(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト又は動物由来の多能性幹細胞を培養して筋芽細胞へ分化する能力を有する間葉系幹細胞を生産する方法であって、
i）凍結保存された前記多能性幹細胞を用意すること、
ii）前記用意した多能性幹細胞を未分化の状態で８〜１２回数継代すること、
iii）前記継代した前記多能性幹細胞を、生体外で脂肪細胞へ分化誘導可能な条件で培養すること、及び
iv）前記培養過程において、ＣＤ１０５陽性である細胞を分離回収すること、
を包含する生産方法。
【請求項２】
前記多能性幹細胞としてＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分化誘導可能な条件として、レチノイン酸を添加した培養液で浮遊培養した後、インシュリンおよびトリヨードサイロニンを添加した培養液で培養する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記継代した後の前記多能性幹細胞の分化誘導可能な条件での培養は、２１日を超えない期間行う、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
セルソーティング法を用いて前記ＣＤ１０５陽性である細胞を分離回収する、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ヒト又は動物由来の多能性幹細胞を培養して筋芽細胞を生産する方法であって、
i）凍結保存された前記多能性幹細胞を用意すること、
ii）前記用意した多能性幹細胞を未分化の状態で８〜１２回数継代すること、
iii）前記継代した前記多能性幹細胞を、生体外で脂肪細胞へ分化誘導可能な条件で培養すること、
iv）前記培養過程において、ＣＤ１０５陽性である間葉系幹細胞を分離回収すること、及び
v）前記分離回収したＣＤ１０５陽性細胞を、生体外で筋芽細胞へ分化誘導可能なそれぞれの条件で更に培養すること、
を包含する生産方法。
【請求項７】
前記多能性幹細胞としてＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を使用する、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導過程において得られる間葉系幹細胞とその生産方法に関する。詳しくは、高率に筋芽細胞へ分化し得るＣＤ１０５陽性の間葉系幹細胞とその生産方法に関する。
なお、本国際出願は２００８年４月１８日に出願された日本国特許出願第２００８−１０９００２号に基づく優先権を主張しており、その出願の全内容は本明細書中に参照として組み入れられている。
【背景技術】
【０００２】
再生医療において、人工的に培養した細胞や組織を用いて、病気や事故などによって失われた細胞、組織、器官の再生や機能の回復させる取り組みが進められている。特に、動脈硬化症・心筋梗塞・肝硬変・糖尿病等の生活習慣病や、有効な治療薬のないパーキンソン病・筋ジストロフィーなどの難病に対する治療として、移植に適合する安全且つ効果的な細胞の探索が行われている。
間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ；ＭＳＣ）は、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、及び筋芽細胞等の、種類の異なるさまざまな間葉系の細胞へ分化する能力を持つ細胞で、自家移植が可能であることから、再生医療への応用が期待されている細胞の一つとして挙げられる。
間葉系幹細胞としては、ヒトの骨髄中に骨髄由来の間葉系幹細胞として存在しているものが知られているが、骨髄から分離して精製される量が非常に少ないため、他の生体組織から、特に脂肪組織から間葉系幹細胞（Ａｄｉｐｏｓｅ-ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ；以下「ＡＤＳＣｓ」という。）を大量に得る方法が注目されている。脂肪組織から分離されたＡＤＳＣｓは、脂肪細胞や骨細胞への多分化能力を持ち、また、免疫寛容性を持つことが報告されている（非特許文献１〜４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Zuk,P.A.et al. Mol.Biol.Cell. 13: 4279-4295, 2002
【非特許文献２】Zuk,P.A.et al. Tissue Eng. 7: 211-228, 2001
【非特許文献３】Rodriguez,A.M.et al. J.Exp.Med. 201: 1397-1405, 2005
【非特許文献４】Qu-Petersen.et al. J. Cell Biol. 157: 851-864, 2002
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、ヒトの脂肪組織中には、ＡＤＳＣｓの他にも神経、血管、及び脂肪細胞等のさまざまな細胞種が混在しており、その中からＡＤＳＣｓを効率良く分離することは困難である。
また、脂肪組織中から分離したＡＤＳＣｓは、多分化能力を有するものの、ＡＤＳＣｓから脂肪細胞又は骨細胞へと分化誘導するのに比べて、筋芽細胞には極めて分化誘導され難いことが知られている。筋芽細胞は、筋芽細胞同士が融合して管状の筋管を形成し、さらに分化を続けると最終的に骨格筋を形成する前駆細胞であり、再生医療において有用な細胞である。
従って、ＡＤＳＣｓに代わって、如何にして筋芽細胞へと分化する間葉系幹細胞を効率良く大量に分離回収するかが本発明の課題として挙げられる。【０００５】
本発明はかかる課題に鑑みてなされたものであり、その主な目的は、多能性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導過程において、筋芽細胞へ分化し得る間葉系幹細胞を効率良く且つ大量に生産する方法を提供することである。また、当該生産方法により得られる細胞培養物であって、筋芽細胞へ分化し得る間葉系幹細胞を高率に含有する細胞培養物を提供することを他の目的とする。また、そのような方法及び／又は細胞培養物の利用により、多能性幹細胞から効率よく目的の形態に分化した細胞（例えば、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、或いは筋芽細胞）を生産する方法を提供することを他の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記課題を解決すべく本発明によって提供される細胞培養物は、ヒト又は動物由来の多能性幹細胞から分化したＣＤ１０５陽性の間葉系幹細胞を含む細胞培養物であって、該培養物に含まれる細胞の少なくとも一部は、上記多能性幹細胞を脂肪細胞へ分化誘導可能な条件での培養によって筋芽細胞へ分化する能力を有する細胞であることを特徴とする。【０００７】
なお、本明細書において「多能性幹細胞」とは、成体を構成する種々の組織に分化できる多能性と自己複製能を有する未分化細胞をいい、例えば、ＥＣ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎａｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ；胚性癌種細胞）、ＥＳ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ；胚性幹細胞）、ＥＧ細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｇｅｒｍ  ｃｅｌｌ；胚性生殖細胞）、及びｉＰＳ細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ；人工多能性幹細胞）等は、ここでいう多能性幹細胞の典型例である。また、本明細書においては、ヒト又は動物（典型的には哺乳動物）に由来する多能性幹細胞をいう。
また、本明細書において「間葉系幹細胞」とは、未分化な細胞で、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、筋芽細胞、線維芽細胞、ストローマ細胞、及び腱細胞等のさまざまな間葉系の細胞へ分化する能力を持ち、且つ自己複製の能力を持つ細胞をいう。生体内においては骨髄に存在する間葉系幹細胞がその代表的なものであるが、他の組織、例えば脂肪組織、臍帯血、歯髄等から分離されたさまざまな組織由来の間葉系幹細胞が存在する。
また、本明細書において「ＣＤ１０５」とは、成長及び分化因子であるＴＧＦ−βのレセプターであって、ＡＤＳＣｓの細胞表面や、血管や血球の前駆細胞、骨髄由来幹細胞等で発現する糖タンパク質である。【０００８】
本発明者らは、多能性幹細胞のさまざまな間葉系の細胞へと分化する多能性と自己複製能を利用することによって、ヒト又は動物由来の多能性幹細胞から、脂肪細胞へ分化誘導する過程において、ＣＤ１０５陽性の間葉系幹細胞を含む細胞培養物を生産したところ、上記間葉系幹細胞には筋芽細胞に分化する能力を有する細胞が含まれることを見出し、本発明を完成するに至った。従って、上記間葉系幹細胞を分離回収し、目的の細胞（例えば、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、或いは筋芽細胞、典型的には筋芽細胞）への分化誘導可能なそれぞれの条件で更に培養すると、目的の形態に分化した細胞（例えば、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、或いは筋芽細胞、典型的には筋芽細胞）が得られる。例えば、上記ＣＤ１０５陽性の細胞培養物を筋芽細胞への分化誘導可能な条件で培養することにより、紡錘形状の筋芽細胞が得られる。
高度な機能を有する骨格筋の前駆体である筋芽細胞は、脂肪細胞や骨細胞へ分化誘導するのと比較して、間葉系幹細胞から分化誘導するのが困難である。しかしながら、ここで開示される本発明によると、ヒト又は動物由来の多能性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導過程において、筋芽細胞に分化する能力を有する細胞を高率に含む細胞培養物を容易且つ大量に得ることができる。
即ち、本発明は、筋芽細胞へ分化する能力を有する細胞を移植細胞として提供する。本発明によると、再生医療において、広範な筋肉の欠損部位や機能損傷部位の機能改善や組織形成に寄与し得る細胞培養物を好適に提供することができる。【０００９】
ここで開示される細胞培養物の好ましい一態様では、上記ヒト又は動物由来の多能性幹細胞はＥＳ細胞である。
かかるＥＳ細胞は、高い増殖能とさまざまな細胞へと分化できる多能性を持つことから本発明に係る多能性幹細胞として有用であり好ましい。
また、ここで開示される細胞培養物の他の好ましい一態様では、上記ヒト又は動物由来の多能性幹細胞はｉＰＳ細胞である。ｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞と同様の特性を持ちつつ、且つ体細胞から作製され倫理的な問題が絡まない点において、本発明にかかる目的を達成する上で特に好ましい多能性幹細胞である。【００１０】
また、ここで開示される細胞培養物の他の好ましい一態様では、上記間葉系幹細胞から分化した筋芽細胞を含むことを特徴とする。かかる態様の細胞培養物により、上記幹細胞から分化した筋芽細胞を提供することができる。
また、ここで開示される細胞培養物の他の好ましい一態様では、少なくとも５０％以上（特に好ましくは８０％以上）の細胞が上記間葉系幹細胞であることを特徴とする。かかる態様の細胞培養物によると、高率に上記幹細胞から分化した筋芽細胞を提供することができる。【００１１】
さらに、本発明は、上記目的を実現する他の側面として、ヒト又は動物由来の多能性幹細胞を培養して筋芽細胞へ分化する能力を有する間葉系幹細胞を生産する方法を提供する。
ここで開示される方法は、i）凍結保存された上記多能性幹細胞を用意すること、ii）上記用意した多能性幹細胞を未分化の状態で所定回数継代すること、iii）上記継代した上記多能性幹細胞を、生体外で脂肪細胞へ分化誘導可能な条件で培養すること、及びiv）上記培養過程において、ＣＤ１０５陽性である細胞を分離回収すること、を包含する。
本発明に係る生産方法では、ヒト又は動物由来の多能性幹細胞から脂肪細胞へ分化誘導する過程において、脂肪細胞の形成以前に出現する細胞の中から、ＣＤ１０５を発現した間葉系幹細胞のみを分離回収する。従って、ＡＤＳＣｓのように、神経、血管、及び脂肪細胞等のさまざまな細胞種が混在する脂肪組織の中からＡＤＳＣｓのみを取り出すような複雑な処理を伴わない。即ち、多能性幹細胞を脂肪細胞に分化誘導する培養の過程の中で、効率的且つ大量に間葉系幹細胞を生産することができる。【００１２】
本発明の生産方法では上記凍結保存された多能性幹細胞は、脂肪細胞への分化誘導を行う前に自己複製、即ち未分化の状態で所定回数継代する。これにより、間葉系幹細胞から筋芽細胞への分化誘導効率を向上させることができる。
例えば、ＥＳ細胞の場合、凍結保存されたＥＳ細胞（胞胚内の内部細胞塊より新たに樹立したＥＳ細胞、或いは、既に樹立されたＥＳ細胞のいずれも限定しない）を白血病抑制因子であるＬＩＦ（Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆａｃｔｏｒ）の存在下で継代を繰り返した後、脂肪細胞への分化誘導を行う。このように未分化の状態で継代を行うことにより、凍結保存された多能性幹細胞を分化誘導に適する細胞数まで増やすことができる。
また、ここで開示される方法の好ましい一態様では、上記継代は未分化の状態で８〜１２回（特に好ましくは９〜１１回）行うことを特徴とする。８〜１２回継代した多能性幹細胞を用いて脂肪細胞へ分化誘導する条件の培養を行うことによって、得られるＣＤ１０５陽性の間葉系幹細胞の筋芽細胞への分化能力を顕著に向上させることができる。
即ち、本態様の生産方法によると、凍結解凍後の多能性幹細胞の継代を８〜１２回（特に好ましくは９〜１１回）行うことによって、筋芽細胞へと分化誘導することができる能力を有する間葉系幹細胞を大量に得ることができる。その結果、かかる態様の方法では、再生医療において非常に有用な医療材料としての役割を担い得る間葉系幹細胞を提供することができる。【００１３】
ここで開示される方法の他の好ましい一態様では、生体外で脂肪細胞へ分化誘導可能な条件下で培養を行う。典型的な分化誘導可能な条件として、レチノイン酸を添加した培養液で浮遊培養した後、インシュリンおよびトリヨードサイロニン（Ｔ３）を添加した培養液で培養することが挙げられる。例えば、レチノイン酸を添加した培養液での浮遊培養は、数日間（例えば、２〜３日間、特に好ましくは２日間）行うことが好ましい。生体外で上記培養液を用いて分化誘導を行うと、多能性幹細胞の分化が促進され、培養過程において間葉系幹細胞を高率に発現させることができる。
また、ここで開示される方法の他の好ましい一態様では、上記継代した後の上記多能性幹細胞の分化誘導可能な条件での培養は、２１日を超えない期間行うことを特徴とする。２１日以上の期間培養すると多能性幹細胞のうち脂肪細胞に分化する確率が高まるため、脂肪細胞の分化以前に発現する間葉系幹細胞の分離回収効率が低下するため好ましくない。従って、継代後の培養開始から２１日を超えない期間（典型的には７〜２１日間、好ましくは７〜１４日間、特に好ましくは１２〜１４日間）培養し、後述するＣＤ１０５陽性である細胞を分離させる処理を行うことが好ましい。【００１４】
さらに、ここで開示される方法の他の好ましい一態様では、ＣＤ１０５陽性である細胞を分離する手段として、種々のセルソーティング法が用いられる。特に、好ましい態様として、マグネティックセルソーティング法（ＭＡＣＳ法）が挙げられる。例えば、かかる方法の一例として、抗ＣＤ１０５抗体にあらかじめ磁気を帯びたビーズを担持させた修飾分子を用意し、細胞表面にＣＤ１０５を発現している細胞に抗原抗体反応により該修飾分子を結合させて、該修飾分子が結合したＣＤ１０５陽性の細胞のみを磁石により分離するという方法が挙げられる。このように、本態様の方法によると、煩雑で手間のかかる操作を行うことなく、ＣＤ１０５を細胞表面に発現しているＣＤ１０５陽性の細胞（即ち間葉系幹細胞）を効率良く大量に得る（分離回収する）ことができる。【００１５】
また、本発明は、上記目的を実現する他の側面として、ヒト又は動物由来の多能性幹細胞を培養して目的の形態に分化した細胞（例えば、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、或いは筋芽細胞、典型的には筋芽細胞）を生産する方法を提供する。
この方法は、i）凍結保存された上記多能性幹細胞を用意すること、ii）上記用意した多能性幹細胞を未分化の状態で所定回数継代すること、iii）上記継代した上記多能性幹細胞を、生体外で脂肪細胞へ分化誘導可能な条件で培養すること、iv）上記培養過程において、ＣＤ１０５陽性である間葉系幹細胞を分離回収すること、及び、v）上記分離回収したＣＤ１０５陽性細胞を、生体外で目的の細胞（例えば、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、或いは筋芽細胞、典型的には筋芽細胞）へ分化誘導可能なそれぞれの条件で更に培養すること、を包含する。
好ましくは、上記多能性幹細胞としてＥＳ細胞を使用する。
また、好ましくは、上記多能性幹細胞を未分化の状態で８〜１２回（特に好ましくは９〜１１回）継代する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、多能性幹細胞を脂肪細胞に分化誘導可能な条件下で培養し、培養後１３日目の細胞をＣＤ１０５蛍光免疫染色した蛍光顕微鏡写真である。
【図２】図２は、多能性幹細胞を脂肪細胞に分化誘導可能な条件下で培養し、培養後１３日目の細胞をＣＤ１０５蛍光免疫染色した位走査顕微鏡写真である。
【図３】図３は、多能性幹細胞の継代数に対するＣＤ１０５陽性細胞の収率を示したグラフである。
【図４】図４は、ＭＡＣＳ法による分離を行っていない細胞群のＦＡＣＳによる解析結果を示す。
【図５】図５は、ＭＡＣＳ法により分離した細胞群（ＣＤ１０５陽性細胞群）のＦＡＣＳによる解析結果を示す。
【図６】図６は、ＭＡＣＳ法により分離した細胞群を位走査顕微鏡で観察した写真である。
【図７】図７は、脂肪細胞へ分化誘導したＣＤ１０５陽性細胞をＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色した細胞の観察写真である。
【図８】図８は、脂肪細胞へ分化誘導したＣＤ１０５陰性細胞をＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色した細胞の観察写真である。
【図９】図９は、骨細胞へ分化誘導したＣＤ１０５陽性細胞をＡｌｉｚａｒｉｎ  ｒｅｄ染色した細胞の観察写真である。
【図１０】図１０は、骨細胞へ分化誘導したＣＤ１０５陰性細胞をＡｌｉｚａｒｉｎ  ｒｅｄ染色した細胞の観察写真である。
【図１１】図１１は、軟骨細胞へ分化誘導したＣＤ１０５陽性細胞をＡｌｃｉａｎ  ｂｌｕｅ染色した細胞の観察写真である。
【図１２】図１２は、軟骨細胞へ分化誘導したＣＤ１０５陰性細胞をＡｌｃｉａｎ  ｂｌｕｅ染色した細胞の観察写真である。
【図１３】図１３は、筋芽細胞へ分化誘導したＣＤ１０５陽性細胞をＭ-ｃａｄｈｅｒｉｎ免疫蛍光染色した細胞の観察写真である。
【図１４】図１４は、筋芽細胞へ分化誘導したＣＤ１０５陽性細胞をＭＨＣ免疫蛍光染色した細胞の観察写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の好適な実施形態を説明する。なお、本明細書において特に言及している事項（例えば、間葉系幹細胞を生産する方法）以外の事柄であって本発明の実施に必要な事柄（例えば、多能性幹細胞の継代方法、脂肪細胞への分化誘導条件、骨細胞への分化誘導条件、軟骨細胞への分化誘導条件、筋芽細胞への分化誘導条件）は、医学、薬学、生化学、有機化学、タンパク質工学、分子生物学、獣医学、衛生学等の分野における従来技術に基づく当業者の設計事項として把握され得る。本発明は、本明細書によって開示されている技術内容と当該分野における技術常識とに基づいて実施することができる。
【００１８】
ここで開示される方法は、上述のとおり、多能性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導過程において、筋芽細胞へ分化し得る間葉系幹細胞を効率良く且つ大量に生産する方法であり、以下の工程を含む。
本発明に係る間葉系幹細胞の生産方法は、i）凍結保存された上記多能性幹細胞を用意すること、ii）上記用意した多能性幹細胞を未分化の状態で所定回数継代すること、iii）上記継代した前記多能性幹細胞を、生体外で脂肪細胞へ分化誘導可能な条件で培養すること、iv）上記培養過程において、ＣＤ１０５陽性である間葉系幹細胞を分離回収すること、を含む。
さらに、v）上記分離回収したＣＤ１０５陽性細胞を生体外で目的の細胞（例えば、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、或いは筋芽細胞、典型的には筋芽細胞）へ分化誘導可能なそれぞれの条件で更に培養することによって、目的の形態に分化した細胞（例えば、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、或いは筋芽細胞、典型的には筋芽細胞）を生産することができる。
以下、本発明に係る間葉系幹細胞の生産方法、及び該間葉系幹細胞を分化誘導させて筋芽細胞その他の目的の細胞を生産する方法について詳細に説明する。
【００１９】
本発明の目的を実現する限り、使用する多能性幹細胞は特に制限されない。成体を構成する種々の組織に分化できる多能性と自己複製能を有する細胞であって、例えば、ＥＣ細胞、ＥＳ細胞、ＥＧ細胞、及びｉＰＳ細胞等が挙げられるが、ここに開示される技術が好ましく適用される典型例として、ヒト又は動物由来のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞が挙げられる。
ＥＳ細胞としては、内部細胞塊（哺乳動物における受胎後１４日以内の胚）から多能性幹細胞を取り出し、生体外で培養できるように株化したものが挙げられる。ＥＳ細胞の培養については、例えばＬＩＦの存在下では未分化性を維持し増殖させることができる。その一方、ＬＩＦの非存在下では初期胚同様の細胞分化誘導を起こすことができる。本発明において使用されるＥＳ細胞は、胞胚内の内部細胞塊より新たに樹立したＥＳ細胞、又は既に樹立されたＥＳ細胞のいずれに限定するものではない。
また、ＥＳ細胞の由来としては、ヒト又は動物に由来するものであることが好ましい。例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタなどの哺乳動物由来のものが好ましく使用され得る。動物由来ＥＳ細胞としては、細胞バンクに登録されたＥＳ細胞株又は市販のＥＳ細胞株を使用することができる。しかしながら、ヒトの治療には、ヒト由来のＥＳ細胞を用いることが好ましい。尚、ヒト由来ＥＳ細胞としては、胚が人の生命の萌芽であること及びヒト由来ＥＳ細胞がすべての細胞に分化する可能性があることに配慮し、人の尊厳を侵すことのないよう誠実かつ慎重に取扱いを行うことが要請される。
本発明の実施に好適な他の多能性幹細胞として、ｉＰＳ細胞が挙げられる。ｉＰＳ細胞は、ＥＳ細胞のように受精卵を用いることなく、いずれかの体組織（例えば皮膚組織）に由来する体細胞（典型的には線維芽細胞）から多能性を有する細胞へと人工的に構築された細胞である。即ち、患者本人の細胞から作れるため、拒絶反応を生じずに組織の欠損部位や機能損傷部位の機能改善や組織再生を目的とする治療の一つとして、再生医療への応用が期待される細胞である。
【００２０】
また、本発明に係る多能性幹細胞としては、凍結保存された上記ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を好適に用いることができる。そして、用意した多能性幹細胞は、脂肪細胞への分化誘導を行う前に未分化の状態で継代することが好ましい。所定回数継代することによって、凍結保存された多能性幹細胞を分化誘導に適する細胞数まで増殖させることができる。また、所望する細胞種への分化誘導効率を向上させることができる。
継代の回数としては、５〜１７回が一般的に広く行われている継代回数であるが、本発明においては継代を８〜１２回（特に好ましくは９〜１１回）行うことが好ましい。凍結保存された多能性幹細胞を解凍後に８〜１２回（特に好ましくは９〜１１回）継代した多能性幹細胞を用いて脂肪細胞へ分化誘導する条件の培養を行うとよい。このことによって、得られるＣＤ１０５陽性の間葉系幹細胞の筋芽細胞への分化能力（確率）を顕著に向上させることができる。
【００２１】
生体外での脂肪細胞への分化誘導方法としては、従来から用いられている如何なる誘導方法を用いてもよく、特に限定されないが、典型的には、レチノイン酸を添加した培養液で数日間（例えば２〜３日間、特に好ましくは２日間）浮遊培養した後、インシュリンおよびトリヨードサイロニン（Ｔ３）を添加した培養液で培養する。以下の実施例に記載される培養液組成は、好適な一例である。
また、本発明の目的を実現する限り、従来この種の細胞の培養に用いられる培養条件を利用することができ、例えば、培地の種類、組成物の内容、組成物の濃度、及び培養温度等に関して特に制限はない。
また、培養期間は、典型的には２１日を超えない期間培養をするのが好ましい。脂肪細胞へと分化誘導させた多能性幹細胞は、２１日以上のような長期間培養を続けると脂肪細胞へ分化した細胞が大勢を占めるため好ましくない。従って、培養開始から２１日を超えない期間（典型的には７〜２１日間、好ましくは７〜１４日間、特に好ましくは１２〜１４日間）のうちに、後述する分離方法を用いて、ＣＤ１０５陽性の細胞を分離回収するのが好ましい。
【００２２】
発現したＣＤ１０５陽性細胞を分離回収する手段としては、従来知られた種々の方法が採用され得るが、好ましい手法として種々のセルソーティング法を用いることができる。例えば、ＦＡＣＳ法（Fluorescence Activated Cell Sorting）を用いたセルソーターやフローサイトメーターによる分離法や、ＭＡＣＳ法（Magnetic Cell Sorting）、等が挙げられる。本発明においては、多能性幹細胞から分化誘導させる方法を用いているため、生体組織から単離するような方法と異なり、細胞培養物中における間葉系幹細胞の発現量は比較的多い。従って、大量に発現した間葉系幹細胞（即ちＣＤ１０５陽性細胞）を簡易かつ効率良く分離するためＭＡＣＳ法を好ましく用いることができる。
具体的には、ＣＤ１０５に特異的に結合する抗ＣＤ１０５抗体（或いは該抗体に特異的に結合する二次抗体）に磁気ビーズを担持させたものを利用することにより、ＭＡＣＳ法によりＣＤ１０５陽性細胞を選択的に分離・回収することができる。
また、ＭＡＣＳ法によって分離収集した細胞の精製率を上げるために、ＭＡＣＳ法によって分離した細胞を、さらにセルソーターやフローサイトメーター等のＦＡＣＳ法を用いて精製することができる。
【００２３】
また、ここで開示される生産方法により得られる細胞培養物は、ヒト又は動物由来の多能性幹細胞から脂肪細胞に分化誘導する条件の培養によって発現するＣＤ１０５陽性の間葉系幹細胞を含む（好ましくは総細胞数の５０％以上の割合で含む）細胞培養物であればよく、その他の細胞を含有していてもよい。例えば、好適な一態様では、当該培養物中の細胞の少なくとも一部として筋芽細胞へ分化する能力を有する細胞を含む。この態様においても、細胞培養物には、筋芽細胞への分化誘導を阻害しない限りにおいて、上記細胞以外の種々の細胞が含まれていてもよい。
当該細胞培養物に含まれる上記ＣＤ１０５陽性の間葉系幹細胞は、例えばＣＤ１０５蛍光免疫染色によって確認することができる。細胞培養物中の全細胞（生存細胞）のうち少なくとも５０％以上（特に好ましくは８０％以上）がＣＤ１０５陽性の間葉系幹細胞として観察される細胞培養液は、本発明に係る細胞培養液として好適な一態様であって、間葉系幹細胞を目的の細胞（例えば、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、或いは筋芽細胞、典型的には筋芽細胞）へ分化誘導可能なそれぞれの条件の下で培養することにより、高率に目的の形態に分化した細胞（例えば、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、或いは筋芽細胞、典型的には筋芽細胞）を提供することができる。
【００２４】
上記細胞培養物中に目的の細胞へと分化誘導し得る細胞が存在することは、上記のようにしてＣＤ１０５陽性細胞を分離・回収した後、当該分離した細胞をそれぞれの培養条件下で培養を続ける過程において種々の生化学的アプローチ或いは形態観察により確認することができる。
例えば、顕微鏡による細胞観察、種々の細胞染色法、ハイブリダイゼーションを用いたノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ法等のさまざまな確認方法によって分化した細胞の種類を特定することができる。特に、筋芽細胞は、細胞の外形が紡錘形であり、且つ、その形状が特徴的であることから、細胞の形状を観察することによっても容易に判定することができる。或いは、細胞を抗Ｍ-ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体を使用する免疫蛍光染色および抗Ｍｙｏｓｉｎ Ｈｅａｖｙ Ｃｈａｉｎ（ＭＨＣ）抗体を使用する免疫蛍光染色を行うことにより筋芽細胞の存在を確認することができる。
一方、脂肪細胞、骨細胞及び軟骨細胞は、その細胞の形状からは判定が困難であるが、細胞内脂質を染色する（例えばＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色法により赤く染色できる。）ことにより脂肪細胞の存在を確認することができる。また、細胞をアリザリンレッド（Ａｌｉｚａｒｉｎ ｒｅｄ）染色を行うことにより骨細胞の存在を確認することができる。また、細胞をアルシアンブルー（Ａｌｃｉａｎ ｂｌｕｅ）染色を行うことにより軟骨細胞の存在を確認することができる。 
【００２５】
以下の実施例によって、本発明に係る筋芽細胞へ分化する能力を有する間葉系幹細胞を効率的に生産し得る方法（換言すれば筋芽細胞を効率的に生産する方法）の好例を詳細に説明するが、本発明を以下の実施例に限定することを意図したものではない。
【００２６】
［多能性幹細胞の継代］
本実施例では、多能性幹細胞としてマウス由来のＥＳ細胞を用いた。
ＥＳ細胞の培養液（ＥＳ−ＤＭＥＭ）は、４５００ｍｇ/ｌグルコースを含むDulbecco's modified Eagle's medium（ＤＭＥＭ；D-5796、Sigma社製品）に、１０％fetal bovine serum（ＦＢＳ；VMS1500、Vitromex社製品）、１％non-essential amino acids（NEAA；11140-50、GIBCO社製品）、１％sodium pyruvate（11360-070、GIBCO社製品）、７×１０−６％2−mercaptoethanol（M3148、Sigma社製品）、０．５％antibiotic antimycotic（15240-096、GIBCO社製品）を添加して調製した。
ＥＳ細胞の培養には、０．１％gelatin（G-1890、Sigma社製品）を含むDulbecco's Phosphate Buffered Saline（ＰＢＳ；D5652-10XIL、Sigma社製品）でコートされた直径１００ｍｍ培養皿（353003、FALCON社製品）を用いた。未分化を維持したＥＳ細胞の培養のために、ＥＳ−ＤＭＥＭに１０３ｕｎｉｔｓのLeukemia Inhibitory Factor（ＬＩＦ；ESGRO ESG1107、Chemicon社製品）を添加した培養液を使用した。
凍結保存されたマウス由来のＥＳ細胞を解凍後、培養皿に播種し、ＥＳ−ＤＭＥＭにＬＩＦを添加した培養液を加えて培養した。未分化のＥＳ細胞が培養皿の７割程度に増殖したところでＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳで３倍希釈した０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ/１ｍＭ-ＥＤＴＡ（L7K5399、Nakalai社製品）を加えて細胞を剥離した。１２００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞数をカウントして、細胞数が約５×１０５ｃｅｌｌｓ/ｄｉｓｈの濃度になるように新しい培養皿に播種した。継代の培養は、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で行った。これを継代１回目とし、この継代を７〜１８回繰り返した。詳しくは、サンプル１の未分化の多能性幹細胞は７〜１８回継代し、サンプル２は９〜１４回継代し、サンプル３は８〜１５回継代し、サンプル４は７、１０〜１２、１４回継代した。
【００２７】
［脂肪細胞へ分化誘導可能な条件下での培養］
上記継代した未分化ＥＳ細胞を、脂肪細胞へ分化誘導可能な条件下で培養を行った。
まず、分化を開始するために、ＬＩＦを含まないＥＳ−ＤＭＥＭ培養液を使用し、径１００ｍｍの培養皿の蓋に１００ｃｅｌｌｓ／μｌの濃度で細胞を含む細胞混濁液を１０μｌずつ滴下するHanging drop法により、胚様体（embryoid body;ＥＢ）を作製した。
その後２日間、ＥＳ−ＤＭＥＭに、０．０２％ all-trans retinoic acid（レチノイン酸の一種である全トランス型レチノイン酸：R2625、Sigma社製品）を添加した培養液で浮遊培養させ、さらに２日間、ＥＳ−ＤＭＥＭで浮遊培養させた。
その後、細胞をgelatinでコートされた培養皿に播種し、ＥＳ−ＤＭＥＭに０．００５％インシュリン（I-1882、Sigma社製品）と、０．００７％3,3,5−Triiodo-Ｌ-thyronine（トリヨードサイロニン（Ｔ３）；T5516、Sigma社製品）を添加した培養液で培養した。培養液は２日おきに交換した。
【００２８】
上記培養１３日目に、培養された細胞をＣＤ１０５蛍光免疫染色することによって、ＣＤ１０５陽性細胞の発現を確認した。
まず、培養細胞をＰＢＳで２回洗浄したあと、ＰＢＳで１００倍に希釈したラット抗マウスＣＤ１０５モノクローナル抗体（clone：209701、R&D社製品）を培養細胞に添加し、３７℃で、１５分間の抗原抗体反応を行った。反応終了後、供試細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４％Paraformaldehydeに１５分間浸漬することにより、供試細胞を固定した。固定後の供試細胞をＰＢＳで１０分間の洗浄を計５回行い、次いで、４００倍希釈した二次抗体であるAlexa Fluor（登録商標）色素標識ヤギ抗ラットＩｇＧ抗体（A-11007、Molecular Probes社製品）を供試細胞に添加し、室温で１時間の抗原抗体反応を行った。かかる反応後、供試細胞をＰＢＳで３０分間の洗浄を計２回行った。こうして得られた細胞を、蛍光退色を防止する水溶性封入剤である「PermaFluor（登録商標）（43499,Thermo社製品）」で封入し、次いで、蛍光顕微鏡により観察した。
かかる観察時に撮影した写真を図１及び図２にそれぞれ示す。図１は、蛍光顕微鏡で撮影した写真である。また、図２は、位走査顕微鏡で撮影した写真であって、いずれも同一視野を撮影したものである。
図１及び図２に示されるように、球形の細胞が赤く染色されていることが確認された。また、染色された細胞は、全体の５０％以上存在することを確認した。従って、培養１３日目の細胞培養物中には、全細胞中の５０％以上の割合でＣＤ１０５陽性細胞が存在していることが確認された。
【００２９】
［マグネティックセルソーティング法によるＣＤ１０５陽性細胞の分離］
上記確認後、培養皿に接着させて脂肪誘導培地で培養した細胞をＭＡＣＳ（Magnetic Cell Sorting）法を用いて分離・回収した。
まず、培養皿をＰＢＳで２回洗浄した後、ＰＢＳで希釈した５ｍＭのethylene diamine tetra acetic acid（ＥＤＴＡ：E-7889、Sigma社製品）を培地に加え、３７℃で１５分間反応させ、細胞を剥離した。次に、細胞を４℃のＰＢＳ中に０．５％bovine serum albumin（ＢＳＡ：A2934-25G、Sigma社製品）と２ｍＭのＥＤＴＡ（E-7889、Sigma社製品）を加えたＭＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒ中に移し、該細胞懸濁液を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄みをアスピレーターで吸い、細胞数をカウントした。
さらに、該細胞に対して、一次抗体としてＰＢＳで１００倍希釈したラット抗マウスＣＤ１０５モノクローナル抗体（clone：209701、R&D社製品）を加え、４℃で５分間の抗原抗体反応を行った。次に、供試細胞に上記ＭＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒを加え、１０００ｒｐｍで５分間遠心することによって洗浄し、余剰の一次抗体を除去した。その後、二次抗体としてＰＢＳで４００倍希釈したヤギ抗ラットＩｇＧ結合マイクロビーズ（130-048-501,Miltenyi Biotech社製品）を上記洗浄後の供試細胞に添加し、４℃で１５分間の抗原抗体反応を行った。その後、上記一次抗体との反応後と同様の洗浄を行い、余剰の二次抗体を除去した。
こうして得られた上記マイクロビーズでラベルされた細胞を含む細胞懸濁液を、製造元が供給しているマニュアルに従ってｍｉｎｉ−ＭＡＣＳ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｃｏｌｕｍｎ（Miltenyi Biotech社製品）に通した。これにより、ＣＤ１０５陽性細胞の選択的な分離を行った。なお、ｍｉｎｉ−ＭＡＣＳ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｃｏｌｕｍｎによる分離は、細胞の純度を高めるために連続して二度行った。
【００３０】
［ＣＤ１０５陽性細胞の収率］
上記ＭＡＣＳ法を用いて分離収集したＣＤ１０５陽性細胞の収率について、多能性幹細胞の継代数との相関を調べた。即ち、凍結保存された未分化の多能性幹細胞を解凍後、７〜１８回継代したサンプル１、９〜１４回継代したサンプル２、８〜１５回継代したサンプル３、及び７、１０〜１２、１４回継代したサンプル４のそれぞれについて、上記脂肪細胞へ分化誘導を行い、培養過程過においてＣＤ１０５陽性である細胞を分離し収率を求めた。図３は、各サンプルの継代数に対するＣＤ１０５陽性細胞の収率を示したグラフである。横軸は継代数を、縦軸は分離したＣＤ１０５陽性細胞の収率を表す。
図３から明らかなように、サンプル１、３、及び４は、継代１０回の多能性幹細胞を用いた場合、分離したＣＤ１０５陽性細胞の収率が最も高く、サンプル２では、１２回継代した多能性幹細胞を用いた場合、分離したＣＤ１０５陽性細胞の収率が最も高かった。また、いずれのサンプルでも継代数８〜１２回の多能性幹細胞を用いた場合、高収率でＣＤ１０５陽性細胞を分離することができることが確認された。
【００３１】
［ＣＤ１０５陽性細胞のＦＡＣＳ解析］
次いで、蛍光標識された抗マウスＣＤ１０５モノクローナル抗体を用いて、ＭＡＣＳ法により分離したＣＤ１０５陽性細胞の純度をＦＡＣＳ（Fluorescence Activated Cell Sorting）により解析し、分離性能を評価した。
【００３２】
即ち、ＣＤ１０５陽性細胞の収率の最も高い継代数１０回の多能性幹細胞を脂肪細胞へ分化誘導し、培養皿に接着させて脂肪誘導培地で培養した細胞を剥離した。そして、上記ＭＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒで懸濁した懸濁培養液から上澄みを除去し細胞を得た。
そして、該細胞に対して、一次抗体として蛍光物質フィコエリスリン（ＰＥ）標識された抗マウスＣＤ１０５モノクローナル抗体（clone：209701、FAB1320P、R&D社製品）をＰＢＳで１０倍希釈して加え、４℃で１０分間の抗原抗体反応を行った。次に、供試細胞に上記ＭＡＣＳ Ｂｕｆｆｅｒを加え、１０００ｒｐｍで１０分間遠心することによって洗浄し、余剰の一次抗体を除去した。その後、二次抗体としてＰＢＳで８倍希釈した抗ＰＥマイクロビーズ（130-048-801,Miltenyi Biotech社製品）を上記洗浄後の供試細胞に添加し、４℃で１５分間の抗原抗体反応を行った。上記一次抗体との反応後と同様の洗浄を行い、余剰の二次抗体を除去した。
こうして得られた上記マイクロビーズでラベルされた細胞を含む細胞懸濁液を、製造元が供給しているマニュアルに従ってｍｉｎｉ−ＭＡＣＳ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｃｏｌｕｍｎ（Miltenyi Biotech社製品）に通した。これにより、ＣＤ１０５陽性細胞の選択的な分離を行った。なお、ｍｉｎｉ−ＭＡＣＳ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｃｏｌｕｍｎによる分離は、細胞の純度を高めるために連続して二度行い、ＣＤ１０５陽性細胞を分離した。
【００３３】
上記蛍光標識された抗マウスＣＤ１０５モノクローナル抗体を用いてＭＡＣＳ法により分離した細胞群（ＣＤ１０５陽性細胞群）およびＭＡＣＳ法による分離を行っていない細胞群を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ フローサイトメーター（ＢＤ社製品）を用いて、ＰＥ陽性の細胞について解析した。図４は、ＭＡＣＳ法による分離を行っていない細胞群を示し、図５は、ＭＡＣＳ法で分離したＣＤ１０５陽性細胞群を示す。なお、ＥＧＦＰ(Enhanced GFP)の波長で定量解析に必須な画像の補正を行った。
ＦＡＣＳ解析の結果、図４に示されるように、ＭＡＣＳ法による分離を行っていない細胞群には、ＰＥ陽性のＣＤ１０５陽性細胞が３４．４％含むことが確認された。また、図５に示されるように、ＭＡＣＳ法による分離を行った細胞群は、９１．４％がＰＥ陽性のＣＤ１０５陽性細胞であることが確認された。以上の結果から、ＭＡＣＳ法を用いることにより、培養細胞からＣＤ１０５陽性細胞を高純度で分離し、収集できることが示された。
【００３４】
さらに、上記ＭＡＣＳ法により分離した細胞群を位走査顕微鏡で観察した。図６は、位走査顕微鏡で撮影したＣＤ１０５陽性細胞の写真である。
図６に示されるように、ＣＤ１０５陽性細胞は、脂肪組織中から分離したＡＤＳＣｓの細胞形状と極めてよく似た紡錘状の形状を有することが確認された。
【００３５】
［分化誘導で発現した細胞の確認］
上記ＭＡＣＳ法によって分離したＣＤ１０５陽性細胞を、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞または筋芽細胞に分化誘導可能なそれぞれの条件下で培養することにより、該ＣＤ１０５陽性細胞が目的の形態に分化した脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞または筋芽細胞へ分化誘導される否かを確認した。
【００３６】
即ち、上記ＭＡＣＳ法によって分離したＣＤ１０５陽性細胞を、ｇｅｌａｔｉｎでコートされた培養皿に低密度（１×１０３〜２．５×１０３ｃｅｌｌｓ/ｃｍ２）で播種し、それぞれの細胞への分化誘導可能なＥＳ−ＤＭＥＭ培養液で２〜３週間培養した。ＥＳ−ＤＭＥＭ培養液は２日おきに交換し、それぞれ以下の組成のものを使用した。
なお、ＭＡＣＳ法により分離されない細胞群（以下、「ＣＤ１０５陰性細胞」という）を同様の方法を用いて、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞または筋芽細胞に分化誘導可能なそれぞれの条件下で２〜３週間培養することにより、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞または筋芽細胞へ分化誘導される否かを確認した。
【００３７】
脂肪細胞への分化誘導は、従来公知の種々の脂肪細胞分化誘導用の培養液を採用することができるが、ここでは、ＥＳ−ＤＭＥＭに０．００５％インシュリン（I-1882、Sigma社製品）、０．００７％3,3,5−Triiodo-Ｌ-thyronine（トリヨードサイロニン（Ｔ３）；T5516、Sigma社製品）、1μＭ Dexamethasone(D4902-25MG、Sigma社製品)、５００μＭ 3-Isobutyl-1-methyl-xanthin (IBMX；I5879-100MG、Sigma社製品)を加えたＥＳ−ＤＭＥＭ培養液を用いた。
骨細胞への分化誘導は、従来公知の種々の骨細胞分化誘導用の培養液を採用することができるが、ここでは、ＥＳ-ＤＭＥＭに０．１μＭのDexamethasone（D4902-25MG、Sigma社製品）、１０ｍＭ β-glycerol phosphate (37177-30 、KANTO CHEMICAL社製品)、２００μＭ ascorbic acid（A4544-25G、Sigma社製品）を加えたＥＳ−ＤＭＥＭ培養液を用いた。
軟骨細胞への分化誘導は、従来公知の種々の軟骨細胞分化誘導用の培養液を採用することができるが、ここでは、無血清のＥＳ−ＤＭＥＭに１０ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦβ３(243-B3、Sigma社製品)、１００ｎＭ ＰＴＨ（parathyroid hormone、12583-68-5、Sigma社製品)、１％ ＦＢＳを加えた培養液を用いた。
筋芽細胞への分化誘導は、従来公知の種々の筋芽細胞分化誘導用の培養液を採用することができるがここでは、無血清のＥＳ-ＤＭＥＭに５％血清代替物（ＫＳＲ：KNOCKOUT（登録商標）Serum Replacement（10828-028、Invitrogen社製品）を加えた培養液を用いた。
【００３８】
そして、分化誘導により生じた細胞を観察し、細胞の種類を判定した。細胞の種類の判定は、以下の方法により行った。
【００３９】
脂肪細胞へ分化誘導された細胞は、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色により判定を行った。０．３％Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ（115K0683、Sigma社製品）,１-Propanol（24-6070-5、Sigma社製品）溶液を保存液とし、保存液を蒸留水と６：４の割合で希釈し、ろ過したものをＯｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色液として使用した。また、同時に細胞の核を染色するためにHematoxylin液を使用した。
まず、培養細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳに溶解した４％Paraformaldehye（24-0630-5、Sigma社製品）に３０分間浸漬することにより細胞を固定した。次に，固定された供試細胞をＰＢＳで３０分間洗浄し、次に６０％１-Propanolで１分間反応させた。上記Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色液を添加後、３７℃で１５分間反応させた。その後、６０％１-Propanolで２分間反応させ、次いで蒸留水で２分間洗浄した。
その後、Hematoxylin液で５分間核を染色し、蒸留水で２分間洗浄した。最後にＰＢＳで希釈した８０％ Glycerol（12-1120-5、Sigma社製品）で封入した。
上記Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色した細胞の観察写真を図７および図８に示す。図７は、ＣＤ１０５陽性細胞を、図８は、ＣＤ１０５陰性細胞を示す。
【００４０】
骨細胞へ分化誘導し発現した細胞は、Ａｌｉｚａｒｉｎ  ｒｅｄ染色を用いて確認した。まず、１％ Alizarin red S水溶液(A5533-25G、Sigma社製品)に２８％アンモニア水溶液(MKD1711、米山薬品工業株式会社製品)をゆっくりと加え、ｐＨ６．３６〜６．４０に調整したものをＡｌｉｚａｒｉｎ ｒｅｄ染色液として使用した。そして、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、４％Paraformaldehyde（24-0630-5,Sigma社製品）で３０分間固定した。これをさらに蒸留水で数回洗浄し、Ａｌｉｚａｒｉｎ ｒｅｄ染色液を加え、５分間反応させた。最後に蒸留水で数回洗浄後、Glycerolで封入した。
上記Ａｌｉｚａｒｉｎ  ｒｅｄ染色した細胞の観察写真を図９および図１０に示す。図９は、ＣＤ１０５陽性細胞を、図１０は、ＣＤ１０５陰性細胞を示す。
【００４１】
また、軟骨細胞へ分化誘導し発現した細胞は、Ａｌｃｉａｎ  ｂｌｕｅ染色を用いて確認した。まずＰＢＳで２回洗浄したのち、ＰＢＳに４％Paraformaldehyde（24-0630-5,Sigma社製品）を含む固定液で１５分間固定した。その後、ＰＢＳで１５分間洗浄し、さらに３％酢酸水溶液で５分間洗浄した。洗浄後、Alcian blue8GX １ｇを３％酢酸溶水溶液１００ｍｌに溶解したものをＡｌｃｉａｎ ｂｌｕｅ染色液として調製し、該染色液を添加して３０分間染色した。そして、３％酢酸溶水溶液で５分間洗浄し、さらに蒸留水で５分間洗浄した。最後にＰＢＳで希釈した８０％ Glycerol (12-1120-5、Sigma社製品)で封入した。
上記Ａｌｃｉａｎ  ｂｌｕｅ染色した細胞の観察写真を図１１および図１２に示す。図１１は、ＣＤ１０５陽性細胞を、図１２は、ＣＤ１０５陰性細胞を示す。
【００４２】
さらに、筋芽細胞へ分化誘導し発現した細胞は、抗Ｍ-ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体を使用する免疫蛍光染色および抗Ｍｙｏｓｉｎ Ｈｅａｖｙ Ｃｈａｉｎ（ＭＨＣ）抗体を使用する免疫蛍光染色によりそれぞれ確認した。まず、ＰＢＳで２回洗浄したのち、ＰＢＳに４％Paraformaldehyde（24-0630-5,Sigma社製品）を含む固定液で１５分間固定した。その後、ＰＢＳで１５分間洗浄し、正常ヤギ血清（G9023,Sigma社製品）を０．１％Triton PBSで１０％に希釈したブロッキング液を加えて、３７℃で３０分間非特異反応を抑制した。次いで、一次抗体である抗Ｍｙｏｓｉｎ Ｈｅａｖｙ Ｃｈａｉｎ抗体（MHC;clone A4.1025,Upstate社製品）および抗Ｍ-ｃａｄｈｅｒｉｎ抗体（clone 12G4,Nanotools社製品）を０．１％Triton PBSでそれぞれ２００倍、１００倍希釈したものを加え、３７℃で1時間の抗原抗体反応を行った。かかる反応後、ＰＢＳで１５分間洗浄した。さらに、二次抗体であるヤギのAlexa594標識抗マウスIgG抗体（A11001,Molecular Probes社製品）を０．１％%Triton PBSで２００倍希釈したものを添加し、３７℃で１時間抗原抗体反応を行った。その後、室温でＰＢＳにより１５分間洗浄し、蛍光退色防止封入剤PermaFluor（登録商標）（43499,Thermo社製品）で封入した。上記Ｍ-ｃａｄｈｅｒｉｎ免疫蛍光染色およびＭＨＣ免疫蛍光染色したＣＤ１０５陽性細胞の観察写真を、それぞれ、図１３および図１４に示す。
【００４３】
上記目的の脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞または筋芽細胞へ分化誘導可能な条件で発現した各細胞の判定結果を以下に述べる。
まず、脂肪細胞への分化誘導においては、図７および図８に示されるように、図７のＣＤ１０５陽性細胞は、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色により脂肪細胞が確認された。一方、図８のＣＤ１０５陰性細胞は、脂肪細胞へ分化誘導を行っても脂肪細胞は発現していないことが確認された。
また、骨細胞への分化誘導では、図９および図１０に示されるように、図９のＣＤ１０５陽性細胞は、Ａｌｉｚａｒｉｎ  ｒｅｄ染色により骨細胞が確認された。一方、図１０のＣＤ１０５陰性細胞は、骨細胞へ分化誘導を行っても骨細胞は発現していないことが確認された。
また、軟骨細胞への分化誘導では、図１１および図１２に示されるように、図１１のＣＤ１０５陽性細胞は、Ａｌｃｉａｎ  ｂｌｕｅ染色により軟骨細胞が確認された。一方、図１２のＣＤ１０５陰性細胞は、軟骨細胞へ分化誘導を行っても軟骨細胞は発現していないことが確認された。
さらに、筋芽細胞への分化誘導では、図１３および図１４に示されるように、図１３のＭ-ｃａｄｈｅｒｉｎ免疫蛍光染色および図１４のＭｙｏｓｉｎ  Ｈｅａｖｙ  Ｃｈａｉｎ（ＭＨＣ）免疫蛍光染色ともに、ＣＤ１０５陽性細胞は筋芽細胞が確認された。また、図示しないが、ＣＤ１０５陰性細胞は、筋芽細胞へ分化誘導を行っても筋芽細胞は発現していないことが確認された。
【００４４】
［ＲＴ-ＰＣＲ解析］
次いで、上記ＭＡＣＳ法によって分離したＣＤ１０５陽性細胞を、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞または筋芽細胞に分化誘導可能なそれぞれの条件下で培養することにより、該ＣＤ１０５陽性細胞が目的の細胞へ分化誘導されたか否かをＲＴ-ＰＣＲ法を用いて解析した。
【００４５】
ＲＴ−ＰＣＲ解析は、従来公知の一般的な方法を採用することができるが、ここでは、以下の方法により行った。
即ち、培養皿に接着している分化誘導した細胞をCell Scraperを用いて剥離し、超音波破砕機（Handy Sonic ,TOMY SEIKO社製品）によって細胞を破砕した。ＲＮＡ抽出キット（RNeasy, Quiagen社製品）を用いてｍＲＮＡのみを収集し、吸光度計(Nanodrop社製品)により計量した。そして、収集したＲＮＡから、Oligo (dT) Primer（18418-012、Invitrogen社製品）を用いて、逆転写酵素Superscript reverse transcriptase II（Invitrogen社製品）によりテンプレートとなるｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲでは、Taq DNA polymeraseとしてBlend Taq（登録商標）（Toyobo社製品）と、付属のBuffer（BTQ-101、Toyobo）、及び各細胞の遺伝子に特異的な以下のプライマーをそれぞれ使用した。脂肪細胞のプライマーとしては、ＰＰＡＲγおよびＬＰＬを使用し、骨細胞のプライマーとしては、Ｒｕｎｘ ２およびＯｓｔｅｒｉｘを使用した。また、軟骨細胞のプライマーとしては、Ｃｏｌｌａｇｅｎ ２ａｌおよびＡｇｇｌｙｃａｎを使用し、筋芽細胞のプライマーとしては、Ｍ-ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＭＨＣ，ＭｙｏＤ、およびＭｙｆ５を使用した。また、ＰＣＲ反応のサイクル条件は、９５℃ ６０秒間、６０℃ ３０秒間、７０℃３０秒間で合計３６サイクル行った。サイクル後、ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル（800171、NIPPON GENE社製品）に装填し、Mulpid-2plus（１００Ｖ、４５分;ADVANCE社製品）で電気泳動した。電気泳動したアガロースゲルは、CYBR safe DNA gel stain（54022A、invitrogen社製品）を用いて染色し、FAS-III（Toyobo社製品）でそれぞれの特異的バンドを検出した。
【００４６】
ＲＴ−ＰＣＲ解析の結果、脂肪細胞へ分化誘導された細胞には、脂肪細胞で特異的に発現するＰＰＡＲγおよびＬＰＬのｍＲＮＡのバンド（図示しない）を確認した。また、骨細胞へ分化誘導された細胞には、骨細胞で特異的に発現するＲｕｎｘ ２およびＯｓｔｅｒｉｘのｍＲＮＡのバンド（図示しない）を確認した。軟骨細胞へ分化誘導された細胞には、軟骨細胞で特異的に発現するＣｏｌｌａｇｅｎ ２ａｌおよびＡｇｇｌｙｃａｎのｍＲＮＡのバンド（図示しない）を確認した。さらに、筋芽細胞へ分化誘導された細胞には、筋芽細胞で特異的に発現するＭ-ｃａｄｈｅｒｉｎ、ＭＨＣ，ＭｙｏＤ、およびＭｙｆ５のｍＲＮＡバンドのバンド（図示しない）を確認した。
【００４７】
以上の結果から、上記ＭＡＣＳ法によって分離したＣＤ１０５陽性細胞は、目的の形態に分化した細胞（脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、または筋芽細胞）を高効率に発現する能力を備えた間葉系幹細胞であることが示された。また、ここで開示される生産方法および細胞培養物によって、多能性幹細胞由来の脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞または筋芽細胞を提供することができることが確認された。
【００４８】
［継代数の異なる多能性幹細胞による分化能の確認］
さらに、継代数の異なる多能性幹細胞を用いて脂肪細胞への分化誘導を行い、ＣＤ１０５陽性細胞を分離した。そして、それぞれ分離したＣＤ１０５陽性細胞を、脂肪細胞または筋芽細胞へ分化誘導し細胞を観察した。
【００４９】
＜サンプルＡ＞
多能性幹細胞として、上記実施の形態と同様に未分化の凍結保存されたマウス由来のＥＳ細胞を用いて１０回継代した。これをサンプルＡとし、ＥＳ細胞を１０回継代した後、上述と同様の方法を用いて生体外で脂肪細胞への分化誘導を行い、ＭＡＣＳ法を用いてＣＤ１０５陽性細胞を分離した。さらに、分離したＣＤ１０５陽性細胞を生体外で筋芽細胞へ分化誘導可能な条件でさらに２０日間培養し、分化誘導により生じた細胞を観察した。
【００５０】
＜サンプルＢ＞
サンプルＢでは、上述のサンプルＡと同様の凍結保存されたマウス由来のＥＳ細胞を多能性幹細胞として用いて継代した。ただし、継代回数を５回と変更した。
それ以外は、サンプルＡと同様の手順で、継代した多能性幹細胞を用いて脂肪細胞への分化誘導を行い、ＭＡＣＳ法を用いてＣＤ１０５陽性細胞を分離した。
さらに、分離したＣＤ１０５陽性細胞をサンプルＡと同様に生体外で筋芽細胞へ分化誘導可能な条件でさらに２０日間培養し、分化誘導により生じた細胞を観察した。
【００５１】
＜サンプルＣ＞
サンプルＣでは、上述のサンプルＡと同様の凍結保存されたマウスのＥＳ細胞を多能性幹細胞として用いて継代した。ただし、継代回数を１７回と変更した。
それ以外は、サンプルＡと同様の手順で、継代した多能性幹細胞を用いて脂肪細胞への分化誘導を行い、ＭＡＣＳ法を用いてＣＤ１０５陽性細胞を分離した。
さらに、分離したＣＤ１０５陽性細胞をサンプルＡと同様に生体外で筋芽細胞へ分化誘導可能な条件でさらに２０日間培養し、培養過程で分化した細胞を観察した。
【００５２】
而して、顕微鏡による観察の結果、サンプルＡでは、筋芽細胞へ分化誘導した細胞は、紡錘形の筋芽細胞（図示しない）が確認された。従って、サンプルＡに係る細胞培養物に含まれるＣＤ１０５陽性の細胞は高効率に筋芽細胞へ分化し得る能力を備えた間葉系幹細胞であることが示された。また、ここで開示される生産方法および細胞培養物によって、多能性幹細胞由来の筋芽細胞を提供することができることが確認された。
一方、サンプルＢ及びサンプルＣでは、筋芽細胞へ分化誘導した細胞を顕微鏡観察したが、紡錘形の細胞の存在が確認されなかった。そこで、サンプルＢおよびサンプルＣの多能性幹細胞を脂肪細胞へ分化誘導し、Ｏｉｌ Ｒｅｄ Ｏ染色を行ったところ、サンプルＢおよびサンプルＣ（図示しない）の分化誘導後に生じた細胞は赤く染まったことから、脂肪細胞であることが確認された。従って、サンプルＡと継代回数の異なるサンプルＢ及びサンプルＣに係るＣＤ１０５陽性の細胞は、高確率で脂肪細胞へ分化し得る間葉系幹細胞であることが示された。このことから、継代回数が１０回の多能性幹細胞を脂肪細胞へ分化誘導し分離したＣＤ１０５陽性細胞は、高効率で筋芽細胞へ分化誘導することが確認された。また、継代回数が５回または１７回の多能性幹細胞を脂肪細胞へ分化誘導すると、ＣＤ１０５陽性細胞を僅かに収集することはできた。しかしながら、筋芽細胞へ分化誘導した細胞は顕微鏡観察では筋芽細胞を確認できなかったが、脂肪細胞へ分化誘導すると脂肪細胞を発現することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
以上の実施の形態から明らかなように、本発明よると、多能性幹細胞から脂肪細胞への分化誘導過程において、筋芽細胞或いはその他の目的の細胞へ分化し得る間葉系幹細胞を効率良く且つ大量に生産する方法を提供することができる。従って、本発明の実施によって、従来は間葉系幹細胞から分化誘導され難い細胞種であった筋芽細胞を多能性幹細胞から大量に生産することができる。
【図３】
0005429755.tif 000002
【図１】
0005429755.tif 000003
【図２】
0005429755.tif 000004
【図４】
0005429755.tif 000005
【図５】
0005429755.tif 000006
【図６】
0005429755.tif 000007
【図７】
0005429755.tif 000008
【図８】
0005429755.tif 000009
【図９】
0005429755.tif 000010
【図１０】
0005429755.tif 000011
【図１１】
0005429755.tif 000012
【図１２】
0005429755.tif 000013
【図１３】
0005429755.tif 000014
【図１４】
0005429755.tif 000015