(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
再灌流の影響に対して哺乳動物の組織を治療するための組成物であって、フラジェリンを含む、組成物。
【請求項２】
前記再灌流が、傷害に起因する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記傷害が、虚血または低酸素である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記虚血が、頻脈、梗塞、急性腎不全に起因する虚血、脳卒中、低血圧、塞栓症、血栓塞栓症、鎌状赤血球症、体の末端に対する局部圧力、および腫瘍から成る群から選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記血栓塞栓症が血塊である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記低酸素が、低酸素血症低酸素、貧血性低酸素、低酸素血症低酸素および組織中毒性低酸素から成る群から選択される、請求項３に記載の組成物。
【請求項７】
前記低酸素血症低酸素が、一酸化炭素中毒、睡眠時無呼吸、慢性閉塞性肺疾患、呼吸停止およびシャントからなる群より選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記貧血性低酸素が低Ｏ２含有量である、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記傷害が、心筋梗塞、脳卒中、および急性腎傷害から成る群から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項１０】
前記局部圧力が、止血帯に起因する、請求項４に記載の組成物。
【請求項１１】
酸素の流入の前に、酸素の流入と共に、または酸素の流入の後に投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組織が、消化管、肺、腎臓、肝臓、心血管系、血管内皮、中枢神経系、末梢神経系、筋肉、骨、および毛包から成る群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
抗酸化剤と組み合わせて投与されることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記抗酸化剤が、アミホスチンおよびビタミンＥから成る群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００８年８月１日に出願された米国仮特許出願６１／０８５，７６６号の利益を主張し、その内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
本発明は、再灌流の影響から組織を治療するための、フラジェリン関連ポリペプチドの使用に関連する。
【背景技術】
【０００３】
血液および酸素の欠乏した組織は、不可逆的な臓器の損傷の可能性のある虚血性ネクローシスまたは梗塞を起こす。一旦血液および酸素の流れが臓器または組織に回復しても（再灌流）、その臓器はすぐには正常な虚血前の状態には戻らない。冠血管血流の再灌流は、虚血または低酸素組織または臓器が蘇生するために必要である。タイムリーな再灌流は、細胞の救済を促進し、そして罹患率および死亡率を減少させる。虚血領域の再灌流は、著明な内皮細胞の機能不全を含む、逆説機能不全を引き起こし得、それは血管収縮、血小板および白血球の活性化、オキシダント産生の増加、および液体およびタンパク質の血管外漏出の増加を引き起こす。
【０００４】
過去２０年以上にわたって、再灌流傷害を制限するためにデザインされた、いくつかの薬理学的介入が見られた。残念ながら、いくつかの薬剤の成功は、虚血および再灌流の実験モデルに限られていた。一貫した臨床的利点の欠如は、良くない臨床試験のデザイン、不適切な薬物動態学的（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｎｔｉｃ）／薬力学的研究、およびヒトインビボモデルの複雑さを含む、様々な因子に関連し得る。
【０００５】
虚血対再灌流の治療的戦略を区別するニーズが当該分野において存在し、そして最大限の臨床的利点を引き出すために、薬剤の組み合わせが必要である可能性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
再灌流の影響から哺乳類の組織を治療する方法が、本明細書中で提供され、それはフラジェリンを含む組成物を、組織の治療が必要な哺乳類に投与することを含み得る。その組成物を、アミホスチンおよびビタミンＥから成る群から選択され得る、抗酸化剤と組み合わせて投与し得る。
【０００７】
再灌流は、虚血または低酸素であり得る傷害によって起こり得る。虚血は、頻脈、梗塞、低血圧、塞栓症、血栓塞栓症（ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｏｂｌｉｓｍ）（血塊）、鎌状赤血球症、体の末端に対する局部圧力、および腫瘍から成る群から選択され得る。低酸素は、低酸素血症低酸素（一酸化炭素中毒、睡眠時無呼吸、慢性閉塞性肺疾患、呼吸停止、シャント）、貧血性低酸素（低Ｏ２含有量）、および組織中毒性低酸素から成る群から選択され得る。局部圧力は、止血帯に起因し得る。
【０００８】
その組成物を、酸素の流入の前に、それと共に、またはその後に投与し得る。その組織を、消化管、肺、腎臓、肝臓、心血管系、血管内皮、中枢神経系、末梢神経系、筋肉、骨、および毛包から成る群から選択し得る。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
再灌流の影響から哺乳動物の組織を治療する方法であって、該治療を必要とする哺乳動物に、フラジェリンを含む組成物を投与することを含む、方法。
（項目２）
前記再灌流が、傷害に起因し得る、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記傷害が、虚血または低酸素である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記虚血が、頻脈、梗塞、急性腎不全、脳卒中、低血圧、塞栓症、血栓塞栓症（血塊）、鎌状赤血球症、体の末端に対する局部圧力、および腫瘍から成る群から選択される、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記低酸素が、低酸素血症低酸素（一酸化炭素中毒；睡眠時無呼吸、慢性閉塞性肺疾患、呼吸停止；シャント）、貧血性低酸素（低Ｏ２含有量）、低酸素血症低酸素および組織中毒性低酸素から成る群から選択される、項目３に記載の方法。
（項目６）
前記傷害が、心筋梗塞、脳卒中、および急性腎傷害から成る群から選択される、項目２に記載の方法。
（項目７）
前記局部圧力が、止血帯に起因する、項目４に記載の方法。
（項目８）
前記組成物が、酸素の流入の前に、酸素の流入と共に、または酸素の流入の後に投与される、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記組織が、消化管、肺、腎臓、肝臓、心血管系、血管内皮、中枢神経系、末梢神経系、筋肉、骨、および毛包から成る群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目１０）
前記組成物が、抗酸化剤と組み合わせて投与される、項目１に記載の方法。
（項目１１）
前記抗酸化剤が、アミホスチンおよびビタミンＥから成る群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目１２）
再灌流の影響から哺乳動物の組織を治療する方法であって、該治療を必要とする哺乳動物に、ＴＬＲ５を標的とすることができる薬剤を含む組成物を投与することを含む、方法。
（項目１３）
前記薬剤が、ＴＬＲ５の抗体またはアゴニストである、項目１２に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、０．０１μｇ、０．５μｇ、１．０μｇ、または５．０μｇ／匹のいずれかの濃度において、フラジェリンを静脈内投与した後５日間のマウスの血清におけるクレアチニンのレベルを示す。
【図２】図２は、腎虚血を行う前に、マウスに投与したフラジェリンの作用（ａｆｆｅｃｔ）、および虚血腎臓の再灌流後の生存およびクレアチニンの測定を示す。パネルＡは、０．０１μｇ、０．５μｇ、１．０μｇ、または５．０μｇ／匹のいずれかの濃度のフラジェリン、またはコントロールとしてＰＢＳで前処置したマウスの生存パーセントを示す。パネルＢは、前処置マウスおよびコントロールマウスの同じ群におけるクレアチニンのレベルを示す。
【図３】図３は、ＰＢＳまたは０．０１μｇ、０．５μｇ、１．０μｇ、または５．０μｇ／匹のいずれかの濃度のフラジェリンで前処置した、再灌流の２４時間後の虚血腎臓細胞の病理組織（ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ）を示す。偽の（ｓｈａｍ）列は、腎虚血を行わなかったマウスから単離された腎臓細胞を示す。
【図４】図４は、再灌流の７日後の腎臓細胞の病理組織を示す。最初のパネルにおいて、病理組織スライドは、腎臓虚血の前にＰＢＳで前処置し、そして続いて虚血腎臓の再灌流を行ったマウスから単離された腎臓細胞を示す。最初のパネルにおいて、病理組織スライドは、腎虚血前にＰＢＳで前処置し、続いて虚血腎臓の再灌流を行なったマウスから単離した腎臓細胞を示す。２番目のパネルにおいて、その病理組織スライドは、０．５μｇ／匹の濃度のフラジェリンで前処置したが、腎臓虚血を行わなかったマウスから単離された腎臓細胞を示す。３番目のパネルは、０．５μｇ／匹の濃度のフラジェリンで前処置し、そして腎臓虚血を行い、そして続いて虚血腎臓の再灌流を行ったマウスから単離された腎臓細胞を示す病理組織スライドを示す。
【図５ａ】図５は、ＰＢＳまたは０．５μｇ／匹のフラジェリンで前処置したマウスから単離された虚血腎臓細胞への、再灌流の９時間および２４時間後の白血球浸潤の評価を示す。図５ａは、ＰＢＳまたは０．５μｇ／匹のフラジェリンで前処置したマウス由来の、虚血および非虚血処置腎臓細胞における、再灌流の９時間および２４時間後の好中球浸潤のレベルに関して免疫組織化学的に染色した腎臓組織細胞である。図５ｂは、ＰＢＳまたは０．５μｇ／匹の濃度のフラジェリンで前処置したマウスから単離された腎臓組織細胞へ浸潤している好中球、マクロファージ、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数である。図５ｃ
【図５ｂ】図５は、ＰＢＳまたは０．５μｇ／匹のフラジェリンで前処置したマウスから単離された虚血腎臓細胞への、再灌流の９時間および２４時間後の白血球浸潤の評価を示す。図５ａは、ＰＢＳまたは０．５μｇ／匹の濃度のフラジェリンで前処置したマウス由来の、虚血および非虚血処置腎臓細胞における、再灌流の９時間および２４時間後の好中球浸潤のレベルに関して免疫組織化学的に染色した腎臓組織細胞である。図５ｂは、ＰＢＳまたは０．５μｇ／匹のフラジェリンで前処置したマウスから単離された腎臓組織細胞へ浸潤している好中球、マクロファージ、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数である。図５ｃ
【図５ｃ】図５は、ＰＢＳまたは０．５μｇ／匹のフラジェリンで前処置したマウスから単離された虚血腎臓細胞への、再灌流の９時間および２４時間後の白血球浸潤の評価を示す。図５ａは、ＰＢＳまたは０．５μｇ／匹の濃度のフラジェリンで前処置したマウス由来の、虚血および非虚血処置腎臓細胞における、再灌流の９時間および２４時間後の好中球浸潤のレベルに関して免疫組織化学的に染色した腎臓組織細胞である。図５ｂは、ＰＢＳまたは０．５μｇ／匹のフラジェリンで前処置したマウスから単離された腎臓組織細胞へ浸潤している好中球、マクロファージ、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数である。図５ｃ
【図６】図６は、虚血腎臓組織への白血球浸潤の誘導における、ケモカインＣＸＣＬ１／ＫＣおよびＣＸＣＬ２／ＫＣを防止する、フラジェリンの重要な役割を示す。図６ｂは、フラジェリン前処置（ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）動物における、再灌流の９時間後の虚血腎臓において、急性期タンパク質ＩＬ−１ｂおよびＩＬ−６のｍＲＮＡレベルも減少したが、ＴＮＦａは減少しないことを示す。
【図６ｂ】図６は、虚血腎臓組織への白血球浸潤の誘導における、ケモカインＣＸＣＬ１／ＫＣおよびＣＸＣＬ２／ＫＣを防止する、フラジェリンの重要な役割を示す。図６ｂは、フラジェリン前処置（ｐｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ）動物における、再灌流の９時間後の虚血腎臓において、急性期タンパク質ＩＬ−１ｂおよびＩＬ−６のｍＲＮＡレベルも減少したが、ＴＮＦａは減少しないことを示す。
【図７−１】図７は、４５分間の両側性腎臓茎閉塞を受け、そして０．５μｇのフラジェリンを腎臓クランプの除去後様々な時間に投与された、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群における、生存およびクレアチニンレベルを示す。
【図７−２】図７は、４５分間の両側性腎臓茎閉塞を受け、そして０．５μｇのフラジェリンを腎臓クランプの除去後様々な時間に投与された、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群における、生存およびクレアチニンレベルを示す。
【図８】図８は、野生型骨髄で再構成した野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの虚血腎臓の再灌流の３０分以内における、０．５μｇのフラジェリンの投与は、ＣＸＣＬ１およびＣＸＣＬ２ｍＲＮＡレベルを減少させたことを示す。ＭｙＤ８８−／−または野生型骨髄で再構成したＭｙＤ８８−／−レシピエントにおいて、虚血腎臓の再灌流の間、ＣＸＣＬ１およびＣＸＣＬ２ｍＲＮＡはほとんど誘導されず、そしてこれらの腎臓の再灌流の間のフラジェリンの投与は、これらのケモカインのｍＲＮＡレベルを減少させなかった。対照的に、ＭｙＤ８８−／−ドナー由来の骨髄の野生型レシピエントは、高レベルのＣＸＣＬ１およびＣＸＣＬ２ｍＲＮＡを発現し、そしてこれらのレベルは、虚血腎臓の再灌流の間のフラジェリンの投与によって減少した。
【図９】図９は、抗ＴＬＲ５抗体で染色した、野生型Ｃ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃマウス由来の腎臓切片を示す。図９ｂは、ＴＬＲ５ｍＲＮＡの発現レベルは、腎臓虚血／再灌流を行う前の腎臓において低かったが、虚血腎臓の再灌流の間に迅速に増加したことを示す。
【図１０】図１０は、細菌フラジェリンのドメイン構造を示す。Ｆ４１のＣａバックボーントレース、疎水性コアの分布、および構造情報。ドメインＤ１、Ｄ２ａ、Ｄ２ｂ、およびＤ３を規定する、４つの別々の疎水性コア。全ての疎水性側鎖原子を、Ｃａバックボーンと共に示す。側鎖原子は色分けされている：Ａｌａ、黄；Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、またはＶａｌ、橙；ＰｈｅおよびＴｙｒ、紫（炭素原子）および赤（酸素原子）。ｃ、フラジェリンのアミノ酸配列の様々な構造的特徴の位置および領域。上から下へ：Ｆ４１断片を青で；３つのｂ−ｆｏｌｉｕｍ  ｆｏｌｄを茶で；ａ−ヘリックスを有する２次構造分布を黄で；ｂ−構造を緑で、そしてｂ−ターンを紫で；５０残基ごとにチックマーク（ｔｉｃ  ｍａｒｋ）を青で；ドメインＤ０、Ｄ１、Ｄ２およびＤ３；プロトエレメント（ｐｒｏｔｏ−ｅｌｅｍｅｎｔ）内の軸サブユニット接触領域をシアンで；よく保存されたアミノ酸配列を赤で、そして可変領域を青紫で；異なるスーパーコイルのエレメントを生じるＦ４１の点変異。下部の文字は、変異エレメントの形態を示す：Ｌ（Ｄ１０７Ｅ、Ｒ１２４Ａ、Ｒ１２４Ｓ、Ｇ４２６Ａ）、Ｌ型直鎖；Ｒ（Ａ４４９Ｖ）、Ｒ型直鎖；Ｃ（Ｄ３１３Ｙ、Ａ４１４Ｖ、Ａ４２７Ｖ、Ｎ４３３Ｄ）、カーリー３３（ｃｕｒｌｙ３３）。
【図１１】図１１は、サルモネラフラジェリンドメイン、その断片、およびそのＴＬＲ５との相互作用の概略図を示す。黒いバーは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ａ’、およびＢ’を含む断片を構築するために使用されるフラジェリン遺伝子の領域を示す。
【図１２】図１２は、フラジェリン誘導体を示す。選択されたフラジェリン誘導体（右側に列挙）のドメイン構造およびおよその境界（アミノ酸座標）。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｄｕｂｌｉｎのＦｌｉＣフラジェリンは、５０５アミノ酸（ａａ）内にコードされる。
【図１３−１】図１３は、以下のフラジェリン変異体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す：ＡＡ’（配列番号第７−８番）、ＡＢ’（配列番号第９−１０番）、ＢＡ’（配列番号第１１−１２番）、ＢＢ’（配列番号第１３−１４番）、ＣＡ’（配列番号第１５−１６番）、ＣＢ’（配列番号第１７−１８番）、Ａ（配列番号第１９−２０番）、Ｂ（配列番号第２１−２２番）、Ｃ（配列番号第２３−２４番）、ＧＳＴ−Ａ’（配列番号第２５−２６番）、ＧＳＴ−Ｂ’（配列番号第２７−２８番）、ＡＡ’ｎ１−１７０（配列番号第２９−３０番）、ＡＡ’ｎ１−１６３（配列番号第３３−３４番）、ＡＡ’ｎ５４−１７０（配列番号第３１−３２番）、ＡＡ’ｎ５４−１６３（配列番号第３３５−３６番）、ＡＢ’ｎ１−１７０（配列番号第３７−３８番）、ＡＢ’ｎ１−１６３（配列番号第３９−４０番）、ＡＡ’ｎ１−１２９（配列番号第４１−４２番）、ＡＡ’ｎ５４−１２９（配列番号第４３−４４番）、ＡＢ’ｎ１−１２９（配列番号第４５−４６番）、ＡＢ’ｎ５４−１２９（配列番号第４７−４８番）、ＡＡ’ｎ１−１００（配列番号第４９−５０番）、ＡＢ’ｎ１−１００（配列番号第５１−５２番）、ＡＡ’ｎ１−７０（配列番号第５３−５４番）、およびＡＢ’ｎ１−７０（配列番号第５５−５６番）。ｐＲＳＥＴｂリーダー配列を、イタリック体で示す（リーダーはＭｅｔを含み、それはまたＦｌｉＣのアミノ酸１である）。Ｎ末端定常ドメインを下線で示す。アミノ酸リンカー配列を太字で示す。Ｃ末端定常ドメインを下線で示す。もし存在するなら、ＧＳＴを強調する。
【図１３−２】図１３は、以下のフラジェリン変異体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す：ＡＡ’（配列番号第７−８番）、ＡＢ’（配列番号第９−１０番）、ＢＡ’（配列番号第１１−１２番）、ＢＢ’（配列番号第１３−１４番）、ＣＡ’（配列番号第１５−１６番）、ＣＢ’（配列番号第１７−１８番）、Ａ（配列番号第１９−２０番）、Ｂ（配列番号第２１−２２番）、Ｃ（配列番号第２３−２４番）、ＧＳＴ−Ａ’（配列番号第２５−２６番）、ＧＳＴ−Ｂ’（配列番号第２７−２８番）、ＡＡ’ｎ１−１７０（配列番号第２９−３０番）、ＡＡ’ｎ１−１６３（配列番号第３３−３４番）、ＡＡ’ｎ５４−１７０（配列番号第３１−３２番）、ＡＡ’ｎ５４−１６３（配列番号第３３５−３６番）、ＡＢ’ｎ１−１７０（配列番号第３７−３８番）、ＡＢ’ｎ１−１６３（配列番号第３９−４０番）、ＡＡ’ｎ１−１２９（配列番号第４１−４２番）、ＡＡ’ｎ５４−１２９（配列番号第４３−４４番）、ＡＢ’ｎ１−１２９（配列番号第４５−４６番）、ＡＢ’ｎ５４−１２９（配列番号第４７−４８番）、ＡＡ’ｎ１−１００（配列番号第４９−５０番）、ＡＢ’ｎ１−１００（配列番号第５１−５２番）、ＡＡ’ｎ１−７０（配列番号第５３−５４番）、およびＡＢ’ｎ１−７０（配列番号第５５−５６番）。ｐＲＳＥＴｂリーダー配列を、イタリック体で示す（リーダーはＭｅｔを含み、それはまたＦｌｉＣのアミノ酸１である）。Ｎ末端定常ドメインを下線で示す。アミノ酸リンカー配列を太字で示す。Ｃ末端定常ドメインを下線で示す。もし存在するなら、ＧＳＴを強調する。
【図１３−３】図１３は、以下のフラジェリン変異体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す：ＡＡ’（配列番号第７−８番）、ＡＢ’（配列番号第９−１０番）、ＢＡ’（配列番号第１１−１２番）、ＢＢ’（配列番号第１３−１４番）、ＣＡ’（配列番号第１５−１６番）、ＣＢ’（配列番号第１７−１８番）、Ａ（配列番号第１９−２０番）、Ｂ（配列番号第２１−２２番）、Ｃ（配列番号第２３−２４番）、ＧＳＴ−Ａ’（配列番号第２５−２６番）、ＧＳＴ−Ｂ’（配列番号第２７−２８番）、ＡＡ’ｎ１−１７０（配列番号第２９−３０番）、ＡＡ’ｎ１−１６３（配列番号第３３−３４番）、ＡＡ’ｎ５４−１７０（配列番号第３１−３２番）、ＡＡ’ｎ５４−１６３（配列番号第３３５−３６番）、ＡＢ’ｎ１−１７０（配列番号第３７−３８番）、ＡＢ’ｎ１−１６３（配列番号第３９−４０番）、ＡＡ’ｎ１−１２９（配列番号第４１−４２番）、ＡＡ’ｎ５４−１２９（配列番号第４３−４４番）、ＡＢ’ｎ１−１２９（配列番号第４５−４６番）、ＡＢ’ｎ５４−１２９（配列番号第４７−４８番）、ＡＡ’ｎ１−１００（配列番号第４９−５０番）、ＡＢ’ｎ１−１００（配列番号第５１−５２番）、ＡＡ’ｎ１−７０（配列番号第５３−５４番）、およびＡＢ’ｎ１−７０（配列番号第５５−５６番）。ｐＲＳＥＴｂリーダー配列を、イタリック体で示す（リーダーはＭｅｔを含み、それはまたＦｌｉＣのアミノ酸１である）。Ｎ末端定常ドメインを下線で示す。アミノ酸リンカー配列を太字で示す。Ｃ末端定常ドメインを下線で示す。もし存在するなら、ＧＳＴを強調する。
【図１３−４】図１３は、以下のフラジェリン変異体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す：ＡＡ’（配列番号第７−８番）、ＡＢ’（配列番号第９−１０番）、ＢＡ’（配列番号第１１−１２番）、ＢＢ’（配列番号第１３−１４番）、ＣＡ’（配列番号第１５−１６番）、ＣＢ’（配列番号第１７−１８番）、Ａ（配列番号第１９−２０番）、Ｂ（配列番号第２１−２２番）、Ｃ（配列番号第２３−２４番）、ＧＳＴ−Ａ’（配列番号第２５−２６番）、ＧＳＴ−Ｂ’（配列番号第２７−２８番）、ＡＡ’ｎ１−１７０（配列番号第２９−３０番）、ＡＡ’ｎ１−１６３（配列番号第３３−３４番）、ＡＡ’ｎ５４−１７０（配列番号第３１−３２番）、ＡＡ’ｎ５４−１６３（配列番号第３３５−３６番）、ＡＢ’ｎ１−１７０（配列番号第３７−３８番）、ＡＢ’ｎ１−１６３（配列番号第３９−４０番）、ＡＡ’ｎ１−１２９（配列番号第４１−４２番）、ＡＡ’ｎ５４−１２９（配列番号第４３−４４番）、ＡＢ’ｎ１−１２９（配列番号第４５−４６番）、ＡＢ’ｎ５４−１２９（配列番号第４７−４８番）、ＡＡ’ｎ１−１００（配列番号第４９−５０番）、ＡＢ’ｎ１−１００（配列番号第５１−５２番）、ＡＡ’ｎ１−７０（配列番号第５３−５４番）、およびＡＢ’ｎ１−７０（配列番号第５５−５６番）。ｐＲＳＥＴｂリーダー配列を、イタリック体で示す（リーダーはＭｅｔを含み、それはまたＦｌｉＣのアミノ酸１である）。Ｎ末端定常ドメインを下線で示す。アミノ酸リンカー配列を太字で示す。Ｃ末端定常ドメインを下線で示す。もし存在するなら、ＧＳＴを強調する。
【図１３−５】図１３は、以下のフラジェリン変異体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す：ＡＡ’（配列番号第７−８番）、ＡＢ’（配列番号第９−１０番）、ＢＡ’（配列番号第１１−１２番）、ＢＢ’（配列番号第１３−１４番）、ＣＡ’（配列番号第１５−１６番）、ＣＢ’（配列番号第１７−１８番）、Ａ（配列番号第１９−２０番）、Ｂ（配列番号第２１−２２番）、Ｃ（配列番号第２３−２４番）、ＧＳＴ−Ａ’（配列番号第２５−２６番）、ＧＳＴ−Ｂ’（配列番号第２７−２８番）、ＡＡ’ｎ１−１７０（配列番号第２９−３０番）、ＡＡ’ｎ１−１６３（配列番号第３３−３４番）、ＡＡ’ｎ５４−１７０（配列番号第３１−３２番）、ＡＡ’ｎ５４−１６３（配列番号第３３５−３６番）、ＡＢ’ｎ１−１７０（配列番号第３７−３８番）、ＡＢ’ｎ１−１６３（配列番号第３９−４０番）、ＡＡ’ｎ１−１２９（配列番号第４１−４２番）、ＡＡ’ｎ５４−１２９（配列番号第４３−４４番）、ＡＢ’ｎ１−１２９（配列番号第４５−４６番）、ＡＢ’ｎ５４−１２９（配列番号第４７−４８番）、ＡＡ’ｎ１−１００（配列番号第４９−５０番）、ＡＢ’ｎ１−１００（配列番号第５１−５２番）、ＡＡ’ｎ１−７０（配列番号第５３−５４番）、およびＡＢ’ｎ１−７０（配列番号第５５−５６番）。ｐＲＳＥＴｂリーダー配列を、イタリック体で示す（リーダーはＭｅｔを含み、それはまたＦｌｉＣのアミノ酸１である）。Ｎ末端定常ドメインを下線で示す。アミノ酸リンカー配列を太字で示す。Ｃ末端定常ドメインを下線で示す。もし存在するなら、ＧＳＴを強調する。
【図１３−６】図１３は、以下のフラジェリン変異体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す：ＡＡ’（配列番号第７−８番）、ＡＢ’（配列番号第９−１０番）、ＢＡ’（配列番号第１１−１２番）、ＢＢ’（配列番号第１３−１４番）、ＣＡ’（配列番号第１５−１６番）、ＣＢ’（配列番号第１７−１８番）、Ａ（配列番号第１９−２０番）、Ｂ（配列番号第２１−２２番）、Ｃ（配列番号第２３−２４番）、ＧＳＴ−Ａ’（配列番号第２５−２６番）、ＧＳＴ−Ｂ’（配列番号第２７−２８番）、ＡＡ’ｎ１−１７０（配列番号第２９−３０番）、ＡＡ’ｎ１−１６３（配列番号第３３−３４番）、ＡＡ’ｎ５４−１７０（配列番号第３１−３２番）、ＡＡ’ｎ５４−１６３（配列番号第３３５−３６番）、ＡＢ’ｎ１−１７０（配列番号第３７−３８番）、ＡＢ’ｎ１−１６３（配列番号第３９−４０番）、ＡＡ’ｎ１−１２９（配列番号第４１−４２番）、ＡＡ’ｎ５４−１２９（配列番号第４３−４４番）、ＡＢ’ｎ１−１２９（配列番号第４５−４６番）、ＡＢ’ｎ５４−１２９（配列番号第４７−４８番）、ＡＡ’ｎ１−１００（配列番号第４９−５０番）、ＡＢ’ｎ１−１００（配列番号第５１−５２番）、ＡＡ’ｎ１−７０（配列番号第５３−５４番）、およびＡＢ’ｎ１−７０（配列番号第５５−５６番）。ｐＲＳＥＴｂリーダー配列を、イタリック体で示す（リーダーはＭｅｔを含み、それはまたＦｌｉＣのアミノ酸１である）。Ｎ末端定常ドメインを下線で示す。アミノ酸リンカー配列を太字で示す。Ｃ末端定常ドメインを下線で示す。もし存在するなら、ＧＳＴを強調する。
【図１３−７】図１３は、以下のフラジェリン変異体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す：ＡＡ’（配列番号第７−８番）、ＡＢ’（配列番号第９−１０番）、ＢＡ’（配列番号第１１−１２番）、ＢＢ’（配列番号第１３−１４番）、ＣＡ’（配列番号第１５−１６番）、ＣＢ’（配列番号第１７−１８番）、Ａ（配列番号第１９−２０番）、Ｂ（配列番号第２１−２２番）、Ｃ（配列番号第２３−２４番）、ＧＳＴ−Ａ’（配列番号第２５−２６番）、ＧＳＴ−Ｂ’（配列番号第２７−２８番）、ＡＡ’ｎ１−１７０（配列番号第２９−３０番）、ＡＡ’ｎ１−１６３（配列番号第３３−３４番）、ＡＡ’ｎ５４−１７０（配列番号第３１−３２番）、ＡＡ’ｎ５４−１６３（配列番号第３３５−３６番）、ＡＢ’ｎ１−１７０（配列番号第３７−３８番）、ＡＢ’ｎ１−１６３（配列番号第３９−４０番）、ＡＡ’ｎ１−１２９（配列番号第４１−４２番）、ＡＡ’ｎ５４−１２９（配列番号第４３−４４番）、ＡＢ’ｎ１−１２９（配列番号第４５−４６番）、ＡＢ’ｎ５４−１２９（配列番号第４７−４８番）、ＡＡ’ｎ１−１００（配列番号第４９−５０番）、ＡＢ’ｎ１−１００（配列番号第５１−５２番）、ＡＡ’ｎ１−７０（配列番号第５３−５４番）、およびＡＢ’ｎ１−７０（配列番号第５５−５６番）。ｐＲＳＥＴｂリーダー配列を、イタリック体で示す（リーダーはＭｅｔを含み、それはまたＦｌｉＣのアミノ酸１である）。Ｎ末端定常ドメインを下線で示す。アミノ酸リンカー配列を太字で示す。Ｃ末端定常ドメインを下線で示す。もし存在するなら、ＧＳＴを強調する。
【図１３−８】図１３は、以下のフラジェリン変異体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す：ＡＡ’（配列番号第７−８番）、ＡＢ’（配列番号第９−１０番）、ＢＡ’（配列番号第１１−１２番）、ＢＢ’（配列番号第１３−１４番）、ＣＡ’（配列番号第１５−１６番）、ＣＢ’（配列番号第１７−１８番）、Ａ（配列番号第１９−２０番）、Ｂ（配列番号第２１−２２番）、Ｃ（配列番号第２３−２４番）、ＧＳＴ−Ａ’（配列番号第２５−２６番）、ＧＳＴ−Ｂ’（配列番号第２７−２８番）、ＡＡ’ｎ１−１７０（配列番号第２９−３０番）、ＡＡ’ｎ１−１６３（配列番号第３３−３４番）、ＡＡ’ｎ５４−１７０（配列番号第３１−３２番）、ＡＡ’ｎ５４−１６３（配列番号第３３５−３６番）、ＡＢ’ｎ１−１７０（配列番号第３７−３８番）、ＡＢ’ｎ１−１６３（配列番号第３９−４０番）、ＡＡ’ｎ１−１２９（配列番号第４１−４２番）、ＡＡ’ｎ５４−１２９（配列番号第４３−４４番）、ＡＢ’ｎ１−１２９（配列番号第４５−４６番）、ＡＢ’ｎ５４−１２９（配列番号第４７−４８番）、ＡＡ’ｎ１−１００（配列番号第４９−５０番）、ＡＢ’ｎ１−１００（配列番号第５１−５２番）、ＡＡ’ｎ１−７０（配列番号第５３−５４番）、およびＡＢ’ｎ１−７０（配列番号第５５−５６番）。ｐＲＳＥＴｂリーダー配列を、イタリック体で示す（リーダーはＭｅｔを含み、それはまたＦｌｉＣのアミノ酸１である）。Ｎ末端定常ドメインを下線で示す。アミノ酸リンカー配列を太字で示す。Ｃ末端定常ドメインを下線で示す。もし存在するなら、ＧＳＴを強調する。
【図１３−９】図１３は、以下のフラジェリン変異体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す：ＡＡ’（配列番号第７−８番）、ＡＢ’（配列番号第９−１０番）、ＢＡ’（配列番号第１１−１２番）、ＢＢ’（配列番号第１３−１４番）、ＣＡ’（配列番号第１５−１６番）、ＣＢ’（配列番号第１７−１８番）、Ａ（配列番号第１９−２０番）、Ｂ（配列番号第２１−２２番）、Ｃ（配列番号第２３−２４番）、ＧＳＴ−Ａ’（配列番号第２５−２６番）、ＧＳＴ−Ｂ’（配列番号第２７−２８番）、ＡＡ’ｎ１−１７０（配列番号第２９−３０番）、ＡＡ’ｎ１−１６３（配列番号第３３−３４番）、ＡＡ’ｎ５４−１７０（配列番号第３１−３２番）、ＡＡ’ｎ５４−１６３（配列番号第３３５−３６番）、ＡＢ’ｎ１−１７０（配列番号第３７−３８番）、ＡＢ’ｎ１−１６３（配列番号第３９−４０番）、ＡＡ’ｎ１−１２９（配列番号第４１−４２番）、ＡＡ’ｎ５４−１２９（配列番号第４３−４４番）、ＡＢ’ｎ１−１２９（配列番号第４５−４６番）、ＡＢ’ｎ５４−１２９（配列番号第４７−４８番）、ＡＡ’ｎ１−１００（配列番号第４９−５０番）、ＡＢ’ｎ１−１００（配列番号第５１−５２番）、ＡＡ’ｎ１−７０（配列番号第５３−５４番）、およびＡＢ’ｎ１−７０（配列番号第５５−５６番）。ｐＲＳＥＴｂリーダー配列を、イタリック体で示す（リーダーはＭｅｔを含み、それはまたＦｌｉＣのアミノ酸１である）。Ｎ末端定常ドメインを下線で示す。アミノ酸リンカー配列を太字で示す。Ｃ末端定常ドメインを下線で示す。もし存在するなら、ＧＳＴを強調する。
【図１３−１０】図１３は、以下のフラジェリン変異体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す：ＡＡ’（配列番号第７−８番）、ＡＢ’（配列番号第９−１０番）、ＢＡ’（配列番号第１１−１２番）、ＢＢ’（配列番号第１３−１４番）、ＣＡ’（配列番号第１５−１６番）、ＣＢ’（配列番号第１７−１８番）、Ａ（配列番号第１９−２０番）、Ｂ（配列番号第２１−２２番）、Ｃ（配列番号第２３−２４番）、ＧＳＴ−Ａ’（配列番号第２５−２６番）、ＧＳＴ−Ｂ’（配列番号第２７−２８番）、ＡＡ’ｎ１−１７０（配列番号第２９−３０番）、ＡＡ’ｎ１−１６３（配列番号第３３−３４番）、ＡＡ’ｎ５４−１７０（配列番号第３１−３２番）、ＡＡ’ｎ５４−１６３（配列番号第３３５−３６番）、ＡＢ’ｎ１−１７０（配列番号第３７−３８番）、ＡＢ’ｎ１−１６３（配列番号第３９−４０番）、ＡＡ’ｎ１−１２９（配列番号第４１−４２番）、ＡＡ’ｎ５４−１２９（配列番号第４３−４４番）、ＡＢ’ｎ１−１２９（配列番号第４５−４６番）、ＡＢ’ｎ５４−１２９（配列番号第４７−４８番）、ＡＡ’ｎ１−１００（配列番号第４９−５０番）、ＡＢ’ｎ１−１００（配列番号第５１−５２番）、ＡＡ’ｎ１−７０（配列番号第５３−５４番）、およびＡＢ’ｎ１−７０（配列番号第５５−５６番）。ｐＲＳＥＴｂリーダー配列を、イタリック体で示す（リーダーはＭｅｔを含み、それはまたＦｌｉＣのアミノ酸１である）。Ｎ末端定常ドメインを下線で示す。アミノ酸リンカー配列を太字で示す。Ｃ末端定常ドメインを下線で示す。もし存在するなら、ＧＳＴを強調する。
【図１３−１１】図１３は、以下のフラジェリン変異体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す：ＡＡ’（配列番号第７−８番）、ＡＢ’（配列番号第９−１０番）、ＢＡ’（配列番号第１１−１２番）、ＢＢ’（配列番号第１３−１４番）、ＣＡ’（配列番号第１５−１６番）、ＣＢ’（配列番号第１７−１８番）、Ａ（配列番号第１９−２０番）、Ｂ（配列番号第２１−２２番）、Ｃ（配列番号第２３−２４番）、ＧＳＴ−Ａ’（配列番号第２５−２６番）、ＧＳＴ−Ｂ’（配列番号第２７−２８番）、ＡＡ’ｎ１−１７０（配列番号第２９−３０番）、ＡＡ’ｎ１−１６３（配列番号第３３−３４番）、ＡＡ’ｎ５４−１７０（配列番号第３１−３２番）、ＡＡ’ｎ５４−１６３（配列番号第３３５−３６番）、ＡＢ’ｎ１−１７０（配列番号第３７−３８番）、ＡＢ’ｎ１−１６３（配列番号第３９−４０番）、ＡＡ’ｎ１−１２９（配列番号第４１−４２番）、ＡＡ’ｎ５４−１２９（配列番号第４３−４４番）、ＡＢ’ｎ１−１２９（配列番号第４５−４６番）、ＡＢ’ｎ５４−１２９（配列番号第４７−４８番）、ＡＡ’ｎ１−１００（配列番号第４９−５０番）、ＡＢ’ｎ１−１００（配列番号第５１−５２番）、ＡＡ’ｎ１−７０（配列番号第５３−５４番）、およびＡＢ’ｎ１−７０（配列番号第５５−５６番）。ｐＲＳＥＴｂリーダー配列を、イタリック体で示す（リーダーはＭｅｔを含み、それはまたＦｌｉＣのアミノ酸１である）。Ｎ末端定常ドメインを下線で示す。アミノ酸リンカー配列を太字で示す。Ｃ末端定常ドメインを下線で示す。もし存在するなら、ＧＳＴを強調する。
【図１４】図１４Ａは、ヘマトキシリン／エオジン染色を用いた、３時間の温虚血後の再灌流の１４日後の、マウス後肢筋肉の組織を示す（ここでそのマウスに、再灌流の１５分以内に０．５μｇのＣＢＬＢ５０２を与えた）。図１４Ｂは、ヘマトキシリン／エオジン染色を用いた、３時間の温虚血後の再灌流の１４日後の、マウス後肢筋肉の組織を示す（ここでそのマウスに、再灌流の１５分以内にビヒクル（ＰＢＳ）を与えた）。図１４Ｃは、３時間の虚血後に、再灌流の１５分以内にＣＢＬＢ５０２またはＰＢＳのいずれかを投与したマウスの四肢における組織浮腫の湿潤／乾燥比を示す。浮腫の比をまた、ＣＢＬＢ５０１またはＰＢＳを投与したが、３時間の虚血を割愛したマウスの四肢において測定した。図１５は、３時間の虚血後に、再灌流の１５分以内にＣＢＬＢ５０１またはＰＢＳのいずれかを投与したマウスの四肢の重量１グラムあたりのＢｌｕｅ  Ｄｙｅを用いた、血管漏出の湿潤／乾燥比（ｒａｔｉｏｎ）を示す。血管漏出の比をまた、ＣＢＬＢ５０１またはＰＢＳを投与したが、３時間の虚血を割愛したマウスの四肢において測定した。
【図１５】図１５は、２１種の細菌由来の、保存されたアミノ（図１５Ａ）およびカルボキシ（図１５Ｂ）末端のアミノ酸配列の比較を示す。ＴＬＲ５の活性に重要な、１３個の保存されたアミノ酸を、陰影で示す。そのアミノ酸配列を、ＴｒＥＭＢＬ（最初の文字＝Ｑ）またはＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ（最初の文字＝Ｐ）からの受託番号によって同定する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
発明者らは、フラジェリンは、再灌流の影響から保護するという驚くべき発見をした。血液からの酸素および栄養素の欠乏または減少は、循環の回復が、正常な機能の回復ではなく、酸化ストレスの誘導によって炎症および酸化損傷を生じる状況を作る。回復した血流は、細胞内に酸素を再導入し、それは細胞タンパク質、ＤＮＡおよび形質膜を損傷する。細胞膜への損傷は、次により多くのフリーラジカルの放出を引き起こし得る。そのような反応性の種はまた、酸化還元シグナル伝達において作用して、虚血組織細胞のアポトーシスを誘導する。それに加えて、炎症性反応はさらに組織を損傷する。新しく戻った血液によってその領域に運ばれた白血球は、組織の損傷に反応して、インターロイキンおよびフリーラジカルのような多数の炎症性因子を放出する。白血球はまた毛細血管に蓄積し得、毛細血管を閉塞し、そしてより虚血を引き起こす。理論によって拘束されないが、フラジェリンは、組織に対する酸化および炎症性ストレスを低下させ、それによってアポトーシスを予防し、そして組織の正常状態へのより速い回復を可能にすることによって、再灌流の影響からの保護を提供し得る。このフラジェリンの保護的性質を、再灌流の開始時に使用し得る、または再灌流のためのさらなる損傷を予防するために使用し得る。以下で記載する発明は、部分的には、再灌流の影響から哺乳類の組織を治療するための、フラジェリンの投与に関連する。
【００１１】
１．定義
本明細書中で使用される用語は、特定の実施態様のみを記載する目的のためであり、そして制限することを意図しない。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を指示しなければ、複数の指示対象を含む。
【００１２】
本明細書中における数の範囲の列挙に関して、同じ程度の正確さを有するその間に入る数それぞれが、明確に意図される。例えば、６〜９の範囲に関して、数７および８が、６および９に加えて意図され、そして範囲６．０〜７．０に関して、数６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９および７．０が明らかに意図される。
【００１３】
「投与する」は、ＮＦ−κＢ活性を誘導する薬剤の投薬を意味し得、その薬剤の単回用量または複数回用量を意味する。
【００１４】
「アナログ」は、ペプチドまたはポリペプチドの文脈において、１つまたは複数の非標準アミノ酸、または従来のアミノ酸のセットからの他の構造的変種を含むペプチドまたはポリペプチドを意味し得る。
【００１５】
「抗体」は、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはＩｇＥの抗体、または断片、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄおよび一本鎖抗体を含むその断片または誘導体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、二機能性抗体およびその誘導体を意味し得る。その抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、アフィニティー精製抗体、または望ましいエピトープまたはそれ由来の配列に対して十分な結合特異性を示すその混合物であり得る。その抗体はまた、キメラ抗体であり得る。その抗体を、当該分野で公知の、１つまたは複数の化学的、ペプチド、またはポリペプチド部分の結合によって誘導体化し得る。その抗体を、化学的部分と結合し得る。
【００１６】
「アポトーシス」は、細胞質の小器官の完全性の保存を伴う、進行性の細胞体積の収縮；光学顕微鏡または電子顕微鏡で見られるようなクロマチンの凝縮（すなわち核凝縮）；および／または遠心沈降アッセイによって決定されるような、ヌクレオソームサイズの断片へのＤＮＡ切断を含む、細胞死の形式を意味し得る。細胞死は、無傷の（ｉｎｔａｃｔ）細胞断片（「アポトーシス小体」）の食細胞による貪食を伴って、細胞の膜の完全性が失われたとき（例えば膜小胞形成）に起こる。
【００１７】
「ペプチド」または「ポリペプチド」は、連結したアミノ酸の配列を意味し得、そして天然、合成、または天然または合成の修飾または組み合わせであり得る。
【００１８】
「治療する」、「治療」または「治療すること」はそれぞれ、一時的または持続的に、症状、臨床的徴候、または状態または障害の基礎にある病理の出現を、軽減する、抑制する、抑圧する、排除する、予防する、または遅らせることを意味し得る。疾患の予防は、疾患の発症前に、本発明の組成物を動物に投与することを含む。疾患の抑制は、疾患の誘発後であるが、その臨床的出現の前に、本発明の組成物を動物に投与することを含む。疾患の抑圧は、疾患の臨床的出現の後に、本発明の組成物を動物に投与することを含む。
【００１９】
２．再灌流の影響の治療
本明細書中において、フラジェリンを含む組成物を、再灌流の影響の治療が必要な哺乳類に投与することにより、再灌流の影響を治療する方法が提供される。再灌流は、傷害によって引き起こされ得る。
【００２０】
再灌流は、損傷後に血液の供給が体の構成要素に戻ったときに、その体の構成要素を傷害し得る。再灌流の影響は、傷害そのものよりも、体の構成要素にとってより有害であり得る。酸素フリーラジカル、細胞内カルシウム過負荷、および内皮機能障害を含む、再灌流のいくつかのメカニズムおよびメディエーターが存在する。過剰な量の活性酸素種は、前に損傷した体の構成要素に再導入された場合、連続的な還元を受け、酸素フリーラジカルの形成を引き起こす。スーパーオキシドアニオン、ヒドロキシルラジカル、およびペルオキシナイトライトのような、強力なオキシダントラジカルが、体の構成要素への再流の最初の数分以内に産生され得、そして再灌流傷害の発生において重要な役割を果たし得る。酸素フリーラジカルはまた、分子酸素の還元以外の供給源から産生され得る。これらの供給源は、キサンチンオキシダーゼ、チトクロムオキシダーゼ、およびシクロオキシゲナーゼのような酵素、およびカテコラミンの酸化を含む。
【００２１】
再灌流はまた、好中球の活性化および集積に対して強力に刺激するものであり、それは次に活性酸素種産生に対して強力に刺激するものとして作用する。具体的には、好中球呼吸バーストの主な産物は、過酸化水素、フリー酸素ラジカル、および次亜塩素酸塩を含む強力な酸化剤である。好中球は、通常全循環白血球の５０から６０％を占める、最もよくある型の貪食細胞であり、そして通常損傷した体の構成要素の部位へ到着する最初の細胞である。酸素由来フリーラジカルは、多価不飽和脂肪酸と反応することによって損傷を生じ、脂質過酸化物およびヒドロペルオキシドの形成を引き起こし、それは体の構成要素を損傷し、そして膜結合酵素システムの機能を障害する。フリーラジカルは、内皮の血小板活性化因子および好中球活性化因子のようなケモカイン、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１、およびケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１の放出を刺激し、それがより多くの好中球を誘引し、そしてオキシダントラジカルの産生および再灌流傷害の程度を増幅する。活性酸素種はまた、一酸化窒素を消失させ、内皮の傷害および組織細胞機能不全を悪化させる。産生の増加に加えて、内因性オキシダント除去酵素の相対的な欠損も存在し、それがさらにフリーラジカルによる心機能不全を悪化させる。
【００２２】
再灌流はさらに、著明な内皮細胞機能不全を引き起こし得る。内皮機能障害は、再灌流の重要なメディエーターである、血小板および好中球活性化によって特徴付けられる、血栓形成促進性の表現型の発現を促進する。一旦好中球が機能不全内皮と接触すれば、それらは活性化され、そして一連の詳細に明らかにされた段階（ローリング、安定した接着、および遊出）で、それらは自然免疫反応の一部として、内皮細胞接合部を通って、組織傷害の領域へ遊走する。
【００２３】
細胞内カルシウムホメオスタシスの変化が、再灌流の発生において重要な役割を果たす。再灌流は、細胞内カルシウムの増加と関連し得る；この影響は、Ｌ型カルシウムチャネルを通した、筋細胞膜のカルシウム流入の増加と関連し得る、または筋質小網（ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）カルシウムサイクリングの変化に対し二次的なものであり得る。細胞内カルシウム過負荷に加えて、カルシウムに対する筋フィラメントの感受性の変化が、再灌流に結びつけられた。結果として生じる筋フィラメントタンパク質分解による、カルシウム依存性プロテアーゼ（カルパインＩ）の活性化が、トロポニンのタンパク質分解と同様、再灌流傷害を強調すると示唆された。
【００２４】
傷害を受けた組織細胞の再灌流は、細胞代謝の変化を有し、それは次に機能回復の遅延に寄与し得る。例えば、傷害は細胞において、ラクテートの正味の生産を有する細胞での嫌気性代謝を誘導し得る。ラクテートの放出は再灌流の間持続し、正常な好気性代謝への回復の遅延を示唆する。同様に、ミトコンドリアピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）の活性は、傷害後４０％まで阻害され得、そして再灌流の３０分後まで抑制されたままであり得る。
【００２５】
再灌流の間のこれらのイベントはそれぞれ、組織細胞へのストレスおよび組織細胞のプログラム細胞死（アポトーシス）およびネクローシスを引き起こし得る。アポトーシスは通常、傷ついた、および遺伝的に損傷した細胞から組織を「浄化」するよう機能し、一方サイトカインは、病原体に対する生物体の防衛システムを動員するよう作用する。しかし、重症の傷害の条件下では、両方のストレス反応メカニズムが、それ自身で死の原因として作用し得る。
【００２６】
ａ．フラジェリン
フラジェリンは、フラジェリン関連ポリペプチドであり得る。フラジェリンは、様々なグラム陽性およびグラム陰性細菌種を含む、任意の供給源由来であり得る。フラジェリンは、その内容が本明細書中で参考文献に組み込まれる、米国特許公開第２００３／００４４４２９号の図７において描写された、細菌種由来の２３個のフラジェリンのうちの１つのアミノ酸配列を有し得る。米国特許公開第２００３／００４４４２９の図７で列挙されたフラジェリンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋデータベースを含む供給源において、公的に入手可能である。
【００２７】
フラジェリンは、細菌鞭毛の主な構成成分であり得る。フラジェリンは、３つのドメインから成り得る（図１０）。ドメイン１（Ｄ１）およびドメイン２（Ｄ２）は、不連続であり得、そしてアミノ末端およびカルボキシ末端の残基が、ヘアピン構造の形成によって近接する場合に形成され得る。Ｄ１およびＤ２ドメインを含むアミノおよびカルボキシ末端は最も保存され得、一方中央の超可変ドメイン（Ｄ３）は、高度に可変性であり得る。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉヒンジによって分けられたアミノＤ１およびＤ２およびカルボキシルＤ１およびＤ２を含む組換えタンパク質（ＮＤ１−２／ＥＣＨ／ＣＤ２）を用いた研究は、Ｄ１およびＤ２が、ＥＣＨエレメントと結合した場合に生物活性であり得ることを示す。このキメラは、２つの腸管上皮細胞系統において、ＩｋＢａ分解、ＮＦ−κＢ活性化、およびＮＯおよびＩＬ−８産生を誘導し得るが、ヒンジ単独ではしない。保存されていないＤ３ドメインは、鞭毛フィラメントの表面に存在し得、そして主な抗原性エピトープを含み得る。フラジェリンの強力な炎症性活性は、高度に保存されたＮおよびＣ  Ｄ１およびＤ２領域に存在し得る。
【００２８】
フラジェリンは、Ｔｏｌｌ様受容体５（ＴＬＲ５）への結合によって、ＮＦ−κＢ活性を誘導し得る。ＴＬＲファミリーは、少なくとも１０個のメンバーから成り得、そして病原体に対する自然免疫防御において必須である。自然免疫系は、微生物病原体において保存されている、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を認識し得る。ＴＬＲは、細菌フラジェリンに特別な、保存された構造を認識し得る。その保存された構造は、アミノ酸含有量の変動にいくらか許容的な残基の大きな群から成り得る。Ｓｍｉｔｈら、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：１２４７−５３（２００３）は、ＴＬＲ５によって認識される保存された構造の一部である、フラジェリンの１３個の保存アミノ酸を同定した。ＴＬＲ５活性に重要であり得るフラジェリンの１３個の保存アミノ酸を、図１１に示す。
【００２９】
フラジェリンは、サルモネラ種由来であり得、その代表的な例はＳ．ｄｕｂｌｉｎ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ８４９７２によってコードされる）（配列番号第１番）であり得る。フラジェリン関連ポリペプチドは、ＴＬＲ５に結合し、そしてＮＦ−κＢ活性の活性化のようなＴＬＲ５による活性を誘導する、配列番号第１番の断片、変異体、アナログ、ホモログ、または誘導体、またはその組み合わせであり得る。フラジェリンの断片、変異体、アナログ、ホモログ、または誘導体を、フラジェリンのドメイン構造およびＴＬＲ５によって認識される保存された構造に基づいた、合理的なデザインによって得ることができる。
【００３０】
フラジェリンは、図１１に示す、１３個の保存されたアミノ酸のうちの少なくとも１０、１１、１２、または１３個を含み得る（位置８９、９０、９１、９５、９８、１０１、１１５、４２２、４２３、４２６、４３１、４３６および４５２）。フラジェリンは、配列番号第１番のアミノ酸１から１７４および４１８から５０５と、少なくとも３０−９９％同一であり得る。図２６は、配列番号第１番と比較した、公知のＴＬＲ−５刺激活性を有するフラジェリンのアミノおよびカルボキシ末端の同一性パーセントを列挙する。
【００３１】
フラジェリンは、その内容が本明細書中に組み込まれる、米国特許公開２００３／００００４４４２９において開示されたフラジェリンポリペプチド、および米国特許公開２００３／００００４４４２９の図２５において示されたＢＬＡＳＴ結果に列挙された受託番号に対応するフラジェリンペプチドまたはその変異体を含むがそれに限らない、任意のグラム陽性またはグラム陰性細菌種由来のフラジェリンポリペプチドであり得る。
【００３２】
フラジェリンは、ＴＬＲ５活性を刺激し得る。少なくともいくらかのＴＬＲ５刺激活性を保持する、フラジェリンの多くの欠失変異体が作製された。フラジェリンは、本明細書中の実施例で開示された欠失変異体であり得、そしてアミノ酸１８５から３０６または４４４から４９２を欠く、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｄ１３６８９、またはアミノ酸１７９−４１５を欠くＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ８４９７３から翻訳された配列、またはその変異体を含み得る。
【００３３】
フラジェリンは、トランスポゾンの挿入および可変Ｄ３ドメインへの変化を含み得る。Ｄ３ドメインを、部分的に、または全体として、その変異体がＴＬＲ５活性を刺激するように、Ｄ１およびＤ２ドメインが適切にフォールディングすることを可能にするヒンジまたはリンカーポリペプチドで置換し得る。変異体ヒンジエレメントを、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭｕｋＢタンパク質において見出し得、そして配列番号第３および４番で示したような配列、またはその変異体を有し得る。
【００３４】
ＴＬＲ５受容体を標的化するために、他の薬剤を使用し得る。これらの薬剤は、ＴＬＲ５のアゴニストであり得、そしてＴＬＲ５活性を刺激し得る。そのアゴニストは、抗ＴＬＲ５抗体または他の小分子であり得る。
【００３５】
ｂ．傷害
体の構成要素への傷害によって、再灌流の影響を引き起こし得る。その傷害は、虚血、低酸素、梗塞、または塞栓症のためであり得る。傷害の治療は、再灌流および体の構成要素に対するさらなる損傷を引き起こし得る。
【００３６】
（１）虚血
虚血は、体の構成要素への血液供給の絶対的または相対的な不足であり得る。相対的不足は、体の構成要素に供給される血液（酸素送達）対、適当な酸素付加のために体の構成要素に必要な血液の、いかに小さくてもミスマッチであり得る。虚血はまた、供給血管の狭窄または封鎖による、体の一部への不適切な血流であり得、そして体の任意の構成要素に影響し得る。不十分な血液の供給は、体の構成要素を低酸素にする、または酸素が全く供給されなければ、無酸素にする。これは、ネクローシスを引き起こし得る。虚血のメカニズムは、非常に異なり得る。例えば、任意の体の構成要素に対する虚血は、頻脈（異常に速い心拍）、動脈硬化症（動脈の管腔を閉塞する脂質を含むプラーク）、低血圧（敗血症性ショック、心不全における低い血圧）、血栓塞栓症（血塊）、血管の外側の圧迫（腫瘍）、塞栓症（循環における異物、例えば羊水（ａｍｎｉｏｎｔｉｃ  ｆｌｕｉｄ）塞栓症）、鎌状赤血球症（異常な形のヘモグロビン）、梗塞、血流を制限し、血液を体の末端へ強制する誘導ｇ力、凍傷、氷、不適切な冷却圧迫治療による局所的な極度の寒冷、および止血帯のような、四肢への血流を制限する任意の他の力のためであり得る。四肢への血流を制限する力は、重症の裂傷、切開、ナイフで切ることのような穿刺、鈍的力外傷による粉砕損傷、および銃撃または榴散弾弾子の創傷による銃創のために必要とされ得る。虚血は、心臓疾患、虚血性大腸炎、一過性虚血発作、脳血管偶発症候、急性腎傷害、破裂動静脈奇形、および末梢動脈閉塞性疾患（ｄｉｓｅａｅ）の特徴であり得る。
【００３７】
（２）低酸素
低酸素は、酸素の適当な供給の欠乏（ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ）であり得る。低酸素は、全体としての体（全身性低酸素）または体の領域（組織低酸素）が、適当な酸素供給が欠乏している病的状態であり得る。動脈酸素のレベルにおける変動は、体の構成要素による酸素の供給および需要の間のミスマッチのためであり得る。酸素供給の完全な欠乏は、無酸素である。低酸素は、低酸素血症低酸素、貧血性低酸素、低酸素血症低酸素、組織中毒性低酸素、組織中毒性低酸素および虚血性低酸素であり得る。
【００３８】
低酸素血症低酸素は、動脈血における低い酸素分圧によって起こる体全体に対する酸素の不十分な供給であり得る。低酸素血症低酸素は、高地におけるような、環境酸素の低い分圧、下水溝のような、変化した（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）大気の換気混合物における酸素の置換、亜酸化窒素の娯楽的使用におけるような意図的な酸素の置換、睡眠時無呼吸または減呼吸による血液の酸素飽和度の減少、慢性閉塞性肺疾患または呼吸停止のような不十分な肺の換気、肺循環の解剖学的または機械的シャント、または心臓および肺の右左シャントのためであり得る。シャントは、依然として灌流している、虚脱した肺胞、またはその肺の領域への換気の阻害を引き起こし得る。テベージウス（Ｔｈｅｂｅｓｉａ）血管が左心室および気管支へ酸素を供給する気管支循環へ入るので、シャントは肺システムのための血液が換気されないようにし、そしてガス交換を阻害し得る。
【００３９】
貧血性低酸素は、全酸素含有量が減少するが、動脈酸素圧は正常な状態であり得る。低酸素血症低酸素は、血液が酸素を標的の体構成要素へ送達できない場合であり得る。低酸素血症低酸素は、ヘモグロビンの、それに結合した酸素を放出する能力を阻害する一酸化炭素中毒、または血液中に蓄積する異常なヘモグロビン、メトヘモグロビン血症によって起こり得る。
【００４０】
組織中毒性低酸素は、無能になった酸化的リン酸化酵素により、効率的に酸素を使えないためであり得る。
【００４１】
（３）梗塞
梗塞は、虚血を引き起こし得る病的状態の型である。梗塞は、閉塞のために十分な血液供給の喪失を引き起こしたネクローシス組織の巨視的な領域であり得る。梗塞は、血小板から成り、そして心臓、脾臓、および腎臓のような内臓組織においてネクローシスを引き起こす白色梗塞であり得る。梗塞は、肺の内臓組織における赤血球およびフィブリン鎖から成る赤色梗塞であり得る。梗塞と関連する疾患は、心筋梗塞、肺塞栓症、脳血管偶発症候（脳卒中）、急性腎不全、末梢動脈閉塞性疾患（例は壊疽である）、抗リン脂質症候群、敗血症、巨細胞性動脈炎（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、ヘルニア、および腸捻転を含み得る。
【００４２】
（４）塞栓症
塞栓症は、虚血を引き起こし得る病的状態の型である。塞栓症は、体の１つの部分から移動し、そして体の別の部分で血管の閉塞または遮断を引き起こすものであり得る。塞栓症は、血栓塞栓症、脂肪塞栓症、空気塞栓症、敗血症性塞栓症、組織塞栓症、異物塞栓症、羊水塞栓症であり得る。血栓塞栓症は、血栓症の部位から、完全にまたは部分的に脱離した血塊であり得る。脂肪塞栓症は、血液循環に逸脱した内因性脂肪組織であり得る。骨折は、破裂した血管および動脈への脂肪組織の漏出の１つの例である。空気塞栓症は、肺胞の破裂および血管に漏出する吸入した空気であり得る。鎖骨下静脈の破裂または静脈内治療が、血管への空気の漏出の例である。ガス塞栓症は窒素およびヘリウムのような気体であり得る。なぜなら、それは不溶性でありそして血液中で小さい泡を形成するからである。
【００４３】
ｃ．体の構成要素
本発明は、哺乳類における体構成要素の治療に関連する。体構成要素は、臓器、組織、または細胞であり得る。体構成要素は、腹部、寛骨臼、脂肪、副腎皮質、副腎、副腎髄質、肺胞マクロファージ、羊膜、大動脈、動脈、腹水（ａｓｃｉｔｅｓ）、腹水（ａｓｃｉｔｉｃ  ｆｌｕｉｄ）、腋窩リンパ節、膀胱、血液、骨、骨髄、腸、脳、乳房、気管支、軟骨、尾幹（ｃａｕｄａｌ  ｔｒｕｎｋ）、小脳、子宮頸部、絨毛膜絨毛、結腸、結膜、結合組織、角膜、真皮、脊髄神経節、十二指腸、異形成舌粘膜、卵、胚、内分泌、子宮内膜、内皮、表皮、上皮、赤血球形成、眼、線維芽細胞、ひれ、胎児、足、包皮、Ｇａｓｓｅｒ’ｓ  ｎｏｄｅ、歯肉間質（ｇｉｎｇｉｖａｌ  ｓｔｒｏｍａ）、性腺、鼠径部リンパ節、心臓、上腕骨、回腸、腸管、回盲部（ｉｌｅｏｃｅｃａｌ）、回腸、ランゲルハンス（Ｌａｎｇｅｒｈａｎｍ）島、腎臓、幼生（ｌａｒｖａ）、幼生（ｌａｒｖａｌ）、喉頭、肝臓、肺、肺（気管支肺胞上皮）、リンパ、リンパ節、リンパ組織、リンパ球系、リンパ球系臓器、乳房、乳房肺胞小結節（ｍａｍｍａｒｙ  ａｌｖｅｏｌａｒ  ｎｏｄｕｌｅ）、乳腺、中腎、中皮、脱皮若虫、口、筋肉、鼻腔内、鼻中隔、神経系、神経、食道胃接合部、食道、経口、卵巣、口蓋間葉、膵臓、乳頭卵巣（ｐａｐｉｌｌａｒｙ  ｏｖａｒｉａｎ）、陰茎、末梢血、腹膜、咽頭、下垂体、胎盤、胸水、胸膜液、前立腺、さなぎ（ｐｕｐａｌ  ｏｖａｒｙ）、直腸、網膜、右軸リンパ節、唾液腺管、唾液腺、骨格筋、皮膚、小腸（ｓｍａｌｌ  ｂｏｗｅｌ）、小腸（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）、軟組織、脾臓、胸骨、胃、尾、精巣、睾丸、大腿、胸腺、甲状腺（ｔｈｙｒｏｉｄ）、甲状腺（ｔｈｙｒｏｉｄ  ｇｌａｎｄｓ）、舌、扁桃腺、気管、体幹、鼻甲介、臍帯、臍、子宮、膣、内臓、外陰部、胃腸管、肺、腎臓、肝臓、心血管系、血管内皮、中枢および末梢神経系、筋肉、骨、毛包、および卵黄嚢由来であり得る。
【００４４】
３．組成物
本発明はまた、治療的に有効な量のフラジェリンを含む組成物に関連する。その組成物は、当該分野で周知の方法を用いて産生され得る医薬組成物であり得る。その組成物はまた、助剤（ｃｏａｇｅｎｔ）を含み得る。上記で記載したように、その組成物を、再灌流の影響を治療するために、哺乳類へ投与し得る。
【００４５】
ａ．投与
本明細書中で記載された方法を用いた組成物の投与は、経口投与、非経口投与、舌下投与、経皮投与、直腸内投与、経粘膜投与、局所投与、吸入投与、口腔投与、またはその組み合わせであってよい。非経口投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、くも膜下腔内、および関節内を含むがこれに限らない。獣医学的な使用のために、その組成物を、通常の獣医学的医療に従う適切に許容可能な製剤として投与し得る。獣医は、特定の動物に最も適当な投与レジメおよび投与経路を容易に決定し得る。その組成物を、ヒト患者、ネコ、イヌ、大型動物、または鳥類へ投与し得る。
【００４６】
その組成物を、他の治療薬と同時に、または規則正しく投与し得る。本明細書中で使用される「同時」または「同時に」という用語は、その組成物および他の治療薬を、お互いに４８時間以内、好ましくは２４時間以内、より好ましくは１２時間以内、さらにより好ましくは６時間以内、そして最も好ましくは３時間以内またはそれより少ない時間以内に、投与することを意味する。本明細書中で使用される「規則正しく」という用語は、他の治療薬と異なる時間における、そして反復投与に対応したある特定の頻度における、その組成物の投与を意味する。
【００４７】
その組成物を、再灌流の約１２０時間、１１８時間、１１６時間、１１４時間、１１２時間、１１０時間、１０８時間、１０６時間、１０４時間、１０２時間、１００時間、９８時間、９６時間、９４時間、９２時間、９０時間、８８時間、８６時間、８４時間、８２時間、８０時間、７８時間、７６時間、７４時間、７２時間、７０時間、６８時間、６６時間、６４時間、６２時間、６０時間、５８時間、５６時間、５４時間、５２時間、５０時間、４８時間、４６時間、４４時間、４２時間、４０時間、３８時間、３６時間、３４時間、３２時間、３０時間、２８時間、２６時間、２４時間、２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、５５分、５０分、４５分、４０分、３５分、３０分、２５分、２０分、１５分、１０分、９分、８分、７分、６分、５分、４分、３分、２分、および１分前を含む、再灌流前の任意の時点で投与し得る。その組成物を、傷害の約１２０時間、１１８時間、１１６時間、１１４時間、１１２時間、１１０時間、１０８時間、１０６時間、１０４時間、１０２時間、１００時間、９８時間、９６時間、９４時間、９２時間、９０時間、８８時間、８６時間、８４時間、８２時間、８０時間、７８時間、７６時間、７４時間、７２時間、７０時間、６８時間、６６時間、６４時間、６２時間、６０時間、５８時間、５６時間、５４時間、５２時間、５０時間、４８時間、４６時間、４４時間、４２時間、４０時間、３８時間、３６時間、３４時間、３２時間、３０時間、２８時間、２６時間、２４時間、２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、５５分、５０分、４５分、４０分、３５分、３０分、２５分、２０分、１５分、１０分、９分、８分、７分、６分、５分、４分、３分、２分、および１分前を含む、傷害前の任意の時点で投与し得る。
【００４８】
その組成物を、再灌流の約１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、２４時間、２６時間、２８時間、３０時間、３２時間、３４時間、３６時間、３８時間、４０時間、４２時間、４４時間、４６時間、４８時間、５０時間、５２時間、５４時間、５６時間、５８時間、６０時間、６２時間、６４時間、６６時間、６８時間、７０時間、７２時間、７４時間、７６時間、７８時間、８０時間、８２時間、８４時間、８６時間、８８時間、９０時間、９２時間、９４時間、９６時間、９８時間、１００時間、１０２時間、１０４時間、１０６時間、１０８時間、１１０時間、１１２時間、１１４時間、１１６時間、１１８時間、および１２０時間後を含む、再灌流後の任意の時点で投与し得る。
【００４９】
ｂ．製剤化
本方法は、再灌流の影響に対する治療のための、組成物を投与することを含み得る。本明細書中で提供される組成物は、従来の方式で製剤化された、錠剤またはロゼンジの形態であり得る。例えば、経口投与のための錠剤およびカプセルは、結合剤、増量剤、滑沢剤、崩壊剤、および湿潤剤を含むがこれに限らない、従来の賦形剤を含み得る。結合剤は、シロップ、アラビアゴム（ａｃｃａｃｉａ）、ゼラチン、ソルビトール、トラガカントゴム、デンプンおよびポリビニルピロリドンの粘漿剤を含むがこれに限らない。増量剤は、ラクトース、糖、微晶性セルロース、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、およびソルビトールを含むがこれに限らない。滑沢剤は、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、ポリエチレングリコール、およびシリカを含むがこれに限らない。崩壊剤は、ジャガイモデンプンおよびデンプングリコール酸（ｇｌｙｃｏｌｌａｔｅ）ナトリウムを含むがこれに限らない。湿潤剤は、ラウリル硫酸ナトリウムを含むがこれに限らない。錠剤を、当該分野で周知の方法によってコーティングし得る。
【００５０】
本明細書中で提供される組成物はまた、水性または油性懸濁液、溶液、エマルション、シロップ、およびエリキシルを含むがこれに限らない、液体製剤であり得る。その組成物をまた、使用前に水または他の適当なビヒクルによって構成するための乾燥製品として製剤化し得る。そのような液体製剤は、懸濁剤、乳化剤、非水性ビヒクルおよび保存剤を含むがこれに限らない添加物を含み得る。懸濁剤は、ソルビトールシロップ、メチルセルロース、グルコース／糖シロップ、ゼラチン、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ステアリン酸アルミニウムゲル、および硬化食用脂肪を含むがこれに限らない。乳化剤は、レシチン、モノオレイン酸ソルビタン、およびアラビアゴムを含むがこれに限らない。非水性ビヒクルは、食用油、アーモンド油、分画ココナッツ油、油性エステル、プロピレングリコール、およびエチルアルコールを含むがこれに限らない。保存剤は、メチルまたはプロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸およびソルビン酸を含むがこれに限らない。
【００５１】
本明細書中で提供される組成物をまた、坐剤として製剤化し得、それはカカオバターまたはグリセリドを含むがこれに限らない、坐剤基剤を含み得る。本明細書中で提供される組成物をまた、吸入のために製剤化し得、それは、ジクロロジフルオロメタンまたはトリクロロフルオロメタンのような噴霧剤を用いて、乾燥粉末として、またはエアロゾルの形態で投与し得る、溶液、懸濁液、またはエマルションを含むがこれに限らない形態であってよい。本明細書中で提供される組成物をまた、クリーム、軟膏、ローション、ペースト、薬用プラスター、パッチ、または膜を含むがこれに限らない、水性または非水性ビヒクルを含む経皮製剤として製剤化し得る。
【００５２】
本明細書中で提供される組成物をまた、注射または持続注入を含むがこれに限らない非経口投与のために製剤化し得る。注射のための製剤は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、またはエマルションの形態であり得、そして懸濁剤、安定化剤、および分散剤を含むがこれに限らない処方剤を含み得る。その組成物をまた、滅菌、発熱物質を含まない水を含むがこれに限らない適当なビヒクルで再構成するための粉末形態で提供し得る。
【００５３】
本明細書中で提供される組成物をまた、デポー製剤として製剤化し得、それを埋め込みによってまたは筋肉内注射によって投与し得る。その組成物を、適当なポリマー性または疎水性物質（例えば許容可能な油中のエマルションとして）、イオン交換樹脂、または難溶性誘導体（例えば難溶性塩として）を用いて製剤化し得る。
【００５４】
ｃ．投与量
本方法は、治療的に有効な量の組成物を、その必要のある患者へ投与することを含み得る。治療において使用するために必要な、治療的に有効な量は、治療する状態の性質、造血幹細胞を血流中に増加させるために所望される時間の長さ、および患者の年齢／状態によって変動する。しかし、一般的に、成人ヒト治療のために採用される用量は、典型的には１日あたり０．００１ｍｇ／ｋｇから約２００ｍｇ／ｋｇの範囲である。その用量は、１日あたり約１μｇ／ｋｇから約１００μｇ／ｋｇであり得る。所望の用量を、単回用量で、または適当な間隔で、例えば１日あたり２回、３回、４回またはそれを超えるサブ用量として投与する複数回用量として、簡便に投与し得る。複数回用量が望ましい、または必要である場合がある。
【００５５】
その投与量は、約０．１μｇ／ｋｇ、０．２μｇ／ｋｇ、０．３μｇ／ｋｇ、０．４μｇ／ｋｇ、０．５μｇ／ｋｇ、０．６μｇ／ｋｇ、０．７μｇ／ｋｇ、０．８μｇ／ｋｇ、０．９μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ、７５μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ、１２５μｇ／ｋｇ、１５０μｇ／ｋｇ、１７５μｇ／ｋｇ、２００μｇ／ｋｇ、２２５μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、２７５μｇ／ｋｇ、３００μｇ／ｋｇ、３２５μｇ／ｋｇ、３５０μｇ／ｋｇ、３７５μｇ／ｋｇ、４００μｇ／ｋｇ、４２５μｇ／ｋｇ、４５０μｇ／ｋｇ、４７５μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ、５２５μｇ／ｋｇ、５５０μｇ／ｋｇ、５７５μｇ／ｋｇ、６００μｇ／ｋｇ、６２５μｇ／ｋｇ、６５０μｇ／ｋｇ、６７５μｇ／ｋｇ、７００μｇ／ｋｇ、７２５μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、７７５μｇ／ｋｇ、８００μｇ／ｋｇ、８２５μｇ／ｋｇ、８５０μｇ／ｋｇ、８７５μｇ／ｋｇ、９００μｇ／ｋｇ、９２５μｇ／ｋｇ、９５０μｇ／ｋｇ、９７５μｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇを含むがこれに限らない、任意の投与量であり得る。
【００５６】
４．助剤（ｃｏａｇｅｎｔ）
フラジェリンまたはその組成物を、助剤と同時投与し得る。その助剤は、再灌流の影響を遅延させるまたは予防する任意の化合物であり得る。その助剤は抗酸化剤であり得る。その抗酸化剤は、他の分子、細胞、組織、または臓器の酸化を遅延または予防し得る。その抗酸化剤は、ビタミンＥ、アスコルビン酸、グルタチオン、リポ酸、尿酸、β−カロチンのようなカロチン、およびレチノール、ビタミンＥおよびコエンザイムＱ、システインのようなチオール、システアミン、グルタチオン、およびビリルビン（ｂｉｌｒｕｂｉｎ）、アミホスチン、およびフラボノイド（ｆｌａｖａｎｏｉｄｓ）であり得る。
【００５７】
その助剤は、ナトリウム−水素交互輸送阻害剤であり得る。傷害および再灌流は、著しい細胞内アシドーシスを引き起こし得る。ナトリウム−水素交互輸送阻害剤を、プロトン放出を抑制し、そしてＣａ２＋の増加を防止するために使用し得る。ナトリウム−水素阻害剤は、カリポリドであり得る。
【００５８】
その助剤は、インスリンであり得る。インスリンを、ＰＤＨ活性を刺激し、そして再灌流後のＰＤＨ活性の阻害を防止するために使用し得る。
【００５９】
その助剤は、アデノシンであり得る。アデノシンを、ミトコンドリアＫＡＴＰチャネルを開口するために使用し得る。
【００６０】
５．併用治療
本方法を、傷害を治療するための他の方法と組み合わせて使用し得る。他の方法は、心筋梗塞（心臓発作）、肺塞栓症、脳血管偶発症候（脳卒中）、末梢動脈閉塞性疾患（例は壊疽である）、抗リン脂質症候群、敗血症、巨細胞性動脈炎、ヘルニア、腸捻転、固形腫瘍癌、減圧病、鎌状赤血球貧血、鎖骨下静脈の破裂、骨折、高地病、亜酸化窒素の娯楽使用、睡眠時無呼吸、減呼吸、シャント、貧血、一酸化炭素中毒、メトヘモグロビン血症（ｍｅｔｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎａｅｍｉａ）、血栓塞栓症、脂肪塞栓症、空気塞栓症、敗血症性塞栓症、組織塞栓症、異物塞栓症、羊水塞栓症、誘導ｇ力、および重度の切り傷、去勢、または切断のために血流を抑制するための外部圧力の治療であり得る。その方法をまた、低用量の硫化水素（ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｓｕｌｆａｔｅ）（Ｈ２Ｓ）、ｇｌｉｓｏｄｅｎ、またはコムギグリアジン（ｇｌｉａｌｉｎ）の投与、または低体温療法または大動脈遮断（ｃｒｏｓｓ−ｃｌａｍｐｉｎｇ）の実施のような、再灌流傷害を治療する方法と組み合わせて使用し得る。
【００６１】
本発明は、以下の制限しない実施例によって説明される、複数の局面を有する。
【実施例】
【００６２】
実施例１
腎機能に対するフラジェリンの用量依存性保護［フラジェリンはＴＬＲ５アゴニストであり得る］
特定の投与量において、フラジェリンは腎機能に影響を与えない。この影響を、異なる投与量のフラジェリンの全身性投与後に、マウスの血清におけるクレアチニンレベルを測定することによって実証した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、０．０１μｇ、０．５μｇ、１．０μｇ、または５．０μｇのいずれかのフラジェリンを注射し、そして図１に示すように、血清クレアチニンのレベル（ｍｇ／ｄｌ）を毎日モニターした。５μｇのフラジェリンの投与は、血清濃度の増加を引き起こし、それは投与後２４時間以内に明らかであった。さらに２４時間後（全部で４８時間後）、クレアチニンのレベルはピークに達し、そして次いで投与後７２時間までにバックグラウンドレベルまで戻り、そして次いで再び低いレベルまでゆっくりと上昇し始めた（図１）。対照的に、１μｇのフラジェリンの投与も、血清クレアチニンレベルの上昇を誘導したが、これは４８時間後に１回のピークとして検出されたのみであり、そして次いで投与後７２時間までにバックグラウンドレベルまで低下した。０．５μｇおよび０．１μｇの投与は、研究期間を通して、血清クレアチニンレベルにおいていかなる測定可能な増加も誘導しなかった。
【００６３】
実施例２
腎機能に対するフラジェリンの用量依存性の効果
特定の投与量において、フラジェリンは、急性腎虚血の影響から、哺乳類の腎組織を保護し得る。この効果は、フラジェリンを、腎虚血の実施（ｉｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）前にマウスに投与し、そして虚血腎臓の再灌流後の生存を測定することによって実証された。具体的には、４５分間の両側性腎臓茎（ｐｅｄｉｃｌｅ）閉塞を行う３０分前に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群に、４００μｌのＰＢＳ中様々な用量のフラジェリン（１匹あたり０．０１μｇ、０．５μｇ、１．０μｇ、または５．０μｇ）またはＰＢＳ単独（４００μｌ）のいずれかを静脈内投与によって投与した。次いでマウスの生存、血清クレアチニンレベル、および病理組織学的データを収集した。
【００６４】
ａ．生存
両側性腎茎閉塞を、以前に詳述されたようにマウスにおいて実施した（参考文献）。マウスに２０Ｕ（ユニット／ｍｌ）のヘパリンナトリウムを、腹腔内投与によって、手術の２０分前に投与した。そのマウスをフェノバルビタールによって麻酔し、そして手術まで６０−Ｗ白熱電球の下で温かく維持した。無菌条件下で、腹腔を正中線切開によって開き、そして両側腎茎を、微小血管クランプ（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓａｒａｓｏｔａ、ＦＬ）で非外傷性に閉塞し、そして創傷を一時的に４−０絹糸縫合によって閉鎖した。マウスを、６０ワット白熱電球の下でヒートパッド上に置き、そしてＴｒａｃｅａｂｌｅＴＭ  Ｃｅｒｔｉｆｉｃａｔｅ  Ｍｅｍｏｒｙ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｔｈｅｒｍｏｍｅｔｅｒ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を腹腔に置いて、腎虚血を実施している間の３２℃における温度の維持を保証した。腎臓は４５分間の虚血を受けた。クランプの除去後、即時および完全な腎再灌流を視覚的に確認し、そして腹膜腔を閉鎖した。偽手術マウスを、腎茎の両側性クランプ以外は同一の方式で処置した。
【００６５】
フラジェリン無しのＰＢＳを与えたコントロール群において、８０％の動物が、虚血腎臓の再灌流後５日以内に死亡した（図２ａを参照のこと）。腎虚血の実施前に５μｇのフラジェリンを与えた全ての動物が、再灌流後５日以内に死亡した。対照的に、腎虚血の前に１または０．５μｇいずれかのフラジェリンを与えた全ての動物は、再灌流後４５日を超えて生存した。０．１または０．０１μｇを与えた動物は傷害に対して保護されなかったので、急性腎虚血におけるフラジェリンの保護効果はまた、用量依存性であることが観察された。
【００６６】
ｂ．腎機能測定
腎機能に対するフラジェリンの保護的効果を決定するために、血清クレアチニンレベルも測定した。偽手術したマウスおよび両側性腎Ｉ／Ｒ傷害を受けたマウスを、イソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）で麻酔し、そして２４時間間隔で、ヘパリンでコーティングしたミクロキャピラリーチューブを用いて、眼窩後方叢から採血した。その血清を、測定まで−８０℃で保存した。血清クレアチニンレベルを、Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を用いて測定した。フラジェリンの保護的効果は、虚血実施の３０分前に１．２５または０．５μｇのフラジェリンを与えた動物において、再灌流後２４時間において決定した血清クレアチニンの低レベルによって反映された（図２ｂを参照のこと）。非保護的低用量のフラジェリン（０．１および０．０１μｇ）を与えた動物は、より高いレベルのクレアチニンレベルを有しており、それは両側性茎閉塞の３０分前にＰＢＳを与えたコントロール群において観察されたもののすぐ下のレベルであった。
【００６７】
ｃ．腎組織の組織学的研究
虚血−再灌流傷害の実施によって誘発される腎機能不全を示す、高い血清クレアチニンレベルは、再灌流の２４時間後の虚血腎臓の病理組織によって支持された（図３を参照のこと）。免疫組織化学に関して、回収した腎臓を半分にし、ＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ  Ｕ．Ｓ．Ａ．、Ｔｏｒｒｅｎｃｅ、ＣＡ）に包埋し、そして即座に液体窒素中で凍結した。冠状切片を切断し（７ｍｍ）、スライドにのせ、１時間乾燥し、そして次いでアセトンで１０分間固定した。スライドをＰＢＳに１０分間、および３％過酸化水素／メタノールに５分間室温で浸して、内因性ペルオキシダーゼ活性を排除した。内因性ビオチン活性を、Ｂｉｏｔｉｎ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＤＡＫＯ、Ｃａｒｐｅｎｔａｒｉａ、ＣＡ）でブロックした。正常ラット血清（１：１００）で処理した後、好中球を検出するために、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ中で１：１００に希釈した抗マウスＧｒ−１ｍＡｂ（ＲＢ６．８Ｃ５）、またはＣＤ４＋Ｔ細胞を検出するために、１：５０希釈のラット抗マウスＣＤ４ｍＡｂ（ＧＫ１．５）、ＣＤ８＋Ｔ細胞を検出するためにラット抗マウスＣＤ８ａｍＡｂ（５３−６．７）、またはラット抗マウスマクロファージ（Ｆ４／８０）ｍＡｂ（ＳＥＲＯＴＥＣ、Ｒａｌｅｉｇｈ、ＮＣ）を切片に加えた。コントロールスライドを、ラットＩｇＧとインキュベートした。１時間後、スライドをＰＢＳで３回洗浄し、そしてＰＢＳ／１％ＢＳＡ中で１：１００に希釈した、ビオチン化ウサギ抗ラットＩｇＧ抗血清（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）と２０分間インキュベートした。ＰＢＳで３回洗浄した後、スライドをストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＤＡＫＯ）と２０分間インキュベートした。ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジジン）基質−色素原（ｃｈｒｏｍａｇｅｎ）溶液（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を、０．５〜３分間スライドに適用した。ｄＨ２Ｏ中ですすいだ後、スライドをヘマトキシリンで対比染色し、ｄＨ２Ｏで洗浄し、カバーガラスをかけ、そして光学顕微鏡で観察した。画像を、Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ、ＭＤ）を用いて記録した。
【００６８】
ＴＬＲ５を染色するために、１ｍｇの抗ＴＬＲ５ｍＡｂ（ＡＢＲ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｇｏｌｄｅｎ、ＣＯ）をスライドへ適用し、そして室温で１時間インキュベートし、そして洗浄後１：１００に希釈したビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と室温で３０分間インキュベートした。ＤＡＢを適用した後、スライドを水道水（ｔａｐ  ｗａｔｅｒ）で洗浄し、ヘマトキシリンに３秒間浸し、そして次いで洗浄した。そのスライドを５０％まで増加する濃度のエタノールで脱水し、そして次いでそれぞれ、ｃｉｔｒａｓｏｌｖｅに２回、１０分間浸した。そのスライドを水道水で洗浄し、カバーガラスをかけ、そして光学顕微鏡で観察した。
【００６９】
虚血−再灌流傷害の実施によって誘発された腎機能不全を示すものとして血清クレアチニンレベルを使用することは、再灌流後２４時間の虚血腎臓の病理組織によって支持された（図３を参照のこと）。腎虚血の実施の３０分前にＰＢＳを与えたコントロール群の動物は、再灌流の２４時間後に明らかなｃａｓｔｅ形成を有する重度の尿細管ネクローシスを有していた。５μｇのフラジェリンの投与による腎機能不全の誘発と一致して、虚血の実施無しに、５μｇのフラジェリンの投与の３０分後に腎病理学の証拠が存在し、そしてこれは腎虚血および再灌流の実施後に、明らかな出血、血栓症およびｃａｓｔｅ形成を伴って重症度が増加した。対照的に、虚血の実施の３０分前に０．５μｇのフラジェリンを投与した動物は、再灌流の２４時間後、低レベルの白血球浸潤を有していたが、腎の構造は比較的正常に見えた。低い、非保護的用量の０．１μｇのフラジェリンは、虚血／再灌流傷害によって誘発された腎の病態を救出しなかった。生存動物の腎臓を、再灌流後７日目に調査した場合、腎虚血の実施前に０．５μｇのフラジェリンを投与した動物において、尿細管ネクローシスおよび白血球浸潤の著明な減少、および血栓症およびｃａｓｅ形成の欠如が観察された（図４を参照のこと）。
【００７０】
ｄ．損傷した腎組織への好中球の浸潤
好中球の浸潤および活性化が、腎虚血−再灌流後の組織傷害に主に寄与するものであるので、虚血の実施前にＰＢＳ単独または０．５μｇのフラジェリンで処置した動物から、再灌流の９および２４時間後に、虚血腎臓を回収し、そして好中球浸潤のレベルを、調製した組織切片の免疫組織化学的染色によって評価した。
【００７１】
再灌流の間の虚血腎臓における好中球、マクロファージ、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数を直接決定するために、回収した腎臓の４分の１の部分を切断し、そして重量を測定した。その腎臓を、２％ウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地中で１時間インキュベートし、そして次いでシリンジプランジャーを用いて、押して７０ｍｍのセルストレーナーを通した。その細胞を回収し、そしてＡＣＫ  Ｌｙｓｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＧＩＢＣＯ、Ｇｒａｎｄ  ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を用いて赤血球を溶解した。２回洗浄した後、生細胞の数を、トリパンブルー排除を用いて計測した。非特異的抗体結合をブロックするために、細胞のアリコートを抗ＣＤ１６／ＣＤ３２Ｆｃ受容体抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）と５分間プレインキュベートし、そして次いでサンプルを、マクロファージ（Ｆ４／８０）またはＣＤ８＋Ｔ細胞（５３−６．７）を検出するために、ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ４５ｍＡｂおよびＰＥ結合抗体と、および好中球（ＲＢ６．８Ｃ５）またはＣＤ４＋Ｔ細胞（ＧＫ１．５）を検出するために、ＡＰＣ結合抗体と、４℃で３０分間インキュベートした（全ての抗体はＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ由来）。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）において、２色フローサイトメトリーを用いて細胞を分析した。腎臓組織において白血球をゲートするために前方散乱およびＦＬ１（ＣＤ４５＋）チャネルを使用し、続いて特異的白血球集団を分析した。各サンプルについて、２００，０００イベントを蓄積した。そのデータを、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。各白血球集団の全数を、（計測した白血球の全数）×（ＣＤ４５＋細胞において計測した白血球集団の％）／１００によって計算した。そのデータを、偽およびＩ／Ｒ動物由来の腎組織１ｇあたりの各白血球集団の数として報告する。
【００７２】
動物に０．５μｇのフラジェリンを与えた場合、再灌流の９および２４時間後に、好中球浸潤の著明な減少が観察された（図５ａを参照のこと）。虚血腎臓への白血球浸潤の直接的定量は、０．５μｇのフラジェリンは、好中球の浸潤を、ほとんど偽手術コントロール動物で観察されるレベルまで抑制したことを示した（図５ｂを参照のこと）。再灌流の２４時間後に、虚血腎臓において、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞およびマクロファージの数の減少が観察され、そして虚血３０分前の０．５μｇのフラジェリンの投与は、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞両方の数をさらに減少させた。
【００７３】
実施例３
フラジェリン条件は、虚血腎臓の再灌流の間、炎症性サイトカイン発現を減少させる
この実施例は、虚血腎臓組織への白血球浸潤の誘導においてケモカインＣＸＣＬ１／ＫＣおよびＣＸＣＬ２／ＫＣを予防する、フラジェリンの重要な役割を実証する。以前の研究が、虚血腎臓における、好中球化学誘引物質ＣＸＣＬ１／ＫＣおよびＣＸＣＬ２／ＫＣのピークレベルが、再灌流の９時間後に起こることを示した［参考文献］。
【００７４】
動物を０．５μｇのフラジェリンで条件付けた場合の、虚血腎臓への白血球浸潤の低下の基礎にあるメカニズムの調査を開始するために、腎臓を再灌流の９および２４時間後に除去し、そして好中球およびマクロファージ化学誘引物質のｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを決定した（図６）。採取した腎臓から４分の１の部分を切り取り、そして液体窒素中で凍結した。全組織ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙＴＭ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて抽出し、そしてＨｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）を用いて逆転写した。Ｐｒｉｓｍ７７００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）において、テストＫＣ／ＣＸＣＬ１、ＭＩＰ−２／ＣＸＣＬ２およびＭＣＰ−１／ＣＣＬ２プライマーを用いてリアルタイムＰＣＲを行い、そしてＭｒｐ１３２をコントロールとして使用した（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）。
【００７５】
液体窒素に保存した腎臓サンプルを、０．０１ＭのＥＤＴＡおよびプロテイナーゼ阻害剤カクテル（１０ｍｇ／ｍｌのフェニルメチルスルホニルフルオリド、２ｍｇ／ｍｌのアプロチニン、２ｍｇ／ｍｌのロイペプチン、１００ｍｇ／ｍｌのＰｅｆａｂｌｏｃＳＣ、および１００ｍｇ／ｍｌのキモスタチン）を含む５００ｍｌのＰＢＳ中に溶解し、そして次いでＰＢＳ中１．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を１ｍｌ加えた。撹拌しながら４℃で１時間インキュベートした後、サンプルを遠心し、上清を回収し、そしてＢＣＡＴＭ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて全タンパク質濃度を決定した。ＫＣ／ＣＸＣＬ１、ＭＩＰ−２／ＣＸＣＬ２およびＭＣＰ−１／ＣＣＬ２濃度を、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｍ  Ｋｉｔｓ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。虚血腎臓の再灌流の間の好中球の活性化を決定するために、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）の濃度を、マウスＭＰＯ  ＥＬＩＳＡ  テストキット（Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｎｔｏｎ、ＭＡ）を用いて測定した。結果を、全組織タンパク質の１ｍｇあたりのテストタンパク質の濃度±ＳＤとして報告する。
【００７６】
保護的用量のフラジェリン（１．２５または０．５μｇ）によるプレコンディショニングは、再灌流の９時間後において、好中球化学誘引物質ＣＸＣＬ１およびＣＸＣＬ２のｍＲＮＡ発現およびタンパク質レベルの有意な減少を引き起こした。ＣＣＬ２ｍＲＮＡの発現またはタンパク質レベルは、再灌流の９および２４時間後の両方で低く、そしてフラジェリンによるプレコンディショニングによってさらに影響を受けなかった。それに加えて、急性期タンパク質ＩＬ−１ｂおよびＩＬ−６のｍＲＮＡも、フラジェリンでプレコンディショニングした動物において、再灌流の９時間後に虚血腎臓において減少したが、ＴＮＦαはしなかった（図６ｂ）。
【００７７】
実施例４
虚血腎臓の再灌流の間に投与された場合の、フラジェリンの保護的効果
この実施例は、フラジェリンが、再灌流の開始後に与えられた場合、急性虚血処置腎臓に保護的効果を提供することを実証する。上記で記載したように、両側性腎茎閉塞をマウスにおいて行い、そして血清クレアチニンレベルを測定して、再灌流の開始後の腎機能に対するフラジェリンの保護的効果を決定した。
【００７８】
具体的には、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群に、４５分間の両側性腎茎閉塞を行い、そして腎クランプの除去後様々な時間に、０．５μｇのフラジェリンを投与した（図７を参照のこと）。遮断解除の３０分前または遮断解除後３０分以内のフラジェリンの投与は、虚血傷害を受けた全てのマウスの生存能を救出した。再灌流の開始後１時間およびその後のフラジェリン投与は、傷害からどのマウスも救出できなかった。遮断解除３０分前または遮断解除後３０分以内のフラジェリン投与の保護的効果は、虚血腎臓の再灌流後２４時間モニターした血清クレアチニンの低いレベルによって反映された（図７ｂ）。
【００７９】
実施例５
フラジェリンの保護的効果は、腎実質細胞におけるＴＬＲ５シグナル伝達を必要とする
この実施例は、組織の再灌流の間のフラジェリン治療の保護的効果の標的源を実証する。実施例１−４で議論したように、再灌流研究を虚血腎臓において行った。
【００８０】
野生型Ｃ５７ＢＬ／６およびＢ６．ＭｙＤ８８−／−マウスの間で、放射線誘発骨髄再構成キメラを産生した。放射線誘発骨髄再構成キメラを、野生型Ｃ５７ＢＬ／６およびＢ６．ＭｙＤ８８−／−マウスの大腿骨および脛骨の先端を切断し、そしてＲＰＭＩ１６４０で流して骨髄細胞を採取することによって産生させた。骨髄レシピエントマウスは、最初に１１００Ｒａｄのｇ−照射を受け、そして次いで３時間後に２０×１０６骨髄細胞を静脈内に投与された。照射ＣＤ９０．１レシピエントは、類遺伝子性ＣＤ９０．１ドナー由来の骨髄を投与され、または逆もまた同じであった。再構成レシピエントは、予防として、１から７日目まで飲用水中で抗生物質（０．２ｍｇ／ｍｌスルファメトキサゾールおよび０．４ｍｇ／ｍｌトリメトプリム）を投与された。そのレシピエントを８〜１２週間回復させ、そして完全なキメラ現象を、末梢血細胞をＦＩＴＣ結合９０．２およびＰＥ結合９０．１で染色することによって確認した。
【００８１】
図８は、野生型骨髄で再構成した野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの虚血腎臓の再灌流の３０分以内に０．５μｇのフラジェリンを投与することは、ＣＸＣＬ１およびＣＸＣＬ２ｍＲＮＡレベルを減少させたことを示す。ＭｙＤ８８−／−または野生型骨髄のいずれかで再構成したＭｙＤ８８−／−レシピエントにおいて、虚血腎臓の再灌流の間に、ＣＸＣＬ１およびＣＸＣＬ２ｍＲＮＡがほとんど誘導されず、そしてこれらの腎臓の再灌流の間のフラジェリン投与は、これらのケモカインのｍＲＮＡレベルを減少させなかった。対照的に、ＭｙＤ８８−／−ドナー由来の骨髄の野生型レシピエントは、高レベルのＣＸＣＬ１およびＣＸＣＬ２ｍＲＮＡを発現し、そしてこれらのレベルは、虚血腎臓の再灌流の間のフラジェリン投与によって減少した。これは、フラジェリンの標的は、白血球ではなく実質腎細胞であったことを実証する。
【００８２】
これをさらに調査するために、野生型Ｃ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃマウス由来の腎切片を、抗ＴＬＲ５抗体で染色した（図９ａ）。陽性に染色された細胞は、主に脈管構造の細胞であり、そして腎尿細管細胞または糸球体において染色は明らかではなかった。ＴＬＲ５の発現に遺伝的欠損を有するＭｏｔｈ  Ｅａｔｅｎマウス由来の腎切片は、抗ＴＬＲ５抗体で染色されなかった。腎虚血／再灌流の実施前の腎臓におけるＴＬＲ５ｍＲＮＡの発現レベルは低かったが、虚血腎臓の再灌流の間に急速に増加した（図９ｂ）。
【００８３】
実施例６
後肢虚血モデルにおけるフラジェリンの保護的効果
マウス後肢虚血モデルにおけるＣＢＬＢ５０２の潜在的な保護的効果を、止血帯誘発虚血傷害のシミュレーションにおいて調査した。これらの研究は、両側性腎茎閉塞を受けたマウスに投与されたＣＢＬＢ５０２は、虚血傷害および再灌流に反応した好中球化学誘引物質産生の減少、虚血腎臓への好中球浸潤の減少、および血清クレアチニンレベルの上昇の減弱および生存能の喪失を含む腎機能不全を減弱したことを示す研究に由来する。その保護剤を、腎茎閉塞実施（ｉｍｐｏｓｏｔｉｏｎ）の前、または臨床的使用のためにより重要には、虚血腎臓の再灌流後３０分までのいずれかに投与し得る。
【００８４】
幅広いゴムバンドをマウスの左後肢に２〜４時間締めることによって、止血帯誘発傷害をモデル化した。虚血時間の後、ゴムバンドをゆるめ、そして除去した。その動物は麻酔から回復したが、虚血肢の使用不能を示し、それを９日までの期間、虚血肢を後ろにひきずった。その虚血損傷はまた、視覚的にも明瞭な浮腫を含み、そしてそれを湿潤−乾燥重量測定および反対側の非虚血後肢との比較によって定量したが、その虚血傷害はまた、好中球化学誘引物質を含む高レベルの炎症性サイトカインの誘発、および虚血肢への強い好中球浸潤も含んでいた。それに加えて、エバンスブルー色素の注射は、虚血肢におけるかなりの量の血管漏出を示した（データは示していない）。
【００８５】
ＣＢＣＬ５０２の保護的効果を研究するために、幅広いゴムバンドを左後肢に３時間締めることによって、マウスに再び止血帯誘発傷害を行った。虚血時間の後、ゴムバンド（ｒｕｂｂｅｒ  ｂａｎｋ）をゆるめ、そして除去した。ゴムバンドの除去および再灌流の開始の１５分後に、０．５μｇのＣＢＬＢ５０２またはビヒクル（ＰＢＳ）を、左虚血肢へ筋肉内投与した。ＣＢＬＢ５０２を投与したマウスは、肢の使用のより迅速な回復を有し、そして再灌流の１４日後までに、虚血肢に関して１０ＧＦの測定可能な握力（ｇｒｉｐ  ｓｔｒｅｎｇｔｈ）を有していた。対照的に、再灌流の１５分後にＰＢＳしか投与しなかったマウスは、２１日までこの強さを達成しなかった。ＣＢＬＢ５０２を与えた肢はまた、再灌流時にビヒクルのみを与えたマウス由来の虚血肢の３．４に対して２．５の湿潤／乾燥重量比によって明らかなように（ｅｖｉｄｅｎｃｅ）、再灌流の２５時間後にほとんど浮腫の証拠を有さなかった（図１４Ｃを参照のこと）。血管漏出に関して、ビヒクル投与マウスの１３．１μｇに対して、ＣＢＬＢ５０１を投与したマウスは、肢組織全（ｗｅｂ）重量１ｇあたり７．４μｇのエバンスブルー色素を有していた（Ｐ＜０．００１）（図１４Ｄを参照のこと）。最後に、再灌流時にＣＢＬＢ５０２で治療した肢は、組織好中球およびマクロファージ化学誘引物質ＣＸＣＬ２、ＣＣＬ２、およびミエロペルオキシダーゼの有意な減少を有していた（各アッセイに関してＰ＜０．０５）［我々は定量された数を有するか？］。ＣＢＬＢ５０２（図１４Ａ）またはビヒクル（図１４Ｂ）で治療したマウスに対して、３時間の虚血後の再灌流後１４日目に、後肢筋肉に対してヘマトキシリン／エオジン染色を行った。
【００８６】
再灌流の３０分以内のＣＢＬＢ５０２の注射はまた、好中球化学誘引物質産生および虚血肢への好中球浸潤の減少、浮腫の目に見える減少、および虚血肢の使用の回復の促進（４〜６日目）を引き起こした。組織学的調査がまた、保護剤で治療した動物の虚血肢における、より多くの筋肉線維束の厚さを示した（データは示していない）。
【００８７】
ＣＢＬＢ５０２保護剤の投与あり対なしで、後肢虚血を行った動物における炎症および肢機能不全の定量的測定によって、これらの結果をさらに調査する。これは、他の炎症性サイトカインの定量、好中球浸潤の直接的定量、筋肉線維束の厚さおよび筋肉線維のアポトーシスの定量、および浮腫の程度および期間を含む。
【図２】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６】
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【図６ｂ】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−６】
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【図１３−７】
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【図１３−８】
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【図１３−９】
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【図１３−１０】
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【図１３−１１】
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【図１５Ａ−１】
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【図１５Ａ−２】
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【図１５Ｂ】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図９】
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【図１１】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１４】
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【配列表】
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