(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２または６と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリエステラーゼタンパク質。
【請求項２】
配列番号４、７、８または９のアミノ酸配列を含む請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
配列番号２、４または６と少なくとも９５％または９８％の配列同一性を有する請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
少なくともクチナーゼもしくはスベリナーゼの活性またはその両方を有する請求項１に記載タンパク質。
【請求項５】
さらにリパーゼ活性を有する請求項４に記載のタンパク質。
【請求項６】
コプリナス・シネレウスに由来する請求項１に記載のタンパク質。
【請求項７】
Ｃ．シネレウスに由来し、配列番号２、４、６、７、８または９に対応するアミノ酸配列を含む請求項６に記載のタンパク質。
【請求項８】
以下から成る群から選択される単離されたポリヌクレオチド：
ａ）配列番号１、３または５のヌクレオチド配列または請求項１に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
ｂ）ａ）の相補鎖；および
ｃ）遺伝暗号の結果として、ａ）またはｂ）の何れか１つに対して縮重する配列。
【請求項９】
請求項８に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１０】
請求項９に記載のベクターを形質転換された、遺伝的に改変された微生物。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリエステラーゼタンパク質を製造するための方法であって、請求項８に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを微生物に形質転換すること、前記ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下で前記形質転換した微生物を培養すること、および前記発現したタンパク質を回収することを含む方法。
【請求項１２】
前記ポリヌクレオチドが、コプリナス・シネレウスに由来し、トリコデルマ、サッカロマイセス、ピキア、アスペルギルスおよび細菌から成る群から選択される宿主において発現する請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドが、コプリナス・シネレウスに由来し、Ｔ．リーゼイにおいて発現する請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載のタンパク質を含む酵素製剤。
【請求項１５】
クチン、スベリンまたはその他のポリエステルを加水分解する方法であって、クチン、スベリンまたはその他のポリエステルを含む材料を、前記ポリエステルの部分的または完全な加水分解が可能な条件下にて請求項１に記載のタンパク質で処理することを含む方法。
【請求項１６】
農業原料もしくは食品原料または野菜、果実、液果もしくは穀類から得られた副産物を、前記タンパク質で処理することを含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
木材原料、パルプおよび紙製品、または加工廃棄物もしくは水または副産物を、前記タンパク質で処理することを含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
合成もしくはその他の人工ポリエステル繊維または織物を、前記タンパク質で処理することを含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
洗濯および食器からの粘着物または脂肪を、前記タンパク質によって除去することを含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
クチンまたはスベリンを前記タンパク質によって脱重合することを含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
食品産業、パルプおよび紙産業、織物工業における、または洗濯および食器洗いの用途における、または化学合成における、請求項１に記載のタンパク質または請求項１４に記載の酵素製剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のエステラーゼに関し、より具体的にはクチナーゼおよび／またはスベリナーゼ活性を有するポリエステラーゼタンパク質に関する。前記酵素は、真菌コプリナス属またはトリコデルマ属から得られてよい。本発明はまた、前記タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチドに関し、ポリヌクレオチドを含むベクターおよび遺伝的に改変された微生物に関し、並びに前記タンパク質を製造する方法に関する。さらにまた、本発明は、ポリエステラーゼタンパク質を含む酵素製剤に関し、タンパク質または製剤の使用に関する。最終的に、本発明は、前記ポリエステラーゼを使用する、クチンおよび／またはスベリンまたはその他のポリエステルの加水分解の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クチナーゼおよびスベリナーゼは、植物性ポリエステルワックス、すなわちクチンおよびスベリンを分解または部分的脱重合することができるポリエステラーゼである。著しい量のクチン／スベリンが、様々な農業原料および森林原料および副産物、例えばカバノキの樹皮、およびコルク、液果、穀類、野菜およびそれらの加工された副産物中に存在する。植物原料におけるこれらのワックスの存在は、その疎水的特徴および頑強な構造のために、植物原料の産業的加工の障害となる可能性がある。
【０００３】
ポリエステルの修飾は、幾つかの天然の材料の加工および利用を促進し、加工処理した共産物（ｃｏ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の廃棄または廃棄物を減少させる。これらの廃棄物画分は、より価値ある化合物の供給源として使用できる可能性があり、たとえば、スベリンに基づくオリゴエステルは潤滑剤および結合剤の潜在的な原料となりうる。ポリエステラーゼの使用は、幾つかの植物材料、例えば穀類、果実、野菜および液果の加工および利用を促進し、また、これらの原材料から価値ある生理活性および機能性成分の放出および回収を促進する。
【０００４】
天然資源の持続的使用および廃棄物の管理は、廃棄物の生成の最小化に寄与する。化学的および物理的加工との相乗作用による酵素の使用は、廃棄物共産物に価値を付与する環境に優しい手段である。クチナーゼ／スベリナーゼは、また、例えば洗濯および食器洗いの用途において脂肪を除去するために使用でき、ならびに、コットンバイオスコアリング（ｃｏｔｔｏｎ  ｂｉｏｓｃｏｕｒｉｎｇ）および人工ポリエステル繊維の表面修飾に使用できる。
【０００５】
脂質およびワックスは、様々な工業製品およびリグノセルロース残留物中の豊富な構成成分であるものの、従来のリパーゼのほかに、脂質改変酵素の限定的なセットのみしか商業的に利用できない。クチナーゼおよびスベリナーゼは、従来のリパーゼによって加水分解することのできない、天然の脂質およびワックスの改変のための潜在的な酵素とみなされている。
【０００６】
植物／動物病原菌フサリウム・ソラニ種ピシ由来のクチナーゼは今まで最も研究されたクチナーゼであるが（Ｃａｒｖａｌｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）、クチナーゼは、アルタルナリア・ブラシコラ（Ｔｒａｉｌ  ａｎｄ  Ｋｏｌｌｅｒ，  １９９３）、ボトリティス・シネレア（Ｇｉｎｄｒｏ  ａｎｄ  Ｐｅｚｅｔ  １９９９）、ベンチュリア・イナエクアリス（Ｋｏｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｅｒ，  １９８９）、アスペルギルス・オリザエ（Ｍａｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）および特定のストレプトマイセス種（Ｆｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２）といった微生物においても見つかっている。生化学的に十分特徴付けられたクチナーゼの全ては、セリンプロテアーゼおよび幾つかのリパーゼに共通する古典的なＳｅｒ−Ｈｉｓ−Ａｓｐの三つ組を含むセリンプロテアーゼである。特徴づけられたクチナーゼは、中性から酸性域に最適ｐＨを有する。
【０００７】
クチナーゼは多数の用途が提案されているが、そのごく一部をここに示す。ＷＯ２００４／０２９１９３では、例えば、発酵工程における、特にエタノール製造工程におけるクチナーゼを含むリパーゼの使用を提案している。ＵＳ６，２５５，４５１は、リパーゼおよびクチナーゼによる生物分解性ポリマーの分解に関する。多数の潜在的脂肪分解性酵素産生生物が挙げられており、そこには特にコプリナス・シネリウスおよびトリコデルマ・リーゼイが含まれる。しかしながら、これらの生物に由来するリパーゼに関する開示は存在しない。Ｇａｒｃｉａ−Ｌｅｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７では、様々な属および種からの５１の菌の自己溶解培養物においてリパーゼ活性についてスクリーニングしている。フサリウム属の菌はリパーゼ活性を最も作り出し、またそれらは、クチンおよびスベリンに対して低い活性を示した。アスペルギルスもまた一定の活性があった一方、ペニシリウム種は非常に低い活性を有する。トリコデルマ属、ケカビ目および担子菌綱由来のその他の種および株はリパーゼ活性を示さなかった。
【０００８】
クチナーゼは、植物病原性菌によってしばしば作られる。これは、それらが、高等植物の構造的クチンポリマーの破壊に関与するためである。クチナーゼは、菌感染の初期段階における宿主植物へのクチクラ障壁を介した病原性菌の浸潤を可能にする分泌タンパク質である。しかしながら、植物病原性菌は、ユーザーの否定的な認識のために、望ましくない産業的酵素の供給源である。実際、食品等級のポリエステラーゼおよびスベリン加工酵素は現在市販されていない。したがって、新規且つより有効なポリエステラーゼに対する要求が存在する。本発明はこの要求を満たすだろう。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の対象の１つは、配列番号２、６、１１または１３と少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリエステラーゼタンパク質、またはポリエステラーゼ活性を有するその変種もしくは断片である。
【００１０】
本発明のその他の対象は、以下から成る群から選択される単離されたポリヌクレオチドである：
ａ）配列番号１、３、５、１０または１２のヌクレオチド配列または請求項１に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
ｂ）ａ）の相補鎖；および
ｃ）遺伝暗号の結果として、ａ）またはｂ）の何れかに対して縮重する配列。
【００１１】
本発明の更なる対象の１つは、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、このベクターを形質転換された遺伝的に改変された微生物である。
【００１２】
本発明の対象の更なる１つは、前記ポリエステラーゼタンパク質を製造するための方法であって、前記ポリヌクレオチドを含むベクターを微生物に形質転換すること、前記ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下で前記形質転換した微生物を培養すること、および前記発現したタンパク質を回収することを含む方法である。
【００１３】
本発明は、また、前記ポリエステラーゼタンパク質を含む酵素製剤を包含する。
【００１４】
さらに、本発明は、クチン、スベリンまたはその他のポリエステルを加水分解する方法であって、クチン、スベリンまたはその他のポリエステルを含む材料を、前記ポリエステルの部分的または完全な加水分解が可能な条件下にて前記ポリエステラーゼタンパク質で処理することを含む方法を包含する。
【００１５】
またさらに、本発明は、食品産業、パルプおよび紙産業、織物工業における、または洗濯および食器洗いの用途における、または化学合成における、前記ポリエステラーゼタンパク質または酵素製剤の使用を包含する。本発明の特定の実施態様は、従属請求項に記載される。本発明のその他の対象、詳細および利点は、以下の図、発明の詳細な説明および実施例において明らかとなるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、コプリナス・シネレウスのクチナーゼ様タンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図２】図２は、２０Ｌバイオリアクター培養における、コプリナス・シネレウスクチナーゼ０９６６８（ＣｃＣＵＴ）の細胞外製造を示す。
【図３】図３は、２０Ｌバイオリアクター培養における、トリコデルマ・リーゼイのクチナーゼ（ＴｒＣＵＴ）およびスベリナーゼ（ＴｒＳＵＢ）の細胞外製造を示す。
【図４】図４は、ｐＨ７および４０℃で測定される、コプリナス・シネレウスクチナーゼ０９６６８（ＣｃＣＵＴ）およびトリコデルマ・リーゼイのクチナーゼ（ＴｒＣＵＴ）のエステル分解活性に対する脂肪酸鎖長の効果を示す。
【発明の詳細な説明】
【００１７】
本発明は、天然のおよび人工のポリエステル中のエステル結合を加水分解することができる新規の酵素タンパク質を提供する。それらの少なくとも一部は、酸性ｐＨにおいても実質的に活性を有し、このことは特定の用途において利点となる。タンパク質は、（ＥＣ３．１．１）と分類される酵素、言い換えればカルボン酸エステル加水分解酵素を包含する「エステラーゼ」である。特に、本発明のタンパク質は、様々なポリエステルに対し、例えば、植物性ポリエステルワックス、すなわちクチンおよびスベリンまたは人工ポリエステルに対し顕著な活性を有することを意味する「ポリエステラーゼ」である。本発明の好ましい実施態様によると、当該タンパク質はクチナーゼ活性を有する。「クチナーゼ」とは、（ＥＣ３．１．１．７４）に分類される酵素である。クチナーゼは、セリン加水分解酵素の古典的なＳｅｒ、Ｈｉｓ、Ａｓｐの三つ組を含むセリンエステラーゼである。本発明の別の実施態様によると、当該タンパク質はスベリナーゼ活性を有する。「スベリナーゼ」とは、スベリンを分解できる酵素である。当該タンパク質は、モデル基質または基質としての単離されたクチンまたはスベリンを使用して測定される、複数の前記酵素活性を有してもよい。ポリメラーゼ活性は、従って、少なくともクチナーゼ活性もしくはスベリナーゼ活性、またはそれらの両方であってよい。さらに、当該タンパク質は、ＥＣ３．１．１とも分類されるリパーゼ活性といったその他の酵素活性を有してもよい。
【００１８】
ポリエステラーゼは、配列番号２、６、１１または１３と少なくとも５０％の、または好ましくは少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列、またはポリエステラーゼ活性を有するその変種もしくは断片を含む。好ましい実施態様によると、ポリエステラーゼは、配列番号２と少なくとも５０％
の配列同一性を有するアミノ酸配列、またはクチナーゼ活性を有するその変種もしくは断片を含む。そのようなポリエステラーゼは、例えば、配列番号４、７、８または９のアミノ酸配列を含むものである。そのようなタンパク質は、配列番号４と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有してよい。
【００１９】
ここにおいて「同一性」という用語は、互いに比較される２つのアミノ酸配列間における配列同一性を意味する。ここにおいて配列の同一性は、欧州分子生物学研究所−欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＭＢＬ−ＥＢＩ；  http://www.ebi.ac.uk/clustalw/）のウェブページにて見つけられるＣｌｕｓｔａｌ  ｗ  マルチプルアラインメントプログラムにて、デフォルトセッティングおよび代替マトリックスとしてＢｌｏｓｕｍ６２を使用して（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４）決定される。
【００２０】
１つまたは数個のアミノ酸の欠失、付加または置換が、酵素タンパク質の触媒特性を必ずしも変化させないことが周知である。それゆえ、本発明はまた、ポリエステラーゼ活性を有する、所与のアミノ酸配列の変種および断片を包含する。ここにおいて使用される「変種」という用語は、所与の配列と比較してアミノ酸配列におけるマイナーな変化を有する配列を意味する。そのような変種は、例えば同一の株、種または属内における対立形質として自然発生してよく、または突然変異誘発またはその他の遺伝子改変によって作製してよい。それは、アミノ酸の置換、欠失または挿入を含んでもよいが、所与の酵素と実質的に同一の様式で機能し、特に、ポリエステラーゼとしての触媒機能を保持する。
【００２１】
所与のタンパク質配列の「断片」とは、そのような配列の一部を意味し、たとえば、Ｎ末端および／またはＣ末端にて切断された配列を意味する。それは、例えば、シグナル配列を含むタンパク質の成熟した部分であってよく、成熟タンパク質の酵素的に活性な断片のみであってよい。
【００２２】
本発明はまた、相補鎖および縮重鎖を含む、開示されるポリエステラーゼをコードする単離されたポリヌクレオチドに関する。所与の配列に対する「遺伝暗号の結果として縮重する」ポリヌクレオチドとは、それが１以上の異なるコドンを含むが、同一のアミノ酸をコードすることを意味する。ここにおいて使用される「ポリヌクレオチド」とは、一本鎖または二本鎖のポリ核酸であってよい。当該用語は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。
【００２３】
同一の触媒活性を有する酵素をコードする異なる生物由来の遺伝子は、配列の類似性を有する。これらの類似性は、同一のまたは類似の触媒活性を有するその他の生物からのその他の遺伝子をクローン化する多くの方法で利用できる。
【００２４】
新規のエステラーゼをコードするポリヌクレオチドは、例えばインシリコで、ヌクレオチド配列を比較することで同定してよい。そのような配列が利用できない場合、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列における保存された領域を同定することができ、またはＰＣＲ技術を使用して遺伝子断片をクローン化することできる。クローニング手段は、関心のあるＤＮＡ断片を一生物から自己複製遺伝子要素へ、および更におそらく外来性の宿主細胞へ運ぶ。断片の配列決定後、完全な遺伝子は、たとえばそれ自体既知の様式でｃＤＮＡライブラリーを使用して得ることができる。ポリエステラーゼ遺伝子を同定する別の方法は、従来の核酸ハイブリダイゼーション技術である。
【００２５】
クローニングのための特定のプローブは、例えば対応するｍＲＮＡから作ることができ、または当該プローブは、遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列の一部が既知である場合は作製することができる。候補ＤＮＡ配列が一旦決定されると、アルゴリズムの方法を使用して、マッチする標的ゲノムを効率的にサーチすることができる。ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）はこの目的のために設計された広く使用されるシステムである。
【００２６】
本発明のタンパク質またはポリヌクレオチドは、それらを含む細菌の、真菌の、酵母の、植物のまたは哺乳類の細胞を含む任意の適した生物から得ることができる。好ましくは、酵素は、真菌に由来し、特に、糸状菌、例えばコプリナス属またはトリコデルマ属に由来し、特に、Ｃ．シネレウスまたはＴ．リーゼイ（ヒポクレア・ジェコリナ）に由来する。
【００２７】
特定の生物に「由来する」タンパク質またはポリヌクレオチドは、前記生物から単離された生成物ならびにその改変を受けたものを包含する。特定の生物に由来するタンパク質は、天然のタンパク質と同一のまたは改変物である、組み換え技術によって作製された生成物であってよい。タンパク質はまた、例えばグリコシル化、リン酸化またはその他の化学的修飾によって改変されてもよい。改変はまた、関心あるタンパク質への、適したペプチドまたはタンパク質融合パートナーの付着であってよい。融合パートナーは有益な役割を有してよく、たとえば、関心あるタンパク質の加水分解または加工の効率を上げてよく、または融合パートナーは、関心あるタンパク質の精製の助けとなってよい。そのような融合パートナーの例は、真菌ハイドロフォビンである。特定の生物に由来する生成物はまた、生成物の変異体および天然の変種であって、１以上の核酸および／またはアミノ酸が欠失、挿入および／または置換されているものを包含する。
【００２８】
上述のとおり、タンパク質は、生物から単離される自然に発生するものであってよく、宿主細胞において組み換え的に作製されてよく、または例えばペプチド合成によって合成的に作製されてよい。好ましくは、タンパク質は組み換えタンパク質である。それは、まず、タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む断片を、ＰＣＲ反応による増幅（Ｃｏｅｎ，２００１）またはその他の組み換えＤＮＡ法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）によって単離することにより作製してよい。次に、単離されたポリヌクレオチドは、ベクター、例えばプラスミドベクター、特に発現ベクターに挿入され、それは、次の実施可能的に繋がる要素を含む：転写プロモーター、ポリエスエラーゼをコードするセグメント、転写性ターミネーター。プロモーターは、好ましくはタンパク質の過剰発現を可能にする強力なプロモーターである。１つの適したプロモーターは、Ｔ．リーゼイのセロビオヒドラーゼ（ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒａｓｅ）（ｃｂｈ１）プロモーターである。プロモーターは、選択した生産用宿主における関心ある遺伝子の発現を生じさせることができるものが選択される。ベクターは、染色体に組み込まれるものであってよく、または自律的に複製するものであってもよい。
【００２９】
次に、ベクターは、異種性または同種製の宿主細胞に形質転換されて「遺伝的に改変された微生物」が作られ、タンパク質の発現が可能な条件下で培養される。異なる宿主の系における組み換え技術によるタンパク質生産の方法は当該分野において周知である（Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎ，２００５）。あるいは、強力なプロモーターのみが、宿主の染色体上においてポリエステラーゼ遺伝子に実施可能的につながっており、それによって前記遺伝子が過剰発現する。宿主細胞は、任意の適した真核細胞または原核細胞であってよい。好ましくは、それは、真菌、例えば糸状菌または酵母であり、最も好ましくは、それはトリコデルマ属に属し、特にそれはＴ．リーゼイである。それはまた、サッカロマイセスまたはピキア株、たとえばそれぞれＳ．セレビジエおよびＰ．スチピチス（ｓｔｉｐｉｔｉｓ）である。さらに、それは、アスペルギルス株、例えばＡ．ニデュランス、Ａ．ニガーもしくはＡ．オリザエであってよく、または細菌宿主であってもよい。
【００３０】
ポリエステラーゼタンパク質は、好ましくは細胞外に作製され、これによって分泌されたタンパク質を培養液から取得してよい。あるいは、細胞を破壊して酵素を放出させてよく、その後、細胞の細片を除去した上清から取得してよい。さらに、必要に応じて、様々なタンパク質精製方法を用いて酵素を精製してもよい。そのような精製は、例えば、その他のタンパク質および特にその他の酵素を除去するための濃縮、沈殿、クロマトグラフィー、免疫精製、相分離等を含んでよい。
【００３１】
本発明の文脈における「酵素製剤」とは、少なくとも１つの本発明のポリエステラーゼを含む任意の組成物をであってよい。それは、さらに、１以上のその他の酵素を含んでよい。それは、粗製の形態であってよく、例えば、使用済みの培養液または細胞上清の形態であってよく、または、それは、精製されたまたは実質的に精製された形態のポリエステラーゼを含んでよい。
【００３２】
ポリエステラーゼは、クチン、スベリンまたはその他のポリエステルを含む材料の加水分解に有用である。クチンおよび／またはスベリンを含む材料は通常植物由来であり、一方、その他のポリエステルを含む材料は植物由来または人工のものであってよい。所望の反応を触媒するのに有効な量の酵素が材料に添加され、加水分解が可能な条件下で処理される。ポリエステラーゼは、例えば植物性ポリエステルワックス、例えばクチンおよびスベリンを分解または部分的に脱重合化させるために使用してよい。したがって、ポリエステラーゼは、例えば、農業的原材料もしくは食料原材料、または野菜、果実、果液および穀類から得られる副産物を処理するために使用してもよい。それらはまた、非食品加工において、例えば、木材原材料、パルプおよび紙製品、または加工廃棄物もしくは水または副産物を処理すること、または合成もしくはその他の人工ポリエステル繊維または織物を改変すること、または洗濯および食器からの粘着物または脂肪を除去することを含む方法に適用してよい。
【００３３】
ポリエステラーゼはまた、適した条件下で、逆反応、すなわちエステル化を触媒するために使用してよい。当該エステル化とは、例えば脂肪酸とアルコールとの間のエステル結合の形成である。
【００３４】
本発明は、以下の非限定的な例によって例証される。しかしながら、上記の発明の詳細および実施例に示される実施態様は例示の目的でのみ示され、様々な変更および修飾を請求項の範囲内で行うことができると解釈されるべきである。
【実施例】
【００３５】
［実施例１．ポリエステラーゼ活性の測定］
スベリン分解をモデル化する方法
スベリンの脂肪性層の分解は、モデル基質、すなわちナフトール誘導体に限定されており、発色団の大きさ（１−ナフチル、２−ナフチル、ナフトールＡＳ、ナフトールＡＳ−Ｄ）およびエステル結合する炭素鎖の長さの両方において異なっていた。ナフトール誘導体の基質溶液（０．５−１ｍＭ）を、１％アセトンおよび１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む５０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ５）または５０ｍＭ  ＮａＰ（ｐＨ８）にて作製した。１７０μｌの基質溶液および１０μｌの酵素サンプルを含む反応混合物を４０℃で２０分インキュベートした。インキュベーション後、２０μｌの１％Ｆａｓｔ  Ｂｌｕｓ  ＢＢ塩色素を添加し、さらに１０分インキュベーションした後に、吸光度（１ＮＡ基質−４５０ｎｍ、２ＮＡ基質−５１０ｎｍ、ＮＡＳ基質−５９５ｎｍ、ＮＡＳＤ基質−５９５ｎｍ）を測定した。様々な量の１ＮＡ、２ＮＡ、ＮＡＳまたはＮＡＳＤ（着色した反応生成物）から得られた検量線を参照して酵素活性を決定した。
【００３６】
芳香族化合物を含むスベリンの層の分解を、蛍光分子（４−メチルウンベリフェロン、４ＭＵ）でエステル化されたｐ−クマル酸（本来のスベリンにて見つかる）を含むモデル基質４−メチルウンベリフェリル４−メチルフェルラ酸エステル（ＭＵＦＥ）によってモニターした。ＭＵＦＥアッセイは、１９０μｌの０．１ｍＭ基質溶液と１０μｌの酵素溶液とを４０℃でインキュベートすることで行った。２０分のインキュベーションの後に、基準としての４−メチルウンベリフェロン（４ＭＵ）を使用して蛍光を測定した（λｅｘ＝３５５ｎｍ；λｅｍ＝４６５ｎｍ）。
【００３７】
スベリンの分解はまた、基質として放射性標識したスベリンを使用して測定した。カバノキの外部の樹皮から単離されたスベリンを［３Ｈ］ＮａＢＨ４で標識した。反応混合物は、１０ｍｇのスベリン（５ｘ１０５−１０６ｄｐｍ／ｍｇ）、１．９ｍｌのバッファー（０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５、または５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７）および０．１ｍＭの酵素溶液を含んでいた。反応混合物を３７℃でインキュベートし、０．１ｍｌの反応サンプルを４８時間のインキュベートの間に取り出した。酵素反応によって放出される加水分解産物（３Ｈ標識モノマー）を、エチルアセテートによって反応サンプルから抽出し、得られる放射能を液体シンチレーションカウンターによって測定した。酵素による分解の程度（％）を、アルカリによるスベリンの完全な加水分解後に放出される放射能を測定することで定量した。
【００３８】
クチン分解をモデル化する方法
クチナーゼ活性をモデル化するエステラーゼ活性を、２．１ｍＭのｐ−ニトロフェニルブチレート（ｐ−ＮＰＢ）を基質として使用して、分光光度法（Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００を若干改変）によって測定した。反応は、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中で、４０℃で１０分間行い、市販されるｐ−ニトロフェノールを基準として使用して、放出されたｐ−ニトロフェノールの量を３４０ｎｍで測定した。このモデルは、簡便で迅速な非特定的エステラーゼ活性のためのアッセイを可能とする。
【００３９】
クチナーゼ活性はまた、３Ｈ標識リンゴクチンを基質として使用し、Ｋｏｌｌｅｒら（１９８２）およびＤａｖｉｅｓら（２０００）によって提示された方法論を適用して測定した。反応混合物は、８ｍｇのクチン（５ｘ１０６ｄｐｍ／ｍｇ）、１．９ｍｌのマスターミックス（０．０２５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）および０．１ｍｌの酵素溶液を含むものであった。反応混合物を３７℃でインキュベートし、反応を２４時間続けた。クチナーゼの作用により放出される加水分解産物（３Ｈ標識されたモノマー）を、エチルアセテートによって０．１ｍｌの反応サンプルから抽出し、得られる放射能を液体シンチレーションカウンターによって測定した。酵素の分解の程度（％）は、アルカリによるクチンの完全な加水分解後に放出される放射能を測定することによって定量できる。
【００４０】
［実施例２．ポリエステル分解活性のスクリーニング］
全体で５５の微生物（大半が糸状菌）を、スベリン改変酵素を生産する能力について、スベリン誘導条件にてスクリーニングした。スクリーニングは培養上清の酵素的アッセイ（実施例１に開示されるように、ナフトール基質および蛍光標識された芳香族化合物および放射標識されたスベリンの加水分解）および分離された固体のＧＣ／ＭＳ分析に基づき、ヒドロキシ脂肪酸およびジオールといった長鎖脂肪酸の増大によって、微生物が増殖の間にスベリンを分解できたことが確認された。コプリナス・シネレウスおよびトリコデルマ・リーゼイは、クチン／スベリン分解酵素の潜在的な生産生物であることがわかった。
【００４１】
［実施例３．ポリエステラーゼをコードする遺伝子のためのコプリナス・シネレウスのゲノム分析］
コプリナス・シネレウスは、クチンおよびスベリンといった天然のポリエステラーゼに対して活性を有するポリエステラーゼを生産できることがわかった（実施例２）。コプリナス・シネレウスの公開されているゲノム（http://www.broad.mit.edu/annotation/genome/coprinus_cinereus/Home.html）を、既知のポリエステラーゼ（クチナーゼおよびスベリナーゼ）に基づく類似性のサーチに利用し、６つの異なるクチナーゼ様遺伝子が見つかった。タンパク質の類似性は、Ｃｌｕｓｔａｌ  ｗマルチプルアラインメントプログラムによって分析した。５つの遺伝子（ＣＣ１Ｇ＿０９６６８．１、ＣＣ１Ｇ＿０３９２２．１、ＣＣ１Ｇ＿１１５０３．１、ＣＣ１Ｇ＿０７４８２．１、およびＣＣ１Ｇ＿０９３６５．１）がクチナーゼに高い配列相同性を示し、１つ（ＣＣ１Ｇ＿０５４３０．１）がアセチルキシランエステラーゼ（ＡＸＥ）と高い相同性を共有し、たとえばトリコデルマ・リーゼイＡＸＥ１と３０％の配列同一性を示した。結果を図１に示す。クチナーゼのセリン活性部位およびアスパラギン酸およびヒスチジン活性部位が示される。前記遺伝子および対応する酵素は、以降、単純にそれぞれ０９６６８、０３９２２，１１５０３、０７４８２、０９３６５および０５４３０と称する。
【００４２】
Ｃｌｕｓｔａｌ  ｗマルチプルアラインメントにて分析したコプリナス・シネレウスクチナーゼ間の配列同一性は表１に示される。遺伝子０９６６８、０３９２２、および１１５０３は１９９のアミノ酸を有し、０７４８２は２００のアミノ酸を有し、０９３６５は２１６、および０５４３０は２２９アミノ酸を有する。
【表１】
0005496883.tif 000002
【００４３】
［実施例４．ポリエステラーゼをコードする遺伝子のためのトリコデルマ・リーゼイのゲノム分析］
トリコデルマ・リーゼイは、クチンおよびスベリンに対する活性を持つことがわかった（実施例２）。Ｔ．リーゼイの公開されたゲノム（http://genome.jgipsf.org/Trire2/Trire2.home.html）を、既知のクチナーゼに基づく類似性のサーチに利用し、１つのクチナーゼ（様）遺伝子（ｖ１．２：ｔｒｅ１７７３２，  ｖ２．０：ｔｒｅ６０４８９，スキャフォールド７）が見つかった。
【００４４】
スベリナーゼ様遺伝子は（ｖ１．２：ｔｒｅ４０８７１，ｖ２．０：ｔｒｅ３１２２７，スキャフォールド３７）は、広範なブラスティング（ｂｌａｓｔｉｎｇ）によって見つかった。ストレプトマイセス・スカビーズ（ｓｃａｂｉｅｓ）のスベリナーゼのタンパク質配列を、まず国立生物工学情報センター、ＮＣＢＩにおけるＢＬＡＳＴプログラム（ｂｌａｓｔｐ）による、デフォルトパラメーター（Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ６２，ｇａｐ  ｃｏｓｔｓ：ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  １１，ｅｘｔｅｎｓｉｏ１）を用いたブラスティングに使用した。続いて、トリコデルマ・リーゼイのゲノムを、デフォルトパラメーターを用いて、Ｓ．スカビーズのスベリナーゼ（ＳＥＳＴ様ドメインを含む）との類似性を有する真菌配列とブラストした。
【００４５】
ＳＥＳＴドメインを含む酵素は、エステラーゼおよびリパーゼとして作用するが、真のリパーゼとの配列相同性はほとんどもたない。これらの酵素の三次の折り畳みは、アルファ／ベータ加水分解酵素ファミリーのそれと実質的に異なり、全ての既知の加水分解酵素の中で独特である。この種のエステラーゼドメインを含むタンパク質は、様々な加水分解酵素にて見つかった。構造的情報を有するものは、ジャガイモ斑点病の原因薬剤であり、スベリンの特異的エステル結合を加水分解するストレプトマイセス・スカビーズ（ＳＥＳＴ）由来のエステラーゼを含む。ある仮定上のまたは推定上のタンパク質もまた、ストレプトマイセス・スカビーズエステラーゼと類似性を有する。
【００４６】
［実施例５．コプリナス・シネレウス由来の新規のポリエステラーゼのクローニング］
互いに低い相同性を示す、実施例３からの３種の異なるポリエステラーゼ（０９６６８、０７４８２、０５４３０）を、トリコデルマ・リーゼイにおける過剰発現について選択した。選択されたクチナーゼは、発現する宿主にとって、最適なコドン頻度を有し、本来の適したシグナル配列を有していた。
【００４７】
染色体ＤＮＡの単離のために、コプリナス・シネレウス株ＶＴＴ−Ｄ−０４１０１１を、胞子から開始した液体培養にて菌糸として増殖させた。胞子を、５０ｍｌのＹＰ培地に播種し、２４℃で撹拌しながら２時間増殖させた。菌糸をろ過によって回収し、ゲノムＤＮＡをＲａｅｄｅｒおよびＢｒｏｄａ、１９８５の方法によって単離した。ゲノムＤＮＡを鋳型として、Ｃ末端Ｈｉｓ６タグを形成し、ファージラムダベースの部位特異的組み換え配列を有するように設計したプライマーを用いて、ＰＣＲによって、２つのクチナーゼ遺伝子（ＣＣ１Ｇ＿０９６６８．１、ＣＣ１Ｇ＿０７４８２．１）およびＡＸＥ様遺伝子（Ｃ１Ｇ＿０５４３０．１）を増幅した。遺伝子の本来のシグナル配列を利用した。使用したプライマーは、次のものであった：ＣＣ１Ｇ＿０９６６８．１  フォワード：配列番号１４、ＣＣ１Ｇ＿０９６６８．１  リバース：配列番号１５、ＣＣ１Ｇ＿０７４８２．１  フォワード：配列番号１６、ＣＣ１Ｇ＿０７４８２．１  リバース：配列番号１７、ＣＣ１Ｇ＿０５４３０．１  フォワード：配列番号１８、ＣＣ１Ｇ＿０５４３０．１  リバース：配列番号１９。ＰＣＲ反応は、製造者によって推奨される反応混合物において、Ｐｈｕｓｉｏｎ熱安定性ポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ、フィンランド）にて行った。ＰＣＲプログラムは、最初の変性工程として９８℃で３０秒を行い、続いて、１０秒９８℃、３０秒６４℃および３０秒７２℃にて２５サイクル行い、ここにおいて、アニーリング温度は、５０℃に達するまで、１サイクルごとに１℃減少させた。この後、７２℃で１０分の最後の伸長工程を行った。増幅したＰＣＲ産物はＧａｔｅｗａｙドナーベクターｐＤＯＮＲ２２１（インビトロジェン）に、Ｇａｔｅｗａｙ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎキット（インビトロジェン）に組み込み、配列決定した。配列は表２に示される。
【表２】
0005496883.tif 000003
【００４８】
０９６６８の２つのクローン３．１および３．５が配列決定された。これらは、クローン３．５のヌクレオチド配列およびゲノム配列との間でほとんど違いがないが、３つ全てのヌクレオチド配列が、同一のアミノ酸配列（配列番号２）をコードする。公開されているゲノム配列は、一倍体のゲノムに由来しており、自動化されたゲノムアノテーションに基づく。それゆえ、クローン化された遺伝子の配列は、公開されたゲノム配列とか異なってもよい。違いはまた、ＰＣＲの際に導入してもよい。
【００４９】
配列番号４および配列番号６は、それぞれ、ゲノムから推定されるアミノ酸配列との間で１つのアミノ酸が異なる。この違いは図１に示されており、ここにおいて２つの異なるアミノ酸が網掛けされている。その他の３つのクチナーゼ様タンパク質ＣＣ１Ｇ＿０３９２２、ＣＣ１Ｇ＿１１５０３およびＣＣ１Ｇ−０９３６５の配列は、配列表中配列番号７、８および９にそれぞれ示される。
【００５０】
遺伝子は、ｐＤＯＮＲ２２１からトリコデルマ・リーゼイ発現ベクターｐＭＳ１８６に対し、ＬＲ組み換え反応によって移行され、プラスミドｐＡＷＰ２６（ＣＣ１Ｇ＿０９６６８．１）、ｐＡＷＰ２７（ＣＣ１Ｇ＿０７４８２．１）およびｐＡＷＰ２８（ＣＣ１Ｇ＿０５４３０１．１）を生じさせる。ｐＭＳ１８６ベクターは、ｃｂｈ１（セロビオヒドラーゼ１）プロモーターとターミネーターとの間に挿入されるＧａｔｅｗａｙリーディングフレームカセットＣ（ＲｆＣ）を含み、ハイグロマイシン耐性カセットを含む。ＬＲ組み換え反応は、製造者による指示の通りに、Ｇａｔｅｗａｙ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎキット（インビトロジェン）によって行った。
【００５１】
［実施例６．トリコデルマ・リーゼイ由来の新規のポリエステラーゼのクローニング］
トリコデルマ・リーゼイ由来のクチナーゼ（ｖ１．２：ｔｒｅ１７７３２、ｖ２．０：ｔｒｅ６０４８９、スキャフォールド７）およびスベリナーゼ（ｖ１．２：ｔｒｅ４０８７１、ｖ２．０：ｔｒｅ３１２２７、スキャフォールド３７）ｃＤＮＡを、トリコデルマ・リーゼイＲｕｔＣ−３０（Ｍａｒｇｏｌｌｅｓ−Ｃｌａｒｋ  Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９６）のｃＤＮＡ発現ライブラリーから、Ｃ末端Ｈｉｓ６タグを作りファージラムダベースの部位特異的組み換え配列を有するよう設計されたプライマー（クチナーゼフォワード：配列番号２０、クチナーゼリバース：配列番号２１、スベリンフォワード：配列番号２２、スベリンリバース：配列番号２３）によってＲＴ−ＰＣＲによって単離した。クチナーゼの本来のシグナル配列を使用した一方、ｃｂｈ１のシグナル配列を、スベリナーゼ構築物のために使用した。ＰＣＲ反応は、製造者の奨励する反応混合物中にて、Ｐｈｕｓｉｏｎ熱安定性ポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ、フィンランド）によって行った。ＰＣＲプログラムは、３０秒で９８℃の最初の変性工程を行い、続いて、１０秒９８℃、３０秒６４℃および３０秒７２℃を２５サイクル行い、ここにおいて、アニーリング温度は、５０℃に達するまでサイクルごとに１℃低下させた。この後に、１０分７２℃で最後の伸長工程を行った。増幅したＰＣＲ生成物は、Ｇａｔｅｗａｙ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎキット（インビトロジェン）によって、ＧａｔｅｗａｙドナーベクターｐＤＯＮＲ２２１（インビトロジェン）に組み込み、配列決定した。配列は表３に示される。
【表３】
0005496883.tif 000004
【００５２】
クチナーゼのクローン化されたヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列は、５’末端および３’末端の両方において、Ｔ．リーゼイゲノムのコンピューターアノテーションによって予測されるよりも長かった。
【００５３】
クチナーゼおよびスベリナーゼ遺伝子は、ＬＲ組み換え反応によって、ｐＤＯＮＲ２２１ベクターからトリコデルマ・リーゼイ発現ベクターｐＭＳ１８６に移動し、プラスミドｐＡＷＰ２４（クチナーゼ）およびｐＡＷＰ２５（スベリナーゼ）を得た。ｐＭＳ１８６ベクターは、ｃｂｈ１（セロビオヒドラーゼ１）のプロモーターとターミネーターとの間に挿入されたＧａｔｅｗａｙリーディングフレームカセットＣ（ＲｆＣ）およびハイグロマイシン耐性カセットを含む。ＬＲ組み換え反応は、製造者の指示に従って、Ｇａｔｅｗａｙ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎキット（インビトロジェン）によって行った。
【００５４】
［実施例７．トリコデルマ・リーゼイにおける新規のポリエステラーゼの発現］
ポリメラーゼ遺伝子を、主要なセルラーゼ遺伝子ｃｂｈ１の強力な誘導性プロモーターの下、Ｔ．リーゼイにて発現させた。環状発現ベクター（５μｇ）を、本質的にＰｅｎｔｔｉｌａ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ  １９８７に開示されるようなＰＥＧ−介在形質転換によって、Ｔ．リーゼイｃｂｈ１陰性株ＶＴＴ−Ｄ−０４９６６に形質転換し、１２５μｇ／ｍｌのハイグロマイシンＢを含むプレートにおいて、形質転換体からハイグロマイシン耐性菌を選択した。形質転換体を２回の連続的なラウンドで選択培地にストリークし、ゲノムへの組み込みをＰＣＲで試験した。陽性の形質転換体を、単一の胞子から培養することにより精製し、ｐ−ニトロフェニルブチレート（ｐ−ＮＰＢ）をモデル基質として使用して、液体培地中でクチナーゼ活性を試験した（実施例１）。５０ｍｌの培養液（ＴｒＭＭ＋４％ラクトース、２％使用済み穀類、１００ｍＭ  ＰＩＰＰＳ、ｐＨ５．５）に、１ｘ１０７の胞子を播種し、２５０ｒｐｍで撹拌しながら、２８℃で最大１０日間増殖させた。３つ全てのトリコデルマ構築物、すなわち、それぞれコプリナス遺伝子０９６６８、０７４８２および０５４３０を形質転換したものは、ｐ−ＮＰＢ活性を示した。それぞれの遺伝子の最も高い活性を示した６つの形質転換体を、より徹底的な分析のために再度培養した。Ｃ．シネレウス０９６６８は最も有望な候補であり、実験室スケールのファーメンターで培養した。Ｔ．リーゼイクチナーゼまたはスベリナーゼ遺伝子を保持する最も強力な形質転換体（ｐ−ＮＰＢによる活性アッセイに基づく）もまた、ファーメンターにおける培養のために選択した。
【００５５】
［実施例８．実験室スケールのファーメンターにおける新規のポリエステラーゼの生産］
クチナーゼ（ＣｃＣＵＴ）を生産する０９６６８の形質転換体を、ワーキングボリュームを２０リッターとして、Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｓｔａｔ  Ｃファーメンター（Ｂ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ドイツ）にて培養した。培地は、ラクトース（６０ｇ／ｌ）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（５ｇ／ｌ）およびＫＨ２ＰＯ４（５ｇ／ｌ）を含んだ。培地の液相は、６０ｇ／ｌの使用済み穀類を１１５℃で２０分間オートクレーブ中で加熱し、冷却しおよび遠心分離して、固体成分を除去して作製した、蒸留家の使用済み穀類の水性抽出物であった。窒素源および誘導物質の両方を含む遠心分離の上清は、唯一の液体として培地中に使用した。培養温度は２８℃で、ｐＨは５．０−５．５とした（水酸化アンモニウムおよびリン酸の添加によって調節した）。３００．．．７００ｒｐｍの撹拌、８ｌ／分の一定の通気により、溶存酸素を＞３０％に維持した。起泡は、Ｓｔｒｕｋｔｏｌ  Ｊ６３３  ポリオレアート抗起泡剤（Ｓｃｈｉｌｌ＆Ｓｅｉｌａｃｈｅｒ、ドイツ）を自動的に添加することで調節した。培養後、細胞を遠心分離によって回収し、培養上清を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（フランス）ＢｉｏＭａｘ１０メンブレン、公称カットオフ１０ｋＤａを使用して、限外ろ過によって濃縮した。
【００５６】
Ｃ．シネレウスクチナーゼ（ＣｃＣＵＴ）は、良好にファーメンター中で生産された。クチナーゼ生産は、９６時間後に、最大で８０００ｎｋａｔ／ｍｌを超えるまで増大した（図２）。１０倍の培養ろ液は７００００ｎｋａｔ／ｍｌのエステラーゼ活性（ｐ−ＮＰＢ）を有し、１０４ｍｇ／ｍｌの総タンパク質含有量であり、約２３ｍｇ／ｍｌの量のクチナーゼであった。培養上清におけるクチン分解活性の存在もまた、更なる研究の前に単離されたリンゴクチンにて確認した（表４）。クチンは、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の存在下、酵素用量を１０００、５０００および２００００ｎｋａｔ／ｇの基質（ｐＨ７、４０℃）として、培養上清（４５時間サンプル、１７８０ｎｋａｔ／ｍｌのｐ−ＮＰＢ活性）にて処理した。
【表４】
0005496883.tif 000005
【００５７】
トリコデルマ・リーゼイのクチナーゼ（ＴｒＣＵＴ）およびスベリナーゼ（ＴｒＳＵＢ）を生産する形質転換体は、ＣｃＣＵＴについて先に記載したのと同様に研究室のファーメンターで培養した。酵素活性は、図３にて、時間の関数として示される。
【００５８】
［実施例９．組み換え酵素の精製］
Ｃ末端Ｈｉｓ（６）タグの存在は、固定化金属アフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）を用いたＣｃＣＵＴおよびＴｒＣＵＴの一段階精製を可能にする。濃縮された培養上清を、Ｎｉ２＋を予め添加し、５００ｍＭのＮａＣｌおよび５ｍＭのイミダゾールを含むｐＨ７．２の５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液で平衡化したキレーティングＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ウプサラ、スウェーデン）に適用した。カラムを、５０ｍＭ（ＣｃＣＵＴのために）または２０ｍＭ（ＴｒＣＵＴのために）のイミダゾールを補った平衡化緩衝液で洗浄し、未結合の材料を除去した。組み換えタンパク質は、２００ｍＭイミダゾールを添加した平衡化緩衝液で溶出し、画分を回収し、ｐ−ＮＰＢに対する活性およびタンパク質の存在をＳＤＳ−ＰＡＧＥによりスクリーニングした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｒｅａｄｙ  Ｇｅｌ，Ｂｉｏ−Ｒａｄ）はＬａｅｍｍｌｉ（１９７０）の方法に従って行い、予め染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥスタンダード（Ｂｒｏａｄ  Ｒａｎｇｅ  Ｃａｔ．  ｎｏ．  １６１−０３１８，  Ｂｉｏ−ＲａｄまたはＬＭＷ，Ｃａｔ．  Ｎｏ  １７−０４４６−０１，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびタンパク質の染色のためにクマシーブリリアントブルー（Ｒ３５０；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用した。
【００５９】
精製したＣｃＣＵＴはＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で均一性を示し、約１０グラムの精製された酵素を、更なる特徴づけおよび加水分解研究のために作製した。３グラムのＴｒＣＵＴを精製し、９５％前後の純度であった（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づく）。ＴｒＳＵＢは、特徴づけに関して、ＣｃＣＵＴおよびＴｒＣＵＴと同様に精製した。
【００６０】
［実施例１０．新規のポリエステラーゼの特徴付け］
精製されたコプリナス・シネレウス（ＣｃＣＵＴ）およびトリコデルマ・リーゼイ（ＴｒＣＵＴ）クチナーゼは、大きさ、活性、基質特異性、ｐＨおよび温度の特徴に関して生物化学的に特徴づけした。
【００６１】
基質特異性
基質特異性を、アセテート（Ｃ２）、プロピオネート（Ｃ３）、ブチレート（Ｃ４）、バレレート（Ｃ５）、カプロエート（Ｃ６）、カプレート（Ｃ１０）、ラウレート（Ｃ１２）、ミリステート（Ｃ１４）、パルミタート（Ｃ１６）およびステアラート（Ｃ１８）によってエステル化されたｐ−ニトロフェノールを使用して決定した。基質分散液の濃度は５ｍＭであった。より濃度の低いｐ−ニトロフェニルステアラート（２．５ｍＭ）を、その可溶性がより低いため使用した。活性アッセイを、記述されるとおりに、ｐ−ニトロフェニルブチレート（ｐ−ＮＰＢ）のためにｐＨ７、４０℃で行った（実施例１）。得られた特異的活性は図４に示される。ＣｃＣＵＴおよびＴｒＣＵＴは、より短い脂肪酸（Ｃ２−Ｃ１０）の方が、より長い脂肪酸（Ｃ１６およびＣ１８）よりも高い活性を示した。驚くべきことに、ｐ−ＮＰアセテート（Ｃ２）及びプロピオネート（Ｃ３）に対する活性は、ｐ−ＮＰＢ（Ｃ４）よりも明確に高いことがわかった。ＣｃＣＵＴおよびＴｒＣＵＴのＣ４／Ｃ１６の比は、それぞれ１．８および３．１であった。典型的に、クチナーゼは、Ｃ２−Ｃ８脂肪酸にて高い活性を有し、Ｃ４／Ｃ１６の比は１から４の間である。約１または＜１のＣ４／Ｃ１６比はクチン分解活性がないことを意味する（Ｋｏｌａｔｔｕｋｕｄｙ  １９８４）。
【００６２】
リパーゼおよびコレステリルエステラーゼ活性
Ｋｏｎｔｋａｎｅｎら（２００４）にならって、オリーブオイルエマルジョンを基質として使用して、リパーゼ活性をアッセイした。ＣｃＣＵＴおよびＴｒＣＵＴのリパーゼ活性は表５に示される。
【００６３】
コレステリルエステラーゼ（ＣＥ）活性の決定のために使用されるアッセイは、Ｔｅｎｋａｎｅｎら（２００２）にならって、４．３ｍＭのコレステリルオレアートの加水分解後に遊離するコレステロールの分光光度計による決定に基づく。
【００６４】
ＣｃＣＵＴ製剤は、コレステリルエステラーゼ活性を示さなかった。ＴｒＣＵＴ製剤における活性は決定しなかった。
【００６５】
タンパク質アッセイ
タンパク質の濃度は、標準としてウシ血清アルブミンを使用し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＤＣタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、リッチモンド、カリフォルニア州）にて決定した。
【００６６】
温度安定性
ＣｃＣＵＴおよびＴｒＣＵＴの熱安定性は、酵素を３０−８０℃で１、３および２０時間、タンパク質濃度５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ５（２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液）でインキュベートすることで調べた。インキュベーション後、残る活性を、ｐ−ＮＰＢを基質として使用して測定した（ｐＨ７および４０℃で）。ＣｃＣＵＴは５０℃までの温度では安定であったが、６０℃において敏感に残りの活性が減少した。ＴｒＣＵＴは、５０℃で２０時間または６０℃で１時間インキュベートしたとき、活性の８０％を維持してある程度安定であった（表５）。
【００６７】
ｐＨ安定性
ＣｃＣＵＴおよびＴｒＣＵＴのｐＨ安定性を、室温および５０℃で２０時間、様々なｐＨ値にて、精製した酵素溶液インキュベートすることで調べた。溶液のｐＨは、ｐＨ２．２から８．０ではＭｃｌｌｖａｉｎｅ緩衝液（０．２Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４および０．１Ｍクエン酸）で調整し、ｐＨ７．２から９．１では０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で調整し、または、ｐＨ８．６から１０．６では０．２Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液で調整し、５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を得た。残る活性を、ｐ−ＮＰＢを用いてｐＨ７および４０℃で測定した。結果は表５に示される。双方の酵素が、酸性領域を含む幅広いｐＨの領域にわたって活性を有しているようであった。ＣｃＣＵＴの残る活性は、室温、ｐＨ３で約８０％であり、５０℃での残る活性は、ｐＨ５で約４０％、ｐＨ６で約１００％であった。ＴｒＣＵＴは、ｐＨ４から７の範囲で９０％を超える活性を保持していた。
【００６８】
最適ｐＨ
精製したクチナーゼ製剤のエステラーゼ活性を、ｐＨ２．３から８ではＭｃｌｌｖａｉｎｅ緩衝液（０．２Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４および０．１Ｍクエン酸）、ｐＨ７．２から９．１では０．２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液およびｐＨ８．６から１０．６では０．２Ｍグリシン−ＮａＯＨ緩衝液を使用して様々なｐＨ値にて測定した。反応時間は、４０℃で１０分とした。結果を表５に示す。ＣｃＣＵＴの最適ｐＨは７から８周辺であり、ＴｒＣＵＴは、２つの明確に異なる最適ｐＨ（４および８の周辺）を有していることが示された。したがって、ＴｒＣＵＴはより酸性の範囲における処理に適している。
【表５】
0005496883.tif 000006
【００６９】
［実施例１１．単離されたリンゴクチンの加水分解］
単離されたリンゴクチンをＣｃＣＵＴおよびＴｒＣＵＴで処理した。基質を酵素的におよび化学的に処理し、炭水化物およびペクチンならびに非共有結合脂質をそれぞれ除去した。クチンを０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８）に、２０ｍｇ／ｍｌの濃度で懸濁し、４５℃で２９時間ＣｃＣＵＴおよびＴｒＣＵＴで処理した。酵素用量は１０００および１００００ｎｋａｔ／ｇ基質（ｐ−ＮＰＢ活性）とし、処理は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の添加および非添加の状態で行った。加水分解物を２倍量のＭＴＢＥで２度抽出し固体マトリックスから全ての脂肪酸、モノマーおよびオリゴマーの両方を回収した。ＭＴＢＥ抽出物中の遊離脂肪酸を、酵素的比色法（Ｆｒｅｅ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ，  Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｔｉｃ  Ｌｔｄ）によって、直接分析し、および放出されたオリゴマーのアルカリ加水分解の後に分析した。放出された脂肪酸の量を表６に示す。双方のクチナーゼがリンゴクチンを加水分解できた。
【表６】
0005496883.tif 000007
【００７０】
［実施例１２．カバノキの樹皮のスベリンの加水分解］
蒸気爆発させたカバノキの外側の樹皮のスベリンをＣｃＣＵＴおよびＴｒＣＵＴで上記のクチン処理と同様に処理した。結果を表７に示す。
【表７】
0005496883.tif 000008
【００７１】
［実施例１３．皮をはいだ小麦粉の処理］
皮をはいだ小麦粉をクチナーゼ（ＣｃＣＵＴ）で処理し、非置換直鎖キシランおよびクチンの層から主に成る種皮の除去を促した。穀物（２ｇ）を、乾燥含有量２０％で含む水懸濁液にて、３０℃で２時間撹拌して（１００ｒｐｍ）処理した。５００および５０００ｎｋａｔ／ｇの基質（ｐ−ＮＰＢ活性として）の酵素用量をＣｃＣＵＴについて試験した。２つの異なるキシラナーゼおよびリパーゼの効果も調べた。酵素処理の後、遠心分離（９７００ｇ／１０分）によって、液相と固体相とを分離した。穀物を水（１０ｍｌ）で洗浄し、遠心分離を繰り返した。穀物を凍結乾燥し、重量を測定して重量損失を分析した。基準となる処理を、酵素添加を行わない以外は同一条件下で行った。放出された脂肪酸の量をＭＴＢＥ抽出後に分析し、脂肪酸をＥｔＯＨ／Ｔｒｉｔｏｎ／水の溶液に溶解した。還元糖を、ＤＮＳ法（Ｂｅｒｎｆｉｅｌｄ、１９５５）を用いて液体サンプルから分析した。
【００７２】
放出された脂肪酸の量および酵素処理後の溶解した炭水化物の量を表８に示す。ＣｃＣＵＴは、使用した条件の下で放出された脂肪酸の量を明確に増大させたことがわかる。行った処理は、炭水化物の量に何の効果も与えなかった。処理後、穀物の外観に何ら変化が見られなかったことは、クチンの選択的作用を示唆している。
【表８】
0005496883.tif 000009
【００７３】
［参考文献］
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以下に、当初の特許請求の範囲に記載していた発明を付記する。
［１］
配列番号２、６、１１または１３と少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリエステラーゼタンパク質、またはポリエステラーゼ活性を有するその変種もしくは断片。
［２］
配列番号４、７、８または９のアミノ酸配列を含む［１］に記載のタンパク質、またはポリエステラーゼ活性を有するその変種もしくは断片。
［３］
配列番号２、４、６、１１または１３と少なくとも８０％、９０％、９５％または９８％の配列同一性を有する［１］に記載のタンパク質。
［４］
少なくともクチナーゼもしくはスベリナーゼの活性またはその両方を有する［１］に記載タンパク質。
［５］
さらにリパーゼ活性を有する［４］に記載のタンパク質。
［６］
トリコデルマまたはコプリナスに由来する、好ましくはトリコデルマ・リーゼイまたはコプリナス・シネレウスに由来する［１］に記載のタンパク質。
［７］
Ｃ．シネレウスに由来し、配列番号２、４、６、７、８または９に対応するアミノ酸配列を含む［６］に記載のタンパク質、または少なくともクチナーゼもしくはスベリナーゼの活性またはその両方を有するその変種もしくは断片。
［８］
Ｔ．リーゼイに由来し、配列番号１１に対応するアミノ酸配列を含む［６］に記載のタンパク質、または少なくともクチナーゼもしくはスベリナーゼの活性またはその両方を有するその変種もしくは断片。
［９］
Ｔ．リーゼイに由来し、配列番号１３に対応するアミノ酸配列を含む［６］に記載のタンパク質、または少なくともスベリナーゼ活性を有するその変種もしくは断片。
［１０］
以下から成る群から選択される単離されたポリヌクレオチド：
ａ）配列番号１、３、５、１０または１２のヌクレオチド配列または［１］に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド；
ｂ）ａ）の相補鎖；および
ｃ）遺伝暗号の結果として、ａ）またはｂ）の何れか１つに対して縮重する配列。
［１１］
［１０］に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［１２］
［１１］に記載のベクターを形質転換された、遺伝的に改変された微生物。
［１３］
［１］に記載のポリエステラーゼタンパク質を製造するための方法であって、［１０］に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを微生物に形質転換すること、前記ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下で前記形質転換した微生物を培養すること、および前記発現したタンパク質を回収することを含む方法。
［１４］
前記ポリヌクレオチドが、コプリナス・シネレウスに由来し、トリコデルマ、サッカロマイセス、ピキア、アスペルギルスおよび細菌から成る群から選択される宿主において、特にＴ．リーゼイである宿主において発現する［１３］に記載の方法。
［１５］
前記ポリヌクレオチドが、トリコデルマ・リーゼイに由来し、トリコデルマ、サッカロマイセス、ピキア、アスペルギルスおよび細菌から成る群から選択される宿主において、特にＴ．リーゼイである宿主において発現する［１３］に記載の方法。
［１６］
［１］に記載のタンパク質を含む酵素製剤。
［１７］
クチン、スベリンまたはその他のポリエステルを加水分解する方法であって、クチン、スベリンまたはその他のポリエステルを含む材料を、前記ポリエステルの部分的または完全な加水分解が可能な条件下にて［１］に記載のタンパク質で処理することを含む方法。
［１８］
農業原料もしくは食品原料または野菜、果実、液果もしくは穀類から得られた副産物を、前記タンパク質で処理することを含む［１７］に記載の方法。
［１９］
木材原料、パルプおよび紙製品、または加工廃棄物もしくは水または副産物を、前記タンパク質で処理することを含む［１７］に記載の方法。
［２０］
合成もしくはその他の人工ポリエステル繊維または織物を、前記タンパク質で処理することを含む［１７］に記載の方法。
［２１］
洗濯および食器からの粘着物または脂肪を、前記タンパク質によって除去することを含む［１７］に記載の方法。
［２２］
クチンまたはスベリンを前記タンパク質によって脱重合することを含む［１７］に記載の方法。
［２３］
食品産業、パルプおよび紙産業、織物工業における、または洗濯および食器洗いの用途における、または化学合成における、［１］に記載のタンパク質または［１６］に記載の酵素製剤の使用。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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