(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む細胞であって、前記キシロースイソメラーゼのアミノ酸配列が、配列番号３で示されるアミノ酸配列と少なくとも９４％の配列同一性を有し、かつ前記ヌクレオチド配列が宿主に対して非相同的である、細胞。
【請求項２】
真核細胞である、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
酵母細胞である、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項４】
サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クロエケラ属（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、シュワンニオマイセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）またはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の酵母細胞である、請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
前記酵母細胞が、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ブルデリ（Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ）、サッカロミセス・バーネッティ（Ｓ．ｂａｒｎｅｔｔｉ）、サッカロミセス・エキシグス（Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ）、サッカロミセス・ウバルム（Ｓ．ｕｖａｒｕｍ）、サッカロミセス・ディアスタティカス（Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）またはクルイベロミセス・フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）種の細胞である、請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
糸状真菌細胞である、請求項１または２に記載の細胞。
【請求項７】
前記糸状真菌細胞が、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、クモノスカビ属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ヒューミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、またはフザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）である、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
前記糸状菌細胞が、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、またはリゾプス・オリーゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）である、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
ａ．細胞におけるキシロースの輸送の増加；
ｂ．キシルロースキナーゼ活性の増加；
ｃ．ペントースリン酸経路を介したフラックスの増加；
ｄ．アルドースレダクターゼ活性の減少；
ｅ．カタボライトリプレッションに対する感受性の減少；
ｆ．エタノール、オスモル濃度または有機酸に対する耐性の増加；または
ｇ．副生成物の産生の低減；
をもたらす、１つまたは複数の遺伝子修飾を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１０】
前記の１つまたは複数の遺伝子修飾によって、ペントースリン酸経路の非酸化的部分の酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子が過剰発現される、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
前記遺伝子が、リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼまたはトランスアルドラーゼをコードする遺伝子である、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
前記の１つまたは複数の遺伝子修飾によって、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼをコードする少なくとも遺伝子が過剰発現される、請求項１０または１１に記載の細胞。
【請求項１３】
前記の１つまたは複数の遺伝子修飾によって、キシルロースキナーゼをコードする遺伝子が過剰発現される、請求項９から１２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１４】
過剰発現される前記遺伝子が、細胞に対して内因性の遺伝子である、請求項８から１３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１５】
前記の１つまたは複数の遺伝子修飾によって、細胞における非特異的アルドースレダクターゼ活性が低下する、請求項９から１４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１６】
前記の１つまたは複数の遺伝子修飾が、非特異的アルドースレダクターゼをコードする内因性遺伝子の発現を低減する、または前記非特異的アルドースレダクターゼの活性を低減する、請求項１５に記載の細胞。
【請求項１７】
前記非特異的アルドースレダクターゼ遺伝子が、非特異的アルドースレダクターゼ遺伝子の少なくとも一部の欠失によって、または該遺伝子の破壊によって不活化される、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１８】
非特異的アルドースレダクターゼをコードする細胞における非特異的アルドースレダクターゼをコードする各遺伝子の発現が低減される、請求項１６または１７に記載の細胞。
【請求項１９】
Ｌ−アラビノースを使用する能力を有する、請求項１から１８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２０】
トランスアルドラーゼ遺伝子（ＴＡＬ１）、トランスケトラーゼ遺伝子（ＴＫＬ１）、リブロース５−リン酸エピメラーゼ遺伝子（ＲＰＥ１）およびＲＫＩ１遺伝子が過剰発現される、請求項９から１９のいずれかに記載の細胞。
【請求項２１】
ＧＲＥ３遺伝子のコード領域が、トランスアルドラーゼ遺伝子（ＴＡＬ１）、トランスケトラーゼ遺伝子（ＴＫＬ１）、リブロース５−リン酸エピメラーゼ遺伝子（ＲＰＥ１）およびＲＫＩ１遺伝子を含むヌクレオチド配列でコード領域を置換することによって不活化される、請求項９から２０のいずれかに記載の細胞。
【請求項２２】
ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来の遺伝子ａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤが発現される、請求項９から２１のいずれかに記載の細胞。
【請求項２３】
発現される遺伝子修飾された遺伝子が構成的に発現される、または構成的に過剰発現される、請求項９から２２のいずれかに記載の細胞。
【請求項２４】
構成的に発現または構成的に過剰発現される１つまたは複数の遺伝子修飾された遺伝子が、細胞のゲノムに安定に組み込まれる、請求項２３に記載の細胞。
【請求項２５】
構成的に発現または構成的に過剰発現される遺伝子修飾された遺伝子が、細胞のゲノムに安定に組み込まれる、請求項２４に記載の細胞。
【請求項２６】
細胞がキシロースを発酵産物へと発酵するように、請求項１から２５のいずれか一項に記載の細胞で、キシロース源を含有する培地を発酵させることを含む、発酵産物を産生する方法。
【請求項２７】
細胞がキシロースおよびＬ−アラビノースを発酵産物へと発酵するように、請求項１９から２３のいずれかに記載の細胞で、少なくともキシロース源およびＬ−アラビノース源を含有する培地を発酵させることを含む、発酵産物を産生する方法。
【請求項２８】
請求項１から１８のいずれか一項に記載の細胞で、少なくともキシロース源およびＬ−アラビノース源を含有する培地を発酵させることを含む方法であって、それによって、各細胞がキシロースおよび／またはアラビノースを発酵産物へと発酵させる、発酵産物を産生する方法。
【請求項２９】
前記発酵産物を回収することを含む、請求項２６から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記培地が、グルコース源も含有する、請求項２６から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記発酵産物が、エタノール、ブタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、イタコン酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、ブタノール、β−ラクタム系抗生物質およびセファロスポリンである、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
嫌気性である、請求項２６から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
好気性条件下にて行われる、請求項２６から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
好気性条件が、酸素制限条件である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
発酵産物を産生する方法における、請求項１から２５のいずれか一項に記載の細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、キシロースをキシルロースに異性化することができる細胞に関する。本発明は、かかる細胞が、エタノールなどの発酵産物の産生に使用される方法にも関する。
【０００２】
［背景技術］
過去数１０年間の従来の化石燃料（石油ベースの燃料）の大規模な消費は、高レベルの汚染の一因となっている。化石燃料の世界的な蓄えが有限ではないという認識、および高まりつつある環境に対する意識に加えて、このことが、無鉛ガソリンよりも、放出するリットル当たりのＣＯ２が少ない、微粒子不含燃焼燃料資源であるエタノールなどの代替燃料の可能性を研究する新たな構想の刺激となっている。
【０００３】
バイオマス由来エタノールは、多くの異なる資源から得られるヘキソース糖を発酵することによって産生することができるが、燃料アルコールの工業規模生産に通常使用されるショ糖およびトウモロコシデンプンなどの基質は高価である。したがって、燃料エタノール産生を増加するには、低コストの供給原料を使用することが必要である。
【０００４】
現在、植物バイオマス由来のリグノセルロース系供給原料のみが、エタノール産生に現在使用されている作物の代わりとして使用するのに十分な量で入手可能である。大部分のリグノセルロース系材料において、グルコースの次に一般的な糖はキシロースである。したがって、経済的に実現可能な燃料生産方法のためには、ヘキソース糖とペントース糖のどちらも発酵させて、エタノールを形成しなければならない。サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母は強く、エタノール産生によく適合するが、炭素源としてキシロースを使用してエタノールを産生することができない。さらに、キシロースをエタノールに発酵することができ、高いエタノール収率および高いエタノール生産性を有する天然生物は知られていない。したがって、リグノセルロース系供給原料からの工業的に実現可能なエタノール産生を可能にするために、これらの特性を有する生物が必要とされている。
【０００５】
［発明の概要］
本発明に従って、アルコール発酵などの発酵が可能であり、かつ炭素源としてキシロースを使用することができる細胞が提供される。かかる細胞は、キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含み、そのキシロースイソメラーゼのアミノ酸配列は、配列番号３に記載のアミノ酸配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有し、かつそのヌクレオチド配列は宿主に対して非相同的である。かかる細胞は、炭素源としてキシロースを使用した場合に、野生型糸状菌と比較して多い量のエタノールを産生する。
【０００６】
本発明は：
−細胞がキシロースを発酵産物へと発酵させるように、本発明の細胞でキシロース源を含有する培地を発酵させることを含む、発酵産物を産生する方法；
−細胞がキシロースおよびＬ−アラビノースを発酵産物へと発酵させるように、Ｌ−アラビノースを用いることもできる、定義される本発明の細胞で、少なくともキシロース源とＬ−アラビノース源を含有する培地を発酵させることを含む、発酵産物を産生する方法；
−本発明の細胞およびＬ−アラビノースを使用することもできる細胞で、少なくともキシロース源とＬ−アラビノース源を含有する培地を発酵させることを含む方法であって、各細胞がキシロースおよび／またはアラビノースを発酵産物へと発酵させる、発酵産物を産生する方法；
も提供する。
【０００７】
本発明はさらに、発酵産物を産生する方法における本発明の細胞の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現に関する、バクテロイデス・ユニフォルミス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ  ８４９２由来のキシロースイソメラーゼをコードするｐＹＩＳＩＴ４−ＸＫＳ１−ｘｙｌＡ（Ｂａｕｎ  ＣｐＯ）のプラスミドマップを示す。ＣｐＯは、最適化されたコドン対を意味する。
【図２】プラスミドｐＰＷＴ０８０の物理的地図を示し、その配列が配列番号４に示される。
【図３】野生型ＧＲＥ３遺伝子座の物理的地図（パネルａ）およびＧＲＥ３遺伝子座におけるＰＷＴ０８０の１コピーの組込みを示す（パネルｂはプライマーが結合する場所を示し、パネルｃはＲＫＩ１プローブが結合する場所を示す）。
【図４】ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤにおけるプラスミドｐＰＷＴ０８０の１コピーの正しい組込みを表すオートラジオグラムを示す：    パネルａ：ＲＫＩ１プローブとハイブリダイズされた染色体ＤＮＡ標本のＸｃｍＩによる消化。レーン１：ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ；レーン２：ＢＩＥ１０４Ｆ１；レーン３：ＢＩＥ１０４Ｐ１    パネルｂ：ＲＫＩ１プローブとハイブリダイズされた染色体ＤＮＡ標本のＰｓｉＩによる消化。レーン１：ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ；レーン２：ＢＩＥ１０４Ｆ１；レーン３：ＢＩＥ１０４Ｐ１    ΔＧＲＥ３：：ＰＰＰは、強力な構成プロモーター、ΔＧＲＥ３：：［ＴＰＩ１ｐ−ＴＡＬ１−ＡＤＨ１ｐ−ＴＫＬ１−ＰＧＩ１ｐ−ＲＰＥ１−ＥＮＯ１ｐ−ＲＫＩ１］の制御下におけるＴＡＬ１、ＴＫＬ１、ＲＫＩ１およびＲＰＥ１遺伝子を含有するカセットによる、ＧＲＥ３遺伝子のコード領域の置換を表す。
【図５】ＧＲＥ３遺伝子のコード領域が、ＰＰＰ遺伝子ＴＡＬ１、ＴＫＬ１、ＲＫＩ１およびＲＰＥ１の組込みによって置換された、ＧＲＥ３遺伝子座の物理的地図を示す。パネルａは、配列番号５および６のプライマーが結合する場所を示し、パネルｂは、ＲＫＩ１プローブが結合する場所を示す。
【図６】プラスミドｐＹＩ＃ＳＩＴ４の物理的地図を示す。
【図７】プラスミドｐＰＷＴ００７の物理的地図を示す。
【図８】プラスミドｐＰＷＴ０４２の物理的地図を示す。
【図９】野生型ＳＩＴ４遺伝子座の物理的地図（パネルａ）およびＳＩＴ４遺伝子座におけるＰＷＴ０８０の１コピーの組込みを示す（パネルｂはプライマーが結合する場所を示す）。
【図１０】数回前培養した後の唯一の炭素源としての２％キシロース上でのＢＩＥ１０４Ｐ１Ｙ９の増殖曲線、およびゲノムにｐＰＷＴ０４２の１コピーが組み込まれていない参照株の増殖曲線を示す。数字によりグラフに事象が示される：（１）：ＹＮＢ  １％グルコース＋１％キシロースに移行；（２）：ＹＮＢ  ０．１％グルコース＋２％キシロースに移行；（３）ＹＮＢ  ２％キシロースに移動；（４）ＹＮＢ  ２％キシロースに移行（ＢＩＥ１０４Ｐ１Ｙ９のみ）。
【図１１】参照株ＢＩＥ１０４Ｐ１、およびキシロース代謝株ＢＩＥ１０４Ｐ１Ｙ９の増殖曲線を示す。
【図１２−１】グルコース上で前培養された株ＢＩＥ１０４Ｐ１（パネルａ）、グルコース上で前培養されたＢＩＥ１０４Ｐ１Ｙ９（パネルｂ）およびキシロース上で前培養されたＢＩＥ１０４Ｐ１Ｙ９（パネルｃ）の時間の経過によるキシロースおよびグルコース消費ならびにエタノール産生を示す。
【図１２−２】グルコース上で前培養された株ＢＩＥ１０４Ｐ１（パネルａ）、グルコース上で前培養されたＢＩＥ１０４Ｐ１Ｙ９（パネルｂ）およびキシロース上で前培養されたＢＩＥ１０４Ｐ１Ｙ９（パネルｃ）の時間の経過によるキシロースおよびグルコース消費ならびにエタノール産生を示す。
【図１２−３】グルコース上で前培養された株ＢＩＥ１０４Ｐ１（パネルａ）、グルコース上で前培養されたＢＩＥ１０４Ｐ１Ｙ９（パネルｂ）およびキシロース上で前培養されたＢＩＥ１０４Ｐ１Ｙ９（パネルｃ）の時間の経過によるキシロースおよびグルコース消費ならびにエタノール産生を示す。
【図１３】プラスミドｐＰＷＴ０１８の物理的地図を示す。
【図１４】プラスミドｐＰＷＴ００６の物理的地図を示す。
【図１５】サザンブロットオートラジオグラムを示す。野生型株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ（レーン１）およびＢＩＥ１０４Ａ２（レーン２）の染色体ＤＮＡを大腸菌（ＥｃｏＲＩ）およびヒンディースリー（ＨｉｎｄＩＩＩ）の両方で消化した。そのブロットを特異的なＳＩＴ２プローブとハイブリダイズした。
【図１６】野生型ＳＩＴ２遺伝子座の物理的地図（パネルａ）ならびにプラスミドｐＰＷＴ０１８の組込みによるａｒａ遺伝子導入後、続いて、分子内組換えによってベクターおよび選択マーカー配列の欠損が生じた物理的地図（パネルｂ）を示す。プローブのハイブリダイゼーションが示される。
【図１７−１】異なる培地上でのＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１Ｙ９株の増殖曲線のグラフ図を示す。パネルａ：ガラクトース上で増殖され、続いて数字によりグラフに示される事象（１）１％アラビノース＋１％キシロースへの移行および（２）２％キシロース＋０．２％アラビノースへの移行が行われたＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１Ｙ９株。パネルｂ：グルコース上で増殖され、続いて（１）１％アラビノース＋１％キシロースへの移行、および（２）２％キシロース＋０．２％アラビノースへの移行が行われたＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１Ｙ９株。
【図１７−２】異なる培地上でのＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１Ｙ９株の増殖曲線のグラフ図を示す。パネルａ：ガラクトース上で増殖され、続いて数字によりグラフに示される事象（１）１％アラビノース＋１％キシロースへの移行および（２）２％キシロース＋０．２％アラビノースへの移行が行われたＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１Ｙ９株。パネルｂ：グルコース上で増殖され、続いて（１）１％アラビノース＋１％キシロースへの移行、および（２）２％キシロース＋０．２％アラビノースへの移行が行われたＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１Ｙ９株。
【０００９】
［配列表の簡単な説明］
配列番号１は、バクテロイデス・ユニフォルミス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ  ８４９２由来の野生型キシロースイソメラーゼ配列を示す。Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＹＨ０２００００３６。
配列番号２は、配列番号１に由来するコドン最適化配列を示す。
配列番号３は、バクテロイデス・ユニフォルミス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ  ８４９２由来のキシロースイソメラーゼのアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、プラスミドｐＰＷＴ０８０の配列を示す。
配列番号５は、フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号６は、リバースプライマーの配列を示す。
配列番号７は、診断ＰＣＲ用の多機能性フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号８は、診断ＰＣＲ用の多機能性リバースプライマーの配列を示す。
配列番号９は、フォワードプライマーＲＫＩ１プローブの配列を示す。
配列番号１０は、リバースプライマーＲＫＩ１プローブの配列を示す。
配列番号１１は、フォワードプライマーｋａｎＭＸカセットの配列を示す。
配列番号１２は、リバースプライマーｋａｎＭＸカセットの配列を示す。
配列番号１３は、フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号１４は、リバースプライマーの配列を示す。
配列番号１５は、診断ＰＣＲ用の多機能性フォワードプライマーの配列を示す。
配列番号１６は、診断ＰＣＲ用の多機能性リバースプライマーの配列を示す。
配列番号１７は、プラスミドｐＰＷＴ０１８の配列の配列を示す。
配列番号１８は、フォワードプライマー組込みｐＰＷＴ０１８の配列を示す。
配列番号１９は、リバースプライマー組込みｐＰＷＴ０１８の配列を示す。
配列番号２０は、フォワードプライマーＳＩＴ２プローブの配列を示す。
配列番号２１は、リバースプライマーＳＩＴ２プローブの配列を示す。
【００１０】
［発明の詳細な説明］
本明細書および添付の特許請求の範囲全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含有する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という単語および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含有する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの変形形態は、包括的に解釈される。すなわち、これらの単語は、状況が許す場合、特に記載されていない他の要素または整数の可能性のある包含を意味することが意図される。
【００１１】
本発明は、キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む細胞に関し、キシロースイソメラーゼのアミノ酸配列は、配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも約７０％の同一性を有し、ヌクレオチド配列は宿主に非相同である。
【００１２】
キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列の存在は、キシロースをキシルロースへと異性化する能力を細胞に与える。
【００１３】
「キシロースイソメラーゼ」（ＥＣ５．３．１．５）は、Ｄ−キシロースのＤ−キシルロースへの、かつ／またはその逆の直接的な異性化を触媒する酵素として本明細書において定義される。その酵素は、Ｄ−キシロースケトイソメラーゼとしても知られる。本明細書において、キシロースイソメラーゼは、Ｄ−グルコースとＤ−フルクトースの間の転化を触媒することもできる（したがって、グルコースイソメラーゼと呼ぶこともできる）。本明細書において、キシロースイソメラーゼは、補因子としてマグネシウム、マンガンまたはコバルトなどの二価カチオンを必要とすることがある。
【００１４】
したがって、本発明の細胞は、キシロースをキシルロースに異性化することができる。キシロースをキシルロースに異性化する能力は、定義されるキシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物で宿主細胞を形質転換することによって、宿主細胞に与えられる。本発明の細胞は、キシルロースへのキシロースの直接的な異性化によって、キシロースをキシルロースに異性化する。これは、キシロースレダクターゼおよびキシリトールデヒドロゲナーゼによりそれぞれ触媒される、キシリトール中間体を介ての、キシルロースへのキシロースの２段階転化とは対照的に、キシロースイソメラーゼにより触媒される１回の反応でキシロースがキシルロースへと異性化されることを意味すると理解される。
【００１５】
キシロースイソメラーゼ活性の単位（Ｕ）は本明細書において、Ｋｕｙｐｅｒら（２００３，ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．４：６９−７８）によって記載されている条件下にて、１分間にキシロース１ｎｍｏｌを産生する酵素の量として定義される。
【００１６】
本発明の細胞は、配列番号３のアミノ酸配列またはそれと少なくとも約７０％の配列同一性を有する配列を有するキシロースイソメラーゼを基準として定義される。同様に、本発明の細胞は、かかるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であるキシロースイソメラーゼを基準として定義され得る。
【００１７】
配列番号３は、バクテロイデス・ユニフォルミス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ  ８４９２由来のキシロースイソメラーゼのアミノ酸配列を示す。本発明の細胞は、配列番号３のアミノ酸を有する、またはそれと少なくとも約７０％の配列同一性を有するキシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。
【００１８】
好ましくは、本発明による細胞は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％または少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するキシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む細胞である。しかしながら、本発明による細胞は、配列番号３に示されるアミノ酸配列と少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％または少なくとも約７０％の配列同一性を有する配列を有するキシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含み得る。
【００１９】
配列同一性（または配列類似性）は本明細書において、配列の比較によって決定される、２つ以上のアミノ酸（ポリペプチドまたはタンパク質）配列または２つ以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列の間の関係として定義される。通常、配列同一性または類似性は、一般に比較される配列の全長によって比較される。しかしながら、配列は、より短い比較の窓によって比較することができる。当技術分野において、「同一性」とは、場合により、かかる配列のストリング間のマッチによって決定される、アミノ酸または核酸配列間の配列関連性の程度も意味する。
【００２０】
同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間の最も大きなマッチが得られるように設計される。同一性および類似性を決定する方法は、一般公開されているコンピュータープログラムで体系化されている。２つの配列間の同一性および類似性を決定するのに好ましいコンピュータープログラム法としては、例えばＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、ＮＣＢＩおよび他の情報源から一般公開されている方法（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓら、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８９４）が挙げられる。ＢＬＡＳＴＰを使用したアミノ酸配列比較のための好ましいパラメーターは、ギャップオープン１１．０、ギャップ伸長１、Ｂｌｏｓｕｍ  ６２マトリックスである。ＢＬＡＳＴＰを用いた核酸配列比較のための好ましいパラメーターは、ギャップオープン１１．０、ギャップ伸長１、ＤＮＡ完全マトリックス（ＤＮＡ同一性マトリックス）である。
【００２１】
任意に、アミノ酸類似性の程度の決定において、当業者は、当業者には明らかであるだろう、いわゆる「保存的」アミノ酸置換も考慮に入れることができる。
【００２２】
保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の互換性を意味する。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびトレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンであり；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。
【００２３】
好ましい保存的アミノ酸置換基は：バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。本明細書において開示されるアミノ酸配列の置換型は、開示される配列において少なくとも１つの残基が除去されており、異なる残基がその場所に挿入されている配列である。アミノ酸の変化が保存的であることが好ましい。天然アミノ酸それぞれの好ましい保存的置換は以下のとおりである：Ａｌａからｓｅｒ；Ａｒｇからｌｙｓ；Ａｓｎからｇｌｎまたはｈｉｓ；Ａｓｐからｇｌｕ；Ｃｙｓからｓｅｒまたはａｌａ；Ｇｌｎからａｓｎ；Ｇｌｕからａｓｐ；Ｇｌｙからｐｒｏ；Ｈｉｓからａｓｎまたはｇｌｎ；Ｈｅからｌｅｕまたはｖａｌ；Ｌｅｕからｉｌｅまたはｖａｌ；Ｌｙｓからａｒｇ；ｇｌｎまたはｇｌｕ；Ｍｅｔからｌｅｕまたはｉｌｅ；Ｐｈｅからｍｅｔ、ｌｅｕまたはｔｙｒ；Ｓｅｒからｔｈｒ；Ｔｈｒからｓｅｒ；Ｔｒｐからｔｙｒ；Ｔｙｒからｔｒｐまたはｐｈｅ；および、Ｖａｌからｉｌｅまたはｌｅｕへの置換。
【００２４】
本発明によるキシルロースへのキシロースの転化を触媒する酵素をコードするヌクレオチド配列は、配列番号３で示される配列またはそれと少なくとも約７０％の配列同一性を有する配列を有する酵素をコードするヌクレオチド配列と、中程度の、または好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下にてハイブリダイズするその能力によっても定義され得る。
【００２５】
形式上、かかるヌクレオチド配列は、配列番号３で示される配列またはそれと少なくとも約７０％の配列同一性を有する配列を有する酵素をコードするヌクレオチド配列の逆相補配列とハイブリダイズし、例えば配列番号１または２の逆相補配列とハイブリダイズする配列とハイブリダイズする。
【００２６】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は本明細書において、少なくとも約２５個、好ましくは約５０個のヌクレオチド、７５または１００個、最も好ましくは約２００個以上のヌクレオチドの核酸配列を温度約６５℃にて約１Ｍ塩を含む溶液、好ましくは６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム）または同等のイオン強度を有する他の任意の溶液中でハイブリダイズし、約０．１Ｍ以下の塩を含む溶液、好ましくは０．２×ＳＳＣまたは同等のイオン強度を有する他の任意の溶液中で６５℃にて洗浄することを可能にする条件として定義される。好ましくは、ハイブリダイゼーションは一晩、すなわち少なくとも１０時間行われ、好ましくは洗浄は、洗浄液の少なくとも２回の交換を伴って、少なくとも１時間行われる。これらの条件は通常、約９０％以上の配列同一性を有する配列の特異的なハイブリダイゼーションを可能にする。
【００２７】
中程度の条件は本明細書において、少なくとも約５０個のヌクレオチド、好ましくは約２００個以上のヌクレオチドの核酸配列を温度約４５℃にて約１Ｍの塩を含む溶液、好ましくは６×ＳＳＣまたは同等のイオン強度を有する他の任意の溶液中でハイブリダイズし、約１Ｍの塩を含む溶液、好ましくは６×ＳＳＣまたは同等のイオン強度を有する他の任意の溶液中で室温にて洗浄することを可能にする条件として定義される。好ましくは、ハイブリダイゼーションは一晩、すなわち少なくとも１０時間行われ、好ましくは洗浄は、洗浄液の少なくとも２回の交換を伴って、少なくとも１時間行われる。これらの条件は通常、約５０％までの配列同一性を有する配列の特異的なハイブリダイゼーションを可能にする。当業者であれば、同一性が５０％〜９０％の様々な配列を特異的に同定するために、これらのハイブリダイゼーション条件に変更を加えることができるだろう。
【００２８】
導入酵素が本発明の細胞において活性型で発現する可能性を高めるために、選択される酵母細胞に対してそのコドン使用頻度を最適化するように、相当するコードヌクレオチド配列を適応させることができる。コドン最適化のいくつかの方法は当技術分野で公知である。酵母に対してヌクレオチド配列のコドン使用頻度を最適化する好ましい方法は、国際公開第２００６／０７７２５８号パンフレットおよび／または国際公開第２００８／０００６３２号パンフレットに開示されているコドン対最適化技術である。国際公開第２００８／０００６３２号パンフレットでは、コドン対最適化に取り組んでいる。コドン対最適化は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、そのコドン使用頻度に関して、特に使用されるコドン対に関して修飾して、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の向上した発現および／またはコードされるポリペプチドの向上した産生を得る方法である。コドン対は、コード配列における１組の２個の連続したトリプレット（コドン）として定義される。
【００２９】
遺伝子発現および翻訳効率の簡単な測定法として、Ｘｕｈｕａ  Ｘｉａ，Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００７：３  ５３−５８に記載のコドン使用頻度の指標（Ｃｏｄｏｎ  Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｅｘ）（ＣＡＩ）が使用される。この指標では、各コドンの相対的なメリットを評価するためにある種からの高度に発現した遺伝子の参照セットを用い、遺伝子のスコアは、その遺伝子におけるすべてのコドンの使用頻度から計算される。この指標によって、コドン使用頻度パターンの形作りにおいて、選択がどの程度まで有効であるのか、その程度が評価される。その点から、遺伝子の発現レベルを予想し、宿主に対するウイルス遺伝子の適応を評価し、かつ異なる生物におけるコドン使用頻度を比較するのに、この指標は有用である。この指標によって、異種遺伝子発現の有望な成功のおよその指標も得られる。本発明によるコドン対最適化遺伝子では、そのＣＡＩは、０．６以上、０．７以上、０．８以上、０．８５以上、０．８７以上、０．９０以上、０．９５以上、または約１．０である。
【００３０】
本発明の細胞において、キシロースイソメラーゼは一般に、その細胞と非相同である。すなわち、キシロースイソメラーゼは、それがその中に存在する生物、細胞、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ配列の一部として、論議されている細胞において天然に存在しない配列を有する。すなわち、キシロースイソメラーゼはその細胞に対して外来性であり、あるいはその細胞に天然に存在しない。したがって、キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列は一般に、形質転換宿主細胞において活性型で発現される、または発現されることができる。
【００３１】
したがって、本発明の細胞は、上記で定義されるキシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物を含む細胞、すなわち、その核酸構築物で形質転換されている細胞である。キシロースイソメラーゼコード配列を含む核酸構築物は好ましくは、宿主細胞においてキシロースイソメラーゼを発現することができる。
【００３２】
細胞において非相同キシロースイソメラーゼ配列を発現する方法は、当業者にはよく知られている。
【００３３】
したがって、本発明の細胞は組換え細胞である。すなわち、本発明の細胞は、対象の細胞において天然に存在しないヌクレオチド配列を含む、またはそのヌクレオチド配列で形質転換される、またはそのヌクレオチド配列で遺伝子組換えされる。
【００３４】
細胞におけるキシロースイソメラーゼの組換え発現の技術、ならびに本発明の細胞の更なる遺伝子修飾の技術は、当業者にはよく知られている。一般に、かかる技術は、関連する配列を含む核酸構築物での細胞の形質転換を含む。かかる方法は、例えばＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ（２００１）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＰｒｅｓｓまたはＦ．Ａｕｓｕｂｅｌら編「Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）などの標準専門書から知られている。真菌宿主細胞の形質転換および遺伝子修飾方法は、例えば欧州特許出願公開第Ａ−０６３５５７４号明細書、国際公開第９８／４６７７２号パンフレット、国際公開第９９／６０１０２号パンフレット、国際公開第００／３７６７１号パンフレット、国際公開第９０／１４４２３号パンフレット、欧州特許出願公開第Ａ−０４８１００８号明細書、欧州特許出願公開第Ａ−０６３５５７４号明細書および米国特許第６，２６５，１８６号明細書から知られている。
【００３５】
大部分のエピソームまたは２μプラスミドは比較的不安定であり、各世代後に約１０−２個以上の細胞で失われる。選択的な増殖の条件下でさえ、６０〜９５％の細胞のみがエピソームプラスミドを保持する。大部分のエピソームプラスミドのコピー数は、ｃｉｒ＋宿主の細胞１個につき１０〜４０の範囲である。しかしながら、プラスミドは、細胞の中に等しく分布しておらず、母集団における細胞当たりのコピー数に高い分散がある。組込みプラスミドで形質転換された株は、選択的圧力の非存在下でさえ、非常に安定である。しかしながら、プラスミドの欠失は、直列型反復ＤＮＡ間の相同的組換えによって、約１０−３〜１０−４回の頻度で起こり、ベクター配列のループアウトが生じる。したがって、好ましくは、安定な組込みの場合におけるベクターデザインは、いったん選択マーカー遺伝子が欠失すると（これは分子内、相同的組換えによっても起こる）、組込み構築物のループアウトがもはや不可能となる、デザインである。好ましくは遺伝子がこのように安定に組み込まれる。安定な組込みは本明細書において、組込み構築物のループアウトがもはや不可能である、ゲノムへの組込みとして定義される。好ましくは、選択マーカーは存在しない。
【００３６】
一般に、核酸構築物は、プラスミド、例えば低コピーのプラスミドまたは高コピーのプラスミドであることができる。本発明による細胞は、例えば、ヌクレオチド構築物の複数のコピーによって、またはキシロースイソメラーゼ配列の複数のコピーを有する構築物の使用によって、キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列の１つ以上のコピーを含み得る。
【００３７】
核酸構築物は、エピソーム的に維持され、したがって、常染色体複製配列などの自律的複製の配列を含む。適切なエピソーム核酸構築物は、例えば酵母２μまたはｐＫＤ１プラスミド（Ｇｌｅｅｒら、１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：９６８−９７５）、またはＡＭＡプラスミド（Ｆｉｅｒｒｏら、１９９５，Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ．２９：４８２−４８９）をベースとし得る。代替方法として、各核酸構築物は、細胞のゲノムに１つまたは複数のコピーで組み込まれてもよい。細胞のゲノムへの組込みは、非相同的組換えによってランダムに起こるが、好ましくは、核酸構築物は、当技術分野でよく知られているように、相同的組換えによって細胞のゲノムへ組み込まれ得る（例えば、国際公開第９０／１４４２３号パンフレット、欧州特許出願公開第Ａ−０４８１００８号明細書、欧州特許出願公開第Ａ−０６３５５７４号明細書および米国特許第６，２６５，１８６号明細書参照）。
【００３８】
一般に、キシロースイソメラーゼをコードする配列は、キシロースイソメラーゼ配列の転写および／または翻訳を提供することができる、または助けることができる、１つ以上の核酸配列に作動可能に連結される。
【００３９】
「作動可能に連結される」という表現は、記載の構成要素が、それらが意図されるように機能することを可能にする関係にある、近位（ｊｕｘｔａｐｏｓｉｔｉｏｎ）を意味する。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、コード配列に作動可能に連結され、前記プロモーターまたはエンハンサーはコード配列の転写に影響を及ぼす。
【００４０】
本明細書で使用される、「プロモーター」という用語は遺伝子の転写開始部位の転写方向に対して上流に位置する１つ以上の遺伝子の転写を制御するように機能し、かつＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位および当業者に公知の他の任意のＤＮＡ配列の存在によって構造的に同定される、核酸断片を意味する。「構成的」プロモーターは、大部分の環境的および発生的条件下にて活性なプロモーターである。「誘導」プロモーターは、環境的および発生的制御下にて活性なプロモーターである。
【００４１】
本発明による酵素をコードするヌクレオチド配列の発現を達成するために使用することができるプロモーターは、発現される酵素をコードするヌクレオチド配列に対して天然（ｎａｔｉｖｅ）ではないかもしれない。すなわち、それが作動可能に連結されるヌクレオチド配列（コード配列）に対して非相同的であるプロモーターである。しかしながら、プロモーターは、宿主細胞に対して相同的、すなわち内因性であることができる。
【００４２】
この文脈における適切なプロモーターとしては、当業者にはよく知られている、構成的かつ誘導性の天然プロモーターならびに改変（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）プロモーターが挙げられる。真核生物の宿主細胞における適切なプロモーターは、ＧＡＬ７、ＧＡＬ１０、またはＧＡＬ１、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＡＤＨ１、ＰＧＬ、ＰＨ０５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ１、ＴＰＩ１、およびＡＯＸ１である。他の適切なプロモーターとしては、ＰＤＣ１、ＧＰＤ１、ＰＧＫ１、ＴＥＦ１、およびＴＤＨ３が挙げられる。
【００４３】
本発明の細胞において、キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド酸配列の３’末端は好ましくは、転写ターミネーター配列に作動可能に連結される。好ましくは、ターミネーター配列は、例えば選択した酵母種など、選択した宿主細胞において作動可能である。いずれにせよ、ターミネーターの選択は重要ではなく、例えば、いずれかの酵母遺伝子由来であることができるが、非酵母、真核生物遺伝子由来である場合には、ターミネーターが時々機能することがある。通常、キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列は、ターミネーターを含む。好ましくは、かかるターミネーターは、本発明の宿主細胞におけるナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解を防ぐ変異と組み合わせられる（例えば：Ｓｈｉｒｌｅｙら、２００２，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６１：１４６５−１４８２参照）。
【００４４】
転写終結配列は好ましくは、ポリアデニル化シグナルをさらに含む。
【００４５】
任意に、本発明で使用するのに適した核酸構築物に選択マーカーが存在し得る。本明細書で使用される、「マーカー」という用語は、マーカーを含有する宿主細胞の選択またはスクリーニングを可能にする形質または表現型をコードする遺伝子を意味する。マーカー遺伝子は、抗生物質抵抗性遺伝子であることができ、それによって、適切な抗生物質を使用して、形質転換されていない細胞の中から形質転換細胞を選択することができる。適切な抗生物質耐性マーカーの例としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ、３’−Ｏ−ホスホトランスフェラーゼＩＩ（カナマイシン、ネオマイシンおよびＧ４１８耐性）が挙げられる。抗生物質耐性マーカーは、倍数性宿主細胞の形質転換には最も簡便であるが、好ましくは、栄養要求性マーカー（ＵＲＡ３、ＴＲＰｌ、ＬＥＵ２）またはＳ．ｐｏｍｂｅ  ＴＰＩ遺伝子（Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｐ  Ｒ，１９８５，Ｇｅｎｅ  ４０：１２５−１３０に記載）などの非抗生物質耐性マーカーが使用される。好ましい実施形態において、核酸構築物で形質転換された宿主細胞はマーカー遺伝子を含まない。マーカー遺伝子を含まない組換え微生物宿主細胞を作製する方法が、欧州特許出願公開第Ａ−Ｏ６３５  ５７４号明細書に開示されておりアスペルギルス・ニデュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）遺伝子または酵母ＵＲＡ３およびＬＹＳ２遺伝子などの二方向性マーカーの使用に基づく。代替方法としては、緑色蛍光タンパク質、ｌａｃＬ、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−グルクロニダーゼなどのスクリーニング可能なマーカーを本発明の核酸構築物中に組込み、形質転換細胞のスクリーニングを可能にすることができる。
【００４６】
本発明で使用するのに適している核酸構築物に存在することができる更なる任意の要素としては、限定されないが、１つ以上のリーダー配列、エンハンサー、組込み因子、および／またはレポータ遺伝子、イントロン配列、セントロメア、テロマーおよび／またはマトリックス接着（ＭＡＲ）配列が挙げられる。本発明の核酸構築物はさらに、ＡＲＳ配列などの自律的複製のための配列を含み得る。
【００４７】
好ましくは、キシロースイソメラーゼは、サイトゾルにおいて発現される。サイトゾルでの発現は、ミトコンドリアまたはペルオキシソーム標的シグナルの欠失または修飾によって達成される。
【００４８】
本発明の細胞は、細菌などの原核細胞または真核細胞など、いずれかの適切な細胞であることができる。一般に、細胞は、真核細胞、例えば酵母または糸状菌である。
【００４９】
本明細書において酵母は、真核微生物として定義され、主に単細胞型で増殖するＥｕｍｙｃｏｔｉｎａ亜門のすべての種を包含する（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓ，Ｃ．Ｊ．，１９６２，Ｉｎ：Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ）。
【００５０】
酵母は単細胞葉状体の出芽によっても、また生物体の分裂によっても増殖することができる。本発明の細胞として好ましい酵母は、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クロエケラ属（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、シュワンニオマイセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）またはヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）に属する。酵母は、嫌気性発酵ができる酵母、さらに好ましくは嫌気性アルコール発酵ができる酵母が好ましい。
【００５１】
本明細書において糸状菌は、Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ亜門のすべての糸状形態を含む真核微生物として定義される。これらの菌は、キチン、セルロース、および他の複合多糖で構成される栄養菌糸によって特徴付けられる。
【００５２】
本発明の細胞として使用するのに適している糸状菌は、形態学的、生理学的、および遺伝的に酵母と異なる。大部分の菌が繁殖に無菌条件を必要とせず、かつバクテリオファージの感染に対して感受性が低いことから、糸状真菌細胞は有利に使用され得る。糸状菌による栄養増殖は菌糸の伸長によるものであり、大部分の糸状菌の炭素異化は、偏性好気性である。本発明の宿主細胞として好ましい糸状菌は、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ヒューミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｒｒａ属、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）またはペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）に属し得る。より好ましくは、糸状真菌細胞は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリーゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、またはリゾプス・オリーゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）細胞であり得る。
【００５３】
長年にわたって、作物糖からバイオエタノールを生産するために、種々の生物体の導入が提案されてきた。しかしながら、実際には、主要なすべてのバイオエタノール生産方法では、エタノール生産体としてサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の酵母が使用され続けている。これは、工業プロセスに対するサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）の多くの魅力的な特徴、すなわち酸、エタノールおよび浸透圧に対する高い耐性、嫌気性増殖能力、および当然のことながらその高いアルコール発酵能力によるものである。宿主細胞として好ましい酵母種としては、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ブルデリ（Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ）、サッカロミセス・バーネッティ（Ｓ．ｂａｒｎｅｔｔｉ）、サッカロミセス・エキシグス（Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ）、サッカロミセス・ウバルム（Ｓ．ｕｖａｒｕｍ）、サッカロミセス・ディアスタティカス（Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）またはクルイベロミセス・フラギリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）が挙げられる。
【００５４】
本発明の細胞は、植物バイオマス、セルロース、ヘミセルロース、ペクチン、ラムノース、ガラクトース、フコース、マルトース、マルトデキストリン、リボース、リブロース、またはデンプン、デンプン誘導体、ショ糖、ラクトースおよびグリセロールを、例えば発酵性糖へと転化することができる。したがって、本発明の細胞は、セルロースをグルコースモノマーへと転化し、ヘミセルロースをキシロースモノマーおよびアラビノースモノマーへと転化するのに必要なセルラーゼ（エンドセルラーゼまたはエキソセルラーゼ）、ヘミセルラーゼ（エンドまたはエキソ−キシラナーゼまたはアラビナーゼ）、ペクチンをグルクロン酸およびガラクツロン酸へと転化することができるペクチナーゼ、またはデンプンをグルコースモノマーへと転化するアミラーゼなどの１つ以上の酵素を発現することができる。
【００５５】
本発明の細胞は、細胞へのキシロースの能動輸送または受動輸送が可能な宿主であることが好ましい。
【００５６】
好ましくは、本発明の細胞は：
能動解糖が可能であり；かつ／または
ペントースリン酸経路を通じてフラックスを示し；かつ／または
キシロースから異性化されたキシルロースがピルビン酸塩へと代謝され得るようなキシルロースキナーゼ活性を示す。
【００５７】
細胞は好ましくは、エタノール、ブタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、フマル酸、リンゴ酸、イタコン酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム系抗生物質またはセファロスポリンなどの所望の発酵産物へとピルビン酸塩を転化するのに必要な酵素活性をさらに含む。
【００５８】
本発明の好ましい細胞は、アルコール発酵、好ましくは嫌気性アルコール発酵が天然に可能な細胞である。本発明の細胞は好ましくは、エタノールに対する高い寛容性、低ｐＨに対する高い寛容性（すなわち、約５、約４、約３、または約２．５より低いｐＨで増殖することができる）および乳酸、酢酸またはギ酸などの有機酸および／またはフルフラルおよびヒドロキシメチルフルフラルなどの糖分解生成物に対する高い寛容性かつ／または高温に対する高い寛容性を有する。
【００５９】
本発明の細胞の上記の特性および活性のいずれも、細胞に天然に存在するか、または遺伝子修飾によって導入または修飾される。
【００６０】
キシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列は一般に、形質転換宿主細胞において活性型で発現される、または発現されることができる。したがって、宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現によって、一般に約３０℃でタンパク質１ｍｇ当たりに少なくとも約１０Ｕのキシロースイソメラーゼ活性、好ましくは約３０℃でタンパク質１ｍｇ当たりに少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約５０、少なくとも約１００、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約５００、少なくとも約７５０または少なくとも約１０００Ｕのキシロースイソメラーゼ活性の特異的な活性を有する活性キシロースイソメラーゼが産生される。形質転換宿主細胞において発現されるキシロースイソメラーゼの特異的な活性は、本明細書において宿主細胞の細胞不含ライセート、例えば酵母細胞不含ライセートのタンパク質１ｍｇ当たりのキシロースイソメラーゼ活性単位の量として定義される。キシロースイソメラーゼ活性、タンパク質の量の決定および細胞不含ライセートの調製は、本明細書に記述されるとおりである。好ましくは、宿主細胞におけるキシロースイソメラーゼをコードするヌクレオチド配列の発現によって、５０、４０、３０または２５ｍＭ未満であるキシロースに対するＫｍを有するキシロースイソメラーゼが産生され、さらに好ましくはキシロースに対するＫｍは約２０ｍＭ以下である。
【００６１】
本発明の細胞は、ペントースリン酸経路のフラックスを増加する、１つ以上の遺伝子修飾を含み得る。特に遺伝子修飾（１つまたは複数）によって、非酸化的部分のペントースリン酸経路を通じてフラックスの増加が生じる。ペントースリン酸経路の非酸化的部分のフラックスの増加を生じさせる遺伝子修飾は本明細書において、その遺伝子修飾がフラックスを増加させることを除いて遺伝的に同一である株におけるフラックスと比較して、フラックスを少なくとも約１．１、約１．２、約１．５、約２、約５、約１０または約２０倍増加する修飾を意味すると理解される。ペントースリン酸経路の非酸化的部分のフラックスは、唯一の炭素源としてのキシロース上で修飾宿主を増殖させ、特異的なキシロース消費速度を決定し、キシリトールが生産された場合には特異的なキシロース消費速度から特異的なキシリトール生産速度を引くことによって、測定される。しかしながら、ペントースリン酸経路の非酸化的部分のフラックスは、唯一の炭素源としてのキシロース上での増殖速度、好ましくは唯一の炭素源としてのキシロース上での嫌気性増殖速度と比例する。唯一の炭素源としてのキシロース上での増殖速度（μｍａｘ）と、ペントースリン酸経路の非酸化的部分のフラックスとの間には、比例関係がある。糖でのバイオマスの収量は一定であるため特異的なキシロース消費速度（Ｑｓ）は、糖でのバイオマスの収量（Ｙｘｓ）で割った増殖速度（μ）に等しい（ある一連の条件下での：嫌気性、増殖培地、ｐＨ、株の遺伝的背景等；すなわち、Ｑｓ＝μ／Ｙｘｓである）。したがって、ペントースリン酸経路の非酸化的部分のフラックス増加は、輸送を除いて、これらの条件下で最大増殖速度の増加から推定される（取込みは律速である）。
【００６２】
ペントースリン酸経路のフラックスを増加する１つ以上の遺伝子修飾は、様々な方法で宿主細胞において誘導される。これらは、例えば、キシルロースキナーゼおよび／または非酸化的部分ペントースリン酸経路の酵素のうちの１つ以上のより高い定常状態活性レベル、かつ／または非特異的アルドースレダクターゼ活性の低減された定常状態レベルを達成することを含む。定常状態活性レベルのこれらの変化は、変異体（自然に起こる、または化学物質または放射線によって誘発される）の選択によって、および／または組換えＤＮＡ技術によって、例えば、酵素をコードする遺伝子またはこれらの遺伝子を調節する因子をそれぞれ過剰発現または不活化させることによって起こり得る。
【００６３】
好ましい宿主細胞において遺伝子修飾は、（非酸化的部分）ペントースリン酸経路の少なくとも１つの酵素の過剰発現を含む。好ましくは、その酵素は、リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼをコードする酵素からなる群から選択される。（非酸化的部分）ペントースリン酸経路の酵素の様々な組み合わせを過剰発現することができる。例えば、過剰発現される酵素は、少なくとも、リブロース−５−リン酸イソメラーゼおよびリブロース−５−リン酸エピメラーゼ酵素；または少なくとも、リブロース−５−リン酸イソメラーゼおよびトランスケトラーゼ酵素；または少なくとも、リブロース−５−リン酸イソメラーゼおよびトランスアルドラーゼ酵素；または少なくとも、リブロース−５−リン酸エピメラーゼおよびトランスケトラーゼ酵素；または少なくとも、リブロース−５−リン酸エピメラーゼおよびトランスアルドラーゼ酵素；または少なくとも、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ酵素；または少なくとも、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ酵素；または少なくとも、リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ酵素；または少なくとも、リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、およびトランスアルドラーゼ酵素；または少なくとも、リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、およびトランスケトラーゼ酵素であることができる。本発明の一実施形態において、リブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼ酵素のそれぞれが、宿主細胞において過剰発現される。宿主細胞における遺伝子修飾が少なくともトランスケトラーゼとトランスアルドラーゼ酵素の両方の過剰発現を含む宿主細胞が、そのような宿主細胞は既にキシロース上での嫌気性増殖が可能なため、より好ましい。実際には、一部の条件下で、トランスケトラーゼとトランスアルドラーゼのみを過剰発現する宿主細胞は既に、その酵素のうち４種類すべて、すなわちリブロース−５−リン酸イソメラーゼ、リブロース−５−リン酸エピメラーゼ、トランスケトラーゼおよびトランスアルドラーゼを過剰発現する宿主細胞と同じキシロース上での嫌気性増殖速度を有する。さらに、これらの酵素のうち１種類のみの過剰発現によって代謝の不均衡が起こり得るため、イソメラーゼのみ、またはエピメラーゼのみを過剰発現する宿主細胞よりも、酵素リブロース−５−リン酸イソメラーゼとリブロース−５−リン酸エピメラーゼの両方を過剰発現する宿主細胞が好ましい。
【００６４】
「リブロース５−リン酸エピメラーゼ」酵素（ＥＣ５．１．３．１）は本明細書において、Ｄ−リブロース５−リン酸へのＤ−キシルロース５−リン酸のエピマー化およびその逆のエピマー化を触媒する酵素として定義される。この酵素は、ホスホリブロースエピメラーゼ；エリトロース−４−リン酸イソメラーゼ；ホスホケトペントース３−エピメラーゼ；キシルロースリン酸３−エピメラーゼ；ホスホケトペントースエピメラーゼ；リブロース５−リン酸３−エピメラーゼ；Ｄ−リブロースリン酸−３−エピメラーゼ；Ｄ−リブロース５−リン酸エピメラーゼ；Ｄ−リブロース−５−Ｐ３−エピメラーゼ；Ｄ−キシルロース−５−リン酸３−エピメラーゼ；ペントース−５−リン酸３−エピメラーゼ；またはＤ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼとしても知られる。リブロース５−リン酸エピメラーゼはさらに、そのアミノ酸配列によって定義される。同様に、リブロース５−リン酸エピメラーゼは、その酵素をコードするヌクレオチド配列によって、ならびにリブロース５−リン酸エピメラーゼをコードする参照ヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列によって定義される。リブロース５−リン酸エピメラーゼをコードするヌクレオチド配列は、本明細書においてＲＰＥ１と示される。
【００６５】
「リブロース５−リン酸イソメラーゼ」酵素（ＥＣ５．３．１．６）は本明細書において、Ｄ−リブロース５−リン酸へのＤ−リボース５−リン酸の直接的異性化およびその逆の直接的異性化を触媒する酵素として定義される。この酵素は、ホスホペントイソメラーゼ；ホスホリボイソメラーゼ；リボースリン酸イソメラーゼ；５−ホスホリボースイソメラーゼ；Ｄ−リボース５−リン酸イソメラーゼ；Ｄ−リボース−５−リン酸ケトール−イソメラーゼ；またはＤ−リボース−５−リン酸アルドース−ケトース−イソメラーゼとしても知られる。リブロース５−リン酸イソメラーゼはさらに、そのアミノ酸配列によって定義され得る。同様に、リブロース５−リン酸イソメラーゼは、その酵素をコードするヌクレオチド配列によって、ならびにリブロース５−リン酸イソメラーゼをコードする参照ヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列によって定義される。リブロース５−リン酸イソメラーゼをコードするヌクレオチド配列は、本明細書においてＲＰＩ１と示される。
【００６６】
「トランスケトラーゼ」酵素（ＥＣ２．２．１．１）は本明細書において、以下の反応：Ｄ−リボース５−リン酸＋Ｄ−キシルロース５−リン酸＜−＞セドヘプツロース７−リン酸＋Ｄ−グリセルアルデヒド３−リン酸およびその逆の反応を触媒する酵素として定義される。この酵素は、グリコールアルデヒドトランスフェラーゼまたはセドヘプツロース−７−リン酸：Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸グリコールアルデヒドトランスフェラーゼとしても知られる。トランスケトラーゼはさらに、そのアミノ酸配列によって定義され得る。同様に、トランスケトラーゼは、その酵素をコードするヌクレオチド配列によって、ならびにトランスケトラーゼをコードする参照ヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列によって定義され得る。トランスケトラーゼをコードするヌクレオチド配列は、本明細書においてＴＫＬ１と示される。
【００６７】
「トランスアルドラーゼ」酵素（ＥＣ２．２．１．２）は明細書において、以下の反応：セドヘプツロース７−リン酸＋Ｄ−グリセルアルデヒド３−リン酸＜−＞Ｄ−エリトロース４−リン酸＋Ｄ−フルクトース６−リン酸およびその逆の反応を触媒する酵素として定義される。この酵素は、ジヒドロキシアセトントランスフェラーゼ；ジヒドロキシアセトンシンターゼ；ホルムアルデヒドトランスケトラーゼ；またはセドヘプツロース−７−リン酸：Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸グリセロントランスフェラーゼとしても知られる。トランスアルドラーゼはさらに、そのアミノ酸配列によって定義され得る。同様に、トランスアルドラーゼは、その酵素をコードするヌクレオチド配列によって、ならびにトランスアルドラーゼをコードする参照ヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列によって定義され得る。トランスアルドラーゼをコードするヌクレオチド配列は、本明細書においてＴＡＬ１と示される。
【００６８】
本発明の細胞において酵素を発現および過剰発現するための様々な手段が当業者には公知である。特に、宿主細胞において酵素をコードする遺伝子のコピー数を増加することによって、例えば宿主細胞のゲノムに遺伝子の更なるコピーを組み込むことによって、エピソーム多コピー型発現ベクターから遺伝子を発現することによって、または遺伝子の複数のコピーを含むエピソーム発現ベクターを導入することによって、酵素を過剰発現することができる。
【００６９】
代替方法としては、本発明の宿主細胞における酵素の過剰発現は、過剰発現されるべき酵素をコードする配列に対して天然ではないプロモーター、すなわち、それが作動可能に連結されるコード配列に対して非相同的なプロモーターを使用することによって達成することができる。プロモーターは好ましくは、それが作動可能に連結されるコード配列に対して非相同的であるが、プロモーターは、宿主細胞に対して相同的、すなわち宿主細胞に対して内因性であることも好ましい。非相同的プロモーターは、好ましくはキシロースまたはキシロースおよびグルコースが炭素源として、さらに好ましくは主要な炭素源（すなわち、利用可能な炭素源の５０％を超える割合が、キシロースまたはキシロースおよびグルコースからなる）として、最も好ましくは唯一の炭素源として利用可能な条件下にて、そのコード配列に対して天然のプロモーターよりも、高い定常状態レベルのコード配列を含む転写物を産生することができる（単位時間当たりに、多くの転写物分子、すなわちｍＲＮＡ分子を産生することができる）ことが好ましい。この文脈における適切なプロモーターとしては、構成的かつ誘導性の天然のプロモーターならびに改変プロモーターが挙げられる。本発明で使用するのに好ましいプロモーターはさらに、カタボライト（グルコース）レプレッションを受けず、かつ／または好ましくは誘導のためにキシロースを必要としない。これらの特徴を有するプロモーターは広く入手可能であり、当業者に公知である。かかるプロモーターの適切な例としては、例えば解糖遺伝子からのプロモーター、例えば酵母または糸状菌由来のホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ、ＴＤＨ３またはＧＡＰＤＨ）、ピルビン酸キナーゼ（ＰＹＫ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターなどが挙げられる。酵母由来のかかるプロモーターについての詳細は、（国際公開第９３／０３１５９号パンフレット）に記載されている。他の有用なプロモーターは、リボソームタンパク質コード遺伝子プロモーター、ラクターゼ遺伝子プロモーター（ＬＡＣ４）、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（ＡＤＨｌ、ＡＤＨ４等）、およびエノラーゼプロモーター（ＥＮＯ）である。他のプロモーター、構成的かつ誘導性のプロモーター、およびエンハンサーまたは上流活性化配列は、当業者にはよく知られているだろう。本発明の宿主細胞において使用されるプロモーターは、所望の場合には、その制御特性に影響を及ぼすように修飾することができる。
【００７０】
上記の酵素の過剰発現に用いられるコード配列は好ましくは、本発明の宿主細胞に対して相同的であり得る。しかしながら、本発明の宿主細胞に対して非相同的なコード配列を使用することができる。
【００７１】
遺伝子組換え宿主細胞における酵素の産生について言及される場合、酵素の過剰発現とは、同一条件下での非修飾宿主細胞と比較して、酵素が高レベルの特異的酵素活性で産生されることを意味する。通常これは、酵素的に活性なタンパク質（またはマルチサブユニット酵素の場合におけるタンパク質）は、同一条件下での非修飾宿主細胞と比較して、多くの量または高い定常状態レベルで産生されることを意味する。同様に、これは通常、酵素的に活性なタンパク質をコードするｍＲＮＡが、同一条件下での非修飾宿主細胞と比較して、多くの量または高い定常状態レベルで産生されることを意味する。したがって、酵素の過剰発現は好ましくは、本明細書に記載の適切な酵素アッセイを用いて、宿主細胞における酵素の特異的な活性のレベルを測定することによって決定される。代替方法としては、酵素の過剰発現は、酵素タンパク質の特異的な定常状態レベルを例えば酵素に対して特異的な抗体を用いて定量化することによって、または酵素をコードするｍＲＮＡの特異的な定常レベルを定量化することによって、間接的に決定することができる。後者は特に、その酵素の基質が市販されていないことから、その酵素アッセイが容易に実行可能ではないペントースリン酸経路の酵素に適している。好ましくは本発明の宿主細胞において、過剰発現されるべき酵素は、過剰発現を生じさせる遺伝子修飾を除いて遺伝的に同一である株と比較して、少なくとも約１．１、約１．２、約１．５、約２、約５、約１０または約２０倍過剰発現される。過剰発現のこれらのレベルは、酵素の活性の定常状態レベル、酵素のタンパク質の定常状態レベルならびに酵素をコードする転写物の定常状態レベルに当てはまり得ることを理解されたい。
【００７２】
本発明の細胞は、特異的なキシルロースキナーゼ活性を高める、１つ以上の遺伝子修飾を含み得る。好ましくは遺伝子修飾（１つまたは複数）によって、例えば、キシルロースキナーゼをコードするヌクレオチド配列の過剰発現によって、キシルロースキナーゼの過剰発現が起こる。キシルロースキナーゼをコードする遺伝子は宿主細胞に対して内因性であるか、または宿主細胞に対して非相同的であるキシルロースキナーゼであることができる。本発明の宿主細胞におけるキシルロースキナーゼの過剰発現に使用されるヌクレオチド配列は、キシルロースキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
【００７３】
「キシルロースキナーゼ」酵素（ＥＣ２．７．１．１７）は本明細書において、ＡＴＰ＋Ｄ−キシルロース＝ＡＤＰ＋Ｄ−キシルロース５−リン酸の反応を触媒する酵素として定義される。この酵素は、リン酸化キシルロキナーゼ、Ｄ−キシルロキナーゼまたはＡＴＰ：Ｄ−キシルロース５−ホスホトランスフェラーゼとしても知られる。本発明のキシルロースキナーゼはさらに、そのアミノ酸配列によって定義され得る。同様に、キシルロースキナーゼは、その酵素をコードするヌクレオチド配列によって、ならびにキシルロースキナーゼをコードする参照ヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列によって定義され得る。
【００７４】
本発明の細胞において、特異的なキシルロースキナーゼ活性を高める遺伝子修飾は、上述のペントースリン酸経路のフラックスを増加する修飾のいずれかと組み合わせることができる。しかしながら、これは必須ではない。
【００７５】
したがって、本発明の宿主細胞は、特異的なキシルロースキナーゼ活性を高める遺伝子修飾（１つまたは複数）のみを含み得る。本発明の宿主細胞におけるキシルロースキナーゼの過剰発現を達成し、かつ解析するための、当技術分野で利用可能な様々な手段は、ペントースリン酸経路の酵素について上述した手段と同じである。好ましくは本発明の宿主細胞において、過剰発現されるキシルロースキナーゼは、過剰発現を生じさせる遺伝子修飾を除いて遺伝的に同一である株と比較して、少なくとも約１．１、約１．２、約１．５、約２、約５、約１０または約２０倍過剰発現される。過剰発現のこれらのレベルは、酵素の活性の定常状態レベル、酵素のタンパク質の定常状態レベルならびに酵素をコードする転写物の定常状態レベルに当てはまることを理解されたい。
【００７６】
本発明の細胞は、宿主細胞において非特異的アルドースレダクターゼ活性を低減する１つ以上の遺伝子修飾を含み得る。好ましくは、非特異的アルドースレダクターゼ活性は、非特異的アルドースレダクターゼをコードする遺伝子の発現を低減する、またはその遺伝子を不活化する、１つ以上の遺伝子修飾によって、宿主細胞において低減される。好ましくは遺伝子修飾は、宿主細胞における非特異的アルドースレダクターゼをコードする遺伝子の各内因性コピーの発現を低減または不活化する。宿主細胞は、二倍性、多倍数性または異数性の結果として、非特異的アルドースレダクターゼをコードする遺伝子の複数のコピーを含み、かつ／または宿主細胞は、アミノ酸配列が異なり、かつ異なる遺伝子によってそれぞれがコードされている、アルドースレダクターゼ活性を有するいくつかの異なる（イソ）酵素を含有し得る。さらに、かかる場合において、好ましくは、非特異的アルドースレダクターゼをコードする各遺伝子の発現が低減または不活化される。好ましくは、その遺伝子は遺伝子の少なくとも一部の欠失によって、または遺伝子の破壊によって不活化され、それによって、この文脈では遺伝子という用語は、コード配列の上流または下流の非コード配列も含み、その（部分的な）欠失または不活化の結果として、宿主細胞における非特異的アルドースレダクターゼ活性の発現が低減される。
【００７７】
本発明の宿主細胞においてその活性が低減される、アルドースレダクターゼをコードするヌクレオチド配列は、アルドースレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。
【００７８】
本発明の宿主細胞において、宿主細胞において非特異的アルドースレダクターゼ活性を低減する遺伝子修飾は上述のペントースリン酸経路のフラックスを増加する修飾のいずれか、および／または宿主細胞における特異的なキシルロースキナーゼ活性を高める修飾のいずれかと組み合わせることができる。しかしながら、これは必須ではない。
【００７９】
したがって、宿主細胞において非特異的アルドースレダクターゼ活性を低減する遺伝子修飾のみを含む本発明の宿主細胞が、特に本発明に含まれる。
【００８０】
「アルドースレダクターゼ」酵素（ＥＣ１．１．１．２１）は本明細書において、キシロースまたはキシルロースをキシリトールへと還元することができる酵素として定義される。本発明の文脈において、アルドースレダクターゼは、本発明の宿主細胞に対して天然（内因性）であり、かつキシロースまたはキシルロースをキシリトールへと還元することができるいずれかの非特異的アルドースレダクターゼであり得る。非特異的アルドースレダクターゼは、以下の反応：
アルドース＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋Ｈ＋  ?  アルジトール＋ＮＡＤ（Ｐ）＋
を触媒する。
【００８１】
この酵素は広い特異性を有し、アルドースレダクターゼ；ポリオールデヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ＋）；アルジトール：ＮＡＤＰオキシドレダクターゼ；アルジトール：ＮＡＤＰ＋１−オキシドレダクターゼ；ＮＡＤＰＨ−アルドペントースレダクターゼ；またはＮＡＤＰＨ−アルドースレダクターゼとしても知られる。
【００８２】
サッカロミセス・セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に対して内因性であり、かつＧＲＥ３遺伝子によってコードされる、かかる非特異的アルドースレダクターゼの詳細な例（Ｔｒａｆｆら、２００１，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６７：５６６８−７４）。したがって、本発明のアルドースレダクターゼはさらに、そのアミノ酸配列によって定義される。同様に、アルドースレダクターゼは、その酵素をコードするヌクレオチド配列によって、ならびにアルドースレダクターゼをコードする参照ヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列によって定義される。
【００８３】
本発明の細胞は、キシロース上での、好ましくは炭素源としてのキシロース上での、さらに好ましくは嫌気性条件下での増殖のために、自然発生の、または誘発される（例えば、放射線または化学物質よって）変異体を選択することによって、キシロースの利用に適応される。変異体の選択は、例えばＫｕｙｐｅｒら（２００４，ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．４：６５５−６６４）により記載されている培養物の連続継代などの技術によって、またはケモスタット培養物における選択圧下での培養によって行われる。好ましい本発明の宿主細胞において、変異体の選択によって得られる修飾を含む上述の遺伝子修飾のうちの少なくとも１つは、炭素源としての、好ましくは唯一の炭素源としてのキシロース上で、好ましくは嫌気性条件下で増殖する能力を宿主細胞に与える。好ましくは、修飾された宿主細胞は、本質的にキシリトールを産生せず、例えば、産生されるキシリトールは、検出限界を下回り、または例えば消費される炭素の約５、約２、約１、約０．５、または約０．３％未満（モル基準）である。
【００８４】
本発明の細胞は、好気性条件下にて少なくとも約０．０５、約０．１、約０．２、約０．２５または約０．３ｈ−１の速度で、または適用可能な場合には嫌気性条件下にて少なくとも約０．０３、約０．０５、約０．０７、約０．０８、約０．０９、約０．１、約０．１２、約０．１５または約０．２ｈ−１の速度で、唯一の炭素源としてのキシロース上で増殖する能力を有し得る。好ましくは、修飾された宿主細胞は、好気性条件下にて少なくとも約０．０５、約０．１、約０．２、約０．２５または約０．３ｈ−１の速度で、または適用可能な場合には嫌気性条件下にて少なくとも約０．０３、約０．０５、約０．１、約０．１２、約０．１５、約０．２ｈ−１の速度で、唯一の炭素源としてのグルコースとキシロースの混合物（重量比１：１）上で増殖する能力を有する。
【００８５】
本発明の細胞は、少なくとも約２００、約２５０、約３００、約３４６、約３５０、約４００、約５００、約６００、約７５０、または約１０００ｍｇのキシロース／ｇ  細胞／ｈの特異的なキシロース消費速度を有し得る。本発明の細胞は、グルコース上での発酵産物（エタノールなど）の宿主細胞の収率の少なくとも約４０、約５０、約５５、約６０、約７０、約８０、約８５、約９０、約９５、約９８または約９９％である、キシロース上での発酵産物（エタノールなど）の収率を有し得る。さらに好ましくは、キシロース上での本発明の細胞の発酵産物（エタノールなど）の収率は、グルコース上での発酵産物（エタノールなど）の細胞の収率と等しい。同様に、キシロース上での細胞のバイオマス収率は、グルコース上での宿主細胞のバイオマス収率の少なくとも約４０、約５０、約５５、約６０、約７０、約８０、約８５、約９０、約９５、約９８または約９９％である。さらに好ましくは、キシロース上での細胞のバイオマス収率は、グルコース上での宿主細胞のバイオマス収率と等しい。グルコース上およびキシロース上での収率の比較において、どちらの収率も、好気性条件下または嫌気性条件下で比較されることを理解されたい。
【００８６】
本発明の細胞は、アラビノースを使用することができる。したがって、本発明の細胞は、Ｌ−アラビノースをＬ−リブロースおよび／またはキシルロース５−リン酸に、かつ／または所望の発酵産物、例えば本明細書に記載の産物のうちの１つに転化することができる。
【００８７】
生物、例えばＬ−アラビノースからエタノールを産生できるサッカロミセス・セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株は、適切な源からのａｒａＡ（Ｌ−アラビノースイソメラーゼ）、ａｒａＢ（Ｌ−リブロキナーゼ）およびａｒａＤ（Ｌ−リブロース−５−Ｐ４−エピメラーゼ）遺伝子を導入する細胞を修飾することによって作製される。かかる遺伝子は、アラビノースを使用することができるように本発明の細胞に導入される。かかるアプローチは国際公開第２００３／０９５６２７号パンフレットに記載されている。
【００８８】
本発明の細胞は、エタノールの産生に適している細胞である。しかしながら、本発明の細胞は、エタノール以外の発酵産物の産生にも適している。かかる非エタノール発酵産物は原則的に、酵母または糸状菌などの真核微生物によって産生可能な塊状または微細化学物質を含む。
【００８９】
かかる発酵産物は、例えば、ブタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、イタコン酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム系抗生物質またはセファロスポリンである。非エタノール発酵産物を産生するための、好ましい本発明の修飾宿主細胞は、結果としてアルコールデヒドロゲナーゼ活性を低減する遺伝子修飾を含有する宿主細胞である。
【００９０】
更なる態様において、本発明は、本発明の修飾宿主細胞が、キシロースなどのキシロース源を含む炭素源の発酵に使用される、発酵プロセスに関する。キシロース源に加えて、発酵培地における炭素源は、グルコース源も含み得る。キシロースまたはグルコース源はキシロースまたはグルコース自体であるか、またはキシロースもしくはグルコース単位を含む炭水化物オリゴマーまたはポリマー、例えばリグノセルロース、キシラン、セルロース、デンプン等であることができる。かかる炭水化物からキシロースまたはグルコース単位を放出するために、適切なカルボヒドラーゼ（キシラナーゼ、グルカナーゼ、アミラーゼ等）が発酵培地に添加されるか、または修飾宿主細胞によって産生される。後者の場合には、かかるカルボヒドラーゼが産生および排出されるように、修飾宿主細胞が遺伝子操作される。グルコースのオリゴマーまたはポリマー源を使用する更なる利点は、例えば、律速量のカルボヒドラーゼを使用することによって、発酵中に低濃度の遊離グルコースを維持することが可能となることである。次に、これは、キシロースなどの非グルコース糖の代謝および輸送に必要なシステムの抑制を防ぐ。
【００９１】
好ましい方法において、修飾宿主細胞は、キシロースとグルコースのどちらも、好ましくは同時に発酵させ、その場合には、好ましくはグルコース抑制を受けず、ディオーキシー増殖（ｄｉａｕｘｉｃ  ｇｒｏｗｔｈ）を防ぐ修飾宿主細胞が使用される。炭素源としてのキシロース（およびグルコース）源に加えて、発酵培地はさらに、修飾宿主細胞の増殖に必要な適切な成分を含むだろう。酵母などの微生物を増殖させるための発酵培地の組成は当技術分野でよく知られている。その発酵プロセスは、例えば、エタノール、ブタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、イタコン酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、ペニシリンＧまたはペニシリンＶおよびその発酵誘導体およびセファロスポリンなどのβ−ラクタム系抗生物質などの発酵産物を産生する方法である。
【００９２】
発酵プロセスは、好気性または嫌気性発酵プロセスである。嫌気性発酵プロセスは本明細書において、酸素の存在下にて行われるか、または実質的に酸素が消費されない、好ましくは約５未満、約２．５または約１ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈ、さらに好ましくは０ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈが消費される（すなわち、酸素消費量が検出不可能である）、かつ有機分子が電子供与体と電子受容体両方としての役割を果たす、発酵プロセスとして定義される。酸素の非存在下では、解糖およびバイオマス形成で産生されるＮＡＤＨは、酸化的リン酸化によって酸化することができない。この問題を解決するために、多くの微生物では、電子および水素受容体としてピルビン酸またはその誘導体の１つが用いられ、それによってＮＡＤ＋が再生される。
【００９３】
したがって、好ましい嫌気性発酵プロセスでは、ピルビン酸は電子（および水素受容体）として使用され、エタノール、ブタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム系抗生物質およびセファロスポリンなどの発酵産物に還元される。
【００９４】
発酵プロセスは好ましくは、修飾宿主細胞に最適な温度で行われる。したがって、大部分の酵母または真菌宿主細胞については、発酵プロセスは、約４２℃未満、好ましくは約３８℃未満の温度で行われる。酵母または糸状真菌宿主細胞については、発酵プロセスは、好ましくは約３５、約３３、約３０または約２８℃より低い温度で、および約２０、約２２、または約２５℃より高い温度で行われる。
【００９５】
好ましい方法は、エタノールを産生する方法であり、そのため、その方法は、（ａ）キシロース源を含有する培地を上記で定義される修飾宿主細胞で発酵させ、それによって、宿主細胞がキシロースをエタノールに発酵させる工程；任意に、（ｂ）エタノールを回収する工程；を含む。発酵培地は、エタノールに発酵されるグルコース源も含み得る。その方法において、容積測定によるエタノール生産性は好ましくは、少なくとも約０．５、約１．０、約１．５、約２．０、約２．５、約３．０、約５．０または約１０．０ｇエタノール／リットル／時間である。この方法におけるキシロースおよび／またはグルコース上でのエタノール収率は好ましくは、少なくとも約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約９５または約９８％である。エタノール収率は本明細書において、理論最大収量のパーセンテージとして定義される。
【００９６】
本発明は、ブタノール乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、イタコン酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム系抗生物質およびセファロスポリンからなる群から選択される産物などの発酵産物を産生する方法にも関する。この方法は好ましくは、本明細書において上記で定義される修飾宿主細胞でキシロース源を含有する培地を発酵させることを含み、それによって、宿主細胞がキシロースを発酵産物に発酵させる。
【００９７】
本発明は、エタノール、ブタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、イタコン酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム系抗生物質およびセファロスポリンからなる群から選択される産物などの発酵産物を産生する方法も提供する。この方法は好ましくは、細胞がキシロースおよびＬ−アラビノースを発酵産物へと発酵させるように、キシロースとＬ−アラビノースの両方を使用することができる上記で定義される細胞で、少なくともキシロース源とＬ−アラビノース源を含有する培地を発酵させることを含む。
【００９８】
本発明は、エタノール、ブタノール、乳酸、３−ヒドロキシ−プロピオン酸、アクリル酸、酢酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、フマル酸、イタコン酸、アミノ酸、１，３−プロパン−ジオール、エチレン、グリセロール、β−ラクタム系抗生物質およびセファロスポリンからなる群から選択される産物などの発酵産物を産生する方法も提供する。この方法は好ましくは、上記で定義される細胞およびＬ−アラビノースを使用することができる細胞で、少なくともキシロース源とＬ−アラビノース源を含有する培地を発酵させ、それによって各細胞がキシロースおよび／またはアラビノースを発酵産物へと発酵させることを含む。
【００９９】
本発明の方法は、発行産物の回収も含み得る。その方法が行われる培地は、グルコース源も含有し得る。
【０１００】
本発明による方法は、好気性および嫌気性条件下で行われる。好ましくは、方法は、微好気性または酸素制限条件下にて行われる。
【０１０１】
嫌気性発酵プロセスは本明細書において、酸素の非存在下にて行われる、または実質的に酸素が消費されない、好ましくは約５未満、約２．５または約１ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈが消費される、かつ有機分子が電子供与体と電子受容体の両方としての役割を果たす、発酵プロセスとして定義される。
【０１０２】
酸素制限発酵プロセスは、酸素消費量が、気体から液体への酸素移動によって制限されるプロセスである。酸素制限の程度は、入ってくるガスフローの量および組成、ならびに使用される発酵装置の実際の混合／物質移動特性によって決定される。好ましくは、酸素制限条件下のプロセスにおいて、酸素消費量の速度は、少なくとも約５．５、さらに好ましくは少なくとも約６、例えば少なくとも７ｍｍｏｌ／Ｌ／ｈである。
【０１０３】
以下の実施例によって本発明を説明する。
【０１０４】
［実施例］
別段の指定がない限り、用いられる方法は、生化学的標準技術である。適切な一般方法論の教科書の例としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃが挙げられる。
【０１０５】
キシロース異性化活性（実施例１および２で決定される）
５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）、１０ｍＭキシロース、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２および適切な量の細胞不含抽出物を含有する反応混合物において３７℃で、キシロースイソメラーゼ活性がアッセイされる。形成されるキシルロースの量は、システイン−カルバゾール法（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  ＭｃＣｕｓｋｅｒ，Ｙｅａｓｔ  １５，１５４１−１５５３，１９９９）によって決定される。代替方法としては、キシロースイソメラーゼ活性は、Ｋｅｒｓｔｅｒｓ−Ｈｉｌｄｅｒｓｓｏｎらの酵素アッセイを用いて３０℃でアッセイされる（Ｄ−ソルビトールデヒドロゲナーゼを使用した酵素アッセイによるＤ−キシロースイソメラーゼの速度論的キャラクタリゼーション、Ｅｎｚ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．９（１９８７）１４５−１４８）。形質転換サッカロミセス・セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株の細胞不含抽出物におけるキシロースイソメラーゼの生体外活性は、二価カチオン（Ｍｇ２＋またはＣｏ２＋）に依存する。
【０１０６】
サッカロミセス・セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の形質転換
サッカロミセス・セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の形質転換は、ＧｉｅｔｚおよびＷｏｏｄｓ（２００２；Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＬｉＡｃ／ＳＳ  ｃａｒｒｉｅｒ  ＤＮＡ／ＰＥＧ  ｍｅｔｈｏｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ３５０：８７−９６）によって記述されるように行われた。
【０１０７】
コロニーＰＣＲ
単一コロニー分離株をプラスチック製爪楊枝でつまみ、ミリＱ水５０μｌに再懸濁した。試料を９９℃で１０分間インキュベートした。供給元から提供される説明書に従ってＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（フィンザイム社（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ））を使用してＰＣＲ反応の鋳型として、インキュベートした試料５μｌを使用した。
【０１０８】
【表１】
0005625199.tif 000002
【０１０９】
キシロースイソメラーゼ活性の決定のための試料の前処理（本明細書および実施例３において一般的な）
０．１Ｍ  ＭＯＰＳバッファー（ｐＨ７．５）０．５ｍｌを一晩培養液の細胞ペレットに添加した。細胞を再懸濁し、直径０．４〜０．５ｍｍのガラスビーズ０．５ｇを既に含有する２ｍｌエッペンドルフチューブにそれを移した。エッペンドルフチューブ振盪機（ＩＫＡ  ＶＩＢＲＡＸ−ＶＸＲ）において最高速度で４℃にて２０分間、すべての試料を激しく振盪した。抽出物を１４０００ｒｐｍおよび４℃で５分間遠心分離した。細胞不含抽出物である上清を新たなエッペンドルフチューブに移した。
【０１１０】
アッセイ条件  キシロースイソメラーゼ活性アッセイ（本明細書において一般的であり、実施例３で決定される）
以下の方法は、Ｄｉｓｃｈｅ−Ｂｏｒｅｎｆｒｅｕｄ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９５１）１９２，２，５８３−５８７により記載の方法の改良型である。基質混合物（１００ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，１０ｍＭ  Ｄ−キシロース）１．０ｍｌを（希釈された）細胞不含抽出物５０μｌと氷上で二つ組で混合した。続いて、反応チューブを５０℃の水浴に３０分間入れた。さらに、反応も二つ組で３０℃で行った。氷水上に反応チューブを置き、続いて１．６７％Ｌ−システイン塩酸塩一水和物（メルク社（Ｍｅｒｃｋ））溶液０．２ｍｌを添加することによって、反応を停止した。次いで、ボルテックスすることによって、混合物をよく混合した。続いて、Ｈ２ＳＯ４溶液（９５〜９７％濃Ｈ２ＳＯ４４５０ｍｌを含む水１９０ｍｌ）６ｍｌを添加して直ぐに、エタノールに溶解された０．１２％（ｗ／ｖ）カルバゾール（メルク社）０．２ｍｌを添加した。この最終混合物をボルテックスすることによって混合し、室温で６０分間放置した。プラスチック製キュベットを使用して５６０ｎｍにて吸収を測定する。
【０１１１】
ケトースでもあるＤ（＋）−フルクトースを参照として使用した。このために、Ｄ−フルクトース約１０００ｍｇを正確に計量し、５０ｍｌメスフラスコ中で０．１Ｍ  ＭＯＰｓバッファー（ｐＨ７．５）に溶解した。一連の希釈は、約２〜２０μモル／ｍｌの範囲で行われた。これらのフルクトース溶液５０μｌを上述のアッセイで使用し、５６０ｎｍでの吸収を用いて較正曲線を作製した。５６０ｎｍでの吸光度を較正曲線に関連付けることによって、試料の活性を計算した。
【０１１２】
ブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）法の改良プロトコルに従って、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（サーモサイエンティフィック社（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））を用いて、試料のタンパク質濃度を決定した。キシロースイソメラーゼの特異的活性は、ｎｍｏｌ／ｍｇタンパク質／分として表される。
【０１１３】
［実施例１］
サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるバクテロイデス・ユニフォルミス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ  ８４９２からのイソメラーゼの発現
１．１．１  キシロースイソメラーゼ発現ベクターの作製
バクテロイデス・ユニフォルミス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ  ８４９２からのキシロースイソメラーゼ［Ｅ．Ｃ．４．２．１．２］，ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＹＨ０２００００３６（配列番号１）をコドン使用頻度について解析した。国際公開第２００６／０７７２５８号パンフレットおよび国際公開第２００８／０００６３２号パンフレットに記載のように、コドン使用を最適化した（配列番号２）。
【０１１４】
サッカロミセス・セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＴＰＩ１プロモーターの前方で、配列番号２による遺伝子をクローン化した。可能性のあるキシロースイソメラーゼの非効率的な発現を防ぐために、次の配列：
ＡＣＴＡＧＴＡＡＡＡＡＣＡＣＡＴＡＣＡＴＡＡＡＣＴＡＡＡＡＡＴＧ
をコード配列の前に置き、開始コドンを下線を引いて示した。
【０１１５】
ＳｐｅＩ制限部位ＡＣＴＡＧＴ）を強力な構成ＴＰＩ１プロモーターに導入し、配列：
ＴＣＴＴＧＣＴＴＡＡＡＴＣＴＡＴＡＡＣＴＡＣＡＡＡＡＡＡＣＡＣＡＴＡＣＡＴＡＡＡＣＴＡＡＡＡＡＴＧ（元のＴＰＩ１プロモーター）を
ＴＣＴＴＧＣＴＴＡＡＡＴＣＴＡＴＡＡＣＴＡＧＴＡＡＡＡＡＣＡＣＡＴＡＣＡＴＡＡＡＣＴＡＡＡＡＡＴＧに変更した。
【０１１６】
これによって、コドン最適化キシロースイソメラーゼコード配列をＴＰＩ１プロモーターに作動可能に連結することが可能となる。
【０１１７】
さらに、終止コドンＴＡＡを、酵母における最も効率的な終止コドンであるＴＡＡＧに変更した。簡便な制限部位を加えて、クローン化を促進した。ジーンアート社（ＧｅｎｅＡｒｔ  ＡＧ）（ドイツ、レーゲンスブルク（Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ））によって、配列が合成される。
【０１１８】
最終的な酵母発現コンストラクトｐＹＩＳＩＴ４−ＸＫＳ１−ｘｙｌＡ（Ｂａｕｎ  ＣｐＯ）を図１に示す。
【０１１９】
１．２  酵母形質転換
サッカロミセス・セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ（ＭＡＴａ  ＵＲＡ３  ＨＩＳ３  ＬＥＵ２  ＴＲＰ１  ＭＡＬ２−８  ＳＵＣ２）  およびそのＧＲＥ３遺伝子がペントースリン酸経路（上記参照）の非酸化的部分の遺伝子によって置換されたＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄの誘導体（ＭＡＴａ  ＵＲＡ３  ＨＩＳ３  ＬＥＵ２  ＴＲＰ１  ＭＡＬ２−８  ＳＵＣ２  ＧＲＥ３：：［ＴＰＩ１ｐ−ＴＡＬ１＿ＡＤＨ１ｐ−ＴＫＬ１＿ＰＧＩ１ｐ−ＲＰＥ１＿ＥＮＯ１ｐ−ＲＫＩ１］）を構築物ｐＹＩＳＩＴ４−ＸＫＳ１−ｘｙｌＡ（Ｂａｕｎ  ＣｐＯ）で形質転換する。酵母カーボンベース（ＹＣＢ）ｗ／ｏ硫酸アンモニウム（ディフコ社（Ｄｉｆｃｏ））、４０ｍＭ  ＫＰｉ（ｐＨ６．８）および５ｍＭアセトアミド上に、形質転換混合物をプレーティングした。非形質転換細胞はこの培地で増殖することができない。
【０１２０】
形質転換体は、ＰＣＲ技術および／またはサザンブロット技術を使用して特徴付けられる。
【０１２１】
［実施例２］
キシロース上での形質転換酵母株の増殖
２．１  培地の組成
増殖実験：以下の組成：０．６７％（ｗ／ｖ）酵母窒素ベースおよびグルコース、ガラクトースまたはキシロースのいずれか、またはこれらの基質の組み合わせ（以下参照）を有する培地上で、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株を増殖させる。寒天平板を得るために、培地に２％（ｗ／ｖ）細菌学的（ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ）寒天を追加した。
【０１２２】
エタノール産生：振盪フラスコ培養を合成培地中で３０℃にて行った（Ｖｅｒｄｕｙｎら、Ｙｅａｓｔ  ８：５０１−５１７，１９９２）。滅菌前に２Ｍ  ＫＯＨで培地のｐＨを調整した。固形合成培地を得るために、寒天１．５％を加えた。
【０１２３】
５００ｍｌ振盪フラスコにおいて適切な糖を含有する培地１００ｍｌに凍結ストック培養物を接種することによって、前培養物を調製した。オービタルシェーカー（２００ｒｐｍ）で３０℃にてインキュベートした後、この培養物を用いて、振盪フラスコ培養物を接種した。嫌気性培養のための合成培地に、エタノールに溶解されたエルゴステロール０．０１ｇ／ＬおよびＴｗｅｅｎ８０  ０．４２ｇ／Ｌを追加した（Ａｎｄｒｅａｓｅｎ  ａｎｄ  Ｓｔｉｅｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４１：２３−３６，１９５３；  およびＡｎｄｒｅａｓｅｎ  ａｎｄ  Ｓｔｉｅｒ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．４３：２７１−２８１，１９５４）。
【０１２４】
２．２  増殖実験
ｐＹＩＳＩＴ４−ＸＫＳ１−ｘｙｌＡ（Ｂａｕｎ  ＣｐＯ）で形質転換された、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤまたはＰＰＰを構成的に発現する誘導体（実施例１参照）を炭素源として２％グルコースを有する寒天平板上で増殖させる。コロニーが目に見える場合には、単一コロニーを用いて、炭素源としての１００ｍＭキシロース、１００ｍＭグルコースおよび１００ｍＭガラクトース、またはその組み合わせを有する液体培地に、接種する。ＬＫＢ  Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  Ｋ分光光度計で６００ｎｍにて光学濃度の増加を測定することによって、増殖がモニターされる。
【０１２５】
２．３  エタノール産生
ｐＹＩＳＩＴ４−ＸＫＳ１−ｘｙｌＡ（Ｂａｕｎ  ＣｐＯ）で形質転換されたサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７ＤまたはＰＰＰを構成的に発現する誘導体（実施例１参照）を炭素源として２％グルコースを有する寒天平板上で増殖させる。コロニーが目に見える場合には、単一コロニーを用いて合成培地に接種する（上記のＶｅｒｄｕｙｎら）。グルコース、キシロースおよびまたはガラクトースの混合物を炭素源として培地に０〜５０グラム／リットルの範囲で添加する。ＬＫＢ  Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  Ｋ分光光度計で６００ｎｍにて光学濃度の増加を測定することによって、増殖がモニターされる。エタノールの産生および糖の消費は、ＨＰＬＣおよび／またはＮＭＲ分析によってモニターされる。
【０１２６】
［実施例３］
３．１  非酸化的ペントースリン酸経路の構成的に発現された４つの遺伝子の導入
ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ（ＭＡＴａ  ＵＲＡ３  ＨＩＳ３  ＬＥＵ２  ＴＲＰ１  ＭＡＬ２−８  ＳＵＣ２）をプラスミドｐＰＷＴ０８０で形質転換することによって遺伝子ＴＡＬ１、ＴＫＬ１、ＲＫＩ１およびＲＰＥ１を構成的に発現するサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＩＥ１０４Ｐ１を得た（図２）。プラスミドｐＰＷＴ０８０は大部分が、ジーンアート社（ドイツ、レーゲンスブルク）によって合成された合成ＤＮＡを使用して作製された。プラスミドｐＰＷＴ０８０の配列は配列番号４に示される。手短に言えば、プラスミドｐＰＷＴ０８０は、図２に示されるように、ＧＲＥ３遺伝子のプロモーター領域、続いて強力な構成プロモーターの制御下の４つのＰＰＰ遺伝子ＴＡＬ１、ＴＫＬ１、ＲＫＩ１およびＲＰＥ１、およびＧＲＥ３遺伝子の３’非コード配列からなる。選択マーカーとして、Ｇ４１８に対する耐性を付与するｋａｎＭＸ遺伝子および唯一の窒素源としてのアセトアミド中で形質転換体が増殖することを可能にするアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）ａｍｄＳ遺伝子がこのプラスミド上に存在する。組込みに続いて分子内組換えされると、マーカーは失われ、この構築物の組込みによって、ＧＲＥ３遺伝子のコード領域が不活化され遺伝子ＴＡＬ１、ＴＫＬ１、ＲＰＥ１およびＲＫＩ１の過剰発現が起こる。
【０１２７】
ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄの形質転換の前に、供給元によって提供される説明書に従って制限酵素ＳｆｉＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、ｐＰＷＴ０８０を直鎖化した。１ｍｌ当たりＧ４１８（シグマ・アルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ））１００μｇを含有するＹＰＤ（１リットル当たり：酵母抽出物１０ｇ、ペプトン２０ｇ／Ｌ、ブドウ糖２０ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ）上に形質転換混合物をプレーティングした。
【０１２８】
２〜４日後に、コロニーがプレート上に現れたのに対して、ネガティブコントロール（すなわち、形質転換実験でＤＮＡが添加されていない）では、ブランクのＹＰＤ／Ｇ４１８プレートが得られた。
【０１２９】
プラスミドｐＰＷＴ０８０の組込みは、ＧＲＥ３遺伝子座に向けられる。ＰＣＲおよびサザンブロット技術を用いて、形質転換体を特徴付けた。
【０１３０】
プラスミドｐＰＷＴ０８０の１コピーの正しい組み込みを表すＰＣＲ反応は、配列番号５と６、および配列番号６と７によって示されるプライマーで行われた（図３参照）。配列番号５および６のプライマー対を用いて、ＧＲＥ３遺伝子座での正しい組込みをチェックした。プラスミドｐＰＷＴ０８０が複数のコピーで組み込まれる（頭−尾（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）の組込み）場合、配列番号６および７のプライマー対によって、ＰＣＲ産物が得られる。後者のＰＣＲ産物が存在しない場合、これは１つのコピーの組込みを表す。
【０１３１】
上述のＰＣＲ技術を用いて、それ自体が同定された形質転換体における正しい１コピーの組込みを検証するために、サザンブロット分析を行った。このために、分子生物学標準技術を用いて、野生型株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄおよび形質転換体から、染色体ＤＮＡを単離した。その染色体ＤＮＡを制限酵素ＸｃｍＩおよびＰｓｉＩで消化し、０．７％アガロースゲル上で電気泳動し、製造元の説明書に従ってナイロン膜（Ｈｙｂｏｎｄ  Ｎ＋、アマシャム・ファルマシア・バイオテク社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社））にＤＮＡを移行した。
【０１３２】
プラスミドｐＰＷＴ０８０の正しい組込みを検出するためのプローブとして、プラスミドｐＰＷＴ０８０に存在するＲＫＩ１遺伝子由来のプローブを使用した。配列番号９と１０のプライマーおよびプラスミドｐＰＷＴ０８０を鋳型として使用することによって、プローブを作製した。ＥＣＬ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍの供給元（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）によって提案されるように、プローブの標識化およびそれに続くハイブリダイゼーションおよび洗浄手順を行った。
【０１３３】
図４で表されるオートラジオグラムは、図３から推定することができる、予想されたハイブリダイゼーションと一致して、プラスミドｐＰＷＴ０８０の１コピーの正しい組込みを示す（パネルｃ）。その株をＢＩＥ１０４Ｆ１と示した。
【０１３４】
キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼをコードする遺伝子を導入することができるようにするためには（セクション３．２）、プラスミドｐＰＷＴ０８０の組込みによって導入される選択マーカーを除去する必要がある。プラスミドｐＰＷＴ０８０のデザインは、染色体にｐＰＷＴ０８０を組み込むと、相同配列が互いに極めて接近するようなデザインであった。このデザインによって、これらの相同領域の自発的な（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ）分子内組換によって、選択マーカーが失われることが可能となる。株からのマーカーの除去によって、マーカーを含有する株よりも、その使用における安定性が高いマーカー不含株が得られる。さらに具体的には、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＧＲＥ３遺伝子座にてｐＰＷＴ０８０の１コピーを組み込んだ後に、ＧＲＥ３遺伝子のプロモーター領域およびＧＲＥ３遺伝子の３’非コード領域を複製する。栄養増殖すると、低頻度であるが、分子内組換えが起こる。この組換えの頻度は、ゲノムにおける相同領域の長さおよび遺伝子座に依存する（未発表の結果）。新たな培地に培養物の細画分を逐次的に移すと、時間の経過と共に、分子内組換え体が蓄積する。
【０１３５】
このために、コロニー分離株から開始して、ＢＩＥ１０４Ｆ１株をＹＰＤ−２％グルコース中で培養した。一晩培養液２５μｌを使用して、新たなＹＰＤ−２％グルコース培地に接種した。５回の連続的な移行後に、培養物の光学濃度を決定し、濃度約５０００／ｍｌに細胞を希釈した。３０ｍＭ  ＫＰｉ（ｐＨ６．８）、０．１％（ＮＨ４）２ＳＯ４、４０ｍＭフルオロアセトアミド（アマシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ））および１．８％寒天（ディフコ社）を含有する酵母カーボンベース（ディフコ社）上に、細胞浮遊液１００μｌをプレーティングした。ＢＩＥ１０４Ｆ１株の細胞と同一な、つまり、細胞内組換えなしの細胞はさらに、ａｍｄＳ遺伝子を含有する。それらの細胞に対して、フルオロアセトアミドは毒性である。これらの細胞はフルオロアセトアミドを含有する培地上で増殖することができず、かつコロニーを形成しない。しかしながら、分子内組換えが生じている場合には、選択マーカーを欠失しているＢＩＥ１０４Ｆ１変異株は、フルオロアセトアミドを増殖抑制化合物へと変換することができないため、フルオロアセトアミド培地上で増殖することができる。それらの細胞は、この寒天培地上でコロニーを形成する。
【０１３６】
このようにして得られたフルオロアセトアミド耐性コロニーを、配列番号５と６、および配列番号７と８のプライマーを用いてＰＣＲ分析にかけた。配列番号５と６のプライマーによって、図５に示されるように選択マーカーの組換えが意図した通りに起こった場合にバンドが得られる。結果として、ＧＲＥ３遺伝子のコード領域は、４つの遺伝子ＴＫＬ１、ＴＡＬ１、ＲＫＩ１およびＲＰＥ１によって置換される。その場合には、プライマー７は、外部組換えされるべき領域でプライミングすることから、配列番号７および８を用いたＰＣＲ反応によって、ＰＣＲ産物は得られない（図３、パネルｂ参照）。バンドがこれらのプライマーで得られる場合、これは、ゲノムにおける完全なプラスミドｐＰＷＴ０８０の存在を表すため、組換えは起こっていない。
【０１３７】
配列番号５および６のプライマーによってＰＣＲ産物が得られない場合、完全なプラスミドｐＰＷＴ０８０がゲノム外で組換えするように、組換えが起こっている。選択マーカーだけでなく、４つのＰＰＰ遺伝子も失われた。実際に、野生型酵母が回収されている。
【０１３８】
予想されるＰＣＲ結果が示す分離株をサザンブロット分析にかけた（上記参照）。この結果を図４に示す。サザンブロット上のバンドの正確なパターン（図３から推定される）を表す株の１つは、ＢＩＥ１０４Ｐ１と示される株である。
【０１３９】
３．２  キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼをコードする、構成的に発現される遺伝子の導入
形質転換体のＧ４１８選択を可能にするために、図１に示すプラスミドｐＹＩＳＩＴ４−ＸＫＳ１−ｘｙｌＡ（Ｂａｕｎ  ＣｐＯ）を改良した。このために、制限酵素ＭｌｕＩおよびＳａｃＩＩを使用して、プラスミドｐＹＩＳＩＴ４−ＸＫＳ１−ｘｙｌＡ（Ｂａｕｎ）（図１）から、ＴＰＩ１プロモーターの制御下のｘｙｌＡ遺伝子およびＴＤＨ１プロモーターの制御下のＸＫＳ１遺伝子を含有する４６３０ｂｐインサートを切断した。
【０１４０】
図６に示すプラスミドｐＹＩ＃ＳＩＴ４を制限酵素Ａｃｃ６５Ｉで消化した。
【０１４１】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（カナマイシン）およびサッカロミセス・セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｇ４１８）における選択を可能にする、プラスミドｐ４２７ＴＥＦ（デュアルシステムズ・バイオテック社（Ｄｕａｌｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＧ））上に存在するカナマイシン耐性マーカー（ｋａｎＭＸ）を、配列番号１１および１２のプライマーを用いたＰＣＲによって単離した。配列番号１２のプライマーの配列は、ｋａｎＭＸ断片におけるＭｌｕＩ部位が失われるようにデザインされ、得られるプラスミド（ｐＰＷＴ００７、以下参照）におけるＭｌｕＩ部位がユニーク（ｕｎｉｑｕｅ）に維持される。Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＴＯＰＯ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｕｂ−ｃｌｏｎｉｎｇ（インビトロゲン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用して、ｐＣＲＩＩ−ＴＯＰＯベクターにおいてＰＣＲ産物をサブクローニングした。制限酵素Ａｃｃ６５を使用してｋａｎＭＸ耐性マーカーを切断するために、正しいクローンを用いた。消化されたプラスミドｐＹＩ＃ＳＩＴ４とこの断片をライゲートした結果、図７に示すｐＰＷＴ００７が得られた。
【０１４２】
プラスミドｐＰＷＴ００７を制限酵素ＭｌｕＩおよびＳａｃＩＩで切断した。このベクターを精製した後、上述のｐＹＩＳＩＴ４−ＸＫＳ１−ｘｙｌＡ（Ｂａｕｎ）の４６３０ｂｐ  ＭｌｕＩ−ＳａｃＩＩ断片をライゲートした。得られたプラスミドは、ｐＰＷＴ０４２と呼ばれ、図８に示される。
【０１４３】
ＢＩＥ１０４Ｐ１株（ＭＡＴａ  ＵＲＡ３  ＨＩＳ３  ＬＥＵ２  ＴＲＰ１  ＭＡＬ２−８  ＳＵＣ２  ΔＧＲＥ３：：［ＴＰＩ１ｐ−ＴＡＬ１−ＡＤＨ１ｐ−ＴＫＬ１−ＰＧＩ１ｐ−ＲＰＥ１−ＥＮＯ１ｐ−ＲＫＩ１］）（セクション３．１参照）をプラスミドｐＰＷＴ０４２で形質転換した。ＢＩＥ１０４Ｐ１を形質転換する前に、供給元により提供される説明書に従って、制限酵素ＳｆｉＩを用いて、ｐＰＷＴ０４２を直鎖化した。１ｍｌ当たりＧ４１８（シグマ・アルドリッチ社）１００μｇを含有するＹＰＤ（１リットル当たり：酵母抽出物１０ｇ，ペプトン２０ｇ／Ｌ、ブドウ糖２０ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ）上に形質転換混合物をプレーティングした。
【０１４４】
２〜４日後に、コロニーがプレート上に現れたのに対して、ネガティブコントロール（すなわち、形質転換実験でＤＮＡが添加されていない）では、ブランクのＹＰＤ／Ｇ４１８プレートが得られた。
【０１４５】
プラスミドｐＰＷＴ０４２のＳｆｉＩでの消化については、その組込みは、ゲノムにおけるＳＩＴ４遺伝子座に向けられる（Ｇｏｔｔｌｉｎ−Ｎｉｎｆａ  ａｎｄ  Ｋａｂａｃｋ（１９８６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．６，２１８５−２１９７）。ＰＣＲおよびサザンブロット技術を用いて、形質転換体を特徴付けた。
【０１４６】
プラスミドｐＰＷＴ０４の１コピーの正しい組み込みを表す、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（フィンザイム社）を用いたＰＣＲ反応は、配列番号１３と１４、および配列番号１４と１５によって示されるプライマーで行われた。図９に示すように、配列番号１３および１４のプライマー対を用いて、ＳＩＴ４遺伝子座での正しい組込みをチェックした。ＳＩＴ４遺伝子座におけるプラスミドの正しい組込みは、配列番号１５および１６のプライマー対でもチェックすることができる（図９）。プラスミドｐＰＷＴ０４２が複数のコピーで組み込まれる（頭−尾の組込み）場合、配列番号１４および１５のプライマー対によって、ＰＣＲ産物が得られる。後者のＰＣＲ産物が存在しない場合、これはプラスミドｐＰＷＴ０４２の１コピーの組込みを表す。
【０１４７】
ゲノムに組み込まれたプラスミドｐＰＷＴ０４２の１コピーを有する株をＢＩＥ１０４Ｐ１Ｙ９と示した。
【０１４８】
３．３  増殖実験
ＢＩＥ１０４Ｐ１およびＢＩＥ１０４Ｐ１Ｙ９株の単一コロニー分離株を用いて、２％グルコースが追加されたＹＮＢ−培地（ディフコ社）に接種した。接種されたフラスコを約３０℃および２８０ｒｐｍにて約１６時間インキュベートした。一晩培養液の６００ｎｍでの光学濃度を決定した。１％グルコースおよび１％キシロースが追加されたＹＮＢ培地に、０．２の初期ＯＤ６００にて一晩培養液を接種した。細胞を３０℃および２８０ｒｐｍで一晩増殖させた。続いて、２％キシロースおよび０．１％グルコースを含有するＹＮＢ培地に０．２の初期ＯＤ６００で接種した。
【０１４９】
後者の培地中に存在する微量のグルコースは両方の株によって急速に消費された。０．２の初期ＯＤ６００にて、炭素源として２％キシロースを有するＹＮＢに移行すると、約４週間の非常に長い誘導期の後に、ＢＩＥ１０４Ｐ１Ｙ９のみが、この培地上で増殖することができた。６００ｎｍでの光学濃度が少なくとも２．０の値に達した場合、０．２の初期ＯＤ６００にて２％キシロースを含有する新たなＹＮＢ培地を有するフラスコに細胞を移した。
【０１５０】
図１０に示すように、これを何度も繰り返した。ＢＩＥ１０４Ｐ１Ｙ９株が、唯一の炭素源として２％キシロースを含有する無機培地上で迅速かつ効率的に増殖したのに対して、組込みプラスミドｐＰＷＴ０４２を欠損している参照株はそのように増殖することができないことが、グラフにはっきりと示されている。
【０１５１】
３．４  キシロースイソメラーゼ活性
ＢＩＥ１０４Ｐ１およびＢＩＥ１０４Ｐ１Ｙ９株の単一コロニー分離株を用いて、ＹＰＤ２％グルコースに接種した。接種されたフラスコを約３０℃および２８０ｒｐｍにて約１６時間インキュベートした。一晩培養液の６００ｎｍでの光学濃度を決定した。遠心分離によって細胞を収集した。０．１Ｍ  ＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸；シグマ社）バッファー（ｐＨ７．５）でペレットを１回洗浄し、分析が行われるまで−２０℃で凍結した。
【０１５２】
分析結果を以下の表にまとめる。
【０１５３】
【表２】
0005625199.tif 000003
【０１５４】
３．５  エタノール産生
ＩＥ１０４Ｐ１およびＢＩＥ１０４Ｐ１Ｙ９株の単一コロニー分離株を用いて、唯一の炭素源として２％グルコースが追加されたＶｅｒｄｕｙｎ培地（Ｖｅｒｄｕｙｎら、Ｙｅａｓｔ  ８：５０１−５１７，１９９２）に接種した。さらに、唯一の炭素源として２％キシロースを有するＶｅｒｄｕｙｎ培地においてＢＩＥ１０４Ｐ１Ｙ９株を接種した。接種されたフラスコを約３０℃および２８０ｒｐｍにて約６４時間インキュベートした。培養物の６００ｎｍでの光学濃度を決定した。遠心分離によって細胞を収集し、細胞ペレットを滅菌ミリＱ水（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））で洗浄した。
【０１５５】
２％グルコースおよび２％キシロースが追加された、新たなＶｅｒｄｕｙｎ培地に、上述の前培養物を接種した。接種した細胞の量は、初期ＯＤ６００が０．２となるような量であった。培地およびヘッドスペースから酸素がなくなった後に、フラスコをウォーターロックで密閉し、嫌気性増殖条件を確保した。
【０１５６】
フラスコを約３０℃および２８０ｒｐｍにて７２時間インキュベートした。分析のために、試料を２３、４７および７１時間の時点で採取した。以下の分析を行った：ＯＤ６００の決定、ＮＭＲ分析（キシロース、グルコース、エタノール、酢酸およびグリセロール）。この結果を図１１および１２および以下の表に示す。データは、示される糖の残留量（グルコースおよびキシロース（ｇ／Ｌ））および（副）生成物（エタノール、グリセロールおよび酢酸）の形成を表す。
【０１５７】
図１１において、時間の経過に伴う６００ｎｍでの光学濃度（ＯＤ６００）の発生を示す。参照株、ＢＩＥ１０４Ｐ１は、実験を開始する前または開始して２３時間後に、その最大ＯＤ６００に達する。明らかに、２３時間の時点で、または２３時間の時点前に、培地からグルコースが消耗されている（図１２、パネルａ）。さらに、グルコースがこの酵母株によって消費された時点で、エタノール産生もその最大に達する。必要な活性タンパク質（すなわち、キシロースイソメラーゼおよび過剰発現されたキシルロキナーゼ）を欠損しているため、この株はキシロースを利用し、キシロースを発酵することができないことから、増殖およびエタノール産生のどちらも止まる。
【０１５８】
しかしながら、バクテロイデス・ユニフォルミス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のキシロースイソメラーゼおよび天然キシルロキナーゼが過剰発現される、ＢＩＥ１０４Ｐ１Ｙ９株は、増殖することができ、かつキシロースをエタノールに発酵することができる（図１１および１２）。嫌気性培養して約１日後、ＢＩＥ１０４Ｐ１Ｙ９株は既に、いくらかのキシロースを消費し、すべてのグルコースが既に消費された。その後、図１２（パネルｂおよびｃ）および以下の表から分かるように、残留量のグルコースがエタノールへと発酵された。副生成物の形成（酢酸およびグリセロール）は、以下の表から分かるように少ない。
【０１５９】
図１１および１２に示される結果から分かるように、この結果は、前培養物（グルコースまたはキシロース）によって（著しく）影響を受けない。
【０１６０】
【表３】
0005625199.tif 000004
【０１６１】
これらの結果に基づいて、キシロース上で予備増殖されたＢＩＥ１０４Ｐ１Ｙ９株の場合には、キシロース３６３ｍｇ／バイオマス１ｇ／時のＱｓが計算された（時間間隔２３〜４７時間；光学濃度３０は乾燥物質６ｇ／Ｌに等しい）。
【０１６２】
［実施例４］
４．１  サッカロミセス・セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のゲノムへのａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ遺伝子の導入
図１３に示すプラスミドｐＰＷＴ０１８を以下のように作製した：ＳＩＴ２遺伝子座（Ｇｏｔｔｌｉｎ−Ｎｉｎｆａ  ａｎｄ  Ｋａｂａｃｋ（１９８６）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．６，ｎｏ．６，２１８５−２１９７）と、抗生物質Ｇ４１８上での形質転換体の選択およびアセトアミド上で増殖する能力を可能にするマーカー（上記参照）と、からなるベクターｐＰＷＴ００６（図１４）を制限酵素ＢｓｉＷＩおよびＭｌｕＩで消化した。国際特許出願公開第２００８／０４１８４号パンフレットに開示される、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）由来のアラビノースイソメラーゼ（ａｒａＡ）、Ｌ−リブロキナーゼ（ａｒａＢ）およびＬ−リブロース−５−リン酸−４−エピメラーゼ（ａｒａＤ）をコードする遺伝子は、ジーンアート社（ドイツ、レーゲンスブルク）によって合成された。サッカロミセス・セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の強力なプロモーター、すなわち、ａｒａＡ遺伝子の発現を制御するＴＤＨ３プロモーター、ａｒａＢ遺伝子を制御するＥＮＯ１プロモーターおよびａｒａＤ遺伝子を制御するＰＧＩ１プロモーターの制御下の（またはそれらのプロモーターに作動可能に連結された）、上記の３つのａｒａ遺伝子を有する１つの大きな断片を合成した。この断片は、ユニークな制限酵素Ａｃｃ６５ＩおよびＭｌｕＩによって囲まれた。ＭｌｕＩおよびＢｓｉＷＩで消化されたｐＰＷＴ００６へのこの断片のクローニングによって、プラスミドｐＰＷＴ０１８（図１３）が得られた。プラスミドｐＰＷＴ０１８の配列は、配列番号１７で示される。
【０１６３】
供給元の説明書に従って、予めＳｆｉＩ（ニューイングランドバイオラブス社（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ））で直鎖化されたプラスミドｐＰＷＴ０１８で、ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ（ＭＡＴａ  ＵＲＡ３  ＨＩＳ３  ＬＥＵ２  ＴＲＰ１  ＭＡＬ２−８  ＳＵＣ２）を形質転換した。ＳＩＴ２遺伝子の５’フランキング領域において合成ＳｆｉＩ部位を消化した（図１３参照）。１ｍｌ当たりＧ４１８（シグマ・アルドリッチ社）１００μｇを含有するＹＰＤ寒天（１リットル当たり：酵母抽出物１０ｇ，ペプトン２０ｇ／Ｌ，ブドウ糖２０ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ）上に形質転換混合物をプレーティングした。
【０１６４】
２〜４日後に、コロニーがプレート上に現れたのに対して、ネガティブコントロール（すなわち、形質転換実験でＤＮＡが添加されていない）では、ブランクのＹＰＤ／Ｇ４１８プレートが得られた。
【０１６５】
プラスミドｐＰＷＴ０１８の組込みは、ＳＩＴ２遺伝子座に向けられる。ＰＣＲおよびサザンブロット技術を用いて、形質転換体を特徴付けた。
【０１６６】
プラスミドｐＰＷＴ０１８の１コピーの正しい組み込みを表すＰＣＲ反応は、配列番号１８と１５、および配列番号１５と１４によって示されるプライマーで行われた（図３参照）。配列番号１８および１５のプライマー対を用いて、ＳＩＴ２遺伝子座での正しい組込みをチェックした。プラスミドｐＰＷＴ０１８が複数のコピーで組み込まれる（頭−尾の組込み）場合、配列番号１５および１４のプライマー対によって、ＰＣＲ産物が得られる。後者のＰＣＲ産物が存在しない場合、これはプラスミドｐＰＷＴ０１８の１コピーの組込みを表す。プラスミドｐＰＷＴ０１８の１コピーがＳＩＴ２遺伝子座に組み込まれた株をＢＩＥ１０４Ｒ２と示した。
【０１６７】
他の構築物で酵母株を形質転換することができるようにするためには、選択マーカーを除去する必要がある。プラスミドｐＰＷＴ０１８のデザインは、染色体にｐＰＷＴ０１８を組み込むと、相同配列が互いに極めて接近するようなデザインであった。このデザインによって、これらの相同領域の自発的な分子内組換によって、選択マーカーが失われることが可能となる。
【０１６８】
栄養増殖すると、低頻度であるが、分子内組換えが起こる。この組換えの頻度は、ゲノムにおける相同領域の長さおよび遺伝子座に依存する（未発表の結果）。新たな培地に培養物の細画分を逐次的に移すと、時間の経過と共に、分子内組換え体が蓄積する。
【０１６９】
このために、単一コロニー分離株から開始して、ＢＩＥ１０４Ｒ２株をＹＰＤ培地（１リットル当たり：酵母抽出物１０ｇ、ペプトン２０ｇ／Ｌ、ブドウ糖２０ｇ／Ｌ）中で培養した。一晩培養液２５μｌを使用して、新たなＹＰＤ培地に接種した。少なくとも５回のかかる連続的な移行後に、培養物の光学濃度を決定し、濃度約５０００／ｍｌに細胞を希釈した。３０ｍＭ  ＫＰｉ（ｐＨ６．８）、０．１％（ＮＨ４）２ＳＯ４、４０ｍＭフルオロアセトアミド（アマシャム社）および１．８％寒天（ディフコ社）を含有する酵母カーボンベース培地（ディフコ社）上に、細胞浮遊液１００μｌをプレーティングした。ＢＩＥ１０４Ｒ２株の細胞と同一な、つまり、細胞内組換えなしの細胞はさらにａｍｄＳ遺伝子を含有する。それらの細胞に対して、フルオロアセトアミドは毒性である。これらの細胞はフルオロアセトアミドを含有する培地上で増殖することができず、かつコロニーを形成しない。しかしながら、分子内組換えが生じている場合には、選択マーカーを欠失しているＢＩＥ１０４Ｒ２変異株は、フルオロアセトアミドを増殖抑制化合物へと変換することができないため、フルオロアセトアミド培地上で増殖することができる。それらの細胞は、この寒天培地上でコロニーを形成する。
【０１７０】
このようにして得られたフルオロアセトアミド耐性コロニーを、配列番号１８および１５、および１４および１９のプライマーを用いてＰＣＲ分析にかけた。配列番号１８および５のプライマーによって、選択マーカーの組換えが意図した通りに起こった場合にバンドが得られる。結果として、強力な酵母プロモーターの制御下のａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ遺伝子を有するカセットが、宿主株のゲノムのＳＩＴ２遺伝子座に組み込まれた。その場合には、プライマー１４は、外部組換えされるべき領域でプライミングすることから、配列番号１４および１９のプライマーを用いたＰＣＲ反応によって、ＰＣＲ産物は得られない。バンドが後者のプライマーで得られる場合、これは、ゲノムにおける完全なプラスミドｐＰＷＴ０１８の存在を表すため、組換えは起こっていない。
【０１７１】
配列番号１８および１５のプライマーによってＰＣＲ産物が得られない場合、完全なプラスミドｐＰＷＴ０１８がゲノム外で組換えするように、組換えが起こっている。選択マーカーのみならず、ａｒａ遺伝子も失われた。実際に、野生型酵母が回収されている。
【０１７２】
ｐＰＷＴ０１８の１コピーの組込みに従って得られたＰＣＲ結果が示す分離株をサザンブロット分析にかけた。ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ株の染色体ＤＮＡおよび正しい組換え体を大腸菌（ＥｃｏＲＩ）およびヒンディースリー（ＨｉｎｄＩＩＩ）で消化した（二重消化）。鋳型としてｐＰＷ０１８を用いて、配列番号２０および２１のプライマーでＳＩＴ２プローブを作製した。ハイブリダイゼーション実験の結果を図１５に示す。図１６（パネルａおよびｂ）に示すように、予想ハイブリダイゼーションパターンは物理的地図から推定される。
【０１７３】
その野生型株において、予想されるサイズと一致する、２．３５ｋｂのバンドが確認される（図１６、パネルａ）。プラスミドｐＰＷＴ０１８の組込みおよび組換えによる部分的な欠損で、１．０６ｋｂのバンドが予想された（図１６、パネルｂ）。実際に、図１５（レーン２）に示されるように、このバンドが確認される。
【０１７４】
サザンブロット上のバンドの正しいパターンを示す株の１つは（図１５から推定されるように）、ＢＩＥ１０４Ａ２と示される株である。
【０１７５】
４．２  非酸化的ペントースリン酸経路の、構成的に発現される４つの遺伝子の導入
構成的にａｒａＡ、ａｒａＢおよびａｒａＤ遺伝子を発現するサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＢＩＥ１０４Ａ２をプラスミドｐＰＷＴ０８０で形質転換した（図２）。その手順および結果は既に、実施例３に記述されている（セクション３．１）。要するに、ＳｆｉＩで消化されたｐＰＷＴ０８０で、ＢＩＥ１０４Ａ２を形質転換した。１ｍｌ当たりＧ４１８（シグマ・アルドリッチ社）１００μｇを含有するＹＰＤ寒天（１リットル当たり：酵母抽出物１０ｇ、ペプトン２０ｇ／Ｌ、ブドウ糖２０ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ）上に形質転換混合物をプレーティングした。
【０１７６】
２〜４日後に、コロニーがプレート上に現れたのに対して、ネガティブコントロール（すなわち、形質転換実験でＤＮＡが付加されていない）では、ブランクのＹＰＤ／Ｇ４１８プレートが得られた。
【０１７７】
プラスミドｐＰＷＴ０８０の組込みは、ＧＲＥ３遺伝子座に向けられる。実施例３、セクション３．１に記載のように、ＰＣＲおよびサザンブロット技術を用いて、形質転換体を特徴付けた。
【０１７８】
予想されるハイブリダイゼーションパターンと一致して、プラスミドｐＰＷＴ０８０の１コピーの正しい組み込みを示す形質転換体をＢＩＥ１０４Ａ２Ｆ１と示した。
【０１７９】
キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼをコードする遺伝子を導入することができるようにするためには（セクション３．２）、プラスミドｐＰＷＴ０８０の組込みによって導入される選択マーカーを除去する必要がある。このために、コロニー分離株から開始して、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｆ１株をＹＰＤ培地中で培養した。一晩培養液２５μｌを使用して、新たなＹＰＤ培地に接種した。５回の連続的な移行後に、培養物の光学濃度を決定し、濃度約５０００／ｍｌに細胞を希釈した。３０ｍＭ  ＫＰｉ（ｐＨ６．８）、０．１％（ＮＨ４）２ＳＯ４、４０ｍＭフルオロアセトアミド（アマシャム社）および１．８％寒天（ディフコ社）を含有する酵母カーボンベース（ディフコ社）上に、細胞浮遊液１００μｌをプレーティングした。フルオロアセトアミド耐性コロニーをＰＣＲ分析にかけ、正しいＰＣＲプロファイルの場合には、サザンブロット分析にかけた（実施例３のセクション３．１）。サザンブロット上にバンドの正しいパターンを示した株の１つは、ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１と示される株である。
【０１８０】
４．３  キシロースイソメラーゼおよびキシルロキナーゼをコードする構成的に発現される遺伝子の導入
ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１株（ＭＡＴａ  ＵＲＡ３  ＨＩＳ３  ＬＥＵ２  ＴＲＰ１  ＭＡＬ２−８  ＳＵＣ２  ＳＩＴ２：：［ＴＤＨ３−ａｒａＡ，ＥＮＯ１−ａｒａＢ，ＰＧＩ１−ａｒａＤ］  ΔＧＲＥ３：：［ＴＰＩ１ｐ−ＴＡＬ１，ＡＤＨ１ｐ−ＴＫＬ１，ＰＧＩ１ｐ−ＲＰＥ１，ＥＮＯ１ｐ−ＲＫＩ１］）をプラスミドｐＰＷＴ０４２で形質転換した。ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１を形質転換する前に、供給元により提供される説明書に従って、制限酵素ＳｆｉＩを用いて、ｐＰＷＴ０４２を直鎖化した。１ｍｌ当たりＧ４１８（シグマ・アルドリッチ社）１００μｇを含有するＹＰＤ寒天（１リットル当たり：酵母抽出物１０ｇ、ペプトン２０ｇ／Ｌ、ブドウ糖２０ｇ／Ｌ、寒天２０ｇ）上に形質転換混合物をプレーティングした。
【０１８１】
２〜４日後に、コロニーがプレート上に現れたのに対して、ネガティブコントロール（すなわち、形質転換実験でＤＮＡが添加されていない）では、ブランクのＹＰＤ／Ｇ４１８プレートが得られた。
【０１８２】
プラスミドｐＰＷＴ０４２をＳｆｉＩで消化すると、その組込みは、ゲノムにおけるＳＩＴ４遺伝子座に向けられる（Ｇｏｔｔｌｉｎ−Ｎｉｎｆａ  ａｎｄ  Ｋａｂａｃｋ（１９８６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．６，２１８５−２１９７）。実施例３（セクション３．２）に記載のように、ＰＣＲおよびサザンブロット技術を用いて、形質転換体を特徴付けた。
【０１８３】
ゲノムに組み込まれたプラスミドｐＰＷＴ０４２の１コピーを有する株をＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１Ｙ９と示した。
【０１８４】
４．４  増殖実験
ＢＩＥ１０４Ａ２Ｐ１Ｙ９株の単一コロニー分離株を用いて、２％グルコースまたは２％ガラクトースが追加されたＹＮＢ培地（ディフコ社）に接種した。６００ｎｍでの光学濃度が少なくとも２．０の値に達するまで、接種されたフラスコを約３０℃および２８０ｒｐｍにてインキュベートした。
【０１８５】
１％アラビノースおよび１％キシロースが追加されたＹＮＢ培地に、０．２の初期ＯＤ６００で一晩培養液を接種した。細胞を３０℃および２８０ｒｐｍで増殖させた。６００ｎｍでの光学濃度を定期的にモニターした。光学濃度が２．０を超える値に達すると、２％キシロースおよび０．２％アラビノースを含有する新たなＹＮＢ培地に、培養物のアリコートを移した。添加された細胞の量は、培養物の初期ＯＤ６００が０．２となるような量であった。
【０１８６】
光学濃度を定期的にモニターした。結果を図１７のパネルａ（ガラクトース上の前培養物）およびパネルｂ（グルコース上の前培養物）に示す。
【０１８７】
株がアラビノースとキシロースの両方を用いることができることが、結果にはっきりと示されている。
【図２】
0005625199.tif 000005
【図４】
0005625199.tif 000006
【図５】
0005625199.tif 000007
【図６】
0005625199.tif 000008
【図７】
0005625199.tif 000009
【図９】
0005625199.tif 000010
【図１１】
0005625199.tif 000011
【図１２−１】
0005625199.tif 000012
【図１２−２】
0005625199.tif 000013
【図１２−３】
0005625199.tif 000014
【図１５】
0005625199.tif 000015
【図１６】
0005625199.tif 000016
【図１７−１】
0005625199.tif 000017
【図１７−２】
0005625199.tif 000018
【図１】
0005625199.tif 000019
【図３】
0005625199.tif 000020
【図８】
0005625199.tif 000021
【図１０】
0005625199.tif 000022
【図１３】
0005625199.tif 000023
【図１４】
0005625199.tif 000024
【配列表】
0005625199000001.app