(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面と内相との界面とをもつバルクポリマーマトリックスにより画成され、０．１〜１０，０００ミクロンの範囲の径のエマルジョン誘導の細孔と１００ミクロンまでの範囲の径のエマルジョンから誘導される細孔の結合部とから構成される７５％以上の多孔度をもつ均質に架橋された開放型セル状物質からなり、前記ポリマーマトリックスの隔壁はナノメータサイズの径のナノポア（ｎａｎｏ−ｐｏｒｅ）を含む、マイクロセルラーポリハイプポリマーの骨組（ｓｃａｆｆｏｌｄ）の製造方法であって、 
分散相にはナトリウムカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）又はポリエチレンオキシドの水溶性ポリマーを含み、 連続相にはスチレン又はアクリル酸−２−エチルヘキシルのモノマーを含み、連続相に界面活性剤としてモノオレイン酸ソルビタンを使用し、分散相に開始剤として過硫酸カリウムを使用して、前記ナノポアのサイズを達成するためにナノサイズのシリカ粒子を含む充填剤を連続相に使用して、６０〜１５０℃の温度で混合しながら連続相に分散相を投与して、その後重合することによって、連続相に連続相と混ざり合わない分散相の高内相エマルジョン（ＨＩＰＥ）を形成することを含むことを特徴とするマイクロセルラーポリハイプポリマーの骨組の製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の製造方法により得られることを特徴とするマイクロセルラーポリハイプポリマーの骨組。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】  本発明は、生物活性システム、器官支持モジュール及び生物成長媒体としてのポリマーと生物細胞とからなるマイクロセルラーポリマーと、物質内での細胞成長のための方法、、それをヒト又は動物の体内の内植組織（implants）として又は生体外で「そのもの自体を」（in vitro）研究するための使用、マイクロセルラーポリマーとそれらによって得られるポリマーの製造と改質のための新規なプロセス及び器官支持モジュールの製造のための方法に関係する。【０００２】  より具体的には、本発明は、ポリマー全体で三次元の細胞成長のための細胞成長媒体として相対的な結合部と細孔の寸法ｄ／Ｄをもつ細孔と細孔を結合する構造の形態で、７５％以上の多孔度をもつマイクロセルラーポリマーと、これから構成されるシステムと、その成長方法と使用方法と、その製造のための新規は方法とそれから得たポリマーに関係する。
【背景技術】
【０００３】  細孔が相互に連結しているマイクロセルラー合成有機／無機／天然物質は、動植物の細胞又は酵素を成長させるための支持体としてよく使用される。【０００４】  特定の細胞成長の用途に合わせてマイクロセルラー支持体を調製することは、マイクロセルラー物質が天然物であるために難しいことが多い。最近では、分散した相の相容量が約７５％よりも大きい高内相エマルジョン（High Internal Phase Emulsion：ＨＩＰＥ）の重合ルートを経由して製造され、引き続き、剛直な構造を得るために実質的に重合され及び／又は架橋されている新開発されたマイクロセルラー物質上で細胞を成長させる研究が行われているが、これは多くの利点をもたらしている。これら物質は、公開文献でも特許の開示でも記述されており、ポリハイプポリマー（Polyhipe Polymers：ＰＨＰ）と呼ばれている。【０００５】  これら物質の重要な特性は以下のことであると記述されている。
１．細孔容積を９７％程度にすることができる（実用的に）。
２．細孔は相互に連結される。
３．細孔とその相互結合部分のサイズは正確かつ別々に制御できる。
４．補完的に重縮合が達成できる。
５．たんぱく質、ポリマー、ケイ酸塩又は有機ポリマーで架橋が行え、幅広い範囲の多孔質物質が得られる。
６．ＰＨＰの重合／架橋後の改質は、乳化の段階で官能性モノマーを使用することによってより簡単にできる。
７．ＰＨＰはブロック及び／又は粒子状で得ることができる。
８．ＨＩＰＥはポンプ注入できるため、成形構造を形成することができる。【０００６】  米国特許第５，０７１，７４７号には、空孔（結合部）で相互連結される空隙（void）（孔(pore)）の平均直径が１〜１５０μｍの範囲内のマイクロセルラーポリマーの支持物質の製造方法が記載されている。空孔（pore）のサイズ（ｄ）は空隙（void）のサイズ（Ｄ）に関係し、その比率は０＜ｄ／Ｄ＜０．３の範囲で制御できる。ｄ／Ｄ比の制御は界面活性剤の濃度制御と、電解質、主にＣａＣｌ２を１０−４モルから５モルの範囲で添加することによって行う。電解質は、溶解性ハロゲン化物と硫酸塩から選択される。電解質の機能は空孔（holes）のサイズの制御とエマルジョンの安定性の改善に関係してくる。【０００７】  工程１では、油相と水相は変形（攪拌）されながら導入され、工程２では、結果として得られるＨＩＰＥは変形（攪拌）しながら均質化される（is homogenised）。分散相をバッチミキサー中の相に導入する導入速度（つまり、投与時間（ｔＤ））、及びその後のＨＩＰＥの均質化の時間（ｔＨ）は米国特許第５，０７１，７４７号で見積もられているが、混合条件は指定されていない。重合は細胞の導入前に行う。【０００８】  米国特許第５，０７１，７４７号は、ミクロ細孔物質の総称であるポリビニルポリハイプポリマー（ＰＨＰ）における三次元（３Ｄ）での動植物のアイソトロピック（非指向性）細胞の成長を開示している。反応物又は栄養素が、相互連結する空孔（holes）（結合部(interconnected)）を介してＰＨＰ内に提供されて、細胞が成長又は反応して生成物を生成する空隙（voids）（細孔(pores)）にアクセスする。ＰＨＰは空孔（holes）と結合部(interconnected)を連絡チャネルとして使用して、空隙（voids）内で正常な細胞の機能性を可能にする細胞成長媒体としてのみ使用する。空隙（voids）と空孔（holes）は、空隙の径が、導入されて成長する細胞の径の６〜１２倍で、空孔の径が３〜６倍で、つまり、約５ミクロンの酵母細胞の成長の場合は、空隙の径が４５ミクロンで、空孔の径が１５ミクロンとされる。しかしながら、この場合、細胞の成長は圧倒的に表面成長であった。別の事例では、多孔性高分子ネットワークを透過すると分かっている菌の成長のために、多孔度９０％、空隙の径と空孔の径がそれぞれ３０ミクロンと１０ミクロンであるＰＨＰが使用された。【０００９】  それにも関わらず、前記文献では、細孔（pores）と結合部(interconnect)のサイズの制御に関してわずかに限定された示唆を与えているだけである。上記米国特許第５，０７１，７４７号では、特許請求される寸法をどのように得たかについて述べていないため、実際、提供される限定的な情報では５０ミクロン以上の細孔の寸法を得ることはできないであろうし、広範囲にわたる実験をせずに１〜５０ミクロンの範囲内に特定の細孔のサイズを制御又は予め決定することは不可能であろう。
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】  そのため、細胞の成長のためのＰＨＰ物質の有効性は未だ極めて限定的なものに留まっており、さらに高度な細胞の成長を可能にするより高度なポリマーを製造するための物質と方法が必要である。
【００１１】  ここで我々は驚くべきことに、ＰＨＰポリマー内でコヒーレントな細胞成長が達成されて、多数の用途に利用できる共同作用する多細胞システム（multi cell system）を提供でき、また生物的及び非生物的用途に利用できる新規な特徴をもつ新規なＰＨＰを得られることを発見した。
【００１２】  本発明のＰＨＰが細胞の成長に重要であるため、細胞が発明のＰＨＰで共同作用することが特に有利である。
【００１３】  従って、本発明の最も広範な側面では、７５％より大きい多孔度をもち、１〜１０，０００ミクロンの径の細孔と１００ミクロンまでの径の細孔結合部（pore interconnects）とからなる均質に架橋された開放型セル状物質（open cellular material）の形態の天然又は合成のマイクロセルラーポリハイプポリマーで、ポリハイプが、ポリマーの細孔と結合部が細胞の位置と形状を調整するのに適した複数の分離又は相互透過ゾーンに構成される三次元の多細胞(multicell)の成長のための骨組（a scaffold）であって、それによって細胞の成長が指向性及び／又は非指向性の方法で複数のゾーン内に制限される及び／又は複数のゾーンに広がって、生体医学分野での応用のための多細胞構造を提供する天然又は合成のマイクロセルラーポリハイプポリマーを提供する。
【００１４】  本発明に従ったポリマーは、特定の目的のためにミクロ毛細管ネットワーク、ナノポア（nanopores）、表面、化学的改質、電気的特性など特性の形で追加的な特徴を備えることができる。
【００１５】  このように、本発明はその多くの応用が非常に重要である有益なＰＨＰ物質を提供し、具体的には本発明は細胞を一定の化学及び／又は電気ポテンシャルの下で発現し、機能しなければならない多重チャネル生体外器官モジュール（multi-channel in vitro organ module）として使用することができる。化学及び／又は電気ポテンシャルはマイクロチャネルの成分によって提供される。この種のモジュールは肝臓、腎臓及びすい臓などの器官には必要である。マイクロチャネルのあるモジュールは、細胞の発現が各種のチャネル成分によって課される化学及び／又は電気ポテンシャルの存在により調整される選択的バイオリアクタとして使用することもできる。様々な種類のポテンシャルとポテンシャルの強さでの細胞の発現を利用して、病気の過程を理解し及び／又は薬剤分野での応用で新たんぱく質の調製に導くことのできる生化学物質を生成することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１６】  生化学物質の生成にＰＨＰ物質を使用することは、好ましい構成（architecture）と生理的条件で支持システムを用いて成長する動物細胞に限定されない。細菌及びウイルスなどの微生物と同様に植物細胞も、ＰＨＰ物質を使用して成長させることができる。この場合、開放型細孔のある粒状のＰＨＰ物質を使用して、細胞、細菌又はウイルスの成長を助けることができる。粒状ＰＨＰ物質は、さらに処理するために生化学反応のための適切な生物媒体中に懸濁できる。本発明で説明するもののようなモノリシック支持システムは、この目的でも使用することもできる。ウイルスをＰＨＰ支持体上で成長させるとき、１ミクロン未満の小さな細孔サイズの物質が好ましいであろう。
【００１７】  好ましくは、ゾーンを、それぞれ複数のゾーン内に独立して制限される及び／又は複数のゾーンで広がる多細胞の型の成長に適応させる。
【００１８】  細胞の成長を促進する重要なパラメータとは、細孔（pores）と結合部(interconnect)のサイズ、及び支持面の化学的及び物理的特性である。場合によっては、細胞の成長はアニソトロピック（指向性（directional））であるため、細胞の支持体の細孔は細胞の情報伝達（communication）と細胞を透過（penetration）するために、結合部と共にマイクロチャネルを形成することが要求される。マイクロチャネルの隔壁は、（生）分解の後に細胞融合が得られるように、（生）分解が可能である。
【００１９】  生体医学分野での応用には、物質（the materials）が生物システムと干渉して体内のあらゆる組織、器官又は機能を評価、処理、増殖、又は置換する応用が含まれる。そのため、物質（the materials）は、例えば、コンタクトレンズ、歯科用装着具、蝸牛殻の移植、心臓弁などの血管のサポート及び心臓のペースメーカー、薬剤デリバリ皮膚パッチなどの製造の多様な応用が考えられる。
【００２０】  ここで骨組（a scaffold）というとき、支持体を提供し、骨組が成長に向かう初期の段階で骨組で位置認識又は荷重支持機能を可能にする、又は細胞が骨組内で成長し、細胞外マトリックスを発展させて荷重支持能力を得て、それ自体で荷重を固定するまで、荷重を牽引する多孔質物質をいう。
【００２１】  細胞の成長とは、細胞が骨組に導入される又は骨組に移動することであり、例えば、周辺組織から細胞を移動することによって、骨組が人工的に成長するために使用され又は自然の細胞の成長のために使用される場合である。
【００２２】  ここでポリハイプというとき、高内相エマルジョン（a high internal phase emulsion）を重合することによって得られる、これ以降定義する細孔と結合部とからなるあらゆる天然又は合成ポリマーをいう。
【００２３】  ここでポリマーの細孔（pores）と結合部(interconnect)というとき、その間に細孔の結合部をもつ空の細孔又は細胞のことをいい、これは空にすることができ又は溶解あるいは分散した物質を含有することができる。細孔と結合部とは、以下に定義するようにその相対的な大きさと寸法で区別される。物質の総多孔度は、すべての細孔と結合部の総和が提供する空の空間を合計したものである。
【００２４】  ここでポリマー内のゾーンというとき、ゾーンに構成される細孔と結合部の形状、位置、大きさ又は他の特性によって特徴付けられる個別の領域又は相互透過領域をいう。例えば、１つ以上のゾーンはポリマーの表面、そのバルクマトリックス、ポリマーと内相（internal phase）の界面、異なる形状又は寸法のあるいは異なる細胞の型の成長に適する隣接する細孔及び／又は結合部の界面にある。ゾーン群は、各ゾーンの隣接する細孔及び／又は結合部の間にある境界又は隣接する細孔及び／又は結合部内に含まれる境界によって区別される。複数の細胞の型を同時培養するときには、細孔と結合部のサイトが異なると、２又はそれ以上の区別できるゾーンをもつ細胞の支持物質が必要である。
【００２５】  好ましくは、本発明のポリマーは別の細胞の型が骨組が提示する境界を横切る構造を通して成長する間に選択した細胞タイプが特定の境界に制限されるマルチゾーン細胞構造を提供するマルチセルタイプの成長に適している。この手段によって、ポリハイプ骨組は、任意に結合部間又はミクロ毛細管内の成長と生物細胞のゾーニングと任意に生物細胞間のゾーニングを含んで、骨組を通して広がる多細胞システムを備えている。
【００２６】  本発明のポリマーは、さらに、所望の細胞のタイプの望ましい移動に合わせたゾーン内、ゾーン全体、及びゾーン間の移動によって細胞の自然のゾーニングを促進することができる。
【００２７】  本発明のポリマーは、生体適合性を示すあらゆる所望の天然又は合成モノマー、オリゴマー、マクロモノマー、反応性高分子、及びその混合物から得ることができる。ポリハイプは市販されており、又は米国特許第５０７１７４７号及びそれに参照される別の特許公報で開示される方法あるいは後述する方法を使用して製造することができる。
【００２８】
市販されている一般的なポリハイプポリマーはポリビニルポリハイプから構成され、油相のモノマーであるスチレン、ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）、及び界面活性剤（Ｓｐａｎ８０、モノオレイン酸ソルビタン）から得られ、モノマーの相対的な割合によって剛直又は柔軟な形態になり、さらにモノマーであるアクリル酸−２−エチルヘキシルを含む柔軟な形態、及び水相の開始剤としての過硫酸カリウムの量によって水相にできる。
【００２９】  本発明のポリマーは、天然又は合成、可溶性又は不溶性ポリマーであり、任意に（生物）分解できる架橋ポリマー、好ましくは、たんぱく質とセルロース、ポリアクリルアミド、剛直又は柔軟な形態のポリビニル、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリカプロラクトン、ポリ（ラクチド／グリコリド）及びポリアクリルイミドから選択される。
【００３０】  市販されるポリハイプは一般的には、５〜５０ミクロンの範囲の細孔の径をもつ。
【００３１】  本発明のＰＨＰ支持体は０．５又は１〜１０，０００ミクロンの範囲の細孔の径をもつことができる。好ましい範囲の下限は１０ミクロンで、より好ましくは３０ミクロンであり、例えば５０ミクロンである。好ましい上限は、３００ミクロンで、より好ましくは２００ミクロンである。特別な細孔の径をもつポリハイプは、後述する方法で得ることができ、例えば、細孔の径が約２００ミクロン未満の場合は０＜ｄ／Ｄ＜０．５の範囲、好ましくは０．１＜ｄ／Ｄ＜０．５の範囲の所望の結合部と細孔の径の比率をもつことができる。結合部は、１００ミクロンまで、好ましくは０．００１〜１００ミクロン、より好ましくは１０〜５０ミクロンの範囲の径をもつことができる。毛細管をマイクロセルラーポリマーで分離して、１０ミクロン程度の小さい径の細長いミクロ毛細管の広範なネットワークを設けることができる。毛細管の隔壁とバルクポリマーの界面からなるゾーンは、所望のサイズの細胞の成長のために所望の厚さの表層を備えることができる。０．５〜５ミクロン程度の薄い表層をもつ界面は、指向性が重要なニューロン（神経細胞）又は筋細胞の成長に特に適する。バルクよりも細孔のサイズが小さい界面は、内張りを形成する細胞の成長、例えば血管を内張りする細胞の成長、又は界面の表面で内皮細胞を成長させるために理想的なゾーンを提供する。
【００３２】  本発明の細孔構造は、４種類のメカニズムによって形成される。これらのメカニズムを多くの場合、組合わせて使用して器官の支持体のための現実的なモデルを作るための数種類の支持構成を得る。４種類の異なる細孔構造を以下に説明する。
【００３３】  タイプ１の細孔（基本的細孔）：これは、そのサイズがＰＨＰ形成の乳化の段階で決定する基本的な細孔構造である。そのため、細孔のサイズは主に、エマルジョンの変形（フロー）歴によって決定する。これら細孔は重合の間、そのままの形を維持されて、結合部がこの段階で形成される。油相と水相の化学、相の容量と温度及び圧力などの重合化の条件によって、結合部のサイズを０＜ｄ／Ｄ＜０．５の範囲に制御できる。
【００３４】  タイプ２の細孔（コアレセンス細孔）：この種の細孔の構成は、重合の間にタイプ１の細孔のコアレセンス（coalescence）を制御することによって得られる。ＰＨＰのエマルジョン中の分散相の液滴を、水溶性ポリマーを水相に添加することによって、又はわずかに親水性の油（スチレンオキシドなど）を油相に添加することによってコアレセンスが得られる。この場合の結合部のサイズは、コアレセンス細孔が組込まれたマトリックスを形成するタイプ１の細孔のものと同じである。しかし、コアレセンス細孔は基本的な細孔に比べて非常に大きいという事実のために、ｄ／Ｄ比は非常に小さい。
【００３５】  タイプ３の細孔（ミクロ毛細管）：タイプ１又はタイプ２の細孔内にミクロ毛細管ネットワークを得ることができる（すなわち、これら細孔によって支持される）、つまり現実的には、タイプ１の細孔と毛細管の隔壁を形成するタイプ２の細孔又はその反対（タイプ２の細孔と毛細管の隔壁を形成するタイプ１の細孔）で支持されるミクロ毛細管を得ることができる。これらミクロ毛細管は、ロッド又は微細繊維が挿入される特別に構成される成形用型を使用して形成される。ＰＨＰエマルジョンが成形用モールド内にくみ上げられて、重合が行われる。重合化の後、これらインサートは引き出すか（重合が収縮となるとき、又は高分子インサートが重合の間に最初に膨れて、その後重合のとき又はモノマーの充填剤として使用する溶剤の除去の際に収縮するとき）、又はインサートを酸もしくは適切な溶剤で溶解することによって取り出す。これらミクロ毛細管の最小の径は、１０ミクロン程度に小さくすることができる（ガラス、炭素又は高分子繊維を使用して）。金属繊維を使用して、５０〜１０００ミクロン以上の範囲のミクロ毛細管を得ることができる。
【００３６】  タイプ４の細孔（ナノポア）：細孔ＰＨＰの細孔の隔壁は、油相に適した「充填剤」を使用することによってナノポア（nano-pore）状とすることができるので、重合の後、充填剤又はその反応物が溶剤抽出により除去できる。充填剤は油、又は重合を受けない別のモノマーもしくはマクロモノマーでよく、又はモノマー／マクロモノマーが重合する場合には、合成ポリマーが抽出できる。充填剤は、モノマーに溶解する別のポリマー又は反応性ポリマーでもよく、あるいは適切な炭化水素油及びシリカパウダー又はゼオライトなどのナノ(nano)サイズの固体でもよい。「充填剤」である油が得られた架橋ポリマーと同程度にモノマーに非常に溶解する場合には、抽出の後に非常に微細な細孔が作られる。得られたポリマーが充填剤の油に溶解しない場合、又は膨れない場合、多数の架橋鎖により互いに付着するサブミクロン粒子が形成される。この粒子と充填剤の油のネットワークが連続的なシステム（co-continuous system）を形成する。この方法はマイクロポラスポリマーでナノ多孔度の量を制御するために使用することができる。ナノ細孔は、モノマーに溶解するポリマーを使用して得ることもできる。これらポリマーは、ナノ細孔を作るためにポリハイプポリマーの形成後にも抽出できる。上記充填剤ポリマーは、抽出されない場合、特に強度を増すことができる。上記ナノ細孔は、隔壁がこれら生体溶質の移動のための膜を作るため、低分子量の溶質を器官の支持体全体に分散させることができる。上記溶質には、酸素、二酸化炭素、栄養素、成長ホルモン、電解質などを含む。ナノ細孔の存在は、有効表面積が非常に高いため、器官の支持体が加水分解ポリマーの分解によって生分解の制御に役立つ。
【００３７】  あらゆるモジュラー形、例えば、シェル及び管タイプ、又は立方体／多角体で細孔の形を取り得る。
【００３８】  好ましくは、細孔のサイズと結合部のサイズは、成長する細胞の型と成長のタイプ、つまり透過（penetration）の有無に従って選択され、ゾーンの間の境界又は交錯する境界（crossing boundary）に制限される。ゾーン全体の細胞の成長のためのゾーンの細孔のサイズは、好ましくは成長する細胞の径の２〜３倍の、例えば細胞の径の２．５倍の径をもつ。この理論に制限されることなく、この寸法比は軟骨細胞の型を含め、細胞の型に最適と考えられ、それによって細胞はコラーゲンの生成に示されるように、成長及び繁殖することができる。例えば、１０ミクロン径の軟骨細胞は、１７〜３０ミクロンの範囲、具体的には２５ミクロンの径の細孔で成長した。
【００３９】  ポリハイプ骨組は、重合または後重合の間に自然に（in situ）導入される被覆材を使用して、表面被覆により特徴付けられる所望の表面を提供することに適している。一般的に細胞の成長に使用するポリマーの被覆用に使用される既知の物質、例えばヒドロキシルリン灰石（hydroxylapatite）又はリン酸三カルシウムなどの生体適合性も促進する細胞成長助触媒、他の鉱物、シリカ、コラーゲン、ヒアルロン酸誘導体（hyaluran）、ポリエチレンオキシド、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、たんぱく質、有機ポリマー、粒子などを採用することができる。自然位(in situ)のコーティングは、骨組全体を均質に被覆にする。例えばレーザー剥離を使用した後重合の被覆は、バルクマトリックスの表面に制限される被覆となり、粒子の被覆になる。
【００４０】  ポリハイプ骨組は、以前に定義したあらゆる所望の物質から構成することができる。支持体の周期的な機械的ストレイン（strain）又は電界の印加も、細胞の成長速度を高めることが分かっている。ほとんどの場合、支持体の生分解性は重要でないと思われるため、成長細胞をもつ支持物質を拒絶反応のおそれなく動物の体内に移植できる。しかし、細胞と細胞の融合が必要な場合、（生）分解性が重要となる。
【００４１】  そのため、ポリマーは好ましくは弾力的に（resiliently）変形可能な又は伸縮自在の物質から作るか、又は適切な手段によって弾力的に（resiliently）に変形を受ける又は伸縮性になる。そのため、好ましい物質とは、細胞の成長に影響があり、適切な方法で変形できる熱可塑性樹脂である。好ましくは、これまでに定義したポリハイプ支持体は、細胞の成長中に受ける骨組の振動性のストレイン（strain）による繰返し応力と弛緩に適している。これは、細胞の成長速度の促進に有益な効果があると分かっている。
【００４２】  以前に定義したポリハイプ骨組は導電性でもよく、又は既知の手段で導電性となるものでもよく、それによって細胞の成長点に電流が流れるようになる。この技術は、一定の細胞の型を区別するため及びニューロンや筋細胞などの特定の細胞の型の成長と融合を促進するために特に有利である。
【００４３】  ポリハイプ骨組は生分解性のものでもよく、又は既知の手段で生分解を受けてもよく、それによって、例えばある生物学的助剤又は環境などの所望の作用物質と接触することによって、又は所望の環境に導入することによって分解される。好ましくは、ポリハイプ骨組はポリマー鎖と架橋の加水分解又は酵素触媒による加水分解又はポリマーの腐蝕で分解される。この手段によって、ポリハイプ骨組はそのシステムが自身を確立して自立するために必要な期間の間、生物活性システムを支持する骨組として使用することができ、それ以降有害な効果をもつことなく分解できる。好ましくは分解できる骨組を、例えば筋細胞などの細胞の型の成長に使用する。これによって、骨組は所望のゾーンに種々の細胞の型に用いられ、それ以降介在する骨組もなく、自己融合を起こさせながら分解し、それによって生物活性なミクロシステムの機能が作られる。
【００４４】  本発明の別の側面では、以前に定義したポリマーゾーンの前記定義した三次元での成長に特徴を有する多細胞から構成される、前記定義したポリハイプ骨組を提供する。
【００４５】  細胞を含む骨組は、以前に定義した特性のいずれかから構成することができる。
【００４６】  多細胞は、ヒト、動物及び植物の細胞から選択したあらゆる所望の細胞の型でよい。好ましくは、細胞はヒト又は動物の細胞であり、典型的にはヒト又は動物の体内のあらゆる器官、システム又は部位に存在する多細胞の型である。細胞は好ましくは、軟骨、角膜、骨髄などに存在する等方性組織および骨、神経、筋、血管細胞などの異方性細胞から選択する。細胞の型には、例えば、繊維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、骨髄の骨細胞、肝細胞、心臓細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｃｙｔｅ）、ニューロン、筋芽細胞、大食細胞、及び微小血管の内皮細胞が含まれる。
【００４７】  本発明の別の側面では、ヒト又は動物の体内に存在する自然の生物活性システムに関係して機能する正常細胞を提供するのに適した以前定義したポリハイプ骨組と多細胞とからなる生物活性システムを提供する。生物活性システムは、完全な状態又は以前定義した融合又は環境への同化に適した部分的に分解された状態のポリハイプ骨組から構成することができる。
【００４８】
本発明の別の側面では、制御された環境の中で、骨組中又は骨組上に細胞を提供する工程と、既知の方法での成長に適した適切な栄養素を提供する工程とからなる、前記定義のポリハイプ骨組で多細胞を成長させるための方法を提供する。本発明の方法には、前記定義の構造システムを提供するのに適した成長促進、位置制御などのためのあらゆる技術が含まれる。
【００４９】  本発明の別の側面では、ヒト又は動物の体の生体内の内植組織（an implant in vivo）として、又はヒト又は動物の体の一部を模倣する生体外（modules for in vitro）の研究のためのモジュールとして使用するため、あるいは以前定義した別のシステムの成長環境で使用するため、例えば器官をシュミレートするためにモジュールの細胞側で器官細胞を成長させるために、前記定義の多細胞と前記定義の生物活性システムとからなる、前記定義の多細胞の成長に適したポリハイプ骨組を提供する。
【００５０】  本発明の別の側面では、密接に絡み合っているがＰＨＰに埋没する相互連結チャネルではない立方体又は多角体のモジュールからなる器官支持モジュールを提供する。このモジュールはＰＨＰ及び／又はチャネルにおける特定の器官細胞の成長に適している。特定のマイクロチャネルに接触する細胞もあるが、すべての細胞は細胞間連絡ができる。
【００５１】
本発明のこの側面に従えば、バルク細孔で細胞を成長させながら、栄養素循環と排泄物除去のために以前定義した骨組（a scaffold）のミクロ毛細管の結合部を使用して、器官を生成でき、補完的に又はその後、例えば心臓血管系などを模倣するために異方性（anisotropic）細胞の成長が必要なときに、ミクロ毛細管の結合部で細胞を成長させながら、ミクロ細孔の骨組のバルク細孔を通して、栄養素の循環と排泄物の除去に用いる。これによって成長を可能にし、長期間で細胞の機能を維持することが本発明の特に有利な点である。生体外（in vitro）の器官として前記定義の骨組とシステムを使用することは、ヒト又は動物の体内に投与する薬剤及びあらゆる物質の試験のため、遺伝子工学のため、制御された条件下で病気などに関連するメカニズムを研究するためなどに利用できる。これは、動物実験の必要性がなくなる点で特に有利である。特定の種類の多細胞と応用のために以前定義した生体外（in vitro）のモジュールを提供でき、必要な生理的条件を備える計器に関連づけることができる。
【００５２】  モジュールはＰＨＰ及び／又はチャネルにおける特定の器官細胞の成長に適する。特定のマイクロチャネルに接触する細胞もあるが、すべての細胞は細胞間連絡(intercell communication)ができる。
【００５３】  器官内の自然な環境の細胞を模倣するためには、細胞の機能を生理的に補正するための多数の実験装置を備えなければならない。この実験装置とは以下のようにまとめることができる。
１．血管又は栄養素補給ミクロ毛細管
２．細胞発現集合チャネル（cell expression collection channels）
３．神経のシュミレーション
４．支持細胞の同時培養のためのマイクロセルラー支持体
５．生体適合性と生分解性の制御、及び
６．支持体の機械的、化学的及び電気的特性の制御
【００５４】
（１）〜（３）を機能させるために、細胞支持物質（器官支持のバルク）によって分離されるミクロ毛細管チャネルのセットを割当てることができる。このような器官支持システムでは、細胞はこれらミクロ毛細管の数百ミクロン分の１以内になる。バルクと同様に各セットの毛細管ネットワークでは、細胞発現生成物が指定される毛細管のセットに集合した後、回収されるように、平均圧力が調整できる。ニューロンは指定のミクロ毛細管で成長して、外部のマイクロチップで電気的にシュミレートできる。細胞の発現は外部応力（周期的な緊張や温度などの物理的応力、血液／栄養素中の薬物／毒物などの化学的応力、神経を通る電気シュミレーション）に影響を受けるため、生体外（in vitro）の器官で非常に正確に制御できる外部応力によって、異なる細胞の発現を得ることができる。生体内（in vivo）では、外部応力の範囲と持続時間が制限され、必ず他の細胞から干渉を受ける。そのため、外部応力に対する細胞の反応の範囲を広げるためには、生理的な実験装置をもつ生体外の（in vitro）器官が便利である。この点について、生体外の（in vitro）器官とは、新規なたんぱく質の合成と病気の過程を理解できるバイオリアクタとして考えることができる。
【００５５】  利用できるスペースを占有するために、細胞が長い距離を移動する必要がないように、播種のために１セットの毛細管を使用することができる。播種後、これらミクロ毛細管を他の目的に利用できる。
【００５６】  主な器官細胞に非常に近接して支持細胞を同時培養できる器官支持システムを設計することが可能である。細孔と結合部のサイズの異なるＰＨＰエマルジョンを、所望の構成で（つまり濃度的に又は横位置に並べて（side-by-side））同時押出し成形できる（co-extruded）。本発明で分かるように、細孔と結合部のサイズが細胞のサイズに対して大きすぎたり、又は小さすぎたりすると、細胞は透過しない。そのため、各種類の細胞は支持と成長のために最適な細孔構造を選ぶことができる。
【００５７】  ミクロ毛細管で神経細胞を成長させる電気的刺激は、ミクロ毛細管を導電性ポリマーで被覆することによって達成できる。電気スティミュレーション（刺激）にニューラルネットワークがない場合には、導体として炭素繊維のネットワークを使用して、支持システム内に電界を作ることができる。
【００５８】  本発明は、以前定義したポリハイプ骨組を以前定義したゾーンに制御された細孔の寸法と径で提供することによって、例えばある細胞の型が骨組を透過し、２番目の細胞の型が表面で成長できるという発見から導き出されていることに評価がなされるべきである。これによって、生物活性を備えるために共同作用するのに適した多細胞構造を作るように、細胞の成長と位置付けの制御が可能となる。
【００５９】
本発明の別の側面では、連続相に分散相の高内相エマルジョン（ハイプＨＩＰＥ）を形成するための工程からなる、以前定義した天然の又は合成のマイクロセルラーポリハイプポリマーの製造プロセスにおいて、分散相を空にするか、又は溶解もしくは分散物質を含有させることができ、モノマー、オリゴマー及び／又はプレポリマーが連続相に存在し、その均質化と重合化は、制御した温度で注意深く混合しながら、制御した投与で分散相を連続相に投入する工程によってエマルジョンとなり、その後、変形をしながら（under controlled deformation）、制御した期間で均質化し、温度と圧力を制御しながら重合する調製プロセスを提供する。
【００６０】  本発明のプロセスにより、プロセス技術と組成条件を制御することによって、広範な範囲の細孔のサイズを得ることができ、特に以前定義したタイプ１〜４のミクロ細孔を得ることができる。細孔のサイズは大体３グループで得られる。つまり、小細孔サイズ：１〜１０μｍ；大細孔サイズ：１１〜２００μｍ；特大細孔サイズ：２０１〜１０，０００μｍである。
【００６１】  非常に小さい細孔サイズのエマルジョン（約０．５μｍ）は、フローが非常に弾力的で、乳化温度をできるだけ低くした非常に高い変形率のフローを利用して得られる。大きな細孔サイズのエマルジョン（約２００μｍ）は、高温で、それ以下ではエマルジョンが完全に又は部分的に転化する臨界変形率のちょうど上で、例えば水中油滴型のシステムで得られる。臨界変形率は、例えば所望のシステムの混合中の添加速度又は変形率を変えることによって、決定できる。これらエマルジョンも、主にせん断流れを利用して短時間で処理するべきである。
【００６２】  非常に大きな細孔のエマルジョン（約１０，０００μｍ）は、重合の間に細孔のコアレッセンスを制御する方法で得られる。コアレッセンス制御を行う方法は２つある。１）水（分散）相に既知の量の水溶性ポリマーを添加する方法、又は２）「充填剤」である溶質を連続油相に添加する方法である。両方法とも、これら添加剤の濃度と種類が重要である。濃度が低ければ、これら添加剤はある程度は所望の特性をもった１〜２００μｍの範囲のポリハイプポリマーとなる。濃度が一定値を超えると、コアレッセンス細孔が形成し始める。この場合、細孔のサイズは、合成の開始前の細孔のサイズ、重合の温度と濃度、添加剤の分子量と種類によって決まる。
【００６３】  エマルジョンは、連続相と分散相を形成するあらゆる所望の混ざり合わない相から、好ましくは水相と非水相から、より好ましくは水相と油相から得られる。得られたエマルジョンは油エマルジョンでは水性で、又は水エマルジョンでは油性である。
【００６４】  本発明のプロセスは、以前定義したあらゆる所望のポリマーの製造に利用することができる。
【００６５】
本発明のこの側面に従えば、驚くべきことに、連続相の中への分散相の投与を制御することによって、所望のエマルジョンを得ることができることが分かった。バッチミキサーでは、１つの又は複数のエントリーポイントを使用して、分散相の投与をミキサーの底から優先的に行う。マルチエントリー供給（feed）をするとより大きな細孔のエマルジョンになった。投与速度が非常に速ければ、現れる水相の噴射によって生じる混合は非常に激しかったため、エマルジョンの細孔のサイズは減少する。そのため、比較的長時間の投与と複数の供給（feed）ポイントのこの組合わせが大きな細孔のエマルジョンを作った。投与完了後、エマルジョンを均質化するべきであろうが、均質化の期間が長かった場合は細孔のサイズは小さくなる。
【００６６】  以前定義した混合の制御は臨界的（critical）であったり補完的（extended）であったりする。臨界的な混合とは、転相せずに油相への水相の分散をさせるための十分な混合である。臨界的な混合は、均質な混合場を使用することによって得られ、それによって細孔のサイズはエマルジョンの破壊と転相を避けながら、実質的に均一になる。
【００６７】  混合は、実質的に２つの相の総容量全体で均質な混合場を設けるのに適した手段によって行うことができ、好ましくは多重ブレード、多重噴射などの混合による。
【００６８】  そのため驚くべきことに、米国特許第５，０７１，７４７号の教唆とは反対に、大きな細孔の径をもつ安定したエマルジョンの達成は、混合の強度を最小限に押さえることによって得られることが分かった。本発明によれば、投与、均質な混合などにより、安定したエマルジョンは強い混合が必要な分散をしながら得ることができると分かっている。
【００６９】
投与、乳化及び均質化は、最終的なポリハイプポリマーの細孔のサイズに応じてあらゆる適切な温度で行うことができる。所望の細孔のサイズが大きければ、好ましい温度も高いが、それでも沸点が最低の相の沸点よりは低い。沸点が最低の相としての水相は、約１００℃で沸騰する。６０℃以上の乳化温度を採用する本発明のプロセスでは、６０ミクロンを超える細孔のサイズをもつポリマーが得られることになると分かっている。乳化温度を６０℃以上に上昇させると、６０℃以下の温度で同様に上昇させるときに比べて、大きいサイズの細孔が劇的に増加する。
【００７０】  細孔の乳化温度は沸点が最低の相の通常の沸騰温度より高くしてもよく、例えば沸点が最低の相には沸点を上昇させるのに適したあらゆる適切な成分を含めることができる。好ましくは、水相には１００℃で安定し、かつ潜在的に不活性な電解質が含まれる。これによって、プロセスは好ましくは６０〜１５０℃の範囲で、より好ましくは８０〜１４０℃、さらに好ましくは８０〜１２０℃の範囲の均質化温度を利用して行う。
【００７１】  乳化とその後の重合は、水又は連続相物質の通常の沸点以上の温度で、密閉した連続処理装置を使用して、大気圧以上に圧力を上昇させて行うことができる。
【００７２】  プロセスは補完的な水又は油相の開始剤、架橋剤、充填剤などを使用して行うこともでき、これらが以前定義した最高操作温度で安定することが好ましい。開始剤、架橋剤などの選択は、乳化と均質化に受け入れられる相の粘度を参考にして行う。プレポリマーと部分的に架橋したポリマーの割合を利用することによって必要な架橋剤の量を少なくすることも可能であり、任意に適切な油相の充填剤を使用して、油粕の量を増やし、有効な（effective）粘度を低くすることも可能である。
【００７３】  好ましくは、本発明のプロセスは、当技術分野で知られている水相の開始剤とともに、又は水相の代わりに、油相の開始剤を使用することを特徴とする。
【００７４】  好ましくは、プロセスは油相の充填剤を使用して行い、高い乳化温度で、最低量の架橋剤を使用して行われる。これは、ナノポアを作り、結合部のサイズを大きくしながら、高沸点の炭化水素などの油相の充填剤を重合の後で浸出（maybe leached out）させることができるという別の利点をもつ。
【００７５】  電解質とは、例えば塩化カルシウム又はハイドロキシアパタイトなどの鉱物でよい。
【００７６】  より低温で作用させるために水相開始剤を用いることができ、過硫酸ナトリウム又はカリウムなどを含む。
【００７７】  ８０℃以上の高温で作用させるためには、好ましくは、例えば１，１−アゾビズ（シクロヘキサンカルボニトリル）などの油相の開始剤を用いる。
【００７８】  架橋剤とは、例えばジビニルベンゼン（ＤＶＢ）でよい。ポリハイプが生分解できることが必要な場合、加水分解できる架橋を得ることができる。これら架橋剤とは、エチレンジアクリレート、Ｎ−Ｎ’−ジアリル(allyl)タルタルジアミン、Ｎ−Ｎ（１，２，ジヒドロキシエタン）−ビス−アクリルアミド、及びＮ−Ｎ’−Ｎ’’−トリアリル(allyl)クエン酸トリアミドである。しかし、生分解できる架橋剤の場合、ポリマー自体が生分解できるべきである。これらポリマーとは、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（イプシロン）−カプロラクタム、及びポリアクリルイミドである。
【００７９】  マイクロセルラー構造を形成するために水溶性ポリマーが必要な場合、架橋する必要がある。上記ポリマーの場合、モノマー（アクリルアミドなど）を水に溶解して、このモノマー溶液を、適切な界面活性剤、開始剤及び架橋剤の存在下で、ヘキサン又はトルエンなどの炭化水素の液体に投与しながら、ＨＩＰＥエマルジョンを形成する。
【００８０】  たんぱく質及びセルロースもマイクロセルラー構造を形成することができる。この場合、これら物質を適切な乳化剤とともに適切な水相（たんぱく質については水、セルロースについてはシュワイツァー試薬、Ｃｕ（ＮＨ３）４（ＯＨ）２）で溶解して、炭化水素の液体に投与して、水連続ＨＩＰＥを形成する。ＨＩＰＥをグルタルアルデヒド溶液（たんぱく質について）又は酸性溶液（セルロース）に浸漬して、架橋を行う。
【００８１】  油相の充填剤とは、あらゆる高沸点の炭化水素、他のモノマー又はマクロモノマー、反応性又は不活性ポリマー、固体粒子、又はその組み合わせでよい。
【００８２】  本プロセスには、重合前又は後に、以前定義したあらゆる適切な補正剤（modifier）を投入する工程を含めることができる。例えば、ハイドロキシアパタイトなどの鉱物を分散した水相に投入して、以前定義した連続相に投与することができる。代わりに、後重合の改質工程を採用して、単純に界面活性剤、電解質及び不活性モノマーを除去する工程と、被覆する工程と、さらに既存のポリマーの表面で重合させる工程又は反応させる工程の形をとることができる。当技術分野では補正剤及び改質技術は知られている。
【００８３】  重合は、当技術分野で知られているとおり、重合する各モノマー、オリゴマー及び／又はプレポリマーの既知の時間と温度条件下で行う。
【００８４】  本発明の別の側面では、平均の細孔の径が５０ミクロン以上の以前定義した高内相（high internal phase）エマルジョン（ＨＩＰＥ）を重合することによって形成される細孔と細孔の結合部からなる、７５％以上の多孔度をもつ均質に架橋された開放型細胞物質の形態で、天然の又は合成のマイクロセルラーポリハイプポリマーを提供する。好ましくは平均の細孔の径は１００ミクロン以上であり、より好ましくは１５０ミクロン以上で、所望のポリマーの応用に適するように選択する。１０，０００ミクロンまでの細孔の径が考えられる。結合部の径はこれ以前に定義するとおりである。
【００８５】  本発明の別の側面では、ポリマーをその重合の間又は後重合の間に、導電性であって、分解可能に改質させるか、又はマトリックス全体に分散させるか、もしくは表面被膜として鉱物を含むようにして、１〜１０，０００ミクロンの範囲の以前定義した平均細孔サイズをもつ、以前定義したポリハイプポリマーを提供する。
【００８６】  本発明の別の側面では、以前定義した分散相を投与する投入用の複数の入口をもつ連続相を含むのに適した混合容器と、以前定義した均質に混合するための手段と、温度上昇及び調整手段とからなる本発明に従ったポリマーの調製器具を提供する。
【００８７】  本発明の別の側面では、これ以前に定義する器官支持モジュールを製造するための方法を提供する。この方法はタイプ１〜４の細孔を作るために以前定義した１つ以上の工程を採用する。
【発明を実施するための形態】
【００８８】  ここで、本発明を以下の実施例及び図面を参照しながら説明するが、本発明はこれらに制限されない。
【００８９】  図１ａ〜２ｂは、発明を用いた器官支持システムの概略図と断面図である。
【００９０】
実施例Ａ―発明に従った器具を使用したポリハイプの製造
エマルジョンの製造は、油相と水相からバッチミキサーで行い、エマルジョンを一定の回転速度で攪拌しながら、所定の速度でエマルジョン成分を投与した。投与速度、変形速度（deformation rate）、混合速度は、各相の容量、バッチミキサーとインペラーの径、インペラーの回転速度、及び均質化の時間の関数として予め決めた。
【００９１】  異なる混合条件の実施での違いを避けるために、我々は以下のように混合を特徴づけた。
【００９２】  投与速度  ＲＤ＝ＶＡ／ｔＤ
投与中の変形速度  ＲＥ＝ＶＡ／（ｔＤＶ０）
混合速度  ＲＭ＝Ｄ１Ω／Ｄ０
ここで、
ＶＡ＝時間ｔＤの間に添加された水相の容量
ＶＯ＝バッチミキサー内にある油相の容量
Ｄ１＝インペラーの径
Ｄ０＝バッチミキサーの径
Ω＝回転速度
我々はまた、ｔＨを均質化時間、ｔＴを総混合時間と定義した。
ｔＴ＝ｔＤ＋ｔＨ
【００９３】  以下の実施例のそれぞれに説明する所定の条件セットの下でエマルジョンを製造した後、エマルジョンを６０℃で８時間重合した。試料をさらに以下の実施例で説明する通り改質した。
【００９４】  細孔（pores）と結合部(interconnect)のサイズは、完全に乾燥して洗浄した試料を用いて、走査電子顕微鏡で判断した。
【００９５】
実施例Ａ１−細孔と結合部のサイズに対する操作条件の影響
油相に７８％のスチレン、８％のＤＶＢモノマー、１４％のＳｐａｎ８０（界面活性剤、モノオレイン酸ソルビタン）を入れ、一方水相には１％の過硫酸カリウムを入れた。２枚のフラットパドルインペラー（８ｃｍ径、１．４ｃｍ幅）を、８．５ｃｍの混合タンクに使用した。インペラーは１ｃｍ離した。２５ｍｌの油相をタンクの底に入れ、２２５ｍｌの水相を１６個の供給ポイントを使用して投与した。水相の温度範囲は、−１．０〜８０℃であった。
【００９６】
【表１】
0005548968.tif 000002
【００９７】実施例Ａ２−制御した細孔合着における細孔と結合部のサイズに対する水溶性ポリマーの影響
エマルジョンを油相として７８％のスチレン、８％のＤＶＢ、１４％ののＳｐａｎ８０を使用して調製した。水相には１％の過硫酸カリウム、様々な量の水溶性ポリマー、ナトリウムカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）又はポリエチレンオキシドを入れた。乳化は２５℃で、水相の容量は８５％で、水相は１つの入口を通して供給される。処理条件は：ｔＤ＝ｔＨ＝６００秒、ＲＤ＝０．７０ｍｌ／秒、ＲＥ＝０．００６７秒−１、ＲＭ＝４．７秒−１であった。
【００９８】
【表２】
0005548968.tif 000003
【００９９】実施例Ａ３−ハイドロキシアパタイトで被覆した自然位（in situ）の表面
エマルジョンを、（Ａ１）７８％のスチレン、８％のＤＶＢ、１４％のＳｐａｎ８０、又は（Ａ２）１５％のスチレン、６０％のアクリル酸−２−エチルヘキシル、１０％のＤＶＢ、１５％のＳｐａｎ８０を使用して調製した。水相には、ハイドロキシアパタイト（ＨＡ）を溶解するために使用する０．５％のハイドロキシアパタイト（ＨＡ）、１５％のリン酸に対して（Ｂ１）１％の過硫酸カリウム、又は（Ｂ２）１％の過硫酸カリウムのいずれかを入れた。乳化は２５℃で、水相を８５％の容量で行い、水相は１つの入口から供給する。処理条件は、ｔＤ＝ｔＨ＝６００秒、ＲＤ＝０．８３ｍｌ／秒、ＲＭ＝４．７秒−１、ＲＥ＝０．００６７秒−１であった。乳化と重合の後、ハイドロキシアパタイト含有の試料を１ＭのＮａＯＨに浸漬して、ハイドロキシアパタイトを沈殿させた。沈殿後、試料を水で洗浄し、ｐＨ＝７とＩＰＡを保ち、その構造を検証した。
【０１００】
【表３】
0005548968.tif 000004
【０１０１】  組成（Ａ１：Ｂ１）と（Ａ１：Ｂ２）の試料をＳＥＭで検証し、その表面元素分析は、表４に示すようにハイドロキシアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２）の均一な分布を示した。
【０１０２】  スチレンだけを含有する油相を剛直なＰＨＰと呼び、油相がアクリル酸−２−エチルヘキシルを含有する場合には、その合成組成を弾性ＰＨＰと呼ぶ。
【０１０３】
【表４】
0005548968.tif 000005
【０１０４】  材料のハイドロキシアパタイト溶液内での後重合ソーキング(post-polymerization soaking)と、続いて生じる沈殿で、大きいけれども局在的ハイドロキシアパタイト結晶がポリハイプ細孔内に形成されたので、このポリハイプの原位置（in situ）ハイドロキシアパタイト被覆が好ましいものである。
【０１０５】実施例Ａ４−細孔と結合部のサイズに対する油相の組成の影響
エマルジョンを、０．５％の油相の開始剤である１，１’−アゾビス（シクロヘキサンカルボニトリル）を入れて、前述の通り製造した。総容量と粘度は実質的に変更しなかった。エマルジョンを前述の通り処理し、重合したが、当技術分野で知られている従来の混合時間と混合速度を用いて（投与速度ＲＤ＝０．７１ｍｌ、混合速度ＲＭ＝４．７秒−１、混合時間ｔＤ＝ｔＨ＝６００秒）、物質特性を評価した。結果を表５に示す。
【０１０６】
【表５】
0005548968.tif 000006
【０１０７】実施例Ａ５−ハイドロキシアパタイトで改質させたポリハイプに対する油相の可溶性開始剤の影響
エマルジョンを、水相の開始剤を用いず、０．５重量％のハイドロキシアパタイト溶液（ｐＨ＝２．５リン酸で調整済み）を使用して得た。油相には、７７．５％のスチレン、８％のＤＶＢ、１４％のＳｐａｎ８０、油粕の開始剤として０．５％のアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を入れた。
【０１０８】  他の実験条件はすべて実施例３と同じであった。表６には、ハイドロキシアパタイトで改質したポリハイプを、実施例の対応する物質と比較した（つまり、剛直な／ＨＡ  ＰＨＰ）。
【０１０９】
【表６】
0005548968.tif 000007
【０１１０】  上記表から、油相の開始剤の存在は細孔と結合部のサイズに実質的な影響を与えないことが分かる。しかし、ＥＤＡＸを用いたポリハイプ表面の元素分析（エネルギ分散性Ｘ線分析）から、ＨＡの存在は、油相の開始剤を使用する場合により顕著であることが分かる。これら結果を表７に示す。
【０１１１】
【表７】
0005548968.tif 000008
【０１１２】  カルシウムイオンの濃度は、ＡＩＢＮを含んでいない対照試料よりも大きい。
【０１１３】実施例Ａ６−水及び油相におけるシリカ粒子の影響
親水性シリカ（Ａｅｒｏｓｉｌ３８０、粒径７ｎｍ）を水相に入れ、一方、疎水性シリカ（Ａｅｒｏｓｉｌ  Ｒ８１２、粒径２０ｎｍ）を油相に入れた。これらシリカ試料はドイツのデグッサ（Ｄｅｇｕｓｓａ）社から入手した。それぞれの場合において、シリカ充填量は、０．５、１．０、２．０又は５．０重量％であった。水相の相容量は９０％で、処理条件は、投与速度ＲＤ＝０．３７５ｍｌ／秒、混合速度ＲＭ＝４．７秒−１、混合時間ｔＤ＝６００秒、ｔＨ＝１２００秒であった。油相は最初に１５％のスチレン、６２％のアクリル酸−２−エチルヘキシル、８％のＤＶＢ、１５％のＳｐａｎ８０を入れた。疎水性シリカを様々なレベルでこの混合物に添加した。水相には１％の過硫酸カリウムを入れた。親水性シリカを水相に用いたとき、油相にはシリカを入れず、上記の通り最初の油相の組成を使用した。結果を表８と表９に示す。
【０１１４】
【表８】
0005548968.tif 000009
【０１１５】
【表９】
0005548968.tif 000010
【０１１６】
実施例Ｂ７−ポリハイプでの多細胞の成長
軟骨細胞（ウシの中趾骨関節から得た）、ヒトの骨芽細胞（ＨＯＢ）とラットの３Ｔ３繊維芽細胞を得た。ＨＡなしとありのポリハイプの２つの試料をディスク（discs）に切り、洗浄して完全に殺菌した。Ｔｈｅｒｍａｎｏｘ円板を対照として使用した。円板を各細胞培養媒体に２４時間浸漬して、箱型プレートに置いた。３Ｔ３、ＨＯＢ及び軟骨細胞を、それぞれ１ｍｌ当たり１００，０００、１００，０００及び５００，０００個の密度でそれぞれ円板に播種した。次にプレートを約３週間３７℃で５％のＣＯ2下で培養した。試料を１、７、１４及び２１日後に、ＳＥＭで組織について検証した。
【０１１７】結果
剛直なポリハイプで成長した３Ｔ３は急激に倍増していったことが分かり、１日で両種類のポリハイプに合流層(a confluent layer)が現れた。この層は実験の間ずっと残った。組織学から透過がなかったと考えられ、７日までに数試料で、１４日までに全試料で細胞の層がポリハイプの表面に残り始めた（to leave the surface of the polyhipe）。
【０１１８】  ＨＯＢ細胞はＳＥＭで１日にかなり広がった形態を示し、細胞は結合部に成長していくのとは反対に、ポリハイプの表面に結合部を架橋していた。７日までに、全試料の表面に合流層(a confluent layer)が現れた。組織学から、わずかに透過したことが分かり、ＨＡ含有の試料では細孔１個分の深さにとどまった。層は実験の間ずっと表面にしっかりと付着したままだった。
【０１１９】  １日と７日の時点での軟骨細胞はポリハイプディスクに接着し、細胞が広がって外観がフィブロブラスチックとなるＴｅｒｍａｎｏｘＲの対照と比較すると、両種類のポリハイプで丸い形状を示した。１４日までに、扁平な細胞の兆候が現れ、２１日までに数試料で合流層(a confluent layer)が現れた。ＨＡポリハイプの細胞は、未処理のポリハイプと比べ、初期の時点で扁平になることが分かる。組織学から、５日以降、両ポリハイプで透過（penetration）が現れ、３Ｄ構造内に細胞が存在すると示されたが、ＨＡポリハイプの方が透過が大きく、目視ではより多くの細胞が含まれるように見えた。未処理のポリハイプを透過した細胞は数が少なかったが、その丸い形状は維持していた。
【０１２０】  Ｓａｆｉｎｉｎ  Ｏ染色の結果から、健康な軟骨細胞はポリマーマトリックスの中心にも周辺にも存在することが分かる。ポリマー中と周辺の両方にＧＡＧを分泌する生存能力のある細胞があった。
【０１２１】  軟骨細胞の成長率の研究（ＤＮＡ検定から得た）から、ハイドロキシアパタイトで改質したポリハイプは、表１０に示すように未処理のポリハイプと比較して著しく速い成長を生じることが分かる。
【０１２２】
【表１０】
0005548968.tif 000011
【０１２３】実施例Ｂ８−細胞の成長に対する細孔のサイズの影響
６種類のスチレン／アクリル酸−２−エチルヘキシルのポリハイプポリマー（ヒドロキシルアパタイト被覆を含む）を、平均細孔サイズを８、１７、２４、３１、３７及び８９μｍで製造した。全事例の結合部のサイズは同じようにした。これら試料をさらに軟骨細胞と播種し、細孔のサイズの影響に注目した。結果を表１１に示す。
【０１２４】
【表１１】
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【０１２５】  ２型コラーゲンの生成は、正確な生理学的細胞の機能の指標である。この実施例では、細胞のサイズが約１０μｍの軟骨細胞に関しては、最適な細孔のサイズは約２５μｍであることが分かる。細孔のサイズが小さすぎると、細胞はポリマーを透過できず、細孔のサイズが大きすぎると、細胞の形状が丸型から扁平なフィブロブラステックの様相に変化する。これらフィブロブラステックの細胞は急激に増殖し、ポリマーを透過するよりも表面に層を形成する。
【０１２６】  過剰なセルラーマトリックスの生成の別の尺度は、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の産量である。ＧＡＧの濃度は比色検定で判断した。ＧＡＧの生成における細孔のサイズの影響を、表１０でまとめた細胞培養研究を使用して評価した。また、ＧＡＧ生成の研究は組織培養プラスチック（ＴＣＰ）と比較した。結果を表１２に示す。結果は組織培養プラスチック（ＴＣＰ）を使用して細胞培養研究とも比較した。
【０１２７】
【表１２】
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【０１２８】実施例Ｂ９−スルホン化ポリハイプポリマーでの大食細胞の活動
物質の生体適合性は、それを大食細胞（macrophages）に暴露して試験することができる。物質に対する大食細胞の反応を、ａ）大食細胞の形状変化、ｂ）大食細胞による過酸化水素の生成、及びｃ）大食細胞によるベータグルクロニダーゼの生成によって評価する。大食細胞は生体外(in vitro)では球形で、この反応からずれるとマイナスの反応である。過酸化水素とベータグルクロニダーゼの過剰な生成もマイナスの反応である。
【０１２９】  スチレン／アクリル酸−２−エチルヘキシルのポリハイプポリマーを製造した。この物質の一部をスルホン化して（スルホン化度は１２％）、その後水酸化ナトリウムで中和する。大食細胞をこれらポリマーで播種して、６時間後にその形状と過酸化水素及びベータグルクロニダーゼの生成能力を評価した。結果を表１３に示す。
【０１３０】
【表１３】
0005548968.tif 000014
【０１３１】  表１３から、スルホン化ＰＨＰは非常に高いレベルのマイナス活動を産出することが分かり、そのため上記ポリマーはスルホン化度が低下したときに活動が減少するマイナス標準として使用することができる。
【０１３２】実施例Ｃ−器官支持システムの製作
図１ａ〜２ｂには、実施例Ｃの方法で得たポリハイプモジュールにおけるミクロ及びマクロスケールの毛細管とチャネル構成を図示している。
【０１３３】  細胞支持システムでは、タイプ１の細孔（基本的細孔）だけが効果的な細胞の播種であり、その後栄養素のチャネルとして作用するミクロ毛細管のセットと存在すると考えられる。この場合、これらミクロ毛細管のチャネルは密接に密集させる必要はなく、５００ミクロン程度の大きな径をもつことができる。上記細胞支持システムは管状形の配列とすることができ、断面積を円筒形又は正方形又は長方形に構成することができる。この配列は、外板の側面がバルクＰＨＰからなり、ミクロ毛細管／バルクＰＨＰの界面が非常に薄い（０．５〜５ミクロン）ことを除けば、中空繊維の束と似ている。
【０１３４】  器官支持システムでは、複数の種類のミクロ毛細管が存在する。立方体又は多角体の器官支持体、カートリッジ、では、相対する面が互いにミクロ毛細管で連結できる。最も簡単な事例として、３種類のマイクロチャネルをもつ立方体又は直方体の器官支持カートリッジを図１ａ、ｂに図示する。図１ａは、典型的な三次元（３Ｄ）のミクロ毛細管を示し（３種類のみの毛細管を図示する）、一方、図１ｂでは、毛細管とＰＨＰ全部をバルクにして示した断面積を図示する。ここで、チャネルをＡチャネル、Ｂチャネル及びＣチャンネルとして示す。
【０１３５】  以下の手順を用いて、その後ＰＨＰのエマルジョンを充填した後重合化する成形用型で、繊維の３Ｄネットワークを得た。しかし、この手順は固有のものではなく、生体外（in vitro）の器官支持システムの製造技術を例証するためのものである。
【０１３６】１．所定の径の金属ロッド又は繊維のストランドを、ホットプレス又は２つのロールミル（カレンダー）のいずれかを使用して、２枚のシート状のポリマーの間に挟む。金属繊維又はロッドを互いに平行にして、最終的にＡチャネルを作る。このサンドイッチ状のパネルを所定のサイズに切断して、任意にダイでスタンピングして、最終的にＢチャネルの形成させる金属ロッドを収容する空孔を形成する。これらサンドイッチ状のパネルのいくらかを、この方法で製造する。
【０１３７】２．上記手順を、Ｃチャネルを得るための所望の径の金属ロッド又は繊維を使用して繰り返す。Ａチャネルの径とＢチャネルの径を同じにするなら、個々の繊維／ロッドをパネルに挟み込む必要はない。
【０１３８】３．これらパネルを、その間の２種類の薄い金属スペーサで互いに載るように成形用型内に置く。第１の種類のスペーサは繊維をその場所で固定し、第２の種類のスペーサは繊維アセンブリがＢチャネルの方向に圧縮されるとき取外すことができる。ＡチャネルとＣチャネルを形成する繊維の配向は互いに垂直である。成形用型にはすでにＢチャネルを形成する金属ロッドが入っている。薄い金属スペーサの厚さによって、ＡチャネルとＣチャネルの隙間を決定する。
【０１３９】４．これらパネルをしっかりと締め付けてオーブンに置き、オーブンの温度が徐々にサンドイッチ状のパネルに使われるポリマーの融点以上に上昇するとき、繊維／ロッド層を締め付けることができる。ポリマーを完全に焼成して、繊維／ロッドの３Ｄネットワークが残るように、温度をさらに上昇させる。
【０１４０】５．これら繊維／ロッドは、所定の毛細管／バルクの界面を作るためには表面をポリマーで被覆しなければならない場合がある。例えば、これら鋳型の繊維／ロッドを疎水性ポリマーで被覆して、スチレンベースのＰＨＰポリマーを製造するときに、界面に緊密な細孔構造を得ることができる。鋳型の繊維／ロッドをポリエチレンオキシドなどの水溶性ポリマーで被覆すると、界面でタイプ２の細孔を得ることができる。金属を被覆しない場合、界面で開放型細孔構造が得られる。
【０１４１】６．完全に充填するために、成形用型を揺らしながらゆっくりとエマルジョンを充填する。タイプ２の金属スペーサを取外すことによって、過剰なエマルジョンが逃げられるように、成形用型をさらにＢチャネルの方向に圧縮する。エマルジョンの粘度はできるだけ低くするべきで、エマルジョンは充填中に再循環させるべきである。
【０１４２】
７．成形用型充填及び重合の後、鋳型のロッドを外して、繊維を酸の中で溶解することで、ミクロ毛細管チャネルがむき出しになる。
【０１４３】  器官支持カートリッジの製作後、水の中で洗浄し、中和して、その後エタノールで洗浄して残留モノマーをすべて取除き、さらに水で再洗浄して乾燥してから殺菌すると、生体外（in vitro）の器官支持体として使用できる状態になる。
【０１４４】  図１ａ〜２ｂの直方体モジュールでは、３種類のチャネルＡ、Ｂ、Ｃがある。これは図２ａと図２ｂに図示されており、立方体の面の連結が図２ａではそれぞれＡ−Ａ’、Ｂ−Ｂ’、Ｃ−Ｃ’として示される。Ａチャネルは血液（又は血漿又は栄養素）を運搬でき、Ｂチャネルは細胞の生成物（細胞の発現、代謝生成物）を運搬するために使用し、Ｃチャネルは神経又は筋の細胞などの異方性細胞を成長させるために使用できる。８面をもつ直方体モジュール、そのため４種類のマイクロチャネルを使用すると、血液と細胞生成物が集合しながらも、神経細胞とともに筋細胞も成長させることができる。マイクロチャネルの間の空間には、特定の器官の細胞又は結合組織又は組織又は刺激剤が入る。
【０１４５】  各チャネルは異なる径、異なる充填密度で作ることができ、表面を別々に改質することができる（例えば、電気的に導電性にする、又は異なる界面の多孔度もしくは細孔サイズをもつ、又は異なる化学構造をもつ）。神経細胞を成長させる代わりに、例えばこれらチャネルに存在する炭素繊維に電気的な導電性をもたせれば十分なこともある。
【図面の簡単な説明】
【図１ａ】  本発明による実施例で用いた器官支持システムの概略図と断面図である。
【図１ｂ】  本発明による実施例で用いた器官支持システムの概略図と断面図である。
【図２ａ】  本発明による実施例で用いた器官支持システムの概略図と断面図である。
【図２ｂ】  本発明による実施例で用いた器官支持システムの概略図と断面図である。
【符号の説明】    Ａ、Ｂ、Ｃ  チャネル
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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