(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
生細胞に対して励起光を照射する光源と、
該光源から発せられた励起光が照射された結果、生細胞から発生する蛍光を撮影して画像を取得する画像取得部と、
生細胞の状態を検出する細胞状態検出部と、
該細胞状態検出部により検出された生細胞の状態に基づいて、該生細胞の状態の変化の速度に応じた周期で画像を取得するように、前記画像取得部による画像取得周期を切り替える周期切替手段とを備える蛍光観察装置。
【請求項２】
前記細胞状態検出部により検出された生細胞の状態に基づいて前記画像取得部により取得される画像の解像度を切り替える解像度切替手段をさらに備える請求項１に記載の蛍光観察装置。
【請求項３】
前記細胞状態検出部により検出された生細胞の状態に基づいて前記画像取得部により取得される画像の次元数を切り替える次元数切替手段をさらに備える請求項１に記載の蛍光観察装置。
【請求項４】
前記周期切替手段が、前記画像取得部によるフレームレートを切り替える請求項１に記載の蛍光観察装置。
【請求項５】
前記画像取得部が、画像取得周期の異なる複数種の撮像部を備え、
前記周期切替手段が、前記細胞状態検出部より検出された生細胞の状態に基づいて前記画像取得部を構成する撮像部を切り替える請求項１に記載の蛍光観察装置。
【請求項６】
前記画像取得部は、前記周期切替手段によって画像取得周期が短くなるように切り替えられたときに、取得する画像の解像度を増大させる請求項１に記載の蛍光観察装置。
【請求項７】
生細胞に対して励起光を照射する光源と、
該光源から発せられた励起光が照射された結果、生細胞から発生する蛍光を撮影して画像を取得する画像取得部と、
生細胞の状態を検出する細胞状態検出部と、
該細胞状態検出部により検出された生細胞の状態に基づいて前記画像取得部による画像取得周期を切り替える周期切替手段とを備え、
前記画像取得部が、画像取得周期の異なる複数種の撮像部を備え、
前記周期切替手段が、前記細胞状態検出部より検出された生細胞の状態に基づいて前記画像取得部を構成する撮像部を切り替える蛍光観察装置。
【請求項８】
生細胞に対して励起光を照射する光源と、
該光源から発せられた励起光が照射された結果、生細胞から発生する蛍光を撮影して画像を取得する画像取得部と、
生細胞の状態を検出する細胞状態検出部と、
該細胞状態検出部により検出された生細胞の状態に基づいて前記画像取得部による画像取得周期を切り替える周期切替手段とを備え、
前記画像取得部は、前記周期切替手段によって画像取得周期が短くなるように切り替えられたときに、取得する画像の解像度を増大させる蛍光観察装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光観察装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来、細胞の観察において、特定の生理現象を検出したり、光や薬剤等の外部刺激に対する反応を観察することが行われている（例えば、特許文献１〜特許文献３参照。）。これらの場合に、特定の生理現象の発生や反応の発生を逃すことなく観察するために、当該生理現象や反応の発生前から長時間にわたって観察し続ける必要がある。
そして、細胞の反応、形態の変化には速度の大小、および変化の大小が存在する。また、細胞の生理現象は３次元的に進行する場合が多い。
【０００３】
これらの変化を記録するためには、例えば、速い動きであれば短い撮影周期にて細胞を観察し続ける必要があるし、変化を詳細に捉えるためには、高解像度で細胞を観察し続ける必要がある。加えて、３次元的な反応を捕らえるためには、細胞の断面像の光軸方向への観察を繰り返し行う必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−３０９７７６号公報
【特許文献２】特開２００５−２３０２０２号公報
【特許文献３】特開２００５−１２８０８６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、このような観察方法を採用する場合、動作の速い動きは逃すことなく撮影できるものの、不必要に細胞に励起光を照射しなければならず、細胞にダメージが与えられてしまうという不都合がある。また、このような観察方法を採用する場合、細胞の変化を高精細に、立体的に捉えることができるものの、前記同様、不必要に細胞に励起光を照射しなければならず、細胞にダメージを与えてしまうという不都合がある。
本発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、細胞に与えるダメージを低減しつつ、細胞の変化を逃すことなく、長時間にわたるタイムラプス蛍光観察を行うことができる蛍光観察装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、生細胞に対して励起光を照射する光源と、該光源から発せられた励起光が照射された結果、生細胞から発生する蛍光を撮影して画像を取得する画像取得部と、生細胞の状態を検出する細胞状態検出部と、該細胞状態検出部により検出された生細胞の状態に基づいて、前記光源による励起光の照射周期および前記画像取得部による画像取得周期を切り替える周期切替手段、取得する画像の解像度を切り替える解像度切替手段、または、観察する次元を切り替える次元切替手段とを備える蛍光観察装置を提供する。
【０００７】
本発明によれば、光源から発せられた励起光が生細胞に対して照射されると、生細胞内に存在する蛍光物質が励起されて蛍光が発生し、発生した蛍光が画像取得部によって撮影されて、蛍光画像が取得される。この場合において、細胞状態検出部が、生細胞の状態を検出し、周期切替手段が、生細胞の状態に基づいて励起光の照射周期および画像取得周期を切り替え、または、解像度切替手段が細胞の状態に基づいて取得解像度を切り替え、または、次元切替手段が細胞の状態に基づいて次元数を切り替えることにより、生細胞の状態に合わせた画像取得周期、解像度または次元数で蛍光画像を取得することができる。
【０００８】
ここで、生細胞の状態としては、細胞分裂で生じた娘細胞が再び母細胞となって細胞分裂を行い、新しい娘細胞となるまでの細胞周期（Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期）における各過程や分子の結合等の状態を挙げることができる。
これにより、例えば、細胞周期のＳ期、Ｇ２期、Ｍ期を検出したい場合に、そこに至るまでの生細胞の状態の変化はゆっくりと進行するので、比較的長い画像取得周期で撮影を行い、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期が検出された時点で画像取得周期を短く切り替えることで、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期における細胞の迅速な変化についても逃すことなく撮影することができる。したがって、細胞の形態変化がゆっくりと進行する場合に、光源からの励起光を過度に生細胞に照射しなくて済み、生細胞に与えるダメージを低減することができる。
【０００９】
上記発明においては、前記周期切替手段が、前記画像取得部によるフレームレートを切り替えることとしてもよい。
このようにすることで、生細胞の状態の変化の速度に合わせてフレームレートを切り替えて、不必要な励起光の照射防止と、必要な頻度での蛍光画像の取得とを図ることができる。
【００１０】
また、上記発明においては、前記画像取得部が、画像取得周期の異なる複数種の撮像部を備え、前記周期切替手段が、前記細胞状態検出部より検出された生細胞の状態に基づいて前記画像取得部を構成する撮像部を切り替えてもよい。
このようにすることで、生細胞の状態の変化の速度に合わせて撮像部を切り替えて、不必要な励起光の照射防止と、必要な頻度での蛍光画像の取得とを図ることができる。
【００１１】
前記画像取得部は、前記周期切替手段によって画像取得周期が短くなるように切り替えられたときに、細胞の変化を高精細に捉えるために、取得する画像の解像度を増大させることにしてもよい。
前記画像取得部は、前記次元切替手段によって画像取得周期が短くなるように切り替えられたときに、反応を３次元空間で捕らえるために、取得する画像の次元数を増大させることにしてもよい。
【００１２】
このようにすることで、生細胞の状態の変化の速度が高くなり、画像取得周期が短くなるように切り替えられたときに、取得する画像の解像度を増大させることによって、より高精細な画像を取得することができる。また、取得する画像の次元数を増大させることによって、３次元空間で細胞の反応を捉えることができる。これにより、生細胞の重要な動作を鮮明に、立体的に観察することができる。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、細胞に与えるダメージを低減しつつ、細胞の変化を逃すことなく、長時間にわたるタイムラプス蛍光観察を行うことができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の一実施形態に係る蛍光観察装置を示すブロック図である。
【図２】図１の蛍光観察装置の変形例を示すブロック図である。
【図３】図１の蛍光観察装置の他の変形例を示すブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の一実施形態に係る蛍光観察装置について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置１は、図１に示されるように、励起光を発生する光源２と、該光源２から発せられた励起光が生細胞Ａに照射されることにより生細胞Ａから発生する蛍光を撮影する画像取得部３と、生細胞Ａの状態を検出する細胞状態検出部４と、該細胞状態検出部４により検出された生細胞Ａの状態に基づいて、光源２および画像取得部３を制御する制御部５とを備えている。
【００１６】
光源２は制御部５からの指令信号に応じて、所定の時間にわたって、所定の波長帯域の励起光を所定の強度で出力するようになっている。
画像取得部３は、光源２から発せられた励起光を２次元的に走査するスキャナ６と、スキャナ６により走査された励起光を生細胞Ａに対して照射し、生細胞Ａにおいて発生した蛍光を集光する対物レンズ７と、該対物レンズ７により集光された蛍光を検出する光検出器８と、スキャナ６による走査位置と光検出器８により検出された蛍光の強度とに基づいて生細胞Ａの２次元画像を生成する画像生成部９とを備えている。図中、符号１０は励起光を通過し、蛍光を反射するダイクロイックミラー、符号１１は、画像生成部９において生成された画像を記憶する記憶部である。
【００１７】
スキャナ６は、制御部５からの指令信号に応じて、光源２からの励起光が出力されている時間範囲にわたって作動させられるようになっている。
細胞状態検出部４は、画像生成部９により生成された画像から、生細胞Ａに投与された、細胞周期進行を可視化するための蛍光プローブ（Ｆｕｃｃｉ：Fluorescent, ubiquitination-based cell cycle indicator）の色を監視することにより、細胞周期（Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｍ期）における分化過程を検出するようになっている。
【００１８】
制御部（周期切替手段）５は、細胞状態検出部４により、細胞周期の内のＧ１期が検出されているとき、すなわち、生細胞Ａに投与されている蛍光プローブの色が赤色であるときには、光源２および画像取得部３に対して比較的長い画像取得周期、例えば、３０分を指令するようになっている。また、細胞状態検出部４により、細胞周期の内のＳ期、Ｇ２期、Ｍ期が検出されたとき、すなわち、生細胞Ａに投与されている蛍光プローブの色が赤色から緑色へと変化したときには、光源２および画像取得部３に対して比較的短い画像取得周期、例えば、３０秒を指令するようになっている。
【００１９】
また、制御部５は、細胞状態検出部４により、細胞周期の内のＳ期、Ｇ２期、Ｍ期が検出されたときには、スキャナ６の動作を遅くして、同じ画像取得範囲において蛍光強度を取得する数、すなわち解像度を増大させるように制御するようになっている。
また、制御部５は、細胞状態検出部４により、細胞周期の内のＳ期、Ｇ２期、Ｍ期が検出されたときには、細胞のＸＹ平面画像を取得するたびに、顕微鏡のステージ、もしくは対物レンズを光軸方向に移動し、細胞の断面像を取得する、すなわち、次元数を増大させるように制御するようになっている。
【００２０】
このように構成された本実施形態に係る蛍光観察装置１の作用について以下に説明する。
本実施形態に係る蛍光観察装置１を用いて生細胞Ａの長期間にわたるタイムラプス観察を行うには、生細胞ＡにＦｕｃｃｉ等の蛍光プローブを投与した状態で、光源２から励起光を出射させ、画像取得部３によって生細胞Ａの蛍光画像を取得する。
【００２１】
光源２から発せられた励起光は、スキャナ６によって走査され、対物レンズ７によって生細胞Ａに照射される。生細胞Ａ内には蛍光プローブの他に蛍光物質が存在しているので、その蛍光物質が励起光によって励起されることにより、蛍光が発生する。発生した蛍光は対物レンズ７によって集光され、光検出器８によって検出される。スキャナ６による励起光の走査位置と、光検出器８によって検出された蛍光の強度とを対応づけて記憶することにより、画像生成部９によって２次元的な画像を生成することができる。
【００２２】
画像生成部９において生成された画像は、細胞状態検出部４に送られ、そこで蛍光プローブの色が監視される。蛍光プローブの色が赤色である場合には、生細胞Ａの状態は、細胞周期の内のＧ１期にあると考えられ、それらの過程においては、生細胞Ａの動作は比較的緩慢である。そして、この状態では、制御部５は画像取得部３による画像取得周期を比較的長く設定するので、光源２およびスキャナ６による生細胞Ａへの励起光の照射頻度が低減され、励起光の過度の照射が防止される、これにより、生細胞Ａに過大なダメージが受けることが防止される。すなわち、生細胞Ａを健全な状態に維持しながら、長期間にわたるタイムラプス観察を行うことができる。
【００２３】
また、細胞状態検出部４により検出された蛍光プローブの色が赤色から緑色に変化した場合には、生細胞Ａの状態は、細胞周期の内のＳ期、Ｇ２期、Ｍ期にあると考えられ、この過程においては、生細胞Ａの動作は比較的俊敏である。そして、この状態では、制御部５は画像取得部３による画像取得周期を比較的短く設定するので、多くの蛍光画像を取得することができる。これにより、生細胞Ａの細胞分裂等の俊敏な動きを逃すことなく観察することができる。
【００２４】
さらに、本実施形態においては、上述したように、生細胞Ａの状態が細胞状態検出部４により細胞周期の内のＳ期、Ｇ２期、Ｍ期にあると考えられるときには、制御部５は、スキャナ６を制御して画像取得部３により取得される蛍光画像の解像度を増大させる。これにより、詳細な観察が必要とされるＳ期、Ｇ２期、Ｍ期において、高解像度の蛍光画像を取得することができる。
【００２５】
例えば、同じ視野を５１２×５１２画素で画像取得していたものを、生細胞Ａの状態変化の検出後に１０２４×１０２４画素に切り替えると、１画素の蛍光測光時間はほぼ同じなので、画素数が４倍になるとレーザ照射時間も４倍になるが、常時１０２４×１０２４画素で画像取得する場合と比較して生細胞Ａに与えるダメージを低減することができる。
【００２６】
さらに、本実施形態においては、上述したように、生細胞Ａの状態が細胞状態検出部４により細胞周期の内のＳ期、Ｇ２期、Ｍ期にあると考えられるときには、制御部５は、次元数を増加させる。これにより、詳細な観察が必要とされるＳ期、Ｇ２期、Ｍ期において、その変化を３次元的に捉えることができる。
【００２７】
例えば、特定のＺ方向位置でＸＹ平面画像を取得していたものを、生細胞Ａの状態変化の検出後に標本の３次元的な変化の様子を観察するためにＸＹＺ画像取得に切り替えると、同一領域に対してＺ方向に複数枚画像を取得することになるのでレーザ照射時間が増えるが、常時ＸＹＺ画像取得し続ける場合と比較すると生細胞Ａに与えるダメージを低減することができる。
【００２８】
このように、本実施形態に係る蛍光観察装置１によれば、画像取得部３により取得された蛍光画像に基づいて、生細胞Ａの状態に応じて画像取得周期が調節されるので、ユーザが常に蛍光観察装置１の前に待機しなくても、目的とするＳ期、Ｇ２期、Ｍ期において生細胞Ａに発生する現象を逃すことなく高精細に、かつ立体的に観察することができるという利点がある。
また、本実施形態に係る蛍光観察装置１によれば、生細胞Ａの動作がゆっくりとしている細胞周期の内のＧ１期においては、長い画像取得周期でＸＹ平面画像を取得するので、取得する画像数が少なくて済み、重要性の低い期間におけるデータ量を低減することができる。
【００２９】
なお、本実施形態においては、画像取得部３として、単一のスキャナ６を有する場合について説明したが、これに代えて、図２に示されるように、動作速度の異なる２以上のスキャナ６，６’を設け、生細胞Ａの状態に応じてスキャナ６，６’を切り替えることにしてもよい。図中、符号１２，１３はミラーである。
【００３０】
また、図３に示されるように、スキャナとは別の光路上に、面照明光源１４とＣＣＤ１５のような撮像手段を併設することによって、動きの速いＳ期、Ｇ２期、Ｍ期における生細胞Ａについては、ＣＣＤ１５によって瞬時に画像を取得するように切り替えることにしてもよい。図中、符号１６はダイクロイックミラー、符号１７はミラーである。
【００３１】
また、生細胞Ａに投与した蛍光プローブから発生する蛍光の色を監視することによって細胞周期を検出することとしたが、これに代えて、蛍光画像における生細胞Ａの輝度、生細胞Ａの形状、生細胞Ａの動態、生細胞Ａから発生する蛍光の波長あるいは生細胞Ａの速度を監視して生細胞Ａの状態を検出することにしてもよい。
【００３２】
また、生細胞ＡがＳ期、Ｇ２期、Ｍ期にあるときに蛍光画像を取得する周期を変化させる、もしくは取得する蛍光画像の解像度を増大させることとしたが、これに代えて、取得する蛍光画像の位置や範囲を切り替えることにしてもよい。
【００３３】
また、本実施形態においては、細胞周期を検出して、画像取得周期を切り替えることとしたが、これに代えて、フレームレートを切り替えることにしてもよい。すなわち、重要性の低い期間においては、低いフレームレートで画像を取得し、重要性の高い期間においてはビデオレートのように高いフレームレートで画像を取得することにすればよい。
【００３４】
さらに、細胞周期を検出して画像取得周期を切り替えることに代えて、他のイベント、例えば、分子の結合を検出して画像取得周期を切り替えることにしてもよい。観察対象である生細胞Ａに分子が結合することにより、誘発されるＣａ２＋の濃度変化を監視し、Ｃａ２＋濃度変化が発生したときには、ビデオレートのような高いフレームレートで画像を取得することにすればよい。これにより、分子の移動やＣａ２＋の濃度変化のような異なる反応速度に対応して生細胞Ａを観察することができるという利点がある。
【００３５】
また、スキャナ６を介して戻る蛍光を検出することによりディスキャン画像を生成することとしたが、これに代えて、光源をフェムト秒パルスレーザ光により構成する場合には、スキャナ６と対物レンズ７との間から分岐した蛍光を検出してノンディスキャン画像を生成することにしてもよい。
また、撮像素子としては、ＣＣＤ１５に代えて、ＣＭＯＳを採用してもよい。
【００３６】
また、本実施形態においては、制御部５が、画像取得の時間間隔の短縮、取得する画像の解像度の増大および取得する画像の次元数の増大を行うこととしたが、これに代えて、これらのいずれか１つまたは２つのみを行うことにしてもよい。
【符号の説明】
【００３７】
Ａ  生細胞
１  蛍光観察装置
２  光源
３  画像取得部
４  細胞状態検出部
５  制御部（周期切替手段）
８  光検出器（撮像部）
１５  ＣＣＤ（撮像部）
【図１】
0005562582.tif 000002
【図２】
0005562582.tif 000003
【図３】
0005562582.tif 000004