(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
カブトガニの血球の抽出物に含まれる所定の蛋白質を、試薬中に分散可能な微粒子の表面に吸着させ、
前記蛋白質が吸着した前記微粒子が分散した試薬と試料とを混和させ、
前記試薬と前記試料との混和液におけるゲルの生成を検出することで、前記試料中に存在する生物由来の生理活性物質の検出を行いまたは、前記ゲルの生成の程度を測定することで前記生理活性物質の濃度を測定する、生物由来の生理活性物質の測定方法であって、
前記微粒子は無機性の素材で形成され、
前記微粒子は、アルミナ、チタニア、カオリン、酸化マンガンのいずれかの素材で形成されたことを特徴とする生物由来の生理活性物質の測定方法。
【請求項２】
前記所定の蛋白質は、カブトガニの血球の抽出物から精製されたコアギュロゲンであることを特徴とする請求項１に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
【請求項３】
前記所定の蛋白質が吸着した前記微粒子が分散した試薬を、さらに、カブトガニの血球の抽出物と混合し、
前記混合と同時または混合後において、前記試薬と前記試料とを混和させることを特徴とする請求項１または２に記載の生物由来の生理活性物質の測定方法。
【請求項４】
カブトガニの血球の抽出物に含まれる所定の蛋白質を、試薬中に分散可能な微粒子の表面に吸着させて調製された、生物由来の生理活性物質の測定用試薬キットであって、前記微粒子は、無機性の素材で形成され、
前記微粒子は、アルミナ、チタニア、カオリン、酸化マンガンのいずれかの素材で形成されたことを特徴とする生物由来の生理活性物質の測定用試薬キット。
【請求項５】
前記所定の蛋白質は、カブトガニの血球の抽出物から精製されたコアギュロゲンであることを特徴とする請求項４に記載の生物由来の生理活性物質の測定用試薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンなど、カブトガニの血球抽出物であるＬＡＬとの反応によってゲル化する特性を有する生物由来の生理活性物質を含有する試料において、前記生理活性物質を検出しまたはその濃度を測定するための測定方法及び、同検出または濃度測定に用いられる試薬キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
エンドトキシンはグラム陰性菌の細胞壁に存在するリポ多糖であり、最も代表的な発熱性物質である。このエンドトキシンに汚染された輸液、注射薬剤、血液などが人体に入ると、発熱やショックなどの重篤な副作用を惹起するおそれがある。このため、上記の薬剤などは、エンドトキシンにより汚染されることが無いように管理することが義務付けられている。【０００３】
ところで、カブトガニの血球抽出物(以下、「ＬＡＬ : Limulus amoebocyte lysate」ともいう。)の中には、エンドトキシンによって活性化されるセリンプロテアーゼが存在する。そして、ＬＡＬとエンドトキシンとが反応する際には、エンドトキシンの量に応じて活性化されたセリンプロテアーゼによる酵素カスケードによって、ＬＡＬ中に存在するコアギュロゲンがコアギュリンへと加水分解されて会合し、不溶性のゲルが生成される。このＬＡＬの特性を用いて、エンドトキシンを高感度に検出することが可能である。【０００４】
また、β−Ｄ−グルカンは真菌に特徴的な細胞膜を構成しているポリサッカライド（多糖体）である。β−Ｄ−グルカンを測定することにより、カンジダやアスペルギルス、クリプトコッカスのような一般の臨床でよく見られる真菌のみならず、稀な真菌も含む広範囲において真菌感染症のスクリーニングなどが可能となる。β−Ｄ−グルカンの測定においても、カブトガニの血球抽出成分がβ−Ｄ−グルカンによって凝固（ゲル凝固）する特性を利用して、β−Ｄ−グルカンを高感度に検出することが可能となっている。
【０００５】
上記したエンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンなどの、カブトガニの血球抽出成分によって検出可能な生物由来の生理活性物質（以下、所定生理活性物質ともいう）の検出または濃度測定（以下、これを単に所定生理活性物質の測定ともいう。）を行う方法としては、ＬＡＬと混和した試料を静置し、一定時間後に容器を転倒させて、試料の垂れ落ちの有無により試料がゲル化したかどうかを判定し、試料に一定濃度以上の所定生理活性物質が含まれるか否かを調べる半定量的なゲル化法がある。また、所定生理活性物質の別の高感度な定量法として、ＬＡＬと所定生理活性物質との反応によるゲルの生成に伴う試料の濁りを経時的に計測して解析する比濁法（試料を攪拌しながら濁りを計測する攪拌比濁法を含む。）や、酵素カスケードにより加水分解されて発色する合成基質を用いる比色法などがある。【０００６】
上記の定量法のうち比濁法は、低濃度の所定生理活性物質を作用させたときには、活性化される酵素が少ないためゲルの生成が検出されるまでに非常に長い反応時間を要する場合があった。一方比色法は、試料の濁り（血脂質など）や混入する色素（溶血によるヘモグロビンなど）の影響を受け易いという不都合があった。これらのことから、特に、救急時における患者の血液中の所定生理活性物質の測定や、人工透析時の透析液や血液中の所定生理活性物質の測定には、上記の比濁法や比色法は必ずしも最適な方法とは言えなかった。【０００７】
また、ＬＡＬと所定生理活性物質とを混和した試料を攪拌することによりゲル微粒子を早期に生成させるとともに、ゲル微粒子により散乱されるレーザー光の強度からゲル微粒子の大きさと数を解析して、凝集初期のゲル微粒子生成を測定するレーザー光散乱粒子計測法が提案されている。この方法によれば、測定時間を比濁法に比べて約３分の１に短縮でき、且つ、試料の濁りや色の影響を低減できることが報告されている。【０００８】
しかしながら、上記のレーザー光散乱粒子計測法を用いたとしても、低濃度の所定生理活性物質の測定には４０〜５０分の測定時間を要する。また、レーザー光散乱粒子計測法においては微小空間領域の粒子を観察するため光学系が複雑となり、多検体測定が困難であるという不都合があった。【０００９】
これに対し、ＬＡＬ中に含まれる蛋白質を、予め薬液中に分散したポリスチレンラテックスなどの微粒子の表面に結合させた試薬を作り、この試薬とエンドトキシンを含む試料とを混和させる、所定生理活性物質の測定方法が提案されている。これによれば、微粒子上の蛋白質に所定生理活性物質を作用させて微粒子同士を会合させ、早期に大きな凝集塊を生成させることができる。そして、この凝集塊の生成を光学的に測定することでエンドトキシンの検出または濃度測定を極めて短時間で行うことが可能となる。【００１０】
しかしながら、上記ポリスチレンラテックスの微粒子を用いた測定法においては、高温で乾熱滅菌処理を行なうことが困難なため、試薬の調製中に試薬がエンドトキシンに汚染されてしまうおそれがあった。また、ポリスチレンラテックスの微粒子上にＬＡＬ中の蛋白質を結合するためには、ポリスチレンラテックスの微粒子表面にカルボキシル基などの官能基を固定する必要があり、試薬の調製のための工数が多くなる不都合があった。このことは、試薬がエンドトキシンに汚染される危険性を助長することにもなっていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特許第２６６７６９５号公報
【特許文献２】特開平２００９−１５０７２３号公報
【特許文献３】特開２００４−０６１３１４号公報
【特許文献４】特開平１０−２９３１２９号公報
【特許文献５】国際公開第ＷＯ２００８／０３８３２９号パンフレット
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Satoshi Fukuzaki, Hiromi Urano and Kazuya Nagata ”Adsorption of bovine serum albumin onto metal oxide surfaces”, Journal of Fermentation and Bioengineering Volume 81, Issue 2, 1996, Pages 163-167
【非特許文献２】福崎智司、浦野博水「酸化物の表面電荷特性とタンパク質の吸着挙動」、防菌防黴誌、Volume 27, No.1, 1999, Pages 33-40
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は上述の問題点に鑑みて案出されたものであり、その目的とするところは、ＬＡＬ中に含まれる蛋白質を予め薬液中に分散した微粒子の表面に結合させた試薬を、より簡単に調製可能であり、所定生理活性物質の検出または濃度測定の精度を向上させることが可能な技術を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明に係る所定生理活性物質の測定方法においては、ＬＡＬ中に含まれる蛋白質を、予め準備され薬液中に分散した微粒子の上に吸着させた試薬を作る。そして、この試薬に所定生理活性物質を含む試料を作用させることにより、微粒子同士を会合させて早期に大きな凝集塊を生成させ、この凝集塊の生成を検出することで所定生理活性物質の測定を行う。そして、上記の微粒子を無機性の素材で形成したことを最大の特徴とする。【００１５】
より詳細には、カブトガニの血球の抽出物に含まれる所定の蛋白質を、試薬中に分散可能な微粒子の表面に吸着させ、
前記蛋白質が吸着した前記微粒子が分散した試薬と試料とを混和させ、
前記試薬と前記試料との混和液におけるゲルの生成を検出することで、前記試料中に存在する生物由来の生理活性物質の検出を行いまたは、前記ゲルの生成の程度を測定することで前記生理活性物質の濃度を測定する、生物由来の生理活性物質の測定方法であって、
前記微粒子は無機性の素材で形成されたことを特徴とする。【００１６】
ここで、カブトガニの血球の抽出物であるＬＡＬ中に含まれる蛋白質を微粒子の上に吸着させた状態で所定生理活性物質を作用させると、前述のように、ＬＡＬ単体に所定生理活性物質を作用させた場合と比較して、より大きな凝集塊を早期に生成することが分かっている。これは、微粒子上の蛋白質が所定生理活性物質の作用で惹起される酵素カスケードにより加水分解されてコアギュリンとなり、これらが微粒子同士を会合させることによると考えられている。【００１７】
本発明においては、この現象を利用し、微粒子同士を会合させてより大きな凝集塊を早期に生成させ、ＬＡＬと試料との混和液におけるゲルの生成を促進することとした。これによれば、所定生理活性物質の検出または濃度の測定を迅速且つ簡便に行うことが可能になる。【００１８】
なお、上記において所定の蛋白質は、所定生理活性物質と反応してゲルを生成させる特性を有するものであり、少なくともコアギュロゲンを含む。また、セリンプロテアーゼ等の他の蛋白質を含んでいてもよい。また、本発明においてゲルの生成とは、上記の微粒子同士の会合による凝集塊の生成、微粒子に吸着していないコアギュリンが会合することによるゲルの粒子の生成、ＬＡＬと試料との混和液のゲル化、の少なくともいずれかを含んだ現象を意味している。【００１９】
また、本発明においてゲルの生成の程度とは、例えば、上記の微粒子同士の会合による凝集塊及び、微粒子に結合または吸着していないコアギュリンが会合することによるゲルの粒子の大きさまたは数の増加を意味する。あるいは、ＬＡＬ試薬と試料との混和液のゲル化に起因する混和液の物理、化学特性（例、濁度）の変化を意味する。【００２０】
ここで、上記の微粒子としてポリスチレンラテックス等の樹脂製の微粒子を用いた場合について考える。この場合には、まず、微粒子の製造過程において高熱が作用する工程がない（高熱を作用させると樹脂が変性してしまう）ため、微粒子自体が初期段階で所定生理活性物質に汚染されていないという保証が得られづらい。また、上記の樹脂製の微粒子にはコアギュロゲンなどのＬＡＬ中の蛋白質が比較的吸着されづらいために、微粒子上にカルボキシル基などの官能基を固定して活性化するための工程が必要となる。このことにより、試薬の調製工程が複雑になってしまう。また、このことは、調製過程において試薬が所定生理活性物質に汚染される機会が増加することにも繋がっていた。【００２１】
これに対し本発明では、上記の微粒子を無機性の素材で形成することとした。そうすると、微粒子を樹脂などの有機性の素材で形成した場合と比較して、微粒子自体の耐熱性を向上させられるため、試薬の調製過程において乾熱滅菌処理を行なうことができる。その結果、調整過程において試薬が所定生理活性物質に汚染されることを抑制できる。また、樹脂などの有機性の素材で微粒子を形成した場合と比較して、蛋白質の微粒子への吸着性を向上させることができる。従って、微粒子上にカルボキシル基などの官能基を固定させなくとも、静電的に蛋白質を微粒子表面に吸着させることができ、試薬の調製工程を大幅に簡略化することができる。また、このことにより、調製過程において試薬が所定生理活性物質に汚染される機会を減少させることができる。なお、無機性の素材の例としては、例えば金属酸化物や鉱物を挙げることができる。【００２２】
また、本発明において上記の微粒子は、アルミナ、チタニア、カオリン、酸化マンガンのいずれかにより形成されるようにしてもよい。これらの素材で微粒子を形成すれば、ＬＡＬ中の蛋白質の微粒子への吸着性をより確実に向上させることができるとともに、微粒子の光散乱性または光吸収性を向上させることができる。そうすれば、比濁法において試料とＬＡＬ試薬の混和液の吸光度の変化をより明確に検出することが可能となり、また、レーザー光散乱法において前記混和液からの散乱光強度のピークをより明確に検出することが可能となる。その結果、より高精度に所定生理活性物質の測定を行なうことが可能となる。【００２３】
また、微粒子を上記の素材で形成すれば、微粒子として充分な機械的強度を得られるため、試料と微粒子を含む試薬とを混和させて攪拌した際にも、機械的な負荷によって微粒子が粉砕され、混和液の物理的、光学的性質が変化することを抑制できる。【００２４】
ここで、前記所定の蛋白質は、カブトガニの血球抽出物から精製されたコアギュロゲンであってもよい。【００２５】
前述のように、ＬＡＬに所定生理活性物質を作用させた際の凝集反応においては、コアギュロゲンがＬＡＬ中の酵素カスケードにより加水分解されてコアギュリンとなり、これらが微粒子同士を会合させる。従って、ＬＡＬ中の蛋白質を予め精製してコアギュロゲンのみを抽出し、微粒子に吸着させておくことで、より効率的に微粒子同士を会合させることが可能となり、より早期に凝集塊を生成させることが可能となる。【００２６】
また、本発明においては、前記所定の蛋白質が吸着した前記微粒子が分散した試薬を、さらに、カブトガニの血球の抽出物と混合し、
前記混合と同時または混合後において、前記試薬と前記試料とを混和させるようにしてもよい。【００２７】
これによれば、蛋白質が結合または吸着した微粒子が分散した試薬に対して、さらにＬＡＬ中の蛋白質を補給しておくことができる。そうすると、所定生理活性物質を含有する試料と混和した際に、より確実に所定生理活性物質を試薬中のセリンプロテアーゼに作用させ、微粒子上に吸着されたコアギュロゲン及び、混合されたＬＡＬ中のコアギュロゲンを加水分解してコアギュリンとすることができる。その結果、より確実に、微粒子上に吸着されたコアギュリン同士または、微粒子上に吸着されたコアギュリンと混合されたＬＡＬ中のコアギュリンとを会合させることができ、微粒子を中心とした凝集塊の生成を促進することができる。これにより、より短時間での所定生理活性物質の測定が可能となる。【００２８】
また、これによれば、ＬＡＬ中の蛋白質を予め精製してコアギュロゲンのみを抽出し、微粒子に結合または吸着させた場合にも有利である。すなわちこれらの場合でも、前記試薬と所定生理活性物質を含有する試料とを混和した際に、より確実に所定生理活性物質をセリンプロテアーゼに作用させることができる。【００２９】
なお、上記においては、前記所定の蛋白質が吸着した前記微粒子が分散した試薬を、さらに、カブトガニの血球の抽出物と混合し、その上で所定生理活性物質を含有する試料と混和するところ、この混和の時期は、前記血球抽出物との混合の後であってもよいし、混合と同時であってもよい。しかし、試薬中に補給されたコアギュロゲンやセリンプロテアーゼをより均一に分散させておけるという点では、所定生理活性物質を含有する試料との混和は、前記試薬と前記血球抽出物との混合時から所定時間が経過した後とするのが望ましい。【００３０】
また、本発明は、カブトガニの血球の抽出物に含まれる所定の蛋白質を、試薬中に分散可能な微粒子の表面に吸着させて調製された、生物由来の生理活性物質の測定用試薬キットであって、前記微粒子は、無機性の素材で形成されたことを特徴とする生物由来の生理活性物質の測定用試薬キットであってもよい。【００３１】
その場合、前記微粒子は、金属酸化物または鉱物で形成されるようにしてもよい。また、前記微粒子は、アルミナ、チタニア、カオリン、酸化マンガンのいずれかの素材で形成されるようにしてもよい。また、所定の蛋白質は、カブトガニの血球の抽出物から精製されたコアギュロゲンであってもよい。【００３２】
なお、上記した本発明の課題を解決する手段については、可能なかぎり組み合わせて用いることができる。
【発明の効果】
【００３３】
本発明にあっては、ＬＡＬ中に含まれる蛋白質を予め薬液中に分散した微粒子の表面に結合させた試薬を、より簡単に調製可能であり、所定生理活性物質の検出または濃度測定の精度を向上させることが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明の実施例におけるＬＡＬ結合ビーズの凝集メカニズムについて説明するための図である。
【図２】攪拌比濁法によるエンドトキシン濃度測定で、製造例１に係るＬＡＬ結合ビーズ試薬を用いた場合と用いなかった場合の各々における、エンドトキシン濃度と検出時間との関係を示したグラフである。
【図３】レーザー光散乱粒子計測法によるエンドトキシン濃度測定で、製造例２に係るＬＡＬ結合ビーズ試薬を用いた場合と用いなかった場合の各々における、検出粒子数の時間的変化を示したグラフである。
【図４】レーザー光散乱粒子計測法によるエンドトキシン濃度測定で、製造例２に係るＬＡＬ結合ビーズ試薬を用いた場合と用いなかった場合の各々における、エンドトキシン濃度と検出時間との関係を示したグラフである。
【図５】チタニア粒子を用いたＬＡＬ結合ビーズ試薬を用いた場合と用いなかった場合の各々における、エンドトキシン濃度と検出時間との関係を示したグラフである。
【図６】実施例４におけるビーズ１の素材の各々についての、波長４３０ｎｍの光を入射した場合における吸光度を示したグラフである。
【図７】攪拌比濁法によるエンドトキシン濃度測定で、アルミナ、カオリン、酸化マンガンの各々をビーズの素材としたＬＡＬ結合ビーズ試薬を用いた場合と、ＬＡＬ結合ビーズ試薬を用いなかった場合の各々における、光透過率の時間的変化を示したグラフである。
【図８】攪拌比濁法によるエンドトキシン濃度測定で、アルミナ、シリカの各々をビーズの素材としたＬＡＬ結合ビーズ試薬を用いた場合と、ＬＡＬ結合ビーズ試薬を用いなかった場合の各々における、光透過率の時間的変化を示したグラフである。
【図９】ハイドロキシアパタイトをビーズの素材とした場合の、光透過率と攪拌時間との関係を示したグラフである。
【図１０】エンドトキシンまたはβ―Ｄ−グルカンにより、ＬＡＬがゲル化する過程及び、その検出方法について説明するための概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
ＬＡＬとエンドトキシンとが反応してゲルが生成される過程はよく調べられている。図  １０に示すように、エンドトキシンがＬＡＬ中のセリンプロテアーゼであるＣ因子に結合すると、Ｃ因子は活性化して活性型Ｃ因子となる、活性型Ｃ因子はＬＡＬ中の別のセリンプロテアーゼであるＢ因子を加水分解して活性化させ活性化Ｂ因子とする。この活性化Ｂ因子は直ちにＬＡＬ中の凝固酵素の前駆体を加水分解して凝固酵素とし、さらに、この凝固酵素がＬＡＬ中のコアギュロゲンを加水分解してコアギュリンを生成する。そして、生成したコアギュリンが互いに会合して不溶性のゲルをさらに生成し、ＬＡＬ全体がこれに巻き込まれてゲル化すると考えられている。
【００３６】
また、同様にβ−Ｄ−グルカンがＬＡＬ中のＧ因子に結合すると、Ｇ因子は活性化して活性型Ｇ因子となる、活性型Ｇ因子はＬＡＬ中の凝固酵素の前駆体を加水分解して凝固酵素とする。その結果、エンドトキシンとＬＡＬとの反応と同様、コアギュリンが生成され、生成したコアギュリンが互いに会合して不溶性のゲルをさらに生成する。
【００３７】
この一連の反応は哺乳動物に見られるクリスマス因子やトロンビンなどのセリンプロテアーゼを介したフィブリンゲルの生成過程に類似している。このような酵素カスケード反応はごく少量の活性化因子であっても、その後のカスケードを連鎖して活性化していくために非常に強い増幅作用を有する。従って、エンドトキシンやβ−Ｄ−グルカンなどの所定生理活性物質についてＬＡＬを用いて測定すれば、サブピコグラム／ｍＬオーダーのきわめて微量の所定生理活性物質を検出することが可能になっている。以下においては、所定生理活性物質としてエンドトキシンを例にとって説明を続けるが、本発明はエンドトキシンのみならず、β−Ｄ−グルカンを始め他の所定生理活性物質に適用することが可能である。
【００３８】
エンドトキシンを定量することが可能な測定法としては前述のように比濁法（攪拌比濁法を含む）ならびに、レーザー光散乱粒子計測法などが挙げられる。図１０に示すように、これらの測定法は上述のＬＡＬの酵素カスケード反応によって生成されるコアギュリンの会合物を前者は試料の濁りとして、後者は系内に生成されるゲルの微粒子として検出することで、高感度な測定を可能にしている。
【００３９】
しかしながら、比濁法では個々のコアギュリンはナノメータオーダーの微小な粒子であるため、これらが漸次会合していっても、光学的に検出可能な大きさまで成長しないと濁りとして検出できない。また、比濁法においては一般的に試料を静置して系全体におけるゲルの生成を待つので、コアギュリン同士の衝突確率が低く、会合の速度は必ずしも速くない。従って、比濁法を用いた場合には、エンドトキシンの検出または濃度測定が可能なるまでには相当の時間を要する場合があった。
【００４０】
それに対して、レーザー光散乱粒子計測法では、系内に生成されたゲルの微粒子を直接測定するため、比濁法よりも高感度であり、且つ、一般的にＬＡＬと検体からなる試料を強制的に攪拌するので、比濁法と比較して短時間でゲルの生成を検出できる。しかしながら、レーザー光散乱粒子計測法においては、微小空間領域の粒子を観察するため光学系が複雑となり、簡便な装置による測定が困難である場合があった。
【００４１】
本実施形態においては、予め、比濁法あるいは、レーザー光散乱粒子計測法で検出され得るか、検出され得る限界より若干小さいサイズの無機物からなる微粒子の表面にコアギュロゲンを結合させておく。そして、これをＬＡＬ試薬と混合して調製した試薬に、エンドトキシンを含有する試料を混和する。これにより、ＬＡＬ中に生成されるコアギュリンと微粒子上に吸着されたコアギュリンとを会合させ、また、微粒子上に吸着されたコアギュリン同士を会合させて、短時間で、比濁法あるいは、レーザー光散乱粒子計測法で検出可能なサイズの凝集塊を生成する。その結果、比濁法あるいは、レーザー光散乱粒子計測法によって、より迅速にエンドトキシンの測定を行うことができる。
【００４２】
図１には、本実施例による微粒子の凝集メカニズムを示した。図１において中央の矢印の左側はエンドトキシンと反応する前の試薬の模式図である。矢印の右側はエンドトキシンと反応した後の試薬の模式図である。
【００４３】
図１に示すとおり、反応前は、本実施例における微粒子であるビーズ１と、微粒子の表面に結合されたコアギュロゲン２と、微粒子の表面に結合されていないコアギュロゲン３とが分散した状態である。なお、以下において便宜上、ビーズ１にコアギュロゲン２を結合させた状態の微粒子をＬＡＬ結合ビーズ１０と呼ぶことにする。
【００４４】
ここで、ビーズ１に用いられる素材が満たすべき条件について考える。ビーズ１に用いられる素材は、まず、ビーズ１自体を乾熱滅菌処理できるものが望ましい。換言すると、樹脂などの有機性の素材ではなく無機性の素材が望ましい。そうすれば、ビーズ１の形成段階またはＬＡＬ結合ビーズ１０の調整段階においてエンドトキシンを乾熱滅菌で熱により不活性化することが可能となり、ＬＡＬ結合ビーズ１０がエンドトキシンに汚染される危険性を低下させることができる。
【００４５】
また、ビーズ１に用いられる素材は、蛋白質の吸着性の高い素材であることが求められる。なお、非特許文献１には、ウシ血清アルブミンのシリカ、チタニア、ならびに、アルミナへの吸着量が蛋白質の等電点と酸化金属の零電荷点の視点から論ぜられている。また、非特許文献２では、酸化金属の零電荷点は溶液中に存在する緩衝液の種類によって 大きく変化する場合があることが示されている。ここで、蛋白質の吸着性の高い素材であるか否かは、蛋白質の等電点とビーズ１の零電荷点との関係によって定められる。すなわち、ビーズ１が蛋白質を吸着するためにはビーズ１と蛋白質との間に電位差があることが要求される。例えばコアギュロゲンが電気的に中和されるｐＨである等電点は約１０であるという報告があるので、コアギュロゲンとの間で充分な電位差を有する素材としては、チタニア（ｐＨ６．１）、ジルコニア（ｐＨ７．３）などが挙げられる。また、非特許文献２にあるように、アルミナは零電荷点がアルカリ側に高いが（ｐＨ９．０）、溶液に含まれる緩衝液の影響を受け易く、零電荷点が大きく酸性側にシフトする。そのため、アルミナでも、リムルス試薬のように緩衝液を含む充分にコアギュロゲンを吸着することが充分に可能である。
【００４６】
なお、コアギュロゲンの等電点は約１０と、アルカリ側に非常に高くなっているため、例えばｐＨ７付近の中性の環境（試薬の調整及び使用時にはｐＨ６−８に収まることが多い）においては、コアギュロゲンはプラス側に荷電していると考えられる。従って、蛋白質をより強力に吸着するには中性の環境（ｐＨ７）でビーズ１がマイナス側に帯電するような零電荷点を有する素材がより望ましいと言える。このとき、零電荷点がマイナス側に帯電している素材であっても良いし、適当な緩衝液が存在する環境においてマイナス側に帯電するような素材であっても良い。
【００４７】
また、ビーズ１の素材としては、凝集が生じた際の濁りの強度がある程度以上強いことが求められる。本実施例では、ＬＡＬ中の蛋白質とエンドトキシンとの反応に基づくビーズ１の凝集を比濁法やレーザー光散乱粒子法などの光学的手段によって測定する。換言すると、ビーズ１が分散された混和液による透過光や散乱光の強度変化を利用してビーズ１の凝集を測定する。従って、ビーズ１の素材としては、光を散乱し易い白色の素材、あるいは、光を吸収し易い黒色あるいは特定の有色の素材が望ましい。
【００４８】
その他、本実施例におけるエンドトキシンの測定に有利なビーズ１の素材としては、使用中に水に溶解しないものが望ましい。また、攪拌のし易さの観点から比重が水に近く極端に大きくない素材が望ましい。さらに、攪拌によって粒径が変化しては困るので、攪拌に耐える程度の機械的な強度を有するものが望ましい。
【００４９】
以上の要件より、ビーズ１の素材としては、無機物の中でも、中性領域の水に不溶の酸化金属の粒子または鉱物の粒子が望ましい。酸化金属粒子の例としては、シリカ、チタニア、ジルコニア、アルミナ、セリア、酸化マンガン、フェライト並びに、これらの複合物あるいは混合物が挙げられる。その他、マグネシア（ＭｇＯ）、カルシア(ＣａＯ)、アルミナ(Ａｌ２Ｏ３)、アルミナ−チタニア(Ａｌ２Ｏ３−ＴｉＯ２)、ムライト(３Ａｌ２Ｏ３-２ＳｉＯ２）、スピネル(Ａｌ２Ｏ３−ＭｇＯ)、ジルコニア(ＺｒＯ２)、クロミア(Ｃｒ２Ｏ３)、イットリア(Ｙ２Ｏ３)、セリア(ＣｅＯ２)、チタン酸バリウム(ＢａＴｉＯ３)、ハフニア(ＨｆＯ２)などが、本実施例に係るビーズ１の素材として使用できる可能性がある。
【００５０】
その他、本実施形態のビーズ１としては、粒度が揃っていることも要求される。特に、レーザー光散乱粒子計測法でエンドトキシンの測定を行う場合には粒度の均一性は重要な要因となる。エンドトキシンとＬＡＬ結合ビーズ１０を含む試薬とを混和させた場合に、ビーズ１の粒度が不均一だと凝集の進行がばらついてしまう。その結果、濁度や粒子数の変化が緩慢になって測定精度が低下したり、測定の再現性が低下するなどの不都合が生じるおそれがある。既に、充分な粒度均一性を有する粒子として流通している素材としては、チタニア、アルミナ、酸化マンガンなどを挙げることができる。
【００５１】
なお、ビーズ１上にコアギュロゲン２を吸着させる際には、ＬＡＬ中に含まれる蛋白質を選別することなくビーズ１に吸着させてもよいし、ＬＡＬ中のコアギュロゲンを精製して吸着させてもよい。ＬＡＬ中に含まれる蛋白質を選別することなく微粒子に吸着させる方法をとった場合には、ビーズ１上にコアギュロゲン２以外の蛋白質も吸着される可能性もあるが、ＬＡＬ中のコアギュロゲンを精製する工程を省略することができるので試薬の調製、精製に係るコストを低減することができる。なお、その場合には、図１において、ビーズ１上及び、ビーズ１の周囲の試薬中にコアギュロゲン２、３以外に、ＬＡＬ中に含まれる他の蛋白質（不図示）がより多く存在することとなる。
【００５２】
次に、本実施形態におけるＬＡＬ結合ビーズ試薬による実際のエンドトキシンの検出または濃度測定について、ビーズ１の素材としてポリスチレンラテックスを使用した場合と比較しつつ説明する。
【００５３】
＜比較製造例１＞（ポリスチレンラテックスを用いた場合）
まず、比較製造例として、カルボキシル基をビーズ表面に有するポリスチレンラテックス粒子とＬＡＬ試薬とを不可逆的な酵素阻害剤を作用させた環境下で結合させたＬＡＬ結合ビーズ試薬の製造例について説明する。具体的には、カルボキシル基を表面に有するビーズ１として、Polyscience社製の粒径０．４５μｍ、あるいは、１．０μｍのPolybead Calboxylate Microsphere（以下「ＰＣＭ」と略す。）を用いた。
【００５４】
ＬＡＬ試薬としては、和光純薬製のエンドトキシン検出試薬であるリムルスＨＳ−Ｔシングルテストワコー（以下「ＬＡＬ試薬」または「リムルス試薬」と略す。）を用いた。１．０ｍＬのＰＣＭを最大容量２．０ｍＬの遠心管に入れて、さらにｐＨ９．６の０．１Ｍ炭酸バッファを最大容量まで加えてよく混合した後、卓上遠心器で１２５００ｒｐｍにて５分間遠心してＰＣＭを沈殿させて上澄みを除去した。この炭酸バッファとの混和、遠心、上澄みの除去といった一連の作業をさらに２回繰り返し、次に、沈殿させたＰＣＭにｐＨ４．５の０．０２Ｍのリン酸バッファを最大容量まで加えて混和させた後、同様に遠心分離、上澄みの除去という操作を合計３回行なった。
【００５５】
次に、遠心分離して上澄みを除去したＰＣＭに対し、オートクレーブにて１２１℃、２０分の条件で加熱処理を行った。これにより、この時点でＰＣＭがエンドトキシンに汚染されていたとしても、当該エンドトキシンのかなりの部分を不活性化することができる。その後さらに、バッファによる洗浄を行った。
【００５６】
次に、得られたＰＣＭの沈殿物にリン酸バッファを０．７５ｍＬ加え、さらに、０．７５ｍＬの２．０％カルボジイミド水溶液（水溶性カルボジイミド、同仁化学製）を加えて、室温で３時間転倒攪拌法を用いて攪拌してＰＣＭ上のカルボキシル基を活性化させた。
【００５７】
反応後のＰＣＭは遠心して上澄みを除去した後、再び、同様にリン酸バッファで３回洗浄し、最後に得られたＰＣＭの沈殿物にｐＨ８．５の０．２Ｍホウ酸バッファ０．５ｍＬを加えて懸濁させた。次に、ＬＡＬ試薬にホウ酸バッファを０．２５ｍＬ加えて溶解させたＬＡＬ試薬溶液を２本用意し、これらとＰＣＭ懸濁液を混合して容量を１．０ｍＬとした。さらに、これにセリンプロテアーゼ阻害剤であるＰＭＳＦ（Phenylmethanesulfonyl fluoride）を最終濃度で４ｍＭになるように加えた。混合溶液中のＰＣＭ上にある活性化したカルボキシル基とＬＡＬ中の各蛋白質が持つアミノ基がアミド結合するように室温で４時間以上攪拌して反応させた。
【００５８】
その後、混合溶液を遠心して上澄みを除去した後、１．２ｍＬのホウ酸バッファに再懸濁させ、さらに、この溶液に０．２５Ｍの２−アミノエタノール／ホウ酸バッファを５０μＬ加えて室温で３０分転倒攪拌させて、ＰＣＭ上の未反応の活性化カルボキシル基をアミノエタノールで消費した。さらに、ＰＣＭ懸濁液を遠心してＰＣＭ沈殿物を得た後に注射用生理食塩水（大塚製薬製）で再懸濁、遠心、上澄みの除去による一連の操作で合計３回洗浄してＬＡＬ結合ビーズ試薬を得た。最後に、防腐剤と界面活性剤とを添加してＬＡＬ結合ビーズ試薬を最適濃度に調整した。
【００５９】
以上のように、ビーズ１の素材としてポリスチレンラテックスを用いた場合には、非常に多くの工程を踏んでＬＡＬ結合ビーズ試薬を得ることとなり、ＬＡＬ結合ビーズ試薬を得るために２日を費やす場合もある。
【００６０】
これに対し、本実施形態に係るＬＡＬ結合ビーズ試薬では、ビーズ１として無機物の金属酸化物粒子、具体的にはアルミナの微粒子を使用することとした。以下、ビーズ１としてアルミナの微粒子を使用した場合のＬＡＬ結合ビーズ試薬の調製法について説明する。
【００６１】
アルミナ製のビーズ１は、例えば、霧状のアルミのエアロゾルを火炎に吹きつけ、エアロゾルの各粒子を酸化させることにより形成してもよい。これからも分かるように、アルミナのビーズ１は、通常１０００℃以上の高温において形成されるので、少なくともビーズ１の形成段階においては、微粒子がエンドトキシンに汚染されていないことを保証できる。
【００６２】
なお、アルミナに関しては、粒子サイズが大きい場合（一次粒子のサイズとして０．３〜０．４μｍ）は粒子自体が強い光散乱体であるために、光透過率（吸光度）を測定する手法に適している。粒子サイズが小さい場合（一次粒子のサイズとして０．１μｍ以下）は粒子自体はそれほど強い散乱を発生させないので、光散乱計測法（レーザー光散乱粒子計測法、レイリー散乱法など）での使用に適していると言える。
【００６３】
＜製造例１＞（光透過率測定用のＬＡＬ結合ビーズの製造）
デンカ製の球状アルミナ粒子ＡＳＦＰ−２０（平均粒径０．３μｍ）を、念のため乾熱処理（２５０℃、３時間）し、コンタミしているエンドトキシンを熱により不活性化した。球状アルミナ粒子は、高温で乾熱滅菌することが可能なので、この段階においてもエンドトキシンをより完全に不活性化することができる。
【００６４】
次に、球状アルミナ粒子を２０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように注射用蒸留水に分散させ、１０００ｒｐｍで３分間遠心し、ダマになっている粒子や大粒径の粒子を遠沈して除去した。次に、球状アルミナ粒子の分散液をリムルス試薬（和光純薬、ＨＳ−Ｔ）１本に対して３００μＬになるように加えてリムルス試薬を溶解させた。ボルテックスミキサーで攪拌して混和させた後、アルミブロックヒーターを用いて６０℃で２０分間熱処理して球状アルミナ粒子へのリムルス試薬中の蛋白質の吸着と固定を行った。
【００６５】
なお、前述のように球状アルミナ粒子はコアギュロゲンなどの蛋白質に対して強い吸着力を有しており、さらに加熱によってより蛋白質を吸着、固定し易い状態となる。従って本実施形態では、より簡単な工程で球状アルミナ粒子への蛋白質の固定を実現することができる。また、この熱処理によりリムルス試薬中のセリンプロテアーゼは完全に失活する。従って、球状アルミナ粒子を用いた場合には、ＰＭＳＦなどのセリンプロテアーゼ阻害剤を添加する必要なくなる。加熱処理後、防腐剤（アジ化ナトリウム）と界面活性剤（ＴｒｉｔｏｎＸ-１００）を０．０５％になるように加えて、総量が３．０ｍＬになるように注射用蒸留水で希釈した。
【００６６】
このように、ビーズ１の素材として、無機物であり、金属酸化物であるアルミナの微粒子を用いたことにより、ＬＡＬ結合ビーズ試薬の製造工程を極めて簡単にすることができた（合計３０分〜１時間）。これにより、ＬＡＬ結合ビーズ試薬の調整中にエンドトキシンによる汚染が発生する危険性を低減することができる。また、ビーズ１が無機物（金属酸化物）であるので高温の熱処理によってエンドトキシンを完全に不活性化することができる。
【００６７】
また、ビーズ１の素材としてポリスチレンラテックスの微粒子を用いた場合には、微粒子上に固定されたカルボキシル基とＬＡＬ中の蛋白質とをアミド結合することで結合させた。この場合には、蛋白質どうしの架橋が生じ易く、結果として、ビーズ１の凝縮物が出来易く、ビーズ１の分散性を均一に維持することが困難な場合があった。
【００６８】
それに対し、素材として球状アルミナ粒子を用いた場合は、アルミナの微粒子が有する蛋白質に対する吸着力によってアルミナ表面に蛋白質を吸着・固定する。従って、ビーズ１の濃度と蛋白質の濃度とを調整することで、ビーズ１どうしを架橋させることなく、ビーズ１の表面全体を蛋白質で覆うような状態を作ることが可能である。そうすると、ビーズ１どうしが不用意に凝集してしまうことを抑制でき、ＬＡＬ結合ビーズ試薬における分散の均一性を向上させることができる。なお、本製造例では、アルミブロックヒーターを用いて６０℃で２０分間熱処理することで、球状アルミナ粒子へのリムルス試薬中の蛋白質の吸着と固定を行ったが、球状アルミナ粒子は充分に高い蛋白質の吸着性を有しているので、熱処理は必ずしも必要ではない。
【００６９】
＜製造例２＞（レーザー光散乱粒子計測法用のＬＡＬ結合ビーズの製造）
アエロジル社製アルミナ粒子ＡＬｕＣ（１次粒子粒径０．０３μｍ）を乾熱処理（２５０℃、３時間）し、コンタミしているエンドトキシンを熱により不活性化した。次に、粒子を１０ｍｇ／ｍＬの濃度になるように注射用蒸留水に分散させ、３０００ｒｐｍで1分間遠心し、ダマになっている粒子や大粒径の粒子を遠沈して除去した。次に、微粒子の分散液を２倍に注射用蒸留水で希釈し、リムルス試薬（和光純薬、ＨＳ−Ｔ）１本に対して１００μＬになるように加えてリムルス試薬を溶解させた。
【００７０】
ボルテックスミキサーで攪拌して混和させた後、アルミブロックヒーターを用いて６０℃で２０分間熱処理してアルミナ微粒子へのリムルス試薬中の蛋白質の吸着と固定を行った。また、この熱処理によりリムルス試薬中のセリンプロテアーゼは完全に失活した。加熱処理後、防腐剤（アジ化ナトリウム）と界面活性剤（ＴｒｉｔｏｎＸ-１００）を０．０５％になるように加えて、総量が１．５ｍＬになるように注射用蒸留水で希釈した。
【００７１】
＜製造例３＞（エンドトキシンフリーガラス容器）
光透過率測定法ではφ６ｍｍ、長さ５０ｍｍのガラス製で、試料を攪拌するためのステンレス製の攪拌子（φ０．７５ｍｍ、長さ３．５ｍｍ）を内在した専用の容器を、一方、レーザー散乱粒子計測法では、φ７ｍｍ、長さ５０ｍｍのガラス製で、試料を攪拌するためのステンレス製の攪拌子（φ１ｍｍ、長さ５ｍｍを）を内在した専用の容器を使用した。これらの容器をガラス容器の開口部をアルミ箔で覆い、さらに、２０本ずつアルミ箔で小分けに梱包したものを鉄製の乾熱処理缶に詰め、２５０℃で３時間加熱処理して、エンドトキシンを不活性化した。
【００７２】
次に、上記で製造した球状アルミナ粒子を用いたＬＡＬ結合ビーズ試薬を用いたエンドトキシン測定について説明する。
【００７３】
＜実施例１＞（光透過率測定）
エンドトキシン希釈系列（２、０．２、０．０２、０．００２、０．０００２ＥＵ／ｍＬになるように注射用蒸留水で希釈して調製）５０μＬを製造例３で製造した測定用ガラス容器（φ６ｍｍ）に入れた。次に、リムルス試薬（和光純薬製ＥＳ−II）を製造例１で製造したＬＡＬ結合ビーズ試薬１００μＬで溶解させ、そのうちの５０μＬを上記のエンドトキシン希釈水が入ったガラス容器に移注し、攪拌比濁型エンドトキシン測定装置（ＥＸ−１００、興和）を用いて測定を行った。また、同時にリムルス試薬をＬＡＬ結合ビーズ試薬ではなく、注射用蒸留水１００μＬで溶解させ、そのうちの５０μＬをエンドトキシン希釈水が入ったガラス容器に移注し、同様に測定を行った。
【００７４】
エンドトキシンがリムルス試薬と反応するとＬＡＬ結合ビーズが含まれない試料ではリムルス試薬中に不溶性の蛋白質であるコアギュリンが生成されるため、混和液が濁って光透過率が減少してくる。一方、ＬＡＬ結合ビーズ試薬を用いた混和液ではもともと試薬がビーズによって白濁しているが、コアギュリンの生成が開始した初期にコアギュリンがビーズ上に生成されたコアギュリンと会合してビーズが凝集するために濁りがなくなり、光透過率が一旦上昇する。光透過率が急激に変化する変局点を検出する手法（並列差分法）を用いて変局点が現われた時刻をエンドトキシン検出時間とした。
【００７５】
図２にはエンドトキシン濃度を横軸に、検出時間を縦軸に取り、両対数でプロットしたグラフを示す。図２に示すように、本発明のＬＡＬ結合ビーズ試薬を使用することにより、エンドトキシン濃度の測定精度は維持しつつ大幅な測定時間の短縮が可能であることが分かった。また、図２から分かるように、ＬＡＬ結合ビーズ試薬を使用しない場合には、エンドトキシン濃度が低い領域では検出時間が極端に長くなっており、現実的に測定不可能な領域が広くなっている。従って、本実施例におけるＬＡＬ結合ビーズ試薬を用いることでエンドトキシン濃度の測定限界を広げることが可能となる。
【００７６】
＜実施例２＞（レーザー光散乱粒子計測）
エンドトキシン希釈系列（２、０．２、０．０２、０．００２、０．０００２ＥＵ／ｍＬになるように注射用蒸留水で希釈して調製）１００μＬを製造例３で製造した測定用ガラス容器（φ７ｍｍ）に入れた。次に、リムルス試薬（和光純薬製ＥＳ−II）を製造例１で製造したＬＡＬ結合ビーズ懸濁液１００μＬで溶解させ、それを上記のエンドトキシン希釈水が入ったガラスキュベットに移注し、レーザー光散乱粒子計測装置（ＥＸ−３００、興和）を用いて測定を行った。
【００７７】
また、同時にリムルス試薬をＬＡＬ結合ビーズ試薬ではなく、注射用蒸留水１００μＬで溶解させ、それをエンドトキシン希釈水が入ったガラス容器に移注し、同様に測定を行った。エンドトキシンがリムルス試薬と反応するとＬＡＬ結合ビーズが含まれない混和液ではリムルス試薬中に不溶性の蛋白質であるコアギュリンが生成されるため、試料中にゲル粒子が発生する。これは光を散乱するため、ＥＸ−３００によってゲル微粒子として検出される。
【００７８】
一方、ＬＡＬ結合ビーズを混和液に含む場合、製造例２で製造したＬＡＬ結合ビーズ試薬は製造例１のＬＡＬ結合ビーズ試薬と比較して濁りが少なく、ＥＸ−３００で測定してもほとんど光散乱体として検出されない。しかし、エンドトキシンを作用させて反応が進行すると試料中にコアギュリンが生成され、ＬＡＬ結合ビーズを架橋していくので、ゲル粒子として検出されるようになる。図３には、ＬＡＬ結合ビーズ試薬とエンドトキシンとの混和後の経過時間と、検出された粒子数との関係のグラフを示す。
【００７９】
図３に示されるように、ＬＡＬ結合ビーズが存在しない場合、コアギュリン（５ｎｍ程度）が検出可能な大きさに成長するまで時間がかかるが、ＬＡＬ結合ビーズが存在するとコアギュリン単独の粒子が充分な大きさに成長するのを待たずに、会合したビーズ１が凝集微粒子として検出されるため、検出粒子数の立ち上がりが早くなる。図４にはエンドトキシン濃度を横軸に、検出時間を縦軸に取り、両対数でプロットしたグラフを示す。図４に示すように、本発明のＬＡＬ結合ビーズ試薬を使用することによりエンドトキシン濃度の測定精度は維持しつつ大幅な測定時間の短縮が可能であることが分かった。なお、本測定ではエンドトキシンの検出はゲル粒子の総数が２０を越えた時刻とした。
【００８０】
＜実施例３＞
次に、ビーズ１としてチタニア粒子を用いた場合について説明する。本実施例においては、チタニア粒子（日本アエロジル製Ａｅｒｏｘｉｄｅ Ｐ２５）を２５０℃で３時間乾熱処理し、混入しているエンドトキシンを熱により完全に不活性化した。次に、これを１０ｍｇ/ｍＬになるように注射用蒸留水（大塚製薬製）で分散させたのち、１５０μＬをリムルス試薬（ＨＳ−Ｔ、和光純薬製）に加えて試薬を溶解した後、６０℃で２０分加熱して粒子表面にリムルス試薬の蛋白質を吸着及び固定させた。さらに、これを注射用蒸留水で３．０ｍＬになるように希釈し、そのうちの２．０ｍＬでリムルス試薬（ＥＳ-IIマルチテスト試薬、和光純薬製）を溶解し、溶解した試薬５０μＬとエンドトキシン希釈系列溶液５０μＬを測定容器内で混和させ、攪拌比濁法測定装置（ＥＸ−１００、興和製）でエンドトキシン凝集反応を測定した。
【００８１】
上記の測定の結果、アルミナをビーズ１として用いた場合と略同様の現象が観察された。すなわち、凝集反応の初期にはビーズ１の会合により光透過率が一旦上昇した。そして、その後に光透過率が減少した。本実施例におけるＬＡＬ結合ビーズ試薬を使用した場合とＬＡＬ結合ビーズ試薬を使用しない場合におけるエンドトキシン濃度とエンドトキシン検出時間の関係を図５に示す。図５に示すように両軸を対数でプロットするといずれも直線近似され、チタニア粒子のビーズ１を使用した場合にも、エンドトキシン濃度の測定精度を維持しつつ測定時間を大幅に短縮することが可能であることがわかった。
【００８２】
＜実施例４＞
次に、ビーズ１に用いられる酸化金属微粒子として、アルミナ（電気化学工業（デンカ）製球状アルミナＡＳＦＰ−２０）、シリカ（日本アエロジル製Ａｅｒｏｓｉｌ３００）、チタニア（日本アエロジル製Ａｅｒｏｘｉｄｅ Ｐ２５）、および、酸化マンガン（IV）粉末（関東化学製）を、鉱物微粒子としてハイドロキシアパタイト（コバレントマテリアル製）、カオリン（関東化学製）、および、ベントナイト（関東化学製）を用いて、これらの無機性の素材で形成されたビーズ１によりＬＡＬ結合ビーズ試薬を調製し、エンドトキシン測定時間の短縮効果を調べた。
【００８３】
これらのビーズ１を２５０℃で３時間乾熱処理し、コンタミしたエンドトキシンの熱による不活性化を行い、それぞれのビーズ１の濃度が１００ｍｇ／ｍＬとなるように注射用蒸留水で懸濁した。これらの粒子懸濁液を１０ｍｇ/ｍＬに希釈し、波長４３０ｎｍの光を入射させた場合における吸光度は各々図６のようになった。
【００８４】
図６に示すように、最も高い吸光度を示したのはチタニア（Ｔｉ）であり、アルミナ（Ａｌ）、カオリン（Ｋａｏ）の順番で吸光度は低くなった。また、ベントナイト（Ｂｅｎ）、酸化マンガン（Ｍｎ）、ハイドロキシアパタイト（ＨＡＰ）、シリカ（Ｓｉ）の粒子懸濁液ではカオリン（Ｋａｏ）の場合より低い吸光度が得られた。次に、予め５０μＬの注射用蒸留水で溶解しておいたリムルス試薬（和光純薬製ＨＳ−Ｔシングルテスト）に対してこれらの粒子懸濁液５０μＬを加えてボルテックスミキサーで攪拌し、それぞれを６０℃で３０分間処理し、粒子上にリムルス試薬中の蛋白質を固定化した。
【００８５】
アルミナ、ならびに、チタニア原料のものは３．０ｍＬに、それ以外の原料のものは１．５ｍＬになるように注射用蒸留水で希釈し、さらに、それぞれのビーズ液５０μＬをエンドトキシン希釈溶液（０．０２ＥＵ/ｍＬ）で溶解したリムルス試薬（ＥＳ-II、和光純薬製）５０μＬと混和させて、攪拌比濁法測定装置（ＥＸ−１００、興和製）を用いて凝集反応を調べた。
【００８６】
測定結果を図７に示す。図７においては、今回調べた無機性の粒子では、既に効果について述べたチタニア、アルミナのほかに、カオリン、酸化マンガンにおいても凝集反応初期にビーズ１が会合して光透過率が上昇する現象が顕著であることが確認された。一方、シリカ、ベントナイトを用いた場合は、凝集反応初期に光透過率が上昇する相が小さく、ＬＡＬ結合ビーズ試薬を用いることによる効果はあまり大きくなかった。図８にはシリカを用いた場合の結果を示す（図８中の領域Ａはエンドトキシン凝集反応と無関係に光透過率が減少していく相、領域Ｂは若干粒子の凝集により光透過率が上昇しているように見える相である）。シリカを用いた場合に上記のように光透過率の上昇が弱くなる原因としては、重量あたりの吸光度が低いことが主因として挙げられる。
【００８７】
また、ビーズ１としてハイドロキシアパタイトを用いた場合は、ＬＡＬとエンドトキシンとの反応に起因する凝集反応とは無関係に光透過率が減少して行く現象が観察された。ハイドロキシアパタイトにおけるこの現象の原因としては、ハイドロキシアパタイトは機械的強度が弱く、攪拌により崩壊してしまうため、凝集反応とは無関係に崩壊したビーズ１による光透過率の減少が生じたためと考えられる。図９には、ハイドロキシアパタイトの崩壊による光透過率の変化のグラフを示す。
【００８８】
上記より、ＬＡＬ結合ビーズ試薬を製造するに当たっては、ビーズ１の素材として、（１）蛋白質の吸着性が高い。（２）重量あたりの吸光度が高い。（３）攪拌という外力に対して崩壊しないだけの機械的強度を有する。という条件を満たすものが望ましいことが確認された。また、アルミナ、チタニア、カオリン、酸化マンガンは、上記の条件を満たすことで、ビーズ１として充分に使用可能な素材であることが確認された。
【００８９】
なお、本発明の微粒子に使用される無機性の素材は、例示されたものに限られないことは当然である。（１）蛋白質の吸着性が高い。（２）重量あたりの吸光度が高い。（３）攪拌という外力に対して崩壊しないだけの機械的強度を有する。という条件を満たす素材であれば使用することができる。それらの条件を満たす素材の組成が複合化合物である場合はもちろんのこと、組成の異なるビーズを複数混合したものであっても良い。例えば、シリカアルミナ、アルミナチタニア、チタニアジルコニア等を使用することも可能であるし、アルミナ、チタニア、シリカを素材としたビーズを適当な割合で混合して使用しても構わない。
【００９０】
なお、本実施形態における製造例１及び２では、ＬＡＬ中に含まれる蛋白質を選別することなくビーズ１に吸着させてＬＡＬ結合ビーズ試薬を調製している。しかし、上記の実施例のように、ＬＡＬ結合ビーズ試薬をさらにＬＡＬ試薬と混合した上で、エンドトキシンを含有する試料と混和し、ＬＡＬ結合ビーズ１０を凝集させる場合には、ＬＡＬ結合ビーズ１０を形成するビーズ１上にはなるべく多くのコアギュロゲンが吸着していることが望ましい。従って、ＬＡＬ結合ビーズ１０を生成する際には、ＬＡＬ中に含まれる蛋白質を選別することなくビーズ１に結合させるよりもむしろ、精製したコアギュロゲンをビーズ１に吸着させるようにしてもよい。
【００９１】
なお、上記の実施例において調製されたＬＡＬ結合ビーズ試薬は、本発明におけるエンドトキシンの測定用試薬キットに相当する。
【符号の説明】
【００９２】
１・・・ビーズ
２・・・コアギュロゲン
３・・・コアギュロゲン
１０・・・ＬＡＬ結合ビーズ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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