(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘパリンの構成成分である多糖類の一般的構造を有する、ヘパリンより誘導された硫酸化オリゴ糖の混合物であって、
− 平均分子量１５００〜３０００ダルトン、抗Ｘａ活性１５４.３〜２００ＩＵ／ｍｇ、抗IIａ活性１０ＩＵ／ｍｇ未満、および抗Ｘａ活性／抗IIａ活性の比３０超を有し、
− 混合物の構成成分であるオリゴ糖が、
− 糖単位２〜２６個を含み、
− 該オリゴ糖の末端の一方において４,５−不飽和ウロン酸またはその２−Ｏ−硫酸単位を有し、
− 硫酸オリゴ糖の混合物が：
− ６糖類画分を含み、ここで、前記６糖類画分の８〜１５％が式
【化１】
0005389140.tif 000007
の６糖類ΔIIａ−IIｓ−Ｉｓであり、そして
アルカリまたはアルカリ土類金属塩の形態である、
特徴を有する硫酸化オリゴ糖の混合物を有効成分とする医薬。
【請求項２】
オリゴ糖の混合物のアルカリまたはアルカリ土類金属の塩がナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウム塩から選択されることを特徴とする請求項１記載の医薬。
【請求項３】
オリゴ糖の混合物中における６糖類画分の含有量が１５〜２５％であることを特徴とする請求項１または２に記載の医薬。
【請求項４】
オリゴ糖の混合物の抗IIａ活性が５ＩＵ／ｍｇ未満であることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の医薬。
【請求項５】
オリゴ糖の混合物の抗IIａ活性が０.５〜３.５ＩＵ／ｍｇであることを特徴とする請求項４記載の医薬。
【請求項６】
オリゴ糖の混合物の抗Ｘａ活性／抗IIａ活性の比が５０超であることを特徴とする請求項１〜５の何れか１項に記載の医薬。
【請求項７】
オリゴ糖の混合物の抗Ｘａ活性／抗IIａ活性の比が１００超であることを特徴とする請求項６記載の医薬。
【請求項８】
オリゴ糖の混合物の平均分子量が２０００〜３０００ダルトンであることを特徴とする請求項１〜７の何れか１項に記載の医薬。
【請求項９】
オリゴ糖の混合物の平均分子量が２４００〜２６５０ダルトンであることを特徴とする請求項８記載の医薬。
【請求項１０】
オリゴ糖の混合物の抗Ｘａ活性が１５４.３〜２００ＩＵ／ｍｇであり、抗IIａ活性が０.５〜３.５ＩＵ／ｍｇであり、そして平均分子量が２４００〜２６５０ダルトンであることを特徴とする請求項１〜９の何れか１項に記載の医薬。
【請求項１１】
静脈および動脈の血栓、深静脈血栓、肺塞栓、および心筋梗塞の予防または治療のための請求項１〜１０の何れか１項に記載の医薬。
【請求項１２】
有効成分として請求項１〜１０の何れか１項に記載のオリゴ糖の混合物を少なくとも１つ含み、さらに薬学的に不活性な賦形剤またはベヒクルまたは添加剤１つまたはそれ以上を含む医薬組成物。
【請求項１３】
皮下または静脈内の経路による注射のための溶液、肺経路を意図した吸入のための製剤、または経口経路を意図した投与のための製剤よりなることを特徴とする請求項１２記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヘパリンより誘導した多糖類の混合物、その製造方法およびそれを含有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘパリンは特にその抗凝固作用および抗血栓作用により使用されている動物起源の硫酸化ムコ多糖類の混合物である。
【０００３】
しかしなおヘパリンはその使用の条件を限定する不都合な点を有している。特にその高い抗凝固活性（抗ＩＩａ活性）が出血を誘発する場合がある。
【０００４】
ヘパリンエステルの塩基性脱重合により得られる低分子量のヘパリンが提案されている（ＥＰ４０１４４）が；これらの生成物はなお高い抗ＩＩａ活性を有している。
【０００５】
超低分子量ヘパリンもまた米国特許６３８４０２１号に記載されている。しかしながら、記載されている実施例において得られた抗Ｘａ活性の値は１２０ＩＵを超えておらず、そして得られた抗Ｘａ／抗ＩＩａの比は１５〜５０である。
【０００６】
国際特許出願ＷＯ−０２０８２９５において、超低分子量ヘパリンが米国特許６３８４０２１号とは異なる方法で製造されており、そして、特定の適用例においてもやはり極めて高値となっている抗Ｘａ／抗ＩＩａの比とともに活性１００〜１５０ＩＵを示している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、このクラスの医薬においては、特に１５０ＩＵ／ｍｇより高値の活性を得る際の抗Ｘａ活性、および、抗Ｘａ／抗ＩＩａの比を改善し、これによりヘパリン誘導体の新しい世代を開発する必要性がなお存在している。
【０００８】
従って本発明の１つの目的は、特に脱重合工程の間の水の比率を制御することによる、従来技術の方法を変更することにより抗Ｘａ活性および抗Ｘａ／抗ＩＩａの比を改善させることである。即ちこのようにして得られたヘパリンは優れた抗血栓活性を示し、そして、極めて低いａＩＩａ活性により出血の危険性を低減しながらヘパリンと同様のａＸａ活性を保有する。同様に、本発明の生成物はヘパリンよりも顕著に長い半減期を示す。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
従って本発明の主題は活性化因子Ｘ（Ｘａ因子）に対して、および、活性化因子ＩＩ（ＩＩａ因子）に対して、ヘパリンよりも高い選択的活性を有する、ヘパリンから誘導された多糖類の新しい混合物である。
【００１０】
平均分子量１５００〜３０００Ｄａを有する多糖類の混合物をオリゴ糖と称するものとする。
【００１１】
従って本発明の主題は、ヘパリンの構成成分である多糖類の一般的構造を有し、そして、以下の特徴：
−  平均分子量１５００〜３０００ダルトン、抗Ｘａ活性１２０〜２００ＩＵ／ｍｇ、抗ＩＩａ活性１０ＩＵ／ｍｇ未満、および、抗Ｘａ活性／抗ＩＩａ活性の比３０超を有し
、
−  混合物の構成成分であるオリゴ糖が、糖単位２〜２６個を含み、その末端の一方において４，５−不飽和ウロン酸２−Ｏ−硫酸単位を有し、下記式：
【化１】
0005389140.tif 000002
の６糖類ΔＩＩａ−ＩＩｓ−Ｉｓを含む、
を有する硫酸化オリゴ糖の混合物である。
【００１２】
本発明のオリゴ糖の混合物中に含有される６糖類ΔＩＩａ−ＩＩｓ−ＩｓはＡＴＩＩＩに対する高い親和性を有し、７４０Ｕ／ｍｇより高いａＸａ活性を特徴とする配列である。
【００１３】
本発明のオリゴ糖混合物は、アルカリまたはアルカリ土類金属の塩の形態である。
【００１４】
アルカリまたはアルカリ土類金属の塩としては、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウム塩が好ましい。
【００１５】
平均の分子量は高圧液体クロマトグラフィーにより、連続２本のカラム、例えばＴＳＫ
Ｇ３０００  ＸＬおよびＴＳＫ  Ｇ２０００  ＸＬの商品名の元に販売されているものを使用して測定する。検出は屈折率測定法により行う。使用する溶離剤は硝酸リチウムであり、流量は０．６ｍｌ／分である。系はアガロースポリアクリルアミドゲル（ＩＢＦ）上のクロマトグラフィーによりエノキサパリン（ＡＢＥＮＴＩＳ）の分画により製造した標準物質を用いて補正する。この製造はＢａｒｒｏｗｃｌｉｆｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，１２，２７−３６（１９７７−７８）またはＤ．Ａ．Ｌａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，１２，２５７−２７１（１９７７−７８）に記載の手法に従って行う。結果はＧＰＣ６ソフトウエア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて計算する。
【００１６】
抗Ｘａ活性はＴｅｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，１０，３９９−４１０（１９７７）に記載する色素性基質に対するアミド分解法により、標準物質として低分子量ヘパリンの第１国際標準物質を用いながら測定する。
【００１７】
抗ＩＩａ活性はＡｎｄｅｒｓｏｎ  Ｌ．Ｏ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．，１５，５３１−５４１（１９７９）に記載する手法により、標準物質として低分子量ヘパリンの第１国際標準物質を用いながら測定する。
【００１８】
６糖類画分は好ましくはオリゴ糖混合物１５〜２５％を示す。
【００１９】
好ましくは、本発明の混合物はオリゴ糖の混合物の６糖類画分中に６糖類ΔＩＩａ−ＩＩｓ−Ｉｓ８〜１５％を含む。
【００２０】
６糖類画分の比率はＴＳＫ  Ｇ３０００  ＸＬおよびＴＳＫ  Ｇ２０００  ＸＬカラム上の高圧液体クロマトグラフィーにより、または、６糖類画分の分取分離により分析的に測定してよい。混合物はこの場合、ＵｌｔｒｏｇｅｌＡＣＡ２０２R（Ｂｉｏｓｅｐｒａ
）の商標で販売されているもののようなポリアクリルアミドアガロース型のゲルを充填したカラム上のクロマトグラフィーに付す。混合物を炭酸水素ナトリウム溶液で溶離する。好ましくは、炭酸水素ナトリウム溶液は０．１ｍｏｌ／ｌ〜１ｍｏｌ／ｌの溶液である。更に好ましくは分離は１ｍｏｌ／ｌの濃度で行う。測定はＵＶスペクトル分析により行う（２５４ｎｍ）。分画後、炭酸水素ナトリウム中の溶液中の６糖類画分を氷酢酸で中和する。次に溶液を減圧下に濃縮することにより３０重量％より高濃度の酢酸ナトリウムを得る。６糖類画分は３〜５容量のメタノールを添加することにより沈殿させる。６糖類画分をＮｏ．３焼結ガラス上の濾過により回収する。得られた６糖類混合物はＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）で分析することにより６糖類ΔＩＩａ−ＩＩｓ−Ｉｓの含有量を求めてよい。６糖類ΔＩＩａ−ＩＩｓ−Ｉｓは分取ＨＰＬＣにより、または、当業者の知る手法に従った抗トロンビンＩＩＩセファロースカラム上のアフィニティークロマトグラフィーにより単離してよい（Ｍ．Ｈｏｏｋ，Ｉ．Ｂｊｏｒｋ，Ｊ．Ｈｏｐｗｏｏｄ  ａｎｄ  Ｕ．Ｌｉｎｄａｈｌ，Ｆ．Ｅ．Ｂ．Ｓ  ｌｅｔｔｅｒｓ，ｖｏｌ６５６（１）（１９７６））。
【００２１】
最も好ましくは、本発明の混合物は抗Ｘａ活性１５０ＩＵ／ｍｇ〜２００ＩＵ／ｍｇを有する。
【００２２】
好ましくは本発明の混合物は抗ＩＩａ活性５ＩＵ／ｍｇ未満、特に０．５〜３．５ＩＵ／ｍｇを有する。以下に記載する適用例は、上記方法の好ましい特性を使用する場合の１．１〜１．６ＩＵ／ｍｇの値を示している。
【００２３】
好ましくは、混合物は抗Ｘａ活性／抗ＩＩａ活性の比５０超、特に１００超を示す。
【００２４】
好ましくは、本発明の混合物は平均分子量２０００〜３０００ダルトン、特に平均分子量２４００〜２６５０Ｄａを有する。
【００２５】
従って、本発明の主題は、最も好ましくは、抗Ｘａ活性１５０〜２００ＩＵ／ｍｇ、抗ＩＩａ活性０．５〜３．５ＩＵ／ｍｇおよび平均分子量２４００〜２６５０Ｄａを示すことを特徴とする上記した混合物である。
【００２６】
本発明のオリゴ糖混合物は、好ましくは２０より大きいｐＫａを有する有機の強塩基を用いた有機溶媒中のヘパリンのベンジルエステルの第４アンモニウム塩の脱重合（特性は好ましくは例えばＲ．Ｓｃｈｗｅｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２６，１１６７−１１６９（１９８７），Ｒ．Ｓｃｈｗｅｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１０５，１４２０（１９９３）に従って定義したホスファゼン類のファミリーと同様）、脱重合されたヘパリンのベンジルエステルの第４アンモニウム塩のナトリウム塩への変換、残存エステルのケン化および場合により精製により製造してよい。本発明の方法は、上記した物理化学的特性および活性を有する本発明のオリゴ糖の混合物を得ることを可能とする本質的な特性を加えながら、国際特許出願ＷＯ０２０８２９５号に記載された方法の主要な工程を反復するものである。
【００２７】
実際、本発明のオリゴ糖の特定の混合物を得るためには、脱重合工程の間の混合物の水
分含有量の極めて厳密な制御により塩基の選択性を制御することが必要である。
【００２８】
本発明の方法は実際は、脱重合の間の塩基の高い選択性の制御を特徴としている。これにより本発明に記載した６糖類ΔＩＩａ−ＩＩｓ−ＩｓのようなＡＴＩＩＩに対するアフィニティーを有する配列を可能な限り温存しながらヘパリンを脱重合することが可能となる。方法の重要な工程により、本発明の多糖類を得ることが可能となる。
【００２９】
方法のこの特徴により、オリゴ糖の混合物の平均分子量に関して予測されなかったａＸａ活性がもたらされる（２０００Ｄａ〜３０００Ｄａの平均分子量に対して１５０ＩＵ／ｍｇ＜ａＸａ＜２００ＩＵ／ｍｇ）。この選択性は２０より大きいｐＫａ、極めて高い立体障害および弱い求核性を有するホスファゼン塩基の極めて特別な物理化学的特性によるものである。
【００３０】
この作用は反応媒体が無水である場合に十分現れる。一方、反応媒体の水分含有量が増大すると、脱重合の選択性の劇的な低下が観察される。ＡＴＩＩＩに対する親和性を有する配列の保存が低下し、その結果ａＸａ活性の大きな低下が起こる。少量の水の存在下では、ホスファゼン塩基はプロトン化され、反応性物質種が水酸化第４アンモニウムになる。この場合、極めて高度な立体障害および弱い求核性の特徴が失われ、得られる生成物の性質に多大な影響が及ぶ。測定され制御された水分含有量で脱重合試験を行った場合、この作用が十分現れると考えられる。
【００３１】
以下の表は脱重合の選択性に対する水分含有量の影響を総括したものである（このパラメーターのみが試験における変数であり、試薬の化学量論的な量、希釈度、温度は当業者の基準に従って一定とする。使用した塩基はホスファゼン塩基：２−ｔ−ブチルイミノ−２−ジエチルアミノ−１，３−ジメチルパーヒドロ−１，２，３−ジアザホスフォリンである）。
【表１】
0005389140.tif 000003
【００３２】
至適選択性およびＡＴＩＩＩに対する親和性を有する配列の最大の保存のためには、ヘパリンのベンジルエステルのベンゼトニウム塩に対してホスファゼン塩基１モル当量を使用する場合には、水分含有量０．６％未満、最も詳しくは０．３％未満で操作を実施することが好ましい。
【００３３】
従って本発明の主題は、特に当業者に知られている方法に従って得られたヘパリンのベンジルエステルの第４アンモニウム塩の脱重合の工程であり、これは、０．６％未満の水分率を有する特にジクロロメタン溶液中のホスファゼンのファミリーの塩基を使用することを特徴とする。好ましくは、この水分率は０．３％未満、特に０．２％未満となるように選択しなければならない。
【００３４】
好都合には、強塩基／エステルのモル比は０．２〜５、好ましくは０．６〜２、特に０．８〜１．２である。従って等モル比の使用は本発明の好ましい実施形態の部分を形成する。
【００３５】
ＴＨＦまたはＤＭＦのような当業者の知る他の非プロトン性溶媒も使用してよい。
【００３６】
ヘパリンのベンジルエステルの第４アンモニウム塩は好ましくはベンゼトニウム、セチルピリジニウムまたはセチルトリメチルアンモニウムの塩である。
【００３７】
ホスファゼンのファミリーの塩基は好ましくは下記式：
【化２】
0005389140.tif 000004
［式中、基Ｒ１〜Ｒ７は同じかまたは異なっていて、アルキル基を示す］の塩基である。
【００３８】
上記した式において、アルキル基は直鎖または分枝鎖の形態の炭素原子１〜６個を含む。
【００３９】
従って本発明の主題は、本発明のオリゴ糖の混合物の製造方法であって、下記工程：
ａ）塩化ベンゼトニウムの作用によるヘパリンナトリウムの塩転移反応（ｔｒａｎｓａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、
ｂ）塩化ベンジルの作用によるベンゼトニウムヘパリネートのエステル化、
ｃ）得られたベンジルエステルの第４アンモニウム塩への塩転移反応、
ｄ）上記した方法によるヘパリンのベンジルエステルの第４アンモニウム塩の脱重合、
ｅ）ナトリウム塩への第４アンモニウム塩の変換、
ｆ）場合により水酸化ナトリウムのような塩基の作用によるヘパリンのケン化、
ｇ）場合により特に過酸化水素のような酸化剤の作用による精製、
を包含する上記方法である。
【００４０】
以下の反応スキームが本発明を説明するものである。
【化３】
0005389140.tif 000005
【００４１】
脱重合されたヘパリンのベンジルエステルの第４アンモニウム塩のナトリウム塩への変換（工程ｅ）は一般的に、１５〜２５℃の温度で、酢酸ナトリウムのアルコール溶液、好ましくはメタノール中の酢酸ナトリウムの１０％溶液（質量／体積）により反応媒体を処理することにより行う。添加する酢酸塩の質量による当量は、好ましくは脱重合反応に使用されるヘパリンのベンジルエステルの第４アンモニウム塩の質量より３倍多い量である。
【００４２】
ケン化（工程ｆ）は一般的に０〜２０℃、好ましくは０〜１０℃の温度で、水性媒体中、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたは水酸化リチウムのようなアルカリ金属水酸化物を用いて行う。アルカリ金属水酸化物の１〜５モル当量を一般的には使用する。好ましくは、ケン化はアルカリ金属水酸化物１〜２モル当量の存在下に行う。
【００４３】
最終生成物は場合により、脱重合されたヘパリンを精製するための何れかの知られた方
法（例えばＥＰ００３７３１９Ｂ１）により精製してよい（工程ｇ）。好ましくは、精製は１０〜５０℃の温度で水性媒体中過酸化水素を用いて行う。好ましくは、この操作は２０〜４０℃で行う。
【００４４】
ヘパリンのベンジルエステルの第４アンモニウム塩は以下の反応スキーム：
ａ）ベンゼトニウムヘパリネートを得るための塩化ベンゼトニウムを用いたナトリウム塩の形態へのヘパリンの変換（塩転移）、
ｂ）ヘパリンのベンジルエステルのナトリウム塩を得るための、上記の通り得られたベンゼトニウム塩の塩化ベンジルを用いたエステル化および酢酸ナトリウムのアルコール溶液による処理、
ｃ）第４アンモニウム塩、好ましくはベンゼトニウム、セチルピリジニウムまたはセチルトリメチルアンモニウム塩へのヘパリンのベンジルエステルのナトリウム塩の塩転移、に従って製造してよい。
【００４５】
工程ａ）の反応は１５〜２５℃の温度でヘパリンナトリウム上、過剰量の塩化ベンゼトニウムの作用により行う。好都合には、塩／ヘパリンナトリウムのモル比は３〜４である。
【００４６】
使用する原料ヘパリンは好ましくはブタヘパリンである。後者は、特許ＦＲ２６６３６３９に記載の方法に従ってその硫酸デルマタンレベルを低減するために予め精製する。
【００４７】
工程ｂ）のエステル化は、２５〜４５℃、好ましくは３０〜４０℃の温度で、塩素化有機溶媒（例えばクロロホルムまたは塩化メチレン）中で好ましくは行う。次にベンゼトニウム塩の形態のエステルを、メタノールのようなアルコール中１０質量％の酢酸ナトリウムを用いた沈殿によりナトリウム塩の形態で回収する。一般的に反応媒体の容量当りアルコール１〜１．２容量を使用する。塩化ベンジルの量および反応時間は、エステル化の程度が５０〜１００％、好ましくは７０〜９０％となるように調節する。好ましくは、塩化ベンジル０．５〜１．５質量部をヘパリンのベンゼトニウム塩１質量部に対して使用する。同様に、好ましくは、反応時間は１０〜３５時間である。
【００４８】
工程ｃ）の塩転移は、１０〜２５℃の温度で水性媒体中、塩化第４アンモニウムを用いることにより、そして好ましくは塩化ベンゼトニウム、塩化セチルピリジニウムまたは塩化セチルトリメチルアンモニウムを用いることにより行う。好都合には、塩化第４アンモニウム／ヘパリンのベンジルエステルのナトリウム塩のモル比は２〜３である。
【００４９】
ナトリウム塩の形態の本発明の混合物は、別のアルカリまたはアルカリ土類金属の塩に変換してよい。１つの塩から別のものへの移行は、場合により特許ＦＲ７３１３５８０に記載の方法を用いて達成する。
【００５０】
本発明の混合物は非毒性であり、したがって医薬として使用してよい。
【００５１】
本発明のオリゴ糖の混合物は抗血栓剤として使用してよい。特に、これらは静脈および動脈の血栓、深静脈血栓、肺塞栓、不安定狭心症、心筋梗塞、心臓虚血、末梢動脈の閉塞性疾患および心房細動の治療または予防のために有用である。更にまた、平滑筋細胞の増殖、アテローム性動脈硬化症および動脈硬化症の予防および治療、血管形成および成長因子の変調による癌の治療および予防、ならびに、糖尿病性網膜症および腎症のような糖尿病性障害の治療および予防において有用である。
【００５２】
本発明はまた、場合により不活性賦形剤１つまたはそれ以上と組み合わせて式（Ｉ）の混合物を活性成分として含有する医薬組成物に関する。
【００５３】
医薬組成物は例えば皮下または静脈内の経路により注射できる溶液である。これらはまた肺経路（吸入）または経口経路による投与のためにも有用である。
【００５４】
用量は患者の年齢、体重および健康状態により異なる。成人の場合は一般的に筋肉内または皮下の経路により１日当り２０〜１００ｍｇである。
【００５５】
以下の実施例は本発明を限定することなくこれを説明するものである。
【００５６】
実施例Ａ：ヘパリネートのベンジルのベンゼトニウム塩の製造
ベンゼトニウムヘパリネート
水１２５ｍｌ中の塩化ベンゼトニウム２５ｇの溶液を、水１００ｍｌ中のナトリウム塩の形態のヘパリン１０ｇの溶液に添加した。生成物を濾過し、水で洗浄し、乾燥した。
【００５７】
ヘパリンのベンジルエステル（ナトリウム塩）
塩化ベンジル１６ｍｌを塩化メチレン８０ｍｌ中のベンゼトニウムヘパリネート２０ｇの溶液に添加した。溶液を１２時間３０℃に加熱した。次にメタノール中酢酸ナトリウムの１０％溶液１０８ｍｌを添加し、混合物を濾過し、メタノールで洗浄し、乾燥した。このようにしてヘパリンのベンジルエステル７．６ｇが、エステル化度７７％のナトリウム塩の形態で得られる。
【００５８】
ヘパリンのベンジルエステル（ベンゼトニウム塩）
ヘパリンのベンジルエステル（ナトリウム塩）３６ｇ（０．０５４９モル）および蒸留水５４０ｍｌを、２Ｌの三角フラスコＡに導入した。約２０℃の温度でホモゲナイズした後、淡黄色の溶液が得られた。塩化ベンゼトニウム６４．４５ｇ（０．１４３８モル）および水４５０ｍｌの溶液を１Ｌの三角フラスコＢ中に磁気攪拌しながら製造した。三角フラスコＢ中の溶液を攪拌しながら三角フラスコＡ中の溶液内に約３５分かけて注ぎ込んだ。大量の白色沈殿の形成が観察された。三角フラスコＢを蒸留水２００ｍｌで洗浄し、洗浄水を三角フラスコＡ内に導入した。次に攪拌を停止し、懸濁液を１２時間沈殿させる。この時間が経過した後、上澄みの透明の部分を除去し、廃棄した。水５６０ｍｌを沈降した沈殿に添加し（スラリーの発生）、そして混合物を２０分間攪拌した。沈殿を約３０分再沈殿させる。上澄みを除去し廃棄する（５６０ｍｌ）。蒸留水約５６０ｍｌを用いて洗浄するこの操作を、沈降させた沈殿に対して２回反復した。最後の洗浄操作において、沈殿が懸濁液中に残存し、これをＮｏ．３焼結ガラスで濾過した。次にケーキを蒸留水２００ｍｌで４回洗浄した。湿潤した白色固体を、排水してから６０℃程度の温度で減圧下（２．７ｋＰａ）に乾燥した。１２時間乾燥後、ベンジルヘパリネート、ベンゼトニウム塩８７．５ｇを得た。収率９４．９％が得られた。
【００５９】
実施例Ｂ：６糖類ＡＴＩＩＩ（ΔＩＩａ−ＩＩｓ−Ｉｓ）の性状
【化４】
0005389140.tif 000006
プロトンスペクトル、D2O, 500 MHz, T＝298 K, ppmにおけるδ: 1.97 (3H, s), 3.18 (1H, dd, 10 および 3Hz), 3.30 (1H, t, 8Hz), 3.37 (1H, dd, 10 および 3Hz), 3.60 (2H, m), 3.65〜3.85 (6H, m), 3.87 (2H, m), 3.95 (1H, d, 8Hz), 4.03 (1H, d, 8Hz), 4.05〜4.13 (4H, m),  4.16〜4.45 (8H, m), 4.52 (1H, d, 8Hz), 4.67 (1H, m), 5.06 (1H, d, 6Hz), 5.10 (1H, d, 3Hz), 5.33 (1H, d, 4Hz), 5.36 (1H, d, 3Hz), 5.46 (1H, d,
3Hz), 5.72 (1H, d, 4Hz)。
４−デオキシ−α−Ｌ−スレオ−ヘキセンピラノシル−ウロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−アセトアミド−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→４）−β−Ｄ−グルコピラノシルウロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−３，６−ジ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル）−（１→４）−２−Ｏ−スルホ−α−Ｌ−ヨードピラノシルウロン酸−（１→４）−２−デオキシ−２−スルファミド−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノース。
−  実施例１〜７および１２は重合反応の選択性に対する水分含有量の影響および得られた生成物のａＸａおよびａＩＩａ活性を示す。
−  実施例８〜１０は得られた生成物のａＸａおよびａＩＩａ活性に対する塩基当量数の影響を示す（水分含有量０．１％）。
−  実施例１１は２−ｔ−ブチルイミノ−２−ジエチルアミノ−１，３−ジメチルパーヒドロ−１，２，３−ジアザホスホリン以外のホスファゼン塩基の使用：ｔ−ブチルイミノトリ（ピロリジノ）ホスホランの使用を説明する。
【実施例１】
【００６０】
脱重合およびナトリウム塩への変換（０．１％水）：
ジクロロメタン７０ｍｌを三角フラスコＡ中に入れた。実施例Ａに記載の通りえられたヘパリンのベンジルエステル（エステル化度：７５％、ベンゼトニウム塩）１０ｇ（０．００６モル）を攪拌しながらゆっくり添加した。反応媒体の水分含有量を０．１％に調節した。溶液を窒素下４０℃に加熱した。完全に溶解した後、溶液を２０℃程度の温度に冷却し、２−ｔ−ブチルイミノ−２−ジエチルアミノ−１，３−ジメチルパーヒドロ−１，２，３−ジアザホスホリン１．７５ｍｌ（０．００６モル）を添加した。得られた混合物を２４時間２０℃程度の温度で攪拌した。この間、メタノール３００ｍｌ中の無水酢酸ナトリウム３０ｇの溶液を三角フラスコＢ中に製造した。完全に溶解した後、ハイフロスーパーセルセライト５ｇを溶液に添加した。三角フラスコＡ中の反応混合物を、磁気攪拌しながら５℃程度の温度で酢酸ナトリウムのメタノール溶液中に１分３０秒かけて注ぎ込んだ。５分間攪拌の後、懸濁液を１時間３０分放置して沈降させた。上澄みの透明部分を分離し、廃棄した（２２０ｍｌ）。メタノール２２０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。沈殿を約１時間２０分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した（２５０ｍｌ）。メタノール２５０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間
攪拌した。次に懸濁液中の沈殿をＮｏ．３焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキをメタノール１００ｍｌで洗浄した。淡黄色の湿潤固体を、排液してから次に４０℃程度の温度で減圧下（６ｋＰａ）に乾燥した。１８時間乾燥後、セライト（５ｇ）中の脱重合ヘパリンのナトリウム塩２．５１ｇを得た。得られた収率は６４％であった。
【００６１】
ケン化：
上記の通り得られたセライト（５ｇ）中の粗製の脱重合ヘパリンナトリウム塩２．５ｇ（０．００３８モル）および水１７ｍｌを５０ｍｌの三角フラスコに入れた。懸濁液をＮｏ．３焼結ガラスで濾過し、水５ｍｌで２回洗浄した。得られた濾液を１５０ｍｌの三角フラスコに入れた。３０％苛性ソーダ０．４ｍｌ（０．００４モル）を５℃程度の温度で磁気攪拌しながら導入した。添加後、混合物を２時間攪拌した。１ＮＨＣｌを添加することにより溶液を中和し、そして塩化ナトリウム３ｇを添加した。溶解後、メタノール２１ｍｌを反応媒体に添加した。１５分間攪拌の後、メタノール４４ｍｌを添加し、その後１時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を５℃程度の温度で４５分間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した（９０ｍｌ）。メタノール９０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。沈殿を約２０分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した（８０ｍｌ）。メタノール８０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。次に懸濁液中の沈殿をＮｏ．３焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキをメタノール５０ｍｌで洗浄した。湿潤した固体を、廃液してから次に４０℃程度の温度で減圧下（６ｋＰａ）に乾燥した。１８時間乾燥後、粗製の脱重合ヘパリン（ナトリウム塩）１．３１ｇを得た。得られた収率は６６％であった。
【００６２】
精製：
上記において得られた粗製の脱重合ヘパリン１．３ｇおよび蒸留水１３ｍｌを５０ｍｌの三角フラスコに入れた。混合物を磁気攪拌しながら４０℃とした。１Ｎ水酸化ナトリウムを添加することによりｐＨを９．７±０．１とした。反応媒体を０．４５μｍメンブレンで濾過し、３０％過酸化水素水溶液０．０７ｍｌを添加した。２０℃程度の温度で約２時間攪拌した後、１ＮＨＣｌを添加することにより混合物を中和し、その後、塩化ナトリウム２ｇを添加した。次に溶液を０．４５μｍメンブレンで濾過し、次にメタノール１４ｍｌを注ぎ込んだ。次に溶液を１０℃に冷却し、そして約１５分間攪拌した。次にメタノール３６ｍｌを添加し、その後１時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を約１５分間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した（５０ｍｌ）。メタノール５０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。沈殿を約２５分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した（５０ｍｌ）。次に懸濁液中の沈殿をＮｏ．３焼結ガラスで濾過した。次に得られた白色のケーキをメタノール５０ｍｌで洗浄した。湿潤した固体を、排液してから次に４０℃程度の温度で減圧下（６ｋＰａ）に乾燥した。１８時間乾燥後、純粋な脱重合ヘパリン（ナトリウム塩）１．１３ｇを得た。得られた収率は８７％であった。
【００６３】
このようにして得られた脱重合ヘパリンの特性は以下の通りであった。
平均分子量：２６００ダルトン
抗Ｘａ活性：１７７ＩＵ／ｍｇ
抗ＩＩａ活性：１．５ＩＵ／ｍｇ
抗Ｘａ活性／抗ＩＩａ活性の比：１１８
【実施例２】
【００６４】
脱重合およびナトリウム塩への変換（０．２％水）：
ジクロロメタン７０ｍｌを三角フラスコＡ中に入れた。実施例Ａに記載の通りえられたヘパリンのベンジルエステル（エステル化度：７５％、ベンゼトニウム塩）１０ｇ（０．００６モル）を窒素気圧下に攪拌しながらゆっくり添加した。反応媒体の水分含有量を０
．２％に調節した。完全に溶解した後、２−ｔ−ブチルイミノ−２−ジエチルアミノ−１，３−ジメチルパーヒドロ−１，２，３−ジアザホスホリン１．７５ｍｌ（０．００６モル）を添加した。得られた混合物を２４時間２０℃程度の温度で攪拌した。この間、メタノール３００ｍｌ中の無水酢酸ナトリウム３０ｇの溶液を三角フラスコＢ中に製造した。完全に溶解した後ハイフロスーパーセルセライト５ｇを溶液に添加した。三角フラスコＡ中の反応混合物を磁気攪拌しながら５℃程度の温度で酢酸ナトリウムのメタノール溶液中に１分３０秒かけて注ぎ込んだ。５分間攪拌の後、懸濁液を２時間放置して沈降させた。上澄みの透明部分を分離し、廃棄した（２２０ｍｌ）。メタノール２２０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。沈殿を２時間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した（２３０ｍｌ）。メタノール２３０ｍｌを沈降した沈殿に添加し。次に懸濁液中の沈殿をＮｏ．３焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキをメタノール１５０ｍｌで洗浄した。淡黄色の湿潤固体を引き出し、次に４０℃程度の温度で減圧下（６ｋＰａ）に乾燥した。１８時間乾燥後、セライト（５ｇ）中の粗製の脱重合ヘパリンの２．６３ｇを得た。得られた収率は６７％であった。
【００６５】
ケン化：
上記の通り得られたセライト（５ｇ）中の脱重合ヘパリンのナトリウム塩２．５ｇ（０．００３８モル）および水１８ｍｌを５０ｍｌの三角フラスコに入れた。懸濁液をＮｏ．３焼結ガラスで濾過し、水５ｍｌで２回洗浄した。得られた濾液を１５０ｍｌの三角フラスコに入れた。３０％苛性ソーダ０．４ｍｌ（０．００４モル）を５℃程度の温度で磁気攪拌しながら添加した。添加後、混合物を２時間攪拌した。１ＮＨＣｌを添加することにより溶液を中和し、そして塩化ナトリウム２ｇを添加した。メタノール１４ｍｌを反応混合物に注ぎ込んだ。１５分間攪拌の後、メタノール３６ｍｌを添加し、その後１時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を５℃程度の温度で４５分間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した（８０ｍｌ）。メタノール８０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。次に懸濁液中の沈殿をＮｏ．３焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキをメタノール５０ｍｌで洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に４０℃程度の温度で減圧下（６ｋＰａ）に乾燥した。４８時間乾燥後、粗製の脱重合ヘパリン（ナトリウム塩）２．３ｇを得た。得られた収率は６５％であった。
【００６６】
精製：
上記において得られた粗製の脱重合ヘパリン１．４ｇおよび蒸留水１５ｍｌを５０ｍｌの三角フラスコに入れた。混合物を磁気攪拌しながら４０℃とした。１Ｎ水酸化ナトリウムを添加することによりｐＨを９．７±０．１とした。反応媒体を０．４５μｍメンブレンで濾過し、３０％過酸化水素水溶液０．０７ｍｌを添加した。４０℃程度の温度で約２時間攪拌した後、混合物を２０℃程度の温度に冷却し、次に１ＮＨＣｌを添加することにより混合物を中和した。塩化ナトリウム２ｇを反応混合物に添加した。次に溶液を０．４５μｍメンブレンで濾過し、次にメタノール１４ｍｌを注ぎ込んだ。次に溶液を１０℃に冷却し、そして１５分間攪拌した。次にメタノール３６ｍｌを添加し、その後１時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を約１５分間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した（４０ｍｌ）。メタノール４０ｍｌを沈降した沈殿に添加し（スラリー発生）、混合物を５分間攪拌した。沈殿を約２０分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した（５０ｍｌ）。次に懸濁液中の沈殿をＮｏ．３焼結ガラスで濾過した。次に得られた白色のケーキをメタノール５０ｍｌで洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に４０℃程度の温度で減圧下（６ｋＰａ）に乾燥した。１８時間乾燥後、純粋な脱重合ヘパリン（ナトリウム塩）１．２ｇを得た。得られた収率は８６％であった。
【００６７】
このようにして得られた脱重合ヘパリンの特性は以下の通りであった。
平均分子量：２６５０ダルトン
抗Ｘａ活性：１６１ＩＵ／ｍｇ
抗ＩＩａ活性：１．４ＩＵ／ｍｇ
抗Ｘａ活性／抗ＩＩａ活性の比：１１５
【実施例３】
【００６８】
脱重合およびナトリウム塩への変換（０．３％水）：
ジクロロメタン７０ｍｌを三角フラスコＡ中に入れた。実施例Ａに記載の通りえられたヘパリンのベンジルエステル（エステル化度：７５％、ベンゼトニウム塩）１０ｇ（０．００６モル）を窒素気圧下に攪拌しながら添加した。反応媒体の水分含有量を０．３％に調節した。完全に溶解した後、２−ｔ−ブチルイミノ−２−ジエチルアミノ−１，３−ジメチルパーヒドロ−１，２，３−ジアザホスホリン１．７５ｍｌ（０．００６モル）を添加した。混合物を２４時間２０℃程度の温度で攪拌した。この間、メタノール３００ｍｌ中の無水酢酸ナトリウム３０ｇの溶液を三角フラスコＢ中に製造した。完全に溶解した後ハイフロスーパーセルセライト５ｇを溶液に添加した。三角フラスコＡ中の反応混合物を磁気攪拌しながら５℃程度の温度で酢酸ナトリウムのメタノール溶液中に１分３０秒かけて注ぎ込んだ。５分間攪拌の後、懸濁液を１時間１０分放置して沈降させた。上澄みの透明部分を分離し、廃棄した（２２０ｍｌ）。メタノール２２０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。次に懸濁液中の沈殿をＮｏ．３焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキをメタノール１００ｍｌで洗浄した。湿潤固体を引き出し、次に４０℃程度の温度で減圧下（６ｋＰａ）に乾燥した。１８時間乾燥後、セライト（５ｇ）中のナトリウム塩として粗製の脱重合ヘパリン２．５７ｇを得た。得られた収率は６６％であった。
【００６９】
ケン化：
上記の通り得られたセライト（５ｇ）中の粗製の脱重合ヘパリンナトリウム塩２．５ｇ（０．００３８モル）および水１８ｍｌを５０ｍｌの三角フラスコに入れた。懸濁液をＮｏ．３焼結ガラスで濾過し、水５ｍｌで２回リンスした。得られた濾液を１５０ｍｌの三角フラスコに入れた。３０％苛性ソーダ０．４ｍｌ（０．００４モル）を５℃程度の温度で磁気攪拌しながら添加した。添加後、混合物を２時間攪拌した。１ＮＨＣｌを添加することにより溶液を中和し、そして塩化ナトリウム３ｇを添加した。メタノール１５ｍｌを反応混合物に注ぎ込んだ。１５分間攪拌の後、メタノール３６ｍｌを添加し、その後１時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を１時間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した（７０ｍｌ）。メタノール７０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。次に懸濁液中の沈殿をＮｏ．３焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキをメタノール５０ｍｌで洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に４０℃程度の温度で減圧下（６ｋＰａ）に乾燥した。４８時間乾燥後、粗製の脱重合ヘパリン（ナトリウム塩）１．４２ｇを得た。得られた収率は６２％であった。
【００７０】
精製：
上記において得られた粗製の脱重合ヘパリン１．４ｇおよび蒸留水１４ｍｌを５０ｍｌの三角フラスコに入れた。混合物を磁気攪拌しながら４０℃とした。１Ｎ水酸化ナトリウムを添加することによりｐＨを９．７±０．１とした。反応媒体を０．４５μｍメンブレンで濾過し、３０％過酸化水素水溶液０．０７ｍｌを添加した。２０℃程度の温度で約２時間攪拌した後、１ＮＨＣｌを添加することにより混合物を中和し、その後、塩化ナトリウム２ｇを添加した。溶解後、次に溶液を０．４５μｍメンブレンで濾過し、次にメタノール１４ｍｌを注ぎ込んだ。次に濾液を１０℃に冷却し、そして１５分間攪拌した。次にメタノール３６ｍｌを添加し、その後１時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を４０分間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した（５０ｍｌ）。メタノール５０ｍｌを沈降した沈殿に添加し（スラリー発生）、混合物を５分間攪拌した。沈殿を約２５分間放置して再沈降させた。次に懸濁液中の沈殿をＮｏ．３焼結ガラスで濾過した。次に得られた白色のケーキをメタノール５０ｍｌで洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に
４０℃程度の温度で減圧下（６ｋＰａ）に乾燥した。１８時間乾燥後、純粋な脱重合ヘパリン（ナトリウム塩）１．２４ｇを得た。得られた収率は８９％であった。
【００７１】
このようにして得られた脱重合ヘパリンの特性は以下の通りであった。
平均分子量：２４００ダルトン
抗Ｘａ活性：１３２ＩＵ／ｍｇ
抗ＩＩａ活性：１．４ＩＵ／ｍｇ
抗Ｘａ活性／抗ＩＩａ活性の比：９４
【実施例４】
【００７２】
脱重合およびナトリウム塩への変換（０．４％水）：
ジクロロメタン７０ｍｌを三角フラスコＡ中に入れた。実施例Ａに記載の通りえられたヘパリンのベンジルエステル（エステル化度：７５％、ベンゼトニウム塩）１０ｇ（０．００６モル）を攪拌しながらゆっくり添加した。反応媒体の水分含有量を０．４％に調節した。溶液を窒素下３０℃に加熱した。完全に溶解した後、混合物を２０℃程度の温度に冷却し、２−ｔ−ブチルイミノ−２−ジエチルアミノ−１，３−ジメチルパーヒドロ−１，２，３−ジアザホスホリン１．７５ｍｌ（０．００６モル）を添加した。混合物を２４時間２０℃程度の温度で攪拌した。この間、メタノール３００ｍｌ中の無水酢酸ナトリウム３０ｇの溶液を三角フラスコＢ中に製造した。完全に溶解した後ハイフロスーパーセルセライト５ｇを溶液に添加した。三角フラスコＡ中の反応混合物を、磁気攪拌しながら５℃程度の温度で酢酸ナトリウムのメタノール溶液中に１分３０秒かけて注ぎ込んだ。５分間攪拌の後、懸濁液を２時間放置して沈降させた。上澄みの透明部分を分離し、廃棄した（８０ｍｌ）。メタノール８０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。沈殿を約１時間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した（８０ｍｌ）。メタノール８０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。次に懸濁液中の沈殿をＮｏ．３焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキをメタノール１５０ｍｌで洗浄した。淡黄色の湿潤固体を引き出し、次に４０℃程度の温度で減圧下（６ｋＰａ）に乾燥した。１８時間乾燥後、セライト（５ｇ）中のナトリウム塩として粗製の脱重合ヘパリン３．２５ｇを得た。得られた収率は８３％であった。
【００７３】
ケン化：
上記の通り得られたセライト（１０ｇ）中の粗製の脱重合ヘパリンナトリウム塩３．１ｇ（０．００１８モル）および水２１ｍｌを、５０ｍｌの三角フラスコに入れた。懸濁液をＮｏ．３焼結ガラスで濾過し、水６ｍｌで２回リンスした。得られた濾液を１５０ｍｌの三角フラスコに入れた。３０％苛性ソーダ０．７ｍｌ（０．００７モル）を５℃程度の温度で磁気攪拌しながら添加した。添加後、混合物を２時間攪拌した。１ＮＨＣｌを添加することにより溶液を中和し、そして塩化ナトリウム４ｇを添加した。メタノール２８ｍｌを反応混合物に注ぎ込んだ。１５分間攪拌の後、メタノール７２ｍｌを添加し、その後１時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を１時間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した（９０ｍｌ）。メタノール９０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。沈殿を約２０分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した（９０ｍｌ）。メタノール９０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。次に懸濁液中の沈殿をＮｏ．３焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキをメタノール５０ｍｌで洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に４０℃程度の温度で減圧下（６ｋＰａ）に乾燥した。４８時間乾燥後、粗製の脱重合ヘパリン（ナトリウム塩）１．９ｇを得た。得られた収率は６７％であった。
【００７４】
精製：
上記において得られた粗製の脱重合ヘパリン１．９ｇおよび蒸留水１９ｍｌを５０ｍｌの三角フラスコに入れた。混合物を磁気攪拌しながら４０℃とした。１Ｎ水酸化ナトリウ
ムを添加することによりｐＨを９．７±０．１とした。反応媒体を０．４５μｍメンブレンで濾過し、３０％過酸化水素水溶液０．１ｍｌを添加した。２０℃程度の温度で約２時間攪拌した後、１ＮＨＣｌを添加することにより混合物を中和し、その後、塩化ナトリウム２ｇを添加した。次に溶液を０．４５μｍメンブレンで濾過し、次にメタノール１４ｍｌを注ぎ込み、そして混合物を１５分間攪拌した。次にメタノール３６ｍｌを添加し、その後１時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を約１５分間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した（４０ｍｌ）。メタノール４０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。沈殿を約２０分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した（５０ｍｌ）。メタノール５００ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。沈殿を約２０分間放置して再沈降させた。次に懸濁液をＮｏ．３焼結ガラスで濾過した。次に得られた白色のケーキをメタノール５０ｍｌで洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に４０℃程度の温度で減圧下（６ｋＰａ）に乾燥した。７２時間乾燥後、純粋な脱重合ヘパリン（ナトリウム塩）１．５６ｇを得た。得られた収率は８２％であった。
【００７５】
このようにして得られた脱重合ヘパリンの特性は以下の通りであった。
平均分子量：２３５０ダルトン
抗Ｘａ活性：１２２ＩＵ／ｍｇ
抗ＩＩａ活性：１．３ＩＵ／ｍｇ
抗Ｘａ活性／抗ＩＩａ活性の比：９４
【実施例５】
【００７６】
脱重合およびナトリウム塩への変換（０．５７％水）：
ジクロロメタン１４０ｍｌを三角フラスコＡ中に入れた。実施例Ａに記載の通りえられたヘパリンのベンジルエステル（エステル化度：７５％、ベンゼトニウム塩）２０ｇ（０．０１９モル）を攪拌しながらゆっくり添加した。反応媒体の水分含有量を０．５７％に調節した。完全に溶解した後、２−ｔ−ブチルイミノ−２−ジエチルアミノ−１，３−ジメチルパーヒドロ−１，２，３−ジアザホスホリン３．５ｍｌ（０．０１２モル）を添加した。混合物を２４時間２０℃程度の温度で攪拌した。この間、メタノール６００ｍｌ中の無水酢酸ナトリウム６０ｇの溶液を三角フラスコＢ中に製造した。完全に溶解した後、ハイフロスーパーセルセライト１０ｇを溶液に添加した。三角フラスコＡ中の反応混合物を、磁気攪拌しながら４℃程度の温度で酢酸ナトリウムのメタノール溶液中に１分３０秒かけて注ぎ込んだ。５分間攪拌の後、懸濁液を３０分放置して沈降させた。上澄みの透明部分を分離し、廃棄した（４００ｍｌ）。メタノール４００ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。沈殿を約１時間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した（４２０ｍｌ）。メタノール４２０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。次に懸濁液をＮｏ．３焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキをメタノール２００ｍｌで洗浄した。淡黄色の湿潤固体を引き出し、次に５０℃程度の温度で減圧下（６ｋＰａ）に乾燥した。１８時間乾燥後、セライト（１０ｇ）中のナトリウム塩として、粗製の脱重合ヘパリン６．６６ｇを得た。得られた収率は８５％であった。
【００７７】
ケン化：
上記の通り得られたセライト（１０ｇ）中の粗製の脱重合ヘパリンナトリウム塩６．６６ｇ（０．０１０１モル）および水４７ｍｌを５０ｍｌの三角フラスコに入れた。懸濁液をＮｏ．３焼結ガラスで濾過し、水１５ｍｌで２回リンスした。得られた濾液を１５０ｍｌの三角フラスコに入れた。３０％苛性ソーダ１．１ｍｌ（０．０１１モル）を５℃程度の温度で磁気攪拌しながら添加した。添加後、混合物を２時間攪拌した。１ＮＨＣｌを添加することにより溶液を中和し、そして塩化ナトリウム９．５ｇを添加した。メタノール６６ｍｌを反応媒体に添加した。１５分間攪拌の後、メタノール１７１ｍｌを添加し、その後１時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を５℃程度の温度で３／４時間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した（１６０ｍｌ）。メタノール１６０ｍｌを沈
降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。沈殿を約２０分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した（１８０ｍｌ）。メタノール１８０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。次に懸濁液をＮｏ．３焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキを２回メタノール５０ｍｌで洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に４０℃程度の温度で減圧下（６ｋＰａ）に乾燥した。１８時間乾燥後、粗製の脱重合ヘパリン（ナトリウム塩）４．５３ｇを得た。得られた収率は７４％であった。
【００７８】
精製：
上記において得られた粗製の脱重合ヘパリン４．５３ｇおよび蒸留水４５ｍｌを１００ｍｌの三角フラスコに入れた。混合物を磁気攪拌しながら４０℃とした。１Ｎ水酸化ナトリウムを添加することによりｐＨを９．７±０．１とした。反応媒体を０．４５μｍメンブレンで濾過し、３０％過酸化水素水溶液０．２５ｍｌを添加した。２０℃程度の温度で約２時間攪拌した後、１ＮＨＣｌを添加することにより混合物を中和し、その後、塩化ナトリウム５．５ｇを添加した。次に溶液を０．４５μｍメンブレンで濾過し、次に１０℃程度の温度でメタノール３８ｍｌを注ぎ込んだ。次に溶液を２０℃とし、そして１５分間攪拌した。次にメタノール１００ｍｌを添加し、その後１時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を２０分間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した（９０ｍｌ）。メタノール９０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。沈殿を約２５分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した（１００ｍｌ）。次に懸濁液中の沈殿をＮｏ．３焼結ガラスで濾過した。次に得られた白色のケーキをメタノール５０ｍｌで洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に５０℃程度の温度で減圧下（６ｋＰａ）に乾燥した。１８時間乾燥後、純粋な脱重合ヘパリン（ナトリウム塩）３．７ｇを得た。得られた収率は８２％であった。
【００７９】
このようにして得られた脱重合ヘパリンの特性は以下の通りであった。
平均分子量：２２００ダルトン
抗Ｘａ活性：１２０ＩＵ／ｍｇ
抗ＩＩａ活性：１．４ＩＵ／ｍｇ
抗Ｘａ活性／抗ＩＩａ活性の比：８６
【実施例６】
【００８０】
脱重合およびナトリウム塩への変換（１．８％水）：
ジクロロメタン１４０ｍｌを三角フラスコＡ中に入れた。実施例Ａに記載の通りえられたヘパリンのベンジルエステル（エステル化度：７５％、ベンゼトニウム塩）２０ｇ（０．０１９モル）を攪拌しながらゆっくり添加した。反応媒体の水分含有量を１．８％に調節した。完全に溶解した後、２−ｔ−ブチルイミノ−２−ジエチルアミノ−１，３−ジメチルパーヒドロ−１，２，３−ジアザホスホリン３．５ｍｌ（０．０１２モル）を添加した。混合物を２４時間２０℃程度の温度で攪拌した。この間、メタノール６００ｍｌ中の無水酢酸ナトリウム６０ｇの溶液を三角フラスコＢ中に製造した。完全に溶解した後ハイフロスーパーセルセライト１０ｇを溶液に添加した。三角フラスコＡ中の反応混合物を、磁気攪拌しながら４℃程度の温度で酢酸ナトリウムのメタノール溶液中に１分３０秒かけて注ぎ込んだ。５分間攪拌の後、懸濁液を３０分放置して沈降させた。上澄みの透明部分を分離し、廃棄した（４００ｍｌ）。メタノール４００ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。沈殿を約１時間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した（４２０ｍｌ）。メタノール４２０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。次に懸濁液中の沈殿をＮｏ．３焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキをメタノール２００ｍｌで洗浄した。淡黄色の湿潤固体を引き出し、次に５０℃程度の温度で減圧下（６ｋＰａ）に乾燥した。１８時間乾燥後、セライト（１０ｇ）中ナトリウム塩として、粗製の脱重合ヘパリン７．５４ｇを得た。得られた収率は９６％であった。
【００８１】
ケン化：
上記の通り得られたセライト（１０ｇ）中の粗製の脱重合ヘパリンナトリウム塩７．５４ｇ（０．０１０１モル）および水５３ｍｌを、５０ｍｌの三角フラスコに入れた。この溶液をＮｏ．３焼結ガラスで濾過し、水１５ｍｌで２回リンスした。得られた濾液を１５０ｍｌの三角フラスコに入れた。３０％苛性ソーダ１．２５ｍｌ（０．０１２モル）を４℃程度の温度で磁気攪拌しながら添加した。添加後、混合物を２時間攪拌した。１ＮＨＣｌを添加することにより溶液を中和し、そして塩化ナトリウム１０．５ｇを添加した。メタノール７０ｍｌを反応媒体に添加した。１５分間攪拌の後、メタノール１９０ｍｌを添加し、その後１時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を４℃程度の温度で３／４時間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した（１８０ｍｌ）。メタノール１８０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。沈殿を約２０分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した（１８０ｍｌ）。メタノール１８０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。次に懸濁液中の沈殿をＮｏ．３焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキを２回メタノール５０ｍｌで洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に５０℃程度の温度で減圧下（６ｋＰａ）に乾燥した。１８時間乾燥後、粗製の脱重合ヘパリン（ナトリウム塩）５．５３ｇを得た。得られた収率は８０％であった。
【００８２】
精製：
上記において得られた粗製の脱重合ヘパリン５．５３ｇおよび蒸留水５５ｍｌを１００ｍｌの三角フラスコに入れた。混合物を磁気攪拌しながら４０℃とした。１Ｎ水酸化ナトリウムを添加することによりｐＨを９．７±０．１とした。反応媒体を０．４５μｍメンブレンで濾過し、３０％過酸化水素水溶液０．３１ｍｌを添加した。２０℃程度の温度で約２時間攪拌した後、１ＮＨＣｌを添加することにより混合物を中和し、その後、塩化ナトリウム７ｇを添加した。次に溶液を０．４５μｍメンブレンで濾過し、次に１０℃程度の温度でメタノール４９ｍｌを注ぎ込んだ。次に溶液を２０℃とし、そして１５分間攪拌した。次にメタノール１２６ｍｌを添加し、その後１時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を２０分間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した（１０５ｍｌ）。メタノール１０５ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。沈殿を約２５分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した（１１０ｍｌ）。次に懸濁液中の沈殿をＮｏ．３焼結ガラスで濾過した。次に得られた白色のケーキをメタノール５０ｍｌで洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に５５℃程度の温度で減圧下（６ｋＰａ）に乾燥した。１８時間乾燥後、純粋な脱重合ヘパリン（ナトリウム塩）４．５３ｇを得た。得られた収率は８２％であった。
【００８３】
このようにして得られた脱重合ヘパリンの特性は以下の通りであった。
平均分子量：２６００ダルトン
抗Ｘａ活性：１０５ＩＵ／ｍｇ
抗ＩＩａ活性：３．１ＩＵ／ｍｇ
抗Ｘａ活性／抗ＩＩａ活性の比：３４
【実施例７】
【００８４】
脱重合およびナトリウム塩への変換（２．５％水）：
ジクロロメタン１４０ｍｌを三角フラスコＡ中に入れた。実施例Ａに記載の通りえられたヘパリンのベンジルエステル（エステル化度：７５％、ベンゼトニウム塩）２０ｇ（０．０１９モル）を攪拌しながらゆっくり添加した。反応媒体の水分含有量を２．５％に調節した。完全に溶解した後、２−ｔ−ブチルイミノ−２−ジエチルアミノ−１，３−ジメチルパーヒドロ−１，２，３−ジアザホスホリン３．５ｍｌ（０．０１２モル）を添加した。混合物を２４時間２０℃程度の温度で攪拌した。この間、メタノール６００ｍｌ中の無水酢酸ナトリウム６０ｇの溶液を三角フラスコＢ中に製造した。完全に溶解した後、ハイフロスーパーセルセライト１０ｇを溶液に添加した。三角フラスコＡ中の反応混合物を
、磁気攪拌しながら４℃程度の温度で酢酸ナトリウムのメタノール溶液中に１分３０秒かけて注ぎ込んだ。５分間攪拌の後、懸濁液を１時間放置して沈降させた。上澄みの透明部分を分離し、廃棄した（４００ｍｌ）。メタノール４００ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。沈殿を約３０分間放置して再沈降させた。上澄みの透明部分を分離し、廃棄した（４００ｍｌ）。次に懸濁液中の沈殿をＮｏ．３焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキをメタノール２００ｍｌで洗浄した。淡黄色の湿潤固体を引き出し、次に５０℃程度の温度で減圧下（６ｋＰａ）に乾燥した。１８時間乾燥後、セライト（１０ｇ）中のナトリウム塩として、粗製の脱重合ヘパリン７．７ｇを得た。得られた収率は９９．６％であった。
【００８５】
ケン化：
上記の通り得られたセライト（１０ｇ）中の粗製の脱重合ヘパリンナトリウム塩７．７８ｇ（０．０１１９モル）および水７９ｍｌを５０ｍｌの三角フラスコに入れた。懸濁液をＮｏ．３焼結ガラスで濾過し、水１５ｍｌで２回リンスした。得られた濾液を１５０ｍｌの三角フラスコに入れた。３０％苛性ソーダ１．３ｍｌ（０．０１２モル）を４℃程度の温度で磁気攪拌しながら添加した。添加後、混合物を２時間攪拌した。１ＮＨＣｌを添加することにより溶液を中和し、そして塩化ナトリウム１０ｇを添加した。メタノール６０ｍｌを反応媒体に添加した。１５分間攪拌の後、メタノール１９０ｍｌを添加し、その後１時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を４℃程度の温度で３／４時間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した（１８０ｍｌ）。メタノール１８０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。沈殿を約２０分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した（１８０ｍｌ）。メタノール１８０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。次に懸濁液中の沈殿をＮｏ．３焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキを２回メタノール５０ｍｌで洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に５０℃程度の温度で減圧下（６ｋＰａ）に乾燥した。１８時間乾燥後、粗製の脱重合ヘパリン（ナトリウム塩）５．８７ｇを得た。得られた収率は８２％であった。
【００８６】
精製：
上記において得られた粗製の脱重合ヘパリン５．８７ｇおよび蒸留水５９ｍｌを１００ｍｌの三角フラスコに入れた。混合物を磁気攪拌しながら４０℃とした。１Ｎ水酸化ナトリウムを添加することによりｐＨを９．７±０．１とした。反応媒体を０．４５μｍメンブレンで濾過し、３０％過酸化水素水溶液０．３４ｍｌを添加した。２０℃程度の温度で約２時間攪拌した後、１ＮＨＣｌを添加することにより混合物を中和し、その後、塩化ナトリウム７ｇを添加した。次に溶液を０．４５μｍメンブレンで濾過し、次に１０℃程度の温度でメタノール４９ｍｌを注ぎ込んだ。次に溶液を２０℃とし、そして１５分間攪拌した。次にメタノール１２６ｍｌを添加し、その後１時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を２０分間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した（１０５ｍｌ）。メタノール１０５ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。沈殿を約２５分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した（１１０ｍｌ）。次に懸濁液中の沈殿をＮｏ．３焼結ガラスで濾過した。次に得られた白色のケーキをメタノール５０ｍｌで洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に５５℃程度の温度で減圧下（６ｋＰａ）に乾燥した。１８時間乾燥後、純粋な脱重合ヘパリン（ナトリウム塩）５．２１ｇを得た。得られた収率は８９％であった。
【００８７】
このようにして得られた脱重合ヘパリンの特性は以下の通りであった。
平均分子量：３５５０ダルトン
抗Ｘａ活性：９９ＩＵ／ｍｇ
抗ＩＩａ活性：１３．４ＩＵ／ｍｇ
抗Ｘａ活性／抗ＩＩａ活性の比：７．４
【実施例８】
【００８８】
脱重合およびナトリウム塩への変換（塩基０．５当量）：
ジクロロメタン１４０ｍｌを三角フラスコＡ中に入れた。実施例Ａに記載の通りえられたヘパリンのベンジルエステル（エステル化度：７５％、ベンゼトニウム塩）２０ｇ（０．０１９モル）を攪拌しながらゆっくり添加した。３０℃程度の温度で完全に溶解させ、そして２０℃程度の温度に冷却した後、２−ｔ−ブチルイミノ−２−ジエチルアミノ−１，３−ジメチルパーヒドロ−１，２，３−ジアザホスホリン１．７５ｍｌ（０．００６モル）を添加した。混合物を２４時間２０℃程度の温度で攪拌した。この間、メタノール６００ｍｌ中の無水酢酸ナトリウム６０ｇの溶液を三角フラスコＢ中に製造した。三角フラスコＡ中の反応混合物を、磁気攪拌しながら４℃程度の温度で酢酸ナトリウムのメタノール溶液中に注ぎ込んだ。１時間攪拌した後、懸濁液を２時間放置して沈降させた。上澄みの透明部分を分離し、廃棄した（４２０ｍｌ）。メタノール４２０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を３０分間攪拌した。沈殿を約１８時間放置して再沈降させた。上澄みの透明部分を分離し、廃棄した（４００ｍｌ）。メタノール４００ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を３０分間攪拌した。上澄みを分離し、廃棄した（４００ｍｌ）。次に懸濁液中の沈殿をＮｏ．３焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキをメタノール１００ｍｌで２回洗浄した。淡黄色の湿潤固体を引き出し、次に６０℃程度の温度で減圧下（６ｋＰａ）に乾燥した。乾燥後、粗製の脱重合ヘパリン５．７ｇをナトリウム塩として得た。得られた収率は７３％であった。
【００８９】
ケン化：
上記の通り得られた粗製の脱重合ヘパリンナトリウム塩５．７ｇ（０．００８６モル）および水５３ｍｌを１００ｍｌの三角フラスコに入れた。３０％苛性ソーダ０．９３ｍｌ（０．００９モル）を４℃程度の温度で磁気攪拌しながら添加した。添加後、混合物を２時間攪拌した。１ＮＨＣｌを添加することにより溶液を中和し、そして塩化ナトリウム６ｇを添加した。メタノール４２ｍｌを反応媒体に添加した。１５分間攪拌の後、メタノール１０８ｍｌを添加し、その後３０分間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を４℃程度の温度で３０分間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した（１８０ｍｌ）。メタノール１８０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。沈殿を約３０分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した（１７０ｍｌ）。メタノール１７０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を３０分間攪拌した。次に懸濁液中の沈殿をＮｏ．３焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキを２回メタノール３０ｍｌで洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に６０℃程度の温度で減圧下に乾燥した。乾燥後、粗製の脱重合ヘパリン（ナトリウム塩）３．５ｇを得た。得られた収率は６７．４％であった。
【００９０】
精製：
上記において得られた粗製の脱重合ヘパリン３．５ｇおよび蒸留水３５ｍｌを１００ｍｌの三角フラスコに入れた。混合物を磁気攪拌しながら４０℃とした。１Ｎ水酸化ナトリウムを添加することによりｐＨを９．６±０．１とした。反応媒体を０．４５μｍメンブレンで濾過し、３０％過酸化水素水溶液０．１８ｍｌを添加した。２０℃程度の温度で約２時間攪拌した後、１ＮＨＣｌを添加することにより混合物を中和し、その後、塩化ナトリウム３．６ｇを添加した。次に溶液を０．４５μｍメンブレンで濾過し、次に１０℃程度の温度でメタノール２７ｍｌを注ぎ込んだ。次に溶液を２０℃とし、そして１５分間攪拌した。次にメタノール６５ｍｌを添加し、その後３０分間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を３０分間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した（８０ｍｌ）。メタノール８０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を３０分間攪拌した。沈殿を約３０分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した（７０ｍｌ）。メタノール７０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を３０分間攪拌した。次に懸濁液中の沈殿をＮｏ．３焼結ガラスで濾過した。次に得られた白色のケーキをメタノール３０ｍｌで２回洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に６０℃程度の温度で減圧下に乾燥した。乾燥後、純粋な
脱重合ヘパリン（ナトリウム塩）２．８ｇを得た。得られた収率は８０％であった。
【００９１】
このようにして得られた脱重合ヘパリンの特性は以下の通りであった。
平均分子量：２９００ダルトン
抗Ｘａ活性：１４６．１ＩＵ／ｍｇ
抗ＩＩａ活性：５．１ＩＵ／ｍｇ
抗Ｘａ活性／抗ＩＩａ活性の比：２８．６
【実施例９】
【００９２】
脱重合およびナトリウム塩への変換（塩基０．６当量）：
ジクロロメタン２８０ｍｌを三つ口フラスコＡ中に入れた。実施例Ａに記載の通りえられたヘパリンのベンジルエステル（エステル化度：７５％、ベンゼトニウム塩）４０ｇ（０．０２４モル）を攪拌しながらゆっくり添加した。３０℃程度の温度で完全に溶解させ、そして２０℃程度の温度に冷却した後、２−ｔ−ブチルイミノ−２−ジエチルアミノ−１，３−ジメチルパーヒドロ−１，２，３−ジアザホスホリン４．２ｍｌ（０．０１４モル）を添加した。混合物を２４時間２０℃程度の温度で攪拌した。この間、メタノール６００ｍｌ中の無水酢酸ナトリウム６０ｇの溶液を三角フラスコＢ中に製造した。三つ口フラスコＡ中の反応混合物の半量を、磁気攪拌しながら４℃程度の温度で酢酸ナトリウムのメタノール溶液中に注ぎ込んだ。１時間攪拌した後、懸濁液を２時間放置して沈降させた。上澄みの透明部分を分離し、廃棄した（３１０ｍｌ）。メタノール３１０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を１時間攪拌した。沈殿を約１８時間放置して再沈降させた。上澄みの透明部分を分離し、廃棄した（４００ｍｌ）。メタノール４００ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を１時間間攪拌した。上澄みを分離し、廃棄した（３００ｍｌ）。次に懸濁液中の沈殿をＮｏ．３焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキをメタノール１００ｍｌで２回洗浄した。淡黄色の湿潤固体を引き出し、次に６０℃程度の温度で減圧下に乾燥した。乾燥後、粗製の脱重合ヘパリン６ｇをナトリウム塩として得た。得られた収率は７７％であった。
【００９３】
ケン化：
上記の通り得られた粗製の脱重合ヘパリンナトリウム塩６ｇ（０．００９１モル）および水５６ｍｌを２５０ｍｌの三角フラスコに入れた。３０％苛性ソーダ１ｍｌ（０．０１０モル）を４℃程度の温度で磁気攪拌しながら添加した。添加後、混合物を２時間攪拌した。１ＮＨＣｌを添加することにより溶液を中和し、そして塩化ナトリウム６．４ｇを添加した。メタノール４５ｍｌを反応媒体に添加した。１５分間攪拌の後、メタノール１１５ｍｌを添加し、その後３０分間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を４℃程度の温度で３０分間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した（１７０ｍｌ）。メタノール１７０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を３０分間攪拌した。沈殿を約３０分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した（１４０ｍｌ）。メタノール１４０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を３０分間攪拌した。次に懸濁液中の沈殿をＮｏ．３焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキを２回メタノール３０ｍｌで洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に６０℃程度の温度で減圧下に乾燥した。乾燥後、粗製の脱重合ヘパリン（ナトリウム塩）３．６ｇを得た。得られた収率は６５．３％であった。
【００９４】
精製：
上記において得られた粗製の脱重合ヘパリン３．５ｇおよび蒸留水３５ｍｌを１００ｍｌの三角フラスコに入れた。混合物を磁気攪拌しながら４０℃とした。１Ｎ水酸化ナトリウムを添加することによりｐＨを９．６±０．１とした。反応媒体を０．４５μｍメンブレンで濾過し、３０％過酸化水素水溶液０．１８ｍｌを添加した。２０℃程度の温度で約２時間攪拌した後、１ＮＨＣｌを添加することにより混合物を中和し、その後、塩化ナトリウム３．５ｇを添加した。次に溶液を０．４５μｍメンブレンで濾過し、次に１０℃程
度の温度でメタノール２５ｍｌを注ぎ込んだ。次に溶液を２０℃とし、そして１５分間攪拌した。次にメタノール６３ｍｌを添加し、その後３０分間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を３０分間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した（７０ｍｌ）。メタノール７０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を３０分間攪拌した。沈殿を数分間放置して再沈降させた。次に懸濁液をＮｏ．３焼結ガラスで濾過した。次に得られた白色のケーキをメタノール３０ｍｌで２回洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に６０℃程度の温度で減圧下に乾燥した。乾燥後、純粋な脱重合ヘパリン（ナトリウム塩）２．５ｇを得た。得られた収率は７１．４％であった。
【００９５】
このようにして得られた脱重合ヘパリンの特性は以下の通りであった。
平均分子量：２６００ダルトン
抗Ｘａ活性：１５０．５ＩＵ／ｍｇ
抗ＩＩａ活性：３．２ＩＵ／ｍｇ
抗Ｘａ活性／抗ＩＩａ活性の比：４７
【実施例１０】
【００９６】
脱重合およびナトリウム塩への変換（塩基０．８当量）：
ジクロロメタン７０ｍｌを三角フラスコＡ中に入れた。実施例Ａに記載の通り得られたヘパリンのベンジルエステル（エステル化度：７５％、ベンゼトニウム塩）１０ｇ（０．００６モル）を攪拌しながらゆっくり添加した。３０℃程度の温度で完全に溶解させ、そして２０℃程度の温度に冷却した後、２−ｔ−ブチルイミノ−２−ジエチルアミノ−１，３−ジメチルパーヒドロ−１，２，３−ジアザホスホリン１．３８ｍｌ（０．００４モル）を添加した。混合物を２４時間２０℃程度の温度で攪拌した。この間、メタノール３００ｍｌ中の無水酢酸ナトリウム３０ｇの溶液を三角フラスコＢ中に製造した。三角フラスコＡ中の反応混合物を磁気攪拌しながら４℃程度の温度で酢酸ナトリウムのメタノール溶液中に１分１５秒かけて注ぎ込んだ。５分間攪拌の後、懸濁液を１時間放置して沈降させた。上澄みの透明部分を分離し、廃棄した（１９０ｍｌ）。メタノール１９０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。沈殿を約３０分間放置して再沈降させた。上澄みの透明部分を分離し、廃棄した（１９０ｍｌ）。メタノール１９０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を３０分間攪拌した。上澄みを分離し、廃棄した（１９０ｍｌ）。次に懸濁液中の沈殿をＮｏ．３焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキをメタノール１５０ｍｌで洗浄した。淡黄色の湿潤固体を引き出し、次に４０℃程度の温度で減圧下（６ｋＰａ）に乾燥した。１８時間乾燥後、粗製の脱重合ヘパリン３．０５ｇをナトリウム塩として得た。得られた収率は８０％であった。
【００９７】
ケン化：
上記の通り得られた粗製の脱重合ヘパリンナトリウム塩３．０５ｇ（０．００４８モル）および水２１ｍｌを１００ｍｌの三角フラスコに入れた。溶液をＮｏ．３焼結ガラスで濾過し、水６ｍｌで２回リンスした。得られた濾液を１５０ｍｌの三角フラスコに入れた。３０％苛性ソーダ０．６ｍｌ（０．００６モル）を４℃程度の温度で磁気攪拌しながら添加した。添加後、混合物を２時間攪拌した。１ＮＨＣｌを添加することにより溶液を中和し、そして塩化ナトリウム４ｇを添加した。メタノール２８ｍｌを反応媒体に添加した。１５分間攪拌の後、メタノール７２ｍｌを添加し、その後１時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を４℃程度の温度で３０分間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した（８０ｍｌ）。メタノール８０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。沈殿を約３０分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した（８０ｍｌ）。メタノール８０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を３０分間攪拌した。次に懸濁液中の沈殿をＮｏ．３焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキをメタノール５０ｍｌで洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に４０℃程度の温度で減圧下（６ｐＫａ）に乾燥した。乾燥後、粗製の脱重合ヘパリン（ナトリウム塩）１．６ｇを得た。得られた収率
は５７％であった。
【００９８】
精製：
上記において得られた粗製の脱重合ヘパリン１．６ｇおよび蒸留水１６ｍｌを５０ｍｌの三角フラスコに入れた。混合物を磁気攪拌しながら４０℃とした。１Ｎ水酸化ナトリウムを添加することによりｐＨを９．６±０．１とした。反応媒体を０．４５μｍメンブレンで濾過し、３０％過酸化水素水溶液０．０８ｍｌを添加した。２０℃程度の温度で約２時間攪拌した後、１ＮＨＣｌを添加することにより混合物を中和し、その後、塩化ナトリウム２ｇを添加した。次に溶液を０．４５μｍメンブレンで濾過し、次に１０℃程度の温度でメタノール１４ｍｌを注ぎ込んだ。次に溶液を２０℃とし、そして１５分間攪拌した。次にメタノール３６ｍｌを添加し、その後１時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を３０分間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した（５０ｍｌ）。メタノール５０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。沈殿を約３０分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した（５０ｍｌ）。次に懸濁液中の沈殿をＮｏ．３焼結ガラスで濾過した。湿潤した固体を引き出し、次に４０℃程度の温度で減圧下（６ｐＫａ）に乾燥した。乾燥後、純粋な脱重合ヘパリン（ナトリウム塩）１．２５ｇを得た。得られた収率は７８％であった。
【００９９】
このようにして得られた脱重合ヘパリンの特性は以下の通りであった。
平均分子量：２４００ダルトン
抗Ｘａ活性：１５４．３ＩＵ／ｍｇ
抗ＩＩａ活性：１．６ＩＵ／ｍｇ
抗Ｘａ活性／抗ＩＩａ活性の比：９６．４
【実施例１１】
【０１００】
脱重合およびナトリウム塩への変換：
ジクロロメタン１４０ｍｌを三角フラスコＡ中に入れた。実施例Ａに記載の通りえられたヘパリンのベンジルエステル（エステル化度：７５％、ベンゼトニウム塩）２０ｇ（０．０１９モル）を攪拌しながらゆっくり添加した。４０℃程度の温度で完全に溶解させ、そして２０℃程度の温度に冷却した後、ｔ−ブチルイミノトリ（ピロリジノ）ホスホラン３．５ｍｌ（０．０１１モル）を添加した。混合物を２４時間２０℃程度の温度で攪拌した。この間、メタノール６００ｍｌ中の無水酢酸ナトリウム６０ｇの溶液を三角フラスコＢ中に製造した。完全に溶解した後、ハイフロスーパーセルセライト１０ｇを溶液に添加した。三角フラスコＡ中の反応混合物を、磁気攪拌しながら４℃程度の温度で酢酸ナトリウムのメタノール溶液中に１分３０秒かけて注ぎ込んだ。５分間攪拌の後、懸濁液を３０分放置して沈降させた。上澄みの透明部分を分離し、廃棄した（４００ｍｌ）。メタノール４００ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。沈殿を約１時間２０分放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した（２５０ｍｌ）。メタノール２５０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。次に懸濁液中の沈殿をＮｏ．３焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキをメタノール２００ｍｌで洗浄した。淡黄色の湿潤固体を引き出し、次に４０℃程度の温度で減圧下（６ｋＰａ）に乾燥した。乾燥後、脱重合ヘパリン（ベンジルエステル、ナトリウム塩）５．３９ｇを得た。得られた収率は６９％であった。
【０１０１】
ケン化：
上記の通り得られた脱重合ヘパリン（ベンジルエステル、ナトリウム塩）５ｇ（０．００７６モル）および水３５ｍｌを５０ｍｌの三角フラスコに入れた。溶液をＮｏ．３焼結ガラスで濾過し、水１０ｍｌで２回リンスした。得られた濾液を２５０ｍｌの三角フラスコに入れた。３０％苛性ソーダ１ｍｌ（０．０１モル）を４℃程度の温度で磁気攪拌しながら添加した。添加後、混合物を２時間攪拌した。１ＮＨＣｌを添加することにより溶液
を中和し、そして塩化ナトリウム６ｇを添加した。メタノール４２ｍｌを反応媒体に添加した。１５分間攪拌の後、メタノール１０４ｍｌを添加し、その後１５分間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を４℃程度の温度で１時間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した（１４０ｍｌ）。メタノール１４０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。沈殿を約４５分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した（１６０ｍｌ）。メタノール１６０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。次に懸濁液中の沈殿をＮｏ．３焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキをメタノール１００ｍｌで洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に４０℃程度の温度で減圧下（６ｋＰａ）に乾燥した。４８時間乾燥後、粗製の脱重合ヘパリン（ナトリウム塩）２．７ｇを得た。得られた収率は５９％であった。
【０１０２】
精製：
上記において得られた粗製の脱重合ヘパリン２．６ｇおよび蒸留水２５ｍｌを５０ｍｌの三角フラスコに入れた。混合物を磁気攪拌しながら４０℃とした。１Ｎ水酸化ナトリウムを添加することによりｐＨを９．７±０．１とした。反応媒体を０．４５μｍメンブレンで濾過し、３０％過酸化水素水溶液０．１５ｍｌを添加した。２０℃程度の温度で約２時間攪拌した後、１ＮＨＣｌを添加することにより混合物を中和し、その後、塩化ナトリウム３ｇを添加した。次に溶液を０．４５μｍメンブレンで濾過し、次に１０℃程度の温度でメタノール２１ｍｌを注ぎ込んだ。次に溶液を２０℃とし、そして１５分間攪拌した。次にメタノール５４ｍｌを添加し、その後１時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を２０分間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した（５０ｍｌ）。メタノール５０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。沈殿を約２０分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した（５０ｍｌ）。次に懸濁液中の沈殿をＮｏ．３焼結ガラスで濾過した。次に得られた白色のケーキをメタノール５０ｍｌで洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に４０℃程度の温度で減圧下（６ｋＰａ）に乾燥した。１８時間乾燥後、純粋な脱重合ヘパリン（ナトリウム塩）２．３５ｇを得た。得られた収率は９０％であった。
【０１０３】
このようにして得られた脱重合ヘパリンの特性は以下の通りであった。
平均分子量：２４００ダルトン
抗Ｘａ活性：１６７．５ＩＵ／ｍｇ
抗ＩＩａ活性：１．１ＩＵ／ｍｇ
抗Ｘａ活性／抗ＩＩａ活性の比：１５２
【実施例１２】
【０１０４】
脱重合およびナトリウム塩への変換（０．０５％水）：
ジクロロメタン１４０ｍｌを三角フラスコＡ中に入れた。実施例Ａに記載の通りえられたヘパリンのベンジルエステル（エステル化度：７５％、ベンゼトニウム塩）２０ｇ（０．０１９モル）を攪拌しながらゆっくり添加した。４Ａのモレキュラーシーブ２０ｇを反応媒体に添加し、４８時間ゆっくり攪拌しながら水分含有量を０．０５％とした。上澄みを不活性雰囲気下、三角フラスコＡに移した。完全に溶解した後、２−ｔ−ブチルイミノ−２−ジエチルアミノ−１，３−ジメチルパーヒドロ−１，２，３−ジアザホスホリン３．５ｍｌ（０．０１２モル）を添加した。混合物を２４時間２０℃程度の温度で攪拌した。この間、メタノール６００ｍｌ中の無水酢酸ナトリウム６０ｇの溶液を三角フラスコＢ中に製造した。完全に溶解した後、ハイフロスーパーセルセライト１０ｇを溶液に添加した。三角フラスコＡ中の反応混合物を、磁気攪拌しながら４℃程度の温度で酢酸ナトリウムのメタノール溶液中に約２分間かけて注ぎ込んだ。１５分間攪拌の後、懸濁液を１時間放置して沈降させた。上澄みの透明部分を分離し、廃棄した（４２０ｍｌ）。メタノール４２０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を１５分間攪拌した。沈殿を約１時間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した（４５０ｍｌ）。メタノール４５０ｍｌを沈
降した沈殿に添加し、混合物を１５分間攪拌した。次に懸濁液をＮｏ．３焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキをメタノール２００ｍｌで洗浄した。淡黄色の湿潤固体を引き出し、次に５０℃程度の温度で減圧下（６ｋＰａ）に乾燥した。１６時間乾燥後、セライト（１０ｇ）中のナトリウム塩として粗製の脱重合ヘパリン５．３６ｇを得た。得られた収率は６８．６％であった。
【０１０５】
ケン化：
上記の通り得られたセライト（１０ｇ）中の粗製の脱重合ヘパリンナトリウム塩５．３６ｇ（０．００８１７モル）および水５０ｍｌを５０ｍｌの三角フラスコに入れた。懸濁液をＮｏ．３焼結ガラスで濾過し、水１５ｍｌで２回リンスした。得られた濾液を１５０ｍｌの三角フラスコに入れた。３５％苛性ソーダ１．０１ｍｌ（０．０１２２モル）を、４℃程度の温度で磁気攪拌しながら添加した。添加後、混合物を３時間攪拌した。１ＮＨＣｌを添加することにより溶液を中和し、そして塩化ナトリウム１１ｇを添加した。メタノール７７ｍｌを反応媒体に添加した。１５分間攪拌の後、メタノール２００ｍｌを添加し、その後１時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を４℃程度の温度で１時間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した（２４０ｍｌ）。メタノール２４０ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を１０分間攪拌した。沈殿を約３０分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した（２２５ｍｌ）。メタノール２２５ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を１０分間攪拌した。次に懸濁液をＮｏ．３焼結ガラスで濾過した。次に得られたケーキを２回メタノール５０ｍｌで洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に４０℃程度の温度で減圧下（６ｋＰａ）に乾燥した。１８時間乾燥後、粗製の脱重合ヘパリン（ナトリウム塩）２．６５ｇを得た。得られた収率は５３．７％であった。
【０１０６】
精製：
上記において得られた粗製の脱重合ヘパリン２．６５ｇおよび蒸留水２６．５ｍｌを１００ｍｌの三角フラスコに入れた。混合物を磁気攪拌しながら４０℃とした。１Ｎ水酸化ナトリウムを添加することによりｐＨを９．７±０．１とした。反応媒体を０．４５μｍメンブレンで濾過し、３０％過酸化水素水溶液０．２５ｍｌを添加した。２０℃程度の温度で約２時間攪拌した後、１ＮＨＣｌを添加することにより混合物を中和し、その後、塩化ナトリウム３ｇを添加した。次に溶液を０．４５μｍメンブレンで濾過し、次に１０℃程度の温度でメタノール２１ｍｌを注ぎ込んだ。次に溶液を２０℃とし、そして１５分間攪拌した。次にメタノール５４ｍｌを添加し、その後１時間攪拌した。次に攪拌を停止し、懸濁液を４５分間放置して沈降させた。次に上澄みを分離し、廃棄した（４６ｍｌ）。メタノール４６ｍｌを沈降した沈殿に添加し、混合物を５分間攪拌した。沈殿を約３０分間放置して再沈降させた。上澄みを分離し、廃棄した（５０ｍｌ）。メタノール５０ｍｌを添加し、次に懸濁液中の沈殿をＮｏ．４焼結ガラスで濾過した。次に得られた白色のケーキをメタノール各１０ｍｌで２回洗浄した。湿潤した固体を引き出し、次に５０℃程度の温度で減圧下（６ｋＰａ）に乾燥した。１８時間乾燥後、純粋な脱重合ヘパリン（ナトリウム塩）２．３６３ｇを得た。得られた収率は８９．１％であった。
【０１０７】
このようにして得られた脱重合ヘパリンの特性は以下の通りであった。
平均分子量：２５００ダルトン
抗Ｘａ活性：１９２ＩＵ／ｍｇ
抗ＩＩａ活性：１．３ＩＵ／ｍｇ
抗Ｘａ活性／抗ＩＩａ活性の比：１４８