(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者のアルツハイマー病の健康状態若しくは健康状態における変化を判定するためのデータを収集する方法、又は患者のアルツハイマー病、アルツハイマー病に伴う認知症、アルツハイマー病に伴う認知障害、アルツハイマー病のリスク、アルツハイマー病に伴う認知障害のリスク、若しくはアルツハイマー病に伴う認知症のリスクを判定するためのデータを収集する方法であって、
ａ）前記患者由来の少なくとも１つの血液試料を分析して、１又は複数の代謝産物マーカーについての定量化データを得るステップ、及び
ｂ）前記１又は複数の代謝産物マーカーについての定量化データと、１又は複数の標準試料について得られた対応するデータとを比較して、前記血液試料における前記１又は複数の代謝産物マーカーの増加若しくは減少のレベルを確認するステップ、を含み、
前記１又は複数の代謝産物マーカーが、プラスメニルエタノールアミン、プラスマニルエタノールアミン、及びそれらの組合せからなる群から選択される１又は複数の分子を含み、かつ
前記１又は複数の標準試料から得られた前記対応するデータに対する前記少なくとも１つの血液試料における前記１又は複数の代謝産物マーカーのレベルの増加若しくは減少が、前記患者がアルツハイマー病、アルツハイマー病に伴う認知症、若しくはアルツハイマー病に伴う認知障害を有するか、又はアルツハイマー病のリスク、アルツハイマー病に伴う認知症のリスク、若しくはアルツハイマー病に伴う認知障害のリスクを有するかを示す、方法。
【請求項２】
患者のアルツハイマー病、アルツハイマー病に伴う認知症又はアルツハイマー病に伴う認知障害を治療するための療法の効力を評価するためのデータを収集する方法であって、
ａ）前記患者由来の少なくとも１つの血液試料を分析して、１又は複数の代謝産物マーカーについての定量化データを得るステップ、及び
ｂ）前記１又は複数の代謝産物マーカーについての定量化データと、１又は複数の標準試料について得られた対応するデータとを比較して、前記血液試料における前記１又は複数の代謝産物マーカーの増加若しくは減少のレベルを確認するステップ、を含み、
前記１又は複数の代謝産物マーカーが、プラスメニルエタノールアミン、プラスマニルエタノールアミン、及びそれらの組合せからなる群から選択される１又は複数の分子を含み、かつ
前記１又は複数の標準試料から得られた前記対応するデータに対する前記少なくとも１つの血液試料における前記１又は複数の代謝産物マーカーのレベルの増加又は減少が、前記療法が前記患者の生化学的状態を改善しているかどうかを示す、方法。
【請求項３】
試料がＭＳ／ＭＳ移行により分析される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
試料が抽出イオンクロマトグラフィー（ＥＩＣ）及びＭＳ／ＭＳ移行により分析される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
患者由来の少なくとも１つの試料を分析して、１又は複数の内部対照代謝産物についての定量化データを得るステップ、及び
前記１又は複数の代謝産物マーカーのレベルの各々の、前記１又は複数の内部対照代謝産物について得られたレベルに対する比率を算出するステップ
をさらに含み、比較ステップ（ｂ）が、各々の比率と、前記１又は複数の標準試料について得られた１又は複数の対応する比率とを比較するステップを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
１又は複数の内部対照代謝産物が、ホスファチジルエタノールアミン（ＰｔｄＥｔ）である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ホスファチジルエタノールアミンが、ＰｔｄＥｔ １６：０／１８：０、ＰｔｄＥｔ １６：０／１８：１、ＰｔｄＥｔ １８：０／１８：０、ＰｔｄＥｔ １８：０／１８：１及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ホスファチジルエタノールアミンが、ＰｔｄＥｔ １６：０／１８：０を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
血液試料における１又は複数の代謝産物マーカーのレベルの減少が、比較ステップ（ｂ）において確認される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
血液試料における１又は複数の代謝産物マーカーのレベルの増加が、比較ステップ（ｂ）において確認される、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
プラスマニルエタノールアミンが、プラスマニル１６：０／１８：１、プラスマニル１６：０／１８：２、プラスマニル１６：０／２０：４、プラスマニル１６：０／２２：４、プラスマニル１６：０／２２：６、プラスマニル１８：０／１８：１、プラスマニル１８：０／１８：２、プラスマニル１８：０／２０：４、プラスマニル１８：０／２２：４、プラスマニル１８：０／２２：６及びそれらの組合せからなる群から選択されるか、
プラスメニルエタノールアミンが、プラスメニル１６：０／１８：１、プラスメニル１６：０／１８：２、プラスメニル１６：０／２０：４、プラスメニル１６：０／２２：４、プラスメニル１６：０／２２：６、プラスメニル１８：０／１８：１、プラスメニル１８：０／１８：２、プラスメニル１８：０／２０：４、プラスメニル１８：０／２２：４、プラスメニル１８：０／２２：６及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
試料が、ＭＳ／ＭＳ移行により分析され、
プラスマニルエタノールアミンのＭＳ／ＭＳ移行がそれぞれ、７０２．０／２８１．０、７００．０／２７９．０、７２４．０／３０３．０、７５２．０／３３１．０、７４８．０／３２７．０、７３０．０／２８１．０、７２８．０／２７９．０、７５２．０／３０３．０、７８０．０／３３１．０及び７７６．０／３２７．０であり、かつ
プラスメニルエタノールアミンのＭＳ／ＭＳ移行がそれぞれ、７００．０／２８１．０、６９８．０／２７９．０、７２２．０／３０３．０、７５０．０／３３１．０、７４６．０／３２７．０、７２８．０／２８１．０、７２６．０／２７９．０、７５０．６／３０３．２、７７８．０／３３１．０及び７７４．０／３２７．０である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
定量化データが、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴、飛行時間型、オービトラップ、四重極又は三重四重極質量分析計を用いて得られる、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
質量分析計にクロマトグラフィーシステムが備えられている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
血液試料が全血試料、全血の亜分画、血清試料又は血漿試料である、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
試料について液／液抽出を実施し、これにより無極性代謝産物が有機溶媒に溶解され、極性代謝産物が水性溶媒に溶解される、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
抽出された試料が、正若しくは負のエレクトロスプレーイオン化、正若しくは負の気圧化学イオン化、又はそれらの組合せにより分析される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
１又は複数の標準試料が、
ａ）非認知症対照個体から得た１又は複数の標準試料；
ｂ）認知症対象から得た１又は複数の標準試料；
ｃ）アルツハイマー病であると病理的に診断された対象から得た１又は複数の標準試料；ｄ）アルツハイマー病であると臨床的に診断された対象から得た１又は複数の標準試料；
ｅ）ＡＤＡＳ−ｃｏｇで測定される認知障害の患者から得た１又は複数の標準試料；
ｆ）ＭＭＳＥで測定される認知障害の患者から得た１又は複数の標準試料；又は
ｇ）前記（ａ）〜（ｆ）の任意の組合せ
である、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
ａ）アルツハイマー病（ＡＤ）の存在若しくはリスク、
ｂ）ＡＤ病態の存在若しくはリスク、
ｃ）アルツハイマー病に伴う認知症の存在若しくはリスク、
ｄ）アルツハイマー病に伴う認知障害の存在若しくはリスク、又は
ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）の組合せ
を判定するためのデータを収集する方法である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ａ）アルツハイマー病（ＡＤ）、
ｂ）ＡＤ病態、
ｃ）アルツハイマー病に伴う認知症、
ｄ）アルツハイマー病に伴う認知障害、又は
ｅ）前記（ａ）〜（ｄ）の組合せ
を治療する療法の効力を評価するためのデータを収集する方法である、請求項２に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｂ）で定義された１又は複数の標準試料の少なくとも１つが、患者から得た治療前基準試料である、請求項２又は２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臨床的に診断された認知症又は他の神経障害と正常な患者との間で存在度が有意に異なることが発見されている、小分子又は代謝産物に関する。本発明は、認知症及び他の神経障害の診断方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢脳の最も重症な結果は認知症であり、それは、Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4th edition (DSM-IV)で、以下のように定義される。
【０００３】
「記憶障害及び以下の認知障害、すなわち失語症、失行症、失認症又は実行機能の障害の少なくとも１つを含む複数の認知欠損の発達。認知障害は、職業的又は社会的な機能の障害を引き起こすのに十分重症でなければならず、それ以前のより高いレベルの機能からの低下を示さなければならない。」（American Psychiatric Association.  Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders - Fourth Edition.  Washington D.C.: American Psychiatric Association; 1994.）
【０００４】
我々の社会で高齢者の数は急増し、結果として、認知症は主要な健康問題となりつつある。１９９１年に、健康と加齢に関するカナダ試験は、６５歳を超える集団の２５％がある型の認知症を有すると推定した。その研究は、カナダで認知症を抱える人数は、２０１１年及び２０３１年までにそれぞれ２倍及び３倍になるとも推定した（Canadian Study of Health and Aging Working Group.  Canadian Study of Health and Aging: study methods and prevalence of dementia.  CMAJ, 1994.  150: p. 899-913.）。
【０００５】
認知症の臨床症状は、神経変性（例えばアルツハイマー病［ＡＤ、Alzheimer's Disease］、レーヴィ小体を有する認知症［ＤＬＢ、dementia with Lewy bodies］及び前頭側頭葉認知症［ＦＴＬＤ、frontotemporal lobe dementia］）、血管性（例えば多発脳梗塞性認知症）若しくは無酸素性事象（例えば心停止）、脳への外傷（例えばボクサー認知症［ボクサー認知症］）、又は、感染性因子（例えばクロイツフェルト・ヤコブ病）若しくは毒性因子（例えばアルコール誘導性認知症）への曝露から生じることがある（Cummings, J.L., and Benson, D.F.  Dementia: a clinical approach.  Stoneham MA: Butterworth, 1992.）。
【０００６】
ＡＤは認知症で最も一般的な原因であって、血管認知症（ＶａＤ、vascular dementia）、ＤＬＢ及びＦＴＬＤがそれに続く（Dugue, M., et al.  Review of Dementia.  Mt Sinai J Med, 2003.  72: p. 45-53.）。認知症の型の鑑別診断は直接的ではなく、一般的に他の障害の排除に基づく（McKhann, G., et al.  Clinical diagnosis of Alzheimer's disease: report of the NINCDS-ADRDA Work Group under the auspices of Department of Health and Human Services Task Force on Alzheimer's Disease.  Neurology, 1984. 34: p. 939-44.）。例えば、ビタミンＢ１２欠乏症、貧血症、感染症、性病又は甲状腺障害が認知症症状の可能な理由であり得るかどうか判断するために、血液化学検査値が測定される。症状が、腫瘍、感染症又は血管性事象の存在によることができるかどうか判断するために、磁気共鳴画像法又はコンピュータ断層撮影法などの様々な神経画像処理技術を利用することができる（Dugue, M., et al.  Review of Dementia.  Mt Sinai J Med, 2003.  72: p. 45-53.）。
【０００７】
認知症症状を他の障害によって説明することができない場合、臨床症状（例えば転倒の頻度、視覚又は聴覚の幻覚の急な開始、存在、その他）に基づいて排他的にＡＤ、ＤＬＢ又はＦＴＬＤの診断がなされる。剖検で脳の組織病理学的評価が実施されるまでは、確定的な診断を得ることができない（McKhann, G., et al.  Clinical diagnosis of Alzheimer's disease: report of the NINCDS-ADRDA Work Group under the auspices of Department of Health and Human Services Task Force on Alzheimer's Disease.  Neurology, 1984. 34: p. 939-44.、McKeith, I.G., et al.  Consensus guidelines for the clinical and pathologic diagnosis of dementia with Lewy bodies (DLB): report of the consortium on DLB internal workshop.  Neurology, 1996.  47: p. 1113-24.、Neary, D., et al.  Frontotemporal lobar degeneration: a consensus on clinical diagnostic criteria.  Neurology, 1998.  51: p. 1546-54.）。８５歳を超える人々におけるＡＤの有病率に関する前向き研究は、ＡＤの神経病理学的基準を有する個体の半分より多くの者は、非認知症であったか又は誤ってＶａＤと診断されたことを示した。同様に、臨床上の特徴に基づいてＡＤと診断された個体の３５％は、神経病理学的評価がその診断を支持しなかったことから、誤って診断されたものである（Polvikoski, T., et al.  Prevalence of Alzheimer's disease in very elderly people: a prospective neuropathological study.  Neurology, 2001. 56: p. 1690-6.）。様々な認知症の臨床症状はしばしば重複するので誤診の程度は理解でき、それは、関連情報が臨床医に知らされるかどうかに依存する。
【０００８】
異なる型の認知症は、特定の神経病理学的特徴に基づく。ＡＤの確定診断は、２種類のニューロンタンパク質の沈着、すなわち、神経細胞内神経原線維濃縮体（ＮＦＴ、neurofibrillary tangle）の形のタウ、及び老人斑（ＳＰ、senile plaque）を形成する細胞外β−アミロイドの蓄積に基づく。タウは、細管の結合及び重合の促進による、ニューロン軸索における微小管の形成にとって重要である。ＡＤでは、タウは過リン酸化されることによって、その基本機能を破壊する。タウは集積し、軸索中で濃縮体を形成する。ニューロンはそれ以上機能することができず、死に至る。タウタンパクは細胞外空間に放出され、そこで、それは脳脊髄液（ＣＳＦ、cerebrospinal fluid）中に検出することができる（Lee, V.M.Y., et al.  Neurodengerative tauopathies.  Annu Rev Neurosci, 2001.  24: p. 1121-59.）。しかし、ＳＰの形成は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ、amyloid precursor protein）からの、４０及び４２残基のタンパク質β−アミロイドの蓄積による（Morishima-Kawashima, M. and Ihara, Y.  Alzheimer's disease: β-Amyloid protein and tau.  J Neurosci Res, 2002.  70: p. 392-41）。β−アミロイドの形成及び分泌はホメオスタシスによって緊密に調節されるが、ホメオスタシスを破壊して脳内でのタンパク質の蓄積をもたらし、その周辺のニューロンを破壊する何かがＡＤでは発生する（Morris, J.C., et al.  Very mild Alzheimer's disease: informant-based clinical, psychometric, and pathological distinction from normal aging.  Neurology, 1991. 41: p. 469-78.、Price, J.L. et al.  The distribution of tangles, plaques and related immunohistochemical markers in healthy aging and Alzheimer's disease.  Neurobiol Aging, 1991.  12: p. 295-312.）。ＣＳＦ内での増加するタウの量及びβ−アミロイドの非存在が、ＡＤの可能な診断マーカーとして提案されているが、結果は一貫していない。問題は、正常な加齢の間に増加するＮＦＴ及びＳＰの存在によるのかもしれない（Price, J.L., and Morris, J.C.  Tangles and plaques in nondemented aging and "preclinical" Alzheimer's disease.  Ann Neurol, 1999.  45: p. 358-68.）。ＮＦＴ及びＳＰがＡＤの診断であるためには、それらは脳の特定の領域（新皮質及び辺縁系領域）に一緒に局在しなければならない（Price, J.L. et al.  The distribution of tangles, plaques and related immunohistochemical markers in healthy aging and Alzheimer's disease.  Neurobiol Aging, 1991.  12: p. 295-312.）。ＮＦＴを伴わないＳＰは、軽度の認知障害（ＭＣＩ、mild cognitive impairment）の個体及び７５歳より上の非認知症の個体の２７％で、同じ領域に存在する（Price, J.L., and Morris, J.C.  Tangles and plaques in nondemented aging and "preclinical" Alzheimer's disease.  Ann Neurol, 1999.  45: p. 358-68.）。
【０００９】
ＤＬＢの診断は、脳幹及び皮質ニューロン中の、レーヴィ小体と称されるα−シヌクレインと呼ばれるタンパク質沈着物の存在に基づく（McKeith, I.G., et al.  Consensus guidelines for the clinical and pathologic diagnosis of dementia with Lewy bodies (DLB): report of the consortium on DLB internal workshop.  Neurology, 1996.  47: p. 1113-24.）。認知欠損は、脳中のレーヴィ小体の量に対応する。
【００１０】
ＦＴＬＤは、特定の神経病理学的特徴を特徴としない。一般的に、前頭／側頭の皮質領域は、ニューロンの減少、海綿状変化（微小空胞化）及び重症の星状細胞神経膠症を起こす。ＦＴＬＤの臨床症状は、病状の種類よりも病状が発見される場所によって決まる（Neary, D., et al.  Frontotemporal lobar degeneration: a consensus on clinical diagnostic criteria.  Neurology, 1998.  51: p. 1546-54.）。
【００１１】
現在では、認知症を診断するのを助けるために様々な神経心理学的検査が用いられる。例えば、言語能力（言葉及び理解）、記憶、幾何学図形を複製する能力並びに現在の時間と場所の見当識を検査するために、アルツハイマー病評価スケール（ＡＤＡＳ、Alzheimer's Disease Assessment Scale）認知サブセットが用いられる。同様に認知障害を測定するフォルスタインのミニ精神状態検査（ＭＭＳＥ、Mini-Mental State Exam）は、広く検証されている、見当識、短期及び長期の記憶、行動、言語及び理解の検査法である。これらの検査は個体の認知障害のレベルを示すことができるが、それらは、認知症がＡＤによって、又は、ＡＤ以外の認知症によって起こることができるのかを示すものではない。
【００１２】
記載される認知症のいずれかで何らかの症状が明らかになるまでには、不可逆的なニューロンの減少が起きていると一般に受け取られている（Price, J.L., et al.  Neuron number in the entorhinal cortex and CA1 in preclinical Alzheimer disease.  Arch Neurol, 2001.  58: p. 1395-402.）。ＭＣＩは、正常な認知機能を有する、記憶の顕著な障害を特徴とする（Petersen, R.C., et al.  Mild cognitive impairment: clinical characterization and outcome.  Arch Neurol, 1999.  56: p. 303-8.）。ＭＣＩを有する個体の多数は後にＡＤ、ＤＬＢ又はＦＴＬＤと診断され、認知症が十分発達した全ての個体は最初にＭＣＩに類似した軽度の認知症症状を示すことから、ＭＣＩは正常な加齢と数種類の認知症との間の移行段階と考えられる（Bennett, D.A., et al.  Natural history of mild cognitive impairment in older persons.  Neurology, 2002.  59: p. 198-205.）。
【００１３】
認知症の種類を客観的に互いに識別する必要性がある。好ましくは、そのような方法は特異的、正確及び効率的である。明らかに、剖検の前に認知症の鑑別診断をする差し迫った必要がある。
【００１４】
臨床症状の前に神経病理学的変化を検出することができるバイオマーカーは、大きな価値があろう。ＡＤのバイオマーカーで期待されるものに関して、１９９９年にコンセンサスに到達した（Growdon, J.H., et al.  Application of the National Institute on Aging (NIA)-Reagan Institute criteria for the neuropathological diagnosis of Alzheimer disease.  J Neuropathol Exp Neurol, 1999.  58: p. 1147-55.）。
１．神経病理学上の基本的な特徴を検出すること
２．ＡＤを検出するための＞８０％の診断鋭敏度
３．他の認知症を識別するための＞８０％の特異性
４．信頼できること
５．再現性のあること
６．非侵襲性であること
７．実施が簡単なこと
８．安価であること
【００１５】
ヒト血清中のＡＤ特異バイオマーカーの識別は極めて有用であろうが、その理由は、それが非侵襲性であり、臨床症状の出現の前にＡＤ病状の存在を検出し、異なる形の認知症であるが類似した臨床症状を有するであろう患者を区別するために用いることができるからである。
【非特許文献１】American Psychiatric Association.  Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders - Fourth Edition.  Washington D.C.: American Psychiatric Association; 1994.
【非特許文献２】Canadian Study of Health and Aging Working Group.  Canadian Study of Health and Aging: study methods and prevalence of dementia.  CMAJ, 1994.  150: p. 899-913.
【非特許文献３】Cummings, J.L., and Benson, D.F.  Dementia: a clinical approach.  Stoneham MA: Butterworth, 1992.
【非特許文献４】Dugue, M., et al.  Review of Dementia.  Mt Sinai J Med, 2003.  72: p. 45-53.
【非特許文献５】McKhann, G., et al.  Clinical diagnosis of Alzheimer's disease: report of the NINCDS-ADRDA Work Group under the auspices of Department of Health and Human Services Task Force on Alzheimer's Disease.  Neurology, 1984. 34: p. 939-44.
【非特許文献６】McKeith, I.G., et al.  Consensus guidelines for the clinical and pathologic diagnosis of dementia with Lewy bodies (DLB): report of the consortium on DLB internal workshop.  Neurology, 1996.  47: p. 1113-24.
【非特許文献７】Neary, D., et al.  Frontotemporal lobar degeneration: a consensus on clinical diagnostic criteria.  Neurology, 1998.  51: p. 1546-54.
【非特許文献８】Polvikoski, T., et al.  Prevalence of Alzheimer's disease in very elderly people: a prospective neuropathological study.  Neurology, 2001. 56: p. 1690-6.
【非特許文献９】Lee, V.M.Y., et al.  Neurodengerative tauopathies.  Annu Rev Neurosci, 2001.  24: p. 1121-59.
【非特許文献１０】Morishima-Kawashima, M. and Ihara, Y.  Alzheimer's disease: β-Amyloid protein and tau.  J Neurosci Res, 2002.  70: p. 392-410
【非特許文献１１】Morris, J.C., et al.  Very mild Alzheimer's disease: informant-based clinical, psychometric, and pathological distinction from normal aging.  Neurology, 1991. 41: p. 469-78.
【非特許文献１２】Price, J.L. et al.  The distribution of tangles, plaques and related immunohistochemical markers in healthy aging and Alzheimer's disease.  Neurobiol Aging, 1991.  12: p. 295-312.
【非特許文献１３】Price, J.L., and Morris, J.C.  Tangles and plaques in nondemented aging and "preclinical" Alzheimer's disease.  Ann Neurol, 1999.  45: p. 358-68.
【非特許文献１４】Price, J.L., et al.  Neuron number in the entorhinal cortex and CA1 in preclinical Alzheimer disease.  Arch Neurol, 2001.  58: p. 1395-402.
【非特許文献１５】Petersen, R.C., et al.  Mild cognitive impairment: clinical characterization and outcome.  Arch Neurol, 1999.  56: p. 303-8.
【非特許文献１６】Bennett, D.A., et al.  Natural history of mild cognitive impairment in older persons.  Neurology, 2002.  59: p. 198-205.
【非特許文献１７】Growdon, J.H., et al.  Application of the National Institute on Aging (NIA)-Reagan Institute criteria for the neuropathological diagnosis of Alzheimer disease.  J Neuropathol Exp Neurol, 1999.  58: p. 1147-55.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、臨床的に診断された認知症又は他の神経障害と正常な患者との間で存在度が有意に異なることが発見されている小分子又は代謝産物に関する。本発明は、認知症及び他の神経障害の診断方法にも関する。
【００１７】
本発明は、ＡＤ認知症、非ＡＤ認知症、認知障害又はそれらの組合せを識別して診断するための、１又は複数の代謝産物マーカーを特定する方法であって、
臨床的に診断されたＡＤ認知症、臨床的に診断された非ＡＤ認知症、かなりの認知障害又はそれらの任意の組合せを有する１人又は複数の患者からの、複数の代謝産物を含む１又は複数の試料を高分解能質量分析計に導入する工程と、
代謝産物の定量化データを取得する工程と、
前記定量化データのデータベースを構築する工程と、
試料からの特定及び定量化データを、参考試料からの試料から取得した対応するデータと比較する工程と、
同試料と前記参考試料との間で異なる１又は複数の代謝産物マーカーを特定する工程とを含み、
【００１８】
代謝産物マーカーは、表１〜７、１０〜１３及び１８に記載の代謝産物又はそれらの任意の組合せから選択される方法。本方法は、最適診断のために必要とされる最小限の数の代謝産物マーカーを選択する工程をさらに含むことができる。それには限定されない例では、高分解能質量分析計はフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計（ＦＴＭＳ、Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer）である。
【００１９】
本発明は、表７〜１３に記載の代謝産物からなる群から選択される新規化合物も提供する。代謝産物は、ホスファチジルコリン関連化合物、エタノールアミンプラスマロゲン、内因性脂肪酸、必須脂肪酸、脂質酸化副産物、前記代謝産物クラスの代謝産物誘導体、及び、何らかの前記代謝産物クラスの同化的／異化的代謝に寄与することができる任意の代謝産物からなる群から選択することができる。
【００２０】
本発明の一実施形態では、化合物は、ダルトン単位で測定した正確な質量が、５４１．３４３２、５６９．３６８７、６９９．５１９８、７２３．５１９５、７２３．５１９７、７５１．５５５５、８０３．５６８、８８６．５５８２、５６５．３３９４、５６９．３６９、８０１．５５５及び８５７．６１８６であるか又はそれらと実質的に同等である代謝産物からなる群から選択することができる。ダルトン単位で測定した正確な質量が、ａ）５４１．３４３２、ｂ）５６９．３６８７、ｃ）６９９．５１９８、ｄ）７２３．５１９５、ｅ）７５１．５５５５及びｆ）８０３．５６８であるか又はそれらと実質的に同等である代謝産物は、それぞれ
ａ）図４Ａで示す抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ、extracted ion chromatogram）及び図６で示すＭＳ／ＭＳスペクトル、
ｂ）図４Ｂで示すＥＩＣ及び図７で示すＭＳ／ＭＳスペクトル、
ｃ）図４Ｃで示すＥＩＣ及び図８で示すＭＳ／ＭＳスペクトル、
ｄ）図４Ｄで示すＥＩＣ及び図９で示すＭＳ／ＭＳスペクトル、
ｅ）図４Ｅで示すＥＩＣ及び図１０で示すＭＳ／ＭＳスペクトル、並びに
ｆ）図４Ｆで示すＥＩＣ及び図１１で示すＭＳ／ＭＳスペクトル
であることを特徴とすることもできる。
【００２１】
先に述べた化合物は、さらに、それぞれ分子式ａ）Ｃ２５Ｈ５１ＮＯ９Ｐ、ｂ）Ｃ２７Ｈ５５ＮＯ９Ｐ、ｃ）Ｃ３９Ｈ７４ＮＯ７Ｐ、ｄ）Ｃ４１Ｈ７４ＮＯ７Ｐ、ｅ）Ｃ４３Ｈ７８ＮＯ７Ｐ及びｆ）Ｃ４３Ｈ８１ＮＯ１０Ｐで、並びに／又は、それぞれａ）図１２、ｂ）図１３、ｃ）図１７、ｄ）図１８、ｅ）図１９及びｆ）図１４で示す構造を特徴とすることもできる。
【００２２】
化合物は、ダルトン単位で測定した正確な質量が、ａ）５６７．３５４７、ｂ）５６５．３３９４、ｃ）８０５．５８３２、ｄ）８２７．５７、ｅ）８２９．５８５６、ｆ）８３１．５９９７及びｇ）８５３．５８５４であるか又はそれらと実質的に同等である代謝産物からなる群から選択することもできる。これらの化合物は、さらに、それぞれ分子式ａ）Ｃ２７Ｈ５５ＮＯ９Ｐ、ｂ）Ｃ２７Ｈ５５ＮＯ９Ｐ、ｃ）Ｃ４３Ｈ８３ＮＯ１０Ｐ、ｄ）Ｃ４５Ｈ８１ＮＯ１０Ｐ、ｅ）Ｃ４５Ｈ８３ＮＯ１０Ｐ、ｆ）Ｃ４５Ｈ８５ＮＯ１０Ｐ及びｇ）Ｃ４７Ｈ８３ＮＯ１０Ｐで、並びに／又は、それぞれａ）図１５Ａ、ｂ）図１５Ｂ、ｃ）図１５Ｃ、ｄ）図１５Ｄ、ｅ）図１５Ｅ、ｆ）図１５Ｆ及びｇ）図１５Ｇで示す構造を特徴とすることもできる。
【００２３】
化合物は、さらに、正確な質量が表１８に記載のものであるか又はそれらと実質的に同等である代謝産物Ｍ０５〜Ｍ２４からなる群から選択することができる。これらの化合物中で、ダルトン単位で測定した正確な質量が、ａ）７０１．５３５９１、ｂ）６９９．５２０２６、ｃ）７２３．５２０２６、ｄ）７４７．５２０２６、ｅ）７２９．５６７２１、ｆ）７２７．５５１５６、ｇ）７７９．５８２８６及びｈ）７７５．５５１５６であるか又はそれらと実質的に同等である代謝産物は、それぞれａ）図２１、ｂ）図２２、ｃ）図２３、ｄ）図２４、ｅ）図２５、ｆ）図２６、ｇ）図２７及びｈ）図２８で示すＭＳ／ＭＳスペクトルをさらに特徴とすることができる。
【００２４】
先に述べた化合物は、さらに、それぞれ分子式ａ）Ｃ３９Ｈ７６ＮＯ７Ｐ、ｂ）Ｃ３９Ｈ７４ＮＯ７Ｐ、ｃ）Ｃ４１Ｈ７４ＮＯ７Ｐ、ｄ）Ｃ４３Ｈ７４ＮＯ７Ｐ、ｅ）Ｃ４１Ｈ８０ＮＯ７Ｐ、ｆ）Ｃ４１Ｈ７８ＮＯ７Ｐ、ｇ）Ｃ４５Ｈ８２ＮＯ７Ｐ及びｈ）Ｃ４５Ｈ７８ＮＯ７Ｐで、並びに／又は、それぞれ構造
【００２５】
【化１】
0005496513.tif 000002
を特徴とすることができる。
【００２６】
新規化合物は、表３０に記載の代謝産物からなる群から選択することもできる。これらの化合物中で、ダルトン単位で測定した正確な質量が、２０７．０８２２、２７５．８７１２、３７１．７３１１、３７３．７２８、４３２．１５３２、４８５．５６０３、４８７．６４８２、５６２．４６、６２２．２５３９、６４０．２６３７、７３０．６４９３及び７４２．２９７２であるか又はそれらと実質的に同等である代謝産物が、特に興味深い。
【００２７】
本発明の化合物の１又は複数は、認知症の鑑別診断のために使用することができる。
【００２８】
他の実施形態では、本発明は、患者の認知症又は認知症のリスクを鑑別診断するための方法であって、
ａ）前記患者から試料を得る工程と、
ｂ）１又は複数の代謝産物マーカーの定量化データを得るために前記試料を分析する工程と、
ｃ）前記１又は複数の代謝産物マーカーの定量化データを１又は複数の標準試料（reference sample）から得た対応するデータと比較する工程と、
ｄ）認知症又は認知症のリスクを鑑別診断するために前記比較を用いる工程とを含む方法。
【００２９】
分析工程（工程ｂ）は、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ、liquid chromatography mass spectrometry）によって試料を分析することを含むことができ、或いは、その方法がハイスループットな方法である場合は、液体クロマトグラフィー及びリニアイオントラップ質量分析によって試料を分析することを含むことができる。
【００３０】
直前の方法において、１又は複数の参考試料は、非認知症の対照個体から得た第１の参考試料である。１又は複数の参考試料は、臨床的に診断されたＡＤ−認知症の患者から得た第２の参考試料、臨床的に診断された非ＡＤ認知症の患者から得た第３の参考試料、及び／又はかなりの認知障害を起こしている患者から得た第４の参考試料を含むこともできる。
【００３１】
上記方法の一代替形態では、試料及び参考試料は血清試料であり、１又は複数の代謝産物マーカーは、表１〜７で記載の代謝産物又はそれらの組合せから選択される。これらの代謝産物マーカーは、ホスファチジルコリン関連化合物、エタノールアミンプラスマロゲン、内因性脂肪酸、必須脂肪酸、脂質酸化副産物、前記代謝産物クラスの代謝産物誘導体、及び、何らかの代謝産物クラスの同化的／異化的代謝に寄与することができる任意の代謝産物からなる群から選択することができる。
【００３２】
最適な診断のために必要とされる１又は複数の代謝産物マーカーは、ダルトン単位で測定される正確な質量が、５４１．３４３２、５６９．３６８７、６９９．５１９８、７２３．５１９５、７２３．５１９７、７５１．５５５５、８０３．５６８、８８６．５５８２であるか又はそれらと実質的に同等である代謝産物及びそれらの任意の組合せを含むことができる。
これらの中で、正確な質量が、６９９．５１９８、７２３．５１９５、７２３．５１９７及び７５１．５５５の代謝産物は、エタノールアミンプラスマロゲンであって、ＡＤ認知症患者で特に減少し、正確な質量が、５４１．３４３２、５６９．３６８７、８０３．５６８及び８８６．５５８２の代謝産物マーカーは、ホスファチジルコリン代謝産物であって、ＡＤＡＳ−ｃｏｇの認知障害の患者で減少し、認知障害の程度は減少の程度と相関する。
【００３３】
１又は複数の代謝産物マーカーは、ダルトン単位で測定した正確な質量が、ａ）５４１．３４３２、ｂ）５６９．３６８７、ｃ）６９９．５１９８、ｄ）７２３．５１９５、ｅ）７５１．５５５５及びｆ）８０３．５６８であるか又はそれらと実質的に同等である代謝産物でよい。これらの代謝産物は、さらに、それぞれ
ａ）図４Ａで示す抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）及び図６で示すＭＳ／ＭＳスペクトル、
ｂ）図４Ｂで示すＥＩＣ及び図７で示すＭＳ／ＭＳスペクトル、
ｃ）図４Ｃで示すＥＩＣ及び図８で示すＭＳ／ＭＳスペクトル、
ｄ）図４Ｄで示すＥＩＣ及び図９で示すＭＳ／ＭＳスペクトル、
ｅ）図４Ｅで示すＥＩＣ及び図１０で示すＭＳ／ＭＳスペクトル、
ｆ）図４Ｆで示すＥＩＣ及び図１１で示すＭＳ／ＭＳスペクトル、
を特徴とすることができる。
【００３４】
代謝産物は、さらに、それぞれ分子式ａ）Ｃ２５Ｈ５１ＮＯ９Ｐ、ｂ）Ｃ２７Ｈ５５ＮＯ９Ｐ、ｃ）Ｃ３９Ｈ７４ＮＯ７Ｐ、ｄ）Ｃ４１Ｈ７４ＮＯ７Ｐ、ｅ）Ｃ４３Ｈ７８ＮＯ７Ｐ及びｆ）Ｃ４３Ｈ８１ＮＯ１０Ｐで、並びに／又は、それぞれａ）図１２、ｂ）図１３、ｃ）図１７、ｄ）図１８、ｅ）図１９及びｆ）図１４で示す構造を特徴とすることもできる。
【００３５】
上記方法の他の形態では、試料及び参考試料は脳脊髄液（ＣＳＦ）試料でよく、１又は複数の代謝産物マーカーは、表１３に記載の代謝産物又はそれらの組合せから選択される。特に関心があるのは最適な診断に必要とされる代謝産物マーカーであり、それらは、ダルトン単位で測定した正確な質量が、２０７．０８２２、２７５．８７１２、３７１．７３１１、３７３．７２８、４３２．１５３２、４８５．５６０３、４８７．６４８２、５６２．４６、６２２．２５３９、６４０．２６３７、７３０．６４９３、７４２．２９７２であるか又はそれらと実質的に同等である代謝産物及びそれらの任意の組合せを含むことができる。これらの中で、代謝産物マーカー２０７．０８２２、４３２．１５３２、５６２．４６、６２２．２５３９、６４０．２６３７、７３０．６４９３及び７４２．２９７２は、ＡＤ認知症患者で増加し、代謝産物マーカー２７５．８７１２、３７１．７３１１、３７３．７２８、４８５．５６０３及び４８７．６４８２は、ＡＤ認知症患者で減少する。
【００３６】
上記方法の他の形態では、試料及び参考試料は血清試料であり、１又は複数の代謝産物マーカーは、正確な質量が表１８に記載のものであるか又はそれらと実質的に同等である代謝産物Ｍ０５〜Ｍ２４から選択することができる。これらの中で、特に関心のある１又は複数の代謝産物マーカーは、ダルトン単位で測定した正確な質量が、ａ）７０１．５３５９１、ｂ）６９９．５２０２６、ｃ）７２３．５２０２６、ｄ）７４７．５２０２６、ｅ）７２９．５６７２１、ｆ）７２７．５５１５６、ｇ）７７９．５８２８６及びｈ）７７５．５５１５６であるか又はそれらと実質的に同等である代謝産物を含むことができ、ａ）〜ｈ）のレベルの減少は、重度の認知障害を伴うＡＤ認知症を示す。
【００３７】
上記代謝産物は、それぞれａ）図２１、ｂ）図２２、ｃ）図２３、ｄ）図２４、ｅ）図２５、ｆ）図２６、ｇ）図２７及びｈ）図２８で示すＭＳ／ＭＳスペクトルをさらに特徴とすることができる。代謝産物は、さらに、それぞれ分子式ａ）Ｃ３９Ｈ７６ＮＯ７Ｐ、ｂ）Ｃ３９Ｈ７４ＮＯ７Ｐ、ｃ）Ｃ４１Ｈ７４ＮＯ７Ｐ、ｄ）Ｃ４３Ｈ７４ＮＯ７Ｐ、ｅ）Ｃ４１Ｈ８０ＮＯ７Ｐ、ｆ）Ｃ４１Ｈ７８ＮＯ７Ｐ、ｇ）Ｃ４５Ｈ８２ＮＯ７Ｐ及びｈ）Ｃ４５Ｈ７８ＮＯ７Ｐで、並びに／又は、それぞれ構造
【００３８】
【化２】
0005496513.tif 000003
を特徴とすることができる。
【００３９】
本発明の他の態様では、患者の認知症又は認知症のリスクを評価するための方法であって、
ａ）前記患者から血清試料を得る工程と、
ｂ）１又は複数の代謝産物マーカーの定量化データを得るために前記試料を分析する工程と、
ｃ）前記１又は複数の代謝産物マーカーの定量化データを１又は複数の参考試料から得た対応するデータと比較する工程と、
ｄ）認知症又は認知症のリスクを評価するために前記比較を用いる工程とを含む方法が提供される。
【００４０】
分析工程（工程ｂ）は、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によって試料を分析することを含むことができ、或いは、その方法がハイスループットな方法である場合は、液体クロマトグラフィー及びリニアイオントラップ質量分析によって試料を分析することを含むことができる。
【００４１】
直前の方法において、１又は複数の参考試料は、非認知症の対照個体から得た第１の参考試料であることができる。１又は複数の参考試料は、さらに、ＡＤＡＳ−ｃｏｇで測定される認知障害の患者から得た第２の参考試料、及び／又は、ＭＭＳＥで測定される認知障害の患者から得た第３の参考試料を含むこともできる。
【００４２】
上記方法の１又は複数の代謝産物マーカーは、表１０〜１２で記載の代謝産物から選択することができるか又はそれらの組合せでよい。特に関心のあるのは、ダルトン単位で測定した正確な質量が、５４１．３４３２、５６９．３６８７、６９９．５１９８、７２３．５１９５、７２３．５１９７、７５１．５５５５、８０３．５６８、８８６．５５８２、５６５．３３９４、５６９．３６９、８０１．５５５、８５７．６１８６であるか又はそれらと実質的に同等である代謝産物及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される１又は複数の代謝産物マーカーである。これらの中で、患者試料中の代謝産物マーカー６９９．５１９８、７２３．５１９５、７２３．５１９７及び７５１．５５５の減少はＡＤ病状を示し、患者試料中の代謝産物マーカー５４１．３４３２、５６９．３６８７、８０３．５６８及び８８６．５５８２の減少は、ＡＤＡＳ−ｃｏｇによる認知障害を示し、患者試料中の代謝産物マーカー５６５．３３９４、５６９．３６９、８０１．５５５及び８５７．６１８６の減少は、ＭＭＳＥによる認知障害を示す。
【００４３】
本発明の他の実施形態では、患者の認知症又は認知症のリスクを鑑別診断するための方法であって、
ａ）前記患者から試料を得る工程と、
ｂ）１又は複数の代謝産物マーカーの定量化データを得るために前記試料を分析する工程と、
ｃ）１又は複数の代謝産物マーカーそれぞれの内部対照代謝産物に対する比率を得る工程と、
ｄ）前記１又は複数の代謝産物マーカーの内部対照代謝産物に対する各比率を１又は複数の参考試料から得た対応するデータと比較する工程と、
ｅ）認知症又は認知症のリスクを鑑別診断するために前記比較を用いる工程とを含む方法が提供される。
【００４４】
分析工程（工程ｂ）は、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によって試料を分析することを含むことができ、或いは、その方法がハイスループットな方法である場合は、液体クロマトグラフィー及びリニアイオントラップ質量分析によって試料を分析することを含むことができる。
【００４５】
直前の方法において、１又は複数の参考試料は、非認知症の対照個体から得た第１の参考試料であることができる。１又は複数の参考試料は、さらに、臨床的に診断されたＡＤ−認知症の患者から得た第２の参考試料、臨床的に診断された非ＡＤ認知症の患者から得た第３の参考試料、及び／又はかなりの認知障害を起こしている患者から得た第４の参考試料を含むことができる。
【００４６】
上記方法の一態様では、試料及び参考試料は血清試料であり、１又は複数の代謝産物マーカーは、正確な質量が表１８に記載のものであるか又はそれらと実質的に同等である代謝産物Ｍ０５〜Ｍ２４から選択される。特に関心のあるものは、ダルトン単位で測定した正確な質量が、ａ）７０１．５３５９１、ｂ）６９９．５２０２６、ｃ）７２３．５２０２６、ｄ）７４７．５２０２６、ｅ）７２９．５６７２１、ｆ）７２７．５５１５６、ｇ）７７９．５８２８６及びｈ）７７５．５５１５６であるか又はそれらと実質的に同等である代謝産物を含む１又は複数の代謝産物マーカー、及びダルトン単位で測定した正確な質量が７１９．５４６４８であるか又はそれと実質的に同等である代謝産物を含む内部対照代謝産物である。これらの代謝産物及び内部対照代謝産物を使用する場合、代謝産物の内部対照代謝産物に対する比率の低下は、重度の認知障害を伴うＡＤ認知症を示す。
【００４７】
上記代謝産物は、さらに、それぞれａ）図２１、ｂ）図２２、ｃ）図２３、ｄ）図２４、ｅ）図２５、ｆ）図２６、ｇ）図２７及びｈ）図２８で示すＭＳ／ＭＳスペクトルを特徴とすることができる。これらの代謝産物は、さらに、それぞれ分子式ａ）Ｃ３９Ｈ７６ＮＯ７Ｐ、ｂ）Ｃ３９Ｈ７４ＮＯ７Ｐ、ｃ）Ｃ４１Ｈ７４ＮＯ７Ｐ、ｄ）Ｃ４３Ｈ７４ＮＯ７Ｐ、ｅ）Ｃ４１Ｈ８０ＮＯ７Ｐ、ｆ）Ｃ４１Ｈ７８ＮＯ７Ｐ、ｇ）Ｃ４５Ｈ８２ＮＯ７Ｐ及びｈ）Ｃ４５Ｈ７８ＮＯ７Ｐを特徴とすることができ、内部対照代謝産物は分子式Ｃ３９Ｈ７８ＮＯ８Ｐを特徴とすることができ、並びに／又は前記代謝産物は、それぞれ構造
【００４８】
【化３】
0005496513.tif 000004
で、内部標準代謝産物は、さらに、構造
【００４９】
【化４】
0005496513.tif 000005
を特徴とすることができる。
【００５０】
本発明のさらに他の実施形態では、患者の認知症を治療するための療法の効力を評価する方法であって、
ａ）前記患者から試料を得る工程と、
ｂ）１又は複数の代謝産物マーカーの定量化データを得るために前記試料を分析する工程と、
ｃ）前記定量化データを１又は複数の参考試料から得た対応するデータと比較する工程と、
ｄ）前記療法が患者の認知症状態を改善しているかどうかを判断するために前記比較を用いる工程とを含む方法が提供される。
【００５１】
分析工程（工程ｂ）は、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によって試料を分析することを含むことができ、或いは、その方法がハイスループットな方法である場合は、液体クロマトグラフィー及びリニアイオントラップ質量分析によって試料を分析することを含むことができる。
【００５２】
直前の方法において、１又は複数の参考試料は、非認知症の対照個体から得た複数の試料、臨床的に診断されたＡＤ患者から得た複数の試料、前記患者から得た１又は複数の治療前基準試料、又は、それらの任意の組合せでよい。
【００５３】
上記方法の一態様では、試料及び参考試料は血清試料であり、１又は複数の代謝産物マーカーは、表１〜７で記載の代謝産物又はそれらの組合せから選択される。最適な診断に必要とされるこれらの代謝産物マーカーは、ホスファチジルコリン関連化合物、エタノールアミンプラスマロゲン、内因性脂肪酸、必須脂肪酸、脂質酸化副産物、前記代謝産物クラスの代謝産物誘導体、及び、何らかの前記代謝産物クラスの同化的／異化的代謝に寄与することができる任意の代謝産物からなる群から選択することができる。特に関心があるのは、ダルトン単位で測定した正確な質量が、５４１．３４３２、５６９．３６８７、６９９．５１９８、７２３．５１９５、７２３．５１９７、７５１．５５５５、８０３．５６８、８８６．５５８２であるか又はそれらと実質的に同等である代謝産物である。
【００５４】
他の態様では、試料及び参考試料は脳脊髄液（ＣＳＦ）試料であり、１又は複数の代謝産物マーカーは、表１３に記載の代謝産物又はそれらの組合せから選択される。特に関心があるのは、ダルトン単位で測定した正確な質量が、２０７．０８２２、２７５．８７１２、３７１．７３１１、３７３．７２８、４３２．１５３２、４８５．５６０３、４８７．６４８２、５６２．４６、６２２．２５３９、６４０．２６３７、７３０．６４９３、７４２．２９７２であるか又はそれらと実質的に同等である代謝産物である。
【００５５】
第３の態様では、試料及び参考試料は血清試料であり、１又は複数の代謝産物マーカーは、正確な質量が表１８に記載のものであるか又はそれらと実質的に同等である代謝産物Ｍ０５〜Ｍ２４から選択することができる。これらの代謝産物の中で、ダルトン単位で測定した正確な質量が、７０１．５３９５１、６９９．５２０２６、７２３．５２０２６、７４７．５２０２６、７２９．５６７２１、７２７．５５１５６、７７９．５８２８６及び７７５．５５１５６であるか又はそれらと実質的に同等である代謝産物が、特に関心があるものであろう。
【００５６】
本発明は、患者の認知症を治療するための療法の効力を評価する方法であって、
ａ）前記患者から試料を得る工程と、
ｂ）１又は複数の代謝産物マーカーの定量化データを得るために前記試料を分析する工程と、
ｃ）１又は複数の代謝産物マーカーそれぞれの内部対照代謝産物に対する比率を得る工程と、
ｄ）前記１又は複数の代謝産物マーカーの内部対照代謝産物に対する各比率を１又は複数の参考試料から得た対応するデータと比較する工程と、
ｅ）前記療法が患者の認知症状態を改善しているかどうかを判断するために前記比較を用いる工程とを含む方法も提供する。
【００５７】
分析工程（工程ｂ）は、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によって試料を分析することを含むことができ、或いは、その方法がハイスループットな方法である場合は、液体クロマトグラフィー及びリニアイオントラップ質量分析によって試料を分析することを含むことができる。
【００５８】
直前の方法において、１又は複数の参考試料は、非認知症の対照個体から得た複数の試料、臨床的に診断されたＡＤ患者から得た複数の試料、前記患者から得た１又は複数の治療前基準試料、又は、それらの任意の組合せでよい。
【００５９】
上記方法では、試料及び参考試料は血清試料であり、１又は複数の代謝産物マーカーは、正確な質量が表１８に記載のものであるか又はそれらと実質的に同等である代謝産物Ｍ０５〜Ｍ２４から選択することができる。特に関心があるのは、ダルトン単位で測定した正確な質量が、７０１．５３９５１、６９９．５２０２６、７２３．５２０２６、７４７．５２０２６、７２９．５６７２１、７２７．５５１５６、７７９．５８２８６及び７７５．５５１５６であるか又はそれらと実質的に同等である代謝産物、並びに、ダルトン単位で測定した正確な質量が７１９．５４６４８であるか又はそれと実質的に同等である内部対照代謝産物である。
【００６０】
ＨＴＳアッセイを含む本発明の方法は、本出願で特定の「健康状態」が、それに限定されないが認知症を指す、以下のことのために用いることができる。
【００６１】
１．個体からとられる任意の生体試料を用いて複数の健康状態を区別することができる小分子代謝産物バイオマーカーを特定すること、
【００６２】
２．本出願で記載の、血清、血漿、全血、血清、ＣＳＦ及び／又は他の組織生検材料で特定される代謝産物を用いて健康状態を特定診断すること、
【００６３】
３．本出願で言及するものなどの管理された統計的方法を用いて最適診断アッセイの性能統計のために必要な最小限の代謝産物特性を選択すること、
【００６４】
４．ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、ＭＳｎ及びＮＭＲを用いて非標的メタボロミック分析から選択されるバイオマーカー代謝産物の構造特性を特定すること、
【００６５】
５．血清中の選択された代謝産物のレベルを分析するためのハイスループットＬＣ−ＭＳ／ＭＳ方法を開発すること、
【００６６】
６．それらに限定されないが質量分析、ＮＭＲ、ＵＶ検出、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法、enzyme-linked immunosorbant assay）、化学反応、像解析、その他を含む任意の方法を用いて、ＦＴＭＳ分析の患者血清から開示される代謝産物特性の任意の組合せのレベルを測定することにより、所与の健康状態を、又は健康状態を起こすリスクを診断すること。
【００６７】
リスクを評価するために、文字通り全ての者を彼らの寿命にわたって長くスクリーニングすることができるので、認知症の診断に及ぼす本発明の影響は膨大である。本発明の試験の性能特性が一般集団を代表するものであるとすると、この試験は単独で今日利用できる他のいかなるスクリーニング法よりも優れたものであることができるが、その理由は、それが臨床症状の出現の前に疾患の進行を検出する潜在能力を有することができるからである。
【００６８】
本発明のこの概要は、必ずしも本発明の全ての特徴を記載するものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６９】
本発明のこれら及び他の特徴は、添付の図を参照する以下の記載からより明らかになる。
【００７０】
本発明は、臨床的に診断された認知症又は他の神経障害と正常な患者との間で存在度が有意に異なることが発見されている小分子又は代謝産物に関する。本発明は、認知症及び他の神経障害の診断方法にも関する。
【００７１】
本発明は、１又は複数の疾患又は特定の健康状態の代謝産物マーカーを発見し、検証し、実施するための新規方法を提供する。本発明の一実施形態では、ＡＤ認知症、非ＡＤ認知症、認知障害又はそれらの組合せを鑑別診断するための特異的バイオマーカーを特定する方法であって、臨床的に診断されたＡＤ認知症、臨床的に診断された非ＡＤ認知症又はかなりの認知障害を有する１人又は複数の患者からの、複数の代謝産物を含む１又は複数の試料を高分解能質量分析計（例えば、それに限定するものではないが、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計（ＦＴＭＳ））に導入する工程と、代謝産物の特定及び定量化データを取得する工程と、前記特定及び定量化データのデータベースを構築する工程と、試料からの特定及び定量化データを、非認知症の正常患者からの試料から取得した対応するデータと比較する工程と、異なる１又は複数の代謝産物を特定する工程とを含む方法が提供される。本発明の方法を用いて特定される代謝産物マーカーには、表１〜７、１０〜１３及び１８で記載の代謝産物を含めることができる。本方法は、最適診断のために必要とされる最小限の数の代謝産物マーカーを選択する工程をさらに含むことができる。
【００７２】
特定の集団で所与の健康状態の生化学的マーカーを決定するために、その健康状態（すなわち特定の疾患）を代表する一群の患者及び／又は一群の「正常な」対応体が必要である。次に、ＦＴＭＳ及び／又はＬＣ−ＭＳを用いて試料中に存在する生化学物質を分析することによって、それら２つの群の間の生化学的相違を特定することを期待して、特定の健康状態カテゴリーの患者から採取される生体試料を、正常な集団から採取される同じ試料と、並びに類似した健康状態カテゴリーの患者と比較することができる。
【００７３】
上記の代謝産物マーカーの発見のための方法は、非標的のメタボロミックな手法又は方法を用いて実行することができる。複数の非標的のメタボロミクス手法が、ＮＭＲ（Reo, N.V., NMR-based metabolomics. Drug Chem Toxicol, 2002. 25(4): p. 375-82）、ＧＣ−ＭＳ（Fiehn, O., et al.  Metabolite profiling for plant functional genomics. Nat Biotechnol, 2000. 18(11): p. 1157-61.、Viani, P., et al., Effect of endothelin-1 induced ischemia on peroxidative damge and membrane properties in rat striatum synaptosomes.  Neurochem Res, 1995. 20: p. 689-95.、Zhang, J.-P., Sun, G.Y.  Free fatty acids, neutral glycerides, and phosphoglycerides in transient focal cerebral ischemia.  J Neurochem, 1995.  64: p. 1688095.）、ＬＣ−ＭＳ及びＦＴＭＳ手法（Reo, N.V., NMR-based metabolomics. Drug Chem Toxicol, 2002. 25(4): p. 375-82、Demediuk, P., et al.  Membrane lipd changes in laminectomized and traumatized cat spinal cord.  Proc Natl Acad Sci U S A, 1985. 82: p. 7071-5.、Wells, K., et al., Neural membrane phospholipids in Alzheimer disease.  Neurochem Res, 1995.  20: p. 1329-33.、Ginsberg, L., et al., Disease and anatomic specificity of ethanolamine plasmalogen deficiency in Alzheimer's disease brain.  Brain Res, 1995.  698: 223-6.）を含む科学文献で記載されている。本発明で差別的に発現された代謝産物の発見のために使用したメタボリックプロファイリング手法は、Phenomenome Discoveriesによる非標的ＦＴＭＳ手法（Zhang, J.-P., Sun, G.Y.  Free fatty acids, neutral glycerides, and phosphoglycerides in transient focal cerebral ischemia.  J Neurochem, 1995.  64: p. 1688095.、Ginsberg, L., et al., Disease and anatomic specificity of ethanolamine plasmalogen deficiency in Alzheimer's disease brain.  Brain Res, 1995.  698: 223-6.、Ginsberg, L., Xuereb, J.H. Gershfeld, N.L.  Membrane instability, plasmalogen content, and Alzheimer's disease.  J Neurochem, 1998.  70: p. 2533-8.、Guan, Z., et al.  Decrease and structural modifications of phosphatidylethanolamine plasmalogen in the brain with Alzheimer disease.  J Neuropathol Exp Neurol, 1999.  58: 740-7.、Pettegrew, J.W., et al., Brain membrane phospholipid alterations in Alzheimer's disease.  Neurochem Res, 2001.  26: p. 771-82.）、また、米国特許出願公開２００４−００２９１２０Ａ１号明細書、カナダ国特許出願２,２９８,１８１号明細書及び国際公開０１５７５１８パンフレットも参照）であった。非標的分析は、事前知識なしに又は分析前の成分の選択なしに、試料中のできるだけ多くの分子を測定することを含む。したがって、新規代謝産物バイオマーカーを発見する非標的分析の能力は、所定の分子リストを検出する標的方法に対して高い。本発明では、臨床的に診断されたＡＤ個体及び非ＡＤ個体の間で異なる血清試料中の代謝産物成分を特定するために、非標的方法を用いる。認知症を有する臨床的に診断されたＡＤ個体と認知症を有する臨床的に診断された非ＡＤ個体とで異なる代謝産物成分をＣＳＦ試料中で特定するために、同じ技術を用いた。
【００７４】
しかし、本発明で開示される差別的に調節される代謝産物のいくつか又は全てを発見するために他の代謝産物プロファイリング手法を用いることができること、及び、発見されたもの又は測定されたものであれ、本明細書で記載する代謝産物が、それらを検出、測定するために用いることができる分析技術とは無関係にある特異な化学成分を表すことを、当業者は認めよう。
【００７５】
本発明は、患者の認知症又は認知症のリスクを鑑別診断するための方法であって、
ａ）前記患者から試料を得る工程と、
ｂ）１又は複数の代謝産物マーカーの定量化データを得るために前記試料を分析する工程と、
ｃ）前記１又は複数の代謝産物マーカーの定量化データを１又は複数の参考試料から得た対応するデータと比較する工程と、
ｄ）認知症又は認知症のリスクを鑑別診断するために前記比較を用いる工程とを含む方法も提供する。
試料分析工程（工程ｂ）は、質量分析計（ＭＳ、mass spectrometer）を用いて試料を分析することを含むことができる。例えば、それらに限定するものではないが、そのような質量分析計は、ＦＴＭＳ型、オービトラップ（orbitrap）型、飛行時間（ＴＯＦ、time of flight）型又は四重極型でよい。代わりに、質量分析計は、さらなるプレ検出器マスフィルターを備えることができよう。例えば、それらに限定するものではないが、そのような器具は、四重極−ＦＴＭＳ（Ｑ−ＦＴＭＳ、quadrupole-FMS）、四重極−ＴＯＦ（Ｑ−ＴＯＦ、quadrupole-TOF）又は三重四重極（ＴＱ、triple quadrupole、若しくはＱＱＱ）と一般に呼ばれる。さらに、質量分析計は親イオン検出モード（ＭＳ）又は、ｎ＞＝２であるＭＳｎモードで作動させることができた。ＭＳｎは、親イオンが衝突誘発性解離（ＣＩＤ、collision induced dissociation）又は他の断片化手法によって断片化して断片イオンを形成し、その後、前記断片の１又は複数が質量分析計によって検出される状況を指す。次に、そのような断片をさらに断片化して、さらなる断片を形成することができる。代わりに、液体若しくはガスクロマトグラフィー系を用いて、又は、直接注入によって、試料を質量分析計に導入することができた。
【００７６】
用語「鑑別診断」又は「鑑別診断する」は、病態の様々な態様を互いから区別することができることを意味する。詳細には、本発明は、認知症の様々な状態の鑑別診断を可能にする。例えば、それらに限定するものではないが、本発明は、ＡＤ認知症、非ＡＤ認知症、認知障害又はそれらの組合せの鑑別診断を提供することができる。
【００７７】
本明細書で開示される代謝産物の全て又はサブセットを用いることによる、任意の種類の神経障害の診断又は排除を本発明は企図する。用語「認知症」は、本明細書で、認知障害並びに認知障害を引き起こす病状の両方を示す広義の用語として用いる。認知症は、いくつかの神経障害によって起こることができる。本明細書で使用する「ＡＤ認知症」は、アルツハイマー病（ＡＤ、本明細書では「ＳＤＡＴ」と呼ぶこともできる）に起因する認知症を指し、「非ＡＤ認知症」の種類には、それらには限定されないが、レーヴィ小体を伴う認知症（ＤＬＢ）、前頭側頭葉認知症（ＦＴＤ）、血管誘発認知症（例えば多発脳梗塞性認知症）、無酸素性事象誘発認知症（例えば心停止）、脳外傷誘発認知症（例えばボクサー認知症［ボクサーの認知症］）、感染因子（例えばクロイツフェルト・ヤコブ病）若しくは毒性因子（例えばアルコール誘発認知症）への曝露から生じる認知症、自閉症、多発性硬化症、パーキンソン病、双極性障害、貧血、ハンチントン舞踏病、大うつ病性障害、非開放性頭部損傷、水頭症、記憶喪失、不安障害、外傷性脳損傷、強迫性障害、精神分裂症、精神発達遅滞及び／又は癲癇が含まれる。ＡＤ認知症並びにＦＴＤ及びＤＬＢの非ＡＤ認知症が、特に関心がある。
【００７８】
認知障害は、当技術分野で公知の任意の方法によって評価することができる。例えば、それに限定するものではないが、アルツハイマー病評価スケール（ＡＤＡＳ）−認知サブセットを用いることができる。この神経心理学的検査は、言語能力（言葉及び理解）、記憶、幾何学図形を複製する能力及び現在の時間と場所の見当識を検査するために用いられる。検査のエラーは記録され、逆スコアの障害（すなわち、ＡＤＡＳのスコアが高いほど、認知障害は大きい）が得られる。０〜１５のスコアは正常とみなされ、１６〜４７は軽度から中程度の障害とみなされ、４８〜７０のスコアは中程度から重度の障害とみなされる（Graham, D.P., et al.  The alzheimer's disease assessment scale - cognitive subscale: normative date for older adult controls.  Alzheimer Dis Assoc Disord, 2004.  18: p. 236-40.）。他の神経心理学的検査である、認知障害を測定するフォルスタインのミニ精神状態検査（ＭＭＳＥ）を用いてもよい。ＭＭＳＥは広く使われており、見当識、短期及び長期の記憶、行動、言語及び理解の広く検証された検査である。当業者は、同じ認知欠損の態様を測定するさらなる神経心理学的評価、例えば、それらに限定されないが、ブレストロスの認知症評価スケール、７分スクリーニング、ウェクスラー記憶スケール（ＷＭＳ、Wechsler Memory Scale）、ハルステッド−ライタン検査、レイ聴覚言語学習検査、カリフォルニア言語学習検査、ブシケ選択的想起検査、ボストンネーミング検査、言語機能の臨床評価、ピーボディー画像用語検査、マティス認知症評価スケール、記憶評価スケール、記憶及び学習の検査、記憶及び学習の広範囲評価を用いることもできることを認めよう。
【００７９】
さらに、当業者は、認知障害又は構造変化を示す能力を有する任意の画像化技術、例えば、それらに限定されないが、構造磁気共鳴画像法（ＭＲＩ、magnetic resonance imaging）、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ、positron emission tomography）、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ、computerized tomography）、機能的磁気共鳴画像法（ｆＭＲＩ、functional magnetic resonance imaging）、脳波検査法（ＥＥＧ、electroencephalography）、単陽電子放出断層撮影法（ＳＰＥＣＴ、single positron emission tomography）、事象関連電位、脳磁気図記録法、多様式画像化は、その認知欠損及びＡＤ病状の原因である構造的／部位的脳領域を測定するものであり、したがって、本発明で開示される代謝産物に関連するであろうことを認めよう。
【００８０】
本発明に従い、体内の任意の箇所に由来する任意の種類の生体試料、例えば、それらに限定されないが、血液（血清／血漿）、ＣＳＦ、尿、便、呼気、唾液、又は、腫瘍、隣接する正常な平滑筋及び骨格筋、脂肪組織、肝臓、皮膚、髪、脳、腎臓、膵臓、肺、結腸、胃、その他を含む任意の固体組織の生検材料を用いることができる。血清又はＣＳＦである試料に、特に関心がある。用語「血清」を本明細書で用いるが、血漿又は全血又は全血の亜分画を用いることもできることを、当業者は認めよう。ＣＳＦは、局所麻酔薬を必要とする腰椎穿刺によって得ることができる。
【００８１】
それには限定されない実施例において、血液サンプルを患者から引き抜く場合、試料処理のためにいくつかの方法がある。処理の範囲は、全く処理しない単純なもの（すなわち凍結全血）又は、特定の細胞型の単離のような複雑なものでもよい。最も一般的な常用手法は、全血からの血清又は血漿の調製を含む。ろ紙又は他の固定材料などの固相支持体上への血液サンプルのスポッティングを含む全ての血液サンプル処理方法も、本発明によって企図される。
【００８２】
他のそれには限定されない実施例において、腰椎穿刺手法を用いてＣＳＦ試料を収集することができるが、局所麻酔薬を背中の腰部に適用する。次に、それが硬膜下腔を突き通すまで、針をＬ４及びＬ５椎骨の間の麻痺させた皮膚に挿入する。ＣＳＦは、無菌試験管に収集することができる。
【００８３】
例えば、決して限定するものではないが、ＣＳＦ試料を得ることは採血することよりも患者に多くの不快感をもたらすが、ＡＤ及び非ＡＤの間の鑑別診断であるＡＤ特異血清検査で陽性の結果が出た後に使用するＣＳＦアッセイは、高い程度の確証を有する。
【００８４】
決して限定するものではないが、上述の処理した血液、血清又はＣＳＦ試料は、次に、処理した血清又はＣＳＦ試料中に含まれる代謝産物の検出及び測定に使用される組織的な分析技術に適合するように、さらに処理することができる。処理の種類は、それ以上の処理はしないものから、分別抽出及び化学的誘導体化のような複雑なものまで様々であることができる。抽出法には、超音波処理、ソックレー抽出、マイクロ波抽出（ＭＡＥ、microwave assisted extraction）、超臨界流体抽出（ＳＦＥ、supercritical fluid extraction）、加速溶媒抽出（ＡＳＥ、accelerated solvent extraction）、加圧液体抽出（ＰＬＥ、pressurized liquid extraction）、加圧熱水抽出（ＰＨＷＥ、pressurized hot water extraction）及び／又は、メタノール、エタノール、アルコール類及び水の混合物、又は酢酸エチル若しくはヘキサンなどの有機溶媒などの普通溶媒中での界面活性剤抽出（ＰＨＷＥ、surfactant assisted extraction）が含まれよう。ＦＴＭＳ非標的分析のために代謝産物を抽出するための特に関心のある方法は、無極性代謝産物が有機溶媒に溶解し、極性代謝産物が水性溶媒に溶解する、液／液抽出を実施することである。
【００８５】
抽出した試料は、当技術分野で公知である任意の適当な方法で分析することができる。例えば、決して限定するものではないが、生体試料の抽出物は、直接注入による又はクロマトグラフィー分離の後の、基本的に任意の質量分析プラットホーム上での分析に適合する。代表的な質量分析計は、試料中の分子をイオン化する源泉及びイオン化された分子又は分子断片を検出するための検出器を含む。一般的な源泉のそれには限定されない例には、電子衝撃、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ、electrospray ionization）、気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ、atmospheric pressure chemical ionization）、気圧光イオン化（ＡＰＰＩ、atmospheric pressure photo ionization）、マトリックス援用レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ、matrix assisted laser desorption ionization）、表面強化レーザ脱離イオン化（ＳＥＬＤＩ、surface enhanced laser desorption ionization）及びそれらの派生物が含まれる。一般的な質量分離及び検出システムには、四重極、四重極イオントラップ、リニアイオントラップ、飛行時間型（ＴＯＦ）、磁性セクター、イオンサイクロトロン（ＦＴＭＳ）、オービトラップ（Orbitrap）及びそれらの派生物及び組合せが含まれてもよい。他のＭＳベースのプラットホームに勝るＦＴＭＳの利点は、低分解能器具ではその多くが見逃される、わずか１／１００ダルトンだけ異なる代謝産物の分離を可能にするその高い分解能力である。
【００８６】
用語「代謝産物」は、そのレベル又は強度が試料中で測定され、疾病状態を診断するマーカーとして用いることができる特定の小分子を意味する。これらの小分子は、本明細書で「代謝産物マーカー」、「代謝産物成分」、「バイオマーカー」又は「生化学的マーカー」と称することもできる。
【００８７】
代謝産物は通常、上記方法で用いられる質量分析法で測定されるそれらの正確な質量を特徴とする。正確な質量は、「正確な中性質量」又は「中性質量」と称すこともできる。代謝産物の正確な質量は、本明細書ではダルトン（Ｄａ）又は、それに実質的に同等である質量で示される。「それと実質的に同等である」は、正確な質量の±５ｐｐｍの差は同じ代謝産物を示すことを意味し、そのことは、当業者は認めよう。正確な質量は、中性代謝産物の質量として示される。当業者が認めるように、試料の分析中に起こる代謝産物のイオン化は、１又は複数の水素原子の損失又は獲得及び電子の損失又は獲得を引き起こす。これは、正確な質量を、イオン化の間に失われるか獲得される水素及び電子の質量分だけ正確な質量と異なる、「イオン化質量」に変化させる。特に明記しない限り、本明細書では、正確な中性質量と称す。
【００８８】
同様に、代謝産物がその分子式又は分子構造で記載される場合、中性代謝産物の分子式又は分子構造が示される。当然、イオン化代謝産物の分子式又は分子構造は、イオン化の間に失われるか獲得される水素の数の分だけ、中性分子の式又は構造と異なる。
【００８９】
分析中にデータが収集され、１又は複数の代謝産物の定量化データが得られる。「定量化データ」は、試料中に存在する特定の代謝産物のレベル又は強度を測定することによって得られる。
【００９０】
定量化データは、１又は複数の参考試料から得た対応するデータと比較される。「参考試料」は、特定の疾病状態のための任意の適当な参考試料である。例えば、決して限定するものではないが、本発明で、参考試料は、非認知症の対照個体、すなわちＡＤ認知症、非ＡＤ認知症又は認知障害を起こしていない者（本明細書では「「正常な」対応個体」とも称す）からの試料でよく、また、参考試料は、ＡＤと臨床的に診断された患者、臨床的に診断された非ＡＤ認知症患者、又はかなりの認知障害と診断された患者から得られる試料でもよい。当業者によって理解されるように、１つ以上の参考試料を定量化データとの比較のために用いることができる。例えば、それに限定するものではないが、１又は複数の参考試料は、非認知症の対照個体から得た第１の参考試料でよい。１又は複数の参考試料は、臨床的に診断されたＡＤ−認知症の患者から得た第２の参考試料、臨床的に診断された非ＡＤ認知症の患者から得た第３の参考試料、かなりの認知障害を起こしている患者から得た第４の参考試料、又はそれらの任意の組合せをさらに含むことができる。
【００９１】
本発明は、本発明の方法を用いて特定される新規化合物も提供する。前記のように、新規化合物は、認知症の鑑別診断で代謝産物マーカーとして用いることができる。
【００９２】
一実施形態では、化合物は、表１〜７で記載の代謝産物から選択することができるか又はそれらの組合せでよい。これらの代謝産物を血清試料中で特定し、それらは、ホスファチジルコリン関連化合物、エタノールアミンプラスマロゲン、内因性脂肪酸、必須脂肪酸、脂質酸化副産物、前記代謝産物クラスの代謝産物誘導体、及び、何らかの前記代謝産物クラスの同化的／異化的代謝に寄与することができる任意の代謝産物でよい。
【００９３】
最適な化合物群は、表１〜７で記載の代謝産物から特定することができる。例えば、それらに限定するものではないが、代謝産物マーカーは、ダルトン単位で測定した正確な質量が、５４１．３４３２、５６９．３６８７、６９９．５１９８、７２３．５１９５、７２３．５１９７、７５１．５５５５、８０３．５６８、８８６．５５８２であるか又はそれらと実質的に同等である代謝産物でよい。正確な質量が、６９９．５１９８、７２３．５１９５、７２３．５１９７及び７５１．５５５の代謝産物は、現在、エタノールアミンプラスマロゲンと同定されており、ＡＤ認知症患者で特異的に減少する。正確な質量が、５４１．３４３２、５６９．３６８７、８０３．５６８及び８８６．５５８２の代謝産物マーカーは、現在、ホスファチジルコリン代謝産物と同定されており、ＡＤＡＳ−ｃｏｇの認知障害患者で減少し、認知障害の程度は減少の程度と相関する。
【００９４】
ダルトン単位で測定した正確な質量が、ａ）５４１．３４３２、ｂ）５６９．３６８７、ｃ）６９９．５１９８、ｄ）７２３．５１９５、ｅ）７５１．５５５５、ｆ）８０３．５６８であるか又はそれらと実質的に同等である代謝産物は、それぞれ
【００９５】
ａ）図４Ａで示す抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）及び図６で示すＭＳ／ＭＳスペクトル、Ｃ２５Ｈ５１ＮＯ９Ｐの分子式、並びに／又は図１２で示す構造、
【００９６】
ｂ）図４Ｂで示すＥＩＣ及び図７で示すＭＳ／ＭＳスペクトル、Ｃ２７Ｈ５５ＮＯ９Ｐの分子式、並びに／又は図１３で示す構造、
【００９７】
ｃ）図４Ｃで示すＥＩＣ及び図８で示すＭＳ／ＭＳスペクトル、Ｃ３９Ｈ７４ＮＯ７Ｐの分子式、並びに／又は図１７で示す構造、
【００９８】
ｄ）図４Ｄで示すＥＩＣ及び図９で示すＭＳ／ＭＳスペクトル、Ｃ４１Ｈ７４ＮＯ７Ｐの分子式、並びに／又は図１８で示す構造、
【００９９】
ｅ）図４Ｅで示すＥＩＣ及び図１０で示すＭＳ／ＭＳスペクトル、Ｃ４３Ｈ７８ＮＯ７Ｐの分子式、並びに／又は図１９で示す構造、
【０１００】
ｆ）図４Ｆで示すＥＩＣ及び図１１で示すＭＳ／ＭＳスペクトル、Ｃ４３Ｈ８１ＮＯ１０Ｐの分子式、並びに／又は図１４で示す構造
【０１０１】
をさらに特徴とすることができる。
【０１０２】
エタノールアミンプラスマロゲン代謝産物（中性質量６９９．５１９８、７２３．５１９５、７５１．５５５５）及びホスファチジルコリン代謝産物（中性質量６９９．５１９８、７２３．５１９５、７５１．５５５５）は、かなりの認知障害を示すＡＤ対象の血清で減少することが現在分かっている。これは、ＡＤ及び認知症と関連するこれらの代謝産物の血清ベースの変化の最初の報告である。開示される血清ホスファチジルコリン関連の代謝産物の減少は、ＡＤ状態に関係なくＡＤＡＳ−ｃｏｇで測定されるかなりの認知障害を示す全ての患者で発生すること、及び、減少の程度は認知障害の程度と相関することがさらに分かっている。しかし、開示されるエタノールアミンプラスマロゲンの観察される減少は、認知障害とは無関係であり、ＡＤ対象で特異的に生じ、したがって、ＡＤの真の診断基準である。
【０１０３】
エタノールアミンプラスマロゲンは、１種のエタノールアミンリン脂質である。エタノールアミンリン脂質は、それらのｓｎ−１構造（アシル、エーテル又はビニルエーテル）に基づいて、さらに区別することができる。ｓｎ−２位置は一般的にアシルであり、ｓｎ−３位置はホスホエタノールアミン部分を含む。したがって、これら３つのクラスは、ジアシル（本明細書ではＰｔｄＥｔとも称す）、アルキルアシル（本明細書ではプラスマニルとも称す）又はアルケニルアシル（本明細書ではＥｔｎＰｌ若しくはプラスメニルとも称す）と記載される。エタノールアミンリン脂質の様々な基本構造は、本明細書で用いる標準的な命名法と一緒に図２０で示す。
【０１０４】
開示されるエタノールアミンプラスマロゲンの減少は、最初の又は初期の段階のＡＤを表すことができ、特定のエタノールアミンプラスマロゲンの血清レベルを測定することによって、生きている対象で非侵襲的に検出することができる。同様に、認知障害は、特定のホスファチジルコリン代謝産物の血清レベルを測定することによって、非侵襲的に数量化することができる。
【０１０５】
他の代謝産物も、特定された。例えば、ダルトン単位で測定した正確な質量が、ａ）５４１．３４３２、ｂ）５６９．３６８７、ｃ）６９９．５１９８、ｄ）７２３．５１９５、ｅ）７５１．５５５５、ｆ）８０３．５６８であるか又はそれらと実質的に同等である代謝産物がそうであり、それらは、それぞれ
【０１０６】
ａ）分子式Ｃ２７Ｈ５５ＮＯ９Ｐ、及び／又は図１５Ａで示す構造、
【０１０７】
ｂ）分子式Ｃ２７Ｈ５５ＮＯ９Ｐ、及び／又は図１５Ｂで示す構造、
【０１０８】
ｃ）分子式Ｃ４３Ｈ８３ＮＯ１０Ｐ、及び／又は図１５Ｃで示す構造、
【０１０９】
ｄ）分子式Ｃ４５Ｈ８１ＮＯ１０Ｐ、及び／又は図１５Ｄで示す構造、
【０１１０】
ｅ）分子式Ｃ４５Ｈ８３ＮＯ１０Ｐ、及び／又は図１５Ｅで示す構造、
【０１１１】
ｆ）分子式Ｃ４５Ｈ８５ＮＯ１０Ｐ、及び／又は図１５Ｆで示す構造、
【０１１２】
ｇ）分子式Ｃ４７Ｈ８３ＮＯ１０Ｐ、及び／又は図１５Ｇで示す構造
【０１１３】
をさらに特徴とすることができる。
【０１１４】
ＡＤ認知症に特異的な代謝産物（正確な質量６９９．５１９８、７２３．５１９５、７２３．５１９７、７５１．５５５）のエタノールアミンプラスマロゲンとしての同定に基づいて、他のエタノールアミンリン脂質代謝産物マーカーを同定した。これらは、表１８で記載され、特性決定される（正確な質量、名前／組成、分子式）、代謝産物Ｍ０５〜Ｍ２４である。代謝産物の構造は、表１８で示す代謝産物名及び図２０で示す命名法に基づいて推測することができる。
【０１１５】
表１８に記載の化合物の中で、特に関心のあるものには、ダルトン単位で測定した正確な質量が、ａ）７０１．５３５９１、ｂ）６９９．５２０２６、ｃ）７２３．５２０２６、ｄ）７４７．５２０２６、ｅ）７２９．５６７２１、ｆ）７２７．５５１５６、ｇ）７７９．５８２８６及びｈ）７７５．５５１５６であるか又はそれらと実質的に同等である代謝産物が含まれ、それらは、それぞれ
【０１１６】
ａ）図２１で示すＭＳ／ＭＳスペクトル、分子式Ｃ２７Ｈ５５ＮＯ９Ｐ、及び／又は構造
【０１１７】
【化５】
0005496513.tif 000006
【０１１８】
ｂ）図２２で示すＭＳ／ＭＳスペクトル、分子式Ｃ３９Ｈ７４ＮＯ７Ｐ、及び／又は構造
【０１１９】
【化６】
0005496513.tif 000007
【０１２０】
ｃ）図２３で示すＭＳ／ＭＳスペクトル、分子式Ｃ４１Ｈ７４ＮＯ７Ｐ、及び／又は構造
【０１２１】
【化７】
0005496513.tif 000008
【０１２２】
ｄ）図２４で示すＭＳ／ＭＳスペクトル、分子式Ｃ４３Ｈ７４ＮＯ７Ｐ、及び／又は構造
【０１２３】
【化８】
0005496513.tif 000009
【０１２４】
ｅ）図２５で示すＭＳ／ＭＳスペクトル、分子式Ｃ４１Ｈ８０ＮＯ７Ｐ、及び／又は構造
【０１２５】
【化９】
0005496513.tif 000010
【０１２６】
ｆ）図２６で示すＭＳ／ＭＳスペクトル、分子式Ｃ４１Ｈ７８ＮＯ７Ｐ、及び／又は構造
【０１２７】
【化１０】
0005496513.tif 000011
【０１２８】
ｇ）図２７で示すＭＳ／ＭＳスペクトル、分子式Ｃ４５Ｈ８２ＮＯ７Ｐ、及び／又は構造
【０１２９】
【化１１】
0005496513.tif 000012
【０１３０】
ｈ）図２８で示すＭＳ／ＭＳスペクトル、分子式Ｃ４５Ｈ７８ＮＯ７Ｐ、及び／又は構造
【０１３１】
【化１２】
0005496513.tif 000013
【０１３２】
をさらに特徴とすることができる。
【０１３３】
本発明の他の実施形態では、化合物は、表１３に記載の代謝産物から選択することができるか又はそれらの組合せでよい。これらの代謝産物は、ＣＳＦ試料中で特定された。ダルトン単位で測定した正確な質量が、２０７．０８２２、２７５．８７１２、３７１．７３１１、３７３．７２８、４３２．１５３２、４８５．５６０３、４８７．６４８２、５６２．４６、６２２．２５３９、６４０．２６３７、７３０．６４９３、７４２．２９７２であるか又はそれらと実質的に同等である代謝産物が、特に興味深い。認知症の診断で用いる場合、代謝産物マーカー２０７．０８２２、４３２．１５３２、５６２．４６、６２２．２５３９、６４０．２６３７、７３０．６４９３及び７４２．２９７２は、ＡＤ認知症患者で増加し、代謝産物マーカー２７５．８７１２、３７１．７３１１、３７３．７２８、４８５．５６０３及び４８７．６４８２は、ＡＤ認知症患者で減少する。
【０１３４】
本発明の他の方法では、患者の認知症又は認知症のリスクを評価するための方法が記載される。本方法は、
ａ）前記患者から血清試料を得る工程と、
ｂ）１又は複数の代謝産物マーカーの定量化データを得るために前記試料を分析する工程と、
ｃ）前記１又は複数の代謝産物マーカーの定量化データを１又は複数の参考試料から得た対応するデータと比較する工程と、
ｄ）認知症又は認知症のリスクを評価するために前記比較を用いる工程とを含む。
【０１３５】
試料分析工程（工程ｂ）は、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により試料を分析することを含むことができる。或いは、試料分析工程（工程ｂ）は、その方法がハイスループット方法である場合、リニアイオントラップ質量分析及びその後の液体クロマトグラフィーにより試料を分析することを含むことができる。
【０１３６】
１又は複数の参考試料は、非認知症対照個体から得た第１の参考試料、ＡＤＡＳ−ｃｏｇで測定される認知障害の患者から得た第２の参考試料、ＭＭＳＥで測定される認知障害の患者から得た第３の参考試料、又はこれらの１又は複数の組合せを含むことができる。
【０１３７】
決して限定するものではないが、認知症又は認知症のリスクを評価するために用いる１又は複数の代謝産物マーカーは、表１０〜１２に記載の代謝産物から選択することができるか又はそれらの組合せでよい。特に関心があるのは、ダルトン単位で測定した正確な質量が、５４１．３４３２、５６９．３６８７、６９９．５１９８、７２３．５１９５、７２３．５１９７、７５１．５５５５、８０３．５６８、８８６．５５８２、５６５．３３９４、５６９．３６９、８０１．５５５、８５７．６１８６であるか又はそれらと実質的に同等である代謝産物である。患者試料中の代謝産物マーカー６９９．５１９８、７２３．５１９５、７２３．５１９７及び７５１．５５５の減少はＡＤ病状を示し、患者試料中の代謝産物マーカー５４１．３４３２、５６９．３６８７、８０３．５６８及び８８６．５５８２の減少は、ＡＤＡＳ−ｃｏｇによる認知障害を示し、５６５．３３９４、５６９．３６９、８０１．５５５及び８５７．６１８６は、ＭＭＳＥによる認知障害を示す。
【０１３８】
本発明の他の実施形態では、患者の認知症又は認知症のリスクを鑑別診断するための方法が提供される。本方法は、
ａ）前記患者から試料を得る工程と、
ｂ）１又は複数の代謝産物マーカーの定量化データを得るために前記試料を分析する工程と、
ｃ）１又は複数の代謝産物マーカーそれぞれの内部標準代謝産物に対する比率を得る工程と、
ｄ）前記１又は複数の代謝産物マーカーの内部標準代謝産物に対する各比率を１又は複数の参考試料から得た対応するデータと比較する工程と、
ｅ）認知症又は認知症のリスクを鑑別診断するために前記比較を用いる工程とを含む。
【０１３９】
試料分析工程（工程ｂ）は、質量分析計（ＭＳ）を用いて試料を分析することを含むことができる。例えば、それらに限定するものではないが、そのような質量分析計は、ＦＴＭＳ型、オービトラップ（orbitrap）型、飛行時間（ＴＯＦ）型又は四重極型でよい。代わりに、質量分析計は、さらなるプレ検出器マスフィルターを備えることができよう。例えば、それらに限定するものではないが、そのような器具は、四重極−ＦＴＭＳ（Ｑ−ＦＴＭＳ）、四重極−ＴＯＦ（Ｑ−ＴＯＦ）又は三重四重極（ＴＱ若しくはＱＱＱ）と一般に呼ばれる。さらに、質量分析計は親イオン検出モード（ＭＳ）又は、ｎ＞＝２であるＭＳｎモードで作動させることができた。ＭＳｎは、親イオンが衝突誘発性解離（ＣＩＤ）又は他の断片化手法によって断片化されて断片イオンを形成し、その後、前記断片の１又は複数が質量分析計によって検出される状況を指す。次に、そのような断片をさらに断片化して、さらなる断片を形成することができる。代わりに、液体若しくはガスクロマトグラフィー系を用いて、又は、直接注入によって、試料を質量分析計に導入することができた。
【０１４０】
直前の方法において、１又は複数の参考試料は、非認知症の対照個体から得た第１の参考試料でよい。１又は複数の参考試料は、臨床的に診断されたＡＤ−認知症の患者から得た第２の参考試料、臨床的に診断された非ＡＤ認知症の患者から得た第３の参考試料、かなりの認知障害を起こしている患者から得た第４の参考試料、又はそれらの任意の組合せをさらに含むことができる。
【０１４１】
前記方法において、試料及び参考試料は、血清試料であることができる。１又は複数の代謝産物マーカーは、表１８で記載され、特性決定される（正確な質量、名前／組成、分子式）、代謝産物から選択することができる。「内部標準代謝産物」は、患者に本来存在する内因性の代謝産物を指す。疾病状態にわたって変動しない任意の適当な内因性代謝産物を、内部標準代謝産物として用いることができる。例えば、それに限定するものではないが、内部標準代謝産物は、表１８に示すホスファチジルエタノールアミン１６：０／１８：０（ＰｔｄＥｔ１６：０／１８：０、Ｍ０１）であることができ、この内部標準代謝産物はＣ３９Ｈ７８ＮＯ８Ｐの分子式、及び、
【０１４２】
【化１３】
0005496513.tif 000014
を特徴とする構造を有する。
【０１４３】
代謝産物マーカーの内部標準代謝産物に対する比率の使用は、代謝産物マーカーの絶対レベルの測定よりも安定で再現性のある測定を提供する。内部標準代謝産物は本来全ての試料に存在し、疾病状態の間で異なることはあまりないようなので、試料間の変動（取扱い、抽出、その他によるもの）は最小化される。
【０１４４】
表１８に記載の化合物の中で、上記方法で特に関心のあるものには、ダルトン単位で測定した正確な質量が、ａ）７０１．５３５９１、ｂ）６９９．５２０２６、ｃ）７２３．５２０２６、ｄ）７４７．５２０２６、ｅ）７２９．５６７２１、ｆ）７２７．５５１５６、ｇ）７７９．５８２８６及びｈ）７７５．５５１５６であるか又はそれらと実質的に同等である代謝産物が含まれる。ａ）〜ｈ）の内部標準代謝産物に対する比率の低下は、重度の認知障害を伴うＡＤ認知症を示す。これらの代謝産物は、さらに、それぞれ
【０１４５】
ａ）図２１で示すＭＳ／ＭＳスペクトル、分子式Ｃ２７Ｈ５５ＮＯ９Ｐ、及び／又は構造
【０１４６】
【化１４】
0005496513.tif 000015
【０１４７】
ｂ）図２２で示すＭＳ／ＭＳスペクトル、分子式Ｃ３９Ｈ７４ＮＯ７Ｐ、及び／又は構造
【０１４８】
【化１５】
0005496513.tif 000016
【０１４９】
ｃ）図２３で示すＭＳ／ＭＳスペクトル、分子式Ｃ４１Ｈ７４ＮＯ７Ｐ、及び／又は構造
【０１５０】
【化１６】
0005496513.tif 000017
【０１５１】
ｄ）図２４で示すＭＳ／ＭＳスペクトル、分子式Ｃ４３Ｈ７４ＮＯ７Ｐ、及び／又は構造
【０１５２】
【化１７】
0005496513.tif 000018
【０１５３】
ｅ）図２５で示すＭＳ／ＭＳスペクトル、分子式Ｃ４１Ｈ８０ＮＯ７Ｐ、及び／又は構造
【０１５４】
【化１８】
0005496513.tif 000019
【０１５５】
ｆ）図２６で示すＭＳ／ＭＳスペクトル、分子式Ｃ４１Ｈ７８ＮＯ７Ｐ、及び／又は構造
【０１５６】
【化１９】
0005496513.tif 000020
【０１５７】
ｇ）図２７で示すＭＳ／ＭＳスペクトル、分子式Ｃ４５Ｈ８２ＮＯ７Ｐ、及び／又は構造
【０１５８】
【化２０】
0005496513.tif 000021
【０１５９】
ｈ）図２８で示すＭＳ／ＭＳスペクトル、分子式Ｃ４５Ｈ７８ＮＯ７Ｐ、及び／又は構造
【０１６０】
【化２１】
0005496513.tif 000022
【０１６１】
をさらに特徴とすることができる。
【０１６２】
本発明の他の実施形態では、患者の認知症を治療するための療法の効力を評価する方法であって、
ａ）前記患者から試料を得る工程と、
ｂ）１又は複数の代謝産物マーカーの定量化データを得るために前記試料を分析する工程と、
ｃ）前記定量化データを１又は複数の参考試料から得た対応するデータと比較する工程と、
ｄ）前記療法が患者の認知症状態を改善しているかどうかを判断するために前記比較を用いる工程とを含む方法が提供される。
【０１６３】
任意選択で、分析工程（工程ｂ）の後に、１又は複数の各代謝産物マーカーの内部標準代謝産物に対する比率を得ることができる。この場合、前記１又は複数の代謝産物マーカーの内部標準代謝産物に対する比率を１又は複数の参考試料から得た対応するデータと比較して、その療法の効力を評価する。
【０１６４】
分析工程（工程ｂ）は、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によって試料を分析することを含むことができ、或いは、その方法がハイスループットな方法である場合は、液体クロマトグラフィー及びリニアイオントラップ質量分析によって試料を分析することを含むことができる。
【０１６５】
用語「療法」は、評価する患者の健康状態又は認知症の状態を改善することができる、任意の適当な療法コースを意味する。療法の効力を評価する場合、患者の健康状態を改善するか又は低下させる、特定の療法の影響が測定される。その際に、当業者は、その療法が認知症の状態を治療するのに有効であるかどうかを判断できよう。
【０１６６】
上記方法において、１又は複数の参考試料は、任意の適当な参考試料でよい。例えば、決してそれらに限定するものではないが、参考試料は、非認知症の対照個体から得た複数の試料、臨床的に診断されたＡＤ患者から得た複数の試料、前記患者から得た１又は複数の治療前基準試料、又は、それらの任意の組合せでよい。患者からの治療前基準試料は、代謝産物の変化がその患者に特異的になるので、特に有用である。
【０１６７】
試料及び参考試料は、血清試料であることができる。この場合、１又は複数の代謝産物マーカーは、表１〜７で記載の代謝産物から選択することができるか又はそれらの組合せでよく、例としては、ダルトン単位で測定した正確な質量が、５４１．３４３２、５６９．３６８７、６９９．５１９８、７２３．５１９５、７２３．５１９７、７５１．５５５５、８０３．５６８、８８６．５５８２であるか又はそれらと実質的に同等である代謝産物マーカーがある。或いは、代謝産物マーカーは、正確な質量が表１８に記載のものであるか又はそれらと実質的に同等である代謝産物Ｍ０５〜Ｍ２４から選択することができ、例としては、ダルトン単位で測定した正確な質量が、７０１．５３９５１、６９９．５２０２６、７２３．５２０２６、７４７．５２０２６、７２９．５６７２１、７２７．５５１５６、７７９．５８２８６及び７７５．５５１５６であるか又はそれらと実質的に同等である代謝産物がある。代謝産物Ｍ０５〜Ｍ２４は、代謝産物及び内部標準代謝産物の間の比率が得られる場合にも、用いることができよう。内部代謝産物は、例えば、表１８で記載の代謝産物Ｍ０１でよかろう。
【０１６８】
試料及び参考試料は、脳脊髄液（ＣＳＦ）試料でもよい。この場合、１又は複数の代謝産物マーカーは、表１３に記載の代謝産物から選択することができるか又はそれらの組合せでよく、例としては、ダルトン単位で測定した正確な質量が、２０７．０８２２、２７５．８７１２、３７１．７３１１、３７３．７２８、４３２．１５３２、４８５．５６０３、４８７．６４８２、５６２．４６、６２２．２５３９、６４０．２６３７、７３０．６４９３、７４２．２９７２であるか又はそれらと実質的に同等である代謝産物がある。
【０１６９】
特定された代謝産物は、全身で容易に測定することができる。ＡＤ及び他の神経障害に関連する大多数の研究は末梢系を無視しているので、この点は基本的に重要である。血液サンプル中で神経変性過程を測定する能力は、認知症の診断においてかなりの価値を有する。本発明の特定のエタノールアミンプラスマロゲン代謝産物に関しては、これらはＡＤ病状の有効な生化学的マーカーであるが、その理由は、この分子種の含量が、認知症がしばしば付随する疾患であるパーキンソン病で不変であるからである（Emre, M., Dementia associated with Parkinson's disease. Lancet Neurol, 2003. 2(4): p. 229-37.）。さらに、ＡＤに対するプラスマロゲン代謝産物の特異性は、リスクを評価するために又は、臨床症状の出現より前の疾患の早期発見のために、その血清中レベルを個体の寿命をとおして時系列で容易に測定することができることを示す。
【０１７０】
本発明は、ＡＤ認知症及び非ＡＤ認知症状態の鑑別診断のために、ハイスループット方法も提供する。本方法は、親分子の断片化を含むことができ、非限定的実施例において、これはＱ−Ｔｒａｐ（商標）システムによって達成することができる。代謝産物の検出は、比色化学的アッセイ（ＵＶ若しくは他の波長）、抗体ベースの酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、核酸検出アッセイのためのチップベースのポリメラーゼ連鎖反応、ビーズベースの核酸検出法、ディップスティック化学的アッセイ又は他の化学反応、画像分析、例えば磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）スキャン、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）スキャン、核磁気共鳴（ＮＭＲ、nuclear magnetic resonance）及び様々な質量分析ベースの系を含む、様々なアッセイプラットホームの１つを用いて実施することができる。
【０１７１】
人血中の代謝産物のレベルを測定し、そのレベルを正常な「標準」集団でのレベルと比較するためのハイスループット方法により、その人がＡＤを有するかどうか予測することができる。これは、いくつかの方法で実施することができる。１つの方法は、前述の通り、検査試料を分類する予測アルゴリズムを用いることであり、それは、ＡＤを有する確率を出力する。代謝産物の強度を測定することができる限り、予測的手法はアッセイ方法とは独立して機能するであろう。他の方法は、単に質量分析計からの閾値強度レベルを設定し、その人のプロフィールが彼らのＡＤ状態を示すであろう閾値の上又は下にあるかどうかを判断することに基づくことができよう。或いは、決してそれに限定するものではないが、好ましい方法は、非認知症の正常な集団及びＡＤ集団における６つの代謝産物のモル濃度を測定するために実施することができる、真に定量的なアッセイである。次に、ＡＤ陽性について絶対閾値濃度を決定することができよう。臨床場面では、これは、代謝産物又は代謝産物の組合せの測定レベルがある濃度より低いならば、個体がＡＤ陽性であるという関連する可能性が存在することを意味するものであろう。したがって、最適診断検査は、血清中の代謝産物の強度を測定する方法、及び、その強度値を受け取って、ＡＤを有する予測確率並びに健康である（すなわち、ＡＤ陰性である）予測確率を出力するためのアルゴリズムを含むことができよう。
【０１７２】
試料中の小分子又は代謝産物に基づく本発明の方法及び特定されるバイオマーカーは、特定の代謝産物を検出することができるアッセイの開発が比較的簡単でアッセイあたりの費用が経済的であるので、理想的なスクリーニング検査のために１９９９年に特定された基準を満たす（非特許文献８２）。この検査の侵襲性は最小限であり、認知障害及びＡＤ病状を指し示す。現在の臨床化学ラボラトリーハードウェアに適合する臨床アッセイへの本方法の変換は、商業的に許容され、有効である。さらに、本発明の方法は、検査を実施して解釈するために、高度に訓練された人員を必要としない。
【０１７３】
本発明は、以下の実施例でさらに説明される。
【実施例１】
【０１７４】
差別的に発現される代謝産物の識別
差別的に発現された代謝産物を、かなりの認知障害が付随する及び付随しない臨床的に診断されたＡＤ、臨床的に診断された非ＡＤ及び非認知症対照で特定した。
【０１７５】
臨床試料。記載したＡＤ血清診断アッセイについては、非認知症の健康な個体、及び、臨床的に診断されたＡＤ及び非ＡＤ認知症患者の代表的な集団から試料を得た。本発明で記載されるＡＤの生化学的マーカーは、可能性のあるＡＤと臨床的に診断された患者（かなりの認知障害を伴う患者４３人、認知障害を認めない患者３２人）からの７５個の血清試料、臨床的に診断された非ＡＤ認知症の患者３０人からの血清試料、及び非認知症対照からの３１個の血清試料の分析に由来した。３群の試料は、年齢、民族性、体重、職業が異なり、様々な非認知症関連の健康状態を示していた多様な個体集団からのものであった。全ての試料は、単一時点で収集したものであった。患者の認知障害は、アルツハイマー病評価スケール（ＡＤＡＳ）−認知サブセットを用いても評価した。
【０１７６】
記載したＡＤ  ＣＳＦ診断アッセイについては、臨床的に診断された認知症を伴うＡＤを代表する患者及び非ＡＤ認知症患者の群から試料を得た。本発明で記載されるＡＤの生化学的マーカーは、臨床的に診断されたＡＤ認知症患者からの６個のＣＳＦ試料、及び臨床的に診断された非ＡＤ認知症患者からの５個のＣＳＦ試料の分析に由来した。
【０１７７】
両群の試料は、年齢、民族性、体重、職業が異なり、様々な非認知症関連の健康状態を示していた多様な個体集団からのものであった。全ての試料は、単一時点で収集したものであった。１３６個の血清試料及び本出願で用いる１１個のＣＳＦ試料に含まれる代謝産物を、超音波処理及び激しい混合（ボルテックス混合）により極性及び無極性の抽出物に分離した。
【０１７８】
質量分析。１３６人の個体（臨床的に診断されたＡＤが７５人、臨床的に診断された非ＡＤが３０人及び非認知症の健常対照者が３１人）から収集した血清抽出物、並びに、１１個のＣＳＦ抽出物（臨床的に診断されたＡＤ患者が６人、臨床的に診断された非ＡＤ患者が５人）の分析を、ＦＴＭＳへの直接注入及び、ＥＳＩ又は気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）による正及び負のモードでのイオン化によって実施した。試料抽出物は、負のイオン化モードではメタノール：０．１％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウム（５０:５０、ｖ／ｖ）で、又は、正のイオン化モードではメタノール：０．１％（ｖ／ｖ）蟻酸（５０:５０、ｖ／ｖ）で３倍又は６倍に希釈した。ＡＰＣＩについては、試料抽出物は、希釈せずに直接注入した。全ての分析は、７．０Ｔの能動的に保護された超伝導磁石を備えたBruker Daltonics社製のAPEX IIIフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析計（Bruker Daltonics社製、Billerica、MA）で実施した。試料は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）及び／又はＡＰＣＩを用いて、毎時１２００μＬの流速で直接注入した。イオン転移／検出パラメータは、セリン、四アラニン、レセルピン、Hewlett-Packard社製の調整混合物、及び副腎皮質刺激ホルモン断片４〜１０の標準混合物を用いて最適化した。さらに、器具の条件は、器具製造業者の推奨に従って、１００〜１０００ａｍｕの質量範囲にわたってイオン強度及び広帯域蓄積を最適化するために調整した。上記標準物の混合物は、１００〜１０００ａｍｕの取得範囲にわたる質量正確度のために、各試料スペクトルを内部較正するために用いた。
【０１７９】
全体で、各試料について、抽出物及びイオン化モードの組合せを含む６つの別個の分析が得られた。
水抽出物
１．正のＥＳＩ（分析モード１１０１）
２．負のＥＳＩ（分析モード１１０２）
有機抽出物
３．正のＥＳＩ（分析モード１２０１）
４．負のＥＳＩ（分析モード１２０２）
５．正のＡＰＣＩ（分析モード１２０３）
６．負のＡＰＣＩ（分析モード１２０４）
【０１８０】
質量分析データ処理。各内部標準質量ピークがその理論上の質量と比較して＜１ｐ．ｐ．ｍ．の質量誤差を有するように、線形最小二乗回帰線を用いて、質量軸値を較正した。Bruker Daltonics社製のXMASSソフトウェアを用いて、１メガワードのデータファイルサイズを取得し、２メガワードにゼロ充てんした。sinmデータ変換を、フーリエ変換及びマグニチュード計算の前に実施した。各分析からの質量スペクトルを積算し、正確な質量及び各ピークの絶対強度を含むピークリストを作成した。１００〜２０００ｍ／ｚの範囲の化合物を分析した。異なるイオン化モード及び極性にわたってデータを比較、要約するために、水素付加体形成を仮定して、検出された全質量ピークをそれらの対応する中性質量に変換した。次に、DISCOVAmetrics（商標）ソフトウェア（Phenomenome Discoveries Inc.社製、Saskatoon、SK、Canada）を用いて、自然発生した二次元の（質量対試料強度）アレイを作成した。複数ファイルからのデータを積算し、次にこの合併ファイルを処理して固有の質量を求めた。各固有質量の平均を求め、ｙ軸を表した。この値は、統計学的に同等であると決定された、全ての検出された正確な質量の平均を表す。較正標準に対する機器の質量正確度が約１ｐｐｍであることを考慮すると、当業者は、これらの平均質量がこの平均質量の±５ｐｐｍ内に入る個々の質量を含むことができることを認めよう。当初、分析するために選択した各ファイルのためにコラムを作成し、ｘ軸を表した。選択した各ファイルで見られる各質量の強度を、次に、それを表すｘ，ｙ座標に埋め込んだ。強度値を含まない座標は、空欄にした。アレイに入った後、データをさらに処理、可視化、解釈し、推定される化学的同一性を割り当てた。次に、検出した全ての代謝産物の質量及び強度を得るために、各スペクトルのピークを拾った。全てのモードからのこれらのデータは、次に、１試料につき１つのデータファイルを作成するために合併させた。次に、全１３６個の試料からのデータを合併、整列させ、各試料がコラムによって表され、各固有の代謝産物が単列によって表される二次元の代謝産物アレイを作成した。所与の代謝産物試料の組合せに対応する細胞で、その試料中の代謝産物の強度が示される。データがこのフォーマットで表される場合、試料群間で差を示す代謝産物を判定した。同じ手法を用いて、１１個のＣＳＦ試料を二次元の代謝産物アレイに併合させた。
【０１８１】
Ａ．血清バイオマーカー
【０１８２】
以下の異なる臨床群の間で血清で有意に異なる代謝産物について選択するために、スチューデントのｔ検定を用いた。ｐ＜０．０５未満の代謝産物を、有意とみなした。
【０１８３】
Ａ１−臨床的に診断されたＡＤ患者（ｎ＝７５）対非認知症対照（ｎ＝３１）。この比較から、２６２個の代謝産物が得られた（表１を参照）。
【０１８４】
Ａ２−かなりの認知障害を伴う臨床的に診断されたＡＤ患者（ｎ＝３２）対非認知症対照（ｎ＝３１）。この比較から、２９２個の代謝産物が得られた（表２を参照）。
【０１８５】
Ａ３−かなりの認知障害を伴う臨床的に診断されたＡＤ患者（ｎ＝３２）対かなりの認知障害を伴う臨床的に診断された非ＡＤ患者（ｎ＝３０）。この比較から、１１８個の代謝産物マーカーが得られた（表３を参照）。
【０１８６】
Ａ４−かなりの認知障害を伴う臨床的に診断されたＡＤ患者（ｎ＝３２）対かなりの認知障害を伴わない臨床的に診断されたＡＤ患者（ｎ＝４３）。この比較から、９７個の代謝産物マーカーが得られた（表４を参照）。
【０１８７】
Ａ５−臨床的に診断された非ＡＤ患者（ｎ＝３０）対非認知症対照（ｎ＝３１）。この比較から、１９９個の代謝産物マーカーが得られた（表５を参照）。
【０１８８】
Ａ６−軽度の認知障害を伴う臨床的に診断されたＡＤ患者（ｎ＝４３）対非認知症対照（ｎ＝３１）。この比較から、１３６個の代謝産物が得られた（表６を参照）。
【０１８９】
Ａ７−かなりの認知障害を有する患者（ｎ＝４２）及び軽度の認知障害を有する患者（ｎ＝４３）。この比較から、８１個の代謝産物が得られた（表７を参照）。
【０１９０】
表１〜７は、血清中のその濃度又は量が検査した集団の間で有意に異なり（ｐ＜０．０５）、したがって、前記各集団の識別のために潜在的な診断有用性を有する生化学的マーカーを示す。これらの特徴は、それらの正確な質量及び分析モードによって記載され、これらは、共同で、各代謝産物の推定される分子式並びに化学的特性（例えば極性及び推定される官能基）を提供するのに十分である。
【０１９１】
数百の可能な代謝産物の最初のリストから、８個の代謝産物の組合せが血清認知症検査の基準を満たすと判断された。この組合せは、ＡＤ認知症を、非ＡＤ認知症、ＡＤの初期段階及び健常対照から区別することができる。８個の代謝産物の最良の組合せには、中性質量（ダルトン単位で測定したもの）が５４１．３４３２、５６９．３６８７、６９９．５１９８、７２３．５１９５、７２３．５１９７、７５１．５５５５、８０３．５６８、８８６．５５８２である代謝産物が含まれた。これらは実質量であるが、当業者は、±５ｐｐｍの差が同じ代謝産物を指し示すことを認めるであろう。
【０１９２】
本結果を分析する際に、当業者は、以下の臨床群が関心対象であることを理解するであろう。かなりの認知障害を伴う非ＡＤ、かなりの認知障害を伴うＡＤ、かなりの認知障害を伴わないＡＤ及び非認知症の対照。４つの異なる臨床群の８個のバイオマーカーの平均±ＳＥＭを表す棒グラフを、図１に示す。対照の、非認知症の個体と比較して、３つの非対照状態は、以下の通りに記載することができる。
【０１９３】
１．かなりの認知障害を伴うＡＤ対対照
ａ．バイオマーカー５４１．３４３２−減少
ｂ．バイオマーカー５６９．３６８７−減少
ｃ．バイオマーカー６９９．５１９８−差はない
ｄ．バイオマーカー７２３．５１９５−差はない
ｅ．バイオマーカー７２３．５１９７−差はない
ｆ．バイオマーカー７５１．５５５５−差はない
ｇ．バイオマーカー８０３．５６８−減少
ｈ．バイオマーカー８８６．５５８２−減少
【０１９４】
２．かなりの認知障害を伴う臨床的に診断されたＡＤ対対照
ａ．バイオマーカー５４１．３４３２−減少
ｂ．バイオマーカー５６９．３６８７−減少
ｃ．バイオマーカー６９９．５１９８−減少
ｄ．バイオマーカー７２３．５１９５−減少
ｅ．バイオマーカー７２３．５１９７−減少
ｆ．バイオマーカー７５１．５５５５−減少
ｇ．バイオマーカー８０３．５６８−減少
ｈ．バイオマーカー８８６．５５８２−減少
【０１９５】
３．かなりの認知障害を伴わない臨床的に診断されたＡＤ対対照
ａ．バイオマーカー５４１．３４３２−減少
ｂ．バイオマーカー５６９．３６８７−差はない
ｃ．バイオマーカー６９９．５１９８−減少
ｄ．バイオマーカー７２３．５１９５−減少
ｅ．バイオマーカー７２３．５１９７−減少
ｆ．バイオマーカー７５１．５５５５−減少
ｇ．バイオマーカー８０３．５６８−差はない
ｈ．バイオマーカー８８６．５５８２−差はない
【０１９６】
上述の３つの非対照ケースのそれぞれで、固有のマーカーサブセットが減少した。
【０１９７】
かなりの認知障害を有する２つの異なる臨床群の８個のバイオマーカーの平均±ＳＥＭを表す棒グラフを、図２に示す。かなりの認知障害を伴う非ＡＤ認知症と比較して、かなりの認知障害を伴うＡＤ患者は、
ａ．バイオマーカー５４１．３４３２−差はない
ｂ．バイオマーカー５６９．３６８７−差はない
ｃ．バイオマーカー６９９．５１９８−減少
ｄ．バイオマーカー７２３．５１９５−減少
ｅ．バイオマーカー７２３．５１９７−減少
ｆ．バイオマーカー７５１．５５５５−減少
ｇ．バイオマーカー８０３．５６８−差はない
ｈ．バイオマーカー８８６．５５８２−差はない
と記載することができる。
【０１９８】
本発明の結果は、かなりの認知障害を伴う臨床的に診断されたＡＤの個体、かなりの認知障害を伴わない臨床的に診断されたＡＤの個体（これは、初期ＡＤの可能性がある）、かなりの認知障害を伴う非ＡＤ認知症の個体、及び非認知症対照の血清の間の、明らかな相違を示す。本出願で記載のように、これらの知見により、異なる型の認知症を互いから、及び、認知障害の初期段階から識別及び区別することができる。上の結果から、質量が、６９９．５１９８、７２３．５１９５、７２３．５９９７、７５１．５５５５の代謝産物マーカーはＡＤ病状に特異的であるが、質量が、５４１．３４３２、５６９．３６８７、８０３．５６８、８８６．５５８２であるマーカーは認知障害に特異的であると、ＡＤＡＳ−ｃｏｇ検査からさらに結論づけることができる。
【０１９９】
第２の神経心理学的検査である、認知障害を測定するフォルスタインのミニ精神状態検査（ＭＭＳＥ）を、１３６人の患者全てに適用した。ＭＭＳＥは広く使われており、見当識、短期及び長期の記憶、行動、言語及び理解の広く検証された検査である。かなりの認知障害を有しない臨床的に診断されたＡＤ患者（ｎ＝４３）において、それらの患者のうちの１５人は、正常な認知を示すＭＭＳＥスコア（ＭＭＳＥ≧２８）を有したが、残りの２８人の患者は、軽度の障害（１８〜２３のスコア、ｎ＝１１）又は重度の認知障害（９〜１７のスコア、ｎ＝１７）を示すＭＭＳＥスコアを有した。ＡＤＡＳ−ｃｏｇ検査で有意な認知障害を伴わない（ｐ＜０．０５）４３人の臨床的に診断されたＡＤ患者で、ＭＭＳＥスコア（正常、軽度又は重度の認知障害）が有意に異なる代謝産物について選択するために、Ｆ検定を用いた。２３個の代謝産物が、この基準を満たした（表８に示す）。これらは全て、２つの集団の間で統計学的に異なる特徴であり、したがって、潜在的な診断有用性を有する。これらの特徴は、それらの正確な質量及び分析モードによって記載され、これらは、共同で、各代謝産物の推定される分子式並びに化学的特性（例えば極性及び推定される官能基）を提供するのに十分である。
【０２００】
２３個の代謝産物からの、その全ては減少することが観察された４個の代謝産物の最適なサブセットを、主成分分析（ＰＣＡ、Principal Components Analysis）を用いて選択した。群間で最大の分離を生じさせることができた４個の代謝産物は、５６５．３３９４、５６９．３６９、８０１．５５５、８５７．６１８６であった。これらの代謝産物は、表８でアスタリスクによって示され、ＭＭＳＥでの認知障害と関連する４代謝産物バイオマーカーパネルを表す。代謝産物の第２のセットが認知障害と関連するという事実は、ＡＤＡＳ−ｃｏｇが特異的に測定しない他の１つ又はいくつかの認知状態に対してＭＭＳＥが特異的でなければならないことを示唆する。
【０２０１】
したがって、合計３つの４バイオマーカーパネルを１３６人の患者に適用して彼らを８つのカテゴリーの１つに分類することができ、それは、同時に、ＡＤ病状の存在（バイオマーカー６９９．５１９８、７２３．５１９５、７２３．５９９７、７５１．５５５５）、ＡＤＡＳ−ｃｏｇによる認知障害の存在（５４１．３４３２、５６９．３６８７、８０３．５６８、８８６．５５８２）、及びＭＭＳＥによる認知障害の存在（５６５．３３９４、５６９．３６９、８０１．５５５、８５７．６１８６）を示す。０／１バイナリーモデルを用いると、認知障害及びＡＤ病状のないことを示す「０００」からＭＭＳＥ及びＡＤＡＳ−ｃｏｇ障害並びにＡＤ病状を示す「１１１」までの３桁コードを用いて、各患者を標識することができる。表９は、８つのカテゴリーへの患者試料の分離を示す。
【０２０２】
３つの４バイオメーカーパネルを個々に代謝産物アレイに適用し、ＰＣＡプロットで最大の分離を示した患者を選択した。これらの患者を選択した理由は、彼らが異なる３群［ＡＤ（ｎ＝２０）対非ＡＤ病状（ｎ＝２０）、高ＡＤＡＳスコア（ｎ＝２０）対低ＡＤＡＳスコア（ｎ＝１２）、ＭＭＳＥスコア上の認知障害（ｎ＝２０）対ＭＭＳＥスコア上の正常な認知（ｎ＝２０）］の間の最良の識別子であったからである。異なる臨床群の間でスチューデントのｔ検定を実施した（ｐ＜０．０５）。ＡＤ対非ＡＤ病状のｐ値基準を満たした１１６個の代謝産物を、表１０に記載する。表１１は、高ＡＤＡＳスコア対低ＡＤＡＳスコアのｐ値基準を満たした１２４個の代謝産物を記載し、表１２は、ＭＭＳＥ上の障害スコア及びＭＭＳＥ上の正常な認知のｐ値基準を満たした３４４個の代謝産物のリストを含む。
【０２０３】
ＡＤＡＳ−ｃｏｇ及びＭＭＳＥ神経心理学的検査は、行動、見当識、記憶及び言語能力に関連する認知エラーを測定する。したがって、ＡＤＡＳ−ｃｏｇスコア及び／又はＭＭＳＥと関連するバイオマーカーが、なじみの薄いシーケンスを考案、組織化及び開始する能力、自己及び環境の認識、並びに記憶及び言語能力と関係することを示唆することは、理にかなっている。このように、これらのバイオマーカーは、認知症と関連する認知障害に限定されず、むしろ、任意の種類の行動、見当識、記憶及び／又は言語上の欠陥をもたらす任意の状態が、生体試料中で類似した減少を示すであろう。
【０２０４】
この発見のために用いた試料セット（１３６個体）は微々たるものではなく、様々な民族的及び地理的背景の個体並びに様々な年齢及び健康状態の個体を含んだ。したがって、これらの知見が一般認知症集団を代表すると予想する、強固な理由がある。
【０２０５】
Ｂ．ＣＳＦバイオマーカー。
【０２０６】
ＣＳＦ試料で、臨床的に診断されたＡＤ患者と臨床的に診断された非ＡＤ患者との間で異なる代謝産物について選択するために、スチューデントのｔ検定を用いた（ｐ＜０．０５）。４２個の代謝産物が、この基準を満たした（表１３に示す）。これらの代謝産物は、２つの集団の間で統計学的に異なり、したがって、潜在的な診断有用性を有する。これらの代謝産物は、それらの正確な質量及び分析モードによって記載され、これらは、共同で、各代謝産物の推定される分子式並びに化学的特性（例えば極性及び推定される官能基）を提供するのに十分である。
【０２０７】
上の４２個の代謝産物から、１２個の代謝産物の最適なサブセットを選択した。これらの代謝産物は、２つの群の間で最大の統計的差を有した（ｐ＜０．０１）。各群で、試料の少なくとも６０％（臨床的に診断されたＡＤでは４／６、臨床的に診断された非ＡＤでは３／５）で検出されなかった代謝産物は除外した。パネルは、質量２０７．０８２２、２７５．８７１２、３７１．７３１１、３７３．７２８、４３２．１５３２、４８５．５６０３、４８７．６４８２、５６２．４６、６２２．２５３９、６４０．２６３７、７３０．６４９３、７４２．２９７２を含む。これらは実質量であるが、当業者は、±５ｐｐｍの差が同じ代謝産物を指し示すことを認めるであろう。
【０２０８】
１２バイオマーカーパネルを、診断未確定患者からの５個のＣＳＦ試料を用いて検査した。試料に関して入手できる唯一の情報は、対象の年齢、性別及び個体が認知欠陥を有するかどうかであった。１２バイオマーカーパネルが正しい場合、対象は、ＡＤ認知症、非ＡＤ認知症を有するか又は正常と診断することができた。診断未確定患者によって提供された５個のＣＳＦ試料から、１つは非ＡＤ認知症と、２つはＡＤ認知症と、２つは正常と診断された。２人の健常人は、ミニ精神状態検査（ＭＭＳＥ）スコアが示すように、認知障害を有さなかった。したがって、１２個の代謝産物の特性セットを用いて、ＡＤ及び非ＡＤの認知症を診断することが可能であった。
【０２０９】
２つの異なる臨床群の１２個のバイオマーカーの平均±ＳＥＭを表す棒グラフを、図３に示す。かなりの認知障害を伴う非ＡＤ認知症と比較して、かなりの認知障害を伴うＡＤ患者は、以下のように記述することができる。
ａ．バイオマーカー２０７．０８２２−増加
ｂ．バイオマーカー２７５．８７１２−減少
ｃ．バイオマーカー３７１．７３１１−減少
ｄ．バイオマーカー３７３．７２８−減少
ｅ．バイオマーカー４３２．１５３２−増加
ｆ．バイオマーカー４８５．５６０３−減少
ｇ．  バイオマーカー４８７．６４８２−減少
ｈ．バイオマーカー５６２．４６−増加
ｉ．バイオマーカー６２２．２５３９−増加
ｊ．バイオマーカー６４０．２６３７−増加
ｋ．バイオマーカー７３０．６４９３−増加
ｌ．バイオマーカー７４２．２９７２−増加
【０２１０】
これらの結果に基づいて、臨床的に診断された非ＡＤ及びＡＤ患者のＣＳＦの間で、明瞭な区別がなされた。したがって、そのような知見は、ＡＤ認知症を非ＡＤ認知症から識別及び区別することを可能にし、本出願で記載されるＣＳＦでの認知症診断検査の基礎をなすことができる。これらの知見は、一般認知症集団を代表すると予想される。
【０２１１】
非標的型のＦＴＭＳベースのプラットホームを、血清及びＣＳＦでの最適代謝産物の識別及び選択で用いたが、他のＭＳベースのプラットホーム、ＥＬＩＳＡ、比色アッセイなどを含む他の分子の事後検出方法を、分子の検出のために用いることができる。
【実施例２】
【０２１２】
発見された代謝産物の独立した確認方法
Ａ．血清バイオマーカー
【０２１３】
ＦＴＭＳ法を用いて発見された８個の診断代謝産物の、非認知症の正常血清及び臨床的に診断されたＡＤ血清の間での強度差を検査するために、独立した質量分析方法を用いた。８個の代表的な臨床的に診断されたＡＤ試料抽出物及び８個の代表的な非認知症対照試料抽出物を、ABI Q-Star質量分析計に連結したHP 1100高性能液体クロマトグラフィーを用いてＬＣ−ＭＳによって分析した。
【０２１４】
５個の臨床的に診断されたＡＤ及び非認知症の生存対照試料抽出物からの水性分画を窒素ガスの下で蒸発させ、１００μＬのメタノール：水：蟻酸（５：９４．９：０．１）で再構成した。再構成した試料の５μＬをフルスキャンのＨＰＬＣ（Agilent Technologies社）（Metasil AQ 3uを備えたHP 1100、１００×２ｍｍのカラム）にかけ、１０μＬを流速０．２ｍｌ／分のＭＳ／ＭＳにかけた。
【０２１５】
ＨＰＬＣからの溶出液を、ターボイオンスプレーイオン（ＥＳＩ）源を取り付けたABI Q-Star XL質量分析計を負のモードで用いて分析した。フルスキャンモードのスキャン型は飛行時間型（ＴＯＦ）であり、蓄積時間１．００００秒、質量範囲５０〜１５００Ｄａ、及び継続時間７０分であった。源パラメータは以下の通りであった。イオン源ガス１（ＧＳ１、gas 1）５５；イオン源ガス２（ＧＳ２、gas 2）９０；カーテンガス（ＣＵＲ、Curtain gas）４０；ネブライザー流（ＮＣ、Nebulizer Current）０；温度４５０℃；デクラスタリングポテンシャル（ＤＰ、Declustering Potential）−５５；フォーカシングポテンシャル（ＦＰ、Focusing Potential）−２６５；デクラスタリングポテンシャル２（ＤＰ２）−１５。ＭＳ／ＭＳモードでは、スキャン型は生成イオンであり、蓄積時間１．００００秒、スキャン範囲５０〜１０００Ｄａ、継続時間７０分であった。全ての源パラメータは上と同じであるが、衝突エネルギー（ＣＥ、collision energy）は−５０Ｖであり、衝突ガス（ＣＡＤ、collision gas、窒素）は５ｐｓｉであった。
【０２１６】
前にＦＴＭＳで見出された８個の代謝産物質量の６つを、ABI Q-Star質量分析計で検査した。正確な質量が７２３．５１９５及び７２３．５１９７である代謝産物は同じ代謝産物であると判定され、正確な質量が８８６．５５８２である代謝産物は検出されなかった。したがって、残りの分析のためには６個の代謝産物（６９９．５１９８、７２３．５１９５、７５１．５５５５、５４１．３４３２、５６９．３６８７、８０３．５６８）だけを用いた。
【０２１７】
６個のバイオマーカーの抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）を、図４で示す。上部パネルは８個の非認知症対照のＥＩＣを示し、それぞれの下部パネルは８個の臨床的に診断されたＡＤのＥＩＣを示す。Q-starの感度はＦＴＭＳよりも優れ、非認知症の対照対象及び臨床的に診断されたＡＤ集団の間の、選択されたバイオマーカーのより大きな強度差をもたらす。図５は、ＦＴＭＳ及びQ-Starで検出された、８個の非認知症の対照及び８個の臨床的に診断されたＡＤ試料の６個のバイオマーカーの平均生強度を示す。
【０２１８】
Ｂ．ＣＳＦバイオマーカー
【０２１９】
本発明で記載される代謝産物及び臨床変数とのそれらの関連を、独立した質量分析系を用いてさらに確認する。調査中の臨床変数の間で強度が異なる代謝産物を特定する目的で質量及び強度情報を得るために、様々な群のそれぞれからの代表的な試料抽出物を、HP 1050高性能液体クロマトグラフィー、又はABI Q-Starに連結した同等物、又は同等の質量分析計を用いてＬＣ−ＭＳによって再分析する。
【実施例３】
【０２２０】
一次代謝産物バイオマーカーの構造解明
代謝産物の構造解明のために用いることができる特性には、正確な質量及び分子式の決定、極性、酸／塩基性質、ＮＭＲスペクトル並びにＭＳ／ＭＳ又はＭＳｎスペクトルが含まれる。これらのデータ、特にＭＳ／ＭＳスペクトルは、特定の代謝産物のフィンガープリントとして用いることができ、完全な構造が決定されているかどうかに関係なく、特定の代謝産物の特異識別子である。
【０２２１】
Ａ．血清バイオマーカー−構造解明
【０２２２】
１．ＬＣ滞留時間。目的の代謝産物を含む抽出物を、上の実施例２で記載のように、C18カラムを用いる逆相ＬＣ−ＭＳ及びＭＳによる分析にかけた。表１４は、６個の血清代謝産物マーカーそれぞれについて得られた滞留時間及び検出質量を記載する。６個のバイオマーカー全ての滞留時間は、これらのＨＰＬＣ条件下で約２９〜４２分である。
【０２２３】
２．抽出条件。抽出条件は、バイオマーカーの化学的性質に関する洞察も提供する。血清中の全８個の代謝産物（実施例１からのもの）を負のモードでイオン化したが（３個はＡＰＣＩで５個はＥＳＩで）、それは、カルボン酸又はリン酸などの酸性部分を含む分子を指し示す。水素原子を失うことができる任意の部分は、負のイオン化モードで検出することができる。代謝産物マーカーの３つは、有機酢酸エチル分画に抽出され（プラスマロゲン代謝産物）、それは、これらの代謝産物が酸性条件下で無極性であることを示し、１つは有機酢酸エチル分画に抽出、乾燥され、ブタノール中に再懸濁されたが、それは、この代謝産物（プラスマロゲン代謝産物）が酸性条件下で無極性であることを示す。代謝産物のうちの４つ（ホスファチジルコリン関連代謝産物）は有機分画に抽出せず、むしろ、水メタノール／水酸化アンモニウム分画に残り、それは、これらの代謝産物が非常に極性であることを示す。
【０２２４】
３．ＭＳ／ＭＳスペクトル。最高の診断の能力を有すると特定された６個の血清代謝産物は、衝突誘発性解離（ＣＩＤ）を用いるＭＳ／ＭＳ断片化を受けた。所与分子の構造は、その分子に特異的である（人の指紋に相当する）、既定条件下での特異断片化パターンを決定する。分子構造のわずかな変化でさえ、異なる断片化パターンをもたらすことができる。分子同一性のフィンガープリントを提供することに加えて、ＣＩＤによって生成される断片は、分子構造に関する洞察を得るために、及び、非常に特異的なハイスループット定量検出法を生成するために用いることができる（例としては、（Hager, J.W., et al., High-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry with a new quadrupole/linear ion trap instrument. J Chromatogr A, 2003. 1020(1): p. 3-9.、Hopfgartner, G., et al., Triple quadrupole linear ion trap mass spectrometer for the analysis of small molecules and macromolecules. J Mass Spectrom, 2004. 39(8): p. 845-55、Xia, Y.Q., et al., Use of a quadrupole linear ion trap mass spectrometer in metabolite identification and bioanalysis. Rapid Commun Mass Spectrom, 2003. 17(11): p. 1137-45.、Zhang, M.Y., et al., Hybrid triple quadrupole-linear ion trap mass spectrometry in fragmentation mechanism studies: application to structure elucidation of buspirone and one of its metabolites. J Mass Spectrom, 2005. 40(8): p. 1017-1029.）を参照）。図６〜１１は、６個のマーカーのそれぞれの−５０Ｖの衝突エネルギー（ＣＥ）電圧でのＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。
【０２２５】
次に、各マーカーの表（表１５〜１７）で示すように、ＡＤＡＳ−ｃｏｇスコアに固有の代謝産物の各断片イオンの推定される式を計算するために、各親質量のＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳから得られた質量を用いた。断片化データに固有の情報は各代謝産物に高度に特異的及び説明的であり、それは、各分子について構造に関する洞察を得るために用いることができる。全てのパラメータを前述のようにし、衝突ガスとして５ｐｓｉの窒素を用い、−５０ボルトの衝突エネルギー（ＣＥ）設定を用いて、ABI-Q Star XLでＭＳ／ＭＳを実施した。
【０２２６】
断片化パターン及び質量に基づいて、ＡＤＡＳ−ｃｏｇスコアに固有の代謝産物マーカーに、ホスファチジルコリン関連骨格を有する構造を割り当てた。ＣＩＤ  ＭＳ／ＭＳから、ＡＤＡＳ−ｃｏｇスコアに固有の３つの代謝産物（正確な中性質量が、５４１．３４３２、５６９．３６８７、８０３．５６８のもの）の分子式は、それぞれＣ２５Ｈ５１ＮＯ９Ｐ、Ｃ２７Ｈ５５ＮＯ９Ｐ及びＣ４３Ｈ８１ＮＯ１０Ｐと決定された。それらの構造を、図１２〜１４に示す。さらなるマーカーの推定される構造を、図１５に示す。
【０２２７】
正確な中性質量が７５１．５５５５、６９９．５１９８及び７２３．５１９５である、ＡＤ病状に特異的な３つの代謝産物を、ＦＴ−ＩＣＲＭＳ及びＬＣ／ＭＳ手法を用いて、また、ＨＲＡＰＣＩ−ＭＳ及びＭＳ／ＭＳ分光分析によって分析した。各代謝産物マーカーの断片化パターンから決定される娘イオンを、図１６〜１８に示す。分子式は、それぞれＣ４３Ｈ７８ＮＯ７Ｐ、Ｃ３９Ｈ７４ＮＯ７Ｐ及びＣ４１Ｈ７４ＮＯ７Ｐと決定された。断片化パターン及び質量に基づいて、ＡＤ病状に固有の代謝産物マーカーに、エタノールアミンプラスマロゲン骨格を有する構造を割り当てた。
【０２２８】
７５１．５５５５代謝産物（Ｃ４３Ｈ７８ＮＯ７Ｐ）については、負イオン化条件のために、測定されたＨＲＡＰＣＩ−ＭＳ  ｍ／ｚは、７５０．５４８２（［Ｍ−Ｈ］−、Ｃ４３Ｈ７７ＮＯ７Ｐの計算値７５０．５４７７）であった。測定されたＭＳ／ＭＳ断片質量（ＭＳ／ＭＳ  ｍ／ｚ）の相対強度は、以下の通りであった。７５０（［Ｍ−Ｈ］−、２５％）、４８２（１％）、４６４（１２％）、４４６（５％）、３２９（８％）、３０３（１００％）、２５９（１２％）、２０５（８％）、１４０（８％）。ＭＳ／ＭＳ断片を、図１６に示す。ｍ／ｚ３０３の強いＭＳ／ＭＳ断片イオン、及び、ケトンとしてのｓｎ−２アシル基（ｍ／ｚ４６４）の損失、小さいもののｓｎ−１ビニルエーテル側鎖（ｍ／ｚ４８２）の損失による他の断片イオン、並びにホスホエタノールアミン（ｍ／ｚ１４０）による断片イオンは、代謝産物が、ｓｎ−２位置のアラキドン酸を有するプラスメニルホスファチジルエタノールアミン型の分子であることを示した。これらの結果に基づいて、７５１．５５５５代謝産物の構造は、１−Ｏ−１’−（Ｚ）−オクタデセニル−２−アラキドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンと判明した。これは、それらのＬＣ／ＭＳ及びＭＳ／ＭＳスペクトルデータの比較によって確認された（図１９）。
【０２２９】
分子式Ｃ３９Ｈ７４ＮＯ７Ｐ（中性質量６９９．５１９８）及びＣ４１Ｈ７４ＮＯ７Ｐ（中性質量７２３．５１９５）を有する２つの残りの代謝産物は、ＬＣ／ＭＳで７５１．５５５５代謝産物と同時溶出することが分かった。代謝産物のＭＳ／ＭＳ断片イオン及び断片化パターンは、７５１．５５５５代謝産物のそれらと類似していた。
【０２３０】
６９９．５１９８代謝産物については、測定されたＨＲＡＰＣＩ−ＭＳ  ｍ／ｚは、６９８．５１２５（［Ｍ−Ｈ］−、Ｃ３９Ｈ７３ＮＯ７Ｐの計算値６９８．５１３０）であった。測定されたＭＳ／ＭＳ  ｍ／ｚの相対強度は、以下の通りであった。６９８（［Ｍ−Ｈ］−、８％）、５３６（４％）、２７９（１００％）、２５５（１５％）、１１９（１０％）。ＭＳ／ＭＳ断片を、図１７に示す。これらの結果及び７５１．５５５５代謝産物とのその構造類似性に基づき、６９９．５１９８代謝産物の構造は、１−Ｏ−１’−（Ｚ）−ヘキサデセニル−２−リノレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンと決定された。
【０２３１】
７２３．５１９５代謝産物については、測定されたＨＲＡＰＣＩ−ＭＳ  ｍ／ｚは、７２２．５１２４（［Ｍ−Ｈ］−、Ｃ４１Ｈ７３ＮＯ７Ｐの計算値７２２．５１３０）であった。測定されたＭＳ／ＭＳ  ｍ／ｚの相対強度は、以下の通りであった。７２２（［Ｍ−Ｈ］−、１２％）、４８２（１％）、４３６（１５％）、４１８（６％）、３０３（１００％）、２７９（６％）、２５９（１５％）、２５５（１０％）、２０５（４％）、１４０（５％）。ＭＳ／ＭＳ断片を、図１８に示す。これらの結果及び７５１．５５５５代謝産物とのその構造類似性に基づき、７２３．５１９５代謝産物の構造は、１−Ｏ−１’−（Ｚ）−ヘキサデセニル−２−アラキドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンと提案された。
【０２３２】
４．ＮＭＲスペクトル。ＭＳ／ＭＳ断片化は、代謝産物に関する非常に特異的で記述的な情報を提供する。しかし、核磁気共鳴（ＮＭＲ）は、代謝産物の構造を解明し、確認する際に役立つことができる。ＮＭＲ分析技術は質量分析技術よりも一般的に感度が低いので、ＨＰＬＣに複数の注入を実施して、目的代謝産物に対応する滞留時間ウィンドウを収集、併合する。次に、合わせた抽出物を蒸発乾燥させ、ＮＭＲ分析のために適当な溶媒で再構成する。
【０２３３】
複数のＮＭＲ技術及び機器を利用でき、例えば、ＮＭＲスペクトルデータは、目的代謝産物のクロマトグラフィー分離及び精製の後、低温プローブを備えたBruker Avance社製600 MHz分光器で記録される。１ＨＮＭＲ、１３ＣＮＭＲ、ｎｏｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｐｅｃ、並びに異核多重量子相関（ＨＭＱＣ、heteronuclear multiple quantum correlation）及び異核多重結合相関（ＨＭＢＣ、heteronuclear multiple bond correlation）のような２次元ＮＭＲ技術が、バイオマーカーの構造解明研究のために用いられる。
【０２３４】
Ｂ．ＣＳＦバイオマーカー
【０２３５】
１２個のＣＳＦ代謝産物マーカーの構造特性（ＬＣ滞留時間、抽出条件、ＭＳ／ＭＳ断片）を、上で詳述されているのと同様に決定する。
【実施例４】
【０２３６】
血清中エタノールアミンリン脂質の特性評価
ＡＤ病状に特異的な代謝産物マーカーはエタノールアミンプラスマロゲン骨格を有するという事実に基づいて、他の血清プラスマロゲンがＡＤの指標となることができるかどうかについて、さらに調査した。血清中のエタノールアミンリン脂質のこの特性評価は、質量分析検出器と組み合わせたクロマトグラフィー法を用いて実施した。
【０２３７】
クロマトグラフィーを含むＭＳ／ＭＳ適用及び実験については、Agilent 1100HPLCシステムを、Applied Biosystems QSTAR XL質量分析計と組み合わせて用いた。Agilent Zorbax RX-SIL（４．６×１５０ｍｍ、５μｍ）カラムを、順相クロマトグラフィーのために用いた。条件には、実行時間が合計１５分の、１．０ｍｌ／分の流速でのアイソクラチック移動相（５５:４０：５のイソプロパノール：ヘキサン：Ｈ２Ｏ）が含まれた。カラムを、３５℃に加熱した。試料注入量は、１０μｌであった。試料の有機溶媒抽出物（酢酸エチル）を、窒素ガスの下で蒸発乾燥させ、注入前に残留物をイソプロパノール：ヘキサン：Ｈ２Ｏが５５:４０：５の溶液１００μＬで再構成した。
【０２３８】
QSTAR XL機器に、負のモードで作動するＡＰＣＩ（加熱したネブライザー）源を取り付けた。主な機器パラメータの値は、ＤＰ、−６０；ＦＰ、−２６５；ＤＰ２、−１５；ＧＳ１、７５；ＧＳ２、１５；ＣＵＲ、３０；ＮＣ、−３；ＴＥＭ、４００℃；スキャン範囲、５０〜１５００ａｍｕ；蓄積時間、１秒であった。
【０２３９】
３つのクラスのエタノールアミンリン脂質は、ジアシル（本明細書ではＰｔｄＥｔとも称す）、アルキルアシル（本明細書ではプラスマニルとも称す）又はアルケニルアシル（本明細書ではＥｔｎＰｌ若しくはプラスメニルとも称す）と記載される。エタノールアミンリン脂質の様々な基本構造は、本明細書で用いる標準的な命名法と一緒に図２０で示す。表１８は、現在特定され、特に関心のある、プラスマニル及びプラスメニルのエタノールアミンリン脂質（Ｍ５〜Ｍ２４）のリストを示す。
【０２４０】
図２１〜３２は、血清中に検出された、選択された代謝産物に関する構造情報を示す。これらの図は、選択された分子の滞留時間、ＭＳ／ＭＳ断片化パターン及び推定される構造を例示する。これらの分子の間の保存されたＭＳ／ＭＳ断片化機構のために、理論上のＭＳ／ＭＳ移行は、親イオン質量及びｓｎ-１若しくはｓｎ-２位置の部分の断片質量の組合せを用いることによって、任意のエタノールアミンリン脂質について決定することができる。
【実施例５】
【０２４１】
ハイスループット市販方法の開発
ＡＤ認知症及び非ＡＤ認知症状態の鑑別診断のための、ハイスループット方法を確立した。
【０２４２】
ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ、high throghput screening）を、Agilent 1100 LCシステムに連結したリニアイオントラップ質量分析計（Q-trap 4000、Applied Biosystems社製）で実施した。試料は、１５μＬの内部標準（５μｇ／ｍＬの（２４〜１３Ｃ）コール酸のメタノール溶液）を、各試料の１２０μＬの酢酸エチル分画に加えることによって調製した。１００μｌの試料をフローインジェクション分析（ＦＩＡ、flow injection analysis）によって注入し、負のＡＰＣＩモードで監視した。本方法は、各代謝産物及び１つの内部標準の１つの親／娘移行の多重反応監視（ＭＲＭ、multiple reaction monitoring）スキャンモードに基づいた。各移行は、７０ｍｓの間スキャンし、総周期時間は２．４７５秒であった。アイソクラチックなＥｔＯＡｃの１０％メタノール溶液溶出を、３６０μｌ／分の流速で１分間実施した。源パラメータは以下の通りに設定した。ＣＵＲ：１０．０、ＣＡＤ：８、ＮＣ：−４．０、ＴＥＭ：４００、ＧＳ１：３０、ＧＳ２：５０、インターフェースヒーターはオンにした。化合物パラメータは、以下の通りに設定した。ＤＰ：−１２０．０、ＥＰ：−１０、ＮＣ：−４．０、ＣＥ：−４０、ＣＸＰ：−１５。図３３は、一定濃度の内部標準（２４〜１３Ｃ）−コール酸を維持しながら正常な血清試料を希釈することによって生成したＥｔｎＰｌ１６：０／２２：６のための、この方法の代表的な標準曲線を例示する。
【実施例６】
【０２４３】
エタノールアミンリン脂質の血清レベルに及ぼす加齢及び認知症程度の影響
様々なレベルの認知症を有する４０〜９５歳の７５２人の対象におけるエタノールアミンリン脂質の血清レベルに及ぼす加齢及び認知症程度の影響を調査した。対象コホートに関する臨床データを、表１９に示す。
【０２４４】
年齢の影響を、認知症を起こしていない、認知状態が未検査の一組の年齢３０〜９５歳の対象を用いて評価した。対象を、彼らの年代（３０代、４０代、５０代、６０代及び≧７０歳）に基づいて、５つのサブグループの１つに分けた。４０〜４９歳のコホートは、この年齢での低い認知症発生率のために、前認知症標準群として用いた。目的代謝産物（表１８を参照）を、実施例５で記載のハイスループット方法を用いて測定した。
【０２４５】
認知症程度の影響は、６８人の認知的に確認された非認知症の対象（ＭＭＳＥ≧２８）、現時点でＳＤＡＴ（ＡＤＡＳ−ｃｏｇが６〜７０、ＭＭＳＥが０〜２６）と診断された２５６人の対象、２０人の死後確認されたＳＤＡＴ、及び２０人の死後確認された対照が含まれた、５６〜９５歳の対象で判定した。対象を、彼らのＭＭＳＥスコア［≧２８＝認知的に正常］又は彼らのＡＤＡＳ−ｃｏｇスコア［５〜１９＝低い認知障害）、２０〜３９＝中程度、４０〜７０＝重度］に基づいて、４つの認知症サブグループの１つに分類した。
【０２４６】
６Ａ．エタノールアミンリン脂質の絶対レベル
【０２４７】
女性だけがＥｔｎＰｌの年齢関連の減少を示したという点で、かなりの性別偏りが観察された。男性及び女性の遊離ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、遊離２２：６、Ｍ２５）は、４０〜４９歳のコホートと比較して、５０〜５９歳、６０〜６９歳及び７０＋コホートで有意に増加した。しかし、男性だけが、１６：０／２２：６−ＥｔｎＰｌ（Ｍ１９）及び１８：０／２２：６−ＥｔｎＰｌ（Ｍ２４）の同時増加を示した（男性については表２０〜２１を、女性については表２２〜２３を参照）。これらのデータは、女性において、ＤＨＡのＥｔｎＰｌへのパケジングの際に年齢関連の機能障害がある可能性を示す。この性差により、非常に高齢の女性における認知症の発生率の増加を説明することができる(Fiehn, O., et al.  Metabolite profiling for plant functional genomics. Nat Biotechnol, 2000. 18(11): p. 1157-61.)。
【０２４８】
男性及び女性において、全ての認知症サブグループのＥｔｎＰｌの大半は、認知対照と比較して有意に減少した。男性及び女性において、遊離ＤＨＡ（Ｍ２５）は、重度認知症の対象だけで有意に減少した。女性において、１８：２を含むＥｔｎＰｌの両方が、軽度又は中程度の認知症の女性に対して重度認知症の対象で有意に低く、１６：０／２０：４（Ｍ１７）が軽度の群に対して重度の群で低かった点で、認知症の影響は３つのＥｔｎＰｌ（１６：０／１８：２（Ｍ１６）、１８：０／１８：２（Ｍ２１）及び１６：０／２０：４（Ｍ１７）で観察された（表２４〜２６を参照）。男性においては、遊離ＤＨＡ（Ｍ２５）が軽度の群に対して中程度の群、及び、中程度の群に対して重度の群で減少し、１６：０／２２：６（Ｍ１９）が軽度の群に対して重度の群で減少した点で、認知症の影響はＤＨＡ（Ｍ２５）及び１６：０／２２：６（Ｍ１９）で観察された（表２７〜２９を参照）。これらの結果は、ＡＤにおける進行性の認知能低下が、両性で僅かに異なって現れることを示す。
【０２４９】
脳白質は１８:１を含むＥｔｎＰｌ及び１８：２を含むＥｔｎＰｌを主に含み、２０：４を含むＥｔｎＰｌ及び２２：６を含むＥｔｎＰｌのレベルは低いが、灰白質は有意により高いレベルの２０：４を含むＥｔｎＰｌ及び２２：６を含むＥｔｎＰｌを含む（Cummings, J.L., Kaufer, D. Neuropsychiatric aspects of Alzheimer's disease: the cholinergic hypothesis revisited. Neurology, 1996. 47(4): p. 876-83.）。女性においては、認知症の進行は白質（１８:２）及び灰白質（２０:４）のＥｔｎＰｌに同等に影響を及ぼすようであるが、男性においては、主に灰白質（２２:６）ＥｔｎＰｌがより大きな影響を受けるようである。
【０２５０】
病理確認をした２０人のＡＤ対象及び最小限のアミロイド沈着を有する２０人の対象からの死後収集血清試料も、分析した。灰白質及び白質のＥｔｎＰｌは、年齢を合致させた対照と比較して、死後確認ＡＤで有意に減少していた（表３０及び３１を参照）。
【０２５１】
６Ｂ．エタノールアミンリン脂質の相対レベル
【０２５２】
１６：０／１８：０ＰｔｄＥｔ（Ｍ０１）を有する各エタノールアミンリン脂質のレベルの間で比率を得るために、上で収集したデータを再分析した。このようなエタノールアミンリン脂質レベルの測定は、絶対レベルの測定よりも安定で再現性がある。さらに、１６：０／１８：０ＰｔｄＥｔ（Ｍ０１）は本来全ての試料に存在し、疾病状態の間で異なることはあまりないようなので、この手法は、試料間の変動（取扱い、抽出、その他によるもの）を最小化する。
【０２５３】
得られた結果は、６Ａで得られた観察及び結論をさらに支持する。性的偏りはＥｔｎＰｌの年齢関連の減少に関してであり、Ｍ０１に対する比率が測定されたデータで明らかであった（男性については表３２〜３３を、女性については表３４〜３５を参照）。認知障害の重症度に関する同じ傾向も観察された（男性については表３６〜３８を、女性については表３９〜４１を参照）。さらに、死後血清試料の病理結果は、類似した傾向を示す（表４２及び４３）。
【０２５４】
ＥｔｎＰｌの絶対レベル及びＭ０１に対するＥｔｎＰｌの比率は、両方とも認知症の有意な影響を示した。８つのＥｔｎＰｌ（１６：０／１８：１（Ｍ１５）、１６：０／１８：２（Ｍ１６）、１６：０／２０：４（Ｍ１７）、１６：０／２２：６（Ｍ１９）、１８：０／１８：１（Ｍ２０）、１８：０／１８：２（Ｍ２１）、１８：０／２０：４（Ｍ２２）、１８：０／２２：６（Ｍ２４））全てのＥｔｎＰｌ対Ｍ０１比は、軽度群と比較して重度認知症群で有意に低く、８つのうちの６つは、中程度の群と比較して重度の群で有意に低かった
【実施例７】
【０２５５】
灰白質及び白質スコア分布
白質及び灰白質特異ＥｔｎＰｌスコアリングシステムを開発し、それによって、各対象の各ＥｔｎＰｌをそれらのそれぞれの性特異認知正常平均に標準化し、ｌｏｇ２変換し、平均を中心にした。各対象の白質スコアを、そのようなプラスメニル１６：０／１８：１（Ｍ１５）、１６：０／１８：２（Ｍ１６）、１８：０／１８：１（Ｍ２０）及び１８：０／１８：２（Ｍ２１）ＥｔｎＰｌの最低値とし、彼らの灰白質スコアを、プラスメニル１６：０／２０：４（Ｍ１７）、１６：０／２２：６（Ｍ１９）、１８：０／２０：４（Ｍ２２）及び１８：０／２２：６（Ｍ２４）ＥｔｎＰｌの最低値とした。
【０２５６】
これらの簡略化されたスコアは、灰白質及び白質両方のＥｔｎＰｌがＡＤの全ての段階で減少すること（図３９）、並びに、死後確認ＡＤにおけるレベルが両性の重度認知症対象におけるレベルに非常に合致することを明らかにした（表４４〜４５）。様々なレベルの認知症の対象における横断的白質及び灰白質のスコア分布は、母平均の認知症依存性変動を明らかに示した（表４６〜４７）。白質及び灰白質スコアに及ぼす年齢の影響も、測定された（表４８〜４９）。これは、灰白質ＥｔｎＰｌの血清レベルの変化が白質の変化に先行することがあり、おそらく、ＡＤの初期危険因子である可能性を示した。そのような横断データでは、対象間のベースライン変動は説明されない。これらのスコアの個々の長期的な軌跡により、さもなければ健康で非認知症の対象で、ＡＤの初期リスクをより正確に検出することができる。
【０２５７】
これらのスコアに基づき、リスクの予測を男女の対象で実施することができ（表４９〜５０）、そこでは、約２０〜３０％の認知正常対象が中間の若しくは高いリスクとして分類されるカットオフ値が用いられる。このカットオフ値を用いて、対象の白質及び灰白質スコアを評価する。対象の検査結果が両スコアで正常であるならば、対象は低リスクにあると考えられる。対象の検査結果がスコアの１つで陽性であるならば、対象は中間のリスクにあると考えられ、対象が両スコアで陽性であるならば、対象は高リスクにあると考えられる。
【実施例８】
【０２５８】
男女併合対象における認知症重症度及びＡＤ病状の血清ＥｔｎＰｌレベルに及ぼす影響
認知症程度の影響は、６８人の認知的に確認された非認知症の対象（ＭＭＳＥ≧２８）及び、現時点でＡＤ（ＡＤＡＳ−ｃｏｇが６〜７０、ＭＭＳＥが０〜２６）と診断された２５６人の対象が含まれた、５６〜９５歳の３２４人（女性１７６人、男性１４８人）の対象で判定した。ＡＤ病状の影響は、２０人の死後確認されたＡＤ及び１９人の対照対象から収集した血清試料を用いて判定した（表１９）。対象を、彼らのＭＭＳＥスコア［≧２８＝認知的に正常］又は彼らのＡＤＡＳ−ｃｏｇスコア［５〜１９＝低い認知障害、２０〜３９＝中程度、４０〜７０＝重度］に基づいて、４つの認知症重症度コホートの１つに分類した。
【０２５９】
１６：０／１８：１（Ｍ１５）、１６：０／１８：２（Ｍ１６）、１６：０／２０：４（Ｍ１７）、１６：０／２２：６（Ｍ１９）、１８：０／１８：１（Ｍ２０）、１８：０／１８：２（Ｍ２１）、１８：０／２０：４（Ｍ２２）、１８：０／２２：６（Ｍ２４）のＥｔｎＰｌ、遊離ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ、遊離２２：６、Ｍ２５）、及びホスファチジルエタノールアミン（ＰｔｄＥｔ）１６：０／１８：０（Ｄ１６：０／１８：０  Ｍ０１）の平均血清レベルを、各群について測定した（図３４）。全認知症サブグループの８つ全てのＥｔｎＰｌは、認知対照と比較して有意に減少することが観察された（２４の対比較、ｔ検定ｐ値２．６ｅ−２〜２．０ｅ−１０、中央値＝３．９ｅ−５）。遊離のＤＨＡ（Ｍ２５）は、中程度及び重度認知症の対象で有意に減少した（ｐ＜０．０５）。８つ全てのＥｔｎＰｌは、年齢を合致させた対照と比較して、死後確認ＳＤＡＴでも有意に減少していた。Ｄ１６：０／１８：０（Ｍ０１）レベル、非プラスマロゲンリン脂質は、異なる認知症コホートにわたって不変であった。
【実施例９】
【０２６０】
認知症重症度の関数としての人口分布
ＥｔｎＰｌ  １６：０／２２：６（Ｍ１９）対ＰｔｄＥｔ  １６：０／１８：０の比率（Ｍ０１）（ＤＨＡ−ＥｔｎＰｌ）は、最も強い全体的な性別非依存性の認知症影響を示したので（表３８、４１）、以降の全ての人口分布及び比較のために用いた。この比率を用いた重要な比較の概要を、表５２に記載する。次に、この比率をｌｏｇ（２）変換し、認知障害が進行する各コホートの集団ヒストグラムを作成するために用いた（図３５）。カットオフ値は、Bennett et al（非特許文献３５）の知見に基づいて選択した（すなわち、ＣＮ群の約３０％がＡＤとして検出されること）（図３５、点線）。このカットオフを用いて、軽度、中程度及び重度の認知症の対象のそれぞれ６３％、７９％及び８３％が、その後ＡＤとして分類された。
【０２６１】
ＡＤでこれらの分布をＡβ病状の既知の分布と比較するために、４つの前向き病理研究（Polvikoski, T., et al.  Prevalence of Alzheimer's disease in very elderly people: a prospective neuropathological study.  Neurology, 2001. 56: p. 1690-6.、非特許文献３５〜３７）の結果を併合し、Ａβは各集団で正規分布すると仮定して、認知症及び非認知症の集団におけるＡβ病状の理論上の人口分布を生成した（図３６Ａ）。これらの研究から、臨床的に診断されたＡＤ対象のわずか７１％（１４０人／１９８人）が死亡時にＡＤ病状を有し、認知正常対象の３２％（８７人／２６８人）が死亡時にＡＤの神経病理学的基準を満たすことが報告された。我々の認知検査した対象の全てからのデータを合わせた場合、彼らの血清ＥｔｎＰｌレベルに基づき、非認知症集団の３２％（２２人／６８人）及び認知症集団の７５％（１９２人／２５６人）がＡＤ陽性と分類された（図３６Ｂ）。この比較は、観察された２２：６含有ＥｔｎＰｌ減少の分布が、認知症及び非認知症の対象でのＡＤ病状の理論的分布に完全に合致することを明らかにした。
【実施例１０】
【０２６２】
疾患進行及び血清ＥｔｎＰｌ減少の線形外挿
臨床的に診断されたＡＤ集団においてＥｔｎＰｌの減少及び認知症の増加の間に相関が存在するかどうかを調査するために、各認知症コホートの２２：６含有ＥｔｎＰｌの平均レベル（ＣＮに標準化したもの）及びこれら３つのコホートのそれぞれの平均ＡＤＡＳ−ｃｏｇスコアを用いて、線形回帰分析を実施した（図３７）。３つの認知症コホートの２２:６含有ＥｔｎＰｌの平均レベル及び平均ＡＤＡＳ−ｃｏｇスコアの間に、非常に高い相関が観察された（ｒ２＝０．９９）。しかし、この線形の減少は、ＣＮ群へ外挿されなかった（Ｘ対ＣＮ）。１年に７．５ＡＤＡＳ−ｃｏｇ単位のＡＤの臨床的進行を仮定すると、この外挿により、２２：６含有ＥｔｎＰｌレベルは、臨床認知障害（ＡＤＡＳ−ｃｏｇ＝１５）が明白になる約７年前に低下し始めると予測される。
【実施例１１】
【０２６３】
血清ＤＨＡ−ＥｔｎＰｌレベルに及ぼす暦年齢の影響
上記予測を実験的に検証することができるかどうかを調査するために、認知状態が未知であるが現時点で認知症と診断されていない２０９人の対象（男性１１０人、女性９９人、表１９）の血清中２２:６含有ＥｔｎＰｌレベルを測定し、臨床ＡＤ及びＣＮコホートと比較した（図３８）。この分析の結果から、５０〜５９歳のコホートに対して６０〜６９歳のコホートでの、血清中２２：６含有ＥｔｎＰｌの有意な減少が明らかになった（図３８Ａ）。ＣＮ群は平均して１３歳年長であったが、ＣＮ群に対しても、このコホートは有意に低いレベルを有していた。面白いことに、７０〜９５歳のコホートは、５０〜５９歳のコホート及びＣＮコホートから有意に異なることはなかったが、ＳＤＡＴコホートよりも有意に高いレベルを有した。
【実施例１２】
【０２６４】
血清ＤＨＡ−ＥｔｎＰｌレベルで特定される亜母集団
図３８Ｂで示す各年齢群での血清ＤＨＡ−ＥｔｎＰｌの分布も、検討した。年齢及び認知症状態によって区別した５群（３年齢群、ＣＮ及びＡＤ）の人口分布は、３つの異なる集団（Ｐ１〜Ｐ３、図３８Ｂ）の存在を明らかにする。これらの集団は、下記の通り指定した。Ｐ１−ＡＤ病状を有し、残りの余力のない対象；Ｐ３−ＡＤ病状がほとんど又は全くない対象；Ｐ２−Ｐ３からＰ１に移行する対象。これらのＰ２対象は、ＡＤ病状を有し、多少のレベルの残存余力を有すると仮定される。
【０２６５】
ＡＤ対象は診断から１０年未満の平均余命を有し（非特許文献３８、３９）、低レベルの２２：６含有ＥｔｎＰｌはＡＤ重症度と高度に関連するので、７０〜９５歳のコホートで観察されるＰ１対象数の減少は、Ｐ１とＰ２又はＰ３の間の平均余命の差によるものであろう。Ｐ２の移行的性質は、図７Ｂの下方の３つのパネルで観察されるように、Ｐ２と比較したＰ３に存在する対象の割合の間で異なる比率を検討することで、最もよく示される。これらの３つのコホートは、認知症状態だけが異なる。Ｐ３対Ｐ２比は、確認された認知正常群での３:１（６８％対２２％）から、認知状態が未知の正常な健康高齢群での１:１（４３％対４６％）の中間比に、確認された認知症ＡＤコホートでの０．６：１（２５％対４０％）に変化する。
【０２６６】
全ての引用は、本明細書で参照により組み込まれる。
【０２６７】
本発明は、１又は複数の実施形態に関して記載された。しかし、請求項で定義される本発明の範囲から逸脱することなく、いくつかの変更及び修正を加えることができることは、当業者にとって明らかになる。
【０２６８】
【表１】
0005496513.tif 000023
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【０２６９】
【表２】
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【０２７０】
【表３】
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【０２７１】
【表４】
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【０２７２】
【表５】
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【表５】
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【表５】
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【０２７３】
【表６】
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【０２７４】
【表７】
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【０２７５】
【表８】
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【０２７６】
【表９】
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【０２７７】
【表１０】
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【０２７８】
【表１１】
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【表１２】
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【０２８０】
【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【０２８８】
【表２１】
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【０２８９】
【表２２】
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【０２９０】
【表２３】
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【０２９１】
【表２４】
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【０２９２】
【表２５】
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【０２９３】
【表２６】
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【０２９４】
【表２７】
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【０２９５】
【表２８】
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【０２９６】
【表２９】
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【０２９７】
【表３０】
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【０２９８】
【表３１】
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【０２９９】
【表３２】
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【０３００】
【表３３】
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【表３４】
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【０３０２】
【表３５】
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【０３０３】
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【０３０４】
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【表３８】
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【０３０６】
【表３９】
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【０３０７】
【表４０】
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【０３０８】
【表４１】
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【０３０９】
【表４２】
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【０３１０】
【表４３】
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【０３１１】
【表４４】
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【０３１２】
【表４５】
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【０３１３】
【表４６】
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【０３１４】
【表４７】
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【０３１５】
【表４８】
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【０３１６】
【表４９】
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【０３１７】
【表５０】
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【０３１８】
【表５１】
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【０３１９】
【表５２】
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【図面の簡単な説明】
【０３２０】
【図１】非認知症対照と比較した各異なる臨床群（かなりの認知障害を伴うＡＤ、非ＡＤ認知症及び認知障害をあまり伴わないＡＤ）のＡＤ血清８バイオマーカーパネルの平均の信号対雑音±ＳＥＭを示す図。
【図２】かなりの認知障害を伴う２つの臨床群（ＡＤ及び非ＡＤ認知症）のＡＤ血清８バイオマーカーパネルの平均の信号対雑音±ＳＥＭを示す図。
【図３】かなりの認知障害を伴う２つの臨床群（ＡＤ及び非ＡＤ認知症）のＡＤ  ＣＳＦ１２バイオマーカーパネルの平均の信号対雑音±ＳＥＭを示す図。
【図４】代謝産物５４１．３４３２（Ａ）、５６９．３６８７（Ｂ）、６９９．５１９８（Ｃ）、７２３．５１９５（Ｄ）、７５１．５５５５（Ｅ）及び８０３．５６８（Ｆ）のＱ−Ｓｔａｒ抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）を示す図。上部パネルは非認知症の対象からの８試料を、下パネルは臨床的に診断されたＡＤ対象からの８試料を示す。
【図５】ＦＴＭＳ及びＱ−Ｓｔａｒ分析からの８個のＡＤ試料及び８個の非認知症対照試料の平均のＡＤバイオマーカー強度を示す図。
【図６】ＣＥ電圧−５０Ｖによる代謝産物５４１．３４３２のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図。
【図７】ＣＥ電圧−５０Ｖによる代謝産物５６９．３６８７のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図。
【図８】ＣＥ電圧−５０Ｖによる代謝産物６９９．５１９８のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図。
【図９】ＣＥ電圧−５０Ｖによる代謝産物７２３．５１９５のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図。
【図１０】ＣＥ電圧−５０Ｖによる代謝産物７５１．５５５５のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図。
【図１１】ＣＥ電圧−５０Ｖによる代謝産物８０３．５６８のＭＳ／ＭＳスペクトルを示す図。
【図１２】ＡＤＡＳ−ｃｏｇ血清バイオマーカー５４１．３４３２の構造決定を示す図。
【図１３】ＡＤＡＳ−ｃｏｇ血清バイオマーカー５６９．３６８７の構造決定を示す図。
【図１４】ＡＤＡＳ−ｃｏｇ血清バイオマーカー８０３．５６８の構造決定を示す図。
【図１５ａ】、
【図１５ｂ】さらなる血清バイオマーカーの推定構造を示す図。Ａ−５６７．３５４７の質量の代謝産物、Ｂ−５６５．３３９４の質量の代謝産物、Ｃ−８０５．５８３２の質量の代謝産物、Ｄ−８２７．５７の質量の代謝産物、Ｅ−８２９．５８５６の質量の代謝産物、Ｆ−５３１．５９９７の質量の代謝産物、及び、Ｇ−８５３．５８５４の質量の代謝産物。
【図１６】７５１．５５５５代謝産物のＭＳ／ＭＳ分析で得られた断片並びにその提案された構造を示す図。
【図１７】６９９．５１９８代謝産物のＭＳ／ＭＳ分析で得られた断片並びにその提案された構造を示す図。
【図１８】７２３．５１９５代謝産物のＭＳ／ＭＳ分析で得られた断片並びにその提案された構造を示す図。
【図１９】７５１．５５５５代謝産物（１８：０／２０：４  ＥｔｎＰｌ）のＬＣ−ＭＳ及びＭＳ／ＭＳ分析を示す図。パネルＡ１は、純粋な標準の親イオン７５０（Ｍ−Ｈ−）の抽出イオンクロマトグラム（ＥＩＣ）であり、パネルＡ２は、滞留時間４．８〜５．０分時の親イオンＭ／Ｚ７５０のＭＳ／ＭＳスペクトルである。パネルＢ１は、認知機能が正常な対象からの親イオン７５０のＥＩＣであり、パネルＢ２は、４．８〜５．０分時の親イオンＭ／Ｚ７５０のＭＳ／ＭＳスペクトルである。パネルＣ１は、ＡＤ対象からの親イオン７５０のＥＩＣであり、パネルＣ２は、４．８〜５．０分時の親イオンＭ／Ｚ７５０のＭＳ／ＭＳスペクトルである。
【図２０】エタノールアミンリン脂質の一般構造並びに本明細書で用いる命名法を示す図。
【図２１】ヒト血清中のＥｔｎＰｌ１６：０／１８：１（Ｍ１５）の抽出イオンクロマトグラム（上パネル）及びＭＳ／ＭＳスペクトル（下パネル）を示す図。
【図２２】ヒト血清中のＥｔｎＰｌ１６：０／１８：２（Ｍ１６）の抽出イオンクロマトグラム（上パネル）及びＭＳ／ＭＳスペクトル（下パネル）を示す図。
【図２３】ヒト血清中のＥｔｎＰｌ１６：０／２０：４（Ｍ１７）の抽出イオンクロマトグラム（上パネル）及びＭＳ／ＭＳスペクトル（下パネル）を示す図。
【図２４】ヒト血清中のＥｔｎＰｌ１６：０／２２：６（Ｍ１９）の抽出イオンクロマトグラム（上パネル）及びＭＳ／ＭＳスペクトル（下パネル）を示す図。
【図２５】ヒト血清中のＥｔｎＰｌ１８：０／１８：１（Ｍ２０）の抽出イオンクロマトグラム（上パネル）及びＭＳ／ＭＳスペクトル（下パネル）を示す図。
【図２６】ヒト血清中のＥｔｎＰｌ１８：０／１８：２（Ｍ２１）の抽出イオンクロマトグラム（上パネル）及びＭＳ／ＭＳスペクトル（下パネル）を示す図。
【図２７】ヒト血清中のＥｔｎＰｌ１８：０／２０：４（Ｍ２３）の抽出イオンクロマトグラム（上パネル）及びＭＳ／ＭＳスペクトル（下パネル）を示す図。
【図２８】ヒト血清中のＥｔｎＰｌ１８：０／２２：６（Ｍ２４）の抽出イオンクロマトグラム（上パネル）及びＭＳ／ＭＳスペクトル（下パネル）を示す図。
【図２９】ヒト血清中のＥｔｎＰｌ１８：１／１８：２及びプラスマニル１６：０／２０：４（Ｍ０７）の抽出イオンクロマトグラム（上パネル）及びＭＳ／ＭＳスペクトル（下パネル）を示す図。
【図３０】ヒト血清中のＥｔｎＰｌ２０：０／２０：４及びＥｔｎＰｌ１８：０／２２：４（Ｍ２３）の抽出イオンクロマトグラム（上パネル）及びＭＳ／ＭＳスペクトル（下パネル）を示す図。
【図３１】ヒト血清中のプラスマニル１８：０／２０：４（Ｍ１２）及びプラスマニル１６：０／２２：４（Ｍ０８）の抽出イオンクロマトグラム（上パネル）及びＭＳ／ＭＳスペクトル（下パネル）を示す図。
【図３２】ヒト血清中のＥｔｎＰｌ１８：１／２０：４、ＥｔｎＰｌ１６：０／２２：５、プラスマニル１６：０／２２：６（Ｍ０９）の抽出イオンクロマトグラム（上パネル）及びＭＳ／ＭＳスペクトル（下パネル）を示す図。
【図３３】健康なヒト血清中のＥｔｎＰｌ１６：０／２２：６（Ｍ１９）のＱ−Ｔｒａｐフローインジェクション分析標準曲線を示す図。
【図３４】認知症重症度及びＳＤＡＴ病状の血清ＥｔｎＰｌレベルに及ぼす影響（男女対象を合わせたもの）。（Ａ）一価及び二価不飽和ＥｔｎＰｌ及び飽和ＰｔｄＥｔ内部標準。（Ｂ）多価不飽和ＥｔｎＰｌ及び遊離のＤＨＡ（２２:６）。ＥｔｎＰｌ略記号：（脂肪酸炭素：二重結合、ビニルエーテル二重結合を含まず）及びグリセリン骨格上の位置（ｓｎ−１／ｓｎ−２）。Ｄ１６：０／１８：０は、ｓｎ−１にパルミチン酸（１６:０）及びｓｎ−２にステアリン酸（１８:０）を有するジアシルグリセロホスファチジルエタノールアミンを表し、２２:６は、遊離のＤＨＡを表す。値は、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝１９〜１１２）で表す。
【図３５】異なるレベルの認知症重症度を有する対象（男女対象を合わせたもの）における、血清ＤＨＡ−ＥｔｎＰｌ（Ｌｏｇ（２）ＥｔｎＰｌ１６：０／２２：６（Ｍ１９）対ＰｔｄＥｔ１６：０／１８：０（Ｍ０１）比）分布を示す図。
【図３６】参考文献５〜８から編集したＡＤ病状の理論的分布（Ａ）及び認知機能が正常な対象及び認知症の対象における、血清２２：６含有ＥｔｎＰｌ（Ｌｏｇ（２）ＥｔｎＰｌ１６：０／２２：６（Ｍ１９）対ＰｔｄＥｔ１６：０／１８：０（Ｍ０１）比）の実験的に決定された分布（Ｂ）の比較を示す図。矢印は、ＡＤの陽性の診断を示す。
【図３７】２５６名のＡＤ対象における、重症度（ＡＤＡＳ−ｃｏｇ）及び血清２２：６含有ＥｔｎＰｌ（ＥｔｎＰｌ１６：０／２２：６（Ｍ１９）対ＰｔｄＥｔ１６：０／１８：０（Ｍ０１）比）のレベルの線形回帰分析を示す図。Ｘは、ＥｔｎＰｌ減損の予測される開始である。値は、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝６６〜１１２）で表す。臨床的進行は、ＡＤＡＳ−ｃｏｇの７．５ポイント／年を仮定する。
【図３８】ＡＤ対象、認知機能が正常な対象及び一般集団対象における、血清２２：６含有ＥｔｎＰｌ（ＥｔｎＰｌ１６：０／２２：６（Ｍ１９）対ＰｔｄＥｔ１６：０／１８：０（Ｍ０１）比）レベルを示す図。（Ａ）平均値±ＳＥＭ（ｎ＝６８〜２５６）。（Ｂ）Ｌｏｇ（２）分布。
【図３９】男性及び女性における血清の白質及び灰白質ＥｔｎＰｌスコアの分布を示す図。
【０３２１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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