッグを含む。限定はしないが、本発明で使用されるプロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞障害性剤の例には、前記の化学療法剤が含まれる。
【００８７】
「抗血管新生剤」又は「血管新生(血管形成)インヒビター」は、直接的又は間接的に、血管新生、脈管形成又は望ましくない血管透過を阻害する、小分子量の物質、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、単離したタンパク質、組換えタンパク質、抗体、又はそれらのコンジュゲート又は融合タンパク質を意味する。例えば、抗血管新生剤は、上記に定義したように血管新生剤に対する抗体又は他のアンタゴニスト、例えば、ＶＥＧＦに対する抗体、ＶＥＧＦレセプターに対する抗体、ＶＥＧＦレセプターシグナル伝達を遮断する小分子(例えば、PTK787/ZK2284、SU6668、SUTENT/SU11248 (sunitinib malate)、AMG706)である。また、抗血管新生剤には、天然の血管新生インヒビター、例えばアンジオスタチン、エンドスタチンなどが含まれる。例えばKlagsbrun及びD'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991)；Streit及びDetmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003)(例えば、悪性黒色腫の抗血管新生治療を列挙している表３)；Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999)；Tonini等, Oncogene, 22:6549-6556 (2003)(例えば、抗血管新生因子を列挙している表２)；及び、Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)(例えば、臨床試験で用いられる抗血管新生剤を列挙している表１)を参照のこと。
【００８８】
「生体試料」(「試料」又は「組織ないし細胞試料」と交換可能に称される)は、個体から入手した様々な種類の試料を包含し、診断アッセイ又はモニタリングアッセイに用いられうる。この定義には、血液及び生体起源の他の液体試料、生検標本や組織培養物やそれらに由来する細胞などの固形組織試料、及びこれらのプロジェニーが包含される。また、この定義には、入手後何らかの方法、例えば試薬で処理する、可溶化する、又はタンパク質やポリヌクレオチドなどの特定の成分について濃縮する、又は切片化のために半流動性基質ないしは固形基質に包埋することによって操作してある試料が含まれる。「生体試料」なる用語は臨床試料を包含し、培養物中の細胞、細胞上清物、細胞溶解物、血清、血漿、体液、及び組織試料も含む。生体試料の供給源は、新鮮な、凍結された及び／又は保存されていた臓器や組織試料又は生検又は吸引による固形組織；血液又は血液成分；大脳脊髄液、羊水、腹水又は間質液などの体液；被検体の妊娠期又は発生期の任意の時期の細胞であってもよい。いくつかの実施態様では、生体試料は原発性腫瘍又は転移性腫瘍から得られる。生体試料は、防腐剤、抗凝血物質、バッファ、固定液、栄養分、抗生物質など天然の組織にはもともと混在していない化合物を含んでもよい。
【００８９】
本明細書中の組織試料の「切断部分」とは、組織試料の一部又は一片、例えば組織試料から切り出した組織又は細胞の一薄片を意味する。組織試料の複数の切断部分は採取され、本発明の分析に供されうることが理解される。いくつかの実施態様では、組織試料の同じ切断部分は形態学的及び分子的レベルで分析されるか、タンパク質及び核酸の両方に関して分析される方法を含む。
本明細書中で用いられる「標識」なる言葉は、核酸プローブや抗体などの試薬に直接的又は間接的にコンジュゲートないしは融合され、コンジュゲートないしは融合した試薬の検出を容易にする化合物又は組成物を指す。標識自体が検出可能なもの(例えば放射性標識又は蛍光性標識)であってよく、酵素標識の場合、検出可能な基質化合物ないしは組成物の化学的変化を触媒するものであってもよい。
【００９０】
Ｎｏｔｃｈ１レセプター及び活性化変異
Ｎｏｔｃｈ１レセプターはフリン様プロテアーゼによって膜貫通ドメインの外側の部位Ｓ１およそ７０のアミノ酸で細胞表面への輸送中にタンパク質分解的にプロセシングされ、細胞外Ｎｏｔｃｈ(ＥＣＮ)サブユニットとＮｏｔｃｈ膜貫通サブユニット(ＮＴＭ)が生成される。これら２つのサブユニットは非共有的に結合したままで、成熟したヘテロダイマー細胞−表面レセプターを構成する。Ｎｏｔｃｈ１ ＥＣＮサブユニットは、３６のＮ末端ＥＧＦ様リピートの後に３つのタンデムリピートＬＮＲモジュール(ＬＮＲ＿Ａ、ＬＮＲ＿Ｂ及びＬＮＲ＿Ｃ)を含む。各ＬＮＲモジュールは、カルシウムイオンを調整することが予測される保存された酸性かつ極性の残基の基と３つのジスルフィド結合を含有する。ＥＧＦリピート領域内に、活性化するリガンドのための結合部位が位置する。ＬＮＲモジュールは、リガンドが誘導する活性化の前に静止高次構造にＮｏｔｃｈを維持することに関与する。Ｎｏｔｃｈ１ ＮＴＭは、細胞外領域と、膜貫通部分と、ＲＡＭ(ＲＢＰ Ｊκ結合分子)ドメイン、アンキリンリピート、トランスアクチベーションドメイン及びカルボキシ末端ＰＥＳＴ配列を含む大きな細胞内部分とを含む。ＥＣＮ及びＮＴＭサブユニットの安定な結合は、ＥＣＮのカルボキシ終末端(ＨＤＣと称される)とＮＴＭの細胞外アミノ末端(ＨＤ-Ｎと称される)とを含むヘテロ二量体化ドメイン(ＨＤ)に依存している。ＥＣＮサブユニットへのＮｏｔｃｈリガンドの結合により、制御された細胞内タンパク質分解により生じる２つの連続的なタンパク質分解性切断が開始する。部位Ｓ２(ＮＴＭ内に位置する)のメタロプロテアーゼによる第一切断によって、Ｎｏｔｃｈ膜貫通サブユニットの、原形質膜の内側の小葉の近くの部位Ｓ３での第二切断が起こりやすくなる。プレセニリンとニカストリンを含む多タンパク質複合体により触媒される部位Ｓ３切断は、Ｎｏｔｃｈ膜貫通サブユニット(細胞内Ｎｏｔｃｈ、「ＩＣＮ」とも称される)の細胞内部分を遊離し、核に転位させ、標的の遺伝子の転写を活性化する。
【００９１】
図１１−１から１１−４は、ヒト(配列番号：５６)とマウス(配列番号：５７)との間のＮｏｔｃｈ１アミノ酸配列のアラインメントを示す。シグナルペプチドは配列番号：５６又は５７のおよそアミノ酸１−１８に及び、ＥＧＦリピート(ＥＧＦ１からＥＧＦ３６)は配列番号：５６又は５７のおよそアミノ酸２０−１４２６に及び、ＬＮＲ＿Ａは配列番号：５６又は５７のおよそアミノ酸１４４６−１４８９に及び、ＬＮＲ＿Ｂは配列番号：５６又は５７のおよそアミノ酸１４９０−１５２７に及び、ＬＮＲ＿Ｃは配列番号：５６又は５７のおよそアミノ酸１５２８−１５６２に及び、ＨＤ−Ｎはおよそ配列番号：５６のアミノ酸１５６３−１６６４又は配列番号：５７のアミノ酸１５６３−１６５４に及び、ＨＤ−Ｃはおよそ配列番号：５６のアミノ酸１６６５−１７３３又は配列番号：５７のアミノ酸１６５５−１７２３に及び、そしてＰＥＳＴドメインは配列番号：５６のおよそアミノ酸２４８４−２５５５又は配列番号：５７のおよそアミノ酸２４５９−２５３０に及ぶ。ＨＤ−Ｎ及びＨＤ−Ｃを含むＨＤドメインは、およそ配列番号：５６のアミノ酸１５６３−１７３３又は配列番号：５７のアミノ酸１５６３−１７２３に及ぶ。Ｓ１切断部位は、配列番号：５６のアミノ酸１６６４と１６６５との間に、そして配列番号：５７のアミノ酸１６５４と１６５５との間にある。Ｓ２切断部位は、配列番号：５６のアミノ酸１７２０と１７２１との間に、そして配列番号：５７のアミノ酸１７１０と１７１１との間にある。膜貫通部分は、配列番号：５６のおよそアミノ酸１７３６−１７４７、そして、配列番号：５７のおよそアミノ酸１７２６−１７３７に及ぶ。
【００９２】
Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達に影響する様々なタイプのＮｏｔｃｈ１変異が同定され、特徴付けられている。Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達を活性化するＮｏｔｃｈ１変異は、大まかに２つのクラス、すなわちリガンド非依存性の活性化変異とリガンド依存性の活性化変異に分けられる。さらに、リガンド依存性の活性化変異の中にはやはりリガンド応答性であるものもある。Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達を活性化する変異はＴ−ＡＬＬと関係していた(Weng et al., Science 306:269-271, 2004; Malecki et al., Mol. Cell. Biol. 26:4642-4651, 2006)。特に、Ｔ−ＡＬＬと関連するＮｏｔｃｈ１活性化変異はＨＤ領域とＰＥＳＴドメイン内で同定された。さらに、転位の結果異常なＮｏｔｃｈ１シグナル伝達となりうる。例えば、Ｎｏｔｃｈ１は(７;９)(ｑ３４;ｑ３４.３)染色体転位においてパートナー遺伝子として発見された。この転位はＴ−ＡＬＬの稀なサブセットに見られ、Ｎｏｔｃｈ１遺伝子の３'末端をＴ細胞レセプターβプロモーター／エンハンサーに融合させる(Weng et al., Science 306:269-271, 2004)。
リガンド結合がない場合にシグナル伝達するがリガンド結合への応答能は保持しているリガンド非依存性変異の例は、Ｎｏｔｃｈ１のＨＤ領域内の変異である。ヒトＮｏｔｃｈ１のＨＤ−Ｎ領域内の活性化変異には、例えば、Ｌ１５７５Ｐ、Ｖ１５７７Ｅ、Ｆ１５９３Ｓ、Ｌ１５９４Ｐ、Ｌ１５９７Ｈ、Ｒ１５９９Ｐ、Ｌ１６０１Ｐ、及びＩ１６１７Ｔ／Ｎが含まれる。ヒトＮｏｔｃｈ１のＨＤ−Ｃ領域内の活性化変異の例には、Ｖ１６７７Ｄ、Ｌ１６７９Ｐ、Ｉ１６８１Ｎ、Ａ１７０２Ｐ、Ｉ１７１９Ｔ、及びＳ２切断部位での挿入（ＡＲＬＧＳＬＮＩＰＹＫＩＥＡ；配列番号：５２）（Ｐ１２挿入）が含まれる。Ｌ１５７５Ｐ、Ｖ１５７７Ｅ、Ｆ１５９３Ｓ、Ｌ１５９４Ｐ、Ｌ１５９７Ｈ、Ｒ１５９９Ｐ、Ｌ１６０１Ｐ、Ｉ１６１７Ｔ／Ｎ、Ｖ１６７７Ｄ、Ｌ１６７９Ｐ、Ｉ１６８１Ｎ、Ａ１７０２Ｐ及びＩ１７１９Ｔの変異、及びＰ１２挿入により、Ｓ２及びＳ３の切断が増加し、Ｎｏｔｃｈ１シグナル伝達は野生型Ｎｏｔｃｈ１レセプターのシグナル伝達よりも大きい。
【００９３】
Ｎｏｔｃｈ１活性化変異のサブセットによりヘテロダイマー安定性が減少し、ＥＣＮ領域とＮＴＭの相互作用を弱くする。ヒトＮｏｔｃｈ１でのヘテロダイマー安定性を低減する変異の例には、Ｌ１５７５Ｐ、Ｖ１５７７Ｅ、Ｆ１５９３Ｓ、Ｌ１５９４Ｐ、Ｌ１５９７Ｈ、Ｒ１５９９Ｐ、Ｉ１６１７Ｔ、Ｉ１６１７Ｎ、Ｉ１６８１Ｎ、Ａ１７０２Ｐ及びＩ１７１９Ｔが含まれる。Ｐ１２挿入は、Ｓ２切断の部位から離れて内在性のＨＤ−Ｃドメインを再配置することが予測される直接重複から生じ、金属プロテアーゼへのＳ２部位のアクセスを亢進しうる(Malecki et al., Mol. Cell. Biol. 26:4642-4651, 2006)。
リガンド依存性であるＮｏｔｃｈ１活性化変異の例には、リーディングフレームないの変化を引き起こす挿入や欠失又は成熟前の停止コドンを生じさせるポイント変異のような、ＰＥＳＴドメイン内の変異が含まれる。阻害性ＰＥＳＴドメインの除去は、ＩＣＮの半減期を増やすと考えられる。ＰＥＳＴドメイン内の変異の例は、ヒトＮｏｔｃｈ１アミノ酸配列(配列番号：５７)のアミノ酸２４７３で始まるカルボキシ末端欠失であるＤｅｌＰＥＳＴである。ＰＥＳＴドメイン内の他の変異は当分野で公知であり、例えばWeng et al. (Science 306:269-271, 2004)に記載されている。
【００９４】
本発明の組成物及び同組成物の作製方法
本発明は、医薬組成物を含む組成物であって、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を含んでなる組成物、及び、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体をコードする配列を含むポリヌクレオチドを包含する。本明細書で用いられるように、組成物は、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲに結合する一又は複数の抗体、及び／又はＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲに結合する一又は複数の抗体をコードする配列を含む一又は複数のポリヌクレオチドを含有する。さらに、これらの組成物は、適切な担体、例えばバッファなどの薬学的に受容可能な賦形剤を含みうる。これは当分野で周知である。
【００９５】
また、本発明は、単離された抗体及びポリヌクレオチドの実施態様を包含する。また、本発明は、実質的に純粋な抗体及びポリヌクレオチドの実施態様を包含する。
本発明の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体は望ましくはモノクローナルである。また、本明細書中で提供される抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体のＦａｂ、Ｆａｂ'、Ｆａｂ'-ＳＨ及びＦ(ａｂ')２断片も本発明の範囲内に包含される。これらの抗体断片は、従来の方法、例えば酵素消化により作製されるか、組換え体技術により生成されてもよい。このような抗体断片は、キメラでもよいし、ヒト化のものでもよい。これらの断片は、後述する診断目的及び治療目的のために有用である。
【００９６】
モノクローナル抗体は実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、わずかながら存在しうる天然に生じる突然変異体を除いて同一のものである。よって、「モノクローナル」との修飾詞は、別個の抗体の混合物ではなく、抗体の特性を示すものである。
本発明の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲモノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４８１６５６７号)によって作製することができる。
【００９７】
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを免疫化し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を誘導する。一般的に、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲへの抗体は、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲとアジュバントを複数回皮下(ｓｃ)又は腹腔内(ｉｐ)に注射することにより動物内に生じる。Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲは当分野で公知の方法を用いて調製されうる。その方法のいくつかは本明細書中でさらに記載される。例えば、ヒト及びマウスのＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲの組み換え産生は以下に記載される。一実施態様では、動物を、免疫グロブリン重鎖のＦｃ部位に融合したＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲで免疫化する。好適な実施態様では、動物を、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ−ＩｇＧ１融合タンパク質で免疫化する。通常、動物は、一リン酸化リピドＡ(ＭＰＬ)／トレハロースジクリノミコレート(trehalose dicrynomycolate)(ＴＤＭ) (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT)によりＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲの免疫原性コンジュゲート又は誘導体に対して免疫化され、該溶液は複数の部位の皮下に注射される。２週後に、動物を追加免役する。７〜１４日後、動物から採血して、血清を抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ力価について検定する。力価がプラトーになるまで動物を追加免役する。
【００９８】
別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,59-103頁(Academic Press, 1986))。
【００９９】
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
【０１００】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの生産を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫系、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、San Diego, California USAから入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及びアメリカ培養細胞系統保存機関、Rockville, Maryland USAから入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されたものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
【０１０１】
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲに対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunsonほか, Anal. Biochem., 107:220 (1980)のスキャッチャード分析法によって測定することができる。
【０１０２】
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地には、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地が包含される。加えて、該ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインA-SEPHAROSE、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような常套的な免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
【０１０３】
本発明の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体は、所望される活性を有する合成抗体クローンをスクリーニングするために、コンビナトリアルライブラリを用いて同定することができる。原則として、合成抗体クローンを、ファージコートタンパク質と融合した抗体可変領域(Fv)の種々の断片を表示するファージを有するファージライブラリをスクリーニングすることによって選択される。このようなファージライブラリは、所望される抗原に対するアフィニティークロマトグラフィーによって選別される。所望される抗原と結合することができるFv断片を発現するクローンは抗原へ吸収され、それによって、ライブラリの非結合クローンから分離される。次いで、この結合クローンは、抗原から溶出させることが可能であり、抗原吸収／溶出の付加的サイクルによってさらに濃縮することができる。本発明の任意の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体は、興味の対象であるファージクローンを選択するために適切な抗原スクリーニング手法を設計し、続いて、興味の対象であるファージクローンからのＦｖ配列、及びKabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3に記載の適切な定常領域(Fc)配列を用いての全長抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体クローンの構築によって得ることができる。
【０１０４】
抗体の抗原結合ドメインは、約１１０アミノ酸の２つの可変(Ｖ)領域である軽(ＶＬ)及び重(ＶＨ)鎖で形成され、その双方には、３つの超可変ループ又は相補鎖決定領域(ＣＤＲ)が存在する。可変ドメインは、Winter等，Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455(1994)に記載のように、ＶＨ及びＶＬが短くて柔軟なペプチドを介して共有結合している一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)断片として、又は定常ドメインと融合して非共有的に相互作用しているＦａｂ断片のいずれかとしてファージ上に機能的に表示することができる。ここで用いられているように、ｓｃＦｖコード化ファージクローン、及びＦａｂコード化ファージクローンは、総称して「Ｆｖファージクローン」又は「Ｆｖクローン」と呼ぶ。
【０１０５】
ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーを、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)によって分離してクローンし、ファージライブラリにおいてランダムに組み換えられることが可能であり、それは、Winter等，Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455(1994)に記載のように抗原結合クローンについて探索することが可能である。免疫化したソースからのライブラリは、ハイブリドーマを構成する必要がなく、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。あるいは、天然レパートリーをクローニングして、Griffiths等，EMBO J, 12: 725-734(1993)に記載のようにどんな免疫化もせずに、幅広い非自己及びまた自己抗原に対するヒト抗体の単一のソースを提供することが可能である。最終的には、天然ライブラリは、また、Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol. 227: 381-388(1992)に記載のように、幹細胞からの再配列されていないV遺伝子セグメントをクローニングし、及びランダム配列を有するＰＣＲプライマーを利用して高度可変ＣＤＲ３領域をコードし、インビトロでの再配列を完成させることによって合成的に作製することができる。
【０１０６】
繊維状ファージは、マイナーコートタンパク質ｐＩＩＩへの融合によって、抗体断片を表示するのに用いられる。この抗体断片は、一本鎖Ｆｖ断片として表示することが可能であり、そのＶＨ及びＶＬドメインは、例えば、Marks等，J. Mol. Biol. 222: 581-597(1991)に記載のような、又は、例えば、Hoogenboom等，Nucl. Acids. Res., 19: 4133-4137(1991)に記載のような、１つの鎖はｐＩＩＩと融合し、もう一方の鎖は、幾つかの野生型コートタンパク質を置換することによってファージ表面上に表示されるようになるＦａｂコートタンパク質構造のアセンブリがある細菌宿主細胞のペリプラズムへ分泌されるＦａｂ断片のように、柔軟なポリペプチドスペーサーによって同じポリペプチド鎖上に連結されている。
【０１０７】
一般的に、抗体遺伝子断片をコードする核酸は、ヒト又は動物から収集した免疫細胞から得られる。抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲクローンに有利になるように偏ったライブラリが望ましい場合には、個体をＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲで免疫化して抗体応答を生成させ、そして、脾臓細胞及び／又は他の末梢血リンパ球(ＰＢＬ)である循環Ｂ細胞を、ライブラリ構築のために回収する。好ましい実施態様では、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ免疫化により、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲに対するヒト抗体を産生するＢ細胞が生じるように、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲクローンに好ましいヒト抗体遺伝子断片ライブラリは、機能的ヒト免疫グロブリン遺伝子アレイを有する(及び、機能的な内因性抗体産生系を欠く)トランスジェニックマウスにおける抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体応答を生成することによって得られる。ヒト抗体産生トランスジェニックマウスの作製は以下に記載する。
【０１０８】
抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ反応細胞集団のさらなる濃縮は、適切なスクリーニング手法を利用してＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲ特異的膜結合抗体を発現するＢ細胞を単離すること、例えば、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲアフィニティクロマトグラフィーによる細胞分離、又は蛍光色素標識Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲへの細胞の吸着とその後の蛍光標示式細胞分取器(ＦＡＣＳ)によって得ることができる。
【０１０９】
あるいは、非免疫化供与体からの脾臓細胞及び／又はＢ細胞又は他のＰＢＬの利用によって可能性のある抗体レパートリーのより良い表示が提供され、また、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲが免疫原ではない任意の動物(ヒト又は非ヒト)種を利用した抗体ライブラリの構築が可能となる。インビトロの抗体遺伝子コンストラクトを取り込むライブラリに関しては、幹細胞を個体から収集して非再配列の抗体遺伝子セグメントをコードする核酸を提供する。対象の免疫細胞は、種々の動物種、例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ目、オオカミ、犬科、ネコ科、ブタ、ウシ、ウマ、及びトリ種等から得ることができる。
【０１１０】
抗体可変遺伝子セグメント(ＶＨ及びＶＬセグメントを含む)をコードする核酸を、興味の対象の細胞から回収して増幅した。再配列したＶＨ及びＶＬ遺伝子ライブラリの場合では、その所望するＤＮＡは、Orlandiら，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86: 3833-3837 (1989)に記載されているように、リンパ球からのゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡを単離し、再配列したＶＨ及びＶＬ遺伝子の５'及び３'末端と一致するプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)を行うことによって得ることが可能であり、よって発現のための多様なＶ遺伝子レパートリーを作製することができる。このＶ遺伝子は、Orlandi等, (1989)及びWardら，Nature, 341: 544-546(1989)に記載のように、成熟Ｖドメインをコードするエクソンの５'末端のバックプライマーとＪセグメントに基づいた前方向プライマーにより、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡから増幅することが可能である。しかしながら、ｃＤＮＡからの増幅のためには、バックプライマーは、また、Jonesら，Biotechnol., 9:88-89(1991)に記載のようにリーダーエクソンに、前方向プライマーは、Sastryら，Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86:5728-5732(1989)に記載のように定常領域内に基づくことが可能である。相補性を最大にするために、Orlandiら(1989)又はSastryら(1989)に記載のように、縮重をプライマーへ取り込むことが可能である。好ましくは、例えば、Marksら，J. Mol. Biol., 222: 581-597(1991)の方法に記載のように、又はOrumら，Nucleic Acids Res., 21: 4491-4498(1993)の方法に記載のように、免疫細胞の核酸試料に存在するすべての入手可能なＶＨ及びＶＬ配列を増幅するために、各Ｖ遺伝子ファミリーを標的にしたＰＣＲプライマーを用いて、そのライブラリの多様性を最大にする。発現ベクターへの増幅ＤＮＡのクローニングに関しては、希な制限部位を、Orlandiら(1989)に記載のように、又はClacksonら，Nature, 352: 624-628(1991)に記載のようにタグ付加したプライマーによるさらなるＰＣＲ増幅によって、ＰＣＲプライマー内の１つの末端へタグとして導入することができる。
【０１１１】
合成的に再配列したＶ遺伝子のレパートリーは、Ｖ遺伝子セグメントからインビボで誘導することができる。殆どのヒトＶＨ遺伝子セグメントはクローニング及び配列決定(Tomlinson等, J. Mol. Biol. 227: 776-798(1992)に報告されている)、そしてマッピングがされている(Matsudaら，Nature Genet., 3: 88-94(1993))；これらクローニングされたセグメント(Ｈ１及びＨ２ループのすべての主要なコンホメーションを含む)は、Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol. 227: 381-388(1992)に記載のように、多様な配列と長さのＨ３ループをコードするＰＣＲプライマーによる多様なＶＨ遺伝子レパートリーを作製するのに用いられる。ＶＨレパートリーは、また、Barbas等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457-4461(1992)に記載されているように、単一の長さの長いＨ３ループに焦点を合わせたすべての配列多様性をともなって作製することができる。ヒトＶκ及びＶλセグメントはクローニング及び配列決定がなされ(Williams及びWinter， Eur. J. Immunol., 23: 1456-1461(1993))、合成軽鎖レパートリーを作製するのに利用することができる。ＶＨ及びＶＬフォールドの範囲及びＬ３及びＨ３の長さに基づく合成的Ｖ遺伝子レパートリーは、相当に構造的多様性を有する抗体をコードする。ＤＮＡをコードするＶ遺伝子の増幅に続いて、生殖系のＶ遺伝子セグメントは、Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol. 227: 381-388(1992)の方法に従ってインビトロで再配列することができる。
【０１１２】
抗体断片のレパートリーは、幾つかの方法でＶＨ及びＶＬ遺伝子レパートリーを共に組み合わせることによって構築することができる。各レパートリーを異なるベクターで作製し、そのベクターを、例えばHogrefe等, Gene, 128: 119-126(1993)に記載のようにインビトロで、又はコンビナトリアル・インフェクション、例えばWaterhouse等, Nucl. Acids Res., 21: 2265-2266(1993)に記載のloxP系によってインビボで作製することが可能である。このインビボの組み換え手法では、大腸菌の形質転換効率によって強いられるライブラリの大きさの限界を克服するために、二本鎖種のＦａｂフラグメントが利用される。ナイーブのＶＨ及びＶＬレパートリーは、１つはファージミドへ、そして他はファージベクターへと個別にクローニングされる。この２つのライブラリは、その後、各細胞が異なる組み合わせを有し、そのライブラリの大きさが、存在する細胞の数(約１０１２クローン)によってのみ限定されるように、ファージミド含有細菌のファージ感染によって組み合わせられる。双方のベクターは、ＶＨ及びＶＬ遺伝子が単一のレプリコンへ組み換えられ、ファージビリオンへ共にパッケージされるように、インビボの組み換えシグナルを有する。これら巨大なライブラリは、良好な親和性(約１０-8MのKｄ-1)の多くの多様な抗体を提供する。
【０１１３】
別法として、このレパートリーは、例えばBarbas等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982(1991)に記載のように同じベクターへ連続してクローニング、又は、Clakson等, Nature, 352: 624-628(1991)に記載のようにＰＣＲ後に、クローニングすることでアセンブリすることができる。ＰＣＲアセンブリは、また、柔軟なペプチドスペーサーをコードしているＤＮＡとＶＨ及びＶＬ ＤＮＡを連結させて、単鎖のＦｖ(ｓｃＦｖ)レパートリーを形成することに利用することができる。さらに他の技術では、「細胞内でのＰＣＲアセンブリ」は、Embleton等, Nucl. Acids Res., 20: 3831-3837(1992)に記載のように、ＰＣＲによってリンパ球内のＶＨ及びＶＬ遺伝子を組み合わせて、その後、連結した遺伝子のレパートリーをクローニングするのに利用される。
【０１１４】
ナイーブのライブラリ(天然又は合成のいずれか)によって産生された抗体は中度の親和性(約１０６〜１０７M-1のKd-1)である可能性があるが、Winterら(1994), 上掲に記載のように第二番目のライブラリから構築して遊離することによって、親和性成熟をもインビトロで模倣することが可能である。例えば、Hawkins等, J. Mol. Biol. 226: 889-896(1992)の方法、又はGram等, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 3576-3580(1992)の方法においてエラー・プローンポリメラーゼ(Leung等, Technique, 1:11-15(1989)で報告されている)を利用することによって、突然変異をインビトロでランダムに導入することができる。さらには、１つ又はそれより多いＣＤＲをランダムに変異させることによって、例えば、選択した個々のＦｖクローンにおいて、対象のＣＤＲまで及ぶランダム配列を有するプライマーによるＰＣＲを利用して、そしてより高い親和性クローンをスクリーニングすることで親和性成熟をおこなうことが可能である。国際公開第９６０７７５４号(１９９６年３月１４日に公開)は、免疫グロブリン軽鎖の相補性決定領域へ突然変異生成を誘導して軽鎖遺伝子のライブラリを作製する方法を記載している。その他の有効な手法は、Marks等, Biotechnol. 10: 779-783(1992)に記載のように、非免疫化供与体から得られた天然で発生するＶドメイン変異体のレパートリーによるファージディスプレイによって選択されたＶＨ又はＶＬドメインを組み換えること、及び数回のチェーン・シャッフリングにおいてより高い親和性についてスクリーニングすることである。この技術は、１０-9Mの範囲の親和性の抗体及び抗体断片の産生を可能にする。
【０１１５】
Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ核酸及びアミノ酸配列刃当分野で公知である。Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲをコードする核酸配列は、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲの所望の領域のアミノ酸配列、例えば細胞外ドメインを用いて設定できる。配列には配列番号：５５、１３又は１４の配列が含まれる。あるいは、GenBank寄託番号NM_017617のｃＤＮＡ配列(又はその断片)を用いてもよい。Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲをコードする核酸は、当分野で公知の様々な方法によって調製できる。これらの方法には、Engels 等, Agnew. Chem. Int. Ed. Engl., 28: 716-734 (1989)に記載の何れかの方法、例えばトリエステル、亜リン酸エステル、ホスホラミダイト及びＨ-ホスホン酸塩方法による化学的な合成法が含まれるがこれに限定されるものではない。一実施態様では、発現宿主細胞に好ましいコドンが、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲコード化ＤＮＡの設定に用いられる。これに対して、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲをコードするＤＮＡは、ゲノムないしｃＤＮＡのライブラリから単離できる。
【０１１６】
Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲをコードするＤＮＡ分子の構築に続いて、そのＤＮＡ分子は、プラスミド等の発現ベクターの発現コントロール配列と作用可能に連結し、このコントロール配列は、そのベクターで形質転換した宿主細胞によって認識される。一般的に、プラスミドベクターは、その宿主細胞と適合する種から誘導された複製及びコントロール配列を有する。このベクターは、通常は、形質転換細胞で表現型の選択を提供することが可能なタンパク質をコードする配列だけでなく複製部位を有する。原核宿主細胞及び真核宿主細胞での発現に好適なベクターは当分野で公知であり、さらにそのいくつかを本明細書に記載する。酵母菌などの原核生物、又は哺乳動物などの多細胞生物由来の細胞が用いられうる。
【０１１７】
場合によっては、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲをコードしているＤＮＡは宿主細胞によって培地中への発現産物の分泌を生じさせる分泌リーダー配列に作用可能に結合される。分泌リーダー配列の例には、stII、エコチン(ecotin)、lamB、ヘルペスGD、lpp、アルカリホスファターゼ、インベルターゼ、及びアルファ因子が含まれる。ここでの使用にまた適しているのはプロテインＡの３６アミノ酸リーダー配列である(Abrahmsen等, EMBO J., 4:3901(1985) )。
【０１１８】
宿主細胞はこの発明の上述の発現又はクローニングベクターでトランスフェクトされ、好ましくは形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように変性された一般的な培養液中で培養される。
【０１１９】
トランスフェクションとは、実際に任意のコード化配列が発現するかどうか分からない宿主細胞による発現ベクターの取り込みを意味する。トランスフェクションの多くの方法は、通常の技能を有する技術者に知られており、例えば、ＣａＰＯ４沈降法及び電気穿孔法がある。一般に成功したトランスフェクションは、宿主細胞内で該ベクターの働きの兆候が現れた時に認識される。
【０１２０】
形質転換とは、ＤＮＡが染色体外成分として又は染色体組み込みによってのいずれかで複製可能となるように、生物にＤＮＡを導入することを意味する。用いる宿主細胞によって、その細胞に適した基本的な技術を用いて形質転換は行われる。形質転換法は当分野で公知であり、そのいくつかをさらに本明細書中に記載する。
【０１２１】
Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲを産生するために用いる原核生物宿主細胞は、一般的に、Sambrook等, 上掲に記載のように培養することが可能である。
Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲを産生するために使用される哺乳動物宿主細胞は、様々な培地で培養することができる。その培地は当分野で周知であり、そのいくつかを本明細書中に記載する。
この開示で言及している宿主細胞には、宿主動物内の細胞だけでなくインビトロ培養物の細胞が含まれる。
【０１２２】
Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲの精製は、当分野で認識される方法を用いて実施される。そのいくつかを本明細書中に記載する。
ファージディスプレイクローンのアフィニティークロマトグラフィー分離での利用のために、例えば、アガロースビーズ、アクリルアミドビーズ、ガラスビーズ、セルロース、種々のアクリルコポリマー、ヒドロキシルメタクリルゲル、ポリアクリル及びポリメタクリルコポリマー、ナイロン、中性及びイオン性担体等の適切な基質へ精製したＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲを付着させることが可能である。基質へのＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲタンパク質の付着は、Methods in Enzymology, ４４巻(1976)に記載されている方法によって完遂することができる。アガロース、デキストラン又はセルロース等の多糖類基質へタンパク質リガンドを付着させるために広く用いられている技術には、ハロゲン化シアンによる担体の活性化、それに続く、活性化基質へのペプチドリガンドの第１級脂肪族又は芳香族アミンのカップリングが含まれる。
【０１２３】
あるいは、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲは、吸収プレートのウェルをコーティングするために利用すること、吸収プレートへ付着させた宿主細胞上で発現させるか又はセルソーティングで利用すること、又はストレプトアビジンでコーティングしたビーズによる捕獲のためにビオチンとコンジュゲートすること、又はファージディスプレイライブラリをパニングするためのあらゆる他の当該分野の方法において利用することが可能である。
【０１２４】
吸着剤との少なくともファージ粒子の一部分の結合に適した条件下で、ファージライブラリの試料を固定化Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲと接触させる。通常は、ｐＨ、イオン強度、温度等を含む条件を選択して、生理学的条件を模倣する。固相と結合したファージを洗浄し、その後、例えばBarbas等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 7978-7982(1991)に記載されているように酸で、又は例えばMarks等, J. Mol. Biol. 222: 581-597(1991)に記載にされているようにアルカリで、又は例えばClackson等, Nature, 352: 624-628(1991)の抗原競合法に類似の手法であるＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗原競合によって溶出する。ファージは、１回目の選択で２０〜１，０００倍に濃縮することが可能である。さらには、この濃縮したファージを細菌培養液で生育させ、さらなる回の選択に供することが可能である。
【０１２５】
選択の効率は多くの要因に依存し、それには、洗浄の間の解離の動力学、そして単一のファージ上の複数の抗体断片が同時に抗原と関われるかどうかということが含まれる。一次解離定数(及び弱い結合親和性)を有する抗体は、短い洗浄、多価ファージディスプレイ及び固相の抗原の高いコーティング密度の利用によって保持することが可能である。高い密度は、多価相互作用を介してファージを安定化するだけでなく、解離したファージの再結合に有利に作用する。遅い解離動力学(及び良好な結合親和性)を有する抗体の選択は、Bass等, Proteins, 8: 309-314(1990)及び国際公開第92/09690号に記載されているような長い洗浄と単価ファージディスプレイの利用、そしてMarks等, Biotechnol., 10: 779-783(1992)に記載されているような抗原の低度のコーティング密度によって促進することが可能である。
【０１２６】
親和性に僅かな違いがあったとしても、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲに対する異なる親和性のファージ抗体の中で選択することは可能である。しかしながら、選択した抗体のランダム変異(例えば、上記の幾つかの親和性成熟の技術で行われているような)は、多くの変異を生じやすく、その殆どが抗原と結合し、僅かがより高い親和性である。Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲを限定すると、希な高い親和性のファージが競合して除かれることが可能である。すべてのより高い親和性の変異を保持するために、ファージは、過度のビオチン化Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲとインキュベートすることが可能であるが、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲに対する標的モル濃度親和定数よりも低いモル濃度のビオチン化Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲとインキュベートできる。次いで、高親和性結合ファージをストレプトアビジンでコーティングした常磁性体ビーズによって捕獲することが可能である。そのような「平衡捕獲」は、結合の親和性に従い、親和性の低い過度のファージから、僅かに２倍高い親和性の変異体クローンの単離を可能にする感度で抗体を選択することを可能にする。固相と結合したファージを洗浄するのに用いる条件を操作して、解離定数を基礎として識別することも可能である。
【０１２７】
抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲクローンは活性選択されうる。一実施態様では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ１レセプターとそのリガンド(例えばＪａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、デルタ様１、デルタ様３、及びデルタ様４)との結合又はリガンド結合により誘導されるＮｏｔｃｈ１のタンパク質分解性切断をブロックする抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を提供する。このような抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体に対応するＦｖクローンは、(1) 上記のようなファージライブラリから抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲクローンを単離して、場合によって、好適な宿主細胞で個体集団を成長させることによって、ファージクローンの単離した母集団を増幅する、(2) 望ましいブロック活性及び非ブロック活性のそれぞれについて第二タンパク質とＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲを選択する、(3) 固定されたＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲに抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲファージクローンを吸着する、(4) 過剰量の第二タンパク質を用いて、第二タンパク質の結合決定基と共有するかオーバーラップするＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲ−結合決定基を認識する任意の望ましくないクローンを溶出する、そして、(5) 工程(4)の後に吸着されたまま残ったクローンを溶出する、ことによって選別できる。場合によって、所望のブロック／非ブロック特性を有するクローンを、本明細書に記載の選別手順を一又は複数回繰り返すことによって、さらに濃縮できる。
【０１２８】
ハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡ又は本発明のファージディスプレイＦｖクローンは、常法を用いて(例えば、ハイブリドーマの対象の領域をコードする重鎖及び軽鎖又はファージＤＮＡ鋳型を特異的に増幅するように設定したオリゴヌクレオチドプライマーを用いることにより)即座に分離されて、配列決定される。ひとたび分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外では抗体タンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌での組み換え発現に関する概説論文には、Skerra等, Curr. Opinion in Immunol., 5:256-262(1993)及びPluckthun, Immunol. Revs. 130: 151-188(1992)が含まれる。
【０１２９】
本発明のＦｖクローンをコードするＤＮＡは、重鎖及び／又は軽鎖定常領域をコードする公知のＤＮＡ配列(例えば好適なＤＮＡ配列は上掲のカバット等から得ることができる)と組み合わせて、完全長ないし一部の重鎖及び／又は軽鎖をコードするクローンを形成できる。このために、何れかのアイソタイプの定常領域、例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ定常領域を用いることができることが理解されるであろう。このような定常領域は任意のヒト又は動物種から得ることができる。ある動物(例えばヒト)種の可変ドメインＤＮＡから得て、次いで「ハイブリッド」である完全長重鎖及び／又は軽鎖のコード配列を形成するために他の動物種の定常領域ＤＮＡに融合したＦｖクローンは、本明細書で用いられる「キメラ」及び「ハイブリッド」抗体の定義に含まれる。好適な実施態様では、ヒト可変ＤＮＡから得たＦｖクローンをヒト定常領域ＤＮＡに融合して、すべてのヒト、完全長ないし一部の重鎖及び／又は軽鎖のコード配列を形成する。
【０１３０】
また、本発明のハイブリドーマ由来の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体をコードするＤＮＡは、例えば、ハイブリドーマクローン由来の相同的マウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列を置換すること(例えばMorrison等, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:6851(1984)の方法)によって修飾することができる。ハイブリドーマ又はＦｖクローン由来の抗体ないし抗体断片をコードするＤＮＡは、免疫グロブリンコード化配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード化配列の全て又は一部を共有結合させることによってさらに修飾することができる。そのように、「キメラ」又は「ハイブリッド」抗体は、本発明のＦｖクローン又はハイブリドーマクローン由来の抗体の結合特異性を有するように調製される。
【０１３１】
抗体断片
本発明は抗体断片を包含する。特定の場合では、全抗体よりも抗体断片の利用に利点がある。より小さいサイズの断片によりクリアランスが速くなり、固形腫瘍へのアクセスが改善されうる。
【０１３２】
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、完全な抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、Ｆａｂ、Ｆｖ及びＳｃＦｖ抗体断片はすべて、大腸菌で発現され、分泌されるため、この断片の大規模産生が容易となる。抗体断片は上述において検討した抗体ファージライブラリーから分離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。サルベージレセプター結合エピトープ残基を含有する、インビボ半減期が増加したＦａｂ及びＦ(ａｂ')２断片は米国特許第５８６９０４６号に記載される。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦＶ)である。国際公開９３/１６１８５；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。Ｆｖ及びｓＦｖは、定常領域が欠けている完全な結合部を有する唯一の種である；したがって、それらは、インビボでの使用の間の非特異的結合を減らすために適する。ｓＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノ末端又はカルボキシ末端の何れかで、エフェクタータンパク質の融合物を得るために構築されうる。上掲のAntibody Engineering, ed. Borrebaeckを参照。また、抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。このような直線状の断片は単特異的又は二重特異的であってもよい。
【０１３３】
ヒト化抗体
本発明はヒト化抗体を包含する。非ヒト抗体をヒト化する様々な方法は従来からよく知られている。例えば、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にはヒト抗体の該当する高頻度可変領域配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jonesほか, Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmannほか, Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyenほか, Science, 239:1534-1536(1988))を使用して実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、完全なヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４８１６５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくつかの高頻度可変領域残基及び場合によってはいくらかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
【０１３４】
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク領域として受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J. Immunol., 151:2623(1993))。
【０１３５】
更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、ある方法によって、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接的かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【０１３６】
ヒト抗体
本発明のヒト抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体は、上記のように、ヒト由来のファージディスプレイライブラリから選択したＦｖクローン可変ドメイン配列を公知のヒト定常ドメイン配列と結合することによって構築することができる。あるいは、本発明のヒトモノクローナル抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体は、ハイブリドーマ法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の生産のためのヒトミエローマ及びマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞株は，例えば，Kozbor, J. Immunol. 133, 3001(1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；及びBoerner 等, J. Immunol., 147: 86 (1991)によって記載されている。
【０１３７】
免疫化することで、内因性免疫グロブリンの生産なしに、ヒト抗体の完全なレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物(例えばマウス)を生産することが現在は可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系変異体マウスでの抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子のホモ接合体欠失は、内因性抗体の生産の完全な阻害をもたらすことが記載されている。そのような生殖細胞系変異体マウスでのヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子配列の転移は、抗原の挑戦によってヒト抗体の生産を引き起こす。例えば、Jakobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551-255(1993)；Jakobovits等, Nature 362, 255-258(1993)を参照のこと。
【０１３８】
また、遺伝子シャフリングは、ヒト抗体が開始非ヒト、例えば齧歯類の抗体と類似した親和性及び特性を有している場合、非ヒト、例えば齧歯類の抗体からヒト抗体を得るために使用することもできる。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれるこの方法により、上記のファージディスプレイ技術により得られた非ヒト抗体断片の重鎖可変領域遺伝子又は軽鎖可変領域遺伝子の何れかをヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置換し、非ヒト鎖／ヒト鎖ｓｃＦｖないしＦａｂキメラの集団を作成する。抗原を選択することにより、ヒト鎖が初めのファージディスプレイクローンにおいて一致した非ヒト鎖の除去により破壊された抗原結合部位を回復する、非ヒト鎖／ヒト鎖キメラｓｃＦｖないしＦａｂが単離される、つまり、エピトープがヒト鎖のパートナーの選択をつかさどる(インプリントする)。残りの非ヒト鎖を置換するためにこの工程を繰り返すと、ヒト抗体が得られる(１９９３年４月１日公開のＰＣＴ特許出願ＷＯ９３／０６２１３を参照)。伝統的なＣＤＲ移植による非ヒト抗体のヒト化と異なり、この技術により、非ヒト起源のＦＲ又はＣＤＲ残基を全く持たない完全なヒト抗体が得られる。
【０１３９】
二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒト抗体ないしヒト化抗体である。この場合、結合特異性の一つはＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲに対するものであり、他方は任意の他の抗原に対するものである。例示的な二重特異性抗体は、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲの２つの異なるエピトープに結合しうる。また、二重特異性抗体はＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲを発現する細胞に細胞障害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲ結合アーム及び細胞障害剤(例えば、サポリン(saporin)、抗インターフェロン-α、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテン)と結合するアームを有する。二重特異性抗体は完全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。
【０１４０】
二重特異性抗体を作製する方法は当該分野において既知である。二重特異性抗体の伝統的な組み換え産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの重鎖は異なる特異性を持っている(Millstein等, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が１９９３年５月１３日に公開の国際公報９３／０８８２９及びTraunecker等、EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。
【０１４１】
異なったより好適なアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原−抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、コンストラクトに使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が特に重要性を持たないときは、２又は３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０１４２】
このアプローチ法の好適な実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公報９４／０４６９０に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。
【０１４３】
他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【０１４４】
二特異性抗体とは架橋抗体や「ヘテロ抱合抗体」を含む。例えば、ヘテロ抱合体の一方の抗体がアビジンと結合し、他方はビオチンと結合していても良い。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせること(米国特許第４６７６９８０号)及びＨＩＶ感染の治療(国際公報９１/００３６０、国際公報９２/００３７３及び欧州特許第０３０８９号)等の用途が提案されている。ヘテロ抱合抗体は適当な架橋方法によって生成できる。当技術分野においては、適切な架橋剤は周知であり、それらは複数の架橋法と共に米国特許第４６７６９８０号などに記されている。
【０１４５】
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は完全な抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルヒド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
【０１４６】
最近の進歩により大腸菌からＦａｂ'-ＳＨ断片を直接回収することが容易となっており、これにより化学的にカップリングされて二重特異性抗体にを形成する。Shalaby 等, J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)は、完全なヒト化二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')２分子の産生について記述している。各々のＦａｂ'断片は大腸菌から別々に分泌されて、インビトロで化学的にカップリングされて、二重特異性抗体を形成する。したがって、形成された二重特異性抗体は、ＨＥＲ２を過剰発現する細胞及び正常ヒトT細胞に結合するだけでなく、ヒト胸部腫瘍の標的に対するヒト細胞毒性リンパ球の溶解活性を引き起こすことができた。
【０１４７】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産された。Kostelny等, J.Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させられた。抗体ホモダイマーはヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、ついで再酸化させて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーを使用する他の二重特異性抗体断片製造方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol., 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等, J.Immunol. 147:60(1991)。
【０１４８】
多価抗体
多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション(及び／又は異化)されうる。本発明の抗体は、３又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(ＩｇＭクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと３又はそれ以上の抗原結合部位を有する。好ましい二量化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオにおいて、抗体はＦｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端に３又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ここで、好ましい多価抗体は３ないし８、好ましくは４の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。多価抗体は少なくとも１つのポリペプチド鎖(好ましくは２つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖(類)は２又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖(類)はＶＤ１-(Ｘ１)ｎ-ＶＤ２-(Ｘ２)ｎ-Ｆｃを有し、ここでＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域のポリペプチド鎖の一つであり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖(類)は：ＶＨ-ＣＨ１-柔軟なリンカー-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖を有し得る。ここで多価抗体は、好ましくは少なくとも２つ(好ましくは４つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有する。ここで多価抗体は、例えば約２〜約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有する。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、場合によってはＣＬドメインを更に有する。
【０１４９】
抗体変異体
いくつかの実施態様では、ここに開示する抗体のアミノ酸配列の修飾を考える。例えば、抗体の結合親和性及び／又は生物学的特性を向上することができれば望ましい。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体の核酸に適切なヌクレオチド変化を導入して、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、抗体のアミノ酸配列内の残基の、例えば、欠失型、又は挿入或いは置換を含む。最終構成物が所望する特徴を有していれば、欠失、挿入又は置換をどのように組合せてもよい。アミノ酸変化は、配列ができるときに被検体の抗体アミノ酸配列に導入されうる。
【０１５０】
突然変異誘発に好ましい位置である抗体の特定の残基又は領域の同定に有益な方法は、Cunningham及びWellsによりScience, 244:1081-1085 (1989年)に開示されているように、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的となる残基又は残基の組が同定され(例えば、arg、asp、his、lys、及びgluなどの荷電した残基)、中性の、又は負に荷電したアミノ酸(最も好ましくはアラニン又はポリアラニン)で置換され、アミノ酸の抗原との相互作用に影響を与える。次いで、置換に対する機能的感受性を示しているそれらアミノ酸位置を、置換の部位において、又は置換の部位のために、さらなる、又は他の変異体を導入することにより精製する。このように、アミノ酸配列変異体を導入する部位は予め決定されるが、突然変異自体の性質は予め決定する必要は無い。例えば、任意の部位における突然変異の機能を分析するために、標的コドン又は領域においてａｌａスキャンニング又はランダム突然変異誘発を実行し、発現した免疫グロブリンを所望の活性についてスクリーニングする。
【０１５１】
アミノ酸配列挿入には、１残基から１００以上の残基を有するポリペプチドまでの長さに亘るアミノ−末端融合及び／又はカルボキシ−末端融合、ならびに、単一又は多重アミノ酸残基の配列内挿入を含む。端末挿入の例には、Ｎ−末端メチオニル残基を持つ抗体、又は細胞障害性ポリペプチドに融合した抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体の血清半減期を増加させるポリペプチド又は(例えばＡＤＥＰＴのための)酵素の抗体のＮ−末端又はＣ−末端への融合が含まれる。
【０１５２】
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン(ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸)のトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作出される。Ｏ結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、糖類Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つが結合することを意味するが、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた用いられる。
【０１５３】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、それが一又は複数の上述したトリペプチド配列(Ｎ結合グリコシル化部位のもの)を含むように変化させることによって簡便に達成される。該変化は、元の抗体の配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる(Ｏ-結合グリコシル化部位の場合)。
【０１５４】
抗体がＦｃ領域を含有する場合、それに接着する炭水化物を変更してもよい。例えば、抗体のＦｃ領域に接着するフコースを欠損する成熟炭水化物構造の抗体は、米国公開特許第２００３／０１５７１０８号(Presta, L.)に記載される。米国公開特許第２００４／００９３６２１号(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.)も参照のこと。抗体のＦｃ領域に接着した炭水化物内のＮ-アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)を二分する抗体は、国際公報第０３／０１１８７８号、Jean-Mairet 等、及び米国特許第６６０２６８４号、Umana 等に参照されている。抗体のＦｃ領域に接着するオリゴサッカライド内の少なくとも一のガラクトース残基を有する抗体は、国際公報第９７／３００８７号、Patel 等に報告される。また、抗体のＦｃ領域に接着する変更された炭水化物を有する抗体については、国際公報第９８／５８９６４号(Raju, S.)及び国際公報第９９／２２７６４号(Raju, S.)も参照のこと。また、修飾されたグリコシル化を有する抗原結合分子については、米国公開特許第２００５／０１２３５４６号(Umana 等)を参照。
【０１５５】
本明細書中の好適なグリコシル化変異形はＦｃ領域を含有し、Ｆｃ領域に接着される炭水化物構造はフコースを欠いている。このような変異形は改善されたＡＤＣＣ機能を有する。場合によって、Ｆｃ領域は、更にＡＤＣＣを改善する一つ以上のアミノ酸置換、例えばＦｃ領域の位置２９８、３３３及び／又は３３４の置換(Ｅｕ残基番号付け)を更に含む。「脱フコース化」又は「フコース欠失」抗体に関する文献の例には以下のものを含む：米国公開番号２００３／０１５７１０８；国際公報２０００／６１７３９；国際公報２００１／２９２４６；米国公開番号２００３／０１１５６１４；米国公開番号２００２／０１６４３２８；米国公開番号２００４／００９３６２１；米国公開番号２００４／０１３２１４０；米国公開番号２００４／０１１０７０４；米国公開番号２００４／０１１０２８２；米国公開番号２００４／０１０９８６５；国際公報２００３／０８５１１９；国際公報２００３／０８４５７０；国際公報２００５／０３５５８６；国際公報２００５／０３５７７８；；国際公報２００５／０５３７４２；Okazaki 等 J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)；及びYamane-Ohnuki 等 Biotech. Bioeng.87: 614 (2004)。脱フコース化抗体を産生する細胞株の例として、タンパク質フコース化欠失Ｌｅｃ１３ ＣＨＯ細胞 (Ripka 等 Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国公開番号２００３／０１５７１０８, Presta, L；及び国際公報２００４／０５６３１２, Adams 等, 特に実施例１１)、及びノックアウト細胞株、例としてα-１,６-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８,-ノックアウトＣＨＯ細胞 (Yamane-Ohnuki 等 Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004))などがある。
【０１５６】
他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗体分子において少なくとも一つのアミノ酸残基に異なる残基が挿入されている。置換突然変異について最も関心ある部位は高度可変領域を含むが、ＦＲ交互変化も考慮される。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表１に示す。これらの置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表１に「例示的置換」と名前を付けた又はアミノ酸の分類を参照して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入して、生成物をスクリーニングしてよい。
【０１５７】
表１
0005623272.tif 000004
【０１５８】
抗体の生物学的性質における実質的な修飾は、(ａ)置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、(ｂ)標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は(ｃ)側鎖の嵩を維持するそれらの効果において実質的に異なる置換を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいて群に分けることができる：
(１)疎水性：ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile；
(２)中性の親水性：cys、ser、thr、asn、gln；
(３)酸性：asp、glu；
(４)塩基性：his、lys、arg；
(５)鎖配向に影響する残基：gly、pro； 及び
(６)芳香族：trp、tyr、phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
【０１５９】
ある型の置換変異体は、親抗体(例えば、ヒト化又はヒト抗体)の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的に、さらなる発展のために選択され、得られた変異体は、それらが作製された親抗体と比較して向上した生物学的特性を有している。そのような置換変異体を作製する簡便な方法は、ファージディスプレイを使用する親和性突然変異を含む。簡潔に言えば、幾つかの高頻度可変領域部位(例えば６−７部位)を突然変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された多価抗体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物としてディスプレイされる。ファージディスプレイ変異体は、ついで、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。修飾のための候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。別法として、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体と抗原の接点を特定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここに述べた技術に従う置換の候補である。そのような変異体が生成されると、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択する。
【０１６０】
抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、この分野で知られた種々の方法によって調製される。これらの方法は、限定するものではないが、天然源からの単離(天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合)又は初期に調製された抗体の変異体又は非変異体のオリゴヌクレオチド媒介(又は部位特異的)突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による調製を含む。
【０１６１】
本発明の免疫グロブリンポリペプチドのＦｃ領域内に一以上のアミノ酸修飾を導入してＦｃ領域変異型を生成することが望ましい。Ｆｃ領域変異体は、ヒンジシステイン修飾を含む、一以上のアミノ酸位置でのアミノ酸修飾(例えば、置換)を有するヒトＦｃ領域配列(例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４ Ｆｃ領域)を含みうる。
当分野での記載や教示に従って、ある実施態様では、本発明の方法を用いた抗体が野生型の対応抗体と比較して例えばＦｃ領域内に一以上の変異を有することを考慮する。にもかかわらず、この抗体はその野生型対応物と比較して治療的有用性を示す実質的に同じ特徴を維持している。例えば、国際公開９９／５１６４２などに記載のようにＣ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞障害(ＣＤＣ)を変更する(すなわち改良又は減少する)結果となるＦｃ領域内に特定の変異を生じさせることが考えられる。また、Ｆｃ領域変異型の他の例に関するDuncan & Winter Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第５６４８２６０号；米国特許第5,624,821号；及び国際公開公報94/29351を参照。国際公開公報００／４２０７２(Presta)及び国際公開公報２００４／０５６３１２(Lowman)は、ＦｃＲへの結合が改善したか、減退した抗体変異体を開示している。これらの特許文献の内容は出典明記によって、本明細書に特別に組み込まれる。また、Shields 等 J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照のこと。半減期が増加して、胎児への母性ＩｇＧの移送を担う(Guyer 等, J. Immunol. 117:587 (1976)及びKim 等, J. Immunol. 24:249 (1994))新生児Ｆｃレセプター(ＦｃＲｎ)への結合が改善している抗体は、米国特許公開２００５／００１４９３４Ａ１ (Hinton 等)に開示されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を向上させる一又は複数の置換を有するＦｃ領域を含んでなる。Ｆｃ領域アミノ酸配列が変更されてＣ１ｑ結合能力が増加したか減少したポリペプチド変異体は、米国特許第６１９４５５１号Ｂ１、国際公開公報９９／５１６４２に開示される。これらの特許文献の内容は出典明記によって、本明細書に特別に組み込まれる。また、Idusogie 等 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)を参照のこと。
【０１６２】
抗体誘導体
本発明の抗体は当該分野において知られ直ぐに利用できる更なる非タンパク質性部分を含むように更に修飾することができる。好ましくは、抗体の誘導体化に適した部分は水溶性ポリマーである。水溶性ポリマーの非限定的な例には、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-１,３-ジオキソラン、ポリ-１,３,６-トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマーかランダムコポリマー)、及びデキストラン又はポリ(ｎ-ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール(例えばグリセロール)、ポリビニルアルコール、及びそれらの混合物が含まれる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは水中におけるその安定性のために製造の際に有利であろう。ポリマーは任意の分子量であってよく、分枝状でも非分枝状でもよい。抗体に結合するポリマーの数は変化してもよく、一を超えるポリマーが結合する場合、それらは同じでも異なった分子でもよい。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／又はタイプは、限定されるものではないが、その抗体誘導体が定まった条件下での治療に使用されるかどうか、改善される抗体の特定の性質又は機能を含む考慮事項に基づいて決定することができる。
【０１６３】
所望の特性を有する抗体のスクリーニング
本発明の抗体は当該分野で知られている様々なアッセイによってその物理的／化学的性質及び生物学的機能について特徴付けることができる。いくつかの実施態様では、抗体は、Ｎｏｔｃｈ１活性化の低減又はブロック、Ｎｏｔｃｈ１下流分子のシグナル伝達の低減又はブロック、リガンド(例えばＪａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、デルタ様１、デルタ様３、又はデルタ様４)へのＮｏｔｃｈ１結合の破壊又はブロック、及び／又は腫瘍、細胞増殖性疾患又は癌の治療及び／又は予防；及び／又はＮｏｔｃｈ１の発現及び／又は活性(例えばＮｏｔｃｈ１の発現及び／又は活性の増加)と関連する疾患の治療又は予防の何れか一又は複数に特徴がある。他の実施態様では、抗体は、Ｎｏｔｃｈ１活性化の誘導ないし増加、Ｎｏｔｃｈ１下流分子シグナル伝達の誘導ないし増加、及び／又はＮｏｔｃｈ１の発現及び／又は活性と関連する疾患の治療又は予防のいずれか一又は複数に特徴がある。
【０１６４】
精製された抗体は、限定されるものではないが、Ｎ末端シークエンシング、アミノ酸解析、非変性サイズ排除高圧液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)、質量分析、イオン交換クロマトグラフィー及びパパイン消化を含む一連のアッセイによって更に特徴付けることができる。
【０１６５】
本発明の特定の実施態様では、ここで生産された抗体はその生物学的活性について分析される。ある実施態様では、本発明の抗体はその抗原結合活性について試験される。当該分野で知られ、ここで使用することができる抗原結合アッセイには、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ(酵素結合免疫吸着検定法)、「サンドウィッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、蛍光イムノアッセイ、及びプロテインＡイムノアッセイのような技術を用いた任意の直接的又は競合的結合アッセイが制限なく含まれる。抗原結合アッセイは以下の実施例の項で解説する。
【０１６６】
さらに他の実施態様では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲへの結合について抗体Ａ、抗体Ａ−１、抗体Ａ−２及び／又は抗体Ａ−３と競合する抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲモノクローナル抗体を提供する。このような競合抗体には、抗体Ａ、抗体Ａ−１、抗体Ａ−２及び／又は抗体Ａ−３により認識されるＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲエピトープと同じか、このエピトープとオーバーラップするＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲエピトープを認識する抗体が含まれる。このような競合抗体は、標識した抗体Ａ、抗体Ａ−１、抗体Ａ−２及び／又は抗体Ａ−３と競合して固定されたＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲへ結合することについて、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲハイブリドーマ上清をスクリーニングすることによって得ることができる。競合抗体を含有するハイブリドーマ上清は、無関係な抗体を含有する(又は抗体を含有しない)コントロール結合混合物において、検出される結合した標識抗体の量と比較して、被検体競合結合混合物において、検出される結合した標識抗体の量が減少しているであろう。本明細書に記載の何れかの競合結合アッセイが前述の手順に適している。
【０１６７】
他の態様では、本発明は、抗体Ａ、抗体Ａ−１、抗体Ａ−２及び／又は抗体Ａ−３の一又は複数(例として、２、３、４、５及び／又は６)のＨＶＲを含む抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲモノクローナル抗体を提供する。抗体Ａ、抗体Ａ−１、抗体Ａ−２及び／又は抗体Ａ−３の一又は複数のＨＶＲを含む抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲモノクローナル抗体は、抗体Ａ、抗体Ａ−１、抗体Ａ−２及び／又は抗体Ａ−３の一又は複数のＨＶＲを、鋳型抗体配列、例えば親抗体の対応するマウス配列に最も近いヒト抗体配列、又は親抗体の軽鎖ないし重鎖の特定のサブグループのすべてのヒト抗体のコンセンサス配列に移植し、そして、本明細書中に記載の組み換え宿主細胞において、結果として定常領域配列(一又は複数)を伴うないしは伴わないキメラ軽鎖及び／又は重鎖可変領域配列(一又は複数)を発現させることによって、構築することができる。
【０１６８】
本明細書に記載の特有の性質を有する本発明の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体は、任意の簡便な方法によって、所望の性質について抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲハイブリドーマクローンをスクリーニングすることによって、得られうる。例えば、Ｎｏｔｃｈ１に対するＮｏｔｃｈ１リガンドの結合をブロックするかブロックしない抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲモノクローナル抗体が望まれる場合、候補抗体は、結合競合アッセイ、例として競合的結合ＥＬＩＳＡにて試験できる。このアッセイでは、Ｎｏｔｃｈ１にてプレートウェルをコートして、過剰量のＮｏｔｃｈ１の抗体溶液をコートしたプレートに重ね、例えば結合した抗体と西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲート抗Ｉｇ抗体ないしビオチン化した抗Ｉｇ抗体とを作用させてＨＲＰ呈色反応を起こす、例えば、ストレプトアビジン-ＨＲＰ及び／又は過酸化水素にてプレートを反応させて、ＥＬＩＳＡプレートリーダーによる４９０ｎｍの分光測定によって、ＨＲＰ呈色反応を検出することによって、結合した抗体を酵素的に検出する。
【０１６９】
細胞増殖を阻害する抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体が望ましい場合、候補の抗体は、細胞増殖の阻害を測定するインビトロ及び／又はインビボのアッセイにて試験されうる。このようなアッセイは当分野で公知であり、さらに本明細書中に記載し例示する。
【０１７０】
一実施態様では、本発明はすべてではなくいくつかのエフェクター機能を有する変更した抗体を考慮し、このことによって抗体のインビボ半減期が重要なある種のエフェクター機能(補体及びＡＤＣＣなど)が不要で有害である多くの手法の所望する候補となる。特定の実施態様では、生成した免疫グロブリンのＦｃ活性を測定して、所望の特性が維持されていることを確認する。インビボ及び／又はインビトロ細胞障害アッセイを行って、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃレセプター(ＦｃＲ)結合アッセイを行って、抗体がＦｃγＲ結合を欠損している(すなわちＡＤＣＣ活性をほとんど欠損している)が、ＦｃＲｎ結合能は維持していることを確認することができる。ＡＤＣＣに関与している第一細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲIIIのみを発現しており、その一方で単核細胞はＦｃγＲI、ＦｃγＲII及びＦｃγＲIIIを発現している。造血系細胞でのＦｃＲ発現については、Ravetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)の464頁の表3に要約されている。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの例は、米国特許第5,500,362号又は同第5,821,337号に記載されている。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー(ＮＫ)細胞が含まれる。あるいは、又は加えて、対象とする分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynes 等. PNAS (USA) 95:652-656 (1998)に開示されているような動物モデル内でインビボに評価することができる。また、Ｃ１ｑ結合アッセイを行って、抗体がＣ１ｑに結合できない、つまりＣＤＣ活性を欠損していることを確認してもよい。補体活性化を評価するために、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載のように、ＣＤＣアッセイを行ってもよい。また、ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期測定を、当分野で公知の方法を用いて行うことができる。その例を実施例の項目に記載する。
【０１７１】
ベクター、宿主細胞及び組換え方法
本発明の抗体の組み換え生成のために、コードする核酸を単離して、更なるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製ベクターに挿入する。抗体をコードするＤＮＡは従来の手順で簡単に単離し、配列決定される(例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて)。多くのベクターが利用可能である。用いる宿主細胞にある程度依存してベクターを選択する。一般的に、好適な宿主細胞は原核生物又は真核生物(一般的に哺乳動物)由来の細胞である。ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＥ定常領域を含め、任意のアイソタイプの定常領域がこの目的のために使われてもよく、このような定常領域はヒト又は動物種の何れかから得られうることは理解されるであろう。
【０１７２】
a. 原核生物の宿主細胞を用いた抗体生成
i. ベクターの構築
本発明の抗体のポリペプチド成分をコードしているポリヌクレオチド配列は標準的な組換え技術を使用して得ることができる。所望のポリヌクレオチド配列はハイブリドーマ細胞のような抗体産生細胞から単離し配列決定することができる。あるいは、ポリヌクレオチドはヌクレオチド合成機又はＰＣＲ法を使用して合成することができる。ひとたび得られると、ポリペプチドをコードしている配列は原核生物宿主中で異種ポリヌクレオチドを複製し、発現することが可能な組換えベクター中に挿入される。当該分野において入手でき知られている多くのベクターを本発明の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、主として、ベクターに挿入される核酸のサイズとベクターで形質転換される特定の宿主に依存する。各ベクターは、機能(異種性ポリヌクレオチドの増幅又は発現ないしその両方)及び属する特定の宿主細胞への適合性に応じて、様々な成分を含む。一般的に、限定するものではないが、ベクター成分には複製起源、選択マーカー遺伝子、プロモータ、リボゾーム結合部位(ＲＢＳ)、シグナル配列、異種性核酸挿入及び転写終末配列が含まれる。
【０１７３】
一般には、レプリコン及び宿主細胞と適合性のある種に由来するコントロール配列を含んでいるプラスミドベクターが、宿主細胞と関連して使用される。そのベクターは、通常、複製開始点並びに形質転換細胞において表現型の選択を提供可能なマーキング配列を有する。例えば、一般的に大腸菌は、大腸菌種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換する。ｐＢＲ３２２はアンピシリン(Ａｍｐ)及びテトラサイクリン(Ｔｅｔ)耐性のコード遺伝子を含んでいるため、形質転換細胞を容易に同定することができる。ｐＢＲ３２２、その誘導体又は他の微生物プラスミド又はバクテリオファージも外来性タンパク質を発現する微生物によって使用可能なプロモータを含むか、含むように変更される。特定の抗体の発現に使用されるｐＢＲ３２２誘導体の例はCarter等の米国特許第５６４８２３７号に詳細に記載されている。
【０１７４】
また、レプリコン及び宿主微生物と適合性のあるコントロール配列を含んでいるファージベクターを、これらの宿主との関連でトランスフォーミングベクターとして使用することができる。例えば、λＧＥＭ.ＴＭ.-１１のようなバクテリオファージを、大腸菌ＬＥ３９２のような感受性の宿主細胞を形質転換するために使用できる組換えベクターを作製する際に利用することができる。
【０１７５】
本発明の発現ベクターは各ポリペプチド成分をコードする２又はそれ以上のプロモータ−シストロン(翻訳単位)対を含みうる。プロモーターはその発現を調節するシストロンの上流(５')に位置している非翻訳配列である。原核生物のプロモーターは典型的には誘導性と構成的との二つのクラスのものがある。誘導性プロモーターは、例えば栄養分の有無又は温度の変化のような、培養条件の変化に応答してその調節下でシストロンの転写レベルを増大させるように誘導するプロモーターである。
【０１７６】
様々な潜在的宿主細胞によって認識されるプロモータが非常にたくさん公知となっている。選択したプロモーターを、制限酵素消化によって供給源ＤＮＡからプロモータを除去し、本発明のベクター内に単離したプロモータを挿入することによって軽鎖又は重鎖をコードするシストロンＤＮＡに作用可能に連結することができる。天然プロモーター配列と多くの異種プロモーターの双方を、標的遺伝子の増幅及び／又は発現を生じさせるために使用することができる。ある実施態様では、天然の標的ポリペプチドプロモーターと比較して、一般的に発現する標的遺伝子をより多く転写させ、効率をよくするので、異種プロモーターが有用である。
【０１７７】
原核生物宿主での使用に好適なプロモーターには、ＰｈｏＡプロモーター、βガラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃ又はｔｒｃプロモーターが含まれる。しかし、細菌中で機能性である他のプロモーター(例えば他の既知の細菌又はファージプロモーター)も好適である。そのヌクレオチド配列は発表されており、よって当業者は、任意の必要とされる制限部位を供給するリンカー又はアダプターを使用して標的軽鎖及び重鎖をコードするシストロンにそれらを作用可能に結合させることができる(Siebenlist等 (1980) Cell 20:269)。
【０１７８】
本発明の一態様では、組換えベクター内の各シストロンは、膜を貫通して発現されるポリペプチドの転写を誘導する分泌シグナル配列成分を含む。一般に、シグナル配列はベクターの成分でありうるか、ベクター中に挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部でありうる。この発明の目的のために選択されるシグナル配列は宿主細胞によって認識されプロセシングされる(つまりシグナルペプチダーゼにより切断される)ものでなければならない。異種ポリペプチドに天然のシグナル配列を認識せずプロセシングする原核生物宿主細胞に対しては、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンＩＩ(ＳＴＩＩ)リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ及びＭＢＰからなる群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。一実施態様では、発現系の双方のシストロンに使用されるシグナル配列はＳＴＩＩシグナル配列又はその変異体である。
【０１７９】
他の態様では、本発明による免疫グロブリンは宿主細胞の細胞質内で産生されるので、各シストロン内に分泌シグナル配列の存在は必要でない。この点において、免疫グロブリン軽鎖及び重鎖は発現され、折り畳まれ、集合して細胞質内に機能的免疫グロブリンを形成する。ジスルフィド結合形成に好適な細胞質条件を示し、発現したタンパク質サブユニットを好適に折り畳み、集合することができる宿主系が存在する(例として大腸菌ｔｒｘＢ−系)。Proba及びPluckthun Gene, 159:203 (1995)。
【０１８０】
本発明の抗体を発現するのに適した原核生物宿主細胞には、古細菌及び真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物が含まれる。有用な細菌の例には、エシェリキア属(例えば大腸菌)、バシラス属(例えば枯草菌)、エンテロバクター属、シュードモナス種(例えば緑膿菌)、ネズミチフス菌、霊菌(Serratia marcescans)、クレブシエラ属、プロテウス属、赤痢菌、根粒菌、ビトレオシラ(Vitreoscilla)又はパラコッカス(Paracoccus)が含まれる。一実施態様では、グラム陰性菌が使用される。一実施態様では、大腸菌細胞が本発明の宿主として使用される。大腸菌株の例として、遺伝子型W3110 ΔfhuA (ΔtonA) ptr3 lac Iq lacL8 ΔompTΔ(nmpc-fepE) degP41 kanR を有する３３Ｄ３株(米国特許第5,639,635号)を含むW3110株 (Bachmann, Cellular and Molecular Biology, vol. 2 (Washington, D.C.: American Society for Microbiology, 1987), 1190-1219頁；ATCC寄託番号27,325)及びその誘導体が含まれる。また、大腸菌294 (ATCC 31,446), 大腸菌B, 大腸菌λ 1776 (ATCC 31,537)及び大腸菌RV308(ATCC 31,608) など、他の株及びその誘導体も好適である。この例は限定的なものでなく例示的なものである。定義した遺伝子型を有する上記の何れかの細菌の誘導体の構築方法は当業者に公知であり、例として, Bass等, Proteins, 8:309-314 (1990)に記載されている。一般的に、細菌細胞中でのレプリコンの複製能を考慮して適した細菌を選択することが必要である。ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、又はｐＫＮ４１０のようなよく知られたプラスミドを使用してレプリコンを供給する場合、例えば、大腸菌、セラシア属、又はサルモネラ種を宿主として好適に用いることができる。典型的に、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌しなければならず、望ましくは更なるプロテアーゼインヒビターを細胞培養中に導入することができる。
【０１８１】
ii. 抗体産生
上述した発現ベクターで宿主細胞を形質転換又は形質移入し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適するように修飾された通常の栄養培地中で培養する。
形質転換とは、ＤＮＡを原核生物宿主中に導入し、そのＤＮＡを染色体外要素として、又は染色体組込みによって複製可能にすることを意味する。使用される宿主細胞に応じて、形質転換はそのような細胞に適した標準的技術を使用してなされる。塩化カルシウムを用いるカルシウム処理は実質的な細胞壁障害を含む細菌細胞のために一般に使用される。形質転換のための他の方法はポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。さらに別の方法はエレクトロポレーションである。
【０１８２】
本発明のポリペプチドを生産するために使用される原核生物細胞は当該分野で知られ、選択された宿主細胞の培養に適した培地中で増殖させられる。好適な培地の例には、ルリア培地(ＬＢ)プラス必須栄養分サプリメントが含まれる。ある実施態様では、培地は発現ベクターを含む原核生物細胞の増殖を選択的に可能にするために、発現ベクターの構成に基づいて選択される選択剤をまた含む。例えば、アンピシリンがアンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖用培地に加えられる。
【０１８３】
炭素、窒素及び無機リン酸源の他に任意の必要なサプリメントを、単独で、又は複合窒素源のような他のサプリメント又は培地との混合物として導入される適切な濃度で含有させられうる。場合によっては、培養培地はグルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリトリトール及びジチオトレイトールからなる群から選択される一又は複数の還元剤を含みうる。
【０１８４】
原核生物宿主細胞は適切な温度で培養される。例えば、大腸菌の増殖に対しては、好適な温度は約２０℃から約３９℃、より好ましくは約２５℃から約３７℃の範囲、更により好ましくは約３０℃である。培地のｐＨは、主として宿主生物に応じて、約５から約９の範囲の任意のｐＨでありうる。大腸菌に対しては、ｐＨは好ましくは約６．８から約７．４、より好ましくは約７．０である。
【０１８５】
本発明の発現ベクターに誘導性プロモータが用いられる場合、プロモータの活性に適する条件下でタンパク質発現を誘導する。本発明の一態様では、ポリペプチドの転写制御のためにＰｈｏＡプロモータが用いられる。したがって、形質転換した宿主細胞を誘導のためにリン酸限定培地で培養する。好ましくは、リン酸限定培地はＣ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である(例として、Simmons等, J. Immunol. Methods (2002), 263:133-147を参照)。様々な他の誘導因子は用いるベクターコンストラクトに応じて当業者に知りうるように用いてよい。
【０１８６】
一実施態様では、発現された本発明のポリペプチドは宿主細胞の細胞膜周辺中に分泌され、そこから回収される。タンパク質の回収は、一般的には浸透圧ショック、超音波処理又は溶解のような手段によって典型的には微生物を破壊することを含む。ひとたび細胞が破壊されると、細胞片又は全細胞を遠心分離又は濾過によって除去することができる。タンパク質は、例えばアフィニティー樹脂クロマトグラフィーによって更に精製することができる。あるいは、タンパク質は培養培地に輸送しそこで分離することができる。細胞を培養物から除去することができ、培養上清は濾過され、生成したタンパク質の更なる精製のために濃縮される。発現されたポリペプチドを更に単離し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(ＰＡＧＥ)及びウェスタンブロットアッセイ法のような一般的に知られている方法を使用して同定することができる。
【０１８７】
本発明の一側面では、抗体産生は発酵法によって多量に受け継がれる。組換えタンパク質の生産には様々な大規模流加発酵法を利用することができる。大規模発酵は少なくとも１０００リットルの容量、好ましくは約１０００から１０００００リットルの容量である。これらの発酵槽は、酸素と栄養分、特にグルコース(好ましい炭素／エネルギー源)を分散させる撹拌翼を使用する。小規模発酵とは一般におよそ１００リットル以下の容積で、約１リットルから約１００リットルの範囲でありうる発酵槽での発酵を意味する。
【０１８８】
発酵法では、タンパク質の発現の誘導は、典型的には、細胞が適切な条件下にて、初期定常期に細胞があるステージで、所望の密度、例えば約１８０−２２０のＯＤ５５０まで増殖したところで開始される。当該分野で知られ上述されているように、用いられるベクターコンストラクトに応じて、様々なインデューサーを用いることができる。細胞を誘導前の短い時間の間、増殖させてもよい。細胞は通常約１２−５０時間の間、誘導されるが、更に長い又は短い誘導時間としてもよい。
【０１８９】
本発明のポリペプチドの生産収量と品質を改善するために、様々な発酵条件を変更することができる。例えば、分泌される抗体ポリペプチドの正しい組み立てとフォールディングを改善するために、例えばＤｓｂタンパク質(ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ及び／又はＤｓｂＧ)又はＦｋｐＡ(シャペロン活性を持つペプチジルプロピルシス、トランス-イソメラーゼ)のようなシャペロンタンパク質を過剰発現する更なるベクターを用いて宿主原核細胞を同時形質転換させることができる。シャペロンタンパク質は細菌宿主細胞中で生産される異種性タンパク質の適切な折り畳みと溶解性を容易にすることが実証されている。Chen等 (1999) J Bio Chem 274:19601-19605；Georgiou等, 米国特許第６０８３７１５号；Georgiou等, 米国特許第６０２７８８８号；Bothmann及びPluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17100-17105；Ramm及びPluckthun (2000) J. Biol. Chem. 275:17106-17113；Arie等 (2001) Mol. Microbiol. 39:199-210。
【０１９０】
発現された異種タンパク質(特にタンパク分解を受けやすいもの)のタンパク質分解を最小にするために、タンパク質分解酵素を欠くある種の宿主株を本発明に用いることができる。例えば、原核生物宿主細胞株を改変して、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ及びその組合せのような既知の細菌プロテアーゼをコードしている遺伝子に遺伝子突然変異を生じさせることができる。幾つかの大腸菌プロテアーゼ欠損株が利用でき、例えば、上掲のJoly等 (1998)；Georgiou等, 米国特許第５２６４３６５号；Georgiou等, 米国特許第５５０８１９２号；Hara等 (1996) Microbial Drug Resistance 2:63-72に記載されている。
ある実施態様では、タンパク質溶解性酵素を欠損した、一以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドで形質転換した大腸菌株を本発明の発現系の宿主細胞として用いる。
【０１９１】
iii. 抗体精製
当分野で公知の標準的なタンパク質精製方法を用いることができる。以下の方法は好適な精製手順の例である：免疫親和性又はイオン交換カラムによる分画化、エタノール沈降法、逆相ＨＰＬＣ、シリカ又はＤＥＡＥなどの陽性交換樹脂によるクロマトグラフィ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム沈降法及び、例えばSephadex G-75を用いたゲル濾過法。
【０１９２】
一態様では、固形層に固定したプロテインＡを本発明の完全長抗体産物の免疫親和性精製法に用いる。プロテインＡは抗体のＦｃ領域に高い親和性で結合する黄色ブドウ球菌から単離した４１ｋＤの細胞壁タンパク質である。Lindmark等 (1983) J. Immunol. Meth. 62:1-13。プロテインＡを固定した固形層は、ガラス又はシリカ表面、より好ましくは孔を調節したガラスカラム又はケイ酸カラムを含むカラムが好ましい。ある方法では、カラムは非特異的な混入物の接着を防ぐためにグリセロールなどの試薬でコートされている。
【０１９３】
精製の初めの工程では、上記に記載のように細胞培養物からの調製物をプロテインＡ固定固形層に適応し、プロテインＡに対象とする抗体を特異的に結合させる。ついで、固形層を洗浄して、固形層に非特異的に結合した混入物を除去する。最後に、対象とする抗体を溶出により固形層から除去する。
【０１９４】
b. 真核生物の宿主細胞を用いた抗体の生成
一般的に、ベクターは、限定するものではないが、以下の一以上を含む：シグナル配列、複製起点、一以上のマーカ遺伝子、エンハンサー因子、プロモータ及び転写終末因子。
【０１９５】
(i) シグナル配列成分
真核生物の宿主細胞に用いるベクターは、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいは対象とするポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドを含んでいてもよい。好ましく選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。哺乳動物細胞での発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用できる。
このような前駆体領域のＤＮＡは、多価抗体をコードするＤＮＡに読み取り枠を一致させて結合される。
【０１９６】
(ii) 複製開始点
一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である。例えば、ＳＶ４０開始点は典型的にはただ初期プロモーターを有しているために用いられる。
【０１９７】
(iii) 選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(ａ)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(ｂ)必要があれば栄養要求性欠陥を補い、又は(ｃ)複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
選択方法の一例では、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換した細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を生産し、よって選択工程を生存する。このような優性選択の例は、薬剤ネオマイシン、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンを使用する。
【０１９８】
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの他の例は、抗体核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することを可能にするもの、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ、好ましくは、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等々である。
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Ｍｔｘ)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞である(例として、ATCC CRL-9096)。
あるいは、抗体をコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ(ＡＰＨ)のような他の選択可能マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第４９６５１９９号を参照のこと。
【０１９９】
(iv) プロモーター成分
発現及びクローニングベクターは通常は宿主生物体によって認識され抗体ポリペプチド核酸に作用可能に結合しているプロモーターを含む。真核生物のプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子が、転写開始部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に見出されるＡＴリッチ領域を有している。多数の遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
【０２００】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの抗体ポリペプチドの転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(ＳＶ４０)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
ＳＶ４０ウィルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点を更に含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いて哺乳動物宿主中でＤＮＡを発現させる系が、米国特許第4419446号に開示されている。この系の変形例は米国特許第4601978号に開示されている。あるいは、ラウス肉腫ウィルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。
【０２０１】
(v) エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物によるこの発明の抗体ポリペプチドをコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによってしばしば増強される。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物プロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、抗体ポリペプチドコード配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされうるが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
【０２０２】
(vi) 転写終末成分
また、真核生物宿主細胞に用いられる発現ベクターは、典型的には、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'、時には３'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、抗体をコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号とそこに開示された発現ベクターを参照のこと。
【０２０３】
(vii) 宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載のベクター中のＤＮＡをクローニングあるいは発現させるために適切な宿主細胞は、脊椎動物の宿主細胞を含む本明細書中に記載の高等真核生物細胞を含む。培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１);ヒト胚腎臓株(２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977))；ハムスター乳児腎細胞(ＢＨＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))；マウスのセルトリ細胞(ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980))；サルの腎細胞 (ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０); アフリカミドリザルの腎細胞(ＶＥＲＯ-７６, ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト子宮頸癌細胞 (ＨＥＬＡ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞 (ＭＤＣＫ, ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞 (ＢＲＬ３Ａ, ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞 (Ｗ１３８, ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２, ＨＢ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞 (ＭＭＴ０６０５６２, ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞;ＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株(ＨｅｐＧ２)である。
宿主細胞は、抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養される。
【０２０４】
(viii) 宿主細胞の培養
本発明の抗体を産生するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((ＭＥＭ),(シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０号；国際公開第８７／００１９５号；又は米国再発行特許第３０９８５号に記載された何れの培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地には何れもホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインシュリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、GENTAMYCINTM薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は等価なエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について過去に用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【０２０５】
(ix) 抗体の精製
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内で生成され、又は培地内に直接分泌される。抗体が細胞内に生成された場合、第１の工程として、宿主細胞か溶解された断片の何れにしても、粒子状の細片が、例えば遠心分離又は限外濾過によって除去される。抗体が培地に分泌された場合は、そのような発現系からの上清を、一般的には先ず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばＡｍｉｃｏｎ又はＰｅｌｌｉｃｏｎの限外濾過装置を用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含めて、タンパク質分解を阻害してもよく、また抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長を防止してもよい。
【０２０６】
細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティクロマトグラフィーが好ましい精製技術である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる(Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983))。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている(Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986))。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Bakerbond ABXＴＭ樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂上でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥＴＭクロマトグラフィー(ポリアスパラギン酸カラム)、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿法も、回収される多価抗体に応じて利用可能である。
予備的精製工程に続いて、目的の抗体及び混入物を含む混合液をｐＨ約２．５−４．５、好ましくは低塩濃度(例として、約０−０．２５Ｍ塩)の溶出緩衝液を用いて低ｐＨ疎水性作用クロマトグラフィを行う。
【０２０７】
イムノコンジュゲート
また、本発明は、化学療法剤、薬剤、成長阻害剤、毒素(例えば、細菌、糸状菌、植物又は動物由来の酵素活性性毒素、又はその断片)、又は放射性同位体(すなわち放射性コンジュゲート)などの細胞毒性剤にコンジュゲートした本明細書中に記載の何れかの抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を含む、イムノコンジュゲート(「抗体−薬剤コンジュゲート」又は「ＡＤＣ」と交換可能に称される)を提供する。
【０２０８】
細胞障害性又は細胞分裂停止性の薬剤、すなわち癌治療における腫瘍細胞を殺す又は阻害するための薬剤の局部運搬に抗体−薬剤コンジュゲートを用いると(Syrigos及びEpenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drg Del. Rev. 26:151-172；米国特許第4,975,278号)、腫瘍への薬剤成分の標的とする運搬とそこでの細胞内集積が可能となるものであり、この非コンジュゲート薬物作用剤の全身性投与により正常細胞並びに除去しようとする腫瘍細胞への毒性が容認できないレベルとなりうる(Baldwin等, (1986) Lancet pp. (Mar. 15, 1986):603-05; Thorpe, (1985) 「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,」 in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pincheraら. (ed.s), pp. 475-506)。これによって、最小限の毒性で最大限の効果を求める。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体はこの方策に有用であるとして報告されている(Rowland等, (1986) Cancer Immunol. Immunother., 21:183-87)。この方法に用いる薬物には、ダウノマイシン、ドキソルビジン、メトトレキサート及びビンデジンが含まれる(Rowland等, (1986)、上掲)。抗体−毒素コンジュゲートに用いる毒素には、ジフテリア毒素などの細菌性毒素、ゲルダナマイシン(Mandlerら(2000) Jour. of the Nat. Cancer Inst. 92(19):1573-1581；Mandlerら(2000) Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-1028；Mandlerら(2002) Bioconjugate Chem. 13:786-791)、メイタンシノイド(EP 1391213；Liu等, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:8618-8623)、及びカリケアマイシン(Lode等, (1998) Cancer Res. 58:2928；Hinman等, (1993) Cancer Res. 53:3336-3342)などのリシン、小分子毒素などの植物毒が含まれる。該毒素は、チューブリン結合、ＤＮＡ結合又はトポイソメラーゼ阻害を含む機能によりその細胞障害性及び細胞分裂停止性の効果に影響しうる。ある種の細胞障害性剤は、大きな抗体又はタンパク質レセプターリガンドにコンジュゲートした場合に、不活性又は活性が低減する傾向がある。
【０２０９】
ゼバリン(ZEVALIN)(登録商標)(イブリツモマブチウキセタン(ibritumomab tiuxetan), Biogen/Idec)は正常及び悪性のＢリンパ球の細胞表面上にみられるＣＤ２０抗原に対するマウスＩｇＧ１κモノクローナル抗体と111In又は90Y放射性同位体とがチオウレアリンカーキレート剤にて結合した抗体−放射性同位体コンジュゲートである(Wiseman等, (2000) Eur. Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77；Wiseman等, (2002) Blood 99(12):4336-42；Witzig等, (2002) J. Clin. Oncol. 20(10):2453-63；Witzig等, (2002) J. Clin. Oncol. 20(15):3262-69)。ゼバリンはＢ細胞非ホジキン性リンパ球(ＮＨＬ)に対して活性を有するが、投与によってほとんどの患者に重症で長期の血球減少を引き起こす。カリケアマイシンに連結したｈｕＣＤ３３抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるマイロターグ(MYLOTARG)(登録商標)(ゲムツズマブオゾガミシン(gemtuzumab ozogamicin), Wyeth Pharmaceuticals)は、急性骨髄性白血病の治療用注射剤として2000年に認可された(Drugs of the Future (2000) 25(7):686；米国特許第4970198号；同第5079233号；同第5585089号；同第5606040号；同第5693762号；同第5739116号；同第5767285号；同第5773001号)。ジスルフィドリンカーＳＰＰを介してメイタンシノイド薬剤分子ＤＭ１と連結しているｈｕＣ２４２抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるカンツズマブメルタンシン(Cantuzumab mertansine)(Immunogen, Inc.)は、ＣａｎＡｇを発現する癌、例として大腸、膵臓、胃などの治療用に第ＩＩ相試験へと進んでいる。メイタンシノイド薬剤分子ＤＭ１と連結している抗前立腺特異的膜抗原(ＰＳＭＡ)モノクローナル抗体からなる抗体薬剤コンジュゲートであるＭＬＮ−２７０４(Millennium Pharm., BZL Biologics, Immunogen Inc.)は、前立腺癌の潜在的治療の開発段階にある。アウリスタチン(auristatin)ペプチド、アウリスタチンＥ(ＡＥ)及びモノメチルアウリスタチン(ＭＭＡＥ)、ドラスタチン(dolastatin)の合成類似体は、キメラモノクローナル抗体ｃＢＲ９６(癌細胞上のルイスＹに特異的)及びｃＡＣ１０(血液系悪性腫瘍上のＣＤ３０に特異的)(Doronina等, (2003) Nature Biotechnology 21(7):778-784)にコンジュゲートしており、治療的開発段階にある。
【０２１０】
免疫複合体(イムノコンジュゲート)の生成に有用な化学治療薬を本明細書中(例えば、上記)に記載した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、(緑膿菌からの)外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPII、及びPAP-S)、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria officinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)が含まれる。例として1993年10月28日に公開の国際公開公報93/21232を参照のこと。放射性コンジュゲート抗体の生成には、様々な放射性ヌクレオチドが利用可能である。例としては、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅが含まれる。抗体及び細胞障害性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステルの二官能性誘導体(ジメチルアジピミデートＨＣＬ等)、活性エステル(ジスクシンイミジルスベレート等)、アルデヒド(グルタルアルデヒド等)、ビス-アジド化合物(ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等)、ビス-ジアゾニウム誘導体(ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等)、ジイソシアネート(トリエン２，６-ジイソシアネート等)、及びビス-活性フッ素化合物(１，５-ジフルオロ-２，４-ジニトロベンゼン等)を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されているように調製することができる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレントリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。国際公開94/11026参照。
抗体のコンジュゲートと一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、ドラスタチン、アウロスタチン、トリコセン(trichothene)及びＣＣ１０６５、及び毒性活性を有するこれらの毒素の誘導体が、ここで考察される。
【０２１１】
i. メイタンシン及びメイタンシノイド
いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲートは一又は複数のメイタンシノイド分子と結合している本発明の抗体(完全長又は断片)を含んでなる。
メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第３８９６１１１号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第４１５１０４２号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第4,137,230号；同4,248,870号；同4,256,746号；同4,260,608号；同4,265,814号；同4,294,757号；同4,307,016号；同4,308,268号；同4,308,269号；同4,309,428号；同4,313,946号；同4,315,929号；同4,317,821号；同4,322,348号；同4,331,598号；同4,361,650号；同4,364,866号；同4,424,219号；同4,450,254号；同4,362,663号；及び同4,371,533号に開示されている。
メイタンシノイド薬剤成分は、(i) 発酵又は化学修飾、発酵産物の誘導体化によって調製するために相対的に利用可能である(ii) 抗体に対する非ジスルフィドリンカーによる共役に好適な官能基による誘導体化に従う、(iii) 血漿中で安定、そして(iv) 様々な腫瘍細胞株に対して有効であるため、抗体薬剤コンジュゲートの魅力的な薬剤成分である。
【０２１２】
メイタンシノイドを含有するイムノコンジュゲート、その作製方法及びそれらの治療用途は、例えば米国特許第5,208,020号、同5,416,064号、欧州特許第0425235 B1号に開示されており、その開示は出典を明示してここに取り込まれる。Liu等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93：8618-8623(1996)には、ヒト結腸直腸癌に対するモノクローナル抗体Ｃ２４２に結合するＤＭ１と命名されたメイタンシノイドを含有するイムノコンジュゲートが記載されている。前記コンジュゲートは培養された結腸癌細胞に対して高い細胞障害性を有することが見出されており、インビボ腫瘍成長アッセイにおいて抗腫瘍活性を示す。Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)には、メイタンシノイドが、ジスルフィド結合を介して、ヒト結腸癌株化細胞の抗原に結合するマウス抗体Ａ７、又はＨＥＲ-２／ｎｅｕオンコジーンに結合する他のマウスモノクローナル抗体ＴＡ.１に結合しているイムノコンジュゲートが記載されている。ＴＡ.１-メイタンシノイドコンジュゲートの細胞障害性はヒト乳癌株化細胞ＳＫ-ＢＲ-３におけるインビトロで試験され、細胞当たり３×１０５ＨＥＲ-２表面抗原が発現した。薬剤コンジュゲートにより、遊離のメイタンシノイド剤に類似した細胞障害度が達成され、該細胞障害度は、抗体分子当たりのメイタンシノイド分子の数を増加させることにより増加する。Ａ７-メイタンシノイドコンジュゲートはマウスにおいては低い全身性細胞障害性を示した。
【０２１３】
抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子に抗体を化学的に結合させることにより調製される。例えば、米国特許第5,208,020号(この開示内容は出典明記により特別に組み込まれる)を参照。１分子の毒素／抗体は、裸抗体の使用において細胞障害性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均３−４のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞障害性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第5,208,020号、及び他の特許、及び上述した特許ではない刊行物に開示されている。好ましいメイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。
【０２１４】
例えば、米国特許第5,208,020号又は欧州特許第0425235 B1号、Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)、及び2004年10月8日に出願の米国特許出願番号10/960,602(これらの開示内容は出典明記により特別に組み込まれる)に開示されているもの等を含め、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。リンカー成分ＳＭＣＣを含んでなる抗体-メイタンシノイドコンジュゲートは、2004年10月8日に出願の米国特許出願番号10/960,602に開示されるように調製されうる。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。更なる結合基を本願明細書中に記載し、例示する。
【０２１５】
抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート(ＳＭＣＣ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。特に好ましいカップリング剤には、ジスルフィド結合により提供されるＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート(ＳＰＰ)及びＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)(Carlsson等, Biochem. J. 173：723-737[1978])が含まれる。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ-３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ-２０位で生じる。好ましい実施形態において、結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のＣ-３位で形成される。
【０２１６】
ii. アウリスタチン類及びドラスタチン類
いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲートは、ドラスタチン又はドロスタチンペプチジル類似体及び誘導体、アウリスタチン(auristatin) (米国特許第5635483号；同第5780588号)にコンジュゲートした本発明の抗体を含んでなる。ドラスタチン及びアウリスタチンは、微小管動態、ＧＴＰ加水分解及び核と細胞の分割を妨げ(Woyke 等 (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584)、抗癌活性(米国特許第5663149号)及び抗真菌性活性(Pettit 等 (1998) Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965)を有することが示されている。ドラスタチン又はアウリスタチン薬剤成分は、ペプチジル薬剤分子のＮ(アミノ)末端又はＣ(カルボキシル)末端により抗体に接着しうる(国際公開公報02/088172)。
例示的なアウリスタチンの実施態様は、Ｎ末端連結モノメチルアウリスタチン薬剤成分ＤＥ及びＤＦを含み、"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands", US Ser. No. 10/983,340, filed Nov. 5, 2004に開示される。この開示内容は出典明記によってその全体が特別に組み込まれる。
【０２１７】
一般的に、ペプチドベースの薬剤成分は、２以上のアミノ酸及び／又はペプチド断片間でペプチド結合を形成することによって調製されうる。このようなペプチド結合は、例えば、ペプチド化学の分野において周知の液相合成方法に従って調製することができる(E. Schroder and K. Lubke, "The Peptides", volume 1, pp 76-136, 1965, Academic Pressを参照)。アウリスタチン／ドラスタチン薬剤成分は、米国特許第5635483号；同第5780588号；Pettit 等 (1989) J. Am. Chem. Soc. 111: 5463-5465；Pettit 等 (1998) Anti-Cancer Drug Design 13:243-277；Pettit, G.R., 等 Synthesis, 1996, 719-725；及びPettit 等 (1996) J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 5:859-863の方法に従って調製されうる。また、Doronina (2003) Nat Biotechnol 21(7): 778-784; "Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"、2004年11月5日に出願のUS Ser. No. 10/983,340も参照のこと。これらは出典明記によってその全体が本願明細書中に組み込まれる(例えば、リンカー及びモノメチルバリン化合物、例えばＭＭＡＥ及びリンカーにコンジュゲートしたＭＭＡＦの調整方法を開示している)。
【０２１８】
iii. カリケアマイシン
他の実施態様では、イムノコンジュゲートは、一又は複数のカリケアマイシン分子と結合した本発明の抗体を含んでなる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第5712374号、同5714586号、同5739116号、同5767285号、同5770701号、同5770710号、同5773001号、同5877296号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１(Hinman等, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58：2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。
【０２１９】
iv. 他の細胞障害剤
本発明の抗体と結合可能な他の抗腫瘍剤には、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン及び５-フルオロウラシル、米国特許第5053394号、同5770710号に記載されており、集合的にＬＬ-Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第5877296号)が含まれる。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(PAPI、PAPII及びPAP-S)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、1993年10月28日公開の国際公開第93/21232号を参照のこと。
本発明は、抗体と核酸分解活性を有する化合物(例えばリボヌクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮアーゼ)との間に形成されるイムノコンジュゲートをさらに考察する。
【０２２０】
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗体を生成するために、種々の放射性同位体が利用される。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２及びＬｕの放射性同位体が含まれる。コンジュゲートが検出に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)映像(磁気共鳴映像、mriとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。
放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばｔｃ９９ｍ又はＩ１２３、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８及びＩｎ１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57)は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
【０２２１】
抗体と細胞障害剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート(ＳＭＣＣ)、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第94/11026号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞障害剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第5208020号)。
本発明の化合物は、限定するものではないが、架橋剤：市販されている(例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aより)BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、及びスルホ-SMPB、及びSVSB (succinimidyl-(4-ビニルスルホン)安息香酸塩)にて調製したＡＤＣが特に考えられる。2003-2004 Applications Handbook and Catalogの467-498頁を参照。
【０２２２】
v. 抗体薬剤コンジュゲートの調製
本発明の抗体薬剤コンジュゲート(ＡＤＣ)において、抗体(Ａｂ)を、リンカー(Ｌ)を介して、一つ以上の薬剤部分(Ｄ)、例えば抗体につき約１〜約２０の薬剤部分にコンジュゲートする。式ＩのＡＤＣはいくつかの手段、当業者に公知の有機化学反応、状態及び試薬を用いて調製されうる：(1) 共有結合の後に薬剤部分Ｄと反応してＡｂ-Ｌを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた抗体の求核基の反応；及び(2) 共有結合の後に抗体の求核基と反応してＤ-Ｌを形成するための、二価のリンカー試薬を用いた薬剤部分の求核基の反応、が含まれる。ＡＤＣを調製するための更なる方法は本願明細書中に記載される。
Ａｂ−(Ｌ−Ｄ)ｐ            Ｉ
リンカーは、一つ以上のリンカー成分から成ってもよい。例示的なリンカー成分は、６-マレイミドカプロイル(「ＭＣ」)、マレイミドプロパノイル(「ＭＰ」)、バリン-シトルリン(「val-cit」)、アラニン-フェニルアラニン(「ala-phe」)、ｐ-アミノベンジルオキシカルボンイル(「ＰＡＢ」)、Ｎ-スクシンイミジル４(２-ピリジルチオ)ペンタノエート(「ＳＰＰ」)、Ｎ-スクシンイミジル４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１カルボキシレート(「ＳＭＣＣ」)、及びＮ-スクシンイミジル(４-イオド-アセチル)アミノ安息香酸エステル(「ＳＩＡＢ」)を含む。更なるリンカー成分は当分野で公知であり、そのいくつかは本願明細書において、記述される。また、"Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands"、2004年11月5日に出願した米出願番号10/983,340を参照。その内容は出典明記により本願明細書に組み込まれる。
【０２２３】
いくつかの実施態様では、リンカーはアミノ酸残基を含みうる。例示的なアミノ酸リンカー成分には、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド又はペンタペプチドなどがある。例示的なジペプチドは、バリン-シトルリン(vc又はval-cit)、アラニン-フェニルアラニン(af又はala-phe)を含む。例示的なトリペプチドは、グリシン-バリン-シトルリン(gly-val-cit)及びグリシン-グリシン-グリシン(gly-gly-gly)を含む。アミノ酸リンカー成分を含んでなるアミノ酸残基は、天然に生じるもの、並びに微量のアミノ酸及び非天然に生じるアミノ酸類似体、例えばシトルリンを含む。アミノ酸リンカー成分は設定され、特に酵素、例えば腫瘍関連プロテアーゼ、カテプシンＢ、Ｃ及びＤ又はプラスミンプロテアーゼによる酵素的切断の選択性に最適化できる。
【０２２４】
抗体上の求核基には、限定するものでなく、以下のものを含む：(i) Ｎ末端アミン基、(ii) 側鎖アミン基、例えばリシン、(iii) 側鎖チオール基、例えばシステイン、及び(iv) 抗体がグリコシル化される糖水酸基又はアミノ基。アミン、チオール及び水酸基は、求核であり、反応して、リンカー部分上の求電子性の群及びリンカー試薬により共有結合を形成することができる：(i) 活性エステル、例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸及び酸ハロゲン化物；(ii) アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；(iii) アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド群、が含まれる。特定の抗体は、還元しうる鎖間ジスルフィド、すなわちシステイン架橋を有する。抗体は、還元剤、例えばＤＴＴ(ジチオトレイトール)による処置によって、リンカー試薬を用いたコンジュゲート反応を行ってもよい。ゆえに、各々のシステイン架橋は、理論的には、２の反応性のチオール求核基を形成する。チオールにアミンを転換させる２-イミノチオラン(トラウトの試薬)を用いてリシンを反応させることによって抗体に付加的な求核基を導入することができる。反応性のチオール基は、１、２、３、４又はそれ以上のシステイン残基を導入する(例えば、一又は複数の非天然のシステインアミノ酸残基を含んでなる変異体抗体を調製する)ことによって抗体(又は、その断片)に導入されてもよい。
【０２２５】
また、本発明の抗体薬剤コンジュゲートは、抗体を修飾して求電子性の部分を導入する(リンカー試薬又は薬剤上の求核置換基と反応させることができる)ことによって生成してもよい。グリコシル化された抗体の糖質を、例えば過ヨウ素酸塩酸化剤を用いて酸化して、リンカー試薬又は薬剤部分のアミン基と反応するアルデヒド又はケトン基を形成させてもよい。生じたイミンシッフ塩基群が安定結合を形成するか、又は例えば安定アミン結合を形成させるホウ化水素試薬によって、還元してもよい。一実施態様では、ガラクトースオキシダーゼ又はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩の何れかによるグリコシル化抗体の炭水化物部分の反応により、薬剤(Hermanson, Bioconjugate Techniques)上の適当な基と反応することができるタンパク質のカルボニル(アルデヒド及びケトン)基が生じうる。他の実施態様では、Ｎ末端セリン又はスレオニン残基を含んでいるタンパク質はナトリウムメタ過ヨウ素酸塩と反応して、第一のアミノ酸の代わりにアルデヒドを生成する(Geoghegan & Stroh, (1992) Bioconjugate Chem. 3:138-146；米国特許第5362852号)。このようなアルデヒドは、薬剤部分又はリンカー求核基と反応することができる。
【０２２６】
同様に、薬剤部分上の求核基には、限定するものではないが、以下のものを含む：反応して、リンカー部分及びリンカー試薬上の求電子性の基と共有結合することができるアミン、チオール、ヒドロキシル、ヒドラジド、オキシム、ヒドラジン、チオセミカルバゾン、ヒドラジンカルボン酸エステル及びアリールヒドラジド基：(i) 活性エステル(例えばＮＨＳエステル、ＨＯＢｔエステル、ハロギ酸及び酸ハロゲン化物)；(ii) アルキル及びベンジルハライド、例えばハロアセトアミド；(iii) アルデヒド、ケトン、カルボキシル及びマレイミド基、が含まれる。
別法として、抗体及び細胞障害剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。
他の実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを個体に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から非結合コンジュゲートを除去し、細胞障害剤(例えば放射性ヌクレオチド)にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
【０２２７】
薬剤的製剤
本発明の抗体を含んでなる治療用製剤は、所望の純度を持つ抗体と、場合によっては生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤を混合することにより(Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000))、水溶液、凍結乾燥又は他の乾燥製剤の形態に調製されて保存される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量と濃度でレシピエントに非毒性であり、ホスフェート、シトレート、ヒスチジン及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(約１０残基未満)のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質複合体)；及び／又はTWEENTM、PLURONICSTM又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０２２８】
ここでの製剤は、治療される特定の徴候のために必要ならば一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を与えない相補的活性を持つものも含んでよい。そのような分子は、好適には、意図する目的のために有効な量で組み合わされて存在する。
また活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリー系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ-粒子及びナノカプセル)に、あるいはマクロエマルションに捕捉させてもよい。このような技術は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th edition (2000)に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
【０２２９】
徐放性調合物を調製してもよい。徐放性調合物の好ましい例は、本発明の免疫グロブリンを含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチルメタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3773919号)、Ｌ-グルタミン酸とγエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOTTM(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフィア)、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシブチル酸が含まれる。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸等のポリマーは、分子を１００日以上かけて放出することを可能にするが、ある種のヒドロゲルはタンパク質をより短い時間で放出する。カプセル化された抗体が体内に長時間残ると、３７℃の水分に暴露された結果として変性又は凝集し、生物活性を喪失させ免疫原性を変化させるおそれがある。合理的な戦略を、関与するメカニズムに応じて安定化のために案出することができる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換による分子間Ｓ-Ｓ結合の形成であることが見いだされた場合、安定化はスルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分含有量を制御し、適当な添加剤を使用し、また特定のポリマーマトリクス組成物を開発することによって達成されうる。
【０２３０】
使用
本発明の抗体を、例えば、インビトロ、エクスビボ及びインビボの治療法に用いてもよい。
一態様では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ１の発現及び／又は活性(シグナル伝達)の増加と関係する腫瘍、癌及び／又は細胞増殖性疾患を治療するか又は予防するための方法であって、このような治療を必要とする個体に有効量の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を投与することを含んでなる方法を提供する。
他の態様では、本発明は、腫瘍又は癌の増殖の低減、阻害又は予防のための方法であって、このような治療を必要とする被検体に有効量の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を投与することを含んでなる方法を提供する。
【０２３１】
さらに、少なくとも本発明のいくつかの抗体は、他の種由来の抗原を結合しうる。望ましくは、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体はヒト及びマウスのＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲに、望ましくは１×１０−７Ｋｄ以上の強さで結合する。したがって、本発明の抗体は、例えば、抗原を含有する細胞培養物、ヒト個体、又は、本発明の抗体が交差反応する抗原を有する他の哺乳類の被検体(例えばチンパンジ、ヒヒ、マーモセット、カニクイザル及びアカゲザル、ブタ又はマウス)において、特異的な抗原活性を結合するために用いてもよい。一実施態様では、本発明の抗体は、抗原活性が阻害されるように抗原と抗体を反応させることによって、抗原活性を阻害するために用いることができる。抗原はヒトタンパク質分子であることが望ましい。
【０２３２】
一実施態様では、本発明の抗体は、抗原の発現及び／又は活性(シグナル伝達)の増加に関連する疾患に罹患している個体での抗原を結合する方法であって、個体の抗原が結合されるように本発明の抗体が個体に投与されることを含む方法に用いることができる。Ｎｏｔｃｈ１活性(シグナル伝達)の増加には、Ｎｏｔｃｈ活性化変異によるＮｏｔｃｈ１活性の増加、Ｎｏｔｃｈリガンドの発現及び／又は活性の増加によるＮｏｔｃｈ１活性の増加、並びに他のメカニズムによるＮｏｔｃｈ１活性の増加が包含されることが理解される。好ましくは、抗原はヒトのタンパク質分子であり、個体はヒトである。これに対して、個体は、本発明の抗体が結合する抗原を発現している哺乳動物であってもよい。また更に、個体は、抗原が導入されている(例えば、抗原の投与、又は抗原導入遺伝子の発現によって、)哺乳動物であってもよい。本発明の抗体は、治療目的のためにヒト個体に投与されてもよい。さらに、本発明の抗体は、獣医学のために又はヒト疾患の動物モデルとしての、免疫グロブリンが交差反応する抗原を発現する非ヒト哺乳動物(例えば霊長類、ブタ又はマウス)に投与されてもよい。後者に関して、このような動物モデルは、本発明の抗体の治療有効性を評価するため(例えば、投与の用量及び時間経過の試験)に有用でありうる。
本発明の抗体を、一又は複数の抗原分子の発現及び／又は活性に関連する疾患、障害ないし症状を治療、阻害、進行を遅延、再発を予防／遅延、寛解、又は予防するために用いることができる。
【０２３３】
例示的な疾患は、上皮癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病ないしはリンパ系悪性腫瘍を含む。このような癌のより具体的な例には、扁平上皮癌(squamous cell cancer)(例えば、上皮性扁平上皮癌)、肺癌、例として小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平カルシノーマ、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃(gastric又はstomach)癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、泌尿器の癌、肝腫瘍、乳癌、大腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮カルシノーマ、唾液腺カルシノーマ、腎臓(kidney又はrenal)癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝カルシノーマ、肛門カルシノーマ、陰茎カルシノーマ、メラノーマ、多発性骨髄腫及びＢ細胞リンパ腫、脳、並びに頭部及び頸部の癌、及び関連する転移が含まれる。ある実施態様では、癌は、小細胞肺癌、神経芽細胞腫、メラノーマ、胸部カルシノーマ、胃癌、結腸直腸癌(ＣＲＣ)及び肝細胞カルシノーマからなる群から選択される。
また、本発明の抗体は、病態に細胞性変性ないしは機能不全を伴う疾患の治療(予防を含む)、例えば様々な(慢性)神経変性性疾患及び急性神経細胞傷害の治療に有用である。このような神経変性性疾患には、限定するものではないが、末梢神経障害、運動神経疾患、例えば、筋萎縮性側索硬化症(ＡＬＳ、Lou Gehrig's病)、Bell's麻痺、及び脊髄筋萎縮又は麻痺を伴う様々な症状、及び、他のヒト神経変性疾患、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、癲癇、多発性硬化症、ハンチントン舞踏病、ダウン症候群、神経性難聴、及びメニエール病、及び急性神経細胞傷害、例えば外傷や脊髄損傷によるものが含まれる。
【０２３４】
Ｎｏｔｃｈ１活性は、発生期及び成体期において様々な幹細胞系及び初期プロジェニター細胞系の発達に関与していた。例としてChirba, S. (2006) Stem Cells 24:2437-2447を参照。したがって、他の態様では、本発明は、前駆細胞の分化が阻害されるように前駆細胞におけるＮｏｔｃｈ経路を調節することによって、最終でない分化した細胞(「前駆細胞」)の増殖方法を提供する。本明細書中で用いる「前駆細胞」は任意の最終でない分化した細胞を意味する。前駆細胞は望ましくは幹細胞又は始原(プロジェニター)細胞である。いくつかの実施態様では、本発明は、幹細胞の分化が阻害されるように、細胞内のＮｏｔｃｈ経路を活性化することによる、前駆細胞を含む集団内の前駆細胞の増殖方法を提供する。さらに、前駆細胞は、Ｎｏｔｃｈ経路活性化の前か後に細胞群から、必要に応じて、単離してもよい。Ｎｏｔｃｈ経路の活性化は、好ましくは、細胞を抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲアゴニスト抗体と接触させることによって達成される。
【０２３５】
本発明の実施態様は、所望の細胞群をＮｏｔｃｈ経路のアゴニストにて処理し、次いでこれらの細胞を培養中で増殖させた後に適切な領域内へ戻し移植するか、又は細胞を必ずしもインビトロ増殖することなく直接移植することである。アンタゴニストは、Ｎｏｔｃｈ機能アゴニストの作用を逆転させるか又は中和するために用いてもよい。
本発明の増殖させた幹細胞群は、疾患又は損傷の治療のため、又は、移植される幹細胞及び移植部位の種類に適切である当分野で公知のいずれかの方法による遺伝子治療のために、個体に移植されてもよい。肝臓に位置する肝臓幹細胞がそうであるように、造血性幹細胞は静脈内に移植されてもよい。神経幹細胞は、脳の損傷又は疾患の部位に直接移植されてもよい。
【０２３６】
本明細書中に記載の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲアンタゴニスト抗体の使用に加えて、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲアゴニスト抗体もまた、Ｎｏｔｃｈ１の発現及び／又は活性、生物学的に関連するＮｏｔｃｈ１及び／又はＮｏｔｃｈ１リガンド生物学的経路の破壊に関連する疾患状態を調節するための治療法又は組成物に有用である。
一態様では、本発明は、免疫学的疾患の治療又は予防のための方法であって、処置が必要な個体に有効量の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲアゴニスト抗体を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施態様では、免疫学的疾患が、異常なＴ細胞発達又は調節から生じる疾患である(例としてMcKenzie et al., Expert. Opin. Ther. Targets 9:395-410, 2005を参照)。
他の態様では、本発明は、自己免疫性疾患の治療又は予防のための方法であって、処置を必要とする個体に有効量の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲアゴニスト抗体を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施態様では、自己免疫性疾患は、自己免疫性糖尿病、多発性硬化症又は関節リウマチである。
更なる態様では、本発明は、移植拒絶反応の治療又は予防のための方法であって、処置を必要とする個体に有効量の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲアゴニスト抗体を投与することを含む方法を提供する。
更なる態様では、本発明は、組織再生及び／又は修復の促進方法であって、処置を必要とする個体に有効量の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲアゴニスト抗体を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施態様では、方法は、骨格又は心筋又は骨の再生及び／又は修復を促進することを伴う。
【０２３７】
また、本発明は、Ｎｏｔｃｈ１の発現及び／又は活性、例えば発現及び／又は活性の増加ないし減少、又は望ましくない発現及び／又は活性と関連する疾患状態を調節するために有用な方法と組成物を提供する。
一態様では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ１の発現及び／又は活性の増加と関連する腫瘍、癌及び／又は細胞増殖性疾患の治療又は予防のための方法であって、処置を必要とする個体に有効量の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を投与することを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、血管新生の阻害方法であって、処置を必要とする個体に有効量の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を投与することを含む方法を提供する。
一態様では、本発明は、血管新生と関連する病的状態の治療方法であって、処置を必要とする個体に有効量の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施態様では、血管新生と関連する病的状態は腫瘍、癌、及び／又は細胞増殖性疾患である。いくつかの実施態様では、血管新生と関連する病的状態は眼内新生血管疾患である。
【０２３８】
ある実施態様では、一又は複数の細胞障害性剤とコンジュゲートした抗体を含んでなるイムノコンジュゲートを個体に投与する。いくつかの実施態様では、イムノコンジュゲート及び／又はそれが結合する抗原が細胞に内在化されていると、結合する標的細胞を殺す際のイムノコンジュゲートの治療効果が増す。一実施態様において、細胞障害性剤は標的細胞内の核酸を標的とするか又は妨げる。一実施態様では、細胞障害性剤は微小管重合を標的とするか又は妨げる。このような細胞障害性剤の例には、本明細書に記載の何れかの化学療法剤(例えばメイタンシノイド、アウリスタチン、ドラスタチン又はカリケアマイシン)、放射性同位元素、又はＲＮＡ分解酵素ないしＤＮＡエンドヌクレアーゼが含まれる。
【０２３９】
本発明の抗体は、単独で、又は、他の組成物と組み合わせて治療に用いることができる。例えば、本発明の抗体は、他の抗体、化学療法剤(一又は複数)(化学療法剤の混合を含む)、他の細胞障害性剤(一又は複数)、抗血管形成剤(一又は複数)、サイトカイン及び／又は増殖阻害性剤(一又は複数)と同時に投与してもよい。本発明の抗体が腫瘍増殖を阻害する場合、腫瘍の増殖を阻害する一又は複数の他の治療薬とも組み合わせることが大いに所望されうる。あるいは又はさらに、個体は、併用放射線療法(抗体など、放射性標識した薬剤による療法又は遠隔照射)を受けてもよい。上記の併用治療には、併用投与(２以上の作用剤が同じか又は別の製剤に包含される)及び別々の投与が含まれ、別々の投与の場合には、本発明の抗体は補助治療(一又は複数)の前及び／又はその後に投与することができる。
【０２４０】
併用療法
上記のように、本発明は、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体が他の療法によって投与される併用療法を提供する。例えば、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体は、様々な腫瘍性又は非腫瘍性の症状を治療するために抗癌療法又は抗脈管新生療法と組み合わせて用いられる。一実施態様では、腫瘍性又は非腫瘍性の症状は異常ないしは望ましくない血管新生に関連する病的状態に特徴がある。抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体は、同じ組成物中で又は別々の組成物として、これらの目的のために有効である他の薬剤と組み合わせて、又は連続的に投与されうる。あるいは又はさらに、Ｎｏｔｃｈ１の複数のインヒビターが投与されてもよい。
抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体の投与は、例えば単一の組成物として、又は、２以上の異なる組成物として、同じないしは異なる投与経路を使用して、同時になされうる。あるいは又はさらに、前記投与はいずれかの順序で経時的になされうる。ある実施態様では、２以上の組成物の投与の間には数分から数日、数週から数か月の範囲の間隔がありうる。例えば、抗癌剤がまず投与され、その後Ｎｏｔｃｈ１インヒビターが投与されてもよい。しかしながら、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体の同時投与又は第一投与も考慮される。
【０２４１】
抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体と組み合わせて投与される治療薬の有効量は医師又は獣医の裁量である。治療される症状を最大限管理するために用量投与及び調整がなされる。用量は、さらに、使用される治療薬の種類及び治療される特定の個体などの因子に依存するであろう。抗癌剤の好適な用量は現在用いられているものであり、抗癌剤及び抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体の組合せ作用(相乗作用)のために低くてもよい。ある実施態様では、阻害薬の組合せは単一の阻害薬の有効性を増強する。「増強」なる用語は、その一般的又は認可された用量での治療薬の有効性の改善を指す。
【０２４２】
一般的に、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体及び抗癌剤は、腫瘍増殖又は癌細胞の増殖などの病理学的疾患をブロック又は低減するために、同じないしは類似に疾患に好適である。一実施態様では、抗癌剤は抗血管新生剤である。
例示的な抗癌剤には、アルキル化剤、葉酸塩アンタゴニスト、ピリミジンアンタゴニスト、細胞障害性抗生物質、白金化合物ないし白金ベースの化合物、タキサン、ビンカアルカロイド、ｃ−Ｋｉｔインヒビター、トポイソメラーゼインヒビター、抗血管新生インヒビター、例えば抗ＶＥＧＦインヒビター、ＨＥＲ-２インヒビター、ＥＧＦＲインヒビター又は二重ＥＧＦＲ／ＨＥＲ-２キナーゼインヒビター、抗卵胞ホルモン、例えばフルベストラント、及びホルモン療法剤、例えばカルボプラチン、シスプラチン、ゲムシタビン、カペシタビン、エピルビシン、タモキシフェン、アロマターゼインヒビター及びプレドニゾンが含まれる。いくつかの実施態様では、癌は結腸直腸癌であり、第二医薬はエルロチニブなどのＥＧＦＲインヒビター、ベバシズマブなどの抗ＶＥＧＦインヒビターであるか、又はセツキシマブ、アリノテカン、イリノテカン又はFOLFOXであるか、又は癌が乳癌であり、第二医薬がフルベストラントなどの抗卵胞ホルモン調節剤、タモキシフェン又はレトロゾール、エキセメスタン又はアナストロゾールなどのアロマターゼインヒビターであるか、又はベバシズマブなどの抗ＶＥＧＦインヒビターであるか、又はドキソルビシンなどの化学療法剤及び／又はパクリタキセルなどのタキサンであるか、又はトラツズマブなどの抗ＨＥＲ−２インヒビター、又はラパチニブなどの二重ＥＧＦＲ／ＨＥＲ-２キナーゼインヒビターないしは１７ＡＡＧ(熱ショックタンパク質[Ｈｓｐ]９０毒であるゲルダナマイシン誘導体)(例えばトラスツズマブに進行した乳癌のために)などのＨＥＲ−２ダウンレギュレーターである。他の実施態様では、癌は小細胞肺癌などの肺癌であり、第二医薬はベバシズマブなどのＶＥＧＦインヒビター、又は例えばエルロチニブなどのＥＧＦＲインヒビター又は例えばイマチニブなどのｃ−Ｋｉｔインヒビターである。
癌との関連の抗血管新生療法は、腫瘍増殖を支える栄養分の供給に必要な腫瘍血管の発達を阻害することを目的とした癌治療方略である。血管新生が原発性腫瘍増殖と転移の療法に伴うので、本発明によって提供される抗血管新生療法は、原発部位での腫瘍の新生物性増殖の阻害と二次部位での腫瘍の転移の予防が可能であり、ゆえに他の療法によって腫瘍の攻撃がなされる。
【０２４３】
多くの抗血管新生剤が同定されており、当分野で公知であり、本明細書中に挙げるもの、例えば定義の項目に挙げるもの、例えばCarmeliet and Jain, Nature 407:249-257 (2000)；Ferrara等, Nature Reviews:Drug Discovery, 3:391-400 (2004)；及びSato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)に挙げるものなどがある。また、米国特許公開第２００３００５５００６号を参照。ある実施態様では、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体は、抗ＶＥＧＦ中和抗体(又は断片)及び／又は他のＶＥＧＦアンタゴニストないしはＶＥＧＦレセプターアンタゴニスト、例として、限定するものではないが、例えば、可溶性ＶＥＧＦレセプター(例えば、ＶＥＧＦＲ-１、ＶＥＧＦＲ-２、ＶＥＧＦＲ-３、ニューロピリン(例えば、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２))断片、ＶＥＧＦないしはＶＥＧＦＲを遮断することができるアプタマー、中和抗ＶＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ(ＲＴＫ)の低分子量インヒビター、ＶＥＧＦのアンチセンス方略、ＶＥＧＦないしはＶＥＧＦレセプターに対するリボザイム、ＶＥＧＦのアンタゴニスト変異体、及びこれらのいずれかの組み合わせと組み合わせて用いられる。あるいは又はさらに、２つ以上の血管新生インヒビターは、場合によってＶＥＧＦアンタゴニスト及び他の薬剤に加えて個体に同時に投与されてもよい。ある実施態様では、一又は複数の更なる治療薬、例えば抗癌剤は、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体、ＶＥＧＦアンタゴニスト及び抗血管新生剤と組み合わせて投与されてもよい。
本発明のある態様では、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体による併用腫瘍療法に有用な他の治療剤には、他の癌療法(例えば、外科的治療、放射線処置(例えば、放射活性物質の照射又は投与を伴う)、化学療法、本明細書中に挙げる抗癌剤及び当分野で公知の抗癌剤、又はこれらの組み合わせ)が含まれる。あるいは又はさらに、本明細書中に開示した同じ又は２以上の異なる抗原を結合する２以上の抗体が個体に同時に投与されてもよい。また、個体に一又は複数のサイトカインを投与することが有益であることもある。
【０２４４】
化学療法剤
ある態様では、本発明は、有効量のＮｏｔｃｈ１のアンタゴニスト及び／又は血管新生インヒビター(一又は複数)と一又は複数の化学療法剤を、癌に罹りやすい個体又は癌と診断された個体に投与することによって、腫瘍増殖又は癌細胞の増殖を遮断する又は低減する方法を提供する。様々な化学療法剤が本発明の併用治療方法で用いられてもよい。考慮する化学療法剤の例示的及び非限定的リストを本明細書中の「定義」の項目に示し、いくつかを上記する。
当業者によって理解されるように、化学療法剤の適切な用量は、一般的に、化学療法剤が単独ないしは他の化学療法剤と組み合わせて投与される臨床治療に既に用いられる用量の程度であろう。用量の変更はおそらく治療する症状に応じて行うであろう。治療を行う医師は、個体ごとに適当な用量を決定することが可能であろう。
【０２４５】
再発性腫瘍増殖 
また、本発明は、再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖を阻害するか又は予防するための方法及び組成物を提供する。再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖は、一又は複数の現在利用可能な治療法(例えば、癌治療、例として化学療法、放射線療法、外科治療、ホルモン療法及び／又は生物学的療法／免疫療法、抗ＶＥＧＦ抗体療法、特に特定の癌のための標準的な治療投薬計画)を施されている個体ないしはこれらによって治療された個体が臨床的に治療に不十分であるか、又は個体がこのような治療からもはやいかなる有用な効果を得ておらず更なる有効な治療を求める場合の症状を表すために用いられる。本明細書中で用いるように、この表現も「非応答性／再発性の」個体の症状を指すものであり、例えば、副作用に苦しむ治療に応答する個体、耐性を生じる個体、治療に応答しない個体、治療に満足に応答しない個体などを表す。様々な実施態様では、癌は、癌細胞の数が有意に低減しなかった、又は増加した、又は腫瘍の大きさが有意に減少しなかった、又は大きくなった、又は癌細胞のサイズないしは数に何らかの減少が生じなかった、再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖である。癌細胞が再発性腫瘍増殖であるか再発性癌細胞増殖であるかの決定は、文脈上で「再発」又は「難治性」又は「非応答性」の当分野で容認される意味を用いて、癌細胞に対する治療の有効性をアッセイするための当分野で公知の任意の方法によってインビトロないしはインビボでなされうる。再発性腫瘍増殖のある例は抗ＶＥＧＦ治療に耐性のある腫瘍である。
【０２４６】
本発明は、一又は複数の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を投与して、個体の再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖を遮断又は低減することによって、個体の再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖を遮断又は低減する方法を提供する。ある実施態様では、アンタゴニストは癌治療剤に続いて投与されてもよい。他の実施態様では、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体は癌療法と同時に投与される。あるいは又はさらに、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体療法は他の癌療法と交互に行い、いずれの順序でも実施可能である。また、本発明は、癌を有する傾向にある個体の癌の発症や再発を予防するために一又は複数の阻害性抗体を投与するための方法も包含する。通常、個体は、癌療法を施されたか同時に施されている。一実施態様では、癌療法は、抗血管新生剤、例えばＶＥＧＦアンタゴニストによる治療である。抗血管新生剤は当分野で公知のものや本明細書中の定義の項目に見られるものなどがある。一実施態様では、抗血管新生剤は、抗ＶＥＧＦ中和抗体ないしは断片(例えば、ヒト化Ａ４.６.１、アバスチン(登録商標)(Genentech, South San Francisco, CA)、Ｙ０３１７、Ｍ４、Ｇ６、Ｂ２０、２Ｃ３など)である。例として、米国特許第６５８２９５９号、同第６８８４８７９号、同第６７０３０２０号、国際公開第９８／４５３３２号、同第９６／３００４６号、同第９４／１０２０２号、欧州特許第０６６６８６８号Ｂ１、米国公開特許第２００３０２０６８９９号、同第２００３０１９０３１７号、同第２００３０２０３４０９号、同第２００５０１１２１２６号、Popkov等, Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)、及び国際公開第２００５０１２３５９号を参照。更なる薬剤は、再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖を遮断又は低減するために、ＶＥＧＦアンタゴニスト及び抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体と組み合わせて投与することができる。例として本明細書中の併用療法と題する項目を参照のこと。
【０２４７】
本発明の化合物(例えば抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体)は、例えば経口、局所又は吸入の経路、非経口的、皮下、腹膜内、肺内、及び鼻腔内、そして、必要に応じて局所の治療のために、病巣内投与による、一定期間にわたる持続注入又は大量瞬時投与としての静脈内投与などの公知の方法に従って、個体(例えばヒト患者)に投与される。非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹膜内、脳脊髄内、滑膜内、包膜(腱鞘)内又は皮下的な投与が含まれる。多大な副作用又は毒性がＮｏｔｃｈ１シグナル伝達の阻害と関係している場合、特に局所投与が望ましい。また、エクスビボ方策が医療適用のために用いられてもよい。エクスビボ方策は、例えば、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体をコードするポリヌクレオチドにて個体から得た細胞を形質移入又は形質導入することを伴う。次いで、形質移入又は形質導入された細胞は個体に返される。細胞は、限定するものではないが、造血性細胞(例えば骨髄細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞、Ｔ細胞又はＢ細胞)、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、ケラチン合成細胞又は筋細胞を含む広範囲の種類のいずれかであってよい。
さらに、抗体は、特に抗体の用量を漸減するパルス注入によって好適に投与されてよい。好ましくは、投薬は、投与が短期であるか長期であるかにいくらか依存して、注射、最も好ましくは静脈内又は皮下注射によってなされる。
【０２４８】
他の例では、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体は、疾患又は腫瘍の位置が可能である場合、例えば直接注射によって局所的に投与され、注射は定期的に繰り返されてよい。また、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体は、局所再発又は転移を予防ないし低減するために、個体に全身的に運搬されるか、又は、腫瘍細胞、例えば腫瘍の外科切除後の腫瘍ないし腫瘍ベッドに直接運搬されうる。 
あるいは、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体をコードする核酸配列を含む阻害性核酸分子ないしはポリヌクレオチドは、個体の適切な細胞に運搬されうる。ある実施態様では、核酸は腫瘍自体に方向付けられうる。   
核酸は、用いるベクターに適切な任意の手段によって、細胞に導入されてもよい。このような方法の多くは当分野で周知である(Sambrook et al., supra, and Watson et al., Recombinant DNA, Chapter 12, 2d edition, Scientific American Books, 1992)。遺伝子運搬方法の例には、リポソーム媒介形質移入、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム／ＤＥＡＥデキストラン方法、ジーンガン(gene gun)、マイクロインジェクションが含まれる。
【０２４９】
本発明の抗体組成物は、医学的実用性に合わせた様式で調製し、１回分に分けて、投与する。ここで考慮する要因は、治療する特定の疾患、治療する特定の哺乳動物、個体の臨床状態、疾患の原因、薬剤の運搬部位、投与の方法、投与の日程計画、及び医師が知る他の因子を含む。必要ではないが場合によっては、問題の疾患を予防するか又は治療するために一般に用いられる一つ以上の作用剤と抗体とを調製する。そのような他の作用剤の有効量は、製剤中の本発明の抗体の量、疾患の型又は治療、及び上記の他の因子に依存する。一般的に、以前用いたのと同じ用量及び投与経路で、又は前回用いた用量の１〜９９％で用いる。
【０２５０】
疾患の予防又は治療のために、本発明の抗体の好適な用量は(単独で用いる場合、又は化学療法剤などの他の作用剤と組み合わせて用いる場合)、治療する疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体を予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前の治療法、個体の病歴及び抗体への応答性、及び担当医師の判断に依存するであろう。抗体は一時的又は一連の治療にわたって好適に個体に投与される。疾患のタイプ及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ(例えば０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ)の抗体が、例えば一以上の分割投与又は連続注入による個体投与の初期候補用量である。ある典型的な１日量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与は、所望の疾患症状の抑制が得られるまで持続する。抗体の用量の例は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。ゆえに、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの一以上の用量を(又はそれらを組み合わせて)個体に投与してもよい。このような用量は、間欠的に、例えば週ごと又は３週ごとに投与してもよい(例えば個体に約２〜約２０、例えば約６用量の抗体が投与される)。初期のより高い負荷投与量の後、一以上のより低い用量を投与してもよい。例示的用量療法は、約４ｍｇ／ｋｇの初期負荷投与量の後、約２ｍｇ／ｋｇの毎週の維持用量抗体を投与することを含む。しかしながら、他の投与計画が有効かもしれない。この治療の進行は、従来技術及びアッセイにより容易にモニターすることができる。
【０２５１】
また、本発明の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体は、特定の細胞又は組織におけるＮｏｔｃｈ１の発現を検出するアッセイ(例えば診断アッセイ又は予後のアッセイ)に有用であり、このアッセイでは抗体は後述のように標識され、及び／又は不溶性の基質に固定される。
他の態様では、本発明は、試料中のＮｏｔｃｈ１−抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体複合体を検出することを含む、Ｎｏｔｃｈ１の検出方法を提供する。本明細書において、用いられる「検出」なる用語は、コントロールに対する参照の有無にかかわらず、定性的及び／又は定量的な検出(測定レベル)を含む。
他の態様では、本発明は、Ｎｏｔｃｈ１の発現及び／又は活性に関連する疾患を診断するための方法であって、該疾患を有する又は有すると思われる患者からの生体試料において、Ｎｏｔｃｈ１−抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体複合体を検出することを含む方法を提供する。いくつかの実施態様では、Ｎｏｔｃｈ１発現は、発現の増加又は異常な(望ましくない)発現である。いくつかの実施態様では、疾患は癌、腫瘍、及び／又は細胞増殖性疾患である。あるいは、又はＮｏｔｃｈ１発現の検出に加えて、本明細書中に記載の診断又は治療の方法では、生体試料におけるＮｏｔｃｈ１リガンドの発現を決定してもよい。Ｎｏｔｃｈ１リガンド発現は当分野の標準的な方法を用いて決定されてよい。
【０２５２】
他の態様では、本発明は、本明細書に記載の何れかの抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を提供するものであって、この抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体は検出可能な標識を含んでなる。
他の態様では、本発明は、本明細書に記載の何れかの抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体とＮｏｔｃｈ１の複合体を提供する。いくつかの実施態様では、複合体はインビボ又はインビトロである。いくつかの実施態様では、複合体は癌細胞を含んでなる。いくつかの実施態様では、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体は検出可能に標識される。
【０２５３】
抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体は、多くの良く知られた診断的アッセイ法の任意の１つにおいて、Ｎｏｔｃｈ１の検出に利用することができる。例えば、所望する起源から試料を得て、抗体が混合物中に存在する任意のＮｏｔｃｈ１と抗体／Ｎｏｔｃｈ１複合体を形成するように試料と抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を混合させ、混合物に存在する任意の抗体／Ｎｏｔｃｈ１複合体を検出することによって、Ｎｏｔｃｈ１に関して生物学的試料をアッセイすることができる。特定の試料に適した当該分野で知られた方法によって、アッセイのために生物学的試料を調製することができる。用いられるアッセイの型によって、抗体と試料を混合させる方法、及び抗体／Ｎｏｔｃｈ１複合体を検出する方法を選択する。そのようなアッセイには、免疫組織化学法、競合及びサンドイッチアッセイ、及び立体阻害アッセイが含まれる。立体阻害アッセイが単一反応混合液で行われるのに対して、競合アッセイ及びサンドイッチ法は不可欠な部分として相分離ステップを利用する。
Ｎｏｔｃｈ１についての分析法では、すべて、１つ又はそれより多い次の試薬を用いる：標識Ｎｏｔｃｈ１アナログ、固定化Ｎｏｔｃｈ１アナログ、標識抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体、固定化抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体及び立体コンジュゲート。標識試薬は、「トレーサー」としても知られている。
【０２５４】
利用される標識は、Ｎｏｔｃｈ１と抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体の結合を妨害しない任意の検出可能な機能性である。免疫アッセイでは、多くの標識が知られており、その例には、直接に検出することができる分子、例えば蛍光色素、化学発光剤、及び放射性標識、並びに分子、酵素等の検出されるように反応又は誘導体化されるべきものが含まれる。そのような標識の例には以下のものが含まれる。用いられる標識はエフリンＢ２と抗エフリンＢ２抗体の結合を干渉しないいくらか検出可能な機能がある。イムノアッセイでの使用のための多くの標識が公知であり、例えば、直接検出されうる成分、例えば、蛍光色素、化学発光、及び放射性標識、並びに検出されるように反応される又は誘導体化される酵素などの成分がある。このような標識の例には、ラジオアイソトープ３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ、フルオロフォア、例えば希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシェフェラーゼ、例えばホタルルシェフェラーゼ及び細菌ルシェフェラーゼ(米国特許第４７３７４５６号)、ルシェフェリン、２,３-ジヒドロフタルジネジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)、アルカリフォスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖オキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘテロサイクリックオキシダーゼ、例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、色素前駆体、例えばＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、安定な遊離ラジカルなどを酸化する過酸化水素を利用する酵素とカップリングさせたもの、などが含まれる。
【０２５５】
これら標識を共有的にタンパク質又はポリペプチドと結合させるために、常套的方法が利用可能である。例えば、カップリング剤、例えばジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、ビス-イミデート、ビス-ジアゾ化ベンジジン等が、上記の蛍光剤、化学発光剤、酵素標識で抗体をタグするのに利用することが可能である。例えば、米国特許第3,940,475号(フルオロメトリー)及び3,645,090号(酵素)；Hunter等, Nature, 144: 945(1962); David等, Biochemistry, 13: 1014-1021(1974)；Pain等, J. Immunol. Methods, 40: 219-230(1981)；及びNygren, J. Histochem. and Cytochem., 30: 407-412(1982)を参照せよ。ここでの好ましい標識は、西洋ワサビペルオキシダーゼ及びアルカリフォスファターゼ等の酵素である。抗体への酵素を含むそのような標識のコンジュゲーションは、免疫アッセイ技術における通常の技術の１つにとって標準的な操作法である。例えば、O'Sullivan等, "Methods for Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay, "  in Methods in Enzymology, 編 J. J. Langone & H. Van Vunakis, 73巻(Academic Press, ニューヨーク, ニューヨーク, 1981), 147-166頁を参照せよ。
【０２５６】
あるアッセイ法では、試薬の固定化を必要とする。固定化は、溶液で遊離に存在するあらゆるＮｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲから抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を分離することを伴う。水不溶性基質又は表面への吸着による(Bennich等, 米国特許第３７２０７６０号)、共有結合による(例えば、グルタルアルデヒド架橋を利用して)、又は例えば免疫沈降による、後に抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体又はＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲアナログを不溶化することによるように、アッセイ法の前に抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体又はＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲアナログの何れかを不溶化することによって、これは常套的に完遂される。
試料におけるタンパク質の発現は、免疫組織化学及び染色プロトコールを用いて試験しうる。組織切片の免疫組織化学染色は、試料中のタンパク質の存在を評価ないしは検出するための確実な方法であることが示されている。免疫組織学法(「ＩＨＣ」)技術は、抗体を用いて、一般的には色素生産性方法又は蛍光性方法によって、インサイツで細胞性抗原を探索して視覚化する。試料の調整では、哺乳動物(典型的にはヒト)の組織又は細胞試料を用いてもよい。試料の例には、限定するものではないが、大腸、乳房、前立腺、子宮、肺、胃、膵臓、リンパ腫、及び白血病癌細胞などの癌細胞が含まれる。前記試料は、当分野で公知の様々な手順、限定するものではないが、外科的切除、吸引又は生検などによって採取することができる。組織は新鮮なものでも凍結したものでもよい。一実施態様では、前記試料は固定し、パラフィンなどに包埋する。前記組織試料は従来の方法によって固定(すなわち保存)されてもよい。当分野の通常の技術者は、組織学的染色ないしは他の分析に供する試料の目的に応じて固定液を選択することは理解するところであろう。また、当分野の通常の技術者は、組織試料の大きさ及び用いる固定液に応じて固定の長さを決定することも理解するであろう。
【０２５７】
ＩＨＣは、形態学的染色及び／又は蛍光発光インサイツハイブリダイゼーションなどの付加的な技術と組み合わせて行ってもよい。ＩＨＣの直接アッセイ及び間接アッセイの２つの一般的な方法が有用である。第一のアッセイでは、標的抗原(例えばＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲ)に対する抗体の結合は、直接的に測定される。この直接アッセイは、更なる抗体相互作用を必要とせずに可視化されうる酵素標識一次抗体又は蛍光タグ付加一次抗体などの標識された試薬を用いる。代表的な間接アッセイでは、コンジュゲートしていない一次抗体が抗原と結合し、次いで標識された二次抗体が一次抗体と結合する。二次抗体が酵素標識にコンジュゲートする場合、抗原を視覚化させるために色素生産性基質ないしは蛍光発生基質が加えられる。二次抗体の中には一次抗体上の異なるエピトープと反応するものもあるので、シグナルの増幅が起こる。
一般的に、免疫組織化学に使用する一次及び／又は二次抗体は、検出可能な成分にて標識されるであろう。通常、以下の種類に分類できる多くの標識が利用可能である。
【０２５８】
上記の試料調整手順以外に、ＩＨＣ前、ＩＨＣの間又はＩＨＣ後に組織切片の更なる処置が所望されてもよい。例えば、クエン酸塩バッファ中で組織サンプルを加熱するなどのエピトープ検索方法が実施されてもよい(例として、Leong 等 Appl. Immunohistochem. 4(3): 201 (1996)を参照)。
場合によって行うブロック処置の後に、一次抗体が組織試料中の標的タンパク質抗原と結合するような好適な条件下と十分な時間、組織切片を一次抗体に曝露させる。これを達成するための好適な条件は慣例的な実験によって決定できる。試料に対する抗体の結合の範囲は、上記の検出可能な標識の何れか一つを用いて決定される。標識は、３,３'-ジアミノベンジジンクロモゲンなどの色素生産性基質の化学変化を触媒する酵素標識(例えばＨＲＰＯ)であることが望ましい。好ましくは、酵素標識は、一次抗体(例えば、一次抗体はウサギポリクローナル抗体であり、二次抗体はヤギ抗ウサギ抗体である)に特異的に結合する抗体にコンジュゲートさせる。
【０２５９】
このようにして調製される検査材料はマウントしてカバーグラスをかけてもよい。その後、例えば顕微鏡を使用してスライドの評価を行い、当分野で通常用いられる染色強度判定基準を用いてもよい。染色強度の基準は以下のように評価されうる。
表２
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【０２６０】
典型的に、ＩＨＣアッセイのおよそ２＋以上の染色パターンスコアは診断／予後を予測するものである。いくつかの実施態様では、およそ１＋以上の染色パターンスコアは診断／予後を予測するものである。他の実施態様では、およそ３以上の染色パターンスコアは診断／予後を予測するものである。腫瘍又は大腸腺腫の細胞及び／又は組織をＩＨＣを用いて試験する場合、一般的に、染色は(試料中に存在しうる間質性組織又は周辺組織とは対照的に)腫瘍細胞及び／又は組織内で決定又は評価されることは理解される。
【０２６１】
競合アッセイ又はサンドイッチアッセイとして知られている他のアッセイ方法は十分に確立されており、市販の診断法産業において、広く使われている。
競合アッセイは、限られた数の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体抗原結合部位について試験試料Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲと競合するトレーサーＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲ類似体の能力に依存する。一般的に、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体は、競合の前又は競合の後に不溶化して、次いで抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体に結合したＮｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲとトレーサーを結合していないトレーサーとＮｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲから分離する。この分離は、別の容器へ移す(結合パートナーが予め不溶化された場合)か、又は遠心分離する(結合パートナーが競合反応の後で沈殿した場合)ことにより達成される。マーカー物質の量で測定されるように、試験試料Ｎｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲの量は結合したトレーサーの量に反比例する。Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲの既知量による用量-反応曲線を作成して、試験結果と比較して試験試料に存在するＮｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲの量を量的に決定する。検出可能なマーカーとして酵素が用いられる場合に、これらのアッセイはＥＬＩＳＡシステムと呼ばれている。
「均質な」アッセイと称される競合アッセイの他の種類は、相分離を必要としない。ここで、Ｎｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲと酵素とのコンジュゲートが調製され、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体がＮｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲに結合する場合に抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体の存在により酵素活性が修飾されるように用いられる。この場合、Ｎｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲ又はその免疫学的に活性な断片は、二機能性有機架橋によって、ペルオキシダーゼなどの酵素にコンジュゲートされる。抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体の結合が標識の酵素活性を阻害するか又は強化するために、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体により使用についてコンジュゲートを選別する。この方法自体は、ＥＭＩＴという名前で広く実施される。
【０２６２】
立体的コンジュゲートは、均質なアッセイの立体障害方法で用いられる。ハプテンに対する抗体は抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体と同時にコンジュゲートを結合することが実質的にできないので、これらのコンジュゲートは低分子のハプテンを小さいＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲ断片に共有結合することにより合成される。このアッセイ手順で、試験試料に存在するＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲは抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を結合し、それによって、抗ハプテンはコンジュゲートを結合できる。その結果、コンジュゲートハプテンの特徴の変化、例えばハプテンが蛍光体である場合の蛍光の変化が生じる。
サンドイッチアッセイは、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ又は抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体の測定のために特に有用である。一連のサンドイッチアッセイにおいて、固定された抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を用いて、試験試料Ｎｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲを吸着し、洗浄によって、試験試料を除去し、結合したＮｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲを用いて第二の標識した抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を吸着して、次いで結合した材料を残留するトレーサーから分離する。結合したトレーサーの量は、試験試料Ｎｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲに正比例する。「同時」サンドイッチアッセイにおいて、試験試料は、標識した抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲを加える前に分離されない。一抗体として抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲモノクローナル抗体を、他方の抗体としてポリクローナル抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を用いる一連のサンドイッチアッセイは、試料をＮｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲについて試験する際に有用である。
前述は、単にＮｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲのための例示的な検出アッセイにすぎない。Ｎｏｔｃｈ１又はＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲの測定のために抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を用いる、現在の他の方法又は今後開発される方法は、本明細書に記載のバイオアッセイを含め、本願の権利内に包含される。
【０２６３】
ある態様では、本発明は、個体、例えばヒト個体からの生体試料中のポリヌクレオチド(一又は複数)(例えばＮｏｔｃｈ１ポリヌクレオチド)(例えばポリヌクレオチドの有無又は量)を検出するための方法を提供する。様々なポリヌクレオチドの検出方法を行うことができ、例えばＲＴ-ＰＣＲ、タックマン(登録商標)遺伝子発現アッセイ、増幅法、ポリヌクレオチドマイクロアレイなどが含まれる。
ポリヌクレオチド(例えばｍＲＮＡ)の検出方法は周知であり、例えば、相補的ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションアッセイ(例えば、標識したＮｏｔｃｈ１のリボプローブを用いたインサイツハイブリダイゼーション)、ノーザンブロット及び関連した技術、及び様々な核酸増幅アッセイ(例えば、Ｎｏｔｃｈ１に特異的な相補的プライマーを用いたＲＴ-ＰＣＲ及び、他の増幅型の検出法、例えば枝分れＤＮＡ、ＳＰＩＡ(単一プライマー等温増幅法)、Ｒｉｂｏ-ＳＰＩＡ、ＳＩＳＢＡ、ＮＡＳＢＡ(核酸配列ベースの増幅法)、ＴＭＡ(転写媒介性増幅法)など)が含まれる。
【０２６４】
哺乳動物の生体試料は、例えばノーザンブロット、ドットブロット又はＰＣＲ分析を用いて、Ｎｏｔｃｈ１のｍＲＮＡについて都合よくアッセイすることができる。例えば、定量的ＰＣＲアッセイなどのＲＴ-ＰＣＲアッセイは公知技術である。本発明の例示的実施態様では、生体試料中のＮｏｔｃｈ１のｍＲＮＡの検出方法は、少なくとも一のプライマーを用いて逆転写によって、試料からｃＤＮＡを生成し、該Ｎｏｔｃｈ１のｃＤＮＡを増幅するために、Ｎｏｔｃｈ１のポリヌクレオチドをセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとして用いて産生された該ｃＤＮＡを増幅し、そして、増幅されたＮｏｔｃｈ１のｃＤＮＡの有無を検出することを含む。加えて、このような方法は、生体試料中のＮｏｔｃｈ１のｍＲＮＡの量(レベル)を決定し得る一ないし複数の工程(例えば、アクチンファミリメンバーなどの「ハウスキーピング」遺伝子のコントロールｍＲＮＡ配列と該レベルを同時に検討すること)を含んでもよい。場合によって、増幅されたＮｏｔｃｈ１のｃＤＮＡの配列を決定してもよい。
プローブ及び／又はプライマーは、検出可能なマーカー、例えば放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレート剤又は酵素にて標識されてもよい。このようなプローブ及びプライマーを、試料中のＮｏｔｃｈ１のポリヌクレオチドの存在を検出するため、及び、Ｎｏｔｃｈ１のタンパク質を発現する細胞を検出するための手段として用いることができる。技術者に理解されるように、多数の異なるプライマー及びプローブは、(例えば、本願明細書中で示される配列に基づいて)調製されてもよく、Ｎｏｔｃｈ１のｍＲＮＡの有無及び／又は量を増幅、クローン化及び／又は決定するために効率的に用いてもよい。
【０２６５】
本発明の任意の方法には、マイクロアレイ技術によって、組織又は細胞試料中のポリヌクレオチド、例えばＮｏｔｃｈ１ポリヌクレオチドの検出を含む手順が含まれる。例えば、核酸マイクロアレイを用いて、試験及びコントロールの組織試料から得た試験及びコントロールのｍＲＮＡ試料を逆転写させて、ｃＤＮＡプローブを生成するために標識する。次いで、プローブを、固形支持体に固定した核酸のアレイにハイブリダイズさせる。アレイの配列及び各々のメンバーの位置がわかるように、アレイを設定する。例えば、特定の疾患状態において発現されうる選択した遺伝子を、固形支持体上に配列してもよい。特定のアレイメンバーと標識プローブとのハイブリダイゼーションは、プローブが由来する試料がその遺伝子を発現することを示す。疾患組織の差次的遺伝子発現分析は、貴重な情報を提供する。マイクロアレイ技術は、単一の実験で何千もの遺伝子のｍＲＮＡ発現性質を評価するために、核酸ハイブリダイゼーション技術及び演算技術を利用する。(2001年10月11日公開の国際公開公報０１／７５１６６を参照、(例えば米国特許第５７００６３７号、同第５４４５９３４号及び同第５８０７５２２号、Lockart, Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996))、アレイ製作の考察のためにはCheung, V.G.等, Nature Genetics 21(Suppl): 15-19 (1999)を参照)。ＤＮＡマイクロアレイは、ガラス又は他の基質上で染色されるか直接合成される遺伝子断片を含有する微小なアレイである。何千もの遺伝子は、通常単一のアレイ上に現れる。代表的なマイクロアレイ実験は以下の工程を伴う：（１）試料から単離したＲＮＡからの蛍光性標識標的の調製、（２）マイクロアレイへの標識した標的のハイブリダイゼーション、（３）洗浄、染色及びアレイのスキャニング、（４）走査画像の分析、そして（５）遺伝子発現性質の生成。一般に、ＤＮＡマイクロアレイには２つの主要な種類、ｃＤＮＡから調製されたＰＣＲ産物を含有する遺伝子発現アレイ及びオリゴヌクレオチドアレイ(通常２５〜７０mer)が用いられる。アレイを形成する際に、オリゴヌクレオチドは、事前に作製して表面にスポットしても、(インサイツで)表面上で直接合成してもよい。
【０２６６】
Affymetrix GeneChip(登録商標)システムは、ガラス表面上でオリゴヌクレオチドを直接合成することにより製造されるアレイを含んでなる市販のマイクロアレイシステムである。プローブ／遺伝子アレイ：オリゴヌクレオチド(「オリゴ」)(通常２５mer)は、半導体ベースのフォトリソグラフィーと固相化学合成技術との組合せによって、ガラスウェーハ上へ直接合成される。各々のアレイは最高４０００００の異なるオリゴヌクレオチドを含有し、各々のオリゴヌクレオチドは何百万ものコピーで存在する。オリゴヌクレオチドプローブがアレイ上の既知の位置で合成されるので、ハイブリダイゼーションのパターン及びシグナル強度は、Affymetrix Microarray Suiteソフトウェアによる遺伝子同一性と相対的な発現レベルに置き換えて解釈できる。各々の遺伝子は、一連の異なるオリゴヌクレオチドプローブによって、アレイ上に表される。各々のプローブ対は、完全一致のオリゴヌクレオチドと、不一致のオリゴヌクレオチドからなる。完全一致プローブは、特定の遺伝子に対して完全に相補的な配列を有するため、遺伝子の発現を測定する。不一致プローブは、中心塩基位置での単一塩基置換によって、完全一致プローブとは異なり、標的遺伝子転写物の結合を妨げる。これによって、完全一致オリゴヌクレオチドを決定するシグナルの一因となるバックグラウンド及び非特異的ハイブリダイゼーションを決定できる。Microarray Suiteソフトウェアは、完全一致プローブのハイブリダイゼーション強度から不完全一致プローブのハイブリダイゼーション強度を減算して、それぞれのプローブセットの絶対値又は特異的強度の値を決定する。プローブは、Ｇｅｎｂａｎｋ及び他のヌクレオチド貯蔵所の当時の情報に基づいて選択される。この配列は遺伝子の３'末端の特定の領域を認識すると思われている。GeneChipハイブリダイゼーションオーブン(「回転式(rotisserie)」オーブン)を用いて、一度に最高６４アレイのハイブリダイゼーションを行う。fluidics stationでは、プローブアレイの洗浄と染色が行われる。これは完全に自動化しており、４つのモジュールを含有しており、その各々のモジュールが一つのプローブアレイを保持している。各々のモジュールは、事前にプログラム化されたfluidicsプロトコールを用いたMicroarray Suiteソフトウェアにより個々に制御される。スキャナは、プローブアレイ結合した標識ｃＲＮＡにより発される蛍光強度を測定する共焦点レーザー蛍光発光スキャナである。Microarray Suiteソフトウェアを有するコンピュータワークステーションがfluidics stationとスキャナを制御する。Microarray Suiteソフトウェアは、プローブアレイについて事前にプログラム化したハイブリダイゼーション、洗浄及び染色プロトコールを用いてfluidics stationを８つまで制御できる。また、ソフトウェアは、ハイブリダイゼーション強度データを得て、適切なアルゴリズムを使用して各々の遺伝子の存在／非存在情報に変換する。最後に、ソフトウェアは、比較分析によって、遺伝子発現における実験間の変化を検出して、テキストファイルに出力する。このファイルは更なるデータ分析のために他のソフトウェアプログラムに用いることができる。
【０２６７】
いくつかの実施態様では、Ｎｏｔｃｈ１遺伝子欠損、遺伝子変異又は遺伝子増幅が検出される。遺伝子欠損、遺伝子変異又は増幅は、当分野で公知の様々なプロトコールの何れか一つ、例えば、慣例的なサザンブロット、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201 5205 (1980))、ドットブロット(ＤＮＡ分析)、又は適切に標識したプローブを用いたインサイツハイブリダイゼーション(例えば蛍光インサイツハイブリダイゼーション(「ＦＩＳＨ」))、適切に標識したプローブを用いた細胞遺伝学的方法又は比較ゲノムハイブリダイゼーション(ＣＧＨ)によって、測定できる。加えて、これらの方法を用いて、Ｎｏｔｃｈ１リガンド遺伝子欠損、リガンド変異又は遺伝子増幅を検出してもよい。本願明細書中で用いられる「Ｎｏｔｃｈ１発現を検出する」はＮｏｔｃｈ１の遺伝子欠損、遺伝子変異又は遺伝子増幅の検出を包含する。
【０２６８】
加えて、組織又は細胞試料中のＮｏｔｃｈ１の遺伝子のメチル化状態を調べてもよい。遺伝子５'調節領域内のＣｐＧ島の異常な脱メチル化及び／又は過剰メチル化は、不死化細胞及び形質転換細胞内でしばしば起こり、様々な遺伝子の発現が変化する。遺伝子のメチル化状態を調べるための様々なアッセイは、公知技術である。例えば、サザンハイブリダイゼーション方法では、ＣｐＧ島のメチル化状態を評価するために、メチル化されたＣｐＧ部位を含有する配列を切断することができないメチル化感受性制限酵素を利用できる。加えて、ＭＳＰ(メチル化特異的ＰＣＲ)は、与えられる遺伝子のＣｐＧ島に存在するすべてのＣｐＧ部位のメチル化状態の分布を迅速に測定できる。この手順は、亜硫酸水素ナトリウムによるＤＮＡの初期修飾(すべてのメチル化されていないシトシンをウラシルに変換する)の後に、メチル化されたＤＮＡ対非メチル化ＤＮＡに特異的なプライマーを用いた増幅を伴う。また、メチル化干渉を伴うプロトコールは、例えばCurrent Protocols In Molecular Biology, Unit 12, Frederick M. Ausubel 等 eds., 1995、De Marzo 等, Am. J. Pathol. 155(6): 1985-1992 (1999)、Brooks 等, Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 1998, 7:531-536)、及び、Lethe 等, Int. J. Cancer 76(6): 903-908 (1998)にみられる。本願明細書中で用いられる「Ｎｏｔｃｈ１発現を検出する」はＮｏｔｃｈ１遺伝子メチル化の検出を包含する。
【０２６９】
製造品
本発明の他の態様では、上記の疾患の治療、予防及び／又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。該製造品は容器と該容器上又は該容器に付随するラベル又はパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。容器は、症状を治療、予防及び／又は診断するのに有効な組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる(例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる)。組成物中の少なくとも一つの活性剤は本発明の抗体である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が癌のような選択した症状の治療に使用されることを示す。更に、製造品は、(a)本発明の抗体を含有する組成物を中に収容する第一の容器；と(b)さらに細胞障害剤を含有してなる組成物を中に収容する第二の容器とを含みうる。本発明のこの実施態様における製造品は、第一及び第二の抗体組成物を癌などの特定の症状の治療に使用することができることを示しているパッケージ挿入物を更に含む。あるいは、もしくは付加的に、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用の静菌水(ＢＷＦＩ)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二の(又は第三の)容器を更に具備してもよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。
【０２７０】
以下は、本発明の方法及び組成物の例である。上記に示す一般的な説明により、様々な他の実施態様が実施しうることは理解される。
【実施例】
【０２７１】
実施例１：抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を作製するためのイムノゲンの作製
ｈＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲ
ヒトＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲ(ｈＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲ)を含むイムノゲンを以下のように得た。
発現サブクローニング
参照配列および鋳型としてのヒトＮｏｔｃｈ１(ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１７６１７)の完全長クローンを使用して、４つのＰＣＲプライマの一セットを設定し、配列番号：５６のアミノ酸Ｖ１３０７からＱ１７３３にわたるＮｏｔｃｈ1の領域を増幅した。この領域はＥＧＦリピート３４−３６を含み、膜貫通ドメインの直前で終わる。５'プライマーは、遺伝子特異的な配列の上流の直近にＮ末端Ｆｌａｇタグを加えるように設定した。このドメインに対応するＰＣＲ産物は、制限酵素依存性クローニング(ＲＩＣ；Restriction Independent Cloning)手順を用いてＳｆ-９昆虫細胞からの分泌された発現のためにベクターＢ９.１にクローニングした。簡単にいうと、プライマーは、Ｐｆｕポリメラーゼ(Stratagene)を用いて作製した２つの独立したＰＣＲ産物に、ＢａｍＨＩとＥｃｏＲＩの制限酵素部位の部分を付加するために必要な５'伸展を含んでいた。これらＰＣＲ産物の変性及び再アニーリングにより、この産物の２５％がその５'末端及び３'末端のそれぞれにＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ突出を表すように適切なヌクレオチドを含んでいるＤＮＡ群が生成された。次いで、このＤＮＡ混合物を、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩによる制限酵素消化によって調製したＢ９.１ベクターにライゲーションした。結果として生じたコンストラクトは、ＤＮＡ配列を確認し、６９６.Ｇ４０.Ｖ２.Ｎｏｔｃｈ１.Ｖ１３０７-Ｑ１７３３(Ｎ−Ｆｌａｇ ).Ｂ９なる名称にした。ベクターＢ９.１は、ＢａｍＨＩクローニング部位の前にＧｐ６７分泌シグナル、Ｃ末端トロンビン切断部位およびＨｉｓタグを含有するｐＡＣＧＰ６７バキュロウイルスＤＮＡ導入ベクター(BD Pharmingen)の変更バージョンである。 
ヒトＮｏｔｃｈ１コンストラクトのクローニングに関連する配列を以下に示す。
【０２７２】
ＰＣＲプライマー：
フォワード：[Phosp]gatccGATTACAAAGATGACGATGACAAGggctctggtGTCATCAATGGCTGCAAAGGCAAG (配列番号：４８)
リバース：cCTGCGCCGGCGGGGGCGGCTCCACG (配列番号：４９)
フォワード：cGATTACAAAGATGACGATGACAAGggctctggtGTCATCAATGGCTGCAAAGGCAAG (配列番号：５０)
リバース：[phosp]aattcCTGCGCCGGCGGGGGCGGCTCCACG  (配列番号：５１)
大文字はＮｏｔｃｈ１遺伝子特異的な配列を表し、小文字は付加された制限酵素部位を表し、下線はＦｌａｇタグを表す。
【０２７３】
発現されたタンパク質のＤＮＡ配列：
0005623272.tif 000006
発現されたタンパク質配列：
0005623272.tif 000007
大文字はＮｏｔｃｈ１遺伝子特異的な配列を表し、小文字はＧｐ６７分泌シグナル、Ｎ末端Ｆｌａｇタグ、トロンビン部位、Ｃ末端Ｆｌａｇタグおよび発現ベクターによって付加されたいずれかの残基を表す。
【０２７４】
バキュロウイルス株(Stock)生成およびタンパク質産生
ヒトＮｏｔｃｈ１のアミノ酸Ｖ１３０７−Ｑ１７３３をコードするコンストラクトはＳｆ-９細胞において発現された。バキュロウイルス株は、ＤＮＡ導入ベクター[１０１Ｖ-１]：６９６.Ｇ４０.Ｖ２.Ｎｏｔｃｈ１.Ｖ１３０７-Ｑ１７３３(Ｎ−Ｆｌａｇ ).Ｂ９.１を用いて作製した(発現サブクローニングの項目を参照のこと)。製造業者の勧告に従って、導入ベクターＤＮＡは、ＢａｃＰａｋ６ＴＭ直線化ウイルスＤＮＡ(BD Clontech, Palo Alto CA)とＢａｃｆｅｃｔｉｎＴＭ(BD Clontech)とともに、ＥＳＦ９２１無タンパク質培地(Expression Systems LLC, Woodland CA.)中で２７℃で培養した接着性Ｓｆ-９昆虫細胞に同時形質移入した。生じたＰ１ウイルス株は２回増幅して、大規模なタンパク質産生のために使用するＰ３ウイルス株を生産した。ＥＳＦ９２１培地の懸濁液中で培養したＳｆ-９細胞は、細胞当たり０．３ウイルス粒子の予測感染効率(ＭＯＩ)を用いて１から２×１０６細胞／ｍｌの密度で感染させ、感染時の３〜５日後に回収した。Ｓｆ-９細胞は遠心分離法にて取り除き、生じたウイルス株を濾過し確実に無菌にし、３％熱不活性化ウシ胎児血清(ＦＢＳ)をウイルス安定性のために加えた。すべてのウイルス株は４℃で保存した。[１０１Ｖ-１]:６９６.Ｇ４０.Ｖ２.Ｎｏｔｃｈ１.Ｖ１３０７-Ｑ１７３３(Ｎ-Ｆｌａｇ).Ｂ９.１コンストラクトを含むウイルス株は、Ｓｆ-９細胞に効率よく感染し、組み換えタンパク質を発現することが示された。 
[１０１Ｖ-１]:６９６.Ｇ４０.Ｖ２.Ｎｏｔｃｈ１.Ｖ１３０７-Ｑ１７３３(Ｎ-Ｆｌａｇ).Ｂ９.１コンストラクトは、１１及び１６リットルのスケールで２回の発酵において発現された。無タンパク質培地の懸濁液増殖に適応するＳｆ-９細胞が、発酵に使われた。細胞は、同様な操作条件下にて種バイオリアクターから２×１０６細胞／ｍｌ以下の濃度の細胞を生産容器に播種した。ＥＳＦ９２１培地中で２７℃で発酵を行い、応需及び継続ヘッドスペース通気の散布酸素を用いて溶存酸素レベルを５０％の空気飽和度に調節した。バイオリアクターは、用いる容器に応じて、２ピッチの羽根又は１つの平らな羽根を用いて１００ｒｐｍの撹拌で操作した。細胞は、２４から４８時間にわたって、２．０から２．７×１０６細胞／ｍｌ以下の濃度の感染ポイントまで生育し、次いで、Ｎｏｔｃｈ１ポリペプチドコード化ウイルス株にて、０．５ウイルス粒子／細胞のＭＯＩで感染させた。細胞は、感染の兆候(成長の停止、細胞直径の増加)についてモニターし、更に６５〜７２時間生育させた。結果として生じた培地を冷やし、遠心分離にて回収し、すぐにタンパク質精製を行った。
【０２７５】
ｈＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲ含有イムノゲンの精製
コンストラクト６９６.Ｇ４０.Ｖ２.Ｎｏｔｃｈ１.Ｖ１３０７-Ｑ１７３３(Ｎ-Ｆｌａｇ).Ｂ９.１によってコードされるポリペプチドを発現するＳＦ９細胞の上清培地を、氷冷バッファＡ(５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７.５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、及び０.５ｍＭ フッ化フェニルメチルスルホニル)にて希釈し(ｖ／ｖ＝１：４)、１５〜２０分間バッチ結合させ、培地１リットルにつき２ｍｌの樹脂の割合で予めＮｉ−ＮＴＡスーパーフロー樹脂(Qiagen, Product No. 30450)を平衡化した。０．８μｍフィルター(Nalgene, Product No. 450-0080)による濾過によってＮｉ−ＮＴＡ親和性樹脂を回収し、その後適切な重力点滴カラム(gravity drip)(ｄ：ｈ  １：１０)に詰めた。カラムは、１０カラム容量(ＣＶ)の氷冷バッファＢ(５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ ７.５、１０００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２及び１０ｍＭ イミダゾール)にて洗浄した後、１０ＣＶの無ＰＭＳＦバッファＡにて洗浄した。次いで、カラムは、２５０ｍＭのイミダゾール(無ＰＭＳＦ)を含む５ＣＶのバッファＡにて溶出した。溶出されたタンパク質は、製造業者の勧告に従って、Ａｍｉｃｏｎウルトラ濃縮器(３０００ ＭＷＣＯ)を用いて濃縮し、バッファをＰＤ−１０カラム(GE Healthcare)を用いて貯蔵バッファ(１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ ７.５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ及び５ｍＭ ＣａＣｌ２)に交換した。タンパク質純度は、クーマシー染色によるＳＤＳ−ＰＡＧＥによるところ９０％を上回ると推定された。精製されたタンパク質の濃度は、標準物質としてＢＳＡを用いたＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ(Coomassie Plus kit, Pierce、カタログ番号２３２３６)によって推定した。タンパク質のトリプシン消化の質量分析によるペプチド配列決定を用いて同一性を確認した。
【０２７６】
ｍＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲ
マウスＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲ(ｍＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲ)を含むイムノゲンを以下のように得た。  
マウスＮｏｔｃｈ１(配列番号：５７)のアミノ酸Ｖ１３０７からＱ１７２３にわたる配列をサブクローニングし、一般にヒトＮｏｔｃｈ１イムノゲンについて上記したように発現させた。マウスＮｏｔｃｈ１のこの領域はＥＧＦリピート３４−３６を含み、膜貫通ドメインの直前で終わる。このイムノゲンを発現するコンストラクトを６４７９４.Ｇ１.Ｎｏｔｃｈ１.Ｖ１３０７-Ｑ１７２３ (Ｎ-Ｆｌａｇ, Ｃ-Ｈｉｓ).ｐＲＫ５-ＧＮＥと称する。マウスＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲに対する抗体を生成するために用いたイムノゲンのための発現タンパク質のアミノ酸配列は以下の通りであり、Ｎ末端ＦＬＡＧタグ及びＣ末端Ｈｉｓタグを含む。
0005623272.tif 000008
上記の配列のＮ末端(配列番号：１４のアミノ酸MGGTAARLGA VILFVVIVGL HGVRG)はタンパク質を発現する細胞によって切り離される。それ自体は、マウスＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲ特異的な抗体を生成するために用いたイムノゲンはこのＮ末端配列を欠く。
【０２７７】
タンパク質産生
マウスＮｏｔｃｈ１のアミノ酸Ｖ１３０７からＱ１７２３をコードするコンストラクトは、無血清懸濁培地 (FreeStyle 293-F Cells Invitrogen カタログ＃Ｒ７９０−０７)に適用したＦｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３-Ｆ細胞において過渡的に発現させた。
細胞は、ＧＩＢＣＯ(登録商標)ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３発現培地(Invitrogen カタログ＃１２３３８−０１８)にて培養した。細胞は、１２５ｒｐｍで回転する環状振とうプラットフォーム上で８％ＣＯ２の加湿大気中で３７℃でインキュベートした振とうフラスコ中で０．３から３×１０６生細胞／ｍｌの濃度に維持した。形質移入の前日に、５×１０５生細胞／ｍｌの濃度の細胞を播いた。形質移入の日に、生存率と濃度について細胞を調べた(＞９０％、１×１０６細胞／ｍｌ)。各々の形質移入のために、脂質−ＤＮＡ複合体を以下のように調製した。１×１０６細胞／ｍｌの細胞５００ｍｌにつき、５００μｇのプラスミドＤＮＡを、４０ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ(登録商標) I (Invitrogen カタログ＃５１９８５−０３４)、５００μｌのポリエチレンイミン  １．５μｇ／ｍｌ溶液（ＰＥＩポリエチレンイミン、線状、ＭＷ２５０００ Polysciences カタログ＃９００２−９８−６)にゆっくりと加えた。混合物を穏やかに混合し、室温で２０〜３０分間インキュベートして、ＤＮＡ−脂質複合体を形成させた。次いで、ＤＮＡ−脂質複合体を細胞にゆっくり加え、３日間のインキュベートの後に培地を回収した。
ｍＮｏｔｃｈ１コンストラクトは１リットルにて２回行い発現させた。細胞は、０．９〜１×１０６細胞／ｍｌの濃度で形質移入し、６５〜７５時間後、細胞が２．２〜２．５×１０６／ｍｌの濃度かつ７５〜７８％生存率の時に培地を回収した。
結果として得た培地を冷やし、遠心分離にて回収した後すぐにＮＲＲを含むマウスＮｏｔｃｈ１ポリペプチドの精製に用いた。
【０２７８】
ｍＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲを含むイムノゲンの精製
抗ＦＬＡＧ Ｍ２アガロース(Sigma-Aldrich、製造番号Ａ２２２０)を用いたバッチモードにより、イムノゲンをＨＥＫ２９３分泌培地から精製した。バッファＢ(５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２)の抗ＦＬＡＧ Ｍ２アガロースは、ＥＤＴＡプロテアーゼインヒビター(培地１リットルにつき２０錠、Roche)を含まない分泌培地含有完全培地に、培地１リットルにつき５ｍｌのアガロースの比率で加えた。次いで培地を一定の回転で３時間４℃でインキュベートした。０．８μｍフィルター(Nalgene、製造番号４５０−００８０)による濾過によって抗ＦＬＡＧアガロースを回収し、重力フローカラム(gravity flow)(BioRad、製造番号７３１−０００３)に詰めた。アガロースは、１０カラム容量のバッファＢにて洗浄し、その後タンパク質を４カラム容量の０．１ｍｇ／ｍｌ ＦＬＡＧペプチド(Sigma-Aldrich、製造番号Ｆ３２９０)を含むバッファＢにて溶出した。溶出されたタンパク質は、Ａｍｉｃｏｎウルトラ濃縮器(１００００  ＭＷＣＯ、Millipore、製造番号ＵＦＣ９０１０９６)を用いて濃縮し、バッファをＰＤ−１０カラム(GE Healthsciences、製造番号１７−０８５１−０１)を用いて貯蔵バッファ(１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７.５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、５％グリセロール)に交換した。純度は、逆相ＨＰＬＣにて９２％を上回ると推定された。濃度は、標準物質としてＢＳＡを用いたＢｒａｄｆｏｒｄアッセイ(Coomassie Plus kit、Pierce、カタログ番号２３２３６)によって推定した。タンパク質の同一性は、質量分析によるタンパク質トリプシン消化のペプチド配列決定により確認した。
【０２７９】
実施例２：抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体の生成
抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体は以下のように生成した。
抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体を同定するためのライブラリ選別とスクリーニング
ヒトＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲタンパク質イムノゲン(上記のもの)を抗原として用いた。ＮＵＮＣ９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐイムノプレートを標的抗原(１０μｇ／ｍｌ)にて４℃で終夜コートして、ファージ遮断(ブロック)バッファＰＢＳＴ(リン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)と１％(w/v)ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)と０．０５％(v/v)Ｔｗｅｅｎ２０)にて室温で１時間かけて遮断した。Ｆａｂ断片を表示する抗体ファージライブラリ(例としてLee et al., J. Immunol. Meth. 284:119-132, 2004を参照)を抗原プレートに加え、室温で終夜インキュベートした。翌日、抗原コートプレートをＰＢＴ(０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ)にて１０回洗浄し、結合したファージを５０ｍＭ ＨＣｌと５００ｍＭ ＮａＣｌにて３０分間かけて溶出し、等量の１Ｍトリス塩基ｐＨ７．５にて中和した。回収したファージを大腸菌ＸＬ-１ブルー細胞中で増幅させた。その後の選別ラウンドの間、抗原コートプレートとの抗体ファージのインキュベートを２〜３時間に短縮し、プレート洗浄のストリンジェンシーを徐々に上げた。
４回のパニングの後、顕著な濃縮が観察された。１９０のクローンを拾い、これらがヒトＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲに特異的に結合したか否かを決定し、１９０すべてのクローンをＰＣＲ配列決定し、固有の配列クローンを同定した。
【０２８０】
ヒト及びマウスのＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲに結合したファージ抗体を同定するために、すべての固有のクローンをＥＬＩＳＡによりヒト及びマウスのＮｏｔｃｈ１への結合について試験した。この実施例で後述するように、ファージ抗体の親和性は単一スポット競合ＥＬＩＳＡを用いて分類した。さらに、基本的にLee, C. V., et al. (2004) J Mol Biol 340, 1073-93に記載される競合的ファージ-結合ＥＬＩＳＡを用いて、ファージ抗体ＩＣ５０値を決定した。簡単にいうと、ＮＵＮＣ９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐイムノプレートを１ｕｇ／ｍｌのヒトＮＲＲ１又はマウスＮＲＲ１にて４℃で終夜コートし、ブロックバッファＰＢＳＴ(ＰＢＳと１％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０)にて室温で１時間かけて遮断した。ファージを段階的に希釈したヒト又はマウスのＮＲＲ１と室温で１時間かけて混合し、その後混合物をヒト及びマウスのＮＲＲ１コートプレートに加えた。結合したファージを抗Ｍ１３ ＨＲＰコンジュゲートにて検出し、およそ５分間、ＴＭＢ基質と反応させ、１Ｍ Ｈ３ＰＯ４にて反応を止め、４５０ｎｍを分光測定で読み取った。競合曲線を４-パラメータ非線形回帰曲線フィッティングプログラム(Kaleidagraph、Synergyソフトウェア)にあてはめて、ファージディスプレイ抗体の固定抗原への結合が５０％阻害される溶液結合段階での抗原の濃度として算出されるＩＣ５０値を決定した。
抗体Ａ、ＢおよびＣは、ＬＰＧ３およびＬＰＧ４ベクターのそれぞれに別々のクローンのＶＬ及びＶＨ領域をクローニングし、哺乳類のＣＨＯ細胞において過渡的に発現させ、プロテインＡカラムにて精製することによって、再編成した。これらクローンは、ヒト及びマウスのＮｏｔｃｈ２ ＮＲＲ、Ｎｏｔｃｈ３ ＮＲＲ及びＮｏｔｃｈ４ ＮＲＲの一又は複数への交差反応、及び実施例５に記載の共培養アッセイを用いたブロック活性について試験した。この特徴づけの結果を表３に示す。
表３：抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ ＩｇＧの特徴付け
0005623272.tif 000009
* ＩＣ５０〜１００ｎｇ／ｍｌ 
ＮＤ＝未測定
【０２８１】
ＶＨライブラリから得られたクローンの親和性改善のためのコンストラクトライブラリ
抗体Ａを親和性改善のために選択した。プラスミドｐＷ０７０３(プラスミドｐＶ０３５０-２ｂ由来(Lee et al., J. Mol. Biol 340, 1073-1093 (2004))、すべてのＣＤＲ−Ｌ３位置に停止コドン(ＴＡＡ)を含み、Ｍ１３バクテリオファージの表面上に一価のＦａｂを提示している)を、親和性成熟のためのＶＨライブラリからの対象のクローンの重鎖可変ドメイン(ＶＨ)のためのライブラリテンプレートとして用いた。ハード及びソフトランダム化方策を親和性成熟のために用いた。ハードランダム化(hard randomization)では、３つの軽鎖ＣＤＲの選択した位置を有する１つの軽鎖ライブラリを、天然のヒト抗体を模倣するように設定したアミノ酸を用いてランダム化し、設定したＤＮＡ縮重はLee et al. (J. Mol. Biol 340, 1073-1093 (2004))に記載される通りであった。ソフトランダム化(soft randomization)では、ＣＤＲ-Ｌ３の位置９１−９４及び９６、及びＣＤＲ-Ｈ１の２８−３１及び３４−３５、ＣＤＲ-Ｈ２の５０、５２及び５３−５８、ＣＤＲ-Ｈ３の９５−９９及び１００Ａの残基を標的とし、２つの異なるＣＤＲループの組合せであるＬ３／Ｈ１／Ｈ２およびＬ３／Ｈ３をランダム化のために選択した。選択した位置でおよそ５０％の変異率となるソフトランダム化状態を達成するために、突然変異誘発ＤＮＡを、７０−１０−１０−１０混合の野生型ヌクレオチドを好む(favoring)塩基により合成した(Gallop et al., Journal of Medicinal Chemistry 37:1233-1251 (1994))。
【０２８２】
親和性改善を生成するためのファージ分類方策 
親和性改善選別のために、ファージライブラリは、第１ラウンドではプレート分類に、その後３回のラウンドでは溶液分類に用いた。プレート分類の第１ラウンドでは、３つのライブラリを、標的(ヒトＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲ−ＥＣＤ)コートプレート(NUNC Maxisorpプレート)に対して別々に分類した。ファージインプットは、３７℃、２時間で、１％ＢＳＡおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中でおよそ３Ｏ.Ｄ／ｍｌであった。プレート分類の第１ラウンドの後、溶液分類を３〜４回行って、選別のストリンジェンシーを上げた。溶液分類では、プレート分類の第１ラウンドにて増殖した１Ｏ.Ｄ.／ｍｌのファージを、２０ｎＭのビオチン化標的タンパク質(ここでは濃度は親のクローンファージＩＣ５０値を基にしている)を含む、１％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ(Pierce Biotechnology)と０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１００μｌのバッファ中で室温で３０分間インキュベートした。さらに、混合物を１％Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋにて１０倍に希釈し、１００μｌ／ウェルをニュートラビジンコートウェルに添加し(５μｇ／ｍｌ)、室温で５分間、ゆっくりと撹拌しながら、ビオチン化標的をファージに結合させた。ウェルをＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０にて１０回洗浄した。バックグラウンド結合を決定するために、ビオチン化していない標的を有するファージを含むコントロールウェルをニュートラビジンコートプレート上で捕獲した。結合したファージを０．１Ｎ ＨＣｌにて２０分間溶出し、１／１０量の１Ｍ トリスｐＨ１１にて中和し、力価を測定して、次のラウンドのために増殖させた。次に、２回又は３回目以降のラウンドの溶液分類はともに、選択ストリンジェンシーを高めた２つの方法により実施した。その一つ目は、２ｎＭから０．１ｎＭにビオチン化標的タンパク質濃度を減少することによるオンレート(on-rate)選択であり、その二つ目は、弱い結合物を完全に除くために過剰量(１００〜１０００倍以上)の非ビオチン化標的タンパク質を添加することによるオフレート(off-rate)選択である。また、ファージインプットはバックグラウンドファージ結合を低くするために低くした(０．１〜０．５Ｏ.Ｄ／ｍｌ)。 
【０２８３】
ハイスループット親和性スクリーニングＥＬＩＳＡ(単一スポット競合)
第３および第４ラウンドのスクリーニング物からコロニーを拾い、９６ウェルプレート(Falcon)中で５０μｇ／ｍｌカルベニシリンと１Ｅ１０／ｍｌのＫＯ７を含む１５０μｌ／ウェルの２ＹＴ培地にて３７℃で終夜生育させた。同じプレートから、ＸＬ-１感染親ファージのコロニーをコントロールとして拾った。９６ウェルNunc Maxisorpプレートを、１００μｌ／ウェルの標的タンパク質(２μｇ／ｍｌ)を含むＰＢＳにて、４℃で終夜又は室温で２時間かけてコートした。６５μｌの１％ ＢＳＡにて３０分間、そして４０μｌの１％ Ｔｗｅｅｎ２０にてさらに３０分間置いて、プレートをブロックした。
ファージ上清を、１０ｎＭの標的タンパク質を含む又は含まないＥＬＩＳＡ(酵素結合吸着アッセイ)バッファ(０．５％ＢＳＡと０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ)にて１:１０に希釈して全量を１００μｌとし、Ｆプレート(NUNC)にて室温で少なくとも１時間インキュベートした。標的タンパク質を含む又は含まない７５μｌの混合物を、標的タンパク質コートプレートに並んで移した。プレートを１５分間緩やかに振とうし、標的タンパク質コートプレートに結合していないファージを捕獲させた。プレートを、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０にて少なくとも５回洗浄した。結合は、ＥＬＩＳＡバッファ(１：５０００)に西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)結合抗Ｍ１３抗体を加えて定量し、室温で３０分間インキュベートした。ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０にて少なくとも５回ウェルを洗浄した。次に、３,３',５,５'-テトラメチルベンジジン(ＴＭＢ)ペルオキシダーゼ基質とペルオキシダーゼ溶液Ｂ(Ｈ２Ｏ２)((Kirkegaard-Perry Laboratories (Gaithersburg, MD))を１：１の比率で含む１００μｌ／ウェルの溶液をウェルに加えて、室温にて５分間インキュベートした。各ウェルに１００μlの１Ｍリン酸(Ｈ３ＰＯ４)を加えることによって反応を止め、室温で５分間インキュベートした。各ウェルの黄色の４５０ｎｍのＯＤ(光学密度)を、標準的なＥＬＩＳＡプレート読み込み器を用いて定量した。ＯＤ減少(％)は、以下の方程式によって算出した。
ＯＤ４５０ｎｍ減少(％)＝[(競合物質を含むウェルのＯＤ４５０ｎｍ)／(競合物質を含まないウェルのＯＤ４５０ｎｍ)]＊１００
【０２８４】
親ファージのウェルのＯＤ４５０ｎｍ減少(％)(１００％)と比較して、５０％より低いＯＤ４５０ｎｍ減少(％)を有するクローンを配列分析に選択した。ファージ調製のために固有のクローンを選択し、親クローンとの比較のために結合親和性(ファージＩＣ５０)を決定した(表４)。 
表４：親和性成熟抗体クローンの特徴付け
0005623272.tif 000010
ＮＲＲ１＝Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ
【０２８５】
実施例３：抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体の特徴付け
さらに抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ Ｍａｂの結合親和性と結合動態を特徴付けるために、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ-３０００にて表面プラスモン共鳴(ＳＲＰ)測定値を用いた(BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)。簡単に言うと、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5、BIAcore Inc.)を、提供者の指示書に従ってＮ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミノプロピル)-カルボジイミド塩酸塩(ＥＤＣ)とＮ-ヒドロキシスクシニミド(ＮＨＳ)にて活性化した。ウサギ抗ヒト抗体(Pierce)を１０ｍＭ 酢酸ナトリウム(ｐＨ４．８)にて２０μｇ／ｍｌに希釈し、結合した抗体の反応単位(ＲＵ)がおよそ３０００になるように５μｌ／分の流速で注入した。次に、反応しない群をブロックするために１Ｍのエタノールアミンを注入した。およそ２００反応単位(ＲＵ)を達成するために、抗ＮＲＲ１ ｍａｂ(完全長ＩｇＧとしてフォーマットしたもの)をチップ上にコートしたウサギ抗ヒトＩｇＧによって捕獲させた。動力学的な測定のために、２倍の段階希釈したヒトＮＲＲ１−ＥＣＤ又はマウスＮＲＲ１−ＥＣＤタンパク質(３．９ｎＭから５００ｎＭ)を、２５℃、３０μｌ／分の流速でＰＢＴバッファ(０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ)に注入した。単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model) (BIAcore Evaluationソフトウェアバージョン３.２)を用いて、会合速度(ｋｏｎ)と解離速度(ｋｏｆｆ)を算出した。平衡解離定数(ＫＤ)をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として算出した。
この実験の結果を表５に示す。「ＮＡ」は測定が行われなかったことを表す。  
表５：抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体のヒト及びマウスのＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲ含有ポリペプチドに対する結合の結合親和性と動態
0005623272.tif 000011
【０２８６】
実施例４：抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体エピトープの特徴付け
抗体Ａ、Ａ−１及びＡ−２の結合決定因子を調べるために、ヒト及びマウスのＮｏｔｃｈ１断片を用いて結合実験を行った。
これらの実験において以下のタンパク質を用いた。
(1) 上掲の実験１に記載の、ｈＦＬＡＧ−ＥＧＦ３４＋ＮＲＲ−Ｈｉｓ６ (１０１Ｖ)−ヒトＮｏｔｃｈ１イムノゲン。
(2) ｈＦＬＡＧ−ＮＲＲ−Ｈｉｓ６ (１０２Ｖ)：ヒトＮｏｔｃｈ１のアミノ酸Ｅ１４４７−Ｑ１７３３、ＦＬＡＧタグ、ＨＩＳタグ及びトロンビン切断部位を含む。Ｎｏｔｃｈ１タンパク質はＬＮＲ＿Ａ、ＬＮＲ＿Ｂ、ＬＮＲ＿Ｃ、ＨＤ＿Ｎ、ＨＤ＿Ｃの配列を含む。このタンパク質はいずれのＥＧＦ様リピート配列も含まない。
(3) ｈＦＬＡＧ−ＨＤ−Ｈｉｓ６(１０３Ｖ)；ヒトＮｏｔｃｈ１のアミノ酸Ｒ１５６８−Ｑ１７３３、ＦＬＡＧタグ、トロンビン切断部位及びＨＩＳタグを含む。Ｎｏｔｃｈ１タンパク質はＬＨＤ＿Ｎ及びＨＤ＿Ｃの配列を含む。このタンパク質はいずれのＥＧＦ様リピート配列も含まず、３つのＬＮＲ領域も含まない。
(4) ｍＦＬＡＧ−ＥＧＦ３４＋ＮＲＲ−Ｈｉｓ６：上記の実施例１に記載の、マウスイムノゲン。
(5) ｍＥＧＦ３４＋ＮＲＲ−Ｌ１５９７Ｈ−ＦＬＡＧ−ＴＥＶ−Ｆｃ：Ｌ１５９７Ｈ変異を有するマウスＮｏｔｃｈ１のアミノ酸Ｖ１３０７−Ｑ１７２３、Ｆｌａｇタグ、Ｆｃタグ及びＴＥＶプロテアーゼ部位を含む。Ｌ１５９７Ｈ変異によりＮｏｔｃｈ１が活性化され、この変異は例えば Weng et al., Science 306:269-271, 2004に記載されている。 
(6) Ｆｌａｇコントロール：Ｆｌａｇタグを含むコントロールポリペプチドである。
(7) Ｈｉｓコントロール：ＨＩＳタグを含むコントロールポリペプチドである。
【０２８７】
ＥＬＩＳＡプロトコール：
４℃で終夜をかけて、１μｇ／ｍｌのタンパク質を含むＰＢＳ, ｐＨ７．４をＥＬＩＳＡプレート(Nunc Maxisorp)上にコートした。室温で１時間かけて、カゼインブロッカーを含むＰＢＳ(リン酸緩衝生理食塩水；Pierce)にてプレートをブロックした。ＰＢＳＴバッファ(０．５％(w/v)ＢＳＡを含むＰＢＴバッファ(ＰＢＳ＋０．０５％(v/v)Ｔｗｅｅｎ２０))にて段階的に３倍希釈した抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ ＩｇＧ又は無関係のＩｇＧをプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳＴにて洗浄し、結合した抗体をペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＦａｂ特異的ＩｇＧ(Sigma)にて検出した。ＴＭＢ基質(３,３',５,５'-テトラメチルベンジジン)を用いて、標準的なＥＬＩＳＡプレート読み取り機を用いて６５０ｎＭの吸光度を読み取った。吸光度は、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ(Synergy Software)を用いてＩｇＧの濃度に対してプロットした。
この実験の結果を、図１２Ａ(抗体Ａ−ｈＩｇＧ１)、１２Ｂ(抗体Ａ−１−ｈＩｇＧ１)、および１２Ｃ(抗体Ａ−２−ｈＩｇＧ１)に示す。抗体Ａ、Ａ−１及びＡ−２は、ポリペプチドｈＦＬＡＧ−ＥＧＦ３４＋ＮＲＲ−Ｈｉｓ６(１０１Ｖ)、ｈＦＬＡＧ−ＮＲＲ−Ｈｉｓ６(１０２Ｖ)、ｈＦＬＡＧ−ＨＤ−Ｈｉｓ６(１０３Ｖ)、ｍＦＬＡＧ−ＥＧＦ３４＋ＮＲＲ−Ｈｉｓ６を結合し、Ｎｏｔｃｈ１配列を欠くコントロールポリペプチドを結合しなかった。これらの結果は、Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲドメインが抗体Ａ、抗体Ａ−１及び抗体Ａ−２の結合に十分であることを示す。また、抗体Ａ、Ａ−１及びＡ−２は、Ｎｏｔｃｈ１活性化変異Ｌ１５９７Ｈを含むタンパク質ｍＥＧＦ３４＋ＮＲＲ−Ｌ１５９７Ｈ−ＦＬＡＧ−ＴＥＶ−Ｆｃを結合した。この結果は、抗体が変異Ｎｏｔｃｈ１レセプターに結合することができることを示す。
【０２８８】
実施例５：抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体の機能アッセイ
Ｎｏｔｃｈ１レポーターアッセイ
Ｎｏｔｃｈ１レポーターアッセイ(「共培養アッセイ」とも称される)を行って、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体のＮｏｔｃｈ１シグナル伝達阻害能を測定した。簡単にいうと、アッセイは以下の工程を伴う。
(1) ヒトＮｏｔｃｈ１を発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞はＮｏｔｃｈシグナル伝達に応答するルシフェラーゼレポータープラスミドにより形質移入された。
(2) 細胞を抗体又は様々なコントロール試薬にて処理した。
(3) ヒトＪａｇｇｅｄ１を安定して発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞を加えることによりシグナル伝達を開始した。
(4) レポータープラスミドから発現されるルシフェラーゼ活性を測定することにより、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のレベルを評価した。
【０２８９】
更に詳細には、アッセイは以下の通りに実行した。
(1) ヒトＮｏｔｃｈ１(Ｎ１)を安定して発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、黒色壁の透明ウェルの９６ウェルプレートに、１０％ＦＢＳを含むが抗生物質を含まないＤＭＥＭ高グルコース培地に、１ウェル当たり５０００細胞をプレーティングした。細胞は５％ＣＯ２、３７℃で１６時間インキュベートした。次いで、培地を無血清のＤＭＥＭに交換し、１００ｎｇ／ウェルのＴＰ−１(ＣＳＬプロモーター、Ｎｏｔｃｈ活性化に応答性)ルシフェラーゼプラスミド(例えばMinoguchi et al., Mol. Cell. Biol. 17:2679-2687 (1997)を参照)と５ｎｇ／ｍｌのｐＲＬ−ＣＭＶウミシイタケルシフェラーゼレポーター(Promega)にて、細胞を形質移入した。形質移入は５％ＣＯ２、３７℃で６時間続け、４時間目に血清を戻し添加した。
(2) ６時間の終わりに、形質移入試薬を含む培地を吸引によって除去し、５０μｌのＤＭＥＭ／ＦＢＳを以下のように加えた。Ａ．新鮮培地(偽刺激のためのコントロールＮＩＨ−３Ｔ３細胞親細胞を投与した後)、Ｂ.新鮮培地(１０％ＦＢＳを有するＤＭＥＭ)、Ｃ.４００ｎｇ／ｍｌのヒトＩｇＧアイソタイプコントロール抗体、４つの異なる濃度(Ｄ．１６ｎｇ／ｍｌ、Ｅ．８０ｎｇ／ｍｌ、Ｆ．４００ｎｇ／ｍｌ、Ｇ．２０００ｎｇ／ｍｌ)の抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体Ａ、Ｈ.精製したＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲタンパク質(１ウェル当たり５μｇ)とともに３０分間予めインキュベートした４００ｎｇ／ｍｌの抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体Ａ、Ｉ．Ｈのように処理したＮｏｔｃｈ１ ＮＲＲタンパク質と４００ｎｇ／ｍｌのヒトＩｇＧアイソタイプコントロール抗体、Ｊ．ＢＳＡタンパク質を戻し添加して(６．５μｇ／ウェル)３０分間予めインキュベートした４００ｎｇ／ｍｌの抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体Ａ、Ｋ.１μＭの化合物Ｅ(γ-分泌酵素インヒビター；Ｃ２７Ｈ２４Ｆ２Ｎ４Ｏ３；Seiffert et al., J. Biol. Chem. 275:34086, 2000)、及び、Ｌ．ＤＭＳＯコントロール(化合物Ｅ溶媒のみ)。上記した試薬は、５％ＣＯ２、３７℃で１時間形質移入したＮＩＨ−３Ｔ３−Ｎｏｔｃｈ１細胞とともにインキュベートした。
【０２９０】
ヒトＪａｇｇｅｄ１リガンドを安定して発現する５０００のＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、細胞がＮＩＨ−３Ｔ３親系統であるＪを除き、各ウェルに加えた。次いで、プレートを５％ＣＯ２、３７℃で２３時間インキュベートした。
ホタル(ＴＰ１)およびウミシイタケ(ｐＲＬ-ＣＭＶ)ルシフェラーゼ活性は、Ｄｕａｌ-Ｇｌｏルシフェラーゼキット(Promega)により測定した。Ｎｏｔｃｈシグナル伝達のレベルは、ホタル読み値をウミシイタケ読み値にて除し、各条件の８回分を平均化することによって算出した。結果を図７に示し、ここで誤差バーは８回分の標準偏差を表す。
図７に示すように、抗体Ａは強力なＮｏｔｃｈ１インヒビターである。ＴＰ１−Ｌｕｃレポーターを用いて測定されるように、抗体ＡはＮｏｔｃｈシグナル伝達を阻害する。抗体の力価を示す。４００ｎｇ／ｍｌの抗体では、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達はコントロールの１８％、「オン」レベル(４００ｎｇ／ｍｌのアイソタイプコントロールを用いて観察されるシグナル伝達のレベル)にまで抑制される。さらに、ＢＳＡコントロールでなく溶液ＮＲＲの添加により、シグナル伝達への抗体が誘導するブロックが低減したことから、シグナル伝達の抗体阻害は抗体−Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ相互作用によるものであることが示唆された。γ-分泌酵素インヒビターである化合物Ｅを、阻害を示すためのコントロールとして用いた。他のコントロールとして、Ｊａｇｇｅｄ１発現細胞を親細胞(ＮＩＨ−３Ｔ３単独、Ｊａｇｇｅｄ１なし)と置き換えると、完全なシグナル伝達を誘導しなかったことから、シグナル伝達はＪａｇｇｅｄ１が必要であることを示唆する。
先に用いた共培養アッセイ法を用いて、様々な濃度の処理による、その親和性成熟相対物である抗体Ａ−１、抗体Ａ−２及び抗体Ａ−３と抗体Ａとを比較した。８０ｎｇ／ｍｌの抗体で明らかなように、抗体Ａ−２及び抗体Ａ−３は、抗体ＡよりもＮｏｔｃｈシグナル伝達を強力にブロックした(図８)。
【０２９１】
Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞分化アッセイ
分化培地にて処理した場合、マウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞は筋管に分化する。Ｊａｇｇｅｄ１リガンド発現細胞とともに培養すると、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を刺激することによって分化が阻害される。以下に詳細に示すように、抗体ＡのＮｏｔｃｈ１シグナル伝達阻害能と一致して、抗体Ａの添加により分化が回復された。コントロールとして、γ分泌酵素インヒビターも分化を回復した。
特に、マウスＣ２Ｃ１２筋芽細胞は、滅菌丸底の１０ｍｍカバースリップを有する２４ウェル組織培養ディッシュに、１ｍｌ当たり２．５×１０４細胞を、１ウェルに１ｍｌ用いてプレーティングした。次いで、細胞を接着させ、５％ＣＯ２、３７℃で成長培地(１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ)中で２２時間生育させた。次いで、成長培地を吸引し、分化培地(ＤＭ)(６％ウマ血清を含むＤＭＥＭ)を加えた。Ａ. ＤＭ単独、Ｂ．３Ｔ３−Ｊ１細胞を含むＤＭ、Ｃ．ＮＩＨ−３Ｔ３−Ｊａｇｇｅｄ１とヒトＩｇＧアイソタイプコントロール抗体を含むＤＭ、Ｄ．３Ｔ３−Ｊ１細胞と２００ｎｇ／ｍｌの抗体Ａを含むＤＭ、Ｅ．ＮＩＨ−３Ｔ３−Ｊａｇｇｅｄ１細胞とＤＭＳＯ(ベヒクル)を含むＤＭ、Ｆ．３Ｔ３−Ｊ１細胞と１μＭの化合物Ｅ(γ-分泌酵素インヒビター)を含むＤＭにより、細胞を処理した。これらの条件下で５％ＣＯ２、３７℃で４日間細胞をインキュベートした。カバースリップを回収し、細胞を４％パラホルムアルデヒドにて固定し、０．２％トリトンＸ-１００を含むＰＢＳにて透過処理した。次いで、細胞を１０％ＦＢＳを含むＰＢＳにてブロックした。ミオシン重鎖を認識する抗体(Millipore、抗ミオシンＨＣ、クローンＡ４.１０２５腹水)と、Ａｌｅｘａ(登録商標)４８８に結合したヤギ抗マウスＩｇＧ(Ｈ＋Ｌ)二次抗体(Molecular Probes)を用いて分化した筋管を染色した。ＤＡＰＩを用いて核を対比染色した。各条件について３つの異なるフィールドの画像を撮った。画像のサブセットを図１０に示す。Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア(Molecular Devices)を用いて核の数とＡｌｅｘａ(登録商標)４８８染色の領域を数えた。Ａｌｅｘａ(登録商標)４８８染色の領域を、核の数で除し、平均してグラフ化した。誤差バーは、３つの画像の標準偏差を表す。これらの結果を図９に示す。
【０２９２】
実施例６：野生型及び変異型のＮｏｔｃｈ１レセプターによるシグナル伝達を阻害する抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体
基本的には上記のように、リポフェクタミン及びリポフェクタミンプラス試薬(Invitrogen)とヒトＪａｇｇｅｄ１を安定して発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞とを用いて、Ｌ１５９４Ｐ変異Ｎｏｔｃｈ１レセプター、ＤｅｌＰＥＳＴ変異Ｎｏｔｃｈ１レセプター及び野生型(ｗｔ)Ｎｏｔｃｈ１レセプターをコードするＴＰ−１及びｐＲＬ−ＣＭＶプラスミドにて過渡的に形質移入したＮＩＨ−３Ｔ３細胞を用いて、ルシフェラーゼレポーター共培養アッセイを行った。Ｌ１５９４Ｐ変異は、ＨＤ−Ｎドメインのアミノ酸(ａａ)１５９４で、ロイシンからプロリンへの突然変異を意味する(例としてWeng et al., Science 306:269-271, 2004を参照)。ＤｅｌＰＥＳＴは、ａａ２４７３から始まるＰＥＳＴドメインのカルボキシル末端欠失を意味する(例としてMalecki et al., Mol. Cell. Biol. 26:4642-4651, 2006を参照)。発表されている結果と一致して、図１３に示す結果から、Ｌ１５９４ＰとＤｅｌＰＥＳＴ変異がＮｏｔｃｈ１シグナル伝達を活性化することが確認される。同じアイソタイプの無関係なファージ由来モノクローナル抗体を使用したネガティブコントロールと関連して、抗体Ａは、用量依存的な様式で各々３つのレセプターによるシグナル伝達を阻害した。ＤＭＳＯに溶解したγ分泌酵素インヒビターである化合物Ｅ(ＣｍｐＥ)は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達の阻害のポジティブコントロールとして用いた。黒色バーは２０００ｎｇ／ｍｌのコントロール抗体を用いて得られた結果を示し、荒いドットのバーは８０ｎｇ／ｍｌの抗体Ａを用いて得られた結果を示し、細かい縞のバーは４００ｎｇ／ｍｌの抗体Ａを用いて得られた結果を示し、荒い縞のバーは２０００ｎｇ／ｍｌの抗体Ａを用いて得られた結果を示し、斜交平行線のバーは１０μＭの化合物Ｅを用いて得られた結果を示し、細かいドットのバーはＤＭＳＯ(化合物Ｅのベヒクル)を用いて得られた結果を示す。各条件の結果は８回の実施で測定され、次いで標準偏差を示す誤差バーとともに平均値として表した。 
【０２９３】
実施例７：血管形成と脈管形成を破壊する抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体
血管形成及び脈管形成に対する抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体の作用を、ＨＵＶＥＣ細胞出芽アッセイを用いて調べた。このアッセイは、Nakatsu et al. (Microvasc. Res. 66 (2): 102-112, 2003)によって記載されたものと類似している。ＨＵＶＥＣ細胞を、Cytodex 3(登録商標)ビーズ(Amersham Biosciences, Piscataway, New Jersey)上にコートし、次いでそれをフィブリンゲルに移植した。ヒトの皮膚線維芽細胞をフィブリンゲル層上にプレーティングし、次いでそれに組織培養液をかぶせた。ＨＵＶＥＣ細胞からの脈管出芽を４〜９日後に調べた。抗Ｄｌｌ４処理で観察された結果と同様に、図１４Ａに示すように、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ処理により脈管出芽と長さの顕著な増加が生じた。示すように、コントロールとしてＰＢＳ、又は抗体ＡないしＡ−２にて処理した細胞についての結果を示す。抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体は、脈管出芽と脈管構造ネットワーク密度を増加することによって、脈管形成と血管形成を阻害する。
また、脈管形成及び血管形成に対する抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体の作用を、血管新生の角膜ポケットアッセイを用いて調べた。図１４Ｂにまとめたプロトコールに示すように、通常血管のない齧歯類の角膜をＶＥＧＦペレットとともに移植して(＃６３、＃１３２及び＃３９０)、血管新生を誘導するか、ネガティブコントロールとして無処理のまま放置した(＃３８１)。その後、脈管ネットワーク密度の増加についてのポジティブコントロールとして抗Ｄｌｌ４にて(＃１３２)、又は抗体Ａ−２にて(＃３９０)、角膜を処理した。脈管は、抗ＣＤ３１ベースの免疫蛍光染色法(赤)によって視覚化した。図１４Ｂに示すように、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ処理により脈管ネットワーク密度が有意に増加した。図１４Ｂについて上記のように処理した角膜内の血管もまたＦＩＴＣ−デキストラン(緑)にて還流し、血管によるフローを評価した。図１４Ｃに示すように、抗Ｄｌｌ４処理血管及び抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ処理血管による還流は制限された。
また、血管新生のマウス網膜モデルにおける抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体の作用を調べた。図１４Ｄにまとめたプロトコールに示すように、Ｐ１(出生後１日)又はＰ３(出生後３日)からのマウス網膜を、示した濃度の抗体Ａ−２又はネガティブコントロールとしての抗ブタクサ抗体にて処理した。Ｐ５(出生後５日)で網膜を採取した。イソレクチンＢ４を用いて脈管構造を視覚化した。図１４Ａ−１４Ｃに示す結果と一致して、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ処理により脈管構造密度が増加し、過剰な出芽表現型が生じた。図１４Ｄについて上記のように処理したマウス網膜はＤＡＰＩにて染色して、核ＤＮＡを可視化した。図１４Ｅに示すように、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ処理により核の数が増加したことから、増殖の増加の可能性が示唆された。
【０２９４】
実施例８：インビボの腫瘍増殖を阻害する抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体
腫瘍増殖に対する抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体の作用をインビボマウスモデルを用いて調べた。免疫欠損マウス(Ｂａｌｂ−Ｃ Ｎｕ／Ｎｕ)を、ＨＭ７細胞株(大腸腺癌)による移植片試験に用いた。５００００００細胞を０．１ｍｌのマトリゲル(BD Biosciences, San Jose, California)に移植し、それをマウスの皮下に接種した。腫瘍をおよそ２５０〜３００立方ミリメートルまで成長させた後、示すように投与を開始するために３つの処理群にマウスをランダムに分けた。図１５Ａに示すように、抗体Ａ−２による処理は腫瘍増殖を抑制した。抗ブタクサと抗ＶＥＧＦは、それぞれネガティブとポジティブのコントロールとした。図１５Ａについて上記と類似する実験では、様々な用量の抗体Ａ−２を腫瘍増殖を停止又は緩徐化する能力について試験した。結果を図１５Ｂに示す。ＨＭ７細胞株の代わりにＣＡＬＵ６細胞株(非小細胞肺癌細胞株)を用いたことを除き、図１５Ａについて上記したのと同じ実験では、図１５Ｃに示すように、抗体Ａ−２は腫瘍体積を低減することが明らかとなった。まとめると。図１５Ａ−１５Ｃに示す結果は、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体が腫瘍増殖を阻害することを示す。
図１５Ｂについて上記したのと同じ実験では、図１５Ｄに示すように、抗体Ａ−２による処理は、用量依存的な様式で体重損失を引き起こすことが明らかとなった。図１５Ｂについて上記したのと同じ実験では、抗体Ａ−２のクリアランスは、示された時間点で処置したマウスの血清中のヒトＦｃの濃度を測定することによって調べた。結果を図１５Ｅに示す。
【０２９５】
実施例９：腸細胞の増殖と分化に作用する抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体
マウス腸管内の細胞に対する抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体の作用を調べた。３〜４日ごとに抗体Ａ−２を投与したおよそ１０日後の処置マウスとコントロールマウス(ベヒクル)から腸を単離した。。ヘマトキシリンとエオジン、並びにムチンに対してはアルシアンブルー(青、分泌細胞のマーカー)又は共通して用いられる増殖マーカータンパク質であるＫｉ−６７に対しては抗Ｋｉ−６７(茶、抗体ベースの免疫組織化学染色手順)にて、試料を染色した。図１６Ａ及び１６Ｂは、示した濃度の抗体Ａ−２又はコントロール抗体(ベヒクル)にて処置したマウスの、それぞれ小腸又は大腸からの陰窩及び絨毛の例を示す。結果は、抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲが移行増幅細胞の増殖を停止し、杯細胞及びパネート細胞を含む分泌細胞の数を増加させることを示す。
【０２９６】
実施例１０：特定の癌細胞株の生存率を低減する抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ抗体とγ分泌酵素インヒビター
癌細胞株のパネルに対する抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲ及びγ分泌酵素インヒビターＤＡＰＴ及び「化合物Ｅ」(ＣｍｐＥ)の作用を調べた。図１７に示す細胞株(ｘ軸)は、示すように抗体Ａ−２、ＤＡＰＴ、ＣｐｍＥ又はＤＭＳＯ(コントロール、γ分泌酵素インヒビターのベヒクル)の存在下又は非存在下で増殖させ、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏＴＭ発光細胞生存率アッセイ(Promega, Madison, WI)を用いて細胞の生存率を評価した。このアッセイにより、代謝活性のある細胞を表すＡＴＰ存在の定量化に基づき、培地中の生細胞数が決定される。発光は、図１７の「相対的な発光の単位」(ｙ軸)として定量化される。図１７に示すように、乳腺癌株であることが報告されたＭＴ−３と卵巣癌細胞株であるＯＶＣＡＲ−３がＡＴＰレベルの低減を示した。このＡＴＰレベルはＤＡＰＴ、ＣｍｐＥ又は抗Ｎｏｔｃｈ１ ＮＲＲの存在下でインキュベートした後の増殖低減及び／又は細胞死増加を表す。
【０２９７】
前述の発明は、理解明確にするために図及び実施例によりある程度詳細に記載しているが、この記載や実施例が本発明の権利範囲を制限するものと解されるものではない。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１７】
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【図１０】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【配列表】
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