(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ａｖｅｎａｅ  ｓｕｂｓｐ．  ｃｉｔｒｕｌｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ、Ａｃｉｄｉｐｈｌｉｕｍ  ｃｒｙｐｔｕｍ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、及び、Ｃｈｒｏｍｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓの内の何れかの硝酸還元細菌の検出または定量のためのＰＣＲに用いられ、配列番号：１によって包括的に記載されている複数の塩基配列の内の何れかを有している複数のプライマーの混合物であることを特徴とするプライマー。
【請求項２】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ａｖｅｎａｅ  ｓｕｂｓｐ．  ｃｉｔｒｕｌｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ、Ａｃｉｄｉｐｈｌｉｕｍ  ｃｒｙｐｔｕｍ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、及び、Ｃｈｒｏｍｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓの内の何れかの硝酸還元細菌の検出または定量のためのＰＣＲに用いられ、フォワードプライマーとリバースプライマーとを含んでおり、前記フォワードプライマーとして、配列番号：２によって包括的に記載されている複数の塩基配列の内の何れかを有している複数のプライマーの混合物であるプライマーが用いられており、前記リバースプライマーとして、配列番号：１によって包括的に記載されている複数の塩基配列の内の何れかを有している複数のプライマーの混合物であるプライマーが用いられていることを特徴とするプライマーセット。
【請求項３】
配列番号：１によって包括的に記載されている複数の塩基配列の内の何れかを有している複数のプライマーの混合物であるプライマーと配列番号：２によって包括的に記載されている複数の塩基配列の内の何れかを有している複数のプライマーの混合物であるプライマーとを用いたリアルタイムＰＣＲによってＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ａｖｅｎａｅ  ｓｕｂｓｐ．  ｃｉｔｒｕｌｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ、Ａｃｉｄｉｐｈｌｉｕｍ  ｃｒｙｐｔｕｍ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、及び、Ｃｈｒｏｍｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓの内の何れかの硝酸還元細菌の定量を実施することを特徴とする硝酸還元細菌定量方法。
【請求項４】
硝酸態窒素を含有する被処理水と硝酸還元細菌とを含む混合相を槽内に形成させて前記硝酸還元細菌により前記硝酸態窒素を還元する生物処理を前記槽内で実施する生物処理方法であって、
配列番号：１によって包括的に記載されている複数の塩基配列の内の何れかを有している複数のプライマーの混合物であるプライマーと配列番号：２によって包括的に記載されている複数の塩基配列の内の何れかを有している複数のプライマーの混合物であるプライマーとを用いたリアルタイムＰＣＲによってＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ａｖｅｎａｅ  ｓｕｂｓｐ．  ｃｉｔｒｕｌｌｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ、Ａｃｉｄｉｐｈｌｉｕｍ  ｃｒｙｐｔｕｍ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｖｉｏｌａｃｅｕｍ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ  ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、及び、Ｃｈｒｏｍｏｈａｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓａｌｅｘｉｇｅｎｓの内の何れかの硝酸還元細菌の定量を実施しつつ生物処理を実施することを特徴とする生物処理方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（以下「ＰＣＲ」という）に用いられるプライマー、ならびに、プライマーセットに関し、さらには、硝酸還元細菌定量方法、および、生物処理方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、窒素除去に係わる硝化細菌や脱窒細菌の検出や、その存在量の定量は、培養法により行なわれている。
例えば、硝酸還元細菌などの脱窒細菌の定量は、「下水試験方法  上巻  １９９７年版（発行所  財団法人日本下水道協会）」の６１３頁〜６１５頁に記載される方法によって行なわれている。
この培養法では、通常、結果が得られるまでに多大な時間を要し、例えば、培養法による脱窒細菌数の定量には７日〜１０日もの時間を必要としている。
【０００３】
近年、分子生物学的手法の発達により、硝化細菌や脱窒細菌を上記培養法などに比べて、比較的簡単にかつ短時間で定量できるようになっている。
例えば、硝化反応に関与する細菌としてアンモニアを亜硝酸に酸化するアンモニア酸化細菌や亜硝酸を硝酸に酸化する亜硝酸酸化細菌が知られている。
このアンモニア酸化細菌の存在量の定量は、アンモニア酸化細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に特異的なプライマーセットとプローブを用いたリアルタイムＰＣＲで定量可能である（参考文献：Ｃｅｒｄａ  Ｈａｒｍｓ他、Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２００３年、３７巻、３４３頁〜３５１頁）。
また、亜硝酸酸化細菌の一種であるＮｉｔｒｏｓｐｉｒａ属細菌の存在数量は、亜硝酸酸化細菌の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に特異的なプライマーセットとプローブを用いたリアルタイムＰＣＲで定量可能である（参考文献：Ｈｅｂｅ  Ｍ．Ｄｉｏｎｉｓｉ他、Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００３年，６９巻，６５９７頁〜６６０４頁）。
【０００４】
脱窒反応に関与する細菌としては、硝酸を亜硝酸に還元する硝酸還元細菌、亜硝酸を一酸化窒素に還元する亜硝酸還元細菌、一酸化窒素を亜酸化窒素に還元する一酸化窒素還元細菌、および亜酸化窒素を窒素ガスに還元する亜酸化窒素還元細菌が知られている。
この内、亜硝酸還元細菌の存在数量は、亜硝酸還元酵素遺伝子（例えば、ｎｉｒＫやｎｉｒＳ遺伝子）に特異的なリアルタイムＰＣＲで定量が可能である（参考文献：Ｓｏｎｉａ  Ｈｅｎｒｙ他，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．，２００４年，５９巻，３２７頁〜３３５頁、Ｅｌｌｅｎ  Ｋａｎｄｅｌｅｒ他，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００６年，７２巻，５９５７頁〜５９６２頁）。
また、近年、ＰＣＲによるｎｏｒＢ遺伝子の検出や定量も検討されている（下記特許文献１参照）。
【０００５】
また、亜酸化窒素還元細菌の存在数量は、亜酸化窒素還元酵素遺伝子（例えば、ｎｏｓＺ遺伝子）に特異的なリアルタイムＰＣＲ法で定量可能である（参考文献：Ｓ．Ｈｅｎｒｙ他，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００６年，７２巻，５１８１頁〜５１８９頁）。
【０００６】
さらに、硝酸還元細菌数の定量に関しても硝酸還元酵素遺伝子（ｎａｒＧ遺伝子）に特異的なＰＣＲプライマーを用いたリアルタイムＰＣＲが検討されている（参考文献：Ｊｕａｎ Ｃ．Ｌｏｐｅｚ−Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ他，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．，２００４年，５７巻，３９９頁〜４０７頁）。
しかし、上記において検討されている方法は、ある特定の遺伝子グループに属するｎａｒＧ遺伝子だけを標的にしたＰＣＲプライマーを用いた定量方法であり、汎用的な定量方法ではない。
【０００７】
ところで、上記のような細菌を用いて、処理対象となる排水（以下「被処理水」ともいう）からアンモニアや有機性窒素成分などの処理対象物質を除去する生物処理方法が広く行われている。
この生物処理方法においては、細菌と被処理水とが収容される槽（以下「生物処理槽」ともいう）が用いられており、生物処理方法は、前記生物処理槽内に細菌と被処理水とを含む混合相が形成されて実施されている。
近年、この生物処理槽から排出される処理水の水質を一定以上に維持させるべく、生物処理槽の槽内水の一部を試料として採取してこの試料中の細菌数や溶存酸素濃度などを計測し、該計測結果をもとにシミュレーションを実施してシミュレーション結果を生物処理槽の運転方法にフィードバックさせることが行われている。
【０００８】
しかし、上記のように硝酸還元細菌については、ＰＣＲ用のプライマーとして、特定の遺伝子グループに属するｎａｒＧ遺伝子だけを標的にしたものしか見出されておらず、硝酸還元細菌の検出やその定量が可能な汎用的なＰＣＲの方法が確立されてはいない。
また、培養法では、上記のように多大な時間がかかることから硝酸還元細菌の定量の結果を生物処理槽の運転方法に反映させることは実質不可能である。
【０００９】
すなわち、従来、硝酸還元細菌の検出や定量のためのＰＣＲに用いられるプライマーあるいはプライマーセットにおいては、硝酸還元細菌の検出や定量に適したものが提供されていないという問題を有している。
したがって、ＰＣＲによる硝酸還元細菌の定量方法も汎用性を有していないという問題を有している。
さらには、硝酸還元細菌による硝酸態窒素の還元が実施される生物処理方法においては、処理水の水質を予測することが困難で一定以上の水質を維持させることが困難であるという問題を有している。
【００１０】
【特許文献１】特開２００５−２２９９２９号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、上記問題に鑑みてなされたものであり、硝酸還元細菌の検出や定量のためのＰＣＲに適したプライマーの提供を課題としている。
また、本発明は、硝酸還元細菌の検出や定量のためのＰＣＲに適したプライマーセットの提供を課題としている。
また、本発明は、硝酸還元細菌の汎用的な定量方法の提供を課題としている。
さらには、本発明は、硝酸還元細菌による硝酸態窒素の還元が実施される生物処理方法において、処理水の水質が一定以上に維持された生物処理を容易に実施させ得る生物処理方法の提供を課題としている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、硝酸還元細菌の検出や定量のためのＰＣＲのプライマーとして好適なプライマーを見出し本発明の完成に到ったのである。
【００１３】
すなわち、本発明にかかるプライマーは、硝酸還元細菌の検出または定量のためのＰＣＲに用いられ、配列番号：１に記載の塩基配列を有していることを特徴としている。
【００１４】
また、本発明にかかるプライマーセットは、硝酸還元細菌の検出または定量のためのＰＣＲに用いられ、フォワードプライマーとリバースプライマーとを含んでおり、前記フォワードプライマーとして、配列番号：２に記載の塩基配列を有しているプライマーが用いられており、前記リバースプライマーとして、配列番号：１に記載の塩基配列を有しているプライマーが用いられていることを特徴としている。
【００１５】
また、本発明にかかる硝酸還元細菌定量方法は、配列番号：１に記載の塩基配列を有しているプライマーと配列番号：２に記載の塩基配列を有しているプライマーとを用いたリアルタイムＰＣＲによって硝酸還元細菌の定量を実施することを特徴としている。
【００１６】
さらに、本発明にかかる生物処理方法は、硝酸態窒素を含有する被処理水と硝酸還元細菌とを含む混合相を槽内に形成させて前記硝酸還元細菌により前記硝酸態窒素を還元する生物処理を前記槽内で実施する生物処理方法であって、配列番号：１に記載の塩基配列を有しているプライマーと配列番号：２に記載の塩基配列を有しているプライマーとを用いたリアルタイムＰＣＲによって前記硝酸還元細菌の定量を実施しつつ生物処理を実施することを特徴としている。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、硝酸還元細菌の検出や定量のためのＰＣＲに適したプライマーならびにプライマーセットを提供し得る。
また、本発明によれば、ＰＣＲによる硝酸還元細菌の定量方法の汎用性をも向上させ得る。
さらには、硝酸還元細菌により硝酸態窒素を還元する生物処理が実施される生物処理方法において、処理水の水質が一定以上に維持された生物処理を容易に実施させ得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の実施の形態について、硝化槽から排出された硝酸態窒素などの窒素成分を含有する被処理水をパラッコッカス（Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ）属細菌、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属細菌などの硝酸還元細菌が収容されている生物処理槽（以下「脱窒槽」ともいう）に導入するとともに、該脱窒槽において前記硝酸還元細菌で硝酸態窒素が還元されて窒素成分が除去（脱窒）された処理水を排出させる生物処理方法を例に説明する。
【００１９】
本実施形態の生物処理方法においては、被処理水と硝酸還元細菌とを含んだ活性汚泥状態で前記脱窒槽内に混合相を形成させて生物処理を実施する。
しかも、定期的に前記混合相が形成されている脱窒槽の槽内水（以下「活性汚泥」ともいう）をサンプリングして、該サンプリングされた槽内水中の窒素成分含有量、溶存酸素量を測定するとともに硝酸還元細菌の定量を実施して得られた測定結果をパラメータとするシミュレーションを実施して脱窒槽から排出される処理水の水質を予測する。
そしてこの予測結果を硝化槽や脱窒槽の運転条件などにフィードバックさせて、例えば、硝化槽における散気量や、硝化槽、脱窒槽の槽内温度、汚泥の引抜き条件、汚泥返送条件などを調整する。
本実施形態の生物処理方法は、後述するリアルタイムＰＣＲにより硝酸還元細菌の定量を簡便且つ短時間に測定し得ることから、上記のようなシミュレーションとその結果のフィードバックとを容易に実施させることができ、脱窒槽から排出される処理水の水質を一定以上に維持させることを容易に実施させ得る。
【００２０】
前記シミュレーションは、例えば、ＩＷＡ（世界水協会）により作成された、ＡＳＭ１、ＡＳＭ２、ＡＳＭ２ｄ、ＡＳＭ３などのシミュレーションモデルを利用して実施させることができる。
また、シミュレーションに用いるパラメータの内、硝酸還元細菌の量（個体数）などはＰＣＲによって求めることができる
【００２１】
このＰＣＲとしては、簡便でありながら比較的高い精度で細菌の定量が可能なリアルタイムＰＣＲを実施することが好ましい。
このリアルタイムＰＣＲとしては、蛍光を発する色素をインターカレートさせる方法や、蛍光色素を結合させたプローブを用いる方法などを採用し得る。
また、例えば、このリアルタイムＰＣＲは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７３００（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社製）などのリアルタイムＰＣＲ装置を使用して実施することができる。
【００２２】
このリアルタイムＰＣＲには、フォアワードプライマーとしてｎａｒＨ５０Ｆ（配列番号２：５’−ＡＡＲＴＧＹＡＴＣＧＧＹＴＧＣＣＡ−３’）（参考文献：Ｒａｌｆ  Ｐｅｔｒｉ ａｎｄ  Ｊｏｈａｎｎｅｓ  Ｆ．Ｉｍｈｏｆｆ，２０００年，Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２３巻，４７頁〜５７頁）と、リバースプライマーとして本発明者が設計したｎａｒＨｒ３Ｂ（配列番号１：５’−ＴＣＣＣＡＲＫＣＣＴＴＧＧＧＲＴＡＧ−３’）とを含むプライマーセットを用いることが好ましい。
上記プライマーならびにプライマーセットを用いることにより、ｎａｒＨ遺伝子（参考文献：Ｒａｌｆ  Ｐｅｔｒｉ ａｎｄ  Ｊｏｈａｎｎｅｓ  Ｆ．Ｉｍｈｏｆｆ，２０００年，Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２３巻，４７頁〜５７頁）との相同性の高いＤＮＡの増幅を他の遺伝子の非特異的な増幅を抑制しつつＰＣＲを実施させることができ好適である。
【００２３】
このようなプライマーセットを用いたリアルタイムＰＣＲによる硝酸還元細菌の定量は汎用性にも優れており、迅速且つ精度良く硝酸還元細菌の定量が実施でき、生物処理方法における処理水質の向上にも有用である。
【実施例１】
【００２４】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００２５】
（硝酸還元細菌用PCRプライマーの設計）
１）硝酸還元細菌のｎａｒＨ遺伝子のクローニングとシーケンス
生物学的に窒素除去を行っている排水処理設備の脱窒槽から活性汚泥を採取し、ＩＳＯＩＬ  ｆｏｒ  Ｂｅａｄｓ  Ｂｅａｔｉｎｇ（株式会社ニッポンジーン製）を用いＤＮＡを精製した。
なお、このＤＮＡの精製は、製造業者の推奨する方法に従って実施した。
【００２６】
この精製したＤＮＡを鋳型としてｎａｒＨ５０Ｆ（配列番号２：５’−ＡＡＲＴＧＹＡＴＣＧＧＹＴＧＣＣＡ−３’）とｎａｒＨ４３０Ｂ（配列番号３：５’−ＴＣＮＴＣＣＣＡＧＴＴＮＧＧＮＣＣ−３’）のプライマーセット（参考文献：Ｒａｌｆ  Ｐｅｔｒｉ  ａｎｄ  Ｊｏｈａｎｎｅｓ  Ｆ．Ｉｍｈｏｆｆ，２０００年，Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２３巻，４７頁〜５７頁）を用いて硝酸還元細菌のｎａｒＨ遺伝子を増幅した。
【００２７】
この増幅産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（株式会社キアゲン製）を用いて精製後、ＴＯＰＯ  ＴＡクローニングキット（インビトロジェン株式会社製）を用い、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターにクローニングし、大腸菌を形質転換した。
なお、増幅産物の精製ならびにクローニングの方法は、各製造業者の推奨する方法に従って実施した。
【００２８】
得られた形質転換体を任意に４８個選択し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（インビトロジェン株式会社製）を用いて組み換えプラスミドを精製した。
このプラスミドを鋳型にしてＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ１．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社製）を用いてＰＣＲ増幅産物のＤＮＡ配列を決定した。
なお、この組み換えプラスミドの精製ならびにＤＮＡ配列の決定については、各製造業者の推奨する方法に従って実施した。
【００２９】
２）ＰＣＲプライマーの設計
上記“手順１”で決定したＰＣＲ増幅産物のＤＮＡ配列と既知の遺伝子とのＢＬＡＳＴ相同性検索（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｍｌ．ｇｏｖ／）を行い、ＰＣＲ増幅産物が既知のｎａｒＨ遺伝子と相同性が高いことを確認した。
引き続いて決定したＤＮＡ配列のＣＬＵＳＴＡＬＷ解析（ｈｔｔｐ:／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／）を行い、それぞれのＰＣＲ増幅産物に共通に存在するＤＮＡ配列を検索し、下記のプライマーを設計した。
ｎａｒＨｒ３Ｂ（配列番号１：５’−ＴＣＣＣＡＲＫＣＣＴＴＧＧＧＲＴＡＧ−３’）
【００３０】
３）リアルタイムＰＣＲ条件の検討
上記１）で精製したＤＮＡを鋳型にして、フォアワードプライマーとしてｎａｒＨ５０Ｆ（配列番号２：５’−ＡＡＲＴＧＹＡＴＣＧＧＹＴＧＣＣＡ−３’）（参考文献：Ｒａｌｆ  Ｐｅｔｒｉ  ａｎｄ  Ｊｏｈａｎｎｅｓ  Ｆ．Ｉｍｈｏｆｆ，２０００年，Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２３巻，４７頁〜５７頁）、リバースプライマーとして上記ｎａｒＨｒ３Ｂ（配列番号１：５’−ＴＣＣＣＡＲＫＣＣＴＴＧＧＧＲＴＡＧ−３’）、および、ＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（タカラバイオ株式会社）を含む反応液を用いて、ＰＣＲの条件検討を行った。
【００３１】
ＰＣＲ反応は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００リアルタイムＰＣＲシステム（アプライドバイオシステムズジャパン株式会社製）を用いて行なった。
各プライマー濃度と反応温度を変え、アガロースゲル電気泳動で目的とする１２８ｂｐの単一の増幅産物が得られること、融解曲線分析でシングルピークとなること、および増幅効率が８０％以上となるような条件を検討した。
その結果、表１に示す最適条件を決定した。
【００３２】
【表１】
0005577017.tif 000002
【００３３】
さらに、リアルタイムＰＣＲの増幅産物を上記１）に記載の方法と同様の方法でｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターにクローニングし、６１個の形質転換体からプラスミドを精製しＰＣＲ増幅産物のＤＮＡ配列を決定した。
これらのＤＮＡ配列と既知の遺伝子とのＢＬＡＳＴ相同性解析を行った。
【００３４】
上記表１に示す最適条件でリアルタイムＰＣＲを行なった時のＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動写真を図１に、融解曲線を図２にそれぞれ示す。
アガロースゲル電気泳動により、目的とする１２８ｂｐの単一のバンドが増幅されていたこと、および融解曲線はシングルピークとなっていたことから、非特異的なＤＮＡの増幅は起こっていないことが確認された。
さらに、ＰＣＲ産物のＤＮＡ配列と既知の遺伝子とのＢＬＡＳＴ相同性検索の結果、解析した６１個のクローン全てにおいてｎａｒＨ遺伝子と相同性が高く、他の遺伝子の非特異的な増幅は起きていないことを確認した（下記表２参照）。
【００３５】
【表２】
0005577017.tif 000003
【００３６】
４）硝酸還元細菌の存在数量の定量
窒素除去を行っている火力発電所の排水処理設備および下水処理場の排水処理設備から活性汚泥を採取し、上記１）と同様の方法で活性汚泥からＤＮＡを精製した。このＤＮＡを鋳型にして表１に示す条件でリアルタイムＰＣＲを行い、硝酸還元細菌の存在数量を求めた。
【００３７】
検量線作成用のスタンダードサンプルは、上記１）にてクローニングしたｎａｒＨ遺伝子を用いた。
検量線の作成には３．２×１０4、１．６×１０5、８．０×１０6、４．０×１０6、２．０×１０7および１．０×１０8ｃｏｐｉｅｓ／ｒｅａｃｔｉｏｎのスタンダードサンプルを用いた。
表３に火力発電所排水処理設備の脱窒槽の活性汚泥および下水処理場の曝気槽の活性汚泥に存在する硝酸還元細菌数、すなわちｎａｒＨ遺伝子のコピー数をリアルタイムＰＣＲで定量した結果を示す。
【００３８】
【表３】
0005577017.tif 000004
【００３９】
その結果、火力発電所排水処理設備の脱窒槽の活性汚泥には１ｍｌあたり１．６０×１０8〜３．４３×１０8コピー、また下水処理場の曝気槽の活性汚泥には６．８４×１０7〜９．９７×１０7コピーのｎａｒＨ遺伝子が存在することがわかった。
【００４０】
上記のことからも、配列番号１に示す塩基配列を有するプライマーが硝酸還元細菌の検出や定量に好適であることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動写真。
【図２】ＰＣＲ産物の融解曲線を示すグラフ。
【図１】
0005577017.tif 000005
【図２】
0005577017.tif 000006
【配列表】
0005577017000001.app