(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
トレハロースを２０〜４０％（ｇ／１００ｍL）で含有する血液寒天培地。
【請求項２】
トレハロースの含有量が、２０〜３０％（ｇ／１００ｍL）である請求項１記載の血液寒天培地。
【請求項３】
トレハロースを２０〜４０％（ｇ／１００ｍL）で含有する血液寒天培地を−４０℃〜４０℃で保存することを特徴とする血液寒天培地の保存方法。
【請求項４】
保存温度が、４〜３５℃である請求項３記載の血液寒天培地の保存方法。
【請求項５】
保存期間が、１〜１００日間である請求項３又は４記載の血液寒天培地の保存方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液寒天培地及びその保存方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般的に、血液寒天培地は、血液成分が栄養リッチであること、また血液成分に含まれる赤血球を利用して、栄養要求の厳しい微生物や溶血性を有する微生物の検出に用いられている。
血液寒天培地としては、例えばＣＷ血液寒天培地、血液加ブルセラ培地、スキロー培地、バツラ培地、プレストン培地、カンピロバクター培地、ボルデー・ジャング培地、コロンビア・ＣＮＡ培地、血液加トリプトソーヤ寒天培地等が挙げられる。
しかしながら、血液寒天培地は、離水がおこり易く長期間保存することが困難であり、大量にストックすることができず、作業効率が悪かった。
【０００３】
ところで、トレハロースは、ほとんどの細菌によって分解されず黄色ブドウ球菌によって分解されることを利用した黄色ブドウ球菌の同定のために０．５〜５重量％で含有させたり（特許文献１）、デイメイン液体培地の色調の変化を防止するために２〜１０ｇ／培地１Ｌで含有させたり（特許文献２）、またカンジタ・アルビカンス鑑別用発色培地中に５ｇ／培地Ｌで含有させたり（特許文献３）して、検出培地の成分として利用されている。
一方で、一般的に微生物の発育を抑制させるために食品に配合して用いられているショ糖よりも、食品の水分活性を効果的に低下させ、また離水を防ぐことができるため、優れた微生物発育抑制作用を有していることが知られている（特許文献４）。
しかしながら、微生物検出用の血液寒天培地へのトレハロースの使用については知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開平５−２２７９９２号公報
【特許文献２】特許平５−８６１９３号公報
【特許文献３】特開２００３−３１０２９８号公報
【特許文献４】特開平９−５６３４２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、冷凍〜室温下の保存条件でも離水が抑制され、またゲル強度が強く、しかも微生物の発育も阻害されることのない血液寒天培地を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
そこで、本発明者らは、斯かる実情に鑑み、種々検討を行った結果、全く意外にも、微生物発育抑制作用のあるトレハロースを高濃度で血液寒天培地に含有させた場合に、冷凍、低温及び室温下で一定期間保存しても血液寒天培地の離水が抑制され、かつ血液寒天培地のゲル強度が強く、しかも微生物の発育が阻害されることがないので、作業効率もよく、良好に微生物を検出することができることを見出し、本発明を完成させた。
【０００７】
すなわち、本発明は、トレハロースを２０〜４０％（ｇ/１００ｍL）含有する血液寒天培地を提供するものである。
【０００８】
また、本発明は、トレハロースを２０〜４０％（ｇ/１００ｍL）含有する血液寒天培地を−４０℃〜４０℃で保存することを特徴とする血液寒天培地の保存方法を提供するものである。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の血液寒天培地は、冷凍〜室温下の保存条件でも離水が抑制され、またゲル強度が強いと云う優れた効果を有するものである。更に、当該培地は、高濃度のトレハロースを含有するものの微生物の発育を阻害しないので幅広い微生物の検出に利用できるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】４℃保存におけるトレハロース０〜６０質量％含有の羊血寒天培地の、０〜２５日間の水分減量を示すものである。
【図２】６℃保存におけるトレハロース０〜６０質量％含有の羊血寒天培地の、０〜２５日間の水分減量を示すものである。
【図３】２５℃保存におけるトレハロース０〜６０質量％含有の羊血寒天培地の、０〜２５日間の水分減量を示すものである。
【図４】３５℃保存におけるトレハロース０〜６０質量％含有の羊血寒天培地の、０〜２５日間の水分減量を示すものである。
【図５】４℃保存におけるトレハロース０〜６０質量％含有の牛血寒天培地の、０〜２５日間の水分減量を示すものである。
【図６】６℃保存におけるトレハロース０〜６０質量％含有の牛血寒天培地の、０〜２５日間の水分減量を示すものである。
【図７】２５℃保存におけるトレハロース０〜６０質量％含有の牛血寒天培地の、０〜２５日間の水分減量を示すものである。
【図８】３５℃保存におけるトレハロース０〜６０質量％含有の牛血寒天培地の、０〜２５日間の水分減量を示すものである。
【図９】４℃保存におけるトレハロース０〜６０質量％含有の馬血寒天培地の、０〜２５日間の水分減量を示すものである。
【図１０】６℃保存におけるトレハロース０〜６０質量％含有の馬血寒天培地の、０〜２５日間の水分減量を示すものである。
【図１１】２５℃保存におけるトレハロース０〜６０質量％含有の馬血寒天培地の、０〜２５日間の水分減量を示すものである。
【図１２】３５℃保存におけるトレハロース０〜６０質量％含有の馬血寒天培地の、０〜２５日間の水分減量を示すものである。
【図１３】４℃保存におけるトレハロース０〜６０質量％含有の兔血寒天培地の、０〜２５日間の水分減量を示すものである。
【図１４】６℃保存におけるトレハロース０〜６０質量％含有の兔血寒天培地の、０〜２５日間の水分減量を示すものである。
【図１５】２５℃保存におけるトレハロース０〜６０質量％含有の兔血寒天培地の、０〜２５日間の水分減量を示すものである。
【図１６】３５℃保存におけるトレハロース０〜６０質量％含有の兔血寒天培地の、０〜２５日間の水分減量を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の血液寒天培地に含有させるトレハロースの量は、使用最終濃度で２０〜４０％（ｇ/１００ｍL）（以下、（％）とする）である。
トレハロース２０％以上の場合に、血液寒天培地の離水が抑制され、かつゲル強度が強く、微生物検出の際の取り扱い及び操作が容易であり、またトレハロース４０％以下の場合に、微生物の発育が抑制されることなく幅広い微生物の検出が可能である。しかも、２０〜４０％と云う高濃度のトレハロースを含有させても血液成分に大きなダメージを与えることなく、長期間保存した際に血液成分の変質を抑制することが可能である。
好ましいトレハロースの培地中の含有量は、寒天のゲル強度が強く、かつ微生物の発育も良好なことから、使用最終濃度で２０〜３０％である。
【００１２】
本発明の血液寒天培地に含有させる血液は、特に限定されないが、例えば、哺乳類及び鳥類の由来の血液が挙げられる。哺乳類由来の血液としては、例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ウサギ、モルモット、ヤギ、イヌ、ネコ及びヒト等の血液が挙げられる。また鳥類由来の血液としては、ニワトリ、アヒル及びガチョウ等の血液が挙げられる。このうち、ヒツジ、ウシ、ウマ及びウサギの血液が好ましい。
尚、血液を１種で又は２種以上混合して血液寒天培地に含有させてもよい。
また、血液は、微生物検出の際の微生物汚染を防止するため、無菌保存血液又は脱繊維血液を使用するのが好ましい。
また、本発明の血液寒天培地に含有させる血液の量は、特に限定されないが、使用最終濃度で、好ましくは１〜２０％、より好ましくは３〜１０％、更に好ましくは５〜１０％である。
【００１３】
本発明の血液寒天培地に含有させる寒天の量は、特に限定されないが、使用最終濃度で、好ましくは１〜３０％、より好ましくは２〜２０％、更に好ましくは２〜１５％である。
【００１４】
本発明の血液寒天培地は、トレハロースを使用最終濃度で２０〜４０％含有する寒天培地組成物を水に懸濁後滅菌処理し、冷却した後、寒天が固化する前に上記動物由来の血液を加えて混合後、固化させることによって得ることができる。
【００１５】
上記寒天培地組成物として、トレハロースと、微生物栄養成分、無機塩類、トレハロース以外の糖類、ｐＨ調整剤、抗生物質及び検出試薬等から選ばれる少なくとも１種とを配合して調製したものを使用してもよく、またトレハロースと、一般的に使用されている血液培地から血液を除いた寒天を含む培地組成物とを配合して調製したものを使用してもよい。
【００１６】
微生物栄養成分としては、ペプトン、酵母エキス及び魚肉エキス等が挙げられる。これらは単独で又は２種以上組み合わせて使用することができる。
【００１７】
また、無機塩類としては、塩化ナトリウム及びチオ硫酸ナトリウム等の無機酸金属塩；クエン酸鉄アンモニウム及びクエン酸ナトリウム等の有機酸金属等が挙げられる。また、他の無機塩類は、胆汁末、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム等が挙げられる。これらは単独で又は２種以上組み合わせて使用することができる。このうち、塩化ナトリウムが好ましく、塩化ナトリウムの含有量は、血液寒天培地中、０．０５〜１０％であるのが好ましい。
【００１８】
また、トレハロース以外の糖類としては、単糖及びトレハロース以外のオリゴ糖等が挙げられ、例えばラクトース、シュークロース、キシロース、セロビオース及びマルトース等が挙げられる。これらは単独で又は２種以上組み合わせて使用することができる。
ｐＨ調整剤としては、シュウ酸、炭酸水素ナトリウム、塩酸及び水酸化ナトリウム等が挙げられる。これらは単独で又は２種以上組み合わせて使用することができる。
抗生物質としては、カナマイシン、ポリミキシン、ノボビオシン及びゲンタマイシン等が挙げられる。これらは単独で又は２種以上組み合わせて使用することができる。
検出試薬としては、5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide、5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl-beta-D-galacto-pyranoside、6-Chloro-3-indoxyl-beta-D-galacto-pyranoside、N-Methylindoxyl-beta-D-galacto-pyranoside、4-Methylumbelliferyl-beta-D-galacto-pyranoside、2-Nitrophenyl-beta-D-galacto-pyranoside、5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-galacto-pyranoside、5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-acety-beta-D-galactosaminide、5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-N-acetyl-beta-D-glucosaminide、4-Methylumbelliferyl-beta-D-glucuronide、5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl-beta-D-gluco-pyranoside、5-Bromo-6-chloro-3-indoxyl-phosphate、5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-caprylate-nonanoate、5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-myo-inositol-1-phosphate及び5-Bromo-3-indoxyl-phosphate等が挙げられる。これらは単独で又は２種以上組み合わせて使用することができる。
【００１９】
また、上記一般的に使用されている血液培地としては、特に限定されないが、例えばＣＷ血液寒天培地、血液加ブルセラ培地、スキロー培地、バツラー培地、プレストン培地、カンピロバクター培地、ボルデー・ジャング培地、コロンビア・ＣＮＡ培地及び血液添加のトリプトソーヤ寒天培地等が挙げられる。
【００２０】
かようにして得られた本発明の上記血液寒天培地は、一定の保存温度下で一定期間保存することができ、その後検体を培地に接種して培養し、微生物のコロニーや血液寒天培地の状態を観察することによって微生物を検出できる。
【００２１】
保存の温度条件としては、特に限定されず、冷凍（−４０℃〜０℃未満）、低温（０℃〜１０℃未満）、室温（１０〜４０℃）のいずれでもよく、具体的には保存温度が−４０℃〜４０℃であるが好ましい。長期間保存可能な冷凍保存の場合、トレハロースを２０％以上含有させることによって血液寒天培地のゲル強度が微生物検出に使用できる程度にまで保持することができ、また、低温〜室温保存の場合であっても、血液寒天培地の離水抑制と共に血液寒天培地の品質劣化を抑制することができる。特に、４〜３５℃保存の際に血液寒天培地の離水抑制効果が高い。
保存期間は、特に限定されないが、微生物検出の作業効率及びロットの均一化を考慮すると、大量に調製された血液寒天培地を長期間ストックすることが望ましく、一方で血液寒天培地の品質劣化が少ない状態が望ましいので、血液寒天培地調製後、１時間〜１００日間、より１時間〜３０日間、更に６時間〜３日間、より更に１５時間〜４８時間であるのが好ましい。
【００２２】
検体は、特に限定されず、例えば、水道水、食品等から採取したものであり、原液又はこれを希釈（例えば１０〜１００倍希釈）したものを使用すればよい。
【００２３】
培養は、検出する微生物に適した条件で行えばよく、例えば嫌気や好気条件で３０〜４０℃で６時間〜７日間行う。
検出可能な微生物としては、特に限定されないが、嫌気又は好気の細菌、酵母及びカビ等が挙げられる。細菌としては、例えば、Bacillus属菌、Staphylococcus属菌、Escherichia属菌及びEnterobacter属菌、Bordetella属菌、Neisseria 属菌及びBranhamella属菌等が挙げられる。
微生物の検出は、各微生物のコロニー状態（発色や形状等）や検出試薬等による蛍光、発色や呈色状態等の観察や計測により行う。
【００２４】
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２５】
試験例１：離水抑制試験
〔培地組成〕
トレハロース：  トレハロース１００（Ｌｏｔ  Ｎｏ．８Ｈ０６１）（株）林原生物化学研究所
基礎培地：トリプトソーヤ寒天培地（１００ｍＬ組成）
カゼインペプトン  １．５ｇ、ダイズペプトン  ０．５ｇ、  塩化ナトリウム  ０．５ｇ、寒天  １．５ｇ、  ｐＨ  ７．３±０．２
血液：馬、兎、牛、綿羊
〔各トレハロース含有の血液寒天培地の調製〕
使用最終濃度が０％，２０％，３０％，４０％，５０％，６０％及び７０％になるようにトレハロースを各トリプトソーヤ寒天培地に添加し、オートクレーブ滅菌（１２１℃、１５分間）した後、５０℃のウォーターバスで保温した。この加熱滅菌培地に各動物由来の脱繊維血液を５％の割合で添加攪拌後、各滅菌シャーレへ分注し、トレハロース含有量及び由来血液が異なる各血液寒天培地を各３枚ずつ作製した。
〔試験方法〕
作製した各血液寒天培地を、４℃、６℃、２５℃及び３５℃の保存温度条件に調整した各インキュベーター内に置いて保存し、０日目（作製直後）、７日目、１２日目、１８日目及び２５日目毎に、各血液寒天培地を科学天秤にて測定し、「作製直後の血液寒天培地の質量−測定時の血液寒天培地の質量」から「各血液寒天培地の水分減量」を算出した。
【００２６】
図１〜１６に、各血液寒天培地の水分減量の結果を示す。
何れの保存温度条件においても、トレハロース無添加の血液寒天培地の水分減量に比し、トレハロース２０〜６０％含有の血液寒天培地の水分減量が少なかった。すなわち、トレハロースを最終濃度２０〜６０％で血液寒天培地に含有させることによって、血液寒天培地の保水性が向上したこと、言い換えれば、血液寒天培地の離水が抑制されたことが認められた。
特に、保存温度２５℃のような室温条件において、トレハロース無添加のものとトレハロース２０〜６０％含有のものとの差が大きかった。
血液寒天培地において、培地の離水が抑制されると、保水状態が製造直後と変わりなく培地表面が滑らかになり、微生物の検出がスムーズにできることから、微生物検出用培地の保存において培地の離水抑制が重要となる。更に、離水により培地表面が濡れている状態にならないために敢えて培地表面を乾燥させる必要がないことから、取り扱いも容易となる。
【００２７】
また、トレハロースを６０％含有させた、何れの血液寒天培地でも、トレハロースの析出は認められなかったので、微生物の検出培地としては有効である。
【００２８】
試験例２：解凍後の物性変化試験
〔培地組成〕
トレハロース：  トレハロース１００（Ｌｏｔ  Ｎｏ．８Ｈ０６１）（株）林原生物化学研究所
基礎培地：トリプトソーヤ寒天培地（試験例１と同様）
血液：羊脱繊維血液
〔各トレハロース含有の血液寒天培地の調製方法〕
試験例１と同様にして、各濃度（０，１０，２０，３０，４０，５０及び６０％）のトレハロース含有の羊血液寒天培地を、それぞれ３枚作製した。
〔試験方法〕
作製した各血液寒天培地を−２０℃と−４０℃の冷凍庫へ一晩（１５ｈ）放置し、凍結された血液寒天培地を調製した。凍結された血液寒天培地を室温に放置し、培地を完全に凍結がなくなった状態にし、レオメーター（装置名レオテックス：SD-700DP、会社名株式会社サン科学）で１ｍｍ侵入する強度を比較した。また、凍結前の血液寒天培地の強度も同様に測定した。このとき培地中のｐＨも測定した。
【００２９】
【表１】
0005548436.tif 000002
【００３０】
凍結（−２０℃及び−４０℃）後解凍した場合、トレハロースを含有してない血液寒天培地を用いると、その表面全体がボソボソになっており、白金耳を培地表面に押し付けた際に抵抗なく培地地中にめり込み、作業効率が低下したのに対し、トレハロースを１０〜６０％で含有させた血液寒天培地を用いると、その表面がボソボソになっておらず、白金耳で画線塗抹がスムーズにでき、作業効率が向上した。
このことから、従来の血液寒天培地は長期間冷凍保存には適していなかったにも拘わらず、トレハロースを２０〜６０％で含有させることによって、長期間冷凍保存も可能となったことは、極めて重要である。
なお、何れの培地中のｐＨは約７付近で、トレハロース含有量の影響は少なく、安定的であった。
【００３１】
すなわち、トレハロースを１０〜６０％で血液寒天培地に含有させることによって、冷凍による血液寒天培地の品質劣化が抑制され、冷凍しても微生物検出用培地としての品質を維持できることが認められた。
そして、試験例１の結果も考慮すると、トレハロースを１０〜６０％で血液寒天培地に含有させることによって、冷凍、低温及び室温の何れの保存温度条件でも保存が可能であると考えた。
更に、微生物検出の作業効率、ロットの均一化及び血液寒天培地の品質劣化を考慮すると、培地調製後１〜１００日内に使用するのがよいと考えられる。
【００３２】
また、凍結（−２０℃及び−４０℃）後解凍したトレハロース２０〜４０％含有血液寒天培地に、細菌Bacillus cereus、Staphylococcus epidemidis、Staphylococcus aureus、Escherichia coli、Enterobacter intermedium（原液：トリプトソイ液体培地）を接種し、３５℃、２４時間培養した結果、微生物の発育に影響がなかったので、冷凍による血液成分の品質劣化も抑制されたと考えた。  よって、輸送中に凍結したとしても、これによって寒天の劣化をきたし製品を廃棄することがないため経済効果も大きい。
【００３３】
試験例３：微生物発育試験
〔使用する微生物〕
（１）Bordetella septica ATCC 19395；Neisseria meningitidis 4；Branhamella catarrhalis ATCC 25238
（２）Bacillus cereus；Staphylococcus epidemidis；Staphylococcus aureus；Escherichia coli；Enterobacter intermedium
これら各微生物を、トリプトソイ液体培地に接種し、  ３５℃、４８時間、前培養し、これを種菌とした。
〔使用する血液寒天培地〕
上記製造例１と同様にして、各濃度のトレハロースを含有する５％羊血寒天培地を調製し、２５℃で３日間常温保存したものを使用した。
〔培養条件〕
各血液寒天培地に、上記種菌を「原液又はこの１０倍希釈液を植菌後、好気培養又は嫌気条件下で、３５℃、２日間培養して、コロニー数を目視にて測定した。
好気条件とは、窒素８０％、酸素２０％、嫌気条件とは、窒素８０％、二酸化炭素１０％、水素１０％である。
微生物発育の評価基準は、微生物のコロニー数を計測し、コロニー数１０以上の場合は「＋」で示し、コロニー数１〜９の場合はコロニー数を「数」で示し、更に１未満の場合には「−」で示した。また、種菌の原液を「原液」と示し、原液の１０倍希釈液を「−１」と示した。
【００３４】
【表２】
0005548436.tif 000003
【００３５】
【表３】
0005548436.tif 000004
【００３６】
【表４】
0005548436.tif 000005
【００３７】
【表５】
0005548436.tif 000006
【００３８】
表２〜５に示すように、トレハロース濃度が５０％以上になると微生物の発育阻害が認められるものの、トレハロース１０〜４０％の高濃度でも微生物の発育阻害は認められず、幅広い微生物を検出することができた。
【００３９】
以上の結果から、優れた血液寒天培地の離水抑制効果及びゲル強度を有しつつ、幅広い微生物が検出可能なトレハロースの含有量は、２０〜４０％であり、特に２０〜３０％であるのが好ましいと考えられた。
また、本発明の血液寒天培地の保存温度条件は、血液寒天培地の品質劣化の抑制の点から、冷凍、低温及び室温の何れでもよいと考え、室温条件（特に２０〜３０℃）で血液寒天培地の離水抑制効果が高かった。また保存期間は、作業効率やロットの均一化の点から、１〜１００日間であるのがよいと考えられた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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