(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の尿に由来する試料から、ヒトウロモジュリンとヒトＩｇＡとの複合体を検出する複合体検出工程を含むＩｇＡ腎症の検査方法。
【請求項２】
前記複合体検出工程は、前記試料と、ヒトウロモジュリンに対する抗体及びヒトＩｇＡに対する抗体とを接触させることを含む請求項１に記載の検査方法。
【請求項３】
前記複合体検出工程で検出された複合体の検出量の、被験者の尿に由来する試料中の尿蛋白質量に対する比率を得る工程をさらに含む請求項１または請求項２に記載の検査方法。
【請求項４】
前記比率に基づいて、前記被験者の尿に由来する試料を、ＩｇＡ腎症患者の尿に由来する試料に関連づける工程をさらに含む請求項３に記載の検査方法。
【請求項５】
前記比率に基づいて、ＩｇＡ腎症と判定する判定工程（但し、医師によるヒトの診断行為を除く）をさらに含む請求項３または請求項４に記載の検査方法。
【請求項６】
被験者の尿に由来する試料から、ヒトウロモジュリンとヒトＩｇＡとの複合体を検出する複合体検出工程を含む腎疾患の検査方法。
【請求項７】
前記複合体検出工程は、前記試料と、ヒトウロモジュリンに対する抗体及びヒトＩｇＡに対する抗体とを接触させることを含む請求項６に記載の検査方法。
【請求項８】
前記複合体の検出量に基づいて、前記被験者の尿に由来する試料を、腎疾患患者の尿に由来する試料に関連づける工程をさらに含む請求項６または請求項７に記載の検査方法。
【請求項９】
前記複合体の検出量に基づいて、腎疾患と判定する工程（但し、医師によるヒトの診断行為を除く）をさらに含む請求項６〜請求項８のいずれか１項に記載の検査方法。
【請求項１０】
被験者の尿に由来する試料から、ヒトウロモジュリンとヒトＩｇＡとの複合体を検出する複合体検出工程と、
前記複合体検出工程で検出された前記複合体の検出量、あるいは被験者の尿に由来する試料中の尿蛋白質量に基づいて、前記被験者の尿に由来する試料を、腎疾患患者の尿に由来する試料に関連づける第１の工程と、
前記試料中の尿蛋白質量に対する前記複合体検出工程で検出された前記複合体の検出量の比率に基づいて、前記被験者の尿に由来する試料を、ＩｇＡ腎症患者の尿に由来する試料に関連づける第２の工程と、を含むＩｇＡ腎症の検査方法。
【請求項１１】
被験者の尿に由来する試料から、ヒトウロモジュリンとヒトＩｇＡとの複合体を検出する複合体検出工程と、
前記複合体検出工程で検出された前記複合体の検出量、あるいは被験者の尿に由来する試料中の尿蛋白質量に基づいて、腎疾患と判定する第１の判定工程（但し、医師によるヒトの診断行為を除く）と、
前記試料中の尿蛋白質量に対する前記複合体検出工程で検出された前記複合体の検出量の比率に基づいて、前記腎疾患をＩｇＡ腎症と判定する第２の判定工程（但し、医師によるヒトの診断行為を除く）と、を含むＩｇＡ腎症の検査方法。
【請求項１２】
前記複合体検出工程は、ヒトウロモジュリンに対する抗体と、ヒトＩｇＡに対する抗体とを用いる免疫化学的方法である請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載の検査方法。
【請求項１３】
前記免疫化学的方法は、サンドイッチ法である請求項１２に記載の検査方法。
【請求項１４】
被験者の尿に由来する試料と、ヒトウロモジュリンに対する抗体及びヒトＩｇＡに対する抗体とを接触させる工程を含む、ヒトウロモジュリンとヒトＩｇＡとの複合体の検出方法。
【請求項１５】
前記複合体は、前記ヒトウロモジュリンに対する抗体と、ヒトＩｇＡに対する抗体とを用いて免疫化学的方法で検出される請求項１４に記載の検出方法。
【請求項１６】
前記免疫化学的方法は、サンドイッチ法である請求項１５に記載の検出方法。
【請求項１７】
前記被験者は、腎疾患を発症しているヒト、腎疾患を発症していると疑われるヒト、または、腎疾患を発症する可能性を有しているヒトである請求項１４〜請求項１６のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項１８】
前記腎疾患は、ＩｇＡ腎症である請求項１７に記載の検出方法。
【請求項１９】
請求項１〜請求項１８のいずれかに１項に記載の方法に使用するための、ヒトウロモジュリンに対する抗体と、ヒトＩｇＡに対する抗体とを含む、ヒトウロモジュリンとヒトＩｇＡとの複合体の検出キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩｇＡ腎症の検査方法及び検査キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩｇＡ腎症は１９６８年Bergerらによって記載された疾患であり、糖尿病性腎症を除く慢性糸球体腎炎の中で最も頻度の高い腎疾患である（例えば、非特許文献１参照）。ＩｇＡ腎症は長期予後不良の疾患であり、透析治療を必要とする末期腎不全患者の約２５％がＩｇＡ腎症を起因疾患とするものと推定されている。従来、ＩｇＡ腎症の進行を遅延させる治療法はあっても治癒させる治療法はなかった。しかし、近年堀田らにより早期に治療を開始すれば完全寛解が得られる治療法が確立されてきた。【０００３】
一方、ＩｇＡ腎症の診断方法は「厚生省特定疾患進行性腎障害調査研究班と日本腎臓学会の共同委員会」によると、尿検査（持続的顕微鏡的血尿、持続的または間欠的蛋白尿、肉眼的血尿）、血液検査（血清ＩｇＡ値が３５０ｍｇ/ｄｌ以上）を補助的診断基準とし、確定診断は腎生検によって腎糸球体メサンギウム領域へのＩｇＡの沈着を証明することを唯一の方法としている。しかし、腎生検は1週間程度の入院を必要とし、出血の多い危険な検査方法であるため、受診率は必ずしも高いとは言えない。早期のＩｇＡ腎症を簡便かつ安全な方法で診断できる検査方法が求められているのが現状である。
また、ＩｇＡ腎症の診断方法としてＩｇＡ−フィブロネクチン複合体を用いる方法等が知られているが（例えば、特開２０００−２４１４３１号公報、特許２５９２１２１号公報、Cederholm et al., Proc.Natl.Acad.Sci., 85:4865-8, 1988参照）、これまで実用化された方法は無かった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の課題は、検出感度と特異性とが良好で、簡便かつ安全にＩｇＡ腎症と判定することができるＩｇＡ腎症の検査方法及び検査キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、鋭意努力を重ね、ヒト尿中のウロモジュリンとＩｇＡとの複合体の検出量を測定したところ、健康人やＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者に比べＩｇＡ腎症患者において、前記複合体がより高い濃度で存在することを見出し、本発明を完成するに至った。【０００６】
すなわち、前記課題を解決するための具体的手段は以下の通りである。
本発明の第１の態様は、被験者の尿に由来する試料から、ヒトウロモジュリンとヒトＩｇＡとの複合体を検出する複合体検出工程を含むＩｇＡ腎症の検査方法である。前記複合体検出工程は、前記試料と、ヒトウロモジュリンに対する抗体及びヒトＩｇＡに対する抗体とを接触させることを含むことが好ましい。また、前記複合体検出工程で検出された前記複合体の検出量の、被験者の尿に由来する試料中の尿蛋白質量に対する比率を得る工程をさらに含むことが好ましく、前記比率に基づいてＩｇＡ腎症と判定する判定工程をさらに含むことがより好ましい。【０００７】
本発明の第２の態様は、被験者の尿に由来する試料から、ヒトウロモジュリンとヒトＩｇＡとの複合体を検出する複合体検出工程を含む腎疾患の検査方法である。前記複合体検出工程は、前記試料と、ヒトウロモジュリンに対する抗体及びヒトＩｇＡに対する抗体とを接触させることを含むことが好ましい。【０００８】
本発明の第３の態様は、被験者の尿に由来する試料から、ヒトウロモジュリンとヒトＩｇＡとの複合体を検出する複合体検出工程と、前記複合体検出工程で検出された前記複合体の検出量、あるいは前記試料中の尿蛋白質量に基づいて腎疾患と判定する第１の判定工程と、前記尿料中の尿蛋白質量に対する前記複合体検出工程で検出された前記複合体の検出量の比率に基づいて、前記腎疾患をＩｇＡ腎症と判定する第２の判定工程と、を含むＩｇＡ腎症の検査方法である。
前記複合体検出工程は、ヒトウロモジュリンに対する抗体と、ヒトＩｇＡに対する抗体とを用いる免疫化学的方法であることが好ましく、サンドイッチ法であることがより好ましい。【０００９】
本発明の第４の態様は、被験者の尿に由来する試料と、ヒトウロモジュリンに対する抗体及びヒトＩｇＡに対する抗体とを接触させる工程を含む、ヒトウロモジュリンとＩｇＡとの複合体の検出方法である。前記複合体はヒトウロモジュリンに対する抗体と、ヒトＩｇＡに対する抗体とを用いて免疫化学的方法で検出されることが好ましく、前記免疫化学的方法はサンドイッチ法であることがより好ましい。
また前記被験者は、腎疾患を発症しているヒト、腎疾患を発症していると疑われるヒト、または腎疾患を発症する可能性があるヒトであることが好ましく、前記腎疾患はＩｇＡ腎症であることがより好ましい。【００１０】
また、本発明の第５の態様は、少なくとも、ヒトウロモジュリンに対する抗体と、ヒトＩｇＡに対する抗体とを含む、ヒトウロモジュリンとヒトＩｇＡとの複合体の検出キットである。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、検出感度と特異性とが良好で、簡便かつ安全にＩｇＡ腎症と判定することができるＩｇＡ腎症の検査方法及び検査キットを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】尿中のＩｇＡ−ウロモジュリン複合体をＥＬＩＳＡ法で検出した測定値の分布図である。
【図２】尿中のＩｇＡ−ウロモジュリン複合体をＥＬＩＳＡ法で検出した測定値についてのＲＯＣ解析の結果を示す図である。
【図３】尿中のＩｇＡ−ウロモジュリン複合体をＥＬＩＳＡ法で検出した測定値を尿蛋白濃度当りに補正した値の分布図である。
【図４】尿中のＩｇＡ−ウロモジュリン複合体をＥＬＩＳＡ法で検出した測定値を尿蛋白濃度当りに補正した値についてのＲＯＣ解析の結果を示す図である。
【図５】尿中のＩｇＡ−ウロモジュリン複合体をＥＣＬ法で検出した測定値の分布図である。
【図６】尿中のＩｇＡ−ウロモジュリン複合体をＥＣＬ法で検出した測定値についてのＲＯＣ解析の結果を示す図である。
【図７】尿中のＩｇＡ−ウロモジュリン複合体をＥＣＬ法で検出した測定値を尿蛋白濃度当りに補正した値の分布図である。
【図８】尿中のＩｇＡ−ウロモジュリン複合体をＥＣＬ法で検出した測定値を尿蛋白濃度当りに補正した値についてのＲＯＣ解析の結果を示す図である。
【図９】ａｎｔｉ-ＩｇＡ結合ビーズに結合した蛋白質のウエスタンブロッティング解析の結果を示す図である。
【図１０】尿中のＩｇＡ−ウロモジュリン複合体をＥＬＩＳＡ法で検出した測定値の分布図である。
【図１１】尿中のＩｇＡ−ウロモジュリン複合体をＥＬＩＳＡ法で検出した測定値についてのＲＯＣ解析の結果を示す図である。
【図１２】尿中のＩｇＡ−ウロモジュリン複合体をＥＬＩＳＡ法で検出した測定値を尿蛋白濃度当りに補正した値の分布図である。
【図１３】尿中のＩｇＡ−ウロモジュリン複合体をＥＬＩＳＡ法で検出した測定値を尿蛋白濃度当りに補正した値についてのＲＯＣ解析の結果を示す図である。
【図１４】尿中のヒトウロモジュリンをＥＬＩＳＡ法で検出した測定値の分布図である。
【図１５】尿中のヒトＩｇＡをＥＬＩＳＡ法で検出した測定値の分布図である。
【図１６】尿中のヒトＩｇＡをＥＬＩＳＡ法で検出した測定値についてのＲＯＣ解析の結果を示す図である。
【図１７】尿中のヒトＩｇＡをＥＬＩＳＡ法で検出した測定値を尿蛋白濃度当りに補正した値の分布図である。
【図１８】尿中のヒトＩｇＡをＥＬＩＳＡ法で検出した測定値を尿蛋白濃度当りに補正した値についてのＲＯＣ解析の結果を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。
本発明の腎疾患の検査方法は、被験者の尿に由来する試料から、ヒトウロモジュリンとヒトＩｇＡとの複合体を検出する複合体検出工程を含むものである。前記複合体を前記試料から検出することによって、被験者における腎疾患を良好な検出感度と良好な特異性で検出することができる。尚、前記腎疾患は、ＩｇＡ腎症とＩｇＡ腎症以外の腎疾患とを含むものである。【００１４】
本発明において、被験者の尿に由来する試料とは、被験者から採取した尿自体であっても、採取した尿に通常行われる稀釈、濃縮等の処理を行ったものであってもよい。本発明においては、ヒトから採取した尿を常法により稀釈した尿試料であることが好ましい。
さらに前記被験者の尿に由来する試料は、前記尿試料をヒトウロモジュリンに対する抗体、またはヒトＩｇＡに対する抗体と接触させて得られるものであってもよい。【００１５】
ヒトウロモジュリン（以下、単に「ウロモジュリン」ということがある）は腎臓由来の分子量８５ｋｄの糖蛋白質である。ウロモジュリンはＩＬ１、ＴＮＦと結合すること、また、ＩＬ１の阻害剤として作用することが知られており、抗炎症作用を有すると考えられている。更に妊娠中の尿中に多量に存在することが知られている。
またウロモジュリンの蛋白質部分は、健常人の尿中の主要な糖蛋白質であるタム・ホースフォール蛋白質（Tamm-Horsfall protein）の蛋白質部分と同一であることが知られている。しかしながら、ウロモジュリンと腎疾患との関係については全く知られていない。
尚、本発明において「ヒトウロモジュリン」または「ウロモジュリン」は、ウロモジュリンおよびタム・ホースフォール蛋白質を包含するものである。【００１６】
前記複合体の検出方法については特に制限はなく、通常用いられる蛋白質の検出方法を適用することができるが、検出される複合体を定量又は半定量可能な方法であることが好ましい。例えば、前記複合体と結合する抗体を用いる方法、イオン交換クロマトグラフィー、質量分析等を挙げることができる。【００１７】
本発明において複合体の検出に用いる装置には特に制限はなく、複合体の検出方法に応じて適宜選択することができる。具体的には例えば、ＨＰＬＣ機器、質量分析機器（マススペクトロメトリー）、電気泳動機器（キャピラリー電気泳動装置等）、全自動あるいは半自動酵素免疫測定機器、セルウォッシャー、全自動あるいは半自動化学発光免疫測定機器、発光測定装置、全自動あるいは半自動電気化学発光免疫測定機器、光学測定装置、プレートリーダー、ＣＣＤカメラ、全自動あるいは半自動蛍光免疫測定機器、蛍光測定装置、全自動あるいは半自動放射免疫測定機器、液体シンチレーションカウンター、クールターカウンター、表面プラズモン測定装置、ブロッティング装置、デンシトメーター等を挙げることができる。【００１８】
本発明においては、検出感度、特異性及び簡便性の観点から、前記複合体に対する抗体を用いる免疫化学的方法であることが好ましい。前記複合体に対する抗体は、前記複合体を免疫特異的に認識して結合可能な抗体であれば特に制限はない。例えば、前記複合体中のウロモジュリンとＩｇＡとの結合部位を認識して結合する抗体、前記複合体中のウロモジュリンを認識して結合する抗体、および前記複合体中のＩｇＡを認識して結合する抗体等を挙げることができる。
尚、本明細書において「複合体に対する抗体」とは、「複合体を認識する抗体」、「複合体に結合する抗体」等の抗体において通常用いられる意味で用いられるものである。すなわち、前記「複合体に対する抗体」は、ヒトウロモジュリン及びヒトＩｇＡからなる複合体の少なくとも一部と結合し、新たな複合体を形成する。以下、「ヒトウロモジュリンに対する抗体」、「ヒトＩｇＡに対する抗体」等についても同様である。
本発明における免疫化学的方法としては、通常行われる方法を特に制限なく用いることができる。具体的には例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、化学発光免疫測定法、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬ）、吸光度測定、蛍光抗体法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、表面プラズモン共鳴、ウェスタンブロット法、ドットブロット法等を挙げることができる。本発明においては、検出感度、特異性及び簡便性の観点から、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）または電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬ）を用いることが好ましい。【００１９】
本発明における免疫化学的方法としては、特異性と簡便性の観点から、前記複合体中のウロモジュリンを認識して結合する抗体と前記複合体中のＩｇＡを認識して結合する抗体とを用いるサンドイッチ法であることが好ましい。【００２０】
前記サンドイッチ法は例えば、以下のようにして行うことができる。前記複合体と結合する抗体（一次抗体）を、プレート等の担体に固相化する。通常プレート等の非特異的な結合部位をふさぐため、カゼイン等の蛋白質あるいは界面活性剤でブロッキング操作を行なう。次いで尿に由来する試料または被検試料を添加してインキュベーションする。プレート等を洗浄した後、前記複合体と結合する抗体であって標識された二次抗体を添加し、インキュベーション後、プレート等を洗浄し、標識を検出する方法で行うことができる。【００２１】
本発明においては、検出感度と特異性の観点から、前記一次抗体及び前記二次抗体として、前記複合体に結合する抗体から選ばれる２種の抗体を用いることが好ましく、前記一次抗体及び前記二次抗体のうち一方の抗体としてウロモジュリンに対する抗体を用い、他方の抗体としてヒトＩｇＡに対する抗体を用いることが、より好ましい。【００２２】
本発明において、前記複合体に結合する抗体はポリクローナル抗体であってもモノクローナル抗体であってもよいが、腎疾患の検出特異性の観点から、モノクローナル抗体であることが好ましい。
前記複合体に結合する抗体は、通常行われる方法によって調製することができる。【００２３】
ウロモジュリンに対するポリクローナル抗体は通常の作製方法により得ることができ、例えば、次のようにして得ることができる。ウロモジュリンをウサギ、ヤギ等の動物に免疫して血清を得る。これを例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、ウロモジュリンをカップリングしたアフィニティカラム等により精製することで調製できる。
本発明においては、ヒトウロモジュリンを用いて作製した抗体からウロモジュリン以外の抗原に結合する抗体を、通常行われる方法、例えば吸収操作等によって除いたウロモジュリンに対する特異性がより高い抗体であることが好ましい。【００２４】
またウロモジュリンに対するモノクローナル抗体は、通常の作製方法で得ることができる。例えば、ウロモジュリンを、マウスなどの小動物に免疫を行う。同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、マウスミエローマ細胞とポリエチレングリコールなどの試薬により融合させる。これにより形成された融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、ウロモジュリンと結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで選択したハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収する。得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインＡ、プロテインＧカラム、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、ウロモジュリンをカップリングしたアフィニティカラム等により精製することで調製できる。
また、ウロモジュリンに対する抗体としては、市販の抗ヒトタム・ホースフォール蛋白質抗体、抗ヒトウロモジュリン抗体等を用いることもできる。さらに前記ウロモジュリンに対するモノクローナル抗体は、上記のようにして得られるマウス等の小動物に由来する抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および完全ヒト抗体等のいずれであってもよい。【００２５】
またヒトＩｇＡに対する抗体としては、前記複合体中のＩｇＡと結合可能な抗体であれば特に制限はなく、ヒトＩｇＡのＨ鎖、Ｊ鎖、分泌片（secretory component）等のいずれを認識するものであってもよい。
また、ヒトＩｇＡに対する抗体はポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよいが、複合体の検出特異性の観点から、ヒトＩｇＡに対するモノクローナル抗体であることが好ましい。
前記ヒトＩｇＡに対するモノクローナル抗体は、抗原としてヒトＩｇＡを用いて、上記ウロモジュリンに対する抗体と同様にして調製することができる。またヒトＩｇＡに対する抗体としては、市販の抗ヒトＩｇＡ抗体を用いることもできる。さらに前記ヒトＩｇＡに対するモノクローナル抗体は、上記のようにして得られるマウス等の小動物に由来する抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および完全ヒト抗体等のいずれであってもよい。【００２６】
前記標識としては特に制限なく公知の標識を用いることができる。例えば、酵素、化学発光物質、電気化学発光物質、放射性物質等を挙げることができる。
本発明においては、検出感度と簡便性の観点から、前記標識として酵素または電気化学発光物質を用いることが好ましい。
前記酵素としては、物理的、化学的方法で定量可能な酵素であれば特に制限はない。例えば、アルカリフォスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ等の酵素を挙げることができる。【００２７】
また標識の検出方法は、標識を定量又は半定量可能な検出方法であれば特に制限はなく、標識に応じて適宜選択することができる。例えば、吸光度、発光強度、蛍光強度、放射線計数等を挙げることができる。
標識を定量又は半定量することで、前記複合体を定量又は半定量することができる。【００２８】
本発明における複合体検出工程を、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用い、標識の検出を吸光度にて行なう場合、本発明に好ましく用いられる前記複合体の検出量を測定する測定装置としては、複合体に結合した標識によって生じた色素の吸光度を測定可能な吸光度測定装置であって、標識によって生じた色素を含む試料を載置する試料載置部と、前記試料に光を照射する光照射部と、前記試料からの反射光及び透過光の少なくともいずれかを受光し、受光した光量を測定する光量測定部と、を備える吸光度測定装置を挙げることができる。
本発明においては、検体（被験者の尿に由来する試料）に含まれるヒトウロモジュリンとヒトＩｇＡとの複合体と結合した標識によって生じた色素を含む試料に、前記光照射部により光を照射し、前記色素の吸光度を光量測定部より定量化することにより、検体中におけるヒトウロモジュリンとヒトＩｇＡとの複合体の存在量を測定することができる。
また、前記標識の検出を吸光度に代えて、試料からの発光を検出することによって行うこともできる。その場合は、前記吸光度測定装置に代えて、後述する電気化学発光免疫測定法に用いる装置と同様の装置を用いることができる。【００２９】
本発明における複合体検出工程を、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬ）を用い、標識の検出を試料からの発光の測定にて行なう場合、本発明に好ましく用いられる前記複合体の検出量を測定する測定装置としては、複合体に結合した標識そのものまたは反応液中の標識の基質から発せられる光を測定可能な測定装置であって、標識を含む試料を載置する試料載置部と、前記試料からの発光を受光し、受光した光量を測定する光量測定部と、を備える測定装置を挙げることができる。
本発明においては、検体に含まれるヒトウロモジュリンとヒトＩｇＡとの複合体と結合した標識を含む試料から発せられた光を前記光量測定部より定量化することにより、検体中におけるヒトウロモジュリンとヒトＩｇＡとの複合体の存在量を測定することができる。【００３０】
本発明の腎疾患の検査方法は、前記尿に由来する試料中に含まれる前記複合体の検出量に基づいて、腎疾患と判定する判定工程を含むことが好ましい。本発明における前記複合体の検出量としては、前記尿に由来する試料中に含まれる前記複合体の濃度又はそれに対応する定量値又は半定量値であれば特に制限なく用いることができる。例えば、前記複合体の検出量を直接的に測定した測定値、前記複合体の検出量を標識の検出を介して間接的に測定した測定値等を挙げることができる。【００３１】
また本発明の腎疾患の検査方法においてＩｇＡ腎症を検査する場合、ＩｇＡ腎症と判定することに用いる複合体の検出量は、被験者の尿に由来する試料中の総尿蛋白質量に対する複合体の検出量の比率であることが好ましい。前記比率は複合体の検出量の測定値を被験者の尿に由来する試料中の総尿蛋白質量の測定値で除して得られるものであっても、総尿蛋白質量に対する相対値として得られる複合体の検出量であってもよい。かかる比率に基づいて判定することで、より高い感度と特異性でＩｇＡ腎症と判定することができる。
尚、総尿蛋白質量を測定する被験者の尿に由来する試料は、同一の被験者から得られるものであれば、前記複合体の検出に用いる尿に由来する試料とは異なる試料であってもよい。【００３２】
本発明の腎疾患の検査方法における判定工程は、被験者の尿に由来する試料からのウロモジュリンとヒトＩｇＡとの複合体の検出量と、対照となる健常人の尿に由来する試料からの前記複合体の検出量とを比較する工程と、前記被験者の尿に由来する試料中の前記複合体の検出量が対照となる健常人の尿に由来する試料中の前記複合体の検出量よりも大きい場合と腎疾患とを関連づける工程と、を含むことが好ましい。【００３３】
ここで対照となる健常人とは、腎疾患を発症していないことが予め判明している個体を意味する。また、検出量が大きいとは、健常人と腎疾患患者とを区別するために設定された正常検出量（カットオフ値）よりも、被験者に由来する前記複合体の検出量のほうが大きいことである。【００３４】
前記カットオフ値は、例えば、腎疾患患者の尿に由来する試料群における前記複合体の検出量と、対照となる健常体群の尿に由来する試料群における前記複合体の検出量とをＲＯＣ解析等に付することよって設定することができる。ＲＯＣ解析は、例えば、疾病の検査方法の検出能、診断能を評価可能な解析方法であって、日本臨床検査自動化学会会誌「臨床検査の診断的有用性評価マニュアル」Ver.1.3(2004.9.1)、Vol.29 Suppl.1(通巻第154号)(2004年9月1日発行)に記載された解析方法である。
また、カットオフ値は、例えば、健常人の検出レベルの平均値に、標準偏差を２倍あるいは３倍した値を加算した値として定めることもでき、更に、感度（検出率）・特異性（偽陽性率の低さ）をバランスよく満たす値に適宜定めることができる。【００３５】
本発明における腎疾患としては、例えば、ＩｇＡ腎症（ＩｇＡＮ）、膜性腎症（ＭＮ）、ループス腎炎（ＳＬＥ）、巣状糸球体硬化症（ＦＧＳ）、微小変化型ネフローゼ症候群（ＭＣＮＳ）、糖尿病性腎症（ＤＭＮ）、アミロイドーシス、遺伝性腎症（Ａｌｐｏｒｔ）、燃え尽きＩｇＡ腎症（ＩｇＡ腎症の自然寛解状態）、膜性増殖性糸球体腎炎（ＭＰＧＮ）、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）関連腎炎、菲薄基底膜症候群（ＴＢＭＤ）、腎硬化症等を挙げることができる。
本発明の腎疾患の検査方法は、尿中の前記複合体を検出することで、ＩｇＡ腎症をはじめとする種々の腎疾患を検出することができる。【００３６】
本発明のＩｇＡ腎症の検査方法は、被験者の尿に由来する試料から、ウロモジュリンとヒトＩｇＡとの複合体を検出する複合体検出工程と、前記複合体検出工程で検出された前記複合体の検出量、あるいは被験者の尿に由来する試料中の尿蛋白質量に基づいて腎疾患と判定する判定工程と、被験者の尿に由来する試料中の尿蛋白質量に対する前記複合体検出工程で検出された前記複合体の検出量の比率に基づいて、前記腎疾患をＩｇＡ腎症と判定する判定工程と、を含むことを特徴とする。
尿に由来する試料中の総蛋白質量に対する前記複合体の検出量の比率に基づいて、ＩｇＡ腎症と判定することで、高感度かつ高特異的であって、治療介入によって完全寛解が得られる初期段階においても、簡便かつ安全にＩｇＡ腎症を判定することができる。【００３７】
本発明における複合体検出工程は、前記腎疾患の検査方法における複合体検出工程と同様である。
また、尿蛋白質量の検出方法は、尿に由来する試料中の総蛋白質量を測定可能であれば特に制限なく、通常行われる尿に由来する試料中の蛋白質検出方法を適用することができる。例えば、金井光正ら著の「臨床検査法概要改訂版第３２版」、１７３〜１７４頁、２００５年に記載の方法を適用することができる。【００３８】
本発明における第１の判定工程において、前記複合体検出工程で検出された前記複合体の検出量に基づいて腎疾患と判定する工程は、前記腎疾患の検査方法における判定工程と同様である。
また、前記尿に由来する試料中の尿蛋白質量に基づいて腎疾患と判定する工程は、健常人と腎疾患患者とを区別するために設定された正常検出量（カットオフ値）よりも、被験者の尿に由来する試料中の尿蛋白質量のほうが大きい場合と腎疾患とを関連づける工程、を含むことが好ましい。
ここで尿蛋白質量の正常検出量は通常の方法で設定することができる。【００３９】
本発明における第２の判定工程は、被験者の尿に由来する試料中の前記複合体の検出量の前記試料中の総蛋白質量に対する比率（複合体／総蛋白質）と、対照となるＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者の尿に由来する試料中の前記複合体の検出量の前記試料中の総蛋白質量に対する比率とを比較する工程と、前記被験者の尿に由来する試料中の前記複合体の検出量の前記試料中の総蛋白質量に対する比率が対照となるＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者の尿に由来する試料中の前記複合体の検出量の前記試料中の総蛋白質量に対する比率よりも大きい場合とＩｇＡ腎症とを関連づける工程と、を含むことが好ましい。【００４０】
ここで、比率が大きいとは、ＩｇＡ腎症とＩｇＡ腎症以外の腎疾患を区別するために設定されたカットオフ値よりも、被験者の尿に由来する試料中の前記複合体の検出量比率のほうが大きいことである。
前記カットオフ値は上述した腎疾患の検査方法におけるカットオフ値と同様にして設定することができるが、検出特異性の観点から、ＲＯＣ解析の結果に基づいてカットオフ値を設定することが好ましい。【００４１】
本発明のＩｇＡ腎症の検査方法は、尿中の前記複合体の検出量と総蛋白質量とを測定し、前記総蛋白質量に対する前記複合体の検出量の比率に基づいて、ＩｇＡ腎症を検出することが可能であることから、簡便で安全なＩｇＡ腎症の検査方法である。【００４２】
本発明のヒトウロモジュリンとヒトＩｇＡとの複合体の検出方法は、被験者の尿に由来する試料と、ヒトウロモジュリンに対する抗体及びヒトＩｇＡに対する抗体とを接触させる工程を含む。これによりヒトウロモジュリンとヒトＩｇＡとの複合体を、高感度かつ高い特異性で検出することができる。
本発明の複合体の検出方法には、前記腎疾患の検査方法における複合体検出工程において説明した事項を同様に適用することができる。【００４３】
また前記被験者は、腎疾患を発症しているヒト、腎疾患を発症していると疑われるヒト、または、腎疾患を発症する可能性を有しているヒトであることが好ましい。ここで言う腎疾患を発症する可能性を有しているヒトとは、腎疾患を発症しているヒトまたは腎疾患を発症していると疑われるヒトのいずれでもないあらゆるヒトをいう。また前記腎疾患はＩｇＡ腎症であることがより好ましい。【００４４】
本発明の腎疾患の検査キットは、ヒトウロモジュリンに対する抗体の少なくとも１種と、ヒトＩｇＡに対する抗体の少なくとも１種とを含むことを特徴とする。前記ヒトウロモジュリンに対する抗体と、ヒトＩｇＡに対する抗体とを用いて、尿に由来する試料中のヒトウロモジュリンとヒトＩｇＡとの複合体を検出することで、良好な検出感度と特異性で腎疾患と判定することが可能になる。
本発明の腎疾患の検査キットは、前記抗体に加えて、被験者の尿に由来する試料と、ヒトウロモジュリンに対する抗体及びヒトＩｇＡに対する抗体とを接触させて、ヒトウロモジュリンとヒトＩｇＡとの複合体を検出し、その検出量と腎疾患と関連付けることが記載された取扱い説明書をさらに含むことが好ましい。
本発明の腎疾患の検査キットは、ＩｇＡ腎症の検査用としてより好ましく用いることができる。【００４５】
日本国出願番号第２００８−１４４８８２号の開示はその全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。
【実施例】
【００４６】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。尚、特に断りのない限り、「％」は質量基準である。【００４７】
[実施例１]
＜腎疾患の検出＞
〜ＥＬＩＳＡ法による尿中ＩｇＡ−ウロモジュリン複合体の検出〜
抗ヒトタム・ホースフォール蛋白質（Tamm-Horsfall protein）抗体（Cedarlane Laboratories社製）をＰＲＯＳＥＰ−Ａ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ社製）で精製後、更に５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、０．１５Ｍ  ＮａＣｌで透析して精製した精製抗体を５μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌの濃度に５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、０．１５Ｍ  ＮａＣｌで希釈した後、ポリソープカップ（ＮＵＮＣ社製）に５０μｌ／ｗｅｌｌ注入した。カップを湿潤ボックスに入れ４℃、一夜コートした。コート後、洗浄液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、ブロッキング液（５０％ Ｎ１０２(日本油脂社製）、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、７５ｍＭ ＮａＣｌ、２％ブロックエース(大日本住友製薬社製)）を１５０μｌ／ｗｅｌｌ注入後、室温で２時間又は４℃で１日以上ブロッキングした（以下、「anti-Tamm-Horsfallカップ」という）。【００４８】
anti-Tamm-Horsfallカップを洗浄液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、検体希釈液（５０％ Ｎ１０２（日本油脂社製）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２％ブロックエース（大日本住友製薬社製））で５０倍希釈した尿検体を５０μｌ／ｗｅｌｌ注入し、室温で１時間反応した。洗浄液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄後、Can Get Signal２（ＴＯＹＯＢＯ社製）で３０００倍希釈したHRP-GOAT Anti-Human ＩｇＡ(Zymed社製)を、５０μｌ／ｗｅｌｌ注入し、室温で１時間反応した。洗浄液で３回洗浄後、3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine(TMB)Liquid Substrate System for ELISA（SIGMA社製）を１００μl／well注入し、室温で30分反応した。０．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４を１００μｌ／ｗｅｌｌ注入して反応を停止させた後、ＯＤ（４５０−６５０ｎｍ）を測定した。ＩｇＡ腎症患者９５例を含む腎疾患患者１４７例と健康人（健常人）２０例について測定した結果を図１に示す。【００４９】
ブランクを差し引いた値を比較することで、ＩｇＡ腎症患者９５例を含む腎疾患患者１４７例と健康人２０例を有意に区別できる結果を得た。
また、腎疾患患者１４７例と健康人２０例についてＲＯＣ解析を行った。ＲＯＣ曲線を図２に示す。ＲＯＣ曲線から求めたカットオフ値は０．０６６であり、そのカットオフ値から腎疾患患者１４７例と健康人２０例の陽性率を求めた結果を表１に示す。表１に示した通り、腎疾患患者１４７例中陽性１３４例（９１．２％）、健康人２０例中陽性１例（５％）であり、両者を有意に区別できた。その時の感度は９１．２％、特異度（特異性）は９５％、診断効率は９１．６％であった。【００５０】
【表１】
0005425063.tif 000002
【００５１】
＜ＩｇＡ腎症の検出＞
次に、カットオフ値以上の発色値を示した検体についてピロガロールレッド法により尿中の尿蛋白濃度を定量した。上記で得られた複合体検出量の値を尿蛋白濃度で除して、尿蛋白量あたりの複合体検出量を算出した。結果を図３に示す。尿蛋白量あたりの複合体検出量を比較することで、ＩｇＡ腎症患者８６例とＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者４７例を有意に区別できる結果を得た。
また、ＩｇＡ腎症患者８６例とＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者４７例についてＲＯＣ解析を行なったところ、図４に示すＲＯＣ曲線が得られた。ＲＯＣ曲線から求めたカットオフ値は６．５であった。そのカットオフ値からＩｇＡ腎症患者８６例とＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者４７例の陽性率を求めた結果を表２に示す。表２に示した通り、ＩｇＡ腎症患者８６例中陽性６２例（７２．１％）、ＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者４７例中陽性１３例（２７．７％）であり、両者を有意に区別できた。その時の感度は７２．１％、特異度は７２．３％、診断効率は７２．２%であった。【００５２】
【表２】
0005425063.tif 000003
【００５３】
[実施例２]
＜腎疾患の検出＞
〜電気化学発光（ＥＣＬ）法による尿中ＩｇＡ-ウロモジュリン複合体の検出〜
３０ｍｇ/ｍｌのDynabeads  M-450  Epoxy（Invitrogen社製）１ｍｌを磁石でトラップして、１ｍｌのＰＢＳ-１（１０ｍＭ燐酸カリウムバッファー、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．８）で５回洗浄した。次いで、磁石でトラップしたビーズに、精製抗ヒトタム・ホースフォール蛋白質（Tamm-Horsfall protein）抗体（Cedarlane Laboratories社製）を上記ＰＢＳ-１で透析した後、０．２ｍｇ/ｍｌの濃度に調製した溶液１ｍｌを加え、２０時間２５℃で混合した。
次いで、上記で得られたビーズを磁石でトラップして、１ｍｌの上記ＰＢＳ-１で洗浄後、１％ＢＳＡを含む５０ｍＭＴｒｉｓ-ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌを加えて２時間室温で混合した。ビーズを磁石でトラップして、１ｍｌの上記ＰＢＳ-１で５回洗浄後、０．１％ＢＳＡを含む５０ｍＭＴｒｉｓ-ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌに懸濁した（以下、「anti-Tamm-Horsfall結合ビーズ」という）。【００５４】
２４．３μgのルテニウム錯体（Igen社製）と、GOAT Anti-Human IgA (Cappel社製)１．４２５ｍｇを室温遮光下で３０分混合し、２Ｍグリシン／ＰＢＳ−１を２５μl添加し、室温遮光下で１０分混合した後、Sephdex G-25カラムでゲルろ過し、抗ヒトＩｇＡ抗体にルテニウム錯体が結合した分画をプールした（以下、「anti-IgAルテニウム標識抗体」という）。【００５５】
anti-Tamm-Horsfall結合ビーズ３０ｍｇ／ｍｌを検体希釈液（５０％ Ｎ１０２（日本油脂）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２％ ブロックエース（大日本住友製薬））で６０倍希釈（０．５ｍｇ／ｍｌ）した。また、anti-IgAルテニウム標識抗体をCan Get Signal２（ＴＯＹＯＢＯ社製）で希釈し０．５μｇ／ｍｌ濃度に調製した。６０倍希釈したanti-Tamm-Horsfall結合ビーズと０．５μｇ／ｍｌ濃度に調製したanti-IgAルテニウム標識抗体をそれぞれ専用ホルダーにセットした。反応管に検体希釈液を２００μl注入し、次いで検体５μlをそれぞれ添加して混合攪拌した。専用の反応管ラックに反応管を詰め、電気化学発光法自動測定装置（ピコルミシリーズ、三光純薬社製）に試薬と検体をセットして、第一反応時間９分、第二反応時間９分の反応条件で自動測定した。ＩｇＡ腎症患者８８例を含む腎疾患患者１２８例と健康人１９例について測定した結果を図５に示す。【００５６】
測定カウント値からブランク値を差し引いた値を比較したとき、ＩｇＡ腎症患者８８例を含む腎疾患患者１２８例と健康人１９例を有意に区別できる結果を得た。
また、ＩｇＡ腎症患者８８例を含む腎疾患患者１２８例と健康人１９例についてＲＯＣ解析を行なったところ、図６に示すＲＯＣ曲線が得られた。ＲＯＣ曲線から求めたカットオフ値は５１０．３であった。そのカットオフ値からＩｇＡ腎症患者８８例を含む腎疾患患者１２８例と健康人１９例の陽性率を求めた結果を表３に示す。表３に示した通り、腎疾患患者１２８例中陽性１０９例（８５．２％）、健康人１９例中陽性３例（１５．８％）であり、両者を有意に区別できた。またその時の感度は８５．２％、特異度は８４．２％、診断効率は８５．０％であった。【００５７】
【表３】
0005425063.tif 000004
【００５８】
＜ＩｇＡ腎症の検出＞
次に、測定カウント値からブランク値を差し引いた値が、カットオフ値以上の値を示した検体についてピロガロールレッド法により尿中の蛋白濃度を定量した。上記で得られた複合体検出量の値を尿蛋白濃度で除して、尿蛋白量あたりの複合体検出量を算出した。結果を図７に示す。図７から、ＩｇＡ腎症患者７７例とＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者３２例を有意に区別できることが分かる。
また、ＩｇＡ腎症患者７７例とＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者３２例についてＲＯＣ解析を行ったところ、図８に示すＲＯＣ曲線が得られた。ＲＯＣ曲線から求めたカットオフ値は３９．５２５であった。そのカットオフ値からＩｇＡ腎症患者７７例とＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者３２例の陽性率を求めた結果を表４に示す。表４に示した通り、ＩｇＡ腎症患者７７例中陽性５８例（７５．３％）、ＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者３２例中陽性９例（２８．１％）であり、両者を有意に区別できた。その時の感度は７５．３％、特異度は７１．９％、診断効率は７４．３%であった。【００５９】
【表４】
0005425063.tif 000005
【００６０】
[実施例３]
＜尿中のウロモジュリン−ＩｇＡ複合体中に含まれるウロモジュリンのウェスタンブロット法による解析＞
３０ｍｇ/ｍｌのDynabeads  M-450  Epoxy（Invitrogen社製）１ｍｌを磁石でトラップして、１ｍｌのＰＢＳ-１（１０ｍＭ燐酸カリウムバッファー、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．８）で３回洗浄した後、磁石でトラップしたビーズに、抗ヒトＩｇＡ抗体（Cappel社製）を上記ＰＢＳ-１で透析した後、０．２ｍｇ/ｍｌの濃度に調製した溶液１ｍｌを加え、１昼夜２５℃で混合した。
得られたビーズを磁石でトラップして、１ｍｌの上記ＰＢＳ-１で洗浄後、１％ＢＳＡを含む５０ｍＭＴｒｉｓ-ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌを加えて１昼夜４℃で混合した。ビーズを磁石でトラップして、１ｍｌの上記ＰＢＳ-１で３回洗浄後、０．１％ＢＳＡを含む５０ｍＭＴｒｉｓ-ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）、１５ｍＭ ＮａＣｌに懸濁した（以下、「ａｎｔｉ-ＩｇＡ結合ビーズ」という）。
同様に、３０ｍｇ/ｍｌのDynabeads  M-450  Epoxy  １ｍｌを磁石でトラップして、１ｍｌの上記ＰＢＳ-１で３回洗浄した後、磁石でトラップしたビーズに１％ＢＳＡを含む５０ｍＭＴｒｉｓ-ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌを加えて１昼夜４℃で混合した。得られたビーズを磁石でトラップして、１ｍｌの上記ＰＢＳ-１で３回洗浄後、０．１％ＢＳＡを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌに懸濁した（以下、「ＢＳＡ結合ビーズ」という）。【００６１】
４５ｍｌの尿サンプルに２．５ｍｌの１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．５）、１．５ｍｌの５Ｍ  ＮａＣｌを加え、さらに０．２５ｍｌのanti-IgA結合ビーズまたはＢＳＡ結合ビーズを加えて、１昼夜４℃で混合した。ビーズをそれぞれ磁石でトラップして、５０ｍｌから１ｍｌの上記ＰＢＳ−１で５回洗浄後、０．５ｍｌの０．１Ｍクエン酸バッファー（ｐＨ３)を加えて室温で３０分混合した。ビーズを磁石でトラップして上清を回収し、１／１０濃度の上記ＰＢＳ−１、０．０１％ＮａＮ３で透析後、約１０倍の濃度に遠心濃縮し、タンパク溶液を調製した。【００６２】
調製したタンパク溶液３μlをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ニトロセルロースフィルター（Schleicher&Schuell、ＢＡ８５）にブロッティングした。フィルターをブロッキング液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５％スキムミルク、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％ ＮａＮ３）に浸し、４℃で一夜振とうした後、ブロッキング液を交換した。一次抗体の抗ウロモジュリン抗体（抗ヒトTamm-Horsfall protein monoclonal抗体（Cedarlane Laboratories,Ltd.)）を１／１０００濃度で加え、室温で２時間振とうし、洗浄液で３回洗浄した。次いで洗浄液に二次抗体のＨＲＰ標識抗mouse IgG（Zymed Laboratories,Inc.）を１／１０００濃度で加え、室温で１時間振とうし、洗浄液で３回洗浄した後、発色液（８．３ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．５）、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ 4-Chloro-1-Naphtol、０．０１％ Ｈ２Ｏ２）を加えて発色させた。【００６３】
上記で得られたａｎｔｉ-ＩｇＡ結合ビーズに結合したタンパクのウエスタンブロッティング解析の結果を図９に示した。尚、図９において、レーンＣは、精製ウロモジュリン１０μｇを、レーン１〜３は、ＩｇＡ腎症患者尿のａｎｔｉ−ＩｇＡ結合ビーズに結合したタンパクを泳動した。
ＩｇＡ腎症患者に由来する検体の全例で強いウロモジュリンのバンドが認められた。すなわち、ＩｇＡ腎症患者の尿中から抗ＩｇＡ抗体により免疫沈降させた抗原−ＩｇＡ複合体中には、例外なくウロモジュリンが含まれることが確認された。
以上より、ＩｇＡ腎症患者の尿中の抗原−ＩｇＡ複合体中に、ウロモジュリンが含まれることが示され、抗ウロモジュリン抗体と抗ＩｇＡ抗体によるサンドイッチ法によりＩｇＡ腎症を診断することの妥当性が確認された。【００６４】
[実施例４]
＜腎疾患の検出＞
〜ＥＬＩＳＡ法による尿中ＩｇＡ−ウロモジュリン複合体の検出２、異なる検体群による評価〜
実施例１における検体群とは異なる検体群を用いたこと以外は、実施例１と同様にしてＥＬＩＳＡ法による尿中ＩｇＡ−ウロモジュリン複合体の検出を行った。ただし、複合体量の測定値として、発色値の代わりに、以下のようにして作製した標準物（ヒトＩｇＡ−ヒトウロモジュリン複合体）における発色値を用いて、検体中の複合体量を標準物の濃度に換算した値を用いた。【００６５】
（ヒトＩｇＡ−ヒトウロモジュリン複合体の作製）
１００μｌの２ｍｇ／ｍｌ  Human IgA（Cortex社製）／ＰＢＳ-１（１０ｍＭ燐酸カリウムバッファー、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．８）と１００μｌの１ｍｇ／ｍｌ Human Tamm-Horsfall protein（Cortex社製）／ＰＢＳ-１を混合し、２０μｌのグルタールアルデヒド（TAAB LABORATORIES EQUIPMENT LIMITED社製）溶液（０．５％／ＰＢＳ-１）を加えて、２５℃で２時間混合した後、ＰＢＳ-１にて透析したものをヒトＩｇＡ−ヒトウロモジュリン複合体標準物とした。【００６６】
ＩｇＡ腎症患者３２例を含む腎疾患患者７４例と健康人（健常人）６例とから得られた検体について尿中ＩｇＡ−ウロモジュリン複合体を測定した結果を図１０に示す。【００６７】
ブランクを差し引いた値を比較することで、ＩｇＡ腎症患者３２例を含む腎疾患患者７４例と健康人６例を有意に区別できる結果を得た。
また、腎疾患患者７４例と健康人６例についてＲＯＣ解析を行った。ＲＯＣ曲線を図１１に示す。特異性が１００％になるように定めたカットオフ値は０．０６４であり、そのカットオフ値から腎疾患患者７４例と健康人６例の陽性率を求めた結果を表５に示す。表５に示した通り、腎疾患患者７４例中陽性６７例（９０．５％）、健康人６例中陽性０例（０％）であり、両者を有意に区別できた。その時の感度は９０．５％、特異度は１００％、診断効率は９１．３％であった。【００６８】
【表５】
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【００６９】
＜ＩｇＡ腎症の検出＞
次に、カットオフ値以上の複合体を検出した検体についてピロガロールレッド法により尿中の尿蛋白濃度を定量した。上記で得られた複合体検出量の値を尿蛋白濃度で除して、尿蛋白量あたりの複合体検出量を算出した。結果を図１２に示す。尿蛋白量あたりの複合体検出量を比較することで、ＩｇＡ腎症患者３１例とＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者３６例を有意に区別できる結果を得た。
また、ＩｇＡ腎症患者３１例とＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者３６例についてＲＯＣ解析を行なったところ、図１３に示すＲＯＣ曲線が得られた。ＲＯＣ曲線から求めたカットオフ値は０．１３であった。そのカットオフ値からＩｇＡ腎症患者３１例とＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者３６例の陽性率を求めた結果を表６に示す。表６に示した通り、ＩｇＡ腎症患者３１例中陽性２４例（７７．４％）、ＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者３６例中陽性５例（１３．９％）であり、両者を有意に区別できた。その時の感度は７７．４％、特異度は８６．１％、診断効率は８２．１%であった。
特に臨床診断上ＩｇＡ腎症との鑑別が困難な遺伝性腎症（Alport）８例、ＩｇＡ腎症の自然治癒例（燃え尽きＩｇＡ腎症）４例は全例陰性と判定され、臨床診断上非常に有効であることが示された。【００７０】
【表６】
0005425063.tif 000007
【００７１】
[参考例１]
＜腎疾患の検出＞
〜ＥＬＩＳＡ法による尿中ウロモジュリンの検出〜
抗ヒトタム・ホースフォール蛋白質（Tamm-Horsfall protein）抗体（sheep, poly, Biotrend Chemikalien GmbH社製）をPeroxidase Labeling Kit-NH2（DOJINDO MOLECULAR TECHNOLOGIES, Inc)を用いて、キットに添付されているマニュアルに従って、Peroxidase標識を行った（以下、「Peroxidase標識抗ヒトタム・ホースフォール蛋白質抗体」という）。
上記で得られたanti-Tamm-Horsfallカップを洗浄液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、検体希釈液（５０％ Ｎ１０２（日本油脂社製）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２％ブロックエース（大日本住友製薬社製））で１，０００から１０，０００倍希釈した尿検体を５０μｌ／ｗｅｌｌ注入し、室温で１時間反応した。洗浄液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄後、Can Get Signal２（ＴＯＹＯＢＯ社製）で１０００倍希釈したPeroxidase標識抗ヒトタム・ホースフォール蛋白質抗体を、５０μｌ／ｗｅｌｌ注入し、室温で１時間反応した。洗浄液で３回洗浄後、3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA（SIGMA社製）を１００μl／well注入し、室温で30分反応した。０．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４を１００μｌ／ｗｅｌｌ注入して反応を停止させた後、ＯＤ（４５０−６５０ｎｍ）を測定した。ＩｇＡ腎症患者３２例を含む腎疾患患者７４例と健康人６例について測定した結果を図１４に示す。【００７２】
ブランクを差し引いた値を比較したが、ＩｇＡ腎症患者３２例を含む腎疾患患者７４例と健康人６例とを区別できない結果であった。【００７３】
[参考例２]
＜腎疾患の検出＞
〜ＥＬＩＳＡ法による尿中ＩｇＡの検出〜
抗ヒトImmunoglobulin抗体（goat, poly anti-Human Ig’s, BIOSOURCE社製））を１０μｇ／ｍｌの濃度に、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、０．１５Ｍ  ＮａＣｌで希釈した後、ポリソープカップ（ＮＵＮＣ社製）に５０μｌ／ｗｅｌｌ注入した。カップを湿潤ボックスに入れ４℃、一夜コートした。コート後、洗浄液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、ブロッキング液（５０％ Ｎ１０２(日本油脂社製）、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、７５ｍＭ ＮａＣｌ、２％ブロックエース(大日本住友製薬社製)）を１５０μｌ／ｗｅｌｌ注入後、室温で２時間又は４℃で１日以上ブロッキングした（以下、「anti-Ig’sカップ」という）。
anti-Ig’sカップを洗浄液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄し、検体希釈液（５０％ Ｎ１０２（日本油脂社製）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２％ブロックエース（大日本住友製薬社製））で１，０００倍希釈した尿検体を５０μｌ／ｗｅｌｌ注入し、室温で１時間反応した。洗浄液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄後、Can Get Signal２（ＴＯＹＯＢＯ社製）で１０００倍希釈したＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＡ抗体（Zymed社製）を、５０μｌ／ｗｅｌｌ注入し、室温で１時間反応した。洗浄液で３回洗浄後、3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA（SIGMA社製）を１００μl／well注入し、室温で３０分反応した。０．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４を１００μｌ／ｗｅｌｌ注入して反応を停止させた後、ＯＤ（４５０−６５０ｎｍ）を測定した。ＩｇＡ腎症患者３２例を含む腎疾患患者７４例と健康人６例について測定した結果を図１５に示す。【００７４】
ブランクを差し引いた値を比較することで、ウロモジュリン-ＩｇＡ複合体を測定した場合に比較すると少し劣るものの、ＩｇＡ腎症患者３２例を含む腎疾患患者７４例と健康人６例を有意に区別できる結果を得た。
また、腎疾患患者７４例と健康人６例についてＲＯＣ解析を行った。ＲＯＣ曲線を図１６に示す。特異度が１００％になるように定めたカットオフ値は０．４１８であり、そのカットオフ値から腎疾患患者７４例と健康人６例の陽性率を求めた結果を表７に示す。表５に示した通り、腎疾患患者７４例中陽性６４例（８６．５％）、健康人６例中陽性０例（０％）であり、両者を有意に区別できた。その時の感度は８６．５％、特異度は１００％、診断効率は８７．５％であった。【００７５】
【表７】
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【００７６】
＜ＩｇＡ腎症の検出＞
次に、ＩｇＡ腎症患者３２例を含む腎疾患患者７４例についてピロガロールレッド法により尿中の尿蛋白濃度を定量した。上記で得られたＩｇＡ検出量の値を尿蛋白濃度で除して、尿蛋白量あたりのＩｇＡ検出量を算出した。結果を図１７に示す。また、ＩｇＡ腎症患者３２例とＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者４２例についてＲＯＣ解析を行なったところ、図１８に示すＲＯＣ曲線が得られた。尿蛋白量あたりのＩｇＡ検出量を比較することで、ＩｇＡ腎症患者３２例とＩｇＡ腎症以外の腎疾患患者４２例を有意に区別することは困難であった。【００７７】
上記から、尿中に存在するヒトＩｇＡとヒトウロモジュリンとの複合体を検出することで、健康人（健常人）と腎症患者を識別できた。
また、尿中に存在するヒトＩｇＡとヒトウロモジュリンとの複合体の尿蛋白濃度当りの検出量を測定することでＩｇＡ腎症とそれ以外の腎疾患を識別できた。
一方、尿中に存在するヒトウロモジュリンを単独で測定した場合には健康人（健常人）と腎症患患者を識別することができず、尿中に存在するヒトＩｇＡを単独で測定した場合には健康人（健常人）と腎症患患者を識別することはできるが、尿蛋白濃度当りの検出量を測定することでＩｇＡ腎症とそれ以外の腎疾患を識別することができなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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