(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
バリアントアクチビンＩＩＢ受容体ポリペプチド（ｖＡｃｔＲＩＩＢ）を含む単離されたタンパク質であって、該ポリペプチドが以下：
（ａ）位置２８における一アミノ酸置換、ここで該置換はＥに代わってＡ、ＷおよびＹのいずれか１つから選択されるものとなる置換である、以外は配列番号１８に示されるポリペプチド配列、を有するポリペプチド；
（ｂ）位置２８における一アミノ酸置換、ここで該置換はＥに代わってＡ、ＷおよびＹのいずれか１つから選択されるものとなる置換である、以外は配列番号１８のアミノ酸１９ないし１３４に示されるポリペプチド配列、を有するポリペプチド；
（ｃ）位置２８における一アミノ酸置換、ここで該置換はＥに代わってＡ、ＷおよびＹのいずれか１つから選択されるものとなる置換である、以外は配列番号１８のアミノ酸２３ないし１３４に示されるポリペプチド配列、を有するポリペプチド；
（ｄ）位置２８における一アミノ酸置換、ここで該置換はＥに代わってＡ、ＷおよびＹのいずれか１つから選択されるものとなる置換である、以外は配列番号１８のアミノ酸２５ないし１３４に示されるポリペプチド配列、を有するポリペプチド；および
（ｅ）（ａ）ないし（ｄ）のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド、ここで位置２８における置換はＥに代わってＡ、ＷおよびＹのいずれか１つから選択されるものとなる置換である、そしてここで該ポリペプチドはミオスタチン、アクチビンＡ、またはＧＤＦ−１１に結合することができる；
からなる群より選択される、前記タンパク質。
【請求項２】
バリアントアクチビンＩＩＢ受容体ポリペプチド（ｖＡｃｔＲＩＩＢ）を含む単離されたタンパク質であって、該ポリペプチドが以下：
（ａ）位置２８における一アミノ酸置換、ここで該置換はＥに代わってＡ、ＷおよびＹのいずれか１つから選択されるものとなる置換である、以外は配列番号２に示されるポリペプチド配列、を有するポリペプチド；
（ｂ）位置２８における一アミノ酸置換、ここで該置換はＥに代わってＡ、ＷおよびＹのいずれか１つから選択されるものとなる置換である、以外は配列番号２のアミノ酸１９ないし１６０に示されるポリペプチド配列、を有するポリペプチド；
（ｃ）位置２８における一アミノ酸置換、ここで該置換はＥに代わってＡ、ＷおよびＹのいずれか１つから選択されるものとなる置換である、以外は配列番号２のアミノ酸２３ないし１６０に示されるポリペプチド配列、を有するポリペプチド；
（ｄ）位置２８における一アミノ酸置換、ここで該置換はＥに代わってＡ、ＷおよびＹのいずれか１つから選択されるものとなる置換である、以外は配列番号２のアミノ酸２５ないし１６０に示されるポリペプチド配列、を有するポリペプチド；および
（ｅ）（ａ）ないし（ｄ）のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド、ここで位置２８における置換はＥに代わってＡ、ＷおよびＹのいずれか１つから選択されるものとなる置換である、そしてここで該ポリペプチドはミオスタチン、アクチビンＡ、またはＧＤＦ−１１に結合することができる；
からなる群より選択される、前記タンパク質。
【請求項３】
バリアントアクチビンＩＩＢ受容体ポリペプチド（ｖＡｃｔＲＩＩＢ）を含む単離されたタンパク質であって、該ポリペプチドが以下：
（ａ）位置２８における一アミノ酸置換、ここで該置換はＥに代わってＡ、ＷおよびＹのいずれか１つから選択されるものとなる置換である、および位置４０における一アミノ置換、ここで該置換はＲに代わってＡとなる置換である、以外は配列番号２または配列番号１８に示されるポリペプチド配列、を有するポリペプチド；
（ｂ）位置２８における一アミノ酸置換、ここで該置換はＥに代わってＡ、ＷおよびＹのいずれか１つから選択されるものとなる置換である、および位置４０における一アミノ置換、ここで該置換はＲに代わってＡとなる置換である、以外は配列番号２のアミノ酸１９ないし１６０または配列番号１８のアミノ酸１９ないし１３４に示されるポリペプチド配列、を有するポリペプチド；
（ｃ）位置２８における一アミノ酸置換、ここで該置換はＥに代わってＡ、ＷおよびＹのいずれか１つから選択されるものとなる置換である、および位置４０における一アミノ置換、ここで該置換はＲに代わってＡとなる置換である、以外は配列番号２のアミノ酸２３ないし１６０または配列番号１８のアミノ酸２３ないし１３４に示されるポリペプチド配列、を有するポリペプチド；
（ｄ）位置２８における一アミノ酸置換、ここで該置換はＥに代わってＡ、ＷおよびＹのいずれか１つから選択されるものとなる置換である、および位置４０における一アミノ置換、ここで該置換はＲに代わってＡとなる置換である、以外は配列番号２のアミノ酸２５ないし１６０またはｓ配列番号１８のアミノ酸２５ないし１３４に示されるポリペプチド配列、を有するポリペプチド；および
（ｅ）（ａ）ないし（ｄ）のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド、ここで位置２８における置換はＥに代わってＡ、ＷおよびＹのいずれか１つから選択されるものとなる置換である、および位置４０における置換はＲに代わってＡとなる置換である、そしてここで該ポリペプチドはミオスタチン、アクチビンＡ、またはＧＤＦ−１１に結合することができる；
からなる群より選択される、前記タンパク質。
【請求項４】
バリアントアクチビンＩＩＢ受容体ポリペプチド（ｖＡｃｔＲＩＩＢ）を含む単離されたタンパク質であって、該ポリペプチドが以下：
（ａ）位置４０における一アミノ置換、ここで該置換はＲに代わってＡとなる置換である、以外は配列番号２または配列番号１８に示されるポリペプチド配列、を有するポリペプチド；
（ｂ）位置４０における一アミノ置換、ここで該置換はＲに代わってＡとなる置換である、以外は配列番号２のアミノ酸１９ないし１６０または配列番号１８のアミノ酸１９ないし１３４に示されるポリペプチド配列、を有するポリペプチド；
（ｃ）位置４０における一アミノ置換、ここで該置換はＲに代わってＡとなる置換である、以外は配列番号２のアミノ酸２３ないし１６０または配列番号１８のアミノ酸２３ないし１３４に示されるポリペプチド配列、を有するポリペプチド；
（ｄ）位置４０における一アミノ置換、ここで該置換はＲに代わってＡとなる置換である、以外は配列番号２のアミノ酸２５ないし１６０または配列番号１８のアミノ酸２５ないし１３４に示されるポリペプチド配列、を有するポリペプチド；および
（ｅ）（ａ）ないし（ｄ）のいずれか１つと少なくとも９０％の同一性を有するポリペプチド、ここで位置４０における置換はＲに代わってＡとなる置換である、そしてここで該ポリペプチドはミオスタチン、アクチビンＡ、またはＧＤＦ−１１に結合することができる；
からなる群より選択される、前記タンパク質。
【請求項５】
ポリペプチドが、位置６４においてＲに代わってＡとなる置換をさらに含む、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の単離されたタンパク質。
【請求項６】
ポリペプチドが、配列番号４、６、８、１０、２０、２２、２４、２６、３４、３６、３８、４０、８７および８８からなる群より選択される配列を有する、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の単離されたタンパク質。
【請求項７】
ポリペプチドが、配列番号２０、２４、２６、３４、３８、４０、８７および８８からなる群より選択される、請求項１に記載の単離されたタンパク質。
【請求項８】
ポリペプチドが、少なくとも一つのヘテロロガスポリペプチドに融合している、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の単離されたタンパク質。
【請求項９】
ヘテロロガスポリペプチドがヒトＦｃドメインである、請求項８に記載の単離されたタンパク質。
【請求項１０】
タンパク質がさらにリンカーを含む、請求項９に記載の単離されたタンパク質。
【請求項１１】
タンパク質が、配列番号６０、６２、６４、７０、７２、８７、８８、９１、９３および９５からなる群より選択される配列を有する、請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項１２】
タンパク質が、配列番号９１に示される配列を有する、請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項１３】
位置２８における置換が、Ｅに代わってＷとなる置換である、請求項１に記載の単離されたタンパク質。
【請求項１４】
単離されたタンパク質が、リンカーによってヘテロロガスポリペプチドに融合しているポリペプチドを含む、請求項１に記載の単離されたタンパク質。
【請求項１５】
リンカーがペプチドリンカーを含み、そして、ヘテロロガスポリペプチドがヒトＦｃドメインを含む、請求項１４に記載された単離されたタンパク質。
【請求項１６】
リンカーが配列番号７９を含み、そして、ヘテロロガスポリペプチドが配列番号８０を含む、請求項１５に記載された単離されたタンパク質。
【請求項１７】
リンカーが配列番号７９を含み、そして、ヘテロロガスポリペプチドが配列番号８０を含む、請求項１６に記載された単離されたタンパク質。
【請求項１８】
請求項１ないし１７のいずれか１項に記載のタンパク質を含む、医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１ないし１７のいずれか１項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはその相補体、を含む単離された核酸分子。
【請求項２０】
以下：
（ａ）配列番号３、５、７、９、１９、２１、２３、２５、３３、３５、３７、３９、５９、６１、６３、６９、７１、９２、９４および９６からなる群より選択される配列を有するポリヌクレオチド、またはその相補体；および
（ｂ）配列番号４、６、８、１０、２０、２２、２４、２６、３４、３６、３８、４０、６０、６２、６４、７０、７２、８７、８８、９１、９３および９５からなる群より選択される配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む、請求項１９に記載の単離された核酸分子。
【請求項２１】
以下：
（ａ）配列番号１９、２３、２５、３３、３７、３９、５９、６１、６３、９２、９４および９６からなる群より選択される配列を有するポリヌクレオチド、またはその相補体；および
（ｂ）配列番号２０、２４、２６、３４、３８、４０、６０、６２、６４、８７、８８、９１、９３および９５からなる群より選択される配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
からなる群より選択されるポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子。
【請求項２２】
請求項１９ないし２１のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、組換え発現ベクター。
【請求項２３】
請求項２２に記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
【請求項２４】
請求項１ないし１７のいずれか１項に記載のタンパク質を製造する方法であって、請求項１９に記載の宿主細胞を培養し、それにより該タンパク質を発現させることを含む、前記方法。
【請求項２５】
対象においてミオスタチン活性を阻害するための医薬組成物であって、請求項１ないし１７のいずれか１項に記載のタンパク質を含む、前記医薬組成物。
【請求項２６】
対象において除脂肪筋量を増加させる、または脂肪に対する除脂肪筋量の比率を高めるための医薬組成物であって、請求項１ないし１７のいずれか１項に記載のタンパク質を含む、前記医薬組成物。
【請求項２７】
対象において筋消耗性の疾患または障害を処置するための医薬組成物であって、請求項１ないし１７のいずれか１項に記載のタンパク質を含む、前記医薬組成物。
【請求項２８】
筋消耗性の疾患または障害が、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、うっ血性閉塞性肺疾患、慢性心不全、癌性悪液質、エイズ、腎不全による悪液質、尿毒症、リウマチ性関節炎による悪液質、加齢性サルコペニア、臓器萎縮症、手根管症候群、アンドロゲン欠乏、火傷傷害による悪液質、糖尿病性腎症、および長期間の床上安静、脊髄損傷、卒中、骨折、加齢または極微重力曝露による筋消耗から選択される、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
対象において代謝障害を処置するための医薬組成物であって、請求項１ないし１７のいずれか１項に記載のタンパク質を含む、前記医薬組成物。
【請求項３０】
代謝障害が、糖尿病、肥満症、高血糖症、および骨損失から選択される、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
対象においてアクチビンが過剰発現する疾患を処置するための医薬組成物であって、請求項１ないし１７のいずれか１項に記載のタンパク質を含む、前記医薬組成物。
【請求項３２】
疾患が癌である、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
対象において筋消耗性障害を処置するための医薬組成物であって、請求項２２に記載のベクターを含み、ここで該ベクターは対象においてｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発現を指令することができる、前記医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引照
本出願は、米国仮特許出願番号６１／０６５，４７４、２００８年２月１１日出願、および米国仮特許出願番号６０／９０５，４５９、２００７年３月６日出願に基づく優先権を主張し、それらの開示内容に依存し、それらを本明細書に援用する。
【０００２】
発明の技術分野
本発明の技術分野は、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）ファミリーのメンバーおよび可溶性ＴＧＦ−βの受容体、ならびに種々の障害の処置のためにＴＧＦ−βファミリーのメンバーの活性を調節する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）ファミリーのタンパク質には、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、アクチビン、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、および増殖／分化因子（ＧＤＦ）が含まれる。これらのファミリーメンバーは、細胞の増殖、分化、および他の機能を含めた広範な生物学的プロセスの調節に関与する。
【０００４】
ミオスタチンとも呼ばれる増殖／分化因子８（ＧＤＦ−８）は、大部分が発育中および成体の骨格筋組織の細胞に発現するＴＧＦ−βファミリーのメンバーである。ミオスタチンは骨格筋の増殖の負の制御において本質的な役割を果たすと思われる(McPherron et al., Nature (London) 387, 83-90 (1997))。ミオスタチンに対する拮抗は動物の除脂肪筋量（ｌｅａｎ  ｍｕｓｃｌｅ  ｍａｓｓ）を増加させることが示された(McFerron et al., 前掲, Zimmers et al., Science 296:1486 (2002))。
【０００５】
ＴＧＦ−βファミリーのタンパク質の他のメンバーは、関連の増殖／分化因子ＧＤＦ−１１である。ＧＤＦ−１１はミオスタチンのアミノ酸配列の約９０％の同一性をもつ。ＧＤＦ−１１は発育中の動物の中軸パターン形成において役割をもち(Oh et al, Genes Dev 11:1812-26 (1997))、骨格筋の発育および増殖においても役割を果たすと思われる。
【０００６】
アクチビンＡ、ＢおよびＡＢは、２つのポリペプチド鎖βＡおよびβＢのそれぞれホモ二量体およびヘテロ二量体である(Vale et al. Nature 321, 776-779 (1986), Ling et al., Nature 321, 779-782 (1986))。アクチビンは最初は卵胞刺激ホルモン合成の調節に関与する生殖腺ペプチドとして発見され、現在では多数の生物活性の調節に関与すると考えられている。アクチビンＡが主要な形態のアクチビンである。
【０００７】
アクチビン、ミオスタチン、ＧＤＦ−１１、および他のＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーは、アクチビンＩＩ型とアクチビンＩＩＢ型の組合わせ受容体を結合し、これによりシグナル伝達する；これらは両方とも膜貫通セリン／トレオニンキナーゼである(Harrison et al., J. Biol. Chem. 279, 28036-28044 (2004))。架橋試験により、ミオスタチンはアクチビンＩＩ型受容体ＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢをインビトロで結合しうると判定された(Lee et al., PNAS USA 98:9306-11 (2001))。ＧＤＦ−１１がＡｃｔＲＩＩＡおよびＡｃｔＲＩＩＢの両方に結合するという証拠もある(Oh et al., Genes Dev 16:2749-54 (2002))。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】McPherron et al., Nature (London) 387, 83-90 (1997)
【非特許文献２】Zimmers et al., Science 296:1486 (2002)
【非特許文献３】Oh et al, Genes Dev 11:1812-26 (1997)
【非特許文献４】Vale et al. Nature 321, 776-779 (1986)
【非特許文献５】Ling et al., Nature 321, 779-782 (1986)
【非特許文献６】Harrison et al., J. Biol. Chem. 279, 28036-28044 (2004)
【非特許文献７】Lee et al., PNAS USA 98:9306-11 (2001)
【非特許文献８】Oh et al., Genes Dev 16:2749-54 (2002)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＴＧＦ−βタンパク質の発現は多様な疾患および障害と関連することが知られている。したがって、幾つかのＴＧＦ−βタンパク質に同時に拮抗しうる療法用分子は、これらの疾患および障害に特に有効な可能性がある。
【００１０】
さらに、タンパク質療法薬の製造はタンパク質の発現および精製に際して起きる問題によって複雑となる可能性がある。ひとつの問題は、発現または精製に際してのタンパク質の凝集である。細胞培養状態で高濃度のタンパク質が蓄積すると、凝集が生じる可能性がある。精製過程でタンパク質がいっそうの凝集を促進する追加要因に曝露される可能性がある(Cromwell, M.E.M. et al., The AAPS Journal 8:E572-E579, 2006)。凝集を引き起こす要因を軽減する試みを行なうことはできるが、凝集を生じる傾向が低くなるようにタンパク質を設計することが求められる。本発明は、ＴＧＦ−β関連の疾病状態を処置するのに有用なタンパク質を効率的に製造するために、療法用分子に対する、多数のリガンドに結合し、かつ凝集が少なく、したがって改良された製造適性をもつという要望を満たす。
【課題を課題するための手段】
【００１１】
本発明は、バリアントヒトアクチビン受容体ＩＩＢ（ｖＡｃｔＲＩＩＢと表示する）ポリペプチドを含む単離されたタンパク質を提供する。本明細書中で用いる用語ｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ヒトｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびヒトｖＡｃｔＲＩＩＢ５ポリペプチドの両方を表わす。１態様において、タンパク質はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２または１８の位置Ｅ２８もしくはＲ４０のいずれかまたは位置Ｅ２８およびＲ４０の両方のアミノ酸が他の非−自然（ｎｏｎ−ｎａｔｉｖｅ）アミノ酸で置換されたアミノ酸配列をもつポリペプチドを含み、このポリペプチドはミオスタチン、アクチビンＡ、またはＧＤＦ−１１を結合することができる。１態様において、タンパク質はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２または１８の位置Ｅ２８もしくはＲ４０のいずれかまたは位置Ｅ２８およびＲ４０の両方のアミノ酸が非−自然アミノ酸で置換され、かつシグナルペプチドが除去されたアミノ酸配列をもつポリペプチドを含み、このポリペプチドはミオスタチン、アクチビンＡ、またはＧＤＦ−１１を結合することができる。１態様において、タンパク質はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２または１８の位置Ｅ２８もしくはＲ４０のいずれかまたは位置Ｅ２８およびＲ４０の両方のアミノ酸が別のアミノ酸で置換され、シグナルペプチドが除去され、かつ成熟ポリペプチドのＮ−末端がトランケートしたアミノ酸配列をもつポリペプチドを含み、このポリペプチドはミオスタチン、アクチビンＡ、またはＧＤＦ−１１を結合することができる。１態様において、Ｎ−末端トランケートした成熟ｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは成熟配列のＮ−末端の４個のアミノ酸またはＮ−末端の６個のアミノ酸を欠如し、このポリペプチドはミオスタチン、アクチビンＡ、またはＧＤＦ−１１を結合することができる。１態様において、位置Ｅ２８における置換はＷ、ＹおよびＡからなる群から選択される。他の態様において、位置Ｅ２８における置換はＡ、Ｆ、Ｑ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｋ、Ｈ、ＷおよびＹからなるアミノ酸の群から選択される。他の態様において、位置Ｒ４０における置換はＧ、Ｑ、Ｍ、Ｈ、ＫおよびＮからなるアミノ酸の群から選択される。他の態様において、位置Ｅ２８における置換はＡ、Ｆ、Ｑ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｋ、Ｈ、ＷおよびＹからなるアミノ酸の群から選択され、かつ位置Ｒ４０における置換はＡ、Ｇ、Ｑ、Ｍ、Ｈ、ＫおよびＮからなるアミノ酸の群から選択される。他の態様において、このポリペプチドはさらにヘテロロガスタンパク質を含む。１態様において、ヘテロロガスタンパク質はＦｃドメインである。他の態様において、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ  Ｆｃドメインである。
【００１２】
１態様において、タンパク質はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、６、８、１０、１２、１４、１６、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５２、５４、５６、６０、６２、６４、６６、７０、７２、８７、８８、９１、９３、９５、および９７に示すアミノ酸配列をもつポリペプチドを含む。
【００１３】
他の態様において、タンパク質はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、５、７、９、１１、１３、１５、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、５１、５３、５５、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、９２、９４、９６に示す配列またはその相補配列をもつポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを含む。
【００１４】
他の観点において、本発明はｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。１態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、５、７、９、１１、１３、１５、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、５１、５３、５５、５９、６１、６３、６５、６９、７１、９２、９４、９６に示す核酸配列またはその相補配列をもつポリヌクレオチドを含む。
【００１５】
他の態様において、核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、６、８、１０、１２、１４、１６、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５２、５４、５６、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、８７、８８、９１、９３、９５、および９７からなる群に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。他の態様において、核酸分子はさらに転写または翻訳調節配列を含む。他の観点においては、ｖＡｃｔＲＩＩＢ核酸分子を含む組換えベクターが提供される。他の観点においては、この組換えベクターを含む宿主細胞が提供され、ｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを製造する方法が提供される。
【００１６】
本発明はさらに、少なくとも１種類の本発明のｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはタンパク質を含有する組成物を提供する。１態様において、組成物はｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはタンパク質を医薬的に許容できるキャリヤーと混合したものを含有する医薬組成物である。
【００１７】
他の観点において、本発明は、ｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはタンパク質を含有する療法用組成物を対象に投与することにより、その障害を伴う対象において筋消耗性疾患を治療または予防する方法を提供する。筋消耗性疾患には下記の状態またはそれから生じるものが含まれるが、これらに限定されない：癌性悪液質、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、うっ血性閉塞性肺疾患、慢性心不全、化学的悪液質、ＨＩＶ／エイズによる悪液質、腎不全、尿毒症、リウマチ性関節炎、加齢性サルコペニア、加齢性虚弱質、臓器萎縮症、手根管症候群、アンドロゲン欠乏、ならびに長期間の床上安静、脊髄損傷、卒中、骨折、および加齢による非活動に帰因する筋消耗。筋消耗は、宇宙飛行による無重力、インスリン抵抗性、火傷による筋消耗、アンドロゲン欠乏、および他の障害から生じる可能性もある。他の観点において、本発明はアクチビンＡの発現に相関する疾患を処置する方法を提供する。１態様において、疾患は癌である。他の観点において、本発明は、代謝障害を処置する方法であって、その処置を必要とする対象に療法用組成物を投与することを含む方法を提供する；その際、代謝障害は骨損失、糖尿病、肥満症、糖耐性障害、高血糖症、アンドロゲン欠乏、およびメタボリックシンドロームから選択される。他の観点において、本発明は、前記の障害を処置するための医薬の製造における療法用組成物の使用を提供する。他の観点において、本発明は、その必要がある対象に本発明のｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはタンパク質をコードするベクターを投与することを含む遺伝子療法を提供する；その際、ベクターは対象においてｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドまたはタンパク質を発現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、野生型可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ−ヒトＩｇＧ１  Ｆｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８）を示す。シグナルペプチド配列は太字であり、これに続いて成熟ＡｃｔＲＩＩＢ細胞外ドメイン、および部分ヒンジ部を含むイタリック体のヒトＩｇＧ１  Ｆｃがある。アミノ酸Ｅ２８およびＲ４０に下線を施してある。リンカー配列ＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５）はイタリック体であり、かつ下線を施してある。
【図２】図２は、可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ５−ヒトＩｇＧ１  Ｆｃのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９）を示す。シグナルペプチド配列は太字であり、これに続いて成熟ＡｃｔＲＩＩＢ可溶性ドメインがあり、部分ヒンジ部を含むヒトＩｇＧ１  Ｆｃはイタリック体である。アミノ酸Ｅ２８およびＲ４０に下線を施してある。リンカー配列（ＧＧＧＧＳ）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５）はイタリック体であり、かつ下線を施してある。
【図３】図３は、インヒビン−αノックアウトマウスにおいて可溶性ｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ  Ｅ２８Ｗ処置が精巣（図３Ａ）および卵巣（図３Ｂ）の質量に及ぼす影響を示す。
【図４】図４は、可溶性ｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ  Ｅ２８Ｗ処置が雄（図４Ａ）および雌（図４Ｂ）のインヒビン−αノックアウトマウスの生存率に及ぼす影響を示す。
【図５】図５は、大腸２６腫瘍を保有するマウスにおいて可溶性ｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ  Ｅ２８Ｗ処置が体重に及ぼす影響を示す。
【図６】図６は、大腸２６腫瘍を保有するマウスの生存率に可溶性ｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ  Ｅ２８Ｗ処置が及ぼす影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
バリアントヒトアクチビンＩＩＢ受容体（ｖＡｃｔＲＩＩＢ）ポリペプチドを含むタンパク質を開示する。これらのタンパク質およびポリペプチドは、３種類のＴＧＦ−βタンパク質であるミオスタチン（ＧＤＦ−８）、アクチビンＡ、およびＧＤＦ−１１のうち少なくとも１つに結合してこれらのタンパク質の活性を阻害するそれらの能力を特徴とする。これらのタンパク質およびポリペプチドは、本明細書に開示する修飾を含まないポリペプチドと比較して低い凝集傾向をも示す。これらの修飾は、寄託番号ＮＰ ００１０９７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）の野生型ＡｃｔＲＩＩＢ、およびＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）またはＡｃｔＲＩＩＢ５の細胞外ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）と対比して、位置２８、４０、または２８と４０の両方におけるアミノ酸置換からなる。
【００２０】
本明細書中で用いる用語”ＴＧＦ−βファミリーのメンバー”または”ＴＧＦ−βタンパク質”は、トランスフォーミング増殖因子ファミリーの構造関連増殖因子を表わし、これにはアクチビン、ならびに増殖および分化因子（ＧＤＦ）タンパク質が含まれる(Kingsley et al. Genes Dev. 8: 133-146 (1994), McPherron et al. Growth factors and cytokines in health and disease, Vol. 1B, D. LeRoith and C.Bondy. ed., JAI Press Inc., Greenwich, Conn, USA: pp 357-393)。
【００２１】
ミオスタチンとも呼ばれるＧＤＦ−８は、骨格筋組織の負の調節物質である(McPherron et al. PNAS USA 94:12457-12461 (1997))。ミオスタチンは、長さ約３７５アミノ酸の不活性タンパク質複合体として合成され、ヒトについてＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＢ８６６９４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）をもつ。この前駆タンパク質が４塩基プロセシング部位におけるタンパク質分解開裂によって活性化されて、Ｎ−末端不活性プロドメイン、および約１０９アミノ酸のＣ−末端タンパク質を生成し、これが二量体化して約２５ｋＤａのホモ二量体を形成する。このホモ二量体が生物活性をもつ成熟タンパク質である(Zimmers et al., Science 296, 1486 (2002))。
【００２２】
本明細書中で用いる用語“プロドメイン”または“プロペプチド”は不活性Ｎ−末端タンパク質を表わし、これが開裂除去されて活性Ｃ−末端タンパク質が放出される。本明細書中で用いる用語“ミオスタチン”または“成熟ミオスタチン”は、生物活性をもつ成熟Ｃ−末端ポリペプチド（単量体、二量体または他の形態）、および生物活性フラグメントまたは関連ポリペプチドを表わし、これには対立遺伝子バリアント、スプライスバリアント、ならびに融合したペプチドおよびポリペプチドが含まれる。成熟ミオスタチンは、ヒト、マウス、ニワトリ、ブタ、シチメンチョウおよびラットを含めた多くの種間で１００％の配列同一性をもつと報告されている(Lee et al., PNAS 98, 9306 (2001))。
【００２３】
本明細書中で用いるＧＤＦ−１１は、Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ寄託番号Ｏ９５３９０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０）をもつＢＭＰ（骨形態形成タンパク質）、ならびにそのタンパク質のバリアントおよび種ホモログを表わす。ＧＤＦ−１１は、ミオスタチンに対してアミノ酸レベルで約９０％の配列同一性をもつ。ＧＤＦ−１１は、中軸骨格の前／後パターン形成の調節に関与する(McPherron et al, Nature Genet. 22 (93): 260-264 (1999); Gamer et al, Dev. Biol. 208 (1), 222-232 (1999))が、生後の機能は分かっていない。
【００２４】
アクチビンＡはポリペプチド鎖βＡのホモ二量体である。本明細書中で用いる用語“アクチビンＡ”は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ ００２１９２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）をもつアクチビンタンパク質、ならびにそのタンパク質のバリアントおよび種ホモログを表わす。
【００２５】
アクチビン受容体
本明細書中で用いる用語アクチビンＩＩＢ型受容体（ＡｃｔＲＩＩＢ）は、寄託番号ＮＰ ００１０９７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）をもつヒトアクチビン受容体を表わす。可溶性ＡｃｔＲＩＩＢという用語には、ＡｃｔＲＩＩＢの細胞外ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）、ＡｃｔＲＩＩＢ５の細胞外ドメイン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）、ならびにこれらの配列の位置６４のアルギニンがアラニンで置換されたものも含まれる。
【００２６】
バリアント可溶性ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド
本発明は、ヒトバリアント可溶性ＡｃｔＲＩＩＢ受容体ポリペプチド（本明細書中でｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、またはバリアントポリペプチドと表示する）を含む単離されたタンパク質を提供する。本明細書中で用いる用語“ｖＡｃｔＲＩＩＢタンパク質”は、ｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含むタンパク質を表わす。本明細書中で用いる用語”単離された”は、内因性物質からある程度精製されたタンパク質またはポリペプチド分子を表わす。これらのポリペプチドおよびタンパク質は、アクチビンＡ、ミオスタチン、またはＧＤＦ−１１のいずれか１つに結合してその活性を阻害する能力をもつことを特徴とする。ある態様において、アクチビンＡ、ミオスタチン、またはＧＤＦ−１１に対するバリアントポリペプチドの結合親和性は野生型ポリペプチドと比較して改良されている。
【００２７】
１態様において、ｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２または１８の位置Ｅ２８もしくはＲ４０のいずれかまたは位置Ｅ２８およびＲ４０の両方のアミノ酸が他の非−自然アミノ酸で置換されたアミノ酸配列をもち、このポリペプチドはミオスタチン、アクチビンＡ、またはＧＤＦ−１１を結合することができる。他の態様において、ｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドはこれらの配列の成熟型またはトランケートした成熟型である。本明細書中で用いる用語“成熟ｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド”は、アミノ酸シグナル配列が除去されたポリペプチドを表わす。１態様において、成熟配列は、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸１９〜１６０、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８のアミノ酸１９〜１３４であり、その際、位置２８および４０の一方または両方のアミノ酸が他の非−自然アミノ酸で置換されており、このポリペプチドはアクチビンＡ、ミオスタチン、またはＧＤＦ−１１に結合する能力を保持する。本明細書中で用いる用語トランケートした成熟ｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、シグナル配列およびさらに成熟ポリペプチドのＮ−末端からのアミノ酸が除去されたポリペプチドを表わす。１態様においては、成熟ポリペプチドの成熟Ｎ−末端の４個のアミノ酸またはＮ−末端の６個のアミノ酸が除去されている。この態様において、トランケートした成熟配列は、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸２３〜１６０、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸２５〜１６０；およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８のアミノ酸２３〜１３４、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８のアミノ酸２５〜１３４であり、その際、位置２８および４０の一方または両方のアミノ酸が他の非−野生型アミノ酸で置換されており、これはアクチビンＡ、ミオスタチン、またはＧＤＦ−１１に結合する能力を保持する。本明細書中で用いる用語“位置２８”および“位置４０”（すなわち、Ｅ２８およびＲ４０）は、１８アミノ酸のシグナル配列を含むＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および１８に関するアミノ酸の位置を表わす。一貫性をもたせるために、成熟ｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドが位置１０および／または２２に置換をもつ場合、あるいはトランケートした成熟ポリペプチドが成熟配列またはトランケートした成熟配列に対して位置６および／または１８に置換をもつ場合、あるいは位置４および／または１６に置換をもつ場合、これらのバリアントもなお全長ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および１８について、または図１または２に示すように、すなわち位置Ｅ２８および／またはＲ４０におけるアミノ酸置換について表示する。そのような成熟態様またはＮ−末端トランケートした態様を後記に例示する。
【００２８】
１態様において、位置２８における置換はＷ、ＹおよびＡからなるアミノ酸の群から選択される。１態様において、位置２８における置換はＷである。他の態様において、位置２８における置換はＡ、Ｆ、Ｑ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｋ、Ｈ、ＷおよびＹからなるアミノ酸の群から選択される。他の態様において、位置４０における置換はＧ、Ｑ、Ｍ、Ｈ、ＫおよびＮからなるアミノ酸の群から選択される。他の態様において、位置２８における置換はＡ、Ｆ、Ｑ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｋ、Ｈ、ＷおよびＹからなるアミノ酸の群から選択され、かつ位置４０における置換はＡ、Ｇ、Ｑ、Ｍ、Ｈ、ＫおよびＮからなるアミノ酸の群から選択される。１態様において、タンパク質はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、６、８、１０、１２、１４、１６、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５２、５４、５６、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、８７、８８、９１、９３、９５、および９７からなる群から選択されるアミノ酸配列をもつポリペプチドを含む。他の態様において、タンパク質はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、５、７、９、１１、１３、１５、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、５１、５３、５５、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、９２、９４、９６からなる群に示す配列またはその相補配列をもつポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを含む。
【００２９】
１態様においては、シグナル配列がｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドから除去されて、成熟バリアントポリペプチドが残る。本発明のポリペプチドの製造には多様なシグナルペプチドを使用できる。シグナルペプチドは、図１および２に示す配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）、またはオルタナティブシグナル配列、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４、すなわちＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および１８に対するシグナル配列をもつことができる。ｖＡｃｔＲＩＩＢまたはｖＡｃｔＲＩＩＢ５ポリペプチドの発現に有用な他のいかなるシグナルペプチドも使用できる。
【００３０】
他の態様において、ｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは実質的にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および１８に類似する配列をもつ。本明細書中で用いる用語“実質的に類似する”は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および１８に示すアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、または少なくとも約９９％の同一性をもつポリペプチドを表わし、その際、位置２８および／または４０の一方または両方のアミノ酸が非−野生型アミノ酸で置換されており、このポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および１８のポリペプチドの活性、すなわちミオスタチン、アクチビンＡまたはＧＤＦ−１１を結合して阻害する能力を保持する。さらに、用語ｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２または１８の位置２８および／または４０に本明細書に記載する置換を含むフラグメント、たとえばＮおよびＣ末端トランケーション配列を包含し、その際、このポリペプチドはミオスタチン、アクチビンＡまたはＧＤＦ−１１を結合して阻害することができる。
【００３１】
本明細書中で用いるｖＡｃｔＲＩＩＢおよびｖＡｃｔＲＩＩＢ５ポリペプチドの“誘導体”という用語は、共有または凝集コンジュゲートを形成する少なくとも１つの追加の化合物部分または少なくとも１つの追加のポリペプチド、たとえばグリコシル基、脂質、アセチル基の付加、またはＣ−末端もしくはＮ−末端融合ポリペプチド、ＰＥＧ分子へのコンジュゲーション、および他の修飾を表わす；これらについては後記にさらに詳細に記載する。バリアントＡｃｔＲＩＩＢ受容体ポリペプチド（ｖＡｃｔＲＩＩＢ）は他の修飾体および誘導体をも含むことができ、これには多様な細胞タイプ、たとえば哺乳動物細胞、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母、および他の組換え宿主細胞における発現によるプロセシングから生じるＣおよびＮ末端への修飾が含まれる。さらに、ｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドフラグメント、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、６、８、１０、１２、１４、１６、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５２、５４、５６、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、８７、８８、９１、９３、９５、および９７に示すポリペプチド配列の不活性化されたＮ−グリコシル化部位（１以上）、不活性化されたプロテアーゼプロセシング部位（１以上）、または保存的アミノ酸置換（１以上）を含むポリペプチドが含まれる。
【００３２】
本明細書中で用いる用語“ｖＡｃｔＲＩＩＢまたはｖＡｃｔＲＩＩＢ５ポリペプチド活性”あるいは“可溶性ｖＡｃｔＲＩＩＢまたはｖＡｃｔＲＩＩＢ５ポリペプチドの生物活性”は、ｖＡｃｔＲＩＩＢおよびｖＡｃｔＲＩＩＢ５ポリペプチドの１以上のインビトロまたはインビボ活性を表わし、これには後記の実施例中で証明するものが含まれるが、これらに限定されない。ｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの活性には、ミオスタチンまたはアクチビンＡまたはＧＤＦ−１１に結合する能力、およびミオスタチンまたはアクチビンＡまたはＧＤＦ−１１の活性を低下または中和する能力が含まれるが、これらに限定されない。本明細書中で用いる、ミオスタチン、アクチビンＡ、またはＧＤＦ−１１に“結合することができる”という用語は、当技術分野で既知の方法、たとえば後記の実施例２に記載するＢｉａｃｏｒｅ法により測定した結合を表わす。実施例２においては、ｐＭＡＲＥ  Ｃ２Ｃ１２細胞ベースのアッセイによりアクチビンＡ中和活性、ミオスタチン中和活性、およびＧＤＦ−１１中和活性も測定する。インビボ活性には、動物モデルにおいて証明され、当技術分野で既知であるように、体重の増加、除脂肪筋量の増加、骨格筋量の増加、脂肪量の減少が含まれるが、これらに限定されない。生物活性には、さらに特定のタイプの腫瘍により起きる悪液質の軽減または予防、特定のタイプの腫瘍の増殖の予防、および特定の動物モデルの生存率の向上が含まれる。ｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド活性についての考察をさらに後記に示す。
【００３３】
本発明のポリペプチドはさらに、ｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに直接またはリンカー配列により付加して融合タンパク質を形成したヘテロロガスポリペプチドを含む。本明細書中で用いる用語“融合タンパク質”は、ヘテロロガスポリペプチドが組換えＤＮＡ技術により付加したタンパク質を表わす。ヘテロロガスポリペプチドには下記のものが含まれるが、これらに限定されない：バリアントＡｃｔＲＩＩＢのオリゴマー化および安定化を促進するＦｃポリペプチド、ｈｉｓタグ、およびロイシンジッパードメイン；たとえばＷＯ  ００／２９５８１に記載され、これを本明細書に援用する。１態様において、ヘテロロガスポリペプチドはＦｃポリペプチドまたはドメインである。１態様において、ＦｃドメインはヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４  Ｆｃドメインから選択される。これらをＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０、８２および８４に示す。ｖＡｃｔＲＩＩＢは、さらにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４の各ＩｇＧ  Ｆｃ領域に隣接するヒンジ配列の全部または一部を含むことができる。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４の全ヒンジ配列をそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６、７７、および７８に示す。
【００３４】
ｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、場合によりさらに“リンカー”配列を含むことができる。リンカーは主に、ポリペプチドと第２のヘテロロガスポリペプチドもしくは他のタイプの融合配列との間の、または２以上のバリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド間の、スペーサーとして作用する。１態様において、リンカーは互いにペプチド結合により連結したアミノ酸、好ましくはペプチド結合により連結した１〜２０個のアミノ酸から構成され、その際、アミノ酸は２０種類の天然アミノ酸から選択される。当業者に理解されるように、これらのアミノ酸のうち１以上がグリコシル化されていてもよい。１態様において、これらの１〜２０個のアミノ酸はグリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、およびリジンから選択される。好ましくは、リンカーは大部分が立体障害のないアミノ酸、たとえばグリシンおよびアラニンから構成される。リンカーの例はポリグリシン(特に（Ｇｌｙ）５、（Ｇｌｙ）８、ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）、およびポリアラニンである。後記の実施例中に示す適切なリンカーの一例は、（Ｇｌｙ）４Ｓｅｒ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５）である。他の例において、ｖＡｃｔＲＩＩＢはヒンジリンカーを含むことができる；すなわち、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９に示すように、リンカー配列がヒンジ部に隣接して付与されている。
【００３５】
リンカーは非ペプチドリンカーであってもよい。たとえば、アルキルリンカー、たとえば−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−Ｃ（Ｏ）−を使用でき、ここでｓ＝２〜２０である。これらのアルキルリンカーはさらに、立体障害をもたらさないいずれかの基、たとえば低級アルキル（たとえばＣ１〜Ｃ６）低級アシル、ハロゲン（たとえばＣｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニルなどで置換されていてもよい。
【００３６】
１態様においては、ｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをＦｃポリペプチドに直接に、またはリンカーにより、またはヒンジリンカーにより付加することができる。１態様において、ＦｃはヒトＩｇＧ  Ｆｃである。Ｆｃに付加したｖＡｃｔＲＩＩＢには、表１および２に示すように、また本明細書の実施例に記載するように、たとえばｖＡｃｔＲＩＩＢ−ＩｇＧ１Ｆｃ、Ｅ２８Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０）；ｖＡｃｔＲＩＩＢ−ＩｇＧ１Ｆｃ、Ｅ２８Ｗ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２）、ｖＡｃｔＲＩＩＢ−ＩｇＧ１Ｆｃ、Ｅ２８Ｙ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６４）、ｖＡｃｔＲＩＩＢ−ＩｇＧ  Ｆｃ、Ｒ４０Ｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６）、ｖＡｃｔＲＩＩＢ５−ＩｇＧ１Ｆｃ、Ｅ２８Ａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０）、およびｖＡｃｔＲＩＩＢ５−ＩｇＧ１Ｆｃ  Ｅ２８Ｗ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）が含まれる。他の態様には、ｖＡｃｔＲＩＩＢ−ＩｇＧ２  Ｆｃ、Ｅ２８Ｗ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１）、ｖＡｃｔＲＩＩＢ−ＩｇＧ２  Ｆｃ、Ｅ２８Ｙ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３）、およびｖＡｃｔＲＩＩＢ−ＩｇＧ２  Ｆｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５）が含まれる。これらのバリアントは、後記の実施例内で証明するように、生じる凝集が野生型ＡｃｔＲＩＩＢ−ＩｇＧ２  ＩｇＧ２と比較して少ないことが証明された。
【００３７】
本明細書に開示するｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの分解の減少および／または半減期の延長、毒性の低下、免疫原性の低下、および／または生物活性の増大などの目的特性を付与するために、非ポリペプチド分子に付加することもできる。例示分子には、線状ポリマー、たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリリジン、デキストラン；脂質；コレステロール群（たとえばステロイド）；炭水化物、またはオリゴ糖分子が含まれるが、これらに限定されない。
【００３８】
他の観点において、本発明は本発明のｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離された核酸分子を提供する。本明細書中で用いる用語“単離された”は、内因性物質からある程度精製された核酸分子を表わす。１態様において、本発明の核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、６、８、１０、１２、１４、１６、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５２、５４、５６、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、８７、８８、９１、９３、９５、および９７のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。１より多いコドンが同一アミノ酸をコードすることができる既知の遺伝子コード縮重のため、ＤＮＡ配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、５、７、９、１１、１３、１５、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、５１、５３、５５、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、９２、９４、および９６に示すもの、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、５、７、９、１１、１３、１５、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、５１、５３、５５、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、９２、９４、および９６の相補鎖と異なり、なおＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、６、８、１０、１２、１４、１６、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５２、５４、５６、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、８７、８８、９１、９３、９５、および９７のアミノ酸配列をもつポリペプチドをコードするという可能性がある。そのようなバリアントＤＮＡ配列は、産生中に起きるサイレント変異から生じる可能性があり、あるいはこれらの配列の意図的な変異形成の生成物であってもよい。
【００３９】
他の態様において、本発明の核酸分子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、５、７、９、１１、１３、１５、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、５１、５３、５５、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、９２、９４、および９６に示すポリヌクレオチド配列をもつポリヌクレオチド、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、５、７、９、１１、１３、１５、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、５１、５３、５５、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、９２、９４、および９６の相補鎖を含む。他の態様において、本発明は、ストリンジェントなまたは中等度の条件下でＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、５、７、９、１１、１３、１５、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、５１、５３、５５、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、９２、９４、および９６のポリペプチドコード領域とハイブリダイズする核酸分子を提供し、その際、コードされるポリペプチドはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、６、８、１０、１２、１４、１６、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５２、５４、５６、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、８７、８８、９１、９３、９５、および９７に示すアミノ酸配列を含み、コードされるポリペプチドはｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの活性を保持する。
【００４０】
本発明の核酸分子には、一本鎖および二本鎖の両方の形のＤＮＡ、ならびにそのＲＮＡ相補配列が含まれる。ＤＮＡには、たとえばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ、およびその組合わせが含まれる。ゲノムＤＮＡは、常法により、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１もしくは１７のＤＮＡまたはその適切なフラグメントをプローブとして用いることにより単離できる。ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードするゲノムＤＮＡは、多数の種について入手できるゲノムライブラリーから得られる。合成ＤＮＡは、オーバーラップするオリゴヌクレオチドフラグメントを化学合成し、続いてそれらのフラグメントを組み立ててコード領域およびフランキング配列の一部または全部を再構成することにより得ることができる。ＲＮＡは、ｍＲＮＡの高レベル合成を指令する原核細胞発現ベクター、たとえばＴ７プロモーターを用いるベクターおよびＲＮＡポリメラーゼから得ることができる。ｃＤＮＡは、ＡｃｔＲＩＩＢを発現する種々の組織から単離されたｍＲＮＡから調製したライブラリーから得られる。本発明のＤＮＡ分子には、全長の遺伝子ならびにそのポリヌクレオチドおよびフラグメントが含まれる。全長遺伝子は、Ｎ−末端シグナル配列をコードする配列をも含むことができる。
【００４１】
本発明の他の観点においては、前記の核酸配列を含む発現ベクター、およびそのようなベクターで形質転換した宿主細胞、およびｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを製造する方法も提供される。用語“発現ベクター”は、ポリヌクレオチド配列からポリペプチドを発現させるためのプラスミド、ファージ、ウイルスまたはベクターを表わす。ｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを発現させるためのベクターは、ベクターの増殖およびクローニングされた挿入配列の発現に必要な最小配列を含む。発現ベクターは、下記のアセンブリーを含む転写ユニットを含む：（１）遺伝子発現における調節の役割をもつ遺伝子エレメント（１以上）、たとえばプロモーターまたはエンハンサー、（２）ｍＲＮＡに転写されてタンパク質に翻訳されるべき、ｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードする配列、ならびに（３）適切な転写開始配列および転写終止配列。これらの配列はさらに選択マーカーを含むことができる。宿主細胞における発現に適切なベクターは容易に入手でき、前記の核酸分子を標準的な組換えＤＮＡ技術によりそれらのベクターに挿入する。そのようなベクターは、特定の組織において機能するプロモーター、および標的とするヒトまたは動物の細胞におけるｖＡｃｔＲＩＩＢ発現のためのウイルスベクターを含むことができる。ｖＡｃｔＲＩＩＢの発現に適切な発現ベクターの例は、ｖＡｃｔＲＩＩＢポリヌクレオチドを含むｐＤＳＲａ（ＷＯ  ９０／１４３６３に記載、本明細書に援用する）およびそれの誘導体、ならびに当技術分野で既知の、または後記の他のいずれか適切なベクターである。
【００４２】
本発明は、さらにｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを製造する方法を提供する。他の多様な発現系／宿主系を使用できる。これらの系には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：組換えバクテリオファージ、プラスミドもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した微生物、たとえば細菌；酵母発現ベクターで形質転換した酵母；ウイルス発現ベクター（たとえばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（たとえば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）でトランスフェクションした、もしくは細菌発現ベクター（たとえば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した、植物細胞系；または動物細胞系。組換えタンパク質の製造に有用な哺乳動物細胞には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、またはそれらの誘導系、たとえば無血清培地中で増殖するＶｅｇｇｉｅ  ＣＨＯおよび関連細胞系(参照：Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28:31)、またはＤＨＦＲを欠如するＣＨＯ株ＤＸ−Ｂ１１（参照：Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-20）ＣＯＳ細胞、たとえばＣＯＳ−７系列のサル腎細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）（参照：Gluzman et al., 1981, Cell 23:175)、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １６３）、ＲＩＮ、ＭＤＣＫ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １０）細胞系列、アフリカミドリザル腎細胞系列ＣＶ１に由来するＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞系列（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）（参照：McMahan et al., 1991, EMBO J. 10:2821)、ヒト胚腎細胞、たとえば２９３、２９３  ＥＢＮＡもしくはＭＳＲ  ２９３、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換した霊長類細胞系列、正常二倍体細胞、初代組織のインビトロ培養に由来する細胞株、初代外植体、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫもしくはジャーカット細胞。哺乳動物発現により分泌型または可溶性のポリペプチドを産生することができ、これを増殖培地から回収できる。
【００４３】
適切な宿主−ベクター系を用いて、本発明の核酸分子を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞を産生が可能な条件下で培養することにより、ｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを組換え製造する。形質転換した細胞を長期間の高収率ポリペプチド製造に使用できる。そのような細胞を、目的とする発現カセットのほか選択マーカーを含むベクターで形質転換すると、それらの細胞を富化培地中で１〜２日間増殖させた後、選択培地に切り替えることができる。選択マーカーは、導入した配列をうまく発現する細胞を増殖させて回収することができるように設計される。安定に形質転換された耐性細胞塊を、用いる細胞系列に適切な組織培養法により増殖させることができる。組換えタンパク質の発現についての概説は、Methods of Enzymology, v. 185, Goeddell, D.V., ed., Academic Press (1990)中に見ることができる。
【００４４】
ある場合、たとえば原核細胞系を用いるそのような発現の場合には、生物活性にするために、発現した本発明ポリペプチドを“再フォールディング”および酸化して適正な三次元構造にしかつジスルフィド結合を生成させることが必要な可能性がある。再フォールディングは、当技術分野で周知であるいくらかの方法を用いて達成できる。そのような方法には、たとえば可溶化したポリペプチドを、カオトロピック剤の存在下で通常は７より高いｐＨに曝露することが含まれる。カオトロピック剤の選択は封入体可溶化のために用いる選択と同様であるが、一般にカオトロピック剤をより低い濃度で用いる。カオトロピック剤の例はグアニジンおよび尿素である。大部分の場合、再フォールディング／酸化溶液は、システイン橋形成のためのジスルフィドシャフリングを起こさせる特定の酸化還元電位を生じる特定比率の還元剤およびその酸化形をも含有するであろう。若干の慣用される酸化還元対には、システイン／シスタミン、グルタチオン／ジチオビスＧＳＨ、塩化銅（ＩＩ）、ジチオトレイトールＤＴＴ／ジチアンＤＴＴ、および２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−ｂＭＥが含まれる。多くの場合、再フォールディングの効率を高めるために共溶媒を使用できる。慣用される共溶媒には、グリセロール、種々の分子量のポリエチレングリコール、およびアルギニンが含まれる。
【００４５】
さらに、前記のポリペプチドは常法に従って溶液中または固体支持体上で合成できる。種々の自動合成装置が市販されており、既知のプロトコルに従って使用できる。たとえば、Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2d.Ed., Pierce Chemical Co. (1984); Tam et al., J Am Chem Soc, 105:6442, (1983); Merrifield, Science 232:341-347 (1986); Barany and Merrifield, The Peptides, Gross and Meienhofer, eds, Academic Press, New York, 1-284; Barany et al., Int J Pep Protein Res, 30:705-739 (1987)を参照。
【００４６】
本発明のポリペプチドおよびタンパク質は、当業者に周知のタンパク質精製法に従って精製できる。これらの方法は、ある段階でタンパク質画分と非タンパク質画分の粗分画を伴う。ペプチドポリペプチドを他のタンパク質から分離すると、目的とするペプチドまたはポリペプチドをクロマトグラフィー法および電気泳動法によりさらに精製して、部分または完全精製（または均質になるまでの精製）を達成することができる。本明細書中で用いる用語“単離されたポリペプチド”または“精製されたポリペプチド”は、他の成分から単離可能な組成物であって、そのポリペプチドが自然界で得られるそれの状態と比較して何らかの程度精製された組成物を表わすものとする。したがって、精製したポリペプチドはそれが自然界で存在する可能性のある環境から遊離したポリペプチドをも表わす。一般に“精製した”は、他の種々の成分を除去するための分画が施されたポリペプチド組成物であって、発現したそれの生物活性を実質的に保持している組成物を表わすであろう。“実質的に精製された”という用語を用いる場合、この表記は、ペプチドまたはポリペプチド組成物においてそのポリペプチドまたはペプチドがその組成物の主成分を形成するもの、たとえば組成物中のタンパク質の約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、もしくは約９０％またはそれ以上を構成するものを表わすであろう。
【００４７】
精製に用いるのに適切な多様な方法が当業者に周知であろう。これらには、たとえば硫酸アンモニウム、ＰＥＧ、抗体（免疫沈降法）などまたは熱変性による沈殿に続く遠心分離；クロマトグラフィー、たとえばアフィニティークロマトグラフィー（プロテイン−Ａカラム）、イオン交換、ゲル濾過、逆相、ヒドロキシルアパタイト、疎水性相互作用クロマトグラフィー；等電点フォーカシング；ゲル電気泳動；およびこれらの方法の組合わせが含まれる。当技術分野で一般に知られているように、種々の精製工程を実施する順序を変更し、あるいは特定の工程を省いてもなお、実質的に精製されたポリペプチドを製造するのに適切な方法とすることができると考えられる。精製工程の例を後記の実施例に提示する。
【００４８】
ポリペプチドの精製度を定量するための種々の方法が、本明細書の開示からみて当業者に既知であろう。これらには、たとえば活性画分の特異的結合活性を測定するもの、またはＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析により画分中のペプチドもしくはポリペプチドの量を評価するものが含まれる。ポリペプチド画分の純度を評価するための好ましい方法は、その画分の結合活性を計算して、それを最初の抽出物の結合活性と比較し、これにより、本明細書中で“精製倍数”により評価する精製度を計算するものである。結合活性の量を表わすために用いる実際の単位はもちろん、精製を追跡するために選択した個々のアッセイ法、およびそのポリペプチドまたはペプチドが検出可能な結合活性を示すか否かに依存するであろう。
【００４９】
バリアントアクチビンＩＩＢ型ポリペプチドは筋分解カスケードを活性化するリガンドに結合する。リガンドであるアクチビンＡ、ミオスタチン、および／またはＧＤＦ−１１を結合してその活性を阻害することができるｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、後記の実施例に示すように、筋萎縮を伴う疾患に対する療法効力、ならびに特定の癌および他の疾患を処置する効力をもつ。
【００５０】
しかし、野生型ＡｃｔＲＩＩＢまたはＡｃｔＲＩＩＢ５ポリペプチドの発現または精製に際しては凝集が起きる可能性がある。この凝集には、発現中における構造化オリゴマー形成、ならびに発現中およびポリペプチド精製後の両方における非構造化凝集体生成が含まれる。
【００５１】
構造分析、分子モデリング、および質量分析を組み合わせた方法で、グリコシレーションされていないＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド間の静電相互作用および水素結合相互作用により補助された分子間ジスルフィド結合形成によってＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに多量体形成が生じる可能性のあることが指摘された。２つのＡｃｔＲＩＩＢ分子の境界；たとえば１つのＡｃｔＲＩＩＢのＥ２８側鎖と他のＡｃｔＲＩＩＢのＲ４０側鎖との間に、有意の水素結合がある。さらに、１つのＡｃｔＲＩＩＢのＥ２８と他のＡｃｔＲＩＩＢのＲ４０との間に、重大な静電相互作用がある。
【００５２】
これらの静電相互作用は、一時的なＡｃｔＲＩＩＢ二量体の集団を増加させ、その結果ＡｃｔＲＩＩＢ単位間の非共有結合および／または共有結合の形成を促進する、著しい原因となる可能性がある。残基Ｅ２８とＲ４０間の相互作用は、これらの相互作用のうち最も重大なものである；これら２残基は二重の水素結合および強い静電相互作用に関与するからである。残基Ｅ２８およびＲ４０はＡｃｔＲＩＩＢ：ＡｃｔＲＩＩＢ相互作用に関与し、ＡｃｔＲＩＩＢ：リガンド相互作用には関与しない。したがって、残基２８および４０を本発明に従って非−自然アミノ酸と置換して、これら受容体ポリペプチドの溶解度を改善し、凝集を低下させることができる。したがって、後記に示すように、Ｅ２８およびＲ４０をそれぞれ他の可能な天然アミノ酸で置換し、発現させ、Ｂｉａｃｏｒｅにより試験した。Ｂｉａｃｏｒｅにより測定した結合を後記の実施例２の表１Ａおよび１Ｂに示す。さらに、ｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの凝集率を後記において測定する。
【００５３】
後記実施例の結果は、本明細書に記載するアミノ酸置換をもつｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよびタンパク質について、ミオスタチン、アクチビンＡ、またはＧＤＦ−１１を結合および中和する能力を保持した状態で凝集が低下することを示す。
【００５４】
抗体
本発明はさらに、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに結合する抗体を含み、これには本発明のｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに特異的に結合するものが含まれる。本明細書中で用いる用語“特異的に結合する”は、ｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに対して１０６Ｍ−１以上の結合親和性（Ｋａ）をもつ抗体を表わす。本明細書中で用いる用語“抗体”は、たとえば下記のものを含めた無傷の抗体を表わす：ポリクローナル抗体（たとえばAntibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds), Cold Spring Harbor Press, (1988)を参照)、およびモノクローナル抗体（たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏｓ．ＲＥ  ３２，０１１、４，９０２，６１４、４，５４３，４３９および４，４１１，９９３、ならびにMonoclonal Antibodies: A New Dimension in Biological Analysis, Plenum Press, Kennett, McKearn and Bechtol (eds.) (1980)を参照)。本明細書中で用いる用語“抗体”は、抗体のフラグメント、たとえばＦ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃ、および一本鎖抗体をも表わし、これらは組換えＤＮＡ技術により、または無傷抗体の酵素開裂もしくは化学的開裂により製造される。用語“抗体”は二重特異性または二重機能性抗体をも表わし、これらは２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位をもつ人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’フラグメントの連結を含めた多様な方法により製造できる（参照：Songsivilai et al, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990), Kostelny et al., J. Immunol.148:1547-1553 (1992))。
【００５５】
本明細書中で用いる用語“抗体”は、キメラ抗体、すなわちヒト抗体免疫グロブリン定常ドメインが１以上の非ヒト抗体免疫グロブリン可変ドメインに結合した抗体、またはそのフラグメントをも表わす（たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，５９５，８９８およびＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，６９３，４９３を参照）。抗体は“ヒト化”抗体（たとえばＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，８１６，５６７およびＷＯ  ９４／１０３３２を参照）、ミニボディー（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）（ＷＯ  ９４／０９８１７）、マキシボディー（ｍａｘｉｂｏｄｉｅｓ）、およびトランスジェニック動物が産生する抗体をも表わし、その際、ある割合のヒト抗体産生遺伝子を含むけれども内因性抗体の産生を欠如するトランスジェニック動物は、ヒト抗体を産生することができる(たとえば、Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997)、およびＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．６，３００，１２９を参照）。用語“抗体”には、多量体抗体、すなわちより高次のタンパク質複合体、たとえばヘテロ二量体抗体、および抗イディオタイプ抗体も含まれる。“抗体”には、抗イディオタイプ抗体も含まれる。ｖＡｃｔＲＩＩＢに対する抗体を用いて、たとえばｖＡｃｔＲＩＩＢをインビトロおよびインビボで同定および定量することができる。
【００５６】
いずれかの哺乳動物からのポリクローナル抗体、たとえばマウスおよびラットの抗体、ならびにウサギ抗体であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、６、８、１０、１２、１４、１６、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５２、５４、５６、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、８７、８８、９１、９３、９５、および９７を含めた本明細書に記載するｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドに特異的に結合するものも含まれる。
【００５７】
そのような抗体は研究用ツールとして、および本明細書に開示するポリペプチドを検出およびアッセイするための定量アッセイに利用される。そのような抗体は、本明細書に記載する方法および当技術分野で既知の方法を用いて調製できる。
【００５８】
医薬組成物
本発明のｖＡｃｔＲＩＩＢタンパク質およびポリペプチドを含有する医薬組成物も提供される。そのような組成物は、治療または予防に有効な量のポリペプチドまたはタンパク質を医薬的に許容できる物質および生理的に許容できる配合物質と混合したものを含む。医薬組成物は、たとえば組成物のｐＨ、モル浸透圧、粘度、澄明度、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸着または透過を改変、維持または保持するための配合物質を含有することができる。適切な配合物質には下記のものが含まれるが、これらに限定されない：アミノ酸（たとえばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；抗微生物薬；抗酸化剤（たとえばアスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム）；緩衝剤（たとえばホウ酸塩、炭酸水素塩、トリス−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、他の有機酸）；増量剤（たとえばマンニトールまたはグリシン）、キレート化剤（たとえばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；複合体形成剤（たとえばカフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン）；充填剤；単糖類；二糖類および他の炭水化物（たとえばグルコース、マンノース、またはデキストリン）；タンパク質（たとえば血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；着色剤；着香剤および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（たとえばポリビニルピロリドン）；低分子量ポリペプチド；塩形成性の対イオン（たとえばナトリウム）；保存剤（たとえば塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素）；溶剤（たとえばグリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール）；糖アルコール（たとえばマンニトールまたはソルビトール）；懸濁化剤；界面活性剤または湿潤剤（たとえばｐｌｕｒｏｎｉｃ類、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ類、たとえばｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ２０、ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０、トライトン（ｔｒｉｔｏｎ）、トロメタミン（ｔｒｏｍｅｔｈａｍｉｎｅ）、レシチン、コレステロール、チロキサパル（ｔｙｌｏｘａｐａｌ））；安定性向上剤（ショ糖またはソルビトール）；張性増強剤（たとえばアルカリ金属ハロゲン化物（好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトールソルビトール））；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤および／または医薬佐剤（Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18thEdition, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company, 1990)。
【００５９】
最適な医薬組成物は、たとえば意図する投与経路、送達方式、および目的投与量に応じて当業者により決定されるであろう。たとえば前掲のRemington’s Pharmaceutical Sciencesを参照。そのような組成物は、ポリペプチドの物理的状態、安定性、インビボ放出速度、およびインビボクリアランス速度に影響を及ぼすことができる。たとえば、適切な組成物は非経口投与用の注射用水、生理食塩水の溶液であってもよい。
【００６０】
医薬組成物中の主なビヒクルまたはキャリヤーは、水性または非水性であってよい。たとえば、適切なビヒクルまたはキャリヤーは注射用水、生理食塩溶液、または人工脳脊髄液に、おそらく非経口投与用の組成物に慣用される他の物質を補ったものであってもよい。中性緩衝化した生理食塩水または血清アルブミンと混合した生理食塩水は、ビヒクルのさらに他の例である。医薬組成物の他の例は、約ｐＨ７．０〜８．５のトリス緩衝液、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝液を含み、これらはさらにソルビトールまたはその適切な代替物を含有することができる。本発明の１態様において、組成物は目的純度の選択した組成物を任意配合剤（前掲のRemington’s Pharmaceutical Sciences）と混合することにより、凍結乾燥ケークまたは水溶液の形で保存用として調製できる。さらに、前記の療法用組成物は、適切な賦形剤、たとえばショ糖を用いて、凍結乾燥品として配合することができる。
【００６１】
前記の配合物を多様な方法で、たとえば吸入療法、経口、または注射により送達できる。非経口投与を意図する場合、本発明に使用するための療法用組成物は、目的ポリペプチドを医薬的に許容できるビヒクル中に含む、発熱物質を含まない、非経口用として許容できる水溶液の形であってもよい。非経口注射に特に適切なビヒクルは無菌蒸留水であり、これにポリペプチドを適正に保存処理した無菌等張溶液として配合できる。さらに他の調製法は、製剤の制御放出または持続放出をもたらす注射可能なマイクロスフェア、生分解性粒子、ポリマー化合物（ポリ乳酸、ポリグリコール酸）、ビーズ、またはリポソームなどの物質を目的分子に配合することを伴い、次いで製剤をデポー注射により送達することができる。ヒアルロン酸も使用でき、これは循環中における持続滞留を促進する効果をもつことができる。目的分子を導入するのに適切な他の手段には、埋込み可能な薬物送達デバイスが含まれる。
【００６２】
他の観点において、注射投与に適切な医薬配合物は、水溶液中に、好ましくは生理的に適合性の緩衝液、たとえばハンクス液、リンガー液、または緩衝化生理食塩水中に配合できる。水性の注射用懸濁液剤は、懸濁液の粘度を増大させる物質、たとえばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含有することができる。さらに、有効化合物の懸濁液剤は、適宜、油性の注射用懸濁液剤として調製することができる。適切な親油性の溶剤またはビヒクルには、脂肪油、たとえばゴマ油、または合成脂肪酸エステル、たとえばオレイン酸エチル、トリグリセリド、またはリポソームが含まれる。非脂質系のポリカチオン性アミノポリマーも送達のために使用できる。場合により懸濁液剤は、適切な安定剤、または化合物の溶解度を高めて高濃度液剤を調製するための物質をも含有することができる。他の態様において、医薬組成物は吸入用として配合することができる。吸入用液剤には、エアゾール送達のための噴射剤を配合することもできる。さらに他の態様において、液剤を噴霧することができる。肺投与については、化学修飾したタンパク質の肺送達を記載したＰＣＴ出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５に詳細に記載されている。
【００６３】
特定の配合物は経口投与できることも考慮される。本発明の１態様において、この様式で投与される分子には、固体剤形、たとえば錠剤およびカプセル剤の配合に慣用されるキャリヤーを配合してもよく、配合しなくてもよい。たとえばカプセル剤は、生物学的利用能が最大となりかつ全身前分解（ｐｒｅ−ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）が最小限に抑えられる胃腸管の地点で配合物の有効部分を放出するように設計することができる。療法分子の吸収を容易にする追加物質を含有させることができる。希釈剤、着香剤、低融点ろう、植物油、滑沢剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、および結合剤も使用できる。経口投与用の医薬組成物は、当技術分野で周知の医薬的に許容できるキャリヤーを経口投与に適切な量で用いて配合することもできる。そのようなキャリヤーにより、医薬組成物を患者が摂取できる錠剤、丸剤、糖衣丸、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液剤などとして配合することが可能になる。
【００６４】
経口用の医薬製剤は、有効化合物を固体賦形剤と混和し、得られた顆粒混合物を（場合により粉砕した後に）加工して錠剤または糖衣丸コアを得ることにより得ることができる。所望により、適切な助剤を添加することができる。適切な賦形剤には、炭水化物またはタンパク質系の充填剤、たとえば糖類が含まれ、これには乳糖、ショ糖、マンニトール、およびソルビトール；トウモロコシ、コムギ、コメ、バレイショ、または他の植物からのデンプン；セルロース、たとえばメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウム；アラビアゴムおよびトラガントゴムを含めたゴム；ならびにタンパク質、たとえばゼラチンおよびコラーゲンが含まれる。所望により、崩壊剤または可溶化剤、たとえば架橋ポリビニルピロリドン、寒天、およびアルギン酸またはその塩、たとえばアルギン酸ナトリウムを添加してもよい。
【００６５】
糖衣丸コアを適切なコーティング、たとえば濃厚な糖溶液と共に使用でき、これはアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポール（ｃａｒｂｏｐｏｌ）ゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適切な有機溶剤または溶剤混合物を含有することもできる。製品の識別のために、または有効化合物の量、すなわち投与量の特徴付けのために、染料または色素を錠剤または糖衣丸のコーティングに添加してもよい。
【００６６】
経口使用できる医薬製剤は、ゼラチン製の滑り嵌めカプセル、およびゼラチン製の密閉型軟カプセル、ならびにコーティング、たとえばグリセロールまたはソルビトールをも含むことができる。滑り嵌めカプセルは、有効成分を充填剤または結合剤、たとえば乳糖またはデンプン、滑沢剤、たとえばタルクまたはステアリン酸マグネシウム、および場合により安定剤と混合したものを収容することができる。軟カプセルの場合、安定剤を含むかまたは含まない適切な液体、たとえば脂肪油、液体、または液体ポリエチレングリコールに、有効化合物を溶解または懸濁することができる。
【００６７】
他の医薬組成物は当業者に自明であろう；これには、持続送達または制御送達配合物中にポリペプチドを含む配合物が含まれる。多様な他の持続送達または制御送達手段、たとえばリポソームキャリヤー、生分解性微粒子または多孔質ビーズおよびデポー注射剤を配合するための方法も当業者に既知である。たとえば、医薬組成物を送達するための多孔質ポリマー微粒子の制御放出を記載したＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９を参照。持続放出製剤の他の例には、造形品、たとえばフィルムまたはマイクロカプセルの形の半透性ポリマーマトリックスが含まれる。持続放出マトリックスには、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（Ｕ．Ｓ．３，７７３，９１９、ＥＰ  ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸およびガンマ−Ｌ−グルタミン酸エチルのコポリマー(Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 (1983)、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）(Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277, (1981); Langer et al., Chem. Tech.,12:98-105(1982))、エチレンビニルアセテート(Langer et al.、前掲)、またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ  １３３，９８８）を含めることができる。持続放出組成物はリポソームも含むことができ、これは当技術分野で既知の幾つかの方法のいずれかにより調製できる。たとえばEppstein et al., PNAS (USA), 82:3688 (1985)；ＥＰ  ３６，６７６；ＥＰ  ８８，０４６；ＥＰ  １４３，９４９を参照。
【００６８】
インビボ投与に用いる医薬組成物は、一般に無菌でなけれぱならない。これは無菌濾過膜を通して濾過することにより達成できる。組成物を凍結乾燥する場合、この方法による無菌処理は凍結乾燥および再構成の前または後に実施できる。非経口投与用の組成物は、凍結乾燥した形または溶液で貯蔵できる。さらに、非経口組成物は一般に、無菌取出し口を備えた容器、たとえば皮下注射針で穿孔できるストッパー付きの静脈内投与用液剤バッグまたはバイアルに入れられる。
【００６９】
医薬組成物が配合されると、それを無菌バイアル内に液剤、懸濁液剤、ゲル剤、乳剤、固体、または脱水もしくは凍結乾燥した粉末として貯蔵できる。それらの配合物はそのまま使用できる剤形または投与前に再構成する必要がある剤形（たとえば凍結乾燥品）で貯蔵できる。
【００７０】
特定の態様において、本発明は一回量投与単位を調製するためのキットに関する。これらのキットは、それぞれ乾燥タンパク質を入れた第１容器と水性配合物を入れた第２容器の両方を収容することができる。本発明の範囲には、単一チャンバーおよび多チャンバー型の充填済み注射器（たとえば液剤注射器および凍結乾燥製剤注射器（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を収容したキットも含まれる。
【００７１】
療法に用いる医薬組成物の有効量は、たとえば療法の状況および目的に依存するであろう。したがって、処置に適切な投与量レベルが、一部は、送達される分子、前記のポリペプチドを用いる適応症、投与経路、ならびに患者の体格（体重、体表面積または臓器サイズ）および状態（年齢および全般的な健康状態）に応じて異なることは、当業者に認識されるであろう。したがって、最適な療法効果を得るために臨床医が投与量を判定し、投与経路を改変することができる。一般的な投与量は、前記に述べた要因に応じて約０．１ｍｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇの範囲にまで及ぶことができる。ポリペプチド組成物は、好ましくは静脈内に注射または投与することができる。持効性の医薬組成物は、その配合物の半減期およびクリアランス速度に応じて３〜４日毎、毎週、または隔週に投与することができる。投与頻度は、用いる配合物中のポリペプチドの薬物動態パラメーターに依存するであろう。一般に、目的効果を達成する量に達するまで組成物を投与する。したがって、本発明組成物を一回量として、または多数回量として（同一または異なる濃度／用量で）経時的に、または連続注入として投与することができる。さらに適量の改良をルーティンに行なう。適量は適宜な用量−応答データの使用により確認できる。
【００７２】
医薬組成物の投与経路は既知の方法に従う；たとえば経口；注射：静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、病変部内経路、骨髄内、クモ膜下、心室内、経皮、皮下、もしくは腹腔内による；および鼻腔内、腸内、局所、舌下、尿道、膣、もしくは直腸手段、持続放出系による、または埋込みデバイスによる。所望により、組成物をボーラス注射により、または連続的に注入により、または埋込みデバイスにより投与することができる。あるいは、またはさらに、目的分子を吸収または封入した膜、スポンジその他の適切な材料の埋込みにより、組成物を局所投与することができる。埋込みデバイスを用いる場合、デバイスをいずれか適切な組織または臓器に埋め込むことができ、目的分子の送達は拡散、定時放出ボーラス、または連続投与によるものであってもよい。
【００７３】
ある場合には、本明細書に記載した方法で遺伝子工学的に処理した特定の細胞を移植してポリペプチドを発現および分泌させることにより、本発明のｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを送達することができる。そのような細胞は動物細胞またはヒト細胞であってもよく、オートロガス（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）、ヘテロロガス（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）、または異種（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）であってもよい。場合により、細胞は不死化していてもよい。免疫応答の機会を減らすために、細胞を封入して周囲組織の浸潤を避けることができる。封入材料は一般に、ポリペプチド生成物（１以上）の放出は可能であるけれども患者の免疫系または周囲組織からの他の有害因子による細胞破壊を阻止する生体適合性、半透性のポリマー系封入材または膜である。
【００７４】
ｖＡｃｔＲＩＩＢまたはｖＡｃｔＲＩＩＢ誘導体をコードする核酸分子を対象に直接導入する、インビボでのｖＡｃｔＲＩＩＢ遺伝子療法も想定される。たとえば、ｖＡｃｔＲＩＩＢをコードする核酸配列を、適宜な送達ベクター、たとえばアデノ随伴ウイルスベクターを用いて、または用いずに、核酸構築体の局所注射により標的細胞に導入する。選択しうるウイルスベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペス、ウイルスおよびパピローマウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。このウイルスベクターの物理的トランスファーは、インビボで、目的とする核酸構築体、または目的とする核酸配列を含む他の適切な送達ベクターの局所注射、リポソーム仲介トランスファー、直接注射（裸のＤＮＡ）、または微粒子衝突（遺伝子銃）により達成できる。
【００７５】
ｖＡｃｔＲＩＩＢ組成物の使用
本発明は、ミオスタチン、アクチビンＡ、またはＧＤＦ−１１の量または活性を、これらのポリペプチドとｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの接触によりインビボおよびインビトロで減少または中和するための方法および医薬組成物を提供する。ｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ミオスタチン、アクチビンＡ、およびＧＤＦ−１１に対して高い親和性をもち、ミオスタチン、アクチビンＡ、およびＧＤＦ−１１のうち少なくとも１つの生物活性を低下および阻害することができる。ある態様において、ｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは野生型ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドと比較して改良された活性を示す。これを後記の実施例において証明する。
【００７６】
１観点において本発明は、有効量のｖＡｃｔＲＩＩＢ組成物を対象に投与することにより、その処置を必要とする対象においてミオスタチン関連および／またはアクチビンＡ関連の障害を処置するための方法および薬剤を提供する。本明細書中で用いる用語“対象”は、いずれかの動物、たとえばヒトを含めた哺乳動物を表わす。
【００７７】
本発明の組成物は、体重に対するパーセントとしての除脂肪筋量を増加させ、体重に対するパーセントとしての脂肪量を減少させるために用いられる。
【００７８】
ｖＡｃｔＲＩＩＢ組成物により処置できる障害には、種々の形の筋消耗、ならびに代謝障害、たとえば糖尿病および関連障害、ならびに骨変性性疾患、たとえば骨粗鬆症が含まれるが、これらに限定されない。ｖＡｃｔＲＩＩＢ組成物は、後記の実施例３に示す種々の疾患モデルにおいて筋消耗性障害の処置に有効であることが証明された。これは、インヒビン−α−ノックアウトマウスの処置、大腸−２６悪液質モデルにおける筋消耗の処置、後足懸垂モデルにおける筋萎縮の予防、ＯＸＹ雌の処置において、除脂肪筋量の増加、脂肪量の減少および骨無機質含量の増加を示すことを証明した。
【００７９】
筋消耗性障害には、ジストロフィー、たとえばデュシェンヌ型筋ジストロフィー、進行性筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、デジェリーヌ−ランドジー型筋ジストロフィー、エルプ型筋ジストロフィー、および乳児神経軸索性筋ジストロフィーも含まれる。さらに他の筋消耗性障害は、慢性の疾患または障害、たとえば筋萎縮性側索硬化症、うっ血性閉塞性肺疾患、癌、エイズ、腎不全、臓器萎縮、アンドロゲン欠乏、およびリウマチ性関節炎から生じる。
【００８０】
ミオスタチンおよび／またはアクチビンの過剰発現は、悪液質、重篤な筋および脂肪消耗症候群をもたらす可能性がある。動物モデルにおける悪液質の処置に際してのｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの有効性を後記の実施例３に示す。悪液質は、リウマチ性関節炎、糖尿病性腎障害、腎不全、化学療法、火傷による傷害、および他の原因によっても生じる。他の例において、ミオスタチン−免疫反応性タンパク質の血清濃度および筋内濃度がエイズ関連の筋消耗を示す雄において上昇することが見いだされ、これらは除脂肪体重と逆相関していた(Gonzalez-Cadavid et al., PNAS USA 95: 14938-14943 (1998))。ミオスタチン濃度は火傷傷害に応答して上昇し、その結果、筋異化作用が生じることも示された(Lang et al, FASEB J 15, 1807-1809 (2001))。筋消耗をもたらす他の状態は、能力障害による非活動、たとえば車椅子拘束、長期間の床上安静：卒中、疾病、脊髄損傷、骨折または外傷によるもの、および極微重力環境（宇宙飛行）における筋萎縮から生じる可能性がある。たとえば、血漿ミオスタチン免疫反応性タンパク質は、長期間の床上安静後に増加することが見いだされた(Zachwieja et al. J Gravit Physiol. 6(2): 11(1999)。スペースシャトル飛行中に極微重力環境に曝露されたラットの筋は曝露されなかったラットの筋と比較してミオスタチン量の増加を示すことも見いだされた(Lalani et al., J.Endocrin 167 (3): 417-28 (2000))。
【００８１】
さらに、加齢に伴う脂肪−対−筋比の増大、および加齢性筋萎縮はミオスタチンに関連すると思われる。たとえば、平均血清ミオスタチン免疫反応性タンパク質は青年期（１９〜３５歳）、中年期（３６〜７５歳）、および高年期（７６〜９２歳）の男性および女性のグループにおいて年齢と共に増加し、一方、平均筋量および除脂肪体重はこれらのグループにおいて年齢と共に減少した(Yarasheski et al. J Nutr Aging 6(5):343-8 (2002))。さらに、ミオスタチンは心筋に低濃度で発現し、梗塞後の心筋細胞において発現がアップレギュレートされることが、現在認められている(Sharma et al., J Cell Physiol. 180 (1):1-9 (1999))。したがって、心筋においてミオスタチン濃度を低下させると梗塞後の心筋が回復する可能性がある。
【００８２】
ミオスタチンは、２型糖尿病、非インスリン依存型糖尿病、高血糖症、および肥満症を含めた代謝障害にも影響を及ぼすと思われる。たとえば、ミオスタチン欠如が肥満症および糖尿病の表現型の２匹のマウスモデルを改善することが示された(Yen et al. FASEB J. 8:479 (1994)。米国特許出願ｎｏ：１１／５９０，９６２、米国特許出願公開Ｎｏ：２００７／０１１７１３０に、ＡＡＶ−ＡｃｔＲＩＩＢ５ベクターが、動物において、特に肥満症の動物モデルについて、筋−対−脂肪比を増大させることが証明されている。本発明のｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド、たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、６、８、１０、１２、１４、１６、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、５２、５４、５６、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、８７、８８、９１、９３、９５は、そのような用途に適切である。したがって、本発明の組成物を投与することにより脂肪組成を低下させると、動物において糖尿病、肥満症、および高血糖の状態が改善されるであろう。さらに、ＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドについて米国特許出願ｎｏ：１１／５９０，９６２、米国特許出願公開Ｎｏ：２００７／０１１７１３０において証明されたように、ｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを含有する組成物は肥満症の個体において食物摂取量を減少させることができる。
【００８３】
本発明のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを投与すると、骨強度を改善し、骨粗鬆症および他の変性性骨疾患を軽減することができる。これは後記のＯＶＸマウスモデルにおいて証明された。たとえばミオスタチン欠損マウスは、マウス上腕骨の無機質含量および密度の増大、ならびに骨梁骨および皮質骨の筋付着領域における無機質含量増大、ならびに筋量増加を示すことも見いだされた(Hamrick et al. Calcif Tissue Int 71(1):63-8 (2002))。さらに、本発明のｖＡｃｔＲＩＩＢ組成物は、アンドロゲン欠乏、たとえば前立腺癌の処置に用いるアンドロゲン欠乏療法の影響を処置するために使用できる。
【００８４】
本発明は、有効量のｖＡｃｔＲＩＩＢタンパク質を動物に投与することにより食用動物において筋量を増加させるための方法および組成物をも提供する。成熟Ｃ−末端ミオスタチンポリペプチドは試験したすべての種において同一であるので、ｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、ウシ、ニワトリ、シチメンチョウ、およびブタを含めた農業に重要ないかなる種においても、筋量を増加させ、脂肪を減少させるのに有効であると期待される。
【００８５】
本発明のｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドおよび組成物は、アクチビンＡの活性にも拮抗する。アクチビンＡは、特定のタイプの癌、特に生殖腺腫瘍、たとえば卵巣癌において発現し、重篤な悪液質を引き起こすことが知られている(Ciprano et al. Endocrinol 141 (7):2319-27 (2000), Shou et al., Endocrinol 138 (11):5000-5 (1997); Coerver et al, Mol Endocrinol 10(5):534-43 (1996); Ito et al. British J Cancer 82(8):1415-20 (2000), Lambert-Messerlian, et al, Gynecologic Oncology 74:93-7 (1999)。後記の実施例３において、本発明のｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは重篤な悪液質の処置、腫瘍サイズの縮小、および生存率の延長に有効であることがインヒビン−α−ノックアウトマウスモデルおよび大腸−２６悪液質マウスモデルにおいて証明された。したがって、本明細書に開示する組成物を用いて、アクチビンＡの過剰発現およびミオスタチンの発現に関連する状態、たとえば特定の癌により生じる悪液質を処置し、特定の生殖腺タイプの腫瘍を処置することができる。
【００８６】
本明細書に開示する組成物は、単独で、または他の療法薬と組み合わせてそれらの療法効果を高めるかまたは潜在的な副作用を軽減するために、使用できる。これらの特性には、活性の増大、溶解度の増大、分解の減少、半減期の延長、毒性の低下、および免疫原性の低下が含まれる。したがって、本明細書に開示する組成物は長期間の処置計画に有用である。さらに、本発明化合物の親水性と疎水性の特性はバランスが良く、これによりインビトロおよび特にインビボの両方におけるそれらの有用性が高まる。具体的には、本明細書に開示する化合物は、体内での吸収および生物学的利用能を可能にする水性媒質中で適度な溶解度をもち、一方、化合物が細胞膜を越えて推定機能部位、たとえば特定の筋塊へ移行するのを可能にする脂質中でもある程度の溶解度をもつ。
【００８７】
さらに、本発明のｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは多数のアッセイ法のいずれかにおいてミオスタチン、アクチビンＡ、またはＧＤＦ−１１を検出および定量するのに有用である。一般に本発明のＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドは、多様なアッセイ法においてミオスタチン、アクチビンＡ、またはＧＤＦ−１１を結合および固定化するための捕獲剤として有用である；たとえばAsai, ed., Methods in Cell Biology, 37, Antibodies in Cell Biology, Academic Press, Inc., ニューヨーク(1993)に記載のものと同様。これらのポリペプチドをある様式で標識することができ、あるいはミオスタチンを検出および定量できるように標識された第３の分子、たとえば抗体と反応させることができる。たとえば、ポリペプチドまたは第３の分子を検出可能な部分、たとえばビオチンで修飾し、次いでこれを第４の分子、たとえば酵素標識ストレプトアビジンまたは他のタンパク質により結合することができる(Akerstrom, J Immunol 135:2589 (1985); Chaubert, Mod Pathol 10:585 (1997))。
【実施例】
【００８８】
本発明について記載したが、以下の実施例は説明のために提示され、限定のためのものではない。
【００８９】
実施例１
ｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発現および精製
バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの発現および精製のために下記の方法を用いた。
【００９０】
ヒトアクチビンタイプＩＩＢ受容体のｃＤＮＡをヒト精巣由来のｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．）から単離し、米国特許出願ｎｏ：１１／５９０，９６２、米国特許出願公開Ｎｏ：２００７／０１１７１３０の記載に従ってクローニングした。
【００９１】
アミノ酸置換の決定
構造分析、分子モデリング、および質量分析を組み合わせた方法で、グリコシレーションされていないＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド間の静電相互作用および水素結合相互作用により誘発された分子間ジスルフィド結合形成によってＡｃｔＲＩＩＢに凝集（オリゴマー形成）が生じる可能性のあることが指摘された。残基２８および４０はＡｃｔＲＩＩＢ：ＡｃｔＲＩＩＢ相互作用に関与し、ＡｃｔＲＩＩＢとそれのリガンドとの相互作用には関与しないと判定された。
【００９２】
まず、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ上のＥ２８およびＲ４０をそれぞれの位置においてＡで置換した。光散乱および質量分析により、完全グリコシレーションされたｖＡｃｔＲＩＩＢ−ＩｇＧ１Ｆｃ  Ｅ２８Ａ、およびｖＡｃｔＲＩＩＢ−ＩｇＧ１Ｆｃ  Ｒ４０Ａの画分が野生型と比較して有意に増加したことが確認された。Ｅ２８ＡおよびＲ４０Ａ  ｖＡｃｔＲＩＩＢ−ＩｇＧ１Ｆｃを３７℃で６日間インキュベートした結果、野生型と比較してほとんどまたは全く凝集が生じなかった。野生型ＡｃｔＲＩＩＢ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および１８）の発現および精製に際して起きる可能性のある凝集を軽減または阻止するために、位置２８および４０（シグナル配列を含むＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２および１８に関して）におけるアミノ酸置換を行なった。この凝集は、発現中における構造化オリゴマー形成、ならびに発現中およびタンパク質精製後の両方における非構造化凝集体生成であることが確認されている。
【００９３】
産生および精製プロセスの種々の段階での凝集を、下記の方法に従ってサイズ排除クロマトグラフィーにより測定した。
【００９４】
以下に例示した方法を用いて、バリアントＡｃｔＲＩＩＢポリペプチド（ｖＡｃｔＲＩＩＢおよびｖＡｃｔＲＩＩＢ５）を製造した。ｖＡｃｔＲＩＩＢ  Ｅ２８Ｗをコードするポリヌクレオチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）を、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインをコードするポリヌクレオチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２）またはヒトＩｇＧ２  Ｆｃをコードするポリヌクレオチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４）に、ヒンジリンカー配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９をコードするヌクレオチド）を介して、Ｅ２８Ｗを生じる変異を含むプライマーを用いるＰＣＲオーバーラップ延長により融合させた。この全長ポリヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１である。二本鎖ＤＮＡフラグメントを、ｐＴＴ５（Biotechnology Research Institute, National Research Council Canada (NRCC), 6100 Avenue Royalmount, Montreal (Quebec) Canada H4P 2R2)、ｐＤＳＲα（ＷＯ／９０１４３６３に記載）、および／またはｐＤＳＲαの誘導体中へサブクローニングした。他の態様においては、ｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、リンカーＧＧＧＧＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５）もしくはその多量体、および／またはヒンジリンカー（たとえばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）をコードするポリヌクレオチドに付加した。
【００９５】
操作したｖＡｃｔＲＩＩＢ−ＦｃおよびｖＡｃｔＲＩＩＢ５−Ｆｃの一過性発現を下記に従って実施した。
【００９６】
前記２種類の分子の操作したバリアントを、無血清懸濁に適応させた２９３−６Ｅ細胞（National Research Council of Canada、カナダ国オタワ）において一過性発現させた；細胞は、２５０μｇ／ｍｌのゲネチシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および０．１％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州カールズバッド）中に維持された。トランスフェクションを１Ｌの培養として実施した。要約すると、細胞接種物を１．１´１０６細胞／ｍｌになるまで４Ｌのフェルンバッハ振とうフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．）内で増殖させた。この振とうフラスコ培養を、３７℃および５％  ＣＯ２に維持した加湿インキュベーターに入れたＩｎｎｏｖａ  ２１５０シェーカープラットフォーム（Ｎｅｗｓ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ニュージャージー州エディソン）上、６５ＲＰＭで維持した。トランスフェクションの時点で、２９３−６Ｅ細胞を１．０´１０６細胞／ｍｌに希釈した。
【００９７】
トランスフェクション複合体を１００ｍｌのＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地中で形成した。１ｍｇのプラスミドＤＮＡをまず培地に添加し、続いて３ｍｌのＦｕＧｅｎｅ  ＨＤトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、インディアナ州インディアナポリス）を添加した。このトランスフェクション複合体を室温で約１５分間インキュベートし、次いで振とうフラスコ内の細胞に添加した。トランスフェクションの２４時間後に、２０％（ｗ／ｖ）のペプトンＴＮ１（ＯｒｇａｎｏＴｅｃｈｎｉｅ  Ｓ．Ａ．，ＴｅｋｎｉｅＳｃｉｅｎｃｅ、カナダ国ケベック）を最終濃度０．５％（ｗ／ｖ）に達するまで添加した。このトランスフェクション／発現を４〜７日間実施した後、コンディショニングした培地を４，０００ＲＰＭ、４℃で６０分間の遠心分離により収穫した。
【００９８】
安定トランスフェクションおよび発現を下記に従って実施した。ｖＡｃｔＲＩＩＢ−ヒト（ｈｕ）ＩｇＧ２−Ｆｃ細胞系列は、標準エレクトロポレーション法により、安定なＣＨＯ宿主細胞に発現プラスミドｐＤＣ３２３−ｖＡｃｔＲＩＩＢ（Ｅ２８Ｗ）−ｈｕＩｇＧ２  ＦｃおよびｐＤＣ３２４−ｖＡｃｔＲＩＩＢ（Ｅ２８Ｗ）−ｈｕＩｇＧ２  Ｆｃをトランスフェクションすることによって作製された（Bianchi et al., Biotech and Bioengineering, 84(4):439-444 (2003)に従う）。宿主細胞系列に発現プラスミドをトランスフェクションした後、ＧＨＴを含まない無血清選択培地中で細胞を２〜３週間増殖させてプラスミドを選択し、細胞を回収した。細胞を８５％以上の生存率に達するまで選択した。このトランスフェクションした細胞のプールを、次いで１５０ｎＭのメトトレキセートを含有する培地中で培養した。
【００９９】
細胞系列クローニング
下記の方法に従って、選択したクローンから細胞バンクを調製した。安定トランスフェクションした細胞の増殖プールを９６−ウェルプレートに播種し、候補クローンを増殖および生産性能について小規模試験で評価した。約６０個のバイアルのプレマスター細胞バンク（ｐｒｅ−ｍａｓｔｅｒ  ｃｅｌｌ  ｂａｎｋ（ＰＭＣＢ））を、選択したクローンから調製した。すべてのＰＭＣＢを無菌性、マイコプラズマおよびウイルスについて試験した。
【０１００】
ｖＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ発現細胞系列を一般的な供給−バッチ法（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｐｒｏｃｅｓｓ）により規模拡大した。細胞をＷａｖｅバイオリアクター（Ｗａｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＬＬＣ）に接種した。培養物にボーラス供給物を３回供給した。１０Ｌを１０日目に収穫し、残りを１１日目に収穫した；両収穫物を深層濾過（ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）し、続いて無菌濾過した。コンディショニングした培地を１０インチの０．４５／０．２ミクロンプレフィルターで濾過し、続いて６インチの０．２ミクロンフィルターで濾過した。
【０１０１】
タンパク質の精製
ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２の両方）、ＡｃｔＲＩＩＢ５−Ｆｃ  （ＩｇＧ１およびＩｇＧ２の両方）、およびこれらのバリアントを含有する約５Ｌのコンディショニングした培地を、５ｆｔ２の１０Ｋメンブレン接線流フィルター（Ｐａｌｌ）で濃縮した。濃縮された材料を、ＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ；塩化マグネシウムまたは塩化カルシウムを含まないもの）で平衡化した５ｍＬのＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｃｏｌｕｍｎ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライした。カラムを２８０ｎｍにおける吸光度（ＯＤ２８０）が０．１未満になるまでこの平衡化用緩衝液で洗浄した後、結合しているタンパク質を０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．７で溶離し、直ちに１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５で中和した。中和した溶出プールを１ｍｌの体積に濃縮し、ＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ；塩化マグネシウムまたは塩化カルシウムを含まないもの）中で平衡化した３２０ｍｌのＳｅｐｈａｃｒｙｌ−２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライした。４〜２０％  ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に流して、プールすべき画分を判定した。これらのポリペプチドを活性および凝集度について下記に従って試験した。
【０１０２】
場合により、たとえばＳｈｐ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを用いてポリペプチドをさらに精製することができる。ＯＤ２８０により濃度を測定した。
【０１０３】
実施例２
インビトロ活性アッセイ
前記に従って精製したｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドの試料をリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ：２．６７ｍＭの塩化カリウム、１３８ｍＭの塩化ナトリウム、１．４７ｍＭの一塩基性リン酸カリウム、８．１ｍＭの二塩基性リン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）で０．２ｍｇ／ｍｌに希釈し、３７℃で６日間インキュベートし、次いでＭＡＬＤＩ−ＭＳ（matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析)、ＳＥＣおよび／またはＳＥＣ−ＬＳ分析を行なった。下記に従って、プロテインＡ精製工程後の野生型およびバリアントポリペプチドの凝集をＳＥＣまたはＳＥＣ−ＬＳにより判定し、これらの分子の分子量をＭＡＬＤＩ−ＭＳ法により確認した。
【０１０４】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）．２本のカラム（ＴＯＳＯＨＡＡＳ  Ｇ３０００ｓｗｘｌ、７．８ｘ３００ｍｍ）を縦列に備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステムで実験を行なった。２ｘＰＢＳを移動相として０．５ｍｌ／分で用いた。
【０１０５】
サイズ排除クロマトグラフィー−光散乱（ＳＥＣ−ＬＳ）．Ｓｕｐｅｒｄｅｘ−２００ゲル濾過カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ウィスコンシン州ウォーキショー）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステムで実験を行なった。次いで試料をＷｙａｔｔ  ｍｉｎｉＤａｗｎ  ＬＳレーザー光散乱検出器およびＷｙａｔｔ  Ｏｐｔｉｌａｂ  ＤＳＰ屈折計（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．、カリフォルニア州サンタバーバラ）に導通して分子質量を測定した。ＰＢＳを移動相として０．４ｍｌ／分で用いた。
【０１０６】
マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析．試料をシナピン酸（ｓｉｎａｐｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）と混合し（１：１）、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｖｏｙａｇｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２００９）に付与した。この方法を用いて前記分子の分子量を確認した。
【０１０７】
下記に従ってアクチビンおよびミオスタチンに対する結合親和性を測定し、ＩＣ５０値を求めた。
【０１０８】
定量ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）アッセイ．ＩｇＧ１  Ｆｃとの融合体において、前記に従ってＥ２８およびＲ４０をそれぞれ他の天然アミノ酸で置換した。これらは後記の表に示すようにリンカーを用いて、または用いずに作製された。コンディショニングした培地からそれぞれのｖＡｃｔＲＩＩＢ−ＩｇＧ１Ｆｃ試料を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｃａｔ＃  １０９−００５−０９８，ｌｏｔ  ６３５５０）コーティングしたＣＭ５表面に捕獲した。２０ｎＭのアクチビンＡを、ＢＩＡＣｏｒｅ２０００（ＢＩＡＣｏｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州ピスカッタウェイ）により捕獲試料の表面に注入した。得られたセンサーグラムを、捕獲されたｖＡｃｔＲＩＩＢ−ＩｇＧ１ＦｃバリアントのＲＬ（５００ＲＵ）に対して正規化した。若干のバリアントについての正規化した結合応答（ＲＵ）を表２に示し、以下にさらに記載する。アクチビンに対する相対親和性を、哺乳動物細胞の発現から得られたコンディショニングした培地を用いてＢｉａｃｏｒｅ測定により同様に判定した。アクチビンＡ（２０ｎＭ）を用いて、コンディショニングした培地中の可溶性受容体ポリペプチドを捕獲し、測定したＳＰＲ信号を正規化した。正規化したＳＰＲ  ＋＋＋＋＋：＞６０，＋＋＋＋：４０〜６０，＋＋＋：２０〜４０，＋＋：１０〜２０，＋：５〜１０，−：＜５。
【０１０９】
表１Ａおよび表１Ｂに、相対結合データの結果をまとめる。下記の表は、特定の態様のｖＡｃｔＲＩＩＢ−ＩｇＧ１Ｆｃが特に、野生型より高い親和性でアクチビンＡに結合し、あるいは野生型に匹敵する親和性を保持したことを示す。
【０１１０】
【表１Ａ】
0005496682.tif 000002
【０１１１】
【表１Ｂ】
0005496682.tif 000003
【０１１２】
Ｃ２Ｃ１２細胞ベースの活性アッセイ
ｖＡｃｔＲＩＩＢ５−ＩｇＧ１ＦｃおよびｖＡｃｔＲＩＩＢ−ＩｇＧ１Ｆｃバリアントを前記に従って製造した。これらのバリアントがアクチビンＩＩＢ受容体へのアクチビンＡまたはミオスタチンの結合を阻害する能力を、下記に従って細胞ベースの活性アッセイにより試験した。
【０１１３】
ミオスタチン／アクチビン／ＧＤＦ−１１応答性レポーター細胞系列は、Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＲＬ−１７７２）にｐＭＡＲＥ−ｌｕｃ構築体をトランスフェクションすることにより作製した。ｐＭＡＲＥ−ｌｕｃ構築体は、ミオスタチン／アクチビン応答エレメントであるＣＡＧＡ配列(Dennler et al. EMBO 17: 3091-3100 (1998))の１２反復配列をｐＬｕｃ−ＭＣＳレポーターベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ｃａｔ  ＃２１９０８７）のＴＡＴＡボックスの上流にクローニングすることにより作製される。Ｃ２Ｃ１２細胞は、アクチビン受容体ＩＩＢをそれらの細胞表面に自然発現する。ミオスタチン／アクチビンＡ／ＧＤＦ−１１が細胞の受容体を結合すると、Ｓｍａｄ経路が活性化され、リン酸化されたＳｍａｄが前記の応答エレメントに結合し（Macias-Silva et al. Cell 87:1215 (1996))、その結果ルシフェラーゼ遺伝子が発現する。次いでルシフェラーゼ活性を市販のルシフェラーゼレポーターアッセイキット（ｃａｔ  ＃  Ｅ４５５０、Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）により製造業者のプロトコルに従って測定した。ｐＭＡＲＥ−ｌｕｃでトランスフェクションした安定な系列のＣ２Ｃ１２細胞（Ｃ２Ｃ１２／ｐＭＡＲＥ）を用い、下記の方法に従って活性を測定した。レポーター細胞を９６ウェル培養器に播種した。野生型および前記に従って構築したバリアントＡｃｔＲＩＩＢ−ＩｇＧ１  Ｆｃ融合体の希釈液を用いたスクリーニングを、４ｎＭアクチビンに固定した濃度で実施した。アクチビンＡを数種類の濃度の受容体と共にプレインキュベートした。処理した培養物中のルシフェラーゼ活性を判定することによりアクチビン活性を測定した。各ポリペプチドについてＩＣ５０値を判定した。これらを表２に示す。ミオスタチンの測定のために、前記に従って製造したＡｃｔＲＩＩＢ−ｈｕＩｇＧ２  Ｆｃ融合体について同じ操作を行なった。プロテインＡ精製した野生型およびバリアントを、ミオスタチンについて同じ方法によるＩＣ５０値の判定に用いた。この測定のために、ポリペプチドを４ｎＭミオスタチンと共にプレインキュベートした。さらに、前記の方法を用いて凝集度を測定した。これらの値を下記の表３に示す。
【０１１４】
表１Ａに挙げた一組のＡｃｔＲＩＩＢ５−ＩｇＧ１  Ｆｃバリアントのうち数種類のＡｃｔＲＩＩＢ−ＩｇＧ１  Ｆｃバリアントおよび３種類のＡｃｔＲＩＩＢ５−ＩｇＧ１  Ｆｃバリアントを野生型ポリペプチドと共にさらに精製し、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）により２０ｎＭのアクチビンＡにおいて分析した。表２は、アクチビンに対する選択したｖＡｃｔＲＩＩＢ−ＩｇＧ１  ＦｃポリペプチドのＳＰＲ結合親和性を示す。アクチビンＡ（２０ｎＭ）を用いて試料中のｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドを捕獲し、測定したＳＰＲ信号を正規化した。前記の細胞ベースのアクチビン阻害アッセイからＩＣ５０値を求めた。標準誤差はすべての結果について１０％未満であった。
【０１１５】
【表２】
0005496682.tif 000004
【０１１６】
上記の表２に前記で示したように、野生型と比較して、アクチビン遮断に対するｖＡｃｔＲＩＩＢ−ＩｇＧ１Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ）のＩＣ５０値は２．０７ｎＭであり、ｖＡｃｔＲＩＩＢ−ＩｇＧ１Ｆｃ（Ｅ２８Ｙ）のＩＣ５０値は２．１ｎＭであった。さらに、ｖＡｃｔＲＩＩＢ−ＩｇＧ１ＦｃのＥ２８ＷおよびＥ２８Ｙバリアントはいったん精製すると安定であり、凝集しなかった。
【０１１７】
他のバリアントポリペプチドについても細胞ベースのミオスタチン遮断アッセイにおいてＩＣ５０値を判定した。これらのバリアントは、シグナル配列およびＮ−末端の最初の６個のアミノ酸を欠如するトランケートした成熟ｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドであった。これらの配列を表３に示す。表３は、プロテインＡ精製後のタンパク質の凝集率、およびミオスタチンに対するＩＣ５０値を示す。凝集率は野生型と比較してバリアントポリペプチドの方がはるかに低いことが分かる。シグナル配列およびＮ−末端の４個のアミノ酸を含まず、下記に示すものと同一の置換をもつトランケートした成熟ｖＡｃｔＲＩＩＢポリペプチドについても、同様な結果が得られた。
【０１１８】
表３
【０１１９】
【表３−１】
0005496682.tif 000005
【０１２０】
【表３−２】
0005496682.tif 000006
【０１２１】
表４は、配列表のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜９９に対応する配列を確認する。
【０１２２】
【表４−１】
0005496682.tif 000007
【０１２３】
【表４−２】
0005496682.tif 000008
【０１２４】
【表４−３】
0005496682.tif 000009
【０１２５】
【表４−４】
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【０１２６】
実施例３
ｖＡｃｔＲＩＩＢを用いたインビボ処置
下記の動物実験はすべて、トランケートした成熟ｖＡｃｔＲＩＩＢ−ＩｇＧ２  Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ）ポリペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１）を用い、下記の方法に従って実施された。
【０１２７】
インヒビン−α−欠損マウスにおける筋消耗の処置
インヒビン−αは自然界に存在するアクチビンＡ阻害物質である。インヒビン−αを欠如するマウスは、有意に上昇した循環中アクチビンＡ濃度を示し、腫瘍、たとえば卵巣癌、精巣癌および副腎癌の自然形成に関連する致命的な消耗症候群を伴う(Matzuk et al., PNAS 91(19):8817-21 (1994), Cipriano et al. Endocrinology 121(7): 2319-27(2000), Matzuk et al., Nature 360(6402):313-9 (1992))。下記の実験のために、インヒビン-αノックアウトマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。ｖＡｃｔＲＩＩＢ−ＩｇＧ２  Ｆｃ  Ｅ２８Ｗ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１）（以下、Ｅ２８Ｗ、またはＥ２８Ｗポリペプチド、または可溶性受容体Ｅ２８Ｗ）が体重および筋量に及ぼす影響を、インヒビン−αノックアウトマウスにおいて調べた。８週齢の雄のインヒビン−αノックアウトマウスにおける１４日間の一回注射試験を実施した。８週齢の時点で、雄のインヒビン−αノックアウトマウスは同齢の野生型同腹仔対照マウスと比較して体重が２５％以上減少していた。５匹のノックアウトマウスに一回のＥ２８Ｗ（３０ｍｇ／ｋｇ）皮下注射を行ない、一方、５匹のノックアウトマウスに等体積のＰＢＳ（ビヒクル）を０日目に皮下投与した。ベースライン対照として、５匹の同齢の野生型マウスに０日目にビヒクルの一回皮下注射を行なった。マウスを０、７および１４日目に秤量した。１４日目の終了時にすべての動物を屠殺し、それらの除脂肪屠殺体重および腓筋量を剖検により分析した。１４日間の試験期間にわたって、ビヒクル処置したノックアウトマウスの体重は０日目の２２．５ｇから１４日目の２１．４ｇまで約１．１ｇ減少した。これに対し、Ｅ２８Ｗ処置したノックアウトマウスの平均体重は、０日目の２２．１ｇから１４日目の３３．１ｇまで１１ｇの劇的な増加を示した。最終剖検分析により、下記に示すようにインヒビン−αノックアウトマウスにおいてＥ２８Ｗポリペプチドは除脂肪屠殺体重および腓筋量を実質的に倍増させることが明らかになった。Ｅ２８Ｗ処置したノックアウトマウスの平均除脂肪屠殺体重は、約１４．９ｇであった；ビヒクル処置したノックアウトマウスについての約８．０ｇ、およびビヒクル処置した野生型マウスについての約１２．１ｇと比較。Ｅ２８Ｗ処置したノックアウトマウスの腓筋重量（両足からのもの）は、約４２６ｍｇであった；ビヒクル処置したノックアウトマウスについての約２０９ｍｇ、およびビヒクル処置した野生型マウスについての約３２４ｍｇと比較。これらの結果は、体重減少および筋消耗の疾病状態の処置に対するＥ２８Ｗポリペプチドの有効性を示し、それらを下記の表にまとめる。
【０１２８】
【表５】
0005496682.tif 000011
【０１２９】
＊：野生型＋ビヒクルと比較してＰ＜０．０５；＃：ノックアウト＋ビヒクルと比較してＰ＜０．０５。
【０１３０】
Ｅ２８Ｗポリペプチドの投与が精巣および卵巣の腫瘍の形成率に及ぼす影響を、それぞれ雄および雌のインヒビン−αノックアウトマウスにおいて試験した。この試験では、８週齢の雄（ｎ＝５）および９週齢の雌（ｎ＝６）を含む１１匹のインヒビン−αノックアウトマウスを一回のＥ２８Ｗ（３０ｍｇ／ｋｇ）皮下注射により処置し、一方、同齢の雄（ｎ＝５）および雌（ｎ＝６）を含む他の１１匹のインヒビン−αノックアウトマウスに等体積のＰＢＳ（ビヒクル）を一回注射した。さらに、同齢の雄（ｎ＝５）および雌（ｎ＝６）を含む１１匹の野生型同腹仔対照マウスに一回のビヒクル注射を行なった。処置の２週間後、マウスを屠殺し、剖検して、目視確認可能な精巣および卵巣の腫瘍の形成率を調べた。ビヒクル処置したノックアウトマウス１１匹中の１０匹が確認可能な腫瘍を発症したことが観察された。具体的には、精巣および卵巣の腫瘍形成が、試験した５匹中５匹の雄、および６匹中５匹の雌にそれぞれ見られた。これらの腫瘍のサイズは対応する野生型対照マウスの正常な精巣または卵巣より２〜３倍大きいことが認められた。これを図３に示す。Ｅ２８Ｗ処置したインヒビン−αノックアウトマウスのうちわずか１０％（１１匹中の１匹）が目視確認可能な腫瘍形成を示した。具体的には、雌の場合はＥ２８Ｗ処置したノックアウトマウス６匹中の１匹が確認可能な卵巣腫瘍を発症し、一方、処置しなかった６匹中５匹のノックアウト雌は同齢の野生型対照と比較して卵巣のサイズまたは目視形態にほとんどまたは全く変化がなかった。Ｅ２８Ｗ処置した雄のノックアウトマウス５匹中５匹が目視可能な腫瘍を示さず、同齢の野生型対照と比較して精巣のサイズまたは目視形態にほとんどまたは全く変化がなかった。これらの結果は、Ｅ２８Ｗ投与がインヒビン−αノックアウトマウスにおいて精巣および卵巣の腫瘍形成を減少させるのに有効であったことを証明し、癌療法における可溶性受容体療法の臨床有用性を示唆する。
【０１３１】
食欲低下症の処置におけるＥ２８Ｗポリペプチドの有効性を雄のインヒビン−αノックアウトマウスにおいて調べた。この試験で、インヒビン−αノックアウトマウス（ｎ＝５）における飼料消費量は、同齢の野生型マウス（ｎ＝１０）と比較して有意に減少した。Ｅ２８Ｗ処置したインヒビン−αノックアウトマウスの飼料摂取量は、３週間の試験期間中に有意に増加することが観察された。Ｅ２８Ｗ処置したノックアウトマウスにおける１週間の平均飼料摂取量は同齢の野生型対照マウスのものよりわずかに高いレベルまで増加し、ビヒクルで処置したノックアウトの１週間の平均飼料摂取量より約５０％多かった。したがって、このデータはＥ２８Ｗ処置がインヒビン−αノックアウトマウスにおいて食欲低下症の改善にきわめて有効であったことを示す。
【０１３２】
Ｅ２８Ｗ処置が生存率に及ぼす影響を、それぞれ雄および雌のインヒビン−αノックアウトマウスにおいて調べた。雄については約５０日齢のインヒビン−αノックアウトマウス２５匹にＥ２８Ｗポリペプチドを投与し（１０ｍｇ／ｋｇ／週、皮下）、一方、同齢のインヒビン−αノックアウト雄マウス２６匹にビヒクル（ＰＢＳ）を投与した。同齢の野生型雄マウス１９匹にビヒクルを投与し、ベースライン対照として用いた。ビヒクル処置したノックアウトマウスは試験の１５日目（約６５日齢）に死亡し始めた。実験の３４日目（約８４日齢）までに、ビヒクル処置したノックアウトマウスの５０％が死亡し、７８日目（約１２８日齢）までに、それらの１００％が死亡した。これに対し、Ｅ２８Ｗポリペプチドで処置した２５匹のノックアウトマウス、またはビヒクル処置した１９匹の野生型対照マウスは、試験の７８日目（約１２８日齢）以前には全く死亡しなかった。Ｅ２８Ｗ処置したノックアウトマウスにおいては、２５匹中の１匹が試験の７８日目（約１２８日齢）に死亡し、２５匹中の２４匹が１００日目（約１５０日齢）を超えて生存した。ビヒクル処置した野生型対照マウスは１００日の試験期間中、死亡しなかった。雌のインヒビン−αノックアウトマウスにおいても同様な生存結果が得られた。約５０日齢の雌のインヒビン−αノックアウトマウス２２匹をＥ２８Ｗで処置し（１０ｍｇ／ｋｇ／週、皮下）、一方、同齢の雌のインヒビン−αノックアウトマウス２３匹をＰＢＳ（ビヒクル）で処置した。その間に１７匹の野生型雌対照マウスをビヒクルで処置した。ビヒクル処置した雌のノックアウトマウスは試験の４０日目（約９０日齢）に死亡し始めた。実験の５８日目（約１０８日齢）までに、ビヒクル処置した雌のノックアウトマウスの５０％が死亡し、８６日目（約１３６日齢）までに、それらの１００％が死亡した。これに対し、Ｅ２８Ｗ処置した雌のノックアウトマウスの約５％（２２匹中の１匹）が死亡したにすぎず、一方、約９０％（２２匹中の２０匹）が試験の１２０日目（約１７０日齢）を超えて生存した。ビヒクル処置した野生型対照マウスは１２０日の試験期間中、死亡しなかった。したがって、このデータはＥ２８Ｗポリペプチド療法が雄および雌両方のインヒビン−αノックアウトマウスの生存を劇的に延長するのに有効であることを証明する。雄および雌両方のインヒビン−αノックアウトマウスについての模式的な生存率曲線のプロットを図４に示す。
【０１３３】
大腸−２６腫瘍を保有するマウスにおける筋消耗の処置
大腸−２６腫瘍を保有するマウスは、癌性悪液質の研究のための前臨床動物モデルとして広く用いられている(Fujita et al., Int J Cancer 68(5):637-43 (1996), Kwak et al., Cancer Research 64(22):8193-8 (2004))。Ｅ２８Ｗポリペプチドが体重変化、筋量および生存率に及ぼす影響を、この腫瘍保有マウスにおいて調べた。大腸−２６（Ｃ−２６）腫瘍細胞を１０週齢の雄ＣＤＦ１マウス４０匹にマウス当たり０．５ｘ１０６細胞で皮下移植した。腫瘍の移植を０日目に実施した。腫瘍移植後５日目に開始して、２０匹のＣ−２６マウスを１０ｍｇ／ｋｇのｖＡｃｔＲＩＩＢ  ＩｇＧ２  Ｆｃ  Ｅ２８Ｗ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１）の皮下注射により毎週処置し、一方、２０匹のＣ−２６マウスをビヒクル（ＰＢＳ）で処置した。同時に１０匹の同齢および同体重の正常マウスをビヒクル（ＰＢＳ）のみで処置した。体重および飼料摂取量を週３回測定した。腫瘍保有マウスを生存について１日２回検査した。腫瘍サイズを、ＰＣコンピューターに接続したカリパス（Ｕｌｔｒａ−Ｃａｌ  ＩＶ  ＩＰ６５電気カリパス、Ｆｒｅｄ  Ｖ  Ｆｏｗｌｅｒ  Ｃｏ．、マサチュセッツ州ボストン）で測定し、数値をＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌデータファイルのワークシートに自動的に記録した。図５に示すように、腫瘍移植の２週間後に、Ｃ−２６腫瘍を保有するマウスは重篤な悪液質を発症し、それらの体重が劇的に減少した。Ｅ２８Ｗ処置は、腫瘍保有マウスにおいて体重減少を効果的に軽減した。Ｅ２８Ｗで処置した腫瘍保有マウスの平均体重は、ビヒクルで処置した腫瘍保有マウスのものより有意に高かった（ｐ＜０．００１、腫瘍移植後７日目から３３日目まで、不対Ｔ検定、Ｇｒａｐｈ  ｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）。
【０１３４】
Ｅ２８Ｗポリペプチド処置グループとビヒクル処置グループの間に腫瘍サイズの変化はなく、これはこの処置がＣ−２６腫瘍の増殖に対しては影響をもたなかったことを示唆する。最終剖検分析は、Ｅ２８Ｗ処置したＣ−２６腫瘍保有マウスの平均除脂肪屠殺体重および腓筋重量がビヒクルで処置した腫瘍保有マウスのものより有意に高いことを示した（ｐ＜０．００１、除脂肪屠殺体重および腓筋重量の両方について）。Ｅ２８ＷがＣ−２６腫瘍保有マウスの生存率に及ぼす影響を図６に示す。ビヒクル処置マウスは、腫瘍移植後、約１４日目に死亡し始めた。腫瘍移植後３５日目に、ビヒクル処置したＣ−２６腫瘍保有マウス２０匹すべてが死亡した；しかし、Ｅ２８Ｗで処置したＣ−２６腫瘍保有マウス２０匹中の１７匹がなお生存していた。したがって、Ｅ２８Ｗ処置はＣ−２６腫瘍保有マウスの有意の生存延長をもたらした（ｐ＜０．０００１、カイ二乗検定）。したがって、Ｅ２８Ｗポリペプチドは、Ｃ−２６腫瘍保有マウスの体重および筋量の維持だけでなく、生存延長にも有効であった。
【０１３５】
後足懸垂マウスの処置
後足懸垂マウスモデルを用いて、ｖＡｃｔＲＩＩＢ−ＩｇＧ２  Ｆｃ  Ｅ２８Ｗ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１）が非活動状態の筋量に及ぼす影響を調べた。後足懸垂法は、先にCarlson CJ el al（Carlson CJ, Booth FW and Gordon SE: Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 277: R601-RR606, 1999）が報告したものと本質的に同じである。９週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを試験に用いた。合計６０匹のマウスを下記に従って３グループに分けた：１．懸垂しないベースライン対照グループ（２０匹）をビヒクル（ＰＢＳ）で処置したもの、２．後足懸垂グループ（２０匹）をビヒクルで処置したもの、および３．後足懸垂マウスグループ（２０匹）をｖＡｃｔＲＩＩＢ−ＩｇＧ２  Ｆｃ，Ｅ２８Ｗで処置したもの。具体的には、３０ｍｇ／ｋｇのｖＡｃｔＲＩＩＢ−ＩｇＧ２  Ｆｃ  Ｅ２８Ｗまたはビヒクルの一回皮下注射を、前記のグループそれぞれに後足懸垂の開始時点で行なった。長期間にわたり体重変化を週２〜３回測定した。各グループから５匹のマウスを下記の４つの異なる時点で屠殺した：１日目、３日目、７日目、および１４日目。腓筋重量を剖検により測定した。
【０１３６】
下記の表に示すように、後足懸垂により最高１０％の有意の体重減少が生じた。ＡＮＯＶＡにより分析したところ、後足懸垂マウスをｖＡｃｔＲＩＩＢ−ＩｇＧ２  Ｆｃ  Ｅ２８Ｗで処置すると、ビヒクル処置した後足懸垂グループまたは懸垂しなかったベースライン対照グループより高いレベルにまで有意の体重増加が生じた。２週間の試験期間中、ｖＡｃｔＲＩＩＢ−ＩｇＧ２  Ｆｃ  Ｅ２８Ｗ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１）処置グループの平均体重増加は１２．６％であった；それぞれ、ビヒクル処置した懸垂グループの０．２％減少、および懸垂しなかったベースライン対照グループの４．８％増加と比較。時間経過剖検結果は、後足の筋量が体重と平行して変化することを示した。懸垂マウスをｖＡｃｔＲＩＩＢ−ＩｇＧ２  Ｆｃ（Ｅ２８Ｗ）で処置すると、筋損失は完全に軽減した。したがって、この実験の結果はＥ２８Ｗが非活動に関連する筋萎縮の処置に有効であることを示す。
【０１３７】
【表６】
0005496682.tif 000012
【０１３８】
ＯＶＸマウスの処置
卵巣摘除した雌Ｃ５７Ｂｌ６マウス（ＯＶＸ）は、雌の生殖腺機能低下症および骨粗鬆症のモデルであるとみなされる。２４匹の雌Ｃ５７Ｂｌ６マウスを３カ月齢で卵巣摘除し、３カ月間回復させた。６カ月齢で２４匹のＯＶＸマウスおよび２４匹の同齢の擬似手術した対照Ｃ５７Ｂｌ６マウスを、体重、筋量および脂肪量（ＮＭＲにより）、ならびに骨量（ＰＩＸＩｍｕｓ-ＧＥ  ＬＵＮＡＲ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の長期間にわたる変化について３カ月間の処置期間にわたって測定した。この期間の終了時に動物を屠殺し、最終剖検に際して骨組織を採集し、Ｆａｘｉｔｒｏｎ  Ｘ線分析およびｍｉｃｒｏＣＴ分析（Ｆａｘｉｔｒｏｎ  Ｘ−ｒａｙ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＧＥ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ｓｙｓｔｅｍ）を行なった。Ｅ２８Ｗバリアント受容体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１）は体重、具体的には除脂肪筋量および骨量を増加させ、一方ではマウスの脂肪含量を卵巣摘除していないマウスにみられるレベルまで低下させるのに有効であることが証明された。具体的には、１２週間にわたって、除脂肪筋量はＥ２８Ｗで処置したＯＶＸマウスについて２０ｇから２７．０ｇまで増加した；Ｅ２８Ｗで処置した擬似手術マウスについての２０ｇから２７．５ｇまでと比較、ＯＶＸ＋ビヒクルまたは擬似手術＋ビヒクルについて除脂肪筋量がほとんど増加しなかった（ＯＶＸ＋ビヒクルについては約１９ｇ、野生型＋ビヒクルについては約２０ｇ）のと比較。同じ試験において、Ｅ２８Ｗで処置したＯＶＸマウスは、１２週間の試験の終了時までに動物当たり８ｇ平均から動物当たり４ｇ平均までの脂肪量減少を示した；これは擬似手術した動物に匹敵する。これに対し、ビヒクルで処置したＯＶＸマウスは、試験期間中のいずれの時点でも脂肪量が減少しなかった。最後に、骨量は、Ｅ２８Ｗで処置したＯＶＸマウスにおいてビヒクル処置したＯＶＸマウスと比較して増加した。最終剖検に際して採集した大腿骨／脛骨のＢＭＣ（骨無機質含量）分析をｐＱＣＴ分析（Peripheral Quantitative Computed Tomography、末梢定量コンピュータ断層撮影)により行なった。Ｅ２８Ｗで処置したＯＶＸマウスは、約０．０４５ｇ／ｃｍのＢＭＣが１２週間の試験の終了時に約０．０５５ｇ／ｃｍに増加した；これは擬似手術したビヒクル処置動物の最終ＢＭＣに匹敵する。ビヒクルで処置したＯＶＸマウスは、１２週間の試験の終了時にほぼ同じ約０．０４５ｇ／ｃｍのＢＭＣを示した。Ｅ２８Ｗ処置した野生型マウスは、１２週間の試験の終了時に０．０５４ｇ／ｃｍから約０．０６５ｇ／ｃｍまでのＢＭＣ増加を示した。これらの試験は、加齢における虚弱質、骨粗鬆症、および肥満症の有望な処置としてのＥ２８Ｗポリペプチドの有効性を証明する。
【０１３９】
本発明は本明細書に記載する具体例による範囲に限定されない；これらは本発明の個々の観点の一例としてのものにすぎず、機能的に均等な方法および構成要素は本発明の範囲に含まれる。実際に、以上の記載および添付の図面から、本明細書に提示および記載したもののほか、本発明の種々の態様が当業者に自明であろう。そのような態様は特許請求の範囲に含まれるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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