(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
血漿または血漿画分から得られるプロトロンビンを、トロンビンに活性化した後、および適切な場合はさらなる処理工程の後、疎水性相互作用クロマトグラフィーにより精製することからなるトロンビン製剤の製造方法。
【請求項２】
トロンビンに活性化するために用いるプロトロンビンを、トロンビン製剤の製造中にウイルスの不活性化または削減に付する請求項１に記載のトロンビン製剤の製造方法。
【請求項３】
上記トロンビンを、上記クロマトグラフィー精製の前または後にも、さらにウイルスの不活性化または削減に付する請求項１または２に記載のトロンビン製剤の製造方法。
【請求項４】
上記疎水性相互作用クロマトグラフィーの前または後に、さらに陽イオン交換クロマトグラフィーをも行う請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
上記トロンビン製剤を５.０〜８.０のpHに調節する請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
安定剤としての可溶性カルシウム塩および塩化ナトリウムのほかに、緩衝物質、糖または糖アルコールおよび／またはアミノ酸および／またはモノ−またはポリカルボン酸の塩またはモノ−またはポリヒドロキシカルボン酸の塩を上記トロンビン製剤に添加する請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
トロンビン阻害剤を安定剤として添加する請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
上記トロンビン阻害剤としてベンズアミジンまたはｐ−アミノベンズアミジンを添加する請求項７に記載の方法。
【請求項９】
結合した疎水性残基を有するゲルを上記疎水性相互作用クロマトグラフィーのための吸着剤として用いる請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
吸着剤として用いられる上記ゲルの疎水性残基がフェニル残基である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ウイルスを除去するのに適した孔径を有する膜を通して上記トロンビン製剤をろ過する請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【０００１】  本発明は、液体状態で安定であり、かつ高い純度およびウイルス安全性によって区別されるトロンビン製剤、およびその製造方法に関する。
【０００２】  トロンビンを商業的に製造することが可能になったので、その幾つかの用途が浮かび上がってきている。現在挙げるべき主な用途は、診断の目的のほかに、局所的止血物質としての使用、またはフィブリノゲン含有成分と共に組織膠質の成分としての使用である。医療目的でトロンビンを使用するための前提条件は、高いウイルス安全性を有し、かつトロンビンまたは他の因子の不活な副生成物または分解生成物を極少の含有量で含む安定な製品として、トロンビンを臨床医が入手できるようにすることである。
【０００３】  トロンビンを安定化するための多数の方法が既に提案されている。このように、日本特許出願第５６−３９７８２号には、有機のモノ−またはポリカルボン酸および／またはモノ−またはポリヒドロキシカルボン酸を用いて安定なトロンビン水溶液を製造する方法が開示されている。日本特許出願第５７−１８９８５号には、トロンビン安定剤としてのアルブミンが開示されており、日本特許出願第６２−１０６０２８号には、安定剤としての緩衝液が開示されている。欧州特許出願第０ ３０２ ７５４号では、好ましくは１〜１０重量％の濃度の糖およびアミノ酸がトロンビン溶液の安定剤として提案されている。
【０００４】  さらにドイツ特許公開明細書第３１ ２２ ９２６号には、トロンビン溶液を製造するために、塩化ナトリウムのほかに、３〜６個の炭素原子を有する多価アルコール、硫黄を含まないアミノ酸およびポリエチレングリコールを用いた、貯蔵可能なトロンビン製剤が開示されている。最後に、欧州特許出願第０ ２２１ ７００号には、５〜８のpHで緩衝されたトロンビン製剤が記載されており、これは適切な場合は塩化ナトリウムおよびポリヒドロキシ化合物を含有していてもよい。
【０００５】  緩衝され安定化されたトロンビン溶液は、J. Chabbatらによる刊行物［J. Chabbat, M. Tellier, P. PorteおよびM. Steinbuch; Properties of a new fibrin glue stable in liquid state（液体状態で安定な新しいフィブリン膠質の特性）、Thromb. Res. 7：525-533(1994)］にも開示されている。
【０００６】  加えて、D.V. Brezniak, H.I. HassounaおよびJ.W. Fenton IIによる刊行物［Blood Coagulation and Fibrinolysis（血液凝固およびフィブリン溶解）、6, 847-848(1994)］には、希薄α−トロンビン溶液の安定性に対する塩の効果が既に記載されている。この研究では、０．３モル／リットル以上の塩化ナトリウム濃度が希薄トロンビン溶液に対して顕著な安定化効果を有することが示された。トロンビンは塩化ナトリウム含有溶液中で３７℃において約２週間安定であり、従ってこの安定性は塩化カルシウム含有溶液よりも高く、このことは、おそらく変性に関してより良好な熱安定性によって説明できるであろうと述べられている。
【０００７】  また、多数の特許出願に、高純度トロンビン製剤の製造方法が記載されている。このように、欧州特許出願第０ ４３９ １５６号には、止血のために使用可能な、１６００ Ｕ／ｍｇより高い比活性を有する精製トロンビンの製造方法が開示されている。この方法は、トロンビンを活性化するためのトロンボプラスチンの使用、およびアガロースに基づく支持体材料を用いる陰イオン交換クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィーの使用を伴う。約８０００〜１１,０００ NIH Ｕ／mgの比活性を有する「超純粋な」無色透明のウシトロンビンが米国特許第５ ３９７ ７０４号に記載されている。ここでは、ウシ肺からのトロンボプラスチンがプロトロンビンの活性化のために用いられ、このタンパク質の精製のために陰イオン交換クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマトグラフィーが用いられる。
【０００８】  しかしながら、今日まで開示されたどの方法も、液体状態において０℃以上の温度で安定であり、トロンビン活性が１２か月以上後に最初のレベルのなお７０〜８０％を越える、カルシウムイオンを含有するウイルス安全性の精製トロンビン製剤の製造を可能にしていない。それ故に、本発明の目的は、このようなトロンビン製剤を製造する方法を開発することであり、その意図は、生成物の安全性の理由で、プロトロンビンを活性化するためにトロンボプラスチンを使用しないで済ませることである。追加の目的は、添加される安定剤としてのポリオールの高濃度が製剤の粘度を望ましくなく上昇させるので、この高濃度を回避することであった。
【０００９】  この目的は、血漿または血漿画分から得られるプロトロンビンを、トロンボプラスチンを添加することなくトロンビンに活性した後、および適切な場合はさらなる処理工程の後、疎水性相互作用クロマトグラフィーにより精製し、次いで適切な場合はウイルスを不活性化または除去することによるトロンビン製剤の製造方法によって達成されることが見出された。
【００１０】  この方法のさらなる改善は、疎水性相互作用クロマトグラフィーの前または後に陽イオン交換クロマトグラフィーを追加して行う場合に可能である。この場合、これらのクロマトグラフィーは「正の」（トロンビンの結合）または「負の」（不純物の結合）クロマトグラフィーとして行うことができる。
【００１１】  液体状態における高いトロンビン安定性を達成するためには、用いられるトロンビン溶液の充分な純度が必要なので、高いウイルス安全性を有する高純度トロンビンを用いる簡単で改善された方法が求められた。例えば欧州特許出願第０ ５４３ １７８号に記載されたトロンビン濃縮物の製造方法を基礎として用いることが可能である。しかしながら、本発明によれば、部分的に精製されたプロトロンビンをカルシウム塩の存在下にトロンビンに活性化する他の方法を、トロンビン製剤を製造するための出発材料として用いることもできる。
【００１２】  トロンビンを精製するために疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を単独でまたは陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＣ）と組み合わせて用いるならば、これによって効果的かつ簡単な精製が達成される。さらに、これら二つのクロマトグラフィーの順序が望ましい。クロマトグラフィーを最初に疎水性支持体を用いて行うならば、トロンビン溶離物を直接に陽イオン交換体に結合させ、塩勾配を用いてそれから溶離することができる。これら二つの分離原理の組み合わせば、二つの精製工程にわたり約７０％を越える良好な収率で高純度のトロンビン製剤をもたらす。これによって、活性化または未活性化の凝固因子のような副生成物、および凝固試験で殆どまたは全く活性を示さないトロンビン形態（例えばプロトロンビン、β−トロンビン、γ−トロンビン、または他のトロンビンまたはプロトロンビン断片）の良好な除去が同時に達成される。上記の二つのクロマトグラフィーの組み合わせは、イオン交換クロマトグラフィー方法を単独で用いた場合よりも高い純度をもたらす。
【００１３】  本発明の製造方法は、最初に低純度または中程度の純度のトロンビンを製造するような手段で行われる。これは、血漿または血漿面分からのプロトロンビンをイオン交換体上に吸着させることによって行うことができる。次いで、このようにして得られたプロトロンビンを、例えば低温滅菌法または他の公知の方法、および適切な場合はさらなる処理工程によるウイルスの不活性化に付することができ、動物組織から得られたトロンボプラスチンを添加することなく、それ自体公知の方法によりトロンビンを活性化することができる。次いで、後続の疎水性相互作用クロマトグラフィーは、狭雑している血漿タンパク質、活性化された因子またはそれらの断片、およびトロンビン分解生成物の濃度を低下させる。この精製効果は後続の陽イオン交換クロマトグラフィーによってさらに高められる。
【００１４】  純粋なトロンビンの溶離に続いて、好適な緩衝物質の添加により製剤のpHを５〜８の範囲に調節し、安定剤を添加する。緩衝物質および安定剤を一緒に添加することも可能である。
【００１５】  クロマトグラフィー法としてそれ自体公知である疎水性相互作用クロマトグラフィーに用いられる吸着剤は、結合した疎水性基を有するゲルである。この場合に特に好適な疎水性基は、フェニル基または同様の疎水性を有する他のリガンドである。好ましく用いられる陽イオン交換体は、種々のトロンビン変異体に対して高い分離能を有するゲルである。好適な陽イオン交換ゲルの例は、Fractogel EMD SO3(Merck, Darmstadt)、Macro Prep 50S (Biorad, Munich)、または精製および滅菌可能性に関する必要条件を満たす他の陽イオン交換体である。
【００１６】  次いで、クロマトグラフィー精製後に得られたトロンビン溶液を直接に、ウイルスの不活性化に付するか、または最小のウイルスでさえも効果的な除去を可能にする一方で高収率のトロンビンが得られる、例えば小孔膜を通すろ過のようなウイルスの削減に付することができる。しかしながら、ウイルスの不活性化または削減は、トロンビンのクロマトグラフィー精製の前に行うこともできる。これは、この順序が方法全体を容易にする場合である（例えば後続のクロマトグラフィーにおいて好ましくない成分または副生成物を除去することによる）。
【００１７】  組織膠質中で用いられるか、または単独で局所止血剤として用いられる、液体状態および適切な場合は凍結状態で安定かつ貯蔵可能な成分としてトロンビン製剤を処方するためには、緩衝剤を用いて約５．０〜８．０のpHに調節すべきである。次いで、使用および安定化に対して所望の効果を達成するために、可溶性カルシウム塩、塩化ナトリウム、糖または純アルコールおよび／またはアミノ酸、そうでなければモノ−またはポリカルボン酸の塩および／またはモノ−またはポリヒドロキシカルボン酸の塩を製剤に添加する。これは液体状態および／または凍結状態で１２か月以上の貯蔵時間、良好な安定性をもたらす。
【００１８】  トロンビン活性をインビトロで非共有結合的に阻害する物質を添加すると、特に室温において、トロンビンの自己溶解を減少させることにより、表面的だけでも安定性をいっそう高めうることも明らかになった。この目的に好適な物質は、ベンズアミジンまたはｐ−アミノベンズアミジンのような化合物、または低親和性ないし中親和性の他のプロテアーゼ阻害剤である。これらの低親和性ないし中親和性のプロテアーゼ阻害剤の添加は、フィブリノゲンのような物質に関するトロンビンの活性を、従って例えば組織膠質の成分としての後の使用をも、無視しうるほどしか損なわない。
【００１９】  本発明の方法によれば、液体状態および／または凍結状態で数か月または数年間貯蔵可能であり、かつ、この期間中に活性が７０〜８０％以下には低下しないトロンビン製剤を製造することができる。
【００２０】  本発明の方法を用いると、トロンビンの熱安定性を低下させるカルシウム塩[B.H. Landis, K.A. KoehlerおよびJ.W. Fenton II; Human Thrombins. J Biol chem 256; 4604-4610(1981)]の存在下でさえも、凝固試験で実証できるように、４℃で２４か月以上までの間の高い安定性をもたらすトロンビン製剤を製造することが可能である。表４に示すトロンビン製剤の多くは凍結状態においても安定であり、大部分の場合、室温で３〜６か月間の安定性を示す。室温における安定性は、特に、例えばベンズアミジン、ｐ−アミノベンズアミジンまたは他のプロテアーゼまたはトロンビン阻害剤のような低親和性ないし中親和性のトロンビン阻害剤によって高めることができ、これは凝固試験においてフィブリノゲンに関する有意な活性低下を伴わない。
【００２１】  本明細書に記載した方法により製造されたトロンビン製剤は、特にドイツ特許出願第１９８ ５３ ０３３．１号に記載されているように、２成分、例えばトロンビン含有成分およびフィブリノゲン含有成分からなるか、あるいは３成分、例えばトロンビン含有成分、フィブリノゲン含有成分および因子XIII含有成分からなる液体状態または凍結状態で貯蔵可能な、特にフィブリン膠質の成分として用いることができる。さらに、このようにして製造されたトロンビン製剤を他の成分とその場で混合するか、あるいは３成分フィブリン膠質の場合は、第三成分を添加する前にこれらの成分の一つと予め混合することも可能である。しかしながら、治療目的のために本発明の方法を用いて凍結乾燥トロンビン製剤を製造することも可能であり、この場合、再構成後の液体状態で同様に高い安定性が観察される。
【００２２】  最後に、本発明により製造されたトロンビン濃縮物は、単独でまたは担体と組み合わせて、出血を局所的に止めるための物質として使用することもできる。
本発明の方法を以下の実施例によって、より詳細に説明する。
【実施例】
【００２３】実施例１：トロンビンの精製
公知の方法により製造された低純度ないし中純度のトロンビン濃縮物から出発して、二つのクロマトグラフィー工程を行った。
最初に、トロンビン溶液を０．６モル／リットルの硫酸ナトリウムと混合し、０．６モル／リットルの硫酸ナトリウムを含有する緩衝液Ａ（１０ミリモル／リットルのリン酸Ｎａ、pH６．５）で予め平衡化した疎水性クロマトグラフィーゲル（この場合：Phenyl-Sepharose HP、製造業者：Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany）に吸着させた。０．６モル／リットルの硫酸ナトリウムを含有する緩衝液Ａで洗浄した後、緩衝液Ａ中の硫酸ナトリウム含有量の低下勾配により、結合したトロンビンを溶離した。不純物およびトロンビン断片の大部分は流通画分または洗浄画分中に除去された。【００２４】  このトロンビン画分を、さらに処理することなく直接に、緩衝液Ａで平衡化した陽イオン交換カラム（この場合：Fractogel（登録商標）EMD SO3、製造業者：Merck, Darmstadt, Germany）に負荷し、平衡緩衝液Ａで洗浄し、緩衝液Ａ中の０〜１．０モル／リットルの塩化ナトリウムの勾配により溶離した。分離する間に、得られるα−トロンビン溶離物が約３５００ IU／mgの高い比純度［２８０nmにおける吸収を測定し、J.W. Fenton, II, M.J. Fasco, A.B. Stackrow, D.L. Aronson, A.M. YoungおよびJ.S. Finlayson, Human Thrombins. J Biol Chem 252; 3587-3598(1977)に従い、０．１％濃度の溶液について１．７４の換算係数を用いてタンパク質を決定］を有するように、最終的な副生成物およびトロンビン断片を除去した。表１に、このトロンビン精製の結果および得られた比活性を示す。【００２５】  この段階で、トロンビンをさらに処理するまで冷却状態または急速凍結状態で貯蔵することができる。
【表１】
0005577005.tif 000002
【００２６】実施例２：トロンビンの精製
中程度の純度または低純度のトロンビン濃縮物から出発して、二つのクロマトグラフィー工程を行った。最初に、トロンビン溶液を０．６モル／リットルの硫酸ナトリウムと混合し、０．６モル／リットルの硫酸ナトリウムを含有する緩衝液Ｂ（１０ミリモル／リットルのリン酸Ｎａ、０．１％のＰＥＧ、pH６．５；［この場合はＰＥＧ  ６０００であるが、他の分子量範囲も使用できる］）で予め平衡化した疎水性クロマトグラフィーゲル（この場合：Phenyl-Sepharose HP、製造業者：Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany）に吸着させた。０．６モル／リットルの硫酸ナトリウムを含有する緩衝液Ｂで洗浄した後、緩衝液Ｂ中の硫酸ナトリウム含有量の低下勾配により、結合したトロンビンを溶離した。不純物およびトロンビン断片の大部分は流通面分または洗浄画分中に除去された。【００２７】  このトロンビン画分を、さらに処理することなく直接に、緩衝液Ｃ（１０ミリモル／リットルのリン酸Ｎａ、１６６ミリモル／リットルのＬ−アルギニン、pH６．５）で平衡化した陽イオン交換カラム（この場合：Fractogel（登録商標）EMD SO3、製造業者：Merck, Darmstadt, Germany）に負荷し、平衡化緩衝液Ｃで洗浄し、緩衝液Ｃ中の０〜１．０モル／リットルの塩化ナトリウムの勾配により溶離した。分離する間に、得られるα−トロンビン溶離物が約３３００ IU／mgの高い比純度を有するように、最終的な副生成物およびトロンビン断片を除去した（表２参照）。【００２８】  この段階で、得られたトロンビンをさらに処理するまで冷却状態または急速凍結状態で貯蔵することができる。
【表２】
0005577005.tif 000003
【００２９】実施例３：トロンビンの精製
トロンビンの精製を実施例１と同様にして行ったが、相違点は、クロマトグラフィーに用いた緩衝液がリン酸ナトリウムの代わりに２０ミリモル／リットルのＬ−ヒスチジンを含有していたことであった。この改変を用いた精製の結果は実施例１に匹敵するが、この場合、例えばヒスチジンを緩衝物質として存在させようとするときに、最終生成物へのさらなる処理過程を単純化することができる。【００３０】実施例４：トロンビンの精製およびろ過
実施例１〜３と同様にして精製された、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーの後のトロンビン溶離物から出発して、小さい孔径を有する膜（例えばPlanovaTM、15nm）上でろ過を行った。パルボウイルスのような小さいウイルスでさえも、この膜で効果的に除去することができる。この精製トロンビンを出発材料として用いると、トロンビン活性およびタンパク質に関して極めて良好な収率が良好なろ過速度で得られることが認められた（表３参照）。従って、この方法は高いウイルス削減率でトロンビン濃縮物を製造するのに適している。
【表３】
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【００３１】実施例５：トロンビン処方物
クロマトグラフィーにより精製したトロンビンから出発して、種々の処方物を製造し、−２０℃、４℃、２０〜２５℃、および幾つかの場合には３７℃で貯蔵した。これらのトロンビン溶液は、精製トロンビン濃縮物を処方緩衝液に対してダイアフィルトレーションすることにより、または塩基性緩衝液に対してダイアフィルトレーションし、残余の添加剤を添加し、pHを調節し、トロンビン濃度を調節することにより製造された。このようにして約１〜約１５，０００ IU／mlのトロンビン濃縮物を得ることができる。【００３２】  フィブリノゲンを基質として用いた凝固試験でトロンビン活性を測定することにより、処方物の安定性を試験した。表４に本発明の処方物の選択およびそれらの安定剤組成を示し、表５に三つまでの温度における相当する安定性データを示す。【００３３】
【表４】
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【００３４】
【表５】
0005577005.tif 000006
【００３５】
【表６】
0005577005.tif 000007
【００３６】
【表７】
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