(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの異なる髄膜炎菌因子Ｈ結合タンパク質（ｆＨＢＰ）抗原を含む免疫原性組成物であって、前記髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原の両方は、ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントに吸着され、ここで、（ｉ）前記髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原の両方は、５．０〜７．０の等電点を有し、（ｉｉ）前記ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントは、５．０〜７．０のゼロ電荷点を有し、ここで、前記２つの異なるｆＨＢＰ抗原は、（ｉ）配列番号４と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１ポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号６と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２ポリペプチドであり、前記組成物はさらに、ｐＨを５．０〜７．０の範囲に維持する緩衝剤を含み、Ａｌ＋＋＋濃度は、＜２ｍｇ／ｍｌであり、かつ、前記ポリペプチドはそれぞれ１〜５００μｇ／用量で存在する、組成物。
【請求項２】
２つの異なる髄膜炎菌因子Ｈ結合タンパク質（ｆＨＢＰ）抗原を含む免疫原性組成物であって、前記髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原の両方は、ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントに吸着され、ここで、前記髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原の両方は、５．０〜７．０の等電点を有し、ここで、前記２つの異なるｆＨＢＰ抗原は、（ｉ）配列番号４と少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ末端システインにて脂質付加された第１ポリペプチドと、（ｉｉ）配列番号６と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、Ｎ末端システインにて脂質付加された第２ポリペプチドであり、そしてここで、前記組成物は、（ｉ）ｐＨを５．０〜７．０の範囲に維持するヒスチジン緩衝剤を含み、（ｉｉ）２ｍｇ／ｍｌ未満のＡｌ＋＋＋濃度を有し、（ｉｉｉ）ＮａＣｌを含み、（ｉｖ）ポリソルベート８０を含み、かつ、（ｖ）１〜５００μｇ／用量の各ｆＨＢＰポリペプチドを含む、組成物。
【請求項３】
第１および第２の髄膜炎菌ｆＨＢＰポリペプチドと、ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントと、ヒスチジン緩衝剤とを含む免疫原性組成物であって、ここで：
（ｉ）前記第１のｆＨＢＰポリペプチドは配列番号４と少なくとも９５％の同一性を有する酸配列を有し、かつ、前記第２のｆＨＢＰポリペプチドは配列番号６と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、
（ｉｉ）前記髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原の両方は、５．２〜６．２の等電点を有し、
（ｉｉｉ）前記ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントは、５．０〜７．０のゼロ電荷点を有し、
（ｉｖ）前記緩衝剤は、ｐＨを５．０〜７．０の範囲に維持し、
（ｖ）前記組成物中のＡｌ＋＋＋濃度は、＜２ｍｇ／ｍｌであり、
（ｖｉ）各ｆＨＢＰポリペプチドの合計量は１２０〜５００μｇ／用量であり、そして、
（ｖｉｉ）前記髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原の両方は、前記ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントに少なくとも８５％吸着されている、
組成物。
【請求項４】
第１および第２の髄膜炎菌ｆＨＢＰポリペプチドをヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントに吸着させて免疫原性組成物を得るための方法であって、
（ｉ）前記第１のｆＨＢＰポリペプチドは配列番号４と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、前記第２のｆＨＢＰポリペプチドは配列番号６と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、
（ｉｉ）前記髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原の両方が、５．２から６．２の間の等電点を有し、
（ｉｉｉ）前記ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントが、５．０から７．０の間のゼロ電荷点を有し、
（ｉｖ）前記組成物は、ｐＨを５．０〜７．０の範囲に維持するヒスチジン緩衝剤を含み、
（ｖ）前記組成物中のＡｌ＋＋＋濃度は、＜２ｍｇ／ｍｌであり、
（ｖｉ）各ｆＨＢＰポリペプチドの合計量は１２０μｇ／用量〜５００μｇ／用量であり、そして、
（ｖｉｉ）前記髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原の両方は、前記ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントに少なくとも８５％吸着されており、
前記ｆＨＢＰポリペプチドの両方の吸着が、５．０から７．０の間のｐＨで生じる、方法。
【請求項５】
ＮａＣｌをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＮａＣｌが１０±２ｍｇ／ｍｌの濃度である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記緩衝剤がヒスチジン緩衝剤である、請求項１、５および６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
ポリソルベート８０をさらに含む、請求項１および５〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記ポリソルベート８０が、０．０１〜０．０５％の濃度であり、前記ｆＨＢＰポリペプチドが脂質付加されている、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ｆＨＢＰ抗原の各々が８５％以上吸着されている、請求項１および５〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記髄膜炎菌ｆＨＢＰポリペプチドの両方が５．０から６．０の間の等電点を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
（ｉ）前記髄膜炎菌ｆＨＢＰポリペプチドの両方が５．０から６．０の間の等電点を有し、（ｉｉ）前記ヒドロキシリン酸アルミニウムが、５．０から６．０の間の等電点を有する、請求項４または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記緩衝剤が、ｐＨを５．０〜６．０の範囲に維持する、請求項４および１１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物が、前記アジュバントのゼロ電荷点の０．５ｐＨ単位以内のｐＨを有する、請求項４および１１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ｆＨＢＰポリペプチドが前記ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントに９０％以上吸着されている、請求項４および１１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ｆＨＢＰポリペプチドが前記ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントに９５％以上吸着されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物が、（ａ）１ｍｇ／ｍｌ以下のＡｌ＋＋＋、または、（ｂ）０．２ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌの間のＡｌ＋＋＋を有する、請求項４および１１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物が、ヒトのワクチン用量において、２０、４０、５０、６０、８０、１００または２００μｇの各ｆＨＢＰポリペプチドを有する、請求項４および１１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物が１０±２ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌを含む、請求項４および１１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記２つの異なるｆＨＢＰポリペプチドが、（ａ）配列番号２３のアミノ酸配列を有する第１のリポタンパク質と、（ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を有する第２のリポタンパク質である、請求項４および１１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ｆＨＢＰポリペプチドが、Ｎ末端システインにて脂質付加されており、前記脂質がパルミトイルを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記組成物が水酸化アルミニウムアジュバントを含まない、請求項４および１１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記組成物が結合体化細菌莢膜糖を含む、請求項４および１１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ヒドロキシリン酸アルミニウムが、（ｉ）５．４から６．２の間のＰＺＣを有する、および／または、（ｉｉ）０．８５から１．０の間のＰ／Ａｌモル比を有する、および／または、（ｉｉｉ）非晶質であり、直径１０〜１００ｎｍの板を含む粒子状である、請求項４および１１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記髄膜炎菌ｆＨＢＰポリペプチドの両方が５．０から６．０の間の等電点を有する、請求項１〜３および５〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
（ｉ）前記髄膜炎菌ｆＨＢＰポリペプチドの両方が５．０から６．０の間の等電点を有し、（ｉｉ）前記ヒドロキシリン酸アルミニウムが、５．０から６．０の間の等電点を有する、請求項１〜３、５〜１０および２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記緩衝剤が、ｐＨを５．０〜６．０の範囲に維持する、請求項１〜３、５〜１０および２５〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記組成物が、前記アジュバントのゼロ電荷点の０．５ｐＨ単位以内のｐＨを有する、請求項１〜３、５〜１０および２５〜２７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
前記ｆＨＢＰポリペプチドが前記ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントに９０％以上吸着されている、請求項１〜３、５〜１０および２５〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ｆＨＢＰポリペプチドが前記ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントに９５％以上吸着されている、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記組成物が、（ａ）１ｍｇ／ｍｌ以下のＡｌ＋＋＋、または、（ｂ）０．２ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌの間のＡｌ＋＋＋を有する、請求項１〜３、５〜１０および２５〜３０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３２】
前記組成物が、ヒトのワクチン用量において、２０、４０、５０、６０、８０、１００または２００μｇの各ｆＨＢＰポリペプチドを有する、請求項１〜３、５〜１０および２５〜３１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３３】
前記組成物が１０±２ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌを含む、請求項３、および、請求項３に従属する場合の請求項２５〜３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３４】
前記２つの異なるｆＨＢＰポリペプチドが、（ａ）配列番号２３のアミノ酸配列を有する第１のリポタンパク質と、（ｂ）配列番号２５のアミノ酸配列を有する第２のリポタンパク質である、請求項１〜３、５〜１０および２５〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３５】
前記ｆＨＢＰポリペプチドが、Ｎ末端システインにて脂質付加されており、前記脂質がパルミトイルを含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記組成物が水酸化アルミニウムアジュバントを含まない、請求項１〜３、５〜１０および２５〜３５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３７】
前記組成物が結合体化細菌莢膜糖を含む、請求項１〜３、５〜１０および２５〜３６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３８】
前記ヒドロキシリン酸アルミニウムが、（ｉ）５．４から６．２の間のＰＺＣを有する、および／または、（ｉｉ）０．８５から１．０の間のＰ／Ａｌモル比を有する、および／または、（ｉｉｉ）非晶質であり、直径１０〜１００ｎｍの板を含む粒子状である、請求項１〜３、５〜１０および２５〜３７のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、米国仮出願第６１／１６２，９９９号（２００９年３月２４日出願）からの優先権を主張する。この出願の完全な内容は、参考として本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、髄膜炎菌ワクチン、特にｆＨＢＰ抗原を含有するものの分野にある。
【背景技術】
【０００３】
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ（髄膜炎菌）は、グラム陰性の球状細菌である。現在の髄膜炎菌ワクチンも、莢膜糖に基づく。これらは、１価血清群Ｃ結合体ワクチン（ＭＥＮＪＵＧＡＴＥ（商標）、ＭＥＮＩＮＧＩＴＥＣ（商標）、ＮＥＩＳＶＡＣ−Ｃ（商標））と、血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙについての４価結合体混合物（ＭＥＮＡＣＴＲＡ（商標））とを含む。血清群Ｂ（「ＭｅｎＢ」）に対する一般的な使用のために承認された有用なワクチンは、現在のところ存在しない。
【０００４】
ＭｅｎＢに対する免疫化における使用が提案されているある抗原は、Ｈ因子結合タンパク質（ｆＨＢＰ）である。この抗原は、タンパク質「７４１」（参考文献３４（特許文献１）中の配列番号２５３５および２５３６）、「ＮＭＢ１８７０」、「ＧＮＡ１８７０」［参考文献１〜３（非特許文献１〜３）］、「Ｐ２０８６」、「ＬＰ２０８６」または「ＯＲＦ２０８６」［４〜６］とも呼ばれている。このタンパク質は、よく研究されている。これは、天然ではリポタンパク質であり、すべての髄膜炎菌血清群にわたって発現されている。ｆＨｂｐのＣ末端免疫優性ドメイン（「ｆＨｂｐＣ」）の構造は、ＮＭＲにより決定されている［７］。タンパク質のこの部分は、８本鎖のβバレルを形成し、その鎖は、種々の長さのループで連結されている。バレルの前には、短いαヘリックスとフレキシブルＮ末端テイルがある。
【０００５】
ｆＨＢＰ抗原は、３つの別々のバリアントに当てはまり［８］、ある所定のファミリーに対して産生された血清が、同じファミリー内で殺菌性であるが、その他の２つのファミリーの１つを発現する株に対しては活性でない、すなわちファミリー内交差防御が存在するが、ファミリー間交差防御は存在しないことが見出されている。よって、参考文献８は、ｆＨＢＰの異なるバリアントを単一のワクチン組成物に組み合わせることにより、別々のタンパク質の混合物としてまたは異なるバリアントの融合タンパク質として（後者は「タンデムタンパク質」である）、株の適用範囲（ｃｏｖｅｒａｇｅ）を増加させることを提案している。
【０００６】
参考文献９も、ｆＨＢＰタンデムタンパク質について報告している（参考文献９の第１８〜１９頁）。このタンデムタンパク質は、精製され、アジュバントとしてのリン酸アルミニウムと混合されたが、アジュバントに良好に吸着されないことが報告されている。抗原の良好な吸着が望ましく、このような混合されたｆＨＢＰタンパク質は、代わりにアジュバントとして水酸化アルミニウムを用いると容易に吸着することが見出されている。
【０００７】
しかし、アジュバントとして水酸化アルミニウムを用いる場合の問題は、これがあるいくつかの抗原を分解できることである。例えば、参考文献１０は、これがＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ型結合体ワクチンを低温であっても加水分解し、よって、効力の低減を導くことができることを報告している。同様に、水酸化アルミニウムの存在下でのＳ．ｔｙｐｈｉ  Ｖｉ莢膜糖の加水分解が、参考文献１１において報告されている。よって、アジュバント添加した（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）ワクチンを（製造中または使用時のいずれかに）、水酸化アルミニウムにより損傷されやすいと考えられる抗原、例えば結合体化細菌莢膜糖と混合する場合には特に、リン酸アルミニウムに基づくアジュバントを用いて抗原を処方することが望ましくあり得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第０３／０６３７６６号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍａｓｉｇｎａｎｉら、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ（２００３）１９７：７８９〜７９９
【非特許文献２】Ｗｅｌｓｃｈら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００４）１７２：５６０５〜１５
【非特許文献３】Ｈｏｕら、Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ（２００５）１９２（４）：５８０〜９０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
よって、ｆＨＢＰ（複数可）がアジュバントに吸着されているが、水酸化アルミニウムを必要としないｆＨＢＰ、特に複数のｆＨＢＰバリアントの処方物を提供する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ヒドロキシリン酸アルミニウム（ａｌｕｍｉｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ）アジュバントへのｆＨＢＰタンパク質の効率的な吸着を達成するための一般的な技術を同定した。ヒドロキシリン酸アルミニウムの使用は、水酸化アルミニウムの使用の必要性を回避でき、本発明者らの技術は、参考文献９に記載される非効率的な吸着を回避する。吸着技術は、特に、複数のｆＨＢＰバリアントを含む組成物について有用である。
本発明は例えば以下の項目を提供する：
（項目１）
少なくとも２つの異なる髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原を含む緩衝免疫原性組成物であって、前記髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原の両方は、ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントに少なくとも８５％吸着されている、組成物。
（項目２）
（ｉ）前記２つの異なるｆＨＢＰ抗原のそれぞれが、５．０から７．０の間の等電点を有し、（ｉｉ）前記ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントが、５．０から７．０の間のゼロ電荷点を有する、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記緩衝組成物のｐＨが、５．０〜７．０の範囲である、項目１または項目２に記載の組成物。
（項目４）
２つの異なる髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原を含む免疫原性組成物であって、前記髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原の両方は、ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントに吸着され、ここで、（ｉ）前記髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原の両方は、５．０〜７．０の等電点を有し、（ｉｉ）前記ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントは、５．０〜７．０のゼロ電荷点を有する、組成物。
（項目５）
２つの異なる髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原をヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントに吸着させて免疫原性組成物を得るための方法であって、（ｉ）前記髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原の両方が、５．０から７．０の間の等電点を有し、（ｉｉ）前記ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントが、５．０から７．０の間のゼロ電荷点を有し、（ｉｉｉ）前記ｆＨＢＰ抗原の両方の吸着が、５．０から７．０の間のｐＨで生じる、方法。
（項目６）
共にヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントに吸着された２つの異なる髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原を含む緩衝免疫原性組成物であって、（ｉ）それぞれの髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原が、前記アジュバントのゼロ電荷点より高い等電点を有し、（ｉｉ）前記組成物が、前記アジュバントのゼロ電荷点の１．２ｐＨ単位以内のｐＨを有する、組成物。
（項目７）
２つの異なる髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原をヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントに吸着させるための方法であって、（ｉ）前記髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原が共に前記アジュバントのゼロ電荷点よりも高い等電点を有し、（ｉｉ）それぞれの抗原の吸着が、前記アジュバントのゼロ電荷点の１．２ｐＨ単位以内の緩衝されたｐＨで生じる、方法。
（項目８）
２つの異なる髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原をヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントに吸着させるための方法であって、前記ｆＨＢＰ抗原の両方の吸着が、前記ヒドロキシリン酸アルミニウムのゼロ電荷点以下のｐＨで生じる、方法。
（項目９）
ｐＨを５．０〜７．０の範囲に維持する緩衝剤を含む、項目４に記載の組成物。
（項目１０）
前記髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原の両方が５．０から６．０の間の等電点を有する、前記項目のいずれかに記載の方法または組成物。
（項目１１）
前記ヒドロキシリン酸アルミニウムが、５．０から６．０の間の等電点を有する、項目５に記載の方法または項目４に記載の組成物。
（項目１２）
（ｉ）前記髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原の両方が５．０から６．０の間の等電点を有し、（ｉｉ）前記ヒドロキシリン酸アルミニウムが、５．０から６．０の間の等電点を有する、前記項目のいずれかに記載の方法または組成物。
（項目１３）
前記免疫原性組成物が、ｐＨを５．０〜７．０の範囲に維持する緩衝剤を含む、項目１２に記載の方法または組成物。
（項目１４）
前記免疫原性組成物が、ｐＨを５．０〜６．０の範囲に維持する緩衝剤を含む、項目１３に記載の方法または組成物。
（項目１５）
前記ｐＨを前記アジュバントのゼロ電荷点の１．２ｐＨ単位以内に維持する緩衝剤を含む、項目６に記載の組成物。
（項目１６）
前記アジュバントのゼロ電荷点の０．５ｐＨ単位以内のｐＨを有する、項目４に記載の組成物。
（項目１７）
前記ｐＨを前記アジュバントのゼロ電荷点の０．５ｐＨ単位以内に維持する緩衝剤を含む、項目１６に記載の組成物。
（項目１８）
前記２つの異なるｆＨＢＰ抗原が、
（ａ）（ｉ）配列番号１と少なくとも８４％の配列同一性を有し、かつ／または（ｉｉ）配列番号１からの少なくとも２０隣接アミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む第１ポリペプチド、
（ｂ）（ｉ）配列番号２と少なくとも８４％の配列同一性を有し、かつ／または（ｉｉ）配列番号２からの少なくとも２０隣接アミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む第２ポリペプチド、
（ｃ）（ｉ）配列番号３と少なくとも８４％の配列同一性を有し、かつ／または（ｉｉ）配列番号３からの少なくとも２０隣接アミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む第３ポリペプチド
から選択される（ｉ）第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチド、（ｉｉ）第１ポリペプチドおよび第３ポリペプチド、または（ｉｉｉ）第２ポリペプチドおよび第３ポリペプチドである、前記項目のいずれかに記載の組成物または方法。
（項目１９）
前記２つの異なるｆＨＢＰ抗原が、
（ａ）配列番号４と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１ポリペプチド、
（ｂ）配列番号６と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２ポリペプチド、
（ｃ）配列番号５と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第３ポリペプチド
から選択される（ｉ）第１ポリペプチドおよび第２ポリペプチド、（ｉｉ）第２ポリペプチドおよび第３ポリペプチドである、項目１から１７のいずれか一項に記載の組成物または方法。
（項目２０）
前記２つの異なるｆＨＢＰ抗原が、（ａ）配列番号４と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１ポリペプチドと、（ｂ）配列番号６と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２ポリペプチドである、項目４に記載の組成物または項目５に記載の方法または項目４もしくは５に従属する場合の項目９から１４のいずれか一項に記載の方法もしくは組成物。
（項目２１）
前記第１ポリペプチドが、配列番号２３のアミノ酸配列を有するリポタンパク質であり、前記第２ポリペプチドが、配列番号２５のアミノ酸配列を有するリポタンパク質である、項目２０に記載の組成物または方法。
（項目２２）
水酸化アルミニウムアジュバントを含まない、前記項目のいずれかに記載の組成物。
（項目２３）
結合体化細菌莢膜糖を含む、項目２２に記載の組成物。
（項目２４）
前記ｆＨＢＰポリペプチドが、Ｎ末端システインにて脂質付加されており、前記脂質がパルミトイルを含む、前記項目のいずれかに記載の組成物または方法。
（項目２５）
前記ヒドロキシリン酸アルミニウムが、５．４から６．２の間のＰＺＣを有する、前記項目のいずれかに記載の組成物または方法。
（項目２６）
前記ヒドロキシリン酸アルミニウムが、０．８５から１．０の間のＰ／Ａｌモル比を有する、前記項目のいずれかに記載の組成物または方法。
（項目２７）
前記ヒドロキシリン酸アルミニウムが、非晶質であり、直径１０〜１００ｎｍの板を含む粒子状である、前記項目のいずれかに記載の組成物または方法。
（項目２８）
Ａｌ＋＋＋濃度が、＜２ｍｇ／ｍｌである、前記項目のいずれかに記載の組成物または方法。
【００１２】
本発明の第１の態様において、ｆＨＢＰ吸着は、ヒドロキシリン酸アルミニウムのゼロ電荷点（ＰＺＣ）以下のｐＨにて生じる。ある所定のヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントについて、よって、アジュバントのＰＺＣ以下のｐＨを有する水性媒体（例えば緩衝液）が選択される。逆に、ある所定のｐＨについて、同じまたはより高いＰＺＣを有するヒドロキシリン酸アルミニウムが選択される。ｐＨおよびＰＺＣのこの選択により、ｆＨＢＰがヒドロキシリン酸アルミニウムに安定的に吸着された免疫原性組成物を得ることができる。
【００１３】
第２の態様において、ｆＨＢＰおよびヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントは、ｆＨＢＰが、５．０〜７．０（両端を含む）の範囲内の等電点（ｐＩ）を有し、アジュバントのＰＺＣが、同じ範囲内で選択されるように選択される。抗原およびアジュバントの特徴をこのように近接して確実に一致させることにより、吸着ｐＨがアジュバントのＰＺＣを超えたとしても、安定した吸着組成物を得ることが可能になる。安定な吸着は、ｐＨをこれもまた５．０〜７．０の範囲に維持できる緩衝剤の存在により促進される。
【００１４】
第３の態様において、ｆＨＢＰがヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントのＰＺＣよりも高い等電点を有する場合、緩衝剤を加えて、ｐＨをＰＺＣの１．２ｐＨ単位以内にする。
【００１５】
よって、第１の態様について、本発明は、髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原をヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントに吸着させるための方法であって、吸着が、ヒドロキシリン酸アルミニウムのゼロ電荷点以下のｐＨにて生じる方法を提供する。吸着されたｆＨＢＰ抗原は、免疫原として用いることができる。吸着は、種々の様式で行うことができる。ｆＨＢＰ抗原とヒドロキシリン酸アルミニウムと緩衝剤との混合は、３つすべての成分を別々に組み合わせることによるか、または２つの成分を予め混合し、次いで予備混合物を第３成分と混合することのいずれかによる任意の適切な順序で行うことができる。
【００１６】
本発明は、髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原とヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントとを含む免疫原性組成物であって、前記ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントが、前記免疫原性組成物のｐＨよりも高いゼロ電荷点を有する組成物も提供する。
【００１７】
第２の態様について、本発明は、髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原をヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントに吸着させるための方法であって、（ｉ）前記髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原が、５．０から７．０の間の等電点を有し、（ｉｉ）前記ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントが、５．０から７．０の間のゼロ電荷点を有し、（ｉｉｉ）ｆＨＢＰ抗原の吸着が、５．０から７．０の間のｐＨで生じる方法を提供する。
【００１８】
本発明は、ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントに吸着された髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原を含む免疫原性組成物であって、（ｉ）前記髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原が、５．０から７．０の間の等電点を有し、（ｉｉ）前記ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントが、５．０から７．０の間のゼロ電荷点を有する組成物も提供する。組成物は、典型的には、ｐＨを５．０〜７．０の範囲に維持する緩衝剤を含む。
【００１９】
第３の態様について、本発明は、髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原をヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントに吸着させるための方法であって、（ｉ）前記髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原が、前記アジュバントのゼロ電荷点より高い等電点を有し、（ｉｉ）吸着が、前記アジュバントのゼロ電荷点の１．２ｐＨ単位以内のｐＨで生じる方法を提供する。吸着中のｐＨは、好ましくは、ｐＨをアジュバントのゼロ電荷点の１．２ｐＨ単位以内に維持する緩衝剤を含めることにより達成される。
【００２０】
本発明は、ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントに吸着された髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原を含む免疫原性組成物であって、（ｉ）前記髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原が、前記アジュバントのゼロ電荷点より高い等電点を有し、（ｉｉ）前記組成物が、前記アジュバントのゼロ電荷点の１．２ｐＨ単位以内のｐＨを有する組成物も提供する。組成物は、ｐＨをアジュバントのＰＺＣの１．２ｐＨ単位以内に維持する緩衝剤を含んでよい。
【００２１】
本発明は、１より多いｆＨＢＰのバリアントを含む組成物に関して特に有用である。上記のように、このような組成物は、ホスフェート基を有するアルミニウムアジュバントに良好に吸着しないことが以前に報告されていた。
【００２２】
よって、本発明は、２つの異なる髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原をヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントに吸着させるための方法であって、ｆＨＢＰ抗原の両方の吸着が、ヒドロキシリン酸アルミニウムのゼロ電荷点以下のｐＨで生じる方法を提供する。吸着されたｆＨＢＰ抗原は、広いスペクトルの髄膜炎菌免疫化のために用いることができる。ｆＨＢＰ抗原およびヒドロキシリン酸アルミニウム（および緩衝剤）の混合は、任意の適切な順序で行うことができる。
【００２３】
本発明は、共にヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントに吸着された２つの異なる髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原を含む免疫原性組成物も提供する。組成物は、典型的には、吸着中および／または吸着の後のｐＨを制御するための緩衝剤を含む。
【００２４】
本発明は、２つの異なる髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原とヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントとを含む免疫原性組成物であって、前記ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントが、免疫原性組成物のｐＨよりも高いゼロ電荷点を有する組成物も提供する。
【００２５】
本発明は、２つの異なる髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原をヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントに吸着させるための方法であって、（ｉ）前記髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原の両方が、５．０から７．０の間の等電点を有し、（ｉｉ）前記ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントが、５．０から７．０の間のゼロ電荷点を有し、（ｉｉｉ）ｆＨＢＰ抗原の両方の吸着が、５．０から７．０の間のｐＨで生じる方法も提供する。吸着は、緩衝剤の存在下で生じ得る。
【００２６】
本発明は、共にヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントに吸着された２つの異なる髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原を含む免疫原性組成物であって、（ｉ）前記髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原の両方が、５．０から７．０の間の等電点を有し、（ｉｉ）前記ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントが、５．０から７．０の間のゼロ電荷点を有する組成物も提供する。組成物は、典型的には、ｐＨを５．０〜７．０の範囲に維持する緩衝剤を含む。
【００２７】
本発明は、２つの異なる髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原をヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントに吸着させるための方法であって、（ｉ）前記髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原が共に前記アジュバントのゼロ電荷点よりも高い等電点を有し、（ｉｉ）それぞれの抗原の吸着が、前記アジュバントのゼロ電荷点の１．２ｐＨ単位以内のｐＨで生じる方法も提供する。吸着中のｐＨは、好ましくは、ｐＨをアジュバントのゼロ電荷点の１．２ｐＨ単位以内に維持する緩衝剤を含めることにより達成される。
【００２８】
本発明は、共にヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントに吸着された２つの異なる髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原を含む免疫原性組成物であって、（ｉ）それぞれの髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原が、前記アジュバントのゼロ電荷点より高い等電点を有し、（ｉｉ）前記組成物が、前記アジュバントのゼロ電荷点の１．２ｐＨ単位以内のｐＨを有する組成物も提供する。
【００２９】
本発明は、上記の方法のいずれかにより調製される免疫原性組成物も提供する。
【００３０】
本発明の組成物において、そのまたはそれぞれのｆＨＢＰ抗原は、以下により詳細に記載されるように、好ましくは少なくとも８５％吸着される。
【００３１】
Ｈ因子結合タンパク質（複数可）
本発明の組成物は、少なくとも１つの髄膜炎菌Ｈ因子結合タンパク質（ｆＨＢＰ）を含む。組成物が２つの異なるｆＨＢＰを含む場合、これらは、参考文献８に開示されるように、好ましくは異なるバリアントである。異なるｆＨＢＰは、完全には交差反応性でなく、髄膜炎菌に対する株の適用範囲のより広いスペクトルを提供する異なる免疫応答を生じる。
【００３２】
組成物が単一ｆＨＢＰバリアントを含む場合、これは、以下のものの１つを含み得る：
（ａ）（ｉ）配列番号１と少なくともａ％の配列同一性を有し、かつ／または（ｉｉ）配列番号１からの少なくともｘ個隣接するアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む第１アミノ酸配列を含む第１ポリペプチド；
（ｂ）（ｉ）配列番号２と少なくともｂ％の配列同一性を有し、かつ／または（ｉｉ）配列番号２からの少なくともｙ個隣接するアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む第２アミノ酸配列を含む第２ポリペプチド；
（ｃ）（ｉ）配列番号３と少なくともｃ％の配列同一性を有し、かつ／または（ｉｉ）配列番号３からの少なくともｚ個隣接するアミノ酸のフラグメントからなるアミノ酸配列を含む第３アミノ酸配列を含む第３ポリペプチド。
【００３３】
組成物が２つの異なる髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原を含む場合、これは、（ｉ）上で規定される第１および第２ポリペプチド、（ｉｉ）上で規定される第１および第３ポリペプチド、または（ｉｉｉ）上で規定される第２および第３ポリペプチドの組み合わせを含み得る。第１および第３ポリペプチドの組み合わせが好ましい。２つの異なる髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原のそれぞれが５．０から７．０の間のｐＩを有する組合せ、特に、これらが共に５．０〜６．０の範囲または５．２〜６．２の範囲のｐＩを有する場合が好ましい。
【００３４】
組成物が２つの異なる髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原を含む場合、これらは、いくらかの共通の配列を有し得るが、第１、第２および第３ポリペプチドは、異なるｆＨＢＰアミノ酸配列を有する。
【００３５】
第１アミノ酸配列を含むポリペプチドは、被験体に投与された場合に、配列番号２０の新生アミノ酸配列を有する野生型髄膜炎菌タンパク質（ＭＣ５８）と結合する抗体を含む抗体応答を惹起する。いくつかの実施形態において、これらの抗体のいくつかまたは全ては、配列番号２１の新生アミノ酸配列を有する野生型髄膜炎菌タンパク質にも配列番号２２の新生アミノ酸配列を有する野生型髄膜炎菌タンパク質にも結合しない。
【００３６】
第２アミノ酸配列を含むポリペプチドは、被験体に投与された場合に、配列番号２１の新生アミノ酸配列を有する野生型髄膜炎菌タンパク質（２９９６）と結合する抗体を含む抗体応答を惹起する。いくつかの実施形態において、これらの抗体のいくつかまたは全ては、配列番号２０の新生アミノ酸配列を有する野生型髄膜炎菌タンパク質にも配列番号２２の新生アミノ酸配列を有する野生型髄膜炎菌タンパク質にも結合しない。
【００３７】
第３アミノ酸配列を含むポリペプチドは、被験体に投与された場合に、配列番号２２の新生アミノ酸配列を有する野生型髄膜炎菌タンパク質（Ｍ１２３９）と結合する抗体を含む抗体応答を惹起する。いくつかの実施形態において、これらの抗体のいくつかまたは全ては、配列番号２０の新生アミノ酸配列を有する野生型髄膜炎菌タンパク質にも配列番号２１の新生アミノ酸配列を有する野生型髄膜炎菌タンパク質にも結合しない。
【００３８】
いくつかの実施形態において、配列番号１からの少なくともｘ個隣接するアミノ酸のフラグメントは、配列番号２中にも配列番号３中にも存在しない。同様に、配列番号２からの少なくともｙ個隣接するアミノ酸のフラグメントは、配列番号１中にも配列番号３中にも存在しない可能性がある。同様に、配列番号３からの少なくともｚ個隣接するアミノ酸のフラグメントも、配列番号１中または配列番号２中に存在しない可能性がある。いくつかの実施形態において、配列番号１〜３の１つからの上記のフラグメントを、その他の２つの配列番号に対して隣接配列として整列させた場合に、そのフラグメントとその他の２つの配列番号のそれぞれとの間の同一性は、７５％未満、例えば７０％未満、６５％未満、６０％未満などである。
【００３９】
ａの値は、少なくとも８０、例えば８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９またはそれより大きい値である。ｂの値は、少なくとも８０、例えば８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９またはそれより大きい値である。ｃの値は、少なくとも８０、例えば８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９またはそれより大きい値である。ａ、ｂおよびｃの値は同じまたは異なってよい。いくつかの実施形態において、ａ、ｂおよびｃは同一である。
【００４０】
ｘの値は、少なくとも７、例えば８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０）である。ｙの値は、少なくとも７、例えば８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０）である。ｚの値は、少なくとも７、例えば８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０）である。ｘ、ｙおよびｚの値は同じまたは異なってよい。いくつかの実施形態において、ｘ、ｙおよびｚは同一である。
【００４１】
フラグメントは、好ましくはそれぞれの配列番号の配列からのエピトープを含む。その他の有用なフラグメントは、それぞれの配列番号のＣ末端から１もしくは複数のアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）および／またはＮ末端から１もしくは複数のアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５またはそれより多い）を欠失しているが、その少なくとも１つのエピトープを保持している。
【００４２】
本発明で用いられるアミノ酸配列は、配列番号１、２または３と比較して、１または複数（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）の保存的アミノ酸置換、すなわち関連する側鎖を有する別のものであるアミノ酸の置換を含み得る。遺伝子によりコードされるアミノ酸は、一般的に４つのファミリーに分配される：（１）酸性、すなわちアスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性、すなわちリジン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性、すなわちアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性、すなわちグリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、時折、一緒に芳香族アミノ酸として分類される。一般的に、これらのファミリー内での単一アミノ酸の置換は、生物活性に対して大きな影響を有さない。ポリペプチドは、参照配列に対して１または複数（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）の単一アミノ酸欠失を有してよい。ポリペプチドは、参照配列に対して１または複数（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）の挿入（例えば１、２、３、４または５アミノ酸のそれぞれ）を有してもよい。
【００４３】
有用な第１アミノ酸配列は、配列番号１と少なくとも８５％の同一性（例えば＞９５％または１００％）を有する。別の有用な第１アミノ酸配列は、配列番号４と少なくとも９５％の同一性（例えば＞９８％または１００％）を有する。別の有用な第１アミノ酸配列は、配列番号５と少なくとも９５％の同一性（例えば＞９８％または１００％）を有する。
【００４４】
有用な第３アミノ酸配列は、配列番号３と少なくとも８５％の同一性（例えば＞９５％または１００％）を有する。別の有用な第３アミノ酸配列は、配列番号６と少なくとも９５％の同一性（例えば＞９８％または１００％）を有する。
【００４５】
配列番号４および６付近（またはそれらの近縁バリアント）に基づく第１および第３配列の混合物を含む組み合わせが、特に有用である。別の有用な組み合わせは、配列番号５および６（またはそれらの近縁バリアント）の混合物付近に基づく第１および第３配列の混合物を含む。よって、組成物は、配列番号２３のアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号２５のアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含み得る。
【００４６】
組成物が２つの髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原を含む場合、これは、２価ｆＨＢＰ組成物であり得るか、または２より多い異なるｆＨＢＰ抗原が、例えば３価もしくは４価ｆＨＢＰ組成物中に存在し得る。
【００４７】
いくつかの実施形態において、ｆＨＢＰポリペプチド（複数可）は、例えばＮ末端システインにて脂質付加される。別の実施形態において、しかし、ｆＨＢＰポリペプチド（複数可）は、脂質付加されない。脂質付加ｆＨＢＰについて、システインに付加される脂質は、通常、例えばトリパルミトイル−Ｓ−グリセリル−システイン（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）、ジパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン（Ｐａｍ２Ｃｙｓ）、Ｎ−アセチル（ジパルミトイル−Ｓ−グリセリルシステイン）などとしてのパルミトイル残基を含む。成熟脂質付加ｆＨＢＰ配列の例は、配列番号２３（配列番号４を含む）、配列番号２４（配列番号５を含む）および配列番号２５（配列番号６を含む）である。
【００４８】
ｆＨＢＰの投与は、好ましくは、配列番号１、２または３のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドと結合できる抗体を惹起する。本発明で用いるために有利なｆＨＢＰ抗原は、被験体への投与の後に殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起できる。
【００４９】
ｆＨＢＰポリペプチドの全量は、通常、１〜５００μｇ／用量、例えば６０〜２００μｇ／用量または１２０〜５００μｇ／ｍｌである。それぞれのｆＨＢＰポリペプチドについて２０、４０、５０、６０、８０、１００または２００μｇの量が、ヒトワクチン用量中において典型的である。よって、ワクチンは、この量のそれぞれのｆＨＢＰ（複数可）を含むように処方され得る。
【００５０】
組成物が異なる髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原を含む場合、これらは、上記のように分離したポリペプチド（例えば第１および第２ポリペプチド）として存在してよいか、またはこれらは、参考文献１２において髄膜炎菌抗原について開示されるように、少なくとも２（例えば２、３、４、５またはそれより多く）のｆＨＢＰ抗原が単一ポリペプチド鎖として発現される単一「ハイブリッド」ポリペプチドの部分として存在してよい。
【００５１】
ハイブリッドポリペプチドは、以下の２または３つを含んでよい：上記で定義される第１アミノ酸配列；上記で定義される第２アミノ酸配列；および／または上記で定義される第３アミノ酸配列。
【００５２】
ハイブリッドポリペプチドは、式ＮＨ２−Ａ−｛−Ｘ−Ｌ−｝ｎ−Ｂ−ＣＯＯＨ（式中、Ｘは、上記で定義される第１、第２または第３アミノ酸配列であり、Ｌは、任意選択のリンカーアミノ酸配列であり、Ａは、任意選択のＮ末端アミノ酸配列であり、Ｂは、任意選択のＣ末端アミノ酸配列であり、ｎは、２以上の整数である（例えば２、３、４、５、６など））で表すことができる。通常、ｎは、２または３であり、第１、第２および第３アミノ酸配列の少なくとも２つが存在する。
【００５３】
−Ｘ−部分が、その野生型形のリーダーペプチド配列を有する場合、これは、ハイブリッドタンパク質に含めてよいか、またはハイブリッドタンパク質から省いてよい。いくつかの実施形態において、リーダーペプチドは、ハイブリッドタンパク質のＮ末端にある−Ｘ−部分のもの以外は削除され、すなわち、Ｘ１のリーダーペプチドが保持されるが、Ｘ２・・・Ｘｎのリーダーペプチドは省かれる。このことは、すべてのリーダーペプチドを削除し、Ｘ１のリーダーペプチドを−Ａ−部分として用いることと等しい。
【００５４】
｛−Ｘ−Ｌ−｝のｎの場合のそれぞれについて、リンカーアミノ酸配列−Ｌ−は、存在してよいかまたは存在しなくてよい。例えば、ｎ＝２である場合、ハイブリッドは、ＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｌ１−Ｘ２−ＣＯＯＨ、ＮＨ２−Ｘ１−Ｘ２−Ｌ２−ＣＯＯＨなどであってよい。リンカーアミノ酸配列（複数可）−Ｌ−は、典型的には短い（例えば２０以下のアミノ酸、すなわち２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。例としては、クローニングを容易にする短いペプチド配列、ポリグリシンリンカー（すなわちＧｌｙｎ（ｎ＝２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）を含む）およびヒスチジンタグ（すなわちＨｉｓｎ（ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０以上））が含まれる。その他の適切なリンカーアミノ酸配列は、当業者に明らかである。有用なリンカーは、ＧＳＧＧＧＧ（配列番号１５）またはＧＳＧＳＧＧＧＧ（配列番号１６）であり、Ｇｌｙ−ＳｅｒジペプチドがＢａｍＨＩ制限部位から形成されるので、クローニングおよび操作の助けとなり、（Ｇｌｙ）４テトラペプチドが、典型的なポリグリシンリンカーである。特に最後のＬｎとして用いるための別の適切なリンカーは、Ｌｅｕ−Ｇｌｕジペプチドである。
【００５５】
−Ａ−は、任意選択のＮ末端アミノ酸配列である。これは、典型的には短い（例えば４０以下のアミノ酸、すなわち４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。例としては、タンパク質輸送を指示するリーダー配列、またはクローニングもしくは精製を容易にする短いペプチド配列（例えばヒスチジンタグ、すなわちＨｉｓｎ（ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０以上））が含まれる。その他の適切なＮ末端アミノ酸配列は、当業者に明らかである。Ｘ１がそれ自体のＮ末端メチオニンを欠く場合、−Ａ−は、好ましくは、Ｎ末端メチオニンを提供するオリゴペプチド（例えば１、２、３、４、５、６、７または８アミノ酸を有する）、例えばＭｅｔ−Ａｌａ−Ｓｅｒ、または単一Ｍｅｔ残基である。
【００５６】
−Ｂ−は、任意選択のＣ末端アミノ酸配列である。これは、典型的には短い（例えば４０以下のアミノ酸、すなわち３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１）。例としては、タンパク質輸送を指示する配列、クローニングもしくは精製を容易にする短いペプチド配列（例えばヒスチジンタグ、すなわちＨｉｓｎ（ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０以上）を含む、例えば配列番号１７）、またはタンパク質安定性を増進する配列が含まれる。その他の適切なＣ末端アミノ酸配列は、当業者に明らかである。
【００５７】
ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントおよび吸着
本発明の組成物は、ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントを含む。ヒドロキシリン酸塩は、厳密なＡｌＰＯ４からはヒドロキシル基の存在により区別できるが、このようなアジュバントは、簡便のためにしばしば「リン酸アルミニウム」とよばれる［１３］。例えば、３１６４ｃｍ−１（例えば２００℃に加熱時）でのＩＲスペクトルのバンドは、構造上のヒドロキシルの存在を示す。ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントは、少量の硫酸塩も含有することがあり（すなわち、アルミニウムヒドロキシホスフェートサルフェート）、ナトリウムおよび／または塩化物イオンも含むことがある［１４］。アジュバントは、沈殿により得ることができる。
【００５８】
ヒドロキシリン酸アルミニウムは、化学量論的な化合物ではなく、そのヒドロキシルおよびホスフェート組成は、沈殿反応物および条件に依存する。このヒドロキシル／ホスフェート組成は、アジュバントのゼロ電荷点（ＰＺＣ；表面がゼロ正味電荷を有するｐＨ）に影響する。ＰＺＣは、ホスフェートによるヒドロキシルの置換の程度（Ｐ／Ａｌモル比）と反比例する。ホスフェートアニオンによるヒドロキシルアニオンの置換は、ＰＺＣを低下させる。よって、ＰＺＣは、溶液中の遊離ホスフェートイオンの濃度を変化させること（より多いホスフェート＝より酸性側のＰＺＣ）、またはヒスチジン緩衝剤のような緩衝剤を加えること（ＰＺＣをより塩基性にする）によって変更できる。本発明で用いられるヒドロキシリン酸アルミニウムは、通常、５．０から６．６の間、例えば５．４から６．２の間のＰＺＣを有する。
【００５９】
ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントのＰ／Ａｌモル比は、通常、０．３から１．２の間、好ましくは０．８から１．２の間または０．８５から１．０の間、より好ましくは約０．９である。少なくとも０．５のＰ／Ａｌモル比が、より良好な熟成特性を有するアジュバントを提供できる。
【００６０】
ヒドロキシリン酸アルミニウムは、通常、非晶質である（すなわち、Ｘ線に対して非晶質）。これは、通常、粒子状である（例えば、透過型電子顕微鏡写真により観察されるような板状の形態）。板（ｐｌａｔｅ）の典型的な直径は、１０〜１００ｎｍであり、これらは、０．５〜２０μｍのサイズ（例えば約１〜１０μｍ）の凝集体を形成する。ｐＨ７．４にてＡｌ＋＋＋１ｍｇあたり０．７から１．５ｍｇの間のタンパク質の吸着能力が、ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントについて報告されている。
【００６１】
典型的なアジュバントは、０．８４から０．９２の間のＰ／Ａｌモル比を有する非晶質ヒドロキシリン酸アルミニウムであり、このアジュバントは、０．６ｍｇ  Ａｌ３＋／ｍｌで含まれることができる。
【００６２】
患者に投与するための組成物中のＡｌ＋＋＋の濃度は、好ましくは５ｍｇ／ｍｌ未満、例えば≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌなどである。好ましい範囲は、０．２から１ｍｇ／ｍｌの間である。０．８５ｍｇ／用量の最大Ａｌ＋＋＋濃度が好ましい。
【００６３】
本発明の組成物中のｆＨＢＰの少なくとも８５％（重量で）、例えば≧９０％、≧９５％または１００％さえが、ヒドロキシリン酸アルミニウムに吸着される。吸着されたｆＨＢＰの割合は、処方中の塩濃度および／またはｐＨを変更することにより制御でき、例えば一般的には、より高いＮａＣｌ濃度は、ｆＨＢＰの吸着を低減できる。任意の処方物についての吸着の量は、アジュバントのＰＺＣ、処方中の塩濃度およびｐＨ、アジュバント濃度、抗原濃度ならびに抗原のｐＩを含むパラメーターの組合せに依存する。吸着に対するこれらのパラメーターのそれぞれの影響は、容易に評価できる。吸着の程度は、組成物中のｆＨＢＰ抗原の全量（例えば吸着が生じる前に測定されるか、または吸着された抗原を脱離することにより測定される）を、遠心分離後の上清中に残った量と比較することにより決定できる（例えば参考文献１５の第４章を参照されたい）。遠心分離後の上清中に検出可能な抗原が存在しないことは、完全吸着が生じたこと、すなわちすべてのｆＨＢＰが、不溶性アジュバントとその吸着された内容物とを含有するペレット中にあることを示す。
【００６４】
単一ワクチン中で異なるアルミニウム塩の混合物を用いることが知られている。例えば参考文献１６を参照されたい。ヒドロキシリン酸アルミニウムと水酸化物との両方を含むアジュバントをｆＨＢＰと共に用いることができるが、組成物は、いかなる水酸化アルミニウムアジュバントも含まないことが好ましい。なぜなら、上記のように、これは、ｆＨＢＰと混合され得る特定の抗原（特に結合体化細菌莢膜糖）を分解できるからである。
【００６５】
第１の態様について、本発明者らは、吸着がアジュバントのＰＺＣ以下のｐＨで生じることを確実にすることにより、ｆＨＢＰタンパク質をヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントに効率的に吸着させることができることを見出した。よって、所望の処方ｐＨと等しいかもしくはそれより高いＰＺＣを有するアジュバントを選択できるか、または所望のアジュバントのＰＺＣ以下のｐＨを選択できる。アジュバントおよび抗原をこれらの条件下で組み合わせて、吸着が行われることを可能にする。ｐＨは、吸着を妨げるかまたはｆＨＢＰを不可逆的に変性させるほど低くあるべきではない。よって、理想的には吸着は、ＰＺＣの２ｐＨ単位以内（理想的には１．２ｐＨ単位以内）で行われる。
【００６６】
第２の態様について、本発明者らは、５．０から７．０の間の等電点を有する髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原と、これもまた５．０から７．０の間のゼロ電荷点を有するヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントとを用いることにより、ｆＨＢＰタンパク質をヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントに効率的に吸着させることができることを見出した。吸着は５．０から７．０の間のｐＨで生じ、ｐＨは、ｐＨを５．０〜７．０の範囲に維持する緩衝剤を含めることにより維持し得る（吸着の前、吸着中および／または吸着の後）。５．０および７．０のｐＨ範囲内で、好ましい部分範囲は、５．０〜６．０である。第２の態様は、すべてのｆＨＢＰに適切ではない。なぜなら、いくつか（例えば配列番号２０）は、要求される範囲外のｐＩを有するが、適切なｆＨＢＰを容易に選択できるからである。
【００６７】
ｆＨＢＰの等電点は、等電点電気泳動のような技術により実験により決定できる。しかし、より簡便には、等電点は、理論的等電点である。これは、参考文献１７に記載されるアミノ酸のｐＫａ値を用いて、例えば適切なＥｘＰＡＳｙツール［１８］を用いて算出し得る。例えば、配列番号２０の新生アミノ酸配列は、予測ｐＩが７．７２であり、配列番号２１および２２は、予測ｐＩが５．８７および６．１５である。配列番号２３、２４および２５の成熟配列（それぞれ配列番号４、５および６を含む）はすべて、適切な範囲内の予測ｐＩ、すなわちそれぞれ５．４６、５．７２および５．８６を有する。ブロックされたＮ末端アミン（例えば脂質付加されている場合）の修正は、ｐＩを約０．１低減させるが、配列番号２３、２４および２５はそれでもまだ、５．０〜６．０の範囲内の予測ｐＩを有する。それぞれの異なる髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原が５．０から７．０の間のｐＩを有する組合せ、特にこれらが共に５．０〜６．０の範囲または５．２〜６．２の範囲のｐＩを有する場合が好ましい。
【００６８】
適切な範囲内のｐＩを有するｆＨＢＰ抗原の有用な組合せは、配列番号４および６付近（またはそれらの近縁バリアント）に基づく第１および第３配列の混合物、または配列番号５および６（またはそれらの近縁バリアント）の混合物付近に基づく第１および第３配列の混合物を含み得る。このような抗原を対にすることについてのさらなる詳細は、上に記載している。例えば、配列番号２３と２５の組合せは特に有用であり、これらの２つのタンパク質は、脂質付加されてよい（上で論じたように）。
【００６９】
第３の態様について、本発明者らは、吸着がＰＺＣの１．２ｐＨ単位以内のｐＨで生じることを確実にすることにより、ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントのＰＺＣより高いｐＩを有する髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原を効率的に吸着できることを見出した。吸着は、アジュバントのＰＺＣより高いかまたは低いｐＨで生じ得るが、ｐＨは、ｆＨＢＰを不可逆的に変性させるほど極端であるべきではない。吸着中のｐＨは、好ましくは、ｐＨをアジュバントのＰＺＣの１．２ｐＨ単位以内に維持する緩衝剤を含めることにより達成される。ｐＨが１．２ｐＨ単位以内である場合、これは、１ｐＨ単位以下、例えば０．８ｐＨ単位以内、０．６ｐＨ単位以内または０．５ｐＨ単位以内であってよい。
【００７０】
混合の順序
上記のように、本発明は、髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原をヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントに吸着させるための方法を提供する。ｆＨＢＰ抗原（複数可）とヒドロキシリン酸アルミニウムと任意の緩衝剤との混合は、すべての成分を別々に組み合わせることによるか、または２つの成分を予め混合し、次いで予備混合物を第３成分と混合することによる任意の適切な順序で行うことができる。
【００７１】
よって、例えば、ある実施形態において、本発明は、髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原を含む免疫原性組成物を調製するためのプロセスであって、髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原をヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントと組み合わせるステップを含み、（ｉ）前記ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントがゼロ電荷点を有し、（ｉｉ）組み合わせるステップが、前記ｆＨＢＰ抗原が前記アジュバントに吸着するように前記ゼロ電荷点未満のｐＨで行われるプロセスを提供する。
【００７２】
別の実施形態において、本発明は、髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原を含む免疫原性組成物を調製するためのプロセスであって、髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原をヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントと組み合わせるステップを含み、（ｉ）前記ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントがゼロ電荷点を有し、（ｉｉ）前記組成物が、前記ゼロ電荷点未満のｐＨを有することにより、前記ｆＨＢＰ抗原が前記アジュバントに吸着するプロセスを提供する。
【００７３】
別の実施形態において、本発明は、髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原を含む免疫原性組成物を調製するためのプロセスであって、（ｉ）髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原を含みｐＨを有する水性組成物を提供するステップと、（ｉｉ）前記ｐＨより高いゼロ電荷点を有するヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントを提供するステップと、（ｉｉｉ）前記水性組成物を前記ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントと組み合わせて、前記免疫原性組成物を得るステップとを含むプロセスを提供する。
【００７４】
別の実施形態において、本発明は、髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原を含む免疫原性組成物を調製するためのプロセスであって、（ｉ）ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントを含みｐＨを有する水性組成物を提供するステップであって、前記ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントが、前記ｐＨより高いゼロ電荷点を有するステップと、（ｉｉ）前記水性組成物を髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原と組み合わせて、前記免疫原性組成物を得るステップとを含むプロセスを提供する。
【００７５】
別の実施形態において、本発明は、髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原を含む免疫原性組成物を調製するためのプロセスであって、（ｉ）ｐＨを有する第１水性組成物を提供するステップと、（ｉｉ）髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原と、前記ｐＨより高いゼロ電荷点を有するヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントとを含む第２水性組成物を提供するステップと、（ｉｉｉ）前記第１水性組成物と前記第２水性組成物とを組み合わせて、前記免疫原性組成物を得るステップとを含むプロセスを提供する。
【００７６】
別の実施形態において、本発明は、髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原を含む免疫原性組成物を調製するためのプロセスであって、（ｉ）ｐＨを有する第１水性組成物を提供するステップと、（ｉｉ）髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原を含む第２水性組成物を提供するステップと、（ｉｉｉ）前記ｐＨより高いゼロ電荷点を有するヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントを提供するステップと、（ｉｖ）前記第１水性組成物と前記第２水性組成物と前記ヒドロキシリン酸アルミニウムとを任意の順序で組み合わせて、前記免疫原性組成物を得るステップとを含むプロセスを提供する。
【００７７】
本発明は、２つの異なる髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原をヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントに吸着させるための方法であって、ｆＨＢＰ抗原の両方の吸着が、前記ヒドロキシリン酸アルミニウムのゼロ電荷点以下のｐＨで生じる方法も提供する。ここでもまた、ｆＨＢＰ抗原とヒドロキシリン酸アルミニウムと緩衝剤との混合は、任意の適切な順序で行うことができる。
【００７８】
よって、ある実施形態において、２つの異なるｆＨＢＰ抗原は、適切なｐＨにてヒドロキシリン酸アルミニウムに別々に吸着され、２つの吸着された抗原を、次いで、混合できる。
【００７９】
別の実施形態において、２つの異なるｆＨＢＰ抗原を互いに混合し、混合物を、次いで、ヒドロキシリン酸アルミニウムに加え、ここで、ヒドロキシリン酸アルミニウムは、吸着のために適切なｐＨにあるか、またはｐＨは、混合物を加えた後に調整される。
【００８０】
別の実施形態において、２つの異なるｆＨＢＰ抗原を逐次的にヒドロキシリン酸アルミニウムに加え、ここで、ヒドロキシリン酸アルミニウムは、吸着のために適切なｐＨにあるか、またはｐＨは、一方もしくは両方のｆＨＢＰ抗原を加えた後に調整される。
【００８１】
別の実施形態において、一方のｆＨＢＰ抗原をヒドロキシリン酸アルミニウムと混合し、次いで、他方のｆＨＢＰ抗原を混合物に加え、ここで、ヒドロキシリン酸アルミニウムは、第１ｆＨＢＰ抗原を加える前に吸着のために適切なｐＨにあるか、またはｐＨは、第１ｆＨＢＰ抗原を加えた後に調整されるか、またはｐＨは、第２ｆＨＢＰ抗原を加える前に調整されるか、またはｐＨは、第２ｆＨＢＰ抗原を加えた後に調整される。
【００８２】
これらのおよびその他の可能性は、本発明のすべての実施形態について、当業者に利用可能である。
【００８３】
代替アジュバント
ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントを用いる代わりに、本発明は、「ＩＣ３１」のような免疫賦活性オリゴヌクレオチドとポリカチオンポリマーとの粒子状複合体を用いることができる。上記の定義は、これに従って補正することができる。例えば、本発明は、髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原、および免疫賦活性オリゴヌクレオチドとポリカチオンポリマーとの粒子状複合体を含む免疫原性組成物を提供する。本発明は、または、２つの異なる髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原、および免疫賦活性オリゴヌクレオチドとポリカチオンポリマーとの粒子状複合体を含む免疫原性組成物も提供する。
【００８４】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、有用なアジュバントとして公知である。これらはしばしば、ＣｐＧモチーフ（グアノシンと連結された非メチル化シトシンを含有するジヌクレオチド配列）を含有し、それらのアジュバント効果は、参考文献１９〜２４で論じられている。ＴｐＧモチーフ、パリンドローム配列、複数の連続チミジンヌクレオチド（例えばＴＴＴＴ）、複数の連続シトシンヌクレオチド（例えばＣＣＣＣ）またはポリ（ｄＧ）配列を含有するオリゴヌクレオチドも、２本鎖ＲＮＡがそうであるのと同様に、公知の免疫賦活化剤である。これらの種々の免疫賦活性オリゴヌクレオチドのいずれも本発明で用いることができるが、デオキシイノシンおよび／またはデオキシウリジンを含有するオリゴデオキシヌクレオチド、理想的にはデオキシイノシンとデオキシシトシンとを含有するオリゴデオキシヌクレオチドを用いることが好ましい。イノシン含有オリゴデオキシヌクレオチドは、ＣｐＩモチーフ（イノシンと連結されたシトシンを含有するジヌクレオチド配列）を含み得る。オリゴデオキシヌクレオチドは、１より多い（例えば２、３、４、５、６以上）ＣｐＩモチーフを含んでよく、これらは直接反復であり得る（例えば、配列（ＣＩ）ｘ（ここで、ｘは、２、３、４、５、６以上である）を含む）か、または互いに分離していてよい（例えば、配列（ＣＩＮ）ｘ（ここで、ｘは、２、３、４、５、６以上であり、それぞれのＮは、独立して１または複数のヌクレオチドを表す）を含む）。シトシン残基は、理想的にはメチル化されていない。
【００８５】
オリゴヌクレオチドは、典型的には、１０から１００の間のヌクレオチド、例えば１５〜５０ヌクレオチド、２０〜３０ヌクレオチドまたは２５〜２８ヌクレオチドを有する。これは、典型的には、１本鎖である。
【００８６】
オリゴヌクレオチドは、天然ヌクレオチドだけ、非天然ヌクレオチドだけ、またはこれら両方の混合を含み得る。例えば、これは、１もしくは複数のホスホロチオエート結合（複数可）を含んでよく、かつ／または１もしくは複数のヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチル修飾を有してよい。
【００８７】
好ましいオリゴヌクレオチドは、２６ｍｅｒの配列５’−（ＩＣ）１３−３’（配列番号１８）を含む１本鎖デオキシヌクレオチドである。このオリゴデオキシヌクレオチドは、ポリカチオンポリマーと安定な複合体を形成して、良好なアジュバントが得られる。
【００８８】
ポリカチオンポリマーは、理想的には、ポリカチオンペプチドである。ポリマーは、１もしくは複数のロイシンアミノ酸残基（複数可）および／または１もしくは複数のリジンアミノ酸残基（複数可）を含んでよい。ポリマーは、１または複数のアルギニンアミノ酸残基（複数可）を含んでよい。これは、これらのアミノ酸の１つの少なくとも１回の直接反復、例えば１もしくは複数のＬｅｕ−Ｌｅｕジペプチド配列（複数可）、１もしくは複数のＬｙｓ−Ｌｙｓジペプチド配列（複数可）、または１もしくは複数のＡｒｇ−Ａｒｇジペプチド配列（複数可）を含んでよい。これは、少なくとも１（好ましくは複数、例えば２または３）のＬｙｓ−Ｌｅｕジペプチド配列（複数可）および／または少なくとも１（好ましくは複数、例えば２または３）のＬｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓトリペプチド配列（複数可）を含んでよい。
【００８９】
ペプチドは、配列Ｒｌ−ＸＺＸＺｘＸＺＸ−Ｒ２（ここで、ｘは、３、４、５、６または７であり、それぞれのＸは、独立して、正に荷電された天然および／または非天然のアミノ酸残基であり、それぞれのＺは、独立して、アミノ酸残基Ｌ、Ｖ、Ｉ、ＦまたはＷであり、Ｒ１およびＲ２は、独立して、−Ｈ、−ＮＨ２、−ＣＯＣＨ３または−ＣＯＨからなる群より選択される）を含んでよい。いくつかの実施形態において、Ｘ−Ｒ２は、ペプチドのＣ末端アミノ酸残基のアミド、エステルまたはチオエステルであってよい。
【００９０】
ポリカチオンペプチドは、典型的には、５から５０の間のアミノ酸、例えば６〜２０アミノ酸、７〜１５アミノ酸または９〜１２アミノ酸を有する。
【００９１】
ペプチドは、天然アミノ酸だけ、非天然アミノ酸だけ、またはこれらの両方の混合を含み得る。これは、Ｌ−アミノ酸および／またはＤ−アミノ酸を含んでよい。Ｌ−アミノ酸が典型的である。
【００９２】
ペプチドは、天然Ｎ末端（ＮＨ２−）または改変Ｎ末端、例えばヒドロキシル、アセチルなどを有し得る。ペプチドは、天然Ｃ末端（−ＣＯＯＨ）または改変Ｃ末端、例えばヒドロキシル、アセチルなどを有し得る。このような改変は、ペプチドの安定性を改善し得る。
【００９３】
本発明で用いるために好ましいペプチドは、１１ｍｅｒのＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ（配列番号１９）（すべてＬ−アミノ酸）である。Ｎ末端は、脱アミノ化されてよく、Ｃ末端はヒドロキシル化されてよい。好ましいペプチドは、Ｈ−ＫＬＫＬ５ＫＬＫ−ＯＨ（すべてＬ−アミノ酸）である。このオリゴペプチドは、免疫賦活性オリゴヌクレオチドと安定な複合体を形成して、良好なアジュバントが得られる。
【００９４】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドとポリカチオンポリマーとの最も好ましい混合物は、ＩＣ３１（商標）［２５〜２７］として公知のＴＬＲ９アゴニストであり、これは、配列番号１８のオリゴデオキシヌクレオチドと配列番号１９のポリカチオンオリゴペプチドとの吸着性複合体である。
【００９５】
オリゴヌクレオチドとオリゴペプチドとは、種々の比率で一緒に混合できるが、これらは、通常、モル過剰のペプチドを用いて混合される。モル過剰は、少なくとも５：１、例えば１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０；１、３５：１、４０：１などであってよい。約２５：１のモル比が理想的である［２８、２９］。この過剰比率での混合は、オリゴヌクレオチドとオリゴペプチドとの間での不溶性粒子状複合体の形成をもたらすことができる。複合体は、水中油型エマルジョンと組み合わせることができる。
【００９６】
オリゴヌクレオチドとオリゴペプチドとは、典型的には、水性条件下で混合され、例えば、オリゴヌクレオチドの溶液を、オリゴペプチドの溶液と所望の比率で混合できる。２つの溶液は、水または緩衝液中に乾燥（例えば凍結乾燥）された材料を溶解して、次に混合できるストック溶液を形成することにより調製してよい。複合体は、参考文献３０に開示される方法を用いて分析できる。
【００９７】
ポリアルギニンおよびＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、用い得る複合体を同様に形成する［３１］。
【００９８】
複合体は、水性懸濁物、例えば水または緩衝液中で維持できる。複合体と用いるための典型的な緩衝剤は、リン酸塩緩衝剤（例えばリン酸緩衝食塩水）、Ｔｒｉｓ緩衝剤、Ｔｒｉｓ／ソルビトール緩衝剤、ホウ酸塩緩衝剤、コハク酸塩緩衝剤、クエン酸塩緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤などである。代替として、複合体は、時に、凍結乾燥してよい。
【００９９】
種々の濃度、例えば参考文献２５、２８または２９で用いられる任意の濃度のオリゴヌクレオチドとポリカチオンポリマーを用いることができる。例えば、ポリカチオンオリゴペプチドは、１１００μＭ、１０００μＭ、３５０μＭ、２２０μＭ、２００μＭ、１１０μＭ、１００μＭ、１１μＭ、１０μＭなどで存在できる。オリゴヌクレオチドは、４４ｎＭ、４０ｎＭ、１４ｎＭ、４．４ｎＭ、４ｎＭなどで存在できる。２０００ｎＭ未満のポリカチオンオリゴペプチド濃度が典型的である。１：２５のモル比で混合された配列番号１８および１９について、本発明の３つの実施形態におけるｍｇ／ｍＬでの濃度は、よって、０．３１１と１．３２２、または０．１０９と０．４６３、または０．０３１と０．１３２であってよい。
【０１００】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドとポリカチオンポリマーとの粒子状複合体を含む本発明の実施形態において、複合体が唯一のアジュバントである場合、例えば組成物が、アルミニウム塩を含まず、水中油型エマルジョンを含まない場合が有用である。
【０１０１】
ある具体的な実施形態において、本発明は、免疫賦活性オリゴヌクレオチドとポリカチオンポリマーとの粒子状複合体（例えばＩＣ３１）と、髄膜炎菌ｆＨＢＰ抗原と、髄膜炎菌血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹの１、２、３または４つからの結合体化莢膜糖とを含む免疫原性組成物を提供する。適切な結合体化糖のさらなる詳細は、以下に記載する。
【０１０２】
さらなる抗原（複数可）
ｆＨＢＰ抗原（複数可）に加えて、本発明の組成物は、髄膜炎菌またはその他の病原体、例えば肺炎球菌のようなその他の細菌からのさらなる抗原を含むことができる。
【０１０３】
さらなる髄膜炎菌ポリペプチド抗原
髄膜炎菌ｆＨＢＰポリペプチド抗原（複数可）を含むことに加えて、組成物は、１または複数のさらなる髄膜炎菌ポリペプチド抗原（複数可）を含んでよい。よって、組成物は、２８７、ＮａｄＡ、ＮｓｐＡ、ＨｍｂＲ、ＮｈｈＡ、Ａｐｐおよび／またはＯｍｐ８５からなる群より選択されるポリペプチド抗原を含んでよい。これらの抗原は、精製ポリペプチド、例えば組換えポリペプチドとして有用に存在する。抗原は、好ましくは、対象に投与した後に、殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起する。組成物がＰｏｒＡ抗原を含む場合、いくつかの実施形態において、１つだけの髄膜炎菌ＰｏｒＡ血清サブタイプが含まれる。いくつかの実施形態において、髄膜炎菌ＰｏｒＡ外膜タンパク質は、組成物に含まれない。
【０１０４】
本発明の組成物は、２８７抗原を含んでよい。２８７抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８についての公開されたゲノム配列［３２］中に、遺伝子ＮＭＢ２１３２（ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＧＩ：７２２７３８８；本明細書において配列番号９）として含まれた。多くの株からの２８７抗原の配列が、それ以降公開されている。例えば、２８７の対立遺伝子型は、参考文献３３の図５および１５、参考文献３４の実施例１３および図２１（その中の配列番号３１７９〜３１８４）で見ることができる。２８７抗原の種々の免疫原性フラグメントも報告されている。本発明で用いるために好ましい２８７抗原は、（ａ）配列番号９と５０％以上の同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより多い）を有し、かつ／または（ｂ）配列番号９の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸のフラグメント（ここで、「ｎ」は７以上である（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号９からのエピトープを含む。本発明の最も有用な２８７抗原は、被験体に投与した後に、配列番号９のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドと結合できる抗体を惹起できる。本発明で用いるために有利な２８７抗原は、被験体に投与した後に、殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起できる。
【０１０５】
本発明の組成物は、ＮａｄＡ抗原を含んでよい。ＮａｄＡ抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８についての公開されたゲノム配列［３２］中に、遺伝子ＮＭＢ１９９４（ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＧＩ：７２２７２５６；本明細書において配列番号１０）として含まれた。多くの株からのＮａｄＡ抗原の配列がそれ以降公開され、ナイセリアの付着因子としてのタンパク質活性は、詳細に文書化されている。ＮａｄＡの種々の免疫原性フラグメントも報告されている。本発明で用いるために好ましいＮａｄＡ抗原は、（ａ）配列番号１０と５０％以上の同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより多い）を有し、かつ／または（ｂ）配列番号１０の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸のフラグメント（ここで、「ｎ」は７以上である（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号１０からのエピトープを含む。本発明の最も有用なＮａｄＡ抗原は、被験体に投与した後に、配列番号１０のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドと結合できる抗体を惹起できる。本発明で用いるために有利なＮａｄＡ抗原は、被験体に投与した後に、殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起できる。配列番号６は、あるそのようなフラグメントである。
【０１０６】
本発明の組成物は、ＮｓｐＡ抗原を含んでよい。ＮｓｐＡ抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８についての公開されたゲノム配列［３２］中に、遺伝子ＮＭＢ０６６３（ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＧＩ：７２２５８８８；本明細書において配列番号１１）として含まれた。抗原は、参考文献３５および３６から、以前に公知であった。多くの株からのＮｓｐＡ抗原の配列が、それ以降公開されている。ＮｓｐＡの種々の免疫原性フラグメントも報告されている。本発明で用いるために好ましいＮｓｐＡ抗原は、（ａ）配列番号１１と５０％以上の同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより多い）を有し、かつ／または（ｂ）配列番号１１の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸のフラグメント（ここで、「ｎ」は７以上である（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号１１からのエピトープを含む。本発明の最も有用なＮｓｐＡ抗原は、被験体に投与した後に、配列番号１１のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドと結合できる抗体を惹起できる。本発明で用いるために有利なＮｓｐＡ抗原は、被験体に投与した後に、殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起できる。
【０１０７】
本発明の組成物は、髄膜炎菌ＨｍｂＲ抗原を含んでよい。全長ＨｍｂＲ配列は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８についての公開されたゲノム配列［３２］中に、遺伝子ＮＭＢ１６６８（本明細書において配列番号７）として含まれた。参考文献３７は、異なる株からのＨｍｂＲ配列（本明細書において配列番号８）を報告している。配列番号７と８は、１アミノ酸長異なり、９４．２％の同一性を有する。本発明は、全長ＨｍｂＲ配列を含むポリペプチドを用いることができるが、部分的なＨｍｂＲ配列を含むポリペプチドを頻繁に用いる。よって、いくつかの実施形態において、本発明に従って用いられるＨｍｂＲ配列は、配列番号７と少なくともｉ％（ここで、ｉの値は、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９またはそれより多い）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでよい。別の実施形態において、本発明に従って用いられるＨｍｂＲ配列は、配列番号７からの少なくともｊ連続アミノ酸のフラグメント（ここで、ｊの値は、７、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い）のフラグメントを含んでよい。別の実施形態において、本発明に従って用いられるＨｍｂＲ配列は、（ｉ）配列番号７と少なくともｉ％の配列同一性を有し、かつ／または（ｉｉ）配列番号７からの少なくともｊ連続アミノ酸のフラグメントを含むアミノ酸配列を含んでよい。ｊアミノ酸の好ましいフラグメントは、配列番号７からのエピトープを含む。このようなエピトープは、通常、ＨｍｂＲの表面上にあるアミノ酸を含む。有用なエピトープは、ヘモグロビンとのＨｍｂＲの結合に関与するアミノ酸を有するものを含む。なぜなら、これらのエピトープと結合する抗体は、宿主のヘモグロビンと結合する細菌の能力を遮断できるからである。ＨｍｂＲの位相幾何学およびその重要な機能的残基は、参考文献３８において調べられた。本発明の最も有用なＨｍｂＲ抗原は、被験体に投与した後に、配列番号７のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドと結合できる抗体を惹起できる。本発明で用いるために有利なＨｍｂＲ抗原は、被験体に投与した後に、殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起できる。
【０１０８】
本発明の組成物は、ＮｈｈＡ抗原を含んでよい。ＮｈｈＡ抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８についての公開されたゲノム配列［３２］中に、遺伝子ＮＭＢ０９９２（ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＧＩ：７２２６２３２；本明細書において配列番号１２）として含まれた。多くの株からのＮｈｈＡ抗原の配列がそれ以降公開され、例えば参考文献３３および３９であり、ＮｈｈＡの種々の免疫原性フラグメントが報告されている。これは、Ｈｓｆとしても公知である。本発明で用いるために好ましいＮｈｈＡ抗原は、（ａ）配列番号１２と５０％以上の同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより多い）を有し、かつ／または（ｂ）配列番号１２の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸のフラグメント（ここで、「ｎ」は７以上である（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号１２からのエピトープを含む。本発明の最も有用なＮｈｈＡ抗原は、被験体に投与した後に、配列番号１２のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドと結合できる抗体を惹起できる。本発明で用いるために有利なＮｈｈＡ抗原は、被験体に投与した後に、殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起できる。
【０１０９】
本発明の組成物は、Ａｐｐ抗原を含んでよい。Ａｐｐ抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８についての公開されたゲノム配列［３２］中に、遺伝子ＮＭＢ１９８５（ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＧＩ：７２２７２４６；本明細書において配列番号１３）として含まれた。多くの株からのＡｐｐ抗原の配列がそれ以降公開されている。Ａｐｐの種々の免疫原性フラグメントが報告されている。本発明で用いるために好ましいＡｐｐ抗原は、（ａ）配列番号１３と５０％以上の同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより多い）を有し、かつ／または（ｂ）配列番号１３の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸のフラグメント（ここで、「ｎ」は７以上である（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号１３からのエピトープを含む。本発明の最も有用なＡｐｐ抗原は、被験体に投与した後に、配列番号１３のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドと結合できる抗体を惹起できる。本発明で用いるために有利なＡｐｐ抗原は、被験体に投与した後に、殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起できる。
【０１１０】
本発明の組成物は、Ｏｍｐ８５抗原を含んでよい。Ｏｍｐ８５抗原は、髄膜炎菌血清群Ｂ株ＭＣ５８についての公開されたゲノム配列［３２］中に、遺伝子ＮＭＢ０１８２（ＧｅｎＢａｎｋ受理番号ＧＩ：７２２５４０１；本明細書において配列番号１４）として含まれた。多くの株からのＯｍｐ８５抗原の配列がそれ以降公開されている。Ｏｍｐ８５についてのさらなる情報は、参考文献４０および４１で見出すことができる。Ｏｍｐ８５の種々の免疫原性フラグメントも報告されている。本発明で用いるために好ましいＯｍｐ８５抗原は、（ａ）配列番号１４と５０％以上の同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより多い）を有し、かつ／または（ｂ）配列番号１４の少なくとも「ｎ」連続アミノ酸のフラグメント（ここで、「ｎ」は７以上である（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い））を含むアミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましいフラグメントは、配列番号１４からのエピトープを含む。本発明の最も有用なＯｍｐ８５抗原は、被験体に投与した後に、配列番号１４のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドと結合できる抗体を惹起できる。本発明で用いるために有利なＯｍｐ８５抗原は、被験体に投与した後に、殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起できる。
【０１１１】
髄膜炎菌リポオリゴ糖
髄膜炎菌ｆＨＢＰポリペプチド抗原（複数可）を含むことに加えて、組成物は、１または複数の髄膜炎菌リポオリゴ糖（ＬＯＳ）抗原（複数可）を含んでよい。髄膜炎菌ＬＯＳは、細菌の外膜の外側の単層で見出されるグルコサミンベースのリン脂質である。これは、リピドＡ部分とコアオリゴ糖領域とを含み、リピドＡ部分は、膜において疎水性アンカーとして作用する。オリゴ糖コア中の不均質性が、異なる髄膜炎菌株の間での構造的および抗原的多様性を生じ、これは、株を１２のイムノタイプ（Ｌ１〜Ｌ１２）に細分するために用いられている。本発明は、任意のイムノタイプ、例えばＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７および／またはＬ８からのＬＯＳを用いてよい。
【０１１２】
Ｌ２およびＬ３のα鎖は、天然に、ラクトＮ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）を含む。本発明がＬ２またはＬ３イムノタイプからのＬＯＳを用いる場合、このＬＮｎＴは存在しないことがある。この非存在は、α鎖内でＬＮｎＴ四糖を合成する能力が破壊されるように操作された変異体株を用いることにより、簡便に達成できる。関連する生合成付加を担う酵素のノックアウトによりこの目的が達成されることが公知である［４２、４３］。例えば、ＬｇｔＢ酵素のノックアウトは、ＬＮｎＴの末端ガラクトースの付加を妨げるとともに、α鎖の末端シアル酸の下流の付加も妨げる。ＬｇｔＡ酵素のノックアウトは、ＬＮｎＴのＮ−アセチル−グルコサミンの付加と、下流の付加とを妨げる。ＬｇｔＡノックアウトは、ＬｇｔＣノックアウトを伴い得る。同様に、ＬｇｔＥおよび／またはＧａｌＥ酵素のノックアウトは、内部ガラクトースの付加を妨げ、ＬｇｔＦのノックアウトは、ＨｅｐＩ残基へのグルコースの付加を妨げる。これらのノックアウトのいずれも、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ７またはＬ９イムノタイプ株におけるＬＮｎＴ四糖の破壊のために、単独または組み合わせて用いることができる。有用な免疫原性を保持しながらＬＮｎＴエピトープが除去されたＬＯＳを提供するので、少なくともＬｇｔＢのノックアウトが好ましい。
【０１１３】
ＬＮｎＴエピトープを破壊する変異に加えて、またはその代わりに、ｇａｌＥ遺伝子のノックアウトも、有用な改変ＬＯＳを提供し、リピドＡ脂肪トランスフェラーゼ（ｆａｔｔｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）遺伝子も同様にノックアウトされ得る［４４］。少なくとも１つの第一級Ｏ結合脂肪酸を、ＬＯＳから除去してよい［４５］。１ＬＯＳ分子あたりの第二級アシル鎖の数が低減されたＬＯＳを用いることもできる［４６］。ＬＯＳは、典型的に、少なくともＧｌｃＮＡｃ−Ｈｅｐ２ホスホエタノールアミン−ＫＤＯ２−リピドＡ構造を有する［４７］。ＬＯＳは、ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ三糖を含むが、ＬＮｎＴ四糖を欠くことがある。
【０１１４】
ＬＯＳは、本発明の組成物中に種々の形態で含まれ得る。これは、精製された形態にてそれ自体で用いてよい。これは、担体タンパク質と結合体化してよい。ＬＯＳが結合体化されている場合、結合体化は、ＬＯＳ中のリピドＡ部分を介するか、または任意のその他の適切な部分、例えばそのＫＤＯ残基によるものであってよい。ＬＯＳのリピドＡ部分が存在しない場合、このような代替の連結が必要となる。ＬＯＳについての結合体化技術は、参考文献４５、４７、４８、４９などから公知である。これらの結合体に有用な担体タンパク質は、ジフテリアもしくは破傷風毒素またはそのトキソイドもしくは変異体のような下記で論じる例えば細菌毒素である。
【０１１５】
ＬＯＳは、参考文献５０に記載されるような固定（すなわち相変動性（ｐｈａｓｅ  ｖａｒｉａｂｌｅ）でない）ＬＯＳイムノタイプを有する株（例えば遺伝子操作された髄膜炎菌株）からであってよい。例えば、Ｌ２およびＬ３  ＬＯＳイムノタイプを固定してよい。このような株は、イムノタイプ間のスイッチング率が、元の野生型株に対して１／２未満（＞１／５０にさえ）に低減されてよい。参考文献５０は、ｌｇｔＡおよび／またはｌｇｔＧ遺伝子生成物の改変によりこの結果をどのようにして達成できるかについて開示している。
【０１１６】
ＬＯＳは、例えばＬ３について、そのヘプトースＩＩ残基に付加されたＧｌｃＮａｃ残基上でＯ−アセチル化されてよい［５１］。
【０１１７】
免疫原性組成物は、１より多い型のＬＯＳ、例えば髄膜炎菌イムノタイプＬ２およびＬ３からのＬＯＳを含むことができる。例えば、参考文献５２に開示されるＬＯＳの組み合わせを用いてよい。
【０１１８】
ＬＯＳ抗原は、好ましくは、被験体に投与した後に、殺菌性抗髄膜炎菌抗体を惹起できる。
【０１１９】
しかし、本発明の好ましい組成物は、髄膜炎菌リポオリゴ糖を含まない。
【０１２０】
髄膜炎菌莢膜糖抗原（複数可）
髄膜炎菌ｆＨＢＰポリペプチド抗原（複数可）を含むことに加えて、組成物は、１または複数の髄膜炎菌莢膜糖結合体を含んでよい。本発明の組成物は、髄膜炎菌血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙの１、２、３または４つ、例えばＡ＋Ｃ、Ａ＋Ｗ１３５、Ａ＋Ｙ、Ｃ＋Ｗ１３５、Ｃ＋Ｙ、Ｗ１３５＋Ｙ、Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５、Ａ＋Ｃ＋Ｙ、Ａ＋Ｗ１３５＋Ｙ、Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙなどからの莢膜糖の１または複数の結合体を含んでよい。結合体化血清群Ｃの莢膜糖を含む組成物は有用であり、そして血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙの４つ全てからの糖を含む組成物が理想的である。
【０１２１】
血清群Ａ髄膜炎菌の莢膜糖は、Ｃ３位およびＣ４位に部分的Ｏ−アセチル化を有する（α１→６）結合Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノースアミン−１−ホスフェートのホモポリマーである。Ｃ３位でのアセチル化は、７０〜９５％であり得る。糖を精製するために用いる条件は、脱Ｏ−アセチル化をもたらし得る（例えば塩基性条件下で）が、このＣ３位にてＯＡｃを保持することが有用である。いくつかの実施形態において、血清群Ａの糖中のマンノースアミン残基の少なくとも５０％（例えば少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれより多い）が、Ｃ３位にてＯ−アセチル化される。アセチル基は、加水分解を防ぐために、ブロック基で置き換えることができ［５３］、このような改変糖は、本発明の意味において、まだ血清群Ａの糖である。
【０１２２】
血清群Ｃの莢膜糖は、（α２→９）結合シアル酸（Ｎ−アセチルノイラミン酸または「ＮｅｕＮＡｃ」）のホモポリマーである。糖の構造は、→９）−ＮｅｕｐＮＡｃ７／８ＯＡｃ−（α２→と記載される。ほとんどの血清群Ｃ株は、シアル酸残基のＣ７および／またはＣ８にてＯ−アセチル基を有するが、臨床単離株の約１５％は、これらのＯ−アセチル基を欠く［５４、５５］。ＯＡｃ基の存在または非存在は、ユニークエピトープを生じ、糖と結合する抗体の特異性は、Ｏ−アセチル化された株（ＯＡｃ＋）および脱Ｏ−アセチル化された株（ＯＡｃ−）に対するその殺菌活性に影響し得る［５６〜５８］。本発明で用いられる血清群Ｃの糖は、ＯＡｃ＋またはＯＡｃ−株のいずれかから調製してよい。許諾されたＭｅｎＣ結合体ワクチンは、ＯＡｃ−（ＮＥＩＳＶＡＣ−Ｃ（商標））およびＯＡｃ＋（ＭＥＮＪＵＧＡＴＥ（商標）およびＭＥＮＩＮＧＩＴＥＣ（商標））糖の両方を含む。いくつかの実施形態において、血清群Ｃの結合体の生成のための株は、例えば、血清型１６、血清サブタイプＰ１．７ａ，１などのＯＡｃ＋株である。よって、Ｃ：１６：Ｐ１．７ａ，１  ＯＡｃ＋株を用いてよい。Ｃ１１株のような血清サブタイプＰ１．１中のＯＡｃ＋株も有用である。
【０１２３】
血清群Ｗ１３５の糖は、シアル酸−ガラクトース二糖単位のポリマーである。血清群Ｃの糖と同様に、これは、変動性のＯ−アセチル化を有するが、シアル酸７位および９位においてである［５９］。この構造は、→４）−Ｄ−Ｎｅｕｐ５Ａｃ（７／９ＯＡｃ）−α−（２→６）−Ｄ−Ｇａｌ−α−（１→と記載される。
【０１２４】
血清群Ｙの糖は、二糖反復単位がガラクトースの代わりにグルコースを含む以外は、血清群Ｗ１３５の糖と同様である。血清群Ｗ１３５と同様に、これは、シアル酸７位および９位において変動性のＯ−アセチル化を有する［５９］。血清群Ｙの構造は、→４）−Ｄ−Ｎｅｕｐ５Ａｃ（７／９ＯＡｃ）−α−（２→６）−Ｄ−Ｇｌｃ−α−（１→と記載される。
【０１２５】
本発明に従って用いられる糖は、上記のようにＯ−アセチル化されてよい（例えば、天然の莢膜糖で見られるのと同じＯ−アセチル化パターンで）か、またはこれらは、糖の環の１または複数の位置にて部分的もしくは完全に脱Ｏ−アセチル化されてよいか、またはこれらは、天然の莢膜糖に比べて過剰にＯ−アセチル化されてよい。
【０１２６】
結合体中の糖部分は、髄膜炎菌から調製される全長の糖を含んでよく、かつ／または全長の糖のフラグメントを含んでよく、すなわち、糖は、細菌で見られる天然の莢膜糖より短くてよい。糖は、よって、解重合されてよく、この解重合は、糖の精製の間もしくは後であるが、結合体化の前に生じる。解重合は、糖の鎖長を低減する。ある解重合法は、過酸化水素の使用を伴う。過酸化水素を糖に加え（例えば１％の最終Ｈ２Ｏ２濃度まで）、混合物を、次いで、所望の鎖長の減少が達成されるまでインキュベートする（例えば約５５℃にて）。別の解重合法は、酸加水分解を伴う。その他の解重合法は、当該技術において公知である。本発明に従って用いるための結合体を調製するために用いる糖は、これらの解重合法のいずれによっても得ることができる。解重合は、免疫原性のために最適な鎖長を提供し、かつ／または糖の物理的な管理のしやすさのために鎖長を低減するために用いることができる。いくつかの実施形態において、糖は、以下の範囲の平均重合度（Ｄｐ）を有する：Ａ＝１０〜２０；Ｃ＝１２〜２２；Ｗ１３５＝１５〜２５；Ｙ＝１５〜２５。Ｄｐよりもむしろ分子量の点において、有用な範囲は、全ての血清群について＜１００ｋＤａ；５ｋＤａ〜７５ｋＤａ；７ｋＤａ〜５０ｋＤａ；８ｋＤａ〜３５ｋＤａ；１２ｋＤａ〜２５ｋＤａ；１５ｋＤａ〜２２ｋＤａである。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、髄膜炎菌血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５および血清群Ｙのそれぞれからの糖についての平均分子量は、特にＭＡＬＬＳにより決定して、５０ｋＤａより高く、例えば≧７５ｋＤａ、≧１００ｋＤａ、≧１１０ｋＤａ、≧１２０ｋＤａ、≧１３０ｋＤａなどであってよく［６０］、１５００ｋＤａまででさえあってよい。例えば、ＭｅｎＡの糖は、５０〜５００ｋＤａ、例えば６０〜８０ｋＤａの範囲であってよく、ＭｅｎＣの糖は、１００〜２１０ｋＤａの範囲であってよく、ＭｅｎＷ１３５の糖は、６０〜１９０ｋＤａ、例えば１２０〜１４０ｋＤａの範囲であってよく、かつ／またはＭｅｎＹの糖は、６０〜１９０ｋＤａ、例えば１５０〜１６０ｋＤａの範囲であってよい。
【０１２８】
組成物中の１血清群あたりの髄膜炎菌の糖の質量は、通常、１μｇ〜２０μｇ、例えば１血清群あたり２〜１０μｇ、または約４μｇもしくは約５μｇもしくは約１０μｇである。１より多い血清群からの結合体が含まれる場合、これらは、実質的に等しい質量で存在してよく、例えば、各血清群の糖の質量が、互いの＋１０％以内である。等しい比率の代替として、２倍の質量の血清群Ａの糖を用いてよい。つまり、ワクチンは、ＭｅｎＡの糖を１０μｇと、ＭｅｎＣ、Ｗ１３５およびＹの糖をそれぞれ５μｇで含んでよい。
【０１２９】
髄膜炎菌結合体のために有用な担体タンパク質は、ジフテリアもしくは破傷風毒素のような細菌毒素、またはそのトキソイドもしくは変異体を含む。これらは、結合体ワクチンにおいて通常用いられる。例えば、ＣＲＭ１９７ジフテリア毒素変異体が有用である［６１］。その他の適切な担体タンパク質は、合成ペプチド［６２、６３］、熱ショックタンパク質［６４、６５］、百日咳タンパク質［６６、６７］、サイトカイン［６８］、リンホカイン［６８］、ホルモン［６８］、成長因子［６８］、Ｎ１９［７０］のような種々の病原体由来抗原からの複数のヒトＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質［６９］、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅからのタンパク質Ｄ［７１〜７３］、ニューモリシン［７４］またはその非毒性誘導体［７５］、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ［７６］、鉄取込みタンパク質［７７］、Ｃ．ｄｉｆｆｉｃｉｌｅからの毒素ＡまたはＢ［７８］、組換えＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａエキソタンパク質Ａ（ｒＥＰＡ）［７９］などを含む。ＣＲＭ１９７が好ましい。
【０１３０】
組成物が１より多い髄膜炎菌血清群からの結合体を含む場合、それぞれの別個の結合体について同じ担体タンパク質を用いることができるか、または異なる担体タンパク質を用いることができる。しかし、両方の場合において、異なる結合体の混合物は、通常、それぞれの血清型結合体を別々に調製し、それからそれらを混合して別個の結合体の混合物を形成することにより形成される。
【０１３１】
１：５（すなわち過剰のタンパク質）〜５：１（すなわち過剰の糖）の糖：タンパク質比率（ｗ／ｗ）、例えば１：２〜５：１の比率および１：１．２５〜１：２．５の比率の結合体を用いてよい。参考文献８０に記載されるように、混合物中の異なる髄膜炎菌血清群結合体は、異なる糖：タンパク質の比率を有することができ、例えば、あるものは１：２〜１：５の比率を有し、別のものは５：１〜１：１．９９の比率を有してよい。
【０１３２】
担体タンパク質は、髄膜炎菌糖に、直接またはリンカーを介して共有的に結合体化してよい。種々のリンカーが公知である。例えば、結合は、修飾糖の遊離のヒドロキシル基とＣＤＩとの反応［８１、８２］と、その後のタンパク質との反応によりカルバメート結合を形成することにより形成され得るカルボニルによるものであってよい。カルボジイミド縮合を用いることができる［８３］。アジピン酸リンカーを用いることができ、これは、遊離の−ＮＨ２基（例えばアミノ化により糖に導入される）とアジピン酸（例えばジイミド活性化を用いて）とのカップリングと、次いで得られた糖−アジピン酸中間体へのタンパク質のカップリングにより形成し得る［８４、８５］。その他のリンカーは、β−プロピオンアミド［８６］、ニトロフェニル−エチルアミン［８７］、ハロアシルハロゲン化物［８８］、グリコシド結合［８９］、６−アミノカプロン酸［９０］、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ）［９１］、アジピン酸ジヒドラジドＡＤＨ［９２］、Ｃ４〜Ｃ１２部分［９３］などを含む。
【０１３３】
還元的アミノ化による結合体化を用いることができる。糖は、過ヨウ素酸塩を用いてまず酸化してアルデヒド基を導入し、これが、次いで、担体タンパク質との直接的共有結合を、還元的アミノ化により例えばリジンのε−アミノ基に形成できる。糖が分子あたりに複数のアルデヒド基を含む場合、この結合技術は、複数のアルデヒドが複数の担体アミンと反応した架橋生成物を導くことができる。
【０１３４】
参考文献９４に記載されるように、混合物は、直接の糖／タンパク質結合を有するある結合体と、リンカーを介する結合を有する別の結合体とを含むことができる。この取り合わせは、異なる髄膜炎菌血清群からの糖結合体を用いる場合に特に当てはまり、例えばＭｅｎＡおよびＭｅｎＣの糖はリンカーを介して結合体化してよく、ＭｅｎＷ１３５およびＭｅｎＹの糖は、担体タンパク質と直接結合体化してよい。
【０１３５】
髄膜炎菌糖は、髄膜炎菌から調製される全長のインタクトな糖を含んでよく、かつ／または全長の糖のフラグメントを含んでよく、すなわち、糖は、細菌において見られる天然の莢膜糖よりも短くてよい。糖は、よって、解重合されてよく、この解重合は、糖の精製の間もしくは後であるが、結合体化の前に生じる。解重合は、糖の鎖長を低減する。解重合は、免疫原性のために最適な鎖長を提供し、かつ／または糖の物理的管理しやすさのために鎖長を低減するために用いることができる。
【０１３６】
結合体化肺炎球菌莢膜糖（複数可）
本発明の組成物は、担体タンパク質と結合体化した肺炎球菌莢膜糖を含んでよい。
【０１３７】
本発明は、１または複数の異なる肺炎球菌血清型からの莢膜糖を含むことができる。組成物が１より多い血清型からの糖抗原を含む場合、これらは、好ましくは、別々に調製され、別々に結合体化され、それから組み合わされる。肺炎球菌莢膜糖を精製するための方法は、当該技術において公知であり（例えば参考文献９５を参照されたい）、２３の異なる血清型からの精製された糖に基づくワクチンが、長年、公知である。これらの方法の改良も、例えば血清型３について参考文献９６に、血清型１、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆおよび１９Ａについて参考文献９７に記載されている。
【０１３８】
肺炎球菌莢膜糖（複数可）は、以下の血清型から典型的に選択される：１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび／または３３Ｆ。よって、合計では、組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３またはそれより多くの異なる血清型からの莢膜糖を含んでよい。
【０１３９】
血清型の有用な組合せは、例えば血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆのそれぞれからの莢膜糖を含む７価の組合せである。別の有用な組合せは、例えば血清型１、４、５、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆのそれぞれからの莢膜糖を含む９価の組合せである。別の有用な組合せは、例えば血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆのそれぞれからの莢膜糖を含む１０価の組合せである。１１価の組合せは、血清型３からの糖をさらに含み得る。１２価の組合せは、１０価混合物に、血清型６Ａおよび１９Ａ；６Ａおよび２２Ｆ；１９Ａおよび２２Ｆ；６Ａおよび１５Ｂ；１９Ａおよび１５Ｂ；または２２Ｆおよび１５Ｂを加えてよい。１３価の組合せは、１１価混合物に、血清型１９Ａおよび２２Ｆ；８および１２Ｆ；８および１５Ｂ；８および１９Ａ；８および２２Ｆ；１２Ｆおよび１５Ｂ；１２Ｆおよび１９Ａ；１２Ｆおよび２２Ｆ；１５Ｂおよび１９Ａ；１５Ｂおよび２２Ｆ；６Ａおよび１９Ａなどを加えてよい。
【０１４０】
よって、有用な１３価の組合せは、例えば参考文献９８〜１０１に開示されるようにして調製された、血清型１、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９、１９Ｆおよび２３Ｆからの莢膜糖を含む。あるこのような組合せは、血清型６Ｂの糖を約８μｇ／ｍｌで、およびその他の１２の糖をそれぞれ約４μｇ／ｍｌの濃度で含む。別のこのような組合せは、血清型６Ａおよび６Ｂの糖をそれぞれ約８μｇ／ｍｌで、およびその他の１１の糖をそれぞれ約４μｇ／ｍｌで含む。
【０１４１】
結合体のための適切な担体タンパク質は、髄膜炎菌結合体に関して上で論じている。肺炎球菌結合体ワクチンについて特に有用な担体タンパク質は、ＣＲＭ１９７、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイドおよびＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅタンパク質Ｄである。ＣＲＭ１９７は、ＰＲＥＶＮＡＲ（商標）において用いられている。１３価混合物は、１３の結合体のそれぞれについての担体タンパク質としてＣＲＭ１９７を用いてよく、ＣＲＭ１９７は、約５５〜６０μｇ／ｍｌで存在してよい。
【０１４２】
組成物が１より多い肺炎球菌血清型からの結合体を含む場合、それぞれの別個の結合体について同じ担体タンパク質を用いることができるか、または異なる担体タンパク質を用いることができる。しかし、両方の場合において、異なる結合体の混合物は、通常、それぞれの血清型結合体を別々に調製し、それからそれらを混合して別個の結合体の混合物を形成することにより形成される。参考文献１０２は、多価肺炎球菌結合体ワクチン中に異なる担体タンパク質を用いる場合の潜在的な利点について記載しているが、ＰＲＥＶＮＡＲ（商標）製品は、７つの異なる血清型のそれぞれについて同じ担体を用いて成功している。
【０１４３】
担体タンパク質は、髄膜炎菌結合体について上で論じたように、肺炎球菌糖に、直接またはリンカーを介して共有結合的に結合体化してよい。架橋結合体化技術は、少なくとも肺炎球菌血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆおよび２３Ｆのために特に有用である。
【０１４４】
髄膜炎菌糖について上で論じたように、肺炎球菌糖は、肺炎球菌から調製される全長のインタクトな糖を含んでよく、かつ／または全長の糖のフラグメントを含んでよい。１より多い肺炎球菌血清型を用いる場合、それぞれの血清型についてインタクトな糖を、それぞれの血清型についてフラグメントを、またはいくつかの血清型についてインタクトな糖、およびその他の血清型についてフラグメントを用いることが可能である。組成物が、血清型４、６Ｂ、９Ｖ、１４、１９Ｆおよび２３Ｆのいずれかからの糖を含む場合、これらの糖は、好ましくはインタクトである。対照的に、組成物が、血清型１８Ｃの糖を含む場合、この糖は、解重合されていることが好ましい。
【０１４５】
血清型３の糖も解重合されてよい。例えば、血清型３の糖は、例えば酢酸を用いる、解重合のための酸加水分解［９８］に供することができる。得られるフラグメントを、次いで、活性化のために酸化し（例えば過ヨウ素酸塩酸化、おそらく２価カチオンの存在下、例えばＭｇＣｌ２を用いる）、担体（例えばＣＲＭ１９７）に還元条件下（例えばシアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いて）で結合体化させてよく、次いで（所望により）、糖中のあらゆる未反応のアルデヒドもキャップできる（例えば水素化ホウ素ナトリウムを用いて）［９８］。結合体化は、例えば活性化された糖と担体とを同時凍結乾燥させた後の凍結乾燥材料上で行ってよい。
【０１４６】
血清型１の糖は、重炭酸塩／炭酸塩緩衝液を用いるような例えばアルカリｐＨ緩衝液処理［９９］により達成して、少なくとも部分的に脱Ｏ−アセチル化してよい。このような（部分的）脱Ｏ−アセチル化糖は、活性化のために酸化し（例えば過ヨウ素酸塩酸化）、担体（例えばＣＲＭ１９７）に還元条件下（例えばシアノ水素化ホウ素ナトリウムを用いて）で結合体化させることができ、次いで（所望により）、糖中のあらゆる未反応のアルデヒドもキャップできる（例えば水素化ホウ素ナトリウムを用いて）［９９］。結合体化は、例えば活性化された糖と担体とを同時凍結乾燥させた後の凍結乾燥材料上で行ってよい。
【０１４７】
血清型１９Ａの糖は、活性化のために酸化し（例えば過ヨウ素酸塩酸化）、担体（例えばＣＲＭ１９７）にＤＭＳＯ中で還元条件下に結合体化させてよく、次いで（所望により）、糖中のあらゆる未反応のアルデヒドもキャップできる（例えば水素化ホウ素ナトリウムを用いて）［１０３］。結合体化は、例えば活性化された糖と担体とを同時凍結乾燥させた後の凍結乾燥材料上で行ってよい。
【０１４８】
肺炎球菌結合体は、適切な糖と結合する抗莢膜抗体を理想的に惹起でき、例えば≧０．２０μｇ／ｍＬの抗糖抗体レベルを惹起できる［１０４］。抗体は、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）および／またはオプソニン作用活性（ＯＰＡ）の測定により評価してよい。ＥＩＡ法は、詳細に確認されており、抗体濃度とワクチン効力との間に関連が存在する。
【０１４９】
その他の病原体（複数可）からのさらなる抗原
本発明の組成物は、さらなる病原体（複数可）からの抗原（複数可）を含むことができる。このような組合せの状況において、ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントの使用と水酸化アルミニウムアジュバントの回避とが有利である。なぜなら、上記のように、追加の抗原（特に細菌莢膜糖）は、水酸化物塩に感受性であり得るからである。
【０１５０】
例えば、組成物は、以下のさらなる抗原（複数可）の１または複数を含んでよい：
−表面抗原ＨＢｓＡｇのようなＢ型肝炎ウイルスからの抗原。
−所望によりペルタクチンおよび／または凝集原２および３とも組み合わせた、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓからの百日咳ホロ毒素（ＰＴ）および繊維状ヘマグルチニン（ＦＨＡ）のようなＢ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓからの抗原。
−ジフテリアトキソイドのようなジフテリア抗原。
−破傷風トキソイドのような破傷風抗原。
−Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ（Ｈｉｂ）からの、典型的には結合体化された糖抗原。
−不活化ポリオウイルス抗原（複数可）。
【０１５１】
ジフテリア抗原が組成物に含まれる場合、破傷風抗原と百日咳抗原も含むことが好ましい。同様に、破傷風抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原と百日咳抗原も含むことが好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、ジフテリア抗原と破傷風抗原も含むことが好ましい。ＤＴＰの組み合わせが、よって、好ましい。
【０１５２】
即席調製物
本発明は、（ｉ）上記のようにヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントに吸着された少なくとも１つのｆＨＢＰ抗原を含む第１成分と、（ｉｉ）非髄膜炎菌免疫原を含む第２成分とを含むキットも提供する。キットの成分は、混合して、複数の病原体に対して防御するために患者に投与するための免疫原組成物を得ることができる。
【０１５３】
本発明は、（ｉ）上記のようにヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントに吸着された少なくとも１つのｆＨＢＰ抗原を含む第１成分と、（ｉｉ）非髄膜炎菌免疫原を含む第２成分とを混合するステップを含む混合ワクチンを調製するための方法も提供する。混合された物質は、次いで、患者に投与してよい。第２成分は、凍結乾燥して、水性第１成分がそれを再構成するようにしてよい。
【０１５４】
医薬組成物
本発明は、患者に投与するための免疫原性組成物に関する。これらの組成物は、医薬的に許容可能であり、典型的には、適切な担体を含む。医薬的に許容される担体の詳細な考察は、参考文献１０５で入手可能である。
【０１５５】
有効投薬容量は、日常的に確立できるが、組成物の典型的なヒト用量は、約０．５ｍｌの容量である。
【０１５６】
本発明の組成物のｐＨは、通常、６から８の間、より好ましくは６．５から７．５の間（例えば約７）である。既に上で論じたように、組成物は、緩衝剤、例えばＴｒｉｓ緩衝剤、クエン酸塩緩衝剤、リン酸塩緩衝剤、コハク酸塩緩衝剤（例えばコハク酸ナトリウム緩衝剤）またはヒスチジン緩衝剤を含んでよい。
【０１５７】
本発明の第１の態様において、上で説明したように、吸着の前および／または吸着中に特定のｐＨを用いる。しかし、吸着が安定である場合は、吸着の後にｐＨを維持する必要はなく、例えば中性近くまで上昇することを許容できる。よって、吸着の後に、このような組成物は、アジュバントのＰＺＣより高いｐＨで緩衝してよい。
【０１５８】
同様に、第２の態様による組成物のｐＨは、吸着の前および／または吸着中に５．０〜７．０の範囲であるべきであるが、吸着の後にこの範囲外（例えば７．０〜８．０の範囲）であってよい。理想的には、しかし、第２の態様の組成物は、緩衝剤を用いることにより、５．０〜７．０の範囲の吸着後ｐＨに維持される。
【０１５９】
吸着がアジュバントのＰＺＣより高いｐＨで生じる場合、吸着が安定であれば、ｐＨを維持する必要はなく、例えば中性近くまで降下することを許容できる。よって、吸着の後に、このような組成物は、アジュバントのＰＺＣ未満のｐＨで緩衝してよい。
【０１６０】
第３の態様による組成物のｐＨは、吸着の前および／または吸着中にアジュバントのＰＺＣの１．２ｐＨ単位以内であるが、吸着後にこの範囲外であってよい。理想的には、しかし、第３の態様の組成物は、アジュバントのＰＺＣの１．２ｐＨ単位以内の吸着後ｐＨに維持される。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物は、特に生理食塩水と組み合わせて用いる場合には、３．５から６．５の間のｐＫａを有する緩衝剤を含む。この処方物は、参考文献１０６においてｆＨＢＰについて有用であると言われている。ｐＨが５．８から６．０の間で１〜１０ｍＭコハク酸塩（例えば５ｍＭ）を含むコハク酸塩緩衝液が有用である。組成物は、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌおよび／またはＮａＣｌを含んでよい。
【０１６２】
組成物は、滅菌され、かつ／または発熱物質を含まなくてもよい。本発明の組成物は、ヒトに関して等張であってよい。
【０１６３】
本発明の組成物は、張度を得るためにナトリウム塩（例えば塩化ナトリウム）を含んでよい。１０±２ｍｇ／ｍｌ  ＮａＣｌの濃度、例えば約９ｍｇ／ｍｌが典型的である。
【０１６４】
患者に投与するための本発明の組成物は、免疫原性であり、より好ましくはワクチン組成物である。本発明によるワクチンは、予防的（すなわち感染を防止する）または治療的（すなわち感染を処置する）のいずれかであってよいが、典型的には予防的である。ワクチンとして用いられる免疫原性組成物は、免疫学的有効量の抗原（複数可）と、必要に応じて任意のその他の成分とを含む。「免疫学的有効量」により、単回用量または連続するものの一部のいずれかとしてその量を個体に投与することが、処置または予防のために有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康および体調、年齢、処置される個体の分類群（例えば非ヒト霊長類、霊長類など）、抗体を合成する個体の免疫系の能力、望まれる防御の程度、ワクチンの処方、医療状態についての処置医の評価およびその他の関連する因子に依存して変動する。この量は、日常的な試験により決定できる比較的広い範囲にあると予測される。本発明の組成物の抗原含量は、通常、１用量あたりのタンパク質の量で表される。
【０１６５】
髄膜炎菌は、身体の種々の領域に影響し、よって、本発明の組成物は、種々の液体の形態で調製してよい。例えば、組成物は、溶液または懸濁液のいずれかとしての注射用剤として調製してよい。組成物は、例えば吸入器により、微細な噴霧（ｓｐｒａｙ）を用いての肺投与のために調製してよい。組成物は、例えばスプレー剤またはドロップ剤として鼻、耳または眼投与のために調製してよい。筋肉内投与のための注射用剤が最も典型的である。
【０１６６】
本発明の組成物は、多回用量フォーマットで包装される場合は特に、抗菌剤を含んでよい。チオメルサールおよび２−フェノキシエタノールのような抗菌剤が、ワクチン中で通常見られるが、水銀を含まない防腐剤を用いるか、または防腐剤を全く用いないことが好ましい。
【０１６７】
本発明の組成物は、洗浄剤、例えばＴｗｅｅｎ８０のようなＴｗｅｅｎ（ポリソルベート）を含んでよい。洗浄剤は、通常、低いレベル、例えば＜０．０１％で存在するが、抗原処方物を安定化するためにより高いレベル、例えば１０％までが示唆されている［１０６］。組成物の例は、０．０１〜０．０５％のポリソルベートを含んでよく、これは、脂質付加ｆＨＢＰ抗原（複数可）を用いる場合に特に有用である。
【０１６８】
処置方法
本発明は、本発明の組成物を哺乳類に投与するステップを含む、哺乳類における免疫応答を惹起するための方法も提供する。免疫応答は、好ましくは、髄膜炎菌に対して防御的であり、好ましくは抗体を含む。方法は、既に初回刺激（ｐｒｉｍｅ）された患者における追加免疫応答を惹起し得る。
【０１６９】
哺乳類は、好ましくはヒトである。ワクチンが予防用である場合、ヒトは、好ましくは、小児（例えば、よちよち歩きの幼児または幼児）または１０代の若者であり、ワクチンが治療用である場合、ヒトは好ましくは成人である。小児用を意図するワクチンは、例えば安全性、投薬量、免疫原性などを評価するために、成人に投与してもよい。
【０１７０】
本発明は、医薬品として用いるための本発明の組成物も提供する。医薬品は、好ましくは、上記のように、哺乳類における免疫応答を惹起するために用いられ（すなわちこれは免疫原性組成物である）、より好ましくはワクチンである。
【０１７１】
本発明は、哺乳類における上記のような免疫応答を惹起するための医薬品の製造における、少なくとも１つのｆＨＢＰ抗原と、ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントとの使用も提供する。
【０１７２】
これらの使用および方法は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓを原因とする疾患、例えば細菌性（またはより具体的には髄膜炎菌）髄膜炎もしくは敗血症の予防および／または処置のためであることが好ましい。
【０１７３】
治療処置の効力を確認するある方法は、本発明の組成物の投与後の髄膜炎菌への感染を監視することを含む。予防的処置の効力を確認するある方法は、組成物の投与後の抗原に対する免疫応答を監視することを含む。本発明の組成物の免疫原性は、それらを試験被験体（例えば１２〜１６ヶ月齢の小児、または動物モデル）に投与し、次いで、髄膜炎菌についての血清殺菌性抗体（ＳＢＡ）およびＥＬＩＳＡ力価（ＧＭＴ）を含む標準的なパラメータを決定することにより決定できる。これらの免疫応答は、通常、組成物の投与の４週間後付近に決定され、組成物の投与前に決定された値と比較される。少なくとも４倍または８倍のＳＢＡの増加が好ましい。組成物の１回より多い用量を投与する場合、１回より多い投与後測定を行ってよい。
【０１７４】
本発明の組成物は、通常、患者に直接投与される。直接送達は、非経口注射（例えば皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内または組織の間隙の空間へ）または任意のその他の適切な経路により達成してよい。本発明は、全身および／または粘膜免疫を惹起するために用いてよい。大腿または上腕への筋肉内投与が好ましい。注射は、針を介して（例えば皮下針）であってよいが、無針注射を代わりに用いてよい。典型的な筋肉内用量は、０．５ｍｌである。
【０１７５】
投薬処置は、単回用量計画または多回用量計画であり得る。多回用量は、一次免疫化計画および／または追加免疫化計画で用い得る。一次用量計画の後に、追加用量計画を行い得る。初回刺激用量間（例えば４〜１６週間）、および初回刺激と追加刺激との間の適切なタイミングは、日常的に決定できる。
【０１７６】
全般
本発明の実施は、そうでないと記載しない限り、当該技術の技量内の化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の従来の方法を用いる。このような技術は、文献に詳細に説明されている。例えば参考文献１０７〜１１３などを参照されたい。
【０１７７】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる」を包含し、例えばＸを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘのみからなり得るか、または何か追加のもの、例えばＸ＋Ｙを含み得る。
【０１７８】
数値ｘに関する「約」との用語は、任意選択であり、例えばｘ±１０％を意味する。
【０１７９】
本発明が「エピトープ」に関する場合、このエピトープは、Ｂ細胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープであってよいが、通常、Ｂ細胞エピトープである。このようなエピトープは、経験的に同定できる（例えばＰＥＰＳＣＡＮ［１１４、１１５］または類似の方法を用いて）か、またはこれは予想できる（例えばＪａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原インデックス（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｉｎｄｅｘ）［１１６］、行列に基づくアプローチ［１１７］、ＭＡＰＩＴＯＰＥ［１１８］、ＴＥＰＩＴＯＰＥ［１１９、１２０］、ニューラルネットワーク（ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ）［１２１］、ＯｐｔｉＭｅｒ＆ＥｐｉＭｅｒ［１２２、１２３］、ＡＤＥＰＴ［１２４］、Ｔｓｉｔｅｓ［１２５］、親水性［１２６］、抗原インデックス［１２７］または参考文献１２８〜１３２に開示される方法などを用いて）。エピトープは、抗体またはＴ細胞受容体の抗原結合部位により認識され、それと結合する抗原の部分であり、これらは、「抗原決定基」とよぶこともできる。
【０１８０】
本発明が、「精製された」抗原を用いる場合、この抗原は、それが天然に存在する環境から分離されている。例えば、抗原は、存在する任意のその他の精製された抗原に由来するもの以外のその他の髄膜炎菌成分を実質的に有さない。精製された抗原の混合物は、２つの抗原が天然に混合されて存在していても、それぞれの抗原を別々に精製し、次いでそれらを再び組み合わせることにより典型的に調製される。
【０１８１】
２つのアミノ酸配列間のパーセンテージ配列同一性についての言及は、整列させたときに、アミノ酸のそのパーセンテージが、２つの配列の比較において同じであることを意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、当該技術において公知のソフトウェアプログラム、例えば参考文献１３３の７．７．１８節に記載されるものを用いて決定できる。好ましいアラインメントは、１２のギャップ開始ペナルティおよび２のギャップ伸長ペナルティでのアフィンギャップ検索、６２のＢＬＯＳＵＭマトリクスを用いるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムにより決定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、参考文献１３４に開示されている。
【０１８２】
「実質的に」との語句は、「完全に」を除外せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まないことがある。必要であれば、「実質的に」との語句を、本発明の定義から省くことができる。
【発明を実施するための形態】
【０１８３】
アルミニウムアジュバント
異なる条件下での異なるアルミニウムアジュバントへのｆＨＢＰの吸着を研究した。単一ｆＨＢＰ（予測ｐＩ７．４）または２もしくは３のｆＨＢＰのハイブリッド混合物を含む種々のｆＨＢＰ抗原を用いた。いくつかの実験は、追加の非ｆＨＢＰ髄膜炎菌抗原を含んだ。
【０１８４】
ｐＨ６．５±０．５にて水酸化アルミニウムアジュバントを用いて、ｆＨＢＰの１００％の吸着が、すべての単一および混合抗原について観察された。完全な吸着は、わずかにより高いｐＨにて１０ｍＭヒスチジン緩衝剤の存在下でも観察された。追加の髄膜炎菌ポリペプチドアジュバントの存在は、ｆＨＢＰ吸着の程度を低減しなかった。
【０１８５】
対照的に、ｐＨ７．０にてヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントを用いて、ｆＨＢＰ抗原は、５０％だけが吸着されたことが観察された。このｐＨは、抗原の予測ｐＩより低く、アジュバントのＰＺＣより高い。
【０１８６】
水酸化アルミニウムアジュバントは、通常、約１１．４のＰＺＣを有する。よって、中性ｐＨは、アジュバントのＰＺＣ未満である。対照的に、中性ｐＨは、ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントのＰＺＣより高い。
【０１８７】
ヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントへのｆＨＢＰの吸着を、種々のｐＨにて研究した。以下のデータは、処方の２４時間後に得られたｐＨおよび吸着のデータを示す。これらの３つの処方物は、同じタンパク質濃度（５０μｇ／ｍｌ）およびアジュバント濃度（０．５ｍｇ／ｍｌ）であるが、異なるｐＨでの１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝剤を用いている。
【０１８８】
【表１】
0005597245.tif 000002
よって、約９５％の吸着が、ｐＨ５．８組成物において達成された。このｐＨは、アジュバントのＰＺＣとほぼ等しい（わずかにより高い）が、抗原のｐＩよりかなり低い。対照的に、より高いｐＨ（１．２ｐＨ単位高い）またはより低いｐＨ（２．３ｐＨ単位低い）にて、吸着は乏しかった。
【０１８９】
高いレベルの吸着が、アジュバントの量を４．５倍に増加させることによっても達成できた。
【０１９０】
緩衝剤およびｐＨの影響を、１ｍｇ／ｍｌアジュバントおよび１００μｇ／ｍｌ抗原を用いるさらなる実験で研究した。結果は、以下の通りであった。
【０１９１】
【表２】
0005597245.tif 000003
よって、ヒドロキシリン酸アルミニウムへの高い吸着（≧９５％）が、適切なｐＨを選択することにより達成できた。８５％より高い吸着レベルは、ここでは、ｐＨがアジュバントのＰＺＣの１．２ｐＨ単位以内であった場合にのみ観察された（適切な緩衝剤において）。
【０１９２】
上記のように、これらの研究は、７．４のｐＩを有するｆＨＢＰを用いて行った。このｆＨＢＰは、以下、ｆＨＢＰ−ｖ１と称する。さらなる研究は、さらに２つの髄膜炎菌株からのｆＨＢＰを用いて行った。ｆＨＢＰ−ｖ２についての予測ｐＩは５．８であり、ｆＨＢＰ−ｖ３についてこれは６．１である。さらに、ｖ１、ｖ２およびｖ３の３つすべてを組み合わせる融合物を研究した。これらの４つのタンパク質のそれぞれは、１００μｇ／ｍｌにて０．２２２ｍｇ／ｍｌのアジュバントおよび９ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌと共に処方した。３つの異なる処方物のｐＨ、すなわちｐＨ５、ｐＨ６およびｐＨ７を調べた。ヒドロキシリン酸アルミニウムへのｆＨＢＰタンパク質の吸着の程度を、次いで、決定した。結果は、以下の通りであった。
【０１９３】
【表３】
0005597245.tif 000004
これらの結果から、５．８のｐＩの１つのｆＨＢＰと６．１のｐＩの別のｆＨＢＰ（すなわち、共に５．０から７．０の間）を含むｖ１／ｖ２／ｖ３の組合せが、≧８５％の吸着レベルを、５．０から７．０の間のＰＺＣを有するヒドロキシリン酸アルミニウムアジュバントを用いて達成できたことが確認される。さらに、この組合せについての吸着の最高レベルは、ｐＨがアジュバントのゼロ電荷点の１．２ｐＨ単位以内（すなわちｐＨ７よりもむしろｐＨ５またはｐＨ６）であった場合に観察された。
【０１９４】
高い吸着は、（ｉ）ｐＨがアジュバントのＰＺＣより１．２単位を超えて高い場合のｖ１およびｖ２、（ｉｉ）ｐＨがアジュバントのＰＺＣより低く、ｆＨＢＰのｐＩが５．０〜７．０の範囲外である場合のｖ１以外について観察された。ｐＨ７でのｖ２  ｆＨＢＰの比較的低い吸着は、５．０〜７．０の範囲内のｐＩを有する第２ｆＨＢＰを加えることにより克服できた。
【０１９５】
よって、異なるｐＩ値を有する複数のｆＨＢＰバリアントの混合物は、水酸化アルミニウムを必要とすることなく、高い吸着レベルでうまく処方できる。
【０１９６】
免疫賦活性オリゴヌクレオチド＋ポリカチオンポリマーアジュバント
アルミニウムベースのアジュバントを用いる代わりに、本発明は、ＩＣ３１のような免疫賦活性オリゴヌクレオチドとポリカチオンポリマーとの粒子状複合体を用いることができる。
【０１９７】
参考文献１２（参考文献１３５も参照されたい）に開示される「５ＣＶＭＢ」ワクチンを構成する３つのポリペプチドに、水酸化アルミニウムおよび／またはＩＣ３１をアジュバント添加した。これらの３つのポリペプチドのうちの１つは、ｆＨＢＰ抗原を含む。
【０１９８】
第１組の実験において、９群のマウスに１０μｇの抗原、３ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムおよび変動する用量のＩＣ３１を与えた。群に以下の９つの組成物を与え、群７〜９には、１〜６と同じ抗原であるが異なる処方のものを与えた。
【０１９９】
【表４】
0005597245.tif 000005
＊標準ＩＣ３１懸濁物を用いた。１００μｌのこの懸濁物は、最大強度を示した。より低い容量は、より低い強度を示した。より低い強度の組成物の容量を維持するために、緩衝液を１００μｌまで加えた。
【０２００】
マウスからの血清を、殺菌活性について髄膜炎菌株のパネルに対して試験した。
【０２０１】
実験ＭＰ０３からの殺菌力価は、６つの異なる株Ａ〜Ｆに対して以下の通りであった。
【０２０２】
【表５】
0005597245.tif 000006
よって、ＩＣ３１を用いて得られた力価は、通常、Ａｌ−Ｈを用いて得られたものよりも良好であった。
【０２０３】
「５ＣＶＭＢ」ワクチンを、血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹに対する髄膜炎菌結合体の４価混合物と組み合わせた。混合物に、Ａｌ−ＨまたはＩＣ３１（高濃度または低濃度にて）でアジュバント添加した。殺菌力価は、血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹのぞれぞれからの１つの株のパネルに対して以下の通りであった。
【０２０４】
【表６】
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よって、最良の力価は、ＩＣ３１を用いて観察された。
【０２０５】
別の実験において、ＩＩ−ＩＩＩ−Ｉの順序でｆＨＢＰの３つのバリアントを含有する３重融合ポリペプチド（参考文献２７に開示される通り）に、水酸化アルミニウムまたはＩＣ３１でアジュバント添加した。
【０２０６】
第１組の実験において、６群のマウスに２０μｇの抗原（精製タグを有するかまたは有さない）、３ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムおよび１００μｌのＩＣ３１を与えた。群に、以下の通りに与えた。
【０２０７】
【表７】
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マウスからの血清を、殺菌活性について髄膜炎菌株のパネルに対して試験した。
【０２０８】
実験ＭＰ０５からの血清を、株のパネル（合計２５）に対して再度試験した。群１（ＩＣ３１、タグなし）の株の５６％が、≧１：１０２４の力価を有したのに対し、群５（Ａｌ−Ｈ、タグなし）では株の３６％だけであった。同様に、群１の株の７６％は≧１：１２８の力価を有したのに対し、この力価は、群５では株の６４％でしか観察されなかった。タグ付加していない抗原をみると、群２（ＩＣ３１）の株の８４％が≧１：１２８の力価を有したのに対し、群６（Ａｌ−Ｈ）では７６％であった。よって、より高い殺菌力価が、ＩＣ３１を用いて達成された。
【０２０９】
さらなる免疫原性実験は、同じ群分けおよび株のパネルを用いる実験ＭＰ０４において、ｆＨＢＰＩＩ−ＩＩＩ−Ｉ抗原をＮａｄＡおよび２８７−９５３抗原と組み合わせて用いた。群１は、群５において８４％だけであったのと比較して、株の１００％で≧１：１２８の殺菌力価を示した。≧１：１０２４のより厳しい閾値について、群１からの血清は、群５において５６％だけであったのと比較して、株の８８％に対して殺菌性であった。同様の結果が、タグ付加した抗原を用いて観察され、ここでは、群６の８０％と比較して、群２の８８％が≧１：１２８の殺菌力価を有した。よって、ここでもまた、より良好な抗髄膜炎菌免疫応答が、ＩＣ３１を用いて得られた。
【０２１０】
同様の実験において、ｆＨＢＰＩＩ−ＩＩＩ−ＩとＮａｄＡと２８７−９５３との組合せに、Ａｌ−ＨまたはＩＣ３１でアジュバント添加した。これらの組成物を、Ａｌ−Ｈでアジュバント添加した外膜小胞を含む５ＣＶＭＢワクチンを含む組成物と比較した。ＩＣ３１でアジュバント添加したワクチンは、いずれのその他の組成物よりも、試験した１２の株のすべてにわたってより高い％適用範囲を示した。
【０２１１】
よって、ＩＣ３１は、ｆＨＢＰのための有効なアジュバントである。
【０２１２】
本発明は、例によってのみ記載され、本発明の範囲および精神内に留まったまま改変を行うことができることが理解される。
【０２１３】
参考文献
【０２１４】
【化１】
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【０２１５】
【化２】
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【０２１６】
【化３】
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【０２１７】
【化４】
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【配列表】
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