(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ベクターを導入することによって、目的タンパク質を、その野生型バチルス宿主細胞における発現と比較してより多く発現できるように修飾されたバチルス宿主細胞であって、
前記ベクターは、ＹｍａＨタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド構築体を含み、
前記ポリヌクレオチドがｓｉｇＡ及び／またはｓｉｇＨプロモーター・ポリヌクレオチド配列と操作可能に連結されており、
前記ポリヌクレオチドが配列番号１７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むバチルス宿主細胞。
【請求項２】
前記バチルス細胞が、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・ズブチリス、バチルス・レンタス、バチルス・ブレビス、バチルス・ステロサーモフィラス、バチルス・アルカロフィラス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・コアグランス、バチルス・サーキュランス、バチルス・ラウタス、バチルス・プミルス、バチルス・チューリンゲンシス、バチルス・クラウジイ、及び、バチルス・メガテリウムから成る群から選ばれる、請求項１に記載の修飾された細胞。
【請求項３】
前記目的タンパク質が、前記修飾された宿主細胞と同種または異種である、請求項１に記載の修飾された宿主細胞。
【請求項４】
ａｐｒＥプロモーターが前記目的タンパク質の発現を誘導する、請求項１に記載の修飾された宿主細胞。
【請求項５】
前記目的タンパク質が、アミラーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ラッカーゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、エステラーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、フィターゼ、ペクチナーゼ、グルコシダーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、キチナーゼ、ホルモン、サイトカイン、成長因子、受容体、ワクチン、及び抗体から選ばれる、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項６】
前記目的タンパク質が酵素である、請求項１に記載の宿主細胞。
【請求項７】
前記酵素がプロテアーゼである、請求項６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
前記プロテアーゼが、ズブチリシン１６８、ズブチリシンＢＰＮ’、ズブチリシン・カールスバーグ、バチルス・レンタス・ズブチリシン、バチルス・クラウジイ・ズブチリシン、ズブチリシンＤＹ、ズブチリシン１４７、ズブチリシン３０９、及びそれらの変異体から成る群から選ばれるズブチリシンである、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
請求項１に記載のバチルス宿主細胞であって、
前記バチルス宿主細胞は、プロテアーゼを生成するものであり、
ｄｅｇＵ、ｄｅｇＱ、ｄｅｇＳ、ｓｃｏＣ４、ｓｐｏＩＩＥ、及び、ｄｅｇＲから選ばれる少なくとも１の遺伝子内で変異を含む、前記修飾されたバチルス細胞。
【請求項１０】
前記変異がｄｅｇ（Ｈｙ）３２である、請求項９に記載の修飾された細胞。
【請求項１１】
前記バチルス細胞がバチルス・ズブチリス細胞である、請求項９に記載の修飾された細胞。
【請求項１２】
修飾されたバチルス細胞を得る方法であって、
ａ）ベクターでバチルス宿主細胞を形質転換する工程であって、前記ベクターは、ＹｍａＨタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド構築体を含み、前記ポリヌクレオチドがｓｉｇＡ及び／またはｓｉｇＨプロモーター・ポリヌクレオチド配列と操作可能に連結されており、配列番号１７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列であることを特徴とする工程であって、形質転換されたバチルス細胞が、目的タンパク質を、その野生型バチルス宿主細胞における発現と比較してよりも多く発現できる工程、及び、
ｂ）前記目的タンパク質の発現に適した増殖条件下で前記修飾された細胞を増殖する工程を含む、前記方法。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチド構築体を含む前記ベクターが複製プラスミド上に存在する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記構築体が前記修飾された細胞のゲノム中に統合された、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記目的タンパク質がズブチリシンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
目的タンパク質の生成が可能な修飾されたバチルス細胞内で前記目的タンパク質を生成する方法であって、
ａ）請求項１に記載の修飾されたバチルス宿主細胞を得る工程、及び
ｂ）前記目的タンパク質の発現に適した増殖条件下で前記修飾されたバチルス細胞を増殖させる工程を含む、前記方法。
【請求項１７】
前記目的タンパク質を回収する工程をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ａｐｒＥプロモーターが前記目的タンパク質の発現を誘導する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記目的タンパク質が酵素である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
バチルスからの目的タンパク質の発現を促進させる方法であって、
ａ）そのバチルス親宿主細胞における発現と比較してｙｍａＨを過剰発現するように修飾されたバチルス細胞を得る工程であって、配列番号１７に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し、ｓｉｇＡ及び／またはｓｉｇＨプロモーター・ポリヌクレオチド配列と操作可能に連結されている、ＹｍａＨタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド構築体で前記バチルス親宿主細胞を形質転換するステップを含む工程、
ｂ）適した増殖条件下で前記修飾されたバチルス細胞を増殖する工程、及び
ｃ）前記修飾されたバチルス細胞内で前記目的タンパク質の発現を可能にさせる工程であって、バチルス親宿主細胞内での前記目的タンパク質の発現と比べて、前記修飾されたバチルス細胞内での前記目的タンパク質の発現が促進された前記工程を含む、前記方法。
【請求項２１】
前記ポリヌクレオチド構築体が配列番号１、２、３及び１３から選ばれるポリヌクレオチド配列を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記構築体がプラスミド上に存在するか、または前記修飾された細胞のゲノム中に統合された、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記目的タンパク質が酵素である、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的タンパク質を発現及び／または生成する改変された能力を有することを目的に遺伝子操作された細胞に関する。特に、本発明は、ｙｍａＨを過剰発現可能な、バチルス種等のグラム陽性細菌の修飾された宿主細胞に関する。本発明は、ＹｍａＨをコードするポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド構築体及び発現ベクター、及びそれらを含む修飾された宿主細胞を包含する。特に、本発明は、バチルス種内での目的タンパク質（例えば、プロテアーゼ等）の発現及び生成を促進するためのｙｍａＨを過剰発現する組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子工学は工業用生物反応器、細胞工場として、及び食物発酵において用いる微生物の向上を可能としてきた。特に、バチルス種は多数の有用なタンパク質及び代謝産物を生成及び分泌する（Ｚｕｋｏｗｓｋｉ著、「商業的に有用な産物の生成（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙ  ｖａｌｕａｂｌｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）」、Ｄｏｉ  ａｎｄ  ＭｃＧｌｏｕｇｌｉｎ編集、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂａｃｉｌｌｉ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ、Ｓｔｏｎｅｈａｍ．Ｍａｓｓ、３１１−３３７頁、１９９２年）。工業的に用いられる最も一般的なバチルス種は、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．アミロリケファシエンス及びＢ．ズブチリスである。これらは（通常、安全であると認識される）ＧＲＡＳ状態にあるので、これらのバチルス種株は食品及び医薬業界において利用されるタンパク質生成のもっともな候補である。重要な生成酵素は、α−アミラーゼ、中性プロテアーゼ、及びアルカリ（またはセリン）プロテアーゼを含む。しかしながら、バチルス宿主細胞におけるタンパク質生成の理解の進展にも関わらず、微生物によるこれらのタンパク質の発現及び生成を改善させる方法の必要性が以前としてある。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、目的タンパク質を発現及び／または生成する改変された能力を有することを目的に遺伝子操作された細胞に関する。特に、本発明は、ｙｍａＨを過剰発現可能な、バチルス種等のグラム陽性細菌の修飾された宿主細胞に関する。本発明は、ＹｍａＨをコードするポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド構築体及び発現ベクター、及びそれらを含む修飾された宿主細胞を包含する。特に、本発明は、バチルス種内での目的タンパク質（例えば、プロテアーゼ等）の発現及び生成を促進するためのｙｍａＨを過剰発現する組成物及び方法に関する。
【０００４】
一の実施態様において、本発明は、ＹｍａＨタンパク質をコードするポリヌクレオチドと操作可能に連結されたＳｉｇＡプロモーターを定義するポリヌクレオチド配列を含む単離されたキメラ・ポリヌクレオチドを提供する。
【０００５】
別の実施態様において、本発明は、ＹｍａＨタンパク質をコードするポリヌクレオチドと操作可能に連結されたＳｉｇＡプロモーターを定義するポリヌクレオチド配列を含む単離されたキメラ・ポリヌクレオチドであって、配列番号２または配列番号３を含む前記キメラ・ポリヌクレオチドを提供する。
【０００６】
別の実施態様において、本発明は、ｓｉｇＡ及び／またはｓｉｇＨプロモーターポリヌクレオチド配列と操作可能に連結されたＹｍａＨタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド構築体を含むベクターを提供する。
【０００７】
別の実施態様において、本発明は、ｓｉｇＡ及び／またはｓｉｇＨプロモーターポリヌクレオチド配列と操作可能に連結されたＹｍａＨタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド構築体であって、配列番号１、２、３または１３を含む前記ポリヌクレオチド構築体を含むベクターを提供する。
【０００８】
別の実施態様において、本発明は、ｓｉｇＡ及び／またはｓｉｇＨプロモーターポリヌクレオチド配列と操作可能に連結されたＹｍａＨタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド構築体を含むベクターを含む修飾されたバチルス細胞であって、目的タンパク質を生成可能な前記修飾されたバチルス細胞を提供する。
【０００９】
別の実施態様において、本発明は、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．ズブチリス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．ステロサーモフィラス、Ｂ．アルカロフィラス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．コアグランス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ．ラウタス、Ｂ．プミルス、Ｂ．チューリンゲンシス、Ｂ．クラウジイ、及びＢ．メガテリウムから成る群から選択され、ｓｉｇＡ及び／またはｓｉｇＨプロモーターポリヌクレオチド配列と操作可能に連結されたＹｍａＨタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド構築体を含むベクターを含む修飾されたバチルス宿主細胞であって、目的タンパク質を生成可能な前記修飾されたバチルス宿主細胞を提供する。
【００１０】
別の実施態様において、本発明は、ｓｉｇＡ及び／またはｓｉｇＨプロモーターポリヌクレオチド配列と操作可能に連結されたＹｍａＨタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド構築体を含むベクターを含む修飾されたバチルス宿主細胞であって、前記修飾されたバチルス宿主細胞と同種または異種である目的タンパク質を生成可能な前記修飾されたバチルス宿主細胞を提供する。
【００１１】
別の実施態様において、本発明は、ｓｉｇＡ及び／またはｓｉｇＨプロモーターポリヌクレオチド配列と操作可能に連結されたＹｍａＨタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド構築体を含むベクターを含む修飾されたバチルス宿主細胞であって、目的タンパク質を生成可能であり、ａｐｒＥプロモーターが前記目的タンパク質の発現を誘導する前記修飾されたバチルス宿主細胞を提供する。
【００１２】
別の実施態様において、本発明は、ｓｉｇＡ及び／またはｓｉｇＨプロモーターポリヌクレオチド配列と操作可能に連結されたＹｍａＨタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド構築体を含むベクターを含む修飾されたバチルス宿主細胞であって、アミラーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ラッカーゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、エステラーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、フィターゼ、ペクチナーゼ、グルコシダーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ガラクトシダーゼ、及びキチナーゼ、ホルモン類、サイトカイン、成長因子、受容体、ワクチン、及び抗体から選ばれる目的タンパク質を生成可能な前記修飾されたバチルス宿主細胞を提供する。
【００１３】
別の実施態様において、本発明は、ｓｉｇＡ及び／またはｓｉｇＨプロモーターポリヌクレオチド配列と操作可能に連結されたＹｍａＨタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド構築体を含むベクターを含む修飾されたバチルス宿主細胞であって、酵素を生成可能な前記修飾されたバチルス宿主細胞を提供する。
【００１４】
別の実施態様において、本発明は、ｓｉｇＡ及び／またはｓｉｇＨプロモーターポリヌクレオチド配列と操作可能に連結されたＹｍａＨタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド構築体を含むベクターを含む修飾されたバチルス宿主細胞であって、プロテアーゼを生成可能な前記修飾されたバチルス宿主細胞を提供する。
【００１５】
別の実施態様において、本発明は、ｓｉｇＡ及び／またはｓｉｇＨプロモーターポリヌクレオチド配列と操作可能に連結されたＹｍａＨタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド構築体を含むベクターを含む修飾されたバチルス宿主細胞であって、ズブチリシン１６８、ズブチリシンＢＰＮ’、ズブチリシン・カールスバーグ、Ｂ．レンタス・ズブチリシン、Ｂ．クラウジイ・ズブチリシン、ズブチリシンＤＹ、ズブチリシン１４７、及びズブチリシン３０９、及びそれらの変異体から選ばれる少なくとも１のズブチリシンを生成可能な前記修飾されたバチルス宿主細胞を提供する。
【００１６】
別の実施態様において、本発明は、ｙｍａＨを過剰発現可能なバチルス細胞であって、ｄｅｇＵ、ｄｅｇＱ、ｄｅｇＳ、ｓｃｏ４、ｓｐｏＩＩＥ、ｄｅｇＱ及びｄｅｇＲから選ばれる少なくとも１の遺伝子での変異を含む前記バチルス細胞を生成する修飾されたプロテアーゼを提供する。
【００１７】
別の実施態様において、本発明は、ｙｍａＨを過剰発現可能なバチルス細胞であって、ｄｅｇ（Ｈｙ）３２変異を含む前記バチルス細胞を生成する修飾されたプロテアーゼを提供する。
【００１８】
別の実施態様において、本発明は、ｙｍａＨを過剰発現可能なバチルス・ズブチリス細胞であって、ｄｅｇＵ、ｄｅｇＱ、ｄｅｇＳ、ｓｃｏ４、ｓｐｏＩＩＥ、ｄｅｇＱ及びｄｅｇＲから選ばれる少なくとも１の遺伝子での変異を含む前記バチルス・ズブチリス細胞を生成する修飾されたプロテアーゼを提供する。
【００１９】
別の実施態様において、本発明は、修飾されたバチルス細胞を得る方法であって、ｓｉｇＡ及び／またはｓｉｇＨプロモーターポリヌクレオチド配列と操作可能に連結されたＹｍａＨタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド構築体を含むベクターでバチルス宿主細胞を形質転換し、前記バチルス宿主細胞が目的タンパク質を発現可能である工程、及び前記目的タンパク質の発現に適した増殖条件下で前記修飾されたバチルス宿主細胞を増殖する工程を含む、前記方法を提供する。
【００２０】
別の実施態様において、本発明は、修飾されたバチルス細胞を得る方法であって、ｓｉｇＡ及び／またはｓｉｇＨプロモーターポリヌクレオチド配列と操作可能に連結されたＹｍａＨタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、複製プラスミド上に存在するポリヌクレオチド構築体を含むベクターでバチルス宿主細胞を形質転換し、前記バチルス宿主細胞が目的タンパク質を発現可能である工程、及び前記目的タンパク質の発現に適した増殖条件下で前記修飾されたバチルス宿主細胞を増殖する工程を含む、前記方法を提供する。
【００２１】
別の実施態様において、本発明は、修飾されたバチルス細胞を得る方法であって、ｓｉｇＡ及び／またはｓｉｇＨプロモーターポリヌクレオチド配列と操作可能に連結されたＹｍａＨタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、前記修飾されたバチルス細胞のゲノムに統合されたポリヌクレオチド構築体を含むベクターでバチルス宿主細胞を形質転換し、前記バチルス宿主細胞が目的タンパク質を発現可能である工程、及び前記目的タンパク質の発現に適した増殖条件下で前記修飾されたバチルス宿主細胞を増殖する工程を含む、前記方法を提供する。
【００２２】
別の実施態様において、本発明は、修飾されたバチルス細胞を得る方法であって、ｓｉｇＡ及び／またはｓｉｇＨプロモーターポリヌクレオチド配列と操作可能に連結されたＹｍａＨタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド構築体を含むベクターでバチルス宿主細胞を形質転換し、前記バチルス宿主細胞が少なくとも１のズブチリシンを発現可能である工程、及び前記ズブチリシンの発現に適した増殖条件下で前記修飾されたバチルス宿主細胞を増殖する工程を含む、前記方法を提供する。
【００２３】
別の実施態様において、本発明は、修飾されたバチルス細胞内で目的タンパク質を生成する方法であって、ｙｍａＨを過剰発現可能な前記修飾されたバチルス細胞を培養する工程、及び前記目的タンパク質の発現に適した増殖条件下で前記修飾されたバチルス宿主細胞を増殖する工程を含む、前記方法を提供する。いくつかの実施態様において、前記目的タンパク質は、酵素、例えば、ズブチリシン等である。いくつかの実施態様において、前記バチルス細胞が、バチルス・ズブチリス細胞である。
【００２４】
別の実施態様において、本発明は、修飾されたバチルス細胞内で目的タンパク質を生成する方法であって、ｙｍａＨを過剰発現可能な前記修飾されたバチルス細胞を培養する工程、前記目的タンパク質の発現に適した増殖条件下で前記修飾されたバチルス宿主細胞を増殖する工程、及び前記目的タンパク質を回収する工程を含む、前記方法を提供する。いくつかの実施態様において、前記目的タンパク質は、酵素、例えば、ズブチリシン等である。いくつかの実施態様において、前記バチルス細胞が、バチルス・ズブチリス細胞である。
【００２５】
別の実施態様において、本発明は、修飾されたバチルス細胞内で目的タンパク質を、対応する前駆体宿主細胞内で前記目的タンパク質が生成されるよりも早い時間で生成する方法であって、ｙｍａＨを過剰発現可能な前記修飾されたバチルス細胞を培養する工程、及び前記目的タンパク質の発現に適した増殖条件下で前記修飾されたバチルス宿主細胞を増殖する工程を含む、前記方法を提供する。いくつかの実施態様において、前記目的タンパク質は、酵素、例えば、ズブチリシン等である。いくつかの実施態様において、前記バチルス細胞が、バチルス・ズブチリス細胞である。
【００２６】
別の実施態様において、本発明は、修飾されたバチルス細胞内で目的タンパク質を生成する方法であって、ａｐｒＥプロモーターが前記目的タンパク質の発現を誘導し、ｙｍａＨを過剰発現可能な前記修飾されたバチルス細胞を培養する工程、及び前記目的タンパク質の発現に適した増殖条件下で前記修飾されたバチルス宿主細胞を増殖する工程を含む、前記方法を提供する。いくつかの実施態様において、前記目的タンパク質は、酵素、例えば、ズブチリシン等である。いくつかの実施態様において、前記バチルス細胞が、バチルス・ズブチリス細胞である。
【００２７】
別の実施態様において、本発明は、バチルスからの目的タンパク質の発現を促進する方法であって、バチルス親宿主細胞内でｙｍａＨを過剰発現する工程を含む方法により、修飾されたバチルス細胞を得る工程、適した増殖条件下で得られた前記修飾されたバチルス細胞を増殖する工程、及び前記修飾されたバチルス細胞内で前記目的タンパク質を発現させる工程を含み、前記修飾されたバチルス細胞内での前記目的タンパク質の発現が、親宿主細胞内での同様の前記目的タンパク質の発現と比べ促進されている、前記方法を提供する。いくつかの実施態様において、前記目的タンパク質は、酵素、例えば、ズブチリシン等である。いくつかの実施態様において、前記バチルス細胞が、バチルス・ズブチリス細胞である。
【００２８】
別の実施態様において、本発明は、バチルスからの目的タンパク質の発現を促進する方法であって、バチルス親宿主細胞内でｙｍａＨを過剰発現する工程を含む方法により、修飾されたバチルス細胞を得る工程、適した増殖条件下で得られた前記修飾されたバチルス細胞を増殖する工程、及び前記修飾されたバチルス細胞内で前記目的タンパク質を発現させる工程を含み、前記修飾されたバチルス細胞内での前記目的タンパク質の発現が、親宿主細胞内での同様の前記目的タンパク質の発現と比べ促進され、前記過剰発現する工程が、ＹｍａＨタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド構築体でバチルス宿主細胞を形質転換する工程を含み、前記ポリヌクレオチドがｓｉｇＡまたはｓｉｇＨプロモーターポリヌクレオチド配列と操作可能に連結される、前記方法を提供する。いくつかの実施態様において、前記目的タンパク質は、酵素、例えば、ズブチリシン等である。いくつかの実施態様において、前記バチルス細胞が、バチルス・ズブチリス細胞である。
【００２９】
別の実施態様において、本発明は、バチルスからの目的タンパク質の発現を促進する方法であって、バチルス親宿主細胞内でｙｍａＨを過剰発現する工程を含む方法により、修飾されたバチルス細胞を得る工程、適した増殖条件下で前記修飾されたバチルス細胞を増殖する工程、及び前記修飾されたバチルス細胞内で前記目的タンパク質を発現させる工程を含み、前記修飾されたバチルス細胞内での前記目的タンパク質の発現が、親宿主細胞内での同様の前記目的タンパク質の発現と比べ促進され、前記過剰発現する工程が、配列番号１、２、３、及び１３から選ばれる配列を含むポリヌクレオチド構築体でバチルス宿主細胞を形質転換する工程を含む、前記方法を提供する。いくつかの実施態様において、前記目的タンパク質は、酵素、例えば、ズブチリシン等である。いくつかの実施態様において、前記バチルス細胞が、バチルス・ズブチリス細胞である。
【００３０】
別の実施態様において、本発明は、バチルスからの目的タンパク質の発現を促進する方法であって、バチルス宿主細胞内でｙｍａＨを過剰発現する工程を含む方法により、修飾されたバチルス細胞を得る工程、適した増殖条件下で前記修飾されたバチルス細胞を増殖する工程、及び前記修飾されたバチルス細胞内で前記目的タンパク質を発現させる工程を含み、前記修飾されたバチルス細胞内での前記目的タンパク質の発現が、前記バチルス宿主細胞内での同様の前記目的タンパク質の発現と比べ促進され、前記過剰発現する工程が、プラスミド上に存在するか、または前記修飾されたバチルス細胞のゲノムに統合され、ＹｍａＨタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド構築体でバチルス宿主細胞を形質転換する工程を含み、前記ポリヌクレオチドがｓｉｇＡまたはｓｉｇＨプロモーターポリヌクレオチド配列と操作可能に連結される、前記方法を提供する。いくつかの実施態様において、前記目的タンパク質は、酵素、例えば、ズブチリシン等である。いくつかの実施態様において、前記バチルス細胞が、バチルス・ズブチリス細胞である。
【００３１】
別の実施態様において、本発明は、バチルスからの目的タンパク質の発現を促進する方法であって、野生型バチルス宿主細胞内でｙｍａＨを過剰発現する工程を含む方法により、修飾されたバチルス細胞を得る工程、適した増殖条件下で前記修飾されたバチルス細胞を増殖する工程、及び前記修飾されたバチルス細胞内で前記目的タンパク質を発現させる工程を含み、前記修飾されたバチルス細胞内での前記目的タンパク質の発現が、前記野生型バチルス宿主細胞内での同様の前記目的タンパク質の発現と比べ促進され、前記過剰発現する工程が、ＹｍａＨタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド構築体で野生型バチルス宿主細胞を形質転換する工程を含み、前記ポリヌクレオチドがｓｉｇＡまたはｓｉｇＨプロモーターポリヌクレオチド配列と操作可能に連結される、前記方法を提供する。いくつかの実施態様において、前記目的タンパク質は、酵素、例えば、ズブチリシン等である。いくつかの実施態様において、前記バチルス細胞が、バチルス・ズブチリス細胞である。
【００３２】
別の実施態様において、本発明は、バチルスからの目的タンパク質の発現を促進する方法であって、改変されたバチルス宿主細胞内でｙｍａＨを過剰発現する工程を含む方法により、修飾されたバチルス細胞を得る工程、適した増殖条件下で前記修飾されたバチルス細胞を増殖する工程、及び前記修飾されたバチルス細胞内で前記目的タンパク質を発現させる工程を含み、前記修飾されたバチルス細胞内での前記目的タンパク質の発現が、前記改変された宿主細胞内での同様の前記目的タンパク質の発現と比べ促進され、前記過剰発現する工程が、ＹｍａＨタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド構築体で改変されたバチルス宿主細胞を形質転換する工程を含み、前記ポリヌクレオチドがｓｉｇＡまたはｓｉｇＨプロモーターポリヌクレオチド配列と操作可能に連結される、前記方法を提供する。いくつかの実施態様において、前記目的タンパク質は、酵素、例えば、ズブチリシン等である。いくつかの実施態様において、前記バチルス細胞が、バチルス・ズブチリス細胞である。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１（Ａ−Ｅ）】図１（Ａ−Ｅ）は、本発明のいくつかの実施態様によるポリヌクレオチド構築体の生成に使用されるプライマー位置を示す。パネルＢ−Ｅは、パネルＡで示される、バチルス・ズブチリスのｍｉａＡオペロンのバチルス染色体配列（バチルス・ズブチリス株１６８の１８６５４２８−１８６７０１９塩基対、ＮＣＢＩアクセス番号ＮＣ０００９６４）に関連して、それぞれ構築体ＳｉｇＨ、ＳｉｇＡ１、ＳｉｇＡ２及びＳｉｇＡ３の生成に使用されるプライマー位置を示す。プライマー対Ｐ４−Ｐ５及びＰ６−Ｐ７は、直接増幅される配列と相同である５’末端での塩基対の「テール（ｔａｉｌ）」を含み、相互に相補する融合プライマーである。融合プライマーの相補的なテールは、増幅されたシグマＡプロモーターＤＮＡの増幅されたＹｍａＨ−コーディングＤＮＡへの融合を可能にし、ＹｍａＨ−コーディング配列に隣接するシグマＡプロモーター配列を含むキメラ・ポリヌクレオチドが得られる一方、ｍｉａＡコード配列のほとんどもしくは全てが削除される。
【図２】図２は、ｓｉｇＡプロモーターを定義する配列からＹｍａＨタンパク質をコードする配列の末端を含む一部のＢ．ズブチリス・ゲノムのポリヌクレオチド配列を示す。この配列は、図１、パネルＡで図示される。ｍｉａＡタンパク質をコードする配列の先頭が示され、完全なｍｉａＡコーディング配列は太字の文字で示される。ＹｍａＨタンパク質をコードする配列の先頭が示され、完全なＹｍａＨコーディング配列は下線のある太字の文字で示される。
【図３（Ａ−Ｂ）】図３（Ａ−Ｂ）パネルＡは、バチルス・コントロール宿主細胞（４２ｐＢＳ）及びｙｍａＨを過剰発現する修飾されたバチルス宿主細胞（４２ＳｉｇＡ１及び４２ＳｉｇＨ）で生成されたズブチリシンのタンパク質分解活性のグラフを示す。パネルＢは、バチルス・コントロール宿主細胞（４１ｐＢＳ）及びｙｍａＨを過剰発現する修飾されたバチルス宿主細胞（４１ＳｉｇＨ）で生成されたズブチリシン活性を示す。タンパク質分解活性は、ｐ−ニトロアナリン（ｐ−ｎｉｔｒｏａｎａｌｉｎｅ）の加水分解及び放出による、４０５ｎｍでの吸光度の増加として測定された。酵素活性のレベルは、バチルス宿主細胞によるズブチリシンの生成におけるｙｍａＨを過剰発現する効果の指標となる。
【図４】図４は、バチルス・コントロール宿主細胞４２ｐＢＳ１９及びｙｍａＨを過剰発現する修飾されたバチルス宿主細胞４２ＳｉｇＨ及び４２ＳｉｇＡ１によるズブチリシンの生成のレベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明は、目的タンパク質を発現及び／または生成する改変された能力を有することを目的に遺伝子操作された細胞に関する。特に、本発明は、ｙｍａＨを過剰発現可能な、バチルス種等のグラム陽性細菌の修飾された宿主細胞に関する。本発明は、ＹｍａＨをコードするポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド構築体及び発現ベクター、及びそれらを含む修飾された宿主細胞を包含する。特に、本発明は、バチルス種内での目的タンパク質（例えば、プロテアーゼ等）の発現及び生成を促進するためのｙｍａＨを過剰発現する組成物及び方法に関する。
【００３５】
別途記載のない限り、本発明に係る実施は、分子生物学、微生物学、タンパク質精製、タンパク質工学、タンパク質及びＤＮＡ配列決定、及び組み換えＤＮＡ分野で通常用いられる従来の技術を伴い、これらは当業者の常識の範囲である。その様な技術は当業者に知られており、数多くの教科書及び参考文献に記載されている。本明細書に記載の全ての特許、特許出願、論文及び刊行物は、すでに記載のもの、以下に記載するものを問わず、参照により明確に本明細書に組み入れられる。
【００３６】
別途記載のない限り、本明細書で用いられる全ての技術及び科学上の用語は、本発明が属する分野の当業者により通常理解されるものと同様の意味を持つ。本明細書に含まれる用語を含む様々な科学用語辞典が当業者に周知であり、利用可能である。本明細書に記載の方法及び材料と同様のまたは同等の方法及び材料が本発明の実施または試験のために使用されるが、好ましい方法及び材料が本明細書に記載される。従って、以下に定義される用語は明細書を全体として参照することによってより完全に規定される。本発明は、当業者が使用する状況に依存し、変化することができ、記載された特定の手順、操作方法、及び試薬に限定されないことが理解される。
【００３７】
本明細書で用いる単数形冠詞（ａ、ａｎ）及び定冠詞（ｔｈｅ）は、文意より明らかに他の意味に解される場合を除き、その複数の場合を含む。別途記載のない限り、核酸は左から右ヘ、５’末端から３’末端方向に、アミノ酸配列は左から右ヘ、アミノ基からカルボキシ基方向へ各々記載される。
【００３８】
本明細書で参照される全て特許、特許出願、及びその他の公開刊行物は、そこに開示される全ての配列を含み、個々の公開刊行物、特許、または特許出願が具体的かつ個別に参照によりに組み入れられると示されるのと同程度に、参照により明確に本明細書に組み入れられる。引用される全ての文章は、関連する部分において、参照により本明細書に組み入れられる。しかしながら、文献の引用により、その様な文献が本発明との関係において先行技術であることを承認するものと理解してはならない。
【００３９】
数値範囲は、範囲を規定する数値も含むものとする。本明細書で示される全ての最大数値限定は、本明細書でより少ない数値限定が明確に記載されているかのように、全てのより少ない数値限定を含むことが意図される。本明細書で示される全ての最小数値限定は、本明細書でより多い数値限定が明確に記載されているかのように、全てのより多い数値限定を含む。本明細書で示される全ての数値範囲は、本明細書でより狭義の数値範囲が明確に記載されているかのように、より広義の数値範囲の中にある、全てのより狭義の数値範囲を含む。
【００４０】
本明細書に提供される見出しは、多様な発明の側面または実施態様を制限するものではなく、本明細書の全体を参照することにより含まれることが出来る。従って、上述したように、以下に定義される語は、本明細書の全体を参照することにより、より完全に規定される。
【００４１】
本明細書で用いられる「単離された」及び「精製された」の語は、天然に組み合わされている少なくとも一成分から取り出された核酸またはアミノ酸（または他の成分）をいう。
【００４２】
「キメラ・ポリヌクレオチド」、「キメラ・ポリヌクレオチド構築体」及び「異種核酸構築体」は、制御因子を含む、異なる遺伝子部分を含むポリヌクレオチドをいう。従って、いくつかの実施態様において、キメラ・ポリヌクレオチド構築体は、天然のプロモーターではないプロモーターと操作可能に連結されたタンパク質コーディング領域を含む。いくつかの実施態様において、キメラ・ポリヌクレオチドは、プロモーターを定義するポリヌクレオチド配列を包含し、タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列と操作可能に連結されたポリヌクレオチド配列をいう。いくつかの実施態様において、前記プロモーターと前記コーディングポリヌクレオチドは隣接する。
【００４３】
プロモーターとの関連で用いられる「定義する」の語は、転写を可能にするプロモーター因子を含むポリヌクレオチド配列をいう。
【００４４】
本明細書で用いられる「プロモーター」の語は、下流遺伝子の転写を誘導する／もたらすように機能する核酸配列をいう。一般的に、このプロモーターは、遺伝子が発現される宿主細胞に適したものである。このプロモーターは、他の転写及び翻訳調節核酸配列（「制御配列」とも言われる）とともに所与の遺伝子の発現に必要である。一般に、転写及び翻訳調節配列は、プロモーター配列、リボゾーム結合部位、転写開始及び終止配列、翻訳開始及び終止配列、上流プロモーター・エレメントの上流配列（ＵＰエレメント）及びエンハンサーまたは活性化配列を含むが、それらに限られない。いくつかの実施態様において、このプロモーターは、転写リーダー配列も含む。
【００４５】
本明細書で用いられる「シグマＡプロモーター」及び「ＳｉｇＡプロモーター」の語は、対応するσＡ因子により直接認識される配列を含むコア・プロモーター配列を含むポリヌクレオチド配列をいう。このＳｉｇＡプロモーターは、ｍｉａＡコーディング領域の上流で自然に生じる配列により包含される。
【００４６】
本明細書で用いられる「シグマＨプロモーター」及び「ＳｉｇＨプロモーター」の語は、対応するσＨ因子により直接認識される配列を含むコア・プロモーター配列を含むポリヌクレオチド配列をいう。このＳｉｇＨプロモーターは、ｙｍａＨコーディング領域の上流で自然に生じる配列により包含される（Ｂｒｉｔｔｏｎ他著、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１８４巻、４８８１−４８９０頁、２００２年）。前記コア・プロモーターは、対応するσ因子により直接認識される配列及び対応するσ因子により直接認識される配列との間に位置するスペーサー配列を含むプロモーター配列を含む。
【００４７】
本明細書で用いられる「ａｐｒＥプロモーター」の語は、Ｂ．ズブチリス内でのズブチリシンの発現を自然に誘導するポリヌクレオチドプロモーター配列をいう（Ｆｅｒｒａｒｉ他著、ＪＢａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１７０巻、２８９−２９５頁、１９８８年）。ａｐｒＥプロモーターとの関連において本明細書で用いられる「（ａｎ）ａｐｒＥプロモーター」は、野生型ａｐｒＥプロモーター及びそれの変異体をいう。いくつかの実施態様において、ａｐｒＥプロモーターは、ＤｅｇＵ、ＳｃｏＣ、ＡｂｒＢ及び前記プロモーターの任意の他の調節因子により行われる転写制御に必要なヌクレオチド配列、及び／またはａｐｒＥ転写リーダーを含む（Ｈａｍｂｒａｅｕｓ他著、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第１４８巻、１７９５−１８０３頁、２００２年）。いくつかの他の実施態様において、ａｐｒＥプロモーターは、ＤｅｇＵ、ＳｃｏＣ、ＡｂｒＢ及び他の調節因子により行われる転写制御に必要なヌクレオチド配列、及び／またはａｐｒＥ転写リーダー配列の全てを含まない。
【００４８】
「制限領域」、「制限配列」、及び「発現制御配列」の語は、コードされたアミノ酸配列の発現をもたらすポリペプチド鎖のアミノ酸配列をコードする、ＤＮＡのポリヌクレオチド配列と操作可能に連結されたＤＮＡのポリヌクレオチド配列をいう。この制限配列は前記アミノ酸をコードする前記操作可能に連結されたポリヌクレオチド配列の発現を阻害、抑制、または向上することが出来る。いくつかの実施態様において、この制御配列は、転写調節因子ＹｍａＨをコードするＤＮＡ配列と操作可能に連結されたプロモーターを含む。いくつかの実施態様に置いて、このプロモーターは、ｙｍａＨ遺伝子と異種である（例えば、このプロモーターは、ＹｍａＨタンパク質の発現を直接に誘導しないプロモーターである）。例えば、いくつかの実施態様において、このプロモーターは、ＹｍａＨタンパク質をコードするＤＮＡと操作可能に連結されたシグマＡプロモーターである。いくつかの他の実施態様において、このプロモーターは、ＹｍａＨタンパク質の発現を直接に誘導し、また自然発生の宿主内で起こるようにＹｍａＨをコードするＤＮＡと操作可能に連結されたプロモーターである。
【００４９】
本明細書で相互置換可能に用いられる「ポリヌクレオチド」及び「核酸」の語は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー状形態をいう。これらの語には、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはプリン及びピリミジン塩基、または他の天然の、化学的、生化学的に修飾された非天然のまたは誘導化のヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドの非限定的な具体例は、遺伝子、遺伝子断片、染色体断片、ＥＳＴ、エクソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意配列の単離ＤＮＡ、任意配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマーを含む。遺伝コードの縮退の結果、所与のタンパク質をコードする多数のヌクレオチド配列が生成される可能性があることが、理解されるだろう。
【００５０】
本明細書で用いられる「遺伝子」の語は、ポリペプチド鎖の生成に関連するＤＮＡの染色体断片をいい、これはコード領域の前または後にある領域（例えば、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）または、リーダー配列、及び３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）領域またはトレーラー配列を、また、個々のコーディング領域（エクソン）の間に介在領域（イントロン））を含んでも良く、含まなくても良い。いくつかの実施態様において、この遺伝子は、例えば、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ及びグルコアミラーゼのようなカルボヒドラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、及びリパーゼを含むがそれらに限られない酵素等の商業的に重要な産業タンパク質またはペプチドをコードする。いくつかの他の実施態様において、前記遺伝子は、ｍｉａＡが起こるオペロンによりコードされるタンパク質をコードする（例えば、ｍｉａＡまたはｙｍａＨ）。しかしながら、本発明がいずれか所定の酵素またはタンパク質に限定されることは意図されない。いくつかの他の実施態様において、この遺伝子は、成長因子、サイトカイン、配位子、受容体及び阻害剤並びにワクチン及び抗体のような他のタンパク質またはペプチドをコードする。いくつかの実施態様において、目的遺伝子は、天然遺伝子である一方、他の実施態様において、変異遺伝子または合成遺伝子である。
【００５１】
本明細書で用いられる「合成物」の語は、インビトロでの化学的または酵素的合成で生成されるポリヌクレオチド分子をいう。この語は、限られないがバチルス種のような宿主有機体で用いられる最適コドン使用頻度で作成された変異体核酸を含むが、それに限られない。
【００５２】
本明細書で用いられる「ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）」の語は、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、及び第４，９６５，１８８号の方法（ここで参照により取り込まれる）をいい、クローニングまたは精製を用いないで、ゲノムＤＮＡ混合物において標的配列の領域の濃度を上昇させる方法を含むものをいう。標的配列を増幅させるこの方法は、所望の標的配列を含むＤＮＡ混合物に大過剰の２つのオリゴヌクレオチド・プライマーを導入する工程、つぎにＤＮＡポリメラーゼ存在下における正確な順序の温度サイクルの工程から成る。前記２つのプライマーは、二本鎖標的配列のそれぞれの鎖に相補的である。増幅をもたらすために、前記混合物は変性され、前記プライマーは次に標的分子内の相補的配列にアニーリング（ａｎｎｅａｌ）される。アニーリングに続いて、前記プライマーは相補鎖の新しい対を形成するようにポリメラーゼで伸長される。変性工程、プライマーのアニーリング及びポリメラーゼによる伸長は、所望の標的配列の高濃度の増幅領域を得るために多数回（すなわち、変性、アニーリング、及び伸長は１つの「サイクル」を構成し、多数の「サイクル」があり得る）繰り返すことが出来る。所望の標的配列の増幅領域の長さは、プライマー相互の相対的位置により決定することができ、このためこの長さは制御可能なパラメータである。前記工程の繰り返される点から、前記方法は「ポリメラーゼ連鎖反応（以下、「ＰＣＲ」という。）」と呼ばれる。標的配列の所望の増幅領域が混合物中の主要な配列（濃度という点から）となるため、それらは「ＰＣＲ増幅された」と言われる。
【００５３】
本明細書で用いられる「増幅試薬」の語は、プライマー、核酸鋳型、及び増幅酵素を除いて増幅に必要とされるそれらの試薬（デオキシリボヌクレオチド三燐酸、緩衝液等）をいう。一般的に、他の反応成分とともに増幅試薬は反応容器（試験管、マイクロウェル等）に設置及び含有される。
【００５４】
ＰＣＲを用いることで、ゲノムＤＮＡにおける特定標的配列の１コピーを幾つかの異なる方法により検出可能なレベルまで増幅することが出来る（例えば、標識プローブによるハイブリダイゼーション、アビジン−酵素結合物検出が続くビオチン化プライマーの取り込み、ｄＣＴＰまたはｄＡＴＰのような３２Ｐ標識デオキシヌクレオチド三燐酸の増幅領域への取り込み）。ゲノムＤＮＡに加えて、任意のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列が適当なプライマー分子セットで増幅することが出来る。特に、ＰＣＲ法自体により生成された増幅領域は、それ自体、引き続くＰＣＲ増幅のための効果的な鋳型である。
【００５５】
本明細書で用いられる「ＰＣＲ生成物」、「ＰＣＲ断片」、及び「増幅生成物」の語は、変性、アニーリング、及び伸長の２以上のサイクルのＰＣＲ工程が完了した後に得られる化合物の混合物をいう。これらの語は、１以上の標的配列の１以上の領域の増幅がある場合を包含する。
【００５６】
本明細書で用いられる「制限エンドヌクレアーゼ」及び「制限酵素」の語は、各々が特定核酸配列において、またはその近傍で二本鎖ＤＮＡを切断する微生物酵素をいう。
【００５７】
本明細書で用いられる「組み換え体」の語は、宿主細胞では自然に発生しないポリヌクレオチドまたはポリペプチドをいう。いくつかの実施態様において、組み換え分子は、自然に生じない方法で互いに連結された２以上の自然発生の配列を含む。
【００５８】
他の核酸配列と機能的に関連するよう置かれるとき、核酸は、「操作可能に連結され」る。例えば、配列の転写に影響する場合、ポリヌクレオチド・プロモーター配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと操作可能に連結される。いくつかの他の実施態様において、翻訳を促進するために置かれる場合、リボゾーム結合部位はコーディング配列と操作可能に連結される。いくつかの実施態様において、「操作可能に連結され」ることは、連結されるポリヌクレオチド配列が隣接することを意味する。連結は、都合の良い制限部位においてライゲーションされることで達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチド・アダプターまたはリンカーが慣習に従って使用される。
【００５９】
本明細書で用いられる「相同遺伝子」の語は、相互に対応し、相互に同等か非常に類似する遺伝子であって、異種であるが通常関連する種から得られる遺伝子をいう。この語は、遺伝的複製により分離されてきた遺伝子（例えば、パラログ遺伝子）と同様に種形成（すなわち、新種の発生）により分離した遺伝子（例えば、オーソログ遺伝子）を包含する。
【００６０】
本明細書で用いられる「オーソログ」及び「オーソログ遺伝子」の語は、共通の先祖遺伝子（すなわち、相同遺伝子）から種形成により進化してきた異種の遺伝子をいう。一般的に、オーソログは進化過程で同様の機能を保持している。オーソログ遺伝子の同定は、新しく配列決定されたゲノムにおける遺伝子機能の信頼性のある予測に用いられる。
【００６１】
本明細書で用いられる「パラログ」及び「パラログ遺伝子」の語は、ゲノム内の複製により関連される遺伝子をいう。オーソログが進化過程を通して同様の機能を保持しているのに対し、幾つかの機能が時に従来の機能と関連していたとしても、パラログは新しい機能を発達させている。パラログ遺伝子の例には、いずれもセリンプロテイナーゼであり同種内で共に生じる、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、及びスロンビンをコードする遺伝子が含まれるが、これらに限られない。
【００６２】
本明細書で用いられる「相同性」の語は、配列類似性または同一性をいい、ここで同一性がより好まれる。この相同性は、当該技術分野で既知の標準技術を用いて決定される（例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ著、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．、第２巻、４８２頁、１９８１年、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第４８巻、４４３頁、１９７０年、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８５巻、２４４４頁、１９８８年、ウィスコンシン・ジェネティクス・ソフトウエア・パッケージ（ジェネティクス・コンピュータ・グループ社、マディソン、ウィスコンシン州）におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ等のプログラム、及びＤｅｖｅｒｅｕｘ他著、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．、第１２巻、３８７−３９５頁、１９８４年を参照されたい）。
【００６３】
本明細書で用いられる「類似配列（ａｎａｌｏｇｏｕｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」の語は、その遺伝子機能が好ましいバチルス・ズブチリス株（すなわち、バチルス・ズブチリス１６８）から指定された遺伝子と実質的に同様の遺伝子機能であるものをいう。追加的に、類似遺伝子は、バチルス・ズブチリス株１６８遺伝子の配列と少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％の配列同一性を含む。あるいは、類似配列はＢ．ズブチリス１６８領域に認められる遺伝子の７０〜１００％の位置同一性（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を有し、及び／またはＢ．ズブチリス１６８ゲノムにおける遺伝子と位置同一する領域に認められる少なくとも５〜１０の遺伝子を有する。追加的な実施態様において、上記特性のうちの１以上が前記配列に適用される。類似配列は、配列アラインメント（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）の既知の方法により決定される。通常用いられるアラインメント方法は、ＢＬＡＳＴである。もっとも、前述または後述するように配列アラインメントに用いられる他の方法もある。
【００６４】
有用なアルゴリズムの一の例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、進歩したペア−ワイズ（ｐａｉｒｗｉｓｅ）・アランイメントを用いて関連配列群から多数の配列アラインメントを生成する。また、アラインメントを生成するために用いられる集合（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）関係を示す系統樹をプロットすることも出来る。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅの進歩したアラインメント方法の簡略化方法を用いる（Ｆｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．、第３５巻、３５１−３６０頁、１９８７年）。この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐにより記述された方法に類似している（Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ著、ＣＡＢＩＯＳ、第５巻、１５１−１５３頁、１９８９年）。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータは、３．００のデフォルト・ギャップ重み（Ｄｅｆａｕｌｔｇａｐｗｅｉｇｈｔ）、０．１０のデフォルト・ギャップ長の重み（Ｄｅｆａｕｌｔｇａｐｌｅｎｇｔｈｗｅｉｇｈｔ）、及び重み付けられた末端ギャップ（ｗｅｉｇｈｔｅｄｇａｐｅｎｄｓ）を含む。
【００６５】
他の有用なアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ他により記述される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ他著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２１５巻、４０３−４１０頁、１９９０年、及びＫａｒｌｉｎ他著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９０巻、５８７３−５８８７頁、１９９３年）。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ他著、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第２６６巻、４６０−４８０頁、１９９６年）。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、幾つかの検索パラメータを用い、これらのほとんどはデフォルト値に設定されている。調整可能なパラメータは、以下の値に設定される。すなわち、オーバラップ・スパン＝１、オーバラップ・フラクション＝０．１２５、ワード閾値（ｗｏｒｄ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）（Ｔ）＝１１である。ＨＳＰ  Ｓ及びＨＳＰ  Ｓ２パラメータは動的な値であり、配列の特定の構成、及び目的配列が検索される特定のデータベースの構成に依存してプログラム自体により設定される。しかしながら、これらの値は感度を上げるために調整される。％アミノ酸配列同一性値は、位置を合わせた（ａｌｉｇｎｅｄ）領域で一致する同等な残基数を「より長い」配列の残基総数で割ることで決定される。この「より長い」配列は、位置を合わせた領域において最も多い実質残基（ｔｈｅ  ｍｏｓｔ  ａｃｔｕａｌ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ）を有する配列である（アラインメント・スコアを最大化するためにＷＵ−Ｂｌａｓｔ−２により導入されるギャップは無視される）。
【００６６】
従って、「パーセント（％）核酸配列同一性」は、本明細書で開示される配列のヌクレオチド残基と同等な候補配列における核酸残基の百分率として定義される。好ましい方法は、オーバラップ・スパン及びオーバラップ・フラクションがそれぞれ１及び０．１２５に設定され、デフォルト・パラメータに設定されたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＮモジュールを利用する。
【００６７】
いくつかの実施態様において、前記アライメントは、位置を合わせた配列内でのギャップの導入を含む。加えて、対象核酸配列よりも多いかまたは少ないヌクレオチドを含む配列において、相同性のパーセンテージは、ヌクレオチドの全数に対しての相同ヌクレオチドの数に基づいて決定されることが理解される。従って、例えば、下記で記述するように、本明細書で同定された配列よりも短い配列の相同性は、より短い配列内のヌクレオチドの数を用いて決定される。
【００６８】
本明細書で用いられる「ポリヌクレオチド構築体」、「発現カセット」、及び「発現ベクター」の語は、適した宿主細胞でタンパク質を発現させることの出来る適した制御配列と操作可能に連結されるＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築体をいう。そのような制御配列は、転写をもたらすプロモータ、そのような転写を制御する任意のオペレータ配列、適したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列及び転写及び翻訳の終了を制御する配列を含む。通常、前記ポリヌクレオチド構築体は、タンパク質コーディング領域と操作可能に連結された転写制御領域（例えば、プロモーター）を含む。いくつかの実施態様において、前記ポリヌクレオチド構築体は、天然のプロモーターであるプロモーターと操作可能に連結されたタンパク質コーディング領域を含む（すなわち、前記プロモーターは、自然で見られるコーディング配列に隣接する）。従って、例えば、本発明のポリヌクレオチド構築体は、ｓｉｇＨプロモーター及びｙｍａＨコーディング配列を含む。他の実施態様において、前記ポリヌクレオチド構築体は、自然に隣接するプロモーターではないプロモーターと操作可能に連結されたタンパク質コーディング領域を含む（すなわち、ポリヌクレオチド構築体はキメラ・ポリヌクレオチドを含み、ここで、前記構築体内のコーディング配列に関連したプロモーターの位置は、自然には見られない）。例えば、ｓｉｇＡプロモーターは、ｙｍａＨコーディング配列と操作可能に連結される。他の実施態様において、前記ポリヌクレオチド構築体は、１より多いプロモーター及び１より多いタンパク質コーディング領域を含む（例えば、前記ポリヌクレオチド構築体は、オペロン内で見られるようなプロモーター及びコーディング領域を含む多シストロン性の配列を含む）。いくつかの他の実施態様において、前記ポリヌクレオチド構築体または発現カセットは、選択マーカー（例えば、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子のような抗生物質耐性マーカー）を含む。この選択マーカーは、適切な抗生物質の存在において、宿主細胞のゲノム内のポリヌクレオチド構築体の増幅を可能にする。前記ポリヌクレオチド構築体は、プラスミド、ゲノム、ミトコンドリアＤＮＡ、色素体ＤＮＡ、ウイルスまたは核酸断片内に組み込まれることが出来る。いくつかの実施態様において、前記ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、または単なる潜在的なゲノムの挿入物である。いくつかの追加的な実施態様において、一度適した宿主内に形質転換された場合、前記ベクターは宿主ゲノムに独立して複製及び機能するか、またはいくつかの他の場合において、ゲノム自体内に統合する。本明細書で用いられるように、「プラスミド」、「発現プラスミド」、及び「ベクター」は、しばしば置換可能に用いられ、前記プラスミドは今日最も一般的に、ベクターの形態として用いられる。しかしながら、本発明は、同等の機能として働き、当該技術分野で知られるかまたは知られるようになる、その他の形態の発現ベクターを含むことが意図される。「ベクター」の語は、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージまたはウイルス粒子、ＤＮＡ構築体、カセット等を含む。
【００６９】
本明細書で用いられる「プラスミド」の語は、クローニングベクターとして使用される円環の二重鎖（ｄｓ）ＤＮＡ構造体で、多くの細菌といくつかの真核細胞の染色体外の自律的に複製する遺伝子要素を形成するものをいう。いくつかの実施態様において、プラスミドは宿主細胞のゲノム内に組み込まれるようになる。「プラスミド」の語は、相同的組み換えにより宿主細胞のゲノム内に統合出来るマルチコピー・プラスミドを含む。
【００７０】
本明細書で用いられる「形質転換された」及び「安定に形質転換された」の語は、ゲノム中に統合された非天然の（異種の）ポリヌクレオチド配列を有するかまたは少なくとも二世代の間維持される、エピソームプラスミドを含む細胞をいう。本明細書で用いられる「発現」の語は、ポリヌクレオチドが転写され、得られた転写物がポリペプチドを得るために翻訳される過程をいう。この過程は転写と翻訳の両方を含む。
【００７１】
本明細書で用いられる「過剰発現」の語は、ポリペプチドをコードする配列を含む遺伝子が修飾された細胞内で人工的に発現され、前駆体宿主細胞内での同様のポリペプチドの発現レベルを超える発現レベルでコードされるポリペプチドを生成する過程をいう。従って、遺伝子と併用してこの語が典型的に使用される一方、「過剰発現」の語はまた、タンパク質と併用して使用され、コードする遺伝子の過剰発現に起因した増加したレベルのタンパク質をいうことも出来る。いくつかの実施態様において、タンパク質をコードする遺伝子の過剰発現は、タンパク質をコードする遺伝子のコピー数の増加により達成される。他の実施態様において、タンパク質をコードする遺伝子の過剰発現は、タンパク質をコードする遺伝子の転写及び／または翻訳を増加するような方法でプロモーター領域及び／またはリボソーム結合部位の結合強度を増加させることにより達成される。他の実施態様において、過剰発現は、遺伝子のコピー数の増加及びプロモーター領域及び／またはリボソーム結合部位の結合強度の増加により達成されることが出来る。いくつかの実施態様において、タンパク質をコードする遺伝子の過剰発現は、宿主細胞内に導入されたマルチコピー・プラスミド上に存在する少なくとも１コピーの対応するコーディングポリヌクレオチドの発現に起因する。他の実施態様において、タンパク質をコードする遺伝子の過剰発現は、宿主細胞のゲノム内に統合された２以上のコピーの対応するコーディングポリヌクレオチドの発現に起因する。
【００７２】
「宿主細胞」の語は、本発明に従ってＤＮＡを含む発現ベクターの宿主として機能する細胞由来の適した細胞をいう。適した宿主細胞は、自然発生のまたは野生型宿主細胞とすることが出来るか、または改変された宿主細胞とすることが出来る。一の実施態様において、前記宿主細胞は、グラム陽性細菌である。いくつかの好ましい実施態様において、当該語は、バチルス属内の細胞をいう。
【００７３】
本明細書で用いられる「バチルス細胞」の語は、当業者に知られる「バチルス」属の全ての種を含む。これらには、Ｂ．ズブチリス、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．ステロサーモフィラス、Ｂ．アルカロフィラス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．クラウジイ、Ｂ．ハロデュランス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．コアグランス、Ｂ．シルクランス、Ｂ．ラウタス、及びＢ．チューリンゲンシスが含まれるが、これらに限られない。バチルス属については分類学的再編成が継続しておこなわれているものと考えられる。従って、この属は再分類されてきた種を含むことを意図している。これらには、現在では「ゲオバチルス（ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）・ステロサーモフィラス」と命名されたバチルス・ステロサーモフィラスのような生物体が含まれるが、これに限られない。酸素存在下における抵抗性内生胞子の生産はバチルス属の特徴を決定すると考えられる。もっとも、この特徴も最近命名されたアリシクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アムフィバチルス（Ａｍｐｈｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アノイリニバチルス（Ａｎｅｕｒｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アノキシバチルス（Ａｎｏｘｙｂａｃｉｌｌｕｓ）、ブレビバチルス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、フィロバチルス（Ｆｉｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、グラシリバチルス（Ｇｒａｃｉｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ハロバチルス（Ｈａｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ペニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、サリバチルス（Ｓａｌｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、サーモバチルス（Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ウレイバチルス（Ｕｒｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、及びビルギバチルス（Ｖｉｒｇｉｂａｃｉｌｌｕｓ）に適用する。
【００７４】
「野生型宿主細胞」の語は、組み換え法を用いて遺伝子学的に改変されていない宿主細胞である。
【００７５】
本明細書で用いられる「野生型」の語は、自然発生源から単離された時のその遺伝子または遺伝子生成物の特性を有する遺伝子または遺伝子生成物をいう。通常、野生型遺伝子は個体数中で最も頻繁に観察され、従って、前記遺伝子の「正常」または「野生型」状態として任意に設計される。本明細書で用いられる「野生型配列」、及び「野生型遺伝子」の語は、相互置換可能に用いられ、天然起源のまたは宿主細胞で自然に生ずる配列をいう。この野生型配列は、同種または異種タンパク質のいずれかをコードしている可能性がある。
【００７６】
本明細書で用いられる「改変された宿主細胞」、「改変された細胞」及び「改変された株」は、遺伝子操作された宿主細胞（微生物）をいい、ここで、目的タンパク質は、改変されていないまたは野生型宿主細胞が実質的に同様の増殖条件下で増殖された同様の目的タンパク質の発現及び／または生成されたレベルより高いレベルの発現または生成で目的タンパク質が発現及び／または生成される。いくつかの実施態様において、改変された宿主細胞は、組み換えプロテアーゼ生成細胞である。
【００７７】
本明細書で用いられる「修飾された細胞」及び「修飾された宿主細胞」は、ＹｍａＨタンパク質をコードする遺伝子を過剰発現するように遺伝子操作された野生型または改変された宿主細胞をいう。いくつかの実施態様において、修飾された宿主細胞は、組み換えプロテアーゼ生成宿主細胞である。いくつかの実施態様において、修飾された宿主細胞は、その野生型または改変された親宿主細胞よりも高いレベルで目的タンパク質を発現可能及び／または生成可能である。
【００７８】
本明細書で用いられる「親」または「前駆体」細胞は、修飾された宿主細胞が誘導された細胞をいう。この親または前駆体細胞は、野生型細胞または改変された細胞とすることが出来る。いくつかの実施態様において、改変された親細胞は、改変されていないまたは野生型親／前駆体細胞よりも高いレベルで目的タンパク質を発現可能及び／または生成可能である。
【００７９】
核酸配列を細胞に導入することに関連して本明細書で用いられる「導入される」の語は、細胞に核酸配列を転移させることに適した任意の方法をいう。そのような導入のための方法には、プロトプラスト融合、形質移入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）、及び誘導（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）が含まれるが、これらに限られない（例えば、ハードウッド他編集、「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」（プレナム出版社）中のＦｅｒｒａｒｉ他著、「遺伝学（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、５７−７２頁、１９８９年を参照されたい）。
【００８０】
本明細書で用いられる「形質転換ＤＮＡ／ポリヌクレオチド」、「形質転換配列」、及び「ＤＮＡ／ポリヌクレオチド構築体」の語は、宿主細胞または有機体へ配列を導入するために用いられるＤＮＡをいう。「形質転換ＤＮＡ」の語は、宿主細胞または有機体へ配列を導入することに使用されるＤＮＡをいう。前記ＤＮＡは、ＰＣＲまたは任意の他の適した技術によりインビトロで作成されることが出来る。いくつかの好ましい実施態様において、形質転換ＤＮＡは入来配列（ｉｎｃｏｍｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む一方、他の好ましい実施態様において、ホモロジーボックスの側面に位置する入来配列をさらに含む。さらに別の実施態様において、形質転換ＤＮＡは末端に加えられるその他の非相同配列を含む（すなわち、スタッファー配列（ｓｔｕｆｆｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）またはフランキング配列（ｆｌａｎｋｓ））。いくつかの実施態様において、例えばベクター内への挿入等、形質転換ＤＮＡが閉じた環を形成するよう、前記末端は閉じられる。
【００８１】
本明細書で用いられる「選択マーカー−コーディングヌクレオチド配列」の語は、宿主細胞内で発現可能なヌクレオチド配列をいい、選択マーカーの発現は、対応する選択剤の存在中または必須栄養素の不足中に増殖する能力を、発現される遺伝子を含む細胞に与える。
【００８２】
本明細書で用いられる「選択マーカー」の語は、ベクターを含む宿主の選択を容易にするために、それらの宿主細胞で発現出来る遺伝子をいう。そのような選択マーカーの例には、抗微生物抗体（例えば、カナマイシン、エリスロマイシン、アクチノマイシン、クロラムフェニコール及びテトラサイクリン等）が含まれるが、これに限られない。従って、「選択マーカー」の語は、宿主細胞が目的の導入ＤＮＡを取り込んだか、またはある他の反応が起ったことを示す遺伝子をいう。一般的に、選択マーカーは、形質転換の間にいずれの外部配列をも受容しない細胞から区別される外部ＤＮＡを含むことを細胞が許容するために宿主細胞に微生物に対する抵抗性または代謝上の利点を与える遺伝子をいう。「内在（ｒｅｓｉｄｉｎｇ）選択マーカー」は、形質転換される微生物のゲノム上に位置するマーカーである。内在選択マーカーは、形質転換用のＤＮＡ構築体上の選択マーカーとは異なる遺伝子をコードする。
【００８３】
本明細書で用いられる「増幅」及び「遺伝子増幅」の語は、ゲノム中に初めから存在するよりも増幅された遺伝子がより多くのコピー数で存在するように、特定のＤＮＡ配列が不均一に複製される過程をいう。いくつかの実施態様において、ある薬剤（例えば、阻害可能な酵素の阻害剤）の存在下で増殖による細胞選択は、薬剤存在下で増殖が求められる遺伝子生産物をコードする内因性遺伝子の増幅、またはこの遺伝子生産物をコードする外因性（すなわち、挿入）配列の増幅によるかのいずれか、またはその両方による増幅をもたらす。
【００８４】
本明細書で用いられる「ポリペプチド」の語は、ペプチド結合により連結されたアミノ酸残基から作られた化合物をいう。いくつかの実施態様において、本明細書で用いられる「タンパク質」の語は、「ポリペプチド」の語と同義である。いくつかの別の実施態様において、この語は、２以上のポリペプチドの複合体をいう。従って、「タンパク質」と「ポリペプチド」の語は、相互置換可能に用いられる。
【００８５】
「ＹｍａＨタンパク質」の語は、「Ｈｆｑタンパク質」と相互置換可能に用いられ、目的タンパク質の発現を促進するタンパク質をいう。ＹｍａＨとの関連において本明細書で用いられる「（ａ）ＹｍａＨタンパク質」は、オーソログを含む、野生型ＹｍａＨタンパク質及びそれらの変異体をいう。
【００８６】
本明細書で用いられる「変異体」の語は、Ｃ−及びＮ−末端のいずれかまたは両方への１以上のアミノ酸の付加、アミノ酸配列内での１以上の異なる部位における１以上のアミノ酸の置換、タンパク質の末端またはアミノ酸配列内での１以上の部位のいずれかまたは両方における１以上のアミノ酸の欠失、及び／またはアミノ酸配列内の１以上の部位における１以上のアミノ酸の挿入により前駆体タンパク質（例えば、Ｂ．ズブチリスＹｍａＨタンパク質）に由来するタンパク質をいう。「Ｂ．ズブチリスＹｍａＨタンパク質」は、以下のように修飾されたＢ．ズブチリスＹｍａＨタンパク質をいう。Ｂ．ズブチリスＹｍａＨタンパク質の調製は、天然のタンパク質をコードするＤＮＡ配列の修飾、適した宿主内へのＤＮＡ配列の形質転換、及び派生酵素を形成するための修飾されたＤＮＡ配列の発現により好ましくは達成される。本発明の変異体Ｂ．ズブチリスＹｍａＨタンパク質は、前駆体酵素アミノ酸配列と比べ改変されたアミノ酸配列を含むペプチドを含む。ここで、前記変異体ズブチリスＹｍａＨタンパク質は、ＹｍａＨタンパク質が過剰発現されるＢ．ズブチリス細胞内で目的タンパク質の生成を促進する能力を保有する。変異体の活性は、前駆体分泌因子に対して増加または減少する可能性がある。本発明に係る変異体は、Ｂ．ズブチリスＹｍａＨタンパク質変異体をコードするＤＮＡ断片に由来出来ることが意図される。ここで、前記発現されたＢ．ズブチリスＹｍａＨタンパク質変異体の機能活性は、保持される。
【００８７】
「目的タンパク質」及び「目的ポリペプチド」の語は、宿主細胞により生成されたタンパク質／ポリペプチドをいう。一般的に、目的タンパク質は、商業的重要性を有する所望のタンパク質である。目的タンパク質は、宿主と同種または異種であることが出来る。いくつかの実施態様において、目的タンパク質は、分泌されたポリペプチド、特に、でんぷん分解酵素、タンパク質分解酵素、細胞分解酵素、酸化還元酵素、及び植物壁分解酵素を含むが、それらに限られない酵素である。別の実施態様において、これらの酵素は、アミラーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ラッカーゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、エステラーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、フィターゼ、ペクチナーゼ、グルコシダーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、ガラクトシダーゼ及びキチナーゼを含むが、それらに限られない。さらに別の実施態様において、発現されるポリペプチドはホルモン、サイトカイン、成長因子、受容体、ワクチン、抗体等である。本発明がいずれか特定のタンパク質／ポリペプチドに限られることは意図されないが、いくつかの最も好ましい実施態様において、前記発現される目的タンパク質はプロテアーゼである。
【００８８】
本明細書で用いられる「異種タンパク質」の語は、宿主細胞で天然に生じないタンパク質またはポリぺプチドをいう。異種タンパク質の例としては、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、その他のカルボヒドラーゼ及びリパーゼを含む加水分解酵素、例えば、ラセマーゼ、エピメラーゼ、トートメラーゼまたはムターゼ等のイソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼ及びホスファターゼ等の酵素を含む。いくつかの実施態様において、このタンパク質は、成長因子、サイトカイン、配位子、受容体及び阻害剤並びにワクチン及び抗体を含むがそれらに限られない、治療に重要なタンパク質またはぺプチドである。いくつかの別の実施態様において、このタンパク質は、商業的に重要な工業タンパク質またはぺプチドである（例えば、プロテアーゼ、例えば、アミラーゼ及びグルコアミラーゼ等のカルボヒドラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ及びリパーゼ等）。いくつかの実施態様において、このタンパク質をコードする遺伝子は自然発生の遺伝子である一方、他の実施態様において、変異及び／または合成された遺伝子が使用される。
【００８９】
本明細書で用いられる「同種タンパク質」の語は、宿主細胞内で天然または自然発生のタンパク質またはポリぺプチドをいう。本発明は、組み換えＤＮＡ技術を介して同種タンパク質を生成する宿主細胞を包含する。別の実施態様において、同種タンパク質は、大腸菌を含むが、それに限られないその他の有機体により生成された天然タンパク質である。本発明はさらに、組み換えＤＮＡ技術により同種タンパク質を生成する宿主細胞を包含する。本発明はさらに、自然発生の同種タンパク質（例えば、プロテアーゼ）をコードする核酸の１以上の欠失または１以上の割り込み（ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｉｏｎｓ）を伴い、組み換え体の形態（すなわち、発現カセット）内で再度導入された同種タンパク質をコードする核酸を有する宿主細胞を包含する。他の実施態様において、前記宿主細胞は、同種タンパク質を生成する。
【００９０】
本明細書で用いられる「プロテアーゼ」、及び「タンパク質分解活性」の語は、ペプチド結合を有するペプチドまたは基質を加水分解する能力を示すタンパク質またはペプチドをいう。タンパク質分解活性を測定するための多くの周知の操作法が存在している（Ｆｉｅｃｈｔｅｒ編、「生化学工学／バイオテクノロジーの進歩（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」（１９８８年）中のＫａｌｉｓｚ著、「微生物プロテアーゼ（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ）」）。例えば、タンパク質分解活性は、市販の基質を加水分解する生成されたプロテアーゼの性能を分析する比較アッセイにより確認することが出来る。プロテアーゼまたはタンパク質分解活性のそのような分析に有用な模範的な基質には、ジメチルカゼイン（シグマ社Ｃ−９８０１）、ウシ・コラーゲン（シグマ社Ｃ−９８７９）、ウシ・エラスチン（シグマ社Ｅ−１６２５）、及びウシ・ケラチン（ＩＣＮバイオメディカル社９０２１１１）が含まれるが、これらに限られない。これらの基質を利用した比色試験は、当該技術分野において周知である（例えば、ＷＯ９９／３４０１１及び米国特許第６，３７６，４５０号を参照されたい。両文献は参照により本明細書に取り込まれる）。ＡＡＰＦ試験（例えば、Ｄｅｌ  Ｍａｒ他著、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第９９巻、３１６−３２０頁、１９７９年を参照されたい）も、成熟プロテアーゼの生成を測定するために利用される。この試験は、酵素が溶解性合成基質である、スクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェニルアラニン−ｐ−ニトロアニリド（ｓＡＡＰＦ−ｐＮＡ）を加水分解する際にｐ−ニトロアナリンが放出される速度を測定する。加水分解反応による黄色の生成速度は、分光光度計により４１０ｎｍで測定され、活性酵素濃度に比例する。
【００９１】
本明細書で用いられる「活性」の語は、プロテアーゼに関連するタンパク質分解活性のような、特定のタンパク質に関連する生物学的活性をいう。生物学的活性は、前記タンパク質に起因すると通常当業者に考えられる任意の活性を示す。
【００９２】
目的タンパク質に関連して用いられる「生成」の語は、成熟過程の間に起こることが知られているポリペプチドの活性成熟形態を通常形成するプロ領域の除去を含む、ポリペプチドの生成における処理過程を包含する。いくつかの実施態様において、このポリペプチドの生成は、タンパク質分泌の間に起こることが知られる、シグナル・ペプチドを取り除く過程を含む（例えば、Ｗａｎｇ他著、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３７巻、３１６５−３１７１頁、１９９８年、及びＰｏｗｅｒ他著、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、第８３巻、３０９６−３１００ページ、１９８６年を参照されたい）。いくつかの実施態様において、発現されたタンパク質は発現した細胞の細胞内環境に局在する一方、他の実施態様において、発現されたタンパク質は細胞外環境に分泌される。従って、いくつかの実施態様において、目的タンパク質の生成は、タンパク質発現の細胞の過程及び細胞外培地への分泌を含む。例えば、プロテアーゼの生成は、１．タンパク質分泌の間に起こることが知られるシグナル・ペプチドの除去、及び２．酵素の活性成熟形態を形成し、成熟過程の間に起こることが知られるプロ領域の除去を含む、全長プロテアーゼの２段階の処理過程を含む（Ｗａｎｇ他著、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３７巻、３１６５−３１７１頁、１９９８年、Ｐｏｗｅｒ他著、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、第８３巻、３０９６−３１００頁、１９８６年）。
【００９３】
本明細書で用いられる「早期発現及び／または早期生成」の語は、前駆体／親宿主により正常に発現される目的タンパク質よりも早い時間で宿主細胞内で起こる目的タンパク質の発現及び／または生成を示す。いくつかの実施態様において、目的タンパク質の「早期発現及び／または生成」は、ｙｍａＨを過剰発現しない宿主細胞よりもＹｍａＨを過剰発現する宿主内でより早く起こる。
【００９４】
本明細書で用いられる「促進（増進）された（ｅｎｈａｎｃｅｄ）」の語は、目的タンパク質の改善された生成を示す。好ましい実施態様において、本発明は、修飾された宿主内での目的タンパク質の促進された（すなわち、改善された）生成を提供する。これらの実施態様において、修飾されていない野生型または改変された親宿主（例えば、ＹｍａＨのような転写活性化因子を過剰発現しない野生型細胞または改変された細胞）による正常レベルでの生成と比べ、この「促進された」生成は改善されている。
【００９５】
ＹｍａＨポリペプチド及びポリヌクレオチド構築体
いくつかの実施態様において、本発明は、プロモーター及びＹｍａＨタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド構築体を提供する。ＨＦＱ＿ＢＡＣＳＵとしても知られるＢ．ズブチリスＹｍａＨは、ＲＮＡ結合タンパク質であり、ＲＮＡ結合タンパク質のＨｆｑファミリーのメンバーである（Ｓａｕｔｅｒ他著、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ、第３１巻、４０９１−４０９８頁、２００３年）。ＹｍａＨタンパク質は、バチルス・ズブチリス内でｙｍａＨ遺伝子によりコードされる。この遺伝子は、大腸菌のｈｆｑ遺伝子のオーソログである（Ｓｉｌｖａｇｇｉ他著、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．第１８７（１９）巻、６６４１−６６５０頁、２００５年）。ＹｍａＨは、多く偏在するＲＮＡ結合タンパク質であり、原核生物において、ＲＮＡ代謝の多面的な調節因子として機能する。ＹｍａＨは、いくつかの転写物の安定化及び他の物質の分解に必要とされる。ＹｍａＨは、非構造のＡ／Ｕ高濃度ＲＮＡ配列に優先的に結合し、真核性Ｓｍタンパク質と配列及び構造の両方で類似する。ＹｍａＨはまた、リボ調節因子と呼ばれる小型のＲＮＡ分子と結合することも知られている。このリボ調節因子は、ＲＮＡ転写物の安定性または転写効率を調節する。
【００９６】
本発明は、ｙｍａＨを過剰発現するように修飾された宿主細胞内で目的タンパク質の生成を増加させる、ｙｍａＨの過剰発現にための方法及び組成物を提供する。追加的に、本明細書で示されるように、ｙｍａＨの過剰発現は、バチルス宿主細胞内でのプロテアーゼの生成を促進する。ｙｍａＨの過剰発現は、ＹｍａＨをコードするポリヌクレオチドの転写及び／または翻訳を促進することを含め、様々な手段により達成されることが出来る。例えば、転写レベルにおいて、ｙｍａＨの過剰発現は、宿主細胞内でｙｍａＨをコードするポリヌクレオチド配列の数を増加させることにより、及び／または同種ＲＮＡポリメラーゼの活性を促進させるため、ｙｍａＨプロモーターの結合強度を増加させることにより達成されることが出来る。翻訳レベルにおいて、ｙｍａＨの過剰発現は、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）へのリボソームの親和性を増加させるためにＲＢＳを変異させることにより、翻訳活性を促進することで達成されることが出来る。ｙｍａＨの過剰発現は、ｙｍａＨ遺伝子単独またはｙｍａＨの過剰発現を達成するためにｙｍａＨ遺伝子になされた他の可能な修飾との組み合わせで、ｙｍａＨ遺伝子のコピー数を増加させることによりもたらされることが出来ると当業者は認識することになる。
【００９７】
本発明は、ポリヌクレオチド構築体、ベクター及びｙｍａＨの過剰発現を可能にする宿主細胞を含む組成物を提供する。本発明はまた、目的タンパク質を過剰発現するための本発明に係る組成物を用いた方法も提供する。本発明のポリヌクレオチド構築体は、ＹｍａＨタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列とＳｉｇＡ及び／またはＳｉｇＨプロモーターを含む。
【００９８】
一の実施態様において、本発明は、ｙｍａＨをコードするポリヌクレオチド配列の数を増加させることによるｙｍａＨの過剰発現を提供する。従って、本発明は、ｙｍａＨプロモーターと操作可能に連結された、ｙｍａＨをコードするポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド構築体を提供する。ｙｍａＨプロモーターは、ＹｍａＨの発現を誘導する任意のプロモーター（例えば、ＳｉｇＡ及び／またはＳｉｇＨプロモーター）とすることが出来る。また、ｙｍａＨプロモーターは、選択宿主細胞内で転写活性を示し、変異、切断及びハイブリッド・プロモーターを含む任意の核酸配列とすることが出来る。さらに、ｙｍａＨプロモーターは、宿主細胞と同種または異種のいずれかである細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られることが出来る。このプロモーター配列は、宿主細胞に対して天然または外来であることが出来る。
【００９９】
いくつかの実施態様において、前記プロモーター配列は、微生物源から得られることが出来る。いくつかの実施態様において、前記プロモーター配列は、バチルス株（例えば、バチルス・アルカロフィラス、バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・ブレビス、バチルス・シルクランス、バチルス・クラウジイ、バチルス・コアグランス、バチルス・フィルマス（ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ラウタス、バチルス・レンタス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・メガテリウム、バチルス・プミラス（ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステロサーモフィラス、バチルス・ズブチリス、またはバチルス・チューリンゲンシス）、またはストレプトミセス株（例えば、ストレプトミセス・リビダンス（ｌｉｖｉｄａｎ）またはストレプトミセス・ムリナス（ｍｕｒｉｎｕｓ））のようなグラム陽性細菌またはグラム陰性細菌（例えば、大腸菌またはシュードモナス種）から得られることが出来る。
【０１００】
ｙｍａＨの転写は、２個のプロモーターにより自然に誘導されることが出来る。すなわち、ｍｉａＡコーディング領域の上流に存在するＳｉｇＡプロモーター及びＢ．ズブチリスのｍｉａＡオペロン内のｙｍａＨコーディング領域の直ぐ上流にあるＳｉｇＨプロモーターである。いくつかの実施態様において、本発明は、ＹｍａＨ及びＳｉｇＡプロモーターをコードするポリヌクレオチド配列（例えば、配列番号２及び３）を含むポリヌクレオチド構築体を提供する。配列番号２及び３は、キメラ・ポリヌクレオチド構築体を提供するように、ｙｍａＨコーディング配列がＳｉｇＡプロモーター配列と隣接する実施態様を例示する。従って、いくつかの好ましい実施態様において、キメラ・ポリヌクレオチド構築体は、自然においてｙｍａＨコーディング配列と隣接しないプロモーター配列を含む。例えば、配列番号２及び３は、ｙｍａＨをコードするポリヌクレオチド配列と操作可能に連結されたＳｉｇＡプロモーターを各々含む、キメラ構築体ＳｉｇＡ１及びＳｉｇＡ２をそれぞれ例示する。
【０１０１】
ＧＣＧＣＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＡＣＣＣＴＧＡＡＡＧＧＡＡＡＧＡＣＡＡＧＧＧＡＡＡＴＴＧＴＣＧＧＣＡＡＴＧＡＧＣＣＧＣＴＣＧＧＣＡＧＧＴＡＧＡＡＧＧＡＴＧＴＴＴＡＣＣＧＡＴＧＣＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＣＡＡＡＡＴＧＧＡＴＡＧＧＴＧＧＴＴＧＴＣＣＡＴＧＴＴＧＡＡＴＧＣＴＡＴＡＡＴＧＧＧＧＧＡＧＡＴＴＴＡＴＡＡＡＡＧＡＧＡＧＴＧＡＴＡＣＡＴＡＴＴＧＡＡＴＡＡＴＡＣＧＡＡＧＣＡＧＣＣＣＣＡＣＡＣＡＴＡＴＡＧＣＡＧＧＡＡＡＡＣＴＣＧＡＡＣＴＴＴＡＡＴＣＧＡＡＡＣＴＧＴＡＴＧＡＴＡＴＡＧＡＧＡＡＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＡＴＧＡＡＡＣＣＧＡＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＧＧＡＴＣＡＧＴＴＴＴＴＧＡＡＴＣＡＡＡＴＣＣＧＧＡＡＡＧＡＡＡＡＴＡＣＧＴＡＴＧＴＣＡＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＴＴＴＣＡＧＴＴＧＣＧＧＧＧＣＣＡＧＧＴＧＡＡＡＧＧＣＴＴＴＧＡＴＡＡＣＴＴＴＡＣＣＧＴＡＴＴＧＴＴＧＧＡＡＴＣＧＧＡＡＧＧＴＡＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＴＡＴＡＴＡＴＡＡＡＣＡＴＧＣＧＡＴＣＴＣＡＡＣＧＴＴＴＧＣＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＡＡＣＧＴＣＣＡＧＣＴＴＧＡＡＣＴＣＧＡＡＴＡＧＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴＧＣＣＡＴＧＴＣＡＡＧＡＣＡＴＧＡＧＧＡＡＡＧＧＣＴＧＴＣＧＧＧＧＧＴＴＣＣＣＧＧＣＧＧＣＣＡＴＴＴＴＴＡＡＣＡＴＧＡＡＴＣＣＡＣＴＴＴＴＧＣＴＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＴＧＴＡＡＧＣＴＧＡＣＣＡＴＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＧＧＴＣＴＴＴＴＴＴＴＡＴＧＡＧＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＣＣ（配列番号２）
ＧＣＧＣＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＡＣＣＣＴＧＡＡＡＧＧＡＡＡＧＡＣＡＡＧＧＧＡＡＡＴＴＧＴＣＧＧＣＡＡＴＧＡＧＣＣＧＣＴＣＧＧＣＡＧＧＴＡＧＡＡＧＧＡＴＧＴＴＴＡＣＣＧＡＴＧＣＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＣＡＡＡＡＴＧＧＡＴＡＧＧＴＧＧＴＴＧＴＣＣＡＴＧＴＴＧＡＡＴＧＣＴＡＴＡＡＴＧＧＧＧＧＡＧＡＴＴＴＡＴＡＡＡＡＧＡＧＡＧＴＧＣＴＣＧＡＡＣＴＴＴＡＡＴＣＧＡＡＡＣＴＧＴＡＴＧＡＴＡＴＡＧＡＧＡＡＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＡＴＧＡＡＡＣＣＧＡＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＧＧＡＴＣＡＧＴＴＴＴＴＧＡＡＴＣＡＡＡＴＣＣＧＧＡＡＡＧＡＡＡＡＴＡＣＧＴＡＴＧＴＣＡＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＴＴＴＣＡＧＴＴＧＣＧＧＧＧＣＣＡＧＧＴＧＡＡＡＧＧＣＴＴＴＧＡＴＡＡＣＴＴＴＡＣＣＧＴＡＴＴＧＴＴＧＧＡＡＴＣＧＧＡＡＧＧＴＡＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＴＡＴＡＴＡＴＡＡＡＣＡＴＧＣＧＡＴＣＴＣＡＡＣＧＴＴＴＧＣＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＡＡＣＧＴＣＣＡＧＣＴＴＧＡＡＣＴＣＧＡＡＴＡＧＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴＧＣＣＡＴＧＴＣＡＡＧＡＣＡＴＧＡＧＧＡＡＡＧＧＣＴＧＴＣＧＧＧＧＧＴＴＣＣＣＧＧＣＧＧＣＣＡＴＴＴＴＴＡＡＣＡＴＧＡＡＴＣＣＡＣＴＴＴＴＧＣＴＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＴＧＴＡＡＧＣＴＧＡＣＣＡＴＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＧＧＴＣＴＴＴＴＴＴＴＡＴＧＡＧＧＧＡＴＣＣＧＧＴＧＣＣ（配列番号３）
別の実施態様において、本発明は、ＹｍａＨ及びＳｉｇＨプロモーターをコードするポリヌクレオチド配列（例えば、下記に示される配列番号１のＳｉｇＨ構築体）を含むポリヌクレオチド構築体を提供する。配列番号１はまた、ＳｉｇＨプロモーターと自然に隣接するｙｍａＨコーディング配列を含むポリヌクレオチド構築体を例示する。
【０１０２】
ＧＧＣＡＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＣＧＴＧＧＴＴＴＣＧＣＡＡＣＡＡＡＡＴＧＣＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＧＴＴＣＧＡＴＡＴＧＡＣＡＣＣＧＣＣＴＧＴＴＧＡＴＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡＡＡＴＴＴＴＣＡＣＡＣＡＴＡＴＡＧＣＡＧＧＡＡＡＡＣＴＣＧＡＡＣＴＴＴＡＡＴＣＧＡＡＡＣＴＧＴＡＴＧＡＴＡＴＡＧＡＧＡＡＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＡＴＧＡＡＡＣＣＧＡＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＧＧＡＴＣＡＧＴＴＴＴＴＧＡＡＴＣＡＡＡＴＣＣＧＧＡＡＡＧＡＡＡＡＴＡＣＧＴＡＴＧＴＣＡＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＴＴＴＣＡＧＴＴＧＣＧＧＧＧＣＣＡＧＧＴＧＡＡＡＧＧＣＴＴＴＧＡＴＡＡＣＴＴＴＡＣＣＧＴＡＴＴＧＴＴＧＧＡＡＴＣＧＧＡＡＧＧＴＡＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＴＡＴＡＴＡＴＡＡＡＣＡＴＧＣＧＡＴＣＴＣＡＡＣＧＴＴＴＧＣＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＡＡＣＧＴＣＣＡＧＣＴＴＧＡＡＣＴＣＧＡＡＴＡＧＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴＧＣＣＡＴＧＴＣＡＡＧＡＣＡＴＧＡＧＧＡＡＡＧＧＣＴＧＴＣＧＧＧＧＧＴＴＣＣＣＧＧＣＧＧＣＣＡＴＴＴＴＴＡＡＣＡＴＧＡＡＴＣＣＡＣＴＴＴＴＧＣＴＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＴＧＴＡＡＧＣＴＧＡＣＣＡＴＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＧＧＴＣＴＴＴＴＴＴＴＡＴＧＡＧＧＧＡＴＣＣＧＧＡＧＣＣ（配列番号１）
さらに別の実施態様において、本発明は、ＹｍａＨをコードするポリヌクレオチド配列とＳｉｇＡ及びＳｉｇＨプロモーターを含むポリヌクレオチド構築体を提供する（例えば、下記に示される配列番号１３のＳｉｇＡ３構築体）。
【０１０３】
ＴＣＡＴＡＣＣＣＴＧＡＡＡＧＧＡＡＡＧＡＣＡＡＧＧＧＡＡＡＴＴＧＴＣＧＧＣＡＡＴＧＡＧＣＣＧＣＴＣＧＧＣＡＧＧＴＡＧＡＡＧＧＡＴＧＴＴＴＡＣＣＧＡＴＧＣＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＣＡＡＡＡＴＧＧＡＴＡＧＧＴＧＧＴＴＧＴＣＣＡＴＧＴＴＧＡＡＴＧＣＴＡＴＡＡＴＧＧＧＧＧＡＧＡＴＴＴＡＴＡＡＡＡＧＡＧＡＧＴＧＡＴＡＣＡＴＡＴＴＧＡＡＴＡＡＴＡＣＧＡＡＧＣＡＧＣＣＣＧＴＴＧＴＣＡＴＴＴＴＡＧＴＣＧＧＡＣＣＧＡＣＧＧＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴＴＴＡＡＧＴＡＴＴＣＡＧＣＴＡＧＣＣＡＡＡＴＣＣＴＴＡＡＡＣＧＣＧＧＡＡＡＴＴＡＴＣＡＧＣＧＧＡＧＡＴＴＣＧＡＴＧＣＡＧＡＴＴＴＡＴＡＡＡＧＧＧＡＴＧＧＡＴＡＴＴＧＧＡＡＣＡＧＣＴＡＡＡＡＴＴＡＣＣＧＡＡＣＡＧＧＡＧＡＴＧＧＡＧＧＧＡＧＴＧＣＣＣＣＡＴＣＡＴＣＴＧＡＴＴＧＡＣＡＴＴＴＴＡＧＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡＣＴＣＴＴＴＣＴＣＴＡＣＴＧＣＣＧＡＴＴＡＴＣＡＡＡＧＣＴＴＡＧＴＡＡＧＡＡＡＴＡＡＡＡＴＣＡＧＣＧＡＧＡＴＴＧＣＡＡＡＴＡＧＡＧＧＡＡＡＧＣＴＴＣＣＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＧＧＣＧＧＴＡＣＡＧＧＧＣＴＴＴＡＴＡＴＡＣＡＡＴＣＴＧＡＧＣＴＴＴＡＣＧＡＴＴＡＴＡＣＡＴＴＴＡＣＧＧＡＡＧＡＧＧＣＡＡＡＴＧＡＴＣＣＣＧＴＧＴＴＴＣＧＡＧＡＧＡＧＣＡＴＧＣＡＡＡＴＧＧＣＴＧＣＴＧＡＧＣＧＧＧＡＡＧＧＣＧＣＴＧＡＣＴＴＴＣＴＴＣＡＴＧＣＣＡＡＡＣＴＴＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＴＣＣＣＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＧＡＴＴＣＡＴＣＣＧＡＡＴＡＡＴＡＣＡＡＧＡＡＧＡＧＴＣＡＴＴＣＧＣＧＣＡＣＴＧＧＡＡＡＴＴＴＴＡＣＡＴＡＣＧＴＣＣＧＧＡＡＡＡＡＣＧＡＴＧＴＣＣＣＡＧＣＡＴＴＴＧＡＡＧＧＡＡＣＡＡＡＡＡＣＧＡＧＡＡＣＴＴＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＣＡＧＴＧＴＴＡＡＴＴＧＧＣＣＴＧＡＣＡＡＴＧＧＡＴＡＧＡＧＡＣＡＣＧＣＴＴＴＡＣＧＡＡＡＧＡＡＴＴＡＡＴＣＡＧＣＧＧＧＴＣＧＡＴＴＴＧＡＴＧＡＴＧＣＡＧＴＣＡＧＧＣＣＴＴＣＴＴＣＣＧＧＡＡＧＴＧＡＡＡＣＧＣＴＴＡＴＡＣＧＡＣＡＡＧＡＡＣＧＴＧＡＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＡＴＣＡＡＴＡＣＡＧＧＣＧＡＴＡＧＧＣＴＡＴＡＡＡＧＡＧＣＴＧＴＡＴＧＣＡＴＡＴＴＴＴＧＡＣＧＧＴＴＴＴＧＴＧＡＣＡＣＴＴＴＣＣＧＡＴＧＣＴＧＴＣＧＡＡＣＡＧＣＴＡＡＡＧＣＡＧＡＡＣＴＣＧＡＧＧＣＧＧＴＡＴＧＣＧＡＡＡＣＧＣＣＡＧＣＴＧＡＣＧＴＧＧＴＴＴＣＧＣＡＡＣＡＡＡＡＴＧＣＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＧＴＴＣＧＡＴＡＴＧＡＣＡＣＣＧＣＣＴＧＴＴＧＡＴＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡＡＡＴＴＴＴＣＡＣＡＣＡＴＡＴＡＧＣＡＧＧＡＡＡＡＣＴＣＧＡＡＣＴＴＴＡＡＴＣＧＡＡＡＣＴＧＴＡＴＧＡＴＡＴＡＧＡＧＡＡＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣＡＴＧＡＡＡＣＣＧＡＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＧＧＡＴＣＡＧＴＴＴＴＴＧＡＡＴＣＡＡＡＴＣＣＧＧＡＡＡＧＡＡＡＡＴＡＣＧＴＡＴＧＴＣＡＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＴＴＴＣＡＧＴＴＧＣＧＧＧＧＣＣＡＧＧＴＧＡＡＡＧＧＣＴＴＴＧＡＴＡＡＣＴＴＴＡＣＣＧＴＡＴＴＧＴＴＧＧＡＡＴＣＧＧＡＡＧＧＴＡＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＴＡＴＡＴＡＴＡＡＡＣＡＴＧＣＧＡＴＣＴＣＡＡＣＧＴＴＴＧＣＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＡＡＣＧＴＣＣＡＧＣＴＴＧＡＡＣＴＣＧＡＡＴＡＧＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴＧＣＣＡＴＧＴＣＡＡＧＡＣＡＴＧＡＧＧＡＡＡＧＧＣＴＧＴＣＧＧＧＧＧＴＴＣＣＣＧＧＣＧＧＣＣＡＴＴＴＴＴＡＡＣＡＴＧＡＡＴＣＣＡＣＴＴＴＴＧＣＴＣＣＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＴＧＴＡＡＧＣＴＧＡＣＣＡＴＧＣＣＡＡＧＧＣＡＣＧＧＴＣＴＴＴＴＴＴＴＡＴＧＡＧ（配列番号１３）
ｙｍａＨ遺伝子の発現に導く適したプロモーターの例は、ｍｉａＡをコードする遺伝子を包含するＢ．ズブチリス・オペロン由来の前記ＳｉｇＡ及びＳｉｇＨプロモーターである。例えば、一の実施態様において、本発明は、ＳｉｇＡプロモーターを定義するポリヌクレオチド配列を提供する（下記で示される配列番号１４）。
【０１０４】
ＴＣＡＴＡＣＣＣＴＧＡＡＡＧＧＡＡＡＧＡＣＡＡＧＧＧＡＡＡＴＴＧＴＣＧＧＣＡＡＴＧＡＧＣＣＧＣＴＣＧＧＣＡＧＧＴＡＧＡＡＧＧＡＴＧＴＴＴＡＣＣＧＡＴＧＣＡＡＡＡＡＡＡＧＧＧＣＡＡＡＡＴＧＧＡＴＡＧＧＴＧＧＴＴＧＴＣＣＡＴＧＴＴＧＡＡＴＧＣＴＡＴＡＡＴＧＧＧＧＧＡＧＡＴＴＴＡＴＡＡＡＡＧＡＧＡＧＴＧＡＴＡＣＡＴＡ（配列番号１４）
別の実施態様において、本発明は、ＳｉｇＨプロモーターを定義するポリヌクレオチド配列を提供する（下記で示される配列番号１６）。
【０１０５】
ＡＡＡＧＧＡＡＡＴＴＴＴＣＡＣＡＣＡＴＡＴＡＧＣＡＧＧＡＡＡＡＣＴＣＧＡＡＣＴＴＴＡＡＴＣＧＡＡＡＣＴＧＴＡＴＧＡＴＡＴＡＧＡＧＡＡＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＡＡＡＣ（配列番号１６）
ｙｍａＨ遺伝子の発現に用いられるプロモーターのその他の例は、シグマＡプロモーターを含む。このシグマＡプロモーターは、ストレプトミセス・コエリコラー（ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）のアガラース（ａｇａｒａｓｅ）遺伝子（ｄａｇＡ）のプロモーター、バチルス・レンタスのアルカリプロテアーゼ遺伝子（ａｐｒＨ）のプロモーター、バチルス・リケニフォルミスのアルカリプロテアーゼ遺伝子（ズブチリシン・カールスバーグ遺伝子）のプロモーター、バチルス・ズブチリスのレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）のプロモーター、バチルス・ズブチリスのアルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＥ）のプロモーター、バチルス・リケニフォルミスのアルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）のプロモーター、バチルス・ステロサーモフィラスのマルトジェニック・アミラーゼ（ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ  ａｍｙｌａｓｅ）遺伝子（ａｍｙＭ）のプロモーター、及びバチルス・アミロリケファシエンスのアルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）のプロモーターを含むσＡ因子により認識される。ｙｍａＨ遺伝子の発現に用いられるプロモーターの例は、ｓｐｏ０Ａ、ｓｐｏ０Ｆ、ｓｐｏＶＧ及びｃｉｔＧを含むσＨ因子により認識されるシグマＨプロモーターを含む（Ａ．Ｌ．Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ、Ｊ．Ａ．Ｈｏｃｈ及びＲ．Ｌｏｓｉｃｋ編集、バチルス・ズブチリス及びその最近親種、遺伝子から細胞（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃｌｏｓｅｓｔ  ｒｅｌａｔｉｖｅｓ：  ｆｒｏｍ  ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  ｃｅｌｌｓ．）、アメリカン・ソシエティ・フォー・マイクロバイオロジー社、ワシントンＤ．Ｃ．中のＨｅｌｍａｎｎ，Ｊ．Ｄ．及びＣ．Ｐ．Ｍｏｒａｎ．著、２００２年、ＲＮＡポリメラーゼ及びシグマ因子（ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｎｄ  ｓｉｇｍａ  ｆａｃｔｏｒｓ）、２８９−３１２頁を参照されたい）。
【０１０６】
いくつかの実施態様において、コンセンサスＳｉｇＡ及び／またはＳｉｇＨプロモーターが本発明で使用される。コンセンサス・プロモーターの構築は、バチルス・ズブチリスに用いられる植物性「シグマＡ型」プロモーターの「−１０」及び「−３５」領域に用いられる確立したコンセンサス配列とより完全に一致するプロモーターを作成するための部位特異的突然変異生成により達成されることが出来る（Ｖｏｓｋｕｉｌ他著、Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、第１７巻、２７１−２７９頁、１９９５年）。他の実施態様において、コンセンサス・プロモーターは、バチルス・ズブチリスに用いられる植物性「シグマＨ型」プロモーターの「−１０」及び「−３５」領域に用いられる確立したコンセンサス配列とより完全に一致するプロモーターを作成するための部位特異的突然変異生成により作成される（バチルス・ズブチリス及びその最近親種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃｌｏｓｅｓｔ  ｒｅｌａｔｉｖｅｓ）内のＨｅｌｍａｎ及びＭｏｒａｎ著、Ｃｈ．２１、２８９−３１２頁、Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ他編集、２００２年、ＡＳＭ出版社、ワシントンＤ．Ｃ．を参照されたい）。シグマＡ型プロモーターの「−３５」領域に用いられるコンセンサス配列はＴＴＧａｃａであり、「−１０」領域に用いられる配列はｔｇｎＴＡＴａａｔである。また、シグマＨ型プロモーターの「−３５」領域に用いられるコンセンサス配列はＲｎＡＧＧＡｗＷＷであり、「−１０」領域に用いられる配列はＲｎｎＧＡＡＴである。大文字は高度に保存された部位を示し、小文字は低度に保存された部位を示す。略称ＲはＡまたはＧであることができ、ＷはＡまたはＴであることが出来る。コンセンサス・プロモーターは、バチルス宿主細胞で機能出来る任意のプロモーターから得られることが出来る。
【０１０７】
いくつかの実施態様において、配列番号１４を包含するＳｉｇＡプロモーターは、ｍｉａＡコーディング配列の上流に自然に存在するポリヌクレオチド配列により定義される（下記で示される配列番号１５）。一方、配列番号１６を包含するＳｉｇＨプロモーターは、ｙｍａＨコーディング配列の上流に自然に存在するポリヌクレオチド配列（下記で示される配列番号１７）により定義される。
【０１０８】
ＴＴＧＡＡＴＡＡＴＡＣＧＡＡＧＣＡＧＣＣＣＧＴＴＧＴＣＡＴＴＴＴＡＧＴＣＧＧＡＣＣＧＡＣＧＧＣＡＧＴＧＧＧＧＡＡＡＡＣＣＡＡＴＴＴＡＡＧＴＡＴＴＣＡＧＣＴＡＧＣＣＡＡＡＴＣＣＴＴＡＡＡＣＧＣＧＧＡＡＡＴＴＡＴＣＡＧＣＧＧＡＧＡＴＴＣＧＡＴＧＣＡＧＡＴＴＴＡＴＡＡＡＧＧＧＡＴＧＧＡＴＡＴＴＧＧＡＡＣＡＧＣＴＡＡＡＡＴＴＡＣＣＧＡＡＣＡＧＧＡＧＡＴＧＧＡＧＧＧＡＧＴＧＣＣＣＣＡＴＣＡＴＣＴＧＡＴＴＧＡＣＡＴＴＴＴＡＧＡＴＣＣＣＣＡＡＧＡＣＴＣＴＴＴＣＴＣＴＡＣＴＧＣＣＧＡＴＴＡＴＣＡＡＡＧＣＴＴＡＧＴＡＡＧＡＡＡＴＡＡＡＡＴＣＡＧＣＧＡＧＡＴＴＧＣＡＡＡＴＡＧＡＧＧＡＡＡＧＣＴＴＣＣＧＡＴＧＡＴＴＧＡＣＧＧＣＧＧＴＡＣＡＧＧＧＣＴＴＴＡＴＡＴＡＣＡＡＴＣＴＧＡＧＣＴＴＴＡＣＧＡＴＴＡＴＡＣＡＴＴＴＡＣＧＧＡＡＧＡＧＧＣＡＡＡＴＧＡＴＣＣＣＧＴＧＴＴＴＣＧＡＧＡＧＡＧＣＡＴＧＣＡＡＡＴＧＧＣＴＧＣＴＧＡＧＣＧＧＧＡＡＧＧＣＧＣＴＧＡＣＴＴＴＣＴＴＣＡＴＧＣＣＡＡＡＣＴＴＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＡＴＣＣＣＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＧＡＴＴＣＡＴＣＣＧＡＡＴＡＡＴＡＣＡＡＧＡＡＧＡＧＴＣＡＴＴＣＧＣＧＣＡＣＴＧＧＡＡＡＴＴＴＴＡＣＡＴＡＣＧＴＣＣＧＧＡＡＡＡＡＣＧＡＴＧＴＣＣＣＡＧＣＡＴＴＴＧＡＡＧＧＡＡＣＡＡＡＡＡＣＧＡＧＡＡＣＴＴＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＣＡＧＴＧＴＴＡＡＴＴＧＧＣＣＴＧＡＣＡＡＴＧＧＡＴＡＧＡＧＡＣＡＣＧＣＴＴＴＡＣＧＡＡＡＧＡＡＴＴＡＡＴＣＡＧＣＧＧＧＴＣＧＡＴＴＴＧＡＴＧＡＴＧＣＡＧＴＣＡＧＧＣＣＴＴＣＴＴＣＣＧＧＡＡＧＴＧＡＡＡＣＧＣＴＴＡＴＡＣＧＡＣＡＡＧＡＡＣＧＴＧＡＧＡＧＡＣＴＧＴＣＡＡＴＣＡＡＴＡＣＡＧＧＣＧＡＴＡＧＧＣＴＡＴＡＡＡＧＡＧＣＴＧＴＡＴＧＣＡＴＡＴＴＴＴＧＡＣＧＧＴＴＴＴＧＴＧＡＣＡＣＴＴＴＣＣＧＡＴＧＣＴＧＴＣＧＡＡＣＡＧＣＴＡＡＡＧＣＡＧＡＡＣＴＣＧＡＧＧＣＧＧＴＡＴＧＣＧＡＡＡＣＧＣＣＡＧＣＴＧＡＣＧＴＧＧＴＴＴＣＧＣＡＡＣＡＡＡＡＴＧＣＡＧＧＴＣＡＣＡＴＧＧＴＴＣＧＡＴＡＴＧＡＣＡＣＣＧＣＣＴＧＴＴＧＡＴＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡＡＡＴＴＴＴＣＡＣＡＣＡＴＡＴＡＧＣＡＧＧＡＡＡＡＣＴＣＧＡＡＣＴＴＴＡＡ（配列番号１５）
ＡＴＧＡＡＡＣＣＧＡＴＴＡＡＴＡＴＴＣＡＧＧＡＴＣＡＧＴＴＴＴＴＧＡＡＴＣＡＡＡＴＣＣＧＧＡＡＡＧＡＡＡＡＴＡＣＧＴＡＴＧＴＣＡＣＴＧＴＴＴＴＴＴＴＧＣＴＧＡＡＣＧＧＣＴＴＴＣＡＧＴＴＧＣＧＧＧＧＣＣＡＧＧＴＧＡＡＡＧＧＣＴＴＴＧＡＴＡＡＣＴＴＴＡＣＣＧＴＡＴＴＧＴＴＧＧＡＡＴＣＧＧＡＡＧＧＴＡＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＴＡＴＡＴＡＴＡＡＡＣＡＴＧＣＧＡＴＣＴＣＡＡＣＧＴＴＴＧＣＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＡＡＣＧＴＣＣＡＧＣＴＴＧＡＡＣＴＣＧＡＡＴＡＧ（配列番号１７）
本発明はまた、対応する野生型プロモーターの活性と比べ、プロモーターの活性が増加し、ＹｍａＨタンパク質の過剰発現が結果として生じるように変異されたプロモーター配列も包含する。従って、ＳｉｇＡ及びＳｉｇＨプロモーターを定義する配列の変異体は、本発明の構築体に使用されることが理解される。バチルス種におけるプロモーター変異体の作成方法は、当該技術分野で周知である（Ａ．Ｌ．Ｓｏｎｅｎｓｈｅｉｎ、Ｊ．Ａ．Ｈｏｃｈ及びＲ．Ｌｏｓｉｃｋ編集、バチルス・ズブチリス及びその最近親種、遺伝子から細胞（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃｌｏｓｅｓｔ  ｒｅｌａｔｉｖｅｓ：  ｆｒｏｍ  ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  ｃｅｌｌｓ．）、アメリカン・ソシエティ・フォー・マイクロバイオロジー社、ワシントンＤ．Ｃ．中のＨｅｌｍａｎｎ他著、２００２年、ＲＮＡポリメラーゼ及びシグマ因子（ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｎｄ  ｓｉｇｍａ  ｆａｃｔｏｒｓ）、２８９−３１２頁を参照されたい）。本発明がいずれか特定のプロモーターに限定されることは意図されず、当業者に知られる任意の適したプロモーターが本発明で使用される。それでも、いくつかの実施態様において、前記プロモーターはＢ．ズブチリスｓｉｇＨプロモーターである一方で、他の実施態様において、前記プロモーターはＢ．ズブチリスｓｉｇＡプロモーターである。別の実施態様において、前記ｓｉｇＨ及びｓｉｇＡプロモーターは、ＹｍａＨタンパク質の過剰発現をもたらす役割を果たす。
【０１０９】
いくつかの実施態様において、本発明に係る前記ポリヌクレオチド構築体はまた、ｙｍａＨ  ＲＮＡ転写物の最適な翻訳を確保するため、必須の前記リボソーム結合部位も含む。いくつかの実施態様において、前記ポリヌクレオチド構築体は、ｍｉａＡ遺伝子（ＡＡＧＡＧＡＧ、配列番号２１）のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）配列を含む一方で、他の実施態様において、ポリヌクレオチド構築体は、ｙｍａＨ遺伝子（ＧＧＡＧＧ、配列番号２２）のＲＢＳ配列を含む。さらに別の実施態様において、前記ポリヌクレオチド構築体は、ｍｉａＡ遺伝子及びｙｍａＨ遺伝子のリボソーム結合部位配列を含む。いくつかの実施態様において、本発明は、プロモーター及びｙｍａＨコーディング配列の上流にあるリボソーム結合部位配列を有する構築体を提供する。本発明は、本明細書で開示されるリボソーム結合部位配列に限られず、ｙｍａＨ遺伝子の発現レベルを増加させるように変異された任意の適したリボソーム結合部位配列も包含する。バチルス内で遺伝子の発現を増加させる変異されたリボソーム結合配列を得る方法は、当該技術分野で知られている。例えば、Ｂａｎｄ及びＨｅｎｎｅｒは、１６Ｓ  ｒＲＮＡとのより堅い塩基対合が得られるように前記ＲＢＳを修飾することで、Ｂ．ズブチリス内でのインターフェロンの発現レベルの増加に成功した（Ｂａｎｄ，Ｌ．及びＤ．Ｊ．Ｈｅｎｎｅｒ、ＤＮＡ、第３巻、１７−２１頁、１９８４年）。
【０１１０】
バチルス・ズブチリス由来の自然発生のＹｍａＨタンパク質は、２１９（終止コドンを含めて２２２）塩基対のポリヌクレオチド（ＥＭＢＬ主要アクセス番号（ＥＭＢＬ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ）Ｚ９９１１３、配列番号１７）でコードされる７３アミノ酸のタンパク質（配列番号４）である。
【０１１１】
ＭＫＰＩＮＩＱＤＱＦＬＮＱＩＲＫＥＮＴＹＶＴＶＦＬＬＮＧＦＱＬＲＧＱＶＫＧＦＤＮＦＴＶＬＬＥＳＥＧＫＱＱＬＩＹＫＨＡＩＳＴＦＡＰＱＫＮＶＱＬＥＬＥ（配列番号４）
従って、いくつかの実施態様において、ＹｍａＨをコードするポリヌクレオチド構築体配列は、野生型バチルス・ズブチリス株１６８（配列番号４）のゲノムで見られる自然発生のポリヌクレオチド配列である。本発明はまた、天然タンパク質において、１以上の部位で１以上のアミノ酸の欠失（すなわち、切断）、付加、または置換により野生型タンパク質から派生した変異体ＹｍａＨタンパク質を含む、変異体ＹｍａＨタンパク質も包含する。このような欠失、付加、または置換の方法は、当該技術分野で一般に知られる。例えば、ポリペプチドのアミノ酸配列変異体は、天然の目的タンパク質をコードするクローン化ＤＮＡ配列内での変異により調製されることが出来る。突然変異生成及びヌクレオチド配列の改変の方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｋｕｎｋｅｌ著、１９８５年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８２巻、４８８−４９２頁、Ｋｕｎｋｅｌ他著、１９８７年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．第１５４巻、３６７−３８２頁、米国特許第４，８７３，１９２号、及びそれらに引用される参考文献を参照されたい。それらは参照により本明細書に組み込まれる）。目的タンパク質の変異体の構築において、変異体をコードするヌクレオチド配列への修飾は、その変異体が所望の活性の所持を維持するように作成される。当業者に理解されるように、遺伝コードの縮退のため、多様な修飾ポリヌクレオチドがＹｍａＨタンパク質をコードする。本発明のいくつかの他の実施態様において、配列番号１７のポリヌクレオチド配列と、少なくとも約７０％の配列同一性、少なくとも約７５％の配列同一性、少なくとも約８０％の配列同一性、少なくとも約８５％の配列同一性、少なくとも約９０％の配列同一性、少なくとも約９２％の配列同一性、少なくとも約９５％の配列同一性、少なくとも約９７％の配列同一性、少なくとも約９８％の配列同一性、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが提供される。
【０１１２】
他の実施態様において、本発明のポリヌクレオチド構築体は、バチルス・ズブチリス株１６８のＹｍａＨコーディング配列と類似するＹｍａＨコーディング配列を含む。この株のゲノムは一の４２１５ｋｂのゲノム内に含まれ、よく特性解析されている（Ｋｕｎｓｔ他著、Ｎａｔｕｒｅ、第３９０巻、２４９−２５６頁、１９９７年、及びＨｅｎｎｅｒ他著、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、第４４巻、５７−８２頁、１９８０年を参照されたい）。いくつかの実施態様において、本発明のポリヌクレオチド構築体は、野生型ＹｍａＨタンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも約６５％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約７０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約７５％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約９２％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約９７％のアミノ酸配列同一性、少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性、及び少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を共有するＹｍａＨタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含む。また、本発明のポリヌクレオチド構築体は、野生型ポリペプチド（配列番号４）と比べ、宿主細胞内での目的タンパク質の生成を促進する、同程度または改善された能力を有し、さらに、宿主細胞内での目的タンパク質の発現を促進した能力を保有する。さらに別の実施態様において、本発明は、配列番号１７の野生型バチルス配列の遺伝子と相同、オーソログまたはパラログであるポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド構築体を提供する。また、本発明は、目的タンパク質の生成を促進する能力を保有する。
【０１１３】
本発明はまた、構造的及び／または機能的に類似することにより関連するＹｍａＨタンパク質をコードするコーディング配列を含むポリヌクレオチド構築体も包含する。いくつかの実施態様において、これらのタンパク質は、有機体の分類間での相違（例えば、細菌性タンパク質及び菌性タンパク質）を含め、異なる属及び／または種に由来する。いくつかの実施態様において、これらのタンパク質は、異なる属及び／または種に由来する。追加的な実施態様において、関連タンパク質が同種から提供される。いかにも、本発明がいずれか特定の源に由来する関連タンパク質に限定されることは意図されない。追加的に、「関連タンパク質」の語は、第三構造のホモログ及び主要配列のホモログ（例えば、本発明の前記ＹｍａＨ）を包含する。例えば、本発明は、大腸菌（ＨＦＱ＿ＥＣＯＬＩ）、シグヘラ（Ｓｈｉｇｈｅｌｌａ）・フレキシネリ（ｆｌｅｘｎｅｒｉ）（ＨＦＱ＿ＳＨＩＦＬ）、サルモネラ・チフィムリウヌ（ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（ＨＦＱ＿ＳＡＬＴＹ）、エルシニア・エンテロコリチカ（ＨＦＱ＿ＹＥＲＥＮ）、エルシニア・ペスト（ＨＦＱ＿ＹＥＲＰＥ）、エルビニア・カロトボラ（ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）（ＨＦＱ＿ＥＲＷＣＡ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（ＨＦＱ＿ＨＡＥＩＮ）、パスツレラ・ムルトシダ（ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）（ＨＦＱ＿ＰＡＳＭＵ）、ビブリオ・コレラ（ＨＦＱ＿ＶＩＢＣＨ）、緑膿菌（ＨＦＱ＿ＰＳＥＡＥ）、キサントモナス・アクシノポジス（ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ）（ＨＦＱ＿ＸＡＮＡＣ）、キサントモナス・カムペストリス（ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）（ＨＦＱ＿ＸＡＮＣＰ）、キシレラ（Ｘｙｌｅｌｌａ）・ファスチジオサ（ｆａｓｔｉｄｉｏｓａ）（ＧＳＱ＿ＸＹＬＦＡ）、髄膜炎菌（ＨＦＱ＿ＮＥＩＭＡ）、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）・ソラナシーラム（ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）（ＨＦＱ＿ＲＡＬＳＯ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）・ツメファシエンス（ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）（ＨＦＱ＿ＡＧＲＴＳ）、マルタ熱菌（ＨＦＱ＿ＢＲＵＭＥ）、リゾビウム・ロティ（ＨＦＱ＿ＲＨＩＬＯ）、アゾルヒゾビウム（Ａｚｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）・カウリノダンス（ｃａｕｌｉｎｏｄａｎｓ）（ＨＦＱ＿ＡＺＯＣＡ）、カウロバクター・クレセンタス（ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）（ＨＦＱ＿ＣＡＵＣＲ）、アクイフェクス（Ａｑｕｉｆｅｘ）・メリテンシス（ｍｅｌｉｔｅｎｓｉｓ）（ＨＦＱ＿ＡＱＵＡＥ）、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）・マリティメ（ｍａｒｉｔｉｍｅ）（ＨＦＱ＿ＴＨＥＭＡ）、クロストリジウム・アセトブチリカム（ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ＨＦＱ＿ＣＬＯＡＢ）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（ＨＦＱ＿ＣＬＯＰＥ）、バチルス・ハロジュランス（ＨＦＱ＿ＢＡＣＨＤ）、バチルス・ズブチリス（ＨＦＱ＿ＢＡＣＳＵ）、サーモアナエロバクター（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）・テングコンジェンシス（ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ）（ＨＦＱ＿ＴＨＥＴＮ）、Ｓ．オーリーウス（ａｕｒｅａｕｓ）（Ｑ９９ＵＧ９）、及びＭ．ジャンナジィ（ｊａｎｎａｓｃｉ）（Ｑ５８８３０）のＹｍａＨ（Ｓａｕｔｅｒ他著、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．��第３１巻、４０９１−４０９８頁、２００３年）のような前記ＹｍａＨタンパク質を含むがそれらに限られない、前記相同物を包含する。
【０１１４】
関連（及び派生）タンパク質は、変異体ＹｍａＨタンパク質を含む。いくつかの好ましい実施態様において、変異体タンパク質は親タンパク質と異なり、また、互いに少数のアミノ酸残基で異なる。この異なるアミノ酸残基の数は１以上、好ましくは、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０以上のアミノ酸とすることが出来る。いくつかの好ましい実施態様において、変異体間の異なるアミノ酸の数は約１及び約１０の間である。いくつかの特に好ましい実施態様において、関連タンパク質及び特に変異体タンパク質は、少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、または約９９％のアミノ酸配列同一性を含む。本発明のＹｍａＨタンパク質の変異体の生成に適したいくつかの方法が当該技術分野で知られている。当該方法は、部位集中（ｓｉｔｅ−ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）突然変異生成、スキャンニング突然変異生成、挿入突然変異生成、ランダム突然変異生成、部位特異的突然変異生成、及び指向性進化、並びに多様な他の組み換え技術的な取り組みを含むがそれらに限られない。
【０１１５】
野生型及び変異体タンパク質の特性解析は任意の適した手段を介して達成され、好ましくは目的の特性の評価に基づく。例えば、目的タンパク質の生成を促進可能なＹｍａＨタンパク質を使用することが意図される。
【０１１６】
所定の実施態様において、本発明の組み換えポリヌクレオチドは、使用される宿主細胞内でのＹｍａＨタンパク質の発現のためにコドン最適化されることが出来るポリヌクレオチド配列を含む。多くの細胞内での各コドンの使用頻度を列挙したコドン使用頻度表が当該技術分野（例えば、Ｎａｋａｍｕｒａ他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第２８巻、２９２頁、２０００年を参照されたい）で知られるか、または容易に導き出せることから、タンパク質のアミノ酸配列を発現させるようにこのような核酸は容易に設計されることが出来る。いくつかの実施態様において、前記コドン最適化された配列は、配列番号４と少なくとも約７０％の同一性があるＹｍａＨタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１１７】
ｙｍａＨベクター
本発明は、本発明のポリヌクレオチド構築体を含むベクターを提供する。このベクターは、ＹｍａＨタンパク質を過剰発現するように宿主細胞に導入される。
【０１１８】
いくつかの実施態様において、ポリペプチドの過剰発現は、宿主細胞に導入されたマルチコピー／複製プラスミド上に存在する、ＹｍａＨをコードする対応するポリヌクレオチドの１以上のコピーの発現に起因する。従って、いくつかの実施態様において、本発明は、前記ベクターに組み込まれたポリヌクレオチド構築体を含むベクターを提供する。いくつかの実施態様において、前記ベクターは、宿主細胞内でＹｍａＨを過剰発現させる染色体外自己複製遺伝要素を形成する、マルチコピー／複製プラスミドベクターである。一般に、前記ベクターは、プラスミドを含む宿主細胞の選択を容易にする選択マーカー遺伝子を運ぶプラスミドベクターである。宿主細胞内で自発的に複製するベクターは、ベクターがバチルス細胞内で自発的に複製することを可能にする複製起点を伴うベクターを含む。細菌性の複製起点の例は、大腸菌内での複製を許容するプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７、及びｐＡＣＹＣ１８４、及びバチルス内での複製を許容するｐＵＢ１１０、ｐＣ１９４、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０、及びｐＡＭβ１の複製起点である。前記複製起点は、バチルス細胞内で温度感受性として機能させる変異を有するものとすることが出来る（例えば、Ｅｈｒｌｉｃｈ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ、第７５巻、１４３３頁、１９７８年を参照されたい）。
【０１１９】
上述のように、本発明のいくつかの実施態様において、ＹｍａＨタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞内で複製可能な発現ベクターを介して宿主細胞に導入される。バチルスに適した複製及び統合するプラスミドが当該技術分野で知られる（例えば、Ｈａｒｗｏｏｄ及びＣｕｔｔｉｎｇ編集、「バチルスのための分子生物学的方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」、ジョンウィリー・アンド・サン社、１９９０年、特に第３章を参照されたい、Ｂ．ズブチリスに適した複製プラスミドは９２頁で列挙されるものを含む）。
【０１２０】
いくつかの実施態様において、ＹｍａＨポリペプチドの過剰発現は、宿主細胞のゲノムに統合されたＹｍａＨコードポリヌクレオチドの少なくとも１コピーの発現に起因する。従って、いくつかの実施態様において、宿主細胞にベクターが導入された場合、ベクターはゲノムに統合され、統合されたゲノムと共に複製される。ｙｍａＨ遺伝子の複数のコピーは、宿主細胞のゲノムの数箇所で統合されることが出来る。あるいは、ＹｍａＨをコードする配列及び選択マーカー（例えば、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子のような抗生物質耐性マーカー）を運ぶ増幅可能な発現カセットが単一の交差事象（ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｒｏｓｓ−ｏｖｅｒ  ｅｖｅｎｔ）を介してゲノムに統合され、次に適切な抗生物質（例えば、クロラムフェニコール）の濃度の増加で形質転換された宿主細胞に挑むことで増幅されることが出来る。
【０１２１】
他の実施態様において、本発明は、統合ベクターに組み込まれたポリヌクレオチド構築体を提供する。いくつかの実施態様において、統合ベクターに組み込まれた本発明に係るポリヌクレオチド構築体は、バチルス宿主細胞の染色体配列に的が絞られ、複数のベクターコピーの安定した直列の統合を含む修飾された宿主細胞を作成する。統合ベクターに組み込まれたポリヌクレオチド構築体は通常、抗生物質製剤への耐性を伴う細胞を提供する選択マーカー遺伝子を含み、統合されたｙｍａＨ構築体の複製を可能にする。単一部位への直列の統合並びに単一コピー及び２箇所への統合が起こる可能性がある。前記ポリヌクレオチド構築体がベクターに組み込まれるか、プラスミドＤＮＡの存在無しに使用されるかに関わりなく、ポリヌクレオチド構築体が当該技術分野で知られる任意の適した方法を用いて宿主細胞を形質転換するために用いられる。
【０１２２】
プラスミド構築体を伴うバチルス細胞へのＤＮＡの導入方法及び細菌性宿主細胞へのプラスミドの形質転換の方法は周知である。いくつかの実施態様において、前記プラスミドは継続して大腸菌から単離され、バチルスへ形質転換される。しかしながら、大腸菌のような介在する微生物を使用することは必須ではなく、いくつかの実施態様において、ＤＮＡ構築体またはベクターは、直接バチルス宿主に導入される。
【０１２３】
当業者はバチルス細胞へのポリヌクレオチド配列の適した導入方法を承知している（例えば、Ｈａｒｗｏｏｄ他編集、「バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）」（プレナム出版社）中のＦｅｒｒａｒｉ他著、「遺伝学（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」、５７−７２頁、１９８９年、Ｓａｕｎｄｅｒｓ他著、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１５７巻、７１８−７２６頁、１９８４年、Ｈｏｃｈ他著、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第９３巻、１９２５−１９３７頁、１９６７年、Ｍａｎｎ他著、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第１３巻、１３１−１３５頁、１９８６年、及びＨｏｌｕｂｏｖａ著、Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第３０巻、９７頁、１９８５年、Ｃｈａｎｇ他著、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、第１６８巻、１１−１１５頁、１９７９年、Ｖｏｒｏｂｊｅｖａ他著、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、第７巻、２６１−２６３頁、１９８０年、Ｓｍｉｔｈ他著、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第５１巻、６３４頁、１９８６年、Ｆｉｓｈｅｒ他著、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第１３９巻、２１３−２１７頁、１９８１年、及びＭｃＤｏｎａｌｄ著、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第１３０巻、２０３頁、１９８４年を参照されたい）。いかにも、プロトプラスト形質転換及び会合、形質導入、及びプロトプラスト融合を含む、形質転換としての前記方法が知られ、本発明での使用に適する。形質転換の方法は特に、本発明で提供されるＤＮＡ構築体の宿主細胞への導入に好まれる。
【０１２４】
一般に使用される方法に加えて、いくつかの実施態様において、宿主細胞は直接形質転換される（すなわち、中間細胞が、宿主細胞への導入前のＤＮＡ構築体の増幅または他の過程に使用されない）。宿主細胞へのＤＮＡ構築体の導入は、プラスミドまたはベクターへの挿入なしに宿主細胞へＤＮＡを導入するとして当該技術分野に知られるそれらの物理的及び化学的方法を含む。これらの方法はエレクトロポレーション、裸のＤＮＡまたはリポソーム等の挿入を含むが、それらに限られない。追加的実施態様において、ＤＮＡ構築体はプラスミドに挿入されることなく、プラスミドと共に共同して形質転換される。別の実施態様において、当該技術分野で知られる方法により、選択マーカーは改変されたバチルス株から欠失される（Ｓｔａｈｌ他著、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１５８巻、４１１−４１８頁、１９８４年、及びＰａｌｍｅｒｏｓ他著、Ｇｅｎｅ、第２４７巻、２５５−２６４頁、２０００年を参照されたい）。
【０１２５】
当該技術分野において知られるバチルスの形質転換方法は、プラスミドマーカーレスキュー形質転換等の方法を含み、この方法は部分的に相同の居住プラスミドを運ぶコンピテント細胞によるドナープラスミドの取り込みを伴う（Ｃｏｎｔｅｎｔｅ他著、Ｐｌａｓｍｉｄ、第２巻、５５５−５７１頁、１９７９年、Ｈａｉｍａ他著、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、第２２３巻、１８５−１９１頁、１９９０年、Ｗｅｉｎｒａｕｃｈ他著、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１５４巻、１０７７−１０８７頁、１９８３年、及びＷｅｉｎｒａｕｃｈ他著、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１６９巻、１２０５−１２１１頁、１９８７年を参照されたい）。当該方法において、前記入来ドナープラスミドは、染色体形質転換を再現した過程で、居住「ヘルパー」プラスミドの相同領域と組み換わる。
【０１２６】
プロトプラスト形質転換による形質転換を伴うその他の方法が当該技術分野で周知である（例えば、Ｃｈａｎｇ及びＣｏｈｅｎ著、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、第１６８巻、１１１−１１５頁、１９７９年、Ｖｏｒｏｂｊｅｖａ他著、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．、第７巻、２６１−２６３頁、１９８０年、Ｓｍｉｔｈ他著、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第５１巻、６３４頁、１９８６年、Ｆｉｓｈｅｒ他著、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第１３９巻、２１３−２１７頁、１９８１年、ＭｃＤｏｎａｌｄ著、１９８４年、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第１３０巻、２０３頁、１９８４年、及びＢａｋｈｉｅｔ他著、第４９巻、５７７頁、１９８５年を参照されたい）。追加的に、Ｍａｎｎ他（Ｍａｎｎ他著、Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第１３巻、１３１−１３５頁、１９８６年）はバチルス・プロトプラストの形質転換法を説明し、Ｈｏｌｕｂｏｖａ（Ｈｏｌｕｂｏｖａ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第３０巻、９７頁、１９８５年）はＤＮＡ含有リポソームを用いたプロトプラストへのＤＮＡの導入方法を説明する。いくつかの実施態様において、マーカー遺伝子は宿主細胞内で目的遺伝子が存在するかしないかを示すために用いられる。いくつかの実施態様において、本発明に係る前記ベクター内に含まれるｙｍａＨポリヌクレオチド配列は、配列番号４を有するＹｍａＨタンパク質またはそれの変異体をコードする。
【０１２７】
これらの方法に加えて、他の実施態様において、宿主細胞は直接的に形質転換される。「直接形質転換」において、中間細胞は、宿主（すなわち、バチルス）細胞への導入前の修飾されたポリヌクレオチドの増幅または他の過程に使用されない。宿主細胞への前記修飾されたポリヌクレオチドの導入は、プラスミドまたはベクターへの挿入なしに宿主細胞へ修飾されたポリヌクレオチドを導入する当該技術分野で知られる物理的及び化学的方法を含む。このような方法は、コンピテント細胞の使用並びに細胞へＤＮＡを導入するための塩化カルシウム剤、エレクトロポレーション等のような「人工的手段」の使用も含むがそれらに限られない。従って、本発明は、裸のＤＮＡ、リポソーム等と使用される。さらに別の実施態様において、修飾されたポリヌクレオチドは、プラスミドへ挿入されることなく、プラスミドと共に共同で形質転換される。いくつかの実施態様において、本発明は、ｓｉｇＡプロモーター（例えば、配列番号２及び３）と操作可能に連結されたＹｍａＨタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。別の実施態様において、前記ベクターは、ｓｉｇＨプロモーター（例えば、配列番号１）と操作可能に連結されたＹｍａＨをコードするポリヌクレオチドを含む。さらに別の実施態様において、前記ベクターは、ＹｍａＨコーディング配列、ｓｉｇＡプロモーター及びｓｉｇＨプロモーターを含むポリヌクレオチド構築体を含む（例えば、配列番号１３）。
【０１２８】
いくつかの実施態様において、ｙｍａＨは、統合していないベクターにより過剰発現される。いくつかの実施態様において、ｙｍａＨは、１以上の染色体遺伝子がバチルスゲノムから修飾された（例えば、ｄｅｇＵ）及び／または欠失された（例えば、ｎｐｒＥ）宿主細胞内において過剰発現される。いくつかの別の実施態様において、１以上の在来染色体領域は、対応する野生型バチルス宿主ゲノムから修飾及び／または欠失される。いくつかの好ましい実施態様において、本発明は、バチルスによる少なくとも１の目的タンパク質の改善された発現及び／または分泌のための方法及び組成物を提供する。
【０１２９】
ｙｍａＨ宿主細胞
本発明は、ｙｍａＨを過剰発現するように遺伝的に操作され、増進された目的タンパク質の生成量を有する修飾された宿主細胞を提供する。特に、本発明は、ｙｍａＨを過剰発現するバチルス種のような、グラム陽性微生物の修飾された宿主細胞に関する。いくつかの実施態様において、ｙｍａＨは野生型微生物において過剰発現される一方、他の実施態様において、ＹｍａＨは改変された宿主細胞において過剰発現される。いくつかの実施態様において、前記改変された宿主細胞は、野生型前駆体よりも高いレベルで目的タンパク質を生成可能である。いくつかの特に好ましい実施態様において、過剰生成する改変された親宿主におけるＹｍａＨの過剰発現はさらに、目的タンパク質の生成レベルを増加する。いくつかの実施態様において、改変された親宿主におけるＹｍａＨの過剰発現は、対応する改変されていない親宿主内で起こる生成よりも早い時間で目的タンパク質の生成を誘導する。宿主細胞におけるｙｍａＨの過剰発現は、本明細書で記述されるように本発明に係るベクター及び構築体を用いて得られる。従って、いくつかの実施態様において、本発明はｓｉｇＡ及び／またはｓｉｇＨプロモーターと操作可能に連結されるＹｍａＨコーディング配列を含むベクターで野生型または改変された宿主細胞を形質転換することにより得られる修飾された宿主細胞を提供する。特に、本発明に係る修飾された宿主細胞は目的タンパク質を生成可能であり、いくつかの実施態様において、修飾された宿主細胞はＹｍａＨをコードするポリヌクレオチド構築体（例えば、配列番号１、２、３、または１３）を含む。
【０１３０】
いくつかの実施態様において、本発明は目的タンパク質の生成を増加させるために宿主細胞内においてｙｍａＨを過剰発現させる方法を提供する。目的タンパク質は、宿主と同種または異種のいずれかであることが出来る。いくつかの実施態様において、目的タンパク質は分泌ポリペプチド、特にでんぷん分解酵素、タンパク質分解酵素、細胞分解酵素、酸化還元酵素及び植物壁分解酵素を含むが、それらに限られない酵素である。別の実施態様において、この酵素は、アミラーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ラッカーゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、エステラーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、フィターゼ、ペクチナーゼ、グルコシダーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼホスファターゼ、ガラクトシダーゼ及びキチナーゼを含むが、それらに限られない。さらに別の実施態様において、目的タンパク質はホルモン、サイトカイン、成長因子、受容体、ワクチン、抗体等である。本発明がいずれか特定のタンパク質に限られることは意図されないが、いくつかの実施態様において、前記目的タンパク質はプロテアーゼである。
【０１３１】
いくつかの実施態様において、前記宿主細胞はバチルス種、ストレプトミセス種、エシェリキア種、またはアスペルギルス種である。他の実施態様において、目的タンパク質は、バチルス属の宿主細胞により生成されるプロテアーゼである（例えば、米国特許第５，２６４，３６６号、第４，７６０，０２５号、及びＲＥ３４，６０６０を参照されたい）。いくつかの実施態様において、目的のバチルス株は、好アルカリ性バチルスである。多くの好アルカリ性バチルス株が知られている（例えば、米国特許第５，２１７，８７８号、及びＡｕｎｓｔｒｕｐ他著、Ｐｒｏｃ  ＩＶ  ＩＦＳ、Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈ．Ｔｏｄａｙ、２９９−３０５頁、１９７２年）。特定の目的バチルス株の別の型は、商業的バチルス株の細胞である。商業的バチルス株の例は、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ズブチリス、Ｂ．クラウジイ、及びＢ．アミロリケファシエンスを含むが、それらに限られない。追加的な実施態様において、前記バチルス宿主株は、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．ズブチリス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレビス、Ｂ．ステロサーモフィラス、Ｂ．アルカロフィラス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．コアグランス、Ｂ．サーキュランス、Ｂ．ラウタス、Ｂ．プミラス、Ｂ．チューリンゲンシス、及びＢ．メガテリウム並びにバチルス属に含まれる他の有機体からなる群から選ばれる。好ましい実施態様において、Ｂ．ズブチリス細胞が使用される。
【０１３２】
いくつかの実施態様において、商業的宿主株はバチルス種の非組み換え株、自然発生のバチルス株の変異体、及び組み換えバチルス宿主株から成る群から選ばれる。好ましい宿主株は、組み換え宿主株であり、ここで目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは前もって宿主へ導入される。さらに好ましい宿主株は、バチルス・ズブチリス宿主株であり、特に組み換えバチルス・ズブチリス宿主株である。多くのＢ．ズブチリス株が知られ、本発明の使用に適する（例えば、１Ａ６（ＡＴＣＣ３９０８５）、１６８（１Ａ０１）、ＳＢ１９、Ｗ２３、Ｔｓ８５、Ｂ６３７、ＰＢ１７５３からＰＢ１７５８、ＰＢ３３６０、ＪＨ６４２、１Ａ２４３（ＡＴＣＣ３９，０８７）、ＡＴＣＣ２１３３２、ＡＴＣＣ６０５１、ＭＩ１１３、ＤＥ１００（ＡＴＣＣ３９，０９４）、ＧＸ４９３１、ＰＢＴ１１０、及びＰＥＰ２１１株、Ｈｏｃｈ他著、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第７３巻、２１５−２２８頁、１９７３年、米国特許第４，４５０，２３５号、米国特許第４，３０２，５４４号、欧州特許第０１３４０４８号を参照されたい）。発現宿主としてのＢ．ズブチリスの使用は、当該技術分野で周知である（Ｐａｌｖａ他著、Ｇｅｎｅ、第１９巻、８１−８７頁、１９８２年、Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ及びＦｉｓｃｈｅｒ著、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１６５巻、７９６−８０４頁、１９８６年、及びＷａｎｇ他著、Ｇｅｎｅ、第６９巻、３９−４７頁、１９８８年を参照されたい）。
【０１３３】
特定の目的宿主細胞は、商業的プロテアーゼ生成バチルス株の細胞である。これらの株を用いて、プロテアーゼ生成の高い効率が本発明により提供される修飾されたバチルス株の使用によりさらに増進される。商業的プロテアーゼ生成バチルス株は、特に好ましい発現宿主を提供する。いくつかの実施態様において、本発明に係るこれらの株の使用は、プロテアーゼ生成における更なる増進を提供する。上述のように、通常バチルス種から分泌されるプロテアーゼには２つの一般型、つまり中性プロテアーゼ（または「金属プロテアーゼ」）及びアルカリ性プロテアーゼ（または「セリンプロテアーゼ」）がある。また上述のように、ズブチリシンは、本発明での使用に好まれるセリンプロテアーゼである。各種のバチルス・ズブチリシン、例えば、ズブチリシン１６８、ズブチリシンＢＰＮ’、ズブチリシン・カールスバーグ、ズブチリシンＤＹ、ズブチリシン１４７、ズブチリシン３０９（例えば、欧州特許第４１４２７９Ｂ号、ＷＯ８９／０６２７９、及びＳｔａｈｌ他著、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１５９巻、８１１−８１８頁、１９８４年を参照されたい）、Ｂ．レンタス・ズブチリシン、及びＢ．クラウジー・ズブチリシン（Ｊ  Ｃ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌａａｎ、Ｇ  Ｇｅｒｒｉｔｓｅ、Ｌ  Ｊ  Ｍｕｌｌｅｎｅｒｓ、Ｒ  Ａ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｏｅｋ及びＷ  Ｊ  Ｑｕａｘ．著、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第５７巻、９０１−９０９頁、１９９１年）が同定及び配列決定されてきた。
【０１３４】
本発明に係るいくつかの実施態様において、バチルス宿主株は変種（例えば、変異体）プロテアーゼを生成する。多数の文献が変異体プロテアーゼの例及び参照文献を提供する（例えば、ＷＯ９９／２０７７０、ＷＯ９９／２０７２６、ＷＯ９９／２０７６９、ＷＯ８９／０６２７９、ＲＥ３４，６０６、米国特許第４，９１４，０３１号、米国特許第４，９８０，２８８号、米国特許第５，２０８，１５８号、米国特許第５，３１０，６７５号、米国特許第５，３３６，６１１号、米国特許第５，３９９，２８３号、米国特許第５，４４１，８８２号、米国特許第５，４８２，８４９号、米国特許第５，６３１，２１７号、米国特許第５，６６５，５８７号、米国特許第５，７００，６７６号、米国特許第５，７４１，６９４号、米国特許第５，８５８，７５７号、米国特許第５，８８０，０８０号、米国特許第６，１９７，５６７号、及び米国特許第６，２１８，１６５号を参照されたい）。
【０１３５】
いくつかの実施態様において、宿主細胞内での目的タンパク質の発現は、Ｂ．ズブチリス・ズブチリシンが自然に転写されるａｐｒＥ遺伝子のａｐｒＥプロモーターにより誘導される。ａｐｒＥ遺伝子は、シグマＡ（σＡ）因子により転写され、その発現は、ＤｅｇＵ／ＤｅｇＳ、ＡｂｒＢ、Ｈｐｒ及びＳｉｎＲ（Ｓｍｉｔｈ  Ｉ、Ｓｌｅｐｅｃｋｙ  ＲＡ、Ｓｅｔｌｏｗ  Ｐ編集、原核生物の発生における制御（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｃａｒｙｏｔｉｃ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）、アメリカン・ソシエティ・フォー・マイクロバイオロジー社、ワシントンＤ．Ｃ．中のＶａｌｌｅ及びＦｅｒｒａｒｉ著、１９８９年、１３１−１４６頁）のような数種の調節因子により高度に制御される。また、コンセンサス・シグマＡプロモーターが同定されている
ＴＧＧＧＴＣＴＴＧＡＣＡＡＡＴＡＴＴＡＴＴＣＣＡＴＣＴＡＴＴＡＣＡＡＴＡＡＡＴＴＣＡＣＡＧＡ（配列番号２３、米国特許出願第２００３０１４８４６号、Ｈｅｌｍａｎ他著、１９９５年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第２４巻、２３５１−２３６０頁）。いくつかの実施態様において、前記宿主細胞は、野生型ａｐｒＥプロモーターであるａｐｒＥプロモーターＴＧＧＧＴＣＴＡＣＴＡＡＡＡＴＡＴＴＡＴＴＣＣＡＴＣＴＡＴＴＡＣＡＡＴＡＡＡＴＴＣＡＣＡＧＡ（配列番号２４、米国特許出願公開番号第２００３０１４８４６１号）を含む。
【０１３６】
別の実施態様において、宿主細胞による目的タンパク質の発現は、Ｂ．ズブチリスａｐｒＥプロモーターの変異体により誘導される。いくつかの実施態様において、本発明は、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列と操作可能に連結された変異体ａｐｒＥプロモーターを含むバチルス宿主細胞を提供する。従って、本発明は変異体ａｐｒＥプロモーターから目的タンパク質を発現する宿主細胞を包含する。変異体ａｐｒＥプロモーターの例は、配列ＴＧＧＧＴＣＴＴＧＡＣＡＡＡＴＡＴＴＡＴＴＣＣＡＴＣＴＡＴＴＡＣＡＡＴＡＡＡＴＴＣＡＣＡＧＡ（配列番号２５）を有する変異体ａｐｒＥプロモーターであり、これは、米国特許出願公開第２００３０１４８４６１号で記述される。本明細書で引用される目的タンパク質のいずれか１つ（例えば、バチルス・ズブチリシン）は、ａｐｒＥプロモーターから転写されることが出来る。いくつかの実施態様において、本発明は、ａｐｒＥプロモーターから目的タンパク質を発現可能な、修飾されたバチルス宿主細胞を提供する。いくつかの実施態様において、前記修飾された宿主細胞は、ａｐｒＥプロモーターにより誘導されたプロテアーゼを発現可能な、修飾されたＢ．ズブチリス宿主細胞である。いくつかの実施態様において、ａｐｒＥプロモーターは、ａｐｒＥプロモーター制御因子及び／またはａｐｒＥ転写リーダーを含む一方、他の実施態様において、ａｐｒＥプロモーターは、ａｐｒＥプロモーター制御因子及び／またはａｐｒＥ転写リーダーを含まない。
【０１３７】
ａｐｒＥプロモーターに加えて、本発明はまた、宿主細胞による目的タンパク質を発現する組成物及び方法を包含する。ここで、前記プロモーターがａｐｒＥ遺伝子の転写リーダー配列を含む限り、目的タンパク質をコードする遺伝子の発現は、目的遺伝子の転写を誘導することに適した任意のプロモーターにより誘導される。
【０１３８】
別の実施態様において、バチルス宿主は、ｄｅｇＵ、ｄｅｇＳ、ｄｅｇＲ及び／またはｄｅｇＱ遺伝子の少なくとも１において変異または欠失を含むバチルス種である。好ましい変異は、ｄｅｇＵ遺伝子内においてであり、さらに好ましい変異はｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２である（Ｍｓａｄｅｋ他著、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１７２巻、８２４−８３４頁、１９９０年、及びＯｌｍｏｓ他著、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、第２５３巻、５６２−５６７頁、１９９７年を参照されたい）。最も好ましい宿主株は、ｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２変異を運ぶバチルス・ズブチリスである。別の実施態様において、前記バチルス宿主は、ｓｃｏＣ４（Ｃａｌｄｗｅｌｌ他著、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、第１８３巻、７３２９−７３４０頁、２００１年を参照されたい）及びｓｐｏＩＩＥ（Ａｒｉｇｏｎｉ他著、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第３１巻、１４０７−１４１５頁、１９９９年を参照されたい）内で変異または欠失を含む。いくつかの実施態様において、これらの変異は単独で起こる一方、他の実施態様において、変異の組み合わせが存在する。いくつかの実施態様において、本発明に係る修飾されたバチルスは、上述の１以上の遺伝子内での変異を既に含むバチルス宿主株から得られる。いくつかの実施態様において、増進された目的タンパク質の生成量を有する改変されたバチルス宿主が本発明に係る宿主細胞として選択される。いくつかの実施態様において、改変されたバチルス宿主細胞は、増進されたプロテアーゼの生成量を有する。
【０１３９】
培養方法
本発明は、目的タンパク質を生成可能な修飾された細胞を培養し、目的タンパク質を発現することに適した増殖条件下で細胞を増殖することにより、ｙｍａＨを過剰発現可能な修飾されたバチルス細胞内で目的タンパク質を生成する方法を提供する。いくつかの実施態様において、本発明に係る宿主細胞及び修飾された宿主細胞は、従来の栄養培地で培養される。温度、ｐＨ等の適した特定の培養条件は当業者に知られる。追加的な好ましい培養条件は当業者に周知であり、様々な参照文献で記述される。
【０１４０】
いくつかの実施態様において、修飾された宿主細胞により生成される目的タンパク質は、宿主細胞の細胞内環境に局在する一方、他の実施態様において、宿主細胞により生成される目的タンパク質は、細胞外空間（すなわち、培養地）へ分泌される。従って、いくつかの実施態様において、当該技術分野で知られる方法で宿主細胞を溶解し、目的タンパク質を回収することにより、目的タンパク質を発現した細胞の細胞内環境から目的タンパク質は回収されることが出来る。他の実施態様において、修飾された宿主細胞は発現及び細胞培地からの目的タンパク質の回収に適した条件下で培養される。本発明に係るｙｍａＨを過剰発現する修飾された宿主細胞により生成される目的タンパク質は、培養地に分泌される。いくつかの実施態様において、前記細胞により生成された目的タンパク質（例えば、プロテアーゼ）は、遠心分離または濾過、塩（例えば、硫酸アンモニウム）を用いた方法による上清のタンパク質成分の沈殿または濾過、クロマトグラフィー精製（例えば、イオン交換、ゲル濾過、アフィニティー等）で前記培地から宿主細胞を分離することを含むがそれらに限られない、従来の方法により培養地から回収される。従って、本発明のプロテアーゼを回収することに適した任意の方法が本発明で使用される。しかし、本発明がいずれか特定の精製方法に限られることは意図されない。
【０１４１】
いくつかの実施態様において、他の組み換え構造は、目的タンパク質をコードする異種または同種であるポリヌクレオチド配列と、溶解性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列とを結合する（Ｋｒｏｌｌ  ＤＪ他著、ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ第１２巻、４４１−５３頁、１９９３年）。このような精製を容易にするドメインは、固定された金属（Ｐｏｒａｔｈ著、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ、第３巻、２６３−２８１頁、１９９２年）上で精製を可能にするヒスチジン−トリプトファン・モジュールのような金属キレートペプチド、固定された免疫グロブリン上で精製を可能にするタンパク質Ａドメイン、及びＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製システムで利用されるドメイン（イムネックス社、シアトル、ワシントン州）を含むが、それらに限られない。精製ドメインと異種タンパク質との間の因子ＸＡまたはエンテロキナーゼ（インビトロジェン、サンディエゴ、カリフォルニア州）のような開裂リンカー配列の包括も、精製を容易にするために使用される。
【０１４２】
いくつかの実施態様において、本発明の形質転換された宿主細胞は、目的タンパク質（例えば、プロテアーゼ）の発現を許容する条件下で適した栄養培地中で培養され、その後、得られたプロテアーゼは前記培地から回収される。前記細胞の培養に使用される培地は、適切な栄養補助剤を含む最小培地または複合培地のような宿主細胞の増殖に適した任意の従来の培地を含む。適した培地は、市販供給者から入手可能であるか、（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカテゴリー内で）公開されたレシピに従って調製されることが出来る。いくつかの実施態様において、前記宿主細胞は、バッチ、流加バッチまたは連続発酵条件下で培養される。伝統的なバッチ発酵法は閉鎖系で使用され、ここで、前記培養地は発酵の実行開始前に作られ、前記培地は所望の有機体と共に保温され、さらにいずれの化合物も培地に続けて添加されることなく発酵は起こる。所定の場合において、炭素源含有量ではなく、増殖培地のｐＨ及び酸素含有量がバッチ法の際に変更される。バッチ系の代謝産物及び細胞バイオマスは、発酵が停止される時間に依存して常時変化する。バッチ系において、細胞は通常静的誘導期から対数高成長期を通り、最終的に成長が減少または停止する静止期まで発育する。非処理の場合、静止期の細胞は最終的に死滅する。一般に、対数期の細胞が大部分のタンパク質を生成する。
【０１４３】
標準的バッチ系の一の変形は、「流加バッチ発酵」系である。この系において、栄養（例えば、炭素源、窒素源、Ｏ２、及び通常他の栄養）は、培養内のそれらの濃度が閾値以下に低下した場合にのみ添加される。異化代謝産物抑制により細胞の代謝が抑制される傾向がある場合、及び培地における栄養量の制限が望ましい場合に、流加バッチ系は有用である。流加バッチ系における実際の栄養濃度の測定は、ｐＨ、溶解酸素及びＣＯ２のような排ガスの分圧等の測定可能な因子の変化に基づいて評価される。バッチ及び流加バッチ発酵は一般的であり、当該技術分野で周知である。
【０１４４】
連続発酵は開放系であり、指定された発酵培地が連続的にバイオリアクターへ添加され、同時に等量の調製培地が過程において回収される。連続発酵は一般に、一定高密度での培養で維持され、細胞は主に対数成長期にある。
【０１４５】
連続発酵は、細胞成長及び／または最終生成物濃度に影響する一因子または任意数の因子の調節を可能にする。例えば、いくつかの実施態様において、炭素源または窒素源等の制限栄養素は、定率で維持され、他の全てのパラメーターは、調製可能である。他の系において、増殖に影響する多くの因子は、連続的に変化される一方、培地濁度により測定される前記細胞の濃度は一定に保たれる。連続系は、定常状態の成長条件の維持を目指す。従って、培地の排出による細胞の損失は、発酵における細胞成長率とのバランスが保たれることが出来る。連続発酵過程に用いる栄養素及び成長因子の調節方法並びに生成物の形成率を最大にする技術は、当業者に知られ、本発明に係る方法に従った目的タンパク質（例えば、プロテアーゼ）の生成に使用される。
【０１４６】
上述のように、宿主細胞におけるｙｍａＨの過剰発現は、対応する野生型または改変された親宿主細胞内での同様のタンパク質の生成レベルと比べ、目的タンパク質の生成レベルを増進する。本発明に係るいくつかの実施態様において、バチルス宿主細胞内でのｙｍａＨの過剰発現は、ｙｍａＨを過剰発現しない対応する細胞内で得られるレベル以上の目的タンパク質の生成を増加させる結果をもたらす。いくつかの実施態様において、本発明は、ＹｍａＨを過剰発現する野生型または組み換え（改変された）バチルス宿主細胞を提供する。いつかの実施態様において、組み換えバチルス宿主細胞は、同様の条件下で増殖した場合に、改変されていない親／前駆体バチルス細胞より高いレベルでプロテアーゼを生成するように改変された細胞である。
【０１４７】
本発明はまた、前駆体宿主細胞で必要とされるより少ない時間でｙｍａＨを過剰発現する修飾された細胞内で目的タンパク質を生成する方法も包含する。例えば、本発明に係る修飾された宿主細胞は、対応する修飾されていない前駆体宿主細胞より高いレベル及びより早い時間で目的タンパク質を生成可能である。従って、いくつかの実施態様において、本発明は、親宿主細胞により生成されるよりも高いレベル、かつ、前駆体宿主細胞が発現の最高レベルに達するのに係る時間の約１／６で目的タンパク質（例えば、プロテアーゼ）を生成する方法を提供する。他の実施態様において、修飾された宿主は、前駆体宿主細胞が発現の最高レベルに達するために係る時間の約１／５、約１／４、約１／３、または約１／２で目的タンパク質を生成する。
【０１４８】
生成／活性の測定
いくつかの実施態様において、本発明は、ｙｍａＨを過剰発現する修飾されたバチルス宿主を得、適した増殖条件下で修飾されたバチルス宿主を増殖し、前駆体宿主細胞と比べ増進したレベルで宿主細胞の目的タンパク質の生成を可能にさせることによりバチルス宿主細胞から目的タンパク質の発現を促進する方法を提供する。いくつかの実施態様において、修飾されたバチルス細胞は、野生型バチルス細胞から得られる。他の実施態様において、修飾されたバチルス細胞は、改変された宿主細胞から得られる。宿主細胞による目的タンパク質の生成のレベルは、生成されたタンパク質の活性の機能として決定することが出来る。いくつかの実施態様において、目的タンパク質の発現を促進させる方法は、ＹｍａＨをコードするポリヌクレオチド構築体で形質転換され、ｓｉｇＡ及び／またはｓｉｇＨプロモーターと操作可能に連結された修飾されたバチルス宿主細胞を用いる。いくつかの実施態様において、ポリヌクレオチド構築体は、配列番号１、２、３、及び１３から選ばれる配列を含む。いくつかの実施態様において、ポリヌクレオチド構築体はバチルス細胞内で複製するプラスミド上に存在する一方、別の実施態様において、ポリヌクレオチド構築体は修飾されたバチルス細胞のゲノムに統合される。上述のように、修飾されたバチルス細胞は、でんぷん分解酵素、タンパク質分解酵素、細胞分解酵素、酸化還元酵素、及び植物壁分解酵素から選ばれるものを含むが、それらに限られない目的タンパク質を生成することが可能である。別の実施態様において、これらの酵素はアミラーゼ、プロテアーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ラッカーゼ、フェノールオキシダーゼ、オキシダーゼ、クチナーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、エステラーゼ、ペルオキシダーゼ、カタラーゼ、グルコースオキシダーゼ、フィターゼ、ペクチナーゼ、グルコシダーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、キナーゼホスファターゼ、ガラクトシダーゼ及びキチナーゼを含むが、それらに限られない。別の実施態様において、目的タンパク質はホルモン、サイトカイン、成長因子、受容体、ワクチン、抗体等である。本発明がいずれか特定のタンパク質に限られることは意図されないが、いくつかの特に好ましい実施態様において、前記目的タンパク質はプロテアーゼである。
【０１４９】
本発明に係る宿主細胞により生成された目的タンパク質の活性を検出及び測定する当業者に既知の様々な分析評価がある。特に、分析評価は、４０５ｎｍでの吸光度として測定されたかまたはフォーリン法（Ｆｏｌｉｎ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて比色分析で測定される、カゼインまたはヘモグロビンからの酸可溶性ペプチドの放出に基づいたプロテアーゼ活性の測定に利用出来る（例えば、Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ他著、「酵素解析の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）」、第５巻、ペプチダーゼ、プロテナーゼ及びそれらの阻害剤（Ｐｅｐｔｉｄａｓｅｓ，ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅｓａｎｄｔｈｅｉｒＩｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）、ヴァーラグ・ケミィ（Ｖｅｒｌａｇ  Ｃｈｅｍｉｅ）社、ワインハイム、１９８４年を参照されたい）。いくつかの他の分析評価は、色原体基質の可溶化を伴う（例えば、Ｆｏｇａｒｔｙ編集、微生物酵素及びバイオテクノロジー（ＭｉｃｒｏｂｉａｌＥｎｚｙｍｅｓａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）内のＷａｒｄ著、「プロテナーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ）」、アプライド・サイエンス社、ロンドン、１９８３年、２５１−３１７頁）。他の模範的な分析評価は、スクシニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−パラ・ニトロアニリド試験（ＳＡＡＰＦｐＮＡ）及び２，４，６−トリニトロベンゼン・スルホン酸ナトリウム塩試験（ＴＮＢＳ試験）を含むが、それらに限られない。当業者に知られる多数の追加的な文献が適した方法を提供する（例えば、Ｗｅｌｌｓ他著、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第１１巻、７９１１−７９２５頁、１９８３年、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｏｎ他著、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第２２３巻、１１９−１２９頁、１９９４年、及びＨｓｉａ他著、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第２４２巻、２２１−２２７頁、１９９９年）。本発明がいずれかの特定の分析評価法に限られることは意図されない。
【０１５０】
他の宿主細胞内での目的タンパク質の生成レベルの決定方法及び発現されたタンパク質の検出方法は、前記タンパク質に特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれかを用いた免疫測定の使用を含む。例は、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫分析（ＲＩＡ）、蛍光免疫分析（ＦＩＡ）、及び蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を含む。しかしながら、他の方法が当業者に知られ、目的タンパク質の評価に使用される（例えば、Ｈａｍｐｔｏｎ他著、血清学的方法、ラボラトリー・マニュアル（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、ＡＰＳ出版、セントポール、ミネソタ州、１９９０年、及びＭａｄｄｏｘ他著、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、第１５８巻、１２１１頁、１９８３年）。いくつかの好ましい実施態様において、対応する野生型または改変された宿主よりも、本発明の宿主細胞における目的タンパク質の生成はより高い。当該技術分野で知られるように、本発明を用いて生成されたバチルス細胞は維持され、発現及び細胞培地からの目的ポリペプチドの回収に適した条件下で増殖される。本発明がいずれか特定の分析評価方法に限られることは意図されない。
【０１５１】
野生型または改変された親宿主細胞による同様のプロテアーゼの生成レベルを超える本発明に係る修飾された宿主細胞によるプロテアーゼの生成レベルの増進の一の測定値は、活動比率として検出されることが出来る。活動比率は、ｙｍａＨを過剰発現する宿主細胞により生成される目的タンパク質の酵素活性と、ｙｍａＨを過剰発現しない対応する宿主細胞により生成される目的タンパク質の酵素活性との比率として表されることが出来る。１と等しいか、または１より大きい比率は、ＹｍａＨを過剰発現する宿主細胞により生成された目的タンパク質が、ｙｍａＨを過剰発現しない対応する宿主細胞により生成された同様の目的タンパク質のレベルと同等またはそれ以上のレベルで生成されることを示す。例えば、１．５の活動比率は、同様の条件下で増殖させた場合に、ｙｍａＨを過剰発現する宿主細胞により生成された目的タンパク質が、ｙｍａＨを過剰発現しない対応する宿主細胞により生成された同様の目的タンパク質のレベルの１．５倍のレベルで生成されることを示す（すなわち、ｙｍａＨを過剰発現する宿主細胞が、ｙｍａＨを過剰発現しない対応する宿主細胞よりも５０％多く目的タンパク質を生成する）。いくつかの実施態様において、前記活動比率は、少なくとも１、少なくとも約１．０５、少なくとも約１．１、少なくとも約１．２、少なくとも約１．３、少なくとも約１．４、少なくとも約１．５、少なくとも約１．６、少なくとも約１．７、少なくとも約１．８、少なくとも約１．９、または少なくとも約２である。他の実施態様において、前記活動比率は、少なくとも２．１、少なくとも約２．２、少なくとも約２．３、少なくとも約２．４、少なくとも約２．５、少なくとも約２．６、少なくとも約２．７、少なくとも約２．８、少なくとも約２．９、または少なくとも約３である。さらに別の実施態様において、前記活動比率は、少なくとも約３．５、少なくとも約４．０、または少なくとも約５である。いくつかの実施態様において、１以上の比率が望まれる。
【０１５２】
あるいは、本発明に係る修飾された宿主細胞によるプロテアーゼの生成レベルは、親宿主細胞の生成レベルを超えるパーセンテージの増加として関連されることが出来る。本発明の方法において、修飾されたバチルス細胞は、野生型または改変された親宿主に対して、好ましくは少なくとも約２５％多く、より好ましくは少なくとも約５０％多く、より好ましくは少なくとも約７５％多く、より好ましくは少なくとも約１００％多く、さらにより好ましくは少なくとも約２００％多く、最も好ましくは少なくとも約３００％多く、またさらにもっとも好ましくは少なくとも約４００％多くのポリペプチドを生成する。従って、いくつかの実施態様において、ｙｍａＨを過剰発現する宿主細胞による目的タンパク質の生成は、ｙｍａＨを過剰発現しない宿主細胞による同様の目的タンパク質の生成と比べ、少なくとも約０．５％、約１．０％、約１．５％、約２．０％、約２．５％、約３．０％、約４．０％、約５．０％、約８．０％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％またはそれ以上で促進される。他の実施態様において、ｙｍａＨを過剰発現する宿主細胞による目的タンパク質の生成は、ｙｍａＨを過剰発現しない宿主細胞による同様の目的タンパク質の生成と比べ、少なくとも約１１０％、約１２０％、約１３０％、約１４０％、約１５０％、約１６０％、約１７０％、約１８０％、約１９０％、少なくとも約２００％以下またはそれ以上で促進される。
【０１５３】
本発明及びそれらの利点をさらに説明するために以下の具体的な実施例が、本発明を説明するためにそれらは提供されるという理解と共に与えられ、如何なる場合においても本発明の範囲を限定するものとして意図されるべきではない。
【実施例】
【０１５４】
実験
以下の実施例は、本発明の所定の好ましい実施態様及び側面を実証及びさらに例証するために提供され、それらの範囲を限定するように解釈されない。
【０１５５】
以下の実験の開示において、下記の略語が適用される。ｐｐｍ（百万分の一）、Ｍ（モル）、ｍＭ（ミリモル）、μＭ（マイクロモル）、ｎＭ（ナノモル）、ｍｏｌ（モル）、ｍｍｏｌ（ミリモル）、μｍｏｌ（マイクロモル）、ｎｍｏｌ（ナノモル）、ｇｍ（グラム）、ｍｇ（ミリグラム）、μｇ（マイクログラム）、ｐｇ（ピコグラム）、Ｌ（リットル）、ｍｌ及びｍＬ（ミリリットル）、μｌ及びμＬ（マイクロリットル）、ｃｍ（センチメーター）、ｍｍ（ミリメートル）、μｍ（マイクロメータ）、ｎｍ（ナノメートル）、Ｕ（単位）、Ｖ（ボルト）、ＭＷ（分子量）、ｓｅｃ（秒）、ｍｉｎ（分）、ｈ及びｈｒ（時間）、℃（摂氏温度）、ＱＳ（適切量）、ＮＤ（データなし）、ＮＡ（不適用）、ｒｐｍ（毎分回転数）、Ｈ２Ｏ（水）、ｄＨ２Ｏ（脱イオン水）、ＨＣｌ（塩酸）、ａａ（アミノ酸）、ｂｐ（塩基対）、ｋｂ（キロ塩基対）、ｋＤ（キロダルトン）、ｃＤＮＡ（コピーまたは相補ＤＮＡ）、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）、ｓｓＤＮＡ（単鎖ＤＮＡ）、ｄｓＤＮＡ（二本鎖ＤＮＡ）、ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド三リン酸）、ＲＮＡ（リボ核酸）、ＭｇＣｌ２（塩化マグネシウム）、ＮａＣｌ（塩化ナトリウム）、Ｃｍ（クロラムフェニコール）、ｗ／ｖ（重量対体積）、ｖ／ｖ（体積対体積）、ｇ（重力）、ＯＤ（吸光度）、ダルベッコのリン酸緩衝溶液（ＤＰＢＳ）、ＯＤ２８０（２８０ｎｍでの光学密度）、ＯＤ６００（６００ｎｍでの光学密度）、Ａ４０５（４０５ｎｍでの吸光度）、ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウムバッファ、ｐＨ７．２）、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ＋０．２５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０）、ＰＥＧ（ポリエチレン・グリコール）、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、Ｔｒｉｓ（トリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホニック酸）、ＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水）、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム溶液）、ｂＭＥ、ＢＭＥ及びβＭＥ（βメルカプトエタノールまたは２−メルカプトエタノール）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸）、Ｔｒｉｃｉｎｅ（Ｎ−［トリス−（ハイドロキシメチル）−メチル］−グリシン）、ＤＭＳＯ（ジメチル・スルホキシド）、Ｔａｑ（サームス・アクアチカスＤＮＡポリメラーゼ）、Ｋｌｅｎｏｗ（ＤＮＡポリメラーゼＩラージ（クレノウ）断片）、ＥＧＴＡ（エチレングリコールビス（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）、ｂｌａ（β−ラクタマーゼまたはアンピリシン耐性遺伝子）、ＤＮＡ２．０（ＤＮＡ２．０、メンロパーク、カルフォルニア州）、オキソイド（オキソイド社、ベージングストーク、ハンプシャー州、イギリス）、コーニング（コーニング・ライフ・サイエンス社、コーニング、ニューヨーク州）、ＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、メリーランド州）、シークエテック（シークエテック社、マウンテンビュウ、カルフォルニア州）、ギブコ／ＢＲＬ（��ブコ／ＢＲＬ社、グランド・アイランド、ニューヨーク州）、シグマ（シグマ・ケミカル社、セントルイス、ミズーリ州）、ファーマシア（ファーマシア・バイオテック社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）、ＮＣＢＩ（全米バイオテクノロジー情報センター）、アプライド・バイオシステムズ（アプライド・バイオシステムズ社、フォスター・シティ、カルフォルニア州）、クロンテック（クロンテック・ラボラトリーズ社、パロ・アルト、カルフォルニア州）、オペロン・テクノロジーズ（オペロン・テクノロジーズ社、アラメダ、カルフォルニア州）、バッケム（バッケム・バイオサイエンス、キング・オブ・プロシア、ペンシルベニア州）、ジフコ（ジフコ・ラボラトリーズ社、デトロイト、ミシガン州）、ギブコＢＲＬ（ライフ・テクノロジーズ社、ゲイサーズバーグ、メリーランド州）、ミリポア（ミリポア、ビレリカ、マサチューセッツ州）、バイオ−ラッド（バイオ−ラッド、ハーキュリーズ、カルフォルニア州）、インビトロジェン（インビトロジェン社、サンディエゴ、カリフォルニア州）、ＮＥＢ（ニューイングランド・バイオラボズ社、ベバリー、マサチューセッツ州）、ピアス（ピアス・バイオテクノロジー社、ロックフォード、イリノイ州）、タカラ（タカラバイオ社、大津、日本）、ロシュ（ホフマン・ラ・ロシュ、バーゼル、スイス）、ＥＭサイエンス（ＥＭサイエンス、ギブスタウン、ニュージャージー州）、キアゲン（キアゲン社、ヴァレンシア、カルフォルニア州）、モレキュラー・デバイシス（モレキュラー・デバイシス社、サニーベール、カリフォルニア州）、Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ミネソタ州）、ストラタジェン（ストラタジェン・クローニング・システムズ社、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）、及びマイクロソフト（マイクロソフト社、レドモント、ワシントン州）。
【０１５６】
実施例１
ＳｉｇＡ及びＳｉｇＨポリヌクレオチド構築体の作成
ポリヌクレオチド構築体ＳｉｇＨ、ＳｉｇＡ１及びＳｉｇＡ２を、Ｂ．ズブチリスの宿主細胞内でｙｍａＨを過剰発現させるために作成した。
【０１５７】
ＰＣＲプライマーをバチルス・ズブチリスゲノム（図１Ａ）と相同するように、また、プライマーの５’末端から６塩基対に位置する６塩基対制限酵素部位を含むように設計した。プライマーを、構築体の上流及び下流末端に固有の制限部位を配置するように設計した。ゲノム配列の主要源（Ｋｕｎｓｔ他著、Ｎａｔｕｒｅ、第３９０巻、２４９−２５６頁、１９９７年）、遺伝子位置、及び終始コドン情報は、ＮＣＢＩデータベース、完成されたバチルス・ズブチリス亜種ズブチリス株１６８、または当業者に知られるズブチリスト（ＳｕｂｔｉＬｉｓｔ）・ワールド・ワイド・ウェブ・サーバー（Ｍｏｓｅｒ，Ｉ著、１９９８年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、第４３０（１−２）巻、２８−３６頁）から得た。考慮された配列は、ＮＣＢＩデータベース、ＡＣＣ番号ＮＣ０００９６４内の１８６５４２８−１８６７０１９１との組み合わせで配列番号１３に報告される。
【０１５８】
ＳｉｇＨ構築体（配列番号１）を、シグマＨプロモーター及びＹｍａＨタンパク質をコードする隣接配列を包含するポリヌクレオチド配列を含むように作成した。シグマＨプロモーターは天然において、ｍｉａＡ遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列の３’末端の近くかつｙｍａＨ遺伝子の直ぐ上流に位置する。全体のシグマＨプロモーター及び隣接ｙｍａＨコーディング配列を、５’末端で付加されたＥｃｏＲＩ制御部位を伴うフォワードプライマーＰ１：ＧＧＣＡＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＣＧＴＧＧＴＴＴＣＧＣＡＡＣＡＡＡＡＴＧＣＡＧ（配列番号５、配列番号１３の位置９８７から１０１１）、及び付加されたＢａｍＨＩ制限部位（図１Ｂ）を伴うリバースプライマーＰ２：ＧＧＣＡＣＣＧＧＡＴＣＣＣＴＣＡＴＡＡＡＡＡＡＡＧＡＣＣＧＴＧＣＣＴＴＧＧ（配列番号６、配列番号１３の位置１４７２から１４９６）を用いたＰＣＲにより増幅した。
【０１５９】
ＳｉｇＡ１及びＳｉｇＡ２構築体を、次の３つの工程で作成した。すなわち、１）Ｂ．ズブチリス染色体ＤＮＡの個々の断片を増殖する工程、２）断片を精製及び凝集する工程、及び３）凝集した生成物をＰＣＲで増幅する工程である。
【０１６０】
ＳｉｇＡ１構築体（配列番号２）は、２つのプライマーのセット（図１Ｃ）を用いて作成した。第１のプライマーのセットは、配列番号１３の５’末端に位置するフォワードプライマーＰ３：ＧＣＧＣＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＡＣＣＣＴＧＡＡＡＧＧＡＡＡＧＡＣＡＡＧＧ（配列番号７）、及び配列番号１３上のｂｐ１５３からｂｐ１７７に位置するリバースプライマーＰ４：ＴＴＣＧＡＧＴＴＴＴＣＣＴＧＣＴＡＴＡＴＧＴＧＴＧＧＧＧＣＴＧＣＴＴＣＧＴＡＴＴＡＴＴＣＡＡＴＡＴＧ（配列番号８）を、ＳｉｇＡプロモーター、リボソーム結合部位、開始コドン及びｍｉａＡ遺伝子の初めの数個のコドンを含む第１の断片を増幅させるために用いた。第２のプライマーのセットは、配列番号１３のｂｐ１０７１からｂｐ１０９５に位置するフォワードプライマーＰ５：ＣＡＴＡＴＴＧＡＡＴＡＡＴＡＣＧＡＡＧＣＡＧＣＣＣＣＡＣＡＣＡＴＡＴＡＧＣＡＧＧＡＡＡＡＣＴＣＧＡＡ（配列番号９）及びリバースプライマーＰ２（配列番号６）を、ＹｍａＨタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む第２の断片を増幅させるために用いた。リバースプライマーＰ４及びフォワードプライマーＰ５は、互いに相補するが、ｍｉａＡコーディング配列を干渉することを防ぐために、増幅される配列と相同でない尾部（ｔａｉｌｓ）を含むように設計された融合プライマーである。２つの断片はアニーリングされ、得られたＳｉｇＡ１構築体はＳｉｇＡプロモーター、リボソーム結合部位及びｍｉａＡ遺伝子の転写開始部位を含有した。ＳｉｇＡ１構築体を、各々ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩ制限部位を含む、フォワードプライマーＰ３（配列番号７）及びリバースプライマーＰ２（配列番号６）を用いて増幅し、複製プラスミドｐＢＳ１９のポリリンカー内へライゲートした。ｐＢＳ１９のポリヌクレオチド配列を下記（配列番号１２）に示す。ｐＢＳ１９プラスミドは、大腸菌及びＢ．ズブチリス内で複製することができ、クロラムフェニコール耐性選択マーカー遺伝子を運ぶ。
【０１６１】
ＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＴＣＴＡＧＡＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＧＡＴＣＣＴＧＣＣＴＣＧＣＧＣＧＴＴＴＣＧＧＴＧＡＴＧＡＣＧＧＴＧＡＡＡＡＣＣＴＣＴＧＡＣＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＣＣＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＴＧＴＣＴＧＴＡＡＧＣＧＧＡＴＧＣＣＧＧＧＡＧＣＡＧＡＣＡＡＧＣＣＣＧＴＣＡＧＧＧＣＧＣＧＴＣＡＧＣＧＧＧＴＧＴＴＧＧＣＧＧＧＴＧＴＣＧＧＧＧＣＧＣＡＧＣＣＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＴＡＧＣＧＡＴＡＧＣＧＧＡＧＴＧＴＡＴＡＣＴＧＧＣＴＴＡＡＣＴＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＴＴＧＴＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＣＡＣＣＡＴＡＴＧＣＧＧＴＧＴＧＡＡＡＴＡＣＣＧＣＡＣＡＧＡＴＧＣＧＴＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＴＡＣＣＧＣＡＴＣＡＧＧＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＣＴＣＧＣＴＧＣＧＣＴＣＧＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＴＡＴＣＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＡＡＧＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＧＴＴＡＴＣＣＡＣＡＧＡＡＴＣＡＧＧＧＧＡＴＡＡＣＧＣＡＧＧＡＡＡＧＡＡＣＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＧＡＡＣＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＧＣＧＴＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＡＧＧＣＴＣＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＡＡＴＣＧＡＣＧＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＴＡＡＡＧＡＴＡＣＣＡＧＧＣＧＴＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＡＡＧＣＴＣＣＣＴＣＧＴＧＣＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣＴＴＡＣＣＧＧＡＴＡＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣＴＴＣＧＧＧＡＡＧＣＧＴＧＧＣＧＣＴＴＴＣＴＣＡＴＡＧＣＴＣＡＣＧＣＴＧＴＡＧＧＴＡＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＴＧＴＡＧＧＴＣＧＴＴＣＧＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＴＧＣＡＣＧＡＡＣＣＣＣＣＣＧＴＴＣＡＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＧＣＣＴＴＡＴＣＣＧＧＴＡＡＣＴＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＣＧＧＴＡＡＧＡＣＡＣＧＡＣＴＴＡＴＣＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＴＧＧＴＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＴＡＴＧＴＡＧＧＣＧＧＴＧＣＴＡＣＡＧＡＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＣＣＴＡＡＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣＡＣＴＡＧＡＡＧＧＡＣＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＧＣＴＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＡＧＴＴＡＣＣＴＴＣＧＧＡＡＡＡＡＧＡＧＴＴＧＧＴＡＧＣＴＣＴＴＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＡＣＡＡＡＣＣＡＣＣＧＣＴＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＧＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＴＴＧＡＴＣＴＴＴＴＣＴＡＣＧＧＧＧＴＣＴＧＡＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡＣＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣＧＴＴＡＡＧＧＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧＡＴＴＡＴＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＴＡＡＴＡＴＡＡＡＡＡＣＣＴＴＣＴＴＣＡＡＣＴＡＡＣＧＧＧＧＣＡＧＧＴＴＡＧＴＧＡＣＡＴＴＡＧＡＡＡＡＣＣＧＡＣＴＧＴＡＡＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＣＧＧＣＡＴＴＡＴＣＴＣＡＴＡＴＴＡＴＡＡＡＡＧＣＣＡＧＴＣＡＴＴＡＧＧＣＣＴＡＴＣＴＧＡＣＡＡＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＧＡＧＴＴＣＡＴＡＡＡＣＡＡＴＣＣＴＧＣＡＴＧＡＴＡＡＣＣＡＴＣＡＣＡＡＡＣＡＧＡＡＴＧＡＴＧＴＡＣＣＴＧＴＡＡＡＧＡＴＡＧＣＧＧＴＡＡＡＴＡＴＡＴＴＧＡＡＴＴＡＣＣＴＴＴＡＴＴＡＡＴＧＡＡＴＴＴＴＣＣＴＧＣＴＧＴＡＡＴＡＡＴＧＧＧＴＡＧＡＡＧＧＴＡＡＴＴＡＣＴＡＴＴＡＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＴＴＡＡＧＴＴＡＡＡＣＣＣＡＧＴＡＡＡＴＧＡＡＧＴＣＣＡＴＧＧＡＡＴＡＡＴＡＧＡＡＡＧＡＧＡＡＡＡＡＧＣＡＴＴＴＴＣＡＧＧＴＡＴＡＧＧＴＧＴＴＴＴＧＧＧＡＡＡＣＡＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＣＣＡＴＴＡＴＡＴＴＴＣＴＣＴＡＣＡＴＣＡＧＡＡＡＧＧＴＡＴＡＡＡＴＣＡＴＡＡＡＡＣＴＣＴＴＴＧＡＡＧＴＣＡＴＴＣＴＴＴＡＣＡＧＧＡＧＴＣＣＡＡＡＴＡＣＣＡＧＡＧＡＡＴＧＴＴＴＴＡＧＡＴＡＣＡＣＣＡＴＣＡＡＡＡＡＴＴＧＴＡＴＡＡＡＧＴＧＧＣＴＣＴＡＡＣＴＴＡＴＣＣＣＡＡＴＡＡＣＣＴＡＡＣＴＣＴＣＣＧＴＣＧＣＴＡＴＴＧＴＡＡＣＣＡＧＴＴＣＴＡＡＡＡＧＣＴＧＴＡＴＴＴＧＡＧＴＴＴＡＴＣＡＣＣＣＴＴＧＴＣＡＣＴＡＡＧＡＡＡＡＴＡＡＡＴＧＣＡＧＧＧＴＡＡＡＡＴＴＴＡＴＡＴＣＣＴＴＣＴＴＧＴＴＴＴＡＴＧＴＴＴＣＧＧＴＡＴＡＡＡＡＣＡＣＴＡＡＴＡＴＣＡＡＴＴＴＣＴＧＴＧＧＴＴＡＴＡＣＴＡＡＡＡＧＴＣＧＴＴＴＧＴＴＧＧＴＴＣＡＡＡＴＡＡＴＧＡＴＴＡＡＡＴＡＴＣＴＣＴＴＴＴＣＴＣＴＴＣＣＡＡＴＴＧＴＣＴＡＡＡＴＣＡＡＴＴＴＴＡＴＴＡＡＡＧＴＴＣＡＴＴＴＧＡＴＡＴＧＣＣＴＣＣＴＡＡＡＴＴＴＴＴＡＴＣＴＡＡＡＧＴＧＡＡＴＴＴＡＧＧＡＧＧＣＴＴＡＣＴＴＧＴＣＴＧＣＴＴＴＣＴＴＣＡＴＴＡＧＡＡＴＣＡＡＴＣＣＴＴＴＴＴＴＡＡＡＡＧＴＣＡＡＴＡＴＴＡＣＴＧＴＡＡＣＡＴＡＡＡＴＡＴＡＴＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴＡＴＣＣＣＡＣＴＴＴＡＴＣＣＡＡＴＴＴＴＣＧＴＴＴＧＴＴＧＡＡＣＴＡＡＴＧＧＧＴＧＣＴＴＴＡＧＴＴＧＡＡＧＡＡＴＡＡＡＡＧＡＣＣＡＣＡＴＴＡＡＡＡＡＡＴＧＴＧＧＴＣＴＴＴＴＧＴＧＴＴＴＴＴＴＴＡＡＡＧＧＡＴＴＴＧＡＧＣＧＴＡＧＣＧＡＡＡＡＡＴＣＣＴＴＴＴＣＴＴＴＣＴＴＡＴＣＴＴＧＡＴＡＡＴＡＡＧＧＧＴＡＡＣＴＡＴＴＧＣＣＧＧＴＴＧＴＣＣＡＴＴＣＡＴＧＧＣＴＧＡＡＣＴＣＴＧＣＴＴＣＣＴＣＴＧＴＴＧＡＣＡＴＧＡＣＡＣＡＣＡＴＣＡＴＣＴＣＡＡＴＡＴＣＣＧＡＡＴＡＧＧＧＣＣＣＡＴＣＡＧＴＣＴＧＡＣＧＡＣＣＡＡＧＡＧＡＧＣＣＡＴＡＡＡＣＡＣＣＡＡＴＡＧＣＣＴＴＡＡＣＡＴＣＡＴＣＣＣＣＡＴＡＴＴＴＡＴＣＣＡＡＴＡＴＴＣＧＴＴＣＣＴＴＡＡＴＴＴＣＡＴＧＡＡＣＡＡＴＣＴＴＣＡＴＴＣＴＴＴＣＴＴＣＴＣＴＡＧＴＣＡＴＴＡＴＴＡＴＴＧＧＴＣＣＡＴＴＣＡＣＴＡＴＴＣＴＣＡＴＴＣＣＣＴＴＴＴＣＡＧＡＴＡＡＴＴＴＴＡＧＡＴＴＴＧＣＴＴＴＴＣＴＡＡＡＴＡＡＧＡＡＴＡＴＴＴＧＧＡＧＡＧＣＡＣＣＧＴＴＣＴＴＡＴＴＣＡＧＣＴＡＴＴＡＡＴＡＡＣＴＣＧＴＣＴＴＣＣＴＡＡＧＣＡＴＣＣＴＴＣＡＡＴＣＣＴＴＴＴＡＡＴＡＡＣＡＡＴＴＡＴＡＧＣＡＴＣＴＡＡＴＣＴＴＣＡＡＣＡＡＡＣＴＧＧＣＣＣＧＴＴＴＧＴＴＧＡＡＣＴＡＣＴＣＴＴＴＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴＣＣＧＴＴＣＣＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡＴＴＧＣＡＡＴＡＡＴＡＧＡＡＡＡＴＣＣＡＴＣＴＴＣＡＴＣＧＧＣＴＴＴＴＴＣＧＴＣＡＴＣＡＴＣＴＧＴＡＴＧＡＡＴＣＡＡＡＴＣＧＣＣＴＴＣＴＴＣＴＧＴＧＴＣＡＴＣＡＡＧＧＴＴＴＡＡＴＴＴＴＴＴＡＴＧＴＡＴＴＴＣＴＴＴＴＡＡＣＡＡＡＣＣＡＣＣＡＴＡＧＧＡＧＡＴＴＡＡＣＣＴＴＴＴＡＣＧＧＴＧＴＡＡＡＣＣＴＴＣＣＴＣＣＡＡＡＴＣＡＧＡＣＡＡＡＣＧＴＴＴＣＡＡＡＴＴＣＴＴＴＴＣＴＴＣＡＴＣＡＴＣＧＧＴＣＡＴＡＡＡＡＴＣＣＧＴＡＴＣＣＴＴＴＡＣＡＧＧＡＴＡＴＴＴＴＧＣＡＧＴＴＴＣＧＴＣＡＡＴＴＧＣＣＧＡＴＴＧＴＡＴＡＴＣＣＧＡＴＴＴＡＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＣＧＧＴＣＧＡＡＴＣＡＴＴＴＧＡＡＣＴＴＴＴＡＣＡＴＴＴＧＧＡＴＣＡＴＡＧＴＣＴＡＡＴＴＴＣＡＴＴＧＣＣＴＴＴＴＴＣＣＡＡＡＡＴＴＧＡＡＴＣＣＡＴＴＧＴＴＴＴＴＧＡＴＴＣＡＣＧＴＡＧＴＴＴＴＣＴＧＴＡＴＴＣＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＴＴＧＧＴＴＣＣＡＣＡＣＡＴＡＣＣＡＡＴＡＣＡＴＧＣＡＴＧＴＧＣＴＧＡＴＴＡＴＡＡＧＡＡＴＴＡＴＣＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＡＴＴＧＴＣＡＣＴＴＣＣＧＴＴＧＣＡＣＧＣＡＴＡＡＡＡＣＣＡＡＣＡＡＧＡＴＴＴＴＴＡＴＴＡＡＴＴＴＴＴＴＴＡＴＡＴＴＧＣＡＴＣＡＴＴＣＧＧＣＧＡＡＡＴＣＣＴＴＧＡＧＣＣＡＴＡＴＣＴＧＡＣＡＡＡＣＴＣＴＴＡＴＴＴＡＡＴＴＣＴＴＣＧＣＣＡＴＣＡＴＡＡＡＣＡＴＴＴＴＴＡＡＣＴＧＴＴＡＡＴＧＴＧＡＧＡＡＡＣＡＡＣＣＡＡＣＧＡＡＣＴＧＴＴＧＧＣＴＴＴＴＧＴＴＴＡＡＴＡＡＣＴＴＣＡＧＣＡＡＣＡＡＣＣＴＴＴＴＧＴＧＡＣＴＧＡＡＴＧＣＣＡＴＧＴＴＴＣＡＴＴＧＣＴＣＴＣＣＴＣＣＡＧＴＴＧＣＡＣＡＴＴＧＧＡＣＡＡＡＧＣＣＴＧＧＡＴＴＴＡＣＡＡＡＡＣＣＡＣＡＣＴＣＧＡＴＡＣＡＡＣＴＴＴＣＴＴＴＣＧＣＣＴＧＴＴＴＣＡＣＧＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＴＡＣＴＣＴＡＡＴＡＴＴＴＣＡＧＣＡＣＡＡＴＣＴＴＴＴＡＣＴＣＴＴＴＣＡＧＣＣＴＴＴＴＴＡＡＡＴＴＣＡＡＧＡＡＴＡＴＧＣＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＡＧＴＡＡＴＣＡＡＣＡＴＴＡＧＣＧＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＴＧＧＴＣＴＣＡＣＴＴＴＴＣＣＡＣＴＴＴＴＴＧＴＣＴＴＧＴＣＣＡＣＴＡＡＡＡＣＣＣＴＴＧＡＴＴＴＴＴＣＡＴＣＴＧＡＡＴＡＡＡＴＧＣＴＡＣＴＡＴＴＡＧＧＡＣＡＣＡＴＡＡＴＡＴＴＡＡＡＡＧＡＡＡＣＣＣＣＣＡＴＣＴＡＴＴＴＡＧＴＴＡＴＴＴＧＴＴＴＡＧＴＣＡＣＴＴＡＴＡＡＣＴＴＴＡＡＣＡＧＡＴＧＧＧＧＴＴＴＴＴＣＴＧＴＧＣＡＡＣＣＡＡＴＴＴＴＡＡＧＧＧＴＴＴＴＣＡＡＴＡＣＴＴＴＡＡＡＡＣＡＣＡＴＡＣＡＴＡＣＣＡＡＣＡＣＴＴＣＡＡＣＧＣＡＣＣＴＴＴＣＡＧＣＡＡＣＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＴＧＡＣＧＴＴＡＴＴＴＣＴＡＴＡＴＧＴＡＴＣＡＡＧＡＴＡＡＧＡＡＡＧＡＡＣＡＡＧＴＴＣＡＡＡＡＣＣＡＴＣＡＡＡＡＡＡＡＧＡＣＡＣＣＴＴＴＴＣＡＧＧＴＧＣＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＴＡＡＡＣＴＣＡＴＴＣＣＣＴＧＡＴＣＴＣＧＡＣＴＴＣＧＴＴＣＴＴＴＴＴＴＴＡＣＣＴＣＴＣＧＧＴＴＡＴＧＡＧＴＴＡＧＴＴＣＡＡＡＴＴＣＧＴＴＣＴＴＴＴＴＡＧＧＴＴＣＴＡＡＡＴＣＧＴＧＴＴＴＴＴＣＴＴＧＧＡＡＴＴＧＴＧＣＴＧＴＴＴＴＡＴＣＣＴＴＴＡＣＣＴＴＧＴＣＴＡＣＡＡＡＣＣＣＣＴＴＡＡＡＡＡＣＧＴＴＴＴＴＡＡＡＧＧＣＴＴＴＴＡＡＧＣＣＧＴＣＴＧＴＡＣＧＴＴＣＣＴＴＡＡＧ（配列番号１２）
ＳｉｇＡ２構築体（配列番号３）を、以下のプライマー（図１Ｄ）を用いてＳｉｇＡ１構築体の構築のために記載される方法に従って作成した。ＳｉｇＡプロモーターを含む第１の断片を、フォワードプライマーＰ３（配列番号７）及び配列番号１３上のｂｐ１２５からｂｐ１４９に位置するリバース融合プライマーＰ７：ＣＡＴＡＣＡＧＴＴＴＣＧＡＴＴＡＡＡＧＴＴＣＧＡＧＣＡＣＴＣＴＣＴＴＴＴＡＴＡＡＡＴＣＴＣＣＣＣＣＡ（配列番号１１）を用いて増幅した。前記ＹｍａＨタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含む第２の断片を、配列番号１３上のｂｐ１０９０からｂｐ１１１４に位置するフォワード融合プライマーＰ６：ＴＧＧＧＧＧＡＧＡＴＴＴＡＴＡＡＡＡＧＡＧＡＧＴＧＣＴＣＧＡＡＣＴＴＴＡＡＴＣＧＡＡＡＣＴＧＴＡＴＧ（配列番号１０）及びリバースプライマーＰ２（配列番号６）を用いて増幅した。２つの断片をアニーリングし、得られたＳｉｇＡ２構築体は、ＳｉｇＡプロモーター、リボソーム結合部位及びｙｍａＨ遺伝子の転写開始部位を含有した。
【０１６２】
本発明は、ＳｉｇＡプロモーター、ＭｉａＡタンパク質をコードする領域、ＳｉｇＨ  ＹｍａＨプロモーター及びＹｍａＨタンパク質をコードする領域を含むバチルス染色体ＤＮＡのｍｉａＡ  ｙｍａＨ領域を増幅することで作成される、第４のＳｉｇＡ構築体（ＳｉｇＡ３、配列番号１３、図１Ｅ）も包含する。
【０１６３】
ＳｉｇＡ３構築体を、フォワードプライマー：ＧＣＧＣＧＣＧＡＡＴＴＣＡＧＧＧＡＡＡＴＴＧＴＣＧＧＣＡＡＴＧＡＧＣＣＧＣＴＣＧＧＣ（配列番号１８）及びリバースプライマーＧＣＧＣＧＣＣＡＴＧＧＣＴＧＡＴＴＣＧＴＣＴＣＡＧＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＣＴＴＴＣＡ（配列番号１９）を用いて作成した。配列番号１３は、前記断片の５’末端にＥｃｏＲＩ制限部位を置く一方、配列番号１９は、他方の末端にＮｃｏＩ部位を置く。これにより、下記で示される配列番号２０として報告されるｐＢＮ３ベクター内での前記断片のクローン化が可能となる。
【０１６４】
ＧＡＣＧＴＣＴＡＡＧＡＡＡＣＣＡＴＴＡＴＴＡＴＣＡＴＧＡＣＡＴＴＡＡＣＣＴＡＴＡＡＡＡＡＴＡＧＧＣＧＴＡＴＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＴＴＣＧＴＣＴＴＣＡＡＧＡＡＴＴＡＡＴＴＣＴＣＡＴＧＴＴＴＧＡＣＡＧＣＴＴＡＴＣＡＴＣＧＡＴＡＡＧＣＴＴＧＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧＴＡＣＣＧＡＧＣＴＣＧＡＡＴＴＣＣＴＴＡＡＧＧＡＡＣＧＴＡＣＡＧＡＣＧＧＣＴＴＡＡＡＡＧＣＣＴＴＴＡＡＡＡＡＣＧＴＴＴＴＴＡＡＧＧＧＧＴＴＴＧＴＡＧＡＣＡＡＧＧＴＡＡＡＧＧＡＴＡＡＡＡＣＡＧＣＡＣＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＡＡＡＣＡＣＧＡＴＴＴＡＧＡＡＣＣＴＡＡＡＡＡＧＡＡＣＧＡＡＴＴＴＧＡＡＣＴＡＡＣＴＣＡＴＡＡＣＣＧＡＧＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＧＡＡＧＴＣＧＡＧＡＴＣＡＧＧＧＡＡＴＧＡＧＴＴＴＡＴＡＡＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＡＡＧＧＴＧＴＣＴＴＴＴＴＴＴＧＡＴＧＧＴＴＴＴＧＡＡＣＴＴＧＴＴＣＴＴＴＣＴＴＡＴＣＴＴＧＡＴＡＣＡＴＡＴＡＧＡＡＡＴＡＡＣＧＴＣＡＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＡＧＴＴＧＣＴＧＡＡＡＧＧＴＧＣＧＴＴＧＡＡＧＴＧＴＴＧＧＴＡＴＧＴＡＴＧＴＧＴＴＴＴＡＡＡＧＴＡＴＴＧＡＡＡＡＣＣＣＴＴＡＡＡＡＴＴＧＧＴＴＧＣＡＣＡＧＡＡＡＡＡＣＣＣＣＡＴＣＴＧＴＴＡＡＡＧＴＴＡＴＡＡＧＴＧＡＣＴＡＡＡＣＡＡＡＴＡＡＣＴＡＡＡＴＡＧＡＴＧＧＧＧＧＴＴＴＣＴＴＴＴＡＡＴＡＴＴＡＴＧＴＧＴＣＣＴＡＡＴＡＧＴＡＧＣＡＴＴＴＡＴＴＣＡＧＡＴＧＡＡＡＡＡＴＣＡＡＧＧＧＴＴＴＴＡＧＴＧＧＡＣＡＡＧＡＣＡＡＡＡＡＧＴＧＧＡＡＡＡＧＴＧＡＧＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＡＡＴＣＧＣＴＡＡＴＧＴＴＧＡＴＴＡＣＴＴＴＧＡＡＣＴＴＣＴＧＣＡＴＡＴＴＣＴＴＧＡＡＴＴＴＡＡＡＡＡＧＧＣＴＧＡＡＡＧＡＧＴＡＡＡＡＧＡＴＴＧＴＧＣＴＧＡＡＡＴＡＴＴＡＧＡＧＴＡＴＡＡＡＣＡＡＡＡＴＣＧＴＧＡＡＡＣＡＧＧＣＧＡＡＡＧＡＡＡＧＴＴＧＴＡＴＣＧＡＧＴＧＴＧＧＴＴＴＴＧＴＡＡＡＴＣＣＡＧＧＣＴＴＴＧＴＣＣＡＡＴＧＴＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＧＣＡＡＴＧＡＡＡＣＡＴＧＧＣＡＴＴＣＡＧＴＣＡＣＡＡＡＡＧＧＴＴＧＴＴＧＣＴＧＡＡＧＴＴＡＴＴＡＡＡＣＡＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＧＴＴＣＧＴＴＧＧＴＴＧＴＴＴＣＴＣＡＣＡＴＴＡＡＣＡＧＴＴＡＡＡＡＡＴＧＴＴＴＡＴＧＡＴＧＧＣＧＡＡＧＡＡＴＴＡＡＡＴＡＡＧＡＧＴＴＴＧＴＣＡＧＡＴＡＴＧＧＣＴＣＡＡＧＧＡＴＴＴＣＧＣＣＧＡＡＴＧＡＴＧＣＡＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＴＴＡＡＴＡＡＡＡＡＴＣＴＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＡＴＧＣＧＴＧＣＡＡＣＧＧＡＡＧＴＧＡＣＡＡＴＡＡＡＴＡＡＴＡＡＡＧＡＴＡＡＴＴＣＴＴＡＴＡＡＴＣＡＧＣＡＣＡＴＧＣＡＴＧＴＡＴＴＧＧＴＡＴＧＴＧＴＧＧＡＡＣＣＡＡＣＴＴＡＴＴＴＴＡＡＧＡＡＴＡＣＡＧＡＡＡＡＣＴＡＣＧＴＧＡＡＴＣＡＡＡＡＡＣＡＡＴＧＧＡＴＴＣＡＡＴＴＴＴＧＧＡＡＡＡＡＧＧＣＡＡＴＧＡＡＡＴＴＡＧＡＣＴＡＴＧＡＴＣＣＡＡＡＴＧＴＡＡＡＡＧＴＴＣＡＡＡＴＧＡＴＴＣＧＡＣＣＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＴＡＡＡＴＣＧＧＡＴＡＴＡＣＡＡＴＣＧＧＣＡＡＴＴＧＡＣＧＡＡＡＣＴＧＣＡＡＡＡＴＡＴＣＣＴＧＴＡＡＡＧＧＡＴＡＣＧＧＡＴＴＴＴＡＴＧＡＣＣＧＡＴＧＡＴＧＡＡＧＡＡＡＡＧＡＡＴＴＴＧＡＡＡＣＧＴＴＴＧＴＣＴＧＡＴＴＴＧＧＡＧＧＡＡＧＧＴＴＴＡＣＡＣＣＧＴＡＡＡＡＧＧＴＴＡＡＴＣＴＣＣＴＡＴＧＧＴＧＧＴＴＴＧＴＴＡＡＡＡＧＡＡＡＴＡＣＡＴＡＡＡＡＡＡＴＴＡＡＡＣＣＴＴＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＡＡＧＡＡＧＧＣＧＡＴＴＴＧＡＴＴＣＡＴＡＣＡＧＡＴＧＡＴＧＡＣＧＡＡＡＡＡＧＣＣＧＡＴＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＴＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧＣＡＡＴＧＴＧＧＡＡＴＴＧＧＧＡＡＣＧＧＡＡＡＡＡＴＴＡＴＴＴＴＡＴＴＡＡＡＧＡＧＴＡＧＴＴＣＡＡＣＡＡＡＣＧＧＧＣＣＡＧＴＴＴＧＴＴＧＡＡＧＡＴＴＡＧＡＴＧＣＴＡＴＡＡＴＴＧＴＴＡＴＴＡＡＡＡＧＧＡＴＴＧＡＡＧＧＡＴＧＣＴＴＡＧＧＡＡＧＡＣＧＡＧＴＴＡＴＴＡＡＴＡＧＣＴＧＡＡＴＡＡＧＡＡＣＧＧＴＧＣＴＣＴＣＣＡＡＡＴＡＴＴＣＴＴＡＴＴＴＡＧＡＡＡＡＧＣＡＡＡＴＣＴＡＡＡＡＴＴＡＴＣＴＧＡＡＡＡＧＧＧＡＡＴＧＡＧＡＡＴＡＧＴＧＡＡＴＧＧＡＣＣＡＡＴＡＡＴＡＡＴＧＡＣＴＡＧＡＧＡＡＧＡＡＡＧＡＡＴＧＡＡＧＡＴＴＧＴＴＣＡＴＧＡＡＡＴＴＡＡＧＧＡＡＣＧＡＡＴＡＴＴＧＧＡＴＡＡＡＴＡＴＧＧＧＧＡＴＧＡＴＧＴＴＡＡＧＧＣＴＡＴＴＧＧＴＧＴＴＴＡＴＧＧＣＴＣＴＣＴＴＧＧＴＣＧＴＣＡＧＡＣＴＧＡＴＧＧＧＣＣＣＴＡＴＴＣＧＧＡＴＡＴＴＧＡＧＡＴＧＡＴＧＴＧＴＧＴＣＡＴＧＴＣＡＡＣＡＧＡＧＧＡＡＧＣＡＧＡＧＴＴＣＡＧＣＣＡＴＧＡＡＴＧＧＡＣＡＡＣＣＧＧＴＧＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＡＧＴＧＡＡＴＴＴＴＧＡＴＡＧＣＧＡＡＧＡＧＡＴＴＣＴＡＣＴＡＧＡＴＴＡＴＧＣＡＴＣＴＣＡＧＧＴＧＧＡＡＴＣＡＧＡＴＴＧＧＣＣＧＣＴＴＡＣＡＣＡＴＧＧＴＣＡＡＴＴＴＴＴＣＴＣＴＡＴＴＴＴＧＣＣＧＡＴＴＴＡＴＧＡＴＴＣＡＧＧＴＧＧＡＴＡＣＴＴＡＧＡＧＡＡＡＧＴＧＴＡＴＣＡＡＡＣＴＧＣＴＡＡＡＴＣＧＧＴＡＧＡＡＧＣＣＣＡＡＡＣＧＴＴＣＣＡＣＧＡＴＧＣＧＡＴＴＴＧＴＧＣＣＣＴＴＡＴＣＧＴＡＧＡＡＧＡＧＣＴＧＴＴＴＧＡＡＴＡＴＧＣＡＧＧＣＡＡＡＴＧＧＣＧＴＡＡＴＡＴＴＣＧＴＧＴＧＣＡＡＧＧＡＣＣＧＡＣＡＡＣＡＴＴＴＣＴＡＣＣＡＴＣＣＴＴＧＡＣＴＧＴＡＣＡＧＧＴＡＧＣＡＡＴＧＧＣＡＧＧＴＧＣＣＡＴＧＴＴＧＡＴＴＧＧＴＣＴＧＣＡＴＣＡＴＣＧＣＡＴＣＴＧＴＴＡＴＡＣＧＡＣＧＡＧＣＧＣＴＴＣＧＧＴＣＴＴＡＡＣＴＧＡＡＧＣＡＧＴＴＡＡＧＣＡＡＴＣＡＧＡＴＣＴＴＣＣＴＴＣＡＧＧＴＴＡＴＧＡＣＣＡＴＣＴＧＴＧＣＣＡＧＴＴＣＧＴＡＡＴＧＴＣＴＧＧＴＣＡＡＣＴＴＴＣＣＧＡＣＴＣＴＧＡＧＡＡＡＣＴＴＣＴＧＧＡＡＴＣＧＣＴＡＧＡＧＡＡＴＴＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＡＴＴＣＡＧＧＡＧＴＧＧＡＣＡＧＡＡＣＧＡＣＡＣＧＧＡＴＡＴＡＴＡＧＴＧＧＡＴＧＴＧＴＣＡＡＡＡＣＧＣＡＴＡＣＣＡＴＴＴＴＧＡＡＣＧＡＴＧＡＣＣＴＣＴＡＡＴＡＡＴＴＧＴＴＡＡＴＣＡＴＧＴＴＧＧＴＴＡＣＣＴＧＣＣＴＣＧＣＧＣＧＴＴＴＣＧＧＴＧＡＴＧＡＣＧＧＴＧＡＡＡＡＣＣＴＣＴＧＡＣＡＣＡＴＧＣＡＧＣＴＣＣＣＧＧＡＧＡＣＧＧＴＣＡＣＡＧＣＴＴＧＴＣＴＧＴＡＡＧＣＧＧＡＴＧＣＣＧＧＧＡＧＣＡＧＡＣＡＡＧＣＣＣＧＴＣＡＧＧＧＣＧＣＧＴＣＡＧＣＧＧＧＴＧＴＴＧＧＣＧＧＧＴＧＴＣＧＧＧＧＣＧＣＡＧＣＣＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＴＡＧＣＧＡＴＡＧＣＧＧＡＧＴＧＴＡＴＡＣＴＧＧＣＴＴＡＡＣＴＡＴＧＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＡＴＴＧＴＡＣＴＧＡＧＡＧＴＧＣＡＣＣＡＴＡＴＧＣＧＧＴＧＴＧＡＡＡＴＡＣＣＧＣＡＣＡＧＡＴＧＣＧＴＡＡＧＧＡＧＡＡＡＡＴＡＣＣＧＣＡＴＣＡＧＧＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＣＴＴＣＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＣＴＣＧＣＴＧＣＧＣＴＣＧＧＴＣＧＴＴＣＧＧＣＴＧＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＴＡＴＣＡＧＣＴＣＡＣＴＣＡＡＡＧＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＧＧＴＴＡＴＣＣＡＣＡＧＡＡＴＣＡＧＧＧＧＡＴＡＡＣＧＣＡＧＧＡＡＡＧＡＡＣＡＴＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＣＡＡＡＡＧＧＣＣＡＧＧＡＡＣＣＧＴＡＡＡＡＡＧＧＣＣＧＣＧＴＴＧＣＴＧＧＣＧＴＴＴＴＴＣＣＡＴＡＧＧＣＴＣＣＧＣＣＣＣＣＣＴＧＡＣＧＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＡＡＴＣＧＡＣＧＣＴＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＧＴＧＧＣＧＡＡＡＣＣＣＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＴＡＡＡＧＡＴＡＣＣＡＧＧＣＧＴＴＴＣＣＣＣＣＴＧＧＡＡＧＣＴＣＣＣＴＣＧＴＧＣＧＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＣＧＡＣＣＣＴＧＣＣＧＣＴＴＡＣＣＧＧＡＴＡＣＣＴＧＴＣＣＧＣＣＴＴＴＣＴＣＣＣＴＴＣＧＧＧＡＡＧＣＧＴＧＧＣＧＣＴＴＴＣＴＣＡＴＡＧＣＴＣＡＣＧＣＴＧＴＡＧＧＴＡＴＣＴＣＡＧＴＴＣＧＧＴＧＴＡＧＧＴＣＧＴＴＣＧＣＴＣＣＡＡＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＴＧＣＡＣＧＡＡＣＣＣＣＣＣＧＴＴＣＡＧＣＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＧＣＣＴＴＡＴＣＣＧＧＴＡＡＣＴＡＴＣＧＴＣＴＴＧＡＧＴＣＣＡＡＣＣＣＧＧＴＡＡＧＡＣＡＣＧＡＣＴＴＡＴＣＧＣＣＡＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＣＣＡＣＴＧＧＴＡＡＣＡＧＧＡＴＴＡＧＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＴＡＴＧＴＡＧＧＣＧＧＴＧＣＴＡＣＡＧＡＧＴＴＣＴＴＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＣＣＴＡＡＣＴＡＣＧＧＣＴＡＣＡＣＴＡＧＡＡＧＧＡＣＡＧＴＡＴＴＴＧＧＴＡＴＣＴＧＣＧＣＴＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＣＡＧＴＴＡＣＣＴＴＣＧＧＡＡＡＡＡＧＡＧＴＴＧＧＴＡＧＣＴＣＴＴＧＡＴＣＣＧＧＣＡＡＡＣＡＡＡＣＣＡＣＣＧＣＴＧＧＴＡＧＣＧＧＴＧＧＴＴＴＴＴＴＴＧＴＴＴＧＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＧＣＡＧＡＡＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＣＴＴＴＧＡＴＣＴＴＴＴＣＴＡＣＧＧＧＧＴＣＴＧＡＣＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＡＣＧＡＡＡＡＣＴＣＡＣＧＴＴＡＡＧＧＧＡＴＴＴＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧＡＴＴＡＴＣＡＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＡＣＣＴＡＧＡＴＣＣＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡＧＴＴＴＴＡＡＡＴＣＡＡＴＣＴＡＡＡＧＴＡＴＡＴＡＴＧＡＧＴＡＡＡＣＴＴＧＧＴＣＴＧＡＣＡＧＴＴＡＣＣＡＡＴＧＣＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＡＧＧＣＡＣＣＴＡＴＣＴＣＡＧＣＧＡＴＣＴＧＴＣＴＡＴＴＴＣＧＴＴＣＡＴＣＣＡＴＡＧＴＴＧＣＣＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＡＴＡＡＣＴＡＣＧＡＴＡＣＧＧＧＡＧＧＧＣＴＴＡＣＣＡＴＣＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴＧＣＴＧＣＡＡＴＧＡＴＡＣＣＧＣＧＡＧＡＣＣＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＧＧＣＴＣＣＡＧＡＴＴＴＡＴＣＡＧＣＡＡＴＡＡＡＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＧＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＧＣＧＣＡＧＡＡＧＴＧＧＴＣＣＴＧＣＡＡＣＴＴＴＡＴＣＣＧＣＣＴＣＣＡＴＣＣＡＧＴＣＴＡＴＴＡＡＴＴＧＴＴＧＣＣＧＧＧＡＡＧＣＴＡＧＡＧＴＡＡＧＴＡＧＴＴＣＧＣＣＡＧＴＴＡＡＴＡＧＴＴＴＧＣＧＣＡＡＣＧＴＴＧＴＴＧＣＣＡＴＴＧＣＴＡＣＡＧＧＣＡＴＣＧＴＧＧＴＧＴＣＡＣＧＣＴＣＧＴＣＧＴＴＴＧＧＴＡＴＧＧＣＴＴＣＡＴＴＣＡＧＣＴＣＣＧＧＴＴＣＣＣＡＡＣＧＡＴＣＡＡＧＧＣＧＡＧＴＴＡＣＡＴＧＡＴＣＣＣＣＣＡＴＧＴＴＧＴＧＣＡＡＡＡＡＡＧＣＧＧＴＴＡＧＣＴＣＣＴＴＣＧＧＴＣＣＴＣＣＧＡＴＣＧＴＴＧＴＣＡＧＡＡＧＴＡＡＧＴＴＧＧＣＣＧＣＡＧＴＧＴＴＡＴＣＡＣＴＣＡＴＧＧＴＴＡＴＧＧＣＡＧＣＡＣＴＧＣＡＴＡＡＴＴＣＴＣＴＴＡＣＴＧＴＣＡＴＧＣＣＡＴＣＣＧＴＡＡＧＡＴＧＣＴＴＴＴＣＴＧＴＧＡＣＴＧＧＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＡＣＣＡＡＧＴＣＡＴＴＣＴＧＡＧＡＡＴＡＧＴＧＴＡＴＧＣＧＧＣＧＡＣＣＧＡＧＴＴＧＣＴＣＴＴＧＣＣＣＧＧＣＧＴＣＡＡＴＡＣＧＧＧＡＴＡＡＴＡＣＣＧＣＧＣＣＡＣＡＴＡＧＣＡＧＡＡＣＴＴＴＡＡＡＡＧＴＧＣＴＣＡＴＣＡＴＴＧＧＡＡＡＡＣＧＴＴＣＴＴＣＧＧＧＧＣＧＡＡＡＡＣＴＣＴＣＡＡＧＧＡＴＣＴＴＡＣＣＧＣＴＧＴＴＧＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＣＧＡＴＧＴＡＡＣＣＣＡＣＴＣＧＴＧＣＡＣＣＣＡＡＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＧＣＡＴＣＴＴＴＴＡＣＴＴＴＣＡＣＣＡＧＣＧＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＣＡＡＡＡＡＣＡＧＧＡＡＧＧＣＡＡＡＡＴＧＣＣＧＣＡＡＡＡＡＡＧＧＧＡＡＴＡＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＧＧＡＡＡＴＧＴＴＧＡＡＴＡＣＴＣＡＴＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＴＴＴＣＡＡＴＡＴＴＡＴＴＧＡＡＧＣＡＴＴＴＡＴＣＡＧＧＧＴＴＡＴＴＧＴＣＴＣＡＴＧＡＧＣＧＧＡＴＡＣＡＴＡＴＴＴＧＡＡＴＧＴＡＴＴＴＡＧＡＡＡＡＡＴＡＡＡＣＡＡＡＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＧＣＧＣＡＣＡＴＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＡＧＴＧＣＣＡＣＣＴ（配列番号２０）
全てのＰＣＲ反応を、１−２ｕｌのＤＮＡまたはコロニー再懸濁液、５μｌの１０ＸＰｆｕウルトラ・バッファー（ストラタジェン）、１ｕＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰブレンド（ロシュ）、０．５ｕＬの０．２ｕＭプライマー、１μｌのＰｆｕウルトラ・ハイ・フィデリティ・ポリメラーゼを含み、水で全容積を５０μに調節した５０μｌ容積量で実施した。ＰＣＲ条件は、９５℃２分間、９５℃３０秒間を３０サイクル、６２℃３０分間、７２℃１分間、次に７２℃１０分間を１サイクルであった。
【０１６５】
得られたＰＣＲ断片を、キアゲン・ゲル・ピュアリフィケーション・キットを用いて使用方法に基づき、ゲル精製した。
【０１６６】
融合構築体を、精製されたＰＣＲ断片の０．２５ｕｌのアリコートと混合し、アニーリングすることで得、プライマーＰ３及びＰ２を用いた上記作成方法に従って新しいＰＣＲ混合物に加えた。ＰＣＲ混合物の全容積は５０μｌであった。ＰＣＲ条件は上述の通りであり、プライマーのＴｍに従って、アニーリング温度を調整した。
【０１６７】
所望のＳｉｇＨ、ＳｉｇＡ１、及びＳｉｇＡ２構築体をＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化したｐＢＳ１９プラスミドにライゲートし、実施例２で記載するような宿主細胞の形質転換に使用したＳｉｇＡ及びＳｉｇＨ発現ベクターを作成した。
【０１６８】
形質転換混合物をＬＢ＋１．６％スキムミルク＋５ｕｇ／ｍｌ  ｃｍｐプレート上にプレートした。翌日、輪状のコロニーを採取し、単一コロニー毎にプレートした。コロニー精製を２度行った。５個の個々のクローンをａｐｒＥプロモーター領域のシークエンスにより解析した。それら全てのクローンは、ａｐｒＥプロモーターの−３５領域でコンセンサス配列を有していた。
【０１６９】
実施例２
宿主細胞形質転換及びａｐｒＥプロテアーゼの発現
ＳｉｇＡまたはＳｉｇＨ構築体を含む５マイクロリットルのライゲーション混合物を、エレクトロポレーションによる大腸菌トップ１０細胞（インビトロジェン）の形質転換に用いた。形質転換された細胞を、５ｐｐｍ／ｍｌクロラムフェニコール（Ｃｍ）を含むＬＢ寒天プレート上にプレートした。また、コロニーを３７℃で一晩増殖させた。個々のコロニーを採取し、５ｍｌのＬＢ＋５ｐｐｍ／ｍｌ  Ｃｍを含むチューブに移した。培養地を３７℃で一晩、２５０ｒｐｍで振盪させながら増殖させた。プラスミドＤＮＡを、大腸菌培地から調製し、プラスミドＤＮＡの調製物の一部をシークエンスした（シークエテック）。自動化シークエンス解析を、フレップ（Ｐｈｒｅｐ）、フラップ（Ｐｈｒａｐ）、コンセド（Ｃｏｎｓｅｄ）、クスタルＷ（Ｃｕｓｔａｌ  Ｗ）ソフトウェアを用いて行った。
【０１７０】
３個の発現ベクターの各々から正しい構築体を有する前記プラスミドを、Ｂ．ズブチリス宿主細胞の形質転換に用いた。ＳｉｇＨ（配列番号１）及びＳｉｇＡ１（配列番号２）及びＳｉｇＡ２（配列番号３）構築体を含む発現ベクターを、ｐＢＳ１９  ｙｍａＨ−Ｈ及びｐＢＳ１９  ｙｍａＨ−Ａ１及びｐＢＳ１９  ｙｍａＨ−Ａ２と名づけ、以下のようにＢ．ズブチリス株ＢＧ２９４１及びＢＧ２９４２内に形質転換した。前記適切な構築体を運ぶ、２マイクロリットルのプラスミドＤＮＡを１００μｌのＢ．ズブチリス細胞ＢＧ２９４１（ΔｎｐｒＥ、ａｍｙＥ：：ＰｘｙｌＲＡ−ｃｏｍＫ−ｐｈｌｅｏＲ）及びＢＧ２９４２（ΔｎｐｒＥ、ｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２、ａｍｙＥ：：ＰｘｙｌＲＡ−ｃｏｍＫ−ｐｈｌｅｏＲ）の形質転換に用いた。ＳｉｇＨ構築体を運ぶＢＧ２９４１及びＢＧ２９４２形質転換体をそれぞれ、４１ＳｉｇＨ及び４２ＳｉｇＨと名づけ、ＳｉｇＡ１構築体を運ぶＢＧ２９４１及びＢＧ２９４２形質転換体をそれぞれ、４１ＳｉｇＡ１及び４２ＳｉｇＡ１と名づけた。いくつかのＢＧ２９４１及びＢＧ２９４２宿主細胞もコントロールｐＢＳ１９プラスミドで形質転換し、４１ｐＢＳ１９及び４２ｐＢＳ１９と名づけた。大部分の非ａｐｒＥバックグランドのタンパク質分解活性を取り除き、従って生成されたアルカリ・プロテアーゼ（ａｐｒＥ）の測定を促進する、ｎｐｒＥ遺伝子の欠失が、ＢＧ２９４１宿主細胞及びＢＧ２９４２宿主細胞の両方ともにある。ＢＧ２９４１及び２９４２宿主細胞はまた、キシロースを伴う増殖培地を誘導することでコンピテント細胞の作成を可能にする、カセットａｍｙＥ：：ＰｘｙｌＲＡ−ｃｏｍＫ−ｐｈｌｅｏＲも運ぶ（Ｈａｈｎ他著、Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第１８巻、７５５−６７頁、１９９５年）。前記２９４２宿主細胞はまた、ｄｅｇＵ遺伝子（ｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２変異）内で変異を有する。この変異は、ｄｅｇＵ（Ｈｙ）変異を運ばない宿主細胞により分泌されたズブチリシンのレベルと比べ、宿主細胞により分泌されるズブチリシンのレベルを単独で数倍に増加させる（Ｍｓａｄｅｋ他著、Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、第１７２巻、８２４−８３４頁、１９９０年）。
【０１７１】
バチルス宿主細胞内でのＹｍａＨの過剰発現の効果は、実施例３で記載される分析で質的及び量的に測定した。
【０１７２】
実施例３
プロテアーゼ生成におけるｙｍａＨの過剰発現の効果
カゼイン分析−バチルス宿主細胞によるプロテアーゼ生成におけるｙｍａＨの過剰発現の効果を、スキムミルクの状態でカゼインを含む寒天プレート上で育成したコロニーにより生成された輪（ｈａｌｏ）のサイズを比較する質的分析により、先ず測定した。プロテアーゼ酵素がバチルス細胞から分泌されると、スキムミルク内のカゼインを消化し、育成コロニーの周りに透明な領域または輪を形成する。不活性プロテアーゼを有する宿主細胞は、コロニー周辺に前記輪がほとんどないまたは全くない。従って、前記輪のサイズは、分泌するコロニーにより生成されるプロテアーゼ量の質的評価を提供する（Ｗｅｌｌｓ、Ｔ．Ａ．他著、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第１１巻、７９１１−７９２５頁、１９８３年）。
【０１７３】
ＳｉｇＨまたはＳｉｇＡ１発現ベクターを用いて形質転換されたＢＧ２９４１及びＢＧ２９４２  Ｂ．ズブチリス宿主細胞を、１．６％のスキムミルク及び５ｐｐｍ  Ｃｍ／ｍｌを含むＬＢ寒天プレート上にプレートし、３７℃で一晩保温した。翌日、形質転換体のいくつかに由来するコロニーを、５ｐｐｍ／ｍｌ  Ｃｍを伴うＬＢ寒天プレート上に単離した単一コロニーとし、このプレートを３７℃で一晩保温した。単離された単一コロニーを採取し、同様の型のプレート上に撒き、３７℃で一晩再び保温した。
【０１７４】
ｙｍａＨの過剰発現を可能にするｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２変異及びＳｉｇＨ構築体を運ぶ４２ＳｉｇＨ宿主細胞が最も大きい前記輪を生成した。特に、４２ＳｉｇＨ細胞の前記輪のサイズは、ｙｍａＨの過剰発現が、野生型細胞により生成されるレベルより高いレベルで前記酵素を既に生成する宿主細胞内でのズブチリシンの生成をさらに促進することを証明する。すなわち、４２ＳｉｇＨ細胞は、ｄｅｇＵ（Ｈｙ）変異を運ぶが、ｙｍａＨを過剰発現可能な構築体を運ばない４２ｐＢＳ１９細胞により生成されたものよりも大きい前記輪を生成し、また同様に、ｄｅｇＵ（Ｈｙ）３２変異を運ばず、ｙｍａＨを過剰発現可能な構築体も運ばない４１ｐＢＳ１９細胞により生成されたものよりも大きい前記輪を生成する。４２ＳｉｇＨ細胞により生成された前記輪はまた、ｄｅｇＵ（Ｈｙ）変異を運ばないが、ｙｍａＨを過剰発現可能なＳｉｇＨ構築体を運ぶ４１ＳｉｇＨ細胞により生成された前記輪よりも大きい。
【０１７５】
ＡＡＰＦ分析−ｙｍａＨを過剰発現し、それぞれが４２ｐＢＳ１９及び４１ｐＢＳ１９を制御する形質転換されたバチルス宿主細胞４２ＳｉｇＨ、４２ＳｉｇＡ１、４１ＳｉｇＡ２によるズブチリシンの生成を、分泌されたａｐｒＥプロテアーゼの活性の関数として定量化した。前記分泌されたプロテアーゼのタンパク質分解活性を、基質スクシニル−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｐｒｏ−Ｌ−Ｐｈｅ−ｐ−ニトロアナリド（シグマ・ケミカル社のＡＡＰＦ）の加水分解速度として測定した。ｐ−ニトロアナリンの前記加水分解及び放出によりもたらされる４０５ｎｍ／分での吸光度として、プロテアーゼ生成レベルを前記分析により測定した（Ｅｓｔｅｌｌ他著、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．、第２６０巻、６５１８−６５２１頁、１９８５年）。前記測定値を、ソフマックス（Ｓｏｆｍａｘ）・プロ・ソフトウェアを用いて測定し、また、特定の条件は、型−動力学（Ｋｉｎｅｔｉｃ）、還元（Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）−Ｖｍａｘポイント（最適読み込み１５／２８ポイント）、Ｌｍ１−４０５ｎｍ、時間−５分、及び間隔−１１秒として設定した。
【０１７６】
５ｐｍｍ／ｍｌクロラムフェニコール（Ｃｍ）を含む５ｍｌのＬＢに、形質転換された細胞４１ＳｉｇＨ及び４２ＳｉｇＡ１及び４２ＳｉｇＨの単一コロニーを植菌し、増殖が対数成長期中期に到達するまで３７℃で振盪しつつ、前記細胞を増殖させることで、Ｂ．ズブチリス・コントロール宿主細胞４１ｐＢＳ１９及び４２ｐＢＳ１９、及びｙｍａＨを過剰発現する宿主細胞の液体培養地を得た。前記培養の各々を、５ｐｐｍ／ｍｌ  Ｃｍを含む新しい複合培地で１：１００に希釈し、２５０ｒｐｍで振盪しつつ、３７℃で増殖させた。前記培養のサンプルを、図で示す時間に採取した。このサンプルを遠心分離し、上清をズブチリシンの生成の有無について試験した。
【０１７７】
Ｂ．ズブチリス培養上清の各々１０マイクロリットルを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ＋０．００５％ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０、ｐＨ８．６、及び２５ｕｌの１００ｍｇ／ｍｌ  ＡＡＰＦを含む、１００ｕｌのトリス緩衝液で希釈した。各々のプロテアーゼの活性を計算し、プロテアーゼの生成におけるＹｍａＨの過剰発現の効果を図３Ａ−Ｂ及び図４に示した。
【０１７８】
バチルス宿主細胞内でのｙｍａＨの過剰発現は、ｄｅｇＵ（Ｈｙ）変異の存在（４２ＳｉｇＡ及び４２ＳｉｇＨ、図３Ａ）または不在（４１ＳｉｇＨ、図３Ｂ）に関わりなく、それぞれのコントロール細胞４１ｐＢＳ１９及び４２ｐＢＳ１９により生成されるレベルと比べ、数倍ａｐｒＥズブチリシンの生成を増進させることを、図３Ａ及び３Ｂは示す。追加的に、ｙａｍＨを過剰発現する細胞は、ｙａｍＨを過剰発現しない細胞より早期に上昇したレベルのズブチリシンを生成する。例えば、４２ｓｉｇＨ細胞は２０時間の増殖で、親コントロール細胞が４８時間で生成するズブチリシンとほぼ同量を生成することを、図３Ａは示す。同様に、４１ＳｉｇＨ細胞が２５時間で、４１ｐＢＳコントロール細胞が４８時間で生成するよりも多いズブチリシンを生成することを、図３Ｂは示す。ＳｉｇＨプロモーター（４２ＳｉｇＨ）によりｙｍａＨの発現が誘導される細胞は、シグマ・プロモーター（４２ＳｉｇＡ）によりｙｍａＨの発現が誘導される細胞により生成されるよりも多い、ズブチリシンの生成をもたらすことを図４中のグラフは示す。また、ＳｉｇＨまたはＳｉｇＡプロモーターのいずれかにより誘導されるｙｍａＨの過剰発現が、早くもたったの１時間の細胞増殖後に促進されたズブチリシンの生成をもたらすことも、図４は示す。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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