(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の汚染物質の量または活性を減少させるための処理プロセスを検証する方法であって、
ａ）汚染物質を含むか、または含む疑いのある試料を得る工程；
ｂ）該試料を、生物学的プロセスインジケータの規定量の存在下で処理プロセスに供する工程であって、該生物学的プロセスインジケータが、生物学的成分と共有結合した熱安定性キナーゼを含む、工程；
ｃ）残余キナーゼ活性を測定し、そして必要に応じて、キナーゼ活性の減少を算定する工程；および
ｄ）該残余キナーゼ活性を所定のキナーゼ活性と比較するか、または該キナーゼ活性の減少をキナーゼ活性の所定の減少と比較する工程であって、該所定のキナーゼ活性またはキナーゼ活性の所定の減少が、同じ条件下での該汚染物質の量または活性の確認された減少に相当する、工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記キナーゼ活性の所定の減少が、少なくとも３対数減少、または少なくとも６対数減少、または少なくとも７対数減少、または少なくとも８対数減少である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記汚染物質の量または活性の確認された減少が、少なくとも３対数減少、または少なくとも６対数減少、または少なくとも７対数減少、または少なくとも８対数減少である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記試料を処理する前および前記試料を処理した後に、キナーゼ活性を測定する工程を含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記キナーゼの残余活性を測定する前に、前記試料を８０℃にて少なくとも１０分間処理する工程を含む、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記キナーゼの残余活性を測定する工程が、ＡＤＰを含む基質を前記残余キナーゼに添加する工程、およびＡＴＰの形成を測定する工程を含む、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記残余キナーゼ活性または前記キナーゼ活性の減少が、少なくとも３対数、または少なくとも６対数、または少なくとも７対数、または少なくとも８対数の前記汚染物質の量または活性の確認された減少に相当するまで、前記処理を続ける工程を含む、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
工程（ｃ）で得られるデータを適切なデータキャリア上に記録する工程をさらに含む、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
試料中の汚染物質の量または活性を減少させるための処理プロセスを検証するための生物学的プロセスインジケータとしての、生物学的成分と共有結合した熱安定性キナーゼの使用。
【請求項１０】
試料中の汚染物質の量または活性が減少される処理プロセスを検証するための生物学的プロセスインジケータであって、該インジケータが、生物学的成分に共有結合した熱安定性キナーゼを含み、該生物学的成分が、血液タンパク質、真菌タンパク質、自己凝集タンパク質、細菌線毛タンパク質、細菌毒素タンパク質、細菌胞子タンパク質、ウイルスコアタンパク質、核酸、脂質および糖質からからなる群より選択され、但し、該生物学的成分が抗体でない、生物学的プロセスインジケータ。
【請求項１１】
前記血液タンパク質が、血液凝固タンパク質、血清タンパク質、血小板タンパク質、血球糖タンパク質、およびヘモグロビンからなる群より選択される、請求項１０に記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項１２】
前記血液凝固タンパク質が、フィブリン、フィブリノーゲン、およびトランスグルタミナーゼ基質からなる群より選択される、請求項１１に記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項１３】
前記ウイルスタンパク質が、バクテリオファージウイルス、ノーウォークウイルス、ロタウイルス、コロナウイルス、青舌病ウイルス、ヒトパピローマウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ポリオウイルス、ＨＩＶウイルス、およびテング熱Ｂウイルス由来である、請求項１０に記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項１４】
前記真菌タンパク質が、ハイドロフォビンタンパク質、真菌胞子タンパク質、菌糸タンパク質、マイコトキシン、および真菌プリオンからなる群より選択される、請求項１０に記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項１５】
前記自己凝集タンパク質が、プリオン、プリオン様タンパク質、アミロイド原線維、活性汚泥中のフロック形成および糸状性細菌由来の細胞表面付着因子、ベータアミロイドタンパク質、タウタンパク質、ポリアデニン結合タンパク質、単純疱疹ウイルス糖タンパク質Ｂ、肺サーファクタントタンパク質Ｃ、細菌線毛タンパク質、アポリポタンパク質、ハイドロフォビン、チャップリン、ロドリン、グラム陽性芽胞殻タンパク質、およびフジツボセメント様タンパク質からなる群より選択される、請求項１０に記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項１６】
前記核酸が、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子より選択される、請求項１０に記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項１７】
前記糖質が、エキソ多糖類、リポ多糖類、ペプチドグリカン、キチン、グルカン、リグニン、ムチン、糖脂質、糖タンパク質、胞子抽出物、酵母被膜由来の多糖類、および無脊椎動物分泌物からなる群より選択される、請求項１０に記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項１８】
前記脂質が、糖脂質およびガングリオシドからなる群より選択される、請求項１０に記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項１９】
前記生物学的成分がオリゴヌクレオチドでない、請求項１０に記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項２０】
前記インジケータが、生物学的マトリックスの一部である、請求項１０から１９のいずれかに記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項２１】
前記生物学的マトリックスが、前記試料の模倣物である、請求項２０に記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項２２】
前記生物学的マトリックスが、血液、血清、アルブミン、粘液、卵、神経組織、食物、動物廃棄物、および市販の試験用汚れからなる群より選択される１つ以上の成分を含む、請求項２０または２１に記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項２３】
前記汚染物質が、タンパク質、核酸、脂質、および糖質からなる群より選択される、請求項１０から２２のいずれかに記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項２４】
前記熱安定性キナーゼが、アデニル酸キナーゼ、酢酸キナーゼまたはピルビン酸キナーゼである、請求項１０から２３のいずれかに記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項２５】
前記インジケータが、前記キナーゼを安定化する薬剤をさらに含む、請求項１０から２４のいずれかに記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項２６】
前記安定化剤が、金属イオン、糖、糖アルコール、およびゲル形成剤からなる群より選択される、請求項２５に記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項２７】
前記生物学的成分および前記キナーゼが、融合タンパク質の形で相互に連結されている、請求項１０から２６のいずれかに記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項２８】
前記生物学的プロセスインジケータが、固体支持体中または上に固定化されている、請求項１０から２７のいずれかに記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項２９】
前記生物学的プロセスインジケータが、化学的架橋または吸着によって前記固体支持体中または上に固定化されている、請求項２８に記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項３０】
前記固体支持体が、インジケータストリップ、ディップスティック、またはビーズである、請求項２８または２９に記載の生物学的プロセスインジケータ。
【請求項３１】
試料中の汚染物質の量または活性が減少される処理プロセスの検証に用いるためのキットであって、
（ａ）請求項１０から３０のいずれかに記載の生物学的プロセスインジケータ、および
（ｂ）熱安定性キナーゼのための基質
を含む、キット。
【請求項３２】
前記熱安定性キナーゼのための基質がＡＤＰである、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
ルシフェリン／ルシフェラーゼをさらに含む、請求項３１または３２に記載のキット。
【請求項３４】
前記インジケータの前記キナーゼ活性を前記汚染物質の量または活性と相関させる照合表をさらに含む、請求項３１から３３のいずれかに記載のキット。
【請求項３５】
工程（ｂ）の前記生物学的プロセスインジケータが、請求項１０から３０のいずれかに記載の生物学的プロセスインジケータである、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
試料中の汚染物質の量または活性を減少させるための処理プロセスを検証するための、請求項１０から３０のいずれかに記載の生物学的プロセスインジケータの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学的インジケータの分野に関し、特に、試料中の汚染物質の量または活性を減少させるように設計された処理プロセスの検証のための生物学的インジケータに関する。本発明はさらに、これらのインジケータを調製する方法およびそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
洗浄プロセスおよび汚染除去プロセスの検証のために、広範な種々の生物学的インジケータが知られている。これらは、比較的基本的なインジケータ（例えば、プロセスが有効であったかを評価するのに単純な「可視スコア」を用いるもの）から、レポーター酵素として熱安定性キナーゼに依存するより精巧なインジケータ（ＷＯ２００５／０９３０８５）までに及ぶ。これらのキナーゼベースのインジケータは、生物学的インジケータ分野において重要な開発であり、プロセスの検証の迅速かつ高感度の手段を提供する。
【０００３】
ＷＯ２００５／０９３０８５は、上記のキナーゼベースのインジケータの製造および使用を詳述している。要約すると、代表的なインジケータを、固体支持体（例えば、インジケータストリップまたはディップスティック）上に熱安定性キナーゼを吸着させることにより調製する。次いで、このインジケータを、処理する試料（汚染物質を含む）と共に入れ、このインジケータと試料とを処理プロセスに供する。次いで、処理によるインジケータキナーゼの活性の減少を、汚染物質の量または活性の減少と相関させる。活性のレベルが、汚染物質における受容可能な減少と相関すると分かるものであると決められたとき、この処理を有効とみなす。
【０００４】
これらのキナーゼベースのインジケータの性能は、汚染物質の模倣物／代理物である生物学的成分への熱安定性キナーゼの共有結合架橋によって有意に向上し得ることが見出されている。これにより、インジケータは、処理プロセスへの汚染物質の反応をより正確に反映することができ、その結果、インジケータの精度／感度の向上に至り、したがって、プロセス検証の「誤り」が少なくなる。
【０００５】
生物学的成分が生物学的マトリックスまたは混合物（例えば、市販の試験用汚れ（test soil）（ブラウン汚れ（Browne soil）、エジンバラ汚れ（Edinburgh soil）など）、血液、神経組織、食物、動物廃棄物、血清、卵、粘液、または使用者の特定の要件を満たすように構成した試験用汚れ）の一部であり得ることが有利である。このようにすれば、キナーゼの量／活性の減少は、マトリックスの多様な特性の一機能となり、これは、インジケータの精度／感度をさらに向上させる。
【０００６】
このタイプのインジケータはまた、マトリックスまたは混合物の特定成分の除去／不活性化のモニタリングもできる。熱安定性キナーゼが、マトリックスの除去／不活性化するのに最も「難しい」成分（例えば、血液のマトリックス中、フィブリンが、ヘモグロビンよりも除去するのがずっと難しい）に連結されるように設計し得ることが有利である。このことは、処理プロセスの非常に厳格な検証を提供する。
【０００７】
上記のインジケータは、迅速な一工程のプロセス検証を提供するという利点もまた有する。これは、検証のために複数の工程を必要とし、このため時間および労力のずっと多い投資を必要とする公知の特定検証インジケータとは対照的である。例として、ＷＯ００／６５３４４は、プリオン汚染除去プロセスのための生物学的インジケータとしての酵母プリオンの使用を記載している。このプロセスの最後に、操作者は、さらなる工程において、プロセスを検証するために、酵母プリオンの破壊を評価しなければならない。対照的に、上記のインジケータは、関連する汚染物質（例えば、プリオン）を模倣する生物学的インジケータに対して直接連結されたインジケータキナーゼを有するように設計され、これにより、この成分の破壊が、キナーゼ活性の喪失に密接に関連している。このように、これらのインジケータは、プロセスの有効性の迅速な一工程の指示を提供できる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明は、代替となる／改善されたキナーゼベースの生物学的インジケータを提供するという問題に取り組んでいる。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第一の局面では、試料中の汚染物質の量または活性が減少される処理プロセスを検証するための生物学的プロセスインジケータであって、該インジケータが、生物学的成分に共有結合した熱安定性キナーゼを含み、但し、該生物学的成分が抗体でない、生物学的プロセスインジケータが提供される。
【００１０】
本発明の第二の局面では、試料中の汚染物質の量または活性が減少される処理プロセスの検証に用いるためのキットが提供され、このキットは、
（ｉ）本発明の第一の局面による生物学的プロセスインジケータ、および
（ii）熱安定性キナーゼのための基質
を含む。
【００１１】
第三の局面では、本発明は、試料中の汚染物質の量または活性を減少させるための処理プロセスを検証するための生物学的プロセスインジケータとして、生物学的成分と共有結合した熱安定性キナーゼの使用を提供する。
【００１２】
第四の局面では、本発明は、試料中の汚染物質の量または活性を減少させるための処理プロセスを検証する方法を提供し、この方法は、
ａ）汚染物質を含むか、または含む疑いのある試料を得る工程；
ｂ）該試料を、生物学的成分と共有結合した熱安定性キナーゼの規定量の存在下で処理プロセスに供する工程；
ｃ）残余キナーゼ活性を測定し、そして必要に応じて、キナーゼ活性の減少を算定する工程；および
ｄ）該残余キナーゼ活性を所定のキナーゼ活性と比較するか、または該キナーゼ活性の減少をキナーゼ活性の所定の減少と比較する工程であって、該所定のキナーゼ活性またはキナーゼ活性の所定の減少が、同じ条件下での該汚染物質の量または活性の確認された減少に相当する、工程
を含む。
【００１３】
第五の局面では、本発明は、試料中の汚染物質の量または活性の減少と、本発明の第一の局面に関して記載された生物学的プロセスインジケータのキナーゼ活性とを相関させる方法を提供する。この方法は、
（ｉ）該汚染物質の規定量を含有する試料および本発明の第一の局面による該インジケータの規定量を含有する試料を調製するか、または該汚染物質の規定量および本発明の第一の局面による該インジケータの規定量の両方を含有する１つの試料を調製する工程；
（ii）該１つまたは複数の試料を処理に供する工程；
（iii）インジケータキナーゼの残余活性を測定し、そして必要に応じて、キナーゼ活性の減少を算定する工程；
（iv）該汚染物質の残余量または活性を測定し、そして必要に応じて、該汚染物質の量または活性の減少を算定する工程；
（v）処理パラメーターの少なくとも１つを変更して、工程（ｉ）から（v）を繰り返す工程
を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】７０℃（Ａ）、８０℃（Ｂ）、および９０℃（Ｃ）での処理後のアデニル酸キナーゼ（ＡＫ）酵素の活性を示す。
【図２】大腸菌で組換え発現した種々のＡＫ酵素の熱安定性を示す。実施例３に記載するように、ＡＫ酵素をコードする遺伝子をクローニングし、そして発現させた。S. acidocaldariusクローンＩを除いて、全ての遺伝子をベクターpET28aから発現させた。S. acidocaldariusクローンＩは、前に記載したように、pET3aから発現させた。発現レベルは、各クローンについて同様であったが、Pyrococcus furiosus (P.fu)酵素の一部は、不溶性画分中にあった。このことは、この酵素のアッセイされる量を減少させたと考えられる。１mg/ml総細胞タンパク質からの１０倍系列希釈で（これにより、カラム１２は、１fg/mlの総タンパク質に等価となる）、大腸菌粗溶解物中で８０℃にて３０分間インキュベートした後に、組換え酵素の熱安定性を測定した。Thermotoga maritimaおよびArchaeoglobus fulgidus由来の酵素は、試験した他の酵素よりも有意に大きな安定性を示したが、残りの酵素（Sulfolobus solfataricus（S.so P2）、Aeropyrum pernix、およびP.fu）は、以前のアッセイの基準として用いたS. acidocaldarius酵素（S.ac Iと記載したデータ）と同様の活性を示した。
【図３】ｔＡＫ−フィブリンペプチド融合の発現および精製のゲル電気泳動分析（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す。レーン１、Seeblueマーカー；レーン２、全細胞ホモジネート；レーン３、不溶性ペレット（Ｐ１）；レーン４、上清（Ｓ１）；レーン５、熱処理Ｓ１−不溶性ペレット（Ｐ２）；レーン６、熱処理Ｓ１−可溶性画分（Ｓ２）；レーン７〜１２、Cibacron Blueアフィニティークロマトグラフィーから連続的に溶出した、精製されたｔＡＫ−フィブリン画分。
【図４】精製ｔＡＫ（Ｓａｃ）−フィブリンペプチド融合物および野生型ｔＡＫ（Ｓａｃ）の質量分析を示す。精製されたＳａｃ（Ａ）およびＳａｃ−フィブリン（Ｂ）を、シリコンコーティングチップ（ＮＰ）にアプライし、乾燥し、そしてＳＥＬＤＩ質量分析用のマトリックスにアプライする（シニピン酸(Sinipinic酸)）。分子量を横軸に、相対シグナルを縦軸に示す。フィブリンペプチドの添加は、２１１７０Ｄａ(Ａ）から２２１８８Ｄａ（Ｂ）までのＳａｃ分子量の増加を生じ、該ペプチドの分解は見られない。また、二量体および三量体のＳａｃ種が、それぞれ、Ｓａｃについて４２３２４Ｄａおよび６３４４８Ｄａ、ならびにＳａｃ−フィブリンについて４４３５７Ｄａおよび６６４９４Ｄａで観察され得る。
【図５】清澄化された封入体調製物からの可溶化されそしてリフォールディングされたＳｕｐ３５−ｔＡＫ（Ｓａｃ）のゲル電気泳動分析（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す。レーン１、SeeBlue Plus 2マーカー；レーン２、Ｓｕｐ  ｔ３５ＡＫ、（還元剤（ＤＴＴ）の存在下で調製された）可溶化された封入体から、２０ｍＭ  Tris-HCl  ｐＨ８．５中でリフォールディングされた；レーン３、ＤＴＴ不在下で調製された可溶化された封入体を用いたこと以外はレーン２と同様；レーン４、レーン３と同様、不溶性画分；レーン５、７５℃にて１０分間加熱処理したこと以外はレーン２と同様、可溶性画分；レーン６、７５℃にて１０分間加熱処理したこと以外はレーン３と同様、可溶性画分；レーン７、レーン６と同様、不溶性画分；レーン８、レーン７と同様、洗浄されたペレット；レーン９、レーン２と同様、ＰＥＧ１００００で覆われた透析管で濃縮した；レーン１０、レーン１と同様。Ｓｕｐ３５−ｔＡＫを発現する大腸菌RV308を、振とうフラスコ内で３０℃にて最終ＯＤ６００ｎｍが１４になるまで培養した。遠心分離した細胞ペーストを、２０ｍＭのTris-HCl、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１％のTriton X-100に、０．０５×培養液量で再懸濁した。細胞を、超音波処理によって溶解した。封入体を、遠心分離によって粗細胞溶解物から単離し、２０ｍＭのTris-HCl、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＥＤＴＡ、１％のTriton X-100で３回洗浄した。洗浄されたペレットの最終湿重量は、５ｇ／Ｌ培養物であった。封入体を、０．３％のN-ラウロイルサルコシンおよび＋／−１ｍＭのＤＴＴを含有する５０ｍＭのＣＡＰＳ、ｐＨ１１中に１５ｍｇ／ｍｌで再懸濁し、２０℃にて１．７５時間インキュベートし、そしてＳＳ３４ロータを備えたSorval遠心分離機で１２，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離することによって清澄化した。次いで、可溶化タンパク質を含む上清を、使用前に緩衝液を５回（最初の２回はＤＴＴを含み、残りは含まない）交換して透析した。リフォールディングされたＳｕｐ３５−ｔＡＫは、それぞれレーン２および４に示すように、ＤＴＴの存在下または不在下で封入体を可溶化することによって、可溶性または不溶性の形態で調製できた。リフォールディングされた可溶性のＳｕｐ３５−ｔＡＫは、上記熱処理に対して安定性を示した。
【図６】ｔＡＫ−Ｓｕｐ３５（Ｓａｃ）原線維形成の電子顕微鏡分析を示す。精製された封入体を、先に記載のように可溶化してリフォールディングした（図５）。４℃にて２４時間〜７２時間、２mg/mlのタンパク質濃度でインキュベートすることにより、原線維形成を誘導した。試料を、ネガティブ染色として酢酸ウラニルを用いる標準の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）技術によって分析した。画像の全域で、複数のポリマー種が観察され得る（矢印で示す）。２mg/mlを下回るタンパク質濃度では、原線維種は観察されなかった。
【図７】ＳＰＤＰを用いた精製されたブタムチンへのｔＡＫの架橋を示す。レーン１、分子量マーカー；レーン２、ムチンに結合体化したｔＡＫ；レーン３、ＤＴＴを用いて還元されたｔＡＫ−ムチン結合体。先に記載したようにｔＡＫおよびムチンをＳＰＤＰ誘導体化すると、高分子量の結合体種が形成される（＜200kDa）。レーン２には、結合体化されていないｔＡＫは存在せず、これは、これらの２つのタンパク質種間で非常に効率的に架橋したことを示している。結合体の還元は架橋結合を切断し、レーン３に示されるような遊離ｔＡＫの出現を生じる。
【図８】洗浄消毒器中のｔＡＫ−ムチンインジケータの処理を示す。非改変ｔＡＫをブタムチンに添加し、ｔＡＫをインジケータ表面上で乾燥させることにより、ムチン中ｔＡＫ（tAK in mucin）を調製した。先に記載のように、ＳＰＤＰを用いてｔＡＫおよびムチンを架橋させることにより、ｔＡＫ−ムチン結合体を調製した。これらのインジケータを、界面活性剤として3E-zymeを用いて、検証済みの洗浄消毒機内で処理した。
【図９】ｔＡＫ−フィブリン融合タンパク質をフィブリノーゲンと共有結合により付着させてｔＡＫ−フィブリン膜を形成したもののＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。レーン１、SeeBlue2マーカー；レーン２、1:1000比のｔＡＫ−フィブリン：フィブリノーゲンの反応−トロンビン活性化しないコントロール；レーン３、1:500のｔＡＫ−フィブリン：フィブリノーゲン比としたこと以外はレーン２と同様；レーン４、1:250のｔＡＫ−フィブリン：フィブリノーゲン比としたこと以外はレーン２と同様；レーン５、トロンビン活性化としたこと以外はレーン２と同様；レーン６、トロンビン活性化としたこと以外はレーン３と同様；レーン７、トロンビン活性化としたこと以外はレーン４と同様。反応は、必要に応じて５Ｕのトロンビンの存在または不在下で、３７℃にて１時間インキュベートした。最適な共有結合の取り込みは、ｔＡＫ−フィブリン：フィブリノーゲンの比が1:1000であるときに達成され（レーン５）、示されるように、より高い分子量の種（＜198kDa）が形成され、同時に、非結合体のｔＡＫ−フィブリン種（22.1kDa）が減少した。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
（生物学的プロセスインジケータ）
本発明の第一の局面では、試料中の汚染物質の量または活性が減少される処理プロセスを検証するための生物学的プロセスインジケータであって、該インジケータが、生物学的成分に共有結合した熱安定性キナーゼを含み、但し、該生物学的成分が抗体でない、生物学的プロセスインジケータが提供される。
【００１６】
１つの実施態様では、生物学的成分は、汚染物質の模倣物または代理物であり、したがって汚染物質と実質的に同様にして処理プロセスに反応する。別の実施態様では、生物学的成分は、処理プロセスに供せられる試料中の汚染物質と同じ（しかし物理的に異なる）であってもよく、例えば、汚染物質がタンパク質である場合、生物学的成分もまたタンパク質である；汚染物質が血液タンパク質である場合、生物学的成分もまた血液タンパク質である；汚染物質がＤＮＡ分子である場合、生物学的成分もまたＤＮＡ分子である；汚染物質がＲＮＡ分子である場合、生物学的成分もまたＲＮＡ分子であるなど、その各々について、本明細書中に開示された汚染物質および生物学的成分であり得る。さらなる実施態様では、生物学的成分は、汚染物質と異なり得る。
【００１７】
本発明のインジケータにおいて用いられ得る生物学的成分の例としては、タンパク質、核酸、糖質および脂質が挙げられる。
【００１８】
１つの実施態様では、生物学的成分は、血液タンパク質、細菌タンパク質、ウイルスタンパク質、真菌タンパク質、および自己凝集もしくはアミロイド形成タンパク質からなる群より選択されるタンパク質を含む。
【００１９】
さらなる実施態様では、血液タンパク質は、血液凝固タンパク質（例えば、フィブリノーゲン、フィブリンペプチド、フィブリン、トランスグルタミナーゼ基質、トロンビン）、血清タンパク質（例えば、アルブミンおよびグロブリン）、血小板タンパク質、血球糖タンパク質、およびヘモグロビンからなる群より選択される。
【００２０】
別の実施態様では、細菌タンパク質は、細菌線毛タンパク質（例えば、大腸菌（E.coli）由来ＣｇｓＡおよびサルモネラ（Salmonella）由来ＡｇｆＡ）、細菌毒素タンパク質（例えば、炭疽菌（Bacillus anthracis）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）、ボツリヌス菌（Clostridium botulium）由来の毒素）、細菌細胞表面タンパク質、（例えば、ペプチドグリカン、リポタンパク質）、および細菌胞子タンパク質（例えば、グラム陽性細菌由来であり、そしてクロストリジウム・テニオスポラム（Clostridum taeniosporum）でリボン様付属物（ribbon appendage）を形成するタンパク質に対して同様の配列もしくは全体構造を有する、チャップリン（chaplin）タンパク質、ロドリン（rodlin）タンパク質）からなる群より選択される。
【００２１】
なお別の実施態様では、ウイルスタンパク質は、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルスカプシドタンパク質、およびウイルスコアタンパク質からなる群より選択される。適切には、ウイルスタンパク質は、バクテリオファージウイルス由来（例えば、ＭＳ２およびＰＰ７タンパク質）、ノーウォーク（norwalk）ウイルス由来（例えば、カプシドタンパク質）、ロタウイルス由来（例えば、ＶＰ２、ＶＰ６およびＶＰ７タンパク質）、コロナウイルス由来（例えば、ＳＡＲＳのＳ、ＥおよびＭタンパク質）、青舌病ウイルス由来（例えば、ＶＰ２タンパク質）、ヒトパピローマウイルス由来（例えば、ウイルス主要構造タンパク質、Ｌ１）、Ｂ型肝炎ウイルス由来（例えば、小エンベロープタンパク質ＨＢｓＡｇ）、Ｃ型肝炎ウイルス由来（例えば、コア、Ｅ１およびＥ２タンパク質）、インフルエンザウイルス由来（例えば、ノイラミニダーゼおよびヘマグルチニンおよびマトリックスタンパク質）、ポリオウイルス由来（例えば、カプシドＶＰ０、１および３タンパク質）、ＨＩＶウイルス由来（例えば、Ｐｒ５５ｇａｇ、エンベロープタンパク質）、およびテング熱Ｂウイルス由来（例えば、エンベロープ(e)および前膜／膜(ｐｒＭ／Ｍ)）である。
【００２２】
別の実施態様では、真菌タンパク質は、ハイドロフォビンタンパク質（例えば、スエヒロタケ（Schizophyllum commune）由来ＳＣ３、アスペルギルス・フミガーテス（Aspergillus fumigates）由来ＲｏｄＡ／Ｂ、および酵母由来の等価タンパク質）、真菌胞子タンパク質、菌糸タンパク質、マイコトキシン、および真菌プリオン（例えば、Ｓｕｐ３５、Ｈｅｔ  Ｓ、ＵＲＥ  ２、Ｒｎｑ１、Ｎｅｗ  １）からなる群より選択される。
【００２３】
なお別の実施態様では、自己凝集タンパク質は、プリオン（例えば、ＰｒＰＳｃおよびＰｒＰｃ、Ｓｕｐ３５、Ｈｅｔ  Ｓ、Ｕｒｅ  ２、Ｒｎｑ１、Ｎｅｗ  １）、プリオン様タンパク質、アミロイド原線維、活性汚泥中のフロック形成および糸状性細菌由来の細胞表面付着因子、ベータアミロイドタンパク質、タウタンパク質、ポリアデニン結合タンパク質、単純疱疹ウイルス糖タンパク質Ｂ、肺サーファクタントタンパク質Ｃ、大腸菌由来ＣｓｇＡタンパク質、サルモネラ種由来ＡｇｆＡタンパク質、細菌線毛タンパク質、アポリポタンパク質（例えば、アポリポタンパク質Ａ１）、真菌種由来ハイドロフォビン（例えば、スエヒロタケ由来ＳＣ３、アスペルギルス・フミガーテス（Aspergillus fumigates）由来ＲｏｄＡ／Ｂ）、チャップリン（Chaplins）（例えば、ストレプトマイセスｓｐｐ（Streptomyces spp）由来Ｃｈｐｓ  Ａ−Ｈ）、ロドリン（Rodlins）（例えば、ストレプトマイセスｓｐｐ由来Ｒｄ１ＡおよびＲｄ１Ｂ）、グラム陽性芽胞殻タンパク質（例えば、Ｐ２９ａ、Ｐ２９ｂ、ＧＰ８５およびＳｐｏＶＭアナログ）、およびフジツボセメント様タンパク質（例えば、シロスジフジツボ（Balanus albicostatus）由来の１９ｋＤａタンパク質、およびアカフジツボ（Megabalanus rosa）由来の２０ｋＤａタンパク質、およびシロスジフジツボ由来の新規方解石依存性セメント様タンパク質）からなる群より選択される。
【００２４】
別の実施態様では、核酸は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子より選択される。さらなる実施態様では、核酸は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）または二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）より選択される。１つの実施態様では、核酸は、神経組織に由来する。
【００２５】
別の実施態様では、糖質は、エキソ多糖類、リポ多糖類（ＥＰＳ／ＬＰＳ、時にエンドトキシンとして知られる）（例えば、レジオネラ属種（Legionella species）、大腸菌、ブドウ球菌属種（Staphylococcus species）、レンサ球菌属種（Streptococcus species）、シュードモナス属種（Pseudomonas species）、アシネトバクター属種（Acinetobactor species）、カンピロバクター属種（Campylobactor species）、およびバシラス属種（Bacillus species）由来）、ペプチドグリカン、植物、真菌および酵母の細胞壁成分（例えば、キチン、リグニン、グルカン）、ムチン調製物、糖脂質（特に脳由来糖脂質）、糖タンパク質（例えば、細胞表面糖タンパク質、Eap1p）、胞子抽出物（例えば、バシラスｓｐｐ、クロストリジウムｓｐｐ（Clostridal spp）および他の胞子形成物に由来）、酵母被膜由来の多糖類、および無脊椎動物分泌物（例えば、軟体動物ゲル（molluscan gels）由来）からなる群より選択される。
【００２６】
別の実施態様では、脂質は、糖脂質（例えば、脳由来糖脂質）、ガングリオシド（例えば、神経細胞ガングリオシド（例えばＧＴ１ｂ、ＧＴ１ａ）および一般細胞起源のガングリオシド（例えばＧＭ１））、ならびに植物油および脂質からなる群より選択される。
【００２７】
さらなる実施態様では、生物学的成分は、生物学的マトリックスの一部である。１つの実施態様では、インジケータは、生物学的マトリックスに共有結合している。生物学的マトリックスは、処理される試料の模倣物であり得る。１つの実施態様では、生物学的マトリックスは、タンパク質、脂質、核酸、および糖質、またはそれらのフラグメントもしくは誘導体からなる群より選択される１つ以上の成分を含む。別の実施態様では、生物学的マトリックスは、タンパク質の混合物を含み得る。さらなる実施態様では、生物学的マトリックスは、血液、血清、アルブミン、粘液、卵、神経組織、食物、動物廃棄物、および市販の試験用汚れからなる群より選択される１つ以上の成分を含み得る。本発明の別の実施態様では、生物学的マトリックスは、フィブリノーゲン、トロンビン、第VIII因子、CaCl2、ならびに必要に応じてアルブミンおよび／またはヘモグロビンからなる群より選択される１つ以上の成分を含み得る。
【００２８】
本発明の１つの実施態様では、熱安定性キナーゼが、生物学的成分に共有結合で連結されている。別の実施態様では、熱安定性キナーゼが、生物学的成分に遺伝子的もしくは化学的に架橋されている。さらなる実施態様では、生物学的成分が、融合タンパク質の形で熱安定性キナーゼに連結されている。
【００２９】
本発明のインジケータは、タンパク質、脂質、糖質、および核酸からなる群より選択される汚染物質を除去／不活性化するために設計された処理プロセスを検証するために用いられ得る。
【００３０】
本発明の生物学的プロセスインジケータは、キナーゼを安定化する薬剤（例えば、金属イオン、糖、糖アルコール、またはゲル形成剤）をさらに含み得る。
【００３１】
本発明のインジケータ（任意の生物学的マトリックスを含む）はまた、７０％エタノールまたはイソプロパノールでの処理によって「固定」され得る。これを達成するために、インジケータ／マトリックスは、７０％イソプロパノール中に、室温にて３０分間インキュベートされる。これは、手術器具上の汚染材料の耐性を増大させ得る、一般に遭遇するプロセスの１つを模倣し、したがって、このような材料の除去をモニタリングする有効な方法を、インジケータに提供する。
【００３２】
本発明の生物学的プロセスインジケータは、固体支持体中または上に固定化され得る。１つの実施態様では、生物学的プロセスインジケータは、化学的架橋または吸着によって、固体支持体中に固定化されるか、または固体支持体上に固定化される。インジケータは、熱安定性キナーゼを介してまたは生物学的成分を介して、固体支持体に付着され得る。
【００３３】
１つの実施態様では、固体支持体は、インジケータストリップ、ディップスティック、またはビーズであり、そして必要に応じて、表面に固体支持体を付着するための手段（例えば、ねじ、ナットおよびボルト、またはクランプによる表面への固体支持体の付着のための突起部、凹部、もしくは開口部）をさらに含む。さらなる実施態様では、固体支持体はマトリックスであり、そしてインジケータはマトリックス内に分散されている。
【００３４】
本発明の１つの実施態様では、生物学的プロセスインジケータを形成するために用いられる酵素は、リケナーゼ、キシラナーゼ、キシロシダーゼ、ホルミルトランスフェラーゼ（formiltransferase）、Taqポリメラーゼ、α−アミラーゼ、またはβ−グルコシダーゼでない。
【００３５】
本発明のなお別の実施態様では、上記のようなインジケータを含む試験用汚れが提供される。
【００３６】
（生物学的インジケータの調製）
本発明の生物学的インジケータは、適切な生物学的成分に熱安定性キナーゼを共有結合させることにより調製され得る。当該分野で公知の共有結合による付着の任意の適切な方法が用いられ得る。１つの実施態様では、熱安定性キナーゼが、生物学的成分に遺伝子的もしくは化学的に架橋され、そして１つの実施態様では、インジケータは、融合タンパク質として調製される。
【００３７】
化学的架橋は、酵素結合体の生成のためのタンパク質の架橋または他の関連する目的で一般に用いられる種々のホモおよびヘテロの二官能性試薬を用いて達成され得る。例えば、生物学的成分としてフィブリンを含むインジケータでは、フィブリンおよび熱安定性キナーゼを、ＳＰＤＰ（Perbio）を一級アミン基に付加させることで誘導体化し得る。次いで、熱安定性キナーゼを還元して反応性チオール基を生成し得、そして次いでこれをフィブリンと混合して、共有結合によるフィブリン−熱安定性キナーゼの連結を生成させる。
【００３８】
キナーゼはまた、標的の糖質のメタ過ヨウ素酸塩での処理後にヘテロ二官能性剤を用いて糖質、脂質、または他の糖結合体に化学的に架橋され得る。架橋は、実施例２３に略述したように、種々の化学物質を用いて達成され得る。
【００３９】
あるいは、インジケータは、融合タンパク質として調製され得る。これは、適切な熱安定性キナーゼをコードする合成遺伝子（例えば、Sulfolobus acidocaldariusまたはThermotoga neopolitana由来のＡＫをコードする遺伝子）を、適切な生物学的成分をコードする遺伝子に融合させることによって達成される。実施例に、融合タンパク質インジケータの調製についての詳細なプロトコルを示す（例えば、実施例１０および１３を参照のこと）。
【００４０】
（生物学的インジケータに用いるためのキナーゼ酵素）
本発明のインジケータに用いられるキナーゼ酵素は、非常に広い範囲にわたって検出可能であるシグナルを生じ得る。一般に、キナーゼは、ＡＤＰを含む基質を用いて検出される。ＡＤＰは、ＡＴＰに変換され、ＡＴＰはそれ自体、例えば、ルシフェリン／ルシフェラーゼを用いて発光に用いられ、発光はルミノメーターを用いて検出される。この広範な範囲のために、キナーゼはその量／活性が多対数減少した後であっても検出可能なままであるので、インジケータは、検証のために特に適したものとなる。無菌性に関して、ほとんどの国立研究所は、無菌性が検証され得る前に、汚染物質の量または活性の６対数減少が必要であるとみなしている。本発明のインジケータに用いられるキナーゼは、６対数を十分に超えて８対数以上まで汚染物質の量または活性の減少を検証する可能性を与える。
【００４１】
本発明のレポーターキナーゼとして、任意の適切なキナーゼ酵素が用いられ得る。１つの実施態様では、レポーターキナーゼは、アデニル酸キナーゼ、酢酸キナーゼもしくはピルビン酸キナーゼ、またはそれらの組み合わせである。
【００４２】
本発明に用いられるレポーターキナーゼは、種々の認識された三次構造を有し得る。例えば、キナーゼは、三量体または単量体のキナーゼであり得る。これらの三次構造は、例えば、温度、ｐＨ、化学的変性剤、またはプロテアーゼのような条件に対するキナーゼの改善された安定性と関連し得る。
【００４３】
１つの実施態様では、レポーターキナーゼは、Pyrococcus furiousus、P.abyssi、P.horikoshii、P.woesii、Sulfolobus solfataricus、S.acidocaldarius、S.shibatae、Rhodothermus marinus、Thermococcus litoralis、Thermotoga maritima、Thermotoga neapolitanaおよびMethanococcus spp.からなる群より選択される生物に由来する微生物キナーゼである。他の実施態様では、キナーゼは、Sulfolobus sp.キナーゼまたはThermotoga sp.キナーゼである。さらなる他の実施態様では、キナーゼは、A. acidocaldariusキナーゼ、A. fulgidusキナーゼ、A. pernixキナーゼ、A. pyrophilusキナーゼ、B. caldotenax BT1キナーゼ、Bacillus species PS3キナーゼ、B. stearothermophilus 11057キナーゼ、B. stearothermophilus 12001キナーゼ、B. thermocatenulatusキナーゼ、C. stercocorariumキナーゼ、Methanococcus spp.キナーゼ、M. ruberキナーゼ、P. abyssiキナーゼ、P. furiosusキナーゼ、P. horikoshiiキナーゼ、P. woesiiキナーゼ、R. marinusキナーゼ、S. acidocaldariusキナーゼ、S. shibataeキナーゼ、S. solfataricusキナーゼ、T. ethanolicusキナーゼ、T. thermosulfurogenesキナーゼ、T. celereキナーゼ、T. litoralisキナーゼ、T. aquaticus YT1キナーゼ、T. caldophilus GK24キナーゼ、T. thermophilus HB8キナーゼ、T. maritimaキナーゼまたはT. neapolitanaキナーゼである。よりさらなる実施態様では、キナーゼは、T. litoralisキナーゼ、T. maritimaキナーゼ、またはT. neapolitanaキナーゼである。
【００４４】
１つの実施態様では、レポーターキナーゼは熱安定性である。熱安定性キナーゼは、高温に耐性であるだけでなく、通常タンパク質を損傷もしくは破壊し、またはタンパク質を不活性にする他の生化学的プロセスおよび物理的プロセス（例えば、特定化学薬品（例えば、カオトロープ）への曝露、フリーラジカル損傷、界面活性剤、ｐＨの極限、プロテアーゼへの曝露、タンパク質架橋、非透過または半透過膜またはポリマー内へのカプセル封入、表面への不可逆的な固定化）に対して耐性であることが見出されている。（例えば、以下を参照のこと：Daniel RM, Cowan DA, Morgan HW, Curran MP,「A correlation between protein thermostability and resistance to proteolysis」, Biochem J. 1982 207:641-4; Rees DC, Robertson AD,「Some thermodynamic implications for the thermostability of proteins」, Protein Sci. 2001 10: 1187-94; Burdette DS, Tchernajencko V V, Zeikus JG.,「Effect of thermal and chemical denaturants on Thermoanaerobacter ethanolicus secondary-alcohol dehydrogenase stability and activity」, Enzyme Microb Technol. 2000 27: 11-18; Scandurra R, Consalvi V, Chiaraluce R, Politi L, Engel PC.,「Protein thermostability in extremophiles」, Biochimie. 1998 Nov;80 (11): 933-41; およびLiao HH.,「Thermostable mutants of kanamycin nucleotidyltransferase are also more stable to proteinase K, urea, detergents, and water-miscible organic solvents」, Enzyme Microb Technol. 1993 Apr; 15 (4): 286-92、これらの全ては、その全体が参照によって本明細書に援用される）。
【００４５】
本発明に用いるのに適切なキナーゼの例を、以下の配列番号１〜３２に示す。１つの実施態様では、本発明に用いるキナーゼは、配列番号１〜３２と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の同一性を有する。
【００４６】
適切なレポーターキナーゼの他の例は、ＷＯ００／４６３５７およびＷＯ２００５／０９３０８５に見られ得、それらの全体が参照によって本明細書に援用される。
【００４７】
本発明の１つの実施態様では、キナーゼ活性は、ＡＴＰ生物発光検出システムを用いて検出される。標準的なルシフェリン／ルシフェラーゼアッセイ方法は、１０−１５モル程度の少ない量のＡＴＰを検出可能である。生物発光検出法と酵素増幅を組み合わせることによって、１０−２０モル程度の少ない量のキナーゼを検出することが可能である。
【００４８】
（生物学的インジケータの安定化）
熱不活性化に対する酵素（例えば、キナーゼ）の安定性を増大させる多数の添加剤および処方変更は、当業者に公知である。
【００４９】
安定化剤（例えば、４Ｍの濃度までのソルビトール、または２Ｍまでの濃度のエチレングリコール、グリセロール、もしくはマンニトールのような他のポリオール）の添加により、酵素の熱安定性が改善され得る。他の添加剤（例えば、キシラン、トレハロース、ゼラチン）もまた、個別または組み合わせでのいずれかで、さらなる安定化効果を提供し得る。種々の二価金属イオン（最も著しくはＣａ２＋、Ｍｇ２＋、またはＭｎ２＋）の添加によっても、酵素の安定性は改善され得る。
【００５０】
酵素の化学的改変もまた、それらの熱安定性を改善するために使用され得る。グリオキシル酸による表面露出したアミノ基の還元アルキル化（例えば、Melik-Nubarov (1987) Biotech letts 9: 725-730）、タンパク質表面への糖質の付加（例えば、Klibanov (1979) Anal. Biochem. 93: 1-25）、およびアミド化（例えば、Klibanov (1983) Adv. Appl. Microbiol. 29: 1-28）は全て、酵素の安定性を増大させ得る。酵素固定化のための化学的架橋剤の使用および種々の重合支持体の使用を含むさらなる方法もまた、酵素の熱安定性を増大させるための関連の方法である（Gupta (1991) Biotech. Appl. Biochem. 14: 1-11に概説される）。
【００５１】
同様の改変はまた、過酸化水素またはオゾンのような他の滅菌プロセスに対するインジケータの安定化にも関連している。特に、酵素への気相滅菌剤の接近が制限されるプロセス（例えば、適切なポリマー中のカプセル化またはガスの透過を減少させる添加剤を用いた処方による）は、必要に応じて酵素の安定化を増大させるために有用な方法を提供する。
【００５２】
酵素の熱安定性を増大させるのに有効である処理の多くはまた、プロテアーゼ処理に対する、例えば、プロテアーゼ処理によるＴＳＥ因子の有効な不活性化についてのインジケータの開発のための安定化にも関連している。一般に、高レベルの熱安定性を示すタンパク質は、変性またはプロテアーゼ処理のような分解プロセスに対しても高度の安定性を示すと考えられる（例えば、以下を参照のこと：Daniel RM, Cowan DA, Morgan HW, Curran MP,「A correlation between protein thermostability and resistance to proteolysis」, Biochem J. 1982 207: 641-4; Rees DC, Robertson AD,「Some thermodynamic implications for the thermostability of proteins」, Protein Sci. 2001 10: 1187-94; Burdette DS, Tchernajencko V V, Zeikus JG.「Effect of thermal and chemical denaturants on Thermoanaerobacter ethanolicus secondary-alcohol dehydrogenase stability and activity」, Enzyme Microb Technol. 2000 27: 11-18; Scandurra R, Consalvi V, Chiaraluce R, Politi L, Engel PC.,「Protein thermostability in extremophiles」, Biochimie. 1998 Nov; 80 (11): 933-41; およびLiao HH.,「Thermostable mutants of kanamycin nucleotidyltransferase are also more stable to proteinase K, urea, detergents, and water-miscible organic solvents」, Enzyme Microb Technol. 1993 Apr; 15 (4): 286-92）。したがって、熱安定性キナーゼは、一般に、ＴＳＥ因子を不活性化するように設計されたプロテアーゼ処理の作用に対して、等価の中温性キナーゼよりも高度の安定性を示す。用いたプロセスのタイプに依存して、キナーゼは、プロセスの他の特徴に有利であるようにも選択され得る。したがって、酸性ｐＨでのプロテアーゼ処理がS. acidocaldariusまたはS. solfotaricusのような好酸性生物に由来するキナーゼを使用するのに対し、アルカリ性ｐＨでのプロテアーゼ処理のためには、このプロトコルは、P. furiosusのような中程度に好アルカリ性の生物に由来する熱安定性キナーゼを使用する傾向がある。
【００５３】
プロテアーゼ処理に対するキナーゼインジケータの安定性を改善するために必要であれば、多くの他の選択肢が存在する。これらの多くは、熱処理に対する酵素の安定化について上述したものと同じである。例えば、ソルビトール、マンニトール、または他の複合ポリマーを含有する処方物は、インジケータ表面上での酵素の不活性化のレベルを減少させる。さらに、プロテアーゼ基質が分解される速度を特異的に減少させる処理は、この適用に特に関連している。例えば、プロテアーゼの代替基質として作用する適切なキャリアタンパク質（例えば、カゼインまたはアルブミン）を約１０ｍｇ／ｍｌ（インジケータの好ましい濃度に比べて１０倍過剰）までで含有する溶液中のキナーゼの処方物は、キナーゼインジケータの消化の速度を特異的に減少させる。同様に、処方物への遊離アミノ酸（例えば、グリシン、チロシン、トリプトファン）またはジペプチドの添加は、酵素の基質レベル阻害の手段を提供し、キナーゼインジケータの局所的な不活性化を減少させる。
【００５４】
本発明では、細菌での組換え発現によって生産される熱安定性キナーゼもまた用いられ得る。酵素の遺伝的改変は、熱安定性の顕著な増大を提供することが示されており、そして類似性により、このような変異はまた、他のプロセス（例えば、プロテアーゼ処理または気相「滅菌」）におけるインジケータ酵素の安定性を顕著に増大させると考えられている。三量体（古細菌）ＡＫの規定の三次元構造（Vonrheinら(1998) J. Mol. Biol. 282:167-179およびCriswellら (2003) J. Mol. Biol. 330:1087-1099）と取得したキナーゼ酵素との熱安定性の比較により、酵素の安定性に影響するアミノ酸が同定された。
【００５５】
本発明では、改善された熱安定性を示すキナーゼの遺伝子操作改変体もまた用いられ、そして多数の方法で生成され得る。本質的には、これらは、三量体分子の中央コアのパッキング領域の部分を形成すると考えられるアミノ酸の特定の部位特異的変異誘発、およびランダム「定方向進化」法（分子全体が、改善された特性を有する分子の変異誘発および選択／スクリーニングの引き続くラウンドに供せられる）を含む。特定の改変酵素を、配列番号１７〜１９に示す（いくつかの改変体は各参照によって包含される）。概説したこれらの改変は、コンセンサスベースのアプローチを用いるハイブリッドアプローチに基づいて、構造上関連した分子間で観察された差異に基づく酵素の熱安定性に影響すると考えられる領域が決定される。この後、規定の変更を行って最良の熱安定性と相関するアミノ酸が組み込まれるか、あるいはランダム置換を行って、熱安定性に必須であることが決定された位置に全ての利用可能なアミノ酸が組み込まれる。
【００５６】
マトリックスの一部である生物学的成分に結合するインジケータの安定性／耐性は、マトリックスの生物学的成分の濃度を高めることによって、または架橋度を高めることによって、改善され得る。一例として、本発明のインジケータの１つは、フィブリン反応性ペプチドキナーゼインジケータを用いて、フィブリンを含有する生物学的マトリックス（例えば、フィブリン膜）に架橋を生じる。フィブリン膜を変化させることによって（例えば、フィブリンの濃度を高めることによって、または架橋度を高めることによって）、特定のプロセスに対するインジケータの耐性を顕著に増大させることが可能である。
【００５７】
Ｓｕｐ３５のような生物学的成分を含有するインジケータの耐性は、インジケータの線維化（fibrilisation）を促進することによって増大され得る。これは、分子により大きな物理的安定性を付与し、そして天然には多量体であると考えられているプリオンタンパク質のような因子の不活性化のモニタリングに適している。
【００５８】
１つの実施態様では、インジケータは、スクロース（例えば、１ｗ／ｖ％まで）、ムチン（例えば、０．５ｗ／ｖ％まで）、およびアルブミン（例えば、１ｍｇ／ｍｌまで）からなる群より選択されるキャリア中に処方される。
【００５９】
（固体支持体）
本発明の生物学的インジケータは、種々の固体支持体に付着し得る。支持体は、化学的改変を有してもまたは有さなくともよく、例えば、検証されるプロセスの要件に依存して、種々の処方物中に１つ以上のインジケータを含み得る。１つの形態では、支持体は、プラスチック、木材、セラミック、ガラス、織物、鋼、または他の金属もしくはポリマーの表面であり、その上には、インジケータが固定化の手段として乾燥／架橋されている。支持体は、ポリカーボネート、ポリスチレン、またはポリプロピレンのストリップまたはディップスティックであり得、必要に応じて平坦な表面を有し、その上にインジケータが塗布されている。インジケータの付着のために多孔質の表面を有するさらなるタイプの支持体もまた、ガス状プロセスのためのインジケータとして特に有用である。プラスチック、木材、金属、またはセラミックのビーズもまた、固体支持体に有益なフォーマットを提供し得、これらもまた、特にガス状プロセスをモニタリングするのに適している。このような支持体は、インジケータの付着のための顕著に大きな表面面積を提供するため、特定の適用に対して利点を有する。さらなる実施態様では、固体支持体はマトリックスであり、そしてインジケータがこのマトリックス内に分散されている。さらなる他の実施態様では、マトリックスは複雑な生物学的マトリックスである。
【００６０】
（生物学的インジケータの固体支持体上への固定化）
本発明のインジケータは、当該分野で公知の広範な種々の方法のいずれかを用いて固体支持体上に結合され得る。
【００６１】
本発明の１つの実施態様では、インジケータは以下に概説されるように、標準的なタンパク質吸着方法によって固体支持体上に結合される。
【００６２】
インジケータの固体支持体上への結合は、表面にタンパク質を連結させるために慣用的に使用される方法、例えば、約ｐＨ９．６の０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液中で室温にての約１時間のタンパク質のインキュベーションによって達成され得る。あるいは、タンパク質は、当業者に知られる広範な範囲のカップリング化学法のいずれかを用いて、表面に共有結合される。例えば、ＳＰＤＰ（Pierce chemicals；製造者の指示を用いる）で誘導体化し、ＤＴＴで還元して架橋用の遊離スルフヒドリル基を提供したアデニル酸キナーゼ融合タンパク質（例えば、Ｓｕｐ３５に）が、マレイミド表面を有するポリスチレン支持体に共有結合される。このようなスルフヒドリル結合表面を有するプラスチック表面は、文献に十分に記載されている。このカップリング方法のさらなる利点は、必要に応じて、例えばＤＴＴまたはＭＥＳＮＡでの還元によって、酵素が支持体から切断され得、アッセイがインジケータ支持体とは別に実施できるようになることである。本願に記載されるインジケータは、誘導体化およびそのような支持体への架橋の際にそれらの活性が保持されるという特性を有する。
【００６３】
あるいは、ポリスチレンまたはポリカーボネートの支持体上のアミン反応性表面が、二官能基型の架橋剤（例えば、グルタルアルデヒドモノマー）と共に使用されて、タンパク質上の遊離アミン基を介するキナーゼインジケータの直接的な非切断性の架橋を提供する。ＵＶ処理もまた、適切な支持体にインジケータを直接的に連結させるために使用され得る。鋼表面は、インジケータの共有結合を媒介するために、プラスチック表面と同様の方法で処理され得る。
【００６４】
広範な種々のタンパク質架橋試薬は、Pierce chemical company (Perbio)のような企業から入手可能である。スルフヒドリル基、アミノ基、ヒドロキシル基、およびカルボキシル基に対して反応性の試薬が、タンパク質のカップリングのために設計されるが、それらは、天然に反応性であるかまたはコーティングされたかのいずれかの固体支持体（例えば、プラスチック、他のポリマー、ガラス、および金属）へタンパク質を架橋するためにも同等に使用され得る。反応性の化学物質もまた、糖質に酵素を架橋させるために利用可能である。例えば、試薬ＢＭＰＨ（N-[β-マレイミドプロピオン酸]ヒドラジド・TFA）、ＫＭＵＨ（N-[k-マレイミドウンデカン酸]ヒドラジド）、およびＭＰＢＨ（4-(4-N-マレイミドフェニル)酪酸ヒドラジド塩酸塩）が、システイン残基の形態、またはスルフヒドリル反応基を生成するように還元された化学誘導体化タンパク質の形態のいずれかで遊離スルフヒドリルを含むインジケータを、糖質に架橋させるために使用され得る。これは、固体支持体に特に重要であり得、固体支持体は、複合糖質（例えば、紙、セルロースベースの膜、ゲルまたは樹脂）であるか、または適切な反応性の表面を生成するように糖質溶液でコーティングまたは処理され得る。
【００６５】
支持体の各タイプについて、インジケータは、結合を増強する、および／または結合したタンパク質を安定化させる溶液中に処方され得る。このような処方物としては、スクロース、ソルビトール、マンニトール、セルロース、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を１０％（ｗ／ｖ）までで含有する溶液が挙げられる。さらに、インジケータは、適切な支持体の表面または内腔に塗布されるゲルの一部として処方され得る。例としては、アルギン酸マトリックス、寒天マトリックス、またはポリアクリルアミドマトリックスが挙げられる。
【００６６】
インジケータはまた、インジケータを安定化させる薬剤を含み得、そして適切な安定化剤は、金属イオン、糖、糖アルコール、およびゲル形成剤から選択される。
【００６７】
インジケータの使用を容易にするために、インジケータは、固体支持体を表面に取り付ける手段をさらに含み得、そのような手段は、例えば、ねじ、ナットおよびボルト、またはクランプによって支持体を表面に取り付けるための突起部、凹部、または開口部である。
【００６８】
（生物学的インジケータを含むキット）
本発明の第二の局面では、試料中の汚染物質の量または活性が減少される処理プロセスの検証に用いるためのキットが提供され、このキットは、
（ｉ）本発明の第一の局面による生物学的プロセスインジケータ、および
（ii）熱安定性キナーゼのための基質
を含む。
【００６９】
キナーゼ量／活性の測定を実施するために、キットは、ＡＴＰを検出するための手段（例えば、ルシフェリン／ルシフェラーゼ）および必要に応じてルミノメーターを含み得る。１つの実施態様では、熱安定性キナーゼのための基質は、ＡＤＰである。
【００７０】
公知の汚染物質を用いた以前の試験から、汚染物質の量または活性の減少とキナーゼ活性とを相関させるデータが作成され得、したがって、キットは、キナーゼ活性と一連の特定の汚染物質の量または活性の減少との相関を示す、１つ以上の照合表もまた含み得る。１つの実施態様では、キットは、ＴＳＥ不活性化のモニタリングのためである。さらなる実施態様では、キットは、ノロウイルス不活性化のモニタリングのために用いられる。
【００７１】
（生物学的インジケータの使用）
第三の局面では、本発明は、試料中の汚染物質の量または活性を減少させるための処理プロセスを検証するための生物学的プロセスインジケータとして、生物学的成分と共有結合した熱安定性キナーゼの使用を提供する。
【００７２】
１つの実施態様では、生物学的プロセスインジケータは、発明の第一の局面に従って処方される。
【００７３】
本発明の特定の使用に際して、本発明の第一の局面によるインジケータは、洗浄または不活性化の手順後の汚染物質（例えば、感染性因子）の存在可能性を示す方法におけるレポーターである。まず、インジケータを含有する試料を、洗浄／不活性化手順（例えば、選択した温度、ｐＨ、またはプロテアーゼ濃度の１つ以上）に曝露する。次の工程は、熱処理、例えば、６０〜８０℃にて少なくとも１０分間（すなわち、熱安定性キナーゼに顕著に影響しない条件下）によって、いかなる汚染の酵素活性も除去することである。次いで、インジケータを、３０℃と７０℃との間の温度で基質（例えば、ＡＤＰ）と反応させて、ＡＴＰを生成させる。ＡＴＰの形成は、２０〜３０℃にて１０分〜１時間の間のルシフェリン／ルシフェラーゼおよび適切なルミノメーターを用いる生物発光検出によって測定され得る。ルミノメーターからの光出力読み取り（light output reading）によって、残余キナーゼ活性（すなわち、洗浄／不活性化処理への曝露後のキナーゼの活性）の読み取り値が与えられる。以前に別の実験から得られたデータに基づいて、この方法は、残余キナーゼ活性と、処理した試料内の汚染物質の存在可能性とを相関させることにより完了される。
【００７４】
１つの実施態様では、試料中の汚染酵素活性またはＡＴＰが、インジケータの添加前に、初期処理工程（例えば、選択した温度、ｐＨ、またはプロテアーゼ濃度）によって除去され得る。
【００７５】
ここで、種々のプロセスをモニタリング／検証するための本発明のインジケータの使用を説明する。
【００７６】
１つの実施態様では、インジケータは、洗浄サイクルにおける生物学的洗浄調製物の性能を検証するために使用される。洗浄サイクルの検証は家庭環境にて用いられる可能性があるが、その最も有益な使用は、ヘルスケア、製薬、または食品製造環境内にあり、例えば、感染患者または感染因子に曝露された患者（例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）またはノーウォーク／ノーウォーク様ウイルスの集団発生）と関連した寝具、室内着、または他の品目の汚染除去を検証するためである。このような状況では、本発明のインジケータは、血液または他の体液のような生物学的材料に適しているという利点を有する。
【００７７】
洗浄サイクルの検証のために、インジケータは、可撓性の細棒、布のストリップ、またはサイクル内に取り込むのに適した他の材料の上に架橋され得る。インジケータは、投入物の残りと共に洗浄機に入れられる。１つの実施態様では、インジケータは、その回収を容易にするために、洗浄機内部の適切なホルダー内に固定され得る。
【００７８】
次いで、洗浄サイクルが実施され、そしてインジケータが取り出されて、投入物のさらなる取り扱いまたは処理の前に「読み取り機」を用いて評価される。この「読み取り機」は、インジケータ内に受容可能なレベルの残余キナーゼ活性を示すように較正されており、この受容可能なレベルは、プロセス内の適切な洗浄性能の以前の較正および評価から導き出されている。このような評価は、汚れの総レベルおよび微生物の生存数（当業者に公知の適切なモデル生物を用いて評価される）を含み得る。読み出し較正値に基づいて、投入物をさらなる処理に通すか、または洗浄サイクルを繰り返す。
【００７９】
第二の実施態様では、インジケータは、ウイルスの不活性化のためのプロセスを検証するために使用される。環境中の生存ウイルス単離株の検出は、特に、スピードおよび精度が重要になり得る緊急事態が伴う場合に、問題である。本発明は、本質的にリアルタイムに汚染除去手順をモニタリングすることを可能にするインジケータシステムの開発の可能性を提供する。これは、ヘルスケアおよび関連施設において、集団発生（例えば、ノーウォーク様ウイルスの発生）またはウイルス因子（例えば、天然痘）の故意の放出のいずれかの後での表面汚染除去に特に有用である。
【００８０】
ウイルス不活性化プロセスを検証するためのインジケータは、種々の異なる形態（例えば、殺ウイルス剤を噴霧または浸漬した領域をモニタリングするための細棒またはディップスティック、または気相汚染除去プロセスをモニタリングするための懸架式インジケータ）をとり得る。あるいは、インジケータが、汚染除去前に表面に噴霧され得、そして残余キナーゼ活性のレベルが、引き続き、表面のふき取りによって評価され得る。
【００８１】
本発明のさらなる実施態様では、インジケータは、細菌タンパク質毒素、植物毒素（例えば、リシン）、および他の毒素タンパク質、ペプチド、またはペプチドアナログのプロテアーゼ分解を検証するために使用される。
【００８２】
プロテアーゼは、細菌戦争／細菌テロリズムの脅威となる可能性のある因子である広範なタンパク質毒素（ボツリヌス菌毒素、炭疽菌毒素、およびリシンを含む）の分解の重要な可能性を示す。それらはまた、広範な他の潜在的に毒性または有害なタンパク質またはペプチド因子を不活性化して、表面／施設の汚染除去または材料の安全な廃棄を可能にする能力を有する。このような状況では、本発明のインジケータは、汚染除去される表面／材料と一緒に、プロテアーゼ汚染除去手順に供される。この手順の終了時に、インジケータの残余キナーゼ活性のレベルが、本発明の方法に従って評価される。次いで、この残余キナーゼ活性のレベルが、特定のタンパク質毒素または毒素群の不活性化指数と相関される。このレベル活性が規定の指数値以下であると、材料は安全に廃棄され得、または表面／施設は元通りに使用し得る。
【００８３】
１つの実施態様では、適切な安全性余裕が、プロセス性能のいかなる可変性も可能にするように、不活性化指数の較正に組み込まれる。本発明で使用される酵素の付加的な安定性により、これは、好熱性生物由来のＡＫの相対熱安定性を示すデータ（図１、実施例２）により示されるように、広範な他の酵素インジケータ（「熱安定性」生物、例えば、Bacillus stearothermophilus由来の酵素を含む）よりも確実にかつより大きなダイナミックレンジで行われるようになる。
【００８４】
インジケータはまた、薬剤製造装置を洗い落とすためのプロテアーゼ汚染除去手順を検証するために使用され得る。広範な種々の薬剤製品は、ヒトまたは動物由来の材料を使用し、これらは、プリオン（ＴＳＥ）因子およびウイルス（例えば、西ナイルウイルス、肝炎、ＨＩＶ）を含む広範な種々の因子で汚染され得る。材料の供給源が動物起源である場合（例えば、ウシ胎児血清、ウマ免疫グロブリン）および中間処理段階が、特定の試料中の未同定の病原体の濃度を増大させる危険性を有し得る場合、危険性は悪化され得る。製造バッチ間の製造施設および装置（例えば、クロマトグラフィーカラム、容器、配管）を洗い落とすためのプロテアーゼの使用可能性が、汚染物質が事前に同定されていない場合であっても、そのような危険性を減少または排除する見込みを有する。これは、感染危険性の蓄積および最終製品への持ち込みの重大な危険性がある、例えば、血液分画装置中のプリオン因子に特に当てはまる。
【００８５】
このタイプの手順を検証するために、本発明のインジケータは、理想的には、プロテアーゼ処理溶液中に浸漬されるディップスティックとして、または洗浄される装置とともに一列に取り付けられるカートリッジとして処方される。処理後のインジケータデバイス中の残余キナーゼ活性のレベルを評価し、そしてこれを受容可能な洗浄レベルと相関させることにより、性能の迅速かつ信頼性のあるモニターが開発され得る。
【００８６】
本発明の別の実施態様では、インジケータは、汚染物質（例えばＴＳＥ）の気相不活性化を検証するために用いられる。
【００８７】
オゾンまたは他の気相滅菌剤がこのような汚染物質を不活性化する可能性は、広範な刊行物および論文によって示唆されているが、なおも、有効であることが明白に示された方法はない。この気相技術のヘルスケアへの開発および導入を支持するために、この技術の性能を検証する手段が必要である。ＴＳＥのような因子は、従来のウイルスまたは細菌因子よりもこの形態の不活性化に対してずっと耐性であることが既に示されているので、気相不活性化を検証するために現在利用可能な方法は、適切であるとは考えられない。本発明は、この課題に取り組んでいる。
【００８８】
このタイプの検証のために、インジケータキナーゼは、任意の適切な方法、例えば、一般的な吸着およびアミド、ペプチド、カルボニル、またはシステイン結合を介する化学的架橋によって、固体支持体上に付着される。例えば、オゾン滅菌については、剛性ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ガラス、鋼、ポリアミド、またはポリプロピレンの支持体が使用され得、支持体には、キナーゼが、先に記載した方法のいずれか１つによってカップリングされている。次いで、インジケータが、滅菌される材料／器具のバッチ中に入れられ、オゾンに曝露され、そして当の因子の対応する不活性化を評価するために設計した適切に較正した不活性化指数に対して評価される。好結果の不活性化が、材料／器具の処理または使用の前に可能になる。
【００８９】
インジケータは、気体の透過が制限されるように、必要に応じて、チューブの内面または等価の内部空隙部に付着され得る。これは、管腔を有する器具中の等価な空隙中への、または充填された材料を通る、気体の透過を評価するのに適しているモニターを提供する。あるいは、インジケータは、ポリスチレンビーズのような多孔質材料に付着され得るか、またはゲルもしくは樹脂内に固定化され得る。
【００９０】
本発明のさらなる実施態様では、インジケータは、内視鏡および関連装置の処理に用いられるような液体化学滅菌システム（例えば、Endoclens）を検証するために使用される。
【００９１】
広範な内視鏡が医療において慣用的に使用され、そしてこれは、医学的診断および処置の重要な部分となる。これらの器具は、非常に感度が高く、慣用的な洗浄および消毒に非常に重要な問題を提起している。従来、および現行の実施でも変わらず、内視鏡は、低温法を用いて汚染除去される前に、手で洗浄される。従来のオートクレーブ滅菌ができない内視鏡のような装置の感度の高い部分の汚染除去の特定の問題に取り組むために、種々の化学消毒剤および自動化再処理装置が開発されている。これらの方法は、器具の洗浄化が困難である際に、広範なウイルスおよび細菌病原体の医原性伝染と関連している汚染のレベルを下げるのに役立っている。このようなプロセスを検証する現行の方法は、洗浄溶液の流速および温度をモニタリングすることである。本発明のインジケータは、内視鏡管腔内の実際の洗浄有効性の読み出し値を提供する検証のさらなる手段を提供する。
【００９２】
このタイプの検証のために、インジケータは、内視鏡チューブと同様の総内径であるように設計されたチューブの内表面に付着される。このインジケータ装置は、自動化再処理装置において内視鏡と直列に連結されている。次いで、内視鏡は、通常通りに処理される。このプロセスの終了時に、好ましくは内視鏡が装置から取り出される前に、インジケータは取り外され、そして残存するキナーゼ活性のレベルについて評価される。活性のレベルは、プロセスの受容可能な性能について予め規定された閾値と相関させられ得、そしてこの評価に基づいて、内視鏡は、追加の洗浄もしくは汚染除去に移され得るか、または使用するために準備され得る。性能のレベルが十分でない場合、器具は、前と同様に付着させた新たなインジケータを用いて（同じ条件またはより厳しい条件を用いて）再処理され得る。このインジケータ装置はまた、内視鏡および／または管腔を有する任意の他の器具の手動洗浄を検証するのにも適している。
【００９３】
本発明のさらなる実施態様では、インジケータは、洗浄消毒器（例えば、病院で使用されるもの）で慣用の洗浄性能をモニタリングするために使用される。
【００９４】
本発明の別の実施態様では、インジケータは、グルタルアルデヒドまたはオルトフタルデヒド（ＯＰＡ）処理をモニタリングするために使用される。グルタルアルデヒドおよびホルムアルデヒドが、長年にわたって滅菌剤として広範に使用されている。化学消毒剤は、それらの機能を破壊するために非特異的様式でタンパク質を多架橋させることにより作用する。オルトフタルデヒド（ＯＰＡ）は、このファミリーにおいて新規な消毒剤として近年見出され、そしてこれはグルタルアルデヒドと関連した毒性問題のいくつかを回避するので広範に使用されつつある。本発明のインジケータは、このクラスの化学消毒剤の全てをモニタリングするのに適している。これは、キナーゼが、この種の非特異的架橋に感受性であるからである。このインジケータは、適切な表面に共有結合され、滅菌されるべき他の品目と共に化学滅菌剤に曝露され得る。プロセスの有効性は、インジケータの残余酵素活性を測定することによって評価される。この活性は、プロセスの正確な性能を示す規定の閾値と比較される。
【００９５】
異なるタイプのキナーゼの使用は、種々の適用に必要とされ得るように、プロセスに対する付加的な感度または感受性を提供し得る。本明細書中に記載の熱安定性アデニル酸キナーゼは、それらの分子構造に基づいて、２つの群に広く分類され得る。したがって、Sulfolobus種由来の酵素は、高温でそれらの活性を維持するのに主要な決定基である中心の疎水性コアを有する三量体構造を有する酵素の例である。第二の群の酵素は、単量体である（Thermotoga種由来のアデニル酸キナーゼにより例示される）が、活性部位に影響する付加的な「蓋形」ドメインを有するわずかにより長いポリペプチド鎖を有する。これらの異なるタイプの熱安定性酵素は、酵素作用の間のそれらのペプチド鎖の可変的なフレキシビリティーに起因して、このタイプの化学滅菌剤に対して差異のある感度を示す。任意の特定の滅菌剤および／または濃度について、経験的スクリーンにより、これらのタイプの化学物質をモニタリングおよび検証するために適切な感受性を有する酵素が同定される。
【００９６】
本発明のさらなる実施態様では、インジケータは、エチレンオキサイド、過酸化水素、または他の気相プロセスについての超高速読み出しモニターとして使用される。
【００９７】
現在、広範な気相滅菌剤は、細菌およびウイルス因子の慣用的な消毒のために、種々の製造業者によって使用されつつある。現行の方法は、気体の酸化特性を利用して、ペプチド結合を破壊している。したがって、本発明のキナーゼは、それらの強い物理化学特性から、不活性化の非常に迅速な読み出しを提供するのに理想的である。本実施例におけるインジケータは、例えば、ＴＳＥのような因子のオゾン不活性化に関して、前に記載したものと同様である。
【００９８】
滅菌および汚染除去のプロセスについて特に興味深い点は、種々の医薬または他の薬剤製品の製造で必要とされ得るような、大量のバルク液の滅菌を検証する能力である。現行の方法は、特定プロセスの温度、時間、および／または圧力のパラメーターを（その正確な性質に依存して）モニタリングするが、バルク液内で現実の滅菌を検証するために利用可能な方法は、あるとしてもほとんどない。これは、約１リットルの容量内でさえも難しいが、より多い容量ではほぼ不可能である。
【００９９】
本発明は、この問題に取り組む多数の可能な溶液を提供する。その最も簡易な形態では、インジケータが、プロセスの終了時にキナーゼ不活性化の規定のレベルを測定しそしてこれを滅菌のレベルと同一視するのに適した濃度で、滅菌される液体に添加され得る。これは、特定のタイプのプロセスにおいては望ましくはないが、キナーゼの不活性な性質および全ての生物における等価な酵素活性の遍在的な存在によって受容可能になり得る。この受容可能性は、多くの熱安定性酵素が非常に濃縮され、したがって、動物への接種後の免疫原性が非常に低くなることにより、改善され得る。
【０１００】
このような直接的な添加が受容可能でない場合、インジケータは、透析袋、多孔質コンテナー中のバルク液に添加され得るか、またはインジケータが一部分もバルク液に放出されないように適切な支持体に固定化され得るが、滅菌条件は、試料全体についてと同様にインジケータで作用する。液体試料の一般的な拡散を可能にするが、インジケータ試料の動きを制限するように、タンパク質を含有するかまたは固定化する広範に種々の可能な方法が、当業者に公知である。可能な例としては、透析膜、ビスキングチューブ（Visking tubing）、多孔質膜、タンパク質結合樹脂、剛性ゲル、または議論した他のインジケータについて記載したような固体支持体が挙げられるが、これらに限定されない。インジケータは、前に記載した方法のいずれか１つによって表面に付着され得るか、または付着させることなく適切な膜内に単に入れられ得る。これにより、インジケータは、プロセスの完了時にバルク液から簡単に取り出され得る。
【０１０１】
（処理プロセスを検証する方法）
第四の局面では、本発明は、試料中の汚染物質の量または活性を減少させるための処理プロセスを検証する方法を提供し、この方法は、
ａ）汚染物質を含むか、または含む疑いのある試料を得る工程；
ｂ）該試料を、生物学的成分と共有結合した熱安定性キナーゼの規定量の存在下で処理プロセスに供する工程；
ｃ）残余キナーゼ活性を測定し、そして必要に応じて、キナーゼ活性の減少を算定する工程；および
ｄ）該残余キナーゼ活性を所定のキナーゼ活性と比較するか、または該キナーゼ活性の減少をキナーゼ活性の所定の減少と比較する工程であって、該所定のキナーゼ活性またはキナーゼ活性の所定の減少が、同じ条件下での該汚染物質の量または活性の確認された減少に相当する、工程
を含む。
【０１０２】
工程（ａ）の試料は、いかなる汚染物も全く含まないことも考えられる。検証の論点は、処理を行った後、存在していたはずである因子が、受容可能な程度に除去／不活性化されたことが確認されることである。しかし、一般に、試料は、汚染物を含んでいることが知られているか、または含んでいる疑いがある。
【０１０３】
１つの実施態様では、本方法の工程（ｂ）で用いられる熱安定性キナーゼは、本発明の第一の局面によるインジケータとして処方される。
【０１０４】
別の実施態様では、工程（ｃ）における残余キナーゼ活性は、ＡＤＰを含む基質を残余キナーゼに添加し、そしてＡＴＰの形成を測定することによって測定される。ＡＴＰの形成は、ルシフェリン／ルシフェラーゼおよび適切なルミノメーターを用いる生物発光検出によって測定され得る。
【０１０５】
代表的には、操作者は、試料を処理する前および試料を処理した後に、キナーゼ活性を測定する。また、キナーゼ活性についてアッセイする前に、夾雑する（通常、中温性の）キナーゼが試料中に入り込んでいることもあり得る。したがって、１つの実施態様では、アッセイは、残余キナーゼ活性を測定する前に、（例えば、７０℃にて少なくとも３０分間、または８０℃にて少なくとも１０分間試料を処理することにより）中温性のキナーゼを不活性化する工程を含む。
【０１０６】
１つの実施態様では、キナーゼは、処理前に、ルミノメーターによってルシフェリン／ルシフェラーゼの存在下で測定した場合に、１ｍｇキナーゼ当たり少なくとも10,000,000相対発光量（ＲＬＵ）、または１ｍｇキナーゼ当たり少なくとも8,000,000ＲＬＵ、または１ｍｇキナーゼ当たり少なくとも5,000,000ＲＬＵ、または１ｍｇキナーゼ当たり少なくとも3,000,000ＲＬＵ、または１ｍｇキナーゼ当たり少なくとも1,000,000ＲＬＵ、または１ｍｇキナーゼ当たり少なくとも500,000ＲＬＵの活性を有する。
【０１０７】
本発明の別の実施態様では、所定のキナーゼ活性は、１ｍｇキナーゼ当たり10,000ＲＬＵ未満、または１ｍｇキナーゼ当たり1000ＲＬＵ未満、または１ｍｇキナーゼ当たり500ＲＬＵ未満、または１ｍｇキナーゼ当たり250ＲＬＵ未満、または１ｍｇキナーゼ当たり100ＲＬＵ未満、または１ｍｇキナーゼ当たり10ＲＬＵ未満、または１ｍｇキナーゼ当たり1ＲＬＵ未満、または１ｍｇキナーゼ当たり0ＲＬＵである。
【０１０８】
本発明のさらなる実施態様では、キナーゼ活性の所定の減少は、キナーゼ活性の１対数減少、または２対数減少、または３対数減少、または４対数減少、または５対数減少、または６対数減少、または７対数減少、または８対数減少、または９対数減少に等しいかそれより大きい。
【０１０９】
他の実施態様では、キナーゼ活性の所定の減少は、キナーゼの量または濃度の３対数減少、または６対数減少、または７対数減少、または８対数減少、または９対数減少に相当する。さらなる実施態様では、キナーゼ活性の所定の減少は、少なくとも800,000ＲＬＵ、または少なくとも900,000ＲＬＵ、または少なくとも950,000ＲＬＵ、または少なくとも990,000ＲＬＵ、または少なくとも999,000ＲＬＵ、または少なくとも999,900ＲＬＵ、または少なくとも999,990ＲＬＵ、または少なくとも999,999ＲＬＵのＲＬＵ減少に相当する。
【０１１０】
本発明のなお別の実施態様では、試料内の汚染物質の量または活性の確認された減少は、少なくとも３対数、少なくとも６対数、好ましくは少なくとも７対数、より好ましくは少なくとも８対数、最も好ましくは少なくとも９対数である。
【０１１１】
本発明の別の実施態様では、残余キナーゼ活性またはキナーゼ活性の減少が、少なくとも３対数、少なくとも６対数、または少なくとも７対数、または少なくとも８対数、または少なくとも９対数の汚染物質の量または活性の確認された減少に相当するまで、処理が続けられる。
【０１１２】
本発明の１つの実施態様では、本方法は、工程（ｃ）で得られるデータを適切なデータキャリア上に記録する工程をさらに含む。
【０１１３】
（相関させる方法）
第五の局面では、本発明は、試料中の汚染物質の量または活性の減少と、本発明の第一の局面に関して記載された生物学的プロセスインジケータのキナーゼ活性とを相関させる方法を提供する。この方法は、
（ｉ）該汚染物質の規定量を含有する試料および本発明の第一の局面による該インジケータの規定量を含有する試料を調製するか、または該汚染物質の規定量および本発明の第一の局面による該インジケータの規定量の両方を含有する１つの試料を調製する工程；
（ii）該１つまたは複数の試料を処理に供する工程；
（iii）インジケータキナーゼの残余活性を測定し、そして必要に応じて、キナーゼ活性の減少を算定する工程；
（iv）該汚染物質の残余量または活性を測定し、そして必要に応じて、該汚染物質の量または活性の減少を算定する工程；
（v）処理パラメーターの少なくとも１つを変更して、工程（ｉ）から（v）を繰り返す工程
を含む。
【０１１４】
１つの実施態様では、処理パラメーターは、時間、温度、ｐＨ、圧力、プロテアーゼ濃度、および滅菌剤または界面活性剤の濃度の１つ以上を含む。
【０１１５】
特定の実施態様では、処理は、５０〜１４０℃、または８０〜１００℃、または１３４〜１３８℃にて試料を加熱する工程を含み；処理パラメーターは時間であり；そして１分、５分、１０分、２０分、４０分、および６０分の間、試料をこの処理に供することにより、工程（ｉ）から（iv）が繰り返される。
【０１１６】
さらなる実施態様では、処理は、９〜１４のｐＨ、またはｐＨ１２以上、より好ましくは約ｐＨ１２に試料を曝露する工程を含み；処理パラメーターは時間であり；そして１分、５分、１０分、２０分、４０分、および６０分の間、試料をこの処理に供することにより、工程（ｉ）から（iv）が繰り返される。
【０１１７】
別の実施態様では、処理は、0.5〜２mg/ml、または約１mg/ml、または約２mg/mlの濃度のプロテアーゼに試料を曝露する工程を含み；処理パラメーターは時間であり；そして１分、５分、１０分、２０分、４０分、および６０分の間、該試料を該処理に供することにより、工程（ｉ）から（iv）が繰り返される。
【０１１８】
上記方法により、汚染物質を含むか、または含む疑いのある試料に対する処理の検証のためのインジケータを将来的に使用するための較正データの調製が可能になる。多くの処理プロセスの較正は、ＷＯ２００５／０９３０８５に記載される。
【０１１９】
（定義の節）
用語「汚染物質」は、生物学的供給源に由来する感染性および非感染性の両方の因子を包含する。汚染物質の例としては、細菌、ウイルス、真菌、プリオン、毒素、アレルゲン、胞子、生物学的成分として上に列挙した因子のいずれか、ならびに前出のいずれかのフラグメントおよび誘導体が挙げられる。本発明の状況においては、汚染物質はまた、汚染する生物学的因子とも呼ばれ得る。
【０１２０】
用語「架橋された」とは、１つ以上の共有結合を介する２つの物の付着をいう。架橋は、化学的または遺伝子的であり得る。遺伝子的架橋は、融合タンパク質として調製されたインジケータを包含する。
【０１２１】
用語「試料」は、任意の品目、器具、表面、流体、または材料を含む。例としては、臨床試料（例えば、全血、血清、口腔試料（例えば、唾液）、膿、膣試料、糞便試料、吐物）、環境試料（例えば、水、土、空気試料）、手術器具および医療器具、マイクロタイタープレート、ディップスティック、側方流動デバイス（lateral flow devices）、院内室内着、寝具、バルク液、動物廃棄物、薬剤、作業台、壁および床、生物学的マトリックスが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２２】
用語「処理」または「処理プロセス」は、試料中の汚染物質の量または活性を減少するように設計される任意のプロセスを含む。適切な処理は、以下の１つ以上を含む：選択されたｐＨ（例えば、次のｐＨを下回る：ｐＨ  １、２、３、４、５、６もしくは７、または次のｐＨを上回る：ｐＨ  ７、８、９、１０もしくは１１、または約ｐＨ１２）、温度（例えば、少なくとも４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、９０℃、１００℃、１１０℃、１２０℃、１３０℃、１４０℃、１５０℃、もしくは１６０℃、または５０〜１２０℃の間）、または圧力（例えば、少なくとも５０ｋＰａ、７０ｋＰａ、１００ｋＰａ、１５０ｋＰａ、２００ｋＰａ、もしくは２５０ｋＰａ）、プロテアーゼもしくは他の溶解酵素への試料の曝露、界面活性剤、化学滅菌剤、放射線、フリーラジカルもしくは気相滅菌剤への試料の曝露。１つの実施態様では、処理は、感染性生物学的汚染物質（例えば、ＴＳＥ）の感染活性（infectious activity）（感染度（infectivity）としても知られる）を減少させるように設計される。用語「処理」または「処理プロセス」はまた、湿流または乾流の高温オートクレーブ滅菌、オゾン滅菌、Ｈ２Ｏ２滅菌、レンダリング、または生物学的因子を除去または不活性化するように設計された他の方法のような洗浄プロセスおよび不活性化プロセスを含む。本発明の別の実施態様では、インジケータおよび汚染物質ともに、処理プロセスに直接曝露される。すなわち、インジケータ／汚染物質と処理プロセスとの間に封も障壁もない。したがって、インジケータおよび汚染物質は共に、処理プロセスに直接接触し、同じ処理条件に供せられる。
【０１２３】
用語「生物学的成分」は、キナーゼ酵素に共有結合で連結され得る任意の生物学的分子を包含する。生物学的成分は、タンパク質、核酸、脂質、または糖質より選択され得る。生物学的成分は、適切には、処理される試料中の汚染物質の模倣物または代理物であり、したがって汚染物質と実質的に同様にして処理プロセスに反応する。１つの実施態様では、生物学的成分は、処理プロセスに供せられる試料中の汚染物質と同じ（しかし物理的に異なる）であってもよく、例えば、汚染物質がタンパク質である場合、生物学的成分もまたタンパク質である；汚染物質が血液タンパク質である場合、生物学的成分もまた血液タンパク質である；汚染物質がＤＮＡ分子である場合、生物学的成分もまたＤＮＡ分子である；汚染物質がＲＮＡ分子である場合、生物学的成分もまたＲＮＡ分子であるなど、その各々について、本明細書中に開示された汚染物質および生物学的成分であり得る。別の実施態様では、生物学的成分は、汚染物質と異なる。本発明の１つの実施態様では、生物学的成分は、ペプチド、タンパク質またはポリペプチドではない。本発明のさらなる実施態様では、生物学的成分は、オリゴヌクレオチド（例えば、ＨＰＶ１６に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ）ではない。本発明のなおさらなる実施態様では、生物学的成分は、レクチン、成長因子、ＤＮＡ／ＲＮＡアプタマー、バクテリオファージ、または分析物に特異的な結合因子ではない。
【０１２４】
用語「タンパク質」は、任意のタンパク質含有分子もしくはペプチド含有因子を包含する。用語「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」は、本明細書では交互に用いられる。
【０１２５】
用語「血液タンパク質」は、血液中に存在する任意のタンパク質を包含する。特定の例としては、血液凝固タンパク質（例えば、フィブリノーゲン、フィブリンペプチド、フィブリン、トランスグルタミナーゼ基質、トロンビン）、血清タンパク質（例えば、アルブミンおよびグロブリン）、血小板、血球糖タンパク質、およびヘモグロビンが挙げられる。
【０１２６】
用語「細菌タンパク質」は、細菌に由来する任意のタンパク質を包含する。特定の例としては、細菌線毛タンパク質（例えば、大腸菌由来ＣｇｓＡおよびサルモネラ由来AgfA）、細菌毒素タンパク質（例えば、炭疽菌、ジフテリア菌、ボツリヌス菌由来の毒素）、細菌細胞表面タンパク質（例えば、活性汚泥中のフロック形成および糸状性細菌由来の細胞表面接着因子、ペプチドグリカン、リポタンパク質）、および細菌胞子タンパク質（例えば、グラム陽性細菌由来であり、そしてクロストリジウム・テニオスポラムでリボン様付属物を形成するタンパク質に対して同様の配列もしくは全体構造を有する、チャップリンタンパク質Ａ−Ｈ、ロドリンタンパク質Ｒｄ１ＡおよびＲｄ１Ｂ（ストレプトマイセスｓｐｐ由来））が挙げられる。
【０１２７】
用語「ウイルスタンパク質」は、ウイルスに由来する任意のタンパク質を包含する。特定の例としては、ウイルス外被タンパク質、ウイルスエンベロープタンパク質、ウイルスカプシドタンパク質、およびウイルスコアタンパク質が挙げられる。１つの実施態様では、ウイルスタンパク質は、バクテリオファージウイルス由来（例えば、ＭＳ２およびＰＰ７タンパク質）、ノーウォークウイルス由来（例えば、カプシドタンパク質）、ロタウイルス由来（例えば、ＶＰ２、ＶＰ６およびＶＰ７タンパク質）、コロナウイルス由来（例えば、ＳＡＲＳのＳ、ＥおよびＭタンパク質）、青舌病ウイルス由来（例えば、ＶＰ２タンパク質）、ヒトパピローマウイルス由来（例えば、ウイルス主要構造タンパク質、Ｌ１）、Ｂ型肝炎ウイルス由来（例えば、小エンベロープタンパク質ＨＢｓＡｇ）、Ｃ型肝炎ウイルス由来（例えば、コア、Ｅ１およびＥ２タンパク質）、インフルエンザウイルス由来（例えば、ノイラミニダーゼおよびヘマグルチニンおよびマトリックスタンパク質）、ポリオウイルス由来（例えば、カプシドＶＰ０、１および３タンパク質）、ＨＩＶウイルス由来（例えば、Ｐｒ５５ｇａｇ、エンベロープタンパク質）、およびテング熱Ｂウイルス由来（例えば、エンベロープ（ｅ）および前膜／膜(ｐｒＭ／Ｍ)）である。
【０１２８】
用語「真菌タンパク質」は、真菌に由来する任意のタンパク質を包含する。特定の例としては、ハイドロフォビンタンパク質（例えば、スエヒロタケ由来ＳＣ３、アスペルギルス・フミガーテス由来ＲｏｄＡ／Ｂ、および酵母由来の等価タンパク質）、真菌胞子タンパク質、菌糸タンパク質、マイコトキシン、および真菌プリオン（例えば、Ｓｕｐ３５、Ｈｅｔ  Ｓ、Ｕｒｅ  ２、Ｒｎｑ１、Ｎｅｗ  １）が挙げられる。
【０１２９】
用語「自己凝集タンパク質」は、アミロイド原線維または表面反応性バイオフィルムに自己凝集または自己集合し得る任意のタンパク質を包含する。特定の例としては、プリオン（例えば、ＰｒＰＳｃおよびＰｒＰｃ、Ｈｅｔ  Ｓ、Ｕｒｅ  ２、Ｒｎｑ１、Ｎｅｗ  １）、プリオン様タンパク質、アミロイド原線維、活性汚泥中のフロック形成および糸状性細菌由来の細胞表面付着因子、ベータアミロイドタンパク質、タウタンパク質、ポリアデニン結合タンパク質、肺サーファクタントタンパク質Ｃ、大腸菌由来ＣｓｇＡタンパク質、サルモネラ種由来ＡｇｆＡタンパク質、細菌線毛タンパク質、アポリポタンパク質（例えば、アポリポタンパク質Ａ１）、真菌種由来ハイドロフォビン（例えば、スエヒロタケ由来ＳＣ３、アスペルギルス・フミガーテス由来ＲｏｄＡ／Ｂ、チャップリン（Chaplins）（例えば、ストレプトマイセスｓｐｐ由来Ｃｈｐｓ  Ａ−Ｈ）、ロドリン（Rodlins）（例えば、ストレプトマイセスｓｐｐ由来Ｒｄ１ＡおよびＲｄ１Ｂ）、グラム陽性芽胞殻タンパク質（例えば、Ｐ２９ａ、Ｐ２９ｂ、ＧＰ８５およびＳｐｏＶＭアナログ）、およびフジツボセメント様タンパク質（例えば、シロスジフジツボ由来の１９ｋＤａタンパク質、およびアカフジツボ由来の２０ｋＤａタンパク質、およびシロスジフジツボ由来の新規方解石依存性セメント様タンパク質）が挙げられる。
【０１３０】
用語「核酸」は、任意の長さまたは組成のヌクレオチドポリマーを包含する。特定の例としては、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子が挙げられる。１つの実施態様では、核酸は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）または二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）より選択される。別の実施態様では、該核酸は、神経組織に由来する。
【０１３１】
用語「糖質」は、任意の糖質含有分子を包含する。特定の例としては、エキソ多糖類、リポ多糖類（ＥＰＳ／ＬＰＳ、時にエンドトキシンとして知られる）（例えば、レジオネラ（Legionella）、大腸菌、ブドウ球菌属種（Staphylococcus species）、レンサ球菌属種（Streptococcus species）、シュードモナス属種（Pseudomonas species）、アシネトバクター属種（Acinetobactor species）、カンピロバクター属種（Campylobactor species）、およびバシラス属種（Bacillus species）由来）、ペプチドグリカン、植物、真菌および酵母の細胞壁成分（例えば、キチン、リグニン、グルカン）、ムチン調製物、糖脂質（特に脳由来糖脂質）、糖タンパク質（例えば、細胞表面糖タンパク質、Eap1p）、胞子抽出物（例えば、バシラスｓｐｐ、クロストリジウムｓｐｐおよび他の胞子形成物に由来）、酵母被膜由来の多糖類、および無脊椎動物分泌物（例えば、軟体動物ゲル（molluscan gels）由来）が挙げられる。
【０１３２】
用語「脂質」は、任意の脂質含有分子を包含する。特定の例としては、糖脂質（例えば、脳由来糖脂質）、ガングリオシド（例えば、ＧＴ１ｂ、ＧＴ１ａ、ＧＭ１）、ならびに植物油および脂質が挙げられる。
【０１３３】
「トランスグルタミナーゼ基質」は、トランスグルタミナーゼ酵素の基質である任意の分子である。トランスグルタミナーゼは、遊離アミン基（例えば、タンパク質もしくはペプチドが結合したリジン）とタンパク質もしくはペプチドが結合したグルタミンのγ−カルボキサミド基との間の共有結合の形成を触媒する酵素ファミリー（EC 2.3.2.13）である。このような酵素の例としては第VIII因子、ケラチノサイトトランスグルタミナーゼ、および組織トランスグルタミナーゼが挙げられる。フィブリン（第VIII因子によって作用される）は、トランスグルタミナーゼ基質の一例である。
【０１３４】
「生物学的マトリックスまたは混合物」は、タンパク質、脂質、核酸および糖質からなる群より選択される１つ以上の成分を含み得る。１つの実施態様では、それは、タンパク質の混合物であり得、または血液、血清、粘液、卵、神経組織、食物、もしくは動物廃棄物であり得る。生物学的マトリックスまたは混合物はまた、市販の試験用汚れ（test soil）（例えば、ブラウン汚れ（Browne soil）、エジンバラ汚れ（Edinburgh soil））でもあり得る。１つの実施態様では、生物学的マトリックス／混合物は、汚染物質が存在するマトリックス／混合物と同様の組成を有する。本発明の状況においては、生物学的マトリックスは、試験用汚れとも呼ばれ得る。
【０１３５】
汚染物質の「模倣物」または「代理物」である生物学的成分は、汚染物質と非常に類似する（または実質的に同じである）様式で処理プロセスに反応する成分である。同様に、試料の「模倣物」または「代理物」である生物学的マトリックスは、試料と同様の組成を有しかつ実質的に同じ様式で処理プロセスに反応するマトリックスである。
【０１３６】
用語「抗体」は、全長免疫グロブリン、およびその全てのフラグメントおよび誘導体（例えば、免疫グロブリンの重鎖、軽鎖、定常ドメイン、可変ドメイン、Fab領域、Fc領域など）を包含する。
【０１３７】
用語「フィブリン」は、全てのフィブリン由来ペプチドを包含する。これは、全長フィブリンペプチド、およびその全てのフラグメントおよび誘導体を含む。それは、フィブリン反応性を有する全てのペプチド（例えば、第VIII因子によって作用されてクロットを形成するペプチド）を包含する。用語フィブリンまたはフィブリンペプチドは、本明細書の全体を通じて用語「トランスグルタミナーゼ基質」と交互に用いられ得る。
【０１３８】
用語「光出力」は、ＡＴＰと生物発光試薬との反応によって発せられる光を意味する。この光出力は、完全に従来の技術（例えば、標準のルミノメーター（例えば、Berthold Orion 96ウェルマイクロプレートルミノメータ、または携帯ルミノメーター））を用いて検出され得る。
【０１３９】
用語「レポーターキナーゼ」は、試験される試料中に固有に存在しないキナーゼ酵素をいう。すなわち、キナーゼは試料に対して外因性である。レポーターキナーゼは、別の試薬として試料に添加される（例えば、単離されたキナーゼとして）。１つの実施態様では、レポーターキナーゼは熱安定性である。
【０１４０】
用語「熱安定性キナーゼ」は、熱への曝露後に活性を保持する（すなわち、高温によって比較的影響を受けない）キナーゼをいう。本発明の１つの実施態様では、熱安定性キナーゼは、５０〜１２０℃の間の温度への曝露後、少なくとも７０％の活性（または８０％の活性、９０％の活性、９５％の活性、もしくは１００％の活性）を保持する。別の実施態様では、熱安定性キナーゼは、４０℃にて３０分間の曝露後、または５０℃にて３０分間の曝露後、または６０℃にて３０分間の曝露後、または７０℃にて３０分間の曝露後、または８０℃にて２０分間の曝露後、または９０℃にて１０分間の曝露後、または１２０℃にて３分間の曝露後、少なくとも７０％の活性（または８０％の活性、９０％の活性、９５％の活性、もしくは１００％の活性）を保持する。熱安定性キナーゼはまた、通常タンパク質を損傷もしくは破壊またはタンパク質を不活性にする種々の他の生化学的プロセスおよび物理的プロセス（例えば、特定化学薬品（例えば、カオトロープ）への曝露、フリーラジカル損傷、界面活性剤、ｐＨの極限、プロテアーゼへの曝露、タンパク質架橋、非透過または半透過膜またはポリマー内へのカプセル封入、表面への不可逆的な固定化など）に対して、非熱安定性キナーゼより耐性であり得る。特定の実施態様では、熱安定性キナーゼは、上記の生化学的プロセスおよび物理的プロセスの１つ以上への曝露後、少なくとも７０％の活性（または８０％の活性、９０％の活性、９５％の活性、もしくは１００％の活性）を保持し得る。全ての場合において、この「保持された活性」は、従来の試験を用いて容易に確認され得る。簡潔に言えば、キナーゼを、所与量の時間にわたって所与の条件下でＡＤＰとインキュベートし、次いで、ルシフェリン／ルシフェラーゼおよびルミノメーターを用いてＡＴＰの生成を検出することにより残余活性について分析する。これから、処理後に保持されたキナーゼ活性の％を決定し得る。
【０１４１】
用語「キナーゼ」および「キナーゼ活性」は、本明細書の全体にわたって交互に用いられる。
【０１４２】
用語「生物発光試薬」は、ＡＴＰと反応して光を生じ得る任意の物質または物質混合物（例えば、ルシフェリンとルシフェラーゼとの混合物）をいう。
【０１４３】
用語「ＲＬＵ」とは、相対発光量を意味する。相対発光量は、相対的な（絶対的ではない）測定値である。本明細書に示した数値は、ルシフェラーゼ／ルシフェリン試薬の添加直後の２秒間の光測定の「フラッシュ」法を用いるインジェクターシステムを備えたBerthold Orion ９６ウェルマイクロプレートルミノメーター（３００〜６５０ｎｍの波長で放射された光を測定する技術仕様光電子増倍管）を用いて求めた測定値に関する。この点に取り組むために、製造業者は、ＲＬＵ「係数」についてのデータを作成しており、所定のルミノメーターにより生じたデータを、較正標準に対して正規化させる。したがって、異なる器具間で、比較がなされ得る。Berthold Orion ９６ウェルマイクロプレートルミノメーターについてのＲＬＵ係数は１である。したがって、本明細書中で示されたＲＬＵ値は、標準化／正規化されたＲＬＵ値としてみなされ得る。
【０１４４】
絶対値の点では、ＲＬＵ値は、本方法に記載されるような試薬を用いて該値を得るのに必要なＡＴＰ濃度に関連し得る。近似変換として、そしてＲＬＵ値とＡＴＰ濃度との間の線形関係を考慮すると、以下の値が用いられ得る：
【０１４５】
【数１】
0005597552.tif 000002
【０１４６】
本願で引用される全ての文献は、その全体が参照によって本明細書に援用される。
【０１４７】
ここで、本発明を、以下の実施例で、および添付の図面を参照して、特定の実施態様において記載する。
【０１４８】
（配列番号）
配列番号１：Sulfolobus solfataricus由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号２：Sulfolobus acidocaldarius由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号３：Sulfolobus tokodaii由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号４：Pyrococcus furiosus由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号５：Pyrococcus horikoshii由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号６：Pyrococcus abyssi由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号７：Methanococcus thermolithotrophicus由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号８：Methanococcus voltae由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号９：Methanococcus jannaschii由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号１０：Methanopyrus kandleri由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号１１：Methanotorris igneus由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号１２：Pyrobaculum aerophilum由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号１３：Thermotoga maritima由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号１４：Aeropyrum pernix由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号１５：Archaeoglobus fulgidus由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号１６：Pyrococcus abyssi由来のアデニル酸キナーゼ（単量体アデニル酸キナーゼ（ＡｄｋＥ））のタンパク質配列
配列番号１７：改善された安定性を提供するように遺伝子操作されたPyrococcus furiosus由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号１８：改善された安定性を提供するように遺伝子操作されたPyrococcus horikoshii由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号１９：改善された安定性を提供するように遺伝子操作されたSulfolobus acidocaldarius由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号２０：Thermotoga maritima由来の酢酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号２１：Pyrococcus horikoshii由来のピルビン酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号２２：Sulfolobus solfataricus由来のピルビン酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号２３：Thermotoga maritima由来のピルビン酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号２４：Pyrococcus furiosus由来のピルビン酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号２５：Methanosarcina thermophila由来の酢酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号２６：Sulfolobus acidocaldarius由来のアデニル酸キナーゼをコードするＤＮＡ配列
配列番号２７：Sulfolobus acidocaldarius由来のアデニル酸キナーゼをコードするＤＮＡ配列であり、コドン使用は大腸菌での遺伝子の発現のために最適化されている
配列番号２８：Thermotoga maritima由来のアデニル酸キナーゼをコードするＤＮＡ配列
配列番号２９：Thermotoga maritima由来のアデニル酸キナーゼをコードするＤＮＡ配列であり、コドン使用は大腸菌での遺伝子の発現のために最適化されている
配列番号３０：Archaeoglobus fulgidus由来のアデニル酸キナーゼをコードするＤＮＡ配列であり、コドン使用は大腸菌での遺伝子の発現のために最適化されている
配列番号３１：Sulfolobus acidocaldarius由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列であり、コドン使用は大腸菌での遺伝子の発現のために最適化されている（配列番号２７）
配列番号３２：Thermotoga maritima由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列であり、コドン使用は大腸菌での遺伝子の発現のために最適化されている（配列番号２９）
配列番号３３：トランスグルタミナーゼ基質のタンパク質配列
配列番号３４：トランスグルタミナーゼ（因子ＸＩＩＩ）基質配列とＮ末端で融合したSulfolobus acidcaldarius由来の熱安定性アデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号３５：トランスグルタミナーゼ（因子ＸＩＩＩ）基質配列とＣ末端で融合したSulfolobus acidcaldarius由来の熱安定性アデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号３６：トランスグルタミナーゼ（因子ＸＩＩＩ）基質配列とＮ末端およびＣ末端で融合したSulfolobus acidcaldarius由来の熱安定性アデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号３７：Thermotoga maritima由来のアデニル酸キナーゼの５’末端に融合したトランスグルタミナーゼ（因子ＸＩＩＩ）基質配列のＤＮＡ配列
配列番号３８：トランスグルタミナーゼ（因子ＸＩＩＩ）基質配列とＮ末端で融合したThermotoga maritima由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号３９：Thermotoga maritima由来のアデニル酸キナーゼの３’末端に融合したトランスグルタミナーゼ（因子ＸＩＩＩ）基質配列のＤＮＡ配列
配列番号４０：トランスグルタミナーゼ（因子ＸＩＩＩ）基質配列とＣ末端で融合したThermotoga maritima由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号４１：Thermotoga maritima由来のアデニル酸キナーゼの５’末端および３’末端の両方に融合したトランスグルタミナーゼ（因子ＸＩＩＩ）基質配列のＤＮＡ配列
配列番号４２：トランスグルタミナーゼ（因子ＸＩＩＩ）基質配列とＮ末端およびＣ末端で融合したThermotoga maritima由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号４３：Saccharomyces cerevisiae由来の完全Ｓｕｐ３５遺伝子構築物のＤＮＡ配列
配列番号４４：Saccharomyces cerevisiae由来の完全Ｓｕｐ３５のタンパク質配列
配列番号４５：大腸菌での最適発現のためのコドンが偏ったＳｕｐ３５Ｎ（Ｎ末端ドメイン）のＤＮＡ配列
配列番号４６：Ｓｕｐ３５Ｎ（Ｎ末端ドメイン）のタンパク質配列
配列番号４７：Saccharomyces cerevisiae由来のＳｕｐ３５  Ｎ末端ドメインとＮ末端で融合したSulfolobus acidcaldarius由来のアデニル酸キナーゼの大腸菌コドンバイアスのあるアデニル酸キナーゼのＤＮＡ配列
配列番号４８：Saccharomyces cerevisiae由来のＳｕｐ３５  Ｎ末端ドメインとＮ末端で融合したSulfolobus acidcaldarius由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号４９：Saccharomyces cerevisiae由来のＳｕｐ３５  Ｎ末端ドメインとＣ末端で融合したSulfolobus acidcaldarius由来のアデニル酸キナーゼの大腸菌コドンバイアスのあるＤＮＡ配列
配列番号５０：Saccharomyces cerevisiae由来のＳｕｐ３５  Ｎ末端ドメインとＣ末端で融合したSulfolobus acidcaldarius由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号５１：Thermotoga maritima由来のアデニル酸キナーゼの５’末端で融合したＳｕｐ３５ＮのＤＮＡ配列
配列番号５２：Ｓｕｐ３５ＮとＮ末端で融合したThermotoga maritima由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号５３：Thermotoga maritima由来のアデニル酸キナーゼの３’末端で融合したＳｕｐ３５ＮのＤＮＡ配列
配列番号５４：Ｓｕｐ３５ＮとＣ末端で融合したThermotoga maritima由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号５５：ｔＡＫ遺伝子を有する融合ペプチドとして使用するための、凝集してアミロイド原線維を形成し得る短いＳｕｐ３５ペプチドをコードするＤＮＡ配列
配列番号５６：Ｓｕｐ３５由来アミロイドペプチド
配列番号５７：ノロウイルスカプシドタンパク質（５８ｋＤａ）をコードするＤＮＡ配列
配列番号５８：ノロウイルスカプシドタンパク質（５８ｋＤａ）のタンパク質配列
配列番号５９：大腸菌での発現のために最適化されたノロウイルスカプシドタンパク質（５８ｋＤａ）をコードする合成遺伝子のＤＮＡ配列
配列番号６０：Thermotoga maritima由来のｔＡＫをコードする遺伝子の５’末端で融合した、大腸菌での発現のために最適化されたノロウイルスカプシドタンパク質（５８ｋＤａ）をコードする合成遺伝子のＤＮＡ配列
配列番号６１：Thermotoga maritima由来のアデニル酸キナーゼのＮ末端で融合したノロウイルスカプシドタンパク質（５８ｋＤａ）のタンパク質配列
配列番号６２：バクテリオファージＭＳ２外被タンパク質のタンパク質配列
配列番号６３：バクテリオファージＰＰ７外被タンパク質単量体のタンパク質配列
配列番号６４：バクテリオファージＰＰ７外被タンパク質二量体のタンパク質配列
配列番号６５：大腸菌ＣｓｇＡのタンパク質配列
配列番号６６：サルモネラＡｇｆＡのタンパク質配列
配列番号６７：大腸菌ＣｓｇＡのＮ末端と結合したThermotoga maritima由来のアデニル酸キナーゼのタンパク質配列
配列番号６８：フザリウム属種由来のハイドロフォビン３タンパク質のタンパク質配列
配列番号６９：フザリウム属種由来のハイドロフォビン５タンパク質のタンパク質配列
配列番号７０：シロスジフジツボ由来のセメント様タンパク質（１９Ｋ）のタンパク質配列
配列番号７１：アカフジツボ由来のセメント様タンパク質（２０Ｋ）のタンパク質配列
配列番号７２：Thermotoga maritima由来のｔＡＫとのシロスジフジツボ由来のフジツボタンパク質の融合物のタンパク質配列；Ｎ末端融合
配列番号７３：Thermotoga maritima由来のｔＡＫとのシロスジフジツボ由来のフジツボタンパク質の融合物のタンパク質配列；Ｃ末端融合
配列番号７４：シロスジフジツボ方解石特異的吸着物質のタンパク質配列
配列番号７５：フジツボセメントタンパク質由来のペプチドのタンパク質配列
配列番号７６：フジツボセメントタンパク質由来のペプチドのタンパク質配列
配列番号７７：フジツボセメントタンパク質由来のペプチドのタンパク質配列
【実施例】
【０１４９】
（実施例１）
（天然型アデニル酸キナーゼ酵素の精製）
２４の種々の好熱性微生物および超好熱性微生物からバイオマスを作製した（表１）。
【０１５０】
古細菌の８つのメンバーを、１６の種々の好気性細菌および嫌気性細菌とともに表した。これらの生物の各々に由来するＡＫを、Cibacron Blue 3A（Blue Sepharose）から選択的吸着および脱着を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。全ての酵素をさらに特徴付け、そしてゲル濾過（Superdex G200）によって精製した。これは、主要なＡＫ画分の同定および分子量の推定を可能にした。
【０１５１】
【表１】
0005597552.tif 000003
【０１５２】
（実施例２）
（天然型アデニル酸キナーゼの熱安定性の分析）
好熱性生物に由来するバイオマスから単離したアデニル酸キナーゼの７０℃、８０℃、および９０℃にての熱安定性を評価し、そしてそれらの結果を図１に示した。
【０１５３】
アデニル酸キナーゼを、Cibacron Blue 3A（Blue Sepharose）から選択的吸着および脱着を用いるアフィニティークロマトグラフィーによってバイオマスから単離した。カラムから溶出した試料を1:10000希釈し、次いで各々１０μlをマイクロタイターウェルに添加した。2.5μlのアピラーゼを各ウェルに添加し、溶出緩衝液から存在するＡＴＰを破壊し、そして３７℃にて３０分間インキュベートした。アピラーゼを６５℃にて２０分間の熱処理によって不活性化した。
【０１５４】
ＡＤＰ基質を添加し、そして７０℃（パネルＡ）、８０℃（パネルＢ）、または９０℃（パネルＣ）のいずれかにて３０分間インキュベートし、そして２５℃まで冷却し、その後１０μlのＤ−ルシフェリン−ルシフェラーゼ試薬を添加した。生じたＡＴＰを、プレートルミノメーター上でＲＬＵとして測定した。
【０１５５】
（実施例３）
（組換えアデニル酸キナーゼの発現および精製）
代表的な熱安定性ＡＫを発現するクローンを獲得し、そして好熱酸性古細菌Sulfolobusacidocaldariusおよび好熱性細菌Bacillus stearothermophilus由来の組換え熱安定性ＡＫを生成した。プラスミドを大腸菌に形質転換し、そして細胞抽出物は、ＡＫの予測分子量に相当する電気泳動でのタンパク質バンドを含有することが示された。適切な温度（Sulfolobus acidocaldarius ＡＫは８０℃およびBacillus stearothermophilus ＡＫは６０℃）でのインキュベーション後に、熱安定性ＡＫ活性を測定した。
【０１５６】
両方の熱安定性ＡＫについての精製方法は確立されている。この方法には、８０℃にて２０分間のインキュベーションの初期熱処理により大腸菌由来のタンパク質を不活性化して凝集し、その後アフィニティークロマトグラフィーおよびゲル濾過を行うことが含まれた。アフィニティークロマトグラフィーは、Blue Sepharoseへの酵素の吸着、次いで低濃度のＡＫ補因子（ＡＭＰ＋ＡＴＰおよびマグネシウムイオン）を用いる特異的溶出を含んだ。溶出緩衝液中のＡＴＰおよびＡＭＰ（Sigma）を、中温性アピラーゼとのインキュベーションにより分解した。中温性アピラーゼは引き続く熱処理によって容易に不活性化される。ゲル濾過クロマトグラフィーをスケールアップし、分取用Superdexカラムを使用して、両酵素を大量に調製できるようにした。
【０１５７】
候補の天然型酵素のスクリーニングの間に同定された好熱性生物由来のＡＫ遺伝子のＰＣＲ増幅のために、プライマーを設計した。
【０１５８】
熱安定性微生物を個々に既定されている増殖条件を用いて増殖させ、そしてゲノムＤＮＡを単離し、そして各生物由来のアデニル酸キナーゼ遺伝子のＰＣＲ増幅の鋳型として使用した。好熱性生物であるThermotoga maritima、Aeropyrum pernix、Sulfolobus acidocaldariusおよびSulfolobus solfataricus由来のＰＣＲ増幅したアデニル酸キナーゼ遺伝子をベクターpET28aにサブクローニングし、そして稀なtRNA（rare tRNA）を発現するコドン増強大腸菌株（Zdanovskyら、2000）に形質転換した。この大腸菌株は、ＡＴリッチ遺伝子の発現レベルの増強に適している。
【０１５９】
形質転換の成功をミニ発現試験によって評価し、そしてこの結果を、ＩＰＴＧでの誘導の前および後に、培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、熱処理工程を含んだ後の上清の分析にも使用した。この熱処理工程は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに流す前に試料を８０℃まで２０分間加熱して、試料中に存在する熱不安定タンパク質を除去することからなる。
【０１６０】
配列
配列番号１−Sulfolobus solfataricus由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＫＩＧＩＶＴＧＩＰ  ＧＶＧＫＴＴＶＬＳＦ  ＡＤＫＩＬＴＥＫＧＩ  
ＳＨＫＩＶＮＹＧＤＹ  ＭＬＮＴＡＬＫＥＧＹ  ＶＫＳＲＤＥＩＲＫＬ  
ＱＩＥＫＱＲＥＬＱＡ  ＬＡＡＲＲＩＶＥＤＬ  ＳＬＬＧＤＥＧＩＧＬ  
ＩＤＴＨＡＶＩＲＴＰ  ＡＧＹＬＰＧＬＰＲＨ  ＶＩＥＶＬＳＰＫＶＩ  
ＦＬＬＥＡＤＰＫＩＩ  ＬＥＲＱＫＲＤＳＳＲ  ＡＲＴＤＹＳＤＴＡＶ  
ＩＮＥＶＩＱＦＡＲＹ  ＳＡＭＡＳＡＶＬＶＧ  ＡＳＶＫＶＶＶＮＱＥ  
ＧＤＰＳＩＡＡＳＥＩ  ＩＮＳＬＭ
【０１６１】
配列番号２−Sulfolobus acidocaldarius由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＫＩＧＩＶＴＧＩＰ  ＧＶＧＫＳＴＶＬＡＫ  ＶＫＥＩＬＤＮＱＧＩ  
ＮＮＫＩＩＮＹＧＤＦ  ＭＬＡＴＡＬＫＬＧＹ  ＡＫＤＲＤＥＭＲＫＬ  
ＳＶＥＫＱＫＫＬＱＩ  ＤＡＡＫＧＩＡＥＥＡ  ＲＡＧＧＥＧＹＬＦＩ  
ＤＴＨＡＶＩＲＴＰＳ  ＧＹＬＰＧＬＰＳＹＶ  ＩＴＥＩＮＰＳＶＩＦ  
ＬＬＥＡＤＰＫＩＩＬ  ＳＲＱＫＲＤＴＴＲＮ  ＲＮＤＹＳＤＥＳＶＩ  
ＬＥＴＩＮＦＡＲＹＡ  ＡＴＡＳＡＶＬＡＧＳ  ＴＶＫＶＩＶＮＶＥＧ  
ＤＰＳＩＡＡＮＥＩＩ  ＲＳＭＫ
【０１６２】
配列番号３−Sulfolobus tokodaii由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＳＫＭＫＩＧＩＶＴ  ＧＩＰＧＶＧＫＴＴＶ  ＬＳＫＶＫＥＩＬＥＥ  
ＫＫＩＮＮＫＩＶＮＹ  ＧＤＹＭＬＭＴＡＭＫ  ＬＧＹＶＮＮＲＤＥＭ  
ＲＫＬＰＶＥＫＱＫＱ  ＬＱＩＥＡＡＲＧＩＡ  ＮＥＡＫＥＧＧＤＧＬ  
ＬＦＩＤＴＨＡＶＩＲ  ＴＰＳＧＹＬＰＧＬＰ  ＫＹＶＩＥＥＩＮＰＲ  
ＶＩＦＬＬＥＡＤＰＫ  ＶＩＬＤＲＱＫＲＤＴ  ＳＲＳＲＳＤＹＳＤＥ  
ＲＩＩＳＥＴＩＮＦＡ  ＲＹＡＡＭＡＳＡＶＬ  ＶＧＡＴＶＫＩＶＩＮ  
ＶＥＧＤＰＡＶＡＡＮ  ＥＩＩＮＳＭＬ
【０１６３】
配列番号４−Pyrococcus furiosus由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＰＦＶＶＩＩＴＧＩ  ＰＧＶＧＫＳＴＩＴＲ  ＬＡＬＱＲＴＫＡＫＦ  
ＲＬＩＮＦＧＤＬＭＦ  ＥＥＡＶＫＡＧＬＶＫ  ＨＲＤＥＭＲＫＬＰＬ  
ＫＩＱＲＥＬＱＭＫＡ  ＡＫＫＩＴＥＭＡＫＥ  ＨＰＩＬＶＤＴＨＡＴ  
ＩＫＴＰＨＧＹＭＬＧ  ＬＰＹＥＶＶＫＴＬＮ  ＰＮＦＩＶＩＩＥＡＴ  
ＰＳＥＩＬＧＲＲＬＲ  ＤＬＫＲＤＲＤＶＥＴ  ＥＥＱＩＱＲＨＱＤＬ  
ＮＲＡＡＡＩＡＹＡＭ  ＨＳＮＡＬＩＫＩＩＥ  ＮＨＥＤＫＧＬＥＥＡ  
ＶＮＥＬＶＫＩＬＤＬ  ＡＶＮＥＹＡ
【０１６４】
配列番号５−Pyrococcus horikoshii由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＰＦＶＶＩＩＴＧＩ  ＰＧＶＧＫＳＴＩＴＫ  ＬＡＬＱＲＴＲＡＫＦ  
ＫＬＩＮＦＧＤＬＭＦ  ＥＥＡＬＫＬＫＬＶＫ  ＨＲＤＥＭＲＫＬＰＬ  
ＥＶＱＲＥＬＱＭＮＡ  ＡＫＫＩＡＥＭＡＫＮ  ＹＰＩＬＬＤＴＨＡＴ  
ＩＫＴＰＨＧＹＬＬＧ  ＬＰＹＥＶＩＫＩＬＮ  ＰＮＦＩＶＩＩＥＡＴ  
ＰＳＥＩＬＧＲＲＬＲ  ＤＬＫＲＤＲＤＶＥＴ  ＥＥＱＩＱＲＨＱＤＬ  
ＮＲＡＡＡＩＴＹＡＭ  ＨＳＮＡＬＩＫＩＩＥ  ＮＨＥＤＫＧＬＥＥＡ  
ＶＮＥＬＶＫＩＬＤＬ  ＡＶＫＥＹＡ
【０１６５】
配列番号６−Pyrococcus abyssi由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＳＦＶＶＩＩＴＧＩ  ＰＧＶＧＫＳＴＩＴＲ  ＬＡＬＱＲＴＫＡＫＦ  
ＫＬＩＮＦＧＤＬＭＦ  ＥＥＡＶＫＡＧＬＶＮ  ＨＲＤＥＭＲＫＬＰＬ  
ＥＩＱＲＤＬＱＭＫＶ  ＡＫＫＩＳＥＭＡＲＱ  ＱＰＩＬＬＤＴＨＡＴ  
ＩＫＴＰＨＧＹＬＬＧ  ＬＰＹＥＶＩＫＴＬＮ  ＰＮＦＩＶＩＩＥＡＴ  
ＰＳＥＩＬＧＲＲＬＲ  ＤＬＫＲＤＲＤＶＥＴ  ＥＥＱＩＱＲＨＱＤＬ  
ＮＲＡＡＡＩＡＹＡＭ  ＨＳＮＡＬＩＫＩＩＥ  ＮＨＥＤＫＧＬＥＥＡ  
ＶＮＥＬＶＥＩＬＤＬ  ＡＶＫＥＹＡ
【０１６６】
配列番号７−Methanococcus thermolithotrophicus由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＫＮＫＬＶＶＶＴＧ  ＶＰＧＶＧＧＴＴＩＴ  ＱＫＡＭＥＫＬＳＥＥ  
ＧＩＮＹＫＭＶＮＦＧ  ＴＶＭＦＥＶＡＱＥＥ  ＮＬＶＥＤＲＤＱＭＲ  
ＫＬＤＰＤＴＱＫＲＩ  ＱＫＬＡＧＲＫＩＡＥ  ＭＶＫＥＳＰＶＶＶＤ  
ＴＨＳＴＩＫＴＰＫＧ  ＹＬＰＧＬＰＶＷＶＬ  ＮＥＬＮＰＤＩＩＩＶ  
ＶＥＴＳＧＤＥＩＬＩ  ＲＲＬＮＤＥＴＲＮＲ  ＤＬＥＴＴＡＧＩＥＥ  
ＨＱＩＭＮＲＡＡＡＭ  ＴＹＧＶＬＴＧＡＴＶ  ＫＩＩＱＮＫＮＮＬＬ  
ＤＹＡＶＥＥＬＩＳＶ  ＬＲ
【０１６７】
配列番号８−Methanococcus voltae由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＫＮＫＶＶＶＶＴＧ  ＶＰＧＶＧＳＴＴＳＳ  ＱＬＡＭＤＮＬＲＫＥ  
ＧＶＮＹＫＭＶＳＦＧ  ＳＶＭＦＥＶＡＫＥＥ  ＮＬＶＳＤＲＤＱＭＲ  
ＫＭＤＰＥＴＱＫＲＩ  ＱＫＭＡＧＲＫＩＡＥ  ＭＡＫＥＳＰＶＡＶＤ  
ＴＨＳＴＶＳＴＰＫＧ  ＹＬＰＧＬＰＳＷＶＬ  ＮＥＬＮＰＤＬＩＩＶ  
ＶＥＴＴＧＤＥＩＬＭ  ＲＲＭＳＤＥＴＲＶＲ  ＤＬＤＴＡＳＴＩＥＱ  
ＨＱＦＭＮＲＣＡＡＭ  ＳＹＧＶＬＴＧＡＴＶ  ＫＩＶＱＮＲＮＧＬＬ  
ＤＱＡＶＥＥＬＴＮＶ  ＬＲ
【０１６８】
配列番号９−Methanococcus jannaschii由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＭＭＭＫＮＫＶＶＶ  ＩＶＧＶＰＧＶＧＳＴ  ＴＶＴＮＫＡＩＥＥＬ  
ＫＫＥＧＩＥＹＫＩＶ  ＮＦＧＴＶＭＦＥＩＡ  ＫＥＥＧＬＶＥＨＲＤ  
ＱＬＲＫＬＰＰＥＥＱ  ＫＲＩＱＫＬＡＧＫＫ  ＩＡＥＭＡＫＥＦＮＩ  
ＶＶＤＴＨＳＴＩＫＴ  ＰＫＧＹＬＰＧＬＰＡ  ＷＶＬＥＥＬＮＰＤＩ  
ＩＶＬＶＥＡＥＮＤＥ  ＩＬＭＲＲＬＫＤＥＴ  ＲＱＲＤＦＥＳＴＥＤ  
ＩＧＥＨＩＦＭＮＲＣ  ＡＡＭＴＹＡＶＬＴＧ  ＡＴＶＫＩＩＫＮＲＤ  
ＦＬＬＤＫＡＶＱＥＬ  ＩＥＶＬＫ
【０１６９】
配列番号１０−Methanopyrus kandleri由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＧＹＶＩＶＡＴＧＶ  ＰＧＶＧＡＴＴＶＴＴ  ＥＡＶＫＥＬＥＧＹＥ  
ＨＶＮＹＧＤＶＭＬＥ  ＩＡＫＥＥＧＬＶＥＨ  ＲＤＥＩＲＫＬＰＡＥ  
ＫＱＲＥＩＱＲＬＡＡ  ＲＲＩＡＫＭＡＥＥＫ  ＥＧＩＩＶＤＴＨＣＴ  
ＩＫＴＰＡＧＹＬＰＧ  ＬＰＩＷＶＬＥＥＬＱ  ＰＤＶＩＶＬＩＥＡＤ  
ＰＤＥＩＭＭＲＲＶＫ  ＤＳＥＥＲＱＲＤＹＤ  ＲＡＨＥＩＥＥＨＱＫ  
ＭＮＲＭＡＡＭＡＹＡ  ＡＬＴＧＡＴＶＫＩＩ  ＥＮＨＤＤＲＬＥＥＡ  
ＶＲＥＦＶＥＴＶＲＳ  Ｌ
【０１７０】
配列番号１１−Methanotorris igneus由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＫＮＫＶＶＶＶＴＧ  ＶＰＧＶＧＧＴＴＬＴ  ＱＫＴＩＥＫＬＫＥＥ  
ＧＩＥＹＫＭＶＮＦＧ  ＴＶＭＦＥＶＡＫＥＥ  ＧＬＶＥＤＲＤＱＭＲ  
ＫＬＤＰＤＴＱＫＲＩ  ＱＫＬＡＧＲＫＩＡＥ  ＭＡＫＥＳＮＶＩＶＤ  
ＴＨＳＴＶＫＴＰＫＧ  ＹＬＡＧＬＰＩＷＶＬ  ＥＥＬＮＰＤＩＩＶＩ  
ＶＥＴＳＳＤＥＩＬＭ  ＲＲＬＧＤＡＴＲＮＲ  ＤＩＥＬＴＳＤＩＤＥ  
ＨＱＦＭＮＲＣＡＡＭ  ＡＹＧＶＬＴＧＡＴＶ  ＫＩＩＫＮＲＤＧＬＬ  
ＤＫＡＶＥＥＬＩＳＶ  ＬＫ
【０１７１】
配列番号１２−Pyrobaculum aerophilum由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＫＩＶＩＶＡＬＰＧ  ＳＧＫＴＴＩＬＮＦＶ  ＫＱＫＬＰＤＶＫＩＶ  
ＮＹＧＤＶＭＬＥＩＡ  ＫＫＲＦＧＩＱＨＲＤ  ＥＭＲＫＫＩＰＶＤＥ  
ＹＲＫＶＱＥＥＡＡＥ  ＹＩＡＳＬＴＧＤＶＩ  ＩＤＴＨＡＳＩＫＩＧ  
ＧＧＹＹＰＧＬＰＤＲ  ＩＩＳＫＬＫＰＤＶＩ  ＬＬＬＥＹＤＰＫＶＩ  
ＬＥＲＲＫＫＤＰＤＲ  ＦＲＤＬＥＳＥＥＥＩ  ＥＭＨＱＱＡＮＲＹＹ  
ＡＦＡＡＡＮＡＧＥＳ  ＴＶＨＶＬＮＦＲＧＫ  ＰＥＳＲＰＦＥＨＡＥ  
ＶＡＡＥＹＩＶＮＬＩ  ＬＲＴＲＱＫＳ
【０１７２】
配列番号１３−Thermotoga maritima由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＭＡＹＬＶＦＬＧＰ  ＰＧＡＧＫＧＴＹＡＫ  ＲＩＱＥＫＴＧＩＰＨ  
ＩＳＴＧＤＩＦＲＤＩ  ＶＫＫＥＮＤＥＬＧＫ  ＫＩＫＥＩＭＥＫＧＥ  
ＬＶＰＤＥＬＶＮＥＶ  ＶＫＲＲＬＳＥＫＤＣ  ＥＫＧＦＩＬＤＧＹＰ  
ＲＴＶＡＱＡＥＦＬＤ  ＳＦＬＥＳＱＮＫＱＬ  ＴＡＡＶＬＦＤＶＰＥ  
ＤＶＶＶＱＲＬＴＳＲ  ＲＩＣＰＫＣＧＲＩＹ  ＮＭＩＳＬＰＰＫＥＤ  
ＥＬＣＤＤＣＫＶＫＬ  ＶＱＲＤＤＤＫＥＥＴ  ＶＲＨＲＹＫＶＹＬＥ  
ＫＴＱＰＶＩＤＹＹＧ  ＫＫＧＩＬＫＲＶＤＧ  ＴＩＧＩＤＮＶＶＡＥ  
ＶＬＫＩＩＧＷＳＤＫ
【０１７３】
配列番号１４−Aeropyrum pernix由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＫＶＲＨＰＦＫＶＶ  ＶＶＴＧＶＰＧＶＧＫ  ＴＴＶＩＫＥＬＱＧＬ  
ＡＥＫＥＧＶＫＬＨＩ  ＶＮＦＧＳＦＭＬＤＴ  ＡＶＫＬＧＬＶＥＤＲ  
ＤＫＩＲＴＬＰＬＲＲ  ＱＬＥＬＱＲＥＡＡＫ  ＲＩＶＡＥＡＳＫＡＬ  
ＧＧＤＧＶＬＩＩＤＴ  ＨＡＬＶＫＴＶＡＧＹ  ＷＰＧＬＰＫＨＶＬＤ  
ＥＬＫＰＤＭＩＡＶＶ  ＥＡＳＰＥＥＶＡＡＲ  ＱＡＲＤＴＴＲＹＲＶ  
ＤＩＧＧＶＥＧＶＫＲ  ＬＭＥＮＡＲＡＡＳＩ  ＡＳＡＩＱＹＡＳＴＶ  
ＡＩＶＥＮＲＥＧＥＡ  ＡＫＡＡＥＥＬＬＲＬ  ＩＫＮＬ
【０１７４】
配列番号１５−Archaeoglobus fulgidus由来のアデニル酸キナーゼ
ＭＮＬＩＦＬＧＰＰＧ  ＡＧＫＧＴＱＡＫＲＶ  ＳＥＫＹＧＩＰＱＩＳ  
ＴＧＤＭＬＲＥＡＶＡ  ＫＧＴＥＬＧＫＫＡＫ  ＥＹＭＤＫＧＥＬＶＰ  
ＤＥＶＶＩＧＩＶＫＥ  ＲＬＱＱＰＤＣＥＫＧ  ＦＩＬＤＧＦＰＲＴＬ  
ＡＱＡＥＡＬＤＥＭＬ  ＫＥＬＮＫＫＩＤＡＶ  ＩＮＶＶＶＰＥＥＥＶ  
ＶＫＲＩＴＹＲＲＴＣ  ＲＮＣＧＡＶＹＨＬＩ  ＹＡＰＰＫＥＤＮＫＣ  
ＤＫＣＧＧＥＬＹＱＲ  ＤＤＫＥＥＴＶＲＥ  ＲＹＲＶＹＫＱＮＴＥ  
ＰＬＩＤＹＹＲＫＫＧ  ＩＬＹＤＶＤＧＴＫＤ  ＩＥＧＶＷＫＥＩＥＡ  
ＩＬＥＫＩＫＳ
【０１７５】
配列番号１６−Pyrococcus abyssi由来の単量体アデニル酸キナーゼ（ＡｄｋＥ）
ＭＮＩＬＩＦＧＰＰＧ  ＳＧＫＳＴＱＡＲＲＩ  ＴＥＲＹＧＬＴＹＩＡ  
ＳＧＤＩＩＲＡＥＩＫ  ＡＲＴＰＬＧＩＥＭＥ  ＲＹＬＳＲＧＤＬＩＰ  
ＤＴＩＶＮＴＬＩＩＳ  ＫＬＲＲＶＲＥＮＦＩ  ＭＤＧＹＰＲＴＰＥＱ  
ＶＩＴＬＥＮＹＬＹＤ  ＨＧＩＫＬＤＶＡＩＤ  ＩＹＩＴＫＥＥＳＶＲ  
ＲＩＳＧＲＲＩＣＳＫ  ＣＧＡＶＹＨＶＥＦＮ  ＰＰＫＶＰＧＫＣＤＩ  
ＣＧＧＥＬＩＱＲＰＤ  ＤＲＰＥＩＶＥＫＲＹ  ＤＩＹＳＫＮＭＥＰＩ  
ＩＫＦＹＱＫＱＧＩＹ  ＶＲＩＤＧＨＧＳＩＤ  ＥＶＷＥＲＩＲＰＬＬ  
ＤＹＩＹＮＱＥＮＲＲ
【０１７６】
（実施例４）
（組換えアデニル酸キナーゼの熱安定性の分析）
組換えｔＡＫ酵素の熱安定性を大腸菌粗細胞溶解物で評価した。
【０１７７】
細胞を、本質的に実施例３の記載と同様に増殖させ、そして超音波処理によって溶解した。粗抽出物のＡＫ活性を８０℃にて３０分間の熱処理の前および後の両方で決定し、引き続き１０倍系列希釈を行った。
【０１７８】
結果（図２を参照のこと）は、広範な種々の組換え酵素が本発明の方法での使用に適していることを示している。１つの実施態様では、ＡＫは、T. maritima、A. fulgidus、およびS. solfataricus由来の酵素である。このような酵素は、生物発光アッセイに、より大きなダイナミックレンジを提供し、必要な場合、なおさらなる感度を提供すると思われる。
【０１７９】
（実施例５）
（安定性を改善するためのアデニル酸キナーゼの遺伝子改変）
当業者に公知の標準的な方法を用いて、P. furiosus、P. horikoshii、およびS. acidocaldarius由来のＡＫ遺伝子において、それぞれ実施例６〜８および配列番号１７〜１９に示すように、部位特異的変異体を構築した。
【０１８０】
各遺伝子で同定した特定の変更に加えて、S. acidocaldarius配列で下線を付した領域は、古細菌アデニル酸キナーゼ三量体構造のコアパッキング領域を形成している。したがって、この領域のパッキングを妨げるアミノ酸置換は、酵素の熱安定性および物理的安定性を減少させるのに大きな効果を有していると思われる。逆に、コアパッキングを改善するアミノ酸置換（特に、大きな側鎖を有する疎水性残基）は、熱または他のプロセスに対して酵素を安定化させ得る。したがって、既に記載された特定の変異に加えて、これらの領域における関連遺伝子配列の局在遺伝子シャッフリング（本質的にStemmer (1994) Nature 370: 389-391およびCrameriら (1996) Nature Biotech. 14: 315-319に記載のように）および縮重オリゴヌクレオチドまたは改変したヌクレオチド混合物を用いるランダムＰＣＲベースの変異誘発（例えば、Vartanianら (1996) Nucleic Acid Res. 24: 2627-2633）を用いる、多くの「選択的」アプローチを使用した。これらの改変の多くは、大腸菌での組換え発現および高温での溶解細胞中のアデニル酸キナーゼ活性の迅速アッセイにより評価した場合に、変化した安定性を示している。
【０１８１】
（実施例６）
（改善された安定性を提供するように遺伝子操作されたPyrococcus furiosus由来のアデニル酸キナーゼ（配列番号１７））
【０１８２】
【化１】
0005597552.tif 000004
【０１８３】
示した部位の１つ以上または全てでの変異が、酵素の熱安定性を改変する。強調した３つの規定の変更に加えて、１５７位のアラニンの別の小さな疎水性残基（例えば、Ｉ、Ｌ）またはより大きな疎水性残基（例えば、Ｆ）への改変は、組換えタンパク質の熱安定性を増大させる。したがって、これらの部位での改変の組み合わせによって可能な３５の改変体が存在する。アミノ酸１５７の極性残基、例えば、Ｔ（P. horikoshiiのＡｄｋＡでの等価な位置に見られる）、Ｓ、Ｙ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒへの改変は、安定性の減少を生じる。
【０１８４】
（実施例７）
（改善された安定性を提供するように遺伝子操作されたPyrococcus horikoshii由来のアデニル酸キナーゼ（配列番号１８））
太字および下線で示した残基のいずれかまたは両方の改変は、酵素の熱安定性を増大さ
せる（３つの改変体が可能である）。
【０１８５】
【化２】
0005597552.tif 000005
【０１８６】
（実施例８）
（改善された安定性を提供するように遺伝子操作されたSulfolobus acidocaldarius由来のアデニル酸キナーゼ（配列番号１９））
示した下線の残基の改変は、酵素の熱安定性を増大させ得る。
【０１８７】
【化３】
0005597552.tif 000006
【０１８８】
（実施例９）
（酢酸キナーゼおよびピルビン酸キナーゼの発現）
実施例３の方法に従って、本発明者らは、酢酸キナーゼおよびピルビン酸キナーゼを発現させた：
【０１８９】
配列番号２０−Thermotoga maritima由来の酢酸キナーゼ
ＭＲＶＬＶＩＮＳＧＳ  ＳＳＩＫＹＱＬＩＥＭ  ＥＧＥＫＶＬＣＫＧＩ  
ＡＥＲＩＧＩＥＧＳＲ  ＬＶＨＲＶＧＤＥＫＨ  ＶＩＥＲＥＬＰＤＨＥ  
ＥＡＬＫＬＩＬＮＴＬ  ＶＤＥＫＬＧＶＩＫＤ  ＬＫＥＩＤＡＶＧＨＲ  
ＶＶＨＧＧＥＲＦＫＥ  ＳＶＬＶＤＥＥＶＬＫ  ＡＩＥＥＶＳＰＬＡＰ  
ＬＨＮＰＡＮＬＭＧＩ  ＫＡＡＭＫＬＬＰＧＶ  ＰＮＶＡＶＦＤＴＡＦ  
ＨＱＴＩＰＱＫＡＹＬ  ＹＡＩＰＹＥＹＹＥＫ  ＹＫＩＲＲＹＧＦＨＧ  
ＴＳＨＲＹＶＳＫＲＡ  ＡＥＩＬＧＫＫＬＥＥ  ＬＫＩＩＴＣＨＩＧＮ  
ＧＡＳＶＡＡＶＫＹＧ  ＫＣＶＤＴＳＭＧＦＴ  ＰＬＥＧＬＶＭＧＴＲ  
ＳＧＤＬＤＰＡＩＰＦ  ＦＩＭＥＫＥＧＩＳＰ  ＱＥＭＹＤＩＬＮＫＫ  
ＳＧＶＹＧＬＳＫＧＦ  ＳＳＤＭＲＤＩＥＥＡ  ＡＬＫＧＤＥＷＣＫＬ  
ＶＬＥＩＹＤＹＲＩＡ  ＫＹＩＧＡＹＡＡＡＭ  ＮＧＶＤＡＩＶＦＴＡ  
ＧＶＧＥＮＳＰＩＴＲ  ＥＤＶＣＳＹＬＥＦＬ  ＧＶＫＬＤＫＱＫＮＥ  
ＥＴＩＲＧＫＥＧＩＩ  ＳＴＰＤＳＲＶＫＶＬ  ＶＶＰＴＮＥＥＬＭＩ  
ＡＲＤＴＫＥＩＶＥＫ  ＩＧＲ
【０１９０】
配列番号２１−Pyrococcus horikoshii由来のピルビン酸キナーゼ
ＭＲＲＭＫＬＰＳＨＫ  ＴＫＩＶＡＴＩＧＰＡ  ＴＮＳＫＫＭＩＫＫＬ  
ＩＥＡＧＭＮＶＡＲＩ  ＮＦＳＨＧＴＦＥＥＨ  ＡＫＩＩＥＭＶＲＥＱ  
ＳＱＫＬＤＲＲＶＡＩ  ＬＡＤＬＰＧＬＫＩＲ  ＶＧＥＩＫＧＧＹＶＥ  
ＬＥＲＧＥＫＶＴＬＴ  ＴＫＤＩＥＧＤＥＴＴ  ＩＰＶＥＹＫＤＦＰＫ  
ＬＶＳＫＧＤＶＩＹＬ  ＳＤＧＹＩＶＬＲＶＥ  ＤＶＫＥＮＥＶＥＡＶ  
ＶＩＳＧＧＫＬＦＳＲ  ＫＧＩＮＩＰＫＡＹＬ  ＰＶＥＡＩＴＰＲＤＩ  
ＥＩＭＫＦＡＩＥＨＧ  ＶＤＡＩＧＬＳＦＶＧ  ＮＶＹＤＶＬＫＡＫＳ  
ＦＬＥＲＮＧＡＧＤＴ  ＦＶＩＡＫＩＥＲＰＤ  ＡＶＲＮＦＮＥＩＬＮ  
ＡＡＤＧＩＭＩＡＲＧ  ＤＬＧＶＥＭＰＩＥＱ  ＬＰＩＬＱＫＲＬＩＲ  
ＫＡＮＭＥＧＫＰＶＩ  ＴＡＴＱＭＬＶＳＭＴ  ＭＥＫＶＰＴＲＡＥＶ  
ＴＤＶＡＮＡＩＬＤＧ  ＴＤＡＶＭＬＳＥＥＴ  ＡＶＧＫＦＰＩＥＡＶ  
ＥＭＭＡＲＩＡＫＶＴ  ＥＥＹＲＥＳＦＧＩＴ  ＲＭＲＥＦＬＥＧＴＫ  
ＲＧＴＩＫＥＡＩＴＲ  ＳＩＩＤＡＩＣＴＩＧ  ＩＫＦＩＬＴＰＴＫＴ  
ＧＲＴＡＲＬＩＳＲＦ  ＫＰＫＱＷＩＬＡＦＳ  ＴＲＥＫＶＣＮＮＬＭ  
ＦＳＹＧＶＹＰＦＣＭ  ＥＥＧＦＮＥＮＤＩＶ  ＲＬＩＫＧＬＧＬＶＧ  
ＳＤＤＩＶＬＭＴＥＧ  ＫＰＩＥＫＴＶＧＴＮ  ＳＩＫＩＦＱＩＡ
【０１９１】
配列番号２２−Sulfolobus solfataricus由来のピルビン酸キナーゼ
ＭＲＫＴＫＩＶＡＴＬ  ＧＰＳＳＥＥＫＶＫＥ  ＬＡＥＹＶＤＶＦＲＩ  
ＮＦＡＨＧＤＥＴＳＨ  ＲＫＹＦＤＬＩＲＴＹ  ＡＰＥＳＳＩＩＶＤＬ  
ＰＧＰＫＬＲＬＧＥＬ  ＫＥＰＩＥＶＫＫＧＤ  ＫＩＶＦＳＱＫＤＧＩ  
ＰＶＤＤＥＬＦＹＳＡ  ＶＫＥＮＳＤＩＬＩＡ  ＤＧＴＩＲＶＲＶＫＳ  
ＫＡＫＤＲＶＥＧＴＶ  ＩＥＧＧＩＬＬＳＲＫ  ＧＩＮＩＰＮＶＮＬＫ  
ＳＧＩＴＤＮＤＬＫＬ  ＬＫＲＡＬＤＬＧＡＤ  ＹＩＧＬＳＦＶＩＳＥ  
ＮＤＶＫＫＶＫＥＦＶ  ＧＤＥＡＷＶＩＡＫＩ  ＥＫＳＥＡＬＫＮＬＴ  
ＮＩＶＮＥＳＤＧＩＭ  ＶＡＲＧＤＬＧＶＥＴ  ＧＬＥＮＬＰＬＩＱＲ  
ＲＩＶＲＴＳＲＶＦＧ  ＫＰＶＩＬＡＴＱＶＬ  ＴＳＭＩＮＳＰＩＰＴ  
ＲＡＥＩＩＤＩＳＮＳ  ＩＭＱＧＶＤＳＩＭＬ  ＳＤＥＴＡＩＧＮＹＰ  
ＶＥＳＶＲＴＬＨＮＩ  ＩＳＮＶＥＫＳＶＫＨ  ＲＰＩＧＰＬＮＳＥＳ  
ＤＡＩＡＬＡＡＶＮＡ  ＳＫＶＳＫＡＤＶＩＶ  ＶＹＳＲＳＧＮＳＩＬ  
ＲＶＳＲＬＲＰＥＲＮ  ＩＩＧＶＳＰＤＰＲＬ  ＡＫＫＦＫＬＣＹＧＶ  
ＩＰＩＳＩＮＫＫＭＱ  ＳＩＤＥＩＩＤＶＳＡ  ＫＬＭＱＥＫＩＫＤＬ  
ＫＦＫＫＩＶＩＶＧＧ  ＤＰＫＱＥＡＧＫＴＮ  ＦＶＩＶＫＴＬＥＱＱ  
ＫＫ
【０１９２】
配列番号２３−Thermotoga maritima由来のピルビン酸キナーゼ
ＭＲＳＴＫＩＶＣＴＶ  ＧＰＲＴＤＳＹＥＭＩ  ＥＫＭＩＤＬＧＶＮＶ  
ＦＲＩＮＴＳＨＧＤＷ  ＮＥＱＥＱＫＩＬＫＩ  ＫＤＬＲＥＫＫＫＫＰ  
ＶＡＩＬＩＤＬＡＧＰ  ＫＩＲＴＧＹＬＥＫＥ  ＦＶＥＬＫＥＧＱＩＦ  
ＴＬＴＴＫＥＩＬＧＮ  ＥＨＩＶＳＶＮＬＳＳ  ＬＰＫＤＶＫＫＧＤＴ  
ＩＬＬＳＤＧＥＩＶＬ  ＥＶＩＥＴＴＤＴＥＶ  ＫＴＶＶＫＶＧＧＫＩ  
ＴＨＲＲＧＶＮＶＰＴ  ＡＤＬＳＶＥＳＩＴＤ  ＲＤＲＥＦＩＫＬＧＴ  
ＬＨＤＶＥＦＦＡＬＳ  ＦＶＲＫＰＥＤＶＬＫ  ＡＫＥＥＩＲＫＨＧＫ  
ＥＩＰＶＩＳＫＩＥＴ  ＫＫＡＬＥＲＬＥＥＩ  ＩＫＶＳＤＧＩＭＶＡ  
ＲＧＤＬＧＶＥＩＰＩ  ＥＥＶＰＩＶＱＫＥＩ  ＩＫＬＳＫＹＹＳＫＰ  
ＶＩＶＡＴＱＩＬＥＳ  ＭＩＥＮＰＦＰＴＲＡ  ＥＶＴＤＩＡＮＡＩＦ  
ＤＧＡＤＡＬＬＬＴＡ  ＥＴＡＶＧＫＨＰＬＥ  ＡＩＫＶＬＳＫＶＡＫ  
ＥＡＥＫＫＬＥＦＦＲ  ＴＩＥＹＤＴＳＤＩＳ  ＥＡＩＳＨＡＣＷＱＬ  
ＳＥＳＬＮＡＫＬＩＩ  ＴＰＴＩＳＧＳＴＡＶ  ＲＶＳＫＹＮＶＳＱＰ  
ＩＶＡＬＴＰＥＥＫＴ  ＹＹＲＬＳＬＶＲＫＶ  ＩＰＶＬＡＥＫＣＳＱ  
ＥＬＥＦＩＥＫＧＬＫ  ＫＶＥＥＭＧＬＡＥＫ  ＧＤＬＶＶＬＴＳＧＶ  
ＰＧＫＶＧＴＴＮＴＩ  ＲＶＬＫＶＤ
【０１９３】
配列番号２４−Pyrococcus furiosus由来のピルビン酸キナーゼ
ＭＲＲＶＫＬＰＳＨＫ  ＴＫＩＶＡＴＩＧＰＡ  ＴＮＳＲＫＭＩＫＱＬ  
ＩＫＡＧＭＮＶＡＲＩ  ＮＦＳＨＧＳＦＥＥＨ  ＡＲＶＩＥＩＩＲＥＥ  
ＡＱＫＬＤＲＲＶＡＩ  ＬＡＤＬＰＧＬＫＩＲ  ＶＧＥＩＫＧＧＹＶＥ  
ＬＫＲＧＥＫＶＩＬＴ  ＴＫＤＶＥＧＤＥＴＴ  ＩＰＶＤＹＫＧＦＰＮ  
ＬＶＳＫＧＤＩＩＹＬ  ＮＤＧＹＩＶＬＫＶＥ  ＮＶＲＥＮＥＶＥＡＶ  
ＶＬＳＧＧＫＬＦＳＲ  ＫＧＶＮＩＰＫＡＹＬ  ＰＶＥＡＩＴＰＫＤＦ  
ＥＩＭＫＦＡＩＥＨＧ  ＶＤＡＩＧＬＳＦＶＧ  ＳＶＹＤＶＬＫＡＫＳ  
ＦＬＥＫＮＮＡＥＤＶ  ＦＶＩＡＫＩＥＲＰＤ  ＡＶＲＮＦＤＥＩＬＮ  
ＡＡＤＧＩＭＩＡＲＧ  ＤＬＧＶＥＭＰＩＥＱ  ＬＰＩＬＱＫＫＬＩＲ  
ＫＡＮＭＥＧＫＰＶＩ  ＴＡＴＱＭＬＶＳＭＴ  ＴＥＫＶＰＴＲＡＥＶ  
ＴＤＶＡＮＡＩＬＤＧ  ＴＤＡＶＭＬＳＥＥＴ  ＡＩＧＫＦＰＩＥＴＶ  
ＥＭＭＧＫＩＡＫＶＴ  ＥＥＹＲＥＳＦＧＬＳ  ＲＩＲＥＦＭＥＩＫＫ  
ＧＴＩＫＥＡＩＴＲＳ  ＩＩＤＡＩＣＴＩＤＩ  ＫＦＩＬＴＰＴＲＴＧ  
ＲＴＡＲＬＩＳＲＦＫ  ＰＫＱＷＩＬＡＦＳＴ  ＮＥＲＶＣＮＮＬＭＦ  
ＳＹＧＶＹＰＦＣＬＥ  ＥＧＦＤＥＮＤＩＶＲ  ＬＩＫＧＬＧＬＶＥＳ  
ＤＤＭＶＬＭＴＥＧＫ  ＰＩＥＫＴＶＧＴＮＳ  ＩＫＩＦＱＩＡ
【０１９４】
配列番号２５−Methanosarcina thermophila由来の酢酸キナーゼ
ＭＫＶＬＶＩＮＡＧＳ  ＳＳＬＫＹＱＬＩＤＭ  ＴＮＥＳＡＬＡＶＧＬ  
ＣＥＲＩＧＩＤＮＳＩ  ＩＴＱＫＫＦＤＧＫＫ  ＬＥＫＬＴＤＬＰＴＨ  
ＫＤＡＬＥＥＶＶＫＡ  ＬＴＤＤＥＦＧＶＩＫ  ＤＭＧＥＩＮＡＶＧＨ  
ＲＶＶＨＧＧＥＫＦＴ  ＴＳＡＬＹＤＥＧＶＥ  ＫＡＩＫＤＣＦＥＬＡ  
ＰＬＨＮＰＰＮＭＭＧ  ＩＳＡＣＡＥＩＭＰＧ  ＴＰＭＶＩＶＦＤＴＡ  
ＦＨＱＴＭＰＰＹＡＹ  ＭＹＡＬＰＹＤＬＹＥ  ＫＨＧＶＲＫＹＧＦＨ  
ＧＴＳＨＫＹＶＡＥＲ  ＡＡＬＭＬＧＫＰＡＥ  ＥＴＫＩＩＴＣＨＬＧ  
ＮＧＳＳＩＴＡＶＥＧ  ＧＫＳＶＥＴＳＭＧＦ  ＴＰＬＥＧＬＡＭＧＴ  
ＲＣＧＳＩＤＰＡＩＶ  ＰＦＬＭＥＫＥＧＬＴ  ＴＲＥＩＤＴＬＭＮＫ  
ＫＳＧＶＬＧＶＳＧＬ  ＳＮＤＦＲＤＬＤＥＡ  ＡＳＫＧＮＲＫＡＥＬ  
ＡＬＥＩＦＡＹＫＶＫ  ＫＦＩＧＥＹＳＡＶＬ  ＮＧＡＤＡＶＶＦＴＡ  
ＧＩＧＥＮＳＡＳＩＲ  ＫＲＩＬＴＧＬＤＧＩ  ＧＩＫＩＤＤＥＫＮＫ  
ＩＲＧＱＥＩＤＩＳＴ  ＰＤＡＫＶＲＶＦＶＩ  ＰＴＮＥＥＬＡＩＡＲ  
ＥＴＫＥＩＶＥＴＥＶ  ＫＬＲＳＳＩＰＶ
【０１９５】
（実施例１０）
（フィブリンベースのインジケータデバイスの調製）
（フィブリンへの架橋のためのｔＡＫ融合物の調製）
トランスグルタミナーゼ基質配列（ＭＮＱＥＱＶＳＰＬＧＧ−配列番号：３３）を、コドンを最適化した遺伝子クローンによってコードされたS. acidocaldarius由来の熱安定性アデニル酸キナーゼのＮ末端、Ｃ末端、またはＮ末端およびＣ末端の両方に付加する。（トランスグルタミナーゼ基質配列は、互換的に、これらの実施例において、フィブリン、フィブリンペプチド、またはトランスグルタミナーゼ基質ともいう）。この構築物を、インハウス発現ベクター（ｐＭＴＬ １０１５；ＷＯ２００５／１２３７６４に記載）中へＮｄｅＩ−ＳａｌＩ断片として導入する。発現構築物をＤＮＡ塩基配列決定によって確認し、続く発現のために発現宿主のＢＬ２１またはＲＶ３０８の中へ導入する。
【０１９６】
同様に、Thermotoga maritimaから再合成したｔＡＫ遺伝子（配列番号２９）を、上記の３方向でトランスグルタミナーゼ配列に融合する。発現系のクローニングおよび調製もまた上記の通りである。融合構築物は、引き続く精製のためのアフィニティータグを付加して、他の発現ベクター−宿主の組み合わせにおいても発現させ得る。この情況において特に有用なのは、融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端のいずれかに６ヒスチジンタグ（精製および検出を支援するが融合タンパク質の固有の特性を妨害しない修飾）を付加した発現ベクターである。このタイプの改変用のベクターとしては、ｐＥＴシリーズベクター（Novagen／Merck）およびｐＱＥシリーズベクター（Qiagen）が挙げられる。
【０１９７】
インジケータデバイス用の材料を生成するために、発現株を、まず、本質的に静置培養条件下で８リットルの発酵槽中で増殖させる。簡潔には、この株をシードストックとして調製し、続いて８リットルの増殖培地（追加グルコースを含有する改変テリフィックブロス(Terrific Broth)）中に希釈する。この培養物を、それらが定常状態に入っていることを示す光学密度（６００ｎｍのＯＤ）に到達するまで（代表的にはおよそＯＤ＝５）、標準的な発酵条件下で増殖させる。次いで、発酵槽を最小限のエアレーションの条件下で最大で１２時間保持し、その後に連続的な遠心分離によって材料を採取する。
【０１９８】
（ｔＡＫ融合物の精製）
次いで、採取した材料を以下のプロトコルに従って精製する。
緩衝液Ａ：２０ｍＭトリス−ＨＣｌ
９００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５
洗浄緩衝液：２０ｍＭトリス−ＨＣｌ
２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５
緩衝液Ｂ：２０ｍＭトリス−ＨＣｌ
２００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５
１０ｍＭ ＡＴＰ
１０ｍＭ ＡＭＰ
１０ｍＭ ＭｇＣｌ２
ＭｇＡｃ緩衝液：１５ｍＭ ＭｇＡｃ（１Ｍ Fluka BioChemika）、ｐＨ６．８
１．凍結した細胞ペースト（１０ｇ）を量り、３×（３０ｍｌ）容量の緩衝液Ａ（ｐＨ７．５）中に再懸濁する。
２．２５サイクルの３０秒オン／３０秒オフを使用して、氷上で超音波処理する（〜１２，０００ｋｈｚ）。１ｍｌの試料を採取する。
３．超音波処理した細胞溶液を４℃にて３０分間、６，０００ｒｐｍで遠心分離する。上清を慎重に捨て、１ｍｌの試料を採取する。
４．上清を水浴槽中８０℃にて２０分間熱処理する。１ｍｌの試料を採取する。（この工程は、融合タンパク質の熱安定性に応じて省略可能な工程である）。
５．熱処理した溶液を４℃にて３０分間、６０００ｒｐｍで遠心分離する。上清を捨て、１ｍｌの試料を採取する。
６．カラム上へロードする前に、０．２μｍの低結合フィルターにより試料を濾過する。
７．５カラム容量（ＣＶ）の緩衝液Ａでブルーセファロースファーストフロー（Blue Sepharose Fast Flow）カラムを平衡化する。
８．試料をロードする。カラムを洗浄緩衝液で０．２ｍｌ／分で一晩洗浄する。
９．１００％緩衝液Ｂで１ｍｌ／分の流速でタンパク質を溶出し、２．５ｍｌの画分で産物を採集する。
１０．タンパク質がすべて溶出したならば、５ＣＶの１００％緩衝液Ｂで５ｍｌ／分でカラムを洗浄する。
１１．５ＣＶの緩衝液Ａでカラムを再平衡化する。
１２．４℃にて保存するために、５ＣＶの２０％エタノールでカラムをすすぐ。
【０１９９】
必要に応じて、追加のタンパク質精製方法を適用し、より高い純度の産物を得る。ＳＰセファロースファストフロー樹脂またはＱセファロースファストフロー樹脂を用いたイオン交換クロマトグラフィーが、特に効果的である。
【０２００】
次いで、この試料を標準のアッセイ形式を使用して分析し、ピークのアデニル酸キナーゼ活性を含有する画分を同定する。これは、標準的な技術を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって確認する（図３を参照）。簡潔には、アッセイは、以下のプロトコルを使用して実施する。
１．精製したｔＡＫ融合物をＭｇＡｃ緩衝液中で１：１０００および１：１０，０００に希釈する。１ウェルあたり１００μｌを添加する。
２．アピラーゼ（ストック濃度１ｍｌあたり２．５ユニットで５０μｌ／ウェル；Sigma Grade VI Apyrase、ジャガイモ由来）で処理し、振盪しながら３０℃にて３０分間インキュベートして、ＡＴＰを除去する。
３．７０℃にて１０分間プレートをインキュベートしてアピラーゼを変性させる。
４．５０μｌ／ウェルのＡＤＰ（ＭｇＡｃ緩衝液中に２７５μＭのＡＤＰ）を添加し、密閉する。７０℃にて２０分間インキュベートする。
５．プレートを取り出し室温まで２０分間冷却し、ルシフェラーゼ／ルシフェリン（Ｌ／Ｌ）試薬を室温まで２０分間温める。
６．１プレートあたり１つまたは２つの空のウェルに２００μｌのＡＴＰスタンダードを添加する。
７．ルミノメーター上にインジェクターを設置し、Ｌ／Ｌ試薬（ＡＴＰ試薬、Biotherma）でそれらをプライミングする。３０μｌのＬ／Ｌ試薬／ウェルで注入する。
８．ルミノメーターを使用して、発生した光を直ちに読み取る。
【０２０１】
次いで、ピークのキナーゼ活性を有する画分をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）に対して十分に透析し、必要になるまで保存する。精製ｔＡＫ上の付加トランスグルタミナーゼ基質配列（すなわちフィブリンペプチド）の存在の確認は、ＳＥＬＤＩ質量分析によって確認する（図４を参照）。
【０２０２】
必要に応じて、ｔＡＫと全長フィブリノーゲン分子との間で融合物を調製し、フィブリン膜内に酵素活性を取り込むさらなる手段を提供し得る。
【０２０３】
（固体支持体上へのｔＡＫ融合の堆積）
ｔＡＫ−フィブリン融合物を、ＰＢＳまたは重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）のいずれかの中で約２００μｇ／ｍｌまで希釈し、３１６Ｌグレードステンレス鋼、プラスチック、ガラスまたは織物の固体支持体に塗布する。室温にて最大で２時間または４℃にて一晩、表面にタンパク質を付着させる。
【０２０４】
必要に応じて、追加の担体分子（例えば、最大で１％ｗ／ｖ濃度のスクロース、最大で１ｍｇ／ｍｌのアルブミン、最大で０．５％ｗ／ｖのブタムチン）を、この段階で添加する。このような担体の添加は、特定のタイプのインジケータにとって特に重要であり得るが、担体の存在によって、続く次の段階で適用するフィブリン膜との相互作用および架橋を妨害されないのがよい。
【０２０５】
（フィブリン含有汚れの重層およびフィブリン−ｔＡＫ融合物への架橋）
次いで、試験汚れ（生物学的マトリックス）を、上記のような表面に付着したｔＡＫ−フィブリン融合物の調製物上に重層する。
【０２０６】
フィブリノーゲン含有溶液を添加して、フィブリン含有試験汚れへのインジケータの架橋を生じさせる。
【０２０７】
最大で３ｍｇ／ｍｌのフィブリノーゲン（第XIII因子を含有する）、２．５ｍＭのＣａＣｌ２、およびトロンビン（最大で１ｍｌあたり５ＮＩＨ単位）を含有する溶液を新たに混合し、固体支持体の被覆表面に添加する。必要とする架橋度に応じて、室温にて最大で３０分間反応を進行させる。必要に応じて、血液様汚れの洗浄にとってより困難でかつより実際的な状況を提供するために、アルブミン（最大で８０ｍｇ／ｍｌ）およびヘモグロビン（最大で８０ｍｇ／ｍｌ）をこの段階で添加する。架橋後、残存する液体を除去し、インジケータデバイスを放置して乾燥させる。
【０２０８】
図９は、ｔＡＫ−フィブリン融合タンパク質をフィブリノーゲンと共有結合により付着させてｔＡＫ−フィブリン膜を形成したもののＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【０２０９】
必要に応じて、ｔＡＫ−フィブリンペプチド融合物を、固体支持体表面へ添加する前に、フィブリン含有試験汚れ溶液（生物学的マトリックス）に添加する。マトリックスへのフィブリンペプチドの架橋は、より多くの第XIII因子の添加、および／または反応の継続期間の延長によって増加させることができる。架橋は、分子の両端部にフィブリンペプチドを付加したｔＡＫ融合タンパク質の使用によっても増強され得る。
【０２１０】
必要に応じて、この溶液にフィブリノーゲン−ｔＡＫ融合物を直接添加し、インジケータにさらなる架橋をもたらし得る。
【０２１１】
（フィブリンまたはフィブリノーゲンへのｔＡＫの共有結合性化学的架橋）
融合タンパク質としてのｔＡＫ−フィブリンの調製を既に上述した。しかしながら、ｔＡＫ−フィブリンは、当業者が精通している広範な種々の方法によって、フィブリン、フィブリンペプチドまたはフィブリノーゲンにｔＡＫを化学的に結合させることによっても調製し得る。例えば、フィブリノーゲンまたはフィブリンの精製タンパク質調製物は、商業的供給源（例えばSigma）から得られる。S. acidocaldarius由来のｔＡＫは上記のように調製される。ｔＡＫを、製造者の使用説明書に従って、アミド反応試薬ＳＰＤＰ（ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート）；Pierce chemical company）を使用して誘導体化する。フィブリンまたはフィブリノーゲンもまた同じプロトコルを使用して誘導体化する。誘導体化したｔＡＫをメルカプトエタノールによる反応によって還元して、反応性スルフヒドリル基を得る。次いで、これをＳＰＤＰで誘導体化したフィブリンと混合し、２分子間の共有結合を形成させる。反応相手の濃度は、ＳＰＤＰに関する製造者の使用説明書内のガイドラインに従って実験的に決定し得る。
【０２１２】
化学的に結合したｔＡＫ−フィブリンまたはｔＡＫ−フィブリノーゲンは、この実施例の前述の説明および後続する実施例の全体にわたって、互換的にまたは融合タンパク質に加えて、使用され得る。
【０２１３】
（実施例１１）
（フィブリン−ｔＡＫインジケータの使用）
（洗浄消毒器における使用）
実施例１０に記載のようにインジケータを調製する。固体支持体は、長方形のステンレス鋼ストリップ（５５ｍｍ×５ｍｍ×０．７５ｍｍ）であり、その片面または両面がコーティングされ得る。１つまたは複数のインジケータストリップを洗浄消毒器のチャンバー内に配置する。至適には、これらは、洗浄が最も困難であり得る部位に配置され得、これにより、最も高い確実性で、洗浄プロセスが効果的であったことが示される。あるいは、それらは複数のスプレーアームの機能をモニタリングするように配置され得る（すなわちこれらが互いに独立したものであり得る場合）。インジケータストリップを洗浄消毒器チャンバーの棚（shelves）または他の下位構造に留めることによって、当該ストリップが洗浄処理中に動かないことを確保する。代理デバイスの向きを変えて、例えばコーティング面が水噴霧の方向に対して直角であるように配置することによって、洗浄プロセスの効果に関するさらなる情報を提供し得る。
【０２１４】
器具ロードを加え、標準的な運転サイクルを実行する。運転の終了時にデバイスをチャンバーから取り出し、実施例１２に略述するように、残余ｔＡＫ−融合物の存在を評価した後に器具を取り出し、後続する処理を行う。必要に応じて、入念に確定したポイントでプロセスを中断することによって、または運転中にインジケータを取り出す方法を提供する機械の使用によってのいずれかで、洗浄プロセス中にデバイスを取り出し得る。
【０２１５】
（内視鏡試験手順における使用）
内視鏡再処理システムをモニタリングするためのインジケータデバイスは、上で略述したものと本質的に同様である。内視鏡内のステンレス鋼部品、ＰＴＦＥチューブまたは他の関連する材料のいずれかの代表となる同様の大きさのインジケータ表面を、チューブ状チャンバー内に置く。これは、内視鏡の前方端部、または患者組織と接触する端部のいずれかに対して、適切なねじ型、プッシュ型または差込型取り付けを介して取り付けられる。これを内視鏡再処理ユニット内に置き、内視鏡チューブの端部およびインジケータデバイスを、ユニット中のポートに対してカップリングする。プロセスを標準通りに実行し、実行の終了時にインジケータデバイスを分析のために取り出し、その後に前進処理をするか、または使用するために内視鏡を戻す。
【０２１６】
（実施例１２）
（洗浄性能を評価する手段）
インジケータデバイスを試験プロセスの終了時に取り外す。インジケータを衛生状態モニターまたはルミノメーター試薬チューブの中に挿入し、製造者の使用説明書に従って処理し、インジケータデバイスのスワブを交換する。携帯型の衛生状態モニターは、相対的発光ユニット（ＲＬＵ）での読み出し値を提供し、これは、生物学的成分に付着したｔＡＫ−酵素によって生成されるＡＴＰの濃度に正比例する。これはさらに、インジケータに代表的に使用される濃度範囲にわたる酵素濃度に正比例する。インジケータデバイスは、所定の閾値を下回るＲＬＵ値が、インジケータ表面に付着したままのｔＡＫ融合物の濃度の少なくとも３ｌｏｇの減少（または許容基準に応じてはより高い場合がある）を示すように較正する。処理した器具のバッチのリリースは、インジケータデバイス上の残余ｔＡＫ融合物によって生成されるＲＬＵ値の減少に基づく。これは、閾値を上回る器具のバッチをすべて戻すように操作員を訓練することによって、またはＲＬＵ値に基づいて単純な合格または不合格の読み出し値を提供するように衛生状態モニターをキャリブレーションすることによってのいずれかで、同定され得る。
【０２１７】
手術器具または他の処理した製品のバッチの前進処理を可能にする実用的なプロセスは、以下のとおりである。
１．洗浄消毒器のチャンバー内の予め決めておいた位置に、インジケータデバイスを挿入する。適所に留める。
２．標準的な操作手順に従って器具ロードを加える。ドアを閉め、実行ボタンを押す。
３．実行中に、標準的な操作手順に必要とされる任意のプロセスパラメーターを記録する。
４．運転の終了時に、時間および標準的な操作手順に必要な任意のプロセスパラメーターを記録する。
５．携帯型の衛生状態モニター（SystemSURE PlusTM；Hygiena）のスイッチを入れ、較正させる。
６．チャンバーからインジケータデバイスを取り出して、試薬チューブ（UltraSnap；Hygiena）にそれらを挿入する。
７．試薬リザーバーを左右に曲げて、試料チューブから試薬をすべて押し出す（製造者の使用説明書に従って）。
８．５秒間チューブを振盪する。
９．衛生状態モニターにチューブを挿入し、シグナルを直ちに記録する。
１０．プロセス実行シートにＲＬＵ値または合格／不合格の読み出し値を記録する。
１１．任意のさらなるインジケータデバイスについて工程６〜１０を繰り返す。
１２．不合格が見られれば、器具を再処理し、工程１から始める。
１３．各日の終了時に、取り付けられたポートを介して適切なデータロガーまたはコンピュータ端末に結果をダウンロードする。
１４．合格／不合格率を毎週および毎月チェックし、不合格のプロセスの傾向を記録する。（曜日、時刻、チャンバー内の位置、操作者）。
【０２１８】
これは適切なプロトコルの例であるが、多くの別の試薬チューブまたは器具（BioTrace、Charm、または他の会社によって調製されたものなど）も、このような器具リリースプロトコルを可能とするのに適している。
【０２１９】
（実施例１３）
（ｔＡＫ−Ｓｕｐ３５融合物の調製）
S. acidocaldariusまたはT. maritimaのいずれかに由来のアデニル酸キナーゼのＮ末端もしくはＣ末端、または両末端のいずれかに融合したSaccharomyces cerevisiae由来のＳｕｐ３５のＮ末端ドメインを含有するクローンを、標準的なＤＮＡ操作技術によって生成する。すべてのクローンをｐＭＴＬ１０１５発現ベクターの中へＮｄｅＩ−ＳａｌＩ断片として導入し、それらの配列を確認する。発現構築物を使用してＢＬ２１発現株またはＲＶ３０８発現株を形質転換し、材料を大スケール発酵条件であるが最小のエアレーションで増殖させる。
【０２２０】
ｔＡＫ−Ｓｕｐ３５融合物の発現および精製は、熱変性工程（工程４）の使用が精製プロトコルの一部でない以外は、実施例１０に記載したフィブリンペプチド融合物のためのものと本質的に同じである。簡潔には、発酵槽からの細胞ペーストを緩衝液Ａ中に再懸濁し、超音波処理によって溶解する。実施例１０に略述したように、細胞残屑を除去し（これらのタイプの融合物について標準的であるように熱処理は使用しない）、上清をカラム精製のために使用する。
【０２２１】
特定の増殖条件下では、融合タンパク質は不溶性であり得、細胞内の封入体として見える。この場合、細胞ペーストを同様に調製および溶解するが、得られた不溶性画分（封入体を含有する）を遠心分離によって回収する。この材料をTriton X-100（最大で５％の濃度）を含有する緩衝液（例えばＰＢＳ）中で洗浄する。各洗浄後に、融合タンパク質を含有するペレットを遠心分離によって分離する。５回の洗浄後に、封入体を８Ｍ尿素含有ＰＢＳで再可溶化し、最大で３０分間穏やかに撹拌する。残存する不溶性物質を遠心分離によって除去する。尿素により可溶化した材料を、最大で５回、１０容量のＰＢＳに対して透析して尿素を除去し、融合タンパク質をリフォールディングさせる。必要に応じて、尿素で可溶化した調製物を迅速に撹拌されているＰＢＳまたは精製のために使用したのと同様の緩衝液Ａの１００容量の中に細いゲージのニードルを介して噴霧することによって、尿素をより迅速に除去し得る。室温にて最大で３０分間撹拌しながら材料を放置した後、続く処理を行なう。図５は、清澄化された封入体調製物からの可溶化されリフォールディングされたＳｕｐ３５−ｔＡＫ（Ｓａｃ）のゲル電気泳動分析（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を示す。
【０２２２】
続く融合物の精製は、本質的に実施例１０に記載のように実施する。溶解した細胞または可溶化されリフォールディングされた封入体のいずれかからの上清を、前もって平衡化したブルーセファロースファーストフローカラム上にロードする。緩衝液Ａおよび続いて洗浄緩衝液中で十分な洗浄を行った後、緩衝液Ｂを使用してタンパク質を溶出する。ピーク画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および酵素分析によって決定する。次いで、画分をプールし、ＰＢＳの中で透析する。
【０２２３】
（ｔＡＫ−Ｓｕｐ３５のアミロイド型への転換）
Ｓｕｐ３５−ｔＡＫ融合物は、線維に集合した場合、汚染除去プロセスの有効性を評価すべき重要な分子であるプリオンなどのアミロイドタンパク質を代表する。
【０２２４】
アミロイド型のＳｕｐ３５−ｔＡＫ融合物は、精製した可溶性タンパクのリフォールディングによって、または尿素により再可溶化した封入体調製物の透析に使用される条件を変更することによってのいずれかで生成される。第一の場合、融合タンパク質をｐＨ４付近の条件へ曝露することによって、コンフォメーション変化を誘導する（例えば、最大で１ＭのＮａＣｌを必要に応じて含有するｐＨ７．４で適切に緩衝した溶液の中での透析によって）。後者の場合、８Ｍ尿素／ＰＢＳ中で再可溶化した融合タンパク質を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の２Ｍ尿素、３００ｍＭ ＮａＣｌに対して室温で６〜１２時間透析する。あるいは、線維化は、類似のインキュベーション条件下で、２０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）１０ｍＭ ＥＤＴＡに対する透析によって誘導し得る。電子顕微鏡を使用して線維の存在を確認する（図６を参照）。
【０２２５】
必要に応じて、融合タンパク質を、正常なＳｕｐ３５を含有する線維の中に取り込み得る。これは、この融合物を同じ方法で発現させた非融合Ｓｕｐ３５と、融合物：Ｓｕｐ３５の比率が１：１〜１：１０で混合することによって達成される。
【０２２６】
（固体支持体上へのｔＡＫ−Ｓｕｐ３５融合物の堆積）
固体支持体上への線維の堆積は、高レベルのＮａＣｌの存在下で、適切な緩衝液（例えば、ＰＢＳ ｐＨ７．４、重炭酸緩衝液ｐＨ９．６）中の単純なタンパク質吸着によってもたらされる。荷電表面またはプレコート表面（例えば、ポリ−Ｌ−リジンによりコーティングしたプラスチック）の使用は、融合タンパク質をより効果的に結合し得る表面の提供に有用である。
【０２２７】
必要に応じて、線維を、スクロース（最大で１％）またはブタムチン（最大で０．５％）またはアルブミン（最大で１ｍｇ／ｍｌ）などの適切な担体中で堆積させ得る。
【０２２８】
（試験用汚れの重層）
次いで、試験用汚れ（生物学的マトリックス）を、上記のように表面上に付着させたアミロイド調製物上に重層する。
【０２２９】
アミロイドインジケータが包埋された適切な生物学的マトリックスとしては、例えば、０．５％ムチン（アルブミンの有無にかかわらず）、市販の試験用汚れ（Browneによって製造されたものなど）、または国内的もしくは国際的な規格委員会によって刊行された指針書において同定されている試験用汚れ（例えば、ＨＴＭ ０１／０１（英国）に詳述されるようなEdinburgh汚れ）のうちのいずれか１つが挙げられる。
【０２３０】
（試験用汚れ内のアミロイド原線維の集合）
複雑なマトリックス中で自己集合するアミロイドの能力を考慮すると、原線維形成そして引き続く表面上への堆積の前に、アミロイド−ｔＡＫ融合物を汚れ成分と混合させることができる。これは、インジケータのさらなる選択肢を提供し、このインジケータでは、アミロイド原線維が混合されて他の汚れ成分との間でキレート化され得る。これにより、表面からの除去がより困難であり得る異なるタイプのマトリックスを提供する。
【０２３１】
（実施例１４）
（ｔＡＫ−Ｓｕｐ３５インジケータの使用）
（洗浄プロセスにおける表面からのプリオン除去の評価のためのｔＡＫ−Ｓｕｐ３５インジケータの使用）
インジケータを、実施例１３に記載のように、線維として調製し、０．５％ムチンの存在下において鋼表面上で乾燥させる。インジケータを洗浄消毒器のチャンバー内の所定の位置に置く。器具ロードを加える。製造者の使用説明書の通りにプロセスを開始し、すべてのプロセス記録を完了させる。プロセスの終了時かつ器具を機械から取り出す前に、実施例１２に記載のようにインジケータデバイスを取り出し、評価する。
【０２３２】
（プロテアーゼベースのプロセスにおけるプリオン不活性化の評価のためのｔＡＫ−Ｓｕｐ３５インジケータの使用）
インジケータを、実施例１３に記載のように、高比率の遊離Ｓｕｐ３５：Ｓｕｐ３５−ｔＡＫ（５：１の過剰量で）を用いて線維として調製し、Edinburgh汚れの存在下で固体支持体ストリップ上に堆積させる。インジケータデバイスを、新たに作製したPrionzymeTM（Genencor International）を含有する前浸漬浴槽中に挿入し、プリオン不活性化処理（６０℃、ｐＨ１２）を行う。インジケータストリップを、インジケータの両端が液体の大部分の内にあるように、槽の側面に留める。器具を必要とされるように加え、３０分間処理する。インジケータデバイスをプロセスの終了時に槽から取り出し、その後に器具を取り出し、実施例１２に記載のように評価する。
【０２３３】
（プリオンの破壊を目的とした酸化プロセスのためのｔＡＫ−Ｓｕｐ３５インジケータの使用）
インジケータを、実施例１３に記載のように、Ｓｕｐ３５−ｔＡＫのみを使用して線維として調製し、ステンレス鋼表面上に堆積させる（必要に応じて０．１％ｗ／ｖスクロースの存在下）。インジケータをGenesisTMコンテナーのふたの内側に取り付け、その中で器具を処理用に調製し、ふたを閉じる。コンテナーを酸化チャレンジに適したプロセッサーのロードチャンバー（例えば、１２５Ｌオゾン滅菌器；ＴＳＯ３、またはFichetら、2004；Lancetによる出版論文に記載のものなどの気相過酸化水素技術）に挿入し、プロセスを製造業者の説明書に従って実行する。プロセスの終了時に、Genesisコンテナーをチャンバーから取り出し、インジケータデバイスを取り出し、実施例１２に記載のように処理する。
【０２３４】
（実施例１５）
（ｔＡＫカップリング成分による神経学的汚れの調製）
（神経学的試験用汚れに必須の成分の同定）
手術器具表面に付着したままであり得る、神経外科手術プロセスで遭遇する重大な標的成分を、実験的研究において決定し得る。神経外科手術病棟からの手術器具は、通常の洗浄プロセスにおいて処理され得る。残余タンパク質または他の生物学的分子は、部分的酸加水分解、強アルカリクリーナーまたは適切な溶菌酵素（例えば、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、リパーゼ）の使用を使用して、器具の表面から可溶化し得る。次いで、主要分子は、表面増強レーザー脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ）などの質量分析技術または同等物を使用して決定し得る。
【０２３５】
同じ分析は、ヒトの神経学的材料または動物種からの同等な試料（例えばげっ歯類脳ホモジネート）により手術器具を人工的に汚染することによって達成され得る。
【０２３６】
代表的な神経学的試験用汚れは、とりわけ、神経由来タンパク質（例えばニューロフィラメント）、神経の周囲の代表的な脂質または糖脂質（例えばシアル酸が豊富なガングリオシド）、および糖質を含む種々の成分を必要とする。試験用汚れが、タンパク質凝集によって引き起こされる疾患（例えば、プリオン病、アルツハイマー病）などの特異的疾患に関する特定の問題に対処するように設計される場合、これらの成分またはその代理物も試験用汚れへの有益な付加物となる。
【０２３７】
（タンパク質または糖脂質へのｔＡＫ−融合物の架橋）
組換えｔＡＫの融合は、本質的に実施例１０および１３に記載のような方法を使用することによって、ニューロフィラメントタンパク質またはそのサブドメインに対してなされ得る。
【０２３８】
さらに、組換え発現クローンを生成する必要なく、架橋を達成し得る。非常に糖化したタンパク質または糖脂質をｔＡＫに結合する場合、これは特に有益であり得る。この場合、タンパク質または糖脂質を、適切な供給源から精製するか、または真核生物細胞株（例えば哺乳動物細胞、バキュロウイルス発現系）で適切な遺伝子構築物を発現させることによって生成する。精製は、種々の周知のタンパク質精製方法の１つを介するか、または膜脂質の界面活性剤による可溶化によるものでもあり得る。次いで、精製した材料を、広範囲のカップリング用化学物質（例えば、タンパク質上の第一級アミンを介してタンパク質を結合するために使用するＳＰＤＰ（Pierce chemicals）；糖質基を開いて糖脂質への架橋を可能にするために使用するメタ過ヨウ素酸塩による処理）の１つを使用して、精製したｔＡＫに架橋する。糖質または脂質を含有する分子とのｔＡＫの架橋を達成するためのさらなる適切な方法を、実施例２３に詳細に記載する。
【０２３９】
この用途で特に有用なものは、ガングリオシド（神経細胞に特異的なもの（例えばＧＴ１ｂ、ＧＴ１ａ）および一般細胞起原のもの（例えばＧＭ１）を含む）などの生物学的成分へのｔＡＫの共有結合性カップリングである。ガングリオシドを、界面活性剤による可溶化、相分配および分画遠心分離を含む標準的な方法によって精製する。あるいは、インジケータを、市販で入手可能な精製ガングリオシドを使用して処方し得る。
【０２４０】
（神経学的試験用汚れの核酸成分へのｔＡＫの結合体化）
ｔＡＫを、精製した、合成で生成した、またはＰＣＲもしくは同様の技術を使用して鋳型から増幅したかのいずれかの適切な核酸に架橋する。架橋は、例えば合成の間におよびストレプトアビジンへ架橋したｔＡＫを使用して、核酸上にビオチン標識を取り込むことによって達成し得る。
【０２４１】
（固体支持体上への試験用汚れ成分の堆積）
固体支持体上への１つ以上のｔＡＫインジケータの堆積は、実施例１０および１３に記載のように達成し得る。簡潔には、ｔＡＫ複合体をＰＢＳまたは重炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中で調製し、ポリカーボネート表面上で室温にて３０分間乾燥させる。必要に応じて、スクロースを最大で１ｗ／ｖ％の濃度で添加し得る。結合条件は、例えば、適切な表面修飾剤を使用してｔＡＫの表面上の残存する活性基をブロッキングすることによって、または高レベルのＮａＣｌの取り込みによって、ｔＡＫよりもむしろ生物学的成分を介する付着を容易にするように設計される。
【０２４２】
必要に応じて、堆積された神経学的汚れを、７０％エタノールまたはイソプロパノールによる処理によって固定し得る。これを達成するために、インジケータを７０％イソプロパノール中で室温にて３０分間インキュベートする。これは、手術器具上の汚染材料の耐性を増加させ得る一般に遭遇するプロセスの１つを模倣し、したがってこのような材料の除去をモニタリングする効果的な方法をインジケータに提供する。
【０２４３】
（実施例１６）
（ノロウイルスカプシドタンパク質（５８ｋＤａ）−ｔＡＫ融合物の調製）
ノロウイルス由来の５８ｋＤａカプシドタンパク質をコードする遺伝子を、合成構築物として生成する。このクローンをThermotoga maritima由来の熱安定性アデニル酸キナーゼをコードする遺伝子の５’末端上にクローニングし、単一融合タンパク質を生成する。配列確認後に、このクローンを、大腸菌における発現用のｐＭＴＬベクター、またはＳＦ９細胞などの昆虫細胞株における発現用のバキュロウイルス発現系（例えばＢａｃＰＡＫ発現系；Clontech）のいずれかに導入する。
【０２４４】
（発現および精製）
大腸菌におけるカプシドタンパク質−熱安定性キナーゼ融合物の発現を、本質的に前の実施例に記載のように実施する。タンパク質は、細胞溶解プロトコルの際に適用する熱変性工程なしに、ブルーセファロースファーストフローで同様のプロトコルを使用して精製する。精製したタンパク質は、前の実施例に記載のように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および酵素分析によって分析する。ウイルス様粒子（ＶＬＰ）への融合タンパク質の集合は、ｐＨおよび塩濃度の変更によって促進される。
【０２４５】
バキュロウイルス発現および引き続く精製は、本質的には、Jiangら、(1992) Expression, self-assembly and antigenicity of the Norwalk virus capsid protein、Journal of Virology、６６、６５２７〜６３５２ページに記載のように実施する。
【０２４６】
（固体支持体上の堆積）
精製したＶＬＰ−ｔＡＫを、食品調製において使用される表面、または病院環境におけるノロウイルスの大発生後の表面の洗い落としおよび消毒の検証に適切な固体支持体上に堆積させる。
【０２４７】
食品調製の表面の汚染除去の検証のために、ＶＬＰ−ｔＡＫを、卵アルブミンおよびスクロースを含む食品粗抽出物を含有するＰＢＳ緩衝液中に調製する。このマトリックスを５ｃｍ×５ｃｍの寸法のポリビニルストリップ上にコーティングし、室温にて２時間または４℃にて一晩のいずれかで乾燥させる。
【０２４８】
ノロウイルスの大発生後の汚染の可能性のあるヘルスケア施設の汚染除去の評価のために、ＶＬＰ−熱安定性キナーゼのインジケータを、ヘルスケアに関連する汚れを模倣するように設計された調製物において作製する。これは、上記のような種々の血液関連タンパク質、または国内的もしくは国際的な汚染除去規格に明記された標準的なベッドパン汚染物質の１つを含んだ。特に効果的なインジケータは、例えば病院のカーテンまたはガウンに代表される織物の固体支持体を使用して設置される。
【０２４９】
（ウイルス除去プロセスの検証のためのノロウイルスＶＬＰ−ｔＡＫ融合物の使用）
ノロウイルスＶＬＰ−ｔＡＫ融合物は、水または食品試料からノロウイルスを除去するプロセスの能力の検証に特に有利である。当該融合物は、親ウイルスのサイズ、電荷および疎水性特性を保持し、それゆえ除去プロセスにおける挙動を模倣する。これはこの場合特に有用である。なぜなら、ノロウイルスには培養方法が存在せず、それゆえ、現在のところ、ＲＴ−ＰＣＲ（時間のかかる可能性のある方法）以外に生ウイルスクリアランスを測定することができないからである。
【０２５０】
例えば、ノロウイルスＶＬＰ−ｔＡＫ融合物を給水源の中に入れ、ウイルス粒子を除去するように設計されたプロセスを介して濾過する。ウイルスクリアランスの必要なレベルを測定するのに十分なウイルスを投入する。濾過後のＶＬＰ数を測定し、所定の合格／不合格基準に対して評価する。
【０２５１】
（実施例１７）
（バクテリオファージＭＳ２外被タンパク質−ｔＡＫ融合物の生成）
ＭＳ２外被タンパク質の生成およびウイルス様粒子への自然集合は、多数の研究（例えば、Peabody (2003)、「A viral platform for chemical modification and multivalent display」、Journal of Nanobiotechnology、１巻、５ページ）に記載されている。
【０２５２】
大腸菌で発現させた場合にＶＬＰを生成し得るＭＳ２外被タンパク質のタンパク質配列を、以下に示す（配列番号６２）：
ＭＡＳＮＦＴＱＦＶＬ  ＶＤＮＧＧＴＧＤＶＴ  ＶＡＰＳＮＦＡＮＧＶ  
ＡＥＷＩＳＳＮＳＲＳ  ＱＡＹＫＶＴＣＳＶＲ  ＱＳＳＡＱＮＲＫＹＴ  
ＩＫＶＥＶＰＫＶＡＴ  ＱＴＶＧＧＶＥＬＰＶ  ＡＡＷＲＳＹＬＮＭＥ  
ＬＴＩＰＩＦＡＴＮＳ  ＤＣＥＬＩＶＫＡＭＱ  ＧＬＬＫＤＧＮＰＩＰ  
ＳＡＩＡＡＮＳＧＩＹ
【０２５３】
ＭＳ２外被タンパク質の構築物を、Thermotoga maritima由来のｔＡＫと共に、その発現タンパク質のＮ末端またはＣ末端のいずれかで融合して生成する。融合の位置に応じて、ＶＬＰの内腔内または表面上に露出するかのいずれかのｔＡＫの取り込みをもたらす。２つの位置はいずれも、インジケータとしての適用に有益な特性を有する。必要に応じて、ＭＳ２外被タンパク質を、天然の配列中の位置１５にシステイン残基を組入れることによって改変し得る（スレオニン１５のシステインへの置換）。ＶＬＰ−ｔＡＫ融合物は、必要ならば追加のイオン交換工程と共に、ｔＡＫ融合物について上記した方法（実施例１０および１３）の組み合わせを使用して精製する。ｔＡＫを取り込んだインタクトなＶＬＰは、セファロースＣＬ−４Ｂカラムを使用するサイズ排除に基づいて精製し得る。
【０２５４】
あるいは、精製したｔＡＫは、化学的架橋試薬を使用してＭＳ２ ＶＬＰに架橋し得る。簡潔には、S. acidocaldarius由来のｔＡＫをＳＰＤＰにより誘導体化し還元して、反応性スルフヒドリル基を得る。次いで、タンパク質のＴ１５Ｃ改変体を含有するＭＳ２ ＶＬＰと混合する。これにより、２つのパートナー間の共有結合性ジスルフィド結合が達成される。これらのタイプの共有結合した分子は、これら実施例の残りの部分の全体にわたって、遺伝子融合物と互換的に使用され得る。
【０２５５】
（固体支持体上へのＭＳ２外被タンパク質−ｔＡＫ融合物の堆積）
精製したｔＡＫを含有するＭＳ２−ＶＬＰは、標準的なタンパク質吸着技術を使用して、前の実施例に記載した融合物と同様の方法で表面上に堆積させる。必要に応じて、高荷電表面または疎水性表面を使用して、プロセスレジーム内の特異的な表面からのウイルス除去の指標を提供し得る。
【０２５６】
ＶＬＰ−ｔＡＫ融合物は、単独で堆積させても、または検証される処理プロセスの際に遭遇する関連する汚れを示すものとして設計された適切な汚れマトリックス内に含有させてもよい。例えば、ベッドパン汚れは、ベッドパン、トイレ、または下痢症状のいずれかからの糞便材料の除去の評価または検証のために使用され得る。
【０２５７】
（洗浄レジームの検証のためのＭＳ２−ｔＡＫ融合物の使用）
ＭＳ２−ＶＬＰインジケータを上記のようにセラミック表面上に設置する。セラミックインジケータを、洗浄するバスルーム表面と同じ洗浄用化学物質、例えば、およそ２．５％（ｖ：ｖ）の希釈度で希釈した次亜塩素酸ナトリウムに、同じ条件下で（周囲温度にて３０分）曝露する。プロセスの終了時に、セラミックインジケータを衛生状態モニターチューブに挿入し、残余ＭＳ２−ｔＡＫを実施例１２の方法を使用して測定する。洗浄が所定の閾値を下回れば、洗浄レジームは成功したとみなされる。もしそうでなければ、疾病伝播のリスクを最小限にするために反復洗浄が必要である。
【０２５８】
（ウイルス除去プロセスの検証のためのＭＳ２−ｔＡＫ融合物の使用）
ＭＳ２−ｔＡＫ ＶＬＰは、親ウイルスのサイズ、表面電荷および疎水性を模倣し、広範な種々の関連ウイルス（例えばポリオウイルス）を代表し得るので、これらのインジケータは、実験室または現場環境のいずれにおいてもウイルス除去プロセスの検証のために非常に有用である。ｔＡＫアッセイの迅速さは、従来の培養ベースの方法を超える顕著な利点を提供する。
【０２５９】
例えば、水処理システムは、ＭＳ２−ｔＡＫ ＶＬＰを使用してその場で検証され得る。十分なＭＳ２−ｔＡＫ ＶＬＰを処理プラントの流入水の中に入れて、国のまたは地方の規制によって決定されるような、プロセスの有効性のための十分なｌｏｇクリアランス評価を提供する。例えば、１リットルあたり１０９のＶＬＰ−ｔＡＫを流入水の中に入れる。プロセスを実施し、プロセス後の水のおよそ１ｍｌの試料を、適切な衛生状態モニターチューブシステム（例えば、Aqua-traceTM、Biotrace、英国）で検査する。１ｍｌの水あたり１未満のＶＬＰ−ｔＡＫを示す値は、用いられたプロセスによるウイルスの６対数クリアランスを実証するのに十分となる。大腸菌における標準の培養ベースの方法では１６〜２４時間が必要であるが、これは、プロセス終了後の２分以内に完了できる。
【０２６０】
このような方法は、ヘルスケア産業、食品産業、水道産業または医薬品産業において広く使用される広範囲のウイルス不活性化プロセスの検証に適している。大部分の場合、それは、親ＭＳ２バクテリオファージ（ウイルス除去のプロセスを検証するために広く使用される）の使用に取って代わり、はるかに迅速かつ感度の高い除去の測定を提供し得る。例えば、セラミックマイクロフィルターを介する水の浄化（Wegmannら、2007、「Modification of ceramic microfilters with colloidal zirconia to promote the adsorption of viruses from water」における親バクテリオファージの置換）、塩素ガスによる水の処理（Clevengerら、2007、「Comparison of the inactivation of Bacillus subtilis spores and MS2 bacteriophage by MIOX, ClorTec and hypochlorite」、J Applied Microbiology、１０３、２２８５〜２２９０ページ）、手洗いの殺ウイルス効果の検証（Jonesら、1991、「The use of bacteriophage MS2 as a model system to evaluate virucidal hand disinfectants」、J Hospital Infection、１７、２７９〜２８５ページ）。他の例は、分画した血液、ヒト起源または動物起原の細胞抽出物、医薬製品、食品調製物（例えば甲殻類抽出物）からのウイルス粒子の除去を進行中に検証することである。
【０２６１】
（実施例１８）
（ウイルス除去または破壊の評価および検証に適したさらなるキナーゼ−ＶＬＰ融合物の調製）
下記の表は、種々のウイルス病原体の除去または不活性化の評価のためのインジケータの開発において有益な一連のＶＬＰ融合タンパク質を列挙する。これらは、除去の検証が必須であり得る実際の病原体、または種々の関連病原体の除去を代表し得るモデルウイルスのいずれかを表す。病原体は、医学分野および獣医学分野の両方からであり、動物からヒトへ伝達され得る種々の公知のまたは可能性のある人畜共通病原体をも包含する。
【０２６２】
【表２】
0005597552.tif 000007
【０２６３】
バクテリオファージＰＰ７外被タンパク質の単量体および二量体のタンパク質配列（CaldeiraおよびPeabody、2007、Journal of Nanobiotechnology、5、p10）を、以下に示す。熱安定性キナーゼ遺伝子は、単量体または二量体のどちらかのＣ末端に融合され得る。
【０２６４】
ＰＰ７単量体（配列番号６３）
ＳＫＴＩＶＬＳＶＧＥＡＴＲＴＬＴＥＩＱＳＴＡＤＲＱＩＦＥＥＫＶＧＰＬＶＧＲＬＲＬＴＡＳＬＲＱＮＧＡＫＴＡＹＲＶＮＬＫＬＤＱＡＤＶＶＤＣＳＴＳＶＣＧＥＬＰＫＶＲＹＴＱＶＷＳＨＤＶＴＩＶＡＮＳＴＥＡＳＲＫＳＬＹＤＬＴＫＳＬＶＶＱＡＴＳＥＤＬＶＶＮＬＶＰＬＧＲ
【０２６５】
ＰＰ７二量体（配列番号６４）
ＭＳＫＴＩＶＬＳＶＧＥＡＴＲＴＬＴＥＩＱＳＴＡＤＲＱＩＦＥＥＫＶＧＰＬＶＧＲＬＲＬＴＡＳＬＲＱＮＧＡＫＴＡＹＲＶＮＬＫＬＤＱＡＤＶＶＤＳＧＬＰＫＶＲＹＴＱＶＷＳＨＤＶＴＩＶＡＮＳＴＥＡＳＲＫＳＬＹＤＬＴＫＳＬＶＡＴＳＱＶＥＤＬＶＶＮＬＶＰＬＧＲＹＧＳＫＴＩＶＬＳＶＧＥＡＴＲＴＬＴＥＩＱＳＴＡＤＲＱＩＦＥＥＫＶＧＰＬＶＧＲＬＲＬＴＡＳＬＲＱＮＧＡＫＴＡＹＲＶＮＬＫＬＤＱＡＤＶＶＤＳＧＬＰＫＶＲＹＴＱＶＷＳＨＤＶＴＩＶＡＮＳＴＥＡＳＲＫＳＬＹＤＬＴＫＳＬＶＡＴＳＱＶＥＤＬＶＶＮＬＶＰＬＧＲ
【０２６６】
（実施例１９）
（表面からのバイオフィルム除去を評価するためのインジケータの開発に用いられるキナーゼ−細菌線毛融合物の発現）
当業者が精通している標準的な組換えクローニングにより、Thermotoga maritima由来のｔＡＫと大腸菌由来のＣｓｇＡタンパク質との間の融合物を生成する。生成したタンパク質配列を以下に示す。
【０２６７】
大腸菌ＣｓｇＡタンパク質の配列（配列番号６５）
ＭＫＬＬＫＶＡＡＩＡＡＩＶＦＳＧＳＡＬＡＧＶＶＰＱＹＧＧＧＧＮＨＧＧＧＧＮＮＳＧＰＮＳＥＬＮＩＹＱＹＧＧＧＮＳＡＬＡＬＱＴＤＡＲＮＳＤＬＴＩＴＱＨＧＧＧＮＧＡＤＶＧＱＧＳＤＤＳＳＩＤＬＴＱＲＧＦＧＮＳＡＴＬＤＱＷＮＧＫＮＳＥＭＴＶＫＱＦＧＧＧＮＧＡＡＶＤＱＴＡＳＮＳＳＶＮＶＴＱＶＧＦＧＮＮＡＴＡＨＱＹ
【０２６８】
ＣｓｇＡタンパク質のＮ末端に融合したThermotoga maritima由来のアデニル酸キナーゼの配列（配列番号６７）
ＭＭＡＹＬＶＦＬＧＰＰＧＡＧＫＧＴＹＡＫＲＩＱＥＫＴＧＩＰＨＩＳＴＧＤＩＦＲＤＩＶＫＫＥＮＤＥＬＧＫＫＩＫＥＩＭＥＫＧＥＬＶＰＤＥＬＶＮＥＶＶＫＲＲＬＳＥＫＤＣＥＫＧＦＩＬＤＧＹＰＲＴＶＡＱＡＥＦＬＤＳＦＬＥＳＱＮＫＱＬＴＡＡＶＬＦＤＶＰＥＤＶＶＶＱＲＬＴＳＲＲＩＣＰＫＣＧＲＩＹＮＭＩＳＬＰＰＫＥＤＥＬＣＤＤＣＫＶＫＬＶＱＲＤＤＤＫＥＥＴＶＲＨＲＹＫＶＹＬＥＫＴＱＰＶＩＤＹＹＧＫＫＧＩＬＫＲＶＤＧＴＩＧＩＤＮＶＶＡＥＶＬＫＩＩＧＷＳＤＫＧＳＧＶＶＰＱＹＧＧＧＧＮＨＧＧＧＧＮＮＳＧＰＮＳＥＬＮＩＹＱＹＧＧＧＮＳＡＬＡＬＱＴＤＡＲＮＳＤＬＴＩＴＱＨＧＧＧＮＧＡＤＶＧＱＧＳＤＤＳＳＩＤＬＴＱＲＧＦＧＮＳＡＴＬＤＱＷＮＧＫＮＳＥＭＴＶＫＱＦＧＧＧＮＧＡＡＶＤＱＴＡＳＮＳＳＶＮＶＴＱＶＧＦＧＮＮＡＴＡＨＱＹ
【０２６９】
発現のために、クローンを、ｐＥＴ３２ａ（Novagen）またはｐＭＡＬ−Ｃ２ｘ（New England Biolabs）などの適切な発現ベクターに組み込み、そしてタンパク質を、通常の増殖条件下、適切な宿主株（例えば、ＢＬ２１）で発現させる。
【０２７０】
増殖条件によって、熱安定性キナーゼ−ＣｓｇＡ融合物は、細胞の細胞質内で可溶性であるか、または細胞内で不溶性の封入体として発現し得る。前者の場合、実施例１０および１３に記載のように、精製を実行する。後者では、封入体を、細胞溶解後に遠心分離することによって単離し、１％のTriton×100を含む緩衝液内で十分に洗浄する。封入体は、８Ｍ尿素または６Ｍグアニジン中に懸濁させることにより可溶化させ、次いで、非常に低い塩緩衝液（代表的には）20mM未満のNaCl）中での迅速な透析によってリフォールディングする。
【０２７１】
自己集合した層の生成は、精製され酵素活性のある融合タンパク質を、１０ｍＭ Tris（ｐＨ８）中で疎水性表面（例えばテフロン（登録商標））と共にインキュベートすることによって媒介される。ステンレス鋼またはガラスなどの親水性表面については、必要に応じて０．１＆ Tween 20の存在下で、５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４）中で、融合物をインキュベートする。結合を増強するためまたは表面の均一な被覆を確実にするため、最大で８０℃の高温を使用し得る。
【０２７２】
他のグラム陽性生物またはグラム陰性生物由来の同等のタンパク質配列（例えばサルモネラ属種由来ＡｇｆＡ）との融合物もまた使用され得る。
【０２７３】
サルモネラＡｇｆＡタンパク質のタンパク質配列（配列番号６６）
ＭＫＬＬＫＶＡＡＦＡＡＩＶＶＳＧＳＡＬＡＧＶＶＰＱＷＧＧＧＧＮＨＮＧＧＧＮＳＳＧＰＤＳＴＬＳＩＹＱＹＧＳＡＮＡＡＬＡＬＱＳＤＡＲＫＳＥＴＴＩＴＱＳＧＹＧＮＧＡＤＶＧＱＧＡＤＮＳＴＩＥＬＴＱＮＧＦＲＮＮＡＴＩＤＱＷＮＡＫＮＳＤＩＴＶＧＱＹＧＧＮＮＡＡＬＶＮＱＴＡＳＤＳＳＶＭＶＲＱＶＧＦＧＮＮＡＴＡＮＱＹ
【０２７４】
（実施例２０）
（バイオフィルム生成のためのさらなる自己集合ペプチドおよびタンパク質）
原線維または表面反応性バイオフィルムに自己集合し得るペプチドとのｔＡＫ融合物を含有するさらなるインジケータデバイスの生成もまた、提供される。適切な融合パートナーのリストを以下の表に示す。
【０２７５】
【表３−１】
0005597552.tif 000008
【０２７６】
【表３−２】
0005597552.tif 000009
【０２７７】
（実施例２１）
（バイオフィルムの除去のためのコンタクトレンズ洗浄の有効性のモニタリングのためのインジケータ）
種々の細菌およびウイルスが、浮遊型およびバイオフィルム型の両方でコンタクトレンズ装用者に対して潜在的危険性をもたらす。インジケータデバイスは、このような生物の除去のための洗浄法の有効性をモニタリングするために有利に生成され得る。
【０２７８】
上記の線毛融合物は、グラム陰性病原体の除去の指標を提供し得る。ハイドロフォビン遺伝子ファミリーのメンバーはいずれも、これらの高度に保存された分子が付着の主要メディエーターである場合、菌類病原体の除去に適切なインジケータ融合物である。ハイドロフォビン遺伝子、またはフザリウム属種（Fusarium species）およびカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）由来の同等物は、これらの生物が潰瘍および長期の損傷に至る眼感染の最も大きな脅威の１つを代表するので、適切である。
【０２７９】
前の実施例に記載のように、これらの分子のいずれかとの融合タンパク質を生成し、そして適切なフィルム内に処方し得る。これらのインジケータは、洗浄チャンバーの一部として取り込み得、そこで、再使用可能なコンタクトレンズが洗浄される。プロセスを適切な時間にわたって実施し、レンズを取り出す。インジケータを取り出し、活性な融合タンパク質の存在を通常の方法で衛生状態モニターを使用して評価する。所定の閾値を下回れば、コンタクトレンズは再利用に適する。上回れば（「不合格」）、コンタクトレンズを再処理するか、または破棄しなければならない。
【０２８０】
フザリウム属種由来のハイドロフォビン３タンパク質のタンパク質配列（配列番号６８）
ＭＱＦＳＴＬＴＴＶＦＡＬＶＡＡＡＶＡＡＰＨＧＳＳＧＧＮＮＰＶＣＳＡＱＮＮＱＶＣＣＮＧＬＬＳＣＡＶＱＶＬＧＳＮＣＮＧＮＡＹＣＣＮＴＥＡＰＴＧＴＬＩＮＶＡＬＬＮＣＶ  ＫＬＬ
【０２８１】
フザリウム属種由来のハイドロフォビン５タンパク質のタンパク質配列（配列番号６９）
ＭＫＦＳＬＡＡＶＡＬＬＧＡＶＶＳＡＬＰＡＮＥＫＲＱＡＹＩＰＣＳＧＬＹＧＴＳＱＣＣＡＴＤＶＬＧＶＡＤＬＤＣＧＮＰＰＳＳＰＴＤＡＤＮＦＳＡＶＣＡＥＩＧＱＲＡＲＣＣＶＬＰＩＬＤＱＧＩＬＣＮＴＰＴＧＶＱＤ
【０２８２】
（実施例２２）
（バイオフィルム除去の測定で使用するセメント様のタンパク質へのｔＡＫ融合物の生成）
Thermotoga maritima由来のｔＡＫをシロスジフジツボ由来の１９ＫＤａタンパク質に融合し、上記のように発現させる。可溶性画分または不溶性画分のいずれからも精製が行われる。ｔＡＫ含有フィルムのリフォールディングおよび引き続く固体支持体上への堆積を、実施例１９のようにして達成する。バイオフィルムの厚み、堆積速度および引き続く除去は、塩濃度およびｐＨの両方を変えることによって、ならびに融合タンパク質の濃度を変更することによって、変更され得る。
【０２８３】
本発明における使用に適したフジツボのセメント様タンパク質のタンパク質配列を、以下に記載する。熱安定性キナーゼは、セメントタンパク質のＮ末端またはＣ末端のいずれかに融合され得る。
【０２８４】
シロスジフジツボ由来のセメント様タンパク質（１９Ｋ）のタンパク質配列（配列番号７０）
ＶＰＰＰＣＤＬＳＩＫＳＫＬＫＱＶＧＡＴＡＧＮＡＡＶＴＴＴＧＴＴＳＧＳＧＶＶＫＣＶＶＲＴＰＴＳＶＥＫＫＡＡＶＧＮＴＧＬＳＡＶＳＡＳＡＡＮＧＦＦＫＮＬＧＫＡＴＴＥＶＫＴＴＫＤＧＴＫＶＫＴＫＴＡＧＫＧＫＴＧＧＴＡＴＴＩＱＩＡＤＡＮＧＧＶＳＥＫＳＬＫＬＤＬＬＴＤＧＬＫＦＶＫＶＴＥＫＫＱＧＴＡＴＳＳＳＧＨＫＡＳＧＶＧＨＳＶＦＫＶＬＮＥＡＥＴＥＬＥＬＫＧＬ
【０２８５】
アカフジツボ由来のセメント様タンパク質（２０Ｋ）のタンパク質配列（配列番号７１）
ＭＫＷＦＬＦＬＬＴＴＡＶＬＡＡＶＶＳＡＨＥＥＤＧＶＣＮＳＮＡＰＣＹＨＣＤＡＮＧＥＮＣＳＣＮＣＥＬＦＤＣＥＡＫＫＰＤＧＳＹＡＨＰＣＲＲＣＤＡＮＮＩＣＫＣＳＣＴＡＩＰＣＮＥＤＨＰＣＨＨＣＨＥＥＤＤＧＤＴＨＣＨＣＳＣＥＨＳＨＤＨＨＤＤＤＴＨＧＥＣＴＫＫＡＰＣＷＲＣＥＹＮＡＤＬＫＨＤＶＣＧＣＥＣＳＫＬＰＣＮＤＥＨＰＣＹＲＫＥＧＧＶＶＳＣＤＣＫＴＩＴＣＮＥＤＨＰＣＹＨＳＹＥＥＤＧＶＴＫＳＤＣＤＣＥＨＳＰＧＰＳＥ
【０２８６】
Thermotoga maritima由来のｔＡＫとのシロスジフジツボ由来のフジツボタンパク質の融合物のタンパク質配列；Ｎ末端融合（配列番号７２）
ＭＲＶＬＶＩＮＳＧＳＳＳＩＫＹＱＬＩＥＭＥＧＥＫＶＬＣＫＧＩＡＥＲＩＧＩＥＧＳＲＬＶＨＲＶＧＤＥＫＨＶＩＥＲＥＬＰＤＨＥＥＡＬＫＬＩＬＮＴＬＶＤＥＫＬＧＶＩＫＤＬＫＥＩＤＡＶＧＨＲＶＶＨＧＧＥＲＦＫＥＳＶＬＶＤＥＥＶＬＫＡＩＥＥＶＳＰＬＡＰＬＨＮＰＡＮＬＭＧＩＫＡＡＭＫＬＬＰＧＶＰＮＶＡＶＦＤＴＡＦＨＱＴＩＰＱＫＡＹＬＹＡＩＰＹＥＹＹＥＫＹＫＩＲＲＹＧＦＨＧＴＳＨＲＹＶＳＫＲＡＡＥＩＬＧＫＫＬＥＥＬＫＩＩＴＣＨＩＧＮＧＡＳＶＡＡＶＫＹＧＫＣＶＤＴＳＭＧＦＴＰＬＥＧＬＶＭＧＴＲＳＧＤＬＤＰＡＩＰＦＦＩＭＥＫＥＧＩＳＰＱＥＭＹＤＩＬＮＫＫＳＧＶＹＧＬＳＫＧＦＳＳＤＭＲＤＩＥＥＡＡＬＫＧＤＥＷＣＫＬＶＬＥＩＹＤＹＲＩＡＫＹＩＧＡＹＡＡＡＭＮＧＶＤＡＩＶＦＴＡＧＶＧＥＮＳＰＩＴＲＥＤＶＣＳＹＬＥＦＬＧＶＫＬＤＫＱＫＮＥＥＴＩＲＧＫＥＧＩＩＳＴＰＤＳＲＶＫＶＬＶＶＰＴＮＥＥＬＭＩＡＲＤＴＫＥＩＶＥＫＩＧＲＶＰＰＰＣＤＬＳＩＫＳＫＬＫＱＶＧＡＴＡＧＮＡＡＶＴＴＴＧＴＴＳＧＳＧＶＶＫＣＶＶＲＴＰＴＳＶＥＫＫＡＡＶＧＮＴＧＬＳＡＶＳＡＳＡＡＮＧＦＦＫＮＬＧＫＡＴＴＥＶＫＴＴＫＤＧＴＫＶＫＴＫＴＡＧＫＧＫＴＧＧＴＡＴＴＩＱＩＡＤＡＮＧＧＶＳＥＫＳＬＫＬＤＬＬＴＤＧＬＫＦＶＫＶＴＥＫＫＱＧＴＡＴＳＳＳＧＨＫＡＳＧＶＧＨＳＶＦＫＶＬＮＥＡＥＴＥＬＥＬＫＧＬ
【０２８７】
Thermotoga maritima由来のｔＡＫとのシロスジフジツボ由来のフジツボタンパク質の融合物のタンパク質配列；Ｃ末端融合（配列番号７３）
ＶＰＰＰＣＤＬＳＩＫＳＫＬＫＱＶＧＡＴＡＧＮＡＡＶＴＴＴＧＴＴＳＧＳＧＶＶＫＣＶＶＲＴＰＴＳＶＥＫＫＡＡＶＧＮＴＧＬＳＡＶＳＡＳＡＡＮＧＦＦＫＮＬＧＫＡＴＴＥＶＫＴＴＫＤＧＴＫＶＫＴＫＴＡＧＫＧＫＴＧＧＴＡＴＴＩＱＩＡＤＡＮＧＧＶＳＥＫＳＬＫＬＤＬＬＴＤＧＬＫＦＶＫＶＴＥＫＫＱＧＴＡＴＳＳＳＧＨＫＡＳＧＶＧＨＳＶＦＫＶＬＥＡＥＴＥＬＥＬＫＧＬＭＲＶＬＶＩＮＳＧＳＳＳＩＫＹＱＬＩＥＭＥＧＥＫＶＬＣＫＧＩＡＥＲＩＧＩＥＧＳＲＬＶＨＲＶＧＤＥＫＨＶＩＥＲＥＬＰＤＨＥＥＡＬＫＬＩＬＮＴＬＶＤＥＫＬＧＶＩＫＤＬＫＥＩＤＡＶＧＨＲＶＶＨＧＧＥＲＦＫＥＳＶＬＶＤＥＥＶＬＫＡＩＥＥＶＳＰＬＡＰＬＨＮＰＡＮＬＭＧＩＫＡＡＭＫＬＬＰＧＶＰＮＶＡＶＦＤＴＡＦＨＱＴＩＰＱＫＡＹＬＹＡＩＰＹＥＹＹＥＫＹＫＩＲＲＹＧＦＨＧＴＳＨＲＹＶＳＫＲＡＡＥＩＬＧＫＫＬＥＥＬＫＩＩＴＣＨＩＧＮＧＡＳＶＡＡＶＫＹＧＫＣＶＤＴＳＭＧＦＴＰＬＥＧＬＶＭＧＴＲＳＧＤＬＤＰＡＩＰＦＦＩＭＥＫＥＧＩＳＰＱＥＭＹＤＩＬＮＫＫＳＧＶＹＧＬＳＫＧＦＳＳＤＭＲＤＩＥＥＡＡＬＫＧＤＥＷＣＫＬＶＬＥＩＹＤＹＲＩＡＫＹＩＧＡＹＡＡＡＭＮＧＶＤＡＩＶＦＴＡＧＶＧＥＮＳＰＩＴＲＥＤＶＣＳＹＬＥＦＬＧＶＫＬＤＫＱＫＮＥＥＴＩＲＧＫＥＧＩＩＳＴＰＤＳＲＶＫＶＬＶＶＰＴＮＥＥＬＭＩＡＲＤＴＫＥＩＶＥＫＩＧＲ
【０２８８】
熱安定性キナーゼ融合タンパク質の生成で使用する新規のフジツボのセメントタンパク質のタンパク質配列。このタンパク質の方解石依存的凝集および接着により、このタイプのインジケータは、凝集物から無機イオンを除去し得るプロセスを、バイオファウリングまたはバイオフィルムの脱安定化および除去に関してこのような方法でモニタリングできる。熱安定性キナーゼは、必要に応じてＮ末端またはＣ末端に融合され得る。Moriら、2007、Calcite-specific coupling protein in barnacle underwater cement；FEBS Journal、２７４、６４３６〜６４４６ページからの配列。
【０２８９】
シロスジフジツボ方解石特異的吸着物質のタンパク質配列（配列番号７４）
ＭＫＹＴＬＡＬＬＦＬＴＡＩＩＡＴＦＶＡＡＨＫＨＨＤＨＧＫＳＣＳＫＳＨＰＣＹＨＣＨＴＤＣＥＣＮＨＨＨＤＤＣＮＲＳＨＲＣＷＨＫＶＨＧＶＶＳＧＮＣＮＣＮＬＬＴＰＣＮＱＫＨＰＣＷＲＲＨＧＫＫＨＧＬＨＲＫＦＨＧＮＡＣＮＣＤＲＬＶＣＮＡＫＨＰＣＷＨＫＨＣＤＣＦＣ
【０２９０】
熱安定性キナーゼ含有ペプチドバイオフィルム調製物の形成で使用するフジツボのセメントタンパク質に由来するペプチドのペプチド配列。Nakanoら、2007、Self assembling peptide inspired by a barnacle underwater adhesive protein；Biomacromolecules、８巻、１８３０〜１８３５ページからの配列。
【０２９１】
ペプチド１（配列番号７５）
ＳＫＬＰＣＮＤＥＨＰＣＹＲＫＥＧＧＶＶＳＣＤＣＫ
【０２９２】
ペプチド２（配列番号７６）
ＳＫＬＰＳＮＤＥＨＰＳＹＲＫＥＧＧＶＶＳＳＤＳＫ
【０２９３】
ペプチド３（配列番号７７）
ＫＴＩＴＣＮＥＤＨＰＣＹＨＳＹＥＥＤＧＶＴＫＳＤＣＤＣＥ
【０２９４】
（医療デバイスの洗浄のモニタリングのためのセメント−ｔＡＫ融合物の使用）
上記のインジケータを、前の実施例に記載の堆積方法を使用して、手術器具として代表的なグレードのステンレス鋼の上へ堆積させる。デバイスを標準的な器具ロードの中に挿入し、プロセスを標準通りに実施する。デバイスをプロセスの終了時に取り出し、ｔＡＫ融合物の残余活性を潜在的に感染性の汚れ成分の除去と相関させる。
【０２９５】
（バイオファウリングの除去のモニタリングのためのセメント−ｔＡＫ融合物の使用）
上記のインジケータは、他の状況において、バイオファウリングの除去をモニタリングするためにも使用し得る。例えば、インジケータは、フジツボおよび他の海洋性バイオフィルムの除去のための洗浄に供されている船底に付着させ得る。インジケータを同じプロセスに供し、手順の終了時に評価する。材料の視覚的な除去が性能を決定する重要な手段ではあるが、より感度の高いアッセイ方法の使用により、顕微鏡的微量の汚染の除去の評価が可能になり、海洋性バイオフィルムの再定着により適したプライマーを提供し得る。従って、この用途では、インジケータは、即時有効性の実証および処理の寿命の指標の両方を提供する。
【０２９６】
（実施例２３）
（大腸菌または黄色ブドウ球菌のエキソ多糖へのｔＡＫの架橋）
エキソ多糖は、当業者が精通している液体培養、半液体培養、バイオフィルム培養または固体培養のいずれかにおいて、標準的な増殖条件下で関連の細菌株を増殖することによって生成される。細菌（代表的には増殖の対数期の終了近く）を、再懸濁（必要な場合）および遠心分離によって回収する。細胞を、通常は中性ｐＨ付近の低浸透力の緩衝液（代表的には１００ｍＭ未満のＮａＣｌ／ＮａＰＯ４）中で洗浄する。洗浄は、室温で１時間激しく混合することによって、または４℃にて一晩緩やかに撹拌しながら実施し得る。必要に応じて、ｐＨ３〜５の酢酸緩衝液を使用して、酸性調製物を抽出し得る。限定的な細胞変動は、非常に低いエネルギー超音波処理を使用して、または低レベルの界面活性剤の添加によって、達成し得る。調製物は、０．２μｍのニトロセルロースまたは酢酸セルロースフィルターを介して濾過滅菌し、その後に４℃または−２０℃にて保存し得る。
【０２９７】
ｔＡＫへの多糖の架橋は、種々のカップリング用化学物質を使用して達成し得る。第一の例では、S. acidocaldarius由来のｔＡＫを使用する。カップリングは、ヘテロ二官能性試薬ＡＢＨ（ｐ−アジドベンゾイルヒドラジド；Pierce Chemical company製品番号２１５１０）を使用する。プロトコルは以下のとおりである。
１．１ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）中に４．３ｍｇのメタ過ヨウ素酸ナトリウムを溶解することによって、２０ｍＭ過ヨウ素酸塩溶液を調製する。暗所で氷上に保存する。
２．少なくとも１mg/mlの糖質の濃度の１ｍｌのエキソ多糖（ＥＰＳ；または他の糖タンパク質、複合糖質もしくは脂質溶液）に、１ｍｌのメタ過ヨウ素酸塩溶液を添加する。４℃にて３０分間インキュベートする。
３．リン酸緩衝生理食塩水に対して一晩透析する。
４．ＤＭＳＯ中にＡＢＨを１．８ｍｇ溶解することによって調製する。
５．工程３で生成された酸化ＥＰＳ溶液へ１０〜１００μｌのＡＢＨを添加し、室温にて２時間インキュベートする。
６．試料を一晩透析して過剰のＡＢＨを除去する。
７．ＡＢＨにより誘導体化したＥＰＳを、前に記載のように調製したS. acidocaldarius由来の精製ｔＡＫと混合する。適切なレベルの架橋に必要なｔＡＫの濃度は、実験的に決定され得るが、代表的には１〜５ｍｇ／ｍｌの範囲である。室温にて３０分間インキュベートする。
８．ＵＶ架橋装置または同等物を使用して、反応混合物を紫外線に対して曝露する。
【０２９８】
利用可能な化学物質の第二の例では、ヘテロ二官能性剤ＭＰＢＨ（４−［４−Ｎ−マレイミドフェニル］酪酸ヒドラジド塩酸塩；Pierce Chemical company製品２２３０５）を使用する。簡潔には、プロトコルは以下のとおりである。
１．ＳＰＤＰによる誘導体化（実施例１０）および引き続く還元によって、上記のように、反応性スルフヒドリルを備えたｔＡＫ（例えばS. acidocaldarius由来）を生成する。あるいは、遊離システイン残基を備えたｔＡＫ（上記のような組換え型で発現されたArchaeoglobus fulgidus由来のｔＡＫなど）、または標準的な組換え方法によって導入した付加システイン残基を備えたｔＡＫを使用し得る。タンパク質は、０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）またはリン酸緩衝生理食塩水中でおよそ１〜５ｍｇ／ｍｌに調製する。
２．１ｍｌのジメチルホルムアミドまたはジメチルスルホキシドのいずれかの中に３．５ｍｇのＭＰＢＨを溶解し、１０ｍＭ溶液を得る。
３．タンパク質に対してＭＰＢＨの５〜１０倍モル過剰を達成するように工程１からのタンパク質に添加し、室温にて２時間（または４℃にて４時間）反応させる。
４．０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）に対して透析する。
５．１ｍｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）中に４．３ｍｇのメタ過ヨウ素酸ナトリウムを溶解することによって、２０ｍＭ過ヨウ素酸塩溶液を調製する。暗所で氷上に保存する。
６．少なくとも１mg/mlの糖質の濃度の１ｍｌのエキソ多糖（ＥＰＳ；または他の糖タンパク質、複合糖質もしくは脂質溶液）に１ｍｌのメタ過ヨウ素酸塩溶液を添加する。４℃にて３０分間インキュベートする。
７．０．１Ｍリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）に対して一晩透析する。
８．セクション４からの誘導体化したスルフヒドリル含有タンパク質を、工程７からの酸化されたＥＰＳ溶液と混合して、室温にて２時間インキュベートする。必要に応じて、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、架橋されたものを残存する遊離成分から分離する。
【０２９９】
上記の方法は、哺乳動物起源、細菌起源、古細菌起原、植物起原または真菌起原由来のものを含む、広範囲の複合糖質、糖タンパク質、糖脂質および他の糖質含有ポリマーとのｔＡＫ結合体の生成に適用可能である。
【０３００】
（エキソ多糖−ｔＡＫ融合物に基づいたインジケータの使用）
ＥＰＳ−ｔＡＫインジケータを、必要に応じて最大で５００ｍＭのＮａＣｌを含有する、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７〜７．４）、炭酸水素ナトリウム（ｐＨ９〜９．６）、または酢酸ナトリウム（ｐＨ４〜５．５）などの適切なコーティング緩衝液中に、比較的高濃度（例えば０．１〜２ｍｇ／ｍｌ）で調製する。この溶液を、手術用鋼（surgical steel）、カテーテルおよびライン（lines）に類似したプラスチック、内視鏡中で一般に使用されるプラスチックなどの適切な固体支持体の上に堆積させる。相互作用を代表的には室温にて１〜２時間進行させ、保存の前に室温で一晩コート表面を乾かす。
【０３０１】
必要に応じて、他の生物学的マトリックス成分を、コーティング段階の際にまたはその後に添加し得る。
【０３０２】
インジケータは、モニタリングされるプロセスに（例えば洗浄消毒器サイクル内に）含まれる。デバイスをプロセスの終了時に取り出し、衛生状態モニターチューブに挿入して、効果的な破壊および／または除去の読み出し値を提供する。得られた値が、ルミノメーターの衛生状態モニターの所定の閾値を下回れば、そのプロセスは、効果的であるとみなされる。好結果であるならば、インジケータと同時に処理された器具または材料のバッチは、使用され得るか、または引き続く処理に回送し得る。不合格とみなされれば、材料は、新しいインジケータデバイスと共に再処理されなくてはならない。
【０３０３】
（実施例２４）
複合糖質および糖結合体インジケータのさらなる例
広範囲の複合糖質含有分子が、上に詳述した方法（実施例２３）のような方法を使用してｔＡＫへの共有結合による付着によって、本発明のインジケータデバイスの中に取り込まれ得る。これらのいくつかのさらなる例を下記表中に記載する。
【０３０４】
【表４】
0005597552.tif 000010
【０３０５】
（実施例２５）
（医療用品の粘液汚染を減少させるように設計されたプロセスを検証するための粘液へのｔＡＫのカップリング）
粘液を、正常なヒト気管支細胞（培養細胞）のような粘液産生細胞株から精製するか、または患者からの喀痰試料から採集する。水または低塩溶液中の洗浄により、他の成分の大部分からムチンを十分に分離し得る。あるいは、動物起源（例えばブタのムチン）の精製ムチンも使用し得る。精製した調製物は、上記の方法を使用してｔＡＫに架橋され、この架橋は、図７において示したようなタンパク質のＳＰＤＰカップリングを介するタンパク質成分に対する架橋、または実施例２３において詳述した具体的な方法を使用する糖質成分に対する架橋のいずれでもよい。インジケータの堆積およびそれに続く使用を、実施例２３および２４に記載したとおりである。図８は、洗浄消毒器におけるムチンの除去をモニタリングするためのｔＡＫ−ムチン結合体の使用の結果を示す。
【図１】
0005597552.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
0005597552.tif 000018
【図９】
0005597552.tif 000019
【配列表】
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