(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（１）〜（６）の工程を含むことを特徴とする、高純度ＢＣＧ−ＣＷＳの製造方法であって、
（１）ＢＣＧ菌東京株の死菌を水に縣濁して破砕し、遠心分離により細胞壁（ＷＣＷ）を集める工程、
（２）（１）で得られる細胞壁（ＷＣＷ）をセラチア  マルセセンス由来の組換エンドヌクレアーゼ（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ３．１．３０．２）を用いて、インキュベートする工程、
（３）（２）で得られたＷＣＷをストレプトマイセス  グリセウス由来の非特異的蛋白分解酵素（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ２３２９６６６）を用いて処理する工程、
（４）（３）で得られるＷＣＷを、５５℃〜６５℃の加温下に、非イオン性界面活性剤のポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテルで処理し、エタノールで洗浄する工程、
（５）（４）で得られるＷＣＷを、テトラヒドロフラン、クロロホルム−メタノール（２：１）、次いでメタノールで洗浄する工程、
（６）（５）で得られるＷＣＷを乾燥する工程、
高純度のＢＣＧ−ＣＷＳに残存する不純物として、
ａ）非構成アミノ酸の含有量が、１．３％（ｗ／ｗ）であり、
ｂ）非構成中性糖の含有量が、１．２％（ｗ／ｗ）であり、
ｃ）細菌エンドトキシン（リポサッカライド；ＬＰＳ）の含有量が、０．００１５ＥＵ／ｍｇ以下、
ｄ）トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）の含有量が、０．０５％（ｗ／ｗ）未満、
ｅ）核酸の含有量が、０．０５％（ｗ／ｗ）未満、
である、高純度ＢＣＧ−ＣＷＳの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌細胞壁骨格成分、詳しくは、ＢＣＧ菌の細胞壁骨格成分（ＢＣＧ−ＣＷＳ）の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌細胞壁骨格成分〔細胞壁骨格成分（Cell Wall Skeleton）を、以下CWSと略する場合がある〕は、免疫賦活作用を有し、例えば動物モデルを用いた実験的腫瘍系、およびヒト癌の免疫療法において抗腫瘍活性を示すことが知られている物質である。
例えばBacille Calmette-Guerin菌（ＢＣＧ菌）の細胞壁骨格成分（以下、ＢＣＧ−ＣＷＳと略する場合がある）を用いた癌免疫療法では、ヒトの癌治療において優れた成績が得られたことが報告されている(非特許文献１及び２を参照)。ＢＣＧ−ＣＷＳの製造方法は、東らにより報告されているが（非特許文献３を参照）、医薬品原薬として工業的スケールで高純度のＢＣＧ−ＣＷＳを製造する方法が求められていた。
【非特許文献１】A. Hayashi et al., Pro. Japan Acad., 70, Ser. B 205-209 (1994)
【非特許文献２】A. Hayashi et al., Pro. Japan Acad., 74, Ser. B 50-56(1998)
【非特許文献３】I. Azuma et al., Journal of the National Cancer Institute, Vol. 52, NO. 1 95-101(1974)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明が解決しようとする課題は、高純度のＢＣＧ−ＣＷＳの製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、工業的スケールで、高純度のＢＣＧ−ＣＷＳを製造すべく、鋭意検討を行った結果、本発明を完成した。
即ち本発明は、
〔１〕  以下の（１）〜（４）の工程を含むことを特徴とする、ＢＣＧ−ＣＷＳの製造方法：
（１）ＢＣＧ菌を破砕し、細胞壁（ＷＣＷ）を集める工程、
（２）（１）で得られる細胞壁（ＷＣＷ）をベンゾナーゼ及びプロナーゼで処理する工程、
（３）（２）で得られる生成物を、５５℃〜６５℃の加温下に、界面活性剤で処理する工程、
（４）（３）で得られる生成物を、１又は複数の有機溶媒で、１又は複数回洗浄する工程；
〔２〕  工程（３）における界面活性剤が非イオン性界面活性剤である、〔１〕に記載の製造方法；
〔３〕  非イオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン（10）オクチルフェニルエーテル（Triton X-100）である、〔１〕又は〔２〕に記載の製造方法；
〔４〕  工程（４）における有機溶媒が、アルコール系溶媒、エーテル系溶媒、ハロゲン系溶媒及びこれらの混合溶媒から選択される１又は複数の、同一又は異なる有機溶媒である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の製造方法；
〔５〕  工程（４）における有機溶媒が、メタノール、エタノール、テトラヒドロフラン、クロロホルム、ジクロロエタン及びこれらの混合溶媒から選択される１又は複数の、同一又は異なる有機溶媒である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の製造方法；
〔６〕  工程（４）における有機溶媒が、テトラヒドロフラン、クロロホルム−メタノール（２：１）、及びメタノールである、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の製造方法；
〔７〕  ＢＣＧ菌が、ＢＣＧ菌東京株である、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の製造方法；
〔８〕  〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の製造方法で得られる、高純度のＢＣＧ−ＣＷＳ；
に関する。
【発明の効果】
【０００５】
本発明により、工業的スケールで、高純度のＢＣＧ−ＣＷＳを提供することが可能になった。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００６】
本明細書において、ＢＣＧ−ＣＷＳとは、ミコバクテリウム属細菌である、Mycobacterium bovis（ウシ型結核菌）、詳しくは、ＢＣＧ菌（カルメット・ゲラン菌；Bacille Calmette-Guerin）由来の細胞壁骨格成分（Cell Wall Skeleton; CWS）を表す。ここで、ＢＣＧ菌として、具体的には、東京株、ロシア株、ブラジル株、スウェーデン株及びオーストラリア株等が挙げられる。更に好ましいＢＣＧ菌として、ＢＣＧ菌Ｔｏｋｙｏ  １７２株（ＡＴＣＣ３５７３７）を挙げることができる。
「細胞壁骨格成分（ＣＷＳ）」とは、細菌の菌体を物理的に粉砕した後、ヌクレアーゼによる除核酸、プロテアーゼによる除蛋白、有機溶媒での洗浄による脱脂などの精製工程を経て得られる、タンパク質、核酸及び脂肪酸等の可溶性成分を実質的に含まない不溶性残渣を表し、ＣＷＳそのものは公知である（J. Nat. Cancer Inst., 52, 95-101 (1974) ）。当該不溶性残渣は、長鎖ヒドロキシ脂肪酸であるミコール酸、及びペプチドグリカンを含む高分子であることが知られている。
【０００７】
出発原料として用いられるＢＣＧ菌は、公知であり、当業者に公知の方法で製造することができる。すなわち、ＢＣＧ菌を、ソートン培地等の適当な培地中、約３７℃で７-１０日、初期定常期まで培地表面に菌膜として培養する。培養細胞は、約８０℃で30分間加熱することによって不活性化した後、全培養液を７０００ｘｇ、４０分間、４℃で遠心分離することにより、沈殿物としてＢＣＧ死菌を得ることができる（J. Nat. Cancer Inst., 52, 95-101 (1974)  等を参照）。
【０００８】
本発明において用いられるベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）Enzyme Commission (EC) Number 3.1.30.2）とは、DNA、RNA、一本鎖、二本鎖、直鎖、環状、スーパーコイルを問わず、核酸を分解する酵素であり、組換え大腸菌で発現させたSerratia marcescens由来のエンドヌクレアーゼ（非特異的phosphodiesteraseとして分類される）である。
本発明において用いられるプロナーゼ（Ｐｒｏｎａｓｅ；EC Number 2329666）とは、Streptomyces griseus由来のタンパク質・ペプチドを非特異的に加水分解する酵素である。
【０００９】
本発明において用いられる界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤が挙げられる。具体的には、ポリオキシエチレン（10）オクチルフェニルエーテル（Triton X-100）を挙げることができる。
【００１０】
本発明の製造方法の各工程について以下に詳細に説明する。
（１）ＢＣＧ菌を破砕し、細胞壁（ＷＣＷ）を集める工程：
原料となるＢＣＧ死菌は、通常乾燥していないウェットなものを用いる。ＢＣＧ菌を６００ｇあたり約２Ｌ〜５Ｌの水にけん濁し、破砕する。破砕する手段には特に限定は無いが、通常は高圧ホモジナイザー等の破砕機を用いて３０〜４０kpsi、好ましくは約３５kpsiの加圧下に破砕することができる。破砕された細胞は、遠心分離を１又は複数回繰り返すことにより、破砕が不十分な細胞片や破砕されていない細胞が除去された均一な細胞壁（以下ＷＣＷという場合がある）とすることができる。当該細胞壁の粒子の大きさは約０．５μｍ〜０．７μｍである。
ここで、ＣＷＳを製造するための原料となる細胞壁を得るための遠心分離の条件は、適宜選択することができる。例えば、２０〜３０℃、好ましくは約２５℃下に、５０００ｘｇ〜９０００ｘｇ、好ましくは７０００ｘｇで、５〜１５分間、好ましくは約１０分間遠心分離した後、上清を２０〜３０℃、好ましくは約２５℃下に、１６０００ｘｇ〜２００００ｘｇ、好ましくは１８０００ｘｇで３０〜９０分、好ましくは約６０分間遠心分離すればよい。
【００１１】
（２）（１）で得られる細胞壁（ＷＣＷ）をベンゾナーゼ及びプロナーゼで処理する工程：
（１）で得られる細胞壁（ＷＣＷ）をベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）及びプロナーゼ（Ｐｒｏｎａｓｅ）で処理する。
ここで、両酵素で処理する順番に特に限定は無いが、好ましくは、ベンゾナーゼで処理した後に、プロナーゼで処理する。
ベンゾナーゼで処理する工程は、通常ＷＣＷ１ｇあたり８００〜１２００Ｕ、好ましくは約１０００Ｕのベンゾナーゼを用い、約２０〜３０℃、好ましくは２５℃下に、約１５〜１７時間反応させる。
プロナーゼで処理する工程は、通常ＷＣＷ１ｇあたり５〜１５ｍｇ、好ましくは約１０ｍｇのプロナーゼを用い、約３５〜４０℃、好ましくは約３７℃下に、１５〜１７時間反応させる。
第一の酵素及び第二の酵素で処理する工程は、特に限定は無く、当業者に周知の方法で適宜行うことができる。通常は、ＷＣＷをトリスバッファー等のｐＨ７．５〜９のバッファー中にけん濁して第一の酵素で処理した後、遠心分離によりＷＣＷを回収する。ＷＣＷを回収する際、適宜界面活性剤を添加することができる。また、ＷＣＷを回収した後、界面活性剤の存在下または非存在下水で再度けん濁し、遠心分離することによってＷＣＷを洗浄する工程を行ってもよい。当該界面活性剤としては、前述のものが挙げられ、具体的には、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００等を用いることができる。洗浄する工程は、例えば、約２３℃〜２７℃下に、約１時間撹拌した後、１６０００ｘｇ〜２００００ｘｇ、好ましくは約１８０００ｘｇで約３０〜９０分、好ましくは約６０分間遠心分離する操作を、１又は複数回、好ましくは１〜５回行えばよい。
次いで、回収したＷＣＷをトリスバッファー等のｐＨ７．５〜９のバッファー中にけん濁して第二の酵素で処理した後、遠心分離によりＷＣＷを回収する。ＷＣＷを回収する際、適宜界面活性剤を添加することができる。また、ＷＣＷを回収した後、界面活性剤の存在下または非存在下水で再度けん濁し、遠心分離することによってＷＣＷを洗浄する工程を行ってもよい。当該界面活性剤としては、前述のものが挙げられ、具体的には、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００等を用いることができる。洗浄する工程は、例えば、約２０〜３０℃、好ましくは約２５℃下に、１６０００ｘｇ〜２００００ｘｇ、好ましくは約１８０００ｘｇで３０〜９０分間、好ましくは約６０分間遠心分離する操作を、１又は複数回、好ましくは１〜５回行えばよい。当該界面活性剤としては、前述のものが挙げられる。
上記の工程を経て、ＢＣＧ−ＣＷＳを得ることができる。
【００１２】
（３）（２）で得られる生成物を、５５〜６５℃の加温下に、界面活性剤で処理する工程：
（２）で得られるＢＣＧ−ＣＷＳを界面活性剤の存在下に水にけん濁させ、５５〜６５℃、好ましくは約６０℃の加温下に、約３０〜９０分間、好ましくは約６０分間攪拌することにより、精製することができる。当該界面活性剤としては、前述のものが挙げられ、具体的には、０．９〜１．１％、好ましくは１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００等を用いることができる。攪拌後、遠心分離により、ＢＣＧ−ＣＷＳを沈殿物として得ることができる。
【００１３】
（４）（３）で得られる生成物を、有機溶媒で洗浄する工程：
（３）で得られたＢＣＧ−ＣＷＳの粗精製物を、有機溶媒で洗浄することにより、高純度のＢＣＧ−ＣＷＳを得ることができる。有機溶媒としては、アルコール系溶媒、エーテル系溶媒、ハロゲン系溶媒及びこれらの混合溶媒から選択される１又は複数の有機溶媒が挙げられる。アルコール系溶媒として、具体的には、メタノール、エタノール等が挙げられる。エーテル系溶媒としては、テトラヒドロフランが挙げられる。ハロゲン系溶媒としては、クロロホルム、1,1-ジクロロエタン等が挙げられ、通常はアルコール系溶媒との混合溶媒として用いる。当該混合溶媒としては、クロロホルム−メタノール（１：１〜３：１、好ましくは２：１）等が挙げられる。
洗浄操作は、上述の有機溶媒から選択される同一もしくは異なる溶媒で、適宜１又は複数回行うことができる。また、１回の洗浄に使用する有機溶媒量は、通常ＢＣＧ−ＣＷＳ１０ｇあたり１．８Ｌ〜２．０Ｌである。
具体的には、例えば以下の１）〜３）の工程：
１）エタノール等のアルコール系溶媒で洗浄する工程、
２）テトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒、及びハロゲン系溶媒とアルコール系溶媒の混合溶媒で洗浄する工程、及び
３)メタノール等のアルコール系溶媒で洗浄する工程、
を含む。
前記２）において、テトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒による洗浄、及びハロゲン系溶媒とアルコール系溶媒の混合溶媒による洗浄は、どちらが先でもよい。
更に好ましくは、エタノール、テトラヒドロフラン、クロロホルム−メタノール（２：１）、及びメタノールの順に洗浄する。
洗浄後に、残渣を乾燥させることにより、高純度のＢＣＧ−ＣＷＳを得ることができる。
【００１４】
本発明の製造方法により得られる高純度のＢＣＧ−ＣＷＳもまた本発明の範疇に含まれる。具体的には、本発明の製造方法により、蛋白質含有量が非構成アミノ酸の合計量として、２．１％(w/w)以下（脱水物換算）、非構成中性糖（グルコース及びマンノース）の含有量が１．７％以下（脱水物換算）である等の性質を有する、高純度のＢＣＧ−ＣＷＳが得られる。
更に具体的には、本発明の製造方法により、上記に加えてエンドトキシン（リポポリサッカライド；ＬＰＳ）の含有量が０．００１５ＥＵ／ｍｇ以下（第十五改正日本薬局方に記載のエンドトキシン標準品を用いた場合）、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）の含有量が０．０５％(w/w)未満、核酸の含有量が０．０５％(w/w)未満（λ-Hind III digestを標準品として用いた場合）であるなどの性質を有する高純度のＢＣＧ−ＣＷＳが得られる。
【００１５】
本発明のＢＣＧ−ＣＷＳは、免疫賦活化作用を有し、癌等における免疫療法剤として用いられる。すなわち、本発明のＢＣＧ−ＣＷＳを、スクワラン、スクワレン又は鉱物油（ドラケオール、モレスコバイオレス等）等の油成分中に分散し、適宜マンニトール等の安定化剤、界面活性剤を添加して水中に乳化させることにより、水中油型エマルション製剤とすることができる。当該水中油型エマルション製剤を凍結乾燥することにより、長期保存可能な凍結乾燥製剤を得ることもできる。これらのＢＣＧ−ＣＷＳを含む製剤については、国際公開パンフレット第００／０３７２４号、同第２００４／０１２７５１号又は同第２００５／１０２３６９号を参照することができる。
【００１６】
以下の実施例に、本発明を具体的に記載するが、本発明はもとより、これに限定されるものではない。
【実施例１】
【００１７】
ＢＣＧ−ＣＷＳの製造
ＢＣＧ菌：Ｍ.ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ  Ｔｏｋｙｏ  １７２株（ＡＴＣＣ３５７３７）を、ソートン（Ｓａｕｔｏｎ）培地中３７℃で初期定常期まで培地表面に菌膜として培養した。培養細胞を30分間８０℃に加熱することによって不活性化させ、遠心分離した。沈殿物として得られるＢＣＧ死菌を原料として、ＢＣＧ−ＣＷＳを調製した。
約６００ｇのＢＣＧ死菌（ウェット）を２Ｌの水にけん濁し、Ｍｉｎｉ  ＤｅＢＥＥ（登録商標）（ＢＥＥインターナショナル社製）を用いて３５ｋｐｓｉで破砕した。破砕された細胞は、２５℃下に６７６０ｘｇで１０分間遠心分離し、大きな細胞片や破砕されていない細胞を除去した。
次いで、上清を２５℃下に１８０００ｘｇで１時間遠心分離し、ペレットを得た（当該ペレットを、ＷＣＷという）。６００ｇのＢＣＧ死菌（ウェット）から得られるＷＣＷの収量は、約１９０ｇであった。次に、ＷＣＷにベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ；Ｍｅｒｃｋ  Ｌｔｄ.製）を加えて、２５℃で１７時間インキュベートし、核酸を分解させた。得られたＷＣＷを遠心分離によって１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で５回洗浄した後、プロナーゼ（Ｐｒｏｎａｓｅ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．製）を加えて、３７℃で１７時間処理し、タンパク質を分解させた。２５℃下に１８０００ｘｇで２０分間遠心分離して細胞壁を集め、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に再けん濁させ、穏やかに６０℃で２時間攪拌してタンパク質分解物を除去した。細胞壁を集め、エタノールで洗浄した。
テトラヒドロフラン、クロロホルム−メタノール（２：１）、次いでメタノールで抽出することによって、遊離脂肪成分を除去した後、残渣を乾燥し、ＢＣＧ−ＣＷＳを得た。乾燥ＢＣＧ−ＣＷＳの収量は、約１０ｇであった。
【実施例２】
【００１８】
ＢＣＧ−ＣＷＳの分析結果
実施例１で得られたＢＣＧ−ＣＷＳを分析した結果を以下に示す。実施例１で得られたＢＣＧ−ＣＷＳは、非構成アミノ酸（具体的には、アスパラギン、バリン、アルギニン、システイン、グリシン、スレオニン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、セリンなどが挙げられる）の含有量が1.3%であり、及び非構成中性糖（グルコース及びマンノース）の含有量が1.2%であり、高純度であった。
【００１９】
【表１】
0005578390.tif 000002
【産業上の利用可能性】
【００２０】
本発明の製造方法で製造されるＢＣＧ−ＣＷＳは、癌免疫療法剤の原薬等として有用である。