(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞から心筋細胞系列細胞を得るための方法であって、
ａ）アクチビンＡの存在下であるがＢＭＰの非存在下で該ｈＥＳ細胞を培養する工程；および
ｂ）その後、該細胞をＢＭＰの存在下であるがアクチビンＡの非存在下で培養する工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記ＢＭＰがＢＭＰ−２またはＢＭＰ−４である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＢＭＰがＢＭＰ−２である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＢＭＰがＢＭＰ−４である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ｈＥＳ細胞が、アクチビンＡの存在下で約１日間培養された後、前記ＢＭＰの存在下で約４日間培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＢＭＰ培養工程に続いて、培地がアクチビンＡもＢＭＰも含まない追加の培養工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記追加の培養工程が少なくとも１週間にわたり行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記追加の培養工程が少なくとも２週間にわたり行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記追加の培養工程がＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩを含有する培地中で行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記追加の培養工程がＩＧＦ−Ｉを含有する培地中で行われる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
胚様体を形成させる工程を含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＢＭＰ培養工程に続いて、前記培養物から細胞を回収する工程、および該回収した細胞集団を心筋細胞系列細胞について富化させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記回収した細胞集団がパーコール勾配によって富化される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記富化が心臓体の形成を伴う、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ｈＥＳ細胞から心筋細胞系列細胞の富化集団を得る方法であって、
ａ）アクチビンＡの存在下であるがＢＭＰの非存在下で、無血清培地中で約１日間該ｈＥＳ細胞を培養する工程；
ｂ）その後、ＢＭＰの存在下であるがアクチビンの非存在下で、無血清培地中で約４日間培養する工程；
ｃ）該培養物から細胞を回収する工程；および
ｄ）該回収した細胞集団を心筋細胞系列細胞について富化させる工程
をこの順序で包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の引用）
本出願は、２００５年６月２２日出願の米国特許出願第６０／６９３，１４１号の優先権を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、インビトロにおいて霊長類多能性幹細胞を心筋細胞系列細胞へと分化させる分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
再生医学研究の主な課題は、心機能の再構築を助けることができる細胞組成物を開発することである。男女約５人に１人が何らかの形態の心血管疾患を有すると推定される（非特許文献１）。広範に及ぶ病態には、冠動脈性心疾患（人口の５％）、先天性心血管障害（０．５％）および先天性心不全（３％）が含まれる。これまで医薬品の技術分野では、心疾患により生じる損傷を抑える助けとなる低分子薬および生物学的化合物が製造されてきたが、損傷した組織の再生を助ける薬剤は市販されていない。
【０００４】
心臓再生を可能にする細胞集団を開発することを目的に、これまで幾つかの角度から研究が行われてきた。幾つかの施設では、心筋梗塞後の治療における自己骨髄由来細胞の利用を検討する臨床試験が行われている（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。これらの細胞は、心臓組織の血液灌流を向上させる洗浄機能を有すると考えられてきた。また、心臓の治療における自己骨格筋筋芽細胞の利用を検討する臨床試験も行われている（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。しかし、横紋筋細胞の収縮が心拍動と十分に協調できるかについては不明である。
【０００５】
より直接的な手法としては、既に心筋細胞の機能を持つ細胞を使用する手法があると考えられる。これまで動物試験においては、恒久的な冠閉塞により生じる損傷の修復に同系の新生児および乳児の心細胞を使用してきた（非特許文献１０；非特許文献１１）。そのため、このような細胞がヒトの治療に利用可能であれば、虚血性心疾患の処置に非常に効果的である可能性がある。さらに、心筋細胞を製剤等の化合物のスクリーニングに使用することもできる。
【非特許文献１】Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｓｕｒｖｅｙ  ＩＩＩ，  １９８８−９４，  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｄｅｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ
【非特許文献２】Ｐｅｒｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０７：２２９４，  ２００３
【非特許文献３】Ｓｔｒａｕｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０６：１９１３，  ２００２
【非特許文献４】Ｚｅｉｈｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０６：３００９，  ２００２
【非特許文献５】Ｔｓｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ  ３６１：４７，  ２００３
【非特許文献６】Ｓｔａｍｍ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ  ３６６１：４５，  ２００３
【非特許文献７】Ｍｅｎａｓｃｈｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ａｍ．  Ｃｏｌｌ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ４１：１０７８，  ２００３
【非特許文献８】Ｐａｇａｎｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ａｍ．  Ｃｏｌｌ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ４１：８７９，  ２００３
【非特許文献９】Ｈａｇｅｇｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ  ３６１：４９１，  ２００３
【非特許文献１０】Ｒｅｆｆｅｌｍａｎｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ３５：６０７，  ２００３
【非特許文献１１】Ｙａｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｃｅｌｌ．  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ３５：６０７，  ２００３
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の簡単な要旨）
本発明は、霊長類多能性幹細胞から心筋細胞系列細胞を得る方法を提供する。心筋細胞系列細胞は、多くの可能性ある利用法を有しており、これには、潜在的な製剤のスクリーニング、細胞毒性化学物質のスクリーニング、および損傷または疾患のある心臓のｉｎ  ｖｉｖｏ修復等の治療的用途が含まれるが、これらに限定されない。
【０００７】
本発明の特定の実施形態において、霊長類多能性幹細胞から心筋細胞系細胞を得る方法は、アクチビンの存在下であるがＢＭＰの非存在下で、霊長類多能性幹細胞を培養する工程；その後ＢＭＰの存在下でこれらの細胞を培養する工程；および得られた回収細胞を培養液から回収する工程をこの順序で含む。
【０００８】
本発明はまた、心筋細胞系列細胞の富化集団を得る方法も提供する。特定の実施形態において、これらの方法は、アクチビン存在下であるがＢＭＰの非存在下で霊長類多能性幹細胞を培養する工程；その後ＢＭＰの存在下でこれらの細胞を培養する工程；これらの細胞を培養液から回収する工程；および回収した細胞集団を心筋細胞系列細胞に富化する工程をこの順序で含む。特定の実施形態において、これらの方法は、アクチビンＡの存在下であるがＢＭＰの非存在下で、無血清培地中で霊長類多能性幹細胞を約１日間培養する工程；その後、ＢＭＰ−４またはＢＭＰ−２の存在下であるがアクチビンの非存在下で、無血清培地中でこれらの細胞を約４日間培養する工程；これらの細胞を培養液から回収する工程；および回収した細胞集団を心筋細胞系列細胞に富化する工程をこの順序で含む。
【０００９】
本発明の特定の実施形態において、これらの細胞は、培養工程時に固体表面に付着させる。特定の実施形態において、これらの細胞は、ＢＭＰによる培養工程時に、胚様体を形成することができる。特定の実施形態において、これらの細胞は、アクチビンおよび／またはＢＭＰによる培養工程時に単一細胞の懸濁液において培養される。
【００１０】
特定の実施形態において、これらの細胞は、アクチビンの存在下で、１日以上培養される。特定の実施形態において、これらの細胞は、ＢＭＰの存在下で、４日間以上培養される。特定の実施形態において、アクチビンはアクチビンＡである。特定の実施形態において、ＢＭＰはＢＭＰ−４またはＢＭＰ−２である。
【００１１】
特定の実施形態において、これらの細胞は、アクチビンまたはＢＭＰの非存在下で、ＢＭＰによる培養工程後の追加期間にわたり培養される。これらの特定の実施形態において、追加の培養工程は２週間以上である。これらの特定の実施形態において、ＩＧＦは培養工程に含まれる。これらの特定の実施形態において、ＩＧＦはＩＧＦ−１である。
【００１２】
本発明の特定の実施形態において、分化プロトコルから得られた細胞集団は、心筋細胞系列細胞に富化される。これらの特定の実施形態においては、心筋細胞系列細胞の集団の富化にパーコール勾配が使用される。
【００１３】
本発明の特定の実施形態において、回収した細胞は、αミオシン重鎖（αＭＨＣ）が少なくとも１０％陽性である。本発明の特定の実施形態において、回収した細胞は、心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）が少なくとも１０％陽性である。本発明の特定の実施形態において、回収した細胞は、心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）が少なくとも２５％陽性である。
【００１４】
本発明の特定の実施形態においては、心筋細胞系列細胞を富化および／または拡大するために、心臓体が形成される。これらの特定の実施形態において、本方法は、単一細胞として存在する富化細胞集団内の細胞を細胞群として存在する細胞から分離する工程；栄養培地中に細胞群として存在する細胞を再懸濁する工程；栄養培地中の再懸濁した細胞を再培養する工程；および再培養した細胞を採取し、洗浄する工程をさらに含む。
【００１５】
本発明はまた、本発明の方法に従って霊長類多能性幹細胞から分化した心筋細胞系列細胞の集団も提供する。本発明はまた、ヒト胚芽細胞から心筋細胞系列細胞を生成する際に培養した複数の細胞集団も提供し、ヒト胚芽細胞から得られた霊長類多能性幹細胞株由来の未分化細胞；および本発明の方法に従って前記霊長類多能性幹細胞から分化した心筋細胞系列細胞の集団も含む。
【００１６】
本発明の特定の実施形態において、霊長類多能性幹細胞の心筋細胞系列細胞への分化は、無血清培地中で行われる。本発明の特定の実施形態において、霊長類多能性幹細胞の心筋細胞系列細胞への分化は、０．５％未満の血清を含む培地中で行われる。本発明の特定の実施形態において、霊長類多能性幹細胞の心筋細胞系列細胞への分化は、１％未満の血清を含む培地中で行われる。本発明の特定の実施形態において、霊長類多能性幹細胞の心筋細胞系列細胞への分化は、５％未満の血清を含む培地中で行われる。
【００１７】
本発明の特定の実施形態において、これらの細胞は、霊長類多能性幹細胞の心筋細胞系列細胞への分化時に、１つ以上のゼラチン、マトリゲル、ラミニン、フィブロネクチンおよび／またはビトロネクチンを含む基質に付着させる。
【００１８】
本発明の特定の実施形態において、霊長類多能性幹細胞は、アクチビンによる培養工程の１〜７日前に、ＭＥＭ−ＣＭ＋ｂＦＧＦ中で培養される。特定の実施形態において、霊長類多能性幹細胞は、アクチビンによる培養工程の約６日前に、ＭＥＭ−ＣＭ＋ｂＦＧＦ中で培養される。
【００１９】
特定の実施形態において、ＲＰＭＩ＋１Ｘ  Ｂ２７培地は、アクチビンの存在下で細胞を培養する場合に使用される。特定の実施形態において、ＲＰＭＩ＋１Ｘ  Ｂ２７培地は、ＢＭＰの存在下で細胞を培養する場合に使用される。特定の実施形態において、ＲＰＭＩ＋Ｎ２培地は、アクチビンの存在下で細胞を培養する場合に使用される。特定の実施形態において、ＲＰＭＩ＋Ｎ２培地は、ＢＭＰの存在下で細胞を培養する場合に使用される。
【００２０】
（定義）
「心筋細胞系列細胞」とは一般的に、心筋細胞の前駆体細胞および成熟心筋細胞双方を指す。特に指示がない限り、本開示内容における心筋細胞系列細胞、前駆体または心筋細胞の言及は、上に定義した通り、心筋細胞の個体発生の制限のない何れかの段階の細胞にも一様に適用することができる。以下に記載の通り、心筋細胞系列細胞は、以下の一覧の１つ以上のマーカー（時には少なくとも３個または５個のマーカー）を有する場合がある：心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）、心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）、サルコメアミオシン重鎖（ＭＨＣ）、ＧＡＴＡ−４、Ｎｋｘ２．５、Ｎ−カドヘリン、β１−アドレナリン受容体（β１−ＡＲ）、ＡＮＦ、転写因子のＭＥＦ−２ファミリー、クレアチンキナーゼＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）、ミオグロビン、または心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）。
【００２１】
「胚様体」という用語は、霊長類多能性幹細胞が懸濁培養液または凝集物中に非特異的に分化することができる場合に生じる分化および部分分化細胞を含む不均質細胞群を指す。
【００２２】
本明細書で使用される「霊長類多能性幹細胞」とは、何れかの種類の胚組織（胎児または胎児前組織）に由来し、３胚葉（内胚葉、中胚葉、外胚葉）全ての誘導体である種々の細胞型の後代を、当技術分野で認められる標準的な試験（例えば８〜１２週齢のＳＣＩＤマウスにおける奇形腫の形成能、または組織培養中における３胚葉全ての識別可能な細胞の形成能）に従い、適切な条件下で生成できる特性を有する細胞を指す。霊長類多能性幹細胞の定義には、種々の胚細胞型、例えば、ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞（例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５，  １９９８）を参照）およびヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞（例えば、Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：１３７２６，  １９９８を参照）；その他の霊長類の胚幹細胞、例えばアカゲザル幹細胞（例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２：７８４４，  １９９５を参照）、マーモセット幹細胞（例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  ５５：２５４，  １９９６を参照）が含まれる。
【００２３】
本明細書で使用される「未分化霊長類多能性幹細胞」とは、集団における霊長類多能性幹細胞およびその誘導体の実質的な割合が未分化細胞の形態的特性を示す細胞培養を指す。集団内の未分化細胞のコロニーは、部分的に分化した隣接細胞により囲まれること多いことが理解される。
【００２４】
本明細書で使用される「胚幹細胞」とは、胚芽細胞段階の、または細胞が３胚葉に実質的に分化する前のヒト胚に由来する多能性幹細胞を指す。但し、特に明示的に要求されない限り、この用語は、ｈＥＳ細胞の表現型特性を担持する一次組織および樹立した株、並びに３胚葉の各後代を精製する能力を常に有するような株の後代が含まれる。「ヒト胚性幹細胞」（ｈＥＳ細胞）のプロトタイプについては、Ｔｈｏｍｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５，  １９８８；米国特許第６２００８０６号）に記載されている。
【００２５】
本明細書で使用される「アクチビン」とは、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーのメンバーであるポリペプチド増殖因子を指す。現在のところ、４つのアクチビン（Ａ、ＡＢ、ＢおよびＣ）が知られている。
【００２６】
本明細書で使用される「骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）」とは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのポリペプチド増殖因子を指す。現在のところ、ＢＭＰファミリー内では約２０のメンバーが知られている。本出願において、「ＢＭＰ」という用語にＢＭＰ−１は含まれない。本明細書で使用される「富化する」とは、混合物中の成分濃度を増加させることを指す。例えば、本発明の特定の実施形態において、所与の細胞集団は、その集団における心筋細胞系列細胞の割合を増加させることによって富化される場合がある。
【００２７】
本明細書で使用される「心臓体」とは、ヒト心筋細胞系列細胞の複数の特性を担持する、懸濁液中の霊長類多能性幹細胞由来細胞の群を指す。
【００２８】
本明細書で使用される「直接分化」とは、霊長類多能性幹細胞を中間体である胚様体を形成することなく、特定の組織型の細胞に富化させた後代に分化するプロセスを指す。即ち、直接分化という用語は、少量の細胞凝集物を無意識に形成するプロセスを包含する。
【００２９】
本明細書で使用される「遺伝子的に変化した」、「トランスフェクトした」または「遺伝的に形質転換した」とは、ポリヌクレオチドを何れかの好適な人工操作の手段により細胞に転移させているか、または細胞が最初に変化した細胞の後代であり、ポリヌクレオチドを遺伝して受け継いでいるプロセスを指す。ポリヌクレオチドは、細胞に高濃度のタンパク質を発現させる、対象のタンパク質をコードする転写可能な配列を含むか、あるいはそれ自体タンパク質をコードすることなくタンパク質の発現に影響する（未分類の細胞または別のポリヌクレオチド配列の導入の何れかにより発現する）ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ等の分子をコードする配列を含む場合がある。遺伝的変化は、変化した細胞の後代が同じ変化を有する場合に「遺伝的に受け継ぐことができる」とされる。
【００３０】
本明細書で使用される「無血清」とは、基準組成物に血清が添加されていない状態を指す。
【００３１】
本明細書で使用される「フィーダー細胞」とは、異なる組織型および一般的には異なるゲノムの細胞であり、これは、共培養した細胞の増殖を促進および／または分化を制御する働きを果たす場合がある。例えば、未分化の霊長類多能性幹細胞は、未分化状態の維持を助けるフィーダー細胞で共培養することができるが、霊長類多能性幹細胞は、特定の組織型に分化を導くフィーダー（例えば、心筋細胞系列細胞）で培養することができる。
【００３２】
本明細書で使用される「無フィーダー」とは、基準組成物にフィーダー細胞が添加されていない状態を指す。即ち、無フィーダーという用語は、とりわけ、一次培養物由来のフィーダーの一部が二次培養物中に存在する場合であっても、霊長類多能性幹細胞を、フィーダーを有する培養物からフィーダーを添加していない培養物に継代培養する状態を包含する。
【００３３】
本明細書で使用される「培養する」とは、細胞をインビトロで維持および／または拡大するプロセスを指す。
【００３４】
本明細書で使用される「同じゲノム」とは、霊長類多能性幹細胞、および霊長類多能性幹細胞由来の分化細胞のゲノムを指し、制限酵素断片長多型（「ＲＦＬＰ」）またはＳＮＰ分析により測定した場合に、染色体ＤＮＡが霊長類多能性幹細胞およびその由来細胞の間で９０％以上同一であることを意味する。霊長類多能性幹細胞またはその由来細胞が遺伝的に変化している場合でも、これらの細胞は、非操作遺伝的要素を保持することから、これが由来する細胞またはこれに由来する細胞として同じゲノムを有すると考えられる。
【００３５】
本明細書で使用される「マトリゲル」とは、ＢＤ  ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ  Ｂａｓｅｍｅｎｔ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｍａｔｒｉｘを指し、これは、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ腫瘍細胞により生成された市販の基底膜調製物であり、ラミニン等の細胞外マトリックス成分を含む。マトリゲルは、Ｂｅｃｔｏｎ，  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ（米国ニュージャージー州フランクリンレイクス）から市販されている。
【００３６】
本明細書で使用される「ＲＰＭＩ」とは、ＲＰＭＩ培地１６４０（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ［米国カリフォルニア州カールスバッド］）を指す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
（発明の詳細な説明）
一般的技法：本発明の実施に有用な一般的技法の詳細については、細胞生物学、組織培養、胎生学および心臓生理学の標準的な文献およびレビューを参照されたい。
【００３８】
組織および細胞培養並びに胚幹細胞に関しては、以下を参照されたい：Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  （Ｅ．Ｊ．  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，  ｅｄ．，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  Ｌｔｄ．  １９８７）；Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｕｓｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  （Ｐ．Ｍ．  Ｗａｓｓｅｒｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９３）；Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  （Ｍ．Ｖ．  Ｗｉｌｅｓ，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２２５：９００，  １９９３）；Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  （Ｐ．Ｄ．  Ｒａｔｈｊｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒｅｐｒｏｄ，  Ｆｅｒｔｉｌ．  Ｄｅｖ．  １０：３１，  １９９８；およびＲ．Ｉ．  Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ２０００）。心細胞の培養に関する一般的な参考文献には、以下が含まれる：Ｔｈｅ  Ｈｅａｒｔ  Ｃｅｌｌ  ｉｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  （Ａ．  Ｐｉｎｓｏｎ  ｅｄ．，  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９８７），  Ｉｓｏｌａｔｅｄ  Ａｄｕｌｔ  Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ（Ｖｏｌｓ．  Ｉ  ＆  ＩＩ，  Ｐｉｐｅｒ  ＆  Ｉｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｄｓ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９）；およびＨｅａｒｔ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  （Ｈａｒｖｅｙ  ＆  Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９８）。分子および細胞生化学の一般的な方法には、以下のような標準的な文献を参照されたい：Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ４ｔｈ  Ｅｄ．；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ｉ．  Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ  ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）；およびＣｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （Ｄｏｙｌｅ  ＆  Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９８）。
【００３９】
（霊長類多機能性幹細胞）
本発明は、霊長類多機能性幹細胞を心筋細胞系列細胞に分化させる方法を提供する。本発明の方法に使用される場合がある霊長類多機能性幹細胞には、胚幹細胞が含まれるが、これに限定されない。胚幹細胞は、霊長類種の胚芽細胞から単離することができる（米国特許第５８４３７８０号；Ｔｈｏｍｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２：７８４４，  １９９５）。ヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞は、例えばＴｈｏｍｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （米国特許第６２００８０６号；Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２：１１４５，  １９９８；Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  ３８：１３３  ｆｆ．，１９９８）およびＲｅｕｂｉｎｏｆｆ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １８：３９９，  ２０００に記載の技法を使用して、ヒト胚芽細胞から調製することができる。その他の霊長類多機能性幹細胞型には、国際公開第ＷＯ  ０１／５１６１０号（Ｂｒｅｓａｇｅｎ）に概説される原始外胚葉様（ＥＰＬ）細胞、およびヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ９５：１３７２６，  １９９８）が含まれるが、これらに限定されない。
【００４０】
本発明に使用する胚幹細胞は胚幹細胞株から選択される場合もあれば、一次胚組織から直接得る場合もある。胚幹細胞株は既に数多く樹立されており、これらには以下が含まれるが、これらに限定されない：Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３またはＨ１４（参照：Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）；ｈＥＳＢＧＮ−０１、ｈＥＳＢＧＮ−０２、ｈＥＳＢＧＮ−０３（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ｉｎｃ．［米国ジョージア州アテネ］）；ＨＥＳ−１、ＨＥＳ−２、ＨＥＳ−３、ＨＥＳ−４、ＨＥＳ−５、ＨＥＳ−６（ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，  Ｉｎｃ．［シンガポール］）；ＨＳＦ−１、ＨＳＦ−６（カリフォルニア大学［サンフランシスコ］）；Ｉ３、Ｉ３．２、Ｉ３．３、Ｉ４、Ｉ６、Ｉ６．２、Ｊ３、Ｊ３．２（Ｔｅｃｈｎｉｏｎ−Ｉｓｒａｅｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、［イスラエル  ハイファ］）；ＵＣＳＦ−１およびＵＣＳＦ−２（Ｇｅｎｂａｃｅｖ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｅｒｔｉｌ．  Ｓｔｅｒｉｌ．  ８３（５）：１５１７−２９，  ２００５）；ＨＵＥＳ１−１７株（Ｃｏｗａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＮＥＪＭ  ３５０（１３）：１３５３−５６，  ２００４）；およびＡＣＴ−１４株（Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ，  ３６５（９４７１）：１６３６−４１，  ２００５）。
【００４１】
特定の実施形態において、本発明において使用する霊長類多機能性幹細胞は、無フィーダーの形態で得られる場合がある（例えば、Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ，  ３６５  （９４７１）：１６３６−４１，  ２００５を参照）。
【００４２】
（霊長類多機能性幹細胞培養）
霊長類多機能性幹細胞は、種々の基質、培地および他の補給剤並びに当技術分野で既知の因子を使用して培養される場合がある。霊長類多機能性幹細胞は、増殖を促進するものの、分化を抑制する培養条件を使用して、継続的に培養物中で繁殖させることができる。例示的な培地を８０％  ＤＭＥＭ（例えば、Ｋｎｏｃｋ−Ｏｕｔ  ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）、既に明らかなウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）若しくは血清代替品（米国特許公開第２００２／００７６７４７  Ａｌ号，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）の何れか２０％、非必須アミノ酸１％、Ｌグルタミン１ｍＭ並びにβメルカプトエタノール０．１ｍＭから精製する。
【００４３】
特定の実施形態において、霊長類多機能性幹細胞は、フィーダー細胞、一般的には胚または胎児組織由来の繊維芽細胞層上で培養される（Ｔｈｏｍｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５，  １９９８）。特定の実施形態において、これらのフィーダー細胞は、ヒトまたはマウス由来である。ヒトフィーダー細胞は、種々のヒト組織から単離し、ヒト幹性細胞を繊維芽細胞へ分化することにより得ることができる（例えば、国際公開第ＷＯ０１／５１６１６号を参照）。特定の実施形態において、使用される場合があるヒトフィーダー細胞には、以下が含まれるが、これらに限定されない：胎盤繊維芽細胞（例えば、Ｇｅｎｂａｃｅｖ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｅｒｔｉｌ．  Ｓｔｅｒｉｌ．  ８３（５）：１５１７−２９，  ２００５を参照）、卵管上皮細胞（例えば、Ｒｉｃｈａｒｄｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２０：９３３−３６，  ２００２を参照）包皮繊維芽細胞（例えば、Ａｍｉｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ，  ６８：２１５０−５６，  ２００３を参照）、子宮内膜細胞（例えば、Ｌｅｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  ７２（１）：４２−４９，  ２００５を参照）。
【００４４】
特定の実施形態において、胚幹細胞は、フィーダー細胞を添加していない未分化の状態で維持される場合がある（例えば、Ｒｏｓｌｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖ．  Ｄｙｎａｍ．  ２２９：２５９−２７４，  ２００４を参照）。無フィーダー培養は、分化しない細胞の増殖を促進する因子を含む栄養培地により一般的に支持される（米国特許第６，８００，４８０号）。特定の実施形態において、このような因子は、このような因子を隠す細胞、例えば、照射された（約４，０００ｒａｄ）初代マウス繊維芽細胞、テロマー化したマウス繊維芽細胞、または霊長類多能性幹細胞由来の繊維芽細胞様細胞（米国特許第６，６４２，０４８号）で培地を培養することにより培地に導入される場合がある。培地は、無血清培地、例えば、２０％血清代替品およびｂＦＧＦ４ｎｇ／ｍＬを補充したＫＯ  ＤＭＥＭ中にフィーダーを入れることによって馴化することができる。１〜２日間馴化した培地は、追加のｂＦＧＦと共に補充され、１〜２日間霊長類多機能性幹細胞培養を支持するために使用される（例えば、国際公開第ＷＯ０１／５１６１６号；Ｘｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９：９７１，  ２００１を参照）。
【００４５】
あるいは、新鮮なまたは非馴化培地を使用することができ、これは、未分化形態の細胞の増殖を促進する添加因子（繊維芽細胞増殖因子またはホルスコリン等）を補充している。例としては、Ｘ−ＶＩＶＯＴＭ  １０（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）またはＱＢＳＦＴＭ−６０（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）のような基本培地があり、これは、ｂＦＧＦ４０〜８０ｎｇ／ｍＬを補充し、場合により幹細胞因子（１５ｎｇ／ｍＬ）またはＦｌｔ３リガンド（７５ｎｇ／ｍＬ）を含む（例えば、Ｘｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２３（３）：３１５−２３，  ２００５を参照）。これらの培地配合は、その他の系の２〜３倍の細胞成速度を支持する利点がある（例えば、国際公開第ＷＯ０３／０２０９２０号を参照）。
【００４６】
例えば、霊長類多能性幹細胞は、１５，０００細胞／ｃｍ２超（場合により９０，０００個／ｃｍ２〜１７０，０００／ｃｍ２）にて培地に入れる。一般的に、酵素消化は細胞が完全に分散する（即ち、コラゲナーゼＩＶにて約５分）前に停止する。次いで、約１０〜２，０００個の細胞のクランプを、さらに分散させずに、基質に直接入れる。あるいは、細胞を酵素なしで回収後、プレートは、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡのＰＢＳ溶液で約５分間インキュベートすることにより、またはプレートから所望の細胞を機械的に簡単に分離させることにより、例えば、微細ピペットでこするまたは分離することによりコンフルエンスに達する。培養管から洗浄後、細胞をさらに分散しないで新しい培養に入れる。さらに説明すると、フィーダーの非存在下で培養した密集したヒト胚性幹細胞を０．０５％（ｗｔ／ｖｏｌ）のトリプシン（Ｇｉｂｃｏ）および０．０５３ｍＭのＭＥＤＴＡ溶液にて、３７℃にて５〜１５分間インキュベートすることにより、プレートから取り除くことができる。プレート内の残りの細胞を取り出し、この細胞をすり潰して、単一細胞および小細胞群を含む懸濁液とし、次いで、生存を促進し分化を制限するために、細胞５０，０００〜２００，０００個／ｃｍ２の密度でプレートに入れた。
【００４７】
顕微鏡下において、霊長類多能性幹細胞は、核／細胞質比が高く、核小体が顕著に出現し、細胞間結合があまり認識できないコロニー形成を集約する。霊長類多能性幹細胞は、一般的に段階特異胚抗原（ＳＳＥＡ）３および４およびＴｒａ−１−６０およびＴｒａ−１−８１を示す抗体を使用して検出可能なマーカーを発現する。また、未分化ヒト胚性幹細胞もまた、一般的には、ＲＴ−ＰＣＲ法により検出されるように、転写因子Ｏｃｔ−３／４、Ｃｒｉｐｔｏ、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）受容体、ポドカリキシン様タンパク質（ＰＯＤＸＬ）およびヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）（米国特許公開第２００３／０２２４４１１  Ａ１号）を発現する。
【００４８】
（霊長類多能性幹細胞の心筋細胞系列細胞への分化）
本発明は、とりわけ、初めにアクチビンの存在下で、霊長類多能性幹細胞を逐次培養し、ＢＭＰの存在下でその後に培養することにより、霊長類多能性幹細胞を心筋細胞系列細胞に分化させる方法を提供する。ＢＭＰは、アクチビンによる培養工程時に除外されるが、アクチビンは、場合によりその後のＢＭＰ培養工程の間も含む場合がある。
【００４９】
特定の実施形態において、アクチビンは、１０ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬまたは２５ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ、あるいは５０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度にて培養培地に含まれる。特定の実施形態において、アクチビンは、１０ｎｇ／ｍＬ未満または２００ｎｇ／ｍＬ以上の濃度にて培養培地に含まれる。
【００５０】
特定の実施形態において、ＢＭＰは、１０ｎｇ／ｍＬ〜２００ｎｇ／ｍＬまたは２５ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ、あるいは５０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度にて培養培地に含まれる。特定の実施形態において、ＢＭＰは、１０ｎｇ／ｍＬ未満または２００ｎｇ／ｍＬ以上の濃度にて培養培地に含まれる。
【００５１】
特定の実施形態において、分化に使用するアクチビンは、アクチビンＡ、アクチビンＢ、アクチビンＡＢまたはアクチビンＣである。特定の実施形態において、複数のアクチビンを使用される場合がある。特定の実施形態において、他のＴＧＦβスーパーファミリーのメンバー、例えば、ＴＧＦβ、ｎｏｄａｌまたはｌｅｆｔｙを、本発明の方法のアクチビンの代わりに置換する、またはアクチビンに添加することができる。
【００５２】
特定の実施形態において、分化に使用するＢＭＰは、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４またはＢＭＰ−７である。特定の実施形態において、ＢＭＰは、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４またはＢＭＰ−７以外のＢＭＰである（ＢＭＰ−１を除く）。特定の実施形態において、複数のＢＭＰを使用される場合がある。
【００５３】
特定の実施形態において、分化細胞は、ＢＭＰ工程後にアクチビンおよびＢＭＰが共にの非存在下で培養される。これらの特定の実施形態において、ＩＧＦは、この培養工程に含まれる。これらの特定の実施形態において、ＩＧＦは、１０ｎｇ／ｍＬ〜５００ｎｇ／ｍＬ、または２５ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬ、あるいは５０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度にて含まれる。特定の実施形態において、ＩＧＦは、１０ｎｇ／ｍＬ以下または５００ｎｇ／ｍｌ以上の濃度にて含まれる。ＩＧＦは、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２であってよい。特定の実施形態において、インスリンを本発明の方法のＩＧＦと置換される場合がある。
【００５４】
霊長類多能性幹細胞の心筋細胞系列細胞への分化時に、細胞は、種々の指定された時間でアクチビン、ＢＭＰまたはＩＧＦの存在下で培養される。特定の実施形態において、アクチビンを有する培養工程は、１２時間〜３６時間の期間または１２時間〜２日間の期間または６時間〜４日間の期間、あるいは４時間〜５日間の期間である。特定の実施形態において、アクチビンを有する培養工程は、５日間以上である。
【００５５】
特定の実施形態において、ＢＭＰを有する培養工程は、３日〜５日間の期間、または２日〜８日間の期間、または１日〜１４日間の期間である。特定の実施形態において、ＢＭＰを有する培養工程は、１４日間以上である。
【００５６】
特定の実施形態において、ＩＧＦを有する培養工程は、３日〜５日間の期間、または２日〜８日間の期間、または１日〜４週間の期間である。特定の実施形態において、ＩＧＦを有する培養工程は、４週間以上である。
【００５７】
例えば、特定の実施形態において、マトリゲル上にのせたヒト胚性幹細胞は、初めにＢＭＰの非存在下でアクチビンＡ５０ｎｇ／ｍＬにて約１日間培養された後、アクチビンの非存在下でＢＭＰ−４  ５０ｎｇ／ｍＬにて約４日間培養される場合がある。次いで、アクチビンおよびＢＭＰ共に非存在下でＩＧＦ−１  ５０ｎｇ／ｍＬの存在下で２週間培養される場合がある。特定の実施形態において、得られた心筋細胞系列細胞は、回収され、実施例３に記載の通りパーコール勾配により富化される。
【００５８】
特定の実施形態において、霊長類多能性幹細胞は、直接分化により心筋細胞系列細胞に分化させる場合がある。霊長類多能性幹細胞の分化は元来、胚様体を意図的に形成することを伴い、これは異なる細胞型間でのクロストークを可能にし、胚を暗示させる方法で組織形成を促進すると考えられた。しかし、多くの場合、分化プロセスをより制御して胚様体の形成の必要性がなくなることは有利であり、得られた細胞集団は、より均質になる傾向がある（例えば、ＷＯ  ０１／５１６１６、米国特許公開第２００２／０１５１０５３  Ａ１号を参照）。
【００５９】
直接分化技法の有利なことの１つに、他の方法では一般的であるような、血清または血清代替品を、心筋細胞分化プロセスを開始または支持するために必要としないことがある。代わりに、培地を心筋細胞またはニューロン等の分化細胞を支持する人工栄養補給剤を含むように配合することができる。例として、Ｂ２７補給剤、Ｎ２補給剤およびＧ５補給剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ）がある。特定の実施形態において、補給剤には、栄養素およびヒトインスリン（５００μｇ／Ｌ）、ヒトトランスフェリン（５〜１０ｍｇ／Ｌ）およびセレニウム（０．５μｇ／ｍＬ）のような共同因子を含み、プトレッシン（１．５ｍｇ／Ｌ）、ビオチン（１μｇ／Ｌ）、ヒドロコルチゾン（０．４μｇ／Ｌ）またはプロゲステロン（０．６μｇ／Ｌ）および／またはＥＧＦまたはＦＧＦ等の低濃度のマイトジェン類（１μｇ／Ｌ）も含む場合がある。販売規模の製造およびヒト治療において、非ヒト動物由来の成分を排除することが有利な場合がある。
【００６０】
特定の実施形態において、分化工程中に使用する培養培地は、無血清である。特定の実施形態において、分化工程中に使用する培養培地は、血清０．２５％以下若しくは血清０．５％以下、または血清１．０％以下、または血清２．０％以下、または血清５．０％以下あるいは血清１０％以下を含む。
【００６１】
このような直接分化法の利点に関係なく、本発明の特定の実施形態において、霊長類多能性幹細胞は、本発明の方法により、アクチビンによる培養工程を除いた分化プロトコルのある時点で、胚様体の形成を通して心筋細胞系列細胞に分化される場合がある。胚様体を当技術分野で既知の種々の方法により形成することができる。
【００６２】
特定の実施形態において、分化細胞は、本発明の方法において基質上で培養される。本発明に使用することができる基質には、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ポリ−Ｌ−リシン−ヒアルロン酸被覆組織培養プラスチックまたはマトリゲルが含まれるが、これらに限定されない。
【００６３】
本発明の実施において、細胞の培養に使用される場合がある固体表面には種々のものがある。これらの固体表面には、６−ウェル、２４−ウェル、９６−ウェル、または１４４−ウェルプレート等の標準細胞培養プレートが含まれるが、これらに限定されない。その他の固体表面には、微粒子担体およびディスクが含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、微粒子担体はビーズである。これらのビーズは、種々の形態、例えば細胞付着性を補強するため陽性電荷基を有するＣｙｔｏｄｅｘ  Ｄｅｘｔｒａｎ微粒子担体ビーズ、細胞付着のためのゼラチン／コラーゲン被覆ビーズおよび細胞の付着のための様々な多孔を有するマクロ多孔性微粒子担体ビーズとなる。Ｃｙｔｏｄｅｘ  ｄｅｘｔｒａｎ、ゼラチン被覆および多孔性微粒子担体ビーズは、市販されている（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ［米国ミズーリ州セントルイス］またはＳｏｌｏｈｉｌｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｉｎｃ．［米国ミシガン州アンアーバー］）。特定の実施形態において、ビーズは、面積３５０〜５００ｃｍ２、粒径９０〜２００μｍである。ビーズは、ガラスまたはプラスチックを含むがこれらに限定されない種々の材料で構成される場合がある。特定の実施形態において、ディスクは、細胞を付着させるために撹拌タンクバイオリアクターにおいて使用される場合がある。ディスクは、Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ．，  Ｉｎｃ．（米国ニュージャーシー州エジソン）等より販売されている。特定の実施形態において、ディスクは、Ｆｉｂｒａ−ｃｅｌ  Ｄｉｓｋｓであり、これはポリエステル／ポリプロピレンディスクである。これらのディスク１ｇは、表面面積１，２００ｃｍ２となる。
【００６４】
固体表面は、種々の物質から製造することができ、ガラス若しくはプラスチック、例えばポリスチレン、塩化ポリビニル、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、メリネックスまたはサーマノックスが含まれるが、これらに限定されない。本発明の特定の実施形態において、固体表面は、３次元の形状であってよい。３次元固体表面の例は、例えば米国特許公開第２００５００３１５９８号に記載されている。
【００６５】
特定の実施形態において、細胞は、本発明の方法の中で単一細胞懸濁液中にある。単一細胞の懸濁は、スピナーフラスコ、振盪フラスコまたは発酵装置の培養を含むがこれらに限定されない種々の方法で実施される場合がある。使用される場合がある発酵装置には、Ｃｅｌｌｉｇｅｎ  Ｐｌｕｄ（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏ，Ｉｎｃ．［米国ニュージャーシー州エジソン］）およびＳＴＲまたは撹拌タンクリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ  Ｉｎｃ．［米国カリフォルニア州フォスターシティ］）が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、バイオリアクターは、培地で継続的に灌流される場合もあれば、流加様態で使用される場合もある。バイオリアクターは、２．２Ｌ、５Ｌ、７．５Ｌ、１４Ｌまたは２０Ｌのような様々な大きさとなる。
【００６６】
（心筋細胞系列細胞の富化および拡大）
本発明は、富化工程なしに高純度心筋細胞系列細胞集団を得る方法を提供する。しかし、１回以上の富化工程を加えることで、さらに高純度心筋細胞系列細胞集団を生成することができる。それゆえ、本発明の方法には、本発明の分化工程により得られた心筋細胞系列細胞を富化および／または拡大する工程が含まれる場合がある。特有の細胞型を富化する種々の方法は、当業者に既知であり、これには、機械的分離法、密度分離法、細胞分別、磁気分別および遺伝選択法が含まれるがこれらに限定されない（細胞分離の概説については、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，  Ｎｅｗ  ｙｏｒｋ，  ２０００−Ｃｈａｐｔｅｒ  １４を参照）。これらの方法論の一部の例を以下に説明する。
【００６７】
（密度勾配）
特定の実施形態において、心筋細胞系列細胞は、例えばパーコール（例えば、本明細書の実施例３およびＸｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃ．  Ｒｅｓ．  ９１（６）：５０１−０８，  ２００２）、Ｆｉｃｏｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、メトリザミド（Ｎｙｇａａｒｄ）、ＲｅｄｉＧｒａｄ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびデキストランを含むがこれらに限定されない密度勾配培地を使用する密度勾配分離法により富化される。
【００６８】
（細胞分別法）
多くの細胞分別法が、非心筋細胞系列細胞から心筋細胞系列細胞を分別するために利用可能である。これらの細胞分別法には、陰性免疫選択および陽性免疫選択が含まれるが、これらに限定されない。
【００６９】
免疫選択とは、選択系の特異性が抗体または抗体様分子、例えばレクチンまたはハプテンにより付与される種々の技法を含む一般的な用語である。このような特異性の例としては、特異的細胞表面抗原の抗体親和性がある。２つ一般的な型の免疫選択技法が実施されている。陰性免疫選択は、不均質な集団から特異的亜集団の成分を排除、例えば本明細書の方法において霊長類多能性幹細胞の分化から生じる細胞集団から非心筋細胞系列細胞の排除に関する。それに対し、陽性免疫選択は、特異的成分の直接選択および回収、例えば、本明細書の方法において霊長類多能性幹細胞の分化から心筋細胞系列細胞の直接選択および回収を示す。種々の免疫選択型を本発明の実施に使用される場合があり、これには、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）、免疫磁気法、抗体カラム、免疫沈降および免疫パンニング法が含まれるが、これらに限定されない。
【００７０】
心臓体：特定の実施形態において、心筋細胞系列細胞は、心臓体と呼ばれる細胞群に成長させることにより、さらに拡大または富化される場合がある。
【００７１】
初めに、心筋細胞系列細胞の表現型特徴を有する細胞を含み、場合により密度分離または他の技法により富化させた細胞集団を発生する。次いで、細胞に群を形成させ、懸濁液中の単一細胞を除去する。これは細胞群を安定させ、単一細胞含有上清をピペットで除去することよりなされる。次に進む前に、時には（例えば、簡潔なトリプシン処理および／または機械的分散により）細胞群を分解することが有利である。次いで、細胞を新鮮な培養培地（例えば、ウシ胎仔血清、血清代替品またはＣＣＴを含む培地）において付着性の低いプレートの懸濁液にて培養することができ、「第２の」心臓体に再凝集することができる。次いで、必要な場合、培養を細胞１０〜５，０００個（一般的には細胞５０〜１，０００個）の細胞群として残る心筋細胞系列細胞を周期的に再追加し続ける。
【００７２】
適切な期間（一般的には１〜７日）が経過後、培養した細胞を特徴付けのために回収し、または薬剤スクリーニングまたは製剤製造に使用することができる。精製効果は、細胞に単一細胞の除去および細胞群の再培養の追加のサイクルを８日間以上行う場合、向上する。各サイクルは場合により、細胞群が単一細胞またはより小さな細胞群に分散する工程を組み込むことができ、さらに拡大することができる。より大きな細胞群は、懸濁細胞の凝集または細胞群内の増殖の何れか、あるいはその両方により形成される場合がある。本発明の仮説において、心筋細胞系列細胞は、適切な条件下でこのような細胞群を形成する傾向にあり、単一細胞の除去が他の細胞型を排除し、均質性の増加を助ける。
【００７３】
心臓体技法を使用して、分化プロセスのどの段階の細胞集団の心筋細胞を拡大および／または富化することができる。以下に挙げる通り、この技法は、前記の密度分離法による富化工程の後に使用することができる。本技法の実施は、本発明を実施後に行うことが有利である。特に、実時間ＰＣＲ法により検出されたミオシン重鎖の発現は、細胞を７日間培養した場合、１０〜１００倍増加する。組成物中の大きな割合の細胞群は、以下の自然な収縮活動を呈する：一般的に５０％以上および既述の様態で加工する場合、潜在的に約８０〜１００％。
【００７４】
（ＥＳ分化心筋細胞系列細胞の特徴付け）
本発明の技法に従って得られた心筋細胞系列細胞を、多くの表現型の基準に従って特徴付けすることができる。
【００７５】
霊長類多能性幹細胞株由来の心筋細胞および前駆体は、多くの場合、他の源からの心筋細胞の形態的特徴を有する。これらは、錐、円、三角または多角の形状を有し、免疫染色により検出可能なサルコメア構造が特徴である横紋を示す（図１）。これらは、平面状の細胞を形成し、または懸濁液中の基質または浮遊物に付着した状態で凝集することができ、電子顕微鏡にて調べた場合、一般的なサルコメアおよび心房性顆粒を示す。
【００７６】
適当な環境下において、霊長類多能性幹細胞由来の心筋細胞は、多くの場合、自然な周期的収縮活動を示す。これは、適切なＣａ＋＋濃度および電解質バランスを有する適切な組織培養環境において培養する場合、培養培地に追加の成分を添加する必要なく、細胞が細胞の１軸に沿って収縮した後弛緩することを意味する。この収縮は、周期的であり、これは規則的または不規則に正常な緩衡液中１分当たり約６〜２００回、および多くの場合１分当たり約２０〜９０回の収縮頻度で繰り返すことを意味する（図２）。各細胞は、それ自体の自然な周期的な収縮活動を示し、または組織中の近接する細胞、細胞凝集物または培養細胞質量に合わせて自然な周期的収縮活動を示す。
【００７７】
細胞の収縮活動は、収縮の性質および頻度による培養条件の影響において特徴付けすることができる。利用可能なＣａ＋＋濃度を減少させるまたはさもなければＣａ＋＋の膜透過輸送体を干渉する化合物は、多くの場合、収縮活動に影響を及ぼす。例えば、Ｌ型カルシウムチャネルブロッカージルチアゼムは、用量依存的に収縮活動を抑制する。一方、イソプレナリンおよびフェニレフリンのようなアドレナリン受容体作用薬は、陽性変時効果を有する。さらに細胞の機能的特性の追加の特徴として、Ｎａ＋、Ｋ＋およびＣａ＋＋のチャネルの特徴付けを含むことがきできる。電気生理学について、心筋細胞様活動電位のパッチクランプ分析を研究することができる。Ｉｇｅｌｍｕｎｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ．  ４３７：６６９，  １９９９；Ｗｏｂｕｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ２７：７５２，  １９９５；およびＤｏｅｖｅｎｄａｎｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ３２：８３９，  ２０００を参照されたい。
【００７８】
心筋細胞系列細胞は、一般的に少なくとも１つの以下の心筋細胞特異的マーカーを有する：
・心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）、横紋筋収縮の制御のためのカルシウム感受性分子スイッチを提供するトロポニン複合体のサブユニット
・心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）
・Ｎｋｘ２．５、マウス初期胚発生中の心臓中胚葉に発現する心臓転写因子であり、これは発達中の心臓内で持続する。
【００７９】
また、細胞は、一般的に少なくとも１つ（および多くの場合、少なくとも３つ、５つまたはそれ以上）の以下のマーカーを発現する：
・心房性ナトリウム利尿因子（ＡＮＦ）、発達中の心臓および胎児心筋細胞に発現するが、成人では下方制御されるホルモン。心臓細胞中に高度な特異様式で発現するが、骨格筋細胞には発現しないため心筋細胞に適したマーカーであると考えられている。
・ミオシン重鎖（ＭＨＣ）、特に心臓特異的であるβ鎖。
・チチン、トロポミオシン、αサルコメアアクチニンおよびデスミン
・ＧＡＴＡ−４、心臓中胚葉に高度に発現し、発達中の心臓内に持続する転写因子。多くの心臓遺伝子を調節し、心臓発生の役割を果たす。
・ＭＥＦ−２Ａ、ＭＥＦ−２Ｂ、ＭＥＦ−２ＣおよびＭＥＦ−２Ｄ；心臓中胚葉に発現し、発達中の心臓内に持続する転写因子。
・Ｎ−カドヘリン、心臓細胞間の付着を媒介する。
・コネキシン４３、心筋細胞間のギャップ結合を形成する。
・β１アドレナリン受容体（β１−ＡＲ）
・クレアチンキナーゼＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）およびミオグロビン、これは、心筋梗塞後の血清において上昇する。
・α−心臓アクチン、初期成長応答（遺伝子）−ＩおよびサイクリンＤ２。
【００８０】
組織特異的マーカーを、適切な免疫学的技法、例えば細胞表面マーカーに対してフローイムノサイトメトリーまたは親和性吸着、細胞内または細胞表面マーカーに対して免疫細胞化学（例えば、細胞または組織切片の固定）、細胞抽出物に対するウェスタンブロット分析および細胞抽出物または培地に隠れた産物に対する酵素結合免疫分析を使用して検出することができる。ｃＴｎＩおよびｃＴｎＴ等の心臓マーカーと他のアイソフォームを区別する抗体は、ＳｉｇｍａおよびＳｐｅｃｔｒａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓのような供給業者から市販されている。細胞による抗原発現により、標準的な免疫細胞化学またはフローサイトメトリー分析において、かなりの検出可能な量の抗体が抗原と結合する場合、場合によって細胞を固定後、および場合によって標識した二次抗体を使用して抗体の検出が可能であるとされている。
【００８１】
また、組織特異的遺伝子産物の発現は、ノーザンブロット分析、ドットブロットハイブリダイゼーション分析または公式に利用可能な配列データ（ＧｅｎＢａｎｋ）を使用して標準的な増幅方法で配列特異的プライマーを使用する逆転写酵素−ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によりｍＲＮＡ濃度で検出することができる。タンパク質またはｍＲＮＡ濃度で検出する場合の組織特異的マーカーの発現は、濃度が未分化の霊長類多能性幹細胞のものより少なくとも２倍および好ましくは１０〜５０倍以上である場合、陽性と考えられる。
【００８２】
また、組織特異的遺伝子産物の発現を、ノーザンブロット分析、ドットブロットハイブリダイゼーション分析または標準的な増幅方法における配列特異的プライマーを使用する逆転写酵素−ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によりｍＲＮＡ濃度にて検出することができる。詳細については、米国特許第５８４３７８０号を参照されたい。本開示内容に記載した特定のマーカーの配列データは、ＧｅｎＢａｎｋ等の公式データベースから得ることができる（ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ：８０／ｅｎｔｒｅｚ）。ｍＲＮＡ濃度での発現は、一般的な対照実験の標準的工程における細胞試料の試験の結果が明らかに識別可能なハイブリッド形成または増幅産物を生じる場合、本開示内容に記載した試験の１つにおいて「検出可能」であると言える。タンパク質またはｍＲＮＡ濃度で検出する場合の組織特異的マーカーの発現は、濃度が未分化の霊長類多能性幹細胞の濃度より少なくとも２倍および好ましくは１０以上または５０倍である場合、陽性であると考えられる。
【００８３】
マーカーを所望の表現型の細胞表面上で同定した場合、これらのマーカーを免疫選択に使用して、免疫パンニング法および抗体媒介フルオロセンス活性細胞分別等の技法により集団をさらに富化することができる。
【００８４】
霊長類多能性幹細胞の樹立した株由来である場合、本発明の細胞集団および分離細胞をこれらが由来する株と同じゲノムを有するように特徴付けすることができる。これは、染色体ＤＮＡが霊長類多能性幹細胞と心臓細胞間でＲＦＬＰおよびＳＮＰ分析により９０％以上同一であり、またこれは、心臓細胞が正常な有糸分裂の過程を介して未分化株から得られた場合、干渉することができることを意味する。心筋細胞系列細胞が親細胞集団由来であるという特徴は、幾つかの点で重要である。特に、未分化細胞集団を、共有したゲノム−かなりの群の心臓細胞または治療に有用な場合がある別の細胞型−例えば患者を心臓同種移植の組織適合性に予め耐性化させることができる集団の何れかで追加の細胞を生成するために使用することができる（米国特許公開第２００２／００８６００５  Ａ１号；国際公開第ＷＯ  ０３／０５０２５１号）。
【００８５】
（分化細胞の遺伝的変化）
本発明の細胞は、分化の前後の何れかに細胞を遺伝的に操作することにより１つ以上の遺伝的変化を含むように生成することができる（米国特許公開第２００２／０１６８７６６  Ａ１号）。例えば、細胞を、発達制限系列細胞または最終分化細胞になる前後の何れかに、細胞がテロメラーゼ逆転写酵素を発現するように遺伝的に変化させることにより複製能を増加するように加工することができる（米国特許公開第２００３／００２２３６７  Ａ１号）。
【００８６】
また、本発明の細胞は、組織再生に関与し、または投与部位に治療的遺伝子を送達する能力を高めるために遺伝的に変化させることできる。ベクターを所望の遺伝子をコードする既知の配列を使用し、また、分化細胞型においてＰａｎ特異的または特異的活性の何れかであるプロモーターと操作可能に結合させるように設計する。特に関心の高いものは、ＦＧＦ等の種々の型の１つ以上の増殖因子、心房性ナトリウム利尿因子等の心臓栄養因子、ｃｒｉｐｔｏ並びにＧＡＴＡ−４、Ｎｋｘ２．５およびＭＥＦ２−Ｃ等の心臓転写制御因子を発現するよう遺伝的に変化させる細胞である。投与部位にてこれらの因子を生成することは、機能的表現型の導入、投与された細胞の有利な効果を向上させるまたは治療部位に近接する宿主細胞の増殖または活性を増加させることを容易にすることができる。
【００８７】
特定の実施形態においては、１つ以上の抗原の発現を減少させるまたは排除し、その結果これらの細胞の免疫原性が低下するように、非ヒト心筋細胞系列細胞遺伝的に変化させることが望ましい。これは、例えば、非ヒト心筋細胞系列細胞をヒトに異種移植する場合に有用な可能性がある。
【００８８】
（ＥＳ分化心筋細胞系列細胞の使用）
本発明は、多数の心筋細胞系列の細胞を生成する方法を提供する。これらの細胞集団は、多くの重要な研究、開発および商業化目的に使用することができる。
【００８９】
（スクリーニング）
本発明の心筋細胞は、このような細胞およびこれらの種々の後代の特徴に影響する因子（例えば、溶剤、低分子薬、ペプチド類、オリゴヌクレオチド類）または環境条件（例えば、培養条件または操作）をスクリーニングするために商業的に使用することができる。
【００９０】
幾つかの用途において、霊長類多能性幹細胞（未分化または分化）は、成熟因子を後の段階の心筋細胞前駆体または最終分化細胞に促進させる因子をスクリーニングする、または長期間培養のこのような細胞の増殖および維持を促進するために使用される。例えば、候補成熟因子または増殖因子を、細胞の追加培養および使用に関する所望の基準により、様々なウェルの細胞に添加した後、得られた幾つかの表現型の変化を決定することにより分析する。
【００９１】
本発明のその他のスクリーニング用途には、心筋組織の維持または修復の効果に対して薬学的化合物を試験することが含まれる。スクリーニングは、化合物がこの細胞において医薬的効果を有するよう設計されている、または別の場所で効果を有するよう設計された化合物がこの組織型の細胞において意図しない副作用を有する恐れがあるかの何れかのために行われる。スクリーニングは、本発明のいつかの前駆体細胞または最終分化細胞を使用して行うことができる。
【００９２】
一般的に、標準的な文献であるＩｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７および米国特許第５０３００１５号を参照されたい。候補となる薬学的化合物の活性の評価には一般的に、本発明の分化細胞と候補化合物を単一または他の薬剤と併用の何れかで組み合わせることが含まれる。本研究者は、形態学、マーカー表現型または化合物に帰因する細胞の機能的活性（未処理の細胞または不活性化合物で処理した細胞を比較）の変化を測定し、次いで化合物の効果と認められた変化を関連付ける。
【００９３】
細胞毒性は、第一に、細胞生存能に対する影響、生存、形態および特定のマーカーおよび受容体の発現により測定することができる。染色体ＤＮＡに対する薬物の効果をＤＮＡ合成または修復を測定することに決定することができる。特に細胞サイクル中の不定期な回数または細胞複製に必要な濃度以上の［３Ｈ］−チミジンまたはＢｒｄＵ取り込みと、薬物効果は一致する。また、望ましくない影響として、中期分裂の広がりにより決定される、異常な割合の姉妹染色分体交換がある。詳細については、Ａ．Ｖｉｃｋｅｒｓ（ｐｐ３７５−４１０  ｉｎ  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９７）を参照されたい。
【００９４】
細胞機能の影響は、表現型または心筋細胞の活性、例えば、マーカー発現、受容体結合、収縮性活動または電気生理学を細胞培養またはｉｎ  ｖｉｖｏの何れかにて観察する幾つかの標準的な試験を使用して評価することができる。また、医薬的候補物質を収縮活動の影響、例えば、収縮の範囲または頻度の増減を見るために分析することができる。影響が認められた場合、有効量中央値（ＥＤ５０）を決定するために化合物の濃度を漸増することができる。
【００９５】
（動物試験）
本発明はまた、心筋細胞およびその前駆体を利用して、代謝機能の先天異常、疾患状態の影響または有意な外傷性障害の結果等、必要と感じる心筋組織の維持または修復を高める方法も提供する。
【００９６】
治療投与に対する細胞組成物の適切性を決定するために、初めに細胞を適切な動物モデルにおいて分析することができる。１濃度にて、細胞をｉｎ  ｖｉｖｏの表現型の生存能および維持能を評価する。細胞組成物を免疫不全動物（例えば、ヌードマウスまたは化学的または放射により免疫不全となった動物）に投与する。組織を再生期間後に採取し、多能性幹由来細胞が依然として存在しているかについて評価する。
【００９７】
これは、検出可能な標識（例えば、緑色蛍光タンパク質またはβガラクトシダーゼ）を発現する細胞、前標識されていた細胞（例えば、ＢｒｄＵまたは［３Ｈ］チミジン）を投与することにより、またはその後の構造的細胞マーカーの検出（例えば、ヒト特異的抗体を使用）により実施することができる。投与細胞の存在および表現型を、ヒト特異的抗体を使用した免疫組織化学若しくはＥＬＩＳＡ法または公式の配列データによりヒトポリヌクレオチドに特異的に増幅するプライマーおよびハイブリッド形成条件を使用するＲＴ−ＰＣＲにより評価することができる。
【００９８】
また、適切性は、心筋細胞系列細胞集団の処理の結果におこる心臓の回復の程度を評価することにより決定することができる。多くの動物モデルがこのような試験に利用可能である。例えば、心臓を、予備冷却したアルミニウム棒を左心室前壁の表面に接触して置くことにより凍結損傷させることができる（Ｍｕｒｒｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９８：２２０９，  １９９６；Ｒｅｉｎｅｃｋｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １００：１９３，  １９９９；米国特許第６０９９８３２号；Ｒｅｉｎｅｃｋｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．，  Ｅｐｕｂ  Ｍａｒ  ２００４）。  より大型の動物において、凍結損傷は、左心室前壁上に液体窒素で冷却した銅ディスクプローブ３０〜５０ｍｍを〜２０分間置くことによりなされる（Ｃｈｉｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．６０：１２，１９９５）。梗塞は、左冠動脈主幹部を結紮し（Ｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１００：１９９１，１９９７）、または徐々に膨張して動脈を塞ぐＡｍｅｒｏｉｄ社のコンストリクションデバイスを使用することにより誘発することがきできる。損傷部位は、本発明の細胞製剤で処置し、損傷領域の細胞の存在について心臓組織を組織学検査により調べる。心機能は、左心室拡張終期圧、心室圧、圧上昇率および減圧率等のパラメータを測定することによりモニターすることができる。
【００９９】
（ヒトにおける治療的使用）
十分に試験した後、本発明の分化細胞をヒト患者またはこのような治療が必要な他の試料の組織再構築または再生に使用することができる。細胞を目的の組織部位にグラフトまたは移動させ、機能的に不完全な領域を再生する様式で投与する。特別なデバイスを、直接心機能を再構築することが可能な細胞を所望の部位にて心臓腔、心膜または心筋内部に投与するために使用することが可能である。
【０１００】
所望する場合、心筋細胞系列細胞の同種移植を受ける患者は、移植細胞の免疫拒絶を減少させるよう治療することができる。検討した方法には、シクロスポリンＡ等の従来の免疫抑制薬の投与（Ｄｕｎｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｒｕｇｓ  ６１：１９５７，２００１）または多能性幹由来細胞の適合集団を使用することによる免疫耐性の誘発（ＷＯ  ０２／４４３４３；米国特許第６２８０７１８号；ＷＯ  ０３／０５０２５１）がある。他の手法は、心筋細胞系列細胞集団を使用して、試料に移植した細胞により生成される尿酸量を例えばアロプリノールで処置することにより減少させることがある。別法または併用して、予め患者にアロプリノールまたは尿酸を代謝する酵素、例えば尿酸酸化酵素を投与する（ＰＣＴ／ＵＳ０４／４２９１７）。
【０１０１】
本発明における再生薬の投与に適した患者は、種々の急性および慢性心疾患、例えば冠状心疾患、心筋症、心内膜炎、先天性心血管障害および先天性心不全を有する患者である。治療の効能は、臨床的に認められた基準、例えば、瘢痕組織の占める面積の減少若しくは瘢痕組織の再血管新成並びに狭心症の頻度および重度、または心室圧、収縮期圧、拡張終期圧、Δ圧／Δ時間、患者の運動性および生活の質の改善によりモニターすることができる。
【０１０２】
本発明の心筋細胞系列細胞は、ヒト投与のために十分に滅菌した状態下において調製された等張性賦形剤を含む、薬学的組成物の形態で供給することができる。分化工程は、心臓体である細胞を培養することを含む場合、プロテアーゼを使用してまたはゆっくりとした機械的操作により細胞を単一細胞または小細胞群の懸濁液に分散させることが望ましい。移植下で細胞の死滅の恐れを減少させるため、細胞を熱衝撃により処置し、または投与の約２４時間前に約０．５Ｕ／ｍＬのエリスロポイエチンにて培養することができる。
【０１０３】
医薬品配合の一般的な原則において、Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，ｂｙ  Ｇ．Ｍｏｒｓｔｙｎ  ＆  Ｗ．Ｓｈｅｒｉｄａｎ  ｅｄｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６；およびＨｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｅ．Ｄ．Ｂａｌｌ，Ｊ．Ｌｉｓｔｅｒ  ＆  Ｐ．Ｌａｗ，Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，２０００を参照する。投与に使用する経路およびデバイスにより、細胞賦形剤および幾つかの組成物の付随要素を選択する。また、この組成物は、心筋細胞系列細胞を移植し、または機能的に運動させることが容易な１つ以上の他の成分を含むまたはこれを伴うことができる。適切な成分には、心筋細胞系列細胞の付着を支持または促進するマトリックスタンパク質類または相補的細胞型、特に内皮細胞類がある。
【０１０４】
また、本発明は、製造、販売または使用中の如何なる時点において存在する１組の細胞または細胞の組み合わせからなる試薬系を含む。細胞組は、本開示内容に記載の複数の細胞集団の組み合わせを含み、例として、未分化の霊長類多能性幹細胞または他の分化細胞型を組み合わせ、多くの場合、同じゲノムを共有する分化多能性幹由来細胞型（心筋細胞類、心筋細胞前駆体、心臓体等）であるが、これらに限定されない。この組の各細胞型は、一緒にまたは別の容器に、同じ施設内または別の場所において、同時間または異なる時間に仕事上の関係を共有する同じ事業体または異なる事業体の管理下において包装することができる。
【０１０５】
本発明の薬学的組成物は、場合により所望の目的、例えば、心筋細胞の疾患状態または心筋異常を改善するために心筋細胞系列細胞の機能の再構築を記載した使用説明書を適切な容器に包装することができる。
【０１０６】
本発明の細胞を、ｃＤＮＡライブラリの生成するために使用することができ、このｃＤＮＡライブラリは他の系列の細胞内に発現したｃＤＮＡに比較的汚染されていないことが好ましい。例えば、心筋細胞系列細胞を１，０００ｒｐｍにて５分間の遠心分離により収集後、ｍＲＮＡを調製し逆転写する。心筋細胞系列細胞の発現パターンを、マイクロアレイ分析により他の細胞型と比較することができる。一般的に、Ｆｒｉｔｚ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８：３１６，２０００；“Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｂｉｏｃｈｉｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，  Ｌ  Ｓｈｉ，  ｗｗｗ．Ｇｅｎｅ−Ｃｈｉｐｓ．ｃｏｍに総説されている。
【０１０７】
また、本発明の分化細胞を使用して、心筋細胞系列細胞のマーカーに特異的な抗体を生成することができる。ポリクローナル抗体を、免疫原性の形態において、本発明の細胞を脊椎動物に注入することにより生成することができる。モノクローナル抗体の生成は、Ｈａｒｒｏｗ  ＆  Ｌａｎｅ  （１９８８）、米国特許第４４９１６３２号、第４４７２５００号および第４４４４８８７号およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ７３Ｂ：３  （１９８１）のような標準的な参照文献に記載されている。
【０１０８】
本出願に記載の全ての刊行物および特許は、如何なる目的においても参考として本明細書に組み入れられている。
【実施例】
【０１０９】
（実施例１）
ゼラチン／ＦＢＳにおける３因子分化
ゼラチン／ＦＢＳ被覆表面の調製：ゼラチン０．５％溶液１ｍＬ／ウェルを６−ウェルプレートのウェルに添加し、３７℃にて一晩インキュベートした。ゼラチン溶液を除去し、十分な２０％ＦＢＳ含有培地（例えば、２０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）含有ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ＤＭＥＭ）をウェルの表面を被覆するよう添加した。プレートを３７℃にてさらに５〜６時間インキュベートした。ヒト胚性幹細胞を添加する前に培地をウェルから除去した。
【０１１０】
その後の分化のための未分化ヒト胚性幹細胞のプレーティング：未分化ヒト胚性幹細胞６ウェル中１ウェルをａ）培地を除去し、ｂ）ウェルをＰＢＳにて１回洗浄し、ｃ）０．２５％トリプシン／５００ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液１ｍＬを添加することにより分離した。ウェルを３７℃にて１０分間インキュベートした後、１ｍＬピペットで１０回粉砕した。細胞が完全に分離していることを確かめるため、ウェルを顕微鏡下で調べた。２０％ＦＢＳ含有培地２ｍＬ（例えば、２０％ＦＢＳ含有ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ＤＭＥＭ）を添加し、トリプシンを不活性化した。分離した細胞を計数し、この細胞数を使用して、所望の密度にて残りのウェルから得られた細胞をプレートに入れた。
【０１１１】
培地を残りのウェルから除去した。コラゲナーゼ２０単位／ｍＬ溶液をウェル（１ｍＬ／ウェル）に添加した。ウェルを３７℃にて１０分間インキュベートし、コラゲナーゼ溶液を除去した。ＭＥＦ馴化培地１ｍＬ＋ｂＦＧＦ８ｎｇ／ｍＬをウェルに添加した。ウェルを細胞が（小細胞群に）分離するまで５ｍＬピペットでこすり、さらに粉砕しなかった。細胞を所望の密度に希釈し、上記のように調製した６ウェルプレートに入れた（この場合、１ウェル当たり５ｍＬ中の細胞は６７０，０００個であり、３ウェルを入れた）。ＥＳ細胞を、消耗した培地を除去し、新しいＭＥＦ−ＣＭ＋ｂＦＧＦ８ｎｇ／ｍＬに入れ換えることにより毎日再追加した（細胞を木曜日に入れるため、土曜日の追加は、一般的に省略した）。
【０１１２】
増殖因子処理：上記のように成長６日後に、細胞の培地を除去し、ＲＰＭＩ＋１Ｘ  Ｂ２７補給剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋アクチビンＡ５０ｎｇ／ｍＬ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）に入れ換えた。１８〜２４時間後、培地を除去し、ＲＰＭＩ＋１Ｘ  Ｂ２７補給剤＋ＢＭＰ−４  ５０ｎｇ／ｍＬ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）に入れ換えた。ＢＭＰ−４含有培地を加えて合計４日後、培地を除去し、アクチビンまたはＢＭＰを含まないＲＰＭＩ＋１Ｘ  Ｂ２７補給剤＋ＩＧＦ−１  ５０ｎｇ／ｍＬ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）に入れ換えた。培養を、消耗した培地を除去し、アクチビンおよびＢＭＰを含まない新鮮なＲＰＭＩ＋１Ｘ  Ｂ２７補給剤＋ＩＧＦ−１  ５０ｎｇ／ｍＬに入れ替えることにより、２〜３日毎に再追加した。
【０１１３】
多くの細胞の拍動群がアクチビンＡを添加後約１２日目から認められた。アクチビンＡを添加２４日後に細胞を計数し（６ウェルプレート中合計３ウェルからの細胞９１０万個）、以下の工程において、心臓トロポニンＩ発現に対してＦＡＣＳ分析を行った：
ＦＡＣＳ分析：培地を吸着により培養物から除去した。ウェルをカルシウム／マグネシウム非含有ＰＢＳ５ｍＬで１回洗浄した。１ウェル当たり０．２５％トリプシン／５００ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液０．５ｍＬを添加し、細胞を３７℃にて２０分間インキュベートした。細胞を単一細胞懸濁液が得られるまでピペットで粉砕した。トリプシン消化は、２０％ＦＢＳ含有培地１ｍＬ（２０％ＦＢＳ含有ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ＤＭＥＭ）を添加することにより停止した。細胞濃度を計数により評価し、約５００，０００個の細胞を染色毎に分類した（ＥＭＡ、アイソタイプ、ｃＴｎＩ、ｃＴｎＩ＋ＥＭＡ；各々１５ｍＬコニカルチューブ）。
【０１１４】
細胞を入れたチューブを４００×ｇ、５分間の遠心分離にかけた。培地を吸引し、細胞ペレットを染色緩衝液（ＰＢＳ＋１％熱不活性化ヤギ血清および０．１％アジ化ナトリウム）１ｍＬに再懸濁した。ＥＭＡ染色において、細胞にＥＭＡを加えて最終濃度５μｇ／ｍＬにした。これらのサンプルを氷上、暗室にて１５分間インキュベートした後、上記のようにペレット化した。ＥＭＡ処理したサンプルをＰＢＳ５００μＬに再懸濁し、１０分間光に暴露した。ＥＭＡ処理したサンプルに４％パラホルムアルデヒド５００μＬを加え、暗室、室温にて１５分間インキュベートした。ＥＭＡを加えなかったが、その後に抗体染色したサンプルを上記のようにペレット化し、ＰＢＳ５００μＬに再懸濁した後、４％パラホルムアルデヒド５００μＬを加え、暗室、室温にて１５分間インキュベートした。
【０１１５】
全てのサンプルを上記のようにペレット化し、ＰＢＳ１００μＬに再懸濁した。次に全てのサンプルに氷冷１００％メタノール９００μＬを加え、氷上にて３０分間インキュベートした。全てのサンプルに染色緩衝液１ｍＬ（ＰＢＳ＋１％熱不活性化ヤギ血清および０．１％アジ化ナトリウム）を加え、上記のようにペレット化した。上清を吸引し、細胞を約５００，０００個／５０μＬの密度でブロッキング用緩衝液（ＰＢＳ＋２０％正常ヤギ血清および０．１％アジ化ナトリウム）に再懸濁した。サンプルを４℃にて１０〜１５分間インキュベートした。各染色サンプルにおいて、少量の細胞５０μＬを１２×７５ｍｍポリスチレンチューブそれぞれに分注した。染色した各サンプルに心臓トロポニンＩ抗体（Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）またはアイソタイプ対照（チューブ当たりの最終の抗体量は、１．２μｇ）のどちら５０μＬを加えた。サンプルを４℃にて３０分間インキュベートした。
【０１１６】
染色緩衝液２ｍＬを添加後、サンプルを上記のようにペレット化した。この洗浄工程を繰り返した。２回目の洗浄上清を除去した後、サンプルを二次抗体（アレクサ４８８で標識したヤギ抗マウスＩｇＧの分子プローブ）０．２５μｇ含有ＰＢＳ中５％正常ヤギ血清５０μＬに再懸濁した。サンプルを４℃の暗室にて３０分間インキュベートし、染色緩衝液２ｍＬを添加して洗浄し、上記のようにペレット化した。上清をデカントし、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ  ｍａｃｈｉｎｅのフローを得るため、サンプルを染色緩衝液３００μＬ中に再懸濁した。
【０１１７】
本実験において、総細胞数の５４．４９％がトリプシン処理後、生存可能であった。これらの生存可能な細胞のうち、細胞の２４．６７〜２７．３６％を心筋細胞サルコメアタンパク質心臓トロポニンＩに対する抗体で染色した。これらの結果を図１に示す。
【０１１８】
（実施例２）
マトリゲル被覆表面における３因子直接分化
増殖因子減少型マトリゲルのアリコート（予め、冷Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ＤＭＥＭで１：２に希釈し、−２０℃で保存）。マトリゲル溶液をさらに冷Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ＤＭＥＭで１：１５に希釈した。６ウェルプレート中の空のウェルに希釈マトリゲル溶液１ｍＬ／ウェルを被覆し、プレートを室温で４〜５時間インキュベートした。マトリゲル溶液を除去した後、ヒトＥＳ細胞を、ウェルを前洗浄することなく以下のようにプレートに入れた。
【０１１９】
その後の分化のための未分化ｈＥＳ細胞のプレーティング：１）未分化ｈＥＳ細胞６ウェル中１ウェルの細胞をａ）培地を除去し、ｂ）ウェルをＰＢＳにて１回洗浄し、ｃ）０．０５％トリプシン／５００ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液１ｍＬを添加して分離した。ウェルを３７℃にて１０分間インキュベートした。細胞が完全に分離するまで細胞をピペットで粉砕した。２０％ＦＢＳ含有培地２ｍＬ（例えば、２０％ＦＢＳ含有ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ＤＭＥＭ）を添加してトリプシンを不活性化した。分離した細胞を計数し、この細胞数を使用して、所望に密度にて残りのウェルから得られた細胞をプレートに入れた。
【０１２０】
培地を残りのウェルから除去した。コラゲナーゼ（２００単位／ｍＬ）溶液を１ｍＬ／ウェル添加し、ウェルを３７℃にて１０分間インキュベートした。コラゲナーゼ溶液を除去し、ＭＥＦ馴化培地＋ｂＦＧＦ８ｎｇ／ｍＬを添加した。ウェルを細胞が（小細胞群に）分離するまでピペットでこすり、さらに粉砕しなかった。細胞を所望の密度に希釈し、上記のように調製した６ウェルプレートに入れた（１ウェル当たり５ｍＬ中の細胞１８５万個）。プレートに入れたｈＥＳ細胞を、消耗した培地を除去し、新しいＭＥＦ−ＣＭ＋ｂＦＧＦ８ｎｇ／ｍＬに入れ換えることにより毎日（但し、２日目はない）追加した。
【０１２１】
増殖因子処理：上記のように成長６日後に、細胞の培地を除去し、ＲＰＭＩ＋１Ｘ  Ｂ２７補給剤＋アクチビンＡ５０ｎｇ／ｍＬに入れ換えた。１８〜２４時間後、培地を除去し、アクチビンＡを含まないＲＰＭＩ＋１Ｘ  Ｂ２７補給剤＋ＢＭＰ−４  ５０ｎｇ／ｍＬに入れ換えた。ＢＭＰ−４含有培地を加えて合計４日後、培地を除去し、アクチビンまたはＢＭＰを含まないＲＰＭＩ＋１Ｘ  Ｂ２７補給剤＋ＩＧＦ−１  ５０ｎｇ／ｍＬに入れ換えた。培養を、消耗した培地を除去し、アクチビンまたはＢＭＰを含まない新鮮なＲＰＭＩ＋１Ｘ  Ｂ２７補給剤＋ＩＧＦ−１  ５０ｎｇ／ｍＬに入れ替えることにより、２〜３日毎に再追加した。
【０１２２】
拍動細胞は、アクチビンＡを添加後１０〜１２日目に認められた。２１日目に、細胞を計数し、以下に記載の通り、心臓トロポニンＩ発現をＦＡＣＳにより分析した。
【０１２３】
ＦＡＣＳ分析：培地を吸着により培養物から除去した。ウェルをカルシウム／マグネシウム非含有ＰＢＳ５ｍＬにて１回洗浄した。１ウェル当たり０．２５％トリプシン／５００ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液１ｍＬを添加し、細胞を３７℃にて５分間インキュベートした。トリプシン中の分離細胞を１５ｍＬコニカルチューブに移し、３７℃にて１５〜２０分間さらにインキュベートした。細胞を単一細胞懸濁液が得られるまでピペットで粉砕した。トリプシン消化は、２０％ＦＢＳ含有培地（２０％ＦＢＳ含有ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ＤＭＥＭ）２ｍＬを添加することにより停止した。細胞濃度を計数により評価し、約５００，０００個の細胞を染色毎に分類した（ＥＭＡ、アイソタイプ、ｃＴｎＩ、ｃＴｎＩ＋ＥＭＡ；各々１５ｍＬコニカルチューブ）。細胞を入れたチューブを４００×ｇ、５分間の遠心分離にかけた。培地を吸引し、細胞ペレットを染色緩衝液１ｍＬに再懸濁させた（ＰＢＳ＋２％熱不活性化ウシ胎仔血清および０．１％アジ化ナトリウム）。ＥＭＡ染色において、細胞にＥＭＡを加えて最終濃度５μｇ／ｍＬにした。これらのサンプルを氷上、暗室にて１５分間インキュベートした後、上記のようにペレット化した。ＥＭＡ処理したサンプルをＰＢＳ１ｍＬに再懸濁させ、１０分間光に暴露した。ＥＭＡ処理したサンプルに４％パラホルムアルデヒド１ｍＬを加え、暗室、室温にて１５分間インキュベートした。ＥＭＡを加えなかったが、その後に抗体染色したサンプルを上記のようにペレット化し、ＰＢＳ５００μＬに再懸濁した後、４％パラホルムアルデヒド５００μＬを加え、暗室、室温にて１５分間インキュベートした。全てのサンプルを上記のようにペレット化し、ＰＢＳ１００μＬに再懸濁した。
【０１２４】
次に全てのサンプルに氷冷１００％メタノール９００μＬを加え、氷上にて３０分間インキュベートした。全てのサンプルに染色緩衝液１ｍＬ（ＰＢＳ＋２％熱不活性化ウシ胎仔血清およびラット抗マウスＦｃブロック（ＢＤ）０．２μｇ／０．５×１０６個）を加え、上記のようにペレット化した。上清液を吸引し、細胞を約５００，０００個／１００μＬの密度にてブロッキング用緩衝液（ＰＢＳ＋２０％正常ヤギ血清および０．１％アジ化ナトリウム）に再懸濁した。サンプルを４℃にて１０〜１５分間インキュベートした。各染色サンプルにおいて、１００μＬの少量の細胞を１２×７５ｍｍポリスチレンチューブそれぞれに分注した。染色した各サンプルに心臓トロポニンＩ抗体（Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）またはアイソタイプ対照（チューブ当たりの最終の抗体量は、１．２μｇ）の何れか２０μＬを加えた。サンプルを４℃にて３０分間インキュベートした。  染色緩衝液４ｍＬを添加後、サンプルを上記のようにペレット化した。
【０１２５】
２回目の洗浄上清液を除去した後、サンプルを二次抗体（アレクサ６４７で標識したヤギ抗マウスＩｇＧの分子プローブ）０．２５μｇ含有ＰＢＳ中５％正常ヤギ血清５０μＬに再懸濁した。サンプルを暗室、４℃にて３０分間インキュベートし、染色緩衝液４ｍＬを添加して洗浄し、上記のようにペレット化した。上清液をデカントし、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ  ｍａｃｈｉｎｅのフローを得るため、サンプルを染色緩衝液３００μＬ＋０．５％パラホルムアルデヒド中に再懸濁した。結果を、Ｆｌｏｊｏソフトウェアを使用して分析した。この実験において、総細胞数の６９％がトリプシン分離後に生存可能であった。これらの生存可能な細胞のうち、８．９％が心筋細胞特異的タンパク質心臓トロポニンＩに対する抗体に染色した（図２を参照）。
【０１２６】
（実施例３）
４相遠心分離法の富化の実施例
心筋細胞は、４日間の胚様体形成により、Ｈ７株のｈＥＳ細胞から発生し、次いで、１７日間ゼラチン被覆プレートにおいて増幅させた（５−アザ−デオキシ−シチジンおよび増殖因子を使用しなかった）。次いで、細胞を、コラゲナーゼＢを使用して分離し、分化培地に再懸濁した。次いで細胞懸濁液をパーコール不連続勾配に層状に重ね、１，５００ｇ、３０分間遠心分離した。以下の４つの画分を収集した：Ｉ、上部の界面；ＩＩ、４０．５％層；ＩＩＩ、下部の界面；ＩＶ、５８．５％層。細胞を洗浄し、分化培地に再懸濁した。免疫染色のための細胞を１ウェル当たり細胞１０４個にてチャンバースライドに播種し、２または７日間培養し、その後固定し染色した。
【０１２７】
結果を図３に示す。ＭＨＣ陽性細胞の割合を、各画分用に３回のウェルからの３０画像の細胞を計数することにより決定し、３つのウェルの細胞の平均±標準偏差で表した。
【０１２８】
【表３】
0005560393.tif 000002
拍動細胞は全画分中に認められたが、画分ＩＩＩおよびＩＶが最も高い割合を含んだ。
【０１２９】
間接免疫細胞化学により決定した場合の細胞の表現型を表４に示す。
【０１３０】
【表４】
0005560393.tif 000003
密度勾配遠心分離により分離した心筋細胞集団をｃＴｎＩおよびＭＨＣ染色により分類することができた。ミオゲニン、αフェトプロテインまたはβチューブリンＩＩＩが染色しなかったことは、骨格筋、内胚細胞型およびニューロンが存在しなかったことを示す。ＳＳＥＡ−４およびＴｒａ−１−８１染色が少なかったことにより、未分化ｈＥＳ細胞が存在しなかったことを確認した。
【０１３１】
α平滑筋アクチン（ＳＭＡ）は、胚および胎児心筋細胞に存在するが、成人心筋細胞に存在しないことが報告されている（Ｌｅｏｒ，  ａｌ．，  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９７：Ｉ１３３２，  １９９６；Ｅｔｚｉｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．  ３３：１３２１，  ２００１）。事実上、心筋細胞分化プロトコルにおいて得られたｃＴｎＩ陽性細胞全ておよびｃＴｎＩ陰性細胞のサブセットは、ＳＭＡに陽性であり、これらは、初期段階であり、増殖の可能性があることを示唆する。
【０１３２】
画分ＩＩＩおよびＩＶの細胞を再度プレートに入れてさらに２日間培養した。ＭＨＣ陽性細胞の４３±４％がＢｒｄＵを発現し、これらは、細胞サイクルのＳ期にあることを示した。他の実験において、ｃＴｎＩ陽性細胞のサブセットは、Ｋｉ−６７を発現することが認められた。これらの結果は、集団中の心筋細胞の約２０％または４０％が活動性増殖を行っていることを示す。
【０１３３】
（実施例４）
心臓体生成による収縮細胞の富化の実施例
この実施例は、心臓体である心筋細胞群のその後の培養により治療による使用および他の目的に望ましい特徴を有する細胞に富化することについて説明する。
【０１３４】
Ｈ７株の未分化ｈＥＳ細胞を入れた２２５ｃｍ２フラスコ３つを使用して既述のように胚様体を発生させた。各フラスコのＥＢを培地７５ｍＬに再懸濁し、付着の弱い６ウェルプレート３つ（１ウェル当たり細胞懸濁液４ｍＬ）に移し、懸濁液中のＥＢをいれたプレートを合計９つ精製した。ＥＢは、懸濁１日後に、新たに形成したＥＢを５０ｍＬコニカルチューブに移し（１チューブ当たり１プレート）、ＥＢを撹拌することなく室温にて１０〜２０分間静置した後、培地を除去し、新鮮な培地（チューブ当たり２５ｍＬ）に入れ換えることにより再追加した。
【０１３５】
ＥＢをもとの接着の弱いプレートに戻し、さらに３日間２０％ＦＢＳ含有培地の懸濁液に維持した後、ゼラチン被覆した２２５ｃｍ２組織培養フラスコの合計３つに移した。ゼラチン被覆したフラスコに移した２日後、培地を除去し、各フラスコに２０％ＦＢＳ含有培地７５ｍＬを再追加した。同様の再追加を８日目、１１日目、１３日目、１５日目および１８日目に行った。分化培養をブレンザイム（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ［ドイツ  ペンツベルグ］）で分離し、既述のようにパーコール不連続勾配において分画した。画分ＩＶ（高密度画分）を回収し、計数し、約３．７×１０６個の単一細胞および小細胞群を生成した。
【０１３６】
画分ＩＶ細胞を約６．５ｍＬの２０％ＦＢＳ含有培地に再懸濁し、１５ｍＬコニカルチューブに移し、撹拌せずに室温にて１０分間静置した。培地（細胞２．８×１０６個含有、これは大部分の単一細胞）を除去し、新鮮な培地を入れ換えた。細胞懸濁液を単一の接着の低い６ウェルプレート（１ウェル当たり細胞懸濁液〜４ｍＬ）に移した。ＣＢを同様な様式（５０ｍＬチューブに移し、１０分間静置し、培地を除去し、入れ換える）にて４８時間毎に再追加した。
【０１３７】
図３は、実時間ＰＣＲにより測定したサルコメア遺伝子αＭＨＣおよび心臓トロポニンＩの発現を示す。ゼラチン培養２０日後の発現に対して、パーコールによる細胞の分離により、画分ＩＶ細胞の発現が２〜５倍に増加した。単一細胞を除去し、細胞群を回収することにより、発現が５〜２０倍に増加した。心臓体である細胞を培養して８日後、発現は、分離していない細胞に比べて１００〜５００倍であった。
【０１３８】
ＣＢをゼラチンまたはマトリゲルに再び入れる場合、細胞群は付着、平面化し、広い範囲の自然な収縮細胞を生成する。動物試験に使用において、心臓体を直接埋め込み、または単一細胞の懸濁液に分散することができる。
【０１３９】
（実施例５）
Ｈ７ｈＥＳ細胞の分化を実施例１のように行った。但し、分化は６ウェルプレートの代わりに２４ウェルプレートにて行い、因子量はウェル当たり１ｍＬであった。さらに、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４を２５ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬおよび１００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用した。各濃度で３回行った。図４は、対照の相対的倍率として表し、これはアクチビン、ＢＭＰまたはＩＧＦ−Ｉを添加しないプロトコルを実施した。また、ＢＭＰ−２は分化プロトコルにおいて効果があったことが認められた。
【０１４０】
（実施例６）
Ｈ７ｈＥＳ細胞が密集する６ウェルプレートをＰＢＳ２ｍＬで洗浄した。次いで、ＰＢＳ中０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液２ｍＬを各ウェルに添加し、プレートを１０分間、３７℃でインキュベートした。ＥＤＴＡ溶液をマウス胚繊維芽細胞馴化培地（ＭＥＦ−ＣＭ）１ｍＬ＋ｂＦＧＦ８ｎｇ／ｍＬ（「培地Ａ」）に入れ換えた。未分化ＥＳ細胞を２〜３回ピペットで分離した後、培地Ａ中の細胞４００，０００個／ウェルにて２４ウェルプレートに播種した。細胞を２日間３７℃でインキュベートした。
【０１４１】
ｈＥＳ細胞の分化を誘発するため、培地Ａを２４ウェルプレートの１ウェル当たりＢ２７：ＲＰＭＩ（１：５０）（共にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎの試薬）０．５ｍＬ＋アクチビンＡ１００ｎｇ／ｍＬ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｅｓ）（「培地Ｂ」）に入れ換えた。細胞を２４時間インキュベートした。次いで、培地Ｂを２４ウェルプレートの１ウェル当たりＢＭＰ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｅｓ）１０ｎｇ／ｍＬ＋１：５０のＢ２７：ＲＰＭＩ１ｍＬ（培地Ｃ）に入れ換えた。細胞を４日間インキュベートした。
【０１４２】
培地Ｃを２４ウェルプレートの１ウェル当たり１：５０のＢ２７：ＲＰＭＩ１ｍＬに入れ換え、プレートを１５日間インキュベートした。得られた細胞を実施例２のようにＦＡＣＳ分析した。但し、細胞を０．２５％トリプシン／５００ｍＭ  ＥＤＴＡ溶液に実施例２で使用した２０分のかわりに５分間インキュベートした。細胞の約３６％がｃＴｎＩを発現した。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１Ａ】実施例１に記載の方法に従って、Ｈ７細胞をゼラチンおよびＦＢＳで被覆したウェルに入れた後、分化した。最初にアクチビンを添加してから２４日後に、培養液をトリプシン−ＥＤＴＡにより分離し、固定・透過した後、心臓トロポニンＩに対する抗体で染色した。固定前に細胞をＥＭＡでインキュベートし、死亡細胞（ＥＭＡを取り込んだ細胞）から生存細胞（ＥＭＡを排除した細胞）を分類した。試料をＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒで分析し、死亡細胞を分析から除外した。この実験では、約５４％の細胞がトリプシン分離から生き残り、これらの生存細胞の２４〜２７％が、心臓トロポニンＩ特異的抗体で標識することにより測定した場合に心筋細胞であった。２枚の画像では、２つの異なるゲート法を使用した（図１Ａ：棒グラフおよび図１Ｂ：散布図）。心筋細胞の割合は、何れの方法でも類似していた。
【図１Ｂ】実施例１に記載の方法に従って、Ｈ７細胞をゼラチンおよびＦＢＳで被覆したウェルに入れた後、分化した。最初にアクチビンを添加してから２４日後に、培養液をトリプシン−ＥＤＴＡにより分離し、固定・透過した後、心臓トロポニンＩに対する抗体で染色した。固定前に細胞をＥＭＡでインキュベートし、死亡細胞（ＥＭＡを取り込んだ細胞）から生存細胞（ＥＭＡを排除した細胞）を分類した。試料をＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒで分析し、死亡細胞を分析から除外した。この実験では、約５４％の細胞がトリプシン分離から生き残り、これらの生存細胞の２４〜２７％が、心臓トロポニンＩ特異的抗体で標識することにより測定した場合に心筋細胞であった。２枚の画像では、２つの異なるゲート法を使用した（図１Ａ：棒グラフおよび図１Ｂ：散布図）。心筋細胞の割合は、何れの方法でも類似していた。
【図２】実施例２に記載の方法に従って、Ｈ７細胞をマトリゲルで被覆したウェルに入れた後、分化した。最初にアクチビンを添加してから２１日後に、培養液をトリプシン−ＥＤＴＡにより分離し、固定・透過した後、心臓トロポニンＩに対する抗体で染色した。固定前に細胞をＥＭＡでインキュベートし、死亡細胞（ＥＭＡを取り込んだ細胞）から生存細胞（ＥＭＡを排除した細胞）を分類した。試料をＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒで分析し、死亡細胞を分析から除外した。この実験では、約６９％の細胞がトリプシン分離から生き残り、これらの生存細胞の８．９％が、心臓トロポニンＩ特異的抗体で標識することにより測定した場合に心筋細胞であった。
【図３】図３は、４つの各パーコール画分から形成される心臓体において測定したｃＴｎＩの発現量を示す。未分化ｈＥＳ細胞を陰性対照として使用する。心臓体として画分ＩＶの細胞を培養することにより、αＭＨＣまたはｃＴｎＩの発現量を１００〜５００倍に富化した。
【図４】図４は、異なる濃度のＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４を使用してｈＥＳ細胞の分化から得られた細胞集団におけるαＭＨＣの発現量を示す。
【図１Ａ】
0005560393.tif 000004
【図１Ｂ】
0005560393.tif 000005
【図２】
0005560393.tif 000006
【図３】
0005560393.tif 000007
【図４】
0005560393.tif 000008