(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４または配列番号６のヌクレオチド配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項２】
請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、酵母発現構築物をさらに含む、単離されたポリヌクレオチド分子。
【請求項３】
配列番号４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに機能的に連結された酵母発現ベクターを含む、酵母発現構築物。
【請求項４】
請求項３に記載の酵母発現構築物であって、配列番号４のヌクレオチド配列を含む該ポリヌクレオチドに機能的に連結されたアルファ因子をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、酵母発現構築物。
【請求項５】
請求項４に記載の酵母発現構築物であって、配列番号４のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドに機能的に連結されたアルファ因子をコードする該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が配列番号６である、酵母発現構築物。
【請求項６】
配列番号４または配列番号６のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む酵母発現構築物で形質転換された酵母細胞。
【請求項７】
該発現構築物は該酵母細胞内において染色体外である、請求項６に記載の酵母細胞。
【請求項８】
該発現構築物は、該酵母細胞の染色体に安定的に統合される、請求項６に記載の酵母細胞。
【請求項９】
請求項６に記載の酵母細胞であって、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）、分裂酵母、出芽酵母、またはヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞である、酵母細胞。
【請求項１０】
請求項６に記載の酵母細胞であって、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞である、酵母細胞。
【請求項１１】
エンテロキナーゼの生成方法であって、配列番号４または配列番号６のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む酵母発現構築物で形質転換された酵母細胞を培養して、それにより配列番号４または配列番号６のヌクレオチド配列によりコードされるエンテロキナーゼを生成するステップを含む、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、該酵母細胞は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）、分裂酵母、出芽酵母、またはヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞である、方法。
【請求項１３】
該酵母細胞はピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
配列番号４または配列番号６のヌクレオチド配列によりコードされる該エンテロキナーゼを精製することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に従って、２０１０年１１月２３日出願の米国仮特許出願第６１／４１６，６２２号に対する優先権を主張し、当該出願はその全体が援用される。
【背景技術】
【０００２】
エンテロキナーゼ（ＥＫ、エンテロペプチダーゼ（ＥＰ）としても知られる；ＥＣ３．４．２１．９）は十二指腸の細胞により生成されるヘテロダイマー糖タンパク質である。胃を通ってきた摂取された食物の進入後に腸腺（リーベルキューンのクリプト）から分泌され、そして十二指腸および空腸粘膜中に存在する、セリンプロテアーゼのキモトリプシン‐クランの一部である。食物タンパク質の消化に関連して、ＥＫはトリプシン前駆体からのＮ末端酸性ペプチド断片の切断を触媒し、このチモーゲンをその活性形トリプシンに変換する。トリプシンの活性化はタンパク質分解反応のカスケードを開始し、キモトリプシン前駆体、プロエラスターゼ、プロカルボキシペプチダーゼ、およびいくつかのプロリパーゼを含む多くの膵臓チモーゲンの活性化を引き起こす。
【０００３】
エンテロキナーゼは例えば、ヒト、ウシ、ラット、およびマウスを含むいくつかの哺乳類源からクローニングされている。構造的には、ＥＫは小腸の刷子縁膜中にエンテロキナーゼを固定する約８２〜１４０ｋＤａ重鎖および触媒サブユニットを含む３５〜６２ｋＤａ軽鎖を含むセリンプロテアーゼである。軽鎖は単一のジスルフィド架橋を介して重鎖に結合されている。この単一のドメイン内ジスルフィド架橋に加えて、軽鎖はさらなる８つのシステイン残基を含み、それらは特異的なドメイン間ジスルフィド結合を形成することが示されている。エンテロキナーゼ軽鎖は触媒活性を含み、そして切断能がある。ＥＫおよびその触媒活性断片はペンタ‐ペプチド配列Ａｓｐ‐Ａｓｐ‐Ａｓｐ‐Ａｓｐ‐Ｌｙｓ（配列番号１）に高く特異的であり、リジン残基の後ろに位置する切断しやすい結合を切断する（ＤＤＤＤＫ↓）。
【０００４】
高い特異性のために、ＥＫは生化学およびバイオ技術適用において好適な試薬として使用されている。例えば、その配列自体によりＥＫ切断部位に連結された（ポリ‐Ｈｉｓの如き）Ｃ末端精製タグを含む融合タンパク質はその精製タグを除去するためにＥＫにより切断され、タンパク質精製後にその標的タンパク質を与え得る。あるいは、活性化前に切断されなければならないプロテアーゼのＮ末端プロ配列はエンテロキナーゼでの活性化を可能にするために変異され得る。
【０００５】
組換えエンテロキナーゼ（ｒＥＫ）は触媒軽鎖ドメインのみを含む２８ｋＤａタンパク質を生成する遺伝子を利用して大腸菌の如き細菌およびピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）の如き酵母の両方でうまく生成されている。しかしながら、商業適用に十分な収率でこの組換え酵素を発現することはまだ困難である。本明細書はコスト効率の良い様式かつ商業適用に有用な量で組換えエンテロキナーゼを生成するために有用な改善された発現構築物を開示している。
【発明の概要】
【０００６】
本明細書の態様はエンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド分子を開示する。エンテロキナーゼをコードする開示されたポリヌクレオチド分子は、非限定的に、配列番号４、配列番号６、それらのヌクレオチド変異形、それらの切断変異形、および／またはそれらの相補体を含む。本明細書中に開示されるポリヌクレオチドは酵母発現ベクターをさらに含み得る。他の態様は酵母発現ベクターおよびエンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド分子を含む酵母発現構築物を開示する。
【０００７】
本明細書の他の態様はエンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド分子を含む酵母発現構築物を含む酵母細胞を開示する。開示された酵母発現構築物は酵母細胞内に過渡的に含有され得るまたはそれは酵母細胞内に安定的に含有され得る。酵母細胞は、非限定的に、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株からの細胞、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）株からの細胞、ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）株からの細胞、分裂酵母株からの細胞、出芽酵母株からの細胞、またはヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株からの細胞を含む。
【０００８】
本明細書のさらに他の態様は酵母発現構築物を用いたエンテロキナーゼの生成方法を開示する。開示された方法は酵母細胞内で本明細書中に開示される酵母発現構築物を発現するステップを含む。他の態様は本明細書中に開示される酵母発現構築物を酵母細胞内に導入するステップ、およびその酵母細胞内でその発現構築物を発現させるステップを含む、エンテロキナーゼの生成方法を提供する。
【０００９】
本明細書のまた他の態様はエンテロキナーゼを用いたエンテロキナーゼ切断部位を含むポリペプチドの切断方法を開示する。開示された方法はエンテロキナーゼ切断部位を含むポリペプチドをエンテロキナーゼと接触させるステップを含み、そのポリペプチドをエンテロキナーゼと接触させることはそのエンテロキナーゼ切断部位の特異的切断をもたらす。使用されるエンテロキナーゼは本明細書中に開示されるポリヌクレオチド分子によりコードされるもの、本明細書中に開示される酵母発現構築物を用いて生成されるもの、および／または本明細書中に開示される酵母細胞内で発現させることにより生成されるものであり得る。
【００１０】
本明細書の他の態様はエンテロキナーゼを用いたエンテロキナーゼ切断部位を含むポリペプチドの調製方法を開示する。開示された方法はエンテロキナーゼ切断部位を含むポリペプチドをエンテロキナーゼと接触させるステップを含み、そのポリペプチドをエンテロキナーゼと接触させることはそのエンテロキナーゼ切断部位の特異的切断をもたらす。使用されるエンテロキナーゼは本明細書中に開示されるポリヌクレオチド分子によりコードされるもの、本明細書中に開示される酵母発現構築物を用いて生成されるもの、および／または本明細書中に開示される酵母細胞内で発現させることにより生成されるものであり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本明細書中に開示される統合されたＥＫカセットを含む６つの異なる酵母細胞系から生成されたエンテロキナーゼの平均酵素活性のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
酵母発現系は異種のポリペプチドのための生成システムとしていくつかの利点を提供する。第１に、酵母細胞は発酵槽内で高いバイオマスになるまで（＞３００ｇ／Ｌウェット細胞重量）生育され、大量の所望のポリペプチドを生成するための濃い培養物を提供し得る。第２に、原核生物の発現系と異なり、酵母発現系は真核生物ポリペプチドに特異的な翻訳後フォールディングおよび他の修飾を正確に制御することができ、それによりその異種のポリペプチドの生理活性、機能および安定性の保持を確実にする。第３に、酵母発現系は多用途かつ柔軟性があり、１）染色体外またはゲノムベースの発現、２）発現の構成的または誘導的制御、および３）発現された異種のポリペプチドを特定の細胞または細胞外区画に方向付け、単離、および精製を促進する能力を提供する。
【００１３】
本明細書はコスト効率の良い様式かつ商業適用に有用であるように十分多い量で組換えエンテロキナーゼを生成するために有用な改善された発現構築物を開示する。これらの結果はエンテロキナーゼをコードする開示された遺伝子工学で改変されたポリヌクレオチド分子のいずれか１つを用いて達成され得る。一旦、酵母発現ベクター内にクローニングされ、および酵母細胞内に導入されたら、これらの改変された分子は現在可能な量よりも顕著に多い量のエンテロキナーゼを生成し得る。
【００１４】
したがって、本明細書の態様は、部分的に、ポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書中に開示されるポリヌクレオチド分子は生物のゲノムから単離された一重鎖または二重鎖ＤＮＡ、組換え生成ｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ分子であり得る。さらに、「単離された」ポリヌクレオチド分子はゲノム源から単離されまたは組換え技術により生成されたとき典型的に他の細胞物質から実質的に制約を受けないまたは化学的に合成されたとき化学前駆体または他の化学物質から実質的に制約を受けない。
【００１５】
本明細書の態様は、部分的に、エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド分子を提供する。本明細書中で使用されるとき、用語「エンテロキナーゼ」は「ＥＫ」と同意語であり、そしてペンタ‐ペプチド配列Ａｓｐ‐Ａｓｐ‐Ａｓｐ‐Ａｓｐ‐Ｌｙｓ（配列番号１）を選択的に認識し、リジン残基の後ろに位置する切断しやすい結合で切断し得る（ＤＤＤＤＫ↓）どんなポリペプチドをも言う。本明細書中で使用されるとき、エンテロキナーゼについて使用されるとき用語「選択的に認識し、そして切断する」はエンテロキナーゼの配列番号１を含む分子との識別的な相互作用および配列番号１のリジン残基の後ろに位置する切断しやすい結合の切断、ならびに一方で、その分子内に位置する他のペンタ‐ペプチド配列とは実質的に相互作用せず、そしてそれらを切断しないことを言う。そのように、エンテロキナーゼは単一のジスルフィド架橋により結合された約８２〜１４０ｋＤａ重鎖および約３５〜６２ｋＤａ軽鎖を含む天然ヘテロダイマー糖タンパク質および触媒的に活性な軽鎖断片を言う。エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド分子の作出の例は実施例１、２、および４〜６中に示される。
【００１６】
１つの実施形態において、エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド分子は配列番号４、配列番号６またはそれらの相補体であり得る。本明細書中で使用されるとき、用語「相補体」はエンテロキナーゼをコードするセンス分子に対してアンチセンス分子であるポリヌクレオチド分子を言う。エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド分子は例えば、精製タグ、細胞分泌シグナル、および／または細胞小器官ローカリゼーションシグナルの如き、他の型のポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチド領域を含み得る。そのような種類の例示的なポリヌクレオチド分子は配列番号６である。エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド分子は例えば、転写、翻訳、および／または翻訳後プロセッシングの局面を方向付けまたは促進する制御または調節ポリヌクレオチド領域をもまた含み得る。
【００１７】
別の態様において、エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド分子は配列番号４、配列番号６またはそれらの相補体のヌクレオチド変異形であり得る。ただし、配列番号４もしくは配列番号６またはそれらの相補体におけるヌクレオチド変化はそのポリヌクレオチド変異形によりコードされるエンテロキナーゼのアミノ酸配列を変えない。そのように、本明細書中に開示される配列番号４ポリヌクレオチド変異形は配列番号５のエンテロキナーゼをコードし、そして本明細書中に開示される配列番号６ポリヌクレオチド変異形は配列番号７のエンテロキナーゼをコードする。
【００１８】
この実施形態の態様において、エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド変異分子は配列番号４、配列番号６またはそれらの相補体のポリヌクレオチド配列と例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であり得る。
【００１９】
この実施形態の他の態様において、エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド変異分子は配列番号４、配列番号６またはそれらの相補体に比較して例えば、約１〜約１０、約１〜約１５、約１〜約２０、約１〜約２５、約１〜約３０、約５〜約２５、約５〜約３０、約５〜約３５、約５〜約４０、約５〜約４５、約１０〜約４０、約１０〜約４５、約１０〜約５０、約１０〜約５５または約１０〜約６０の不連続ヌクレオチド置換を有し得る。この実施形態のさらに他の態様において、エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド変異分子は配列番号４、配列番号６またはそれらの相補体に比較して例えば、約１〜約１０、約１〜約１５、約１〜約２０、約１〜約２５、約１〜約３０、約５〜約２５、約５〜約３０、約５〜約３５、約５〜約４０、約５〜約４５、約１０〜約４０、約１０〜約４５、約１０〜約５０、約１０〜約５５または約１０〜約６０の連続ヌクレオチド置換を有し得る。
【００２０】
非限定的に、グローバル法、ローカル法および例えばセグメントアプローチ法の如きハイブリッド法を含む、さまざまな配列整列法のいずれも本明細書中に開示されるポリヌクレオチドまたはポリペプチドのパーセント同一性を決定するために使用され得る。パーセント同一性を決定するためのプロトコルは当業者の技術の範囲内のおよび本明細書中の教示からのルーチン手順である。
【００２１】
グローバル法はその分子の始めから終わりまでの配列を並べ、そして個々の残基ペアのスコアを足すことによりおよびギャップペナルティを課すことにより最も良い整列を決定する。非限定的な方法は、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ（例えば、Ｊｕｌｉｅ  Ｄ．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ：  Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，Ｐｏｓｉｔｉｏｎ‐Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｇａｐ  Ｐｅｎａｌｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｃｈｏｉｃｅ，２２（２２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４６７３‐４６８０（１９９４）を参照のこと）；および反復改良法（例えば、Ｏｓａｍｕ  Ｇｏｔｏｈ，Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  ｉｎ  Ａｃｃｕｒａｃｙ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ  ｂｙ  Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ  ａｓ  Ａｓｓｅｓｓｅｄ  ｂｙ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ，２６４（４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８２３‐８３８（１９９６）を参照のこと）を含む。
【００２２】
ローカル法は全てのインプット配列に共有される１以上の保存されたモチーフを同定することにより配列を整列する。非限定的な方法は、例えば、マッチボックス（例えば、Ｅｒｉｃ  Ｄｅｐｉｅｒｅｕｘ  ａｎｄ  Ｅｒｎｅｓｔ  Ｆｅｙｔｍａｎｓ，Ｍａｔｃｈ‐Ｂｏｘ：  Ａ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｌｙ  Ｎｅｗ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｅｖｅｒａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，８（５）ＣＡＢＩＯＳ  ５０１‐５０９（１９９２）を参照のこと）；ギブスサンプリング（例えば、Ｃ．Ｅ．Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  Ｓｕｂｔｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｓｉｇｎａｌｓ：  Ａ  Ｇｉｂｂｓ  Ｓａｍｐｌｉｎｇ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ，２６２（５１３１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０８‐２１４（１９９３）を参照のこと）；アライン‐Ｍ（例えば、Ｉｖｏ  Ｖａｎ  Ｗａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｌｉｇｎ‐Ｍ  ‐  Ａ  Ｎｅｗ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｉｇｈｌｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，２０（９）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，：１４２８‐１４３５（２００４）を参照のこと）を含む。
【００２３】
ハイブリッド法はグローバルおよびローカル整列法両方の機能的局面を組み合わせる。非限定的な方法は、例えば、セグメント対セグメント比較（例えば、Ｂｕｒｋｈａｒｄ  Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｂａｓｅｄ  Ｏｎ  Ｓｅｇｍｅｎｔ‐Ｔｏ‐Ｓｅｇｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，９３（２２）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１２０９８‐１２１０３（１９９６）を参照のこと）；Ｔ‐Ｃｏｆｆｅｅ（例えば、Ｃｅｄｒｉｃ  Ｎｏｔｒｅｄａｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔ‐Ｃｏｆｆｅｅ：  Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ，３０２（１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０５‐２１７（２０００）を参照のこと）；ＭＵＳＣＬＥ（例えば、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｃ．Ｅｄｇａｒ，ＭＵＳＣＬＥ：  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｗｉｔｈ  Ｈｉｇｈ  Ｓｃｏｒｅ  Ａｃｃｕｒａｃｙ  ａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ，３２（５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７９２‐１７９７（２００４）を参照のこと）；およびＤＩＡＬＩＧＮ‐Ｔ（例えば、Ａｍａｒｅｎｄｒａｎ  Ｒ  Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＩＡＬＩＧＮ‐Ｔ：  Ａｎ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  Ｓｅｇｍｅｎｔ‐Ｂａｓｅｄ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ，６（１）ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ６６（２００５）を参照のこと）を含む。
【００２４】
この実施形態のさらなる態様において、エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド変異分子は厳密な条件下で、配列番号４、配列番号６またはそれらの相補体を含むポリヌクレオチド分子にハイブリダイズするポリヌクレオチド変異形であり得る。上記厳密なハイブリダイゼーション条件は当業者に周知であり、そして例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１‐６．３．６中に見られることができ、当該出願はその全体が援用される。厳密な（例えば、高い厳密さ）ハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は約４５℃で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション後、５０〜６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄である。
【００２５】
この実施形態のさらに他の態様において、エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド変異分子は表１中に開示されるポリヌクレオチド変異形であり得る。この表はエンテロキナーゼ軽鎖のアミノ酸配列、この軽鎖断片をコードする配列番号４および配列番号６のポリヌクレオチド領域のオープンリーディングフレームを含むコドン、ならびに配列番号４および配列番号６のコドンについて置換され得るコドン変異形を含む。この実施形態の態様において、エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド変異分子は配列番号４または配列番号６中の対応するコドンの存在について置換された、例えば、表１の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の変異コドンを有する。この実施形態の他の態様において、エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド変異分子は配列番号４または配列番号６中の対応するコドンの存在について置換された、例えば、表１の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９または少なくとも２０の変異コドンを有する。この実施形態のさらに他の態様において、エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド変異分子は配列番号４または配列番号６中の対応するコドンの存在について置換された、例えば、表１の多くて１、多くて２、多くて３、多くて４、多くて５、多くて６、多くて７、多くて８、多くて９、多くて１０、多くて１１、多くて１２、多くて１３、多くて１４、多くて１５、多くて１６、多くて１７、多くて１８、多くて１９または多くて２０の変異コドンを有する。
【表１−１】
0005425350.tif 000002
【表１−２】
0005425350.tif 000003
【表１−３】
0005425350.tif 000004
【００２６】
この実施形態のさらなる態様において、エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド分子は表２中に開示されるポリヌクレオチド変異形であり得る。この表はエンテロキナーゼ軽鎖のアミノ酸配列、この軽鎖断片をコードする配列番号４および配列番号６のポリヌクレオチド領域のオープンリーディングフレームを含むコドン、ならびに配列番号４および配列番号６のコドンについて置換され得るコドン変異形を含む。この実施形態の態様において、エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド変異分子は配列番号４または配列番号６中の対応するコドンの存在について置換された、例えば、表２の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の変異コドンを有する。この実施形態の他の態様において、エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド変異分子は、配列番号４または配列番号６中の対応するコドンの存在について置換された、例えば、表２の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９または少なくとも２０の変異コドンを有する。この実施形態の他の態様において、エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド変異分子は配列番号４または配列番号６中の対応するコドンの存在について置換された、例えば、表２の多くて１、多くて２、多くて３、多くて４、多くて５、多くて６、多くて７、多くて８、多くて９、多くて１０、多くて１１、多くて１２、多くて１３、多くて１４、多くて１５、多くて１６、多くて１７、多くて１８、多くて１９または多くて２０の変異コドンを有する。
【表２−１】
0005425350.tif 000005
【表２−２】
0005425350.tif 000006
【表２−３】
0005425350.tif 000007
【００２７】
また別の態様において、エンテロキナーゼをコードするポリヌクレオチド分子は配列番号４、配列番号６またはそれらのヌクレオチド変異形の切断断片であり得る。本明細書中で使用されるとき、用語「配列番号４、配列番号６またはそれらのヌクレオチド変異形の切断断片」は配列番号４もしくはそのヌクレオチド変異形により示される７１０のヌクレオチド配列または配列番号６もしくはそのヌクレオチド変異形により示される９５３のヌクレオチド配列からのヌクレオチドの除去を言う。配列番号４、配列番号６またはそれらのヌクレオチド変異形の５’末端、３’末端または５’末端および３’末端の両方からのヌクレオチドが除去され得る。
【００２８】
この実施形態の態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０のヌクレオチドが配列番号４、配列番号６もしくはそれらのヌクレオチド変異形またはそれらの相補体の５’末端、３’末端または５’末端および３’末端の両方から除去される。この実施形態の他の態様において、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５または少なくとも５０のヌクレオチドが配列番号４、配列番号６もしくはそれらのヌクレオチド変異形またはそれらの相補体の５’末端、３’末端または５’末端および３’末端の両方から除去される。この実施形態のさらに他の態様において、多くて１、多くて２、多くて３、多くて４、多くて５、多くて６、多くて７、多くて８、多くて９、多くて１０、多くて１１、多くて１２、多くて１３、多くて１４、多くて１５、多くて１６、多くて１７、多くて１８、多くて１９、多くて２０、多くて２５、多くて３０、多くて３５、多くて４０、多くて４５または多くて５０のヌクレオチドが配列番号４、配列番号６もしくはそれらのヌクレオチド変異形またはそれらの相補体の５’末端、３’末端または５’末端および３’末端の両方から除去される。
【００２９】
この実施形態の他の態様において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０のコドンが配列番号４、配列番号６もしくはそれらのヌクレオチド変異形またはそれらの相補体の５’末端、３’末端または５’末端および３’末端の両方から除去される。この実施形態の他の態様において、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９または少なくとも２０のコドンが配列番号４、配列番号６もしくはそれらのヌクレオチド変異形またはそれらの相補体の５’末端、３’末端または５’末端および３’末端の両方から除去される。この実施形態のさらに他の態様において、多くて１、多くて２、多くて３、多くて４、多くて５、多くて６、多くて７、多くて８、多くて９、多くて１０、多くて１１、多くて１２、多くて１３、多くて１４、多くて１５、多くて１６、多くて１７、多くて１８、多くて１９または多くて２０のコドンが配列番号４、配列番号６もしくはそれらのヌクレオチド変異形またはそれらの相補体の５’末端、３’末端または５’末端および３’末端の両方から除去される。
【００３０】
本明細書の態様は、部分的に、酵母発現ベクターを含むポリヌクレオチド分子を開示する。非限定的に、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）発現ベクター、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）発現ベクター、ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）発現ベクター、分裂酵母発現ベクター、出芽酵母発現ベクターおよびヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）発現ベクターを含む、広くさまざまな酵母発現ベクターがＥＫをコードするポリヌクレオチド分子を発現するために使用され得る。酵母発現ベクターの非限定的な例はｐＧａｌ‐ＭＦ発現ベクター（ＤｕａｌｓｙｓｔｅｍｓＢｉｏｔｅｃｈ，ＡＧ，Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ，ＣＨ）、ｐＭＥＴ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＰＩＣＨＩＡＰＩＮＫ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ｐＰＩＣＺ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ｐＰｐＴ４アルファ発現ベクター（Ｉｎｇｅｎｚａ，Ｌｔｄ．，Ｍｉｄｌｏｔｈｉａｎ，ＵＫ）、ｐＴＥＦ‐ＭＦ発現ベクター（ＤｕａｌｓｙｓｔｅｍｓＢｉｏｔｅｃｈ，ＡＧ，Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ，ＣＨ）、ｐＹＥＳ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含む。
【００３１】
酵母発現ベクターは例えば、複製、統合、転写、翻訳、および／または翻訳後プロセッシングの局面を方向付けまたは促進する制御または調節ポリヌクレオチド領域を典型的に含む。例えば、酵母発現ベクターはＥＫ発現を方向付けるために使用される構成的プロモーターおよびエンハンサーエレメントおよび／または誘導的プロモーターおよびエンハンサーエレメントを含み得る。構成的発現ベクターの非限定的な例はＥＫ生成を方向付けるためにグリセルアルデヒド‐３‐フォスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ）プロモーターを使用するものである。誘導的発現ベクターの非限定的な例は誘導剤としてメタノールを伴う、アルデヒドオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）プロモーターを使用するものである。いずれの場合にも、高レベルの発現が達成されることができ、１リットル当たり数グラムまでの生成物が得られる。例えば、メタノール誘導酵母細胞において、ＡＯＸ１は可溶性タンパク質全体の３０％を生成し得る。ＡＯＸ１遺伝子を欠く株（ＭｕｔＳ株とも呼ばれる）でも、それらはアルコールオキシダーゼ２遺伝子（ＡＯＸ２）を発現するので、メタノールにより誘導され得るが、それらはメタノールが唯一の炭素源として使用されるとき野生型株よりゆっくり生育する。しかしながら、ＡＯＸ１タンパク質生成のために主にエネルギーおよび源を用いる代わりに、ＭｕｔＳ株においてＡＯＸ１のプロモーターの力は主に組換えタンパク質生成に向かって方向付けられ得る。さらに、より低いメタノール値が適用され得る。
【００３２】
酵母発現ベクターは例えば、精製タグ、細胞分泌シグナル、および／または細胞小器官ローカリゼーションシグナルの如き、他の型のポリペプチド分子をコードするポリヌクレオチド領域を含み得る。そのようなポリヌクレオチド領域は通常融合ポリペプチドの形態でＥＫに機能的に連結される。精製タグの非限定的な例はヒスチジンタグ、ｍｙｃタグ、Ｖ５タグを含む。シグナル配列の非限定的な例はＥＫを細胞質、ペルオキシソームの如き細胞オルガネラへまたは細胞外培養培地へ方向付けるシグナル配列を含む。例えば、アルファ因子ペプチドシグナルの包含はＥＫの培養培地への分泌を可能にする。
【００３３】
本明細書の態様は、部分的に、酵母発現構築物を含むポリヌクレオチド分子を開示する。酵母発現構築物は本明細書中に開示されるように酵母発現ベクターに機能的に連結された本明細書中に開示されるようなＥＫをコードするポリヌクレオチド分子を含む。酵母発現構築物の例は実施例２および４〜６中に示される。
【００３４】
本明細書の態様は、部分的に、酵母細胞内に本明細書中に開示されるポリヌクレオチド分子を導入することを開示する。細胞内に導入されたポリヌクレオチド分子はその細胞に過渡的にまたは安定的に維持され得る。安定的に維持されるポリヌクレオチド分子は染色体外に存在し、そして自律的に複製し得るまたはそれらはその細胞の染色体物質に統合され、そして非自律的に複製し得る。
【００３５】
細胞内への本明細書中に開示されるポリヌクレオチド分子の導入のためのいずれかのおよび全ての方法が使用され得ることが構想される。細胞内へ核酸分子を導入するために有用な方法は、非限定的に、例えば、リン酸カルシウム仲介、ジエチル‐アミノエチル（ＤＥＡＥ）デキストラン仲介、脂質仲介、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）仲介、ポリリジン仲介およびポリブレン仲介の如き化学物質仲介トランスフェクション、例えば、微粒子銃粒子デリバリー、マイクロインジェクション、プロトプラスト融合およびエレクトロポーレーションの如き物理的仲介トランスフェクション、および例えば、レトロウイルス仲介トランスフェクションの如きウイルス仲介トランスフェクションを含む。当業者は、細胞への発現構築物の導入のための特定の方法の選択は、部分的に、その細胞が発現構築物を過渡的に含有するであろうかどうかまたはその細胞が発現構築物を安定的に含有するであろうかどうかによるであろうことを理解する。これらのプロトコルは当業者の技術の範囲内のおよび本明細書中の教示からのルーチン手順である。例えば、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｃｌｏｎｅｄ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎｔｏ  Ｃｕｌｔｕｒｅｄ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，ｐｐ．１６．１‐１６．６２（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，ｅｄｓ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｖｏｌ．３，３ｒｄ  ｅｄ．２００１）を参照のこと。本明細書中に開示される酵母発現構築物の酵母細胞内への導入の例は実施例２および４〜６中に示される。
【００３６】
本明細書の態様は、部分的に、本明細書中に開示されるようにＥＫをコードするポリヌクレオチド分子を含む酵母発現構築物を含む酵母細胞を開示する。この実施形態の態様において、酵母細胞は本明細書中に開示されるようにＥＫをコードするポリヌクレオチド分子を含む酵母発現構築物を過渡的に含有する。この実施形態の別の態様において、酵母細胞は本明細書中に開示されるようにＥＫをコードするポリヌクレオチド分子を含む発現構築物を安定的に含有する。この実施形態の態様において、酵母細胞はピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）、分裂酵母、出芽酵母またはヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）由来の酵母細胞株である。この実施形態の他の態様において、酵母発現構築物はピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）発現ベクター、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）発現ベクター、ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）発現ベクター、分裂酵母発現ベクター、出芽酵母発現ベクターまたはヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）発現ベクターである。この実施形態のさらに他の態様において、ＥＫをコードするポリヌクレオチド分子は配列番号４、配列番号６もしくはそれらのヌクレオチド変異形またはそれらの相補体である。
【００３７】
本明細書の態様は、部分的に、酵母発現系を用いて本明細書中に開示されるポリヌクレオチド分子からＥＫを発現することを開示する。酵母発現系を用いたポリヌクレオチド分子の発現は、非限定的に、誘導的発現、非誘導的発現、構成的発現、ウイルス仲介発現、安定的統合発現、および過渡的発現を含むさまざまな特徴のいずれかを含み得る。これらのプロトコルは当業者の技術の範囲内のおよび本明細書中の教示からのルーチン手順である。酵母発現系の非限定的な例はＥＡＳＹＳＥＬＥＣＴ（商標）ピキア発現キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＥＡＳＹＳＥＬＥＣＴ（商標）ＥＣＨＯ（商標）ピキア発現キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＰＩＣＨＩＡＰＩＮＫ（商標）分泌タンパク質キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＹＥＳ‐ＥＣＨＯ（商標）発現ベクターキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）およびＳＰＥＣＴＲＡ（商標）分裂酵母発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含む。酵母発現系を用いた本明細書中に開示されるポリヌクレオチド分子からのＥＫの発現の例は実施例２〜６中に示される。
【００３８】
１つの実施形態において、配列番号４、配列番号６またはそれらのポリヌクレオチド変異形のポリヌクレオチド分子を含む酵母発現構築物から発現されたＥＫの量は配列番号２から発現されたＥＫの量に比較して増加される。
【００３９】
この実施形態の態様において、配列番号４、配列番号６またはそれらのポリヌクレオチド変異形のポリヌクレオチド分子を含む酵母発現構築物から発現されたＥＫの量は配列番号２から発現されたＥＫの量に比較して、例えば、少なくとも０．５倍、少なくとも１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍または少なくとも４０倍増加される。この実施形態の他の態様において、配列番号４、配列番号６またはそれらのポリヌクレオチド変異形のポリヌクレオチド分子を含む酵母発現構築物から発現されたＥＫの量は配列番号２から発現されたＥＫの量に比較して、例えば、約１倍〜約５倍、約１倍〜約１０倍、約１倍〜約１５倍、約１倍〜約２０倍、約１倍〜約２５倍増加される。
【００４０】
この実施形態の他の態様において、配列番号４、配列番号６またはそれらのポリヌクレオチド変異形のポリヌクレオチド分子を含む酵母発現構築物から発現されたＥＫの量は約１００ｍｇ／Ｌ〜約３０ｇ／Ｌである。この実施形態の態様において、配列番号４、配列番号６またはそれらのポリヌクレオチド変異形のポリヌクレオチド分子から発現されたＥＫの量は、例えば、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１ｇ／Ｌ、少なくとも１．５ｇ／Ｌ、少なくとも２．５ｇ／Ｌ、少なくとも５ｇ／Ｌ、少なくとも７．５ｇ／Ｌ、少なくとも１０ｇ／Ｌ、少なくとも１２．５ｇ／Ｌ、少なくとも１５ｇ／Ｌ、少なくとも２０ｇ／Ｌ、少なくとも２５ｇ／Ｌまたは少なくとも３０ｇ／Ｌであり得る。この実施形態のさらに他の態様において、配列番号４、配列番号６またはそれらのポリヌクレオチド変異形のポリヌクレオチド分子を含む酵母発現構築物から発現されたＥＫの量は、例えば、約１００ｍｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約１５ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約２５ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ〜約３０ｇ／Ｌであり得る。
【００４１】
本明細書中に開示される酵母発現構築物から発現されたＥＫはさまざまな方法のいずれかを用いて酵母細胞または培養培地から精製され得る。精製方法の例は、非限定的に、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除（分子ふるい）クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ファストパフォーマンス液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を含む。問題の標的ペプチドの結合部分は、非限定的に、樹脂、アガロース、および磁気ビーズを含むさまざまな物質のいずれかに結合され得る。さらに、非限定的に、バッチ式プロセッシング、および重力送りカラムを含むさまざまなプロセッシング技術のいずれかが使用され得る。タンパク質再折りたたみステップはまた本明細書中に開示される核酸分子によりコードされる機能的に活性なＢｏＮＴ／Ａの回復を確実にすることが必要であり得る。タンパク質の精製および回復のための特定のプロトコルの非限定的な例は、例えば、Ｊｏｈｎ  Ａｂｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＧＵＩＤＥ  ＴＯ  ＰＲＯＴＥＩＮ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０）、ＰＲＯＴＥＩＮ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ：  ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ，（Ｒｏｂｅｒｔ  Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，３ｒｄ．ｅｄ．１９９４）、ＰＲＯＴＥＩＮ  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ：  Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ，（Ｓｉｍｏｎ  Ｒｏｅ  ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．２００１）、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，上記，（２００１）、Ｉａｎ  Ｍ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，ＰＲＯＴＥＩＮ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＆  ＰＵＲＩＦＩＣＡＴＩＯＮ：  ＢＥＮＣＨＴＯＰ  ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，２００２）中に示される。これらのプロトコルは当業者の技術の範囲内のおよび本明細書中の教示からのルーチン手順である。
【００４２】
ＥＫの量はさまざまな方法のいずれかを用いてＥＫ発現中、ＥＫ発現の完了後、および／またはＥＫ精製後に計測され得る。タンパク質計測法の例は、非限定的に、ゲル電気泳動法およびタンパク質染色、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、タンパク質ラベリング、ＵＶ吸収、Ｌｏｗｒｙ法、ビウレット分析、スミス銅／ビシンコニン酸（ＢＣＡ）分析、およびブラッドフォード染色分析を含む。例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｖ．Ｓａｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２９（２）  ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．ＡＰＰＬ．ＢＩＯＣＨＥＭ．９９‐１０８，（１９９９）を参照のこと。
【００４３】
本明細書の態様は、部分的に、ＥＫを用いたＥＫ切断部位を含むポリペプチドの切断方法を開示する。１つの実施形態において、ＥＫ切断部位を含むポリペプチドの切断方法はＥＫ切断部位を含むポリペプチドをＥＫと接触させるステップを含み、そのＥＫは酵母細胞内で配列番号４、配列番号６、それらのポリヌクレオチド変異形またはそれらの切断変異形を含む酵母発現構築物を発現させることにより生成され、その組換えポリペプチドをエンテロキナーゼと接触させることはＥＫ切断部位の特異的切断をもたらす。この実施形態の１つの態様において、そのＥＫ切断部位は配列番号１である。そのポリペプチドは天然にＥＫ切断部位を有するものであり得るまたはそれはＥＫ切断部位を含有するよう遺伝子工学で作出された組換えポリペプチドであり得る。
【００４４】
本明細書の態様は、部分的に、ＥＫを用いたＥＫ切断部位を含むポリペプチドの調製方法を開示する。１つの実施形態において、ＥＫ切断部位を含むポリペプチドの調製方法はＥＫ切断部位を含むポリペプチドをＥＫと接触させるステップを含み、そのＥＫは酵母細胞内で配列番号４、配列番号６、それらのポリヌクレオチド変異形またはそれらの切断変異形を含む酵母発現構築物を発現させることにより生成され、その組換えポリペプチドをエンテロキナーゼと接触させることはＥＫ切断部位の特異的切断をもたらす。この実施形態の１つの態様において、ＥＫ切断部位は配列番号１である。そのポリペプチドは天然にＥＫ切断部位を有するものであり得るまたはそれはＥＫ切断部位を含有するように遺伝子工学で作出された組換えポリペプチドであり得る。
【００４５】
ＥＫ切断部位を含むポリペプチドの切断または調製のためにＥＫを使用する方法は標準のｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質分解切断分析を用いて行われ得る。例えば、ＥＫ切断部位を含むポリペプチドは２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ‐ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＣａＣｌ２および本明細書中に示されるように生成されたＥＫを含む反応混合物に添加され、そして約２０〜約２２℃で約２時間〜約１６時間インキュベートされ得る。そのようにして生成された切断されたまたは調製されたポリペプチドの量は例えば、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析、ウェスタンブロット分析もしくはＥＬＩＳＡのような免疫ベースの分析またはそのポリペプチドの活性分析の如き、標準の手順を用いて評価され得る。切断されたまたは調製されたポリペプチドはまた標準の手順を用いて精製され得る。ＥＫ切断部位を含むポリペプチドの切断または調製のために有用な分析は例えば、Ｏｇｉｗａｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅｎｔｅｒｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，米国特許第８，０１３，１３７号；  Ｌａ  Ｖａｌｌｉｅ，Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  Ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｕｓｅ，米国特許第６，７４６，８５９号中に示され、当該出願はそれぞれその全体が援用される。
【００４６】
本明細書の態様はまた以下のように示され得る。
１．配列番号４、配列番号６、それらのポリヌクレオチド変異形またはそれらの切断変異形およびそれらの相補体を含む単離されたポリヌクレオチド分子。
２．実施形態１に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、そのポリヌクレオチド変異形は配列番号４、配列番号６またはそれらの相補体のポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である、ポリヌクレオチド分子。
３．実施形態１に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、そのポリヌクレオチド変異形は配列番号４、配列番号６またはそれらの相補体に比較して約１〜約１０、約１〜約１５、約１〜約２０、約１〜約２５、約１〜約３０、約５〜約２５、約５〜約３０、約５〜約３５、約５〜約４０、約５〜約４５、約１０〜約４０、約１０〜約４５、約１０〜約５０、約１０〜約５５または約１０〜約６０の不連続ヌクレオチド置換を有する、ポリヌクレオチド分子。
４．実施形態１に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、そのポリヌクレオチド変異形は配列番号４、配列番号６またはそれらの相補体に比較して約１〜約１０、約１〜約１５、約１〜約２０、約１〜約２５、約１〜約３０、約５〜約２５、約５〜約３０、約５〜約３５、約５〜約４０、約５〜約４５、約１０〜約４０、約１０〜約４５、約１０〜約５０、約１０〜約５５または約１０〜約６０の連続ヌクレオチド置換を有する、ポリヌクレオチド分子。
５．実施形態１に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、そのポリヌクレオチド変異形は厳密な条件下で配列番号４、配列番号６またはそれらの相補体を含むポリヌクレオチド分子にハイブリダイズする、ポリヌクレオチド分子。
６．実施形態１に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、そのポリヌクレオチド変異形は配列番号４または配列番号６中の対応するコドンの存在について置換された表１からの少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９または少なくとも２０の変異コドンを有する、ポリヌクレオチド分子。
７．実施形態１に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、そのポリヌクレオチド変異形は配列番号４または配列番号６中の対応するコドンの存在について置換された表２からの少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９または少なくとも２０の変異コドンを有する、ポリヌクレオチド分子。
８．実施形態１に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、その切断変異形は配列番号４、配列番号６もしくはそれらのヌクレオチド変異形またはそれらの相補体の５’末端、３’末端または５’末端および３’末端の両方から少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５または少なくとも５０のヌクレオチドを除去されている、ポリヌクレオチド分子。
９．実施形態１に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、その切断変異形は配列番号４、配列番号６もしくはそれらのヌクレオチド変異形またはそれらの相補体の５’末端、３’末端または５’末端および３’末端の両方から少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９または少なくとも２０のコドンを除去されている、ポリヌクレオチド分子。
１０．酵母発現ベクターである、実施形態１〜９に記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
１１．実施形態１０に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、その酵母発現ベクターはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）発現ベクター、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）発現ベクター、ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）発現ベクター、分裂酵母発現ベクター、出芽酵母発現ベクターおよびヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）発現ベクターである、ポリヌクレオチド分子。
１２．実施形態１０または１１に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、その酵母発現ベクターは実施形態１〜９のポリヌクレオチド分子の発現を方向付ける構成的プロモーター、構成的エンハンサー、誘導的プロモーター、誘導的エンハンサーまたはそれらの組み合わせを含む、ポリヌクレオチド分子。
１３．実施形態１２に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、その誘導的プロモーターはアルデヒドオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）プロモーターである、ポリヌクレオチド分子。
１４．実施形態１０〜１４に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、その酵母発現ベクターは実施形態１〜９のポリヌクレオチド分子によりコードされるＥＫを特定の細胞または細胞外区画へ方向付けるシグナル配列をコードするポリヌクレオチド領域を含む、ポリヌクレオチド分子。
１５．実施形態１０〜１４に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、その酵母発現ベクターは実施形態１〜９のポリヌクレオチド分子によりコードされるＥＫを細胞質、細胞オルガネラへまたは細胞外培養培地へ方向付けるシグナル配列をコードするポリヌクレオチド領域を含む、ポリヌクレオチド分子。
１６．実施形態１４または１５に記載の単離されたポリヌクレオチド分子であって、そのシグナル配列はアルファ因子ペプチドである、ポリヌクレオチド分子。
１７．酵母発現構築物である、実施形態１〜９に記載の単離されたポリヌクレオチド分子。
１８．酵母発現ベクターおよび配列番号４、配列番号６、それらのポリヌクレオチド変異形またはそれらの切断変異形およびそれらの相補体を含むポリヌクレオチド分子を含む酵母発現構築物。
１９．実施形態１８に記載の酵母発現構築物であって、そのポリヌクレオチド変異形は配列番号４、配列番号６またはそれらの相補体のポリヌクレオチド配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である、酵母発現構築物。
２０．実施形態１８に記載の酵母発現構築物であって、そのポリヌクレオチド変異形は配列番号４、配列番号６またはそれらの相補体に比較して約１〜約１０、約１〜約１５、約１〜約２０、約１〜約２５、約１〜約３０、約５〜約２５、約５〜約３０、約５〜約３５、約５〜約４０、約５〜約４５、約１０〜約４０、約１０〜約４５、約１０〜約５０、約１０〜約５５または約１０〜約６０の不連続ヌクレオチド置換を有する、酵母発現構築物。
２１．実施形態１８に記載の酵母発現構築物であって、そのポリヌクレオチド変異形は配列番号４、配列番号６またはそれらの相補体に比較して約１〜約１０、約１〜約１５、約１〜約２０、約１〜約２５、約１〜約３０、約５〜約２５、約５〜約３０、約５〜約３５、約５〜約４０、約５〜約４５、約１０〜約４０、約１０〜約４５、約１０〜約５０、約１０〜約５５または約１０〜約６０の連続ヌクレオチド置換を有する、酵母発現構築物。
２２．実施形態１８に記載の酵母発現構築物であって、そのポリヌクレオチド変異形は厳密な条件下で配列番号４、配列番号６またはそれらの相補体を含むポリヌクレオチド分子にハイブリダイズする、酵母発現構築物。
２３．実施形態１８に記載の酵母発現構築物であって、そのポリヌクレオチド変異形は配列番号４または配列番号６中の対応するコドンの存在について置換された表１からの少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９または少なくとも２０の変異コドンを有する、酵母発現構築物。
２４．実施形態１８に記載の酵母発現構築物であって、そのポリヌクレオチド変異形は配列番号４または配列番号６中の対応するコドンの存在について置換された表２からの少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９または少なくとも２０の変異コドンを有する、酵母発現構築物。
２５．実施形態１８に記載の酵母発現構築物であって、その切断変異形は配列番号４、配列番号６もしくはそれらのヌクレオチド変異形またはそれらの相補体の５’末端、３’末端または５’末端および３’末端の両方から少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５または少なくとも５０のヌクレオチドを除去されている、酵母発現構築物。
２６．実施形態１８に記載の酵母発現構築物であって、その切断変異形は配列番号４、配列番号６もしくはそれらのヌクレオチド変異形またはそれらの相補体の５’末端、３’末端または５’末端および３’末端の両方から少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９または少なくとも２０のコドンを除去されている、酵母発現構築物。
２７．実施形態１８〜２６に記載の酵母発現構築物であて、その酵母発現ベクターはピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）発現ベクター、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）発現ベクター、ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）発現ベクター、分裂酵母発現ベクター、出芽酵母発現ベクターおよびヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）発現ベクターである、酵母発現構築物。
２８．実施形態２７に記載の酵母発現構築物であって、その酵母発現ベクターは実施形態１〜９のポリヌクレオチド分子の発現を方向付ける構成的プロモーター、構成的エンハンサー、誘導的プロモーター、誘導的エンハンサーまたはそれらの組み合わせを含む、酵母発現構築物。
２９．実施形態２８に記載の酵母発現構築物であって、その誘導的プロモーターはアルデヒドオキシダーゼ１（ＡＯＸ１）プロモーターである、酵母発現構築物。
３０．実施形態２７〜２９に記載の酵母発現構築物であって、その酵母発現ベクターは実施形態１〜９のポリヌクレオチド分子によりコードされるＥＫを特定の細胞または細胞外区画へ方向付けるシグナル配列をコードするポリヌクレオチド領域を含む、酵母発現構築物。
３１．実施形態２７〜２９に記載の酵母発現構築物であって、その酵母発現ベクターは実施形態１〜９のポリヌクレオチド分子によりコードされるＥＫを細胞質、細胞オルガネラへまたは細胞外培養培地へ方向付けるシグナル配列をコードするポリヌクレオチド領域を含む、酵母発現構築物。
３２．実施形態３０または３１に記載の酵母発現構築物であって、そのシグナル配列はアルファ因子ペプチドである、酵母発現構築物。
３３．実施形態１〜１７に記載のポリヌクレオチドを含む酵母細胞。
３４．実施形態３３に記載の酵母細胞であって、その発現構築物はその酵母細胞内に過渡的に含有される、酵母細胞。
３５．実施形態３３に記載の酵母細胞であって、その発現構築物はその酵母細胞内に安定的に含有される、酵母細胞。
３７．ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株からの細胞、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）株からの細胞、ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）株からの細胞、分裂酵母株からの細胞、出芽酵母株からの細胞、またはヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株からの細胞を含む、実施形態３３〜３５に記載の酵母細胞。
３８．ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株からの細胞である、実施形態３３〜３５に記載の酵母細胞。
３９．実施形態１８〜３２に記載の酵母発現構築物を含む酵母細胞。
４０．実施形態３９に記載の酵母細胞であって、その発現構築物はその酵母細胞内に過渡的に含有される、酵母細胞。
４１．実施形態３９に記載の酵母細胞であって、その発現構築物はその酵母細胞内に安定的に含有される、酵母細胞。
４２．ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株からの細胞、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）株からの細胞、ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ）株からの細胞、分裂酵母株からの細胞、出芽酵母株からの細胞、またはヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株からの細胞を含む、実施形態３９〜４１に記載の酵母細胞。
４３．ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）株からの細胞である、実施形態３９〜４１に記載の酵母細胞。
４４．エンテロキナーゼの生成方法であって、実施形態３３〜４３の酵母細胞を用いてエンテロキナーゼを発現するステップを含む、方法。
４５．エンテロキナーゼを精製することをさらに含む、実施形態４４に記載の方法。
４６．組換えポリペプチドの切断方法であって、配列番号１の切断部位を含む組換えポリペプチドをエンテロキナーゼと接触させるステップを含み、そのエンテロキナーゼは実施形態４４または４５の方法により生成され、その組換えポリペプチドをエンテロキナーゼと接触させることは配列番号１の特異的切断をもたらす、方法。
４７．組換えポリペプチドの調製方法であって、配列番号１の切断部位を含む組換えポリペプチドをエンテロキナーゼと接触させるステップを含み、そのエンテロキナーゼは実施形態４４または４５の方法により生成され、その組換えポリペプチドをエンテロキナーゼと接触させることは配列番号１の特異的切断をもたらす、方法。
【実施例】
【００４７】
以下の非限定的な例はここで企図される代表的な実施形態のより完全な理解を促進するために例示目的のためにのみ提供される。これらの実施例は本明細書中に開示されるような酵母発現系を用いたＥＫの発現方法に関するものを含む、本明細書中に示される実施形態のいずれかを限定するものと解釈されるべきでない。
【００４８】
実施例１  ＥＫをコードするポリヌクレオチド分子の合成
ポリヌクレオチド分子配列番号４は標準の化学的手順を用いて合成される（ＢｌｕｅＨｅｒｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）。例えば、長さ２０〜５０塩基のオリゴヌクレオチドは標準のホスホラミダイト合成を用いて合成される。これらのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズして二重鎖にし、ライゲートして全長ポリヌクレオチド分子を組み立てる。このポリヌクレオチド分子を標準の分子生物学的方法を用いてｐＵＣＢＨＢ１ベクター内のＳｍａＩ部位にクローニングし、ｐＵＣＢＨＢ１／ＥＫを作出する。その合成されたポリヌクレオチド分子をＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）およびＡＢＩ  ３１００シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いたシークエンスにより検証する。同様の合成法をポリヌクレオチド分子配列番号６、配列番号４または配列番号６のヌクレオチド変異形、および配列番号４または配列番号６の切断変異形を作出するために使用する。
【００４９】
所望の場合、配列番号２、配列番号４または配列番号６に基づく、発現を最適化されたポリヌクレオチド分子が酵母細胞内での発現を改善するために合成される。ＥＫをコードするポリヌクレオチド分子は１）選択の酵母株の天然ポリヌクレオチド分子中に典型的に存在する同義のコドンを含むよう、２）選択の酵母株中に見られる天然ポリヌクレオチド分子の平均Ｇ＋Ｃ含有量により厳密に合うＧ＋Ｃ含有量を含むよう、３）そのポリヌクレオチド分子内に見られるポリモノヌクレオチド領域を減少させるよう、および／または４）そのポリヌクレオチド分子内に見られる内在の調節または構造部位を消去するよう改変される。例えば、Ｌａｎｃｅ  Ｅ．Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔｙｐｅ  Ｅ，国際特許公開公報ＷＯ  ２００６／０１１９６６（２００６年２月２日）；Ｌａｎｃｅ  Ｅ．Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  Ｔｏｘｉｎ  Ｔｙｐｅ  Ａ，国際特許公開公報ＷＯ  ２００６／０１７７４９（２００６年２月１６日）を参照のこと、および当該出願はそれぞれその全体が援用される。一旦、配列最適化が完了したら、長さ２０〜５０塩基のオリゴヌクレオチドは標準のホスホラミダイト合成を用いて合成される。これらのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせて二重鎖にし、ライゲートして全長ポリヌクレオチド分子を組み立てる。このポリヌクレオチド分子を標準の分子生物学的方法を用いてｐＵＣＢＨＢ１ベクター内のＳｍａＩ部位にクローニングし、ｐＵＣＢＨＢ１／ＥＫを作出する。合成されたポリヌクレオチド分子をＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）およびＡＢＩ  ３１００シークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いたシークエンスにより検証する。同様の合成法を配列番号４もしくは配列番号６のヌクレオチド変異形または配列番号４もしくは配列番号６の切断変異形であるポリヌクレオチド分子を作出するために使用する。
【００５０】
実施例２  ｐＰｐＴ４アルファ／ＥＫの構築および発現
本明細書中に開示されるようにＥＫをコードするポリヌクレオチド分子を含む酵母発現構築物を構築するために、配列番号４を含むｐＪ２０１／ｒＥＫ構築物をＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化し、配列番号４挿入物を切り出した。生ずる制限酵素処理断片をＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）ゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）により精製し、そして配列番号４断片を制限酵素エンドヌクレアーゼＸｈｏＩおよびＮｏｔＩで消化したｐＰｐＴ４アルファ＿Ｓベクター（Ｉｎｇｅｎｚａ，Ｌｔｄ．，Ｍｉｄｌｏｔｈｉａｎ，ＵＫ）内にサブクローニングした。ｐＰｐＴ４アルファ＿Ｓベクターはアルファ因子分泌シグナル配列、ＡＯＸ１プロモーターの一部、ＡＯＤおよびＡＯＸ１転写終了配列、およびＺＥＯＣＩＮ（商標）のオープンリーディングフレームを含む。その断片およびベクターを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼプロトコルを用いてライゲートし、ｐＰｐＴ４アルファ／ｒＥＫを作出し、そしてこのライゲーション混合物の一部を用いて標準のエレクトロポーレーションプロトコルによりエレクトロコンピテントＮＥＢ１０細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を形質転換した。形質転換された細胞を２５μｇ／ｍＬのＺＥＯＣＩＮ（商標）を含む１．５％Ｌｕｒｉａ‐Ｂｅｒｔａｎｉ  Ｌｅｎｎｏｘアガープレート（ｐＨ７．０）上に撒き、そして３７℃のインキュベーター内に入れ、一晩生育させた。候補発現構築物をＺＥＯＣＩＮ（商標）耐性コロニーとして選択した。耐性コロニーを続いて生育させ、回収し、そして標準の手順を用いてプラスミドＤＮＡを単離し、そして正しい挿入断片の存在および向きを決定するために、候補発現構築物をＸｈｏＩおよびＮｏｔＩ、ＸｂａＩまたはＮｄｅＩを用いた制限酵素消化によりスクリーニングした。所望のｐＰｐＴ４アルファ／ｒＥＫ発現構築物を含む培養物を生育させ、回収し、そして標準の手順を用いてプラスミドＤＮＡを単離し、そして正しい発現構築物が作出されたことを検証するために、候補発現構築物をシークエンスした。このクローニング法は配列番号４を含む酵母発現構築物を作出した。同様の方法を配列番号６、配列番号４もしくは配列番号６のヌクレオチド変異形または配列番号４もしくは配列番号６の切断変異形を含むｐＰｐＴ４アルファ／ＥＫ発現構築物を作出するために使用する。あるいは、配列番号４のポリヌクレオチド分子、配列番号４、配列番号４もしくは配列番号６のヌクレオチド変異形または配列番号４もしくは配列番号６の切断変異形を実施例１中に示されるように合成する。
【００５１】
配列番号４によりコードされるエンテロキナーゼを発現する酵母細胞系を構築するために、ｐＰｐＴ４アルファ／ｒＥＫ発現構築物からのＤＮＡを配列番号８のＡＯＸ前向きプライマーおよび配列番号９のＰＵＣ逆向きプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅し、直鎖状の統合カセットを作出した。ＡＯＸ前向きプライマーのはじめの５つの塩基対はｐＰｐＴ４アルファ／ＥＫ  ＤＮＡ配列に同一でないＢｇｌＩＩ部位を含む。ＡＯＸ前向きプライマーはＡＯＸ１プロモーターの部分である領域の後ろに結合する。全長ＡＯＸ１遺伝子は直鎖状の統合カセット上に存在しないが、全長ＡＯＸ１遺伝子全体はピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）染色体との統合に際して再構築される。生ずる直鎖状発現構築物で、エレクトロポーレーション法を用いて適切なピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＭｕｔＳ株ＣＢＳ７４３５を形質転換した。形質転換混合物を１００μｇ／ｍＬ、２５０μｇ／ｍＬまたは５００μｇ／ｍＬのＺＥＯＣＩＮ（商標）を含む１．５％酵母、ペプトン、デキストロース、ソルビトール（ＹＰＤＳ）アガープレート（ｐＨ７．５）上に撒き、そして２８〜３０℃のインキュベーター内に１〜３日間入れる。５’ＡＯＸ１位置でｐＰｐＴ４アルファ／ＥＫ断片を統合した形質転換体の選択をＺＥＯＣＩＮ（商標）に対するコロニー耐性により決定する。６２個の組換えコロニーを異なる濃度のＺＥＯＣＩＮ（商標）を含むさまざまなＹＰＤＳプレートから選択し、そして１００μｇ／ｍＬ  ＺＥＯＣＩＮ（商標）を含む酵母、ペプトン、およびデキストロース（ＹＰＤ）培養液に接種した。単離された酵母細胞系は予想されたとおりＺＥＯＣＩＮ（商標）を含むＹＰＤ培養液中で生育し、その株がＺｅｏｃｉｎ耐性であり、そして統合ｐＰｐＴ４アルファ／ＥＫカセットを含むことを示した。単離された酵母細胞系を含むＹＰＤ培養物の一部を１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む１ｍＬ  ＹＰＤ培養液を有するバイアル中に入れて確立された酵母細胞系を作出し、そしてそのバイアルを−８０℃で貯蔵した。同様の方法を配列番号６のエンテロキナーゼ、配列番号４もしくは配列番号６のヌクレオチド変異形または配列番号４もしくは配列番号６の切断変異形を発現する酵母細胞系を作出するために使用する。
【００５２】
統合ｐＰｐＴ４アルファ／Ｅカセットの存在をさらに検証し、そして各単離された酵母細胞系中の相対的ＥＫ遺伝子コピー数を決定するために、６２個の単離された細胞系についてＰＣＲ分析を行った。上記に議論されるＹＰＤ培養物から１ｍＬ取り、それを溶解し、そして標準の手順を用いてゲノムＤＮＡを単離した。単離されたゲノムＤＮＡを配列番号１０のＥＫ前向きプライマーおよび配列番号１１のＥＫ逆向きプライマーを用いて２９サイクル、ＰＣＲ増幅し、ＥＫ遺伝子からの２５０塩基対生成物を作出した。増幅完了後、その反応混合物を０．１Ｋｂ〜１０Ｋｂサイズ２‐ｌｏｇＤＮＡラダーと並べてポリヌクレオチド染色を含む０．８％アガロースゲル上に溶解した。これらの実験から、試験された６１個の細胞系について、予想された２５０塩基対ＥＫ断片が作出されたことが確実となった。同じゲノムＤＮＡ調製物を用いて、株間の相対的コピー数を見積もるために１８サイクルのみ、ＰＣＲ増幅を繰り返した。比較的低レベルの変異が観察されたが、４つの細胞系は他に比較してより高い遺伝子コピー数を示した。
【００５３】
実施例３  エンテロキナーゼ活性の分析
発現されたエンテロキナーゼの存在、質および量について試験するために、統合ｐＰｐＴ４アルファ／ＥＫカセットを含む細胞系を液体比色エンテロキナーゼ（ＥＫ）分析、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット、およびＥＬＩＳＡを用いて分析した。統合ｐＰｐＴ４アルファ／ＥＫカセットからエンテロキナーゼの発現を誘導するために、各確立された酵母細胞系からの等分を１．３４％（ｗ／ｖ）酵母窒素ベース（ＹＮＢ）、２００ｍＭリン酸緩衝液、４×１０−５％（ｗ／ｖ）ビオチン、および１％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む１０ｍＬの定義された生育培養液を含む１００ｍＬバッフル付き振とうフラスコに接種するために使用した。接種したものを振とうインキュベーター（２５０ｒｐｍ）内で約２８〜３０℃で約６０〜６５時間生育させた。細胞を遠心分離（２２℃で３，０００×ｇ、５分間）により回収した。エンテロキナーゼ発現を誘導するために、その細胞ペレットを１．３４％（ｗ／ｖ）酵母窒素ベース（ＹＮＢ）、２００ｍＭリン酸緩衝液、４×１０−５％（ｗ／ｖ）ビオチン、および５％（ｖ／ｖ）メタノールを含む１ｍＬの第１誘導培養液中に再懸濁した。その細胞を振とうインキュベーター（２５０ｒｐｍ）内で約２８〜３０℃で約８〜１０時間培養した。その培養物を１００μＬのメタノールでチャージし、約１６〜１８時間培養し、そして追加の１００μＬのメタノールを２４時間毎にその培養液に添加し、最終的なチャージを誘導から約７２〜７４時間後に添加した。振とうフラスコサンプルから得られたデータを比較するために、基準株Ｂ１８（Ｈｉｓタグエンテロキナーゼを生成するピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＣＢＳ７４３５ＭｕｔＳｐＰｐＴ４アルファ／ＥＫ‐ＨＩＳ発現構築物）を統合株と並べて２つの振とうフラスコ中にセットした。
【００５４】
発現されたエンテロキナーゼの酵素活性を決定するために、サンプルを培養物誘導の過程中に取り、そして液体比色エンテロキナーゼ活性分析を用いてエンテロキナーゼ活性について分析した。誘導後０時間、２４時間、４８時間、７２時間および９６時間に、培養液の試験用部分を上記に示される酵母培養物から取った。試験用部分を管に添加し、そして１４，０００ｒｐｍで２回遠心分離し、確実に細胞を除去した。調製培養液サンプルの一部をその後５，５’ジチオ‐ビス（２‐ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）の存在下で１ｍＭの比色ペプチド基質Ｎ‐カルボベンジルオキシ‐Ｌｙｓ‐チオベンジルエステル（Ｚ‐Ｌｙｓ‐ＳＢＺＬ；  Ｂａｃｈｅｍ，ＡＧ，Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ，ＣＨ）を含む反応混合物に添加した。切断反応は無色〜黄色の変化を開始させ、そして開始速度を４０５ｎｍの吸収、速度論モードで、プレートリーダー上で計測した。サンプル希釈が分析の直線状の範囲内（０〜１００ｍＯＤ／分）であることを確実にするように、酵素濃度を調節した。サンプルをネガティブおよびポジティブコントロールと並べて三重で分析した。
【００５５】
全ての株のエンテロキナーゼ活性分析結果に続いて、液体比色エンテロキナーゼ活性分析を、ＹＣＬ‐４８、ＹＣＬ‐４９、ＹＣＬ‐９８、ＹＣＬ‐９９と呼ばれる最も高いエンテロキナーゼ活性を有する４つの確立された酵母細胞系、およびＹＣＬ‐４０およびＹＣＬ‐８８と呼ばれる最も低いエンテロキナーゼ活性を有する２つの細胞系を用いて繰り返した。全てのサンプルを１バッチの基質を用いて三重で分析した。図Ｘは誘導後の時間に対する各酵母細胞系についての平均エンテロキナーゼ活性を示す。エラーバーは三重の振とうフラスコ値間の９５％信頼区間を示す。このデータから、ＹＣＬ‐４９は最も高いエンテロキナーゼ活性を有し、そしてＹＣＬ‐８８は最も低い活性を有した。
【００５６】
発現されたエンテロキナーゼの同一性および質を決定するために、ＹＣＬ‐４０、ＹＣＬ‐４８、ＹＣＬ‐４９、ＹＣＬ‐８８、ＹＣＬ‐９８およびＹＣＬ‐９９の誘導後９６〜９８時間時点からのサンプルを取り、そしてＳＤＳ‐ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析を用いて分析した。サンプルを２×ＳＤＳサンプル緩衝液に添加し、そして変性、還元条件下で１０〜２０％  Ｂｉｓ‐Ｔｒｉｓプレキャストポリアクリルアミドゲル（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いたＭＯＰＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離した。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ分析のために、ゲルをクマシーブリリアントブルーで染色し、タンパク質バンドパターンを染め出した。ウェスタンブロット分析のために、上記のように分離されたポリペプチドをニトロセルロースに移し、そしてポリクローナルアルファ‐エンテロキナーゼ抗体で染色した。エンテロキナーゼポリペプチドは約３８ｋＤａの単一のバンドとしてＳＤＳ‐ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット上で明らかに見えた。電気泳動での移動は、そのエンテロキナーゼが翻訳後修飾を受けたことを示す。さらに、検出可能な偽のバンドがないことから、統合ｐＰｐＴ４アルファ／ＥＫカセットを含む酵母細胞系の発現されたエンテロキナーゼの質が高いことが示された。
【００５７】
発現されたエンテロキナーゼの濃度を決定するために、ＹＣＬ‐４９、ＹＣＬ‐８８、およびＹＣＬ‐９８の誘導後９６〜９８時間時点からのサンプルを取り、そしてサンドウィッチ酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）を用いて分析した。１連の希釈物を試験サンプルから調製し、そして市販の組換えエンテロキナーゼ標準（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ‐Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から定義された濃度を並べて三重で分析した。市販の標準の希釈シリーズから作出された標準曲線からＹＣＬ‐４９およびＹＣＬ‐８８サンプルの定量が可能となった。ＥＬＩＳＡ結果を振とうフラスコでの生育および統合株の発現後に得られた培養液サンプル全体の上清中に存在するＥＫ物質のレベルを計測するために使用した（表３）。
【表３】
0005425350.tif 000008
【００５８】
上記に示される分析は、いくつかの確立された酵母細胞系が統合ｐＰｐＴ４アルファ／ＥＫカセットから高品質の酵素的に活性なエンテロキナーゼを発現したことを示した。
【００５９】
実施例４  ｐＰＩＣＺ  Ａ／ＥＫ‐ｍｙｃ‐Ｈｉｓの構築および発現
本明細書中に開示されるようにＥＫをコードするポリヌクレオチド分子を含む酵母発現構築物を構築するために、機能的に連結された核酸分子をｐＰＩＣ  Ａベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングするために好適な制限酵素エンドヌクレアーゼ部位を標準のＤＮＡ合成手順を用いて配列番号４の５’‐および３’末端に導入した。この構築物を１）エンテロキナーゼをコードする配列番号４を切り出す、および２）この挿入物がｐＰＩＣ  Ａベクターに機能的に連結されることを可能にする制限酵素で消化する。この挿入物をＴ４  ＤＮＡリガーゼ手順を用いてｐＰＩＣ  Ａ／ＢｏＮＴ／Ｅ‐ｍｙｃ‐Ｈｉｓを作出するのに適切な制限酵素エンドヌクレアーゼで消化されたｐＰＩＣ  Ａベクター内にサブクローニングする。ヒートショック法を用いてそのライゲーション混合物で化学的コンピテント大腸菌ＤＨ５アルファ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を形質転換し、２５μｇ／ｍＬのＺＥＯＣＩＮ（商標）を含む１．５％低塩Ｌｕｒｉａ‐Ｂｅｒｔａｎｉアガープレート（ｐＨ７．５）上に撒き、そして３７℃のインキュベーター内に入れ一晩生育させる。発現構築物を含む細菌はＺＥＯＣＩＮ（商標）耐性コロニーとして同定される。候補構築物を、アルカリ溶解プラスミドミニプレップ手順を用いて単離し、そして制限酵素エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析し、その挿入物の存在および向きを決定する。このクローニング法はカルボキシ末端ｃ−ｍｙｃおよびポリヒスチジン結合ペプチドに機能的に連結されたエンテロキナーゼをコードする酵母発現構築物を作出する。同様の方法を配列番号６、配列番号４もしくは配列番号６のヌクレオチド変異形または配列番号４もしくは配列番号６の切断変異形を含むｐＰＩＣ  Ａ／ＥＫ発現構築物を作出するために使用する。
【００６０】
エンテロキナーゼを発現する酵母細胞系を構築するために、ｐＰＩＣＺ  Ａ／ＥＫ‐ｍｙｃ‐Ｈｉｓを好適な制限酵素エンドヌクレアーゼ（すなわち、ＳａｃＩ、ＰｍｅＩまたはＢｓｔＸＩで消化し、そして生じる直鎖状発現構築物でエレクトロポーレーション法を用いて適切なピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＭｕｔＳ株ＫＭ７１Ｈを形質転換する。形質転換混合物を１００μｇ／ｍＬのＺＥＯＣＩＮ（商標）を含む１．５％  ＹＰＤＳアガープレート（ｐＨ７．５）上に撒き、そして２８〜３０℃のインキュベーター内に入れ、１〜３日間生育させた。５’ＡＯＸ１位置にｐＰＩＣＺ  Ａ／ＥＫ‐ｍｙｃ‐Ｈｉｓを統合する形質転換体の選択はＺＥＯＣＩＮ（商標）に対するコロニー耐性により決定する。ｐＰＩＣＺ  Ａ／ＥＫ‐ｍｙｃ‐Ｈｉｓ構築物を統合する細胞系はその後エンテロキナーゼ発現について試験される。統合ｐＰＩＣＺ  Ａ／ＥＫ‐ｍｙｃ‐Ｈｉｓを有する試験細胞系から単離されたコロニーを１００ｍＬのＭＧＹＨ培養液を含む１．０Ｌバッフル付きフラスコを接種するために使用し、そして振とうインキュベーター（２５０ｒｐｍ）内で約２８〜３０℃で、その培養物がＯＤ６００＝２〜６に達するまで（約１６〜１８時間）生育させる。細胞を遠心分離（２２℃で３，０００×ｇ、５分間）により回収する。発現を誘導するために、その細胞ペレットを１５ｍＬのＭＭＨ培養液中に再懸濁し、そして１００％メタノールを終濃度０．５％になるように添加する。培養物を振とうインキュベーター（２５０ｒｐｍ）内で約２８〜３０℃で６日間生育させる。追加の１００％メタノールを２４時間毎に終濃度０．５％になるようにその培養物に添加する。０時間時点で始まり１４４時間時点で終わるように２４時間毎に１．０ｍＬの試験用部分をその培養物から取る。細胞をその細胞をペレットにするための微量遠心分離によりその部分から回収し、そして−８０℃で５分間、その後３７℃で５分間からなる３回の凍結融解ラウンドを用いて溶解する。溶解サンプルを２×ＳＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に添加し、そして確立された細胞系からの発現をＳＤＳ‐ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析により計測する（実施例３中に示されるように）。エンテロキナーゼの最も高い発現レベルを示すピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＭｕｔＳ  ＫＭ７１Ｈ細胞系を市販の発酵手順を用いたラージスケール発現に選択する。ラージスケール発現の手順は、その培養体積が５Ｌ  ＢｉｏＦｌｏ３０００発酵槽内で生育される約２．５Ｌ  ＭＧＹＨ培養液であることおよび全ての試薬の濃度がこの体積に比例して増加されるであろうことを除いては、上記に概略されるとおりである。この実施例中に示される全ての手順についてのより詳細については、ＥａｓｙＳｅｌｅｃｔ（商標）ピキア発現キット、バージョンＧ、Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｕｓｉｎｇ  ｐＰＩＣＺ  ａｎｄ  ｐＰＩＣＺα  ｉｎ  Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ，１２２７０１，２５‐０１７２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃ��）を参照のこと。同様の方法を配列番号６、配列番号４もしくは配列番号６のヌクレオチド変異形または配列番号４もしくは配列番号６の切断変異形のエンテロキナーゼを発現する酵母細胞系を作出するために使用する。
【００６１】
実施例５  ｐＭＥＴ／ＥＫ‐Ｖ５‐Ｈｉｓの構築および発現
本明細書中に開示されるようにＥＫをコードするポリヌクレオチド分子を含む酵母発現構築物を構築するために、機能的に連結された核酸分子をｐＭＥＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）にクローニングするために好適な制限酵素エンドヌクレアーゼ部位を標準のＤＮＡ合成手順を用いて配列番号４の５’および３’末端に導入する。この構築物を、１）エンテロキナーゼをコードする配列番号４を切り出す、２）この挿入物がｐＭＥＴベクターに機能的に連結されることを可能にする、制限酵素で消化する。この挿入物をＴ４  ＤＮＡリガーゼ手順を用いて適切な制限酵素エンドヌクレアーゼで消化されたｐＭＥＴベクター内にサブクローニングし、ｐＭＥＴ／ＢｏＮＴ／Ｅ‐Ｖ５‐Ｈｉｓを作出する（図９）。ヒートショック法を用いてそのライゲーション混合物で化学的コンピテント大腸菌ＤＨ５アルファ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含む１．５％低塩Ｌｕｒｉａ‐Ｂｅｒｔａｎｉアガープレート（ｐＨ７．５）上に撒き、そして３７℃のインキュベーター内に入れ、一晩生育させる。発現構築物を含む細菌をアンピシリン耐性コロニーとして同定する。候補構築物を、アルカリ溶解プラスミドミニプレップ手順を用いて単離し、そして制限酵素エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析し、その挿入物の存在および向きを決定する。このクローニング法はカルボキシ末端Ｖ５に機能的に連結されたエンテロキナーゼおよびポリヒスチジン結合ペプチドをコードする酵母発現構築物を作出する。同様の方法を配列番号６、配列番号４もしくは配列番号６のヌクレオチド変異形または配列番号４もしくは配列番号６の切断変異形を含むｐＭＥＴ／ＥＫ発現構築物を作出するために使用する。
【００６２】
エンテロキナーゼを発現する酵母細胞系を構築するために、ｐＭＥＴ／ＢｏＮＴ／Ｅ‐Ｖ５‐Ｈｉｓを好適な制限酵素エンドヌクレアーゼ（すなわち、ＡｐａＩ、ＡｓｃＩ、ＦｓｅＩ、ＰａｃＩ、ＫｐｎＩまたはＰｓｔＩ）で消化し、そして生ずる直鎖状発現構築物でエレクトロポーレーション法を用いて適切なピキア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）ＭｕｔＳ株ＰＭＡＤ１６を形質転換する。その形質転換混合物を、アデニンを欠く１．５％ＭＤアガープレート（ｐＨ７．５）上に撒き、そして２８〜３０℃のインキュベーター内で３〜４日間生育させる。ｐＭＥＴ／ＥＫ‐Ｖ５‐Ｈｉｓを統合した形質転換体の選択はアデニン欠損培地上でのコロニーの生育により決定される。ｐＭＥＴ／ＥＫ‐Ｖ５‐Ｈｉｓ構築物を統合したＡｄｅ＋細胞系を、スモールスケール発現試験を用いてエンテロキナーゼ発現について試験する。統合ｐＭＥＴ／ＥＫ‐Ｖ５‐Ｈｉｓを有する試験細胞系から単離されたＡｄｅ＋コロニーを１５ｍＬのＢＭＤＹ培養液に接種するために使用し、そして細胞を振とうインキュベーター（２５０ｒｐｍ）内で約２８〜３０℃で、その培養物がＯＤ６００＝２〜１０に達するまで（約１６〜１８時間）生育させる。細胞を遠心分離（２２℃で１，５００×ｇ、５分間）により回収する。発現を誘導するために、細胞ペレットを５ｍＬのＢＭＭＹ培養液中に再懸濁し、そして培養物を振とうインキュベーター（２５０ｒｐｍ）内で約２８〜３０℃で生育させる。２４時間後、一部５００μＬを取り、メタノールを終濃度０．５％になるように添加し、そしてその培養物を振とうインキュベーター（２５０ｒｐｍ）内で約２８〜３０℃で生育させる。一部５００μＬを取り、そして追加のメタノールをその培養物に２４時間毎に３〜５日間、終濃度０．５％になるように添加する。回収された細胞を遠心分離（４℃で１，５００×ｇ、５分間）し、水中で１回洗浄し、そして細胞ペレットを必要になるまで−８０℃で貯蔵する。誘導されたエンテロキナーゼの発現を検出するために、各時点の細胞ペレットを、酸洗浄ガラスビーズ法を用いて溶解する。溶解サンプルを２×ＳＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に添加し、そして確立された細胞系からの発現をＳＤＳ‐ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析により計測する（実施例３中に示されるように）。エンテロキナーゼの最も高い発現レベルを示すピキア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）ＭｕｔＳＰＭＡＤ１６細胞系を市販の発酵槽手順を用いたラージスケール発現に選択する。ラージスケール発現の手順は、その培養体積が５Ｌ  ＢｉｏＦｌｏ３０００発酵槽中で生育される約２．５Ｌ  ＢＭＤＹ／ＢＭＭＹ培養液であることおよび全ての試薬の濃度がこの体積に比例して増加されるであろうことを除いては、上記に概略されるとおりである。この実施例中に示される全ての手順についてのより詳細については、ピキア・メタノリカ（Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）発現キット、バージョンＣ、Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ，０６２１０１，２５‐０２８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を参照のこと。同様の方法を配列番号６、配列番号４もしくは配列番号６のヌクレオチド変異形または配列番号４もしくは配列番号６の切断変異形のエンテロキナーゼを発現する酵母細胞系を作出するために使用する。
【００６３】
実施例６  ｐＹＥＳ２／ＥＫ‐Ｖ５‐Ｈｉｓの構築および発現
本明細書中に開示されるようにＥＫをコードするポリヌクレオチド分子を含む酵母発現構築物を構築するために、機能的に連結された核酸分子をｐＹＥＳ２ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）内にクローニングするために好適な制限酵素エンドヌクレアーゼ部位を標準のＤＮＡ合成手順を用いて配列番号４の５’および３’末端に導入する。この構築物を、１）エンテロキナーゼをコードする配列番号４を切り出す、および２）この挿入物がｐＹＥＳ２ベクターに機能的に連結されることを可能にする、制限酵素で消化する。この挿入物をＴ４  ＤＮＡリガーゼ手順を用いて適切な制限酵素エンドヌクレアーゼで消化されたｐＹＥＳ２ベクター内にサブクローニングし、ｐＹＥＳ２／ＥＫ‐Ｖ５‐Ｈｉｓを作出する（図１０）。ヒートショック法を用いてそのライゲーション混合物で化学的コンピテント大腸菌ＤＨ５アルファ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含む１．５％低塩Ｌｕｒｉａ‐Ｂｅｒｔａｎｉアガープレート（ｐＨ７．５）上に撒き、そして３７℃のインキュベーター内に入れ、一晩生育させる。発現構築物を含む細菌をアンピシリン耐性コロニーとして同定する。候補構築物を、アルカリ溶解プラスミドミニプレップ手順を用いて単離し、そして制限酵素エンドヌクレアーゼ消化マッピングにより分析し、その挿入物の存在および向きを決定する。このクローニング法はカルボキシ末端Ｖ５に機能的に連結されたエンテロキナーゼおよびポリヒスチジン結合ペプチドをコードする酵母発現構築物を作出する。同様の方法を配列番号６、配列番号４もしくは配列番号６のヌクレオチド変異形または配列番号４もしくは配列番号６の切断変異形を含むｐＹＥＳ２／ＥＫ発現構築物を作出するために使用する。
【００６４】
エンテロキナーゼを発現する酵母細胞系を構築するために、リチウムベースの形質転換法を用いてｐＹＥＳ２／ＥＫ‐Ｖ５‐Ｈｉｓでコンピテント出芽酵母株ＩＮＶＳｃ１を形質転換する。その形質転換混合物を、０．０１％ウラシルを有するまたはウラシルを欠く２％グルコースを含む２％ＳＣ最低限培地アガープレート（ｐＨ７．５）上に撒き、そして２８〜３０℃のインキュベーター内に入れ、１〜３日間生育させる。ｐＹＥＳ２／ＥＫ‐Ｖ５‐Ｈｉｓを含む形質転換体の選択はウラシルを含むプレート上でのみのコロニーの生育により決定される。ｐＹＥＳ２／ＥＫ‐Ｖ５‐Ｈｉｓ構築物を含む細胞を、スモールスケール発現試験を用いてエンテロキナーゼ発現について試験する。ｐＹＥＳ２／ＥＫ‐Ｖ５‐Ｈｉｓを含む試験細胞から単離されたコロニーを２％グルコースおよび０．０１％ウラシルを含む１５ｍＬのＳＣ培養液を含む５０ｍＬ管に接種するために使用し、そして振とうインキュベーター（２５０ｒｐｍ）内で約２８〜３０℃で一晩生育させる。一晩の培養物のＯＤ６００を決定し、そして５０ｍＬ体積中０．４のＯＤ６００の細胞濃度を得るよう等分する。これらの部分を遠心分離（２２℃で１，５００×ｇ、５分間）し、そして生ずる細胞ペレットを２０％ガラクトースおよび１０％ラフィノースを含むＳＣ培養液中に再懸濁する。細胞を振とうインキュベーター（２５０ｒｐｍ）内で約２８〜３０℃で生育させ、そして５ｍＬ部分を０時間、４時間、８時間、１２時間、１６時間および２４時間で取り、そしてＯＤ６００濃度を各サンプルについて決定する。回収された細胞を遠心分離（４℃で１，５００×ｇ、５分間）し、水中で１回洗浄し、そして細胞ペレットを必要になるまで−８０℃で貯蔵する。誘導されたＢｏＮＴ／Ｅ‐Ｖ５‐Ｈｉｓの発現を検出するために、各時点の細胞ペレットを、酸洗浄ガラスビーズ法を用いて溶解する。溶解サンプルを２×ＳＤＳサンプル緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に添加し、そして確立された細胞系からの発現をＳＤＳ‐ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット分析により計測する（実施例３中に示されるように）。エンテロキナーゼの最も高い発現レベルをもたらす誘導条件は市販の発酵槽手順を用いたラージスケール発現に選択される。ラージスケール発現の手順は、その培養体積が５Ｌ  ＢｉｏＦｌｏ３０００発酵槽内で生育される約２．５Ｌ  ＳＣ培養液であることおよび全ての試薬の濃度はこの体積に比例して増加されるであろうことを除いては上記に概略されるとおりである。この実施例中に示される全ての手順についてのより詳細については、ｐＹＥＳ２／ＣＴ，ｐＹＥＳ３／ＣＴ，ａｎｄ  ｐＹＣ２／ＣＴ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  Ｃ‐ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｔａｇｓ  ａｎｄ  Ａｕｘｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｍａｒｋｅｒｓ，ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｅ，２５‐０３０４，２００３年１月２７日（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を参照のこと。同様の方法を配列番号６、配列番号４もしくは配列番号６のヌクレオチド変異形または配列番号４もしくは配列番号６の切断変異形のエンテロキナーゼを発現する酵母細胞系を作出するために使��する。
【００６５】
終わりに、本明細書の態様は特定の実施形態を参照することにより強調されるが、当業者はこれらの開示された実施形態は本明細書中に開示される主題の原理の例示のみであることを容易に理解するであろう。それゆえ、開示された主題は本明細書中に示される特定の方法、プロトコル、および／または試薬等に限定されることはないことが理解されるべきである。そのように、開示された主題に対するさまざまな改変もしくは変化または開示された主題の代替の配置は本明細書の精神から離れることなく本明細書中の教示に従ってなされ得る。最後に、本明細書中で使用される技術は特定の実施形態を示す目的のためのみであり、そして本発明の範囲を限定するとは意図されず、本発明の範囲は請求項によってのみ定義される。したがって、本発明は表示されおよび説明されるように正確なものに限定されない。
【００６６】
本発明者に知られる本発明を実施するのに最も良いモードを含む、本発明のある実施形態が本明細書中に示される。もちろん、これらの示される実施形態についての変形は上記の説明を読めば当業者に明らかになるであろう。本発明者は、当業者が適切なようにそのような変形を使用することを予想し、そして本発明者は本発明が本明細書中に特に示されるものとは異なって実施されることを意図する。したがって、本発明は適用可能な法により許可されるように、付属の請求項中に列挙される主題の全ての改変および相当物を含む。さらに、上記に示される実施形態のそれらの全ての可能な変形でのどんな組み合わせも、包含されないことが本明細書中に示されない限りまたは包含されることが文脈により明らかに否定されない場合、本発明により包含される。
【００６７】
本発明に係る代替の実施形態、要素またはステップのグループ化は限定として解釈されるべきでない。各グループの構成要素は個々にまたは本明細書中に開示される他のグループ構成要素との組み合わせでも参照され、および請求され得る。あるグループの１以上の構成要素は利便性および／または特許性の理由のためにグループに含まれまたはグループから消去され得ることが予想される。そのような包含または消去が起こるとき、本明細書は改変され、したがって付属の請求項中で使用される全てのマーカッシュグループの記述を満たすように、そのグループを含むと考えられる。
【００６８】
別段の定めなき限り、本明細書および請求項中で使用される特徴、項目、量、パラメーター、特性、用語等を表現する全ての数字は用語「約」により全ての場合に改変されると理解されるべきである。本明細書中で使用されるとき、用語「約」は、そのように限定された特徴、項目、量、パラメーター、特性または用語が示された特徴、項目、量、パラメーター、特性または用語の値の±１０％超および未満の範囲を含むことを意味する。したがって、逆のように示されない限り、本明細書および付属の請求項中に設定される数字パラメーターは変化し得る概数である。少なくとも、そして請求項の範囲の相当物の原則の適用を制限する意図としてではなく、各数字表示は少なくとも報告された顕著なディジットの数字に照らしておよび通常の端数の切り捨て技術を適用することにより解釈されるべきである。本発明の広い範囲に設定される数字範囲および値は概数であるにもかかわらず、特定の実施例中に設定される数字範囲および値は可能な限り正確に報告されている。しかしながら、数字範囲または値はそれらの各試験計測中に見られる標準偏差から必然的に生ずるある誤差を固有に含む。本明細書中の値の数字範囲の詳述は単にその範囲に入る各別々の数値に個々に言及する略記法としてはたらくと意図される。本明細書中に別段の定めなき限り、数字範囲の各個々の値はそれが本明細書中で個々に列挙されるかのように本明細書中に援用される。
【００６９】
本発明を示す文脈中で（特に以下の請求項の文脈中で）使用される用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および同様の指示物は、本明細書中に別段の定めなき限りまたは文脈により明らかに否定されない限り、単数および複数の両方を含むと解釈されるべきである。本明細書中に示される全ての方法は本明細書中に別段の定めなき限りまたは文脈により明らかに別段のように否定されない限り、どんな好適な順序でも行われ得る。本明細書中に提供されるいずれのおよび全ての実施例または例示的な言語（例えば「〜の如き」）の使用は単に本発明をよりよく照らすことが意図され、そして別段のように請求される本発明の範囲の限定を提示しない。本明細書中のいかなる言語も本発明の実施に本質的な非請求要素を示すと解釈されるべきである。
【００７０】
本明細書中に開示される特定の実施形態は言語からなることまたは本質的に言語からなることを用いた請求項中にさらに限定され得る。請求項中で使用されるとき、出願されまたは修正毎に追加されるとき、遷移用語「〜からなる」は請求項中で特定されない要素、ステップまたは成分を排除する。遷移用語「本質的に〜からなる」は請求の範囲を特定の物質またはステップならびに基本的なおよび新規特徴（単数または複数）に実質的に影響しない物質またはステップに限定する。そのように請求される本発明の実施形態は本明細書中で固有にまたは特に示され、および可能にされる。
【００７１】
本明細書中に引用され、同定される全ての特許、特許公開公報、および他の出版物は例えば、本発明に関連して使用され得るそのような出版物中に示される組成物および方法を示すおよび開示する目的のために、個々にかつ明示的にその全体が援用される。これらの出版物は、本出願の出願日前の開示であるために提供されているに過ぎない。この点におけるいずれも、本発明者が先行発明によってまたは他の理由のためにそのような開示に先行する権利を有さないという容認として解釈されるべきでない。日付についての全ての主張またはこれらの書類の内容についての提示は本出願者に入手可能な情報に基づき、これらの書類の日付または内容の正確さについて何ら容認するものではない。
【図１】
0005425350.tif 000009
【配列表】
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