(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつセロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項２】
以下の（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡ：
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有し、かつセロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項３】
以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド：
（ａ）配列番号２により示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつセロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項４】
請求項１又は２に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項５】
請求項１又は２に記載のＤＮＡにより形質転換された形質転換体。
【請求項６】
形質転換体がマグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）子嚢菌である、請求項５に記載の形質転換体。
【請求項７】
植物由来原料を請求項３に記載のポリペプチドと接触させるステップを含む、植物由来原料の糖化のための方法。
【請求項８】
以下のステップ：
（ａ）請求項５又は６に記載の形質転換体を培養するステップ、及び
（ｂ）培養後の培地及び／又は形質転換体からセロビオヒドロラーゼを回収するステップ
を含む、セロビオヒドロラーゼの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なセロビオヒドロラーゼに関する。より具体的には、本発明は、マグナポルテ・オリゼ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｏｒｙｚａｅ）から単離されたセロビオヒドロラーゼに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、化石資源の枯渇化や化石資源の燃焼により発生する二酸化炭素による地球温暖化などが深刻な問題となっているため、クリーンかつ再生産可能なエネルギーの創出が求められている。石油の代替エネルギーとして自動車などの大型機械の動力源となるバイオエタノールが注目されている。バイオエタノールは、現在は主としてサトウキビやサトウダイコンのショ糖、トウモロコシのデンプンなどを原料として生産されている。植物は石油などの化石燃料に比べはるかに早いサイクルで再生産が可能である。しかし、サトウキビやサトウダイコン、トウモロコシなどはバイオエタノール原料と食料との競合により、これら原料の価格高騰や食糧危機を招いている。そのため、次世代のバイオエタノールとして、植物の葉や茎などの非食部に含まれる細胞壁の糖鎖を利用することが求められている。
【０００３】
植物の細胞壁は主としてセルロースやヘミセルロース、ペクチンなどの糖鎖により形成されている（非特許文献１〜３）。特にセルロースやキシログルカン、キシランの構成糖は、主としてグルコースやキシロースであり、これらを原料とした発酵によりバイオエタノールを製造することができる。
【０００４】
上記の細胞壁糖鎖は酸加水分解や酵素加水分解によりグルコースやキシロースなどに変換することができる。しかしながら、酸加水分解では酸の中和により生じる廃液が環境に対して大きな負荷を与えるだけでなく、大きな廃液処理費用を要する。そのため廃液量の少ない、酵素を用いた細胞壁糖鎖の加水分解法が望ましい。酵素による細胞壁糖鎖の加水分解は可能であるが、現在の技術水準では効率がよくないという問題がある。その理由として、細胞壁は糖鎖が互いに強固に結合していること、及びリグニン、高濃度のセロビオース、又はグルコースによる酵素活性（加水分解）の阻害などが挙げられる。そのため、効率的な糖化を達成するためには、細胞壁糖鎖の加水分解に適した酵素の開発が必要である。
【０００５】
特許文献１には、最適反応ｐＨをｐＨ１０付近に有し、反応生成物の１つであるセロビオースによって阻害されないセルラーゼ（エンドグルカナーゼ）が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２００１−３４００７４
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｃａｒｐｉｔａ  Ｎ．Ｃ．  ａｎｄ  Ｇｉｂｅａｕｔ  Ｄ．Ｍ．，１９９３，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌｓ  ｉｎ  ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ  ｐｌａｎｔｓ：  ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｗａｌｌｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ．３，１−３０
【非特許文献２】ＭｃＣａｎｎ  Ｍ．Ｃ．  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓ  Ｋ．，１９９４，Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｏｔ．４５，１６８３−１６９１
【非特許文献３】Ｃｏｓｇｒｏｖｅ  Ｄ．Ｊ．，１９９７，Ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｈｉｇｈ−ｓｔｒｅｓｓ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ：  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂａｓｅｓ  ｏｆ  ｅｘｔｅｎｓｉｂｌｅ  ｃｅｌｌ  ｗａｌｌｓ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｅｎｌａｒｇｅｍｅｎｔ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，９，１０３１−１０４１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
植物の細胞壁糖鎖の加水分解に適した、好ましい特性を有する酵素が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
イネいもち病菌（マグナポルテ・オリゼ、マグナポルテ・グリセアなどと称される）はイネに感染し、収穫量に大きな被害を与える病原菌である。イネいもち病菌がイネへ侵入する際には、イネの細胞壁分解が生じている。本発明者らは、イネいもち病菌による細胞壁分解を解明することにより、効率的な細胞壁糖鎖の加水分解が達成できると考えた。
【００１０】
そこで、イネいもち病菌がイネに感染する際に生産している細胞壁分解に関与している酵素及びそれらの性質を調べたところ、（ｉ）セロビオースによる活性阻害を受けず、（ｉｉ）結晶性セルロースより水溶性の１，４−β−グルカン及びセロオリゴ糖を効率良く加水分解し、（ｉｉｉ）カルシウムにより活性化されるセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ、配列番号２）を見出した。また、該セロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）の製造方法及び精製方法を確立した。
【００１１】
したがって、本発明は具体的には以下の特徴を有する。
〔１〕以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつセロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド。
〔２〕以下の（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡ：
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ。
〔３〕以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチド：
（ａ）配列番号２により示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつセロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド。
〔４〕上記〔１〕又は〔２〕に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【００１２】
〔５〕上記〔１〕又は〔２〕に記載のＤＮＡにより形質転換された形質転換体。
〔６〕形質転換体がマグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）子嚢菌である、上記〔５〕に記載の形質転換体。
〔７〕植物由来原料を請求項３に記載のポリペプチドと接触させるステップを含む、植物由来原料の糖化のための方法。
〔８〕以下のステップ：
（ａ）上記〔５〕又は〔６〕に記載の形質転換体を培養するステップ、及び
（ｂ）培養後の培地及び／又は形質転換体からセロビオヒドロラーゼを回収するステップ
を含む、セロビオヒドロラーゼの製造方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、反応生成物であるセロビオースによる活性阻害を受けないセロビオヒドロラーゼが提供され、該酵素によって、効率的なセルロース及びセロオリゴ糖の加水分解、したがって植物由来材料のエネルギー源としての利用を実現することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】イネいもち病菌（マグナポルテ・オリゼ）に感染させたイネの葉での、本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）の遺伝子発現を表すＲＴ−ＰＣＲの結果である。イネいもち病菌の感染に従い、本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）遺伝子発現が増加しており、本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）はイネいもち病菌のイネへの感染に関与していることが示された。
【図２】遺伝子導入したイネいもち病菌での本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）の酵素活性（Ａ）及びタンパク質発現（Ｂ）を示す図である。本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）遺伝子を有するイネいもち病菌を液体培地（ＹＳ培地）で１〜４日間培養し、液体培地に分泌されたセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）の加水分解活性を調べた（Ａ）。また、ヒスチジンタグに対する抗体を用いてウエスタンブロットを行い、培養日数によるセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）のタンパク質量変化を調べた（Ｂ）。
【図３】精製した組換え発現ＭｏＣｅｌ６Ａを表す電気泳動像である。レーン１：タンパク質染色；レーン２：抗Ｈｉｓタグ抗体によるウエスタンブロット。
【図４】本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）の加水分解活性の温度依存性を表すグラフである。異なる温度条件下において、本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）によるセルロース（Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ  ２０）に対する加水分解活性を測定した。その結果、４０℃において本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）による最も高い加水分解活性が得られた。
【図５】本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）の加水分解活性のｐＨ依存性を表すグラフである。異なるｐＨ条件下において、セロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）によるセルロース（Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ  ２０）に対する加水分解活性を測定した。その結果、ｐＨ６．０においてセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）による最も高い加水分解活性が得られた。
【図６−１】本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）の加水分解産物のＬＣ／ＭＳＤ解析を表す図である。反応基質：（Ａ）セロトリオース、（Ｂ）セロテトラオース。本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）によりセロテトラオースはセロビオースに加水分解され、セロペンタオース及びセロへキサオースはセロビオースとセロトリオースに加水分解された。一方、セロトリオースはまったく加水分解されなかった。
【図６−２】本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）の加水分解産物のＬＣ／ＭＳＤ解析を表す図である。反応基質：（Ｃ）セロペンタオース、（Ｄ）セロヘキサオース。本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）によりセロテトラオースはセロビオースに加水分解され、セロペンタオース及びセロへキサオースはセロビオースとセロトリオースに加水分解された。一方、セロトリオースはまったく加水分解されなかった。
【図７】本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）のセロオリゴ糖に対する基質特異性を表すグラフである。セロテトラオースが最も速く加水分解されることが示された。
【図８】本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）による蛍光標識セロオリゴ糖の加水分解産物を表す電気泳動像である。蛍光標識したセロテトラオース（Ｃ４−ＳＲ）、セロペンタオース（Ｃ５−ＳＲ）、セロへキサオース（Ｃ６−ＳＲ）を基質として、本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）による加水分解反応産物を調べた。反応産物はシリカゲル上でブタノール：酢酸：水＝３：１：１で展開した。セロテトラオースはセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）により加水分解されたが、Ｃ４−ＳＲは加水分解されなかった。Ｃ５−ＳＲからはＣ３−ＳＲ、Ｃ６−ＳＲからはＣ４−ＳＲとＣ３−ＳＲが検出された。この結果から、セロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）は非還元末端からセロビオース及びセロトリオース単位で加水分解するセロビオヒドロラーゼＩＩであることが明らかとなった。
【図９】本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）の加水分解のメカニズムを表す模式図である。白丸はグルコース残基、斜線は蛍光標識の施された１−ａｍｉｎｏ−１−ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｉｔｏｌを示す。
【図１０】本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）の加水分解活性に対するセロビオースの存在による活性阻害の解析を表す図である。反応基質：（Ａ）セロペンタオース；（Ｂ）セロヘキサオース。本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）の加水分解反応に高濃度セロビオース（〜１５％）を加え、セロペンタオース（Ａ）及びセロへキサオース（Ｂ）の加水分解反応の阻害を調べた。反応産物はシリカゲル上で展開し、反応基質として用いたセロペンタオース及びセロへキサオースの減少及び生産されたセロトリオースの増加により、セロビオースによる阻害を解析した。その結果、高濃度セロビオース存在下においても、本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）による加水分解反応は阻害を受けないことが示された。
【図１１】本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）の加水分解活性に対するセロビオースの存在による活性阻害の解析を表す図である。反応基質：（Ａ）セロペンタオース；（Ｂ）セロヘキサオース。本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）の加水分解反応に高濃度セロビオース（〜１５％）を加え、セロペンタオース（Ａ）及びセロへキサオース（Ｂ）の加水分解反応の阻害を調べた。反応産物はＬＣ−ＭＡＳＳに供し、反応基質として用いたセロペンタオースとセロへキサオースの減少及び生産されたセロトリオースの増加により、セロビオースによる阻害を解析した。高濃度セロビオース存在下においても、本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）による加水分解反応は阻害を受けないことが示された。
【図１２】本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）の加水分解活性に対するセロビオースの存在による活性阻害の解析を表す図である。反応基質：（Ａ）蛍光標識セロペンタオース；（Ｂ）蛍光標識セロヘキサオース。本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）の加水分解反応に高濃度セロビオースを加え、蛍光標識したセロペンタオース及び蛍光標識したセロへキサオースの加水分解反応の阻害を調べた。反応産物はシリカゲル上で展開し、反応基質として用いたセロペンタオースとセロへキサオースの減少及び生産されたセロトリオースの増加により、セロビオースによる阻害を解析した。高濃度セロビオース存在下においても、本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）による加水分解反応は阻害を受けないことが示された。
【図１３】本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）の加水分解活性に対する金属イオンの影響を表すグラフである。本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）はｐＨ３．５では低い加水分解活性を示すが、カルシウムイオンにより加水分解活性が促進された。ｐＨ４．５においては至適ｐＨ６．０における加水分解活性より高い加水分解活性を示した。また、鉄イオンよってもセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）による加水分解反応が促進された。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、マグナポルテ・オリゼ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｏｒｙｚａｅ）から単離されたセロビオヒドロラーゼ、及びその変異体に関する。
【００１６】
本発明のセロビオヒドロラーゼは、配列番号２により示されるアミノ酸配列からなるか、あるいは配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつセロビオヒドロラーゼ活性を有する。
【００１７】
本発明に関してセロビオヒドロラーゼ遺伝子とは、以下の（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ：
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換又は付加を含むアミノ酸配列からなり、かつセロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチド、
あるいは、以下の（ｃ）又は（ｄ）のＤＮＡ：
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ、
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセロビオヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ
を意味する。
【００１８】
一般的には、セルラーゼとの用語が、セルロース等のβ−１，４−グリコシド結合を加水分解してグルコース、セロビオース、セロオリゴ糖等を生成する酵素を意味する。セルラーゼはいくつかの異なる酵素分類に分類される酵素を含み、そのような酵素分類としては、エンドグルカナーゼ（ＥＧ；ＥＣ３．２．１．４）、セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ；ＥＣ３．２．１．９１）、β−グルコシダーゼ（ＢＧ；ＥＣ３．２．１．２１）が挙げられる（Ｓｃｈｕｌｅｉｎ，Ｍ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１６０：２３５−２４２，１９９８）。
【００１９】
ＥＧ、ＣＢＨ、及びＢＧ成分を含む完全セルラーゼ系は、結晶性セルロースをグルコースに変換するのに相乗的に働く。セロビオヒドロラーゼ及びエンドグルカナーゼは協働してセルロースを小さなセロオリゴ糖へと分解する。これらのオリゴ糖（主としてセロビオース）は、次いでβ−グルコシダーゼによりグルコースへと加水分解される。
【００２０】
本発明において、セロビオヒドロラーゼ活性とは、微結晶セルロース、膨潤セルロースなどを基質として作用して、これらのセルロースのβ−１，４−グリコシド結合をエキソ型に加水分解する活性（エキソ型セルラーゼ活性）を意味する。セロビオヒドロラーゼ活性は、具体的には、例えば、被験試料を、基質となる糖鎖（結晶性セルロース、リン酸膨潤セルロース、カルボキシメチルセルロース、セロオリゴ糖など）とともにインキュベートした後、ＰＡＲＢＡＲ法（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．，１９７２，Ａ  ｎｅｗ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ．  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７，２７３−２７９）により還元力の増大を測定することにより検出することができる。セロビオヒドロラーゼ活性は、セロビオヒドロラーゼＩ活性とセロビオヒドロラーゼＩＩ活性に分類される。
【００２１】
本発明においてセロビオヒドロラーゼＩ活性とセロビオヒドロラーゼＩＩ活性とは、セロビオヒドロラーゼＩがセルロース鎖の還元末端に指向性を有するのに対して、セロビオヒドロラーゼＩＩがセルロース鎖の非還元末端に指向性を有する点で異なる。セロビオヒドロラーゼＩ活性又はセロビオヒドロラーゼＩＩ活性の特異的な検出は、対象となる酵素によるセロオリゴ糖の加水分解産物を解析することにより行なうことができる。ＣＢＨ  ＩＩは、セロヘキサオースからセロテトラオースを生成する。あるいは、ｐ−ニトロフェニルラクトース（ｐＮＰＬ）を基質とした測定を用いることができる。ｐＮＰＬはＣＢＨ  Ｉ及びＣＢＨ  ＩＩのうち、ＣＢＨ  Ｉによってのみ分解されるため、そのような測定によってＣＢＨ  Ｉ活性のみを測定することができる。詳細には、ＣＢＨ  Ｉ活性は、例えば、５ｍＭ  ｐＮＰＬの存在下、４０℃にて６０分間反応を行い、加水分解によって生じたｐ−ニトロフェノールを、４２０ｎｍでの吸光度を定量することにより測定することができる。ｐＮＰＬはＳＩＧＭＡ社製のものなどが市販されている。
【００２２】
本発明のセロビオヒドロラーゼは、１，４−β−グルカンを非還元末端から加水分解して、セロビオース及びトリオースを生じる。当該技術分野で用いられているトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）などに由来するセロビオースの多くは、反応生成物であるセロビオースによる阻害を受ける。このことは、反応が進むにつれて酵素活性が低減することを意味し、酵素反応の効率に重大な影響を与える。本発明のセロビオヒドロラーゼは、以下に示すように、高濃度のセロビオースの存在下においても活性阻害を受けない。本発明のセロビオヒドロラーゼは、このような生成物阻害を受けない点で従来の酵素よりも有利であり、従来技術と比較して高効率な酵素反応を提供することができる。
【００２３】
本明細書に用いられる「ストリンジェンシー」又は「ストリンジェントな」という用語は、核酸ハイブリダイゼーションが行われる時の、温度、イオン強度、及び有機溶媒のような他の化合物の存在の条件に関して用いられる。上述のパラメータを、別々に又は一斉に変化させることにより「ストリンジェンシー」条件が変化されうることを、当業者は認識すると考えられる。「ストリンジェントな」条件では、核酸塩基対構成は、相補的塩基配列が高頻度にある核酸断片間のみ生じるであろう（例えば、「ストリンジェントな」条件下でのハイブリダイゼーションは、約７０％〜１００％の同一性、好ましくは約８５％〜１００％の同一性をもつ相同体の間で起こりうる）。中程度にストリンジェントな条件では、核酸塩基対構成は、相補的塩基配列が中間の頻度にある核酸間に生じるであろう（例えば、「中程度にストリンジェントな」条件下でのハイブリダイゼーションは、約５０％〜７０％の同一性をもつ相同体の間に起こりうる）。
【００２４】
核酸ハイブリダイゼーションに関して用いられる場合の「ストリンジェントな条件」とは、約５００ヌクレオチド長のプローブを使用する場合、例えば、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、６．９ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ及び１．８５ｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬及び１００μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中、４２℃でハイブリダイゼーション、続いて、０．１×ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む溶液中、４２℃で洗浄することと等価の条件を含む。
【００２５】
核酸ハイブリダイゼーションに関して用いられる場合の「中程度にストリンジェントな条件」とは、約５００ヌクレオチド長のプローブを使用する場合、例えば、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、６．９ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ及び１．８５ｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬及び１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中、４２℃でハイブリダイゼーション、続いて、１．０×ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む溶液中、４２℃で洗浄することと等価の条件を含む。
【００２６】
「低いストリンジェンシーの条件」とは、約５００ヌクレオチド長のプローブを使用する場合、例えば、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、６．９ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ及び１．８５ｇ／Ｌ  ＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨ７．４に調整）、０．１％  ＳＤＳ、５×デンハルト試薬［５０×デンハルト試薬５００ｍｌあたり、５ｇフィコール（４００型、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））、５ｇ  ＢＳＡ（フラクションＶ；シグマ（Ｓｉｇｍａ））を含む］及び１００ｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中、４２℃ではハイブリダイゼーション、続いて、５×ＳＳＰＥ、０．１％  ＳＤＳを含む溶液中、４２℃で洗浄することと等価の条件を含む。
【００２７】
配列番号１に示される配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列は、配列番号１に示される配列に対して、好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、又は９０％の同一性、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有する。
【００２８】
２つのアミノ酸配列又は塩基配列の％同一性を決定するためには、最適な比較がなされるように配列をアライメントする。２つの配列間の％同一性は、配列が共有する同一な位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一な位置の数／位置（例えば、一部重複する位置）の総数×１００）。１つの態様において、比較対象の２つの配列は同じ長さである。２つの配列間の％同一性は、ギャップを許容する場合、許容しない場合の両方で、以下に述べるものに類似した方法を用いて決定し得る。％同一性の算出に関しては、一般的に、厳密に一致するもののみを算定する。
【００２９】
２つの配列間の％同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。２つの配列の比較に用いられる数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３−５８７７において改変された、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，２２６４のアルゴリズムである。この種のアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。本発明のポリペプチドの変異体を得るには、ＢＬＡＳＴのタンパク質検索を、スコア＝３０、ワード長（ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ）＝３としたＸＢＬＡＳＴプログラムを用いて実行するとよい。本発明のＤＮＡの変異体を得るためには、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、スコア＝１００、ワード長＝１２としたＮＢＬＡＳＴプログラムを用いて実行するとよい。比較用のギャップが入ったアライメントを得るためには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，２５，３３８９に記載されたＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを用いるとよい。
【００３０】
配列番号１に示される配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列によりコードされるポリペプチドは、配列番号２に示されるポリペプチドに対して、好ましくは８０〜１００％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。配列番号２に示されるポリペプチドに対してアミノ酸の変化を有するそのような変異体が、本明細書中に示される配列番号２に示されるポリペプチドと同一又は同等の活性及び性質を有する限り、該変異体は本発明において用いられるのに好適である。アミノ酸の変化とは、アミノ酸の欠失、置換又は付加を含む。
【００３１】
ここで、アミノ酸の置換に関して、アミノ酸の側鎖は、疎水性、電荷などの化学的性質又は構造的性質においてそれぞれ異なるものであるが、実質的にポリペプチド全体の３次元構造（立体構造とも言う）に影響を与えないという意味で保存性の高い幾つかの関係が、経験的にまた物理化学的な実測により知られている。本発明のアミノ酸間の置換は、化学的又は構造的性質の類似したアミノ酸間の保存的置換でもよいし、あるいは、そのような性質の異なるアミノ酸間の非保存的置換でもよい。化学的又は構造的性質の類似したアミノ酸は次のように分類することができる。
【００３２】
疎水性アミノ酸群には、アラニン（Ａｌａ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、バリン（Ｖａｌ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、プロリン（Ｐｒｏ）が含まれる。極性アミノ酸群には、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）が含まれる。芳香族アミノ酸群には、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）が含まれる。酸性アミノ酸群には、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）が含まれる。塩基性アミノ酸群には、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）が含まれる。
【００３３】
例えば、保存的置換の例としては、グリシン（Ｇｌｙ）とプロリン（Ｐｒｏ）、グリシンとアラニン（Ａｌａ）又はバリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）とイソロイシン（Ｉｌｅ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）とアスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン（Ｇｌｎ）とアスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）とスレオニン（Ｔｈｒ）、スレオニンとセリン（Ｓｅｒ）又はアラニン、リジン（Ｌｙｓ）とアルギニン（Ａｒｇ）等のアミノ酸の間での置換が含まれる。
【００３４】
好ましくは、本発明のセロビオヒドロラーゼは、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる。
【００３５】
本発明はまた、本発明のセロビオヒドロラーゼ遺伝子を含む組換えベクター、及び該ベクターで形質転換された形質転換体にも関する。
【００３６】
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明のセロビオヒドロラーゼ遺伝子を連結することにより得ることができる。本発明のセロビオヒドロラーゼ遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等が挙げられる。プラスミドＤＮＡとしては、酵母由来のプラスミド（例えばＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）、大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１１８等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、などが挙げられ、ファージＤＮＡとしてはλファージ（Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）が挙げられる。
【００３７】
ベクターに本発明の遺伝子を挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する方法などが採用される。
【００３８】
上記ベクターには複製開始点、選択マーカー、プロモーターを含み、必要に応じてエンハンサー、ターミネーター、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル等を含んでいてもよい。
【００３９】
複製開始点としては、酵母用ベクターには、例えば２μｍ  ＤＮＡ、ＡＲＳ１由来のものが、大腸菌用ベクターには、例えばＣｏｌＥ１、Ｒ因子、Ｆ因子由来のものが、動物細胞用ベクターには、ＳＶ４０、アデノウイルス由来のものが用いられる。
【００４０】
プロモーターとしては、酵母用ベクターには、ｇａｌ１プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸ１プロモーター等が、大腸菌用ベクターには、Ｔ７プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等が用いられる。
【００４１】
選択マーカーとしては、酵母用ベクターには、Ｈｉｓ３、Ａｄｅ２、Ｌｙｓ２、Ｌｅｕ２、Ｔｒｐ１、Ｕｒａ３遺伝子等の栄養要求性マーカー遺伝子、オーレオバシジン、セルレニン、カナバニン、ゼオシン、シクロヘキシミド、テトラサイクリン等の薬剤耐性遺伝子等が、大腸菌用ベクターには、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等が用いられる。
【００４２】
ベクターは商業的に入手可能なものを使用することができるが、そのようなベクターには、宿主細胞が酵母である場合は、例えばｐＥＳＰ−１発現ベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）、ｐＡＵＲ１２３ベクター（宝酒造社製）、ｐＰＩＣベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＹＥＳ２ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＲＳベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社製）等が、宿主細胞が大腸菌である場合は、例えばｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）、ｐＴｒｘＦＵＳベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＣＹＢベクター（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＭＤ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｓ社製）等がそれぞれ挙げられる。
【００４３】
本発明の形質転換体の宿主としては、限定するものではないが、大腸菌、酵母（サッカロミセス・セレビジエ）、枯草菌、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）子嚢菌、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）子嚢菌、植物細胞などが挙げられる。好ましい宿主は、マグナポルテ属子嚢菌である。最も好ましい宿主は、マグナポルテ・オリゼ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｏｒｙｚａｅ）である。
【００４４】
宿主細胞への遺伝子導入は、ＰＥＧ法（Ｊｅｏｎｇ，  Ｊ．Ｓ．，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｔ．Ｋ．ａｎｄ  Ｄｅａｎ，Ｒ．Ａ．（２００７）Ｔｈｅ  Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ  ｓｎｏｄｐｒｏｔ１  ｈｏｍｏｌｏｇ，ＭＳＰ１，ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．２７３（２），１５７−１６５）、リン酸カルシウム法（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，９．１．４〜９．１．９，１９９９）、リポフェクション、エレクトロポレーションなどの公知の手法を用いて行なうことができる。
【００４５】
本発明はまた、植物由来原料を本発明のセロビオヒドロラーゼと接触させるステップを含む、植物由来材料を糖化するための方法にも関する。
【００４６】
本発明のセロビオヒドロラーゼは、以下に示すように、結晶性セルロース、膨潤セルロース、カルボキシメチルセルロースなど、広範な基質を加水分解し得るので、植物由来原料の処理に適している。本発明のセロビオヒドロラーゼを用いて糖化処理を施した植物由来原料は、エネルギー源として用いることができる。例えば、糖化処理後、発酵に供することにより、バイオエタノールの生成に用いることができる。
【００４７】
本発明はさらに、以下のステップ：
（ａ）本発明のセロビオヒドロラーゼ遺伝子で形質転換された形質転換体を培養するステップ、及び
（ｂ）培養後の培地及び／又は宿主からセロビオヒドロラーゼを回収するステップ
を含む、セロビオヒドロラーゼの製造方法にも関する。
【００４８】
マグナポルテ属子嚢菌は、例えば、ＹＧ液体培地中で、２００ｒｐｍ、２５℃にて培養することができる。培養は、２〜７日間、好ましくは４日間行う。
【００４９】
培養後の培地及び／又は宿主からのセロビオヒドロラーゼの回収は、例えば、培地から回収する場合、フィルター濾過及び遠心分離により培養物から液体培地を回収し、限外濾過により濃縮及び脱塩（グルコース、オリゴ糖の除去も含む）を行なうことにより実施することができる。宿主（例えば、封入体）からセロビオヒドロラーゼを回収する場合には、培養物を超音波処理に供することにより宿主細胞を破砕し、遠心分離により封入体を回収し、次いでＳＤＳ処理により可溶化し、透析により溶媒を交換し、限外濾過により濃縮及び脱塩（グルコース、オリゴ糖の除去も含む）を行なうことにより実施することができる。
【００５０】
宿主に遺伝子導入する際に、導入される遺伝子をタグなどのペプチド配列との融合タンパク質として発現されるようにすることで、濃縮画分から、さらにセロビオヒドロラーゼを精製することができる。例えば、導入される遺伝子をＨｉｓタグとの融合タンパク質として発現される融合遺伝子とした場合、市販の金属アフィニティーカラムにより所望のタンパク質を精製することができる。
【００５１】
得られたセロビオヒドロラーゼの加水分解活性は、例えば、セルロースとリン酸ナトリウム（１００ｍＭ、ｐＨ６．０）、酵素標品（液体培地の濃縮液）を含む１００μＬの反応液を３０℃で１８時間処理した後、ＰＡＲＢＡＲ法（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．，１９７２，Ａ  ｎｅｗ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ．  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７，２７３−２７９）によって水可溶性画分の還元力を測定することにより、検出することができる。
【００５２】
トリコデルマ属宿主に遺伝子導入した場合、トリコデルマ属宿主は細胞壁糖鎖の加水分解に関与する酵素を多量に産生しているため、本発明のセロビオヒドロラーゼをそれらの他の加水分解酵素とともに、バルクで酵素製剤として得ることができる。そのような製剤は、植物由来材料の細胞壁糖鎖の加水分解を効率的に行なうことができるため、有利である。
【実施例】
【００５３】
以下に、本発明を実施例によってより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【００５４】
［実施例１］
イネいもち病菌（マグナポルテ・オリゼ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｏｒｙｚａｅ））由来セロビオヒドロラーゼのクローニング
マグナポルテ・オリゼ（イネいもち病菌）がイネに感染する際に発現している細胞壁分解酵素の遺伝子を解析した結果、マグナポルテ・グリセアのＭＧ０５５２０．６遺伝子に相同性を有する遺伝子が高発現していることを見出した。ＭＧ０５５２０．６遺伝子配列に基づき、以下のプライマーを作製した。
【００５５】
センス：５’−ａｔｇｇｃｔａｇｃａａｇｃｔｇｔｔｃｃｔｃｇｃｃｇ−３’（配列番号３）
アンチセンス：５’−ｃｔａｃａａｇｇｇｔｇｇｇｔｔｇｇｃｇｔｔｇｇｔｇ−３’（配列番号４）
【００５６】
ＹＧ液体培地中で増殖させたイネいもち病菌（マグナポルテ・オリゼＩｎａ７２株、神戸大学  土佐幸雄教授から供与）からｔｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出し、オリゴｄＴ及び逆転写酵素を用いて逆転写反応をＦｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを合成した。このｃＤＮＡを鋳型として、上記のプライマーを用い、ＰＣＲによりマグナポルテ・オリゼ由来遺伝子を増幅した。得られたＤＮＡのシーケンス解析から、当該遺伝子の塩基配列を決定した。この遺伝子の配列は、マグナポルテ・グリセア由来のＭＧ０５５２０．６遺伝子の配列と１００％の同一性を有していた。
【００５７】
予想されるアミノ酸配列から、この遺伝子は、セロビオヒドロラーゼ、ＧＨ（Ｇｌｙｃｏｓｙｌ  Ｈｙｄｒｏｌａｓｅ）ファミリー６に属するタンパク質をコードすると考えられたため、得られた遺伝子をＭｏＣｅｌ６Ａと命名した。
【００５８】
［実施例２］
イネいもち病菌（マグナポルテ・オリゼ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｏｒｙｚａｅ））のイネ感染時におけるセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）遺伝子の発現解析
イネいもち病菌（マグナポルテ・オリゼ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｏｒｙｚａｅ）Ｉｎａ７２株）（神戸大学  土佐幸雄教授から供与）をスプレーによりイネへ感染し、１、２、３、４日後のイネの葉を回収した。これらから抽出したｔｏｔａｌ  ＲＮＡに対して、オリゴｄＴと逆転写酵素を用いて逆転写反応を行い、Ｆｉｒｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡを合成した。本発明のセロビオヒロドラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）遺伝子に対する特異的なプライマーを用いてＰＣＲを行い、セロビオヒロドラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）のＤＮＡ断片を増幅した。アガロース電気泳動により本発明のセロビオヒロドラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）の発現量を測定した。
【００５９】
結果を図１に示す。イネいもち病菌（マグナポルテ・オリゼ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｏｒｙｚａｅ））のイネへの感染時に、ＭｏＣｅｌ６Ａが高発現していることが見て取れる。このことから、当該遺伝子はイネいもち病菌のイネ感染時の細胞壁糖鎖の加水分解に深く関与していることが示唆された。
【００６０】
［実施例３］
本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）を生産するイネいもち病菌の作出
配列番号１に示されるセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）の遺伝子（１〜１４６１塩基）及び連続する７個のヒスチジン（ヒスチジンタグ）をコードする遺伝子を含むｐＢＡＦベクターをＰＥＧ法によりイネいもち病菌（マグナポルテ・オリゼ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｏｒｙｚａｅ））に遺伝子導入した（Ｊｅｏｎｇ，Ｊ．Ｓ．，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，  Ｔ．Ｋ．  ａｎｄ  Ｄｅａｎ，Ｒ．Ａ．（２００７）Ｔｈｅ  Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ  ｓｎｏｄｐｒｏｔ１  ｈｏｍｏｌｏｇ，  ＭＳＰ１，  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．２７３（２），１５７−１６５）。遺伝子導入されたイネいもち病菌（形質転換イネいもち病菌）はビアラフォス（Ｂｉａｌａｐｈｏｓ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ、２５０μｇ／ｍＬ、和光純薬工業）を含むＹＳプレート（１％Ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、１％  Ｓｕｃｒｏｓｅ、１．５％  Ａｇａｒ）上で選抜し、それぞれの形質転換イネいもち病菌をＹＧ液体培地で２５℃、４日間培養した。フィルター濾過と遠心分離により液体培地を回収し、限外濾過により濃縮及び脱塩（グルコースやオリゴ糖の除去も含む）した後、加水分解活性を測定した。加水分解反応は、セルロース（Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ  ２０（Ｓｉｇｍａ）、５ｍｇ）とリン酸ナトリウム（１００ｍＭ、ｐＨ６．０）、酵素標品（液体培地の濃縮液）を含む１００μＬの反応液を３０℃で１８時間処理した後、ＰＡＲＢＡＲ法（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．（１９７２）Ａ  ｎｅｗ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７，２７３−２７９）により水可溶性画分の還元力を測定することにより、加水分解活性を決定した。以上の方法により加水分解活性を有し、本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）を生産するイネいもち病菌を作出した。
【００６１】
［実施例４］
セロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）の精製及びウエスタンブロット
本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）を生産する形質転換イネいもち病菌を４日間培養した培地を限外濾過で濃縮した後、ヒスチジン結合樹脂（ＴＡＬＯＮ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）の精製を行った。
【００６２】
限外濾過により濃縮したイネいもち病菌の培養液にヒスチジン結合緩衝液（５０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）を加え、ヒスチジン結合樹脂にアプライした。ヒスチジン結合樹脂及び洗浄液（５０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、１５ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ７．０）でヒスチジン結合樹脂を洗った後、溶出液（５０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ、１５０ｍＭ  ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．２Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）で溶出した。精製したセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、染色し（Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｔｉｎ、Ｐｉｅｒｃｅ）、分子量からセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）が精製されていることを確認した。またＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＰＶＤＦメンブレンへのトランスファー、抗Ｈｉｓタグ抗体（Ａｎｔｉ−Ｈｉｓ  ｔａｇ、Ｑｉａｇｅｎ）を用いたウエスタンブロットを順次行い、精製したタンパク質がセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）であることを確認した。
結果を図２及び図３に示す。
【００６３】
培養日数３〜４日目において、高い加水分解活性及び本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）が高濃度に蓄積されていることが明らかとなった（図２）。この結果から、培養日数４日目にセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）の調製を行うこととした。
【００６４】
ヒスチジンタグを有する本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより単一のバンドを示すとともに、ヒスチジンタグに対する抗体を用いたウエスタンブロットにより認識された。イネいもち病菌を用いたタンパク質発現により、本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）はイネいもち病菌の培養液１リットルから約５００μｇ得ることができた。
【００６５】
［実施例５］
セロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）の活性測定
本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）、セルロース（Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ  ２０、５ｍｇ）又はセロオリゴ糖（０．８ｍｇ）、リン酸ナトリウム（１００ｍＭ、ｐＨ６．０）を含んだ反応液（１００μＬ）を３０℃、１８時間処理した。その後、ＰＡＲＢＡＲ法及びＬＣ／ＭＡＳＳ解析、ＴＬＣ（Ｔｈｉｎ  ｌａｙｅｒ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）により本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）の加水分解活性を決定した。
【００６６】
ＰＡＲＢＡＲ法では、反応液に３００μＬのＰＡＲＢＡＲ溶液（５０ｍｇの４−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｈｙｄｒａｚｉｄｅを１ｍＬの０．５Ｎ  ＨＣｌで溶解した後、４ｍＬの０．５Ｎ  ＮａＯＨで溶解した）を加え、１００℃、１０分間処理した。自然冷却後、４１０ｎｍにおける吸光度を測定することにより、セロビオヒドロラーゼの加水分解活性を決定した。なおセルロース（Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ  ２０）を基質として用いた場合、酵素反応後に遠心分離を行い、上清をＰＡＲＢＡＲ法により解析した。
【００６７】
ＬＣ−ＭＡＳＳによる解析では、本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）を用いた加水分解反応により生じた反応産物をＰＭＰ溶液（０．５Ｍ  ３−ｍｅｔｈｙｌ−１−ｐｈｅｎｙｌ−５−ｐｙｒａｚｏｌｏｎｅ、０．３Ｍ  ＮａＯＨを含むメタノール）に加え、７０℃、３０分間処理した。塩酸（０．３Ｍ  ＨＣｌ）で中和した後、減圧乾燥を行い、再度メタノールで溶解した。ＰＭＰ処理を施した反応産物はＬＣ／ＭＡＳＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて分離・解析した。分離条件は、Ａ：８０ｍＭ酢酸アンモニウム溶液；Ｂ：アセトニトリル溶液＝８０：２０でカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＺＯＲＢＡＸ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＸＤＢ−Ｃ１８）を緩衝した後、サンプルをアプライした。溶出は２０分後にＡ液：Ｂ液＝７０：３０になるグラジエントを用いた。また流速は０．５ｍＬ／分とした。標準試料として、ＰＭＰ処理したグルコース及びセロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、及びセロへキサオースを用いた。
【００６８】
ＴＬＣによる解析では、反応液をシリカゲル上にスポットし、酢酸エチル：酢酸：水＝２：１：１の溶媒で展開した。シリカゲルは０．５％チモール（Ｔｈｙｍｏｌ）を含む硫酸／エタノール（５：９５）に浸し、１１０℃で加熱することでグルコース及びセロオリゴ糖を検出した。
結果を図４〜図７及び表１、２に示す。
【００６９】
本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）による結晶性セルロースの加水分解は、至適温度が４０℃（図４）、至適ｐＨがｐＨ６．０（図５）であった。また、本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）は、セルロース（Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ  ２０）やリン酸膨潤セルロース、ＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）、１，３−１，４−β−グルカンヒドロキシエチルセルロースなどの１，４−β−グルカンを有する糖鎖を加水分解した（表１）。表１のデータは、反応基質としてセルロース（Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ  ２０、５ｍｇ）、アビセル（Ａｖｉｃｅｌｌ（Ｆｌｕｋａ）、５ｍｇ）、リン酸膨潤セルロース（Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｗｏｌｌｅｎ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ２０、アビセルをリン酸で膨潤して調製、１ｍｇ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ、Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（Ｓｉｇｍａ）、５００ｍｇ）、１，３−１，４−β−グルカン（１，３−１，４−β−ｇｌｕｃａｎ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）、５００ｍｇ）、ヒドロキシエチルセルロース（Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ（Ｆｌｕｋａ）、５００ｍｇ）、キシラン（Ｘｙｌａｎ（Ｓｉｇｍａ）、５００ｍｇ）を用いて、本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）の加水分解反応を調べた結果を示している。セルロースに対する加水分解量を１００とし、相対値で表した。本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）は、特に、結晶性セルロース（Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ２０、Ａｖｉｃｅｌ）に比べ、水溶性の１，４−β−結合を有する糖鎖に対して高い加水分解を触媒したことが明らかとなった。
【００７０】
【表１】
0005597366.tif 000002
【００７１】
さらに、セルロースやセロオリゴ糖を基質として本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）による加水分解産物をＬＣ−ＭＡＳＳにより解析した結果、セルロースやセロへキサオース、セロペンタオースはセロビオース及びセロトリオースに分解され、セロテトラオースはセロビオースのみに分解された（図６）。一方、セロトリオースやセロビオースは本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）の反応基質とは成り得なかった。ＬＣ−ＭＡＳＳの分析結果を定量化したところ、セロテトラオースに対する加水分解反応が最も触媒されることが明らかとなった。また、セルロースより水可溶性のセロオリゴ糖の方が反応基質として良く分解されることが明らかとなった。これらの結果より、本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）はセロビオヒドロラーゼ活性を示すことが証明された。
【００７２】
また、本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）によって生成される加水分解産物はセロテトラオースの加水分解によって生じるセロビオースが最も多かった（図７）。セロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）のカイネティクスの結果では、セロペンタオースに対して親和性が最も高く、セロヘキサオースに対して反応速度は最も高い結果となった（表２）。表２では、反応基質としてセロテトラオース、セロペンタオース、セロへキサオースを用いて、本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）の加水分解反応のカイネティクスをＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋプロットにより算出した結果を示している。これらの結果より、本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）はセロオリゴ糖に対する加水分解力が最も高く、次に水溶性の１，４−β−グルカンに対して高い加水分解力を示した。
【００７３】
【表２】
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【００７４】
［実施例６］
セロオリゴ糖の蛍光標識化
１０ｍｇのセロオリゴ糖（Ｃ２：セロビオース、Ｃ３：セロトリオース、Ｃ４：セロテトラオース、Ｃ５：セロペンタオース、Ｃ６：セロへキサオース、生化学工業）を３ｍＬのＳｏｄｉｕｍ  ｃｙａｎｏｂｏｒｏｈｙｄｏｒｉｄｅ（４％）を含む飽和炭酸水素アンモニウムに溶解し、室温、７日間放置した。この溶液を凍結乾燥及びＢｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）によるゲル濾過を行った後、ニンヒドリン反応により陽性を示す画分を再度凍結乾燥した。次にホウ酸ナトリウム（３％、ｐＨ９．０）にアミノ化したセロオリゴ糖を溶解し、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ  Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｂ−Ｓｕｌｆｏｎｙｌ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ（１．３３％）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を加え、室温、１６時間放置した。未反応の蛍光色素を除くため、反応液をＢｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−２にアプライし、蛍光標識したセロオリゴ糖を精製した。蛍光標識したセロオリゴ糖を基質として本発明のセロビオヒドロラーゼの加水分解反応を解析する際、反応産物をシリカゲル上においてブタノール：酢酸：水＝３：１：１で分離した。
【００７５】
得られた蛍光標識セロオリゴ糖の予想される構造は、以下の通りである。
【００７６】
【化１】
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【００７７】
［実施例７］
蛍光標識セロオリゴ糖を用いた本発明のセロビオヒドロラーゼの酵素活性解析
上記で調製した蛍光標識したセロテトラオース（Ｃ４−ＳＲ）、セロペンタオース（Ｃ５−ＳＲ）、セロへキサオース（Ｃ６−ＳＲ）を基質として、本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）による加水分解反応産物を調べた。具体的には、以下の反応条件を用いた：蛍光標識したセロオリゴ糖２００μｇ、本発明のセロビオヒドロラーゼ０．５μｇ、リン酸ナトリウム１００ｍＭを含む反応液２０μＬを、３０℃でインキュベートした。反応産物はシリカゲル上でブタノール：酢酸：水＝３：１：１で展開した。
結果を図８に示す。
【００７８】
本発明のセロビオハイロドラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）は、Ｃ６−ＳＲ（セロヘキサオースの蛍光標識）を加水分解し、Ｃ３−ＳＲ（セロトリオースの蛍光標識）とＣ４−ＳＲ（セロテトラオースの蛍光標識）が検出された。また、Ｃ５−ＳＲ（セロペンタオースの蛍光標識）からはＣ３−ＳＲが検出された。本発明のセロビオハイロドラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）は、セロテトラオース（標識なし）をセロビオースに加水分解することができるが、Ｃ４−ＳＲを加水分解することはできなかった（図８）。本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）によるＣ６−ＳＲの加水分解反応からＣ４−ＳＲが検出されるのは、セロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）が非還元末端からセロビオース単位で加水分解したためであり、このことから、本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）はセロビオヒドロラーゼＩＩ活性を有することが証明された（図８）。
【００７９】
［実施例８］
セロビオースによる本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）の加水分解活性の阻害
セロビオヒドロラーゼによるセルロースやセロオリゴ糖の加水分解により生じるセロビオース及び反応系に加えられたセロビオースは、セロビオヒドロラーゼの加水分解反応を阻害することが報告されている（Ｍｏｒａｇ，Ｅ．，Ｈａｌｅｖｙ，Ｉ．，Ｂａｙｅｒ，Ｅ．Ａ．ａｎｄ  Ｌａｍｅｄ，Ｒ．（１９９１）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｏｍｅ  ｏｆ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７３，４１５５−４１６２）。したがって、本発明のセロビオヒドロラーゼの加水分解活性に対するセロビオースの影響を調べるために、本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）の加水分解反応系に１〜１５％のセロビオースを添加し、基質となるセロペンタオース及びセロへキサオースの加水分解を調べた。セロビオース（０〜１５％）、本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）、セロペンタオース（０．８％）又はセロへキサオース（０．８％）、リン酸ナトリウム（１００ｍＭ、ｐＨ６．０）を加えた反応液（１００μＬ）を３０℃でインキュベートした。反応産物はＴＬＣ、ＬＣ−ＭＡＳＳ、蛍光標識セロオリゴ糖を利用することにより解析した。本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）の加水分解のメカニズムを表
す模式図を、図９に示す。白丸はグルコース残基、斜線は蛍光標識の施された１−ａｍｉｎｏ−１−ｄｅｏｘｙｇｌｕｃｉｔｏｌを表す。
結果を図１０〜１２に示す。
【００８０】
反応産物をＴＬＣにより分離した結果、基質として用いたセロペンタオース（Ｃ５）及びセロへキサオース（Ｃ６）の加水分解は添加したセロビオースによる影響なく触媒された（図１０）。また、加水分解により生じたセロトリオースは添加したセロビオースによる影響なく生産された。これらの結果より、本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）は、セロビオース（１〜１５％）の存在により活性阻害を受けず、加水分解反応を触媒し得ることが示された。
【００８１】
また、ＬＣ−ＭＡＳＳを用いた反応産物の解析結果から、添加されたセロビオースの影響なしに、セロペンタオース（Ｃ５）又はセロへキサオース（Ｃ６）が加水分解により減少し、セロトリオース（Ｃ３）が増加していることが明らかとなった。これにより、ＬＣ−ＭＡＳＳによる解析からも、本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）の加水分解反応はセロビオースにより阻害されないことが示された（図１１）。
【００８２】
蛍光標識したセロオリゴ糖を利用したセロビオースによる阻害を調べた結果においても、セロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）によりＣ６−ＳＲとＣ５−ＳＲは加水分解により減少し、反応産物であるＣ４−ＳＲやＣ３−ＳＲが増加していた。この結果からも、本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）は添加されたセロビオース（〜１５％）の存在により活性阻害を受けないことが示された（図１２）。
【００８３】
［実施例９］
本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）の加水分解活性に対する金属イオンの影響
本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）とセルロース（Ｓｉｇｍａｃｅｌｌ  ２０）、リン酸ナトリウム（１００ｍＭ、ｐＨ６．０）、金属塩化物（ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＺｎＣｌ２、ＦｅＣｌ２、ＳｎＣｌ２、又はＮａＣｌ）を加えた反応液（１００μＬ）を３０℃、１８時間インキュベートした。反応産物の解析はＰＡＲＢＡＲ法（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．（１９７２）Ａ  ｎｅｗ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４７，２７３−２７９）により行った。
結果を図１３Ａ及びＢに示す。
【００８４】
イネいもち病菌由来の本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）はｐＨ６．０付近において高い加水分解活性を示し、ｐＨ３．５〜ｐＨ４．５付近においては低い加水分解活性を示す（図５）。カルシウムイオン（Ｃａ２＋）の添加により、ｐＨ６．０付近では加水分解活性に大きな変化はないが、ｐＨ３．５及びｐＨ４．５においては、カルシウムイオンを添加しない場合に比べ、約２倍の加水分解活性が得られた（図１３Ａ）。また、他の金属イオンによる本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）の活性増加について調べたところ、カルシウムイオンと鉄イオンの存在による本発明のセロビオヒドロラーゼ（ＭｏＣｅｌ６Ａ）の活性増加が認められた（図１３Ｂ）。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明によれば、植物由来原料の糖化を容易に行なうことが可能となり、植物由来原料のエネルギー源としての利用が実現される。したがって、本発明は、工業、エネルギー産業分野での利用可能性を有する。
【配列表フリーテキスト】
【００８６】
配列番号３〜４：プライマー
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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