(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）薬学的に許容される担体または希釈剤と、
ｉｉ）低温誘導性ＲＮＡ結合タンパク質（ＣＩＲＰ）阻害剤と
を含む、炎症性状態の治療における使用のための医薬組成物であって、炎症性状態が外傷出血または出血ショックであり、ＣＩＲＰ阻害剤がＣＩＲＰに特異的に結合する抗体またはその機能的断片である、医薬組成物。
【請求項２】
前記抗体が、ポリクローナル抗体である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記抗体が、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記抗体が、単鎖抗体である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項６】
炎症性状態を有する被験体を治療するための、ＣＩＲＰ阻害剤を含む医薬組成物であって、該ＣＩＲＰ阻害剤が、ＣＩＲＰへの結合について、ウサギに配列番号：１の精製組換えＣＩＲＰを注射することで生じたＣＩＲＰに対するウサギポリクローナル抗血清と特異的に競合する抗体またはその機能的断片であり、炎症性状態が、外傷出血または出血ショックである、医薬組成物。
【請求項７】
該抗体が、ポリクローナル抗体である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
該抗体が、モノクローナル抗体である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項９】
該抗体が、キメラ抗体、ヒト抗体、またはヒト化抗体である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
該抗体が、単鎖抗体である、請求項６に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は２００９年４月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／２１２，５８４号明細書の利益を主張するものである。上記出願の全教示は参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府支援
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）からの助成金ＲＯｌ  ＨＬ  ０７６１７９号の下で、政府の支援によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
炎症は、病原体、損傷細胞、または刺激物などの有害な刺激に対する脈管組織の複雑な生物反応である。有害な刺激を除去し、組織の修復プロセスを開始させることは、生体の保護的活動である。炎症が起こらなければ、よくても創傷および感染がもっとゆっくりと治癒することになり、組織の破壊が進んで生体の生存が危うくなる。しかしながら、炎症が抑制されずに広がると、多くの疾患が生ずることにもなる。
【０００４】
炎症は、急性または慢性のいずれかに分類することができる。急性炎症は、有害な刺激に対する身体の初期反応であり、血液から損傷組織への血漿および白血球の移動が増大することにより起こる。生化学的事象のカスケードにより炎症反応が伝播し、完成する。この炎症反応には局所脈管系、免疫系、および損傷組織内の様々な細胞が関与する。慢性炎症として知られる長期にわたる炎症は、炎症部位に存在する細胞のタイプが進行につれて変化し、炎症過程による組織の破壊と修復が同時に起こることを特徴とする。
【０００５】
急性の炎症性状態（たとえば、敗血症、外傷出血、および腸虚血再潅流障害）を有する患者の管理における最近の進歩にもかかわらず、多数の患者が続発性循環性ショックおよび多臓器不全が原因で死亡する。ショックおよび多臓器不全は、死亡率が容認できないほど高く、医療外科集中治療室における主要な死因であり続けている。循環虚脱を防ぎ、死亡率を低下させるために多数の治療法および物質が研究されてきたが、完全に成功したものはない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
今日、現代医療は、慢性炎症が慢性変性疾患の主な要因であると認め始めている。炎症促進性サイトカインは、酸化力のある化学薬品と共に細胞を攻撃し死滅させることができる免疫系の一部である。処置しなければ、炎症は組織および器官を損傷する可能性がある。たとえば、炎症は、関節炎患者に軟骨破壊をもたらし、糖尿病患者の膵臓を損傷し、現在では心臓血管疾患および癌に影響を与えると考えられている。
【０００７】
これまでのところ、急性および慢性のヒト炎症性状態の処置には、非常に限定された特定の療法しかない。したがって、副作用を最小限に抑えた、炎症性状態の有効な新しい治療に対する、未だ満たされていない大きな医療ニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、低温誘導性ＲＮＡ結合タンパク質（ＣＩＲＰ）の阻害により炎症反応が減弱するという発見に基づいている。より具体的には、本出願人は、出血性ショックの動物モデルにおいて、ＣＩＲＰの阻害がアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、肝臓ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、乳酸、ＴＮＦ、血清ＴＮＦ、ならびに血清、肺、および肝臓のＩＬ−６のレベルを無処置対照と比較して低下させことを発見した（図７〜図８）。さらに、ＣＩＲＰの阻害は出血誘発性の死を減少させる（図６）。この発見に基づいて、炎症性状態の処置のための医薬組成物および方法を開示する。
【０００９】
一実施形態では、本発明は、薬学的に許容される担体または希釈剤、およびＣＩＲＰ阻害剤を含む医薬組成物である。
【００１０】
別の実施形態では、本発明は、被験対象に有効量のＣＩＲＰ阻害剤を投与することを含む、炎症性状態を有する被験対象を処置する方法である。
【００１１】
別の実施形態では、本発明は、ＣＩＲＰに特異的に結合する単離抗体（「ＣＩＲＰ抗体」）またはその抗原性断片であり、前記抗体または抗原性断片は、ＣＩＲＰの１つまたは複数の生物活性を阻害する。
【００１２】
別の実施形態では、本発明は、有効量のＣＩＲＰ阻害剤をそれを必要とする被験対象に投与することを含む、ＣＩＲＰ活性を阻害する方法である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ヒトＣＩＲＰアミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。
【図２】出血の動物モデルにおいて、擬似（血液ではない）対照と比較して、肝臓、心臓、および血液のＣＩＲＰ遺伝子が過剰発現することを示す図である。
【図３】組換えＣＩＲＰ（ｒＣＩＲＰ）の投与後にＡＳＴおよびＡＬＴが上昇することを示す１対のグラフである。
【図４】ｒＣＩＲＰの投与後に血液、肝臓、および腸のＴＮＦおよびＨＭＧＢｌが増大することを示す図である。
【図５】培養マクロファージからのサイトカイン（ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＨＭＧＢｌ）の放出を促進し増大させる、ｒＣＩＲＰの時間経過および効果を示す図である。
【図６】出血の動物モデルにおいて、無処置対照と比較して、抗ＣＩＲＰ抗体の添加により生存率が増大することを示すグラフである。
【図７】出血の動物モデルにおいて、無処置対照と比較して、抗ＣＩＲＰ抗体組成物の投与後に血清のＡＳＴ、ＡＬＴ、および乳酸が減少することを示す１組のグラフである。
【図８】出血の動物モデルにおいて、無処置対照と比較して、抗ＣＩＲＰ抗体の投与後に抗ＣＩＲＰ抗体により血清、肺、および肝臓のＩＬ−６が減少することを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本出願人は、驚いたことに、炎症反応の間にＣＩＲＰ発現がアップレギュレートされ、血液循環に放出されることを発見した。本出願人はまた、いったんＣＩＲＰが血流に入ると、それは強力な炎症促進性メディエーターまたはサイトカインとして働き、組織障害および死さえも引き起こすことを発見した。
【００１５】
本発明は、ＣＩＲＰの阻害が、敗血症の動物モデルにおいて、これらに限定されるものではないが、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、肝臓ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、乳酸、ＴＮＦ、血清ＴＮＦ、ならびに血清、肺、および肝臓のＩＬ−６を含む炎症メディエーターおよびマーカーのレベルを無処置対照と比較して低下させるという発見に基づいている。この低下は、炎症性疾患および炎症性状態の処置においてＣＩＲＰを標的とすることが有益な効果を及ぼすことを反映し、ある場合には説明するものである。さらに、この低下は、そのような疾患および状態の処置においてＣＩＲＰ阻害剤およびアンタゴニストが治療上有益であることを説明する。
【００１６】
ＣＩＲＰは、軽度の低温ストレス（３２℃）によって培養細胞に誘導される、哺乳類、好ましくはヒトのタンパク質である。ＣＩＲＰはＮ末端ＲＮＡ結合ドメインおよびＣ末端グリシンリッチドメインを含む。ヒトＣＩＲＰのアミノ酸配列を図１の配列番号１に示す（Ｎｉｓｈｉｙａｍａら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１３７巻、１９９７を参照されたい）。「哺乳類ＣＩＲＰ」は、天然に存在する哺乳類ＣＩＲＰまたは内因性の対応する哺乳類ＣＩＲＰと同じアミノ酸配列を有するタンパク質（たとえば、組換えタンパク質、合成タンパク質（すなわち、有機合成化学の方法を使用して生成したもの））を含む。この用語はまた、ＣＩＲＰの多型または対立遺伝子の変異体および他のアイソフォーム（たとえば、選択的スプライシングまたは他の細胞プロセスによって生成されたもの）、ならびに前述したものの修飾形態または未修飾形態（たとえば、脂質付加形態、グリコシル化形態、非グリコシル化形態）を含む。このようなタンパク質は、哺乳類ＣＩＲＰを天然に産生する供給源から回収または単離することができる。ＣＩＲＰは、低温誘導性の細胞増殖抑制に本質的な役割を果たしている。
【００１７】
本明細書において定義する「ＣＩＲＰ阻害剤」は、ＣＩＲＰに結合し、ＣＩＲＰの１つまたは複数の生物活性を阻害する（たとえば、低下させる、妨害する、減少させる、中和する）作用物質（たとえば、分子、天然もしくは合成の核酸または核酸アナログ、アンチセンス分子、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、タンパク質、ペプチド、抗体、抗原性断片、化学物質など）、あるいはＣＩＲＰ遺伝子および／もしくはＣＩＲＰタンパク質の発現または生物活性ＣＩＲＰの放出を阻害する作用物質である。用語「ＣＩＲＰの生物活性」は、ＣＩＲＰ受容体結合、ＣＩＲＰシグナリング、炎症促進性サイトカインのＣＩＲＰ媒介放出、ＣＩＲＰ媒介炎症および／または他のＣＩＲＰ媒介活性を指す。用語「アンタゴニスト」は、用語「阻害剤」と互換的に使用することができる。
【００１８】
ＣＩＲＰ阻害剤は、ＣＩＲＰの１つもしくは複数の生物活性または生物機能に結合し、阻害する（たとえば、低下させる、妨害する、または中和する）抗体であってもよい。
【００１９】
抗体はポリクローナルであってもまたはモノクローナルであってもよく、用語「抗体」は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を包含するように意図したものである。ポリクローナルおよびモノクローナルという用語は、抗体調製物の均一性の程度を指すものであり、特定の製造方法に限定することを意図したものではない。本明細書において使用する用語「抗体」はさらに、キメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、ベニヤ抗体、または単鎖抗体の断片を含む、抗体の機能的断片を包含する。この機能的断片には、哺乳類ＣＩＲＰに結合する抗原結合性断片が含まれる。このような断片は酵素的切断または組換え技術によって作製することができる。たとえば、パパイン、ペプシン、または必要な基質特異性を有する他のプロテアーゼを使用して断片を生成することができる。抗体はまた、１つまたは複数の停止コドンが本来の停止部位の上流に導入された抗体遺伝子を使用して、様々な切断形態で作製することができる。
【００２０】
様々な種から由来する断片を含む、単鎖抗体、およびキメラ抗体、ヒト化抗体もしくは霊長類化抗体（ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｅｄ抗体）、またはベニヤ抗体、ならびにキメラ単鎖抗体、ＣＤＲ−ｇｒａｆｔｅｄ単鎖抗体、もしくはベニヤ単鎖抗体などを、本発明および用語「抗体」は包含する。これらの抗体の様々な断片は、従来技術によって化学的に相互に連結することができるか、または遺伝子工学技術を使用して連続したタンパク質として調製することができる。たとえば、キメラ鎖またはヒト化鎖をコードする核酸を発現させて、連続したタンパク質を生成させることができる。たとえば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許第０，１２５，０２３（Ｂｌ）号明細書；Ｂｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号明細書；Ｂｏｓｓら、欧州特許第０，１２０，６９４（Ｂｌ）号明細書；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｍ．Ｓ．ら、国際公開第８６／０１５３３号パンフレット；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ、Ｍ．Ｓ．ら、欧州特許第０，１９４，２７６（Ｂｌ）号明細書；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号明細書；Ｗｉｎｔｅｒ、欧州特許第０，２３９，４００（Ｂｌ）号明細書；Ｑｕｅｅｎら、欧州特許第０，４５１，２１６（Ｂｌ）号明細書；およびＰａｄｌａｎ、Ｅ．Ａ．ら、欧州特許出願公開第０，５１９，５９６（Ａ１）号明細書を参照されたい。霊長類化抗体に関して、Ｎｅｗｍａｎ，Ｒ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：１４５５〜１４６０（１９９２）、ならびに単鎖抗体に関して、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号明細書およびＢｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６（１９８８）を参照されたい。
【００２１】
ヒト化抗体は、標準的方法または他の適切な手法を用いる合成または組換えＤＮＡ技術を使用して作製することができる。ヒト化可変領域をコードする核酸（たとえばｃＤＮＡ）配列はまた、あらかじめヒト化された可変領域からのＤＮＡ鋳型など、ヒト鎖またはヒト化鎖をコードするＤＮＡ配列を変更するためにＰＣＲ突然変異誘発方法を使用して構築することができる（たとえば、Ｋａｍｍａｎ，Ｍ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１７：５４０４（１９８９）；Ｓａｔｏ，Ｋ．ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５３：８５１〜８５６（１９９３）；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ，Ｂ．Ｌ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１９（９）：２４７１〜２４７６（１９９１）；ならびにＬｅｗｉｓ，Ａ．Ｐ．およびＪ．Ｓ．Ｃｒｏｗｅ、Ｇｅｎｅ、１０１：２９７〜３０２（１９９１）を参照されたい）。これらの方法または他の適切な方法を使用すれば、変異体も容易に作製することができる。一実施形態では、クローン化した可変領域を変異させることができ、かつ所望の特異性を有する変異体をコードする配列を選択することができる（たとえば、ファージライブラリーから；たとえば、Ｋｒｅｂｂｅｒら、米国特許第５，５１４，５４８号明細書；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、１９９３年４月１日に公開の国際公開第９３／０６２１３号パンフレットを参照されたい）。
【００２２】
哺乳類（たとえばヒト）ＣＩＲＰに特異的な抗体は、配列番号１の単離および／もしくは組換えヒトタンパク質またはその断片（合成ペプチドなどの合成分子を含む）などの適切な免疫原に対して産生させることができる。また、ＣＩＲＰを発現する細胞を有する適切な宿主（たとえばマウス）を免疫することによっても抗体を産生させることができる。さらに、ＣＩＲＰを発現する細胞は、免疫原としてまたはＣＩＲＰを結合する抗体のスクリーニングに使用することができる。
【００２３】
免疫抗原の調製ならびにポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の作製は、任意の適切な技術を使用して行なうことができる。様々な方法が記載されてきた（たとえば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７（１９７５）およびＥｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１〜５１９（１９７６）；Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ２６６：５５０〜５５２（１９７７）、Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉら、米国特許第４，１７２，１２４号明細書；Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＤ．Ｌａｎｅ、１９８８、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２巻（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ２７、Ｓｕｍｍｅｒ  ’９４）、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編、（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）、１１章、（１９９１）を参照されたい）。一般に、ハイブリドーマは、抗体産生細胞と適切な不死細胞株（たとえば、ＳＰ２／０、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３などの骨髄腫細胞株、またはヘテロ骨髄腫細胞）とを融合させることにより作製する。抗体産生細胞は、目的の抗原で免疫したヒトまたは他の適切な動物の末梢血または好ましくは脾臓もしくはリンパ節から得ることができる。融合細胞（ハイブリドーマ）は、選択培養条件を使用して単離し、限界希釈法によってクローン化することができる。所望の特異性を有する抗体を産生する細胞を適切なアッセイ（たとえばＥＬＩＳＡ）によって選択することができる。
【００２４】
必要な特異性を有する抗体（たとえばヒト化抗体または抗原結合性断片）を作製または単離する他の適切な方法を使用することができる。これらの方法には、たとえば、ライブラリー（たとえばファージディスプレイライブラリー）から組換え抗体を選択する方法、またはヒト抗体のレパートリーを作製することができるトランスジェニック動物（たとえばマウス）を免疫する方法（たとえば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：２５５１〜２５５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：２５５〜２５８（１９９３）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、米国特許第５，５４５，８０６号明細書；Ｓｕｒａｎｉら、米国特許第５，５４５，８０７号明細書；Ｌｏｎｂｅｒｇら、国際公開第９７／１３８５２号パンフレットを参照されたい）が含まれる。このような免疫および単離の手法は、当業者には周知である。
【００２５】
抗原性断片は、体内に入ると抗体産生を刺激する物質である。抗原には、毒素、細菌、外来の血球、および／または移植臓器の細胞を含めることができる。
【００２６】
ＣＩＲＰ阻害剤は、ＣＩＲＰの活性に特異的に結合し、阻害する（低下させる、妨害する、減少させる、中和する）ペプチド（たとえば、合成、組換え、融合、または誘導化されたペプチド）であってもよい。このペプチドは、直鎖状であっても、分岐を有していても、または環状であってもよい。たとえば、いくつかのアミド結合を含むヘテロ原子環状構造を有するペプチドであってもよい。特定の実施形態では、ペプチドは環状ペプチドである。ペプチドは、アミノ酸のアミノ基がペプチド結合によって別のアミノ酸のカルボキシル基に連結されている、約２から約１００個のアミノ酸残基からなる化合物を指す。このようなペプチドの長さは、通常は約１００アミノ酸残基未満であるが、好ましくは約１０、約２０、約３０、約４０、または約５０残基である。
【００２７】
ＣＩＲＰの特定のドメイン（たとえばユニークなドメイン）に選択的に結合するペプチドを作製することができる。ペプチドはたとえば、酵素的または化学的切断によって天然タンパク質から誘導しても、または取り出してもよく、あるいはたとえば固層ペプチド合成（たとえばＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ型合成）（たとえば、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙら「Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、第２版、１９７６を参照されたい）などの適切な方法によって合成してもよい。ＣＩＲＰ阻害剤になるペプチドはまた、たとえば組換えＤＮＡ法または他の適切な方法を用いて作製することもできる（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．およびＲｕｓｓｅｌｌ  Ｄ．Ｗ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００１を参照されたい）。
【００２８】
ＣＩＲＰ阻害剤はまた、たとえば、担体タンパク質（たとえば、ｍｙｃ、ｈｉｓ、グルタチオンスルフヒドリルトランスフェラーゼ）に融合しかつ／または標識された（たとえば、放射性標識された、蛍光標識された）融合ペプチドであってもよい。
【００２９】
ペプチドは、たとえば、一般α−アミノ酸（たとえば、アラニン、グリシン、バリン）、非α−アミノ酸（たとえば、β−アラニン、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、サルコシン、スタチン）、および異常アミノ酸（たとえば、シトルリン、ホモシトルリン、ホモセリン、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン）など任意の適切なＬ−またはＤ−アミノ酸を含むことができる。ペプチド上のアミノ基、カルボキシル基、および／または他の官能基は、フリー（たとえば、未修飾）であってもよく、または適切な保護基で保護されていてもよい。アミノ基およびカルボキシル基のための適切な保護基、および保護基を付加または除去する方法は、当技術分野で公知であり、たとえば、ＧｒｅｅｎおよびＷｕｔｓ，「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９１に開示されている。ペプチドの官能基はまた、当技術分野で公知の方法を使用して、誘導体化（たとえば、アルキル化）することもできる。
【００３０】
ペプチドは、合成して少数から多数の異なる分子種を含むライブラリーに集めることができる。このようなライブラリーは、コンビナトリアルケミストリーの方法を使用して作製することができ、そのライブラリーを任意の適切な方法を用いてスクリーニングすることにより、それが所望の生物活性を有するペプチドを含むか否かを決定することができる。次いで、そのようなペプチド阻害剤は適切な方法を使用して単離することができる。
【００３１】
所望であれば、ポリペプチドは修飾（たとえば、アミノ酸リンカー、アシル化、アセチル化、アミド化、メチル化、末端修飾（たとえば環化修飾））を含むことができる。ポリペプチドはまた、化学的修飾（たとえばＮ−メチル−α−アミノ基置換）を含有することができる。さらに、ペプチド阻害剤は、公知のかつ／または天然に存在するペプチドのアナログ、たとえば保存的アミノ酸残基置換を有するペプチドアナログであってもよい。これらの修飾により、ＣＩＲＰ阻害活性を含む、ペプチドの様々な性質（たとえば、溶解性、結合性）を改良することができる。
【００３２】
ペプチドミメティックは、ポリペプチドではないが、その構造的側面を模倣する分子を指す。ペプチドミメティックアンタゴニストは、従来の化学的手法によって調製することができる（たとえば、Ｄａｍｅｗｏｏｄ  Ｊ．Ｒ．「Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍｉｍｅｔｉｃ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ａｉｄ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」  ｉｎ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００７、９巻、１〜８０頁，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９６；Ｋａｚｍｉｅｒｓｋｉ  Ｗ．Ｋ．、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：  Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９９を参照されたい）。たとえば、ペプチドと同じ官能基を有する多糖を調製することができる。ペプチドミメティックは、たとえば標的分子に結合しているかまたは結合することになる環境における、ペプチド作用物質の３次元構造を確定することにより設計することができる。ペプチドミメティックは、少なくとも２つの構成要素、１つまたは複数の結合部分および骨格構造または支持構造を含む。
【００３３】
結合部分は、（たとえば、疎水性相互作用またはイオン相互作用を介して）標的分子、たとえばリガンド結合部位またはその近傍のアミノ酸と反応するかまたは複合体を形成する化学原子または化学基である。たとえば、ペプチドミメティックの結合部分は、ペプチド阻害剤またはタンパク質阻害剤のものと同じとすることができる。この結合部分は、ペプチド阻害剤の結合部分と同じかまたは類似の様式で受容体と反応する原子または化学基とすることもできる。たとえば、ＣＩＲＰに結合してＣＩＲＰの活性を阻害するペプチドミメティックを設計するために、計算化学を使用することができる。ペプチド中の塩基性アミノ酸に対するペプチドミメティックの設計で使用するのに適している結合部分の例としては、アミン、アンモニウム、グアニジン、およびアミドなどの窒素含有基またはホスホニウムが挙げられる。酸性アミノ酸に対するペプチドミメティックの設計で使用するのに適している結合部分の例としては、たとえば、カルボキシル、低級アルキルカルボン酸エステル、スルホン酸、低級アルキルスルホン酸エステル、または亜リン酸もしくはそのエステルが挙げられる。
【００３４】
支持構造は、１つまたは複数の結合部分に結合していると、ペプチドミメティックの立体配置を与える化学要素である。この支持構造は有機的であっても、または無機的であってもよい。有機的支持構造の例としては、有機合成ポリマー（ポリビニルアルコールまたはポリラクチドなど）の多糖、ポリマー、またはオリゴマーが挙げられる。支持構造は、ペプチドの骨格すなわち支持構造と実質的に同じ大きさおよび次元を有することが好ましい。これは、ペプチドおよびペプチドミメティックの原子および結合の大きさを計算または測定することより決定することができる。一実施形態では、ペプチド結合の窒素を酸素または硫黄と置換して、たとえばポリエステル骨格を形成させることができる。別の実施形態では、カルボニルをスルホニル基またはスルフィニル基と置換して、ポリアミド（たとえば、ポリスルホンアミド）を形成させることができる。ペプチドの逆アミド（ｒｅｖｅｒｓｅ  ａｍｉｄｅ）を作製することができる（たとえば、−ＮＨＣＯ−基を１つまたは複数の−ＣＯＮＨ−基で置換する）。さらに別の実施形態では、ペプチド骨格はポリシラン骨格で置換することができる。
【００３５】
これらの化合物は公知の方法によって製造することができる。たとえば、ポリエステルペプチドミメティックは、アミノ酸のα−アミノ基を対応する水酸基で置換して、ヒドロキシ酸を調製し、次いでヒドロキシ酸をエステル化することによって調製することができる。場合によっては、副反応を最小限に抑えるために塩基性側鎖および酸性側鎖をブロックする。適切な化学合成ルートの決定は、一般に、化学構造の決定により容易に確認することができる。
【００３６】
ペプチドミメティックは、合成して少数から多数の異なる分子種を含むライブラリーに集めることができる。このようなライブラリーはコンビナトリアルケミストリーの周知の方法を使用して作製することができ、そのライブラリーをスクリーニングすることによりそれが所望の活性を有する１つまたは複数のペプチドミメティックスを含むか否かを決定することができる。次いで、そのようなペプチドミメティック阻害剤を適切な方法によって単離することができる。
【００３７】
非ペプチド性化合物または小分子などの他のＣＩＲＰ阻害剤は、自然界に見つける（たとえば、同定する、単離する、精製する）ことができ、かつ／または作製する（たとえば、合成する）ことができる。作用物質は、化学物質および／または化学ライブラリー（たとえば、化学薬品、ペプチド、核酸のライブラリー）のハイスループットスクリーニングなどのスクリーニングでＣＩＲＰ結合特異性に関してテストすることができる。化合物または小分子は、たとえば、ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  （ＰｕｂＣｈｅｍ）の多数の利用可能な化合物ライブラリーおよび市販の他のライブラリーから同定することができる。このような分子ライブラリーまたは分子コレクションはまた、コンビナトリアルケミストリーの周知の方法など周知の化学的手法を使用して作製することができる。ライブラリーをスクリーニングして、ＣＩＲＰに結合し阻害する化合物を同定することができる。同定された化合物は、医薬品化学の周知の方法を使用してさらに多様性を得るためのリード化合物として用いることができる。たとえば、リードの構造変異体の化合物コレクションを作製して、ＣＩＲＰ結合活性および／または阻害活性に関してスクリーニングすることができる。これにより、化合物の構造と生物活性とを関連づける構造活性相関を展開させることができる。適度な結合活性および阻害活性を有する化合物は、インビボで使用するためにさらに開発を進めることができる。「Ｏｘｙｇｅｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＲＢＭ３  ａｎｄ  ＣＩＲＰ  ｂｙ  ＨＩＦ−１−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ」、Ｓ．Ｗｅｌｌｍａｎｎら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１１７、１７８５〜１７９４、２００４に開示されているように、ある例では、小分子のＮａＮ３がＣＩＲＰ転写を阻害する。
【００３８】
本発明のある実施形態では、ＣＩＲＰ阻害剤は分子量が１０００ダルトン未満である。
【００３９】
ＣＩＲＰ阻害剤には、ＣＩＲＰの発現を阻害する（低下させる、減少させる、中和する、妨害する）作用物質もある。ＣＩＲＰ遺伝子の発現（たとえば、転写、ｍＲＮＡのプロセシング、翻訳）を阻害する作用物質（分子、化合物、核酸、オリゴヌクレオチド）は、有効なＣＩＲＰ阻害剤になる。アンチセンスオリゴヌクレオチド（たとえば、ＤＮＡ、リボプローブ）もＣＩＲＰサブユニットの発現を阻害するＣＩＲＰ阻害剤として使用することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的核酸配列（たとえば、ｍＲＮＡ）に特異的にハイブリダイズし、標的核酸の分解（たとえば、リボヌクレアーゼＨ依存メカニズムによるＲＮＡの分解）を誘導するか、またはスプライシングもしくは翻訳機構の進行を立体的に妨害する、概ね短い（約１３〜約２５塩基）一本鎖核酸である（たとえば、Ｄｉａｓ  Ｎ．およびＳｔｅｉｎ  Ｃ．Ａ．、Ｍｏｌ．Ｃａｎ．Ｔｈｅｒ．１：３４７〜３５５、２００２を参照されたい）。メチルホスホネートオリゴヌクレオチド、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド、リボースの２’位の水素がＯ−アルキル基（たとえば、メチル）によって置換されているオリゴヌクレオチド、ポリアミド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（デオキシリボース部分はモルホリン環に置換されている）、ＰＮ（リボースの３’位の酸素のアミン基によるＮ３’→Ｐ５’置換）、およびキメラオリゴヌクレオチド（たとえば、２’−０−メチル／ホスホロチオエート）を含む、ＣＩＲＰ阻害剤として使用することができる多くの様々なタイプのアンチセンスオリゴヌクレオチドがある。
【００４０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、予測アルゴリズムを使用してＣＩＲＰに特異的になるように設計することができる（たとえば、Ｄｉｎｇ，Ｙ．およびＬａｗｒｅｎｃｅ，Ｃ．Ｅ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２９：１０３４〜１０４６、２００１；Ｓｃｚａｋｉｅｌ，Ｇ．、Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．、５：Ｄ１９４〜Ｄ２０１、２０００；Ｓｃｈｅｒｒ，Ｍ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２８：２４５５〜２４６１、２０００；Ｐａｔｚｅｌ，Ｖ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２７：４３２８〜４３３４、１９９９；Ｃｈｉａｎｇ，Ｍ．Ｙ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：１８１６２〜１８１７１、１９９１；Ｓｔｕｌｌ，Ｒ．Ａ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２０：３５０１〜３５０８、１９９２；Ｄｉｎｇ，Ｙ．およびＬａｗｒｅｎｃｅ，Ｃ．Ｅ．、Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｃｈｅｍ．、２３：３８７〜４００、１９９９；Ｌｌｏｙｄ，Ｂ．Ｈ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２９：３６６４〜３６７３、２００１；Ｍｉｒ，Ｋ．Ｕ．およびＳｏｕｔｈｅｒｎ、Ｅ．Ｍ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１７：７８８〜７９２、１９９９；Ｓｏｈａｉｌ，Ｍ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２９：２０４１〜２０５１、２００１；Ａｌｔｍａｎ，Ｒ．Ｋ．ら、Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．、１：４９３〜５０８、１９９９を参照されたい）。アンチセンスオリゴヌクレオチドは適切な方法によって作製することができる。たとえば、自動核酸シンセサイザー（たとえばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を使用する核酸（たとえば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ）合成（Ｍａｒｔｉｎ，Ｐ．、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  ７８：４８６〜５０４、１９９５も参照されたい）。アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、適切な発現ベクトルを含有する細胞内で安定に発現させることができる。
【００４１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、吸着性エンドサイトーシスのプロセスを介して標的細胞に取り込まれ得る。したがって、被験対象（たとえば、哺乳類）の処置では、アンチセンスＣＩＲＰは、たとえば注射または点滴によって標的細胞に送達させることができる。たとえば、精製されたオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡは、単独でまたは適切な薬物送達媒体（たとえば、リポソーム、カチオン性ポリマー（たとえば、ポリ‐Ｌ‐リジン、ＰＡＭＡＭデンドリマー、ポリアルキルシアノアクリレートナノ粒子、およびポリエチレンイミン））を含む製剤で投与可能であり、あるいは適切な担体ペプチド（たとえば、ホメオティック転写因子、アンテナペディアペプチド、ＨＩＶ−１のＴａｔタンパク質、Ｅ５ＣＡペプチド）に結合させることができる。
【００４２】
ＣＩＲＰに対するアンタゴニスト作用物質（たとえば、抗体）を同定する方法を以下に述べる。
【００４３】
ＣＩＲＰを含む組成物を結合アッセイに使用して、本発明の抗体を含む、ＣＩＲＰに結合できる作用物質を検出および／または同定することができる。
【００４４】
結合アッセイにおける使用に適した組成物には、たとえば、哺乳類ＣＩＲＰまたはその機能的変異体を自然に発現する細胞、および哺乳類ＣＩＲＰまたはその機能的変異体を発現する組換え細胞が含まれる。さらに、結合アッセイにおける使用に適した組成物には、哺乳類ＣＩＲＰまたはその機能的変異体を含む膜調製物も含まれる。そのような膜調製物には、天然膜（たとえば細胞膜）または合成膜が含まれ得る。この膜調製物は、哺乳類ＣＩＲＰまたはその機能的変異体を含有する細胞の膜画分であることが好ましい。
【００４５】
一実施形態では、哺乳類ＣＩＲＰに結合する作用物質（たとえば、抗体）を検出または同定する方法は、試験作用物質（たとえば抗体）が参照作用物質（たとえば、リガンドまたは特異性が知られている別の抗体）の結合を阻害する能力を評価する競合的結合アッセイである。たとえば、参照作用物質は下記に記載のような適切な標識で標識することができ、アッセイ中に存在するＣＩＲＰを飽和させるために必要な標識参照作用物質の量を決定することができる。飽和量の標識参照作用物質および様々な量の試験作用物質を、哺乳類ＣＩＲＰまたはその機能的変異体を含む組成物と、判定する結合および複合体形成に適した条件下で接触させることができる。ＣＩＲＰと試験作用物質との間の複合体形成の特異性は、適切な対照（たとえば、非標識作用物質、標識のみ）を使用して決定することができる。
【００４６】
参照作用物質または試験作用物質のいずれかとＣＩＲＰまたは上述した免疫原性ペプチドを含むＣＩＲＰ断片との間の複合体形成は、適切な方法を使用して直接的または間接的に検出または測定することができる。たとえば、作用物質は適切な標識で標識することができ、複合体形成は標識の検出によって決定することができる。複合体の特異性は、非標識作用物質または標識のみなどの適切な対照を使用して決定することができる。作用物質と哺乳類ＣＩＲＰまたはその機能的変異体との間の複合体の検出に使用するのに適した標識としては、たとえば、ラジオアイソトープ、エピトープ、アフィニティ標識（たとえば、ビオチン、アビジン）、スピン標識、酵素、蛍光基、または化学発光基が挙げられる。
【００４７】
ＣＩＲＰに結合する抗体などの試験作用物質の能力を決定するために使用する競合的結合アッセイに関していえば、そのような能力は、標識参照作用物質の特異的結合を５０％阻害するのに要する試験作用物質濃度（ＩＣ５０値）として報告することができる。特異的結合は、全結合（たとえば、複合体中の全標識）から非特異的結合を引いたものとして定義することが好ましい。非特異的結合は、過剰な非標識参照作用物質の存在下で形成した複合体中になお検出される標識の量として定義することが好ましい。この方法で使用するのに適した参照作用物質には、哺乳類ＣＩＲＰまたはその機能的変異体に特異的に結合する分子および化合物、たとえばＣＩＲＰのリガンドまたは抗体が含まれる。好ましい参照作用物質は、ヒトＣＩＲＰ（配列番号１）の断片に対する特異性が知られている抗体である。
【００４８】
ＣＩＲＰに結合する作用物質をさらに研究することにより、その作用物質が１つまたは複数の「ＣＩＲＰの生物活性」を阻害する（たとえば、低下させる、妨害する、中和する）能力を評価することができる。前に定義した用語「ＣＩＲＰの生物活性」は、ＣＩＲＰ受容体結合、ＣＩＲＰシグナリング、炎症促進性サイトカインのＣＩＲＰ媒介放出、ＣＩＲＰ媒介炎症および／または他のＣＩＲＰ媒介活性を指す。したがって、これらのＣＩＲＰ媒介機能を検出するアッセイを使用して、試験作用物質の阻害活性（たとえば、試験作用物質が１つまたは複数のＣＩＲＰ機能を阻害する能力）を評価することができる。
【００４９】
作用物質（たとえば抗体）がＣＩＲＰの生物活性を阻害するか否かの評価は、たとえば抗体が哺乳類細胞からの炎症促進性サイトカインの放出を阻害するか否かを決定することにより行なうことができる。適切なサイトカインの例としては、ＴＮＦ、ＩＬ−６またはＨＭＧＢｌが挙げられる。
【００５０】
これらの方法についていえば、細胞は、炎症促進性サイトカインの産生を誘導できる任意の細胞でよい。この細胞は、免疫細胞、たとえば、マクロファージ、単球、または好中球である。
【００５１】
サイトカイン産生阻害の評価は、サイトカインの定量（たとえば、ＥＬＩＳＡによる）を含む公知の任意の方法、またはバイオアッセイ（たとえば、炎症促進性サイトカイン活性減少の判定）、または炎症促進性サイトカインｍＲＮＡの測定によって行うことができる。当業者は、過度の実験をすることなく、これらのアッセイのいずれかを利用することができるであろう。ＣＩＲＰ阻害作用物質による、炎症促進性サイトカイン放出の阻害に関する非限定実施例に関して、図４および図８を参照されたい。出血の動物モデルにおいて、無処置対照と比較して、抗ＣＩＲＰ抗体の処置により血清ＴＮＦが減少することを図８Ａに示す。出血の動物モデルにおいて、無処置対照と比較して、抗ＣＩＲＰ抗体による処置によって組織ＴＮＦが減少することを図８Ｂ〜図８Ｃに示す。出血の動物モデルにおいて、無処置対照と比較して、抗ＣＩＲＰ抗体による処置によってＩＬ−６（たとえば、血清、肺、および肝臓のＩＬ−６）が減少することを図８Ｄ〜図８Ｆに示す。
【００５２】
炎症促進性サイトカイン放出を測定する別の方法では、炎症促進性サイトカインカスケードを刺激する作用物質と共に抗体で哺乳類細胞を処置することが含まれる。好ましい作用物質は細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）である。この化合物は、作用物質の前、作用物質と同時、または作用物質の後のいずれかに哺乳類細胞に投与することができる。この化合物は作用物質の前に投与することが好ましい。たとえば、米国特許第６，６１０，７１３号明細書を参照されたい。その関連する教示は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００５３】
ＣＩＲＰ阻害を評価するために測定することができるＣＩＲＰの他の生物活性としては、動物モデルのＡＳＴレベル、動物モデルの肝臓ＭＰＯレベル、および動物モデルの乳酸レベルが挙げられる。これらのマーカーのレベルは、炎症反応の間に通常上昇する。ＣＩＲＰの生物活性の阻害剤は、炎症反応を起こしている動物モデルにおいて、無処置対照と比較して、これらの１つまたは複数のマーカーのレベルを低下させることができる。ＣＩＲＰ阻害作用物質による、これらのマーカーの放出の阻害を評価する方法を、実施例セクションの図７Ａ〜図７Ｃに示す。出血の動物モデルにおける、無処置対照と比較した、ＡＳＴレベルに対する抗ＣＩＲＰ抗体の阻害効果を図７Ａに示す。出血の動物モデルにおいて、無処置対照と比較して、抗ＣＩＲＰ抗体の処置により肝臓ＭＰＯレベルが減少することを図８Ｇに示す。抗ＣＩＲＰ抗体により血清のＡＬＴおよび乳酸が減少することを図７Ｂ〜図７Ｃに示す。
【００５４】
これらの方法は、動物、たとえばラットを、炎症促進性サイトカインカスケードを刺激する作用物質と共にこの化合物で処置するインビボで実施することができ、また、炎症促進性サイトカインカスケードの誘導に対するこの作用物質の効果は、たとえば血清ＴＮＦレベルの測定により測定する。しかしながら、動物全体を用いるよりも細胞培養物を用いてこのタイプのアッセイを行うほうが比較的容易であるため、それらの方法は、たとえばマクロファージ培養物を使用して、インビトロで実施することが好ましい。
【００５５】
治療方法
本明細書において使用する「炎症性疾患または炎症性状態」とは、個体内の炎症を亢進させる疾患または状態を指す。炎症性疾患または炎症性状態はまた、個体内の炎症を亢進させる感染疾患または感染状態を指す。炎症性疾患または炎症性状態は、「慢性の炎症性疾患または炎症性状態」とすることができる。慢性の炎症性疾患または炎症性状態は、数週間、数ヶ月、またはそれより長期間過ぎても回復しない炎症性状態である。慢性の炎症性状態は、急性の炎症性状態の後に続くこともあり、またはある疾患もしくはある状態に関しては、急性の炎症性疾患または炎症性状態がない状態で起こることもある。あるいは、炎症性状態は急性の炎症性エピソードの結果であることもある。本明細書において使用する「急性の炎症性エピソード」は、亢進した免疫反応を指す。急性炎症の症状には、発赤、熱、腫脹、疼痛、および機能の喪失、たとえば関節運動の喪失が挙げられる。たとえば、慢性の炎症性疾患または炎症性状態の急性の炎症性エピソードは、以下のように慢性の炎症性疾患または炎症性状態の典型的な症状とは異なる。急性の炎症反応中に、血流中に検出できる急性期タンパク質または急性期反応物質を肝臓が合成することがしばしば起こる。急性期反応物質としては、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）；α１−アンチトリプシン；α１−アンチキモトリプシン；α２−マクログロブリン；フィブリノゲン、フィブリン、プロトロンビン、トロンビン、第ＶＩＩＩ因子、およびプラスミノゲンなどの凝固因子；補体タンパク質、ならびに血清アミロイドタンパク質が挙げられる。さらに、急性の炎症性エピソードの間に、局所の炎症細胞、たとえば好中球およびマクロファージが、血流中へ多くのサイトカイン、最も顕著にはＩＬ−Ｉ、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＨＭＧＢｌ、およびＴＮＦ−α（「サイトカインカスケード」）を分泌する。ＣＩＲＰ阻害剤は、投与されて、これらの炎症性状態の作用物質およびマーカーの一部またはすべてを阻害するか、低下させるか、さもなければ改善することができる。
【００５６】
本発明を使用して、有用に処置することができる炎症性状態の非限定例は、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵臓炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸閉塞、喉頭蓋炎、無弛緩症、胆管炎、胆嚢炎、肝炎、ウィップル病、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、免疫複合体病、器官虚血再潅流障害、器官ネクローシス、枯草熱、セプシス、セプシス−敗血症性ショック、敗血症、内毒素性ショック、悪液質、過高体温、好酸球性肉芽腫、肉芽腫症、サルコイドーシス、敗血症性流産、精巣上体炎、膣炎、前立腺炎、尿道炎、気管支炎、気腫、鼻炎、肺炎、塵肺症、肺胞炎、細気管支炎、咽頭炎、肋膜炎、静脈洞炎、インフルエンザ、呼吸合包体ウイルス感染症、ヘルペス感染症、ＨＩＶ感染症、Ｂ型肝炎ウイルス感染症、Ｃ型肝炎ウイルス感染症、播種性菌血症、デング熱、カンジダ症、マラリア、フィラリア症、アメーバ症、包虫嚢胞、脈管炎、血管炎、心内膜炎、動脈炎、アテローム性動脈硬化症、血栓性静脈炎、心膜炎、心筋炎、虚血、結節性動脈周囲炎、リウマチ熱、小児脂肪便症、成人呼吸促迫症候群、慢性閉塞性肺疾患、脳膜炎、脳炎、神経炎、神経痛、脊髄損傷、麻痺、ブドウ膜炎、関節炎、関節痛、骨髄炎、筋膜炎、パジェット病、痛風、歯周病、関節炎、関節滑膜炎、重症筋無力症、甲状腺炎、全身性紅斑性狼瘡、同種異系移植片拒絶反応、移植片対宿主疾患、グッドパスチャー症候群、ベーチェット症候群、強直性脊椎炎、ベルガー病、ライター症候群、ホジキン病、乾癬、心筋梗塞、脳卒中、炎症性腸疾患、壊死性小腸大腸炎、および外傷出血からなる群から選択される。
【００５７】
別の実施形態では、炎症性状態は、虫垂炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、腹膜炎、膵臓炎、肝炎、喘息、アレルギー、アナフィラキシーショック、器官ネクローシス、枯草熱、セプシス、セプシス−敗血症性ショック、敗血症、内毒素性ショック、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸閉塞、悪液質、敗血症性流産、播種性菌血症、小児脂肪便症、成人呼吸促迫症候群、慢性閉塞性肺疾患、関節炎、全身性紅斑性狼瘡、同種異系移植片拒絶反応、移植片対宿主疾患、脊髄損傷、麻痺、乾癬、虚血再潅流（腸、肝臓、腎臓、心臓、脳、および四肢）、心筋梗塞、脳卒中、炎症性腸疾患、壊死性小腸大腸炎、および外傷出血からなる群から選択される。
【００５８】
別の実施形態では、炎症性状態は、腹膜炎、膵臓炎、セプシス、セプシス−敗血症性ショック、内毒素性ショック、クローン病、潰瘍性大腸炎、腸閉塞、成人呼吸促迫症候群、慢性閉塞性肺疾患、慢性関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、虚血再潅流（腸、肝臓、腎臓、心臓、脳、および四肢）、心筋梗塞、脳卒中、炎症性腸疾患、壊死性小腸大腸炎、喘息、および外傷出血からなる群から選択される。
【００５９】
また、炎症性状態は、外傷出血、セプシス−敗血症性ショック、虚血再潅流（腸、肝臓、腎臓、心臓、脳、および四肢）、心筋梗塞、脳卒中、炎症性腸疾患、および壊死性小腸大腸炎からなる群から選択される。
【００６０】
投与方法
ＣＩＲＰ阻害剤の投与ルートは、処置すべき炎症性状態に依存する。たとえば、静脈注射は、敗血症性ショックなど全身性疾患の処置に好ましく、経口投与は、胃潰瘍など胃腸障害を処置するのに好ましい。
【００６１】
この方法によれば、本発明の１つまたは複数のＣＩＲＰ阻害剤は、適切なルートによって、単独または他の薬との併用のいずれかで被験対象に投与することができる。有効量の作用物質（すなわちＣＩＲＰ阻害剤）を投与する。「有効量」は、炎症反応の阻害および炎症性状態の緩和または治癒のために十分な量など、投与条件下で所望の治療効果または予防効果を達成するために十分な量である。作用物質の投与は、単回または複数回とすることができる。用量は、当技術分野で公知の方法によって決定することができ、たとえば、選ばれた具体的な作用物質、被験対象の年齢、薬剤に対する感受性および耐性、ならびに全体的な健康状態に依存する。抗体の適正用量は、１回の処置当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重とすることができる。
【００６２】
たとえば、経口、食事、局所、経皮、直腸、非経口（たとえば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下注射、皮内注射）、および吸入（たとえば、気管支内吸入、鼻腔内吸入、または経口吸入、鼻腔内点滴）の投与ルートを含む様々な投与ルートが、作用物質および処置すべき疾患または状態に依存して可能になる。投与は、指示どおりに局所または全身とすることができる。投与の好ましい方法は、選択した具体的な作用物質（ＣＩＲＰ阻害剤）、および処置される具体的な状態（たとえば、疾患）に依存して変えることができる。静脈内、経口、または非経口の投与が好ましい。
【００６３】
作用物質は中性の化合物、または薬学的に許容される塩として投与することができる。アミンまたは他の塩基性基を含有する化合物の塩は、たとえば、塩化水素、臭化水素、酢酸、過塩素酸など適切な有機酸または無機酸と反応させることによって得ることができる。第四級アンモニウム基を有する化合物もまた、塩化物、臭化物、ヨウ化物、酢酸塩、過塩素酸塩などの対アニオンを含有する。カルボン酸または他の酸性官能基を含有する化合物の塩は、適切な塩基、たとえば水酸化物（ｈｙｄｏｘｉｄｅ  ｂａｓｅ）と反応させることにより調製することができる。酸性官能基の塩は、ナトリウム、カリウムなどの対カチオンを含有する。
【００６４】
本明細書において使用する、開示化合物の「薬学的に許容される塩」とは、本発明の化合物を酸または塩基のいずれかと反応させて得られる、被験対象に投与するのに適したイオン結合含有生成物である。たとえば、アミンまたは他の塩基性基を含有する化合物の酸性塩は、塩化水素、臭化水素、酢酸、過塩素酸などの適切な有機酸または無機酸とこの化合物を反応させることにより得ることができる。このような塩の他の例として、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、メタンスルホン酸塩、硝酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩（たとえば、（＋）−酒石酸塩、（−）−酒石酸塩、またはラセミ混合物を含むその混合物）、コハク酸塩、安息香酸塩、およびグルタミン酸などのアミノ酸との塩が挙げられる。化合物が−ＣＯＯＨまたは−ＳＯ３Ｈなどの酸性官能基を含む場合、適切な有機塩基と共に塩を形成させることもできる。本発明の化合物との、薬学的に許容される塩基添加塩の形成に適したそのような塩基には、無毒で酸性官能基と反応するのに十分強い有機塩基が含まれる。このような有機塩基は当技術分野で周知であり、アルギニンおよびリジンなどのアミノ酸、モノ−、ジ−、およびトリエタノールアミン、コリン、モノ−、ジ−、およびトリアルキルアミン（メチルアミン、ジメチルアミン、およびトリメチルアミンなど）、グアニジン、Ｎ−ベンジルフェネチルアミン、Ｎ−メチルグルコサミン、Ｎ−メチルピペラジン、モルホリン、エチレンジアミン、トリスヒドロキシメチルアミノメタンなどが含まれる。
【００６５】
作用物質は、ＣＩＲＰ阻害剤および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物の一部として個体に投与することができる。
【００６６】
本明細書において使用する「医薬組成物」とは、開示されたＣＩＲＰアンタゴニスト（抗ＣＩＲＰ抗体など）および薬学的に許容される希釈剤または担体を含む、被験対象への投与に適した形態の製剤である。薬学的に許容される適切な担体には、不活性な固体賦形剤または固体希釈剤、および無菌の水溶液または有機溶液が含まれる。製剤は、選択した投与ルートによって変えることになる（たとえば、溶液、エマルジョン、カプセル）。適切な医薬担体は、ＣＩＲＰの促進剤（アゴニスト）または阻害剤（アンタゴニスト）と相互作用しない不活性成分を含有することができる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａに記載のものなど、標準医薬品製剤技術を使用することができる。非経口投与に適した医薬担体としては、たとえば、滅菌水、生理食塩水、静菌食塩水（約０．９％ｍｇ／ｍｌのベンジルアルコールを含有する食塩水）、リン酸緩衝生理食塩水、ハンクス溶液、乳酸リンゲル液などが挙げられる。組成物の封入方法（固いゼラチンまたはシクロデキストランのコーティングの中など）は、当技術分野で公知である（Ｂａｋｅｒら、「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｅ  Ａｇｅｎｔｓ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９８６）。吸入については、作用物質を可溶化して投与に適したディスペンサー（たとえば、アトマイザ、ネブライザー、または加圧式エアロゾルディスペンサー）に充填することができる。
【００６７】
医薬組成物はバルク、または単位用量形態とすることができる。単位用量形態は、たとえば、カプセル、ＩＶバッグ、錠剤、エアロゾル吸入器上の単一ポンプ、またはバイアルを含む様々な形態のうちのいずれでもよい。組成物の単位用量中の有効成分（すなわち開示化合物またはその塩の製剤）の量は、有効量とし、関係する具体的な処置によって変えることができる。患者の年齢および状態に応じてルーチン的に用量を変えることが必要になる場合があることを認識することができる。用量はまた投与ルートに依存することになる。
【００６８】
本明細書において使用する「被験対象」には、哺乳動物、たとえば、ヒト、コンパニオンアニマル（たとえば、イヌ、ネコ、トリなど）、家畜（たとえば、畜牛、ヒツジ、ブタ、ウマ、家禽など）、実験動物（たとえば、ラット、マウス、モルモットなど）が含まれる。本開示方法の好ましい実施形態では、被験対象はヒトである。
【００６９】
本発明の実施には、特に指示がないかぎり、当技術分野の範囲に入る、細胞培養、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および免疫学の通常技術を使用する。このような技術は、文献に十分に説明されている。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９５）、「Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  （数巻）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （数巻）、および  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （数巻）を参照されたい。
【００７０】
本発明の好ましい実施形態は、以下の実施例において述べる。本明細書における特許請求の範囲に含まれる他の実施形態は、本明細書において開示する、本発明の詳細または実施を検討することにより当業者には明らかであろう。本明細書は、実施例と共に例示のみであって、実施例に続く特許請求の範囲によって示される本発明の範囲と精神をもって考慮されるべきことを意図するものである。
【実施例】
【００７１】
材料および方法
実験動物：雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（体重２７５〜３２５ｇ）は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から入手し、１２時間の明／暗サイクルの恒温室に収容し、標準Ｐｕｒｉｎａラット用固形飼料を摂取させた。出血ショックの誘発に先立って、ラットを一晩絶食させた。ただし、水は自由に飲ませた。本実験は、実験動物の使用のためのＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈのガイドラインに従って実施した。このプロジェクトは、Ｔｈｅ  Ｆｅｉｎｓｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＲｅｓｅａｒｃｈのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。
【００７２】
出血ショックの動物モデル：本実験で使用する出血ショックのモデルは、少し変更を伴うが以前に詳細に記載したものである（Ｗａｎｇ  Ｐ、Ｈａｕｐｔｍａｎ  ＪＧ、Ｃｈａｕｄｒｙ  ＩＨ：Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｓ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｂｌｏｏｄ  ｆｌｏｗ  ｗｈｉｃｈ  ｐｅｒｓｉｓｔｓ  ｄｅｓｐｉｔｅ  ｆｌｕｉｄ  ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ．Ｃｉｒｃ  Ｓｈｏｃｋ  ３２：３０７〜３１８、１９９０．；Ｗｕ  Ｒ、Ｄｏｎｇ  Ｗ、Ｚｈｏｕ  Ｍ、Ｃｕｉ  Ｘ、Ｓｉｍｍｓ  Ｈ  Ｈ、Ｗａｎｇ  Ｐ：Ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｆｔｅｒ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｓｈｏｃｋ：ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｓｕｒｇｅｒｙ  １３７：２００５）。手短に言えば、ラットをイソフルラン吸入薬で麻酔した。大腿部の神経および血管を注意深く分離した後に大腿部の静脈および動脈にカテーテル（ＰＥ−５０チューブ）を挿入した。反対側の大腿動脈にもカテーテルを挿入した。一方の動脈カテーテルは、血圧アナライザー（Ｄｉｇｉ−Ｍｅｄ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，ＫＹ）によって平均動脈圧（ＭＡＰ）および心拍数（ＨＲ）をモニターするために使用し、他方は採血用とし、静脈カテーテルは、輸液蘇生のために使用した。ラットを出血させて１０分以内にＭＡＰ４０ｍｍＨｇとした。少量の血液をさらに採血することによって、または少量の乳酸リンゲル液を供給することによって、この血圧を９０分間維持した。この低血圧期間の終了後に、６０分間をかけて乳酸リンゲル液（計算血液量の約６０％である、最大出血量の４倍相当量）によりラットを蘇生した。採血した血液は蘇生のために使用せず、動物は出血の前、その間、またはその後でヘパリン処理をしなかった。４時間後に、血液試料を集め、氷上に置いて凝固させた。次いで、この試料を４℃にて１０分間、１２００ｇで遠心分離し、血清試料は分析するまで−８０℃で保存した。組織試料も集め、液体窒素に直ちに保存した後、分析するまで−８０℃で保存した。擬似手術動物は、同じ外科手術を受けたが、出血も蘇生もさせなかった。
【００７３】
組換えタンパク質（ｒＣＩＲＰ）：我々は、細菌の発現系によるヘキサヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）を有する組換えタンパク質の発現およびその精製のための一連の方法を使用した。ｃＤＮＡは、以前に記載したように（Ｄｗｉｖｅｄｉ  ＡＪ、Ｗｕ  Ｒ、Ｎｇｕｙｅｎ  Ｅ、Ｈｉｇｕｃｈｉ  Ｓ、Ｗａｎｇ  Ｈ、Ｋｒｉｓｈｎａｓａｓｔｒｙ  Ｋ、Ｍａｒｉｎｉ  ＣＰ、Ｒａｖｉｋｕｍａｒ  ＴＳ、Ｗａｎｇ  Ｐ：Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  ａｎｄ  ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１  ｐｒｅｖｅｎｔ  ａｃｕｔｅ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｆｔｅｒ  ｇｕｔ  ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｓｕｒｇ  ２０５：２８４〜２９３、２００７）、修飾オリゴｄ（Ｔ１６）プライマーを使用して、ＭｕＬＶ逆転写酵素５０Ｕによりラット心臓の全ての組織ＲＮＡ４μｇを逆転写することによって調製した。ＣＩＲＰタンパク質を得るために、プライマーセット（センス５’−ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＧＧＣ  ＡＴＣ  ＡＧＡ  ＴＧＡ  ＡＧＧ−３’（配列番号２）およびアンチセンス５’−ＣＴＣ  ＧＴＴ  ＧＴＧ  ＴＧＴ  ＡＧＣ  ＡＴＡ  ＧＣ−３’（配列番号３）を合成し（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿０３１１４７、ＮＣＢＩによる設計）、ラットＣＩＲＰクローンを単離するために使用した）を用いてＣＩＲＰｃＤＮＡからＰＣＲによってＣＩＲＰコード配列を増幅した。次いで、ＥｃｏＲＶおよびＮｏｔＩによりＰＣＲ産物を消化し、ｐＥＮＴＲベクター、すなわちＣ末端ヘキサヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−ｔａｇ）システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって記載されている）にクローン化した後、得られた発現プラスミドとして大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。製造業者（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）によって記載されているように、ＣＩＲＰの発現誘導を数リットルのＢＬ２１（ＤＥ３）細胞培養液中で実施し、次いでＣＩＲＰを単離し精製した。不注意によるいかなるリポ多糖（ＬＰＳ）の混入も回避するために、我々は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４抽出を用いてエンドトキシン混入の可能性を取り除き、最終的なＬＰＳ含量は、カブトガニ血球溶解物（ＬＡＬ）アッセイ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｉｎｃ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を使用して、以前に記載のように決定した（Ｅｒｔｅｌ  Ｗ、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＭＨ、Ｗａｎｇ  Ｐ、Ｂａ  ＺＦ、Ａｙａｌａ  Ａ、Ｃｈａｕｄｒｙ  ＩＨ：Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｓｅｐｓｉｓ．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ，ｃａｃｈｅｃｔｉｎ，ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎｓ．Ａｎｎ  Ｓｕｒｇ  ２１４：１４１〜１４８、１９９１）。
【００７４】
ｒＣＩＲＰの投与：追加の健常動物群では、ｒＣＩＲＰ（１ｍｇ／ｋｇ体重）または緩衝液（同容量、１ｍｌ）を投与した。処置終了の４時間後に、血液試料を集め、氷上に置いて凝固させた後、４℃にて１０分間、１２００ｇで遠心分離し、血清試料は分析するまで−８０℃で保存した。また、組織試料を集め、液体窒素に直ちに保存した後、分析するまで−８０℃で保存した。別の出血動物群では、大腿部の静脈カテーテルを介した４５分間にわたる出血動物の蘇生を開始して１５分後に、ＣＩＲＰに対する抗体（３ｍｇ／ｋｇ体重）または緩衝液（同容量、１ｍｌ）を投与した。処置終了の１．５時間後に、組織試料または血液試料を上述と同じに集めた。
【００７５】
抗ＣＩＲＰ抗体の作製：ＣＩＲＰに対するポリクローナル抗血清は、標準手順に従い３週以上の間隔で精製組換えＣＩＲＰをウサギに注射して作製した（Ｃｏｖａｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｄｅｎｖｅｒ、ＰＡ）。抗ＣＩＲＰ抗体のＩｇＧは、供給者の説明書（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）に従い、固定化ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｅｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ／Ｇカラムを使用して血清からアフィニティ精製した。抗体価は、９６穴フォーマットで直接ＥＬＩＳＡにより決定した（Ｃｏｖａｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｄｅｎｖｅｒ、ＰＡによる記載のように）。ＬＰＳは、カブトガニ血球溶解物アッセイ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）によって測定したとき精製抗体調製物中に検出されなかった。
【００７６】
ＣＩＲＰ遺伝子発現の測定：ＣＩＲＰ遺伝子の発現が出血において変化するか否かを調べるために、リアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって出血組織を測定し定量した。マウス白血病ウイルス逆転写酵素（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＲＮＡ４μｇから逆転写されたｃＤＮＡ試料についてＱ−ＰＣＲを実施する。ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して、順方向プライマーおよび逆方向プライマー２ｐｍｏｌ、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ１２μｌ、およびｃＤＮＡｌμｌを含有する最終容量２４μｌの中で反応を実施する。Ｑｉａｇｅｎの推奨に従い、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００のリアルタイムＰＣＲを使用して増幅を実施する。ラットＧ３ＰＤＨのｍＲＮＡの発現量を各試料の規準化のために使用し、個々の特定のｍＲＮＡの分析は二つ組で行う。ｍＲＮＡの相対的な発現をΔΔＣｔ法によって計算し、対応する実験対照に対する倍率変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）として結果を表す。以下のラットプライマーを使用する：ＣＩＲＰ（ＮＭ＿０３１１４７）：５’−ＧＧＧ  ＴＣＣ  ＴＡＣ  ＡＧＡ  ＧＡＣ  ＡＧＣ  ＴＡＣ  ＧＡ−３’（順方向）（配列番号４）、５’−ＣＴＧ  ＧＡＣ  ＧＣＡ  ＧＡＧ  ＧＧＣ  ＴＴＴ  ＴＡ−３’（逆方向）（配列番号５）；Ｇ３ＰＤＨ（ＸＭ＿５７９３８６）：５’−ＡＴＧ  ＡＣＴ  ＣＴＡ  ＣＣＣ  ＡＣＧ  ＧＣＡ  ＡＧ−３’（順方向）（配列番号６）、５’−ＣＴＧ  ＧＡＡ  ＧＡＴ  ＧＧＴ  ＧＡＴ  ＧＧＧ  ＴＴ−３’（逆方向）（配列番号７）。ＴＮＦ−αの遺伝子発現は、ＲＴ−ＰＣＲを使用して評価した。ＴＮＦ−α遺伝子およびハウスキーピング遺伝子のためのプライマーは以下のものであった。以前に記載のように（Ｗｕ  Ｒ、Ｚｈｏｕ  Ｍ、Ｗａｎｇ  Ｐ：Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  ａｎｄ  ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ  ｉｎ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ａｎｄ  ｒａｔ  Ｋｕｐｆｆｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｒｅｇｕｌ  Ｐｅｐｔ  １１２：１９〜２６、２００３）、ラットＴＮＦ−α、５’ＣＣＣ  ＡＧＡ  ＣＣＣ  ＴＣＡ  ＣＡＣ  ＴＣＡ  ＧＡ３’（配列番号８）、５’ＧＣＣ  ＡＣＴ  ＡＣＴ  ＴＣＡ  ＧＣＡ  ＴＣＴ  ＣＧ３’（配列番号９）およびＧ３ＰＤＨ、５’ＴＧＡ  ＡＧＧ  ＴＣＧ  ＧＴＧ  ＴＣＡ  ＡＣＧ  ＧＡＴ  ＴＴＧ、ＧＣ３’（配列番号１０）、５’ＣＡＴ  ＧＴＡ  ＧＧＣ  ＣＡＴ  ＧＡＧ  ＧＴＣ  ＣＡＣ  ＣＡＣ３’（配列番号１１）。
【００７７】
ウエスタンブロット解析：血清および組織におけるＣＩＲＰタンパク質の発現は、ＣＩＲＰに対するウサギポリクローナル抗体（ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ  Ｇｒｏｕｐ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）を使用してウエスタンブロット解析により測定した。手短に言えば、等量の血清（容量）および組織ホモジネート（タンパク質ｍｇ／レーン）を、４〜１２％ＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）上で分離し、ニトロセルロース膜に転写し、次いで、５％脱脂粉乳を含有するＴＢＳＴ緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ  ７．５］、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）中、室温で１時間インキュベートすることによってブロックした。膜は、ウサギポリクローナル抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳＴ緩衝液中で数回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）と共にインキュベートした後、製造業者の説明書に従い化学発光ペルオキシダーゼ基質（ＥＣＬ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を供し、膜をＸ線フィルムに暴露した。ＧＳ８００  Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ  Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して、ウエスタンブロットの結果を走査し相対的なバンド強度を定量した。抗β−アクチン抗体（細胞質タンパク質用、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をロードが等量であることを確認するために使用した。ラット血清中のＨＭＧＢｌのレベルは、以前に記載したように（Ｗａｎｇ  Ｈ、Ｂｌｏｏｍ  Ｏ、Ｚｈａｎｇ  Ｍ、Ｖｉｓｈｎｕｂｈａｋａｔ  ＪＭ、Ｏｍｂｒｅｌｌｉｎｏ  Ｍ、Ｃｈｅ  Ｊ、Ｆｒａｚｉｅｒ  Ａ、Ｙａｎｇ  Ｈ、Ｉｖａｎｏｖａ  Ｓ、Ｂｏｒｏｖｉｋｏｖａ  Ｌ、Ｍａｎｏｇｕｅ  ＫＲ、Ｆａｉｓｔ  Ｅ、Ａｂｒａｈａｍ  Ｅ、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  Ｊ、Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  Ｕ、Ｍｏｌｉｎａ  ＰＥ、Ａｂｕｍｒａｄ  ＮＮ、Ｓａｍａ  Ａ、Ｔｒａｃｅｙ  ＫＪ：ＨＭＧ−１  ａｓ  ａ  ｌａｔｅ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｌｅｔｈａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：２４８〜２５１、１９９９）、ウサギポリクローナル抗ＨＭＧＢｌ抗体を使用して測定した。
【００７８】
細胞培養：マウスマクロファージ様ＲＡＷ２６４．７細胞をＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手し、１０％（容積／容積）ＦＢＳ（５６℃で３０分加熱不活性化）、ｌ００Ｕ／ｍｌペニシリン、ｌ００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、および２ｍＭグルタミンを含有するダルベッコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）中で増殖させた。細胞を培地中に再懸濁し、加湿インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）中で一晩、６穴または４８穴の組織培養プレートで培養した。本実験では、様々な指示濃度および様々な指示時間で組換えＣＩＲＰと共にまたはＣＩＲＰなしで細胞単層を刺激した。ＴＮＦ−αについてＥＬＩＳＡにより、ＨＭＧＢｌについてウエスタンブロット解析により無細胞の上清を分析した。
【００７９】
炎症性サイトカインの分析：炎症性サイトカインカスケードおよび急性炎症反応の指標として、組換えＣＩＲＰと共にインキュベートした細胞の上清を、市販の酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）キット（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）を使用して製造業者の説明書に従いＴＮＦ−αおよびＩＬ−６のレベルについて測定した。血清中および組織中のＴＮＦ−αおよびＩＬ−６のタンパク質レベルを定量するために、我々は、出血の４時間後または組換えＣＩＲＰによる処置の４時間後にラットを屠殺したときの心穿刺によって動物から血清試料を採取し、また組織試料を集め、上記と同じ方法によって測定した。
【００８０】
トランスアミナーゼおよび乳酸の血中レベルの測定：アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、および乳酸の血清濃度は、アッセイキットを使用して製造業者の説明書  （Ｐｏｉｎｔｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｐａｒｋ、ＭＩ）に従い測定した。
【００８１】
顆粒球ミエロペルオキシダーゼの評価：肺および肝臓の組織内好中球の蓄積は、以前に報告したように（Ｄｗｉｖｅｄｉ  ＡＪ、Ｗｕ  Ｒ、Ｎｇｕｙｅｎ  Ｅ、Ｈｉｇｕｃｈｉ  Ｓ、Ｗａｎｇ  Ｈ、Ｋｒｉｓｈｎａｓａｓｔｒｙ  Ｋ、Ｍａｒｉｎｉ  ＣＰ、Ｒａｖｉｋｕｍａｒ  ＴＳ、Ｗａｎｇ  Ｐ：Ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  ａｎｄ  ａｄｒｅｎｏｍｅｄｕｌｌｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１  ｐｒｅｖｅｎｔ  ａｃｕｔｅ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｆｔｅｒ  ｇｕｔ  ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｓｕｒｇ  ２０５：２８４〜２９３、２００７）、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）活性測定法を使用して評価した。
【００８２】
統計分析：データはすべて平均±ＳＥとして示し、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ法によって比較する。生存率はＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法によって評価し、ログランク検定によって比較した。Ｐ＜０．０５の場合、値の相違は有意であると見なした。
【００８３】
結果
出血後の循環血中および組織内のＣＩＲＰレベルの変化：実験により失血（出血）したラットでは、様々な組織においてＣＩＲＰ  ｍＲＮＡの発現が顕著に増大することが示された。擬似手術対照と比較して、ＣＩＲＰの発現が肝臓において約５倍（図２Ａ）、心臓において約３倍（図２Ｂ）増大した。循環血中に高レベルのＣＩＲＰタンパク質が、出血ラットのウエスタンブロット解析によって検出された。出血群では免疫反応性の明確なＣＩＲＰバンドが示されたが、擬似群ではそのバンドは見つからなかった（図２Ｃ）。擬似手術ラットと比較して、ＣＩＲＰタンパク質の発現が出血動物の心臓でも増大した（図２Ｄ）（β−アクチンが、ロードが等量であることを確認することになる）。
【００８４】
組換えＣＩＲＰ（ｒＣＩＲＰ）は、健常ラットに組織障害を誘発する：健常動物におけるｒＣＩＲＰの影響を調べるために、我々は、細菌の発現系から精製した組換えタンパク質であるｒＣＩＲＰ（１ｍｇ／ｋｇ体重）を健常ラットに投与し、ＡＳＴおよびＡＬＴ（肝臓障害の指標）の血清レベルを測定した。ｒＣＩＲＰで処置したラットでは、ＡＳＴ（図３Ａ）およびＡＬＴ（図３Ｂ）のレベルが顕著に上昇することが示された。これらの結果は、ｒＣＩＲＰが炎症性組織障害を直接引き起こすことを示す。
【００８５】
組換えＣＩＲＰ（ｒＣＩＲＰ）は、健常ラットにおいて炎症促進性サイトカインのレベルを増大させる：ｒＣＩＲＰ（１ｍｇ／ｋｇ体重）または対照として緩衝液（同容量）を注射した後に、ＴＮＦ−αの血清レベルは、ｒＣＩＲＰ群において著しく増大し、緩衝液（擬似）群より約５倍高かった（図４Ａ）。ＴＮＦ−αの遺伝子およびタンパク質の両方の発現が、ｒＣＩＲＰの投与後に肝臓（図４Ｃおよび図４Ｄ）および腸（図４Ｅおよび図４Ｆ）において増大した。図４Ｂに、ｒＣＩＲＰ（１ｍｇ／ｋｇ体重）の投与後に、炎症促進性サイトカインであるＨＭＧＢｌの循環血中レベルが増大することを示す。擬似群（二つ組）における弱いバンドと比較して、ｒＣＩＲＰ処置ラットでは強い免疫反応性ＨＭＧＢｌバンド（三つ組）が示された。
【００８６】
ｒＣＩＲＰによるマクロファージ刺激後の炎症性サイトカイン放出の増大：並列実験において、我々はｒＣＩＲＰと共に培養した培養ＲＡＷ細胞の上清中のサイトカインを測定した。組換えＣＩＲＰと共にインキュベートした培養ＲＡＷ細胞の上清中のＴＮＦ−αおよびＩＬ−６のレベルの上昇は、用量依存的かつ時間依存的であった。図５Ａに示すように、１００ｎｇ／ｍｌのｒＣＩＲＰ（４時間インキュベーション）は、ＴＮＦ−αの放出を顕著に増大させた。時間経過に関して、１００ｎｇ／ｍｌのｒＣＩＲＰは、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の産生をそれぞれインキュベーションの４時間後および２時間後には早くも顕著に増大させた（図５Ｃ〜図５Ｄ）。上清のＨＭＧＢｌレベルは、ｒＣＩＲＰ刺激後に用量依存的に増大した。培養ＲＡＷ細胞からのＨＭＧＢｌの放出が、５００ｎｇ／ｍｌのｒＣＩＲＰと共に２０時間インキュベートした後に約６倍に増大することがウエスタンブロットの定量によって示された（図５Ｂ）。
【００８７】
抗ＣＩＲＰ抗体には出血後の有意な延命効果がある：ＣＩＲＰが、出血などの様々な誘発に対する炎症反応での新しいメディエーターであることをさらに確認するために、我々は、ＣＩＲＰ（３ｍｇ／ｋｇ体重）に対する特異抗体を出血ラットに投与した。その結果は、急性の失血において、ＣＩＲＰの遮断が有意な延命効果を与えることを示した。図６に示すように、抗ＣＩＲＰ抗体による処置は、実験的に出血させた動物の生存率を４３％から８５％に増大させた（Ｐ＜０．０５）。
【００８８】
抗ＣＩＲＰ抗体は出血後の組織障害を減弱する：出血に対する反応でのｒＣＩＲＰの病態生理学的影響を引き続き調べるために、我々は、ＣＩＲＰに対する特異抗体（３ｍｇ／ｋｇ体重）を出血ラットに投与した。我々の結果は、出血後のＡＳＴ、ＡＬＴ、および乳酸のレベルの増大が、抗ＣＩＲＰ抗体によって有意に減弱される（３０％〜４０％の減少、Ｐ＜０．０５）ことを示した（図７Ａ〜図７Ｃ）。
【００８９】
抗ＣＩＲＰ抗体は、炎症促進性サイトカインにおける、出血誘発性の増大を減弱する：抗ＣＩＲＰ抗体（３ｍｇ／ｋｇ体重）による処置は、血清中のＴＮＦ−α（図８Ａ）およびＩＬ−６（図８Ｄ）の出血誘発性のアップレギュレーションを有意に減少させた。極めて類似の結果が、実験による血液除去（出血）後の動物の肺および肝臓それぞれのＴＮＦ―α（図８Ｂおよび図８Ｃ）およびＩＬ−６（図８Ｅおよび図８Ｆ）の組織内レベルにおいても観察された。
【００９０】
抗ＣＩＲＰ抗体は、出血後のＭＰＯ活性の増大を低下させる：ＭＰＯ（ミエロペルオキシダーゼ）は炎症の一般的な指標と考えられ、組織ＭＰＯ活性の増大は好中球の血管外遊出を反映する。実験による出血は、肝臓のＭＰＯ活性の増大を誘発した。我々は、抗ＣＩＲＰ抗体の投与後にＭＰＯの増大が有意に低下することを観察した（図８Ｇ）。
【００９１】
本明細書で引用したすべての参考文献は参照によって本明細書に組み込まれる。
【図１】
0005625043.tif 000002
【図２】
0005625043.tif 000003
【図３】
0005625043.tif 000004
【図４】
0005625043.tif 000005
【図５】
0005625043.tif 000006
【図６】
0005625043.tif 000007
【図７】
0005625043.tif 000008
【図８】
0005625043.tif 000009
【配列表】
0005625043000001.app