(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
セルロースまたはセルロース誘導体を含有する多孔質担体であって、
エポキシ基数が３以上であり、且つ、化学結合の連なりで数えた原子数でみて、最も離れているエポキシ基間の原子数が６以上であるグリシジルエーテル系化合物の架橋剤で架橋して得られたことを特徴とする多孔質担体。
【請求項２】
前記架橋剤の水溶率が５０％以上である請求項１に記載の多孔質担体。
【請求項３】
ヘップラー式に基づいて測定される前記架橋剤の粘度が１００ｍＰａ・ｓ以上５００００ｍＰａ・ｓ以下である請求項１又は２に記載の多孔質担体。
【請求項４】
前記架橋剤の官能基当量が１００以上６００以下である請求項１〜３のいずれか一項に記載の多孔質担体。
【請求項５】
５％圧縮時の圧縮応力が０．０１ＭＰａ以上１ＭＰａ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０３ＭＰａ以上３ＭＰａ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が０．０６ＭＰａ以上５ＭＰａ以下である請求項１〜４のいずれか一項に記載の多孔質担体。
【請求項６】
前記架橋剤の使用量が担体の体積の０．０１倍以上１０倍以下である請求項１〜５のいずれか一項に記載の多孔質担体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の多孔質担体が、ホルミル基を含有することを特徴とする多孔質担体。
【請求項８】
体積平均粒径が２０μｍ以上３００μｍ以下であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の多孔質担体。
【請求項９】
前記ホルミル基は、過ヨウ素酸酸化法によって生成されたものである請求項７に記載の多孔質担体。
【請求項１０】
多孔質担体にアフィニティーリガンドが固定された精製用吸着体であって、
前記多孔質担体が、請求項１〜８のいずれか一項に記載の多孔質担体である精製用吸着体。
【請求項１１】
アフィニティーリガンドとしてプロテインＡが導入されたことを特徴とする請求項１０に記載の精製用吸着体。
【請求項１２】
線速３００ｃｍ／ｈ以上で請求項１０または１１に記載の精製用吸着体に通液することを特徴とする精製方法。
【請求項１３】
請求項１０または１１に記載の精製用吸着体を直径２ｃｍ以上及び高さ５ｃｍ以上のカラムに充填して実施することを特徴とする請求項１２に記載の精製方法。
【請求項１４】
請求項１０または１１に記載の精製用吸着体を直径２ｃｍ以上及び高さ５ｃｍ以上のカラムに充填して実施することを特徴とする精製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアフィニティークロマトグラフィー用吸着体、特に抗体医薬品精製用吸着体に関する。
【背景技術】
【０００２】
多孔質担体は各種クロマトグラフィー用吸着体やアフィニティークロマトグラフィー用吸着体として広く用いられている。アフィニティークロマトグラフィー用吸着体は、効率よく目的物を精製、または不要物濃度を低減できることから（例えば非特許文献１参照）、抗体医薬品精製用吸着体として利用されてきている。抗体医薬品市場は近年大きく成長しており、これに伴って、抗体医薬品精製の大スケール化及び高線速化が積極的に行われている。精製の大スケール化及び高線速化に伴って、精製に用いられる吸着体、つまりは多孔質担体の強度を大きくする必要が生じる場合がある。強度が小さい多孔質担体では、大スケール且つ高線速下で使用すると、多孔質担体の圧密化が起こり、液が流れなくなってしまう等の問題が起こる場合がある。従来、強度の大きいゲルとしては、例えば特許文献１に示されるようなシリカゲル系多孔質担体、例えば特許文献２に示されるようなアガロース系架橋多孔質担体、例えば特許文献３に示されるようなセルロース系多孔質担体およびセルロース系架橋多孔質担体等が知られている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平６−２８１６３８
【特許文献２】特表２０００−５０８３６１
【特許文献３】特開平１−２１７０４１
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】”アフィニティークロマトグラフィー”、笠井献一ら著、東京化学同人、１９９１年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、シリカゲル系多孔質担体は精製目的物の吸着量が小さい傾向があり、またアルカリ条件で使用が困難な場合が多い。また、従来のアガロース系架橋多孔質担体は架橋方法が煩雑である場合が多く、また高価である場合が多い。また、セルロース系多孔質担体、およびセルロース系架橋多孔質担体は、ガラス系多孔質担体やアガロース系架橋多孔質担体のような短所は少ないものの、最近の抗体医薬品精製で主流となりつつあるスケール及び線速においては、圧密化が生じる場合がある。
【０００６】
そこで、本発明は従来の技術が有する上記課題に鑑みてなされたものであり、抗体等の精製を大スケール且つ高線速下で圧密化を生じること無く行える強度を有し、且つ精製目的物の吸着量が大きい多孔質担体、およびそれを用いた精製用吸着体、およびそれらの製造方法、およびそれらを用いた精製方法を簡便かつ安価に提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決するために本発明者らは鋭意研究の結果、下記発明を提供した。
【０００８】
即ち、５％圧縮時の圧縮応力が０．０１ＭＰａ以上１ＭＰａ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０３ＭＰａ以上３ＭＰａ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が０．０６ＭＰａ以上５ＭＰａ以下である多孔質担体を提供した。
【０００９】
これによれば、抗体等の精製を大スケール且つ高線速下で問題無く行える強度を有し、且つ精製目的物の吸着量が大きい精製用吸着体が得られる。
【００１０】
また、５％圧縮時の圧縮応力が０．０２ＭＰａ以上１ＭＰａ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０６ＭＰａ以上３ＭＰａ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が０．１ＭＰａ以上５ＭＰａ以下である、多孔質担体を提供した。
【００１１】
また、官能基数が２以上であり、最も離れている官能基間の原子数が６以上である架橋剤により架橋された、多孔質担体を提供した。
【００１２】
また、架橋剤の官能基数が３以上であることを特徴とする、多孔質担体を提供した。
【００１３】
また、架橋剤の官能基間に水酸基が存在していることを特徴とする、多孔質担体を提供した。
【００１４】
また、架橋剤の水溶率が５０％以上であることを特徴とする、多孔質担体を提供した。
【００１５】
また、架橋剤の粘度が１００ｍＰａ・ｓ以上５００００ｍＰａ・ｓ以下であることを特徴とする、多孔質担体を提供した。
【００１６】
また、架橋剤の官能基当量が１００以上６００以下であることを特徴とする、多孔質担体を提供した。
【００１７】
また、架橋剤がグリシジルエーテル系化合物であることを特徴とする、多孔質担体を提供した。
【００１８】
また、架橋剤の使用量が担体の体積の０．０１倍以上１０倍以下であることを特徴とする、多孔質担体を提供した。
【００１９】
また、多孔質担体が多糖類を含有することを特徴とする、多孔質担体を提供した。
【００２０】
また、多孔質担体がセルロースまたはセルロース誘導体を含有することを特徴とする、多孔質担体を提供した。
【００２１】
また、ホルミル基を含有することを特徴とする多孔質担体を提供した。
【００２２】
また、体積平均粒径が２０μｍ以上３００μｍ以下であることを特徴とする、多孔質担体を提供した。
【００２３】
また、多孔質担体の製造方法を提供した。
【００２４】
また、多孔質担体を用いた精製用吸着体を提供した。
【００２５】
また、アフィニティーリガンドとしてプロテインＡが導入されたことを特徴とする、精製用吸着体を提供した。
【００２６】
また、アフィニティーリガンドの導入量が多孔質担体１ｍＬ当り、１ｍｇ以上１０００ｍｇ以下であることを特徴とする、精製用吸着体を提供した。
【００２７】
また、精製目的物の吸着量が精製用吸着体１ｍＬあたり１ｍｇ以上であることを特徴とする、精製用吸着体を提供した。
【００２８】
また、精製用吸着体の製造方法を提供した。
【００２９】
また、精製用吸着体を用いた精製方法を提供した。
【００３０】
また、直径２ｃｍ以上及び高さ５ｃｍ以上のカラムを用いることを特徴とする、精製方法を提供した。
【００３１】
また、線速３００ｃｍ／ｈ以上で通液する工程を有することを特徴とする、精製方法を提供した。
【００３２】
本発明によれば、抗体医薬品等の精製を、大スケール、高速及び低コストで行うことができる。
【発明の効果】
【００３３】
本発明によれば、抗体医薬品等の精製を大スケール、高速及び低コストで行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】本発明の実施例、比較例、参考例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明は、５％圧縮時の圧縮応力が０．０１ＭＰａ以上１ＭＰａ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０３ＭＰａ以上３ＭＰａ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が０．０６ＭＰａ以上５ＭＰａ以下である多孔質担体を提供する。
【００３６】
本発明者らは、５％圧縮時の圧縮応力が０．０１ＭＰａ以上１ＭＰａ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０３ＭＰａ以上３ＭＰａ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が０．０６ＭＰａ以上５ＭＰａ以下である多孔質担体によって、大スケール、高線速で精製を行っても圧密化を生じない多孔質担体が得られることを見出した。
【００３７】
多孔質担体の５％圧縮時の圧縮応力が０．０１ＭＰａ以上、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０３ＭＰａ以上、および１５％圧縮時の圧縮応力が０．０６ＭＰａ以上であれば、大スケール、高線速で精製を行っても圧密化を生じない多孔質担体が得られる。また、多孔質担体の５％圧縮時の圧縮応力が１ＭＰａ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が３ＭＰａ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が５ＭＰａ以下であれば、脆性が向上し、微粒子発生が抑制できる。
【００３８】
ここで、５％圧縮時の圧縮応力とは、多孔質担体が圧縮されて、初期体積より体積が５％減少した時の応力、１０％圧縮時の圧縮応力とは、多孔質担体が圧縮されて、初期体積より体積が１０％減少した時の応力、１５％圧縮時の圧縮応力とは、多孔質担体が圧縮されて、初期体積より体積が１５％減少した時の応力である。初期体積とは、多孔質担体を含むスラリーに振動を与えながら、多孔質担体の体積が減少しなくなるまで沈降させて充填した状態の体積である。圧縮時の圧縮応力は、以下の方法で測定しうるものである。
１）  内径１５ｍｍのガラス製メスシリンダーに多孔質担体の５０ｖｏｌ％のスラリーを投入する。
２）  ガラス製メスシリンダーに振動を与えながら、多孔質担体体積が減少しなくなるまで沈降させて充填し、多孔質担体体積が約４ｍＬとなるよう多孔質担体量を調整する。この時の体積を初期体積とする。
３）  金属製ピストン（メスシリンダーの内壁と摩擦を生じず、且つ多孔質担体が漏れないように加工したもの）を、２０Ｎ用ロードセルを装着したオートグラフ（ＳＨＩＭＡＤＺＵ製ＥＺ−ＴＥＳＴ）に取り付ける。
４）  多孔質担体の１２０ｖｏｌ％に相当する位置にピストンの底面を合わせる。
５）  気泡が入らないように、試験速度５ｍｍ／ｍｉｎでピストンを下降させ、多孔質担体を圧縮して体積を減少させる。
６）  任意の点の圧縮応力を測定する。
【００３９】
また、本発明の多孔質担体は、５％圧縮時の圧縮応力が０．０１ＭＰａ以上１ＭＰａ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０４ＭＰａ以上３ＭＰａ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が０．０６ＭＰａ以上５ＭＰａ以下であることがより好ましく、さらに、５％圧縮時の圧縮応力が０．０１ＭＰａ以上１ＭＰａ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０６ＭＰａ以上３ＭＰａ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が０．０７ＭＰａ以上５ＭＰａ以下であることが好ましい。特に、繰り返し使用に適しているという理由から、多孔質担体の５％圧縮時の圧縮応力が０．０２ＭＰａ以上１ＭＰａ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０６ＭＰａ以上３ＭＰａ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が０．０９ＭＰａ以上５ＭＰａ以下であることが特に好ましく、最も好ましくは、５％圧縮時の圧縮応力が０．０２ＭＰａ以上１ＭＰａ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．０８ＭＰａ以上３ＭＰａ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が０．１１ＭＰａ以上５ＭＰａ以下である。また、コストの観点から、５％圧縮時の圧縮応力が０．５ＭＰａ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が１．５ＭＰａ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が２．５ＭＰａ以下であることが好ましく、５％圧縮時の圧縮応力が０．２ＭＰａ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．７ＭＰａ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が２ＭＰａ以下であることが好ましく、さらに５％圧縮時の圧縮応力が０．１ＭＰａ以下、１０％圧縮時の圧縮応力が０．３ＭＰａ以下、および１５％圧縮時の圧縮応力が２ＭＰａ以下であることが特に好ましい。
【００４０】
多孔質担体の強度を大きくする方法としては、特に限定は無く、多孔質担体のマトリックス含量（例えば樹脂含量）を大きくする方法等が好ましいが、多孔質担体の細孔径が小さくなり難いという利点から、架橋剤を作用させて多孔質担体の強度を大きくすることがより好ましい。架橋剤や架橋反応条件に特に限定は無く、公知の技術を用いて行うことができる。例えば、エピクロロヒドリン、エピブロモヒドリン、ジクロロヒドリン等のハロヒドリンや、２官能性ビスエポキシド（ビスオキシラン）や、多官能性ポリエポキシド（ポリオキシラン）を挙げることができる。また、本発明者らは、官能基数が２以上であり、最も離れている官能基間の原子数が６以上である架橋剤により架橋された多孔質担体が、大スケール、高線速で精製を行っても圧密化を生じない多孔質担体として好ましいことを見出した。理由は定かではないが、驚くべきことに、架橋剤の官能基数が２以上であると、強度が大きくなりやすいことを本発明者らは発見した。また、理由は定かではないが、最も離れている官能基間の原子数が６以上であると、強度がより大きくなりやすいことを本発明者らは発見した。本発明で使用される、官能基数が２以上であり、最も離れている官能基間の原子数が６以上である架橋剤は特に限定は無いが、例えば、レソルシノールジグリシジルエーテル、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル、１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル、ヒドロゲナートビスフェノールＡジグリシジルエーテル、グリセロールジグリシジルエーテル、トリメチロールプロパンジグリシジルエーテル、ジグリシジルテレフタレート、ジグリシジルオルトフタレート、エチレングリコールジグリシジルエーテル、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル、プロピレングリコールジグリシジルエーテル等を挙げることができる。
【００４１】
また、本発明に用いる架橋剤の官能基数は３以上であることが、多孔質担体の強度がより大きくなる傾向にあるため好ましい。官能基数が３以上である架橋剤は特に限定は無いが、例えば、グリセロールポリグリシジルエーテル、トリメチロールプロパンポリグリシジルエーテル、ペンタエリスリトールポリグリシジルエーテル、ジグリセロールポリグリシジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、ソルビトールポリグリシジルエーテル等を挙げることができる。
【００４２】
また、本発明に用いる架橋剤は、官能基間に水酸基が存在していることが好ましい。架橋剤の官能基間に水酸基が存在していると、多孔質担体の強度がより大きくなる傾向があるため好ましい。理由は定かではないが、驚くべきことに、架橋剤の官能基間に水酸基が存在していると、多孔質担体の強度がより大きくなりやすいことを、本発明者らは発見した。さらに、架橋剤の最も離れている官能基間に水酸基が存在していることが、より好ましい。理由は定かではないが、驚くべきことに、架橋剤の最も離れている官能基間に水酸基が存在していると、さらに強度が大きくなりやすいことを、本発明者らは発見した。
【００４３】
官能基間に水酸基が存在している架橋剤としては、特に限定は無いが、例えば、ソルビトールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−６１１、ＥＸ−６１２、ＥＸ−６１４、ＥＸ−６１４Ｂ、ＥＸ−６２２等）、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル（（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−５１２、ＥＸ−５２１等）、ジグリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−４２１等）、グリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−３１３、ＥＸ−３１４等）を挙げることができる。
【００４４】
また、本発明に用いる架橋剤の水溶率は５０％以上であることが好ましい。架橋剤の水溶率が５０％以上であると、多孔質担体の強度がより大きくなるため好ましい。特に架橋反応の溶媒に水を用いる場合において、架橋剤の水溶率が５０％以上であると、強度がより大きくなる傾向がみられるため好ましい。理由は定かではないが、驚くべきことに、架橋剤の水溶率が５０％以上であると、多孔質担体の強度が大きくなりやすいことを、本発明者らは発見した。また、架橋剤の水溶率は６０％以上１００％以内であることが特に好ましい。ここで、水溶率とは、室温にて水９０部に架橋剤１０部を溶解させる操作を行ったとき、水に実際に溶解した架橋剤の割合を指す。水溶率が５０％以上の架橋剤としては特に限定は無いが、例えば、グリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−３１３、ＥＸ−３１４等）、ジグリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−４２１等）、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−５１２、ＥＸ−５２１等）、ソルビトールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−６１４、ＥＸ−６１４Ｂ等）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−８１０、ＥＸ−８１１等）、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−８５０、ＥＸ−８５１等）、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−８２１、ＥＸ−８３０、ＥＸ−８３２、ＥＸ−８４１、ＥＸ−８６１、ＥＸ−９１１、ＥＸ−９４１、ＥＸ−９２０、ＥＸ−９３１等）を挙げることができる。
【００４５】
また、本発明に用いる架橋剤の粘度は、１００ｍＰａ・ｓ以上５００００ｍＰａ・ｓ以下であることが好ましい。架橋剤の粘度がこの範囲にあると、多孔質担体の強度がより大きくなり、精製用吸着体に用いた場合に、精製目的物の吸着量がより大きくなるため好ましい。理由は定かではないが、驚くべきことに、架橋剤の粘度が１００ｍＰａ・ｓ以上であると、多孔質担体の強度が大きくなりやすいことを、本発明者らは発見した。また、理由は定かではないが、驚くべきことに、架橋剤の粘度が５００００ｍＰａ・ｓ以下であれば、多孔質担体を吸着体に用いた場合の精製目的物の吸着量が大きくなりやすいことを、本発明者らは発見した。また、粘度のより好ましい範囲は、１００ｍＰａ・ｓ以上３００００ｍＰａ・ｓ以下であり、さらに好ましくは１５０ｍＰａ・ｓ以上２５０００ｍＰａ・ｓ以下であり、特に好ましくは１５０ｍＰａ・ｓ以上５５００ｍＰａ・ｓ以下である。粘度はヘップラー式またはＢ型粘度計で測定することができる。粘度が１００ｍＰａ・ｓ以上５００００ｍＰａ・ｓ以下である架橋剤としては特に限定は無いが、例えば、レソルシノールジグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−２０１等）、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−２１１等）、１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−２１２等）、ヒドロゲナートビスフェノールＡジグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−２５２等）、グリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−３１３、ＥＸ−３１４等）、トリメチロールプロパンポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−３２１等）、ペンタエリスリトールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−４１１等）、ジグリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−４２１等）、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−５１２、ＥＸ−５２１等）、ソルビトールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−６１１、ＥＸ−６１２、ＥＸ−６１４、ＥＸ−６１４Ｂ、ＥＸ−６２２等）、ジグリシジルテレフタレート（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−７１１等）、ジグリシジルオルト−フタレート（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−７２１等）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−８１０、ＥＸ−８１１等）、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−８５０、ＥＸ−８５１等）、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−８２１、ＥＸ−８３０、ＥＸ−８３２、ＥＸ−８４１、ＥＸ−８６１、ＥＸ−９１１、ＥＸ−９４１、ＥＸ−９２０、ＥＸ−９３１等）を挙げることができる。
【００４６】
また、本発明に用いる架橋剤の官能基当量は１００以上６００以下であることが好ましい。架橋剤の官能基当量がこの範囲であると、多孔質担体の強度がより大きくなり、吸着体に用いた場合の精製目的物の吸着量がより大きくなるため好ましい。理由は定かではないが、驚くべきことに、官能基当量が１００以上６００以下であれば、多孔質担体の強度が大きくなり、精製目的物の吸着量も大きくなりやすいことを、本発明者らは発見した。本発明に用いる架橋剤の官能基当量のより好ましい範囲は１００以上５００以下であり、さらに好ましい範囲は１００以上３００以下であり、特に好ましくは１３０以上〜１９０以下である。ここで官能基当量とはｗｅｉｇｈｔ  ｐｅｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｒｏｕｐ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔであり、架橋剤の分子量÷官能基数で求めることができる。官能基当量が１００以上５００以下である架橋剤としては特に限定は無いが、例えば、レソルシノールジグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−２０１等）、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−２１１等）、１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−２１２等）、ヒドロゲナートビスフェノールＡジグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−２５２等）、グリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−３１３、ＥＸ−３１４等）、トリメチロールプロパンポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−３２１等）、ペンタエリスリトールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−４１１等）、ジグリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−４２１等）、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−５１２、ＥＸ−５２１等）、ソルビトールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−６１１、ＥＸ−６１２、ＥＸ−６１４、ＥＸ−６１４Ｂ、ＥＸ−６２２等）、ジグリシジルテレフタレート（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−７１１等）、ジグリシジルオルト−フタレート（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−７２１等）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−８１０、ＥＸ−８１１等）、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−８５０、ＥＸ−８５１等）、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−８２１、ＥＸ−８３０、ＥＸ−８３２、ＥＸ−８４１、ＥＸ−８６１、ＥＸ−９１１、ＥＸ−９４１、ＥＸ−９２０、ＥＸ−９３１等）を挙げることができる。
【００４７】
また、本発明の架橋剤は、グリシジルエーテル系化合物であることが好ましい。グリシジルエーテル系は産業的に容易に得ることができ、効率よく架橋反応が進行するため好ましい。グリシジルエーテル系化合物を含有する架橋剤としては特に限定は無いが、例えば、レソルシノールジグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−２０１等）、ネオペンチルグリコールジグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−２１１等）、１，６−ヘキサンジオールジグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−２１２等）、ヒドロゲナートビスフェノールＡジグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−２５２等）、グリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−３１３、ＥＸ−３１４等）、トリメチロールプロパンポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−３２１等）、ペンタエリスリトールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−４１１等）、ジグリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−４２１等）、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−５１２、ＥＸ−５２１等）、ソルビトールポリグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−６１１、ＥＸ−６１２、ＥＸ−６１４、ＥＸ−６１４Ｂ、ＥＸ−６２２等）、ジグリシジルテレフタレート（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−７１１等）、ジグリシジルオルト−フタレート（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−７２１等）、エチレングリコールジグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−８１０、ＥＸ−８１１等）、ジエチレングリコールジグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−８５０、ＥＸ−８５１等）、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル（ナガセケムテックス社製デナコールＥＸ−８２１、ＥＸ−８３０、ＥＸ−８３２、ＥＸ−８４１、ＥＸ−８６１、ＥＸ−９１１、ＥＸ−９４１、ＥＸ−９２０、ＥＸ−９３１等）を挙げることができる。
【００４８】
また、本発明の架橋剤の使用量は多孔質担体の体積の０．０１倍以上１０倍以下であるであることが好ましい。架橋剤の使用量が担体の体積の０．０１倍以上であれば、架橋反応により強度が大きくなりやすいため好ましく、また１０倍以下であれば、コストや予期せぬ過激な反応を抑制でき、さらに多孔質担体を吸着体に用いた場合の精製目的物の吸着量が大きくなりやすいため好ましい。また架橋剤の使用量のより好ましい範囲は多孔質担体の体積の０．０５倍以上５倍以下、さらに好ましくは０．１倍以上３倍以下、特に好ましくは０．３倍以上２倍以下であり、最も好ましくは０．３倍以上１倍以下である。
【００４９】
これら架橋剤を用いて、多孔質担体の強度を大きくする方法は特に限定は無いが、反応効率の観点から、これら架橋剤をアルカリ条件下で担体に作用させることが好ましい。架橋剤の投入方法には特に限定は無く、全使用量を反応初期から投入しても良いし、複数回に分けて反応を繰り返しても良く、また滴下ロート等を用いて、少量ずつ架橋剤を投入しても良く、また架橋剤が投入された反応容器に多孔質担体を投入しても良い。架橋反応の溶媒については特に限定は無いが、水、ヘプタン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジオキソラン等の汎用有機溶媒や、エタノール、メタノール、プロパノール等のアルコールや、これらの２種以上の混合溶媒を用いることができる。また、反応効率を高めるため、ソディウムボロヒドリド等の還元剤を共存させることがより好ましい。架橋反応時の温度については特に限定は無いが、反応速度的に有利であるという理由から０℃以上であることが好ましく、および／または安全性や多孔質担体へのダメージの観点から１００℃以下であることが好ましく、官能基が失活し難いという理由から７０℃以下であることがより好ましい。架橋反応は攪拌または振とうしながら行うことが好ましく、その１分間当りの回転数または回数は、均一攪拌が可能で、且つ多孔質担体に物理的なダメージが加わらないという理由から５０回〜１０００回であることが好ましく、より好ましくは１００〜５００回であるが、各原料の比重の差や多孔質担体の強度に合わせて調整することが特に好ましい。架橋反応時間については、特に限定は無いが、官能基の失活や担体へのダメージが少ないという理由から、ハロヒドリンを用いる場合は、１時間以上８時間以下、ビスエポキシド（ビスオキシラン）やポリエポキシド（ポリオキシラン）を用いる場合は、２時間以上、１５時間未満であることが好ましく、架橋剤の反応性や、アルカリの強さや、反応温度に合わせて調整することがより好ましい。
【００５０】
本発明の多孔質担体の材質に特に限定は無いが、例えば、多糖類、ポリスチレン、スチレン−ジビニルベンゼン共重合体、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル、ポリビニルアルコール、およびこれらの誘導体等を挙げることができる。これらは、ヒドロキシエチルメタクリレート等のヒドロキシ基を有する高分子材料やポリエチレンオキサイド鎖を有する単量体と他の重合性単量体との共重合のようなグラフト共重合体等のコーティング層を有していてもよい。これらの中で多糖類や、ポリビニルアルコール等が、担体表面に活性基を導入しやすいため、好ましく用いることができる。
【００５１】
なかでも、本発明の多孔質担体は多糖類を含有することがより好ましい。多糖類は産業的に容易に得ることが可能であり、また生体に対する安全性が高いため好ましい。本発明の多孔質担体に用いることができる多糖類に特に限定は無いが、例えば、アガロース、セルロース、デキストリン、キトサン、キチン、及びこれらの誘導体等を挙げることができる。
【００５２】
また、本発明の多孔質担体は、セルロースまたはセルロース誘導体を含有することがより好ましい。セルロースまたはセルロース誘導体を含有する多孔質担体は、機械的強度が比較的高く、強靱であるため破壊されたり微粒子を生じたりすることが少なく、カラムに充填した場合に液を高線速で流しても比較的圧密化し難いため好ましい。また、強度やコストの観点から本発明の多孔質担体の材質に最も好ましいのはセルロースである。
【００５３】
本発明の多孔質担体は、精製用吸着体に用いることができる。精製用吸着体として利用するためには、アフィニティーリガンドを多孔質担体に固定化することが多い。アフィニティーリガンドを固定化する方法は、例えば非特許文献１の表８・１や図８・１５に示される臭化シアン法、トリクロロトリアジン法、エポキシ法、トレシルクロリド法等の、様々な固定化法の中から選択することができる。中でも、アミノ基を有するアフィニティーリガンドを固定化する場合において、安全性の観点や、固定化反応の容易さ、比較的容易な方法で産生されたタンパク質リガンドが使用できる等の理由から、担体のホルミル基と、アフィニティーリガンドのアミノ基との反応を固定化に用いることが、産業上好ましい。これらの観点から、本発明の多孔質担体は、ホルミル基を含有することが好ましい。ホルミル基を担体に導入する方法としては、例えば、ビシナルの水酸基を持つ多糖類を過ヨウ素酸酸化法によって酸化し、糖鎖上にホルミル基を生成させる方法（以下糖鎖開裂型と略す）が挙げられる。この方法を介して得られた吸着体は、リガンドの漏れ（リーク）が少ないため好ましい。また、非特許文献１の図８・１５に示されるような、グルタルアルデヒドを作用させる方法や、エポキシ基の開環により得られるグリセリル基に過ヨウ素酸塩を作用させる方法等により得られる、各種スペーサーを介してホルミル基を導入する方法（以下、スペーサー型と略す）が挙げられる。このスペーサー型ホルミル基含有担体を用いた吸着体は、比較的、精製目的物質の吸着量が大きい傾向にあり好ましい。また、本発明者らが最近独自に見出した発明によれば、グルコサミン等に代表されるアミノ糖を、スペーサーとして導入し、次いでこのスペーサー上に過ヨウ素酸酸化法によりホルミル基を含有させた多孔質担体を用いることにより、リガンドの漏れが少なく、且つ精製目的物の吸着量も大きい吸着体が得られやすいことが判明している。よってこの本発明者らの最近の発明を、本発明の強度が大きい多孔質担体に応用し、ホルミル基を含有する強度が大きい多孔質担体を得ることが特に好ましい。これら多孔質担体のホルミル基含量は、多孔質担体１ｍＬあたり１μｍｏｌ以上１００μｍｏｌ以下であることが好ましい。ホルミル基含量が多孔質担体１ｍＬあたり１μｍｏｌ以上であれば、アフィニティーリガンドを効率よく固定化でき、精製用吸着体として用いた場合に、精製目的物の吸着量が大きくなるため好ましい。また、理由は定かではないが、驚くべきことに、ホルミル基含量が多孔質担体１ｍＬあたり１００μｍｏｌ以下であれば、精製目的物の吸着量が大きくなりやすいことを、本発明者らは発見した。ホルミル基含量のより好ましい範囲は多孔質担体１ｍＬあたり２μｍｏｌ以上５０μｍｏｌ以下であり、さらに好ましくは２μｍｏｌ以上４０μｍｏｌ以下であり、特に好ましくは４μｍｏｌ以上３０μｍｏｌ以下であり、最も好ましくは、５μｍｏｌ以上２５μｍｏｌ以下である。ホルミル基含量は、ｐＨ８の０．１Ｍリン酸バッファーで置換した多孔質担体２ｍＬと、フェニルヒドラジンを溶解したｐＨ８の０．１Ｍリン酸バッファー溶液２ｍＬとを接触させ、４０℃で１時間攪拌し、ＵＶ測定により反応液の上清の２７８ｎｍ付近の吸収極大の吸光度を測定し、これにより得られたフェニルヒドラジンの多孔質担体への吸着量として、見積もっている。この時、フェニルヒドラジンの投入量は予想ホルミル基含量の２倍モルとし、フェニルヒドラジンの投入量に対して、多孔質担体への吸着量が２５％以下、または７５％以上であった場合は、フェニルヒドラジンの投入量を見直し、再度測定を行うものとしている。
【００５４】
また、本発明の多孔質担体は、体積平均粒径が２０μｍ以上３００μｍ以下であることが好ましい。多孔質担体の体積平均粒径が２０μｍ以上であれば、圧密化が起こり難いため好ましく、３００μｍ以下であれば精製用吸着体に用いた場合の精製目的物の吸着量が大きくなるため好ましい。多孔質担体の体積平均粒径のより好ましい範囲は、４０μｍ以上２００μｍ以下であり、さらに好ましくは６０μｍ以上１５０μｍ以下であり、特に好ましくは７５μｍ以上１００μｍ以下であり、最も好ましくは８０μｍ以上９５μｍ以下である。体積平均粒径は、ランダムに選んだ１００個の多孔質担体の粒径を測定して求めることができる。個々の多孔質担体の粒径は、個々の多孔質担体の顕微鏡写真を撮影して電子データーとして保存し、粒径測定ソフトウェア（メディアサイバーネティックス社製イメージプロプラス）を用いて、測定することができる。
【００５５】
また、本発明者らは以上に述べた本発明の多孔質担体を用いた精製用吸着体をも提供する。本発明の多孔質担体は精製用吸着体に用いることができる。本発明の多孔質担体を用いることができる精製用吸着体としては特に限定は無く、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー用の吸着体を挙げることができる。本発明の多孔質担体を精製用吸着体として利用するためには、アフィニティーリガンドを多孔質担体に固定化することが多い。固定化できるアフィニティーリガンドに特に限定は無く、所望のアフィニティーリガンドを固定化するために活性化された多孔質担体を用いて、様々なアフィニティーリガンドを固定化することができる。例えば非特許文献１の表８・１、表８・２、図８・１５に示されるような、臭化シアン法、トリクロロトリアジン法、エポキシ法、トレシルクロリド法、過ヨウ素酸酸化法、ジビニルスルホン酸法、ベンゾキノン法、カルボニルジイミダゾール法、アシルアジド法等を用いてアミノ基含有リガンドを固定化する方法、エポキシ法、ジアゾカップリング法等を用いて水酸基含有リガンドを固定化する方法、エポキシ法、トレシルクロリド法、ジビニルスルホン酸法等を用いて、チオール基含有リガンドを固定化する方法、アミノ化担体にカルボン酸含有リガンドやホルミル基含有リガンドを固定化する方法等の様々な固定化法を挙げることができる。
【００５６】
抗体医薬品精製用吸着体等に用いられる場合のアフィニティーリガンドとしては、特に限定は無いが、例えば、抗体に特異性の高い抗原やタンパク質や、プロテインＧ、Ｌやその変異体、抗体結合活性を有するペプチド等を挙げることができる。特に、免疫グロブリン（ＩｇＧ）を特異的に吸着、溶出できる吸着体として、プロテインＡをアフィニティーリガンドとして担体に固定化した吸着体が注目されている。また、抗体医薬精製の分野においては、大スケール、高速、及び低コストが望まれている。このような観点から、本発明の吸着体は、アフィニティーリガンドとしてプロテインＡが導入された精製用吸着体であることが好ましい。本発明に用いることができるプロテインＡには特に限定は無く、天然物、遺伝子組み換え物等を制限なく使用することができる。また、抗体結合ドメイン及びその変異体を含むもの、融合蛋白質等であってもよい。また、菌体抽出物もしくは培養上清より、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー及び膜分離技術を用いた分子量分画、分画沈殿法等の手法から選択される精製法を組合せ、および／または繰り返すことにより製造された、プロテインＡを用いることもできる。特に、国際公開特許公報ＷＯ２００６／００４０６７や米国特許公報ＵＳ５１５１３５０に記載されている方法で得られたプロテインＡであることが好ましい。
【００５７】
プロテインＡをアフィニティーリガンドとして多孔質担体に導入する方法としては、前述の様々な固定化方法から選択することができるが、より好ましいのは多孔質担体が含有するホルミル基と、プロテインＡのアミノ基との反応を利用して固定化を行う方法であり、特に好ましくは、グルコサミン等に代表されるアミノ糖を、スペーサーとして導入し、次いでこのスペーサー上に過ヨウ素酸酸化法によりホルミル基を含有させた多孔質担体を用いて、アフィニティーリガンドとしてプロテインＡが導入された精製用吸着体を得る方法である。
【００５８】
また、本発明の精製用吸着体のアフィニティーリガンドの導入量は、多孔質担体１ｍＬ当り、１ｍｇ以上１０００ｍｇ以下であることが好ましい。アフィニティーリガンドの導入量が多孔質担体１ｍＬ当り１ｍｇ以上であれば、精製目的物に対する吸着量が大きくなるため好ましく、１０００ｍｇ以下であれば、製造コストを抑制できるため好ましい。より好ましいアフィニティーリガンドの導入量は、多孔質担体１ｍＬ当り２ｍｇ以上１２０ｍｇ以下であり、さらに好ましくは３ｍｇ以上６０ｍｇ以下であり、特に好ましくは４ｍｇ以上３０ｍｇ以下であり、最も好ましくは５ｍｇ以上１５ｍｇ以下である。アフィニティーリガンドの導入量は、固定化反応後の反応液上清中のアフィニティーリガンド由来の吸光度を測定することによって求めることができる。また、元素分析法を用いて、アフィニティーリガンドの導入量を求めることができる。例えば、アミノ基含有アフィニティーリガンドであれば、精製用吸着体のＮ含量分析を行うことにより、アフィニティーリガンドの導入量を測定することができる。
【００５９】
また、本発明の精製用吸着体の、精製目的物の吸着量は、精製用吸着体１ｍＬあたり１ｍｇ以上であることが好ましい。精製目的物の吸着量が、精製用吸着体１ｍＬあたり１ｍｇ以上であれば、効率よく精製が行えるため好ましい。また精製目的物の吸着量が、精製用吸着体１ｍＬあたり１０００ｍｇ以下であれば、吸着した精製目的物を精製用吸着体から溶出しやすいため好ましい。より好ましい精製用吸着体の、精製目的物の吸着量は、精製用吸着体１ｍＬあたり５ｍｇ以上５００ｍｇ以下であり、さらに好ましくは１０ｍｇ以上２５０ｍｇ以下であり、特に好ましくは２０ｍｇ以上１５０ｍｇ以下であり、最も好ましくは３０ｍｇ以上８０ｍｇ以下である。精製目的物の吸着量は、ｐＨ７．４のリン酸バッファー（シグマ社製）で置換した精製用吸着体０．５ｍＬに対し、７０ｍｇの精製目的物を３５ｍＬのｐＨ７．４のリン酸バッファー（シグマ社製）に溶解させた溶液を接触させ、２５℃で２時間攪拌した後、上清中の精製目的物の減少量を測定することにより求めることができる。
【００６０】
本発明の精製用吸着体は、前述したとおり、様々なアフィニティーリガンド固定化反応の中から、適切なものを都度選択して製造することができる。アフィニティーリガンドとしてタンパク質を用いる場合は、タンパク質が失活し難いという観点から、反応温度は反応液の融点以上１００℃以下が好ましく、より好ましくは融点以上７０℃以下、さらに好ましくは融点以上５０℃以下、特に好ましくは融点以上３０℃以下、最も好ましくは融点以上１５℃以下である。また、アフィニティーリガンドとしてタンパク質を用いる場合の反応液のｐＨは、タンパク質が失活し難いという観点から、ｐＨ２以上１３未満であることが好ましく、より好ましくは、ｐＨ３以上１２未満、さらに好ましくは、ｐＨ４以上１１以下、特に好ましくは、ｐＨ５以上１１以下、最も好ましくは、ｐＨ６以上１１以下である。一方、ｐＨが大きくなるとアフィニティーリガンドの固定化量が大きくなりやすいという観点も加味すれば、反応液のｐＨは、ｐＨ７以上１１以下が好ましく、より好ましくは、ｐＨ８以上１１以下、さらに好ましくはｐＨ９以上１１以下、特に好ましくはｐＨ１０以上１１以下である。アフィニティーリガンドの投入方法には特に限定は無く、全使用量を反応初期から投入しても良いし、複数回に分けて反応を繰り返しても良く、また滴下ロート等を用いて、少量ずつアフィニティーリガンドを投入しても良く、またアフィニティーリガンドが投入された反応容器に多孔質担体を投入しても良い。アフィニティーリガンド固定化反応の溶媒については特に限定は無いが、水、ヘプタン、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジオキソラン等の汎用有機溶媒や、エタノール、メタノール、プロパノール等のアルコールや、これらの２種以上の混合溶媒を用いることができる。また、反応効率を上げる目的や、ｐＨの変動を抑制する等の目的で、炭酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩等の少なくとも１種以上を加えることも好ましい。これら塩類の反応液における好ましい濃度は０．００１Ｍ以上１０Ｍ以下、より好ましくは０．０１Ｍ以上５Ｍ以下、さらに好ましくは０．０５Ｍ以上１Ｍ以下、特に好ましくは０．１Ｍ以上０．５Ｍ以下である。また、タンパク質等の高分子化合物をアフィニティーリガンドとして用いる場合、多孔質担体とアフィニティーリガンド間の多点結合を抑制する目的で、食塩等の塩類を加えることも好ましい。これら食塩等の塩類の反応液における好ましい濃度は０．００１Ｍ以上１０Ｍ以下、より好ましくは０．０１Ｍ以上５Ｍ以下、さらに好ましくは０．０５Ｍ以上１Ｍ以下、特に好ましくは０．１Ｍ以上０．５Ｍ以下である。また、ホルミル基含有多孔質担体を用いる場合は、ソディウムボロヒドリドやトリメチルアミンボラン、ジメチルアミンボラン、ピコリンボラン、ピリジンボラン、ソディウムシアノボロヒドリド、ソディウムトリアセトキシボロヒドリド等の還元剤をアフィニティーリガンド固定化反応終了後に添加、または固定化反応時に共存させて、固定化を安定させることが好ましい。また、アフィニティーリガンドの固定化終了後に、多孔質担体上に残存した活性基を不活性化させる目的で、封止剤を作用させることも好ましい。封止剤としては特に限定は無いが、多孔質担体上の活性基と反応する官能基を含有する低分子化合物であることが好ましく、例えば、多孔質担体上の活性基がエポキシ基やホルミル基の場合は、アミノ基を含有する低分子化合物を用いることが好ましく、これの一例として、グリシンやモノエタノールアミン、トリス等を挙げることができる。アフィニティーリガンド固定化反応およびこれに関連する反応（例えば、還元反応や封止反応）は、攪拌または振とうしながら行うことが好ましく、その１分間当りの回転数または回数は、均一攪拌が可能で、且つ多孔質担体に物理的なダメージが加わらないという理由から１回以上１０００回以下であることが好ましく、より好ましくは１０回以上５００回以下、さらに好ましくは２５回以上３００回以下、特に好ましくは５０回以上１５０回以下であるが、各原料の比重の差や多孔質担体の強度に合わせて調整することが特に好ましい。アフィニティーリガンド固定化反応時間については、特に限定は無いが、アフィニティーリガンドの失活や担体へのダメージが少ないという理由から、０．１時間以上１０００時間以下であることが好ましく、より好ましくは０．５時間以上１００時間以下、さらに好ましくは１時間以上５０時間以下、特に好ましくは１．５時間以上２４時間以下、最も好ましくは３時間以上１２時間以下であるが、反応性や、ｐＨや、反応温度に合わせて調整することがより好ましい。
【００６１】
本発明の精製用吸着体は、アフィニティークロマトグラフィーを用いた各種精製目的物の精製や、非特許文献１に示されるような各種精製方法に利用することができる。さらに、本発明の精製用吸着体は、精製目的物の精製を大スケール、高速及び低コストで行うことを可能とする。
【００６２】
よって、本発明の精製用吸着体を用いた精製方法は、直径２ｃｍ以上及び高さ５ｃｍ以上のカラムを用いることが好ましい。直径が２ｃｍ以上及び高さ５ｃｍ以上であれば、精製を効率よく行うことができる。また、精製の精度や効率の観点から、カラムの大きさは直径２０００ｃｍ以下及び高さ５０００ｃｍ以下であることが好ましい。より好ましいカラムの大きさは直径４ｃｍ以上２００ｃｍ以下、高さ７ｃｍ以上３００ｃｍ以下であり、さらに好ましくは直径８ｃｍ以上１００ｃｍ以下及び高さ９ｃｍ以上１５０ｃｍ以下であり、特に好ましくは直径１６ｃｍ以上８５ｃｍ以下及び高さ１２ｃｍ以上８５ｃｍ以下であり、最も好ましくは直径２５ｃｍ以上８５ｃｍ以下及び高さ１４ｃｍ以上３５ｃｍ以下である。
【００６３】
また、本発明の精製用吸着体を用いた精製方法は、線速３００ｃｍ／ｈ以上で通液する工程を有することが好ましい。線速３００ｃｍ／ｈ以上で通液する工程を有していれば、精製を効率よく行うことができるため好ましい。また精製の精度や精製装置の耐久性の観点から、本発明の精製用吸着体を用いた精製は、線速１００００ｃｍ／ｈ以下で行うことが好ましい。より好ましい精製の線速は４００ｃｍ／ｈ以上５０００ｃｍ／ｈ以下、さらに好ましくは５００ｃｍ／ｈ以上２５００ｃｍ／ｈ以下、特に好ましくは６００ｃｍ／ｈ以上１５００ｃｍ／ｈ以下、最も好ましくは７００ｃｍ／ｈ以上１２００ｃｍ／ｈ以下である。
【００６４】
本発明の多孔質担体、およびそれを用いた精製用吸着体、およびそれらの製造方法、およびそれらを用いた精製方法は、本発明を用いない場合に比べて、精製のスケール、速度及びコストが著しく改善できる。
【実施例】
【００６５】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００６６】
（実施例１）
体積平均粒径が９２μｍ、樹脂含量が６％、排除限界分子量が５０００万の多孔質セルロース担体（チッソ社製ＣＫ−Ａ）とＲＯ水の１：１スラリーを、グラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ-２）上で１５分間吸引ろ過（サクションドライ）した。得られたサクションドライ済みの多孔質セルロース担体を２７．４ｇをポリ容器（サンプラテック社製１００ｍＬ）に投入し、これに０．６Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（和光純薬工業社製水酸化ナトリウムとＲＯ水で調整）２７．４ｍＬを加え、４０℃で３０分加温した。液温が４０℃に加温された後、水素化ホウ素ナトリウム（和光純薬工業社製）を５４．８ｍｇ、架橋剤としてグリセロールポリグリシジルエーテルを含有するデナコールＥＸ−３１４（ナガセケムテックス社製）２７．４ｍＬの順に加え、恒温振とう機（トーマス科学社製サーモスタティックウォーターバスＴ−２５）を用いて、４０℃で５時間、１００回／分で振とうしながら反応させた。反応終了後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ-２）上で吸引ろ過しながら、多孔質担体の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、目的とする多孔質担体を得た。
【００６７】
（実施例２）
架橋剤にトリメチロールプロパンポリグリシジルエーテルを含有するデナコールＥＸ−３２１（ナガセケムテックス社製）を用いた他は、実施例１と同様の方法で、目的とする多孔質担体を得た。
（実施例３）
架橋剤にジグリセロールポリグリシジルエーテルを含有するデナコールＥＸ−４２１（ナガセケムテックス社製）を用いた他は、実施例１と同様の方法で、目的とする多孔質担体を得た。
【００６８】
（実施例４）
実施例１で作製した多孔質担体を、オートクレーブ(サクラ社製  高圧滅菌器ネオクレーブ)を用いて１２０℃で４０分間加温し、室温まで放冷した後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ-２）上で多孔質担体の５倍体積量のＲＯ水で洗浄した。この洗浄後の多孔質担体について、実施例１と同様の方法で更に架橋反応を行い、目的とする多孔質担体を得た。
【００６９】
（実施例５）
実施例２で作製した多孔質担体を、オートクレーブ(サクラ社製  高圧滅菌器ネオクレーブ)を用いて１２０℃で４０分間加温し、室温まで放冷した後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ-２）上で多孔質担体の５倍体積量のＲＯ水で洗浄した。この洗浄後の多孔質担体について、実施例２と同様の方法で更に架橋反応を行い、目的とする多孔質担体を得た。
【００７０】
（実施例６）
実施例３で作製した多孔質担体を、オートクレーブ(サクラ社製  高圧滅菌器ネオクレーブ)を用いて１２０℃で４０分間加温し、室温まで放冷した後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ-２）上で多孔質担体の５倍体積量のＲＯ水で洗浄した。この洗浄後の多孔質担体について、実施例３と同様の方法で更に架橋反応を行い、目的とする多孔質担体を得た。
【００７１】
（実施例７）
実施例４で作製した多孔質担体を、オートクレーブ(サクラ社製  高圧滅菌器ネオクレーブ)を用いて１２０℃で４０分間加温し、室温まで放冷した後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ-２）上で多孔質担体の５倍体積量のＲＯ水で洗浄した。洗浄後の多孔質担体１０ｍＬとＲＯ水２．６ｍＬを遠沈管（岩城硝子社製５０ｍＬ）に入れ、さらに２Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（和光純薬工業社製水酸化ナトリウムとＲＯ水で調整）３．７ｍＬをこれに加えて、４０℃で３０分加温した。液温が４０℃に加温された後、エピクロロヒドリン（和光純薬工業社製）を１．３ｍＬ加えて、恒温振とう機（トーマス科学社製サーモスタティックウォーターバスＴ−２５）を用いて、４０℃で２時間、１００回／分で振とうしながら反応させた。反応終了後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ-２）上で、多孔質担体の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、エポキシ化多孔質担体を得た。このエポキシ化多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ-２）上で、ｐＨ１０の０．５Ｍ炭酸バッファー（和光純薬工業社製の炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウムと、ＲＯ水で調整）３０ｍＬを用いて置換した。置換後のエポキシ化多孔質担体１０ｍＬとｐＨ１０の０．５Ｍ炭酸バッファー１０ｍＬを遠沈管（岩城硝子社製５０ｍＬ）に入れ、さらにＤ（＋）−グルコサミン塩酸塩（和光純薬工業社製）を９５ｍｇ加え、恒温振とう機（トーマス科学社製サーモスタティックウォーターバスＴ−２５）を用いて、５０℃で４時間、１００回／分で振とうし、次いで室温で１２時間静置して反応させた。反応後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ-２）上で、多孔質担体の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、グルコサミン化多孔質担体を得た。得られたグルコサミン化多孔質担体８．５ｍＬとＲＯ水４．３ｍＬを遠沈管（岩城硝子社製５０ｍＬ）に入れた。次に９８ｍｇの過ヨウ素酸ナトリウム（和光純薬工業社製）を８．５ｍＬのＲＯ水に溶解させ、この過ヨウ素酸ナトリウム水溶液を遠沈管に加えて、インキュベーター（イワキガラス社製インキュベーターＬＯＷ−ＴＥＭＰ  ＩＣＢ−１５１Ｌ）中で、ミックスローター（井内盛栄堂社製バリアブルミックスローターＶＭＲ−５）を用いて、２５℃で１時間、１００回／分で振とうしながら反応させた。反応後、グラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ-２）上で、多孔質担体の２０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、ホルミル基含有多孔質担体を得た。得られたホルミル基含有多孔質担体のホルミル基含量を前述の方法で測定した結果、ホルミル基含量は多孔質担体１ｍＬあたり５６μｍｏｌであった。このホルミル基含有多孔質担体７．４ｍＬをグラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ-２）上で、ｐＨ１０の０．５Ｍリン酸＋０．１５Ｍ食塩バッファー（和光純薬工業社製リン酸水素２ナトリウム、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、ＲＯ水を用いて調整）３０ｍＬで置換した。置換後のホルミル基含有多孔質担体７．４ｍＬとｐＨ１０の０．５Ｍリン酸＋０．１５Ｍ食塩バッファー４．９ｍＬを遠沈管（岩城硝子社製５０ｍＬ）に入れ、国際公開特許公報ＷＯ２００６／００４０６７に記載の方法で作製されたプロテインＡの濃度が、５２．６ｍｇ／ｍＬのプロテインＡ含有溶液（カネカ社製ＰＮＸ���２８）を１．１３ｍＬ加え、インキュベーター（イワキガラス社製インキュベーターＬＯＷ−ＴＥＭＰ  ＩＣＢ−１５１Ｌ）中で、ミックスローター（井内盛栄堂社製バリアブルミックスローターＶＭＲ−５）を用いて、４℃で１２時間、１００回／分で振とうしながら反応させた。反応後の反応液のｐＨが８になるように４Ｍ塩酸（和光純薬工業社製塩酸とＲＯ水で調整）を用いて調整した後、水素化ホウ素ナトリウムを２１ｍｇ加えて、４℃で１時間、ゆるやかに振とうしながら反応させた。反応後、反応液の２７７ｎｍ付近の吸収極大の吸光度を測定した結果、アフィニティーリガンドであるプロテインＡの導入量が、多孔質担体１ｍＬ当り、８ｍｇであることがわかった。反応後の多孔質担体をグラスフィルター（ＴＯＰ社製１７Ｇ-２）上で、多孔質担体の５０倍体積量のＲＯ水で洗浄し、目的とするプロテインＡ固定化精製用吸着体を得た。得られた精製用吸着体の精製目的物であるＩｇＧの吸着量を前述の方法で求めた結果、精製用吸着体１ｍＬあたり、２６ｍｇであることが分かった。
【００７２】
（実施例８）
実施例６で作製した多孔質担体を用いて、実施例７と同様の方法で、ホルミル基含量が多孔質担体１ｍＬあたり５８μｍｏｌのホルミル基含有多孔質担体を得た。次いで実施例７と同様の方法で、アフィニティーリガンドであるプロテインＡ導入量が多孔質担体１ｍＬ当り８ｍｇで、精製目的物であるＩｇＧの吸着量が、精製用吸着体１ｍＬあたり２５ｍｇの精製用吸着体を得た。
【００７３】
(比較例１)
体積平均粒径が９２μｍ、樹脂含量が６％、排除限界分子量が５０００万の多孔質セルロース担体（チッソ社製ＣＫ−Ａ）を本発明の比較として用いた。
【００７４】
(比較例２)
ＣＫ−Ａの約１．７倍の樹脂含量を示す多孔質セルロース担体（チッソ社製ＣＫ−Ｃ）を本発明の比較として用いた。
【００７５】
(比較例３)
架橋剤にエピクロロヒドリン（和光純薬工業社製）を用いた他は、実施例１と同様の方法で、多孔質担体を得た。
【００７６】
(参考例１)
多孔質アガロース担体に、アフィニティーリガンドとしてプロテインＡが導入されている、ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ社製）を参考に用いた。
【００７７】
(参考例２)
多孔質アガロース架橋担体に、アフィニティーリガンドとしてプロテインＡが導入されている、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ社製）を参考に用いた。
【００７８】
（圧縮応力測定）
各多孔質担体または精製用吸着体の圧縮応力測定を前述の方法により行った。結果を表１と図１に示す。
【００７９】
【表１】
0005623357.tif 000002
【産業上の利用可能性】
【００８０】
本発明はアフィニティークロマトグラフィー分野、特に抗体医薬品精製の分野に利用できる。
【図１】
0005623357.tif 000003