(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、７８６番目のグルタミン、１７９番目のリジン及び６８５番目のバリンからなる群から選ばれる少なくとも１つに相当するアミノ酸残基が、他のアミノ酸に置換され、野生型Ｔ７様バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼと比較して、熱安定性及び／または比活性が向上していることを特徴とするＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体であって少なくとも７８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基がロイシンまたはメチオニンに置換された、前記Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項２】
配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、７８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基がロイシンまたはメチオニンに置換され、野生型Ｔ７様バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼと比較して熱安定性及び／または比活性が向上していることを特徴とするＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項３】
配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、さらに、少なくとも６８５番目のバリンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換され、野生型Ｔ７様バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼと比較して、熱安定性及び比活性が向上していることを特徴とする、請求項１に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項４】
配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、６８５番目のバリンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換され、７８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基がロイシンまたはメチオニンに置換されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体をコードする遺伝子。
【請求項６】
請求項１から４のいずれか１項に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体をコードする遺伝子を発現してＴ７ＲＮＡポリメラーゼを生産することのできる細胞。
【請求項７】
請求項１から４のいずれか1項に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体をコードする遺伝子を発現させることによるＴ７ＲＮＡポリメラーゼの生産方法。
【請求項８】
請求項１から４のいずれか１項に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体を用いてＲＮＡを製造する方法。
【請求項９】
請求項１から４のいずれか１項に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体を用いてＲＮＡを増幅する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は野生型ＲＮＡポリメラーゼのアミノ配列の一部に変異を導入することで、改善された機能を持つＲＮＡポリメラーゼ、特に熱安定性及び／または比活性が向上したＲＮＡポリメラーゼ、当該ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子、当該ＲＮＡポリメラーゼの生産方法、及び当該ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、高温条件下で野生型よりも安定性及び／または比活性が向上した、バクテリオファージから得られる変異型ＲＮＡポリメラーゼ、特にＴ７ＲＮＡポリメラーゼに関する。大腸菌に感染し得るバクテリオファージとして、Ｔ３、Ｔ７、φＩ、φＩＩ、Ｗ３１、Ｈ、Ｙ、Ａ１、ｃｒｏＣ２１、Ｃ２２、及びＣ２３があるが、そのうちＴ７ファージによってコードされるＲＮＡポリメラーゼがＴ７ＲＮＡポリメラーゼである。
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの特徴として、まず、プロモーター配列に対する高い選択性がある。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、自身の特異なプロモーター配列には結合するが、それ以外のプロモーター配列とは他のバクテリオファージのプロモーター配列であっても結合しない。この高い選択性により、ＲＮＡポリメラーゼの転写反応が、宿主のゲノムに対してではなく、自身のゲノムに対して確実に向けられる。
次に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは他のポリメラーゼと違い、補助因子を必要とせずに、プロモーターを認識し、転写を開始、ＲＮＡ転写物を伸長させ、転写を終結させるといった一連の性能を有しており、転写速度も大腸菌のＲＮＡポリメラーゼと比較して５倍速くＲＮＡを伸長させることができる。
さらに、分子量が９８．６ｋＤａ、８８３アミノ酸の単鎖タンパク質であることから、酵素の安易な大量製造が可能である。
以上に述べた有利な点を持つＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、各種分野で積極的に用いられており、例えば、インヴィトロ転写や大腸菌における高発現系（米国特許第４９５２４９６号公報：特許文献１）、無細胞タンパク合成系、塩基配列決定法（特開平１１−１８７９９号公報：特許文献２）、等温核酸増幅法の中で利用されている。等温核酸増幅法の１つであるＴＲＣ法（特開２０００−１４４００号公報：特許文献３及びＩｓｈｉｇｕｒｏ  Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１４，７７−８６（２００３）：非特許文献１）について詳細に説明する。
ＴＲＣ法はＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼと逆転写酵素との協奏的作用によって特定のＲＮＡ配列を含む標的ＲＮＡを増幅する方法である。即ち、標的となるＲＮＡに対しＴ７プロモーター配列を含むプライマーと逆転写酵素及びリボヌクレアーゼＨによりプロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡを合成し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼにより特定ＲＮＡ配列から成るＲＮＡを合成する。以降生成したＲＮＡを前記プロモーター配列を含む２本鎖ＤＮＡ合成の鋳型とし、上記の反応を連鎖的に行なうものである。ＴＲＣ法による核酸増幅法はＰＣＲ法で増幅する場合と異なり、一定の温度で反応することが可能であるため、複雑な温度コントロールを必要としない長所がある。しかしながら、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを使用してＴＲＣ法を用いた核酸増幅を行なうと、４６℃以上の条件ではＴ７ＲＮＡポリメラーゼの活性低下により核酸増幅効率の低下が見られた。そのため、現状ＴＲＣ法での核酸増幅は一般に４０℃から４５℃といった比較的低温条件下で行なわれている。低温条件下ではＲＮＡが複雑な高次構造をとりやすく、そのことがＴＲＣ法における高感度に検出するプライマーの設計を困難にしてきた。そのため、４６℃以上の条件においても、熱安定性及び／または比活性の高いＴ７ＲＮＡポリメラーゼが求められてきた。
変異により各種の改善された機能を持つＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの活性を測定する系が確立されている（Ｉｋｅｄａ  Ｒ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１，９０７３−９０８０（１９９２）：非特許文献２及びＩｋｅｄａ  Ｒ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，２０，２５１７−２５２４（１９９２）：非特許文献３）ことから、これまでいくつか作製されている。例えばアミノ酸置換により認識するプロモーター配列を改変した酵素（米国特許第５３８５８３４号公報：特許文献４）、高温での比活性及び熱安定性を高めた酵素（特表２００３−５２５６２７号公報：特許文献５）、アミノ酸の欠失と置換により３’−デオキシリボヌクレオチドの取り込み能を増強した酵素などである（特開２００３−６１６８３号公報：特許文献６）。
【発明の概要】
【０００３】
本発明が解決する課題は、野生型と比較して熱安定性及び／または比活性が向上したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体とその製造方法を提供するものである。
上記課題を解決するために検討した結果、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのアミノ酸を遺伝子工学的手法によって置換することで、熱安定性または比活性が向上するアミノ酸部位を見出し、野生株と比較して熱安定性または比活性が向上した変異体の作成に成功した。さらに、熱安定性が向上したアミノ酸部位の変異と、比活性が向上したアミノ酸部位の変異を組み合わせることで、熱安定性及び比活性が向上した変異体の作成に成功した。
詳しくは、配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち少なくとも、７８６番目のグルタミン及び／または１７９番目のリジンに相当するアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体が、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと比較し熱安定性及び／または熱安定性が向上していることを見出した。
さらに、上記部位とは異なる部位のアミノ酸残基、すなわち、６８５番目のバリンに相当するアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換することで、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと比較し熱安定性及び／または熱安定性が向上していることを見出した。
また、上記各アミノ酸残基をそれぞれ組み合わせることで、さらに熱安定性及び／または熱安定性が向上したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体を得ることができた。
即ち本発明は、以下の発明を包含する：
（１）配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち少なくとも、７８６番目のグルタミン、１７９番目のリジン及び６８５番目のバリンからなる群から選ばれる少なくとも１つに相当するアミノ酸残基が、他のアミノ酸に置換され、野生型Ｔ７様バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼと比較して、熱安定性及び／または比活性が向上していることを特徴とするＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
（２）配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、少なくとも７８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基が疎水性アミノ酸に置換され、野生型Ｔ７様バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼと比較して熱安定性及び／または比活性が向上していることを特徴とするＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
（３）配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、少なくとも７８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基がロイシンまたはメチオニンに置換され、野生型Ｔ７様バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼと比較して熱安定性及び／または比活性が向上していることを特徴とするＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
（４）配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、さらに、少なくとも１７９番目のリジンに相当するアミノ酸残基がグルタミン酸、アスパラギン、システインのいずれかに置換され、野生型Ｔ７様バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼと比較して、熱安定性及び比活性が向上していることを特徴とする、（２）又は（３）に記載のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
（５）配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、少なくとも１７９番目のリジンに相当するアミノ酸残基がグルタミン酸、アスパラギン、システインのいずれかに置換され、野生型Ｔ７様バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼと比較して熱安定性及び／または比活性が向上していることを特徴とするＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
（６）配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、さらに、少なくとも６８５番目のバリンに相当するアミノ酸残基が中性または弱疎水性アミノ酸に置換され、野生型Ｔ７様バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼと比較して、熱安定性及び比活性が向上していることを特徴とする、（２）から（５）のいずれかのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
（７）配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、さらに、少なくとも６８５番目のバリンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換され、野生型Ｔ７様バクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼと比較して、熱安定性及び比活性が向上していることを特徴とする、（６）のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
（８）配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、少なくとも６８５番目のバリンに相当するアミノ酸残基が中性または弱疎水性アミノ酸に置換され、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと比較して熱安定性及び／または比活性が向上していることを特徴とする、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
（９）配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、少なくとも６８５番目のバリンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換され、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと比較して熱安定性及び／または比活性が向上していることを特徴とする、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
（１０）配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、６８５番目のバリンに相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換され、さらに、１７９番目のリジン及び／または７８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
（１１）配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、６８５番目のバリンに相当するアミノ酸残基がアラニンに置換され、さらに、１７９番目のリジンに相当するアミノ酸残基がグルタミン酸に置換、及び／または７８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基がロイシンまたはメチオニンに置換されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体。
（１２）（１）から（１１）のいずれかのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体をコードする遺伝子。
（１３）（１）から（１１）のいずれかのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体をコードする遺伝子を発現してＴ７ＲＮＡポリメラーゼを生産することのできる細胞。
（１４）（１）から（１１）のいずれかのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体をコードする遺伝子を発現させることによるＴ７ＲＮＡポリメラーゼの生産方法。
（１５）（１）から（１１）のいずれかのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体を用いてＲＮＡを製造する方法。
（１６）（１）から（１１）のいずれかのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体を用いてＲＮＡを増幅する方法。
本発明の変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと比べて熱安定性及び／または比活性が向上しているため、野生株と比較し、より広い温度範囲での転写反応及び／または転写反応時間の短縮が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
図１は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをクローニングしたプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌの制限酵素地図を示す。
図２は、ｐＣＤＦ２プラスミドの制限酵素地図を示す。
図３は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを生産するプラスミドｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰの制限酵素地図を示す。
図４は、Ｎ末端にヒスチジンヘキサマーを融合したＴ７ＲＮＡポリメラーゼを生産するプラスミドｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓの制限酵素地図を示す。
図５は、Ｔ７プロモーターによって発現が誘導されるＧＦＰ遺伝子を持つｐＳＴＶＧＦＰの制限酵素地図を示す。
図６は、作製したＴ７ＲＮＡポリメラーゼの野生型とその変異体Ｋ１７９Ｅ、Ｑ７８６Ｌ及び二重変異体（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）それぞれの４７℃での加熱に対する熱安定性を比較した結果（電気泳動写真）を示す。なお、図中のレーン１は野生型の、レーン２はＫ１７９Ｅ変異体の、レーン３はＱ７８６Ｌ変異体の、レーン４は（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）変異体のＴ７ＲＮＡポリメラーゼをそれぞれ用いたときの結果である。
図７は、作製したＴ７ＲＮＡポリメラーゼの野生型とその変異体Ｋ１７９Ｅ、Ｑ７８６Ｌ及び二重変異体（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）それぞれの４３から５０℃でのＲＮＡ生産量を比較した結果を示す。
図８は、作製したＴ７ＲＮＡポリメラーゼの野生型とその変異体Ｋ１７９Ｅ、Ｋ１７９Ｃ及びＫ１７９Ｎそれぞれの４３から５０℃でのＲＮＡ生産量を比較した結果を示す。
図９は、作製したＴ７ＲＮＡポリメラーゼの野生型とその変異体Ｑ７８６Ｌ、Ｑ７８６Ｍ、Ｑ７８６Ｆ及びＱ７８６Ｙそれぞれの４３から５０℃でのＲＮＡ生産量を比較した結果を示す。
図１０は、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、変異体Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼＱ７８６Ｌ、Ｑ７８６Ｍ、Ｑ７８６Ｆ、Ｑ７８６Ｙ、Ｋ１７９Ｅ、Ｋ１７９Ｃ及びＫ１７９Ｎそれぞれの４７℃での加熱に対する熱安定性を比較した結果を示す。
図１１は、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）二重変異体、及び（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）三重変異体、それぞれの４３から５０℃でのＲＮＡ生産量を比較した結果を示す。
図１２は、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）二重変異体、及び（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）三重変異体、それぞれの４８℃での加熱に対する熱安定性を比較した結果を示す。
図１３は、サルモネラｓｔｎ  ＲＮＡを標的に、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ及び（Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）二重変異体を用いて、ＴＲＣ法による等温核酸増幅反応を行なった結果を示す。
図１４は、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、及びＶ６８５Ａ変異体、それぞれの４３から４９℃でのＲＮＡ生産量を比較した結果を示す。
図１５は、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、及びＶ６８５Ａ変異体、それぞれの４６℃での加熱に対する熱安定性を比較した結果を示す。
図１６は、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｖ６８５Ａ変異体、及び（Ｖ６８５Ａ＋Ｑ７８６Ｍ）二重変異体、それぞれの４３℃から５０℃でのＲＮＡ生産量を比較した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
以下、本発明を詳細に説明する。
第一の観点において、本発明で開示する、熱安定性及び／または比活性が向上したＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号６に示す野生型のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、少なくとも７８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換したものであり、好ましくは置換したアミノ酸が疎水性アミノ酸（ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン）のいずれかであり、さらに好ましくは置換したアミノ酸がロイシンまたはメチオニンである。なお、本明細書において「７８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基」とは、配列番号６に示すアミノ酸配列を基準としたとき、７８６番目にあるグルタミン残基のことをいい、配列番号６に示す配列からなるＴ７ＲＮＡポリメラーゼの５’末端側にポリペプチドが付加または削除された場合は、前記付加または削除されたポリペプチドの長さの分だけ位置がずれる（例えば、配列番号６に示す配列からなるＴ７ＲＮＡポリメラーゼの５’末端側にアミノ酸１０残基からなるポリペプチドが付加されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼの場合、「７８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基」は７９６番目にあるグルタミンとなる）。
第二の観点において、本発明で開示する、熱安定性及び／または比活性が向上したＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号６に示す野生型のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、少なくとも１７９番目のリジンに相当するアミノ酸残基を他のアミノ酸に置換したものであり、好ましくは置換したアミノ酸がグルタミン酸、アスパラギン、システインのいずれかであり、さらに好ましくは置換したアミノ酸がグルタミン酸である。なお、本明細書において「１７９番目のリジンに相当するアミノ酸残基」とは、配列番号６に示すアミノ酸配列を基準としたとき、１７９番目にあるリジン残基のことをいい、配列番号６に示す配列からなるＴ７ＲＮＡポリメラーゼの５’末端側にポリペプチドが付加または削除された場合は、前記付加または削除されたポリペプチドの長さの分だけ位置がずれる。
第三の観点において、本発明で開示する、熱安定性及び比活性が向上したＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号６に示す野生型のＴ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、少なくとも７８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基及び１７９番目のリジンに相当するアミノ酸残基をそれぞれ他のアミノ酸に置換したものであり、好ましくは７８６番目のアミノ酸残基を疎水性アミノ酸（ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン）のいずれかに、１７９番目のアミノ酸残基をグルタミン酸、アスパラギン、システインのいずれかにそれぞれ置換したものであり、さらに好ましくは７８６番目のアミノ酸残基をロイシンまたはメチオニンに１７９番目のアミノ酸残基をグルタミン酸、アスパラギン、システインのいずれかにそれぞれ置換したものである。
第四の観点において、本発明で開示する、熱安定性及び／または比活性が向上したＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、少なくとも６８５番目のバリンに相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されたものであり、好ましくは当該アミノ酸が中性または弱疎水性アミノ酸（アラニン、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミン）のいずれかに置換され、さらに好ましくは置換したアミノ酸がアラニンである。なお、本明細書において「６８５番目のバリンに相当するアミノ酸残基」とは、配列番号６に示すアミノ酸配列を基準としたとき、６８５番目にあるバリン残基のことをいい、配列番号６に示す配列からなるＴ７ＲＮＡポリメラーゼの５’末端側にポリペプチドが付加または削除された場合は、前記付加または削除されたポリペプチドの長さの分だけ位置がずれる（例えば、配列番号６に示す配列からなるＴ７ＲＮＡポリメラーゼの５’末端側にアミノ酸１０残基からなるポリペプチドが付加されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼの場合、「６８５番目のバリンに相当するアミノ酸残基」は６９５番目にあるリジンとなる）。
第五の観点において、本発明で開示する、熱安定性及び／または比活性が向上したＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、配列番号６に示す野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを構成するアミノ酸配列のうち、前述の６８５番目のバリンに相当するアミノ酸残基の置換に加え、さらに、１７９番目のリジン及び／または７８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたものであり、好ましくは１７９番目のリジンに相当するアミノ酸残基がグルタミン酸に、及び／または７８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基がロイシンまたはメチオニンにそれぞれ置換されたものである。なお、本明細書において「１７９番目のリジン及び／または７８６番目のグルタミンに相当するアミノ酸残基」とは、配列番号６に示すアミノ酸配列を基準としたとき、１７９番目にあるリジン及び／または７８６番目にあるグルタミン残基のことをいい、配列番号６に示す配列からなるＴ７ＲＮＡポリメラーゼの５’末端側にポリペプチドが付加または削除された場合は、前記付加または削除されたポリペプチドの長さの分だけ位置がずれる。
本発明の変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子へ変異を導入することで作製することができる。所定の核酸配列に所望の変異を導入する方法は当業者に公知である。例えば、部位特異的変異誘発法、縮重オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ、核酸を含む細胞の変異誘発剤または放射線への露出といった公知の技術を適宜使用することによって、変異を有するＤＮＡを構築することができる。
野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の入手は、当業者のなし得る方法であればいかなる方法でもよいが、例えばＴ７ファージ（ＤＳＭ  Ｎｏ．４６２３，ＡＴＣＣ  １１３０３−Ｂ７，ＮＣＩＭＢ１０３８０など）から、そのゲノム情報から作製した適当なプライマーを用いてＰＣＲによって取得することができる。
本発明の酵素の取得方法については特に制限はなく、化学合成により合成した蛋白質でもよいし、遺伝子組み換え技術により作製した組み換え蛋白質でもよい。遺伝子組み換え技術を利用して取得する場合、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を適当な方法で宿主に組み込むことで目的の酵素を得ることができる。
使用される宿主には酵母、動物細胞株、植物細胞、昆虫細胞など各種培養細胞が使用できるが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の場合、もともとのバクテリオファージの感染先であり、かつ取り扱いの簡便な大腸菌を宿主として用いることが望ましい。形質転換に用いる大腸菌はＪＭ１０９株、ＨＢ１０１株が例示できるがそれらに限定されない。
本発明の遺伝子は適当なベクター中に挿入して使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立複製型ベクターでもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれるものであってもよい。好ましくは、本発明で用いるベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて本発明の遺伝子は、転写に必要な要素（例えば、プロモーター等）が機能的に連結される。プロモーターは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。大腸菌で使用できるプロモーターには  ｌａｃ、ｔｒｐもしくはｔａｃプロモーターなどが挙げられ、宿主に大腸菌を利用する場合には適当なプラスミドに目的の遺伝子を組み込み、形質転換する方法が簡便である。使用するプラスミドはｐＴｒｃ９９Ａ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）、ｐＣＤＦ−１ｂ（タカラバイオ製）といった発現用プラスミドが例示できるがそれらに限定されず、一般的な大腸菌用ベクターであれば当業者が入手し得るベクターを使用すればよい。また、作製するＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子は酵素の精製のために有用な配列を付加してもよい。例えばシグナルペプチドを利用し細胞外分泌型酵素としたり、シグナルペプチドとして末端にヒスチジンヘキサマーを含んだタグ配列が付加されるように遺伝子を作製することができる。もっとも、シグナルペプチドの種類やシグナルペプチドと本酵素の結合方法は上記方法に限定されることはなく、当業者が利用可能な任意のシグナルペプチドを利用することが出来る。
作製した形質転換体は、導入されたＤＮＡ構築物の発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養することで、本発明の酵素を取得することができる。形質転換体の培養物からの単離精製には、通常のタンパク質で用いられる単離、精製法を用いればよい。例えば、本発明の酵素が細胞内に発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し適当な水系緩衝液に懸濁後、リゾチーム処理や超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。さらに無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清を通常のタンパク質の単離精製法で精製する。即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）トヨパール（商品名）（東ソー製）といったレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルトヨパール及びフェニルトヨパール（商品名）（東ソー製）といったレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動といった電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、精製標品を得ることができる。また、シグナルペプチドを利用し対応する方法で精製する方法も簡便であり、例えばヒスチジンヘキサマー配列とニッケルカラムを用いることで容易に精製することができる。
本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体は上記方法のほかにも、例えば化学的に合成して得ることもできる。
上記で説明した本発明の酵素は、従来知られているＴ７ＲＮＡポリメラーゼとして、各用途で使用することができる。即ち、本発明の酵素は、ＲＮＡポリメラーゼとして、ＲＮＡを合成するために使用することができる。具体的には、基質としてリボヌクレオチド（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ）を使用し、特定の配列を有する二本鎖ＤＮＡを鋳型に、一本鎖ＲＮＡ合成を行なうことができる。
さらに本発明のＲＮＡポリメラーゼは、逆転写酵素との協奏的作用によって特定のＲＮＡ配列を含む標的ＲＮＡを増幅する等温核酸増幅反応にも使用することができる。等温核酸増幅反応としてはＴＲＣ法（特許文献３及び非特許文献１）、ＮＡＳＢＡ法、ＴＭＡ法などが挙げられる。
本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと比べて熱安定性及び／または比活性が向上している。そのため、野生型と比較して保存が容易であり、また長期間の保存も可能である。よって、使い勝手がよく、長期に渡って使用可能な試薬を提供することができる。
また、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体は、野生型よりも高温条件下で使用可能であることから、転写反応や等温核酸増幅反応における実験条件を改善することが可能で、インヴィトロ、インヴィヴォを問わず、野生型よりも広い温度範囲で使用可能である。
特にＴＲＣ法を用いた等温核酸増幅反応において、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを使用した場合は前記酵素が４６℃以上で活性低下を生じるため、４０℃から４５℃といった比較的低温条件下で核酸増幅反応を行なう必要があった。また、前記温度条件下では、ＲＮＡが複雑な高次構造をとりやすく、そのことが高感度に検出するプライマーの設計を困難にしてきた。一方、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体は４６℃以上の温度条件下において、野生型より安定性及び／または比活性が向上している。そのため、ＴＲＣ法による核酸増幅反応を４６℃以上の温度条件下で実施することが可能となり、従来より検出時間が短縮した核酸増幅試薬を提供することができる。また高温条件下では、ＲＮＡが複雑な高次構造をとりにくくなるため、より高感度に検出するプライマーの設計も容易になる。そのため、本発明のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体を用いて、ＴＲＣ法による核酸増幅反応を４６℃以上の温度条件下で行なうことで、従来より高感度に検出する核酸増幅試薬も提供することができる。
【実施例】
【０００６】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
実施例１  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニング
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニングは以下の方法に従い実施した。
（１）Ｔ７ファージゲノミックＤＮＡゲノミックライブラリー（シグマ製）を鋳型プラスミドとして、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を、以下の試薬組成及び反応条件にて、前半部分と後半部分に分けてＰＣＲ法を用い増幅した。なお、試薬組成のうち合成ＤＮＡプライマーは、前半部分の増幅にはプライマーＦＦ（配列番号１）及びプライマーＦＲ（配列番号２）を、後半部分の増幅にはプライマーＲＦ（配列番号３）及びプライマーＲＲ（配列番号４）を、それぞれ用いた。
（試薬組成）（総反応液量：１００μＬ）
各２００ｐＭ  合成ＤＮＡプライマー
１００ｎｇ  鋳型プラスミド
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ
０．０２５ｕｎｉｔ／μＬ  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（商品名）、
タカラバイオ製）
酵素に付属するバッファー
（反応条件）
サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用い、９４℃で２分加熱後、９４℃・１分、５８℃・３０秒、７２℃・１分の温度サイクルを２５回繰り返した。
（２）ＰＣＲ反応後の液を１％アガロース電気泳動で泳動後、エチジウムブロマイド染色を行ない、染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出すことで、ＰＣＲ産物を精製した。
（３）精製したＰＣＲ産物のうち、前半部分のＰＣＲ産物を制限酵素ＢｓｐＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ製）で消化し、制限酵素ＮｃｏＩ（タカラバイオ製）及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＴｒｃ９９Ａベクター（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）にＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させた。
（４）（３）の反応液を大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換させ、ＬＢＧ／Ｃｒｂ寒天培地（１％  ポリペプトン、０．５％  酵母エキス、１％  ＮａＣｌ、０．５％  グルコース、１％  寒天、５０μｇ／ｍＬ  カルベニシリン（ｐＨ７．４））上で選択を行ない、３７℃で一晩培養後に生育してきたコロニーの保持するプラスミドをｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７Ｆとした。
（５）常法に従いｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７Ｆを調製後、後半部分のＰＣＲ産物を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７ＦにＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させた。
（６）（５）の反応液を大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換させ、ＬＢＧ／Ｃｒｂ寒天培地（１％  ポリペプトン、０．５％  酵母エキス、１％  ＮａＣｌ、０．５％  グルコース、１％  寒天、５０μｇ／ｍＬ  カルベニシリン（ｐＨ７．４））上で選択を行ない、３７℃で一晩培養後に生育してきたコロニーの保持するプラスミドをｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌとした。図１にｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌの制限酵素地図を示す。なお、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子については実施例６に示す方法を用いて塩基配列を決定することにより、意図しない変異が導入されていないことを確認した。得られたＴ７ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子配列を配列番号５に、アミノ酸配列を配列番号６に示す。
実施例２  発現ベクターの作製
実施例１で作製したｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌ（図１）を鋳型にＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を含んだＤＮＡ断片をＰＣＲ法にて増幅し、ｐＣＤＦ２プラスミド（図２）と連結した。
（１）ｐＴｒｃ９９Ａ−Ｔ７ＲＮＡｐｏｌ（図１）を鋳型プラスミドとして、以下の試薬組成及び反応条件にて、ＰＣＲ反応を行なった。
（試薬組成）（総反応液量：１００μＬ）
２００ｐＭ  プライマーｐＴｒｃＦ（配列番号７）
２００ｐＭ  プライマーｐＴｒｃＲ（配列番号８）
１００ｎｇ  鋳型プラスミド
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ
０．０２５ｕｎｉｔ／μＬ  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（商品名）、
タカラバイオ製）
酵素に付属するバッファー
（反応条件）
サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用い、９４℃で２分加熱後、９４℃・１分、５８℃・３０秒、７２℃・２分４０秒の温度サイクルを２５回繰り返した。
（２）１％アガロース電気泳動で泳動後、エチジウムブロマイド染色を行ない、染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出すことで、ＰＣＲ産物を精製した。
（３）精製したＰＣＲ産物を制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉ（タカラバイオ製）及びＢｌｎＩ（タカラバイオ製）で消化し、制限酵素ＰｓｔＩ（タカラバイオ製）及びＢｌｎＩで消化したｐＣＤＦ２プラスミド（図２）にＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させた。
（４）（３）の反応液を大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換させ、ＬＢＧ／Ｃｒｂ寒天培地（１％  ポリペプトン、０．５％  酵母エキス、１％  ＮａＣｌ、０．５％  グルコース、１％  寒天、５０μｇ／ｍＬ  カルベニシリン（ｐＨ７．４））上で選択を行ない、３７℃で一晩培養後に生育してきたコロニーの保持するプラスミドをｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰとした。図３にｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰの制限酵素地図を示す。なお、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子については実施例６に示す方法を用いて塩基配列を決定することにより、意図しない変異が導入されていないことを確認した。
（５）ｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰ（図３）を基に以下に示す方法でヒスチジンヘキサマーの導入を行なった。
（５−１）ｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰ（図３）を鋳型プラスミドとして、以下の試薬組成及び反応条件にて、１回目のＰＣＲ反応を行なった。なお、合成プライマーはプライマーＨｉｓＦ（配列番号９）とプライマーｐＣＤＦＲ（配列番号１０）の組み合わせ、またはプライマーＨｉｓＲ（配列番号１１）とプライマーｐＣＤＦＦ（配列番号１２）の組み合わせを用いた。
（試薬組成）（総反応液量：１００μＬ）
各２００ｐＭ  合成ＤＮＡプライマー
１００ｎｇ  鋳型プラスミド
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ
０．０２５ｕｎｉｔ／μＬ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名）、タカラバイオ製）
酵素に付属するバッファー
（反応条件）
サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用い、９８℃で３０秒加熱後、９８℃・３０秒、５５℃・３０秒、７２℃・３分の温度サイクルを３０回繰り返した後、７２℃で７分間反応した。
（５−２）反応液を１％アガロース電気泳動で泳動後、エチジウムブロマイド染色を行ない、染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出すことで、ＰＣＲ産物を精製した。
（５−３）得られた２種類のＰＣＲ産物を鋳型に、合成ＤＮＡプライマーとしてプライマーｐＣＤＦＲ（配列番号１０）とプライマーｐＣＤＦＦ（配列番号１２）の組み合わせを用いて２回目のＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ反応における試薬組成、及び反応条件は合成ＤＮＡプライマーと鋳型以外は（５−１）と同じ条件で行ない、増幅した産物を（５−２）と同様にアガロースゲルにて電気泳動後、抽出、精製した。
（５−４）ｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰプラスミド（図３）と、（５−３）で精製した２回目のＰＣＲ産物に０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ、０．０２５ｕｎｉｔ／μＬ  ＤＮＡポリメラーゼ及び酵素に付属するバッファーを加え、総反応液量を１００μＬとした。この反応液をサーマルサイクラーを用いて９５℃で３０秒加熱後、９５℃・３０秒、５５℃・１分、６８℃・８分の温度サイクルを１８回繰り返した後、６８℃で７分間反応させることで、ＰＣＲ反応を行なった。
（５−５）ＰＣＲ反応終了後、制限酵素ＤｐｎＩを１０ｕｎｉｔｓ加え、３７℃で１時間消化し、常法に従い大腸菌ＪＭ１０９に形質転換した。
（５−６）形質転換した溶液はＬＢＧ／Ｃｒｂ寒天培地（１％  ポリペプトン、０．５％  酵母エキス、１％  ＮａＣｌ、０．５％  グルコース、１％  寒天、５０μｇ／ｍＬ  カルベニシリン（ｐＨ７．４））に塗布し、３７℃で一晩保温した。生成したコロニーから常法によりプラスミドを抽出し、ｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓプラスミドとした。図４にｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓの制限酵素地図を示す。さらに実施例６に示す方法を用いて塩基配列を決定することにより、意図しない変異が導入されていないこと、及びヒスチジンヘキサマーが導入されていることを確認した。また培養した菌体から酵素を抽出し、ニッケルキレート樹脂によるアフィニティ精製が可能であることを確認した。得られたヒスチジンヘキサマーを融合したＴ７ＲＮＡポリメラーゼの遺伝子配列を配列番号１３にアミノ酸配列を配列番号１４に示す。
実施例３  変異ライブラリーの作製（その１）
実施例２で作製したｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓプラスミド（図４）のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子に以下の手順で変異を導入した。
（１）ｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓ（図４）を鋳型プラスミドとして、以下の試薬組成及び反応条件にて、エラープローンＰＣＲ反応を行なった。
（試薬組成）（総反応液量：１００μＬ）
０．１から０．３ｍＭ（必要に応じて）  ＭｎＣｌ２
２００ｐＭ  プライマーｐＴｒｃＦｓ（配列番号１５）
２００ｐＭ  プライマーｐＴｒｃＲｓ（配列番号１６）
１００ｎｇ  鋳型プラスミド
０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ
０．２ｍＭ  ｄＧＴＰ
１ｍＭ  ｄＣＴＰ
１ｍＭ  ｄＴＴＰ
２ｍＭ  ＭｇＣｌ２
０．０１ｕｎｉｔ／μＬ  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＧｏＴａｑ（商品名）、Ｐｒｏｍｅｇａ製）
酵素に付属するＭｇフリーのバッファー
（反応条件）
サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用い、９４℃で２分加熱後、９４℃・３０秒、５５℃・１分、７２℃・８分の温度サイクルを２５回繰り返した。
（２）ＰＣＲ産物を、１％アガロース電気泳動で泳動後、エチジウムブロマイド染色を行ない、染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出すことで精製した。
（３）精製されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を制限酵素ＮｃｏＩ及びＰｓｔＩで消化後、同酵素で消化したｐＣＤＦ２プラスミド（図２）にＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させ、反応後のＤＮＡ溶液をＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子変異体ライブラリーとした。
（４）作製したライブラリーの一部を定法に従い大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換しプラスミドを精製し、実施例６に示す方法で塩基配列を決定することでエラープローンＰＣＲの効果を確かめた。
実施例４  スクリーニングベクターの作製
実施例３で作製した変異ライブラリーの活性を評価するためにＧＦＰを用いた活性確認用ベクターの作製を行なった。
（１）ＧＦＰ遺伝子は塩基配列情報（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＡＦ１８３３９５）に基づき、ｄｓＤＮＡを合成した。合成したＧＦＰ遺伝子には、Ｔ７プロモーターとクローニング用の制限酵素ＳｐｈＩ（タカラバイオ製）の塩基配列を持つように設計した。
（２）合成したＧＦＰ遺伝子は制限酵素ＳｐｈＩで３７℃で３時間消化し、１．０％アガロース電気泳動で泳動後、エチジウムブロマイド染色を行ない、染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出すことで精製した。これを同様に消化、精製したｐＳＴＶ２８ベクター（タカラバイオ製）とＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させた。
（３）（２）の反応液を大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換させ、ＬＢＧ／Ｃｍ寒天培地（１％  ポリペプトン、０．５％  酵母エキス、１％  ＮａＣｌ、０．５％  グルコース、１％  寒天、３０μｇ／ｍＬ  クロラムフェニコール）上で選択を行ない、３７℃で一晩培養後に生育してきたコロニーを取得した。
（４）取得したコロニーは、ＬＢＧ／Ｃｍ液体培地（１％  ポリペプトン、０．５％  酵母エキス、１％  ＮａＣｌ、０．５％  グルコース、３０μｇ／ｍＬ  クロラムフェニコール）を用いて、３７℃で一晩培養後、プラスミドを回収し、このプラスミドをＴ７プロモーターによって発現が誘導されるＧＦＰ遺伝子を持つｐＳＴＶＧＦＰとした。図５にｐＳＴＶＧＦＰの制限酵素地図を示す。
（５）取得したｐＳＴＶＧＦＰ（図５）を、実施例３で作製したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子変異体ライブラリーと共に大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換を行なった。この菌液を３７℃のＳＯＣ培地で１．５時間培養後、ＦＡＣＡｒｉａセルソーター（日本ＢＤ製）で蛍光が観察される株を１クローンずつ分取し３７℃の２×ＹＴＧ／Ｃｒｂ培地（１．６％  バクトトリプトン、１％  バクト酵母エキス、０．５％  ＮａＣｌ、０．５％  グルコース、５０μｇ／ｍＬ  カルベニシリン（ｐＨ７．４））で増殖してきた株を、それぞれ変異体候補株とした。
実施例５  高温型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのスクリーニング
変異株のスクリーニングは効率的に変異体が評価できるよう９６ウェルタイタープレートを用いて行なった。
（１）１ｍＬ容量の９６ウェルディープウェルプレートに２００μＬのＬＢＧ／Ｃｒｂ培地（１％  ポリペプトン、０．５％  酵母エキス、１％  ＮａＣｌ、０．５％  グルコース、５０μｇ／ｍＬ  カルベニシリン（ｐＨ７．４））を加え、実施例４で得たＧＦＰ陽性のコロニーを植菌し、３７℃にて一晩６００回転／分で培養した。
（２）２ｍＬ容量の９６ディープウェルプレートに１．０ｍＬの２×ＹＴＧ／Ｃｒｂ培地（１．６％  バクトトリプトン、１％  バクト酵母エキス、０．５％  ＮａＣｌ、０．５％  グルコース、５０μｇ／ｍＬ  カルベニシリン（ｐＨ７．４））を加え、（１）での一晩培養液を１０μＬ植菌し、３７℃にて７５０回転／分で培養を開始した。
（３）（２）での培養約４時間後、５０ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）溶液１０μＬを添加し、温度を３０℃に下げて更に３時間振とう培養した。培養終了後、４℃にて３０００回転／分で１５分間遠心分離して菌体を回収し、得られた菌体は−３０℃にて一晩凍結保存した。
（４）凍結させた菌体に溶菌液１００μＬ（組成：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．０２％  デオキシコール酸ナトリウム、０．０３％  リゾチーム（太陽化学製）、０．２５ｕｎｉｔのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（ノバジェン製））を加え、３０℃にて５００回転／分で１時間振とうし、４℃にて３０００回転／分で３０分間遠心分離し、上清を回収した。
（５）（４）で得られた上清の全量をニッケルキレート樹脂（ヒスバインド（商品名）、ノバジェン製）を充填した９６ウェルフィルタープレートにアプライし、緩衝液Ａ（２０ｍＭのイミダゾール及び５００ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））２００μＬで４回洗浄後、５０μＬの緩衝液Ｂ（１５０ｍＭのイミダゾール及び５００ｍＭの塩化ナトリウムを含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０））で溶出させた。
（６）溶出画分は実施例７の手順と同様にタンパク質濃度及び転写活性を測定し、タンパク量あたりの転写産物量である比活性を求めた。転写活性の測定条件は反応温度４６℃、反応時間６０分、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ量０．５μＬに設定し、ＲＮＡの定量はＱｕａｎｔ−ＩＴ  ＲＮＡアッセイキット（商品名）（インビトロジェン製）を用いた。約４０００の変異株から野生型の比活性よりも約２倍高い菌株６０種類をスクリーニングした。
実施例６  シークエンス方法
実施例５で選択した変異体候補株は、３７℃のＬＢＧ／Ｃｒｂ液体培地（１％ポリペプトン、０．５％  酵母エキス、１％  ＮａＣｌ、０．５％  グルコース、５０μｇ／ｍＬ  カルベニシリン（ｐＨ７．４））で一晩培養後、定法によりプラスミドを抽出した。抽出したプラスミドに含まれるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の塩基配列決定は以下の方法で行なった。
（１）Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（商品名）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）を用いて、添付のバッファー２．０μＬ、プレミックス４．０μＬ、合成ＤＮＡプライマー３．２ｐｍｏｌ、鋳型プラスミド５００ｎｇを滅菌水にて２０μＬに調製し、サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用い、９６℃で１分加熱後、９６℃・１０秒、５０℃・５秒、６０℃・４分の温度サイクルを２５回繰り返した。
（２）（１）で調製した塩基配列決定用サンプルをＣｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐスピンカラム（商品名）（ＡＢＩ製）を用いて、以下に示す方法で精製した。
（２−１）Ｃｅｎｔｒｉ−Ｓｅｐスピンカラムに滅菌水を８００μＬ加え、ボルテックスにより乾燥したゲルを十分に水和させた。
（２−２）カラムに気泡がないことを確認後、室温にて２時間以上放置した。
（２−３）上のキャップ、下のストッパーを順に外しカラム内の滅菌水をゲル表面まで自然落下させた後、７３０×ｇで２分間遠心分離を行なった。
（２−４）（２−１）から（２−３）により作製したスピンカラムの中央に塩基配列決定用サンプルをアプライし、７３０×ｇで２分間遠心分離によりサンプルをチューブに回収した。
（２−５）回収したサンプルについて減圧乾燥を行なった後、ホルムアミドに溶解した。
（３）（２）で調製した塩基配列決定用サンプルを９５℃で２分間処理し、氷上で急冷後、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３１０−ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（商品名）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製）で解析することで、塩基配列を決定した。塩基配列決定に使用した合成ＤＮＡプライマーは、プライマーｐＴｒｃＦｓ（配列番号１５）、プライマーｐＴｒｃＲｓ（配列番号１６）、プライマーＴ７Ｆ０（配列番号１７）、プライマーＴ７Ｆ１（配列番号１８）、プライマーＴ７Ｆ２（配列番号１９）、プライマーＴ７Ｆ３（配列番号２０）、プライマーＴ７Ｆ４（配列番号２１）、プライマーＴ７Ｆ５（配列番号２２）、プライマーＴ７Ｆ６（配列番号２３）、プライマーＴ７Ｒ０（配列番号２４）、プライマーＴ７Ｒ１（配列番号２５）、プライマーＴ７Ｒ２（配列番号２６）、プライマーＴ７Ｒ３（配列番号２７）、プライマーＴ７Ｒ４（配列番号２８）、プライマーＴ７Ｒ５（配列番号２９）、プライマーＴ７Ｒ６（配列番号３０）を必要に応じて選択し使用した。
（４）決定した塩基配列はＧＥＮＥＴＹＸ  ｖｅｒ．８．０（商品名）（ゼネティクス製）を使用して解析を行なった。
解析の結果、１９株に塩基配列の置換が見出された。そのうち、１０株にはアミノ酸の変化をもたらす変異が含まれていた。そのうちの１つは、野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ塩基配列（配列番号５）のうち、５３５番目のアデニンがグアニンに置換されることでＡＡＧコドンがＧＡＧコドンに置換され、当該ポリメラーゼアミノ酸配列（配列番号６）の１７９番目のリジンがグルタミン酸に変異していることがわかった。この変異を有するＴ７ＲＮＡポリメラーゼをＫ１７９Ｅ変異体とし、その遺伝子配列を配列番号３１に、アミノ酸配列を配列番号３２に示す。さらに、残りの９株は野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ塩基配列（配列番号５）のうち、２３５７番目のアデニンがチミンに置換されることでＣＡＡコドンがＣＴＡコドンに置換され、当該ポリメラーゼアミノ酸配列（配列番号６）の７８６番目のグルタミンがロイシンに変異していることがわかった。この変異を有するＴ７ＲＮＡポリメラーゼをＱ７８６Ｌ変異体とし、その遺伝子配列を配列番号３３に、アミノ酸配列を配列番号３４にそれぞれ示す。
実施例７  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの調製と活性測定
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの調製は以下に示す手順で行なった。
（１）ＬＢＧ／Ｃｒｂ液体培地（１％  ポリペプトン、０．５％  酵母エキス、１％  ＮａＣｌ、０．５％  グルコース、５０μｇ／ｍＬ  カルベニシリン（ｐＨ７．４））３ｍＬに実施例５で得た形質転換体のグリセロールストックを植菌し、１８ｍＬ試験管にて３７℃で一晩振とう培養した。
（２）２×ＹＴＧ／Ｃｒｂ培地（１．６％  バクトトリプトン、１％  バクト酵母エキス、０．５％  ＮａＣｌ、０．５％  グルコース、５０μｇ／ｍＬ  カルベニシリン（ｐＨ７．４））１００ｍＬに（１）の前培養液１．０ｍＬを植菌し、５００ｍＬ容量のひだ付き三角フラスコにて、３７℃、１５０回転／分（タイテック製、ロータリー式）で培養した。
（３）（２）の培養約３から４時間後（Ｏ．Ｄ．６００ｎｍの値としておよそ１．０程度）に５００ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）１００μＬを添加し、温度を３０℃に下げて更に３時間振とう培養した。
（４）培養終了後、４℃にて４０００回転／分で１５分間遠心分離し、菌体を回収した。直ちに菌体破砕を行わない場合は−３０℃に保存した。
（５）回収した菌体は２０ｍＬの２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）により１回洗浄し、同じ組成の緩衝液２０ｍＬに再懸濁し、菌体破砕した。菌体破砕は超音波発生装置（インソネーター２０１Ｍ（商品名）、久保田商事製）を用いて、５℃にて約１５０Ｗの出力で約５分間処理した。
（６）得られた菌体破砕液を４℃にて１２０００回転／分で１０分間遠心分離し、回収した上清を酵素抽出液として、塩化ナトリウム及びイミダゾールをそれぞれ５００ｍＭ，２０ｍＭになるように添加し、ニッケルキレート樹脂によるアフィニティ精製に供した。
（７）Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに付加させたヒスチジンヘキサマータグを利用したアフィニティ精製により、以下の方法で酵素精製を行なった。
（７−１）２ｍＬのニッケルキレート樹脂（ヒスバインド（商品名）、ノバジェン製）のスラリーを付属の空カラムに充填し、３ｍＬの滅菌水で洗浄した。
（７−２）洗浄したニッケルキレート樹脂に５ｍＬの５０ｍＭの硫酸ニッケル水溶液でキレート樹脂にニッケルを結合させ、更に３ｍＬの緩衝液Ａ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ  塩化ナトリウム、２０ｍＭ  イミダゾール）で洗浄した。そこに上記の酵素抽出液を加え、６ｍＬの緩衝液Ａで洗浄後、１ｍＬの緩衝液Ｂ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、５００ｍＭ  塩化ナトリウム、１５０ｍＭ  イミダゾール）で溶出し、活性画分を回収した。
（７−３）回収した画分を脱塩カラム（ＰＤ−１０（商品名）、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）により、５ｍＭ  ジチオスレイトール及び０．１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に置換し、等量のグリセロールを加えた。精製したＴ７ＲＮＡポリメラーゼは牛血清アルブミンをコントロールタンパク質としたプロテインアッセイキット（バイオラッド製）により濃度を求めた。また７．５％濃度のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより酵素の純度を分析し、ほぼ単一であることを確認した。
（８）活性測定を、インヴィトロ転写反応にて生成したＲＮＡ量を測定する方法で行なった。なお、鋳型ＤＮＡはＴ７ＲＮＡポリメラーゼが特異的に認識するＴ７プロモーター配列を有するＤＮＡを用いるが、ここではＴ７プロモーター配列を含むプラスミドを鋳型にＰＣＲで増幅した約１．５ｋｂｐＤＮＡ断片を用いた。また、Ｔ７プロモーター配列の下流のＤＮＡの長さは１．０ｋｂｐであり、転写されるＲＮＡは約１．０ｋｂになる。
（８−１）Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを除いた反応液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ジチオスレイトール、２０ｎｇ  鋳型ＤＮＡ、０．４Ｕ  ＲＮａｓｅ阻害剤、各０．４ｍＭ  ＮＴＰｓ（ＡＴＰ，ＣＴＰ，ＧＴＰ，ＵＴＰ））を０．２ｍＬのＰＣＲチューブにいれ、精製したＴ７ＲＮＡポリメラーゼを０℃に冷却した状態で加え、合計１０μＬとした。
（８−２）予め反応温度に保温しておいたヒートブロック（マスターサイクラーｅｐグラジエント（商品名）、エッペンドルフ製）に先ほど調製したＰＣＲチューブをセットし、転写反応を行なった。反応停止は８０℃で２分間加熱することで行なった。
（８−３）生成したＲＮＡ量は１％アガロースゲルにて電気泳動した後、エチジウムブロマイドにて染色する方法、及び市販のＲＮＡ定量キットのＱｕａｎｔ−ＩＴ  ＲＮＡアッセイキット（商品名）（インビトロジェン製）を用いて蛍光染色し、添付の標準ＲＮＡで作製した検量線より濃度換算する方法にて分析した。
実施例８  （Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）二重変異体の作製
Ｋ１７９Ｅ変異体とＱ７８６Ｌ変異体を基に、Ｋ１７９ＥとＱ７８６Ｌの二つの変異を持った二重変異体を作製した。
（１）Ｋ１７９Ｅ変異体とＱ７８６Ｌ変異体、それぞれからミニプレップ法を用いてプラスミドを調製した。
（２）Ｋ１７９Ｅ変異体から調製したプラスミドを鋳型として、以下の試薬組成及び反応条件にて、ＰＣＲ反応を行なった。
（試薬組成）（総反応液量：１００μＬ）
２００ｐＭ  プライマーＴ７Ｒ２（配列番号２６）
２００ｐＭ  プライマーｐＴｒｃＦｓ（配列番号１５）
１００ｎｇ  鋳型プラスミド
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ
０．０２５ｕｎｉｔ／μＬ  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（ＴａＫａＲａ  Ｅｘ  Ｔａｑ（商品名）、
タカラバイオ製）
酵素に付属するバッファー
（反応条件）
サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用い、９４℃で２分加熱後、９４℃・１分、５８℃・３０秒、７２℃・２分４０秒の温度サイクルを２５回繰り返した。
（３）反応液を１％アガロース電気泳動で泳動後、エチジウムブロマイド染色を行ない、染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出すことで精製した。
（４）Ｑ７８６Ｌ変異体から調製したプラスミドを鋳型に、合成プライマーとしてプライマーＴ７Ｆ２（配列番号１９）とプライマーｐＴｒｃＲｓ（配列番号１６）の組み合わせを使用した他は（１）から（２）と同じ条件で、ＰＣＲ反応と精製を行なった。
（５）（３）及び（４）で得られた、２種類の精製ＰＣＲ産物を鋳型として、さらにＰＣＲ反応を行ない、二重変異体遺伝子を作製した。なお、ＰＣＲ反応における試薬組成、反応条件、及び精製操作は、合成ＤＮＡプライマーとしてプライマーｐＴｒｃＦｓ（配列番号１５）とプライマーｐＴｒｃＲｓ（配列番号１６）の組み合わせを使用した他は（１）から（２）と同じ条件である。
（６）（５）で得られた、精製二重変異体遺伝子は制限酵素ＮｃｏＩ及びＰｓｔＩ（タカラバイオ製）で消化後、同酵素で消化したｐＣＤＦ２ベクターにＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させた。
（７）（６）の反応液を大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換させ、ＬＢＧ／Ｃｒｂ寒天培地（１％  ポリペプトン、０．５％  酵母エキス、１％  ＮａＣｌ、０．５％  グルコース、１％  寒天、５０μｇ／ｍＬ  カルベニシリン（ｐＨ７．４））上で選択を行ない、３７℃で一晩培養後に生育してきたコロニーを二重変異体とした。さらに二重変異体は実施例６に示す塩基配列決定法により変異の導入を確認し、（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）変異体とした。その遺伝子配列を配列番号３５に、アミノ酸配列を配列番号３６に示す。
実施例９  変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの熱安定性評価（その１）
変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの熱安定性を以下のように測定した。
（１）実施例５でスクリーニングした変異体の塩基配列解析の結果（実施例６）から、高温域で野生型よりも活性が高かった、１７９番目のアミノ酸をリジンからグルタミン酸に置換した変異体（Ｋ１７９Ｅ）、７８６番目のアミノ酸をグルタミンからロイシンに置換した変異体（Ｑ７８６Ｌ）及び２つの変異を合わせた二重変異体（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）を、実施例７に記載した方法に従い精製酵素を調製した。なお、精製した酵素のタンパク濃度及び転写活性は実施例７に示した方法に準じ測定した。
（２）実施例７で調製した各種Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを希釈液（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、２０ｍＭ  塩化マグネシウム、５ｍＭ  ジチオスレイトール、７０ｍＭ  ＫＣｌ、０．１ｍｇ／ｍＬ  牛血清アルブミン）を用いて５０μｇ／ｍＬに調製した。
（３）０．２ｍＬのＰＣＲチューブに２５μＬ分注し、４７℃にて５分間、１０分間、２０分間、それぞれ加熱させた。
（４）加熱処理後遠心分離に上清を回収後、４３℃にて３０分間転写反応を行ない、残存活性を求めた。
（５）生成したＲＮＡ量は１％アガロースによる電気泳動にて分析した。
結果を図６に示した。図６から変異体Ｑ７８６Ｌ及び（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）は野生型ではほとんど活性が無くなる４７℃でも、明瞭なＲＮＡのバンドが認められた。このことから、少なくともＱ７８６Ｌの変異を導入したＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、野生型よりも熱安定性が優れていることがわかる。
実施例１０  変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの活性評価（その１）
変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの各反応温度における活性を以下のように測定した。
（１）実施例５でスクリーニングした変異体の塩基配列解析の結果（実施例６）から、高温域で野生型よりも活性が高かった１７９番目のアミノ酸をリジンからグルタミン酸に置換した変異体（Ｋ１７９Ｅ）、７８６番目のアミノ酸をグルタミンからロイシンに置換した変異体（Ｑ７８６Ｌ）及び２つの変異を合わせた二重変異体（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）を、実施例７に記載した方法に従い精製酵素を調製した。なお、精製した酵素のタンパク濃度及び転写活性は実施例７に示した方法に準じ測定した。
（２）Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの活性を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの酵素量を１０μｇ／ｍＬ、反応温度を４３から５０℃の範囲で１０分間反応させて測定した。
（３）生成したＲＮＡ量をＱｕａｎｔ−ＩＴ  ＲＮＡアッセイキット（商品名）（インビトロジェン製）を用いて求めた。
測定したＲＮＡ濃度を図７に示した。変異体Ｋ１７９Ｅは４２．９℃から４６．８℃の範囲で野生型よりも比活性が高いことがわかり、このことから、少なくともＫ１７９Ｅの変異を導入したＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、野生型よりも比活性が向上していることがわかる。次に、変異体Ｑ７８６Ｌは４４．７℃から４７．９℃の範囲で野生型よりも比活性が高かったが、これは実施例９の結果より熱安定性が向上したことに由来すると思われる。また、二重変異体（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）では４２．９℃から４７．９℃の温度域で野生型よりも比活性が高かった。このことから、少なくともＫ１７９Ｅ及びＱ７８６Ｌの変異を導入したＴ７ＲＮＡポリメラーゼは、野生型よりも熱安定性及び比活性が向上していることがわかる。
実施例１１  変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の調製（その１）
野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのアミノ配列（配列番号６）のうち、１７９番目のリジンを他のアミノ酸に置換したＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子の調製を、以下に示す手順で行なった。
（１）ｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓ（図４）を鋳型プラスミドとして、以下の試薬組成及び反応条件にて、１回目のＰＣＲ反応を行なった。なおＴ７ポリメラーゼ遺伝子の５’末端側を増幅するための合成ＤＮＡプライマーとして、プライマーｐＣＤＦＦ（配列番号１２）とプライマー１７９ＭＩＸＲ（配列番号３９）の組み合わせを、３’末端側を増幅するための合成プライマーとして、プライマー１７９ＭＩＸＦ（配列番号３７）とプライマーｐＣＤＦＲ２（配列番号３８）の組み合わせをそれぞれ用いた。
（試薬組成）（総反応液量：１００μＬ）
各２００ｐＭ  合成ＤＮＡプライマー
１００ｎｇ  鋳型プラスミド
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ
０．０２５ｕｎｉｔ／μＬ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名）、タカラバイオ製）
酵素に付属するバッファー
（反応条件）
サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用い、９８℃で３０秒加熱後、９８℃・３０秒、５５℃・３０秒、７２℃・１分３０秒の温度サイクルを３０回繰り返した後、７２℃で７分間反応した。
（２）（１）で調製したＰＣＲ産物を、１％アガロース電気泳動で泳動後、エチジウムブロマイド染色を行ない、染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出すことで、ＰＣＲ産物を精製した。
（３）得られた２種類（５’末端側及び３’末端側）のＰＣＲ産物を鋳型に、プライマーｐＣＤＦＦ（配列番号１２）とプライマーｐＣＤＦＲ２（配列番号３８）を合成ＤＮＡプライマーとして用いて、２回目のＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ反応における試薬組成、及び反応条件は合成ＤＮＡプライマーと鋳型以外は（１）と同じ条件で行ない、増幅した産物を（２）と同様にアガロースゲルにて電気泳動後、抽出、精製した。
（４）（３）で精製した２回目のＰＣＲ産物を、制限酵素ＮｒｕＩ及びＳａｃＩで消化後、同酵素で消化したｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓプラスミド（図４）にＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させ、反応後のＤＮＡ溶液をＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子変異体ライブラリーとした。
（５）（４）で作製したライブラリーを大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、３７℃のＬＢＧ／Ｃｒｂ培地（１．０％  バクトトリプトン、０．５％  バクト酵母エキス、０．５％  ＮａＣｌ、０．５％  グルコース、５０μｇ／ｍＬ  カルベニシリン（ｐＨ７．４））で増殖してきたコロニーを９０個、各ライブラリーから選抜した。
（６）選抜した菌株は常法によりプラスミドを抽出後、ｐＣＤＦＦ（配列番号１２）を塩基配列決定用合成ＤＮＡプライマーとして使用した他は、実施例６の手順と同様に塩基配列決定を行なうことで、塩基配列の変異を確認した。
実施例１２  変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の調製（その２）
野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのアミノ配列（配列番号６）のうち、７８６番目のグルタミンを他のアミノ酸に置換したＴ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子の調製を、以下に示す手順で行なった。
（１）ｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓ（図４）を鋳型プラスミドとして、以下の試薬組成及び反応条件にて、１回目のＰＣＲ反応を行なった。なおＴ７ポリメラーゼ遺伝子の５’末端側を増幅するための合成ＤＮＡプライマーとして、プライマーｐＣＤＦＦ４（配列番号４２）とプライマー７８６ＭＩＸＲ（配列番号４１）の組み合わせ、３’末端側を増幅するための合成プライマーとして、プライマー７８６ＭＩＸＦ（配列番号４０）とプライマーｐＴｒｃＲＳ（配列番号１６）の組み合わせをそれぞれ用いた。
（試薬組成）（総反応液量：１００μＬ）
各２００ｐＭ  合成ＤＮＡプライマー
１００ｎｇ  鋳型プラスミド
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰｓ
０．０２５ｕｎｉｔ／μＬ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名）、タカラバイオ製）
酵素に付属するバッファー
（反応条件）
サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用い、９８℃で３０秒加熱後、９８℃・３０秒、５５℃・３０秒、７２℃・１分３０秒の温度サイクルを３０回繰り返した後、７２℃で７分間反応した。
（２）（１）で調製したＰＣＲ産物を、１％アガロース電気泳動で泳動後、エチジウムブロマイド染色を行ない、染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出すことで、ＰＣＲ産物を精製した。
（３）得られた２種類（５’末端側及び３’末端側）のＰＣＲ産物を鋳型に、プライマーｐＣＤＦＦ４（配列番号４２）とプライマーｐＴｒｃＲＳ（配列番号１６）を合成ＤＮＡプライマーとして用いて、２回目のＰＣＲ反応を行なった。ＰＣＲ反応における試薬組成、及び反応条件は合成ＤＮＡプライマーと鋳型以外は（１）と同じ条件で行ない、増幅した産物を（２）と同様にアガロースゲルにて電気泳動後、抽出、精製した。
（４）（３）で精製した２回目のＰＣＲ産物を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＫｐｎＩで消化後、同酵素で消化したｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓプラスミド（図４）にＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させ、反応後のＤＮＡ溶液をＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子変異体（１７９番目）ライブラリーとした。
（５）（４）で作製したライブラリーを大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、３７℃のＬＢＧ／Ｃｒｂ培地（１．０％  バクトトリプトン、０．５％  バクト酵母エキス、０．５％  ＮａＣｌ、０．５％  グルコース、５０μｇ／ｍＬ  カルベニシリン（ｐＨ７．４））で増殖してきたコロニーを９０個、各ライブラリーから選抜した。
（６）選抜した菌株は常法によりプラスミドを抽出し、ｐＣＤＦＦ４（配列番号４２）を塩基配列決定用合成ＤＮＡプライマーとして使用した他は、実施例６の手順と同様に塩基配列決定を行なうことで、塩基配列の変異を確認した。
実施例１３  変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体の活性評価（その２）
実施例１１及び１２で作製した変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子から、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの調製及び転写活性の測定を実施例７の方法に従い実施した。結果を図８（１７９番目のリジンを他のアミノ酸に置換したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ）及び９（７８６番目のグルタミンを他のアミノ酸に置換したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ）に示す。
１７９番目のリジンを他のアミノ酸に置換した場合、スクリーニングで得られたグルタミン酸置換（Ｋ１７９Ｅ）の他にも、システイン置換（Ｋ１７９Ｃ）、アスパラギン置換（Ｋ１７９Ｎ）した変異体が野生型より耐熱性及び／または比活性が向上しており、特にグルタミン酸に置換した（Ｋ１７９Ｅ）変異体が、野生型に対する耐熱性及び比活性の向上が大きかった（図８）。
一方、７８６番目のグルタミンを他のアミノ酸に置換した場合、スクリーニングで得られたロイシン置換（Ｑ７８６Ｌ）の他にも、メチオニン置換（Ｑ７８６Ｍ）、フェニルアラニン置換（Ｑ７８６Ｆ）、チロシン置換（Ｑ７８６Ｙ）した変異体が野生型より耐熱性及び／または比活性が向上しており、特にメチオニンに置換した（Ｑ７８６Ｍ）変異体が、野生型に対する耐熱性及び比活性の向上が大きかった（図９）。
実施例１４  変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの熱安定性評価（その２）
実施例１３で調製した変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの熱安定性を以下に示す方法で測定した。
（１）実施例１３で調製した変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｑ７８６Ｍ、Ｑ７８６Ｌ、Ｑ７８６Ｆ、Ｑ７８６Ｙ、Ｋ１７９Ｅ、Ｋ１７９Ｃ、及びＫ１７９Ｎ）及び野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを以下に示す組成の緩衝液を用いて１００μｇ／ｍＬに調製し、０．２ｍＬのＰＣＲチューブに２５μＬ分注後、４７℃にて１分、２分、５分、１０分、２０分、３０分間加熱処理した。
（緩衝液組成）
４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）
２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
５ｍＭ  ジチオスレイトール
７０ｍＭ  ＫＣｌ
０．０１ｍｇ／ｍＬ  牛血清アルブミン
（２）加熱処理後の液を用いて、４３℃・３０分間の転写反応により活性を測定し、各処理時間の活性を加熱前の活性で割った値を残存活性とした。
残存活性のグラフを図１０に示す。また、図１０のグラフの傾きから各種変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ及び野生型の半減期を求めた結果を表１に示す。表１より各種変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは野生株よりも半減期が長く、４８℃における熱安定性に優れていることがわかる。また特に、Ｑ７８６Ｌ及びＱ７８６Ｍ変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの熱安定性が高いことがわかる。
【表１】
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実施例１５  変異ライブラリーの作製（その２）
実施例８で作製した（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）変異体遺伝子配列（配列番号３５）、及び前記配列の５’末端側にヒスチジンヘキサマー配列を含むプラスミドベクターｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓ（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）を用いて、以下の手順で変異を導入した。
（１）ｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓ（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）を鋳型プラスミドとして、以下の試薬組成及び反応条件にて、エラープローンＰＣＲ反応を行なった。
（試薬組成）（総反応液量：１００μＬ）
０．１から０．３ｍＭ（必要に応じて）  ＭｎＣｌ２
２００ｐＭ  プライマーｐＴｒｃＦｓ（配列番号１５）
２００ｐＭ  プライマーｐＴｒｃＲｓ（配列番号１６）
１００ｎｇ  鋳型プラスミド
０．２ｍＭ  ｄＡＴＰ
０．２ｍＭ  ｄＧＴＰ
１ｍＭ  ｄＣＴＰ
１ｍＭ  ｄＴＴＰ
２ｍＭ  ＭｇＣｌ２
０．０１ｕｎｉｔ／μＬ  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＧｏＴａｑ（商品名）、Ｐｒｏｍｅｇａ製）
酵素に付属するＭｇフリーのバッファー
（反応条件）
サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用い、９４℃で２分加熱後、９４℃・３０秒、５５℃・１分、７２℃・８分の温度サイクルを２５回繰り返した。
（２）ＰＣＲ産物を、１％アガロース電気泳動で泳動後、エチジウムブロマイド染色により行い、ゲルから切り出して精製した。
（３）精製されたＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を制限酵素ＮｃｏＩ及びＰｓｔＩで消化後、同酵素で消化したｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓプラスミド（図４）にＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させ、反応後のＤＮＡ溶液をＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子変異体ライブラリーとした。
（４）作製したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子変異体ライブラリーを、実施例４で作製したプラスミドｐＳＴＶＧＦＰ（図５）を含む大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換し、前記形質転換液を３７℃のＳＯＣ培地で１時間培養後、ＬＢＧ／Ｃｒｂ／Ｃｍ寒天体培地（１％ポリペプトン、０．５％  酵母エキス、１％  ＮａＣｌ、０．５％  グルコース、５０μｇ／ｍＬ  カルベニシリン、３０μｇ／ｍＬ  クロラムフェニコール、１．５％  寒天）で増殖し、かつＧＦＰ蛍光を発する株を変異体候補株とした。なお作製したライブラリーは、その一部を用いて定法に従い大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換しプラスミドを精製し、実施例６に示す方法で塩基配列を決定することでエラープローンＰＣＲの効果を確かめた。
実施例１６  高温型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのスクリーニング（その２）
実施例１５で得られた変異株のスクリーニングは実施例５と同じ方法でスクリーニングを行なった。スクリーニングの結果、約４０００の変異株から、実施例８で作製した（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼより比活性が約２倍高い菌株が３４株得られ、これを一次候補株とした。更に前記一次候補株を実施例５と同じ方法で再スクリーニングを行ない、最終的に（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼより比活性が２倍以上高い菌株１株を選定した。
実施例１７  選定株の塩基配列解析
実施例１６で選定した菌株を実施例６に記載の方法で、塩基配列の確認を行ない変異部位を確認した。その結果、塩基配列２０５４番目のチミンがシトシンに置換されることでＧＴＧコドンがＧＣＧコドンに置換されアミノ酸配列６８５番目のバリンがアラニンに変異していることがわかった。この変異を有するＴ７ＲＮＡポリメラーゼを（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）変異体とし、その遺伝子配列を配列番号４３にアミノ酸配列を配列番号４４に示す。
実施例１８  （Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの作製
実施例１６で得られたヒスチジンヘキサマー配列を有する（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）三重変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する大腸菌ＪＭ１０９株を用い、以下の手順で酵素を調製した。
（１）ＬＢＧ／Ｃｒｂ液体培地（１％  ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１％  ＮａＣｌ、０．５％  グルコース、５０μｇ／ｍＬ  カルベニシリン（ｐＨ７．４））４０ｍＬに実施例１６で得られた菌株のグリセロールストックを植菌し、１００ｍＬ容量のひだ付き三角フラスコにて３７℃で一晩振とう培養した。
（２）１．５Ｌの２×ＹＴＧ／Ｃｒｂ培地（１．６％  バクトトリプトン、１％  バクト酵母エキス、０．５％  ＮａＣｌ、０．５％  グルコース、５０μｇ／ｍＬ  カルベニシリン（ｐＨ７．４））に前培養液３０ｍＬを植菌し、３Ｌ容量の発酵槽にて、３７℃にて培養した。
（３）（２）の培養約３時間後（Ｏ．Ｄ．６００ｎｍの値としておよそ２．０）に５００ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）１．５ｍＬを添加し、温度を３０℃に下げてさらに３時間培養した。培養中酸素濃度は１．６ｐｐｍ以上、ｐＨは６．８から７．２の範囲に調整した。
（４）培養終了後、４℃にて１５分間、７０００回転／分で遠心分離し、湿菌体２１ｇを得た。菌体は１００ｍＬの２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄し、直ちに次の処理をしない場合は−３０℃に保存した。
（５）回収した菌体の半分を０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）４２ｍＬに懸濁し、菌体破砕した。菌体破砕は超音波発生装置（インソネーター２０１Ｍ（商品名）、久保田商事製）を用いて、５℃にて約５分間、約１５０Ｗの出力で処理し、４℃にて１０分間、１２０００回転／分の遠心分離にて可溶性画分を回収した。
（６）回収した画分４５ｍＬに５．１ｍＬの２Ｍ  硫酸アンモニウム、及び０．９５ｍＬの１０％ポリエチレンイミンをそれぞれ添加し、０℃で約１時間保冷した後、４℃にて１０分間、１２０００回転／分の遠心分離にて上清を回収した。
（７）回収した上清の一部を用いて、実施例７に示した方法に準じ、ヒスチジンヘキサマータグを利用したアフィニティクロマトグラフにより精製した。
精製したＴ７ＲＮＡポリメラーゼのタンパク濃度は２８０ｎｍの吸光度より求めた。また５から２０％濃度のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより酵素タンパク純度を分析し、ほぼ単一のタンパクであることを確認した。
実施例１９  変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの活性評価（その３）
実施例１８で作製した（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）三重変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの活性評価を実施例７に示したインヴィトロ転写反応によって生成したＲＮＡ量を測定する方法で行なった。なお、転写反応温度は４３から５０℃の範囲に設定し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの酵素量を１０ｎｇ／μＬ、反応時間は３０分間とした。また、対照として実施例８で作製した（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）二重変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、及び野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いた。
各温度において生成したＲＮＡ量を図１１に示した。図１１から（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）三重変異体は元の変異体である（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）二重変異体よりも反応温度４６℃以上で比活性が高いことがわかる。
実施例２０  変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの熱安定性評価（その３）
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ各種変異体及び野生型の熱安定性は以下の方法で測定した。
（１）実施例１８で作製した（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）三重変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、実施例８で作製した（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）二重変異体型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、及び野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを以下に示す組成の緩衝液を用いて１００μｇ／ｍＬに調製し、０．２ｍＬのＰＣＲチューブに２５μＬ分注後、４８℃にて１分、２分、５分、１０分、２０分間加熱処理した。
（緩衝液組成）
４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）
２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２
５ｍＭ  ジチオスレイトール
７０ｍＭ  ＫＣｌ
０．０１ｍｇ／ｍＬ  牛血清アルブミン
（２）加熱処理後の液を用いて、４３℃にて３０分間の転写反応により活性を測定し、各処理時間の活性を加熱前の活性で割った値を残存活性とした。
残存活性のグラフを図１２に示す。また、図１２のグラフの傾きから各種変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ及び野生型の半減期を求めた結果を表２に示す。表２より（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）三重変異体は（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ）二重変異体や野生株よりも半減期が長く、４８℃における熱安定性に優れていることがわかる。
【表２】
0005625908.tif 000003
実施例２１  （Ｑ７８６Ｌ＋Ｍ６８５Ａ）変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの作製
実施例１８で作製した（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）三重変異型Ｔ７ポリメラーゼより、以下の方法で（Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）二重変異型Ｔ７ポリメラーゼを作製した。
（１）（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）三重変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を挿入したｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓ（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）プラスミド、及び野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を挿入したプラスミドｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰ（図３）をミニプレップ法で調製した。
（２）両プラスミド２００ｎｇを常法により制限酵素ＫｐｎＩ及びＳａｃＩで消化し、アガロースゲル電気泳動後、野生型の４．５ｋｂｐのフラグメント及び（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）変異体の１．４ｋｂｐのフラグメントをゲル抽出法により精製した。
（３）精製した野生型フラグメント４０ｎｇと（Ｋ１７９Ｅ＋Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）変異体のフラグメント８０ｎｇをＴ４リガーゼを用いて１６℃で３０分間反応し、常法により大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。
（４）前記形質転換体を、ＬＢＧ／Ｃｒｂ寒天培地（１％  ポリペプトン、０．５％  酵母エキス、１％  ＮａＣｌ、０．５％グルコース、１．５％  寒天、５０μｇ／ｍＬ  カルベニシリン（ｐＨ７．４））上で選別を行ない、３７℃で一晩培養後に生育してきたコロニーのプラスミドを調製した。
（４）で調製したプラスミドは実施例６に示す塩基配列決定法により目的とする変異の導入を確認した。当該プラスミド遺伝子配列を配列番号４５、アミノ酸配列を配列番号４６に示す。
実施例２２  （Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの精製
実施例２１で作製した（Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）二重変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する大腸菌ＪＭ１０９株を用い、以下の方法で（Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを調製した。
（１）実施例１８に示した手順に準じ培養を行ない、湿菌体２８ｇを得た。
（２）得られた菌体を０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ及び１ｍＭ  ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１１２ｍＬに懸濁後、超音波にて菌体を破砕し、遠心分離により上清を回収した。
（３）得られた酵素抽出液１３５ｍＬに対し１７．５ｍＬの２Ｍ  硫酸アンモニウム及び３．５ｍＬの１０％  ポリエチレンイミンを添加し、０℃で約１時間保冷後、遠心分離により上清を回収した。
（４）回収した上清１３０ｍＬに５１ｇの硫酸アンモニウムを加え、０℃で１時間保冷後、遠心分離にて回収した沈殿を以下の組成の緩衝液３０ｍＬに溶解させた。
（緩衝液組成）
２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）
１ｍＭ  ジチオスレイトール
０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ
１ｍＭ  ＥＤＴＡ
（５）（４）で調製した沈殿溶解液を以下の方法で高速液体クロマトグラフィーにて精製した。
（５−１）疎水カラム（ＴＳＫｇｅｌ  Ｐｈｅｎｙｌ−５ＰＷ（商品名）、東ソー製）により以下の条件で精製した。
（精製条件）
溶離液Ａ：
２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）
５０ｍＭ  ＮａＣｌ
０．６Ｍ  硫酸アンモニウム
１ｍＭ  ＤＴＴ
１ｍＭ  ＥＤＴＡ
溶離液Ｂ：
溶離液Ａのうち硫酸アンモニウムを除いた組成
グラジエント：
０分から６０分：溶離液Ａ１００％
６０分から１２０分：溶離液Ａ１００％から０％へのリニアグラジエント
１２０分から１３０分：溶離液Ａ０％
１３０分：溶離液Ａ０％から１００％へのステップグラジエント
検出：２８０ｎｍ
流速：４ｍＬ／分
（５−２）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりＴ７ＲＮＡポリメラーゼの含有量が多い画分１００ｍＬを回収し、３９ｇの硫酸アンモニウムで塩析した。
（５−３）遠心分離で回収した塩析物を以下に示す組成の緩衝液５ｍＬに溶解させた。
（緩衝液組成）
２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）
１ｍＭ  ジチオスレイトール
０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ
１ｍＭ  ＥＤＴＡ
（５−４）分画分子量１２０００の透析膜を用いて同組成の緩衝液に一晩４℃で透析し、イオン交換カラム（ＴＳＫｇｅｌ  ＤＥＡＥ−５ＰＷ（商品名）、東ソー製）により以下の条件で精製した。
（精製条件）
溶離液Ａ：
２０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）
５０ｍＭ  ＮａＣｌ
１ｍＭ  ジチオスレイトール
１ｍＭ  ＥＤＴＡ
溶離液Ｂ：
溶離液ＡのうちＮａＣｌ濃度を０．８Ｍに変更した組成グラジエント：
０分から２０分：溶離液Ａ１００％
２０分から８０分：溶離液Ａ１００％から０％へのリニアグラジエント
８０分から９０分：溶離液Ａ０％
９０分：溶離液Ａ０％から１００％へのステップグラジエント
検出：２８０ｎｍ
流速：４ｍＬ／分
（５−５）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析でＴ７ＲＮＡポリメラーゼの含有量が多い画分５ｍＬを回収し、１．９５ｇの硫酸アンモニウムで塩析した。
（５−６）ゲルろ過精製に用いる緩衝液１ｍＬに溶解させ、ゲルろ過カラム（ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷ（商品名）、東ソー製）で以下の条件で精製した。
（精製条件）
溶離液：
４０ｍＭ  リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．６）
２００ｍＭ  ＮａＣｌ
２ｍＭ  ジチオスレイトール
０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ
検出：２８０ｎｍ
流速：５ｍＬ／分
（５−７）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析からＴ７ＲＮＡポリメラーゼの含有量が多い画分４ｍＬを回収した。
（５−８）回収画分を１．５６ｇの硫酸アンモニウムで塩析したのち、脱塩カラム（ＰＤ−１０（商品名）、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）を用いてゲルろ過カラム精製と同じ組成の緩衝液で置換し、等量のグリセロールを加えて２．５ｍＬとした。
精製したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ二重変異体のタンパク濃度を２８０ｎｍの吸光度より求めたところ１．９ｍｇ／ｍＬだった。また５から２０％濃度のＳＤＳ−ＰＡＧＥで酵素タンパクを分析し、ほぼ単一なバンドであることを確認した。
実施例２３  変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによる核酸増幅反応
実施例２２で調製した（Ｑ７８６Ｌ＋Ｍ６８５Ａ）二重変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたＴＲＣ法による核酸増幅を、以下の方法でサルモネラ毒素遺伝子（ｓｔｎ  ＲＮＡ）を標的ＲＮＡとし、測定した。なお、対照として野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いた。
（１）サルモネラｓｔｎ  ｍＲＮＡ検出試薬（ＴＲＣＲｔｅｓｔ  ｓｔｎ−ｍ（商品名）、東ソー製）に添付のｓｔｎ  ＲＮＡ陽性標準（濃度：１０６コピー／５μＬ）をＲＮＡ希釈液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｕ／μＬ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、５ｍＭ  ジチオスレイトール）にて、１０４コピー／５μＬとなるよう希釈した。コントロール試験区（陰性）にはＲＮＡ希釈液のみを用いた。
（２）以下の組成の反応液２０μＬを０．５ｍＬ容のＰＣＲ用チューブに分注し、これに上記ＲＮＡ試料５μＬを添加した。
（反応液の組成）（最終反応液量３０μＬにおける濃度または量）
６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．６）
１７ｍＭ  ＭｇＣｌ２
１００ｍＭ  ＫＣｌ
６Ｕ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
１ｍＭ  ジチオスレイトール
各０．２５ｍＭ  ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、
ｄＴＴＰ
３．６ｍＭ  ＩＴＰ
各３．０ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰ
０．１２μＭ  切断用オリゴヌクレオチド（配列番号４７、３’末端の水酸基はアミノ化）
１．０μＭ  第一のプライマー（配列番号４８）
１．０μＭ  第二のプライマー（配列番号４９）
７．５ｎＭ  インターカレーター性蛍光色素で標識された核酸プローブ（配列番号５０、５’末端側１２番目の「Ａ」と１３番目の「Ａ」の間にインターカレーター性蛍光色素が標識され、かつ３’末端側の水酸基はグリコール基で修飾）
１％  ＤＭＳＯ
容量調整用蒸留水
（３）（２）の反応液を変異体は４９℃、５０℃、５１℃の各温度で、野生型は４３℃、４９℃の各温度で、５分間保温後、あらかじめ各温度で２分間保温した以下に示す組成の酵素液５μＬを添加した。
（酵素液の組成）（最終反応液量３０μＬにおける濃度または量）
２％  ソルビトール
３．６μｇ  牛血清アルブミン
４Ｕ  ＡＭＶ逆転写酵素（ライフサイエンス製）
４６Ｕ  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ
容量調整用蒸留水
（４）直接測定可能な温度調節機能付き蛍光光度計を用い、各温度でＰＣＲチューブを保温し、励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５１０ｎｍで、反応溶液を経時的に測定した。
酵素添加時の時間を０分として、反応液の蛍光強度比（所定時間の蛍光強度値をバックグラウンドの蛍光強度値で割った値）の経時変化を図１３に示した。野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを使用したときは、反応温度４９℃の時点でｓｔｎ  ＲＮＡの増幅が見られなかったのに対し、（Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）二重変異体は反応温度５１℃においてもｓｔｎ  ＲＮＡの増幅がみられた。このことから、（Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）二重変異体は野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと比較し、４９℃から５１℃といった高温領域での熱安定性及び／または比活性に優れていることがわかる。
実施例２４  Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体による核酸増幅反応の最低検出濃度測定
実施例２２で調製した（Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）二重変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのｓｔｎ  ｍＲＮＡ標準ＲＮＡに対する最低検出濃度を確認した。
測定方法は、反応温度を５０℃（二重変異体）または４３℃（野生型）、標的ＲＮＡの濃度を１０、５０、１００、３００、５００、１０００コピー／５μＬに変更した他は、実施例２３の同様の方法で行なった。
各初期ＲＮＡコピー数における（Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）二重変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ及び野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの検出率を表３に示した。表３より（Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）二重変異体を用いた時のｓｔｎ  ＲＮＡの検出率は野生型４３℃の検出率より高く、検出率８０％以上を示す最小ＲＮＡ濃度で比較すると、野生型では１０００コピー／５μＬに対し、（Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）二重変異体は２００コピー／５μＬであった。両酵素の最適温度条件で比較した場合、（Ｑ７８６Ｌ＋Ｖ６８５Ａ）変異体は野生型より約５倍感度が向上していることがわかる。
【表３】
0005625908.tif 000004
実施例２５  Ｖ６８５Ａ変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの作製
実施例２で作製したｐＣＤＦ−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓプラスミド（図４）のＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子より、以下の手順で、アミノ酸配列６８５番目のバリンがアラニンに変異したＴ７ＲＮＡポリメラーゼ変異体（Ｖ６８５Ａ変異体）を作製した。
（１）ｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓ（図４）を鋳型プラスミドとして、以下の試薬組成及び反応条件にて、ＰＣＲ反応を行なった。なお、合成プライマーはプライマーＶ６８５ＡＦ（配列番号５１）とプライマーｐＴｒｃＲｓ（配列番号１６）の組み合わせ、またはｐＣＤＦＦ４（配列番号４２）とプライマーＶ６８５ＡＲ（配列番号５３）の組み合わせを用いた。
（試薬組成）（総反応液量：５０μＬ）
各１００ｐＭ  合成ＤＮＡプライマー
５０ｎｇ  鋳型プラスミド
０．１ｍＭ  ｄＮＴＰｓ
０．０２５ｕｎｉｔ／μＬ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名）、タカラバイオ製）
酵素に付属するバッファー
（反応条件）
サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用い、９６℃で３０秒加熱後、９６℃・３０秒、５０℃・３０秒、７２℃・１分の温度サイクルを３０回繰り返した。
（２）反応液を１％アガロース電気泳動で分離後、エチジウムブロマイド染色を行ない、染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出すことで精製した。
（３）（２）で得られた、２種類の精製ＰＣＲ産物を鋳型として、さらにＰＣＲ反応を行ない、Ｖ６８５Ａ変異体遺伝子を作製した。なお、ＰＣＲ反応における試薬組成、反応条件、及び精製操作は、合成ＤＮＡプライマーとしてプライマーｐＣＤＦＦ４（配列番号４２）とプライマーｐＴｒｃＲｓ（配列番号１６）の組み合わせを使用した他は（１）から（２）と同じ条件である。
（４）（３）で得られたＤＮＡ断片を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＫｐｎＩ（タカラバイオ製）で消化後、同じ酵素で消化したｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓベクターにＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させた。
（５）（４）の反応液を大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換させ、ＬＢＧ／Ｃｒｂ寒天培地（１％  ポリペプトン、０．５％  酵母エキス、１％  ＮａＣｌ、０．５％  グルコース、１．５％  寒天、５０μｇ／ｍＬ  カルベニシリン（ｐＨ７．４））上で選択を行ない、３７℃で一晩培養後に生育してきたコロニーをＶ６８５Ａ変異体とした。さらにＶ６８５Ａ変異体は実施例６に示す塩基配列決定法により変異の導入を確認した。その遺伝子配列を配列番号５４に、アミノ酸配列を配列番号５５に示す。
実施例２６  Ｖ６８５Ａ変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの精製と活性評価
実施例２５で作製したＶ６８５Ａ変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する大腸菌ＪＭ１０９株を用いて、実施例７に示した方法で、Ｖ６８５Ａ変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの調製及び活性評価を行なった。なお、転写反応温度は４３から４９℃の範囲に設定し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの酵素量を２０ｎｇ／μＬ、反応時間は３０分間とした。また、対照として野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いた。
各温度において生成したＲＮＡ量を図１４に示した。図１４からＶ６８５Ａ変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは野生型よりも反応温度４５℃以上でＲＮＡ生産量が多く、高温での比活性が向上していることがわかる。
実施例２７  Ｖ６８５Ａ変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの熱安定性評価
実施例２６で調製したＶ６８５Ａ変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、実施例２０に示した方法でＶ６８５Ａ変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの熱安定性を評価した。なお、加熱処理温度は４６℃に設定し、処理時間は１分、２分、５分間とした。また、対照として野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いた。
残存活性のグラフを図１５に示す。また、図１５のグラフの傾きからＶ６８５Ａ変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ及び野生型の半減期を求めた結果を表４に示す。表４よりＶ６８５Ａ変異体は野生型よりも半減期が長く、４６℃における熱安定性に優れていることがわかる。
【表４】
0005625908.tif 000005
実施例２８  （Ｖ６８５Ａ＋Ｑ７８６Ｍ）変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの作製
実施例２５で作製した、Ｖ６８５Ａ変異体Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を挿入したｐＣＤＦ−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓプラスミド（図４）を用いて、以下の方法で、さらにアミノ酸配列７８６番目のグルタミンがメチオニンに変異した（Ｖ６８５Ａ＋Ｑ７８６Ｍ）二重変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを作製した。
（１）Ｖ６８５Ａ変異体のｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓを鋳型プラスミドとして、以下の試薬組成及び反応条件にて、ＰＣＲ反応を行なった。なお、合成プライマーはプライマーＱ７８６ＭＦ（配列番号５６）とプライマーｐＴｒｃＲｓ（配列番号１６）の組み合わせ、またはｐＣＤＦＦ４（配列番号４２）とプライマーＱ７８６ＭＲ（配列番号５７）の組み合わせを用いた。
（試薬組成）（総反応液量：５０μＬ）
各１００ｐＭ  合成ＤＮＡプライマー
５０ｎｇ  鋳型プラスミド
０．１ｍＭ  ｄＮＴＰｓ
０．０２５ｕｎｉｔ／μＬ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（商品名）、タカラバイオ製）
酵素に付属するバッファー
（反応条件）
サーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ製）を用い、９６℃で３０秒加熱後、９６℃・３０秒、５０℃・３０秒、７２℃・１分の温度サイクルを３０回繰り返した。
（２）反応液を１％アガロース電気泳動で分離後、エチジウムブロマイド染色を行ない、染色後のゲルから目的産物のバンドを切り出すことで精製した。
（３）（２）で得られた、２種類の精製ＰＣＲ産物を鋳型として、さらにＰＣＲ反応を行ない、（Ｖ６８５Ａ＋Ｑ７８６Ｍ）変異体遺伝子を作製した。なお、ＰＣＲ反応における試薬組成、反応条件、及び精製操作は、合成ＤＮＡプライマーとしてプライマーｐＣＤＦＦ４（配列番号４２）とプライマーｐＴｒｃＲｓ（配列番号１６）の組み合わせを使用した他は（１）から（２）と同じ条件である。
（４）（３）で得られたＤＮＡ断片を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＫｐｎＩ（タカラバイオ製）で消化後、同じ酵素で消化したｐＣＤＦ２−Ｔ７ＲＮＡＰＨｉｓベクターにＴ４リガーゼを用いて４℃で３０分反応させた。
（５）（４）の反応液を大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換させ、ＬＢＧ／Ｃｒｂ寒天培地（１％  ポリペプトン、０．５％  酵母エキス、１％  ＮａＣｌ、０．５％  グルコース、１．５％  寒天、５０μｇ／ｍＬ  カルベニシリン（ｐＨ７．４））上で選択を行ない、３７℃で一晩培養後に生育してきたコロニーを（Ｖ６８５Ａ＋Ｑ７８６Ｍ）変異体とした。さらに（Ｖ６８５Ａ＋Ｑ７８６Ｍ）変異体は実施例６に示す塩基配列決定法により変異の導入を確認した。その遺伝子配列を配列番号５８に、アミノ酸配列を配列番号５９に示す。
実施例２９  （Ｖ６８５Ａ＋Ｑ７８６Ｍ）変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの精製と活性評価
実施例２８で作製した（Ｖ６８５Ａ＋Ｑ７８６Ｍ）変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する大腸菌ＪＭ１０９株を用いて、実施例７に示した方法で、（Ｖ６８５Ａ＋Ｑ７８６Ｍ）変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの調製及び活性評価を行なった。なお、転写反応温度は４３から５０℃の範囲に設定し、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの酵素量を２０ｎｇ／μＬ、反応時間は３０分間とした。また、対照として野生型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いた。
各温度において生成したＲＮＡ量を図１６に示した。図１６から（Ｖ６８５Ａ＋Ｑ７８６Ｍ）変異型Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは野生型よりも反応温度４５℃以上でＲＮＡ生産量が多く、高温での比活性が向上していることがわかる。
［配列表］
0005625908.tif 000006
0005625908.tif 000007
0005625908.tif 000008
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0005625908.tif 000014
0005625908.tif 000015
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0005625908.tif 000017
0005625908.tif 000018
0005625908.tif 000019
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図６】
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