(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検試料における普通系コムギの存在を検出する方法であって、被検試料から抽出した核酸を鋳型として、配列番号５に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーとを用いて、ＰＣＲ法を実施し、ＰＣＲ増幅産物の存在を検出することを含む、上記方法。
【請求項２】
被検試料における普通系コムギの存在を検出する方法であって、被検試料から抽出した核酸を鋳型として、配列番号５に示される塩基配列からなるプライマー、配列番号６に示される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号１１に示される塩基配列からなる核酸プローブとを用いて、定量ＰＣＲ法を実施し、普通系コムギの存在を定性的及び／又は定量的に検出する方法。
【請求項３】
配列番号１１に示される塩基配列からなる核酸プローブが標識核酸プローブであって、ＰＣＲ中に、該標識核酸プローブがもたらす増幅産物量に応じたシグナルをモニターして増幅曲線を得ることを含む、請求項２記載の普通系コムギの存在を定性的及び／又は定量的に検出する方法。
【請求項４】
配列番号１１に示される塩基配列からなる核酸プローブが標識核酸プローブであって、ＰＣＲ中に、該標識核酸プローブがもたらす増幅産物量に応じたシグナルをモニターして増幅曲線を得て、予め作成した検量線を用いて、普通系コムギの存在を定量的に検出する、請求項２記載の方法。
【請求項５】
配列番号５に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーとを含むプライマーセット。
【請求項６】
配列番号５に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーを用いた定量的ＰＣＲ用の、配列番号１１に示される塩基配列からなる核酸プローブ。
【請求項７】
配列番号１１に示される塩基配列からなり、その５’末端が蛍光物質で修飾され、及びその３’末端がクエンチャー物質で修飾されている、請求項６記載の核酸プローブ。
【請求項８】
被検試料における普通系コムギ及び／又は普通系コムギ以外のコムギの存在を検出する方法であって、
（１）被検試料から核酸を抽出して核酸試料を調製し、
(a) 該核酸試料を用いて、配列番号５に示される塩基配列からなるプライマー、配列番号６に示される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号１１に示される塩基配列からなる核酸プローブとを用いて、定量ＰＣＲ法を実施し、該核酸プローブがもたらす増幅産物量に応じたシグナルをモニターして増幅曲線を得て、普通系コムギの存在を検出すること、及び
(b) 該核酸試料を用いて、配列番号９に示される塩基配列からなるプライマー、配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマー、及び配列番号１３に示される塩基配列からなる核酸プローブとを用いて、定量ＰＣＲ法を実施し、該核酸プローブがもたらす増幅産物量に応じたシグナルをモニターして増幅曲線を得て、コムギの存在を検出すること、及び
（２）(a)と(b)との結果を比較すること
を含む、上記方法。
【請求項９】
（１）(a)において、核酸プローブがもたらす増幅産物量に応じたシグナルをモニターして増幅曲線を得て、予め作成した検量線を用いて、普通系コムギの存在を定量的に検出し、及び
(b)において核酸プローブがもたらす増幅産物量に応じたシグナルをモニターして増幅曲線を得て、予め作成した検量線を用いて、コムギの存在を定量的に検出し、及び
（２）(a)における定量値と(b)における定量値とを比較する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
配列番号１１に示される塩基配列からなる核酸プローブ及び配列番号１３に示される塩基配列からなる核酸プローブが、各々標識核酸プローブである、請求項８又は９記載の方法。
【請求項１１】
配列番号１１に示される塩基配列からなる核酸プローブがその５’末端が蛍光物質で修飾され、及びその３’末端がクエンチャー物質で修飾されている核酸プローブであって、及び配列番号１３に示される塩基配列からなる核酸プローブがその５’末端が蛍光物質で修飾され、及びその３’末端がクエンチャー物質で修飾されている核酸プローブである、請求項８〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
配列番号５に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号６に示される塩基配列からなるプライマーとのプライマーセットを含む、普通系コムギ検出用キット。
【請求項１３】
さらに、配列番号１１に示される塩基配列からなり、その５’末端が蛍光物質で修飾され、及びその３’末端がクエンチャー物質で修飾されている核酸プローブを含む、請求項１２記載の普通系コムギ検出用キット。
【請求項１４】
さらに、配列番号９に示される塩基配列からなるプライマーと配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーとのプライマーセット、及び配列番号１３に示される塩基配列からなり、その５’末端が蛍光物質で修飾され、及びその３’末端がクエンチャー物質で修飾されている核酸プローブとを含む、請求項１３記載の普通系コムギ検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＲ法を利用した普通系コムギの特異的な検出法に関する。本発明は具体的には、食品原料や加工食品など各種被検試料に含まれる普通系コムギを特異的に定性的及び／又は定量的に検出する方法に関する。本発明は、さらに、被検試料に含まれるコムギが普通系コムギであるか、又は普通系コムギ以外の例えばデュラムコムギなどであるかの判別をすることができ、さらにはその双方が存在することを検出できる方法に関する。本発明はまた、上記の検出方法に用いるプライマーセット、核酸プローブ及び検出用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
食の安全・安心の観点から、消費者は食品の表示制度に高い関心を寄せている。食品への表示は、消費者自らが食品の品質を判断し選択する上でなくてはならないものとなっている。小麦は様々な加工工程を経て各種製品となり、市場に流通している。その代表的な製品の一つであるマカロニ類の表示は加工食品品質表示基準及びマカロニ類品質表示基準に定められており、「デュラムコムギのセモリナ」、「デュラムコムギ粉」、「強力小麦のファリナ」又は「強力小麦粉」を使用した原料小麦粉の多いものから順に表示することとなっている。製造過程における追跡調査を除けば、それら小麦加工食品に含まれる普通系コムギとデュラムコムギとを定性的及び／又は定量的に判別可能な技術は存在せず、その技術の開発が求められている。
【０００３】
これまでに様々な技術を駆使してコムギを特異的且つ高感度に検出するための手法が考案されてきた。それらの手法は、基本的に被検試料中に含まれるコムギ由来のタンパク質ないしはＤＮＡを検出対象としている手法に分類される。
タンパク質を検出する手法としては、電気泳動法、ウエスタンブロッティング法、免疫化学的方法、あるいはそれらを組み合わせた方法などが挙げられる。特にＥＬＩＳＡ法は、周辺機器や試薬類が取り揃えられているため、広く市場に受け入れられている。
しかしながら、普通系コムギとデュラムコムギの種の起源は共通性が極めて高く、それら個体を形成する諸成分も近似している。タンパク質も例外ではなく、タンパク質の構成比は異なるものの、各コムギに含まれるタンパク質の種類に差はほとんど無い。それ故、タンパク質レベルで普通系コムギとデュラムコムギを判別することは困難である。
他方で、遺伝子増幅技術の一つであるＰＣＲ法を用いてコムギを特異的に検出するための技術も幾つか考案されてきた。しかしながら、コムギのＤＮＡや遺伝子の解析が必ずしも十分ではないために、最適な検査方法の開発には困難をきたしている。
【０００４】
非特許文献１では、コムギＤゲノムにコードされているＷｘ−Ｄ１遺伝子を標的として、ＰＣＲを利用したコムギ検出法が報告された。この検査法は、極めて特異性高く普通系コムギを検出することが可能であり、植物体・穀粒・コムギ粉等のコムギ加工品の検査には最適である。当該検査法では、Ｄゲノムを有しないデュラムコムギは検出されない。
一方、特許文献１では、コムギＡ、Ｂ、ＤゲノムにコードされるスターチシンターゼII（Ｓｔａｒｃｈ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ  II、略称：ＳＳII）遺伝子を標的としてＰＣＲを利用した定性的及び／又は定量的にコムギを検出する方法が開示された。この検出法によると、ＳＳII−Ａ、Ｂ、Ｄの共通領域を標的として特異的且つ高感度にコムギを検出することが可能である。特許文献１でＳＳII−Ｄを特異的に判別するプライマーセットが開示されたが、必ずしも特異性が保障されるものではなく、更に定量的測定には不適であった。
非特許文献２では、加熱などの中・高度加工過程において原料のゲノムが物理的に切断される事が報告された。コムギゲノムのＰＣＲ増幅標的領域が長いと加工工程によってその内部が切断されるため、定量的ＰＣＲによる測定値が実際のコムギの含有量を反映しない可能性がある。それ故、中・高度加工を受けてコムギゲノムが断片化されたとしても、ＰＣＲ標的領域が断片化を受ける可能性が低くなるようにする工夫が必要である。
従って、食品原材料や加工処理された食品に含まれる普通系コムギを高い特異性をもって且つ高感度で検出する方法が望まれている。また、食品原材料や加工処理された食品に含まれる普通系コムギと、普通系コムギ以外の例えばデュラムコムギを定性的及び／又は定量的に判別して検出する適切な手法が未だ存在せず、その検出方法の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００９−５５８８号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】イイダ・エト・オル、デヴェロップメント・オブ・タキソン−スペシフィック・シークエンス・オブ・コモン・ウィート・フォオ・ザ・デテクション・オブ・ジェネティカリィ・モディファイド・ウィート、ジャーナル・オブ・アグリカルチャア・フード・ケミストリー、２００５年、８月号、１０；５３（１６）：６２９４−３００（Iiｄａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔａｘｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｃｏｍｍｏｎ  ｗｈｅａｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｗｈｅａｔ．  Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．  ２００５  Ａｕｇ  １０；５３（１６）：６２９４−３００．）
【非特許文献２】ヨシムラ・エト・オル、コンパラティブ・スタディーズ・オブ・ザ・クアンティフィケイション・オブ・ジェネティカリー・モディファイド・オーガニズムズ・イン・フーズ・プロセスド・フロム・マイズ・アンド・ソイ・ユージング・トライアル・プロデューシング、ジャーナル・オブ・アグリカルチャア・フード・ケミストリー、２００５年、５月号、２３；５３（６）：２０６０−９（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｉｎ  ｆｏｏｄｓ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  ｆｒｏｍ  ｍａｉｚｅ  ａｎｄ  ｓｏｙ  ｕｓｉｎｇ  ｔｒｉａｌ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ．  Ｊ  Ａｇｒｉｃ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．  ２００５  Ｍａｒ  ２３；５３（６）：２０６０−９．）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、食品原料や加工食品など各種被検試料に含まれるコムギのうち、普通系コムギを特異的に且つ高感度で、定性的及び／又は定量的に検出する方法を提供することである。本発明はまた、食品原材料や加工処理された食品に含まれる普通系コムギと、普通系コムギ以外のコムギ、例えばデュラムコムギとを、定性的及び／又は定量的に判別し検出する方法を提供することを目的とする。
本発明はさらに、ＰＣＲ法を用いた上記の検出方法に使用することができる、プライマーセット、核酸プローブ、及び検出用キットを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは上記課題を達成するために鋭意研究を重ねた結果、コムギのＤゲノム上にコードされているＳＳII（Ｓｔａｒｃｈ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ  II−Ｄ、略称：ＳＳII−Ｄ）に特異的な塩基配列を見出し、この塩基配列を基盤としてプライマーセットを設計し、これを用いてＰＣＲ法を実施することにより、被検試料中に含まれるコムギのうち普通系コムギを特異的且つ高感度で検出することを見出した。本発明者らはまた、定量ＰＣＲ法を実施するに当たって有用な核酸プローブを見出すべく、ＳＳII−Ｄ遺伝子上、上記のプライマーセットに挟まれる領域の塩基配列の中から、特定の核酸プローブを設計した。
本発明者らはさらに、上記の普通系コムギを検出する方法と、コムギのＡ、Ｂ、Ｄゲノム上にコードされるＳＳIIの共通領域を特異的且つ高感度で検出して、コムギを広範囲に検出する方法とを組み合わせて、これらの方法から得られる結果を相対比較及び／又は絶対比較することにより、被検試料中に含まれる普通系コムギと普通系コムギ以外の例えばデュラムコムギとを判別できることを見出した。
【０００９】
コムギのゲノムはＡ、Ｂ、Ｄと称される３種類のゲノムから構成されており、各々７本の染色体を有している。普通系コムギはＡＡＢＢＤＤの六倍体であり、デュラムコムギはＡＡＢＢの四倍体である。これまでに数多くのコムギ遺伝子が同定されており、それら遺伝子の配座に関する情報も蓄積されているが、それらは必ずしも十分ではない。
本発明では、その中でも特にＡ、Ｂ、Ｄの各ゲノムにおける配座が決定されているＳｔａｒｃｈ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ  II（略称ＳＳII−Ａ、ＳＳII−Ｂ、ＳＳII−Ｄ）に着目した。これらＳＳIIはコムギＡ、Ｂ、Ｄゲノム各々の７番染色体の短腕にコードされていることが報告されている（シンバタ・エト・オル、ミューテーションズ・イン・ウィート・スターチ・シンターゼ・II・ジーンズ・アンド・ピーシーアール・ベースド・セレクション・オブ・ア・エスジーピー−１・ヌル・ライン、セオリティカル・アンド・アプライド・ジェネティクス、２００５年、１０月号、１１１（６）：１０７２−９．（Ｓｈｉｍｂａｔａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｗｈｅａｔ  ｓｔａｒｃｈ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  II  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ＳＧＰ−１  ｎｕｌｌ  ｌｉｎｅ．  Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ．  ２００５  Ｏｃｔ；１１１（６）：１０７２−９．）
【００１０】
Ａ、Ｂ及びＤの各ゲノムにコードされているＳＳIIの塩基配列は微妙に異なっており、プライマーセットの設計次第ではＳＳII−Ａ、Ｂ、Ｄの各々を特異的に見分けることも可能である。これら情報を総括し、ＳＳII−Ａ、ＳＳII−Ｂ、ＳＳII−Ｄ間の微妙に異なる特徴的な塩基配列を見出すことによって、Ｄゲノムを有する普通系コムギ群を特異的に検出することが可能であるという結論を導き出した。
すなわち、普通系コムギを構成するＤゲノムにコードされるＳＳII−Ｄにおいて特徴的な塩基配列であり、且つＤゲノムを有していないデュラムコムギや他の植物に交叉しない塩基配列を選抜し、該塩基配列に相補的にハイブリダイズするプライマーセット及び核酸プローブを設計し、それらを用いたＰＣＲ法を実施して、被検試料中に含まれる普通系コムギを検出することに至った。さらに、このＰＣＲ法の実施とともに、同一の試料に対して、先に開発した方法、すなわちＳＳII−Ａ、Ｂ、Ｄ共通領域を標的としたＰＣＲ法を実施し、両ＰＣＲ法によるＰＣＲ増幅産物の発現を相対比較及び／又は絶対比較することによって、被検試料中に含まれるコムギのうち普通系コムギと、普通系コムギ以外のコムギ、例えばデュラムコムギなどとを、定性的及び／又は定量的に判別できることに至った。
【００１１】
従って本発明は、被検試料における普通系コムギの存在を検出する方法であって、被検試料から抽出した核酸を鋳型として、配列番号５に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号６に示される塩基配列を有するプライマーとを用いて、ＰＣＲ法を実施し、ＰＣＲ増幅産物の存在を検出することを含む方法である。ここで、ＰＣＲ増幅産物の存在は例えば電気泳動法などの公知の手段で確認することができ、ＰＣＲ増幅産物が認められれば普通系コムギの存在が肯定される。
【００１２】
本発明はさらに、上記のプライマーセットと所定の核酸プローブを用いて定量ＰＣＲ法を実施して、普通系コムギの存在を定性的及び／又は定量的に検出する方法にも向けられている。よって、本発明はまた、被検試料における普通系コムギの存在を検出する方法であって、被検試料から抽出した核酸を鋳型として、配列番号５に示される塩基配列を有するプライマー、配列番号６に示される塩基配列を有するプライマー、及び配列番号１１に示される塩基配列を有する核酸プローブとを用いて、定量ＰＣＲ法を実施し、普通系コムギの存在を定性的及び／又は定量的に検出する方法である。本発明のこの方法の実施態様において、配列番号１１に示される塩基配列を有する核酸プローブは具体的には標識核酸プローブであって、ＰＣＲ中に、該標識核酸プローブがもたらす増幅産物量に応じたシグナルをモニターして増幅曲線を得て、普通系コムギの存在を定性的及び／又は定量的に検出することができる。
上記方法の実施態様において、段階希釈したスタンダードサンプルで定量ＰＣＲ法を予め実施し、増幅曲線を得て適当な閾値（Threshold）を設定することでＣｔ値（Threshold Cycle)を算出し、初期鋳型量との関連で検量線を作成しておくことにより、この検量線を用いて、被検試料における初期鋳型量を求めることができる。従って、更なる実施態様として、上記定量ＰＣＲ法の実施に当たって、予め作製した検量線を用いて、普通系コムギの存在を定量的に検出することができる。
本発明はさらに、配列番号５に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号６に示される塩基配列を有するプライマーとを含むプライマーセット、及び配列番号１１に示される塩基配列を有する核酸プローブ、及び配列番号１１に示される塩基配列を有し、その５’末端が蛍光物質で修飾され、及びその３’末端がクエンチャー物質で修飾されている、核酸プローブに向けられている。
【００１３】
本発明はまた、被検試料における普通系コムギ及び／又は普通系コムギ以外のコムギの存在を検出する方法であって、
（１）被検試料から核酸を抽出して核酸試料を調製し、
(a) 該核酸試料を用いて、配列番号５に示される塩基配列を有するプライマー、配列番号６に示される塩基配列を有するプライマー、及び配列番号１１に示される塩基配列を有する核酸プローブとを用いて、定量ＰＣＲ法を実施し、該核酸プローブがもたらす増幅産物量に応じたシグナルをモニターして増幅曲線を得て、普通系コムギの存在を検出すること、及び
(b) 該核酸試料を用いて、配列番号９に示される塩基配列を有するプライマー、配列番号１０に示される塩基配列を有するプライマー、及び配列番号１３に示される塩基配列を有する核酸プローブとを用いて、定量ＰＣＲ法を実施し、該核酸プローブがもたらす増幅産物量に応じたシグナルをモニターして増幅曲線を得て、コムギの存在を検出すること、及び
（２）(a)と(b)との結果を比較すること
を含む、方法である。
【００１４】
上記方法の実施態様において、段階希釈したスタンダードサンプルで定量ＰＣＲ法を予め実施し、増幅曲線を得て適当な閾値を設定することでＣｔ値を算出し、初期鋳型量との関連で検量線を作成しておくことにより、この検量線を用いて、被検試料における初期鋳型量を求めることができる。
従って、上記方法の実施態様において、（１）(a)において、核酸プローブがもたらす増幅産物量に応じたシグナルをモニターして増幅曲線を得て、予め作成した検量線を用いて、普通系コムギの存在を定量的に検出し、及び(b)において核酸プローブがもたらす増幅産物量に応じたシグナルをモニターして増幅曲線を得て、予め作成した検量線を用いて、コムギの存在を定量的に検出し、及び（２）(a)における定量値と(b)における定量値とを比較することができる。
上記の方法において、例えば(a)において普通系コムギの存在が検出され、その定量値と、(b)におけるコムギの定量値とを比較して、(a)の定量値＜(b)の定量値であると、その差異が被検試料中における普通系コムギ以外のコムギに由来することが推測される。また、例えば(a)においてＰＣＲ増幅産物が検出されず、一方(b)においてＰＣＲ増幅産物が検出されると、被検試料中に普通系コムギではなく、普通系コムギ以外のコムギ、例えばデュラムコムギの存在が肯定される。
【００１５】
上記の普通系コムギ及び／又は普通系コムギ以外のコムギの存在を検出する方法の実施にあたり、配列番号１１に示される塩基配列を有する核酸プローブ及び配列番号１３に示される塩基配列を有する核酸プローブは具体的には、各々、標識核酸プローブであり得る。さらに、配列番号１１に示される塩基配列を有する核酸プローブは具体的には、その５’末端が蛍光物質で修飾され、及びその３’末端がクエンチャー物質で修飾されている核酸プローブであり得、及び配列番号１３に示される塩基配列を有する核酸プローブは具体的にはその５’末端が蛍光物質で修飾され、及びその３’末端がクエンチャー物質で修飾されている核酸プローブであり得る。
【００１６】
本発明はさらに、上記検出方法を実施するための下記のキットに向けられている。
(i)配列番号５に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号６に示される塩基配列を有するプライマーとのプライマーセットを含む、普通系コムギ検出用キット、
(ii) 配列番号５に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号６に示される塩基配列を有するプライマーとのプライマーセット、及び配列番号１１に示される塩基配列を有し、その５’末端が蛍光物質で修飾され、及びその３’末端がクエンチャー物質で修飾されている核酸プローブとを含む、普通系コムギ検出用キット、及び
(iii)配列番号５に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号６に示される塩基配列を有するプライマーとのプライマーセット、配列番号１１に示される塩基配列を有し、その５’末端が蛍光物質で修飾され、及びその３’末端がクエンチャー物質で修飾されている核酸プローブ、配列番号９に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号１０に示される塩基配列を有するプライマーとのプライマーセット、及び配列番号１３に示される塩基配列を有し、その５’末端が蛍光物質で修飾され、及びその３’末端がクエンチャー物質で修飾されている核酸プローブとを含む、普通系コムギ検出用キット。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の普通系コムギの検出方法によって、被検試料における普通系コムギの存在を高い特異性をもって且つ高感度で、定性的及び／又は定量的に検出することができる。また、本発明の方法によって、被検試料に含まれるコムギが普通系コムギであるか、又は普通系コムギ以外の例えばデュラムコムギであるか、又はその双方であるかの判別を高い精度で行うことができる。本発明の方法によればさらに、被検試料に含まれる普通系コムギ及び／又は普通系コムギ以外のコムギ、例えばデュラムコムギを定量的に検出することができる。
本発明の方法は、被検試料、例えば加工食品中に存在するコムギの判別手段として有用であり、該コムギが普通系コムギであるか、又は普通系コムギ以外のコムギ（その代表例としてデュラムコムギ）であるかの判別及び検出手段として有用である。
本発明のプライマーセット、核酸プローブ、又はそれらを含むキットを用いて、本発明の方法を簡便に及び迅速に、及び高い精度をもって実施することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＰＣＲによる普通系コムギの検出限界を示す写真である。
【図２】定量ＰＣＲにおける普通系コムギ検出用プライマーセット３（ＳＳII−Ｄ１７６９Ｕ／１８８９Ｌ：配列番号５／６）及びＳＳII−Ｄ１７９７Ｔ核酸プローブ（配列番号１１）の評価（スレッシュホールドラインに達するＰＣＲのサイクル数と鋳型ＤＮＡの対数との関係）を示す図である。
【図３】定量ＰＣＲによる普通系コムギ検出用プライマーセット３（ＳＳII−Ｄ１７６９Ｕ／１８８９Ｌ：配列番号５／６）及びＳＳII−Ｄ１７９７Ｔ核酸プローブ（配列番号１１）の評価（普通系コムギに対するプライマーセットと核酸プローブの特異性）を示す図である。
【図４】混合率を変えた普通系コムギのゲノムＤＮＡとＤＵＲＵＭコムギのゲノムＤＮＡとの混合液から、コムギ検出用プライマーセット５（ＳＳII−Ａ３１１８Ｕ／３２３１Ｌ：配列番号９／１０）及びＳＳII−Ａ ｅｘ７−Ｔ８２核酸プローブ（配列番号１３）を用いて定量ＰＣＲを行った結果を示す図である。
【図５】混合質量を変えた普通系コムギの粉体とＤＵＲＵＭコムギの粉体からゲノムＤＮＡを抽出し、それらを鋳型ＤＮＡとし、コムギ検出用プライマーセット５（ＳＳII−Ａ３１１８Ｕ／３２３１Ｌ：配列番号９／１０）及びＳＳII−Ａ ｅｘ７−Ｔ８２核酸プローブ（配列番号１３）を用いて定量ＰＣＲを行った結果を示す図である。
【図６】適宜混合率を変えた普通系コムギのゲノムＤＮＡとＤＵＲＵＭコムギのゲノムＤＮＡとの混合液から、普通系コムギ検出用プライマーセット３（ＳＳII−Ｄ１７６９Ｕ／１８８９Ｌ：配列番号５／６）及びＳＳII−Ｄ１７９７Ｔ核酸プローブ（配列番号１１）を用いて定量ＰＣＲを行った結果を示す図である。
【図７】適宜混合質量を変えた普通系コムギの粉体とＤＵＲＵＭコムギの粉体からゲノムＤＮＡを抽出し、それらを鋳型ＤＮＡとし、普通系コムギ検出用プライマーセット３（ＳＳII−Ｄ１７６９Ｕ／１８８９Ｌ：配列番号５／６）及びＳＳII−Ｄ１７９７Ｔ核酸プローブ（配列番号１１）を用いて定量ＰＣＲを行った結果を示す図である。
【図８】図６の結果から、普通系コムギの混合割合とスレッシュホールドラインに達するＰＣＲのサイクル数との関係を表した図である。
【図９】図７の結果から、普通系コムギの混合割合とスレッシュホールドラインに達するＰＣＲのサイクル数との関係を表した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明におけるコムギとは、ゲノム構成がＡＡＢＢＤＤの六倍体である普通系コムギ、及びＡＡＢＢの四倍体である二粒系コムギ（主にデュラムコムギ）を含む食用コムギとして栽培されているコムギ全般を言う。普通系コムギには、一般的に汎用されている普通コムギやクラブコムギ、スペルトコムギなどが分類される。また、二粒系コムギにはデュラムコムギの他、エンマーコムギなどが分類される。
本発明は、食品原料や加工食品など各種被検試料に含まれる普通系コムギとデュラムコムギなどの二粒系コムギとを判別するのに有用である。
【００２０】
本発明に使用する被検試料、被検試料からの核酸（例えばＤＮＡ）の抽出、核酸試料の調製、検出対象塩基配列、プライマーセット、核酸プローブ、ＰＣＲ反応条件及び定量ＰＣＲ法について、以下に詳細に説明する。
被検試料は、被検試料由来のゲノムＤＮＡ又はその断片等の核酸を抽出できるものであれば特に制限されるものではなく、植物体、原材料、加工過程にある材料、加工食品等を用いることができる。
例えば、生ないしは乾燥種子、薄力粉等の粉末、グリッツなどの中間加工品、菓子類や麺類等の加熱調理済みの食品などが挙げられる。また、これらの被検試料は、必要に応じて粉砕するなどして、核酸の抽出に適した形状に加工して用いることができる。
【００２１】
被検試料に含まれるコムギの含有量は特に指定するものではないが、本発明では、被検試料から核酸を抽出し、調製した検体核酸溶液中にコムギ由来核酸が少なくとも１０ｐｐｍ、好ましくは５０ｐｐｍ以上含まれていれば、被検試料中に存在するコムギの有無を判定することができると共に、コムギの存在を定量的に測定することができる。
また、タンパク質等の生体を構成する化合物と比較して、核酸は加熱や加圧などの物理的加工に対して比較的安定であり、そのような加工に供された加工品の中に微量でも核酸が存在していれば十分に検出することが可能である。
これらのことは、生産者が意図しない各種食品へのコムギの混入を検出するための基礎データを得ることが可能であることを意味する。
【００２２】
被検試料由来の核酸は、被検試料に含まれる植物体のゲノムＤＮＡであることが好ましい。被検試料からの核酸の抽出方法は特に制限されず、ＰＣＲ法に供するに足る品質が保証される方法であればどのような方法又はキットでも使用することができる。例えば、ＣＴＡＢ法やＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｎｔ  ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ社製）等の市販キットを用いることができる。
また、必要に応じてこれらの方法を改変することもできる。これらの方法により抽出した核酸は、ＰＣＲ法の鋳型として用いるのに適した状態で保持することが望ましく、例えば適切な緩衝液に溶解させて低温下で保管することが好ましい。このようにして、核酸試料となる核酸溶液、例えば鋳型ＤＮＡ溶液を調製することができる。
得られた核酸の濃度と純度は、分光光度計を用いて２３０、２６０、２８０、３２０ｎｍの吸光度を測定することにより検定することができる。ＰＣＲ法を行う上で、２６０／２３０ｎｍの吸光度比が２．０以上、２６０／２８０ｎｍの吸光度比が１．８付近と評価された核酸溶液を用いることが好ましい。
この際、２６０／２８０ｎｍの比が２．０に近づくに従ってＲＮＡの混入が疑われるので、ＤＮＡ濃度を検定する際には注意する必要がある。
さらに、抽出したＤＮＡを評価するために、アガロースゲル電気泳動及び被検試料を構成する植物体の種特異的遺伝子に相補的なプライマーセットを用いてＰＣＲ反応が進行することを確認してもよい。
【００２３】
ＤＮＡ塩基配列決定方法の改良と共に数多くの遺伝子が同定され、今日に至ってはＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）やＤＤＢＪ（ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ、国立遺伝学研究所）などの機関により膨大な塩基配列のデータベースが一般に公開されている。検出対象とするコムギＤＮＡ塩基配列は、それらのデータベースを活用してもよいし、自ら実験的に解析・取得した塩基配列を用いてもよい。一般的に、コムギを含む植物体のＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡで構成されている。細胞内のゲノムＤＮＡは核に１組のみ存在するが、それに対して葉緑体ＤＮＡとミトコンドリアＤＮＡの数は細胞内に存在する各オルガネラの数量に依存するので組織や細胞によって異なる。
本発明の目的を達成するために、コムギのＤゲノムＤＮＡに特異的であり、コムギのＤゲノムＤＮＡにおいてコピー数が特定されているＤＮＡ塩基配列を検出対象として選抜する必要があった。選抜した塩基配列を元情報として、ＰＣＲ法を基盤とした検出方法に適したプライマーセットならびに核酸プローブを設計することができる。
また、プライマーセットの設計には様々な条件が課せられる。すなわち、プライマーセットは、増幅対象となるＤＮＡ塩基配列を特異的に増幅できる限りどのようなものであってもかまわないが、被検試料が加工食品である場合には加工工程において被検試料中のゲノムＤＮＡ等が断片化されることがあるので、ＰＣＲ増幅産物が８０〜５００ｂｐより好ましくは８０〜１５０ｂｐ程度になるように設計されることが望ましい。そして、適切なＰＣＲ増幅産物を得るために、プライマーセット及び定量ＰＣＲ法に用いる核酸プローブの塩基配列の様々な制約を満たす必要がある。定量ＰＣＲ法に用いる核酸プローブは、対応するプライマーセットのＴｍ値よりも１０℃程度高く、且つクエンチング効果を維持するために１８〜２５塩基程度の長さになるように設計されることが望ましい。
【００２４】
上記のアプローチを考慮して、本発明者らは特定の塩基配列を見出した。
ここで、配列番号５の塩基配列は、コムギＳＳII−Ｄ遺伝子の位置１７６９〜１７９１にある配列であり、配列番号６の塩基配列は、コムギＳＳII−Ｄ遺伝子の位置１８８９〜１８６５に相補的な配列であり、これらがプライマーセットとなる。また、配列番号１１の塩基配列は、コムギＳＳII−Ｄ遺伝子の位置１７９７〜１８１９にある配列である。
また、配列番号９の塩基配列は、コムギＳＳII−Ａ遺伝子の位置３１１８〜３１３６にある配列であり、配列番号１０の塩基配列は、コムギＳＳII−Ａ遺伝子の位置３２３１〜３２１１に相補的な配列であって、これらはプライマーセットとなる。また、配列番号１３の塩基配列は、コムギＳＳII−Ａ遺伝子の位置３１６１〜３１８５にある配列である。
【００２５】
以上のようにして設計されたプライマーセットを用い、あるいは更に核酸プローブを用いて、被検試料から抽出した核酸を鋳型としてＰＣＲ法、あるいは定量ＰＣＲ法を実施することができる。
ＰＣＲ法又は定量ＰＣＲ法の実施には、一般に市販されている機器を用いて、公知である種々の方法及びそれらの改良法を用いることができる。ＰＣＲ法及び定量ＰＣＲ法を実施する際の具体的な手法は、特に限定されるものではない。
【００２６】
本発明は、被検試料における普通系コムギの存在を検出する方法であって、被検試料から抽出した核酸を鋳型として、配列番号５に示される塩基配列を有するプライマーと配列番号６に示される塩基配列を有するプライマーとを用いて、ＰＣＲ法を実施し、ＰＣＲ増幅産物の存在を検出することを含む方法に向けられている。
ＰＣＲ法の実施に当たり、プライマーセット、鋳型となる核酸、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌなどの適切な緩衝液、ｄＮＴＰ、塩化カリウム、塩化マグネシウム、耐熱性ＤＮＡ合成酵素などの試薬類をそれぞれ適当な量を混合して、ＰＣＲ反応液とすることができる。
ＰＣＲ反応は、鋳型ＤＮＡの熱変性、プライマーセットと鋳型ＤＮＡとのアニーリング、耐熱性ＤＮＡ合成酵素によるＤＮＡの合成反応の３つのステップから構成される。各ステップは、それぞれ異なった温度と時間を必要とするので、増幅しようとする領域の塩基配列とその長さを考慮して適切な範囲で設定する。ＰＣＲ反応の工程の具体的条件は特に限定されるものでなく、例えば、９５℃で１０分間保持し、以後９５℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとして３５〜４０サイクルの反復を行い、サイクル終了後に７２℃で７分保持し、その後４℃に保持することで行うことができる。
このような反応は、一般に市販されている装置を用いて行うことができ、その中には定量ＰＣＲ法に対応する装置も含まれる。
【００２７】
本発明におけるＰＣＲ法による増幅産物の検出は、特に限定されるものではないが、一般的に電気泳動法又は蛍光検出法により行われる。例えば、必要に応じて陰性コントロールや陽性コントロール、マーカーと共に被検試料のＰＣＲ増幅産物をアガロース電気泳動に供し、泳動後エチジウムブロマイドなどのインターカレーターで染色し、紫外光照射下で検出される。
この際、ＰＣＲ増幅産物のバンドが観察されれば、被検試料中に普通系コムギが存在することを意味する。
【００２８】
本発明はまた、被検試料における普通系コムギの存在を検出する方法であって、被検試料から抽出した核酸を鋳型として、配列番号５に示される塩基配列を有するプライマー、配列番号６に示される塩基配列を有するプライマー、及び配列番号１１に示される塩基配列を有する核酸プローブとを用いて、定量ＰＣＲ法を実施し、普通系コムギの存在を定性的及び／又は定量的に検出する方法に向けられている。
定量ＰＣＲ法は一般的に、ＰＣＲ増幅反応開始時点における反応液中の鋳型核酸量、例えば鋳型ＤＮＡ量を定量するための一連の反応を実施する方法を指す。定量ＰＣＲ法として具体的にリアルタイムＰＣＲ法を採用することができる。定量ＰＣＲ法にはインターカレーターを用いる方法と、蛍光標識プローブを用いる方法があり、蛍光標識プローブを用いる方法では、該プローブがＰＣＲ増幅反応によって生じた増幅産物の分子数に対応したシグナル変化をもたらす。
本発明では、蛍光標識プローブを用いる方法を好ましく使用することができ、さらにはＴａｑＭａｎプローブ法を採用することが好ましい。配列番号１１を有する核酸プローブ、及び配列番号１３の塩基配列を有する核酸プローブを、上述のシグナル変化をもたらすＴａｑＭａｎプローブとすることができる。この核酸プローブは通常、ＤＮＡが用いられる。
ＴａｑＭａｎプローブ法を採用するに当たって、蛍光物質とクエンチャー物質（クエンチング効果を有する物質）とによって二重標識した上記核酸プローブを用いる。通常、核酸プローブの５’末端を蛍光物質で修飾し、３’末端をクエンチャー物質で修飾する。蛍光物質の例としてＦＡＭ、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＦＩＴＣなどが挙げられ、クエンチャー物質としては、ＴＡＭＲＡ、Ｅｃｌｉｐｓｅ、ＤＡＢＣＹＬなどが挙げられる。蛍光物質及びクエンチャー物質は特に限定されるものではなく、ＴａｑＭａｎプローブ法の実施に適合する蛍光物質及びクエンチャー物質を適宜選択して用いることができる。
ＰＣＲ増幅反応に依存して上記のＴａｑＭａｎプローブはＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅによって消化され、蛍光物質が遊離することによりＰＣＲ反応溶液中の蛍光量が増加する。その蛍光により検出したシグナル強度をモニターすることで増幅曲線が得られる。蛍光量の増加はＰＣＲ増幅産物の増加の程度を反映する指標となる。これにより、ＰＣＲにおける増幅の様子をリアルタイムで簡便に検出することができる。
定量ＰＣＲ法の実施にあたって、段階希釈したスタンダードサンプルで定量ＰＣＲ法を予め実施し、増幅曲線を得て適当な閾値（Threshold）を設定することでＣｔ値（Threshold Cycle)を算出し、初期鋳型量との関連で検量線を作成しておくことにより、この検量線を用いて、被検試料における初期鋳型量を求めることができる。すなわち被検試料について、スタンダードサンプルと同様にＣｔ値を算出し、この検量線に当てはめることで、初期鋳型量を求めることができる。
定量ＰＣＲ法の実施にあたり、プライマーセット、核酸プローブ、鋳型となる核酸、適切な緩衝液、ｄＮＴＰ、塩化カリウム、塩化マグネシウム、耐熱性ＤＮＡ合成酵素などの試薬類をそれぞれ適当な量を混合して、ＰＣＲ反応液とすることができる。定量ＰＣＲ法における反応条件は、上述のＰＣＲ法で述べたのと同様に設定することができる。また、定量ＰＣＲ法を実施する装置としては、公知のものが使用できる。
【００２９】
本発明はさらに、定量ＰＣＲ法を用いた上記の被検試料における普通系コムギの存在を検出する方法と、定量ＰＣＲ法を用いたコムギを広範囲に検出する方法とを組み合わせた検出方法にも向けられている。
それは、被検試料における普通系コムギ及び／又は普通系コムギ以外のコムギの存在を検出する方法であって、具体的には
（１）被検試料から核酸を抽出して核酸試料を調製し、
(a) 該核酸試料を用いて、配列番号５に示される塩基配列を有するプライマー、配列番号６に示される塩基配列を有するプライマー、及び配列番号１１に示される塩基配列を有する標識核酸プローブとを用いて、定量ＰＣＲ法を実施し、該標識核酸プローブがもたらす増幅産物量に応じたシグナルをモニターして増幅曲線を得て、予め作成した検量線を用いて、普通系コムギの存在を定量的に検出し、普通系コムギの存在を定量的に検出すること、及び
(b) 該核酸試料を用いて、配列番号９に示される塩基配列を有するプライマー、配列番号１０に示される塩基配列を有するプライマー、及び配列番号１３に示される塩基配列を有する標識核酸プローブとを用いて、定量ＰＣＲ法を実施し、該標識核酸プローブがもたらす増幅産物量に応じたシグナルをモニターして増幅曲線を得て、予め作成した検量線を用いて、コムギの存在を定量的に検出すること、及び
（２）(a)と(b)との結果を比較すること
が  できる。
例えば、被検試料から核酸を抽出し調製した核酸試料を少なくとも２分割し、例えば等容量に少なくとも２分割し、それらをそれぞれ上記(a)及び(b)の定量ＰＣＲ反応に供することもできる。
【００３０】
上記の方法において、例えば(a)において普通系コムギの存在が検出され、その定量値と、(b)におけるコムギの定量値とに差異がなければ、普通系コムギの存在が肯定される。また、例えば(a)において普通系コムギの存在が検出され、その定量値と、(b)におけるコムギの定量値とを比較して、(a)の定量値＜(b)の定量値であると、その差異は被検試料中における普通系コムギ以外のコムギに由来することが推測され、被検試料における普通系コムギと普通系コムギ以外のコムギの共存が推測される。また、例えば(a)においてＰＣＲ増幅産物が検出されず、一方(b)においてＰＣＲ増幅産物が検出されると、被検試料中に普通系コムギではなく、普通系コムギ以外のコムギ、例えばデュラムコムギの存在が肯定される。
このような方法を用いて、同時に作成した検量線を用いた数学的演算により、被検試料中の普通系コムギ及びコムギの存在を定量的に検出することができる。
【００３１】
本発明のキットは、本発明の方法においてＰＣＲ法又は定量ＰＣＲ法を実施するに当たり、試薬キットとして用いることができる。本発明のキットには、ＰＣＲを実施するための最適な各種試薬類ならびに検出するための試薬類が付属されていてもよい。
本発明のキットによれば、微量のコムギ及び／又は普通系コムギを検出することができるので、被検試料中にコムギが含まれる旨の情報だけではなく、普通系コムギとデュラムコムギの有無とそれぞれの量を把握することが可能である。そのため、マカロニ類などのデュラムコムギを使用した製品において、使用した原料コムギ粉の種別を表示することが可能となる。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
１．普通系コムギ検出のためのプライマーセット及び定量用核酸プローブの構築方法
＜標的遺伝子の選抜＞
一般的にコムギのゲノムＤＮＡは３種類のゲノムから構成されており、各々Ａ、Ｂ、Ｄゲノムと称されている。普通系コムギはＡＡＢＢＤＤゲノムを有する六倍体であり、デュラムコムギはＡＡＢＢゲノムを有する四倍体である。本発明で標的遺伝子としたＳｔａｒｃｈ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ  IIは、コムギのＡ、Ｂ、Ｄゲノム各々の７番染色体の短腕にコードされており、これらの遺伝子は各々ＳＳII−Ａ、ＳＳII−Ｂ、ＳＳII−Ｄと略称される（シンバタ・エト・オル、ミューテーションズ・イン・ウィート・スターチ・シンターゼ・II・ジーンズ・アンド・ピーシーアール・ベースド・セレクション・オブ・ア・エスジーピー−１・ヌル・ライン、セオリティカル・アンド・アプライド・ジェネティクス、２００５年、１０月号、１１１（６）：１０７２−９．（Ｓｈｉｍｂａｔａ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｗｈｅａｔ  ｓｔａｒｃｈ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  II  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ＳＧＰ−１  ｎｕｌｌ  ｌｉｎｅ．  Ｔｈｅｏｒ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ．  ２００５  Ｏｃｔ；１１１（６）：１０７２−９．）。
これらの遺伝子を標的遺伝子とし、且つＤゲノム上の塩基配列に特異的にハイブリダイズするプライマーセットを用いて、ＰＣＲによる普通系コムギの検出法を構築することができれば、本課題の目的を達成できると判断し、ＳＳII−Ｄ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ  ｗＳＳII−Ｄ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｓｔａｒｃｈ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  II−Ｄ、ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｃｄｓ．、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＡＢ２０１４４７、全長７０１０ｂｐ）（配列番号１２）を検出標的遺伝子として選択した。
【００３３】
＜ＳＳII−Ｄに特異的なプライマーセットの設計＞
ＳＳII−Ｄ遺伝子を対象として、遺伝子工学用ソフトウェアＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｖｅｒ．２．０．０（アプライドバイオシステムズ社製）を用いてプライマーの候補となる塩基配列の検索を実施した。最適なプライマーを設計するには、ＧＣ含量やＴｍ値、塩基配列長、ＰＣＲ産物長など各種条件を満たす必要がある。その結果、複数のプライマーの候補塩基配列を選抜することができた。選抜した塩基配列をＢＬＡＳＴ検索することにより、コムギＳＳIIを特異的に認識する可能性が高いプライマーを絞り込み、最終的に４組のプライマーセットを選抜した。これら４組のプライマーセットのＴｍ値は、塩基配列より理論的に算出し、ＰＣＲ反応における最適なアニール温度を設定するための指標とした。これらの４組のプライマーセットは、後述の表２に示される配列番号１と２、配列番号３と４、配列番号５と６、及び配列番号７と８である。
【００３４】
＜ＳＳII−Ｄに特異的な定量的ＰＣＲ用核酸プローブの設計＞
定量的ＰＣＲの手法は既に幾通りか報告されているが、解析機器や反応試薬が充実していることから、定量ＰＣＲ法の一種であるＴａｑＭａｎプローブ法を採用した。各プライマーセットに対応する核酸プローブは、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｖｅｒ．２．０．０（アプライドバイオシステムズ社製）を使用して設計した。
なお、核酸プローブの標識化合物には、蛍光物質としてＦＡＭ（アプライドバイオシステムズ社製）を、クエンチング効果を有する物質としてＴＡＭＲＡ（アプライドバイオシステムズ社製）を用いた。
【００３５】
２．ＰＣＲに用いた鋳型ＤＮＡの抽出
各種植物の種子を用いて、鋳型ＤＮＡ試料を調製した。後述の表３に各植物種を示す。
コムギ及びその他イネ科植物やマメ科植物等の種子は、その表面を界面活性化剤ＳＤＳの１．０％溶液で洗浄後、蒸留水で良く濯ぎ洗いをし、凍結乾燥した。この種子をマルチビーズショッカー（安井機器社製）もしくは超遠心粉砕機（レッチェ社製）を用いて微粉砕した。
各粉砕試料からＤＮＡ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。抽出操作については、ＤＮＡ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｈａｎｄｂｏｏｋを参照し、一部に改良を加えた方法にて実施した。すなわち、粉砕試料をＡＰ１緩衝液とＲＮａｓｅ  ＡおよびＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋの混合液に懸濁し、これを３７℃に加温した反応層で２時間保持した。この後の操作については前出のＨａｎｄｂｏｏｋに従って実施した。
なお、Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋについては、０．１ｇ粉砕試料あたり５μｌの２０ｍｇ／ｍｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ溶液（タカラバイオ社製）を添加することとした。この添加量については、種子の種類や状態により適当量に変更することができる。
抽出したＤＮＡは、分光光度計により２３０、２６０、２８０、３２０ｎｍの吸光度を測定してその純度と濃度を求め、０．８％アガロースゲル電気泳動に供した。その後、純水あるいはＴＥ緩衝液を添加して２０ｎｇ／μｌに希釈してＰＣＲの鋳型ＤＮＡ溶液とした。
【００３６】
３．ＰＣＲとＰＣＲ増幅産物の検出方法
ＰＣＲには、ＡｍｐｌｉＴａｑ(登録商標) Ｇｏｌｄ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（アプライドバイオシステムズ社製）とその付属試薬を用い、次のような組成でＰＣＲ反応液を調製した。
すなわち、２．５μｌのＰＣＲ  ｂｕｆｆｅｒ  II、２．５μｌの２ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ、１．５μｌの２５ｍＭ塩化マグネシウム、０．１２５μｌの５ｕｎｉｔｓ／μｌ  ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、２μｌの２．５μＭ  プライマーセットおよび１３．８７５μｌの滅菌水を十分に混合した溶液に２．５μｌの２０ｎｇ／μｌ鋳型ＤＮＡ溶液を添加して全量を２５μｌとした。
ＰＣＲ増幅装置には２７２０  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、以下の表１に示した反応条件で実施した。アニール温度は、前出の計算法で求めた個々のプライマーのＴｍ値を基準にして実験的に検証されるので、ＰＣＲに用いるプライマーセット毎に最適な温度を設定した。
ＰＣＲ増幅産物の電気泳動に際して、ＰＣＲ反応液とローディング緩衝液とを適量混合し、３％アガロースゲルに供した。
電気泳動後、エチジウムブロマイド染色を行い、各プライマーセットによる至適サイズのＰＣＲ増幅産物を確認することによりサンプル中の普通系コムギの有無を判定した。この際、陽性コントロールおよび陰性コントロールの増幅バンドの有無によりＰＣＲの妥当性を確認した。
【００３７】
表１：ＰＣＲの反応条件
0005625211.tif 000002
*アニール温度は、用いるプライマーセットにより異なり、アニール温度は、配列番号１と２のセット、配列番号３と４のセット及び配列番号７と８のセットでは５５℃に設定し、配列番号５と６のセットでは６０℃に設定し、及び配列番号９と１０のセットでは５６に設定した（後述の表２参照）。
【００３８】
４．各種プライマーセットによる普通系コムギの検出
コムギＤゲノムにコードされているＳＳII−Ｄ（配列番号１２）を元配列として設計した各種プライマーセット１〜４、及びコムギＡゲノムにコードされているＳＳII−Ａ（配列番号１４）を元配列として設計したプライマーセット５を以下の表２に示す。
配列番号１の塩基配列は、コムギＳＳII−Ｄ遺伝子の位置４０１５〜４０３７にある配列であり、配列番号２の塩基配列は、コムギＳＳII−Ｄ遺伝子の位置４１４２〜４１２２に相補的な配列であって、配列番号３の配列はコムギＳＳII−Ｄ遺伝子の位置４４６９〜４４８７にある配列であって、配列番号４の配列はコムギＳＳII−Ｄ遺伝子の位置４５５５〜４５３１に相補的な配列であって、配列番号７はコムギＳＳII−Ｄ遺伝子の位置９３７〜９５５にある配列であり、配列番号８はコムギＳＳII−Ｄ遺伝子の位置１０８０〜１０６１に相補的な配列である。なお、配列番号９及び１０の配列は各々、特開２００９−５５８８号公報に開示された配列番号３及び４の配列に相当する。
【００３９】
表２
0005625211.tif 000003
【００４０】
これらのプライマーセットを用いて、上記「３．ＰＣＲとＰＣＲ増幅産物の検出方法」に述べた手法に従って、上記で得た各植物種からの鋳型ＤＮＡ試料を用いて、ＰＣＲ法を実施した。その結果、各プライマーセットによる、至適サイズのＰＣＲ増幅産物の有無を、表３中に＋、−で表した。
表３
0005625211.tif 000004
【００４１】
プライマーセット３（ＳＳII−Ｄ１７６９Ｕ／１８８９Ｌ：配列番号５／６）は、普通系コムギの試料のみで目的の長さのＰＣＲ増幅産物が得られ、一方デュラムコムギ、オオムギ、ライムギ、ソバ、コメ、トウモロコシ、ダイズの各植物種ではＰＣＲ増幅産物は得られなかった。この結果は、このプライマーセットが普通系コムギを特異的に認識していることを示した。
一方、他のプライマーセットでは、デュラムコムギの試料についてもＰＣＲ増幅産物が得られた。
【００４２】
５．ＰＣＲ法による検出限界の評価
好適に普通系コムギを特異的に検出するプライマーセット３（ＳＳII−Ｄ１７６９Ｕ／１８８９Ｌ：配列番号５／６）を用いたＰＣＲにより、普通系コムギＤＮＡの半定量的な検出限界を検討した。サケ精子ＤＮＡ溶液を希釈母体として、普通系コムギから抽出したゲノムＤＮＡを２０ｎｇ／μｌ、１０ｎｇ／μｌ、１ｎｇ／μｌ、０．１ｎｇ／μｌ、５０ｐｇ／μｌ、１０ｐｇ／μｌ、１ｐｇ／μｌになるように段階的に希釈した。
上記「３．ＰＣＲとＰＣＲ増幅産物の検出方法」に述べた手法に従って、この溶液２．５μｌを鋳型ＤＮＡ溶液としてＰＣＲを実施し、５．０μｌのＰＣＲ反応液を電気泳動に供した。その検出結果を図１に示した。
普通系コムギＤＮＡ溶液を鋳型とした検出限界は、プライマーセット３において５０ｐｇ／μｌであった。これらのことからプライマーセット３を用いたＰＣＲにより５０ｐｇ／μｌの高感度で普通系コムギゲノムＤＮＡを検出することが可能となった。
【００４３】
６．定量ＰＣＲによる普通系コムギの特異的検出の確認
普通系コムギを特異的に検出したプライマーセット３（ＳＳII−Ｄ１７６９Ｕ／１８８９Ｌ：配列番号５／６）と、それと共に用いる核酸プローブによる、定量ＰＣＲにおける普通系コムギの特異的検出の性能を調べた。
鋳型ＤＮＡとして、普通系コムギ、デュラムコムギ、オオムギ、コメ、ソバの合計５種類の被検試料から抽出したＤＮＡを用いた。この際、ブランクとして鋳型ＤＮＡを含まない滅菌水の増幅シグナルの有無により定量ＰＣＲの妥当性を確認した。
定量ＰＣＲには、ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ社製）を用い、次のような組成で定量用ＰＣＲ反応液を調製した。すなわち、１２．５μｌのＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（２Ｘ）、０．５μｌの２５μＭ  プライマーセット、０．５μｌの１０μＭ核酸プローブおよび９μｌの滅菌水を十分に混合した溶液に２．５μｌの鋳型ＤＮＡ溶液を添加して全量を２５μｌとした。コムギの鋳型ＤＮＡ溶液には、サケ精子ＤＮＡ溶液を希釈母体としてコムギゲノムＤＮＡを２０ｎｇ／μｌ、１０ｎｇ／μｌ、１ｎｇ／μｌ、０．１ｎｇ／μｌ、５０ｐｇ／μｌ、１０ｐｇ／μｌ、１ｐｇ／μｌになるように段階的に希釈したコムギＤＮＡ溶液を用いた。デュラムコムギ、オオムギ、コメ、ソバの場合には、サケ精子ＤＮＡ溶液で１０ｎｇ／μｌに希釈したＤＮＡ溶液を用いた。なお、この定量ＰＣＲに用いた核酸プローブを表４に示す。
【００４４】
表４：核酸プローブの配列
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この核酸プローブの５’末端をＦＡＭで修飾し、３’末端をＴＡＭＲＡで修飾した。
【００４５】
定量ＰＣＲ反応は、今回は定量ＰＣＲ装置Ｒｏｔｏｒ−Ｇｅｎｅ３０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を用いて行ったが、他社の定量ＰＣＲ装置を用いても同様の結果が得られている。
反応条件は、反応液を９５℃で１０分間保持し、以後９５℃で１５秒、６０℃で３０秒を１サイクルとして４５サイクルの反復を行った。反応過程において各反応ウェル中の蛍光量が経時的に計測され続けるので、反応終了後に反応チューブごとの蛍光量の経時的な変化を解析することで蛍光量の増加があったチューブを特定することができる。標的塩基配列にハイブリダイズした核酸プローブがＤＮＡの伸張反応の過程で分解され、それに伴って蛍光標識された塩基が遊離するので、蛍光量はＰＣＲ増幅反応の進行と共に増加する。従って、蛍光量の増加はＰＣＲ増幅反応が起こっていることを意味する。
普通系コムギから抽出したＤＮＡを鋳型とした定量ＰＣＲの結果を図２に示した。図中の矢印が示しているものは、各濃度の鋳型ＤＮＡを用いたときに得られた定量ＰＣＲにおける増幅曲線である。プライマーセット３と配列番号１１の核酸プローブの組合せによって好適に増幅シグナルが認められ、検出限界は５０ｐｇ／μｌであった。それらの増幅シグナルがスレッシュホールドラインに達するサイクル数と鋳型ＤＮＡ濃度の対数とは直線関係にあり、好適な定量的ＰＣＲが進行していることを示した。
また、普通系コムギ、デュラムコムギ、オオムギ、コメ、ソバから抽出したＤＮＡを鋳型とした定量ＰＣＲの結果を図３に示した。普通系コムギでは、増幅シグナルが得られたが、デュラムコムギ、オオムギ、コメ、ソバでは増幅シグナルが得られなかった。
図２、図３の結果は、前記のプライマーセットと核酸プローブの組合せが定量ＰＣＲにおいて、高感度で好適に普通系コムギを定量的に検出できることを表している。
【００４６】
７．２種の定量ＰＣＲの組み合わせによる、普通系コムギ又はデュラムコムギの特異的検出の確認
同一検体に対して、コムギＤＮＡを特異的に検出するプライマーセット及び該塩基配列を特異的に認識する核酸プローブによる定量ＰＣＲと、普通系コムギＤＮＡを特異的に検出するプライマーセット及び該塩基配列を特異的に認識する核酸プローブによる定量ＰＣＲとを行って、該検体に含まれる普通系コムギとデュラムコムギをそれぞれ定量可能であるかを確認した。
定量ＰＣＲは、上記で述べた手法に従って、コムギＤＮＡを特異的に検出するプライマーセット５（ＳＳII−Ａ３１１８Ｕ／３２３１Ｌ：配列番号９／１０）と、該プライマーセットに対応する以下の核酸プローブＳＳII−Ａ  ｅｘ７−Ｔ８２を用いた定量ＰＣＲと、普通系コムギＤＮＡを特異的に検出するプライマーセット３（ＳＳII−Ｄ１７６９Ｕ／１８８９Ｌ：配列番号５／６）と配列番号１１の核酸プローブ（ＳＳII−Ｄ−１７９７Ｔ)を用いた定量ＰＣＲとをそれぞれ行った。
検体とする鋳型ＤＮＡ溶液として、次の２種類を調製した。
(1)普通系コムギのゲノムＤＮＡ溶液と、デュラムコムギのゲノムＤＮＡ溶液とを容量比１００：０、５０：５０、５：９５、０．５：９９．５、０．２５：９９．７５、０：１００の比率になるように混合し、総ＤＮＡ濃度を２０ｎｇ／μｌにした「ＤＮＡ溶液混合検体」
(2)普通系コムギの粉体とデュラムコムギの粉体とを質量比１００：０、５０：５０、５：９５、０．５：９９．５、０．２５：９９．７５、０：１００の比率になるように混合し、それらからゲノムＤＮＡを抽出し、ＤＮＡ濃度を２０ｎｇ／μｌに調製した「粉体混合検体」
コムギＤＮＡの定量に用いた核酸プローブを表５に示す。
【００４７】
表５：核酸プローブの配列
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この核酸プローブの５’末端をＦＡＭで修飾し、３’末端をＴＡＭＲＡで修飾した。
【００４８】
コムギＤＮＡを特異的に検出する定量ＰＣＲの結果を図４、図５に示した。図４は「ＤＮＡ溶液混合検体」を鋳型ＤＮＡとして用いた結果を表し、図５は「粉体混合検体」を鋳型ＤＮＡとして用いた結果を表している。図中で矢印が示しているものは、各濃度の鋳型ＤＮＡを用いたときに得られた定量ＰＣＲ増幅曲線である。図４及び図５の結果から、プライマーセット５と配列番号１３の核酸プローブの組合せで、いずれの鋳型ＤＮＡにおいても好適に増幅シグナルが認められ、それらの増幅シグナルが同じ曲線を描くことが分かった。”
普通系コムギＤＮＡを特異的に検出する定量ＰＣＲの結果を図６、図７に示した。図６は「ＤＮＡ溶液混合検体」を鋳型ＤＮＡとして用いた結果を表し、図７は「粉体混合検体」を鋳型ＤＮＡとして用いた結果を表している。図中で矢印が示しているものは、各濃度の鋳型ＤＮＡを用いたときに得られた定量ＰＣＲ増幅曲線である。図６及び図７の結果から、プライマーセット３と配列番号１１の核酸プローブの組合せによって、普通系コムギとデュラム系コムギとの比率が１００：０、５０：５０、５：９５、０．５：９９．５、０．２５：９９．７５のサンプルについて、好適に増幅シグナルが認められ、普通系コムギ濃度が高いサンプルほど、増幅シグナルが大きく、増幅曲線が早く立ち上がってくることが分かった。ただし、普通系コムギと、デュラム系コムギとを０：１００に混合したものについては増幅シグナルが得られなかった。
また、図６、図７の結果について、それぞれ、普通系コムギの混合割合を横軸に、Ｃｔ（スレッシュホールドラインに達したときのサイクル数、Threshold Cycle）を縦軸にプロットしたグラフを図８、図９に表した。図８、図９ともに鋳型ＤＮＡ中の普通系コムギの混合割合が増えるにつれ、Ｃｔが比例的に小さくなっており、普通系コムギの定量が可能であることがわかった。
【配列表フリーテキスト】
【００４９】
配列番号１：ＰＣＲ用プライマー
配列番号２：ＰＣＲ用プライマー
配列番号３：ＰＣＲ用プライマー
配列番号４：ＰＣＲ用プライマー
配列番号５：ＰＣＲ用プライマー
配列番号６：ＰＣＲ用プライマー
配列番号７：ＰＣＲ用プライマー
配列番号８：ＰＣＲ用プライマー
配列番号９：ＰＣＲ用プライマー
配列番号１０：ＰＣＲ用プライマー
配列番号１１：ＰＣＲ用核酸プローブ 修飾：１−ＦＡＭ−ａ、２３−ａ−ＴＡＭＲＡ
配列番号１２：Triticum aestivum wＳＳII−Ｄ遺伝子の配列
配列番号１３：ＰＣＲ用核酸プローブ 修飾：１−ＦＡＭ−ａ、２５−ａ−ＴＡＭＲＡ
配列番号１４：Triticum aestivum wＳＳII−Ａ遺伝子の配列
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１】
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【配列表】
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