(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下に記載の遺伝子群から選択される少なくとも１種の遺伝子からなる、甲状腺乳頭癌用予後予測マーカー：
KCNV1
PAPPA
SLC7A5（ｈLAT1）
RASGRF1
SFTPB
CYP4B1
C8orf4
【請求項２】
前記甲状腺乳頭癌予後予測マーカーが、以下に記載の遺伝子群の少なくとも１種の遺伝子からなる、請求項１に記載の甲状腺乳頭癌用予後予測マーカー：
KCNV1
PAPPA
SLC7A5（ｈLAT1）。
【請求項３】
以下に記載の遺伝子群から選択される少なくとも１種の遺伝子によって発現される少なくとも１種のｍＲＮＡの塩基配列、又は該ｍＲＮＡの相補塩基配列の一部からなるオリゴヌクレオチドであって、前記ｍＲＮＡに部位特異的に結合するオリゴヌクレオチドを含むプライマー又はプローブを用いて、前記ｍＲＮＡを定量することを特徴とする、甲状腺乳頭癌の予後を予測する方法：
KCNV1
PAPPA
SLC7A5（ｈLAT1）
RASGRF1
SFTPB
CYP4B1
C8orf4。
【請求項４】
請求項３に記載の遺伝子によって発現される少なくとも１種のｍＲＮＡとハイブリダイズし得るＤＮＡを備えたＤＮＡチップを用いて前記遺伝子の発現を定量することを特徴とする甲状腺乳頭癌の予後を予測する方法。
【請求項５】
請求項３に記載の遺伝子から発現される少なくとも１種の蛋白質に対する抗体を用いて、該蛋白質を定量することを特徴とする甲状腺乳頭癌の予後を予測する方法。
【請求項６】
ＥＬＩＳＡ法を用いることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項３に記載の遺伝子によって発現される少なくとも１種のｍＲＮＡの塩基配列、又は該ｍＲＮＡの相補塩基配列の一部からなるオリゴヌクレオチドであって、前記ｍＲＮＡに部位特異的に結合するオリゴヌクレオチドを含むプライマー又はプローブを含む甲状腺乳頭癌の予後を予測するためのキット。
【請求項８】
請求項３に記載の遺伝子によって発現される少なくとも１種のｍＲＮＡとハイブリダイズし得るＤＮＡを備えたＤＮＡチップを含む甲状腺乳頭癌の予後を予測するためのキット。
【請求項９】
請求項３に記載の遺伝子から発現される少なくとも１種の蛋白質に対する一次抗体及び該一次抗体に対する標識化された二次抗体、を含む甲状腺乳頭癌の予後を予測するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、甲状腺乳頭癌を診断するための遺伝子マーカー、ｍＲＮＡマーカー、蛋白質マーカー、抗体、方法、ＤＮＡチップおよびキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
甲状腺癌には乳頭癌、濾胞癌、髄様癌、未分化癌、悪性リンパ腫の５種類が存在し、日本では甲状腺癌の85〜90％を乳頭癌が占めている。
【０００３】
甲状腺乳頭癌は、一般的に、予後が良く、癌死することはほとんどない。しかし、甲状腺乳頭癌の約10％の症例は予後が悪く、肺、脳、骨などの遠隔転移から癌死に至る。このように、甲状腺乳頭癌は、予後の良い低リスク群と予後の悪い高リスク群に分類されるといわれている。甲状腺乳頭癌の癌死危険度分類は、手術の時点で、原発巣の大きさ、年齢、転移の有無、癌の甲状腺外への浸潤の有無等によって行われる。
【０００４】
高リスク群の甲状腺乳頭癌であると判定された場合だけでなく、手術の時点で低リスク群の甲状腺乳頭癌と判定された場合も、その後、局所再発あるいは血行性転移で癌死することがあるので、術後の経過をみる必要がある。甲状腺乳頭癌は肺癌等の他の癌に比し進行が遅いため、5年から10年の経過を見ないとその予後はわからないのが現状である。経過を見る上で転移の可能性は現在血中サイログロブリン値で評価しているが、抗サイログロブリン抗体を持つ際には測定値は正確ではなく、また炎症によって細胞が破壊される際にも上昇が認められるため、特異性に優れているとは言いがたい。
【０００５】
特許文献１は甲状腺腫瘍マーカーを記載しているが、このマーカーは甲状腺乳糖癌の腫瘍マーカーとしては不十分なものである。
【特許文献１】特開２００４−２８３０７４号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明は、甲状腺乳頭癌を診断するための新規の遺伝子マーカー、ｍＲＮＡマーカー、蛋白質マーカー、抗体、方法、ＤＮＡチップおよびキットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、甲状腺乳頭癌患者を、年齢および遠隔転移・浸潤の有無により、低リスク群と高リスク群に分類した。そして、本発明者は、高リスク群（Ａ群：50歳以上の老年者であって、病理所見で甲状腺外に癌の転移・浸潤が見られた患者）および低リスク群（Ｃ群：30歳以下の若年者であって、病理所見で癌が甲状腺内限局していた患者）において、甲状腺乳頭癌の原発巣の組織における遺伝子発現量を詳細に比較し、鋭意検討を重ねた結果、１１個の遺伝子について著しく発現量に差があることを見出した。
【０００８】
更に鋭意検討を重ねた結果、本発明者は、上記１１遺伝子のうち３遺伝子について、同年齢（老年者）における高リスク群（上記Ａ群）と低リスク群（Ｂ群：50歳以上の老年者であって病理所見で癌が甲状腺内限局していた患者）間の甲状腺乳頭癌の原発巣の組織における発現量においても著しく差があることを見出した。これらの知見から、本発明者は本発明を完成した。
【０００９】
即ち、本発明は、以下の各項に示す発明に関する：
項１．  以下の少なくとも１種の遺伝子からなる、甲状腺乳頭癌を診断するための遺伝子マーカー：
SUV39H2
CRLF1
TMPRSS2
FXYD3
MYCN
NMU
TREX1
KCNV1
CAPN6
PAPPA
SLC7A5（ｈLAT1）。
項２．  以下の少なくとも１種の遺伝子からなる、上記項１に記載の遺伝子マーカー：
KCNV1
PAPPA
SLC7A5（ｈLAT1）。
項３．  以下の少なくとも１種の遺伝子からなる、甲状腺乳頭癌を診断するための遺伝子マーカー：
RASGRF1
SFTPB
CYP４B１
C8orf4
EHF
CYP１B１。
項４．  上記項１〜３のいずれかに記載の遺伝子によって発現される少なくとも１種のｍＲＮＡからなる、甲状腺乳頭癌を診断するためのｍＲＮＡマーカー。
項５．  上記項１〜３のいずれかに記載の遺伝子によって発現される少なくとも１種の蛋白質からなる、甲状腺乳頭癌を診断するための蛋白質マーカー。
項６．  上記項１〜３のいずれかに記載の遺伝子によって発現される少なくとも１種のｍＲＮＡを定量することを特徴とする、甲状腺乳頭癌を診断する方法。
項７．  上記項１〜３のいずれかに記載の遺伝子によって発現される少なくとも１種の蛋白質を定量することを特徴とする、甲状腺乳頭癌を診断する方法。
項８．  抗原抗体反応により前記蛋白質を定量することを特徴とする、上記項７に記載の方法。
項９．  ＥＬＩＳＡ法を用いることを特徴とする、上記項８に記載の方法。
項１０．  サイログロブリンを定量する工程と項１〜３のいずれかに記載の遺伝子によって発現される少なくとも１種の蛋白質を定量する工程を含むことを特徴とする、甲状腺乳頭癌を診断する方法。
項１１．  上記項４に記載のｍＲＮＡとハイブリダイズし得るＤＮＡを備える、ＤＮＡチップ。
項１２．  上記項５に記載の蛋白質に対する抗体。
項１３．  上記項５に記載の蛋白質に対する一次抗体と、該一次抗体に対する標識化された二次抗体とを含む、キット。
項１４．  甲状腺乳頭癌を診断するための項１３に記載のキット。
【００１０】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【００１１】
（１）甲状腺乳頭癌を診断するための遺伝子マーカー、ｍＲＮＡマーカーおよび蛋白質マーカー：
本発明の甲状腺乳頭癌を診断するための遺伝子マーカーは、以下の少なくとも１種の遺伝子からなる：
SUV39H2
CRLF1
TMPRSS2
FXYD3
MYCN
NMU
TREX1
KCNV1
CAPN6
PAPPA
SLC7A5（ｈLAT1）。
【００１２】
hLAT1とSLC7A5は、遺伝子名およびGene Bank のaccession numberは異なっているが、同一遺伝子であり、共通の塩基配列を有するamino acid transporter geneである。
【００１３】
本発明の遺伝子マーカーは、より好ましくは、以下の少なくとも１種の遺伝子からなる：
KCNV1
PAPPA
SLC7A5（ｈLAT1）。
【００１４】
また、別の実施形態において、本発明の遺伝子マーカーは、以下の少なくとも１種の遺伝子からなる：
RASGRF1
SFTPB
CYP４B１
C8orf4
EHF
CYP１B１。
【００１５】
本発明の遺伝子マーカーの塩基配列は、公知のデータベース（NCBI）で、表１に記載の対応のアクセッション番号（Accession Number）を検索することによって確認できる。
【００１６】
【表１】
0005629894.tif 000002
【００１７】
本発明の甲状腺乳頭癌を診断するためのｍＲＮＡマーカーは、本発明の遺伝子マーカーの遺伝子によって発現される少なくとも１種のｍＲＮＡからなる。
【００１８】
また、本発明の甲状腺乳頭癌を診断するための蛋白質マーカーは、本発明の遺伝子マーカーの遺伝子によって発現される少なくとも１種の蛋白質からなる。
【００１９】
本明細書において、本発明の甲状腺乳頭癌を診断するための遺伝子マーカー、ｍＲＮＡマーカーおよび蛋白質マーカーを合わせて、単に腫瘍マーカーと呼ぶことがある。
【００２０】
（２）甲状腺乳頭癌を診断する方法：
本明細書において、「甲状腺乳頭癌を診断する」とは、術前に甲状腺癌の悪性度を診断すること、甲状腺乳頭癌の予後を予測すること、術後の甲状腺乳頭癌の経過を予測すること等を含む。甲状腺乳頭癌は、癌組織の手術による全摘出が必要であるが、進行が遅い癌である。従って、手術前に転移の可能性を予め把握しておくことで、手術後の検査の種類、頻度などについて適切な方針を決定することができる。例えば、本発明の甲状腺乳頭癌の腫瘍マーカーを測定することで、手術後５〜１０年の経過を事前に予測することが可能になる。これにより、悪性度の低い患者の負担を軽減できるだけでなく、悪性度の高い患者のケアを十分に行うことが可能になる。
【００２１】
１つの実施形態において、本発明の甲状腺乳頭癌を診断する方法は、本発明の遺伝子マーカーの遺伝子によって発現される少なくとも１種のｍＲＮＡを定量することを特徴とする。ｍＲＮＡを定量するための検体としては、原発巣の手術検体、血液中の白血球等が挙げられる。
【００２２】
本発明の１つの好ましい実施形態において、本発明の甲状腺乳頭癌を診断する方法は、本発明の遺伝子マーカーの遺伝子によって発現される少なくとも１種の蛋白質を定量することを特徴とする。該蛋白質は抗原抗体反応により定量することができる。抗原抗体反応としてはＥＬＩＳＡ法が特に好ましい。甲状腺乳頭癌の転移等の予後を予測するために、従来サイログロブリンが使用されてきた。サイログロブリンは、甲状腺乳頭癌の手術により測定値が低下し、その後転移が起こると測定値が上昇すると考えられていたが、その精度は満足のいくものではなかった。しかしながら、本発明の腫瘍マーカーの少なくとも１種とサイログロブリンのサンプル（組織、血清、血漿等の血液サンプル、リンパ液、尿、唾液等）の測定値を組み合わせることで、より精度の高い甲状腺乳頭癌の診断が可能になり得る。
【００２３】
本発明の遺伝子マーカーを用いた甲状腺乳頭癌の診断は、例えば、低リスク群（30歳以下の若年者であって、病理所見で癌が甲状腺内に限局していた患者）からの甲状腺組織、血液または尿中（好ましくは、血液中）における本発明の腫瘍マーカーの量を基準とし、この基準と甲状腺乳頭癌組織、血液または尿中（好ましくは、血液中）における本発明の腫瘍マーカーの量とを比較することによって行われ得る。
【００２４】
本発明の甲状腺乳頭癌の腫瘍マーカーを用いた診断を行う場合、腫瘍マーカー（ｍＲＮＡ、蛋白質）の定量は、例えば、ｍＲＮＡの場合には１細胞あたりの絶対量として測定してもよく、相対量として測定してもよい。タンパク質の場合には、血液等のサンプル中の濃度として測定することができる。測定操作が簡便であり正確である点等から、ｍＲＮＡの遺伝子発現量は、相対量として測定することが好ましい。前記相対量は、例えば、内部対照となる遺伝子を設定し、その遺伝子発現量を用いて求めることができる。前記内部対照となる遺伝子としては、正常甲状腺組織細胞および甲状腺腫瘍細胞で発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、βアクチン（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃ Ｎｏ． Ｘ００３５１）遺伝子、GAPDH遺伝子が好ましく例示できる。腫瘍マーカーがタンパク質の場合、当該タンパク質に対する抗体（モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、特にモノクローナル抗体）を使用して、ＥＬＩＳＡ等の免疫学的測定法により好ましく測定できる。
【００２５】
本発明の甲状腺乳頭癌を診断するための遺伝子マーカーを定量するための前記ｍＲＮＡマーカーを定量する方法としては、細胞内の特定ｍＲＮＡ量を定量できる方法であれば、特に制限されず、例えば、前記ｍＲＮＡマーカーのｍＲＮＡもしくはそのｃＤＮＡの塩基配列またはそれらの相補塩基配列の一部からなるオリゴヌクレオチドであって、前記ｍＲＮＡマーカーのｍＲＮＡまたはｃＤＮＡに部位特異的に結合するオリゴヌクレオチドを含むプライマーやプローブを用いた方法が挙げられる。前記プライマーやプローブは、前記オリゴヌクレオチドが前記マーカーｍＲＮＡのｍＲＮＡまたはそのｃＤＮＡと部位特異的塩基対を形成するものであれば、前記ｍＲＮＡを検出・定量するための様々な修飾がされたものであってよい。また、前記方法としては、必要試料量が少なく、精度および感度がよく、簡便な方法が好ましく、具体的には、例えば、リアルタイムＰＣＲ法やコンペティティブＰＣＲ法、または、ｍＲＮＡを直接測定する方法等があげられる。これらの中でも、例えば、同一チューブまたはウェル内の反応で、本発明の遺伝子マーカーのｍＲＮＡと内部対照遺伝子のｍＲＮＡとを同時に測定できる方法がより好ましい。
【００２６】
前記リアルタイムＰＣＲ法としては、例えば、細胞内のトータルＲＮＡやｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡを鋳型に目的領域をＰＣＲで増幅し、リアルタイムモニタリング用試薬を用いて増幅産物の生成過程をリアルタイムでモニタリングし、解析する方法があげられる。前記リアルタイムモニタリング試薬としては、例えば、ＳＹＢＲ（登録商標：ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ社）ＧｒｅｅｎＩや、ＴａｑＭａｎ（登録商標：Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）プローブ等があげあられる。
【００２７】
また、前記コンペティティブＰＣＲ法としては、例えば、細胞内のトータルＲＮＡやｍＲＮＡから逆転写酵素を用いてｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡとＤＮＡコンペティターとを同一チューブ内で反応させる方法や、さらに前記逆転写反応時にｍＲＮＡとともにＲＮＡコンペティターを加えて反応させる方法等があげられる。またコンペティターのプライマー配列以外の内部配列としては、例えば、増幅目的ｍＲＮＡの配列と相同配列でもよく、非相同な配列でもよい。
【００２８】
またさらに、前記ｍＲＮＡを直接測定する方法としては、例えば、Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標：ＴｈｉｒｄＷａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）ＲＮＡアッセイ等があげられる。ただし、本発明の遺伝子マーカーを用いて甲状腺乳頭癌を診断する方法のためのマーカー遺伝子のｍＲＮＡの定量方法としては、これらの方法に限られず、前記オリゴヌクレオチド、プライマーまたはプローブを用いた種々の定量方法を適用できる。
【００２９】
本発明の甲状腺乳頭癌を診断するための遺伝子マーカーを定量するための前記蛋白質マーカーを定量する具体的方法としては、細胞内の特定蛋白質を定量できる方法であれば、特に制限されず、例えば、前記蛋白質マーカーの蛋白質に特異的な抗体を用いた方法があげられ、その中でも、必要な細胞量が少なく、精度および感度がよく、簡便な方法が好ましい。具体的には、例えば、各種のエンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）やラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等があげられ、これらの中でも、より感度がよく、簡便という点から、固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）やサンドウィッチＥＬＩＳＡが好ましい。これらの方法に使用する抗体としては、前記蛋白質の定量方法に応じて、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であってもよい。ただし、本発明の甲状腺乳頭癌の診断のための蛋白質マーカーの定量方法は、これらの方法に限られない。
【００３０】
本発明の抗体は、例えば本発明の遺伝子マーカーの遺伝子によって発現される蛋白質をマウスに免疫して得られたハイブリドーマから産生される抗体、特にモノクローナル抗体である。免疫に用いられる動物には、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ等があげられるが、マウスが特に好ましい。本発明の抗体を得るためには、本発明の遺伝子マーカーの遺伝子によって発現される蛋白質を免疫原としてハイブリドーマを作製した後、該蛋白質に反応する抗体を産生するハイブリドーマを選択する必要がある。免疫の惹起は、通常1ng〜10mgの量の免疫原を10〜14日の日数を開けて1〜5回に分けた操作で行うことができる。十分な免疫後、抗体産生能を有する器官（脾臓やリンパ節）を動物から無菌的に摘出し、細胞融合時の親株とする。なお、摘出する器官としては、脾臓が最も好ましい。細胞融合のパートナーとしては、ミエローマ細胞が用いられる。ミエローマ細胞には、マウス由来、ラット由来、ヒト由来等があるが、マウス由来が好ましい。細胞融合には、ポリエチレングリコールを用いる方法、細胞電気融合法等が挙げられるが、ポリエチレングリコールを用いる方法が簡便で好ましい。細胞融合しなかった脾臓細胞やミエローマ細胞とハイブリドーマとの選択は、例えばHATサプリメント（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）を添加した血清培地で培養することで行うことができる。ハイブリドーマの選択は、前述の培養上清を採取し、本発明の遺伝子マーカーの遺伝子によって発現される蛋白質を固相化したEIAプレートでの直接ELISAが好ましい。直接ELISAの結果、強い発色がみられたウエルを選択し、そのウエルの細胞をクローニングに供する。その強く発色した培養上清に対応するハイブリドーマを、本発明の遺伝子マーカーの遺伝子によって発現される蛋白質に反応する抗体を産生するハイブリドーマとして選択する。
【００３１】
クローニングとは、抗体産生ハイブリドーマを選別し単一化する作業であり、限界希釈法、フィブリンゲル法、セルソーターを用いる方法等があるが限界希釈法が好ましい。これにより、目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを獲得することができる。上記方法により得られたハイブリドーマを培養することで、培養上清中にモノクローナル抗体を得ることができる。さらに、大量のモノクローナル抗体を得るには、in vivoおよびin vitroによる方法があるが、in vivoによる方法、特にマウス腹水で得る方法が好ましい。培養上清やマウス腹水からのモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム塩折法、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー等により行われるが、精製純度や簡便性を考慮するとアフィニティークロマトグラフィーが最も好ましい。さらに高純度のモノクローナル抗体を得るためには、アフィニティークロマトグラフィーの後に最終精製としてゲルろ過クロマトグラフィーやイオン交換クロマトグラフィー等を行うのが好ましい。精製したモノクローナル抗体をサンドイッチELISAに利用するためには、抗体の組み合わせを決定しなければならない。サンドイッチELISAは異なる2種類の抗体で抗原を挟み込むことで微量な抗原を測定できるが、それぞれの抗体は異なるエピトープに反応することが好ましい。組み合わせを決定するためには、精製したモノクローナル抗体の一部をEIAプレートに固相化し、一部をビオチン等で標識化することが好ましいが、抗体のクラスが異なれば標識化は必ずしも必要ではない。抗体を固相化したEIAプレートに本発明の遺伝子マーカーの遺伝子によって発現される蛋白質を段階希釈したものを添加し、標識化した、あるいはしていない抗体を添加して組み合わせを検討する。最終的に、少なくとも10ng/ml、好ましくは1ng/mlの蛋白質まで測定できる組み合わせを選択することが好ましい。
【００３２】
（３）甲状腺乳頭癌を診断するためのキット、ＤＮＡチップ：
本発明のＤＮＡチップは、本発明の遺伝子マーカーの遺伝子によって発現されるｍＲＮＡとハイブリダイズし得るＤＮＡを備える。
【００３３】
また、本発明のキットは、本発明の遺伝子マーカーの遺伝子によって発現される蛋白質に対する一次抗体と、該一次抗体に対する標識化された二次抗体とを含む。
【００３４】
本発明の遺伝子マーカーを用いての甲状腺乳頭癌を診断するためのｍＲＮＡマーカーを定量するために使用するキットは、前記ｍＲＮＡマーカーのｃＤＮＡを定量可能なように増幅するための前記プライマーおよびポリメラーゼと、検出のため前記増幅産物に対合させる前記プローブとを含む細胞内の特定ｍＲＮＡを定量できるキットである。本発明のキットに含まれるその他の消耗試薬としては、特に制限されず、例えば、ｍＲＮＡを定量するために必要な酵素、バッファー、反応試薬等があげられる。
【００３５】
また、本発明の遺伝子マーカーを用いての甲状腺乳頭癌を診断するための蛋白質マーカーを定量するために使用するキットは、前記蛋白質マーカーの蛋白質に特異的な第一の抗体と、前記第一の抗体に特異的な第二の抗体であって、例えば、適宜な酵素または化学物質で標識化された抗体とを含む細胞内の特定蛋白質を定量するためのキットである。本発明のキットに含まれるその他の消耗試薬としては、特に制限されず、例えば、蛋白質を定量するために必要な酵素、バッファー、反応試薬等があげられる。
【００３６】
また、本発明の遺伝子マーカーを用いた甲状腺乳頭癌の判定のためのｍＲＮＡマーカーを定量するために使用するＤＮＡチップは、前記ｍＲＮＡマーカーのｍＲＮＡもしくはそのｃＤＮＡの塩基配列またはその相補塩基配列の一部からなるオリゴＤＮＡを備えるＤＮＡチップである。
【発明の効果】
【００３７】
本発明の腫瘍マーカーによれば、甲状腺分化癌の中でも最も頻度の多い乳頭癌を診断することができ、転移や予後を予測することで診断や治療に役立て、各個人に応じたオーダーメード医療を行うことができる。
【実施例】
【００３８】
本発明を以下の実施例において更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【００３９】
（１）一次スクリーニング：
（サンプル）
一次スクリーニングにおいて、以下のサンプルを使用した：
・高リスク群（Ａ群：50歳以上の老年者であって、病理所見で甲状腺外に癌の転移・浸潤が見られた患者）２例
・低リスク群（Ｃ群：30歳以下の若年者であって、病理所見で癌が甲状腺内限局していた患者）２例。
【００４０】
（組織サンプルおよびRNAの調製）
甲状腺乳頭癌（thyroid papillary carcinoma ; TPC）の組織を、患者のインフォームドコンセントを得た後、手術により得た。全ての組織を液体窒素中で急冷し、使用するまで−８０℃で保存した。腫瘍は、熟練した病理学者により甲状腺腫瘍のＷＨＯ組織学的分類に従って分類され、組織は高い純度を有した（腫瘍中９０％以上の新生物性細胞）。
【００４１】
トータルRNAを、ChmczynskiおよびSacchiの方法（Single-Step Methods of RNA Isolation by Acid Guanidinium Thyocyanate- Phenol -Chloroform Extraction. Chomczynski P and Sacchi N. Anal.Biochem. 162:156-159, 1987.）に従って抽出し、そしてRNeasy Mini kit （Qiagen, Valencia, CA）を使用して精製した。
【００４２】
（マイクロアレイ分析）
マイクロアレイ分析をhttp://www.affymetrix.comで詳細に記載されているように行った。cRNAを１０μｇのトータルRNAから調製し、HG-U133A Gene chip, Affimetrix oligonucleotide arrays （２万以上のヒト遺伝子を含有）へハイブリダイズさせ、スキャンし、そしてAffymetrix (Santa Clara, CA) プロトコルに従って分析した。スキャンした画像ファイルを、artifactsのために視覚的に検査し、そしてGCOSソフトウエア（Affimetrix）を使用して標準化した。若年TPC腫瘍と老年TPC腫瘍との間で、遺伝子発現レベルの相対変化を示すthe fold change valuesを比較して、GCOSソフトウエア（Affimetrix）を使用することによってこれら２つの条件の間で異なって発現される遺伝子を同定した。
【００４３】
（データ分析）
これらのｃＤＮＡをサンプルとしてAffinmetrix社製のGene  chipを用いて予後の良いと考えられる乳頭癌と予後が悪いと考えられる乳頭癌の2群間で発現の異なる遺伝子群を既知の2万遺伝子の中から選出した。βアクチン遺伝子をEndgenous controlとして使用した。その結果、2群間で遺伝子発現相対比が2.0以上である有意に発現量が異なる遺伝子の中から上位95遺伝子を選択した。結果を下記の表２に示す。表２に記載の95遺伝子は、2群間での遺伝子発現相対比が3.6以上であり、甲状腺乳頭癌を診断するための遺伝子マーカーとして有用であり得る。次いで、これらの95遺伝子を用いて二次スクリーニングを行った。
【００４４】
【表２】
0005629894.tif 000003
【００４５】
【表３】
0005629894.tif 000004
【００４６】
【表４】
0005629894.tif 000005
【００４７】
【表５】
0005629894.tif 000006
【００４８】
（２）二次スクリーニング
（サンプル）
二次スクリーニングにおいて、一次スクリーニングとは異なる以下のサンプルを使用した：
・高リスク群（Ａ群：50歳以上の老年者であって、病理所見で甲状腺外に癌の転移・浸潤が見られた患者）４例
・低リスク群（Ｂ群：50歳以上の老年者であって、病理所見で癌が甲状腺内限局していた患者）４例。
・低リスク群（Ｃ群：30歳以下の若年者であって、病理所見で癌が甲状腺内限局していた患者）５例。
【００４９】
（組織サンプルおよびRNAの調製）
一次スクリーニングと同様にして組織サンプルおよびRNAの調製とcDNA合成を行った。一次スクリーニングとは異なる甲状腺乳頭癌のサンプル（Ｃ群：若年者（30歳以下）で癌が甲状腺内に留まっている症例4例。Ａ群：老年者（50歳以上）で癌が遠隔転移あるいは甲状腺外に浸潤をもつ症例4例）をサンプルとしてこれらの遺伝子発現量をABI社のABI  7900HTとMicrofludic  cardを用いてTaqMan PCR法により定量し（Distinctive gene expression of human lung adenocarcinoma carrying LKB1 mutations. Oncogene 23, 5084-5091, 2004）、再検討を行った。
【００５０】
（Micro Fluidic Cards）
Applied Biosystems  fluorogenic 5’ nuclease assays を含むThe Micro Fluidic Card (Applied Biosystems, Foster City, CA )を、遺伝子チップによって選択された９５標的間での遺伝子発現の差異を検出するために使用した。遺伝子発現の相対レベルを、the ABI PRISM 7900 HT Sequence Detection (Applied Biosystems)を使用して、ＰＣＲリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲ（TaqMan PCR）の間に発せられる蛍光データより測定した。外部の内部対照（external endogenous control）（FAM-GAPDH）を、相対定量計算（relative quantitation calculations）における標準物質として使用した。１００ｎｇのcDNAおよびTaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems)をアッセイのために使用した。
【００５１】
その結果、Ａ群とＣ群との間で9.0倍以上発現の異なる11遺伝子(SUV39H2  24.9倍, CRLF1  16.3倍, TMPRSS2  12.96倍, FXYD3  12.7倍, MYCN  11.5倍, NMU 11.1倍, TREX1  10.4倍, KCNV1  9.9倍, CAPN6  9.9倍, PAPPA  9.0倍, SLC7A5 (hLAT1)  13.7倍)が得られた(＋GAPDH遺伝子をEndgenous  controlとして使用)。結果を表３に示す。
【００５２】
年齢による遺伝子発現への影響を除外するため、これらの11遺伝子の中から同年齢（老年者この場合は50歳以上）で癌が甲状腺内に留まっている症例及び癌が遠隔転移あるいは甲状腺外に浸潤をもつ症例間（即ち、Ａ群とＢ群との間）でも有意に遺伝子発現量の異なる遺伝子を検討したところ、これらのうちの3遺伝子（SLC7A5 (hLAT1)  137.57倍, PAPPA  70.57倍, KCNV1 23.6倍）が予後の差によって著しく発現が異なることが明らかとなった。結果を表３に示す。
【００５３】
即ち、これらの3遺伝子（hLAT1とSLC7A5とは同一遺伝子である）は、その遺伝子発現量について、Ａ群（老年者で予後の悪い群）とＣ群（若年者で予後の良い群）との間で差異（9.0倍以上）が認められ、かつＡ群（老年者で予後の悪い群）とＢ群（老年者で予後の良い群）との間でも顕著な差異が認められた（23.6倍以上）。即ち、これらの3遺伝子は、年齢よりもむしろ予後（癌の悪性度）でより大きな差異が認められた遺伝子であり、甲状腺乳頭癌を診断するマーカーとして非常に有用と考えられる。
【００５４】
また、表３に記載の23遺伝子（RASGRF1、SFTPB、CYP４B１、C8orf4、EHF、CYP１B1、HS3ST1、PCDHA2、SCEL、CXCL2、KIAA1579、CH13L1、PRO2533、CD2AP、PROS1、CMG1、ERO1-L、OSF-2、AGR2、FOSB、ZNF407、SMC2L1、FLNB）についてもその遺伝子発現量を測定したところ、Ａ群（老年者で予後の悪い群）とＣ群（若年者で予後の良い群）との間では上記11遺伝子の場合ほど差異が認められられなかったが（6.8倍以下）、Ａ群（老年者で予後の悪い群）とＢ群（老年者で予後の良い群）との間ではより大きな差異が認められた（1.92〜51.8倍）。即ち、これらの23遺伝子も、年齢よりもむしろ予後（癌の悪性度）で差異が認められた遺伝子であり、甲状腺乳頭癌を診断するマーカーとして有用と考えられる。特に、これら23遺伝子の中でも6遺伝子（RASGRF1、SFTPB、CYP４B１、C8orf4、EHF、CYP１B１）は、Ａ群とＢ群との間でその発現量の差異が大きく（5.9〜51.8倍）、甲状腺乳頭癌を診断する遺伝子マーカーとして有用であり得る。
【００５５】
【表６】
0005629894.tif 000007
【００５６】
また、二次スクリーニングで用いたＡ、ＢおよびＣ群についての手術前の血中サイログロブリン値を測定した。結果を病理所見と共に表４に示す。
【００５７】
【表７】
0005629894.tif 000008
【００５８】
（３）三次スクリーニング：
これらの11遺伝子について結果の再現性を異なるより多くの症例のサンプルを用いて（若年者10例、老年者12例）同じくTaqMan  PCR法にて定量し、確認した。
【００５９】
（リアルタイム定量RT-PCR；TaqMan PCR）
上記11遺伝子転写物について、PCR増幅されたDNA鎖を蛍光色素を用いてリアルタイムに定量的検出を行った。50ｎｇのcDNAをTaq Man Universal PCR Master Mix を用いて、ABI  PRISM7900HT Sequence Detection system上で遺伝子発現を定量的に測定した。標的遺伝子のcDNAは以下の条件でPCR法により増幅された［95℃で10分間、次いで（95℃で30秒続いて60℃で30秒）を40サイクルのPCR条件］。インプットcDNAにおける変動を補正するために内在性コントロール遺伝子としてGAPDHを使用した。
【００６０】
閾値サイクル（Ct）を測定し、そして相対的遺伝子発現を以下のように算出した：fold change ＝2−△(△Ct)（式中、△Ct＝Cttarget−CtGAPDH）（サイクル差異）。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
以上の結果から、これらの11遺伝子（中でも3遺伝子は特に）は甲状腺乳頭癌を診断するマーカーとして臨床検査上、有用と考えられる。また、これらの遺伝子の組み合わせあるいはサイログロブリンとの組み合わせが新しい甲状腺癌の腫瘍マーカーとして診断率を上げ、有用な可能性がある。手術組織のみならず、これらの遺伝子の発現量を血中の白血球を用いて血液レベルで定量が可能であり、あるいは蛋白レベルで抗原抗体法を用いて血清レベルで簡便な測定が可能であり、患者の予後を予測し、術後の再発や転移の検索の参考にすることができ、外来診療上で非常に有用である。