(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質に結合し、該タンパク質を発現する細胞の増殖の阻害を媒介する能力を有するモノクローナル抗体。
【請求項２】
前記増殖の阻害が、前記細胞によって発現される前記タンパク質への前記抗体の結合によって誘導される、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記増殖の阻害が、前記細胞によって発現される前記タンパク質の細胞外ドメインへの前記抗体の結合によって誘導される、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
前記タンパク質を発現する前記細胞が癌細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
前記癌細胞が、腫瘍形成性乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、結腸癌、膵癌、食道癌、頭頸部癌、腎癌、前立腺癌及び肝癌細胞から成る群より選択される、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
キメラ抗体、ヒト若しくはヒト化抗体、又は抗体のフラグメントである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ抗体から成る群より選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
前記タンパク質に特異的に結合する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
生細胞の表面上に存在する前記タンパク質の天然（ネイティブ）エピトープに結合する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
癌細胞に結合する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
前記癌細胞が乳癌細胞である、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
前記タンパク質が前記細胞の表面上で発現される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１３】
配列番号２〜１０及び３５〜７９から成る群より選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質若しくはペプチド、又はその免疫原性フラグメント若しくは誘導体、又は前記タンパク質若しくはペプチドを発現する核酸若しくは宿主細胞、又はその免疫原性フラグメント若しくは誘導体で動物を免疫する工程を含む方法によって入手できる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体を産生することができるハイブリドーマ。
【請求項１５】
治療薬に結合された、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体を含むコンジュゲート。
【請求項１６】
前記治療薬が、毒素、放射性同位体、薬剤又は細胞傷害性物質である、請求項１５に記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体及び／又は請求項１５若しくは１６に記載のコンジュゲート、及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１８】
配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質を発現する細胞及び／又はその細胞表面と該タンパク質との結合によって特徴づけられる細胞の増殖を阻害する方法に使用するための医薬組成物を調製するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体及び／又は請求項１５若しくは１６に記載のコンジュゲートの使用であって、該方法は、該細胞と、有効量の該抗体及び/又は該コンジュゲートとを接触させることを含む、使用。
【請求項１９】
配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質を発現する細胞及び／又はその細胞表面と該タンパク質との結合によって特徴づけられる細胞の転移拡散を抑制する方法に使用するための医薬組成物を調製するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体及び／又は請求項１５若しくは１６に記載のコンジュゲートの使用であって、該方法は、該細胞と、有効量の該抗体及び/又は該コンジュゲートとを接触させることを含む、使用。
【請求項２０】
配列番号２のアミノ酸配列を有するタンパク質を発現する細胞及び／又はその細胞表面と該タンパク質との結合によって特徴づけられる細胞が関与する疾患又は障害を治療する又は予防する方法に使用するための医薬組成物を調製するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体及び／又は請求項１５若しくは１６に記載のコンジュゲートの使用であって、該方法は、該抗体、該コンジュゲート及び/又は請求項１７に記載の医薬組成物を被験者に投与することを含む、使用。
【請求項２１】
前記疾患又は障害が腫瘍関連疾患である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記腫瘍関連疾患が、乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、結腸癌、膵癌、食道癌、頭頸部癌、腎癌、前立腺癌及び肝癌細胞から成る群より選択される、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記タンパク質が前記細胞の表面上で発現される、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
抗体に基づく癌治療は、臨床現場に導入されて成功を収め、この１０年間に腫瘍学における最も有望な治療薬として浮上してきた。
【０００２】
癌のための抗体による治療は、従来の薬剤と比較してより高い特異性とより低い副作用プロファイルの潜在的可能性を備える。その理由は、抗体による正常細胞と腫瘍細胞の正確な識別、及びそれらの作用形態が、補体活性化及び細胞傷害性免疫細胞の動員のような、より毒性の低い免疫学的抗腫瘍機序に基づくという事実である。
【０００３】
抗体治療の標的は、正常細胞と腫瘍細胞の適切な識別のための基礎を形成する、特定の性質を有する必要がある。明らかに、腫瘍細胞に排他的に限定され、且つ正常組織では全く検出不能である標的は、効率的で安全な抗体治療の開発にとって理想的である。別の態様では、高レベルの過剰発現が治療ウインドウと低い副作用のための基礎であり得、これは、遺伝子増幅の結果として抗体トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）の良好な標的である、ヒト上皮増殖因子受容体２型（ＨＥＲ−２）に例示される。
【０００４】
腫瘍治療のための既に認可されているか又は臨床開発中かのいずれかである抗体の他の標的は、腫瘍細胞上での標的分子の数的な過剰発現に基づかない、異なる性質を有する。プロテオグリカンＭＵＣ−１に対する抗体の場合は、標的の骨格内のペプチドリピートエピトープを腫瘍細胞において低グリコシル化し、それによって正常な対応物に変化させる。ＣＤ２０に対する抗体（リツキシマブ）、ＣＤ５２に対する抗体（Ｃａｍｐａｔｈ−１Ｈ）及びＣＤ２２（エプラツズマブ）に対する抗体の場合、抗体標的は腫瘍細胞と正常リンパ球で同等の発現レベルを有する。この場合、標的陰性幹細胞が正常なリンパ球レパートリーを回復するので、抗体による正常細胞の除去は耐容される。抗体標的の差次的なアクセス可能性の他の例は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）及びカルボアンヒドラーゼＩＸ（ＣＡ９）である。どちらの抗原も、それぞれ結腸及び腎臓の正常上皮で発現される。しかし、放射能標識したイメージング抗体は腫瘍組織と正常組織をはっきりと識別し、細胞傷害性抗体は耐容性良好である。これはおそらく、ＩｇＧ抗体がアクセスできない正常上皮組織の管腔側でのＣＡ９とＣＥＡの限定発現によるものであると考えられる。抗原上皮細胞接着分子（Ｅｐ−ＣＡＭ）もこのカテゴリーに属する。上皮細胞に対する同型細胞接着分子として、Ｅｐ−ＣＡＭは細胞間隙に局在する。興味深いことに、高親和性の抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体は非常に毒性が強いが、中間親和性抗体は耐容性良好である。これは、正常細胞上でのＥｐ−ＣＡＭ標的のアクセス可能性を示唆するが、同時に抗体結合の動態が治療ウインドウを開き得ることを示す。
【０００５】
８つの抗体が腫瘍疾患の治療のために承認されているが、それらの大部分はリンパ腫及び白血病においてである（Ａｄａｍｓ，Ｇ．Ｐ．＆  Ｗｅｉｎｅｒ，Ｌ．Ｍ．（２００５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３，１１４７−１１５７）。固形癌は癌に起因する死亡の９０％以上を占めるが、３つのｍＡｂ、すなわちＨｅｒｃｅｐｔｉｎ、Ａｖａｓｔｉｎ及びＥｒｂｉｔｕｘだけが固形癌タイプを対象とする。実質的に残る医学上の必要性、承認済のｍＡｂが既に提供してきた重要な臨床的有意性、及びそれらの相当数の商業的成功の全体が、広範な患者群のための抗体による治療を開発するだけにとどまらず、それらの効果を改善することも視野に入れた革新的なアプローチの波の原動力となった（Ｂｒｅｋｋｅ，Ｏ．Ｈ．＆  Ｓａｎｄｌｉｅ，Ｉ．（２００３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２，５２−６２；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．（２００１）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  １，１１８−１２９）。
【０００６】
次世代の機能的に改良された抗体による癌治療の到来のために克服すべき課題の１つは、好ましい毒性／効果プロフィールにとっての鍵である、適切な標的分子の選択である。
【０００７】
正常組織でそれらの標的を発現することにより、固形癌の治療のために使用できる現在の抗体は、抗体分子内に組み込まれた作用形態の累積的な力を十分に引き出せてはいない。例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎの標的であるＨｅｒ２／ｎｅｕは、心筋を含む多くの正常ヒト組織において発現される（Ｃｒｏｎｅ，Ｓ．Ａ．，Ｚｈａｏ，Ｙ．Ｙ．，Ｆａｎ，Ｌ．，Ｇｕ，Ｙ．，Ｍｉｎａｍｉｓａｗａ，Ｓ．，Ｌｉｕ，Ｙ．，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｌ．，Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｋａｈｎ，Ｒ．，Ｃｏｎｄｏｒｅｌｌｉ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８，４５９−４６５）。結果として、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎは低い免疫学的効力を有するように設計され、最大有効量で投与することはできない。というのは、そうしなければ許容できない毒性が生じるからである。この「潜在的に鋭利なナイフの鈍化（ｂｌｕｎｔｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ  ｓｈａｒｐ  ｋｎｉｆｅ）」はＨｅｒｃｅｐｔｉｎの治療効果を制限する。
【０００８】
毒性に関連する正常組織での発現がないことに加えて、腫瘍細胞の表面での強固な高発現及び腫瘍促進機能の表出は、理想的な抗体標的にとっての望ましい特徴である（Ｈｏｕｓｈｍａｎｄ，Ｐ．＆  Ｚｌｏｔｎｉｋ，Ａ．（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１５，６４０−６４４）。
【０００９】
癌の抗体治療のための新たな標的の発見に向けて統合的なデータ検索と実験的検証アプローチを使用して、我々はＧＴ４６８を同定した。ＧＴ４６８は胎盤特異的遺伝子であり、他のいかなる正常ヒト組織においても検出可能には発現されない。しかし、様々な腫瘍型、特に乳癌ではしばしば異常活性化され、高発現される。ＭＣＦ−７及びＢＴ−５４９乳癌細胞におけるＲＮＡｉを介したＧＴ４６８のサイレンシングは、運動、移動及び浸潤を大きく妨げ、Ｇ１／Ｓ細胞周期ブロックを誘導して、増殖をほぼ完全に廃する。ＧＴ４６８のノックダウンは、サイクリンＤ１の発現低下及びＡＫＴキナーゼの低リン酸化と関連している。さらに、ＧＴ４６８は癌細胞の表面に局在し、この分子の生物学的機能に拮抗する抗体がアクセス可能である。
【００１０】
ＧＴ４６８は、それを治療用抗体にとっての極めて魅力的な標的にするいくつかの性質を有する。妊娠のような例外的な状態においてのみヒトの体内で出現する細胞系譜の分化抗原であるので、おそらく自己抗原がそうであるように、健常な毒性関連組織では存在しない。様々な腫瘍実体におけるその高い存在率の故に、幅広い患者がＧＴ４６８ターゲティング療法による治療に適する。例えば乳癌の場合は、患者の８２％がこの標的を担持する。この癌タイプの治療のために使用可能な唯一のｍＡｂであるＨｅｒｃｅｐｔｉｎの標的、Ｈｅｒ２／ｎｅｕは、対照的に、乳癌患者の２０〜２５％においてのみ過剰発現される（Ｓｌａｍｏｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｇｏｄｏｌｐｈｉｎ，Ｗ．，Ｊｏｎｅｓ，Ｌ．Ａ．，Ｈｏｌｔ，Ｊ．Ａ．，Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｇ．，Ｋｅｉｔｈ，Ｄ．Ｅ．，Ｌｅｖｉｎ，Ｗ．Ｊ．，Ｓｔｕａｒｔ，Ｓ．Ｇ．，Ｕｄｏｖｅ，Ｊ．，Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４，７０７−７１２）。肺癌及び胃癌に関しては、それぞれ症例の４２％及び５８％においてＧＴ４６８が発現されるが、これらの癌タイプでは適切な標的がないため、これまでのところ認可されたｍＡｂ治療はない。
【００１１】
ＧＴ４６８は生細胞上の抗体によって薬剤化可能（ｄｒｕｇａｂｌｅ）であり、そのような抗体は、増殖阻害などの抗腫瘍作用を促進し得る。ＧＴ４６８は増殖に関与するだけでなく、細胞の運動、移動及び浸潤にも関わる。最も興味深いことは、これらの属性すべてが、腫瘍表現型に実質的に寄与するのみならず、同時にヒト栄養芽層の固有の性質でもあって、その生理的な特徴は速やかに成長して、子宮組織に効率良く侵入することである。ＡＤＣＣ及びＣＤＣなどの免疫エフェクター機能を媒介する潜在能に加えてこれらの機能すべてに同時に干渉する、ＧＴ４６８に対するｍＡｂが人工的に工作できると予想される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、一般に、癌、特に乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、結腸癌、膵癌、食道癌、頭頸部癌、腎癌、前立腺癌及び肝癌などの腫瘍関連疾患を含む、ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞に関連する疾患を治療する及び／又は予防するための治療薬として有用な抗体を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
１つの態様では、本発明は、ＧＴ４６８に結合する能力を有する抗体に関する。好ましくは、抗体は細胞表面に位置するＧＴ４６８に結合する能力を有し、好ましくはＧＴ４６８の細胞外ドメイン内に、好ましくはＧＴ４６８のアミノ酸残基２３〜２１２内に位置する１又はそれ以上のエピトープに結合し、最も好ましくは配列番号３〜１０及び３５〜７９のアミノ酸配列の１つの中に位置するエピトープに結合する。１つの好ましい実施形態では、抗体は配列番号３〜１０及び３５〜７９のアミノ酸配列の１又はそれ以上に特異的である。様々な実施形態では、抗体は、配列番号２のアミノ酸２９〜１１９、好ましくはアミノ酸２９〜２１２、より好ましくはアミノ酸２３〜２１２を含むペプチドに結合する能力を有する。好ましくは、抗体は癌細胞、特に上記の癌タイプの細胞に結合し、好ましくは、非癌性細胞には実質的に結合しない。好ましくは、癌細胞のような、ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞への該抗体の結合は、該細胞の死滅を媒介する及び／又は運動、移動、浸潤及び増殖などの、そのような細胞の１又はそれ以上の活性を阻害する。好ましくは、抗体は該細胞の死滅を媒介する及び／又は該細胞の増殖を阻害する。
【００１４】
本発明の抗体による細胞の死滅及び／又は細胞の１又はそれ以上の活性の阻害、特に細胞増殖の阻害は、好ましくは該細胞によって発現されるＧＴ４６８への抗体の結合によって及び／又は該細胞の表面と結合することによって誘導される。そのような細胞の死滅及び／又は細胞の１又はそれ以上の活性の阻害は、本明細書において記載されるように治療的に利用できる。特に、細胞の死滅及び／又は細胞の増殖の阻害は、癌を治療する又は予防するために利用できる。細胞の運動、移動、浸潤及び／又は増殖の阻害は、癌、特に癌の転移及び癌細胞の転移拡散を治療する又は予防するために利用できる。
【００１５】
ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞は、好ましくは癌細胞であり、特に、腫瘍形成性乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、肝癌、結腸癌、膵癌、食道癌、頭頸部癌、腎癌及び前立腺癌細胞から成る群より選択される。
【００１６】
好ましくは、本発明の抗体は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を介した細胞溶解、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介した細胞溶解、アポトーシス、同型接着、及び／又は貪食作用を誘導することによって、好ましくはＣＤＣを介した細胞溶解及び／又はＡＤＣＣを介した細胞溶解を誘導することによって細胞の死滅を媒介する。
【００１７】
１つの実施形態では、本発明の抗体はＣＤＣを介した細胞の溶解を誘導しない。
好ましくは、ＡＤＣＣを介した細胞の溶解はエフェクター細胞の存在下で起こり、エフェクター細胞は、特定実施形態では、単球、単核細胞、ＮＫ細胞及びＰＭＮから成る群より選択され、また貪食作用はマクロファージによるものである。
【００１８】
本発明の抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト、若しくはヒト化抗体、又は抗体のフラグメントであってもよく、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、好ましくはＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥから成る群より選択してもよい。
【００１９】
本発明のすべての態様によれば、ＧＴ４６８は、好ましくは配列番号２によるアミノ酸配列を有する、より好ましくは配列番号２によるアミノ酸配列の細胞外ドメインのアミノ酸配列を有する、特に配列番号２のアミノ酸２３から２１２までにわたるアミノ酸配列を有する、好ましくはヒトＧＴ４６８である。
【００２０】
特に好ましい実施形態では、本発明の抗体は、配列番号３〜１０及び３５〜７９に示すもののような、生細胞の表面上に存在するＧＴ４６８の天然エピトープに結合する。さらなる好ましい実施形態では、本発明の抗体は癌細胞、好ましくは乳癌細胞に特異的である。
【００２１】
本発明のある実施形態では、ＧＴ４６８は細胞の表面で発現される及び／又は細胞の表面と結合する。
【００２２】
本発明の抗体は、配列番号２〜１０及び３５〜７９から成る群より選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質若しくはペプチド、又はその免疫原性フラグメント若しくは誘導体、又は該タンパク質若しくはペプチドを発現する核酸若しくは宿主細胞、又はその免疫原性フラグメント若しくは誘導体で動物を免疫する工程を含む方法によって入手し得る。好ましくは、本発明の抗体は、上記タンパク質、ペプチド、又はその免疫原性フラグメント若しくは誘導体に特異的である。免疫において使用されるタンパク質又はペプチドに関連して、誘導体は、それが由来するタンパク質又はペプチドと同じ免疫原性を有する、そのようなタンパク質又はペプチドの変異体に関する。特に、タンパク質又はペプチドの誘導体は、抗体、特にモノクローナル抗体の作製のために免疫において使用されるとき、免疫においてそのタンパク質又はペプチドを使用したときに得られる抗体と同じ特異性を有する抗体を提供する。例えばそのような誘導体は、１又はそれ以上のアミノ酸の欠失、置換又は付加を含み得る。特に、Ｎ末端又はＣ末端又はその両方におけるシステインなどの１又はそれ以上のアミノ酸の付加を含み得る。
【００２３】
特に好ましい実施形態では、本発明の抗体は、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２２（４Ｅ９−１Ｈ９）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２６（９Ｂ６−２Ａ９）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２４（５９Ｄ６−２Ｆ２）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２５（６１Ｃ１１−２Ｂ５）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２３（７８Ｈ１１−１Ｈ６）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９５（２２−１Ａ−１）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９３（２２−２Ａ−１）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９６（２２−９Ｂ−１）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９７（２３−３３Ａ−１）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９１（２３−１９Ａ−１）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９４（Ｆ１１＃３３Ｆ７Ｄ１２）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９２（４Ａ１２  ２Ｄ４  １Ａ１０）、又はＤＳＭ  ＡＣＣ２８９８（４Ｅ９  １Ｄ１２  ２Ｄ４）を有するクローンによって産生される。
【００２４】
１つの実施形態では、本発明の抗体は、毒素、放射性同位体、薬剤又は細胞傷害性物質などの治療薬に結合される。
【００２５】
さらなる態様では、本発明は、本発明の抗体を産生することができるハイブリドーマに関する。好ましいハイブリドーマは、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２２（４Ｅ９−１Ｈ９）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２６（９Ｂ６−２Ａ９）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２４（５９Ｄ６−２Ｆ２）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２５（６１Ｃ１１−２Ｂ５）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２３（７８Ｈ１１−１Ｈ６）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９５（２２−１Ａ−１）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９３（２２−２Ａ−１）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９６（２２−９Ｂ−１）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９７（２３−３３Ａ−１）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９１（２３−１９Ａ−１）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９４（Ｆ１１＃３３Ｆ７Ｄ１２）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９２（４Ａ１２  ２Ｄ４  １Ａ１０）、又はＤＳＭ  ＡＣＣ２８９８（４Ｅ９  １Ｄ１２  ２Ｄ４）を有するものである。
【００２６】
本発明の抗体は、本明細書では、抗体の名称に言及することによって及び／又は抗体を産生するクローン、例えば４Ｅ９−１Ｈ９に言及することによって示される。
【００２７】
本発明はまた、本発明の抗体及び／又は治療薬と本発明の抗体とのコンジュゲート、及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。
【００２８】
さらなる態様では、本発明は、細胞を本発明の抗体及び／又は治療薬と本発明の抗体とのコンジュゲートの有効量と接触させることを含む、ＧＴ４６８を発現する及び／又はその細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞の、運動、移動、浸潤及び増殖から選択される１又はそれ以上の活性、好ましくは増殖を阻害する及び／又は該細胞を死滅させる方法に関する。ＧＴ４６８は、好ましくは該細胞の表面上で発現される。
【００２９】
さらなる態様では、本発明は、本発明の抗体、治療薬と本発明の抗体とのコンジュゲート、又は本発明の抗体若しくは治療薬と本発明の抗体とのコンジュゲートを含む医薬組成物を被験者に投与することを含む、ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞が関与する疾患又は障害を治療する又は予防する方法に関する。好ましくは、疾患又は障害は腫瘍関連疾患であり、特定実施形態では、乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、結腸癌、膵癌、食道癌、頭頸部癌、腎癌、前立腺癌及び肝癌から成る群より選択される。ＧＴ４６８は、好ましくは該細胞の表面上で発現される。
【００３０】
好ましくは、本発明の抗体は、癌細胞及び非悪性細胞を含む異なる細胞型によって発現されるＧＴ４６８変異体を識別する能力を有する。
【００３１】
本発明における「結合」という用語は、好ましくは特異的結合に関する。「特異的結合」は、抗体のような物質が、別の標的への結合と比較して、それが特異的であるエピトープのような標的により強く結合することを意味する。物質が２番目の標的についての解離定数（ＫＤ）より低い解離定数で１番目の標的に結合する場合、その物質は２番目の標的と比較して１番目の標的により強く結合する。好ましくは、物質が特異的に結合する標的についての解離定数（ＫＤ）は、その物質が特異的に結合しない標的についての解離定数（ＫＤ）よりも１０倍以上低い、好ましくは２０倍以上低い、より好ましくは５０倍以上低い、さらに一層好ましくは、１００倍、２００倍、５００倍又は１０００倍以上低い。
【００３２】
本発明の抗体は、好ましくは、ＧＴ４６８に結合することにより、ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞の死滅を媒介する。好ましくは、ＧＴ４６８は該細胞の表面上で発現される。１つの実施形態では、本発明の抗体は、ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を介した溶解、例えば該細胞の少なくとも約２０〜４０％のＣＤＣを介した溶解、好ましくは約４０〜５０％のＣＤＣを介した溶解、より好ましくは５０％以上のＣＤＣを介した溶解を誘導する。代替的には、又はＣＤＣを誘導することに加えて、本発明の抗体は、エフェクター細胞（例えば単球、単核細胞、ＮＫ細胞及びＰＭＮ）の存在下でＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導し得る。本発明の抗体は、ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞のアポトーシスを誘導する、ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞の同型接着を誘導する、及び／又はＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞の貪食作用を誘導する能力を有し得る。本発明の抗体は、上述した機能特性の１又はそれ以上を有し得る。好ましくは、本発明の抗体は、ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞のＣＤＣを介した溶解及びＡＤＣＣを介した溶解を誘導し、より好ましくは、ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞のＡＤＣＣを介した溶解を誘導するが、該細胞のＣＤＣを介した溶解は誘導しない。本発明の抗体の例示的な標的細胞は、腫瘍形成性乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌及び肝細胞癌細胞などの、ＧＴ４６８を発現する癌細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる癌細胞を含むが、これらに限定されない。特に好ましい実施形態では、本発明の抗体によって媒介される細胞の死滅はＧＴ４６８特異的である、すなわち本発明の抗体は、ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞の死滅、好ましくはＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣを介した溶解を媒介するが、ＧＴ４６８を発現しない細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられない細胞の死滅は媒介しない。上述した抗体は、乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、結腸癌、膵癌、食道癌、頭頸部癌、腎癌、前立腺癌及び肝癌などの癌の治療又は予防において腫瘍細胞の死滅を媒介するために使用され得る。
【００３３】
本発明の抗体は、マウス、ラット、ウサギ、モルモット及びヒトを含むがこれらに限定されない種々の種に由来し得る。本発明の抗体はまた、１つの種、好ましくはヒトに由来する抗体定常領域が別の種に由来する抗原結合部位と組み合わされているキメラ分子を含む。さらに本発明の抗体は、非ヒト種に由来する抗体の抗原結合部位がヒト起源の定常領域及びフレームワーク領域と組み合わされているヒト化分子を含む。
【００３４】
本発明の抗体は、ポリクローナル及びモノクローナル抗体を含み、ＩｇＧ２ａ（例えばＩｇＧ２ａ、κ、λ）、ＩｇＧ２ｂ（例えばＩｇＧ２ｂ、κ、λ）、ＩｇＧ３（例えばＩｇＧ３、κ、λ）及びＩｇＭ抗体を含む。しかし、ＩｇＧ１、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ抗体を含む、他の抗体アイソタイプも本発明に包含される。抗体は、全長抗体又は、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖフラグメント又は二重特異性抗体を含む、全長抗体の抗原結合フラグメントであり得る。さらに、抗原結合フラグメントは、（ｉ）免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドに融合した結合ドメインポリペプチド（重鎖可変領域又は軽鎖可変領域など）、（ｉｉ）ヒンジ領域に融合した免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域、及び（ｉｉｉ）ＣＨ２定常領域に融合した免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域を含む、結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質を包含する。そのような結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質は、さらに、米国特許出願第２００３／０１１８５９２号及び米国特許出願第２００３／０１３３９３９号に開示されている。
【００３５】
本発明の抗体は、好ましくは約１〜１００ｎＭ又はそれ以下の解離平衡定数（ＫＤ）でＧＴ４６８から解離する。好ましくは、本発明の抗体は関連細胞表面抗原と交差反応せず、このためそれらの機能を阻害しない。
好ましい実施形態では、本発明の抗体は以下の性質： 
ａ）ＧＴ４６８に対する特異性；
ｂ）約１００ｎＭ又はそれ以下、好ましくは約５〜１０ｎＭ又はそれ以下、より好ましくは約１〜３ｎＭ又はそれ以下の、ＧＴ４６８に対する結合親和性；
ｃ）ＣＤ５５／５９陰性細胞上又はＣＤ５５／５９陽性細胞上のいずれかで高レベルのＣＤＣを媒介する能力；
ｄ）ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞の増殖を阻害する能力；
ｅ）ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞のアポトーシスを誘導する能力；
ｆ）ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞の同型接着を誘導する能力；
ｇ）エフェクター細胞の存在下でＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞のＡＤＣＣを誘導する能力；
ｈ）ＧＴ４６８を発現する腫瘍細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる腫瘍細胞を有する被験者の生存を延長させる能力；
ｉ）ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞を枯渇させる能力；
ｊ）低レベルのＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞を枯渇させる能力；及び／又は
ｋ）生細胞の表面でＧＴ４６８を集合させる能力
の１又はそれ以上によって特徴づけることができる。
【００３６】
本発明の抗ＧＴ４６８抗体は、他の結合特異性部分に誘導体化する、連結する又は他の結合特異性部分と共発現することができる。特定実施形態では、本発明は、ＧＴ４６８に対する少なくとも１つの第一の結合特異性部分（例えば抗ＧＴ４６８抗体又はその模倣体）、及びＦｃ受容体（例えばＦｃγＲＩなどのＦｃγ受容体、又は他の任意のＦｃ受容体）又はＴ細胞受容体、例えばＣＤ３に対する結合特異性部分のような、エフェクター細胞に対する第二の結合特異性部分を含む二重特異性又は多重特異性分子を提供する。
【００３７】
従って、本発明は、ＧＴ４６８及びＦｃ受容体又はＴ細胞受容体、例えばＣＤ３の両方に結合する二重特異性及び多重特異性分子を含む。Ｆｃ受容体の例は、ＩｇＧ受容体、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）などのＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）である。ＩｇＡ受容体（例えばＦｃαＲＩ）などの他のＦｃ受容体も標的とすることができる。Ｆｃ受容体は、好ましくはエフェクター細胞の表面、例えば単球、マクロファージ又は活性化単核細胞の表面上に位置する。好ましい実施形態では、二重特異性及び多重特異性分子は、受容体の免疫グロブリンＦｃ（例えばＩｇＧ又はＩｇＡ）とは異なる部位でＦｃ受容体に結合する。このため、二重特異性及び多重特異性分子の結合は生理的レベルの免疫グロブリンによってブロックされない。
【００３８】
さらに別の態様では、本発明の抗ＧＴ４６８抗体は、別の機能性分子、例えば別のペプチド又はタンパク質（例えばＦａｂ'フラグメント）で誘導化される、該分子に連結される又は該分子と共発現される。例えば本発明の抗体は、別の抗体（例えば二重特異性又は多重特異性抗体を作製するため）、細胞毒、細胞リガンド又は抗原（例えば免疫毒素のような免疫複合体を作製するため）のような、１又はそれ以上の分子実体に機能的に連結することができる（例えば化学結合、遺伝子融合、非共有結合又は他の方法によって）。本発明の抗体は、他の治療用成分、例えば放射性同位体、低分子抗癌剤、組換えサイトカイン又はケモカインに連結することができる。従って、本発明は、それらのすべてが、ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞に結合し、他の分子をそのような細胞に標的するために使用できる、多様な抗体コンジュゲート、二重特異性及び多重特異性分子、並びに融合タンパク質を包含する。
【００３９】
さらなる態様では、本発明はまた、非免疫グロブリンドメインに由来するＧＴ４６８結合タンパク質、特に一本鎖タンパク質を想定している。そのような結合タンパク質及びそれらの生産のための方法は、例えば参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３（１０）：１２５７−１２６８に記載されている。免疫グロブリン又は免疫グロブリン由来の結合分子に関して本明細書で与える教示は、同様に非免疫グロブリンドメインに由来する結合分子にも適用される。特に、非免疫グロブリンドメインに由来するそのような結合分子を用いて、該標的を発現する細胞及び／又はそれらの細胞表面と該標的の結合によって特徴づけられる細胞のＧＴ４６８をブロックすることが可能であり、このため本発明の抗体に関して本明細書で開示する治療効果、特に、増殖などの、本明細書で開示する腫瘍細胞の１又はそれ以上の活性の阻害を生じさせることが可能である。必須ではないが、例えば抗体のＦｃ領域への融合によって、そのような非免疫グロブリン結合分子に抗体のエフェクター機能を付与することが可能である。
【００４０】
さらに別の態様では、本発明は、本発明の抗体の１つ又は本発明の抗体の組合せと共に製剤された医薬的に許容される担体を含む組成物、例えば医薬及び診断用組成物／キットを提供する。特定実施形態では、組成物は、異なるエピトープに結合する抗体、又はＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣを誘導すること及びアポトーシスを誘導することのような、異なる機能的特徴を有する抗体の組合せを含む。本発明のこの実施形態では、抗体は、組み合わせて、例えば２又はそれ以上の抗ＧＴ４６８モノクローナル抗体を含む医薬組成物として使用し得る。例えば、異なるが補完的な活性を有する抗ＧＴ４６８抗体を、所望の治療効果を達成するために単一治療において組み合わせることができる。好ましい実施形態では、組成物は、アポトーシスを誘導する別の抗ＧＴ４６８抗体と組み合わせた、ＣＤＣを媒介する抗ＧＴ４６８抗体を含む。別の実施形態では、組成物は、ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞の増殖を阻害する別の抗ＧＴ４６８抗体と組み合わせた、エフェクター細胞の存在下で標的細胞の極めて有効な死滅を媒介する抗ＧＴ４６８抗体を含む。
【００４１】
本発明はまた、本発明の２又はそれ以上の抗ＧＴ４６８抗体の同時又は連続投与を含み、好ましくは該抗体の少なくとも１つはキメラ抗ＧＴ４６８抗体であり、及び少なくとも１つのさらなる抗体はヒト抗ＧＴ４６８抗体であり、それらの抗体はＧＴ４６８の同じか又は異なるエピトープに結合する。好ましくは、本発明のキメラＧＴ４６８抗体を最初に投与し、続いて本発明のヒト抗ＧＴ４６８抗体を投与するが、ヒト抗ＧＴ４６８抗体は、好ましくは長期間投与される、すなわち維持療法として投与される。
【００４２】
本発明の抗体、免疫複合体、二重特異性及び多重特異性分子並びに組成物は、細胞の増殖が阻害されるように及び／又は細胞が死滅するように、細胞を該抗体、免疫複合体、二重特異性／多重特異性分子又は組成物の有効量と接触させることにより、ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞の増殖を阻害するため、及び／又はＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞を選択的に死滅させるために様々な方法において使用できる。１つの実施形態では、該方法は、例えばＣＤＣ、アポトーシス、ＡＤＣＣ、貪食作用による、又はこれらの機序の２又はそれ以上の組合せによる、場合によりエフェクター細胞の存在下での、ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞の死滅を含む。本発明の抗体を使用して阻害する又は死滅させることができる、ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞は、乳房、肺、胃、卵巣、肝臓、結腸、膵臓、食道、頭頸部、腎臓、前立腺及び肝細胞などの癌細胞を含む。
【００４３】
従って、本発明の抗体は、ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞が関与する様々な疾患を、そのような疾患に罹患している患者に本発明の抗体を投与することによって治療する又は予防するために使用できる。治療する（例えば改善する）又は予防することができる例示的な疾患は、腫瘍形成性疾患を含むが、これらに限定されない。治療及び／又は予防できる腫瘍形成性疾患の例は、乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、結腸癌、膵癌、食道癌、頭頸部癌、腎癌、前立腺癌及び肝癌を含む。
【００４４】
本発明の特定実施形態では、抗体を投与される被験者は、化学療法剤、放射線で、又は、例えばＦｃγ受容体といったＦｃ受容体の発現又は活性を調節する（例えば高める又は阻害する）、サイトカインなどの物質で、付加的に治療される。治療期間中に投与するための典型的なサイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含む。典型的な治療薬は、中でも特に、ドキソルビシン、シスプラチン、タキソテール、５−フルオロウラシル、メトトレキサート、ゲムシタビン及びシクロホスファミドなどの抗腫瘍薬を含む。
【００４５】
さらに別の態様では、本発明は、抗体を得るためにマウスなどの非ヒト動物をヒトＧＴ４６８又はそのペプチドフラグメントで免疫するための免疫方法に関する。免疫のための好ましいペプチドは、配列番号２〜１０及び３５〜７９から成る群より選択されるもの、又はそれらの誘導体である。従って、好ましい実施形態では、本発明の抗体は、配列番号２〜１０及び３５〜７９から成る群より選択されるペプチド、又はそれらの誘導体を用いた免疫によって得られるものである。同様に、ＧＴ４６８に対する抗体は、トランスジェニックマウスのような、トランスジェニック非ヒト動物において作製できる。トランスジェニック非ヒト動物は、抗体の全部又は一部をコードする重鎖導入遺伝子と軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニックマウスであり得る。
【００４６】
野生型並びにトランスジェニック非ヒト動物は、ＧＴ４６８抗原及び／又はＧＴ４６８若しくはそのペプチドフラグメントを発現する核酸及び／又は細胞の精製又は冨化製剤で免疫することができる。好ましくは、非ヒト動物は、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換え及びアイソタイプスイッチを受けることによってＧＴ４６８に対するヒトモノクローナル抗体の多数のアイソタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＭ）を産生することができる。アイソタイプスイッチは、例えば古典的又は非古典的アイソタイプスイッチによって起こり得る。
【００４７】
従って、さらに別の態様では、本発明は、上述したような非ヒト動物からの単離Ｂ細胞を提供する。単離Ｂ細胞は、その後、本発明の抗体の供給源（例えばハイブリドーマ）を提供するために不死化細胞への融合によって不死化され得る。そのようなハイブリドーマ（すなわち本発明の抗体を産生する）も、本発明の範囲内に包含される。
【００４８】
本明細書において例示するように、本発明の抗体は、抗体を発現するハイブリドーマから直接得られるか、又はクローニングして、宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞又はリンパ球細胞）において組換え発現させることができる。宿主細胞のさらなる例は、大腸菌などの微生物及び酵母などの真菌である。代替的には、本発明の抗体は、トランスジェニック非ヒト動物又は植物において組換え生産することができる。
【００４９】
本発明の抗体を生産するための好ましいハイブリドーマ細胞は、以下の名称とアクセッション番号を有する、ＤＳＭＺ（Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ．７Ｂ，３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に寄託されたものである：
ａ．４Ｅ９−１Ｈ９、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２２、２００７年３月１３日寄託
ｂ．９Ｂ６−２Ａ９、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２６、２００７年３月１３日寄託
ｃ．５９Ｄ６−２Ｆ２、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２４、２００７年３月１３日寄託
ｄ．６１Ｃ１１−２Ｂ５、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２５、２００７年３月１３日寄託
ｅ．７８Ｈ１１−１Ｈ６、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２３、２００７年３月１３日寄託
ｆ．２２−１Ａ−Ｉ、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９５、２００８年３月１１日寄託
ｇ．２２−２Ａ−１、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９３、２００８年３月１１日寄託
ｈ．２２−９Ｂ−１、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９６、２００８年３月１１日寄託
ｉ．２３−３３Ａ−１、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９７、２００８年３月１１日寄託
ｊ．２３−１９Ａ−１、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９１、２００８年３月１１日寄託
ｋ．Ｆ１１＃３３Ｆ７Ｄ１２、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣ２８９４、２００８年３月１１日寄託
１．４Ａ１２  ２Ｄ４  １Ａ１０、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９２、２００８年３月１１日寄託
ｍ．４Ｅ９  １Ｄ１２  ２Ｄ４、アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９８、２００８年３月１１日寄託
【００５０】
本発明の好ましい抗体は、上述したハイブリドーマによって産生されるもの及び上述したハイブリドーマから得られるもの並びにそれらのキメラ及びヒト化形態である。本発明のさらなる好ましい抗体は、上述したハイブリドーマによって産生される及び上述したハイブリドーマから得られる抗体の特異性を有するもの、特に上述したハイブリドーマによって産生される及び上述したハイブリドーマから得られる抗体の抗原結合部分又は抗原結合部位、特に可変領域を含むものである。
【００５１】
好ましい実施形態では、抗体、特に本発明による抗体のキメラ形態は、配列番号１７又は２４によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントなどのヒト重鎖定常領域に由来するアミノ酸配列を有する重鎖定常領域（ＣＨ）を含む抗体を包含する。さらなる好ましい実施形態では、抗体、特に本発明による抗体のキメラ形態は、配列番号１８又は２２によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントなどのヒト軽鎖定常領域に由来するアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む抗体を包含する。特定の好ましい実施形態では、抗体、特に本発明による抗体のキメラ形態は、配列番号１７又は２４によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントなどのヒトＣＨに由来するアミノ酸配列を有するＣＨを含み、及び配列番号１８又は２２によって表されるアミノ酸配列又はそのフラグメントなどのヒトＣＬに由来するアミノ酸配列を有するＣＬを含む抗体を包含する。
【００５２】
配列番号１７によって表されるアミノ酸配列を含むＣＨは、配列番号２０によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされ得る。配列番２４によって表されるアミノ酸配列を含むＣＨは、配列番号２３によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされ得る。配列番号１８によって表されるアミノ酸配列を含むＣＬは、配列番号１９によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされ得る。配列番号２２によって表されるアミノ酸配列を含むＣＬは、配列番号２１によって表される核酸配列を含む核酸によってコードされ得る。
【００５３】
上記で使用される「フラグメント」又は「アミノ酸配列のフラグメント」は、抗体配列の一部、すなわち、Ｎ末端及び／又はＣ末端で短縮された抗体配列を表す配列に関し、抗体内で該抗体配列に取って代わったとき、ＧＴ４６８への該抗体の結合及び、好ましくは、本明細書に記載される例えばＣＤＣを介した細胞溶解又はＡＤＣＣを介した細胞溶解といった該抗体の機能、を保持するものであり、好ましくは、アミノ酸配列のフラグメントは、該アミノ酸配列のアミノ酸残基の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％を含む。本明細書において記載されるアミノ酸配列のフラグメントは、該アミノ酸配列をコードする核酸配列のそれぞれのフラグメントによってコードされる。
【００５４】
本発明はまた、本明細書において記載される抗体又はその部分、例えば抗体鎖をコードする遺伝子又は核酸配列を含む核酸に関する。核酸は、ベクター内に、例えばプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ又は、例えば従来の遺伝子工学において使用される別のベクター内に含まれ得る。ベクターは、適切な宿主細胞において及び適切な条件下でベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子などの遺伝子をさらに含み得る。さらに、ベクターは、適切な宿主においてコード領域の適切な発現を可能にする発現制御エレメントを含み得る。そのような制御エレメントは当業者に公知であり、プロモーター、スプライシングカセット及び翻訳開始コドンを含み得る。
【００５５】
好ましくは、本発明の核酸は、真核又は原核細胞における発現を可能にする上記発現制御配列に作動可能に結合される。真核又は原核細胞における発現を確実にする制御エレメントは当業者に周知である。
【００５６】
本発明による核酸分子の構築のための方法、上記核酸分子を含むベクターの構築のための方法、適切に選択された宿主細胞へのベクターの導入のための方法、発現を生じさせる又は達成するための方法は、当該技術分野において周知である。
【００５７】
本発明のさらなる態様は、本明細書において開示する核酸又はベクターを含む宿主細胞に関する。
【００５８】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】Ｆｉｇ．１。ＧＴ４６８は、癌細胞において異常活性化される栄養芽層細胞系譜のマーカーである。（Ａ）正常組織、原発性乳癌試料及び癌細胞系（１、ＭＣＦ−７；２、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ；３、ＢＴ−５４９；４、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１；５、ＳＮＵ−１６；６、ＬＣＬＣ−１０３Ｈ；７、ＫＹＳＥ−５１０；８、ＫＹＳＥ−３０；９、ＥＦＯ−２７；１０、ＴＯＶ−２１Ｇ；１１、ＴＯＶ−１１２Ｄ；１２、ＣＡＯＶ−３；１３、ＥＦＯ−２１；１４、ＦＵ−ＯＶ−１；１５、ＬＮＣＡＰ；１６、ＣＡＰＡＮ−２）における３５サイクルのエンドポイントＲＴ−ＰＣＲ。（Ｂ）正常組織（１、精巣；２、胎盤；３、脳；４、肺；５、乳房；６、結腸；７、肝臓；８、胃；９、腎臓；１０、前立腺；１１、膵臓；１２、卵巣；１３、脾臓；１４、皮膚；１５、心筋；１６、子宮内膜；１７、休止ＰＢＭＣ；１８、増殖ＰＢＭＣ；１９、副腎）、原発性乳癌試料における４０サイクルの定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ。
【図２】Ｆｉｇ．１。（Ｃ）癌細胞系における４０サイクルの定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ。
【図３】Ｆｉｇ．１。（Ｄ）ＭＣＦ−７及びＢＴ−５４９乳癌細胞におけるｓｉＲＮＡを介したＧＴ４６８サイレンシングの定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析。（Ｅ）ｓｉＲＮＡを介したＧＴ４６８タンパク質発現低下のウエスタンブロット分析。対照細胞は、処理しないか、又はスクランブルした非サイレンシング二本鎖（ｎｓ−ｓｉＲＮＡ）でトランスフェクトした。（Ｆ）正常及び腫瘍性ヒト組織におけるＧＴ４６８タンパク質レベルのウエスタンブロット分析。（Ｇ）ＧＴ４６８特異的抗体を使用した、正常ヒト乳房組織（左）及び乳癌（右）に由来する切片の免疫組織化学検査。
【図４】Ｆｉｇ．２。ＧＴ４６８は細胞表面結合タンパク質である。ＧＴ４６８特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ  Ｎｏ．１）又は非サイレンシングｓｉＲＮＡ（ｎｓ−ｓｉＲＮＡ）でのトランスフェクション後の抗ＧＴ４６８／Ｃ末端抗体による、（Ａ）メタノール固定及び（Ｂ）非固定ＭＣＦ−７及びＢＴ−５４９乳癌細胞の染色。
【図５】Ｆｉｇ．３。ＧＴ４６８発現は乳癌細胞の運動、移動及び浸潤を促進する。（Ａ）上部並びに下部チェンバーに５％ＦＣＳを添加したトランスウエル遊走アッセイにおけるケモキネシス（運動性）の１２時間後の分析。（Ｂ）勾配を得るために下部チェンバーにのみ５％ＦＣＳを添加してから１２時間後のトランスウエル遊走アッセイにおけるＭＣＦ−７及びＢＴ−５４９細胞の走化性分析。（Ｃ）化学誘引物質として５％ＦＣＳを下部チェンバーに添加してから２４時間後のマトリゲルへの走化性浸潤の分析。
【図６】Ｆｉｇ．４。ＧＴ４６８発現は乳癌細胞の増殖を促進する。（Ａ）ＧＴ４６８特異的ｓｉＲＮＡ二本鎖によってノックダウンを開始してから７２時間後のＭＣＦ−７及びＢＴ−５４９細胞における増殖の分析。（Ｂ）種々の細胞周期状態にある細胞画分の棒グラフとして示す、ＧＴ４６８サイレンシングの開始から７２時間後の細胞の細胞周期分析。（Ｃ）ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションの７２時間後にアネキシンＶ染色によって測定したアポトーシス細胞。アネキシンＶ染色についての陽性対照として、細胞を６μＭカンプトテシンで１２時間処理した。
【図７】Ｆｉｇ．５。ＧＴ４６８は機能拮抗抗体によって薬剤化可能である。種々の量の抗ＧＴ４６８抗体及び対照抗体（アイソタイプ対照）と共に４８時間インキュベートした後のＭＣＦ−７及びＢＴ−５４９細胞の増殖分析。
【図８】Ｆｉｇ．６。サイクリンＤ１及びＡＫＴキナーゼはＧＴ４６８機能に関与する。細胞をＧＴ４６８特異的ｓｉＲＮＡ二本鎖で７２時間処理した後のサイクリンＤ１の（Ａ）定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析及び（Ｂ）ウエスタンブロット分析。（Ｃ）ＧＴ４６８ノックダウンの７２時間後及び（Ｄ）抗ＧＴ４６８／Ｃ末端抗体による処理の１時間後のＡＫＴ  Ｓｅｒ４７３リン酸化のウエスタンブロット分析。
【図９】Ｆｉｇ．７。ハイブリドーマ上清においてＧＴ４６８に対して惹起した抗体の特異性を測定するためのペプチドＥＬＩＳＡ。ハイブリドーマ上清のみが、免疫のために使用したペプチドと反応性である。
【図１０】Ｆｉｇ．８。ＧＴ４６８に対して惹起した抗体を含有するハイブリドーマ上清による、ＧＴ４６８−ｅＧＦＰ構築物でトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の染色。ハイブリドーマ上清は、ＧＴ４６８−ｅＧＦＰを発現する細胞を特異的に染める。
【図１１】Ｆｉｇ．９。ＧＴ４６８は、機能拮抗性モノクローナル抗体によって薬剤化可能である。ハイブリドーマ上清と共に７２時間インキュベートした後の種々の癌細胞系の増殖分析。
【図１２】Ｆｉｇ．１０。ハイブリドーマ上清においてＧＴ４６８に対して惹起した抗体の特異性を測定するための（Ａ）粗溶解産物（ＣｒＥＬＩＳＡ）又は（Ｂ）ペプチド特異的ＥＬＩＳＡ。ハイブリドーマ上清のみが、ＧＴ４６８溶解産物（Ａ）又は免疫のために使用したそれぞれのペプチド（Ｂ）と反応性である。
【図１３】Ｆｉｇ．１１。ハイブリドーマ上清においてＧＴ４６８に対して惹起した抗体の特異性を測定するためのフローサイトメトリー分析。すべてのハイブリドーマ上清が、ＧＴ４６８でトランスフェクトした細胞の特異的染色を示したが、模擬トランスフェクト細胞では染色は認められなかった。
【図１４】Ｆｉｇ．１２。ハイブリドーマ上清においてＧＴ４６８に対して惹起した抗体の特異性を測定するためのウエスタンブロット法。すべてのハイブリドーマ上清が、ＧＴ４６８  ｐｃＤＮＡ３．１発現プラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の溶解産物と特異的反応性を示したが、模擬トランスフェクト細胞の溶解産物はシグナルを示さなかった。模擬溶解産物におけるハイブリドーマ上清２３−３３Ａ−１のかすかなシグナルは、ＨＥＫ  ＧＴ４６８溶解産物の漏出作用によるものである。
【図１５】Ｆｉｇ．１３。ＧＴ４６８タンパク質における抗体結合エピトープを同定するためのペプチドＥＬＩＳＡ。ハイブリドーマ上清２２−１Ａ−１、２３−３３Ａ−１及び２３−１９Ａ−１は各々、ＧＴ４６８の線状エピトープに対する反応性を示唆する２つのオーバーラップペプチドへの結合を示した。２２−２Ａ−１及び２２−９Ｂ−１の結合パターンは、ＧＴ４６８タンパク質の立体配座エピトープ（不連続エピトープ）に対する反応性を示唆する。
【図１６】Ｆｉｇ．１４。ＧＴ４６８は、機能拮抗性モノクローナル抗体によって薬剤化可能である。精製ハイブリドーマ上清と共に７２時間又は１２０時間インキュベートした後の種々の癌細胞系の増殖分析。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
本明細書において記載される抗体は、ＧＴ４６８上に存在するエピトープ、好ましくはＧＴ４６８の細胞外ドメインに位置するエピトープ、より好ましくは配列番号３〜１０及び３５〜７９に特異的に結合する単離モノクローナル抗体であり得る。本発明に包含される単離モノクローナル抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ１−４、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びＩｇＤ抗体を含む。１つの実施形態では、抗体はＩｇＧ１抗体、より好ましくはＩｇＧ１κ又はＩｇＧ１λアイソタイプである。別の実施形態では、抗体はＩｇＧ３抗体、より好ましくはＩｇＧ３κ又はＩｇＧ３λアイソタイプである。さらに別の実施形態では、抗体はＩｇＧ４抗体、より好ましくはＩｇＧ４κ又はＩｇＧ４λアイソタイプである。なおさらに別の実施形態では、抗体はＩｇＧＡ１又はＩｇＡ２抗体である。なおさらに別の実施形態では、抗体はＩｇＭ抗体である。
【００６１】
１つの実施形態では、本発明は、（ｉ）ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞に結合し、及び（ｉｉ）ＧＴ４６８を発現しない細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられない細胞には結合しない抗体に関する。本発明の抗体は、好ましくは（ｉ）ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞の死滅を媒介し及び／又は該細胞の増殖を阻害し、及び（ｉｉ）ＧＴ４６８を発現しない細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられない細胞の死滅を媒介しない及び／又は該細胞の増殖を阻害しない。
【００６２】
別の実施形態では、本発明は、（ｉ）ＧＴ４６８を発現する腫瘍細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる腫瘍細胞に結合し、及び（ｉｉ）非癌性胎盤細胞のＧＴ４６８には結合しない抗体に関する。
【００６３】
本発明はまた、（ｉ）ＧＴ４６８を発現する腫瘍細胞及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる腫瘍細胞の死滅を媒介し、及び（ｉｉ）正常胎盤のＧＴ４６８発現細胞の死滅を媒介しない抗体を含む。
【００６４】
本発明の抗体は完全ヒト抗体を含む。そのような抗体は、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換え及びアイソタイプスイッチを受けることによってＧＴ４６８に対するヒトモノクローナル抗体の多数のアイソタイプを産生することができるトランスジェニック動物、例えばトランスジェニックマウスにおいて作製され得る。そのようなトランスジェニック動物はまた、米国特許出願第２００３／００１７５３４号に開示されるようなポリクローナル抗体を作製するためのトランスジェニックウサギであり得る。
【００６５】
ＧＴ４６８抗原への本発明の抗体の結合は、例えば補体系の活性化によって、ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞の死滅を媒介し得る、及び／又はＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞（例えば腫瘍細胞）の増殖を阻害し得る。代替的には、又はＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞の死滅を媒介すること及び／又はＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞の増殖を阻害することに加えて、ＧＴ４６８抗原への本発明の抗体の結合は、ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞（例えば腫瘍細胞）の運動、移動及び／又は浸潤を阻害することができ、これにより腫瘍細胞の転移拡散を阻害し得る。ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞の死滅は、以下の機序の１又はそれ以上によって起こり得る：ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞のアポトーシス；ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞のエフェクター細胞による貪食作用；又はＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞のエフェクター細胞による抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）。
【００６６】
本発明がより容易に理解され得るために、いくつかの用語を最初に定義する。さらなる定義は詳細な説明全体を通じて記載している。
【００６７】
［用語の定義］
「ＧＴ４６８」という用語は、好ましくはヒトＧＴ４６８に関し、特に（ｉ）配列番号１の核酸配列を含む核酸などの、配列番号２のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸、又は（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むタンパク質に関し、細胞によって天然に発現される又はＧＴ４６８遺伝子でトランスフェクトされた細胞によって発現されるその任意の変異体、立体配座、アイソフォーム及び種ホモログを包含する。１つの実施形態では、「ＧＴ４６８」という用語は、細胞外ドメインに対応するＧＴ４６８の部分に関し、好ましくはＮ末端疎水性ドメインを含まないＧＴ４６８のアミノ酸配列に関する。「ＧＴ４６８」という用語は、配列番号２のアミノ酸２９〜１１９、好ましくはアミノ酸２９〜２１２、より好ましくはアミノ酸２３〜２１２を含むタンパク質を包含する。
【００６８】
「ＧＴ４６８の変異体」はまた、基本的にＧＴ４６８の細胞外ドメイン又はエクトドメインから成るＧＴ４６８の形態を含む。本発明によれば、ＧＴ４６８についての「細胞外ドメイン」又は「エクトドメイン」という用語は、ＧＴ４６８を発現する細胞の表面に結合して認められるＧＴ４６８の部分に関する。好ましくは、該「細胞外ドメイン」又は「エクトドメイン」は細胞外画分に存在する。ＧＴ４６８の「細胞外ドメイン」又は「エクトドメイン」は、好ましくはＮ末端疎水性ドメインを含まない、完全長ＧＴ４６８の部分を指す。本発明によれば、ＧＴ４６８についての「疎水性ドメイン」は、細胞外ドメインの一部ではなく、及び好ましくはＧＴ４６８のＮ末端に近接して位置する疎水性配列を含む、ＧＴ４６８の部分に関する。ＧＴ４６８の「疎水性ドメイン」は、疎水性配列に先行し、ＧＴ４６８のＮ末端に位置する配列を含み得る。配列番号２に関して、Ｎ末端疎水性ドメインは、好ましくはアミノ酸１〜２２を含む。本発明のＧＴ４６８ポリペプチドに関して同定されるいかなる疎水性ドメイン又は配列も、疎水性ドメイン又は配列を同定するために当該技術分野で常套的に用いられる判定基準に従って同定されることが理解される。疎水性ドメインの正確な境界は異なり得るが、本明細書において最初に同定されるように、おそらくドメインのいずれの末端でも約５アミノ酸以下しか異ならない可能性が高い。これにより、場合によって、ＧＴ４６８ポリペプチドの細胞外ドメインは、本明細書において同定される疎水性ドメイン／細胞外ドメイン境界のいずれかの末端側に約５又はそれ以下のアミノ酸を含有し得る。
【００６９】
「細胞表面」は、当該技術分野におけるその通常の意味に従って使用されこのためタンパク質及び他の分子による結合に利用され得る細胞の外側を含む。
【００７０】
「細胞の表面で発現されるＧＴ４６８」という表現は、細胞によって発現されるＧＴ４６８が該細胞の表面に結合して認められることを意味する。
【００７１】
ＧＴ４６８が該細胞の表面に位置し、細胞に加えられたＧＴ４６８特異的抗体による結合に利用可能である場合、ＧＴ４６８は細胞表面と結合している。好ましい実施形態では、その細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞は、ＧＴ４６８を発現する細胞である。ＧＴ４６８が細胞によって発現される場合、該細胞の表面と結合したＧＴ４６８は、発現されるＧＴ４６８の一部に過ぎず、特に上記で定義したその細胞外ドメインであり得ることが理解される。
【００７２】
「ＧＴ４６８変異体」という用語は、（ｉ）ＧＴ４６８のスプライス変異体、（ｉｉ）特にＮグリコシル化状態などの異なるグリコシル化を有する変異体を含む、ＧＴ４６８の翻訳後修飾変異体、（ｉｉｉ）ＧＴ４６８の立体配座変異体、（ｉｖ）ＧＴ４６８の癌関連変異体及びＧＴ４６８の非癌関連変異体を包含する。
【００７３】
「ラフト」という用語は、細胞の形質膜の外葉領域に位置するスフィンゴ脂質とコレステロールに富む膜マイクロドメインを指す。そのようなドメイン内と結合するある種のタンパク質の能力及び「凝集体」又は「巣状凝集体（ｆｏｃａｌ  ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）」を形成するそれらの能力は、タンパク質の機能に影響を及ぼし得る。例えばそのような構造内へのＧＴ４６８分子の転位は、本発明の抗体によって結合された後、形質膜において高密度のＧＴ４６８抗原−抗体複合体を創製する。そのような高密度のＧＴ４６８抗原−抗体複合体は、ＣＤＣの間の補体系の効率的な活性化を可能にし得る。
【００７４】
本発明によれば、「疾患」という用語は、癌を含む任意の病理状態、特に本明細書において記載される癌のそれらの形態を指す。
【００７５】
「腫瘍」とは、迅速で制御されない細胞増殖によって成長し、新たな成長を開始させた刺激が停止した後も成長を続ける異常な群の細胞又は組織を意味する。腫瘍は、構造機構及び正常組織との機能的統合の部分的又は完全な欠如を示し、通常、良性又は悪性のいずれかであり得る、組織の別個の塊を形成する。
【００７６】
「転移」とは、その初発部位から身体の別の部分への癌細胞の拡散を意味する。転移の形成は非常に複雑な過程であり、原発腫瘍からの悪性細胞の分離、細胞外マトリックスの侵襲、体腔及び脈管に入り込むための内皮基底膜の貫通、及び次に、血液によって輸送された後、標的器官の浸潤に依存する。最後に、標的部位における新たな腫瘍の成長は血管新生に依存する。腫瘍転移はしばしば原発腫瘍の除去後でさえも発生し、これは、腫瘍細胞又は成分が残存して、転移の潜在的可能性を発現し得るからである。１つの実施形態では、本発明による「転移」という用語は、原発腫瘍及び所属リンパ節系から遠く離れた転移に関係する「遠隔転移」に関する。
【００７７】
「疾患の治療」という用語は、疾患又はその症状の治癒、期間の短縮、改善、進行若しくは悪化の予防、緩慢化若しくは阻害、又は発症の予防又は遅延を含む。
【００７８】
本発明によれば、試料は、本発明に従って有用ないかなる試料であってもよく、特に体液を含む組織試料及び／又は細胞試料などの生物学的試料であり得、パンチ生検を含む組織生検、及び血液、気管支吸引液、痰、尿、糞便又は他の体液の採取などの従来の方法で入手し得る。本発明によれば、「生物学的試料」という用語はまた、生物学的試料の分画を包含する。
【００７９】
「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互に連結された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質、又はその抗原結合部分を指す。「抗体」という用語はまた、すべての組換え形態の抗体、特に本明細書に記載される抗体、例えば原核生物において発現される抗体、非グリコシル化抗体、及び以下に記載される任意の抗原結合抗体フラグメント及び誘導体を包含する。各々の重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略する）と重鎖定常領域から成る。各々の軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略する）と軽鎖定常領域から成る。ＶＨ及びＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域が組み入れられた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域にさらに細分できる。各々のＶＨとＶＬは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端方向に配置された、３つのＣＤＲと４つのＦＲから成る：ＦＲｌ、ＣＤＲｌ、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）及び古典的補体系の補体第一成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【００８０】
「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト種からの免疫グロブリンに実質的に由来する抗原結合部位を有する分子を指し、分子の残りの免疫グロブリン構造はヒト免疫グロブリンの構造及び／又は配列に基づく。抗原結合部位は、定常ドメインに融合した完全な可変ドメインを含むか、又は可変ドメイン内の適切なフレームワーク領域に移植された相補性決定領域（ＣＤＲ）だけを含むかのいずれかであり得る。抗原結合部位は、野生型であり得るか、又は１若しくはそれ以上のアミノ酸置換によって修飾され得る、例えばより厳密にヒト免疫グロブリンに類似するように修飾され得る。一部の形態のヒト化抗体は、すべてのＣＤＲ配列を保存する（例えばマウス抗体からの６つのＣＤＲすべてを含むヒト化マウス抗体）。他の形態は、もとの抗体に比べて変化した１又はそれ以上のＣＤＲを有する。
【００８１】
「キメラ抗体」という用語は、重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列の各々の一部が特定種に由来する又は特定クラスに属する抗体内の対応する配列に相同であるが、鎖の残りのセグメントは別の抗体内の対応配列に相同である抗体を指す。典型的には、軽鎖及び重鎖の両方の可変領域が哺乳動物の１つの種に由来する抗体の可変領域を模倣するが、定常部分は別の種に由来する抗体の配列に相同である。そのようなキメラ形態の１つの明らかな利点は、可変領域が、例えばヒト細胞製剤に由来する定常領域と組み合わせて、容易に入手可能なＢ細胞又は非ヒト宿主生物からのハイブリドーマを使用して、現在公知のソースに好都合に由来し得ることである。可変領域は作製の容易さという利点を有し、特異性がソースによって影響されないが、定常領域がヒトであるので、抗体を注入したとき、非ヒトソースからの定常領域よりもヒト被験者からの免疫応答を惹起する可能性が低い。しかし、定義はこの特定例に限定されない。
【００８２】
本明細書において使用される、抗体の「抗原結合部分」（又は単に「結合部分」）という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１又はそれ以上のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能が完全長抗体のフラグメントによって実行され得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合フラグメントの例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨドメインから成る１価フラグメントである、Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む２価フラグメントである、Ｆ（ａｂ'）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨドメインとＣＨドメインから成るＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の１本の腕のＶＬドメインとＶＨドメインから成るＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインから成る、ｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；及び（ｖｉｉ）場合により合成リンカーによって連結されていてもよい２又はそれ以上の単離ＣＤＲの組合せ。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、組換え法を用いて、それらを、ＶＬ領域とＶＨ領域が１価分子を形成するように対合するタンパク質一本鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えばＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３参照）として作製することを可能にする合成リンカーによって連結され得る。そのような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることが意図されている。さらなる例は、（ｉ）免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドに融合した結合ドメインポリペプチド、（ｉｉ）ヒンジ領域に融合した免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域、及び（ｉｉｉ）ＣＨ２定常領域に融合した免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域を含む、結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である。結合ドメインポリペプチドは、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域であり得る。結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質は、米国特許出願第２００３／０１１８５９２号及び米国特許出願第２００３／０１３３９３９号にさらに開示されている。これらの抗体フラグメントは当業者に公知の従来の手法を用いて得られ、該フラグメントは、無傷抗体と同じ方法で有用性に関してスクリーニングされる。
【００８３】
「エピトープ」という用語は、抗体に結合することができるタンパク質決定基を意味し、本明細書において「結合」という用語は、好ましくは特異的結合に関する。エピトープは通常、アミノ酸又は糖側鎖などの化学的に活性な表面集団の分子から成り、通常は特異的な三次元構造特徴並びに特異的な電荷特徴を有する。立体配座エピトープと非立体配座エピトープは、変性溶媒の存在下では前者への結合が失われるが、後者への結合は失われないという点で識別される。
【００８４】
本明細書において使用される「不連続エピトープ」という用語は、タンパク質の一次配列内の少なくとも２つの別々の領域から形成されるタンパク質抗原上の立体配座エピトープを意味する。
【００８５】
「二重特異性分子」という用語は、２つの異なる結合特異性を有する任意の物質、例えばタンパク質、ペプチド、又はタンパク質若しくはペプチド複合体を含むことが意図されている。例えば該分子は、（ａ）細胞表面抗原、及び（ｂ）エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体に結合し得る又はそれらと相互作用し得る。「多重特異性分子」又は「異種特異性分子」という用語は、２以上の異なる結合特異性を有する任意の物質、例えばタンパク質、ペプチド、又はタンパク質若しくはペプチド複合体を含むことが意図されている。例えば該分子は、（ａ）細胞表面抗原、及び（ｂ）エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体、及び（ｃ）少なくとも１つの他の成分に結合し得る又はそれらと相互作用し得る。従って、本発明は、ＧＴ４６８及びエフェクター細胞上のＦｃ受容体などの他の標的に対する二重特異性、三重特異性、四重特異性及び他の多重特異性分子を含むが、これらに限定されない。「二重特異性抗体」という用語はまた、ダイアボディを包含する。ダイアボディは、ＶＨドメインとＶＬドメインが１本のポリペプチド鎖上で発現されるが、同じ鎖上の２つのドメインの間で対合を形成するには短すぎるリンカーを使用し、それによってそのドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を創製する、二価の二重特異性抗体である（例えばＨｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３参照）。
【００８６】
本発明はまた、本明細書において記載される抗体の誘導体を含む。「抗体誘導体」という用語は、抗体の任意の修飾形態、例えば抗体と別の物質又は抗体とのコンジュゲートを指す。本明細書において使用されるように、抗体が動物を免疫することによって又は免疫グロブリン遺伝子ライブラリーをスクリーニングすることによって系から得られる場合、抗体は特定生殖細胞系配列に「由来」し、選択される抗体は、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列に少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、さらに一層好ましくは少なくとも９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。典型的には、特定生殖細胞系配列に由来する抗体は、生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子によりコードされるアミノ酸配列に対して、１０個以下のアミノ酸の相違、より好ましくは５個以下、さらに一層好ましくは４個、３個、２個又は１個以下のアミノ酸の相違を示す。
【００８７】
本明細書において使用される、「異種抗体（ｈｅｔｅｒｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語は、そのうちの少なくとも２つが異なる特異性を示す、２又はそれ以上の抗体、その誘導体、又は共に連結された抗原結合領域を指す。これらの異なる特異性は、エフェクター細胞上のＦｃ受容体に対する結合特異性、及び標的細胞、例えば腫瘍細胞上の抗原又はエピトープに対する結合特異性を含む。
【００８８】
本明細書において記載される抗体はヒト抗体であり得る。本明細書において使用される、「ヒト抗体」という用語は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域と定常領域を有する抗体を含むことが意図されている。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えばインビトロでのランダム若しくは部位特異的突然変異誘発によって又はインビボでの体細胞突然変異によって導入される突然変異）を含み得る。
【００８９】
本明細書において使用される「モノクローナル抗体」という用語は、単一分子組成の抗体分子の製剤を指す。モノクローナル抗体は特定のエピトープに対する単一の結合特異性と親和性を示す。１つの実施形態では、モノクローナル抗体は、不死化細胞に融合された、非ヒト動物、例えばマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。
【００９０】
本明細書において使用される、「組換え抗体」という用語は、（ａ）免疫グロブリン遺伝子に対してトランスジェニック又はトランスクロモソーマル（ｔｒａｎｓｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ）である動物（例えばマウス）又はそれから作製されたハイブリドーマから単離された抗体、（ｂ）抗体を発現するように形質転換された宿主細胞から、例えばトランスフェクトーマから単離された抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離された抗体、及び（ｄ）免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む他の任意の手段によって作製された、発現された、創製された又は単離された抗体などの、組換え集団によって作製される、発現された、創製された又は単離されたすべての抗体を含む。
【００９１】
本明細書において使用される、「トランスフェクトーマ」という用語は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、植物細胞、又は酵母細胞を含む真菌などの、抗体を発現する組換え真核生物宿主細胞を含む。
【００９２】
本明細書において使用される、「異種抗体（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、そのような抗体を産生するトランスジェニック生物に関して定義される。この用語は、トランスジェニック生物から構成されない生物において認められるものに対応するアミノ酸配列又はコード核酸配列を有し、一般にそのトランスジェニック生物以外の種に由来する抗体を指す。
【００９３】
本明細書において使用される、「ヘテロハイブリッド抗体」は、異なる生物起源の軽鎖と重鎖を有する抗体を指す。例えばマウス軽鎖と結合したヒト重鎖を有する抗体はヘテロハイブリッド抗体である。
【００９４】
本明細書に記載される抗体は、好ましくは単離されている。本明細書において使用される「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない（例えばＧＴ４６８に特異的に結合する単離抗体は、ＧＴ４６８以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）抗体を指すことが意図されている。ヒトＧＴ４６８のエピトープ、アイソフォーム又は変異体に特異的に結合する単離抗体は、しかし、例えば他の種（例えばＧＴ４６８の種ホモログ）からの、他の関連抗原に対する交差反応性を有し得る。さらに、単離抗体は、他の細胞物質及び／又は化学物質を実質的に有しない場合がある。本発明の１つの実施形態では、「単離」モノクローナル抗体の組合せは、異なる特異性を有し、明確に定義された組成で組み合わされている抗体に関する。
【００９５】
本発明によれば、「結合」という用語は「特異的結合」に関する。本明細書において使用される、「特異的結合」は、所定の抗原に結合する抗体を指す。典型的には、抗体は、約１×１０−７Ｍ又はそれ以下のＫＤに相当する親和性で結合し、所定の抗原又は密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えばＢＳＡ、カゼイン）への結合についての組成物の親和性よりも少なくとも２桁低いＫＤに相当する親和性で所定の抗原に結合する。
【００９６】
本明細書において使用される、「ＫＤ」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数を指すことが意図されている。
【００９７】
本明細書において使用される、「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えばＩｇＭ又はＩｇＧ１）を指す。
【００９８】
本明細書において使用される、「アイソタイプスイッチ」は、それによって抗体のクラス又はアイソタイプが１つのＩｇクラスからその他のＩｇクラスの１つに変化する現象を指す。
【００９９】
１つの対象に適用される場合の、本明細書において使用される「天然に生じる」という用語は、対象が天然に見出され得るという事実を指す。例えば天然の供給源から単離できる生物（ウイルスを含む）中に存在し、実験室でヒトによって意図的に改変されていないポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、天然に生じる。
【０１００】
本明細書において使用される、「再編成された」という用語は、Ｖセグメントが、それぞれ基本的に完全なＶＨ又はＶＬドメインをコードする立体配座においてＤ−Ｊ又はＪセグメントに直接隣接して位置する、重鎖又は軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の立体配置を指す。再編成された免疫グロブリン（抗体）遺伝子遺伝子座は、生殖細胞系ＤＮＡとの比較によって同定できる；再編成された遺伝子座は、少なくとも１つの組み換えられた七量体／九量体相同性エレメントを有することになる。
【０１０１】
Ｖセグメントに関して本明細書においてされる「再編成されていない」又は「生殖細胞系立体配置（ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）」という用語は、ＶセグメントがＤ又はＪセグメントに直接隣接するように組み換えられていない立体配置を指す。
【０１０２】
本明細書において使用される、「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むことが意図されている。核酸分子は一本鎖又は二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【０１０３】
本発明に従って記載される核酸は、好ましくは単離されている。「単離核酸」という用語は、本発明によれば、核酸が、（ｉ）例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、インビトロで増幅された、（ｉｉ）クローニングによって組換え生産された、（ｉｉｉ）例えば切断とゲル電気泳動分画によって、精製された、又は（ｉｖ）例えば化学合成によって、合成されたことを意味する。単離核酸は、組換えＤＮＡ手法による操作のために利用可能な核酸である。
【０１０４】
核酸は、本発明によれば、単独で、又は相同若しくは異種であり得る、他の核酸と組み合わせて存在し得る。好ましい実施形態では、核酸は、該核酸に対して同種又は異種であり得る発現制御配列に機能的に連結されている。「同種」という用語は、核酸が天然で発現制御配列に機能的に連結されていることを意味し、「異種」という用語は、核酸が天然では発現制御配列に機能的に連結されていないことを意味する。
【０１０５】
ＲＮＡ及び／又はタンパク質若しくはペプチドを発現する核酸のような核酸と発現制御配列は、それらが、該核酸の発現又は転写が該発現制御配列の制御下又は影響下にあるように互いに共有結合されている場合、互いに「機能的に」連結されている。核酸が、コード配列に機能的に連結された発現制御配列を有する、機能的タンパク質に翻訳される場合、該発現制御配列の誘導は、コード配列内のフレームシフトを引き起こさずに又は該コード配列が所望のタンパク質若しくはペプチドに翻訳されることができないという事態を伴わずに、該核酸の転写を生じさせる。
【０１０６】
「発現制御配列」という用語は、本発明によれば、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、及び遺伝子の転写又はｍＲＮＡの翻訳を調節する他の制御エレメントを含む。本発明の特定実施形態では、発現制御配列は調節され得る。発現制御配列の正確な構造は、種又は細胞型に応じて異なり得るが、一般に、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列等のような、それぞれ転写及び翻訳の開始に関与する５'非転写配列並びに５'及び３'非翻訳配列を含む。より具体的には、５'非転写発現制御配列は、機能的に連結された核酸の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。発現制御配列はまた、エンハンサー配列又は上流アクチベーター配列を含み得る。
【０１０７】
本発明によれば、「プロモーター」又は「プロモーター領域」という用語は、発現される核酸配列の上流（５'側）に位置し、ＲＮＡポリメラーゼのための認識及び結合部位を提供することによって配列の発現を制御する核酸配列に関する。「プロモーター領域」は、遺伝子の転写の調節に関与するさらなる因子のためのさらなる認識及び結合部位を含み得る。プロモーターは、原核生物又は真核生物の遺伝子の転写を制御し得る。さらに、プロモーターは「誘導性」であり得、誘導物質に応答して転写を介させ得るか、又は転写が誘導物質によって制御されない場合、「構成的」であり得る。誘導性プロモーターの制御下にある遺伝子は、誘導物質が存在しない場合は、発現されないか又は小さな程度にだけ発現される。誘導物質の存在下では、遺伝子のスイッチが入って作動するか又は転写のレベルが上昇する。これは、一般に、特異的転写因子の結合によって媒介される。
【０１０８】
本発明による好ましいプロモーターは、ＳＰ６、Ｔ３及びＴ７ポリメラーゼについてのプロモーター、ヒトＵ６  ＲＮＡプロモーター、ＣＭＶプロモーター、及び１又は複数の部分が、例えばヒトＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）などの他の細胞タンパク質の遺伝子のプロモーターの１又はそれ以上の部分に融合している、付加的なイントロンを含む又は含まない、それらの人工ハイブリッドプロモーター（例えばＣＭＶ）を含む。
【０１０９】
本発明によれば、「発現」という用語は、その最も一般的な意味で使用され、ＲＮＡの生産又はＲＮＡとタンパク質／ペプチドの生産を含む。この用語はまた、核酸の部分的発現を含む。さらに、発現は、一過性に又は安定に行われ得る。
【０１１０】
好ましい実施形態では、核酸分子は、本発明によれば、適切な場合は核酸の発現を調節するプロモーターと共に、ベクター内に存在する。「ベクター」という用語は、本明細書ではその最も一般的な意味で使用され、該核酸が、例えば原核細胞及び／又は真核細胞に導入され、及び適切な場合は、ゲノムに組み込まれることを可能にする、核酸のための任意の中間媒体を含む。この種のベクターは、好ましくは細胞において複製及び／又は発現される。ベクターは、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージ又はウイルスゲノムを含む。本明細書において使用される「プラスミド」という用語は、一般に、染色体ＤＮＡとは独立して複製することができる染色体外遺伝物質の構築物、通常は環状ＤＮＡ二本鎖に関する。
【０１１１】
抗体の発現のためのベクターとして、抗体の重鎖と軽鎖が異なるベクター内に存在するベクター型又は重鎖と軽鎖が同じベクター内に存在するベクター型のいずれかが使用できる。
【０１１２】
特定核酸及びアミノ酸配列、例えば配列表に示すものに関して本明細書において提供する教示は、該特定配列と機能的に等価である配列、例えば特定アミノ酸配列のものと同じか又は類似の性質を示すアミノ酸配列及び特定核酸配列によってコードされるアミノ酸配列のものと同じか又は類似の性質を示すアミノ酸配列をコードする核酸配列を生じさせる、該特定配列の修飾型にも関連すると解釈されるべきである。１つの重要な性質は、抗体のその標的への結合を保持すること又は抗体のエフェクター機能を維持することである。好ましくは、特定配列に対して修飾された配列は、それが抗体内の特定配列に取って代わったとき、該抗体のＧＴ４６８への結合、及び好ましくは本明細書に記載される該抗体の機能、例えばＣＤＣを介した細胞溶解又はＡＤＣＣを介した細胞溶解の機能を保持する。
【０１１３】
特にＣＤＲ、超可変領域及び可変領域の配列が、ＧＴ４６８に結合する能力を失わずに修飾され得ることは当業者に認識される。例えばＣＤＲ領域は、本明細書において特定される抗体の領域に同一であるか又は高度に相同である。「高度に相同」とは、１〜５、好ましくは１〜４、例えば１〜３又は１又は２個の置換がＣＤＲ内で為され得ることを考慮する。加えて、超可変及び可変領域は、それらが本明細書において特定して開示される抗体の領域と実質的な相同性を示すように修飾され得る。
【０１１４】
本明細書に記載される特異的核酸はまた、特定宿主細胞又は生物におけるコドン使用頻度を最適化するために修飾された核酸を含むことが理解されるべきである。生物の間でのコドン使用頻度の相違は、異種遺伝子発現に関する様々な問題を導き得る。もとの配列の１又はそれ以上のヌクレオチドを変化させることによるコドン最適化は、該核酸が発現される同種又は異種宿主における核酸の発現の最適化、特に翻訳効率の最適化を生じさせ得る。例えばヒトに由来し、抗体の定常領域及び／又はフレームワーク領域をコードする核酸が、例えばキメラ又はヒト化抗体を作製するために、本発明に従って使用される場合、特に、場合により本明細書において記載される他の生物に由来する核酸のような異種核酸に融合した、該核酸が、マウス又はハムスターなどのヒトとは異なる生物からの細胞において発現される場合、コドン使用頻度の最適化のために該核酸を修飾することが好ましいと考えられる。例えばそれぞれ配列番号１９及び２０に示すもののような、ヒト軽鎖及び重鎖定常領域をコードする核酸は、コドン使用頻度の最適化を生じさせるが、アミノ酸配列の変化を生じさせない、１又はそれ以上、好ましくは少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、及び好ましくは１０、１５、２０、２５、３０、５０、７０又は１００まで又はそれ以上のヌクレオチド置換を含むように修飾され得る。そのようなヌクレオチド置換は、好ましくは、コードされるアミノ酸配列の変化を生じさせない、それらの修飾対応物と共に、それぞれ配列番号１９及び２０の以下のアラインメントに示す置換から選択され、それぞれ配列番号１９及び２０内のヌクレオチドの置換に関するか、又はそれぞれヒト軽鎖及び重鎖定常領域をコードする他の核酸配列内の対応する位置での対応する置換に関する。好ましくは、コードされるアミノ酸配列の変化を生じさせない、それらの修飾対応物と共に、それぞれ配列番号１９及び２０の以下のアラインメントに示す置換のすべてが、それぞれヒト軽鎖及び重鎖定常領域をコードする核酸配列において実施される。
【０１１５】
【化１】
0005389675.tif 000002
【０１１６】
【化２】
0005389675.tif 000003
【０１１７】
さらに、本発明によれば、配列を所望のアロタイプ、例えばコーカサス人において認められるアロタイプに適合させるために、本明細書に記載されるアミノ酸配列、特にヒト重鎖定常領域のアミノ酸配列を修飾することが望ましい場合がある。そのような修飾は、好ましくは配列番号１７内の以下のアミノ酸置換：Ｋ９３Ｒ、Ｄ２３５Ｅ及びＬ２３７Ｍ、又は他のヒト重鎖定常領域内の対応する位置のアミノ酸置換から成る群より選択される。好ましくは、これらの修飾のすべてがヒト重鎖定常領域のアミノ酸配列に含まれる。
【０１１８】
本発明によれば、「対応する位置」という用語は、２つの核酸又はタンパク質配列の配列アラインメントにおいて互いに整列されるヌクレオチド又はアミノ酸残基に関する。
【０１１９】
好ましくは、本明細書に記載される特定核酸配列と該特定核酸配列に対して修飾された又は該特定核酸配列の変異体である核酸配列との間の同一性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに一層好ましくは少なくとも９０％又は最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％である。ＧＴ４６８核酸変異体に関して、同一性の程度は、好ましくは少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約４５０、少なくとも約５００、少なくとも約５５０、少なくとも約６００又は少なくとも約６３０ヌクレオチドの領域に対して与えられる。好ましい実施形態では、同一性の程度は、配列表に示される核酸配列などの、参照核酸配列の全長に対して与えられる。好ましくは、２つの配列はハイブリダイズすることができ、お互いと安定な二本鎖を形成することができ、ハイブリダイゼーションは、好ましくはポリヌクレオチドの間での特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件（ストリンジェント条件）下で実施される。ストリンジェント条件は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｉｔｏｒｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９又はＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されており、例えばハイブリダイゼーション緩衝液（３．５×ＳＳＣ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％ＳＤＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中６５℃でのハイブリダイゼーションが参照できる。ＳＳＣは、０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡを転写した膜を、例えば２×ＳＳＣ中室温で洗浄し、次に０．１〜０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳ中６８℃までの温度で洗浄する。
【０１２０】
好ましくは、実質的な相同性を示すアミノ酸配列との間のような、本明細書に記載される特定アミノ酸配列と該特定アミノ酸配列に対して修飾された又は該特定アミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列との間の類似性、好ましくは同一性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに一層好ましくは少なくとも９０％又は最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％となる。ＧＴ４６８ポリペプチド変異体に関して、類似性又は同一性の程度は、好ましくは少なくとも約１００、少なくとも約１２０、少なくとも約１４０、少なくとも約１６０、少なくとも約１８０、少なくとも約２００、少なくとも約２１０又は２１２アミノ酸の領域に対して与えられる。好ましい実施形態では、類似性又は同一性の程度は、配列表に示されるアミノ酸配列などの、参照アミノ酸配列の全長に対して与えられる。
【０１２１】
上述した修飾配列又は配列変異体のすべてが本発明の範囲内である。
【０１２２】
「配列類似性」は、同一であるか又は保存的アミノ酸置換であるアミノ酸の割合を示す。２つのポリペプチド又は核酸配列の間の「配列同一性」は、２つの配列の間で同一であるアミノ酸又はヌクレオチドの割合を示す。
【０１２３】
「同一性パーセンテージ」は最良のアラインメント後に得られ、この割合は純粋に統計的であり、２つの配列の間の相違はランダムに及びそれらの全長にわたって分布する。２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列の間の配列比較は、最適に整列した後これらの配列を比較することによって従来より実施され、該比較は、配列類似性の局所領域を同定し、比較するためにセグメントごとに又は「比較ウインドウ」ごとに実施される。比較用の配列の最適アラインメントは、手動で行う以外に、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ  Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３の局所相同性アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，２４４４の相同性検索法によって、又はこれらのアルゴリズムを用いたコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ  Ｐ、ＢＬＡＳＴ  Ｎ及びＴＦＡＳＴＡ）によって作成され得る。
【０１２４】
同一性パーセンテージは、これらの２つの配列の間の同一性パーセンテージを得るために比較する２つの配列の間で同一の位置の数を決定し、この数を比較した位置の数で除して、得られた結果に１００を乗じることによって算定される。
【０１２５】
「保存的置換」は、例えば、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び／又は両親媒性の類似度に基づいて行われ得る。例えば（ａ）非極性（疎水性）アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンを含む；（ｂ）極性中性アミノ酸極性（中性）アミノ酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンを含む；（ｃ）正電荷をもつ（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リシン及びヒスチジンを含む；並びに（ｄ）負電荷をもつ（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。置換は、典型的には（ａ）〜（ｄ）の群内で行われ得る。加えて、グリシンとプロリンは、αへリックスを壊すそれらの能力に基づいて互いに置換され得る。一部の好ましい置換は、以下の群：（ｉ）ＳとＴ；（ｉｉ）ＰとＧ；及び（ｉｉｉ）Ａ、Ｖ、Ｌ及びＩの間で行われ得る。公知の遺伝暗号、並びに組換え及び合成ＤＮＡ手法を考慮して、当業者は保存的アミノ酸変異体をコードするＤＮＡを容易に構築することができる。
【０１２６】
本発明は、抗体の機能的又は薬物動態特性を変化させるためにＦｃ領域内に変更が為された抗体を含む。そのような変更は、Ｃ１ｑ結合とＣＤＣの低下若しくは上昇、又はＦｃγＲ結合とＡＤＣＣの低下若しくは上昇を生じさせ得る。置換は、例えば重鎖定常領域のアミノ酸残基の１又はそれ以上において実施することができ、それにより、修飾抗体と比較して抗原に結合する能力を保持しながらエフェクター機能に変化を生じさせ得る。米国特許第５，６２４，８２１号及び同第５，６４８，２６０号参照。
【０１２７】
抗体のインビボ半減期は、分子が無傷ＣＨ２ドメイン又は無傷Ｉｇ  Ｆｃ領域を含まないように、Ｉｇ定常ドメイン又はＩｇ様定常ドメインのサルベージ受容体エピトープを修飾することによって改善できる。米国特許第６，１２１，０２２号及び同第６，１９４，５５１号参照。インビボ半減期は、例えば２５２位のロイシンをトレオニンに置換することにより、２５４位のセリンをトレオニンに置換することにより、又は２５６位のフェニルアラニンをトレオニンに置換することにより、Ｆｃ領域内に突然変異を作製することによってさらに延長させることができる。米国特許第６，２７７，３７５号参照。
【０１２８】
さらに、抗体のエフェクター機能を変化させるために抗体のグリコシル化パターンを改変することが出来る。例えば、Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の親和性を高め、ひいてはＮＫ細胞の存在下で抗体のＡＤＣＣ上昇を生じさせるために、Ｆｃ領域の２９７位のＡｓｎに通常結合しているフコース単位を加えないトランスフェクトーマにおいて抗体を発現させることができる。Ｓｈｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＪＢＣ，２７７：２６７３３参照。さらに、ＣＤＣを改変するためにガラクトシル化の改変も実施できる。
【０１２９】
代替的には、別の実施形態では、飽和突然変異誘発などにより、抗ＧＴ４６８抗体コード配列の全部又は一部に沿って突然変異をランダムに導入することができ、生じる改変された抗ＧＴ４６８抗体を結合活性に関してスクリーニングすることができる。
【０１３０】
本明細書において使用される、「組換え宿主細胞」（又は単に「宿主細胞」）という用語は、組換え発現ベクターが導入された細胞を指すことが意図されている。そのような用語は、特定被験者細胞を指すだけでなく、そのような細胞の子孫をも指示することが意図されていることは理解されるべきである。突然変異又は環境のいずれかの影響によりある種の改変が後の世代で起こり得るので、そのような子孫は、実際には、親細胞と同じではないことがあり得るが、それでもなお本明細書で使用される「宿主細胞」という用語の範囲内に包含される。組換え宿主細胞は、例えばＣＨＯ細胞、ＮＳ／０細胞及びリンパ球細胞などのトランスフェクトーマを含む。
【０１３１】
本明細書において使用される、「被験者」という用語は、いかなるヒト又は非ヒト動物も包含する。「非ヒト動物」という用語は、すべての脊椎動物、例えば哺乳動物及び非哺乳動物をいい、非ヒト霊長動物、ヒツジ、イヌ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類等をいう。
【０１３２】
「トランスジェニック動物」という用語は、１又はそれ以上の導入遺伝子、好ましくは重鎖及び／又は軽鎖導入遺伝子、又は導入染色体（動物の天然のゲノムＤＮＡに組み込まれた又は組み込まれていない）を含むゲノムを有し、好ましくは導入遺伝子を発現することができる動物を指す。例えばトランスジェニックマウスは、マウスが、ＧＴ４６８抗原及び／又はＧＴ４６８を発現する細胞で免疫したときヒト抗ＧＴ４６８抗体を産生する又はＧＴ４６８を発現する細胞を産生するように、ヒト軽鎖導入遺伝子及びヒト重鎖導入遺伝子又はヒト重鎖導入染色体のいずれかを有し得る。ヒト重鎖導入遺伝子は、トランスジェニックマウス、例えばＨＣｏ７又はＨＣｏｌ２マウスなどのＨｕＭＡｂマウスの場合のように、マウスの染色体ＤＮＡに組み込まれ得るか、又はヒト重鎖導入遺伝子は、国際公開第０２／４３４７８号に記載されているトランスクロモソーマル（例えばＫＭ）マウスの場合のように、染色体外に維持され得る。そのようなトランスジェニック及びトランスクロモソーマルマウスは、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換えとアイソタイプスイッチを受けることによってＧＴ４６８に対するヒトモノクローナル抗体の多数のアイソタイプ（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ及び／又はＩｇＥ）を産生することができる場合がある。
【０１３３】
本明細書で使用される「低減する」又は「阻害する」は、レベル、例えば細胞の増殖のレベルの全体的な低下、好ましくは５％又はそれ以上、１０％又はそれ以上、２０％又はそれ以上、より好ましくは５０％又はそれ以上、最も好ましくは７５％又はそれ以上の低下を生じさせる能力を意味する。
【０１３４】
［ｍＡｂの作用機序］
以下は、本発明の抗体の治療効果の基礎となる機序についての考察を提供するが、いかなる意味においても本発明に対する限定とみなされるべきではない。
【０１３５】
本明細書に記載される抗体は、好ましくはＡＤＣＣ又はＣＤＣを通して、好ましくは免疫系の成分と相互作用する。本発明の抗体はまた、腫瘍細胞を直接死滅させるために本体部分（ｐａｙｌｏａｄｓ）（例えば放射性同位体、薬剤又は毒素）を標的するために使用できるか、又は伝統的な化学療法剤と相乗作用的に使用することができ、Ｔリンパ球への化学療法剤の細胞傷害性副作用のために損なわれた可能性がある抗腫瘍免疫応答を含み得る補完的な作用機序を通して腫瘍を攻撃することができる。しかし、本発明の抗体はまた、単に細胞表面上のＧＴ４６８に結合することによって、これにより例えば細胞の増殖をブロックすることによって作用を及ぼし得る。
【０１３６】
［抗体依存性細胞媒介性細胞傷害］
ＡＤＣＣは、本明細書に記載されるエフェクター細胞、特にリンパ球の細胞死滅能力を表し、好ましくは抗体によって印が付けられた標的細胞を必要とするものをいう。
【０１３７】
ＡＤＣＣは、好ましくは、抗体が腫瘍細胞上の抗原に結合し、抗体Ｆｃドメインが免疫エフェクター細胞の表面のＦｃ受容体（ＦｃＲ）と係合して結合したときにおこる。Ｆｃ受容体のいくつかのファミリーが同定されており、特定細胞集団は規定されたＦｃ受容体を特徴的に発現する。ＡＤＣＣは、抗原提示と腫瘍に対するＴ細胞応答の誘導を導く様々な程度の即時腫瘍破壊を直接誘導する機序とみなすことができる。好ましくはインビボでのＡＤＣＣの誘導は腫瘍に対するＴ細胞応答及び宿主由来の抗体応答を導く。
【０１３８】
［補体依存性細胞傷害］
ＣＤＣは、抗体によって指令され得る別の細胞死滅法である。ＩｇＭは補体活性化のために最も有効なアイソタイプである。ＩｇＧ１及びＩｇＧ３も、古典的補体活性化経路を通してＣＤＣを指令する上でどちらも非常に有効である。好ましくは、このカスケードにおいて、抗原−抗体複合体の形成は、ＩｇＧ分子などの関与する抗体分子のＣＨ２ドメイン上のごく近接する多数のＣ１ｑ結合部位の露出を生じさせる（Ｃ１ｑは補体Ｃ１の３つのサブ成分の１つである）。好ましくはこれらの露出されたＣ１ｑ結合部位は、それまでは低親和性のＣ１ｑ−ＩｇＧ相互作用を高いアビディティのものに変換し、それが、一連の他の補体タンパク質が関与する事象のカスケードを惹起し、エフェクター細胞走化性／活性化物質、Ｃ３ａ及びＣ５ａのタンパク質分解放出を導く。好ましくは、補体カスケードは膜攻撃複合体の形成で終了し、膜攻撃複合体は、細胞の内外への水と溶質の自由な通過を促進する細胞膜の細孔を作製する。
【０１３９】
［抗体の作製］
本発明の抗体は、従来のモノクローナル抗体法、例えばＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）の標準体細胞ハイブリダイゼーション手法を含む、様々な手法によって作製できる。体細胞ハイブリダイゼーション手順は、原則として、好ましいが、モノクローナル抗体を作製するための他の手法、例えばＢリンパ球のウイルス若しくは発癌性形質転換又は抗体遺伝子のライブラリーを使用したファージディスプレイ手法も使用できる。
【０１４０】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製するための好ましい動物系は、マウス系である。マウスにおけるハイブリドーマの生産は、十分に確立された手順である。免疫プロトコール及び融合のための免疫脾細胞の単離についての手法は当該技術分野において公知である。融合パートナー（例えばマウス骨髄腫細胞）及び融合手順も公知である。
【０１４１】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを作製するための他の好ましい動物系は、ラット及びウサギ系である（例えばＳｐｉｅｋｅｒ−Ｐｏｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：９３４８（１９９５）に記載されている、またＲｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１２４：２９５（２００５）も参照のこと）。
【０１４２】
さらに別の好ましい実施形態では、ＧＴ４６８に対するヒトモノクローナル抗体は、マウス系よりむしろヒト免疫系の部分を担持するトランスジェニック又はトランスクロモソーマルマウスを用いて作製できる。これらのトランスジェニック及びトランスクロモソーマルマウスは、それぞれＨｕＭＡｂマウス及びＫＭマウスとして知られるマウスを含み、本明細書においては集合的に「トランスジェニックマウス」と称する。そのようなトランスジェニックマウスにおけるヒト抗体の生産は、国際公開第２００４／０３５６０７号においてＣＤ２０に関して詳述されているように実施できる。
【０１４３】
モノクローナル抗体を作製するためのさらに別の方法は、規定された方法の抗体を産生するリンパ球から、抗体をコードする遺伝子を直接単離することである。例えばＢａｂｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｓｉｎｇｌｅ，  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｏｆ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｔｒａｔｅｇｙ参照。組換え抗体の工作の詳細については、Ｗｅｌｓｃｈｏｆ  ａｎｄ  Ｋｒａｕｓ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ＩＳＢＮ−０−８９６０３−９１８−８及びＢｅｎｎｙ  Ｋ．Ｃ．Ｌｏ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ＩＳＢＮ  １−５８８２９−０９２−１も参照のこと。
【０１４４】
［免疫］
ＧＴ４６８に対する抗体を作製するため、前述したように、組換え発現されたＧＴ４６８抗原又はそのフラグメント及び／又はＧＴ４６８を発現する細胞の冨化製剤である、ＧＴ４６８配列に由来する担体結合ペプチドでマウスを免疫することができる。代替的には、完全長ヒトＧＴ４６８（例えば配列番号１）をコードするＤＮＡ又はそのフラグメント、特に配列番号３〜１０及び３５〜７９をコードするものでマウスを免疫することができる。ＧＴ４６８抗原の精製又は冨化製剤を用いた免疫が抗体を生じない場合は、免疫応答を促進するために、ＧＴ４６８を発現する細胞、例えば細胞系でマウスを同様に免疫することができる。
【０１４５】
免疫応答は、免疫プロトコールの間、尾静脈又は眼窩後採血によって得られる血漿及び血清試料を用いてモニターすることができる。十分な力価の抗ＧＴ４６８免疫グロブリンを有するマウスを融合のために使用できる。特異的抗体分泌ハイブリドーマの割合を高めるために、犠死及び脾臓の切除の３日前にＧＴ４６８発現細胞で腹腔内又は静脈内経路でマウスを追加免疫することができる。
【０１４６】
［モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製］
ＧＴ４６８に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するため、免疫マウスからの脾細胞及びリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞系などの適切な不死化細胞系に融合することができる。生じたハイブリドーマを、次に、抗原特異的抗体の産生に関してスクリーニングすることができる。個々のウエルを、その後、抗体分泌ハイブリドーマに関してＥＬＩＳＡによってスクリーニングすることができる。ＧＴ４６８発現細胞を用いた免疫蛍光及びＦＡＣＳ分析により、ＧＴ４６８に対して特異性を有する抗体が同定できる。抗体分泌ハイブリドーマを再びプレートに植え付け、スクリーニングして、抗ＧＴ４６８モノクローナル抗体に対して依然として陽性である場合は、限界希釈法によってサブクローニングすることができる。安定なサブクローンを、その後、特性付けのために組織培養培地において抗体を作製するためにインビトロで培養することができる。
【０１４７】
［モノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの作製］
本発明の抗体はまた、例えば当該技術分野において周知である組換えＤＮＡ手法と遺伝子トランスフェクション法の組合せを用いて、宿主細胞トランスフェクトーマにおいて作製することができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２）。
【０１４８】
例えば１つの実施形態では、対象とする遺伝子、例えば抗体遺伝子を、国際公開第８７／０４４６２号、国際公開第８９／０１０３６号及び欧州特許第３３８  ８４１号に開示されているＧＳ遺伝子発現系又は当該技術分野で周知の他の発現系によって使用されるような真核生物発現プラスミドなどの発現ベクターに連結することができる。クローン化された抗体遺伝子を有する精製プラスミドを、ＣＨＯ細胞、ＮＳ／０細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞又はＨＥＫ２９３細胞などの真核宿主細胞に、代替的には植物由来細胞、真菌又は酵母細胞のような他の真核細胞に導入することができる。これらの遺伝子を導入するために使用される方法は、電気穿孔、リポフェクチン、リポフェクタミン他のような当該技術分野において記述されている方法であり得る。これらの抗体遺伝子の宿主細胞への導入後、抗体を発現する細胞を同定し、選択することができる。これらの細胞はトランスフェクトーマであり、その後それらを発現レベルに増幅し、抗体を生産するために規模拡大することができる。これらの培養上清及び／又は細胞から組換え抗体を単離し、精製することができる。
【０１４９】
代替的には、クローン化された抗体遺伝子を、微生物、例えば大腸菌などの原核生物を含む、他の発現系において発現させることができる。さらに、抗体は、ヒツジ及びウサギからの乳又はニワトリからの卵などの、トランスジェニック非ヒト動物において、若しくはトランスジェニック植物において、生産することができる；例えばＶｅｒｍａ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２１６：１６５−１８１；Ｐｏｌｌｏｃｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２３１：１４７−１５７；及びＦｉｓｃｈｅｒ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８０：８２５−８３９参照。
【０１５０】
［無傷抗体を発現するための部分抗体配列の使用（すなわちヒト化又はキメラ化）］
ａ）キメラ化
マウスモノクローナル抗体は、毒素又は放射性同位体で標識したとき、ヒトにおける治療抗体として使用できる。非標識マウス抗体は、繰り返し適用したときヒトにおいて高度に免疫原性であり、治療効果の低下を導く。主たる免疫原性は重鎖定常領域によって媒介される。ヒトにおけるマウス抗体の免疫原性は、それぞれの抗体をキメラ化又はヒト化した場合、低減するか又は完全に回避することができる。キメラ抗体は、その異なる部分が異なる動物種に由来する抗体、例えばマウス抗体に由来する可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有する抗体である。抗体のキメラ化は、マウス抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域をヒト重鎖及び軽鎖の定常領域と連結する（例えばＫｒａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｓｅｒｉｅｓ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ＩＳＢＮ−０−８９６０３−９１８−８に記載されているように）ことによって達成される。好ましい実施形態では、キメラ抗体は、ヒトκ軽鎖定常領域をマウス軽鎖可変領域に連結することによって作製される。同様に好ましい実施形態では、キメラ抗体は、ヒトλ軽鎖定常領域をマウス軽鎖可変領域に連結することによって作製される。キメラ抗体の作製のための好ましい重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４である。キメラ抗体の作製のための他の好ましい重鎖定常領域は、ＩｇＧ２、ＩｇＡ、ＩｇＤ及びＩｇＭである。
【０１５１】
ｂ）ヒト化
抗体は、主として６つの重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基を通して標的抗原と相互作用する。この理由から、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲの外側の配列よりも個々の抗体間で多様である。ＣＤＲ配列は大半の抗体−抗原相互作用に関与するので、異なる性質を有する異なる抗体由来のフレームワーク配列に移植された特定の天然に生じる抗体からのＣＤＲ配列を含む発現ベクターを構築することにより、特定の天然に生じる抗体の性質を模倣する組換え抗体を発現することが可能である（例えばＲｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｊｏｎｅｓ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；及びＱｕｅｅｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９−１００３３参照）。そのようなフレームワーク配列は、生殖細胞系抗体遺伝子配列を含む公的なＤＮＡデータベースから入手できる。これらの生殖細胞系配列は、Ｂ細胞成熟の間にＶ（Ｄ）Ｊ結合によって形成される、完全に構築された可変遺伝子を含まないので、成熟抗体遺伝子配列とは異なる。生殖細胞系遺伝子配列はまた、高親和性の二次レパートリー抗体の配列とも、可変領域全体にわたって個々に均一に異なる。例えば体細胞突然変異は、フレームワーク領域１のアミノ末端部分及びフレームワーク領域４のカルボキシ末端部分では比較的まれである。さらに、多くの体細胞突然変異は抗体の結合特性を有意に変化させない。この理由から、もとの抗体と類似の結合特性を有する無傷組換え抗体を再創製するために特定抗体のＤＮＡ配列全体を得る必要はない（国際公開第９９／４５９６２号参照）。ＣＤＲ領域にわたる部分重鎖及び軽鎖配列が、典型的にはこの目的のために十分である。部分配列を使用して、いずれの生殖細胞系可変（Ｖ）及び連結（Ｊ）遺伝子セグメントが組み換えられた抗体可変遺伝子に寄与したかを決定する。次に、生殖細胞系配列を用いて可変領域の欠けている部分を充填する。重鎖及び軽鎖リーダー配列はタンパク質成熟の間に切断され、最終的な抗体の性質には寄与しない。欠けている配列を加えるために、クローン化されたｃＤＮＡ配列を連結又はＰＣＲ増幅によって合成オリゴヌクレオチドと組み合わせることができる。代替的には、可変領域全体を一組の短い重複するオリゴヌクレオチドとして合成し、完全な合成可変領域クローンを創製するためにＰＣＲ増幅によって結合することができる。この工程は、特定制限部位の除去若しくは包含、又は特定コドンの最適化などのいくつかの利点を有する。
【０１５２】
天然配列と同一のアミノ酸コード能力を有する合成Ｖ配列を創製するために、ハイブリドーマからの重鎖及び軽鎖転写産物のヌクレオチド配列を用いて合成オリゴヌクレオチドの重複するセットを設計する。合成重鎖及びκ鎖配列は、３つの方法で天然配列と異なるものにすることができる：オリゴヌクレオチド合成とＰＣＲ増幅を容易にするために一続きの反復するヌクレオチド塩基を中断する；コザック規則（Ｋｏｚａｋ，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７−１９８７０）に従って最適翻訳開始部位を組み込む；及びＨｉｎｄＩＩＩ部位を翻訳開始部位の上流に工作する。
【０１５３】
重鎖及び軽鎖可変領域の両方について、最適化されたコード鎖及び対応する非コード鎖配列を、対応する非コードオリゴヌクレオチドのほぼ中間点で３０〜５０ヌクレオチドに分解する。このようにして、各々の鎖について、オリゴヌクレオチドを、１５０〜４００ヌクレオチドのセグメントにわたる重複する二本鎖のセットに構築することができる。次に該プールを、１５０〜４００ヌクレオチドのＰＣＲ増幅産物を作製するための鋳型として使用する。典型的には、１つの可変領域オリゴヌクレオチドのセットを２つのプールに分解し、それらを別々に増幅して２つの重複するＰＣＲ産物を作製する。これらの重複産物を、次に、ＰＣＲ増幅によって組み合わせて完全な可変領域を形成する。また、発現ベクター構築物に容易にクローニングすることができるフラグメントを作製するために、重鎖又は軽鎖定常領域の重複するフラグメントをＰＣＲ増幅に含めることが望ましいと考えられる。
【０１５４】
再構築されたキメラ又はヒト化重鎖及び軽鎖可変領域を、次に、発現ベクター構築物を形成するためにクローン化されたプロモーター、リーダー、翻訳開始、定常領域、３'非翻訳、ポリアデニル化及び転写終結配列と組み合わせる。重鎖及び軽鎖発現構築物は、単一ベクターに組み合わせるか、宿主細胞にコトランスフェクトする、連続的にトランスフェクトする又は別々にトランスフェクトすることができ、それらはその後、両方の鎖を発現する宿主細胞を形成するために融合される。ヒトＩｇＧκのための発現ベクターの構築において使用するためのプラスミドを以下に記載される。ＰＣＲ増幅したＶ重鎖及びＶκ軽鎖ｃＤＮＡ配列が完全な重鎖及び軽鎖ミニ遺伝子を再構築するために使用できるようにプラスミドを構築した。これらのプラスミドは、完全なヒト化又はキメラＩｇＧ１κ又はＩｇＧ４κ抗体を発現するために使用できる。同様のプラスミドを、他の重鎖アイソタイプの発現のため、又はλ軽鎖を含む抗体の発現のために構築することができる。
【０１５５】
そこで、本発明の別の態様では、本発明の抗ＧＴ４６８抗体の構造特徴を使用して、ＧＴ４６８に結合することなどの、本発明の抗体の少なくとも１つの機能的特性を保持する構造的に関連するヒト化抗ＧＴ４６８抗体を作製する。より具体的には、マウスモノクローナル抗体の１又はそれ以上のＣＤＲ領域を公知のヒトフレームワーク領域及びＣＤＲと組換え結合して、本発明の付加的な、組換え操作されたヒト化抗ＧＴ４６８抗体を創製することができる。
【０１５６】
［抗原発現細胞への結合］
ＧＴ４６８に結合する抗体の能力は、実施例に記載されるもの（例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット法、免疫蛍光及びフローサイトメトリー分析）のような、標準的結合アッセイを用いて決定することができる。
【０１５７】
［抗体の結合の特徴付け］
抗ＧＴ４６８抗体を精製するため、選択したハイブリドーマをモノクローナル抗体精製用の２リットルスピナーフラスコで増殖させることができる。代替的には、抗ＧＴ４６８抗体は、透析膜に基づくバイオリアクターにおいて生産することができる。上清をろ過し、必要に応じて濃縮した後、プロテインＧ−セファロース又はプロテインＡ−セファロースでのアフィニティークロマトグラフィーにかけることができる。溶出されたＩｇＧは、純度を保証するためにゲル電気泳動及び高速液体クロマトグラフィーによって検査することができる。緩衝液をＰＢＳに交換し、１．４３の吸光係数を用いてＯＤ２８０によって濃度を決定することができる。モノクローナル抗体を等分（アリコート）に分け、−８０℃で保存することができる。
【０１５８】
選択した抗ＧＴ４６８モノクローナル抗体がユニークなエピトープに結合するかどうかを判定するために、部位指定突然変異誘発又は多重部位指定突然変異誘発（ｍｕｌｔｉ−ｓｉｔｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）が使用できる。
【０１５９】
［アイソタイプの決定］
精製抗体のアイソタイプを決定するため、様々な市販のキット（例えばＺｙｍｅｄ，Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）によるアイソタイプＥＬＩＳＡが実施できる。マイクロタイタープレートのウエルを抗マウスＩｇで被覆することができる。ブロックした後、プレートをモノクローナル抗体又は精製アイソタイプ対照と周囲温度で２時間反応させる。次にウエルをマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ若しくはＩｇＧ３、ＩｇＡ又はマウスＩｇＭ特異的ペルオキシダーゼ結合プローブと反応させることができる。洗浄後、プレートをＡＢＴＳ基質（１ｍｇ／ｍｌ）で展開し、４０５〜６５０のＯＤで分析することができる。代替的には、ＩｓｏＳｔｒｉｐ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１４９３０２７）を製造者によって説明されているように使用し得る。
【０１６０】
［フローサイトメトリー分析］
免疫したマウスの血清中の抗ＧＴ４６８抗体の存在又はＧＴ４６８を発現する生細胞へのモノクローナル抗体の結合を明らかにするために、フローサイトメトリーが使用できる。天然に又はトランスフェクション後にＧＴ４６８を発現する細胞系とＧＴ４６８発現を欠く陰性対照（標準的増殖条件下で増殖させた）を、ハイブリドーマ上清中又は１％ＦＢＳを含むＰＢＳ中で様々な濃度のモノクローナル抗体と混合し、４℃で３０分間インキュベートすることができる。洗浄後、ＡＰＣ又はＡｌｅｘａ６４７で標識した抗ＩｇＧ抗体を、一次抗体染色と同じ条件下でＧＴ４６８結合モノクローナル抗体に結合させることができる。単一生細胞に対してゲートする光散乱及び側方散乱特性を用いるＦＡＣＳ装置でのフローサイトメトリーによって試料を分析することができる。単一測定においてＧＴ４６８特異的モノクローナル抗体を非特異的結合抗体から区別するために、コトランスフェクションの方法が使用できる。ＧＴ４６８と蛍光マーカーをコードするプラスミドで一過性にトランスフェクトした細胞を上述したように染色することができる。トランスフェクトした細胞は、抗体染色細胞とは異なる蛍光チャネルで検出できる。トランスフェクト細胞の大部分は両方の導入遺伝子を発現するので、ＧＴ４６８特異的モノクローナル抗体は蛍光マーカー発現細胞に選択的に結合するが、非特異的抗体は非トランスフェクト細胞に同等の割合で結合する。蛍光顕微鏡検査を用いた代替的アッセイを、フローサイトメトリーアッセイに加えて又はその代わりに使用し得る。細胞を上述したように正確に染色し、蛍光顕微鏡によって検査することができる。
【０１６１】
［免疫蛍光顕微鏡検査］
免疫したマウスの血清中の抗ＧＴ４６８抗体の存在又はＧＴ４６８を発現する生細胞へのモノクローナル抗体の結合を明らかにするために、免疫蛍光顕微鏡検査分析が使用できる。例えば自然に又はトランスフェクション後にＧＴ４６８を発現する細胞系とＧＴ４６８発現を欠く陰性対照を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、標準的増殖条件下にてチェンバースライドで増殖させる。次に細胞をメタノール若しくはパラホルムアルデヒドで固定するか又は処理しないままにしておくことができる。その後、細胞をＧＴ４６８に対するモノクローナル抗体と２５℃で３０分間反応させることができる。洗浄後、細胞を同じ条件下でＡｌｅｘａ５５５標識抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と反応させることができる。その後、蛍光顕微鏡によって細胞を検査することができる。
【０１６２】
細胞をメタノール固定又はパラホルムアルデヒド固定し、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で細胞の透過性を上げたとき、細胞中の総ＧＴ４６８レベルを観察することができる。生細胞及び透過性を上げていないパラホルムアルデヒド固定細胞では、ＧＴ４６８の細胞表面局在が検査できる。加えて、密着結合へのＧＴ４６８のターゲティングは、ＺＯ−１などの密着結合マーカーでの共染色によって分析できる。さらに、抗体結合の作用及び細胞膜内のＧＴ４６８の局在が検査できる。
【０１６３】
［ウエスタンブロット法］
抗ＧＴ４６８  ＩｇＧを、ウエスタンブロット法によってＧＴ４６８抗原との反応性に関してさらに試験することができる。簡単に述べると、ＧＴ４６８を発現する細胞と適切な陰性対照からの細胞抽出物を調製し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供することができる。電気泳動後、分離された抗原をニトロセルロース膜に転写し、ブロックして、試験するモノクローナル抗体でプローブする。抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼを用いてＩｇＧ結合を検出し、ＥＣＬ基質で展開することができる。
【０１６４】
［免疫組織化学］
抗ＧＴ４６８マウスＩｇＧは、当業者に周知の方法で、例えば常套的な手術手順の間に患者から得た又は自然に若しくはトランスフェクション後にＧＴ４６８を発現する細胞系を接種した異種移植腫瘍を担持するマウスから得た、非癌組織又は癌組織試料からのパラホルムアルデヒド若しくはアセトン固定した凍結切片又はパラホルムアルデヒドで固定したパラフィン包埋組織切片を用いて、免疫組織化学によってＧＴ４６８抗原との反応性に関してさらに試験することができる。免疫染色のために、ＧＴ４６８に対して反応性の抗体をインキュベートし、続いて販売元の指示書に従ってホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス抗体又はヤギ抗ウサギ抗体（ＤＡＫＯ）と共にインキュベートすることができる。
【０１６５】
［インビトロでの抗体の貪食及び細胞死滅作用］
ＧＴ４６８に特異的に結合することに加えて、抗ＧＴ４６８抗体は、ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞の貪食作用及び死滅を媒介するそれらの能力に関して試験することができる。インビトロでのモノクローナル抗体活性の試験は、インビボモデルでの試験に先立つ初期スクリーニングを提供する。
【０１６６】
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）：
簡単に述べると、健常ドナーからの多形核細胞（ＰＭＮ）、ＮＫ細胞、単球、単核細胞又は他のエフェクター細胞を、Ｆｉｃｏｌｌ  Ｈｙｐａｑｕｅ密度遠心分離とそれに続く汚染赤血球の溶解によって精製することができる。洗浄したエフェクター細胞を、１０％熱不活化ウシ胎仔血清か、代替的には５％熱不活化ヒト血清を添加したＲＰＭＩに懸濁し、ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる５１Ｃｒ標識標的細胞と、エフェクター細胞対標的細胞の様々な比率で、混合することができる。代替的には、標的細胞を蛍光増強リガンド（ＢＡＴＤＡ）で標識してもよい。死細胞から放出される増強リガンドとユウロピウムの高度蛍光キレートを蛍光光度計によって測定することができる。別の代替的手法は、ルシフェラーゼによる標的細胞のトランスフェクションを利用し得る。添加したルシファーイエローは、生細胞によってのみ酸化され得る。次に、精製抗ＧＴ４６８  ＩｇＧを様々な濃度で添加することができる。無関係なヒトＩｇＧが陰性対照として使用できる。アッセイは、使用するエフェクター細胞型に依存して３７℃で４〜２０時間実施できる。培養上清中の５１Ｃｒの放出又はＥｕＴＤＡキレートの存在を測定することによって試料を細胞溶解に関して検定することができる。代替的には、ルシファーイエローの酸化から生じる発光が生細胞の測定であり得る。
【０１６７】
抗ＧＴ４６８モノクローナル抗体はまた、細胞溶解が複数のモノクローナル抗体で増強されるかどうかを調べるために様々な組合せで試験することができる。
【０１６８】
補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）：
モノクローナル抗体抗ＧＴ４６８抗体は、様々な公知の手法を用いてＣＤＣを媒介するそれらの能力に関して試験することができる。例えば補体用の血清は、当業者に公知の方法で血液から入手できる。ｍＡｂのＣＤＣ活性を測定するために、種々の方法が使用できる。例えば５１Ｃｒ放出を測定するか又はヨウ化プロピジウム（ＰＩ）排除アッセイを用いて膜透過性上昇を評価することができる。簡単に述べると、標的細胞を洗浄し、５×１０５／ｍｌを様々な濃度のｍＡｂと共に室温で又は３７℃で１０〜３０分間インキュベートすることができる。次に血清又は血漿を添加して２０％（ｖ／ｖ）の最終濃度にし、細胞を３７℃で２０〜３０分間インキュベートすることができる。各々の試料からのすべての細胞をＦＡＣＳチューブ中のＰＩ溶液に添加することができる。その後直ちに、ＦＡＣＳＡｒｒａｙを用いたフローサイトメトリー分析によって混合物を分析することができる。
【０１６９】
代替的アッセイでは、接着細胞上でのＣＤＣの誘導を測定することができる。このアッセイの１つの実施形態では、アッセイの２４時間前に、細胞を組織培養平底マイクロタイタープレートに３×１０４／ウエルの密度で接種する。その翌日、増殖培地を取り出し、三組の細胞を抗体と共にインキュベートする。対照細胞は、それぞれバックグラウンド溶解と最大溶解を測定するために増殖培地又は０．２％サポニンを含有する増殖培地と共にインキュベートする。室温で２０分間のインキュベーション後、上清を取り、ＤＭＥＭ中の２０％（ｖ／ｖ）ヒト血漿又は血清（あらかじめ３７℃に温めておく）を細胞に添加して、３７℃でさらに２０分間インキュベートする。各々の試料からのすべての細胞をヨウ化プロピジウム溶液（１０μｇ／ｍｌ）に添加する。その後、上清を、２．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有するＰＢＳに取り換え、５２０ｎｍでの励起後の蛍光発光を、Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅを用いて６００ｎｍで測定する。特異的溶解の割合を以下のように算定する：特異的溶解％＝（試料蛍光−バックグラウンド蛍光）／（最大溶解蛍光−バックグラウンド蛍光）×１００。
【０１７０】
モノクローナル抗体による細胞増殖の阻害：
アポトーシスを開始させる能力を試験するため、モノクローナル抗ＧＴ４６８抗体を、例えば、ＧＴ４６８陽性腫瘍細胞又はＧＴ４６８でトランスフェクトした腫瘍細胞と共に３７℃で約２０時間インキュベートすることができる。細胞を採取し、アネキシンＶ結合緩衝液（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で洗浄して、ＦＩＴＣ又はＡＰＣ（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と結合したアネキシンＶと共に暗所にて１５分間インキュベートすることができる。各々の試料からのすべての細胞をＦＡＣＳチューブ中のＰＩ溶液（ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ）に添加し、直ちにフローサイトメトリーによって（上記のように）評価することができる。
【０１７１】
代替的には、モノクローナル抗体による細胞増殖の一般的な阻害は、市販のキットを用いて検出することができる。ＤＥＬＦＩＡ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号ＡＤ０２００）は、マイクロプレートにおける増殖細胞のＤＮＡ合成の間の５−ブロモ−２'−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）取込みの測定に基づく非同位体免疫検定法である。取り込まれたＢｒｄＵは、ユウロピウム標識モノクローナル抗体を用いて検出される。抗体検出を可能にするため、細胞を固定し、固定溶液を用いてＤＮＡ変性する。非結合抗体を洗い流し、ＤＥＬＦＩＡ誘導物質を添加して標識抗体からユウロピウムイオンを溶液中に解離し、溶液中でユウロピウムイオンはＤＥＬＦＩＡ誘導物質の成分と高度蛍光キレートを形成する。検出に時間分解蛍光定量法を用いて、測定された蛍光は、各々のウエルの細胞におけるＤＮＡ合成に比例する。
【０１７２】
［前臨床試験］
ＧＴ４６８に結合するモノクローナル抗体はまた、ＧＴ４６８を発現する腫瘍細胞の増殖を制御するうえでのそれらの効果を測定するため、インビボモデルにおいて（例えば、場合によりトランスフェクション後に、ＧＴ４６８を発現する細胞系を接種した異種移植腫瘍を担持する免疫欠損マウスにおいて）試験することができる。
【０１７３】
ＧＴ４６８発現腫瘍細胞を免疫減弱状態のマウス又は他の動物に異種移植した後、本発明の抗体を用いてインビボ試験を実施することができる。腫瘍の形成又は腫瘍関連症状を予防する抗体の作用を測定するため、腫瘍を有さないマウスに抗体を投与し、続いて腫瘍細胞を注射することができる。腫瘍の増殖、転移又は腫瘍関連症状を低減するそれぞれの抗体の治療効果を測定するため、腫瘍担持マウスに抗体を投与することができる。抗体適用を、細胞増殖抑制薬、増殖因子阻害剤、細胞周期遮断薬、血管新生阻害剤又は他の抗体などの他の物質の適用と組み合わせて、組合せの相乗作用的効果及び潜在的毒性を測定することができる。本発明の抗体によって媒介される毒性副作用を分析するため、動物に抗体又は対照試薬を接種し、ＧＴ４６８抗体治療に関連する可能性がある症状を十分に調べることができる。ＧＴ４６８抗体のインビボ適用の起こり得る副作用は、特に胎盤を含むＧＴ４６８発現組織における毒性を含む。ヒト及び他の種、例えばマウスにおいてＧＴ４６８を認識する抗体は、ヒトにおいてモノクローナルＧＴ４６８抗体の適用によって媒介される潜在的副作用を予測するために特に有用である。
【０１７４】
［エピトープマッピング］
本発明の抗体によって認識されるエピトープのマッピングは、"Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ"（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）ｂｙ  Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ  ＩＳＢＮ−０８９６０３−３７５−９及び"Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ"Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ，２４８  ｂｙ  Ｏｌｗｙｎ  Ｍ．Ｒ．Ｗｅｓｔｗｏｏｄ，Ｆｒａｎｋ  Ｃ．Ｈａｙの中で詳細に記載されているように実施できる。
【０１７５】
［Ｉ．ＧＴ４６８に結合する二重特異性／多重特異性分子］
本発明のさらに別の実施形態では、ＧＴ４６８に対する抗体は、多数の結合部位又は標的エピトープに結合する二重特異性／多重特異性分子を作製するために、誘導体化する又は別の機能性分子、例えば別のペプチド又はタンパク質（例えばＦａｂ'フラグメント）に連結することができる。例えば本発明の抗体は、別の抗体、ペプチド又は結合模倣体などの、１又はそれ以上の他の結合分子に機能的に連結することができる（例えば化学結合、遺伝子融合、非共有結合又は他の方法によって）。
【０１７６】
従って、本発明は、少なくとも１つのＧＴ４６８に対する第一結合特異性と２番目の標的エピトープに対する第二の結合特異性を含む二重特異性及び多重特異性分子を包含する。本発明の特定実施形態では、２番目の標的エピトープは、Ｆｃ受容体、例えばヒトＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）若しくはヒトＦｃα受容体（ＣＤ８９）、又はＴ細胞受容体、例えばＣＤ３である。これにより、本発明は、ＦｃγＲ、ＦｃαＲ又はＦｃεＲを発現するエフェクター細胞（例えば単球、マクロファージ又は多形核細胞（ＰＭＮ））とＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる標的細胞との両方に結合することができる二重特異性及び多重特異性分子を含む。これらの二重特異性及び多重特異性分子は、ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞をエフェクター細胞に標的することができ、ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞の貪食作用、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、サイトカイン放出又はスーパーオキシドアニオンの生成などの、Ｆｃ受容体を介したエフェクター細胞活性を惹起することができる。
【０１７７】
本発明の二重特異性及び多重特異性分子は、抗Ｆｃ結合特異性及び抗ＧＴ４６８結合特異性に加えて、第三の結合特異性をさらに含み得る。第三の結合特異性は、抗増強因子（ＥＦ）部分、例えば細胞傷害活性に関与する表面タンパク質に結合し、それによって標的細胞に対する免疫応答を高める分子である。「抗増強因子部分」は、所与の分子、例えば抗原又は受容体に結合し、それによってＦｃ受容体又は標的細胞抗原に対する結合決定基の作用の増強を生じさせる、抗体、機能的抗体フラグメント又はリガンドであり得る。「抗増強因子部分」は、Ｆｃ受容体又は標的細胞抗原に結合することができる。代替的には、抗増強因子部分は、第一及び第二の結合特異性部分が結合する実体とは異なる実体に結合することができる。例えば、抗増強因子部分は細胞傷害性Ｔ細胞に結合することができる（例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＩＣＡＭ−１又は標的細胞に対する免疫応答の増大を生じさせる他の免疫細胞を通して）。
【０１７８】
１つの実施形態では、本発明の二重特異性及び多重特異性分子は、例えばＦａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｖ又は一本鎖Ｆｖを含む、少なくとも１つの抗体を結合特異性として含む。抗体はまた、軽鎖若しくは重鎖二量体、又はＦｖ若しくはＬａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，９４６，７７８号に記載されている一本鎖構築物のようなその任意の最小フラグメントであり得る。抗体はまた、米国特許出願第２００３／０１１８５９２号及び米国特許出願第２００３／０１３３９３９号に開示されているような結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質であり得る。
【０１７９】
１つの実施形態では、本発明の二重特異性及び多重特異性分子は、エフェクター細胞の表面に存在するＦｃγＲ又はＦｃαＲに対する結合特異性、及び標的細胞抗原、例えばＧＴ４６８に対する第二の結合特異性を含む。
１つの実施形態では、Ｆｃ受容体に対する結合特異性は、その結合がヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）によってブロックされないモノクローナル抗体によって提供される。本明細書において使用される、「ＩｇＧ受容体」という用語は、第１番染色体に位置する８つのγ鎖遺伝子のいずれかを指す。これらの遺伝子は、３つのＦｃγ受容体クラス：ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）に分類される合計１２の膜貫通型又は可溶性受容体アイソフォームをコードする。１つの好ましい実施形態では、Ｆｃγ受容体はヒト高親和性ＦｃγＲＩである。
【０１８０】
これらの好ましいモノクローナル抗体の生産と特徴づけは、国際公開第８８／０００５２号及び米国特許第４，９５４，６１７号においてＦａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．によって記載されている。これらの抗体は、受容体のＦｃγ結合部位とは異なる部位でＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ又はＦｃγＲＩＩＩのエピトープに結合し、このためそれらの結合は生理的レベルのＩｇＧによって実質的にブロックされない。本発明において有用な特異的抗ＦｃγＲＩ抗体は、ｍＡｂ２２、ｍＡｂ３２、ｍＡｂ４４、ｍＡｂ６２及びｍＡｂ１９７である。他の実施形態では、抗Ｆｃγ受容体抗体は、モノクローナル抗体２２（Ｈ２２）のヒト化形態である。Ｈ２２の生産と特徴づけは、Ｇｒａｚｉａｎｏ，Ｒ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５（１０）：４９９６−５００２及び国際公開第９４／１０３３２号に記載されている。Ｈ２２抗体を産生する細胞系は、ＨＡ０２２ＣＬ１の名称の下に１９９２年１１月４日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、アクセッション番号ＣＲＬ  １１１７７を有する。
【０１８１】
さらなる他の好ましい実施形態では、Ｆｃ受容体に対する結合特異性は、その結合が、好ましくはヒト免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）によってブロックされない、ヒトＩｇＡ受容体、例えばＦｃα受容体（ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９））に結合する抗体によって提供される。「ＩｇＡ受容体」という用語は、第１９番染色体に位置する１つのα遺伝子（ＦｃαＲＩ）の遺伝子産物を含むことが意図されている。この遺伝子は、５５〜１１０ｋＤａのいくつかの選択的にスプライシングされる膜貫通型アイソフォームをコードすることが知られている。ＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）は、単球／マクロファージ、好酸性及び好中性顆粒球上で構成的に発現されるが、非エフェクター細胞集団では発現されない。ＦｃαＲＩはＩｇＡ１及びＩｇＡ２の両方に対して中等度の親和性を有するが、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインに曝露されると親和性が上昇する（Ｍｏｒｔｏｎ，Ｈ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６：４２３−４４０）。ＩｇＡリガンド結合ドメインの外側でＦｃαＲＩに結合する、Ａ３、Ａ５９、Ａ６２及びＡ７７と同定される４つのＦｃαＲＩ特異的モノクローナル抗体が記述されている（Ｍｏｎｔｅｉｒｏ，Ｒ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１７６４）。
ＦｃαＲＩ及びＦｃγＲＩは、それらが、（１）主として免疫エフェクター細胞、例えば単球、ＰＭＮ、マクロファージ及び樹状細胞上で発現され；（２）高レベルで発現され（例えば細胞当たり５，０００〜１００，０００）；（３）細胞傷害活性（例えばＡＤＣＣ、貪食作用）の媒介物質であり；（４）それらを標的とする、自己抗原を含む抗原の抗原提示増強を媒介するので、本発明における使用のための好ましいトリガー受容体である。
【０１８２】
別の実施形態では、二重特異性分子は、１つが主としてＣＤＣを誘導することによって働く抗体であり、他方が主としてアポトーシスを誘導することによって働く抗体であるような、補完的機能活性を有する本発明に従った２つのモノクローナル抗体から成る。
【０１８３】
本明細書において使用される「エフェクター細胞特異的抗体」は、エフェクター細胞のＦｃ受容体に結合する抗体又は機能的抗体フラグメントを指す。本発明における使用のための好ましい抗体は、内因性免疫グロブリンによって結合されない部位でエフェクター細胞のＦｃ受容体に結合する。
【０１８４】
本明細書において使用される、「エフェクター細胞」という用語は、免疫応答の認識期及び活性化期に対して、免疫応答のエフェクター期に関与する免疫細胞を指す。例示的な免疫細胞は、骨髄系又はリンパ系起源の細胞、例えばリンパ球（例えば細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含むＢ細胞及びＴ細胞）、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、好酸球、好中球、多形核細胞、顆粒球、マスト細胞、及び好塩基球を含む。一部のエフェクター細胞は特異的にＦｃ受容体を発現し、特異的免疫機能を果たす。好ましい実施形態では、エフェクター細胞は抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導することができ、例えばＡＤＣＣを誘導することができる好中球である。例えばＦｃＲを発現する単球、マクロファージは、標的細胞の特異的死滅及び免疫系の他の成分への抗原提示又は抗原を提示する細胞への結合に関与する。他の実施形態では、エフェクター細胞は、標的抗原、標的細胞又は微生物を貪食することができる。エフェクター細胞上の特定ＦｃＲの発現は、サイトカインなどの体液性因子によって調節され得る。例えばＦｃγＲＩの発現は、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）によって上方調節されることが認められている。この発現増強は標的に対するＦｃγＲＩ担持細胞の細胞傷害活性を上昇させる。エフェクター細胞は、標的抗原又は標的細胞を貪食する又は溶解することができる。
【０１８５】
「標的細胞」とは、本発明の抗体によって標的することができる、被験者（例えばヒト又は動物）における任意の望ましくない細胞を意味する。好ましい実施形態では、標的細胞は、ＧＴ４６８を発現する若しくは過剰発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞である。ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞は、典型的には腫瘍細胞を含む。
【０１８６】
本発明の二重特異性及び多重特異性分子は、化学的手法（例えばＤ．Ｍ．Ｋｒａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：５８０７参照）、「ポリドーマ（ｐｏｌｙｄｏｍａ）」手法（例えばＲｅａｄｉｎｇへの米国特許第４，４７４，８９３号参照）、又は組換えＤＮＡ手法を用いて作製できる。
【０１８７】
特に、本発明の二重特異性及び多重特異性分子は、当該技術分野で公知の方法を用いて、構成結合特異性、例えば抗ＦｃＲ結合特異性と抗ＧＴ４６８結合特異性を結合することによって作製できる。例えば二重特異性及び多重特異性分子の各々の結合特異性部分を別々に作製し、その後互いに結合することができる。結合特異性部分がタンパク質又はペプチドであるとき、様々な結合剤又は架橋剤が共有結合共役のために使用できる。架橋剤の例は、プロテインＡ、カルボジイミド、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチル−チオアセテート（ＳＡＴＡ）、５，５'−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）、ｏ−フェニレンジマレイミド（ｏＰＤＭ）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、及びスルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ）を含む（例えばＫａｒｐｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：１６８６；Ｌｉｕ，ＭＡ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：８６４８参照）。他の方法は、Ｐａｕｌｕｓ（Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓ．Ｍｉｔｔ．（１９８５）Ｎｏ．７８，１１８−１３２）；Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８５）２２９：８１−８３）、及びＧｌｅｎｎｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８７）１３９：２３６７−２３７５）によって記載されているものを含む。好ましい結合剤はＳＡＴＡ及びスルホ−ＳＭＣＣであり、どちらもＰｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から入手できる。
【０１８８】
結合特異性部分が抗体であるときは、２本の重鎖のＣ末端ヒンジ領域のスルフヒドリル結合を通してそれらを結合することができる。特に好ましい実施形態では、結合の前に、奇数のスルフヒドリル残基、好ましくは１個のスルフヒドリル残基を含むようにヒンジ領域を修飾する。
【０１８９】
代替的には、両方の結合特異性部分を同じベクター内にコードさせ、同じ宿主細胞において発現させ、構築することができる。この方法は、二重特異性及び多重特異性分子がＭＡｂ×ＭＡｂ、ＭＡｂ×Ｆａｂ、Ｆａｂ×Ｆ（ａｂ'）２又はリガンド×Ｆａｂ融合タンパク質である場合に特に有用である。本発明の二重特異性及び多重特異性分子、例えば二重特異性分子は、一本鎖二重特異性抗体、１つの一本鎖抗体と結合決定基を含む一本鎖二重特異性分子、又は２つの結合決定基を含む一本鎖二重特異性分子などの一本鎖分子であり得る。二重特異性及び多重特異性分子もまた、一本鎖分子であり得るか又は少なくとも２つの一本鎖分子を含み得る。二重特異性及び多重特異性分子を作製するための方法は、例えば米国特許第５，２６０，２０３号；同第５，４５５，０３０号；同第４，８８１，１７５号；同第５，１３２，４０５号；同第５，０９１，５１３号；同第５，４７６，７８６号；同第５，０１３，６５３号；同第５，２５８，４９８号；及び同第５，４８２，８５８号に記載されている。
【０１９０】
二重特異性及び多重特異性分子の、それらの特異的標的への結合は、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫検定法（ＲＩＡ）、ＦＡＣＳ分析、バイオアッセイ（例えば増殖阻害）、又はウエスタンブロット検定法によって確認することができる。これらの検定法の各々は、一般に、特定対象とするタンパク質−抗体複合体の存在を、対象複合体に特異的な標識試薬（例えば抗体）を使用することによって検出する。例えばＦｃＲ−抗体複合体は、例えば抗体−ＦｃＲ複合体を認識して特異的に結合する酵素結合抗体又は抗体フラグメントを用いて検出することができる。代替的には、様々な他の免疫検定法のいずれかを用いて複合体を検出することができる。例えば抗体を放射性標識して、放射免疫検定法（ＲＩＡ）において使用することができる（例えばＷｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｔｒａｉｎｉｎｇ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｏｎ  Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｔｈｅ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｍａｒｃｈ，１９８６参照）。放射性同位体は、γカウンター又はシンチレーションカウンターの使用又はオートラジオグラフィーなどの手段によって検出できる。
【０１９１】
［ＩＩ．免疫複合体］
別の態様では、本発明は、細胞毒、薬剤（例えば免疫抑制剤）又は放射性同位体などの治療用の成分又は物質に結合した抗ＧＴ４６８抗体を特徴とする。そのような複合体を本明細書では「免疫複合体」と称する。１又はそれ以上の細胞毒を含む免疫複合体を「イムノトキシン」と称する。細胞毒又は細胞傷害性物質は、細胞に対して有害であり、特に細胞を死滅させる任意の物質を含む。例は、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール及びピューロマイシン並びにそれらの類似体又はホモログを含む。
【０１９２】
本発明の免疫複合体を形成するための適切な治療薬は、代謝拮抗物質（例えばメトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５−フルオロウラシル、デカルバジン）、アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）（シスプラチン）、アントラサイクリン（例えばダウノルビシン（以前のダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えばダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン及びアントラマイシン（ＡＭＣ））、及び抗有糸分裂薬（例えばビンクリスチン及びビンブラスチン）を含むが、これらに限定されない。好ましい実施態様では、治療薬は細胞傷害性物質又は放射性毒性物質である。別の実施態様では、治療薬は免疫抑制剤である。さらに別の実施態様では、治療薬はＧＭ−ＣＳＦである。好ましい実施態様では、治療薬は、ドキソルビシン、シスプラチン、硫酸ブレオマイシン、カルムスチン、クロラムブシル、シクロホスファミド又はリシンＡである。
【０１９３】
本発明の抗体はまた、癌などのＧＴ４６８関連疾患を治療するための細胞傷害性放射性薬剤を作製するために、放射性同位体、例えばヨウ素−１３１、イットリウム−９０又はインジウム−１１１に結合することができる。本発明の抗体複合体は、所与の生物学的応答を修飾するために使用でき、薬剤部分は古典的化学療法剤に限定されると解釈されるべきではない。例えば薬剤部分は、所望の生物活性を有するタンパク質又はポリペプチドであり得る。そのようなタンパク質は、例えばアブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、又はジフテリア毒素などの酵素活性毒素又はその活性フラグメント；腫瘍壊死因子又はインターフェロンγなどのタンパク質；又は、例えばリンホカイン、インターロイキン−１（「ＩＬ−１」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、顆粒球コロニー刺激因子（「Ｇ−ＣＳＦ」）、又は他の増殖因子などの生物学的応答調節物質を含み得る。
【０１９４】
そのような治療用成分を抗体に結合するための手法は周知であり、例えばＡｒｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ"，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２４３−５６（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ"，ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．６２３−５３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，"Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ"，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  '８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｐｉｎｃｈｅｒａｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．４７５−５０６（１９８５）；"Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ"，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．３０３−１６（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）、及びＴｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，"Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ"，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，６２：１１９−５８（１９８２）参照。
【０１９５】
さらなる実施形態では、本発明による抗体を、抗体を放射性同位体に結合することを可能にするリンカーキレート化剤、例えばチウキセタンに連結する。
【０１９６】
［ＩＩＩ．医薬組成物］
別の態様では、本発明は、本発明の抗体の１つ又は本発明の抗体の組合せを含有する組成物、例えば医薬組成物を提供する。医薬組成物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９５に開示されているような従来の手法に従って、医薬的に許容される担体又は希釈剤並びに他の任意の公知のアジュバント及び賦形剤と共に製剤し得る。１つの実施形態では、組成物は、異なる機序によって作用する本発明の複数の（例えば２又はそれ以上）単離抗体の組合せ、例えば主としてＣＤＣを誘導することによって働く１つの抗体と主としてアポトーシスを誘導することによって働く別の抗体との組合せを含む。
【０１９７】
本発明の医薬組成物はまた、併用療法において、すなわち他の薬剤と併用して投与することができる。例えば併用療法は、少なくとも１つの抗炎症薬又は少なくとも１つの免疫抑制剤と本発明の組成物を含み得る。１つの実施形態では、そのような治療薬は、例えばステロイド系薬剤又はＮＳＡＩＤ（非ステロイド系抗炎症薬）などの、１又はそれ以上の抗炎症薬を含む。好ましい薬剤は、例えば、アスピリン及び他のサリチル酸塩、ロフェコキシブ（Ｖｉｏｘｘ）及びセレコキシブ（Ｃｅｌｅｂｒｅｘ）などのＣｏｘ−２阻害剤、イブプロフェン（Ｍｏｔｒｉｎ，Ａｄｖｉｌ）、フェノプロフェン（Ｎａｌｆｏｎ）、ナプロキセン（Ｎａｐｒｏｓｙｎ）、スリンダック（Ｃｌｉｎｏｒｉｌ）、ジクロフェナク（Ｖｏｌｔａｒｅｎ）、ピロキシカム（Ｆｅｌｄｅｎｅ）、ケトプロフェン（Ｏｒｕｄｉｓ）、ジフルニサール（Ｄｏｌｏｂｉｄ）、ナブメトン（Ｒｅｌａｆｅｎ）、エトドラク（Ｌｏｄｉｎｅ）、オキサプロジン（Ｄａｙｐｒｏ）、及びインドメタシン（Ｉｎｄｏｃｉｎ）などのＮＳＡＩＤを含む。
【０１９８】
別の実施形態では、そのような治療薬は、低用量シクロホスファミド、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＩＬ−２又は抗ＩＬ−２受容体抗体のような、調節Ｔ細胞の枯渇又は機能的不活性化を導く物質を含む。
【０１９９】
さらに別の実施形態では、そのような治療薬は、タキソール誘導体、タキソテール、ゲムシタビン、５−フルオロウラシル、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、シスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ）、シクロホスファミド（Ｃｙｔｏｘａｎ、Ｐｒｏｃｙｔｏｘ、Ｎｅｏｓａｒ）などの１又はそれ以上の化学療法剤を含む。別の実施形態では、本発明の抗体は、好ましくは乳癌、肺癌、胃癌及び／又は卵巣癌、又は、例えばここに記載されるような他の癌型に罹患している患者において治療効果を示す化学療法剤と併用して投与し得る。
【０２００】
さらに別の実施形態では、本発明の抗体は、放射線治療及び／又は自己末梢幹細胞又は骨髄移植と併用して投与し得る。
【０２０１】
さらに別の実施形態では、本発明の抗体は、抗ＣＤ２５抗体、抗ＥＰＣＡＭ抗体、抗ＥＧＦＲ、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ及び抗ＣＤ４０抗体から選択される１又はそれ以上の抗体と併用して投与し得る。
【０２０２】
なおさらなる実施形態では、本発明の抗体は、補体活性化を増強するために抗Ｃ３ｂ（ｉ）抗体と併用して投与し得る。
【０２０３】
本明細書において使用される、「医薬的に許容される担体」は、生理的に適合性である任意のすべての溶媒、分散媒、被覆物、抗菌剤及び抗真菌剤、等張化剤及び吸収遅延剤等を含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与（例えば注射又は注入による）に適する。投与経路に依存して、活性化合物、すなわち抗体、二重特異性及び多重特異性分子を、化合物を不活性化する可能性がある酸及び他の自然条件の作用から化合物を保護するための物質で被覆し得る。
【０２０４】
「医薬的に許容される塩」は、親化合物の所望の生物活性を保持し、望ましくない毒性作用を与えない塩を指す（例えばＢｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９参照）。
【０２０５】
そのような塩の例は、酸付加塩及び塩基付加塩を含む。酸付加塩は、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸等のような非毒性無機酸から、並びに脂肪族モノ及びジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族及び芳香族スルホン酸等のような非毒性有機酸から誘導されるものを含む。塩基付加塩は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等のようなアルカリ土類金属から、並びにＮ，Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカイン等のような非毒性有機アミンから誘導されるものを含む。
【０２０６】
本発明の組成物は、当該技術分野において公知の様々な方法によって投与することができる。当業者に認識されるように、投与の経路及び／又は方式は所望の結果に依存して異なる。活性化合物は、インプラント、経皮パッチ及びマイクロカプセル化送達システムを含む、制御放出製剤などの、迅速な放出から化合物を保護する担体と共に調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸などの、生分解性で生体適合性のポリマーが使用できる。そのような製剤の調製のための方法は一般に当業者に公知である。例えばＳｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８参照。
【０２０７】
ある一定の投与経路によって本発明の化合物を投与するには、その不活性化を防ぐための物質で化合物を被覆するか、又は該物質と化合物を同時投与することが必要であり得る。例えば、化合物を適切な担体中で、例えばリポソーム又は希釈剤中で被験者に投与し得る。医薬的に許容される希釈剤は、生理食塩水及び水性緩衝液を含む。リポソームは、水中油中水型ＣＧＦエマルジョン並びに従来のリポソームを含む（Ｓｔｒｅｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．７：２７）。
【０２０８】
医薬的に許容される担体は、滅菌水溶液又は分散液及び滅菌注射溶液又は分散液の即時調製用の滅菌粉末を含む。医薬的に活性な物質のためのそのような媒質及び物質の使用は当該技術分野において公知である。従来の媒質又は物質が活性化合物と不適合性でない限り、本発明の医薬組成物におけるその使用が考慮される。補助的な活性化合物も組成物に組み込むことができる。
【０２０９】
治療用組成物は、典型的には製造及び保存条件下で無菌且つ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、又は高い薬剤濃度に適する他の秩序構造として製剤することができる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等）、及びそれらの適切な混合物を含有する溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えばレシチンなどの被覆物の使用によって、分散の場合は必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって保持できる。多くの場合、等張化剤、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、又は塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸塩及びゼラチンを組成物中に含めることにより、注射用組成物の持続的な吸収を生じさせることができる。
【０２１０】
滅菌注射用溶液は、必要量の活性化合物を、必要に応じて上記に列挙した成分の１つ又は成分の組合せと共に適切な溶媒に組み込み、続いて滅菌精密ろ過することによって調製できる。
【０２１１】
一般に、分散液は、基本的分散媒及び上記に列挙したものの中から必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、あらかじめ滅菌ろ過されたそれらの溶液から、有効成分に加えて任意の付加的な所望の成分を含む粉末を生成する真空乾燥及び凍結乾燥である。
【０２１２】
投与法は、至適な所望の応答（例えば治療応答）を与えるように調節される。例えば単回ボーラスを投与し得るか、又は数回の分割用量を一定期間にわたって投与してもよく、又は治療状況の緊急性によって指示されるのに比例して用量を低減又は増加してもよい。投与を容易にし、用量を均一にするために非経口組成物を単位投与形態として処方することは特に好都合である。本明細書において使用される単位投与形態は、治療する被験者にとっての単位用量として適する物理的に分離した単位を指す；各々の単位は、必要な医薬担体と共同して所望の治療効果を生じさせるように計算された、所定量の活性化合物を含有する。本発明の単位投与形態についての規格は、（ａ）活性化合物の独自の特徴及び達成しようとする特定の治療効果、及び（ｂ）個体における感受性の治療のためにそのような活性化合物を調剤する技術分野に固有の限界によって決定され、直接それらに依存する。
【０２１３】
医薬的に許容される抗酸化剤の例は以下を含む：（１）アスコルビン酸、塩酸システイン、重硫酸ナトリウム、メタ重硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等のような水溶性抗酸化剤；（２）パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロール等のような油溶性抗酸化剤；及び（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸等のような金属キレート化剤。
【０２１４】
治療用組成物に関して、本発明の製剤は、経口、経鼻、局所（口腔内及び舌下を含む）、直腸、膣及び／又は非経口投与に適するものを含む。処方物は単位投与形態として好都合に提供でき、薬学技術分野において公知の任意の方法によって調製し得る。単一投与形態を生産するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、治療する被験者及び特定投与方法に依存して異なる。単一投与形態を生産するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、一般に治療効果を生じさせる組成物の量である。
【０２１５】
一般に、１００％のうちで、この量は約０．０１％〜約９９％の有効成分、好ましくは約０．１％〜約７０％、最も好ましくは約１％〜約３０％の範囲である。
【０２１６】
経膣投与に適する本発明の製剤はまた、適切であることが当該技術分野において公知の担体を含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡又はスプレー製剤を含む。本発明の組成物の局所又は経皮投与用の剤型は、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ及び吸入剤を含む。活性化合物を、医薬的に許容される担体と共に、及び必要に応じて任意の防腐剤、緩衝剤又は高圧ガスと共に無菌条件下で混合し得る。
【０２１７】
本明細書において使用される「非経口投与」及び「非経口的に投与される」という語句は、通常は注射による、腸内及び局所投与以外の投与方法を意味し、限定を伴わずに、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、髄腔内、硬膜外及び胸骨内への注射及び注入を含む。
【０２１８】
本発明の医薬組成物において使用し得る適切な水性及び非水性担体の例は、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等）、及びそれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、及びオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルを含む。適切な流動性は、例えばレシチンなどの被覆材料の使用によって、分散の場合は必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって保持できる。
【０２１９】
これらの組成物はまた、防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などのアジュバントを含有し得る。微生物の存在は、滅菌手順、及び様々な抗菌及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸等を含むことの両方によって確実に予防し得る。また、糖類、塩化ナトリウム等の等張化剤を組成物に組み込むことも望ましいと考えられる。加えて、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの吸収を遅延させる物質を組成物中に含めることにより、注射用薬剤形態の持続的な吸収を生じさせ得る。
【０２２０】
１つの実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は、皮下注射によって結晶形態で投与される。Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）ＰＮＡＳ，１００（１２）：６９３４−６９３９参照。本発明の化合物を薬剤としてヒト及び動物に投与するとき、それらを単独で与えるか又は、例えば医薬的に許容される担体と組み合わせて０．０１〜９９．５％（より好ましくは０．１〜９０％）の有効成分を含有する医薬組成物として投与できる。
【０２２１】
選択する投与経路にかかわらず、適切な水和形態として使用し得る本発明の化合物、及び／又は本発明の医薬組成物は、当業者に公知の従来の方法によって医薬的に許容される投与形態に製剤される。
【０２２２】
本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の用量レベルは、患者への毒性を伴わずに、特定の患者、組成物及び投与方法に関して所望の治療応答を達成するために有効な有効成分の量が得られるように変化させ得る。選択される用量レベルは、使用する本発明の特定組成物の活性、投与経路、投与時間、使用する特定化合物の排泄速度、治療期間、使用する特定組成物と組み合わせて使用される他の薬剤、化合物及び／又は物質、治療する患者の年齢、性別、体重、状態、全身の健康及び既往歴、並びに医学技術分野において周知の同様の因子を含む様々な薬物動態因子に依存する。
【０２２３】
当該技術分野における通常の技術を有する医師又は獣医は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定し、処方することができる。例えば医師又は獣医は、医薬組成物中で使用される本発明の化合物の用量を、所望の治療効果を達成するために必要とされるよりも低いレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加することができる。一般に、本発明の組成物の適切な１日用量は、治療効果を生じさせるために有効な最小用量である化合物の量である。そのような有効用量は一般に、上述した因子に依存する。投与は静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下経路であることが好ましく、好ましくは標的部位の近位に投与される。所望により、治療組成物の有効１日用量を、場合により単位投与形態で、１日を通じて適切な間隔を置いて別々に投与される２、３、４、５、６又はそれ以上の小分け用量として投与し得る。本発明の化合物を単独で投与することも可能であるが、医薬製剤（組成物）として化合物を投与することが好ましい。
【０２２４】
１つの実施形態では、本発明の抗体は、毒性副作用を低減するために注入によって、好ましくは２４時間以上などの長期間にわたる緩やかな持続注入によって投与し得る。投与はまた、２〜２４時間、例えば２〜１２時間にわたる持続注入によって実施し得る。そのような投与計画を、必要に応じて、例えば６ヶ月後又は１２ヶ月後に、１又はそれ以上の回数、繰り返してもよい。用量は、抗ＧＴ４６８抗体を標的する抗イディオタイプ抗体を使用して、生物学的試料における投与時の循環モノクローナル抗ＧＴ４６８抗体の量を測定することによって決定又は調節できる。
【０２２５】
さらに別の実施形態では、抗体は、例えば６カ月又はそれ以上の期間にわたって週に１回などの、維持療法によって投与される。
【０２２６】
さらに別の実施形態では、本発明による抗体は、ＧＴ４６８に対する抗体の１回の注入、続いて放射性同位体に結合したＧＴ４６８に対する抗体の注入によって投与し得る。この投与計画は、例えば７〜９日後に繰り返してもよい。
【０２２７】
治療組成物は、当該技術分野において公知の医療装置を用いて投与できる。例えば好ましい実施形態では、本発明の治療組成物は、米国特許第５，３９９，１６３号；同第５，３８３，８５１号；同第５，３１２，３３５号；同第５，０６４，４１３号；同第４，９４１，８８０号；同第４，７９０，８２４号；又は同第４，５９６，５５６号に開示されている装置などの、無針皮下注射装置で投与することができる。本発明において有用な周知のインプラント及びモジュールの例は、制御された速度で薬剤を分配する移植可能なマイクロインフュージョンポンプを開示する米国特許第４，４８７，６０３号；皮膚を通して薬剤を投与するための治療用装置を開示する米国特許第４，４８６，１９４号；正確な注入速度で薬剤を送達するための医療用インフュージョンポンプを開示する米国特許第４，４４７，２３３号；持続的な薬剤送達のための可変流量式移植可能注入装置を開示する米国特許第４，４４７，２２４号；複数のチェンバー区画を有する浸透圧薬剤送達システムを開示する米国特許第４，４３９，１９６号；及び浸透圧薬剤送達システムを開示する米国特許第４，４７５，１９６号に記載されているものを含む。
【０２２８】
他の多くのそのようなインプラント、送達システム及びモジュールが当業者に公知である。ある実施形態では、本発明の抗体は、インビボでの適切な分布を確実にするように処方することができる。例えば血液脳関門（ＢＢＢ）は多くの高度親水性化合物を排除する。本発明の治療化合物が確実にＢＢＢを越える（所望により）ようにするため、それらを、例えばリポソームに製剤することができる。リポソームを製造する方法については、例えば米国特許第４，５２２，８１１号；同第５，３７４，５４８号；及び第５，３９９，３３１号参照。リポソームは、特定細胞又は器官に選択的に輸送され、これにより標的薬剤送達を増強する１又はそれ以上の部分を含み得る（例えばＶ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５参照）。例示的な標的分子は、葉酸塩又はビオチン（例えばＬｏｗ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第５，４１６，０１６号参照）；マンノシド類（Ｕｍｅｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８）；抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５７：１４０；Ｍ．Ｏｗａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０）；及びサーファクタントプロテインＡ受容体（Ｂｒｉｓｃｏｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４）を含む。
【０２２９】
本発明の１つの実施形態では、本発明の治療用化合物はリポソーム中に製剤される。より好ましい実施形態では、リポソームは標的部分を含む。最も好ましい実施形態では、リポソーム中の治療用化合物は、所望の領域の近位部位、例えば腫瘍の部位にボーラス注射によって送達される。組成物は、容易に注射できる程度に流動性でなければならない。製造及び保存条件下で安定でなければならず、また細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護されねばならない。
【０２３０】
さらなる実施形態では、本発明の抗体は、胎盤を越える輸送を防ぐ又は低減するように製剤することができる。これは当該技術分野で公知の方法によって、例えば抗体のＰＥＧ化によって又はＦ（ａｂ）２'フラグメントの使用によって実施できる。さらに"Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ−Ｒｕｎｄｌｅｓ  Ｃ，Ｚｈｕｏ  Ｚ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  Ｂ５  Ｋｅｅｎａｎ  Ｊ．（１９９２）  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｇｌｙｃｏｌ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１５２：１７７−１９０；及び"Ｌａｎｄｏｒ  Ｍ．（１９９５）Ｍａｔｅｒｎａｌ−ｆｅｔａｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ，Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７４：２７９−２８３が参照できる。
【０２３１】
腫瘍治療のための「治療有効量」は、完全又は部分的であり得る他覚的腫瘍応答によって測定することができる。完全応答（ＣＲ）は、疾患の臨床的、放射線医学的又は他の証拠がないことと定義される。部分応答（ＰＲ）は、腫瘍集合体の大きさの５０％以上の減少から生じる。進行までの平均時間は、他覚的腫瘍応答の持続性を特徴づける測定値である。
【０２３２】
腫瘍治療のための「治療有効量」はまた、疾患の進行を安定化するその能力によっても測定できる。癌を抑制する化合物の能力は、ヒト腫瘍における効果を予測する動物モデル系において評価できる。代替的には、組成物のこの特性は、当業者に公知のインビトロアッセイによって細胞増殖又はアポトーシスを阻害する化合物の能力を検査することによって評価できる。治療用化合物の治療有効量は、被験者において腫瘍の大きさを減少させるか、又は症状を改善することができる。当業者は、被験者の大きさ、被験者の症状の重症度、及び選択される特定組成物又は投与経路などの因子に基づいてそのような量を決定することができる。
【０２３３】
組成物は、無菌であり、注射器によって送達可能である程度に流動性でなければならない。水に加えて、担体は、等張緩衝食塩水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等）、及びそれらの適切な混合物であり得る。適切な流動性は、例えばレシチンなどの被覆物の使用によって、分散の場合は必要な粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって保持できる。多くの場合、等張化剤、例えば糖類、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、及び塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム又はゼラチンを組成物中に含めることにより、注射用組成物の長期的な吸収を生じさせることができる。
【０２３４】
上述したように、活性化合物が適切に保護されているとき、化合物は、例えば不活性希釈剤又は同化可能な食用担体と共に経口投与し得る。
【０２３５】
［ＩＶ．発明の用途及び方法］
本発明の抗体（本明細書の中に記載される免疫複合体、二重特異性／多重特異性分子、組成物及び他の誘導体を含む）は、ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞が関与する疾患の治療を含む、数多くの治療上の有用性を有する。例えば抗体は、本明細書に記載されるような様々な疾患を治療する又は予防するために、例えばインビトロ又はエクスビボで培養下の細胞に、又は例えばインビボでヒト被験者に投与することができる。本明細書において使用される、「被験者」という用語は、ＧＴ４６８に対する抗体に応答するヒト及び非ヒト動物を包含することが意図されている。好ましい被験者は、疾患細胞、特に正常細胞と比較してＧＴ４６８の変化した発現パターン及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合の変化したパターンによって特徴づけられる細胞を死滅させることによって矯正できる又は改善できる疾患を有するヒト患者を含む。
【０２３６】
本明細書で論じる治療における治療効果は、好ましくは、例えば補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を介した細胞溶解、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介した細胞溶解、アポトーシス、同型接着、及び／又は貪食作用を誘導することによって、好ましくはＣＤＣを介した細胞溶解及び／又はＡＤＣＣを介した細胞溶解を誘導することによって細胞の死滅を媒介する、本発明の抗体の機能的特性を通して達成される。
【０２３７】
例えば１つの実施形態では、本発明の抗体は、腫瘍形成性疾患、例えば、乳癌を含む、ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞の存在を特徴とする疾患を有する被験者を治療するために使用できる。治療及び／又は予防できる腫瘍形成性疾患の例は、乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、結腸癌、膵癌、食道癌、頭頸部癌、腎癌、前立腺癌及び肝癌を含む、ＧＴ４６８を発現するすべての癌及び腫瘍実体を包含する。これらの癌は、早期、中期又は進行期、例えば転移であり得る。
【０２３８】
本発明に従って記載される医薬組成物及び治療方法はまた、本明細書に記載される疾患を予防するための免疫又はワクチン接種にも使用し得る。
【０２３９】
別の実施形態では、本発明の抗体は、ＧＴ４６８若しくは特定形態のＧＴ４６８のレベル、又はそれらの膜表面にＧＴ４６８を含む細胞のＧＴ４６８レベルを検出するために使用でき、その後、それらのレベルを上述したような特定の疾患又は疾患症状に結び付けることができる。代替的には、抗体は、ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞の機能を枯渇させるか又は該細胞の機能と相互作用させ、それによってこれらの細胞を疾患の重要な媒介物質として関係づけることができる。これは、抗体とＧＴ４６８の間での複合体の形成を可能にする条件下で試料及び対照試料を抗ＧＴ４６８抗体と接触させることによって達成できる。抗体とＧＴ４６８の間で形成される任意の複合体を検出し、試料及び対照試料、すなわち参照試料において比較することができる。
【０２４０】
本発明の抗体は、最初にインビトロでの治療的又は診断的用途に関連するそれらの結合活性に関して試験することができる。例えば本明細書に記載されるフローサイトメトリーアッセイを用いて抗体を試験することができる。
【０２４１】
さらに、ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞の増殖を阻害すること及び／又は該細胞を死滅させることを含む、少なくとも１つのエフェクター媒介性エフェクター細胞活性を惹起する上での抗体の活性を検定することができる。例えばＣＤＣ及び／又はアポトーシスを惹起する抗体の能力が検定できる。ＣＤＣ、同型接着、分子クラスタリング又はアポトーシスを検定するためのプロトコールを本明細書に記載される。
【０２４２】
本発明の抗体は、以下の生物活性の１又はそれ以上をインビボ又はインビトロで惹起するために使用できる：ＧＴ４６８を発現する及び／又はその細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞の増殖及び／又は分化を阻害する；ＧＴ４６８を発現する及び／又はその細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞を死滅させる；エフェクター細胞の存在下でＧＴ４６８を発現する及び／又はその細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞の貪食作用又はＡＤＣＣを媒介する；補体の存在下でＧＴ４６８を発現する及び／又はその細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞のＣＤＣを媒介する；ＧＴ４６８を発現する及び／又はその細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞のアポトーシスを媒介する；同型接着を誘導する；及び／又はＧＴ４６８に結合したとき脂質ラフトへの転位を誘導する。
【０２４３】
特定実施形態では、抗体は、様々なＧＴ４６８関連疾患を治療する、予防する又は診断するためにインビボ又はインビトロで使用される。ＧＴ４６８関連疾患の例は、中でも特に、乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、肝細胞癌、結腸癌、膵癌、食道癌、頭頸部癌、腎癌、前立腺癌及び肝癌などの癌を含む。
【０２４４】
インビボ及びインビトロで本発明の抗体組成物を投与する適切な経路は当該技術分野において周知であり、当業者によって選択され得る。
【０２４５】
上述したように、本発明の抗ＧＴ４６８抗体は、本発明の抗体に対する免疫応答の誘導を低減するために１又はそれ以上の他の治療薬、例えば細胞傷害性薬剤、放射性毒性物質、抗血管新生薬及び／又は免疫抑制剤と同時投与することができる。抗体は、作用物質に連結する（免疫複合体として）ことができるか又は物質とは別に投与することができる。後者（別々の投与）の場合、抗体は、物質の前、後若しくは同時に投与できるか、又は他の公知の治療、例えば抗癌治療、例えば放射線と同時投与することができる。そのような治療薬は、中でも特に、上記に列挙したような抗腫瘍薬を含む。化学療法剤と本発明の抗ＧＴ４６８抗体の同時投与は、腫瘍細胞に対して細胞傷害作用を生じさせる、異なる機序を通して働く２つの抗癌剤を提供する。そのような同時投与は、薬剤に対する耐性の発現又は腫瘍細胞を抗体と非反応性にする、腫瘍細胞の抗原性の変化を原因とする問題を解決することができる。
【０２４６】
本発明の別の特定実施形態では、抗体を投与される被験者は、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦＲを標的する抗体及び血管新生を阻害する１又はそれ以上の化合物を含む抗血管新生薬で付加的に治療される。これらの薬剤による前処理又は並行適用は、バルク腫瘍内への抗体の浸透を改善し得る。
【０２４７】
本発明の別の特定実施形態では、抗体を投与される被験者は、ＥＧＦＲ受容体に結合するモノクローナル抗体並びにＥＧＦＲ、Ｈｅｒ１又はＨｅｒ２／ｎｅｕ受容体によって開始されるシグナル伝達を阻害する化合物を含む、増殖因子受容体のシグナル伝達を阻害する化合物で付加的に治療される。
【０２４８】
標的特異的エフェクター細胞、例えば本発明の組成物（例えば抗体、多重特異性及び二重特異性分子）に結合するエフェクター細胞も、治療薬として使用することができる。ターゲティングのためのエフェクター細胞は、マクロファージ、好中球又は単球などのヒト白血球であり得る。他の細胞は、好酸球、ナチュラルキラー細胞及び他のＩｇＧ又はＩｇＡ受容体担持細胞を含む。所望により、治療する被験者からエフェクター細胞を得ることができる。標的特異的エフェクター細胞は、生理的に許容される溶液中の細胞の懸濁液として投与できる。投与される細胞の数は、約１０８〜１０９であり得るが、治療目的に依存して異なる。一般に、その量は、標的細胞、例えばＧＴ４６８を発現する及び／又はその細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる腫瘍細胞における局在を得るため、及び、例えば貪食作用によって、細胞の死滅を生じさせるために十分である。投与経路も様々に変化し得る。
【０２４９】
標的特異的エフェクター細胞による治療は、標的細胞の除去のための他の手法を併用して実施することができる。例えば本発明の組成物及び／又はこれらの組成物を装備したエフェクター細胞を用いる抗腫瘍治療を化学療法と共に使用することができる。加えて、併用免疫療法も、２つの異なる細胞傷害性エフェクター集団を腫瘍細胞の排除へと向かわせるために使用し得る。例えば抗Ｆｃ−ＲＩ又は抗ＣＤ３に結合した抗ＧＴ４６８抗体を、ＩｇＧ又はＩｇＡ受容体特異的結合剤と共に使用し得る。
【０２５０】
本発明の二重特異性及び多重特異性分子はまた、細胞表面上の受容体をキャップし、排除することなどにより、エフェクター細胞上のＦｃγＲ又はＦｃαＲレベルを調節するために使用できる。抗Ｆｃ受容体の混合物もこの目的のために使用できる。
【０２５１】
補体に結合するＩｇＧ１、ＩｇＧ２若しくはＩｇＧ３又はＩｇＭからの部分などの、補体結合部位を有する本発明の組成物（例えば抗体、多重特異性及び二重特異性分子及び免疫複合体）も、補体の存在下で使用することができる。１つの実施形態では、本発明の結合剤及び適切なエフェクター細胞による、標的細胞を含む細胞の集団のエクスビボ処理を、補体又は補体を含む血清の添加によって補足することができる。本発明の結合剤で被覆した標的細胞の貪食作用は、補体タンパク質の結合によって改善し得る。別の実施形態では、本発明の組成物で被覆した標的細胞も、補体によって溶解することができる。さらに別の実施形態では、本発明の組成物は補体を活性化しない。
【０２５２】
本発明の組成物はまた、補体と共に投与することができる。従って、抗体、多重特異性又は二重特異性分子及び血清又は補体を含む組成物は本発明の範囲内である。これらの組成物は、補体が抗体、多重特異性又は二重特異性分子にごく近接して位置するという点で有利である。
【０２５３】
代替的には、本発明の抗体、多重特異性又は二重特異性分子及び補体又は血清を別々に投与することができる。標的細胞への本発明の組成物の結合は、ＧＴ４６８抗原−抗体複合体の、細胞膜の脂質ラフト内への転位を生じさせ得る。そのような転位は、ＣＤＣを効率的に活性化し得る及び／又は増強し得る高密度の抗原−抗体複合体を創製する。
【０２５４】
本発明の抗体組成物（例えば抗体及び免疫複合体）及び使用のための指示書を含むキットも本発明の範囲内である。キットは、免疫抑制試薬、細胞傷害性物質又は放射性毒性物質などの１又はそれ以上の付加的な試薬、又は本発明の１又はそれ以上の付加的な抗体（例えば補完的な活性を有する抗体）をさらに含有することができる。
【０２５５】
従って、本発明の抗体組成物で治療される患者は、本発明の抗体の治療効果を増強する又は高める、細胞傷害性物質又は放射性毒性物質などの別の治療薬を付加的に投与され得る（本発明の抗体の投与の前に、投与と同時に又は投与後に）。
【０２５６】
他の実施態様では、例えば被験者をサイトカインで治療することにより、Ｆｃγ又はＦｃα受容体の発現又は活性を調節する、例えば高める又は阻害する物質で被験者を付加的に治療することができる。好ましいサイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含む。本明細書に記載される抗体及び医薬組成物の治療効果を高めるための他の重要な物質は、分枝グルコース残基のホモ多糖であり、様々な植物及び微生物、例えば細菌、藻類、真菌、酵母及び穀物によって生産されるβグルカンである。生物によって生産されるβグルカンのフラグメントも使用し得る。好ましくは、βグルカンは、骨格グルコース単位の少なくとも一部、例えば骨格グルコース単位の３〜６％がβ（１，６）分枝などの分枝を有する、β（１，３）グルコースのポリマーである。
【０２５７】
特定実施形態では、本発明は、試料及び対照試料を、抗体又はその部分とＧＴ４６８の間での複合体の形成を可能にする条件下で、ＧＴ４６８に特異的に結合する抗体と接触させることを含む、試料中のＧＴ４６８抗原の存在を検出する、又はＧＴ４６８抗原の量を測定するための方法を提供する。次に複合体の形成を検出し、対照試料と比較したときの試料の複合体形成の差が試料中のＧＴ４６８抗原の存在の指標である。
【０２５８】
さらに別の実施形態では、本発明は、インビボ又はインビトロでＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞の存在を検出する又は細胞の量を定量化するための方法を提供する。その方法は、（ｉ）検出可能なマーカーに結合した本発明の組成物を被験者に投与すること；及び（ｉｉ）ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞を含む領域を同定するために、被験者を、該検出可能なマーカーを検出するための手段に曝露することを含む。
【０２５９】
上述した方法は、特に、ＧＴ４６８関連疾患を診断するため及び／又は癌疾患などのＧＴ４６８関連疾患の局在化のために有用である。好ましくは、対照試料におけるＧＴ４６８の量よりも多い試料中のＧＴ４６８の量は、その試料が由来する被験者、特にヒトにおけるＧＴ４６８関連疾患の存在の指標である。
【０２６０】
さらに別の実施形態では、化合物（例えば治療薬、標識、細胞毒、放射性毒素、免疫抑制剤等）を抗体に結合することにより、ＧＴ４６８がそれらの表面と結合している細胞にそのような化合物を標的するために本発明の免疫複合体が使用できる。このため、本発明はまた、循環腫瘍細胞などの、ＧＴ４６８を発現する及び／又はそれらの細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞をエクスビボ又はインビトロで局在化するための方法を提供する。
【０２６１】
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、それらの実施例は本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２６２】
実施例１：実験材料及び方法
本明細書において言及する手法及び方法は、それ自体公知である方法で及び、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載されているように、又は以下に記載されるように実施される。キット及び試薬の使用を含むすべての方法は製造者の情報に従って実施される。
【０２６３】
＜組織及び細胞系＞
組換えＤＮＡ作業を、公式の許可を得て、Ｒｈｅｉｎｌａｎｄ−Ｐｆａｌｚ州政府の規則に従って実施した。組織は、常套的な診断又は治療手順の間のヒトの余剰材料として入手し、使用時まで−８０℃で保存した。乳癌細胞系ＭＣＦ−７及びＢＴ５４９をＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳにおいて培養した。
【０２６４】
＜ＲＮＡの単離、ＲＴ−ＰＣＲ及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ＞
ＲＮＡの抽出、第一鎖ｃＤＮＡの合成、ＲＴ−ＰＣＲ及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを先に記載されているように（Ｋｏｓｌｏｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｓａｈｉｎ，Ｕ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｃ．＆  Ｔｕｒｅｃｉ，Ｏ．（２００６）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１５，２３９２−２３９９）実施した。エンドポイント解析のためにＧＴ４６８特異的オリゴヌクレオチド（センス５'−ＡＡＡ  ＴＴＴ  ＧＧＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＣＴＴ  ＣＡＣ−３'；アンチセンス５'−ＴＧＡ  ＴＧＣ  ＣＡＣ  ＡＴＴ  ＣＡＧ  ＴＡＡ  ＣＡＣ−３'、６０℃でアニーリング）を３５サイクルのＲＴ−ＰＣＲにおいて使用した。リアルタイムの定量的発現解析を４０サイクルのＲＴ−ＰＣＲにおいて三重に実施した。ＨＰＲＴ（センス５'−ＴＧＡ  ＣＡＣ  ＴＧＧ  ＣＡＡ  ＡＡＣ  ＡＡＴ  ＧＣＡ−３'；アンチセンス５'−ＧＧＴ  ＣＣＴ  ＴＴＴ  ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＣＡＡ  ＧＣＴ−３'、６２℃でアニーリング）に正規化した後、△△ＣＴ法の計算を用いて、腫瘍試料中のＧＴ４６８転写産物を正常組織と比較して定量化した。任意の選択試料からの増幅産物をクローニングし、配列決定することによってＰＣＲ反応の特異性を確認した。
【０２６５】
＜バイオインフォマティクス＞
栄養芽層特異的分子のインシリコでのクローニングのために、別の場所で詳述されているデータマイニング法を修正して適合させた（Ｋｏｓｌｏｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｂｅｌｌ，Ｃ，Ｓｅｉｔｚ，Ｇ．，Ｌｅｈｒ，Ｈ．Ａ．，Ｒｏｅｍｅｒ，Ｋ．，Ｍｕｎｔｅｆｅｒｉｎｇ，Ｈ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｃ，Ｓａｈｉｎ，Ｕ．＆  Ｔｕｒｅｃｉ，Ｏ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４，５９８８−５９９３；Ｋｏｓｌｏｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｔｕｒｅｃｉ，Ｏ．，Ｂｅｌｌ，Ｃ，Ｋｒａｕｓｅ，Ｐ．，Ｌｅｈｒ，Ｈ．Ａ．，Ｂｒｕｎｎｅｒ，Ｊ．，Ｓｅｉｔｚ，Ｇ．，Ｎｅｓｔｌｅ，Ｆ．Ｏ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｃ．＆  Ｓａｈｉｎ，Ｕ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２，６７５０−６７５５；Ｋｏｓｌｏｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｓａｈｉｎ，Ｕ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｃ．＆  Ｔｕｒｅｃｉ，Ｏ．（２００６）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１５，２３９２−２３９９）。簡単に述べると、ＧｅｎＢａｎｋの階層化キーワード検索をデジタルｃＤＮＡ−サブトラクションと組み合わせた。
【０２６６】
キーワード検索のために、ＥＮＴＲＥＺ  Ｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｅｎｔｒｅｚ）を使用して、胎盤又は栄養芽層組織において特異的に発現されると注釈されている遺伝子に関してＧｅｎＢａｎｋのヌクレオチド配列ファイルにアクセスした。冗長性を除くためにすべてのヒトヌクレオチド配列に対する各々のヌクレオチド配列についての配列相同性検索プログラムＢＬＡＳＴＮ（ｈｔｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ）を連続的に実施した。２番目のフィルターとして、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ）のＥＳＴデータベースに対する各々の対象ＤＮＡ配列のＢＬＡＳＴ検索によるキーワード検索で得たすべてのクローンに関して電子的ノーザン（ｅＮｏｒｔｈｅｒｎ）を実施した。公知のいくつかのｃＤＮＡライブラリーが正しく注釈されていない（Ｓｃｈｅｕｒｌｅ，Ｄ．，Ｄｅ  Ｙｏｕｎｇ，Ｍ．Ｐ．，Ｂｉｎｎｉｎｇｅｒ，Ｄ．Ｍ．，Ｐａｇｅ，Ｈ．，Ｊａｈａｎｚｅｂ，Ｍ．＆  Ｎａｒａｙａｎａｎ，Ｒ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０，４０３７−４０４３）ことを考慮に入れた。
【０２６７】
デジタルサブトラクションのために、各々のプールが単一ライブラリー又はいくつかのライブラリーのいずれかであり得る、ｃＤＮＡの２つのプール（Ａ及びＢ）の間の遺伝子発現を比較する、ＮＣＢＩのＣａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｔｏｍｙ  ＰｒｏｊｅｃｔｃＤＮＡ  ｘＰｒｏｆｉｌｅｒツール（ｈｔｔｐ：／／ｃｇａｐ．ｎｃｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｔｉｓｓｕｅｓ／ｘＰｒｏｆｉｌｅｒ）を使用した。ｄｂＥＳＴ内のすべてのｃＤＮＡライブラリーを検索するために、プールＡ及びプールＢについての検索オプションを、生物については「ヒト」及びライブラリーグループについては「すべてのＥＳＴライブラリー」と設定した。検索オプションの設定にマッチする胎盤及び栄養芽層組織から作製したすべてのｃＤＮＡライブラリーを、混合組織ライブラリーを除いてプールＡに割り当てた。プールＢについては、胎盤、栄養芽層、精巣、卵巣及び胎児の全身を除く正常組織から作製したすべてのｃＤＮＡライブラリーを選択した。
【０２６８】
ＧＴ４６８プロモーター領域の分析のためにＥＭＢＯＳＳ  ＣｐＧＰｌｏｔ（Ｒｉｃｅ，Ｐ．，Ｌｏｎｇｄｅｎ，Ｉ．＆  Ｂｌｅａｓｂｙ，Ａ．（２０００）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６，２７６−２７７）ソフトウエアを使用した。さらに、ＭＥＭＳＡＴ３（Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．Ｔ．，Ｔａｙｌｏｒ，Ｗ．Ｒ．＆  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．Ｍ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３，３０３８−３０４９）、ＴＭｐｒｅｄ（Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｋ．＆  Ｓｔｏｆｆｅｌ，Ｗ．（１９９３）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ  ３７４，１６６）及びＧＯＲ  ＩＶ（Ｇａｍｉｅｒ，Ｊ．，Ｏｓｇｕｔｈｏｒｐｅ，Ｄ．Ｊ．＆  Ｒｏｂｓｏｎ，Ｂ．（１９７８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１２０，９７−１２０）に関してＧＴ４６８タンパク質配列の分析を実施した。
【０２６９】
＜抗血清、免疫蛍光及び免疫化学試験＞
ＧＴ４６８のアミノ酸１１７−１２７に対して惹起したポリクローナル抗血清を、抗体受託生産サービス（Ｓｑｕａｒｉｘ，Ｍａｒｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって作製した。ＶＥＣＴＯＲ  ＮｏｖａＲＥＤ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を製造者の指示に従って使用して、組織凍結切片に関して免疫組織化学試験を実施した。ウエスタンブロット分析のために、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで溶解した細胞から抽出した全タンパク質３０μｇを使用した。抽出物を還元試料緩衝液（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に希釈し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して、その後ＰＶＤＦ膜（Ｐａｌｌ，Ｅａｓｔ  Ｈｉｌｌｓ，ＮＹ）に電気転写した。ｐＡＫＴ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、ＡＫＴ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）、サイクリンＤ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）及びβアクチン（Ａｂｅａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）に対して反応性の抗体で免疫染色を実施し、続いてホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス及びヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で一次抗体を検出した。
【０２７０】
＜ｓｉＲＮＡ二本鎖＞
ＧＴ４６８  ｓｉＲＮＡ二本鎖（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（センス５'−ｒ（ＣＣＡ  ＵＧＡ  ＧＡＧ  ＵＡＧ  ＣＣＡ  ＧＣＡ）ｄＴｄＴ−３'、アンチセンス５'−ｒ（ＵＵＧ  ＣＵＧ  ＧＣＵ  ＡＣＵ  ＣＵＣ  ＡＵＧ  Ｇ）ｄＡｄＧ−３'）は、ＧＴ４６８  ｍＲＮＡ配列のヌクレオチド６７０〜６９０（ＮＭ＿０２１７９６．３）を標的した。対照としてスクランブルｓｉＲＮＡ二本鎖（センス５'−ｒ（ＵＡＡ  ＣＵＧ  ＵＡＵ  ＡＡＵ  ＣＧＡ  ＣＵＡ  Ｇ）ｄＴｄＴ−５'、アンチセンス５'−ｒ（ＣＵＡ  ＧＵＣ  ＧＡＵ  ＵＡＵ  ＡＣＡ  ＧＵＵ  Ａ）ｄＧｄＡ−３'）を使用した。ＧＴ４６８サイレンシング試験のために、ＨｉＰｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の指示に従って使用して、細胞を１０ｎＭ  ｓｉＲＮＡ二本鎖でトランスフェクトした。すべての結果を、ヌクレオチド３４２〜３６２を標的するＧＴ４６８  ｓｉＲＮＡ二本鎖の２番目のセット（センス５'−ｒ（ＧＧＵ  ＵＣＡ  ＧＧＡ  ＣＡＡ  ＡＧＵ  ＣＣＡ  Ａ）ｄＴｄＴ−３'、アンチセンス５'−ｒ（ＵＵＧ  ＧＡＣ  ＵＵＵ  ＧＵＣ  ＣＵＧ  ＡＡＣ  Ｃ）ｄＧｄＧ−３'）で再現した。
【０２７１】
＜ｓｉＲＮＡのトランスフェクション後の細胞増殖分析＞
ｓｉＲＮＡ二本鎖によるトランスフェクションの２４時間後、１×１０４細胞を、１０％ＦＣＳを添加した培地で４８時間培養した。Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２マルチラベルカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）で、ＤＥＬＦＩＡ細胞増殖キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を製造者の指示に従って使用し、新たに合成されたＤＮＡ鎖へのＢｒｄＵの取り込みを測定することによって増殖を分析した。
【０２７２】
＜細胞周期分析＞
細胞を、１０％ＦＣＳを添加した培地において様々な濃度で培養した。ｓｉＲＮＡ二本鎖によるトランスフェクションの７２時間後に細胞を採取し、ＥｔＯＨ固定して、ヨウ化プロピジウムで染色した後、フローサイトメトリーによるＤＮＡ含量分析に供した。細胞周期の異なる期にある細胞を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（ＴＭ）  Ｐｒｏ（ＢＤ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）及びＦｌｏｗＪｏ（ＴＭ）（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）フローサイトメトリー分析ソフトウエアを用いて定量した。ｓｉＲＮＡトランスフェクションの４８時間後と７２時間後に、アポトーシス細胞をアネキシンＶ染色によって定量した。
【０２７３】
＜細胞移動及びインビトロ浸潤アッセイ＞
細胞移動アッセイを、８．０μｍの細孔膜（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を有するトランスウエルチェンバーにおいて、実験前に無血清培地で１２時間培養した細胞に関して実施した。ｓｉＲＮＡ実験のために、上述したようにｓｉＲＮＡ二本鎖によるトランスフェクションの２４時間後に細胞を無血清条件に移した。無血清培養培地４００μｌ中の４×１０４細胞を上部チェンバーに添加した。下部チェンバーは、化学誘引物質として５％ＦＣＳを添加した培養培地８００μｌを含んだ。２４時間後、膜の底部側に移動していた細胞を氷冷メタノール中に固定した；膜を切り出し、顕微鏡のスライドガラスに載せて、蛍光顕微鏡検査のためにＨｏｅｃｈｓｔ（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で封入した。５つのランダムな視野の細胞（倍率１００×）を各々の膜について計数した。すべての実験を三重に実施した。化学誘引物質を上部と下部の両方のチェンバーに添加して、同じ実験設定を用いて細胞のケモキネシスへの作用を分析した。インビトロ浸潤アッセイのために、無血清培地中で１ｍｇ／ｍｌに希釈したマトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＮＪ）１００μｌを用いて上部チェンバーを準備した。ゲル化のためにチェンバーを３７℃で５時間インキュベートした。
【０２７４】
＜抗体とのインキュベーション後の細胞増殖分析＞
内因性にＧＴ４６８を発現する癌細胞系ＢＴ−５４９、Ｃａｏｖ−３、ＥＦＯ−２１、ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１を、ＤＭＥＭ細胞培養培地中で１：２に希釈したハイブリドーマ上清と共に７２時間インキュベートした。Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ２マルチラベルカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で、ＤＥＬＦＩＡ細胞増殖キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を製造者の指示に従って使用し、新たに合成されたＤＮＡ鎖へのＢｒｄＵの取り込みを測定することによって増殖を分析した。
【０２７５】
代替的には、内因性にＧＴ４６８を発現する癌細胞系ＳＫ−ＢＲ−３及びＭＣＦ−７を、それぞれ、指示されている濃度でＤＭＥＭ細胞培養培地に希釈したＨＰＬＣ精製ハイブリドーマ上清と共に７２時間又は１２０時間インキュベートした。上述したように増殖を分析した。
【０２７６】
＜免疫蛍光顕微鏡検査＞
免疫マウスの血清中の抗ＧＴ４６８抗体の存在又はＧＴ４６８を発現する生細胞へのモノクローナル抗体の結合を明らかにするため、免疫蛍光顕微鏡分析を使用した。ＧＴ４６８−ｅＧＦＰでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中、標準的増殖条件下にてチェンバースライドで増殖させた。次に細胞をメタノール又はパラホルムアルデヒド／０．１％サポニンで固定した。細胞を、ＧＴ４６８に対する抗体と２５℃で６０分間インキュベートした。洗浄後、細胞を同じ条件下でＡｌｅｘａ５５５標識抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と共にインキュベートした。
【０２７７】
＜ＧＴ４６８ペプチド特異的ＥＬＩＳＡ＞
マイクロウエルプレート（Ｎｕｎｃ）を関連ＧＴ４６８ペプチド（５μｇ／ｍｌ）で３７℃にて１時間被覆した。ＰＢＳ  ３％ＢＳＡによるブロッキングを４℃で一晩実施した。ＰＢＳで３回洗浄した後、プレートにハイブリドーマ上清（ＰＢＳ  ３％ＢＳＡ中１：５又は１：１０希釈、５０μｌ／ウエル）を負荷し、室温で１時間インキュベートした（９０ｒｐｍで軌道振とう）。ＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳ  ３％ＢＳＡ中の二次抗体（ＨＲＰＯ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、９０ｒｐｍで軌道振とうしながら室温で１時間インキュベートした。最終洗浄工程（ＰＢＳで３回）後、１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）中の１．５ｍＭ  ＡＢＴＳから成る基質溶液を添加した。使用の直前に、０．３μｌ／ｍｌの３０％Ｈ２Ｏ２を基質溶液に添加した。３０〜６０分後にＴｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ  Ｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｔｅｃａｎ）で４０５ｎｍの吸収を測定した。
【０２７８】
＜免疫＞
アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２２（４Ｅ９−１Ｈ９）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２６（９Ｂ６−２Ａ９）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２４（５９Ｄ６−２Ｆ２）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２５（６１Ｃ１１−２Ｂ５）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２３（７８Ｈ１１−１Ｈ６）の下で寄託されたクローンの作製において、Ｂａｌｂ／ｃ又はＣ５７／ＢＬ６をＫＬＨ結合ペプチドで免疫した。ペプチド５０μｇ及びアジュバントとしてＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０Ｖ  ５０μｌを１、１５、４５及び８６日目に腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。マウスの血清中のＧＴ４６８に対する抗体の存在を、２４、５７及び９２日目にペプチド特異的ＥＬＩＳＡによってモニターした。検出可能な免疫応答を有するマウスを、モノクローナル抗体の作製のために脾摘出の３日前に追加免疫した。
【０２７９】
他のすべての場合には、Ｂａｌｂ／ｃ又はＣ５７／ＢＬ６マウスを１及び１５日目にＧＴ４６８  ｐｃＤＮＡ３．１プラスミド及びアジュバントとしてＰＥＩマンノースにより筋肉内経路で（ｉ．ｍ．）免疫した。その後、３０及び４５日目にペプチド５０μｇとアジュバントとしてＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５０Ｖ  ５０μｌ（腹腔内経路）、又はタンパク質１５０μｇとフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）（皮下経路）を注射した。マウスの血清中のＧＴ４６８に対する抗体の存在を、２４、５７及び９２日目にペプチド特異的ＥＬＩＳＡ又はＣｒＥＬＩＳＡによってモニターした。検出可能な免疫応答を有するマウスを、モノクローナル抗体の作製のために脾摘出の３日前に追加免疫した。
【０２８０】
＜ＧＴ４６８に対するヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製＞
マウス脾細胞を単離し、標準プロトコールに基づいてＰＥＧによりマウス骨髄腫細胞系に融合した。生じたハイブリドーマを、次に、ペプチド特異的ＥＬＩＳＡ、ＧＴ４６８  ＣｒＥＬＩＳＡ及びＧＴ４６８−ｅＧＦＰでトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を用いて、ＧＴ４６８特異性を有する免疫グロブリンの産生をＩＦによってスクリーニングした。
【０２８１】
免疫マウスからの脾リンパ球の単細胞懸濁液を、５０％ＰＥＧ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＣＲＬ  ７３８６４１）を用いて２：１の比率でＰ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１非分泌マウス骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ，ＣＲＬ  １５９７）と融合した。細胞を平底マイクロタイタープレートに約３×１０４／ウエルで塗布し、続いて１０％ウシ胎仔血清、２％ハイブリドーマ融合物及びクローニング用添加剤（ＨＦＣＳ，Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＣＲＬ  １  ３６３  ７３５）プラス１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．０５５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン及び１×ＨＡＴ（Ｓｉｇｍａ，ＣＲＬ  Ｈ０２６２）を含有する選択培地で約２週間インキュベーションした。１０〜１４日後、個々のウエルをペプチド特異的ＥＬＩＳＡによって抗ＧＴ４６８モノクローナル抗体に関してスクリーニングした。ハイブリドーマを分泌する抗体を再び植え付け、スクリーニングして、抗ＧＴ４６８モノクローナル抗体に関して依然として陽性である場合は、限界希釈によってサブクローニングした。その後、安定なサブクローンをインビトロで培養して、特徴づけのために組織培養培地において少量の抗体を生成した。親細胞の反応性を保持する（ＥＬＩＳＡ及びＩＦによって）、各々のハイブリドーマから少なくとも１つのクローンを選択した。
【０２８２】
＜アイソタイプ決定＞
ハイブリドーマ上清のアイソタイプ決定のために、ＩｓｏＳｔｒｉｐ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号１４９３０２７）を製造者によって記載されているように使用した。
【０２８３】
＜ＧＴ４６８を発現する細菌溶解産物の粗溶解産物を用いたＣｒＥＬＩＳＡ手順＞
・抗原の調製
大腸菌ＸＬＯＬＲ細菌をＧＴ４６８  ｐＱＥプラスミド又は挿入物を含まないｐＱＥ  （「基準物質」と称する）のいずれかで形質転換し、ＬＢ培地でＡ６００ｎｍ〜０．３５Ｅに増殖させた。２ｍＭ  ＩＰＴＧでタンパク質発現を誘導し、細胞を３７℃でさらに４時間増殖させた。タンパク質発現の適切な誘導とその反応速度をクマシーゲル分析によってモニターした。細菌を遠沈させ、０．２ｍＭプロテアーゼ阻害剤ＡＥＢＳＦ塩酸塩（ＡｐｐｌｉＣｈｅｍ）を含有する少量のＰＢＳ  ｐＨ７．２に再懸濁した。細胞を氷上に置き、超音波処理（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｃ  Ｐｏｗｅｒ  Ａ  Ｓｍｉｔｈｋｌｉｎｅ）によって破壊した。ＧＴ４６８及び標準的溶解産物を、０．２ｍＭ  ＡＥＢＳＦ及び２０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有するＰＢＳ中で２ｍｇ／ｍｌの総タンパク質濃度に希釈した。アリコートを窒素中で衝撃凍結し、使用時まで−７０℃で保存した。
【０２８４】
・固相酵素免疫検定法の実施
使用の前に、ＧＴ４６８並びに標準的溶解産物を被覆緩衝液（１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２）に希釈し、次に平底Ｆ９６  Ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロウエルプレート（５０μｌ／ウエル、Ｎｕｎｃ）に移して、３７℃で２時間吸着させた。
【０２８５】
抗原の固定化後、プレートを、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２）で２回洗浄し、その後洗浄剤を用いずに２回洗浄した。１：１００に希釈したヒト血清５０μｌを各ウエルについて添加し、軌道振とう機にて周囲温度で１時間インキュベートした。一部の実験では、ヒト血清を、アッセイに供する前に前処理した。
各々個々の血清試料を、ＧＴ４６８又は標準的溶解産物で被覆したウエルに関して並行して二重に試験した。プレートを再び上述したように洗浄し、３％（ｗ／ｖ）粉乳を含有する５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）に１：５０００希釈した二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＡＰ、Ｄｉａｎｏｖａ）５０μｌ／ウエルと共に室温で１時間インキュベートした。プレートを１００μｌ／ウエルの基質溶液［４−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム六水和物（Ｍｅｒｃｋ）２ｍｇ／ｍｌ  ＡＬＰ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）］により室温で３０分間展開し、マイクロプレートリーダー（Ｖｉｃｔｏｒ２  Ｗａｌｌａｃ，Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ，Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）で、４０５ｎｍでの吸光度値を直ちに読み取った。
【０２８６】
＜フローサイトメトリー分析＞
ＧＴ４６８  ｐｃＤＮＡ３．１プラスミド又は挿入物を含まないプラスミド（モック）でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を採取し、氷冷メタノールで固定して、ＰＢＳ／１０％ＦＣＳで３０分間ブロックした。細胞をハイブリドーマ上清と共に１時間インキュベートし、ＰＢＳ／１ＦＣＳで１０分間ずつ２回洗浄し、ヤギ抗マウスＣｙ３二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と共にインキュベートした。
【０２８７】
＜ウエスタンブロット法＞
ＧＴ４６８  ｐｃＤＮＡ３．１プラスミド又は挿入物を含まないプラスミド（モック）トランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の全細胞溶解産物を、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘに基づく溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ  ７．４）、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、  ５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＮａＦ）を用いて調製した。抽出物を還元試料緩衝液（Ｒｏｔｈ）に希釈し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して、その後ＰＶＤＦ膜（Ｐａｌｌ）に電気転写した。ＧＴ４６８に反応性のポリクローナル抗体（Ｋｏｓｌｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２００７）で免疫染色を実施し、続いてホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で一次抗体を検出した。
【０２８８】
実施例２：ＧＴ４６８は様々な腫瘍において異常活性化され、高発現される
胎盤特異的栄養芽層遺伝子を同定するため、ゲノム全体のデータマイニング法を適合させた。この方法はもともと、生殖細胞特異的分子のインシリコでの同定のために我々が開発したものである（Ｋｏｓｌｏｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｂｅｌｌ，Ｃ，Ｓｅｉｔｚ，Ｇ．，Ｌｅｈｒ，Ｈ．Ａ．，Ｒｏｅｍｅｒ，Ｋ．，Ｍｕｎｔｅｆｅｒｉｎｇ，Ｈ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｃ，Ｓａｈｉｎ，Ｕ．＆  Ｔｕｒｅｃｉ，Ｏ．（２００４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４，５９８８−５９９３；Ｋｏｓｌｏｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｔｕｒｅｃｉ，Ｏ．，Ｂｅｌｌ，Ｃ，Ｋｒａｕｓｅ，Ｐ．，Ｌｅｈｒ，Ｈ．Ａ．，Ｂｒｕｎｎｅｒ，Ｊ．，Ｓｅｉｔｚ，Ｇ．，Ｎｅｓｔｌｅ，Ｆ．Ｏ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｃ．＆  Ｓａｈｉｎ，Ｕ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２，６７５０−６７５５；Ｋｏｓｌｏｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｓａｈｉｎ，Ｕ．，Ｈｕｂｅｒ，Ｃ．＆  Ｔｕｒｅｃｉ，Ｏ．（２００６）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１５，２３９２−２３９９）。原則的には、真正の胎盤特異的遺伝子の予測のためにＧｅｎＢａｎｋの階層的キーワード検索をデジタルｃＤＮＡライブラリーサブトラクション法と組み合わせた。ＧＴ４６８はこのアプローチによって同定された。
ＧＴ４６８  ｍＲＮＡを、正常組織標本と腫瘍組織標本の包括的なセットにおいてエンドポイントＲＴ−ＰＣＲ及び定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって調べた。ＧＴ４６８の発現は胎盤に限定されることが確認された。他のすべての正常組織標本では、転写産物の量は、かろうじて高感度ＲＴ−ＰＣＲの検出限界であるか又は検出限界未満である（図１、図２（Ｆｉｇ．１Ａ、Ｂ、Ｃ）、表１）。唯一の例外が精巣であるが、転写産物のレベルは胎盤で認められるレベルより３〜４対数低い。
【０２８９】
【表１】
0005389675.tif 000004
【０２９０】
種々の癌型にわたって原発腫瘍標本の３８％（８６／２２５）及び腫瘍細胞系の５５％（２２／４０）において、しかし、さもなければ転写が厳密に制御されるこの遺伝子の異常活性化が認められた。ＧＴ４６８の保有率及び転写産物レベルは乳癌及び乳癌細胞系において最も高かった（図１、図２（Ｆｉｇ．１Ａ、Ｂ、Ｃ））。６２の原発乳癌試料のうち４４（８２％）がＧＴ４６８発現に関して陽性と判定され（非栄養芽層正常組織におけるバックグラウンドの少なくとも１００倍と定義される）、２４％（１５／６２）が低発現（１００〜１０００倍）、４０％（２５／６２）が中等度の発現（１０００〜１０，０００倍）、１７％（１１／６２）が高発現（＞１０，０００倍）を示した（図１（Ｆｉｇ．１Ｂ））。さらに我々は、５０例の肺癌試料のうち２１例（４２％）において並びに胃癌及び卵巣癌においてＧＴ４６８の転写を認めた（表１）。ＧＴ４６８の誘導は、組織学的亜型、腫瘍の病期又は腫瘍悪性度に相関しなかった。
【０２９１】
実施例３：ＧＴ４６８は癌細胞の表面に位置し、抗体にとってアクセス可能である
ＧＴ４６８特異的ペプチドエピトープ（配列番号２のアミノ酸１１７−１２７）に対するポリクローナルウサギ抗体（ウサギ抗ＧＴ４６８／Ｃ末端）を惹起した。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用したＧＴ４６８の遺伝子サイレンシングによって抗体の特異性を確認した。ｓｉＲＮＡを排除するため、二組のＧＴ４６８特異的ｓｉＲＮＡ二本鎖、スクランブル非サイレンシングオリゴヌクレオチド及び非トランスフェクト細胞に関して標的活性試験を実施した。これらのｓｉＲＮＡ二本鎖で乳癌細胞系ＭＣＦ−７及びＢＴ−５４９をトランスフェクトすることにより、対照と比較して構成的ＧＴ４６８  ｍＲＮＡ発現の８０〜９０％の安定で再現可能な低下が達成された（図３（Ｆｉｇ．１Ｄ））。この所見と一致して、ウエスタンブロット法でのＧＴ４６８の予測サイズに従って検出された２６ｋＤａのバンドは、両方の細胞系においてほぼ完全に消失し（図３（Ｆｉｇ．１Ｅ））、ＧＴ４６８タンパク質発現及び抗体の特異性の両方の強力なノックダウンを提供した。
【０２９２】
一次ヒト組織試料中のＧＴ４６８タンパク質のウサギ抗ＧＴ４６８／Ｃ末端によるウエスタンブロット染色は、ＧＴ４６８が発現される唯一の正常組織としての胎盤と同等のレベルで、この遺伝子が乳癌標本において検出可能であることを確認した（図３（Ｆｉｇ．１Ｆ））。ヒト乳癌切片に関するウサギ抗ＧＴ４６８／Ｃ末端での免疫組織化学は、ＲＴ−ＰＣＲによってＧＴ４６８  ｍＲＮＡ発現に関して陽性と分類された標本における特異的免疫反応性を示した。染色は腫瘍細胞集団に限定され、隣接する間質細胞及び非腫瘍性上皮細胞並びに患者のマッチする正常組織は反応性ではなかった（図３（Ｆｉｇ．１Ｇ））。腫瘍細胞の免疫染色は形質膜で際立ち、ＧＴ４６８が細胞表面タンパク質であることの証拠を提供した。
【０２９３】
ＧＴ４６８タンパク質配列のトポロジーのインシリコ解析は、アミノ酸５〜２２にわたる疎水性ドメインとそれに続く、アミノ酸２３〜２１２によって構成される大きな細胞外ドメインを予測した。ＧＴ４６８の細胞外部分のアミノ酸２９〜１１９は、トランケートされた透明帯（ＺＰ）ドメインである。ＺＰドメインは、ＴＧＦ−β受容体ＩＩＩがタンパク質、ウロモジュリン、糖タンパク質ＧＰ２並びに精子受容体ＺＰ２及びＺＰ３（Ｂｏｒｋ，Ｐ．＆  Ｓａｎｄｅｒ，Ｃ．（１９９２）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３００，２３７−２４０）を含む、様々な細胞外に露出された受容体様タンパク質において認められ、重合に関与する（Ｊｏｖｉｎｅ，Ｌ．，Ｊａｎｓｓｅｎ，Ｗ．Ｇ．，Ｌｉｔｓｃｈｅｒ，Ｅ．Ｓ．＆  Ｗａｓｓａｒｍａｎ，Ｐ．Ｍ．（２００６）ＢＭＣ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７，１１）。構成的に発現されるＧＴ４６８の細胞内局在を、おそらくタンパク質の細胞外部分にそのエピトープ（アミノ酸１１７〜１２７）を有する、ウサギ抗ＧＴ４６８／Ｃ末端で染色したＭＣＦ−７及びＢＴ−５４９乳癌細胞の免疫蛍光顕微鏡検査によって評価した。どちらの細胞系も細胞膜において明確な染色を示した（図４（Ｆｉｇ．２Ａ））。ｓｉＲＮＡが誘導するＧＴ４６８発現のノックダウン後のシグナルの喪失により、染色の特異性を確認した。最も重要な点として、特異的免疫染色が、メタノール固定細胞だけでなく固定していない天然細胞でも認められ（図４（Ｆｉｇ．２Ｂ））、抗体のエピトープが細胞膜の透過化を必要とせずにアクセス可能であることを示唆し、これによりカルボキシ末端の細胞外局在化と共に予測されたトポロジーを裏づけた。
【０２９４】
実施例４：ｓｉＲＮＡが誘導するＧＴ４６８の遺伝子サイレンシングは癌細胞の運動、移動及び浸潤を阻害し、増殖をブロックする
腫瘍細胞におけるＧＴ４６８の生物学的重要性を調べるため、そのｓｉＲＮＡ誘導の遺伝子サイレンシングの、基本的細胞機能への影響を試験した。
【０２９５】
第一に、トランスウエル遊走アッセイにおける乳癌細胞系ＭＣＦ−７及びＢＴ−５４９の性能を調べた。化学誘引物質として５％ＦＣＳを系の上部及び下部チェンバーの両方に添加することによって評価した両細胞系の基線運動性（ケモキネシス）は、ＧＴ４６８特異的ｓｉＲＮＡ二本鎖によって実質的に阻害された（Ｆｉｇ．３Ａ）。その結果として、我々はまた、細胞の指向性走化性遊走能（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ  ｍｉｇｒａｔｏｒｙ  ｃａｐａｃｉｔｙ）の著明な低下を認めた（図５（Ｆｉｇ．３Ｂ））。さらに、細胞はマトリゲルの障壁を突破して化学誘引物質勾配に沿って遊走することができなかったので、細胞の化学浸潤活性はＧＴ４６８  ｓｉＲＮＡ処理によって大きく影響された（図５（Ｆｉｇ．３Ｃ））。
次に、ＤＮＡへのＢｒｄＵの取り込みによって測定した腫瘍細胞増殖は、ＧＴ４６８特異的ｓｉＲＮＡ二本鎖により両細胞系において８０〜９０％低減することが認められた（図６（Ｆｉｇ．４Ａ））。細胞周期分析は、増殖ブロックの基礎となる原因として、ＧＴ４６８  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞における明確なＧ１／Ｓ停止を明らかにした（図６（Ｆｉｇ．４Ｂ））。細胞の生命力は影響を受けず、アネキシンＶについての染色はアポトーシス細胞死の指標を示さなかった（図６（Ｆｉｇ．４Ｃ））。
【０２９６】
実施例５：抗ＧＴ４６８抗体による癌細胞の処理は細胞増殖を阻害する
我々は、ウサギ抗ＧＴ４６８／Ｃ末端及び非反応性対照抗体と共にインキュベートしたＭＣＦ−７及びＢＴ−５４９細胞の増殖を測定した。ＧＴ４６８のターゲティングは、濃度依存的に両細胞系の増殖の効率的な阻害を生じさせた（図７（Ｆｉｇ．５））。
【０２９７】
実施例６：ｓｉＲＮＡ誘導のサイレンシングの下流作用及び抗体が誘導するＧＴ４６８の機能的拮抗作用
真核細胞における増殖及び細胞周期進行は、サイクリン及びサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）によって支配される。個々のサイクリンは、一連のＣＤＫの活性を刺激することによって細胞周期の異なる時期で作用する。制限点の制御はサイクリンＤ及びＥ依存性キナーゼファミリーによって媒介される（Ｍｏｒｇａｎ，Ｄ．Ｏ．（１９９７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１３，２６１−２９１；Ｓｈｅｒｒ，Ｃ．Ｊ．（２０００）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６０，３６８９−３６９５）。ＧＴ４６８サイレンシングが、サイクリン発現の変化を通して認められた細胞周期調節不全を誘導するかどうかを調べるため、ＧＴ４６８  ｓｉＲＮＡで処理したＭＣＦ−７及びＢＴ−５４９乳癌細胞におけるサイクリンＤ１、Ｄ２、Ｄ３及びサイクリンＥの発現を測定した。
【０２９８】
興味深いことに、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定したサイクリンＤ１転写産物（図８（Ｆｉｇ．６Ａ））並びにウエスタンブロット法でのサイクリンＤ１タンパク質レベル（図８（Ｆｉｇ．６Ｂ））の有意の低下が、ＧＴ４６８ノックダウンの結果として起こった。分析したその他のサイクリンに関しては転写レベルの変化を認めなかった。
【０２９９】
サイクリンＤ１は、細胞周期のＧ１期からＳ期への進行の主要調節因子であることが知られている。興味深いことには、散発性乳癌の腫瘍形成において、サイクリンＤ１の過剰発現が早期事象とみなされている（Ｃａｌｄｏｎ，Ｃ．Ｅ．，Ｄａｌｙ，Ｒ．Ｊ．，Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｒ．Ｌ．＆  Ｍｕｓｇｒｏｖｅ，Ｅ．Ａ．（２００６）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．９７，２６１−２７４；Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｒ．Ｌ．＆  Ｍｕｓｇｒｏｖｅ，Ｅ．Ａ．（２００４）Ｊ．Ｍａｍｍａｒｙ．Ｇｌａｎｄ．Ｂｉｏｌ．Ｎｅｏｐｌａｓｉａ．９，９５−１０４）。Ｄ型サイクリンは不安定であり、それらの誘導、合成及び触媒パートナーとの集合はすべて、持続的なマイトジェンシグナル伝達に依存する。このため、Ｄ型サイクリンは増殖因子のセンサーとして働き、細胞外因子に応答して活性キナーゼを形成する（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｒ．Ｌ．＆  Ｍｕｓｇｒｏｖｅ，Ｅ．Ａ．（２００４）Ｊ．Ｍａｍｍａｒｙ．Ｇｌａｎｄ．Ｂｉｏｌ．Ｎｅｏｐｌａｓｉａ．９，９５−１０４；Ｓｈｅｒｒ，Ｃ．Ｊ．（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７３，１０５９−１０６５）。乳癌において、サイクリンＤ１の発現がホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／ＡＫＴ依存整形によって制御されることが示された（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｒ．Ｌ．＆  Ｍｕｓｇｒｏｖｅ，Ｅ．Ａ．（２００４）Ｊ．Ｍａｍｍａｒｙ．Ｇｌａｎｄ．Ｂｉｏｌ．Ｎｅｏｐｌａｓｉａ．９，９５−１０４；Ｄ'Ａｍｉｃｏ，Ｍ．，Ｈｕｌｉｔ，Ｊ．，Ａｍａｎａｔｕｌｌａｈ，Ｄ．Ｆ．，Ｚａｆｏｎｔｅ，Ｂ．Ｔ．，Ａｌｂａｎｅｓｅ，Ｃ，Ｂｏｕｚａｈｚａｈ，Ｂ．，Ｆｕ，Ｍ．，Ａｕｇｅｎｌｉｃｈｔ，Ｌ．Ｈ．，Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒ，Ｌ．Ａ．，Ｔａｋｅｍａｒｕ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，３２６４９−３２６５７；Ｍｕｉｓｅ−Ｈｅｌｍｅｒｉｃｋｓ，Ｒ．Ｃ．，Ｇｒｉｍｅｓ，Ｈ．Ｌ．，Ｂｅｌｌａｃｏｓａ，Ａ．，Ｍａｌｓｔｒｏｍ，Ｓ．Ｅ．，Ｔｓｉｃｈｌｉｓ，Ｐ．Ｎ．＆  Ｒｏｓｅｎ，Ｎ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３，２９８６４−２９８７２）。ＡＫＴは、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β）を不活性化し、それによってサイクリンＤ１の転写並びにそのタンパク質分解による代謝回転及び核におけるそのタンパク質レベルを上昇させる（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｒ．Ｌ．＆  Ｍｕｓｇｒｏｖｅ，Ｅ．Ａ．（２００４）Ｊ．Ｍａｍｍａｒｙ．Ｇｌａｎｄ．Ｂｉｏｌ．Ｎｅｏｐｌａｓｉａ．９，９５−１０４，Ｄｉｅｈｌ，Ｊ．Ａ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｍ．，Ｒｏｕｓｓｅｌ，Ｍ．Ｆ．＆  Ｓｈｅｒｒ，Ｃ．Ｊ．（１９９８）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１２，３４９９−３５１１；Ｒａｄｕ，Ａ．，Ｎｅｕｂａｕｅｒ，Ｖ．，Ａｋａｇｉ，Ｔ．，Ｈａｎａｆｕｓａ，Ｈ．＆  Ｇｅｏｒｇｅｓｃｕ，Ｍ．Ｍ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２３，６１３９−６１４９）。加えて、ＡＫＴ経路は、ＧＴ４６８が見かけ上関与する他の２つの細胞機能、癌細胞の運動及び移動の重要な調節剤である（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ，Ｒ．Ｌ．＆  Ｍｕｓｇｒｏｖｅ，Ｅ．Ａ．（２００４）Ｊ．Ｍａｍｍａｒｙ．Ｇｌａｎｄ．Ｂｉｏｌ．Ｎｅｏｐｌａｓｉａ．９，９５−１０４，Ｃａｎｔｌｅｙ，Ｌ．Ｃ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６，１６５５−１６５７；Ｌｕｏ，  Ｊ．，Ｍａｎｎｉｎｇ，Ｂ．Ｄ．＆  Ｃａｎｔｌｅｙ，Ｌ．Ｃ．（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ４，２５７−２６２）。このことが我々に、ＧＴ４６８がＭＣＦ−７及びＢＴ−５４９細胞におけるＡＫＴキナーゼの調節に影響を及ぼすかどうかを分析することを促した。
【０３００】
ＰＩ３Ｋの過剰活性化に続くＡＫＴの構成的リン酸化と過剰活性化がしばしば腫瘍細胞において認められる。ｓｉＲＮＡ技術によるＧＴ４６８のサイレンシングの後のＡＫＴのＳｅｒ４７３リン酸化（ｐＡＫＴ）のレベル及び抗ＧＴ４６８／Ｃ末端抗体によるその機能的拮抗作用のレベルの定量はどちらも、特にＭＣＦ−７細胞においてｐＡＫＴレベルの著明な低下を生じさせ（図８（Ｆｉｇ．６Ｃ））、ＡＫＴキナーゼの活性化がＧＴ４６８の下流作用の遂行に関与することを示唆した。興味深いことに、ｐＡＫＴの下方調節は、ＰＴＥＮを欠き、このためより高いレベルのＰＩ３Ｋ過剰活性化を有する、ＢＴ−５４９細胞においてより顕著ではなかった。
【０３０１】
実施例７：ＧＴ４６８特異的モノクローナル抗体
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製のために配列番号３〜１０に示す配列を有するペプチドを使用した。例えば配列番号３のペプチドを用いた免疫はハイブリドーマ４Ｅ９−１Ｈ９及び９Ｂ６−２Ａ９を生成し、配列番号４のペプチドを用いた免疫はハイブリドーマ５９Ｄ６−２Ｆ２を生成し、配列番号６のペプチドを用いた免疫はハイブリドーマ６１Ｃ１１−２Ｂ５及び７８Ｈ１１−１Ｈ６を生成した。
【０３０２】
モノクローナル抗体の特異的結合を確実にするためにペプチド特異的ＥＬＩＳＡを実施した。ハイブリドーマ上清を、マウスの免疫のために使用したそれぞれのペプチドに対して１：５又は１：１０希釈で試験した。対照として、すべてのハイブリドーマ上清を２つの無関係なペプチドに対して試験した。すべてのモノクローナル抗体が、マウスの免疫のために使用したそれぞれのペプチドとのみ特異的に反応した（図９（Ｆｉｇ．７））。
【０３０３】
完全長ＧＴ４６８タンパク質へのモノクローナル抗体の特異的結合を免疫蛍光（ＩＦ）顕微鏡検査によって分析した。ＧＴ４６８−ｅＧＦＰ融合構築物のトランスフェクションの２４時間後にＣＨＯ細胞をハイブリドーマ上清（１：５希釈）で染色した。ｅＧＦＰシグナルと二次抗マウス抗体（Ａｌｅｘａ５５５）のシグナルのマージングは、ＧＴ４６８−ｅＧＦＰトランスフェクト細胞だけの染色を示し、非トランスフェクト細胞は陰性であった（図１０（Ｆｉｇ．８））。
【０３０４】
ＧＴ４６８へのモノクローナル抗体の結合が癌細胞の増殖に及ぼす影響を分析するため、内因性にＧＴ４６８を発現する癌細胞系ＢＴ−５４９、Ｃａｏｖ−３、ＥＦＯ−２１、ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１をハイブリドーマ上清（１：２希釈）と共に７２時間インキュベートした。細胞の増殖をＤＮＡへのＢｒｄＵの取り込みによって測定した。モノクローナル抗体４Ｅ９  １Ｈ９は、使用した濃度で細胞の増殖を変化させず、抗体９Ｂ６  ２Ａ９及び５９Ｄ６  ２Ｆ２は、分析したすべての癌細胞系の増殖を明らかに低減した（図１１（Ｆｉｇ．９））。
【０３０５】
これにより、細胞によって発現されるＧＴ４６８を選択的に標的するモノクローナル抗体が生産できることが示された。さらに、ＧＴ４６８を発現する癌細胞の増殖を阻害する、ＧＴ４６８に対するモノクローナル抗体が生産できることが示された。
【０３０６】
実施例８：ＧＴ４６８  ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドでの免疫とそれに続くペプチド／タンパク質の注射から得られるＧＴ４６８特異的モノクローナル抗体
ＧＴ４６８  ＤＮＡを用いた２回の筋肉内免疫及びそれに続く組換えＧＴ４６８タンパク質の２回の皮下投与は、ハイブリドーマ２２−１Ａ−１、２２−２Ａ−１、２２−９Ｂ−１、２３−３３Ａ−１及び２３−１９Ａ−１を生じさせた。ＧＴ４６８  ＤＮＡを用いた２回の筋肉内免疫及びそれに続く配列番号１０に示すペプチドの２回の腹腔内投与は、ハイブリドーマＦ１１＃３３Ｆ７Ｄ１２を生じさせた。ＧＴ４６８  ＤＮＡを用いた２回の筋肉内免疫及びそれに続く配列番号３に示すペプチドの２回の腹腔内投与は、ハイブリドーマ４Ａ１２  ２Ｄ４  １Ａ１０及び４Ｅ９  １Ｄ１２  ２Ｄ４を生じさせた。
【０３０７】
以下の表は、得られた抗体及びそれらのアイソタイプを列記する。
【０３０８】
【表２】
0005389675.tif 000005
【０３０９】
ハイブリドーマ２２−１Ａ−１、２２−２Ａ−１、２２−９Ｂ−１、２３−３３Ａ−１及び２３−１９Ａ−１からのモノクローナル抗体の特異的結合を確実にするために粗溶解産物アッセイ（ＣｒＥＬＩＳＡ）を実施した。ハイブリドーマ上清を、ＧＴ４６８  ｐＱＥ発現ベクターで形質転換した大腸菌の溶解産物に対して試験した。対照として、ハイブリドーマ上清を、挿入物を含まない（モック）ｐＱＥプラスミドで形質転換した大腸菌の溶解産物に関して試験した。すべてのモノクローナル抗体が、特異的ＧＴ４６８溶解産物とのみ特異的に反応した（図１２（Ｆｉｇ．１０Ａ））。
【０３１０】
ハイブリドーマＦ１１＃３３Ｆ７Ｄ１２、４Ａ１２  ２Ｄ４  １Ａ１０及び４Ｅ９  １Ｄ１２  ２Ｄ４からのモノクローナル抗体の特異的結合を確実にするため、ペプチド特異的ＥＬＩＳＡを実施した。ハイブリドーマ上清を、マウスの免疫のために使用したそれぞれのペプチドに対して試験した。対照として、ハイブリドーマ上清を無関係なペプチドに対して試験した。モノクローナル抗体は、マウスの免疫のために使用したそれぞれのペプチドとのみ特異的に反応した（図１０（Ｆｉｇ．１０Ｂ））。
【０３１１】
完全長ＧＴ４６８タンパク質へのモノクローナル抗体の特異的結合を、本明細書で述べたようにフローサイトメトリー分析によって検査した。モノクローナル抗体４Ｅ９  １Ｄ１２  ２Ｄ４のフローサイトメトリー分析のために、約４０％のトランスフェクション率を有する一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ細胞を使用した。すべてのハイブリドーマ上清がＧＴ４６８トランスフェクト細胞の特異的染色を示し、モックトランスフェクト細胞では染色を認めなかった（図１３（Ｆｉｇ．１１））。
【０３１２】
完全長ＧＴ４６８タンパク質へのモノクローナル抗体の特異的結合をウエスタンブロット法によって分析した。すべてのハイブリドーマ上清が、ＧＴ４６８  ｐｃＤＮＡ３．１発現プラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞の溶解産物と特異的反応性を示し、モックトランスフェクト細胞の溶解産物はシグナルを示さなかった（図１４（Ｆｉｇ．１２）；モック溶解産物中のハイブリドーマ上清２３−３３Ａ−１のかすかなシグナルは、ＨＥＫ  ＧＴ４６８溶解産物の漏出から生じたと考えられる）。
【０３１３】
モノクローナル抗体が結合するＧＴ４６８タンパク質中のエピトープを同定するためにペプチドＥＬＩＳＡを実施した。完全なＧＴ４６８タンパク質配列を、１１アミノ酸の重複を有する５１個のオーバーラップペプチド（１５量体）のセットとして合成した。すべてのハイブリドーマ上清を、これらのペプチドへの特異的結合に関してＥＬＩＳＡで試験した。対照として、無関係なペプチドを使用した。すべての上清がＧＴ４６８ペプチドへの特異的結合を示した。ハイブリドーマ上清２２−１Ａ−１、２３−３３Ａ−１及び２３−１９Ａ−１は各々、２個のオーバーラップペプチドへの結合を示し、ＧＴ４６８の線状エピトープに対する反応性を示唆した。２２−２Ａ−１及び２２−９Ｂ−１の結合パターンはより複雑であり、ＧＴ４６８タンパク質の立体配座エピトープに対する反応性を示唆した。
【０３１４】
ＧＴ４６８へのモノクローナル抗体の結合が癌細胞の増殖に及ぼす影響を分析するため、内因性にＧＴ４６８を発現する癌細胞系ＳＫ−ＢＲ−３（４Ａ１２  ２Ｄ４  １Ａ１０）又はＭＣＦ−７（４Ｅ９  １Ｄ１２  ２Ｄ４）を、図１６（Ｆｉｇ．１４）に示されている濃度で精製ハイブリドーマ上清と共に７２時間又は１２０時間インキュベートした。細胞の増殖をＤＮＡへのＢｒｄＵの取り込みによって測定した。無関係な対照モノクローナル抗体は細胞の増殖を変化させなかったが、モノクローナル抗体４Ａ１２  ２Ｄ４  １Ａ１０及び４Ｅ９  １Ｄ１２  ２Ｄ４は濃度依存的に細胞の増殖を明らかに低下させた（図１６（Ｆｉｇ．１４））。
本発明は、さらに以下の態様をとり得る。
１．ＧＴ４６８に結合し、ＧＴ４６８を発現する細胞の死滅及び／又は前記細胞の１又はそれ以上の活性の阻害を媒介する能力を有する抗体。
２．前記活性が、細胞運動、細胞移動、細胞の浸潤及び細胞増殖から成る群より選択される、１に記載の抗体。
３．前記活性が細胞増殖である、１に記載の抗体。
４．前記細胞の死滅及び／又は細胞の１又はそれ以上の活性の阻害が、前記細胞によって発現されるＧＴ４６８への前記抗体の結合によって誘導される、１〜３のいずれかに記載の抗体。
５．前記細胞の死滅及び／又は細胞の１又はそれ以上の活性の阻害が、前記細胞によって発現されるＧＴ４６８の細胞外ドメインへの前記抗体の結合によって誘導される、１〜４のいずれかに記載の抗体。
６．非癌性ＧＴ４６８を発現する細胞への前記抗体の結合により、前記の死滅及び／又は１又はそれ以上の活性の阻害が誘導されない、１〜５のいずれかに記載の抗体。
７．ＧＴ４６８を発現する前記細胞が癌細胞である、１〜６のいずれかに記載の抗体。
８．癌細胞が、腫瘍形成性乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌及び肝細胞癌細胞から成る群より選択される、７に記載の抗体。
９．補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を介した細胞溶解、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を介した細胞溶解、アポトーシス、同型接着、及び／又は貪食作用を誘導することによって細胞の前記死滅を媒介する、１〜８のいずれかに記載の抗体。
１０．ＣＤＣを介した細胞溶解及び／又はＡＤＣＣを介した細胞溶解を誘導することによって細胞の前記死滅を媒介する、１〜９のいずれかに記載の抗体。
１１．前記細胞のＣＤＣを介した溶解を誘導しない、１〜１０のいずれかに記載の抗体。
１２．前記ＡＤＣＣを介した細胞溶解が、単球、単核細胞、ＮＫ細胞及びＰＭＮから成る群より選択されるエフェクター細胞の存在下で起こる、９〜１１のいずれかに記載の抗体。
１３．前記貪食作用がマクロファージによる、９〜１２のいずれかに記載の抗体。
１４．モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト若しくはヒト化抗体、又は抗体のフラグメントである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体。
１５．ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、好ましくはＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥから成る群より選択される、１〜１４のいずれかに記載の抗体。
１６．ＧＴ４６８が配列番号２によるアミノ酸配列を有する、１〜１５のいずれかに記載の抗体。
１７．抗体がＧＴ４６８に特異的に結合する、１〜１６のいずれかに記載の抗体。
１８．生細胞の表面上に存在するＧＴ４６８の天然（ネイティブ）エピトープに結合する、１〜１７のいずれかに記載の抗体。
１９．癌細胞、好ましくは乳癌細胞に特異的である、１〜１８のいずれかに記載の抗体。
２０．前記ＧＴ４６８が前記細胞の表面上で発現される、１〜１９のいずれかに記載の抗体。
２１．配列番号２〜１０及び３５〜７９から成る群より選択されるアミノ酸配列を有するタンパク質若しくはペプチド、又はその免疫原性フラグメント若しくは誘導体、又は前記タンパク質若しくはペプチドを発現する核酸若しくは宿主細胞、又はその免疫原性フラグメント若しくは誘導体で動物を免疫する工程を含む方法によって入手できる、１〜２０のいずれかに記載の抗体。
２２．アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２２（４Ｅ９−１Ｈ９）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２６（９Ｂ６−２Ａ９）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２４（５９Ｄ６−２Ｆ２）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２５（６１Ｃ１１−２Ｂ５）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２３（７８Ｈ１１−１Ｈ６）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９５（２２−１Ａ−１）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９３（２２−２Ａ−１）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９６（２２−９Ｂ−１）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９７（２３−３３Ａ−１）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９１（２３−１９Ａ−１）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９４（Ｆ１１＃３３Ｆ７Ｄ１２）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９２（４Ａ１２  ２Ｄ４  １Ａ１０）、又はＤＳＭ  ＡＣＣ２８９８（４Ｅ９  １Ｄ１２  ２Ｄ４）の下で寄託されたクローンによって産生される抗体。
２３．１〜２２のいずれかに記載の抗体を産生することができるハイブリドーマ。
２４．アクセッション番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２２（４Ｅ９−１Ｈ９）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２６（９Ｂ６−２Ａ９）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２４（５９Ｄ６−２Ｆ２）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２５（６１Ｃ１１−２Ｂ５）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８２３（７８Ｈ１１−１Ｈ６）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９５（２２−１Ａ−１）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９３（２２−２Ａ−１）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９６（２２−９Ｂ−１）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９７（２３−３３Ａ−１）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９１（２３−１９Ａ−１）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９４（Ｆ１１＃３３Ｆ７Ｄ１２）、ＤＳＭ  ＡＣＣ２８９２（４Ａ１２  ２Ｄ４  １Ａ１０）、又はＤＳＭ  ＡＣＣ２８９８（４Ｅ９  １Ｄ１２  ２Ｄ４）の下で寄託されたハイブリドーマ。
２５．治療薬に結合された、１〜２２のいずれかに記載の抗体を含むコンジュゲート。
２６．治療薬が、毒素、放射性同位体、薬剤又は細胞傷害性物質である、２５に記載のコンジュゲート。
２７．１〜２２のいずれかに記載の抗体及び／又は２５若しくは２６に記載のコンジュゲート、及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
２８．細胞を１〜２２のいずれかに記載の抗体及び／又は２５若しくは２６に記載のコンジュゲートの有効量と接触させることを含む、ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はその細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞の増殖を阻害する方法。
２９．細胞を１〜２２のいずれかに記載の抗体及び／又は２５若しくは２６に記載のコンジュゲートの有効量と接触させることを含む、ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はその細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞を死滅させる方法。
３０．細胞を１〜２２のいずれかに記載の抗体及び／又は２５若しくは２６に記載のコンジュゲートの有効量と接触させることを含む、ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はその細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞の転移拡散を抑制する方法。
３１．１〜２２のいずれかに記載の抗体、２５若しくは２６に記載のコンジュゲート又は２７に記載の医薬組成物を被験者に投与することを含む、ＧＴ４６８を発現する細胞及び／又はその細胞表面とＧＴ４６８の結合によって特徴づけられる細胞が関与する疾患又は障害を治療する又は予防する方法。
３２．疾患又は障害が腫瘍関連疾患である、３１に記載の方法。
３３．腫瘍関連疾患が、乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌及び肝細胞癌細胞から成る群より選択される、３２に記載の方法。
３４．前記ＧＴ４６８が配列番号２によるアミノ酸配列を有する、２８〜３３のいずれかに記載の方法。
３５．前記ＧＴ４６８が前記細胞の表面上で発現される、２８〜３４のいずれかに記載の方法。
【図５】
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【図１５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１６】
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【配列表】
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