(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＴＧＡ２の１６４８Ａ→Ｇ、ＳＡＨのＡ→Ｇ（−７ from exon １３）、ＣＹＢＡの２４２Ｃ→Ｔ、ＭＭＰ２の−１３０６Ｃ→Ｔ、ＮＯＳ３の−７８６Ｔ→Ｃ、及びＰＡＩ１のＡ→Ｇ（Ｔｙｒ２４３Ｃｙｓ）の遺伝子多型を検出することを特徴とする高血圧の遺伝的リスク検出法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高血圧の遺伝的リスク検出法等に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノムプロジェクトの成功によって、一般的な疾患に影響を与える遺伝子の同定を含め、臨床医学に対して大きな利益がもたらされつつある。そのような遺伝子を同定するための方法の一つとして、特定の疾患に注目しつつ、適切に選択された遺伝子多型を探るという方法がある。そのような遺伝子は、その疾患の発症・進展に関与するタンパク質をコードしていることが知られており、かつ疾患に連鎖する染色体領域に存在しているからである。
【０００３】
高血圧は、多くの因子が複雑に関与する疾患であり、個人の遺伝的特性と多くの環境要因の相互作用によって発症すると考えられている（非特許文献１：関連文献については、明細書の末尾にまとめて示す。）。高血圧は冠動脈疾患、脳血管障害、および重篤な腎障害の主要な危険因子であるため、高血圧を予防することは医学的・社会的に重要である。個人に応じた高血圧の予防と最適な治療方法を選択するための方法の一つは、疾患に関与する遺伝子を同定することである。
【０００４】
遺伝的連鎖解析（非特許文献２〜６）と候補遺伝子解析（非特許文献２、７〜１０）によって、いくつかの候補遺伝子が高血圧に関与することが示唆されている。しかしながら、依然として高血圧の遺伝的要因については、十分解明されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、上記の事情に鑑みてなされたものであり、その目的は、高血圧について、遺伝的リスクを判断するための一材料を得るための遺伝子検出法等を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は、高血圧に関し、４８５３名の日本人について、１２８遺伝子中の１５０カ所の遺伝子多型に関する大規模研究を行った。本研究の目的は、高血圧に関与する遺伝子多型を同定し、この知見に基づいて、ある者に対して高血圧を避けるための有用な情報を与えることである。
【０００７】
上記解析の結果、第１の発明に係る高血圧のリスク検出法は、ＩＴＧＡ２の１６４８Ａ→Ｇ、ＧＣＫの−３０Ｇ→Ａ、ＰＴＧＩＳの１１１７Ｃ→Ａ、ＳＡＨのＡ→Ｇ（−７ from exon １３）、ＥＳＲ１の−１９８９Ｔ→Ｇ、ＣＹＢＡの２４２Ｃ→Ｔ、ＭＭＰ２の−１３０６Ｃ→Ｔ、ＡＢＣＣ８の３８５７Ｇ→Ａ、ＴＮＦの−８６３Ｃ→Ａ、ＴＨＢＤの２１３６Ｃ→Ｔ、Ｆ３の−６０３Ａ→Ｇ、ＧＣＬＭの−５８８Ｃ→Ｔ、ＮＯＳ３の−７８６Ｔ→Ｃ、ＰＡＩ１のＡ→Ｇ（Ｔｙｒ２４３Ｃｙｓ）のうちの少なくとも１個または２個以上の遺伝子多型と、性差とを評価因子とし、各評価因子のオッズ比を乗じた発症リスクを計算し、この発症リスクを平均と分散またはパーセント区分に応じて３つ以上の複数の群を作成し、各群に応じて発症のリスクを検出することを特徴とする。
【０００８】
このとき、群を形成するときに使用する分散については、統計上の分散値、或いは標準偏差値（ＳＤ）、パーセントによる区分などを用いることができる。なお、遺伝子多型については、必ずしも上記１４個には限られず、これら１４個の多型のうちの任意の１個〜１３個、或いは本明細書中で示される上記１４個の他の多型を含む１５個以上で実施することもできる。
【０００９】
本明細書中において、多型の記載方法は、次の通りである。原則として、各遺伝子について、「多型が生じている位置、データベースに登録されている塩基（Ａ：アデニン、Ｇ：グアニン、Ｃ：シトシン、Ｔ：チミン）→多型塩基」の順で記載する。例えば、「ＩＴＧＡ２の１６４８Ａ→Ｇ」は、ＩＴＧＡ２遺伝子について、１６４８位のＡがＧとなっている多型を意味している。また、場所の指定がない多型については、表１〜表５に記載のｄｂＳＮＰのアクセス番号から、その内容を容易に理解することができる。なお、ｄｂＳＮＰのアクセス番号から検索された多型と、表１〜表５に記載された多型とが一致しない場合がある。その場合は、読む方向が異なることを意味している。例えば、順方向（forward strand）に読んで、Ａ／Ｇ多型として記録されている場合であっても、逆方向（reverse strand）で読むとＴ／Ｃ多型となる。このように、必ずしもｄｂＳＮＰのデータベースに記載された多型と表中の多型とが同一でない場合には、読む方向が逆であることを意味している。
【００１０】
一般に多型は、集団（例えば、日本人集団、西洋人集団など）が異なると、その種類・頻度が異なることが知られている。このため、日本人以外の集団において、高血圧との関係が指摘されている多型であっても、必ずしも日本人集団においてそのような関連が認められるわけではない。このため、従来の報告については、国または疾患が異なる場合には、必ずしも日本人における多型および高血圧との関連が裏付けられるわけではない。但し、日本人集団に近い集団、例えば韓国人、中国人の集団においては、同じ傾向が認められる可能性が高い。
【００１１】
また、第２の発明に係る高血圧の遺伝的リスク検出法は、ＩＴＧＡ２の１６４８Ａ→Ｇ、ＧＣＫの−３０Ｇ→Ａ、ＰＴＧＩＳの１１１７Ｃ→Ａ、ＳＡＨのＡ→Ｇ（−７ from exon １３）、ＥＳＲ１の−１９８９Ｔ→Ｇ、ＣＹＢＡの２４２Ｃ→Ｔ、ＭＭＰ２の−１３０６Ｃ→Ｔ、ＡＢＣＣ８の３８５７Ｇ→Ａ、ＴＮＦの−８６３Ｃ→Ａ、ＴＨＢＤの２１３６Ｃ→Ｔ、Ｆ３の−６０３Ａ→Ｇ、ＧＣＬＭの−５８８Ｃ→Ｔ、ＮＯＳ３の−７８６Ｔ→Ｃ、ＰＡＩ１のＡ→Ｇ（Ｔｙｒ２４３Ｃｙｓ）のうちの少なくとも１個または２個以上の遺伝子多型を検出することを特徴とする。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、高血圧について、遺伝的リスクおよび発症リスクを判断するための検出法等が提供される。この発明を用いることにより、高血圧に対する予防が可能となり、その結果、高血圧が原因で生じる心筋梗塞、脳血管障害、腎不全などの発症を減少させることにより、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
次に、本発明の実施形態について、図表を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。また、本発明の技術的範囲は、均等の範囲にまで及ぶものである。
【００１４】
＜試験方法＞
研究対象
研究対象は、４８５３名（男性２６８８名、女性２１６５名）の日本人であった。彼らは、６つの研究参加施設（岐阜県立岐阜病院、岐阜県立多治見病院、岐阜県立下呂温泉病院、弘前大学病院、黎明郷リハビリテーション病院、および横浜総合病院）のいずれかに２００２年１０月から２００５年３月までに来院あるいは入院した者であった。２８１８名の高血圧患者（男性１６７７名、女性１１４１名）は、収縮期血圧が１４０ｍｍＨｇ以上、または拡張期血圧が９０ｍｍＨｇ以上のいずれか（あるいは、両方）の基準を満たす者か、降圧薬を服用していた者であった。心臓弁膜症、心臓または血管の先天性奇形、腎臓または内分泌系疾患によって二次的な高血圧を有している者については、研究対象から除外した。
【００１５】
２０３５名のコントロール者（男性１０１１名、女性１０２４名）は、毎年の健康診断のために来院した者であった。彼らは正常血圧（収縮期血圧が１４０ｍｍＨｇ未満であり、かつ拡張期血圧が９０ｍｍＨｇ未満）であり、高血圧の病歴がなく、降圧薬を服用していなかった。血圧は、１０分間以上座って安静とした状態において、少なくとも２回以上の測定を行った。また、血圧測定は、米国心臓協会のガイドライン（非特許文献１１）に従って、熟練した医師によって行った。研究プロトコールはヘルシンキ宣言に従い、三重大学医学部、弘前大学医学部、岐阜県国際バイオ研究所、および参加病院の倫理委員会によって承認された。各参加者に対しては書面によるインフォームドコンセントを得た。
【００１６】
多型の選択
公開データベースの使用および本発明者の鋭意検討により、血管に関する生物学、血小板および白血球に関する生物学、凝固と線維素溶解のカスケード、神経学的因子、脂質・グルコース・ホモシステイン代謝、他の代謝因子に関する包括的な概要に基づき、高血圧に関連する可能性のある１２８個の候補遺伝子を選択した。本発明者は、これら１２８個の遺伝子について、１５０個の多型を選択した。これらの多型の多くは、プロモーター領域、エクソン、イントロンのスプライシングの供与部位或いは受容部位に多く位置しており、多型の結果として、コードされたタンパク質の機能または発現に変化を与えることがあり得ると考えられた。これらの多型は、表１〜表５に示した。なお、表中においては、左欄から順に、座位（Locus）、遺伝子名（Gene）、簡易記載（Symbol）、多型（Polymorphism）、多型データベース登録番号（dbSNP）を示している。なお、多型データベース登録番号が無い場合には、ＮＣＢＩ遺伝子バンクに登録されている番号を示した。
【００１７】
【表１】
0005578536.tif 000002
【００１８】
【表２】
0005578536.tif 000003
【００１９】
【表３】
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【００２０】
【表４】
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【００２１】
【表５】
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【００２２】
遺伝子多型の検出方法
７ｍＬの静脈血を５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ(ジナトリウム塩)を含むチューブに採取し、ゲノムＤＮＡをキット(ゲノミックス社製)によって分離した。１５０個の多型の遺伝子型は、ＰＣＲと配列特異的オリゴヌクレオチドプローブをサスペンジョン・アレイ・テクノロジー（ＳＡＴ：Ｌｕｍｉｎｅｘ  １００）と組み合わせて使用する方法によって決定した（Ｇ＆Ｇサイエンス株式会社）。プライマー、プローブ、その他の条件は、下表６に示した。表には左から順に、遺伝子表記（Gene Symbol）、多型（Polymorphism）、センスプライマー（Sense primer）、アンチセンスプライマー（Antisense primer）、プローブ１（Probe 1）、プローブ２（Probe 2）、アニーリング温度（Annealing）、およびサイクル数（Cycles）を示した。また、詳細な方法については、既報のもの（非特許文献１２）を基本として、適宜に増幅条件を変えて行った。なお、高血圧との関連が認められなかった多型を検出するための条件については記載を省略した。
【００２３】
【表６】
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【００２４】
ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法
方法の詳細については、非特許文献１２に記載の通りである。以下には、この方法の概要について説明する。
図１には、Ｌｕｍｉｎｅｘ１００フローサイトメトリーで検出するマイクロビーズの微細構造と特徴を示した。マイクロビーズ（図中の符号（Ａ））は、直径が約５.５μｍ程度であり、ポリスチレン製である。ビーズ表面には、特異的な塩基配列を認識するプローブが結合されている。各ビーズには、一種類のプローブが結合されている。このマイクロビーズには、赤色色素と赤外色素との割合を変化させることにより、図中の符号（Ｂ）に示すように、最大で１００種類のものを混合した状態で、各ビーズの同定が行えるようになっている。複数種類のプローブを備えたマイクロビーズ（但し、各マイクロビーズには一種類のプローブのみ）を適当な割合で混合し、１００ビーズ／μＬとなるようにしたビーズミックスを調製した（図中の符号（Ｃ））。
【００２５】
図２には、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法の手順の概要を示した。
＜増幅反応（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）＞
目的とするＤＮＡを増幅するＰＣＲ反応には、５’末端をビオチンでラベルしたプライマーを用いた。１.５ｍＭ塩化マグネシウムを含む１ｘＰＣＲ溶液（５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８.３）、２％ＤＭＳＯ、０.２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、及び０.１μＭ〜１０μＭプライマーセットを混合し、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（５０Ｕ／ｍＬ）と５０ｎｇ〜１００ｎｇのゲノムＤＮＡを加えて２５μＬとした。ＰＣＲ反応は、９５℃で１０分間処理の後、９４℃で２０秒間の変性、６０℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で３０秒間の伸長を１サイクルとし、これを５０サイクル繰り返した。機器としてＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラー（アプライドバイオシステムズ社製）を用いた。
【００２６】
＜ハイブリダイゼーション（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）＞
増幅したＤＮＡを変性した後、ビーズミックスとハイブリダイズさせた。９６ウエルプレートの各ウエルに、５μＬの増幅反応後のＰＣＲ増幅液、５μＬのビーズミックス、及び４０μＬのハイブリダイズ用緩衝液（３.７５Ｍ  ＴＭＡＣ、６２.５ｍＭ  ＴＢ（ｐＨ８.０）、０.５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０.１２５％  Ｎ−ラウロイルザルコシン）を添加し、全量５０μＬとした。この混合液を添加した９６ウエルプレートについて、９５℃で２分間の変性、及び５２℃で３０分間のハイブリダイゼーションを行った（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラーを用いた。）。
図２中には、増幅したＤＮＡを認識するプローブを有するビーズ（１）のみが、ＤＮＡと結合する様子が示されている。
【００２７】
＜ストレプトアビジン−フィコエリトリン反応（ＳＡ−ＰＥ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）＞
次に、上記ビーズミックス−ＤＮＡをＳＡ−ＰＥと反応させた。ハイブリダイゼーション反応の後、各ウエルに１００μＬのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（１ｘＰＢＳ（ｐＨ７.５）、０.０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）を添加し、１０００ｘｇで５分間の遠心を行い、上清を取り去ることで、マイクロビーズを洗浄した。各ウエルに残ったマイクロビーズに、それぞれ７０μＬのＳＡ−ＰＥ溶液（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎにより、市販品（Ｇ＆Ｇサイエンス株式会社製）を１００倍希釈したもの）を添加し混合した後、５２℃で１５分間の反応を行った（ＧｅｎｅＡｍｐ９７００サーマルサイクラーを用いた。）。
図２中には、ビーズ（１）のプローブにのみビオチン化ＤＮＡが結合しているので、そのビオチンにＳＡ−ＰＥが結合する様子が示されている。
【００２８】
＜測定（Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）＞
次に、反応後のサンプルはＬｕｍｉｎｅｘ１００を用いて、ビーズ種類の同定と、そのビーズにＰＥが結合しているか否かを判定した。測定は２種類のレーザを使用して行い、ビーズの種類は６３５ｎｍレーザにより同定し、ＰＥ蛍光は５３２ｎｍレーザを用いて定量した。オリゴビーズに結合したＤＮＡは１測定あたり各々のビーズを最低５０個ずつ測定し、定量されたＰＥの蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）を使用した。
図２中には、各ビーズ（１）〜（３）が同定され、かつビーズ（１）にのみＰＥが測定されたことから、ビーズ（１）に結合させたプローブが認識するＤＮＡが増幅された様子が示されている。
【００２９】
統計解析
臨床データは、高血圧（hypertension）の患者群とコントロール群との間で、対応のないスチューデントt検定により比較した。質的データは、カイ二乗検定によって比較した。対立遺伝子頻度は遺伝子カウント法によって概算し、ハーディ・ワインベルク平衡にあてはまるかどうかを判定するためにカイ二乗検定を使った。各常染色体における遺伝子型分布は、高血圧患者と、コントロール者との間でカイ二乗検定(３ｘ２)によって比較した。Ｘ染色体上にある遺伝子多型については、対立遺伝子頻度をカイ二乗検定(２ｘ２)によって比較した。
【００３０】
高血圧と関連（Ｐ＜０.０６）する多型は、交絡因子を含む多項ロジスティック回帰分析法により解析した。このとき、交絡因子については、年齢（age）、性差(sex：女性＝０、男性＝１)、肥満指数(body mass indes：BMI)、喫煙状態(smoking：非喫煙者＝０、喫煙者＝１)、および各遺伝子型を独立変数とし、高血圧を従属変数とした。各遺伝子型は、優性、劣性、および２つの付加（付加１および２）遺伝モデルに従って評価し、Ｐ値、オッズ比、および９５％信頼区間を計算した。
【００３１】
各遺伝モデルは２つの群から成る。優性モデルは「変異型のホモ接合体とヘテロ接合体の結合群」対「野生型のホモ接合体」、劣性モデルは「変異型のホモ接合体」対「野生型のホモ接合体とヘテロ接合体の結合群」、付加１モデルは「ヘテロ接合体」対「野生型のホモ接合体」、付加２モデルは「変異型のホモ接合体」対「野生型のホモ接合体」である。組み合わせ遺伝子型（combined genotype）を分析するために、年齢、性別、肥満指数、喫煙状態、および組み合わせ遺伝子型を独立変数とし、高血圧を従属変数とした多項ロジスティック回帰分析法を実行した。各遺伝子型は、統計的優位性に基づいて優性モデルまたは劣性モデルを用いた。また、各組み合わせ遺伝子型は、高血圧について最も高い遺伝的リスクを与える組み合わせ遺伝子型と比較した。さらに、高血圧に対する遺伝子型または他の交絡因子の効果を確認するために、ステップワイズ変数増加法により解析を行った。モデルへの包含の基準レベルを０.２５とし、モデルからの除外の基準レベルを０.１とした。
【００３２】
高血圧と、遺伝子型の多重比較の結果を得る際に、タイプＩエラーを避けるために統計的有意性（Ｐ＜０.０１)の厳密な基準を採用した。その他の臨床的バックグラウンドデータについては、危険率５％未満（Ｐ＜０.０５）は統計的に有意であると見なした。統計的有意性は、両側検定によって試験した。統計解析は、ＪＭＰソフトウェア・バージョン５.１（ＳＡＳインスティテュート社製）によって実行した。
【００３３】
＜試験結果＞
４８５３名の研究対象に関する基礎的データを表７に示した。左欄より順に、特徴（Characteristics）、高血圧患者群（hypertension）、およびコントロール群（Controls）を示している。また、特徴欄は、上より順に、者数（No. of subjects）、年齢（Age）、性別（男性／女性）（sex(male/female)）、肥満指数（Body mass index）、現在または過去の喫煙率（Current or former smoker）、糖尿病（Diabetes mellitus）、高コレステロール血症（Hypercholesterolemia）、収縮期血圧（Systolic blood pressure）、および拡張期血圧（Diastolic blood pressure）を示している。
【００３４】
【表７】
0005578536.tif 000008
【００３５】
年齢と肥満指数については、平均±ＳＤで示した。喫煙率については、一日あたり１０本以上を吸った場合を喫煙とした。糖尿病については、空腹時血糖値が６.９３ｍｍｏｌ／Ｌ（１２６ｍｇ／ｄＬ）以上、またはヘモグロビンA1cが６.５％以上の者、或いは糖尿病治療薬を服用している者とした。高コレステロールについては、血清総コレステロールが５.７２ｍｍｏｌ／Ｌ（２２０ｍｇ／ｄＬ）以上、または脂質降下薬を服用している者とした。また、表中、「＊」はコントロール群との間にＰ＜０.００１の有意差が認められたことを意味している。
高血圧患者群では、年齢、男性の割合、ＢＭＩ、および糖尿病・高コレステロール血症の罹患率が、コントロール群に比べて高かった。
【００３６】
＜高血圧のリスク診断システム＞
表８には、高血圧のリスク診断システムに関する詳細を示した。表には、左欄より順に、因子（Variable）、Ｐ値（P value）、オッズ比（９５％信頼区間）（OR(95%CI)）を示した。また、最下段には、従来の危険因子（Conventional risk factors）と、今回の研究で見出された遺伝因子（Genetic risk factors）のオッズ比を乗じた総合リスク（Total risk）を示した。
【００３７】
【表８】
0005578536.tif 000009
【００３８】
後述のステップワイズ変数増加法で危険率が０.０５未満（P <0.05）であった遺伝子多型群および年齢・性別・喫煙・ＢＭＩを独立因子（交絡因子）とし、高血圧を従属因子として多項ロジスティック回帰分析を行った。したがってこれらの因子は独立したものであり、オッズ比の積（かけ算）により総合的な高血圧発症リスクを予測することができる。多項ロジスティック回帰分析の結果、従来の危険因子としては性別（男性の方が高リスク）が高血圧の発症に関連した。また今回の研究により、遺伝因子としては、ＩＴＧＡ２、ＧＣＫ、ＰＴＧＩＳ、ＳＡＨ、ＥＳＲ１、ＣＹＢＡ、ＭＭＰ２、ＡＢＣＣ８、ＴＮＦ、ＴＨＢＤ、Ｆ３、ＧＣＬＭ、ＮＯＳ３、ＰＡＩ１の各遺伝子多型が高血圧の発症に関連した。従来の危険因子では最小オッズ比が１.００で最大オッズ比が１.５３、遺伝因子では最小オッズ比が０.０４で最大オッズ比が９.２３であった。したがって、従来の危険因子と今回判明した遺伝因子を総合すると、最小オッズ比が０.０４で最大オッズ比が１４.１２であり、３５３倍の差が認められた。
【００３９】
本研究成果の臨床的な意義について以下に述べる。病院、クリニックまたは健診センターにおいて希望者に対して従来の危険因子と今回の遺伝因子に関する検査を行い、高血圧の発症リスクの予測を行う。従来の危険因子と遺伝因子全体のオッズ比の積の分布からリスクの程度を３段階以上（例えば、５段階）に分ける。例えば、平均±１ＳＤの範囲を平均的リスク群とし、平均＋１ＳＤ〜平均＋２ＳＤをやや高リスク群、平均＋２ＳＤより大きいものを高リスク群とする。また、平均−１ＳＤ〜平均−２ＳＤをやや低リスク群、平均−２ＳＤより小さいものを低リスク群とする。本実施形態では有意な関連が認められなかったが、一般的に喫煙・肥満・加齢も高血圧の危険因子と考えられているので、これらの因子を加味することもできる。
【００４０】
実際に本研究において、リスク値の分布は、リスクが高い群では高血圧群が１４．３％でコントロール群が３．７％、リスクがやや高い群では高血圧群が３３．１％でコントロール群が１５．７％、平均的リスクの群では高血圧群が４９．２％でコントロール群が６５．８％、リスクがやや低い群では高血圧群が３．４％でコントロール群が１４．４％、リスクが低い群では高血圧群が０％でコントロール群が０．４％であった。他の方法として、コントロール群のリスク値の大きい順に全体を５％、２０％、５０％、２０％、５％に区分し、リスク値の最も大きい５％の群をリスクが高い群、次の２０％の群をリスクがやや高い群、次の５０％の群を平均的リスクの群、次の２０％の群をリスクがやや低い群、リスク値が最も小さい５％の群をリスクが低い群とする。実際に本研究における高血圧群の分布は、リスクが高い群は１８．４％（コントロール群は５．０％）、リスクがやや高い群は３８．３％（コントロール群は２０．０％）、平均的リスクの群は３５．８％（コントロール群は５０．０％）、リスクがやや低い群は６．６％（コントロール群は２０．０％）、リスクが低い群は０．８％（コントロール群は５．０％）であった。
【００４１】
結果については、医師等の有資格者の判断を含めてカウンセリングを行い、とりわけ高リスク群またはやや高リスク群に属する場合には、生活習慣の改善（禁煙・食事療法即ち塩分制限・運動療法・肥満の軽減・ストレス解消・睡眠不足解消など）を行うことにより高血圧の一次予防を積極的に推進する。喫煙、過剰な塩分摂取、運動不足、ストレス過多、睡眠不足などの生活習慣や肥満は、一般的に高血圧の原因と考えられているため、遺伝的に高血圧の発症リスクが平均より高いと予測された場合は、生活習慣の改善により高血圧の発症リスクを減少させるようにクライアントに説明する。特に高血圧や心筋梗塞・脳血管障害の家族歴のある人への適用が有効である。本システムにより高血圧のオーダーメイド予防が可能になり、その結果、高血圧が原因で生じる心筋梗塞、脳血管障害、腎不全などの発症を減少させることにより、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。
【００４２】
＜統計解析＞
次に、上記リスク判断システムを開発するに至った統計解析の結果について説明する。
カイ二乗検定により、１７個の遺伝子多型が、高血圧との関連を示した（Ｐ＜０.０６）。詳細を表９に示した。表においては、左欄より順に、遺伝子表記（Gene symbol）、多型（Polymorphism）、および危険率（Ｐ）を示している。
【００４３】
【表９】
0005578536.tif 000010
【００４４】
これらの多型については、高血圧との関連について更に詳細に分析した。年齢、性差、肥満指数、喫煙率を補正した多項ロジスティック回帰分析を行ったところ、劣性モデルにおいては、インテグリンα２遺伝子（ＩＴＧＡ２）の１６４８Ａ→Ｇ多型が、優性モデルにおいては、グルコキナーゼ遺伝子（ＧＣＫ）の−３０Ｇ→Ａ多型と、高血圧関連ＳＡラットホモログ遺伝子（ＳＡＨ：hypertension-associated SA, rat, homolog of, gene）のＡ→Ｇ多型と、プロスタグランジンＩ２シンターゼ遺伝子（ＰＴＧＩＳ）の１１１７Ｃ→Ａ多型が、高血圧の罹患率に有意に（Ｐ＜０.０１）関連した。またこのとき、ＩＴＧＡ２の１６４８Ｇ対立遺伝子は、高血圧に対する危険因子となっていたのに対し、ＧＣＫの−３０Ａ対立遺伝子、ＳＡＨのＧ対立遺伝子、およびＰＴＧＩＳの１１１７Ａ対立遺伝子は、高血圧に対し防御的に作用していた。詳細を表１０に示した。表中、危険率が０.０１未満（Ｐ＜０.０１）のデータについては、太字で示した。
【００４５】
【表１０】
0005578536.tif 000011
【００４６】
表においては、左欄より順に、遺伝子表記（Gene symbol）、多型（Polymorphism）、優性モデル（Dominant）における危険率（P）・オッズ比（OR）・９５％信頼区間（95% CI）、劣性モデル（Recessive）における危険率（P）・オッズ比（OR）・９５％信頼区間（95% CI）、付加１モデル（Additive 1）における危険率（P）・オッズ比（OR）・９５％信頼区間（95% CI）、付加２モデル（Additive 2）における危険率（P）・オッズ比（OR）・９５％信頼区間（95% CI）をそれぞれ示している。
【００４７】
次に、高血圧に対する１４個の多型の遺伝子型、年齢、性別、および肥満指数の影響について、ステップワイズ変数増加法により解析した。結果を表１１に示した。表には、左欄より順に、因子（Variable）、Ｐ値（P value）、寄与率（R2）を示した。
【００４８】
【表１１】
0005578536.tif 000012
統計的有意性が高い順に、年齢、性別（Gender）、肥満指数、ＩＴＧＡ２遺伝子型（劣性モデル）、ＧＣＫ遺伝子型（優性モデル）、およびＰＴＧＩＳ遺伝子型（優性モデル）が非常に高度に有意であり（Ｐ＜０.０１）、各要因が独立して高血圧に影響を与えることが分かった。
次に、３個の多型（ＩＴＧＡ２の１６４８Ａ→Ｇ、ＧＣＫの−３０Ｇ→Ａ、及びＰＴＧＩＳの１１１７Ｃ→Ａ）の組み合わせ遺伝子型について、オッズ比、９５％信頼区間、およびＰ値を計算した。結果を表１２に示した。
【００４９】
【表１２】
0005578536.tif 000013
【００５０】
表においては、左より順に、ＩＴＧＡ２の１６４８Ａ→Ｇの遺伝子型、ＧＣＫの−３０Ｇ→Ａの遺伝子型、ＰＴＧＩＳの１１１７Ｃ→Ａ遺伝子型、各組み合わせ遺伝子型における高血圧患者群／コントロール群の数比、オッズ比（９５％信頼区間）、およびＰ値を示した。多項ロジスティック回帰分析法は、年齢、性差、肥満指数、および喫煙率について補正して行った。３個の多型について組み合わせ遺伝子型を解析することにより、ＩＴＧＡ２についてＧＧ、ＧＣＫについてＧＧ、ＰＴＧＩＳについてＣＣの組み合わせ遺伝子型を１.００として、最小オッズ比の０.４７が、ＩＴＧＡ２についてＡＡまたはＡＧ、ＧＣＫについてＧＡまたはＡＡ、ＰＴＧＩＳについてＣＣの組み合わせ遺伝子型について認められた。
また、高血圧に対する関与が高い（P < 0.01）４個の多型の遺伝子型の分布について、高血圧患者群とコントロール群との間の比較を行った。結果を表１３に示した。
【００５１】
【表１３】
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【００５２】
表においては、左欄より順に、遺伝子表記（Gene symbol）、多型（Polymorphism）、高血圧群（Hypertension）における各遺伝子型の頻度（％）、コントロール群（Controls）における各遺伝子型の頻度（％）を示している。例えば、ＩＴＧＡ２の１６４８Ａ→Ｇ多型では、高血圧群においては、ＡＡ遺伝子型が０.１％、ＡＧ遺伝子型が７.４％、ＧＧ遺伝子型が９２.６％であり、コントロール群においては、ＡＡ遺伝子型が０.３％、ＡＧ遺伝子型が９.４％、ＧＧ遺伝子型が９０.２であった。これら４個の多型に関する遺伝子型の頻度については、高血圧群およびコントロール群のいずれの群でも、ハーディ・ワインバーグ平衡にあった。
【００５３】
＜考察＞
本発明者は、高血圧への関与が推定された１２８個の候補遺伝子中１５０個の多型と高血圧との関係について研究を行った。４８５３名の大規模な研究によって、特にＩＴＧＡ２の１６４８Ａ→Ｇ多型、ＧＣＫの−３０Ｇ→Ａ多型、及びＰＴＧＩＳの１１１７Ｃ→Ａ多型が、日本人集団においては、高血圧について有意に関連していることが分かった。これら３個の多型の組み合わせ遺伝子型を解析した結果、高血圧の素因として、最も低いオッズ比では０.４７が得られた。
【００５４】
インテグリンα２鎖（ＩＴＧＡ２、platelet glycoprotein Ia）は、コラーゲン（α２β１インテグリン）に対する主たる受容体の構成要素である。ＩＴＧＡ２が欠損すると出血性体質となる。一方、α２β１インテグリン濃度が高いと、高剪断力の条件下では、血小板とタイプＩコラーゲンとの結合が促進される。ＩＴＧＡ２の１６４８Ａ→Ｇ（Ｌｙｓ５０５Ｇｌｕ）多型は、免疫原性Ｂｒａ／ｂ（ＨＰＡ−５ａ／ｂ）多型に関与している（非特許文献１３）。Ｌｙｓ５０５Ｇｌｕ多型はＩＴＧＡ２のカチオン結合ドメインに位置していることから、α２β１インテグリンとリガンドとの相互作用に影響を及ぼしているのかも知れない。
【００５５】
ＩＴＧＡ２の１６４８Ａ→Ｇ（Ｌｙｓ５０５Ｇｌｕ）多型は、低リスク群において冠動脈疾患との関係が示されており、患者群ではＧＧ遺伝子型の頻度が高いことが報告された（非特許文献１４）。我々の研究によれば、この多型は高血圧と関連しており、ＧＧ遺伝子型は高血圧の危険因子であった。分子的機構は不明であるが、ＩＴＧＡ２の１６４８Ａ→Ｇ（Ｌｙｓ５０５Ｇｌｕ）多型が高血圧に関与するという知見は、本研究が初めてである。高血圧患者においては、血小板機能が活性化されていることが知られている。活性化血小板は血小板微小体（platelet microparticles）を放出する。重篤な高血圧患者では、その微小体の血中濃度が上昇しており、収縮期及び拡張期血圧が上昇することが知られている。したがって、ＩＴＧＡ２の１６４８Ａ→Ｇ（Ｌｙｓ５０５Ｇｌｕ）多型の血小板機能に対する影響が、高血圧への関与の理由かも知れない。
【００５６】
グルコキナーゼは膵臓β細胞および肝細胞で発現し、その発現は二つの臓器特異的プロモーターによって調節されている。膵グルコキナーゼはグルコースのセンサーとして働いており、インスリン分泌を調節している。若年者の成人発症型糖尿病の１０％〜５０％は、ＧＣＫの変異に依ると報告されている。ＧＣＫの−３０Ｇ→Ａ多型はβ細胞特異的プロモーターに位置しており、日本人においては、β細胞機能の低下および耐糖能異常に関与している（非特許文献１５、１６）。この多型のＡ対立遺伝子は、冠動脈疾患のリスクを増加させ、２型糖尿病の有無を補正した後も冠動脈疾患との関連は不変であった（非特許文献１７）。
【００５７】
Ａ対立遺伝子による冠動脈疾患のリスクは、糖尿病でない人に比べると、２型糖尿病患者の方が大きい。今回の研究では、ＧＣＫの−３０Ｇ→Ａ多型は高血圧に関与しており、このときＡ対立遺伝子は防御的に作用していた。Ａ対立遺伝子が、冠動脈疾患のリスクを増加させ（非特許文献１７）、β細胞の機能を減少させて耐糖能異常を起こし（非特許文献１５、１６）、高血圧のリスクを減少させるというメカニズムについては、今のところ不明である。肝臓特異的ＧＣＫプロモーターに位置する−２５８Ｇ→Ａ多型は、台湾人において、高血圧と関与することが知られている（非特許文献１８）。
【００５８】
プロスタグランジンI2（プロスタサイクリン）は、強力な血管拡張作用を有しており、平滑筋細胞の増殖を抑制することに加え、体内成分としては最も強力な血小板凝集抑制効果を示す。このため、プロスタサイクリンの合成を調節するＰＴＧＩＳの変異は、心臓血管系疾患の病態において重要な役割を果たすのではないかと考えられている。岩井らは、プロモーター活性に影響を及ぼすＰＴＧＩＳのプロモーター領域の反復多型を見出した（非特許文献１９）。彼らは、一般住民での調査により、転写活性が低い遺伝子型は、集団全体でより高い脈圧と関連し（特に女性で顕著）、高齢者においてはより高い収縮期血圧と関連することを示した。ＰＴＧＩＳのエクソン８における１１１７Ｃ→Ａ多型は、心筋梗塞の罹患率に関連しており、ＣＣ遺伝子型がリスク因子であることが報告された（非特許文献２０）。ＣＣ遺伝子型は高い収縮期血圧にも関与していたが、統計的には有意性が認められるボーダーラインであった。今回の研究では、ＰＴＧＩＳの１１１７Ｃ→Ａ多型は高血圧に有意に関与しており、Ｃ多型はリスク因子であることが分かった。１１１７Ｃ→Ａ多型はアミノ酸の変異を伴わない（Ａｒｇ３７３Ａｒｇ）ので、ＰＴＧＩＳの発現或いはプロスタグランジンI2合成酵素の活性に直接的な影響を与える可能性は低い（非特許文献２０）。この多型は、ＰＴＧＩＳの他の多型或いは近傍にある高血圧に関与する他の遺伝子の多型と連鎖不平衡にある遺伝マーカーなのかも知れない。
このように本実施形態によれば、高血圧について、遺伝的リスクおよび発症リスクを判断するための検出法等が提供される。この発明を用いることにより、高血圧に対する予防が可能となり、高齢者の健康寿命延長・ＱＯＬ向上・ねたきり防止ならびに今後の医療費削減など、医学的・社会的に大きく貢献できる。
【００５９】
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【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】Ｌｕｍｉｎｅｘ１００で検出するマイクロビーズの微細構造と特徴を示す図である。
【図２】ＰＣＲ−ＳＳＯＰ−Ｌｕｍｉｎｅｘ法の手順の概要を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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