(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫調節作用の増強された乳酸菌の製造方法であって、  
免疫調節作用を有する乳酸菌であって推奨培養温度が３０℃の乳酸菌を、３１℃〜４１℃であってかつ推奨培養温度による培養で得られる菌濃度の２５〜９５％の菌濃度が得られる温度で、浸透圧５００〜１０００ｍＯｓｍの培地にて培養する工程を含み、それによって免疫調節作用の増強された乳酸菌が得られ、
ここで、前記乳酸菌はラクトバシラス・ペントーサスまたはラクトバシラス・プランタラムである、前記製造方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法によって得られる乳酸菌。
【請求項３】
請求項２に記載の乳酸菌を含む飲食品、医薬または化粧料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫調節作用の増強された乳酸菌の製造方法に関する。より具体的には、乳酸菌の細胞壁、すなわち免疫調節成分を増やすことにより、免疫賦活作用および抗アレルギー作用等の免疫調節作用の増強された乳酸菌の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、加齢による免疫低下に起因した感染症が増加している。多忙な現代社会およびストレス環境での生活によっても免疫が低下することが知られており、その対策が強く望まれている。また最近では、トリインフルエンザなどの新興感染症、結核などの再興感染症が猛威を振るっており、外敵から身を守る免疫力を強化することは免疫力の低下が危惧される現代人にとって重要である。このような状況の中で、免疫調節作用を長期間にわたって発揮し、ストレス環境下の人々の健康を維持できる安全な食品を開発することが急務とされている。【０００３】
免疫調節作用を有する食品素材として多くの乳酸菌、または乳酸菌を含む乳製品が市販されている。乳酸菌としては、ラクトバシラス属、ラクトコッカス属、ストレプトコッカス属、ペディオコッカス属、エンテロコッカス属などが挙げられ、それら乳酸菌が免疫賦活または抗アレルギー作用を有することは知られている（特許文献１〜４）。しかしながら、これらの特許文献で開示されている免疫賦活作用は、試験管内または動物試験での結果であり、実際にヒトでの免疫調節作用に関する知見は開示されていない。【０００４】
また、乳酸菌の免疫調節作用を増強する方法として、培養時にコーンスティープリカー培地を使用する方法（特許文献５）、５〜１５％の塩を含む培地を使用する方法（特許文献６）、０．１〜１％界面活性剤＋０．０１％〜０．１％炭酸塩を含む培地を使用し、かつ８０〜１２０℃、５〜３０分間熱処理を行う方法（特許文献７）などがあるが、原材料が増える、工程が増えるなどコスト面での問題がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−１８４６９号公報
【特許文献２】特開平６−８０５７５号公報
【特許文献３】特許第３１７４６１１号公報
【特許文献４】特開２０００−９５６９７号公報
【特許文献５】特許第４１１５１８１号公報
【特許文献６】特開２００６−２８０４７号公報
【特許文献７】特開２００７−１３１６１０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記のように、免疫調節作用を長期間にわたって発揮し、ストレス環境下の人々の健康を維持できる安全な食品を開発することが急務とされている。【０００７】
本発明の目的は、上記の問題点に鑑み、特殊な培地または特殊な工程を必要とせず、乳酸菌の免疫調節機能を高めることにより、ヒトにおいて優れた免疫調節作用を有する乳酸菌、またはそれを含む飲食品、医薬品または化粧料等を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、乳酸菌を異なる温度で培養すると乳酸菌の生育が変化すること、その生育変化に伴って細胞壁合成酵素遺伝子、細胞壁成分量、および細胞壁の厚さが変化することを見出した。【０００９】
より検討を重ねた結果、驚くべきことに、用いる乳酸菌の推奨培養温度よりも高温側で培養することにより細胞壁量および細胞壁厚みが増加し、この増加に相関して免疫調節作用が高まることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。【００１０】
すなわち本発明は、次の［１］〜［１０］である。
［１］免疫調節作用の増強された乳酸菌の製造方法であって、乳酸菌を該菌の推奨培養温度の１℃以上であり、かつ推奨培養温度による培養で得られる菌濃度の２５〜９５％の菌濃度が得られる温度で培養する工程を含み、それによって免疫調節作用の増強された乳酸菌が得られる、前記製造方法。
［２］免疫調節作用の増強された乳酸菌の製造方法であって、乳酸菌を該菌の推奨培養温度で培養した場合と比較して、細胞壁中のジアミノピメリン酸量が１．３５倍以上、又は細胞壁の厚みが１０６％以上となる培養温度で培養する工程を含み、それによって免疫調節作用の増強された乳酸菌が得られる、前記製造方法。
［３］乳酸菌の推奨培養温度が３０℃または３７℃である、［１］または［２］に記載の方法。
［４］乳酸菌の推奨培養温度が３０℃であり、培養温度が３１℃〜４１℃である、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］乳酸菌の推奨培養温度が３７℃であり、培養温度が４１℃〜４４℃である、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［６］乳酸菌がラクトバシラス属菌である、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。［７］乳酸菌がラクトバシラス・ペントーサス、ラクトバシラス・プランタラム、ラクトバシラス・ブレビス、ラクトバシラス・ファーメンタム、またはラクトバシラス・カゼイである、［６］に記載の方法。
［８］さらに、培地の浸透圧を５００〜１０００ｍＯｓｍとする、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］［１］〜［８］のいずれかに記載の方法によって得られる乳酸菌。
［１０］［９］に記載の乳酸菌を含む飲食品、医薬または化粧料。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の乳酸菌あるいはそれを含む組成物は、食品素材から製造されているため、安全性が高く、短期ないし長期間にわたり、日常的にまたは適当な日数間隔で継続的に摂取することができる。したがって飲食品もしくは健康食品として摂取した場合、長期間にわたって免疫機能を調節することにより、さまざまな要因で起こる免疫機能低下を防止することができる。また、免疫機能のバランスを調節することにより、生体に悪影響を及ぼす免疫機能の過度の亢進を防止することができる。【００１２】
本発明の乳酸菌は、医薬品としても応用することができ、免疫機能の低下または免疫機能の過度の亢進に起因する各種の症状を、穏やかな効き目で緩和ないし治癒することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、培養終了時のラクトバシラス・ペントーサス Ｓ−ＰＴ８４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２８）の菌濃度を示す。
【図２】図２は、培養終了時のラクトバシラス・ペントーサス ＪＣＭ１５５８Tの菌濃度を示す。
【図３】図３は、細胞壁構成アミノ酸であるジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）測定結果を示す。
【図４】図４は、培養温度の違いによるＩＬ−１２誘導能変化を示す（ラクトバシラス・ペントーサス Ｓ−ＰＴ８４）。
【図５】図５は、培養温度の違いによるＩＬ−１２誘導能変化を示す（ラクトバシラス・ペントーサス ＪＣＭ１５５８T）。
【図６】図６は、培養終了時のラクトバシラス・プランタラム ＪＣＭ１１４９Tの菌濃度を示す。
【図７】図７は、培養温度の違いによるＩＬ−１２誘導能変化を示す（ラクトバシラス・プランタラム ＪＣＭ１１４９T）。
【図８】図８は、培養終了時のラクトバシラス・カゼイ ＪＣＭ１１３４Tの菌濃度を示す。
【図９】図９は、培養温度の違いによるＩＬ−１２誘導能変化を示す（ラクトバシラス・カゼイ ＪＣＭ１１３４T）。
【図１０】図１０は、培養温度変化による細胞壁合成酵素遺伝子発現量の変化を示す。
【図１１】図１１は、浸透圧変化による細胞壁合成酵素遺伝子発現量の変化を示す（３０℃）。
【図１２】図１２は、浸透圧変化による細胞壁合成酵素遺伝子発現量の変化を示す（３７℃）。
【図１３】図１３は、細胞壁厚みの測定結果を示す。
【図１４】図１４は、細胞壁厚みの異なる乳酸菌のＩＬ−１２誘導能の測定結果を示す（図１３の菌体使用）。
【図１５】図１５は、実生産スケール（１０００Ｌ）で培養した乳酸菌の細胞壁成分量及びＩＬ−１２誘導能を示す。
【図１６】図１６は、ヒトでの免疫賦活効果の試験結果を示す（摂取前のＮＫ活性を１００とした場合のＮＫ活性変化量）。
【図１７】図１７は、ヒトでの免疫賦活効果の試験結果を示す（摂取前からのＩＦＮ−α産生変化量）。
【図１８】図１８は、ヒトでの免疫賦活効果の試験結果を示す（摂取前からのＴｈ１／Ｔｈ２比変化量）。
【図１９】図１９は、各種乳酸菌の細胞壁厚みとＩＬ−１２誘導能を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態について、詳細に説明する。
【００１５】
＜免疫調節作用の増強された乳酸菌の製造方法＞
乳酸菌
本発明に使用する乳酸菌としては、すべての属、種を使用することができる。例としては、ラクトバシラス属、ラクトコッカス属、ストレプトコッカス属、ペディオコッカス属、エンテロコッカス属菌を挙げることができる。ラクトバシラス属菌としては、例えばラクトバシラス・ペントーサスが挙げられる。
【００１６】
乳酸菌は複数種類の菌を混合して用いることもできる。
【００１７】
培養温度
本発明の方法では、乳酸菌を該菌の推奨培養温度の１℃以上であり、かつ推奨培養温度による培養で得られる菌濃度の２５〜９５％の菌濃度が得られる温度で培養する工程を含む。好ましくは、推奨培養温度による培養で得られる菌濃度の３０〜９５％の菌濃度が得られる温度、さらに好ましくは３５〜９５％、４０〜９５％、４５〜９５％、５０〜９５％、の菌濃度が得られる温度で培養する工程を含む。そのような培養を行うことにより、免疫調節作用の増強された乳酸菌が得られる。
【００１８】
推奨培養温度とは、それぞれの乳酸菌で推奨されている培養温度のことである。乳酸菌は、植物由来乳酸菌と動物由来乳酸菌に分けることができるが、一般的には植物由来乳酸菌の推奨培養温度は３０℃であり、動物由来乳酸菌の推奨培養温度は３７℃である。例えば、植物由来乳酸菌であるラクトバシラス・ペントーサス Ｓ−ＰＴ８４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２８）およびラクトバシラス・ペントーサス ＪＣＭ１５５８Tの推奨培養温度は３０℃である。
【００１９】
「推奨培養温度による培養で得られる菌濃度の２５〜９５％の菌濃度が得られる温度」は、推奨培養温度（例えば、３０℃または３７℃）にて培養した場合の最高到達菌体濃度に対して、最高到達菌体濃度として２５〜９５％の菌濃度が得られる培養温度である。ここで、最高到達菌体濃度に達するには、通常１８時間〜３６時間程度を要し、例えば２４時間培養後の菌濃度を比較することによって、上記温度を決定することができる。
【００２０】
好ましい培養温度は、菌体毎に異なるが、推奨培養温度が３０℃の菌では、免疫賦活作用と得られる菌濃度とをあわせて考えると、十分な菌数が確保でき、かつ免疫賦活作用が高い菌体を調製することができる３１−４１℃が望ましく、更に３２℃〜４０℃の範囲が好ましい。推奨培養温度が３７℃の菌では、免疫賦活作用と得られる菌濃度とをあわせて考えると、十分な菌数が確保でき、かつ免疫賦活作用が高い菌体を調製することができる４１−４４℃が好ましい。
【００２１】
「推奨培養温度で培養した場合と比較して、細胞壁中のジアミノピメリン酸量が１．３５倍以上、又は細胞壁の厚みが１０６％以上となる培養温度」とは、推奨培養温度（例えば、３０℃または３７℃）にて培養した場合の細胞壁中のジアミノピメリン酸量に対して、ジアミノピメリン酸量が１．３５倍以上となる温度、又は推奨培養温度（例えば、３０℃または３７℃）にて培養した場合の細胞壁の厚みに対して、細胞壁の厚みが１０６％以上となる温度である。ここで、細胞壁中のジアミノピメリン酸量は、当業者に知られた方法により、細胞壁の糖鎖を架橋しているペプチド構成アミノ酸であるジアミノピメリン酸を定量することにより得られる。細胞壁の厚みは、乳酸菌の電子顕微鏡観察により求めることができ、例えば「（乳酸菌全長（短径）−細胞質長（内膜外側〜反対側の内膜外側））÷２」という式で算出することができる。なお、培養温度は、「推奨培養温度で培養した場合と比較して、細胞壁中のジアミノピメリン酸量が１．５倍以上、又は細胞壁の厚みが１１０％以上となる培養温度」がより好ましく、さらに「推奨培養温度で培養した場合と比較して、細胞壁中のジアミノピメリン酸量が１．６５倍以上、又は細胞壁の厚みが１１５％以上となる培養温度」が最も好ましい。
【００２２】
培養に用いる培地は、乳酸菌が生育可能な培地であればどのようなものでも利用可能であり、乳、ＭＲＳ培地、ＢＬ培地、Ｂｒｏｔｈ培地や合成培地などを用いることができる。
【００２３】
浸透圧
本発明の免疫調節作用の増強された乳酸菌の製造方法では、培地の浸透圧をある範囲に高めることにより、更に免疫調節作用が増強される。具体的には、浸透圧を５００〜１０００ｍＯｓｍとし、所望の培養温度にて培養することにより、免疫調節作用が増強される。
【００２４】
浸透圧を高める方法は、どのような方法であってもよいが、例えばソルビトールなどの成分を培地に加えることにより高めることができる。
【００２５】
免疫調節作用
本発明により得られる乳酸菌は、著しく強い免疫疫調節作用を有する。強い免疫調節作用を有するとは、イ）免疫賦活作用、ロ）免疫抑制作用、ハ）免疫バランスの最適化作用、およびニ）腸管免疫賦活作用の少なくともいずれか一つの作用を有すること、好ましくはこれらの作用を全部有することを意味するが、これらに限定されるものではない。なお、これらの作用は全く独立している訳ではなく、相互に関連する場合があることは当業者に容易に理解されるところである。
【００２６】
イ）免疫賦活作用とは、免疫機能が定常状態や低下状態にあるときこれを活性化する作用である。免疫機能が低下している状態とは、例えば、高齢、ストレス、疲労、睡眠不足などのため、免疫機能が低下する場合が例示される。本発明の乳酸菌が有する免疫賦活作用は、本発明の乳酸菌を添加した動物のマクロファージが活性化されること、ヒトに一定期間摂取させた際の末梢血ＰＢＭＣのＮＫ活性が増強される、また抗ウイルス作用を示すＩＦＮ−α産生が増強されること、などにより確認することができる。具体的には、マクロファージ活性化による免疫賦活作用の評価として、インターロイキン−１２（ＩＬ-１２）産生の測定が挙げられ、本評価には最低乳酸菌サンプルを４〜５検体用いる。具体的には乳酸菌サンプルを最終濃度として、０．７５、２．２５、７．５、２２．５又は７５×１０6個/ｍＬとなるような５水準から２〜３水準を選択し、マクロファージに添加する。２４時間培養後の培養上清中ＩＬ−１２濃度を測定し、ＩＬ−１２産生が強く誘導された２〜３検体の中で、最も高値を示した水準の結果を評価の対象とする。
ロ）免疫抑制作用とは、免疫機能が過度に亢進しているとき（例えば、アレルギー、アトピーなど）にこの亢進を抑制して適切な免疫状態とする作用である。例えば、花粉、ダニなどの抗原に由来したアレルギー反応を抑制する作用などを挙げることができる。
ハ）免疫のバランスの最適化作用とは、細胞性免疫と液性免疫のバランスを最適化する作用である。例えば、サイトカイン産生の促進または抑制作用、リンパ球活性化作用、ＮＫ（ナチュラル・キラー）活性増強作用、Ｔｈ１／Ｔｈ２バランス改善作用等を挙げることができる。
ニ）腸管免疫とは、鼻や喉からまたは飲食物等とともに腸管に侵入する病原因子を排除するために腸管粘膜面に存在する防御システムである。具体的には粘液中に産生されるＩｇＡ産生増強作用、パイエル板、腸間膜リンパ節などに存在する免疫細胞のサイトカイン産生増強作用などが挙げられる。
【００２７】
＜乳酸菌＞
本発明の製造方法により、免疫調節作用の増強された乳酸菌が得られる。
【００２８】
乳酸菌は、本発明の培養方法により得られた乳酸菌は必要に応じてさらに処理しても構わない。例えば、培養終了後の培地を遠心分離、ろ過などの方法で集菌したもの（生菌）、それを凍結乾燥したもの、あるいは加熱処理したものなども免疫調節作用を有する乳酸菌として使用することができる。
【００２９】
乳酸菌投与方法は、経口摂取が好ましい。投与量は例えばヒトの場合、一回投与分として菌数で１０００万〜１兆個、より好ましくは１億個〜１０００億個とすることができ、１日１回あるいは複数回分与とすることもできる。摂取のタイミングは特に制限されない。
【００３０】
＜乳酸菌を含む飲食品、医薬または化粧料＞
本発明に係る乳酸菌は、飲食品、医薬または化粧料等として用いることができる。飲食品に用いる場合には、免疫調節作用を有する健康食品として実施することが好適である。その際、公知の基剤、助剤、甘味料、酸味料、ビタミン等の各種成分と混合して摂取者の嗜好に合う製品としてもよい。例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、粉末剤、顆粒剤、キャンデー、ドロップ、トローチ、ガム、粉末ジュース、ドリンク剤、調味料、加工食品、デザート類または菓子類等の形態で提供することが可能である。飲食品の態様では、日常的に本発明の組成物を摂取して、免疫調節機能を発揮させ、健康の維持を図ることが可能である。
【００３１】
医薬品とする場合には、免疫賦活剤や抗アレルギー剤を挙げることができる。また、主薬に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤等の医薬の製剤技術分野において通常使用する公知の補助剤を用いて製剤化することができる。剤型としては、丸剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、座剤、注射剤等を挙げることができ、特に限定されるものではない。本医薬品の投与経路としては、例えば、経口投与、直腸投与、経腸投与等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。
【００３２】
本発明の乳酸菌を含有する飲食品または医薬は、一回投与分として菌数で１０００万〜１兆個、より好ましくは１億個〜１０００億個含有するが、本発明の乳酸菌は安全性が高いため、実質上の上限は存在しない。
【００３３】
以下に本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例１】
【００３４】
（培養温度の違いにより変化する乳酸菌濃度、細胞壁成分量、インターロイキン−１２誘導作用）
乳酸菌培養・菌体調製
ラクトバシラス・ペントーサス Ｓ−ＰＴ８４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２８）およびラクトバシラス・ペントーサス ＪＣＭ１５５８TをＭＲＳ培地で各温度（２５℃〜４３℃）、２４時間培養した。【００３５】
培養終了後に８０００ｒｐｍ，１０分遠心することで集菌し、生理食塩液で洗浄、再遠心した。その後、生理食塩液で１回、イオン交換水で１回洗浄した後、適量のイオン交換水で再縣濁、乳酸菌浮遊液を調製し、最終菌濃度（個／ｍＬ）を測定した。その後、９５℃、１分殺菌し、凍結乾燥を行った。乾燥後、総重量を測定し、重量あたりの菌数を算出した。なおラクトバシラス・ペントーサス Ｓ−ＰＴ８４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２８）およびラクトバシラス・ペントーサス ＪＣＭ１５５８Tの推奨培養温度は３０℃である。【００３６】
ジアミノピメリン酸測定法
凍結乾燥菌体に６Ｎ ＨＣｌを添加し、１００℃、２０ｈｒ加水分解した後、遠心式濃縮機（Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社製）を用いて蒸発乾固した。１ｍｇ ｄｒｙ ｃｅｌｌｓ / ｍＬになるように０．０５Ｎ ＨＣｌを添加し、孔径０．２μｍのＨＰＬＣ前処理用ディスクフィルターで濾過後、Ｌ-８８００形日立高速アミノ酸分析計に供した。細胞壁成分の指標として、細胞壁の糖鎖を架橋しているペプチド構成アミノ酸であるジアミノピメリン酸（以下、「ＤＡＰ」という）を用いた。【００３７】
インターロイキン−１２（ＩＬ-１２）誘導作用の測定
ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週齢・雌）に４．０５％チオグリコレート２ｍＬを腹腔内投与し、４日後にＰＢＳを用いて腹腔内マクロファージを回収し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて２×１０6ｃｅｌｌｓ/ｍＬに調製した後、４８ｗｅｌｌプレートに０．５ｍＬずつ播いた。各ｗｅｌｌに各培養温度での培養で得られた菌体を７．５×１０6個/ｍＬを添加し、２４時間培養後の培養上清中のＩＬ−１２濃度を測定した。ＩＬ−１２の活性型はｐ３５とｐ４０のサブユニットが結合したｐ７０であることから、ＩＬ−１２（ｐ７０）を測定した。なおＩＬ−１２の測定にはＯｐｔＥＩＡ ｍｏｕｓｅ ＩＬ-１２測定キット（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を使用した。【００３８】
培養終了時のラクトバシラス・ペントーサス Ｓ−ＰＴ８４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２８）の菌濃度結果を図1に、ラクトバシラス・ペントーサス ＪＣＭ１５５８Tの菌濃度結果を図２に示した。Ｓ−ＰＴ８４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２８）、ＪＣＭ１５５８Tともに４２℃で、２５℃での菌濃度の３０％以上、３０℃での菌濃度の７５％以上の低下が認められた。【００３９】
細胞壁構成アミノ酸であるＤＡＰ測定結果を図３に示した。Ｓ−ＰＴ８４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２８）は２５℃培養に比較して３０℃培養でほぼ倍に増加し、若干の増減はあるものの培養温度とともに増加した。ＪＣＭ１５５８Tは３１℃以上で、２５℃培養に比較してＤＡＰ濃度が増加し、４２℃で最大となった。また、３０℃培養時のＤＡＰ濃度に比較してＳ−ＰＴ８４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２８）では３．０４倍、ＪＣＭ１５５８Tでは３．６１倍に増加した。【００４０】
免疫賦活作用の指標としてｉｎ ｖｉｔｒｏでＩＬ−１２誘導能を検討した。結果を図４、図５に示した。Ｓ−ＰＴ８４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２８）は３０℃以上でＤＡＰ量が培養温度の上昇とともに増加したが、ＤＡＰ量と相関して４１℃までＩＬ−１２誘導能も増加した。ＪＣＭ１５５８Tは３１℃以上でＤＡＰ量が培養温度の上昇とともに増加し、Ｓ−ＰＴ８４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２８）と同様に、４１℃までＩＬ−１２誘導能は増加した。いずれの菌体も４２、４３℃でも２５℃よりＩＬ−１２誘導活性は高かったが、４０℃よりも活性が低下した。活性だけならば３１−４３℃で十分高い免疫賦活作用が認められるが、菌濃度とあわせて考えると、十分な菌数が確保でき、かつ免疫賦活作用が高い菌体を調製するためには３１−４１℃が望ましいと考えられた。
【実施例２】
【００４１】
（培養温度の違いにより変化する乳酸菌濃度、インターロイキン−１２誘導作用）
乳酸菌培養・菌体調製
ラクトバシラス・プランタラムＪＣＭ１１４９Tを各温度（３０℃〜３８℃）、ラクトバシラス・カゼイＪＣＭ１１３４Tを各温度（２５℃〜４４℃）、２４時間ＭＲＳ培地で培養した。【００４２】
培養終了後に８０００ｒｐｍ，１０分遠心することで集菌し、生理食塩液で洗浄、再遠心した。その後、生理食塩液で１回、イオン交換水で１回洗浄した後、適量のイオン交換水で再縣濁、乳酸菌浮遊液を調製し、最終菌濃度（個／ｍＬ）を測定した。その後、９５℃、１分殺菌し、凍結乾燥を行った。乾燥後、総重量を測定し、重量あたりの菌数を算出した。【００４３】
なおラクトバシラス・プランタラムＪＣＭ１１４９Tの推奨培養温度は３０℃、ラクトバシラス・カゼイＪＣＭ１１３４Tの推奨培養温度は３７℃である。【００４５】
インターロイキン−１２（ＩＬ-１２）誘導作用の測定
ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週齢・雌）に４．０５％チオグリコレート２ｍＬを腹腔内投与し、４日後にＰＢＳを用いて腹腔内マクロファージを回収し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を用いて２×１０6ｃｅｌｌｓ/ｍＬに調製した後、４８ｗｅｌｌプレートに０．５ｍＬずつ播いた。各ｗｅｌｌに各培養温度での培養で得られた菌体を７．５×１０6個/ｍＬを添加し、２４時間培養後の培養上清中のＩＬ−１２濃度を測定した。ＩＬ−１２の活性型はｐ３５とｐ４０のサブユニットが結合したｐ７０であることから、ＩＬ−１２（ｐ７０）を測定した。なおＩＬ−１２の測定にはＯｐｔＥＩＡ ｍｏｕｓｅ ＩＬ-１２測定キット（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）を使用した。【００４６】
培養終了時のラクトバシラス・プランタラムＪＣＭ１１４９Tの菌濃度結果を図６に示した。３８℃で、３０℃での菌濃度の４４．３％の低下が認められた。【００４７】
免疫賦活作用の指標としてインビトロでＩＬ−１２誘導能を検討した。ラクトバシラス・プランタラムＪＣＭ１１４９Tの結果を図７に示した。３０℃に比較して３１℃〜３８℃でＩＬ−１２誘導能が高値を示し、ピークは３３℃であった。菌濃度、免疫賦活作用とあわせて考えると、十分な菌数が確保でき、かつ免疫賦活作用が高い菌体を調製するためには３１−３８℃が望ましいと考えられた。【００４８】
培養終了時のラクトバシラス・カゼイＪＣＭ１１３４Tの菌濃度結果を図８に示した。４４℃で、３７℃での菌濃度の５３．４％の低下が認められた。【００４９】
免疫賦活作用の指標としてインビトロでＩＬ−１２誘導能を検討した。ラクトバシラス・カゼイＪＣＭ１１３４Tの結果を図９に示した。３７℃に比較して３９℃〜４４℃でＩＬ−１２誘導能が高値を示し、ピークは４２℃であった。菌濃度、免疫賦活作用とあわせて考えると、十分な菌数が確保でき、かつ免疫賦活作用が高い菌体を調製するためには４１−４４℃が望ましいと考えられた。
【実施例３】
【００５０】
（培養温度の違いにより変化する細胞壁合成酵素遺伝子発現解析と細胞壁成分量）
細胞壁合成関連酵素発現解析プライマー
ゲノム情報が公開されているラクトバシラス属の遺伝子情報に基づき、phospho-N-acetylmuramoyl-pentapeptide転移酵素(ｍｒａＹ)及びpenicillin binding protein 1A (ｐｂｐ１Ａ) , penicillin binding protein 2A (ｐｂｐ２Ａ)のＱ-ＲＴ-ＰＣＲ用プライマーを作成した。プライマーはｍｒａＹ用としてｍｒａＹ１１６:aggaaggtcctaagtggca／ｍｒａＹ８９５ actcgctccaacccttcat、ｐｂｐ１Ａ用としてｐｂｐ１Ａ３０４: gccgtcgtctcaatcgaaga／ｐｂｐ１Ａ１７２４:gtaccagtcttaccagcttg、ｐｂｐ２Ａ用としてｐｂｐ２Ａ５９２:gcgatgtatttgaataacgc／ｐｂｐ２Ａ１６８８:agcatcatactggtcatttcを用いた。また、すべての発現解析は１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子発現をコントロールとし、プライマーはラクトバシラス・ペントーサス Ｓ−ＰＴ８４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２８）の１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子情報に基づいて作成した（Ｓ−ＰＴ８４−１６Ｓ−ｆ:accgacttcgggtgttacaa／Ｓ−ＰＴ８４−１６Ｓ−ｒ:cgcctacatgaagtcggaat）。【００５１】
発現誘導条件
温度の違い：乳酸菌をＭＲＳ培地で３０℃、１６ｈｒ培養した後に、２ｍＬの培養液を１００ｍＬ ＭＲＳ培地に接種し、３０℃、３７℃で４ｈｒ培養した。【００５２】
ＲＮＡ抽出とＱ−ＲＴ−ＰＣＲ条件
ＲＮＡ抽出はＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、キットのプロトコールに従った。得られたＲＮＡ抽出液へのＤＮＡ混入を防ぐために、ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｓｅｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）をＲＮＡ抽出液に添加し、常温で15分インキュベートして混入ＤＮＡを分解した。得られたＤＮａｓｅ処理ＲＮＡ溶液を鋳型とした。１６Ｓ ｒＲＮＡではＤＮａｓｅ処理ＲＮＡ溶液を１００倍希釈したものを鋳型とした。１０μＭの各プライマーを含む反応溶液１８μｌに鋳型を２μｌ加えてＱ−ＲＴ−ＰＣＲを行った。Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲはＯｎｅ Ｓｔｅｐ ＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｉｍｅ Ｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ−ＰＣＲ Ｋｉｔ II(ＴａＫａＲａ社製)を用い、キットのプロトコールに従った。また、Ｑ−ＲＴ−ＰＣＲ装置はApplied Biosystems 7300/7500 Real-Time PCR Systemを用いた。【００５３】
細胞壁成分量
温度：乳酸菌をＭＲＳ培地で３０℃、１６ｈｒ培養した後に、２ｍＬの培養液を１００ｍＬ ＭＲＳ培地に接種し、３０℃あるいは３７℃で２４ｈｒ培養した。【００５４】
浸透圧：乳酸菌をＭＲＳ培地で３０℃、１６ｈｒ培養した後に、２ｍＬの培養液を１００ｍＬの１，３，５，１０ ％ （浸透圧として４９０、６１４、７４２、１０７９ｍＯｓｍ）ソルビトール含有ＭＲＳ培地(コントロールはＭＲＳ培地)に接種し、３０℃あるいは３７℃、２４ｈｒ培養した。また、ＯＤ６６０を測定した。
洗浄および凍結乾燥：８０００ｒｐｍ、１０分遠心分離することで集菌し、生理食塩液で洗浄、再遠心した。その後、生理食塩液で1回、イオン交換水で1回洗浄した後、適量のイオン交換水で再縣濁、乳酸菌浮遊液を調製し、最終菌濃度（個／ｍＬ）を血球計算盤で測定した。その後、乳酸菌溶液を−８０℃、１６ｈｒで凍結し、３日間凍結乾燥を行った。凍結乾燥菌体は乳鉢で均一に磨り潰し、アミノ酸分析のサンプルとした。【００５５】
温度変化実験において、３０℃をコントロールとした相対定量の結果、３７℃ではｍｒａＹ:２．２８倍、ｐｂｐ１Ａ:４．０３倍、ｐｂｐ２Ａ:４．００倍の発現量の増加が見られた（図１０）。【００５６】
ここでは細胞壁成分量指標であるジアミノピメリン酸をＤＡＰと表記する。【００５７】
３０℃培養時には、コントロール(ソルビトール無添加ＭＲＳ培地、２４ｈｒ) : ０．１３８ ｎｍｏｌ ＤＡＰ／１０6ｃｅｌｌ (ＯＤ６６０ : １１．２)に対し、１０％ ソルビトール含有ＭＲＳ 培養のみで０．１７５ ｎｍｏｌ ＤＡＰ／１０6ｃｅｌｌ (ＯＤ６６０ : １１．０)を示し、１．２７倍のＤＡＰの増加を確認した。（図１１）。【００５８】
これに対して３７℃培養時は、コントロール(ソルビトール無添加ＭＲＳ培地、２４ｈｒ) : ０．１９２ ｎｍｏｌ ＤＡＰ／１０6ｃｅｌｌに対し、１％で０．２０８ ｎｍｏｌ ＤＡＰ／１０6ｃｅｌｌ、３％で０．２５２ ｎｍｏｌ ＤＡＰ／１０6ｃｅｌｌ、５％で０．２６３ ｎｍｏｌ ＤＡＰ／１０6ｃｅｌｌ、１０％で０．２３３ ｎｍｏｌ ＤＡＰ／１０6ｃｅｌｌを示し、それぞれ１．０８、１．３１、１．３７および１．２１倍のＤＡＰの増加を確認した（図１２）。
【実施例４】
【００５９】
（培養温度の違いにより変化する細胞壁厚みの測定）
乳酸菌培養・固定
Ｓ−ＰＴ８４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２８）はＭＲＳ培地で２５、３０および３７℃、２４時間培養した。ＪＣＭ１５５８TはＭＲＳ培地で２５および３７℃、２４時間培養した。培養終了後、８０００ｒｐｍ、１０分遠心分離することで集菌し、生理食塩液で洗浄、再遠心した。その後、生理食塩液で1回、イオン交換水で1回洗浄した後、ペレットに２％グルタルアルデヒド／２％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳを添加し、固定した。【００６０】
電子顕微鏡撮影
遠心によりペレットを作成し、蒸留水で洗浄した後、１％過マンガン酸カリウム水溶液で後固定を行った（４℃、１時間）。再度蒸留水で洗浄し、アセトンで脱水後、Ｑｕｅｔｏｌ ６５１（エポキシ樹脂）で熱重合を行った（６０℃、２４時間）。ウルトラミクロトームにて超薄切片を作成し、酢酸ウラニル／鉛染色液で２重染色した後、ＪＯＥＬ ＪＥＭ１２００ＥＸを用いてＴＥＭ撮影を行った。【００６１】
細胞壁厚み測定
乳酸菌の細胞壁を次のように定義した。“乳酸菌短径の最長部分を選択し、内膜外側〜細胞外可視限界を細胞壁とする”この定義にしたがって細胞壁の厚みは次式で算出した。
細胞壁厚み：（乳酸菌全長（短径）−細胞質長（内膜外側〜反対側の内膜外側））÷2
Ｓ−ＰＴ８４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２８）２５、３０、３７℃でそれぞれ６４．１、６６．４および８３．５ｎｍ、ＪＣＭ１５５８Tは２５℃、３７℃でそれぞれ４５．２および６５．４ｎｍであり、どちらも温度依存的に細胞壁厚みが増加した（図１３）。また前述の方法でＩＬ−１２誘導能を検討した結果、Ｓ−ＰＴ８４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２８）２５、３０、３７℃でそれぞれ２．３、２．８、５．２ｎｇ／ｍＬ、ＪＣＭ１５５８Tは２５℃、３７℃でそれぞれ１．５、３．７ｎｇ／ｍＬとなり、細胞壁の厚みが増加することで免疫賦活作用が増加した（図１４）。
【実施例５】
【００６２】
（実生産スケールでの検討）
実施例１ではＭＲＳ培地を用いたが、実生産スケール（１０００Ｌ培養）でも同様の現象が得られるかどうかを検討した。Ｓ−ＰＴ８４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２８）をブドウ糖、酵母エキス（アロマイルド、ＳＫ酵母エキスＨｉ−Ｋ）およびイオン交換水を混合した培地で２５℃（２４−２６℃）、３０℃（２９−３１℃）および３７℃（３６−３８℃）、２４時間（２０−２８時間）培養した。それぞれの培養温度で３ロットずつ作成し、細胞壁成分量、ＩＬ−１２誘導能を検討した。その結果、２５、３０、３７℃でそれぞれ０．０３３、０．１０６および０．１１２ｎｍｏｌ ＤＡＰ／１０6ｃｅｌｌとなり、培養温度依存的に細胞壁量が増加した。またＩＬ−１２誘導能はそれぞれ３８．４、９８．４および３５９．０ｐｇ／ｍＬであり、やはり培養温度依存的に誘導能は増強された（図１５）。したがって培地が異なっても同様の現象が起こることが示された。
【実施例６】
【００６３】
（ヒトでの免疫賦活効果）
試験方法
これまでの実施例で確認されているように、細胞壁成分量が増加し、細胞壁厚みが増す培養温度（３７℃）で生産したＳ−ＰＴ８４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２８）を用いてヒトでの免疫賦活効果を検討した。【００６４】
Ｓ−ＰＴ８４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２８）はデキストリンで１０倍希釈したものを原料とし、適宜賦形剤添加により、菌数として５、１５億個あるいは４５億個含有の錠剤を作成した。事前のスクリーニングで末梢血ＰＢＭＣのＮＫ活性が３０％未満の被験者を選抜し、平均値に差がないように群分けした。乳酸菌摂取前、摂取開始２週後、摂取開始４週後に採血を行い、末梢血ＰＢＭＣを分離し、免疫機能（ＮＫ活性、ＨＶＪ刺激２４時間後のＩＦＮ−α産生能およびＰＨＡ刺激２４時間後のＩＦＮ−γ／ＩＬ-4産生比）を評価した。【００６５】
ＮＫ活性
摂取開始２週目においては、Ｓ−ＰＴ８４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２８）を１５億個摂取することにより摂取開始前と比較して有意なＮＫ活性の増強が認められた。また摂取開始４週目においては、Ｓ−ＰＴ８４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２８）用量依存的な増加が認められ、さらに４５億個摂取することにより摂取開始前と比較して有意なＮＫ活性の増強が認められた（図１６）。【００６６】
ＩＦＮ−α産生能
プラセボ摂取群では試験開始２週あるいは４週後のＩＦＮ−α産生が低下したが、Ｓ−ＰＴ８４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２８）摂取群ではいずれの群でもＩＦＮ−α産生能が維持あるいは増強され、特に１５億個摂取群で産生増加が認められた（図１７）。【００６７】
ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４産生能
生体内に存在するヘルパーＴ細胞には、１型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１）と２型ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ２）とが存在する。このＴｈ１細胞とＴｈ２細胞からは、それぞれＩＦＮ−γ、ＩＬ−４を産生することが知られており、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−４比よりＴｈ１／Ｔｈ２細胞のバランスを算出した。２週目においてはプラセボ摂取群がＴｈ２に偏向したが、Ｓ−ＰＴ８４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２８）１５億個摂取群ではＴｈ１側にシフトし、また４週目においてはＳ−ＰＴ８４（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１００２８）用量依存的にＴｈ１偏向が認められた（図１８）。
【実施例７】
【００６８】
（他種乳酸菌の評価）
実施例１、３〜５についてはラクトバシラス・ペントーサス２株で行ったが、他の種でも同様の現象が起こるかどうかを検討した。ラクトバシラス プランタラム ＪＣＭ１１４９T、ラクトバシラス ブレビス ＪＣＭ１０５９T、ラクトバシラス ファーメンタム ＩＦＯ３６５６、ラクトバシラス カゼイ ＪＣＭ１１３４TをそれぞれＭＲＳ培地で各温度（推奨培養温度３０℃の乳酸菌は２５、３０あるいは３７℃で、推奨培養温度３７℃の乳酸菌は３０℃あるいは４２℃）、２４時間培養した。これらの菌体を前述の方法で電子顕微鏡によるＴＥＭ撮影を行い、細胞壁厚みを計測するとともに、ＩＬ−１２誘導作用を検討した。【００６９】
推奨培養温度が３０℃であるラクトバシラス プランタラム ＪＣＭ１１４９Tおよびラクトバシラス ブレビス ＪＣＭ１０５９Tは培養温度の上昇とともに細胞壁の厚みおよびＩＬ−１２誘導作用が増加し、ラクトバシラス・ペントーサス同様の現象が認められた（図１９）。驚いたことに、推奨培養温度が３７℃であるラクトバシラス ファーメンタム ＩＦＯ３６５６およびラクトバシラス カゼイ ＪＣＭ１１３４Tでも全く同様の現象が認められた（図１９）。これらの結果から、培養温度の上昇による細胞壁厚みの増加および免疫調節作用の増強は、種を超えて起こる現象であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
用いる乳酸菌の推奨培養温度よりも高温側で培養することにより細胞壁量および細胞壁厚みが増加し、この増加に相関して免疫調節作用が高まった乳酸菌が得られる。本発明の方法では、特殊な培地または特殊な工程を必要とせず、乳酸菌の免疫調節機能を高めることにより、ヒトにおいて優れた免疫調節作用を有する乳酸菌、またはそれを含む飲食品、医薬品または化粧料等を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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