(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化Ｔ細胞のＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド１に結合すると、活性化Ｔ細胞の死を誘導する、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド１とＰ−セレクチンとの結合を妨げることなく、ヒトＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド１と特異的に結合し、配列番号：１９の軽鎖可変領域及び配列番号：２０の重鎖可変領域、またはアミノ酸配列（ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＳＱＳＩＶＨＮＤＧＮＴＹＦＥＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＨＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＦＱＧＳＹＶＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ）及びアミノ酸配列（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＹＩＮＧＧＳＳＴＩＦＹＡＮＡＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＡＳＹＧＧＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）を含む、単離された抗体。
【請求項２】
前記抗体が、ヒトＩｇＧ１、Ｇ２、またはＩｇＧ４の重鎖定常領域を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
アミノ酸配列（ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＳＱＳＩＶＨＮＤＧＮＴＹＦＥＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＨＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＦＱＧＳＹＶＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ）、及びアミノ酸配列（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＹＩＮＧＧＳＳＴＩＦＹＡＮＡＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＡＳＹＧＧＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）を含む、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
ヒトＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド１の１１５〜１２６番目のアミノ酸残基に特異的に結合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項５】
前記抗体は、１１７〜１２３番目のアミノ酸残基に特異的に結合する、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体は、１１９〜１２１番目のアミノ酸残基に特異的に結合する、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
活性化Ｔ細胞の死を誘導するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体を含む医薬品組成物。
【請求項８】
過剰のＴ細胞が仲介する免疫応答に関連する症状を有するまたは前記症状を有する危険性のある患者のＴ細胞が仲介する免疫応答を調節するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体を含む医薬品組成物。
【請求項９】
前記症状は、炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギー疾患、またはＴ細胞癌である、請求項８に記載の医薬品組成物。
【請求項１０】
前記患者は、同種もしくは異種移植を受けたまたは同種もしくは異種移植を受ける予定がある、請求項９に記載の医薬品組成物。
【請求項１１】
配列番号：１９の軽鎖可変領域及び配列番号：２０の重鎖可変領域を含むポリペプチドをコード化する核酸を含む、宿主細胞。
【請求項１２】
アミノ酸配列（ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＳＱＳＩＶＨＮＤＧＮＴＹＦＥＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＨＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＦＱＧＳＹＶＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ）、及びアミノ酸配列（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＹＩＮＧＧＳＳＴＩＦＹＡＮＡＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＡＳＹＧＧＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）を含むポリペプチドをコード化する核酸を含む、宿主細胞。
【請求項１３】
前記細胞は、細菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞である、請求項１１または１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
前記哺乳動物細胞は、ハイブリドーマ細胞である、請求項１３に記載の宿主細胞。
【請求項１５】
（ｉ）ヒトカッパ軽鎖定常領域と結合するアミノ酸配列（ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＳＳＱＳＩＶＨＮＤＧＮＴＹＦＥＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＨＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＦＱＧＳＹＶＰＬＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ）を有するＶ領域を含む軽鎖と、
（ｉｉ）ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域と結合するアミノ酸配列（ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＦＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＹＩＮＧＧＳＳＴＩＦＹＡＮＡＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＹＡＳＹＧＧＧＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ）を有するＶ領域を含む重鎖と、
を含み、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド１とＰ−セレクチンとの結合を妨げることなく、ヒトＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド１と特異的に結合する、単離された抗体。
【請求項１６】
請求項１５に記載の抗体を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００４年５月１０日付で提出された、米国仮特許出願第６０／５６９，８９２号の優先権を主張し、当該仮出願は参考によって完全に本明細書中に引用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
非常に攻撃的なＴ細胞は、しばしば、望ましくない免疫反応を引き起こし、これにより、様々な疾患、例えば、自己免疫疾患、移植拒絶反応、アレルギー疾患、及びＴ細胞誘発癌を引き起こす。したがって、攻撃的なＴ細胞の制御はこのような疾患を治療するのに重要である。これらの細胞の活性は、免疫抑制によってまたは免疫寛容の誘導によって封じられうる。別の解決方法としては、アポプトシスの誘導があり、これは、非常に攻撃的なＴ細胞などの、望ましくない細胞を除去するのに係わりがあると考えられている。例えば、Ｋａｂｅｌｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １４，３３８−３４０；およびＲａｆｆ（１９９２）  Ｎａｔｕｒｅ  ３５６，３９７−３９９を参照。
【発明の開示】
【０００３】
要約
本発明は、活性化Ｔ細胞のＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）に結合するとアポプトシスを誘導する抗体およびその誘導体に関する。
【０００４】
一つの態様では、本発明は、（ｉ）それぞれ、ＲＳＳＱＳＩＶＨＮＤＧＮＴＹＦＥ、ＫＶＳＮＲＦＳ、およびＦＱＧＳＨＶＰＬＴ（配列番号：１〜３）を含む；（ｉｉ）それぞれ、ＳＦＧＭＨ、ＹＩＮＧＧＳＳＴＩＦＹＡＮＡＶＫＧ、およびＹＡＳＹＧＧＧＡＭＤＹ（配列番号：４〜６）を含む；（ｉｉｉ）、それぞれ、ＲＡＳＳＴＶＮＳＴＹＬＨ、ＧＳＳＮＬＡＳ、およびＱＱＹＳＧＹＰＬＴ（配列番号：７〜９）を含む；（ｉｖ）それぞれ、ＡＹＹＩＨ、ＶＮＰＮＴＧＧＴＳＹＮＰＫＦＫＧ、およびＳＧＳＰＹＹＲＹＤＤ（配列番号：１０〜１２）を含む；（ｖ）それぞれ、ＲＳＳＱＳＩＶＮＳＮＧＮＴＹＬＥ、ＫＶＳＮＲＦＳ、およびＦＱＧＳＨＶＰＷＴ（配列番号：１３〜１５）を含む；または（ｖｉ）それぞれ、ＴＮＡＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥ、ＴＹＹＡＤＳＶＫＤ、およびＧＧＳＹＷＹＦＤＶ（配列番号：１６〜１８）を含む、３種の配列を有する免疫グロブリン鎖を特徴とする。
【０００５】
上記６セットの配列は、それぞれ、下記実施例に記載される３つのマウス１５Ａ７、４３Ｂ６、および９Ｆ９抗体のものなどの、ＰＳＧＬ−１に結合する抗体の３種の軽鎖または重鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）に相当する。以下に、これらの３つの抗体の軽鎖および重鎖可変（Ｖ）領域を示す（配列番号：１９〜２６、ＣＤＲは下線がふされ、強調されている）：
【０００６】
【化１】
0005623690.tif 000002
【０００７】
【化２】
0005623690.tif 000003
【０００８】
【化３】
0005623690.tif 000004
【０００９】
【化４】
0005623690.tif 000005
【００１０】
【化５】
0005623690.tif 000006
【００１１】
【化６】
0005623690.tif 000007
【００１２】
抗体の抗原結合特異性はその軽鎖および重鎖ＣＤＲによって決定されるため、上記ＣＤＲは、抗原結合特異性を保持する抗体誘導体を得るのに使用できる。抗体誘導体の例としては、キメラ抗体、ヒト化抗体、およびこれらの機能的な等価物が挙げられる。以下に、それぞれ、配列番号：１〜３及び配列番号：４〜６を含む、ヒト化１５Ａ７抗体の軽鎖Ｖ領域（配列番号：２５）及び重鎖Ｖ領域（配列番号：２６）を示す：
【００１３】
【化７】
0005623690.tif 000008
【００１４】
【化８】
0005623690.tif 000009
【００１５】
本発明はまた、上記免疫グロブリン鎖の一をコード化する配列を有する単離された核酸を特徴とする。「抗体」または「免疫グロブリン鎖」ということばは、単離されたポリペプチド、即ち、自然界で関連する他のタンパク質、脂質、及び核酸から実質的に分離されたポリペプチドを意味する。ポリペプチドは、少なくとも５０、７０、または９５乾燥重量％の精製調製物を構成しうる。「単離された核酸」ということばは、自然発生する核酸の構造にまたは自然発生するゲノム核酸のフラグメントの構造と一致しない構造を有する核酸を意味する。したがって、当該ことばは、例えば、（ａ）自然発生するゲノムＤＮＡ分子の一部の配列を有するが自然発生している生物体のゲノムの分子のその部分に隣接するコーディング配列の双方には隣接しないＤＮＡ；（ｂ）得られる分子が自然発生するベクターまたはゲノムＤＮＡに一致しないようにベクター中にまたは原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれた核酸；（ｃ）ｃＤＮＡ、ゲノムフラグメント、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって製造されるフラグメント、または制限断片などの別の分子；および（ｄ）ハイブリッド遺伝子、即ち、融合タンパク質をコード化する遺伝子の一部である組換えヌクレオチド配列を包含する。本発明の核酸は、本発明のポリペプチドを発現するのに使用できる。上記を目的として、適当な調節配列に核酸を機能できるように(operatively)連結して、発現ベクターを得てもよい。
【００１６】
ベクターとは、予め連結された他の核酸を輸送することができ、また、宿主ＤＮＡ中への自己複製または組み込みができる核酸分子を意味する。例としては、プラスミド、コスミド、及びウィルスベクターが挙げられる。本発明のベクターは、宿主中で核酸を発現させるのに適当な形態の核酸を含む。好ましくは、本ベクターは、一以上の調節配列が発現させる核酸配列に機能できるように(operatively)連結させてなる。調節配列の例としては、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）が挙げられる。調節配列はまた、組織特異的調節および／または誘導配列に加えて、ヌクレオチド配列の構成性発現をさせるものなどが挙げられる。このような発現ベクターの設計は、形質転換させる宿主細胞の選択および所望の発現レベルなどの考慮に基づいて行なわれる。発現ベクターを宿主細胞に導入して、本発明のポリペプチドを製造してもよい。本発明はまた、上記核酸を含む宿主細胞をも包含する。宿主細胞とは、外因性のコーディング配列または非コーディング配列を含む細胞を意味する。外因性配列は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクション(DEAE-Dextran mediated transfection)、またはエレクトロポレーションによって細胞中に導入されうる。適当な宿主細胞としては、細菌細胞（例えば、大腸菌(E. coli)、枯草菌(Bacillus subtilis)、及びネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)）、酵母細胞（例えば、サッカロマイセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)及びシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)）、植物細胞（例えば、タバコ(Nicotiana tabacum)及びゴシピウム・ヒルスタム(Gossypium hirsutum)）、ならびに哺乳動物細胞（例えば、マウスハイブリドーマ細胞、ＣＨＯ細胞、及び３Ｔ３線維芽細胞）が挙げられる。
【００１７】
本発明の免疫グロブリン鎖を製造するためには、上記核酸によってコード化されるポリペプチドを発現できる条件下で宿主細胞を培養し、さらに培養物からポリペプチドを単離することができる。または、本発明の核酸を、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写及び翻訳してもよい。
【００１８】
抗体は、本発明の範囲に包含される。抗体は、第一の免疫グロブリン鎖及び第二の免疫グロブリン鎖によって形成され、これらは、それぞれ、上記マウス１５Ａ７、４３Ｂ６、または９Ｆ９抗体の軽鎖ＣＤＲ及び重鎖ＣＤＲを含む。好ましくは、この抗体は、１５Ａ７の軽鎖及び重鎖によって形成される。
【００１９】
（ｉ）Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド１とＰ−セレクチンとの結合を妨げることなくＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド１に特異的に結合し、および（ｉｉ）活性化Ｔ細胞のＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド１に結合すると、Ｔ細胞の死を誘導する他の抗体もまた、本発明の範囲に含まれる。一実施態様において、この抗体は、ヒトＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド１に特異的に結合する。
【００２０】
成熟ヒトＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド１の１１５〜１２６番目のアミノ酸残基に特異的に結合する他の抗体もまた、本発明の範囲にさらに含まれる。好ましくは、本抗体は、１１７〜１２３番目のアミノ酸残基に特異的に結合する。より好ましくは、本抗体は、全ての試験エピトープの中の共通配列である、１１９〜１２１番目のアミノ酸残基に特異的に結合する。実際には、これらの３つのアミノ酸残基の一以上の変異によって、抗体の結合性がなくなる。一つの例としては、この抗体は、活性化Ｔ細胞のＰ−セレクチン糖タンパク質リガンド１に結合すると、活性化Ｔ細胞の死を誘導する。
【００２１】
一実施態様において、上記した２つの抗体の一方は、それぞれ、配列番号：１〜３及び配列番号：４〜６（例えば、配列番号：１９及び２０、または配列番号：２５及び２６）を含む軽鎖及び重鎖によって形成される。
【００２２】
さらなる態様によると、本発明は、活性化Ｔ細胞の死を誘導する方法を特徴とする。本方法は、上記の３つの抗体の一を活性化Ｔ細胞と接触することを含み、この際、抗体が活性化Ｔ細胞に結合することにより、細胞の死が誘導される。
【００２３】
本発明はまた、患者のＴ細胞が仲介する免疫応答を調節する方法を特徴とする。本方法は、（１）過剰のＴ細胞が仲介する免疫応答に関連する症状を有するまたは前記症状を有する危険性のある患者を同定し、さらに（２）この患者に上記３つの抗体の一を有効量投与することを有する。「過剰のＴ細胞が仲介する免疫応答」とは、過剰なレベルの活性化Ｔ細胞によって引き起こされる応答を意味する。過剰なレベルとは、（１）正常なレベルより高いレベル、および（２）たとえ正常なレベル以下であるものの、個体で望まれるレベルより高いレベルを意味する。症状の例としては、患者が同種もしくは異種移植を受けたまたは同種もしくは異種移植を受ける予定があるような状況に加えて、炎症疾患、自己免疫疾患、アレルギー疾患、またはＴ細胞癌が挙げられる。
【００２４】
本発明の一以上の実施態様の詳細は、下記説明で記載される。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、詳細な説明から明らかであろう。
【００２５】
詳細な説明
本発明は、少なくとも一部は、活性化Ｔ細胞のＰＳＧＬ−１に抗体またはその誘導体を結合させることによって、活性化Ｔ細胞のアポプトシスを誘導でき、さらに活性化Ｔ細胞を枯渇させることができるという予想できない発見に基づくものである。上記抗体及びその誘導体は、過剰のもしくは望ましくないＴ細胞が仲介する免疫応答またはＴ細胞の増殖に関連する症状を治療するのに有用である。
【００２６】
したがって、本発明は、抗ＰＳＧＬ−１抗体の免疫グロブリン軽鎖または重鎖ＣＤＲを含むポリペプチド、さらにはこのようなポリペプチドをコード化する核酸を特徴とするものである。免疫グロブリン鎖及び核酸は双方とも、上記抗体及び誘導体を作製するのに使用できる。
【００２７】
本発明の免疫グロブリン鎖は、合成ポリペプチドまたは組換えポリペプチドとして得られてもよい。組換えポリペプチドを調製するためには、これをコード化する核酸を、融合パートナー、例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６ｘ−Ｈｉｓエピトープタグ(6x-His epitope tag)、Ｍ１３ジーン３プロテイン(M13 Gene 3 protein)、または免疫グロブリン重鎖定常領域をコード化する他の核酸に連結しうる。得られた融合核酸は、タンパク質発現を目的として細胞に導入されうる。融合タンパク質は、当該分野において既知の方法によって宿主細胞から単離できる。単離された融合タンパク質は、さらに、例えば、酵素による消化によって処理して、融合パートナーを除去し、有益な組換えポリペプチドを得てもよい。または、免疫グロブリン鎖は、鎖をコード化する核酸の内因性発現を活性化することによって、適当な宿主から得てもよい。
【００２８】
本発明の免疫グロブリン鎖のアミノ酸組成は、ＰＳＧＬ−１に結合できる抗体の形成能を破壊しない限り様々なものでありうる。例えば、このような変異体は、一以上の構成性アミノ酸置換を含むものであってもよい。「構成性アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基を同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換したものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基群は、当該分野において規定されている。これらの群としては、塩基側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、無極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。ゆえに、ポリペプチドにおける予想される非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖群から他のアミノ酸残基で置換される。または、飽和突然変異誘発などによって、本発明のポリペプチドのすべてまたは一部にそってランダムに突然変異を導入してもよく、得られた変異体は、下記実施例に記載されるのと同様にして、ＰＳＧＬ−１に結合できる抗体の形成能についてスクリーニングすることにより、本発明の変異体を同定してもよい。ゆえに、一例としては、「配列番号：１９を含む免疫グロブリン鎖」ということばは、配列番号：１９の変異体を含む免疫グロブリン鎖を包含する。
【００２９】
上記免疫グロブリン鎖及び変異体は、本発明の抗体またはその誘導体を作製するのに使用できる。「抗体」は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ（単鎖抗体）、及びｄＡｂ（ドメイン抗体、Ｗａｒｄ，  ｅｔ．  ａｌ．  （１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ，  ３４１，  ５４４）等の、完全な分子、さらにはその断片を含む。抗体の誘導体とは、本発明のポリペプチド変異体のタンパク質またはタンパク質複合体を意味する。本発明の抗体または誘導体は、下記実施例で記載されるのと同様にして適当な宿主細胞中で対応する軽鎖及び重鎖ＣＤＲを含むポリペプチドを一緒に発現させることによって作製されうる。または、これらは、モノクローナル及びポリクローナル抗体ならびにフラグメントを作製する分野における既知の方法によって作製されうる。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  （１９８８）  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照。
【００３０】
本発明の抗体を作製するためには、ＰＳＧＬ−１またはその抗原性フラグメントを、ＫＬＨ等の、キャリアタンパク質にカップリングし、アジュバントと混合して、宿主動物に注射してもよい。次に、その動物で産生した抗体は、ペプチドアフィニティクロマトグラフィーによって精製できる。一般的に使用される宿主動物としては、ウサギ、マウス、モルモット、及びラットが挙げられる。免疫学的な応答を増大するのに使用できる様々アジュバントは、宿主の種によって異なり、フロイントアジュバント（完全及び不完全）、水酸化アルミニウム等の無機ゲル、リゾレシチン等の界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、及びジニトロフェノールが挙げられる。使用できるヒト用アジュバントとしては、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌(bacille Calmette-Guerin)）及びコリネバクテリウム・パルヴム(Corynebacterium parvum)が挙げられる。
【００３１】
抗体分子の異種集団である、ポリクローナル抗体は、免疫処置を受けた患者の血清中に存在する。特定の抗原に対する抗体の同種集団である、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術を用いて調製されうる。例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７５）  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５；Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６，５１１；Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６，２９２；及びＨａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．を参照。特に、モノクローナル抗体は、米国特許第４，３７６，１１０号に記載されるような培養物における連続細胞系による抗体分子の製造を提供する技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４，７２；Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０，２０２６）およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６）によって得られる。このような抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ等の免疫グロブリンクラス、及びこのいずれかのサブクラスであってもよい。本発明のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養されてもよい。インビボで高力価のモノクローナル抗体を生産できると、特に有用な生産方法が得られる。
【００３２】
加えて、「キメラ抗体」の生産を目的として開発された技術が使用されうる。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８１，６８５１；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３１２，  ６０４；およびＴａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３１４，４５２を参照。キメラ抗体は、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域及びヒト免疫グロブリン定常領域を有するものなどの、異なる部分が異なる動物種由来である分子である。または、単鎖抗体の生産について記載される技術（米国特許第４，９４６，７７８号及び第４，７０４，６９２号）を適用して、単鎖Ｆｖ抗体のファージライブラリーを生産してもよい。単鎖抗体は、アミノ酸架橋を介してＦｖ領域の重鎖及び軽鎖フラグメントを連結することによって形成される。さらに、抗体フラグメントは、既知の技術によって得られる。例えば、このようなフラグメントとしては、以下に制限されるものではないが、抗体分子のペプシン消化によって製造されうるＦ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって得られるＦａｂフラグメントがある。抗体はまた、下記実施例に記載されるまたは既知の方法によってヒト化されてもよい。例えば、所望の結合特異性を有するモノクローナル抗体は、商業上、ヒト化されうる（Ｓｃｏｔｇｅｎｅ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ；およびＯｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）。形質転換動物中で発現するものなどの、完全ヒト化抗体は、本発明の範囲に包含される（例えば、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７，１３；ならびに米国特許第５，５４５，８０６号及び第５，５６９，８２５号参照）。
【００３３】
例えば、インビトロで活性化Ｔ細胞を本発明の抗体と接触させることによって、および有効量の抗体を活性化Ｔ細胞の死を誘導する必要のある患者に投与することによって、活性化Ｔ細胞の死を誘導する方法もまた、本発明の範囲に含まれる。治療される患者は、過剰のまたは望ましくないＴ細胞が仲介する免疫応答に関連する症状を有するとまたはこのような症状を有する危険性のあると同定されるものでありえ、例えば、自己免疫疾患、移植拒絶、アレルギー疾患、またはＴ細胞誘導性癌を罹患する患者がありうる。本方法は、単独でまたは他の薬剤若しくは治療法と組合わせて行なわれ得る。
【００３４】
「治療」ということばは、疾患、疾患の症状、疾患に続発する病状、または罹患しやすい傾向を治癒する、緩和する、軽減する、修復する、予防する、または改善することを目的とした患者への組成物の投与を意味する。「有効量」とは、治療される患者に医学的に望ましい結果を生じさせ得る組成物の量である。
【００３５】
治療される疾患例としては、真性糖尿病、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨粗鬆症、及び乾癬性関節炎を含む）、多発性硬化症、脳脊髄炎、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎及び湿疹様皮膚炎を含む）、乾癬、シェーグレン症候群、クローン病、アフター性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、１型糖尿病、炎症性大腸炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、ハンセン病逆転反応(leprosy reversal reactions)、癩性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳脊髄炎、特発性両側性進行性感音難聴、再生不良性貧血、赤芽球癆、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーブンス−ジョンソン症候群、突発性スプルー(idiopathic sprue)、扁平苔癬、グレーブス病、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎、間質性肺線維症、移植片対宿主病、骨髄移植、肝臓移植、またはいずれかの器官もしくは組織の移植等の移植の症例（同種または異種組織を用いた移植を含む）、アトピー性アレルギー等のアレルギー、ＡＩＤＳ、および白血病またはリンパ腫等のＴ細胞腫瘍が挙げられる。
【００３６】
一つのインビボアプローチでは、治療用組成物（例えば、本発明の抗体を含む組成物）を、患者に投与する。通常、抗体は、製薬上許容できる担体（例えば、生理食塩水）に懸濁し、経口でもしくは静脈内注射によって投与し、または皮下に、筋肉内に、髄腔内に、腹腔内に、直腸内に、膣内に、鼻腔内に、胃内に、気管内に、もしくは肺内に注射または移植してもよい。
【００３７】
必要投与量は、投与径路の選択；製剤の性質；患者の病状の性質；患者の大きさ、体重、表面積、年齢及び性別；投与される他の薬剤；ならびに主治医の判断によって異なる。適当な投与量は、０．０１〜１００．０ｍｇ／ｋｇの範囲である。必要投与量の変更は、様々な利用できる組成物や様々な投与経路の異なる有効性を考慮して予想されうる。例えば、経口投与は、静脈内注射による投与に比してより高い投与量が必要であることが予想される。これらの投与レベルの変更は、当該分野においてよく理解されるような最適化のための標準的な経験手順を用いて調節できる。適当なデリバリーベヒクル（例えば、ポリマー微粒子または移植可能なデバイス）への組成物のカプセル封入により、デリバリー、特に経口デリバリーの有効性を高めてもよい。
【００３８】
製薬上許容できる担体および有効量の本発明の抗体を含む薬剤組成物もまた、本発明の範囲に含まれる。本薬剤組成物は、上記したような病気を治療するのに使用できる。製薬上許容できる担体としては、溶剤、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、ならびに等張剤及び吸収遅延剤が挙げられる。
【００３９】
本発明の薬剤組成物は、公知の方法を用いて様々な投与経路用の剤形で配合されうる。例えば、経口投与を目的としてカプセル、ゲルシール、または錠剤状に配合されてもよい。カプセルは、ゼラチンまたはセルロース等の標準的な製薬上許容できる材料を含んでもよい。錠剤は、本組成物を固体担体及び滑剤と一緒に圧縮混合することにより、公知の方法に従って配合されうる。固体担体の例としては、デンプン、糖ベントナイトが挙げられる。本組成物はまた、ハードシェルタブレットまたは結合剤、例えば、ラクトースまたはマンニトール、公知の充填剤、および錠剤化剤を含むカプセルの形態で投与されてもよい。本薬剤組成物は、非経口経路で投与されてもよい。非経口用の剤形の例としては、水溶液、等張液もしくは活性剤の５％グルコース、または他の既知の製薬上許容できる賦形剤が挙げられる。シクロデキストリン、または当業者に既知の他の可溶化剤を治療剤のデリバリーを目的とする製薬用の賦形剤として使用してもよい。
【００４０】
本発明の組成物の有効性は、インビトロ及びインビボ双方で評価できる。例えば、下記実施例を参照。簡単にいうと、本組成物を、インビトロでの活性化Ｔ細胞の死の誘導能について試験してもよい。インビボでの研究では、組成物を動物（例えば、マウスモデル）に注射した後、その治療効果を評価する。結果に基づいて、適当な投与量の範囲および投与経路を決定すればよい。
【００４１】
下記特定の実施例は、単に詳細に説明するものであると解され、いかなる場合であっても残りの開示を制限するものではない。さらに説明を要さずに、当業者は、本明細書の記載に基づいて、本発明を十分利用することができると考えられる。本明細書中に列挙された公報はすべて参考によって完全に本明細書中に引用される。
【００４２】
実施例１：マウスモノクローナル抗体１５Ａ７、４３Ｂ６、及び９Ｆ
抗ＰＳＧＬ−１抗体の生成
標準的な技術を用いて、ヒトＰＳＧＬ−１（ｈＣＤ１６２）に特異的に結合するマウスモノクローナル抗体を得た。より詳細には、マウスを、ＰＨＡ−活性化ヒトＴ細胞の膜画分で免疫処置し、剖検して、ハイブリドーマ細胞系を得た。得られたハイブリドーマ細胞系の上清を、安定してｈＣＤ１６２を発現するＣＨＯ細胞への結合性についてスクリーニングした。ｈＣＤ１６２を発現するＣＨＯ細胞に結合するが親のＣＨＯ細胞には結合しない抗体を生産する細胞系を同定し、サブクローニングし、さらに下記のようにして分析した。
【００４３】
ｍ１５２−１５Ａ７、ｍ１６６−４３Ｂ６、及びｍ１２８−９Ｆ９は、同定された系の中に含まれていた。これらは、それぞれ、ＩｇＧ１抗体１５Ａ７、４３Ｂ６、及び９Ｆ９を生産していた。免疫ブロッティングアッセイから、活性化Ｔ細胞の溶解産物から破壊されたこれらの３種の抗体は、抗ｈＣＤ１６２抗体(kpl-1, PharMingen, San Diego, CA)によって検出されうるタンパク質を産生することが示された。
【００４４】
上記した３種の抗体について、活性化Ｔ細胞のアポプトシス誘導能を試験した。３種のハイブリドーマ細胞系によって分泌されるモノクローナル抗体を含む培養上清を、それぞれ、６時間、非活性化ヒトＴ細胞（０日目）またはインビトロで活性化されたヒトＴ細胞（７日目）と共にインキュベートした。次に、細胞を、アネクシンＶ(annexin V)で染色し、ＦＡＣＳ分析にかけた。ＣＤ３に陽性な細胞を取り出して(gate)、インビトロで活性化されたヒトＴ細胞数または休止ヒトＴ細胞数のいずれかを計測した。アポプトシス細胞は、アネクシンＶ染色に陽性であった。表１は、スキャンされた全Ｔ細胞中に占められるアポプトシスＴ細胞の割合（％）を要約する。
【００４５】
【表１】
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【００４６】
これらの結果から、マウス１５Ａ７、４３Ｂ６、及び９Ｆ９抗体は、（１）ｈＣＤ１６２に特異的であり、（２）ヒト活性化Ｔ細胞に結合して、休止ヒトＴ細胞のアポプトシスは誘導せずに、活性化Ｔ細胞のアポプトシスは誘導することが示された。
【００４７】
また、アポプトシスアッセイをＰＨＡ活性化ヒト末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）で行なった。抗体は、活性化Ｔ細胞のみのアポプトシスを誘導し、休止Ｔ細胞、Ｂ細胞の、または好中球のアポプトシスは誘導しないことが分かった。
【００４８】
抗ＣＤ３等の、Ｔ細胞枯渇抗体が可溶性因子の生産を誘導することが可能であることは知られている。このような抗体を用いた治療法は、一般的に、有害なサイトカイン症候群を引き起こす。抗ＰＳＧＬ−１抗体がサイトカインに関連する副作用を引き起こすか否かを試験するために、新たに単離されたヒトＰＢＭＣを、１５Ａ７と共に２４、４８、または７２時間培養した。次に、上清中のサイトカインレベルを測定した。かなりの量のＩＬ−２、ＴＮＦ−a、及びＩＦＮ−aがＰＨＡ活性化ＰＢＭＣ（ポジティブコントロール）では生産されたが、１５Ａ７で処置された細胞からの上記サイトカインのレベルは検出不可能であった。これらの結果から、抗ＰＳＧＬ−１は、アポプトシス誘導及び細胞活性化双方において、休止末梢血細胞には何らあるいはほとんど影響を及ぼさないことが示唆された。
【００４９】
上記抗体は、休止Ｔ細胞または他の免疫細胞に悪影響を与えることなく、活性化Ｔ細胞のアポプトシスを選択的に誘導するので、このような抗体を患者に投与することによって、抗ＣＤ３または免疫抑制剤のようなリンパ球減少症または広範な免疫不全は引き起こさないものと考えられる。
【００５０】
抗ＣＤ１６２抗体のエピトープマッピング
ヒトＣＤ１６２でのマウス１５Ａ７、４３Ｂ６、及び９１７９の結合エピトープのマッピングを行なうために、ヒトＣＤ１６２の様々な領域を包含する一連の融合タンパク質を発現させ、精製した。融合タンパク質とこれらのモノクローナル抗体との相互作用を、サンドイッチ酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって試験した。
【００５１】
簡潔にいうと、ヒトＣＤ１６２遺伝子の様々な領域を包含するフラグメントを、大腸菌でヒト免疫グロブリンガンマ１重鎖定常領域との融合タンパク質として発現させた。ヒト免疫グロブリンガンマ１重鎖定常領域をコード化するｃＤＮＡを、ＢｇｌＩＩ部位及びＢａｍＨＩ部位を有するプライマーを用いたＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物をＢｇｌＩＩ及びＢａｍＨＩで切断し、さらに予め同様の酵素で消化したｐＥＴ−３２ａベクター(Novagen)中にサブクローニングした。次に、ｈＣＤ１６２の様々な領域をコード化するｃＤＮＡを、５’末端にはＮｄｅＩ部位をおよび３’末端にはＢｇｌＩＩ部位を有するプライマーを用いたＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物を、対応する酵素で切断し、ｐＥＴ−３２ａベクターのヒト免疫グロブリンガンマ１重鎖定常領域をコード化する配列にフレーム単位で融合した(in frame fuse)。各構築で使用したプライマーを表２に列挙し、プライマーの配列を表３に記載する。
【００５２】
【表２−１】
0005623690.tif 000011
【００５３】
【表２−２】
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【００５４】
【表３−１】
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【００５５】
【表３−２】
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【００５６】
上記発現構築物を、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。ＩＰＴＧ（２ｍＭ）誘導を６時間行なった後、形質転換細胞を集め、ＰＢＳに再懸濁した。細胞を超音波処理し、１４，０００ｇで１０分間遠心した後、得られた上清を融合タンパク質の精製用に集めた。より詳しくは、上清をまず、４℃で３時間、プロテインＧまたはプロテインＡビーズと共にインキュベートした。次に、このビーズを３，０００ｇで遠心し、洗浄バッファーＩ（０．０５％  トリトンＸ−１００、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．５、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣ１２及び１ｍｇ／ｍｌ  ＯＶＡ）および洗浄バッファーＩＩ（０．０５％  トリトンＸ−１００、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．５及び１５０ｍＭのＮａＣｌ）で、それぞれ、５回洗浄した。さらに、結合タンパク質を０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ  ２．７を含む溶出バッファーで溶出し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．６で中和した。全精製融合タンパク質を、バイオ−ラッド  プロテインアッセイ(Bio-Rad protein assay)(Bio-Rad Laboratories, Cat. No. 500-0006)で定量し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。
【００５７】
ｈＣＤ１６２フラグメントと１５Ａ７、９Ｆ９、及び４３Ｂ６のそれぞれとの相互作用を研究するために、サンドイッチＥＬＩＳＡを行なった。９６ウェルマイクロタイタープレートを、４℃で一晩、ヤギ抗ヒトＩｇＧ(Southern Biotechnology, Cat. No. 2040-01)抗体（２μｇ／ｍｌ、５０μｌ／ウェル）で被覆した。プレートを、３７℃で１時間、ＰＢＳにおける０．２５％ＢＳＡ（１５０μｌ／ウェル）と共にインキュベートすることによってブロックした。次に、ブロックしたプレートを、室温で２時間、ヒトＣＤ１６２（２μｇ／ｍｌ）の様々なフラグメントを含む融合タンパク質と共にインキュベートした。０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で４回洗浄した後、プレートを室温で１．５時間、試験抗体（２μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。インキュベーション後、プレートをＰＢＳＴで４回洗浄した。さらに、５０μｌの１／３０００倍に希釈したアルカリホスファターゼと共役したヤギ抗マウスＩｇＧ(Southern Biotechnology, Cat. No. 1031-04)を各ウェルに添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。５０μｌのアルカリホスファターゼ基質溶液（１個のアルカリホスファターゼ基質錠剤を、ｐＨ  ８．６で０．０１２ＭのＮａ２ＣＯ３、０．１６ＭのＮａＨＣＯ３及び１ｍＭのＭｇＣｌ２を含む５ｍｌの基質バッファーに溶解したもの）を加えて、酵素反応を行ない、４０５ｎｍの吸光度を測定した。
【００５８】
４３Ｂ６及び９Ｆ９が成熟ヒトＣＤ１６２の５０〜６０番目の残基を含むすべての融合タンパク質と相互作用することができることが分かったことから、４３Ｂ６及び９Ｆ９のエピトープは５０〜６０番目の残基の間に位置することが示唆された。９Ｆ９及び４３Ｂ６とは異なり、１５Ａ７だけは、４２〜１１９番目の残基をカバーする融合タンパク質ではなく、４２〜３１９番目の残基をカバーする融合タンパク質に結合したことから、１５Ａ７のエピトープは１１９〜３１９番目の残基の間に位置することが示唆された。次に、１５Ａ７のエピトープの位置は１１５〜１２６番目の位置の間にまで狭まった。１２０番目の位置の一アミノ酸の変更（Ｇｌｕ→Ａｒｇ）によって、１５Ａ７と融合タンパク質との相互作用が消失したことから、ヒトＣＤ１６２の１５Ａ７の一次接触ドメインは１２０番目の位置にあるいはその付近に位置し、残基Ｇｌｕは相互作用に必須であることが示唆された。
【００５９】
また、様々なヒトＣＤ１６２領域をカバーする融合タンパク質を、哺乳動物細胞で発現させて、１５Ａ７との相互作用について試験した。これらの領域をカバーするフラグメントを、哺乳動物細胞中でヒト免疫グロブリンガンマ１重鎖定常領域との融合タンパク質として発現させた。まず、ヒト免疫グロブリンガンマ１重鎖定常領域をコード化するｃＤＮＡを、ｐｃＤＮＡ３ベクター(Invitrogen)に挿入した。第二に、ｈＣＤ１６２の様々な領域をコード化するｃＤＮＡを、５’末端にＢａｍＨＩ部位及び３’末端にＸｈｏＩ部位を導入するプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した。これらのＰＣＲ産物を対応する酵素で切断し、ヒト免疫グロブリンガンマ１重鎖定常領域を含むｐｃＤＮＡ３ベクターにサブクローニングした。各プライマーの名前及び配列を上記表２及び３に列挙する。
【００６０】
上述した哺乳動物発現ベクターを、製造社の指示に従って、リポフェクタミン２０００(Invitrogen, Cat.  No.  11668-027)によってＣＯＳ−７細胞に一時的にトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を超低Ｉｇ培地(Invitrogen, Cat.  No. 16250-078)中で生育させた。発現タンパク質を精製し、上記したのと同様にしてサンドイッチＥＬＩＳＡにかけた。
【００６１】
ＥＬＩＳＡの結果から、９４〜１４８番目の残基を含む融合タンパク質のみが１５Ａ７と相互作用できたことが示される。これらの結果は、１５Ａ７が１１５〜１２６番目の残基の間に位置するという考えと一致する。
【００６２】
上記結果すべてから、３種の抗体すべてが細菌で発現した融合タンパク質に結合するため、９Ｆ９、４３Ｂ６、及び１５Ａ７のエピトープは、炭水化物修飾依存性ではなく、タンパク質依存性であることが示される。また、１５Ａ７、９Ｆ９、及び４３Ｂ６は結合特異性及び活性化Ｔ細胞のアポプトシスの融合作用の面で同様の特性を示すが、ヒトＣＤ１６２の異なるドメインにより機能し、挙動が異なることも示唆される。
【００６３】
実施例２：キメラ抗体１５Ａ７、４３Ｂ６、及び９Ｆ９
抗ＣＤ１６２抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のクローニング
抗体１５Ａ７、４３Ｂ６、及び９Ｆ９の軽鎖及び重鎖可変領域（ＶＬ及びＶＨ）をコード化するｃＤＮＡを、アンカーＰＣＲ法(anchored PCR method)によって増幅した。３’プライマーはＣ領域とハイブリッド形成し、５’プライマーはターミナルデオキシトランスフェラーゼを用いてｃＤＮＡに結合したＧテールとハイブリッド形成した。ＰＣＲフラグメントをｐＣＲＩＩベクター(Invitrogen)にクローニングした。各鎖について幾つかの独立したクローンの配列を決定し、比較した。大部分の独立したクローンに代表される配列を選択した。次に、翻訳アミノ酸配列を分析し、所定の配列が具体的なマウス軽鎖または重鎖Ｖ領域の特性を有し、特定のサブタイプに属することを確認した。さらに、翻訳アミノ酸配列を各サブタイプの共通配列と比較することによって、相補性決定領域（ＣＤＲ）を同定した。使用される各プライマーの名前及び配列を上記表２及び３に列挙する。１５Ａ７、４３Ｂ６、及び９Ｆ９の軽鎖及び重鎖Ｖ領域の推定アミノ酸配列（配列番号：１９〜２４）を要約して示す。
【００６４】
キメラ抗体
キメラ抗体を発現させるためのベクターを得るために、１５Ａ７、４３Ｂ６、及び９Ｆ９のＶＬ及びＶＨ領域をコード化するｃＤＮＡを、５’シグナルペプチド配列及び３’スプライスドナーシグナルを含むようにプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した。上記プライマーはまた、ＰＣＲ産物の両末端にＸｂａＩ部位が導入されており、さらにこれをＸｂａＩ酵素で切断し、ＸｂａＩで消化したｐＶｋ、ｐＶｇ１、ｐＶｇ２、またはｐＶｇ４ベクターにライゲートした。より詳細には、１５Ａ７、４３Ｂ６、及び９Ｆ９のＶＬ領域ｃＤＮＡを、プラスミドｐＶｋにサブクローニングした。このプラスミドは、ＣＭＶプラスミド、及びヒト軽鎖定常領域をコード化した配列を含んでいた。１５Ａ７、４３Ｂ６及び９Ｆ９のＶＨ領域ｃＤＮＡを、プラスミドｐＶｇ１、ｐＶｇ２、またはｐＶｇ４にサブクローニングした。上記３つのプラスミドは、それぞれ、ＣＭＶプロモーターを有していた。これらはまた、それぞれ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４のヒト重鎖定常領域を含んでいた。
【００６５】
上記軽鎖をコード化するプラスミドを、それぞれ、ＣＯＳ−７細胞中に、重鎖をコード化するプラスミドと一緒にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞の上清を集めた。上清中のキメラ抗体について、ヒトＣＤ１６３への結合能及び活性化Ｔ細胞のアポプトシス誘導能を分析した。
【００６６】
１５Ａ７、４３Ｂ６、及び９Ｆ９から作製されたキメラ抗体はすべて、ヒトＣＤ１６２を安定して発現するＳｐ２／０トランスフェクタントには結合したが、親Ｓｐ２／０細胞には結合しないことが分かり、これから、これらはヒト１６２結合能特異性を保持していることが示唆された。さらに、キメラ抗体は、７日間活性化されたＴ細胞のアポプトシスを誘導したことが分かり、これから、これらはマウスカウンターパートの機能も同様に保持していることが示唆された。
【００６７】
ヒト化抗体
マウス１５Ａ７を用いて、ヒトのフレームワークにＣＤＲをグラフトすることによってヒト化抗体を作製した。結合親和性及び特異性を保持するために、ＣＤＲをヒトのフレームワークにグラフトする際にＶ領域の構造を保存することが重要である。適当なフレームワークドナーを選択するために、マウス１５Ａ７軽鎖及び重鎖Ｖ領域のアミノ酸配列を、予めヒト化された５０個のマウス抗体のアミノ酸配列と比較した。
【００６８】
マウス抗体、ｍＤＲＥＧ−５５は、軽鎖及び重鎖の双方でマウス１５Ａ７のＶ領域と高い配列相同性を有することが分かった。このｍＤＲＥＧ−５５抗体に対するマウス１５Ａ７の配列アライメント(sequence alignment)を下記に列挙する（ＣＤＲは強調している）。
【００６９】
【化９】
0005623690.tif 000015
【００７０】
マウスＤＲＥＧ−５５は、Ｌ−セレクチンに対するＩｇＧ１モノクローナル抗体である。マウス１５Ａ７のＶＬ及びＶＨ領域の配列は、マウスＤＲＥＧ５５のものに対して、それぞれ、６４．３％（フレームワークのみ：７３．８％）及び７０％（フレームワークのみ：８１．６％）の相同性である。ヒト化ＤＲＥＧ−５５（ＨｕＤＲＥＧ−５５）は、ヒト抗体ＧａｌからＶＬ及びＶＨ領域のフレームワーク配列を用いてすでに構築されていた。したがって、マウス１５Ａ７をヒト化するために、ヒトＧａｌ軽鎖及び重鎖のフレームワーク配列を用いて、マウス１５Ａ７のカウンターパートを置換した。
【００７１】
ヒト化１５Ａ７軽鎖及び重鎖可変領域を、それぞれ、４対の合成オリゴヌクレオチド（約８０塩基長）によって組み立てた。各対のオリゴヌクレオチドは、約２０ヌクレオチドほど重複していた。ヌクレオチド配列を選択し、シグナルペプチドを含むヒト化可変領域のタンパク質配列をコート化するように合成した。遺伝子の組み立て及び増幅は、下記４段階で行なった：（１）４対の相補オリゴヌクレオチドをアニールして、４つの別個の反応でクレノウフラグメントを用いて伸張し；（２）得られた４個のｄｓＤＮＡフラグメントをペアワイズ混合し(mix pair wise)、変性し、再アニールし、さらに２つの別個の反応で伸張し；（３）得られた２個のｄｓＤＮＡフラグメントを混合し、変性し、再アニールし、さらに伸張して、最終の全長ｄｓＤＮＡを作製し；さらに（４）得られたＤＮＡを、双方の末端にＸｂａＩ部位を導入するように、プライマーを用いてＰＣＲによって増幅した。次に、ＰＣＲフラグメントを、ＸｂａＩで切断し、ＸｂａＩで消化したｐＶｋ及びｐＶｇ４ベクターのそれぞれに挿入した。さらに、ＣＤＲとフレームワークとの相互作用が重要であると考えられる位置で、Ｇａｌの残基をマウス１５Ａ７（即ち、Ｉ６２Ｖ及びＤ７４Ｈ）のものに変更しなおした。ｍＤＲＥＧ−５５に対するマウス１５Ａ７及びヒト化１５Ａ７（Ｈｕｌ５Ａ７）のアライメントを下記に示し、この際、Ｖ６２及びＨ７４に下線をふしている。
【００７２】
【化１０】
0005623690.tif 000016
【００７３】
このようにして得られたプラスミドは、ヒト化１５Ａ７の重鎖及び軽鎖をコード化していた。次に、これらのプラスミドをＣＯＳ−７細胞中に一緒にトランスフェクトした。さらに、培養細胞から消耗した上清(exhausted supernatant)を集めた。上清中のヒト化１５Ａ７について、ｈＣＤ１６２を安定して発現するＣＨＯトランスフェクタントへの結合能および７日間活性化したＴ細胞のアポプトシス誘導能を試験した。結果から、これはこれらの能力を保持していることが示される。
【００７４】
キメラ及びヒト化抗体の調製
ヒト化及びキメラ抗体を産生する細胞を得た。より詳細には、Ｓｐ２／０細胞（Ｓｐ２／０−Ａｇｌ４；ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １５８１）を、製造社の指示に従って、３６０Ｖ及び２５μＦのキャパシタンスでＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ装置(Gene Pulser apparatus)(Bio-Rad Laboratories)を用いたエレクトロポレーションによって適当なプラスミドを安定してトランスフェクトした。トランスフェクション前に、プラスミドを、ＢａｍＨＩ酵素で消化することによって線状にした。すべてのトランスフェクションは、ＰＢＳ中で１０７細胞及び２０μｇの各プラスミドＤＮＡを用いて行なった。各トランスフェクションから得られた細胞を９６ウェル組織培養プレートに播種した。４８時間後、選択培地（ＤＭＥＭ  １０％  ＦＢＳ／ヒポキサンチン／チミジン媒体補足）及び１μｇ／ｍｌミコフェノール酸を適用した。抗体を産生する細胞を、ＥＬＩＳＡによって培養上清中の抗体の存在を調べることによってスクリーニング、単離した。
【００７５】
単離された細胞を血清を含まないまたは低Ｉｇ培地で培養し、培養上清を集めた。抗体を、スタフィロコッカスプロテインＡ−セファロースＣＬ−４Ｂ(staphylococcal protein A-Sepharose CL-4B)のカラムに通すことによって精製した。洗浄バッファーＩ（０．０５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．５、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣ１２及び１ｍｇ／ｍｌ  ＯＶＡ）及び洗浄バッファーＩＩ（０．０５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．５及び１５０ｍＭのＮａＣｌ）でそれぞれ５回洗浄した後、結合した抗体を、０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ  ２．７を含む溶出バッファーで溶出し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．６で中和した。
【００７６】
親和性測定
上記マウス、キメラ、及びヒト化１５Ａ７抗体の結合親和性を、競合的結合によって測定した。
【００７７】
マウス１５Ａ７を、ＥＺ−リンク  スルホ−ＮＨＳ−ビオチンシステム(EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin system)(Pierce Biotechnology, Cat. No. 21217)によってビオチン化した。簡単にいうと、０．５ｍｇ（３．３×１０−６ｎｍｏｌｅ）のマウス１５Ａ７を、１８７μｌのＰＢＳに溶解し、６．８×１０−５ｎｍｏｌｅのスルホ−ＮＨＳ−ビオチンと混合した。次に、この混合物を２時間氷上でインキュベートした後、ＰＢＳで一晩４℃で透析することによって、遊離ビオチンを除去した。このようにして得られたビオチン標識マウス１５Ａ７を使用するまで４℃で貯蔵した。
【００７８】
ヒトＣＤ１６２を安定して発現するＳｐ２／０トランスフェクタントを、ヒトＣＤ１６２抗原源として使用した。ビオチン標識マウス１５Ａ７をトレーサーとして用いた。コンペティター抗体（マウス、キメラ、またはヒト化１５Ａ７）の量を増やして、３５ｎｇのビオチン標識マウス１５Ａ７と混合し、常時振盪しながら４℃で１．５時間、１×１０５個のＣＤ１６２を発現するＳｐ２／０細胞と共にインキュベートした。洗浄後、２次抗体、ストレプトアビジン−ＰＥ(Streptavidin-PE)(Becton Dickinson Immunocytometry System Inc. Cat. No. 349023)をこの混合物に添加した。４℃で４５分間インキュベートした後、細胞を再度洗浄し、３００μｌのＰＢＳ−１％のＦＢＳ中に再懸濁し、ＦＡＣＳ分析にかけた。
【００７９】
キメラ及びヒト化１５Ａ７の半値競合濃度(half-maximum competing concentration)は、それぞれ、約５．７１μｇ／ｍｌ及び４．５１μｇ／ｍｌであるのに大して、マウス１５Ａ７の半値競合濃度は３．７２μｇ／ｍｌであることが分かった。これらの結果から、マウス、キメラ、及びヒト化１５Ａ７の親和性は匹敵することが示唆された。換言すると、キメラ及びヒト化１５Ａ７に対する結合親和性（Ｋａ）は、それぞれ、２．６２×１０７Ｍ−１及び３．３３×１０７Ｍ−１であるのに対して、マウス１５Ａ７に対する結合親和性（Ｋａ）は４．０３×１０７Ｍ−１である。
【００８０】
競合分析
競合分析を行なって、上記３種のマウス抗体、ＰＳＧＬ−１、及びＰ−セレクチンのうちの相互作用を研究した。
【００８１】
Ｐ−セレクチンは、ほとんどの白血球のＰＳＧＬ−１に対する主要な高親和性リガンドである。３種の抗体がＰ−セレクチンのＰＳＧＬ−１への結合を妨げるか否かを調べるために、精製したヒトＰ−セレクチンの活性化Ｔ細胞への結合を、上記３種の抗体の存在下で測定した。Ｐ−セレクチン及びＰＳＧＬ−１の相互作用を遮断することが知られている、ＫＰＬ−１を、ポジティブコントロールとして使用した。
【００８２】
ヒトＰＢＭＣを、１％  ＰＨＡで２日間活性化し、ＩＬ−２を含む培地に３日間維持した。細胞を、９Ｆ９、１５Ａ７、４３Ｂ６、ＫＰＬ−１（ＰＳＧＬ−１のアンタゴニスト）、またはコントロール抗体（９Ｅ１０）を滴下しながら、３０分間インキュベートした後、組換ヒトＰ−セレクチン（１．２５μｇ／ｍｌ）を添加した。Ｐ−セレクチンの活性化Ｔ細胞への結合を、ＦＲＣＳで分析した抗Ｐ−セレクチン−ＦＩＴＣによって測定した。 
【００８３】
従来の報告と一致することに、ＫＰＬ−１は、低濃度（０．３１μｇ／ｍｌ）でほとんど完全に活性化Ｔ細胞へのＰ−セレクチンの結合を阻害した。４３Ｂ６は、ＫＰＬ−１と同様の有効性で活性化Ｔ細胞へのＰ−セレクチンの結合を遮断したが、この際、より高濃度の９Ｆ９が同様の効果を達成するために必要であった。確かに、０．０８μｇ／ｍｌ  ＫＰＬまたは４３Ｂ６が、５０％結合を阻害するのに必要であった。これに対して、５μｇ／ｍｌ  ９Ｆ９が必要であった。さらに、１５Ａ７は、２０μｇ／ｍｌでもＰ−セレクチン結合に阻害作用を示さなかった。驚くべきことに、これは、ＰＳＧＬ−１へのＰ−セレクチンの結合を促進した。これらの結果から、１５Ａ７及びＰ−セレクチンは、活性化Ｔ細胞のＰＳＧＬ−１の異なるモチーフに結合することが示唆される。
【００８４】
１５Ａ７がＰＳＧＬ−１についてＰ−セレクチンと競合しないという事実から、１５Ａ７のｉｎ  ｖｉｖｏ投与は、白血球のＰ−セレクチン依存補充(recruitment)を妨げることによって先天性免疫に影響を及ぼすとは考えられないことが示唆される。
【００８５】
ＰＳＧＬ−１は血小板で低レベルで発現することが報告されている。血小板への１５Ａ７抗体の効果を調べた。抗体はヒト血小板の凝集を促進あるいは阻害しないことが分かった。
【００８６】
実施例３：マウスＰＳＧＬ−１に対するハムスターのモノクローナル抗体ＴＡＢ４
マウスＰＳＧＬ−１に対するモノクローナル抗体である、ＴＡＢ４を、実施例１に記載した方法と同様にして調製した。これは、インビトロでＴ細胞のアポプトシスを誘導し、インビボでＴ細胞を枯渇した。マウスＰＳＧＬ−１とマウスＰ−セレクチンとの結合を妨げるか否かを決定するために、競合分析を実施例２に記載した方法と同様にして行なった。ＴＡＢ４は、２０μｇ／ｍｌという高濃度でもマウスＰＳＧＬ−１へのマウスＰ−セレクチンの結合を阻害しないことが分かった。
【００８７】
実施例４：マウスモノクローナル抗体  ４Ｂ７、５Ｃ４、１２Ｅ７、１４Ｂ３、１７Ｅ５、及び１８Ｄ１２
ヒトＰＳＧＬ−１に対するモノクローナル抗体  ４Ｂ７、５Ｃ４、１２Ｅ７、１４Ｂ３、１７Ｅ５、及び１８Ｄ１２の特徴をさらに明らかにした。活性化Ｔ細胞に結合すると、これらはすべて、活性化Ｔ細胞の死を誘導した。ＰＳＧＬ−１とＰ−セレクチンとの相互作用を遮断するか否かを決定するために、競合分析を実施例２に記載した方法と同様にして行なった。これらの抗体は、最も高い試験濃度（５μｇ／ｍｌ）でも、ヒトＰＳＧＬ−１へのヒトＰ−セレクチンの結合に阻害作用を、示したとしても、ほとんど示さないことが分かった。
【００８８】
他の実施態様
本明細書に開示された態様はすべて、いずれの組み合わせで組み合わされてもよい。本明細書に開示された各態様は、同じ、等価の、または同様の目的を果たす別の態様に置換されてもよい。ゆえに、特記しない限り、開示された各態様は包括的な等価のあるいは同様の態様群の一例に過ぎない。
【００８９】
上記記載から、当業者は、本発明の必須の特徴を容易に確認することができ、本発明の概念及び範囲を逸脱することなく、様々な発明の変更や修飾を行なって、様々な用途及び条件に適用することができる。ゆえに、他の実施態様もまた、本発明の範囲に含まれる。
【配列表】
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