(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
空間的に互いに異なる少なくとも１つの電子供与体領域および少なくとも１つの正電荷の静電気的領域を有するカチオンを含むイオン性液体の、タンパク質のリフォールディング、熱安定性の増大および／または凝集の低減のための使用であって、該イオン性液体が、以下の一般構造ＡまたはＢ
［ＨｅｔＮ］＋−ＥＤ                Ａ
または
［ＨｅｔＮＥＤ］＋                  Ｂ
ここで、ＨｅｔＮは、少なくとも１つの窒素原子を環系の一部とする芳香族性、一部芳香族性または非芳香族性のヘテロシクリル環系であり、ＥＤは、電子供与体である、
の１つを含むカチオンを有し、ここで、該カチオンが、
【化１】
0005496898.tif 000005
ここで、Ｒ１’〜Ｒ４’はそれぞれ互いに独立して、
−Ｈ、−ＣＮ、−ＯＲ’、−ＮＲ’２、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）２、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−ＮＯ２、１〜２０のＣ原子を有する直鎖または分枝鎖アルキル、２〜２０のＣ原子および１または２以上の二重結合を有する直鎖もしくは分枝鎖アルケニル、２〜２０のＣ原子および１または２以上の三重結合を有する直鎖もしくは分枝鎖アルキニル、１〜６のＣ原子を有するアルキル基によって置換されていてもよい、３〜７のＣ原子を有する飽和、部分的に不飽和もしくは完全に不飽和のシクロアルキル、飽和、部分的に不飽和もしくは完全に不飽和のヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｃ１〜Ｃ６アルキルもしくはアリール−Ｃ１〜Ｃ６アルキルを表し、
ここで、置換基Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’および／またはＲ４’が一緒になって環系を形成してもよく、
ここで、１または２以上の置換基Ｒ１’〜Ｒ４’が部分的にまたは完全にハロゲン、特に−Ｆおよび／または−Ｃｌ、または−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘ、または−ＮＯ２によって置換されていてもよいが、Ｒ１’およびＲ４’が同時に完全にハロゲンによって置換されることはできず、
ここで、置換基Ｒ１’〜Ｒ４’の１または２の隣接していない炭素原子であってヘテロ原子と結合していないものが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−および−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−から選択される原子および／または原子群と置き換えられていてもよく、
ここで、Ｒ’＝Ｈ、非フルオロ化、一部フルオロ化、あるいはパーフルオロ化されたＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、または非置換もしくは置換フェニルおよびＸ＝ハロゲンであり、
ただし、ピリジニウムカチオンは、−ＣＮ、−ＯＲ’、−ＮＲ’２、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）２、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’、−ＳＯ２ＮＲ’２または−ＮＯ２である置換基Ｒ１’〜Ｒ４’を１分子当たり少なくとも１つ、および／または−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘ、または−ＮＯ２で置換されているかあるいは１または２の隣接していない炭素原子であってヘテロ原子と結合していないものが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−および−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−から選択される原子および／または原子群と置き換えられている置換基Ｒ１’〜Ｒ４’を１分子当たり少なくとも１つ有している、
の群から選択されることを特徴とする、前記使用。
【請求項２】
カチオンが、
Ｎ−メチル−４−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノ）−ピリジニウム、
Ｎ−エチル−４−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノ）−ピリジニウム、
Ｎ−ブチル−４−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノ）−ピリジニウム、
４−（シアノメチル）−４−メチルモルホリニウム、
４−（３−ヒドロキシエチル）−４−メチルモルホリニウム、
１−ブチル−３−メチルイミダゾリウム、
１−エチル−３−メチルイミダゾリウムまたは
４−（３−ヒドロキシプロピル）−４−メチルモルホリニウム
であることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
カチオンが、
Ｎ−メチル−４−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノ）−ピリジニウム、
Ｎ−エチル−４−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノ）−ピリジニウムまたは
Ｎ−ブチル−４−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノ）−ピリジニウムであることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
イオン性液体のアニオンが、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−またはＢＦ４−であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
タンパク質のリフォールディング、熱安定性の増大および／または凝集の低減方法であって、
ここで、処理するタンパク質を、空間的に互いに異なる少なくとも１つの電子供与体領域および少なくとも１つの正電荷の静電気的領域を有するカチオンを含むイオン性液体を少なくとも１種含む液体媒体と接触させ、
ここで、該カチオンが、
【化２】
0005496898.tif 000006
ここで、Ｒ１’〜Ｒ４’はそれぞれ互いに独立して、
−Ｈ、−ＣＮ、−ＯＲ’、−ＮＲ’２、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）２、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−ＮＯ２、１〜２０のＣ原子を有する直鎖または分枝鎖アルキル、２〜２０のＣ原子および１または２以上の二重結合を有する直鎖もしくは分枝鎖アルケニル、２〜２０のＣ原子および１または２以上の三重結合を有する直鎖もしくは分枝鎖アルキニル、１〜６のＣ原子を有するアルキル基によって置換されていてもよい、３〜７のＣ原子を有する飽和、部分的に不飽和もしくは完全に不飽和のシクロアルキル、飽和、部分的に不飽和もしくは完全に不飽和のヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｃ１〜Ｃ６アルキルもしくはアリール−Ｃ１〜Ｃ６アルキルを表し、
ここで、置換基Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’および／またはＲ４’が一緒になって環系を形成してもよく、
ここで、１または２以上の置換基Ｒ１’〜Ｒ４’が部分的にまたは完全にハロゲン、特に−Ｆおよび／または−Ｃｌ、または−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘ、または−ＮＯ２によって置換されていてもよいが、Ｒ１’およびＲ４’が同時に完全にハロゲンによって置換されることはできず、
ここで、置換基Ｒ１’〜Ｒ４’の１または２の隣接していない炭素原子であってヘテロ原子と結合していないものが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−および−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−から選択される原子および／または原子群と置き換えられていてもよく、
ここで、Ｒ’＝Ｈ、非フルオロ化、一部フルオロ化、あるいはパーフルオロ化されたＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、または非置換もしくは置換フェニルおよびＸ＝ハロゲンであり、
ただし、ピリジニウムカチオンは、−ＣＮ、−ＯＲ’、−ＮＲ’２、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）２、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’、−ＳＯ２ＮＲ’２または−ＮＯ２である置換基Ｒ１’〜Ｒ４’を１分子当たり少なくとも１つ、および／または−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘ、または−ＮＯ２で置換されているかあるいは１または２の隣接していない炭素原子であってヘテロ原子と結合していないものが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−および−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−から選択される原子および／または原子群と置き換えられている置換基Ｒ１’〜Ｒ４’を１分子当たり少なくとも１つ有している、
の群から選択されることを特徴とする、前記方法。
【請求項６】
ａ）タンパク質を、変性剤またはカオトロピック剤で封入体から可溶化すること、
ｂ）ステップａ）で可溶化したタンパク質を、空間的に互いに異なる少なくとも１つの電子供与体領域および少なくとも１つの正電荷の静電気的領域を有するカチオンを含むイオン性液体を少なくとも１種含む液体媒体と接触させることによってリフォールディングすること、
ここで、該カチオンが、
【化３】
0005496898.tif 000007
ここで、Ｒ１’〜Ｒ４’はそれぞれ互いに独立して、
−Ｈ、−ＣＮ、−ＯＲ’、−ＮＲ’２、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）２、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−ＮＯ２、１〜２０のＣ原子を有する直鎖または分枝鎖アルキル、２〜２０のＣ原子および１または２以上の二重結合を有する直鎖もしくは分枝鎖アルケニル、２〜２０のＣ原子および１または２以上の三重結合を有する直鎖もしくは分枝鎖アルキニル、１〜６のＣ原子を有するアルキル基によって置換されていてもよい、３〜７のＣ原子を有する飽和、部分的に不飽和もしくは完全に不飽和のシクロアルキル、飽和、部分的に不飽和もしくは完全に不飽和のヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｃ１〜Ｃ６アルキルもしくはアリール−Ｃ１〜Ｃ６アルキルを表し、
ここで、置換基Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’および／またはＲ４’が一緒になって環系を形成してもよく、
ここで、１または２以上の置換基Ｒ１’〜Ｒ４’が部分的にまたは完全にハロゲン、特に−Ｆおよび／または−Ｃｌ、または−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘ、または−ＮＯ２によって置換されていてもよいが、Ｒ１’およびＲ４’が同時に完全にハロゲンによって置換されることはできず、
ここで、置換基Ｒ１’〜Ｒ４’の１または２の隣接していない炭素原子であってヘテロ原子と結合していないものが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−および−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−から選択される原子および／または原子群と置き換えられていてもよく、
ここで、Ｒ’＝Ｈ、非フルオロ化、一部フルオロ化、あるいはパーフルオロ化されたＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、または非置換もしくは置換フェニルおよびＸ＝ハロゲンであり、
ただし、ピリジニウムカチオンは、−ＣＮ、−ＯＲ’、−ＮＲ’２、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）２、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’、−ＳＯ２ＮＲ’２または−ＮＯ２である置換基Ｒ１’〜Ｒ４’を１分子当たり少なくとも１つ、および／または−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘ、または−ＮＯ２で置換されているかあるいは１または２の隣接していない炭素原子であってヘテロ原子と結合していないものが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−および−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−から選択される原子および／または原子群と置き換えられている置換基Ｒ１’〜Ｒ４’を１分子当たり少なくとも１つ有している、
の群から選択されることを特徴とする、
により、タンパク質を封入体から抽出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、空間的に互いに異なる少なくとも１つの電子供与体領域および少なくとも１つの正電荷の静電気的領域を有するカチオンを含むイオン性液体の、タンパク質リフォールディングのための使用、該イオン性液体を用いたタンパク質のリフォールディング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
バイオテクノロジーにおける１つの重要なプロセスは、組換タンパク質の発現である。分子生物学において達成された発達に起因して、タンパク質を、そのコード配列から始めてクローニングすること、および組換のやり方で、それを宿主生物中で産生することが可能である。バクテリアにおける組換タンパク質の高収率産生により、組換タンパク質はしばしば、生物学的に不活性な凝集体または封入体の形態で沈殿する。これらの封入体中に含まれるタンパク質は、続いて、in vitroリフォールディングにより、生物学的に活性な形態に変換されなければならない。
【０００３】
第１のステップにおいて、封入体は、典型的には尿素または塩酸グアニジニウムなどの変性剤またはカオトロピック剤で、可溶化される。これは、組換タンパク質が変性され（完全にアンフォールドされ）、可溶化される（凝集体が溶解される）ことを意味する。ほとんどの状況で、変性および可溶化のステップにおいて還元剤を含ませることが必要である。還元剤は、天然にはない鎖間および鎖内ジスルフィド結合を破壊するように作用する。
【０００４】
第２のステップにおいて、変性および可溶化後、タンパク質は、天然および活性な三次元コンフォメーションへとリフォールドされなければならない。復元またはリフォールディング方法は、標的タンパク質を変性環境から、正常にフォールディングした、活性タンパク質に有利な環境へと移すことを企図している。大多数の標的タンパク質にとって、リフォールディング環境が重要である。これが正しくない場合、標的タンパク質はリフォールドに失敗し、再凝集して再び沈殿する。
【０００５】
例えば塩、バッファ、グリコール類、アミノ酸類または糖類など、タンパク質のリフォールディングを促進する多くの異なる分子が同定されてきた。例えば、非変性濃度で尿素またはグアニジニウムなどの分子を添加することは、リフォールディングの効率にポジティブな影響を有することができることが知られている。グアニジニウムまたは尿素の代替として、例えばアルキルウレア、またはカルボン酸アミドまたはアルキル化アミンなどの有機共溶媒などのカオトロピック基質が、in vitroフォールディングプロセスに用いられている。
【０００６】
Ｌ−アルギニンの添加によってin vitroフォールディングの収率を増強することができることもまた観察される。in vitroフォールディングの効率を増大する他の添加物は、トリスバッファ、ポリエチレングリコールまたはデタージェントである。
ＷＯ０３／０５１９０８には、特別なイオン性液体、すなわち置換イミダゾリウム塩のリフォールディング剤としての使用が開示されている。
【０００７】
これらの膨大なリフォールディング添加物にもかかわらず、依然としてリフォールディングしづらいまたは悪い収率でリフォールドする組換タンパク質が多くある。
それゆえ、新規な、高度に有効なタンパク質リフォールディング添加物についてのはっきりとしたニーズが存在した。
【発明の概要】
【０００８】
発明の簡単な説明
特定の電子密度分布を有するイオン性液体が、タンパク質リフォールディングおよび安定化剤に特に有効であることが見出された。前記イオン性液体は、空間的に互いに異なる少なくとも１つの電子供与体領域および少なくとも１つの正電荷の静電気的領域を有するカチオンを含む必要がある。
【０００９】
本発明はしたがって、空間的に互いに異なる少なくとも１つの電子供与体領域および少なくとも１つの正電荷の静電気的領域を有するカチオンを含むイオン性液体の、タンパク質のリフォールディングのための、熱安定性の増大のための、および／または凝集の低減のための使用に関する。
【００１０】
好ましい態様において、空間的に互いに異なる少なくとも１つの電子供与体領域および少なくとも１つの正電荷の静電気的領域を有するカチオンを含むイオン性液体は、以下の一般構造ＡまたはＢ、
［ＨｅｔＮ］＋−ＥＤ                  Ａ
または
［ＨｅｔＮＥＤ］＋                    Ｂ
ここで、ＨｅｔＮは、少なくとも１つの窒素原子を環系の一部とする芳香族性、一部芳香族性または非芳香族性のヘテロシクリル環系である、
の１種であるカチオンを有する。典型的には、ＨｅｔＮは５または６員環構造である。
【００１１】
ＥＤは、電子供与体である。構造Ａによれば、ＥＤはヘテロシクリル環系の1つの原子に共有結合している置換基であるが、ＥＤは環系の一部ではない。
構造Ｂによれば、ＥＤはヘテロシクリル環系の一部であり、これはＥＤが環構造に直接組込まれた電子供与基であることを意味する。
【００１２】
好ましい態様において、ＨｅｔＮ＋は、
【化１】
0005496898.tif 000002
【００１３】
の群から選択され、ここで、環中の酸素原子が電子供与体としての役割を果たし得るために、モルホリニウムおよびオキサゾリジニウムは［ＨｅｔＮＥＤ］＋の例であり、他の構造は、電子供与体機能が少なくとも１つの置換基Ｒ１’からＲ４’によって提供される［ＨｅｔＮ］＋−ＥＤの例を与え、
【００１４】
ここで、置換基Ｒ１’からＲ４’はそれぞれ互いに独立して
−Ｈ、−ＣＮ、−ＯＲ’、−ＮＲ’２、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）２、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−ＮＯ２、１〜２０のＣ原子を有する直鎖または分枝鎖アルキル、２〜２０のＣ原子および１または２以上の二重結合を有する直鎖もしくは分枝鎖アルケニル、２〜２０のＣ原子および１または２以上の三重結合を有する直鎖もしくは分枝鎖アルキニル、１〜６のＣ原子を有するアルキル基によって置換されていてもよい、３〜７のＣ原子を有する飽和、部分的に不飽和もしくは完全に不飽和のシクロアルキル、飽和、部分的に不飽和もしくは完全に不飽和のヘテロアリール、ヘテロアリール−Ｃ１〜Ｃ６アルキルもしくはアリールＣ１〜Ｃ６アルキルを表し、
【００１５】
ここで、置換基Ｒ１’、Ｒ２’、Ｒ３’および／またはＲ４’が一緒になって環系を形成してもよく、
ここで、１または２以上の置換基Ｒ１’〜Ｒ４’が部分的にまたは完全にハロゲン、特に−Ｆおよび／または−Ｃｌ、または−ＯＨ、−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘ、または−ＮＯ２によって置換されていてもよいが、Ｒ１’およびＲ４’が同時に完全にハロゲンによって置換されることはできず、
ここで、置換基Ｒ１’からＲ４’の１または２の隣接していない炭素原子であってヘテロ原子と結合していないものが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−および−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−から選択される原子および／または原子群と置き換えられていてもよく、
ここで、Ｒ’＝Ｈ、非フルオロ化、一部フルオロ化、あるいはパーフルオロ化されたＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ３〜Ｃ７シクロアルキル、または非置換もしくは置換フェニルおよびＸ＝ハロゲンであり、
【００１６】
ただし、モルホリニウムおよびオキサゾリジニウム以外の全ての他のＨｅｔＮ＋は、−ＣＮ、−ＯＲ’、−ＮＲ’２、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）２、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’、−ＳＯ２ＮＲ’２または−ＮＯ２である置換基Ｒ１’からＲ４’を１分子当たり少なくとも１つ、および／または−ＯＲ’、−ＣＮ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−ＳＯ２ＯＨ、−ＳＯ２Ｘ、または−ＮＯ２で置換されている置換基Ｒ１’からＲ４’を１分子当たり少なくとも１つ、および／または１または２の隣接していない炭素原子であってヘテロ原子と結合していないものが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）−、−ＳＯ２−、−ＳＯ２Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｎ＋Ｒ’２−、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’−、−ＳＯ２ＮＲ’−、−ＯＰ（Ｏ）Ｒ’Ｏ−、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）ＮＲ’−、−ＰＲ’２＝Ｎ−および−Ｐ（Ｏ）Ｒ’−から選択される原子および／または原子群と置き換えられている置換基Ｒ１’からＲ４’を１分子当たり少なくとも１つ有している。
【００１７】
これは、モルホリニウムおよびオキサゾリジニウムのように既に環構造に統合された電子供与体機能がない場合、置換基Ｒ１’からＲ４’の少なくとも１つが前記電子供与体特性の１つを含む必要があることを意味する。
好ましい態様において、本発明のイオン性液体のカチオンは、１つだけの電子供与体領域を有する。
【００１８】
本発明の目的のため、完全に不飽和の置換基はまた芳香性置換基を意味する。
置換基Ｒ’は、特に好ましくはメチル、エチル、イソプロピル、プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチルまたはヘキシルである。
好ましい態様において、１分子当たり置換基Ｒ１’からＲ４’のうちの１つ、ただし１つのみが、−ＣＮ、−ＯＲ’、−ＮＲ’２、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）２、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２または−ＮＯ２である。
【００１９】
好ましい態様において、１分子当たり置換基Ｒ１’からＲ４’のうちの１つ、ただし１つのみが、−ＣＮ、−ＯＲ’、−ＮＲ’２、−Ｐ（Ｏ）Ｒ’２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ’）２、−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ’２）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’２、−ＳＯ２ＮＲ’２または−ＮＯ２であり、かつ他の置換基Ｒ１’〜Ｒ４’が、互いに独立して−Ｈまたは１〜２０のＣ原子を有する直鎖もしくは分枝鎖アルキル、好ましくは−Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチルまたはヘキシルを表す。
【００２０】
好ましい態様において、空間的に互いに異なる少なくとも１つの電子供与体領域および少なくとも１つの正電荷の静電気的領域を有するカチオンが、
【化２】
0005496898.tif 000003
の群から選択される。
【００２１】
最も好ましいモルホリニウムカチオンは、４−（シアノメチル）−４−メチルモルホリニウムおよび４−（３−ヒドロキシエチル）−４−メチルモルホリニウムである。
【００２２】
非常に好ましい態様において、空間的に互いに異なる少なくとも１つの電子供与体領域および少なくとも１つの正電荷の静電気的領域を有するカチオンは、
【化３】
0005496898.tif 000004
の群から選択され、ここで、１つ、ただし１つのみのＲ２’は、ジメチルアミノまたはジエチルアミノの群から選択され、最も好ましくはジメチルアミノである。
そして、他のＲ２’は、互いに独立して、−Ｈ、メチル、エチル、イソプロピル、n-プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシルである。最も好ましくは−Ｈである。
そして、Ｒ１’は、メチル、エチル、（イソ−）プロピル、ｎ−プロピルまたはｎ−ブチルの群から選択される。
【００２３】
非常に好ましい態様において、カチオンは、Ｎ−メチル−４−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノ）−ピリジニウム、Ｎ−エチル−４−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノ）−ピリジニウム、Ｎ−ブチル−４−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノ）−ピリジニウムである。
別の好ましい態様において、イオン性液体のアニオンは、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−またはＢＦ４−である。
【００２４】
本発明は、タンパク質のリフォールディング、熱安定性の増大および／または凝集の低減方法にも向けられ、該方法において、処置されるタンパク質を、空間的に互いに異なる少なくとも１つの電子供与体領域および少なくとも１つの正電荷の静電気的領域を有するカチオンを含むイオン性液体を少なくとも１種含む液体媒体と接触させる。本発明の使用のための上記の好ましい態様は、タンパク質のリフォールディング、熱安定性の増大および／または凝集の低減についての方法に用いられる好ましい態様でもある。
【００２５】
本発明はさらに、
ａ）タンパク質を、尿素や塩酸グアニジニウムなどの変性剤またはカオトロピック剤で封入体から可溶化すること（これは、組換タンパク質が、変性（完全にアンフォールド）され、可溶化（凝集体が溶解）することを意味する）、
ｂ）ステップａ）で可溶化されたタンパク質を、空間的に互いに異なる少なくとも１つの電子供与体領域および少なくとも１つの正電荷の静電気的領域を有するカチオンを含むイオン性液体を少なくとも１種含む液体媒体と接触させることによってリフォールディングすること、
により、タンパク質を封入体から抽出する方法にも向けられる。
【００２６】
本発明はさらに、空間的に互いに異なる少なくとも１つの電子供与体領域および少なくとも１つの正電荷の静電気的領域を有するカチオンを含むイオン性液体を少なくとも１種含む剤にも向けられる。
好ましい態様において、剤は付加的に１種または２種以上の以下の物質を含む：
−トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、還元型グルタチオン、１，４−ジチオスレイトール、または２−メルカプトエタノールなどの、還元剤、
−酸化型および還元型グルタチオンの混合物あるいはシステインおよびシスチンの混合物などの、酸化還元系、
−尿素、グアニジニウム、Ｌ−アルギニン、アルキルウレア、カルボン酸アミド、アルキル化アミン、トリスバッファ、ポリエチレングリコール、デタージェント、糖、および／または両性イオン分子などの、リフォールディングを推進することが知られている他の物質
【００２７】
本発明の使用のための最も好ましいイオン性液体は、Ｎ−メチル−４−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノ）−ピリジニウム、Ｎ−エチル−４−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノ）−ピリジニウム、Ｎ−ブチル−４−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノ）−ピリジニウム、４−（シアノメチル）−４−メチルモルホリニウムおよび／または４−（３−ヒドロキシエチル）−４−メチルモルホリニウムの塩化物、臭化物および／またはヨウ化物であり、例えば４−（３−ヒドロキシエチル）−４−メチルモルホリニウムヨーダイド、４−（３−ヒドロキシプロピル）−４−メチルモルホリニウムクロライド、Ｎ−エチル−４−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノ）−ピリジニウムブロマイドまたはＮ−メチル−４−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノ）−ピリジニウムヨーダイドである。
【００２８】
本発明の使用のための上記の好ましい態様は、タンパク質のリフォールディング、熱安定性の増大および／または凝集の低減についての方法のため、および封入体からタンパク質を抽出する方法のために用いられる好ましい態様でもある。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
図面の記載
【図１】図１は、リフォールディングバッファ中にイオン性液体が含まれた際の、ＭＭＰ１２のリフォールディングの結果を示す。さらなる詳細は例２に見出すことができる。
【図２】図２は、リフォールディングバッファ中にイオン性液体が含まれた際の、ｔｒｘ−ＧＦＰのリフォールディングの結果を示す。さらなる詳細は例３に見出すことができる。
【図３】図３は、リフォールディングバッファ中にイオン性液体Ｎ−エチル−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジニウムブロマイドが含まれた際の、ＥＫのリフォールディングの結果を示す。さらなる詳細は例４に見出すことができる。
【００３０】
【図４】図４は、リフォールディングバッファ中に様々な濃度でイオン性液体Ｎ−メチル−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジニウムヨーダイドが含まれた際の、λＰＰａｓｅのリフォールディングの結果を示す。さらなる詳細は例５に見出すことができる。
【図５】図５は、イオン性液体Ｎ−エチル−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジニウムブロマイドの存在下において、上昇した温度におけるウシヘモグロビンの安定性を示す。さらなる詳細は例６に見出すことができる。
【００３１】
【図６】図６は図６Ａおよび６Ｂを含み、非デタージェントスルホベタイン（図６Ａ）ならびにトレハロースおよびポリエチレングリコール（６Ｂ）と比較した、イオン性液体４−（３−ヒドロキシエチル）−４−メチルモルホリニウムヨーダイドの存在下におけるｓｃＦｖ−ｔｒｘ融合タンパク質のリフォールディングの結果を示す。
【００３２】
図、表およびその他において用いられている略語は、以下の意味を有する：
ＢＣＡはビシンコニン酸を意味する
ｂｉｓ−ＴＲＩＳは２，２−ビス（ヒドロキシメチル）−２−２’−２’’−ニトリロトリエタノールを意味する
ＢＭＥは２−メルカプトエタノールを意味する
ｂｍｉｍＣｌは１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムクロライドを意味する
Ｂｒｉｊ−３５はＣ１２Ｅ２３ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテルを意味する
【００３３】
ＢＳＡはウシ血清アルブミンを意味する
ＣＨＥＳは２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸を意味する
ＤＴＥはエリスロ−１，４−ジメルカプト−２，３−ブタンジオールを意味する
ＤＴＴは１，４−ジチオスレイトールを意味する
ＥＤＴＡはエチレンジアミンテトラ酢酸を意味する
ＥＫはウシエンテロキナーゼの触媒性サブユニットを意味する
ｅｍｉｍＣｌは１−エチル−３−メチルイミダゾリウムクロライドを意味する
【００３４】
ＥＰＰＳは４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸を意味する
Ｈｅｐｅｓは４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸を意味する
λＰＰａｓｅはλタンパク質ホスファターゼを意味する
Ｍｅｓは２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸を意味する
ＭＭＰ１２はヒトマトリクスメタロプロテイナーゼ１２からの触媒性サブユニットを意味する
Ｍｏｐｓは３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸を意味する
【００３５】
ＴＡＰＳは［（２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチル）アミノ］−１−プロパンスルホン酸を意味する
ＴＣＥＰはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンを意味する
ＴＨＰはトリス（ヒドロキシプロピル）ホスフィンを意味する
Ｔｒｉｓはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを意味する
ｔｒｘ−ＧＦＰは細菌性チオレドキシンタンパク質および緑色蛍光タンパク質からなる融合タンパク質を意味する
【００３６】
発明の詳細な説明
イオン性液体または液体塩は、有機カチオンおよび無機または（それ程多くないが）有機アニオンからなるイオン種である。これらは中性分子を含まない。これは本発明にしたがって使用されるイオン性液体が、室温で液体であり、あるいは室温で液体でない場合、少なくとも処理条件下で、液体型で存在する、および／または液体媒体に可溶であるべきであることを意味する。例えば、Ｎ−エチル−４−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノ）−ピリジニウムは室温で固体であるが、４〜３７℃の室温で生物学的に関連のあるバッファ（ｐＨ５．０〜９．０）に高度に可溶（＞２．０Ｍ）である。
【００３７】
潜在用途が多種多様であるため、現在、イオン性液体の分野において徹底的な調査が行われている。イオン性液体についての総説は、例えばR. Sheldon "Catalytic reactions in ionic liquids", Chem. Commun., 2001, 2399-2407; M.J. Earle, K.R. Seddon "Ionic liquids. Green solvent for the future", Pure Appl. Chem., 72 (2000), 1391-1398; P. Wasserscheid, W. Keim "Ionic Fluessigkeiten   neue Loesungen fuer die Uebergangsmetallkatalyse" [Ionic Liquids   Novel Solutions for Transition-Metal Catalysis], Angew. Chem., 112 (2000), 3926-3945; T. Welton "Room temperature ionic liquids. Solvents for synthesis and catalysis", Chem. Rev., 92 (1999), 2071-2083 または R. Hagiwara, Ya. Ito "Room temperature ionic liquids of alkylimidazolium cations and fluoroanions”, J. Fluorine Chem., 105 (2000), 221-227などである。
【００３８】
本発明によれば、「空間的に互いに異なる少なくとも１つの電子供与体領域および少なくとも１つの正電荷の静電気的領域を有するカチオンを含むイオン性液体」は、好ましくは、カチオンの正電荷の静電気的領域とは空間的に異なる少なくとも１つの電子供与体領域を有するカチオンを含むイオン性液体を意味する。
【００３９】
空間的に互いに異なる１より多い正電荷の静電気的領域を有するカチオン（２価のカチオン、またはジカチオン）を有することも可能である。
例えば、１，４−メチルピペラジンは２価の１，１，４，４−テトラメチルピペラジニウムカチオンに変換することができるが、好ましい態様においては、本発明のイオン性液体は、１つの正電荷の静電気的領域を有するカチオンのみを含有する。
【００４０】
「空間的に異なる」とは、電子供与体領域と正電荷の静電気的領域との間に典型的には少なくとも２つの結合があることを意味する。好ましい態様において、電子供与体領域の中心と正電荷の静電気的領域の中心との間に少なくとも２つの結合がある。中心は、電子供与体領域の電子が主に集中する原子団または１つの原子、あるいは正電荷が主に集中する原子団または１つの原子を意味する。
【００４１】
本発明によれば、電子供与体領域は、電子放出基を含む領域である。電子放出基は、反応中心に電子を放出することができる官能基である。電子放出基の例は、アルコール基、シアノ基、エーテル基およびアミノ基である。
電子供与体領域を有するカチオンの例は、Ｎ−アルキルジメチルアミノピリジニウムおよびＮ，Ｎ−ジアルキルモルホリニウムである。
【００４２】
本発明によれば、正電荷の静電気的領域は、電子の欠損によって正の静電気的電位を有する領域である。この領域は、点電荷である、単一原子上に位置する、または電荷が２もしくは３以上の原子に分散して非局在化することができる。（モルホリニウムまたはピロリジニウムなどの）非芳香族性カチオンにおいて、正電荷の静電気的領域は環窒素原子を直接取り巻く領域に局在し、環窒素原子が中心となる。（ピリジニウムまたはイミダゾリウムなどの）芳香族カチオンにおいて、正電荷は環の原子間に非局在および分散する（しかし均一ではない）。
【００４３】
本発明のリフォールディングは、タンパク質の再生、すなわち、その生物学的活性を示す、タンパク質の天然の状態を取り戻すことを意味する。典型的には、リフォールドされなければならないタンパク質は、変性タンパク質である。リフォールディングは典型的には、タンパク質の３次元秩序の変更を意味する。
【００４４】
本発明によれば、凝集の低減は、通常液体媒体中での長期の保存の間に起こり、生物学的機能性の喪失または低減を伴うタンパク質の凝集の低減またはもっと言えば実質的防止を意味することを意図する。
本発明によれば、熱安定性の増大は、それぞれ、生物学的活性または正しいタンパク質フォールディングが、室温よりはるかに高温であり得る温度においてさえ長期間に渡って維持されることを意味する。
【００４５】
本発明によれば、リフォールディング剤、リフォールディング媒体またはリフォールディング液とも呼ばれる、はリフォールドされるタンパク質を接触させる液体混合物である。典型的には、少なくとも１種の液体媒体および少なくとも１つのタイプの、空間的に互いに異なる少なくとも１つの電子供与体領域および少なくとも１つの正電荷の静電気的領域を有するカチオンを含むイオン性液体を含む。リフォールディング剤は、安定化剤、ＴＣＥＰまたはグルタチオンなどの還元剤、（例えば、ＤＴＴ、ＤＴＥ、グルタチオン、システイン、メルカプトエタノールなどの、還元されたおよび酸化されたチオール基質からなる）酸化還元系または例えば尿素、グアニジニウム、Ｌ−アルギニン、アルキルウレア、カルボン酸アミド、アルキル化アミン、トリスバッファ、ポリエチレングリコール、デタージェント、糖、および／または両性イオン分子（非デタージェントのスルホベタイン）などの、リフォールディングを推進することが知られている他の物質などの、さらなる添加物を含んでもよい。本発明のリフォールディング剤はまた、２または３種以上の異なる、空間的に互いに異なる少なくとも１つの電子供与体領域および少なくとも１つの正電荷の静電気的領域を有するカチオンを含むイオン性液体を含んでもよい。
【００４６】
空間的に互いに異なる少なくとも１つの電子供与体領域および少なくとも１つの正電荷の静電気的領域を有するカチオンを含むイオン性液体のためのカチオンの好適な例は、上記および請求項中に与えられている。
【００４７】
好適なアニオンは、上記空間的に互いに異なる少なくとも１つの電子供与体領域および少なくとも１つの正電荷の静電気的領域を有するカチオンとともにイオン性液体を生成するのに用いることができる全てのアニオンである。好ましい態様において、イオン性液体のアニオンはＣｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−またはＢＦ４−である。
【００４８】
本発明の剤および方法は、あらゆるタンパク質またはあらゆるタンパク質のクラスをリフォールディングするのに好適である。タンパク質は、化学合成によって産生されたタンパク質または例えば原核細胞または真核細胞などのウィルス、細胞もしくは組織から抽出されたタンパク質であり得る。本発明の剤および方法は、組換タンパク質をリフォールディングするのに特に好適である。典型的には、組換タンパク質は例えばE. coli細胞などの細菌細胞のような宿主細胞中に発現される。これに関連して、封入体は、組換タンパク質の密な、不溶な、ミスフォールドした凝集体として定義され、宿主細胞の細胞質および／または周辺質空間に位置する。組換タンパク質に加えて、封入体は宿主細胞タンパク質、核酸、脂質、および／または他の宿主細胞分子を含み得る。
【００４９】
リフォールドされるタンパク質の他の好適な給源としては、これに限定するものではないが、天然の三次元構造に折り畳まれた、酵母細胞、昆虫細胞、真菌細胞、哺乳類細胞中で、またはin vitro翻訳システムで産生された組換タンパク質である。
封入体は、多くの確立された手法のいずれかを用いて、宿主細胞から単離されてよい。
【００５０】
本発明の方法によりリフォールドできるタンパク質は：
プロテアーゼ、好ましくはセリンプロテアーゼ、特にトロンビン、Ｘａ因子、カスパーゼ、カテプシン、トリプシンおよびキモトリプシン、システインプロテアーゼ、ペプシンまたはレンニンなどの酸性プロテアーゼ、サーモリシンなどのメタロプロテイナーゼ；
プロテアーゼ阻害剤、好ましくはペプスタチン、アンチパイン、キモスタチン、エラスチナール、ロイペプチン、ベスタチン、アンチトロンビンＩＩＩ；
【００５１】
ＤＮＡ結合プロテイン、好ましくは転写因子、特にＮＦカッパＢおよびｊｕｎ、ｆｏｓ、ｋｒｏｘ、ｍｙｃ、Ｅ２Ｆファミリーのメンバー、ウィルス性Ｔ抗原；
ウィルスタンパク質、例えば、ウィルスエンベロープタンパク質、カプシドタンパク質、ウィルスプロテアーゼ、ポリメラーゼおよび／またはＴ抗原；
ホスファターゼ；
プロテインキナーゼ、好ましくはチロシンキナーゼおよび／またはセリンキナーゼ；
【００５２】
免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質、例えば抗体およびその断片；
成長因子、例えば上皮成長因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、インスリン様成長因子ＩおよびＩＩ（ＩＧＦ  ＩおよびＩＩ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、神経成長因子（ＮＧＦ）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）および／または血小板成長因子（ＰＤＧＦ）、
ならびにこれらのタンパク質から誘導されるタンパク質および断片である。
【００５３】
本発明の剤および方法は特に：
ウシエンテロキナーゼ（エンテロキナーゼについてＥＫ）。プロテインデータバンク（ＰＤＢ）同定番号１ＥＫＢ。
マトリクスメタロプロテアーゼ１２（ＭＭＰ１２）。ＰＤＢ同定番号２ＯＸＵ。
チオレドキシンおよび緑色蛍光タンパク質の融合タンパク質（ｔｒｘ−ＧＦＰ）。ＴｒｘのＰＤＢ同定番号２ＴＲＸ。ＧＦＰのＰＤＢ同定番号１Ｂ９Ｃ。
ラムダプロテインホスファターゼ（λＰＰａｓｅ）。ＰＤＢ同定番号１Ｇ５Ｂ。
ヒトライノウィルスプロテアーゼ３Ｃ（ＨＲＶ  ３Ｃ）。ＰＤＢ同定番号１ＣＱＱ。
のリフォールディングに好適である。
【００５４】
本発明によれば、ジスルフィドなしの、およびジスルフィド架橋されたタンパク質がリフォールディング可能である。例えばリゾチーム、エンテロキナーゼ、ｒＰＡ（組換プラスミノーゲン活性化因子、商品名リプラーゼ（replase））、アルファグルコシダーゼ、それらから誘導された抗体および断片ならびに／あるいは成長因子などのマルチドメインタンパク質および複合体ジスルフィド架橋タンパク質が処理可能である。これらのタンパク質分類は、単に例示として与えられており、本発明はこの列挙に限定されるものではない。
【００５５】
タンパク質をリフォールディングするための本発明の方法における液体媒体としては、好ましくは水性媒体、すなわち水、水性バッファシステム、水もしくは水性バッファシステムと、エタノール、ブチルアルコール、アセトニトリルなど水溶性有機溶媒との混合物（典型的には、有機溶媒が２０体積％を超えない）が用いられる。好ましいバッファは、Ｔｒｉｓ、Ｈｅｐｅｓ、Ｍｅｓ、Ｍｏｐｓ、ＥＰＰＳ、ＴＡＰＳ、ＣＨＥＳ、ｂｉｓ−ＴＲＩＳ、酢酸塩、グリシンおよび／またはリン酸塩である。
【００５６】
液体媒体中のバッファ濃度は、好ましくは１０および１０００ｍＭの間、より好ましくは５および２００ｍＭの間、同様に好ましくは１０および２００ｍＭの間、さらに好ましくは１０および５０ｍＭの間である。液体媒体のｐＨは、好ましくは４〜１１の間、さらに好ましくは６．５〜９．０の間である。ほとんどのタンパク質について、ｐＨ７．０および８．５の間で良い結果が達成できる。例えば、組換エンテロキナーゼの場合、再生の間のｐＨ値は訳７．０〜８．５であり、チオレドキシン−緑色蛍光タンパク質の再生について、ｐＨ値は好ましくは６．５〜８．５である。リフォールドされる他のタンパク質について、バッファ組成パラメータは、リフォールドされたタンパク質の最大収率を得るために、独立に適応および最適化され得る。
【００５７】
必須ではないが、リフォールディングの前に、リフォールドされるタンパク質の調製物中の汚染物質の量を低減させるのが好ましい。汚染物質は、タンパク質調製物、典型的にはリフォールドされるタンパク質を含む封入体を、洗浄剤を含む緩衝化した水性溶液で洗浄することにより低減または除去されてよい。好適な洗浄剤は、これに限定するものではないが、軽度のデタージェント、デタージェント様分子、カオトロープ、および塩を含む。代替的に、組換えタンパク質を最初に変性および還元し（下記）、得られた調製物をクロマトグラフィー樹脂に適用することにより、汚染物質を低減または除去し得る。
【００５８】
典型的には、組換タンパク質は、クロマトグラフィー樹脂上に選択的に固定され、不純物質は樹脂に結合しないかまたはカオトロピック剤を含む緩衝化された水性溶液で洗い流される。標的タンパク質および樹脂の間の相互作用の力を顕著に低減するようにバッファ条件を調節することにより、組換タンパク質をクロマトグラフィー樹脂から溶出する。洗浄手順は、リフォールドされるタンパク質および汚染物質の性質に対して、当業者によって調節され得る。
【００５９】
リフォールディングの前に、標的タンパク質を完全に可溶化しおよび変性する必要がしばしばある。完全に可溶化されたタンパク質は、主として単量体であり、立体構造を欠損しているはずである。好ましくは、可溶化は、ミスフォールドした、凝集したおよび／または不溶性の標的タンパク質と、グアニジン塩酸塩、尿素またはＮ−ラウリルサルコシンなどのカオトロピック剤およびＤＴＴ、ＢＭＥ、ＴＨＰまたはＴＣＥＰなどの還元剤を高濃度で含有する緩衝化水性溶液とを接触させることにより達成される。
【００６０】
本発明の方法において、可溶化および変性状態にある、リフォールドされるまたは処理されるタンパク質の接触は、好ましくは処理されるタンパク質を、リフォールディング液と希釈、透析および／または膜分離（diafiltrating）することにより行われる。主に、変性タンパク質のリフォールディング液へのバッファ交換は、リフォールディングを確実にする。
【００６１】
リフォールディング剤との接触の間および特にリフォールディングの間、好ましい処理されるタンパク質のタンパク質濃度は、５〜５００μｇ／ｍｌであり、好ましくは１０〜２００μｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは１００〜２００μｇ／ｍｌである。これらの数値は、それぞれリフォールディングされるまたは処理されるタンパク質に関して、それぞれのタンパク質の溶解度特性を考慮して、当業者によって調節され得る。
【００６２】
本発明の方法は、ジスルフィドのない、およびジスルフィド架橋されたタンパク質のリフォールディングに有用である。ジスルフィドのないタンパク質に関し、これらを好ましくは、ＤＴＴ、ＤＴＥ、グルタチオンおよび／またはシステインなどの還元剤を、好ましくは１〜１０ｍＭの濃度でさらに含むリフォールディング媒体と接触させる。
【００６３】
ジスルフィド架橋されたタンパク質のリフォールディングに関し、これらを好ましくは、ＤＴＴ、ＤＴＥ、グルタチオン、システイン、メルカプトエタノールなどの還元型および酸化型チオール物質、好ましくは１〜１０ｍＭの濃度、からなる酸化還元系の存在下で接触させる。これらの場合、好ましくは還元型物質と酸化型物質との濃度比（「酸化型：還元型」）は１：１０から２０：１、好ましくは１：５〜１０：１、さらに好ましくは１：１から５：１である。
【００６４】
接触の間および特にリフォールディングの間、空間的に互いに異なる少なくとも１つの電子供与体領域および少なくとも１つの正電荷の静電気的領域を有するカチオンを含むイオン性液体の濃度は、典型的には約０．２５〜５Ｍ、好ましくは０．３から１．５Ｍ、最も好ましくは０．５から１．０Ｍである。
【００６５】
一般的に、リフォールディングの期間は、好ましくは０．１〜１００ｈ、さらに好ましくは１〜５０ｈ、さらにより好ましくは２〜２４ｈである。
高温においては凝集反応が増大するため、リフォールディングは好ましくは０〜３７℃、好ましくは５〜２０℃の低温で行われる。
典型的には、リフォールディング効率のパラメータとして、プロセスの過程に渡ってまたはその後に、タンパク質の生物学的活性および凝集動態を計測することができる。
【００６６】
本発明の方法の別の態様において、タンパク質を数回連続して、パルス状の方法でまたは持続的な方法で、リフォールディング剤に添加することができる。好ましくは、リフォールディング手順はバッチ式に成され、これは、タンパク質の全量が好適な量のリフォールディング剤に一度に添加されることを意味する。
【００６７】
下流の用途に依存して、リフォールディング剤、特にリフォールディング剤に含まれるイオン性液体を、リフォールドされたタンパク質から除去することが必要かもしれない。あるイオン性液体は、生物学的または酵素活性についてのアッセイを妨害し得る。これらの状況下において、イオン性液体の濃度を透析を用いて（本質的にゼロに）減じる。タンパク質は透析膜内に保持され、イオン性液体は透析バッファと平衡となる。
【００６８】
リフォールディング効率は、標的タンパク質および封入体調製の質（汚染物質の量およびタイプ）によって大きく変化する。
さらなる詳述をすることなく、上記記載を用いて、当業者は本発明を最大限活用できると信じられる。したがって、好ましい特定の態様および例は、単に描写的であり、本開示の残りの部分に多少なりとも限定するものでは全くないと解されるべきである。
【００６９】
上記および下記で引用した全ての出願、特許および出版物ならびに対応米国仮出願ＵＳ６０／９７９，５４２、２００７年１０月１０日出願、の開示の全体が、参照により本明細書に組込まれる。
【００７０】
例
以下の例は、本発明の実際の適用を表したものである。
例１
封入体として発現したタンパク質の変性（または可溶化）および還元
封入体の形態のタンパク質を、５０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８．０、７．０Ｍのグアニジン塩酸塩、０．２ＭのＮａＣｌ、２．０ｍＭのＥＤＴＡ、および１０ｍＭのＴＣＥＰ溶液中の封入体を室温下で約２時間攪拌することで変性、可溶化および還元する。サンプルを２５，０００×ｇ、４℃で１５分遠心し、その後０．４５μｍフィルターに通して、あらゆる不溶性物質を除去する。タンパク質サンプルの濃度を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）法（例えば、Smith, P.K., et al., (1985). Anal. Biochem. 150, 76-85あるいはEMD Chemicalsの商品番号７１２８５またはThermoFisherの商品番号２３２２５参照）を用いて決定した。
【００７１】
例２
Ｎ−エチル−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジニウムブロマイド、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムクロライドまたは１−エチル−３−メチルイミダゾリウムクロライドを用いたマトリクスメタロプロテイナーゼ１２のリフォールディング
５０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８．０、７．０Ｍのグアニジン塩酸塩、０．２ＭのＮａＣｌ、２．０ｍＭのＥＤＴＡおよび１０ｍＭのＴＣＥＰ中に存在する、マトリクスメタロプロテイナーゼ１２（ＭＭＰ１２）のリフォールディングを、１：５０の比率でリフォールディングバッファ中に速やかに希釈することによって行う。タンパク質の最終濃度は１００μｇ／ｍＬである。リフォールディングバッファは、０．５Ｍのイオン性液体Ｎ−エチル−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジニウムブロマイド、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムクロライドまたは１−エチル−３−メチルイミダゾリウムクロライドを含む、５０ｍＭのｂｉｓ−ＴＲＩＳ、ｐＨ６．５、である。リフォールディングサンプルを、３００ＲＰＭで振とうしながら２２±２℃で２０〜２４時間インキュベートする。リフォールディング後、サンプルを、５０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ７．５、０．１５ＭのＮａＣｌ、２．０ｍＭのＣａＣｌ２、１．０μＭのＺｎＣｌ２および０．０３％（ｖ／ｖ）のＢｒｉｊ−３５に対して、１：４００００またはそれ以上のサンプル対バッファ比率で、１０±２℃で２０〜２４時間透析する。リフォールディングは、ＭＭＰ１２特異的な酵素活性アッセイを用いて計測する。ＭＭＰ１２酵素活性の計測に用いられる基質は、Invitrogen社から入手可能な、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ−標識ＤＱエラスチン抱合体（カタログ番号Ｅ１２０５６）である。
【００７２】
図１は、イオン性液体がリフォールディングバッファ中に含有されたときのＭＭＰ１２のリフォールディングからの結果を示す。ＭＭＰ１２のリフォールディングは、ピリジニウムベースのイオン性液体Ｎ−エチル−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジニウムブロマイドの０．５Ｍ溶液中で、イミダゾリウムベースのイオン性液体１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムクロライド（ｂｍｉｍ  Ｃｌ）または１−エチル−３−メチルイミダゾリウムクロライド（ｅｍｉｍ  Ｃｌ）の０．５Ｍ溶液中でのＭＭＰ１２のリフォールディングより、より効率的である。
【００７３】
例３
４−（３−ヒドロキシプロピル）−４−メチルモルホリニウムクロライドを用いたチオレドキシン−緑色蛍光タンパク質融合体のリフォールディングおよびリフォールディング剤Ｌ−アルギニン、ＮａＣｌおよび非デタージェントスルホベタイン２５６との比較
５０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８．０、７．０Ｍのグアニジン塩酸塩、０．２ＭのＮａＣｌ、２．０ｍＭのＥＤＴＡおよび１０ｍＭのＴＣＥＰ中に存在する、チオレドキシン−緑色蛍光タンパク質融合体（ｔｒｘ−ＧＦＰ）のリフォールディングを、１：５０の比率でリフォールディングバッファ中に速やかに希釈することによって行う。タンパク質の最終濃度は１００μｇ／ｍＬである。リフォールディングバッファは、５０ｍＭのＴＡＰＳ、ｐＨ８．５、７．６ｍＭの還元型グルタチオン、２．４ｍＭの酸化型グルタチオンおよび０．５Ｍのイオン性液体４−（３−ヒドロキシプロピル）−４−メチルモルホリニウムクロライドまたは３種のコントロールリフォールディング添加物：０．５ＭのＬ−アルギニン、０．２５ＭのＮａＣｌ、もしくは１．０Ｍの非デタージェントスルホベタイン、のうちの１種である。リフォールディングサンプルを、３００ＲＰＭで振とうしながら２２±２℃で２０〜２４時間インキュベートする。リフォールディング後、サンプルを、５０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８．０に対して、１：４００００またはそれ以上のサンプル対バッファ比率で、１０±２℃で２０〜２４時間透析する。ｔｒｘ−ＧＦＰ融合タンパク質のリフォールディングの程度は、３８８ｎｍの励起波長および５０４ｎｍの発光波長を用いて、リフォールドされたサンプルの相対蛍光強度を計測することによって判断する。
【００７４】
図２は、イオン性液体がリフォールディングバッファ中に含有されたときのｔｒｘ−ＧＦＰのリフォールディングからの結果を示す。ｔｒｘ−ＧＦＰのリフォールディングは、モルホリニウムベースのイオン性液体４−（３−ヒドロキシプロピル）−４−メチルモルホリニウムクロライドの０．５Ｍ溶液中で、３種のコントロールタンパク質リフォールディング添加物：０．５ＭのＬ−アルギニン、０．２５ＭのＮａＣｌ、または１．０Ｍの非デタージェントスルホベタイン中のいずれにおけるｔｒｘ−ＧＦＰのリフォールディングより、より効率的である。
【００７５】
例４
Ｎ−エチル−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジニウムブロマイドを用いたウシエンテロキナーゼのリフォールディングおよびリフォールディング剤Ｌ−アルギニン、ＮａＣｌおよび非デタージェントスルホベタイン２５６との比較
５０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８．０、７．０Ｍのグアニジン塩酸塩、０．２ＭのＮａＣｌ、２．０ｍＭのＥＤＴＡおよび１０ｍＭのＴＣＥＰ中に存在する、ウシエンテロキナーゼ（ＥＫ）のリフォールディングを、１：５０の比率でリフォールディングバッファ中に速やかに希釈することによって行う。タンパク質の最終濃度は１００μｇ／ｍＬである。リフォールディングバッファは、１．０Ｍのイオン性液体Ｎ−エチル−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジニウムブロマイドまたは３種のコントロールリフォールディング添加物：０．５ＭのＬ−アルギニン、０．２５ＭのＮａＣｌ、もしくは１．０Ｍの非デタージェントスルホベタイン、のうちの１種を含む、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５である。リフォールディングサンプルを、３００ＲＰＭで振とうしながら２２±２℃で２０〜２４時間インキュベートする。リフォールディング後、サンプルを、２０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび２．０ｍＭのＣａＣｌ２に対して、１：４００００またはそれ以上のサンプル対バッファ比率で、１０±２℃で２０〜２４時間透析する。リフォールディングは、ＥＫ特異的な酵素活性アッセイを用いて計測する。酵素活性の計測に用いられる基質は、Sigma Aldrich社から入手可能な、蛍光標識されたペプチド基質（Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−β−ナフチルアミド、カタログ番号Ｇ５２６１）である。
【００７６】
図３は、イオン性液体Ｎ−エチル−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジニウムブロマイドがリフォールディングバッファ中に含有されたときのＥＫのリフォールディングからの結果を示す。ウシエンテロキナーゼのリフォールディングは、ピリジニウムベースのイオン性液体Ｎ−エチル−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジニウムブロマイドの１．０Ｍ溶液中で、３種のコントロールリフォールディング添加物：０．５ＭのＬ−アルギニン、０．２５ＭのＮａＣｌ、または１．０Ｍの非デタージェントスルホベタイン中のいずれにおけるＥＫのリフォールディングより、より効率的である。
【００７７】
例５
Ｎ−メチル−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジニウムヨーダイドを用いたラムダプロテインホスファターゼのリフォールディング
５０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８．０、７．０Ｍのグアニジン塩酸塩、０．２ＭのＮａＣｌ、２．０ｍＭのＥＤＴＡおよび１０ｍＭのＴＣＥＰ中に存在する、ラムダプロテインホスファターゼ（λＰＰａｓｅ）のリフォールディングを、１：５０の比率でリフォールディングバッファ中に速やかに希釈することによって行う。タンパク質の最終濃度は２００μｇ／ｍＬである。リフォールディングバッファは、７．６ｍＭの還元型グルタチオン、２．４ｍＭの酸化型グルタチオンおよび様々な濃度のイオン性液体Ｎ−メチル−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジニウムヨーダイドを含む、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、である。リフォールディングプロセスは、２２±２℃で２０〜２４時間、３００ＲＰＭで振とうしながら行う。リフォールディング後、サンプルを、５．０ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、０．１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡおよび０．０１％（ｖ／ｖ）のＢｒｉｊ−３５を含む、５０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ７．５中に１：５０で希釈する。リフォールディングは、λＰＰａｓｅ特異的な酵素活性アッセイを用いて計測する。酵素活性の計測に用いられる基質は、Sigma Aldrich社から入手可能な、４−ニトロフェニルホスフェート（カタログ番号Ｎ２２００２）である。
【００７８】
図４は、イオン性液体Ｎ−メチル−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジニウムヨーダイドが様々な濃度でリフォールディングバッファ中に含有されたときの、λＰＰａｓｅのリフォールディングからの結果を示す。リフォールディング効率はＮ−メチル−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジニウムヨーダイドが１．０Ｍで存在するときに最大レベルに達する。
【００７９】
例６
イオン性液体Ｎ−メチル−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジニウムクロライドによる、上昇した温度でのウシヘモグロビンの安定化
天然のウシヘモグロビン（Sigma/Aldrichカタログ番号Ｈ２６２５）を０．１Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、０．４ＭのＮａＣｌ、に最終濃度１０．０ｍｇ／ｍＬで溶解する。このヘモグロビン溶液のアリコートを、１．５ＭのＮ−メチル−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジニウムクロライド、１００％グリセロール、蒸留および脱イオン化したＨ２Ｏ、または１．５ＭのＮａＣｌで２倍に希釈し、以下の４種の試験溶液を作成する。
【００８０】
（１）０．２ＭのＮａＣｌ、５．０ｍｇ／ｍＬのヘモグロビン、および０．７５ＭのＮ−メチル−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジニウムクロライドを含有する、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４（▲）；
（２）０．２ＭのＮａＣｌ、５．０ｍｇ／ｍＬのヘモグロビン、および５０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有する、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４（■）；
（３）０．２ＭのＮａＣｌおよび５．０ｍｇ／ｍＬのヘモグロビンを含有する、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４（●、コントロール）；
（４）０．９５ＭのＮａＣｌおよび５．０ｍｇ／ｍＬのヘモグロビンを含有する、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４（▼；ベースバッファから０．２ＭのＮａＣｌおよび試験として０．７５ＭのＮａＣｌ）
【００８１】
各ヘモグロビン溶液を５５℃で１４３時間インキュベートする。インキュベーションの間、各ヘモグロビン溶液からサンプルを採り、１６，０００×ｇで１５分、室温で遠心してあらゆる沈殿したヘモグロビンを除去する。可溶性画分に残存するヘモグロビンの量を、溶液の５４０ｎｍにおける吸収を計測することで定量する（５４０ｎｍにおけるヘモグロビンの吸収は、タンパク質濃度によって線形的に変化する）。図５中に示されたデータは、各条件下における各時点での３回の独立した計測の平均を表す。各データポイントの標準偏差が示されている。上の図は、全タイムコースからのデータを示している。下の図は最初の８時間のみについての同様のデータを示す。
【００８２】
図５は、最終濃度０．７５ＭでのＮ−メチル−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジニウムクロライドの添加（▲）は、５５℃でインキュベートされた５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、０．２ＭのＮａＣｌ中の５．０ｍｇ／ｍＬのウシヘモグロビン溶液の沈殿を、顕著に遅延、または防止することを示す。０．７５ＭのＮ−メチル−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジニウムクロライド（▲）の安定化効果は、慣用されているタンパク質安定化剤であるグリセロールの５０％（ｖ／ｖ）溶液よりもはるかに優れている。０．７５ＭのＮａＣｌのベースバッファへの添加（▼、０．９５Ｍの総ＮａＣｌ）がコントロールサンプル（●）と比較してヘモグロビンの沈殿を加速させているため、０．７５ＭのＮ−メチル−４−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジニウムクロライド（▲）の安定化効果は、溶液中のイオン強度の増加によるものではない。
【００８３】
例７
４−（３−ヒドロキシエチル）−４−メチルモルホリニウムヨーダイドを用いた一本鎖抗体チオレドキシン融合タンパク質のリフォールディングおよびリフォールディング剤非デタージェントスルホベタイン２５６、トレハロースおよびポリエチレングリコール３３５０との比較
５０ｍＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８．０、７．０Ｍのグアニジン塩酸塩、０．２ＭのＮａＣｌ、２．０ｍＭのＥＤＴＡおよび１０ｍＭのＴＣＥＰ中に存在する一本鎖抗体チオレドキシン融合タンパク質（ｓｃＦｖ−ｔｒｘ）のリフォールディングを、タンパク質をリフォールディングバッファに、４−（３−ヒドロキシエチル）−４−メチルホルホリニウムヨーダイドを含有するリフォールディングバッファについて１：５０の比率で（２００μｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度）、または非デタージェントスルホベタイン２５６、トレハロースもしくはポリエチレングリコール３３５０を含有するリフォールディングバッファについて１：１００の比率で（１００μｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度）、速やかに希釈することにより行う。
【００８４】
図６Ａについて、リフォールディングバッファは５０ｍＭのＥＰＰＳ、ｐＨ８．０である。図６Ｂについて、リフォールディングバッファは１．０ｍＭのＴＣＥＰを含有する５０ｍＭのＴＡＰＳ、ｐＨ８．５である。４−（３−ヒドロキシエチル）−４−メチルモルホリニウムヨーダイドを、１．０Ｍの最終濃度でリフォールディングバッファに添加する。非デタージェントスルホベタイン２５６、トレハロースおよびポリエチレングリコール３３５０を、それぞれ１．０Ｍ、０．５８Ｍ、および０．０６％（ｗ／ｖ）の最終濃度でリフォールディングバッファに添加する。リフォールディングサンプルを、２２±２℃で２０〜２４時間、３００ＲＰＭで振とうしながらインキュベートする。リフォールディング後、サンプルを、０．２ＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＤＴＴ、１０％（ｖ／ｖ）のグリセロールおよび０．０３％（ｖ／ｖ）のＢＲＩＪ３５を含有する２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５に対して、１：４０，０００またはそれ以上のサンプル対バッファ比率で、２０〜２４時間、１０±２℃で透析する。リフォールディングの程度は、正しくフォールドされたｓｃＦｖ−ｔｒｘ融合タンパク質に特異的なＥＬＩＳＡを用いて計測した。
【００８５】
図６Ａは、イオン性液体４−（３−ヒドロキシエチル）−４−メチルモルホリニウムヨーダイド（（ｅＯＨ）ｍｍｏｌ）が５０ｍＭのＥＰＰＳ、ｐＨ８．０リフォールディングバッファに含有されたときの、ｓｃＦｖ−ｔｒｘ融合タンパク質のリフォールディングからの結果と、添加物の非存在下または非デタージェントスルホベタイン２５６（ＮＤＳＢ−２５６）がリフォールディングバッファに含有されたときのリフォールディング結果との比較を示す。ｓｃＦｖ−ｔｒｘ融合タンパク質のリフォールディングは、４−（３−ヒドロキシエチル）−４−メチルモルホリニウムヨーダイドの１．０Ｍ溶液中で、リフォールディング添加物の非存在下または１．０Ｍの非デタージェントスルホベタイン２５６の存在下でのｓｃＦｖ−ｔｒｘ融合タンパク質のリフォールディングより、より効率的である。
【００８６】
図６Ｂは、イオン性液体４−（３−ヒドロキシエチル）−４−メチルモルホリニウムヨーダイド（（ｅＯＨ）ｍｍｏｌ）が５０ｍＭのＴＡＰＳ、ｐＨ８．０、１．０ｍＭのＴＣＥＰリフォールディングバッファに含有されたときの、ｓｃＦｖ−ｔｒｘ融合タンパク質のリフォールディングからの結果と、添加物の非存在下または０．５８Ｍのトレハロースもしくは０．０６％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコール（ＰＥＧ３３５０）がリフォールディングバッファに含有されたときのリフォールディング結果との比較を示す。ｓｃＦｖ−ｔｒｘ融合タンパク質のリフォールディングは、４−（３−ヒドロキシエチル）−４−メチルモルホリニウムヨーダイドの１．０Ｍ溶液中で、リフォールディング添加物の非存在下または０．５８Ｍのトレハロースもしくは０．０６％（ｗ／ｖ）のポリエチレングリコールの存在下でのｓｃＦｖ−ｔｒｘ融合タンパク質のリフォールディングより、より効率的である。
【図１】
0005496898.tif 000008
【図２】
0005496898.tif 000009
【図３】
0005496898.tif 000010
【図４】
0005496898.tif 000011
【図５】
0005496898.tif 000012
【図６】
0005496898.tif 000013