(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基性線維芽細胞成長因子を含むハイドロゲルと、心臓組織由来の多能性幹細胞とを含む、細胞移植療法に用いられる心疾患治療薬であって、前記塩基性線維芽細胞成長因子が、前記多能性幹細胞１×１０6に対して、１〜１００μｇで投与され、かつ、前記多能性幹細胞が、患者の体重１ｋｇ当たり１×１０6以下で投与されるように構成されている心疾患治療薬。
【請求項２】
前記ハイドロゲルと、前記多能性幹細胞とを含むキットとして構成されている、請求項１に記載の心疾患治療薬。
【請求項３】
前記ハイドロゲルが、ゼラチン、コラーゲン、デンプン、ペクチン、ヒアルロン酸、キチン、キトサンまたはアルギン酸及びこれらの材料の誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種類のハイドロゲルである、請求項１又は２に記載の心疾患治療薬。
【請求項４】
前記ハイドロゲルが、コラーゲンハイドロゲル又はゼラチンハイドロゲルである、請求項３に記載の心疾患治療薬。
【請求項５】
塩基性線維芽細胞成長因子を含むハイドロゲルの投与量が、塩基性線維芽細胞成長因子量換算で、患者の体重１ｋｇ当たり１〜１００μｇとなるように構成されている、請求項１〜４のいずれかに記載の心疾患治療薬。
【請求項６】
前記ハイドロゲルがシート状である、請求項１〜５のいずれかに記載の心疾患治療薬。
【請求項７】
さらに生体内非分解性高分子支持体を含む、請求項６に記載の心疾患治療薬。
【請求項８】
前記ハイドロゲルが前記生体内非分解性高分子支持体に固定化して投与されるものである、請求項７に記載の心疾患治療薬。
【請求項９】
前記生体内非分解性高分子支持体がポリテトラフルオロエチレンである、請求項８に記載の心疾患治療薬。
【請求項１０】
前記多能性幹細胞が、患者の体重１ｋｇ当たり１×１０5〜１０×１０5個で投与されるように構成されている、請求項１〜９のいずれかに記載の心疾患治療薬。
【請求項１１】
前記多能性幹細胞が、ＣＤ９０陽性、ＣＤ２９陽性、ＣＤ７３陽性、ｓｔｒｏ−１陽性及びＣＤ１０５陽性である、請求項１〜１０のいずれかに記載の心疾患治療薬。
【請求項１２】
前記多能性幹細胞が、下記工程を経て調製されるものである、請求項１〜１１のいずれかに記載の心疾患治療薬：
（ｉ）ほ乳動物から採取した心臓組織片を酵素処理することにより細胞懸濁液を調製する工程、
（ｉｉ）密度勾配法により、上記細胞懸濁液から心臓組織由来細胞群を分離する工程、及び
（ｉｉｉ）得られた心臓組織由来細胞群を、塩基性線維芽細胞成長因子及び上皮細胞増殖因子を含有する培地で浮遊培養した後、浮遊状のスフェアーを形成している細胞を選択し分離する工程。
【請求項１３】
前記多能性幹細胞が、患者の心臓組織由来のものである、請求項１〜１２のいずれかに記載の心疾患治療薬。
【請求項１４】
前記多能性幹細胞が、患者以外の心臓組織由来のものである、請求項１〜１２のいずれかに記載の心疾患治療薬。
【請求項１５】
前記多能性幹細胞が株化された細胞である、請求項１〜１２のいずれかに記載の心疾患治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞移植療法に用いられる心疾患治療薬に関する。より詳細には、本発明は、細胞移植療法による心疾患の治療において、ドナー細胞の生着性及び心筋細胞の再生が顕著に優れており、一層効果的な心疾患の治療を可能とする心疾患治療薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、再生医学において、幹細胞を移植することにより、目的とする組織及び臓器を修復し、再生する医療技術が精力的に研究されている。これまでに、各種組織や臓器の成熟細胞に分化する幹細胞が見出され、細胞移植への臨床的応用が検討されている。【０００３】
例えば、骨髄由来細胞又は骨格筋芽細胞が、心筋細胞への分化が可能であることが見出されており、これらの細胞を用いて心臓組織への細胞移植を行うと、短期間での心筋細胞の再生が認められることが報告されている。しかしながら、骨髄由来細胞又は骨格筋芽細胞の移植によって認められる心筋細胞の再生は、移植された細胞によって実質的に心筋細胞が再生しているのではなく、パラクライン効果によって心筋を保護するサイトカインの分泌に起因していることが分かっている。【０００４】
また、本発明者等によって、心臓組織から、心筋細胞を初めとする各種成熟細胞への分化能を有する多能性幹細胞を分離、精製する技術が開発されている（国際公開第２００６／０９３２７６号パンフレット）。このような心臓組織由来の多能性幹細胞は、心筋細胞への分化能が卓越しており、従来報告されている心筋幹細胞の中では、最も、心疾患の細胞移植による治療に有用であることが分かっている。【０００５】
しかしながら、如何に有用なドナー幹細胞を用いて細胞移植を行っても、ドナー幹細胞を単独で移植したのでは、移植２週間後にはドナー幹細胞（移植細胞）の多くが死滅し、ドナー幹細胞の生着が不十分になり、その結果、ドナー幹細胞による所望の治療効果が最大限に発現し得ないことが分かっている。そこで、細胞移植による治療効果を高めるには、移植後のホスト環境において、ドナー幹細胞の生着性を向上させることが重要であると考えられている。【０００６】
一方、これまでに、細胞増殖因子を含有するハイドロゲルが、細胞移植部位において細胞増殖因子を徐放させることにより、細胞移植療法においてドナー細胞の生着率を向上させ得ることが報告されている（特開２００２−１４５７９７号公報）。しかしながら、これまでに、心臓組織由来の多能性幹細胞と、細胞増殖因子を含有するハイドロゲルとを併用した細胞移植に関する報告はない。
【発明の開示】
【０００７】
発明が解決しようとする課題
また、本発明者等が検討したところ、後記する実験データに示すように、心臓組織由来の多能性幹細胞とハイドロゲルを単に併用して心臓組織に移植しても、ホスト心臓組織における生着性や心筋細胞の再生効率が不十分である場合があることが確認された。即ち、従来技術からは、従来報告されている心筋幹細胞の中では、最も臨床上有用である心臓組織由来の多能性幹細胞を用いても、ホスト心臓組織における生着性を有効に向上させて、当該多能性幹細胞による治療効果を最大限に発現させ得る細胞移植法が確立できないのが現状である。
【０００８】
そこで、本発明の目的は、心臓組織由来の多能性幹細胞を用いた細胞移植療法において、当該多能性幹細胞の生着性及び心筋細胞の再生効率を顕著に向上させ、心疾患を一層効果的に治療できる、細胞移植法を確立することである。
【０００９】
課題を解決するための手段
本発明者等は、上記課題を解決すべく、様々な細胞移植条件について検討し、多くの試行錯誤を繰り返したところ、心臓組織由来の多能性幹細胞と、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ：ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）を含むハイドロゲルとを併用することにより、当該多能性幹細胞の生着性を高め、心筋細胞の再生効率を有意に向上させることが可能になることを見出した。さらに、当該多能幹細胞の投与量を、患者の体重１ｋｇ当たり１０×１０５個以下に設定することで、当該多能性幹細胞の生着性及び心筋細胞の再生をより向上させうることを見出し、本発明を完成させた。
即ち、本発明は、下記に掲げる細胞移植療法に用いられる心疾患治療薬を提供する：
【００１０】
ｂＦＧＦを含むハイドロゲルと、心臓組織由来の多能性幹細胞とを含む、細胞移植療法に用いられる心疾患治療薬。ここで、前記心疾患治療薬は、前記ハイドロゲルと前記多能性幹細胞とを含むキットとして構成されていてもよい。
【００１１】
本発明の心疾患治療薬で用いられるハイドロゲルとしては、例えば、ゼラチン、コラーゲン、デンプン、ペクチン、ヒアルロン酸、キチン、キトサンまたはアルギン酸及びこれらの材料の誘導体を挙げることができる。なかでも、コラーゲンハイドロゲル又はゼラチンハイドロゲルが好ましい。
【００１２】
本発明の心疾患治療薬は、ｂＦＧＦを含むハイドロゲルの投与量が、ｂＦＧＦ量換算で、患者の体重１ｋｇ当たり１〜１００μｇとなるように構成されることが好ましい。
【００１３】
ハイドロゲルの形状はシート状であることが好ましい。
本発明の心疾患治療薬は、さらに生体内非分解性高分子支持体を含んでいてもよく、前記シート状のハイドロゲルは、この高分子支持体に固定化されて心臓外膜に投与される。前記生体内非分解性高分子支持体としては、例えばポリテトラフルオロエチレン（ゴアテックス（登録商標））を挙げることができる。
【００１４】
本発明の心疾患治療薬は、ｂＦＧＦが、前記多能性幹細胞１×１０６に対して、少なくとも１〜１００μｇで投与されるように構成されていることが好ましい。
本発明の心疾患治療薬は、心臓組織由来の多能性幹細胞が、患者の体重１ｋｇ当たり１×１０６以下で投与されるように構成されることが好ましく、患者の体重１ｋｇ当たり１×１０５〜１０×１０５個で投与されるように構成されることがより好ましい。
【００１５】
本発明で用いられる心臓組織由来の多能性幹細胞は、ＣＤ９０陽性、ＣＤ２９陽性、ＣＤ７３陽性、ｓｔｒｏ−１陽性及びＣＤ１０５陽性であることが好ましい。このような多能性幹細胞は、例えば、下記工程を経て調製される：
（ｉ）ほ乳動物から採取した心臓組織片を酵素処理することにより細胞懸濁液を調製する工程、
（ｉｉ）密度勾配法により、上記細胞懸濁液から心臓組織由来細胞群を分離する工程、及び
（ｉｉｉ）得られた心臓組織由来細胞群を、ｂＦＧＦ及び上皮細胞増殖因子を含有する培地で浮遊培養した後、浮遊状のスフェアーを形成している細胞を選択し分離する工程。
【００１６】
本発明で用いられる心臓組織由来の多能性幹細胞は、患者の心臓組織由来のものであってもよいし（自家移植）、患者以外の心臓組織由来のものであってもよいし（他家移植）、株化された細胞であってもよい。
【００１７】
発明の効果
本発明の心疾患治療薬によれば、細胞移植療法による心疾患の治療において、心臓組織由来の多能性幹細胞の生着性の顕著な向上が認められ、心筋細胞を再生させることができる。例えば、心臓移植を必要とする重症心不全患者に対して、本発明の心疾患治療薬を用いて心疾患の細胞移植療法を行うと、補助人工心臓移植からの離脱に必要十分な改善度を実現でき、更には継続的な薬物療法によって長期的に心臓移植の必要性もなくなる程度の改善度も期待できる。このように、本発明の心疾患治療薬を用いて心疾患の細胞移植療法を行えば、従来の細胞移植療法では実現し得ない疾患改善度を達成することが可能になる。
【００１８】
従って、本発明の心疾患治療薬は、日本全国で７，０００〜１０，０００人いると想定される心臓移植を必要とする患者、人工心臓の補助から離脱困難な末期心不全症患者、又はこれに準ずる患者に対して、革新的な救命法として臨床応用が期待される。
【００１９】
また、心臓組織由来の多能性幹細胞は、間葉系幹細胞の特徴を呈するため、免疫拒絶反応が起きにくいといわれている。そのため、本発明の心疾患治療薬は、自家細胞移植用としてのみならず、他家細胞移植療法としても臨床実用可能である。それ故、本発明の心疾患治療薬は、心臓内の多能性幹細胞数の存在量が少ないことが予想される高齢者に対しては、株化したヒト心臓組織由来の多能性幹細胞を採用して他家細胞移植療法用として用いることにより、心疾患を有効に治療することができる。
【００２０】
多分化能を有する細胞であっても、実際には心筋細胞への分化度は必ずしも高くなく、骨髄幹細胞や骨格筋芽細胞を用いた心臓での細胞移植療法の臨床試験は失敗してきた。本発明は、心臓組織由来の多能性幹細胞とｂＦＧＦを併用することにより、初めてｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞移植治療に成功したといえ、これは従来技術からは予測できない優れた効果といえる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】パーコールの密度勾配遠心法により分離したヒト由来の心臓組織由来細胞群を浮遊培養した後に形成された浮遊状のスフェアー（細胞塊）を示す写真である。図中、Ａは培養１日後に観察されたスフェアーを示し、Ｂは培養７日後に観察されたスフェアーを示す。
【図２】10  株の異なるヒト由来のスフェアー形成細胞(CSC)の各種マーカー（Rex  1、Oct  4、Nanog、Nkx-2.5、Sox  2、GATA-4）の発現をPCRにより分析した結果を示す図である。cFBは心臓内線維芽細胞、BMCは骨髄由来間葉系幹細胞を示す。
【図３】ヒト由来のスフェアー形成細胞の各種細胞表面抗原（c-kit  (CD117)、CD34、CD90、CD105、CD29、CD73、Stro-1、CD45、CD31、HLA-MHC  class  II）をFACS分析した結果である。図中、太(濃)線がスフェアー形成細胞の分析結果であり、細(薄)線がコントロール（標識無しの細胞）の分析結果である。
【図４】ヒト由来のスフェアー形成細胞から分化した心筋細胞の写真である。
【図５】ヒト由来スフェアー形成細胞から分化した心筋細胞の各種マーカー（Nkx-2.5、GATA4、ANP、α-ca-actin、TnT、MLC2v、MLC2a、α-MHC(α-myosin  heavy  chain)、β-MHC(β-myosin  heavy  chain)）の発現をPCRにより分析した結果を示す図である。なお、本分析では、βactinをコントロールとした。
【図６】bFGF含有ゼラチンハイドロゲルをゴアテックス社（登録商標）製のPTFE（ポリテトラフルオロエチレン）心膜パッチ（6×6cm）の中心部に前縫合した後に、虚血心筋部位に縫合した際の写真である。
【図７】ホスト心筋における多能性幹細胞の生着性を評価した結果を示す図である。上段には、心臓組織由来の多能性幹細胞をSPIOでラベルし、鉄染色した結果を示す。下段左には、グループＢ及びＤにおいて、移植治療から4及び28日後の梗塞心筋部位に生着した多能性幹細胞をMRIにて可視化した画像を示す。下段右には、グループＢ及びＤにおいて、移植治療28日後に梗塞心筋部位に生着した多能性幹細胞の割合（SPIO  survival  ratio）を示す。
【図８】催不整脈作用を検証した結果を示す図である。グループＡ〜Ｅについて、心拍数（HR）、pause、及び心室期外収縮(VPC)を測定した結果を示す。図中の心電図は、グループＥの個体を診断した心電図である。
【図９】心機能を解析した結果を示す図である。上段にはMRIにより左室駆出率(LVEF)を測定した結果、下段にはエコー法により左室駆出率を測定した結果を示す。図中、「Pre  Tx」とは治療前、「Post  Tx」とは治療後を意味する。
【図１０】梗塞サイズと微小心筋血流の改善度を解析した結果を示す図である。上段には梗塞サイズ（Infarction  volume）を測定した結果、下段には微小心筋血流（perfusion  ratio）を測定した結果を示す。図中、「Pre  Tx」とは治療前、「Post  Tx」とは治療後を意味する。
【図１１】血管新生度を解析した結果を示す図である。図中、各グループについて、梗塞部位全体(total)の血管密度、梗塞端部（Border  area）の血管密度、梗塞中心部（Scar  area）の血管密度、直径＜50μmの血管密度、直径＞50μmの血管密度を測定した結果をそれぞれ示す。
【図１２】心筋細胞再生の程度について評価した結果を示す図である。図中、左側に示す写真は、グループＤのミニブタの心臓の心筋を染色した結果であって、上段にはbeta-gal(赤色)、中段にはhuman  Y染色体（赤色）、及び下段にはブタ特異的遺伝子プローブ（黄）で染色した結果を示す。また、右上のグラフは各グループにおける心筋細胞分化率を示し、右下のグラフには各グループにおける細胞融合を介する心筋分化率を示す。
【図１３】虚血心での心筋繊維化の形態とマクロファージの浸潤度を解析した結果を示す図である。図中、上段には、各グループのミニブタの心臓の心筋に対してMasson-trichrome染色を行った結果を示す。下段には、グループＤ及びＥの心筋中に存在するマクロファージCD68とマクロファージCD163を染色した結果を示す。
【図１４】移植治療28日後のグループＤ及びＥのミニブタの心臓の心筋において、各種炎症性サイトカイン（IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α）の発現量を測定した結果を示す図である。
【図１５】左：ヒト心臓内幹細胞(CDC)と同一検体より精製したヒト線維芽細胞(cFB)の培養中での成長曲線（縦軸は倍体数、横軸は日数）、中：DNA合成能（BrdU取込み量、BMC:骨髄幹細胞は比較対照群）、右：  bFGF刺激後10分の各チロシンキナーゼのリン酸化、を示す図である。
【図１６】Ａ及びＢ：bFGF＋ヒトCDC同時移植群(bFGF+CDC)と無処置群(control)での左室駆出率(LVEF:  A)と梗塞サイズ(infarct  volume:  B)の経時的推移、Ｃ：両群における移植したドナー細胞(CDC)の生着性（矢印は生着したドナー細胞を示す）、Ｄ：bFGF+CDC移植群のドナー細胞の生着性の経時的評価、を示す図である。
【００２２】
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２００７−２６５００８号（２００７年１０月１０日出願）の明細書に記載された内容を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の心疾患治療薬は、心疾患の細胞移植療法に用いられるものであって、ｂＦＧＦを含むハイドロゲルと、心臓組織由来の多能性幹細胞とを組み合わせてなることを特徴とする。以下、本発明の心疾患治療薬の各構成について、詳述する。【００２４】
ｂＦＧＦを含むハイドロゲル
ｂＦＧＦを含有させるハイドロゲルは、生体吸収性高分子のハイドロゲルであれば特に制限はなく、例えば、ゼラチン、コラーゲン、デンプン、ペクチン、ヒアルロン酸、キチン、キトサンまたはアルギン酸及びこれらの誘導体のハイドロゲル、あるいはこれらを組み合わせて用いることができる。ｂＦＧＦを含むハイドロゲルは、上記の生体吸収性高分子をｂＦＧＦを含む水溶液に浸して膨潤させるか、あるいは緩衝液で膨潤させた生体吸収性高分子にｂＦＧＦを含む溶液を適量滴下して調製することができる。【００２５】
好ましいハイドロゲルとしては、コラーゲンハイドロゲルやゼラチンハイドロゲルを挙げることができる。コラーゲンは、生体構成タンパク質の１／３を占める生体の主要タンパク質であり、それ自身が本来、種々の生理活性ペプチドと相互作用している。例えば、ある種の細胞増殖因子がコラーゲンと分子間力を介して相互作用していることが報告されている（Ｓｃｈｕｐｐａｎ，Ｄ．など、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．，１１４巻，Ｐ１３９，１９９８など）。その相互作用には、静電的、疎水性、水素結合性など種々のものが考えられ、生理活性ペプチドとコラーゲンとの組み合わせによって、それらの相互作用の強さ、割合は異なっている。これらの相互作用によって、ｂＦＧＦと担体としてのコラーゲンとは物理的に結合し、安定なｂＦＧＦ含有コラーゲンハイドロゲルが形成される。【００２６】
コラーゲンとしては、抗原性を除去したアテロコラーゲンを用いることが好ましい。コラーゲンは、市販のコラーゲンスポンジを用いてもよいし、公知の方法により調製してもよい。また、コラーゲンは水溶性の低いものを用いることもが好ましい。コラーゲンも水溶性であるので、可溶化の方法（酸処理、アルカリ処理、酵素処理がある）によっては、ｂＦＧＦ含有コラーゲンハイドロゲルが水溶性となり、生体に投与した際、一過性にｂＦＧＦが当該成形体から放出されてしまい、安定した徐放化が困難となるからである。そのような水不溶性のコラーゲンは、例えば特開２００１−３１６２８２にしたがい、コラーゲンに架橋処理を施すことにより、含水率８５〜９９％のコラーゲンハイドロゲルとして得ることができる。【００２７】
用いるコラーゲンとしては、その出発原料となる動物種、組織部位、年齢に関係なく、いずれのものでもよく、また、その抽出方法、精製法にも依存しない。コラーゲンには十数種類のタイプがあるが、本発明に用いるコラーゲンとしては、架橋処理により水不溶化が可能であればいずれのタイプでもあるいはそれらの混合物でも適用できるが、好ましくは、タイプＩ、あるいは、ＩＩＩ、ＩＶなどのコラーゲンがよい。【００２８】
コラーゲンの架橋は、従来公知の方法に従って行うことができる。具体的には化学架橋剤を使用する方法、熱処理あるいは紫外線を照射によって架橋する方法等が挙げられる。例えば、コラーゲン水溶液（０．３重量％程度が好ましい）をホモジナイザーを用いて泡立てたのち、凍結し、凍結乾燥してコラーゲンスポンジを作製する。次いで、この未架橋コラーゲンスポンジを化学架橋剤処理、あるいは熱、紫外線処理を行うことによって架橋する。化学架橋の場合、架橋剤は、使用するコラーゲンの種類により適宜好適なものが選択されるが、通常、ホルマリン、グルタルアルデヒド；１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリモエチル）カルボジイミド−メト−ｐ−トルエンスルホナート等〕、エピクロロヒドリン、ジエポキシ化合物〔ビスエポキシジエチレングリコール、１．４−ビス−（２．３−エポキシプロポキシ−ブタン）等〕の架橋剤が用いられる。架橋剤の濃度は１０−３〜１０重量％、好ましくは１０−２〜１重量％であり、４〜４０℃、好ましくは２５〜３０℃で、３〜４８時間、好ましくは１２〜２４時間、該未架橋コラーゲンスポンジと該架橋剤溶液と接触させる。【００２９】
熱架橋する場合は、該未架橋コラーゲンを減圧下（好ましくは１０ｍｍＨｇ程度）、１１０〜１６０℃、好ましくは１２０〜１５０℃の雰囲気中に、通常１〜４８時間、好ましくは６〜２４時間放置することによって行う。また、紫外線で架橋する場合は、殺菌ランプ下で、通常、室温、好ましくは０〜４０℃で６〜４８時間放置することによって行なう。【００３０】
ゼラチンハイドロゲルとは、ゼラチンを架橋させて得られるハイドロゲルのことである。本発明において使用されるゼラチンとしては、牛、豚、魚類等を始めとする各種の動物種の皮膚、骨、腱などの身体のあらゆる部位から採取できるコラーゲン、或いはコラーゲンとして用いられている物質から、アルカリ加水分解、酸加水分解、および酵素分解等の種々の処理によって変性させて得ることができる。また、遺伝子組換え型コラーゲンの変性体ゼラチンを用いてもよい。ゼラチンの性質は、用いる材料および処理方法によって異なるが、いずれの性質をもつゼラチンも、本発明においてゼラチンハイドロゲルの材料として利用することができる。【００３１】
ゼラチンの性質を表す尺度としては、例えば、等電点、分子量、ジータ電位などがある。ジータ電位は、物質（ゼラチン）の静電的な荷電の程度を表す尺度である。本発明において、好ましいゼラチンとしては、（ｉ）コラーゲンからのアルカリ加水分解処理によって得られる、酸性ゼラチンであり、（ｉｉ）分子量が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの非還元条件下で約１０万〜約２０万ダルトンであり、且つ（ｉｉｉ）水溶液中のジータ電位が、約−１５〜約−２０ｍＶを有するゼラチンが挙げられる。また、好ましくは、ウシの骨由来のＩ型コラーゲンをアルカリ処理して調製した酸性ゼラチンを用いることができ、新田ゼラチン社の試料等電点（ＩＥＰ）５．０として入手することもできる。なお、酸処理して調製した塩基性ゼラチンは同じく新田ゼラチン社の試料ＩＥＰ９．０として入手することができるが、ジータ電位は以下のように大きく相違する。
酸性ゼラチン  （新田ゼラチン社試料ＩＥＰ５．０）：約−１５〜約−２０ｍＶ
塩基性ゼラチン  （新田ゼラチン社試料ＩＥＰ９．０）：約＋１２〜約＋１５ｍＶ【００３２】
ゼラチンの架橋化方法としては、公知の方法を利用することができる。例えば、ゼラチンの架橋化剤としては、例えばグルタルアルデヒド；１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩等の水溶性カルボジイミド；プロピレンオキサイド、ジエポキシ化合物、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基、イミダゾール基などの間に化学結合を作る縮合剤等が挙げられる。また、ゼラチンは、熱処理又は紫外線照射によっても架橋化することもできる。また、これらの架橋化方法を組み合わせて用いることもできる。更に、塩架橋、静電的相互作用、水素結合、疎水性相互作用などを利用した物理架橋によりハイドロゲルを作製することも可能である。【００３３】
本発明で使用されるゼラチンハイドロゲルにおけるゼラチンの架橋度は、ゼラチンハイドロゲルに対して付与すべき生体吸収性のレベルに応じて適宜設定することができる。架橋化剤を用いてゼラチンハイドロゲルを架橋させる場合、ゼラチンハイドロゲル中のゼラチンと架橋剤の濃度としては、例えばゼラチンが１〜２０重量％、架橋剤が０．０１〜１重量％が挙げられる。架橋反応条件は特に制限はないが、例えば、０〜４０℃、１〜４８時間で行うことができる。一般に、ゼラチンおよび架橋剤の濃度、架橋時間が増大するとともにハイドロゲルの架橋度は増加し、生体吸収性は低くなる。【００３４】
本発明で使用されるゼラチンハイドロゲルの形状は、細胞移植部位に適用可能である限り、特に制限はないが、例えば、シート状、円柱状、角柱状、球状、粒子状等が挙げられる。これらのゼラチンハイドロゲルの形状の中でも、シート状が好ましい。移植された多能性幹細胞を覆うようにシート状のゼラチンハイドロゲルを細胞移植部位に適用することによって、当該多能性幹細胞の生着性を高め、心筋細胞の再生を一層顕著ならしめることができる。【００３５】
ゼラチンハイドロゲルをシート状にする場合、適用される細胞移植部位において、位置ずれを防止するために、当該ゼラチンハイドロゲルが予め心臓外膜に適用されるパッチ（心膜パッチ）に縫合され、当該心膜パッチを介して細胞移植部位に固定できるように構成されていることが望ましい。このような心膜パッチとしては、公知のものを使用することができるが、具体的にはゴアテックス社（商標）製のPTFE（ポリテトラフルオロエチレン）パッチIIが例示される。
【００３６】
本発明に使用されるゼラチンハイドロゲルに含まれるｂＦＧＦとしては、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができ、また既に市販されている製品を使用してもよい。ｂＦＧＦの製造法としては、例えば、ｂＦＧＦを産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養上清等から分離、精製して該ｂＦＧＦを得ることができる。また、遺伝子工学的手法によりｂＦＧＦをコードする遺伝子を適切なベクターに組み込み、これを適当な宿主に挿入して形質転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組換えｂＦＧＦを得ることもできる。（例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３４２，４４０（１９８９）、特開平５−１１１３８２号公報、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１６３，６９７（１９８９）等を参照）。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、酵母、昆虫、かいこ、又は動物細胞等を用いることができる。このようにして得られたｂＦＧＦは、天然型ｂＦＧＦと実質的に同じ作用を有する限り、そのアミノ酸配列中の１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び／又は付加されていてもよく、また同様に糖鎖が置換、欠失及び／又は付加されていてもよい。【００３７】
本発明に使用されるゼラチンハイドロゲルは、一旦ゼラチンを架橋させたハイドロゲルを形成させた後、これにｂＦＧＦを含む溶液を適量滴下して、ゼラチンハイドロゲルに、ｂＦＧＦを含む溶液を浸み込ませることにより得ることができる。更に、本発明に使用されるゼラチンハイドロゲルは、一旦ゼラチンを架橋させたハイドロゲルを適宜、適当な大きさ及び形に切断後凍結乾燥し滅菌し、得られた凍結乾燥したゼラチンハイドロゲルに対してｂＦＧＦ水溶液を滴下して、ハイドロゲル内にｂＦＧＦを含浸させることによっても得ることができる。この含浸操作は、通常、４〜３７℃で１５分間〜１時間、好ましくは４〜２５℃で１５〜３０分間で終了し、その間にハイドロゲルはｂＦＧＦで膨潤し、ｂＦＧＦがゼラチン分子と相互作用することによってゼラチン分子と複合体を形成し、ゼラチンハイドロゲル内に物理的相互作用によって固定される。ｂＦＧＦとゼラチンとの間の複合体の形成には、両者の間の静電的相互作用だけでなく、疎水結合、水素結合等の他の相互作用も大きく寄与していると考えられる。【００３８】
本発明に使用されるハイドロゲルに含まれるｂＦＧＦ量は、適用患者の性別や年齢、ハイドロゲルの形状等に応じて適宜設定すればよいが、通常、患者の体重１ｋｇ当たりｂＦＧＦの投与量が１〜１００μｇ、好ましくは５〜５０μｇ、更に好ましくは５〜１０μｇに相当する量が例示される。このようなｂＦＧＦ投与量を充足することによって、移植された多能性幹細胞の生着性を高め、一層効率的に心筋細胞を再生させることが可能になる。【００３９】
また、本発明に使用されるハイドロゲルにおいて、ハイドロゲルに対するｂＦＧＦの比率についても、上記ｂＦＧＦの投与量やゼラチンの含有量等に応じて定まるが、通常、ハイドロゲルに対するｂＦＧＦの重量比が約５倍量以下であることが好ましい。更に好ましくは、ハイドロゲルに対してｂＦＧＦは約５〜約１／１０４倍量の重量比が挙げられる。【００４０】
本発明で使用されるハイドロゲルの含水率は、ｂＦＧＦの徐放性に影響するので、ｂＦＧＦが好ましい徐放性を示すように適宜設定すればよい。例えば、ハイドロゲルの含水率として、８０〜９９重量％、好ましくは９５〜９８重量％が挙げられる。この架橋度の測定可能な指標に含水率がある。含水率が大きければ架橋度は低くなり、分解されやすくなる。つまり、この含水率の値がｂＦＧＦの徐放（徐々に放出）を左右する。【００４１】
心臓組織由来の多能性幹細胞
本発明の心疾患治療薬で使用されるドナー細胞は、心臓組織由来の多能性幹細胞である。このような多能性幹細胞としては、心臓組織から分離されるものであり、自己複製能と共に、少なくとも心筋細胞への分化能を有しているものであれば特に制限されないが、好ましいものとして、国際公開第２００６／０９３２７６号パンフレットに記載されている多能性幹細胞が例示される。【００４２】
本発明で使用される心臓組織由来の多能性幹細胞の好適な具体例として、細胞表面抗原の特性として、ＣＤ９０陽性、ＣＤ２９陽性、ＣＤ７３陽性、ｓｔｒｏ−１陽性及びＣＤ１０５陽性を示す多能性幹細胞が例示される。これらの細胞表面抗原特性は、間葉系の幹細胞の代表的特徴であり、上記細胞表面抗原特性を備えた細胞は、間葉系の幹細胞であることが、細胞表面特性の点から裏付けられているといえる。また、心臓組織由来の多能性幹細胞の一例として、上記細胞表面特性に加えて、更に、ｃ−ｋｉｔ陰性、ＣＤ４５陰性、ＣＤ３１陰性、ＣＤ３４弱陽性、及びＨＬＡ−ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ陰性を示すものが挙げられる。【００４３】
本発明に使用される心臓組織由来の多能性幹細胞は、その投与量が患者の体重１ｋｇ当たり、１０×１０５個以下、好ましくは８×１０５以下、更に好ましくは７×１０５個以下に設定される。投与量の下限値は特に限定されるものではないが、一般的には多能性幹細胞は１×１０５〜１０×１０５個、好ましくは３×１０５〜８×１０５個、更に好ましくは５×１０５〜７×１０５個の範囲で投与される。上記ハイドロゲルとの併用において、多能性幹細胞の投与量（特に上限）を上記範囲に設定することによって、多能性幹細胞の生着性が向上し、当該多能性幹細胞が有する有用機能を最大限に発現させることが可能になる。一方、当該多能性幹細胞の投与量が、患者の体重１ｋｇ当たり１×１０６個を超える場合、上記ハイドロゲルと併用しても、多能性幹細胞の生着性が低下し、臨床上有意な心筋細胞への分化が認められなくなる。【００４４】
なお上記の投与量から、ｂＦＧＦと多能性幹細胞の割合は、前記多能性幹細胞１×１０６に対して、ｂＦＧＦが少なくとも１〜１００μｇが好ましいことがわかる。【００４５】
上記細胞表面抗原の特性を有する多能性幹細胞は、以下に記載する工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を実施することによって取得することもができる。【００４６】
＜工程（ｉ）細胞懸濁液の調製＞
まず、ほ乳動物から採取した心臓組織片を酵素処理することにより細胞懸濁液を調製する（工程（ｉ））。
本発明では、多能性幹細胞の採取源となる心臓組織は、ほ乳動物由来のものである限り、特に制限されない。本発明において、ほ乳動物としては、例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ヤギ、サル、ヒト等が挙げられる。本発明の心疾患治療薬をヒトに適用する場合、採取源となる心臓組織はヒト由来であることが好ましい。また、本工程で使用される心臓組織の部位についても特に制限されるものではない。【００４７】
ほ乳動物からの心臓組織片の採取は、通常の外科的手法により心臓組織片を摘出することにより行われる。また、摘出された心臓組織片は、酵素処理に先立って、心臓組織以外の組織（例えば、血管、神経組織等）を極力取り除いておくことが望ましい。また、酵素処理の効率を高めるために、採取された心臓組織片は、約１ｍｍ３以下の断片になるまで細切した後に酵素処理に供することが望ましい。【００４８】
また、酵素処理は、生体組織片から細胞懸濁液を調製する際に一般的に使用される酵素を使用して行われる。使用される酵素として、具体的には、コラーゲナーゼ、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン等のプロテアーゼが例示される。これらの中で、好ましくはコラーゲナーゼが挙げられる。かかるコラーゲナーゼとして、具体的には、ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｔｙｐｅ  ２（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社製；２０５Ｕ／ｍｇ）が例示される。なお、本明細書において、コラーゲナーゼ１Ｕとは、ｐＨ７．５、３７℃、５時間で、コラーゲンから１μモルのＬ−ロイシンを遊離できる酵素量を表す。【００４９】
また、酵素処理条件についても、特に制限されないが、一例として、下記酵素処理条件が例示される
酵素濃度：例えば、ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｔｙｐｅ  ２（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社製；２０５Ｕ／ｍｇ）を使用する場合であれば、マウス由来の心筋組織を処理する場合、通常０．１〜０．３重量％、好ましくは０．２重量％程度；ヒト由来の心筋組織を処理する場合、通常０．２〜０．６重量％、好ましくは０．４重量％程度となる濃度が挙げられる。また、例えば、酵素濃度は、心筋組織１００ｍｇ当たり、通常４１００〜１２３００Ｕ、好ましくは８２００Ｕ程度となる濃度が例示される。
処理温度：通常３７℃程度となる温度が挙げられる。
処理時間及び回数：通常２０〜３０分の処理時間で酵素処理を２回繰り返す条件、好ましくは２０分程度の処理時間で酵素処理を２回繰り返す条件が挙げられる。【００５０】
斯くして得られた細胞懸濁液は、酵素処理後に、遠心分離して上清を除去し、細胞の生育に適した培地を添加しておくことが望ましい。細胞の生育に適した培地としては、例えば１０容量％の牛胎児血清（ＦＢＳ）及び１容量％のペニシリン−ストレプトマイシン（５０００Ｕ／ｍｌ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ及び５０００μｇ／ｍｌ  ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅの混合物）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）が例示される。【００５１】
＜工程（ｉｉ）  心臓組織由来細胞群の分離＞
次いで上記細胞懸濁液から、密度勾配法により心臓組織由来細胞群を分離する（工程（ｉｉ））。
本工程において、心臓組織由来細胞群の分離は、細胞の分離に通常採用されている密度勾配法により実施することができる。心臓組織由来細胞群の分離の好ましい実施態様の一例として、パーコール（ｐｅｒｃｏｌｌ）の密度勾配遠心法により心臓組織由来細胞群を分離する方法が例示される。パーコールの密度勾配遠心法は、シリカゲルの一種であるパーコールを用いて遠心分離する公知の方法であり、パーコールを層状に用いているため、遠心力により細胞を破壊することなく分離することができる。【００５２】
パーコールの密度勾配遠心法により、上記細胞懸濁液から目的の幹細胞を含む心臓組織由来細胞群を分離するには、例えば、上記細胞懸濁液を、３０容量％パーコール溶液及び７０容量％パーコール溶液からなる不連続密度勾配にて、室温にて１０００Ｇで２０分間遠心分画すればよく、これによって３０容量％パーコール溶液と７０容量％パーコール溶液の界面に、目的の幹細胞を含む心臓組織由来細胞群が得られる。【００５３】
＜工程（ｉｉｉ）  多能性幹細胞の分離＞
次いで、上記工程（ｉｉ）で得られた心臓組織由来細胞群を、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ；ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）及び塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ；ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）を含有する培地で浮遊培養した後に、浮遊状のスフェアー（細胞塊）を形成している細胞を選択し分離する（工程（ｉｉｉ））。【００５４】
当該浮遊培養に先立って、上記工程（ｉｉ）で得られた心臓組織由来細胞群を更に酵素処理に供して、細胞同士の結合や付着を解消しておくことが望ましい。かかる酵素処理の具体的方法については、特に制限されず、プロテアーゼ等を使用した公知の方法により行うことができる。該酵素処理の一例として、心臓組織由来細胞群を０．０５重量％のトリプシン及び０．５３ｍＭのＥＤＴＡを含有する溶液で、３７℃で１０分間程度処理する方法が例示される。また、当該酵素処理後にはプロテアーゼ阻害剤を添加し、プロテアーゼ活性を失活させた後に本工程（ｉｉｉ）に供されることが望ましい。【００５５】
本工程で使用される培地は、通常の細胞培養（浮遊培養）に使用される培地に、上皮細胞増殖因子及びｂＦＧＦが添加されていればよい。該培地の好適なものとして、例えば、ヒト血清又は牛血清アルブミンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２ＨＡＭ培地に、上記上皮細胞増殖因子及びｂＦＧＦが添加されている培地が例示される。また、本工程で使用される培地は、必要に応じて、ストレプトマイシン、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質；Ｂ２７サプリメント（ＧＩＢＣＯ社製）；ＨＥＰＥＳ（５ｍＭ）等を含有していてもよい。【００５６】
また、本工程で培地に添加される上皮細胞増殖因子及びｂＦＧＦの割合については、例えば、上皮細胞増殖因子が１０〜２０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２０ｎｇ／ｍｌ程度であり、ｂＦＧＦが１０〜４０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは４０ｎｇ／ｍｌ程度が例示される。【００５７】
本工程において、培養開始時の細胞濃度が１×１０４〜２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、好ましくは２×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように設定して、培養を行うことが望ましい。【００５８】
本工程における浮遊培養は、通常３７℃で、５％ＣＯ２下で、通常１４〜２１間、好ましくは１４日間行う。【００５９】
斯くして培養を行うことにより、多能性幹細胞が細胞分裂を繰り返してスフェアー（細胞塊）を形成し、これが培養液中に浮遊する。従って、このスフェアーを回収することにより、目的とする多能性幹細胞を取得することができる。【００６０】
また、上記細胞表面抗原の特性を有する多能性幹細胞は、上記工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を行う方法以外に、上記工程（ｉ）及び（ｉｉ）を実施した後、工程（ｉｉ）で得られた心臓組織由来細胞群から、前述する細胞表面抗原の特徴を有する細胞を公知の手法で分取する方法により取得することもできる。このように細胞を分取する手法の一例として、ソーティング機能を備えるフローサイトメーターを用いる方法が挙げられる。【００６１】
上記多能性幹細胞は、上皮細胞増殖因子及びｂＦＧＦを含有する培地で培養することにより、該多能性幹細胞を増殖させることができる。培養に先立って、上記工程（ｉｉｉ）で得られたスフェアーをプロテアーゼで処理してスフェアーを分解して、多能性幹細胞を浮遊させておくことが望ましい。このように多能性幹細胞を浮遊させる方法としては、例えば、０．０５重量％の濃度のトリプシンで、３７℃で２０分間程度処理する方法が例示される。当該プロテアーゼ処理後には、プロテアーゼ阻害剤を添加して、プロテアーゼの作用を阻害しておくとよい。本培養に使用される培地には、上記工程（ｉｉｉ）で使用される培地と同様である。具体的には、培養開始時の細胞濃度を２０ｃｅｌｌｓ／μｌとして、３７℃、５％ＣＯ２下で、通常１４〜２１日培養を行うことにより、上記多能性幹細胞を所望量に増殖させることができる。【００６２】
さらに、本発明の多能性幹細胞は本発明の心疾患治療薬の投与を必要とする患者自身の心筋組織から調製された細胞であることが望ましいが、移植可能な限りにおいて、患者以外の心筋組織から調製されたものであってよい。たとえば、単離した多能性幹細胞を継代して株化して利用可能にすれば、自己細胞の取得が困難な高齢者等においても細胞移植療法を実施することができる。【００６３】
心疾患治療薬の具体的態様
本発明の心疾患治療薬は、上記ハイドロゲルと、上記多能性幹細胞とを組み合わせてなるものである限り、これらの両者が予め混合されてなる混合医薬組成物であってもよいが、これらの両者が混合されていないキットであることが好ましい。前者（即ち、混合医薬組成物）の場合、上記ハイドロゲルと、上記多能性幹細胞とを均一に混合するという観点から、上記ハイドロゲルは粒子状のものを使用することが望ましい。また、後者（即ち、キット）の場合、上記ハイドロゲルの形状については特に制限されない。【００６４】
本発明の心疾患治療薬が上記混合医薬組成物である場合、当該心疾患治療薬を、カテーテルを利用して、或いは切開して、患者の心疾患部位に注入することにより投与される。【００６５】
また、本発明の心疾患治療薬が上記キットである場合、当該心疾患治療薬の投与は、上記ハイドロゲルと上記多能性幹細胞の同時投与、上記多能性幹細胞の投与後に上記ハイドロゲルを投与、或いは上記ハイドロゲルの投与後に上記多能性幹細胞を投与の何れであってもよい。好ましい態様として、上記多能性幹細胞を投与した後に、シート状のハイドロゲルを上記多能性幹細胞の投与部位（細胞移植部位）を覆うように適用する方法が挙げられる。また、その際、シート状のハイドロゲルを生体非分解性の高分子支持体に予め固定して使用すれば、当該ハイドロゲルを高分子支持体を介して投与部位に固定できる。これにより、術後に当該ハイドロゲルの位置ずれを防止するとともに、細胞の拡散を防止でき、上記多能性幹細胞の生着性の向上をより一層顕著ならしめることができる。生体非分解性の高分子支持体としては、現在臨床で利用可能なものはポリテトラフルオロエチレン（ゴアテックス（登録商標））製の心膜パッチであるが、これに限定されない。
【００６６】
本発明の心疾患治療薬では、投与簡易性、多能性細胞の安定性等の観点から、上記ハイドロゲル、上記多能性幹細胞、又はこれらの混合物が、必要に応じて薬学的に許容される担体で適当に希釈されていてもよい。薬学的に許容される担体としては、例えば、生理食塩水、緩衝液等が使用される。【００６７】
また、本発明の心疾患治療薬の心疾患部位への投与方法としては、上記ハイドロゲルの形状等に応じて、カテーテルを利用する方法、或いは胸部を切開する方法等を適宜選択すればよい。【００６８】
本発明の心疾患治療薬において、対象となる心臓疾患としては、心筋若しくは冠動脈に障害を来し、収縮力が低下するような心臓疾患が挙げられ、具体的には、心筋梗塞、拡張型心筋症、虚血性心疾患、うっ血性心不全等が例示される。【００６９】
相乗的心筋再生効果と安全性
後述する実施例で示されるよう、ｂＦＧＦによる心臓組織由来の多能性幹細胞増殖効果は、他の増殖因子に比べて極めて高く、心臓組織由来の多能性幹細胞はｂＦＧＦとの併用効果が骨髄幹細胞に比較して格段に優れている。多分化能を有する細胞であっても、実際には心筋細胞への分化度は必ずしも高くなく、また分化した細胞が血管細胞を再生しないと心臓細胞移植療法での効果は期待できない。実際、骨髄幹細胞や骨格筋芽細胞を用いた心臓細胞移植療法の臨床試験は失敗している。【００７０】
発明者は、種々の選択肢の中から心臓組織由来の多能性幹細胞とｂＦＧＦの組み合わせを最良のものとして特定したのであり、公知事項を単に組合せたものではない。本発明の心疾患治療薬の優れた効果は、心筋細胞への心臓組織由来多能性幹細胞の高い分化度とハイドロゲルから徐放されるｂＦＧＦの持続的心血管細胞の再生向上効果が相互に作用してもたらされる相乗的な効果である。【００７１】
通常胚性幹細胞やｉＰＳ細胞は奇形腫の問題をはらむが、組織幹細胞である心臓組織由来の多能性幹細胞とｂＦＧＦの併用では奇形腫の合併が見られない。また、本発明の多能性幹細胞は間葉系幹細胞の特徴を呈するため、免疫拒絶反応が起きにくいと考えられる。すなわち、本発明の心疾患治療薬は安全性においても優れている。
【実施例】
【００７２】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
実施例１：ｂＦＧＦ含有ゼラチンハイドロゲルの調製
１０重量％濃度の酸性ゼラチンをグルタルアルデヒドにより化学架橋した後、架橋剤を不活性化した。次に、蒸留水にて数回洗浄し、架橋含水率７５％の厚さ約０．３〜０．４ｍｍのシート状のゼラチンハイドロゲルを得た。続いて２００μｇのｂＦＧＦを含む滅菌蒸留水を滴下し、ｂＦＧＦ水溶液の適量をゼラチンハイドロゲルへ浸み込ませることによってシート状のｂＦＧＦ含有ゼラチンハイドロゲルを得た。【００７３】
得られたシート状のbFGF含有ゼラチンハイドロゲルを5×5cm四方に切断した。得られたbFGF含有ゼラチンハイドロゲルは、１シート当たり、5〜6μg/kgの投与量となるようにbFGF含有量が調節されている。このシート状のbFGF含有ゼラチンハイドロゲルを、ゴアテックス社（登録商標）製のPTFE（ポリテトラフルオロエチレン）心膜パッチ（6×6cm）の中心部に前縫合した。
【００７４】
実施例２：ヒト心臓組織由来多能性幹細胞の取得及び該多能性幹細胞の各心筋胞への分化能の確認
（１）細胞懸濁液の調製
ヒトから採取した心臓組織片を氷上の冷ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）入りシャーレ内に入れて、撹拌して心臓組織片血液を除去した。次いで、新たな冷ＰＢＳ入りシャーレ内で心臓組織片を洗浄した。更に、この心臓組織片の洗浄を二回繰り返し、最後にＰＢＳを除去した。その後、滅菌済みのはさみを用いて破砕した心臓組織断片を約１ｍｍ３以下になるまで細切した。細切した心臓組織片（約１０ｍｇ）を１００ｍｌ容三角フラスコに移し、更に０．２重量％  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｔｙｐｅ２（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社製）含有溶液２０ｍｌを添加し、３７℃恒温漕内で２０分間震盪して酵素処理を行った。次いで、更に１０ｍｌの電動ピペッターを用いて３ｍｌ／ｓｅｃの速度でピペッティングを行い、よく撹拌した後、更に０．１重量％  ＤＮＡｓｅ  Ｉ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ社製）含有溶液２．２ｍｌを添加し、３７℃恒温漕内で３分間震盪した。かかる酵素処理後、２０ｍｌの１０容量％ＦＢＳ（牛胎仔血清）（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）及び１容量％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ社製）培地（以下、「培地１」と表記する）を加えて酵素を中和し、細胞含有液を調製した後、７０μｍ  ｃｅｌｌ  ｓｔｒａｉｎｅｒ（ＦＡＬＣＯＮ社製）及び４０μｍ  ｃｅｌｌ  ｓｔｒａｉｎｅｒ（ＦＡＬＣＯＮ社製）で濾過した。濾過後の細胞含有液を１５００ｒｐｍで５分間遠心分離して、その上清を除去した後に、１０ｍｌの培地１を添加して細胞懸濁液（以下、細胞懸濁液１と表記する）を調製し、これを氷中保存した。また、１００ｍｌ容三角フラスコに残存した心臓組織片に対しても、再度同様の処理を行い、同様に細胞懸濁液（以下、細胞懸濁液２と表記する）を調製した。斯くして得られた細胞懸濁液１及び２を混合し、以下記載する工程に供した。【００７５】
（２）パーコールの密度勾配遠心法による心臓組織由来細胞群の分離
パーコール（ｐｅｒｃｏｌｌ）原液（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）：１０×ＰＢＳ（−）（ＧＩＢＣＯ社製）＝９：１（容量比）の溶液をパーコールストックとした。パーコールストックを１×ＰＢＳ（−）（ＧＩＢＣＯ社製）で希釈し、パーコールストックの濃度が３０容量％、７０容量％の溶液を作成した。３０容量％パーコール溶液にはフェノールレッド（ＳＩＧＭＡ社製）を０．１容量％加えて着色した。容量１５ｍｌの円錐状チューブに、まず３０容量％パーコール溶液を３ｍｌ注ぎ、続いて電動ピペッターを用いて３０容量％パーコール溶液の下層に７０容量％  パーコール溶液を慎重に加えた。続いて、ヒト心臓組織由来由来の上記細胞縣濁液３ｍｌを３０容量％パーコール溶液の上層に慎重に重層した。室温、１０００Ｇ  ２０分で、加速減速を極力遅くして遠心分画した。遠心後、目的の細胞集団は、３０容量％パーコール溶液と７０容量％パーコール溶液の界面に分布していることが確認された。また、一番底には血球成分が分布しており、３０容量％パーコールの上層には主に細胞破砕物が分布していることが確認された。パスツールピペットにてまず細胞破砕物を除去した後、別のピペットで界面に存在する目的の細胞集団を容量５０ｍｌの円錐状チューブに回収した。円錐状チューブに、ＤＭＥＭ／Ｆ１２Ｈａｍ（ＧＩＢＣＯ社製）培地を３０ｍｌ加え、十分に撹拌した後、遠心して上清を除去した。次いで、トリプシン−ＥＤＴＡ（０．０５重量％トリプシン、０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡ・４Ｎａ含有）（ＧＩＢＣＯ社製）溶液１ｍｌを添加して、３７℃恒温漕内で１０分間震盪し、細胞同士の凝集や結合を解消させた。次いで、トリプシン阻害剤（Ｒｏｃｈｅ社製）５００μｌを添加し、更にＤＭＥＭ／Ｆ１２Ｈａｍ培地（ＧＩＢＣＯ社製）８．５ｍｌを添加し、十分に懸濁した後、細胞数を血球計算盤でカウントした。【００７６】
（３）スフェアーの形成
上記（２）で得られたヒト心臓組織由来細胞群を、ｍｏｕｓｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ［ＤＭＥＭ／Ｆ１２Ｈａｍ（ＧＩＢＣＯ社製）、２重量％Ｂ２７サプリメント（ＧＩＢＣＯ社製）、１容量％  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、４０ｎｇ／ｍｌ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｂａｓｉｃ  ＦＧＦ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、及び２０ｎｇ／ｍｌ  ｍｏｕｓｅ  ＥＧＦ（ＳＩＧＭＡ社製）含有］用いて、細胞培養ディッシュ（ｎｏｎｃｏａｔ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｉｓｈ）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）上で、３７℃、５％ＣＯ２下で１４日間、浮遊培養を行った。なお、培養開始時の細胞濃度は、２．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように設定した。【００７７】
培養１日後及び７日後に培養液中に浮遊しているスフェアーを撮影した顕微鏡写真を図１に示す。培養後、スフェアーを回収することにより、ヒト心臓組織由来のスフェアー形成細胞（多能性幹細胞）を取得した。【００７８】
（４）スフェアー形成細胞の増殖
回収したスフェアーを２ｍｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２Ｈａｍ（ＧＩＢＣＯ社製）培地に入れ、よく混合した後に、これを遠心分離（４℃、１５００ｒｐｍ、５分間）して、上清を十分に除去した。次いで、トリプシン−ＥＤＴＡ（０．０５重量％トリプシン、０．５３ｍＭ  ＥＤＴＡ・４Ｎａ含有）（ＧＩＢＣＯ社製）溶液１ｍｌを添加し、３７℃恒温漕内で２０分間震盪することにより、スフェアーを分解して、スフェアーを形成している細胞（以下、スフェアー形成細胞と表記する）を浮遊させた。次いで、トリプシン阻害剤（Ｒｏｃｈｅ社製）５００μｌを添加し十分に懸濁した後、細胞数を血球計算盤でカウントした。【００７９】
斯くして浮遊させたスフェアー形成細胞を、ｍｏｕｓｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ［ＤＭＥＭ／Ｆ１２Ｈａｍ（ＧＩＢＣＯ社製）、２重量％Ｂ２７サプリメント（ＧＩＢＣＯ社製）、１容量％  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、４０ｎｇ／ｍｌ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｂａｓｉｃ  ＦＧＦ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、及び２０ｎｇ／ｍｌ  ｍｏｕｓｅ  ＥＧＦ（ＳＩＧＭＡ社製）含有］を用いて、培養開始時の細胞濃度を２０ｃｅｌｌｓ／μｌとして、フィブロネクチンコーティング細胞培養ディッシュ上で、３７℃、５％ＣＯ２下で３日間培養を行った。【００８０】
培養後のスフェアー形成細胞について、各種マーカー（Ｒｅｘ  １、Ｎｋｘ−２．５、Ｏｃｔ  ４、Ｎａｎｏｇ、ＧＡＴＡ−４、Ｓｏｘ  ２）の発現を、ＰＣＲにより分析した。得られた結果を図２に示す。この結果から、ヒト心臓組織由来のスフェアー形成細胞は、外胚葉系幹細胞や胚性幹細胞と同様の分化特性を備えていることが確認された。【００８１】
また、増殖させたスフェアー形成細胞について各種細胞表面抗原ｃ−ｋｉｔ、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＨＬＡ−ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ、ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ｓｔｒｏ−１及びＣＤ１０５について分析した。分析結果を図３に示す。この結果から、ヒト由来のスフェアー形成細胞は、ｃ−ｋｉｔ陰性、ＣＤ４５陰性、ＣＤ３１陰性、ＣＤ３４弱陽性、ＨＬＡ−ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ陰性、ＣＤ９０陽性、ＣＤ２９陽性、ＣＤ７３陽性、ｓｔｒｏ−１陽性及びＣＤ１０５陽性であることが確認された。【００８２】
（５）スフェアー形成細胞の心筋細胞への分化の確認
上記（４）で増殖させたスフェアー形成細胞を遠心分離により回収し、該細胞を１×１０−８モル／ｌのデキサメサゾン及び１容量％のｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎを含有するＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社製）で、３７℃、５％ＣＯ２下で２１日間培養を行い、心筋細胞への分化誘導を行った。これによって、ヒト心臓組織由来のスフェアー形成細胞が、拍動する心筋細胞に分化することが確認された。なお、心筋細胞への分化は、下記の分析結果からも確認された。【００８３】
＜ヒト心筋特異的トロポニン−Ｔ染色による分析＞
分化誘導後の細胞をヒト心筋特異的トロポニン−Ｔで染色して観察したところ、心筋細胞の存在が確認された（図４参照）。【００８４】
＜ＰＣＲによる分析＞
分化誘導開始２１日後の細胞について、各種マーカー（Ｎｋｘ−２．５、ＧＡＴＡ４、ＡＮＰ、α−ｃａ−ａｃｔｉｎ、ＴｎＴ、ＭＬＣ２ｖ、ＭＬＣ２ａ、α−ＭＨＣ（α−ｍｙｏｓｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）、β−ＭＨＣ（β−ｍｙｏｓｉｎ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）、βａｃｔｉｎ）の発現を、ＰＣＲにより分析した。得られた結果を図５に示す。図５から分かるように、デキサメサゾンの存在下で培養することによって、上記各種マーカーが発現されており、上記ヒト心臓組織由来スフェアー形成細胞が心筋細胞に分化したことが確認された。【００８５】
（６）結果
以上に示す結果から、得られたスフェアー形成細胞は、自己複製能と共に、少なくとも心筋細胞に分化する特性を備えており、心筋幹細胞として有用な多能性幹細胞であることが明らかとなった。【００８６】
実施例３：心筋梗塞ミニブタの作成及び治療
（１）心筋梗塞ミニブタの作成
ミニブタ（約３０ｋｇ、８週齢、雌）に、経皮的バルーンカテーテルにて、左冠動脈を９０分間閉塞した後に再開通させ、続いて２８日間飼育することにより、左室駆出率（ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎ：ＬＶＥＦ）が約６０％から３５〜４５％まで低下した心筋梗塞ミニブタを作成した。２８日飼育後の心筋梗塞ミニブタを用いて、以下の治療を実施した。【００８７】
（２）心筋梗塞ミニブタへのbFGF含有ゼラチンハイドロゲル及び多能性幹細胞の投与
上記で作成した心筋梗塞ミニブタを以下の５つのグループに分けて、梗塞心筋の治療を行った。
グループＡ（n=10）：ミニブタの胸部を切開して、ミニブタの体重1kg当たりDMEM培地3mlを梗塞心筋に投与した後、図６に示すように、心膜パッチが縫合されたシート状bFGF含有ゼラチンハイドロゲル（投与量：5〜6μg/kg）を梗塞心筋に被せてパッチ縫合した。
グループＢ（n=10）：ミニブタの胸部を切開して、上記心臓組織由来の多能性幹細胞をDMEM培地に懸濁した状態で、ミニブタの体重1kg当たり5×105〜6×105個となるように梗塞心筋に投与した。シート状bFGF含有ゼラチンハイドロゲルは投与しなかった。
グループＣ（n=10）：ミニブタの胸部を切開して、骨髄由来間葉系幹細胞（独立行政法人理化学研究所：RIKEN  CELL  BANK、RCB  HMS0008,  HMS0043,  HMS0019,  HMS0021,  HMS0024,  HMS0048,  HMS0049）をDMEM培地に懸濁した状態で、ミニブタの体重1kg当たり5×105〜6×105個となるように梗塞心筋に投与した後、心膜パッチが縫合されたシート状bFGF含有ゼラチンハイドロゲル（投与量：5〜6μg/kg）を梗塞心筋に被せてパッチ縫合した。
グループＤ（n=10）：ミニブタの胸部を切開して、上記心臓組織由来の多能性幹細胞をDMEM培地に懸濁した状態で、ミニブタの体重1kg当たり5×105〜6×105個となるように梗塞心筋に投与した後、心膜パッチが縫合されたシート状bFGF含有ゼラチンハイドロゲル（投与量：5〜6μg/kg）を梗塞心筋に被せてパッチ縫合した。
グループＥ（n=10）：ミニブタの胸部を切開して、上記心臓組織由来の多能性幹細胞をDMEM培地に懸濁した状態で、ミニブタの体重1kg当たり5×106〜6×106個となるように梗塞心筋に投与した後、心膜パッチが縫合されたシート状bFGF含有ゼラチンハイドロゲル（投与量：5〜6μg/kg）を梗塞心筋に被せてパッチ縫合した。
【００８８】
（３）心筋梗塞ミニブタの治療効果の評価
上記（２）の移植治療から２８日間飼育し、以下に示す項目について評価し、ミニブタの梗塞心筋の治療効果を判定した。
＜ホスト心筋における多能性幹細胞の生着性の評価＞
移植治療から４及び２８日後に、ホスト心筋に生着したドナー細胞（上記心臓組織由来の多能性幹細胞）をＳＰＩＯ（ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  ｉｒｏｎ  ｏｘｉｄｅ）でラベルし、鉄染色した。この染色によって、多能性幹細胞は茶色に染まり、ＭＲＩにてその陰影が黒色に可視化される。この染色結果から、ホスト心筋における多能性幹細胞の生着性を判定した。【００８９】
結果を図７に示す。図７の上段には、心臓組織由来の多能性幹細胞をＳＰＩＯでラベルし、鉄染色した結果を示す。図７の下段左には、グループＢ及びＤにおいて、移植治療から４及び２８日後の梗塞心筋部位に生着した多能性幹細胞をＭＲＩにて可視化した画像を示す。また、図７の下段右には、グループＢ及びＤにおいて、移植治療２８日後に梗塞心筋部位に生着した多能性幹細胞の割合（ＳＰＩＯ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｒａｔｉｏ）を示す。この結果から、ｂＦＧＦ含有ゼラチンハイドロゲルと多能性幹細胞（投与量：５×１０５〜６×１０５個／ｋｇ）を併用投与した場合に、多能性幹細胞（投与量：５×１０５〜６×１０５個／ｋｇ）単独の場合に比して、ホスト心筋への生着性が有意に向上することが確認された。【００９０】
＜催不整脈作用の検証＞
移植治療２８日後に、各グループのミニブタの心電図解析を行い、催不整脈作用を検証した。グループＡ〜Ｅのミニブタ移植治療２８日後の心拍数（ＨＲ）、ｐａｕｓｅ、及び心室期外収縮（ＶＰＣ）を測定した結果を図８に示す。図８から分かるように、ｂＦＧＦ含有ゼラチンハイドロゲルと多能性幹細胞（投与量：５×１０６〜６×１０６個／ｋｇ）を併用投与したグループＥでは、心室期外収縮が多く認められた。これに対して、ｂＦＧＦ含有ゼラチンハイドロゲルと多能性幹細胞（投与量：５×１０５〜６×１０５個／ｋｇ）を併用投与したグループＤでは、心室期外収縮が顕著に抑制されていた。【００９１】
＜心機能の解析＞
移植治療２８日後に、各グループのミニブタの心機能について、ＭＲＩ及び心エコー法により解析した。結果を図９に示す。図９の上段にはＭＲＩにより左室駆出率（ＬＶＥＦ）を測定した結果、下段にはエコー法により左室駆出率を測定した結果を示す。この結果から、ｂＦＧＦ含有ゼラチンハイドロゲルと多能性幹細胞（投与量：５×１０５〜６×１０５個／ｋｇ）を併用投与したグループＤにおいてのみ、心機能の顕著な改善が認められた。一方、ｂＦＧＦ含有ゼラチンハイドロゲルと多能性幹細胞（投与量：５×１０６〜６×１０６個／ｋｇ）を併用投与したグループＥでは、心機能の有意な改善効果は認められなかった。【００９２】
＜梗塞サイズと微小心筋血流の改善度の解析＞
移植治療２８日後に、各グループのミニブタの梗塞サイズと微小心筋血流の改善度について、コントラストＭＲＩとコントラスト心エコー法により解析した。結果を図１０に示す。図１０の上段には梗塞サイズ（Ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｖｏｌｕｍｅ）を測定した結果、下段には微小心筋血流（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｒａｔｉｏ）を測定した結果を示す。図９から明らかなように、ｂＦＧＦ含有ゼラチンハイドロゲルと多能性幹細胞（投与量：５×１０５〜６×１０５個／ｋｇ）を併用投与したグループＤにおいてのみ、梗塞サイズと微小心筋血流において有意な改善度が認められた。一方、ｂＦＧＦ含有ゼラチンハイドロゲルと多能性幹細胞（投与量：５×１０６〜６×１０６個／ｋｇ）を併用投与したグループＥでは、グループＡ及びＢと同程度の改善度しか認められなかった。【００９３】
＜血管新生度の解析＞
移植治療２８日後に、各グループのミニブタの血管密度を測定することにより、血管新生度を解析した。図１１に、各グループについて、梗塞部位全体（ｔｏｔａｌ）の血管密度、梗塞周辺部（Ｂｏｒｄｅｒ  ａｒｅａ）の血管密度、梗塞中心部（Ｓｃａｒ  ａｒｅａ）の血管密度、直径＜５０μｍの血管密度、直径＞５０μｍの血管密度をそれぞれ示す。【００９４】
この結果からも、ｂＦＧＦ含有ゼラチンハイドロゲルと多能性幹細胞（投与量：５×１０５〜６×１０５個／ｋｇ）を併用投与したグループＤにおいて、最も有効な血流改善効果が認められた。【００９５】
＜心筋細胞再生の評価＞
移植治療２８日後の各グループのミニブタの心臓の心筋において再生された心筋細胞の評価を行った。各グループのミニブタの心臓の心筋において、新たに再生されたヒト心筋細胞を、ヒトのトロポニン−Ｉプロモーターで制御されているｂｅｔａ−ｇａｌ（赤色）とｈｕｍａｎ  Ｙ染色体（赤色）にて検出した。また、ホストのブタ心筋細胞はブタ特異的遺伝子プローブ（黄）にて区別した。なお、全心筋細胞はａｃｔｉｎ（緑）、核はＤＡＰＩ（青）で検出した。結果を図１２に示す。図１２に示す写真は、グループＤのミニブタの心臓の心筋を染色した結果である。上段にはｂｅｔａ−ｇａｌ（赤色）、中段にはｈｕｍａｎ  Ｙ染色体（赤色）、及び下段にはブタ特異的遺伝子プローブ（黄）で染色した結果を示す。また、図１２中、右上のグラフは、生着している多能性幹細胞の内、心筋細胞に分化した割合（心筋細胞分化率）を示し、右下のグラフには、多能性幹細胞から心筋細胞に分化した細胞の内、細胞融合を介した心筋細胞分化を示す細胞の割合（細胞融合を介する心筋分化率）を示す。【００９６】
この結果からも、ｂＦＧＦ含有ゼラチンハイドロゲルと多能性幹細胞（投与量：５×１０５〜６×１０５個／ｋｇ）を併用投与したグループＤが、グループＣ及びＥに比して、心筋細胞の再生が格段に優れていることが確認された。【００９７】
＜虚血心での心筋繊維化の形態とマクロファージの浸潤度の解析＞
移植治療２８日後の各グループのミニブタの心臓の心筋において、心筋繊維化の形態とマクロファージの浸潤度を解析した。各グループのミニブタの心臓の心筋に、Ｍａｓｓｏｎ−ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色を行って、線維化している細胞を可視化した。また、グループＤ及びＥの心筋中に存在するマクロファージＣＤ６８とマクロファージＣＤ１６３を染色した。結果を図１３に示す。図１３の上段に、各グループのミニブタの心臓の心筋に対してＭａｓｓｏｎ−ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色を行った結果を示す。また、図１３の下段には、グループＤ及びＥの心筋中に存在するマクロファージＣＤ６８とマクロファージＣＤ１６３を染色した結果を示す。この結果から、ｂＦＧＦ含有ゼラチンハイドロゲルと多能性幹細胞（投与量：５×１０６〜６×１０６個／ｋｇ）を併用投与したグループＥは、心筋繊維化が最も強く認められた。また、グループＤでは、グループＥに比べて、抗炎症マクロファージＣＤ１６３が減少しており、炎症惹起マクロファージＣＤ６８が増加していることが確認された。即ち、本試験結果からも、ｂＦＧＦ含有ゼラチンハイドロゲルと多能性幹細胞（投与量：５×１０５〜６×１０５個／ｋｇ）を併用したグループＤでは十分な梗塞心筋の治療効果が認められるものの、ｂＦＧＦ含有ゼラチンハイドロゲルと多能性幹細胞（投与量：５×１０６〜６×１０６個／ｋｇ）を併用したグループＥでは、十分な梗塞心筋の治療効果が得られていないことが示された。【００９８】
＜炎症性サイトカインの発現量の解析＞
移植治療２８日後のグループＤ及びＥのミニブタの心臓の心筋において、各種炎症性サイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α）の発現量を測定した。結果を図１４に示す。グループＥは、グループＤに比べて、炎症性サイトカインであるＩＬ−６とＴＮＦ−ａｌｐｈａの発現上昇が有意に認められた。【００９９】
＜まとめ＞
以上の結果から、ｂＦＧＦ含有ゼラチンハイドロゲルと多能性幹細胞（投与量：５×１０５〜６×１０５個／ｋｇ）を併用投与したグループＤでは、他のグループに比して、顕著に優れた梗塞心筋の治療効果が認められた。グループＤで認められた梗塞心筋の治療効果は、従来の治療方法では実現し得ないレベルにあり、臨床上の実用が強く要望される。【０１００】
また、ｂＦＧＦ含有ゼラチンハイドロゲルと多能性幹細胞（投与量：５×１０６〜６×１０６個／ｋｇ）を併用投与したグループＥでは、有効な梗塞心筋の治療効果が認められなかったことから、ｂＦＧＦ含有ゼラチンハイドロゲルとの併用する際に、当該多能性幹細胞の生着性の向上及び心筋細胞の再生を臨床上有効ならしめるには、多能性幹細胞の投与量を１０×１０５個／ｋｇ以下に設定することに臨界的意義があることが明らかとなった。【０１０１】
なお、ミニブタはヒトモデルとして最適な実験動物であり、ミニブタをモデルとした動物試験から明らかにされた薬物の有効投与量は、ヒトへの薬物投与量にも適用できることは、当該技術分野で周知である。従って、上記の試験結果は、ヒトに対してｂＦＧＦ含有ゼラチンハイドロゲルと多能性幹細胞（投与量：１×１０５〜１０×１０５個／ｋｇ、好ましくは３×１０５〜８×１０５個、更に好ましくは５×１０５〜７×１０５個）を併用投与する際に認められる治療有効性を十分に裏付けるものである。【０１０２】
実施例４：ｂＦＧＦの各種増殖因子の効果
実施例２にしたがい、ヒト心臓組織由来多能性幹細胞を調製した。ｂＦＧＦによる増殖効果を、この心臓組織由来多能性幹細胞（ＣＤＣ）と同一検体より精製した線維芽細胞（ｃＦＢ）において比較した。図１５（左）に示されるよう、ｂＦＧＦによる増殖効果は、心臓組織由来多能性幹細胞に対してのみ顕著であり、同一検体より精製した線維芽細胞（ｃＦＢ）はあまり増殖させなかった。【０１０３】
また、ｂＦＧＦによる増殖効果を、上記の心臓組織由来多能性幹細胞（ＣＤＣ）と同一検体より精製した骨髄幹細胞（ＢＭＣ）において、ＤＮＡの合成能として比較した。ＤＮＡの合成能はＢｒｄＵの取り込みで評価し、ｂＦＧＦの刺激前後の値と各群間での取り込み能の変化率における絶対値を統計学的に検定した。図１５（中）に示されるよう、ｂＦＧＦによる増殖効果は、心臓組織由来多能性幹細胞に対してのみ顕著であり、同一検体より精製した骨髄幹細胞（ＢＭＣ）はあまり増殖させなかった。【０１０４】
さらに、上記のヒト心臓組織由来多能性幹細胞におけるｂＦＧＦ刺激後１０分の各チロシンキナーゼのリン酸化をＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法により検討した。図１５（右）に示されるよう、ｂＦＧＦ刺激を加えた細胞では、Ａｋｔ，ＥＲＫ１／２，ｐ３８の著明なリン酸化が認められ、これらが媒介するシグナル伝達系を通じて細胞を増殖させることが確認された。【０１０５】
次いで、他の増殖因子（ＨＧＦ、ＩＧＦ−１）について、ヒト心臓組織由来多能性幹細胞に対する増殖効果を検討したところ、ＨＧＦやＩＧＦ−１の添加では目視で細胞の増殖は確認できなかった（ｄａｔａ  ｎｏｔ  ｓｈｏｗｎ）。【０１０６】
実施例５：安全性（奇形腫合併の有無）の確認
実施例３にしたがって心筋梗塞ミニブタを作成し、慢性心筋梗塞１ヶ月後にｂＦＧＦ含有ゼラチンハイドロゲルとヒト心臓組織由来多能性幹細胞（ＣＤＣ）を同時移植し、この処置群（ｂＦＧＦ＋ＣＤＣ）を無処置群（ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較した。図１６Ａは左室駆出率（ＬＶＥＦ）を、図１６Ｂは梗塞サイズ（ｉｎｆａｒｃｔ  ｖｏｌｕｍｅ）の経時的推移（移植前、移植後４週間、移植後１６週間）を示す。さらに、両群における移植したドナー細胞（ＣＤＣ）の生着性を細胞移植後ＭＲＩで評価した。図１６Ｃは、１６週目での典型的ＭＲＩ像を示す（黄色の矢印は生着したドナー細胞を示す）を、図１６Ｄは、ｂＦＧＦ＋ＣＤＣ移植群のドナー細胞の生着性を、移植直後に当たる４日目の生着率を１００％として経時的に評価したものである。【０１０７】
図１６に示されるよう、本発明のｂＦＧＦ含有ゼラチンハイドロゲルとヒト心臓組織由来多能性幹細胞（ＣＤＣ）の同時移植の効果は長期的に保持され、奇形腫の合併は全くみられなかった。【０１０８】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明の心疾患治療薬によれば、細胞移植療法による心疾患の治療において、心臓組織由来の多能性幹細胞の生着性の顕著な向上が認められ、心筋細胞を再生させることができる。本発明の心疾患治療薬を用いて心疾患の細胞移植療法を行えば、従来の細胞移植療法では実現し得ない疾患改善度を達成することが可能になる。従って、本発明は、心臓移植を必要とする患者、人工心臓の補助から離脱困難な末期心不全症患者、又はこれに準ずる患者の心疾患治療薬として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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