(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロで、デスレセプターアゴニスト抗体に対する細胞の抵抗性を防止し又は逆転させる方法であって、ＤＤＸ３の１以上の活性の調節因子と標的細胞を接触させる工程を含み、この調節因子が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５からなる群から選択されるＤＤＸ３のフラグメントであるか又はこの調節因子が、配列番号８〜９、配列番号１０〜１１、配列番号１２〜１３、配列番号１４〜１５及び配列番号１６〜１７からなる群から選択されるｓｈＲＮＡであること、この調節が、前記アゴニスト抗体に対する抵抗性を防止し又は逆転させること、及びこのデスレセプターが、ＤＲ５であることを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記調節因子が、デスレセプターへのＤＤＸ３の結合を阻害する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記調節因子が、カスパーゼ又はカスパーゼ調節因子（ＩＡＰ）に対するＤＤＸ３の結合を増大又は低減させる、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記カスパーゼが、カスパーゼ−２又はカスパーゼ−８である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記カスパーゼ調節因子が、ｃＩＡＰ１又はｃＩＡＰ２である、請求項３記載の方法。
【請求項６】
インビトロで、デスレセプターを発現する標的細胞において選択的にアポトーシスを誘導する方法であって、
（ａ）  標的細胞を、デスレセプターと特異的に結合しアポトーシスを誘導するデスレセプターアゴニスト抗体の治療的量と接触させる工程、ここでデスレセプターはＤＲ５である、及び
（ｂ）  前記標的細胞に、ＤＤＸ３の１以上の活性の調節因子の治療的量を投与する工程、ここで、この調節因子は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５からなる群から選択されるＤＤＸ３のフラグメントであるか又はこの調節因子は、配列番号８〜９、配列番号１０〜１１、配列番号１２〜１３、配列番号１４〜１５及び配列番号１６〜１７からなる群から選択されるｓｈＲＮＡである、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
前記調節因子が、デスレセプターへのＤＤＸ３の結合を阻害する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記調節因子が、カスパーゼ又はカスパーゼ調節因子（ＩＡＰ）に対するＤＤＸ３の結合に影響する、請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記カスパーゼが、カスパーゼ−２又はカスパーゼ−８である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記カスパーゼ調節因子が、ｃＩＡＰ１又はｃＩＡＰ２である、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
前記標的細胞が、がん細胞、慢性関節リウマチ滑膜細胞、活性化リンパ球、又はウイルス感染細胞である、請求項６記載の方法。
【請求項１２】
がんを患う被検対象を治療するための組成物であって、（ａ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１４２８を有するマウス−マウスハイブリドーマによって分泌されるデスレセプターアゴニスト抗体又はそのヒト化抗体、及び（ｂ）ＤＤＸ３の１以上の活性の調節因子を含み、この調節因子が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５からなる群から選択されるＤＤＸ３のフラグメントであるか又はこの調節因子が、配列番号８〜９、配列番号１０〜１１、配列番号１２〜１３、配列番号１４〜１５及び配列番号１６〜１７からなる群から選択されるｓｈＲＮＡであること、前記調節因子が前記デスレセプターアゴニストに対する抵抗性を低減させること、及びこのデスレセプターが、ＤＲ５であることを特徴とする、組成物。
【請求項１３】
炎症性又は自己免疫性疾患を患う被検対象を治療するための組成物であって、（ａ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１４２８を有するマウス−マウスハイブリドーマによって分泌されるデスレセプターアゴニスト抗体又はそのヒト化抗体、及び（ｂ）ＤＤＸ３の１以上の活性の調節因子を含み、この調節因子が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４及び配列番号５からなる群から選択されるＤＤＸ３のフラグメントであるか又はこの調節因子が、配列番号８〜９、配列番号１０〜１１、配列番号１２〜１３、配列番号１４〜１５及び配列番号１６〜１７からなる群から選択されるｓｈＲＮＡであること、前記調節因子が前記デスレセプターアゴニストに対する抵抗性を低減させること、及びこのデスレセプターが、ＤＲ５であることを特徴とする、組成物。
【請求項１４】
前記調節因子が、デスレセプターへのＤＤＸ３の結合を阻害する、請求項１２又は１３記載の組成物。
【請求項１５】
前記調節因子が、カスパーゼ又はカスパーゼ調節因子（ＩＡＰ）に対するＤＤＸ３の結合を増大又は低減させる、請求項１２又は１３記載の組成物。
【請求項１６】
前記カスパーゼが、カスパーゼ−２又はカスパーゼ−８である、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
前記カスパーゼ調節因子が、ｃＩＡＰ１又はｃＩＡＰ２である、請求項１５記載の組成物。
【請求項１８】
化学療法剤、抗体、ＴＮＦファミリーのメンバー、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗日和見感染剤、抗生物質、免疫抑制剤、免疫グロブリン、抗マラリア薬、抗慢性関節リウマチ剤、サイトカイン、ケモカイン及び成長因子からなる群から選択される治療剤をさらに含む、請求項１２又は１３記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の参照）
本願は、２００５年２月２日に出願された米国仮出願第６０／６４９４３７号の利益を請求するものであり、この出願は参照によりその全体がここに援用される。
【０００２】
（連邦により補助された研究に関する説明）
本発明は、米国国立衛生研究所（the National Institutes of Health）によって与えられた助成金第Ｐ５０ＣＡ８３５９１号、第Ｐ５０ＣＡ８９０１９号及び第Ｕ１９ＡＩ０５６５４２号の政府の支持によりなされたものである。政府は、本発明について所定の権利を有する。
【０００３】
（発明の技術分野）
開示される本発明は、一般に、デスレセプターのアポトーシス誘導アゴニストに対する抵抗性を阻害する薬剤、及びがん及び自己免疫性又は炎症性疾患の治療におけるこのような薬剤及びアゴニスト及びバイオマーカーの用途に関する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）は、ＴＮＦスーパーファミリーの一員であり、がん細胞に対して強力なアポトーシス誘導活性を有する（Wiley, S.R., et al., 1995., Immunity, 3:673-682）。ＴＮＦ−α及びＦａｓリガンドのようなＴＮＦスーパーファミリーの他の死誘導リガンドとは異なり、ＴＲＡＩＬは、がん治療剤の開発において特に興味深いものであるが、これは、ＴＲＡＩＬが正常細胞にはほとんど又は全く影響を及ぼさずに腫瘍細胞のアポトーシスを優先的に誘導するためである（Walczak, H., et al. 1999. Nat Med 5:157-163）。ＴＲＡＩＬに関して少なくとも５種のレセプターが同定されており、そのうち２種、ＤＲ４（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）及びＤＲ５（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）は、アポトーシスシグナルを伝達することができるが（Walczak, H., et al. 1997. Embo J 16:5386-5397; Pan, G., et al. 1997. Science 276:111-113; Chaudhary, P.M., et al. 1997. Immunity 7:821-830）、一方、それら以外の３種（ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、−Ｒ４及びＯＰＧ）は、ＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスをブロックするためのデコイレセプターとして役立つ（Pan, G., et al. 1997. Science 277:815-818; Marsters, S.A., et al. 1997. Curr Biol 7:1003-1006; Emery, J.G., et al. 1998. J Biol Chem 273:14363-14367）。Ｆａｓ及びＴＮＦＲ１と同様、ＤＲ４及びＤＲ５の細胞内セグメントは、デスドメインを含んでおり、ＦＡＤＤ及びカスパーゼ８依存性経路を通じてアポトーシスシグナルを伝達する（Walczak, H., et al. 1997. Embo J 16:5386-5397; Chaudhary, P.M., et al. 1997. Immunity 7:821-830; Kuang, A.A., et al. 2000. J Biol Chem 275:25065-25068）。マウス及び霊長類を含む実験動物におけるＴＲＡＩＬの組換え可溶性形態の投与は、全身毒性なしに有意な腫瘍退行を誘導する（Walczak, H., et al. 1999. Nat Med 5:157-163）。しかし、ＴＲＡＩＬはヒトにおいて肝臓毒性のような副作用を誘起することが示されているため、ＴＲＡＩＬレセプターの他のアゴニストが開発されてきた。
【０００５】
独特のアゴニスト性モノクローナル抗ＤＲ５抗体であるＴＲＡ−８及びそのヒト化バージョンもしくはヒトバージョンを用いたＤＲ５の選択的ターゲティングは、腫瘍細胞の効率的かつ選択的なアポトーシスを誘導することができる。すべてのＴＲＡＩＬ感受性がん細胞は、ＴＲＡ−８媒介性アポトーシスに対して感受性であることが見出されている。化学療法剤は、インビボ及びインビトロの両方で腫瘍細胞のＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスを相乗的に増強することができる。たとえば、ＴＲＡ−８とアドリアマイシン（Adriamycin）との組合せ療法は、いずれか一方単独の場合よりも有意に高い完全腫瘍退行率をもたらした（Buchsbaum, D.J., et al. 2003. Clin Cancer Res 9:3731-3741）。これらの結果は、化学療法剤がＤＲ５のシグナル伝達又はアポトーシスを誘導するために必要なシグナルの閾値を調節する可能性があることを示唆する。ＴＲＡ−８は、その有効性及び安全性に基づいて、がん治療法としての開発の候補として選択されてきた。前臨床研究により、ＴＲＡ−８が、ヒトがんの異種移植片モデルにおいて、特に化学療法との組合せで、非常に強い抗がん有効性を有していることが示されている（Buchsbaum, D.J., et al. 2003. Clin Cancer Res 9:3731-3741）。さらに、サルがＴＲＡ−８の全身投与をよく許容することも示されている。サルＤＲ５に対するＴＲＡ−８の結合は、ヒトＤＲ５に対する結合と同様であり、サルは、４８mg/kgもの高い用量を許容した。
【０００６】
しかし、標的細胞によるデスレセプターの発現は、このレセプターに関するリガンドによるアポトーシスの誘導に対して細胞を感受性にするのに必ずしも十分ではない。一例として、ほとんどのがん細胞は高レベルのＤＲ５を発現するが、これらはＴＲＡ−８によって誘導されるアポトーシスに対して必ずしも感受性ではなく、ＴＲＡ−８は、ＤＲ５に対して特異的であり、デコイレセプターとは反応しない。そのうえ、がん細胞のような標的細胞は、ＴＲＡ−８又はデスレセプターを通じてアポトーシスを誘導する他の薬剤類（たとえばＤＲ４又はＤＲ５）に対する抵抗性を示すことができる。この技術分野において必要とされているのは、抵抗性を予測するためのバイオマーカーであり、ＴＲＡ−８のようなデスレセプターのアゴニストに対する標的細胞の抵抗性を低減する手段である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（本発明の簡単な概要）
ここで具体化され、広く記載されているとおりの本発明の目的にしたがえば、本発明は、ひとつの側面において、デスレセプターアゴニストに対する標的細胞の抵抗性を逆転させる又は防止する方法であって、標的細胞を、ＣＡＲＤ含有タンパク質の１以上の活性の調節因子（Modulator）と接触させることを含み、その調節がアゴニストに対する抵抗性を逆転させる又は防止するものである、方法に関する。
【０００８】
ここで提供されるのは、デスレセプターアゴニストに対する抵抗性のバイオマーカーについて細胞をスクリーニングする方法であって、細胞を、総ＤＤＸ３又はそのホモログについてアッセイすることを含み、高レベルがアゴニストに対する抵抗性を意味する、方法である。
【０００９】
ここで提供されるのは、デスレセプターアゴニストに対する抵抗性のバイオマーカーについて細胞をスクリーニングする方法であって、デスレセプター及びＣＡＲＤ含有タンパク質の会合をアッセイすることを含み、会合の高レベルがアゴニストに対する抵抗性を意味する、方法である。
【００１０】
ここで提供されるのは、デスレセプターアゴニストに対する抵抗性のバイオマーカーについて細胞をスクリーニングする方法であって、ａ）細胞をデスレセプターアゴニストと接触させる工程、ｂ）デスレセプター及びＣＡＲＤ含有タンパク質のフラクションの会合をモニタリングする工程、を含み、会合がアゴニストに対する抵抗性を意味する、方法である。
【００１１】
さらに提供されるのは、デスレセプターアゴニストに対する抵抗性のバイオマーカーについて細胞をスクリーニングする方法であって、カスパーゼ又はカスパーゼの調節因子（たとえば、ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２、ＸＩＡＰ、サバイビン）とＣＡＲＤ含有タンパク質との会合をモニタリングする工程、及び既知の抵抗性及び非抵抗性対照細胞由来の試料と会合のレベルを比較する工程を含み、抵抗性細胞の場合と同様のレベルでのＩＡＰとＣＡＲＤ含有タンパク質との関連がアゴニストに対する抵抗性を意味する、方法である。場合によっては、スクリーニングされるべき細胞は、デスレセプターアゴニスト（たとえばアゴニスト性抗体）と予備的に接触させる。
【００１２】
ここで提供されるのは、被検対象におけるデスレセプターアゴニストに対する抵抗性をモニタリングする方法であって、（ａ）被検対象から生物学的試料を得る工程、及び（ｂ）この試料中のデスレセプターとＣＡＲＤ含有タンパク質との会合を検出する工程を含み、この会合が抵抗性を示す、方法である。
【００１３】
さらに提供されるのは、被検対象におけるデスレセプターアゴニストに対する抵抗性をモニタリングする方法であって、（ａ）被検対象から生物学的試料を得る工程、及び（ｂ）この試料中のＣＡＲＤ含有タンパク質とカスパーゼ又はカスパーゼの調節因子との会合を検出する工程を含み、この会合が抵抗性を示す、方法である。
【００１４】
同様に提供されるのは、デスレセプターを発現する標的細胞において選択的にアポトーシスを誘導する方法であって、（ａ）デスレセプターと特異的に結合する治療的量のデスレセプターアゴニストと標的細胞とを接触させる工程、及び（ｂ）標的細胞に、治療的量のＣＡＲＤ含有タンパク質の１以上の活性の調節因子を投与する工程を含む、方法である。
【００１５】
提供されるのは、がんを患う被検対象を治療する方法であって、この被検対象に、治療的量の（ａ）デスレセプターアゴニスト及び（ｂ）ＣＡＲＤ含有タンパク質の１以上の活性の調節因子を投与する工程を含み、調節因子がデスレセプターアゴニストに対する抵抗性を低減させる、方法である。
【００１６】
同様に提供されるのは、炎症性疾患又は自己免疫性疾患を患う被検対象を治療する方法であって、この被検対象に、治療的量の（ａ）デスレセプターアゴニスト及び（ｂ）ＣＡＲＤ含有タンパク質の１以上の活性を調節する薬剤を投与する工程を含み、調節因子がデスレセプターアゴニストに対する抵抗性を低減させる、方法である。
【００１７】
ここで提供されるのは、（ａ）デスレセプターアゴニスト及び（ｂ）ＣＡＲＤ含有タンパク質の１以上の活性を調節する薬剤を含む組成物であって、調節因子がデスレセプターアゴニストに対する抵抗性を低減させる、組成物である。
【００１８】
さらに提供されるのは、ｓｈＲＮＡを含む単離された核酸であって、このｓｈＲＮＡがＣＡＲＤ含有タンパク質の発現を阻害する、核酸である。
【００１９】
同様に提供されるのは、デスレセプターのＣＡＲＤ含有タンパク質結合領域をコードする単離されたポリペプチドであって、このポリペプチドは２５個未満のアミノ酸残基を含む、ポリペプチドである。
【００２０】
さらに提供されるのは、ＣＡＲＤ含有タンパク質のデスレセプター結合ドメインを含む単離されたポリペプチドである。
【００２１】
開示された方法及び組成物の付加的な利点は、一部は後述の説明において記載されており、また、一部はその説明から理解されるか、又は開示された方法及び組成物の実施によって学ぶことができる。開示された方法及び組成物の利点は、添付の特許請求の範囲において具体的に指摘された要素及び組合せによって実現され、得られることになる。前述の一般的な説明及び後述の詳細な説明の両方が、例示的及び説明的であるに留まるものであり、特許請求がされている本発明の制限的なものではないことは理解されるべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（発明の詳細な説明）
開示された方法及び組成物は、以下の具体的な態様の詳細な説明及びそこに含まれる実施例、ならびに図面及びその以前及び以下の記載を参照することにより、さらに容易に理解されるであろう。
【００２３】
腫瘍細胞のデスレセプター媒介性アポトーシスの誘導は、がん療法に関して極めて有望なアプローチである。すべてでないとしてもほとんどの療法において、ある程度の標的細胞は抵抗性である。一例として、ＴＲＡ−８、これは独特のアゴニスト性モノクローナル抗ＤＲ５抗体であるが、これは、肝細胞毒性を伴わずにヒトがん細胞のアポトーシスを誘導し（Ichikawa, K., et al. 2001 Nat Med 7:954-960）、動物モデルにおいて強い抗がん効率を示し（Buchsbaum, D.J., et al. 2003 Clin. Cancer Res 9:3731-3741）、そして、非ヒト霊長類における毒性研究において安全性が証明されている。したがって、ＴＲＡ−８は、ここにおいて例として使用されるが、デスレセプター（たとえばＤＲ４又はＤＲ５）活性化を通じてアポトーシスを誘導するその他の薬剤も、ここで教示される方法において使用することができる。ＴＲＡ−８、及びそのヒト化された及びヒトのバージョンは、抗がん療法として臨床開発中であるが、いくつかの腫瘍細胞株は、妥当なレベルのＤＲ５発現にもかかわらずＴＲＡ−８媒介性アポトーシスに対して抵抗性である。これらの観察は、この抵抗性がレセプターの発現に関連するものではなく、むしろＤＲ５によって開始されるシグナリング機構に関するものであることを示唆する。たしかに、ＤＲ５媒介性アポトーシスは、一般的な化学療法剤によって有意に増強することができる（Ohtsuka, T.及びT. Zhou. 2002. J Biol Chem, 277:29294-29303; Ohtsuka, T., D. et al., 2003. Oncogene, 22:2034-2044）。開示されるのは、デスレセプターと結合しカスパーゼ活性化を阻害するＣＡＲＤ含有タンパク質のファミリーをターゲティングすることによりデスレセプターアゴニストに対する抵抗性を阻害するための組成物及び方法である。
【００２４】
開示された方法及び組成物は、別途特定されていない限り、特異的な合成の方法、特異的な分析技術又は特定の試薬に限定されず、変わりうることは理解されるべきである。また、ここで使用される用語法は、特定の態様を説明する目的のみのためであり、限定的であることを意図しないことも理解されるべきである。
【００２５】
開示されているのは、開示された方法及び組成物のために使用されることができ、それらと関連して使用されることができ、それらを調製するために使用されることができ、又は開示された方法及び組成物の生成物である、材料、組成物及び成分である。これらの及び他の材料は、ここで開示されており、これらの材料の組合せ、サブセット、相互作用、グループ等が開示される場合、これらの化合物の各々の種々の個別のもの及び集合的な組合せ及び並べ替えの具体的な参照は必ずしも明示的に開示されていないが、それぞれがここで具体的に企図され説明されていることは理解されるべきである。たとえば、ひとつのベクターが開示され考察され、かつプロモーターを含む多数のベクター成分が考察されている場合、プロモーター及び他のベクター成分の各々の及びすべての組合せ及び並べ替え及び可能な改変は、そうでないことが具体的に示されていない限り、具体的に企図されている。したがって、ひとつのクラスの分子Ａ、Ｂ及びＣならびにひとつのクラスの分子Ｄ、Ｅ及びＦが開示され、組合せ分子の例Ａ−Ｄが開示されている場合、各々が個別に言及されていなくても、各々が個別にかつ集合的に企図されている。したがって、この例においては、Ａ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ及びＣ−Ｆの組合せの各々が、具体的に企図されており、Ａ、Ｂ及びＣ；Ｄ、Ｅ及びＦ；及び例示の組合せＡ−Ｄの開示から開示されたものと考えられるべきである。同様に、これらの任意のサブセット又は組合せもまた、具体的に企図され、開示されている。したがって、たとえば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ及びＣ−Ｅのサブグループは、具体的に企図され、Ａ、Ｂ及びＣ；Ｄ、Ｅ及びＦ；及び例示の組合せＡ−Ｄの開示から開示されたものと考えられるべきである。この考え方は、開示された組成物の製造及び使用の方法の工程を含め、しかしこれらに限らず、本出願のすべての側面に適用される。したがって、行うことができる多様な付加的な工程がある場合、これらの付加的な工程の各々は、開示された方法の任意の具体的な態様又はその組合せとともに行うことができること、また、各々のこのような組合せが具体的に企図されており、開示されていると考えられるべきであることは理解されるべきである。
【００２６】
種々の配列がここで提供されており、これら及びその他のものは、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて、「www.pubmed.gov」で見出すことができる。当業者は、配列の不一致及び相違を解析する方法、及び特定の配列に関する組成物及び方法を他の関連配列に適合させる方法を理解する。プライマー及び／又はプローブは、ここで開示された情報及び当該技術分野において公知の情報が与えられれば、任意の配列について設計することができる。
【００２７】
提供されているのは、標的細胞を、ＣＡＲＤ含有タンパク質の１以上の活性の調節因子と接触させることを含む、デスレセプターアゴニストに対する標的細胞の抵抗性を逆転させる方法又は予防する方法であって、この調節が、アゴニストに対する抵抗性を逆転させ又は予防する、方法である。この方法は、アポトーシスのシグナリングの研究、がん、及び自己免疫性及び炎症性障害のような疾患の治療に有用である。したがって、この方法の接触工程は、インビボ又はインビトロで行うことができる。
【００２８】
終始用いられる「逆転」又は「逆転させる」は、反対の位置、方向又は経路に変えること、たとえばある疾患の経過を悪化することから改善することへ変えることを意味する。たとえば、デスレセプター抵抗性の場合には、デスレセプターアゴニストに対する標的細胞の抵抗性を逆転させることは、細胞を、そのアゴニストに対してより少なく抵抗性にすることである。したがって、たとえば、１００％抵抗性の標的細胞の抵抗性を逆転させることは、この標的細胞を、このデスレセプターアゴニストに対して９０％〜０％抵抗性（９０％、８５％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％及び０％抵抗性を含む）にすることができる。
【００２９】
終始用いられている「予防（する）」は、特に前もっての計画又は作用によって、何かが起こることを排除し、回避し、未然に防ぎ、妨害し、停止させ又は邪魔をすることを意味する。たとえば、デスレセプター抵抗性の場合には、デスレセプターアゴニストに対する標的細胞の抵抗性を予防することは、その細胞を、そのアゴニストに対して抵抗性になる能力をより少なくすることである。したがって、たとえば、標的細胞において１００％抵抗性を予防することは、その標的細胞が、そのデスレセプターアゴニストに対して０％〜９０％のみ抵抗性（０％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％及び９０％抵抗性を含む）であることをもたらすことができる。
【００３０】
「逆転」又は「予防」は、程度における変化又は程度における任意の変化の遅れを指す。したがって、デスレセプター抵抗性の場合には「逆転」又は「予防」は、抵抗性の増大の経過を低減させること又は抵抗性の増大を遅らせることを含む。
【００３１】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「ひとつの」（「a」、「an」）及び「その（この）」（「the」）は、文脈が明らかにそうでないことを示す場合でない限り、複数を含む。したがって、たとえば、「ひとつのポリペプチド」は、そのようなポリペプチドの複数を含み、「そのポリペプチド」についての言及は１又はそれ以上のポリペプチド及び当業者に公知のその等価物等についての言及である。
【００３２】
「付加的な」又は「場合によっては」は、その後に記載される事象、状況又は材料が、起こっても起こらなくてもよく、又は存在してもしなくてもよく、そして、その記載が、その事象、状況又は材料が、起こる又は存在する場合と、起こらない又は存在しない場合とを含むことを意味する。
【００３３】
範囲は、ここで、「約」ある特定の値から、及び／又は「約」別の特定の値までとして表現され得る。このような範囲が表現されている場合、文脈が具体的にそうでないことを示さない限り、同じく具体的に企図され、開示されていると考えられるのは、そのひとつの特定の値から及び／又は別の特定の値までの範囲である。同様に、先行する「約」の語を用いることによって値が近似値で表されている場合、この特定の値が、別の、文脈が具体的にそうでないことを示さない限り具体的に企図され開示されていると考えられるべき態様を形成することは理解されるであろう。さらに、それらの範囲の各々の終点は、文脈が具体的にそうでないことを示さない限り、他方の終点との関連において及び他方の終点とは独立であることにおいての両方で有意であることも理解されるであろう。最後に、明示的に開示された範囲内に含まれるすべての個別の値及び値の下位範囲もまた、文脈が具体的にそうでないことを示さない限り、具体的に企図され、開示されていると考えられるべきであることは理解されるべきである。上記は、いくつかの特定の場合においてこれらの態様のいくつか又は全てが明示的に開示されているかどうかにかかわらず、適用される。
【００３４】
終始用いられている「標的細胞」は、ターゲティングされるデスレセプターを担持する細胞を意味し、たとえば、ＤＲ５又はＤＲ４を発現する細胞を含み、例示的には、乳頭腫及びいぼ；乳がん、結腸がん、肝がん、白血病、肺がん、メラノーマ、ミエローマ、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、頭頚部がん、甲状腺がん、子宮がん、星状細胞腫のような脳腫瘍、活性化免疫細胞（たとえば、活性化されたリンパ球、リンパ様細胞及び骨髄細胞）、炎症性細胞、慢性関節リウマチ滑液細胞、及びウイルス感染細胞のような、異常に生育する細胞及び腫瘍細胞を含む。インビボにおいて、標的細胞は、病理学的状態の個体の細胞であって、がん及び慢性関節リウマチのような、細胞増殖が異常又は制御不良であるものを含む。標的細胞としては、ヒト、非ヒト霊長類、ネコ、イヌ、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ニワトリ、ブタ、マーモセット及びケナガイタチ細胞、又は種々の細胞系統の細胞（たとえばJurkat細胞）が挙げられる。
【００３５】
「デスレセプター」は、いったんリガンドによって結合されたら細胞のアポトーシスを誘導するレセプターを意味する。デスレセプターとしては、たとえば、デスドメインを有する腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）レセプタースーパーファミリーのメンバー（たとえばＴＮＦＲ１、Ｆａｓ、ＤＲ３、４、５、６）、及びデスドメインを有さないＴＮＦレセプタースーパーファミリーのメンバー、ＬＴｂｅｔａＲ、ＣＤ４０、ＣＤ２７、ＨＶＥＭが挙げられる。
【００３６】
たとえばＤＲ５を介したシグナル伝達は、ＤＲ５媒介性アポトーシスの制御における鍵となる機構である。ＴＮＦＲスーパーファミリーのデスレセプターの共通の特徴は、それらがすべてその細胞質テールに保存された「デスドメイン」を有することである（Zhou, T., et al. 2002 Immunol Res 26:323-336）。ＤＲ５媒介性アポトーシスがデスドメインで開始されることは充分に確立されている。ＴＲＡＩＬ又はアゴニスト性抗ＤＲ５抗体による細胞表面でのＤＲ５の架橋は、ＤＲ５のオリゴマー化をもたらし、それに直ちに引き続いてＤＲ５のデスドメインへのＦＡＤＤの動員が起こる（Bodmer, J.L., et al. 2000. Nat Cell Biol 2:241-243; Chaudhary, P.M., et al. 1997. Immunity 7:821-830; Kuang, A.A., et al. 2000. J Biol Chem 275:25065-25068; Schneider, P., et al. 1997. Immunity 7:831-836; Sprick, M.R., et al. 2000. Immunity 12:599-609）。デスドメインと結合したＦＡＤＤは、さらに開始因子であるプロカスパーゼ８及び／又はプロカスパーゼ１０を動員し、特異親和性（homophilic）ＤＤ相互作用を通じてＤＩＳＣを形成する（Krammer, P.H. 2000. Nature 407:789-795）。活性化されたカスパーゼ８及び１０は、カスパーゼ３を直接活性化することができ、あるいは、ＢＨ３含有タンパク質Ｂｉｄを切断して、サイトクロームＣの放出及びカスパーゼ９活性化を通じてミトコンドリア依存性アポトーシス経路を活性化する（Desagher, S.及びJ.C. Martinou. 2000. Trends Cell Biol 10:369-377; Scaffidi, C., et al. 1998. Embo J 17:1675-1687）。デスドメイン複合体の形成に続いて、カスパーゼ、ＮＦ−κＢ及びＪＮＫ／ｐ３８のようないくつかのシグナル伝達経路が活性化される。これらのシグナル経路の活性化は、タンパク質のＢｃｌ−２及びＩＡＰファミリーを通じたデスレセプター媒介性アポトーシスの調節をもたらす。
【００３７】
「アゴニスト」は、細胞上のレセプター（たとえばデスレセプター）と一緒になることができ、内在性リガンドの結合によって典型的に生成される反応又は活性（たとえばアポトーシス）と同じものを開始することができる物質（分子、薬剤、タンパク質等）を意味する。本発明の方法のアゴニストは、デスレセプターリガンドであることができる。したがって、アゴニストは、ＴＮＦ、Ｆａｓリガンド又はＴＲＡＩＬであることができる。アゴニストは、さらに、これらのリガンドのフラグメントであることができ、そのフラグメントは、デスレセプターと結合し、活性化することができるように、デスレセプター結合ドメインを含む。アゴニストは、さらに、融合タンパク質であることができ、この融合タンパク質は、デスレセプターと結合し、活性化することができるように、デスレセプター結合ドメインを含む。アゴニストは、さらに、融合タンパク質であることができ、この融合タンパク質は、デスレセプターと結合し、活性化することができるように、デスレセプター結合ドメインを含む。アゴニストは、さらに、ＴＮＦ、Ｆａｓ又はＴＲＡＩＬと少なくとも８５％相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであることができ、このホモログは、デスレセプターの結合及び活性化を行なうことができる。
【００３８】
アゴニストは、さらに、デスレセプターに結合するアポトーシス誘導性抗体であることができる。「抗体」は、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、単鎖、ヒト化されたもの、完全なヒト抗体あるいはそれらの任意のＦａｂ又はＦ（ａｂ'）２フラグメントであることができる。「アポトーシス誘導性抗体」は、ここで提供される方法を用いた活性化の前又は後に、プログラムされた細胞死を引き起こす抗体を意味する。したがって、本発明の方法のアゴニストは、Ｆａｓ、ＴＮＦＲ１又はＴＲＡＩＬデスレセプターに対して特異的な抗体であることができ、その抗体はデスレセプターを活性化することができる。アゴニストは、ＤＲ４又はＤＲ５に対して特異的な抗体であることができる。アゴニストは、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１４２８（たとえば、ＴＲＡ−８抗体）、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１７４１（たとえば、ＴＲＡ−１抗体）、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１７４２（たとえば、ＴＲＡ−１０抗体）を有するマウス−マウスハイブリドーマと同じエピトープ特異性を有する又はそれらによって分泌される、ＤＲ５抗体であることができる。アゴニストは、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３７９８（たとえば、２Ｅ１２抗体）を有するハイブリドーマと同じエピトープ特異性を有する又はそれらによって分泌される、抗体であることができる。
【００３９】
本発明の方法の抗体によってターゲティングされるＴＲＡＩＬレセプターは、ＤＲ４又はＤＲ５であることができる。このようなレセプターは、公開された特許出願ＷＯ９９／０３９９２、ＷＯ９８／３５９８６、ＷＯ９８／４１６２９、ＷＯ９８／３２８５６、ＷＯ００／６６１５６、ＷＯ９８／４６６４２、ＷＯ９８／５１７３、ＷＯ９９／０２６５３、ＷＯ９９／０９１６５、ＷＯ９９／１１７９１、ＷＯ９９／１２９６３及び公開された米国特許第６，３１３，２６９号に記載されており、これらのすべては参照によりそこに教示されたレセプターに関してその全体がここに援用される。これらのレセプターに対して特異的なモノクローナル抗体は、当業界で公知の方法を用いて生成することができる。たとえば、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495-497 （1975）及びEur. J. Immunol. 6:511-519 （1976）を参照されたい。それらの両方は、これらの方法に関してその全体がここに援用される。また、公開された特許出願ＷＯ０１／８３５６０に教示された方法も参照されたい。それは、参照によりその全体がここに援用される。
【００４０】
本発明の方法の抗体は、当業界で公知の抗体であることができ、たとえば、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１４２８（たとえば、ＴＲＡ−８抗体）、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１７４１（たとえば、ＴＲＡ−１抗体）、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１７４２（たとえば、ＴＲＡ−１０抗体）を有するマウス−マウスハイブリドーマと同じエピトープ特異性を有する又はそれらによって分泌される、ＤＲ５抗体が挙げられる。他の例としては、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−３７９８（たとえば、２Ｅ１２抗体）を有するハイブリドーマと同じエピトープ特異性を有する又はそれらによって分泌される、抗体が挙げられる。
【００４１】
「ＣＡＲＤ含有タンパク質」は、カスパーゼ関連動員ドメイン（ＣＡＲＤ）を含み、デスレセプターと結合する能力を特徴とし、結合が場合によってはデスドメインの外であり、前記デスレセプターのデスドメインによってアポトーシスの活性化を調節する、タンパク質のファミリーを意味する。ＤＤＸ３は、このファミリーの代表的なメンバーである。ＣＡＲＤ含有タンパク質としては、ＤＥＡＤ（配列番号２１）ボックスタンパク質ファミリーのＲＮＡヘリカーゼが挙げられる。開示されたＣＡＲＤ含有タンパク質は、たとえば、ＤＤＸ３（配列番号２５、受託番号ｇｉ：１３５１４８１６）、ｍｄａ−５（受託番号ｇｉ：１１３４４５９３）又はＲＩＧ−１（受託番号ｇｉ：６０４８５６４）であることができる。ＣＡＲＤ含有タンパク質は、さらに、ＤＤＸ３、ｍｄａ−５又はＲＩＧ−１に対して少なくとも８５％の相同性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドであることができる。
【００４２】
ＤＥＡＤボックスタンパク質ファミリーのＲＮＡヘリカーゼは、細菌から哺乳類まで高度に保存されており、ＲＮＡの関与する種々の代謝経路に関与し、細胞の生存に関して重要である（Heinlein, U.A. 1998. J Pathol. 184:345-347）。タンパク質のこのファミリーのすべてのメンバーは、このファミリーの名前の由来である特徴的なアミノ酸配列Ｄ−Ｅ−Ａ−Ｄ（Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｓｐ、配列番号２１）から構成されるＡＴＰアーゼモチーフを有する。ＤＥＡＤ（配列番号２１）ボックスタンパク質は、翻訳開始、ＲＮＡスプライシング、リボソームのアセンブリー、ＲＮＡ分解、ｍＲＮＡ安定性、及びＲＮＡエディティングに必要な、リボ核酸結合タンパク質のようなＲＮＡヘリカーゼであると一般に信じられている。これらのＲＮＡヘリカーゼのいくつかが特別の転写因子の翻訳において重要な役割を果たす一方、いくつかのものの過剰発現は、発がんに関連している。ＤＤＸ１は、神経芽腫においてＮ−ｍｙｃと共増幅される（George, R.E., et al. 1996. Oncogene 12:1583-1587; Godbout, R., et al. 1998. J Biol Chem 273:21161-21168）。ＲＮＡヘリカーゼであるｐ６８は、相当する正常組織と比較して腫瘍において一貫して過剰発現される。蓄積したｐ６８は、ポリユビキチン化されているようであり、これらの腫瘍におけるプロテオソーム媒介性分解の欠陥の可能性が示唆され（Causevic, M., et al. 2001. Oncogene 20:7734-7743）、ｐ６８発現の制御不良が腫瘍発症の初期段階において起こることが示唆される。ＤＥＡＤ（配列番号２１）ボックスタンパク質／ＲＮＡヘリカーゼファミリーのｒｃｋ／ｐ５４は、ｃ−ｍｙｃタンパク質の合成を増大させることによって翻訳レベルでヒト結腸直腸腫瘍の発症における細胞増殖及び発がんに寄与することができる（Hashimoto, K., et al. 2001. Carcinogenesis 22:1965-1970）。ＤＤＸ３は、このファミリーのメンバーであるが、ＤＤＸ３のＲＮＡヘリカーゼ機能は未知である（Fu, J.J., et al. 2002. Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao （Shanghai） 34:655-661）。ＤＤＸ３はＨＣＶコアタンパク質と相互作用することができ、ＨＣＶウイルスタンパク質の翻訳を調節することができると報告されている（Owsianka, A.M. and A.H. Patel. 1999. Virology 257:330-3400）。
【００４３】
ＲＮＡヘリカーゼのいくつかは、保存されたＣＡＲＤ（カスパーゼ動員ドメイン; Yoneyama, M., et al. 2004. Nat Immunol 5:730-737; Kang, D.C., et、al. 2004. Oncogene 23:1789-1800; Kang, D.C., et al. 2002. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:637-642）を含む。サブトラクションハイブリダイゼーションにより、メラノーマ分化関連遺伝子５（ｍｄａ−５）が、分化、がんの逆転及びプログラムされた細胞死（アポトーシス）の間に誘導された遺伝子として同定された。この遺伝子は、カスパーゼ動員ドメイン及び推定ＤＥｘＨグループのＲＮＡヘリカーゼドメインの両方を含む。ｍｄａ−５は、ＩＦＮ誘導性成長阻害及び／又はアポトーシスの媒介因子として機能する（Kang, D. C, et al. 2002. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:637-642）。より最近の研究により、ｍｄａ−５  ｍＲＮＡのレベルは正常組織においては低いが、一方、発現は、ＩＦＮ−βにより正常及びがん細胞のスペクトルにおいて誘導されることが示されている。複製不能のアデノウイルスであるＡｄ.ｍｄａ−５によるｍｄａ−５の発現は、形態学的、生化学的及び分子アッセイにより確認されたとおりＨＯ−１細胞においてアポトーシスを誘導する（Kang, D.C., et al. 2004. Oncogene 23:1789-1800）。レチノイン酸誘導可能遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）は、カスパーゼ動員ドメインを含むＤＥｘＤ／ＨボックスＲＮＡヘリカーゼをコードしており、機能的スクリーニング及びアッセイにより評価したところｄｓＲＮＡ誘導性シグナリングの必須レギュレーターである。インタクトなＡＴＰアーゼ活性を有するヘリカーゼドメインは、ｄｓＲＮＡ媒介性シグナリングに関与していた。カスパーゼ動員ドメインは、シグナルを「下流へ」伝達し、転写因子ＮＦ−κＢ及びＩＲＦ−３の活性化をもたらした。これらの因子による続いての遺伝子活性化は、タイプＩインターフェロン産生を含む抗ウイルス機能を誘導した（Yoneyama, M., et al. 2004. Nat Immunol 5:730-737）。
【００４４】
カスパーゼ関連動員ドメイン（ＣＡＲＤ）を含むタンパク質は、細胞死の鍵となるレギュレーターとして確立されている。ＣＡＲＤは、ある種のカスパーゼのプロ−ドメインのＮ末端に見出される保存されたαへリックスバンドルから構成される。ＣＡＲＤはまた、種々の他のタンパク質にも見出される。デスドメインタンパク質のように、ＣＡＲＤは、ＣＡＲＤ/ＣＡＲＤ相互作用を介してタンパク質のコミュニケーションを可能にする同型タンパク質相互作用モチーフとして機能する。ＣＡＲＤを有するタンパク質は、プロアポトーシス性又はアンチ（抗）アポトーシス性のいずれかであり得る。プロアポトーシス性ＣＡＲＤタンパク質としては、カスパーゼ２、４及び９のようなある種のカスパーゼ及びＡｐａｆｌが挙げられ、これらはアポトーシスの開始において重要な役割を果たす。代表的な抗アポトーシス性ＣＡＲＤタンパク質としては、ｃＩＡＰ１及びｃＩＡＰ２が挙げられ、これらはカスパーゼのＣＡＲＤと相互作用し、それらのＢＩＲドメインを介してカスパーゼ活性化を阻害する。タンパク質のこのファミリーの機能の多くの側面は、がん治療における新規薬剤標的としての潜在的有用性を示す。いくつかのＣＡＲＤ含有タンパク質は、保存された細胞死マシーナリーの重要な成分であり、これは、制御不良となった場合、発がんを促進し、化学療法に対する腫瘍抵抗性に顕著に寄与する。プロアポトーシス性タンパク質であるＡｐａｆｌは、いくつかのがんにおいては不活性化されており、ミトコンドリア誘導性アポトーシスに関しては欠くことのできないＣＡＲＤタンパク質である。ＩＡＰファミリーのタンパク質のような他の抗アポトーシス性ＣＡＲＤタンパク質は、細胞死刺激から腫瘍を保護すること、及びある種の形態のがんにおいて過剰発現されることが示されてきた。したがって、ＣＡＲＤタンパク質を活性化又は阻害する治療剤は、従来の化学療法とともに用いられる場合、化学感作剤又はアポトーシスの調節因子として利用することができる。
【００４５】
デスレセプターアゴニストに対する抵抗性は、開示されたＣＡＲＤ含有タンパク質の活性に帰属させることができる。したがって、本発明の方法は、この抵抗性を防止するための、ＣＡＲＤ含有タンパク質の１以上の活性を調節する組成物を提供する。「調節する（modulates）」は、形態又は機能における、上方調節（アップレギュレーション）、下方調節（ダウンレギュレーション）、活性化、アンタゴニズム又はその他の変更を意味する。タンパク質の「活性」としては、たとえば、転写、翻訳、細胞内転位、分泌、キナーゼによるリン酸化、プロテアーゼによる切断、他のタンパク質に対する特異親和性（homophilic）及び異好性（heterophilic）の結合、ユビキチン化が挙げられる。ＣＡＲＤ含有タンパク質の活性は、部分的には、デスレセプター結合アミノ酸での又はその近傍でのリン酸化によるので、提供された調節因子は、ＣＡＲＤ含有タンパク質リン酸化の阻害剤であることができる。したがって、調節因子はキナーゼ又はホスファターゼの阻害剤であることができる。一例として、調節因子は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ−３）活性の阻害剤であることができる。
【００４６】
ＧＳＫ−３は、哺乳類を含め、種々の生物において見出されるタンパク質キナーゼである。２種のほとんど同一の形態のＧＳＫ−３、ＧＳＫ−３α及びＧＳＫ−３βが存在する。阻害剤は、任意の既知又は新たに発見されたＧＳＫ−３阻害剤であることができる。最適には、提供される方法のＧＳＫ−３阻害剤は、少なくともＧＳＫ−３βを阻害する。ヒトＧＳＫ-３βについてのアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｐ４９８４１で、及び対応するヌクレオチド配列は受託番号ＮＭ＿００２０９３で、入手することができる。実験及びスクリーニングの目的のためには、動物モデルを用いることが望ましい可能性がある。たとえば、ラットＧＳＫ−３β配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｐ１８２６６で、及びマウスはＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＤ３９２５８で、入手することができる。
【００４７】
ＧＳＫ−３阻害剤は、ここで用いる場合、競合的又は非競合的酵素阻害によって; たとえばターゲティングされた遺伝子破壊により、ＧＳＫ−３遺伝子の転写を低減することにより、タンパク質不安定性を増大すること等により、タンパク質レベルを低減することによって、直接又は間接に、細胞におけるＧＳＫ−３のレベルを低減する、化合物である。阻害剤は、小さい有機又は無機分子、アンチセンス核酸、抗体又はそれらに由来するフラグメント等であることができる。ＧＳＫ−３のその他の阻害剤は、コンビナトリアル又は他の化学的ライブラリーをＧＳＫ−３活性の阻害についてスクリーニングすることを通じて見出すことができる。
【００４８】
ＧＳＫ−３タンパク質の直接的な阻害剤の例としては、リチウム（Ｌｉ＋）（Klein et al. 1996）が挙げられ、これは強力にＧＳＫ−３β活性を阻害するが（Ｋｉ＝２mM）、他のタンパク質キナーゼの一般的な阻害剤ではない。ベリリウムイオン類（Ｂｅ２＋）は、ＧＳＫ−３のより強力な阻害剤であって、マイクロモルの範囲で阻害する。しかし、この阻害効果は、リチウムほど選択的ではなく、低用量でＣＤＫｌをも阻害する。
【００４９】
ＧＳＫ−３阻害剤は、また、アロイシン（aloisine）、アロイシンＡ（aloisine A）、ケンパウロン（kenpaullone）を含む。アロイシン（７−ｎ−ブチル−６−（４−メトキシフェニル）［５Ｈ］ピロロ［２，３−ｂ］ピラジン）は、Ｃｄｋｌ／Ｂ（ＩＣ５０＝７００nM）、Ｃｄｋ５／ｐ３５（ＩＣ５０＝１．５μM）及びＧＳＫ−３（ＩＣ５０＝９２０nM）の、強力で選択的な、細胞透過性かつＡＴＰ競合性の阻害剤である（Mettey Y, et al. （2003） J Med Chem 46（2）:222-36；この分子に関する教示についてその全体が参照によりここに援用される）。アロイシンＡ（７−ｎ−ブチル−６−（４−ヒドロキシフェニル）［５Ｈ］ピロロ［２，３−ｂ］ピラジン）は、細胞透過性の化合物であり、サイクリン依存性キナーゼ、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）及びグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ−３）（ＧＳＫ−３α、ＩＣ５０＝５００nM）（ＧＳＫ−３β、ＩＣ５０＝１．５μM）の、強力で選択的な、可逆的かつＡＴＰ競合性の阻害剤として作用する（Mettey Y, et al. （2003） J Med Chem 46（2）:222-36）；この分子に関する教示についてその全体が参照によりここに援用される）。ケンパウロン（９−ブロモ−７，１２−ジヒドロインドロ［３，２−ｄ］［ｌ］ベンザゼピン−６（５Ｈ）−オン）は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ｂ（ＧＳＫ３ｂ、ＩＣ５０＝２３０nM）、Ｌｃｋ及びサイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋｓ）の強力な細胞透過性阻害剤である（Schultz C, et al. （1999） J Med Chem 42（15）:2909-19; Zaharevitz DW, et al. （1999） Cancer Res 59（ll）:2566-9; Kunick C, et al. （2004） J Med Chem 47（1）:22-36）；この分子に関する教示についてそれらすべての全体が参照によりここに援用される）。
【００５０】
多数の他の化合物がＧＳＫ−３を阻害することが見出されている。その大部分は、ＡＴＰ結合部位との相互作用を通じてキナーゼ活性を阻害する。それらとしては、ビスインドール−（Bisindole-）及びアニリノ  マレイミド類（Anilino maleimides）、アルジシン（Aldisine）アルカロイド類、パウロン類（Paullones）、インジルビン類（Indirubins）及びピラノキノザリン類（Pyraloquinoxalines）が挙げられる。たとえば、パウロン類及びＧＳＫ−３阻害におけるそれらの用途は、たとえばKunick C, et al. J Med Chem 2004 Jan l;47（l）:22-36に記載されており、これはパウロン類に関する教示についてその全体が参照によりここに援用される。このような化合物はインビトロではナノモル濃度で、インビボでは低マイクロモル濃度で、有効である。ここでもまた、多くのものが強力であることが示されている一方で、それらはＧＳＫ−３に対して非常に特異的であるのではなく、関連するＣＤＫ類をも同様のレベルで共通して阻害する。しかし、２種の構造的に異なるマレイミド類（ＳＢ２１６７６３及びＳＢ４１５２８６）は、強力であり、かつＧＳＫ−３に対して高い特異性を有することが示されている。これらは、細胞の研究においてＧＳＫ−３阻害剤として有効にリチウムと置き換わることができる。グラヌラチミド類（granulatimides）又はジデムニミド類（didemnimides）と名づけられたクラスの化合物のメンバーもまた、ＧＳＫ−３阻害剤として作用することが見出された（国際特許出願ＷＯ９９／４７５２２、これはこれらの化合物に関する教示についてその全体が参照によりここに援用される）。
【００５１】
いくつかの間接的なＧＳＫ−３阻害剤としては、ワートマニン（wortmannin）が挙げられ、これは、タンパク質キナーゼＢを活性化し、ＧＳＫ−３のリン酸化及び阻害をもたらす。イソプロテレノール（Isoproterenol）は、β３−アドレノレセプターを通じて一次的に作用し、インシュリンと同様の程度（約５０％）までＧＳＫ−３活性を低減させる（Moule et al. 1997）。ｐ７０  Ｓ６キナーゼ及びｐ９０ｒｓｋ−１もまた、ＧＳＫ−３βをリン酸化し、その阻害をもたらす。
【００５２】
ＧＳＫ−３は、ＧＳＫ−３特異的ペプチドを用いて選択的にターゲティングとすることもできる。たとえば、高頻度転位進行型Ｔ細胞リンパ腫１（ＦＲＡＴ１；Frequently Rearranged Advanced T-Cell lymphomas 1）は、ＧＳＫ３結合タンパク質（ＧＢＰ）の哺乳類におけるホモログである。ＦＲＡＴチド（ＦＲＡＴ１の残基１８８〜２２６に相当するペプチド）は、ＧＳＫ３に結合し、ＧＳＫ３により触媒されるアキシン（Axin）及びβ-カテニンのリン酸化をブロックする（Thomas GM, et al. FEBS Lett 1999 Sep 17;458（2）:247-51）。
【００５３】
提供される本方法のＧＳＫ−３阻害剤は、機能的核酸であることもできる。機能的核酸は、標的分子の結合又は特定の反応の触媒のような特異的機能を有する核酸分子である。機能的核酸分子は、制限的であることを意味しない以下のカテゴリーに分けることができる。たとえば、機能的核酸としては、アンチセンス分子、アプタマー、リボザイム、三重鎖（triplex）形成分子、ＲＮＡｉ及び外部ガイド配列が挙げられる。機能的核酸分子は、標的分子が有する特異的活性のアフェクター、阻害剤、調節因子及び刺激剤として作用することができ、又は機能的核酸分子は、あらゆる他の分子とは独立の新規な活性を有することができる。
【００５４】
ＣＡＲＤ含有タンパク質は、デスレセプター誘導性アポトーシスの間に切断され得るので、本発明の方法の調節因子は、ＣＡＲＤ含有タンパク質の切断を促進することにより作用することができる。一例として、ＤＤＸ３は、ＦＡＤＤの動員と平行して（図９Ｅ）、ＤＲ５から解離してＴＲＡ−８誘導性アポトーシスの間に切断される（図９Ａ及びＣ）。ＤＤＸ３の切断部位の一つは、アミノ酸残基１３２〜１３５の間の比較的保存されているＤＥＤＤ（配列番号７）モチーフであり、これはカスパーゼ−２、３、７又は１０によって切断され得る。したがって、調節因子は、カスパーゼ、又はＣＡＲＤ含有タンパク質（たとえばＤＤＸ３）を切断するカスパーゼの誘導体であることができる。
【００５５】
ＣＡＲＤ含有タンパク質の活性はデスレセプターへの結合に依存するので、本発明の方法の調節因子は、ＣＡＲＤ含有タンパク質及びデスレセプター間の相互作用の阻害剤であることができる。ある場合には、調節因子は、デスレセプター結合部位でＣＡＲＤ含有タンパク質に結合する物質（薬剤、分子、ポリペプチド等）であることができる。したがって、調節因子は、ＣＡＲＤ含有タンパク質の結合部位に相当するデスレセプターのアミノ酸を含むポリペプチドであることができる。たとえば、調節因子は、ＤＲ５のアミノ酸２５０〜３４０を含むポリペプチドであることができる（配列番号２２、受託番号ｇｉ:３７２１８７８）。したがって、調節因子は、配列番号２３のアミノ酸配列を含むことができる。調節因子は、さらに、そのフラグメントがＤＤＸ３を結合することができるように、配列番号２３のアミノ酸配列のフラグメントを含むポリペプチドであることができる。一例として、調節因子は、ＤＲ５のアミノ酸２８０〜３１０を含むポリペプチドであることができる（配列番号２２、受託番号ｇｉ:３７２１８７８）。したがって、調節因子は、配列番号２４のアミノ酸配列を含むことができる。別の例として、調節因子は、ＤＲ５のアミノ酸３００〜３３０を含むポリペプチドであることができる（配列番号２２、受託番号ｇｉ：３７２１８７８）。したがって、調節因子は、配列番号３６のアミノ酸配列を含むことができる。
あるいは、調節因子は、アポトーシスを阻害することなしにデスレセプターのＣＡＲＤ含有タンパク質結合部位に結合する物質（薬剤、分子、ポリペプチド等）であることができる。調節因子は、ＣＡＲＤ含有タンパク質のデスレセプター結合部位に相当するアミノ酸を含むポリペプチドであることができる。
【００５６】
本発明の方法の調節因子は、カスパーゼ依存性アポトーシスの活性化を防止するためのＣＡＲＤ含有タンパク質の能力に影響することができる。ＣＡＲＤ含有タンパク質のＣＡＲＤドメインは、アポトーシスの阻害剤の動員に関与することができ（ＩＡＰ）、これはウイルス感染の間に宿主細胞におけるアポトーシスを抑制する（Crook, N.E., et al 1993 J Virol 67:2168-2174）。ＩＡＰファミリーは、成熟カスパーゼと相互作用しその酵素活性を阻害することにより、細胞死に対抗する。８種の異なる哺乳類ＩＡＰが同定されており、これらとしてはＸＩＡＰ、ｃ−ＩＡＰｌ、c−ＩＡＰ２及びＭＬ−ＩＡＰ／Ｌｉｖｉｎが挙げられる（たとえば、Ashhab, Y., et al. 2001 FEBS Lett 495:56-60; Kasof, G.M.及びB.C. Gomes. 2001 J Biol Chem 276:3238-3246; Vucic, D., et al. 2000. Curr Biol 10:1359-1366；これらは、これらのＩＡＰ分子に関して、参照によりその全体がすべてここに援用される）。すべてのＩＡＰは、１〜３個のバキュロウイルスＩＡＰ反復（ＢＩＲ）ドメインを含み、相同配列（ＣＸ２ＣＸ１６ＨＸ６Ｃ）を有する。ＢＩＲドメインを通じて、ＩＡＰ分子はカスパーゼに結合し、これを直接阻害する（Deveraux, Q.L. 及びJ.C. Reed. 1999. Genes Dev 13:239-252; Deveraux, Q.L. et al. 1997. Nature 388:300-304; Deveraux, Q.L.及びJ.C. Reed. 1999. Genes Dev 13:239-252、ＩＡＰ及びカスパーゼの相互作用に関して、これらはすべて参照によりその全体がここに援用される）。ミトコンドリアのタンパク質、Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯは、ＩＡＰに結合してこれに対抗することができ（Suzuki, Y., et al. 2001. J Biol Chem 276:27058-27063）、ＩＡＰ機能を抑制した（Wieland, I, et al. 2000. Oncol Res 12:491-500）（ＩＡＰの阻害に関して、引用した文献はすべて参照によりその全体がここに援用される）。したがって、本発明の方法の調節因子は、ＣＡＲＤ依存性結合の阻害剤であることができる。調節因子は、カスパーゼ又はＩＡＰのようなカスパーゼの調節因子を動員するためのＣＡＲＤ含有タンパク質の能力に影響することができる。調節因子は、ＣＡＲＤ含有タンパク質が低減されたＩＡＰの結合及び動員を有するようにＣＡＲＤ含有タンパク質に結合する物質（薬剤、分子、ポリペプチド、融合タンパク質、抗体、抗体フラグメント等）であることができる。調節因子は、たとえばカスパーゼ−１、カスパーゼ−２、カスパーゼ−４又はカスパーゼ−５、ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２、ＸＩＡＰ又はサバイビンの、ＣＡＲＤ含有タンパク質結合フラグメントであることができる。
【００５７】
調節因子は、さらに、標的細胞におけるＩＡＰ又はＣＡＲＤ含有タンパク質遺伝子発現の阻害剤であることができる。細胞においてタンパク質の発現を阻害する種々の公知の方法が存在し、三重鎖形成分子、リボザイム、外部ガイド配列、アンチセンス分子及びＲＮＡｉ分子が挙げられる。
【００５８】
アンチセンス分子は、カノニカル又は非カノニカル塩基対形成を通じて標的核酸分子と相互作用するように設計される。アンチセンス分子及び標的分子の相互作用は、たとえばＲＮＡｓｅＨ媒介性ＲＮＡ-ＤＮＡハイブリッド分解を通じて、標的分子の破壊を促進するように設計される。あるいは、アンチセンス分子は、転写又は複製のような、標的分子上で通常起こるであろうプロセッシング機能を妨害するように設計される。アンチセンス分子は、標的分子の配列に基づいて設計することができる。標的分子の最も接近しやすい領域を見つけることによりアンチセンス効率を最適化するための多数の方法が存在する。例示的な方法は、ＤＭＳ及びＤＥＰＣを用いたＤＮＡ改変研究及びインビトロ選択実験であろう。アンチセンス分子は、標的分子に、１０−６、１０−８、１０−１０又は１０−１２以下の解離定数（Ｋｄ）で結合することが好ましい。アンチセンス分子の設計及び使用を補助する方法及び技術の代表的な見本は、米国特許第５，１３５，９１７号、第５，２９４，５３３号、第５，６２７，１５８号、第５，６４１，７５４号、第５，６９１，３１７号、第５，７８０，６０７号、第５，７８６，１３８号、第５，８４９，９０３号、第５，８５６，１０３号、第５，９１９，７７２号、第５，９５５，５９０号、第５，９９０，０８８号、第５，９９４，３２０号、第５，９９８，６０２号、第６，００５，０９５号、第６，００７，９９５号、第６，０１３，５２２号、第６，０１７，８９８号、第６，０１８，０４２号、第６，０２５，１９８号、第６，０３３，９１０号、第６，０４０，２９６号、第６，０４６，００４号、第６，０４６，３１９号及び第６，０５７，４３７号に見出すことができ、これらは、アンチセンス分子に関する方法及び技術について、参照によりその全体がここに援用される。
【００５９】
アプタマーは、好ましくは特異的な方法で、標的分子と相互作用する分子である。典型的には、アプタマーは、長さ１５〜５０塩基の範囲の小さい核酸であり、ステム−ループ又はＧ−クアトレット（G-quartets）のような定義された二次及び三次構造に折りたたまれる。アプタマーは、ＡＴＰ（米国特許第５，６３１，１４６号）及びテオフィリン（theophiline）（米国特許第５，５８０，７３７号）のような小さい分子、ならびに逆転写酵素（米国特許第５，７８６，４６２号）及びトロンビン（米国特許第５，５４３，２９３号）のような大きい分子と結合することができる。アプタマーは、１０-１２M未満の標的分子のＫｄで非常にしっかりと結合することができる。アプタマーは、１０-６、１０-８、１０-１０又は１０-１２未満のＫｄで標的分子と結合することが好ましい。アプタマーは、非常に高度の特異性で標的分子と結合することができる。たとえば、標的分子及び分子上の単一の位置のみで異なる別の分子の間での結合親和性に１０，０００倍を超える差を有するアプタマーが単離されている（米国特許第５，５４３，２９３号）。アプタマーは、背景結合分子とのＫｄよりも、少なくとも１０、１００、１０００、１０，０００又は１００，０００倍低い標的分子とのＫｄを有することが好ましい。たとえば、この比較をポリペプチドについて行なう場合、背景分子は異なるポリペプチドであることが好ましい。種々の異なる標的分子に結合するアプタマーの作製及び使用方法の代表的な例は、米国特許第５，４７６，７６６号、第５，５０３，９７８号、第５，６３１，１４６号、第５，７３１，４２４号、第５，７８０，２２８号、第５，７９２，６１３号、第５，７９５，７２１号、第５，８４６，７１３号、第５，８５８，６６０号、第５，８６１，２５４号、第５，８６４，０２６号、第５，８６９，６４１号、第５，９５８，６９１号、第６，００１，９８８号、第６，０１１，０２０号、第６，０１３，４４３号、第６，０２０，１３０号、第６，０２８，１８６号、第６，０３０，７７６号及び第６，０５１，６９８号に見出すことができ、これらは、アプタマーに関する方法及び技術について、参照によりその全体がここに援用される。
【００６０】
リボザイムは、分子内又は分子間で化学反応を触媒することができる核酸分子である。したがって、リボザイムは、触媒性核酸である。リボザイムは、分子間反応を触媒することが好ましい。ハンマーヘッドリボザイム（米国特許第５，３３４，７１１号、第５，４３６，３３０号、第５，６１６，４６６号、第５，６３３，１３３号、第５，６４６，０２０号、第５，６５２，０９４号、第５，７１２，３８４号、第５，７７０，７１５号、第５，８５６，４６３号、第５，８６１，２８８号、第５，８９１，６８３号、第５，８９１，６８４号、第５，９８５，６２１号、第５，９８９，９０８号、第５，９９８，１９３号、第５，９９８，２０３号；Ludwig及びSproatによる国際特許出願ＷＯ９８５８０５８、Ludwig及びSproatによるＷＯ９８５８０５７、及びLudwig及びSproatによるＷＯ９７１８３１２）、ヘアピンリボザイム（たとえば、米国特許第５，６３１，１１５号、第５，６４６，０３１号、第５，６８３，９０２号、第５，７１２，３８４号、第５，８５６，１８８号、第５，８６６，７０１号、第５，８６９，３３９号及び第６，０２２，９６２号）、及びテトラヒメナリボザイム（たとえば、米国特許第５，５９５，８７３号及び第５，６５２，１０７号）のような自然の系において見出されたリボザイムに基づいた、ヌクレアーゼ又は核酸ポリメラーゼ型の反応を触媒する多数の異なるタイプのリボザイムが存在する。また、自然の系には見出されないが新規の特異的反応を触媒するように工学的処理された多数のリボザイムも存在する（たとえば、米国特許第５，５８０，９６７号、第５，６８８，６７０号、第５，８０７，７１８号及び第５，９１０，４０８号）。好ましいリボザイムは、ＲＮＡ又はＤＮＡ基質を切断し、より好ましくはＲＮＡ基質を切断する。リボザイムは、典型的には、標的基質の認識及び結合、そしてその後の切断を通じて、核酸基質を切断する。この認識は、しばしばカノニカル又は非カノニカル塩基対相互作用に基づいている。この特性により、リボザイムは、核酸の標的特異的切断のための特に良好な候補となるが、これは、標的基質の認識は標的基質配列に基づいているためである。種々の異なる反応を触媒するためのリボザイムの作製及び使用方法の代表的な例は、米国特許第５，６４６，０４２号、第５，６９３，５３５号、第５，７３１，２９５号、第５，８１１，３００号、第５，８３７，８５５号、第５，８６９，２５３号、第５，８７７，０２１号、第５，８７７，０２２号、第５，９７２，６９９号、第５，９７２，７０４号、第５，９８９，９０６号及び第６，０１７，７５６号に見出すことができる。
【００６１】
三重鎖形成性機能的核酸分子は、二本鎖又は一本鎖核酸と相互作用することができる分子である。三重鎖分子が標的領域と相互作用した場合、三重鎖（triplex）と呼ばれる構造が形成され、その中には、ワトソン−クリック（Watson-Crick）及びフーグスティーン（Hoogsteen）の塩基対形成の両方に依存する複合体を形成するＤＮＡの３本の鎖が存在する。三重鎖分子は、高い親和性及び特異性で標的領域と結合することができるため、好ましい。三重鎖形成性分子は、１０−６、１０−８、１０−１０又は１０−１２未満のＫｄで標的分子に結合することが好ましい。種々の異なる標的分子に結合する三重鎖形成性分子の作製及び使用方法の代表的な例は、米国特許第５，１７６，９９６号、第５，６４５，９８５号、第５，６５０，３１６号、第５，６８３，８７４号、第５，６９３，７７３号、第５，８３４，１８５号、第５，８６９，２４６号、第５，８７４，５６６号及び第５，９６２，４２６号に見出される。
【００６２】
外部ガイド配列（ＥＧＳｓ）は、標的核酸分子と結合し、複合体を形成する分子であって、この複合体は、標的分子を切断するＲＮａｓｅ  Ｐによって認識される。ＥＧＳは、選択したＲＮＡ分子を特異的にターゲティングするように設計することができる。ＲＮＡｓｅ  Ｐは、細胞内での転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）のプロセッシングを補助する。細菌のＲＮＡｓｅ  Ｐは、標的ＲＮＡ：ＥＧＳ複合体が天然のｔＲＮＡ基質を擬似することを起こすＥＧＳを用いることにより、本質的にあらゆるＲＮＡ配列を切断するために動員され得る（YaleによるＷＯ９２／０３５６６、及びForster及びAltman, Science 238:407-409 （1990））。
【００６３】
同様に、真核生物のＥＧＳ／ＲＮＡｓｅ  Ｐに指示されたＲＮＡの切断は、真核生物細胞内で所望の標的を切断するために利用され得る（Yuan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8006-8010 （1992）；YaleによるＷＯ９３／２２４３４; YaleによるＷＯ９５／２４４８９;Yuan及びAltman, EMBO J 14:159-168 （1995）；及びCarrara et al., Proc. Natl. Acad. Sci. （USA） 92:2627-2631 （1995））。種々の異なる標的分子の切断を容易にするためのＥＧＳ分子の作製及び使用の代表的な方法は、米国特許第５，１６８，０５３号、第５，６２４，８２４号、第５，６８３，８７３号、第５，７２８，５２１号、第５，８６９，２４８号及び第５，８７７，１６２号に見出すことができる。
【００６４】
遺伝子発現もまた、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を通じて、高度に特異的な方式で効率的に、サイレントにすることができる。このサイレンシングは、もともとは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の添加に伴って観察された（Fire,A., et al. （1998） Nature 391:806-11； Napoli, C., et al. （1990） Plant Cell 2:279-89； Hannon, G.J. （2002） Nature, 418:244-51）。いったんｄｓＲＮＡが細胞内に入ると、それは、ＲＮアーゼIII様酵素であるダイサー（Dicer）によって、３’末端に２ヌクレオチドのオーバーハングを有する長さ２１〜２３ヌクレオチドの二本鎖の小干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に切断される（Elbashir, S.M., et al. （2001） Genes Dev. 15:188-200； Bernstein, E., et al. （2001） Nature 409:363-6； Hammond, S.M., et al. （2000） Nature 404:293-6）。ＡＴＰ依存性の工程において、このｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡを標的ＲＮＡ配列に案内する多サブユニットタンパク質複合体であって、ＲＮＡｉ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）として一般に知られるものに統合される（Nykanen, A., et al. （2001）Cell, 107:309-21）。なんらかの時点で、このｓｉＲＮＡ二重体（duplex）は巻き戻される。そして、アンチセンス鎖はＲＩＳＣに結合したまま残り、エンド及びエキソヌクレアーゼの組合せによって相補的なｍＲＮＡ配列の分解を指示するようにみえる（Martinez, J., et al. （2002） Cell, 110:563-74）。しかし、ｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡの効果又はそれらの用途は、どのタイプのメカニズムにも制限されない。
【００６５】
短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングを誘導することができ、それによって遺伝子発現を低減させるか、又は阻害さえすることができる、二本鎖ＲＮＡである。一例において、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ及び標的ＲＮＡの両方の間の配列同一性の領域内で、ｍＲＮＡのような相同ＲＮＡ分子の特異的分解を誘発する。たとえば、ＷＯ０２／４４３２１は、３’オーバーハング末端と塩基対形成した場合、標的ｍＲＮＡの配列特異的分解を行なうことができるｓｉＲＮＡを開示しており、これは、これらのｓｉＲＮＡの作製方法について、参照によりここに援用される。配列特異的遺伝子サイレンシングは、酵素ダイサーによって産生されるｓｉＲＮＡを擬似する短い合成二本鎖ＲＮＡを用いて、哺乳類細胞において達成することができる（Elbashir, S.M., et al. （2001） Nature, 411 :494 498）、（Ui-Tei, K., et al. （2000） FEBS Lett 479:79-82）。ｓｉＲＮＡは、化学的に又はインビトロで合成することができ、又は細胞内でｓｉＲＮＡにプロセッシングされる短い二本鎖ヘアピン様ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡs）の結果であることができる。合成ｓｉＲＮＡは、一般的にアルゴリズム及び従来のＤＮＡ/ＲＮＡ合成機を用いて設計される。供給業者としては、Ambion（Austin, Texas）、ChemGenes（Ashland, Massachusetts）、Dharmacon（Lafayette, Colorado）、Glen Research（Sterling, Virginia）、MWB Biotech（Esbersberg, Germany）、Proligo（Boulder, Colorado）及びQiagen（Vento, The Netherlands）が挙げられる。ｓｉＲＮＡは、Ambionの「SILENCER（登録商標）  siRNA Construction Kit」のようなキットを用いてインビトロで合成することもできる。ここで開示されているのは、ｃ−Ｋｉｔ又はＳＣＦについての配列に基づいて上記のように設計された任意のｓｉＲＮＡである。たとえば、ｃ−Ｋｉｔの遺伝子発現をサイレンシングするためのｓｉＲＮＡは、商業的に入手可能である（「SURESILENCING（登録商標）  Human c-Kit siRNA」； Zymed Laboratories, San Francisco, CA）。
【００６６】
ベクターからのｓｉＲＮＡの産生は、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡs）の転写を通じて、より一般的に行なわれる。ｓｈＲＮＡを含むベクターの作製のためのキットは、たとえば、Imgenexの「GENESUPPRESSOR（登録商標） Construction Kits」及びInvitrogenの「BLOCK-IT（登録商標） inducible RNAi」プラスミド及びレンチウイルスベクターが入手可能である。ここで開示されているのは、ここで開示された炎症媒介因子についての配列に基づいて上記のように設計された任意のｓｈＲＮＡである。
【００６７】
したがって、本発明の方法の調節因子は、ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを含むことができる。調節因子は、ｃＩＡＰ１（受託番号ｇｉ：４１３４９４３５）、ｃＩＡＰ２（受託番号ｇｉ：３３９４６２８３）、ＸＩＡＰ（受託番号ｇｉ：１１８４３１９）、サバイビン（受託番号ｇｉ：２３１５８６２）、ＤＤＸ３（配列番号２５、受託番号ｇｉ：１３５１４８１６）、ｍｄａ−５（受託番号ｇｉ：１１３４４５９３）又はＲＩＧ−１（受託番号ｇｉ：６０４８５６４）遺伝子発現の阻害剤であることができる。したがって、調節因子は、ＤＤＸ３の核酸配列由来のｓｈＲＮＡ（配列番号２５、受託番号ｇｉ：１３５１４８１６）を含むことができる。一例として、調節因子は、配列番号１０、１２、１４又は１６の核酸配列によってコードされるｓｈＲＮＡを含むことができる。
【００６８】
細胞へのｓｉＲＮＡの送達に用いることができるいくつかのトランスフェクション試薬があり、たとえば、Invitrogenの「Lipofectamine 2000」、Mirusの「TransIT-TKO」及びNovagenの「RiboJuice siRNA Transfection Reagent」がある。しかし、トランスフェクション試薬は、一般にインビボでは作動しない。裸のｓｉＲＮＡは、被検対象の脈管構造中に直接送達することができ、これは、他のタンパク質が送達又は発現されないという利点を有し、核酸は免疫原性ではないのでそのことは重要である。上皮を壊すために何らかの形態のエネルギー、たとえばソノフォレシス（sonophoresis）を用いて、皮膚のような上皮バリアを横断して核酸を送達する方法もある（米国特許第５，４２１，８１６号、米国特許第５，６１８，２７５号、米国特許第６，７１２，８０５号及び米国特許第６，４８７，４４７号、皮膚を通した化合物の超音波媒介送達について、これらはすべて参照によりここに援用される）。
【００６９】
提供されているのは、デスレセプターアゴニストに対する抵抗性のバイオマーカーについての細胞のスクリーニング方法であって、総ＤＤＸ３又はそのホモログについて細胞をアッセイする工程を含む方法である。また、提供されているのは、デスレセプターアゴニストに対する抵抗性のバイオマーカーについての細胞のスクリーニング方法であって、デスレセプター及びＣＡＲＤ含有タンパク質の会合をアッセイする工程を含み、高レベルの会合がアゴニストに対する抵抗性を意味する、方法である。デスレセプター及びＣＡＲＤ含有タンパク質の会合は、アゴニストに対する抵抗性を示す。場合によっては、スクリーニングされるべき細胞は、デスレセプターアゴニスト（たとえばアゴニスト性抗体）と予め接触させておく。したがって、提供されるのは、デスレセプターアゴニストに対する抵抗性のバイオマーカーについての細胞のスクリーニング方法であって、細胞をデスレセプターアゴニストと接触させる工程、及びデスレセプター及びＣＡＲＤ含有タンパク質の断片的な（fractional）会合をモニタリングする工程を含み、会合がアゴニストに対する抵抗性を意味する、方法である。場合によっては、会合の検出を含む種々の方法において、解離を測定し、解離した量を総量から引き算して会合量を算出することができる。
【００７０】
本発明の方法の接触工程は、インビボ又はインビトロのいずれでも行うことができる。デスレセプター及びＣＡＲＤ含有タンパク質の間の会合のモニタリングは、特異的抗体を用いての細胞からのタンパク質フラグメント（たとえば、デスレセプター）の単離（たとえば免疫沈降による）を含むことができる。この方法は、さらに、会合タンパク質（たとえばＤＤＸ３）についてのタンパク質フラグメントの、ウェスタン・ブロット、放射性免疫アッセイ（ＲＩＡ）又はＥＬＩＳＡのような標準的免疫検出法による解析を含むことができる。これらの抗体ベースの方法は、当該技術分野で周知であり、目的のデスレセプター、ＣＡＲＤ含有タンパク質、カスパーゼ及びカスパーゼの調節因子の各々について容易に適合させることができる。説明例として、本発明の方法は、被検対象からの細胞をＴＲＡ−８抗体で処理する工程、細胞ライセートからタンパク質を単離する工程、ＤＲ５タンパク質を免疫沈降させる工程、（還元又は非還元条件での）ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によりＤＲ５を分離する工程、分離したタンパク質をニトロセルロース膜に転写する工程、及び標準的なウェスタン・ブロット技術を用いてＤＲ５と会合したＤＤＸ３を検出する工程を含むことができ、会合はその細胞におけるＴＲＡ−８抵抗性の証拠である。
【００７１】
また、提供されているのは、デスレセプターアゴニストに対する抵抗性のバイオマーカーについての細胞のスクリーニング方法であり、カスパーゼ又はカスパーゼの調節因子（たとえば、ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２、ＸｌＡＰ、サバイビン）とＣＡＲＤ含有タンパク質との会合をモニタリングする工程及び既知の抵抗性及び非抵抗性対照細胞由来の試料との会合のレベルを比較する工程を含む。抵抗性細胞のレベルと同様のレベルでのＣＡＲＤ含有タンパク質とのＩＡＰの会合は、そのアゴニストに対する抵抗性を意味する。場合によっては、スクリーニングされるべき細胞は、デスレセプターアゴニスト（たとえば、アゴニスト性抗体）と予め接触させておく。
【００７２】
説明例として、本発明の方法は、被検対象からの細胞をＴＲＡ−８抗体で処理する工程、細胞ライセートからタンパク質を単離する工程、ＤＤＸ３タンパク質を免疫沈降させる工程、（還元又は非還元条件での）ＳＤＳ-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によりＤＤＸ３を分離する工程、分離したタンパク質をニトロセルロース膜に転写する工程、及び標準的なウェスタン・ブロット技術を用いてＤＤＸ３と会合したカスパーゼ（たとえばカスパーゼ-１、カスパーゼ-２、カスパーゼ-４、カスパーゼ-５）及びＩＡＰ（たとえばｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２、ＸＩＡＰ、サバイビン）を検出する工程を含むことができ、ＤＤＸ３とＩＡＰとの検出はその細胞におけるＴＲＡ−８抵抗性の証拠である。会合のレベルは、対照のレベルと比較することができる。対照レベルは、非抵抗性細胞に基づくことができる。試験レベルが非抵抗性対照細胞レベルより高い場合、抵抗性が示されている。対照レベルは、抵抗性細胞に基づくことができ、試験レベルと対照レベルとの類似性は抵抗性を示している。
また、提供されているのは、ＣＡＲＤ含有タンパク質の調節因子についてのスクリーニング方法である。特に、ここで提供されているのは、調節因子がデスレセプターアゴニストに対する標的細胞の抵抗性を逆転又は防止するようなスクリーニング方法である。スクリーニング方法の工程は、候補薬剤とＣＡＲＤ含有タンパク質とを接触させる工程、及び候補薬剤の不存在下と比較して候補薬剤の存在下でのＡＲＤ含有タンパク質の１以上の活性の変化（たとえば低減）を検出する工程を含み、この１又は複数の活性はデスレセプターアゴニストに対する標的細胞の抵抗性と相関する。ＣＡＲＤ含有タンパク質の１又は複数の活性の低減は、その候補薬剤がＣＡＲＤ含有タンパク質を調節することを示す。この方法は、改変されたＣＡＲＤ含有タンパク質を利用するように改変することができ、たとえば、天然の改変又は非天然の改変が含まれる。このような改変としては、短縮化（truncations）、突然変異、キメラタンパク質等が挙げられる。たとえば、ＤＤＸ３の核酸配列は、配列番号２５に定義されている。ＤＤＸ３の突然変異の例としては、配列番号２５の位置１８４２及び２４９３での、アデノシンからグアノシンへの置換が挙げられる。
【００７３】
ＣＡＲＤ含有タンパク質の任意の数の活性を、ここで記載するスクリーニング方法において評価することができる。たとえば、ＣＡＲＤ含有タンパク質の活性は、リン酸化（たとえば、デスレセプター結合アミノ酸での又はその近傍でのリン酸化）であることができる。したがって、本発明の方法は、ＣＡＲＤ含有タンパク質のリン酸化の検出を含むことができる。タンパク質のリン酸化を検出するための細胞ベース及び無細胞のアッセイは、当該技術分野において周知であり、抗体、たとえば抗ホスホセリン（Phosphoserine）（Chemicon（登録商標）  ＡＢ１６０３）（Chemicon, Temecula, CA）、抗ホスホトレオニン（Phosphothreonine）（Chemicon（登録商標）  ＡＢ１６０７）及び抗ホスホチロシン（Phosphotyrosine）（Chemicon（登録商標）  ＡＢ１５９９）を含む抗体の利用が挙げられる。部位特異的抗体もまた、ＤＤＸ３のリン酸化形態に対して特異的に生成させることができる。これらの抗体の生成及び使用の方法は、当該技術分野において周知である。
【００７４】
ここで記載されるスクリーニング方法において評価することができる別のＣＡＲＤ含有タンパク質の活性は、結合活性である。たとえば、ＣＡＲＤ含有タンパク質の活性は、デスレセプターに対する結合であることができる。したがって、本発明の方法は、ＣＡＲＤ含有タンパク質及びデスレセプターの間の相互作用を検出する工程を含むことができる。ＣＡＲＤ含有タンパク質の活性は、ＣＡＲＤ依存性結合であることができる。したがって、本発明の方法は、たとえばｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２、ＸＩＡＰ又はサバイビンに対する、ＣＡＲＤ依存性結合を検出する工程を含むことができる。タンパク質結合の検出の方法は、当該技術分野で周知であり、たとえば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡｓ）又はウェスタン・ブロットと組合せた共免疫沈降が挙げられる。別の例においては、サンドイッチアッセイを用いることができ、ここで、第一の抗体はデスレセプターを捕獲し、第二の抗体はＣＡＲＤ含有タンパク質を検出する。別の例においては、サンドイッチアッセイを用いることができ、ここで、第一の抗体はＣＡＲＤ含有タンパク質を捕獲し、第二の抗体はデスレセプターを検出する。
【００７５】
さらに、ここで提供されているのは、ＣＡＲＤ含有タンパク質の評価される活性が、切断、たとえばデスレセプター誘導アポトーシスの間に起こる切断を含む、スクリーニングアッセイである。したがって、このスクリーニング方法は、ＣＡＲＤ含有タンパク質の切断を検出する工程を含むことができる。タンパク質切断を検出するための方法は当該技術分野において周知であり、たとえば、ウェスタン・ブロット法が挙げられる。
【００７６】
スクリーニング方法の接触工程は、インビボ又はインビトロで行なうことができる。スクリーニング方法は、細胞ベース又は無細胞のいずれであることもできる。したがって、一つの側面においては、ＣＡＲＤ含有タンパク質は、標的細胞内にある。ＣＡＲＤ含有タンパク質は細胞内に天然に存在することができ、又は細胞は、ＣＡＲＤ含有タンパク質を産生するように遺伝子工学的処理されていることができる。無細胞の方法においては、ＣＡＲＤ含有タンパク質は、基質（基材）に付着するように又はキメラタンパク質を形成するように、改変されていることができる。
【００７７】
場合によっては、スクリーニング方法は、さらに、標的細胞又はデスレセプターを含む非細胞系を、デスレセプターアゴニストと１回以上接触させる工程、及びデスレセプターアゴニストに対する抵抗性のレベルを検出する工程を含むことができる。デスレセプターアゴニストに対する抵抗性のレベルは、たとえば、アポトーシスを測定することによって検出することができ、デスレセプターアゴニストに反復的に暴露した際のアポトーシスの低下は、抵抗性の増大を示す。アポトーシスの検出方法は、当該技術分野において周知であり、たとえば、末端ｄＵＴＰニック・エンドラベリング（ＴＵＮＥＬ）、活性カスパーゼ３、アネキシンＶ（Annexin V）による細胞表面リン脂質ホスファチジルセリン（ＰＳ）を検出するための試薬が挙げられる。アポトーシスを検出するためのこれらの及び他の方法のための試薬は、商業的に入手可能である。
【００７８】
一般に、候補薬剤は、天然生成物又は合成（もしくは半合成）抽出物の大規模なライブラリー又は化学ライブラリーから、当該技術分野で公知の方法にしたがって、同定することができる。薬剤の発見及び開発の分野の当業者は、試験抽出物又は化合物の正確な起源は本発明のスクリーニング手順については重要ではないことを理解するであろう。したがって、事実上、任意の数のペプチド、化学抽出物又は化合物を、ここで記載された例示的な方法を用いてスクリーニングすることができる。このようなペプチド、抽出物又は化合物の例としては、植物、菌類、原核生物又は動物ベースの抽出物、発酵物ブロス、及び合成化合物、ならびに存在する化合物の改変物が挙げられるが、これらに限らない。多数の方法が、任意の数の化学化合物（たとえばサッカリド、脂質、ペプチド、ポリペプチド及び核酸ベースの化合物を含むが、それらに限らない）のランダム又は指向性合成（たとえば、半合成又は全合成）を生成するために利用可能である。合成化合物ライブラリーは、たとえばBrandon Associates（Merrimack, NH）及びAldrich Chemical（Milwaukee, WI）から、商業的に入手可能である。あるいは、細菌、菌類、植物及び動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーは、多数の供給源から商業的に入手可能であり、Biotics（Sussex, UK）、Xenova（Slough, UK）、Harbor Branch Oceangraphics Institute（Ft. Pierce, Fla.）及びPharmaMar, U.S.A.（Cambridge, Mass.）が挙げられる。それに加えて、天然及び合成により作製されたライブラリーは、所望の場合、当該技術分野において公知の方法、たとえば標準的な抽出及び分画方法にしたがって作製することができる。さらに、所望の場合、任意のライブラリー又は化合物は、標準的な化学、物理又は生化学の方法を用いて、容易に改変することができる。それに加えて、薬剤の発見及び開発の分野の当業者は、ＣＡＲＤ含有タンパク質の活性に対するそれらの影響について既に知られている材料の複製物もしくは反復物の排除又は脱複製（dereplication）（たとえば、分類学上の脱複製、生物学的脱複製及び化学的脱複製、又はそれらの任意の組合せ）のための方法が、可能な限りいつでも用いられるべきであることを容易に理解する。
【００７９】
未精製（粗）抽出物が、所望の活性を有することが見出された場合、観察された効果の原因である化学的構成成分を単離するために陽性リード抽出物のさらなる分画が必要である。したがって、抽出、分画及び精製プロセスのゴールは、ＣＡＲＤ含有タンパク質の活性を刺激又は阻害する活性を有する未精製抽出物中の化学的実体を注意深く特徴づけし、同定することである。化合物の混合物中の活性の検出についてここで記載されている同じアッセイは、活性成分を精製し、それらの誘導体を試験するために用いることができる。このような異成分からなる抽出物の分画及び精製の方法は、当該技術分野において公知である。所望の場合、治療のための有用な薬剤であることが示された化合物は、当該技術分野において公知の方法にしたがって化学的に改変することができる。治療的価値を有するとして同定された化合物は、続いて、ＣＡＲＤ含有タンパク質の活性を調節又は擬似することが望ましい疾患又は状態の動物モデルを用いて解析されることができる。
【００８０】
提供されているのは、被検対象におけるデスレセプターアゴニストに対する抵抗性をモニタリングする方法であって、被検対象から生物学的試料を得る工程、及び試料中のデスレセプターとＣＡＲＤ含有タンパク質との会合を検出する工程を含む方法であり、会合は抵抗性を表す。上記のとおり、会合のレベルは、対照のレベルと比較することができる。
【００８１】
説明例として、本発明の方法は、被検対象から生物学的試料を単離する工程（被検対象は、治療的抗ＤＲ５抗体（たとえばＴＲＡ−８）で処理されている）、生物学的試料からタンパク質を単離する工程、ＤＲ５タンパク質を免疫沈降させる工程、ＤＲ５を（還元又は非還元条件下の）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離する工程、分離したタンパク質をニトロセルロース膜に転写する工程、及びＤＤＸ３に対する抗体と標準的なウェスタン・ブロット技術とを用いてＤＲ５と会合したＤＤＸ３を検出する工程を含むことができ、ここで、会合はその細胞におけるＴＲＡ−８抵抗性の証拠である、方法である。
【００８２】
提供されているのは、被検対象におけるデスレセプターアゴニストに対する抵抗性をモニタリングする方法であって、被検対象から生物学的試料を得る工程、及び試料中のカスパーゼ又はカスパーゼの調節因子のＣＡＲＤ含有タンパク質との会合を検出する工程を含み、会合が抵抗性を表す、方法である。
【００８３】
説明例として、本発明の方法は、治療的抗ＤＲ５抗体（たとえばＴＲＡ−８）で処理された生物学的試料を被検対象から単離する工程、この生物学的試料からタンパク質を単離する工程、ＤＤＸ３タンパク質を免疫沈降させる工程、ＤＤＸ３を（還元又は非還元条件下の）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離する工程、分離したタンパク質をニトロセルロース膜に転写する工程、及び標準的なウェスタン・ブロット技術を用いてＤＤＸ３と会合したカスパーゼ（たとえばカスパーゼ−１、カスパーゼ−２、カスパーゼ−４、カスパーゼ−５）及びＩＡＰ（たとえば、ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２、ＸＩＡＰ、サバイビン）を検出する工程を含むことができ、ここで、たとえばｃＩＡＰ１及びＤＤＸ３の検出はその細胞におけるＴＲＡ−８抵抗性の証拠である、方法である。
【００８４】
提供されているのは、被検対象におけるデスレセプターアゴニストに対する抵抗性をモニタリングする方法であって、被検対象から生物学的試料を得る工程、及びＤＤＸ３のリン酸化を検出する工程を含む方法である。タンパク質のリン酸化を検出するための方法は、当該技術分野において周知であり、たとえば抗ホスホセリン（Chemicon（登録商標）、ＡＢ１６０３）、抗ホスホトレオニン（Chemicon（登録商標）、ＡＢ１６０７）及び抗ホスホチロシン（Chemicon（登録商標）、ＡＢ１５９９）を含む抗体の使用が挙げられる。部位特異的抗体もまた、ＤＤＸ３のリン酸化形態に対して生成することができる。このような抗体の作製及び使用の方法は、当該技術分野において周知である。
【００８５】
提供されているのは、デスレセプターを発現する標的細胞においてアポトーシスを選択的に誘導する方法であって、標的細胞をデスレセプターに特異的に結合するデスレセプターアゴニストの治療的量と接触させる工程、及び標的細胞にＣＡＲＤ含有タンパク質の１以上の活性の調節因子の治療的量を投与する工程を含む方法である。
アゴニスト及びＣＡＲＤ含有タンパク質調節因子がアポトーシスを誘導する能力は、ヒト白血病細胞株であるJurkat（American Type Culture No. TIB-152）及び星状細胞腫細胞株である１３２１Ｎ１のような細胞を、試験試料を添加した培地中で培養することにより、確認することができる。生存率は、たとえばＡＴＰＬＩＴＥアッセイを用いて、測定することができる。
【００８６】
ここで提供されている方法及び組成物は、細胞の不適切な生存又は増殖に関連する疾患の治療において用いることができ、がん、炎症性及び自己免疫性疾患におけるアポトーシスシステムの調節不全に起因する疾患が挙げられる。炎症性及び自己免疫性疾患としては、代表的には、全身性エリテマトーデス、橋本病、慢性関節リウマチ、移植片対宿主病、シェーグレン症候群、悪性貧血、アジソン病、強皮症、グッドパスチャー症候群、クローン病、自己免疫性溶血性貧血、不妊症、重症筋無力症、多発性硬化症、バセドウ病、血小板減少性紫斑病、インシュリン依存性糖尿病、アレルギー、喘息、アトピー性疾患、動脈硬化症、心筋炎、心筋症、糸球体腎炎、低形成性貧血、臓器移植後の拒絶が挙げられる。がんとしては、肺、前立腺、肝臓、卵巣、直腸、子宮頚部、リンパ及び胸部組織の多数の悪性腫瘍が挙げられる。したがって、提供されている組成物及び方法は、さらに、これらの標的とされた細胞が特異的デスレセプター（すなわちＤＲ４又はＤＲ５）を発現する又は発現するように作られている限りにおいて、活性化されたリンパ球、リンパ性細胞、骨髄細胞及びリウマチ性滑膜細胞（炎症性滑膜細胞（synoviocytes）、マクロファージ様滑膜細胞、線維芽細胞様滑膜細胞を含む）及びウイルス感染細胞（たとえばＨＩＶ感染細胞を含む）を含む活性化された免疫細胞を標的とし、それらに選択的にアポトーシスを誘導するために用いることができる。
【００８７】
提供されているのは、がん、自己免疫性疾患又は炎症性疾患を有する被検対象を治療する方法であって、その被検対象に、治療的量のデスレセプターアゴニスト及びＣＡＲＤ含有タンパク質の１以上の活性の調節因子を投与する工程を含み、この調節因子がデスレセプターアゴニストに対する抵抗性を低減する方法である。
終始用いられている、デスレセプターアゴニスト及び／又はＣＡＲＤ含有タンパク質調節因子の「治療的量」は、標的細胞においてアポトーシスを引き起こすのに充分な量である。ここで用いられる場合、「治療的量」及び「薬学的有効量」という用語は、同義である。当業者は、容易に適正な治療的量を決定することができる。
【００８８】
疾患、たとえばがん、自己免疫性疾患及び炎症性疾患の治療においては、処理の組合せを用いることもできる。たとえば、提供されている方法及び組成物のＣＡＲＤ含有タンパク質の調節因子及びアゴニストは、他の治療的薬剤とともに投与することができる。ここで用いられる場合、「治療的薬剤」は、病理学的状態を改善するのに有効な化合物又は組成物である。放射線療法もまた、他の薬剤とともに、又は他の薬剤なしで、組合せることができる。当業者は、放射線療法の形態を疾患に適合させるであろう。
【００８９】
治療的薬剤の例としては、化学療法剤、抗炎症剤、疾患改変抗リウマチ薬（Disease Modifying Anti Rheumatic Drug；ＤＭＡＲＤ）、抗体、ＴＮＦファミリーのメンバー、抗ウイルス剤、抗日和見感染剤、抗生物質、免疫抑制剤、免疫グロブリン、抗マラリア剤、抗慢性関節リウマチ剤、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、及び抗がん化合物が挙げられる。抗がん化合物は、異常に生育する細胞の成長を阻害又は停止することにおいて有効な化合物又は組成物である。抗がん化合物の説明例としては、以下のものが挙げられる：ブレオマイシン（bleomycin）、カルボプラチン（carboplatin）、クロラムブシル（chlorambucil）シスプラチン（cisplatin）、コルヒチン、シクロホスファミド（cyclophosphamide）、ドーノルビシン（daunorubicin）、ダクチノマイシン（dactinomycin）、ジエチルスチルベストロール（diethylstilbestrol）ドキソルビシン（doxorubicin）、エトポシド（etoposide）、５−フルオロウラシル（5-fluorouracil）、フロクスリジン（floxuridine）、メルファラン（melphalan）、メトトレキセート（methotrexate）、マイトマイシン（mitomycin）、６−メルカプトプリン（6-mercaptopurine）、テニポシド（teniposide）、６−チオグアニン（6-thioguanine）、ビンクリスチン（vincristine）及びビンブラスチン（vinblastine）。抗がん化合物及び治療的薬剤のさらなる例は、「The Merck Manual of Diagnosis and Therapy 15th Ed.」、Berkow et al. eds. 1987 Rahway N.J.及びSladek et al. 「Metabolism and Action of Anti-Cancer Drugs」、1987 Powis et al. eds. Taylor and Francis, New York, N.Y.に見出される。
【００９０】
ＰＫＣ阻害剤、ビスインドリーマレイミドVIII（bisindolymaleimide VIII；（BisVIII）は、Ｆａｓ媒介性アポトーシスを大きく促進する（Zhou T. et al. 1999. Nat Med 5:42-48）。ＪＮＫ／ｐ３８経路の相乗的活性化は、重要な役割を果たすこと（Ohtsuka T.及びT. Zhou. 2002. J Biol Chem 277:29294-29303）、及び３種の一般的な化学療法剤によるＤＲ５媒介性アポトーシスの増強は、同様の機構を通じて起こるらしいこと（Ohtsuka T. D. et al. 2003. Oncogene 22:2034-2044）が示されている。したがって、提供された方法は、さらに、ビスインドリーマレイミドVIII（BisVIII）又はＳＮ−５０もしくはＬＹ２９４００２のような他の感作剤のような、アポトーシス誘導性化合物の使用を含むことができる。したがって、提供された方法及び組成物のＣＡＲＤ含有タンパク質の調節因子及びアゴニストは、BisVIIIと組合せることができる。提供された方法及び組成物のＣＡＲＤ含有タンパク質の調節因子及びアゴニストは、さらに、非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）（たとえば、スリンダックスルフィド（sulindac sulfide）又は他のＣＯＸ−１又はＣＯＸ−２阻害剤）と組合せることができる。
【００９１】
提供された方法及び組成物のアゴニストを用いる療法は、他のアゴニストを用いる療法とも組合せることができる。たとえば、ＤＲ５に対する抗体は、それを必要とする個体に、ＤＲ４に対する抗体の投与とともに又はその前もしくは後に、投与することができる。このような組合せ抗体療法は、さらに、ここで提供されたＣＡＲＤ含有タンパク質の１以上の調節因子の投与と組合せることができ、さらに他の治療的薬剤と組合せることができる。
【００９２】
提供されているのは、デスレセプターアゴニスト及びＣＡＲＤ含有タンパク質の１以上の活性を調節する薬剤を含む組成物であって、ここで、この調節因子はデスレセプターアゴニストに対する抵抗性を低減する組成物である。提供されている組成物は、化学療法剤、ＴＮＦファミリーのメンバー、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗日和見感染剤、抗生物質、免疫抑制剤、免疫グロブリン、抗マラリア剤、抗慢性関節リウマチ剤、サイトカイン、ケモカイン及び成長因子からなる群から選択される治療的薬剤をさらに含むことができる。
【００９３】
「タンパク質」、「ペプチド」、「ポリペプチド」又は「ペプチド部分」という用語は、ここでは互換可能に用いられており、ペプチド結合によって連結された２以上のアミノ酸を広く意味するように用いられる。「フラグメント」という用語は、ここでは、全長ポリペプチド又はタンパク質の部分であって、ポリペプチド上でのタンパク分解反応によって生成されることができる部分、すなわちポリペプチド中のペプチド結合の切断の際に生成されるペプチドを意味するように用いられる。フラグメントは、必ずしもタンパク分解反応によって生成される必要はなく、合成ポリペプチドを製造するための化学合成又は組換えＤＮＡ技術の方法を用いて生成されることができることは認識されるべきである。「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、ここでは、その分子を含む特定のサイズ又はアミノ酸数を示唆するために用いられてはいないこと、及び本発明のペプチドは数個のアミノ酸残基又はそれ以上を含むことができることは認識されるべきである。
【００９４】
「単離された」又は「精製された」という語は、天然においてその組成物が通常関連している材料を含め、他の物質を実質的に含まない組成物（たとえばポリペプチド又は核酸）を意味する。本発明のポリペプチド又はそのフラグメントは、たとえば天然供給源（たとえばファージ）からの抽出、そのポリペプチドをコードする組換え核酸の発現（たとえば細胞内又は無細胞翻訳系における）、又はポリペプチドの化学合成によって、得ることができる。それに加えて、ポリペプチドフラグメントは、これらの任意の方法によって、又は全長ポリペプチドの切断によっても得ることができる。参照タンパク質又はポリペプチドのフラグメントは、その参照タンパク質／ポリペプチドの連続するアミノ酸のみを含み、その参照配列よりも少なくとも１アミノ酸短い。
【００９５】
特異的タンパク質が言及される場合、ここでは変異体、誘導体及びフラグメントが企図される。タンパク質変異体及び誘導体は、当業者には充分に理解されており、アミノ酸配列の改変を含むことができる。たとえば、アミノ酸配列の改変は、典型的には３つのクラスの１つ以上に該当する：置換、挿入又は欠失変異体。挿入としては、１又は複数のアミノ酸残基のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端への融合ならびに配列内への挿入が挙げられる。挿入は、通常はアミノ末端及び／又はカルボキシル末端への融合よりも小さい挿入であり、たとえば１〜４個の残基のオーダーである。欠失は、タンパク質配列からの１以上のアミノ酸残基の除去を特徴とする。典型的には、タンパク質分子内の任意の部位で約２〜６残基を超えない残基が除去されるが、欠失は、１〜３０残基の範囲であることができる。これらの変異体は、通常は、そのタンパク質をコードするＤＮＡ中のヌクレオチドの部位特異的突然変異誘発によってその変異体をコードするＤＮＡを生成し、その後、このＤＮＡを組換え細胞培養において発現させることにより調製することができる。既知の配列を有するＤＮＡにおける予め決められた部位での置換突然変異を作製する技術は周知であり、たとえば、Ｍ１３プライマー突然変異誘発及びＰＣＲ突然変異誘発が挙げられる。アミノ酸置換は、典型的には単一残基であるが、一度に多数の異なる位置で起こることができる。挿入は、通常は約１〜１０アミノ酸残基のオーダーである。欠失又は挿入は、好ましくは隣接する２個の対、すなわち２残基の欠失又は２残基の挿入として作製される。置換、欠失、挿入又はそれらの任意の組合せを、最終構築物に到達するために組合せることができる。突然変異は、配列をリーディングフレーム外に置くものであってはならず、かつ、好ましくは、ｍＲＮＡの二次構造のこのような変化が望ましい場合でない限り、二次ｍＲＮＡ構造を生成し得る相補的領域を生み出さないものである。置換変異体は、少なくとも１残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されているものである。このような置換は、一般的に、以下の表１にしたがって作製され、これらは保存的置換と呼ばれる。
【００９６】
【表１】
0005562521.tif 000002
【００９７】
機能又は免疫学的同一性の実質的な変化は、表1におけるものよりも保存的ではない置換を選択することにより、すなわち（ａ）置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、たとえばシート又はらせんのコンフォメーション、（ｂ）標的部位での分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の大きさ、に対するそれらの効果がより有意に異なる残基を選択することにより、作ることができる。タンパク質の特性に最大の変化を生じると一般に期待される置換は、（ａ）親水性残基、たとえばセリル又はトレオニルが、疎水性残基、たとえばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル又はアラニルと（又はそれによって）置換されること；（ｂ）システイン又はプロリンが、別の任意の残基と（又はそれによって）置換されること；（ｃ）電気的に陽性の側鎖を有する残基、たとえば、リシル、アルギニル又はヒスチジルが電気的に陰性の残基、たとえば、グルタミル又はアスパルチルと（又はそれによって）置換されること；又は（ｄ）嵩高い側鎖を有する残基、たとえばフェニルアラニンが側鎖を有さないもの、たとえばグリシンと（又はそれによって）置換されること、及び（ｅ）硫酸化及び／又はグリコシル化のための部位の数を増加させること、であろう。
【００９８】
たとえば、１つのアミノ酸を生物学的及び／又は化学的に同様の別のもので置換することは、当業者に保存的置換として知られている。たとえば、保存的置換は、ある疎水性残基を別のもので、又はある極性残基を別のもので、置換することであろう。置換としては、表１に示されている組合せが挙げられる。明示的に開示された配列の各々の保存的置換された変異体は、ここで提供されるポリペプチドの範囲内に含まれる。
【００９９】
典型的には、保存的置換は、結果として得られるポリペプチドの生物学的活性に対し、ほとんど又はまったく影響を与えない。特定の例において、保存的置換は、ペプチドの生物学的機能に実質的に影響を与えないペプチド内のアミノ酸置換である。ペプチドは、１以上のアミノ酸置換、たとえば２〜１０個の保存的置換、２〜５個の保存的置換、４〜９個の保存的置換、たとえば２、５又は１０個の保存的置換を含むことができる。
【０１００】
ポリペプチドは、たとえば部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲのような標準的手順を用いて、そのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を操作することにより、１以上の保存的置換を含むように製造することができる。あるいは、ポリペプチドは、標準的ペプチド合成法を用いて１以上の保存的置換を含むように製造することができる。アラニン・スキャンは、タンパク質中のどのアミノ酸残基が、アミノ酸置換を許容することができるかを同定するために用いることができる。一例において、アラニン又は他の保存的アミノ酸（以下に列挙されているもののような）が１以上のネイティブなアミノ酸で置換されている場合、そのタンパク質の生物学的活性は、２５％を超えて、たとえば２０％を超えて、たとえば１０％を超えて低減することはない。
【０１０１】
保存的置換についてのさらなる情報は、Ben-Bassat et al. （J. Bacteriol. 169:751-7, 1987）、O'Regan et al. Gene 77:237-51, 1989）、Sahin-Toth et al. （Protein Sci. 3:240-7, 1994）、Hochuli et al.（Bio/Technology 6:1321-5, 1988）、ならびに遺伝学及び分子生物学の標準的テキストブックのような他の場所に見出すことができる。
【０１０２】
置換又は欠失突然変異誘発は、Ｎ−グリコシル化のための部位（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）又はＯ−グリコシル化のための部位（Ｓｅｒ又はＴｈｒ）を挿入するために用いることができる。システイン又は他の不安定な残基の欠失もまた望ましい。潜在的なタンパク分解部位、たとえばＡｒｇの欠失又は置換は、たとえば、塩基性残基のひとつを欠失させること又はグルタミニル又はヒスチジル残基で置換することによって、達成される。
【０１０３】
ある種の翻訳後誘導体化は、発現されたポリペプチドに対する組換え宿主細胞の作用の結果である。グルタミニル及びアスパラギニル残基は、頻繁に翻訳後脱アミド化され、相当するグルタミル及びアスパリル残基になる。あるいは、これらの残基は、穏和な酸性の条件下で脱アミド化される。他の翻訳後改変としては、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル及びトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のＯ−アミノ基のメチル化（T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 [1983]）、Ｎ末端アミンのアセチル化、及びいくつかの場合には、Ｃ末端カルボキシルのアミド化が挙げられる。
【０１０４】
開示された組成物に取り込まれることができる多数のアミノ酸及びペプチドアナログがあることは理解される。たとえば、多数のＤ−アミノ酸又は表１に示されるアミノ酸とは異なる機能的置換基を有するアミノ酸がある。天然のペプチドとは反対の立体異性体もまた、ペプチドアナログの立体異性体と同様に開示されている。これらのアミノ酸は、選択したアミノ酸をｔＲＮＡ分子に担持させること及びアナログアミノ酸をペプチド鎖に部位特異的な方法で挿入するために、たとえばアンバーコドンを用いる遺伝的構築物を工学的に製造することにより、ポリペプチド鎖に容易に取り込ませることができる（Thorson et al. Methods in Molec. Biol. 77:43-73 （1991）, Zoller, Current Opinion in Biotechnology, 3:348-354 （1992）； Ibba, Biotechnology & Genetic Enginerring Reviews 13:197-216 （1995）, Cahill et al. TIBS, 14（10）:400-403 （1989）； Benner, TIB Tech, 12:158-163 （1994）； Ibba及びHennecke, Bio/technology, 12:678-682 （1994）、これらのすべては、少なくともアミノ酸アナログに関する材料について、参照によりここに援用される）。
【０１０５】
ポリペプチドと似せた分子であるが、天然のペプチド結合を介して連結されていないものを、作製することができる。たとえばアミノ酸又はアミノ酸アナログのための結合としては、ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−、−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−、−ＣＨ＝ＣＨ−−、（シス及びトランス）、−ＣＯＣＨ２−−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、及び−ＣＨＨ２ＳＯ−が挙げられる（これら及びその他のものは、Spatola, A. F. in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins, B. Weinstein eds., Marcel Dekker, New York,p.267 （1983）； Spatola, A. F., Vega Data （March 1983）, Vol. 1, Issue 3, Peptide Backbone Modifications （一般的な総説）； Morley, Trends Pharm Sci （1980） pp. 463-468； Hudson, D. et al., Int J Pept Prot Res 14:177-185 （1979） （−−ＣＨ２ＮＨ−−、ＣＨ２ＣＨ２−−）； Spatola et al. Life Sci 38:1243-1249（1986） （−−ＣＨＨ２−−Ｓ）； Hann J. Chem. Soc Perkin Trans. I307-314 （1982） （−−ＣＨ−−ＣＨ−−、シス及びトランス）； Almquist et al. J. Med. Chem. 23:1392-1398 （1980） （−−ＣＯＣＨ２−−）； Jennings-White et al. Tetrahedron Lett 23:2533 （1982） （−−ＣＯＣＨ２−−）； Szelke et al.の欧州特許出願  ＥＰ  ４５６６５  ＣＡ  （1982）: 97:39405 （1982） （−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−）； Holladay et al. Tetrahedron. Lett 24:4401-4404 （1983） （−−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−−）;及びHruby Life Sci 31:189-199 （1982） （−−ＣＨ２−−Ｓ−−）に見出すことができ、それらの各々が、参照によりここに援用される。特に好ましい非ペプチド結合は、−−ＣＨ２ＮＨ−−である。ペプチドアナログは、結合原子間に、ｂ−アラニン、ｇ−アミノブチル酸などのように２以上の原子を有することができることは理解される。
【０１０６】
アミノ酸アナログ及びアナログ及びペプチドアナログは、しばしば、たとえばより経済的な生産、より大きい化学的安定性、強化された薬学的特性（半減期、吸収、強度、効率等）、変化した特異性（たとえば、生物学的活性の広いスペクトル）、低減された抗原性その他のような、増強された又は望ましい特性を有することができる。
【０１０７】
Ｄ−アミノ酸は、より安定なペプチドを生成するために用いることができるが、これは、Ｄ−アミノ酸はペプチダーゼ等によって認識されないためである。同じタイプのＤ−アミノ酸でのコンセンサス配列の１以上のアミノ酸の系統的な置換（たとえば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）は、より安定なペプチドを生成するために用いることができる。システイン残基は、２以上のペプチドを環状化又は付着させるために用いることができる。これは、ペプチドを特定のコンフォメーションに束縛するために有益である（Rizo及びGierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 （1992）、参照によりここに援用される）。
【０１０８】
ここで開示された遺伝子及びタンパク質の任意の変異体、改変又は誘導体を定義するためのひとつの方法は、既知の特異的な配列に対する相同性によって変異体、改変又は誘導体を定義することであることは理解される。具体的に開示されたのは、ここで開示された核酸及びポリペプチドの変異体であって、記載された又は既知の配列に対して、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％相同性を有するものである。当業者は、２つのタンパク質又は核酸の相同性をいかにして決定するかを容易に理解する。たとえば、相同性は、相同性が最も高いレベルになるように２つの配列を整列させた後に、算出することができる。
【０１０９】
相同性を算出するための別の方法は、公開されたアルゴリズムによって行うことができる。比較のための配列の最適な整列（アラインメント）は、Smith及びWaterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 （1981）の局所的相同性アルゴリズム、Needleman及びWunsch, J. MoL Biol 48:443 （1970）の相同性アラインメントアルゴリズム、Pearson及びLipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444 （1988）の類似性探索（search for similarity）法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ、the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）又は検査（inspection）によって、実行することができる。これらの参考文献は、相同性の算出方法について、参照によりその全体がここに援用される。
【０１１０】
同じタイプの相同性は、核酸について、たとえば、Zuker, M. Science 244:48-52, 1989, Jaeger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7706-7710 1989, Jaeger et al. Methods Enzymol. 183:281-306 1989に開示されたアルゴリズムによって得ることができ、それらは、少なくとも核酸の整列に関する材料について、参照によりここに援用される。
【０１１１】
提供されている組成物は、経口、経直腸、嚢内、心室（脳室）内、頭蓋内、鞘内、関節内、膣内、非経口（静脈内、筋内、又は皮下）、局所的（粉末剤、軟膏又は点滴剤）、腹腔内注射によって、経皮的に、吸入によって又は口腔もしくは鼻腔用スプレーによって、投与することができる。必要な抗体又は治療剤の正確な量は、年齢、体重及び対象の一般的な状態、治療すべき疾患の重症度、腫瘍の位置及び大きさ、用いられる特定の化合物、投与のモード等に応じて、対象ごとに変化する。適切な量は、ここでの教示を与えられれば当業者によってルーチンの実験のみによって決定されることができる。典型的な抗体の単一用量は、０．１〜１０，０００マイクログラムの範囲であり、好ましくは１及び１００マイクログラムの間である。キャリア中の典型的な抗体濃度は、送達される１ミリリットル当たり０．２〜２０００ナノグラムの範囲である。関節内への注射のためには、抗体及びキャリアの容量は、その関節に応じて変化するが、約０．５〜１０ml、及び好ましくは１〜５mlがヒトの膝に注入され、そして、約０．１〜５ml、好ましくは１〜２mlがヒトの足首に注入される。
【０１１２】
組成物は、さらに、製剤学的に許容されうるキャリアを含むことができる。「製剤学（薬学）的に許容されうる」は、生物学的に又はそれ以外で望ましくないものではない材料であって、有意な望ましくない生物学的影響を引き起こすことなしに又はそれが含まれる製剤組成物の他の成分と悪い方式で相互作用することなしに、選択された基質とともに個体に投与され得るもの、を意味する。
【０１１３】
意図された投与モードに応じて、抗体又は治療剤は、たとえば、錠剤、座剤、ピル（丸薬）、カプセル、粉末剤、液体又は懸濁液のような固体、半固体又は液体の用量形態の製剤組成物であることができ、好ましくは正確な用量の単一投与に好適な単位用量形態であることができる。組成物は、有効量の選択された基質を、製剤学的に許容されうるキャリアとの組合せで含み、それに加えて他の医薬、製剤、キャリア又は希釈剤を含むことができる。非経口注入に好適な組成物は、生理学的に許容されうる滅菌された水性又は非水性溶液、分散液、懸濁液又は乳液、及び滅菌された注射可能な溶液又は分散液に再構成される滅菌粉末剤を含むことができる。好適な水性及び非水性キャリア、希釈剤、溶剤又はベヒクルの例としては、水、エタノール、ポリオール類（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール等）、それらの好適な混合物、植物油（たとえばオリーブ油）及びエチルオレエートのような注入可能な有機エステルが挙げられる。適正な流動性は、たとえば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって、維持することができる。
【０１１４】
これらの組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤及び調剤（dispensing agent）のような補助薬をも含んでいてもよい。微生物の作用の防止は、種々の抗細菌剤及び抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等によって確保することができる。等張剤、たとえば、糖類、塩化ナトリウム等を含有させることも望ましい場合がある。注入可能な製剤形態の延長された吸収は、吸収を遅延される薬剤、たとえば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によってもたらされることができる。
【０１１５】
経口投与のための固体用量形態としては、カプセル、錠剤、ピル(丸薬)、粉末剤及び顆粒が挙げられる。このような固体用量形態においては、活性化合物は、少なくとも１種の不活性な慣用的賦形剤（又はキャリア）、たとえばクエン酸ナトリウム又はリン酸２カルシウム、又は（ａ）充填剤又は増量剤、たとえば、スターチ、乳糖、ショ糖、グルコース、マンニトール及び珪酸、（ｂ）結合剤、たとえば、カルボキシメチルセルロース、アリグネート（alignates）、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ショ糖及びアラビアゴム、（ｃ）希釈剤、たとえば、グリセロール、（ｄ）崩壊剤、たとえば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモ又はタピオカデンプン、アルギン酸、ある種の複合体珪酸塩（エステル）及び炭酸ナトリウム、（ｅ）溶解遅延剤（solution retarders）、たとえば、パラフィン、（ｆ）吸収促進剤、たとえば、第４級アンモニウム化合物、（ｇ）湿潤剤、たとえば、セチルアルコール及びモノステアリン酸グリセロール、（ｈ）吸着剤、たとえば、カオリン及びベントナイト、（ｉ）潤滑剤、たとえば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、又はそれらの混合物、と混合される。カプセル、錠剤及びピル（丸薬）の場合、用量形態は、緩衝剤をも含むことができる。
【０１１６】
同様のタイプの固体組成物は、ラクトース又は乳糖ならびに高分子ポリエチレングリコール等のような賦形剤を用いて、軟及び硬充填ゼラチンカプセルの充填剤としてもまた使用することができる。
【０１１７】
錠剤、糖衣錠、カプセル、ピル（丸薬）及び顆粒のような固体用量形態は、腸溶性コーティング及び当該技術分野において周知のその他のコーティングのようなコーティング及びシェルを伴って調製することができる。これらは、乳白剤を含んでいてもよく、遅延された方式で腸管内の一定の部分で１種又は複数の活性化合物を放出するような組成物であることができる。用いることができる包埋組成物の例としては、ポリマー物質及びワックスがある。活性化合物は、適切な場合には、１以上の上記の賦形剤を含むマイクロカプセル化された形態であることができる。
【０１１８】
経口投与のための液体用量形態としては、製剤学的に許容され得る乳剤、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシルが挙げられる。活性化合物に加えて、液体用量形態は、当該分野において一般に用いられる、水又は他の溶剤のような不活性希釈剤、可溶化剤及び乳化剤を含むことができ、たとえば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、カルボン酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３-ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油類、特に、綿実油、塊茎植物油（groundnut oil）、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油及びゴマ油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル類、又はこれらの物質の混合物等である。
【０１１９】
このような不活性希釈剤に加えて、組成物は、湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、甘味料、調味料及び香料のような補助薬をも含むことができる。
【０１２０】
活性化合物に加えて、懸濁液は、懸濁剤、たとえば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微結晶セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天及びトラガカント、又はこれらの物質の混合物等を含んでいてもよい。
【０１２１】
直腸投与のための組成物は、好ましくは、本発明の化合物を、ココアバター、ポリエチレングリコール又は坐剤ワックスのような、通常の温度では固体であるが体温では液体であって、したがって、直腸又は膣腔で融解し活性成分を放出する、好適な非刺激性賦形剤又はキャリアと混合することによって調製することができる、坐剤である。
【０１２２】
本発明の化合物の局所投与のための用量形態としては、軟膏、粉末剤、噴霧薬及び吸入剤が挙げられる。活性成分は、滅菌条件下で、生理学的に許容されうるキャリア及び必要な可能性のある任意の保存料、緩衝剤、又は推進剤と混合される。眼の製剤、軟膏、粉末剤及び溶液もまた、本発明の範囲内であるものとして企図される。
【０１２３】
「製剤学（薬学）的に許容されうる塩類、エステル類、アミド類及びプロドラッグ」という用語は、ここで用いられる場合、健全な医学的判断の範囲内で、患者の組織と接触させての使用に好適であり、過度の毒性、刺激、アレルギー反応等を伴わず、妥当な利益／リスク比と釣り合っており、その意図された用途について効果的である、本発明の化合物のカルボキシレート塩類、アミノ酸付加塩類、、エステル類、アミド類及びプロドラッグ、ならびに可能な場合には本発明の化合物の両性イオン形態を指す。「塩類」という用語は、本発明の化合物の、比較的非毒性の無機及び有機酸付加塩類を指す。これらの塩類は、化合物の最終的な単離及び精製の間にインシチュで調製することができ、又は精製された化合物をその遊離塩基形態で好適な有機又は無機酸と別個に反応させ、形成された塩類を単離することによって調製することができる。代表的な塩類としては、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、硝酸塩、酢酸塩、蓚酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリル酸塩（laurate）、ホウ酸塩、ベンゾエート（安息香酸塩）、乳酸塩、リン酸塩、トシラート、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチレート（naphthylate）、メシレート（mesylate）、グルコヘプトネート（glucoheptonate）、ラクトビオネート（lactobionate）、メタンスルホン酸塩及びラウリル硫酸塩類等が挙げられる。これらは、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム等のようなアルカリ及びアルカリ土類金属ベースのカチオン類、ならびに、非毒性のアンモニウム、第４級アンモニウム及びアミンカチオン類（アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミン等を含むがそれらに限らない）を含んでいてもよい。（たとえば、S. M. Barge et al., "Pharmaceutical Salts," J. Pharm. Sci. 1977 66:1-19を参照されたい、これは参照によりここに援用される。）
【０１２４】
提供されているのは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）における使用のための二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含む単離された核酸である。ｄｓＲＮＡは、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）又は短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であることができる。したがって、提供されているのは、ｓｈＲＮＡを含む単離された核酸であって、そのｓｈＲＮＡはＣＡＲＤ含有タンパク質の発現を阻害する。ｓｈＲＮＡは、配列番号１０、１２、１４又は１６の核酸配列によってコードされていることができる。
【０１２５】
開示された核酸は、たとえば、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ又はヌクレオチド代用品から構成されている。これら及び他の分子の非制限的な例がここで検討される。たとえば、ベクターが細胞において発現される場合、発現されたｍＲＮＡは、典型的にはＡ、Ｃ、Ｇ及びＵから構成されていることが理解される。同様に、もし、たとえばアンチセンス分子が細胞又は細胞環境に、たとえば外来性の送達によって、導入される場合、そのアンチセンス分子は、細胞の環境においてアンチセンス分子の分解を低減するヌクレオチドアナログから構成されていることが有利であることが理解される。
【０１２６】
「単離（された）核酸」又は「精製（された）核酸」は、本発明のＤＮＡが由来した生物の天然のゲノムにおいてその遺伝子に隣接する遺伝子を含まないＤＮＡを意味する。したがって、この用語は、たとえば組換えＤＮＡ、自律複製プラスミド又はウイルスのようなベクター中に取り込まれている;又は原核生物又は真核生物のゲノムＤＮＡに取り込まれている（たとえば、トランスジーン）;又は分離した分子（たとえば、ＰＣＲ、制限エンドヌクレアーゼ消化又は化学もしくはインビトロ合成によって産生された、ｃＤＮＡ、又はゲノムもしくはｃＤＮＡフラグメント）として存在する、組換えＤＮＡを含む。また、それは、付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡをも含む。「単離（された）核酸」という用語は、ＲＮＡ、たとえば、単離されたＤＮＡ分子によってコードされる又は化学合成された、又は少なくともいくらかの細胞成分、たとえば他のタイプのＲＮＡ分子又はポリペプチド分子から分離された又はそれらを実質的に含まない、ｍＲＮＡ分子をも指す。
【０１２７】
ここで提供されているのは、発現制御配列に作動可能に連結された、ここで提供された任意の核酸を含むベクターである。哺乳類宿主細胞でのベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは、種々の供給源から入手することができ、たとえば、以下のようなウイルスのゲノム:ポリオーマ、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及び最も好ましくはサイトメガロウイルス、又は非相同哺乳類プロモーター、たとえばβ−アクチンプロモーター又はＥＦ１プロモーターから、又はハイブリッドもしくはキメラプロモーター（たとえば、β−アクチンプロモーターに融合されたサイトメガロウイルスプロモーター）から入手することができる。ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点をも含むＳＶ４０制限フラグメントとして好都合に得ることができる（Fiers et al., Nature 273:113 （1978））。ヒトサイトメガロウイルスの極初期（immediate early）プロモーターは、ＨｉｎｄIII  Ｅ制限フラグメントとして好都合に得ることができる（Greenway, P.J. et al., Gene 18:355-360 （1982））。もちろん、宿主細胞又は関連種由来のプロモーターもまた、ここでは有用である。
【０１２８】
「エンハンサー」は、一般に、転写開始部位からの固定的な距離を有さずに機能するＤＮＡの配列を指し、転写単位に対して、５’側（Laimins, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78:993 （1981））又は３’側（Lusky, M.L. et al., Mol. Cell Bio. 3:1108 （1983））のいずれであることもできる。さらに、エンハンサーは、イントロンの中（Banerji, J.L. et al., Cell 33:729 （1983））ならびにコード配列それ自体の中（Osborne, T.F. et al., Mol. Cell Bio. 4:1293 （1984））にあることができる。それらは、通常、長さ１０及び３００bpの間であり、シスで機能する。エンハンサーは、近傍のプロモーターからの転写を増大するように機能する。エンハンサーは、しばしば、転写の調節を媒介する応答要素をも含む。プロモーターもまた、転写の調節を媒介する応答要素を含むことができる。エンハンサーは、しばしば、遺伝子の発現の調節を決定する。多くのエンハンサー配列が今では哺乳遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、フェトタンパク質及びインシュリン）から公知である一方で、典型的には、一般的な発現については真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。好ましい例は、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（bp １００２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーである。
【０１２９】
プロモーター及び／又はエンハンサーは、光又はその機能の引き金をひく特異的化学的事象によって、特異的に活性化されてもよい。システムは、テトラサイクリン及びデキサメタゾンのような試薬、合成転写因子、方向付けされたＲＮＡ自己切断（Yen L. et al. 2004. Nature 431:471-476）及び他のアプローチによって制御されることができる。
また、γ線のような放射線照射又はアルキル化化学療法剤に暴露することによって、ウイルスベクター遺伝子発現を増強する方法もある。
【０１３０】
プロモーター及び／又はエンハンサー領域は、転写されるべき転写単位の領域の発現を最大化するための構成的プロモーター及び／又はエンハンサーとして作用することができる。ある種の構築物において、プロモーター及び／又はエンハンサー領域は、特定のタイプの細胞において特定の時のみに発現されるとしても、すべての真核生物細胞タイプにおいて活性である。このタイプの好ましいプロモーターは、ＣＭＶプロモーター（６５０bases）である。他の好ましいプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（及び連結するイントロン配列）、β−アクチン、伸長因子１（ＥＦ−１）及びレトロウイルスベクターＬＴＲである。
【０１３１】
すべての特異的調節要素は、クローニングすることができ、メラノーマ細胞のような特異的な細胞タイプにおいて選択的に発現される発現ベクターを構築するために用いることができることが示されている。神経膠線維性酢酸タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターは、神経膠（星状細胞）起源の細胞において選択的に遺伝子発現するために用いられた。ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ１１ｃ、ファスシン（Fascin）及びＣＤ６８プロモーターは、すべて、マクロファージ及び樹状細胞を含む抗原提示細胞において選択的に遺伝子を発現するために用いられており（Brocker, T., et al. 1997. J Exp Med 185:541-550； Gough, P.J.及びRaines, E.W. 2003. Blood 101:485-491； Cui, Y. et al. 2002. Blood 99:399-408； Sudowe, S. et al. 2003. Mol Ther 8:567-575）、樹状細胞特異的遺伝子（ＣＤ８３等）由来のプロモーター要素もまた、これに関して有用であることが明らかにされている（Berchtold S. et al. 2002. Immunobiology 205:231-246）。
【０１３２】
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト又は有核細胞）において用いられる発現ベクターもまた、ｍＲＮＡ発現に影響し得る転写終結に必要な配列を含んでいることができる。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分のポリアデニル化セグメントとして転写される。３’非翻訳領域もまた、転写終結部位を含む。転写単位は、ポリアデニル化領域をも含むことが好ましい。この領域のひとつの利点は、転写される単位がｍＲＮＡのようにプロセッシングされ、輸送される確率を増大させることである。発現構築物におけるポリアデニル化シグナルの同定及び使用は、充分に確立されている。相同なポリアデニル化シグナルは、トランスジーン構築物において用いられることが好ましい。ある種の転写単位において、ポリアデニル化領域は、ＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルから由来し、約４００塩基からなる。転写される単位は、他の標準的な配列を、単独で又は上記の配列と組合せて含み、構築物からの発現又は構築物の安定性を改善することが好ましい。
【０１３３】
ウイルスベクターは、マーカー生成物をコードする核酸配列を含むことができる。このマーカー生成物は、遺伝子が細胞に送達されたか否か、及びいったん送達されたら、発現されているか否か、を決定するために用いることができる。好ましいマーカー遺伝子としては、β−ガラクトシダーゼをコードする大腸菌（E. coli）のｌａｃＺ遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びルシフェラーゼが挙げられる。
【０１３４】
いくつかの態様においては、マーカーは、選択可能なマーカーであることができる。哺乳類細胞についての好適な選択可能マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシンアナログＧ４１８、ハイグロマイシン及びピューロマイシンである。このような選択可能マーカーが哺乳類宿主細胞内に成功裡に移入されると、形質転換された哺乳類宿主細胞は、選択的圧力下に置かれた場合に生存することができる。２つの広く用いられている異なるカテゴリーの選択的な管理法がある。第一のカテゴリーは、細胞の代謝及び添加物入り培地に依存せずに生育する能力を欠いた突然変異細胞株の使用に基づいている。２つの例は、ＣＨＯ  ＤＨＦＲ細胞及びマウスＬＴＫ細胞である。これらの細胞は、チミジン又はヒポキサンチンのような栄養の添加なしに生育する能力を欠いている。これらの細胞は、完全なヌクレオチド合成経路に必要なある種の遺伝子を欠いているため、添加物入り培地において失われたヌクレオチドが提供されるのでなければ生存できない。培地への添加の代替法は、インタクトなＤＨＦＲ又はＴＫ遺伝子を、それぞれの遺伝子を欠いている細胞に導入し、したがって、その生育要件を変更することである。ＤＨＦＲ又はＴＫ遺伝子で形質転換されていない個別の細胞は、添加物なしの培地中で生存することができない。
【０１３５】
第二のカテゴリーは、優勢選択であり、これは突然変異細胞株の使用を必要とせずに任意の細胞タイプにおいて用いられる選択スキームを指す。これらのスキームは、典型的には、宿主細胞の生育を停止させる薬剤を用いる。新規な遺伝子を有する細胞は、薬剤抵抗性を運ぶタンパク質を発現し、選択を生き抜くであろう。このような優勢選択の例は、薬剤の、ネオマイシン（Southern P.及びBerg P. J. Molec. Appl. Genet. 1 :327 （1982））、ミコフェノール酸（mycophenolic acid）（Mulligan, R.C.及びBerg, P. Science 209:1422 （1980））又はハイグロマイシン（Sugden, B. et al. Mol. Cell. Biol. 5:410-413 （1985））を用いる。この３つの例は、適切な薬剤、それぞれ、薬剤の、Ｇ４１８又はネオマイシン（ゲンチシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）又はハイグロマイシンに対する抵抗性を運ぶための真核生物制御下の細菌遺伝子を用いる。他のものは、ネオマイシンアナログ、Ｇ４１８及びピューロマイシンを含む。
【０１３６】
提供されているのは、ここで提供された任意のベクターを含む細胞である。開示された細胞は、ここで提供されたベクターをクローニング又は増殖させるために用いられる任意の細胞であることができる。したがって、細胞は、任意の一次細胞培養又は確立された細胞株由来であることができる。細胞タイプは、ベクター及び所望の用途の選択に基づいて、当業者が選択することができる。
【０１３７】
提供されているのは、デスレセプターのＣＡＲＤ含有タンパク質結合領域を含む単離されたポリペプチドであって、２５アミノ酸残基未満を含むポリペプチドである。
【０１３８】
したがって、提供されているポリペプチドは、ＴＦＮＲ１のＣＡＲＤ含有タンパク質結合領域であることができる（受託番号ｇｉ:２３３１２３７２）。提供されているポリペプチドは、ＦａｓレセプターのＣＡＲＤ含有タンパク質結合領域であることができる（受託番号ｇｉ:ｌ １９８３３）。提供されているポリペプチドは、ＴＲＡＩＬレセプターのＣＡＲＤ含有タンパク質結合領域であることができる。したがって、提供されているポリペプチドは、ＤＲ４のＣＡＲＤ含有タンパク質結合領域であることができる（受託番号ｇｉ:２１２６４５２５）。提供されているポリペプチドは、ＤＲ５のＣＡＲＤ含有タンパク質結合領域であることができる（受託番号ｇｉ:３７２１８７８）。提供されているポリペプチドは、配列番号２２のアミノ酸配列のフラグメントであることができ、このフラグメントはここで開示されたＣＡＲＤ含有タンパク質に結合するものであることができる。説明例として、提供されているポリペプチドは、ＤＲ５のアミノ酸２５０〜３４０を含むことができる。したがって、ポリペプチドは、配列番号２３のアミノ酸配列を含むことができる。ポリペプチドは、さらに、配列番号２３のアミノ酸配列のフラグメントを含むことができ、このフラグメントはＤＤＸ３に結合することができるものであることができる。一例として、調節因子は、ＤＲ５のアミノ酸２８０〜３１０を含むポリペプチドであることができる。したがって、調節因子は、配列番号２４のアミノ酸配列を含むことができる。別の例として、調節因子は、ＤＲ５のアミノ酸３００〜３３０を含むポリペプチドであることができる。したがって、調節因子は、配列番号３６のアミノ酸配列を含むことができる。
【０１３９】
「結合（する）」は、ポリペプチドが、標準的な生化学的方法で検出することができる充分な親和性で、ＣＡＲＤ含有タンパク質タンパク質と非共有結合（たとえば水素結合）を形成することを意味する。ひとつの側面において、提供されているポリペプチドは、それが由来するデスレセプターと等しい又はそれより大きい親和性で、ＣＡＲＤ含有タンパク質と結合する。
【０１４０】
デスレセプターのＣＡＲＤ含有タンパク質結合領域は、ＣＡＲＤ含有タンパク質結合の競合的阻害のための可溶性レセプターとしても利用性を有する。したがって、提供されているのは、細胞においてデスレセプターへのＣＡＲＤ含有タンパク質結合をブロックする方法であって、細胞を、ここで開示されたデスレセプターの生存領域をコードするポリペプチド又は結合をブロックするそのフラグメントと接触させる工程を含む、方法である。同じく提供されているのは、細胞においてデスレセプターアゴニストに対する細胞の抵抗性を逆転させる方法であって、細胞をポリペプチドと接触させることを含む方法である。
【０１４１】
提供されているのは、ＣＡＲＤ含有タンパク質のデスレセプター結合ドメインを含む単離されたポリペプチドである。提供されているポリペプチドは、ＤＤＸ３のデスレセプター結合ドメインであることができる（配列番号２５、受託番号ｇｉ:１３５１４８１６）。提供されているポリペプチドは、配列番号２５のアミノ酸配列のフラグメントであって、このフラグメントはここで開示されたデスレセプターと結合するものであることができる。ＤＤＸ３は、約アミノ酸２００〜２５０及び３５０〜４００でＤＲ５と結合する。したがって、調節因子は、ＤＤＸ３のアミノ酸２００〜２５０を含むポリペプチド、又はそのフラグメントであることができる。したがって、調節因子は、配列番号３７のアミノ酸配列を含むことができる。したがって、調節因子は、ＤＤＸ３のアミノ酸３５０〜４００を含むポリペプチド、又はそのフラグメントであることができる。したがって、調節因子は、配列番号３８のアミノ酸配列を含むことができる。提供されているポリペプチドは、ｍｄａ−５のデスレセプター結合ドメインであることができる（受託番号ｇｉ:１１３４４５９３）。提供されているポリペプチドは、ＲＩＧ−１のデスレセプター結合ドメインであることができる（受託番号ｇｉ:６０４８５６４）。
【０１４２】
ＣＡＲＤ含有タンパク質のデスレセプター結合ドメインを含む単離されたポリペプチドは、デスレセプター誘導性アポトーシスを阻害することができない場合、ＣＡＲＤ含有タンパク質によるデスレセプター結合の優勢陰性阻害剤としての利用性を有する。したがって、ひとつの側面において、単離されたポリペプチドは、カスパーゼ又はＩＡＰと結合することができない。ＤＤＸ３のＩＡＰ結合に関与するＣＡＲＤモチーフは、アミノ酸約５０〜１００である。したがって、提供されているポリペプチドは、ＤＤＸ３のデスレセプター結合ドメインを含むが、ＤＤＸ３のアミノ酸５０〜１００を含まないことができる。したがって、調節因子は、ＤＤＸ３のアミノ酸２００〜２５０及び／又はアミノ酸３５０〜４００を含むが、ＤＤＸ３のアミノ酸５０〜１００を含まないポリペプチドであることができる。たとえば、提供されているのは、ＤＤＸ３のアミノ酸１５１〜６６２からなるポリペプチドである。したがって、調節因子は、配列番号３９のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことができる。
【０１４３】
さらに別の側面において、ポリペプチドは、内在性ＣＡＲＤ含有タンパク質とデスレセプターとの会合をブロックすることができる。さらに別の側面において、ポリペプチドは、デスレセプターに対するＩＡＰの動員を防止することができる。別の側面においては、ポリペプチドは、デスレセプターに対するＦＡＤＤの動員を阻害することができない。これらの側面の任意の組合せが企図される。
デスレセプター誘導アポトーシスを阻害する、ＤＤＸ３のようなＣＡＲＤ含有タンパク質の能力は、少なくとも一部はＣＡＲＤ含有タンパク質のＣＡＲＤドメインによるデスレセプターに対するＩＡＰの動員によるものである。したがって、提供されているのは、ＩＡＰとデスレセプターとの会合をブロックする方法であって、細胞を、開示されたポリペプチドと接触させる工程を含む方法である。また、提供されているのは、デスレセプターアゴニストに対する細胞の抵抗性を逆転させる方法であって、細胞を、開示されたポリペプチドと接触させることを含む方法である。
【０１４４】
ここで開示された組成物及び開示された方法を実施するために必要な組成物は、別途具体的に記載しない限り、その特定の試薬又は化合物について当業者に公知の任意の方法を用いて作製することができる。
【０１４５】
たとえば、核酸は、標準的な化学合成法を用いて作製することができ、又は酵素的な方法もしくは任意の他の公知の方法を用いて作製することができる。このような方法は、標準的な酵素的消化及びその後のヌクレオチドフラグメントの単離（たとえば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition （Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989）第５、６章を参照されたい）から、純粋に合成による方法、たとえばMilligen又はBeckman System 1Plus ＤＮＡ合成機（たとえばモデル８７００自動合成機、Milligen-Biosearch, Burlington, MA又はＡＢＩモデル３８０Ｂ）を用いるシアノエチルホスホルアミダイト法までにわたる。オリゴヌクレオチドの作製に有用な合成的方法は、Ikuta et al., Ann. Rev. Biochem. 53:323-356 （1984）（ホスホトリエステル法及びホスファイト−トリエステル法）、及びNarang et al., Methods Enzymol., 65:610-620 （1980）（ホスホトリエステル法）にも記載されている。タンパク質核酸分子は、Nielsen et al., Bioconjug. Chem. 5:3-7 （1994）に記載された方法のような公知の方法を用いて作製することができる。
【０１４６】
開示されたポリペプチドを作製するひとつの方法は、タンパク質化学技術によって２又はそれ以上のペプチド又はポリペプチドを連結することである。たとえば、ペプチド又はポリペプチドは、現在利用可能な実験室装置を用いてＦｍｏｃ（９−フルオレニルメチルオキシカルボニル）又はＢｏｃ（tert-ブチルオキシカルボニル）化学を用いて化学的に合成することができる。（Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA）。当業者は、開示されたタンパク質に相当するペプチド又はポリペプチドが、たとえば標準的な化学反応によって合成できることを、容易に認めることができる。たとえば、あるペプチド又はポリペプチドは、合成され、その合成樹脂から切断させないでいることができる一方、他のペプチド又はタンパク質のフラグメントは、合成され、続いてその樹脂から切断されて、それによって他方のフラグメントにおいては官能的に保護されている末端基を暴露することができる。ペプチド縮合反応によって、これらの２つのフラグメントを、それぞれカルボキシル末端及びアミノ末端でペプチド結合を介して共有結合させ、抗体又はそのフラグメントを形成させることができる（Grant GA （1992） Synthetic Peptides: A User Guide. W.H. Freeman and Co., N. Y. （1992）； Bodansky M及びTrost B., Ed. （1993） Principles of Peptide Synthesis. Springer-Verlag Inc., NY 、これらは、少なくともペプチド合成に関連する材料に関して、参照によりここに援用される）。あるいは、ペプチド又はポリペプチドは、ここで記載されているように、インビボで独立して合成される。いったん単離されると、これらの独立したペプチド又はポリペプチドは、同様のペプチド縮合反応を介して連結され、ペプチド又はそのフラグメントを形成することができる。
【０１４７】
たとえば、クローニングされた又は合成されたペプチドセグメントの酵素的連結により、比較的短いペプチドフラグメントを、より大きいペプチドフラグメント、ポリペプチド又はタンパク質ドメイン全体を生成するように結合させることが可能になる（Abrahmsen L et al., Biochemistry, 30:4151 （1991））。あるいは、合成ペプチドのネイティブの化学的連結を、より短いフラグメントから合成により大きいペプチド又はポリペプチドを構築するために利用することができる。この方法は、２工程の化学反応からなっている（Dawson et al. Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation. Science 266:776-779 （1994））。最初の工程は、保護されていない合成ペプチドの化学選択的反応であり、チオエステルと、アミノ末端Ｃｙｓ残基を含む別の保護されていないペプチドセグメントとにより、チオエステル結合中間体を、最初の共有結合生成物として与える。反応条件の変化なしに、この中間体は、偶発的で迅速な分子内反応を起こし、連結部位でネイティブなペプチド結合を形成する（Baggiolini M et al. （1992） FEBS Lett. 307:97-101； Clark-Lewis I et al., J.Biol.Chem., 269:16075 （1994）； Clark-Lewis I et al., Biochemistry 30:3128 （1991）； Rajarathnam K et al., Biochemistry 33:6623-30 （1994））。
【０１４８】
あるいは、保護されていないペプチドセグメントは、化学的に連結され、そこで化学的連結の結果として形成されたペプチドセグメント間の結合は非天然（非ペプチド）結合である（Schnolzer, M et al. Science 256:221 （1992））。この技術は、タンパク質ドメインのアナログ、ならびに充分な生物学的活性を有する大量の比較的純粋なタンパク質を合成するために用いられてきたものである（deLisle Milton RC et al., Techniques in Protein Chemistry IV. Academic Press, New York, pp. 257-267 （1992））。
【０１４９】
以下の実施例は、本発明にしたがった方法及び結果を説明するためのものである。これらの実施例は、本発明の全ての側面を包含するようには意図されておらず、むしろ代表的な方法及び結果を説明することを意図されている。これらの実施例は、当業者には明白な本発明の等価物及び変形を除外することを意図するものではない。
【０１５０】
（実施例）
例１:  デスドメイン機能での封鎖の生成によるＴＲＡＩＬ−Ｒ２媒介性アポトーシスに対する腫瘍細胞の誘導可能な抵抗性
材料及び方法
細胞株、抗体、及び試薬:
ヒト乳がん細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、the American Tissue Culture Collection （ATCC）（Manassas, VA）から購入した。ヒト卵巣がん細胞株、ＵＬ−３Ｃを入手した。細胞は、１０％熱非働化ＦＣＳ、５０μg/ml  ストレプトマイシン、及び５０U/mL  ペニシリン（Cellgro, Mediatec, Inc., Herndon, VA）を添加したＤＭＥＭ又はＲＰＭＩ１６４０中で維持した。抗ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１（クローン:２Ｅ１２）及び抗ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ２（クローン:ＴＲＡ−８）モノクローナル抗体は、以前に記載された（Ichikawa, et al. 2003； Ichikawa, et al. 2001）。フローサイトメトリー及び免疫沈降アッセイのための抗ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ２（クローン:２Ｂ４）は、開発した。組換え可溶性ＴＲＡＩＬは、Alexis Biochemicals（San Diego, CA）から購入した。ポリクローナル抗カスパーゼ３及び抗カスパーゼ８抗体は、BD PharMingen（San Diego, CA）から購入した。モノクローナル抗ヒトカスパーゼ２、３、８、９及び１０抗体、及びモノクローナル抗ヒトＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂａｘ、ｃＩＡＰ−１、ｃＩＡＰ−２、ＸＩＡＰ及びサバイビン抗体は、調製した。ポリクローナル抗ホスホ−ＳＡＰＫ／ＪＮＫ（Ｔｈｒ１８３／Ｔｙｒ１８５）、抗ホスホ−ｐ３８  ＭＡＰＫ（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）、抗ＰＡＲＰ抗体は、Cell Signaling Technology, Inc. （Beverly, MA）から購入した。抗β-アクチン抗体は、Sigma （St. Louis, MO）から購入した。抗ＦＡＤＤは、Transduction Laboratories（Lexington, KY）から購入した。抗ＦＬＩＰは、ProSci Inc.（Poway, CA）から購入した。すべての西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）-コンジュゲート化二次試薬は、Southern Biotechnology Associates, Inc. （Birmingham, AL）から購入した。
【０１５１】
ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２の細胞表面発現のフローサイトメトリー解析:
１０６個の細胞を、１μg/mlのビオチン化２Ｅ１２及び１μg/mlのＰＥ−コンジュゲート化２Ｂ４とともに、氷上で３０分間、インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液（５％  ＦＢＳ及び０．０１％  ＮａＮ３を含むＰＢＳ）で２回洗浄した後、細胞を、ストレプトアビジン−サイクローム（Cychrome）とともにインキュベートした。１０，０００個の生存細胞を、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（BD, CA）で解析した。
【０１５２】
ＴＲＡ−８、２Ｅ１２及びＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスに対する腫瘍細胞感受性の細胞毒性解析:
細胞（１，０００細胞／ウェル）を、９６ウェルプレートに三連で、８種の濃度のＴＲＡ−８、２Ｅ１２又はＴＲＡＩＬ（１，０００ng/mlからの二重連続希釈）とともに播いた。細胞生存率は、製造業者の指示書にしたがってＡＴＰＬＩＴＥアッセイ（Packard Instruments, Meriden, CT）を用いて、一晩培養後に決定した。結果は、培地対照ウェルに対して比較した処理ウェルの生存細胞のパーセンテージとして表す。
【０１５３】
ＴＲＡＩＬ−Ｒ２に対する腫瘍細胞抵抗性の誘導:
細胞（５×１０５/ml）を、１ng/mlの開始用量のＴＲＡ−８とともに２日間インキュベートした。細胞を、２日ごとに新鮮な培地で分割し、ＴＲＡ−８用量が２，０００ng/mlに達するまで、２倍用量のＴＲＡ−８を含む培地でインキュベートした。各処理サイクルで、非誘導（親）細胞及び誘導用量のＴＲＡ−８で処理された誘導細胞の細胞生存率を、ＡＴＰＬＩＴＥアッセイによって決定した。
【０１５４】
ＴＲＡＩＬ−Ｒ２のクローニング及び配列決定:
ＴＲＡＩＬ−Ｒ２の全長ｃＤＮＡは、プラチナＤＮＡプルーフリーディングポリメラーゼ（Invitrogen）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって得た。ｃＤＮＡは、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯベクター（Invitrogen）にクローニングした。少なくとも５個の独立したクローンを配列決定のために選択した。
【０１５５】
アポトーシス関連タンパク質のウェスタン・ブロット解析：
腫瘍細胞（３×１０６）を、冷ＰＢＳで２回洗浄し、１０mM  トリス塩酸（ｐＨ７．６）、１５０mM  ＮａＣｌ、０．５mM  ＥＤＴＡ、１mM  ＥＧＴＡ、０．１％  ＳＤＳ、１mM  オルソバナジウム酸ナトリウム、及びプロテアーゼ阻害剤の混合物（１mM  フェニルメチルスルフォニルフルオリド、１μg/ml  ペプスタチンＡ、２μg/ml  アプロチニン）を含む３００μlの溶解緩衝液で溶解した。ライセートを、１０秒間超音波処理し、２０分間、１２，０００ｇで遠心分離した。細胞ライセート及び等量の総タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液を用いて５分間ボイルした。総（全体）細胞ライセートを、８％、１０％又は１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜に電気的に転写した。これらのブロットを、５％ノンファットドライミルクを含むＴＢＳＴ緩衝液（２０mM  トリス塩酸（ｐＨ７．４）、５００mM  ＮａＣｌ及び０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）でブロッキングし、ブロッキング緩衝液中の一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。ブロットを、ＴＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰ−コンジュゲート化二次抗体を用いて室温で１時間探索した。ＴＢＳＴで４回洗浄後、探索されたタンパク質を、ＥＣＬウェスタン・ブロッティング検出システム（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）を製造業者の指示書にしたがって用いて可視化した。
【０１５６】
アポトーシス及び細胞シグナリング関連遺伝子の転写調節のｃＤＮＡアレイ解析:
ヒトアポトーシス遺伝子アレイ（Human Apoptosis Gene Array；ＨＳ−００２）及びヒトシグナル伝達パスウェイファインダー遺伝子アレイ（Human Signal Transduction PathwayFinder Gene Array；ＨＳ−００８）は、SuperArray, Inc.（Frederick, MD）から購入した。総ＲＮＡは、ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）プロトコール（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いて細胞から抽出した。ｃＤＮＡプローブは、３２Ｐ−ｄＣＴＰを用いて合成した。膜ブロット上のｃＤＮＡを、３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識したプローブと、６０℃で一晩、ハイブリダイズさせた。遺伝子発現プロフィールは、CYCLONE PHOSPHORIMAGER（登録商標）（Packard Instruments, Meridien, CT）を用いて解析した。
【０１５７】
ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２の共免疫沈降:
１０７個の細胞を氷冷したＰＢＳで洗浄し、氷上で１５分間、溶解緩衝液で溶解した（１％  Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１５０mM  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、２０mM  トリス塩酸[pH７．５]、２mM  ＥＤＴＡ、０．５７mM  ＰＭＳＦ、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル）。ライセートを、次に４℃で１０分間、１６，０００ｇで遠心分離することにより、２回清澄化した。可溶性画分を、３０μｌのＴＲＡ−８又は２Ｂ４コンジュゲート化セファロース４Ｂとともに４℃で一晩インキュベートした。溶解緩衝液で７回及び１０mMトリスで３回の洗浄の後、結合したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディング緩衝液中で３分間ボイルすることにより溶出させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。カスパーゼ８及びＦＡＤＤの存在は、ウェスタン・ブロット解析により決定した。
【０１５８】
二次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動:
２Ｂ４−セファロース４Ｂを用いた共免疫沈降の後、タンパク質を溶出させ、アセトンで脱塩して、ＩＥＦサンプル緩衝液（Bio-Rad Hercules, CA）中で再構成した。１６０μgの総タンパク質を、ＩＰＧストリップ（Bio-Rad）に載せ、室温で一晩置き、その後、ＰＲＯＴＥＡＮ  ＩＥＦ（登録商標）Ｃｅｌｌ（BioRad）中で分離した。タンパク質ストリップを、ＲｅａｄｙＰｒｅｐ平衡化緩衝液（Bio-Rad）で平衡化し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでさらに分離した。完了後、ゲルを、１０％メタノール及び７％酢酸を含む緩衝液で固定し、ＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｒｕｂｙ染色緩衝液（Bio-Rad）で染色した。ゲルを、ＶＥＲＳＡＤＯＣ（登録商標）デジタル・イメージング・システム（Bio-Rad）を用いて画像化し、ＰＤＱＵＥＳＴ（登録商標）ソフトウェア（Bio-Rad）で解析した。
【０１５９】
結果
ＴＲＡＩＬ−Ｒ２媒介性アポトーシスに対する選択的抵抗性の誘導。
ヒト乳がん細胞株、ＭＤＡ−２３１及びヒト卵巣がん細胞株、ＵＬ−３Ｃを、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抵抗性の誘導のために選択したが、これは、それらが、抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（２Ｅ１２）及び抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２（２Ｂ４）抗体を用いて二色フローサイトメトリーによって測定したところ、高レベルの細胞表面ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２を共発現したためである（図１Ａ）。２つの腫瘍細胞株は、インビトロ細胞毒性アッセイによて測定したところ、アゴニスト性抗ＴＲＡＩＬレセプター抗体、２Ｅ１２及びＴＲＡ−８、ならびにＴＲＡＩＬによって誘導されるアポトーシスに対して感受性であり（図１Ｂ）、ＴＲＡＩＬについての両レセプターが２つの腫瘍細胞株において機能的であることが示された。これらの腫瘍細胞が処理後にＴＲＡ−８に対するアポトーシス抵抗性を生じるかどうかを決定するために、細胞を、非アポトーシス用量（１ng/ml）から始まるＴＲＡ−８で２日間処理し、次いでこの用量を、２，０００ng/mlになるまで２日ごとに２倍にし、ＴＲＡ−８を除去した。細胞生存率は、各用量で処理及び非処理細胞の両方について測定した。１０ng/ml未満のＴＲＡ−８用量では、処理及び非処理細胞の両方において有意な細胞死は見られなかった。ＴＲＡ−８用量が５０ng/ml以上に増大された場合、非処理細胞において、細胞生存率のＴＲＡ−８用量依存性低減が観察された。これに対して、処理細胞においては、２０００ng/mlまで、有意な細胞死は見られなかった（図１Ｃ）。これらの結果は、低い、非アポトーシス誘導性用量のＴＲＡ−８での反復的な腫瘍細胞の処理が、アポトーシス抵抗性を誘導すること、及び誘導された抵抗性はアポトーシス感受性細胞を除去することによる選択過程のせいではないこと、を示す。
【０１６０】
ＴＲＡ−８の除去後４週間で、親細胞（ＭＤＡ−２３１Ｐ、ＵＬ−３ＣＰ）及び処理細胞（ＭＤＡ−２３１Ｒ、ＵＬ−３ＣＲ）の両方を、ＴＲＡ−８、２Ｅ１２又はＴＲＡＩＬによって誘導されるアポトーシスに対する感受性について試験した。１，０００ng/mlのＴＲＡ−８での処理後の親細胞の１００％近い細胞死と比較して、ＭＤＡ−２３１Ｒ及びＵＬ−３ＣＲ細胞の両方において、ある濃度範囲のＴＲＡ−８で有意な細胞死は誘導されず（図２Ａ）、これらの細胞はＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに対して高度に抵抗性となっていたことが示された。これに対し、２Ｅ１２誘導性アポトーシスに対するＴＲＡ−８抵抗性腫瘍細胞の感受性は不変であった（図２Ｂ）。感受性は低減したが、誘導されたＴＲＡ−８抵抗性細胞は、いまだにＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスに対して感受性であった（図２Ｃ）。これらの結果は、ＴＲＡ−８誘導性アポトーシス抵抗性が、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２について選択的であることを示す。ＴＲＡ−８除去の後、細胞は、少なくとも３ヶ月間、ＴＲＡ−８抵抗性の状態を維持し、その後、感受性は４ヶ月までに親細胞の約３０％のレベルまでゆっくり回復し（図２Ｄ）、ＴＲＡ−８に対する誘導された抵抗性は長く留まるが、部分的に可逆的であることが示された。
【０１６１】
誘導されたＴＲＡＩＬ−Ｒ２抵抗性は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２の変更された細胞表面発現もしくは突然変異、又は内在的なアポトーシス欠陥のためではない。
ＴＲＡ−８誘導性アポトーシス抵抗性がＴＲＡＩＬ−Ｒ２について選択的であることは、ＴＲＡ−８抵抗性の誘導後、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２の発現が選択的に低減され得ること又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２の突然変異が起こり得ることを示す。これらの可能性を除外するために、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２の細胞表面発現を調べ、両ＴＲＡ−８抵抗性細胞において、それらの親細胞と比較してＴＲＡＩＬ−Ｒ２の発現レベルの変更がなかったことが決定された（図３Ａ）。この結果は、ウェスタン・ブロット解析によってさらに確認され、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２タンパク質の２つのアイソフォームが親及び抵抗性細胞において同等に発現されたことが示された（図３Ａ）。両ＴＲＡ−８抵抗性細胞株から単離されたＴＲＡＩＬ−Ｒ２の全長ｃＤＮＡクローンを配列決定し、突然変異は同定されなかった。これらの結果は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２に対する誘導された選択的な抵抗性が、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２自体の変更によるものではないことを示した。
【０１６２】
ＴＲＡＩＬ−Ｒ２媒介性アポトーシスは、多数のアポトーシス調節タンパク質、たとえばアポトーシス阻害剤（ＩＡＰ）ファミリー（Park, et al. 2002； Ng, et al. 2002； Roa, et al. 2003； Cummins, et al. 2004； Li, et al. 2004； Bockbrader, et al. 2005）及びＢｃｌ−２ファミリー（Hinz, et al. 2000； Rokhlin, et al. 2001； Fulda, et al. 2002； Carthy, et al. 2003； Chawla-Sarkar, et al. 2004； Sinicrope, et al. 2004）によって、調節されることができる。新規に開発されたモノクローナル抗体のパネルを用いて、ｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２、ＸＩＡＰ、サバイビン、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ及びＢａｘの発現のタンパク質レベルを、ウェスタン・ブロット解析によって試験した。ＭＤＡ−２３１及びＵＬ−３Ｃは、それらのタンパク質を変化するレベルで発現したが、親細胞及び抵抗性細胞の間で有意な差はなく（図３Ａ）、これらのタンパク質の発現レベルがＴＲＡ−８の誘導に関与している可能性は低いことが示された。アポトーシス及び細胞シグナリング関連遺伝子のパネルにおける潜在的な転写の変更についてのより広範囲のスクリーニングを、２００を超える周知のアポトーシス関連遺伝子（図３Ｂ、上のパネル）及び細胞シグナリング遺伝子（図３Ｂ、下のパネル）を含む膜ｃＤＮＡアレイ（Superarray, Frederick, MD）を用いて実施した。ＭＤＡ−２３１親細胞及び抵抗性細胞間での平行比較により、ＴＲＡ−８抵抗性の誘導後のこれらの遺伝子の発現プロフィールには有意な差がなかったことが示される。
【０１６３】
ＴＲＡ−８抵抗性腫瘍細胞におけるＴＲＡＩＬ−Ｒ２アポトーシスシグナルト伝達の選択的封鎖。
上流カスパーゼ８及び下流カスパーゼ３の連続的な活性化は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２アポトーシスシグナル伝達の鍵となる事象である。したがって、これら２つのカスパーゼの時間依存性活性化を調べた。以前に示されたように、ＴＲＡ−８感受性親ＭＤＡ−２３１細胞のＴＲＡ−８での処理は、ＴＲＡ−８処理後の切断されたカスパーゼフラグメントの生成によって示されるように、カスパーゼ８（図４Ａ、上のパネル）及びカスパーゼ３（図４Ａ、中央のパネル）の活性化を誘導した。カスパーゼ活性化の非常に高感度のマーカーとして、ＰＡＲＰは、急速に切断された（図４Ａ、下のパネル）。しかし、カスパーゼ８、カスパーゼ３の活性化及びその後のＰＡＲＰ切断は、ＴＲＡ−８処理後に抵抗性細胞においては起こらなかった。カスパーゼカスケードの活性化の失敗は、ＴＲＡ−８抵抗性細胞において２Ｅ１２に誘発されたＴＲＡＩＬ−Ｒ１カスパーゼ活性化が損なわれていないので、カスパーゼ経路の内在的な欠陥によるものではない（図４Ａ、左パネル）。これらの結果は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２関連カスパーゼカスケードが、ＴＲＡ−８抵抗性誘導後に、上流カスパーゼ８のレベルで選択的に封鎖されていることを示す。
【０１６４】
ＪＮＫ／ｐ３８キナーゼ経路のカスパーゼ８依存性活性化は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２媒介性アポトーシスにおいて重要な相乗的役割を果たす（Ohtsuka, et al. 2003； Ohtsuka, et al. 2002）。ＪＮＫ／ｐ３８キナーゼの活性化は、ＴＲＡ−８処理中のＪＮＫ／ｐ３８キナーゼのリン酸化のウェスタン・ブロット解析によって測定した。カスパーゼ８活性化に対応して、ＪＮＫ（図４Ｂ、上のパネル）及びｐ３８（図４Ｂ、下のパネル）は時間依存性の方式で急速にリン酸化された。しかし、ＴＲＡ−８抵抗性細胞においては、２Ｅ１２のみがＪＮＫ／ｐ３８のリン酸化を誘導できたがＴＲＡ−８はできなかったのであり、ＪＮＫ／ｐ３８キナーゼ経路もＴＲＡ−８抵抗性細胞において選択的に阻害されていることが示された。
【０１６５】
ＴＲＡ−８抵抗性腫瘍細胞におけるＴＲＡＩＬ−Ｒ２デスドメイン機能の選択的封鎖。
ＦＡＤＤ及びカスパーゼ８はＴＲＡＩＬ−Ｒ２のデスドメインに動員され、ＤＩＳＣの主要な成分であるので、親細胞及び抵抗性細胞の両方において、共免疫沈降アッセイによってＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２でのＤＩＳＣ形成能を調べた。ＭＤＡ−２３１親細胞においては、ＴＲＡ−８又は２Ｅ１２での処理後、ＦＡＤＤ（図５Ａ、上のパネル）及びカスパーゼ８（図５Ａ、中央のパネル）の時間依存性の増大があり、これらはそれぞれＴＲＡＩＬ−Ｒ２（図５Ａ、左パネル）又はＴＲＡＩＬ−Ｒ１（図５Ａ、右パネル）で共免疫沈降された。ＴＲＡ−８抵抗性細胞においては、ＴＲＡ−８媒介性アポトーシスの間にＴＲＡＩＬ−Ｒ２で共免疫沈降されたＦＡＤＤ及びカスパーゼ８はなかったが、２Ｅ１２処理後のＴＲＡＩＬ−Ｒ１とのＦＡＤＤ及びカスパーゼ８の共免疫沈降は影響されなかった。さらに、デスドメインへのカスパーゼ８についての阻害的競合剤であるｃＦＬＩＰがＤＩＳＣ形成の封鎖において役割を果たすかどうかを決定するために、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２とのｃＦＬＩＰの共免疫沈降も調べた。同様の時間依存性パターンで、ｃＦＬＩＰは、親細胞においては、ＴＲＡ−８媒介性アポトーシスの間にＴＲＡＩＬ−Ｒ２と共免疫沈降したが、抵抗性細胞においては沈降しなかった（図５Ａ、下のパネル）。２Ｅ１２媒介性アポトーシスの間におけるＴＲＡＩＬ−Ｒ１とのｃＦＬＩＰの共免疫沈降は、親細胞及びＴＲＡ−８抵抗性細胞の間で異ならなかった。ＦＡＤＤ、カスパーゼ８及びｃＦＬＩＰの同様のレベルの総タンパク質発現があったので、これらのデスドメイン会合タンパク質の動員の失敗は、これらのタンパク質の発現の欠陥のせいではない。これらの結果は、誘導されたＴＲＡ−８抵抗性が、ＴＲＡ−８処理後のＤＩＳＣ形成におけるＦＡＤＤ及びカスパーゼ８の動員のためのＴＲＡＩＬ−Ｒ２についての選択的欠陥である可能性が高い。
【０１６６】
ＴＲＡ−８抵抗性細胞におけるＴＲＡＩＬ−Ｒ２のデスドメインでのＤＩＳＣアセンブリーの失敗は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２タンパク質複合体の機能及び組成が変更されており、そこでは、新規に生成された又は機能的に変更されたタンパク質が、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２と会合することができ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２のデスドメインに対するＦＡＤＤ及びカスパーゼ８の動員を防止することを示す。したがって、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２会合タンパク質のプロテオームプロフィールを、ＴＲＡ−８感受性親細胞及びＴＲＡ−８抵抗性ＭＤＡ−２３１細胞において、ＴＲＡ−８処理の前後で、二次元プロテオーム及びマススペクトロメトリー解析によって比較した。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２と共免疫沈降した差時的に発現されたタンパク質を、ＰＤＱｕｅｓｔソフトウェアによって解析した結果、親細胞及び抵抗性細胞の間でＴＲＡ−８媒介性アポトーシスの間に変化した３つのタンパク質スポットに注目した（図５Ｂ）。スポット１及び２は、それぞれ分子量５０kDa又は２０kDaのタンパク質マスであり、ＴＲＡ−８処理後のＭＡＤ−２３１親細胞のみに出現したが、未処理の細胞及びＴＲＡ−８処理した抵抗性細胞には出現せず、これらのタンパク質は、ＴＲＡ−８媒介性アポトーシスの間にＴＲＡＩＬ−Ｒ２に動員され得ることが示された。それらの分子量及び等電点に基づいて、スポット１のタンパク質は、カスパーゼ８であることが確認され（図５Ｃ）、スポット２はＦＡＤＤであることが（図５Ｄ）ウェスタン・ブロット解析によって確認された。スポット３のタンパク質は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２と定常的に会合しており、ＴＲＡ−８媒介性アポトーシスの間に、より高分子量のタンパク質からより低分子量のタンパク質へのシフトが起こったので、興味深いものであった（図５Ｅ）。この変換は、ＴＲＡ−８処理されたＭＤＡ−２３１親細胞のみにおいて観察されたが、抵抗性細胞では観察されなかったので、誘導されたＴＲＡ−８抵抗性に関連するように見えた。さらに、マススペクトロメトリー分析によって、両スポットがＤＥＡＤ-ボックスＲＮＡヘリカーゼファミリーのメンバーであるＤＤＸ３に由来することが同定された。ＤＤＸ３の高分子形態は、ＴＲＡ−８抵抗性細胞において定常的にＴＲＡＩＬ−Ｒ２と会合しているので、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２のデスドメインへのＦＡＤＤ及びカスパーゼ８の動員を防止する因子であることができる。
【０１６７】
化学療法剤によるＴＲＡ−８抵抗性の逆転。
化学療法剤は、特にＴＲＡ−８抵抗性細胞において、インビトロ及びインビボの両方でＴＲＡ−８媒介性アポトーシス相乗的に増強する（Ohtsuka, et al. 2003； Ohtsuka, et al. 2002； Buchsbaum et al. 2003）。化学療法剤が誘導されたＴＲＡ−８抵抗性を逆転させることができるかどうかを決定するために、一群の化学療法剤、アドリアマイシン、テキソール（Texol）、シスプラチン及びビスインドリーマレイミドVIII（Bisindolymaleimide VIII）（BisVIII）の効果を、誘導された抵抗性細胞のＴＲＡ−８媒介性アポトーシスで調べた。示した濃度の化学療法剤の存在下で、ＴＲＡ−８用量依存性応答は、ＴＲＡ−８抵抗性ＭＤＡ−２３１及びＵＬ−３Ｃ細胞の両方で回復され（図６Ａ）、すべての化学療法剤がＴＲＡ−８誘導性抵抗性を逆転させることができることが示された。アドリアマイシン及びＴＲＡ−８の組合せ療法後のＭＡＤ−２３１抵抗性細胞におけるカスパーゼカスケードの活性化を、モノクローナル抗カスパーゼ抗体のパネルを用いて調べた。抗カスパーゼ８（クローン：２Ｆ４）及び抗カスパーゼ２（クローン：２Ａ３）は、それぞれカスパーゼ８及び２のプロ形態のみを認識するので、カスパーゼ８及び２の活性化は、切断によるプロ形態の低減された量によって明らかにされた。抗カスパーゼ９（クローン：４Ｂ４）及び抗カスパーゼ３（クローン：１Ｈ６）は、それぞれプロ及び切断形態のカスパーゼ９及び３を認識し、それらの活性化は、カスパーゼ９及び３の切断されたフラグメントの存在によって示された。ＴＲＡ−８（図６Ｂ、レーン５）又はアドリアマイシン（図６Ｂ、レーン４）での単一薬剤処理単独は、４時間で、非処理対照と比較して、すべての試験したカスパーゼの有意な活性化は誘導されなかった（図６Ｂ、レーン１）。これに対し、カスパーゼ２、９及び３の活性化は、アドリアマイシン及びＴＲＡ−８の組合せ療法後１時間もの速さで誘導され（図６Ｂ、レーン２）、これは、４時間の時点でさらに増強された（図６Ｂ、レーン３）。カスパーゼ８の活性化は、組合せ療法後４時間の時点で顕著であった。これらの結果は、アドリアマイシンでの処理がＴＲＡ−８抵抗性細胞においてＴＲＡＩＬ−Ｒ２関連カスパーゼカスケードを回復させたことを示す。アドリアマイシンの存在下で、ＴＲＡ−８は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２に対するＦＡＤＤの動員を誘発することができ（図６Ｃ、レーン２及び３）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２の動員機能は、アドリアマイシン処理によって回復された。
【０１６８】
例２：ＴＲＡＩＬ−Ｒ２媒介性アポトーシスにおけるＤＤＸの役割
材料及び方法
細胞株、抗体及び試薬。
ヒト乳がん細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１はthe American Tissue Culture Collection （ＡＴＣＣ）（Manassas, VA）から購入した。ヒト卵巣がん細胞株、ＵＬ−３Ｃは入手した。細胞は、１０％熱非働化ＦＣＳ、５０μg/ml  ストレプトマイシン、及び５０U/mL  ペニシリン（Cellgro Medi-atec, Inc., Herndon, VA）を添加したＤＭＥＭ又はＲＰＭＩ１６４０中で維持した。抗ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ１（クローン：２Ｅ１２）及び抗ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ２（クローン：ＴＲＡ−８）モノクローナル抗体は、以前記載された（Ichikawa et al., 2003； Ichikawa et al., 2001）。抗ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ２（クローン：２Ｂ４）は、フローサイトメトリー及び免疫沈降アッセイのために開発された。組換え可溶性ＴＲＡＩＬは、Alexis Biochemicals（San Diego, CA）から購入した。ポリクローナル抗カスパーゼ３及び抗カスパーゼ８抗体は、BD Pharmingen（San Diego, CA）から購入した。モノクローナル抗ヒトカスパーゼ２、３、８、９及び１０抗体及びモノクローナル抗ヒトＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、Ｂａｘ、ｃＩＡＰ−１、ｃＩＡＰ−２、ＸＩＡＰ及びサバイビン抗体は、調製した。抗ＰＡＲＰ抗体は、Cell Signaling Technology, Inc.（Beverly, MA）から購入した。抗β-アクチン抗体はSigmaから購入した。抗ＦＡＤＤは、Transduction Laboratories（Lexington, KY）から購入した。すべての西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート化二次試薬は、Southern Biotechnology Associates, Inc.（Birmingham, AL）から購入した。活性カスパーゼ−１、カスパーゼ−２、カスパーゼ−３、カスパーゼ−６、カスパーゼ−７、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９及びカスパーゼ−１０は、EMD Biosciences, Inc.（San Diego, CA）から購入した。蛍光原性ペプチド誘導体、Ａｃ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＡＭＣ（Ａｃ−ＶＤＶＡＤ−ＡＭＣ、２６００６０Ｍ００１、配列番号４０）、Ａｃ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−アミノ−４−メチルクマリン（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ、２６００３１Ｍ００１、配列番号４１）及びＡｃ−カルボニル−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−７−アミド−４−メチルクマリン（Ｚ−ＩＥＴＤ−ＡＭＣ、２６００４２Ｍ００１、配列番号４２）は、Alexis Biochemicals, San Diego, CAから購入した。カスパーゼ−２、−３、−８、−１０阻害剤（ＦＭＫＳＰ０ｌ）は、R&D Systems, Inc.から購入した。
【０１６９】
ＴＲＡ−８、２Ｅ１２及びＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスに対する腫瘍細胞感受性の細胞毒性解析。
細胞（１，０００細胞／ウェル）を、９６ウェルプレートに三連で、８種の濃度（１０００ng/mlから始まる二重連続希釈）のＴＲＡ−８、２Ｅ１２又はＴＲＡＩＬとともに播いた。細胞生存率は、製造業者の指示書にしたがってＡＴＰＬＩＴＥ（登録商標）アッセイ（Packard Instruments, Meriden, CT）を用いて一晩培養後に決定した。結果は、培地対照ウェルと比較した処理ウェル中の生存細胞パーセンテージとして表す。
【０１７０】
フローサイトメトリー。
細胞（１０６個）を、ＰＢＳで１回洗浄して、一次抗体（１μg/mlのＴＲＡ−８）を含む１mlの冷ＦＡＣＳ緩衝液（５％  ＦＢＳ及び０．０１％  ＮａＮ３を含むＰＢＳ）中に再懸濁した。細胞を、氷上で６０分間染色し、その後３mlの冷ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、二次抗体（ＰＥコンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧの１：１００希釈）とともに、暗所で４℃で６０分間、インキュベートした。さらに３mlのＦＡＣＳ緩衝液で洗浄後、１０，０００細胞／試料をＦＡＣＳＣＡＮフローサイトメーター（BD Biosciences, San Jose, CA）で解析した。
【０１７１】
アポトーシス関連タンパク質のウェスタン・ブロット解析。
腫瘍細胞（３×１０６個）を、冷ＰＢＳで２回洗浄し、１０mMトリス塩酸（ｐＨ７．６）、１５０mM  ＮａＣｌ、０．５mM  ＥＤＴＡ、１mM  ＥＧＴＡ、０．１％  ＳＤＳ、１mMオルトバナジウム酸ナトリウム、及びプロテアーゼ阻害剤の混合物（１mM  フェニルメチルスルホニルフルオリド、１μg/ml  ペプスタチンＡ、２μg/ml  アプロチニン）を含む３００μlの溶解緩衝液で溶解した。細胞ライセートを、１０秒間超音波処理し、２０分間、１２，０００ｇで遠心分離した。細胞ライセートを等量の総タンパク質とともに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液を用いて５分間ボイルした。総細胞ライセートを、８％、１０％又は１２％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース膜に電気的に転写した。ブロットを、５％ノンファットドライミルクを含むＴＢＳＴ緩衝液（２０mM  トリス塩酸（ｐＨ７．４）、５００mM  ＮａＣｌ及び０．１％  Ｔｗｅｅｎ ２０）でブロッキングし、ブロッキング緩衝液中の一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。ブロットを、ＴＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰコンジュゲート化二次抗体で室温で１時間、探索した。ＴＢＳＴで４回洗浄した後、探索されたタンパク質を、ＥＣＬウェスタン・ブロッティング検出システム（Amersham Biosciences）を製造業者の指示書にしたがって用いて可視化した。
【０１７２】
ＤＤＸ３の寡少発現。
ＲＮＡｉ設計:
オンライン設計ツール、ＢＬＯＯＫ−ｉＴ  ＲＮＡｉデザイナー（Invitrogen）を用いて、ＤＤＸ３のためのＲＮＡｉ標的を同定した。５つのターゲティングされたｓｈＲＮＡ配列を、上位１０種の最高スコアのＲＮＡｉ標的から選択した（表２を参照されたい）。
【０１７３】
【表２】
0005562521.tif 000003
【０１７４】
これらを、次に、ＢＬＯＣＫ−ｉＴ  Ｕ６エントリーベクターにクローニングした。ｓｈＲＮＡは、Ｕ６プロモーターによって制御されており、ほとんどの分裂中又は非分裂中の哺乳類細胞タイプにおいて一過性発現することができる。抵抗性細胞を、ＲＮＡｉ応答のために、ＲＮＡｉを用いるＬＥＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ２０００（Invitrogen）でトランスフェクションした。低減したＤＤＸ３発現を、抗ＤＤＸ３抗体を用いてトランスフェクションの３６時間後にウェスタン・ブロット解析によって決定した。いったん低減したＤＤＸ３発現が達成されると、そのｓｉＲＮＡオリゴを合成した（標的配列：ＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＴＣＡＴＧＧＧＡＡＡＣ（配列番号２７）：センスＲＮＡ  ５’−Ｆｌ−ＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＴＣＡＴＧＧＧＡＡＡＣ（Ｆｌ−配列番号２７）（Ｆｌ＝フルオレッセイン）；  アンチセンスＲＮＡ  ５’−ＧＵＵＵＣＣＣＡＵＧＡＵＡＡＵＵＵＣＵＣＣ−３’（配列番号２８）、及びＲＮＡｉ対照オリゴ（ＲＩ−０１０−ＤＰ）は、Molecula（Columbia, MD）から購入した）。
【０１７５】
発現ベクターの生成。
全長ＤＤＸ３を、ＨｉｓタグをＤＤＸ３のＮ末端につけてｐｃＤＮＡ３．１プラスミド（Invitrogen）にクローニングした。ＤＤＸ３及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２  ｃＤＮＡを、ＭＤＡ−２３１細胞から抽出された総ＲＮＡを用いて実施した逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって、以下のプライマー対を用いて生成した:  ＤＤＸ３１  フォワードプライマー、ＢａｍＨＩあり：  ５’−ａｃｇｇａｔｃｃａａａｔｇａｇｔｃａｔｇｔｇｇｃａｇｔｇｇａ−３’（配列番号２９）；  ＤＤＸ３６６２  リバースプライマー、ＸｈｏＩあり：  ５’−ｃｔｃｔｃｇａｇｃａａａｇｃａｇｇｃｔｃａｇｔｔａｃｃｃ−３’（配列番号３０）。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２１  フォワードプライマー、ＫｐｎＩあり：  ５’−ａａａｇｇｔａｃｃａｇｃｃａｔｇｇａａｃａａｃｇｇｇｇａｃａｇ−３’（配列番号３１）；  ＴＲＡＩＬ−Ｒ２４４１  リバースプライマー、ＥｃｏＶあり：  ５’−ａａａｇａｔａｔｃｔｔａｇｇａｃａｔｇｇｃａｇａｇｔｃｔｇｃａｔｔ−３’（配列番号３２）；  ＤＤＸ３の単離されたポリメラーゼ連鎖反応フラグメントは、ｐｃＤＮＡ３．１−Ｈｉｓベクター（Invitrogen）内でインフレームであった。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２  ｃＤＮＡは、ｐｓｈｕｔｔｅｒ−ＣＭＶベクター中にクローニングした。正しい配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１７６】
ＤＤＸ３／ｐｃＤＮＡ３．１−Ｈｉｓ発現プラスミドは、ＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ部位の間でＤＤＸ３配列を欠失させることによって生成した。ＤＤＸ３１５１  フォワードプライマー、ＢａｍＨＩあり：  ５’−ａｃｇｇａｔｃｃａａａｔｇｔｔｔｔｃｔｇｇａｇｇｃａａｃａｃｔｇｇｇ−３’（配列番号３３）；  ＴＲＡＩＬ−Ｒ２／ｐｓｈｕｔｔｅｒ−ＣＭＶ発現プラスミドは、以下のプライマーを用いてＴＲＡＩＬ−Ｒ２配列を欠失させることにより、生成した：  ＴＲＡＩＬ−Ｒ２３４０  リバースプライマー、ＥｃｏＲＶあり：  ５’−ａａａｇａｔａｔｃｔｔａｃｔｇｔｃｔｃａｇａｇｔｃｔｃａｇｔｇｇｇａｔｃ−３’（配列番号３４）；  ＴＲＡＩＬ−Ｒ２３３０  リバースプライマー、ＥｃｏＲＶ及びｘｈｏＩあり：  ５’−ａａａｇａｔａｔｃｃｔｃｇａｇａｔｔｔｇｃｔｇｇａａｃｃａｇｃａｇｃｃｔ−３’（配列番号３５）。
【０１７７】
細菌におけるＤＤＸ３のための発現プラスミドの構築。
ＤＤＸ３又はｃＩＡＰ１フラグメントを、ＴＯＰＯ１００ベクター（Invitrogen）に挿入した。結果として得られたプラスミドで大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換し、これを指数増殖期までＬＢ培地中で生育させ、０．４mMイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドで３時間誘導した。細胞をペレット化し、溶解緩衝液（３０mM  トリス塩酸、ｐＨ７．５、０．１mM  ＮａＣｌ、１mM  ＤＴＴ、０．１mM  ＥＤＴＡ、１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０及び２０μg/ml  ＰＭＳＦ）中に再懸濁させ、超音波処理した。１４，０００×ｇで１５分間遠心分離した後の上清を、Ｎｉカラムで精製した。タンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイ（Pierce, Rockford, IL）で決定し、アリコートを−８０℃で保存した。
【０１７８】
２９３又は３Ｔ３細胞の一過性トランスフェクション。
２９３又は３Ｔ３細胞を、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２０００（Invitrogen、Inc.）を用いて発現ベクターでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、タンパク質発現を、それぞれのモノクローナル抗体を用いてウェスタン・ブロット解析によって決定した。共免疫沈降解析のためには、細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む免疫沈降溶解緩衝液で溶解した。
【０１７９】
共免疫沈降アッセイ。
抗ＤＤＸ３又は抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体を、セファロースビーズ（Sigma）にコンジュゲート化した。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２  ＤＩＳＣの組成を、以下のようにして決定した。５×１０６個の細胞（別途示さない限り同じ）を、５００ng/mlのＴＲＡ−８で、示した時間、３７℃で処理し、次に、免疫沈降溶解緩衝液（２０mM  トリス塩酸、ｐＨ７．４、１５０mM  ＮａＣｌ、０．２％  ＮＯＮＩＤＥＴ  Ｐ４０及び１０％グリセロール及び完全プロテアーゼ阻害剤カクテル）中で溶解し、あるいは、処理せずに溶解した（無刺激条件）。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２  ＤＩＳＣを、次に３０μlのビーズとともに４℃で一晩沈降させた。免疫沈降後、ビーズを溶解緩衝液で４回洗浄した。このビーズを、次に、１０mM  トリス緩衝液で５回洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び免疫ブロッティング解析のためにローディング緩衝液中に再懸濁した。
【０１８０】
インビトロでのカスパーゼ活性のアッセイ。
蛍光測定アッセイを、９６ウェル透明底プレートで行い、すべての測定を三連のウェルで行った。１００μlのアッセイ緩衝液（１０mM  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、５０mM  ＮａＣｌ、２mM  ＭｇＣｌ２、５mM  ＥＤＴＡ及び１mM  ＤＴＴ）を添加した。活性カスパーゼ８及びペプチド基質（Ａｃ−ＩＥＴＤ−ＡＭＣ）を、各ウェルに添加し、最終濃度１００ng/μlとした。共免疫沈降溶出画分を添加して、反応を開始した。背景蛍光を、アッセイ緩衝液、基質及び溶解緩衝液を含み、細胞ライセートを含まないウェルで測定した。アッセイプレートを３７℃で１時間、インキュベートした。蛍光は、３５５nmでの励起及び４４０nmでの発光にセットした蛍光プレートリーダーで測定した（Bio-Tek, Winooski, VT）。
【０１８１】
インビトロのカスパーゼ切断アッセイ。
ＤＤＸ３を切断するカスパーゼの能力を、インビトロアッセイにおいて調べた。切断反応は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ  ｃｏ−ＩＰからの１０μlの溶出画分、１０μlの反応緩衝液（１０mM  ＨＥＰＥＳ[ｐＨ ７．０]、５０mM  ＮａＣｌ、２mM  ＭｇＣｌ２、５mM  ＥＧＴＡ、１mM  ＤＴＴ、２mM  ＡＴＰ）及び５μl（０．１U/μl）の組換え活性形態のカスパーゼを含有させて、３７℃で３０分間、行った。切断は、抗ＤＤＸ３抗体を用いてウェスタン・ブロットによって決定した。
【０１８２】
結果
抵抗性細胞においてＴＲＡＩＬ−Ｒ２のデスドメインの封鎖を起こす候補タンパク質であるＤＤＸ３のプロテオーム解析。
デスレセプターを標的とする、治療剤、ＴＲＡＩＬ及びアゴニスト性抗体に対する、偶発的に発生した又は誘導されたアポトーシス抵抗性は、これらの薬剤での有効ながん治療における主要な障害を表す。抵抗性細胞におけるＴＲＡＩＬ−Ｒ２デスドメイン複合体の代替的な組成物かどうかを決定するために、存在するＴＲＡＩＬ−Ｒ２関連タンパク質のプロテオームプロフィールを、ＴＲＡ−８感受性親細胞及びＴＲＡ−８抵抗性ＭＤＡ−２３１細胞において、ＴＲＡ−８処理の前後に、二次元プロテオーム及びマススペクトロメトリー解析によって比較した。ＳＹＰＲＯ（登録商標）ルビー（Molecular Probes, Eugene, OR）で染色した二次元ゲルの検査において、約〜８０KDaのタンパク質スポットが見出された。このタンパク質とＴＲＡＴＬ−Ｒ２との会合は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２  ＤＩＳＣの形成をブロックし、それによってＴＲＡ−８抵抗性が引き起こされる。この〜８０kdタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥから切り出し、トリプシンで消化して、ペプチド配列をマススペクトロメトリーで解析した。６個の消化フラグメントからのタンパク質アミノ酸配列は、ヒトＤＤＸ３のＧｅｎｂａｎｋ配列と１００％同一であり（表３）、ＤＩＳＣ形成と相関してＴＲＡ−８誘導性アポトーシスの間にＤＤＸ３がＴＲＡＩＬ−Ｒ２から解離することが示された。このタンパク質が、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２関連タンパク質複合体と会合したままであれば、それは、ＦＡＤＤ動員を防止し、ＤＩＳＣ形成の失敗を起こすことができる。
【０１８３】
【表３】
0005562521.tif 000004
【０１８４】
ＤＤＸ３は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２媒介性アポトーシスにおける新規のＴＲＡＩＬ−Ｒ２会合タンパク質である。ＤＤＸ３が本当にＴＲＡＩＬ−Ｒ２と会合しているかどうかを決定するために、ＤＤＸ３の全長（アミノ酸１〜６６２）、Ｎ末端フラグメント（アミノ酸１〜３１６）及びＣ末端フラグメント（アミノ酸３１０〜６６２）を、Ｎ末端に６−Ｈｉｓタグを有するＰＣＤＮＡIII３．１にクローニングした。これらの発現ベクターでＭＤＡ−２３１親細胞をトランスフェクトし、ＤＤＸ３の組換え全長及び欠失突然変異体の過剰発現を達成した。しかし共免疫沈降及びその後の抗６−His抗体を用いたウェスタン・ブロット解析により検出したところ、全長ＤＤＸ３のみが、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２と会合していたが、Ｎ末端及びＣ末端欠失突然変異体は会合していなかった（図８Ａ）。これらの結果により、ＤＤＸ３がＴＲＡＩＬ−Ｒ２と会合すること及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２に対するその結合は全長依存性であることが確認された。ＤＤＸ３は、ＭＤＡ−２３１細胞において抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２で免疫沈降された。
【０１８５】
ＴＲＡＩＬ−Ｒ２とのＤＤＸ３の会合をさらに確認するために、ＤＤＸ３のＮ末端、Ｃ末端フラグメント及び全長バージョンを、大腸菌において発現させた。タンパク質を精製し、ＤＤＸ３に対するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体パネルを作製するための抗原として用いた。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２会合ＤＤＸ３は、マウス抗ＤＤＸ３モノクローナル抗体を用いて共免疫沈降及びウェスタン・ブロット解析によって検出した。これらの結果により、ＤＤＸ３は非アポトーシス性親細胞及び抵抗性細胞の両方においてＴＲＡＩＬ−Ｒ２と共免疫沈降することが明らかになった（図７）。ＴＲＡ−８感受性細胞においては、ＤＤＸ３の時間依存性の低減があったが、アポトーシス中のＴＲＡ−８抵抗性細胞では見られなかった。それに加えて、ウェスタン・ブロット解析によって、ＴＲＡ−８誘導性アポトーシスの間におけるＴＲＡＩＬ−Ｒ２会合ＤＤＸ３の急速な低減及び切断が観察された。これは、ＤＤＸ３の切断がカスパーゼ依存性であることを示す。これらの結果に基づいて、ＤＤＸ３配列を、Ｎ末端の潜在的切断部位について精査し、比較的保存されたカスパーゼ切断モチーフ、ＤＫＳＤＥＤＤ（配列番号４６）がアミノ酸１２９〜１３５に発見された。切断がＤＩＳＣ上で起こり、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２からのＤＤＸ３の重要な機能的要素の放出をもたらすことは明らかである。これらのデータは、後者のモデルと矛盾がなく、そのことは、開始されたカスパーゼはＴＲＡＩＬ−Ｒ２に急速に動員され、容易にＤＤＸ３を切断することを示唆する。それに加えて、ＦＡＤＤ及びカスパーゼ−８はＴＲＡＩＬ−Ｒ２と会合及び動員され、ＤＩＳＣを形成し、それが今度は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２会合ＤＤＸ３切断と相関するカスパーゼカスケード活性化をもたらし、これは、ある種の状況下において、ＤＤＸ３はアポトーシスプログラムに必須であることを示し、ＤＤＸ３はＴＲＡＩＬ−Ｒ２媒介性アポトーシス抵抗性に関与するＴＲＡＩＬ−Ｒ２と会合することを説明する。
【０１８６】
ＴＲＡＩＬ−Ｒ２とのＤＤＸ３の相互作用領域のマッピング。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２媒介性シグナル伝達におけるＤＤＸ３の調節をよりよく理解するために、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２との結合に必要なおよそのＤＤＸ３領域を、ＤＤＸ３の欠失突然変異体をコードするプラスミドで一過性トランスフェクションされているＨＥＫ２９３Ａ細胞を用いて決定した（図８Ａ）。組換えＤＤＸ３及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２の相互作用は、ＴＲＡ−８を用いて共免疫沈降によって決定した。全長ＤＤＸ３、ＤＤＸ３Δ２０１−６６２又はＤＤＸ３Δ１−４００は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２と結合した。しかし、ＤＤＸ３Δ２５１−６６２及びＤＤＸ３Δ１−３５０のどちらも、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２と結合できなかった（図８Ａ）。これは、ＤＤＸ３がＴＲＡＩＬ−Ｒ２に２個の結合モチーフを有することを示す。一方は、Ｎ末端に位置し（アミノ酸２００〜２５０）； 他方は、アミノ酸３５０〜４００に隣接する。同じ細胞由来のライセートのウェスタン・ブロット解析により、匹敵する量の野生型ＤＤＸ３及びＤＤＸ３の欠失フラグメントの産生が確認され、このことは、これらの結果の説明としてのタンパク質発現の差を除外した。
【０１８７】
ＤＤＸ３は、恒常的にＴＲＡＩＬ−Ｒ２と会合し、ＴＲＡ−８抵抗性細胞における及びＦＡＤＤ動員の封鎖と相関するが、このことは、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２会合ＤＤＸ３がＦＡＤＤの動員を防止することを示す。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２を通じてＤＤＸ３及びＦＡＤＤの間に連絡があり得る。ＤＤＸ３及びＦＡＤＤが、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２のデスドメインで共通の結合モチーフを共有しているのか、又はこれらの２つの結合モチーフが互いに近接しており、先に結合したＤＤＸ３がＦＡＤＤの動員と干渉するのかを試験するために、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２におけるＤＤＸ３結合ドメインの位置を決定した。全長ＴＲＡＩＬ−Ｒ２及び一連のＴＲＡＩＬ−Ｒ２アミノ末端ドメイン欠失体（デスドメインの完全な欠失体を含む）をコードするベクターを構築した（図８Ｂ）。ＤＤＸ３の機能を評価し、内在性ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ２を排除するために、類似したアプローチにおいて、マウス線維芽細胞株、ＮＩＨ３Ｔ３を、ヒトＴＲＡＩＬ−Ｒ２及びＤＤＸ３の共発現のための宿主細胞として選択した。３Ｔ３細胞を、Ｈｉｓタグを有するＤＤＸ３及び全長ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＤＤＸ３及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２の一連の欠失突然変異体、及びＤＤＸ３単独をコードするプラスミドで共トランスフェクションした。細胞表面ＴＲＡＩＬ−Ｒ２発現は、ＴＲＡ−８染色を用いてフローサイトメトリーによって試験した。すべてのトランスフェクションされた細胞は、同様のレベルの細胞表面ＴＲＡＩＬ−Ｒ２を呈し（図８Ｂ）、細胞内ドメインの欠失は、細胞表面ＴＲＡＩＬ−Ｒ２を変更させないことが示された。それに加えて、すべてのトランスフェクションされた細胞は、抗６−Ｈｉｓ抗体を用いて総細胞ライセートのウェスタン・ブロット解析によって検出したところ、同様のレベルの組換えＤＤＸ３を発現した。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２欠失突然変異体との組換えＤＤＸ３の会合は、ＴＲＡ−８との共免疫沈降及び抗６−Ｈｉｓ抗体を用いたウェスタン・ブロット解析によって試験した（図８Ｂ）。ＤＤＸ３とのＴＲＡＩＬ−Ｒ２の相互作用は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２のデスドメインとは独立である。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２結合モチーフをさらにより正確に定義するために、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２のさらなる欠失突然変異体であるＤ３３０及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２の短縮型（Ｔ３００−３３０）を構築し（図８Ｃ）、ＤＤＸ３とともに３Ｔ３細胞を共トランスフェクションして、それらの相互作用について解析した。それらの結果により、ＤＤＸ３はＴＲＡＩＬ−Ｒ２デスドメインと結合せず、むしろ、デスドメイン（アミノ酸３４０〜アミノ酸４２０）の近傍の膜近接領域（アミノ酸３００〜３３０）と結合することが明らかになった（図８Ｃ）。これは、ＤＤＸ３が、以前に同定されたＴＲＡＩＬ−Ｒ２シグナリングにおけるデスドメイン関連タンパク質とは異なる役割を果たす可能性があることを示す。それに加えて、この領域は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＤｃＲ２と非常に相同性が高い（図８Ｄ）。これらのデータは、ＤＤＸ３が、デスレセプターファミリーのメンバーと会合する共通のアダプタータンパク質であることを示す。
【０１８８】
ＤＤＸ３はＣＡＲＤを含有する。
ＴＲＡＩＬ−Ｒ２媒介性アポトーシスにおけるＤＤＸ３の機能的重要性を、次に、この分子の特異的特性を解析することにより調査した。カスパーゼ動員ドメイン（ＣＡＲＤ）を含む、ＤＥＡＤボックスタンパク質ファミリーの少なくとも２つのＲＮＡヘリカーゼが最近同定されており、これらのＲＮＡヘリカーゼのＣＡＲＤは、アポトーシスの調節因子として機能する。ＤＤＸ３はＴＲＡＩＬ−Ｒ２媒介性アポトーシスの調節において重要な役割を果たすので、ＤＥＡＤボックスタンパク質ファミリーメンバーであるＤＤＸ３は、同様にＣＡＲＤを有することができ、ＤＤＸ３のアポトーシス阻害機能はＣＡＲＤに直接依存することができる。したがって、ＤＤＸ３がＣＡＲＤタンパク質である可能性を試験した。アミノ酸整列（アラインメント）解析は、ＤＤＸ３が、ＭＤＡ５及びＲＩＧＩのように、アミノ酸５０〜アミノ酸１５０の間に保存された作用モチーフを有することを示す。ＣＡＲＤは、ホモタイプの（homotypic）相互作用モチーフである。ＣＡＲＤを含有するタンパク質は、このドメインを介して互いに相互作用することができる。ＤＤＸ３は、新規な高度に保存されたＣＡＲＤ含有ヘリカーゼであるため、他のＣＡＲＤタンパク質と相互作用することができる。ｃＩＡＰ１は、同様にＣＡＲＤ含有タンパク質であり、カスパーゼの阻害剤として広く認識されており、ＴＮＦＲＩ及びＴＮＦＲIIに動員されてＴＮＴＲＩ媒介性アポトーシスを調節する。ＤＤＸ３がｃＩＡＰ１と相互作用することができるかどうかを、抗ＤＤＸ３又は抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体を用いて、共免疫沈降実験において試験した。ＴＲＡ−８未処理の親細胞及び抵抗性細胞の両方においてＴＲＡＩＬ−Ｒ２共免疫沈降及びＤＤＸ３共免疫沈降によって解析したところ、ｃＩＡＰ１は、容易にＤＤＸ３と及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２複合体と、共免疫沈降することができると決定された（図８Ｅ）。しかし、ｃＩＡＰ１は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２-ＤＤＸ３複合体から迅速に放出され、これは親細胞におけるＤＤＸ３切断と相関した。これに対し、ｃＩＡＰ１レベルはＴＲＡ−８処理後に抵抗性細胞においてＴＲＡＩＬ−Ｒ２-ＤＤＸ３複合体で増大した（図８Ｅ）。これらの結果は、ＤＤＸ３がＴＲＡＩＬ−Ｒ２及びｃＩＡＰ１の間の連結として役立ち得ることを示す。
【０１８９】
ノックダウンＤＤＸ３による逆抵抗性。
ＴＲＡＩＬ−Ｒ２シグナリングにおけるＤＤＸ３の役割を研究するために、ＴＲＡ−８誘導性アポトーシスにおける内在性ＤＤＸ３の重要性を試験した。ＤＤＸ３はＴＲＡ−８誘導性アポトーシスの間に抵抗性細胞において低減しなかったので、ＤＤＸ３の低減したレベルの発現が、がん細胞がアポトーシス感受性であるために必要であることができる。ＲＮＡｉ戦略を用いて、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２媒介性アポトーシスに対する抵抗性におけるＤＤＸ３の役割を決定した。オンライン設計ツールである、ＢＬＯＣＫ−ＩＴ（登録商標）ＲＮＡｉデザイナー（Invitrogen）を用いて、ＤＤＸ３のためのＲＮＡｉ標的を同定した。５つのターゲティングされたｓｈＲＮＡ配列を、上位１０個の最高スコアのＲＮＡｉ標的から選択し、ＢＬＯＣＫ−ＩＴ（登録商標）Ｕ６エントリーベクター中にクローニングした。ＴＲＡ−８抵抗性ＭＤＡ−２３１細胞を、５つのＲＮＡｉ構築物でトランスフェクトして、ＤＤＸ３のタンパク質発現レベルを、トランスフェクションの４８時間後にモノクローナル抗ＤＤＸ３抗体を用いてウェスタン・ブロット解析により決定した。試験した５つのＲＮＡｉ構築物のうち、４つが、非トランスフェクション又はＧＦＰでトランスフェクションした対照と比較して、ＤＤＸ３発現の非常に効果的な阻害剤（５０％超の低減）であった（図９Ａ）。これらの構築物の最も効果的なものである＃２を、ＴＲＡ−８媒介性アポトーシスにおけるＤＤＸ３ノックダウンの効果の解析のために選択した。ノックダウンＤＤＸ３発現が、ＴＲＡ−８抵抗性細胞におけるＴＲＡ−８感受性を逆転させるかどうかを決定するために、ＴＲＡ−８抵抗性ＭＤＡ−２３１細胞を、ＲＮＡｉベクター（構築物＃２）及びトランスフェクトされた細胞のインジケーターとしてＧＦＰ発現ベクターで共トランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、ＤＤＸ３をＴＲＡＩＬ−Ｒ２と共免疫沈降させ、抗ＤＤＸ３抗体で探索した。期待したとおり、ＤＤＸ３の発現は、対照細胞と比較して有意に低減した（図９Ｂ）。ＧＦＰ陽性細胞を選別し、種々の濃度のＴＲＡ−８とともに一晩培養した。ＡＴＰＬＩＴＥアッセイを用いて、ＧＦＰ及び対照ベクターでトランスフェクションされたＭＤＡ−２３１細胞は、ＴＲＡ−８処理後にアポトーシスを行なわなかったので、これらの細胞がＴＲＡ−８に対する抵抗性を保持していたことが示された。しかし、ＤＤＸ３  ＲＮＡｉ及びＧＦＰで共トランスフェクションされた細胞は、ＴＲＡ−８用量依存性細胞死を呈した（図９Ｃ）。ＴＵＮＥＬ染色を用いて、有意数のＤＤＸ３ノックダウン細胞がアポトーシスを行なったことが見出された（図９Ｄ）。これらの結果は、ＤＤＸ３発現のダウンレギュレーションがＴＲＡ−８抵抗性を逆転させることを示す。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２媒介性アポトーシスにおけるＤＤＸ３の因果的な役割をさらに決定するために、腫瘍細胞のパネルにおいてＤＤＸ３発現を低減させ、それらのＴＲＡ−８誘導性アポトーシス感受性を解析した。ＤＤＸ３  ＲＮＡｉは、内在性ＤＤＸ３の量を低減させ、いくつかの偶発的抵抗性細胞を含む腫瘍細胞のパネルにおいてＴＲＡ−８誘導性アポトーシスを増強した（図９Ｅ〜Ｆ）。これに対し、対照オリゴヌクレオチドで���ランスフェクトされた細胞は、正常なＤＤＸ３発現を示し、ＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに対して抵抗性のままであった（図９Ｅ〜Ｆ）。したがって、ＤＤＸ３は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２シグナル伝達装置の重要成分であり、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２媒介性アポトーシスに対する抵抗性のために必須である。
【０１９０】
ＤＤＸ３結合領域を持たないＴＲＡＩＬ−Ｒ２は、プロアポトーシス性である。
ＤＤＸ３結合モチーフがＴＲＡＩＬ−Ｒ２のデスドメイン機能を調節する新規な負の調節ドメインを表すかどうかを決定するために、突然変異型ＴＲＡＩＬ−Ｒ２のアポトーシス誘導機能を、野生型ＴＲＡＩＬ−Ｒ２と比較した。デスドメインを持たないＴＲＡＩＬ−Ｒ２でトランスフェクトされた細胞は、ＴＲＡ−８処理に応答しないように見えたが、短縮型ＤＤＸ３結合ドメインを有するＴＲＡＩＬ−Ｒ２でトランスフェクトされた細胞は、プロアポトーシス性であり、野生型ＴＲＡＩＬ−Ｒ２でトランスフェクトされた細胞と比較して、ＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに対してより感受性を呈したように見えた（図１０）。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２媒介性アポトーシスを抑制し得るＤＤＸ３の顕著な阻害効果があった。これらの知見は、ＤＤＸ３が、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２誘導性アポトーシスの阻害性媒介因子であることを示す。
【０１９１】
ＤＤＸ３はＴＲＡＩＬ−Ｒ２媒介性アポトーシスを調節するＣＡＲＤタンパク質である。
ＴＲＡＩＬ−Ｒ２-ＤＤＸ３−ｃＩＡＰ１シグナリングを吟味するために、ｃＩＡＰ１に対する結合に必要な領域を評価した。ＣＡＲＤは、ＤＤＸ３のＮ末端にあり、ｃＩＡＰ１と相互作用すると考えられているため、この領域は、ｃＩＡＰ１を結合するのに関与することができる。ＨＥＫ２９３Ａ細胞を、Ｈｉｓタグを有する全長ＤＤＸ３、ＤＤＸ３Δ５１−６６２、ＤＤＸ３Δ１０１−６６２、ＤＤＸ３Δ１５１−６６２、又はＤＤＸ３Δ１−３５０をコードするプラスミドでトランスフェクトした。全長及びＣ末端欠失したＤＤＸ３の両方が、ｃＩＡＰ１を共免疫沈降させることができたが、最初の１００アミノ酸が欠失したＤＤＸ３は、ｃＩＡＰ１を共免疫沈降させることができなかった（図１１Ａ）。これらの結果は、ＤＤＸ３のＮ末端ＣＡＲＤが、ｃＩＡＰ１をＴＲＡＩＬ−Ｒ２複合体に動員することに関与することを確認した。また、ｃＩＡＰ１結合モチーフが切断部位であるアミノ酸１２９〜１３５（ＤＫＳＤＥＤＤ;配列番号４６）の前のＤＤＸ３のアミノ酸５０〜１００に位置することも示された。ＤＤＸ３がＴＲＡＩＬ−Ｒ２媒介性アポトーシス中に切断される場合、ＤＤＸ３のＮ末端フラグメントとｃＩＡＰ１の組合せがＴＲＡＩＬ−Ｒ２複合体から解離し、それによって死シグナリングに対するｃＩＡＰ１の阻害を救済する。したがって、ＤＤＸ３は、アポトーシス抵抗性のためにｃＩＡＰ１及びデスレセプターをカップリングさせる候補である。
【０１９２】
このコンセプトをさらに強固にするために、アミノ酸１〜１５０を欠いた優勢陰性突然変異型ＤＤＸ３を用いた。この突然変異体、ＤＤＸ３ΔＣＡＲＤ（ＤＤＸ３Δ１５１−６６２）は、ｃＩＡＰ１との相互作用に失敗しするが、なおＴＲＡＩＬ−Ｒ２に結合することができる（図１１Ｂ）。したがって、ＤＤＸ３Δ１５１−６６２はＴＲＡＩＬ−Ｒ２を結合する野生型ＤＤＸ３と競合して内在性ＤＤＸ３の優勢陰性阻害剤となり得るかどうかを評価した。４つのタイプの細胞を、ＤＤＸ３ΔＣＡＲＤでトランスフェクトした。図５Ｂに示すように、ＤＤＸ３ΔＣＡＲＤでトランスフェクトされた細胞は、内在性全長ＤＤＸ３と比較して、より高いレベルのＤＤＸ３ΔＣＡＲＤの発現を呈しており、短縮型ＤＤＸ３はＴＲＡＩＬ−Ｒ２結合に関して内在性ＤＤＸ３と競合することができることが示唆された。図１１Ｂに示すように、抗ＤＤＸ３及び抗ｃＩＡＰ１抗体を用いて探索してＴＲＡＩＬ−Ｒ２−ｃｏ−ＩＰ及びウェスタン・ブロッティングにより解析したところ、ｃＩＡＰ１は全長ＤＤＸ３と共免疫沈降されたが、ＤＤＸ３ΔＣＡＲＤとは共免疫沈降されなかった。さらに、ＴＲＡ−８媒介性アポトーシスに対するトランスフェクトされた細胞の感受性を、ＡＴＰＬＩＴＥアッセイを用いて試験した。すべての試験した細胞はＴＲＡ−８処理後に抵抗性のままであったので、全長組換えＤＤＸ３の発現は、ＴＲＡ−８媒介性アポトーシスに対する感受性を変更しなかった。しかし、高レベルのＤＤＸ３ΔＣＡＲＤを発現したＴＲＡ−８抵抗性腫瘍細胞は、ダウンレギュレーションされたＴＲＡＩＬ−Ｒ２がｃＩＡＰ１と会合した後にＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに対する感受性を再獲得した。これらのデータは、ＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに対するｃＩＡＰ１の阻害が、ＤＤＸ３のインタクトなＣＡＲＤによって媒介されることを示す。Ｎ末端ＣＡＲＤを欠いたＤＤＸ３は、ＴＲＡ−８抵抗性を部分的に逆転する優勢陰性剤として役立つことができる。ＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに対するがん細胞の潜在的感受性は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２会合複合体上のＤＤＸ３及びｃＩＡＰ１のレベルによって調節されることができる。
【０１９３】
ＴＲＡＩＬ−Ｒ２−ＤＤＸ３-ｃＩＡＰ１複合体は、カスパーゼ−８の活性化を阻害する。
細胞内に存在するＤＤＸ３のレベルがいかにしてカスパーゼ−８動員及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２  ＤＩＳＣでのプロセッシングに相関しているかを調べるために、ＤＤＸ３を定量した。ＭＤＡ−２３１及びＵＬ−３Ｃ親細胞及び抵抗性細胞を、ＴＲＡ−８で４時間処理し、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２を、ＴＲＡ−８とは異なるＴＲＡＩＬ−Ｒ２エピトープを認識する新規な抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２モノクローナル抗体（クローン:２Ｂ４）を用いて免疫沈降させた。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２／ＤＤＸ３／ｃＩＡＰ１複合体を、ビーズから放出させ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２会合ＤＤＸ３及びｃＩＡＰ１を、抗ＤＤＸ３及び抗ｃＩＡＰ１抗体を用いたイムノブロッティング及びサンドイッチＥＬＩＳＡ解析に供した。ＥＬＩＳＡプレートは、２Ｂ４抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体でコーティングして、免疫沈降されたＴＲＡＩＬ−Ｒ２を捕獲し、ＤＤＸ３及びｃＩＡＰ１を、ＤＤＸ３（３Ｅ２）及びｃＩＡＰ１に対する特異的モノクローナル抗体によって測定した。親−感受性又は誘導−抵抗性腫瘍細胞のいずれかのＴＲＡ−８での処理は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２タンパク質レベルを変更しなかった（図１２Ａ）。しかし、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２会合ＤＤＸ３のレベルは、ＴＲＡ−８処理によって、感受性及び抵抗性細胞の両方で有意に変更された。第一に、非処理抵抗性細胞は、３Ｅ２抗ＤＤＸ３抗体で検出したところ、非処理感受性細胞と比較して、より高いレベルのＴＲＡＩＬ−Ｒ２会合ＤＤＸ３を発現した（図１２Ｂ）。重要なことに、ＴＲＡ−８処理後、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２会合ＤＤＸ３は、ＴＲＡ−８抵抗性細胞において有意に増大したが、感受性細胞においては顕著な低減が明らかにされた。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２複合体におけるｃＩＡＰ１のレベルもまた、ＤＤＸ３と同じパターンで変更された（図１２Ｃ）。これらの結果は、ＤＤＸ３のＣＡＲＤドメインは、切断によってアポトーシス中にＴＲＡ−８感受性細胞においてＴＲＡＩＬ−Ｒ２複合体から切断されて放出された一方、ＤＤＸ３及びｃＩＡＰ１は、感受性細胞よりも抵抗性細胞においてより効率的に、ＴＲＡ−８刺激に際してＴＲＡＩＬ−Ｒ２に動員されたことを示す。
【０１９４】
機能的ＤＩＳＣを形成するために、がん細胞が、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２複合体からｃＩＡＰ１を放出し、ＴＲＡ−８誘導性アポトーシス中にカスパーゼに対する抑制を低減することが必須である。この過程は、ＤＤＸ３の切断を必要とし、この工程がフィードフォワードアポトーシス増幅ループを開始するために重要であることが示される。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２会合ＤＤＸ３の切断抵抗性は、抵抗性細胞におけるＤＩＳＣ形成の失敗と相関するので、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２−ＤＤＸ３−ｃＩＡＰ１複合体でのＤＤＸ３切断感受性は、親及び抵抗性細胞の間で異なる。異なるカスパーゼによるＴＲＡＩＬ−Ｒ２会合ＤＤＸ３切断ポテンシャルを、両細胞で解析した。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２-ＤＤＸ３-ｃＩＡＰ１複合体を、抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体で共免疫沈降させた。ビーズから溶出させた画分を、活性カスパーゼ−２及び−８とともにインキュベートした。ＤＤＸ３の切断を、抗ＤＤＸ３抗体を用いてウェスタン解析によって検出した。これらの結果は、ＥＬＩＳＡ解析と合わせて（図１２Ｅ）、カスパーゼ−２は両細胞において同様のプロテアーゼポテンシャルを呈するが（図１２Ｅ）、抵抗性細胞におけるカスパーゼ−８によるＤＤＸ３切断が、感受性細胞と比較して高度に減衰されたことを明らかにした。これらの結果は、ＴＲＡ−８感受性及び抵抗性細胞間でＤＤＸ３複合体の機能的な差異があることを示す。また、デスレセプター会合開始カスパーゼによるＤＤＸ３の切断の失敗が、ＴＲＡ−８抵抗性の発生における鍵となる工程であることをも示す。
【０１９５】
ＤＤＸ３の切断は、誘導された抵抗性細胞においては阻害されたので、ＤＤＸ３がＴＲＡＩＬ−Ｒ２媒介性アポトーシスを阻害するアポトーシスシグナリングにおける工程を決定するための研究を進めた。ＤＤＸ３/ｃＩＡＰ１複合体は、カスパーゼ−８活性化を阻害すると予測された。したがって、レセプターによる誘発後の最初に検出可能な事象のひとつとして、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２−ＤＤＸ３−ｃＩＡＰ１複合体でのカスパーゼ−８の活性化を試験した。カスパーゼ−８活性化に対するＴＲＡＩＬ−Ｒ２−ＤＤＸ３−ｃＩＡＰ１複合体の効果を評価するために、親−感受性又は誘導−抵抗性細胞由来の活性カスパーゼ−８及びＤＤＸ３ｃｏ−ＩＰ溶出画分とともにインキュベートされた蛍光原性基質であるＡｃ−ＩＥＴＤ−ＡＭＣを用いて、カスパーゼ活性を測定した。感受性細胞と比較して抵抗性細胞由来のＴＲＡＩＬ−Ｒ２  ｃｏ−ＩＰ溶出画分の広範囲の希釈物にわたって、カスパーゼ−８活性の用量依存性の阻害が観察された。それに加えて、精製ｃＩＡＰ１もまた、カスパーゼ−８プロテアーゼ活性を完全に抑制した（図１２Ｆ）。ＤＤＸ３会合ｃＩＡＰ１が、カスパーゼ−８の当初の活性化の阻害剤であって、それによってＤＤＸ３の切断を防止することは妥当である。したがって、これらのデータは、ＤＤＸ３-ｃＩＡＰ１がカスパーゼ−８活性を調節できることの直接証拠を提供し、ＤＤＸ３-ｃＩＡＰ１はＴＲＡＩＬ−Ｒ２と結合したカスパーゼ−８の特異的調節因子であることを示す。
【０１９６】
カスパーゼ−８活性化に対するＴＲＡＩＬ−Ｒ２-ＤＤＸ３-ｃＩＡＰ１の効果を、カスパーゼアッセイによるＤＤＸ３切断と組合わされたｃＩＡＰ１で阻害されたカスパーゼ−８の直接解析によって試験し、ＤＤＸ３-ｃＩＡＰ１もまた、新規なタイプのカスパーゼ阻害剤として機能することが示された。ＤＤＸ３-ｃＩＡＰ１複合体は、カスパーゼ−８の活性化を抑制し、それによって開始カスパーゼによるＴＲＡＩＬ−Ｒ２会合ＤＤＸ３の切断を阻害することにより、デスレセプタープロアポトーシス的シグナルを停止させることができる。このモデルは、ＤＤＸ３がｃＩＡＰ１の動員を介してＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに対して細胞を保護し、がん細胞における死シグナリング経路の封鎖に寄与することを示す。
【０１９７】
例３：  Ｎ末端領域のセリンリン酸化によるＤＲ５へのＤＤＸ３結合の調節
バイオインフォマティクス検索により、ＤＤＸ３中に、ＧＳＫ３の潜在的基質について保存されているセリン豊富なドメイン（配列番号２０；配列番号２６のアミノ酸７０〜９０に相当）が同定された（図１３Ａ）。ＧＳＫ３の２つの最良の基質であるβ-カテニン及びグリコーゲンシンセターゼと比較して、ＤＤＸ３は、活性化された部位（the primed site）に対してＮ末端側に５個の連続するセリンを有する。ＤＤＸ３がＧＳＫ３の基質であることを支持するいくつかの証拠がある：（１）ＤＤＸ３とＧＳＫ３αとの共免疫沈降により明らかにされたところ、ＤＤＸ３は、ＧＳＫ３αと直接会合し、ＧＳＫ３はＤＤＸ３をリン酸化することができる（図１３Ｂ）;（２）ＧＳＫ３はＳｅｒ９０に点突然変異を有するＤＤＸ３をリン酸化できない（図１３Ｃ）；（３）Ｓｅｒ９０突然変異ＤＤＸ３は、ＴＲＡ−８媒介性アポトーシス間に、増大したＤＲ５からの解離及び切断を呈する（図１３Ｄ）。これらの結果は、ＤＤＸ３のＮ末端のセリン豊富ドメインは、ＤＲ５とのＤＤＸ３の会合において調節の役割を果たすことを示す。
【０１９８】
別途定義されていない限り、ここで用いられるすべての技術的及び科学的用語は、開示された方法及び組成物が属する当該技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。ここで記載されたものと同様又は等価の任意の方法及び材料は、本発明の方法及び組成物の実施又は試行において用いることができるが、特に有用な方法、機器及び材料は記載されているとおりである。ここで引用された刊行物及びそれらが引用されている所以の材料は、参照により具体的にここに援用される。ここにおける何物も、本発明の発明が従来の発明のおかげでこのような開示に先んじることを許可されていないことの容認として解釈されるべきではない。いかなる参考文献も先行技術を構成することを容認されていない。参考文献の論述は、それらの著者が主張するものを記載しており、出願人は、引用された書類の正確性及び適切性を攻撃する権利を保持する。多数の刊行物がここで言及されているが、このような参考文献は、これらの書類のいずれかが当該技術分野における普通一般的な知識の一部を形成することの容認を構成しないことは明白に理解されるであろう。
【０１９９】
本明細書の説明及び特許請求の範囲を通じて、「含む（comprise）」という語、及び「comprising」及び「comprises」のようなこの語の変化形は、「包含するが制限されないこと」を意味し、たとえば他の付加物成分、整数又は工程を除外することを意図しない。
当業者は、ここで記載された方法及び組成物の具体的な態様の多数の等価なものを、ルーチンの実験以外のものを用いずに、認識し、又は把握することができるであろう。
【０２００】
（参考文献）
【０２０１】
【表４】
0005562521.tif 000005
【０２０２】
【表５】
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【０２０３】
【表６】
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【０２０４】
【表７】
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【０２０５】
【表８】
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【０２０６】
【表９】
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【０２０７】
【表１０】
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【０２０８】
【表１１】
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【０２０９】
【表１２】
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【０２１０】
【表１３】
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【０２１１】
【表１４】
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【図面の簡単な説明】
【０２１２】
付随する図面は、本明細書に取り込まれ、本明細書の一部を構成するものであり、開示された方法及び組成物のいくつかの態様を説明するものであって、説明文とともに、開示された方法及び組成物の原理を説明するために役立つものである。
【図１】図１は、ＴＲＡ−８媒介性アポトーシスに対する腫瘍細胞の抵抗性の誘導を示す。パネル（Ａ）は、ＴＲＡＩＬ-Ｒ１及びＴＲＡＩＬ-Ｒ２の細胞表面発現のフローサイトメトリー分析を示す。ヒト乳がん細胞株ＭＤＡ−２３１及びヒト卵巣がん細胞株ＵＬ−３Ｃを、サイクロームコンジュゲート化（CyChrome-conjugated）抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１（２Ｅ１２）及びＰＥコンジュゲート化抗ＴＲＡｌＬ−Ｒ２（２Ｂ４）を用いて染色し、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターで分析した。パネル（Ｂ）は、ＴＲＡ−８、２Ｅ１２又はＴＲＡＩＬ媒介性アポトーシスに対するＭＤＡ−２３１及びＵＬ−３Ｃ細胞の感受性を示す。細胞を、９６ウェルプレート中で１ウェル当たり１，０００細胞で３ウェルずつ（三連）で培養し、示した濃度の各アポトーシス誘導剤とともにインキュベートした。架橋剤として、２Ｅ１２誘導アポトーシスについては、２μg/mlのヤギ抗マウスＩｇＧ１を添加し、ＴＲＡＩＬ誘導アポトーシスについては、抗Ｆｌａｇ抗体を添加した。細胞生存率は、一晩培養後にＡＴＰＬＩＴＥアッセイによって決定した。細胞生存率は、処理したウェルのカウントを培地対照のカウントで割ったパーセンテージによって決定した。各点は、３ウェルずつのセットの平均を表し、少なくとも３回の独立した実験の代表値である。パネル（Ｃ）は、ＴＲＡ−８抵抗性の誘導中のＴＲＡ−８媒介性アポトーシスに対する腫瘍細胞の感受性を示す。ＴＲＡ−８抵抗性の誘導は、細胞を１ng/mlのＴＲＡ−８で２日間処理することによって開始した。ＴＲＡ−８の用量は、２，０００ng/mlになるまで２日毎に２倍にした。これらの用量の各サイクルで、非誘導細胞及び対応する各用量で処理中の誘導細胞の細胞生存率を、ＡＴＰＬＩＴＥアッセイによって決定した。データを、３ウェルずつの培養の平均として表す。
【図２】図２は、ＭＤＡ−２３１及びＵＬ−３Ｃ細胞における誘導されたＴＲＡ−８抵抗性の選択性を示す。パネル（Ａ）は、ＭＤＡ−２３１及びＵＬ−３Ｃ細胞におけるＴＲＡＩＬ−Ｒ２誘導性アポトーシスを示す。親及び抵抗性のＭＤＡ−２３１及びＵＬ−３Ｃ細胞の両方を、示した濃度のＴＲＡ−８で処理した。パネル（Ｂ）は、ＭＤＡ−２３１及びＵＬ−３Ｃ細胞におけるＴＲＡＩＬ−Ｒ１誘導性アポトーシスを示す。親及び抵抗性のＭＤＡ−２３１及びＵＬ−３Ｃ細胞の両方を、示した濃度の２Ｅ１２で処理した。パネル（Ｃ）は、ＭＤＡ−２３１及びＵＬ−３Ｃ細胞におけるＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスを示す。親及び抵抗性のＭＤＡ−２３１及びＵＬ−３Ｃ細胞の両方を、示した濃度の組換え可溶性ＴＲＡＩＬで処理した。細胞生存率は、上述のとおりにＡＴＰＬＩＴＥアッセイによって一晩培養後に決定した。パネル（Ｄ）は、ＴＲＡ−８抵抗性の維持を示す。ＴＲＡ−８抵抗性の誘導後、ＴＲＡ−８を撤去した。ＴＲＡ−８抵抗性の維持は、ＴＲＡ−８の撤去後毎週決定した。細胞を、１，０００ng/mlのＴＲＡ−８で一晩処理し、ＡＴＰＬＩＴＥアッセイによって細胞生存率を決定した。
【図３】図３は、ＴＲＡ−８抵抗性細胞におけるＴＲＡＩＬ−Ｒ２及び関連するアポトーシス調節の発現を示す。パネル（Ａ）は、タンパク質発現のウェスタン・ブロット解析を示す。総細胞ライセートをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ウェスタン・ブロットを行なった。これらのブロットを、１μg/mlの一次抗体と一晩反応させ、続いて、ＨＲＰコンジュゲート化二次抗体と反応させた。タンパク質は、ＥＣＬ化学発光によって明らかにした。パネル（Ｂ）は、ＭＤＡ−２３１、親及び抵抗性細胞のｃＤＮＡアレイ解析を示す。ヒトアポトーシス（上のパネル）及び細胞シグナリング関連遺伝子（下のパネル）のパネルについての膜ｃＤＮＡアレイは、SuperArray, Inc.から購入した。３２Ｐ標識ｃＤＮＡプローブを、ＭＤＡ−２３１親及び抵抗性細胞の総ＲＮＡから調製し、ブロット上のｃＤＮＡアレイとハイブリダイズさせた。遺伝子発現プロフィールは、Cyclone Phosphor-Imagerを用いて解析した。
【図４】図４は、ＴＲＡ−８抵抗性細胞におけるＪＮＫ／ｐ３８キナーゼ経路及びカスパーゼ経路の活性化を示す。パネル（Ａ）は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＲ２を引き金としたカスパーゼ活性化を示す。ＭＤＡ−２３１親及び抵抗性細胞を、ｌ，０００ng/mlのＴＲＡ−８（左のパネル）又は２Ｅ１２（右のパネル）で示した時間処理した。総細胞ライセートのウェスタン・ブロットを、ポリクローナル抗カスパーゼ８（上のパネル）、抗カスパーゼ３（中央のパネル）又は抗ＰＡＲＰ（下のパネル）で探索した。矢印は、全長及び切断されたタンパク質を示す。パネル（Ｂ）は、ＪＵＫ／ｐ３８キナーゼ経路の活性化を示す。細胞を、上記と同様にして処理した。総細胞ライセートのウェスタン・ブロットを、ポリクローナル抗リン酸化ＪＮＫ（上のパネル）又は抗リン酸化ｐ３８（下のパネル）で探索した。矢印は、リン酸化されたタンパク質を示す。
【図５Ａ】図５は、ＴＲＡ−８抵抗性細胞における変更されたＤＩＳＣ形成を示す。パネル（Ａ）は、ＤＩＳＣ形成の共免疫沈降アッセイを示す。ＭＤＡ−２３１親及び抵抗性細胞を、１，０００ng/mlのＴＲＡ−８（左のパネル）又は２Ｅ１２（右のパネル）で示した時間処理した。ＴＲＡＩＬ−Ｒｌ及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２は、２Ｅｌ２又は２Ｂ４コンジュゲート化セファロース４Ｂ（Sepharose 4B）とともに免疫沈降した。この共免疫沈降されたタンパク質及び総細胞タンパク質のウェスタン・ブロットを、ポリクローナル抗ＦＡＤＤ（上のパネル）又は抗カスパーゼ８抗体（中央のパネル）又は抗ｃＦＬＩＰ抗体（下のパネル）で探索した。
【図５Ｂ】図５、パネル（Ｂ〜Ｅ）は、ＴＲＡ−８抵抗性細胞のＴＲＡＩＬ−Ｒ２関連タンパク質の二次元プロテオームプロフィールを示す。ＭＤＡ２３１親及び抵抗性細胞を、１，０００ng/mlのＴＲＡ−８で４時間処理するか、又は対照として未処理のままとした。２Ｂ４コンジュゲート化セファロース４ＢとのＴＲＡＩＬ−Ｒ２の免疫沈降の後、溶出したタンパク質を二次元電気泳動によって分離し、ＳＹＰＲＯルビー（Ruby）染色緩衝液で染色した。円で囲まれた差時的に発現されたタンパク質のスポットを、ＰＤＱｕｅｓｔソフトウェアによって同定した。実験は、再現性のある結果を得るために少なくとも３回繰り返した。
【図６】図６は、化学療法剤によるＴＲＡ−８抵抗性の逆転を示す。パネル（Ａ）は、化学療法剤の存在下でのＴＲＡ−８誘導アポトーシスに対するＴＲＡ−８抵抗性細胞の感受性を示す。ＭＤＡ−２３１及びＵＬ−３Ｃ抵抗性細胞を、０．１CMのタキソール、１VMのアドリアマイシン、１００VMのシスプラチン（cisplatin）又は５VMのBisVIIIの存在下又は不存在下で種々の用量のＴＲＡ−８で処理した。細胞生存率は、ＡＴＰＬＩＴＥアッセイによって一晩培養後に決定した。パネル（Ｂ）は、アドリアマイシンによるＴＲＡ−８抵抗性細胞におけるカスパーゼカスケードの活性化を示す。ＭＤＡ−２３１抵抗性細胞を、培地対照（レーン）で培養するか、あるいは１，０００ng/mlのＴＲＡ−８及び１□Mのアドリアマイシンで１時間（レーン２）又は４時間（レーン３）、又は１VMのアドリアマイシン単独又は１，０００ng/mlのＴＲＡ−８単独（レーン５）で処理した。総細胞ライセートのウェスタン・ブロットを、モノクローナル抗ヒトカスパーゼ抗体で探索した。パネル（Ｃ）は、ＴＲＡ−８抵抗性細胞におけるＦＡＤＤのＴＲＡＩＬ−Ｒ２動員を示す。上述したように異なる処理をしたＭＤＡ−２３１抵抗性細胞由来のＴＲＡＩＬ−Ｒ２を、２Ｂ４セファロース４Ｂで免疫沈降させた。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２とのＦＡＤＤの共免疫沈降は、抗ＦＡＤＤ抗体と反応させたウェスタン・ブロットによって決定した。
【図７】図７は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２とのＤＤＸ３の会合を示す。ＭＤＡ２３１親細胞及び抵抗性細胞を、組換え全長ＤＤＸ３でトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を、５００ng/mlのＴＲＡ−８で示した時間処理した。総細胞タンパク質を、モノクローナル抗Ｈｉｓ抗体で探索した（上のパネル）。β-アクチンを、添加対照として用いた。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２会合組換えＤＤＸ３の共免疫沈降アッセイは、抗Ｈｉｓ抗体を用いて決定した（下のパネル）。ＴＲＡＩＬと会合する内在性ＤＤＸ３を解析するために、ＭＤＡ２３１親細胞及び抵抗性細胞を、５００ng/mlのＴＲＡ−８で示した時間処理した。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２は、２Ｂ４コンジュゲート化セファロース４Ｂで免疫沈降された。総細胞タンパク質を、モノクローナル抗ＤＤＸ３抗体、３Ｅ２及び５Ａ６で探索した（上のパネル）。共免疫沈降された内在性ＤＤＸ３を、モノクローナル抗ＤＤＸ３抗体、３Ｅ２及び５Ａ６で探索した（下のパネル）。親細胞及び抵抗性細胞内のＴＲＡＩＬ−Ｒ２を、抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２ポリクローナル抗体を用いてウェスタン・ブロットによって決定した。
【図８Ａ】図８は、ＤＤＸ３及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２の相互作用領域のマッピングを示す。図８Ａは、欠失したＤＤＸ３の構築物を示す。示したとおりの全長及び欠失ＤＤＸ３をコードするｃＤＮＡは、ｐｃＤＮＡ３．１−ＨｉｓＡ発現ベクターにクローニングした。２９３細胞を、Ｎ末端、Ｃ末端欠失ＤＤＸ３及び野生型ＤＤＸ３でトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、組換えＤＤＸ３の発現をウェスタン・ブロットによって抗Ｈｉｓ抗体を用いて検出した（上のパネル）。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２で共免疫沈降した組換えＤＤＸ３は、ウェスタン・ブロット解析によって抗Ｈｉｓモノクローナル抗体を用いて決定した（中央のパネル）。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２は、ウェスタン・ブロットによって、抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２ポリクローナル抗体を用いて決定した（下のパネル）。レーン１:トランスフェクションなし、レーン２〜５:Ｎ末端ＤＤＸ３のΔ２−５、レーン６〜９:Ｃ末端ＤＤＸ３のΔ３−６、レーン１０:全長ＤＤＸ３。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２とのＤＤＸ３の相互作用はデスドメインと独立であることを示す。示したとおりの全長及び欠失したＴＲＡＩＬ−Ｒ２をコードするｃＤＮＡは、シャトルＣＭＶベクターにクローニングした。マウス３Ｔ３細胞を、野生型又は突然変異型のＴＲＡＩＬ−Ｒ２及びＤＤＸ３で共トランスフェクションした。２４時間後、細胞表面発現を、フローサイトメトリー解析によって、ＴＲＡ−８及びＰＥコンジュゲート化抗ｍＩｇＧ１を用いて試験した。共トランスフェクションの４８時間後、細胞ライセートをＴＲＡ−８と共免疫沈降させた。総ＤＤＸ３（上のパネル）及びＴＲＡＴＬ−Ｒ２会合ＤＤＸ３（中央のパネル）を、ウェスタン・ブロットによって抗Ｈｉｓ抗体を用いて試験した。レーン１:トランスフェクションなし;  レーン２:  ＤＤＸ３単独;  レーン３:  野生型ＴＲＡＩＬ−Ｒ２及びＤＤＸ３；  レーン４〜９:   ＴＲＡＩＬ−Ｒ２及びＤＤＸ３のΔｌ−６。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２は、ウェスタン・ブロットによって抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２ポリクローナル抗体を用いて決定した（下のパネル）。
【図８Ｃ】図８Ｃは、示したとおりの全長及び短縮型（truncated）ＴＲＡＩＬ−Ｒ２をコードするｃＤＮＡを、レポータータンパク質としてＧＦＰを有する二重発現ベクターにクローニングしたことを示す。マウス３Ｔ３細胞を、野生型又は突然変異型ＴＲＡＩＬ−Ｒ２及びＤＤＸ３で共トランスフェクションした。２４時間後、細胞表面発現を、フローサイトメトリー解析によってＴＲＡ−８及びＰＥコンジュゲート化抗ｍＩｇＧ１を用いて試験した。共トランスフェクションの４８時間後、細胞ライセートを、ＴＲＡ−８と免疫沈降させた。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２は、ウェスタン・ブロットによって抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２ポリクローナル抗体を用いて決定した（上のパネル）。総ＤＤＸ３（下のパネル）及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２会合ＤＤＸ３（中央のパネル）は、ウェスタン・ブロットによって抗Ｈｉｓ抗体を用いて試験した。レーン１:  ＤＤＸ３単独;  レーン２:   ΔＴＲＡＩＬ−Ｒ２−３００−３３０及びＤＤＸ３；  レーン３:   ΔＤ３３０及びＤＤＸ３；  レーン４:   ΔＤ３４０及びＤＤＸ３；  レーン５:  野生型ＴＲＡＩＬ−Ｒ２及びＤＤＸ３。
【図８Ｄ】図８Ｄは、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２のＤＤＸ３結合領域の、ＤｃＲ２及びＤＲ４とのアミノ酸整列図を示す。
【図８Ｅ】図８Ｅは、ＤＤＸ３がＴＲＡＩＬ−Ｒ２及びｃＩＡＰ１の間の連結物として役立つことを示す。ＭＤＡ２３１親細胞及びＭＤＡ２３１抵抗性細胞を、示した時間、５００ng/mlのＴＲＡ−８で処理した。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２は、２Ｂ４コンジュゲート化セファロース４Ｂで免疫沈降させた。ＤＤＸ３は、３Ｅ４コンジュゲート化セファロース４Ｂで免疫沈降させた。総ＤＤＸ３、ｃＩＡＰ１（上のパネル）、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２と共免疫沈降させたＤＤＸ３、ｃＩＡＰ１（中央のパネル）、ＤＤＸ３と共免疫沈降させたＤＤＸ３、ｃＩＡＰ１（下のパネル）のウェスタン・ブロットを、３Ｅ４モノクローナル抗ＤＤＸ３抗体及び１Ｃ１２モノクローナル抗ｃＩＡＰ１抗体で探索した。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２は、ウェスタン・ブロットによって抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２ポリクローナル抗体を用いて決定した（中央のパネル）。
【図９Ａ】図９は、ＤＤＸ３のダウンレギュレーションがＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに対する抵抗性を逆転させることを示す。図９Ａは、選択された有効なｓＲＮＡｉ−ＤＤＸ３を示す。ＭＤＡ２３１親細胞を、標的ｓＲＮＡｉ−ＤＤＸ３をコードするＵ６エントリーベクターでトランスフェクトしたことを示す。トランスフェクションの４８時間後、ＤＤＸ３発現を、ウェスタン・ブロット解析によって抗ＤＤＸ３抗体を用いて測定した。βアクチンを添加対照として用いた。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ＭＤＡ２３１抵抗性細胞を、ＧＦＰ発現ベクター及びｓＲＮＡｉ−ＤＤＸ３と共トランスフェクションしたことを示す。トランスフェクションの２４時間後、ＧＦＰ陽性細胞をサイトメトリーによってソーティングし、種々の濃度のＴＲＡ−８とともに一晩培養した。ＤＤＸ３発現は、ウェスタン・ブロットによって抗ＤＤＸ３抗体を用いて検出した（上のパネル）。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２は、２Ｂ４コンジュゲート化セファロース４Ｂで免疫沈降させた。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２会合ＤＤＸ３は、３Ｅ４モノクローナル抗ＤＤＸ３抗体で探索した（中央のパネル）。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、種々の濃度のＴＲＡ−８で一晩処理した。ＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに対するトランスフェクションされた細胞の感受性は、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイによって決定した。
【図９Ｃ】
【図９Ｄ】図９Ｄは、アポトーシスを行っているトランスフェクションされた細胞がＴＵＮＥＬ染色によって決定されることを示す。
【図９Ｅ】図９Ｅは、がん細胞のパネルが、対照又はＤＤＸ３ｓＲＮＡｉ  ｏｌｉｇｏでトランスフェクションされたことを示す。トランスフェクションの４８時間後、ＤＤＸ３の低減された発現をウェスタン・ブロットによって抗ＤＤＸ３抗体を用いて検出した。βアクチンを添加対照として用いた。
【図９Ｆ】図９Ｆは、トランスフェクションの２４時間後、細胞を種々の濃度のＴＲＡ−８で一晩処理したことを示す。ＴＲＡ−８誘導性アポトーシスに対するトランスフェクトされた細胞の感受性は、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイによって決定した。
【図１０】図１０は、ＤＤＸ３結合モチーフを欠いたＴＲＡＩＬ−Ｒ２がプロアポトーシス性であることを示す。マウス３Ｔ３細胞を、ΔＤ３４０−ＴＲＡＩＬ−Ｒ２及びＤＤＸ３野生型、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２及びＤＤＸ３、ΔＴ３００−３３０−ＴＲＡＩＬ−Ｒ２及びＤＤＸ３で共トランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を、５００ng/mlのＴＲＡ−８で一晩処理した。アポトーシス性細胞を、ＧＦＰ陽性細胞においてＰＥコンジュゲート化抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体、ビオチンコンジュゲート化アネキシンＶ（annexin V）によってフローサイトメトリー解析を用いて決定した。アポトーシス性細胞は、棒グラフで示した。
【図１１Ａ】図１１は、ＤＤＸ３がＴＲＡＩＬ−Ｒ２にｃＩＡＰ１を連結するアダプタータンパク質として役立つことを示す。図１１Ａは、ＤＤＸ３のｃＣＡＲＤ結合ＩＡＰ１のマッピングを示す。２９３細胞を、示したとおりの一連の欠失型ＤＤＸ３（上のパネル）、Ｎ末端アミノ酸１〜アミノ酸５０欠失（レーン１）、Ｎ末端アミノ酸１〜アミノ酸１００欠失（レーン２）、Ｎ末端アミノ酸１〜アミノ酸１５０欠失（レーン３）及びＣ末端アミノ酸３５０〜アミノ酸６６２欠失ＤＤＸ３（レーン４）及び全長 （レーン５）でトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、ニッケルビーズを用いて組換えＤＤＸ３を免疫沈降させた。総ｃＩＡＰ１（中央のパネル）及び共免疫沈降したｃＩＡＰ１を、ウェスタン・ブロット解析によって抗ｃＩＡＰ１モノクローナル抗体を用いて決定した（下のパネル）。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、ＣＡＲＤを欠いたＤＤＸ３はＴＲＡ−８抵抗性を逆転させることを示す。４系統のＴＲＡ−８抵抗性腫瘍細胞を、全長ＤＤＸ３（ＤＤＸ３−ＦＬ）又はＣＡＲＤ短縮型ＤＤＸ３（ΔＣＡＲＤ−ＤＤＸ３）をコードするアデノウイルスベクターでトランスフェクションした。トランスフェクションの４８時間後、細胞ライセートを、ＴＲＡ−８で免疫沈降させ、続いて、共免疫沈降したＤＤＸ３（上のパネル）及びｃＩＡＰ１（中央のパネル）のウェスタン・ブロット解析を行なった。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２を、ウェスタン・ブロット解析によって抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２ポリクローナル抗体を用いて決定した（下のパネル）。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、ＡＴＰＬｉｔｅアッセイによって決定した細胞生存率を示す。トランスフェクションした細胞を、５００ng/mlのＴＲＡ−８と一晩インキュベートした。
【図１２Ａ−Ｃ】図１２は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２／ＤＤＸ３／ｃＩＡＰ１タンパク質複合体がＴＲＡ−８抵抗性細胞においてカスパーゼ−８活性化及びＤＤＸ３切断をブロックすることを示す。図１２Ａは、ＴＲＡ−８感受性及び抵抗性細胞におけるＴＲＡＩＬ−Ｒ２／ＤＤＸ３／ｃＩＡＰ１タンパク質複合体を示す。ＭＤＡ２３１親（ＭＤＡ２３１ｐ）及び誘導された抵抗性（ＭＤＡ２３１ｒ）細胞、ＵＬ−３Ｃ親（ＵＬ−３Ｃｐ）及び誘導された抵抗性（ＵＬ−３Ｃｒ）細胞を、５００ng/mlのＴＲＡ−８で８時間処理した。総細胞ライセートを、２Ｂ４抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体コンジュゲート化セファロース４Ｂで免疫沈降させ、グリシン−塩酸、ｐＨ２．０で溶出させて、直ちに１Mトリス緩衝液で中和した。ＥＬＩＳＡプレートを、２Ｂ４抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体でコーティングし、３％ＢＳＡ−ＰＢＳでブロッキングした。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２  ｃｏ−ＩＰ由来タンパク質複合体とのインキュベーション後、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２を、ビオチンコンジュゲート化ポリクローナル抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体と、続いてＨＲＰコンジュゲート化ストレプトアビジンとを用いて検出した。図１２Ｂは、ＤＤＸ３が、ビオチンコンジュゲート化３Ｅ２抗ＤＤＸ３抗体、続いてＨＲＰコンジュゲート化ストレプトアビジンによって検出されたことを示す。図１２Ｃは、ｃＩＡＰ１が、ビオチンコンジュゲート化１Ｃ１２抗ｃＩＡＰ１抗体、続いてＨＲＰコンジュゲート化ストレプトアビジンによって検出されたことを示す。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、カスパーゼ媒介性切断に対するＤＤＸ３の差時的感受性を示す。ＤＤＸ３を、示したとおりの細胞から、２Ｂ４抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体コンジュゲート化セファロース４Ｂとの免疫沈降によって単離し、示したとおりのカスパーゼ−２又はカスパーゼ−８と、３７℃で４時間インキュベートした。
【図１２Ｅ】図１２Ｅは、５Ａ６を捕獲抗体、３Ｅ２を検出抗体として、サンドイッチＥＬＩＳＡによってＤＤＸ３の量を測定したことを示す。結果は、切断後のＤＤＸ３を切断しない対照で割ったパーセンテージとして表される。
【図１２Ｆ】図１２Ｆは、カスパーゼ８活性に対するＤＤＸ３／ｃＩＡＰ１複合体の効果を示す。ＤＤＸ３は、示したとおりの細胞から２Ｂ４抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２抗体コンジュゲート化セファロース４Ｂとの免疫沈降によって単離し、カスパーゼ８の蛍光基質であるＡｃ−ＩＥＴＤ−ＡＭＣの存在下で２時間、組換え活性ヒトカスパーゼ８とインキュベートした。カスパーゼ８の阻害は、低減した蛍光強度によって測定した。結果は、対照ウェル中における最大活性のパーセンテージとして表される。
【図１３Ａ】図１３は、会合及び切断の調節におけるＤＤＸ３のセリン豊富なドメインの役割を示す。パネル（Ａ）は、ＧＳＫ３基質の保存されたドメインを示す。
【図１３Ｂ】図１３、パネル（Ｂ）は、ＧＳＫ３αによって共免疫沈降されたＤＤＸ３を示す（上段）。ＴＲＡ−８感受性ＭＤＡ２３１細胞を、リチウムとともに又はなしで、ＴＲＡ−８で２時間処理した。総細胞ライセートを、抗ＧＳＫ３αビーズで免疫沈降させた。ＧＳＫ３αとタンパク質を、ウェスタン・ブロットによって、抗ＤＤＸ３抗体を用いて解析した。ＧＳＫ３はＤＤＸ３をリン酸化する（Ｂ、下段）。組換えＤＤＸ３及びタウ（tau）を基質として用い、ＰＫＡとともに又はなしで、ＧＳＫと１時間インキュベートした。取り込まれた３２Ｐをカウントし、cpmとして表した。
【図１３Ｃ】図１３、（Ｃ）ＧＳＫ３は、Ｓｅｒ９０変異体ＤＤＸ３をリン酸化できない。
【図１３Ｄ】図１３、（Ｄ）ＭＤＡ２３１細胞を野生型ＤＤＸ３及びＳｅｒ９０変異体ＤＤＸ３でトランスフェクトした。ＴＲＡ−８処理後、ＤＲ５からのＤＤＸ３の解離及びＤＤＸ３の切断を決定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０】
0005562521.tif 000035
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ−Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【配列表】
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