(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被分析対象プロテアーゼを含有する試料を、当該プロテアーゼが速やかに失活するｐＨ条件にした後、当該試料を電気泳動に付すことを特徴とする、プロテアーゼ含有試料の電気泳動分析方法。
【請求項２】
前記プロテアーゼが速やかに失活するｐＨ条件が、当該プロテアーゼの至適ｐＨから３以上離れたｐＨ条件である請求項１記載の分析方法。
【請求項３】
前記プロテアーゼが中性プロテアーゼの場合、当該プロテアーゼが速やかに失活するｐＨ条件がｐＨ０．１〜３又はｐＨ１１〜１４であり；前記プロテアーゼが酸性プロテアーゼの場合、当該プロテアーゼが速やかに失活するｐＨ条件がｐＨ１０〜１４であり；前記プロテアーゼがアルカリプロテアーゼの場合、当該プロテアーゼが速やかに失活するｐＨ条件が０．１〜４である請求項１又は２記載の分析方法。
【請求項４】
前記プロテアーゼが中性金属プロテアーゼであり、当該プロテアーゼが速やかに失活するｐＨ条件がｐＨ０．７〜２．０又は１２〜１４である請求項１〜３のいずれか１項記載の分析方法。
【請求項５】
プロテアーゼの純度を分析するものである請求項１〜４のいずれか１項記載の分析方法。
【請求項６】
電気泳動が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又はキャピラリー電気泳動である請求項１〜５のいずれか１項記載の分析方法。
【請求項７】
前記プロテアーゼが、（１）ペニバチルス属に属する細菌により産生され、（２）中性範囲でカゼイン、ヘモグロビンを分解し、（３）至適ｐＨは７．０〜８．０であり、ｐＨ５．５〜９．０で安定であり、（４）２０〜７５℃で作用し、至適温度が５５℃であり、（５）電気泳動法による分子量が３２，０００〜３４，０００Ｄａと推定されるプロテアーゼであり、当該プロテアーゼが速やかに失活するｐＨ条件がｐＨ０．７〜２．０又は１２〜１４である請求項１〜６のいずれか１項記載の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、プロテアーゼの純度を正確に測定することができる電気泳動分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
動物細胞を扱う分野において培養細胞の酵素処理が広く行われている。特に酵素を用いることで、基底膜を構成する細胞外マトリクスなどを温和な条件で分解することができるために、培養細胞の植え継ぎなどでは、欠かすことができないものとなっている。ここで用いられる酵素は、トリプシン、コラゲナーゼなどのプロテアーゼや、ヒアルロニダーゼのような多糖分解酵素がよく知られている。【０００３】
バシロライシンは、微生物特にバチルス属及び近縁属細菌の生産する中性金属プロテアーゼである。バシロライシンの一種であるプロテアーゼが、微生物Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｙｘａ（１９９４年からＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ属に属名変更）の培養液中より見出された。このプロテアーゼは、トリプシンやコラゲナーゼとは、異なった分解作用を示すことが認められ、たとえば、他の酵素ではよく分散できない細胞塊を、細胞自体に損傷を与えることなく単細胞に分散させることができる。また、血清中で阻害されないという性質を利用して、接着性の細胞を浮遊系で培養するのに用いるなど、様々な分野で利用されている（特許文献１、２）。このプロテアーゼは、合同酒精株式会社からディスパーゼ（登録商標）の名称で販売され、世界中で広く使用されている。【０００４】
現在、皮膚組織から分離した上皮細胞を培養してシート状で取り出す場合や、膵臓からインスリン産生細胞を取り出す場合など再生医療関連分野において、このプロテアーゼ（ディスパーゼ）は最も汎用されている。さらに、以上のようなラボ、工業用途だけでなく、医療用として特に眼科領域において、増殖性網膜症の外科手術における硝子体除去時の補助的用途や、糖尿病性白内障の予防療法など、バシロライシンを医薬品として利用する検討が進められている（非特許文献１）。【０００５】
酵素は、比較的古くより医薬品として利用されてきたが、当初は消化促進剤として、プロテアーゼやアミラーゼ、リパーゼ等が利用されるに過ぎなかった。これらは、経口投与されることが多く、これまで純度が問題になることはほとんどなかった。しかし、代謝異常疾患に対する補填療法や、血液凝固系に関与する酵素群の利用などのように、酵素の非経口投与による治療法が行われるようになり、医薬品としての酵素にアレルギー惹起物質やエンドトキシンの除去など、非経口投与に必要な純度や不純物質の除去が要求されるようになってきた。同時に、予期せぬ副作用を未然に防ぐべく原薬としての酵素タンパク質にも高い純度が求められるようになってきた。【０００６】
従来、タンパク質の純度を分析する方法として、ゲル濾過法が用いられる場合もあるが、ゲル濾過法では、数万の分子量を持つタンパク質に対し数千の分子量差を見分ける分解能に欠ける。一方、電気泳動法は分解能が高く、タンパク質の純度を分析する方法として広く利用されている。特に試料を前もってＳＤＳとともに加熱してＳＤＳ化し、ＳＤＳ存在下で泳動を行なうＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）は、同様に界面活性剤下で泳動を行なうキャピラリー電気泳動法とともに、精製されたタンパク質の純度を分析できる優れた方法である（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特公昭５６−５１７４７号公報
【特許文献２】特公昭５７−１４８３６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｔｅｚｅｌ  ＴＨら，Ｒｅｔｉｎａ，１９９８；１８（１）
【非特許文献２】Ｌａｅｍｍｌｉら，Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５（１９７０）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、前記のプロテアーゼ（ディスパーゼ）のような中性金属プロテアーゼを対象としてＳＤＳ処理を伴う電気泳動分析を行ったところ、多数のバンドが検出されてしまうことが判明した。また、この多数のバンドの発生は、高温条件下や市販のプロテアーゼ阻害剤の添加によっては全く防止できないことが判明した。従って、このプロテアーゼが含まれる試料中の純度を測定することはできず、さらに精製したプロテアーゼがどの程度の純度に達しているかは全く不明であった。
本発明は、種々のプロテアーゼを電気泳動により正確に分析できる手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
そこで、本発明者は、プロテアーゼのＳＤＳ処理中の分解を防止すべく種々の検討を行った。まず、プロテアーゼの自己分解を防止すべく、グアニジン、尿素などのタンパク質変性剤を添加したが、やはり分解が観察された。また、前記のプロテアーゼが金属プロテアーゼであることから、金属キレート剤の添加も検討したが、活性は即座に停止することはなく、徐々に不活性化することが観察され、活性を残存する酵素が、自己分解に携わることにより、結果的に本来の純度が反映されないことが判明した。そこでさらに検討したところ、強酸性や強塩基にすると、化学的に加水分解が進行するので、正確な分析はできないと考えられていたにもかかわらず、全く意外にも、そのプロテアーゼが速やかに失活するｐＨに調整し、その後に電気泳動に付すと、自己分解が抑制され、かつ酸や塩基による化学的加水分解も抑制でき、プロテアーゼの主バンドが観察され、正確な純度測定が可能になることを見出した。また、前記のプロテアーゼ(ディスパーゼ)については、初めてその純度が確認でき、純度９２％以上の高純度のものが初めて得られた。【００１１】
すなわち、本発明は、被分析対象プロテアーゼを含有する試料を、当該プロテアーゼが速やかに失活するｐＨ条件にした後、当該試料を電気泳動に付すことを特徴とする、プロテアーゼ含有試料の電気泳動分析方法を提供するものである。【００１２】
また、本発明は、上記の分析方法により９２％以上の純度を有することが確認された、（１）ペニバチルス属に属する細菌により産生され、（２）中性範囲でカゼイン、ヘモグロビンを分解し、（３）至適ｐＨは７．０〜８．０であり、ｐＨ５．５〜９．０で安定であり、（４）２０〜７５℃で作用し、至適温度が５５℃であり、（５）電気泳動法による分子量が３２，０００〜３４，０００Ｄａと推定されるプロテアーゼを提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によるｐＨ条件での処理後に電気泳動を行なうことで、自己分解を起こしやすいプロテアーゼの本来の純度が明確になった。特に、前記特定のプロテアーゼでは、本発明によりはじめて純度算出が可能となった。純度が９２％以上、特に９５％以上に精製されたこのプロテアーゼは、医薬用途に有用であり、副作用が少ない医薬品となりうる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ディスパーゼＩの従来法によるＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図２】ディスパーゼＩのＨＰＬＣゲルろ過カラムクロマトを示す。
【図３】精製酵素のＨＰＬＣゲルろ過カラムクロマトを示す。
【図４】ディスパーゼＩ及び精製酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図５】ＥＤＴＡ、金属、変性剤がＳＤＳ−ＰＡＧＥに及ぼす影響を示す。
【図６】ＥＤＴＡ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥに及ぼす影響を示す。
【図７】酸処理がＳＤＳ−ＰＡＧＥに及ぼす影響を示す。
【図８】酸の種類がＳＤＳ−ＰＡＧＥに及ぼす影響を示す。
【図９】酸処理後ｐＨを変化させた場合のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図１０】アルカリによるサンプル処理後のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図１１】ＴＣＡ処理と硫酸処理の比較を示す。
【図１２】各精製段階のプロテアーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【図１３】キャピラリー電気泳動の結果を示す。
【図１４】本発明の前処理後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる純度確認（左：ディスパーゼＩ、右：精製酵素）結果を示す。
【図１５】各種プロテアーゼの分析（前処理法の比較）結果を示す。
【図１６】Ｄ−プロテアーゼの至適ｐＨを示す。
【図１７】Ｄ−プロテアーゼのｐＨ安定性を示す。
【図１８】Ｄ−プロテアーゼの至適温度を示す。
【図１９】Ｄ−プロテアーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の電気泳動分析法は、被分析対象プロテアーゼを含有する試料を、当該プロテアーゼが速やかに失活するｐＨ条件にした後は、当該試料を電気泳動分析に付すことを特徴とする。
被分析対象プロテアーゼとしては、プロテアーゼであれば特に限定されず、酸性プロテアーゼ、中性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼのいずれも用いることができる。
【００１６】
被分析対象プロテアーゼの具体例としては、キモトリプシン（至適ｐＨ７．８）、トリプシン（至適ｐＨ８．０）、サチライシン（至適ｐＨ７〜１０．５）、プロテアーゼＫ（至適ｐＨ７．５〜１２）等のセリンプロテアーゼ；パパイン（至適ｐＨ６〜７．５）等のシステインプロテアーゼ；ペプシン（至適ｐＨ２〜３）等のアスパラギンプロテアーゼ；サーモライシン（至適ｐＨ７）、ＢＮＰ（至適ｐＨ７．０〜８．０）等のメタロプロテアーゼ等が挙げられる。これらのうち至適ｐＨが中性付近にある中性プロテアーゼが好ましく、中性金属プロテアーゼがより好ましく、前記特許文献１に記載されたプロテアーゼ（以下、Ｄプロテアーゼという）が特に好ましい。
【００１７】
本発明の被分析対象プロテアーゼを含有する試料としては、微生物等の細胞培養液から常法によりプロテアーゼを製造する過程における純度が不明のプロテアーゼ含有試料、精製した純度が不明のプロテアーゼ含有試料、被分析プロテアーゼと他のタンパク質とを含有する試料、純度の不明な市販のプロテアーゼ等を用いることができる。培養液からの精製手段としては吸着、溶剤分画、硫安分画、クロマトグラフィー、結晶化等を挙げることができる。市販のプロテアーゼとしては、前記の各種プロテアーゼ、ディスパーゼＩ、ディスパーゼII（登録商標）などが挙げられる。
【００１８】
本発明においては、被分析対象プロテアーゼを含有する試料を、当該プロテアーゼが速やかに失活するｐＨ条件にする。プロテアーゼが速やかに失活するｐＨとは、プロテアーゼ活性が１分以内に失われるｐＨをいい、特にプロテアーゼ活性が１０秒以内に失われるｐＨが好ましい。そのようなｐＨ条件は、通常、当該プロテアーゼの至適ｐＨから３以上離れたｐＨ条件であるのが好ましく、さらに至適ｐＨから４以上離れたｐＨ条件であるのが好ましい。
【００１９】
より好ましいプロテアーゼが速やかに失活するｐＨ条件は、当該プロテアーゼが中性プロテアーゼの場合には、ｐＨ０．１〜３又はｐＨ１１〜１４が好ましく、さらにｐＨ０．１〜２．０、又は１２〜１４が好ましい。当該プロテアーゼが酸性プロテアーゼの場合には、ｐＨ１０〜１４が好ましく、さらにｐＨ１１〜１４が好ましい。当該プロテアーゼがアルカリプロテアーゼの場合には、ｐＨ０．１〜４が好ましく、さらにｐＨ０．１〜３が好ましい。
【００２０】
プロテアーゼがＤプロテアーゼの場合には、ｐＨ０．７〜２．０に調整するのが好ましい。ｐＨ０．７未満では、プロテアーゼの化学的加水分解が生じ、一方ｐＨ２．０を超えると自己分解を抑制できない。より好ましいｐＨは、０．９〜１．９であり、特に好ましくは１．５〜１．９である。
【００２１】
ｐＨの調整には、酸又はアルカリをプロテアーゼ含有試料に添加すればよい。このような酸としては、硫酸、塩酸、リン酸、硝酸、トリクロロ酢酸等が挙げられる。またアルカリとしては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、水酸化リチウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム等が挙げられる。
【００２２】
このようなｐＨ条件とする時間及び温度は、対象プロテアーゼが失活し、かつ化学的加水分解を生じない条件であればよく、例えば２５℃で、１〜３０分とするのが好ましく、さらに２５℃で１〜１０分とするのが好ましい。
【００２３】
被分析対象プロテアーゼ含有試料は、前記ｐＨ処理によりその活性が失なわれているので、当該ｐＨ処理後は、そのまま電気泳動に付してもよいし、ｐＨを中性付近やアルカリ性として電気泳動に付してもよい。すなわち、電気泳動装置に供する際のｐＨは特に制限されない。
【００２４】
その後、被分析対象プロテアーゼ含有試料は、常法により電気泳動に付せばよい。電気泳動手段としては、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、キャピラリー電気泳動、ネイティブＰＡＧＥ、等電点電気泳動が挙げられる。例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの場合、当該プロテアーゼ含有試料を、ＳＤＳ、メルカプトエタノール、ブロムフェノールブルー色素を含むサンプル処理液に等量で混合後、ＰＡＧＥに供せばよい。なお、前記Ｄプロテアーゼ含有試料を用いる場合には、ＳＤＳ化段階において煮沸を必要としない。逆に、ｐＨ０．７〜２．０の試料を煮沸するとプロテアーゼが分解する可能性がある。従って、ＳＤＳ化は、１０〜３０℃で行うのが好ましい。
【００２５】
またキャピラリー電気泳動の場合、前記ｐＨ処理したプロテアーゼ含有試料を、各装置に示されたサンプル処理液（Ｅｘｐｅｒｉｏｎ  プロ２６０  分析キット  Ｂｉｏｒａｄ社製等）を添加し、キャピラリー電気泳動装置（Ｅｘｐｅｒｉｏｎ  全自動チップ電気泳動装置ＢｉｏＲａｄ社製等）に供すればよい。
【００２６】
泳動後の分析手段は、例えばゲル上の色素を検出すればよく、例えばデンシトメーター等により純度を数値化することもできる。またキャピラリー電気泳動を用いても、純度の算出が可能である。
【００２７】
本発明方法によれば、種々のプロテアーゼ、特にＤプロテアーゼの純度を電気泳動法により正確に測定することができる。従って、本発明方法を用いれば、従来入手不可能であった、９２％以上の純度を有するＤプロテアーゼが確認できる。本発明方法により純度が９２％以上、さらに９５％以上、さらに９８％以上、特に９９％以上であることが確認されたＤプロテアーゼは、特に医薬品として用いることができる。
【００２８】
ここで、Ｄプロテアーゼは、特許文献１には、次の性質を有することが記載されている。（１）バチルス・ポリミキサに属する細菌により産生され、（２）中性範囲でカゼイン、ヘモグロビンを分解し、（３）至適ｐＨは８．５であり、ｐＨ４．０〜９．０で安定であり、（４）２０〜７５℃で作用し、至適温度が６０℃であり、（５）Ｃａ2+、Ｍｎ2+、Ｍｇ2+、Ｆｅ2+、Ｆｅ3+、Ａｌ3+で活性が増強し、（６）超遠心法による分子量が３５９００Ｄａであるプロテアーゼである。
ところが、今回本発明者がＤプロテアーゼの性質を再検討したところ、以下の性質を有していることが判明した。（１）ペニバチルス属に属する細菌により産生され、（２）中性範囲でカゼイン、ヘモグロビンを分解し、（３）至適ｐＨは７．０〜８．０であり、（４）ｐＨ５．５〜９．０で安定であり、（４）２０〜７５℃で作用し、至適温度が５５℃であり、（５）電気泳動法による分子量が３２，０００〜３４，０００Ｄａと推定される。なお、バチルス・ポリミキサは現在、ペニバチルス・ポリミキサに種名が変更されている。
【００２９】
さらに、Ｄプロテアーゼは、詳細には、次の性質を有する。
（１）作用
中性プロテアーゼとしての一般的性質を示し、ｐＨの中性範囲でカゼイン、ヘモグロビンなどの蛋白質を分解してペプチド乃至遊離のアミノ酸を生成する。
酸化インシュリンのＢ鎖に対してはＰｈａ（１）−Ｖａｌ（２）、Ｈｉｓ（５）−Ｌｅｕ（６）、Ｈｉｓ（１０）−Ｌｅｕ（１１）、Ｇｌｕ（１３）−Ａｌａ（１４）、Ａｌａ（１４）−Ｌｅｒ（１５）、Ｌｅｒ（１５）−Ｔｙｒ（１６）、Ｔｙｒ（１６）−Ｌｅｕ（１７）、Ｌｅｕ（１７）−Ｖａｌ（１８）、Ｇｌｙ（２３）−Ｐｈｅ（２４）、Ｐｈｅ（２４）−Ｐｈｅ（２５）、Ｐｈｅ（２５）−Ｔｙｒ（２６）及びＬｙｓ（２９）−Ａｌａ（３０）の１２ヶ所のペプチド結合を切断することが確認されている。
（２）基質特異性
カゼインに対し、温和な蛋白分解作用を示す。
（３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲
イ  至適ｐＨ：カゼインに対する蛋白分解作用の至適ｐＨは、７．０〜８．０である。
ロ  安定のｐＨ範囲：５．５〜９．０の範囲で極めて安定である。
（４）作用適温の範囲
２０℃〜７５℃の範囲で作用し、至適温度は５５℃である。
（５）ｐＨ、温度などによる失活の条件
ｐＨ３．０以下及びｐＨ１０．０以上では、活性は完全になくなる。また、６５℃、１０分間の加熱処理により、完全に失活する。
（６）阻害、活性化及び安定化
エチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）、クエン酸、０−フェナンスロリン、２，２−ジピリジル、フッ化ソーダのごとき、金属キレート剤、及びＮ−ブロモサクシニイミド（ＮＢＳ）、沃素のごとき酸化剤によって阻害される。
カルシウムイオンにより安定化され、活性には亜鉛イオンが必要である。
（７）分子量
電気泳動法による分子量は、３２，０００〜３４，０００Ｄａと推定される。
【実施例】
【００３０】
次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する。【００３１】
参考例１（従来の前処理方法を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析）
市販ディスパーゼＩ（合同酒精株式会社製）をタンパク質が１ｍｇ／ｍＬになるように５０ｍＭトリス−２ｍＭ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。この１００μＬに従来の試料前処理液（２５％グリセリン、２．５％ＳＤＳ、０．１２５Ｍ  トリス−塩酸緩衝液ｐＨ６．８、２メルカプトエタノール２．５％及びブロムフェノールブルー適量を含む）１００μＬを加えた。試料は２本用意し、片方は３分間煮沸した。
以上のように処理した試料を１０μＬずつ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％ゲル）に供した。【００３２】
その結果、図１に示したように、従来の前処理方法を使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて、ディスパーゼＩは多数のバンドが検出された。ディスパーゼＩの主成分であるＤプロテアーゼの分子量は３２ｋＤａ〜３４ｋＤａであることが示されたが、当該分子量バンドより分子量の小さい多数のバンドが検出された。また、試料を煮沸しなかったものは、ＳＤＳ化が起こらなかったためか、Ｄプロテアーゼに該当するバンドが検出されなかった。【００３３】
参考例２（精製酵素の従来の前処理方法による分析）
市販ディスパーゼＩ（合同酒精株式会社製）をタンパク質が０．４ｍｇ／ｍＬになるように５０ｍＭトリス−２ｍＭ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した。この２００ｍＬをあらかじめ５０ｍＭトリス−２ｍＭ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化しておいた陰イオン交換樹脂ＴＳＫ  ＧＥＬ  ＤＥＡＥ  ６５０Ｍカラム（３×２０ｃｍ）に吸着し、０．１Ｍ食塩を含む５０ｍＭトリス−２ｍＭ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ８．０）によりリニアグラジエントで溶出した。クロマト操作は４℃付近で行った。Ｄプロテアーゼの溶出画分を集め、ＵＦ膜（旭化成株式会社製ＡＩＰ）により濃縮し、５０ｍＭトリス−２ｍＭ酢酸カルシウム緩衝液を用いて、脱塩を行ない、結晶を析出させた。本結晶を精製酵素とした。
精製酵素をタンパク質が１ｍｇ／ｍＬとなるように５０ｍＭトリス−２ｍＭ酢酸カルシウム緩衝液（０．２Ｍ食塩を含む、ｐＨ７．５）に溶解し、ゲル濾過ＨＰＬＣ（Ｇ２０００ＳＷＸＬ  ＴＯＳＯＨ製）に供したところ、保持時間１８〜２０分にＤプロテアーゼのピークが検出された。このピークは別途分子量マーカーとの比較によると分子量３０ｋＤａ〜４０ｋＤａであることが推定された。
上記ゲル濾過ＨＰＬＣ用に溶解した試料に、従来の試料前処理液（２５％グリセリン、２．５％ＳＤＳ、０．１２５Ｍ  トリス−塩酸緩衝液ｐＨ６．８、２メルカプトエタノール２．５％及びブロムフェノールブルー適量を含む）１００μＬを加え３分間煮沸した。
こうして処理した試料を１０μＬずつ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％ゲル）に供した。【００３４】
その結果、図２〜図４に示したように、ＤＥＡＥカラムで精製したＤプロテアーゼについても、当該分子量バンドより分子量の小さい多数のバンドが検出された。このことは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法の過程においてＤプロテアーゼが分解していることを示す。特に電気泳動の前処理に原因があると推察された。【００３５】
参考例３（ＥＤＴＡ、金属、タンパク質変性剤の影響）
Ｄプロテアーゼはカルシウム、亜鉛を含む金属プロテアーゼの一種であるので、ＥＤＴＡ等の金属キレート剤及び亜鉛以外の重金属を用いて不活化することで、前処理中の分解が抑制されることを期待した。また、グアニジン、尿素、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ・ｐＨ４．８）などで、たんぱく質を即時に変性させることで、同様に自己による分解が抑制されることを期待した。
市販ディスパーゼＩ（合同酒精株式会社製）をタンパク質が２ｍｇ／ｍＬになるように５０ｍＭトリス−２ｍＭ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。この５０μＬに各濃度のＥＤＴＡあるいは、金属あるいは、タンパク質変性剤５０μＬを添加し、従来の試料の試料前処理液（２５％グリセリン、２．５％ＳＤＳ、０．１２５Ｍ  トリス−塩酸緩衝液ｐＨ６．８、２メルカプトエタノール２．５％及びブロムフェノールブルー適量を含む）１００μＬを加え３分間煮沸した。同様に煮沸しないものも作成した。
こうして処理した試料を１０μＬずつ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％ゲル）に供した。【００３６】
その結果、図５に示したように、煮沸した場合、ＥＤＴＡや金属、タンパク変性剤等では、分解を抑制して本来の純度を反映させることはできなかった。従来法ＳＤＳ−ＰＡＧＥと同程度、又はそれ以上の不純物バンドが検出された。
ただ、煮沸しなかったＥＤＴＡ１０ｍＭサンプルはＤプロテアーゼのバンドが濃く、相対的に不純物バンドが少ない可能性が推察された。【００３７】
参考例４（ＥＤＴＡの効果）
ＥＤＴＡの効果についてさらに検討した。市販ディスパーゼＩ（合同酒精株式会社製）をタンパク質が２ｍｇ／ｍＬになるように５０ｍＭトリス−２ｍＭ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。この５０μＬに各濃度のＥＤＴＡ５０μＬを添加し、従来の試料前処理液（２５％グリセリン、２．５％ＳＤＳ、０．１２５Ｍ  トリス−塩酸緩衝液ｐＨ６．８、２メルカプトエタノール２．５％及びブロムフェノールブルー適量を含む）１００μＬを加えた（煮沸は行なわなかった）。こうして処理した試料を１０μＬずつ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％ゲル）に供した。【００３８】
その結果、図６に示したように、５ｍＭ以上のＥＤＴＡにより不純物バンドの数は減少したが、別途ＥＤＴＡ添加時の残存プロテアーゼ活性を測定したところ、表１に示したようにプロテアーゼ活性を維持していることがわかった。それゆえ、ＥＤＴＡでは、効果的に即座にプロテアーゼ活性を失活させて、本来の純度を反映させるということはできないことが示された。【００３９】
（プロテアーゼ活性の測定方法）
プロテアーゼ活性測定は一般的なカゼイン分解法を用いて行った。すなわち、ＥＤＴＡ添加後の試料を５０ｍＭトリス−２ｍＭ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．５）で適度に希釈し、これを１ｍＬ試験管にとり、３分間３０度に保温した。これにあらかじめ３０℃に保温した０．６％ミルクカゼイン溶液５ｍＬ加え、３０℃で１０分間反応した。沈殿試薬（トリクロル酢酸１８ｇ、酢酸ナトリウム１８ｇ、酢酸１９．８ｇを水で１Ｌとしたもの）５ｍＬを加えて、反応を停止し、しばらく３０℃で沈殿を形成させた後、ろ紙を用いてろ過し、ろ液の２７５ｎｍにおける吸光度を測定した。ブランクは、あらかじめ沈殿試薬で不活化した試料を用いた。【００４０】
結果は、バッファー（ＥＤＴＡ未処理）の場合を１００として相対値で示した。【００４１】
【表１】
0005425930.tif 000002
【００４２】
実施例１（酸による前処理）
Ｄプロテアーゼは中性プロテアーゼであるので、試料処理時のｐＨを酸性にすることで、酵素反応が即時に不活化し、分解が抑制されることを期待した。
市販ディスパーゼＩ（合同酒精株式会社製）をタンパク質が２ｍｇ／ｍＬになるように５０ｍＭトリス−２ｍＭ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。この５０μＬに各濃度の硫酸５０μＬを添加し、従来の試料前処理液（２５％グリセリン、２．５％ＳＤＳ、０．１２５Ｍ  トリス−塩酸緩衝液ｐＨ６．８、２メルカプトエタノール２．５％及びブロムフェノールブルー適量を含む）１００μＬを加えた。また、同様に煮沸したサンプルも作成した。こうして処理した試料を１０μＬずつ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％ゲル）に供した。【００４３】
その結果、図７に示したように、０．０５Ｍ硫酸添加サンプル（ｐＨ１．９）において煮沸したものは、Ｄプロテアーゼバンド（３２ｋＤａ〜３４ｋＤａ）以外に分解物バンドが観察された。一方、０．０５Ｍ〜１．０Ｍ硫酸添加サンプル（ｐＨ０．７〜１．９）において煮沸しなかったものは、Ｄプロテアーゼ（３２ｋＤａ〜３４ｋＤａ）のバンドを示し、またＤプロテアーゼより低分子（３２ｋＤａ未満）に夾雑タンパク質と考えられる複数のバンドが観察された。０．０１Ｍ硫酸添加サンプル（ｐＨ３．７）において煮沸しなかったものは、自己分解が起こったために、Ｄプロテアーゼのバンドが薄く、また、分解物のバンドが顕著に認められた。
すなわち、試料液を前処理として酸性にすることで、その酸性度合いによって分解に差が有ることがわかった。
さらに、この酸性条件においた後ＳＤＳを添加することにより、中性域でＳＤＳを付加する場合に必要な煮沸作業を経ることなく、ＳＤＳ化が進行することが見出された。【００４４】
実施例２（酸の種類による影響）
使用する酸の種類による影響を確認した。市販ディスパーゼＩ（合同酒精株式会社製）をタンパク質が２ｍｇ／ｍＬになるように５０ｍＭトリス−２ｍＭ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。この５０μＬに各種酸５０μＬを添加し、従来の試料前処理液（２５％グリセリン、２．５％ＳＤＳ、０．１２５Ｍ  トリス−塩酸緩衝液ｐＨ６．８、２メルカプトエタノール２．５％及びブロムフェノールブルー適量を含む）１００μＬを加えた。
こうして処理した試料を１０μＬずつ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％ゲル）に供した。【００４５】
その結果、図８に示したように、酢酸を除いて酸の種類を問わず、ｐＨ０．７〜２．０においてＤプロテアーゼ（３２ｋＤａ〜３４ｋＤａ）のバンドを示し、またＤプロテアーゼより低分子領域（３２ｋＤａ未満）に夾雑タンパク質と考えられる複数のバンドが観察された。【００４６】
実施例３（酸処理後ｐＨを中性及びアルカリ性にして電気泳動する）
市販ディスパーゼＩ（合同酒精株式会社製）をタンパク質が２ｍｇ／ｍＬになるように５０ｍＭトリス−２ｍＭ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。この試料０．５ｍＬと等量の０．０５Ｍ  硫酸を混和し、酸処理を施した（このときのｐＨ１．７）。さらにこの試料に、ｐＨを測定しながら０．１Ｍ  水酸化ナトリウムを徐々に加え、ｐＨを中性及びアルカリ性に戻したものを調製した。
各ｐＨの試料５０μＬに等量のサンプル処理液（２５％  グリセリン、５％  ＳＤＳ、ＢＰＢ適量を含む）を加え、よく混和した後、各１０μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％ゲル）に供した。その結果、図９に示したように、酸処理後にｐＨを変化させても、電気泳動結果に違いは見られなかった。【００４７】
実施例４（アルカリ処理（ｐＨ１２付近））
市販ディスパーゼＩ（合同酒精株式会社製）をタンパク質が１ｍｇ／ｍＬになるように蒸留水にて溶解した。この試料５０μＬと等量の水酸化ナトリウム溶液を混和し、アルカリ処理を施した。使用する水酸化ナトリウム溶液の濃度を変化させ、各ｐＨを測定した。
各濃度の水酸化ナトリウム溶液で処理した試料に１００μＬのサンプル処理液（２５％  グリセリン、５％  ＳＤＳ、ＢＰＢ適量を含む）を加え、よく混和した後、各１０μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％ゲル）に供した。その結果、図１０に示すように、アルカリ処理を行っても、酸処理法と同様の電気泳動パターンが得られた。ただし、ｐＨ１２以上の強アルカリの状態にしなかった場合、自己分解物と考えられる不純物バンドが多く見られた。【００４８】
実施例５（ＴＣＡ処理と硫酸処理の比較）
市販ディスパーゼＩ（合同酒精株式会社製）を５ｍｇ／ｍＬになるように蒸留水にて溶解した。また、精製されたＤプロテアーゼを５万ＰＵ／ｍＬ（およそ５ｍｇ／ｍＬ）になるように調製した。この試料０．０５ｍＬと等量の０．１Ｍトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、０．０５Ｍ 硫酸、それぞれを混和して酸処理を行った。この処理は、すべて氷上で冷却した状態で行った。
処理した各試料に０．１ｍＬのサンプル処理液（２５％グリセリン、５％ＳＤＳ、ＢＰＢ適量を含む）を加え、よく混和した後、各１０μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％ゲル）に供した。
その結果、図１１に示すように、ＴＣＡ処理法でも硫酸法でもバンドパターンは、ほぼ同様であった。
また、精製酵素の純度は９８％程度、ディスパーゼＩの純度は９０％程度あることが示された。【００４９】
実施例６（精製酵素の本発明法による分析）
市販ディスパーゼII（粗精製品）、市販ディスパーゼＩ（精製品）及び精製酵素（高度精製品）の溶液に対し、酸を加えた後、従来の試料処理液を加えるという本発明法の効果を確認した。
ディスパーゼＩ、II、及び精製酵素をタンパク質が２ｍｇ／ｍＬになるように５０ｍＭトリス−２ｍＭ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。試料５０μＬに０．０５Ｍ硫酸５０μＬを加えて混合し、次いで従来の試料前処理液（２５％グリセリン、２．５％ＳＤＳ、０．１２５Ｍ  トリス−塩酸緩衝液ｐＨ６．８、２メルカプトエタノール２．５％及びブロムフェノールブルー適量を含む）１００μＬを加えた。比較のために０．０５Ｍ硫酸の代わりに水５０μＬを加え混合し、次いで従来の試料前処理液１００μＬを加え、３分間煮沸したものも作成した。
こうして処理した試料を１０μＬずつ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％ゲル）に供した。【００５０】
その結果、図１２に示すように本発明法による前処理を行なうことで、ディスパーゼＩやディスパーゼIIに含まれるＤプロテアーゼ及び不純物を明瞭に観察することができた。さらに精製酵素では不純物が減少していることを観察することができた。一方、従来法では、試料の精製度合いに関わらず、まったく本来の純度を反映する結果となっておらず、Ｄプロテアーゼのようなプロテアーゼの純度分析には適していないことが確認できた。【００５１】
実施例７（精製酵素の本発明法による分析：キャピラリー電気泳動）
市販ディスパーゼＩ（合同酒精株式会社製）及び精製酵素をタンパク質が２ｍｇ／ｍＬになるように５０ｍＭトリス−２ｍＭ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。
試料５０μＬに０．０５Ｍ硫酸５０μＬを加えて混合し、この４μＬにバイオラッドサンプル処理液（Ｅｘｐｅｒｉｏｎ  プロ２６０  分析キット  Ｂｉｏｒａｄ社製）２μＬ、水８４μＬを添加した。
比較のため試料５０μＬに水５０μＬを添加し撹拌後、この４μＬにバイオラッドサンプル処理液２μＬ、水８４μＬを添加し煮沸した。また同様に煮沸しないサンプルも作成した。
こうして処理した試料をキャピラリー電気泳動（Ｅｘｐｅｒｉｏｎ  全自動チップ電気泳動装置ＢｉｏＲａｄ社製）に供した。【００５２】
その結果、図１３に示したように、本発明法による前処理を行なうと、４５〜５０ｋＤａに、Ｄプロテアーゼのバンドが示され、また本酵素より低分子領域に夾雑タンパク質と考えられるバンドが複数観察された。一方、本発明による前処理を行なわない場合は、５０ｋＤａ以下に多数の分解物バンドが認められた。
本キャピラリー電気泳動法により精製酵素の純度は９８％以上、ディスパーゼＩの純度は８０％であることが示された。【００５３】
実施例８（精製酵素の純度分析）
精製されたＤプロテアーゼの純度を定量化するために、段階希釈法による算出を試みた。不純物バンドを可視化するために、精製酵素１０ｍｇ／ｍＬを段階的に希釈したものを本発明の前処理後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％ゲル）に供した。比較としてディスパーゼＩも同様に処理した。電気泳動後、不純物バンドが、Ｄプロテアーゼに対してどのくらい含まれているかを確認した。【００５４】
その結果、図１４から、精製酵素では、レーン（２）に認められる２８ｋＤａ〜３２ｋＤａのバンドの濃さと、１／５０希釈したレーン（８）の本酵素のバンドの濃さがほぼ一致したことから、今回得られた精製酵素中の２８ｋＤａ〜３２ｋＤａのバンドは２％程度であることがわかった。
同様にディスパーゼＩを分析すると、３２ｋＤａ未満のバンドの総計は８〜１２％程度混在していた。【００５５】
実施例９（一般的なプロテアーゼの本発明による前処理後の分析）
本発明法が他のプロテアーゼへの応用が可能かを確かめるために、Ｄプロテアーゼ以外７種のプロテアーゼを本発明法で分析した。
７種のプロテアーゼをタンパク質が２ｍｇ／ｍＬになるように５０ｍＭトリス−２ｍＭ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。試料５０μＬに０．０５Ｍ硫酸５０μＬを加えて混合し、ついで従来の試料前処理液（２５％グリセリン、２．５％ＳＤＳ、０．１２５Ｍ  トリス−塩酸緩衝液ｐＨ６．８、２−メルカプトエタノール２．５％及びブロムフェノールブルー適量を含む）１００μＬを加えた。
比較のために０．０５Ｍ硫酸の代わりに水５０μＬを加え混合し、次いで従来法の試料処理液１００μＬを加え、３分間煮沸したものも作成した。
こうして処理した試料を１０μＬずつ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％ゲル）に供した。【００５６】
その結果、図１５に示したように、本発明の酸を用いた前処理により、酸性プロテアーゼであるペプシンを除き、プロテアーゼの種類（活性中心の違い）に関わらず、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上のプロテアーゼのバンドは濃く、そのレーンに含まれる他のバンドの数及び量が減少した。このことは、本発明法の前処理法によって、プロテアーゼが、従来の前処理中において自己分解を引き起こすことや、共存するタンパク質を分解することが、抑制されていることを示す。【００５７】
実施例１０（Ｄプロテアーゼの性質の確認）
Ｄプロテアーゼの至適ｐＨ、ｐＨ安定性、至適温度を測定した。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果から分子量を推定した。【００５８】
ｉ）至適ｐＨ（特許文献１：ｐＨ８．５）
市販ディスパーゼＩを各ｐＨに調整したバッファーで５０ＰＵ／ｍＬとなるように希釈し、基質は各ｐＨに調製したバッファーで０．６％ミルクカゼインを調製し各ｐＨにおけるプロテアーゼ分解活性を測定した。別途基質及び酵素を混合し、反応時のｐＨを確認した。
尚、ｐＨ５．５、６．５は５０ｍＭメス−２ｍＭ酢酸カルシウムバッファーを、ｐＨ７．５、８．５は５０ｍＭトリス−２ｍＭ酢酸Ｃａバッファーを、ｐＨ９．５、１０．５、１１．０は５０ｍＭチャップス−２ｍＭ酢酸カルシウムバッファーを用いた。
その結果、Ｄ−プロテアーゼの至適ｐＨは７．０〜８．０であった（図１６）。【００５９】
ii）ｐＨ安定性（特許文献１：ｐＨ４〜９）
市販ディスパーゼＩを各ｐＨに調整したバッファーで６５００ＰＵ／ｍＬとなるように希釈し、４、３７、４５、５０、５５、６０℃の各温度で１時間保持した。それぞれを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−２ｍＭ酢酸カルシウムバッファー（ｐＨ７．５）で５０ＰＵ／ｍＬとなるように希釈し、プロテアーゼ活性（ｐＨ７．５）を測定した。
尚、ｐＨ５．５、６．５は５０ｍＭ  ＭＥＳ−２ｍＭ酢酸カルシウムバッファーを、ｐＨ７．５、８．５は５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−２ｍＭ酢酸Ｃａバッファーを、ｐＨ９．５、１０．５、１１．０は５０ｍＭ  ＣＡＰＳ、２ｍＭ酢酸カルシウムバッファーを用いた。
その結果、Ｄ−プロテアーゼはｐＨ５．５〜９．０で安定であった（図１７）。【００６０】
iii）至適温度（特許文献１：６０℃）
市販ディスパーゼＩを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−２ｍＭ酢酸カルシウムバッファー（ｐＨ７．５）で５０ＰＵ／ｍＬとなるように希釈し、３０、４０、５０、５５、６０℃の各温度でプロテアーゼ活性（ｐＨ７．５）を測定した。
その結果、Ｄ−プロテアーゼの至適温度は５５℃であった（図１８）。【００６１】
iv）分子量の測定（特許文献１：超遠心法により３５，９００Ｄａ）
市販ディスパーゼＩを２ｍｇ／ｍＬになるように５０ｍＭトリス−２ｍＭ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解した。その試料５０μＬに０．０５Ｍ硫酸５０μＬを加え混合した。そこに等量のサンプル処理液（２５％  グリセリン、５％  ＳＤＳ、ＢＰＢ適量を含む）を加え、よく混和した後、各１０μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１５％ゲル）に供した。
電気泳動後、Ｄプロテアーゼのバンドとマーカータンパク分子のバンドの移動度（ＲＦ値）から、Ｄプロテアーゼの分子量を推定した結果３２〜３４ｋＤａと示された（図１９）。
【図３】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１７】
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【図１９】
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