(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
質量分析計において、ｍ／ｚ  １６，４５０〜１６，６２０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ  ２２，０８０〜２２，３１０のピークとして検出されるタンパク質、及びｍ／ｚ  １７，１００〜１７，２７０のピークとして検出されるタンパク質から選ばれるタンパク質からなる、フルオロウラシル、イリノテカン、ＳＮ−３８、それらの塩、及びフルオロウラシル又はその塩とイリノテカン、ＳＮ−３８又はそれらの塩との併用剤から選ばれる抗がん剤の大腸がん感受性判定マーカー。
【請求項２】
フルオロウラシル、イリノテカン、ＳＮ−３８、それらの塩、及びフルオロウラシル又はその塩とイリノテカン、ＳＮ−３８又はそれらの塩との併用剤から選ばれる抗がん剤の大腸がん感受性を判定する目的で、検体中の、質量分析計において、ｍ／ｚ  １６，４５０〜１６，６２０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ  ２２，０８０〜２２，３１０のピークとして検出されるタンパク質、及びｍ／ｚ  １７，１００〜１７，２７０のピークとして検出されるタンパク質から選ばれるタンパク質を測定する方法。
【請求項３】
検体が、大腸がんを有する被験者由来の生体試料である請求項２記載の測定方法。
【請求項４】
検体が、抗がん剤を投与された、大腸がんを有する被験者由来の生体試料である請求項２又は３記載の測定方法。
【請求項５】
検体中の、質量分析計において、ｍ／ｚ  １６，４５０〜１６，６２０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ  ２２，０８０〜２２，３１０のピークとして検出されるタンパク質、及びｍ／ｚ  １７，１００〜１７，２７０のピークとして検出されるタンパク質から選ばれるタンパク質を測定するためのプロトコールを含むことを特徴とする請求項２〜４のいずれか１項記載の測定方法を実施するためのキット。
【請求項６】
質量分析計において、ｍ／ｚ  １６，４５０〜１６，６２０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ  ２２，０８０〜２２，３１０のピークとして検出されるタンパク質、及びｍ／ｚ  １７，１００〜１７，２７０のピークとして検出されるタンパク質から選ばれるタンパク質の発現変動を指標とする、フルオロウラシル、イリノテカン、ＳＮ−３８、それらの塩、及びフルオロウラシル又はその塩とイリノテカン、ＳＮ−３８又はそれらの塩との併用剤から選ばれる抗がん剤の大腸がん感受性亢進剤のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象となる患者のがんが、使用しようとする抗がん剤に治療反応性を有するか否かを判定するために用いる抗がん剤感受性判定マーカー及びその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗がん剤には、アルキル化剤、白金製剤、代謝拮抗剤、抗がん性抗生物質、抗がん性植物アルカロイド等の種類がある。そしてこれらの抗がん剤には、がんの種類によって効果を示す場合と効果を示さない場合がある。しかし、有効であると認められている種類のがんであっても、個々の患者によって効果を示す場合と効果を示さない場合があることが知られている。このような個々の患者のがんに対して抗がん剤が効果を示すか否かを抗がん剤感受性という。【０００３】
塩酸イリノテカン（ＣＰＴ−１１）は日本で開発されたｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅＩ阻害という作用機序を有する抗がん剤である。日本において、ＣＰＴ−１１は、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、子宮頸癌、卵巣癌に有効な薬剤として１９９４年１月に認可され、さらに１９９５年７月に胃癌、結腸・直腸癌、乳癌、有棘細胞癌、悪性リンパ腫に対する適応が認められている。ＣＰＴ−１１は特に大腸癌の領域で多剤併用療法のｆｉｒｓｔ  ｌｉｎｅ  ｄｒｕｇあるいはｓｅｃｏｎｄ  ｌｉｎｅ  ｄｒｕｇとして世界的な標準治療薬の位置を占め、その有用性が認められている（非特許文献１〜６）。
進行性・転移大腸癌に対する化学療法は、１９９０年代に登場したＣＰＴ−１１、オキサリプラチンなどのｋｅｙ  ｄｒｕｇと、それまで大腸癌治療の中心的薬剤であったフルオロウラシル（５−ＦＵ）を中心とするフッ化ピリミジン製剤とを併用することにより、生存率をはじめとする臨床成績が劇的に改善された。しかしそれでもなお奏効率はおよそ５０％程度であり、重篤な副作用という高リスクを冒して抗がん剤が投与された患者の半分では効果が得られていないのが現状であり、個々の治療反応性（レスポンダー・ノンレスポンダー）を判別する抗がん剤感受性予測マーカーの確立は急務である。【０００４】
ＣＰＴ−１１はそれ自体抗腫瘍活性を有するものの、体内でＣａｒｂｏｘｙｌ  ｅｓｔｅｒａｓｅにより活性化され、ＣＰＴ−１１に比べおよそ１００〜数千倍強い抗腫瘍活性を有する７−ｅｔｈｙｌ−１０−ｈｙｄｒｏｘｙｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎ（ＳＮ−３８）へと変換される。ＣＰＴ−１１とＳＮ−３８が同時に体内に存在することで抗腫瘍効果を呈すると考えられている。ＳＮ−３８は肝細胞内でＵＤＰ−グルクロン酸転移酵素（ＵＧＴ：ＵＤＰ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）によりグルクロン酸抱合を受け、細胞毒性のないＳＮ−３８グルクロン酸抱合体（ＳＮ−３８Ｇ）となり、おもに胆汁中に排泄され腸管へと移行し、その後は便中に排泄される。腸管に排泄されたＳＮ−３８Ｇの一部は、腸内細菌が有するβ−グルクロニダーゼにより脱抱合され再び活性型のＳＮ−３８となり、腸管上皮のトランスポーターを介し再吸収され腸肝循環、腸上皮細胞内でのＵＧＴによるグルクロン酸抱合化などのステップを経ながら代謝・排泄を受ける（非特許文献７）。この際に、ＳＮ−３８が腸管粘膜を障害し、下痢を誘発すると考えられている。また、細胞分裂の活発な骨髄にも影響をおよぼし、赤血球減少・白血球減少・血小板減少を引き起こすことが認められている。
重篤な下痢や好中球減少症などの副作用は、ＵＧＴ１Ａ１遺伝多型がもたらすＳＮ−３８体内曝露量の変化が一因であることが示されている。しかし治療効果に関しては、プロドラッグであるＣＰＴ−１１から活性代謝物ＳＮ−３８への変換とその解毒、さらに腸管循環の過程におけるＳＮ−３８の再生成や、ＣＰＴ−１１自体の代謝と代謝物からのＳＮ−３８の生成といった体内動態の複雑性により、また、抗腫瘍効果が腫瘍側の要因により規定されることが多いため、薬物動態により治療効果を予測できるとする報告は未だなされていない。末梢血単核球細胞のカルボキシルエステラーゼｍＲＮＡ発現量がＳＮ−３８とＳＮ−３８ＧのＡＵＣ比とは相関するものの腫瘍縮小効果とは相関がなかったとする報告もなされている（非特許文献８）。【０００５】
ＣＰＴ−１１感受性もしくは耐性に関与する腫瘍側の因子としては、ＳＮ−３８の標的であるｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅＩの変異の有無や発現量、ＣＰＴ−１１からＳＮ−３８への変換に関与するカルボキシルエステラーゼ活性（非特許文献９）、ＣＰＴ−１１やＳＮ−３８の細胞内蓄積量に影響するトランスポーター（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＲＰ）−１、ＭＲＰ−２、Ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＢＣＲＰ）／ＡＢＣＧ２）の関与が報告されており、その他、細胞増殖抗原Ｋｉ−６７、がん抑制遺伝子ｐ５３などもＣＰＴ−１１を用いた治療への反応性との関連が検討されている。ごく最近、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて抗がん剤感受性データとマイクロアレイのデータを組み合わせることで体系的に抗癌剤感受性を予測しようとする試みがなされており、カンプトテシン類ではトポテカンについて検討されている（非特許文献１０）。臨床研究においては、抗アポトーシス作用をもつＴｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１（ＴＩＭＰ−１）の血漿中レベルが、転移結腸・直腸癌に対するＣＰＴ−１１＋５−ＦＵ併用療法の臨床予後と有意に相関することが最近報告されている（非特許文献１１）。【０００６】
大腸がん治療におけるｋｅｙレジメンであるＦＯＬＦＩＲＩ療法では、ＣＰＴ−１１と５−ＦＵが併用される。５−ＦＵは、１９５７年に開発されたフッ化ピリミジン系抗癌剤であり、今なお消化器癌化学療法の基本となる薬剤である。がん細胞に取り込まれた５−ＦＵは、活性代謝物ｆｌｕｏｒｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ−５'−ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ  （ＦｄＵＭＰ）  によるｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＴＳ）の阻害が惹起するＤＮＡ合成阻害を主たる作用機序とする他、同じく活性代謝物である５−ｆｌｕｏｒｏｕｒｉｄｉｎｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＦＵＴＰ）によるＲＮＡ機能障害などにより殺細胞効果を発揮する。【０００７】
フッ化ピリミジン系抗癌剤の治療応答性の予測についてはこれまで多くの研究がなされているが、とくに５−ＦＵの分解酵素であるｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（ＤＰＤ）と活性代謝物の標的酵素であるｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＴＳ）についての報告が多い。５−ＦＵ異化代謝の律速酵素であるＤＰＤを高発現している腫瘍では５−ＦＵ耐性であることが報告されているが（非特許文献１２）、臨床検体を用いての検証報告は多くはない。ＴＳ発現については、酵素活性、タンパク質及びＲＮＡレベルなどの測定法によらず、その多寡がフッ化ピリミジン系抗癌剤の治療効果規定因子となり得ることが報告されている（非特許文献１３、１４）。
しかし、すべての報告において必ずしも一致する結果は得られておらず、さらに５−ＦＵに対する治療反応性を治療早期に予測する明確なバイオマーカーは知られていない。【０００８】
このように５−ＦＵ、ＣＰＴ−１１、及び５−ＦＵ／ＣＰＴ−１１併用療法に対する感受性予測バイオマーカーの必要性が認識され多くの研究がなされているが、標的であるｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅＩについても、５−ＦＵ感受性予測因子とされるＴＳとともに５−ＦＵ／ＣＰＴ−１１併用療法の治療反応性との間に明確な関連性を見出せなかったとする報告もあるなど（非特許文献１５）、治療反応性を予測し得る明確なバイオマーカーは確立されていない。
さらに、一般にがん化学療法の治療スケジュールは長期に渡るため、治療継続中における抗がん剤に対する感受性の経時的モニターは治療継続の是非の判定を可能とし、患者負担や副作用軽減につながるのみならず医療経済の観点からも有用であると考えられる。個々の患者における治療反応性を予測、そして早期に診断して適切な薬剤や治療レジメンを選択する「個別化治療」実現のためには、５−ＦＵ、ＣＰＴ−１１、及び５−ＦＵ／ＣＰＴ−１１併用時の効果予測もしくは治療応答性の早期診断を可能とするバイオマーカーの確立は急務である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １９９３；１１：９０９−９１３．
【非特許文献２】Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １９９９；２６（１  Ｓｕｐｐｌ  ５）：６−１２．
【非特許文献３】Ｌａｎｃｅｔ  １９９８；３５２：１４０７−１４１２．
【非特許文献４】Ｐｒｏ  ＡＳＣＯ  ２００５；Ａｂｓｔｒａｃｔ  ＃３５０６．
【非特許文献５】Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０００；３４３：９０５−９１４．
【非特許文献６】Ｌａｎｃｅｔ  ２０００；３５５：１０４１−１０４７．
【非特許文献７】Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９１；５１：４１８７−４１９１．
【非特許文献８】Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００５；１１：６９０１−６９０７．
【非特許文献９】Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２００７；１７：１−１０．
【非特許文献１０】Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００６；１２：１２９４−１３００．
【非特許文献１１】Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００７；１３：４１１７−４１２２．
【非特許文献１２】Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００４；４０：９３９−９５０.
【非特許文献１３】Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２００２；２８：２７−４７.
【非特許文献１４】Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００４；２２：５２９−５３６.
【非特許文献１５】Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００４；１１１：２５２−２５８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、個々の患者の治療反応性を判別できる抗がん剤感受性判定マーカー及びそれを利用する新たながん治療手段を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
そこで本発明者らは、ヒトがん細胞株を培養し、薬剤曝露後の細胞内タンパク質の経時的発現変化を、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）を用いて網羅的に解析することにより、抗がん剤感受性判定マーカーの探索を行なった。５−ＦＵ、ＣＰＴ−１１の活性代謝物であるＳＮ−３８、及び両者の併用（５−ＦＵ／ＳＮ−３８）に対して高感受性、低感受性を示す２種類のヒト大腸癌細胞に対して、５−ＦＵ単剤、ＳＮ−３８単剤、５−ＦＵ／ＳＮ−３８併用にて曝露し、薬剤曝露後の細胞内タンパク質の経時的発現変化を検討した。その結果、５−ＦＵ曝露後に高感受性細胞における細胞内発現レベルが上昇するピークを見出し、そのピークが、質量分析計において、本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ  １６，４５０〜１６，６２０のピークとして検出されるタンパク質であることを見出した。
同様に、ＳＮ−３８曝露後に、高感受性細胞における細胞内発現レベルが上昇するピークを見出し、そのピークが、質量分析計において、本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ  １６，４５０〜１６，６２０のピークとして検出されるタンパク質、あるいは本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ  ２２，０８０〜２２，３１０のピークとして検出されるタンパク質であることを見出した。
さらに、５−ＦＵ／ＳＮ−３８併用曝露後に、高感受性細胞における細胞内発現レベルが上昇するピークを見出し、そのピークが、質量分析計において、本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ  １６，４５０〜１６，６２０のピークとして検出されるタンパク質であること、また、低感受性細胞における細胞内発現レベルが上昇するピークを見出し、そのピークが、質量分析計において、本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ  １７，１００〜１７，２７０のピークとして検出されるタンパク質であることを見出した。
また、高感受性細胞と低感受性細胞において、薬剤曝露前の細胞内発現レベルが異なるピークを見出し、そのピークが、質量分析計において、本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ  １６，４５０〜１６，６２０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ  １７，１００〜１７，２７０のピークとして検出されるタンパク質、ｍ／ｚ  ２２，０８０〜２２，３１０のピークとして検出されるタンパク質であることを見出した。
かかる知見に基づき、さらに検討した結果、がん患者由来の生体試料中の当該タンパク質の濃度を測定すれば、当該がん患者のがんが、５−ＦＵ、ＳＮ−３８、或いは５−ＦＵ／ＳＮ−３８の併用療法に対して感受性を有するか否かを判定できること、また、この物質の発現抑制を指標とすれば抗がん剤感受性亢進剤のスクリーニングが可能になること、さらに当該抗がん剤感受性亢進剤と感受性亢進の対象となる抗がん剤を併用すれば、当該抗がん剤の治療効果が飛躍的に向上することを見出し、本発明を完成した。【００１２】
すなわち、本発明は、質量分析計において、本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ  １６，４５０〜１６，６２０のピークとして検出されるタンパク質（以下、タンパク質Ａという）、本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ  ２２，０８０〜２２，３１０のピークとして検出されるタンパク質（以下、タンパク質Ｂという）、及び本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ  １７，１００〜１７，２７０のピークとして検出されるタンパク質（以下、タンパク質Ｃという）から選ばれるタンパク質からなる抗がん剤感受性判定マーカーを提供するものである。
また、本発明は、検体中のタンパク質Ａ、タンパク質Ｂ、タンパク質Ｃを測定することを特徴とする抗がん剤感受性の判定方法を提供するものである。
また、本発明は、検体中のタンパク質Ａ、タンパク質Ｂ、タンパク質Ｃを測定するためのプロトコールを含むことを特徴とする抗がん剤感受性の判定方法を実施するためのキットを提供するものである。
さらに本発明は、タンパク質Ａ、タンパク質Ｂ、タンパク質Ｃの発現変動を指標とする抗がん剤感受性亢進剤のスクリーニング方法を提供するものである。
さらにまた本発明は、上記のスクリーニング方法により得られた抗がん剤感受性亢進剤を提供するものである。
さらに本発明は、上記の抗がん剤感受性亢進剤と感受性亢進の対象となる抗がん剤を組み合わせてなるがん治療用組成物を提供するものである。
さらに本発明は、抗がん剤感受性を判定するためのタンパク質Ａ、タンパク質Ｂ、タンパク質Ｃを提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の抗がん剤感受性判定マーカーを用いれば、個々の患者の抗がん剤感受性を治療開始前もしくは治療開始後早期に適確に判定できる結果、治療効果の高い抗がん剤の選択が可能となる。さらに効果が得られない抗がん剤の使用を回避できるため不必要な副作用を回避できる。また、抗がん剤を用いた治療スケジュールは長期に及ぶため、治療継続中においても治療サイクルごとに抗がん剤感受性を判定することにより、そのがんにおける抗がん剤に対する感受性の経時的評価が可能となり、治療を継続すべきか否かの判定ができる。その結果、治療効果の得られない抗がん剤の継続投与に伴うがんの進行、副作用の増大を防止でき、患者の負担軽減、医療費の削減にもつながる。
さらに、また、このマーカーを用いれば、抗がん剤感受性を亢進させる薬剤がスクリーニングでき、その対象となった抗がん剤と抗がん剤感受性亢進剤とを併用すれば、がん治療効果が飛躍的に向上する。本発明の抗がん剤感受性判定マーカーの測定試薬は、抗がん剤感受性判定試薬として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】５−ＦＵ、ＳＮ−３８、５−ＦＵ／ＳＮ−３８併用で７２時間曝露後のＨＣＴ１１６及びＤＬＤ−１の生存率（％）を示す図である。
【図２】ＨＣＴ１１６及びＤＬＤ−１における５−ＦＵ、ＳＮ−３８、５−ＦＵ／ＳＮ−３８併用曝露後のタンパク質Ａの細胞内レベルの経時的変化を示す図である。
【図３】ＨＣＴ１１６及びＤＬＤ−１におけるＳＮ−３８曝露後のタンパク質Ｂの細胞内レベルの経時的変化を示す図である。
【図４】ＨＣＴ１１６及びＤＬＤ−１における５−ＦＵ／ＳＮ−３８併用曝露後のタンパク質Ｃの細胞内レベルの経時的変化を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明における抗がん剤感受性判定マーカーは、タンパク質Ａ〜Ｃであり、より詳細には表面エンハンス型レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）において、陽イオン交換チップを用いてｐＨ４．５の条件で、それぞれ質量分析計において、本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ  １６，４５０〜１６，６２０のピークとして検出されるタンパク質（タンパク質Ａ）、本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ  ２２，０８０〜２２，３１０のピークとして検出されるタンパク質（タンパク質Ｂ）、本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ  １７，１００〜１７，２７０のピークとして検出されるタンパク質（タンパク質Ｃ）である。
【００１６】
タンパク質Ａは、後記実施例に示すように、培養がん細胞の細胞内タンパク質の発現をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いて検討した結果、５−ＦＵ、ＳＮ−３８、５−ＦＵ／ＳＮ−３８併用のいずれに対しても高感受性であるＨＣＴ１１６において、５−ＦＵ、ＳＮ−３８、５−ＦＵ／ＳＮ−３８併用曝露後に細胞内レベルの上昇が認められた。一方、５−ＦＵ、ＳＮ−３８、５−ＦＵ／ＳＮ−３８併用のいずれに対しても低感受性であるＤＬＤ−１の細胞内レベルに顕著な変動は認められなかった。従って、タンパク質Ａは、抗癌剤感受性判定マーカー、特に５−ＦＵ、ＳＮ−３８、並びに５−ＦＵ／ＳＮ−３８併用時の抗癌剤感受性判定マーカーとして有用である。
【００１７】
タンパク質Ｂは、後記実施例に示すように、培養がん細胞の細胞内タンパク質の発現をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いて検討した結果、ＳＮ−３８曝露後、ＳＮ−３８に対して高感受性であるＨＣＴ１１６で細胞内レベルの上昇が認められた。一方、ＳＮ−３８に対して低感受性であるＤＬＤ−１では顕著な変化は認められない、もしくは低下傾向を示した。従って、タンパク質Ｂは、抗癌剤感受性判定マーカー、特にＳＮ−３８の抗癌剤感受性判定マーカーとして有用である。
【００１８】
タンパク質Ｃは、後記実施例に示すように、培養がん細胞の細胞内タンパク質の発現をＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いて検討した結果、５−ＦＵ／ＳＮ−３８併用曝露後、５−ＦＵ／ＳＮ−３８併用に対して低感受性であるＤＬＤ−１で細胞内レベルの上昇が認められた。一方、５−ＦＵ／ＳＮ−３８併用に対して高感受性であるＨＣＴ１１６では顕著な変化は認められなかった。従って、タンパク質Ｃは、抗癌剤感受性判定マーカー、特に５−ＦＵ／ＳＮ−３８併用時の抗癌剤感受性判定マーカーとして有用である。
【００１９】
タンパク質Ａ〜Ｃは、後記実施例に示すように、５−ＦＵ、ＳＮ−３８、５−ＦＵ／ＳＮ−３８併用のいずれに対しても高感受性であるＨＣＴ１１６における薬剤曝露前（非曝露時）の細胞内レベルが、上記いずれの薬剤に対しても低感受性であるＤＬＤ−１と比較して有意に高い値を示した。従って、タンパク質Ａ〜Ｃは、抗がん剤感受性判定マーカー、特に５−ＦＵ、ＳＮ−３８、５−ＦＵ／ＳＮ−３８併用時の抗がん剤感受性判定マーカーとして有用である。
【００２０】
本発明の抗がん剤感受性判定マーカーの対象となる抗がん剤としては特に限定されないが、例えばオキサリプラチン、シクロフォスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イフォスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、ニムスチン（ｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ラニムスチン（ｒａｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、ネダプラチン（ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ペメトレキセド（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、テガフール／ウラシル（ｔｅｇａｆｕｌ・ｕｒａｃｉｌ）、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、テガフール／ギメラシル／オテラシル（ｔｅｇａｆｕｌ・ｇｉｍｅｒａｃｉｌ・ｏｔｅｒａｃｉｌ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、６−メルカプトプリン（６−ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、フルダラビン（ｆｕｌｕｄａｒａｂｉｎ）、ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎｅ）、ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、アムルビシン（ａｍｕｒｕｂｉｃｉｎ）、アクチノマイシンＤ（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎｅ）、ペプレオマイシン（ｐｅｐｌｅｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ（ｍｙｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ）、アクラルビシン（ａｃｌａｒｕｂｉｃｉｎ）、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、イリノテカン活性代謝物（ＳＮ−３８）、ノギテカン（ｎｏｇｉｔｅｃａｎ、ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、トレミフェン（ｔｏｒｅｍｉｆｅｎｅ）、メドロキシプロゲステロン（ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）、アナストロゾール（ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）、エキセメスタン（ｅｘｅｍｅｓｔａｎｅ）、レトロゾール（ｌｅｔｒｏｚｏｌｅ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、��ムツズマブ・オゾガマイシン（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ  ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、ボルテゾミブ（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、スニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、ダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）、パニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、トレチノイン（ｔｒｅｔｉｎｏｉｎ）、三酸化ヒ素（ａｒｓｅｎｉｃ  ｔｒｉｏｘｉｄｅ）、又はそれらの塩、又はそれらの活性代謝物等が挙げられる。このうちフッ化ピリミジン系抗がん剤、植物アルカロイド系抗がん剤が好ましく、特にフルオロウラシル、イリノテカン、ＳＮ−３８又はそれらの塩が好ましい。さらに、フルオロウラシル又はその塩と、イリノテカン、ＳＮ−３８又はそれらの塩との併用剤において好適に利用することができる。
【００２１】
本発明の抗がん剤感受性判定マーカーを用いて抗がん剤感受性を判定するには、検体中のタンパク質Ａ〜Ｃを測定すればよい。ここで、検体としては、がんを有する被験者（がん患者）由来の生体試料、例えば血液、血清、血漿、がん組織生検検体、がん摘出手術標本、便、尿、腹水、胸水、脳脊髄液、喀痰等が挙げられるが、血清が特に好ましい。
【００２２】
また、本発明の対象となるがんとしては、咽頭がんを代表とする口唇、口腔及び咽頭がん、食道がん、胃がん、結腸・直腸がんなどを代表とする消化器がん、肺がんを代表とする呼吸器及び胸腔内臓器がん、骨及び関節軟骨がん、皮膚の悪性黒色腫、有棘細胞がん及びその他の皮膚のがん、中皮腫を代表とする中皮及び軟部組織がん、乳房がん、子宮がん、卵巣がんを代表とする女性性器がん、前立腺がんを代表とする男性性器がん、膀胱がんを代表とする尿路がん、脳腫瘍を代表とする眼、脳及び中枢神経系がん、甲状腺及びその他の内分泌腺がん、非ホジキンリンパ腫やリンパ性白血病を代表とするリンパ組織、造血組織及び関連組織がん、及びこれらを原発巣とする転移組織のがん等が挙げられるが、特に胃がんや結腸・直腸がんに対して好適に利用できる。
【００２３】
検体中のタンパク質Ａ〜Ｃの測定手段は、例えばＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ、免疫学的測定法等により測定可能である。
【００２４】
ここでＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる測定は後記実施例に記載の方法によって行うことができる。また、免疫学的測定法においては、抗タンパク質Ａ〜Ｃ抗体を用いる免疫学的測定法が好ましい。用いる抗タンパク質Ａ〜Ｃ抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。より具体的には、例えば、ラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、発光イムノアッセイ、免疫沈降法、免疫比濁法、ウエスタンブロット、免疫染色、免疫拡散法などを挙げることができるが、好ましくはウエスタンブロット又はエンザイムイムノアッセイであり、特に好ましいのはウエスタンブロット、酵素結合免疫吸着定量法（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ：ＥＬＩＳＡ）（例えば、ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ）である。
【００２５】
タンパク質Ａ、タンパク質Ｂについて、対象とする抗がん剤に対する感受性を判定するには、抗がん剤投与前及び投与後のがん患者由来の生体試料中のタンパク質Ａ、タンパク質Ｂ濃度を測定し、抗がん剤投与前後におけるタンパク質Ａ、タンパク質Ｂの濃度が上昇傾向を示した場合は、そのがんは抗がん剤感受性であり、抗がん剤投与前に比べて投与後におけるタンパク質Ａ、タンパク質Ｂの濃度が変化しない、もしくは低下した場合には、そのがんは抗がん剤感受性ではないと判定できる。つまり、タンパク質Ａ、タンパク質Ｂの濃度が投与後早期の段階において所定の標準濃度より高いと判断される濃度を有する場合は、そのがんは対象とする抗がん剤に対して感受性を有すると判定できるため、治療効果を期待できる患者に対して積極的に治療を継続するためのマーカーとして使用できる。
また、投与後早期の段階において、タンパク質Ａ、タンパク質Ｂの濃度が所定の標準濃度より低いと判断される濃度を有する場合は、そのがんは対象とする抗がん剤に対して感受性ではないと判定できる。対象とする抗がん剤に対して感受性を有さない場合は、その薬効を期待することができず、このような薬効の期待できない抗がん剤の投与が続けられた場合、がんの進行、副作用の増大が危惧される。このように、本発明における抗がん剤感受性判定マーカーは、抗がん剤治療反応性の判定のみならず、薬効の期待できない抗がん剤の継続投与に伴うがんの進行や副作用の増大を回避するためのマーカーとしても使用できる。
【００２６】
タンパク質Ｃについて、対象とする抗がん剤が５−ＦＵ／ＳＮ−３８の併用である場合、抗がん剤に対する感受性を判定するには、抗がん剤投与前及び投与後のがん患者由来の生体試料中のタンパク質Ｃ濃度を測定し、抗がん剤投与前後におけるタンパク質Ｃの濃度が上昇傾向を示した場合は、そのがんは抗がん剤感受性ではなく、抗がん剤投与前に比べて投与後におけるタンパク質Ｃの濃度が変化しない、もしくは低下した場合には、そのがんは抗がん剤感受性であると判定できる。つまり、タンパク質Ｃの濃度が投与後早期の段階において所定の標準濃度より低いと判断される濃度を有する場合は、そのがんは対象とする抗がん剤に対して感受性を有すると判定できるため、治療効果を期待できる患者に対して積極的に治療を継続するためのマーカーとして使用できる。
また、投与後早期の段階において、タンパク質Ｃの濃度が所定の標準濃度より高いと判断される濃度を有する場合は、そのがんは対象とする抗がん剤に対して感受性ではないと判定できる。対象とする抗がん剤に対して感受性を有さない場合は、その薬効を期待することができず、このような薬効の期待できない抗がん剤の投与が続けられた場合、がんの進行、副作用の増大が危惧される。このように、本発明における抗がん剤感受性判定マーカーは、抗がん剤治療反応性の判定のみならず、薬効の期待できない抗がん剤の継続投与に伴うがんの進行や副作用の増大を回避するためのマーカーとしても使用できる。
【００２７】
また、タンパク質Ａ〜Ｃについて、対象とする抗がん剤が５−ＦＵ、ＳＮ−３８、５−ＦＵ／ＳＮ−３８の併用である場合、抗がん剤に対する感受性を判定するには、抗がん剤投与前のがん患者由来の生体試料中のこれらのタンパク質濃度を測定し、これらのタンパク質の濃度が所定の標準濃度より低いと判断される濃度を有する場合は、そのがんは対象とする抗がん剤に対して感受性ではないと判定できる。対象とする抗がん剤に対して感受性を有さない場合は、その薬効を期待することができず、抗がん剤による副作用のみが発現すると考えられるため、本発明における抗がん剤感受性判定マーカーは、不必要な副作用の発現もしくは無効な治療継続に伴うがんの進行や副作用の増大を回避するためのマーカーとしても使用できる。
また、これらのタンパク質の濃度が所定の標準濃度より高いと判断される濃度を有する場合は、そのがんは対象とする抗がん剤に対して感受性を有すると判定できるため、治療効果を期待できる患者を積極的に選出するためのマーカーとしても使用できる。
【００２８】
なお、タンパク質Ｃについて、抗がん剤投与中のマーカーとしては、抗がん剤投与前に比べて投与後におけるタンパク質の濃度が変化しない、もしくは低下した場合には、そのがんは抗がん剤感受性であると判定でき、抗がん剤投与前のマーカーとしては、所定の標準濃度より低いと判断される濃度を有する場合には、そのがんは抗がん剤感受性ではないと判定できる。抗がん剤の投与中、或いは抗がん剤の投与前でマーカーとしての位置づけが異なるため、その点を留意して使用することが好ましい。
【００２９】
本発明の抗がん剤感受性の判定方法を実施するには、検体中のタンパク質Ａ〜Ｃを測定するためのプロトコールを含むキットを用いるのが好ましい。当該キットには、タンパク質Ａ〜Ｃの測定試薬、測定試薬の使用方法、及び抗がん剤感受性の有無を判定するための基準等が含まれる。当該基準には、タンパク質Ａ〜Ｃの標準濃度、高いと判断される濃度、低いと判断される濃度、測定結果に影響を与える要因とその影響の程度等が含まれ、これらの濃度は対象とする抗がん剤ごとに設定することが可能である。当該基準を用いて、前記のように判定することができる。
【００３０】
タンパク質Ａ、タンパク質Ｂについて、これらのタンパク質の発現変動、具体的には発現上昇を指標とすれば、抗がん剤感受性亢進剤がスクリーニングできる。すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏにおいてタンパク質Ａ、タンパク質Ｂの発現を上昇させる物質は、抗がん剤感受性を亢進する。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、各種がん細胞株において抗がん剤の存在下でタンパク質Ａ、タンパク質Ｂの濃度を上昇させる物質は、当該抗がん剤の感受性を亢進する物質（抗がん剤感受性亢進剤）である。またｉｎ  ｖｉｖｏでは、担癌動物における抗がん剤投与前後において、タンパク質Ａ、タンパク質Ｂの濃度の上昇を亢進させる物質は、当該抗がん剤の感受性を亢進する物質（抗がん剤感受性亢進剤）である。
【００３１】
タンパク質Ｃについて、対象とする抗がん剤が５−ＦＵ／ＳＮ−３８の併用である場合、タンパク質Ｃの発現変動、具体的には発現抑制を指標とすれば、抗がん剤感受性亢進剤がスクリーニングできる。すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏにおいてタンパク質Ｃの発現を抑制する物質は、抗がん剤感受性を亢進する。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、各種がん細胞株において抗がん剤の存在下でタンパク質Ｃの濃度を低下させる物質は、当該抗がん剤の感受性を亢進する物質（抗がん剤感受性亢進剤）である。またｉｎ  ｖｉｖｏでは、担癌動物における抗がん剤投与前後において、タンパク質Ｃの濃度の低下を亢進させる物質は、当該抗がん剤の感受性を亢進する物質（抗がん剤感受性亢進剤）である。
【００３２】
また、タンパク質Ａ〜Ｃについて、対象とする抗がん剤が５−ＦＵ、ＳＮ−３８、５−ＦＵ／ＳＮ−３８の併用である場合、これらのタンパク質の発現変動、具体的には発現上昇を指標とすれば、抗がん剤感受性亢進剤がスクリーニングできる。すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏにおいてタンパク質の発現を上昇させる物質は、抗がん剤感受性を亢進する。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、各種がん細胞株において抗がん剤の非存在下でタンパク質の濃度を上昇させる物質は、当該抗がん剤の感受性を亢進する物質（抗がん剤感受性亢進剤）である。またｉｎ  ｖｉｖｏでは、担癌動物における抗がん剤投与前において、タンパク質の濃度の上昇を亢進させる物質は、当該抗がん剤の感受性を亢進する物質（抗がん剤感受性亢進剤）である。なお、タンパク質Ｃについて、抗がん剤の曝露時、或いは抗がん剤の非曝露時でその挙動が異なるため、その点を留意して抗がん剤感受性亢進剤をスクリーニングすることが好ましい。
【００３３】
かくして得られた抗がん剤感受性亢進剤と感受性亢進の対象となる抗がん剤とを併用すれば、当該抗がん剤の治療効果が飛躍的に向上する。抗がん剤感受性亢進剤と感受性亢進の対象となる抗がん剤とを組み合せた形態としては、それらの成分の両方を含む一の組成物であってもよく、それぞれ別個の製剤の組み合せであってもよい。また、それらの成分はそれぞれ別の投与経路であってもよい。
ここで用いられる対象となる抗がん剤としては、前記と同様であり、オキサリプラチン、シクロフォスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、イフォスファミド（ｉｆｏｓｆａｍｉｄｅ）、チオテパ（ｔｈｉｏｔｅｐａ）、メルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、ニムスチン（ｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ラニムスチン（ｒａｎｉｍｕｓｔｉｎｅ）、ダカルバジン（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ）、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂａｚｉｎｅ）、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、ネダプラチン（ｎｅｄａｐｌａｔｉｎ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ペメトレキセド（ｐｅｍｅｔｒｅｘｅｄ）、フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、テガフール／ウラシル（ｔｅｇａｆｕｌ・ｕｒａｃｉｌ）、ドキシフルリジン（ｄｏｘｉｆｌｕｒｉｄｉｎｅ）、テガフール／ギメラシル／オテラシル（ｔｅｇａｆｕｌ・ｇｉｍｅｒａｃｉｌ・ｏｔｅｒａｃｉｌ）、カペシタビン（ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、シタラビン（ｃｙｔａｒａｂｉｎｅ）、エノシタビン（ｅｎｏｃｉｔａｂｉｎｅ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、６−メルカプトプリン（６−ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ）、フルダラビン（ｆｕｌｕｄａｒａｂｉｎ）、ペントスタチン（ｐｅｎｔｏｓｔａｔｉｎ）、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、エピルビシン（ｅｐｉｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、イダルビシン（ｉｄａｒｕｂｉｃｉｎｅ）、ピラルビシン（ｐｉｒａｒｕｂｉｃｉｎ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、アムルビシン（ａｍｕｒｕｂｉｃｉｎ）、アクチノマイシンＤ（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎｅ）、ペプレオマイシン（ｐｅｐｌｅｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシンＣ（ｍｙｔｏｍｙｃｉｎ  Ｃ）、アクラルビシン（ａｃｌａｒｕｂｉｃｉｎ）、ジノスタチン（ｚｉｎｏｓｔａｔｉｎ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンデシン（ｖｉｎｄｅｓｉｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）、イリノテカン活性代謝物（ＳＮ−３８）、ノギテカン（ｎｏｇｉｔｅｃａｎ、ｔｏｐｏｔｅｃａｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、プレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）、デキサメタゾン（ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、トレミフェン（ｔｏｒｅｍｉｆｅｎｅ）、メドロキシプロゲステロン（ｍｅｄｒｏｘｙｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ）、アナストロゾール（ａｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ）、エキセメスタン（ｅｘｅｍｅｓｔａｎｅ）、レトロゾール（ｌｅｔｒｏｚｏｌｅ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、イマチニブ（ｉｍａｔｉｎｉｂ）、ゲフィチニブ（ｇｅｆｉｔｉｎｉｂ）、ゲムツズマブ・オゾガマイシ��（ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ  ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ）、ボルテゾミブ（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）、エルロチニブ（ｅｒｌｏｔｉｎｉｂ）、セツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）、スニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）、ソラフェニブ（ｓｏｒａｆｅｎｉｂ）、ダサチニブ（ｄａｓａｔｉｎｉｂ）、パニツムマブ（ｐａｎｉｔｕｍｕｍａｂ）、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、トレチノイン（ｔｒｅｔｉｎｏｉｎ）、三酸化ヒ素（ａｒｓｅｎｉｃ  ｔｒｉｏｘｉｄｅ）、又はそれらの塩、又はそれらの活性代謝物等が挙げられる。このうちフッ化ピリミジン系抗がん剤、植物アルカロイド系抗がん剤が好ましく、特にフルオロウラシル、イリノテカン、ＳＮ−３８又はそれらの塩が好ましい。さらに、フルオロウラシル又はその塩と、イリノテカン、ＳＮ−３８又はそれらの塩との併用剤を好適に利用することができる。
【実施例】
【００３４】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。【００３５】
実施例１
（１）方法
（ａ）使用細胞
ヒト大腸癌細胞株２種類（ＨＣＴ−１１６、ＤＬＤ−１）は、ＥＣＡＣＣより入手した。培養は、φ１００ｍｍ／Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｄｉｓｈ（ＩＷＡＫＩ）、培地（Ｄ−ＭＥＭ、２ｍＭ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、１０％  Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）、３７℃、５％ＣＯ2の条件下にて行なった。【００３６】
（ｂ）薬剤
フルオロウラシル（５−ＦＵ）はＳｉｇｍａ社より購入し、ＳＮ−３８原末は、株式会社ヤクルト本社より入手した。【００３７】
（ｃ）ＳＮ−３８、５−ＦＵ、及び５−ＦＵとＳＮ−３８併用時（５−ＦＵ／ＳＮ−３８）における感受性の評価
２種類の大腸癌細胞株ＨＣＴ１１６、ＤＬＤ−１（いずれもＥＣＡＣＣより入手）を用い、薬剤曝露４８時間後、７２時間後の細胞生存率をＭＴＳ  ａｓｓａｙ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６TMＡＱueous  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ）にて評価した。薬剤曝露条件は５−ＦＵ単剤としてＣｏｎｔｒｏｌ（０μＭ）、０．００１μＭ、０．０１μＭ、０．１μＭ、１μＭ、３μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭ、１０００μＭ、１００００μＭの１１条件、ＳＮ−３８単剤としてＣｏｎｔｒｏｌ（０ｎＭ）、０．００１ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．３ｎＭ、１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、１０００ｎＭの１１条件を用いた。併用としては５−ＦＵの２μＭ、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭの４濃度それぞれに、ＳＮ−３８の０．００１ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．３ｎＭ、１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、１０００ｎＭの１０濃度を加えた４０条件、及び各併用条件と同濃度の５−ＦＵ単剤として４条件とＣｏｎｔｒｏｌ（０μＭ）を用いた。感受性の評価は、１回の試験においてそれぞれの細胞株、薬剤曝露時間、薬剤曝露条件について３サンプルずつ測定し、異なる継代数の細胞にて３回実施した。
解析は、ＭＴＳ  ａｓｓａｙの結果から算出した生存率をもとに行った。併用効果の有無の判定は、併用時における生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）と、併用時に用いたのと同濃度での各薬剤の単剤曝露時における生存率とを比較し、双方から有意に生存率が低下していれば併用効果があると判定した。【００３８】
（ｄ）薬剤曝露実験
前記（ｃ）の結果にもとづき、曝露実験に用いる薬剤濃度は、５−ＦＵ＋ＳＮ−３８の併用として２μＭ＋１０ｎＭ、２μＭ＋１００ｎＭ、１００μＭ＋１０ｎＭ、１００μＭ＋１００ｎＭの４種類、これら併用曝露で用いるのと同じ濃度の各薬剤単独曝露として５−ＦＵは２μＭ、１００μＭ、ＳＮ−３８は１０ｎＭ、１００ｎＭ、及びこれらに薬剤フリーのＣｏｎｔｒｏｌを加えた全９条件で曝露実験を行った。薬剤曝露時間は曝露直前（０時間）、４時間、２４時間、４８時間の４通りとし、曝露終了時点における細胞数を計測し、細胞内タンパク質を抽出した。【００３９】
（ｅ）細胞内タンパク質の抽出
ｄｉｓｈより培地を除き氷冷ＰＢＳで３回洗浄後、ラバーポリスマンにて剥がしてかき集め、細胞懸濁液を１．５ｍＬマイクロチューブに移した。４℃にて１，２００×ｇ、１０分間遠心して細胞を集め、上清を除いた後に、細胞数１０００万個あたり２００μＬの細胞溶解バッファー（９ｍｏｌ／Ｌ  Ｕｒｅａ、２％  ＣＨＡＰＳ、１ｍＭ  ＤＴＴ、プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ））を加え、氷冷下で超音波破砕処理を行なった後、４℃にて１６，０００×ｇ、２０分間遠心し、上清を液体窒素にて急速凍結後、分析するまで−８０℃にて保存した。上清の一部を用いてタンパク質定量（ＤＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を行なった。【００４０】
（ｆ）タンパク質発現解析のためのサンプル調製及びプロテインチップの作製、細胞内タンパク質の発現解析
細胞溶解バッファー（プロテアーゼインヒビターを除く）にて２．５ｍｇ／ｍＬに調製し、さらに、ｐＨ４．５の希釈／洗浄バッファー（５０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）（以下、バッファー）にて０．５ｍｇ／ｍＬに調製したサンプル１００μＬを、同バッファーにて前処理した陽イオン交換チップアレイ（ＣＭ１０、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のスポットにａｐｐｌｙし、１時間インキュベートして反応させた後、バッファーにて３回洗浄、ｍｉｌｌｉＱ水にて２回リンスした。風乾後、ｅｎｅｒｇｙ  ａｂｓｏｒｂｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＥＡＭ：５０％  ＡＣＮ／０．５％  ＴＦＡ溶液によるｓｉｎａｐｉｎｉｃ  ａｃｉｄの飽和溶液）１．０μＬを、０．５μＬずつ２回に分けて各スポットにａｐｐｌｙし、スポット表面が乾いた後、プロテインチップアレイの分析を行なった。
タンパク質発現解析は、表面エンハンス型レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（ｓｕｒｆａｃｅ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ：ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ）にて行なった。分析機器としては、ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐTM  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｄｅｌ  ＰＣＳ４０００  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用い、Ｍａｓｓ  Ｒａｎｇｅ  ０〜７０，０００  Ｄａｌｔｏｎｓ、Ｆｏｃｕｓ  Ｍａｓｓ  ８，０００  Ｄａｌｔｏｎ、Ｅｎｅｒｇｙ  ４０００  ｎＪ、１サンプルあたり合計２６５ｓｈｏｔｓの条件にて分析を行なった。
ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−ｎｏｉｓｅ  ｒａｔｉｏ（Ｓ／Ｎ比）２以上のピークの抽出とタンパク質発現比較解析は、ＣｉｐｈｅｒｇｅｎＥｘｐｒｅｓｓTM  Ｄａｔａ  Ｍａｎａｇｅｒ  ３．０を用いて行なった。【００４１】
（ｇ）候補ピークの選択
ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる分析の結果、Ｓ／Ｎ比２以上の条件で各サンプルにつき１１２〜１４７個のタンパク質ピークを抽出した。まず、ＣｉｐｈｅｒｇｅｎＥｘｐｒｅｓｓTM  Ｄａｔａ  Ｍａｎａｇｅｒ  ３．０によりピーククラスターを作成した。次に、各条件において、薬剤曝露後に経時的に有意にピーク強度が変化しているピークと、各曝露時間（４、２４、４８時間）において、薬剤曝露条件によってピーク強度が有意に変化しているピークをピックアップした。さらに、両者に共通して検出されるピーク、すなわち曝露時間による発現変化と薬剤条件による発現変化のいずれをも認めるピークを絞り込んだ。【００４２】
（２）結果
（ａ）ＨＣＴ−１１６及びＤＬＤ−１における薬剤感受性の評価
１００μＭの５−ＦＵにて４８時間曝露後の細胞生存率は、ＨＣＴ１１６で約２４％、ＤＬＤ−１で約４９％となり、ＤＬＤ−１がＨＣＴ１１６に比べ５−ＦＵ低感受性であると判断した。１００ｎＭのＳＮ−３８にて７２時間曝露後の細胞生存率は、ＨＣＴ１１６で約２４％、ＤＬＤ−１で約７６％となり、ＤＬＤ−１はＨＣＴ１１６に比べＳＮ−３８低感受性であると判断した。５−ＦＵ／ＳＮ−３８併用曝露後においては、５−ＦＵ  ２μＭ＋ＳＮ−３８  １０ｎＭ、及び５−ＦＵ  １００μＭ＋ＳＮ−３８  １００ｎＭの７２時間曝露後、ＨＣＴ１１６では各々の単剤曝露後の細胞生存率よりも併用時において有意に低い細胞生存率を示し併用効果を認めたが、ＤＬＤ１では有意な併用効果は認められなかった。したがって、ＨＣＴ１１６は５−ＦＵ／ＳＮ−３８併用に対する高感受性細胞、ＤＬＤ−１は低感受性細胞と判断した（図１）。【００４３】
（ｂ）タンパク質発現解析
ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いたプロテオーム解析手法により、５−ＦＵ曝露、ＳＮ−３８曝露、５−ＦＵ／ＳＮ−３８併用曝露に伴う細胞内タンパク質の変動を網羅的に解析した。（１）方法で示した手法により解析した結果、各薬剤曝露後に特徴的な変動を示す以下のタンパク質を見出した。
（１）５−ＦＵ曝露後、ＨＣＴ１１６で細胞内レベルの上昇が認められたピーク（図２）・ｍ／ｚ  １６，４５０〜１６，６２０（タンパク質Ａ）
（２）ＳＮ−３８曝露後、ＨＣＴ１１６で細胞内レベルの上昇が認められたピーク（図２、３）
・ｍ／ｚ  １６，４５０〜１６，６２０（タンパク質Ａ）
・ｍ／ｚ  ２２，０８０〜２２，３１０（タンパク質Ｂ）
（３）５−ＦＵ／ＳＮ−３８併用曝露後、ＨＣＴ１１６で細胞内レベルの上昇が認められたピーク（図２）
・ｍ／ｚ  １６，４５０〜１６，６２０（タンパク質Ａ）
（４）５−ＦＵ／ＳＮ−３８併用曝露後、ＤＬＤ−１で細胞内レベルの上昇が認められたピーク（図４）
・ｍ／ｚ  １７，１００〜１７，２７０（タンパク質Ｃ）
（５）薬剤曝露前（非曝露時）の細胞内レベルが、ＤＬＤ−１と比較してＨＣＴ１１６で有意に高値を示したピーク
・ｍ／ｚ  １６，４５０〜１６，６２０（タンパク質Ａ）
・ｍ／ｚ  ２２，０８０〜２２，３１０（タンパク質Ｂ）
・ｍ／ｚ  １７，１００〜１７，２７０（タンパク質Ｃ）
タンパク質Ａにおける薬剤曝露前の細胞内レベルは、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析によるピーク強度（μＡ）（平均値±Ｓ．Ｄ．、ｎ＝２７）として、ＨＣＴ１１６では１５．０±３．３０、ＤＬＤ−１では８．５９±３．４９、同様にタンパク質Ｂでは、ＨＣＴ１１６  ５．９５±１．１０、ＤＬＤ−１  ２．９９±０．８１、タンパク質Ｃでは、ＨＣＴ１１６  ２６．９±３．９４、ＤＬＤ−１  ５．０１±２．０１であり、いずれもＨＣＴ１１６における薬剤曝露前（非曝露時）細胞内レベルはＤＬＤ−１よりも有意に高値を示した。【００４４】
実施例２
実施例１において、本体もしくはそのフラグメントとして、ｍ／ｚ  １６，４５０〜１６，６２０として検出されたタンパク質（タンパク質Ａ）、ｍ／ｚ  ２２，０８０〜２２，３１０として検出されたタンパク質（タンパク質Ｂ）、ｍ／ｚ  １７，１００〜１７，２７０として検出されたタンパク質（タンパク質Ｃ）について、分子量既知の標準物質として、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ（ｅｑｕｉｎｅ）（ｍ／ｚ  １２３６０．９６＋１Ｈ）、Ａｐｏｍｙｏｇｌｏｂｉｎ（ｅｑｕｉｎｅ）（ｍ／ｚ  １６９５２．２７＋１Ｈ）、Ａｌｄｏｒａｓｅ（ｒｅａｂｂｉｔ  ｍｕｓｃｌｅ）（ｍ／ｚ  ３９２１２．２８＋１Ｈ）を用い、各目的ピークを挟む２種類の標準物質の分子量２点を用いた分子量補正（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）によりｍ／ｚの確認を行った。その結果、実施例１において、検出されたタンパク質Ａ、タンパク質Ｂ及びタンパク質Ｃは、それぞれ、ｍ／ｚ  １６，４５０〜１６，６２０、ｍ／ｚ  ２２，０８０〜２２，３１０、ｍ／ｚ  １７，１００〜１７，２７０の間に検出されることを確認した。【００４５】
実施例３
実施例１において、ｍ／ｚ  １６，４５０〜１６，６２０（タンパク質Ａ）、ｍ／ｚ  ２２，０８０〜２２，３１０（タンパク質Ｂ）、ｍ／ｚ  １７，１００〜１７，２７０（タンパク質Ｃ）のピークとして検出されたタンパク質について、その性質をさらに詳細に調べるために、ｐＨの変化に伴うピーク強度の変化について検討を行った。【００４６】
（１）方法
（ａ）検討に用いたプロテインチップアレイとバッファー条件
陽イオン交換チップアレイ（ＣＭ１０、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に対して、ｐＨ３．０（５０ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ３．５（５０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ４．０（５０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ４．５（５０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ５．０（５０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ５．５（５０ｍＭ  ｓｏｄｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ６．０（５０ｍＭ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ６．５（５０ｍＭ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ７．０（５０ｍＭ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ７．５（５０ｍＭ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ８．０（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ８．５（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ９．０（５０ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ  ｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ９．５（５０ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ  ｂｕｆｆｅｒ）、ｐＨ１０．０（５０ｍＭ  Ｇｌｙｃｉｎｅ−ＮａＯＨ  ｂｕｆｆｅｒ）の１５種類のバッファーを用いた。【００４７】
（ｂ）ＣＭ１０チップアレイを用いた分析のためのサンプル調製及びプロテインチップの作製と分析条件
ＣＭ１０チップアレイを用いた分析のためのサンプル調製及びプロテインチップの作製は、（ａ）の各バッファーを用いて実施例１の（１）方法前記（ｆ）に準じて実施した。【００４８】
（２）結果
ＣＭ１０チップアレイを用いた分析において、ピーク強度の低下を認めるｐＨがそのタンパク質のイオン化が失われる等電点（ｐＩ）付近と判断できる。その結果、実施例１で検出したピークの等電点（ｐＩ）は、ｍ／ｚ  １６，４５０〜１６，６２０（タンパク質Ａ）ではｐＨ４．５〜７．５、ｍ／ｚ  ２２，０８０〜２２，３１０（タンパク質Ｂ）ではｐＨ４．０〜７．０、ｍ／ｚ  １７，１００〜１７，２７０（タンパク質Ｃ）ではｐＨ５．０〜８．０がｐＩ付近に相当すると推定された。【００４９】
実施例４
実施例１で見出した、本体もしくはそのフラグメントがｍ／ｚ  １６，４５０〜１６，６２０のタンパク質（タンパク質Ａ）、ｍ／ｚ  ２２，０８０〜２２，３１０のタンパク質（タンパク質Ｂ）、ｍ／ｚ  １７，１００〜１７，２７０のタンパク質（タンパク質Ｃ）について、実施例２及び３の情報にもとづき、Ｔｈｅ  ＥｘＰＡＳｙ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｓｅｒｖｅｒのＴａｇＩｄｅｎｔ  ｔｏｏｌ（ｈｔｔｐ：／／ａｕ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｔａｇｉｄｅｎｔ．ｈｔｍｌ）を用いてデータベース検索を行った。その結果は以下のとおりであった。【００５０】
【表１】
0005548693.tif 000002
【００５１】
【表２】
0005548693.tif 000003
【００５２】
【表３】
0005548693.tif 000004
【図１】
0005548693.tif 000005
【図２】
0005548693.tif 000006
【図３】
0005548693.tif 000007
【図４】
0005548693.tif 000008