(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍を有する患者の処置に用いるための医薬の製造のための、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドに特異的に結合する抗体の使用であって、該抗体が、ヒトＮＫ細胞上のＣＤ１６ポリペプチドと相互作用することができるＦｃ領域を含み、かつ、ＡＤＣＣを介して該抗体が結合する腫瘍細胞の死または溶解を誘導することができるものである、使用。
【請求項２】
該抗体が、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３のＦｃ部分を有するものである、請求項１の使用。
【請求項３】
該抗体が、２４１、２４３、２４４、２４５、２４９、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６５、２９６、２９９、３０１、３２２、３２９および３３１からなる群より選択されるアミノ酸位置におけるＦｃ領域内の１以上の改変を含むものである、請求項２の使用。
【請求項４】
該抗体が、ＦｃγＲを活性化するための該抗体の親和性を野生型Ｆｃ領域を含む抗体と比較して増強するＦｃ領域内の１以上の改変を含むものである、請求項３の使用。
【請求項５】
該抗体が、１以上のシアル酸残基、１以上のガラクトース残基および／または１以上のフコース残基を実質的に含まないものである、請求項２の使用。
【請求項６】
該抗体が、実質的にフコシル化されていないものである、請求項５の使用。
【請求項７】
該抗体が、（ａ）そこで発現されるタンパク質をフコシル化するための減少した能力を有するようフコース代謝を欠損する操作された宿主細胞の使用；（ｂ）フコシル化を防止するか又は減少させる条件下で細胞を培養すること；（ｃ）フコースの翻訳後除去； または（ｄ）フコシル化されていない産物について選択するための抗体の精製によって調製されるものである、請求項５または６の使用。
【請求項８】
該抗体が、ｉ）４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドまたは４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３受容体に特異的に結合する１つまたは複数の抗体を提供すること； ｉｉ）該抗体の各々のＮＫ細胞活性を増強する能力を試験すること； ｉｉｉ）該ＮＫ細胞活性を増強する複数の抗体から１つの抗体を選択すること； およびｉｖ）ｉｉｉ）において選択された抗体をヒト化またはキメラ化することを含む方法によって得られるか又は得られ得るものである、請求項１の使用。
【請求項９】
腫瘍が、非応答性または抵抗性のものである、請求項１〜８のいずれかの使用。
【請求項１０】
腫瘍が、神経芽細胞腫である、請求項１〜９のいずれかの使用。
【請求項１１】
４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドに特異的に結合する抗体および薬学的に許容可能なキャリアを含む医薬組成物であって、該抗体が、ヒトＮＫ細胞上のＣＤ１６ポリペプチドと相互作用することができるＦｃ領域を含み、かつ、ＡＤＣＣを介して該抗体が結合する腫瘍細胞の死または溶解を誘導することができるものである、医薬組成物。
【請求項１２】
該抗体が、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３のＦｃ部分を有するものである、請求項１１の医薬組成物。
【請求項１３】
該抗体が、２４１、２４３、２４４、２４５、２４９、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６５、２９６、２９９、３０１、３２２、３２９および３３１からなる群より選択されるアミノ酸位置におけるＦｃ領域内の１以上の改変を含むものである、請求項１２の医薬組成物。
【請求項１４】
該抗体が、ＦｃγＲを活性化するための該抗体の親和性を野生型Ｆｃ領域を含む抗体と比較して増強するＦｃ領域内の１以上の改変を含むものである、請求項１３の医薬組成物。
【請求項１５】
該抗体が、１以上のシアル酸残基、１以上のガラクトース残基および／または１以上のフコース残基を実質的に含まないものである、請求項１２の医薬組成物。
【請求項１６】
該抗体が、実質的にフコシル化されていないものである、請求項１５の医薬組成物。
【請求項１７】
該抗体が、ｉ）４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドまたは４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３受容体に特異的に結合する１つまたは複数の抗体を提供すること； ｉｉ）該抗体の各々のＮＫ細胞活性を増強する能力を試験すること； ｉｉｉ）該ＮＫ細胞活性を増強する複数の抗体から１つの抗体を選択すること； およびｉｖ）ｉｉｉ）において選択された抗体をヒト化またはキメラ化することを含む方法によって得られるか又は得られ得るものである、請求項１１の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＫ細胞上の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３受容体を介してＮＫ細胞仲介溶解からの保護を付与する腫瘍関連分子としての４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の同定に関する。本発明は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質とＮＫ細胞細胞障害性を増強するために使用することができるその受容体との間の相互作用を妨害する化合物を提供する。それらを阻害または排除するように４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３発現細胞に結合する化合物もまた提供される。化合物は、腫瘍、炎症症状、感染および移植の処置において特に有用である。４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質を検出することによって、疾患を診断するための方法もまた提供される。
【背景技術】
【０００２】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、従来にない免疫に関与するリンパ球のサブ集団である。ＮＫ細胞の特徴および生物学的特性として、ＣＤ１６、ＣＤ５６、および／またはＣＤ５７のような表面抗原の発現、細胞表面において発現されるα／βまたはγ／δＴＣＲ複合体の不在、特定の細胞溶解性酵素の活性化により、「自己の」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現することができない細胞に結合し、死滅させる能力、腫瘍細胞またはＮＫ活性化受容体−リガンドを発現する他の罹患した細胞を死滅させる能力、および免疫応答を刺激または阻害するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力が挙げられる。
【０００３】
ＮＫ細胞活性は、活性化および抑制シグナルの両方に関与する複雑な機構によって調節される。ＮＫ細胞仲介認識およびＨＬＡクラスＩ欠損標的細胞の死滅に重要な役割を果たすいくらかの異なるクラスのＮＫ特異的受容体が同定されている。１つのそのようなクラスの受容体、ＮＣＲ（自然細胞障害性受容体（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ））は、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６およびＮＫｐ４４、Ｉｇスーパーファミリーのすべてのメンバーを含む。特異的なｍＡｂによって誘導されるそれらの架橋は、ＮＫ細胞を強度に活性化して、細胞内Ｃａ＋＋レベルの増加、細胞障害性の誘発およびリンフォカイン放出を生じる。
【０００４】
ＮＫ細胞は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ特異的抑制性受容体によってネガティブに調節される。これらの特異的受容体は、他の細胞上に存在するＭＨＣクラスＩ分子またはＨＬＡの多形性決定基に結合し、ＮＫ細胞溶解を阻害する。ヒトでは、キラーＩｇ様受容体（ＫＩＲ）と呼ばれる受容体のファミリーの所定のメンバーがＨＬＡクラスＩ対立遺伝子のグループを認識する。
【０００５】
ＫＩＲが一致しないＮＫ細胞集団またはクローン、即ち、宿主のＨＬＡに適合しないＫＩＲを発現するＮＫ細胞の集団は、同種移植において認められる移植片抗白血病効果（ｇｒａｆｔ  ａｎｔｉ−ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｅｆｆｅｃｔ）の最も可能性の高いメディエーターであることが示されている（非特許文献１）。所定の個体においてこのような効果を再現する１つの方法は、ＮＫ細胞上の抑制性受容体とＮＫ細胞仲介溶解からの保護を付与するそれらのリガンドとの間の相互作用を阻止する試薬を使用することである。従って、ＮＫ細胞活性のモジュレーションにおける実際的かつ有効なアプローチの価値は大きい。そのようなアプローチは、広範な疾患の処置において有用である。
【０００６】
癌のような所定の増殖性疾患には有効な処置がない。神経芽細胞腫、癌腫およびメラノーマは、そのような癌の特に顕著な例である。神経芽細胞腫は、特に不良な予後を有する。神経芽細胞腫、小児の最も一般的な固形腫瘍は、交感神経系に沿ってどこにでも生じ得る（非特許文献２、非特許文献３）。しばしば、原発腫瘍は、最も一般的な部位である副腎を伴う腹部に局在する。１歳の年齢は、重要な予後のカットオフ値を提示する。１歳の年齢未満では、ほとんどの腫瘍は局在化される（ステージ１〜２）か、または播種性である場合、成熟化して良性の神経節神経腫となるか、もしくは自然退縮する（いわゆるステージ４Ｓ）。対照的に、１歳の年齢を超えるほとんどの小児は、診断時に、骨髄（ＢＭ）、脳、肝臓および皮膚に関与する転移（ステージ４）および極めて不良な予後を伴う播種性疾患を示す。実際に、神経芽細胞腫は、小児において最も高い死の危険性を伴う腫瘍である。特に、従来の治療後の薬剤耐性または再発のため、ステージ４の小児は、極めて不良な生存率（３年生存率＜１５％）を有する。本研究の目的の１つは、神経芽細胞腫の生物学的挙動の本発明者らの理解を改善すること、ならびに疾患の診断、モニタリングおよび革新的な治療アプローチを試みるために使用される新規のマーカーを同定することである。特に、神経芽細胞腫細胞によって発現される表面分子の特徴付けは、特に、ＢＭにおける腫瘍細胞、腫瘍再発の頻発部位のより正確な同定および定量化を可能にする。これは、診断を改善し、特定の患者における危険性の等級を改良し、最も適切な治療を送達することを可能にする。本発明において、ジシアロガングリオシドＧＤ２は、神経芽細胞腫関連マーカーとして一般に使用される（非特許文献４、非特許文献５）。しかし、抗ＧＤ２モノクローナル抗体（ｍＡｂ）はまた、腫瘍細胞以外の細胞とも反応する。考えられる説明は、神経芽細胞腫の細胞表面から脱離したＧＤ２が他の細胞の表面に結合し、抗ＧＤ２特異的ｍＡｂと反応することである（非特許文献６、非特許文献７）。神経芽細胞腫によって発現される新規の表面抗原の同定はまた、それらのＮＫ仲介溶解の受け易さを評価巣し得る新たな腫瘍細胞を選択的に単離することも可能にする。実際、インビトロで培養された神経芽細胞腫細胞株は、ＮＫ仲介溶解を受け易いことが示されている（非特許文献８）。従って、当該分野では、癌細胞において発現される新規の表面抗原の必要性が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】ルッジェーリ，Ｌ．（Ｒｕｇｇｅｒｉ，Ｌ．）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９５，２０９７−２１００
【非特許文献２】ブロダイル，Ｇ．−Ｍ．（Ｂｒｏｄｅｕｒ，Ｇ．−Ｍ．）Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ．（２００３年）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．３，２０３−２１６
【非特許文献３】シュワブ，Ｍ．（Ｓｃｈｗａｂ，Ｍ．）、ウェスターマン，Ｆ．（Ｗｅｓｔｅｒｍａｎｎ，Ｆ．）、ヘロ，Ｂ．（Ｈｅｒｏ，Ｂ．）、およびバーソルド，Ｆ．（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，Ｆ．）（２００３年）Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．４，４７２−４８０
【非特許文献４】シュルツ，Ｇ．（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．）、チェレシュ，Ｄ．−Ａ．（Ｃｈｅｒｅｓｈ，Ｄ．−Ａ．）、ヴァーキ，Ｎ．−Ｍ．（Ｖａｒｋｉ，Ｎ．−Ｍ．）、ウー，Ａ．（Ｙｕ，Ａ．）、スタフィレノ，Ｌ．−Ｋ．（Ｓｔａｆｆｉｌｅｎｏ，Ｌ．−Ｋ．）、およびライスフィールド  Ｒ．−Ａ．（Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  Ｒ．−Ａ．（１９８４年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４４，５９１４−５９２０
【非特許文献５】ハコモリ，Ｓ．（Ｈａｋｏｍｏｒｉ，Ｓ．）（１９８４年）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，１０３−１２６
【非特許文献６】ラディシュ，Ｓ．（Ｌａｄｉｓｈ，Ｓ．）、ウー，Ｚ．−Ｌ（Ｗｕ，Ｚ．−Ｌ）、ファイグ，Ｓ．（Ｆｅｉｇ，Ｓ．）、シュワルツ，Ｅ．（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｅ．）、フラウトシス，Ｇ．（Ｆｌｏｕｔｓｉｓ，Ｇ．）、ワイリー，Ｆ．（Ｗｉｌｅｙ，Ｆ．）、レナールスキー，Ｃ．（Ｌｅｎａｒｓｋｙ，Ｃ．）、およびシーガー，Ｒ．（Ｓｅｅｇｅｒ，Ｒ．）（１９８７）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．３９，７３−７６
【非特許文献７】バレンチノ，Ｌ．（Ｖａｌｅｎｔｉｎｏ，Ｌ．）、モス，Ｔ．（Ｍｏｓｓ，Ｔ．）、オルソン，Ｅ．（Ｏｌｓｏｎ，Ｅ．）、ワン，Ｈ．−Ｊ．（Ｗａｎｇ，Ｈ．−Ｊ．）、エラショフ，Ｒ．（Ｅｌａｓｈｏｆｆ，Ｒ．）、およびラディシュ，Ｓ．（Ｌａｄｉｓｈ，Ｓ．）（１９９０）Ｂｌｏｏｄ  ７５，１５６４−１５６７
【非特許文献８】シボリ，Ｓ．（Ｓｉｖｏｒ，Ｓ．）、パロリニ，Ｓ．（Ｐａｒｏｌｉｎｉ，Ｓ．）、マルセナロ，Ｅ．（Ｍａｒｃｅｎａｒｏ，Ｅ．）、カストリコニ，Ｒ．（Ｃａｓｔｒｉｃｏｎｉ，Ｒ．）、ペンデ，Ｄ．（Ｐｅｎｄｅ，Ｄ．）、ミロ，Ｒ．（Ｍｉｌｌｏ，Ｒ．）、およびモレッタ，Ａ．（Ｍｏｒｅｔｔａ，Ａ．）（２０００年）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：２２０−２２５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本研究の目的は、神経芽細胞腫細胞の正確な検出を可能にする新規の表面マーカーを同定することであった。新規のｍＡｂの作製のおかげで、本発明者らは、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３分子（サン，Ｍ．（Ｓｕｎ，Ｍ．）、リチャーズ，Ｓ．（Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｓ．）、プラサド，Ｄ．−Ｖ．（Ｐｒａｓａｄ，Ｄ．−Ｖ．）、マイ，Ｘ．−Ｍ．（Ｍａｉ，Ｘ．−Ｍ．）、ルデンスカイ，Ａ（Ｒｕｄｅｎｓｋｙ，Ａ）、およびトン，Ｃ．（Ｄｏｎｇ，Ｃ）（２００２年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８，６２９４−６２９７、スタインバーグ，Ｐ．（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．）、マジディック，Ｏ．（Ｍａｊｉｄｉｃ，Ｏ．）、ダルダク（Ｄｅｒｄａｋ，Ｓ．−Ｖ．）、フィステルシャマー，Ｋ．（Ｐｈｉｓｔｅｒｓｈａｍｍｅｒ，Ｋ）、キルヒバーグ，Ｓ．（Ｋｉｒｃｈｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．）、クラウザー，Ｃ．（Ｋｌａｕｓｅｒ，Ｃ．）、ズィラビンガー，Ｇ．（Ｚｌａｂｉｎｇｅｒ，Ｇ．）、ピクル，Ｗ．−Ｆ．（Ｐｉｃｋｌ，Ｗ．−Ｆ．）、ストックル，Ｊ．（Ｓｔｏｃｋｌ，Ｊ）およびナップ，Ｗ．（Ｋｎａｐｐ，Ｗ）（２００４年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２，２３５２−２３５９）を、特に、ＢＭ吸引物における神経芽細胞腫細胞ならびに、他の癌細胞の検出のための価値の高い表面抗原として同定した。おそらく、より重要なことに、本発明者らは、ＮＫ仲介細胞溶解を阻害することによって、４１ｇ−Ｂ７−Ｈ３分子が、腫瘍細胞において保護的役割を果たす証拠を提供する。この阻害効果は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３分子のｍＡｂ仲介マスキングによって反転され得る。結果は、例えば、抗原を発現する腫瘍細胞を排除するかまたは抗原によって付与される腫瘍細胞への保護効果を取り出す化合物、ＮＫ細胞、患者に輸注する活性型ＮＫ細胞の活性を増強する化合物を使用する新規の免疫治療アプローチのための基礎を提供する。
【０００９】
４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドは、スタインバーグ（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら、２００４年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：２３５２−２３５９（その開示内容は、本明細書において参照により援用される）に記載のＢ７ファミリーのメンバーである。この４免疫グロブリンドメイン含有４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドについては、先にＢ７−Ｈ３と称され、２つの免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎ）ドメインを有することが報告された（シャポバル（Ｃｈａｐｏｖａｌ）ら、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２６９、その開示内容は、本明細書において参照により援用される）。この２Ｉｇ形態は、代替的にスプライスされた形態を表すようである。４免疫グロブリンドメイン含有タンパク質について記載された本発明の方法はまた、２免疫グロブリンドメイン含有タンパク質で実践することができることが理解されよう。本明細書において使用する用語「４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３受容体」または「４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ」は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質と相互作用することが可能であり、ＮＫ細胞のすべてまたは画分において見出される細胞表面分子を指す。好ましくは、ＮＫ細胞受容体は、ＮＫ細胞（休止または活性型）において排他的に発現されるが、該用語はまた、他の細胞型においても発現される受容体を包含する。４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質をコードするヌクレオチド（ｃＤＮＡ）配列および４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および２、ならびに、それぞれ、ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）寄託番号ＮＭ＿００１０２４７３６およびＮＰ＿００１０１９９０７、およびスタインバーグ（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら（２００４年）の図３において示され、上記のそれぞれの開示内容は、核酸およびアミノ酸配列について本明細書において参照により援用される。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、今回、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質とＮＫ細胞細胞障害性を増強するために使用することができるその受容体との間の相互作用を妨害する化合物を提供する。また、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３発現細胞に結合する化合物を提供し、該化合物は、それらを阻害または排除し、ならびにそれらを（例えば、診断もしくは研究用ツールとして）同定するのに有用である。化合物は、腫瘍、炎症症状、感染および移植の処置において特に有用である。
【００１１】
本研究は、神経芽細胞腫細胞生物学およびこの腫瘍とＮＫ仲介免疫応答との関係への２つの重要な見識を提供する。第１に、本発明者らは、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３（サン（Ｓｕｎ）（２００２年）、スタインバーグ（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）（２００４年））を、腫瘍細胞、特に、少なくともＢＭ吸引物における神経芽細胞腫に特異的である新規の表面マーカーとして同定した。第２に、本発明者らは、Ｂ７ファミリーに属するこの分子が、ＮＫ細胞によって発現されるまだ規定されていない受容体と相互作用することによって、神経芽細胞腫のＮＫ仲介溶解を阻害することを示す。本データは、神経芽細胞腫の診断を改善すること、およびおそらく、新たな治療アプローチの将来の試みにおいて著しい影響を及ぼし得る。
【００１２】
従って、好適な態様では、本発明は、腫瘍細胞を死滅させる方法を提供し、該方法は、前記細胞を、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドに特異的に結合するリガンドを接触させることを含んでなり、ここで、リガンドは、腫瘍細胞の死を誘導することが可能である。１つの例において、リガンドは、それが結合する細胞の溶解を仲介することが可能な抗体、例えば、ＩｇＧ１もしくはＩｇＧ３サブタイプの抗体、または毒性部分に連結した抗体である。あるいは、リガンドは、それが結合した細胞に毒性であるか、またはそれが結合した細胞に毒性である分子に連結した小分子である。
【００１３】
従って、本発明はまた、より一般的には、細胞の溶解を誘導するか、または細胞の溶解に対する耐性を軽減する方法を提供し、該方法は、前記細胞を、リガンド、好ましくは、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドに特異的に結合し、細胞の溶解を仲介することが可能である抗体に接触させることを含んでなる。好ましくは、リガンドは、抗体、例えば、ＮＫ細胞上のＦｃ受容体（例えば、ＣＤ１６）と相互作用することが可能なＦｃ領域を有する抗体、または毒性分子によって官能化された抗体である。
【００１４】
別の態様では、本発明は、腫瘍細胞を標的化する方法を開示し、該方法は、前記細胞を、リガンド、好ましくは、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドに特異的に結合する抗体と接触させることを含んでなる。リガンドは、場合により、腫瘍細胞に接触される目的に分子に連結してもよい。
【００１５】
別の態様では、本発明は、腫瘍細胞を同定する方法を開示し、該方法は、細胞を、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドに特異的に結合するリガンド、好ましくは、抗体に接触させ、リガンドの前記細胞への結合を検出することを含んでなり、ここで、前記リガンドが前記細胞に結合するという決定は、細胞が腫瘍細胞であることを示す。別の実施形態では、方法は、細胞において４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドをコードする核酸を検出すること、好ましくは、細胞由来の核酸を、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドをコードする核酸にハイブリダイズする核酸プローブと接触させ、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドをコードする前記核酸の存在を検出することを含んでなり、ここで、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドをコードする前記核酸が存在するという決定は、細胞が腫瘍細胞であることを示す。場合により、前記方法は、そのような腫瘍細胞を所有する個体を、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドのリガンド、好ましくは、細胞の死または溶解を誘導もしくは増強することが可能な細胞障害性抗体または他のリガンドで処置する工程をさらに含んでなる。
【００１６】
別の態様では、本発明は、腫瘍を有する個体を処置する方法を開示し、該方法は、前記被験体の腫瘍細胞が４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチド（該４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドの発現は、被験体が４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドのリガンドに応答することを示す）を発現するかどうかを決定し、腫瘍細胞が４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドを発現する前記被験体を４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドのリガンドで処置することを含んでなる。より好ましくは、リガンドは、細胞の死または溶解を誘導するかまたは増強することが可能な細胞障害性抗体または他のリガンドである。
【００１７】
別の態様では、本発明は、ＮＫ細胞活性化を増強する方法であって、ＮＫ細胞を、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドと４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３受容体との間、または４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドとＮＫ細胞との間の相互作用を阻止する化合物に接触させることを含んでなる、上記方法を提供する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、ＮＫ細胞活性化を阻害する方法であって、ＮＫ細胞を、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドに接触させることを含んでなる、上記方法を提供する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、ＮＫ細胞を同定する方法であって、ＮＫ細胞を、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドに接触させ、ポリペプチドのＮＫ細胞への結合を検出することを含んでなり、ここで、ポリペプチドが細胞に結合するという決定は、細胞がＮＫ細胞であることを示す、上記方法を提供する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、腫瘍細胞を同定する方法であって、細胞を、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドのリガンドに接触させ、リガンドの細胞への結合を検出することを含んでなり、ここで、リガンドが細胞に結合するという決定は、細胞が腫瘍細胞であることを示す、上記方法を提供する。
【００２１】
別の態様では、本発明は、樹状細胞を同定する方法であって、細胞を、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドのリガンドに接触させ、リガンドの細胞への結合を検出することを含んでなり、ここで、リガンドが細胞に結合するという決定は、細胞が樹状細胞であることを示す、上記方法を提供する。
【００２２】
別の態様では、本発明は、増殖性障害、好ましくは、腫瘍のある患者を処置する方法を提供し、該方法は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドに特異的に結合する治療有効量の抗体を前記患者に投与することを含んでなる。好ましくは、前記治療用抗体は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３Ｆｃ部分を有し、それが結合する標的細胞の排除を誘導することが可能である。場合により、方法は、前記患者内の腫瘍細胞の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３状態を決定することをさらに含んでなり、好ましくは、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３状態は、免疫学的アッセイまたは細胞において４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３をコードするｍＲＮＡを検出するためのアッセイを使用して決定される。
【００２３】
別の態様では、本発明は、個体においてＮＫ細胞活性を増強する方法であって、前記個体に、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドとＮＫ細胞との間（または４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドと４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３受容体との間）の相互作用を阻止する化合物を投与することを含んでなる、上記方法を提供する。
【００２４】
別の態様では、本発明は、処置を要するヒト被験体の疾患の処置の方法を提供し、以下を含んでなる：ａ）前記被験体に、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドと４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３受容体またはＮＫ細胞との間の相互作用を阻止する化合物を投与すること、およびｂ）前記被験体に、ＣＤ１６によって結合され得る治療用抗体を投与すること。好ましくは、前記治療用抗体は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３Ｆｃ部分を有し、それが結合する標的細胞の排除を誘導することが可能である。
【００２５】
好ましくは、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドと、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３受容体またはＮＫ細胞との間の相互作用を阻止する前記化合物は、抗体であるか、もしくはそのフラグメントに結合する抗原を含んでなる。
【００２６】
ＮＫ細胞活性を増強する方法
従って、本発明は、ＮＫ細胞活性化における現在の困難を克服する新規の組成物および方法を提供し、さらなる有利な特徴および利益を提供する。１つの例示的態様では、本発明は、ヒトＮＫ細胞の活性化を容易にする化合物を提供する。より詳細には、本発明は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質とＮＫ細胞上の抑制性４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３受容体（４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ）との相互作用を阻止し、受容体の阻害シグナルを中和して、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒを発現するＮＫ細胞におけるＮＫ細胞細胞障害性の増強を生じる新規の化合物を提供する。好適な化合物は、修飾４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質、ならびに抗４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３抗体およびそのフラグメントおよび誘導体である。
【００２７】
第１の態様では、本発明は、修飾４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質を提供し、ここで、前記タンパク質は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質とＮＫ細胞上の抑制性４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３受容体（４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ）との相互作用を阻止し、ＮＫ細胞の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ仲介阻害シグナルを中和し、ＮＫ細胞の活性を増強する。そのような修飾Ｂ７−Ｈ３タンパク質は、典型的に、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質のフラグメント、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質あるいは１つもしくはそれ以上のアミノ酸欠失または置換を含んでなるフラグメント、あるいはＮＫ細胞上のＢ７−Ｈ３受容体の活性を阻止するように修飾されている他の任意のＢ７−Ｈ３タンパク質またはフラグメントである。そのような方法における使用に適切なタンパク質を選択することは、例えば、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドがＮＫ細胞に結合するかどうか、およびポリペプチドがＮＫ細胞の活性化または細胞障害性を阻害するかどうかを決定することによって行うことができ、ここで、適切な４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドは、ＮＫ細胞に結合するが、ＮＫ細胞の活性化または細胞障害性を阻害しない。
【００２８】
第２の態様では、本発明は、抗体、抗体フラグメント、およびそのいずれかの誘導体を提供し、ここで、前記抗体、フラグメント、または誘導体は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質とＮＫ細胞上の抑制性４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３受容体（４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ）との相互作用を阻止し、ＮＫ細胞の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ仲介阻害シグナルを中和し、ＮＫ細胞の活性を増強する。より好ましくは、抗体は、ヒト４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３受容体に結合する。好適な別の実施形態では、本発明の抗体は、ヒト４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質に結合する。
【００２９】
本発明のＮＫ増強化合物は、４−Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３受容体の官能基化を特異的に阻止し、および／または４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３分子の４−Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３受容体への結合を阻害し、それによって、ＮＫ細胞活性を容易にする。両方の活性は、本明細書において使用される用語「ヒト４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒの阻害活性を中和する」によって推察される。本発明において、本発明の抗体が「ＮＫ細胞活性を容易にする」、「ＮＫ細胞細胞障害性を容易にする」、「ＮＫ細胞を容易にする」、「ＮＫ細胞活性を増強する」、「ＮＫ細胞細胞障害性を増強する」、または「ＮＫ細胞を増強する」能力とは、抗体が、表面上で４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒを発現するＮＫ細胞が、それらの表面上で、該特定の抑制性受容体に対する対応するリガンド（例えば、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒタンパク質）を発現する細胞を溶解することが可能であるようにすることを意味する。１つの態様では、本発明は、インビボでＮＫ細胞活性を容易にする抗体を提供する。
【００３０】
また、ＮＫ細胞を活性化する方法も包含され、該方法は、ＮＫ細胞と、化合物、好ましくは、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質と抑制性４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３受容体（４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ）との相互作用を阻止する抗体、フラグメント、または誘導体とを接触させることを含んでなる。ＮＫ細胞の活性化は、インビボであってもまたはインビトロであってもよい。好適な態様では、本発明は、個体、例えば、腫瘍、炎症性疾患または感染性疾患を有する個体を処置する方法を包含し、該方法は、ＮＫ細胞と、化合物、好ましくは、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質と抑制性４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３受容体（４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ）との相互作用を阻止する抗体、フラグメント、または誘導体とを接触させることを含んでなる。好ましくは、化合物は、ＮＫ細胞の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ仲介阻害シグナルを中和する。
【００３１】
好適な実施形態では、本発明は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ヒト受容体に結合し、この受容体によって仲介されるＮＫ細胞細胞障害性の阻害を反転し、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ヒト受容体への結合について５Ｂ１４または７−５１７と競合する抗体を提供する。場合により、前記抗体はキメラ、ヒト、またはヒト化抗体である。
【００３２】
好適な別の実施形態では、本発明は、ヒト４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質に結合し、このタンパク質によって仲介されるＮＫ細胞細胞障害性の阻害を反転し、ヒト４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３への結合について５Ｂ１４または７−５１７と競合する抗体を提供する。場合により、前記抗体は７−５１７ではない。場合により、前記抗体はキメラ、ヒト、またはヒト化抗体である。
【００３３】
別の態様では、本発明は、ＮＫ細胞活性を増強する際の使用、および／または増殖性もしくは炎症性障害または感染性疾患の処置に適切な抗体を産生させる方法を提供し、該方法は次のものを含んでなる：ｉ）４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドまたは４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３受容体に特異的に結合する１つもしくは複数の抗体を提供すること、ｉｉ）ＮＫ細胞活性を増強する抗体のそれぞれの能力を試験すること、ｉｉｉ）ＮＫ細胞活性を増強する複数の抗体から１つの抗体を選択すること、およびｉｖ）抗体をヒトへの投与に適切にすること。
【００３４】
別の態様では、本発明は、ＮＫ細胞活性を増強する際の使用、および／または増殖性もしくは炎症性障害または感染性疾患の処置に適切な抗体を産生させる方法を提供し、該方法は次のものを含んでなる：ｉ）４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドまたは４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３受容体に特異的に結合する１つもしくは複数の抗体を提供すること、ｉｉ）４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質と４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３受容体またはＮＫ細胞との相互作用を阻止する抗体のそれぞれの能力を試験すること、ｉｉｉ）前記相互作用を阻止する複数の抗体から１つの抗体を選択すること、およびｉｖ）抗体をヒトへの投与に適切にすること。
【００３５】
好ましくは、上記の方法における抗体は、それをヒト化またはキメラ化することによって、ヒトへの投与に適切にされる。
【００３６】
他の態様では、本発明は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ機能を阻止し、ＮＫ阻害を軽減する（例えば、ＮＫ細胞活性を増強する）ための修飾４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の使用を提供する。本発明におけるタンパク質は、精製されたまたは単離された形態を含む任意の適切な形態であり得ることが理解されよう。本発明は、生来の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質に対する４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３インヒビター、好ましくは、競合的インヒビターのいずれかとして機能する４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の改変体を提供する。例として、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質のアミノ酸配列に十分に相同であるかまたは該アミノ酸配列から誘導されるアミノ酸配列、例えば、配列番号２またはスタインバーグ（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら（２００４年）、上掲に示されるアミノ酸配列を含んでなるペプチドが挙げられ、それらは、全長４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質より少ないアミノ酸を含み、および／または４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３受容体に結合し、生来の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドと競合するようにアミノ酸置換を含んでなるが、但し、ＮＫ細胞上の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３受容体のＮＫ細胞阻害活性を阻止する。そのようなタンパク質は、ＮＫ細胞活性を増強する。ＮＫ増強ポリペプチドの好適な例として、配列番号２の配列の少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、より好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００もしくは５００アミノ酸の連続スパンを含んでなる４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質が挙げられる。１つの例では、少なくとも１、２、３、５、１０または２０アミノ酸置換を含んでなるタンパク質。別の態様では、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の部分を含んでなり：ＩｇＶ１、ＩｇＣ１、ＩｇＶ２およびＩｇＣ２からなるドメインから選択される１つもしくはそれ以上のドメインを含んでなる。好ましくは、ＮＫ細胞増強ポリペプチドは、可溶性４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドである。
【００３７】
４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３発現疾患細胞を排除する方法
本発明はまた、ヒト４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質およびその受容体が、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３発現細胞によって特徴付けられる増殖性および炎症性障害の処置に有用な抗体を提供することを実証する。抗体を含むがそれらに限定されない４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３リガンドは、そのような疾患の根底にある拡張された細胞、例えば、拡張された神経芽細胞腫、メラノーマまたは癌腫細胞、ならびに成熟および／または未成熟の樹状細胞を特異的に標的化することが可能である。リガンドは、例えば、増殖性細胞への４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の保護効果を中和すること、免疫系による破壊のために増殖性細胞を標的化すること（例えば、ＡＤＣＣとも称される抗体依存性細胞障害性を介する）、またはそれらと、放射性同位元素、毒素、もしくは薬物のような細胞障害性薬剤とを直接接触させることにより細胞を死滅させることによって、細胞増殖の生理学的効果を制限することができる。本明細書に記載の抗体ならびにそれらの使用のための指示書を含んでなるキットのような、多くの増殖性障害、好ましくは、神経芽細胞腫、メラノーマまたは癌腫のいずれかの処置のためにリガンドおよび抗体を使用する方法もまた提供される。
【００３８】
従って、本発明は、増殖性または炎症性障害を有する患者を処置する方法を提供し、該方法は、患者にリガンド、好ましくは、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドに特異的に結合する抗体を投与することを含んでなる。本発明はまた、増殖性または炎症性障害を伴う患者を処置する方法を提供し、該方法は、ａ）患者内の標的細胞の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３状態を決定すること、およびｂ）患者に、リガンド、好ましくは、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチド、好ましくは、標的細胞において顕著に発現される４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３に特異的に結合する抗体を投与することを含んでなる。標的細胞は、好ましくは、増殖性細胞である。好適な増殖性障害の例は、神経芽細胞腫、癌腫およびメラノーマを含むがそれらに限定されない腫瘍である。前記方法に関する診断プロトコルについては、本明細書においてさらに詳述する。
【００３９】
１つの実施形態では、免疫学的アッセイを使用して、標的細胞の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３状態が決定される。別の実施形態では、標的細胞（例えば、増殖性細胞）上に存在する４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３の活性を決定するための機能アッセイを使用して、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３状態が決定される。別の実施形態では、標的細胞において４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３をコードするｍＲＮＡを検出するためのアッセイを使用して、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３状態が決定される。別の実施形態では、受容体は、標的細胞の少なくとも５０％において検出可能に存在する。
【００４０】
他の実施形態では、本発明は、増殖性細胞、特に、腫瘍細胞、または樹状細胞を同定する方法を提供し、該方法は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドまたは核酸の有無を検出することを含んでなり、ここで、ポジティブな検出は、細胞が増殖性細胞、特に、腫瘍細胞、または樹状細胞であることを示す。標的細胞の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３状態は、任意の適切な方法、例えば、免疫学的アッセイ、標的細胞において４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３をコードするｍＲＮＡを検出するためのアッセイを使用して、決定される。
【００４１】
１つの実施形態では、被験体または増殖性細胞を処置するために使用される抗体は、Ｆｃ部分、好ましくは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３サブクラスのＦｃ部分を含んでなる。別の実施形態では、抗体は、抗体フラグメント、好ましくは、抗原結合性フラグメントである。別の実施形態では、抗体は細胞障害性抗体である。別の実施形態では、細胞障害性抗体は、放射性同位元素、毒性ペプチド、および毒性小分子からなる群から選択されるエレメントを含んでなる。別の実施形態では、抗体はヒト化またはキメラである。別の実施形態では、放射性同位元素、毒性ペプチド、または毒性小分子は、抗体に直接付着される。別の実施形態では、細胞障害性抗体は、免疫学的アッセイにおいて４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３状態を決定するために使用される同じ抗体から誘導される。
【００４２】
別の態様では、本発明は、増殖性または炎症性障害の処置における使用に適切な抗体を産生する方法を提供し、前記方法は次のものを含んでなる：ｉ）４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドに特異的に結合する１つもしくは複数の抗体を提供すること、ｉｉ）４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドまたは標的細胞に結合する抗体のそれぞれの能力を試験すること、ｉｉｉ）前記４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドまたは標的細胞に結合する複数の抗体から１つの抗体を選択すること、およびｉｖ）抗体をヒトへの投与に適切にすること。１つの実施形態では、標的細胞は増殖性細胞である。他の実施形態では、標的細胞は、増殖性または（ｏｒ）炎症性障害を有する患者から採取される細胞である。
【００４３】
好ましくは、上記の方法における抗体は、それをヒト化またはキメラ化することによって、ヒトへの投与に適切にされる。
【００４４】
別の実施形態では、方法は、細胞障害性薬剤を抗体に連結する工程をさらに含んでなる。別の実施形態では、細胞障害性薬剤は、放射性同位元素、毒性ポリペプチド、または毒性小分子である。別の実施形態では、細胞障害性薬剤は、抗体に直接連結される。別の実施形態では、抗体は抗体フラグメントである。
【００４５】
１つの実施形態では、抗体は、１つもしくはそれ以上の患者から採取される標的細胞（例えば、腫瘍細胞のような増殖性細胞）の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％または８０％に結合する。別の実施形態では、抗体を使用して、ＮＫ細胞による（ＡＤＣＣを介するような）溶解を免れたかまたは免れる可能性を有する少数の標的細胞を排除してもよく、例えば、抗体は、より小さな割合の標的細胞、例えば、１つもしくはそれ以上の患者から採取される１０％、５％、１％、０．１％未満の標的細胞に結合し得る。
【００４６】
本明細書は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３に結合する抗体の多数の例を提供することが理解され、他の任意の非抗体または非ポリペプチド４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３リガンドもまた同じ様式で使用することも可能である。例えば、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３に結合する任意の小分子またはペプチドを使用して、標的（例えば、腫瘍）細胞を排除することができ、前記小分子またはペプチドは、標的細胞の死を直接誘導する毒性部分を有利に含んでなり得るかまたは該毒性部分に連結され得る。
【００４７】
４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３リガンドはまた、例えば、個体の腫瘍細胞が細胞障害性Ｔリンパ球、または最も好ましくは、ＮＫ細胞による溶解に耐性であるために免疫療法的処置に非応答性または抵抗性である腫瘍の処置にも有用であり得る。「非応答性」または「抵抗性」とは、癌に関連する１つもしくはそれ以上の症状を処置または軽減するには臨床的に十分ではない癌治療（例えば、免疫療法）で処置される患者のことを説明している。典型的に、そのような患者は、重度の持続的に活性な疾患を患い、それらの癌に関連する症状を改善するためのさらなる治療を必要とする。該語句はまた、治療には応答するが、副作用を患う、再発する、耐性を生じるなどの患者についても説明することができる。
【００４８】
他の実施形態では、以下でさらに提供されるように、本発明は、個体の診断および処置において使用することができる診断方法を提供する。本発明は、診断の方法を提供し、次のものを含んでなる：個体における４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドまたは核酸の有無を検出することであって、ここで、ポジティブな検出は、障害を患っているかまたは該障害にかかりやすいことを示す。好ましくは、障害は、増殖性障害、例えば、腫瘍または免疫増殖性障害を含み得るがが、それらに限定されない。標的細胞の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３状態は、任意の適切な方法、例えば、免疫学的アッセイ、標的細胞において４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３をコードするｍＲＮＡを検出するためのアッセイを使用して、決定される。
【００４９】
診断法
１つの態様では、本発明は、診断的および予後的方法において使用することができる方法を提供する。本発明は、特定の細胞が腫瘍細胞であるかどうか、および／あるいはそのような細胞を所有する個体が腫瘍もしくは癌を有するかまたは有し易いかどうかを決定するための方法であって、細胞による４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドの発現を検出することを含んでなり、ここで、前記細胞が４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドを発現するという決定は、前記載細胞が腫瘍細胞であること、および／または前記細胞を所有する個体が腫瘍もしくは癌を有するかまたは有し易いことを示す、上記方法を提供する。
【００５０】
本発明はまた、細胞、一般的に、腫瘍細胞が溶解に対して耐性であるかもしくは該溶解を受け易いか、またはそのようになり得るかどうか、ならびに細胞が腫瘍細胞になり易いか（例えば、それが溶解に耐性であるが故に）どうかを決定するために使用することができる方法を提供し、該方法は、腫瘍細胞による４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドの発現を検出することを含んでなり、ここで、前記細胞が４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドを発現するという決定は、細胞が溶解に耐性であり得るかもしくは該溶解を受け易くあり得るか、またはそのようになり得、および／あるいは前記細胞は腫瘍細胞になり易いことを示す。
【００５１】
従って、本発明はまた、免疫療法的処置、特に、腫瘍細胞を溶解することが可能な細胞、例えば、細胞障害性Ｔリンパ球、α／β（αβ）Ｔ細胞（好ましくは、ＣＤ８＋）、γδＴ細胞（例えば、特に、Ｖγ９／Ｖδ２遺伝子によってコードされるγδＴＣＲヘテロダイマーを発現する細胞）、ＮＫ．Ｔ細胞および／もしくはＮＫ細胞の活性に関与する、または好ましくは、該活性を増加する処置に耐性であり得るか、あるいは耐性であり易いかどうかを決定するための方法も提供する。前記免疫療法的処置の非限定的例として、腫瘍抗原に結合し、特に、ＡＤＣＣ機構を介して、それらが結合する細胞の死を誘導する細胞障害性抗体の投与が挙げられる。後者のグループの特定の非限定的例として、本明細書に記載の表２において列挙される抗体のいずれかが挙げられる。前記免疫療法的処置の他の非限定的例として、細胞障害性Ｔリンパ球、α／β（αβ）Ｔ細胞（好ましくはＣＤ８＋）、γδＴ細胞（例えば、好ましくは、Ｖγ９／Ｖδ２遺伝子によってコードされるγδＴＣＲヘテロダイマー発現する細胞）、ＮＫ．Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の活性を増加する抗体の投与が挙げられる。後者のグループの特定の非限定的例として、国際公開第０５／００９４６５号パンフレット（２００４年７月２３日出願）もしくは米国仮出願第６０／４８９，４８９号明細書（２００３年７月２４日出願）において開示されたＮＫ増強のいずれか、またはＰＣＴ／ＩＢ２００５／０００５０９（２００５年２月８日出願）、表題「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ」もしくは米国特許第６，１９４，３８８号明細書、同第６，００８，２００号明細書、同第６，２０７，６４６号明細書、同第６，２３９，１１６号明細書、および同第６，４２９，１９９号明細書に記載のＴＬＲアゴニスト化合物が挙げられる。先に記載の参考文献のそれぞれの開示内容は、本明細書において開示される免疫療法化合物の参照により本明細書に含まれる。
【００５２】
本発明はまた、腫瘍あるいは腫瘍細胞が４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドのリガンド、例えば、細胞障害性抗体または４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドを発現する細胞の死または溶解を誘導もしくは増強することが可能な他のリガンドによる処置を受け入れるかどうかを決定する方法を提供する。
【００５３】
細胞または腫瘍細胞が４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３を発現するかどうかを決定することは、例えば、癌患者、一般に腫瘍生検由来の生物学的サンプルにおいて１つもしくはそれ以上の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドの存在を検出することによって、実施例に記載のとおりに行うことができる。例えば、神経芽細胞腫、メラノーマおよび癌腫は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質を発現し得、しかも、これらのタイプの腫瘍、ならびにその他は、本発明に従う４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３リガンドで処置することができる。
【００５４】
他の特定の実施形態では、診断的アッセイは、腫瘍サンプルが４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３発現細胞を含んでなるかどうかを決定するために患者由来の腫瘍サンプルに対して実施される。そのようなアッセイについては本明細書に記載されており、例えば、抗体に基づく免疫組織化学アッセイを有利に使用することができる。好ましくは、腫瘍生検を実施して、生物学的サンプルを得る。前記生物学的サンプルが４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３を発現する細胞を含んでなるという決定は、患者が４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３リガンドの投与から利益を得ることができることを示す。次いで、患者は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３リガンドで処置される。
【００５５】
好ましくは、前記被験体における癌細胞が４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドを発現するかどうかを決定する工程は、患者から誘導される腫瘍サンプルに対して実施される。例えば、サンプルは、患者の腫瘍の生検、細胞または組織培養などであり得る。そのようなサンプルは従来の方法によって得ることができる。特定の実施形態では、サンプルは、非侵襲的方法によっておよび／または組織回収物から得ることができる。
【００５６】
従って、本発明に従う方法および使用の１つの実施形態では、前記被験体における癌細胞が４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３受容体を発現するかどうかを決定する工程は：患者由来の腫瘍サンプルを提供し、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドの発現を検出することを含んでなる。４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドの発現は、核酸レベルまたはポリペプチドレベルで検出することができる。
【００５７】
配列決定、ハイブリダイゼーション、増幅および／または特異的リガンド（抗体など）への結合を含む当該分野において公知の多様な技術を使用して、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３発現を検出もしくは定量することもできる。適切な方法として、サザンブロット（ＤＮＡ用）、ノーザンブロット（ＲＮＡ用）、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、ゲル泳動、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）が挙げられる。
【００５８】
ノーザンブロット、ＥＬＩＳＡおよびＲＩＡのようなこれらのアプローチのいくつかは、ポリペプチド配列または発現レベルを評価するのに特に適している。これらの後者は、ポリペプチドに特異的なリガンド、より好ましくは、特異的抗体の使用を必要とする。
【００５９】
特異的抗体のような異なるタイプのリガンドを使用してもよい。特定の実施形態では、サンプルは、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドに特異的な抗体と接触され、免疫複合体の形成が決定される。ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）のような免疫複合体を検出するための多様な方法を使用することができる。
【００６０】
本発明内において、抗体とは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ならびに実質的に同じ抗原特異性を有するそのフラグメントまたは誘導体を表す。フラグメントとしては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２、ＣＤＲ領域などが挙げられる。誘導体としては、一本鎖抗体、ヒト化抗体、多官能性抗体などが挙げられる。本明細書に記載の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３特異的抗体のいずれも使用に適切である。
【００６１】
特定の実施形態では、方法は、被験体由来のサンプルと、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドに特異的な抗体（で被覆された支持体）とを接触させ、免疫複合体の存在を決定することを含んでなる。
【００６２】
代替的実施形態では、前記癌細胞における４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３受容体の発現は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３特異的核酸プライマーまたはプローブを使用して決定される。そのようなプライマーまたはプローブは、適切なハイブリダイゼーション条件下（例えば、ストリンジェントな条件下）で４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３核酸に特異的にハイブリダイズし、従って、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３をコードする遺伝子またはＲＮＡの検出を可能にするように設計される。特定の実施形態は、患者由来の腫瘍サンプルと、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３特異的プライマーまたはプローブとを接触させ、ハイブリッドまたは増幅産物の存在を決定することを含んでなる。サンプル中の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ｍＲＮＡの存在（または量）は、前記受容体の発現についての指標を提供することができる。そのような決定は、ＲＴ−ＰＣＲを含む当該分野において公知の多様な技術によって達成することができる。該目的のために、全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ、カリフォルニア州）のような市販のキットを使用して、癌細胞から単離する。ＤＮａｓｅＩ処置全ＲＮＡ（３μｇ）を、ランダムプライマーを使用し、ＲＮａｓｅＨを含まない逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州）によって、逆転写した。４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３は、実施例に記載の特異的プライマーを使用して増幅することができる。
【００６３】
４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３の発現を決定する前に、サンプルを処置して、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３核酸またはポリペプチドの利用可能性を改善してもよい。そのような処置として、例えば、細胞または組織の溶解（例えば、機械的、酵素的もしくは物理的）を挙げることができる。
【００６４】
本発明はまた、被験体由来の腫瘍サンプルにおいて４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３遺伝子またはポリペプチドの発現を検出するための製品および試薬を含んでなる診断キットに関する。本発明に従う前記診断キットは、任意のプライマー、プライマーの任意の対、任意の核酸プローブおよび／または任意のリガンド、好ましくは、本発明に記載の抗体を含んでなる。本発明に従う前記診断キットは、ハイブリダイゼーション、増幅もしくは抗原−抗体免疫反応を実施するための試薬および／またはプロトコルをさらに含んでなることができる。
【００６５】
さらなる態様
さらなる態様では、本発明は、ＮＫ細胞活性を阻害する方法であって、ＮＫ細胞を、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドに接触させることを含んでなる、上記方法を提供する。ＮＫ細胞活性を同定する方法であって、ＮＫ細胞を４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドに接触させ、ポリペプチドのＮＫ細胞への結合を検出することを含んでなる、上記方法もまた提供される。好ましくは、そのような４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列、もしくはその部分を含んでなるか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。別の態様では、本発明は、標的細胞を、ＮＫ細胞による溶解に感受性にするための方法を提供し、該方法は、前記標的細胞を、標的細胞上の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の活性を選択的に阻害するか、または発現、好ましくは、細胞表面発現を減少することが可能な化合物に接触させることを含んでなり、好ましくは、該化合物は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３遺伝子の発現を阻害するか、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ＲＮＡの翻訳を阻害するか、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３細胞表面発現を阻害するか、または特に、リガンド結合性、もしくは４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質を官能化することを阻害する。関連する実施形態では、本発明は、疾患の処置のための化合物をスクリーニングまたは同定する方法を提供し、該方法は、候補化合物が、標的細胞上の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の活性を選択的に阻害するか、または発現、好ましくは、細胞表面発現を減少することが可能であるかどうか、あるいは好ましくは、化合物が、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３遺伝子の発現を阻害するか、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ＲＮＡの翻訳を阻害するか、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３細胞表面発現を阻害するか、または特に、リガンド結合性、もしくは４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質を官能化することを阻害するかどうかを決定することを含んでなり、ここで、化合物が前記活性のいずれかを有するというポジティブな決定は、候補化合物を、疾患（例えば、腫瘍）の処置に適切な化合物として同定する。
【００６６】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の方法のいずれかを使用して産生される抗体を提供する。本発明はまた、実質的に同じ抗原特異性および活性を有する（例えば、親抗体と同じ抗原に結合することができる）抗体のフラグメントおよび誘導体を包含する。そのようなフラグメントとして、限定はないが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’２フラグメント、ＣＤＲおよびＳｃＦｖが挙げられる。
【００６７】
別の実施形態では、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドに結合する抗体に関与する上記の方法のいずれも、抗体５Ｂ１４もしくは７−５１７、またはそれらと競合する抗体により行うことができる。従って、１つの実施形態では、本発明は、モノクローナル抗体５Ｂ１４または７−５１７と競合する抗体の本明細書に記載の方法のいずれかに従う使用を包含する。場合により、抗体５Ｂ１４または７−５１７と競合する抗体は、それぞれ、抗体５Ｂ１４または７−５１７自体ではない。好ましくは、前記抗体はキメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体である。
【００６８】
用語「競合する」は、特定のモノクローナル抗体（例えば、５Ｂ１４もしくは７−５１７）を指す場合、組換え４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３分子または表面発現４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３分子のいずれかを使用する結合アッセイにおいて、抗体がモノクローナル抗体（例えば、５Ｂ１４もしくは７−５１７）と競合することを意味する。例えば、結合アッセイにおいて、抗体が５Ｂ１４もしくは７−５１７の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３分子への結合を減少する場合、抗体は５Ｂ１４または７−５１７と「競合する」。５Ｂ１４または７−５１７と「競合する」抗体は、ヒト４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３分子への結合について５Ｂ１４または７−５１７と競合し得る。
【００６９】
別の実施形態では、本発明は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドに結合する抗体を含んでなり、ここで、抗体は５Ｂ１４または７−５１７である。宿主細胞、特に、上記の抗体のいずれかを産生するハイブリドーマもまた、包含される。
【００７０】
本発明のモノクローナル抗体は、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット方法のような標準的な免疫化学的手順、および組織染色のような免疫組織化学的手順、ならびに４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３抗原エピトープに特異的な抗体を利用し得る他の手順において有用なアプリケーションを見出すことが提唱される。さらに、異なる種の特定の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３に特異的なモノクローナル抗体が他の有用なアプリケーションにおいて利用され得ることが提唱される。一般に、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３に対するポリクローナルおよびモノクローナル抗体は両方とも、様々な実施形態において使用することができる。例えば、それらは、他の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３をコードするｃＤＮＡまたは遺伝子を得るために、抗体クローニングプロトコルにおいて用いることができる。それらはまた、細胞または動物において、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３関連ペプチド、特に、ＮＫ細胞において見出される４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３受容体の効果を分析するための阻害研究において使用することができる。４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３抗体はまた、多様な細胞事象中の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３の分布を分析するため、例えば、腫瘍の進行における異なる時点での４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドの細胞または組織特異的分布を決定するための免疫局在性研究において有用である。そのような抗体の特に有用なアプリケーションは、例えば、ＮＫ細胞から誘導される生物学的サンプルから４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３受容体を共沈殿させるために、例えば、抗体アフィニティーカラムを使用して、生来または組換え４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３を精製する際において存在する。そのような免疫学的技術の操作は、本開示内容に照らし合わせて当業者に公知である。
【００７１】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗体のいずれか１つもしくはそれ以上を含んでなるキットを提供する。１つの実施形態、キットは、少なくとも１つの診断用抗体および少なくとも１つの治療用（例えば、細胞障害性）抗体を含んでなる。別の実施形態では、診断用抗体および治療用抗体は、同じＮＫ細胞受容体に特異的に結合する。別の実施形態では、キットはまた、本方法に従う抗体を使用するための指示書を含んでなる。
【００７２】
本発明はまた、１つもしくはそれ以上の本抗体、またはそのフラグメントもしくは誘導体、および薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を含んでなる医薬組成物を含んでなる。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】５Ｂ１４ｍＡｂの神経芽細胞腫細胞株との反応性。異なる神経芽細胞腫細胞株を、示された分子に対する５Ｂ１４ｍＡｂまたはｍＡｂ、続いて、ＰＥコンジュゲートヤギ抗マウスアイソタイプ特異的第２試薬で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。白色プロファイルは第２試薬のみと共にインキュベートされた細胞を示す。
【図２】新たに誘導された神経芽細胞腫細胞に対する５Ｂ１４およびＧＤ２反応性の比較細胞蛍光分析。ステージ４（Ａ）または非転移性ステージ１（Ｂ）のいずれかの神経芽細胞腫を患う小児由来の２つの代表的な骨髄吸引物を、示された分子に対する５Ｂ１４ｍＡｂまたはｍＡｂ、続く、ＰＥまたはＦＩＴＣコンジュゲートヤギ抗マウスアイソタイプ特異的第２試薬による二重蛍光および細胞蛍光分析によって分析した。異なる数の浸潤性神経芽細胞腫細胞によって特徴付けられる３つのさらなる代表的なステージ４の骨髄吸引物をパネルＣに示す。（陽性細胞の％についての）統計解析を示す。
【図３】ステージＩＶ神経芽細胞腫の症例由来のＢＭ吸引物におけるＧＤ２および５Ｂ１４陽性細胞の免疫組織化学的検出。パネルＡ：単一細胞およびＮＢ細胞の凝集塊のＢＭ吸引物（ｍＡｂＧＤ２、ＡＰＡＡＰ、拡大２０×）のＣｙｔｏｓｐｉｎ調製物。バックグランドにおいて、いくつかの免疫染色を示すフラグメント。パネルＢ：より高い倍率での詳細図（ｍＡｂＧＤ２、ＡＰＡＡＰ、６３×）：ｍＡｂＧＤ２の免疫染色の輝度により細胞の形態学的特徴が遮蔽され得るため、ＮＢ細胞の認識および該細胞数の量的評価が妨害される。パネルＣ：Ａと同じサンプル由来のＢＭ吸引物のＣｙｔｏｓｐｉｎ。（ｍＡｂ５Ｂ１４、ＡＰＡＡＰ、２０×）。パネルＤ：Ｂと同じＢＭ吸引物由来の細胞の凝集塊のより高い倍率（ｍＡｂ５Ｂ１４、ＡＰＡＡＰ、６３×）での詳細図。（ＧＤ２より）希薄かつ弱い彩度の免疫染色は、若干の「より澄明な」バックグランドを背景にすると認めることができる。核の形態学的特徴は容易に認識できる。
【図４】５Ｂ１４反応性分子の生化学的特徴付けおよび細胞トランスフェクタントの細胞蛍光分析。パネルＡ：２９３ＴおよびＡＣＮ細胞株を１２５Ｉで表面標識し、５Ｂ１４ｍＡｂで免疫沈降した。Ｎ−グリコシダーゼＦで非処置（−）または処置した（＋）細胞を、還元条件下の８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。分子量マーカー（ｋＤ）を示す。パネルＢ：４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ｃＤＮＡで非トランスフェクトまたはトランスフェクトしたＣＨＯ−Ｋ細胞を、５Ｂ１４ｍＡｂ、続いて、ＰＥコンジュゲートヤギ抗マウスアイソタイプ特異的第２試薬で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。白色プロファイルは第２試薬のみと共にインキュベートされた細胞を示す。
【図５】４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３分子は、標的細胞をＮＫ仲介細胞障害性から保護する。ポリクローナルＮＫ細胞集団を、ＣＨＯ−Ｋもしくは４Ｉｇ−Ｂ７Ｈ３−ＣＨＯ−Ｋトランスフェクタント（パネルＡ）、あるいはｍＡｂの非存在下または４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３（５Ｂ１４）もしくはＨＬＡクラスＩ（Ａ６−１３６）に対するｍＡｂの存在下でのいずれかにおける２つの代表的な新たに精製された神経芽細胞腫細胞集団（ＮＢ１およびＮＢ２）（パネルＢ、左）に対する細胞溶解活性について分析した。使用したエフェクター／標的比は、２：１（パネルＡ）または２０：１（パネルＢ）であった。結果は、３つの独立した実験の代表値であり、３回測定の平均の標準偏差は＜５％であった。４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３およびＧＤ２分子が細胞集団全体によって発現されたという事実（パネルＢにおけるＮＢ１およびＮＢ２のフローサイトメトリー、右）によって示されるように、神経芽細胞腫細胞は高度に均質であることに留意すべきである。白色プロファイルは第２試薬のみと共にインキュベートされた細胞を示す。
【図６】Ｂ７−Ｈ３可溶性分子は、ＮＫ細胞によるＩＦＮ−γ産生を誘導しない。健康なドナー由来の代表的なポリクローナルＮＫ細胞集団を、プレート結合可溶性分子（２Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３、ＭＩＣＡ）もしくは抗ＮＫｐ３０ｍＡｂで刺激したまたは刺激せず、ＥＬＩＳＡによりＩＦＮ−γ産生を評価した。データは、４つの独立した実験の代表値である。
【図７】表１、異なる細胞型に対する５Ｂ１４ｍＡｂの表面反応性を示す。正常細胞および異なる組織型のインビトロ培養細胞株を、間接免疫蛍光ならびに５Ｂ１４および抗ＧＤ２ｍＡｂとの反応性についてのＦＡＣＳ解析により分析した。蛍光強度の平均値（ＭＦＳ）：陰性コントロールは（−）（５に対して設定されたＭＦＩ）に、２０未満のＭＦＩは（＋／−）に、２０と１００との間のＭＦＩは（＋）に、１００を超えるＭＦＩは（＋＋）に一致する。
【図８】スタインバーグ（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら、（２００４）に記載の４−Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３のドメイン構造。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
序論
本発明は、増殖性障害、特に、腫瘍、炎症性障害および免疫増殖性障害の診断ならびに処置に適切な抗体を産生させ、使用するための新規の方法を提供する。抗体を使用して患者を診断および処置する方法である本発明に記載の方法を使用して産生される抗体、抗体誘導体、または抗体フラグメントも包含される。特に、本発明は、ヒトＮＫ細胞の活性化を容易にする化合物を提供し、これらの化合物は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質と、ＮＫ細胞上の抑制性４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３受容体（４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ）との相互作用を阻止することによって作用し、受容体の阻害シグナルを中和して、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒを発現するＮＫ細胞におけるＮＫ細胞細胞障害性の増強を生じる。ＮＫ細胞活性のこの増強は、広範な治療アプリケーションを有する。ＮＫ細胞の増強は、腫瘍のような増殖性障害ならびに感染性疾患および炎症性障害の処置に有益であり得る。ＮＫ細胞の増強はまた、治療用抗体、特に、それらが結合する標的細胞のＡＤＣＣ仲介細胞死滅を誘導することが可能な抗体（例えば、腫瘍抗原に結合する抗体）の効果の増加を生じることも実証されている。そのような治療用抗体の範囲については、本明細書においてさらに考察する。
【００７５】
さらに、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質が過剰増殖性細胞（例えば、腫瘍または免疫細胞）において選択的に発現されるという発見に基づいて、本発明は、好ましくは、細胞障害性抗体を使用して、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３を発現するそれらの細胞を特異的に標的化することによって、そのような過剰増殖性細胞によって特徴付けられる障害を処置する方法を提供する。この方法では、過剰増殖性細胞の数が特異的に減少する一方、他の免疫および非免疫細胞は温存される。細胞発現４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３を標的化する化合物は、任意の適切な機構を介して、例えば、増殖性細胞への４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の保護効果を中和すること、免疫系による破壊のために増殖性細胞を標的化すること（例えば、ＡＤＣＣとも称される抗体依存性細胞障害性を介する）、またはそれらと、放射性同位元素、毒素、もしくは薬物のような細胞障害性薬剤とを直接接触させることにより細胞を死滅させることによって、作用することができる。さらに、同じ発見に基づいて、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３の検出を増殖性細胞（例えば、腫瘍、免疫増殖性障害）を同定するための診断ツールとして使用することができるため、本発明はまた、疾患の診断の方法を提供する。一般に、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３発現細胞を標的化することに関連する本方法は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３に特異的なモノクローナル抗体の使用に関与する。有利なことに、２つの組の抗体が使用される。直接的または間接的に標識された抗体を含んでなる１つの組は、本質的に診断用であり、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３が患者由来の細胞（例えば、腫瘍細胞）上で発現されるかどうかを決定するために使用される。処置のために使用される第２の組は、非ヒト動物（但し、ヒトにおける使用に適切であるようになされており、例えば、ヒト化またはキメラ化される）において一般に惹起されるモノクローナル抗体に対応する。所定の実施形態では、抗体は、それらが４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３を発現する細胞を死滅させるように、細胞障害性薬剤で、直接的または間接的にさらに誘導される。例えば、抗体は、放射性同位元素、細胞障害性ポリペプチド、または細胞障害性小分子に連結することができる。
【００７６】
定義
本明細書において使用される以下の用語は、他で指定しない限り、それらに帰属する意味を有する。
【００７７】
明細書に記載の「ＮＫ」細胞は、従来にない免疫に関与するリンパ球のサブ集団を指す。ＮＫ細胞は、ＣＤ１６、ＣＤ５６、および／またはＣＤ５７を含む特異的表面抗原の発現、細胞表面におけるα／βまたはγ／δＴＣＲ複合体の不在、特定の細胞溶解性酵素の活性化により、「自己の」ＭＨＣ／ＨＬＡ抗原を発現することができない細胞に結合して死滅させる能力、腫瘍細胞またはＮＫ活性化受容体に対するリガンドを発現する他の罹患した細胞を死滅させる能力、および免疫応答を刺激または阻害するサイトカインと呼ばれるタンパク質分子を放出する能力のような所定の特徴および生物学的特性によって規定することができる。当該分野において周知の方法を使用してＮＫ細胞を同定するために、これらの特徴および活性のいずれかを使用することができる。
【００７８】
本明細書において使用される「４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３状態」は、個体、例えば、癌患者から採取される増殖性または他の細胞（例えば、腫瘍細胞、樹状細胞、増殖性免疫細胞など）において発現される４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の同一性および重要性を指す。例えば、患者から採取される細胞の検査により、細胞の３０％、４０％、５０％などにおいて４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３が発現されるが見出され得る。「顕著に発現される」は、所定の患者から採取される実質的な数の過剰増殖性または腫瘍細胞において発現される４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質を指す。用語「顕著に発現される」の規定は正確な百分率値には結びつかない一方、ほとんどの場合、「顕著に発現される」といわれるタンパク質は、患者から採取される少なくとも２０％、３０％、４０％、好ましくは、５０％、６０％、７０％もしくはそれ以上の神経芽細胞腫、メラノーマ、癌腫または他の過剰増殖性細胞において存在する。
【００７９】
本明細書において使用する用語「抗体」は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を指す。重鎖の定常ドメインのタイプに依存して、抗体は、５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭのうちの１つに割り当てられる。これらのうちのいくらかは、さらに、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などのようなサブクラスまたはイソタイプに分けられる。例示的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含んでなる。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一な対よりなり、各対は、１本の「軽」（約２５ｋＤａ）および１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識を担う約１００〜１１０もしくはそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれ、これらの軽および重鎖を指す。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ「α」、「δ」、「ε」、「γ」および「μ」と呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および３次元構造が周知である。ＩｇＧおよび／またはＩｇＭは生理学的状況において最も一般的な抗体であり、それらは実験施設において最も容易に作製されるため、それらは本発明において用いられる好適なクラスの抗体であり、ＩｇＧが特に好適である。好ましくは、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。ヒト化、キメラ、ヒト、またはそれ以外のヒトに適切な抗体が特に好適である。「抗体」はまた、本明細書に記載の抗体のいずれかの任意のフラグメントまたは誘導体を含む。
【００８０】
用語「特異的に結合する」は、抗体が、好ましくは、競合結合アッセイにおいて、結合パートナー、例えば、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質または４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３受容体に結合することができることを意味し、組換え形態のタンパク質、その中のエピトープ、または単離されたＮＫもしくは関連の標的細胞の表面上に存在する生来のタンパク質のいずれか一方を使用して評価される。競合結合アッセイおよび特異的結合を決定するための他の方法については、以下においてさらに説明するものとし、当該分野において周知である。
【００８１】
「ヒトに適切な」抗体は、例えば、本明細書に記載の治療的方法において、ヒトにおいて安全に使用することができる任意の抗体、誘導体化された抗体、または抗体フラグメントを指す。ヒトに適切な抗体は、ヒト化、キメラ、または完全なヒト抗体、あるいは抗体の少なくとも一部が、ヒトから誘導されるか、もしくはそうでなければ、生来の非ヒト抗体が使用される場合に一般に惹起される免疫応答を回避するように改変される任意の抗体のすべてのタイプを含む。
【００８２】
「毒性」もしくは「細胞障害性」ペプチドまたは小分子は、細胞の増殖を遅らせるか、停止するか、または反転するか、任意の検出可能な方法でそれらの活性（例えば、ＮＫ細胞の細胞溶解活性）を減少するか、あるいは直接的もしくは間接的にそれらを死滅させることができる任意の化合物を包含する。毒性または細胞障害性化合物は、例えば、ＡＤＣＣを誘導する、アポトーシスを惹起させるまたはその他により細胞を死滅させることによって、作用することができる。本明細書において使用されるように、毒性「ペプチド」は、任意のペプチド、ポリペプチド、または非天然アミノ酸または改変された連結を伴うペプチドまたはポリペプチド誘導体を含むそれらの誘導体を含むことができる。毒性「小分子」は、好ましくは、１０ｋＤ、５ｋＤ、１ｋＤ、７５０Ｄ、６００Ｄ、５００Ｄ、４００Ｄ、３００Ｄ、もしくはそれ以下より小さいサイズを伴う任意の毒性化合物またはエレメントを含むことができる。
【００８３】
「免疫原性フラグメント」とは、本明細書において、（ｉ）前記フラグメントに結合し、ならびに／または膜結合受容体およびそれらから誘導される変異体を含む前記フラグメントを含んでなる任意の形態の分子に結合する抗体の作製、（ｉｉ）任意のＭＨＣ分子および前記フラグメントから誘導されるペプチドを含んでなる二分子複合体に反応するＴ細胞に関与するＴ細胞応答の刺激、（ｉｉｉ）哺乳動物免疫グロブリンをコードする遺伝子を発現するバクテリオファージもしくは細菌のようなトランスフェクトされたビヒクルの結合のような免疫応答を誘発することが可能である任意のポリペプチドまたはペプチドフラグメントを意味する。あるいは、免疫原性フラグメントはまた、共有結合によりキャリアタンパク質にコンジュゲートされたペプチドフラグメント、そのアミノ酸配列において前記ペプチドフラグメントを含んでなるキメラ組換えポリペプチド構築物のような免疫応答を誘発することが可能な任意の構築を指し、特に、配列が前記フラグメントをコードする部分を含んでなるｃＤＮＡでトランスフェクトされる細胞を含む。
【００８４】
本発明の目的のために、「ヒト化」抗体は、１つもしくはそれ以上のヒト免疫グロブリンの定常および可変フレームワークが、結合領域、例えば、動物免疫グロブリンのＣＤＲと融合される抗体を指す。そのようなヒト化抗体は、結合領域が、非ヒト抗体に対する免疫反応を回避するように誘導される非ヒト抗体の結合特異性を維持するように設計される。
【００８５】
「キメラ抗体」は、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が異なるもしくは改変されたクラス、エフェクター機能および／または種の定常領域、または新たな特性をキメラ抗体に付与する全く異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬物などに連結されるように、定常領域、またはその部分が改変、置き換え、または交換されるか、あるいは（ｂ）可変領域、またはその部分が、異なるもしくは改変された抗原特異性を有する可変領域で改変、置き換え、または交換される抗体分子である。
【００８６】
「ヒト」抗体は、抗原チャレンジに応答して特異的ヒト抗体を産生するように「操作」されているトランスジェニックマウスまたは他の動物から得られる抗体である（例えば、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ７：１３、ロンベルグ（Ｌｏｎｂｅｒｇ）ら（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ３６８：８５６、テイラー（Ｔａｙｌｏｒ）ら（１９９４年）Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎ６：５７９（これらの教示内容全体は参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。十分なヒト抗体はまた、遺伝子または染色体トランスフェクション方法、ならびにファージディスプレイ技術（これらのすべては当該分野において公知である）によっても構築することができる（例えば、マキャフェルティー（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）ら（１９９０年）Ｎａｔｕｒｅ３４８：５５２−５５３を参照のこと）。ヒト抗体はまた、インビトロ活性化Ｂ細胞（例えば、米国特許第５，５６７，６１０号明細書および同第５，２２９，２７５号明細書（それらの全体が参照により援用される）を参照のこと）によって作製することができる。ヒト抗体はまた、ヒトから単離される抗体の配列を決定し、細胞培養において組換え宿主細胞から前記抗体をコードするヌクレオチド配列を発現させることによって、得ることができる。
【００８７】
用語「単離された」、「精製された」または「生物学的に純粋な」は、その生来の状態において見出されるように、通常、材料に伴う成分を実質的または本質的に含まない材料を指す。純度および均質度は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーのような分析化学技術を使用して、典型的に決定される。調製物に存在する優勢な種であるタンパク質が実質的に精製される。
【００８８】
本明細書において使用する用語「生物学的サンプル」として、生物学的液体（例えば、血清、リンパ、血液）、細胞サンプルまたは組織サンプル（例えば、骨髄）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８９】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は交換可能に使用され、アミノ酸残基の高分子を指す。該用語は、１つもしくはそれ以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学類似物であるアミノ酸高分子、ならびに天然に存在するアミノ酸高分子および天然に存在しないアミノ酸高分子に当てはまる。
【００９０】
例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関して使用される場合の用語「組換え」は、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入または生来の核酸またはタンパク質の改変によって改変されていること、あるいは、細胞が、そのようにして改変された細胞から誘導されることを示す。従って、例えば、組換え細胞は、該細胞の生来の（非組換え）形態内において見出されない遺伝子を発現するか、または他の点で異常に発現されるか、不十分に発現されるか、もしくは全く発現されない生来の遺伝子を発現する。
【００９１】
本明細書において使用する用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、相互に少なくとも３０％（好ましくは、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９８％）同一であるヌクレオチド配列が典型的に相互にハイブリダイズされたまま保たれるハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件について説明している。そのようなストリンジェントな条件は当業者に公知であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク（１９８９年）において見出され得る。１つの非限定的例では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、約４５℃でのハイブリダイゼーション、それに続く、０．１×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ中、約６８℃での１回もしくはそれ以上の洗浄である。好適な非限定的例では、制限的ハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣ中、約４５℃でのハイブリダイゼーション、それに続く、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０〜６５℃での１回もしくはそれ以上の洗浄（即ち、５０℃、５５℃、６０℃または６５℃での１回もしくはそれ以上の洗浄）である。本発明の核酸は、これらの条件下で、ＡまたはＴヌクレオチドのみからなるヌクレオチド配列だけにハイブリダイズする核酸分子を含まないことが理解される。特定の実施形態では、典型的なハイブリダイゼーション条件は、３０℃を超える、好ましくは、３５℃を超える、より好ましくは、４２℃より高い温度、および／または約５００ｍＭ未満、好ましくは、２００ｍＭ未満の塩度を含む。ハイブリダイゼーション条件は、温度、塩度および／またはＳＤＳ、ＳＳＣなどのような他の試薬の濃度を改変することによって、当業者により調整することができる。
【００９２】
４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３に特異的なモノクローナル抗体の産生
本発明は、ヒトにおける使用に適切であり、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質または４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒタンパク質を標的化する抗体、抗体フラグメント、または抗体誘導体の産生および使用に関与する。本発明の抗体は、様々な当該分野において公知の技術のいずれかによって産生させることができる。典型的に、それらは、非ヒト動物、好ましくは、ＮＫ細胞または標的細胞の表面上に存在する４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３または４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒタンパク質を含んでなる免疫原を伴うマウスの免疫化によって産生される。受容体は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ発現ＮＫ細胞全体、もしくは４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３発現標的細胞（例えば、神経芽細胞腫、メラノーマ、癌腫、成熟または非成熟樹状細胞）、または細胞膜、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３もしくは４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒの全長配列、またはそのフラグメントもしくは誘導体、典型的に、免疫原性フラグメント、即ち、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３もしくは４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒを発現する細胞の表面上に暴露されるエピトープを含んでなるポリペプチドの部分を含んでなり得る。そのようなフラグメントは、典型的に、成熟ポリペプチド配列の少なくとも７連続アミノ酸、さらにより好ましくは、その少なくとも１０連続アミノ酸を含有する。それらは、本質的に、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３または４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒタンパク質の細胞外ドメインから誘導される。好適な実施形態では、抗体を作製するために使用される４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３もしくは４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒタンパク質またはペプチドは、ヒト４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３もしくは４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒタンパク質またはペプチドである。
【００９３】
最も好適な実施形態では、免疫原は、脂質膜、典型的に細胞表面の野生型ヒト４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３もしくは４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒポリペプチドを含んでなる。特定の実施形態では、免疫原は、無傷（ｉｎｔａｃｔ）なＮＫまたは標的細胞、特に、無傷なヒトＮＫまたは標的細胞（場合により処置または溶解された）を含んでなる。４−Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質ならびにｃＤＮＡ配列およびタンパク質構造については、スタインバーグ（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら（２００４年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：２３５２−２３５９ならびに該文献の図８および９に記載されている。
【００９４】
１つの実施形態では、抗体は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３または４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ、例えば、５Ｂ１４もしくは７−５１７を認識する１つもしくはそれ以上の既に現存しているモノクローナル抗体（後者については、例えば、スタインバーグ（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら（２００４年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：２３５２−２３５９を参照のこと）から誘導される。そのような抗体は、患者の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３状態を決定するための本明細書に記載のタイプ分類工程のための診断用抗体としての使用のために、直接的または間接的に標識する（即ち、標識された第二抗体と共に使用される）ことができる。さらに、抗体は、ヒトへの投与に適切であるようにする、場合により、本治療方法において細胞障害性抗体としての使用ために、本発明に記載のように毒性にすることができる。
【００９５】
本診断用または治療用（例えば、細胞障害性）抗体は、完全長の抗体または抗体フラグメントもしくは誘導体であり得る。抗体フラグメントの例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント、二重特異性抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、ただ１つの軽鎖可変ドメイン、または関連重鎖部分を伴わずに軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含有するそのフラグメントを含有する一本鎖ポリペプチド、ただ１つの重鎖可変領域、または関連軽鎖部分を伴わずに重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有するそのフラグメントを含有する一本鎖ポリペプチド、および抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。そのようなフラグメントおよび誘導体ならびにそれらを調製する方法は、当該分野において周知である例えば、ペプシンを使用して、ヒンジ領域のジスルフィド結合より下流の抗体を消化して、Ｆ（ａｂ）’２（それ自体がジスルフィド結合によってＶＨ−ＣＨ１に結合される軽鎖であるＦａｂの二量体である）を生成させることができる。Ｆ（ａｂ）’２を、穏やかな条件下で還元して、ヒンジ領域のジスルフィド結合を切断し、それによって、Ｆ（ａｂ）’２二量体をＦａｂ’単量体に変換してもよい。Ｆａｂ’単量体は、本質的に、ヒンジ領域の部分を伴うＦａｂである（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ポール（Ｐａｕｌ）編、第３版、１９９３年）を参照のこと）。多様な抗体フラグメントが無傷（ｉｎｔａｃｔ）な抗体の消化によって規定される一方、当業者は、そのようなフラグメントを、化学的かまたは組換えＤＮＡ方法論を使用するかのいずれかによって、デノボで合成することができることを理解している。
【００９６】
モノクローナルまたはポリクローナル抗体の調製については当該分野において周知であり、多数の利用可能な技術のいずれかを使用することができる（例えば、ケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）およびミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７（１９７５年）、コズボール（Ｋｏｚｂｏｒ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ４：７２（１９８３年）、コール（Ｃｏｌｅ）ら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９８５）の７７−９６頁を参照のこと）。一本鎖抗体の産生のための技術（米国特許第４，９４６，７７８号明細書）を適応して、所望されるポリペプチドに対する抗体を産生させることができる。また、トランスジェニックマウス、または他の哺乳動物のような他の生物体を使用して、ヒト化、キメラ、または同様に改変された抗体を発現させてもよい。あるいは、ファージディスプレイ技術を使用して、選択された抗原に特異的に結合する抗体およびヘテロメリックなＦａｂフラグメントを同定することができる（例えば、マキャフェルティー（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）ら、Ｎａｔｕｒｅ３４８：５５２−５５４（１９９０年）、マークス（Ｍａｒｋｓ）ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：７７９−７８３（１９９２年）を参照のこと）。１つの実施形態では、方法は、ライブラリーまたはレパートリーから、少なくとも１つのＮＫ受容体と交差反応するモノクローナル抗体またはそのフラグメントもしくは誘導体を洗濯することを含んでなる。例えば、レパートリーは、場合により、任意の適切な構造（例えば、ファージ、細菌、合成複合体など）によってディスプレイされる抗体またはそのフラグメントの任意の（組換え）レパートリーであってもよい。
【００９７】
分野において周知の任意の様式で、非ヒト哺乳動物を抗原で免疫する工程を行うことができる（例えば、Ｅ．ハーロー（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ）およびＤ．レーン（Ｄ．Ｌａｎｅ）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州（１９８８）を参照のこと）。一般に、免疫原は、場合により完全フロイントアジュバントのようなアジュバントと共に、緩衝液に懸濁または溶解される。免疫原の量、緩衝液のタイプおよびアジュバントの量を決定するための方法は当該分野において周知であり、本発明に対する任意の方法において限定されない。
【００９８】
同様に、抗体の産生を刺激するのに十分な免疫の場所および回数もまた、当該分野において周知である。典型的な免疫プロトコルでは、１日目に非ヒト動物に免疫原が腹腔内に注入され、１週間後に再度注入される。これに続いて、場合により、不完全フロイントアジュバントなどのアジュバントを伴って、約２０日目に抗原が再注入される。再注入は静脈内で実施され、数日間連続で反復され得る。これに続いて、静脈内または腹腔内のいずれかで、典型的にアジュバントを伴わずに、４０日目に追加注入が行われる。このプロトコルにより、約４０日後に、抗原特異的抗体産生Ｂ細胞が生じる。他のプロトコルもまた、それらが、免疫に使用される抗原に対する抗体を発現するＢ細胞の産生を生じる限り、利用することができる。
【００９９】
別の実施形態では、非免疫非ヒト哺乳動物由来のリンパ球が単離され、インビトロで増殖され、次いで、細胞培養において免疫原に暴露される。次いで、リンパ球を回収し、下記の融合工程を行う。
【０１００】
本発明の目的に好適であるモノクローナル抗体では、次の工程は、細胞、例えば、免疫された非ヒト哺乳動物由来のリンパ球、脾細胞、またはＢ細胞の単離、および抗体産生ハイブリドーマを形成するための該脾細胞、またはＢ細胞、またはリンパ球と不死化細胞との以後の融合である。従って、本明細書において使用される用語「免疫動物から抗体を調製すること」は、免疫動物からＢ細胞／脾細胞／リンパ球を入手すること、およびそれらの細胞を使用して、抗体を発現するハイブリドーマを産生させること、ならびに免疫動物の血清から直接抗体を入手することを含む。例えば、非ヒト哺乳動物からの脾臓細胞の単離は当該分野において周知であり、例えば、麻酔した非ヒト哺乳動物から脾臓を取り出し、それを小片に切断し、単一の細胞懸濁液が生成されるように、セルストレーナーのナイロンメッシュを介して、適切な緩衝液に脾包（ｓｐｌｅｎｉｃ  ｃａｐｓｕｌｅ）から脾臓細胞を圧搾することに関与する。細胞を洗浄し、遠心分離し、任意の赤血細胞を溶解する緩衝液に再懸濁する。溶液を再度遠心分離し、ペレット内に残留するリンパ球を最終的に新鮮緩衝液に再懸濁する。
【０１０１】
一旦、単離され、単一細胞懸濁液中に存在すると、抗体産生細胞を不死細胞株に融合させることができる。これは、典型的にはマウス骨髄腫細胞系統であるが、ハイブリドーマを作製するのに有用な他の多くの不死細胞系統が当該分野において公知である。好適なマウス骨髄腫株として、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州、米国より入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、メリーランド州、米国より入手可能なＸ６３  Ａｇ８６５３およびＳＰ−２細胞が挙げられるが、これらに限定されない。融合は、ポリエチレングリコールなどを使用して行う。次いで、得られるハイブリドーマを、非融合親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１つもしくはそれ以上の物質を含有する選択培地で増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は、典型的に、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む（ＨＡＴ培地）（該物質はＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を妨害する）。
【０１０２】
ハイブリドーマは、マクロファージのフィーダー層上で増殖され得る。マクロファージは、脾臓細胞を単離するために使用される非ヒト哺乳動物の同腹仔由来であることが好ましく、典型的に、ハイブリドーマプレート化の数日前に、不完全フロイントアジュバントなどで刺激する。融合方法は、例えば、ゴーディング（Ｇｏｄｉｎｇ）「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ」、５９〜１０３頁（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８６年）に記載されており、この開示内容は、本明細書において参照により援用される。
【０１０３】
コロニー形成および抗体産生に十分な時間、細胞を増殖させる。これは、通常、７〜１４日間の間である。次いで、ハイブリドーマコロニーを、所望される基質、例えば、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３または４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒタンパク質を特異的に認識する抗体の産生についてアッセイする。アッセイは、典型的に発色ＥＬＩＳＡ型アッセイであるが、ハイブリドーマが増殖するウェルに適応することができるいずれのアッセイを用いてもよい。他のアッセイとしては、免疫沈降およびラジオイムノアッセイが挙げられる。所望の抗体産生に陽性のウェルを試験して、１つもしくはそれ以上の異なるコロニーが存在するかどうかを決定する。１を超えるコロニー多存在する場合、細胞を再クローニングして、増殖させ、ただ単一の細胞が所望の抗体を産生するコロニーを生じていることを確実にする。明らかに単一のコロニーを伴う陽性ウェルを、典型的に再クローニングし、再アッセイし、ただ１つのモノクローナル抗体が検出され、産生されていることを確実にする。
【０１０４】
次いで、本発明のモノクローナル抗体を産生することが確認されるハイブリドーマを、ＤＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０のような適切な培地において、より多量に培養する。あるいは、ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
【０１０５】
所望されるモノクローナル抗体を産生させるのに十分な増殖後、モノクローナル抗体（または腹水液）を含有する増殖培地を細胞から分別し、そこに存在するモノクローナル抗体を精製する。精製は、ゲル電気泳動、透析、タンパク質Ａもしくはタンパク質Ｇ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、またはアガロースもしくはＳｅｐｈａｒｏｓｅビーズのような固相支持体に連結された抗マウスＩｇを使用するクロマトグラフィーによって、典型的に達成される（すべて、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、出版番号１８−１０３７−４６、ＡＣ版（その開示内容は参照により本明細書に援用される）に記載されている）。結合型抗体は、低ｐＨ緩衝液（グリシンまたはｐＨ３．０もしくはそれ未満の酢酸緩衝液）を使用し、抗体を含有する画分を直ちに中和することによって、タンパク質Ａ／タンパク質Ｇカラムから典型的に溶出される。これらの画分をプールし、透析し、必要であれば濃縮する。
【０１０６】
好適な実施形態では、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３または４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ上に存在する決定基に結合する抗体をコードするＤＮＡを、適切な宿主へのトランスフェクションのために適切な発現ベクターに配置されたハイブリドーマから単離する。次いで、宿主を、抗体の抗原認識部分を含んでなる抗体、その改変体、その活性なフラグメント、またはヒト化もしくはキメラ抗体の組換え産生のために使用する。
【０１０７】
本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、（例えば、マウス抗体の重および軽鎖をコードする遺伝に特異的に結合することが可能であるオリゴヌクレオチドを使用することによって）従来の手順を使用して、容易に単離され、配列決定され得る。一旦単離されたら、ＤＮＡを発現ベクターに配置することができ、次いで、それは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サル（ｓｉｍｉａｎ）ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または他では免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞のような宿主細胞にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体の合成が得られる。抗体をコードするＤＮＡの細菌における組換え発現は当該分野において周知である（例えば、スケラ（Ｓｋｅｒｒａ）ら、（１９９３年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５：２５６、およびプリュックサン（Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ）、（１９９２年）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．、１３０：１５１を参照のこと）。抗体はまた、例えば、ウォード（Ｗａｒｄ）ら、（１９８９年）Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４に開示されているような免疫グロブリンのコンビナトリアルライブラリーの選択によって、産生させてもよい。
【０１０８】
特定の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体５Ｂ１４または７−５１７（後者については、例えば、スタインバーグ（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら（２００４年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：２３５２−２３５９（その開示内容全体が参照により本明細書に援用される）を参照のこと）のうちの１つと本質的に同じエピトープまたは抗原決定基に結合する。モノクローナル抗体と「実質的に同じエピトープまたは決定基に結合する」という用語は、抗体がｘ（ここで、ｘは５Ｂ１４などである）と「競合する」ことを意味する。問題のモノクローナル抗体と実質的に同じエピトープに結合する１つもしくはそれ以上の抗体の同定は、抗体の競合を評価することができる様々な免疫学的スクリーニングアッセイを使用して、容易に決定することができる。そのようなアッセイは当該分野において日常的である（例えば、米国特許第５，６６０，８２７号明細書（参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。抗体が結合するエピトープを実際に決定するのに、いずれの方法においても、問題のモノクローナル抗体と同じかまたは実質的に同じエピトープに結合する抗体を同定する必要はないことが理解されよう。
【０１０９】
例えば、調べようとする試験抗体が異なる供給源動物から得られるか、または異なるＩｇアイソタイプである場合、コントロール（例えば、５Ｂ１４）および試験抗体とを混合（または予め吸着）し、エピトープ含有タンパク質、例えば、５Ｂ１４の場合、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３を含有するサンプルに適用する単一の競合アッセイを用いることができる。ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロッティングに基づくプロトコルおよび（例えば、実施例のセクションに記載のような）ＢＩＡＣＯＲＥの使用は、そのような簡単な競合研究における使用に適切であり、当該分野において周知である。
【０１１０】
所定の実施形態では、抗原（例えば、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３エピトープ）を含有するサンプルに適用する前のある期間にコントロール抗体（例えば、５Ｂ１４）と様々な量の試験抗体（例えば、１：１０または１：１００）とを予め混合し得る。他の実施形態では、コントロールおよび様々な量の試験抗体を、抗原サンプルへの暴露中に簡単に混合することができる。（例えば、非結合型抗体を排除するための分離または洗浄技術を使用することによって）結合型と遊離型の抗体および（例えば、種特異的もしくはアイソタイプ特異的第二抗体を使用することによって、または検出可能な標識でコントロール抗体を特異的に標識することによって）コントロール抗体と試験抗体とを識別することができる限り、試験抗体がコントロール抗体の抗原への結合を減少するかどうかを決定し、試験抗体がコントロールと実質的に同じエピトープを認識することを示すことが可能である。完全に関連のない抗体の非存在下での（標識された）コントロール抗体の結合は、コントロールの高値である。コントロール低値は、標識されたコントロール抗体（例えば、５Ｂ１４）を正確に同じタイプ（例えば、５Ｂ１４）の非標識抗体と共にインキュベートすることによって得られ、ここで、競合が生じ、標識された抗体の結合を減少する。試験アッセイでは、試験抗体の存在下における標識された抗体反応性の有意な減少は、同じエピトープ（即ち、標識されたコントロール抗体と「交差反応する」もの）を認識する試験抗体を示す。約１：１０〜約１：１００の間のコントロール：試験抗体の任意の割合で、標識されたコントロールのそれぞれの抗原への結合を、少なくとも５０％またはより好ましくは７０％だけ減少する任意の試験抗体は、コントロールと実質的に同じエピトープまたは抗原決定基に結合する抗体とみなされる。好ましくは、そのような試験抗体は、コントロールの抗原への結合を少なくとも９０％だけ減少する。
【０１１１】
１つの実施形態では、競合を、フローサイトメトリー試験によって評価することができる。所定の活性化している受容体を有する細胞を、まず、受容体（例えば、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３、および５Ｂ１４抗体を発現するＮＫ細胞）に特異的に結合することが公知であるコントロール抗体と共に、および次いで、例えば、蛍光色素またはビオチンで標識されている試験抗体と共に、インキュベートする。飽和量のコントロール抗体とのプレインキュベーションで得られる結合がコントロールとのプレインキュベーションを伴わない抗体によって得られる結合（蛍光の平均）の８０％、好ましくは、５０、４０もしくはそれ以下である場合、試験抗体はコントロールと競合すると言われている。あるいは、飽和量の試験抗体と共にプレインキュベートした細胞上の（蛍光色素またはビオチンにより）標識されたコントロールにより得られる結合が、抗体とのプレインキュベーションを伴わずに得られる結合の８０％、好ましくは５０％、４０％、もしくはそれ以下である場合、試験抗体はコントロールと競合すると言われている。
【０１１２】
１つの好適な実施例では、試験抗体が予め吸着され、抗体結合のための基質、例えば、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質、または５Ｂ１４によって結合されることが公知であるそのエピトープ含有部分が固定化される表面に、飽和濃度で、適用される簡単な競合アッセイを用いることができる。表面は、好ましくは、ＢＩＡＣＯＲＥチップである。次いで、コントロール抗体（例えば、５Ｂ１４）を、基質飽和濃度で表面と接触させ、コントロール抗体の基質表面結合を測定する。コントロール抗体のこの結合を、試験抗体非存在下でのコントロール抗体の基質含有表面への結合と比較する。試験アッセイでは、試験抗体の存在下における基質含有表面の結合の有意な減少は、試験抗体が同じエピトープ（即ち、コントロール抗体と「交差反応する」もの）を認識することを示す。コントロール抗体の抗原含有基質への結合を、少なくとも３０％またはより好ましくは４０％だけ減少する任意の試験抗体は、コントロール抗体と実質的に同じエピトープまたは抗原決定基に結合する抗体とみなされる。好ましくは、そのような試験抗体は、コントロール抗体の基質への結合を少なくとも５０％だけ減少する。コントロールおよび試験抗体の順序は、反転させることができ、即ち、コントロール抗体をまず表面に結合させ、その後に、試験抗体を表面に接触させることが理解されよう。予想されるとおり、第二抗体について認められる結合の減少（抗体が交差反応しているものとみなす）は、より大きな大きさになるため、好ましくは、まず、基質抗原に対してより高い親和性を有する抗体を、基質含有表面に結合させる。そのようなアッセイのさらなる例は、実施例およびサウナル（Ｓａｕｎａｌ）ら、（１９９５年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ１８３：３３−４１（その開示内容は本明細書において参照により援用される）において提供される。
【０１１３】
１つの実施形態では、特に、そのような抗体が他の関連しないタンパク質との過剰な交差反応性を示さない場合、抗４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３抗体は、Ｂ７ファミリーの複数のタンパク質と相互作用することが可能であり、即ち、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３およびＢ７ファミリーの少なくとも１つの他のタンパク質と相互作用することが可能である。同様に、抗４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ抗体は、Ｂ７ファミリーのタンパク質の複数の受容体と相互作用することが可能であり、即ち、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ＲおよびＢ７ファミリーのタンパク質の少なくとも１つの他の受容体と相互作用することが可能である。
【０１１４】
好ましくは、抗４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３または抗４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ抗体は、他の関連しないタンパク質との過剰な交差反応性を示さない。好ましくは、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３または４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ由来のエピトープを認識するモノクローナル抗体は、特に、患者（例えば、増殖性障害、腫瘍、炎症性障害などを有する）におけるそれぞれ実質的な百分率の標的またはＮＫ細胞上に存在するエピトープと反応するが、ＣＤ２０＋Ｂ細胞とも、または他の免疫もしくは非免疫細胞とも有意には反応しない。好ましくは、抗４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３または抗４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ抗体は、従って、それぞれ、Ｂ７ファミリーの他のタンパク質または受容体とは、有意には反応しない。Ｂ７ファミリーの他のタンパク質として、例えば、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、Ｂ７−Ｈ２（ＩＣＯＳ−Ｌ）、Ｂ７−Ｈ１（ＰＤ−Ｌ１）、Ｂ７−ＤＣ（ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ４、（Ｂ７Ｓ１、Ｂ７ｘ）およびＢＴ３）が挙げられる。Ｂ７ファミリーの他のタンパク質の受容体として、Ｔ細胞上で主に発現されるＣＤ２８、ＩＣＯＳまたはＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１およびＢＴＬＡが挙げられるが、これらに限定されない。好適な実施形態では、抗体はまた、単球、顆粒球、血小板、および赤血球細胞と非反応性である。好適な実施形態では、抗体は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質に対する単一の受容体のみを認識し、従って、そのような疾患の根底にある過剰増殖性細胞に対する治療用（例えば、細胞障害性）抗体の効果をできるだけ多く制限する。
【０１１５】
一旦、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３または４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒを特異的に認識する抗体が同定されると、それぞれ、標的細胞（例えば、増殖性細胞、腫瘍細胞、樹状細胞）またはＮＫ細胞に結合するその能力について試験することができる。標的細胞は、例えば、神経芽細胞腫、メラノーマまたは癌腫のような増殖性障害を伴う患者から採取することができる。
【０１１６】
４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３を特異的に認識する抗体は、例えば、増殖性障害を伴う患者から採取される標的細胞に結合するその能力について試験するためのイムノアッセイにおいてバリデートすることができる。例えば、腫瘍生検を実施し、複数の患者から細胞を採取する（例えば、神経芽細胞腫が疑わしい場合、針生検または骨髄吸引物）。次いで、当業者に周知の標準的な方法を使用して、標的細胞に結合する所定の抗体の能力を評価する。有意な百分率の患者（例えば、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％もしくはそれ以上）由来の実質的な割合の標的細胞（例えば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくはそれ以上）に結合することが見出される抗体は、本発明における使用に、本明細書に記載の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３状態タイプ分類工程中の診断目的に、または本明細書に記載の治療方法における使用に、例えば、ヒトに適切な細胞障害性抗体からの誘導体化に適切である。しかし、前記の割合未満の標的細胞に結合する抗体はなお、有利なことに、例えば、ＮＫ細胞溶解からの腫瘍細胞の逸脱の可能性を排除または防止するために使用することができることが理解されよう。抗体の細胞への結合を評価するために、抗体は、直接的または間接的のいずれかで標識することができる。間接的に標識する場合、第二の標識抗体が、典型的に添加される。次いで、例えば、細胞蛍光分析（例えば、ＦＡＣＳｃａｎ）を使用して、抗体の細胞への結合を検出することができる。例えば、ザンベロ（Ｚａｍｂｅｌｌｏ）ら（２００３年）Ｂｌｏｏｄ１０２：１７９７または他の任意の標準的方法を参照のこと。
【０１１７】
ＮＫ増強抗体
ＮＫ増強抗体の場合、本発明の抗４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３および抗４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ抗体は、ＮＫ細胞細胞障害性の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ仲介阻害を中和することが可能である。従って、これらの抗体は、それが４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３分子と相互作用する場合、それらが少なくとも部分的および検出可能な程度で、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒによって仲介される阻害シグナル伝達経路を阻止する意味で、「中和」または「阻害」抗体である。ＮＫ細胞細胞障害性の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３または４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ仲介阻害の阻害は、結合または細胞アッセイのような多様なアッセイによって、評価することができる。
【０１１８】
一旦、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３または４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒに結合する抗体が同定されると、無傷（ｉｎｔａｃｔ）なＮＫ細胞における４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒの阻害効果を中和するその能力について試験することができる。特定の実施形態では、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３陽性標的細胞の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ陽性ＮＫクローンにより、前記抗体が溶解を再構築する能力によって、中和活性を例示することができる。別の特定の実施形態では、抗体の中和活性は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３分子の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒへの結合を阻害する抗体の能力によって規定される。１つの実施形態では、本発明の抗体の阻害活性を、本明細書において開示されるように、細胞に基づく細胞障害性アッセイで評価することができる。
【０１１９】
別の改変体では、本発明の抗体の阻害活性は、サイトカイン放出アッセイで評価することができ、ここで、ＮＫ細胞は、試験抗体およびＮＫ集団の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ分子によって認識される４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３を発現する標的細胞株と共にインキュベートされ、ＮＫ細胞サイトカイン産生（例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＧＭ−ＣＳＦ産生）が刺激される。例示的プロトコルでは、ＰＢＭＣからのＩＦＮ−γ産生は、培養約４日後に、細胞表面および細胞質内染色ならびにフローサイトメトリーによる分析によって評価される。簡単に説明すると、培養の少なくとも約４時間、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を、約５μｇ／ｍｌの最終濃度で添加することができる。次いで、細胞を、透過化（ＩｎｔｒａＰｒｅｐＴＭ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）およびＰＥ抗ＩＦＮ−γまたはＰＥ−ＩｇＧ１（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）による染色の前に、抗ＣＤ３および抗ＣＤ５６ｍＡｂと共にインキュベートすることができる。ＥＬＩＳＡ（ＧＭ−ＣＳＦ：ＤｕｏＳｅｔ  Ｅｌｉｓａ，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ミネソタ州、ＩＦＮ−γ：ＯｐｔＥ１Ａセット、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を使用して、上清におけるポリクローナル活性型ＮＫ細胞からのＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−γ産生を測定することができる。
【０１２０】
本発明の抗体は、ＮＫ細胞細胞障害性の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ仲介阻害を部分的または完全に中和することができる。本明細書において使用する用語「ＮＫ細胞細胞障害性の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ仲介阻害を中和する」とは、それらの４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒによって阻止されないＮＫ細胞またはＮＫ細胞株により同じエフェクター：標的細胞比で得られる特定の溶解が、細胞障害性の古典的クロム放出試験によって測定されるように、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒを発現するＮＫ細胞集団が（ＮＫ細胞上で発現される４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒによって認識される）同系の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３分子を発現する標的細胞と接触される場合、抗体を伴わずに得られる特定の溶解のレベルと比較して、少なくとも約２０％まで、好ましくは、少なくとも約３０％まで、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％もしくはそれ以上（例えば、約２５〜１００％）増加する能力を意味する。例えば、本発明の好適な抗体は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒを発現する標的細胞集団（一致するものであるかまたはＨＬＡ適合性であるかどうか、または自家移植であろうと）、即ち、前記抗体の非存在下ではＮＫ細胞により効果的に溶解されない細胞集団の溶解を誘導することが可能である。従って、本発明の抗体はまた、インビボでＮＫ細胞活性を容易にすると規定することができる。
【０１２１】
免疫化および脊椎動物または細胞における抗体の産生時に、特許請求の範囲に記載の抗体を単離するために、特定の選択工程を実施することができる。これに関して、特定の実施形態では、本発明はまた、そのような抗体を産生させる方法に関し、以下を含んでなる：
ａ）非ヒト哺乳動物を、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３もしくは４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒポリペプチド、またはそのフラグメントを含んでなる免疫原、あるいは上記のいずれかを発現する細胞で免疫すること、
ｂ）前記免疫動物から抗体を調製することであって、ここで、前記抗体は４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３または４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒポリペプチドに結合する、
ｃ）（ｉ）前記４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒポリペプチドを発現するＮＫ細胞の集団に対するＮＫ細胞細胞障害性の阻害を中和することが可能であるか、または（ｉｉ）４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３を発現する標的細胞へのＮＫ細胞細胞障害性の阻害を中和することが可能である（ｂ）の抗体を選択すること。
【０１２２】
好適な実施形態では、工程（ｂ）において調製される抗体はモノクローナル抗体である。従って、本明細書において使用される用語「前記免疫動物から抗体を調製すること」は、免疫動物からＢ細胞を入手すること、およびそれらのＢ細胞を使用して、抗体を発現するハイブリドーマを産生させること、ならびに免疫動物の血清から直接抗体を入手することを含む。
【０１２３】
さらなる別の好適な実施形態では、工程（ｃ）において選択される抗体は、標準的なクロム放出アッセイにおいて測定されるように、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質を発現する標的細胞に対し、そのような４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質によって阻止されないＮＫ細胞による同じエフェクター／標的比で得られる溶解または細胞障害性と比較して、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ＲをディスプレイするＮＫ細胞によって仲介される少なくとも約１０％特異的溶解、およびより好ましくは少なくとも約４０％特異的溶解、少なくとも約５０％特異的溶解、またはより好ましくは、少なくとも約７０％特異的溶解（例えば、約６０〜１００％特異的溶解）を生じる。
【０１２４】
場合により、方法はまたもしくは代替的に、モノクローナル抗体のフラグメントまたはモノクローナル抗体の誘導体あるいは例えば、本明細書において他に記載したようなフラグメントを作製するさらなる工程をさらに含んでなることができる。
【０１２５】
好適な実施形態では、本発明の適用可能な方法に従う抗体を産生するために使用される非ヒト動物は、例えば、げっ歯類（例えば、マウス、ラットなど）、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどの哺乳動物である。また、非ヒト哺乳動物を、遺伝子的に改変または操作して、ＸｅｎｏｍｏｕｓｅＴＭ（Ａｂｇｅｎｉｘ）またはＨｕＭＡｂ−ＭｏｕｓｅＴＭ（Ｍｅｄａｒｅｘ）などの「ヒト」抗体を産生させてもよい。そのような方法については、本明細書の表題「ヒトにおける使用に適切な抗体の産生」のセクションにおいてさらに説明する。
【０１２６】
別の改変体では、本発明は、以下を含んでなる抗体を得るための方法を提供する：
ａ）ライブラリーまたはレパートリーから、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３または４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体、モノクローナル抗体のフラグメント、またはそれらのいずれかの誘導体を選択すること、および
ｂ）４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒを発現するＮＫ細胞の集団に対するＮＫ細胞の細胞障害性の阻害を中和することが可能である（ａ）の抗体、フラグメント、または誘導体を選択すること。
【０１２７】
レパートリーは、場合により、任意の適切な構造（例えば、ファージ、細菌、合成複合体など）によって示される抗体またはそのフラグメントの任意の（組換え）レパートリーであってもよい。阻害型抗体の選択は、上記に開示されるように実施することができ、実施例においてさらに例示される。
【０１２８】
従って、これらの抗体は、それが４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３分子と相互作用する場合、それらが少なくとも部分的および検出可能な程度で、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒによって仲介される阻害シグナル伝達経路を阻止する意味で、「中和」または「阻害」抗体である。ＮＫ細胞細胞障害性の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３または４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ仲介阻害の阻害は、結合または細胞アッセイのような多様なアッセイによって、評価することができる。
【０１２９】
特定のアプリケーションおよび形式に依存して、ＮＫ細胞増強抗体は、それらが結合する細胞を枯渇させていてもよくまたは枯渇させなくていなくてもよいことが理解されよう。例えば、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３に結合し、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質とその受容体との相互作用を阻止するＮＫ細胞増強抗体は、有利なことに、それが結合する４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３発現細胞を枯渇させ得るが、必ずしも必要ではない。場合により、枯渇化抗体は、細胞障害性部分を含んでなる。場合により、枯渇化抗体は、好ましくは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３サブクラスのＦｃ領域を含んでなる。別の実施形態では、枯渇化抗体は、ＮＫ細胞上のＦｃγＲ３ａ（ＣＤ１６）への結合を増加するように改変され、本明細書においてさらに説明するように、好ましくは、抗体のＦｃ領域において１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換を含んでなる。
【０１３０】
ＮＫ細胞上の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒに結合し、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３受容体と４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３との相互作用を阻止するＮＫ細胞増強抗体は、有利なことに、枯渇させ得ないが、必ずしも必要ではない。そのような非枯渇化抗体は、標的細胞を死滅させることに関与するＮＫ細胞の潜在的枯渇を回避するという利点を有し得る。他の態様では、非枯渇化抗体は、場合により、フラグメントの血清中半減期を増加することが可能な部分（例えば、ＰＥＧ高分子）にさらに連結される抗原結合性フラグメントを含んでなるか、またはこれからなる。他の態様では、この抗体は、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４サブクラスのＦｃ領域を含んでなる。別の実施形態では、この抗体は、ＮＫ細胞上のＦｃγＲ３ａ（ＣＤ１６）への結合を減少するように改変され、本明細書においてさらに説明するように、好ましくは、抗体のＦｃ領域において１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換を含んでなる。
【０１３１】
４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３発現標的細胞に結合する抗体
４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３発現細胞に結合する抗体の場合、本発明の抗４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３抗体は、診断および／または治療方法において有用であり得る。診断用として使用する場合、そのような抗体は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３を発現する過剰増殖性もしくは他の細胞を同定する、例えば、腫瘍を診断するかまたはＮＫ細胞による溶解に耐性である細胞を同定するのに有用であり得る。そのような診断用抗体は、インビボまたはインビトロで使用することができ、即ち、それらを個体に投与してもよく、またはそれらを使用して、生物学的サンプルもしくは細胞培養物における細胞を検出してもよい。治療用として使用する場合、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３発現細胞に結合する抗体は、免疫系による破壊のために増殖性細胞を標的化すること（例えば、ＡＤＣＣとも称される抗体依存性細胞障害性を介する）によるか、またはそれらと、放射性同位元素、毒素、もしくは薬物のような細胞障害性薬剤とを直接接触させることによって細胞を死滅させることにより、細胞への４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の保護効果を中和することができる。
【０１３２】
特定のアプリケーションおよび形式に依存して、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３発現細胞に結合する抗体（例えば、好ましくは、抗４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３抗体）は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質と４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒとの間の相互作用を阻止することができるが、必ずしも必要ではなく、さらに、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３発現細胞への保護効果を中和する必要はないことが理解されよう。特に、そのような阻止または中和機構は、抗４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３抗体が免疫系による破壊のために増殖性細胞を標的化する（例えば、ＡＤＣＣとも称される抗体依存性細胞障害性を介する）ことが依然として可能である場合か、または抗４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３抗体が、それらと、放射性同位元素、毒素、もしくは薬物のような細胞障害性薬剤とを直接接触させることにより細胞を死滅させることが可能である場合、必要としなくてもよい。それにもかかわらず、好適な態様では、抗体は、（ａ）４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質と４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒとの間の相互作用を阻止すること、および（ｂ）標的細胞枯渇を仲介することの両方が可能であり、後者の枯渇工程は、一般に、免疫系による破壊のために細胞を標的化すること（例えば、ＡＤＣＣとも称される抗体依存性細胞障害性を介する）、またはそれらと細胞障害性薬剤とを接触させることを含んでなる。場合により、枯渇化抗体は、細胞障害性部分を含んでなる。場合により、枯渇化抗体は、好ましくは、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３サブクラスのＦｃ領域を含んでなる。別の実施形態では、この抗体は、ＮＫ細胞上のＦｃγＲ３ａ（ＣＤ１６）への結合を増加するように改変され、本明細書においてさらに説明するように、好ましくは、抗体のＦｃ領域において１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換を含んでなる。
【０１３３】
特定のアプリケーションおよび形式に依存して、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３発現細胞に結合する抗体（例えば、好ましくは、抗４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３抗体）は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３発現細胞を枯渇させていてもよくまたは枯渇させなくていなくてもよいことが理解されよう。例えば、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質とその受容体の相互作用を阻止することによって、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の増殖性細胞への保護効果を中和する抗体は、それが結合する４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３発現細胞を枯渇させる必要はない。好適な態様では、この抗体は、場合により、フラグメントの血清中半減期を増加することが可能な部分にさらに連結される抗原結合性フラグメントを含んでなるか、またはこれからなる。他の態様では、この抗体は、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４サブクラスのＦｃ領域を含んでなる。別の実施形態では、この抗体は、ＮＫ細胞上のＦｃγＲ３ａ（ＣＤ１６）への結合を減少するように改変され、本明細書においてさらに説明するように、好ましくは、抗体のＦｃ領域において１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換を含んでなる。
【０１３４】
ヒトにおける使用に適切な抗体の産生
一般に、非ヒト動物において、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３または４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒに特異的に結合することができるモノクローナル抗体が産生される場合、抗体は、一般に、それらをヒトにおける治療用途に適切にするように改変される。例えば、それらがヒト抗体でない場合、それらを、ヒト化するか、キメラ化するか、または当該分野において周知の方法を使用して、ヒト抗体のライブラリーから選択してもよい。そのようなヒトに適切な抗体は、本治療方法において直接使用することができるか、または方法における使用のために、下記のような細胞障害性抗体にさらに誘導体化することができる。
【０１３５】
１つの好適な実施形態では、本発明の抗体、例えば、５Ｂ１４様抗体を産生するハイブリドーマのＤＮＡは、発現ベクターへの挿入前に、例えば、相同非ヒト配列の代わりにヒト重および軽鎖定常ドメインのコーディング配列を置換することによって（例えば、モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）ら、（１９８４年）ＰＮＡＳ８１：６８５１）、または免疫グロブリンコーディング配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコーディング配列のすべてもしくは一部を共有結合させることによって、改変することができる。該様式では、本来の抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体が調製される。典型的に、そのような非免疫グロブリンポリペプチドが、本発明の抗体の定常ドメインに対して置換される。
【０１３６】
１つの特に好適な実施形態では、本発明の抗体はヒト化される。本発明の抗体の「ヒト化」形態は、マウスあるいは他の非ヒト免疫グロブリンから誘導される最小配列を含有する特異的キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖または（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、もしくは抗体の他の抗原結合配列のような）そのフラグメントである。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であって、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基が、本来の抗体（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基によって置き換えられる一方、本来の抗体の所望される特異性、親和性、および能力は維持される。場合により、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基を、対応する非ヒト残基によって置き換えてもよい。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはインポートされたＣＤＲまたはフレームワーク配列のいずれにも見出されない残基を含んでなることができる。これらの改変は、抗体の性能をさらに改質し、最適化するために作製される。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、および典型的に２つの可変ドメインの実質的にすべてを含んでなり、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが本来の抗体の該領域に対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の該領域である。より詳細については、ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１、５２２（１９８６年）、ライヒマン（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ）ら、（１９８８年）Ｎａｔｕｒｅ、３３２、３２３、フェルホエン（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ）ら（１９８８年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：１５３４（１９８８年）、プレスタ（Ｐｒｅｓｔａ）（１９９２年）Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２、５９３（それぞれはその全体が参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
【０１３７】
ヒト化抗体を作製するのに使用すべきヒト可変ドメイン（軽鎖および重鎖の両方）の選択は、抗原性を減少させるのに極めて重要である。いわゆる「ベストフィット」方法に従えば、本発明の抗体の可変ドメインの配列を、公知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングされる。次いで、マウスの配列に最も近いヒト配列は、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として許容される（シムズ（Ｓｉｍｓ）ら、（１９９３年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．，１５１：２２９６、チョチア（Ｃｈｏｔｈｉａ）およびレスク（Ｌｅｓｋ）（１９８７年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１））。別の方法は、軽または重鎖の特定の亜群のすべてのヒト抗体のコンセンサス配列由来の特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークを、いくらかの異なるヒト化抗体に使用することができる（カーター（Ｃａｒｔｅｒ）ら、（１９９２年）ＰＮＡＳ８９：４２８５、プレスタ（Ｐｒｅｓｔａ）ら、（１９９３年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１：１９９３））。
【０１３８】
４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３または４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ、好ましくは、ヒト受容体に対する高い親和性、および他の好適な生物学的特性を保持しながら抗体をヒト化することはさらに重要である。この目的を達成するために、好適な方法に従い、親配列の解析のプロセスならびに親およびヒト化配列の３次元モデルを使用する多様な概念上のヒト化産物によって、ヒト化抗体が調製される。３次元免疫グロブリンモデルは一般に利用可能であり、当業者に熟知されている。選択された候補免疫グロブリン配列の見込まれる３次元コンフォメーション構造を例示および示すコンピュータプログラムが利用可能である。これらの標示を調べることにより、候補免疫グロブリン配列の機能性における残基の可能な役割の解析、即ち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の解析を可能にする。この方法では、ＦＲ残基が選択され、標的抗原の増加した親和性などの所望される抗体の特徴が達成されるように、コンセンサスおよびインポート配列から合わせられる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合への影響に、直接的および最も実質的に関与する。
【０１３９】
ヒト抗体はまた、免疫化のために、ヒト抗体レパートリーを発現するように操作されている他のトランスジェニック動物を使用することのような他の多様な技術に従って、産生させてもよい。この技術では、ヒト重および軽鎖遺伝子座のエレメントが、内因性重および軽鎖遺伝子座の標的化された崩壊を伴うマウスまたは他の動物に導入される（例えば、ジャコボビッツ（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｚ）ら（１９９３年）Ｎａｔｕｒｅ３６２：２５５、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３、ロンベルク（Ｌｏｎｂｅｒｇ）ら（１９９４年）Ｎａｔｕｒｅ３６８：８５６、テイラー（Ｔａｙｌｏｒ）ら（１９９４年）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎ．６：５７９（それらの開示内容全体が参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。あるいは、遺伝子または染色体トランスフェクション方法によって、またはファージディスプレイ方法を使用する抗体レパートリーの選択を介して、ヒト抗体を構築することができる。この技術では、抗体可変ドメイン遺伝子は、糸状バクテリオファージの大または小コートタンパク質遺伝子のいずれかにインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面上の機能的抗体フラグメントとしてディスプレイされる。糸状粒子は、一本鎖ＤＮＡコピーのファージゲノムを含有するため、抗体の機能的特性に基づく選択はまた、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択を生じる。この方法では、ファージは、Ｂ細胞のいくつかの特性を模倣する（例えば、ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）ら（１９９３年）Ｃｕｒｒ  Ｏｐ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ３：５５６４−５７１、マキャフェルティー（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）ら（１９９０年）Ｎａｔｕｒｅ３４８：５５２−５５３（開示内容の全体が参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。ヒト抗体はまた、インビトロ活性化Ｂ細胞（例えば、米国特許第５，５６７，６１０号明細書および同第５，２２９，２７５号明細書（それらの開示内容は、それらの全体が参照により援用される）を参照のこと）によって作製することができる。
【０１４０】
１つの実施形態では、免疫化のために、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｆｒｅｍｏｎｔ、カリフォルニア州）のような動物を使用して、「ヒト」モノクローナル抗体が作製される。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、機能的ヒト免疫グロブリン遺伝子によって置き換えられるその免疫グロブリン遺伝子を有したマウス宿主である。従って、このマウスによりまたはこのマウスのＢ細胞から作製されたハイブリドーマにおいて産生される抗体は、すでにヒト化されている。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、米国特許第６，１６２，９６３号明細書において説明されており、該文献は本明細書においてその全体が参照により援用される。ＨｕＭＡｂ−ＭｏｕｓｅＴＭ（Ｍｅｄａｒｅｘ）を使用して、類似の方法を達成することができる。
【０１４１】
本発明の抗体はまた、それらが所望される生物学的活性を示す限り、重および／または軽鎖の部分が本来の抗体における相同する配列と同一かあるいは相同である一方、鎖の残りの部分は別の種から誘導されるかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列に同一かあるいは相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、ならびにそのような抗体のフラグメントに誘導体化され得る（例えば、モリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）ら、（１９８４年）ＰＮＡＳ８１：６８５１、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照のこと）。
【０１４２】
細胞障害性抗体の調製
特にＩｇＧ１またはＩｇＧ３タイプの誘導体化されていないまたは改変されていない形態の抗体は、過剰増殖性４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３発現細胞の増殖を阻害するか、または神経芽細胞腫、癌腫およびメラノーマ患者由来の細胞のような過剰増殖性４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３発現細胞に対して細胞障害性であることが予想される一方、それらを細胞障害性にするように誘導体化された抗体を調製することも可能である。１つの実施形態では、一旦、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３特異的抗体が単離され、ヒトにおける使用に適するようにされると、それらは、細胞に対して毒性となるように誘導体化される。この方法では、抗体の患者への投与は、抗体の過剰増殖性細胞への比較的特異的な結合をもたらし、従って、疾患の根底にある細胞を直接死滅させるかまたは阻害する。処置の特異性のため、処置によって身体の他の非過剰増殖性細胞が受ける影響は最小限である。
【０１４３】
多数の毒性部分またはストラテジーのうちのいずれかを使用して、そのような抗体を産生させることができる。所定の好適な実施形態では、抗体は、放射性同位元素または他の毒性化合物で直接誘導体化される。そのような場合、標識された単一特異性抗体を、患者に注入することができ、ここで、ついで、それは、標的抗原を発現する細胞に結合し、死滅させることができ、非結合型抗体は、簡単に身体から浄化される。「Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ」（ＡＥＳ）のような間接的ストラテジーを使用することもできる（例えば、米国特許第５，２５６，３９５号明細書、バーベット（Ｂａｒｂｅｔ）ら（１９９９年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ  １４：１５３−１６６を参照のこと、それらの開示内容全体が参照により本明細書に援用される）。この特定のアプローチは、放射性標識ハプテンならびにＮＫ細胞受容体および放射性ハプテンの両方を認識する抗体の使用に関与する。この場合、抗体は、まず、患者に注入され、標的細胞に結合され、次いで、一旦、非結合型抗体が血流から浄化され、放射性標識ハプテンが投与される。ハプテンは過剰増殖性４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３発現細胞上の抗体−抗原複合体に結合し、それによって、それらを死滅させ、非結合型ハプテンは、身体から浄化される。
【０１４４】
細胞障害性または細胞抑制効果を伴う部分の任意のタイプは、特異的４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３発現細胞を阻害または死滅させるために本抗体と共同で使用することができ、放射性同位元素、毒性タンパク質、毒性小分子、例えば、薬物、毒素、免疫調節物質、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、オリゴヌクレオチド、酵素インヒビター、治療用放射性核種、血管新生インヒビター、化学療法薬、ビンカアルカロイド類、アントラサイクリン系薬剤、エピドフィルロトキシン類（ｅｐｉｄｏｐｈｙｌｌｏｔｏｘｉｎｓ）、タキサン系薬剤、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗生物質、ＣＯＸ−２インヒビター、ＳＮ−３８、有糸分裂阻害剤、抗血管新生およびアポトーシス薬剤、特に、ドキソルビシン、メトトレキサート、タキソール、ＣＰＴ−１１、カンプトテシン類（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａｎｓ）、ナイトロジェンマスタード、ゲムシタビン、アルキルスルホン酸、ニトロソ尿素類、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体、白金配位錯体、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素、リシン、アブリン、５−フルオロウリジン、リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）、ＤＮａｓｅＩ、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）エンテロトキシン−Ａ、ヨウシュヤマゴボウ（ｐｏｋｅｗｅｅｄ）抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア（ｄｉｐｈｔｈｅｒｉｎ）毒素、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素、およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）内毒素などを含む（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１９版、（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１９９５年）、Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  （ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ、２００１年）、パスタン（Ｐａｓｔａｎ）ら（１９８６年）Ｃｅｌｌ４７：６４１、ゴールデンベルグ（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ）（１９９４年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ  ４４：４３、米国特許第６，０７７，４９９号明細書を参照のこと、それらの開示内容全体が参照により本明細書に援用される）。毒素は、動物、植物、真菌、または微生物由来であり得るか、または化学合成によりデノボで作製され得ることが理解されよう。
【０１４５】
毒素または他の化合物は、任意の多くの利用可能な方法を使用して、直接的もしくは間接的に抗体に連結することができる。例えば、薬剤を、Ｎ−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）のような架橋剤を使用するジスルフィド結合形成を介するか、または抗体のＦｃ領域における炭水化物部分を介して、還元型抗体成分のヒンジ領域に付着させることができる（例えば、ウー（Ｙｕ）ら（１９９４年）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ５６：２４４、ウォング（Ｗｏｎｇ）、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ１９９１年）、ウペスラシス（Ｕｐｅｓｌａｃｉｓ）ら、「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、バーチ（Ｂｉｒｃｈ）ら（編）、１８７−２３０頁（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．１９９５年）、プライス（Ｐｒｉｃｅ）、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ、リッター（Ｒｉｔｔｅｒ）ら（編）、６０−８４頁（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５年）、カテル（Ｃａｔｔｅｌ）ら（１９８９年）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｔｏｄａｙ７：５１−５８、デルプリノ（Ｄｅｌｐｒｉｎｏ）ら（１９９３年）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ８２：６９９−７０４、アルピッコ（Ａｒｐｉｃｃｏ）ら（１９９７年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｒｎｉｓｔｒｙ８：３、ライスフィールド（Ｒｅｉｓｆｅｌｄ）ら（１９８９年）Ａｎｔｉｈｏｄｙ，Ｉｍｍｕｎｉｃｏｎ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｒｎ．２：２１７を参照のこと、それらのそれぞれの開示内容全体が参照により本明細書に援用される）。
【０１４６】
１つの好適な実施形態では、抗体は、Ｉ−１３１のような放射性同位元素で誘導体化される。多くの適切な放射性同位元素のいずれかを使用することができ、インジウム−１１１、ルテチウム−１７１、ビスマス−２１２、ビスマス−２１３、アスタチン−２１１、銅−６２、銅−６４、銅−６７、イットリウム−９０、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、リン−３２、リン−３３、スカンジウム−４７、銀−１１１、ガリウム−６７、プラセオジム−１４２、サマリウム−１５３、テルビウム−１６１、ジスプロシウム−１６６、ホルミウム−１６６、レニウム−１８６、レニウム−１８８、レニウム−１８９、鉛−２１２、ラジウム−２２３、アクチニウム−２２５、鉄−５９、セレン−７５、ヒ素−７７、ストロンチウム−８９、モリブデン−９９、ロジウム−１０５、パラジウム−１０９、プラセオジム−１４３、プロメチウム−１４９、エルビウム−１６９、イリジウム−１９４、金−１９８、金−１９９、および鉛−２１１を含むがこれらに限定されない。一般に、放射性核種は、好ましくは、オージェ放射体については、２０〜６，０００ｋｅＶの範囲、好ましくは、６０〜２００ｋｅＶの範囲で、β放射体については１００〜２，５００ｋｅＶ、およびα放射体については４，０００〜６，０００ｋｅＶの崩壊エネルギーを有する。α粒子の発生に伴って実質的に崩壊する放射性核種もまた好適である。
【０１４７】
本方法に含まれる細胞障害性部分を選択する際に、該部分は、ヒト身体における心臓、腎臓、脳、肝臓、骨髄、直腸、乳、前立腺、甲状腺、胆嚢、肺、副腎、筋肉、神経線維、膵臓、皮膚、あるいは他の生命を維持する器官または組織から選択される１つもしくはそれ以上の組織のような生命を維持する正常な組織に対して有意なインビボでの副作用を発揮しないことを確実にすることが所望される。本明細書で使用する用語「有意な副作用」は、インビボで投与する場合、化学療法中に通常遭遇するような極僅かなもしくは臨床的に管理可能な副作用しか生じない抗体、リガンドまたは抗体コンジュゲートを指す。
【０１４８】
一旦、所望される抗原（例えば、好ましくは、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３）に特異的に結合することが公知であり、ヒトにおける使用に適切にされ、場合により、毒性部分を含むように誘導体化されている抗体が得られると、それらは、一般に、標的細胞の活性を妨害する、影響を及ぼす、および／または該細胞を死滅させるそれらの能力について評価される。一般に、競合に基づくアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロッティング、ＢＩＡＣＯＲＥに基づくアッセイ、およびフローサイトメトリーアッセイを含む４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３および４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒに結合する抗体を検出するための上記のアッセイは、ヒト化、キメラ、または細胞障害性抗体のような他のヒトに適切な抗体とそれらの標的細胞との相互作用を検出するために、同等に適用することができる。典型的に、標的細胞は、増殖性障害、具体的には、腫瘍または炎症性障害を伴う患者から採取される細胞である。
【０１４９】
本アッセイでは、ヒト化またはヒトに適切な治療用（例えば、細胞障害性）抗体が４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドまたは前記ポリペプチドを発現する細胞に結合する能力は、コントロールタンパク質、例えば、構造的に関連しない抗原に対して惹起された抗体、または非Ｉｇペプチドもしくはタンパク質が同じ標的に結合する能力と比較される。任意の適切なアッセイを使用して、コントロールタンパク質と比べて２５％、５０％、１００％、２００％、１０００％もしくはそれ以上増加した親和性を伴うと評価される標的細胞または４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドに結合する抗体あるいはフラグメントは、標的に「特異的に結合する」または「特異的に相互作用する」と言われており、下記の治療方法における使用に好適である。
【０１５０】
結合に加えて、抗体が増殖を阻害する、または好ましくは、標的細胞を死滅させる能力を評価することができる。１つの実施形態では、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３を発現するヒト細胞は、障害を伴う患者から採取され、プレート、例えば、９６ウェルプレートに導入され、多様な量の関連抗体に暴露される。バイタル染料、即ち、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、カリフォルニア州）のような無傷（ｉｎｔａｃｔ）な細胞によって取り込まれる色素を添加し、洗浄して、過剰な染料を除去することにより、光学密度（抗体によって死滅した細胞が多いほど、光学密度が低い）によって、生存可能な細胞の数を測定することができる。（例えば、コノリー（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ）ら（２００１年）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ２９８：２５−３３（その開示内容は、その全体が参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。他の任意の適切なインビトロ細胞障害性アッセイ、細胞増殖もしくは生存を測定するためのアッセイ、または標的細胞活性を検出するためのアッセイを、同等に使用することができ、同じく、例えば、抗体を動物モデル、例えば、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３を発現するヒト細胞を含有するマウスに投与し、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３発現標的細胞の生存または活性に対する抗体投与の影響を経時的に検出するインビボアッセイも使用することができる。また、抗体が非ヒト４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質、例えば、霊長類４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３発現細胞と交差反応する場合、治療用抗体を、インビトロまたはインビボで使用して、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３を発現する動物由来の標的細胞に結合するおよび／または死滅させる抗体の能力を評価することができる。
【０１５１】
過剰増殖性細胞の増殖をインビトロもしくはインビボで、検出可能な程度で遅らせるか、停止するか、または反転させることができる任意の抗体、好ましくは、ヒトに適切な抗体、例えば、細胞障害性抗体を、本方法において使用することができる。好ましくは、抗体は、増殖を停止する（例えば、標的化された４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドを発現する細胞の数の増加をインビトロもしくはインビボで防止する）ことが可能であり、最も好ましくは、抗体は、増殖を反転させることができ、そのような細胞の総数の減少をもたらす。所定の実施形態では、抗体は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドを発現する細胞の数の１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の減少を生じることが可能である。
【０１５２】
従って、１つの好適な実施形態では、本発明は、癌腫、メラノーマおよび神経芽細胞腫のような増殖性障害の処置における使用に適切な抗体を産生させるための方法を提供し、該方法は、次の工程を含んでなる：ａ）細胞の表面上に存在する４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３に特異的に結合する複数の抗体を提供すること、ｂ）抗体が増殖性障害を伴う１つもしくはそれ以上の患者から採取される細胞（好ましくは、増殖性細胞または腫瘍細胞）に結合する能力を試験すること、ｃ）前記複数の抗体から、１つもしくはそれ以上の前記患者から採取される実質的な数の細胞に結合する抗体を選択すること、およびｄ）前記抗体をヒトへの投与に適切にすること。１つの実施形態では、方法は、細胞障害性薬剤が前記抗体に連結される工程をさらに含んでなる。そのような方法では、「実質的な数」は、例えば、３０％、４０％、５０％、好ましくは、６０％、７０％、８０％、９０％もしくはそれ以上の百分率の細胞を意味し得る。
【０１５３】
等価な方法を使用して、動物を処置するか、または動物モデルにおいて試験するのに適切な抗体を産生させることができることが理解されよう。その場合、抗体は、関連動物由来、および所望されない細胞増殖に関与する動物疾患において普及している４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質を特異的に認識することが可能であることが確実にされている。同様に、抗体は、特定の動物への投与に適切であるように改変される。
【０１５４】
ＡＤＣＣを誘導するための改変された能力を有する抗体
いくつかの実施形態では、本発明は、ＦｃγＲ、例えば、ＦｃγＲＩＩＩを活性化するための変更された親和性（高いまたは低い親和性のいずれか）を有する変更された抗体を提供する。ある好適な実施形態では、ＦｃγＲに対しより高い親和性を有する変更された抗体が提供される。好ましくは、そのような改変はまた、変更されたＦｃ仲介エフェクター機能を有する。このことは、排除のためにＩｇ４−Ｂ７−Ｈ３発現細胞を標的化するために抗Ｉｇ４−Ｂ７−Ｈ３抗体を使用する場合に有利であり得る。
【０１５５】
Ｆｃ仲介エフェクター機能に影響を及ぼす改変は、当該分野において周知である（米国特許第６，１９４，３５１号明細書（その全体が本明細書において参照により援用される）を参照のこと）。改変することができるアミノ酸として、プロリン３２９、プロリン３３１、およびリジン３２２が挙げられるが、これらに限定されない。プロリン３２９および／または３３１、およびリジン３２２は、好ましくは、アラニンで置換可能であるが、任意の他のアミノ酸との置換も考えられる。国際公開第００／１４２０７２号パンフレットおよび米国特許第６，１９４，５５１号明細書（それらの全体が参照により本明細書に援用される）を参照のこと。
【０１５６】
従って、Ｆｃ領域の改変は、抗体Ｆｃ領域に見出されるアミノ酸に対する１つもしくはそれ以上の変更を含んでなり得る。そのような変更は、変更された抗体仲介エフェクター機能、他のＦｃ受容体（例えば、Ｆｃ活性化受容体）への変更された結合、変更されたＡＤＣＣ活性、変更されたＣｌｑ結合活性、変更された相補依存性細胞障害活性、またはそれらの任意の組み合わせを伴う抗体を生じ得る。
【０１５７】
本発明はまた、変更されたオリゴ糖含有量を伴う抗体を提供する。本明細書において使用されるように、オリゴ糖は、２つもしくはそれ以上の簡単な２０の糖を含有する炭水化物を指し、２つの用語は本明細書において交換可能に使用され得る。本発明の炭水化物部分については、当該分野において一般的に使用される命名法を参考にして記載する。炭水化物化学のレビューについては、例えば、ハバード（Ｈｕｂｂａｒｄ）ら、１９８１年、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５０：５５５−５８３（本明細書においてその全体が参照により援用される）を参照のこと。この命名法は、例えば、マンノースを表すＭａｎ、２−Ｎ−アセチルグルコサミンを表すＧｌｃＮＡｃ、ガラクトースを表すＧａｌ、フコースのＦｕｃおよびグルコースのＧｌｃを含む。シアル酸は、５−Ｎ−アセチルノイラミン酸の省略表記ＮｅｕＮＡｃ、および５−グリコイルノイラミン酸（ｇｌｙｃｏｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ）のＮｅｕＮＧｃによって記載される。
【０１５８】
抗体は、典型的に、重鎖の定常領域の保存された位置で炭水化物部分含有し、３０％までのヒトＩｇＧは、グリコシル化Ｆａｂ領域を有する。ＩｇＧは、ＣＨ２ドメインに存在するＡｓｎ２９７において単一のＮ結合型二分岐炭水化物構造を有する（ジェフリーズ（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ）ら、１９９８年，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１６３：５９−７６、ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）ら、１９９７年，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ１５：２６−３２）。ヒトＩｇＧは、典型的に、次の構造炭水化物、ＧｌｃＮＡｃ（フコース）−ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ−（ＭａｎＧｌｃＮＡｃ）２を有する。しかし、ＩｇＧ間で炭水化物含有量の変動が生じ、変更された機能がもたらされる。例えば、ヤッサール（Ｊａｓｓａｌ）ら、３５、２００１年Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８８：２４３−９、グローニンク（Ｇｒｏｅｎｉｎｋ）ら、１９９６年Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６：３７  １４０４−７、ボイド（Ｂｏｙｄ）ら、１９９５年Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１３１１−８、クンペル（Ｋｕｍｐｅｌ）ら、１９９４年、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，５：１４３−５を参照のこと。
【０１５９】
Ａｓｎ２９７に付着された炭水化物部分の変動を含んでなる抗体もまた、主題発明によって提供される。炭水化物部分は、末端のＧｌｃＮＡｃおよび／または３番目のＧｌｃＮａｃ鎖のうちの一方または両方において、ガラクトースおよび／またはガラクトース−シアル酸を有することができる。いくつかの実施形態では、抗体は、１つもしくはそれ以上の選択される糖基、例えば、１つもしくはそれ以上のシアル酸残基、１つもしくはそれ以上のガラクトース残基、および／または１つもしくはそれ以上のフコース残基を実質的に含まない。１つもしくはそれ以上の選択される糖基を実質的に含まない抗体は、例えば、組成物における約９０〜１００％の抗体が、炭水化物部分に付着される選択される糖基を欠くように、選択される糖基の抗体の炭水化物部分への付加を欠損する宿主細胞において本発明の抗体を組換え産生させることを含む、当業者に公知の一般的方法を使用して、調製することができる。
【０１６０】
そのような抗体を調製するための代替的方法は、例えば、１つもしくはそれ以上の選択される糖基の付加を防止もしくは減少する条件下で細胞を培養すること、または１つもしくはそれ以上の選択される糖基の翻訳後の除去を含む。特定の実施形態では、実質的に均質な抗体調製物を産生させる方法であって、ここで、組成物における約８０〜１００％の抗体は、その炭水化物部分（例えば、Ａｓｎ２９７における炭水化物付着）上においてフコースを欠く上記方法が提供される。抗体は、例えば、（ａ）細胞がそこで発現されるタンパク質をフコシル化するための減少した能力を有するようにフコース代謝を欠損する操作された宿主細胞の使用、（ｂ）フコシル化を防止もしくは減少する条件下で細胞を培養すること、（ｃ）例えば、フコシダーゼ酵素によるフコースの翻訳後除去、または（ｄ）フコシル化されていない産物について選択するような抗体の精製によって調製することができる。最も好ましくは、所望される抗体をコードする核酸が、そこで発現される抗体をフコシル化するための減少した能力を有する宿主細胞において発現される。
【０１６１】
そのような抗体の産生のための宿主細胞は、好ましくは、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＲ）欠損である。チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）は、当該分野において公知であり、例えば、Ｌｅｃ１３ＣＨＯ細胞（レクチン耐性ＣＨＯ変異細胞株、リブカ（Ｒｉｂｋａ）およびスタンリー（Ｓｔａｎｌｅｙ）、１９８６年，Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ＆Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎ．１２（１）：５１−６２、リプカ（Ｒｉｐｋａ）ら、１９８６年Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９（２）：５３３−４５）、ＣＨＯ−Ｋｌ、ＤＵＸ−Ｂ１１、ＣＨＯ−ＤＰ１２またはＣＨＯ−ＤＧ４４がある。そのような細胞は、抗体が実質的にフコシル化されないように改変することができる。従って、酵素が細胞において低減した活性および／または減少した発現レベル有するように、細胞は、フコシルトランスフェラーゼ酵素、またはＮ−結合オリゴ糖にフコースを付加することに関与する別の酵素もしくは基質の変更された発現および／または活性を示し得る。変更されたフコース含有量を伴う抗体を賛成させるための方法については、例えば、国際公開第０３／０３５８３５号パンフレットおよびシールズ（Ｓｈｉｅｌｄｓ）ら、２００２年，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（３０）：２６７３３−４０を参照のこと、両方ともそれらの全体が参照により本明細書に援用される。
【０１６２】
変更された炭水化物改変は、抗体の１つもしくはそれ以上の次の特徴をモジュレートすることができる：抗体の可溶化、抗体の細胞内輸送および分泌の簡易化、抗体集成の促進、コンフォメーションの完全性、および抗体仲介エフェクター機能。特定の実施形態では、変更された炭水化物改変は、炭水化物改変を欠く抗体と比べて、抗体仲介エフェクター機能を増強する。変更された抗体仲介エフェクター機能をもたらす炭水化物改変は、当該分野において周知である（シールズ  Ｒ．Ｌ．（Ｓｈｉｅｌｄｓ  Ｒ．Ｌ．）ら、２００１，１０Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（３０）：２６７３３−４０、デイビス  Ｊ．（Ｄａｖｉｅｓ  Ｊ．）ら、２００１年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７４（４）：２８８−２９４を参照のこと）。
【０１６３】
変更された炭水化物改変は、本発明の抗体のＦｃγＲ受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ）への結合を増強する。本発明の方法に従って炭水化物改変を変更することは、例えば、抗体の炭水化物含有量を増加することまたは抗体の炭水化物含有量を減少することを含む。炭水化物含有量を変更する方法は、当業者に公知であり、例えば、ウォリック（Ｗａｌｌｉｃｋ）ら、１９８８年，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６８（３）：１０９９−１１０９、タオ（Ｔａｏ）ら、１９８９年Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１４３（８）：２５９５−２６０１、ラウトレッジ（Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ）ら、１９９５年、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，６０（８）：８４７−５３、エリオット（Ｅｌｌｉｏｔｔ）ら２００３年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２１：４１４−２１、シールズ（Ｓｈｉｅｌｄｓ）ら、２００２年Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７７（３０）：２６７３３−４０を参照のこと、すべてにおいてそれらの全体が参照により本明細書に援用される。本発明のいくつかの態様では、１つもしくはそれ以上の炭水化物部分が抗体に共有結合されるように、１つもしくはそれ以上のグリコシル化部位を含んでなる抗体が提供される。他の実施形態では、本発明は、上掲において開示されたものおよび当業者に公知のもののようなＦｃ領域において１つもしくはそれ以上のグリコシル化部位および１つもしくはそれ以上の改変を含んでなる抗体を包含する。好適な実施形態では、Ｆｃ領域における１つもしくはそれ以上の改変は、野生型Ｆｃ領域を含んでなる抗体と比べて、ＦｃγＲ、例えば、ＦｃγＩＩＩＡを活性するための抗体の親和性を増強する。Ｆｃ領域において１つもしくはそれ以上のグリコシル化部位および／または１つもしくはそれ以上の改変を伴う本発明の抗体は、増強された抗体仲介エフェクター機能、例えば、増強されたＡＤＣＣ活性またはＮＫ活性化活性を有する。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、本発明は、２４１、２４３、２４４、２４５、２４５、２４９、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６５、２９６、２９９、および３０１位のアミノ酸を含むがこれらに限定されない、抗体の炭水化物部分と相互作用することが直接的または間接的に公知であるアミノ酸の１つもしくはそれ以上の改変を含んでなる抗体をさらに含んでなる。抗体の炭水化物部分と直接的または間接的に相互作用するアミノ酸は、当該分野において公知であり、例えば、ジェフリーズ（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ）ら、１９９５年Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，４４：１１１−７（本明細書においてその全体が参照により援用される）を参照のこと。
【０１６５】
好ましくは、抗体の機能性、例えば、ＦｃγＲＩＩＩに対する結合活性を変更することを伴わずに、１つもしくはそれ以上のグリコシル化部位を抗体の１つもしくはそれ以上の部位に導入することによって改変されている抗体もまた、主題発明の実践において使用することができる。グリコシル化部位は、本発明の抗体の可変および／または定常領域に導入してもよい。本明細書において使用されるように、「グリコシル化部位」は、オリゴ糖（即ち、共に連結された２つもしくはそれ以上の簡単な糖を含有する炭水化物）が特異的および共有結合する抗体において任意の特定のアミノ酸配列を含む。オリゴ糖側鎖は、典型的に、Ｎ−またはＯ−結合のいずれか一方を介して、抗体の骨格に連結される。Ｎ−結合型グリコシル化は、アスパラギン残基の側鎖へのオリゴ糖部分の付着を指す。Ｏ−型結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、例えば、セリン、スレオニンへのオリゴ糖部分の付着を指す。本発明の抗体は、Ｎ−結合型およびＯ−結合型グリコシル化部位を含む１つもしくはそれ以上のグリコシル化部位を含んでなり得る。当該分野において公知のＮ−結合型またはＯ−結合型グリコシル化の任意のグリコシル化部位は、本発明に従って使用することができる。本発明の方法に従って有用である例示的Ｎ−結合型グリコシル化部位は、アミノ酸配列：Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ［式中、Ｘは任意のアミノ酸であってもよく、Ｔｈｒ／Ｓｅｒはスレオニンまたはセリンを示す］である。そのような部位（単数または複数）は、本発明が関する当該分野において周知の方法を使用して、本発明の抗体に導入してもよい。例えば、「Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ：Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ、Ｊ．Ｄ．ワトソン（Ｊ．Ｄ．Ｗａｔｓｏｎ）ら、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ニューヨーク、１９８３年、第８章、１０６−１１６頁、（本明細書においてその全体が参照により援用される）を参照のこと。
【０１６６】
グリコシル化部位を本発明の抗体に導入するための例示的方法は、所望されるＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ配列が得られるように、抗体のアミノ酸配列を改変または変異することを含んでなり得る。いくつかの実施形態では、本発明は、グリコシル化部位を付加または欠失することによって、本発明の抗体の炭水化物含有量を改変する方法を包含する。抗体の炭水化物含有量を改変する方法は当該分野において周知であり、本発明内に包含され、例えば、米国特許第６，２１８，１４９号明細書、ＥＰ０３５９０９６Ｂ１号明細書、米国特許公開第２００２１００２８４８６号明細書、国際公開第０３／０３５８３５号パンフレット、米国特許公開第２００３／０１１５６１４号明細書、米国特許第６，２１８，１４９号明細書、米国特許第６，４７２，５１１号明細書を参照のこと、すべてにおいてそれらの全体が参照により本明細書に援用される。他の実施形態では、本発明は、抗体の１つもしくはそれ以上の内因性炭水化物部分を欠失することによって、本発明の抗体の炭水化物含有量を改変する方法を包含する。
【０１６７】
本発明は、本発明の抗体のエフェクター機能を改変する方法をさらに包含し、ここで、方法は、本明細書において開示されるまたは当該分野において公知の方法を使用して、抗体の炭水化物含有量を改変することを含んでなる。例えば、部位特異的変異誘発およびアミノ酸置換を生じるＰＣＲ仲介変異誘発を含む当業者に公知の標準的な技術を使用して、抗体、またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列に変異を導入することができる。好ましくは、誘導体は、本来の抗体またはそのフラグメントと比べて、１５アミノ酸置換未満、１０アミノ酸置換未満、５アミノ酸置換未満、４アミノ酸置換未満、３アミノ酸置換未満、または２アミノ酸置換未満を含む。好適な実施形態では、誘導体は、１つもしくはそれ以上の推定された非必須アミノ酸残基で作製される保存的アミノ酸置換を有する。本発明はまた、本明細書において考察される抗Ｉｇ４−Ｂ７−Ｈ３抗体の可変重鎖および／または軽鎖のアミノ酸配列に少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％同一である可変重鎖および／または可変軽鎖のアミノ酸配列を含んでなる抗体あるいはそのフラグメントを包含する。好適な別の実施形態では、本発明は、同じＦｃγＲに特異的に結合する関連しない抗体またはそのフラグメントよりも大きい親和性でＦｃγＲ（例えば、ＮＫ細胞において見出されるＦｃγＲ）に特異的に結合する「変更された抗体」またはそのフラグメントを提供する。
【０１６８】
４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチド、擬似物およびインヒビター
本発明はまた、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドならびにその改変体および誘導体を使用する方法を提供する。そのようなポリペプチドは、例えば、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３リガンドを同定するため、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３リガンドを発現する細胞（例えば、ＮＫ細胞）を同定するため、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒおよび／またはＮＫ細胞あるいはより一般的には、免疫細胞またはＴリンパ球活性をモジュレート（刺激または阻害）するために使用してもよい。
【０１６９】
１つの態様では、本発明は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３キメラまたは融合タンパク質を提供する。本明細書において使用されるように、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドに作動可能に連結される、好ましくは、インフレームで融合される４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドを含んでなる。好適な実施形態では、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３融合タンパク質は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の少なくとも１つの生物学的に活性なドメインを含んでなる（図８を参照のこと）。別の好適な実施形態では、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３融合タンパク質は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の少なくとも２つの生物学的に活性なドメインを含んでなる。例えば、１つの実施形態では、融合タンパク質は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３配列がＧＳＴ配列のＣ末端に融合されるＧＳＴ−４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３融合タンパク質である。そのような融合タンパク質は、組換え４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３の精製を容易にすることができる。別の実施形態では、融合タンパク質は、例えば、所定の宿主細胞における所望される細胞局在を可能にするためのように、そのＮ末端に異種シグナル配列を含有する４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質である。本発明の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３−融合タンパク質は、例えば、被験体において抗４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３抗体を産生させるための免疫原として、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３リガンドを精製するために、ＮＫ細胞活性をモジュレートするために、およびスクリーニングアッセイにおいて、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３と４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３受容体との相互作用を阻害する分子を同定するために、使用することができる。
【０１７０】
好適な実施例では、融合タンパク質は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質、好ましくは、免疫グロブリンタンパク質のＦｃ部分に融合された少なくとも１つのアミノ酸欠失、置換または挿入を有する４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質を包含する。抗体は、２つの機能的に独立した部分、抗原に結合する「Ｆａｂ」として公知である可変ドメイン、および補体または食細胞のようなエフェクター機能への連結を提供する「Ｆｃ」として公知の定常ドメインを含んでなる。免疫グロブリンのＦｃ部分は、長期の血漿中半減期を有する一方、Ｆａｂは短命である（ケイポン（Ｃａｐｏｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ３３７：５２５−５３１（１９８９年））。好ましくは、Ｆｃ部分は４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質のＣ末端に融合されるが、Ｎ末端にも融合され得る。Ｆｃ−融合タンパク質およびそれらを作製する方法については、本実施例、ならびにＰＣＴ公報国際公開第０３／１０４２８２号パンフレット、国際公開第０３／０６８９７７号パンフレット、国際公開第００／６９９１３号パンフレット、および国際公開第９８／２８４２７号パンフレットおよび米国特許公開第２００４００６７５２０Ａ１号明細書に記載されている。治療用タンパク質産物は、より長期の半減期を提供するため、またはＦｃ受容体結合性、タンパク質Ａ結合性、補体固定化および胎盤通過（すべて免疫グロブリンのＦｃタンパク質に存在する）のような機能を組み入れるために、Ｆｃドメインを使用して構築されている。例えば、ＩｇＧ１抗体のＦｃ領域は、ＣＤ３０−ＬのＮ末端に融合されている（米国特許第５，４８０，９８１）。サイトカインの短い循環半減期を増加するために、ＩＬ−１０、抗炎症性および抗拒絶剤が、マウスＦｃｙ２ａに融合されている（チェン，Ｘ．（Ｚｈｅｎｇ，Ｘ．）ら、ＴｈｅＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５４：５５９０−５６００（１９９５年））。また、研究により、敗血症性ショックを伴う患者を処置するためにヒトＩｇＧｌのＦｃタンパク質に連結された腫瘍壊死因子受容体の使用が評価されている（フィッシャー，Ｃ．（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃ．）ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３４：１６９７−１７０２（１９９６年）、およびバンジー，Ｋ．（Ｖａｎ  Ｚｅｅ，Ｋ．）ら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５６：２２２１−２２３０（１９９６年））。Ｆｃもまた、ＡＩＤＳの処置のための治療用タンパク質を産生させるために、ＣＤ４受容体に融合されている。（ケイポン（Ｃａｐｏｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ，３３７：５２５−５３１（１９８９年））。さらに、インターロイキン２のＮ末端もまた、インターロイキン２の短い半減期およびその全身毒性を克服するために、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３のＦｃ部分に融合されている（ハービル（Ｈａｒｖｉｌｌ）ら、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１：９５−１０５（１９９５年））。上記の参考文献のそれぞれの開示内容は、Ｆｃ融合タンパク質を作製および使用する方法について、本明細書において参照により援用されている。
【０１７１】
本発明はまた、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３擬似物またはＮＫ細胞活性のインヒビターのいずれか一方として機能する４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の改変体の使用に関する。４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の生物学的に活性なタンパク質は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質のアミノ酸配列に十分に相同であるかまたは該アミノ酸から誘導されるアミノ酸配列、例えば、配列番号２または完全長の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質よりも短いアミノ酸を含み、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の少なくとも１つ活性を示すスタインバーグ（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら、（２００４年）、上掲において示されるアミノ酸配列を含んでなるペプチドを含む。好ましくは、前記活性は、ＮＫ細胞の活性を増強することを含んでなる。典型的に生物学的に活性なタンパク質は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の少なくとも１つの活性を伴うドメインまたはモチーフ、好ましくは、図８に示されるドメイン由来の少なくとも１つのドメインを含んでなる。４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の生物学的に活性なタンパク質は、例えば、少なくとも１５、２５、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０もしくは３００、４００もしくは５００アミノ酸長であるポリペプチドであり得る。好ましくは、活性な４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドは、四量体の形態であるか、または４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３四量体を形成することが可能である。
【０１７２】
好適な実施形態では、本発明は、ＮＫ細胞活性を阻害することが可能であり、および／または４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３受容体に結合することが可能である４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質を提供する。好ましくは、そのような４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含んでなるか、それから本質的になるか、またはそれからなる。本発明はまた、配列番号１またはスタインバーグ（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ）ら（２００４年）における図３に示されるヌクレオチド配列、その相補配列もしくはさらにフラグメントによってコードされるポリペプチドに関する。本発明は、配列番号２の配列の少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、より好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００もしくは５００アミノ酸の連続スパンを含んでなる単離された、精製された、および組換え４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質を包含する。他の好適な実施形態では、アミノ酸の連続ストレッチは、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質配列におけるアミノ酸の欠失、付加、スワップまたは縮重を含む変異または機能的変異の部位を含んでなる。場合により、完全長４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の前記部分は、可溶性４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質である。１つの例では、完全長４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の部分は：ＩｇＶ１、ＩｇＣ１、ＩｇＶ２およびＩｇＣ２からなるドメインから選択される１つもしくはそれ以上のドメインを含んでなる。好ましくは、完全長４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の前記部分は、すべての４つのＩｇＶ１、ＩｇＣ１、ＩｇＶ２およびＩｇＣ２メインのうちの２つ、３つを含んでなる。場合により、完全長４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の前記部分は、Ｌドメインをさらに含んでなる。１つの態様では、完全長４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の前記部分は、ＴＭドメイン含まず、および／またはＣＴドメインを含まない。生来の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質のドメインおよびそれに対応するアミノ酸位置を図８に提供する。
【０１７３】
他の好適な実施形態では、ＮＫ細胞活性を増強することが可能な４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質は、少なくとも１、２、３、５、１０もしくは２０アミノ酸置換を含んでなる４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドである。好ましくは、前記ポリペプチドは、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒタンパク質に結合し、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒタンパク質のＮＫ阻害活性を阻止することが可能である。別の実施形態では、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ活性を阻止し、ＮＫ細胞活性を増強することが可能な４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質は、配列番号２の配列の少なくとも６アミノ酸、好ましくは、少なくとも８〜１０アミノ酸、より好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００もしくは５００アミノ酸の連続スパンを含んでなる全長４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の部分であり、場合により、全長４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の前記部分は、可溶性４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質である。１つの例では、完全長４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の部分は：ＩｇＶ１、ＩｇＣ１、ＩｇＶ２およびＩｇＣ２からなるドメインから選択される１つもしくはそれ以上のドメインを含んでなる。好ましくは、完全長４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の前記部分は、すべての４つのＩｇＶ１、ＩｇＣ１、ＩｇＶ２およびＩｇＣ２メインのうちの２つ、３つを含んでなる。場合により、完全長４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の前記部分は、Ｌドメインをさらに含んでなる。１つの態様では、完全長４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の前記部分は、ＴＭドメイン含まず、および／またはＣＴドメインを含まない。生来の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質のドメインおよびそれに対応するアミノ酸位置を図８に提供する。
【０１７４】
ＮＫ細胞を増強することが可能な４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質は、好ましくは、ＮＫ細胞に結合するが、ＮＫ細胞の活性化または細胞障害性を阻害しない組成物である。さらに、前記４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質は、好ましくは、配列番号２の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドと比較して、少なくとも１つのアミノ酸挿入、欠失または置換を含んでなる４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドを含んでなる組成物である。好ましくは、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドを含んでなる組成物は、可溶性ポリペプチドである。好ましくは、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドは、免疫グロブリン重鎖タンパク質のＦｃ部分に融合される。
【０１７５】
他の態様では、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３インヒビターポリペプチド（例えば、ＮＫ細胞増強ポリペプチド）は、四量体形態ではなく、または好ましくは、改変（例えば、１つもしくはそれ以上のアミノ酸置換またはアミノ酸欠失）を含んでなるか、または野生型４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質のフラグメントを含んでなり、生理学的条件下で４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３四量体形成し得ない。
【０１７６】
他の実施形態では、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質は、実質的に配列番号２の配列に相同であり、配列番号２のタンパク質の機能的活性を保持し、なお、天然の対立遺伝子のばらつきまたは変異のためアミノ酸配列が異なる。従って、別の実施形態では、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列に少なくとも約６０％相同なアミノ酸配列を含んでなり、配列番号２の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の機能的活性を保持するタンパク質である。好ましくは、タンパク質は、配列番号２のタンパク質またはそのフラグメントに少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくは９９．８％相同である。
【０１７７】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸の相同性パーセントを決定するために、配列を、至適比較Ｐｕｒｐｏｓｅｓに対し整列させる（例えば、第２のアミノまたは核酸配列との至適アラインメントに対する第１のアミノ酸または核酸配列の配列にギャップを導入されることができ、比較目的のために非相同配列を無視することができる）。好適な実施形態では、比較目的のために整列される参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％もしくは９５％である（例えば、５３４アミノ酸残基を有する配列番号２の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３アミノ酸配列に対して第２の配列を整列させる場合、少なくとも１００、好ましくは少なくとも２００、より好ましくは少なくとも２５０、さらにより好ましくは５００アミノ酸残基が整列され、あるいは配列番号２の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３核酸配列に対して第２の配列を整列させる場合、好ましくは、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質のアミノ酸をコードする３４１９または３４５２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも１００、好ましくは少なくとも２００、より好ましくは少なくとも３００、さらにより好ましくは少なくとも４００、およびさらにより好ましくは少なくとも５００、６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、もしくは１０００ヌクレオチド超を含んでなる、から本質的になる、またはからなるヒト４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３配列を整列させる）。
【０１７８】
次いで、アミノ酸位置またはヌクレオチド位置に対応するアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを比較する。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有される場合、分子は、該位置で相同である（即ち、本明細書において使用されるアミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」に等価である）。２つの配列間の相同性パーセントは、配列によって共有される理想的な位置の数の関数である（即ち、相同性％＝理想的な位置の数（＃）／位置の総数（＃）１００）。
【０１７９】
配列の比較および２つの配列間の相同パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの好適な非限定的例は、カーリン（Ｋａｒｌｉｎ）およびアルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）（１９９３年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３において改変されたカーリン（Ｋａｒｌｉｎ）およびアルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）（１９９０年）Ｐｒｏｃ．ＮａｔＩ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：２２６４−６８のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み入れられる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１，００で実施することができ、配列の比較のために利用される数学的アルゴリズムの非限定的例は、マイヤーズ（Ｍｙｅｒｓ）およびミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）、ＣＡＢＩＯＳ（１９８９年）のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの部分であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み入れられる。アミノ酸配列を比較するためのＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み残基表、１２のギャップ長ペナルティ、および４のギャップペナルティを使用することができる。
【０１８０】
４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の改変体は、変異誘発、例えば、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の個別の点変異誘発または縮重によって作製することができる。４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３アゴニストタンパク質は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の天然に存在する形態と実質的に同じ生物学的活性か、またはその部分集合を保持することができる。４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３アンタゴニストタンパク質は、例えば、ＮＫ細胞上の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３受容体に対する天然に存在する４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の結合を競合的に阻害することによって、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の天然に存在する形態の１つもしくはそれ以上の活性を阻害することができる。従って、制限された機能の改変体による処置によって、特定の生物学的効果を誘発することができる。１つの実施形態では、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３アゴニスト（擬似物）または４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３アンタゴニストのいずれかとして機能する４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の改変体は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質アゴニストまたはアゴニスト活性に対する４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の変異体、例えば、縮重変異体のコンビナトリアルラボラトリーをスクリーニングすることによって同定することができる。１つの実施形態では、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３改変体の多様なライブラリーが、核酸レベルでのコンビナトリアル変異誘発によって作製され、多様な遺伝子ライブラリーによってコードされる。潜在的４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３配列の縮重の組が、個々のポリペプチドとして、あるいは、その中に４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３配列の組を含有する（例えば、ファージディスプレイのための）より大きな融合タンパク質の組として発現可能であるように、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的に連結することによって、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３改変体の多様なライブラリーを生成することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３改変体のライブラリーを生成するために使用することができる様々な方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡ合成機において実施することができ、次いで、合成遺伝子は、適切な発現ベクターに連結される。遺伝子の縮重の組の使用は、１つの混合物において、潜在的４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３配列の所望される組をコードするすべての配列の供給を可能にする。
【０１８１】
さらに、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質コーディング配列のフラグメントのライブラリーを使用して、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の改変体のスクリーニングおよび以後の選択のための多様な集団の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３フラグメントを作製することができる。１つの実施形態では、１分子あたり約１回のみニックが入る条件下で、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３コーディング配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントをヌクレアーゼで処置し、二本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを再生して、異なるニックが入った産物からセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成させ、ＳＩヌクレアーゼに処置によって再形成された二重鎖から一本鎖部分を取り出し、得られるフラグメントライブラリーを発現ベクターに連結することによって、コーディング配列フラグメントのライブラリーを作製することができる。この方法によって、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の多様なサイズのＮ末端、Ｃ末端および内部フラグメントをコードする発現ライブラリーを誘導することができる。
【０１８２】
点変異誘発または縮重によって作製されるコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングし、選択された特性を有する遺伝子産物のためのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのいくらかの技術が当該分野において公知である。そのような技術は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質のコンビナトリアル変異によって作製される遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適応される。ハイスループット分析に従う大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための最も広範に使用される技術は、典型的に、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングすること、ベクターの得られるライブラリーで適切な細胞を形質転換すること、および所望される活性の検出により産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離が容易になる条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現させることを含む。
【０１８３】
ＮＫ細胞上のリガンドを同定するための４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３の使用
４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質が４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３リガンド、特に、ＮＫ細胞上に見出される４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３受容体に結合するかまたは相互作用する能力を決定することは、任意の適切な方法、例えば、候補リガンドへの結合を決定するための方法によって、達成することができる。例えば、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質またはその生物学的に活性なタンパク質を候補リガンドに接触させ、候補リガンドが４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質またはその生物学的に活性なタンパク質に結合する能力を決定するアッセイを使用することができる。候補リガンドの４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質への結合は、直接的または間接的のいずれかで決定することができる。直接結合は、ＢＩＡに基づくプロトコルを介して評価することができる。
【０１８４】
１つの例では、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３リガンドを単離するための免疫沈降方法において４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質を使用することができる。任意の適切な方法を使用することができ、アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら（編）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９４年、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＵＳＡ（その開示内容は、本明細書において参照により援用される）を参照のこと。４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３を固定化して、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３またはそのリガンドの非複合形態から複合形態の分離を容易にすること、ならびにアッセイの自動化を適応することも所望され得る。候補リガンドの４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質への結合は、反応物を含有するのに適切な任意の容器において達成され得る。そのような容器の例として、マイクロタイタープレート、試験管、およびマイクロ遠心管が挙げられる。１つの実施形態では、タンパク質の一方または両方がマトリックスに結合することを可能にするドメインを付加する融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３融合タンパク質またはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）またはグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着させることができ、混合物は、複合体形成を援助する条件下（例えば、塩およびｐＨの生理学的条件で）でインキュベートされる。インキュベーション後、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄して、任意の非結合成分（ビーズの場合は固定化されたマトリックス）を取り出し、例えば、上記のように、複合体を直接的または間接的のいずれかで決定する。あるいは、複合体をマトリックスから解離させることができ、標準的な方法を使用して、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３のレベルが決定される。４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３リガンドの単離後、リガンドを消化することができ（例えば、トリプシンフラグメント）、末端アミノ酸配列を決定することができる。
【０１８５】
マトリックス上にタンパク質を固定化するための技術を本発明のアッセイにおいて使用し、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３および候補リガンドの結合を妨害する化合物を同定することができる。例えば、ビオチンおよびストレプトアビジンのコンジュゲーションを利用して、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質または候補リガンドのいずれか一方を固定化することができる。当該分野において周知の技術（例えば、ビオチン化Ｉｄｔ，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｅｌ．）を使用して、ビオチン−Ｎ−ＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）からビオチン化４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質または候補リガンドを調製し、ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェルに固定化することができる。あるいは、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質または候補リガンドに反応性であるが、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質のその標的分子への結合を妨害しない抗体をプレートのウェルに誘導体化して、抗体コンジュゲーションによって非結合型候補リガンドまたは４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質をウェルに捕捉することができる。これは、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３結合性を妨害する能力について試験しようとする化合物の存在または非存在下で行うことができる。タンパク質複合体を検出するための方法としては、ＧＳＴ固定化複合体についての上記の方法に加えて、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質または候補リガンドに反応性である抗体を使用する複合体の免疫検出、ならびに４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質または候補リガンドに関連する酵素活性の検出に依存する酵素結合アッセイが挙げられる。
【０１８６】
方法は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質の可溶性および／または膜結合型の両方の使用に従う。４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３の膜結合型が使用される場合、単離されたタンパク質の膜結合型が溶液に維持されるように、可溶化剤を利用することが所望され得る。そのような可溶化剤の例として、非イオン性界面活性剤、例えば、ｎオクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド（ｄｏｄｅｃｙｍａｌｔｏｓｉｄｅ）、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイルＮ−メチルグルカミド、ＴｒｉｔｏｎＴＭ  Ｘ−１００、ＴｒｉｔｏｎＴｍ  Ｘ−１１４、ＴｈｅｓｉｔＴｍ、イソトリデシルポリ（Ｉｓｏｔｒｉｄｅｃｙｐｏｌｙ）（エチレングリコールエーテル）ｎ、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアミニオ］−Ｉ−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３コラミドプロピル）ジメチルアミニオール（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｉｎｉｏｌ）ヒドロキシ−ｌ−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）、またはＮｄｏｄｅｃｙｌ＝Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニオ−ｌ−プロパンスルホネートが挙げられる。
【０１８７】
処置方法のための化合物の投与
本方法を使用して生成される化合物は、広範な障害の処置において使用することができる。４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒとそのリガンド（例えば、抗４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３および抗４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ抗体）との相互作用を阻止する化合物は、一般的な様式でＮＫ細胞活性を増強し得、従って、ＮＫ細胞がポジティブな効果を有することができる癌、自己免疫障害、感染性疾患を含むがこれらに限定されない任意の障害の処置に有用であり得る。
【０１８８】
４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３発現細胞の死滅を誘導する化合物は、増殖性障害、具体的には、腫瘍、炎症性および免疫増殖性障害、最も詳細には、神経芽細胞腫、癌腫およびメラノーマを処置するのに特に効果的である。４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３に結合し、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３とそのリガンドとの相互作用を阻止するが、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３発現細胞を直接枯渇しない化合物（例えば、所定のＩｇＧ４ｍＡｂｓ、または抗体フラグメントのような非枯渇性抗４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３抗体）もまた、増殖性障害、具体的には、腫瘍、炎症性および免疫増殖性障害、最も詳細には、神経芽細胞腫、癌腫およびメラノーマを処置するのに有効に使用することができることが理解され、そのような抗体は、ＮＫ細胞の標的細胞仲介阻害を取り出すことができ、従って、標的（例えば、腫瘍）細胞がＮＫ仲介死滅に暴露される。
【０１８９】
場合により、本治療方法は、患者における細胞（例えば、典型的に、増殖性細胞、腫瘍細胞など）上の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３発現が評価されるタイプ分類工程を含んでなり得る。一般に、この工程では、細胞のサンプルが患者から採取され、例えば、イムノアッセイを使用して、細胞における４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３の相対的重要性を決定するために試験される。増殖性または腫瘍細胞はこの方法に好適である一方、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３を発現することが疑わしいかまたは既知である任意の細胞型を使用することができることが理解されよう。理想的には、この工程は、直接的または間接的のいずれかで標識され、共に、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質を認識する１つもしくはそれ以上の抗体を含有するキットを使用して、実施される。４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３タンパク質が細胞上で検出される場合、過剰増殖性細胞が特異的に標的化されるように、抗４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３抗体を投与することができる。
【０１９０】
上記の免疫学的アッセイに加えて、患者から採取される細胞における４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３の同一性および相対的発現レベルを決定するための他の方法を使用することもできる。例えば、ＲＮＡに基づく方法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロッティングを使用して、患者から採取される細胞における多様なＮＫ細胞受容体の相対的転写レベルを調べることができる。多くの場合、単一または少数の受容体特異的転写物が優位であり、転写物によってコードされる特定の受容体に特異的な細胞障害性抗体を使用する患者の処置を可能にする。
【０１９１】
１つの実施形態では、本発明は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３に対する少なくとも１つの診断用抗体、さらに、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３または４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒに対する少なくとも１つの治療用抗体を含んでなる本発明に従って生成されるキットを提供する。
【０１９２】
本発明のキットは、任意の数の診断用および／または治療用抗体、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくは他の任意の数の診断用および／または治療用抗体を含有し得る。そのようなキットでは、診断用抗体は、しばしば、直接的または間接的のいずれか（例えば、第二抗体を使用して）標識される。治療用抗体を改変しない、即ち、任意の連結された細胞障害性または他の部分を伴わずに、標的細胞を不活化するか、細胞死を誘発するか、もしくは免疫系による破壊のために標的細胞を遮蔽することによってＮＫ細胞活性を増強するように、例えば、単純に標的細胞に結合し、それによってリガンド−受容体相互作用を阻止することによって作用することもあり得る。他の実施形態では、治療用抗体は、１つもしくはそれ以上の細胞障害性部分に連結される。キットの内容物のこのような説明は、いかなる方法においても限定されないことが理解されよう。例えば、治療用抗体では、キットは、改変されていないかまたは細胞障害性抗体の任意の組み合わせを含有することができる。さらに、キットは、化学療法または抗増殖剤のような他のタイプの治療化合物も含有し得る。好ましくは、キットはまた、例えば、患者におけるＮＫ受容体状態をタイプ分類し、従って治療用抗体を投与するための本明細書に記載の方法を詳述する抗体を使用するための指示書を含む。
【０１９３】
さらに、処置は、複数ラウンド（ｒｏｕｎｄ）の治療用（例えば、細胞障害性）抗体の投与に関与し得る。例えば、最初のラウンドの抗体投与後、患者における細胞（例えば、腫瘍または増殖性細胞）の全体数を再測定することができ、なお上昇しているのであれば、さらなるラウンドの４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３状態タイプ分類を実施することができ、続いて、さらなるラウンドの治療用抗体投与が行われる。このさらなるラウンドの投与において投与される抗体は、必ずしも、最初のラウンドで使用される抗体と同一である必要はないことが理解されよう。
【０１９４】
本発明は、ＮＫ細胞活性を、それを要する患者において増強する方法であって、前記患者に本発明の組成物を投与する工程を含んでなる、上記方法を提供する。本発明は、より具体的には、ＮＫ細胞活性の増加が有益であるか、ＮＫ細胞による溶解に感受性である細胞に関与するか、影響を及ぼすか、もしくは該細胞によって生じるか、あるいは癌、別の増殖性障害、感染性疾患もしくは免疫障害のような不十分なＮＫ細胞活性によって生じるかまたは特徴付けられる疾患を有する患者においてＮＫ細胞活性を増加させることに関する。より具体的具多的には、本発明の方法は、膀胱、乳、直腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、前立腺、膵臓、胃、頚部、甲状腺および扁平上皮癌を含む皮膚の癌種を含む癌腫、白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞リンパ腫およびバーキットリンパ腫を含むリンパ球系統の造血器腫瘍、急性および慢性骨髄性白血病および前骨髄球性白血病を含む骨髄系統の造血器腫瘍、線維肉腫および横紋筋肉腫を含む間葉起源の腫瘍、黒色腫、精上皮腫、奇形癌種、神経芽細胞腫および神経膠腫を含む他の腫瘍、星細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、および神経鞘腫を含む中枢および末梢神経系の腫瘍、線維肉腫、横紋筋肉腫（ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓｃａｒｏｍａ）、および骨肉腫を含む間葉起源の腫瘍、ならびに黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、精上皮腫、甲状腺濾胞癌および奇形癌種を含む他の腫瘍を含むがこれらに限定されない様々な癌ならびに他の増殖性疾患の処置のために利用される。本発明に従って処置することができる好適な障害は、リンパ球系統の造血器腫瘍、例えば、小細胞および大脳様細胞型を含むＴ細胞性前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）のようなＴ細胞障害を含むが、これらに限定されないＴ細胞ならびにＢ細胞腫瘍、好ましくはＴ細胞型の大顆粒リンパ球白血病（ＬＧＬ）、セザリー症候群（ＳＳ）、成人Ｔ細胞白血病リンパ腫（ＡＴＬＬ）、ａ／ｄＴ−ＮＨＬ肝脾リンパ腫、末梢性／胸腺後段階Ｔ細胞リンパ腫（多形性もしくは免疫芽球性サブタイプ）、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、血管中心性（鼻部）Ｔ細胞リンパ腫、未分化（Ｋｉ１＋）大細胞型リンパ腫、腸Ｔ細胞リンパ腫、Ｔリンパ芽球性、およびリンパ腫／白血病（Ｔ−Ｌｂｌｙ／Ｔ−ＡＬＬ）を含む。
【０１９５】
例えば、過形成、線維症（具体的には、肺、但し、腎線維症のような他のタイプの線維症も含む）、血管新生、乾癬、動脈硬化および狭窄または血管形成術後の再狭窄のような血管における平滑筋増殖を含む他の増殖性障害もまた、本発明に従って処置することが可能である。本発明の化合物および方法を使用して、好ましくは、ウイルス、細菌、原生動物、糸状菌もしくは真菌によって生じる任意の感染症を含む感染性疾患を処置または防止することができる。化合物は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ポリペプチドを発現する細胞に関与する任意の障害を処置または予防するためにさらに使用することができる。
【０１９６】
医薬組成物
本発明はまた、組成物、例えば、任意の適切なビヒクルにおいて、ＮＫ細胞活性の増強、疾患の処置、あるいは患者において４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３を発現する細胞の増殖もしくは活性を阻害するか、または該細胞を死滅させるのに有効な量で、そのフラグメントおよび誘導体を含む本抗体のいずれかを含んでなる医薬組成物を提供する。組成物は、一般に、薬学的に許容可能なキャリアをさらに含んでなる。抗体および組成物を患者に投与する本方法はまた、動物を試験するか、またはヒト疾患の動物モデルにおける本明細書に記載の方法または組成物のいずれかの有効性を試験するために使用することができることが理解されよう。
【０１９７】
これらの組成物に使用され得る薬学的に許容可能なキャリアとして、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えば、リン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩、または電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイダルシリカ、ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースに基づく物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、蝋、ポリエチレン−ポリオキシプロピレン−ブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９８】
本発明の組成物は、経口的、非経口的、吸入スプレーにより、局所的、直腸内、経鼻的、頬側的、膣内にまたはインプラントされたリザーバを介して投与することができる。本明細書で使用する「非経口」は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内および頭蓋内注入または輸注技術を含む。好ましくは、組成物は、経口的、腹腔内または静脈内に投与される。
【０１９９】
本発明の無菌注入可能な形態は、水性または油性懸濁液であり得る。これらの懸濁液は、適切な分散または湿潤剤および懸濁剤を使用して、当該分野において公知の技術に従って処方することができる。無菌注入可能な調製物はまた、非毒性の非経口的な許容可能な希釈剤もしくは溶媒における無菌注入可能な溶液または懸濁液（例えば、１，３−ブタンジオール溶液として）であってもよい。なかでも、用いられ得る許容可能なビヒクルおよび溶媒は、水、リンゲル溶液および等張性塩化ナトリウム溶液である。さらに、無菌の不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として従来的に用いられる。この目的のために、合成モノ−またはジグリセリドを含む任意の低刺激不揮発性油を用いることができる。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体のような脂肪酸は、注入可能物の調製に有用であり、それらは、特に、ポリオキシエチレンバージョン（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌａｔｅｄ  ｖｅｒｓｉｏｎ）のオリーブ油またはヒマシ油のような天然の薬学的に許容可能な油である。これらの油溶液または懸濁液はまた、エマルジョンおよび懸濁液を含む薬学的許容可能な剤形の処方において一般に使用される長鎖アルコール希釈液または分散剤、例えば、カルボキシメチルセルロースまたは類似の分散剤を含有してもよい。薬学的に許容可能な固体、液体、または他の剤形の製造に一般に使用される他の一般に使用される界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ、Ｓｐａｎおよび他の乳化剤またはバイオアベイラビリティーの増強剤もまた、処方の目的のために使用することができる。
【０２００】
本発明の組成物は、カプセル、錠剤、水性懸濁液または溶液を含むがこれらに限定されない任意の経口的な許容可能な剤形で経口的に投与することができる。経口使用のための錠剤の場合、一般に使用されるキャリアとして、乳糖およびトウモロコシデンプンが挙げられる。ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤もまた、典型的に添加される。カプセル形態の経口投与のための有用な希釈剤として、乳糖および乾燥トウモロコシデンプンが挙げられる。経口用途に水性懸濁液が必要な場合、有効成分は乳化および懸濁剤と組み合わせられる。所望であれば、所定の甘味、風味付け、または着色剤もまた添加することができる。
【０２０１】
あるいは、本発明の組成物は、直腸内投与のための坐剤の形態で投与することもできる。これらは、薬剤と、室温では固体であるが直腸温度では液体であり、従って、直腸内では融解して薬物を放出する適切な非刺激性賦形剤とを混合することによって調製することができる。そのような材料として、ココアバター、蜜蝋およびポリエチレングリコールが挙げられる。本発明の処方物はまた、局所に、眼に、経鼻エアゾルまたは吸入によって投与してもよい。そのような組成物は、薬学的処方の分野において周知の技術に従って調製される。
【０２０２】
１つの実施形態では、本発明の抗体は、単独かまたは患者または動物に対して標的化された送達のための別の物質と共に、リポソーム（「免疫リポソーム」）に組み入れられ得る。そのような他の物質は、遺伝子治療のための遺伝子の送達またはＮＫ細胞における遺伝子を抑制するためのアンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉもしくはｓｉＲＮＡの送達ための核酸、あるいは他の手段を介するＮＫ細胞の活性化のための毒素または薬物、あるいはＮＫ細胞の活性化または腫瘍もしくは感染細胞の標的化に有用であり得る本明細書に記載の他の任意の薬剤を含む。
【０２０３】
別の実施形態では、本発明の抗体は、バイオアベイラビリティー、インビボでの半減期などを改善するために改変することができる。例えば、任意の数の形態のポリエチレングリコールおよび当該分野において公知の付着の方法（例えば、リー（Ｌｅｅ）ら（２００３年）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．１４（３）：５４６−５３、ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）ら（２００３年）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２（３）：２１４−２１、デケルト（Ｄｅｃｋｅｒｔ）ら（２０００年）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．８７（３）：３８２−９０を参照のこと）を使用して、抗体をペグ化することができる。
【０２０４】
いくつかのモノクローナル抗体は、Ｒｉｔｕｘａｎ（リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ））、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（トラツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ））またはＸｏｌａｉｒ（オマリズマブ（Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ））、Ｂｅｘｘａｒ（トシツモマブ）、Ｃａｍｐａｔｈ（アレムツズマブ）、Ｚｅｖａｌｉｎ、Ｏｎｃｏｌｙｍならびに類似の投与レジメン（即ち、処方および／または用量および／または投与プロトコル）が本発明の抗体と共に使用され得るような臨床的状況において効率的であることが示されている。糖のためのスケジュールおよび用量は、例えば、製造者の指示書を使用して、これらの製品のための既知の方法に従って決定することができる。例えば、モノクローナル抗体は、１００ｍｇ（１０ｍＬ）または５００ｍｇ（５０ｍＬ）の単回使用のバイアルのいずれかにおいて１０ｍｇ／ｍＬの濃度で供給することができる。生成物は、９．０ｍｇ／ｍＬ塩化ナトリウム、７．３５ｍｇ／ｍＬクエン酸ナトリウム二水和物、０．７ｍｇ／ｍＬポリソルベイト（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ８０）、および注射用滅菌水において、靜注投与のために処方される。ｐＨは６．５に調整される。本発明の抗体のための例示的に適切な用量範囲は、約１０ｍｇ／ｍ２〜５００ｍｇ／ｍ２であり得る。しかし、これらのスケジュールは例示的であること、至適スケジュールおよびレジメンは、臨床治験において決定されなければならない抗体の親和性および忍容性を考慮して適応することができることが理解されよう。
【０２０５】
別の実施形態に従えば、本発明の抗体組成物は、抗体が投与されている特定の治療目的に通常利用される薬剤を含む１つもしくはそれ以上のさらなる治療剤をさらに含んでなることができる。さらなる治療剤は、通常、処置されている特定の疾患または状態のための単剤治療における該薬剤に典型的に使用される量で存在する。そのような治療剤として、癌の処置に試用される治療剤、感染性疾患を処置するために使用される治療剤、他の免疫療法において使用される治療剤、（ＩＬ−２またはＩＬ−１５のような）サイトカイン、他の抗体のおよび他の抗体のフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。特定の治療アプローチが、患者の状態自体に有害であることが知られておらず、ＮＫ細胞受容体抗体に基づく処置を顕著に和らげない限り、その本発明との併用が考慮される。
【０２０６】
固形腫瘍の処置に関連して、本発明は、手術、放射線療法、化学療法などのような古典的なアプローチと組み合わせて使用してもよい。従って、本発明は、ＮＫ細胞受容体に対するヒト化またはヒトに適した抗体が手術または放射性処置と同時、前、または後に使用されるか、あるいは従来の化学療法、放射線治療剤もしくは抗血管新生剤または標的化された免疫毒素もしくはコアギュリガンド（ｃｏａｇｕｌｉｇａｎｄ）と共に、前または後に投与される併用療法を提供する。ＮＫ細胞受容体抗体に基づく治療用および抗癌剤は、単一の組成物において、または異なる投与経路を使用する２つの個別の組成物として同時に患者に投与してもよい。
【０２０７】
１つもしくはそれ以上の薬剤（例えば、抗癌または他のＮＫ増強剤）を本抗体に基づく治療と併用して使用する場合、組み合わされた結果が各処置を個別に行う場合に観察される効果の相加である必要はない。少なくとも相加的効果は一般に所望されるが、単回治療のうちの１つを超える増加した抗細胞増殖効果は、有益で得あり得る。また、併用処置が相乗効果を示すことを求める特定の要件は存在しないが、このことは間違いなく可能であり、有利である。治療用抗４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３または抗４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ抗体に基づく処置は、例えば、数分〜数週間および数箇月の範囲の間隔で、他の処置より前、または後であってもよい。また、治療用抗体に基づく組成物または他の薬剤のいずれかの１回を超える投与が利用されることも予想される。薬剤は、代替的日または週において交換可能に投与され得、または抗４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３もしくは抗４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ抗体に基づく処置のサイクルが付与され、続いて、他の治療のサイクルが行われる。いずれにせよ、併用療法を使用して細胞過剰増殖の阻害を達成するためには、必要なことは、投与時間にかかわらず、抗増殖性効果を発揮するのに十分な組み合わされた量で療法の薬剤を送達することだけである。同じ原理が、感染性疾患における感染細胞および炎症症状における増殖性免疫細胞の処置に当てはまる。
【０２０８】
他の態様では、免疫調節化合物またはレジメンは、本発明との併用で実践され得る。好適な例として、サイトカインによる処置が挙げられる。そのような併用アプローチでは、多様なサイトカインを用いることができる。サイトカインの例として、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＴＧＦ−β、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＬＡＦ、ＴＣＧＦ、ＢＣＧＦ、ＴＲＦ、ＢＡＦ、ＢＤＧ、ＭＰ、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＴＭＦ、ＰＤＧＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、またはＩＦＮ−γが挙げられる。サイトカインは、標準的なレジメンに従い、患者の病態およびサイトカインの相対的毒性のような臨床的適応と一致させて、投与される。
【０２０９】
本発明のそれらとの併用で実践され得る可能物またはレジメンの他の好適な例として、ＮＫ細胞の活性を調節する組成物が挙げられる。例えば、所定の好適な実施形態では、本発明の抗体は、抑制性ＮＫ細胞受容体を阻止することが可能な化合物、例えば、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ受容体もしくは抑制性ＫＩＲ受容体、例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１、およびＫＩＲ３ＤＬ２の活性を阻害することができる天然のリガンド、抗体または小分子と共に投与される（例えば、ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＦＲ０４／０１７０２（２００４年７月１日出願）、表題「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ＮＫ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」ヤワタ（Ｙａｗａｔａ）ら（２００２年）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２（５−６）：４６３−８２、ミッデルトン（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ）ら（２００２年）Ｔｒａｎｓｐｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０（２−３）：１４７−６４、ヴィルチェス（Ｖｉｌｃｈｅｓ）ら（２００２年）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：２１７−５１、またはロング（Ｌｏｎｇ）ら２００１年Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．１８１：２２３−３３）（それらのそれぞれの開示内容は、それらの全体が参照により本明細書に援用される）を参照のこと）。あるいは、ＮＫ細胞受容体を活性化するアゴニストも使用することができる。前記アゴニストは、ＮＫ細胞の任意の活性化受容体、例えば、ＮＫｐ３０（例えば、ＰＣＴ国際公開第０１／３６６３０号パンフレット（その開示内容は、その全体が参照により本明細書に援用される）を参照のこと）、ＮＫｐ４４（例えば、バイタレ（Ｖｉｔａｌｅ）ら（１９９８年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８７：２０６５−２０７２（その開示内容は、その全体が参照により本明細書に援用される）を参照のこと）、ＮＫｐ４６（例えば、シボリ（Ｓｉｖｏｒ）ら（１９９７年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１１２９−１１３６、ペッシノ（Ｐｅｓｓｉｎｏ）ら（１９９８年）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：９５３−９６０を参照のこと、それらの開示内容は、その全体が参照により本明細書に援用される）、ＮＫＧ２Ｄ（例えば、ＯＭＩＭ６０２８９３を参照のこと）、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１８Ｒ、ＩＬ−２１Ｒ、または活性ＫＩＲ受容体、例えば、ＫＩＲ２ＤＳ４受容体（キャリントン（Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ）およびノルマン（Ｎｏｒｍａｎ）、ＫＩＲ  Ｇｅｎｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ、２００３年５月３日：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｏｏｋｓにおいて入手可能）、あるいはＮＫ細胞の実質的な画分に存在し、好ましくは、抑制性ＫＩＲ受容体のような抑制性受容体を介して細胞が予め阻害されている場合であってもその活性化は細胞の活性化もしくは増殖をもたらす他の任意の受容体を刺激し得る。例えば、米国特許出願第６０／５６７，０５８号明細書（２００４年４月３０日出願）（その開示内容は、本明細書において参照により援用される）を参照のこと。
【０２１０】
典型的な例では、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８またはＩＬ−２１）が５〜１０日間の期間連日投与され、該サイトカインは、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ活性阻害するかまたは４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３と４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒとの相互作用を阻止する化合物の最初の注入と同じ日に最初に注入される。前記方法は、好ましくは、皮下経路によるサイトカインの１回もしくは２回の注入／日を含んでなる。サイトカインの用量は、処置しようとする患者の状態に依存して選択される。好適な実施形態では、相対的に低い用量のサイトカインを使用することができる。例えば、サイトカイン含有医薬組成物が連日皮下注入で使用される場合、ＩＬ−２のようなサイトカインの有効量は、典型的に１００万単位／平方メートル／日未満サイトカインである。好適な実施例では、ＩＬ−２は、５〜１０日間、１００万単位／ｍ２未満の連日用量で、皮下に注入される。サイトカインの使用に関するさらなる詳細については、国際特許公開第ＰＣＴ／ＥＰ／０３１４７１６号パンフレットおよび米国特許出願第６０／４３５，３４４号明細書、表題「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｈａｖｉｎｇ  ａｎ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ」（その開示内容は本明細書において参照により援用される）に記載されている。サイトカインは、製造者の指示に従って投与することができ、用量および投与の改変は、治療用抗体に関して本明細書に記載のように行うことができる。
【０２１１】
化学療法は、しばしば、増殖性障害を処置するために使用されるため、本発明のＮＫ細胞受容体抗体治療組成物を、他の化学療法またはホルモン療法剤と併用して投与してもよい。様々なホルモン治療および化学療法剤は、本明細書において開示される併用処置方法において使用することができる。例示的に考えられる化学療法剤として、アルキル化剤、代謝拮抗剤、細胞障害性抗生物質、ビンカアルカロイド、例えば、アドリアマイシン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、カルミノマイシン、ダウノマイシン、ドキソルビシン、タモキシフェン、タキソール、タキソテール、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、エトポシド（ＶＰ−１６）、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、チオテパ、メトトレキサート、カンプトテシン、アクチノマイシンＤ、マイトマイシンＣ、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、アミノプテリン、コンブレタスタチン（系薬剤）、ならびにそれらの誘導体およびプロドラックが挙げられる。ホルモン剤としては、例えば、ＬＨＲＨアゴニスト、例えば、リュープロレリン、ゴセレリン、トリプトレリン、およびブセレリン、抗エストロゲン、例えば、タモキシフェンおよびトレミフェン、抗アンドロゲン例えば、フルタミド、ニルタミド、シプロテロンおよびビカルタミド、アロマターゼ阻害剤例えば、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾールおよびファドロゾール、ならびにプロゲスターゲン例えば、メドロキシ、クロルマジノンおよびメゲストロールが挙げられる。
【０２１２】
当業者に理解されるように、化学療法剤の適切な用量は、一般に、およそ臨床治療においてすでに用いられている用量であり、ここで、化学療法剤は、単独か、または他の化学療法剤との併用で投与される。唯一の例として、シスプラチンのような薬剤、および他のＤＮＡアルキル化剤を使用することができる。シスプラチンは癌を処置するために広範に使用されており、臨床適用において使用される有効量は２０ｍｇ／ｍ２であり、３週間ごとに５日間の投与を合計で３クール行う。シスプラチン経口的には吸収されず、従って、静脈内、皮下、腫瘍内または腹腔内注入を介して送達されなければならない。
【０２１３】
さらに有用な化学療法剤として、ＤＮＡ複製、有糸分裂および染色体分離を妨害する化合物が挙げられ、また、ポリヌクレオチド前駆体の合成および忠実度を破壊する薬剤を使用してもよい。併用治療のための化学療法剤が米国特許第６，５２４，５８３号明細書の表Ｃに列挙されており、薬剤および適応に関する開示内容は、具体的に、本明細書において参照により援用される。列挙されたそれぞれの薬剤は例示的であり、限定的ではない。別の有用な供給源は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１５版、第３３章、特に６２４〜６５２頁である。用量の変動は、治療中の状態に依存して生じる可能性がある。処置を施行する医師は、個々の被験体に対する適切な用量を決定することが可能である。
【０２１４】
本抗体はまた、任意の１つもしくはそれ以上の抗血管新生両方との併用で使用してもよい。そのような薬剤の例として、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体に対する中和抗体、アンチセンスストラテジー、ＲＮＡアプタマーおよびリボザイムが挙げられる（米国特許第６，５２４，５８３号明細書、その開示内容は本明細書において参照により援用される）。国際公開第９８／１６５５１号パンフレット（具体的に本明細書において参照により援用される）に記載されているように、拮抗特性を伴うＶＥＧＦの変異体もまた用いることができる。併用治療に関して有用であるさらなる例示的抗血管新生剤が米国特許第６，５２４，５８３号明細書の表Ｄに列挙されており、薬剤および適応に関する開示内容は、具体的に、本明細書において参照により援用される。
【０２１５】
本抗体はまた、アポトーシスを誘導する方法と有利に併用され得る。例えば、アポトーシス、またはプログラムされた細胞死を阻害する多くの発癌遺伝子が同定されている。このカテゴリー内の例示的発癌遺伝子として、ｂｃｒ−ａｂｌ、ｂｃｌ−２（ｂｃｌ−１、ｃｙｃｌｉｎＤ１とは異なる、（ＧｅｎＢａｎｋ）寄託番号Ｍ１４７４５、Ｘ０６４８７、米国特許第５，６５０，４９１号明細書、および同第５，５３９，０９４号明細書、それぞれ、本明細書において参照により援用される）ならびにＢｃｌ−ｘ１、Ｍｃｌ−１、Ｂａｋ、Ａ１、Ａ２０を含むファミリーメンバーが挙げられるが、これらに限定されない。ｂｃｌ−２の過剰発現はＴ細胞リンパ腫においてはじめて発見された。ｂｃｌ−２は、Ｂａｘ、アポトーシス経路におけるタンパク質に結合し、不活化することによって、癌遺伝子として機能する。ｂｃｌ−２機能を阻害すると、Ｂａｘの不活化が防止され、アポトーシス経路を促進させることが可能である。例えば、アンチセンスヌクレオチド配列または小分子の化学化合物を使用するこのクラスの発癌遺伝子の阻害が、アポトーシスの増強を生じさせるための本発明での使用のために考慮される（米国特許第５，６５０，４９１号明細書、同第５，５３９，０９４号明細書、および同第５，５８３，０３４号明細書、それぞれは本明細書において参照により援用される）。
【０２１６】
本発明の抗体に関与する治療はまた、補助化合物と併用して使用してもよい。補助化合物はとしては、その例として、制吐剤、例えば、セロトニン拮抗薬および治療薬、例えば、フェノチアジン系薬剤、置換ベンズアミド系薬剤、抗ヒスタミン系薬剤、ブチロフェノン系薬剤、副腎皮質ステロイド、ベンゾジアゼピン系薬剤およびカンナビノイド系薬剤、ビスホスホネート系薬剤、例えば、ゾレドロン酸およびパミドロン酸、ならびに造血成長因子、例えば、エリスロポエチンおよびＧ−ＣＳＦ、例えば、フィルグラスチム、レノグラスチムおよびダルベポエチンを挙げることができる。
【０２１７】
ＡＤＣＣを介する細胞溶解を誘導する抗体の有効性の増加
特定の好適な態様では、本発明の化合物を増強するＮＫ細胞は、第二抗体、特に、ＡＤＣＣ機構を介してそれが結合する標的細胞の溶解を誘導することが可能な抗体と併用して使用することができる。米国特許出願第６０／４８９，４８９号明細書（２００３年７月２４日出願）、表題「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｔｈａｔ  ｂｌｏｃｋ  ｔｈｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｏｆ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ」（その開示内容は、本明細書において参照により援用される）において実証されるように、抗Ｉｇ４−Ｂ７−Ｈ３および抗Ｉｇ４−Ｂ７−Ｈ３Ｒ抗体のような化合物を使用して、そのような第二抗体の効果を増加するか、またはそのような第二抗体の用量を減少するかもしくは該第二抗体の処置レジメンを改変することができる。
【０２１８】
第二治療用抗体が個体に投与される場合、ＮＫ細胞活性を増強する本発明の化合物、特に、抗体は、ＡＤＣＣ機構をインビボで有利に増強するために使用することができる。実際に、本発明は、治療用抗体の有効性に関連する現在の困難を克服する新規の組成物および方法を提供する。いくつかの場合、例えば、ＮＫ細胞上の対応（抑制性）受容体の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３による阻害によってＮＫ細胞の活性化の欠如のため、個体由来のＮＫ細胞は、不十分な治療ｍＡｂ（モノクローナル抗体）仲介ＡＤＣＣを有し得る。好ましくは、ＡＤＣＣ機構の増加は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３受容体を阻害する化合物の投与、好ましくは、ナチュラルキラー細胞上での４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３と４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒとの相互作用を阻止する抗体の投与によって達成され、それによって、哺乳動物被験体におけるナチュラルキラー細胞細胞障害性の増強を促進する。
【０２１９】
より具体的には、本発明は、化合物、好ましくは、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ活性を阻害するか、もしくは４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３と４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒとの相互作用を阻止する抗体またはそのフラグメントが第二治療用抗体と共に被験体に同時投与される被験体の処置の方法を開示する。本発明者らは、ここで、第二治療用抗体の有効性が、そのような化合物、好ましくは、例えば、ＮＫ細胞の抑制性４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒタンパク質を阻止することによって、ＮＫ細胞の阻害を克服する抗体またはそのフラグメントの同時投与、例えば、同時注入によって著しく増強され得ることを実証する。
【０２２０】
本発明はまた、化合物、好ましくは、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ活性を阻害するかもしくは４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３と４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒとの相互作用を阻止する抗体またはそのフラグメント、ならびに第二治療用抗体を含んでなる医薬組成物に関する。本発明はまた、化合物、好ましくは、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ活性を阻害するかもしくは４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３と４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒとの相互作用を阻止する抗体またはそのフラグメントを含んでなるキットに関する。
【０２２１】
本発明はまた、治療用抗体による処置の有効を増加する、あるいは治療用抗体による処置を受ける被験体においてＡＤＣＣを増加するための化合物、好ましくは、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ活性を阻害するかもしくは４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３と４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒとの相互作用を阻止する抗体またはそのフラグメントの使用に関する。
【０２２２】
本発明はまた、疾患を処置するための薬物の調製のための化合物、好ましくは、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ活性を阻害するかもしくは４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３と４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒとの相互作用を阻止する抗体またはそのフラグメント、ならびに第二治療用抗体の使用に関する。より詳細には、疾患の処置には、標的化された細胞、好ましくは、ウイルス感染細胞などの疾患細胞、腫瘍細胞または他の病原性細胞の枯渇が必要である。好ましくは、疾患は、癌、感染性または免疫疾患である。より好ましくは、疾患は、癌、自己免疫疾患、炎症性疾患、およびウイルス性疾患からなる群から選択される。疾患はまた、移植片拒絶、より好ましくは、同種移植片拒絶、および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）に関する。
【０２２３】
前記第二抗体または治療用抗体は、一般に、（ｉ）枯渇させようとする標的抗原、および（ｉｉ）ＮＫ細胞上に存在するＣＤ１６に結合することによって、ＡＤＣＣを誘導する抗体である。従って、本発明はまた、第二治療用抗体、例えば、Ｆｃγ受容体、好ましくはＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩａ）によって結合される抗体の用量を減少するための方法を含んでなる。例えば、第二治療用抗体ならびに４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ活性を阻害するかまたは４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３と４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒとの相互作用を阻止する化合物の同時投与は、使用すべき治療用抗体のより低い用量を可能にする。そのような第二抗体は、化合物の非存在下で推奨される用量より２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくはそれより低い用量で使用することができる。
【０２２４】
さらに、本発明は、第二治療用抗体、例えば、ＣＤ１６により結合される抗体の治療上有効な減少された用量を決定するための方法を提供し、該方法は、ｉ）第１の濃度の第二治療用抗体を、標的細胞およびＮＫ細胞と共に、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ活性を阻害するかまたは４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３と４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒとの相互作用を阻止する化合物の非存在下で同時インキュベートすること、ｉｉ）第２のより低い濃度の第二治療用抗体を、標的細胞、ＮＫ細胞と共に、かつ４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ活性を阻害するかまたは４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３および４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒの相互作用を阻止する化合物の存在下で同時インキュベートすること、ｉｉｉ）工程ｉｉ）において観察される標的細胞の枯渇が工程ｉ）において観察される枯渇と同程度に大きいかどうかを決定することを含んでなる。工程ｉｉ）が工程ｉ）と同様に有効であることが観察される場合、所定の患者における使用、例えば、患者の特定の要件に依存して、標的細胞の枯渇、低減された用量の第二治療用抗体、または低減された用量の化合物を最大化するのに適切である異なる条件を同定するために、化合物および第二治療用抗体の相対濃度を変動し、枯渇を観察することができる。
【０２２５】
特定の態様では、本発明は、処置を要するヒト被験体の疾患の処置の方法を提供し、以下を含んでなる：ａ）前記被験体に、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ活性を阻害するかまたは４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３と４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３との間の相互作用を阻止する化合物を投与すること、およびｂ）前記被験体に、ＣＤ１６によって結合され得る第二治療用抗体を投与すること。
【０２２６】
１つの実施形態では、第二治療用抗体および化合物は被験体に同時に投与される。別の実施形態では、第二治療用抗体は、化合物の投与前または後に被験体に投与される。別の実施形態では、化合物は、第二治療用抗体投与の１週間以内、４日以内、３日以内または同日（例えば、約２４時間以内）に被験体に投与される。別の実施形態では、疾患は、癌、感染性または免疫疾患である。
【０２２７】
１つの実施形態では、方法は、被験体におけるＮＫ細胞の活性または数が、化合物の投与の前または後に評価されるさらなる工程をさらに含んでなる。別の実施形態では、さらなる工程は、ｉ）投与前に被験体からＮＫ細胞を入手すること、ｉｉ）化合物の存在または非存在下で治療用抗体によって認識される１つもしくはそれ以上の標的細胞の存在下でＮＫ細胞をインキュベートすること、およびｉｉｉ）ＮＫ細胞が標的細胞を枯渇させる能力に対する化合物の効果を評価することに関与し、ここで、化合物がＮＫ細胞が標的細胞を枯渇させる能力を増強するという検出は、化合物が方法における使用に適切であること、および方法が被験体による使用に適切であることを示す。
【０２２８】
別の態様では、本発明は、例えば、ＣＤ１６によって結合され得る第二治療用抗体、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ活性を阻害するかまたは４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３と４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒとの相互作用を阻止する化合物、および薬学的に許容可能なキャリアを含んでなる医薬組成物を提供する。別の態様では、本発明は、例えば、ＣＤ１６によって結合され得る第二治療用抗体、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ活性を阻害するかまたは４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３と４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒとの相互作用を阻止する１つもしくはそれ以上の化合物を含んでなるキットを提供する。
【０２２９】
任意の上記の方法、組成物、またはキットについて、１つの実施形態では、第二治療用抗体は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３Ｆｃ部分を含んでなる。別の実施形態では、化合物は、抗Ｉｇ４−Ｂ７−Ｈ３またはＩｇ４−Ｂ７−Ｈ３Ｒ抗体またはそのフラグメントである。別の実施形態では、治療用抗体は、モノクローナル抗体またはそのフラグメントである。別の実施形態では、治療用抗体は、放射性または毒性部分にコンジュゲートされない。別の実施形態では、化合物はＮＫ細胞の抑制性受容体を阻害する。別の実施形態では、化合物はＮＫ細胞の活性化受容体を刺激する。別の実施形態では、化合物は、ヒト、ヒト化もしくはキメラ抗体、またはそのフラグメントである。１つの実施形態では、治療用抗体または化合物は、とりわけ、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’２フラグメント、ＣＤＲおよびＳｃＦｖのような抗体フラグメントまたは誘導体であり得る。
【０２３０】
従って、本発明は、処置を要する被験体の疾患の処置の方法に関し、以下を含んでなる：
ｄ）化合物、好ましくは、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ活性を阻害するかもしくは４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３と４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒとの相互作用を阻止する抗体またはそのフラグメントを被験体に投与すること、および
ｅ）前記被験体に治療用抗体を投与すること。
【０２３１】
前記治療用抗体は、好ましくは、ＮＫ細胞のＣＤ１６によって、好ましくは、そのＦｃ領域を介して、結合され得る抗体である。
【０２３２】
好ましくは、本発明のＮＫ増強化合物との併用で使用され得る前記治療用抗体は、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３Ｆｃ部分、特に、モノクローナル抗体またはそのフラグメント、さらに好ましくは、ヒト化、ヒトもしくはキメラ抗体またはそのフラグメント、例えば、リツキシマブを有する。
【０２３３】
１つの実施形態では、本発明のＮＫ増強化合物を併用して使用することができる抗体は、ＦＣＧＲ３Ａ（ＣＤ１６とも呼ばれる、ＦＣＧＲ３、免疫グロブリンＧＦｃ受容体ＩＩＩ、ＩＧＦＲ３、ＩｇＧのＦｃフラグメントに対する受容体、低親和性ＩＩＩａ，、例えば、ＯＭＩＭ１４６７４０を参照のこと）、ＦＣＧＲ２Ａ（ＣＤ３２とも呼ばれる、ＣＤｗ３２、ＩｇＧのＦｃフラグメントに対する受容体、低親和性ＩＩａ、ＦＣＧ２、免疫グロブリンＧＦｃ受容体ＩＩ、例えば、ＯＭＩＭ１４６７９０を参照のこと）、ＦＣＧＲ２Ｂ（ＣＤ３２とも呼ばれる、ＩｇＧのＦｃフラグメントに対する受容体、低親和性ＩＩｂ、ＦＣＧＲ２Ｂ、ＦＣ−γ−ＲＩＩＢ、例えば、ＯＭＩＭ６０４５９０を参照のこと）、ＦＣＧ１ＲＡ（ＣＤ６４とも呼ばれる、ＩｇＧのＦｃフラグメントに対する受容体、高親和性Ｉａ、ＩＧＦＲ１、例えば、ＯＭＩＭ１４６７６０を参照のこと）、ＩｇＧのＦＣＧＲ１フラグメント、高親和性Ｉｃ、免疫グロブリンＧＦｃ受容体ＩＣ、ＩＧＦＲＣ、例えば、ＯＭＩＭ６０１５０３を参照のこと）、またはＦＣＧＲ１Ｂ（ＣＤ６４とも呼ばれる、ＩｇＧのＦｃフラグメントに対する受容体、高親和性Ｉｂ、免疫グロブリンＧＦｃ受容体ＩＢ、ＩＧＦＲＢ、例えば、ＯＭＩＭ６０１５０２を参照のこと）のようなＦｃγ受容体によって、特異的に認識される。
【０２３４】
本発明のＮＫ増強化合物を併用して使用することができる治療用抗体の典型的な例は、リツキシマブ、アレムツズマブおよびトラスツズマブである。そのような抗体は、ヒト被験体での使用について認可されている臨床プロトコルに従って、使用してもよい。治療用抗体のさらなる具体的な例として、例えば、エプラツズマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、セツキシマブ、ラベツズマブ、セビルマブ、ツブリマブ、パリビズマブ、インフリキシマブ、オマリズマブ、エファリズマブ、ナタリズマブ、クレノリキシマブなどが挙げられる。場合により、ＮＫ細胞の活性化受容体を刺激する化合物がサイトカインである場合、治療用抗体は、リツキシマブまたはヘルセプチン以外の抗体であるか、場合により、抗ＣＤ２０または抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体以外である。本発明における使用に好適な治療用抗体の他の例として、抗フェリチン抗体（米国特許公開第２００２／０１０６３２４号明細書）、抗ｐ１４０および抗ｓｃ５抗体（国際公開第０２／５０１２２号パンフレット）が挙げられ、抗ＫＩＲ（キラー抑制性受容体）抗体（ＫＩＲ受容体については、キャリントン（Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ）およびノルマン（Ｎｏｒｍａｎ）、（Ｔｈｅ  ＫＩＲ  Ｇｅｎｅ  Ｃｌｕｓｔｅｒ、２００３年５月３日：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｏｏｋｓにおいて利用可能）、（その開示内容は本明細書において参考として援用される）に記載されている。治療用抗体の他の例は以下の表に列挙しており、そのいずれも（およびその他も）本方法において使用することができる。以下の表または本明細書の他の箇所において記載されているか否かにかかわらず、好ましくは、ＡＤＣＣによって、標的細胞を枯渇することができるあらゆる抗体は、本発明の方法から利益を享受することができ、以下の表２は、本明細書において列挙された抗体または列挙された抗体の標的もしくは適応症について、そのすべてを網羅しているわけではないことが理解されよう。
【０２３５】
【表１】
0005560301.tif 000002
【０２３６】
【表２】
0005560301.tif 000003
【０２３７】
【表３】
0005560301.tif 000004
【０２３８】
【表４】
0005560301.tif 000005
【０２３９】
所定の好適な例では、本発明の方法は、好ましくは、ＮＫ細胞の抑制性受容体を阻止するかまたは活性化受容体刺激することによって、ＮＫ細胞活性を増強する２つもしくはそれ以上の化合物の１つもしくはいくらかの注入を含んでなる。従って、これらの２つもしくはそれ以上の化合物を併用することができる。第１の前記２つもしくはそれ以上の化合物は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ活性を阻害するかまたは４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３と４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒとの相互作用を阻止する本発明の化合物であってもよい。第２の化合物は、ＮＫ細胞の抑制性受容体を阻止するかまたは活性化受容体を刺激することが可能ないずれかの化合物のであってもよい。これは、以下に考察するさらなる治療用抗体のＡＤＣＣおよび有効性のさらに顕著な増大を引き起こす役割を果たし得、および／またはＮＫ細胞の抑制性受容体を阻止するかまたは活性化受容体を刺激する特定の化合物の用量を減少する役割を果たし得る。例えば、ＩＬ−２のような化合物は、増加した用量で毒性であることが公知である。従って、本発明は、好ましくは、処置を要する被験体の疾患の処置の方法を提供し：ａ）前記被験体に少なくとも２つの化合物を投与することであって、好ましくは、ここで、一方または両方の化合物は、ＮＫ細胞の抑制性受容体を阻止するかもしくは活性化受容体を刺激する抗体またはそのフラグメントである、およびｂ）前記被験体に治療用抗体を投与することを含んでなる。例えば、好適なレジメンは、前記２つの化合物が、（ｉ）４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒ活性を阻害するかまたは４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３と４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｒとの相互作用を阻止する抗体、ならびに（ｉｉ）ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６またはＮＫＧ２Ｄ受容体を刺激する抗体、活性ＫＩＲ受容体、抑制性ＫＩＲ受容体またはＮＫＧ２Ａ受容体、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１を阻止する抗体からなる群から選択される化合物である場合である。
【０２４０】
本発明のさらなる態様および利点を、以下の実施例のセクションで開示するが、これは例示的であり、本出願の範囲を限定するものではないとみなすべきである。
【実施例】
【０２４１】
方法
モノクローナル抗体
５Ｂ１４ｍＡｂ（ＩｇＭ）は、先に記載（ボッティノ，Ｃ．（Ｂｏｔｔｉｎｏ，Ｃ．）ら、（２００３年）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９８，５５７−５６７）のとおり、５週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスをＡＣＮ（ヒト神経芽細胞腫）細胞株で免疫することによって入手した。ｃ２１８（ＩｇＧ１、抗ＣＤ５６）、Ａ６−１３６（ＩｇＭ、抗ＨＬＡクラスＩ）、ＡＺ２０（ＩｇＧ１、抗ＮＫｐ３０）を、本発明者らの研究室において産生させた。次のｍＡｂ抗ＧＤ２（１４．Ｇ２ａ、ＩｇＧ２Ａ）および抗ＣＤ４５（ＨＩ３０、ＩｇＧ１）を、それぞれＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＰｈａｒｍｉｎｇｅｎおよびＣＡＬＴＡＧ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）より購入した。
【０２４２】
骨髄吸引物および神経芽細胞腫精製
インフォームドコンセント後、神経芽細胞腫と診断され、Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ−Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇ．  Ｇａｓｌｉｎｉ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに入院した１５例の小児から１．８ゲージ針で２つの腸骨稜より骨髄を吸引した。診断および病期診断は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ  Ｓｔａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ブロダイル，Ｇ．−Ｍ．（Ｂｒｏｄｅｕｒ，Ｇ．−Ｍ．）ら（１９９３年）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．１１，１４６６−１４７７）に従って実施した。診断および治療評価を実施した後の骨髄吸引残部の量を、赤細胞溶解時のフローサイトメトリーによって分析した。神経芽細胞腫細胞は、骨髄吸引物（神経芽細胞腫と診断された小児由来）からＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  ＫＩＴ（ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ，ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、加国）のためのＣＤ４５枯渇によって精製した。研究は、Ｇａｓｌｉｎｉ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ治験審査委員会の承認後に実施した。
【０２４３】
免疫細胞化学によるＧＤ２および５Ｂ１４発現の検出
５×１０５細胞／スライドまでを含有する１７ｍｍ直径の４０のＣｙｔｏｓｐｉｎをＢＭ吸引物から調製した。Ｃｙｔｏｓｐｉｎをホルマリン中に固定し、抗ＧＤ２モノクローナル抗体１４．Ｇ２ａ（５マイクログラム／ｍｌ  ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）または５Ｂ１４マウスモノクローナル抗体（腹水１：１００希釈）と共に３０分間インキュベートした。１つのスライドを、関連特異性を有さないアイソタイプの一致したモノクローナル抗体（陰性コントロール）と共にインキュベートした。洗浄後、スライドを、連続的にウサギ抗マウス抗体（ＤＡＫＯ  Ａ／Ｓ、丁国）（１：２０希釈）と共に３０分間、アルカリホスファターゼおよびマウスモノクローナル抗アルカリホスファターゼ（ＡＰＡＡＰ）複合体（１：２０希釈）（ＤＡＫＯ）と共に３０分間、インキュベートした。続いて、アルカリホスファターゼ基質（ＤＡＫＯ  Ｆｕｃｈｓｉｎｅ）を色素原として添加した。スライドを、ヘマトキシリン中で対比染色し、次いで、カバーガラスで封入した。結果を、光学顕微鏡下で解釈した。
【０２４４】
５Ｂ１４反応性分子の生化学的特徴付けおよび精製
５Ｂ１４ｍＡｂ（ＩｇＭ）を、Ｋａｐｔｉｖ−Ｍ（Ｔｅｃｎｏｇｅｎ  Ｓ．Ｃ．ｐ．Ａ．Ｃａｓｅｒｔａ、伊国）を使用して精製した。２０×１０６細胞を、１２５Ｉ（ＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ、マサチューセッツ州）で標識し、１％ＮＰ−４０中で溶解し、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ−ＣｎＢｒ−（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州）結合５Ｂ１４ｍＡｂにより免疫沈降した。サンプルを、Ｎ−グリコシダーゼＦ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ＧｍｂＨ、独国）により非消化または消化のいずれかで処理していた不連続ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ボッティノ，Ｃ．（Ｂｏｔｔｉｎｏ，Ｃ．）ら、（２００３年））の記載のとおりに得られた２９３Ｔ細胞膜を、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣｎＢｒ結合５Ｂ１４ｍＡｂと共にインキュベートした。特異的タンパク質を溶出させ、濃縮時に非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ポリアクリルアミドゲルを、Ｓｉｍｐｌｙ  Ｂｌｕｅ  Ｓａｆｅｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ、英国）（ボッティノ，Ｃ．（Ｂｏｔｔｉｎｏ，Ｃ．）ら、（２００３年））を使用して染色した。
【０２４５】
ゲル内酵素消化およびトリプシンペプチドのＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析
染色された精製した５Ｂ１４反応性タンパク質のゲル内消化を、先に記載（ボッティノ，Ｃ．（Ｂｏｔｔｉｎｏ，Ｃ．）ら、（２００３年））のとおりに行った。得られるペプチド混合物の分析を、ＨＰＬＣ  Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｎｎｉｇａｎ）を直結し、１×１５０ｍｍカラム、Ｖｙｄａｃ  Ｃ１８、５μｍ、３００Å（Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、カリフォルニア州、米国）を具備したＬＣＱ−ＤＥＣＡ  ＭＳ／ＭＳイオントラップ質量分析計により、（ボッティノ，Ｃ．（Ｂｏｔｔｉｎｏ，Ｃ．）ら、（２００３年））に記載のとおりに実施した。ペプチドＭＳ／ＭＳスペクトルのコンピュータ解析を、ＴｕｒｂｏＳＥＱＵＥＳＴソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ｌｉｃｅｎｓｅｄ  ｔｏ  ＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ  Ｃｏｒｐ．）のバージョン１．２を使用して実施し、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）ヒトタンパク質データベースに対して検索した。
【０２４６】
ヒト４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３および２Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３をコードするｃＤＮＡのＲＴ−ＰＣＲ増幅
２９３Ｔ細胞株からｐｅＱＧｏｌｄ  ＲＮＡ  ｐｕｒｅ（ｐｅＱＬａｂ，Ｅｒｌａｎｇｅｎ、独国）を使用して抽出した全ＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）プライミングを使用する標準的な技術によって、逆転写した。使用したプライマーは、２Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３に対して５’ＡＴＧＣＴＧＣＧＴＣＧＧＣＧＧＧＧ（２Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ＵＰ）（配列番号３）および５’ＧＧＴＣＡＧＧＣＴＡＴＴＴＣＴＴＧＴＣＣＡＴＣ（Ｂ７−Ｈ３ＤＷ）（配列番号４）ならびに４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３に対して５’ＣＡＧＣＣＧＣＣＴＣＡＣＡＧＧＡＡＧ（４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ＵＰ）（配列番号５）および５’ＧＧＴＣＡＧＧＣＴＡＴＴＴＣＴＴＧＴＣＣＡＴＣ（Ｂ７−Ｈ３ＤＷ）（配列番号３）であった。増幅を、ホットスタート技術により、ＡｍｐｌｉＴＡＱ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）を利用して実施した。２Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３増幅（９５３ｂｐ）を、３０サイクル（９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間）、続いて、７２℃での７分間の伸長により実施した。４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３増幅（１６２４ｂｐ）を、１５サイクル（９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で３０秒間）、１５サイクル（９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間）、続いて、７２℃での７分間の伸長により実施した。ＰＣＲ産物をｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）にサブクローニングした。ＤＮＡ配列決定は、ＢｉｇＤｙｅターミネーターＣｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔおよび３７７Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ａｕｔｏｍａｔｉｃ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した。
【０２４７】
可溶性分子
２Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３（ＲｈＢ７−Ｈ３／Ｆｃキメラ）をＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ミネソタ州より購入した。ＭＩＣＡ可溶性分子は、先に説明された（アンドレ  Ｐ．（Ａｎｄｒｅ  Ｐ．）（２００４年）．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：９６１−９７１）。先に記載（ファルコ，Ｍ．（Ｆａｌｃｏ，Ｍ．）、マルセナロ，Ｅ．（Ｍａｒｃｅｎａｒｏ，Ｅ．）、ロミオ，Ｅ．（Ｒｏｍｅｏ，Ｅ．）、ベローラ，Ｅ．（Ｂｅｌｌｏｒａ，Ｆ．）、マラス，Ｄ．（Ｍａｒｒａｓ，Ｄ）、ベリ，Ｆ．（Ｖｅｌｙ，Ｆ．）、フェラッシ，Ｇ．（Ｆｅｒｒａｃｃｉ，Ｇ．）、モレッタ，Ｌ．（Ｍｏｒｅｔｔａ，Ｌ．）、モレッタ，Ａ．（Ｍｏｒｅｔｔａ，Ａ．）およびボッティノ  Ｃ．（Ｂｏｔｔｉｎｏ，Ｃ．）（２００４年）．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）のとおりに、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｆｃ可溶性分子については、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３の細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ配列（リーダー配列を含む）を、コドン１〜コドン４６１で増幅し、一致したｈＩｇＧ１をコードするｃＤＮＡ配列と共にインフレームでｐＲＢ１発現ベクターにクローニングした。ｐＲＢ１−４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｆｃｍｕｔ構築物を、Ｆｕｇｅｎｅ６（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｎｚａ、伊国）を利用して、ヒト胚線維芽細胞２９３Ｔ細胞株に一過的にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞をＤＭＥＭ／１０％Ｕｌｔｒａｌｏｗ  ＩｇＧウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、英国）において培養し、トランスフェクション４日目および８日目に上清を回収した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を利用して、アフィニティークロマトグラフィーにより４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３Ｆｃ分子を精製した。精製したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて、銀染色および５Ｂ１４ｍＡｂを利用するＥＬＩＳＡによって確認した。
【０２４８】
安定トランスフェクション
ＣＨＯ−Ｋ細胞株を、製造者の指示に従い、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ２トランスフェクション試薬（ＧＴＳ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州）を利用して、ｐｃＤＮＡ３．１Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ−２Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３またはｐｃＤＮＡ３．１Ｖ５−Ｈｉｓ−ＴＯＰＯ−４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３構築物でトランスフェクトした。４８時間後、トランスフェクト細胞をＤＭＥＭ＋１．５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８において選択し、限界希釈下でサブクローニングした。選択したクローンを、５Ｂ１４ｍＡｂ、続いて、ＰＥコンジュゲートヤギ抗マウスアイソタイプ特異的第２試薬（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、アラバマ州）で染色し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用するフローサイトメトリーによって分析した。
【０２４９】
ポリクローナルＮＫ細胞
ＮＫ細胞を、Ｈｕｍａｎ  ＮＫ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ−ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）を使用して精製し、ポリクローナル活性型ＮＫ細胞集団を得るために、１００Ｕ／ｍｌ  ｒＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ，Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、米国）および１．５ｎｇ／ｍｌ  ＰＨＡ（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｔｄ，Ｐａｉｓｌｅｙ、蘇国）の存在下で照射したフィーダー細胞上で培養した。
【０２５０】
細胞溶解活性およびフローサイトフルオロメトリー分析
先に記載（ボッティノ，Ｃ．（Ｂｏｔｔｉｎｏ，Ｃ．）ら、（２００３年）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９８，５５７−５６７）のとおり、ＮＫ細胞を、４時間５１Ｃｒ放出アッセイにおいて示された標的細胞に対する細胞溶解活性について試験した。マスキング実験のために添加された多様なｍＡｂの濃度は１０μｇ／ｍｌであった。Ｅ／Ｔ比をテキストで示す。１または２色サイトフルオロメトリー分析（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ＆Ｃｏ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、カリフォルニア州）では、細胞を、適切なｍＡｂ、続いて、ＰＥ−またはＦＩＴＣ−コンジュゲートアイソタイプ特異的ヤギ抗マウス第２試薬（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、アラバマ州）で染色した。
【０２５１】
ＩＦＮ−γ産生
ポリクローナルＮＫ細胞からのＩＦＮ−γ産生を、ＥＬＩＳＡ（ＩＦＮ−γ：ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ  Ｉｎｔ．Ｉｎｃ．、カリフォルニア州、米国）を使用して、上清において測定した。ＮＫ細胞（５×１０５細胞／ｍｌ）を、９６ウェルＵ底組織培養プレートにおいて、精製された２Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３または４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３（上記を参照のこと）可溶性分子の存在もしくは非存在下で、またはポジティブコントロールとして、精製された抗ＮＫｐ３０ｍＡｂ（ＡＺ２０）またはＭＩＣＡ可溶性分子（アンドレ  Ｐ．（Ａｎｄｒｅ  Ｐ．）、（２００４年））の存在下で、それぞれ５０μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌの可溶性分子およびｍＡｂの濃度でインキュベートした。
【０２５２】
結果
５Ｂ１４ｍＡｂの単離
ヒト神経芽細胞腫細胞によって発現される新規の細胞表面マーカーを同定する試みにおいて、マウスを、ＡＣＮ神経芽細胞腫細胞株で免疫した。細胞融合後、ハイブリドーマ上清を、間接的免疫蛍光および神経芽細胞腫細胞株のパネルとの表面反応性についてのサイトフルオロメトリー分析によってスクリーニングした。この実験アプローチを使用して、免疫化細胞だけではなく、神経芽細胞腫について現在、最も信頼できるマーカーと考えられるジシアロガングリオシドＧＤ２を発現しないＳＫ−Ｎ−ＢＥ（図１）およびＧＩＭＥＮ（示さず）を含む試験したすべての神経芽細胞腫細胞株を染色する５Ｂ１４と呼ばれるｍＡｂを選択した。
【０２５３】
本発明者らは、次に、正常細胞ならびに異なる組織型の腫瘍細胞株上の５Ｂ１４反応性分子の表面分布を評価した。表１（図７）に示されるように、５Ｂ１４ｍＡｂは、正常リンパ球またはインビトロで培養されたＮＫ、ＢおよびＴ細胞株のいずれとも反応しなかった。単球で低い反応性を検出することができた一方、インビトロで誘導された未熟または成熟ＤＣ（それぞれｉＤＣおよびｍＤＣ）は明るく染色された。最終的に、５Ｂ１４ｍＡｂは、メラノーマおよび癌腫を含む、異なる由来の腫瘍細胞株の広いパネルで高い反応性を示した。
【０２５４】
新鮮神経芽細胞腫骨髄浸潤物のサイトフルオロメトリー分析
骨髄吸引物を、ステージ４の神経芽細胞腫に罹患した１６例の小児、または（コントロールとして）非転移性ステージ１の１５例の患者から導入した。サンプルを、５Ｂ１４または抗ＧＤ２ｍＡｂ（図２）のいずれか一方を使用する二重蛍光およびサイトフルオロメトリー分析によって分析した。ステージ４のサンプルでは、抗ＧＤ２ｍＡｂは、浸潤性ＣＤ４５−神経芽細胞腫細胞を明るく染色した（図２Ａ）。しかし、抗ＧＤ２ｍＡｂはまた、高い割合のＣＤ４５＋正常細胞と反応したことは注目される。Ｉ抗ＧＤ２ｍＡｂは、神経芽細胞腫細胞表面によって流出される可溶性ＧＤ２分子に結合し得るという仮定（ラディシュ，Ｓ．（Ｌａｄｉｓｈ，Ｓ．）ら（１９８７年）Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．３９，７３−７６）に一致する。
【０２５５】
バレンチノ，Ｌ．（Ｖａｌｅｎｔｉｎｏ，Ｌ．）ら（１９９０年）Ｂｌｏｏｄ７５，１５６４−１５６７）、正常細胞における抗ＧＤ２表面反応性は、神経芽細胞腫細胞を含有しないサンプル、即ち、非転移性ステージ１患者から誘導される骨髄では検出されなかった（図２Ｂ）。ステージ４骨髄吸引物、浸潤性神経芽細胞腫細胞は、５Ｂ１４ｍＡｂによって特異的に認識された（図２Ａ）。意外にも、ＧＤ２ではそれが生じるような５Ｂ１４反応性分子が正常ＣＤ４５＋細胞において検出された例は認められなかった（図２Ｂ）。さらに、５Ｂ１４表面反応性は、異なるステージ４の骨髄吸引物に浸潤している神経芽細胞腫細胞の数にかかわらず、明らかに検出された（図２Ｃ）。
【０２５６】
新鮮神経芽細胞腫骨髄浸潤物の免疫細胞化学
ステージ４の神経芽細胞腫を有するとして診断された患者由来の骨髄サンプルを、ＧＤ２ジシアロガングリオシドの検出に基づくＥ−ＳＩＯＰ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｓｏｃｉｅｔｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄ’Ｏｎｃｏｌｏｇｉｅ  Ｐｅｄｉａｔｒｉｑｕｅ）Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｌｏｇｙ／Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｇｒｏｕｐ（材料および方法を参照のこと）によって標準化された免疫細胞化学アッセイによって分析した。同じＢＭサンプルから同じ方法で調製したＣｙｔｏｓｐｉｎを、５Ｂ１４ｍＡｂと同時に試験した。２名の独立した観察者が、結果の光学顕微鏡的特徴を評価した。ＥＳＩＯＰ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｌｏｇｙ／Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｇｒｏｕｐによって同意された陽性に関して規定された最低基準に従って、ＧＤ２陽性症例について量的評価を行った。次いで、結果を、同じＢＭサンプルにおいて５Ｂ１４試験によって得られた結果と比較した。２つのモノクローナル抗体で適用された染色方法により、類似の数の陽性細胞が認められた。ほとんどのサンプルにおいて、ＧＤ２は、神経芽細胞腫細胞および非正常白血球によって高度かつ恒常的に発現されたが、バックグランド染色は、特に、発病時のほとんどのステージ４の患者由来のもののような多数の神経芽細胞腫細胞を含有する調製物において認められた（図３）。この影響は、陽性細胞の識別および計数を妨害する。５Ｂ１４ｍＡｂで処置した同じ症例由来のＣｙｔｏｓｐｉｎは、ほとんど同一の検出感度を示す一方、非特異的またはバックグランド染色は有意に低いかまたは存在しなかった（図３）。すべての症例において、５Ｂ１４ｍＡｂによる染色の質は、若干弱いかまたは低い明るさであったが、明らかにより明確になり、通常、核のプロファイルまたは細胞の形態学的詳細を遮蔽しなかった。染色の品質は、ＢＭサンプルの全体的評価においても役割を果たす細胞の形態学的特質のより容易な同定に寄与する。
【０２５７】
５Ｂ１４ｍＡｂによって認識される表面分子の生化学的特徴付け
代表的な２９３Ｔ（胚線維芽細胞）およびＡＣＮ（神経芽細胞腫）ヒト細胞株を、１２５Ｉで表面標識し、細胞溶解物を５Ｂ１４ｍＡｂで免疫沈降させた。両方の場合において、５Ｂ１４ｍＡｂは、還元（図４、パネルＡ）および非還元（示さず）条件の両方で約１００ｋＤの表面分子を免疫沈降させた。Ｎ−グリコシダーゼＦによる処置後に保持するタンパク質骨格は、約６０ｋＤの分子量を示し、従って、多数のＮ−結合型グリコシル化の存在が推定された。５Ｂ１４反応性分子を、アフィニティークロマトグラフィーによって２９３Ｔ細胞膜から精製した。ゲル内トリプシン消化された分子を、液体クロマトグラフィーおよびタンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって分析した。３つの異なるペプチドは５Ｂ１４反応性分子の同定を可能にした。Ｖ／Ｃ／Ｖ／Ｃの順の４つのＩｇ様ドメインによって特徴付けられた５３４アミノ酸の膜貫通タンパク質に対応することが見出された（サン，Ｍ．（Ｓｕｎ，Ｍ．）、リチャーズ，Ｓ．（Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｓ．）、プラサド，Ｄ．−Ｖ．（Ｐｒａｓａｄ，Ｄ．−Ｖ．）、マイ，Ｘ．−Ｍ．（Ｍａｉ，Ｘ．−Ｍ．）、ルデンスカイ，Ａ（Ｒｕｄｅｎｓｋｙ，Ａ）、およびトン，Ｃ．（Ｄｏｎｇ，Ｃ）（２００２年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８，６２９４−６２９７）。この分子は、最近、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３と呼ばれている（スタインバーグ，Ｐ．（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．）（２００４年））。上記の生化学的分析に従って、Ｎ−グリコシル化部位の推定により高度のＮｘＳ／Ｔコンセンサス配列が示された。４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３は、ヒト第１５染色体（１５ｑ２３−ｑ２４）上にコードされ、これは、ＩｇＶ−ＩｇＣドメインをコードするエキソンの遺伝子複製の結果であると思われる（サン，Ｍ．（Ｓｕｎ，Ｍ．）ら（２００２年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８，６２９４−６２９７）。ヒトＢ７−Ｈ３は、本来、Ｖ／Ｃの順の２つのＩｇ様ドメインによって特徴付けられる分子として記載されたことが留意される（シャポバル，Ａ．−Ｉ．（Ｃｈａｐｏｖａｌ，Ａ．−Ｉ．）ら（２００１年）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，２６９−２７４）。しかし、２Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３は、マウスおいて見出される独特な形態を示す一方、ヒトでは、それは、選択的スプライシングによって作製される短い形態を示すようである（サン，Ｍ．（Ｓｕｎ，Ｍ．）ら（２００２年））。
【０２５８】
５Ｂ１４反応性分子の同一性を明確に確認するために、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ｃＤＮＡによってトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣癌腫（ＣＨＯ−Ｋ）細胞を、５Ｂ１４ｍＡｂとの表面反応性について分析した。すべての場合において、非トランスフェクトＣＨＯ−Ｋ細胞において反応性を検出することができなかった。一方、５Ｂ１４ｍＡｂは、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３細胞トランスフェクタントと強く反応した（図４、パネルＢ）。遠位および膜近位のＶ／Ｃドメイン間の高い％の同一性（スタインバーグ，Ｐ．（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．）（２００４年））に従って、５Ｂ１４ｍＡｂもまた、２Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３細胞トランスフェクタントを認識した（示さず）。
【０２５９】
４Ｉｇ−Ｂ７Ｈ３分子はヒトＮＫ細胞細胞障害性を阻害する
神経芽細胞腫細胞表面で発現される４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３は、ＮＫ仲介認識に対する阻害もしくは増強効果および／または腫瘍細胞の溶解を発揮する可能性がある。この可能性を評価するために、本発明者らは、トランスフェクトされていないかまたは４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３分子でトランスフェクトされているいずれかのＣＨＯ−Ｋ細胞株に対してインビトロで培養したヒトＮＫ細胞の細胞溶解活性を分析した。図５、パネルＡにおいて示されるように、ＮＫ細胞は、非トランスフェクトＣＨＯ−Ｋ細胞を効率的に溶解した。この場合、５Ｂ１４ｍＡｂの添加は、細胞溶解活性に対する阻害または増強効果のいずれも有さなかった。対照的に、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３トランスフェクトＣＨＯ−Ｋ細胞の溶解は、強度に減少した。さらに、溶解は、５Ｂ１４ｍＡｂの存在下で回復することができた。得られる溶解は、非トランスフェクトＣＨＯ−Ｋ細胞のものに匹敵した。細胞トランスフェクタントに対するすべての結果は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３分子もまた、神経芽細胞腫細胞の場合において「保護的」役割を発揮することを強く示唆する。この可能性を確認するために、さらなる実験を、標的細胞として、ステージ４の患者の５つの異なる骨髄吸引物から誘導される新たに精製された神経芽細胞腫細胞を使用して実施した。これらの細胞はＣＤ４５−であり、ＧＤ２、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３（図５、パネルＢ）およびＣＤ５６（示さず）に対して明るい蛍光を示した、即ち、それらは、神経芽細胞腫に典型的な細胞表現型によって特徴付けられた（コマダ，Ｙ．（Ｋｏｍａｄａ，Ｙ．）ら（１９９８年）Ｃａｎｃｅｒ８２，５９１−５９９）。重要なことに、神経芽細胞腫細胞は、特異的抑制性ＮＫ受容体と相互反応することによってＮＫ仲介攻撃から標的細胞を保護することが公知であるＨＬＡクラスＩ分子の発現に対し、事実上ネガティブであった（図５、パネルＢ）であった（モレッタ，Ａ．（Ｍｏｒｅｔｔａ，Ａ．）ら（２００２年）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３，６−８）。
【０２６０】
従って、ＨＬＡクラスＩ分子のｍＡｂ仲介遮断は、神経芽細胞腫細胞のＮＫ仲介溶解に対して増強効果を有さなかった（図５、パネルＢ）。一方、５Ｂ１４ｍＡｂの添加により、細胞溶解の実質的な増強が生じた（図５、パネルＢ）。これらのデータは、明らかに、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３分子がＮＫ細胞仲介細胞障害性をダウンレギュレートし、従って、ＮＫ仲介攻撃から神経芽細胞腫を保護することが可能であることを示す。結果的に、ＮＫ細胞は、必然的に、阻害機能を発揮する４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３特異的受容体を発現すべきである。この仮定は、２Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３または４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３可溶性分子のいずれかによるこの推定受容体の関与がポリクローナルＮＫ細胞においてＩＦＮ−γ産生を誘導しなかった一方、ＮＫｐ３０またはＮＫＧ２Ｄのような古典的な誘発性ＮＫ受容体（アンドレ，Ｐ．（Ａｎｄｒｅ，Ｐ．）ら（２００４年）．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：９６１−９７１）の関与が豊富なサイトカイン放出を生じるという事実によってさらに実証される（図６）。
【０２６１】
従って、最初の報告はＴ細胞に対する推定Ｂ７−Ｈ３受容体の同時刺激機能を示唆した（シャポバル，Ａ．−Ｉ．（Ｃｈａｐｏｖａｌ，Ａ．−Ｉ．）、（２００１年）が、本発明者らの現在の所見は、ヒトＮＫ細胞において、それは活性化機能よりも阻害機能を発揮し得ることを暗示する。
【０２６２】
考察
本発明者らは、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３（サン，Ｍ．（Ｓｕｎ，Ｍ．）ら、（２００２年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８，６２９４−６２９７、スタインバーグ，Ｐ．（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．）（２００４年））を、少なくともＢＭ吸引物における神経芽細胞腫に特異的である新規の表面マーカーとして同定した。本発明者らは、また、Ｂ７ファミリーに属するこの分子が、ＮＫ細胞によって発現される受容体と相互作用することによって、神経芽細胞腫のＮＫ仲介溶解を阻害することを示す。本データは、神経芽細胞腫の診断を改善すること、およびおそらく、新たな治療アプローチの将来の試みにおいて著しい影響を及ぼし得る。
【０２６３】
神経芽細胞腫細胞株によるマウス免疫化によって得られる新規の５Ｂ１４ｍＡｂは、すべての利用可能な神経芽細胞腫細胞株だけではなく、すべての試験した新たに単離された神経芽細胞腫細胞とも反応することが見出された。５Ｂ１４ｍＡｂは、転移性（ｍｅｔｈａｓｔａｔｉｃ）ステージ４の神経芽細胞腫を伴う患者由来のＢＭ吸引物における高い特異性での腫瘍細胞の検出を可能にする。実際に、二重蛍光およびＦＡＣＳ解析によって、５Ｂ１４ｍＡｂは、選択的に染色されたＣＤ４５−陰性腫瘍細胞である一方、神経芽細胞腫細胞同定に現在使用されている抗ＧＤ２ｍＡｂは、ＣＤ４５＋正常造血細胞とのいくつかの反応性も示した。さらに、精製されたＣＤ４５−陰性神経芽細胞腫細胞は、５Ｂ１４ｍＡｂによって均質に染色された。これらのデータは、５Ｂ１４が、抗ＧＤ２ｍＡｂ（ラディシュ，Ｓ．（Ｌａｄｉｓｈ，Ｓ．）ら（１９８７年）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．３９，７３−７６、バレンチノ，Ｌ．（Ｖａｌｅｎｔｉｎｏ，Ｌ．）ら、（１９９０年）Ｂｌｏｏｄ７５，１５６４−１５６７）とは異なり、分析したすべての神経芽細胞腫細胞株を染色したという所見と共に、５Ｂ１４ｍＡｂが神経芽細胞腫細胞を正確に同定し、腫瘍と正常細胞との間を識別するための新規の価値の高い試薬であることを示す。
【０２６４】
分子分析によって示されるように、５Ｂ１４反応性分子は、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７ファミリーの極最近記載されている新規のメンバー（サン，Ｍ．（Ｓｕｎ，Ｍ．）ら、（２００２年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８，６２９４−６２９７、スタインバーグ，Ｐ．（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．）（２００４年）で同定され得る。重要なことに、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３の表面発現は、ＮＫ仲介死滅から腫瘍細胞を保護した。従って、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３細胞トランスフェクタントは、対応する非トランスフェクト標的細胞よりも耐性であった。さらに、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３分子の５Ｂ１４ｍＡｂ仲介遮蔽は、ＮＫ細胞による細胞トランスフェクタントの効率的な死滅を生じさせた。これらのデータはまた、ＮＫ細胞が、神経芽細胞腫細胞上の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３分子との関与時に、ＮＫ細胞細胞障害性のダウンレギュレーションを生じる阻害シグナルを送達する受容体を発現することを示唆する。ＮＫ細胞によって仲介されるそれらの溶解が５Ｂ１４ｍＡｂの存在下でアップレギュレートされ得るため、この所見は、新たに単離された神経芽細胞腫細胞においても確認されている。従って、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３の表面発現は、神経芽細胞腫細胞が免疫応答の制御を免れることを可能にするさらなる機構を提供し得ることを推測することが可能である。特に、ほとんどの新鮮な神経芽細胞腫細胞は、表面ＨＬＡ−クラスＩ分子を発現せず（本報告）、従って、細胞溶解性Ｔリンパ球による検出を免れる。しかし、ＨＬＡ−クラスＩを消失するときに、それらは、潜在的にＮＫ仲介溶解にかかり易くなる（ガリド，Ｆ．（Ｇａｒｒｉｄｏ，Ｆ．）ら（１９９７年）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ１８，８９−９５）。これに関して、ＮＫ細胞機能を阻害することが可能な４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３の発現は、神経芽細胞腫がまたＮＫ仲介制御も免れるさらなる回避の機構を示し得る。４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３は神経芽細胞腫に制限されないが、メラノーマおよび癌腫を含む他の腫瘍によっても発現されるため、ＮＫ細胞の４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３仲介機能阻害がＮＫ細胞からの腫瘍の逸脱のさらなる一般的な機構を示し得ることが考えられる。
【０２６５】
４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３は、細胞表面リガンドの増殖性Ｂ７ファミリーの新規のメンバーである（カルネロ，Ｂ．−Ｍ．（Ｃａｒｒｅｎｏ，Ｂ．−Ｍ．）、およびコリンズ，Ｍ．（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｍ．）（２００２年）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０，２９−５３、チェン，Ｌ．（Ｃｈｅｎ，Ｌ．）（２００４年）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：３３６−３４７）。これらは、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、Ｂ７−Ｈ２（ＩＣＯＳ−Ｌ）、Ｂ７−Ｈ１（ＰＤ−Ｌ１）、Ｂ７−ＤＣ（ＰＤ−Ｌ２）、Ｂ７−Ｈ４、（Ｂ７Ｓ１、Ｂ７ｘ）およびＢＴ３を含む。これらは、活性化（ＣＤ２８，ＩＣＯＳ）または阻害機能（ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１およびＢＴＬＡ）のいずれかを示す受容体によって特異的に認識され（カルネロ，Ｂ．−Ｍ．（Ｃａｒｒｅｎｏ，Ｂ．−Ｍ．）、およびコリンズ，Ｍ．（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｍ．）（２００２年）、チェン，Ｌ．（Ｃｈｅｎ，Ｌ．）（２００４年））、Ｔリンパ球によって主に発現される。従って、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３に特異的な推定抑制性受容体は、ヒトＮＫ細胞によって発現されるべきＢ７ファミリーメンバーに対する第１の受容体を示す。最初の報告が、推定２Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３特異的受容体が、ヒトＴ細胞活性化中の同時刺激機能を発揮することを示唆したことが留意される（シャポバル，Ａ．−Ｉ．（Ｃｈａｐｏｖａｌ，Ａ．−Ｉ．）ら（２００１年）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，２６９−２７４）。しかし、これらのデータは、本発明者らの結果では支持されない。実際に、ヒトＴ細胞に対して発現される４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３に対する推定受容体の関与は、同時刺激機能を生じない一方、マウス２Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３特異的推定受容体は、ＴＨ１応答に対するネガティブな調節因子として機能することが示されている。従って、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３特異的受容体は、ＴおよびＮＫ細胞仲介応答の両方において刺激機能よりも阻害機能を発揮し得ることが考えられるようである。一方、現時点では、このファミリーの他のメンバー（サ，Ｗ．−Ｋ．（Ｓｕｈ，Ｗ．−Ｋ．）ら（２００３年）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４，８９９−９０６）に類似のＢ７−Ｈ３に対する２つの異なる受容体が、それぞれポジティブまたはネガティブなシグナルを伝達することが可能であり得ることを否定することができない。
【０２６６】
４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３分子は、単球由来の未成熟または成熟なＤＣによって高度に発現されることが留意される。最近の多くの研究により、生来の免疫応答の初期段階ならびにＴＨ１表現型に対する以後のＴ細胞応答を形成するときのＮＫとＤＣとの間に生じる架橋の役割が注目されている（モレッタ，Ａ．（Ｍｏｒｅｔｔａ，Ａ．）（２００２年）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，９５７−９６５）。従って、ＤＣ細胞表面における４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３分子のＮＫ仲介認識は、ＮＫ／ＤＣ相互作用中の調節的役割を果たし得ることが推測され得る。本発明者らの本データは、抗４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３ｍＡｂが、ＢＭ、特に、神経芽細胞腫腫瘍再発の部位における腫瘍細胞の特異的検出を可能にする最も信頼できる診断ツールを示し得ることを示唆する。さらに、それらは、神経芽細胞腫およびおそらく、４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３分子を発現する他の腫瘍における新規のＮＫ細胞に基づく（ルッジェーリ，Ｍ．（Ｒｕｇｇｅｒｉ，Ｍ．）、カパンニ，Ｍ．（Ｃａｐａｎｎｉ，Ｍ．）、アーバニ，Ｅ．（Ｕｒｂａｎｉ，Ｅ．）、ペルシオ，Ｋ．（Ｐｅｒｒｕｃｃｉｏ，Ｋ．）、シュロムチク，Ｗ．−Ｄ．（Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋ，Ｗ．−Ｄ．）、トスティ，Ａ．（Ｔｏｓｔｉ，Ａ．）、ポサティ，Ｓ．（Ｐｏｓａｔｉ，Ｓ．）、ロガイア，Ｄ．（Ｒｏｇａｉａ，Ｄ．）、フレッソニ，Ｆ．（Ｆｒａｓｓｏｎｉ，Ｆ．）、アバールサ，Ｆ．（Ａｖｅｒｓａ，Ｆ．）、マーテリ，Ｍ．−Ｆ．（Ｍａｒｔｅｌｌｉ，Ｍ．−Ｆ．）、およびベラルディ，Ａ．（Ｖｅｌａｒｄｉ，Ａ．）（２００２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２９５：２０９７−２１００、ベラルディ，Ａ．（Ｖｅｌａｒｄｉ，Ａ．）、ルッジェーリ，Ｍ．（Ｒｕｇｇｅｒｉ，Ｍ．）、モレッタ，Ａ．（Ｍｏｒｅｔｔａ，Ａ．）、およびモレッタ，Ｌ．（Ｍｏｒｅｔｔａ，Ｌ．）（２００２年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：４３８−４４４）治療的アプローチの将来的開発の鍵を付与し得る。
【０２６７】
参考文献
１．ブロダイル，Ｇ．−Ｍ．（Ｂｒｏｄｅｕｒ，Ｇ．−Ｍ．）Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ．（２００３年）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ．３，２０３−２１６．
２．シュワブ，Ｍ．（Ｓｃｈｗａｂ，Ｍ．）、ウェスターマン，Ｆ．（Ｗｅｓｔｅｒｍａｎｎ，Ｆ．）、ヘロ，Ｂ．（Ｈｅｒｏ，Ｂ．）、およびバーソルド，Ｆ．（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，Ｆ．）（２００３年）Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ．４，４７２−４８０．
３．シュルツ，Ｇ．（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．）、チェレシュ，Ｄ．−Ａ．（Ｃｈｅｒｅｓｈ，Ｄ．−Ａ．）、ヴァーキ，Ｎ．−Ｍ．（Ｖａｒｋｉ，Ｎ．−Ｍ．）、ウー，Ａ．（Ｙｕ，Ａ．）、スタフィレノ，Ｌ．−Ｋ．（Ｓｔａｆｆｉｌｅｎｏ，Ｌ．−Ｋ．）、およびライスフィールド  Ｒ．−Ａ．（Ｒｅｉｓｆｅｌｄ  Ｒ．−Ａ．（１９８４年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４４，５９１４−５９２０．
４．ハコモリ，Ｓ．（Ｈａｋｏｍｏｒｉ，Ｓ．）（１９８４年）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，１０３−１２６
５．ラディシュ，Ｓ．（Ｌａｄｉｓｈ，Ｓ．）、ウー，Ｚ．−Ｌ（Ｗｕ，Ｚ．−Ｌ）、ファイグ，Ｓ．（Ｆｅｉｇ，Ｓ．）、シュワルツ，Ｅ．（Ｓｃｈｗａｒｔｚ，Ｅ．）、フラウトシス，Ｇ．（Ｆｌｏｕｔｓｉｓ，Ｇ．）、ワイリー，Ｆ．（Ｗｉｌｅｙ，Ｆ．）、レナールスキー，Ｃ．（Ｌｅｎａｒｓｋｙ，Ｃ．）、およびシーガー，Ｒ．（Ｓｅｅｇｅｒ，Ｒ．）（１９８７）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．３９，７３−７６．
６．バレンチノ，Ｌ．（Ｖａｌｅｎｔｉｎｏ，Ｌ．）、モス，Ｔ．（Ｍｏｓｓ，Ｔ．）、オルソン，Ｅ．（Ｏｌｓｏｎ，Ｅ．）、ワン，Ｈ．−Ｊ．（Ｗａｎｇ，Ｈ．−Ｊ．）、エラショフ，Ｒ．（Ｅｌａｓｈｏｆｆ，Ｒ．）、およびラディシュ，Ｓ．（Ｌａｄｉｓｈ，Ｓ．）（１９９０）Ｂｌｏｏｄ７５，１５６４−１５６７
７．シボリ，Ｓ．（Ｓｉｖｏｒ，Ｓ．）、パロリニ，Ｓ．（Ｐａｒｏｌｉｎｉ，Ｓ．）、マルセナロ，Ｅ．（Ｍａｒｃｅｎａｒｏ，Ｅ．）、カストリコニ，Ｒ．（Ｃａｓｔｒｉｃｏｎｉ，Ｒ．）、ペンデ，Ｄ．（Ｐｅｎｄｅ，Ｄ．）、ミロ，Ｒ．（Ｍｉｌｌｏ，Ｒ．）、およびモレッタ，Ａ．（Ｍｏｒｅｔｔａ，Ａ．）（２０００年）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１０７：２２０−２２５．
８．ルッジェーリ，Ｌ．（Ｒｕｇｇｅｒｉ，Ｌ．）、カパンニ，Ｍ．（Ｃａｐａｎｎｉ，Ｍ．）、アーバニ，Ｅ．（Ｕｒｂａｎｉ，Ｅ．）、ペルシオ，Ｋ．（Ｐｅｒｒｕｃｃｉｏ，Ｋ．）、シュロムチク，Ｗ．−Ｄ．（Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋ，Ｗ．−Ｄ．）、トスティ，Ａ．（Ｔｏｓｔｉ，Ａ．）、ポサティ，Ｓ．（Ｐｏｓａｔｉ，Ｓ．）、ロガイア，Ｄ．（Ｒｏｇａｉａ，Ｄ．）、フレッソニ，Ｆ．（Ｆｒａｓｓｏｎｉ，Ｆ．）、アバールサ，Ｆ．（Ａｖｅｒｓａ，Ｆ．）、マーテリ，Ｍ．−Ｆ．（Ｍａｒｔｅｌｌｉ，Ｍ．−Ｆ．）、およびベラルディ，Ａ．（Ｖｅｌａｒｄｉ，Ａ．）（２００２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ．２９５：２０９７−２１００．
９．ベラルディ，Ａ．（Ｖｅｌａｒｄｉ，Ａ．）、ルッジェーリ，Ｍ．（Ｒｕｇｇｅｒｉ，Ｍ．）、モレッタ，Ａ．（Ｍｏｒｅｔｔａ，Ａ．）、およびモレッタ，Ｌ．（Ｍｏｒｅｔｔａ，Ｌ．）（２００２年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：４３８−４４４．
１０．サン，Ｍ．（Ｓｕｎ，Ｍ．）、リチャーズ，Ｓ．（Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｓ．）、プラサド，Ｄ．−Ｖ．（Ｐｒａｓａｄ，Ｄ．−Ｖ．）、マイ，Ｘ．−Ｍ．（Ｍａｉ，Ｘ．−Ｍ．）、ルデンスカイ，Ａ（Ｒｕｄｅｎｓｋｙ，Ａ）、およびトン，Ｃ．（Ｄｏｎｇ，Ｃ）（２００２年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６８，６２９４−６２９７
１１．スタインバーグ，Ｐ．（Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ｐ．）、マジディック，Ｏ．（Ｍａｊｉｄｉｃ，Ｏ．）、ダルダク（Ｄｅｒｄａｋ，Ｓ．−Ｖ．）、フィステルシャマー，Ｋ．（Ｐｈｉｓｔｅｒｓｈａｍｍｅｒ，Ｋ）、キルヒバーグ，Ｓ．（Ｋｉｒｃｈｂｅｒｇｅｒ，Ｓ．）、クラウザー，Ｃ．（Ｋｌａｕｓｅｒ，Ｃ．）、ズィラビンガー，Ｇ．（Ｚｌａｂｉｎｇｅｒ，Ｇ．）、ピクル，Ｗ．−Ｆ．（Ｐｉｃｋｌ，Ｗ．−Ｆ．）、ストックル，Ｊ．（Ｓｔｏｃｋｌ，Ｊ）およびナップ，Ｗ．（Ｋｎａｐｐ，Ｗ）（２００４年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２，２３５２−２３５９
１２．ボッティノ，Ｃ．（Ｂｏｔｔｉｎｏ，Ｃ．）、カストリコニ，Ｒ．（Ｃａｓｔｒｉｃｏｎｉ，Ｒ．），ペンデ，Ｄ．（Ｐｅｎｄｅ，Ｄ．）、リベラ，Ｐ．（Ｒｉｖｅｒａ，Ｐ．）、ナンニ，Ｍ．（Ｎａｎｎｉ，Ｍ．）、カーネモラ，Ｂ．（Ｃａｒｎｅｍｏｌｌａ，Ｂ．）、カントーニ，Ｃ．（Ｃａｎｔｏｎｉ，Ｃ．）、グラッシ，Ｊ．（Ｇｒａｓｓｉ，Ｊ．）、マルセナロ，Ｓ．（Ｍａｒｃｅｎａｒｏ，Ｓ．）、レイモンド，Ｎ．（Ｒｅｙｍｏｎｄ，Ｎ．）、バイタレ，Ｍ．（Ｖｉｔａｌｅ，Ｍ．）、モレッタ，Ｌ．（Ｍｏｒｅｔｔａ，Ｌ．）、ロペス，Ｍ．（Ｌｏｐｅｚ，Ｍ．）、およびモレッタ，Ａ．（Ｍｏｒｅｔｔａ，Ａ．）（２００３年）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９８，５５７−５６７．
１３．ブロダイル，Ｇ．−Ｍ．（Ｂｒｏｄｅｕｒ，Ｇ．−Ｍ．）、プリチャード，Ｊ．（Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ，Ｊ．）、ベルトルド，Ｆ．（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，Ｆ．）、カールセン，Ｎ．−Ｌ．（Ｃａｒｌｓｅｎ，Ｎ．−Ｌ．）、カステル，Ｖ．（Ｃａｓｔｅｌ，Ｖ．）、カステルベリー，Ｒ．−Ｐ（Ｃａｓｔｅｌｂｅｒｒｙ，Ｒ．−Ｐ）、デベルナルディ，Ｂ．（Ｄｅ  Ｂｅｒｎａｒｄｉ，Ｂ．）、エバンス，Ａ．−Ｅ．（Ｅｖａｎｓ，Ａ．−Ｅ．）、ファブロット，Ｍ．（Ｆａｖｒｏｔ，Ｍ．）、ヘドボルグ，Ｆ．（Ｈｅｄｂｏｒｇ，Ｆ．）ら（１９９３年）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．１１，１４６６−１４７７．
１４．アンドレ，Ｐ．（Ａｎｄｒｅ，Ｐ．）、カストリコニ，Ｒ．（Ｃａｓｔｒｉｃｏｎｉ，Ｒ．）、エスペリ，Ｍ．（Ｅｓｐｅｌｉ，Ｍ．）、アンフォッシ．Ｎ．（Ａｎｆｏｓｓｉ．Ｎ．）、フアレス，Ｔ．（Ｊｕａｒｅｚ，Ｔ．）、フエ．Ｓ．（Ｈｕｅ．Ｓ．）、コンウェイ．Ｈ．（Ｃｏｎｗａｙ．Ｈ．）、ロマングネ，Ｆ．（Ｒｏｍａｇｎｅ，Ｆ．）、ドンデロ，Ａ．（Ｄｏｎｄｅｒｏ，Ａ．）、ナンニ，Ｍ．（Ｎａｎｎｉ，Ｍ．）、カイラット−ズックマン，Ｓ．（Ｃａｉｌｌａｔ−Ｚｕｃｍａｎ，Ｓ．）、ロイレット．Ｄ．Ｈ．（Ｒａｕｌｅｔ．Ｄ．Ｈ．）、ボッティノ，Ｃ．（Ｂｏｔｔｉｎｏ，Ｃ．）、ヴィヴィエル，Ｅ．（Ｖｉｖｉｅｒ，Ｅ．）、モレッタ，Ａ．（Ｍｏｒｅｔｔａ，Ａ．）およびポール．Ｐ．（Ｐａｕｌ．Ｐ．）（２００４年）．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３４：９６１−９７１．
１５．ファルコ，Ｍ．（Ｆａｌｃｏ，Ｍ．）、マルセナロ，Ｅ．（Ｍａｒｃｅｎａｒｏ，Ｅ．）、ロミオ，Ｅ．（Ｒｏｍｅｏ，Ｅ．）、ベローラ，Ｅ．（Ｂｅｌｌｏｒａ，Ｆ．）、マラス，Ｄ．（Ｍａｒｒａｓ，Ｄ）、ベリ，Ｆ．（Ｖｅｌｙ，Ｆ．）、フェラッシ，Ｇ．（Ｆｅｒｒａｃｃｉ，Ｇ．）、モレッタ，Ｌ．（Ｍｏｒｅｔｔａ，Ｌ．）、モレッタ，Ａ．（Ｍｏｒｅｔｔａ，Ａ．）およびボッティノ  Ｃ．（Ｂｏｔｔｉｎｏ  Ｃ．）（２００４年）．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１６．シャポバル，Ａ．−Ｉ．（Ｃｈａｐｏｖａｌ，Ａ．−Ｉ．）、ニ，Ｊ．（Ｎｉ，Ｊ．）、ラウ，Ｊ．−Ｓ．（Ｌａｕ，Ｊ．−Ｓ．）、ウェイルコックス，Ｒ．−Ａ．（Ｗｉｌｃｏｘ，Ｒ．−Ａ．）、フリース，Ｄ．−Ｂ．（Ｆｌｉｅｓ，Ｄ．−Ｂ．）、リウー，Ｄ．（Ｌｉｕ，Ｄ．）、トン，Ｈ．（Ｄｏｎｇ，Ｈ．）、シーカ，ＧＬ．（Ｓｉｃａ，ＧＬ．）、チュー，Ｇ．（Ｚｈｕ，Ｇ．）、タマダ，Ｋ．（Ｔａｍａｄａ，Ｋ．）、およびチェン，Ｌ．（Ｃｈｅｎ，Ｌ．）（２００１年）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，２６９−２７４．
１７．コマダ，Ｙ．（Ｋｏｍａｄａ，Ｙ．）、チャン，Ｘ．−Ｌ．（Ｚｈａｎｇ，Ｘ．−Ｌ．）、チョウ，Ｙ．−Ｗ．（Ｚｈｏｕ，Ｙ．−Ｗ．）、イナバ，Ｈ．（Ｉｎａｂａ，Ｈ．）、デグチ，Ｔ．（Ｄｅｇｕｃｈｉ，Ｔ．）、アズマ，Ｅ．（Ａｚｕｍａ，Ｅ．）、およびサクライ  Ｍ．（Ｓａｋｕｒａｉ  Ｍ．）（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ．８２，５９１−５９９．
１８．モレッタ，Ａ．（Ｍｏｒｅｔｔａ，Ａ．）、ボッティノ，Ｃ．（Ｂｏｔｔｉｎｏ，Ｃ．）、ミンガリ，Ｍ．−Ｃ．（Ｍｉｎｇａｒｉ，Ｍ．−Ｃ．）、バイアソルニ，Ｒ．（Ｂｉａｓｓｏｎｉ，Ｒ．）、およびモレッタ，Ｌ．（Ｍｏｒｅｔｔａ，Ｌ．）（２００２年）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３，６−８．
１９．ガリド，Ｆ．（Ｇａｒｒｉｄｏ，Ｆ．）、ルイス−キャベロ，Ｆ．（Ｒｕｉｚ−Ｃａｂｅｌｌｏ，Ｆ．）、カブレラ，Ｔ．（Ｃａｂｒｅｒａ，Ｔ．）、ペレス−ヴィラール，Ｊ．−Ｊ．（Ｐｅｒｅｚ−Ｖｉｌｌａｒ，Ｊ．−Ｊ．）、ロペス−ボテト，Ｍ．（Ｌｏｐｅｚ−Ｂｏｔｅｔ，Ｍ．）、ダガン−キーン，Ｍ．（Ｄｕｇｇａｎ−Ｋｅｅｎ，Ｍ．）、およびスターン，Ｐ．−Ｌ．（Ｓｔｅｒｎ，Ｐ．−Ｌ．）（１９９７年）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ１８，８９−９５
２０．カルネロ，Ｂ．−Ｍ．（Ｃａｒｒｅｎｏ，Ｂ．−Ｍ．）、およびコリンズ，Ｍ．（Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｍ．）（２００２年）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０，２９−５３．
２１．チェン，Ｌ．（Ｃｈｅｎ，Ｌ．）（２００４年）．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：３３６−３４７．
２３．サ，Ｗ．−Ｋ．（Ｓｕｈ，Ｗ．−Ｋ．）、ガジェスカ，Ｂ．−Ｕ．（Ｇａｊｅｗｓｋａ，Ｂ．−Ｕ．）、オカダ，Ｈ．（Ｏｋａｄａ，Ｈ．）、グロンスキー，Ｍ．−Ａ．（Ｇｒｏｎｓｋｉ，Ｍ．−Ａ．）、バートラム，Ｅ．−Ｍ．（Ｂｅｒｔｒａｍ，Ｅ．−Ｍ．）、ダウィキ，Ｗ．（Ｄａｗｉｃｋｉ，Ｗ．）、ダンカン，Ｇ．−Ｓ．（Ｄｕｎｃａｎ，Ｇ．−Ｓ．）、ブクジンスキー，Ｊ．（Ｂｕｋｃｚｙｎｓｋｉ，Ｊ．）、プライテ，Ｓ．（Ｐｌｙｔｅ，Ｓ．）、エリア，Ａ．（Ｅｌｉａ，Ａ．）、ウェークハム，Ａ．（Ｗａｋｅｈａｍ，Ａ．）、イチエ，Ａ．（Ｉｔｉｅ，Ａ．）、チュン，Ｓ．（Ｃｈｕｎｇ，Ｓ．）、ダコスタ，Ｊ．（Ｄａ  Ｃｏｓｔａ，Ｊ．）、アールヤ，Ｓ．（Ａｒｙａ，Ｓ．）、ホラン，Ｔ．（Ｈｏｒａｎ，Ｔ．）、キャンベル，Ｐ．（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｐ．）、ガイダ，Ｋ．（Ｇａｉｄａ，Ｋ．）、オハシ，Ｐ．−Ｓ．（Ｏｈａｓｈｉ，Ｐ．−Ｓ．）、ワッツ，Ｔ．−Ｈ．（Ｗａｔｔｓ，Ｔ．−Ｈ．）、ヨシナガ，Ｓ．−Ｋ．（Ｙｏｓｈｉｎａｇａ，Ｓ．−Ｋ．）、ブレイ，Ｍ．−Ｒ．（Ｂｒａｙ，Ｍ．−Ｒ．）、ジョルダナ，Ｍ．（Ｊｏｒｄａｎａ，Ｍ．）、およびマク，Ｔ．−Ｗ．（Ｍａｋ，Ｔ．−Ｗ．）（２００３年）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４，８９９−９０６．
２４．モレッタ，Ａ．（Ｍｏｒｅｔｔａ，Ａ．）（２００２年）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，９５７−９６５．
【０２６８】
本明細書において引用された刊行物、特許出願および特許を含むすべての参考文献は、あたかも各文献が個々におよび具体的に参照により援用されることが意図され、その全体が本明細書に記載されているかのごとく、本明細書において参照により援用される。
【０２６９】
すべての表題および副題は、簡便のためのみに本明細書において使用され、いかなる方法においても本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
【０２７０】
すべての可能なバージョンにおける上記の要素のいかなる組み合わせも、本明細書所において他に示すかまたは文脈において他に明らかな矛盾が認められない限り、本発明に包含される。
【０２７１】
本発明の説明に関して使用される単数形（「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」）および類似の指示対象は、本明細書において他に示すかまたは文脈において他に明らかな矛盾が認められない限り、単数および複数の両方を含むものと解釈されるべきである。
【０２７２】
本明細書に記載の値の範囲の詳細な記載は、本明細書において他に示さない限り、範囲に当てはまる各個別の値について個々に言及する簡潔な表現方法としての役割を果たすことを単に目的としており、各個々の値は、あたかもそれが本明細書において個々に引用されているがごとく、本明細書に援用される。他に説明しない限り、本明細書において提供されるすべての正確な値は、対応するおおよその値の代表値である（例えば、特定の因子または測定について提供されるすべての正確な値もまた、対応するおおよその測定値を提供し、近似を示唆する「約」によって修飾される）。
【０２７３】
本明細書に記載のすべての方法は、本明細書において他に示すかまたは文脈において他に明らかな矛盾が認められない限り、任意の適切な順序で実施することができる。
【０２７４】
本明細書において提供される任意およびすべての例、または例示的語句（例えば、「のような（ｓｕｃｈ  ａｓ）」）は、単に本発明をより良好に例示することを目的としており、他に示さない限り、本発明の範囲を限定しない。本明細書における語句は、明白に説明しない限り、あらゆる要素が本発明の実施に必須であることを示すと解釈されるべきである。
【０２７５】
本明細書における特許明細書の引用および援用は、簡便のために行われており、そのような特許明細書の有効性、特許可能性および／または権利行使可能性のあらゆる見解に反映しない。
【０２７６】
要素に関する「含んでなる」、「有する」、「含む」または「含有する」などの用語を使用する本発明のあらゆる態様あるいは実施形態の本明細書における説明は、他に説明するかまたは文脈において他に明らかな矛盾が認められない限り、該特定の要素「からなる」、「から本質的になる」、または「実質的に含んでなる」本発明の類似の態様または実施形態への支持を提供することを目的とする（例えば、本明細書において要素を含んでなるものとして説明される組成物は、他に説明するかまたは文脈において他に明らかな矛盾が認められない限り、該要素からなる組成物をもまた説明しているものと理解すべきである）。
【０２７７】
本発明は、適用可能な法律によって許可された最大限の範囲で本明細書に記載の態様または特許請求の範囲に引用される主題のすべての変更および等価物を含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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