(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）生体分子、およびトリエチレンテトラミンとエチレングリコールジグリシジルエーテルとの反応によって得ることができるポリマーからの複合体の製造、および
ｉｉ）細胞を複合体と接触させることによる、生体分子の細胞への導入
の段階を含む、生体分子を細胞へ導入するためのin vitroの方法であって、前記生体分子は核酸であり、かつ前記ポリマーが１ないし５００ｋＤａの範囲の分子量を有する方法。
【請求項２】
段階ｉ）における複合体の調製が、ポリマーを生体分子とｐＨ値６ないし８の範囲にて接触させることによって実施される点で特徴づけられる、請求項１で請求される方法。
【請求項３】
生体分子がデオキシリボ核酸である点で特徴づけられる、請求項１または２で請求される方法。
【請求項４】
ポリマー中に存在するアミノ基または水酸基が以下から選択される１以上の修飾で化学的に修飾される点で特徴づけられる、請求項１〜３のいずれか一項で請求される方法：ビオチン基の結合；アビジン、ストレプトアビジン、トランスフェリンおよびガラクトシドからなる群より選択されるエフェクター基での修飾；前記ポリマーをグリシドールで処理することによる末端ジオール基の形成；前記ポリマーをブロモ酢酸またはその塩で処理することによる負に荷電した基の作製；硫酸ジメチル、臭化メチル、メチルトシラートおよびメチルメシラートからなる群より選択されるアルキル化剤での処理による前記アミノ基の少なくとも一部の四級化；ならびにアミノ基のアルギニン基への変換。
【請求項５】
トリエチレンテトラミンとエチレングリコールジグリシジルエーテルとの反応によって得ることができるポリマーを含む、生体分子の細胞への導入剤であって、前記生体分子は核酸であり、かつ前記ポリマーが１ないし５００ｋＤａの範囲の分子量を有する導入剤。
【請求項６】
生体分子がデオキシリボ核酸である点で特徴づけられる、請求項５で請求される導入剤。
【請求項７】
（β１）トリエチレンテトラミンとエチレングリコールジグリシジルエーテルとの反応によって得ることができる、請求項１から４のうちの一つで定義されるポリマー、および
（β２）他のキット成分
を含む、生体分子を細胞へ導入するためのキットであって、前記生体分子は核酸であるキット。
【請求項８】
生体分子がデオキシリボ核酸である点で特徴づけられる、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
請求項７または８で請求されるキットを使用する点で特徴づけられる、請求項１から４のうちの一つで請求される方法。
【請求項１０】
遺伝子治療に用いられる細胞の製造方法であって、
ｉ）生体分子、および少なくともトリエチレンテトラミンとエチレングリコールジグリシジルエーテルとの反応によって得ることができるポリマーからの複合体の製造であって、前記生体分子は核酸であり、前記ポリマーは１ないし５００ｋＤａの範囲の分子量を有する製造、および
ｉｉ）細胞を複合体と接触させることによる、生物から採取された細胞への生体分子の導入の段階を含む、製造方法。
【請求項１１】
生体分子がデオキシリボ核酸である点で特徴づけられる、請求項１０で請求される製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子を細胞内へ導入するための方法、生体分子を細胞内へ導入するための特定のポリマーの使用、生体分子を細胞内へ導入するためのキット、生体分子を細胞内へ導入するための前記キットの使用、生体分子およびポリマーの複合体、治療用組成物、生体分子およびポリマーの複合体の使用、遺伝子治療による疾患の治療のためのポリマー、および遺伝子治療による疾患の治療のための方法に関する。
【０００２】
外来核酸、特に外来ＤＮＡを、細胞内へ組み込む（形質転換またはトランスフェクション）ための多数のさまざまな方法が先行技術で公知である。ｉｎ ｖｉｖｏ形質転換のためには、本質的に２つの方法が使用される：ウイルス媒介性遺伝子導入、および陽イオン性リポソームまたはたとえばポリエチレンイミン、ポリ−Ｌ−リジンまたはポリ−Ｌ−アルギニンといった陽イオン性ポリマーによる形質転換。使用されるウイルスベクターは、アデノウイルスおよびレトロウイルスを含み、それらは非ウイルスＤＮＡを有糸分裂活性な細胞にトランスフェクションできる。陽イオン性リポソームは、ＤＮＡの負に荷電したリン酸骨格と相互作用する。
【０００３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ形質転換に適した一方法は、リン酸カルシウム沈澱法であり、塩化カルシウムおよびリン酸ナトリウムの混合物中で、導入すべきＤＮＡが沈澱するリン酸カルシウムに結合する。沈澱した結晶は細胞培養に添加され、およびエンドサイトーシスによって細胞に取り込まれる。この化学的形質転換法に加えて、ＤＮＡを細胞核へ、または細胞へ直接注入するために注入器具が用いられるマイクロインジェクション、電気パルスによって細胞膜をＤＮＡ透過性にするエレクトロポレーション、およびＤＮＡで被覆された金属小球を用いて外来ＤＮＡが細胞内へ打ち込まれるいわゆるパーティクルガン法といった多数の物理的ｉｎ ｖｉｔｒｏ形質転換法もまた知られている。
【０００４】
上記のｉｎ ｖｉｔｒｏ形質転換法の特有の短所は、その方法がしばしば非常に細胞特異的であることである。リン酸カルシウム沈澱法では、形質転換過程はさらに、正しい塩濃度の選択に高度に依存し、および実験技能および細胞の種類によって経験が必要である。さらにより重要なことに、しかし、先行技術で記載される形質転換法は、適当な形質転換効率を有する形質転換試薬はしばしば高度に細胞毒性であり、一方、細胞毒性がもしあっても非常に低い試薬はしばしば不十分な形質転換効率を特徴とする、という短所を有する。
【０００５】
代替法として、これらの短所を克服するために、細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ形質転換またはトランスフェクションに陽イオン性ポリマーが使用される。たとえば、ＤＮＡのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）との複合体化は、遺伝子を細胞内へ輸送するためにうまく使用されうることが知られている（ブシフ（Ｂｏｕｓｓｉｆ）他、１９９５；ブシフ（Ｂｏｕｓｓｉｆ）他、１９９６；アブダラ（Ａｂｄａｌｌａｈ）他、１９９６）。この場合、遺伝子導入は複合体がランダムに細胞へ結合しおよび取り込まれることによって起こる。ポリエチレンイミンと同様に、ポリ−Ｌ−リジンのような塩基性アミノ酸のホモポリマー、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリアミド、ポリアリルアミン、陽イオン性メタクリレート、キトサン、またはポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド・グリコリド共重合体）（ＰＬＧＡ）のような樹状陽イオン性ポリマーもまた、細胞のトランスフェクションのための陽イオン性ポリマーとして用いられる。細胞のトランスフェクションに使用されうる陽イオン性ポリマーの総説は、たとえばホルトーフ（Ｈｏｌｔｏｒｆ）およびミコス（Ｍｉｋｏｓ）によって『陽イオン性および非縮合ポリマーを基礎とする遺伝子送達』（“Ｃａｔｉｏｎｉｃ ａｎｄ ｎｏｎ−ｃｏｎｄｅｎｓｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒ−ｂａｓｅｄ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ”）、核酸を基礎とする治療薬の薬学的展望（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ−Ｂａｓｅｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ），２００２（１８３），３６７−３８７ページで示される。
【０００６】
先行技術で公知であるこれらの陽イオン性ポリマーの短所は、それらが低いトランスフェクション効率しか有しないか、またはそれらが十分なトランスフェクション効率を特徴とするがしかししばしば高度に細胞毒性であるかのどちらかである。さらに、先行技術で公知であるポリマーの一部、特に樹状ポリマーについて、合成のコストが不釣り合いに高い。たとえば、４２ｋＤａ ＰＡＭＡＭデンドリマーを合成するためには何週間もかかる。
【０００７】
本発明の一つの目的は、細胞の形質転換、特にｉｎ ｖｉｔｒｏ形質転換において先行技術から生じる短所を克服することであった。
【０００８】
本発明の別の目的は、高い形質転換効率を特徴とする、形質転換細胞の製造のための方法を提供することであった。加えて、可能なら、その方法は細胞毒性である助剤の使用を必要としない。
【０００９】
本発明のもう一つの目的は、形質転換すべき細胞集団の特性および特定の形質転換条件に、可能な最低の合成コストで、形質転換に使用する助剤を適応させることが可能である、形質転換細胞の製造のための方法を提供することであった。使用する助剤が可能な限り容易におよび安価に製造されることもまた可能であるべきである。
【００１０】
前述の目的の達成への貢献が、生体分子を細胞内へ導入するための方法によって提供され、その方法は下記の段階を含む：
ｉ）少なくとも２つのアミン基を有するアミンモノマーの、少なくとも２つのエポキシド基を有するエポキシドモノマーとの反応によって得ることができる、生体分子、好ましくは核酸、およびポリマーからの複合体の調製、および
ｉｉ）細胞を複合体と接触させることによって、生体分子を細胞内へ導入。
【００１１】
全く驚くべきことに、ジアミンのジエポキシドとの重付加反応によって作製されうるポリマーを用いて、生体分子が高い効率でおよびわずかな細胞毒性ストレスだけで、細胞内へ輸送されうることが見出された。
【００１２】
本発明に記載の方法の段階ｉ）において、まず複合体が生体分子およびポリマーから調製され、ポリマーは、少なくとも２つのアミン基を有するアミンモノマーの、少なくとも２つのエポキシド基を有するエポキシドモノマーとの反応によって得ることができる。
【００１３】
好ましくは、本発明に記載の方法が細胞の形質転換に適するように、複合体の調製のための段階ｉ）で使用される生体分子は、核酸である。「形質転換」の語はここでは、生体分子、特に核酸、好ましくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を任意の細胞へ導入する過程を非常に一般的にいう。それはまた、外来ＤＮＡが培養細胞へ導入される、トランスフェクションという特別な場合を特に含む。「形質転換」の語は、細胞へのたとえば遺伝子といったＤＮＡの一時的だけの導入（一過性形質転換）、および細胞のゲノムへのＤＮＡの永続的な組み込み（安定形質転換）の両方を含む。
【００１４】
複合体の調製のための段階ｉ）に使用される核酸は、およびその同意語としてポリヌクレオチドの語もまた使用でき、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、または混合型でもありうるが、デオキシリボ核酸が特に好ましい。一般的に、核酸はプリン又はピリミジン塩基の、または修飾プリンまたはピリミジン塩基の、Ｎ−グリコシドまたはＣ−グリコシドである任意の種類のポリヌクレオチドであることができ、したがってまた天然に存在しない塩基も含みうる。塩基自体以外に、糖残基もまた修飾されうる。核酸は、サブユニットの修飾結合、たとえばホスホロチオレートまたはホスホロアミデート結合を有する核酸を含む。核酸は、一本鎖、二本鎖または多重鎖、直鎖または環状でありうる。核酸は、たとえばゲノムＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のように細胞中に存在する分子に相当しうるか、または相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）、または合成核酸のようにｉｎ ｖｉｔｒｏで作製されうる。核酸は、数個のサブユニット、少なくとも２つのサブユニット、好ましくはたとえばオリゴヌクレオチドのように８個以上のサブユニット、たとえばある種の発現ベクターのように数百サブユニットおよび最大数千サブユニットから成ることができる。好ましくは核酸は、核酸が挿入される細胞においてポリペプチドの発現を可能にする調節配列と機能的関係にある、ポリペプチドについてのコード情報を含む。
【００１５】
したがって、好ましい一実施形態では、核酸は発現ベクターである。別の一実施形態では、核酸はｐＤＮＡ（プラスミドＤＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ二重鎖、ｓｉＲＮＡヘテロ二重鎖またはｍｉＲＮＡであり、「ｓｉＲＮＡ」の語は、酵素「ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）」による二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の切断から生じおよび酵素複合体「ＲＩＳＣ」（ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体）に組み込まれている約２２塩基のリボ核酸をいう。合成ｓｉＲＮＡもまた、段階ｉ）において生体分子として使用されうる。
【００１６】
核酸に加えて、生体分子としてオリゴペプチド、タンパク質または脂質も考慮されうる。
【００１７】
段階ｉ）で使用されるポリマーは、少なくとも２つのアミン基を有するアミンモノマーの、少なくとも２つのエポキシド基を有するエポキシドモノマーとの反応によって得ることができる。
【００１８】
本発明に記載の方法の好ましい一実施形態によると、アミンモノマーは構造Ｉの少なくとも２つの官能基を有し、
0005425477.tif 000002
ここで官能基中の残基Ｒ1は、同一でも異なってもよく、およびＣ1〜Ｃ20炭化水素残基、特に好ましくはＣ1〜Ｃ10炭化水素残基および非常に好ましくはＣ1〜Ｃ5炭化水素残基、特にメチル残基、エチル残基、ｎ−プロピル残基またはイソプロピル残基、ヒドロキシ官能性Ｃ1〜Ｃ20炭化水素残基、特に好ましくはヒドロキシ官能性Ｃ1〜Ｃ10炭化水素残基および非常に好ましくはヒドロキシ官能性Ｃ1〜Ｃ5炭化水素残基または代替的に水素原子を表す。さらに、本発明によると、構造Ｉの官能基中の残基Ｒ1のうち少なくとも１つが水素原子であることもまた好ましい。「炭化水素残基」の語はそのとき、炭素原子および水素原子だけから成る残基、および炭素原子および水素原子と共にヘテロ原子、特にハロゲン類の原子もまた含む残基（＝ハロゲン化炭化水素）の両方を含む。
【００１９】
アミン官能基Ｉはしたがって、一級アミン基、二級アミン基または三級アミン基である可能性があり、および少なくとも２つの一級アミン基（この場合には残基Ｒ1の両方が水素原子である）を有するアミンモノマーが最も好ましい。特に好ましい残基Ｒ1は、エチル基、メチル基、−ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ−基および水素原子である。
【００２０】
さらに、本発明によると、アミンモノマーは構造ＩＩを有するのが好ましく、
0005425477.tif 000003
ＩＩ
ここで
Ｘは、存在する場合、酸素原子または窒素原子、特に好ましくは酸素原子または窒素原子であり、および酸素原子の場合には原子Ｘ上のＲ3基は存在せず、およびアミンモノマー中の原子Ｘはまた異なりうる、
構造ＩＩ中のＲ1は、同一でも異なってもよく、およびＣ1〜Ｃ20炭化水素残基、特に好ましくはＣ1〜Ｃ10炭化水素残基および非常に好ましくはＣ1〜Ｃ5炭化水素残基、特にメチル残基、エチル残基、ｎ−プロピル残基またはイソプロピル残基、ヒドロキシ官能性Ｃ1〜Ｃ20炭化水素残基、特に好ましくはヒドロキシ官能性Ｃ1〜Ｃ10炭化水素残基および非常に好ましくはヒドロキシ官能性Ｃ1〜Ｃ5炭化水素残基または代替的に水素原子を表し、
構造ＩＩ中のＲ2は、同一でも異なってもよく、およびＣ1〜Ｃ20アルキレン基、特に好ましくはＣ1〜Ｃ10アルキレン基および非常に好ましくはＣ1〜Ｃ6アルキレン基またはＣ1〜Ｃ200オキシアルキレン基、特に好ましくはＣ1〜Ｃ50オキシアルキレン基および非常に好ましくはＣ2〜Ｃ10オキシアルキレン基を表し、残基Ｒ2として残基−ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−および−ＣＨＣＨ3ＣＨ2−が特に好ましくおよび−ＣＨ2ＣＨ2−が非常に好ましく、
ｎは、Ｒ2がアルキレン基である場合は、０ないし６、特に好ましくは１ないし５、さらにより好ましくは１ないし３および非常に好ましくは１ないし３の範囲の整数であり、およびＲ2がオキシアルキレン基である場合には、０ないし１００、特に好ましくは１ないし５０、さらにより好ましくは２ないし２５および非常に好ましくは２ないし１０の範囲の整数であり、および
構造ＩＩ中のＲ3は、同一でも異なってもよく、およびＣ1〜Ｃ20炭化水素残基、特に好ましくはＣ1〜Ｃ10炭化水素残基および非常に好ましくはＣ1〜Ｃ5炭化水素残基、特にメチル残基、エチル残基、ｎ−プロピル残基またはイソプロピル残基、ヒドロキシ官能性Ｃ1〜Ｃ20炭化水素残基、特に好ましくはヒドロキシ官能性Ｃ1〜Ｃ10炭化水素残基および非常に好ましくはヒドロキシ官能性Ｃ1〜Ｃ5炭化水素残基、水素原子または構造ＩＩＩの残基を表し、
0005425477.tif 000004
特にＲ1＝ＨおよびＲ2＝−ＣＨ2ＣＨ2−の残基−ＣＨ2−ＣＨ2−ＮＲ1Ｈが残基Ｒ3として非常に好ましい。
【００２１】
上記の構造ＩＩを有する、本発明に記載の特に好ましいアミンモノマーは、下記のモノマーａ〜ｎを含む群から選択される：
0005425477.tif 000005
【００２２】
構造ＩＩを有する上記のアミンモノマー以外で、本発明に記載の方法の別の一実施形態によると、ポリマーの製造のために、随意的にヘテロ原子置換された芳香族環系、特に好ましくは随意的にヘテロ原子置換された芳香族Ｃ6またはＣ10環系を含み、構造Ｉ
0005425477.tif 000006
Ｉ
の少なくとも２つの官能基が結合していてＲ1が上記で定義される通りのアミンモノマーを使用することもまた可能である。
【００２３】
「芳香族環系」とは、好ましくはヒュッケル（Ｈｕｅｃｋｅｌ）則を満たすｓｐ2混成炭素原子の任意の環系を意味し、ここで随意的にまた１個以上のハロゲン原子、たとえばフッ素または塩素（＝ハロゲン化芳香族）、１個以上のアルキル基、特にメチル基、または１個以上の水酸基が炭素原子へ結合しうる。
【００２４】
ポリマーの調製に使用されるエポキシドモノマーは、好ましくは、構造ＩＶの少なくとも２つの官能基を有するエポキシドモノマーであり、
0005425477.tif 000007
ここで構造ＩＶ中の残基Ｒ4は、同一でも異なってもよく、およびＣ1〜Ｃ20炭化水素残基、特に好ましくはＣ1〜Ｃ10炭化水素残基および非常に好ましくはＣ2〜Ｃ5炭化水素残基、特にメチル残基、エチル残基、ｎ−プロピル残基またはイソプロピル残基、ヒドロキシ官能性Ｃ1〜Ｃ20炭化水素残基、特に好ましくはヒドロキシ官能性Ｃ1〜Ｃ10炭化水素残基および非常に好ましくはヒドロキシ官能性Ｃ2〜Ｃ5炭化水素残基または水素原子を表し、残基Ｒ4として水素原子が非常に好ましい。
【００２５】
本発明に記載の特に好ましいエポキシドモノマーは、構造Ｖを有し、
0005425477.tif 000008
ここで
Ｒ4は上記で定義される通りであり、および
Ｒ5は、存在する場合、
Ｃ1〜Ｃ20アルキレン基、特に好ましくはＣ1〜Ｃ10アルキレン基および非常に好ましくはＣ1〜Ｃ6アルキレン基を表し、アルキレン基として−ＣＨ2ＣＨ2−、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−または−ＣＨＣＨ3ＣＨ2−が特に好ましく、および−ＣＨ2ＣＨ2−が非常に好ましく、または構造ＶＩの基であり、
0005425477.tif 000009
ここでＲ6は
Ｃ1〜Ｃ20アルキレン基、特に好ましくはＣ1〜Ｃ10アルキレン基および非常に好ましくはＣ1〜Ｃ6アルキレン基を表し、ここで
−ＣＨ2ＣＨ2−、
−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−、
−ＣＨＣＨ3ＣＨ2−、
[−ＣＨ2ＣＨ2−]n、ｎ＝１〜１０、
[−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−]n、ｎ＝１〜１０、
[−ＣＨＣＨ3ＣＨ2−]n、ｎ＝１〜１０、
またはエチレンおよびプロピレン単位を含むポリアルキレンが、アルキレン基として特に好ましく、
またはＣ1〜Ｃ200オキシアルキレン基、特に好ましくはＣ2〜Ｃ100オキシアルキレン基および非常に好ましくはＣ2〜Ｃ5オキシアルキレン基を表し、ここで
[−ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−]nＣＨ2−、ｎ＝２〜１００、
[−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−Ｏ−]nＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−、ｎ＝２〜１００、
[−ＣＨＣＨ3ＣＨ2−Ｏ−]nＣＨＣＨ3ＣＨ2−、ｎ＝２〜１００、
またはオキシエチレンおよびオキシプロピレン単位を含むポリオキシアルキレンが、オキシアルキレン基として特に好ましい。
【００２６】
上記の構造Ｖを有する、本発明に記載の特に好ましいエポキシドモノマーは、下記のモノマーＡ〜Ｆを含む群から選択される：
0005425477.tif 000010
【００２７】
複合体の調製のための段階ｉ）における使用に好ましい、本発明に記載のポリマーは、特に下記のモノマー成分の反応によって得ることができるものである：ａＡ、ａＢ、ａＣ、ａＤ、ａＥ、ａＦ、ｂＡ、ｂＢ、ｂＣ、ｂＤ、ｂＥ、ｂＦ、ｃＡ、ｃＢ、ｃＣ、ｃＤ、ｃＥ、ｃＦ、ｄＡ、ｄＢ、ｄＣ、ｄＤ、ｄＥ、ｄＦ、ｅＡ、ｅＢ、ｅＣ、ｅＤ、ｅＥ、ｅＦ、ｆＡ、ｆＢ、ｆＣ、ｆＤ、ｆＥ、ｆＦ、ｇＡ、ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇＦ、ｈＡ、ｈＢ、ｈＣ、ｈＤ、ｈＥ、ｈＦ、ｉＡ、ｉＢ、ｉＣ、ｉＤ、ｉＥ、ｉＦ、ｊＡ、ｊＢ、ｊＣ、ｊＤ、ｊＥ、ｊＦ、ｋＡ、ｋＢ、ｋＣ、ｋＤ、ｋＥ、ｋＦ、ｌＡ、ｌＢ、ｌＣ、ｌＤ、ｌＥ、ｌＦ、ｍＡ、ｍＢ、ｍＣ、ｍＤ、ｍＥ、ｍＦ、ｎＡ、ｎＢ、ｎＣ、ｎＤ、ｎＥ、ｎＦ、ｏＡ、ｏＢ、ｏＣ、ｏＤ、ｏＥ、ｏＦ、ｑＡ、ｑＢ、ｑＣ、ｑＤ、ｑＥ、ｑＦ、ｒＡ、ｒＢ、ｒＣ、ｒＤ、ｒＥ、ｒＦ、ｓＡ、ｓＢ、ｓＣ、ｓＤ、ｓＥ、ｓＦ、ｔＡ、ｔＢ、ｔＣ、ｔＤ、ｔＥ、ｔＦ、ｕＡ、ｕＢ、ｕＣ、ｕＤ、ｕＥ、ｕＦ、ｖＡ、ｖＢ、ｖＣ、ｖＤ、ｖＥ、ｖＦ、ｗＡ、ｗＢ、ｗＣ、ｗＤ、ｗＥおよびｗＦ。
【００２８】
アミンモノマーおよびエポキシドモノマーの間の反応は付加反応であり、ここで一級または二級アミン基を有するアミンモノマーが使用された場合は、構造ＶＩＩの少なくとも２つの構造単位を有するポリマーが形成され、
0005425477.tif 000011
およびここでＲ1およびＲ4は前記で定義される通りである。
【００２９】
しかし、三級アミン基を含むアミンモノマーが使用された場合は、構造ＶＩＩＩの少なくとも２つの構造単位を有するポリマーが形成され、
0005425477.tif 000012
ここでＲ1およびＲ4はまた上記で定義される通りである。
【００３０】
アミンモノマーおよびエポキシドモノマーからの重付加反応によるポリマーの合成は、この重合反応について当業者に公知である方法で実施されうる。当業者は、簡単な予備試験によって、目的産物の望まれる性質に関連して、特に望まれる分子量に関連して、反応条件、特に溶媒の種類、原料（アミンモノマーおよびエポキシドモノマー）の濃度、反応温度および反応時間を決定する。
【００３１】
通常、反応はまず、アミンモノマーおよびエポキシドモノマーの両方を、適当な溶媒に溶解または分散、好ましくは溶解することによって実施され、好ましくはアミンモノマーおよびエポキシドモノマーの両方が少なくとも部分的に可溶である溶媒を使用する。適当な溶媒の例は、水、たとえばメタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール、ｎ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノールまたはイソブタノールのようなアルコール、エーテル、ケトン、炭化水素、ハロゲン化炭化水素、アルコキシアルカノール、好ましくはアルコキシプロパノール、アルキルピロリドン、たとえばＮ−メチルピロリドン、ジアルキルスルホキシド、たとえばジメチルスルホキシド、またはこれらの溶媒の少なくとも２つの混合物である。
【００３２】
付加物生成の最初には、溶媒中の各モノマーの濃度は通常は、１ないし１００００ｍｍｏｌ／ｌの範囲、特に好ましくは１０ないし５０００ｍｍｏｌ／ｌ、さらにより好ましくは５０ないし１０００ｍｍｏｌ／ｌおよび非常に好ましくは１００ないし５００ｍｍｏｌ／ｌの範囲である。
【００３３】
さらに、ポリマーが同一の構造のアミンモノマーからおよび同一の構造のエポキシドモノマーから調製される場合、アミンモノマーおよびエポキシドモノマーを、アミンモノマーのエポキシドモノマーに対するモル比２：１ないし１：２、特に好ましくは１．５：１ないし１：１．５および非常に好ましくはモル比約１：１で使用することが有利でありうる。
【００３４】
付加反応は通常は、１０ないし２００℃の範囲の温度にて、特に好ましくは２０ないし１５０℃および非常に好ましくは５０ないし１００℃にて実施され、反応時間および反応に必要な温度は本質的にモノマーの反応性に依存する。通常は、付加反応は約０．５〜１０時間、特に好ましくは約１〜５時間を要する。一級アミン基を有するアミンモノマーを使用する場合、反応は通常は一級アミン基をもう検出できなくなるまで実施される一方、二級または三級アミン基を有するアミンモノマーを使用する場合、反応は二級または三級アミン基がもう検出可能でなくなるまで実施される。
【００３５】
本発明に記載の方法の特別の一実施形態によると、複合体の調製のための段階ｉ）で使用されるポリマーは、構造的に異なるアミンモノマーの、エポキシドモノマーとの反応によって得ることができる。たとえば、本発明に記載の方法のこの特別の一実施形態では、親水性および疎水性アミンモノマーを使用することが可能である。
【００３６】
構造的に異なる２つのアミンモノマーを使用する場合、ポリマーの製造について２つの手順が考えられる。一方では、両方のアミンモノマーをエポキシドモノマーと共に適当な溶媒に溶解または懸濁することができ、およびこの場合には、エポキシドモノマーに関して両方のアミンモノマーが概ね同一の反応性を有するならば、ポリマー中でモノマーのランダムな分布を得る。他方では、しかし、一方のアミンモノマーを過剰のエポキシドモノマーとまず反応させ、アミンモノマーのエポキシドモノマーに対するモル比が多くても０．５：１、特に好ましくは多くても０．２５：１および非常に好ましくは多くても０．１：１であることもまた可能である。この方法では、鎖の末端に反応性エポキシド基を有するポリマーが得られる。第一のアミンモノマーをエポキシドモノマーと反応させた後、このように得られたポリマーを反応混合物の残りの成分、特にまだ存在するエポキシドモノマーから分離し、および前記分離は、当業者に公知である分離方法、たとえば抽出、蒸留、結晶化または透析によって、特に好ましくは透析によって実施されうる。次いでポリマーを、それが今は未反応のモノマーの除去後に純物質の形で存在するとして、再び適当な溶媒に溶解し、および、第二のアミンモノマーが今度はポリマーの末端エポキシド基へ付加するように、第二のアミンモノマーと接触させる。
【００３７】
もちろん、同様に、２種類の構造的に異なるエポキシドモノマーおよび１種類のアミンモノマーからポリマーを調製することもまた可能である。さらに、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４または少なくとも５種類の構造的に異なるアミンモノマーを使用すること、および／または少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４または少なくとも５種類の構造的に異なるエポキシドモノマーを使用することもまた考えられる。
【００３８】
重付加反応の完了に際して、未反応のアミンおよび／またはエポキシドモノマーと共に、使用した溶媒中に溶解または分散しているポリマーが得られる。本発明に記載の方法の段階ｉ）における複合体の調製のためにポリマーを使用する前に、したがって、反応混合物を処理、特にポリマーを反応混合物の残りの成分から分離することが好ましい。分離方法として、再び特に抽出、蒸留、結晶化または透析を考慮することができ、透析では溶媒中に直接溶解または分散してポリマーが得られるため、透析が特に好ましい。加えて、透析膜の選択に応じて、透析は特定のサイズのポリマーの選択的単離を与える。反応混合物の残りの成分からのポリマーの分離に加えて、ポリマーを、または透析の場合には、ポリマーおよび溶媒の組成物を滅菌することもまた好ましく、および再び当業者に公知であるすべての滅菌法、たとえば滅菌ろ過、γ照射、ＵＶ光照射またはオートクレーブを使用でき、滅菌ろ過が最も好ましい。
【００３９】
特に好ましい一実施形態によると、モノマーが反応混合物の残りの成分から分離され、およびポリマーが次いで滅菌され、まず反応混合物を水で、反応混合物の水に対する体積比５：１ないし１：５、特に好ましくは２：１ないし１：２の範囲で、および非常に好ましくは約１：１で希釈し、およびこのように得られた希釈された反応混合物を次いで、分子量カットオフが多くとも１０ｋＤａ、特に好ましくは多くとも５ｋＤａおよび非常に好ましくは多くとも１ｋＤａの透析膜を用いて、好ましくは水系溶媒に対して、たとえば脱塩水に対して、生理食塩水に対して、または栄養培地に対して透析する。水に対して透析された場合、この方法で得られたポリマー水溶液から、次いで水を好ましくは凍結乾燥法によって分離し、およびこの場合には純粋なポリマーを得ることができる。このポリマーを次いで、好ましくは水系媒体に、たとえば脱塩水に、ＰＢＳのような生理食塩水または栄養培地に再懸濁し、および次いで滅菌ろ過する。この方法で得られた滅菌ポリマー水溶液は、好ましくは０．１ないし５００ｍｇ／ｍｌ、特に好ましくは０．５ないし１００ｍｇ／ｍｌおよび非常に好ましくは１ないし１０ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度でポリマーを含む。透析直後に得られた好ましくは水系のポリマー溶液を、直ちに滅菌することもまた考えられる。重要：ｉｎ ｖｉｔｒｏ使用のためには、試薬は無菌でなければならない。
【００４０】
段階ｉ）に使用されるポリマーの、質量分析によって決定される分子量は、好ましくは０．１ないし５００ｋＤａ、特に好ましくは１ないし１００ｋＤａおよび非常に好ましくは１０ないし５０ｋＤａの範囲である。特に、反応時間、モノマーの濃度、溶媒、反応温度、アミンモノマーのエポキシドモノマーに対するモル比、および透析膜のカットオフ値を変えることによって、ポリマーの平均分子量を簡単な方法で調節することができ、およびしたがって形質転換効率もまた、意図される特定の形質転換について最適化されうる。
【００４１】
さらに、本発明に記載の方法の特別の一実施形態によると、反応混合物の残りの成分からの分離前に、または後でさえ、ポリマーを化学的に修飾することもまた有利である可能性があり、修飾は好ましくはポリマー中に存在するアミノ基または水酸基上で実施される。本発明に記載の好ましい修飾は、細胞へのポリマーの取り込みを促進する修飾である。本発明に記載の好ましい修飾は、たとえばＤＥ−Ａ−１００ １６ ８８１に記載される通りのビオチン基の結合を含む。陽イオン性ポリマーへのエフェクター基の結合による細胞への核酸のターゲッティング導入に関する可能性についてのこの文書での開示は参照により本開示に含まれおよび本発明の開示の一部を成す。ビオチン基に加えて、アミン基または水酸基もまた他のエフェクター基で、たとえばアビジンまたはストレプトアビジンで、特定の細胞受容体と結合するリガンドで、たとえばトランスフェリンでまたは糖質で、特にガラクトシドで、またはタンパク質伝達ドメインを持つペプチドで修飾されうる。さらに、グリシドールでの処理によって末端ジオール基をポリマー中に形成でき、またはブロモ酢酸またはその塩での処理によって負に荷電した基をポリマー中に作製できる。さらに、ポリマー中に存在するアミノ基は、たとえば硫酸ジメチル、臭化メチル、メチルトシラートまたはメチルメシラートといったアルキル化剤での処理によって少なくとも一部が四級化されうる。アミノ基のアルギニン基への少なくとも一部の変換もまた考えられる。
【００４２】
段階ｉ）において生体分子およびポリマーから製造される複合体は、生体分子をポリマーと接触させることによって得られ、複合体は静電相互作用の結果として構築される。随意的に生体分子はまた、それが核酸である場合は、ポリマーと接触させる前に、適当なエンハンサーとの、特にサケ精子由来の硫酸プロタミンなどといったポリペプチドとのインキュベートによってまず濃縮されうる。細胞への取り込みを促進するために生体分子をペプチドと接触させることもまた考えられる。生体分子、特に核酸を細胞へ導入するために、ポリマーを、別の形質転換剤、たとえばリポソーム脂質または非リポソーム脂質と組み合わせて、または化学的に異なるポリマーとの混合物で使用することがさらに考えられる。
【００４３】
好ましくは生体分子をポリマーと、生体分子のポリマーに対する重量比１０：１ないし１：５０の範囲で、特に好ましくは１：１ないし１：３０の範囲で、および非常に好ましくは１：２ないし１：２０の範囲で接触させる。当業者は、所定の実験によって混合物の最適比を決定できる。好ましくは、生体分子が核酸である場合、正電荷過剰の場合は、ポリマーの生体分子に対する比は、ゼータ電位が約＋２０〜＋５０ｍＶとなるように設定される。
【００４４】
生体分子のポリマーとの接触は、好ましくは水溶液、たとえば生理食塩水、緩衝液または栄養培地中で起こり、接触は特に好ましくはｐＨ値５ないし８、特に好ましくは５．５ないし７．５の範囲にて、および温度４ないし４０℃、特に好ましくは１０ないし３７℃および非常に好ましくは１５ないし２５℃の範囲にて実施される。有利には、この接触は成分の水溶液を合わせることによって実施され、およびこれらの溶液のうち一方または両方はまた緩衝されていてもよく、および随意的に他の添加物を含みうる。特に好ましくは、接触は、生体分子と形成される複合体が生理食塩水濃度で解離しない条件で実施され、たとえば生体分子が核酸である場合は、エチジウムブロマイド置換検定（プランク（Ｐｌａｎｋ）他１９９９）で容易に測定されうる。
【００４５】
本発明に記載の方法の段階ｉｉ）では、上記の生体分子およびポリマーの複合体を細胞と接触させ、生体分子が導入されている細胞が得られ、および前記接触はｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことができるが、細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ処理が特に好ましい。その時、基本的に、生体分子およびポリマーの複合体は細胞の存在下で形成することが可能である（およびしたがって段階ｉ）およびｉｉ）は同時に実施される）。しかし、段階ｉｉ）が段階ｉ）の後に実施されるように、複合体形成は処理すべき細胞の非存在下で起こることが考えられおよび好ましい。
【００４６】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ処理の場合には、細胞または組織を適当な環境で複合体とインキュベートでき、原核生物および真核生物の両方が細胞として考慮される。培養細胞を処理する場合は、複合体または、複合体を含む滅菌水溶液が培地に添加されうる。本発明に記載の方法は、懸濁液中の細胞培養で増殖する細胞（浮遊細胞）および基材表面に接着しながら増殖する細胞接着細胞）の両方に適する。
【００４７】
ｉｎ ｖｉｖｏでの処理については、複合体または、複合体を含む滅菌水溶液は、ヒトを含む動植物に使用されうる。使用は全身または局所、および動物については特に非経口、たとえば静脈、腹腔内、筋肉内、皮内または皮下注射、点滴静注、肺、頬側、鼻、皮膚または経皮投与によることができる。他の投与経路、たとえば経口／経腸投与もまた、適当な条件下でおよび対応する処方を用いて可能である。複合体または、複合体を含む滅菌水溶液はまた、たとえば臓器または腫瘍といった標的組織へ局所的に直接使用されうる。ｉｎ ｖｉｖｏ使用については、複合体は医薬品として適合する形でなければならない。このために、複合体を医薬品として許容される添加物と組み合わせることができる。処方はその時、投与方法に依存する。注射または輸液のためには、複合体はたとえば等張食塩水に、またはＰＢＳまたはリンゲル液のような等張緩衝液に含まれることが可能であり、肺投与のためには、たとえば医薬品として適合するエアロゾルの形でありうる。たとえば投与前に水で再構成されうる凍結乾燥調製物のように、使用目的に応じて、固形処方もまた選択できる。適当な医薬品添加物および処方は、たとえばジェナロ（Ｇｅｎｎａｒｏ）（編）、『レミントン調剤の科学と実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ）第１９版、１９９５年（マック・パブリッシング社（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）、米国ペンシルベニア州イーストン（Ｅａｓｔｏｎ））から当業者に公知である。この方法で、適当な核酸を生体分子として用いて、複合体は遺伝子治療において医薬品として使用されうる。
【００４８】
用量は、疾患の性質、患者の状態、治療手法および他の因子に関連して当業者によって選択される。一般的に、生体分子が核酸である場合、ヒトへの使用にはＤＮＡ投与量は０．１μｇ／ｋｇないし１００μｇ／ｋｇ体重、好ましくは２．５μｇ／ｋｇないし１０μｇ／ｋｇ体重の範囲となる。
【００４９】
最初に述べた目的の達成への寄与はさらに、生体分子が上記の方法によって導入されている細胞によって提供される。
【００５０】
好ましくは細胞の形質転換のために、生体分子を細胞へ導入するための、少なくとも２つのアミノ基を有するアミンモノマーの、少なくとも２つのエポキシド基を有するエポキシドモノマーとの反応によって得ることができる上記のポリマーの使用もまた、最初に述べた目的の達成に寄与する。
【００５１】
最初に述べた目的の達成へのさらなる寄与はまた、好ましくは細胞の形質転換のために、生体分子を細胞へ導入するための、下記を含むキットによって提供される。
（β１）少なくとも２つのアミノ基を有するアミンモノマーの、少なくとも２つのエポキシド基を有するエポキシドモノマーとの反応によって得ることができる上記のポリマー、および
（β２）他のキット成分、特にエンハンサー（核酸の濃縮の目的でまたは取り込み改善のため）、たとえばサケ精子由来の硫酸プロタミン、ＰＢＳのような追加の緩衝液、または生理食塩水、形質転換効率を調節するための試薬、および別の形質転換試薬、たとえばリポソーム脂質または非リポソーム脂質または別のポリマー。
【００５２】
トランスフェクトすべき特定の細胞型に応じて、脂質またはリポソームとのポリマーの組み合わせまたはさまざまなポリマーの混合物が有用でありうる。このように、本特許出願に基づいて作製された、しかし化学的に異なるポリマーの、混合物の使用もまた用いられうる。
【００５３】
最初に述べた目的の達成へのさらなる寄与はまた、生体分子、好ましくは核酸、および少なくとも２つのアミノ基を有するアミンモノマーと少なくとも２つのエポキシド基を有するエポキシドモノマーとの反応によって得ることができる上記のポリマーの複合体によって提供される。この複合体は、たとえば生体分子およびポリマーを、本発明に記載の方法に関連して最初に記載されたように、適当な水系内で接触させることによって得ることができる。
【００５４】
最初に述べた目的の達成へのさらなる寄与はまた、生体分子、好ましくは核酸、および少なくとも２つのアミノ基を有するアミンモノマーと少なくとも２つのエポキシド基を有するエポキシドモノマーとの反応によって得ることができるポリマーの上記の複合体を含む治療用組成物によって提供される。この複合体に加えて、治療用組成物は特に、医薬品として許容される添加物、たとえば生理食塩水もまた含みうる。同様に、そのような医薬組成物の製造のための上記の複合体の使用はまた、最初に述べた目的の達成に寄与する。
【００５５】
最初に述べた目的の達成へのさらなる寄与はまた、人体または動物体の治療用の、好ましくは遺伝子治療による治療のための、少なくとも２つのアミノ基を有するアミンモノマーと少なくとも２つのエポキシド基を有するエポキシドモノマーとの反応によって得ることができる、本発明に記載の方法に関連して記載されたポリマーによって提供される。
【００５６】
最後に、本発明はまた、下記の段階を含む、遺伝子治療による疾患の治療のための方法に関する：
Ｉ）生物からの細胞の採取、
ＩＩ）採取された細胞への生体分子の導入、好ましくは生体分子を細胞へ導入するための本発明に記載の方法による、採取された細胞の形質転換、および
ＩＩＩ）生物へ細胞を戻す。
【００５７】
前記遺伝子治療のために考慮されうる細胞として、特に、採取、生体分子の導入、好ましくは形質転換、および生物からまたは生物への再移植に耐える、十分に抵抗性であるすべての細胞が使用されうる。また、処理細胞の有利な性質から、たとえば形質転換細胞によって分泌されるタンパク質から、生物が十分な利益を得られるように、細胞は可能な限り長命であるべきである。特に、線維芽細胞のような皮膚細胞、肝細胞、Ｔリンパ球のようなＴ細胞、または骨髄細胞が、細胞として特に有利である。
【００５８】
本発明はここで非限定的な実施例に基づいてより詳細に説明される。
【実施例】
【００５９】
実施例（細胞の形質転換）
ポリマーの製造
トリエチレンテトラミン（１０ｍｍｏｌ）およびエチレングリコールジグリシジルエーテル（１０ｍｍｏｌ）をジメチルスルホキシド５０ｍｌに溶解し、および溶液を丸底フラスコ内で３時間６０℃にて調整する。次いで反応混合物を同量の脱塩水で倍量に希釈し、および脱塩水に対して１８時間透析し、水を３回交換した（分子量カットオフ１ｋＤａの透析膜）。透析後、試料を凍結乾燥し、無色透明の粘性物質を得た。これをエンドトキシンフリー脱塩水に溶解し、ポリマー濃度３ｍｇ／ｍｌを得た。このように得られたポリマー水溶液を滅菌ろ過によって滅菌した。
【００６０】
細胞の培養
肝細胞がん細胞株Ｈｕｈ−７を、９６ウェルプレートに、密度２ｘ１０4細胞／ウェルにてウェル当たり１００μｌのＤＭＥＭ培地中に播種した。細胞播種の２４時間後、トランスフェクションを実施した。
【００６１】
複合体の形成
核酸およびポリマーから複合体を形成するために、ＤＭＥＭＳ培地（０．０１μｇ／μｌ＊）に溶解した表１に示すＤＮＡの量（ｐＣＭＶβプラスミド、クロンテック・ラボラトリーズ社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））、およびトリエチレンテトラミンおよびエチレングリコールジグリシジルエーテル（「ＭＫ−７−１１」）から得られたポリマーの滅菌水溶液の表１に示す量を９６ウェルプレートのウェルへピペットで加え、および１０分間室温にてインキュベートした。先行技術で公知である、キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ ＧｍｂＨ）（ドイツ、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ））のトランスフェクション試薬スーパーフェクト（ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ）（登録商標）を用いたトランスフェクションを対照として実施した。
【００６２】
＊手順に関する注意：ＤＮＡおよびポリマーの間の複合体形成は、血清を含まない培地５０μｌ中で実施した。記載の濃度はこの体積に関する。１０分間のインキュベート時間後、血清を含む培地１００μｌをピペットで加えた。合計体積（１５０μｌ）を次いで、あらかじめ培地を除去してあった細胞へ加えた。
【表１】
0005425477.tif 000013
【００６３】
細胞のトランスフェクション
トランスフェクションのために、直前に培地を交換しておき、複合体を細胞へ加え、および４時間３７℃にてインキュベートした。４時間のインキュベート時間後、培地を交換し、複合体を含む溶液を新しい細胞培地と取り替えた。細胞を本発明に記載の複合体と、または核酸およびスーパーフェクト（ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ）の複合体とインキュベート後、トランスフェクション後２日目に細胞を溶解緩衝液（５ｍＭ ＭｇＣｌ2、１％ ＮＰ−４０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて溶解した。トランスフェクション効率を、β−ガラクトシダーゼ検定によって、ＯＮＰＧ（２−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、メルク社（Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）、ドイツ、ダルムシュタット（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ））を基質として用いて測定した。トランスフェクション効率（ｍｌ当たりβ−ガラクトシダーゼ単位で）を図１に示す。
【００６４】
図１から、本発明に記載の方法によって、先行技術で公知である形質転換試薬よりも良好なトランスフェクション効率が達成されうることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１は、従来のトランスフェクション方法と比較して、本発明に記載の方法によるｐＣＭＶβプラスミドを用いるＨｕｈ−７細胞のトランスフェクションにおけるトランスフェクション効率を示す。「ＭＫ−７−１１」の表示は、下記の実施例においてトリエチレンテトラミンおよびエチレングリコールジグリシジルエーテルから得られたポリマーの表示である。
【図１】
0005425477.tif 000014