(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＬＲＲ１を認識する抗体と、ＥＧＦＲを認識する抗体を含む、神経芽腫の治療薬をスクリーニングするためのＮＬＲＲ１とＥＧＦＲとの相互作用の測定キット。
【請求項２】
被検物質の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、ＮＬＲＲ１とＥＧＦＲとの相互作用を測定する工程と、
被検物質の存在下におけるＮＬＲＲ１とＥＧＦＲとの相互作用が、被検物質の非存在下におけるＮＬＲＲ１とＥＧＦＲとの相互作用よりも弱い場合に、当該被検物質を神経芽腫の治療薬と判定する工程と、
を備える、神経芽腫の治療薬のスクリーニング方法。
【請求項３】
被検物質の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、ＮＬＲＲ１及びＥＧＦＲを発現した細胞を培養する工程と、
培養したそれぞれの細胞における、ＮＬＲＲ１とＥＧＦＲとの相互作用を測定する工程と、
被検物質の存在下で培養した細胞におけるＮＬＲＲ１とＥＧＦＲとの相互作用が、被検物質の非存在下で培養した細胞におけるＮＬＲＲ１とＥＧＦＲとの相互作用よりも弱い場合に、当該被検物質を神経芽腫の治療薬と判定する工程と、
を備える、神経芽腫の治療薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌の治療薬のスクリーニング方法に関する。より詳細には、ＮＬＲＲ１（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）とＥＧＦＲ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）との相互作用を指標とした癌の治療薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＮＬＲＲファミリー遺伝子は、比較的正常神経系に発現し、マウス発生過程での発現解析から、胎生期における神経系および臓器形成において、細胞の増殖、分化、細胞死を制御する過程で重要な役割を果たしているものと考えられている（非特許文献１）。【０００３】
発明者らは、神経芽腫ｃＤＮＡライブラリーから約５４００の遺伝子を単離してきた（特許文献１）。これらの遺伝子の中から予後良好な神経芽腫と予後不良なものとで発現量が異なるものとしてヒトＮＬＲＲ１を同定した（非特許文献２）。図１及び図２はＮＬＲＲ１の構造を示す図である。図１に示すように、ＮＬＲＲ１は１１個のロイシン・リッチ・リピートを持つ膜一回貫通型のタンパクである。また、図２に示すように、ＮＬＲＲ１の細胞内ドメインには、リン酸化されうるチロシン残基が存在する。【０００４】
発明者らは、神経芽腫の予後不良で難治性のものにおいて、ＮＬＲＲ１の発現が有意に高いことを明らかにした（非特許文献２）。また、ＮＬＲＲ１が、代表的な発癌遺伝子であるＭｙｃ（Ｎ−Ｍｙｃ及びｃ−Ｍｙｃ転写因子）により、直接転写誘導されることを見出した。このようなことから、ＮＬＲＲ１と癌との関わりが強く示唆されるが、ＮＬＲＲ１の機能は不明であった。【０００５】
【特許文献１】国際公開第０１／６６７１９号パンフレット
【非特許文献１】Ｈａｉｎｅｓ  ＢＰ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ２８１，１４５−１５９  （２００５）
【非特許文献２】Ｈａｍａｎｏ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｏｎｃｏｌ．  ２４（６），  １４５７−６６  （２００４）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＮＬＲＲ１の機能を明らかにすることは、ＮＬＲＲ１と癌の関係を解明し、新たなメカニズムに基づく癌の治療薬の開発につながる。したがって、本発明の目的の一つは、ＮＬＲＲ１の機能を明らかにすることである。本発明の別の目的は、解明された知見をもとに、新たなメカニズムに基づく癌の治療薬のスクリーニング方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者らは、下記に示すように、本発明においてＮＬＲＲ１とＥＧＦＲが相互作用して複合体を形成することを明らかにした。さらに、この相互作用が、ＥＧＦＲからの細胞増殖シグナルを著しく亢進させることを明らかにした。また、ＮＬＲＲ１が難治性神経芽腫を含むいろいろな癌種、なかでもＮ−Ｍｙｃやｃ−Ｍｙｃが増幅あるいは発現上昇している多くの難治性癌の悪性化に深く関わっていることを明らかにした。したがって、ＮＬＲＲ１とＥＧＦＲとの相互作用を抑制する物質は癌の治療薬となり得る。【０００８】
本発明は、被検物質の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、ＮＬＲＲ１とＥＧＦＲとの相互作用を測定する工程と、被検物質の存在下におけるＮＬＲＲ１とＥＧＦＲとの相互作用が、被検物質の非存在下におけるＮＬＲＲ１とＥＧＦＲとの相互作用よりも弱い場合に、当該被検物質を癌の治療薬と判定する工程と、を備える、癌の治療薬のスクリーニング方法を提供する。本スクリーニング方法は、ＮＬＲＲ１とＥＧＦＲとが直接相互作用して複合体を形成し、ＥＧＦＲからの細胞内増殖シグナルを著しく亢進させるという分子機構に基づくものである。この分子機構は、発明者らが本発明において見出したものであり、新たなメカニズムに基づく癌の治療薬のスクリーニング方法を提供する。【０００９】
本発明はまた、被検物質の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、ＮＬＲＲ１及びＥＧＦＲを発現した細胞を培養する工程と、培養したそれぞれの細胞における、ＮＬＲＲ１とＥＧＦＲとの相互作用を測定する工程と、被検物質の存在下で培養した細胞におけるＮＬＲＲ１とＥＧＦＲとの相互作用が、被検物質の非存在下で培養した細胞におけるＮＬＲＲ１とＥＧＦＲとの相互作用よりも弱い場合に、当該被検物質を癌の治療薬と判定する工程と、を備える、癌の治療薬のスクリーニング方法を提供する。本スクリーニング方法により、新たなメカニズムに基づく癌の治療薬のスクリーニングが可能である。【００１０】
本発明はまた、ＮＬＲＲ１を認識する抗体と、ＥＧＦＲを認識する抗体を含む、ＮＬＲＲ１とＥＧＦＲとの相互作用の測定キットを提供する。このようなキットを用いると上記のスクリーニング方法におけるＮＬＲＲ１とＥＧＦＲとの相互作用を測定する工程を簡便に実施することが可能となる。【００１１】
本発明はまた、ＮＬＲＲ１とＥＧＦＲの相互作用を抑制する抗体を提供する。このような抗体は、癌の治療薬に応用することができる。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、新たなメカニズムに基づく癌の治療薬のスクリーニング方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ＮＬＲＲ１の構造を示す図である。ＳＰ：シグナルペプチド、ＬＲＲ：ロイシン・リッチ・リピート、ＩｇＣ２：イムノグロブリン様Ｃ２、ＦＮＩＩＩ：フィブロネクチン  タイプＩＩＩ、ＴＭ：膜貫通。
【図２】図２は、ＮＬＲＲ１の構造を示す図であり、リン酸化される可能性のあるチロシン残基の位置を示す。ＬＲＲ：ロイシン・リッチ・リピート、Ｉｇ：イムノグロブリン。
【図３】図３は、ＥＧＦＲとＮＬＲＲ１の結合を示すイムノブロットの写真である。ＮＬＲＲ１−ＨＡ：ＨＡタグの付いたＮＬＲＲ１、ＩＰ−ＥＧＦＲ：抗ＥＧＦＲ抗体を用いた免疫沈降、ＩＢ−ＨＡ：抗ＨＡ抗体を用いたイムノブロット、ＩＢ−ＥＧＦＲ：抗ＥＧＦＲ抗体を用いたイムノブロット。
【図４】図４は、細胞へのＥＧＦの結合を示すグラフである。
【図５】図５は、ＥＲＫ及びＡｋｔのリン酸化を示すイムノブロットの写真である。ＮＬＲＲ１−ＨＡ：ＨＡタグの付いたＮＬＲＲ１、ＩＧＦ：インスリン様増殖因子、ｐ−ＥＲＫ：リン酸化されたＥＲＫ、ｐ−Ａｋｔ：リン酸化されたＡｋｔ。
【図６】図６は、ＮＬＲＲ１タンパクの糖鎖修飾を示すイムノブロットの写真である。
【図７】図７は、ＮＬＲＲ１のチロシン残基のリン酸化を示すイムノブロットの写真である。ＩＰ：免疫沈降、ＩＢ：イムノブロット。ＮＬＲＲ１．ｍｙｃ：ｍｙｃタグの付いたＮＬＲＲ１。
【図８】図８は、ＮＬＲＲ１のチロシン残基のリン酸化を示すイムノブロットの写真である。抗ｍｙｃ抗体ＦＢＳ：ウシ胎児血清。
【図９】図９は、細胞の増殖を示すグラフである。ＯＤ：光学密度。
【図１０】図１０は、ｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化を示すイムノブロットの写真である。ＮＬＲＲ１．ｍｙｃ：ｍｙｃタグの付いたＮＬＲＲ１。
【図１１】図１１は、細胞の増殖を示すグラフである。ｓｉ−ＮＬＲＲ１：ＮＬＲＲ１に対するｓｉＲＮＡ、ＯＤ：光学密度。
【図１２】図１２は、ＮＬＲＲ１の発現を示すイムノブロットの写真である。
【図１３】図１３Ａは、ＮＬＲＲ１及びＧＡＰＤＨのｍＲＮＡの発現をＲＴ−ＰＣＲで検討した結果を示す写真である。図１３Ｂは、ＮＬＲＲ１の発現を示すイムノブロットの写真である。ＮＬＲＲ１．ｍｙｃ：ｍｙｃタグの付いたＮＬＲＲ１。
【図１４】図１４は、対照細胞及びＮＬＲＲ１の持続的発現細胞株の増殖を示すグラフである。ＮＬＲＲ１．ｍｙｃ：ｍｙｃタグの付いたＮＬＲＲ１。
【図１５】図１５は、細胞の増殖を示すグラフである。ｓｉＮＬＲＲ１：ＮＬＲＲ１に対するｓｉＲＮＡ、ＯＤ：光学密度。
【図１６】図１６は、イムノブロットの結果を示す写真である。
【図１７】図１７は、ｓｕｂ−Ｇ１細胞の割合を示すフローサイトメトリーの結果である。
【図１８】図１８は、ｓｕｂ−Ｇ１細胞の割合を示すグラフである。ｓｉＮＬＲＲ１：ＮＬＲＲ１に対するｓｉＲＮＡ。
【図１９】図１９は、イムノブロットの結果を表す写真である。
【図２０】図２０は、ＭＹＣＮの発現を解析したイムノブロットの写真である。
【図２１】図２１は、ＮＬＲＲ１の細胞外ドメインの発現を検出したイムノブロットの写真である。
【図２２】図２２は、ＮＬＲＲ１の細胞内ドメインの発現を検出したイムノブロットの写真である。
【図２３】図２３は、細胞の増殖を示すグラフである。ＯＤ：光学密度。
【図２４】図２４は、イムノブロットの結果を示す写真である。Ｍｙｃ−ＮＬＲＲ１：ｍｙｃタグの付いたＮＬＲＲ１、ｐ−ＥＲＫ：リン酸化されたＥＲＫ。
【図２５】図２５は、イムノブロットの結果を示す写真である。ＮＬＲＲ１−ＨＡ：ＨＡタグの付いたＮＬＲＲ１、ｐ−Ａｋｔ：リン酸化されたＡｋｔ。
【図２６】図２６は、細胞の増殖を示すグラフである。ＯＤ：光学密度。
【図２７】図２７は、イムノブロットの結果を表す写真である。ＦＴＩ：ＦＴＩ２７７。
【図２８】図２８は、細胞の増殖を示すグラフである。ＳＫＮＢＥ：ＳＫ−Ｎ−ＢＥ細胞、ｓｉＮＬＲＲ１：ＮＬＲＲ１に対するｓｉＲＮＡ、ＳＹ５Ｙ：ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、ＳＡＮ：ＳＭＳ−ＳＡＮ細胞。
【図２９】図２９は、イムノブロットの結果を示す写真である。Ｐ−ＥＲＫ：リン酸化されたＥＲＫ、Ｐ−ｐ３８ＭＡＰＫ：リン酸化されたｐ３８ＭＡＰＫ。
【図３０】図３０は、イムノブロットの結果を示す写真である。Ｗ．Ｔ．ＮＬＲＲ１．ｍｙｃ：ｍｙｃタグの付いた野生型ＮＬＲＲ１、ＮＬＲＲ１．ｍｙｃ：ｍｙｃタグの付いたＮＬＲＲ１、Ｐ−ＥＲＫ１／２：リン酸化されたＥＲＫ１／２、Ｐ−ｐ３８ＭＡＰＫ：リン酸化されたｐ３８ＭＡＰＫ、Ｐ−ｐ９０ＲＳＫ：リン酸化されたｐ９０ＲＳＫ。
【図３１】図３１は、イムノブロットの結果を示す写真である。ＦＢＳ：ウシ胎児血清、ＮＬＲＲ１．ｍｙｃ：ｍｙｃタグの付いたＮＬＲＲ１、Ｐ−ＥＲＫ１／２：リン酸化されたＥＲＫ１／２、ΔＮ  ＮＬＲＲ１：細胞外ドメインを欠失したＮＬＲＲ１。
【図３２】図３２は、イムノブロットの結果を示す写真である。ＦＢＳ：ウシ胎児血清、ＮＬＲＲ１．ｍｙｃ：ｍｙｃタグの付いたＮＬＲＲ１、Ｐ−ＥＲＫ１／２：リン酸化されたＥＲＫ１／２、ΔＣ  ＮＬＲＲ１：細胞内ドメインを欠失したＮＬＲＲ１。
【図３３】図３３は、イムノブロットの結果を示す写真である。Ｗ．Ｔ．ＮＬＲＲ１．ｍｙｃ：ｍｙｃタグの付いた野生型ＮＬＲＲ１。
【図３４】図３４は、イムノブロットの結果を示す写真である。ＮＬＲＲ１．ｍｙｃ：ｍｙｃタグの付いたＮＬＲＲ１。
【図３５】図３５は、イムノブロットの結果を示す写真である。ΔＣ  ＮＬＲＲ１．ｍｙｃ：細胞内ドメインを欠失したｍｙｃタグ付きＮＬＲＲ１。
【図３６】図３６は、イムノブロットの結果を示す写真である。ΔＮ  ＮＬＲＲ１．ｍｙｃ：細胞外ドメインを欠失したｍｙｃタグ付きＮＬＲＲ１。
【図３７】図３７は、イムノブロットの結果を示す写真である。Ｐ−ＥＲＫ１／２：リン酸化されたＥＲＫ１／２。
【図３８】図３８は、ＭＹＣＮによるＮＬＲＲ１の制御を示す図である。
【図３９】図３９は、イムノブロットの結果を示す写真である。ｍβＣＤ：メチル−β−シクロデキストリン、ＮＬＲＲ１−ＨＡ：ＨＡタグの付いたＮＬＲＲ１、ｐ−ＥＧＦＲ：リン酸化されたＥＧＦＲ、ｐ−ＥＲＫ：リン酸化されたＥＲＫ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（癌の治療薬のスクリーニング方法）
本発明の癌の治療薬のスクリーニング方法は、被検物質の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、ＮＬＲＲ１とＥＧＦＲとの相互作用を測定する工程と、被検物質の存在下におけるＮＬＲＲ１とＥＧＦＲとの相互作用が、被検物質の非存在下におけるＮＬＲＲ１とＥＧＦＲとの相互作用よりも弱い場合に、当該被検物質を癌の治療薬と判定する工程と、を備える。ＮＬＲＲ１とＥＧＦＲとの相互作用とは、より具体的には両者の結合、複合体形成を指す。相互作用の測定は、当業者にとって公知のタンパク質間相互作用を測定する系が利用可能であり、例えば、酵母ツーハイブリッド法やＰＣＡ法（プロテイン・フラグメント・コンプリメンテーション・アッセイ）、免疫沈降法、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）による解析、ゲルシフト法などが例示される。酵母ツーハイブリッド法及びＰＣＡ法の概要を以下に説明する。【００１５】
まず、酵母ツーハイブリッド法を説明する。酵母Ｇａｌ４は、Ｎ末端側のＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）とＣ末端側の転写活性化ドメイン（ＡＤ）とからなる転写制御因子である。両ドメインは基本的には自律的に機能し、ＤＢＤは単独でＤＮＡに結合できるが転写の活性化は起こせない。ＡＤはその反対である。この性質を応用して開発されたのが酵母ツーハイブリッド法である。つまり、Ｇａｌ４のＤＢＤに目的のタンパク質Ｐを融合したタンパク質（ベイト）と、Ｇａｌ４のＡＤに別のタンパク質Ｑを融合したタンパク質（プレイ）を酵母細胞に導入した場合、ＰとＱとが核内で相互作用すれば、酵母細胞内で転写制御複合体が再構成され、Ｇａｌ４結合部位依存的に転写が活性化されることになる。この活性をレポーター遺伝子を用いて検出することにより、タンパク質Ｐ及びＱの間の相互作用が容易に評価できる。レポーター遺伝子としては、例えば、ＨＩＳ３、ｌａｃＺ、ＵＲＡ３などを利用することができる。また、酵母Ｇａｌ４以外にも、ＳＲＦやＬｅｘＡを用いた系も利用することが可能である。【００１６】
酵母ツーハイブリッド法において、タンパク質ＰとしてＮＬＲＲ１を、タンパク質ＱとしてＥＧＦＲを用いた系（又はその逆の系でも構わない）によれば、本発明のスクリーニング方法を行うことが可能である。すなわち、ベイトとしてＮＬＲＲ１又はＥＧＦＲの一方を、プレイとしてＮＬＲＲ１又はＥＧＦＲの他方を酵母に発現させ、被検物質の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下で当該酵母を培養し、培養した酵母のレポーター遺伝子の転写活性（ＮＬＲＲ１とＥＧＦＲとの相互作用の強さを表す）を測定し、被検物質の存在下の転写活性が被検物質非存在下の転写活性よりも上昇している場合、被検物質は癌の治療薬であると判定できる。【００１７】
次に、ＰＣＡ法について説明する。ＰＣＡ法では、一つの機能タンパク質Ａ（酵素、転写因子など）を二つの断片Ａ１及びＡ２に分割し、それぞれを目的タンパク質Ｐ及びＱと融合し、融合タンパク質Ａ１−Ｐ及びＡ２−Ｑを作製する。目的タンパク質Ｐ及びＱが結合すると、機能タンパク質Ａの機能が回復し、その活性を検出することで、Ｐ及びＱの相互作用を判定する、という原理に基づいている。機能タンパク質としては、例えばβ−ラクタマーゼを利用することができる。以下では、β−ラクタマーゼを利用したＰＣＡ法について説明する。【００１８】
β−ラクタマーゼは細菌由来のβ−ラクタム環切断酵素である。β−ラクタマーゼを、Ｎ末端側のα１９７断片（２５〜１９７残基）とＣ末端側のω１９８断片（１９８〜２８８残基）に分割し、それぞれを目的タンパク質との融合タンパク質として発現させる。両者が結合する場合にのみβ−ラクタマーゼタンパク質の立体構造が回復し、活性を示す。β−ラクタマーゼ活性は細胞透過性の蛍光プローブＣＣＦ２／ＡＭ（ＣＣＦ２アセトキシメチルエステル）により検出される。ＣＣＦ２／ＡＭはセファロスポリン分子の両末端に２種類の異なる蛍光物質クマリン及びフルオレセインが結合した構造を有しており、クマリンをドナー、フルオレセインをアクセプターとする分子内ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）を呈する。すなわち、クマリンを４０９ｎｍの光で励起すると、フルオレセイン由来の５２０ｎｍの蛍光を発することになる。しかし、ＣＣＦ２がβ−ラクタマーゼ活性による分解を受けると、２つの蛍光物質は解離し、ＦＲＥＴは観察されなくなるため、４０９ｎｍの光の励起によってクマリン本来の４４７ｎｍの蛍光を発するようになる。４４７ｎｍの蛍光強度を測定することにより、β−ラクタマーゼの活性、すなわち、目的タンパク質の相互作用の強さを測定することが可能となる。【００１９】
したがって、ＰＣＡ法を利用して本発明のスクリーニング方法を行うには、以下の方法によればよい。機能タンパク質の二つの断片Ａ１及びＡ２の一方にＮＬＲＲ１を他方にＥＧＦＲを融合させた融合タンパク質を細胞に発現させ、被検物質の存在下又は非存在下のそれぞれの条件下で当該細胞を培養し、培養した細胞における機能タンパク質の活性を測定し、被検物質の存在下で培養した細胞における機能タンパク質の活性が、被検物質非存在下で培養した細胞における機能タンパク質の活性よりも低下している場合、被検物質は癌の治療薬であると判定できる。【００２０】
また、本発明の癌の治療薬のスクリーニング方法は、被検物質の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、ＮＬＲＲ１及びＥＧＦＲを発現した細胞を培養する工程と、培養したそれぞれの細胞における、ＮＬＲＲ１とＥＧＦＲとの相互作用を測定する工程と、被検物質の存在下で培養した細胞におけるＮＬＲＲ１とＥＧＦＲとの相互作用が、被検物質の非存在下で培養した細胞におけるＮＬＲＲ１とＥＧＦＲとの相互作用よりも弱い場合に、当該被検物質を癌の治療薬と判定する工程と、を備える。相互作用の測定は、当業者にとって公知のタンパク質間相互作用を測定する系が利用可能であり、例えば、免疫沈降法が挙げられる。免疫沈降法を用いたスクリーニング方法を以下に説明する。【００２１】
まず、ＮＬＲＲ１及びＥＧＦＲを発現した細胞を調製する。この細胞は、例えば、２９３細胞などにＮＬＲＲ１及びＥＧＦＲの発現プラスミドを導入することにより、調製することができる。解析を容易にするために、導入するＮＬＲＲ１遺伝子やＥＧＦＲ遺伝子には、ＨＡタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｍｙｃタグなどの標識ペプチドをコードする遺伝子を連結させても良い。そして、被検物質の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下でＮＬＲＲ１及びＥＧＦＲを発現した細胞を培養する。【００２２】
次に、培養したそれぞれの細胞における、ＮＬＲＲ１とＥＧＦＲとの相互作用を測定する。相互作用の測定には、まず、培養した細胞を破砕して細胞可溶化物を調製する。細胞を破砕する前にＥＧＦを培地に添加してＥＧＦＲを刺激しても良い。刺激は、例えばＥＧＦを１０ｎｇ／ｍｌの濃度で培地に添加して３分間培養することで好適に行うことができる。また、細胞を破砕する前にＤＳＰ（ジチオビス［スクシンイミジルプロピオネート］）などのタンパク質架橋剤を反応させても良い。細胞可溶化物は、細胞全体の細胞可溶化物を用いてもよいが、ＮＬＲＲ１とＥＧＦＲとの相互作用は細胞膜上で生じることから、細胞膜画分の細胞可溶化物を用いることが好ましい。調製した細胞可溶化物に、ＮＬＲＲ１又はＥＧＦＲいずれか一方の分子に対する抗体を加えて免疫沈降を行う。あるいはこれらのタンパクに連結させた標識ペプチドに対する抗体を用いて免疫沈降を行っても良い。得られた沈殿物（ＮＬＲＲ１及びＥＧＦＲの複合体が含まれている）を他方の分子に対する抗体を用いた免疫学的手法（イムノブロット等）により、ＮＬＲＲ１及びＥＧＦＲの複合体を検出、定量することにより、ＮＬＲＲ１とＥＧＦＲとの相互作用を測定できる。【００２３】
測定の結果、被検物質の存在下において培養した細胞におけるＮＬＲＲ１とＥＧＦＲとの相互作用が、被検物質の非存在下において培養した細胞におけるＮＬＲＲ１とＥＧＦＲとの相互作用よりも弱い場合（タンパク質複合体の形成量が多い場合）に、当該被検物質を癌の治療薬であると判定できる。【００２４】
上記の被検物質としては、低分子化合物、抗体、抗体断片、抗体誘導体、レクチン及びアプタマーが例示できる。低分子化合物の供給源としては例えば市販の化合物ライブラリーを利用することができる。また、ＮＬＲＲ１やＥＧＦＲを抗原とする抗体、抗体断片、抗体誘導体及びアプタマー並びにレクチンなども被検物質として好適である。これらの被検物質は入手が容易であり、癌の治療薬として大量に製造する技術も確立されている。【００２５】
上記に述べたように、神経芽腫の予後不良で難治性のものにおいて、ＮＬＲＲ１の発現が有意に高い。また、下記に示すように、ＮＬＲＲ１による増殖シグナルの増強は、ＥＧＦＲのみならず、増殖シグナルを送る他の膜受容体であるＩＧＦ（インスリン様増殖因子）受容体（ＩＧＦＲ）においても見られた。したがって、ＮＬＲＲ１は、難治性神経芽腫のみならず、いろいろな癌に関わっていると考えられる。また、上記に述べたように、ＮＬＲＲ１は、代表的な発癌遺伝子であるＭｙｃ（Ｎ−Ｍｙｃ及びｃ−Ｍｙｃ転写因子）により、直接転写誘導される。このようなことから、ＮＬＲＲ１はＮ−Ｍｙｃやｃ−Ｍｙｃが増幅あるいは発現上昇している多くの難治性がんの悪性化にも深く関わっているものと考えられる。【００２６】
したがって、本発明のスクリーニング方法によって得られる癌の治療薬は、Ｎ−Ｍｙｃやｃ−Ｍｙｃが増幅あるいは発現上昇している多くの難治性がんに対するものであってよく、より好ましくは神経芽腫に対するものであってよく、更に好ましくは、予後不良で難治性の神経芽腫に対するものであってよい。【００２７】
また、本発明のスクリーニング方法は、被検物質の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下において、ＮＬＲＲ１及びＥＧＦＲを発現した細胞の増殖速度を測定する工程を更に備えても良い。【００２８】
本発明のスクリーニング方法によって得られた癌の治療薬をリード化合物として、これに化学修飾を行うことで、より活性が高く、物性、薬物動態、毒性の面でも改善された医薬品を得ることも可能である。【００２９】
本発明はまた、ＮＬＲＲ１を認識する抗体と、ＥＧＦＲを認識する抗体を含む、ＮＬＲＲ１とＥＧＦＲとの相互作用の測定キットを提供する。このようなキットを用いると上記のスクリーニング方法におけるＮＬＲＲ１とＥＧＦＲとの相互作用を測定する工程を、例えば免疫沈降法により簡便に実施することが可能となる。これらの抗体は例えばＮＬＲＲ１やＥＧＦＲタンパクの全部又は一部分を抗原として、マウスやウサギなどの動物を免疫して作製してもよいし、抗体のファージディスプレイライブラリーから選択して作製してもよい。【００３０】
上記のキットは、ＮＬＲＲ１やＥＧＦＲの発現プラスミドを更に含んでもよい。これらの発現プラスミドを、例えば２９３細胞などの培養細胞に導入して、ＮＬＲＲ１及びＥＧＦＲを発現した細胞を得ることができる。この細胞は上記の癌の治療薬のスクリーニング方法に利用できる。また、上記のＮＬＲＲ１やＥＧＦＲの発現プラスミドは、ＮＬＲＲ１やＥＧＦＲタンパクが、ｍｙｃタグやＨＡタグなどの標識ペプチドとの融合タンパクとして発現される構造であってもよい。この場合は、キットに含まれる抗体はＮＬＲＲ１やＥＧＦＲを認識する代わりに、ＮＬＲＲ１やＥＧＦＲに連結された標識ペプチドを認識するものであってもよい。【００３１】
上記のキットは、ＮＬＲＲ１やＥＧＦＲが高発現する細胞株を更に含んでもよい。この細胞は上記の癌の治療薬のスクリーニング方法に利用できる。【００３２】
本発明はまた、ＮＬＲＲ１とＥＧＦＲの相互作用を抑制する抗体を提供する。このような抗体は、癌の治療薬に応用することができる。この抗体は、ＮＬＲＲ１及びＥＧＦＲの結合部位を認識する抗体であってもよい。この場合、抗体が上記の結合部位に結合することにより、ＮＬＲＲ１及びＥＧＦＲの結合が阻害される。【００３３】
上記の抗体は、ＮＬＲＲ１やＥＧＦＲに結合する抗体の中から選択することができる。
【実施例】
【００３４】
以下、本発明の実施例を示して、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定される物ではなく、本発明の技術的思想を逸脱しない範囲での種々の変更が可能である。【００３５】
（材料）
ＭＴＴアッセイキット（Ｃｅｌｌ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｋｉｔ）は和光純薬工業株式会社より購入した。インビトロ転写翻訳システム（Ｌ１１７０）はＰｒｏｍｅｇａ社より購入した。ｐＣＤＮＡ３．１はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社より購入した。Ｕ０１２６、ＬＹ２９４００２はＣｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社より購入した。ＡＧ１４７８、ＦＴＩ２７７、ＳＰ６００１２５、ＳＢ２０３５８０はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ社から購入した。ＥＧＦ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、Ｇ４１８およびツニカマイシン（Ｔｕｎｉｃａｍｙｃｉｎｅ）はＳｉｇｍａ社より購入した。アイソトープラベルされた１２５Ｉ−ＥＧＦはＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社から購入した。ＩＧＦはＳｉｇｍａ社から購入した。ＤＡＰＩ（４’６−ジアミノ−２−フェニルインドール）、ＰＩ（プロピジウム  アイオダイド）はＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社より購入した。ＤＳＰはＰＩＥＲＣＥ社から購入した。抗ｍｙｃ抗体（９Ｂ１１）、抗リン酸化ｐ３８ＭＡＰＫ抗体、抗ｐ３８ＭＡＰＫ抗体、抗リン酸化−ＥＧＦＲ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗リン酸化−ＥＲＫ抗体、抗ＥＲＫ抗体、抗リン酸化−Ａｋｔ抗体及び抗Ａｋｔ抗体、抗リン酸化ｐ９０ＲＳＫ抗体はＣｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社より購入した。抗リン酸化チロシン抗体（ＰＹ２０）はＢＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社より購入した。抗アクチン抗体及び抗ＨＡ抗体はＳｉｇｍａ社より購入した。抗ＭＹＣＮ抗体はＯｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社より購入した。【００３６】
（実施例１）
ＥＧＦＲをコードする発現プラスミド及びＨＡタグを付加したＮＬＲＲ１をコードする発現プラスミドを２９３細胞に導入し、強制発現させた。この細胞を１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦを含む培地で３分間培養した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄後、ＤＳＰによるクロスリンク処理を行ない、細胞を回収し、抗ＥＧＦＲ抗体を用いて免疫沈降した。続いてサンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、膜に転写後、抗ＨＡ抗体及び抗ＥＧＦＲ抗体を用いたイムノブロット法により、ＥＧＦＲとＮＬＲＲ１の結合を解析した。図３はイムノブロットの結果を示す写真である。この結果、ＥＧＦＲとＮＬＲＲ１の共発現により、ＥＧＦＲとＮＬＲＲ１の結合が見られ、ＥＧＦ処理によってその結合が増強されることが明らかとなった。【００３７】
（実施例２）
ＭＣＦ−７細胞にＮＬＲＲ１をコードする発現プラスミドを導入し強制発現させた。対照には、空のベクタープラスミドを導入した細胞を用いた。これらの細胞を、アイソトープラベルされた１２５Ｉ−ＥＧＦ  １ｎＭを含む培地で６０分間氷上にて培養した。４℃に冷却したＰＢＳを用いて洗浄後、１Ｍ  ＮａＯＨを用いて細胞を回収し、回収した細胞から検出される放射能をガンマ線測定装置によって測定した。測定結果はサンプルに含まれるタンパク質量で補正した。図４は実験結果を示すグラフである。この結果、ＮＬＲＲ１の発現により、細胞へのＥＧＦの結合が促進されることが明らかとなった。【００３８】
（実施例３）
ＭＣＦ−７細胞にＨＡタグを付加したＮＬＲＲ１をコードする発現プラスミドを導入し強制発現させた。対照には、空のベクタープラスミドを導入した細胞を用いた。これらの細胞を、０、０．１、１及び１０ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＧＦを含む培地で培養し１０分後に回収した。これらの細胞を抗リン酸化−ＥＲＫ抗体、抗ＥＲＫ抗体、抗リン酸化−Ａｋｔ抗体及び抗Ａｋｔ抗体を用いたイムノブロットに供した。図５は、イムノブロットの結果を示す写真である。この結果、ＮＬＲＲ１の強制発現により、対照と比較してＩＧＦ処理によるＥＲＫ及びＡｋｔのリン酸化が増強されることが示された。【００３９】
（実施例４）
糖鎖修飾の有無を確認する目的で、ｍｙｃタグが付加されたＮＬＲＲ１をコードするプラスミドをＣＯＳ７細胞に導入後、糖鎖合成阻害剤である、ツニカマイシン２μｇ／ｍｌの存在下及び非存在下で２４時間培養した。細胞を回収した後、ＮＬＲＲ１の発現をｍｙｃタグに対するイムノブロット法により検出した。図６はイムノブロットの結果を示す写真である。その結果、ＮＬＲＲ１タンパクの多くが糖鎖修飾を受けていることが明らかとなった。【００４０】
（実施例５）
ｍｙｃタグが付加されたＮＬＲＲ１をコードするプラスミドをＣＯＳ７細胞に導入し４８時間培養した。細胞を回収し、抗ｍｙｃ抗体を用いて免疫沈降した。続いてサンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、膜に転写後、抗ｍｙｃ抗体及び抗リン酸化チロシン抗体を用いたイムノブロット法により検出した。図７はイムノブロットの結果を示す写真である。その結果、ＮＬＲＲ１のチロシン残基がリン酸化されていることが示された。以上のことから、ＮＬＲＲ１を、細胞に強制発現させると、自身が活性化され、細胞内ドメインのチロシン残基がリン酸化されることが分かった。【００４１】
ｍｙｃタグが付加されたＮＬＲＲ１をコードするプラスミドをＣＯＳ７細胞に導入し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有条件下及び無血清条件下で４８時間培養した。細胞を回収し、抗ｍｙｃ抗体を用いて免疫沈降した。また、対照として、標準マウスＩｇＧを用いた免疫沈降も行った。続いてサンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、膜に転写後、抗リン酸化チロシン抗体を用いたイムノブロット法により検出した。続いて、膜をリプロービングし、抗ｍｙｃ抗体を用いたイムノブロット法により検出した。図８はイムノブロットの結果を示す写真である。その結果、血清存在下及び非存在下のいずれにおいても、ＮＬＲＲ１のチロシン残基がリン酸化されていることが示された。以上のことからも、ＮＬＲＲ１を細胞に強制発現させると、自身が活性化され、細胞内ドメインのチロシン残基がリン酸化されることが分かった。【００４２】
（実施例６）
ｍｙｃタグが付加されたＮＬＲＲ１をコードするプラスミドを神経芽腫由来のＳＫ−Ｎ−ＢＥ細胞に導入し、強制発現させた。ＭＴＴアッセイキットを用いて、この細胞の増殖を測定した。対照として、空のベクタープラスミドを導入したＳＫ−Ｎ−ＢＥ細胞で同様の測定を行った（図９の「モック」に相当する）。図９は、細胞の増殖を示すグラフである。その結果、ＮＬＲＲ１を強制発現させると細胞の増殖が促進されることが示された。【００４３】
ｍｙｃタグが付加されたＮＬＲＲ１を導入したＳＫ−Ｎ−ＢＥ細胞及び空のベクタープラスミドを導入したＳＫ−Ｎ−ＢＥ細胞（図１０の「モック」に相当する。）を回収し、抗ｍｙｃ抗体、抗リン酸化ｐ３８ＭＡＰＫ抗体、抗ｐ３８ＭＡＰＫ抗体及びローディングコントロールとして抗アクチン抗体を用いてイムノブロット法により検出した。図１０はイムノブロットの結果を示す写真である。その結果、下流のシグナル伝達分子であるｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化が誘導され、活性化されていることが明らかとなった。【００４４】
（実施例７）
神経芽腫由来のＳＫ−Ｎ−ＢＥ細胞にＮＬＲＲ１に対するｓｉＲＮＡを導入し、ＮＬＲＲ１の発現を抑制した。ｓｉＲＮＡとして、次の配列番号３及び４に示す塩基配列のＲＮＡ断片をアニーリングさせて使用した。
５’−ｕｃｕｕｇｇｕｕｇａｇｃｕｇｕｇｕａｇｕｕ−３’（配列番号３）
５’−ａａｃｕａｃａｃａｇｃｕｃａａｃｃａａｇａ−３’（配列番号４）
ｓｉＲＮＡ導入後、細胞を培養し、経時的ＭＴＴアッセイにより細胞増殖を定量化した。対照には、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＃１  ｓｉＲＮＡ（Ａｍｂｉｏｎ社製）を導入した細胞を用いた。図１１は、細胞の増殖を示すグラフである。その結果、ＮＬＲＲ１の発現を抑制することにより、細胞の増殖が抑制されることが示された。４日目及び５日目における結果では、Ｔ検定により、有意水準ｐ＜０．０１で統計学的に有為な差が認められた。図１２は、ＮＬＲＲ１に対するｓｉＲＮＡを導入した細胞及び対照の細胞におけるＮＬＲＲ１の発現を、抗ＮＬＲＲ１ウサギポリクローナル抗体を用いて検出したイムノブロットの写真である。抗ＮＬＲＲ１ウサギポリクローナル抗体は、ＮＬＲＲ１のアミノ酸配列（配列番号２）の６９３〜７１２残基に対応する合成ペプチドを抗原として、ウサギを免疫して作製した。また、ローディングコントロールとして抗アクチン抗体を用いた結果も示す。ｓｉＲＮＡの導入によって、ＮＬＲＲ１の発現が抑制されたことが確認された。【００４５】
（実施例８）
ｍｙｃタグが付加されたＮＬＲＲ１をコードするプラスミドをＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞に導入した。ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞は、神経芽腫に由来する、ＭＹＣＮ癌遺伝子が増幅していない細胞株である。遺伝子導入後、Ｇ４１８含有培地にて薬剤選択を行い、生存した細胞をクローニングすることにより、ＮＬＲＲ１の持続的発現細胞株を得た。対照細胞株として、空のベクタープラスミドを用いて同様の操作を行った細胞を用いた。【００４６】
図１３Ａに、対照細胞（「モック」に相当する）及びＮＬＲＲ１の持続的発現細胞株のＲＴ−ＰＣＲにより、ＮＬＲＲ１のｍＲＮＡの発現を確認した写真を示す。対照として、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ増幅した。プライマーとしては、次の配列のものを使用した。ＮＬＲＲ１  ｆｏｒｗａｒｄ：  ５’−ａａｔｔｃｇｔｃｃｃｔｇｇｔｔｔａｃｃｃ−３’（配列番号５）、ＮＬＲＲ１  ｒｅｖｅｒｓｅ：  ５’−ａｇｃｃｃｇａｃｃｔｃｃｔｔａａｔｇｔｔ−３’（配列番号６）、ＧＡＰＤＨ  ｆｏｒｗａｒｄ：  ５’−ａｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｇｔｃｔａｇａａ−３’（配列番号７）、ＧＡＰＤＨ  ｒｅｖｅｒｓｅ：  ５’−ｔｃｃａｃｃａｃｃｃｔｇｔｔｇｃｔｇｔａ−３’（配列番号８）。ＰＣＲ反応は、ＮＬＲＲ１の検出においては３０サイクル行い、ＧＡＰＤＨの検出においては２０サイクル行った。その結果、ＮＬＲＲ１遺伝子のｍＲＮＡの発現が確認された。【００４７】
図１３Ｂに対照細胞（「モック」に相当する）及びＮＬＲＲ１の持続的発現細胞株をイムノブロット法に供し、抗ｍｙｃ抗体及び抗アクチン抗体を用いて検出した結果を示す。その結果、タンパクレベルにおいてもＮＬＲＲ１の発現が確認された。【００４８】
図１４は、対照細胞（「モック」に相当する）及びＮＬＲＲ１の持続的発現細胞株の増殖を示すグラフである。その結果、ＮＬＲＲ１を強制発現させると細胞の増殖が促進されることが示された。５日目における結果では、Ｔ検定により、有意水準ｐ＜０．０１で統計学的に有為な差が認められ、６日目における結果では、有意水準ｐ＜０．００１で有為な差が認められた。【００４９】
（実施例９）
テトラサイクリン非存在下でＭＹＣＮを強制発現するＳＨＥＰ２１Ｎ細胞にＮＬＲＲ１に対するｓｉＲＮＡを導入し、経時的ＭＴＴアッセイにより細胞増殖を定量化した。図１５は、細胞の増殖を示すグラフである。テトラサイクリンの非存在下（ＭＹＣＮの発現上昇）では、テトラサイクリンの存在下（ＭＹＣＮの発現抑制）と比較して細胞の増殖が促進された。テトラサイクリンの非存在下（ＭＹＣＮの発現上昇）で、対照としてＳｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＃１  ｓｉＲＮＡを導入しても細胞の増殖速度は変化しなかった。一方、テトラサイクリンの非存在下（ＭＹＣＮの発現上昇）で、ＮＬＲＲ１に対するｓｉＲＮＡを導入すると、ＭＹＣＮ発現上昇による細胞増殖促進が起こらなくなった。このことは、ＭＹＣＮの下流でＮＬＲＲ１が機能していることを示唆している。【００５０】
（実施例１０）
ＳＫ−Ｎ−ＢＥ細胞、ＮＬＲＲ１に対するｓｉＲＮＡを導入したＳＫ−Ｎ−ＢＥ細胞及び対照としてＳｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ＃１  ｓｉＲＮＡを導入したＳＫ−Ｎ−ＢＥ細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦの存在下で１０時間培養し、細胞を回収した。続いてこれらの細胞を、抗ＭＹＣＮ抗体、抗ＮＬＲＲ１ウサギポリクローナル抗体及び抗アクチン抗体を用いたイムノブロット法に供し、ＭＹＣＮ及びＮＬＲＲ１のタンパクレベルでの発現を検出した。図１６は、イムノブロットの結果を示す写真である。対照のｓｉＲＮＡを導入した細胞の結果は図１６の「モック」に相当する。ＮＬＲＲ１に対するｓｉＲＮＡの導入により、ＥＧＦ処理によるＭＹＣＮの発現の誘導が抑制された。この結果は、ＥＧＦ処理によるＭＹＣＮの発現誘導が、ＮＬＲＲ１の発現量によって正に制御されることを示す。【００５１】
（実施例１１）
ＳＫ−Ｎ−ＡＳ神経芽腫細胞株は、血清除去すると細胞死が誘導され、フローサイトメトリー解析において、ｓｕｂ−Ｇ１細胞の数が上昇することが知られている。空のベクタープラスミドを導入したＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞（図１７左の「モック」に相当する）、ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞にＮＬＲＲ１をコードするプラスミドを導入したＮＬＲＲ１の持続的発現細胞株（図１７中央の「＋ＮＬＲＲ１」に相当する）及びこの持続的発現細胞株にＮＬＲＲ１に対するｓｉＲＮＡを導入した細胞（図１７右の「＋ｓｉＲＮＡ＋ＮＬＲＲ１」に相当する）を、３６時間の無血清条件下での培養の前後にＰＩで染色し、フローサイトメトリーにより解析した。ｓｕｂ−Ｇ１細胞の割合をアポトーシスの割合として評価した。図１７は、フローサイトメトリーの結果である。図１８は、図１７の結果を基に、各細胞の無血清条件下での培養の前後における、ｓｕｂ−Ｇ１細胞の数の全細胞数に対する割合をグラフにしたものであり、縦軸の単位は％である。ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞では、２０％以上の細胞でアポトーシスが見られたが、ＮＬＲＲ１の持続的発現細胞株では、その割合が減少していた。さらに、ＮＬＲＲ１の持続的発現細胞株にＮＬＲＲ１に対するｓｉＲＮＡを導入した細胞では、アポトーシスの増加が認められた。このことは、血清除去によるアポトーシスを抑える分子機構に、ＮＬＲＲ１が深く関与していることを示唆している。【００５２】
（実施例１２）
神経芽腫細胞株ＳＫ−Ｎ−ＢＥを様々な濃度のＥＧＦを含む培地で１０時間培養し、抗リン酸化−ＥＧＦＲ抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＭＹＣＮ抗体及び抗アクチン抗体を用いてＥＧＦ受容体のリン酸化及びＭＹＣＮの発現をイムノブロット法により解析した。図１９は、イムノブロットの結果を表す写真である。ＥＧＦの濃度に依存してＭＹＣＮの発現が増加することが示された。図２０は、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ細胞を１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦを含む培地で異なる時間培養し、抗ＭＹＣＮ抗体及び抗アクチン抗体を用いてＭＹＣＮの発現をイムノブロット法により解析した写真である。ＥＧＦによる経時的なＭＹＣＮの発現の増加が示された。以上の結果から、次のような正のフィードバック機構が存在することが考えられる。すなわち、ＥＧＦ処理によって、ＥＧＦＲシグナルが活性化され、ＭＹＣＮの発現が促進される。続いて、ＭＹＣＮによりＮＬＲＲ１の転写が促進される。続いてＮＬＲＲ１の発現が増加し、活性化される。続いて、ＮＬＲＲ１によるＥＧＦＲシグナルが活性化される。続いてＭＹＣＮの発現が更に促進される。【００５３】
（実施例１３）
ＮＬＲＲ１の細胞外ドメインのみをコードする発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１ｍｙｃ．Ｅｘｔｒａ．ＮＬＲＲ１）と、細胞内ドメインのみをコードする発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１Ｃｙｔ．ＮＬＲＲ１．ｍｙｃ）を作製した。いずれのプラスミドにもｍｙｃタグを付加させた。ｐｃＤＮＡ３．１ｍｙｃ．Ｅｘｔｒａ．ＮＬＲＲ１  ０．５μｇ及び１．０μｇをそれぞれＨｅＬａ細胞に導入し、抗Ｍｙｃ抗体を用いたイムノブロット法により検出した。対照として、空のベクタープラスミド  １．０μｇを導入したＨｅＬａ細胞を用いた。図２１はＮＬＲＲ１の細胞外ドメインの発現を検出したイムノブロットの写真である。この結果、ＮＬＲＲ１の細胞外ドメインの発現が確認された。【００５４】
ｐｃＤＮＡ３．１Ｃｙｔ．ＮＬＲＲ１．ｍｙｃ  ５μｇ及び１０μｇをそれぞれ発現させた。発現にはインビトロ転写翻訳システムを用いた。対照として、空のベクタープラスミド５μｇ及び１０μｇを発現させた。図２２はＮＬＲＲ１の細胞内ドメインの発現を検出したイムノブロットの写真である。この結果、ＮＬＲＲ１の細胞内ドメインの発現が確認された。【００５５】
（実施例１４）
ＮＬＲＲ１を強制発現させたＳＫ−Ｎ−ＢＥ細胞をＥＲＫ１／２（ＥＲＫ１及びＥＲＫ２）阻害剤Ｕ０１２６の存在下及び非存在下で培養した。また、対照としてＮＬＲＲ１をコードするプラスミドを導入していないＳＫ−Ｎ−ＢＥ細胞をＵ０１２６の非存在下で培養した。これらの細胞の増殖を経時的ＭＴＴアッセイにより定量化した。図２３は、細胞の増殖を示すグラフである。図中、ＡはＮＬＲＲ１を強制発現させたＳＫ−Ｎ−ＢＥ細胞の増殖を示し、ＢはＮＬＲＲ１を強制発現させたＳＫ−Ｎ−ＢＥ細胞をＵ０１２６の存在下で培養した場合の細胞の増殖を示し、Ｃは対照細胞の増殖を示す。この結果、ＥＲＫ１／２阻害剤により、細胞増殖が抑制された。【００５６】
（実施例１５）
ＮＬＲＲ１を乳癌細胞株ＭＣＦ−７に強制発現させ、ＥＧＦを０、０．１、１及び１０ｎｇ／ｍｌ含む培地で１０分間培養した。続いて細胞を回収し、抗リン酸化−ＥＲＫ抗体、抗ＥＲＫ抗体、抗ｍｙｃ抗体を用いたイムノブロット法に供した。図２４は、イムノブロットの結果を示す写真である。その結果、ＮＬＲＲ１の発現により、ＥＧＦによるＥＲＫのリン酸化が増強することが明らかとなった。【００５７】
（実施例１６）
ＭＣＦ−７細胞に、ＮＬＲＲ１のみ、ＥＧＦＲのみ、並びにＮＬＲＲ１及びＥＧＦＲをコードするプラスミドの組み合わせで導入して発現させた。対照として、遺伝子を導入していないＭＣＦ−７細胞を用いた。これらの細胞を、１ｎｇ／ｍｌのＥＧＦを含む培地で１０分間培養した。続いて細胞を回収し、抗リン酸化−Ａｋｔ抗体、抗Ａｋｔ抗体及び抗アクチン抗体を用いたイムノブロット法に供した。図２５は、イムノブロットの結果を示す写真である。その結果、ＮＬＲＲ１又はＥＧＦＲの発現により、ＥＧＦによるＡｋｔのリン酸化が増強することが示された。また、ＮＬＲＲ１及びＥＧＦＲの共発現によりＡｋｔのリン酸化が更に増強されることが明らかとなった。【００５８】
（実施例１７）
ＳＫ−Ｎ−ＢＥ細胞を１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦの存在下（対照、図２６の「モック」に相当する）、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ及び５μＭのＥＧＦＲ阻害剤ＡＧ１４７８の存在下、並びに、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ及び５μＭのＲａｓ阻害剤ＦＴＩ２７７の存在下で培養し、経時的ＭＴＴアッセイにより細胞増殖を定量化した。図２６は細胞の増殖を示すグラフである。その結果、対照と比較して、ＡＧ１４７８及びＦＴＩ２７７の存在下では細胞の増殖が抑制され、Ｔ検定により、有意水準ｐ＜０．０１で統計学的に有為な差が認められた。【００５９】
（実施例１８）
ＳＫ−Ｎ−ＢＥ細胞を１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ及び図２７に示した各濃度のＥＧＦＲ阻害剤ＡＧ１４７８、Ｒａｓ阻害剤ＦＴＩ２７７、ＥＲＫ１／２阻害剤Ｕ０１２６、ＰＩ３Ｋｉｎａｓｅ阻害剤ＬＹ２９４００２、ＪＮＫ阻害剤ＳＰ６００１２５又はｐ３８ＭＡＰＫ阻害剤ＳＢ２０３５８０の存在下で６時間培養した。続いて各細胞を回収し、抗ＭＹＣＮ抗体及び抗アクチン抗体を用いてＭＹＣＮの発現をイムノブロット法により解析した。図２７は、イムノブロットの結果を表す写真である。その結果、ＥＧＦＲ、Ｒａｓ、ＥＲＫ１／２及びＰＩ３Ｋｉｎａｓｅを阻害するとＥＧＦ誘導によるＭＹＣＮの発現上昇が阻害されることが示された。また、ＪＮＫ及びｐ３８ＭＡＰＫを阻害してもＥＧＦ誘導によるＭＹＣＮの発現上昇は阻害されなかった。以上の結果から、ＥＧＦ誘導のＭＹＣＮの発現上昇は、ＥＧＦＲ、Ｒａｓ、ＥＲＫ１／２及びＰＩ３Ｋｉｎａｓｅ経路に依存するが、ＪＮＫ及びｐ３８ＭＡＰＫには依存しないことが明らかとなった。【００６０】
（実施例１９）
神経芽腫由来の細胞株である、ＳＫ−Ｎ−ＢＥ細胞、ＮＬＦ細胞、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、ＳＭＳ−ＳＡＮ細胞及びＮＬＲＲ１に対するｓｉＲＮＡを導入したＳＫＮ−ＢＥ細胞を、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦの存在下及び非存在下で培養し、経時的ＭＴＴアッセイにより細胞増殖を定量化した。図２８は、細胞増殖を示すグラフであり、ＥＧＦの非存在下における細胞の増殖に対するＥＧＦの存在下における細胞の増殖の変化倍率を示す。その結果、ＥＧＦによって、神経芽腫由来の細胞の増殖が促進されることが示された。また、ＮＬＲＲ１の発現を抑制することにより、ＥＧＦ誘導の細胞増殖が顕著に抑制された。この結果は、神経芽腫におけるＥＧＦ誘導の細胞増殖にはＮＬＲＲ１が重要であることを示している。【００６１】
（実施例２０）
ＮＬＲＲ１（ｍｙｃタグ付き）又はＮＬＲＲファミリー遺伝子のひとつであるＮＬＲＲ２（ｍｙｃタグ付き）をＣＯＳ７細胞に強制発現させた。この細胞を２４時間血清飢餓状態にした後、０．０２ｎｇ／ｍｌのＥＧＦを培地に加え、０分、１５分、１時間、４時間後に回収した。これらの細胞を抗ｍｙｃ抗体、抗リン酸化−ＥＲＫ抗体、抗ＥＲＫ抗体、抗リン酸化ｐ３８ＭＡＰＫ抗体及び抗アクチン抗体を用いたイムノブロットに供した。図２９は、イムノブロットの結果を示す写真である。この結果、ＮＬＲＲ１を導入したＣＯＳ７細胞において、ｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化が確認された。【００６２】
ＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞にｍｙｃタグが付加されたＮＬＲＲ１を強制発現させた。この細胞を１２時間血清飢餓状態にした後、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を培地に添加し、０、３、５、１０、３０及び１６０分後に回収した。対照として、空のベクタープラスミドを導入したＳＫ−Ｎ−ＡＳ細胞を用いた（図３０の「モック」に相当する）。これらの細胞を抗ｍｙｃ抗体、抗リン酸化−ＥＲＫ抗体、抗ＥＲＫ抗体、抗リン酸化ｐ３８ＭＡＰＫ抗体及び抗リン酸化ｐ９０ＲＳＫ抗体を用いたイムノブロットに供した。図３０は、イムノブロットの結果を示す写真である。この結果、血清処理によってｐ３８ＭＡＰＫがリン酸化され、このリン酸化はＮＬＲＲ１の強制発現によって増強されることが示された。また同様に、血清処理によってＥＲＫ１／２がリン酸化され、このリン酸化はＮＬＲＲ１の強制発現によって増強されることが示された。【００６３】
以上の結果から、ＮＬＲＲ１は、ｐ３８ＭＡＰＫのリン酸化を神経芽腫由来の細胞のみならず、ＣＯＳ７細胞においても促進することが明らかとなった。【００６４】
（実施例２１）
ＳＫ−Ｎ−ＢＥ細胞に、ＮＬＲＲ１の細胞内ドメインのみ（ｍｙｃタグ付き）又は細胞外ドメインのみ（ｍｙｃタグ付き）をコードする発現プラスミドを導入した。対照として、空のベクタープラスミドを導入した細胞を用いた（図３１及び３２の「モック」に相当する）。これらの細胞を１２時間血清飢餓状態にした後、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を培地に添加し、０、５、１０、３０、６０及び１６０分後に回収した。これらの細胞を抗ｍｙｃ抗体、抗リン酸化−ＥＲＫ抗体及び抗ＥＲＫ抗体を用いたイムノブロットに供した。図３１は、ＮＬＲＲ１の細胞内ドメインのみを導入した細胞のイムノブロットの結果を示す写真である。図３２は、ＮＬＲＲ１の細胞外ドメインのみを導入した細胞のイムノブロットの結果を示す写真である。この結果、いずれの欠失変異体においても、ＥＲＫ１／２の活性化を、対照と比較して増強することができないことが示された。【００６５】
（実施例２２）
ＳＫ−Ｎ−ＢＥ細胞に、ｍｙｃタグを付加したＮＬＲＲ１の発現プラスミドを０、１００、２００、５００、１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で導入した。４８時間培養後、細胞を回収し、抗ｍｙｃ抗体、抗ＭＹＣＮ抗体及び抗アクチン抗体を用いたイムノブロット法に供した。図３３はイムノブロットの結果を示す写真である。この結果、ＮＬＲＲ１の発現量に応じたＭＹＣＮタンパクの発現誘導が観察された。【００６６】
ＳＫ−Ｎ−ＢＥ細胞に、ｍｙｃタグを付加したＮＬＲＲ１の発現プラスミド１０００ｎｇ／ｍｌを導入した。この細胞をＥＧＦＲ阻害剤ＡＧ１４７８  １μＭ又はＥＲＫ１／２阻害剤Ｕ０１２６  ２μＭの存在下で１２時間培養後、細胞を回収し、抗ｍｙｃ抗体、抗ＭＹＣＮ抗体及び抗アクチン抗体を用いたイムノブロット法に供した。図３４はイムノブロットの結果を示す写真である。この結果、ＮＬＲＲ１の発現によるＭＹＣＮタンパクの発現誘導は、ＥＧＦＲ阻害剤ＡＧ１４７８又はＥＲＫ１／２阻害剤Ｕ０１２６の存在下で抑制されることが示された。【００６７】
ＳＫ−Ｎ−ＢＥ細胞に、ｍｙｃタグを付加したＮＬＲＲ１の細胞外ドメインのみをコードする発現プラスミドを０、１００、２００、５００、１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で導入した。４８時間培養後、細胞を回収し、抗ｍｙｃ抗体、抗ＭＹＣＮ抗体及び抗アクチン抗体を用いたイムノブロット法に供した。図３５はイムノブロットの結果を示す写真である。この結果、ＮＬＲＲ１の細胞外ドメインのみでは、ＭＹＣＮタンパクの発現を誘導できないことが示された。【００６８】
ＳＫ−Ｎ−ＢＥ細胞に、ｍｙｃタグを付加したＮＬＲＲ１の細胞内ドメインのみをコードする発現プラスミドを０、１００、２００、５００、１０００ｎｇ／ｍｌの濃度で導入した。４８時間培養後、細胞を回収し、抗ｍｙｃ抗体、抗ＭＹＣＮ抗体及び抗アクチン抗体を用いたイムノブロット法に供した。図３６はイムノブロットの結果を示す写真である。この結果、ＮＬＲＲ１の細胞内ドメインのみでは、ＭＹＣＮタンパクの発現を誘導できないことが示された。【００６９】
以上の結果から、ＮＬＲＲ１の細胞外ドメイン又は細胞内ドメインのどちらがなくても下流のＭＹＣＮタンパクの発現を誘導することができないことが明らかとなった。【００７０】
（実施例２３）
ＳＫ−Ｎ−ＢＥ細胞に、ＮＬＲＲ１の細胞外ドメインのみ（ｍｙｃタグ付き）又は細胞内ドメインのみ（ｍｙｃタグ付き）をコードする発現プラスミドを導入した。対照として、空のベクタープラスミドを導入した細胞を用いた（図３７の「モック」に相当する）。これらの細胞を１２時間血清飢餓状態にした後、１０％ＦＢＳを培地に添加し、０、３、５、１０、３０及び１６０分後に回収した。これらの細胞を抗ｍｙｃ抗体、抗リン酸化−ＥＲＫ抗体及び抗ＥＲＫ抗体を用いたイムノブロットに供した。図３７は、イムノブロットの結果を示す写真である。この結果、ＮＬＲＲ１の細胞外ドメインのみ又は細胞内ドメインのみのいずれの欠失変異体においても、ＥＲＫ１／２の活性化を、対照と比較して増強することができないことが示された。【００７１】
図３８は、発明者らが明らかにしたＭＹＣＮによるＮＬＲＲ１の制御を示す図である。ＥＧＦ処理によって、ＥＧＦＲシグナルが活性化され、ＭＹＣＮの発現が促進される。続いて、ＭＹＣＮによりＮＬＲＲ１の発現が促進される。ＮＬＲＲ１は糖鎖修飾を受ける。ＮＬＲＲ１の発現が増加すると活性化され、細胞内ドメインのチロシン残基がリン酸化される。ＮＬＲＲ１はＥＧＦＲと結合し、ＥＧＦによるＥＧＦＲシグナルを増強する。これによりＭＹＣＮの発現が更に促進される。【００７２】
（実施例２４）
脂質ラフトを阻害するシクロデキストリン（メチル−β−シクロデキストリン、ｍβＣＤ）によって処理した細胞における、ＮＬＲＲ１のＥＧＦシグナル伝達への影響を調べた。図３９は、イムノブロットの結果を示す写真である。ＮＬＲＲ１を強制発現させたＭＣＦ−７細胞をシクロデキストリン（１０ｍＭ）を含む培地で３０分間、３７℃で培養した。培地で洗浄後、濃度の異なるＥＧＦを含む培地で３分間培養した。続いて、ＥＧＦＲおよびＥＲＫのリン酸化をウエスタンブロット法により解析した。ＮＬＲＲ１発現によりＥＧＦによるＥＧＦＲおよびＥＲＫのリン酸化の増強が検出された。これに対し、予め細胞をｍβＣＤで処理してコレステロールを除去し、脂質ラフトを壊しておくと、ＮＬＲＲ１によるＥＧＦＲおよびＥＲＫのリン酸化の増強が見られなくなった。この結果から、ＮＬＲＲ１によるＥＧＦシグナルの増強には、脂質ラフトの構造が必要であることが明らかとなった。このことから、ＮＬＲＲ１を阻害する抗体と脂質ラフトの阻害剤との併用による癌の治療法が有効であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００７３】
本発明によれば、新たなメカニズムに基づく癌の治療薬のスクリーニング方法が提供される。
【図２】
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【図４】
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【図９】
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【図１１】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１８】
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【図２３】
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【図２６】
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【図２８】
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【図１】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２７】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【配列表】
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