(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類における少なくとも一つのＴ細胞エピトープに対して特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を誘発する医薬組成物であって、
ポリクローナル抗リンパ球および抗胸腺細胞免疫グロブリン（ＡＴＧ）、
プリン、
ピリミジン類似体、
アルキル化剤、並びに
抗ＣＤ８、抗ＣＤ４、抗ＣＤ２５、抗ＣＤ３および抗ＣＤ５２モノクローナル抗体からなる群から選択され、末梢および／または中枢で、Ｔ、ＢおよびＮＫリンパ球を涸渇させることができるモノクローナル抗体
からなる群から選択されるリンパ球減少症を誘発する第一の化合物と、
第二化合物として、
アデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）、
熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、
志賀毒素、および、
ＬＡＧ−３
からなる群から選択されるプロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）に選択的親和性を有する分子であって、前記Ｔ細胞エピトープと融合している分子と
を含んでなる、医薬組成物。
【請求項２】
前記第一の化合物が、一過性Ｔ細胞涸渇を誘発することができる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記アデニル酸シクラーゼが、Bordetella pertussis由来であり、ＨＳＰがｈｓｐ６５およびｈｓｐ７０からなる群から選択され、前記志賀毒素がShigella dysenteriae由来である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
アジュバントをさらに含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記アジュバントが、クラス３のＴＬＲリガンド、クラス９のＴＬＲリガンド、およびクラス４のＴＬＲリガンドからなる群から選択されるトル様受容体（ＴＬＲ）リガンドである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記アジュバントが第二の化合物とともに溶液状である、請求項４または５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ＡＰＣに選択的親和性を有する分子が、前記少なくとも一つのＴ細胞エピトープに共有結合してなる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ＡＰＣに選択的親和性を有する分子および前記少なくとも一つのＴ細胞エピトープが、組換えＤＮＡ技術によって融合したＤＮＡ配列によってコードされたポリペプチドである、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記Ｔ細胞エピトープが、感染性疾患病原因子または細胞性悪性疾患、形成異常、腫瘍または癌の由来抗原に由来する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記感染性疾患病原因子が、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、  トラコーマクラミジアおよびヒト結核菌からなる群から選択されるものである、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
細胞性悪性疾患、形成異常、腫瘍または癌の由来抗原が、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＭＡＧＥ−Ａ３、テロメラーゼ（ＴＥＲＴ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）由来のＥ７癌遺伝子、およびＰ５３からなる群から選択されるものである、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
予防ワクチンまたは治療ワクチンとして用いられる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記哺乳類がヒトである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
筋肉内、静脈内、皮内、皮膚、皮下、腹腔内、粘膜または経口投与用に処方されている、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ポリクローナル抗リンパ球および抗胸腺細胞免疫グロブリン（ＡＴＧ）、
プリン、
ピリミジン類似体、
アルキル化剤、並びに
抗ＣＤ８、抗ＣＤ４、抗ＣＤ２５、抗ＣＤ３および抗ＣＤ５２モノクローナル抗体からなる群から選択され、末梢および／または中枢で、Ｔ、ＢおよびＮＫリンパ球を涸渇させることができるモノクローナル抗体
からなる群から選択される第一のリンパ球減少症を誘発する化合物と、
第二の化合物として、
アデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）、
熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、
志賀毒素、および、
ＬＡＧ−３
からなる群から選択されるＡＰＣに選択的親和性を有する分子であって、感染性疾患病原因子由来の抗原の少なくとも一つのＴ細胞エピトープと融合している分子と
を含んでなる、患者の感染性疾患の治療および／または予防における同時、個別または逐次使用のための組み合わせ製剤。
【請求項１６】
前記第一の化合物を、前記第二の化合物の前に投与する、請求項１５に記載の組み合わせ製剤。
【請求項１７】
前記第二の化合物がアジュバントとともに溶液状である、請求項１６に記載の組み合わせ製剤。
【請求項１８】
ポリクローナル抗リンパ球および抗胸腺細胞免疫グロブリン（ＡＴＧ）、
プリン、
ピリミジン類似体、
アルキル化剤、並びに
抗ＣＤ８、抗ＣＤ４、抗ＣＤ２５、抗ＣＤ３および抗ＣＤ５２モノクローナル抗体からなる群から選択され、末梢および／または中枢で、Ｔ、ＢおよびＮＫリンパ球を涸渇させることができるモノクローナル抗体
からなる群から選択されるリンパ球減少症を誘発する第一の化合物と、
第二の化合物として、
アデニル酸シクラーゼ（ＣｙａＡ）、
熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、
志賀毒素、および、
ＬＡＧ−３
からなる群から選択されるＡＰＣに選択的親和性を有する分子であって、細胞性悪性疾患、形成異常、腫瘍または癌由来の抗原の少なくとも一つのＴ細胞エピトープと融合している分子と
を含んでなる、それぞれ患者の細胞性悪性疾患、形成異常、腫瘍または癌の治療および／または予防における同時、個別または逐次使用のための組み合わせ製剤。
【請求項１９】
前記第一の化合物を、前記第二の化合物の前に投与する、請求項１８に記載の組み合わせ製剤。
【請求項２０】
前記第二の化合物がアジュバントとともに溶液状である、請求項１９に記載の組み合わせ製剤。
【請求項２１】
癌細胞がＣＥＡタンパク質を発現し、前記第一の化合物がウサギまたはウマポリクローナルＡＴＧであり、前記第二の化合物がヒトＣＥＡタンパク質のＡ３−Ｂ３領域を有する組換えアデニル酸シクラーゼであり、癌の治療および／または予防に用いられる、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の組み合わせ製剤。
【請求項２２】
癌細胞がＨＰＶのＥ７癌遺伝子を発現し、前記第一の化合物がウサギまたはウマポリクローナルＡＴＧであり、前記第二の化合物がＨＰＶのＥ７癌遺伝子を有する組換えアデニル酸シクラーゼであり、ＨＰＶによって誘発される癌の治療および／または予防に用いられる、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の組み合わせ製剤。
【請求項２３】
ｈｓｐ６５およびｈｓｐ７０が、Mycobacterium bovis由来である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
呼吸器および消化器の癌の治療および／または予防に用いられる、請求項２１に記載の組み合わせ製剤。
【請求項２５】
薬学上許容可能なキャリヤーをさらに含んでなる、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の医薬組成物または組み合わせ製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類における少なくとも一つのT細胞エピトープに対して特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を誘発する医薬組成物であって、
リンパ球減少症を誘発する第一の化合物、
第二の化合物として、プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)に選択的親和性を有する分子であって、該分子が上記T細胞エピトープと関連しているもの、および
所望におり、薬学上許容可能なキャリヤー
を含んでなる、医薬組成物に関する。
【０００２】
本発明はまた、患者の感染性疾患の治療および/または予防における同時、個別または逐次使用のための配合製剤としての、医薬組成物であって、
リンパ球減少症を誘発する第一の化合物、
第二の化合物として、APCに選択的親和性を有する分子であって、感染性疾患病原因子由来の抗原の少なくとも一つのT細胞エピトープと関連しているもの、および
所望により、薬学上許容可能なキャリヤー
を含んでなる医薬組成物に関する。
【０００３】
本発明はまた、それぞれ患者の細胞性悪性疾患、形成異常、腫瘍または癌の治療および/または予防における同時、個別または逐次使用のための配合製剤としての、医薬組成物であって、
リンパ球減少症を誘発する第一の化合物、
第二の化合物として、APCに選択的親和性を有する分子であって、細胞性悪性疾患、形成異常、腫瘍または癌由来の抗原の少なくとも一つのT細胞エピトープと関連しているもの、および
所望により、薬学上許容可能なキャリヤー
を含んでなる、医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
抗癌薬について、腫瘍を有する生物の抗腫瘍免疫の獲得を促進する能力が認められている。シクロホスファミド(1-7)、L-PAM4 (8)、l,3-ビス(2-クロロエチル)-l-ニトロソウレア(9)、ビンブラスチン(10)、フルダラビンおよびブレオマイシン(11)のような数種類の抗癌薬は、様々な動物腫瘍モデル(1, 5, 6, 8-11)および進行黒色腫(2-4)または進行腎臓癌(7)の患者において、T細胞が介在した抗腫瘍応答の獲得を高めることが示されてきた。
【０００５】
抗癌薬が腫瘍を有する生物におけるT細胞依存性の腫瘍撲滅免疫の獲得を高める機構の研究により、化学療法が抗腫瘍細胞性免疫の発生に有利なCTL生成に阻害活性を有する抗炎症性サイトカイン(TGF-βおよびIL-10)からプロ炎症性サイトカイン(例えば、TNF-α, IFN-γおよびGM-CSF)へのサイトカインプロフィールの変化をもたらすことが明らかになった。特に、フルダラビンは、主に無痛リンパ性悪性疾患の治療に用いられてきた免疫抑制性プリン類似体である(12)。反復サイクルのフルダラビン療法は、深刻なT細胞涸渇、特にCD4+ T細胞の涸渇を誘発する(13)。シクロホスファミド、フルダラビンのような他の免疫抑制性の細胞傷害性薬剤は、分裂細胞並びに細胞サイクルのG0-G1期の細胞の両方におけるリンパ球アポトーシスを誘発する。この細胞サイクルとは独立している活性は、薬剤のSTAT1シグナリング阻害による可能性がある(14)。
【０００６】
これまでのところ、癌および慢性の感染性疾患の免疫療法は限定的な成功を収めてきた。本発明者らは、本明細書において、リンパ除去薬と組換えタンパク質性ワクチンとの組合せは、さらに有望な結果を示すことを明らかとする。
【０００７】
リンパ除去薬はリンパ球を殺し(アポトーシス)または不活性化する(アネルギー)ので、抗原をプロフェッショナル抗原提示細胞に送達するワクチンの有効性を減少させることが予想される。
【０００８】
特に、百日咳菌のアデニル酸シクラーゼ(CyaA)は、真核細胞の細胞質ゾルにその触媒ドメインを送達する能力を有する(15)。従って、CyaAの触媒部位に挿入されたCD4+およびCD8+T細胞エピトープは、それぞれ抗原提示細胞(APC; (16))の表面のMHCクラスIIおよびI分子によって加工され、提示される。
【０００９】
さらに、CyaAは、αMβ2インテグリン(CD11b/CD18; (17))に特異的に結合し、従ってこれらのT細胞エピトープをCD11b+樹状細胞サブポピュレーションにターゲッティングすることが示された(18)。
【００１０】
マウスを適当なT細胞エピトープを有する組換えCyaAで免役することにより、強力なCTL応答、致死ウイルス投与に対する完全な防御、および効率的な予防的および治療的抗腫瘍免疫を誘発した(19-21)。
【００１１】
前臨床レベルでは多数の有望な結果が見られたにもかかわらず、採用した細胞に基づく免疫療法の臨床への移行は、多くの失敗に直面した。Rosenbergによれば(22)、癌の免疫療法による試験の客観的応答率は3%を下回り、一層良好な結果が、自家移植した採用細胞の導入療法に基づく手法で得られている。この方法は、手間がかかり、高価であり、安全に一般化するのが困難である。従って、採用した細胞に基づく免疫療法を改良する方策を前臨床レベル明らかにすることは興味のもたれるところである。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、哺乳類にける少なくとも一つのT細胞エピトープに対して特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を誘発する方法であって、
リンパ球減少症を誘発する化合物、および
少なくとも1つのT細胞エピトープを有する異種抗原を含んでなるプロフェッショナル抗原提示細胞(APC)に対して選択的親和性を有する分子
を、それを必要とする哺乳類に投与することを含んでなる方法に関する。
【００１３】
一つの態様によれば、本発明は、慢性の感染性疾患または細胞性悪性疾患、形成異常、腫瘍または癌に罹っている哺乳類患者における治療的免疫応答を誘発する方法であって、
リンパ球減少症を誘発する化合物を含んでなる組成物、および
プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)に選択的親和性を有する分子であって、それぞれ感染性疾患病原因子または細胞性悪性疾患、形成異常、腫瘍あるいは癌の抗原を有する分子を含んでなる組成物
を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、方法に関する。
【００１４】
さらなる態様によれば、本発明は、哺乳類における少なくとも一つのT細胞エピトープに対して特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を誘発し、または慢性の感染性疾患、または細胞性悪性疾患、形成異常、腫瘍または癌に罹っている哺乳類患者における治療的免疫応答を誘発する医薬組成物であって、
リンパ球減少症を誘発する化合物、
プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)に選択的親和性を有する分子であって、少なくとも一つの上記T細胞エピトープと関連しているかまたはそれぞれ感染性疾患病原因子または細胞性悪性疾患、形成異常、腫瘍あるいは癌の抗原と関連している分子、および
所望により、薬学上許容可能なキャリヤー
を含んでなる組成物に関する。
【００１５】
さらになる態様によれば、本発明は、哺乳類における少なくとも一つのT細胞エピトープに対して特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を誘発し、または慢性の感染性疾患、または細胞性悪性疾患、形成異常、腫瘍または癌に罹っている哺乳類患者における治療的免疫応答を誘発するキットであって、
リンパ球減少症を誘発する化合物を含んでなる組成物、および
プロフェッショナル抗原に選択的親和性を有する分子であって、それぞれ感染性疾患病原因子または細胞性悪性疾患、形成異常、腫瘍あるいは癌の抗原を有する少なくとも1つのT細胞エピトープを有する異種抗原を含んでなる分子を含んでなる組成物
を含んでなる上記キットに関する。
【００１６】
さらなる態様によれば、本発明は、哺乳類患者における感染症の予防または治療方法であって、
上記感染症の原因である病原因子が少なくとも一つのT細胞エピトープを含む特異抗原を発現し、
リンパ球減少症を誘発する化合物、および
プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)に選択的親和性を有する分子であって、上記感染症の原因である上記病原因子に特異的な上記抗原を含んでなる少なくとも1つの上記T細胞エピトープまたは上記抗原に含まれる少なくとも1つのT細胞エピトープを有する異種抗原を含んでなる分子
を含んでなる組成物を、
それを必要とする患者に投与することを含んでなる方法に関する。
【００１７】
さらなる態様によれば、本発明は、哺乳類患者における癌、特に呼吸器および消化器の癌の予防または治療方法であって、
腫瘍細胞がヒトCEAタンパク質を発現し、
リンパ球減少症を誘発するウサギまたはウマポリクローナル抗リンパ球または抗胸腺細胞抗体(ATG)を含んでなる組成物、およびさらに、
ヒトCEAタンパク質のA3-B3領域を有する組換えアデニル酸シクラーゼを含んでなる組成物
を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる方法に関する。
【００１８】
さらなる態様では、本発明は、哺乳類患者におけるHPVによって誘発される癌の予防または治療方法であって、
腫瘍細胞がHPVのE7癌遺伝子を発現し、
リンパ球減少症を誘発するウサギまたはウマポリクローナルATGを含んでなる組成物、およびさらに
HPV由来のE7癌遺伝子を有する組換えアデニル酸シクラーゼを含んでなる組成物
を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】(実施例1):  CEA組換えタンパク質のSDS-PAGE分析。  精製タンパク質3μgを4%-15%グラディエントSDSポリアクリルアミドゲル上で分離し、クーマシーブルーにより染色した。レーン1, 野生型CyaA;レーン2, CyaA-CEAA3B3;レーン3, CyaAΔ-CEAA3B3;レーン4,CEAA3B3。
【図２】(実施例1):  組換えCEAタンパク質によるプライム-ブースト免疫によって誘発される分極したTh1応答。  組換えCEAタンパク質50μgを用いてivにて行った免疫を、同様の材料10μgを用いて7-14日後にidでブーストした。最後の免疫の7日後に、CEA特異的IFN-γ産生細胞がFACS分析および細胞内サイトカイン染色によって検出された。データーは、再刺激の際にIFN-γを発現するCD4+またはCD8+細胞のメジアン百分率(n=3)として表されている。未刺激脾臓細胞で得られたバックグラウンドの結果を差し引いている。
【図３】(例1):  免疫抑制治療によって誘発された末梢血のリンパ球涸渇。  フルダラビン200mg/kg/日を6日間連続でi.p.投与した後またはATG 20mg/kgを1回i.p.投与した後(上側の左パネル)の末端血中のリンパ球の数の動的分析。他の3個のパネルは、上記免疫抑制治療後の末梢血中のCD4+、CD8+およびB220+リンパ球の割合の動的分析を示す。
【図４】(例1):  免疫抑制およびプライム-ブースト免疫の結果としてのCEA特異的Th1応答の大きさの増加。  フルダラビンまたはATGに基づく免疫抑制治療を動物に10日間行った後、プライムブースト免疫を組換えCEAタンパク質によって行った。最後の免疫の7日後に、CEA特異的IFN-γ産生細胞がFACS分析および細胞内サイトカイン染色によって検出された。データーは、再刺激の際にIFN-γを発現するCD4+またはCD8+細胞のメジアン百分率(n=3)として表されている。未刺激脾臓細胞で得られたバックグラウンドの結果を差し引いている。
【図５】(例1):  結果または前リンパ除去としての(as a result or prior lymphoablation)  CyaA-CEAA3B3プライムブースト免疫後の生存メジアンの増加。  フルダラビンまたはATGに基づく免疫抑制治療を動物に行った5日後に、2x104個のB16F0CEA-GFP細胞によるsc腫瘍接種を行った。(A)  腫瘍細胞投与の3日後、動物に組換えCEAタンパク質によるプライムブースト免疫を施した。腫瘍増殖を、それについて定期的に測定した。衛生状態から見て必要なときに、マウスを屠殺した。生存曲線を示す。コントロール設定の動物(CTRL)には、免疫抑制を行わなかった。(B)  Aと同様であるが、腫瘍投与の5日後に免疫療法を行った。
【図６】(例2):  CEA組換えタンパク質のSDS-PAGE分析。  精製タンパク質3μgを4%-15%グラディエントSDSポリアクリルアミドゲル上で分離し、クーマシーブルーで染色した。レーン1, CyaA-HPV16E7Δ;  レーン2, CyaA-CEAA3B3;  レーン3, CyaAΔ-CEAA3B3;  レーン4, His-tag CEA。
【図７】(例2):  組換えCEAタンパク質によるプライム-ブースト免疫によって誘発されるTh1応答。  10μg CpGの存在下にて等モル量の上記組換えタンパク質(CyaAについて50μg, His-tag CEAについて19.2μg)を用いてivで行った免疫を、7および14日後に 同様の材料(His-tag CEAについて3.8μg) 10μgおよびCpG 2μgを用いてidにてブーストした。最後の免疫から7日後に、CEA特異的IFN-γ産生CD8+細胞を1μg/ml CEAペプスキャンを用いるエクス・ビボELISpot分析法によって検出した。データーは、γ-IFNスポット形成コロニーSFC (n=3)のメジアン数として表されている。
【図８】(例2):  免疫抑制治療によって誘発される末梢血リンパ球涸渇。  フルダラビン 100mg/kg/日を6日間i.p.投与した後またはATG 20mg/kgを1回i.p.投与した後の末梢血中のリンパ球(CD4+、CD8+、CD49d+およびB220+)の数の動的分析。コントロールは、PBSまたは正常なウサギ血清(NRS) 20mg/kgを投与した。
【図９】(例2):  免疫抑制およびプライム-ブースト免疫の結果としてのCEA特異的Th1応答の大きさの増加。  ATGまたはフルダラビンに基づく免疫抑制治療を動物に行った7日後に、組換えタンパク質によるプライムブースト免疫を行った。10μg CpGの存在下にて等モル量の上記組換えタンパク質(CyaAについて50μg, His-tag CEAについて19.2μg)を用いてivで行った免疫を、7日後に同様の材料(His-tag CEAについて3.8μg) 10μgおよびCpG 2μgを用いてidにてブーストした。最後の免疫から7日後に、CEA特異的IFN-γ産生CD8+細胞を1μg/ml CEAペプスキャンを用いるエクス・ビボELISpot分析法によって検出した。データーは、γ-IFNスポット形成コロニーSFC (n=2)のメジアン数として表されている。
【図１０】(例2):  結果または前リンパ除去としての(as a result or prior lymphoablation)  CyaA-CEAA3B3プライムブースト免疫後の生存メジアンの増加。  腫瘍接種を、5x105個のMCa32A細胞を用いて行った。3日後、ATGまたはフルダラビンに基づく免疫抑制治療を行った。コントロール動物には、正常なウサギ血清を投与した。腫瘍細胞投与の10日後(免疫抑制の7日後)に、動物に組換えCEAタンパク質によるプライムブースト免疫を施した。10μg CpGの存在下にて等モル量の上記組換えタンパク質(CyaAについて50μg, His-tag CEAについて19.2μg)を用いてivで行った免疫を、7日後に同様の材料(His-tag CEAについて3.8μg) 10μgおよびCpG 2μgを用いてidにてブーストした。腫瘍増殖を、それについて定期的に測定した。衛生状態から見て必要なときに、マウスを屠殺した。生存曲線を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明者らは、患者による治療的免疫の獲得を促進する抗胸腺細胞免疫グロブリン(ATG)またはフルダラビンのようなリンパ除去薬の強化作用は、薬剤処方物中の(複数の)抗原がイン・ビボでの投与時にプロフェッショナル抗原提示細胞(APC)に向けられるときには、実質的に高められることを見出した。
【００２１】
マクロファージ、好中球および樹状細胞のようなプロフェッショナル抗原提示細胞(APC)をターゲットとするワクチンベクターは、APCの細胞表面因子に対する特異的結合親和性の結果としてこれらのAPCへ抗原を選択的に送達する上で有利であり、一層強い抗原特異的T細胞応答(ヘルパーおよび/または細胞傷害性)を生じる。しかしながら、リンパ除去化合物の組合せでは、リンパ球の最終ターゲット集団は上記リンパ除去化合物によって影響を受け、縮小し、減少しまたはアネルギー(=無力)になるので、このことは当てはまらないことが予想される。
【００２２】
本発明者らは、抗原がCD11b分子(樹状細胞、マクロファージのようなAPC上あるいは好中球上に特異的に存在する)に高親和性を有するアデニル酸シクラーゼ(CyaA)であるタンパク質ベクターによってイン・ビボでAPCにターゲッティングされるときには、驚くべきことにはATGが介在したリンパ除去治療が行われないときよりも遙かに強力なCTLが誘発されることを示す。これは、予想外のことである。
【００２３】
本発明者らは、ATGが介在したリンパ除去治療の際には、この一層強力なCTL誘発はイン・ビボでの腫瘍増殖を一層良好に防止する能力と関連していることを示す。本発明者らはまた、フルダラビンが介在したリンパ除去治療も腫瘍増殖を阻害することを示す。この特性により、イン・ビボでの腫瘍増殖を一層良好に防止するCyaAに基づく免疫療法の能力が促進される。
【００２４】
本発明者らは、さらに、このような増強は単にATGまたはフルダラビンのような免疫除去化合物の使用によるものではなく、実際にはCyaAに基づくベクターによるCD11bターゲッティングポテンシャルによるものであり、熱ショックタンパク質のようなAPCをターゲットとする他の系に補外することができることを示した。この結論は、3つの理由、
1.  APC上のCD11b結合モティーフについて削除されたCyaAベクターは、もはやAPCをターゲットとせず、CyaAベクターより活性が低いだけでなく、試験動物に免疫涸渇化合物を先験的に投与したときには、挿入された異種抗原(CEAA3B3)に対する免疫応答の誘発を測定可能に向上させない: ワクチンのCD11bターゲッティング機能による増強、
2.  APCに選択的親和性を有する分子を持たないCpGまたはポリICLCまたはモノホスホリルAで補強したCEA抗原は、免疫原性を検出するのに用いた手法によってはCEAに対する有意な免疫応答を誘発する。対照的に、試験動物に免疫涸渇化合物を先験的に投与したときには、異種抗原(CEA)に対する免疫応答の誘発は測定可能に向上しない: 特異細胞をターゲッティングしないアジュバントによる無増強、
3.  本発明者らは、類似の免疫増強をHsp65とCEAA3B3との融合タンパク質によって得ることができることを示唆している予備的証拠を有している。CEAA3B3を有するHsp65タンパク質ベクターは、表面上でトル様受容体(TLR4)を認識することによってAPCをターゲットとする: ワクチンのAPCターゲッティング機能による増強により引き出すことができる。
【００２５】
従って、一つの態様によれば、本発明は、哺乳類における少なくとも一つのT細胞エピトープに対して特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を誘発する医薬組成物であって、
リンパ球減少症を誘発する第一の化合物、
第二の化合物として、プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)に選択的親和性を有する分子であって、上記T細胞エピトープと関連しているもの、および
所望により、薬学上許容可能なキャリヤー
を含んでなる、医薬組成物。
【００２６】
有利には、第一の化合物は、一過性T細胞涸渇を誘発することができる。さらに有利には、第一の化合物は、ウサギまたはウマポリクローナル抗リンパ球および抗胸腺細胞免疫グロブリン(ATG)、プリン、ピリミジン類似体、アルキル化剤、モノクローナルおよびT、BおよびNKリンパ球を末端および/または中枢において涸渇することができるポリクローナル抗体のようなポリクローナル抗リンパ球および抗胸腺細胞免疫グロブリン(ATG)からなる群から選択される。それは、フルダラビンまたはシクロホスファミドであってもよい。リンパ球を除去(depleting)することができる抗体は、抗CD8、抗CD4、抗CD25、抗CD3および抗CD52モノクローナル抗体からなる群から選択される。
【００２７】
具体的態様によれば、APCに選択的親和性を有する分子は、アデニル酸シクラーゼ、熱ショックタンパク質(HSP)、志賀毒素およびLAG-3からなる群から選択される。好ましくは、アデニル酸シクラーゼは百日咳菌由来であり、HSPはhsp65およびhsp70からなる群から選択され、上記hsp65およびhsp70は好都合にはMycobacterium bovis由来であり、上記志賀毒素はShigella dysenteriae由来である。
【００２８】
好ましい態様によれば、本発明による医薬組成物は、さらにアジュバントを含んでなる。アジュバントは当業者には周知であり、本発明において普通に用いることができる。それは、有利にはクラス3のトル様受容体(TLR)リガンド(例えば、ポリ-ICLC)、TLR-9リガンド(例えば、CpG)またはTLR-4リガンド(例えば、モノホスホリル-A)でよく、さらに有利には配列番号:16の配列のCpGアジュバントであって、塩基がホスホロチオエートであるものでよい。上記アジュバントは、好ましくは、第二の化合物とともに溶液状である。
【００２９】
さらに好ましい態様によれば、APCに選択的親和性を有する分子は、上記の少なくとも一つのT細胞エピトープに共有結合している。有利には、APCに選択的親和性を有する分子と上記少なくとも一つのT細胞エピトープは組換えDNA技術によって融合したDNA配列によってコードされているポリペプチドである。
【００３０】
本発明による医薬組成物では、上記T細胞エピトープは、感染性疾患病原因子または細胞性悪性疾患、形成異常、腫瘍または癌から誘導される抗原に由来する。好ましくは、感染性疾患病原因子は、ヒトパピローマウイルス(HPV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、トラコーマクラミジアおよびヒト結核菌からなる群から選択される。また好ましくは、細胞性悪性疾患、形成異常、腫瘍または癌から誘導される抗原癌胎児性抗原(CEA)、MAGE-A3、テロメラーゼ(TERT)、ヒトパピローマウイルス(HPV)由来のE7癌遺伝子およびP53からなる群から選択される。
【００３１】
本発明はまた、予防用または治療用ワクチンとして用いられる上記のような医薬組成物に関する。
好ましい態様によれば、哺乳類はヒトである。
【００３２】
本発明による医薬組成物は、有利には筋肉内、静脈内、皮内、皮膚、皮下、腹腔内、粘膜または経口投与用に処方される。
【００３３】
本発明はまた、
患者の感染性疾患の治療および/または予防における同時、個別または逐次使用のための配合製剤としての、医薬組成物であって、
リンパ球減少症を誘発する第一の化合物、
第二の化合物として、APCに選択的親和性を有する分子であって、感染性疾患病原因子由来の抗原の少なくとも一つのT細胞エピトープと関連しているもの、および
所望により、薬学上許容可能なキャリヤー
を含んでなる、医薬組成物に関する。
【００３４】
配合製剤の好ましい態様によれば、第一の化合物は第二の化合物の前に投与される。有利には、第二の化合物はアジュバントとともに溶液状である。有利には、アジュバントは、ポリ-ICLCのようなクラス3のTLRリガンド、CpGのようなクラス9のTLRリガンドおよびモノホスホリル-Aのようなクラス4のTLRリガンドからなる群から選択されるトル様受容体 (TLR)リガンドである。
【００３５】
本発明は、
それぞれ患者の細胞性悪性疾患、形成異常、腫瘍または癌の治療および/または予防における同時、個別または逐次使用のための配合製剤としての、医薬組成物であって、
リンパ球減少症を誘発する第一の化合物、
第二の化合物として、APCに選択的親和性を有する分子であって、細胞性悪性疾患、形成異常、腫瘍または癌由来の抗原の少なくとも一つのT細胞エピトープと関連しているもの、および
所望により、薬学上許容可能なキャリヤー
を含んでなる、医薬組成物にも関する。
【００３６】
配合製剤の好ましい態様によれば、第一の化合物は第二の化合物の前に投与される。有利には、第二の化合物はアジュバントとともに溶液状である。有利には、アジュバントはポリ-ICLCのようなクラス3のTLRリガンド、CpGのようなクラス9のTLRリガンドおよびモノホスホリル-Aのようなクラス4のTLRリガンドからなる群から選択されるトル様受容体(TLR)リガンドである。
【００３７】
有利には、本発明による医薬組成物は、癌の治療および/または予防に用いられ、癌細胞はヒトCEAタンパク質、有利には呼吸器および消化器の癌を発現し、第一の化合物はウサギまたはウマポリクローナルATGであり、第二の化合物はヒトCEAタンパク質のA3-B3領域を有する組換えアデニル酸シクラーゼである。
【００３８】
別の好ましい態様によれば、本発明による医薬組成物は、癌の治療および/または予防に用いられ、癌細胞はヒトCEAタンパク質、有利には呼吸器および消化器の癌を発現し、第一の化合物はフルダラビンであり、第二の化合物はヒトCEAタンパク質のA3-B3領域を有する組換えアデニル酸シクラーゼである。
【００３９】
別の好ましい態様によれば、本発明による医薬組成物は、HPVによって誘発される癌の治療および/または予防に用いられ、癌細胞はHPVのE7癌遺伝子を発現し、第一の化合物はウサギまたはウマポリクローナルATGであり、第二の化合物はHPVのE7癌遺伝子を有する組換えアデニル酸シクラーゼである。
【００４０】
あるいは、本発明による医薬組成物は、HPVによって誘発される癌の治療および/または予防に用いられ、癌細胞がHPVのE7癌遺伝子を発現し、第一の化合物はフルダラビンであり、第二の化合物はHPVのE7癌遺伝子を有する組換えアデニル酸シクラーゼである。
【００４１】
本発明はまた、哺乳類における少なくとも一つのT細胞エピトープに対して特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を誘発する方法であって、
リンパ球減少症を誘発する化合物、および
プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)に選択的親和性を有する分子であって、少なくとも一つの上記T細胞エピトープを有する異種抗原を含んでなるもの
を、それを必要とする哺乳類に投与することを含んでなる方法に関する。
【００４２】
本発明によれば、上記T細胞エピトープは、感染性疾患病原因子または細胞性悪性疾患、形成異常、 腫瘍、または癌由来の抗原に由来するT細胞エピトープであってもよい。
【００４３】
本発明によれば、リンパ球減少症を誘発する化合物およびプロフェッショナル抗原提示細胞(APC)に選択的親和性を有する分子であって、少なくとも一つの上記T細胞エピトープを有する異種抗原を含んでなる分子は、同時、個別または逐次的に患者に投与することができ、好ましくは、上記化合物および上記分子を逐次的に患者に投与するときには、上記リンパ球減少症を誘発する化合物は、プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)に選択的親和性を有する分子であって、少なくとも一つの上記T細胞エピトープを有する異種抗原を含んでなる上記分子の前に投与してもよい。
【００４４】
本発明によれば、リンパ球減少症を誘発する化合物、およびプロフェッショナル抗原提示細胞(APC)に選択的親和性を有する分子であって、少なくとも一つの上記T細胞エピトープを有する異種抗原を含んでなる分子は、同時に投与され、上記化合物および上記分子は同一または別個の組成物で投与することができる。
【００４５】
別の態様によれば、本発明は、慢性の感染性疾患または細胞性悪性疾患、形成異常、腫瘍または癌に罹っている哺乳類患者における治療的免疫応答を誘発する方法であって、
リンパ球減少症を誘発する化合物を含んでなる組成物、および
プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)に選択的親和性を有する分子であって、それぞれ感染性疾患病原因子または細胞性悪性疾患、形成異常、腫瘍または癌の抗原を有する少なくとも一つの上記T細胞エピトープを有する異種抗原を含んでなる分子を含んでなる組成物
を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる方法に関する。
【００４６】
本発明によれば、リンパ球減少症を誘発する化合物を含んでなる組成物、およびプロフェッショナル抗原提示細胞(APC)に選択的親和性を有する分子であって、少なくとも一つの上記T細胞エピトープを有する異種抗原を含んでなる分子を含んでなる組成物は、同時、個別または逐次的に患者に投与することができ、好ましくは、上記化合物および上記分子を逐次的に患者に投与するときには、上記リンパ球減少症を誘発する化合物はプロフェッショナル抗原提示細胞(APC)に選択的親和性を有する分子であって、少なくとも一つの上記T細胞エピトープを有する異種抗原を含んでなる上記分子の前に投与することができる。
【００４７】
本発明によれば、リンパ球減少症を誘発する化合物を含んでなる組成物とプロフェッショナル抗原提示細胞(APC)に選択的親和性を有し少なくとも一つの上記T細胞エピトープを有する異種抗原を含んでなる分子を含んでなる組成物を同時に投与するときには、上記組成物を同一または別個の組成物で投与することができる。
本発明によれば、上記哺乳類患者はヒトであってもよい。
【００４８】
別の態様によれば、本発明は、哺乳類における少なくとも一つのT細胞エピトープに対して特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を誘発しまたは慢性の感染性疾患、または細胞性悪性疾患、形成異常、腫瘍あるいは癌に罹っている哺乳類患者における治療的免疫応答を誘発する医薬組成物であって、
リンパ球減少症を誘発する化合物、
プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)に選択的親和性を有する分子であって、上記T細胞エピトープと関連しているかまたはそれぞれ感染性疾患病原因子または細胞性悪性疾患、形成異常、腫瘍あるいは癌の抗原と関連している分子、および
所望により、薬学上許容可能なキャリヤー
を含んでなる、上記組成物に関する。
【００４９】
別の態様によれば、本発明は、哺乳類における少なくとも一つのT細胞エピトープに対して特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTL)応答を誘発しまたは慢性の感染性疾患、または細胞性悪性疾患、形成異常、腫瘍あるいは癌に罹っている哺乳類患者における治療的免疫応答を誘発するキットであって、
リンパ球減少症を誘発する化合物を含んでなる組成物、および
プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)に選択的親和性を有する分子であって、それぞれ感染性疾患病原因子、または細胞性悪性疾患、形成異常、腫瘍または癌の抗原を有する少なくとも一つの上記T細胞エピトープを有する異種抗原を含んでなる分子を含んでなる組成物
を含んでなる、上記キットに関する。
本発明によれば、医薬組成物またはキットはワクチンであってもよい。
【００５０】
本発明によれば、組成物は、筋肉内、静脈内、皮内、皮膚、皮下、腹腔内、粘膜または経口投与用に処方することができる。
【００５１】
本発明によれば、分子プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)に選択的親和性を有する分子であって、少なくとも一つの上記T細胞エピトープを有する異種抗原を含んでなる分子は、プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)に選択的親和性を有する分子であって、少なくとも一つのT細胞エピトープを有する上記抗原に共有結合することができる分子からなる。
【００５２】
本発明によれば、上記分子は、プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)に選択的親和性を有し、少なくとも一つのT細胞エピトープを有する上記抗原は、組換えDNA技術によって融合したDNA配列によってコードされるポリペプチドであってもよい。
【００５３】
本発明によれば、リンパ球減少症を誘発する化合物は、一過性のT細胞涸渇を誘発することができる化合物であってもよい。
【００５４】
本発明によれば、リンパ球減少症を誘発する化合物は、ATGおよびフルダラビンからなる群から選択することができる。
【００５５】
本発明によれば、プロフェッショナル抗原提示細胞に選択的親和性を有する分子は、アデニル酸シクラーゼ(CyaA)、熱ショックタンパク質(HSP)、志賀毒素、およびLAG-3からなる群から選択することができる。
【００５６】
一つの態様によれば、本発明は、百日咳菌由来のアデニル酸シクラーゼ(CyaA)ベクターの使用方法に関し、これによってCyaAベクターは、プロフェッショナル抗原提示細胞をターゲッティングしないワクチンと比較して、リンパ除去化合物と組み合わせて用いるときには、ワクチンベクターとしての性能の向上を示す。
【００５７】
一つの態様によれば、本発明は、ATGを含んでなる成分と、異種抗原配列を含むCyaAを含んでなる成分とからなる、医薬組成物に関する。上記抗原配列は、慢性の感染症を誘発する任意の感染性疾患病原因子、および任意の異常分裂する哺乳類細胞、形成異常、腫瘍または癌から誘導することができる。
【００５８】
一つの態様によれば、本発明は、フルダラビンを含んでなる成分と、異種抗原配列を含むCyaAを含んでなる成分とからなる医薬組成物に関する。上記抗原配列は、慢性感染症を誘発する任意の感染性疾患病原因子、および任意の異常分裂する哺乳類細胞、形成異常、腫瘍または癌から誘導することができる。
【００５９】
本発明によれば、上記アデニル酸シクラーゼは百日咳菌であってもよく、または上記HSPはウシ結核菌由来のhsp65、hsp70、さらに好ましくはhsp 65であるか、または上記志賀毒素は志賀赤痢菌由来である。
【００６０】
本発明によれば、上記T細胞エピトープは、
癌胎児性抗原(CEA)、特にA3-B3領域、MAGE-A3、TERT、ヒトパピローマウイルス(HPV)由来のE7癌遺伝子、およびP53のものからなる群から選択される腫瘍抗原由来のT細胞エピトープ、および
HPV、HIV、HBV、HCV、トラコーマクラミジアおよびヒト結核菌からなる群から選択される感染性病原因子由来のT細胞エピトープ
からなる群から選択される。
【００６１】
別の態様によれば、本発明は、哺乳類患者における腫瘍、特に悪性腫瘍の予防または治療の方法であって、
腫瘍細胞が特異的腫瘍関連抗原を発現し、上記腫瘍関連抗原はT細胞エピトープを提示し、
リンパ球減少症を誘発する化合物、および
プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)に選択的親和性を有する分子であって、上記腫瘍に特異的な上記腫瘍関連抗原または上記腫瘍関連抗原に含まれる上記T細胞エピトープを含んでなる、少なくとも一つの上記T細胞エピトープを有する異種抗原を含んでなる、分子
を含んでなる組成物を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、上記方法に関する。
【００６２】
本発明は、哺乳類患者における腫瘍、特に悪性腫瘍の予防または治療の方法であって、
腫瘍細胞が特異的腫瘍関連抗原を発現し、上記腫瘍関連抗原はT細胞エピトープを提示し、
リンパ球減少症を誘発する化合物、および
プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)に選択的親和性を有する分子であって、上記腫瘍に特異的な上記腫瘍関連抗原または上記腫瘍関連抗原に含まれる上記T細胞エピトープを含んでなる、少なくとも一つの上記T細胞エピトープを有する異種抗原を含んでなる、分子
を含んでなる組成物を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、上記方法にも関する。
【００６３】
別の態様によれば、本発明は、哺乳類患者における感染症の予防または治療方法であって、上記感染症の原因である病原因子がT細胞エピトープを提示する特異抗原を発現し、
リンパ球減少症を誘発する化合物、および
プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)に選択的親和性を有する分子であって、上記感染症の上記病原因子に特異的な上記抗原または上記抗原に含まれる少なくとも一つのT細胞エピトープを含んでなる、少なくとも一つの上記T細胞エピトープを有する異種抗原を含んでなる、分子
を含んでなる組成物を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、上記方法に関する。
【００６４】
別の態様によれば、本発明は、哺乳類患者における癌、特に呼吸器または消化器の癌の予防または治療方法であって、
腫瘍細胞がCEAを発現し、
リンパ球減少症を誘発する化合物ATGを含んでなる組成物、および続いて
CEAタンパク質のA3-B3領域を有する組換えアデニル酸シクラーゼを含んでなる組成物
を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる方法に関する。
【００６５】
別の態様によれば、本発明は、哺乳類患者におけるHPVによって誘発される癌の予防または治療方法であって、
腫瘍細胞がHPVのE7癌遺伝子を発現し、
リンパ球減少症を誘発するウサギまたはウマポリクローナルATGを含んでなる組成物、および続いて
HPV由来のE7癌遺伝子を有する組換えアデニル酸シクラーゼを含んでなる組成物
を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる方法に関する。
【００６６】
本発明は、本出願人によって行われた研究に関して行った実験研究の説明を読めば、一層明瞭に理解されるが、この説明は制限的な性質のものであると解釈すべきではない。
【００６７】
本発明の産業上の応用としては、下記のものが挙げられる。
腫瘍抗原、優先的にはCEA、E7、MAGE-A3、TERTおよびP53ポリペプチド配列であって、それぞれが独立してAPCターゲッティングワクチンベクター、優先的にはアデニル酸シクラーゼ(CyaA)ベクター、熱ショックタンパク質ベクター(Hsp65)、志賀毒素、またはLAG-3のようなAPCリガンド配列を含む組換えタンパク質ベクターのような組換えタンパク質ベクターに一緒に挿入されるものを特異的に発現する悪性または新生物性細胞にターゲットを絞った癌の改良した適応免疫療法。
感染性疾患病原因子、優先的にはウイルス、特にHPV、HIV、HBVおよびHCVまたはトラコーマクラミジア、ヒト結核菌のような細胞内細菌の抗原であって、APCターゲッティングワクチンベクター、優先的にはCyaAベクター、または熱ショックタンパク質(hsp)、志賀毒素またはLAG-3のようなAPCリガンド配列を含む組換えタンパク質ベクターに挿入されるものを特異的に発現する患者の感染細胞にターゲットを絞った潜伏性または慢性の感染性疾患の改良した適応免疫療法。 改良したワクチンs comprising an CyaA、Hsp65、Hsp70、志賀毒素、LAG-3、抗原配列 好ましくは、CEA、E7、MAGE-A3、TERT、P53、HPV、HIV、HBV、HCV、トラコーマクラミジア、ヒト結核菌由来のものなどのAPCターゲッティングベクターを含んでなり、ベクターおよびフルダラビン、ATGのような免疫涸渇分子に結合または挿入されることにより、免疫涸渇成分を他の成分の前に、または同時に、その場で混合して患者に優先的に投与する改良ワクチン。
【実施例】
【００６８】
下記の例1および2は、例2において、APCに選択的親和性を有する分子をCpGアジュバントの存在下にて投与することを除き、同様である。
【００６９】
1.  例1
この実施例は、百日咳菌アデニル酸シクラーゼに基づくプライムブースト免疫療法前のリンパ除去法のネズミモデルにおける使用に関する。低用量のウサギ抗胸腺細胞グロブリンまたはフルダラビンによって送達される免疫抑制は一過性であり、免疫療法による治療時に抗原特異的T細胞が一層高頻度で誘発された。これは、目的の抗原を発現する侵襲性腫瘍細胞の増殖を制御/拒絶するマウスの一層高い能力と相関した。この方法は、癌または他の感染性疾患におけるこのベクターの治療潜在能力を向上させるための新たな可能性を示している。
【００７０】
癌胎児性抗原は、特に消化管および肺由来の多くの悪性腫瘍で過剰発現する腫瘍関連抗原である。CEAのサブフラグメントをCyaAの触媒ドメインに挿入することによって、C57/BL6マウスでの免疫原性を示す構築物を生成した。ATGおよびフルダラビンが介在したリンパ涸渇では、CyaA-CEAA3B3によるプライム-ブースト免疫時にCEA特異的Tリンパ球の数が著しく増加した。この現象は、CpGアジュバントで処方したCEAA3B3タンパク質を予防接種したときにはCD8+リンパ球については見られなかったので、CyaAによるCEAのベクトル化(vectorization)に特異的であると思われた。アデニル酸シクラーゼベクターに基づくワクチンに対するアジュバントの効果を評価する実験から、本発明者らは、上記エピトープを有するCyaAに基づくワクチンにアジュバント、すなわち脂質A (モノホスホリル-A)、ポリICLCまたはCpGであって、それぞれトル様受容体クラス3、4および9のリガンドであるもののいずれかを補足すると、エピトープ特異的T細胞応答の頻度を著しく高めることができることを示した(データーは示さず)。
【００７１】
この実施例に記載したATG製剤は、リンパ球または胸腺細胞で免疫して調製したポリクローナルウサギIgGである。それらは、1960年代末以来ヒトの移植(23)における下記の適応症、すなわちステロイド抵抗性拒絶反応などの臓器同種移植片の急性拒絶反応の予防(誘導療法)および治療、骨髄移植後の対宿主性移植片病の治療(24)、療法 of再生不良性貧血の治療(25)、および血縁のないHLAが合致した(26)または半合致(haploidentical)血縁ドナーからの骨髄のレシピエントのコンディショニング(27)に用いられてきた。
【００７２】
1.1  材料および方法
1.1.1  マウス、細胞系
特異的病原体のない6-10週齢の雌C57BL/6マウスは、CER Janvier (Le Gesnet St-IsIe,フランス)から入手した。動物を含む実験は、動物ケアのガイドラインに準じて行った。免疫抑制治療薬はip投与し、腫瘍細胞はscで、免疫はiv (後眼窩)および耳の真皮にidで投与した。血液採取は、尾からの放血によって行った。脾臓摘出およびリンパ節採取は、屠殺した動物で行った(CO2)。腋窩、腸間膜および鼠蹊リンパ節を採取して表現型判別(phenotyping)分析用にプールした。
【００７３】
CEAタンパク質を発現するB16F0細胞は、CEAおよびGFPをコードするpIRES-EPIプラスミドとrMLVプラスミド(Vectalys)との同時形質導入によって得た。B16F0CEA-GFP細胞は、10%の熱不活性化FCS、100単位/ml ペニシリン、100μg/ml ストレプトマイシンおよび5x10-5モル/lの2-メルカプトエタノール(Life Technologies)を補足したGlutaMAXを含むRPMI 1640中に保持した。
【００７４】
1.1.2  細胞計数および表現型判別
血液、リンパ節細胞および脾臓細胞を、計数用の上記方法(28, 29)およびフローサイトメトリー補助表現型判別に準じて処理した。血液リンパ球は、トルコブルーを用いて計数した。
【００７５】
1.1.3  ウサギにおける抗マウス胸腺細胞グロブリンの調製
マウスATGは、6週齢C57BL/6マウスで採取した5x108個の胸腺細胞をウサギにsc投与することによって調製した。この免疫を、14日後に同一材料をiv投与することによってブーストした。7日後に、動物から採血し、血清IgGを固定タンパク質Gカラム(Pierce)上で精製した。純度はSDS PAGE分析によって管理し、既知濃度のウサギIgGを標準として用いるBradford法によって量を評価した。ウサギATGを20mg/kgの濃度で用い、単回投与した。コントロールとしては、正常なウサギ血清を用いた。
【００７６】
1.1.4  試薬、ペプチドおよびオリゴヌクレオチド
フルダラビン(Sigma)を200mg/kg/日の濃度で6日間連続で用いた。モノクローナル抗体である抗CD4-APC、抗CD8-PerCP、抗B220-FITCおよび抗IFN-γ-FITCは、BD Biosciencesから入手した。
【００７７】
11個のアミノ酸だけ重複しかつCEAタンパク質のA3およびB3ドメインをカバーしている15-マーのペプスキャンをデザインして、Mimotope(登録商標)(オーストリア)から入手した。これをDMSOで希釈し、1μg/mlの最終濃度で用いた。CpG ODN 1826はProligo (パリ,フランス)から購入し、投与当たり10μgの最終用量で用いた。上記CpGは配列番号:16の配列であり、塩基はホスホロチオエート(ヌクレアーゼ抵抗性)である。
【００７８】
1.1.5  CEA A3およびB3ドメインを有する組換え百日咳菌CyaAの分子クローニング。組換えCyaA-CEAA3B3の産生および精製。
この項目で用いた組換えアデニル酸シクラーゼを、酵素的に不活性なCyaAをコードするプラスミドpkTRAC-HPV16E7Δ30-42の誘導体を用いて大腸菌で発現させた(21)。
【００７９】
CyaA-CEAA3B3は、2段階で構築した。CEAのアミノ酸残基492-557をコードする第一のDNA断片を、合成CEA遺伝子(Sequentia)とプライマーCEA1 (配列番号:1: 5'-accatcaccgtctctgcg-3')およびCEA2 (配列番号:2: 5'-gggcactagtggtcagggtacggttgcc-3')を用いてPCR増幅した。CEAのアミノ酸残基629-687をコードする第二のDNAは、CEA合成遺伝子とプライマーCEA3 (配列番号:3: 5'-gggcaccggtaatggtatcccgcagcaacac-3')およびCEA4 (配列番号:4: 5'- cgcagagacggtgatggtgttaacggcacccgcagacagacc-3')を用いてPCR増幅した。これらの2個のDNA断片(部分的に重複)を精製し、第三のPCRでプライマーCEA2およびCEA3と組合せ、395bpの長さのDNA断片を増幅した。この断片をNheIおよびKpnIで消化し、pkTRAC-HPV16E7Δ30-42の対応する部位に挿入してプラスミドpkTRAC-CEAB3を得た。次に、CEAのアミノ酸残基545-647をコードするDNA断片を、合成CEA遺伝子とプライマーCEA5 (配列番号:5: 5'-gggcgctagccgtctgcagctgtccaatg-3')およびCEA6 (配列番号:6: 5'-cccgggtacccggcgtgattttggcgata-3')を用いてPCR増幅した。精製したPCR断片をAgeIおよびSpeIによって消化し、同じ制限酵素によって消化したプラスミドpkTRAC-CEAB3に連結した。
【００８０】
CyaAΔ-CEAA3B3は3段階で構築した。最初に、CyaAアミノ酸配列1149-1230に対応するDNA断片をDNAとしてのpTRACE5 (30)とプライマーCyaAΔ1 (配列番号:9: 5'-gggcgagctctggggccacgat-3')およびCyaAΔ2 (配列番号:10: 5'-actagtgcctcgatcccgaagccg-3')を用いてPCR増幅した。CyaAのアミノ酸残基1300-1356をコードする第二のDNA断片を、同じプラスミドDNAとプライマーCyaAΔ3 (配列番号:11: 5'-actagtcatgctgtatggcgacgc-3')およびCyaAΔ4 (配列番号:12: 5'- cccggcatgcgcgccggtctgg-3')を用いてPCR増幅した。これらの部分的に重複しているDNA断片を精製し、第三のPCRでプライマーCyaAΔ1およびCyaAΔ4と組合せ、427bpの長さのDNA断片を増幅した。この断片をSacIおよびSphIで消化し、同じ制限酵素によって消化したプラスミドpkTRAC-CEAA3B3に連結した。生成するプラスミドpKTRACΔ-CEAA3B3は、CD11b分子への結合を欠いているCyaAをコードした(31)。
【００８１】
総ての構築物はDNAシークエンシングによって立証した(Genome Express)。組換えCyaAを、上記と同様に大腸菌BLR株(Novagen)で産生した(21)。組換えタンパク質は、DEAE-セファロースおよびフェニル-セファロースクロマトグラフィーを含む2段階処置によって封入体から均質になるまで精製した。60%イソプロパノールを用いる追加の洗浄段階を行い(21)、混入しているリポ多糖類のほとんどを除去した。精製した組換えタンパク質を、クーマシーブルーで染色したSDS-PAGEによって分析した。タンパク質濃度は、分子吸光係数142,000モル/l 1cm 1を用いて280 nmの吸収から分光光度法によって測定した。
【００８２】
1.1.6  組換えCEA A3およびB3ドメインの分子クローニング
組換えCEAA3B3タンパク質の産生および精製
CEAA3B3タンパク質をコードする大腸菌で最適化したcDNAを、プライマーCEA7 (配列番号:7: 5'-gcggccgcaccatcaccgtctctgcg-3')とCEA8 (配列番号:8: 5'-cccgctcgagggcacccgcagacagacc-3')でPCR増幅した後、NotIとXhoI制限部位の間のpTriEx-1.1ハイグロベクター(Novagen)にサブクローニングした。生成するプラスミドを、大腸菌BL21λDE3株(Novagen)に形質転換した。His-Tag-CEAA3B3タンパク質を0.5ミリモルのイソプロピル-h-D-チオガラクトピラノシド(Euromedex)で誘導することによって発現させ、Ni-NTAアガロース(Qiagen)上で精製した。イソプロパノール洗浄液を用いて、リポ多糖類混入物を除去した。
【００８３】
1.1.7  細胞内サイトカイン染色
脾臓細胞を、完全CEAA3B3ペプスキャンプールの存在下(または非存在下)にてイン・ビトロで36時間刺激した。1時間インキュベーションした後、ブレフェルジン-Aを加えた。細胞をFACSPerm2 (BD Biosciences)を用いて透過性にし、モノクローナル抗体である抗CD4-APC、抗CD8-PerCPおよび抗IFN-γ-FITCで染色した。細胞をFACScalibur(登録商標)フローサイトメーター(BD Biosciences)を用いて分析し、サイトカイン分泌細胞を、CD4+またはCD8+細胞上での最初のゲーティングの後に測定した。
【００８４】
1.2  結果
1.2.1  精製組換えタンパク質のSDS PAGE分析
CyaAベクターがCEA特異的T細胞応答を誘発する能力を検討するため、CEA分子のA3およびB3ドメインを含む3種類の異なる組換え分子を構築した。このCEAの領域は、多くのヒトCTLおよびヘルパーエピトープ(32)並びに現在までのところ記載されている2種類のH-2b制限エピトープ(33, 34)を含むことが示されている。イン・ビトロおよびイン・ビボ分析法を可能にするため、構築物を大腸菌に産生させ、均質になるまで精製した(図1)。リポ多糖類除去処置を精製プロトコル(21)に導入し、1mg当たり内毒素を<300単位含む組換えタンパク質を得た(データーは示さず)。
【００８５】
1.2.2  組換えCEAタンパク質を用いるプライム-ブースト免疫によって誘発される細胞性免疫応答の適度な増幅
従来の研究は、目的の抗原を有する組換えCyaAが異なる投与経路によりTh1型の細胞性T細胞応答を誘発することができることを示している(21, 35)。本発明者らは、プライムブースト法により異なる投与経路を組み合わせることによって、細胞性免疫応答の大きさを増加させることができるかどうかを検討した。図2に示されるように、IFN-γを分泌するCEA特異的CD4+およびCD8+脾臓細胞の頻度は、CEA組換えタンパク質50μgを1回静脈内(iv)投与後には既にかなり高かった。注目すべきことには、CD11bとの相互作用ドメインを欠いているCyaAΔ-CEAA3B3は、実質的にそのベクター能を喪失したことである。対照的に、アジュバント(CpG)を用いて処方したCEAA3B3タンパク質は、Th1型の細胞性免疫応答を発生することができた。CEA特異的IL-5 CD4+T細胞は、CyaAΔ-CEAA3B3で免疫したマウス由来の秘蔵細胞のみで有意な量で検出された(データーは示さず)。
【００８６】
上記の免疫実験を、投与方法を変更して繰り返した。すなわち、プライム予防接種をivにて行い、それぞれ7および14日後に耳真皮に材料10μgをid投与した(プライム・ダブル・ブースト予防接種)。最初のブーストでは、CyaA-CEAA3B3またはCEAA3B3+CpGを接種したマウスでCEA特異的T細胞の頻度が適度に増加した。第二のブーストでは、頻度パラメーターに対する有意な効果は見られなかった(図2)。
【００８７】
細胞に基づく腫瘍免疫療法の重要な目的が、ある状況での画定抗原に対する強力かつ特異的なT細胞応答を示すことであり、これによって患者は他の治療(化学および放射線療法)により免疫抑制されることが多いことに留意すれば、リンパ涸渇環境下で予防接種条件を評価することが重要であると思われる。従って、本発明者らは、中程度および/または調整可能なT細胞涸渇特性を有する免疫抑制薬を実験デザインに含めた。
【００８８】
1.2.3  免疫抑制治療によって誘発される末梢血におけるリンパ球涸渇
ウサギATGは、現在では極めて長い間固形臓器移植に用いられているポリクローナルIgGである。サルで行った研究から、用量依存性のリンパ球涸渇がウサギATGで達成することができることが明らかになった(28)。フルダラビンは、慢性のリンパ性白血病の治療に一般に用いられているアデニンのフッ素化類似体である(39)。フルダラビンはリンパ球減少症を引き起こし、Bリンパ球より顕著にTリンパ球を涸渇させる(40)。
【００８９】
ウサギATGまたはフルダラビンによる免疫抑制治療による血中リンパ球のサブポピュレーションの生成を分析した。従来の研究により、本発明者らは、C57BL/6マウスで20mg/kg体重を1回ip投与することによって軽度のリンパ涸渇を生じさせることができた(データーは示さず)。これらの条件では、本発明者らは、ATG投与の2時間後に循環リンパ球の数が2分の1に減少することを観察した(図3)。これらの値は、8日後には徐々に正常レベル附近まで戻った。CD4+およびCD8+Tリンパ球の擬似的完全消失はATG投与の2時間後に見られ、これはBリンパ球の割合の相対的増加と匹敵した。Tリンパ球コンパートメントの再構築がその後に始まり、正常値近くまで15日以内に回復した。文献(41, 42)から、200mg/kg/日をipで6日間のフルダラビンに基づく方法が、マウスでの軽度のリンパ涸渇を誘発するのに必要であると思われた。これらの条件では、末梢血Tリンパ球コンパートメントの涸渇はATGの場合より顕著ではなく、その後化学療法の終了後に正常レベルに復した。
【００９０】
1.2.4  免疫抑制治療によって誘発されるリンパ様臓器のリンパ球涸渇
血液コンパートメントは、身体のリンパ質量全体の1-2%に過ぎない。免疫抑制開始の10日後に、TおよびB細胞、脾臓およびリンパ節についての表現型によるリンパ球涸渇を測定した。血液コンパートメントにおける状況と同様に、ATGおよびフルダラビンに基づく免疫抑制療法はリンパ様臓器におけるTリンパ球プールの涸渇を誘発した(表1)。
【００９１】
表1は、ATGの単回投与によって誘発される末梢リンパ様臓器涸渇を示す。末梢リンパ様臓器は、免疫抑制治療の投与開始から10日後に採取した。示されている値は、脾臓およびリンパ節で見られたCD4、CD8およびB220細胞の割合である。
【００９２】
【表１】
0005496669.tif 000002
【００９３】
ATGでは、効果はフルダラビンよりも一層顕著であった。効果は、Bリンパ球プールの相対的増加に匹敵した。
【００９４】
要約すれば、研究に用いた免疫抑制性条件下では、Tリンパ球コンパートメントの顕著であるが適度かつ一過性の減少が見られた。
【００９５】
1.2.5  免疫抑制およびプライム-ブースト免疫の結果としてのCEA特異的Th1応答の大きさの増加
次に、上記条件で行われるリンパ涸渇によりその免疫モデルにおけるCEA特異的T細胞応答の大きさを増加させることができるかどうかを検討した。プライム-ブースト免疫(50μg ivおよび7日後に10μg id)の10日前に、動物に上記のようにATGまたはフルダラビンを投与した。コントロールと比較して、 the magnitude ofCyaA-CEAA3B3で免疫したATGおよびフルダラビン投与動物ではCEA特異的細胞性免疫応答の大きさが顕著に増加した。実際に、図4は、IFN-γを分泌するCEA特異的CD4+およびCD8+ T細胞の頻度がリンパ除去前処理を受けた動物では二倍になったことを示している。このような効果はCyaAΔ-CEAA3B3で免疫した動物では見られなかったので、CyaAに基づく療法についてのCD11bターゲッティングの重要性が際立った。注目すべきことには、CEAA3B3+CpG免疫によって、前リンパ涸渇によりIFN-γを分泌するCEA特異的CD4+ T細胞の頻度が著しく増加したが、この効果はCEA特異的CD8+ T細胞については見られなかった。
【００９６】
1.2.6  結果または前リンパ除去としての(as a result or prior lymphoablation)  CyaA-CEAA3B3プライムブースト免疫の生存メジアン値の増加
次に、この観察の関連性を、腫瘍拒絶モデルで試験した。本発明者らは、CEAタンパク質を安定に発現するB16細胞を確立した。2x104個の腫瘍細胞を投与したところ、総ての模造品およびCyaAΔ-CEAA3B3投与動物は腫瘍を発現し、瀕死状態になり、安楽死の必要があった(図5)。これらの条件では、動物の生存メジアン値はそれぞれ15および17日であった。対照的に、腫瘍投与の3日後にCyaA-CEAA3B3およびCEAA3B3+CpGで免疫した動物は、生存メジアン値が高くなった(それぞれ、35および33日)。これらの動物の少数には、B16F0CEA-GFP細胞投与の50日後に腫瘍が見られなかった(図5A)。ATGまたはフルダラビンによるリンパ涸渇の際には、CyaA-CEAA3B3投与マウスの生存メジアン値はそれぞれ45および41日に高まったが、CEAA3B3+CpGで免疫した動物のそれは変化が見られなかった。腫瘍がないままの動物の割合は、変化がなかった。図5Bに示されるように、腫瘍をCyaA-CEAA3B3による治療免疫前5日間増殖させた動物は、コントロールと比較してリンパ涸渇時の生存数が劇的に増加した。実際に、この設定では、CyaA-CEAA3B3およびCEAA3B3+CpG投与マウスの生存メジアン値はそれぞれ27および23日に減少し、腫瘍を持たないままの動物は50日目には見られなかった。リンパ涸渇は、CEAA3B3+CpGで免疫したマウスの生存メジアン値に効果がなかった。対照的に、ATGまたはフルダラビン投与動物の生存数は、CyaA-CEAA3B3で免役することによって劇的に増加し、50日無腫瘍はそれぞれ80%および60%にまで増加した。
【００９７】
1.3    検討
細胞に基づく養子腫瘍免疫療法の分野において、多くの問題が前臨床の結果の臨床への移行を妨げている。それらの１つは、目的とする腫瘍関連抗原に対して誘導された養子応答の大きさである。実際に、ヒトでは、抗原特異的T細胞の増殖および効力は、腫瘍発生に関する多数の要因によって限定されている。これらには、TAAに対して高親和性を有するT細胞クローンの誘導の欠如、調節細胞からのネガティブシグナル、腫瘍ストロマおよび恒常的T細胞調節が挙げられる。養子T細胞導入療法のネズミモデルでは、リンパ涸渇は導入細胞の移植および持続性を増加させることが示されている(43-46)。このような手法は、ごく最近臨床へ極めて良好に移行されている(36-38)。特異的CD8+およびCD4+ T細胞応答を誘発する強力な手段である百日咳菌由来のアデニル酸シクラーゼを用いて、特異的T細胞応答の誘発を目的とする能動免疫に対するリンパ涸渇の影響を測定する方法が検討されてきた。多くの種類の癌でのその過剰発現により、癌胎児性抗原をターゲットとすることが選択されてきた。
【００９８】
CyaAΔ-CEAA3B3免疫原性の欠如により、CyaAが特異的T細胞応答を誘発する能力におけるCD11bターゲッティングの重要性が強調された。従来の研究に示されるように(21)、CyaA-CEAA3B3は免疫原性(図2)および腫瘍免疫療法(図5)に関してCEAA3B3+CpGと同様に有効であることが分かった。
【００９９】
CyaAのベクターツールとしての有効性は前免疫によって影響されないので(20, 21)、均質なプライム・ブースト法が可能であることが示されている。2つの異なる投与経路を用いることによって、本発明者らはCEA-特異的免疫応答の規模を中程度にまでではあるが増加させることができた。第二のidブーストにより細胞性免疫応答をさらに増幅することはできなかった。次に、本発明者らは、一過性の軽度リンパ涸渇が特異的T細胞クローンがさらに増幅するのに必要なスペースを生じると仮定した。優先的にTリンパ球を涸渇させることが示されているヒトで広汎に用いられている生成物に注目した。ATG投与によって得られたリンパ涸渇のパターンは、ヒト以外の霊長類モデルで観察されたものと整合性があった(28)。フルダラビンで得られたリンパ涸渇の全般的レベルはATGのものより低かったが、フルダラビンはシクロホスファミドと共同して良好に作用することが知られている(42)。
【０１００】
前リンパ涸渇により、CEA特異的Tリンパ球の頻度をほぼ二倍にすることができた。これが恒常的T細胞調節の崩壊または調節T細胞の破壊によるものであるかどうかは、さらに検討を要する。リンパ涸渇がさらに高レベルのサイトカインを誘発して残りの活性化したリンパ球を利用してそれらの発生および増幅を促進できるようにすることを無視することはできない。
【０１０１】
リンパ涸渇は、CyaA-CEAA3B3免疫とは対照的に、CEAA3B3 + CpG免疫によるCEA特異的CD8+ T細胞の頻度を増加させなかった。このことは、ここに記載している現象においてAPCターゲッティングの重要性を強調している。CyaAベクターは、その触媒ドメインをCD11b+抗原提示細胞の細胞質ゾルにトランスロケーションする特性によってDCをターゲットとする(17, 18)。興味深いことには、もう一つの系であるCEAA3B3に融合したウシ型結核菌のhsp65タンパク質によるリンパ涸渇後にCEA特異的CD8+リンパ球の頻度が増加するという同様の結果が見られた(データーは示さず)。しかしながら、それらの実験条件であるCpGによって誘発された炎症状態が別のモデルで示されたようなブーストのための記憶T細胞の十分なプールの形成を阻害することを無視することはできない(47)。
【０１０２】
CEA特異的Tリンパ球のレベルは、B16F0CEA-GFP細胞によって送達される腫瘍投与に対する動物の生存能力と関連しており、CEA特異的リンパ球の数とマウスがCEA発現腫瘍細胞を制御しおよび/または拒絶する能力との相関を示唆していた。CyaA-CEAA3B3プライムブースト免疫の有効性に対する前リンパ涸渇の効果は、D+3治療設定よりもD+5で顕著であった。この観察は、リンパ除去薬が生体から消失した後に継続する効果を有する可能性があるので、リンパ涸渇とリンパ刺激の間のタイミングを精確に制御する必要があることを反映している可能性がある。これに関して、ヒト使用のATG相対物はリンパ球表面受容体をダウンモジュレートし、これにより抗原によって誘導される増殖に余り反応しなくなることが示されている(28)。リンパ涸渇と免疫の間の遅延はこの場合には8日間に過ぎないので、この現象がD+3治療的設定における効果の明らかな欠如に関連していることを無視することはできない。
【０１０３】
この研究は、CyaAに基づく活性細胞に基づく免疫療法がATGまたはフルダラビンが介在したリンパ涸渇と適合していることを明らかにしている。これに関連して、2つの異なる投与経路(iv, id)によるプライム-ブースト免疫は、CEA特異的T ヘルパーと、極めて重要なことには、CEA特異的細胞傷害性Tリンパ球の頻度を顕著に増加した。このCEA特異的細胞傷害性Tリンパ球の頻度増加は、CEA発現腫瘍細胞を制御しおよび/または拒絶する一層良好な能力と相関していた。提示された結果から、CyaAまたはhsp65のような抗原提示細胞をターゲットとするベクターを用いてこのような結果を得ることが好ましい。実際に、CD11b結合を欠いているCyaAΔは、CEA特異的T細胞を誘発する能力を喪失している。さらに、CpGアジュバントと共に処方されたCEAA3B3によって誘発されるCEA特異的CD8+ T細胞応答は、ここで用いられたリンパ涸渇条件ではさらに増幅しなかった。
【０１０４】
2.  例2
2.1  材料および方法
2.1.1  マウス、細胞系
特異的病原体のない6-10週齢の雌C57BL/6マウスは、CER Janvier (Le Gesnet St-IsIe,フランス)から入手した。動物を含む実験は、動物ケアのガイドラインに準じて行った。免疫抑制治療薬はip投与し、腫瘍細胞はscで、免疫はiv (後眼窩)および耳の真皮にidで投与した。血液採取は、尾からの放血によって行った。脾臓摘出およびリンパ節採取は、屠殺した動物で行った(CO2)。上顎リンパ節を採取して表現型判別(phenotyping)分析用にプールした。
【０１０５】
CEAタンパク質を発現するMC32aCEA細胞は、Pr. W. Zimermann (LTI,ミュンヘン)から入手した。これらの細胞は、MC38ネズミ結腸腺癌由来である(48)。細胞は、0.3mg/ml G418 (Life Technologies)の存在下にて10%の熱不活性化FCS、100単位/ml ペニシリン、100μg/ml ストレプトマイシンおよび5x10-5モル/lの2-メルカプトエタノールを補足したGlutaMAXを含むRPMI 1640中に保持した。
【０１０６】
2.1.2  細胞計数および表現型判別
血液、リンパ節細胞および脾臓細胞を、計数用の上記方法(28, 29)およびフローサイトメトリー補助表現型判別に準じて処理した。血液リンパ球は、トリパンブルーを用いて計数した。
【０１０７】
2.1.3  ウサギにおける抗マウス胸腺細胞グロブリンの調製
マウスATGは、6週齢C57BL/6マウスで採取した5x108個の胸腺細胞をウサギにsc投与することによって調製した。この免疫を、14日後に同一材料をiv投与することによってブーストした。7日後に、動物から採血し、血清IgGを固定タンパク質Gカラム(Pierce)上で精製した。純度はSDS PAGE分析によって管理し、既知濃度のウサギIgGを標準として用いるBradford法によって量を評価した。ウサギATGを20mg/kgの濃度で用い、単回投与した。コントロールとしては、正常なウサギ血清を用いた。
【０１０８】
2.1.4  試薬、ペプチドおよびオリゴヌクレオチド
フルダラビン(Sigma)を200mg/kg/日の濃度で6日間用いた。モノクローナル抗体である抗CD4-APC、抗CD8-PerCP、抗B220-FITCおよび抗IFN-γ-FITCは、BD Biosciencesから入手した。
【０１０９】
11個のアミノ酸だけ重複しかつCEAタンパク質のA3およびB3ドメインをカバーしている15-マーのペプスキャンをデザインして、Mimotope(登録商標)(オーストリア)から入手した。これをDMSOで希釈し、1μg/mlの最終濃度で用いた。CpG ODN 1826はSigmaから購入した。上記CpGは配列番号:16の配列であり、塩基はホスホロチオエート(ヌクレアーゼ抵抗性)である。
【０１１０】
2.1.4  CEA A3およびB3ドメインを有する組換え百日咳菌CyaAの分子クローニング。組換えCyaA-CEAA3B3の産生および精製。
この項目で用いた組換えアデニル酸シクラーゼを、酵素的に不活性なCyaAをコードするプラスミドpkTRAC-HPV16E7Δ30-42の誘導体を用いて大腸菌で発現させた(21)。
【０１１１】
CyaA-CEAA3B3は、2段階で構築した。CEAのアミノ酸残基492-557をコードする第一のDNA断片を、合成CEA遺伝子(Sequentia)とプライマーCEA1 (配列番号:1: 5'-accatcaccgtctctgcg-3')およびCEA2 (配列番号:2: 5'-gggcactagtggtcagggtacggttgcc-3')を用いてPCR増幅した。CEAのアミノ酸残基629-687をコードする第二のDNAは、CEA合成遺伝子とプライマーCEA3 (配列番号:3: 5'-gggcaccggtaatggtatcccgcagcaacac-3')およびCEA4 (配列番号:4: 5'- cgcagagacggtgatggtgttaacggcacccgcagacagacc-3')を用いてPCR増幅した。これらの2個のDNA断片(部分的に重複)を精製し、第三のPCRでプライマーCEA2およびCEA3と組合せ、395bpの長さのDNA断片を増幅した。この断片をNheIおよびKpnIで消化し、pkTRAC-HPV16E7Δ30-42の対応する部位に挿入してプラスミドpkTRAC-CEAB3を得た。次に、CEAのアミノ酸残基545-647をコードするDNA断片を、合成CEA遺伝子とプライマーCEA5 (配列番号:5: 5'-gggcgctagccgtctgcagctgtccaatg-3')およびCEA6 (配列番号:6: 5'-cccgggtacccggcgtgattttggcgata-3')を用いてPCR増幅した。精製したPCR断片をAgeIおよびSpeIによって消化し、同じ制限酵素によって消化したプラスミドpkTRAC-CEAB3に連結した。
【０１１２】
CyaAΔ-CEAA3B3は2段階で構築した。最初に、配列1230-1300に対応する核酸を欠いているCyaAアミノ酸配列1149-1356 (配列番号:13: 5'- caacgagctctggggccacgatggcaacgacacgatacgcggccggggcggcgacgacatcctgcgcggcggcctggg cctggacacgctgtatggcgaggacggcaacgacatcttcctgcaggacgacgagaccgtcagcgatgacatcgacggcg gcgcggggctggacaccgtcgactactccgccatgatccatccaggcaggatcgttgcgccgcatgaatacggcttcggga tcgaggccatgctgtatggcgacgccggcaacgacaccctctacggggggctgggcgacgatacccttgaaggcggcgc gggcaacgattggttcggccagacgcaggcgcgcgagcatgacgtgctgcgcggcggagatggggtggataccgtcgatt acagccagaccggcgcgcatgccggcattgccgc-3')を合成した(Genecust,フランス)。第二に、この断片をSacIおよびSphIで消化し、同じ制限酵素によって消化したプラスミドpkTRAC-CEAA3B3に連結した。生成するプラスミドpKTRACΔ-CEAA3B3は、CD11b分子への結合を欠いているCyaAをコードした(31)。
【０１１３】
総ての構築物はDNAシークエンシングによって立証した(Genome Express)。組換えCyaAを、上記と同様に大腸菌BLR株(Novagen)で産生した(21)。組換えタンパク質は、DEAE-セファロースおよびフェニル-セファロースクロマトグラフィーを含む2段階処置によって封入体から均質になるまで精製した。60%イソプロパノールを用いる追加の洗浄段階を行い(21)、混入しているリポ多糖類のほとんどを除去した。精製した組換えタンパク質を、クーマシーブルーで染色したSDS-PAGEによって分析した。タンパク質濃度は、分子吸光係数142,000モル/l 1cm 1を用いて280 nmの吸収から分光光度法によって測定した。
【０１１４】
2.1.5  組換えCEAの分子クローニング。組換えCEAタンパク質の産生および精製
CEAタンパク質をコードする大腸菌で最適化したcDNAを、プライマーCEA7 (配列番号:7: 5'-gcggccgcaccatcaccgtctctgcg-3')とCEA8 (配列番号:8: 5'-cccgctcgagggcacccgcagacagacc-3')でPCR増幅した後、NcoIとXhoI制限部位の間のpIvcx 2.4b Ndeベクター(Roche)にサブクローニングした。生成するプラスミドを、大腸菌BL21λDE3株(Novagen)に形質転換した。His-Tag-CEAタンパク質を1ミリモルのイソプロピル-h-D-チオガラクトピラノシド(Euromedex)で誘導することによって発現させ、Ni-NTAアガロース(Qiagen)上で精製した。エンドトラップ(Endtrap)樹脂を用いて、リポ多糖類混入物を除去した。
【０１１５】
2.1.6  γ-IFN ELISpot分析法
マルチスクリーン濾過プレート(96穴; Millipore,フランス)に、ラット抗マウスγインターフェロン(IFN-γ)抗体(クローンR4-6A2; PharMingen,サンディエゴ, カリフォルニア)4μg/mlを室温にて一晩コーティングした。免疫マウス由来の脾臓細胞をウェルに加え、1μg/mlのCEAペプスキャンの存在下または非存在下にて20時間インキュベーションした。十分に洗浄した後、プレートを、ビオチン化ラット抗マウスIFN-γ抗体(クローンXMG 1.2; PharMingen) 5μg/mlでインキュベーションした後、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼ(PharMingen)でインキュベーションすることによって明らかにした。最後に、スポットを、BCIP/NBTを基質として用いて明らかにした。γ-IFN産生細胞の数は、それぞれのウェル(C.T.L., ドイツ)におけるスポット形成コロニー(SFC)の数を数えることによって測定し、結果は1 x 106個の脾臓細胞当たりのSFCの数として表した(20)。
【０１１６】
2.2  結果
2.2.1  精製組換えタンパク質のSDS PAGE分析
CyaAベクターがCEA特異的T細胞応答を誘発する能力を検討するため、本発明者らはCEA分子のサブフラグメントであるA3およびB3ドメインを含む2種類の異なる組換え分子を構築した。このCEAの領域は、多くのヒトCTLおよびヘルパーエピトープ(32)を含むことが示されている。イン・ビトロおよびイン・ビボ分析法を可能にするため、構築物を大腸菌に産生させ、均質になるまで精製した(図6)。リポ多糖類除去処置を精製プロトコル(21)に導入し、1mg当たり内毒素を<300単位含む組換えタンパク質を得た(データーは示さず)。
【０１１７】
2.2.5      組換えCEAタンパク質を用いるプライム-ブースト免疫によって誘発される細胞性免疫応答の適度な増幅
従来の研究は、目的の抗原を有する組換えCyaAが異なる投与経路によりTh1型の細胞性T細胞応答を誘発することができることを示している(21, 35)。本発明者らは、プライムブースト法により異なる投与経路を組み合わせることによって、細胞性免疫応答の大きさを増加させることができるかどうかを検討した。図7に示されるように、IFN-γを分泌するCEA特異的CD8+脾臓細胞の頻度は、CEA組換えタンパク質50μgを1回静脈内(iv)投与後には既にかなり高かった。対照的に、CpGのようなアジュバントを用いて処方したCyaAΔ-CEAA3B3またはHis-tag-CEAタンパク質は、γ-IFN分泌を特徴とする細胞性免疫応答を示すことができなかった。
【０１１８】
本発明者らは、これらの実験を投与方法を変更して繰り返した。すなわち、プライム予防接種を上記と同様にivにて行い、それぞれ7および14日後に耳真皮に材料10μgをid投与した(プライム・ダブル・ブースト予防接種)。アジュバントはそれぞれの予防接種投与に含まれており、最初のブーストでは、CyaA-CEAA3B3+CpGを接種したマウスでCEA特異的T細胞の頻度が増加した。第二のブーストでも、頻度パラメーターに対する有意な効果は見られなかった(図7)。
【０１１９】
2.2.5 免疫抑制治療によって誘発される末梢血におけるリンパ球涸渇
フルダラビンは、慢性のリンパ性白血病の治療に一般に用いられているアデニンのフッ素化類似体である(39)。フルダラビンはリンパ球減少症を引き起こし、Bリンパ球より顕著にTリンパ球を涸渇させる(40)。ウサギATGは、現在では極めて長い間固形臓器移植に用いられているポリクローナルIgGである。サルで行った研究から、用量依存性のリンパ球涸渇がこの治療薬で達成することができることが明らかになった(28)。
【０１２０】
本発明者らは、フルダラビンまたはウサギATGによる免疫抑制治療による血中リンパ球のサブポピュレーションの生成を分析した。フルダラビン100mg/kg/日をipにて6日間では、涸渇効果はT細胞に限定されると思われた(41, 42)。値は投与開始後の7日以内にコントロール群にまで復したので、効果は一過性であった。ウサギATG 20mg/kgの単回ip投与では、ATG投与の2時間後には循環CD4+およびCD8+リンパ球の数の有意な減少を誘発した(図8)。この涸渇効果は、投与後2-4日の間に最大になった。以後、CD4+およびCD8+リンパ球数は、正常値に到達することなく増加し始めた。CD8+リンパ球は、CD4+ T細胞よりも10倍涸渇した。NK細胞も、CD4+細胞に幾分匹敵する割合でATG投与によって涸渇した。対照的に、B細胞の数はATG投与によって影響を受けなかった。
【０１２１】
2.2.4  免疫抑制治療によって誘発されるリンパ様臓器のリンパ球涸渇
血液コンパートメントは、身体のリンパ質量全体の1-2%に過ぎない。従って、本発明者らは、免疫抑制開始の14日後に、TおよびB細胞、脾臓およびリンパ節についての表現型によるリンパ球涸渇を測定した。コントロール(PBSおよびNRS)と比較すると、フルダラビンおよびATGに基づく免疫抑制療法はリンパ様臓器におけるリンパ球の割合の変化を誘発した(表2)。
【０１２２】
表2は、ATGの単回投与によって誘発される末梢リンパ様臓器涸渇を示す。末梢リンパ様臓器は、免疫抑制治療の投与開始から14日後に採取した。示されている値は、脾臓および上顎リンパ節で見られたCD4、CD8、CD49dおよびB220細胞の割合、およびそれぞれの臓器に含まれるリンパ球の数に関するCD4、CD8、CD49dおよびB220の絶対値である。
【０１２３】
【表２】
0005496669.tif 000003
【０１２４】
TおよびNK細胞の割合は、脾臓でフルダラビン投与終了6日後に増加した。これはCD4+T細胞で特に明らかであり、CD8+およびNK細胞では増加幅は少なかった。従って、B220+細胞の割合は、投与終了6日後に顕著に減少した。ATG投与では、T細胞の割合は脾臓およびリンパ節で減少し、CD4+およびCD8+カウント数は著しく低下した。CD8+リンパ球は、CD4+ T細胞よりも影響を受けた。注目すべきことには、フルダラビン投与動物の脾臓で回収されたリンパ球の総数は、コントロールより著しく高かった。また、ATGおよびフルダラビン投与動物の脾臓におけるヌル細胞の割合は15%を上回った。これらのいずれも、リンパ節のレベルでは観察されなかった。
【０１２５】
2.2.5      免疫抑制およびプライム-ブースト免疫の結果としてのCEA特異的Th1応答の大きさの増加
本発明者らは、次に免疫モデルにおけるCEA特異的T細胞応答の大きさに対する上記条件で行ったリンパ涸渇の影響を測定した。プライム-ブースト免疫の7日前に、動物に上記と同様にフルダラビンまたはATGを投与した。PBSコントロールと比較して、CEA特異的細胞性免疫応答の大きさはCpGアジュバントの存在下にてCyaA-CEAA3B3で免疫したフルダラビン投与動物で減少した。意外なことには、ATG投与動物の群では、CEA特異的細胞性免疫応答の大きさはコントロールに比較して二倍であった。CEA特異的細胞性免疫応答は、HPV16E7抗原を有する非関連組換えCyaAで免疫したときにも検出された。低めのCEA特異的細胞性免疫応答がCpGで処方したHis-tag CEAおよびCyaAΔ-CEAA3B3免疫時に検出され、上記効果を最大にするCD11bターゲッティングの重要性が強調された。
【０１２６】
2.2.6  結果または前リンパ除去としての(as a result or prior lymphoablation)  CyaA-CEAA3B3プライムブースト免疫後の生存メジアン値の増加
本発明者らは、次に腫瘍拒絶モデルでのこの観察の関連性を試験した。CEAタンパク質を安定に発現するMC38ネズミ結腸腺癌細胞を用いた(48)。5 x 105個の腫瘍細胞を投与すると、偽薬、CyaAΔ-CEAA3B3およびHis-Tag-CEA-投与動物は腫瘍を発生して瀕死状態になり、安楽死の必要があった(図10)。これらの条件では、動物の生存メジアン値はそれぞれ13-15日であった。対照的に、腫瘍投与の10日後にCyaA-CEAA3B3 + CpGで免疫した動物では、生存メジアン値が増加した(27日)。ATGを投与したときには、偽薬投与動物の生存メジアン値は19-21日まで高まった。この群では、CyaA-CEAA3B3 + CpG投与動物の80%は腫瘍が完全に縮退し、さらに60日生存した。フルダラビン投与動物は、全く異なる腫瘍増殖パターンを示した。MCa32A増殖は、フルダラビンを6日間継続することによって部分的に阻害された。結果的に、偽薬投与動物の生存メジアン値は21-25日まで増加した。CyaA-CEAA3B3 + CpG投与動物の60%では、腫瘍が完全に縮退し、さらに60間生存した。
【０１２７】
2.3    検討
細胞に基づく養子腫瘍免疫療法の分野において、多くの問題が前臨床の結果の臨床への移行を妨げている。それらの１つは、目的とする腫瘍関連抗原(TAA)に対して誘導された養子応答の大きさである。実際に、ヒトでは、抗原特異的T細胞の増殖および効力は、腫瘍発生に関する多数の要因によって限定されている。これらには、TAAに対して高親和性を有するT細胞クローンの誘導の欠如、調節細胞からのネガティブシグナル、腫瘍ストロマおよび恒常的T細胞調節が挙げられる。養子T細胞導入療法のネズミモデルでは、リンパ涸渇は導入細胞の移植および持続性を増加させることが示されている(43-46)。このような手法は、ごく最近臨床へ極めて良好に移行されている(36-38)。特異的CD8+およびCD4+ T細胞応答を誘発する強力な手段である百日咳菌由来のアデニル酸シクラーゼを用いて、本発明者らは、特異的T細胞応答の誘発を目的とする能動免疫に対するリンパ涸渇の影響を分析した。本発明者らは、多くの種類の癌でのその過剰発現により、癌胎児性抗原をターゲットとすることを選択した。
【０１２８】
CyaAのベクターツールとしての有効性は前免疫によって影響されないので(20, 21)、均質なプライム・ブースト法が可能であることが示されている。2つの異なる投与経路を用いることによって、本発明者らはCEA-特異的免疫応答の意義を増加させることができた。第二のidブーストによって細胞性免疫応答をさらに増幅することはできなかった。次に、本発明者らは、CyaAおよびCpGアジュバントによって介在される能動免疫に関するリンパ涸渇の影響を分析した。本発明者らは、優先的にTリンパ球を涸渇させることが示されているヒトで広汎に用いられている生成物に注目した。フルダラビンで得られたリンパ涸渇の全般的レベルはATGのものより低かった。
【０１２９】
予備的フルダラビン誘発免疫抑制は、CyaA-CEAA3B3 + CpGアジュバントによるプライムブースト予防接種時にCEA特異的Tリンパ球の頻度に負の影響を与えた。意外なことには、予備的ATG介在リンパ涸渇は、CyaA-CEAA3B3 + CpGアジュバントによるプライムブースト予防接種時にCEA特異的Tリンパ球の頻度を二倍にした。これが恒常的T細胞調節の崩壊または調節T細胞の破壊によるものであるかどうかは、さらに検討を要する。本発明者らは、リンパ涸渇がさらに高レベルのサイトカインを誘発して残りの活性化したリンパ球を利用してそれらの発生および増幅を促進できるようにすることを無視することはできない。記載された効果は、図8および表2に記載されているように免疫時のリンパ涸渇のレベルを考慮すれば、極めて顕著でありかつ予想外のものである。プライム免疫時には、コントロール群における循環リンパ球はATG群と比較して20-13倍であった。ブースト免疫時には、コントロール群における循環リンパ球はATG群と比較して6倍であった。リンパ様臓器で測定したリンパ涸渇は、ほぼ同じ次数の大きさであった。
【０１３０】
リンパ涸渇は、His-tag CEA + CpGおよびCyaAΔ-CEAA3B3 + CpG免疫時に余り有意にではないが、CEA特異的CD8+ T細胞の頻度を増加させた。このことは、本明細書に記載の現象におけるAPCターゲッティングの重要性を強調している。CyaAベクターは、その触媒ドメインをCD11b+抗原提示細胞の細胞質ゾルにトランスロケーションする特性によってDCをターゲットとする(17, 18)。興味深いことには、本発明者らは、もう一つの系のベクトル化(vectorization)であるCEAA3B3に融合したウシ型結核菌のhsp65タンパク質によるリンパ涸渇後にCEA特異的CD8+リンパ球の頻度が増加するという同様の結果を観察した(データーは示さず)。フルダラビン投与動物を除き、CEA特異的CD8+ T細胞の頻度はMCa32A細胞が介在した腫瘍投与に対して生き残る動物の能力と関連しており、CEA特異的リンパ球の数とマウスがCEA発現腫瘍細胞を制御しおよび/または拒絶する能力との相関を示唆していた。フルダラビンは代謝拮抗薬であり、動物に投与されている中にMCa32A腫瘍増殖を遅らせた。実際に、CyaAに基づく免疫療法の際には、フルダラビン群における腫瘍の大きさは他の郡と比較して20分の1であった。これは、恐らくはCyaA-CEAA3B3 + CpGアジュバントの免疫療法が、コントロール群と比べてより効率的であったからであると思われる。
【０１３１】
この研究は、CyaAに基づく活性細胞に基づく免疫療法がATGが介在したリンパ涸渇と適合していることを明らかにしている。これに関連して、2つの異なる投与経路(iv, id)によるプライム-ブースト免疫は、CEA特異的CD8+ T細胞の頻度を顕著に増加した。このCEA特異的細胞傷害性Tリンパ球の頻度増加は、CEA発現腫瘍細胞を制御しおよび/または拒絶する一層良好な能力と相関していた。提示された結果から、CyaAまたはhsp65のような抗原提示細胞をターゲットとするベクターを用いてこのような結果を得ることが必要である。実際に、CD11b結合を欠いているCyaAΔは、CEA特異的T細胞を誘発する能力を完全に喪失している。また、CyaAに基づく免疫療法はフルダラビンが介在したリンパ涸渇と適合しており、腫瘍投与に対する生存が増加する。
【０１３２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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