(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
青枯病菌に対して感染能を有するファージφＲＳＳ１のゲノムの複製モジュールを含むプラスミドであって、（ａ）ファージφＲＳＢ２に由来する配列番号２に記載のＭＣＰプロモーター領域の配列と同一の塩基配列および当該塩基配列と１または数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入またはこれらの組合せにより配列に変異が生じている塩基配列であってＭＣＰプロモーターと同等の作用を有する塩基配列から選ばれる塩基配列を有するプロモーター領域と、（ｂ）該プロモーター領域の下流に、標識物質をコードする遺伝子と、（ｃ）該標識物質をコードする遺伝子の下流に、ファージφＲＳＢ２に由来する配列番号３に記載のＭＣＰターミネーター領域の配列と同一の塩基配列および当該塩基配列と１または数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入またはこれらの組合せにより配列に変異が生じている塩基配列であってＭＣＰターミネーターと同等の作用を有する塩基配列から選ばれる塩基配列を有するターミネーター領域と、を含む発現カセットを有することを特徴とするプラスミド。
【請求項２】
前記複製モジュールは、配列番号１に記載のファージφＲＳＳ１のゲノムの１〜１７２０番目、および、５８００乃至６１３５番目の何れかから６６６２番目の塩基配列と同一の塩基配列を、または、配列番号１に記載のファージφＲＳＳ１のゲノムの１〜１７２０番目および５８００乃至６１３５番目の何れかから６６６２番目の塩基配列に、１または数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入またはこれらの組合せにより配列に変異が生じている塩基配列であって、配列番号１に記載のファージφＲＳＳ１のゲノムの１〜１７２０番目および５８００乃至６１３５番目の何れかから６６６２番目の塩基配列と同等の作用を有する塩基配列を、含むことを特徴とする請求項１に記載のプラスミド。
【請求項３】
該プラスミドは、さらに、選択マーカーをコードする遺伝子を有することを特徴とする請求項１または２に記載のプラスミド。
【請求項４】
前記選択マーカーをコードする遺伝子は、カナマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする請求項３に記載のプラスミド。
【請求項５】
前記複製モジュールは制限酵素により切断されるサイトを有し、前記発現カセットは該サイトに組み込まれていることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項６】
前記制限酵素により切断されるサイトは、ＥｃｏＲＩサイトであることを特徴とする請求項５に記載のプラスミド。
【請求項７】
前記標識物質は、化学発光タンパク質または蛍光タンパク質であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項８】
前記標識物質は、蛍光タンパク質であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項９】
前記標識物質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）であることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項１０】
前記標識物質は、緑色蛍光タンパク質ｍｕｔ２（ＧＦＰｍｕｔ２）であることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項１１】
請求項１乃至１０のいずれか１項に記載のプラスミドによって形質転換されたことを特徴とする青枯病菌。
【請求項１２】
請求項１１に記載の青枯病菌において発現した前記標識物質を観察することによって、青枯病菌の増殖、減少または挙動を観察することを特徴とするモニタリング方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の青枯病菌を植物に感染させ、植物体内の青枯病菌において発現した前記標識物質を観察することによって、植物体内における青枯病菌の増殖、減少または挙動を観察することを特徴とする請求項１２に記載のモニタリング方法。
【請求項１４】
前記植物体内における青枯病菌の増殖、減少または挙動の観察は、青枯病菌を感染させた植物の横断切片における前記標識物質を観察することによって行うことを特徴とする請求項１３に記載のモニタリング方法。
【請求項１５】
前記植物体内における青枯病菌の増殖、減少または挙動の観察は、青枯病菌を感染させた植物を水平面に対して傾斜角度をつけた寒天培地表面に沿って根または／および茎が伸長するよう培養し、該寒天培地表面に培養した植物体内において産生された前記標識物質を観察することによって行うことを特徴とする請求項１３に記載のモニタリング方法。
【請求項１６】
前記傾斜角度は水平面に対して１５〜７５度であることを特徴とする請求項１５に記載のモニタリング方法。
【請求項１７】
前記標識物質の観察を経時的に行い、青枯病菌の増殖、減少または挙動をリアルタイムで観察することを特徴とする請求項１５または１６に記載のモニタリング方法。
【請求項１８】
請求項１３乃至１７のいずれか１項に記載のモニタリング方法を用い、前記青枯病菌の増殖、減少または挙動を指標として、植物品種による青枯病菌に対する感受性、または、耐性を評価することを特徴とする評価方法。
【請求項１９】
請求項１１に記載の青枯病菌に感染、発病した植物に、被験物質を与え、請求項１３乃至１７のいずれか１項に記載のモニタリング方法を用いて観察することによって、青枯病菌に対して有効な被験物質をスクリーニングすることを特徴とするスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標識物質をコードする遺伝子の発現カセットを有するプラスミド、該プラスミドにより形質転換された青枯病菌、該標識物質を観察することによる、例えば青枯病菌等の病原菌のモニタリング方法、該モニタリング方法を用いた、例えば青枯病菌等の病原菌に対する被験植物の感受性または耐性の評価方法、および、該モニタリング方法を用いた、例えば青枯病菌等の病原菌に対して有効な被験物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
青枯病（立枯病）は、ナス科植物をはじめ２００種以上の植物に感染し、枯死させる農業上深刻な被害をもたらす病害である。病気の進行が急激の場合には青みが残ったまま枯れることもあり、この名がついたと言われている。青枯病になった植物の地際部の茎を切断し、その茎を水につけると、乳白色の粘液（細菌粘塊）を出すのが特徴である。
【０００３】
青枯病菌（学名ラルストニア・ソラナセアラム  Ralstonia solanacearum）は、植物の根の傷などから植物体内に侵入した後、維管束内で増殖する。そして、細胞外多糖を大量に生産する。その結果、維管束の通水が悪化するので、被感染植物は萎凋し、最終的に枯死する。青枯病菌は、乾燥に弱く、酸やアルカリなどで容易に死滅する。しかし、水の中で何年も安定して生残する性質があり、薬剤による土壌消毒を行っても地下深くに生残し、適当な作物が植えられると地上部に上って再び青枯病を発生させる。このため、防除の非常に困難な病害として知られている。
【０００４】
現在、青枯病菌の防除のためには、古典的な輪作法、または、臭化メチルまたはクロルピクリンによる土壌処理等が行われている。しかし、既存農薬の使用は環境への負荷や人体への影響が大きい。そこで、青枯病菌を効果的に防除するための代替手段が開発されている。特許文献１には、青枯病菌に対して溶菌性を示す３種類のバクテリオファージ（バクテリオファージタイプ１、バクテリオファージタイプ２およびバクテリオファージタイプ３）について記載されている。これらのバクテリオファージは、病原性、疫学的特徴、生理・生化学的性質が異なる青枯病菌６株（Ｃ−３１９，Ｍ４Ｓ，Ｐｓ２９，Ｐｓ６５，Ｐｓ７２，Ｐｓ７４）に対して溶菌性を示す。また、これらを有効成分として利用した、青枯病菌の防除剤、青枯病菌の防除方法、土壌改良剤および土壌改良方法についても記載されている。
【０００５】
特許文献２には、特許文献１に記載された各バクテリオファージよりも広い溶菌スペクトルを示すバクテリオファージ、および、該バクテリオファージを用いた青枯病菌の防除剤等について記載されている。このバクテリオファージは、前述した青枯病菌６株だけでなく、さらに、ＭＡＦＦ１０６６０３、ＭＡＦＦ１０６６１１、ＭＡＦＦ２１１２７０、ＭＡＦＦ２１１２７１、ＭＡＦＦ２１１２７２、ＭＡＦＦ３０１５５６、ＭＡＦＦ３０１５５８、ＭＡＦＦ７３０１３８およびＭＡＦＦ７３０１３９の９株についても溶菌性を示す。また、非特許文献１および非特許文献２には、青枯病菌に特異的に感染する４種類のバクテリオファージ、バクテリオファージφＲＳＳ１（以下、ファージφＲＳＳ１）、バクテリオファージφＲＳＭ１（以下、ファージφＲＳＭ１）、バクテリオファージφＲＳＬ１およびバクテリオファージφＲＳＡ１について記載されている。このうち、ファージφＲＳＳ１およびファージφＲＳＭ１の２つのファージは、青枯病菌を溶菌せずに増殖を抑制する特性を持っている。
【０００６】
一方、青枯病菌の感染機構や発病機構を解明するために、生物発光を利用して青枯病菌の生態を解明する方法も開発されている。従来、青枯病菌を標識するために用いられているプラスミド（たとえばｐＫＴ２４０由来のプラスミド）は、青枯病菌中で複製・保持が可能である。しかし、薬剤（例えばカナマイシン）による選択圧がない条件では、速やかに青枯病菌から脱落する。そのために、このようなプラスミドは、薬剤選択圧をかけることができない植物体内または土壌中での長期間の安定した標識化には適さない。
【０００７】
青枯病菌を標識するために、トランスポゾン等を利用してゲノムに目的遺伝子を挿入する方法がある。この方法を用いると、薬剤選択圧がなくても、目的遺伝子は安定に保持される。しかし、トランスポゾン等を利用してゲノムに遺伝子を挿入すると、宿主青枯病菌のゲノムの再編成、あるいは、挿入による位置効果等により、遺伝子の発現パターンに変化が生じる可能性がある。ゲノムに挿入する方法を利用する場合は、これらの副次的な影響を評価しなければならないために、煩雑な手順が必要となる。
【０００８】
特許文献３および非特許文献３には、前述したファージφＲＳＳ１の特定の配列を含有するプラスミドについて記載されている。これらの文献に記載のプラスミドは、ファージφＲＳＳ１のゲノムの複製モジュールを含有し、青枯病菌に容易に取り込まれる。また、このプラスミドを利用すると、薬剤選択がない条件でも青枯病菌に安定して該プラスミドを複製・保持させることが可能となる。そのため、各種の有用な遺伝子を青枯病菌の中に容易に導入することができる。さらに、そのプラスミドが不要となった場合には、青枯病菌のゲノム情報を変化させることなく除去することが可能である。
【０００９】
これらの文献には、例えば、ファージφＲＳＳ１由来の複製モジュールからなるプラスミドの間にカナマイシン耐性カセットを接続させたプラスミドｐＲＳＳ１１（以下、ｐＲＳＳ１１）、または、カナマイシン耐性カセットおよびGreen  Fluorescent Protein uv（以下、ＧＦＰｕｖ）遺伝子を挿入したプラスミドｐＲＳＳ１２（以下、ｐＲＳＳ１２）について記載されている。ｐＲＳＳ１２を用いることで、カナマイシンによる選択圧がない状態においても安定に青枯病菌内に保持させることができる。さらに、ＧＦＰｕｖタンパクのような標識物質を発現させることで、青枯病菌の所在を簡便に標識化することができる。
【００１０】
青枯病菌の所在を確認する手法としては、蛍光標識化された青枯病菌を土壌中で栽培した植物（トマト）に接種し、一定時間後に該植物の接種箇所から種種の距離離れた位置における切片を作製し、その切片を蛍光実体顕微鏡で観察する方法がある。この観察結果からは、植物内での青枯病菌の上方または下方への移動、および、維管束内での移動について観察することができる。
【００１１】
このような土壌中で栽培した植物の切片を観察することによる青枯病菌のモニタリング手法を用い、経時的にモニタリングする場合に、土壌中で栽培した植物を定期的に堀り出し、その茎を切断し、断面を観察し、その後植え直すという方法も考えられる。しかし、このような方法では、切断および植え直しによる植物への影響が大きく、自然の環境下における青枯病菌のモニタリングとは言い難い。そこで、ある植物に対する青枯病菌の病原性の検定を行う場合、従来の方法では、まず検定する植物を複数株１ヶ月程度土壌で栽培する。その後、これらの茎または根に検定菌を接種し、栽培を継続する。最後に、これらの株での病徴（葉や茎の変色・萎凋など）の出現を指数化し統計処理する。このため、観察・判定のために、さらに２〜４週間程度の日数が必要となる（非特許文献４）。このように、土壌中で栽培した植物について青枯病菌のモニタリングを行う場合には、１ヶ月以上の期間が必要となる。そのため、簡便かつ短期間にモニタリングを行う方法の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開２００５−２７８５１３号公報
【特許文献２】特開２００７−２５２３５１号公報
【特許文献３】特開２００９−５５８８１号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Takashi Yamada, Takeru Kawasaki, Shoko Nagata, Akiko Fujiwara, Shoji Usami and Makoto Fujie. New bacteriophages that infect the phytopathogen Ralstonia solanacearum. Microbology, 153, 2630-2639 (2007)
【非特許文献２】Takeru Kawasaki, Shoko Nagata, Akiko Fujiwara, Hideki Satsuma, Makoto Fujie, Shoji Usami, and Takashi Yamada. Genomic Characterization of Filamentous Integrative Bacteriophages,φRSS1 and φRSM1, That Infect Ralstonia solanacearum. J. Bacteriol, 189, 5792-5802 (2007)
【非特許文献３】Kawasaki, T., Satsuma, H, Fujie, M, Shoji, U., and Yamada, T.Monitoring of Phytopathogenic Ralstonia solanacearum cells using green fluorescent protein-expressing plasmid derived from bacteriophage φRSS1. J. Biosci. Bioeng., 104, 451-456 (2007)
【非特許文献４】堀田光生・土屋健一、微生物遺伝資源マニュアル（１２）−青枯病菌  Ralstonia solanacearum−、農業生物資源研究所（２００２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
特許文献３には、標識物質を発現し得る遺伝子を挿入したプラスミド（具体例としてはｐＲＳＳ１２）を作製する場合、プロモーター、オペレーター領域をともに組み込むことができると記載されている。このようなプロモーター、オペレーター領域としては、通常使用されている各種のもの、例えば、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターまたはｔａｃプロモーターなどが挙げられている。
【００１５】
しかし、例えば、前述したｐＲＳＳ１２によって形質転換した青枯病菌に感染した植物中の緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発光を観察する場合、同時に植物の葉緑体に由来する自家蛍光も観察される。そのため、植物体内の青枯病菌をより明瞭に標識化する必要があり、ＧＦＰによる蛍光強度を増強することが望まれる。
【００１６】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、青枯病菌を形質転換した際に例えばＧＦＰのような標識物質の発現を増強して例えばＧＦＰによる蛍光強度を増強できるプラスミド、該プラスミドで形質転換され菌中の標識物質濃度が増大した青枯病菌、該青枯病菌を用いた青枯病菌のモニタリング方法、青枯病菌に対する感受性または耐性の評価方法、および、青枯病菌に対して有効な被験物質のスクリーニング方法、さらには、植物に感染する病原菌を形質転換し得るプラスミドであって該病原菌に感染すると標識物質を産生する性質を有するもので形質転換した当該病原菌を用いた当該病原菌のモニタリング方法、当該病原菌に対する感受性または耐性の評価方法、ならびに、当該病原菌に対して有効な被験物質のスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の第１の態様に係るプラスミドは、青枯病菌に対して感染能を有するファージφＲＳＳ１のゲノムの複製モジュールを含むプラスミドであって、（ａ）ファージφＲＳＢ２に由来する配列番号２に記載のＭＣＰプロモーター領域の配列と同一の塩基配列および当該塩基配列と１または数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入またはこれらの組合せにより配列に変異が生じている塩基配列であってＭＣＰプロモーターと同等の作用を有する塩基配列から選ばれる塩基配列を有するプロモーター領域と、（ｂ）該プロモーター領域の下流に、標識物質をコードする遺伝子と、（ｃ）該標識物質をコードする遺伝子の下流に、ファージφＲＳＢ２に由来する配列番号３に記載のＭＣＰターミネーター領域の配列と同一の塩基配列および当該塩基配列と１または数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入またはこれらの組合せにより配列に変異が生じている塩基配列であってＭＣＰターミネーターと同等の作用を有する塩基配列から選ばれる塩基配列を有するターミネーター領域と、を含む発現カセットを有することを特徴とする。
【００１８】
上記第１の態様において、好ましくは、前記複製モジュールは、配列番号１に記載のファージφＲＳＳ１のゲノムの１〜１７２０番目、および、５８００乃至６１３５番目の何れかから６６６２番目の塩基配列と同一の塩基配列を、または、配列番号１に記載のファージφＲＳＳ１のゲノムの１〜１７２０番目および５８００乃至６１３５番目の何れかから６６６２番目の塩基配列に、１または数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入またはこれらの組合せにより配列に変異が生じている塩基配列であって、配列番号１に記載のファージφＲＳＳ１のゲノムの１〜１７２０番目および５８００乃至６１３５番目の何れかから６６６２番目の塩基配列と同等の作用を有する塩基配列を、含むことを特徴とする。
【００１９】
また、好ましくは、該プラスミドは、さらに、選択マーカーをコードする遺伝子を有することを特徴とする。
【００２０】
さらに、好ましくは、前記選択マーカーをコードする遺伝子は、カナマイシン耐性遺伝子であることを特徴とする。
【００２１】
好ましくは、前記複製モジュールは制限酵素により切断されるサイトを有し、前記発現カセットは該サイトに組み込まれていることを特徴とする。さらに好ましくは、前記制限酵素により切断されるサイトは、ＥｃｏＲＩサイトであることを特徴とする。
【００２２】
また、好ましくは、前記標識物質は、化学発光タンパク質または蛍光タンパク質であることを特徴とする。
【００２３】
さらに、好ましくは、前記標識物質は、蛍光タンパク質であることを特徴とする。
【００２４】
好ましくは、前記標識物質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）であることを特徴とする。
【００２５】
さらに、好ましくは、前記標識物質は、緑色蛍光タンパク質ｍｕｔ２（ＧＦＰｍｕｔ２）であることを特徴とする。
【００２６】
本発明の第２の態様に係る青枯病菌は、本発明の第１の態様に係るプラスミドによって形質転換されたことを特徴とする。
【００２７】
本発明の第３の態様に係る青枯病菌のモニタリング方法は、本発明の第２の態様に係る青枯病菌において発現した前記標識物質を観察することによって、青枯病菌の増殖、減少または挙動を観察することを特徴とする。
【００２８】
上記第３の態様において、好ましくは、本発明の第２の態様に係る青枯病菌を植物に感染させ、植物体内の青枯病菌において発現した前記標識物質を観察することによって、植物体内における青枯病菌の増殖、減少または挙動を観察することを特徴とする。
【００２９】
さらに、好ましくは、前記植物体内における青枯病菌の増殖、減少または挙動の観察は、青枯病菌を感染させた植物の横断切片における前記標識物質を観察することによって行うことを特徴とする。
【００３０】
また、好ましくは、前記植物体内における青枯病菌の増殖、減少または挙動の観察は、青枯病菌を感染させた植物を水平面に対して傾斜角度をつけた寒天培地表面に沿って根または／および茎が伸長するよう培養し、該寒天培地表面に培養した植物体内において産生された前記標識物質を観察することによって行うことを特徴とする。
【００３１】
さらに、好ましくは、前記傾斜角度は水平面に対して１５〜７５度であることを特徴とする。
【００３２】
好ましくは、前記標識物質の観察を経時的に行い、青枯病菌の増殖、減少または挙動をリアルタイムで観察することを特徴とする。
【００３３】
本発明の第４の態様に係る青枯病菌に対する評価方法は、本発明の第３の態様に係るモニタリング方法を用い、前記青枯病菌の増殖、減少または挙動を指標として、植物品種による青枯病菌に対する感受性、または、耐性を評価することを特徴とする。
【００３４】
本発明の第５の態様に係る青枯病菌に対して有効な被験物質のスクリーニング方法は、本発明の第２の態様に係る青枯病菌に感染、発病した植物に、被験物質を与え、本発明の第３の態様に係る青枯病菌のモニタリング方法を用いて観察することによって、青枯病菌に対して有効な被験物質をスクリーニングすることを特徴とする。
【００３５】
本発明の第６の態様に係るモニタリング方法は、植物に感染する病原菌に標識物質をコードする遺伝子を含む外来遺伝子を導入して標識物質を産生する性質を有するものとし、当該病原菌の植物体内における増殖、減少または挙動の観察を、当該病原菌を感染させた植物を水平面に対して傾斜角度をつけた寒天培地表面に沿って根または／および茎が伸長するよう培養し、該寒天培地表面に培養した植物体内において産生された前記標識物質を観察することによって行うことを特徴とする。
【００３６】
上記第６の態様において、好ましくは、前記傾斜角度は水平面に対して１５〜７５度であることを特徴とする。さらに、好ましくは、前記傾斜角度は水平面に対して略４５度であることを特徴とする。
【００３７】
また、好ましくは、前記標識物質の観察を経時的に行い、病原菌の増殖、減少または挙動をリアルタイムで観察することを特徴とする。
【００３８】
本発明の第７の態様に係る評価方法は、本発明の第６の態様に係るモニタリング方法を用い、前記病原菌の増殖、減少または挙動を指標として、植物品種による前記病原菌に対する感受性、または、耐性を評価することを特徴とする。
【００３９】
本発明の第８の態様に係るスクリーニング方法は、植物に感染する病原菌に標識物質をコードする遺伝子を含む外来遺伝子を導入して標識物質を産生する性質を有するものとし、当該病原菌に感染、発病した植物に、被験物質を与え、本発明の第６の態様に係るモニタリング方法を用いて観察することによって、当該病原菌に対して有効な被験物質をスクリーニングすることを特徴とする。
【発明の効果】
【００４０】
本発明の第１の態様に係るプラスミドは、標識物質をコードする遺伝子を特定のプロモーター領域とターミネーター領域とで挟んだ発現カセットを有しているため、青枯病菌を形質転換した際に標識物質の発現を増強することができる。本発明の第２の態様に係る青枯病菌によれば、標識物質の発現が増強した青枯病菌を得ることができる。しかも、当該青枯病菌中のプラスミドは、薬剤選択圧がない条件でも、長期間青枯病菌中に保持されるという性質を有するため、以下で言及するモニタリング等に使用するのにも好適である。本発明の第３の態様に係る青枯病菌のモニタリング方法によれば、青枯病菌の標識物質の発現が増強しているため、明瞭かつ簡便に青枯病菌の増殖または移動等をモニタリングすることができる。本発明の第４の態様に係る青枯病菌に対する評価方法によれば、青枯病菌の標識物質の発現が増強しているため、明瞭かつ簡便に植物品種における青枯病菌に対する感受性または耐性を評価することができる。本発明の第５の態様に係る青枯病菌に対して有効な被験物質のスクリーニング方法によれば、青枯病菌の標識物質の発現が増強しているため、青枯病菌に対して有効な被験物質を明瞭かつ簡便にスクリーニングすることができる。
【００４１】
また、本発明の第６の態様に係るモニタリング方法では、植物に感染する病原菌の増殖または移動等を極めて簡便に観察できる。本発明の第７の態様に係る評価方法では、該モニタリング方法を応用しているため、植物品種における病原菌に対する感受性または耐性の評価を極めて簡便に行える。本発明の第８の態様に係るスクリーニング方法においても、該モニタリング方法を応用しているため、病原菌に対して有効な被験物質を明瞭かつ簡便にスクリーニングすることができるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ｐＲＳＳ１２の構造を示す模式図である。
【図２】ｐＲＳＳ１Ｓの特定構造を示す模式図である。
【図３】ｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｕｖの構造を示す模式図である。
【図４】ｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２の構造を示す模式図である。
【図５】実施例２に係るｐＲＳＳ１２とｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｕｖとの蛍光強度の定量比較データである。
【図６】実施例３に係るｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｕｖとｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２との蛍光強度の定量比較データである。
【図７】参考例２に係るｐＲＳＳ１２を用いて形質転換した青枯病菌を感染させた茎の横断切片の蛍光実体顕微鏡による図面に代わる写真である。
【図８】参考例３に係るｐＲＳＳ１２を用いて形質転換した青枯病菌を感染させた茎の横断切片の蛍光実体顕微鏡による図面に代わる写真である。
【図９】実施例４に係るｐＲＳＳ１２を用いて形質転換した青枯病菌をトマトに感染させ寒天培地表面で培養した様子を示す図面に代わる写真である。
【図１０】実施例５に係るｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２を用いて形質転換した青枯病菌をトマトに感染させ、寒天培地表面で培養し、実体顕微鏡によって明視野で観察した様子を示す図面に代わる写真である。
【図１１】実施例５に係るｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２を用いて形質転換した青枯病菌をトマトに感染させ、寒天培地表面で培養し、蛍光実体顕微鏡によって観察した様子を示す図面に代わる写真である。
【図１２】実施例６に係るｐＲＳＳ１２を用いて形質転換した青枯病菌をトマトに感染させた様子を示す蛍光実体顕微鏡による図面に代わる写真である。
【図１３】実施例６に係るトマト品種別による青枯病菌の侵入割合を示す図である。
【図１４】実施の形態１に係るプラスミドにおいて、選択マーカーをコードする遺伝子を有するプラスミドの一般構造を示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
まず、本発明者らは、標識物質をコードする遺伝子を導入する前の基本となるプラスミドの一種であるプラスミドｐＲＳＳ１Ｓ（以下、ｐＲＳＳ１Ｓ）を構築した。図２は、ｐＲＳＳ１Ｓの特定構造を示す模式図である。上段の図は、ファージφＲＳＳ１のゲノムＤＮＡの構造を示す。下段の図は、ｐＲＳＳ１Ｓの構造を示す。ｐＲＳＳ１Ｓは、ｐＲＳＳ１２と同じくファージφＲＳＳ１に由来する。ｐＲＳＳ１Ｓには、ｐＲＳＳ１２と同様に、ファージφＲＳＳ１のＤＮＡから構造モジュールとアセンブリーおよび分泌モジュールとを除くことで構築された複製モジュールを有している。しかし、ｐＲＳＳ１２とは異なり、ｐＲＳＳ１Ｓの有する複製モジュールは、ファージφＲＳＳ１のゲノムＤＮＡの配列の１〜１７２０番目の塩基配列および５８００〜６６６２番目の塩基配列からなる。
【００４４】
なお、複製モジュールは、配列番号１に記載のファージφＲＳＳ１のゲノムの１〜１７２０番目、および、５８００乃至６１３５番目の何れかから６６６２番目の塩基配列と同一の塩基配列を、または、配列番号１に記載のファージφＲＳＳ１のゲノムの１〜１７２０番目および５８００乃至６１３５番目の何れかから６６６２番目の塩基配列に、１または数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入またはこれらの組合せにより配列に変異が生じている塩基配列であって、配列番号１に記載のファージφＲＳＳ１のゲノムの１〜１７２０番目および５８００乃至６１３５番目の何れかから６６６２番目の塩基配列と同等の作用を有する塩基配列を、含むものであればよい。
【００４５】
なお、このゲノムＤＮＡの目的領域をＰＣＲ法により増幅する際に一方のプライマーに特定の制限酵素により切断される配列（特定制限酵素切断サイト）を付加することにより、増幅されたＤＮＡ断片に特定制限酵素切断サイトを付加することが望ましい。ｐＲＳＳ１Ｓには、増幅された約２．６ｋｂｐの断片に特定制限酵素切断サイトとしてＥｃｏＲＩサイトが付加されている。なお、このような目的で使用される特定制限酵素切断サイトとしては、ＥｃｏＲＩサイト以外にも、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩまたはＮｏｔＩ等の制限酵素に対応するサイトがある。
【００４６】
この増幅産物に、選択マーカーをコードする遺伝子（選択マーカーカセット）を連結することによって本発明のプラスミドの好ましい形態の基本となるものが構築される。ｐＲＳＳ１Ｓでは、カナマイシン耐性カセット（Km cassette）を連結することによって、約４．０ｋｂｐのｐＲＳＳ１Ｓが構築されている。
【００４７】
次に、本発明者らは、青枯病菌中において、例えばＧＦＰ遺伝子等の標識物質をコードする遺伝子をより強く発現させるために、新規プロモーターの検索を行った。青枯病菌に感染する多数のバクテリオファージにおいて、その遺伝子を発現させるプロモーターを検討し、恒常的に高発現するものを検索した。特に、バクテリオファージφＲＳＢ２（以下、ファージφＲＳＢ２）のプロモーターについて検索を行った。ファージφＲＳＢ２は、発明者らが広島県で青枯病菌を宿主として単離した新規なバクテリオファージである。ファージφＲＳＢ２は、本発明者らが単離したすでに公知のファージであるファージφＲＳＢ１に類似性のあるバクテリオファージであることを確認している。
【００４８】
ファージφＲＳＢ２のＭＣＰ（major coat protein）、プライメース、ＤＮＡポリメラーゼまたはテールタンパク質のそれぞれの遺伝子のプロモーターについて検討したところ、ファージφＲＳＢ２のＭＣＰ遺伝子のプロモーター領域の塩基配列を利用すると標的遺伝子発現を増強できることを見出した。さらに、標的遺伝子の下流にＭＣＰ遺伝子のターミネーター領域の塩基配列を付加すると、発現量がさらに増強されることを見出した。なお、ファージφＲＳＢ２のＭＣＰのプロモーター領域の塩基配列は配列番号２に記載の塩基配列からなり、ファージφＲＳＢ２のＭＣＰのターミネーター領域の塩基配列は配列番号３に記載の塩基配列からなる。
【００４９】
ファージφＲＳＢ２のＭＣＰ遺伝子のプロモーター領域とターミネーター領域を用い、先ずはＧＦＰ遺伝子を発現させるカセットを構築した。ＧＦＰ遺伝子としてはＧＦＰｕｖ（特許文献３に係る実施例において使用している遺伝子）またはＧＦＰｍｕｔ２を使用した。図３は、プラスミドｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｕｖ（以下、ｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｕｖ）の構造の模式図である。ｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｕｖは、図２に示すｐＲＳＳ１ＳのＥｃｏＲＩサイトの位置に、ＭＣＰ遺伝子のプロモーター領域、ＧＦＰｕｖ遺伝子およびＭＣＰ遺伝子のターミネーター領域からなる発現カセットを挿入して構築している。
【００５０】
図４は、プラスミドｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２（以下、ｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２）の構造の模式図である。ｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２は、図２に示すｐＲＳＳ１ＳのＥｃｏＲＩサイトの位置に、ＭＣＰ遺伝子のプロモーター領域、ＧＦＰｍｕｔ２遺伝子およびＭＣＰ遺伝子のターミネーター領域からなる発現カセットを挿入して構築している。なお、ＧＦＰｍｕｔ２の詳細については、FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP), Brendan P. Cormack, Raphael H. Valdivia and Stanley Falkow, Gene, 173 (1996) 33-38 を参照されたい。
【００５１】
本発明者らは、本発明のプラスミド、例えばｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｕｖ、ｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２等を用いて青枯病菌を形質転換することによって、青枯病菌でＧＦＰｕｖまたはＧＦＰｍｕｔ２を発現させ、それぞれの蛍光強度を比較する実験を行った。その結果、ファージφＲＳＢ２のＭＣＰプロモーター領域およびＭＣＰターミネーター領域を用いることで、蛍光強度の増強に有効であることが確認できた。また、通常、蛍光実体顕微鏡で行う観察では青色光で励起する場合が多い。そこで、ｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｕｖおよびｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２による蛍光強度の結果を比較すると、青色光励起による観察では蛍光標識にＧＦＰｕｖよりもＧＦＰｍｕｔ２を用いた方が蛍光強度の増強に有効であることがわかった。
【００５２】
また、本発明者らは、本発明のプラスミドである、ｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｕｖ、ｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２等を用いた具体的な青枯病菌のモニタリング方法を開発した。前述したとおり、これらのプラスミドを用いて青枯病菌を形質転換させると、発現したＧＦＰｕｖまたはＧＦＰｍｕｔ２によって青枯病菌を蛍光標識化することができる。そこで、例えばトマト等の青枯病菌に感染する植物にこれらのプラスミドによって形質転換した青枯病菌を接種することによって、植物中における青枯病菌のモニタリングを行えることがわかった。具体的には、本発明者らは２つの手法を用いて青枯病菌のモニタリング実験を行った。
【００５３】
第一の具体的手法では、蛍光標識化された青枯病菌を土壌中で栽培した植物（トマト）に接種し、一定時間後に該植物の接種箇所から種種の距離離れた位置における切片を作製した。その作製した切片を蛍光実体顕微鏡で観察した。この観察結果からは、植物内での青枯病菌の上方または下方への移動、および、維管束内での移動について観察することができた。
【００５４】
このような土壌中で栽培した植物の切片を観察することによる青枯病菌のモニタリング手法を用い、経時的にモニタリングする場合に、土壌中で栽培した植物を定期的に堀り出し、その茎を切断し、断面を観察し、その後植え直すという方法も考えられる。しかし、このような方法では、切断および植え直しによる植物への影響が大きく、自然の環境下における青枯病菌のモニタリングとは言い難い。そこで、ある植物に対する青枯病菌の病原性の検定を行う場合、従来の方法では、まず検定する植物を複数株１ヶ月程度土壌で栽培する。その後、これらの茎または根に検定菌を接種し、栽培を継続する。最後に、これらの株での病徴（葉や茎の変色・萎凋など）の出現を指数化し統計処理する。このため、観察・判定のために、さらに２〜４週間程度の日数が必要となる。（堀田光生・土屋健一、微生物遺伝資源マニュアル（１２）−青枯病菌  Ralstonia solanacearum−、農業生物資源研究所（２００２）参照）。このように、土壌中で栽培した植物について青枯病菌のモニタリングを行う場合には、１ヶ月以上の期間が必要となる。
【００５５】
そこで、本発明者らは、第二の具体的手法として、さらに利便性の高い青枯病菌のモニタリング方法について開発した。このモニタリング方法では、対象となる植物を、水平面に対して１５〜７５度、好ましくは３０〜６０度、より好ましくは４０〜５０度、さらに好ましくは略４５度に傾斜させた寒天培地表面に播種し、この傾斜に沿って伸長するように栽培する。その後、播種後７日程度で対象となる植物に本発明のプラスミドで形質転換した青枯病菌を接種する。すると、茎の切片等を作製しなくとも、栽培状態を維持したまま蛍光実体顕微鏡で植物体内の青枯病菌感染部位を観察することができる。このため、青枯病菌の植物体内における経時的なモニタリングをより簡便に、栽培早期から、観察する植物への影響を抑えて行うことができる。
【００５６】
また、本発明者らは、ｐＲＳＳ１２またはｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２を用いて形質転換を行った青枯病菌を使用してこのモニタリングを行ったが、何れを用いた場合であってもモニタリングが可能であることを確認した。中でもｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２を用いた方がより強い蛍光強度を得ることができた。
【００５７】
この結果から、この第２の具体的モニタリング手法と、青枯病菌以外の例えばFusarium oxysporum等のFusarium属のカビ類、いもち病菌（Magnaporthe grisea）または土壌病原細菌（Erwinia carotovora）等の植物に感染する病原菌に、標識物質をコードする遺伝子を含む外来遺伝子を導入して標識物質を産生する性質を有するようにしたものを組み合わせても、当該病原菌の増殖または移動等を極めて簡便に観察できることが判明した。このような効果を有するため、このモニタリング手法を応用すれば、植物品種における特定病原菌に対する感受性または耐性の評価や特定病原菌に対して有効な被験物質を明瞭かつ簡便にスクリーニングすることができるようになることも判った。
【００５８】
すなわち、本発明者らは、このモニタリング方法を利用した青枯病菌に対する感受性または耐性の評価方法について研究した。まず、ｐＲＳＳ１２によって形質転換した青枯病菌を、青枯病菌に対する感受性・耐性が既知の種種のトマト品種に寒天培地表面で接種した。その結果、その品種の青枯病菌に対する感受性または耐性に応じて、青枯病菌の侵入の様子が異なることがわかった。詳細は、実施例に示すが、特に側根への青枯病菌の侵入の割合が、感受性または耐性のいずれかによって大きく異なることがわかったので、上述のような結論となったのである。
【００５９】
以下、本発明の実施の形態に係るプラスミド、青枯病菌、青枯病菌のモニタリング方法、青枯病菌に対する感受性等の評価方法、および、青枯病菌に対して有効な被験物質のスクリーニング方法等について詳細に説明する。なお、本明細書において「含む」（または「有する」）という用語は、「からなる」すなわち「から構成される」という意味も含む。また、本明細書において「接種」と「感染」とは同様の意味を表す。
【００６０】
（プラスミド）
本発明の実施の形態１は、標識物質をコードする遺伝子の発現カセットを有するプラスミドに関する。すなわち、本実施の形態１に係るプラスミドは、青枯病菌に対して感染能を有するファージφＲＳＳ１のゲノムの複製モジュールを含むプラスミドであって、ファージφＲＳＢ２に由来するＭＣＰプロモーター領域と、該プロモーター領域の下流に標識物質をコードする遺伝子と、該標識物質をコードする遺伝子の下流にファージφＲＳＢ２に由来するＭＣＰターミネーター領域と、を含む発現カセットを有する。具体例としては、図３または図４に示すようなｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｕｖまたはｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２が挙げられる。
【００６１】
用語「複製モジュール」の意味については前述した通りである。また、「ファージφＲＳＳ１のゲノムの複製モジュール」としては、好ましくは、配列表の配列番号１に記載された塩基配列の１〜１７２０番目の配列、および、５８００乃至６１３５番目の何れかから６６６２番目の配列（好ましくは５８００〜６６６２番目の配列）をいう。しかし、該塩基配列と同一の塩基配列だけでなく、該塩基配列に１または数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入またはこれらの組合せにより配列に変異が生じている塩基配列からなるものでも構わない。すなわち、上述の塩基配列と同等の作用を有するもの、具体的には青枯病菌に対する親和性を保持することができる範囲において当業者が適宜配列を変更することができる。
【００６２】
このような変異が生じた配列における相同性としては、６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性が挙げられる。相同性の範囲のより具体的な例示としては、６０％〜９９％、６５％〜９９％、７０％〜９９％、７５％〜９９％、８０％〜９９％、８５％〜９９％、９０％〜９９％、また、６０％〜９５％、６５％〜９５％、７０％〜９５％、７５％〜９５％、８０％〜９５％、８５％〜９５％、９０％〜９５％などが挙げられる。
【００６３】
なお、この相同性については、以下で述べる塩基配列において変異が生じた配列における相同性についても同様に適用される。
【００６４】
また、本実施の形態１に係るプラスミドにおいて、「ファージφＲＳＢ２に由来するＭＣＰプロモーター領域」とは、好ましくは、配列番号２に記載と同一の塩基配列を有するプロモーター配列をいう。しかし、該塩基配列と同一の塩基配列だけでなく、該塩基配列に１または数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入またはこれらの組合せにより配列に変異が生じている塩基配列からなるプロモーター領域でも構わない。すなわち、標識物質をコードする遺伝子の発現を増強させるプロモーター領域として機能する範囲において当業者が適宜配列を変更することができる。また、該プロモーター領域の配列には、リボソーム結合配列（ＳＤ配列あるいはＳＤ配列と考えられる配列）も含まれる。
【００６５】
また、「ファージφＲＳＢ２に由来するＭＣＰターミネーター領域」についても同様であり、好ましくは、配列番号３に記載と同一の塩基配列を有するターミネーター配列をいう。しかし、該塩基配列と同一の塩基配列だけでなく、該塩基配列に１または数個の塩基が欠失、置換、付加もしくは挿入またはこれらの組合せにより配列に変異が生じている塩基配列からなるターミネーター領域でも構わない。すなわち、標識物質をコードする遺伝子の発現を増強させるターミネーター領域として機能する範囲において当業者が適宜配列を変更することができる。
【００６６】
本実施の形態１に係る「プラスミド」とは、宿主染色体とは物理的に独立して自律複製し、安定に遺伝することのできる染色体外遺伝因子であるという、一般的な意味で使用されるものである。また、前述したように、本実施の形態１に係るプラスミドは、ファージφＲＳＳ１のゲノムの複製モジュールおよび標識物質をコードする遺伝子等を含む発現カセットを有するものである。すなわち、ファージφＲＳＳ１のゲノムの複製モジュールおよび該発現カセットのみからなっていてもよいし、公知の各種のプラスミド、例えば、大腸菌由来のｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１９などのプラスミドの中に組み込まれたものも包含している。
【００６７】
さらに、前述したように、本実施の形態１に係るプラスミドは、標識物質をコードする遺伝子を有するため、該標識物質に係る遺伝子を宿主細胞（青枯病菌）に導入することができる。「標識物質をコードする遺伝子」としては、標識として機能できるものであれば特に制限はないが、ルシフェラーゼ遺伝子または緑色蛍光タンパク質（以下、ＧＦＰ）をコードする遺伝子等のような化学発光タンパク質、または／および、蛍光タンパク質をコードする遺伝子が好ましい。一般的な遺伝子としては、ＧＦＰをコードする遺伝子が挙げられる。さらに、ＧＦＰの場合、ＧＦＰｍｕｔ２が最も好ましい。
【００６８】
また、本実施の形態１に係るプラスミドにおいて、「ファージφＲＳＳ１のゲノムの複製モジュール」および「標識物質をコードする遺伝子等を含む発現カセット」の他に、各種の「選択マーカーをコードする遺伝子」などを含有させることもできる。「選択マーカーをコードする遺伝子」としては、通常使用されるものを常法により用いることができる。例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、ネオマイシンまたはカナマイシン等の抗生物質耐性遺伝子等が例示される。なお、図１４に、このような構造を有する本実施の形態１に係るプラスミドにおける一般構造の模式図を示す。図１４中に於いて、Ｘは標識物質Ｘを意味する。
【００６９】
なお、本実施の形態１に係るプラスミドにおいて、「発現カセット」は、ＭＣＰプロモーター領域およびＭＣＰターミネーター領域のいずれをも有する。しかし、本実施の形態１に係るプラスミドの他の形態として、ＭＣＰプロモーター領域のみを有しても構わない。また、「発現カセット」は、好ましくは、図３または図４に示すように、前述した配列番号１に記載の塩基配列の１〜１７２０番目の配列および５８００乃至６１３５番目の何れかから６６６２番目の配列（好ましくは５８００〜６６６２番目の配列）からなる「ファージφＲＳＳ１のゲノムの複製モジュール」と「選択マーカーをコードする遺伝子」とを有するｐＲＳＳ１ＳのＥｃｏＲＩサイトの位置に挿入される。図３または図４に示す、本実施の形態１に係るプラスミドの具体例では、「選択マーカーをコードする遺伝子」をカナマイシン耐性遺伝子（Km cassette）、「発現カセット」中の「標識物質をコードする遺伝子」を緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子（ＧＦＰｕｖまたはＧＦＰｍｕｔ２）として記載している。
【００７０】
このように、本実施の形態１に係るプラスミドでは、「ファージφＲＳＢ２に由来するＭＣＰプロモーター領域」および「ファージφＲＳＢ２に由来するＭＣＰターミネーター領域」が挿入されている。前述したように、該ＭＣＰプロモーター領域を目的遺伝子（「標識物質をコードする遺伝子」）の上流（好ましくは該ＭＣＰプロモーター領域および該ＭＣＰターミネーター領域を、該ＭＣＰプロモーター領域については目的遺伝子の上流および該ＭＣＰターミネーター領域については目的遺伝子の下流）に挿入すると、その遺伝子発現を増強することができる。そのため、本実施の形態１に係るプラスミドを青枯病菌に導入し、形質転換すると、「標識物質をコードする遺伝子」の発現を増強することができ、青枯病菌をより明瞭に標識化することができる。
【００７１】
さらに、本実施の形態１に係るプラスミドは、ファージφＲＳＳ１のゲノムの複製モジュールを含むため、青枯病菌に容易に取り込まれる。また、薬剤選択がない条件でも青枯病菌は該プラスミドを安定に複製・保持することが可能である（本実施の形態に係るプラスミドの青枯病菌内での安定性については特許文献３参照）。該プラスミドが不要となった場合には、青枯病菌のゲノム情報を変化させることなく除去することも可能である。
【００７２】
なお、「複製モジュール」、「ファージφＲＳＢ２に由来するＭＣＰプロモーター領域」、「ファージφＲＳＢ２に由来するＭＣＰターミネーター領域」、「標識物質をコードする遺伝子」および「選択マーカーをコードする遺伝子」に係るＤＮＡ断片については、後述する実施例に示すような、当業者にとって公知であり一般的なＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）技術等を用いて調製することができる。「標識物質をコードする遺伝子」の挿入、「選択マーカーをコードする遺伝子」の挿入、「ファージφＲＳＢ２に由来するＭＣＰプロモーター領域」の挿入、または、「ファージφＲＳＢ２に由来するＭＣＰターミネーター領域」の挿入等についても、標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて行うことができる（Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York参照）。例えば、制限酵素およびＤＮＡリガーゼを用いた周知の方法で行うことができる。
【００７３】
「ファージφＲＳＢ２に由来するＭＣＰプロモーター領域」および「ファージφＲＳＢ２に由来するＭＣＰターミネーター領域」に係るＤＮＡ断片についてはそれぞれ、配列番号２および配列番号３に記載の塩基配列を有するＤＮＡを、当業者にとって公知の方法により合成して得ることができる。例えば、ニッポンジーン株式会社等に外注して所望の塩基配列を有するＤＮＡを合成することも可能である。このように合成されたＭＣＰプロモーター領域とおよびＭＣＰターミネーター領域とを、標識物質をコードする遺伝子とライゲートすることによって、目的の発現カセットを得ることができる。また、ＭＣＰプロモーター領域の塩基配列を含む、標識物質をコードする遺伝子を増幅するためのプライマー（フォワード）と、ＭＣＰターミネーター領域の塩基配列を含む、標識物質をコードする遺伝子を増幅するためのプライマー（リバース）を用いて、標識物質をコードする遺伝子の塩基配列を含むＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ法によりＤＮＡ断片を増幅することによっても目的の発現カセットを取得することができる。
【００７４】
（青枯病菌）
本発明の実施の形態２は、実施の形態１に係るプラスミドによって形質転換された青枯病菌に関する。
【００７５】
実施の形態１に係るプラスミドを青枯病菌に導入する方法としては、従来公知の方法を用いて行うことができる。例えばエレクトロポーレイション法によって形質転換することができる。実施の形態１に係るプラスミドは、青枯病菌に対して極めて親和性が強く、比較的簡単に青枯病菌中に導入することができる。
【００７６】
プラスミドが導入された青枯病菌は、選択マーカーなどにより、通常の方法により選択することができる。選択培地としては、青枯病菌を培養する栄養培地を用いることができる。選択された形質転換細胞（形質転換された青枯病菌）を栄養培地で培養することにより、導入した遺伝子を当該形質転換細胞の中で発現させることができる。栄養培地は、青枯病菌（形質転換体）の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。
【００７７】
炭素源としては、例えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。本実施の形態２に係る形質転換された青枯病菌の好ましい栄養培地としては、ＣＰＧ培地が挙げられる。
【００７８】
本実施の形態２に係る青枯病菌によれば、実施の形態１に係るプラスミドによって形質転換されており、標識物質による発光または蛍光強度等が増強した青枯病菌を得ることができる。しかも、当該青枯病菌中のプラスミドは、薬剤選択圧がない条件でも、長期間青枯病菌中に保持されるという性質を有するため、以下で言及する青枯病菌のモニタリング等に使用するのにも好適である。
【００７９】
（青枯病菌のモニタリング方法）
本発明の実施の形態３は、青枯病菌のモニタリング方法に関する。なお、本明細書において、「青枯病菌のモニタリング」とは、標識物質を観察することによって、青枯病菌の増殖、減少または挙動を観察することをいう。青枯病菌の増殖または減少の観察とは、土壌または植物体内等における青枯病菌の増殖または減少等の量を測定することも含む。なお、青枯病菌の挙動の観察には、土壌または植物体内等における青枯病菌の移動の様子の観察だけでなく、土壌または植物体内等における青枯病菌の所在の観察、すなわち青枯病菌の検出という意味も含む。
【００８０】
本実施の形態３に係る青枯病菌のモニタリング方法は、実施の形態２に係る青枯病菌を、該青枯病菌において発現した標識物質によって、青枯病菌の増殖、減少または挙動を観察することによる。青枯病菌の増殖、減少または挙動の観察とは、土壌中、植物体中または栄養培地上等の様々な場所・条件下において青枯病菌を観察することをいう。
【００８１】
実施の形態２に係る青枯病菌は、標識物質による発光または蛍光強度等が増強しているため、該標識物質を明瞭かつ簡便に観察することができる。これにより、青枯病菌をモニタリングすることができる。前述したように、標識物質には、標識として機能できるものであれば特に制限はないが、例えば、ルシフェラーゼ遺伝子または緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子などの化学発光タンパク質、または／および、蛍光タンパク質をコードする遺伝子が好ましい。例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）であり、好ましくはＧＦＰｍｕｔ２である。
【００８２】
標識物質の観察には、それぞれの標識物質を観察する際に適した従来公知の方法を用いて観察することができる。観察器具としては、例えば、実体顕微鏡、光学顕微鏡、暗視野顕微鏡、蛍光顕微鏡、電子顕微鏡または蛍光実体顕微鏡を用いて観察することができる。すなわち、標識物質によって標識化された青枯病菌を可視化できる手段なら何でもよい。標識物質に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を用いた場合には、好ましくは、蛍光実体顕微鏡を用いて観察することができる。本明細書において、用語「観察」を用いる場合に関しても、標識物質を観察する際に適した観察器具を用いる場合も含むものとする。
【００８３】
本実施の形態３に係る青枯病菌のモニタリング方法においては、好ましくは、実施の形態２に係る青枯病菌を植物に感染させ、植物体内の青枯病菌において発現した標識物質を観察することによって、植物体内における青枯病菌の増殖、減少または挙動の観察をする。
【００８４】
青枯病菌を植物に感染させる場合には、従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、青枯病菌培養液を塗布した針で、植物の茎または根を穿孔して行うことができる。または、例えば、植物が定植している土壌中に青枯病菌培養液をまくことでも行うことができる。この場合、感染させた植物中における青枯病菌の増殖、減少または挙動等を観察する。さらに、実施例で述べるが、本発明者らが新たに開発した、植物の芽生えの根端を切断し形質転換した青枯病菌の培養液をかけるという感染方法でも構わない。（堀田光生・土屋健一、微生物遺伝資源マニュアル（１２）−青枯病菌  Ralstonia solanacearum−、農業生物資源研究所（２００２）等参照）。
【００８５】
植物に感染させた場合、例えば、標識物質の観察は、該植物の横断切片における標識物質の観察によって行う。ここで、「植物の横断切片」とは、植物の根、葉または茎等を剃刀等の切断手段により切断し、該植物の維管束等の、青枯病菌が通る経路の様子が観察できる切片をいう。
【００８６】
または、好ましくは、植物体内における青枯病菌の増殖、減少または挙動の観察は、青枯病菌を感染させた植物を水平面に対して傾斜角度を付けた寒天培地表面に沿って伸長するよう培養し、該寒天培地表面に培養した植物中の標識物質の観察によって行う。以下、このような傾斜寒天培地について詳細に説明する。
【００８７】
寒天培地の成分としては、植物を栽培させるために従来公知の成分を含めばよい。例えば、実施例に詳細に示すようなアガーと、ハイポネックスパウダー（http://vegetea.naro.affrc.go.jp/kinou/shukakugoseiri/page021.html）や植物培養用の例えば Murashige & Skoog (ＭＳ)培地、Ｂ５培地、Ｎ６培地、ＡＡ培地等の自体公知の培地（「生物化学実験法  41、植物細胞工学入門、駒嶺  穆・野村港二  編著、学会出版センター」p17-39参照）の組成に準じた各種必要成分を含むもの等とからなる寒天培地が挙げられる。この寒天培地におけるアガー等の寒天成分の含有量は１〜２ｗ／ｖ％、好ましくは１．３〜１．７ｗ／ｖ％、より好ましくは略１．５ｗ／ｖ％程度である。寒天培地表面の傾斜角度は、植物が寒天培地表面に沿って根または／および茎が伸長するように生育できる角度であれば特に限定されないが、好ましくは水平面に対して１５〜７５度、より好ましくは３０〜６０度、さらに好ましくは４０〜５０度、よりさらに好ましくは略４５度程度である。すなわち、植物の根または／および茎が寒天培地表面に沿って伸長するように生育し、その植物中の標識物質を、該植物を掘り出さずに、直接蛍光実体顕微鏡等により観察できる傾斜角度を意味する。この際、傾斜角度については、寒天培地が水平に形成されたシャーレを傾斜面に置き栽培する場合でも、シャーレ内の寒天培地自体に傾斜をつけ水平面に置き栽培する場合でも構わない。
【００８８】
さらに、好ましくは、標識物質の観察を経時的に行い、青枯病菌の増殖、減少または挙動をリアルタイムで観察する。「経時的にリアルタイムで観察する」とは、一定時間が経過する毎に青枯病菌の増殖、減少または挙動について観察を行うことをいう。
【００８９】
本実施の形態３に係る青枯病菌のモニタリング方法のうち、傾斜寒天培地を用いる方法によれば、標識物質によって標識化された青枯病菌の増殖、減少または挙動をより簡便に観察することができる。例えば、この標識化された青枯病菌を植物体内に取り込ませることによって、植物体内における青枯病菌の所在を例えば直接蛍光実体顕微鏡等により観察でき、青枯病についての研究、例えば青枯病に対する薬剤の研究に利用することができる。さらに、標識化された青枯病菌の観察をリアルタイムで行うことによって、植物体内での青枯病菌の感染機構が解明できる。
【００９０】
本実施の形態３に係る青枯病菌のモニタリング方法によると、植物体内における観察以外でも、標識物質によって標識化された青枯病菌を土壌中に散布することによって、土壌中における青枯病菌の所在、量、さらには増殖の様子をも観察することができる。この観察結果は、土壌から植物への青枯病菌の感染機構の研究に利用することができる。また、青枯病菌を感染させた植物を傾斜寒天培地において培養する方法では、実験室レベルでの青枯病菌の研究に適しており、土壌において栽培した植物に青枯病菌を接種しモニタリングする場合と比較すると、短期間で実験（モニタリング）を行うことができる。さらに、実施の形態２に係る青枯病菌を使用しており、標識物質による発光強度が増強しているため、明瞭かつ簡便に青枯病菌のモニタリングを行うことができる。
【００９１】
（青枯病菌に対する評価方法）
本発明の実施の形態４は、青枯病菌に対する評価方法に関する。本実施の形態４に係る青枯病菌に対する評価方法は、実施の形態３に係るモニタリング方法を用い、青枯病菌の増殖、減少または挙動を指標として、植物品種による青枯病菌に対する感受性、または、耐性を評価する。好ましくは、上述したごとく、指標とする植物体内における青枯病菌に対する増殖、減少または移動の観察は、青枯病菌を感染させた植物を水平面に対して傾斜角度を付けた寒天培地表面に沿って伸長するよう培養し、該寒天培地表面に培養した植物中の標識物質の観察によって行うことが好ましい。
【００９２】
実施例に詳細に示すが、青枯病菌に対して感受性または耐性を有する植物品種では、青枯病菌を感染させた場合の増殖または移動が大きく異なることがわかった。特に、感受性を有する品種では主根から側根へ青枯病菌が短期間で侵入するが、耐性を有する品種では側根へ短期間で侵入することはなかった。さらに、感受性を有する品種では葉脈を含む植物全体において侵入し、品種によっては側根の根端から青枯病菌由来の緑色蛍光の漏出が観察されることもわかった。そこで、本実施の形態４に係る青枯病菌に対する評価方法では、青枯病菌の増殖、減少または移動を指標とし、実施の形態３に係るモニタリング方法を用いることで、植物が青枯病菌に対して感受性を有するのか、耐性を有するのかを評価する。
【００９３】
例えば、実施例に示すポンデローザや大型福寿の実験結果のように、側根への侵入が多く観察される場合には、青枯病菌に対して感受性を有するということができる。一方、Ｂ−バリアーの実験結果のように、側根への侵入があまり観察されないのであれば、青枯病菌に対して耐性を有するということができる。そこで、好ましくは、本実施の形態４に係る評価方法において、指標となる青枯病菌の増殖、減少または挙動とは、実施の形態２に係る青枯病菌の植物の側根への侵入（割合）をいい、これにより青枯病菌に対する感受性または耐性の評価を行う。
【００９４】
本実施の形態４に係る青枯病菌に対する評価方法によれば、各植物品種が青枯病菌に対して感受性であるか耐性であるかを判断することができる。そのため、青枯病菌に対して耐性のある植物品種の開発に利用することができ、青枯病に対する被害の減少にもつなげることができる。また、実施の形態２に係る青枯病菌を使用しており、標識物質による発光または蛍光強度等が増強するため、明瞭かつ簡便に青枯病菌に対する感受性または耐性の評価を行うことができる。
【００９５】
（青枯病菌に対して有効な被験物質のスクリーニング方法）
本発明の実施の形態５は、青枯病菌に対して有効な被験物質のスクリーニング方法に関する。本実施の形態５に係る青枯病菌に対して有効な被験物質のスクリーニング方法は、実施の形態２に係る青枯病菌に感染、発病した植物に、被験物質を与え、実施の形態３に係る青枯病菌のモニタリング方法を用いて観察することにより、青枯病菌に対して有効な被験物質をスクリーニングする。好ましくは、実施の形態３に係る青枯病菌のモニタリング方法では、傾斜寒天培地を用いたモニタリング方法を用いる。
【００９６】
与える「被験物質」は、様々な分子サイズの有機化合物（核酸、ペプチド、タンパク質、脂質（単純脂質または複合脂質（ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、グリコシルグリセリドまたはセレブロシド等）、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペンまたはステロイド等））、もしくは、無機化合物を用いることができる。「被験物質」は、天然物由来であっても合成によるものであってもよい。後者の場合には、例えば、コンビナトリアル合成の手法を利用して効率的なスクリーニング系を構築することができる。なお、細胞抽出液または培養上清等を被験物質として用いてもよい。
【００９７】
「青枯病菌に対して有効な被験物質」とは、例えば、実施の形態４に係る青枯病菌に対する評価方法において青枯病菌に対して感受性を有すると判断した植物品種の場合、その「被験物質」によって、その植物品種の体内（側根や葉脈）への青枯病菌の広がりを抑制することができる物質のことをいう。また、青枯病菌に対して耐性を有すると判断した植物品種であっても、さらに植物体内への枯病菌の広がりを抑制することができる物質ならば該当する。
【００９８】
土壌に植えられた植物に対してこの「被験物質」の有効性を確かめる場合には、例えば、該植物周辺の土壌に「被験物質」を混ぜることによって確かめることができる。また、前述したような、寒天培地表面の植物に対してこの「被験物質」の有効性を確かめる場合には、例えば、寒天培地の成分中に「被験物質」を含ませることによって確かめることができる。
【００９９】
本実施の形態５に係る青枯病菌に対して有効な被験物質のスクリーニング方法によれば、青枯病（菌）に対して有効な被験物質を発見することができる。この発見された被験物質を利用することで、青枯病の被害の減少につなげることができる。また、実施の形態２に係る青枯病菌を使用しており、標識物質による発光、または／および、蛍光強度が増強するため、明瞭かつ簡便に青枯病菌に対して有効な被験物質のスクリーニングを行うことができる。
【０１００】
（モニタリング方法、評価方法およびスクリーニング方法）
本発明の実施の形態６は、傾斜寒天培地を使用したモニタリング方法、評価方法およびスクリーニング方法に関する。
【０１０１】
本発明の実施の形態６に係るモニタリング方法は、植物に感染する病原菌に標識物質をコードする遺伝子を含む外来遺伝子を導入して標識物質を産生する性質を有するものとし、当該病原菌の植物体内における増殖、減少または挙動の観察を、当該病原菌を感染させた植物を水平面に対して傾斜角度をつけた寒天培地表面に沿って根または／および茎が伸長するよう培養し、該寒天培地表面に培養した植物体内において産生された前記標識物質を観察することによって行うことを特徴とする。
【０１０２】
さらにこのモニタリング方法の応用として、植物品種による病原菌に対する感受性、または、耐性を評価する評価方法、さらには病原菌に対して有効な被験物質をスクリーニングする方法がある。
【０１０３】
これら本発明の実施の形態６にかかるモニタリング方法ならびにこれを応用した評価方法およびスクリーニング方法の好ましい実施形態は、使用する病原菌が、本発明の形質転換された青枯病菌を含む「植物に感染する病原菌に標識物質をコードする遺伝子を含む外来遺伝子を導入して標識物質を産生する性質を有するものとした当該病原菌」であることを除いて、上述した青枯病菌に係るモニタリング方法ならびにこれを応用した評価方法およびスクリーニング方法の好ましい実施の形態と実質同一である。
【０１０４】
ここで、病原菌に導入する「標識物質をコードする遺伝子を含む外来遺伝子」としては、簡便に病原菌に導入し得、かつ導入された病原菌内で標識物質を産生する作用を発揮し得るものであれば特に限定されず、そのような外来遺伝子の調製方法や病原菌への導入方法もこの分野で一般に用いられる方法が特に限定されることなく使用し得る。好ましい一例を示せば、本発明のプラスミドのように、病原菌に対応した、バクテリオファージ由来の「複製モジュール」と「標識物質をコードする遺伝子」とを構成要素として有するもの、具体的に例示すれば例えば上述したｐＲＳＳ１２、ｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｕｖ、ｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２等が挙げられる。
【０１０５】
また、これら本発明の実施の形態６にかかるモニタリング方法ならびにこれを応用した評価方法およびスクリーニング方法が適用できる、「植物に感染する病原菌」としては、例えばFusarium oxysporum等のFusarium属のカビ類、いもち病菌（Magnaporthe grisea）、土壌病原細菌（Erwinia carotovora）等この分野でよく知られた病原菌が挙げられる。
【０１０６】
なお、本発明の実施の形態３〜６において「植物」とは、例えばトマト、ナスまたはタバコ等の青枯病菌に感染すると報告されている３３科２００種以上の植物を少なくとも含み（堀田光生・土屋健一、微生物遺伝資源マニュアル（１２）−青枯病菌  Ralstonia solanacearum−、農業生物資源研究所（２００２）等参照）、本発明の実施の形態６においては、さらに上述したFusarium属のカビ類、いもち病菌、土壌病原細菌等に感染すると報告されている植物も含む。
【０１０７】
寒天培地の成分としては、植物を栽培させるために従来公知の成分を含めばよい。例えば、実施例に詳細に示すようなアガーと、ハイポネックスパウダー（http://vegetea.naro.affrc.go.jp/kinou/shukakugoseiri/page021.html）や植物培養用の例えば Murashige & Skoog (ＭＳ)培地、Ｂ５培地、Ｎ６培地、ＡＡ培地等の自体公知の培地（「生物化学実験法  41、植物細胞工学入門、駒嶺  穆・野村港二  編著、学会出版センター」p17-39参照）の組成に準じた各種必要成分を含むもの等とからなる寒天培地が挙げられる。この寒天培地におけるアガー等の寒天成分の含有量は１〜２ｗ／ｖ％、好ましくは１．３〜１．７ｗ／ｖ％、より好ましくは略１．５ｗ／ｖ％程度である。寒天培地表面の傾斜角度は、植物が寒天培地表面に沿って根または／および茎が伸長するように生育できる角度であれば特に限定されないが、好ましくは水平面に対して１５〜７５度、より好ましくは３０〜６０度、さらに好ましくは４０〜５０度、よりさらに好ましくは略４５度程度である。すなわち、植物の根または／および茎が寒天培地表面に沿って伸長するように生育し、その植物中の標識物質を、該植物を掘り出さずに、直接蛍光実体顕微鏡等により観察できる傾斜角度を意味する。この際、傾斜角度については、寒天培地が水平に形成されたシャーレを傾斜面に置き栽培する場合でも、シャーレ内の寒天培地自体に傾斜をつけ水平面に置き栽培する場合でも構わない。
【０１０８】
本実施の形態６に係るモニタリング方法、評価方法およびスクリーニング方法においては、本発明者らの一部が発明したｐＲＳＳ１２を用いることも出来るので、この構造についても参考までに記載しておく。
【０１０９】
図１は、このｐＲＳＳ１２の特定構造を示す模式図である。すなわち、図１は、前述した特許文献３に記載のｐＲＳＳ１２とその元となるファージφＲＳＳ１ゲノムＤＮＡの構造を示す。図１の上段の図は、ファージφＲＳＳ１のゲノムＤＮＡの構造である。図１の下段の図は、ｐＲＳＳ１２の構造である。ファージφＲＳＳ１の全塩基配列はＤＤＢＪに、アクセッション番号ＡＢ２５９１２４として登録されている。アクセッション番号ＡＢ２５９１２４のファージφＲＳＳ１のゲノムＤＮＡの６６６２塩基からなる全配列を配列表の配列番号１に示す。
【０１１０】
一般に、ファージφＲＳＳ１のようなＦｆ様ファージのゲノムは、関連する機能を有する遺伝子同士がまとまった「モジュール」と呼ばれる構造を複数含んでいる。例えば、「複製モジュール」は、ローリングサークルＤＮＡ複製に関与する遺伝子ｇＩＩ、ｇＶ、およびｇＸを含有している。Ｆｆ様ファージのゲノムは共通して、「複製モジュール」、「構造モジュール」、および、「アセンブリーおよび分泌モジュール」の３種類を有している。これらのモジュールは上記の順番でゲノム上に並んでおり、この配置はファージφＲＳＳ１でも維持されている。本明細書において、用語「複製モジュール」とは、ローリングサークルＤＮＡ複製に関与する遺伝子ｇＩＩ、ｇＶ、およびｇＸを含有しているモジュールのことを意味し、または、Ｆｆ様ファージのゲノム構造から「構造モジュール」および「アセンブリーおよび分泌モジュール」を除いた部分のことを意味する。
【０１１１】
ｐＲＳＳ１２を作製するには、まず、ファージφＲＳＳ１のＤＮＡから構造モジュールとアセンブリーおよび分泌モジュールと（ＯＲＦ４〜ＯＲＦ１１）を除くことで、ファージφＲＳＳ１のＤＮＡの約１／３（２２４８塩基）からなるプラスミドを構築する。この２２４８塩基からなる部分には、ファージφＲＳＳ１のＤＮＡのＯＲＦ１〜ＯＲＦ３およびＩＧがコードされている。この配列は、ファージφＲＳＳ１のゲノムＤＮＡの配列の１〜１７２０番目の塩基配列および６１３５〜６６６２番目の塩基配列からなるものである。
【０１１２】
図１の下段の図に示すように、ｐＲＳＳ１２は、ファージφＲＳＳ１の約３分の１のＤＮＡ（２２４８塩基）の１７２０番目と１７２１番目の間にＧＦＰ−Ｋｍ（ＧＦＰ遺伝子（ＧＦＰｕｖ遺伝子）およびカナマイシン耐性カセットが結合したもの）を含有する約４．７ｋｂｐのプラスミドである。念のために付記すれば、ｐＲＳＳ１２ではＧＦＰ遺伝子の発現に大腸菌由来のｌａｃプロモーターを使用している（特許文献３）。なお、ｐＲＳＳ１２の詳細な調製方法等については、特許文献３および非特許文献１乃至３を参照されたい。
【実施例】
【０１１３】
本実施例および参考例において使用するバクテリオファージ（ファージφＲＳＳ１およびファージφＲＳＢ２）は、青枯病菌（ラルストニア・ソラナセアラム（Ralstonia solanacearum））から単離されるものである。ファージφＲＳＳ１は、青枯病菌の菌株Ｃ３１９を用いて繁殖させた。なお、菌株Ｃ３１９はタバコより分離されたレース１の菌株であり、山陰建設工業株式会社（島根県出雲市）より分譲された菌株である。なお、ファージφＲＳＢ２は、本発明者らが広島県より単離した青枯病菌を宿主とする新規なバクテリオファージである。
【０１１４】
本実施例および参考例で使用する青枯病菌の菌株ＭＡＦＦ１０６６１１株は、農林水産省生物資源研究所発行の微生物遺伝資源利用マニュアル（１２）、堀田光生・土屋健一、平成１４年３月に記載の菌株で、農林水産省生物資源研究所農業生物資源ジーンバンクより分譲が可能である。各ファージ単離方法および各菌株の詳細については、背景技術に記載の特許文献１乃至３および非特許文献１乃至３を参照されたい。
【０１１５】
各種の青枯病菌の菌株は、２８℃で２００〜３００ｒｐｍで撹拌してＣＰＧ培地で培養した。ＣＰＧ培地は、０．１％のカザミノ酸、１％のペプトンおよび０．５％のグルコースを含有するものを使用した。各ファージは、単一プラーク単離法により繁殖させ、精製した。細菌細胞の培養液のＯＤ６００が０．１ユニットに達したときに、ファージを０．０１〜０．０５ｍｏｉ（菌数に対するファージの相対数）加えた。その後、１６〜１８時間、培養して遠心分離により細胞を除去し、０．４５μｍのフィルターを通した後、このファージ懸濁液に、ＣｓＣｌ（９．４ｇ／２０ｍＬ）を加え、超遠心分離を行って、さらなる精製を行った。精製されたファージは、使用されるまで４℃で保存した。
【０１１６】
また、蛍光実体顕微鏡での観察は、ＧＦＰ２およびＧＦＰ３ filterを用いたMF16F fluorescence stereomicroscope（Leica Microsystems, Heidelberg, Germany）、および／または、Olympus BH2 fluorescence microscope（Olympus, Tokyo, Japan）を用い、CCD camera（Keyence VB-6010; Osaka, Japan）を用いて記録した。
【０１１７】
以下、ｐＲＳＳ１２，ｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｕｖおよびｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２の調製方法、これらのプラスミドによって形質転換された青枯病菌、ならびに、これらの青枯病菌を用いたモニタリング方法等に係る実施例および参考例について説明する。まず、ｐＲＳＳ１２の調製方法および青枯病菌への形質転換について説明する。
【０１１８】
（参考例１）
ｐＲＳＳ１２を調製するため、まず、ファージφＲＳＳ１のゲノム配列から構造タンパク質および形態形成のモジュール部分が欠落した約１／３の長さ（約２２４８塩基）のＤＮＡ断片をＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）法により増幅した。ファージφＲＳＳ１の全配列はＤＤＢＪに、アクセッション番号ＡＢ２５９１２４としてそれぞれ登録されている。ファージφＲＳＳ１の全ゲノムＤＮＡ配列を、配列番号１に示す。図１に示すように、プライマーには、ファージφＲＳＳ１のゲノムにおけるＯＲＦ１１の３’末端部分に相当する塩基配列を有するフォーワードプライマー１２−Ｆ１（配列番号４、５’−cggaattctatccggagtaacgaaaag−３’）、および、ＯＲＦ４の５’末端部分に相当する塩基配列を有するリバースプライマー１２−Ｒ１（配列番号５、５’−atggaattctccttgagatggaggttgag−３’）を用いた。これらのプライマーにはいずれにもＥｃｏＲＩサイトが付加されている。このＰＣＲは、MY-Cycler（バイオラッド社製）を用い、標準的な条件下で行った。テンプレートとしては、ファージφＲＳＳ１のＲＦ−ＤＮＡ（１ｎｇ）を用いて、２５サイクルで行った。得られたＤＮＡ断片を常法に従い、精製した。
【０１１９】
また、プラスミドｐＵＣ４−ＫＩＸＸ（アマーシャムバイオサイエンス社製）からカナマイシン耐性カセットをＥｃｏＲＩにより切り出した。このカナマイシン耐性カセットの断片を、ＧＦＰ遺伝子を含有しているｐＧＦＰｕｖ（タカラバイオ株式会社製）のＥｃｏＲＩサイトに挿入して、カナマイシン耐性カセットとＧＦＰ遺伝子（ＧＦＰｕｖ）が結合したｐＧＦＰｕｖ−Ｋｍを構築した。各々の遺伝子の向きは、制限酵素マッピング法により確認した。
【０１２０】
さらに、構築したｐＧＦＰｕｖ−Ｋｍをテンプレートとして、カナマイシン耐性カセットとＧＦＰｕｖの結合部分に係るＤＮＡ配列断片（以下、ＧＦＰｕｖ−Ｋｍ）をＰＣＲによって増幅した。プライマーは、フォワードプライマー１２−Ｆ２（配列番号６、 ５’−gagcgccgaattcgcaaaccgcctctcc−３’）、および、リバースプライマー１２−Ｒ２（配列番号７、５’−ttgacaccagacaagttggtaatggtag−３’）を用いた。図１の下段の図に示すように、このＰＣＲ産物（ＧＦＰｕｖ−Ｋｍ）を、前述したファージφＲＳＳ１由来の増幅断片に結合させることにより、ｐＲＳＳ１２を構築した。このようにして構築されたｐＲＳＳ１２は、ファージφＲＳＳのゲノムの１〜１７２０番目の塩基配列、同ゲノムの６１３５〜６６６２番目の塩基配列、カナマイシン耐性カセット、および、ＧＦＰｕｖ遺伝子を有するプラスミドとなる。
【０１２１】
得られたｐＲＳＳ１２に係る青枯病菌への導入については、Gene Pulser Xcell（バイオラッド社製）を用いてメーカーの使用説明書の記載にしたがって、２．５ｋＶで２ｍｍキュベットで、青枯病菌ＭＡＦＦ１０６６１１株にエレクトロポーレーション法により導入した。得られた形質転換体は、１５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＣＰＧ培地で選択した。
【０１２２】
（実施例１）
ｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｕｖおよびｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２の調製方法等に係る実施例について説明する。まず、これらのプラスミドの基礎となるｐＲＳＳ１Ｓを調製するために、前述したｐＲＳＳ１２の場合と同様に、ファージφＲＳＳ１のゲノム配列から構造タンパク質および形態形成のモジュール部分が欠落した約１／３の長さ（２５８３塩基）のＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅した。なお、ｐＲＳＳ１２の場合と比較するとフォワードプライマーの配列が少し異なっている。図２の上段の図に示すように、プライマーには、ファージφＲＳＳ１のＯＲＦ１１の付近に相当する塩基配列を有するフォーワードプライマー１Ｓ−Ｒ（配列番号８、５’−agacatcgacattcggcacatcgc−３’）、および、ＯＲＦ４の５’末端部分に相当する塩基配列を有するリバースプライマー１Ｓ−Ｌ（配列番号９、５’−atggaattctccttgagatggaggttgag−３’）を用いた。なお、１Ｓ−ＬプライマーにはＥｃｏＲＩサイトが導入されている。
【０１２３】
このＰＣＲは、MY-Cycler（バイオラッド社製）を用い標準的な条件下で行った。テンプレートとしては、ファージφＲＳＳ１のＲＦ−ＤＮＡ（１ｎｇ）を用いて、２５サイクルで行った。得られたＤＮＡ断片を常法に従い、精製した。このＤＮＡ断片に、カナマイシン耐性カセットの断片を結合させて、図２の下段の図に示すように、ｐＲＳＳ１Ｓを構築した。カナマイシン耐性カセットは、プラスミドｐＵＣ４−ＫＩＸＸ（アマシャムバイオサイエンス社製）からＥｃｏＲＩにより切り出し、平滑末端化およびリン酸化処理を行うことにより取得した。このようにして構築されたｐＲＳＳ１Ｓは、ファージφＲＳＳのゲノムの１〜１７２０までの塩基配列、同ゲノムの５８００〜６６６２までの塩基配列、および、カナマイシン耐性カセット（Km cassette）を有するプラスミドとなる。
【０１２４】
次に、ファージφＲＳＢ２のＭＣＰ（major coat protein）遺伝子プロモーター（配列番号２）、ＧＦＰ（ＧＦＰｕｖまたはＧＦＰｍｕｔ２）遺伝子、および、ＭＣＰ遺伝子ターミネーター（配列番号３）からなる発現カセットを作製した。ファージφＲＳＢ２は、青枯病菌を宿主とする新規なバクテリオファージであり、発明者が広島県より単離したものである。まず、調製したファージφＲＳＢ２のＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法により、ＭＣＰ遺伝子のプロモーター配列を増幅した。その際、フォワードプライマーにはＭＣＰ−Ｆ−７２（配列番号１０、５’−cccgaattctggaacgccgcgtcgctgcctcgtaag−３’）、リバースプライマーにはＭＣＰ−Ｒ−７４（配列番号１１、５’−tgtggttctccttgaaaagtgatcagggac−３’）を用いた。フォワードプライマーＭＣＰ−Ｆ−７２には、ＥｃｏＲＩサイトが導入されている。ＰＣＲは、２５サイクルで、MY-Cycler（バイオラッド社製）を用い標準的な条件下で行った。
【０１２５】
同様に、ファージφＲＳＢ２のＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ法により、ＭＣＰ遺伝子のターミネーター配列を増幅した。その際、フォワードプライマーにはＴｅｒｍ−Ｆ−７７（配列番号１２、５’−tggccgtcctccaacccaagcata−３’）、リバースプライマーにはＴｅｒｍ−Ｒ−Ｒｌ−７１（配列番号１３、５’−cctgaattctccctgctgggtccccttggggtggtgc−３’）を用いた。リバースプライマーＴｅｒｍ−Ｒ−Ｒｌ−７１には、ＥｃｏＲＩサイトが導入されている。ＰＣＲの条件は、プロモーター配列のＰＣＲの場合と同様である。
【０１２６】
次に、増幅したＭＣＰプロモーター、およびＭＣＰターミネーターの間に、ＧＦＰ（ＧＦＰｕｖまたはＧＦＰｍｕｔ２）遺伝子をライゲーションし、ＥｃｏＲＩサイトで切断することにより、発現カセットを作製した。ＧＦＰｕｖおよびＧＦＰｍｕｔ２については、ｐＧＦＰｕｖ（タカラバイオ株式会社製）およびＧＦＰｍｕｔ２をコードする遺伝子を含むプラスミドであるｐＭＲＰ９−１(Davies, D. G. et al. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm. Science 280, 295-298 (1998).)を用いて調製した。ｐＧＦＰｕｖおよびｐＭＲＰ９−１を鋳型に、各ＧＦＰのコード領域を増幅するプライマーを用いて、ＰＣＲ法によりＧＦＰｕｖおよびＧＦＰｍｕｔ２のＤＮＡ断片をそれぞれ増幅した。また、これらのＤＮＡ配列断片（ＭＣＰプロモーター、ＧＦＰｕｖまたはＧＦＰｍｕｔ２、および、ＭＣＰターミネーター）のライゲーションについては、Ligation High（東洋紡績株式会社製）を用いてＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結した。なお、ＧＦＰｕｖまたはＧＦＰｍｕｔ２、ＭＣＰプロモーター領域、および、ＭＣＰターミネーター領域の向きは、ＰＣＲ法により確認した。
【０１２７】
このようにして作製したＧＦＰｕｖまたはＧＦＰｍｕｔ２の発現カセットを、前述したｐＲＳＳ１ＳのＥｃｏＲＩサイトに導入した。なお、ライゲーションの方法については前述と同様である。ＧＦＰｕｖの発現カセットを導入すると、図３に示すように、ファージφＲＳＳのゲノムの１〜１７２０番目の塩基配列、同ゲノムの５８００〜６６６２番目の塩基配列、ＭＣＰプロモーター領域、ＧＦＰｕｖ遺伝子、ＭＣＰターミネーター領域、および、カナマイシン耐性カセットを有するｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｕｖとなる。一方、ＧＦＰｍｕｔ２の発現カセットを導入すると、図４に示すように、ファージφＲＳＳのゲノムの１〜１７２０番目の塩基配列、同ゲノムの５８００〜６６６２番目の塩基配列、ＭＣＰプロモーター領域、ＧＦＰｍｕｔ２遺伝子、ＭＣＰターミネーター領域、および、カナマイシン耐性カセットを有するｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２となる。
【０１２８】
得られたｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｕｖまたはｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２に係る青枯病菌への導入については、Gene Pulser Xcell（バイオ・ラッド  ラボラトリーズ株式会社製）を用い、メーカーの使用説明書の記載にしたがって、２．５ｋＶで２ｍｍキュベットで、青枯病菌ＭＡＦＦ１０６６１１株にエレクトロポーレーション法により導入した。得られた形質転換体を、１５μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＣＰＧ培地で選択した。
【０１２９】
（実施例２）
以下、ｐＲＳＳ１２とｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｕｖとを用いて形質転換した青枯病菌における、蛍光発光の定量比較に係る実施例について説明する。
【０１３０】
参考例１および実施例１に記載したように、調製したｐＲＳＳ１２およびｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｕｖを青枯病菌ＭＡＦＦ１０６６１１株にエレクトロポーレーション法により導入した。次に、各プラスミドを含む菌株を、対数増殖期までＣＰＧ培地で培養し、遠心後蒸留水に懸濁した。菌の濃度はＯＤ６００＝０．５（１．５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）になるように調整した。懸濁液の希釈系列を作成し、マルチプレートリーダー（Infinit M200,Tecan）を用いて菌の懸濁液の蛍光強度を測定した。測定には２００μｌの懸濁液を用い、４８５ｎｍの青色光で励起し、５１８ｎｍの緑色蛍光を測定・定量した。
【０１３１】
図５は、ｐＲＳＳ１２とｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｕｖとの蛍光強度の定量比較データである。すなわち、図５には、各細胞濃度（ｃｅｌｌ／ｍｌ）における、ｐＲＳＳ１２またはｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｕｖを含む菌の懸濁液の蛍光強度（相対値）が示されている。なお、ｐＲＳＳ１２を用いて形質転換を行った青枯病菌の細胞濃度１．５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌの懸濁液の蛍光強度を１とした。図５に示すように、ｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｕｖを用いて形質転換を行った青枯病菌の細胞濃度１．５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌの懸濁液は、ｐＲＳＳ１２と比較して約１．６倍程度に蛍光強度が増強されている。
【０１３２】
図１および図３に示すように、ｐＲＳＳ１２とｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｕｖとは、ＭＣＰプロモーターおよびＭＣＰターミネーターが組み込まれているか否かという点で異なる。ｐＲＳＳ１２ではＧＦＰ遺伝子の発現に大腸菌由来のｌａｃプロモーターを使用している。また、いずれのプラスミドでも蛍光標識として用いられている遺伝子はＧＦＰｕｖである。以上の結果から、青枯病菌を蛍光標識する場合、ファージφＲＳＢ２のＭＣＰプロモーターおよびＭＣＰターミネーターを用いることで、蛍光強度の増強に有効であることがわかった。すなわち、該プロモーターおよびターミネーター配列を組み込んだプラスミドを用いることで、青枯病菌の検出・植物内でのモニタリングをより明瞭かつ簡便に観察できることがわかった。
【０１３３】
（実施例３）
以下、ｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｕｖとｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２とを用いて形質転換した青枯病菌における、蛍光発光の定量比較に係る実施例について説明する。
【０１３４】
実施例１に記載したように、調製したｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｕｖおよびｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２を青枯病菌ＭＡＦＦ１０６６１１株にエレクトロポーレーション法により導入した。次に、実施例２と同様に、各プラスミドを含む菌株を、対数増殖期までＣＰＧ培地で培養し、遠心後蒸留水に懸濁した。菌の濃度はＯＤ６００＝０．５（１．５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）になるように調整した。懸濁液の希釈系列を作成し、マルチプレートリーダーを用いて菌の懸濁液の蛍光強度を測定した。測定には２００μｌの懸濁液を用い、４８５ｎｍの青色光で励起し、５１８ｎｍの緑色蛍光を測定・定量した。
【０１３５】
図６は、ｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｕｖとｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２との蛍光強度の定量比較データである。すなわち、図６には、各細胞濃度（ｃｅｌｌ／ｍｌ）における、ｐｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｕｖまたはｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２を含む菌の懸濁液の蛍光強度（相対値）が示されている。なお、ｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｕｖを用いて形質転換を行った青枯病菌の細胞濃度１．５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌの懸濁液の蛍光強度を１とした。図６に示すように、ｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２を用いて形質転換を行った青枯病菌の細胞濃度１．５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌの懸濁液は、ｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｕｖと比較して１０倍以上に蛍光強度が増強されている。
【０１３６】
図３および図４に示すように、ｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｕｖとｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２とは、蛍光標識として用いられている遺伝子がＧＦＰｕｖであるかＧＦＰｍｕｔ２であるかの点で異なる。ＭＣＰプロモーターおよびＭＣＰターミネーターについてはいずれも組み込まれている。以上の結果から、青枯病菌を蛍光標識によって標識化する場合、ＧＦＰｍｕｔ２を用いると、蛍光強度をさらに増強することができた。
【０１３７】
（参考例２）
以下、ｐＲＳＳ１２を用いて形質転換した青枯病菌をトマトの茎に接種し、植物の横断切片によって青枯病菌をモニタリングする場合に係る参考例について説明する。
【０１３８】
参考例１に記載した方法で、ｐＲＳＳ１２を調製後、青枯病菌ＭＡＦＦ１０６６１１株を形質転換した。得られた青枯病菌の形質転換菌を、播種後４週間土壌で栽培し４〜６枚の葉を付けたトマト（品種：大型福寿、タキイ種苗株式会社）の苗木の茎に接種させ、青枯病菌のモニタリングを行った。なお、接種に使ったトマトの苗木は、ピートモスおよびバーミキュライトを含有する土壌において２５±３度で播種した。菌の接種は、青枯病菌培養液を塗布した針で、茎を穿孔して行った（堀田光生・土屋健一、微生物遺伝資源マニュアル（１２）−青枯病菌  Ralstonia solanacearum−、農業生物資源研究所（２００２）、１７〜２１頁参照）。なお、該青枯病菌培養液は、ＣＰＧ培地で培養し、菌の濃度が１．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるよう蒸留水で希釈した。
【０１３９】
接種後、１２０時間後に茎の横断切片を作製し、蛍光実体顕微鏡で観察した。図７は、本参考例２に係るｐＲＳＳ１２を用いて形質転換した青枯病菌を感染させた茎の横断切片の蛍光実体顕微鏡による図面に代わる写真である。茎の横断切片は、カミソリにより穿孔箇所（injection point）から１０ｍｍの間隔で、作製した。図７のＡは、感染箇所より２０ｍｍ上方の切片である。図７のＢは、 感染箇所より１０ｍｍ上方の切片である。図７のＣは、感染箇所（穿孔箇所、injection point）の切片である。図７のＤは、 感染箇所より１０ｍｍ上方の切片である。図７のＥは、感染箇所より２０ｍｍ下方の切片である。図７のＦは、青枯病菌を接種していないコントロールの切片である。図７においては、青枯病菌由来の蛍光（ＧＦＰｕｖ）が緑色に検出される。一方、植物の葉緑体に由来する自家蛍光は、赤色に検出される。なお、図中のスケールは１ｍｍである。
【０１４０】
本実施例に係る観察期間における、青枯病菌の移動距離および移動速度は、感染箇所と最も遠い蛍光（ＧＦＰｕｖ）が観察される切片との距離から決定される。また、図７に示すように、感染箇所から上方に２０ｍｍ離れた切片では蛍光（ＧＦＰｕｖ）が観察されるが、感染箇所から下方に２０ｍｍ離れた切片では蛍光（ＧＦＰｕｖ）が観察されていない。
【０１４１】
図７のＡ乃至Ｅに示すように、青枯病菌がトマトの茎を移動する際に、上方への移動速度は下方への移動速度よりも速いことがわかった。詳細には、上方への移動速度は０．４から０．８ｍｍ／ｈであり、下方への移動速度は０．１から０．２ｍｍ／ｈであることがわかった。このように、ｐＲＳＳ１２を用いて形質転換した青枯病菌を植物の茎に接種し（感染させ）、植物の茎の切片の蛍光（ＧＦＰｕｖ）を観察することによって、青枯病菌の検出、移動、追跡または増殖等の観察（すなわちモニタリング）を行えることがわかった。なお、本参考例２ではｐＲＳＳ１２を用いて形質転換した青枯病菌を使用しているが、同様の方法でｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｕｖおよびｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２でもこのようなモニタリングが行えることが示唆される。特に、実施例２および３の結果を考慮すると、ｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｕｖやｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２、好ましくはｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２を用いると、より明瞭かつ簡便にモニタリングが行えることが示唆される。
【０１４２】
（参考例３）
参考例２において述べた、感染箇所から上方と下方との青枯病菌の移動速度の違いは、木部導管を通る水の移動が影響していると考えられる。そこで、本発明者らは、さらなる青枯病菌のモニタリングに関する実験を行った。以下、ｐＲＳＳ１２を用いて形質転換した青枯病菌をトマトの茎に接種し、植物の横断切片によって青枯病菌をモニタリングする場合に係るさらに詳細な参考例について説明する。
【０１４３】
参考例１に記載した方法で、ｐＲＳＳ１２を調製後、青枯病菌ＭＡＦＦ１０６６１１株を形質転換した。得られた青枯病菌の形質転換菌を、播種後４週間の土壌で栽培したトマト（品種：大型福寿、タキイ種苗株式会社）の茎に穿孔法により接種させ（堀田光生・土屋健一、微生物遺伝資源マニュアル（１２）−青枯病菌  Ralstonia solanacearum−、農業生物資源研究所（２００２）、１７〜２１頁参照）、４〜６日後に横断切片を作製し青枯病菌のモニタリングを行った。図８は、本参考例３に係るｐＲＳＳ１２を用いて形質転換した青枯病菌を感染させた茎の横断切片の蛍光実体顕微鏡による図面に代わる写真である。以下に述べる色彩については物件提出書の写真を参照されたい。
【０１４４】
図８のＡは、本参考例３に係る感染実験の模式図を示す。図８のＡにおいて、黄色の線はトマトの茎における維管束を模式的に示す。矢印は、穿孔法により青枯病菌をトマトの茎の維管束に感染させた位置を示す。図８のＢまたはＤは、Ａの破線ＢまたはＤに示す葉柄の分岐点の下部の茎の横断切片の蛍光実体顕微鏡による写真である。図８のＣは、Ａの破線Ｃに示す葉柄の分岐点における茎の横断切片の蛍光実体顕微鏡による写真である。図８のＥは、Ａの破線Ｅに示す葉柄の分岐点における茎の横断切片の蛍光実体顕微鏡による写真である。なお、図中のスケールは1ｍｍである。
【０１４５】
図８のＢ乃至Ｅに示すように、青枯病菌が感染した維管束が緑色蛍光として観察される（矢頭に示す）。植物の葉緑体に由来する自家蛍光は、赤色に検出される。図８のＣに示すように、青枯病菌が感染した維管束が葉柄に接続している場合葉柄でも感染が観察された。また、葉柄に接続する以外の維管束では、蛍光（ＧＦＰｕｖ）は観察されない。一方、図８のＥに示すように、蛍光（ＧＦＰｕｖ）は葉柄に接続している維管束に感染させないと葉柄での感染は観察されない。
【０１４６】
以上の結果から、植物体内での青枯病菌の移動は、主に維管束に沿って縦方向に行われることがわかった。また、維管束間での移動は限定されていること、すなわち、植物の茎を構成する複数の維管束間での青枯病菌の移動は短期間では行われないことが確認された。例えば、図８のＣに示すように、青枯病菌が感染した維管束が葉柄に進入する場合には、他の維管束では青枯病菌は観察されない。
【０１４７】
このような本参考例３の実験結果により、参考例２で述べたような植物の茎の切片での蛍光（ＧＦＰｕｖ）の観察のみではなく、植物体内での維管束の連続性を検討・考慮することにより、植物の茎、葉および根等様々な部位の横断切片を観察することで、さらに詳細に青枯病菌の検出、移動、追跡または増殖等の観察（すなわちモニタリング）を行うことができることが示唆された。なお、本参考例３ではｐＲＳＳ１２を用いて形質転換した青枯病菌を使用しているが、同様の方法でｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｕｖおよびｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２でもこのようなモニタリングが行えることが示唆される。特に、実施例２および３の結果を考慮すると、ｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｕｖやｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２、好ましくはｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２を用いると、より明瞭かつ簡便にモニタリングが行えることが示唆される。
【０１４８】
（実施例４）
以下、ｐＲＳＳ１２を用いて形質転換した青枯病菌を寒天培地表面で発芽させたトマトに感染させた場合に係る実施例について説明する。
【０１４９】
トマト（品種：大型福寿、タキイ種苗株式会社）種子を表面滅菌し、角形シャーレ中の寒天培地表面で発芽させ、無菌的に培養した。寒天培地の成分は、０．１５ｗ／ｖ％ハイポネックスパウダー（株式会社ハイポネックスジャパン）、０．５ｗ／ｖ％スクロースおよび１．５ｗ／ｖ％アガーを含み、ｐＨ５．８に調節をした。培養中の角形シャーレは、２８度の温室中で、１６時間の明期および８時間の暗期の明暗周期において、７〜２１日間人工気象器（サンヨー製）栽培した。栽培中は寒天培地を４５度に傾けて培養し、トマトの根が寒天培地に沿って、真っすぐに伸長するように栽培した。
【０１５０】
実施例１に記載した方法で、ｐＲＳＳ１２を調製後、青枯病菌ＭＡＦＦ１０６６１１株を形質転換した。得られた青枯病菌の形質転換菌を、寒天培地表面の播種後７日のトマトに感染させた。感染方法には、トマトの芽生えの根端を切断し、形質転換した青枯病菌の培養液（２μｌ、１×１０８ｃｅｌｌ／ｍｌ）をかけることで、青枯病菌を感染させる方法を新しく開発した。この方法で青枯病菌を感染させ、蛍光実体顕微鏡で観察を行った。
【０１５１】
図９は、実施例４に係るｐＲＳＳ１２を用いて形質転換した青枯病菌を、トマトに感染させ、寒天培地表面で培養した様子を示す図面に代わる写真である。図９のＡは、 播種後７日経過した感染前のトマトの芽生えの写真である。以下に述べる図９のＢ乃至Ｆの蛍光実体顕微鏡による写真では、青枯病菌由来の蛍光が緑色に検出され、植物の葉緑体に由来する自家蛍光は赤色に検出される。
【０１５２】
図９のＢは、 感染後１２時間後の根の蛍光実体顕微鏡による写真である。青枯病菌の増殖が緑色の蛍光（ＧＦＰｕｖ）として観察される。図９のＣは、感染後２４時間後の根と胚軸の境界の蛍光実体顕微鏡による写真である。図９のＤは、感染後４８時間後の胚軸の蛍光実体顕微鏡による写真である。青枯病菌が胚軸まで侵入している様子がわかる。図９のＥは、感染後48時間後の側根の蛍光実体顕微鏡による写真である。青枯病菌が側根へも侵入を開始していることがわかる。図９のＦは、ｐＲＳＳ１２を含まない青枯病菌を感染させた芽生えの根と胚軸の蛍光実体顕微鏡による写真であり、コントロールである。ＧＦＰｕｖによる緑色蛍光は観察されない。なお、図９中のスケールは、Ａは２ｃｍであり、 Ｂ乃至Ｆは２ｍｍである。
【０１５３】
以上の結果から、このような方法で寒天培地を用いて栽培した植物に、ｐＲＳＳ１２によって形質転換した青枯病菌を感染させることによって、青枯病菌の検出、移動、追跡または増殖等の観察（すなわちモニタリング）を、経時的により簡便に行うことができる。すなわち、前述した参考例で示したような茎の切片を作製する必要はなく、観察の度に植物を切断する必要がない。また、寒天培地の中に根が侵入しないために蛍光実体顕微鏡による観察の解像度を向上でき、さらに、寒天培地表面の栽培であるため短期間で観察を行うことができる。なお、本実施例４ではｐＲＳＳ１２を用いて形質転換した青枯病菌を使用しているが、同様の方法でｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｕｖやｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２でもこのようなモニタリングが行えることが示唆される。特に、実施例２および実施例３の結果を考慮すると、より明瞭かつ簡便なモニタリングが行えることが示唆される。なお、ｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２に係る同様の実施例は、以下の実施例５に示す。
【０１５４】
（実施例５）
以下、ｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２を用いて形質転換した青枯病菌をトマトに感染させ、寒天培地表面で培養した場合に係る実施例について説明する。
【０１５５】
実施例１に記載した方法で、ｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２を調製後、青枯病菌ＭＡＦＦ１０６６１１株を形質転換した。得られた青枯病菌の形質転換菌を、寒天培地表面の播種後７日のトマトに感染させた。なお、寒天培地の成分、トマトの栽培方法および青枯病菌の感染方法など詳細については実施例４と同様である。
【０１５６】
図１０は、実施例５に係るｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２を用いて形質転換した青枯病菌をトマトに感染させ、寒天培地表面で培養し、実体顕微鏡によって明視野で観察した様子を示す図面に代わる写真である。図１１は、実施例５に係るｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２を用いて形質転換した青枯病菌をトマトに感染させ、寒天培地表面で培養し、蛍光実体顕微鏡によって観察した様子を示す図面に代わる写真である。図１０および図１１中のスケールはＡは３ｍｍである。図１１においては、青枯病菌由来の蛍光が緑色に検出され、植物の葉緑体に由来する自家蛍光は赤色に検出される。
【０１５７】
本実施例５では、感染後１２時間後、１８時間後、２４時間後および４８時間後において、青枯病菌の経時的なモニタリングを行った。実施例４において述べたｐＲＳＳ１２の場合と同様、図１１に示すように、感染後１２時間後には青枯病菌の根への増殖が観察された。感染後１８，２４時間後には、側根への侵入も観測され、かつ、ＧＦＰｍｕｔ２による蛍光標識はより強く表れている。感染後４８時間後には、胚軸および茎にも蛍光標識はより強く表れている。
【０１５８】
以上の結果から、実施例４と同様、このような方法で寒天培地を用いて栽培した植物に、ｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２によって形質転換した青枯病菌を感染させることによって、青枯病菌の検出、移動、追跡または増殖等の観察（すなわちモニタリング）を、経時的により簡便に行うことができることが判る。すなわち、前述した参考例で示したような茎の切片を作製する必要はなく、観察の度に植物を切断する必要がない。また、寒天培地の中に根が侵入しないために蛍光実体顕微鏡による観察の解像度を向上でき、さらに、寒天培地表面の栽培であるため短期間で観察を行うことができる。
【０１５９】
また、図９のＥに示す感染後４８時間後の側根と、図１１に示す感染後４８時間後の側根とを比較すると、感染条件および培養条件等は同様であるのに図１１に示すｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２を用いて形質転換した場合の方がより強い蛍光強度を得ている。すなわち、ｐＲＳＳ１２を用いる場合よりも、より簡便かつ明瞭に青枯病菌をモニタリングすることができることがわかった。これは、実施例３に係る結果と一致している。
【０１６０】
（実施例６）
以下、ｐＲＳＳ１２によって形質転換した青枯病菌を用いた、寒天培地表面で栽培したトマトの品種別による青枯病菌への感受性または耐性の評価に係る実施例について説明する。
【０１６１】
参考例１に記載した方法で、ｐＲＳＳ１２を調製後、青枯病菌ＭＡＦＦ１０６６１１株を形質転換した。得られた青枯病菌の形質転換菌を、寒天培地表面の播種後１または３週間のトマトに感染させた。なお、寒天培地の成分、トマトの栽培方法および青枯病菌の感染方法など詳細については実施例４と同様である。トマトには、ポンデローザ、大型福寿およびＢ−バリアー（いずれもタキイ種苗株式会社）の品種を用いた。このうち、ポンデローザおよび大型福寿は青枯病菌に感受性を有する品種であり、Ｂ−バリアーは青枯病菌に耐性を有する品種である。
【０１６２】
図１２は、実施例６に係るｐＲＳＳ１２を用いて形質転換した青枯病菌をトマトに感染させ寒天培地表面で培養した様子を示す蛍光実体顕微鏡による図面に代わる写真である。青枯病菌由来の蛍光（ＧＦＰｕｖ）は緑色に検出され、植物の葉緑体に由来する自家蛍光は赤色に検出される。
【０１６３】
図１２のＡは、播種後１週間のポンデローザ（感受性品種）に感染させた場合の、感染後９６時間経過後の芽生えの様子を示す。既に、葉脈への侵入が観察された。図１２のＢは、播種後１週間のポンデローザに感染させた場合の感染後９６時間経過後の根端の様子を示す。側根の根端より、青枯病菌が漏出している様子が観察された。なお、写真には示していないが、播種後１週間に青枯病菌を感染させた場合には、いずれの品種においても根端、側根および胚軸に蛍光（ＧＦＰｕｖ）で確認された。
【０１６４】
図１２のＣは、播種後３週間のポンデローザに感染させ、１２０時間経過した後の根の様子を示す。青枯病菌の増殖が緑色の蛍光（ＧＦＰｕｖ）で確認され、側根への侵入も生じていた。図１２のＤは、播種後３週間のポンデローザに青枯病菌を感染させ、１２０時間経過した後の胚軸の様子を示す。青枯病菌の増殖が緑色の蛍光（ＧＦＰｕｖ）で確認された。図１２のＥは、播種後３週間のＢ−バリアー（耐性品種）に青枯病菌を感染させ、１２０時間経過した後の根の様子を示す。主根での青枯病菌の増殖が蛍光（ＧＦＰｕｖ）で確認された。側根への侵入は生じていなかった。図１２のＦは、 播種後３週間のＢ−バリアーに青枯病菌を感染させ、１２０時間経過した後の胚軸の様子を示す。胚軸では蛍光（ＧＦＰｕｖ）は、ほとんど観察されなかった。なお、写真中のスケールは、２ｍｍである。
【０１６５】
以上の結果から、播種後１週間の植物に感染させた場合には青枯病菌への感受性または耐性が判断できず、播種後３週間の植物に感染させた場合には青枯病菌への感受性または耐性によって菌の侵入割合が異なることがわかった。播種後３週間で感染させた場合、感受性品種では、葉脈を含む植物体の全般で青枯病菌由来の緑色蛍光が観察され、また品種によっては側根の根端から青枯病菌の漏出が観察されることがわかった。一方、耐性の品種では、菌の増殖は主に主根に限定され、側根への侵入は観察されなかった。そこで、青枯病菌への感受性または耐性による菌の侵入割合について詳細に調べるため、青枯病菌の側根への侵入についてのさらなる実験を行った。
【０１６６】
図１２の場合と同様、まず、３週間寒天培地表面で栽培したトマト（ポンデローザ、大型福寿およびＢ−バリアー）の芽生えの根端に青枯病菌を接種した。その後、各品種での側根への青枯病菌の侵入を経時的に観察しモニタリングを行った。図１３は、実施例６に係るトマト品種別による青枯病菌の侵入割合を示す表である。それぞれの品種において、青枯病菌の接種後（Time after infection）７２時間後、９０時間後および１０８時間後において観察を行った。なお、ポンデローザ（Ponderosa）は１２個、大型福寿（Oogata-fukujyu）は１６個、Ｂ−バリアー（B-barrier）は１４個の側根を用いて観察を行った。
【０１６７】
その結果、図１３に示すように、感染後７２時間では、青枯病菌に感受性の品種であるポンデローザおよび大型福寿では側根への菌の侵入が高い割合で観察された。一方、青枯病菌に耐性の品種であるＢ−バリアーでは、菌の侵入の割合は低かった。感染後９０時間および感染後１０８時間でも同様の結果が観察された。
【０１６８】
本実施例６に係る結果から、青枯病菌の検出、移動、追跡または増殖等の観察（すなわちモニタリング）を行い、そのモニタリング結果を指標として、植物品種による青枯病菌に対する感受性または耐性を評価できることが示唆された。具体的には、感染後７２時間程度での、側根への青枯病菌の侵入割合を調べることで、青枯病菌に対する感受性または耐性を調べることができることがわかった。なお、本実施例６ではｐＲＳＳ１２を用いて形質転換した青枯病菌を使用しているが、同様の方法でｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｕｖおよびｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２でもこのようなモニタリングを利用した評価方法が行えることが示唆される。特に、実施例２および３の結果を考慮すると、ｐＲＳＳ１Ｓ−ＧＦＰｍｕｔ２を用いると、より明瞭かつ簡便に、しかも従来行われていた方法よりも短時間でモニタリングが行えるため感受性または耐性の評価を容易に行えることが示唆される。
【０１６９】
さらに言えば、上述の結果は、本発明の形質転換された青枯病菌を含む「植物に感染する病原菌に標識物質をコードする遺伝子を含む外来遺伝子を導入して標識物質を産生する性質を有するものとした当該病原菌」を用いれば、上述した青枯病菌に係るモニタリング方法ならびにこれを応用した評価方法およびスクリーニング方法に準じて各種病原菌についてのモニタリング方法ならびにこれを応用した評価方法およびスクリーニング方法を実施し得ることを示している。
【産業上の利用可能性】
【０１７０】
本発明によれば、青枯病菌を形質転換した際に標識物質による発光または蛍光の強度を増強できるプラスミド、該プラスミドにより形質転換された青枯病菌、該標識物質を観察することによる青枯病菌のモニタリング方法、該モニタリング方法を用いた青枯病菌に対する感受性または耐性の評価方法、および、該モニタリング方法を用いた青枯病菌に対して有効な被験物質のスクリーニング方法が提供される。
【０１７１】
該プラスミドを用いて形質転換した青枯病菌のモニタリング方法においては、標識物質の発現が増強したことによって、土壌または植物体内における青枯病菌の増殖、減少または挙動を明瞭かつ簡便に観察することができる。しかも、当該青枯病菌中のプラスミドは、薬剤選択圧がない条件でも、長期間青枯病菌中に保持されるという性質を有するため、このようなモニタリング方法等に使用するのに好適である。このような観察は、青枯病についての研究、例えば青枯病に対する薬剤の研究または感染機構の研究において役立てることができる。また、このような青枯病菌のモニタリング方法のうち、特に寒天培地表面において植物を培養・モニタリングする方法では、実験室レベルでの青枯病菌の研究に適しており、土壌において栽培した植物に青枯病菌を接種しモニタリングする場合と比較すると、短期間でモニタリングを行うことができる。また、青枯病菌に対する感受性または耐性の評価方法については、青枯病に耐性のある品種の開発に役立てることができる。さらに、被験物質のスクリーニングに関しても青枯病の被害の減少につなげることができる。
【０１７２】
さらに言えば、本発明のモニタリング方法ならびにこれを応用した評価方法およびスクリーニング方法を用いれば、本発明の形質転換された青枯病菌を含む「植物に感染する病原菌に標識物質をコードする遺伝子を含む外来遺伝子を導入して標識物質を産生する性質を有するものとした当該病原菌」を用いた、各種病原菌についてのモニタリング方法ならびにこれを応用した評価方法およびスクリーニング方法を実施し得る。
【０１７３】
本発明は、上記発明の実施の形態および実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。
【０１７４】
本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、および特許公報等の内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１３】
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【図１４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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