(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゼラチンとトランスグルタミナーゼの組み合わせを具える組成物において、前記ゼラチンの量と前記トランスグルタミナーゼの量の比が、哺乳動物の創傷における出血を低減するのに十分であり、
前記組成物が前記ゼラチンの本来のゾル−ゲル転移温度より低い温度でトランスグルタミナーゼと共に溶液を形成するように修飾されている組成物であって、前記ゼラチンが低減されたゾル−ゲル転移温度を有するように修飾されている組成物であるか、又は前記ゼラチンの前記ゾル−ゲル転移温度を低減する添加剤を更に含む組成物であり、
前記ゼラチンが動物由来、遺伝子組み換え体由来あるいはこれらの組み合わせからできたものであることを特徴とする組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の組成物において、前記トランスグルタミナーゼがトランスグルタミナーゼ組成物の一部として加えられており、ゼラチンとトランスグルタミナーゼ組成物の重量比が１：１乃至１００：１の範囲になることを特徴とする組成物。
【請求項３】
請求項２に記載の組成物において、前記トランスグルタミナーゼ組成物が、少なくとも２００Ｕ／ｇｍの特定の活性レベルのトランスグルタミナーゼを有することを特徴とする組成物。
【請求項４】
請求項２乃至３のいずれか１項に記載の組成物において、血液由来のファクタXIII以外は、前記トランスグルタミナーゼが、植物、遺伝子組み換え、動物、あるいは微生物由来のトランスグルタミナーゼであることを特徴とする組成物。
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれか１項に記載の組成物において、前記動物起源が、魚類及び哺乳類からなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項６】
請求項１乃至５のいずれか１項に記載の組成物において、前記ゼラチンがタイプＡ（酸処理ゼラチン）またはタイプＢ（アルカリ処理ゼラチン）であることを特徴とする組成物。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれか１項に記載の組成物において、前記ゼラチンが少なくとも約２５０ブルームの高分子量ゼラチンを具えることを特徴とする組成物。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか１項に記載の組成物において、前記組成物が５乃至８の範囲のｐＨを有することを特徴とする組成物。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれか１項に記載の組成物において、前記添加剤が可塑剤を具えることを特徴とする組成物。
【請求項１０】
請求項９に記載の組成物において、前記可塑剤が、多価アルコール、グリセリン、グリセロール、キシリトール、スクロース、ソルビトール、トリエタノールアミン、レソルシン、チオジグリコール、トルエンスルホン酸（toluenesulphoacid）のナトリウム塩、ブチレングリコール、硝酸尿素、チオ尿素、尿素、グルタミン酸、アスパラギン酸、バリン、グリシン、ＫＳＣＮ、ＫＩおよびＬｉＢｒからなる群から選択されることを特徴とする組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組成物において、前記可塑剤が尿素であり、尿素の前記濃度比範囲が、１：２乃至２：２ 尿素：ゼラチン、重量／重量であることを特徴とする組成物。
【請求項１２】
請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の組成物が、トレハロース、又はマンニトールを具えることを特徴とする組成物。
【請求項１３】
請求項９に記載の組成物において、前記可塑剤が、尿素、グリセロール、又はソルビトールの少なくとも一つを具え、グリセロールの濃度比範囲が、０．５：１乃至５：１、グリセロール：ゼラチン、重量／重量；選択的に１：１乃至２：１、グリセロール：ゼラチン、重量／重量；であり、ソルビトールの濃度比範囲が、選択的に０．５：１乃至５：１、ソルビトール：ゼラチン、重量／重量；であり、又は選択的に１：１乃至３：１、ソルビトール：ゼラチン、重量／重量；であり、尿素の濃度比範囲が、選択的に１：２乃至２：２、尿素：ゼラチン、重量／重量であることを特徴とする組成物。
【請求項１４】
請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の組成物が、ゼラチン特異的プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤、又は追加の止血剤のうちの一又はそれ以上を具えることを特徴とする組成物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の組成物において、前記追加の止血剤が、アルブミン、コラーゲン、フィブリン、トロンビン、キトサン、硫酸鉄、あるいはその他の硫酸塩のうちの一又はそれ以上を具えることを特徴とする組成物。
【請求項１６】
請求項１乃至１５のいずれかに記載の組成物を具えることを特徴とする止血ドレッシング又はバンデージ。
【請求項１７】
ヒト又は下等哺乳類の身体に挿入する医療デバイスにおいて、請求項１乃至１５のいずれかに記載の組成物を具えることを特徴とする医療デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、吸収性または非吸収性物質及び／又は凝固たんぱく質を含む止血ドレッシング、止血デバイス及び止血剤に関する。この止血デバイスは、創傷組織の治療に有益である。
【背景技術】
【０００２】
大出血（出血）の制御は、応急処置と屋外での外傷治療において重要なステップである。残念なことに、アクセス可能な部位からの過剰出血あるいは致命的出血の発生は珍しいことではない（J.M.Rocko et al (1982) J. Trauma 22:635）。ベトナム戦争による死亡率のデータは、戦闘による死亡の１０％がコントロールできない四肢の出血によるものであった。ベトナム戦争中の放血死の最大三分の一までは、効果的な屋外出血コントロール法を使用することによって防ぐことができたであろう。（SAS/STAT Users Guide, 4th ed. (Cary, N.C.: SAS Institute Inc.; 1990)）。
【０００３】
一般市民の外傷死の統計は、過剰出血による病院前の死に関する正確な数字を提供していないが、事例報告は、同様の発生率を示している（J.M. Rocko et al. (1982).  J.Trauma 22:635）。これらのデータは、生存率の実質的な上昇が、単純で効率の良い出血コントロール法の病院前の使用によって影響されることを示唆している。残念なことに、このような方法は、商業的に入手可能な止血デバイスの使用によって成功裏に示されていない。
【０００４】
これとは別に、外科的創傷縫合は、現在、縫合糸と組織を互いに引っ張ることで治癒を容易なものにするステープルで行われている。しかしながら、身体流体の漏れを防ぐのに必要な適当なシールを作ることは非常に多くの場合行われていない。従って、ステープルと縫合糸に沿って頻繁に生じる漏れを含めて、外科手術後の身体流体漏れを防ぐデバイス及び方法に対する、満たされていない医療上の強い要求がある。このようなデバイス及び方法は、止血、あるいは、抹消血管再建、硬膜再建、胸部、心血管、肺、神経及び胃腸の外科手術におけるその他の液体閉塞を行うための縫合糸あるいはステープルの付属品として必要とされている。
【０００５】
現在市場に出ている最も高圧の止血デバイスは、まったく粘着性のないものであったとしても、名目上のものにすぎない。このようなデバイスの良い例は、QuikClot(登録商標)ACS（商標）（Z-Medica, Wallington, CT）及びHemCon(商標)バンデージ（HemCon, Portland, OR）であり、この二つの止血デバイスは、現在米国陸軍のメンバーに供給されている。QuciClotのスポンジに含まれる鉱物ゼオライト結晶によって、血液中の水分子を吸収し、これによって凝固因子が凝集して、血液凝固を促進する。HemConバンデージを作っているキトサン混合物は、正電荷を持っており、負電荷を持つ赤血球を引き付ける。赤血球は、ドレッシング中に吸い込まれ、創傷の上にシールを形成して、創傷表面を安定化させる。
【０００６】
上述したHemCon社のバンデージ製品は、病院前出血コントロールを提供することを意図して開発されたものであり、屋外においてすでにある程度の成功を示している。しかしながら、HemConバンデージを作っているキトサンネットワークは、血液で飽和してしまい、創傷から急激に血液があふれた場合すぐに、あるいは、中程度の血流の場合は１−２時間後にだめになる（B.S Kheirabadi et al. (2005)  J. Trauma 59:25-35；A.E. Pusateri et al. (2006)  J. Trauma 60:574-682）。また、HemConバンデージパッチは、不規則な創傷に簡単に適合しない固いパッチとしてのみ入手可能であり、その実用性を更に制限している。
【０００７】
出血コントロールに使用するために低減されているそのほかのポリサッカライドベースの止血デバイスは、ＲＤＨ（商標）（アセチルグルコサミン）、Trauma DEX （商標）（ＭＰＨ）、及びChitoskin（商標）（キトサンとゼラチン）である。しかしながら、これらのバンデージタイプのいずれも、多量の血流に直面したときの不具合の回避を確実に示すことができなかった。その他の最近導入された止血デバイスには、Celox(商標)（キトサン結晶）や、WoundStat（商標）（TraumaCure Inc., MD）（スメクタイトミネラルと吸収性に優れたポリマの粒状ブレンド）がある。しかしながら、これらの製品は両方とも、急速に膨張して創傷部位を埋めてしまい、特定タイプの創傷における血液凝固を促進するためにのみ好適であり、周辺血管中の血流を低減あるいは制限する危険を示す。
【０００８】
上述したQuikClot ACS（商標）も、中程度のレベルの出血の止血に有効であることを示している。しかし、鉱物ゼオライトの水分吸収機構は、大量の熱を放出することなくしては発生しない。従って、QiolClot  ACS(商標)の適用は、高温となって傷ついた部位に深刻なやけどが生じ、周辺組織領域にダメージを与えると共に、後の医療ケアを非常に複雑なものにする（A.E. Pusateri et al. (2006)  J. Trauma 60:674-682）。確かに、この有意な副作用のない止血法はより理想的である。QuikClot社は、適用時に熱の放出がより少ないミネラル混合物を開発したが、より温度の低い混合物の有効性は、深刻な外傷治療には十分ではない。更に、元のミネラル混合物も、熱の放出がより少ない混合物も、急激な動脈出血を止めることができない。
【０００９】
上述の製品は全て、自然な凝固が次々に生じることによって、創傷部位からの液体漏れをコントロールしている。このように、これらの製品は、血流を止めるためにのみ有益であり、それぞれ、特定のデバイス用に適した条件下でのみ有益である。一般的に創傷部位のシーリング、特に、血液でない液体が漏れている傷部分は、これらの製品の適用範囲を超えている。
【発明の概要】
【００１０】
限定するわけではないが、外科的用途、出血のコントロール、及び創傷からの出血のコントロールを含む、広い範囲の用途に使用できる非毒性接着材料が求められており、これを有することは有益である。また、止血バンデージの部分として使用できる非毒性接着材料が求められており、これを有することは有益である。さらに、外科的シール剤として使用できる非毒性接着材料が求められており、これを有することは有益である。
【００１１】
本発明は、架橋可能なたんぱく質の架橋を含む、架橋可能なたんぱく質と非毒性材料を具える接着材料を提供することによって、上記背景に記載した欠点を克服するものである。好ましくは、架橋可能なたんぱく質は、上述したとおり、ゼラチン及びゼラチン変異体、又は変異たんぱく質を含む。選択的に及び好ましくは、非毒性材料がトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）を具え、これは、選択的に微生物トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）を具える。本発明の実施例によれば、接着材料はバンデージにおいて提供されており、このバンデージは止血バンデージとしての使用に好適である。そのほかの実施例によれば、この接着材料は、シール剤として提供されており、これは、外科的シール剤としての使用に好適である。
【００１２】
トランスグルタミナーゼによって作用する場合、たんぱく質コラーゲンの変性形であるゼラチンは、急速に架橋して強いゲルを形成する。ここで行われるゼラチンプロセスは、ファクタXIIIとカルシウムに接触すると繊維素が発達する自然な後期血栓カスケードに非常に良く似ている。更に、結果物であるゲルは、それ以下であるとの条件で、フィブリン接着剤の接着能力に非常に良く似た能力を示す（M.K. McDermott, Biomacromolecules 2004 Jul-Aug; 5(4): 1270-9）。
【００１３】
本発明は、ゼラチン−ＴＧ架橋のフィブリン血栓カスケードとの類似性を用いて、改良されたフィブリンドレッシングの優れた止血性能を模倣するものである。フィブリンバンデージのフィブリン−トロンビンサンドイッチをゼラチン−ＴＧサンドイッチに置き換えて、有意な副作用がなく出血をコントロールできる、新規で、価格が安く、安定したドレッシングとする。この新しいバンデージは、創傷部位に、バンデージによって接触していない領域にＴＧが広がることを防止するようにして、大量の混合物を制御して適用することを斟酌することによって、ゼラチン−ＴＧ混合物の接着特性を最大にする。このように、この相乗的技術は、最新のフィブリンドレッシングの分野と、ゼラチン−ＴＧ接着の分野の両方を向上させる。
【００１４】
凝固フィブリンネットワークと異なり、ゼラチン−ＴＧネットワークは、生理的活性がない特定タンパク質分解酵素を特に用いて溶解させることができるという更なる利点を有する（T. Chen, Biomacromolecules 2003 Nov-Dec; 4(6): 1558-63）。従って、ゼラチン−ｍＴＧ止血サンドイッチドレッシングは、フィブリン−トロンビン止血サンドイッチドレッシングの性能を再現できる一方、複雑になることなく所望のとおり除去することもできる。
【００１５】
外傷ケア用止血屋外ドレッシングとしての用途のみならず、本発明のゼラチン−ＴＧベースの止血デバイスは、外科手術の間の急激な動脈からの出血、血管内カテーテル後の出血、または負傷または外科手術を行った後のその他の身体流体の漏れの制御を行うにあたり、大きな可能性を有する。
【００１６】
これまでは、架橋ゼラチン−ＴＧのゲルか特性とゼラチン−ＴＧ架橋の接着能力は別々に研究されてきたが、双方の特性を合わせて使用して、止血あるいは組織シーリング組成物を形成することはなされていなかった。
【００１７】
ゼラチン−ＴＧ組成物の接着剤としての使用は、ラット網膜モデルでインビボで示されており、ここでは、微量のゼラチン−ＴＧ混合物を網膜アタッチメントに使用した（T. Chen, J. Biomed Mater Res B Appl Biomater 2006 May; 77(2): 416-22）。
【００１８】
細胞セラピィ用骨格としてのゼラチン−ＴＧゲルの使用も試験された（米国特許第５，８３４，２３２号、及びIto A, J Biosci & Bioeng 2003; 95(2): 196-99、及びBroderick EP, J Biomed Mater Res B Appl Biomater 2005 Jan 15; 72(1):37-42）。
【００１９】
これらの研究は、ゼラチン−ＴＧ混合物の生理学的使用の安全性を強化するものであったが、各研究とも、ゼラチン−ＴＧ架橋の特性の一つを使用しているだけであり、本発明に記載したような止血と組織シーリングの改良を教示するものでも提言するものでもない。
【００２０】
止血用あるいは身体流体滞留用のゼラチン−ＴＧの使用は、トランスグルタミナーゼ、特に、組織トランスグルタミナーゼを、独立した外科用接着剤として使用するための数多くのこれまでに記載されている試みからの有意な進歩を記している（米国特許第５，７３６，１３２号、米国特許第６１９０８１９６号、その他多数）。ＴＧの基盤としてゼラチンを用いることは、ＴＧの活性に機械的な骨格を加え、ＴＧの単独使用以上の多くの利点を提供する。ゼラチンを伴うＴＧは、ＴＧ単独の場合よりより正確に塗布することができ、創傷部位に正確に合致させることができ、制御された生物吸収性を提供する。
【００２１】
本発明は、背景技術の欠点を克服するものである。従来取り組まれてきた解決法は、緩やかな止血から中程度の止血用に数多くの変形した及び変形していないゼラチンネットワークを使用していた。しかし、動脈からの急激な出血や、その他の有意な身体流体漏れを制御できる強く架橋したゼラチンネットワークをインサイチュウで形成する方法はなかった。インビボで強いゼラチンネットワークを形成することができるゼラチン−ＴＧ架橋などの方法は、ゼラチンマトリックスの機械的強度を上げて、高圧の動脈からの出血や、その他の身体流体漏れの制御に好適なものにする。改良された架橋法とは別に、本発明は、現在のゼラチンベースの止血材料を超える利点を提供するその他多くの手法を含む。非限定的で、説明のためのリストの一部を以下に述べる：
１）ゼラチン鎖と、組織ＥＣＭ（細胞外マトリックス）の内因性コラーゲン間のインサイチュウでの架橋は、身体流体に対する強い止血バリヤを作る。
２）ゼラチンとＴＧは、凍結乾燥した形で適用することでより有効に止血あるいは身体流体停止に作用し、血液あるいはその他の身体流体によって再構築される。
３）凍結乾燥させた形態のゼラチン−ＴＧ混合物は、保存期間を長くする。
４）層状の凍結乾燥させたゼラチン−ＴＧ混合物は、より迅速な再構築を提供し、これは、高圧の液流環境に有益である。
５）基本的なゼラチン−ＴＧ混合物への機械的な支持を加えることは、流れを遅くして、ゼラチン−ＴＧを架橋して液体漏れをブロックするのにより時間をかけることによって混合物の止血あるいは液体制御能力を高める。
【００２２】
本発明の好ましい実施例によれば、ゼラチン−ｍＴＧ混合物は、創傷部位に適用する前、あるいは凍結乾燥の前に部分的に架橋される。別の実施例では、非架橋ゼラチンあるいはｍＴＧが、部分的に架橋したゼラチン−ｍＴＧと共に存在する。
【００２３】
元々接着性のある止血バンデージがこの分野で知られているが、使用が複雑で多くの問題がある。例えば、フィブリノゲンとトロンビンの広範囲に及び止血への使用は、第２次世界大戦の最後の年には普通のことであったが、肝炎の感染のために使用されなくなった（D.B. Kendrick, Blood Program in WW II（Washington, DC: Office of the Surgeon General, Department of Army; 1989） 363-368）。
【００２４】
フィブリノゲンドレッシングは、Grey及び同僚が、予めポリマ化したフィブリンシートとパウダーを作った第１次世界大戦中に外傷外科医によって最初に使用された。第２次世界大戦中に、予めポリマ化した発泡スチロールのようなシート状フィブリンとフィブリンフィルムを用いて米国軍と、米国赤十字によってフィブリンのりが作られた。フィブリンベースのドレッシングは、対照に比して、出血時間のコントロールと、失血の低減に有意な差異を示す（Jackson, M., et al. (1996)  J. of Surg. Res. 60: 15-22; Jackson, M., et al. (1997) Surg. Forum XL, VIII: 70-772）。
【００２５】
出血のコントロールにおけるフィブリノゲンドレッシングの有効性にもかかわらず、フィブリノゲンドレッシングは、ドレッシングが精製ヒトフィブリノゲンや精製動物フィブリノゲンあるいは、その他の精製血液製品を含むため、肝炎やＨＩＶなどの血液及び血清由来の疾病が頻繁に感染したので、その使用が中止された（Holcomb,J.B.,et  al．（１９９７）  Surgical  Clinics  of  North  America．  77：943-952）。
【００２６】
しかしながら、ここ数年間は、プラズマ精製技術が血液および血清由来の疾病リスクを大きく低減させたため、創傷治療用のフィブリンベースの製品に新たな興味がでてきた。
【００２７】
止血サンドイッチドレッシングは、米国赤十字によって記載されており、これは、フィブリノゲンの層間に挟んだトロンビン層を含む（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９９／１０９５２、米国特許第６０５４１２２号、６７６２３３６号参照）。この止血ドレッシングは、潜在的に致命的外傷の治療において大きな成功を示した（E.M.Acheson (2005)  J.Trauma 59(4): 865-74; discussion 874-5; B.S. Kheirabadi (2005)  J. Trauma 59(1): 25-34; discussion 34-5; A.E. Pusateri (2004) J. Biomed . Mater. Res. B. Appl. Biomater. 15;70(1): 114-21）。実際、豚の研究では、フィブリンサンドイッチドレッシングは、潜在的致命的外傷の治療においてHemConとQuikClot製品より機能が優れており、標準的な軍の屋外バンデージや、HemConバンデージ、あるいはQuckClotパウダを使用した場合の生存率が０％であるのに比べて、２時間後に７５％以上の生存率を示した。
【００２８】
このようなドレッシングは、創傷組織の治療方法に使用することができるが、このような従来のサンドイッチドレッシングは薄い層に裂けてしまい、これによってドレッシングの層のエッジが互いに接着しなくなる。このようなデラミネーションは、ドレッシング構成層の相互作用を低減させ、出血防止におけるドレッシングの有効性を下げる。
【００２９】
改良したフィブリン−ベースの止血サンドイッチドレッシングが記載されており、これは、再吸収可能な材料及び／又は凝固タンパク質を含む複数層を具える。特に、ドレッシング（ＰＣＴ／ＵＳ０３／２８１００号、米国特許出願第６０１５５２３４号参照）は、第１及び第２のフィブリノゲン層間に挟まれたトロンビン層を具え、このトロンビン層は、第１及び／又は第２のフィブリノゲン層と同延である。
【００３０】
フィブリン創傷ドレッシングの利点にもかかわらず、これらのバンデージには多くの欠点がある。バンデージを制作するのに使用する凍結乾燥フィブリノゲンは、ヒト血液血清から精製されなければならない。これはコストが高く、デリケートな手順であるため、結果物であるフィブリノゲンバンデージは非常に製造価格が高く、室温での保存期間が非常に短い。支持体に加えるフィブリノゲンが多いほど、バンデージは良く出血を止める。しかし、支持体に加えるフィブリノゲンが多いほど、バンデージは高価になる。更に、バンデージ支持体上の大量のフィブリノゲンは、バンデージの脆弱さに寄与し、バンデージがもろくなって、共に作用することが困難になる。
【００３１】
従って、改良されたフィブリンドレッシングは有意な副作用を生じることなく出血をコントロールすることができ、上述した活性外傷ケア止血における欠点を補うことができるが、このタイプのドレッシングの使用には価格と安定性の制限という大きな不利益がある。
【００３２】
液体フィブリンシーラントあるいはのりは、手術室での出血の制御を補佐するために、長年使用されてきた。（J.L. Garza et al. (1990). J. Trauma. 30:512-513; H. B. Kram et al. (1990). J. Trauma. 30:97-101; M.G. Ochsner et al. (1990). J. Trauma. 30:884-887; T.L. Matthew et al. (1990) Ann. Thorac. Surg. 50:40-44; H.Jakob et al. (1984). J. Vasc. Surg. 1:171-180）。また、単一ドナーフィブリンシーラントも様々な外科的状態において広く臨床的に使用されている。（W.D. Spotnitz. (1995). Thromb. Haemost. 74:482-485; R. Lerner et al. (1990). J. Surg. Res. 48:165-181）。
【００３３】
多数の吸収可能な外科的止血剤が外科的な活動分野で現在用いられているが、危険な出血あるいはその他の身体流体の強い流れを制御するのに必要な機械的及び生物学的サポートを提供するのに十分強い製品は存在しない。
【００３４】
コラーゲン創傷ドレッシング（INSTAT（商標）,Ethicon, Somervill, NJ. 及びAVITENE（商標）、CR Bard, Murray Hill, NJ）またはドライフィブリントロンビン創傷ドレッシング（TACHOCOMB（商標）、Hafslund Nycomed Pharma, Linz, Austria）などの現在入手可能な止血バンデージは、外科的用途に使用が制限されており、高血流における崩壊に対する耐性が十分でない。これらのバンデージは、激しい血流を止める場合に実用目的にかなう十分な接着特性を持たない。これらの現在入手可能な外科用止血バンデージは壊れやすく、従って、曲げあるいは圧力がかかることによってダメージが生じると壊れる傾向にある。これらは、また、出血に際しての溶解に敏感である。このようなバンデージの溶解および崩壊は最悪である。なぜなら、創傷に対する接着力が失われ、出血が衰えることなく続くからである。
【００３５】
動脈出血も、酸化セルロース（SURGICEL, Ethicon, Somerville, NJ）あるいはゼラチンスポンジ（SURGIFOAM, Ethicon, Somerville, NJ）の吸収可能な止血剤では、管理することができない。これらの製品は、骨からの低圧出血及び硬膜外静脈からの血液滲出をコントロールすることを意図している。ゼラチンスポンジは、高圧で、激しく流れる動脈出血には向かない。なぜなら、このスポンジは出血源をしっかり結合するものではなく、従って、取り外しが容易であるからである。酸化セルロースも、動脈出血のコントロールには向いていない。なぜなら、このセルロースは膨張し、止血が達成されると適用部位から取り除く必要があるからである。血流が高すぎると、止血が達成される前に過剰な膨張が生じる（M. Sabel et al. (2004).  Eur. Spine J. 13(1): S97-101）。
【００３６】
最も広く使用されている組織接着剤は、弱い毒性と、容易に製造できず屋外で適用できないという理由で、止血あるいは内液停止デバイスとしての使用には通常不向きである。この良い例は、例えば、Dermabond （商標）、Indermil（商標） 、Liquiband（商標）、その他のシアノアクリレート族の局所皮膚接着剤である。シアノアクリレートの空気に露出したときに迅速に活性化するという特性は、シアノアクリレートベースの製品を活性止血屋外ドレッシングにおける使用を不適当なものにし、湿潤表面への接着ができないため、内部止血、あるいは内液停止用途に不向きである。
【００３７】
内部身体流体停止に使用することを意図している現存の製品も、有意な問題をかかえている。BioGlue（商標）（Cryolife Inc.）は、強力な接着剤でありシーラントであるが、グルタルアルデヒドで架橋したアルブミンを含んでおり、この物質は毒性があり、高い神経毒がある。この毒性が、その利用を大きく制限している。もう一つのシーラントは、CoSeal（Baxter）であり、これは、ポリエチレングリコール(PEG)からなる。これは非毒性であるが、接着強度が弱く、その用途が大きく制限されている。
【００３８】
ゼラチンは、様々な創傷ドレッシングに使用されている。ゼラチンゲルは、比較的融点が低いため、体温ではそれほど安定していない。従って、タンパク質鎖間に架橋を施すことによって、これらのゲルを安定させることが必須である。実際、これは、グルタルアルデヒドあるいはホルムアルデヒドでゼラチンを処理することによって得られる。このように、架橋したゼラチンは、出血している創傷中に止血剤を導入するのに有益であるドライスポンジに製造することができる。このようなスポンジの商業的に入手可能な例には、Spongostan（Ferrosan, Denmark）、Gelforam (Upjohn, USA) 、及びSurgifoam (Ethicon. Somerville, NJ)がある。これらのスポンジの主な欠点は、使用する架橋剤（フォルムアルデヒドまたはグルタルアルデヒド）が細胞に毒性があることである。グルタルアルデヒド架橋のマイナスの効果は、例えば、de Vries et al (Abstract Book of the Second Annual Meeting of the WHS, Richimond, USA, p51, 1992)の発見によって、例証されている。これらの著者は、グルタルアルデヒドで架橋したコラーゲン格子が細胞に毒性があり、非架橋種は毒性がないことを示した。この結果、これらの有益な止血特性にもかかわらず、これらの製品は問題の創傷治療用創傷ドレッシングとしては最適なものではない。更に、別の、毒性がより低い架橋技術を用いるゼラチンベースの創傷ドレッシングが、非常に所望されていた。
【００３９】
潜在的な毒性とは別に、ゼラチンネットワーク単体は、急激な出血をコントロールするのに必要な機械的特性を提供しない。これは、少量の液体吸収を必要とするのみの創傷管理アプリケーションに好適である。ある研究では、グルタルアルデヒドで架橋したゼラチンシートは、長く続く創傷治癒、特に、より長い時間を要するジストロフィ組織用ドレッシングとしてより適していると結論づけている。代替的に、長期に亘ってインサイチュウで存在する間の反応性微環境を刺激する、細胞アタッチメント用骨格として有益である（MG Tucci. (2001). J. Bioactive & Comp. Polymers. 16(29: 145-157)。
【００４０】
ポリサッカライドで架橋したゼラチンネットワークも出血のコントロールに提案されている。これらの止血成分はグルタルアルデヒド架橋ゼラチンスポンジの潜在的な毒性によって妨げられていない。しかし、ゼラチン−ポリサッカライド物質は、一般的に、機械的強度に欠け、主に、手術中の少量の身体流体滲出のコントロール、あるいは、幅広い治療後のケア期間に生じる創傷滲出を制限することを意図している。
【００４１】
ゼラチン−ポリサッカライド化合物は、インサイチュウで架橋されるゼラチン−アルギン酸創傷ドレッシングである。このようなドレッシングは、接着機能を持たず、主に、創傷部位の水分中で保持するために使用されている。このドレッシングは最初のサイズの９０％に膨張し、この膨張によってその機械的強度が著しく低減される(B Balakrishnan et al. (2005). Biomaterials. 26(32): 6335-42)。
【００４２】
もう一つの、より広く知られている例は、架橋ゼラチン−キトサン創傷ドレッシングである（米国特許第６，５０９，０３９号、第４，５７２，９０６号の例）。このようなドレッシングの外傷ケアへの使用（Chitoskin（商標））が提言されている一方で、この物質の止血特性は、単純に、高圧の出血をコントロールするのに不十分である。また、この材料は、容量の大きい身体流体に当たったときに、大きく膨張する。このようなドレッシングは、慢性の創傷ややけどの治療により適している。
【００４３】
可溶化活性ゼラチンが酸化デキストランで架橋されている更に別の例が記載されている（米国特許第６，1３２，７５９号）。この物質は、高い吸収能力と、治療剤の特に創傷への送達用に好ましくコントロールされた放出特性を示すため、創傷をカバーする長期の治療用に提案されている。
【００４４】
現在は、架橋ゼラチンネットワークを含む材料あるいはゼラチンを伴うその他の材料で架橋した材料は、トロンビンを加えたとしても、いずれの材料も、急激な内部出血に対して個別に止血を提供することができなかった。FloSealゼラチンマトリックス（BioSurgery, Fremont, CA）と活性トロンビン溶液に浸したGelFoamゼラチンマトリックスの止血能力を比較した研究がなされた。どちらの強化止血デバイスも、５分後には感謝の２／３以上の流出する出血を止めることができなかった。脈動動脈出血は、流れ出る出血より遙かに急激であり、これらのトロンビン侵漬マトリックスには間違いなく問題が存在するであろう（FA Weaver et al. (2002). Ann. Vasc. Surg. 16(3): 286-93）。
【００４５】
いずれの場合も、外傷ケアに、有意な副作用なく出血をコントロールできる入手可能な新規な活性止血屋外ドレッシングではないという点で、明らかな欠陥を残している。同様に、外科的ケアにおいても、急激な出血に耐えることができて、非血液身体流体が漏れる創傷部位をシールすることができる入手可能な非毒性シーラントがないという点で、明らかな欠陥を残している。
【００４６】
本発明の実施例によれば、創傷組織の治療方法が提供されており、この方法は、組織にゼラチンと非毒性架橋剤を含む組成物を提供するステップを具える。
【００４７】
好ましくは、トランスグルタミナーゼがトランスグルタミナーゼ組成物の一部として含まれており、ゼラチンとトランスグルタミナーゼ組成物の重量比が約１：１乃至３００：１の範囲である。より好ましくは、トランスグルタミナーゼ組成物は、少なくとも約４０Ｕ／ｇｍという特定の活性レベルを有する。最も好ましくは、トランスグルタミナーゼ組成物が少なくとも約８００Ｕ／ｇｍという特定の活性レベルを有する。
【００４８】
選択的に及び好ましくは、ゼラチン−トランスグルタミナーゼ組成物中のトランスグルタミナーゼ活性は、ゼラチンの約２５乃至約４００Ｕ／ｇからのものである。より好ましくは、活性が、ゼラチンの約４０乃至約２００Ｕ／ｇからのものである。
【００４９】
好ましくは、このトランスグルタミナーゼは、血液由来のFactorＸＩＩＩ以外の、植物由来、遺伝子組換動物由来、あるいは微生物由来のトランスグルタミナーゼである。好ましくは、この組成物はｐHが約５乃至８の範囲にある。
【００５０】
選択的に、ゼラチンが動物起源、遺伝子組換動物起源あるいはこの組み合わせから作られている。好ましくは、動物起源は、魚類と哺乳類からなる群から選択される。より好ましくは、この哺乳類は、豚と牛からなる群から選択される。
【００５１】
選択的に、ゼラチンはタイプA（酸処理した）あるいはタイプＢ（アルカリ処理した）である。より好ましくは、ゼラチンは高分子量ゼラチンを具える。
【００５２】
選択的に、創傷組織は、外科的に切開した組織、外科的に修復した組織、及び外傷組織からなる群から選択される。
【００５３】
選択的に、前記方法は更に、出血あるいは組織からのその他の身体流体漏れを低減するステップを具える。更に、身体流体は、脳脊髄液、腸液、空気、胆汁、及び尿からなる群から選択される。好ましくは、この方法は更に、止血または組織中に漏れているその他の身体流体の停止を含む。
【００５４】
選択的に、創傷は出血しているか、別の身体流体が漏れており、創傷組織を治療するステップは、創傷部位へ組成物を適用して、ゼラチン鎖と組織細胞外マトリックスの内因性コラーゲンとの間のインサイチュウ架橋を促進して、身体流体漏れあるいは出血に対してバリアを作るステップを具える。
【００５５】
選択的に、この方法は更に、生体模倣血栓を形成するステップを具える。
【００５６】
選択的に、この組成物を適用するステップは：ゼラチンとトランスグルタミナーゼを混合して混合物を作るステップと；この混合物を組織に適用するステップとを具える。
【００５７】
本発明のその他の実施例によれば、哺乳動物の創傷に止血剤を導入する方法が提供されており、この方法は、ゼラチンとトランスグルタミナーゼを具える組成物を創傷に適用するステップを具える。
【００５８】
本発明の更に別の実施例によれば、形成した生体模倣血栓を傷ついた血管部位に導入する方法が提供されており、この方法は、創傷にゼラチンとトランスグルタミナーゼを含む組成物を適用するステップを具える。
【００５９】
本発明の更に別の実施例によれば、ゼラチンとトランスグルタミナーゼの組み合わせを具える組成物が提供されており、ここで、ゼラチンの量とトランスグルタミナーゼの量の比率は、哺乳類中に生体模倣血栓の形成を誘発するように選択される。
【００６０】
本発明の更に別の実施例によれば、ゼラチン及び非毒性架橋剤の組み合わせを含む組成物が適用されており、ここで、ゼラチンの量と非毒性架橋剤の量の比率は、哺乳類の創傷における出血を低減するのに十分な比率である。
【００６１】
好ましくは、非毒性架橋剤は、トランスグルタミナーゼを含む。より好ましくは、このトランスグルタミナーゼは、トランスグルタミナーゼ組成物の一部として加えられており、ゼラチンとトランスグルタミナーゼ組成物の重量比は約１：１乃至約３００：１の範囲である。より好ましくは、この比が約１：１乃至約１００：１である。最も好ましくは、トランスグルタミナーゼ組成物は、少なくとも約４０Ｕ／ｇｍの比活性度レベルを有する。同じく、最も好ましくは、トランスグルタミナーゼ組成物は、少なくとも約２００，４００，あるいは８００Ｕ／ｇｍの比活性度レベルを有する。
【００６２】
選択的に、ゼラチン−トランスグルタミナーゼ組成物中のトランスグルタミナーゼ活性は、ゼラチンの約２５乃至４００Ｕ／ｇからのものである。好ましくは、活性が、ゼラチンの約４０乃至約２００Ｕ／ｇからのものである。
【００６３】
選択的に、このトランスグルタミナーゼは、血液由来のFactorXIII以外の、植物、組換体、動物、あるいは微生物由来のトランスグルタミナーゼである。好ましくは、この組成物は更に、安定剤あるいは充填剤を具える。又、好ましくは、この組成物のｐＨは、約５乃至約８の範囲である。
【００６４】
選択的に、ゼラチンは動物起源、組換体起源、あるいはこれらの組み合わせから作られる。好ましくは、動物起源は、魚類及びほ乳類からなる群から選択される。より好ましくは、ほ乳類は、豚と牛からなる群から選択される。最も好ましくは、ゼラチンは、豚皮あるいは豚骨、あるいはこの組み合わせを含む。又、最も好ましくは、ゼラチンはタイプＡ（酸処理）あるいはタイプＢ（アルカリ処理）のものである。また、最も好ましくは、このゼラチンは、高分子量ゼラチンを具える。
【００６５】
選択的に、ゼラチンは少なくとも約２５０のブルームを有する。好ましくは、この魚は冷水種の魚を含む。
【００６６】
選択的に、組換ゼラチンは、バクテリア、イースト、動物、昆虫あるいは植物システム、またはいずれかのタイプの細胞培養を用いて製造する。
【００６７】
選択的に、ゼラチンは精製して塩分を除去する。
【００６８】
選択的に、ゼラチンは少なくとも一の調整した、オーダーメイドの、あるいは予め決められた特性を有する。選択的に、ゼラチンは、熱可逆性ゼラチンではない。
【００６９】
本発明の更に別の実施例によれば、ゼラチンと非毒性架橋剤の組み合わせを具える止血剤あるいは身体流体シーリング剤が提供されている。選択的に、非毒性架橋材は、トランスグルタミナーゼを具える。好ましくは、この組み合わせは、凝集ゼラチンとトランスグルミナーゼを具える。
【００７０】
ここに述べるように、トランスグルミナーゼが選択的に、ストレプトバーティシリウムバルダッチ（Streptoverticillium Baldaccii）、ストレプトミセスハイグロスコピカス（Streptomyces Hygroscopicus）菌株、あるいは大腸菌のうちの一又はそれ以上から抽出することができる。
【００７１】
本発明の更に別の実施例によれば、創傷組織に止血、及び／又はシーリングを誘発する方法が提供されており、この方法は、架橋タンパク質基体及び非毒性架橋剤を具える組成物を組織に適用するステップを具える。選択的に、非毒性架橋剤は、トランスグルタミナーゼを含む。好ましくは、基体は、トランスグルタミナーゼ架橋部位を有する一又はそれ以上の合成ポリマシーケンスを具える。より好ましくは、基体は、少なくとも一のトランスグルタミナーゼ架橋部位を具える変成ポリペプチドを含む。
【００７２】
本発明の更に別の実施例によれば、止血及び創傷のシーリングを誘発する組成物が提供されており、この組成物は、ゼラチンとトランスグルタミナーゼの混合物を含んでおり、この混合物は、ゼラチンが、標準的な動物ゼラチンの自然なゾル−ゲル遷移温度より低い温度でトランスグルタミナーゼを伴う溶液を形成するように修飾されている。
【００７３】
選択的に、ゼラチンは、低減したゾル−ゲル遷移温度を有するように修飾されている。好ましくは、この組成物は更に、添加剤を具え、前記混合物中のゼラチンの可溶性を高める。より好ましくは、この組成物は更に、ゼラチンのゾル−ゲル遷移温度を低減する添加剤を具える。最も好ましくは、この組成物は更に、可塑剤を具える。選択的に、及び、最も好ましくは、可塑化剤は、多価アルコール、グリセリン、グリセロール、キシリトール、スクローゼ、ソルビトール、トリエタノールアミン、レゾルシン、チオジグリコール、トルエンスルホン酸のナトリウム塩、ブチレングリコール、硝酸尿素、チオ尿素、尿素、グルタミン酸、アスパラギン酸、バリン、グリシン、ＫＳＣＮ、ＫＩ、およびＬｉＢｒからなる群から選択される。
【００７４】
選択的に、グリセロールの濃度比レンジは、約０．５：１乃至約５：１のグリセロール：ゼラチン、重量／重量である。好ましくは、濃度比レンジは、約１：１乃至約２：１のグリセロール：ゼラチン、重量／重量である。選択的には、ソルビトールの濃度比レンジは、約０．５：１乃至約５：１のソルビトール：ゼラチン、重量／重量である。好ましくは、濃度比レンジは、約１：１乃至約３：１のソルビトール：ゼラチン、重量／重量である。
【００７５】
選択的に、尿素の濃度比レンジは、約１：２乃至約２：２の尿素：ゼラチン、重量／重量である。
【００７６】
選択的に、この組成物は、更に、ｐＨ調整剤と、イオン濃度調整剤からなる群から選択された調整剤を含む。好ましくは、ｐＨ調整剤は、ｐＨを約１．５乃至約５．０の範囲、あるいは約７．０乃至約９．０とする。
【００７７】
選択的に、この組成物は更に塩を含む。
【００７８】
選択的に、この組成物は、更に、スプレー乾燥、凍結乾燥、あるいはその他のタンパク質乾燥用の安定化剤としてトレハロース糖質、マンニトール糖質、あるいはその他の糖質を具えている。
【００７９】
選択的に、この組成物は、さらに変性剤を具える。好ましくは、この変性剤は、グアニジン塩酸塩と尿素からなる群から選択される。より好ましくは、濃度比レンジが約１：２乃至２：２  ＧｕＣｌ：ゼラチン、重量／重量である。より好ましくは、濃度比レンジは約０．５：１乃至約１：１  尿素：ゼラチン、重量／重量である。
【００８０】
選択的に、この組成物は、更に、還元剤を具える。好ましくは、この還元剤は、塩化マグネシウム及びヒドロキノンからなる群から選択される。より好ましくは、ヒドロキノンが前記混合物の溶液中に、約０．２乃至約０．５Ｍの濃度で存在する。最も好ましくは、この濃度が約０．３乃至約０．４Ｍである。
【００８１】
選択的に、塩化マグネシウムは、混合物の溶液中に約２乃至約４Ｍの濃度で存在する。好ましくは、この濃度は約２．５乃至約３．５である。
【００８２】
選択的に、この組成物は更に、発熱剤を含む。好ましくは、この発熱剤は、一又はそれ以上の塩化カルシウム、その他のカルシウム塩、塩化マグネシウム、金属酸化物／ゼオライト、あるいはこれらの組み合わせを含む。より好ましくは、塩化カルシウムの量が、溶液中の混合物１ｍＬ当たりの塩化カルシウムが、周囲温度を超える温度で摂氏温度の上昇に対して、約０．２乃至約０．７ｇ存在する。
【００８３】
選択的に、この組成物が更に、ゼラチン特異的プロテアーゼを具える。
【００８４】
選択的に、この組成物が更に、プロテアーゼ阻害剤を具える。
【００８５】
選択的に、この組成物が更に、追加の止血剤を具える。好ましくは、この止血剤は更に、アルブミン、コラーゲン、フィブリン、トロンビン、キトサン、硫酸鉄、あるいはその他の金属硫化物のうちの一又はそれ以上を具える。
【００８６】
本発明のその他の実施例によれば、止血あるいはシーリングドレッシングが提供されており、これは、（i）第１のゼラチン層と；（ii）第１のゼラチン層に隣接するトランスグルタミナーゼ層と；（iii）トランスグルタミナーゼ層に隣接する第２のゼラチン層を具え、トランスグルタミナーゼ層が、第１のゼラチン層及び／第２のゼラチン層と同延あるいは非同延である。
【００８７】
本発明のその他の実施例によれば、止血あるいはシーリングドレッシングが提供されており、これは、（i）再吸収性あるいは非再吸収性材料層と；（ii）この材料層に隣接する第１のゼラチン層と、（iii）第１のゼラチン層に隣接するトランスグルタミナーゼ層と；（iv）トランスグルタミナーゼ層に隣接する第２のゼラチン層を具え、トランスグルタミナーゼ層が、第１のゼラチン層及び／第２のゼラチン層と同延あるいは非同延である。
【００８８】
本発明のその他の実施例によれば、止血あるいはシーリングドレッシングが提供されており、これは、（i）ゼラチン層と、（ii）ゼラチン層に隣接するトランスグルタミナーゼ層とを具え、トランスグルタミナーゼ層が、ゼラチン層と同延あるいは非同延である。
【００８９】
本発明のその他の実施例によれば、止血あるいはシーリングドレッシングが提供されており、これは、（i）再吸収性あるいは非再吸収性材料層と；（ii）この材料層に隣接するゼラチン層と、（iii）ゼラチン層に隣接するトランスグルタミナーゼ層とを具え、トランスグルタミナーゼ層が、第１のゼラチン層及び／第２のゼラチン層と同延あるいは非同延である。
【００９０】
本発明のその他の実施例によれば、止血あるいはシーリングドレッシングが提供されており、これは、（i）ゼラチン層と、（ii）ゼラチン層に隣接する再吸収性あるいは非再吸収性材料層と（iii）材料層に隣接するトランスグルタミナーゼ層とを具え、トランスグルタミナーゼ層が、ゼラチン層と同延あるいは非同延である。
【００９１】
選択的にドレッシングは更に、支持体材料を具える。
【００９２】
本発明のその他の実施例によれば、止血あるいはシーリングドレッシングが提供されており、これは、（i）再吸収性あるいは非再吸収性マトリックスと；（ii）ゼラチンと、（iii）トランスグルタミナーゼとを具え、ゼラチンとトランスグルタミナーゼが、マトリックスに組み込まれている。
【００９３】
本発明のその他の実施例によれば、止血あるいはシーリングドレッシングが提供されており、これは、（i）多孔性の再吸収性あるいは非再吸収性マトリックスと；（ii）ゼラチンと、（iii）トランスグルタミナーゼとを具え、ゼラチンとトランスグルタミナーゼが、マトリックスに接着されている。
【００９４】
本発明のその他の実施例によれば、ヒトの身体あるいは、下等哺乳類の身体へ挿入する医療デバイスが提供されており、これは、止血あるいはシーリング材あるいは上述した組成物を具える。好ましくは、このデバイスは、血管カテーテルを具える。
【００９５】
本発明のその他の実施例によれば、ヒトの身体あるいは、下等哺乳類の身体へ挿入する医療デバイスが提供されており、これは、止血あるいはシーリング材あるいは上述した組成物を具える。選択的に、このデバイスは、加圧スプレーあるいは泡を具える。
【００９６】
上述した一般的な記載及び以下の詳細な記載はどちらも例示的で説明的なものに過ぎず、クレームに記載した発明の更なる説明を提供するものである。
【００９７】
定義がされていない限り、ここで使用されている全ての技術的及び科学的用語は、この発明が属する分野の当業者によって通常理解されている意味と同様の意味を有する。ここに記載した全ての特許、特許出願及び公開物は、引用によって組み込まれている。
【００９８】
ここで使用されているように、ゼラチン層と非同延であるトランスグルタミナーゼ層は、トランスグルタミナーゼ層の二次元空間的境界が、一方あるいは双方のゼラチン層の空間的境界より小さく、トランスグルタミナーゼ層が、それぞれ、止血ドレッシングの表面積の約５％乃至約９５％のみ同延であるか、及び／又は、止血ドレッシングの第２のゼラチン層の表面積の約５％乃至約９５％のみ同延である。例えば、トランスグルタミナーゼ層は、それぞれ、第１及び第２のゼラチン層の各々の表面積の、約１０，２０，３０，４０，５０、６０、７０、７５，８０，８０あるいは９０％同延である。ゼラチン層と同延のトランスグルタミナーゼ層は、ゼラチン層の全体を覆っており、ゼラチン層表面積の１００％同延である。トランスグルタミナーゼ層は、例えば、全表面積と形状が異なるゼラチン層を用いて、第１のゼラチン層と非同延であり、第２のゼラチン層と同延としても良く、その逆でも良い。
【００９９】
ここで用いている「患者」は、医療ケア及び／又は治療を必要としているヒトあるいは動物個体を意味する。
【０１００】
ここで用いている「創傷」は、患者のいずれかの組織に対するダメージを意味し、循環系から失血を生じるあるいは生理学的経路からのその他の身体流体を失わせるダメージを意味する。この組織は、器官、血管などの内部組織、あるいは皮膚などの外部組織であってもよい。血液あるいは身体流体の喪失は、器官破裂によって生じる内部的なもの、あるいは、裂傷などから生じる外部的なものであってもよい。創傷は器官などの柔組織内のものであっても、骨などの硬組織内のものであってもよい。このダメージは、薬物あるいは外傷、感染あるいは外科的介入を含む源によって引き起こされる。このダメージは、生死に関わるものであっても、かかわらないものであってもよい。
【０１０１】
ここで用いられている「再吸収可能な材料」とは、自然発生的に、及び／又は、哺乳動物の身体によって、創傷治癒及び／又は組織再構築を有意に妨害せず、有意な代謝傷害を起こすことのないように消費されるあるいは排除される成分に分解される材料を意味する。
【０１０２】
ここで用いられている「安定性」とは、活性及び／又は機能を決定する材料のこれらの特徴の保持力を意味する。
【０１０３】
ここで用いられている「結合剤」とは、一の止血ドレッシング層の、一又はそれ以上の別の層への接着性を改善する化合物または化合物の混合物、及び／又は、所定の層のこの化合物の、その層のその他の化合物に対する接着性を改良する化合物または化合物の混合物を意味する。
【０１０４】
ここで用いられている「可溶化剤」は、タンパク質の（好ましい）水溶液への溶解度を改善する化合物または化合物の混合物を意味する。
【０１０５】
ここで用いられている「充填剤」は、止血ドレッシングの一又はそれ以上の層に嵩及び／又は多孔性を提供する化合物又は化合物の混合物を意味する。
【０１０６】
ここで用いられている「放出剤」は、製造モールドから止血ドレッシングの取り外しを容易にする化合物又は化合物の混合物を意味する。
【０１０７】
ここで用いられている「発泡剤」は、適宜の条件下で水和したときに気体を生成する化合物又は化合物の混合物を意味する。
【０１０８】
「ＴＧ」はあらゆるタイプのトランスグルタミナーゼを意味し、「ｍＴＧ」も、微生物トランスグルタミナーゼ及び／又はコンテキストによってはあらゆるタイプのトランスグルタミナーゼを意味する（後述する特定の実験例では、この用語は微生物トランスグルタミナーゼを意味している）。
【０１０９】
「哺乳類」の用語は、特に、治療方法及び／又はデバイスの使用又は用途及び／又は成分に関しては、特に指定がない限り、ヒト及び下等動物の双方を意味する。
【０１１０】
ここで用いられている「約」は、表示されている値の約１０％プラス又はマイナスを意味する。
【０１１１】
本発明のその他の特徴及び利点は、以下に述べる説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
本発明は、添付の図面を参照して、例示によってのみここに述べられている。図面に詳細に特定の符号を用いることで、詳細が例示によるものであり、本発明の好ましい実施例についての議論を説明する目的であることが強調されており、最も有益で、本発明の原理と概念的特徴の説明を容易に理解されると考えらるものを提供するために提示されている。この点に関して、本発明の構造的な詳細を、本発明の基本的な理解に必要である以上により詳細に示す意図はなく、図面を参照しての説明は、本発明の様々な形式がどのように実施できるかを当業者に明らかにするものである。
【図１】図１は、本発明の例示的バンデージの概略ブロック図である。
【図２】図２は、本発明の例示的バンデージの正面図であり、選択的に吸収可能な支持体と、選択的なプラスチックラッピングで覆われている。
【図３】図３は、本発明の例示的止血デバイスの概略ブロック図であり、多孔性マトリックスを組み込んでいる。
【図４】図４は、創傷強度に関する試験ゼラチンの様々な割合での効果を示すグラフである。
【図５】図５は、トランスグルタミナーゼの活性に関する温度の効果を示すグラフである（試験を行った温度範囲は３２乃至１５０°Ｆ；最適範囲は１２２乃至１３１°Ｆ（５０乃至５５℃））。
【図６】図６は、組成物Ａに基づく組織接着剤の代表的な破壊圧力測定を示す図である。
【図７】図７は、組成物Ｂに基づく組織接着剤の代表的な破壊圧力測定を示す図である。
【図８】図８は、ゲルの形成と止血の誘導を示す写真である（図８Ａは、全領域を示し、図８Ｂは、この領域の一部を更に詳細に拡大して示す）。
【図９Ａ】図９Ａは、コントロール溶液を適用した後の血栓形成の欠如を示す図である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、実験溶液及び止血剤のゲル化を示す図である。
【図１０ＡＢ】図１０Ａ−Ｂは、切断されている動脈（１０Ａ）；多量に出血している切断した動脈（１０Ｂ）を示す写真である。
【図１０ＣＤ】図１０Ｃ−Ｄは、本発明の組成物の切断した動脈への適用（１０Ｃ）；及び生体模倣性血栓の形成による止血（１０Ｄ）；を示す写真である。
【図１１】図１１Ａ及び１１Ｂは、二成分止血シーラントを提供する二重シリンジ法の一例を示す図である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、カテーテルがここに述べた成分で覆われており、血管挿入ポイント閉鎖の一例を示す図である。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、カテーテルがここに述べた成分で覆われており、血管挿入ポイント閉鎖の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１１３】
本発明は、接着材料に関するものであり、この材料は、架橋可能なタンパク質と、この架橋可能なタンパク質の架橋を誘導する非毒性材料を具える。好ましくは、架橋可能なタンパク質は、ここに述べるように、ゼラチンおよびゼラチン変成体あるいは変成タンパク質を含む。選択的に又は好ましくは、非毒性材料は、トランスグルタミナーゼ（ＴＧ）を具え、これは、選択的にカルシウム依存性あるいはカルシウム非依存性のトランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）を具える。これは、例えば選択的に微生物トランスグルタミナーゼであっても良い。本発明の実施例によれば、接着材料はバンデージに設けられており、このバンデージは止血バンデージとしての使用に好適である。本発明の様々な実施例は、明確化のためのみであり、限定を意図することのない見出しを付けて、以下により詳細に説明されている。
【０１１４】
ゼラチン及びトランスグルタミナーゼ
本発明の好ましい実施例によれば、止血及び組織シーリング用組成物が提供されており、この組成物において架橋材がトランスグルタミナーゼを具え、架橋可能なタンパク質がゼラチンを具える。
【０１１５】
好ましい実施例によれば、トランスグルタミナーゼは少なくとも約１００Ｕ／ｇｍの特定の活性レベルを有する組成物中に存在するが、例えば、上述の比率を選択的に調整することによって、選択的に、より活性レベルが低いものも使用することができる。この組成物のこのような選択的なより低い活性レベルは、少なくとも約２０Ｕ／ｇｍ、より好ましくは少なくとも約４０Ｕ／ｇｍ、より好ましくは少なくとも約６０Ｕ／ｇｍ、最も好ましくは少なくとも約８０Ｕ／ｇｍである。
【０１１６】
トランスグルタミナーゼは、単独であるいは組成物の部分として、好ましくは、混合物中の結果としてのトランスグルタミナーゼ活性がゼラチンの約２５乃至約１００Ｕ／ｇ、より好ましくはゼラチンの約４０乃至約６０Ｕ／ｇであるような量で、ゼラチンに加えることが好ましい。
【０１１７】
好適なゼラチンとトランスグルタミナーゼは、当業者に知られており、入手可能な方法によって得ることができる。ゼラチンは選択的に、当業者に知られており、好ましくは、限定するものではないが、動物の組織、及び／又は、限定するものではないが、動物の皮膚、結合組織（限定するものではないが、靱帯、軟骨、などを含む）、枝角や角など、及び／又は、骨、及び／又は魚の鱗及び／又は骨、あるいはその他の構成成分を含む動物組織から得たコラーゲンを部分的に加水分解することによって得たあらゆるタイプのゼラチン；及び／又はバクテリア、イースト、動物、昆虫、あるいは植物システム、あるいはあらゆるタイプの細胞培養を用いて生成した組換ゼラチンを含む。
【０１１８】
本発明の好ましい実施例によれば、動物起源のゼラチンは、好ましくは、哺乳類起源のゼラチンであり、より好ましくは、豚の皮膚、豚及び牛の骨、あるいは裂いた牛の皮、あるいはその他の豚あるいはウシ源の一又はそれ以上である。より好ましくは、このゼラチンは、過敏症率が低いため、豚のゼラチンでなる。動物起源のゼラチンは、選択的にタイプＡ（酸処理）あるいはタイプＢ（アルカリ処理）であり、タイプＡが好ましい。
【０１１９】
好ましくは、動物起源のゼラチンは、一般的に、より低い温度（５０−６０℃、ただし、この正確な温度範囲は限定ではない）で行われる最初の抽出で得られたゼラチンでなる。このようにして生成したゼラチンは、２５０乃至３００ブルームの範囲となり、少なくとも９５−１００ｋＤａの高分子量を有する。好ましくは３００ブルームのゼラチンを使用する。
【０１２０】
このようなゼラチンの生産者の非限定的な例は、PB Gelatins(Tessenderlo Group, Belgium)である。
【０１２１】
本発明の実施例によれば、動物起源のゼラチンは、選択的に魚のゼラチンでなる。選択的にあらゆるタイプの魚のゼラチンを使用することができるが、鯉、鱈、鱒、鮪などの冷水魚が好ましい。このゼラチンのｐＨ（１０％溶液中で測定）は、好ましくは４−６の範囲である。
【０１２２】
冷水魚ゼラチンは、１０℃の水中で溶液を形成し、従って、すべての冷水魚ゼラチンは０ブルームであると考えられる。本発明では、高分子量冷水魚ゼラチンを使用することが好ましく、より好ましくは少なくとも約９５−１００ｋＤａの分子量を含む。これは、２５０−３００ブルームの動物ゼラチンと等価である。冷水魚ゼラチンは、プロリンとヒドロキシプロリンのレベルがより低いため、動物ゼラチンよりかなり低い温度で熱可逆ゲル化が生じる。１０００アミノ酸残渣あたり、動物ゼラチンが１３５−１４５プロリン及び９０−１００ヒドロキシプロリンであるのに比べて、冷水魚ゼラチンは１００−１３０プロリン及び５０−７５ヒドロキシプロリン基を有する（Haug IJ, Draget KI, Smidsrod O. (2004).  Food Hydrocolloids. 18: 203-213）。
【０１２３】
このようなゼラチンの製造者の非限定的な例は、Norland Products (Cranbury, NJ)である。
【０１２４】
本発明の好ましい実施例では、ゼラチンを生成して、塩を除去する。これは上述した技術に基づいて行うことができる。このような技術の一つは、水中で２０％ｗ／ｖの溶液を形成し、攪拌して６０℃に加熱するステップを具える。次いで、混合物を一夜静置する。得られたゲルは、脱イオン化した水を繰り返し交換して、塩を除去し、攪拌して、５０℃に加熱し、物理的ネットワークを分ける。最終溶液をフィルタにかけて、凍結乾燥させる。（Crescenzi V, Francescangeli a, Talienti A. (2002). Bioomacromolecules. 3:1384-1391）。代替的に、ゼラチンをサイズ排除コラムで脱塩してもよい。
【０１２５】
本発明の実施例によれば、組換ゼラチンが使用されている。組換ゼラチンは、FibroGen (San Francisco, CA)  によって商業的に製造されている。現時点での好ましい方法は、組換イーストシステム(Pichia Pastoris)を使用して、タイプＩの特定断片、アルファ１ヒト配列コラーゲンを発現することである。
【０１２６】
本発明の選択的な好ましい実施例では、組み換えゼラチンが完全な合成分子であり、ヒトまたは動物からの汚染成分を含まない。「合成」によるとは、ゼラチンが好ましくは、化学合成、無細胞タンパク質合成、細胞組織培養、あらゆるタイプのバクテリア、昆虫あるいはイースト培養、あるいはインプラントから選択された方法によって製造されることを意味する。合成ゼラチンは、望ましくない免疫反応を引き起こすことを含む、組織由来の材料に関連する多くの変性及び欠点を取り除く。例えば、魚ゼラチンは高いアレルギィ誘発性を示し、動物ゼラチンは、低−中程度のアレルギィ誘発性を示すが、組み合えゼラチンは、アレルギィ誘発性がゼロである。ヒトの安全性に関する研究では、組換えゼラチンに関連する有害事象は見られなかった。
【０１２７】
組み換えゼラチンを作る方法およびそれを使用する利点は、米国特許第６，４１３，７４２号及び第６，９９２，１７２号に完全に記載されており、これらの特許はここに引例として組み込まれている。
【０１２８】
組み換えゼラチンは高度に純化して（９９％）製造することができる。組換えゼラチン製品は、限定するものではないが、確定した分子量、ＰＩ（等電点）、保証されたロット間再現性、及び特定のアプリケーションに合わせた分子調整能を含めて、少なくとも一の確定され、予め決められた特徴をもつゼラチンの選択的製品を考慮している。
【０１２９】
特定のアプリケーションに合わせた分子調整の一例は、上述されており、ゼラチンが高親水性に作られている（Warten MWT, et al. (2001). Protein Engineering. 14(6): 447-454）。選択的に及び好ましくは、本発明のゼラチンは、少なくとも一の調整したあるいは予め決められた特徴を有するゼラチンを具える。
【０１３０】
本発明によって選択的に調整することができるその他の特徴の非限定的な例は、熱可逆ゲル化を行うことあるいは行わないことである。組み換えゼラチンは、熱可逆ゲル化を行う、あるいは熱可逆ゲル化を行わないように作ることができる。天然の動物ゼラチンの有利な特徴を一つあるいはそれ以上をもつが、熱可逆ゲル化を行わないゼラチンは、通常の熱可逆化を行う温度でそのほかの手段によってゼラチンの架橋を可能にする点において多大な有用性を有する。このようなゼラチンも、本発明の実施例に含まれる。
【０１３１】
動物（ウシ、豚、その他）ゼラチン、温水魚ゼラチン、及び組み換えゼラチン（ゲル化タイプ）は、約３５−４０℃で、特に高分子量及び／又は高濃度（＞２０％）及び／又は修飾により、及び／又は一又はそれ以上の追加材料により（以下の記載を参照）熱可逆性ゲル化が行われる。室温では、このゼラチンはゲル状であるｍＴＧと容易に混合できない。室温で液状ゼラチン溶液を維持するための、本発明の実施例による成分の様々な変形例が以下に記載されている。
【０１３２】
冷水魚ゼラチンと組み換えゼラチン（非ゲル化タイプ）は、たとえ、更なる修飾及び／又は一又はそれ以上の追加物質が存在したとしても、室温で熱可逆性ゲルの形にならない。これらのゼラチンは、転移点が室温より遙かに低い。室温では、これらのゼラチンは溶液のままであり、さらなる修飾を行うことなくｍＴＧと反応することができる。
【０１３３】
組み換えゼラチンに関する本発明の好ましい実施例によれば、好適なインビボ培養システムを用いて組み換えゼラチンを製造する。組み換えゼラチンの製造に組み換えメチロトローフイーストの使用することに加えて、その他の有機物が使用されていた。
【０１３４】
大腸菌で通常得られる発現レベルはむしろ低く、細胞内精製タンパク質の精製は困難であるが、組み換えゼラチン状タンパク質は、大腸菌に発現する。ブレビス菌は、配列ストレッチ天然コラーゲン遺伝子から選択され、ポリマ化して半合成ゼラチンが形成されているゼラチン状タンパク質の発現に使用されている（Werten MWT, et al. Secreted production of a custom-designed, highly hydrophilic gelatin in Piciapastoris. Protein Engineering, Vol. 14, No. 6, 447-454, June 2001）。
【０１３５】
組み換えゼラチンを精製する成功した方法の更なる例は、哺乳類及び昆虫の細胞を用いた組み換えゼラチンの製造である。コラーゲンとゼラチンは、遺伝子組み換えたばこ、遺伝子組み換えマウスにも発現している。遺伝子組み換え蚕システムを用いて、コラーゲン状配列を含む溶融タンパク質を製造している。これらのシステムには、プロリル水酸化酵素の過剰発現によって克服できる、完全な水酸化コラーゲンを作るのに十分な内因的プロリル水酸化酵素活性がない（Olsen D, et al. Recombinant collagen and gelatin for drug delivery.  Adv Drug Deliv Rev. 2003 Nov 28; 55(12): 1547-67）。植物ベースのシステムも選択的に用いることができる。例えば、アイオワ州立大学とFibrogen社のコラボレーションが、遺伝子組み換えコーン中のゼラチンの発現を開発している。
【０１３６】
止血ドレッシングに使用されるゼラチンは、ゼラチン複合体あるいは何らかのゼラチン、あるいはその誘導体または代謝体、あるいは単一プロセスまたは複数プロセスによって生産したゼラチンであっても良い。例えば、このゼラチンは、選択的にタイプＡのゼラチンあるいはタイプＢのゼラチン、またはこの組み合わせを具えていても良い。
【０１３７】
トランスグルタミナーゼは、選択的に、植物性、動物性、あるいは微生物由来のトランスグルタミナーゼを具えていても良く、好ましくは血液由来のFactor XIII以外のものである。好ましくは、ストレプトバーティシリウムモバラエンシス（Streptoverticillium mobaraensis）から取り出した微生物トランスグルタミナーゼを使用する。
【０１３８】
トランスグルタミナーゼは、選択的に、例えば、安定化剤又は充填剤など、少なくとも一のその他の物質を具える組成物中にあってもよい。これらの物質の非限定的な例には、マルトデキストリン、加水分解されたスキムミルクタンパク質、あるいはその他のタンパク質物質、塩化ナトリウム、サフラワー油、リン酸三ナトリウム、カゼイン酸ナトリウム又はラクトース、あるいはこれらの組み合わせが含まれる。
【０１３９】
粗製トランスグルタミナーゼ活性用の最適ｐＨは６．０であるが、ｐＨ５．０乃至ｐＨ８．０の範囲でも、高活性で機能する。従って、止血用の本発明による組成物は、約５乃至約８の範囲のｐＨ値を有する。
【０１４０】
トランスグルタミナーゼは、負の温度係数を有する。トランスグルタミナーゼ活性の温度範囲の上では、高温で反応する時間がより短く、低温では機能が開始するのにより長い時間がかかる。以下の表は、１０分で生じる５０℃、ｐＨ６．０での反応と同じ反応グレードと比較した、異なる温度での異なる反応時間を示す。
【０１４１】
0005581056.tif 000002
【０１４２】
商業的に入手可能なトランスグルタミナーゼ製品の非限定的な例には、Ajinomoto Co. (Kawasaki, Japan)による製品が含まれる。この会社の製品の好ましい例は、Activa TG-TI (ヨーロッパでは、Activa WM)−原料：ｍＴＧ及びマルトデキストリン；活性：  Activaの８１−１３５Ｕ／ｇが含まれる。この会社の好適な製品のその他の非限定的な例には、Activa TG-FP (原料：加水分解したスキムミルクタンパク質、ｍＴＧ；活性：  ActivaTG-FPの３４−６５Ｕ／ｇ)；Activa TG-GS (原料：塩化ナトリウム、ゼラチンリン酸三ナトリウム、マルチデキストリン、ｍＴＧ、及びサフラワーオイル（加工助剤）；活性：  Activa TG-GSの４７−８２Ｕ／ｇ)；Activa TG-RM（ヨーロッパでは、Activa EB） (原料：カゼイン酸ナトリウム、マルトデキストリン、及びｍＴＧ；活性：  Activeの３４−６５Ｕ／ｇ)；Activa MP（原料：ｍＴＧ、ラクトース、及びマルトデキストリン；  活性 Activaの７８−１２６Ｕ／ｇ）が含まれる。
【０１４３】
商業的に入手可能なトランスグルタミナーゼ製品のその他の限定的な例には、Yiming Biological Products Co. (Jiangsu, China)がある。この会社の製品の好適な例は、TG-B（原料：１％ｍＴＧ,  ９９％コプロテイン；  活性：TG-Aの８０−１３０Ｕ／ｇ）が含まれる。この会社の好適な製品のその他の非限定的な例には、TG-Ａ（原料：０．５％ｍTG,  ９９．５％コプロテイン；  活性：TG-Aの４０−６５Ｕ／ｇ）が含まれる。
【０１４４】
両方の例について、好ましいトランスグルタミナーゼ製品は、最も高い比活性度と最もシンプルな共原料の製品である。なぜなら、これらは、適用時の反応性が最も良好であり、所望しない副作用の可能性がより低いと考えられているからである（単一の仮定によって限定されることなく）。
【０１４５】
別の実施例では、トランスグルタミナーゼが選択的に、ストレプトバーティシリウムバルダッチ（Streptoverticillium Baldaccii）、ストレプトミセスハイグロスコピカス（Streptomyces Hygroscopicus）菌株から抽出されて、低温で（それぞれ約３７℃及び３７℃−４５℃）最適に機能する酵素変異体を生成する（Negus SS. A Novel Microbial Transglutaminase Derived From Streptoverticillium Baldaccii.  PhD Thesis.  School of Biomolecurar and Biomedical Science.  Griffith University, Queensland, Australia and Cui L et al.  Purification and characterization of transglutaminse from a newly isolated Streptomyces hygroscopicus.  2007: 105(2). P. 612-618)。周囲条件の下、より高速で、より強いゼラチンの架橋を達成するには、低温でのより高い比活性度が望ましい。
【０１４６】
実施例によれば、トランスグルタミナーゼは、選択的にトランスグルタミナーゼを含む商業的に入手可能な混合物を含む、上述した組成物の形で使用することができる。
【０１４７】
別の実施例では、上述のトランスグルタミナーゼ混合物は、選択的に、ゲルフィルタレーション、カチオン交換クロマトグラフィ、中空糸フィルタレーション、接線流フィルタレーション、によって精製して、キャリアタンパク質及び／又は糖質を除去することができる。これらの方法のいくつかは、上述されている（Bertoni f, Barbani N, Giusti P, Ciardelli G. Transglutaminase reactiveity with gelatine: perspective applications in tissue engineering Biotechnol Lett (2006) 28: 697-702）（Broderick EP, et al. Enzymatic Stabilization of Gelatin-Based Scafforlds  J Biomed Mater Res 72B: 37-42, 2005）。フィルタレーションに用いるフィルタのポアサイズは、約１０ｋＤＡが好ましい。
【０１４８】
とにかく、トランスグルタミナーゼの活性は、トランスグルタミナーゼ反応性アッセイを伴う本発明による組成物を使用及び／又は製造の前に測定することが好ましい。このようなアッセイは、選択的に、限定するものではないが、ヒドロキサメート法（Hydroxamate Method）、ネスラーアッセイ（Nessler’s Assay）、比色分析アッセイ、あるいはトランスグルタミナーゼ活性のその他のアッセイが含まれる（例えば、Folk JE, Cole PW. Transglutaminase:  mechanistic features of the active site as determined by kinetic and inhibitor studies.  Biochim biophys Acta. 1966; 122:224-64; 又は、Bertoni F, Barbani N, Giusti P, Ciardelli G.  Transglutaminase reactivety with gelatine:  perspective applications in tissue engineering  Biotechnol Lett (2006) 28: 697-702に記載のネスラーアッセイ、参照）。
【０１４９】
一般的には、止血剤組成物に使用するゼラチン及び／又はトランスグルタミナーゼの純度及び／又は品質は、関連する分野における当業者に知られた適宜の純度であり、タンパク質の効力と安定性をリードする。
【０１５０】
ゼラチン以外の架橋物質用タンパク質
上述したとおり、架橋可能なタンパク質は、好ましくはゼラチンであるが、追加であるいは代替的に、別のタイプのタンパク質を含むものであっても良い。本発明の実施例によれば、タンパク質がトランスグルタミナーゼの基質でもあり、好ましくは、適宜のトランスグルタミナーゼ特異的ポリペプチドとポリマ配列を特色とする。これらのタンパク質は、選択的に、限定するものではないが、合成ポリマ配列を含んでおり、これは、独立して、トランスグルタミナーゼによって架橋されるべき物質の能力を強化するトランスグルタミナーゼ特異的基質で修飾された生体接着剤あるいはポリマを形成する特性を有する。これらのタイプの材料の非限定的な例を以下に述べる。
【０１５１】
架橋のための適宜のトランスグルタミナーゼターゲットを持つ合成ポリペプチド及びポリマ配列が開発されており、これは好ましくは約２０乃至約４０℃の転移点を有する。好ましい物理的特性には、限定するものではないが、組織結合能力と遷移形成能力がある。ゲルタイプのゼラチン（上述した）と同様に、これらのポリペプチドは選択的に、転移点がより低い一又はそれ以上の物質を特徴づける組成物中で使用することができる。
【０１５２】
このようなペプチドの非限定的な例は、米国特許第５，４２８，０１４号と第５，９３９，３８５号に記載されている。いずれもZymoGenetics Inc.社によって出願されたものであり、ここに引例として組み込まれている。米国特許第５，４２８，０１４号は、生体適合性があり、生体接着性のあるトランスグルタミナーゼ架橋可能なポリペプチドを記載しており、ここでは、トランスグルタミナーゼはタンパク質結合グルタミニル残基のγ−カルボキサミド基と、リシン残基のε−アミノ基との間のアシル転移反応を触媒して、ε−（γ−グルタミニル）リシンイソペプチド結合を形成するものとして知られている。
【０１５３】
例えば、１３−１２０のアミノ酸残基を有するポリペプチドが記載されており、これは式Ｓ１−Ｙ−Ｓ２のセグメントを具える。ここで、Ｓ１は、Thr-Ile-Gly-Glu-Glu-Gly-Gln；  Ｙは、１−７アミノ酸ででいたスペーサペプチドであるか、又は存在しない；Ｓ２は、Xaa-Lys-Xaa-Ala-Gly-Asp-Valである。選択的に、スペーサペプチドＹは、Gln-His-His-Leu-Gly, Gln-His-Leu-Gly-GlyまたはHis-His-Leu-Gly-Glyである。また選択的に、Ｓ２のXaa  アミノ酸１は、Ala またはSerである。選択的に、スペーサペプチドは、His-His-Leu-Glyを具える。選択的に、また好ましくは、ＹとＳ２の少なくとも一方にはGln残基がない。選択的に、ポリペプチドのカルボキシル末端アミノ酸残基が、Pro又はGlyである。ポリペプチドの特に非限定的な例は以下のものを含む：Thr-Ile-Gly-Glu-Gly-Gln-Gln-His-His-Lue-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val、Thr-Ile-Gly-Glu-Gly-Gln-Gln-His-His-Leu-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val、Thr-Ile-Gly-Glu-Gly-Gln-His-His-Lue-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val,  あるいはLue-Ser-Gln-Ser-Lys-Val-Gly。この特許は、高分子量で、生体適合性で、生体接着性のトランスグルタミナーゼ架橋可能なこれらのペプチドを含むコポリマとホモポリマも記載している。
【０１５４】
米国特許第５，９３９，３８５号は、生体適合性で、生体接着性のトランスグルタミナーゼ架橋可能なポリペプチドを記載している。これらのポリペプチドは、好ましくは、式Ｓ１−Ｙ−Ｓ２のセグメントを具える約９−１２０アミノ酸残基を有する。ここで、Ｓ１は、Ile-Gly-Glu-Gly-Gln, Gly-Glu-Gly-Gln, Glu-Gly-Gln  及び  Gly-Glnからなる群から選択され；ＹはHis-His-Leu-Gly-GlyまたはHis-His-Leu-Glyであり；Ｓ２は、Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp, Ala-Lys-Gln-Ala-Gly, Ala-Lys-Gln-Ala, Ala-Lys-Gln, Ala-Lys-Ala-Gly-Asp-Val, Ala-Lys-Ala及びAla-Lysからなる群から選択され、このポリペプチドはアミノ端末及びカルボキシ端末を有し、トランスグルタミナーゼによって架橋可能である。好ましいポリペプチドは、Gly-Gln-His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Glnである。また、エラストマポリペプチドによってこのアミノ端末とカルボキシ端末のいずれか一方あるいは双方の側部にあるポリペプチドが好ましい。さらに、エラストマポリペプチドは、ペンタペプチドかテトラペプチドであって、特に、側部にあるポリペプチドがVal-Pro-Gly-Val-Gly, Ala-Pro-Gly-Val-Gly, Gly-Val-Gly-Val-Pro, Val-Pro-Gly-Gly又はこれらの部分であり、好ましくは、側部にあるポリペプチドのアミノ末端がValであり、側部にあるポリペプチドのカルボキシ末端がGlyであるものが好ましい。この特許は、これらのペプチドを含む、より分子量が多く、生体適合性で、生体接着性のトランスグルタミナーゼ架橋可能なコポリマ又はホモポリマも記載している。
【０１５５】
これらの特許は、創傷閉塞及び様々なその他の医療アプリケーションにおける、上述のペプチドとポリマの組織接着剤としての使用についての有用性を認めている。しかし、両特許とも、これらのペプチドとポリマの所望の転移点は２０−４０℃であるとしており、この転移点をより低くして、ペプチド／ポリマが創傷部位におていトランスグルタミナーゼと反応できるようにする必要があることを認めている。両特許共に、「ポリマの転移温度は、トランスグルタミナーゼによって架橋できる多数のポリペプチド、ポリペプチドモノマによって調整することができる。当業者には自明であるように、臨床アプリケーションでは、適用時の転移温度を下げることで、創傷部位におけるマトリックスの迅速な固化が容易になる」と述べている。
【０１５６】
もちろん、生体接着剤としての使用を意図した架橋ポリマの最大結合および接着強度を確実にするために、頻繁に架橋可能なモノマを除去することはできない。実際、このような接着剤の結合及び接着強度を最大にするためには、一般的に、より多くの架橋可能なモノマ物質を加えることが好ましい。このように、これらの特許に記載されたポリマの生体接着潜在性は、ポリマ溶液の転移温度によって有意に制限される。
【０１５７】
本発明の好ましい実施例は、止血、組織接着、及び組織シーラントアプリケーションに用いるこれらのポリペプチドまたはポリマの有用性を有意に改善する。例えば、室温でゲル化するポリマの転移点を下げる選択的な実施例が記載されている。これらの戦略は、これらの特許に記載されたペプチド配列及びポリマの転移点を下げるのに有用である。
【０１５８】
また、以下により詳細に述べるように、これらのポリマの量は、上記特許に記載されている元の使用（いずれも、本発明に記載された使用については教示も提言もしていない）とは逆に、本発明の実施例によって異なる。例えば、組織接着キットに使用するこれらの特許に教示されているポリマ濃度範囲は、５乃至１００ｍｇ/ｍｌであり、好ましくは、３５乃至５０ｍｇ/ｍｌである。本発明の実施例は、ポリマ濃度がより高く、例えば、１５０−２５０ｍｇ/ｍｌの範囲である。より高いトランスグルタミナーゼ濃度も、本発明のいくつかの実施例では好ましい。
【０１５９】
本発明の実施例によれば、そのほかの合成物質も選択的に提供されている。好ましくは、短いトランスグルタミナーゼ物質を合成して、繋ぎ合わせ及び／又は結合させて、大きなポリマ分子とする。トランスグルタミナーゼ物質は、一般的に非常に短い（＜２０アミノ酸残基）。このような物質の溶解度と転移点は、その物質が付着するポリマによって異なる。例えば、この物質がゲル化ゼラチンに付着するのであれば、この新たな合成分子溶液は、室温で液状のままにするには別の物質を加える必要があるだろう。
【０１６０】
このタイプの材料の非限定的な例が米国特許第７，２０８，１７１号に記載されており、これはここに引用として組み込まれている。この特許は、合理的に設計されたトランスグルタミナーゼ基質ペプチドを記載している。この設計戦略は、入手可能なアシル受容体リシンーペプチド基質とトランスグルタミナーゼ架橋に利用可能なアシル供与体グルタミニル−ペプチド基質の数を最大にすることに基づいている。更に、LysとGlu基質ペプチドは、既知の生体高分子の基本特性と、トランスグルタミナーゼの剛性ペプチド基質を持つように設計されている。例えば、Glu基質ペプチドは、ペプチドがGlu反復長さを増やすことによってより良いトランスグルタミナーゼ基質となるという証拠（Gormann, J.J.; Fork, J. E.J. Biol. Chem. 1980, 255, 419-427. & Kahlem, P.; Terre, C.; Green, H.; Djian, P. Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1996, 93, 14580-14585）、及び２またはそれ以上の隣接するGlu残基を含むたんぱく質が良好な基質として知られているという証拠（Etoh, Y.; Simon, M.; Green, . Biochem. Biophys. Res. Commun. 1986, 136, 51-56. & Hohenadl, C.; Man, K.; Mayer, U.; Timpl, R.; Paulsson, R.; Aeschlimann, D. J. Biol. Chem. 1995, 270, 23415-23420.）に基づいて、２−５の連続Glu残基を含んでいた。Leu残基は、いくつかのペプチド中のC末端近くのGluに隣接して配置される。なぜなら、Gluの特異性が有意に上がる結果となることを示すからである（Gross, M.; Whetzel, N.K.; Fol, J. E. J. Biol. Chem. 1975, 250, 4648-4655.）。Lys基質ペプチドについては、ペプチド中のリシン残基に隣接するアミノ酸の成分と配列と、タンパク性基質は、アミン特異性に影響することがある（Groenen, P.; Smulders, R.; Peters, R.F.R.; Grootjans, J.J.; Vandenijssel, P.; Bloemendal, H.; Dejong, W. W. Eur. J. Biochem. 1994, 220, 795-799. & Grootjans, J. J.; Groenen, P.; Dejong, W. W. J. Biol. Chem 1995, 270, 22855-22858）。最後に、全ペプチド中、Gly残基がC末端側に加えられ、ペプチド−ポリマ複合体のペプチドとポリマ間のスペーサとして作用し、この複合対中のペプチドが酵素によりアクセスしやすいようにすることができる。
【０１６１】
この特許に述べられているペプチドのトランスグルタミナーゼ特異性アッセイは、アシル受容体及びアシル供与体基質を高いトランスグルタミナーゼ結合特性を用いてをうまく製作することが示されている。この特許には、これらの基質がＰＥＧ、デンドリマ、キトサン、ゼラチン、可溶コラーゲン、ヒアルロン酸、アルギン酸、およびアルブミンに共有結合することができることが提言されている。この特許は、このようなポリマ−ポリペプチドの溶液あるいは液体中での結合は、外科的シーラント及び／又は医療用接着剤として使用できることを提言している。
【０１６２】
この特許は、非常に特異的なトランスグルタミナーゼ架橋可能なペプチド基質について述べているが、本発明の一部として述べられている進んだ適用方法あるいは材料修飾については教示も提言もしておらず、本発明の組成物も教示も提言もしていない。しかしながら、この特許で教示されている基質は、選択的に、トランスグルタミナーゼ架橋を通じて作られた生体接着剤を強化する、あるいは、非トランスグルタミナーゼ特異的ポリマからこのような生体接着剤を作るのに有用である。これらの基質は、ここに記載されている一又はそれ以上のたんぱく質又は骨格と組み合わせて、本発明に有用なものとする必要がある。
【０１６３】
トランスグルタミナーゼ以外の架橋剤
上述したとおり、架橋剤は、好ましくはトランスグルタミナーゼであるが、追加で、あるいは代替的に、別のタイプの架橋剤を具えていても良い。
【０１６４】
このような架橋剤の非限定的な例には、Ｎ，Ｎ−（３−（ジメチルアミノ）プロピル)−Ｎ−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、ＥＤＣの入ったN-ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ） などのカルボジイミド、または、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）（ＰＬＧＡ）とポリアクリル酸と共に用いたカルボジイミドがある。別の実施例では、このような架橋剤は、チロシン酸、キトサン入チロシン酸であっても良い。別の実施例では、架橋（ポリマ化）が紫外線あるいはγ線を用いて光で開始する。別の実施例では、架橋剤が、アルキレン、クエン酸（カルボン酸）、あるいはナノ−ヒドロキシアパタイト（ｎ−ＨＡ）＋ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）を含んでいても良い。
【０１６５】
別の実施例では、架橋剤が、例えば、水酸化シナモン酸、カフェイン酸（３，４−ジヒドロキシシナモン酸）、クロロゲン酸（そのキナ酸エステル）、カフタル酸（そのタルタル酸エステル）、フラボノイド（すなわち、ケルセチンとルチン）などの植物由来のポリフェノールである。別の実施例では、追加の架橋剤が、酸化モノ又はジサッカライド、オキソ−ラクトース、あるいは糖成分（ガラクト−ヘクソジアルドース）（ＧＡＬＡ）ベースのジアルデヒドである。別の実施例では、ゲニピンまたはその他のイリドイド配合体誘導体、あるいは、セコイリドイド、好ましくはオレウロペインが、架橋剤を含む。別の実施例では、架橋剤がチオール反応性ポリ（エチレングリコール）である。別の実施例では、架橋剤が、デキストラン、酸化デキストラン、デキストランジアルデヒドである。別の実施例では、架橋剤がラッカーゼまたはビリルビンオキシダーゼなどの、マルチ−銅オキシダーゼである。
【０１６６】
実例組成物
上述の架橋基質及び架橋剤は、選択的に、一またはそれ以上の材料と組み合わせて、本発明による様々な組成物を形成する。実施例によれば、接着剤は、選択的に及び好ましくは、（i）ゼラチン；（ii）トランスグルタミナーゼ；を具え、このゼラチンとトランスグルタミナーゼは、別々にあるいは共に粒子状に形成される。より好ましくは、ゼラチンとトランスグルタミナーゼは、シーリング、止血剤として有用な十分な量が提供される。
【０１６７】
ゼラチンとトランスグルタミナーゼの各々の量及びその比についてはすでに述べた。トランスグルタミナーゼ含有量は、反応率を上げるために増やすことができ、あるいは、安全性を高めるために減らすこともできる。本発明の実施例によれば、１５−３０％のゼラチン溶液を、次いで、１５−３０％のトランスグルタミナーゼ溶液を適用することが好ましい。
【０１６８】
更に、例えば、成長因子などの薬剤、ポリクロナール及びモノクロナール抗体、その他の成分といった、一又はそれ以上のサプリメントを止血製品に含めることができる。このようなサプリメントの実例は、限定するものではないが、テトラサイクリン、シプロフロキサシン、アモキシシリン、メトロニダゾールなどの抗生物質；活性タンパク質Ｃ、ヘパリン、プロスタサイクリン(PGI2)、プロスタラグラジン、ロイコトリエン、抗トランスグルタミナーゼIII、ＡＤパーゼ、及びプラスミノーゲン活性剤などの抗凝血剤；デキサメタゾンなどのステロイド、プロストサイクリン、プロスタグラジン、ロイコトリエンのインヒビタ及び／又は炎症を抑えるキニン；カルシウムチャンネルブロッカなどの心臓脈管薬、血管拡張剤、及び血管収縮剤；化学誘因物質；ブピバカインなどの局部麻酔剤；５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、タクソール及び／又はタキソテールなどの抗増殖剤／抗癌剤；ガングシクロビア、ジドブジン、アマンチジン、ビダラビン、リバラビン、トリフルリジン、アシクロビア、ジデオキシウリジンなどの抗ウイルス剤、ウイルス成分または遺伝子産物に対する抗体；α−、β−、又はγ−インターフェロン、α−又はβ−腫瘍壊死因子、インターロイキンなどのサイトカイン；コロニー刺激因子；エリスロポエチン；ダイフルカン、ケタコニゾール、ナイスタチンなどの抗菌剤；ペンタミジンなどの抗寄生虫剤；α−１−アンチトリプシン及びα−１−アンチキモトリプシンなどの抗炎剤；ブピバカインなどの麻酔剤；鎮痛剤；防腐剤；及びホルモン、である。その他の実例サプリメントは、限定するものではないが、ビタミン及びその他の栄養サプリメント；糖タンパク質；フィブロネクチン；ペプチド及びタンパク質；炭水化物（単体及び／又は複合体）；プロテオグリカン；抗血管新生剤；抗原；脂質またはリポゾーム、及びオリゴヌクレオチド（センス及び／又はアンチセンスＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）がある。
【０１６９】
本発明の好ましい実施例によれば、熱可逆性架橋が生じるゼラチンを特徴づける成分が提供されている（上述したとおり、全てのタイプのゼラチンが修飾及び／又は一又はそれ以上の追加の物質を使用することなく熱可逆性架橋が生じるわけではない）。動物性ゼラチンの熱可逆性ゲル化は、ゼラチン溶液がおよそ体温（３７℃）に冷却されると生じる。室温にあるゼラチン−ｍＴＧ混合物では、このゲル化が熱可逆性ゲル中のｍＴＧを捕らえ、ゼラチンと反応して不可逆性シーリングゲルを形成することを防止する。手術室の温度は通常２２℃に維持されているので、ゼラチン溶液の熱可逆的ゲル化は、連続的に加熱されないのであれば、臨床環境においてはむしろ迅速に生じる。ゼラチン溶液はｍＴＧを含む混合物に先立って加熱される必要があるので、このことは止血剤用のゼラチン−ｍＴＧ混合物の適用に問題を提供する。適用する前にゼラチンをすぐに加熱しなければならないことは、例えば、敏感な手術室の環境に加熱エレメントを加える必要があるため、論理的及び安全性の両面から望ましくない。手術室外での緊急の場合及び／又は急ぎの医療ケアを行う場合、このような加熱の必要性はより一層問題となる。
【０１７０】
組織接着及び止血に対する障害とは別に、ゼラチンが室温で溶液にならず、微生物トランスグルタミナーゼと混合できないことは、ゼラチン−ｍＴＧ混合物のその他のアプリケーションの可能性を困難なものにする。例えば、ゼラチン−ｍＴＧゲルは、組織エンジニアリングにおいて細胞をカプセル化するときの骨格として使用されるが、ゼラチン溶液を細胞のカプセル化の前に十分に冷却させるには多大なケアが必要である。更に、カプセル化した細胞のインプラントは、ゼラチン−ｍＴＧ混合物が身体に安全にインプラントできる前にゼラチンの熱可逆的ゲル化が生じるため、非常に複雑である。局所薬剤送達に関しても同じ問題があり、ある種の薬物の有効性が、加熱したゼラチンと接触することによって損なわれ、ある種の薬剤を含むゼラチン−ｍＴＧゲルのインプラントがゼラチンの熱可逆的ゲル化によって妨げられることがある。
【０１７１】
幸いなことに、ｍＴＧによるゼラチンの架橋は、LysとGlnアミノ基の結合によって生じる（Chen et al. Biomacromolecules, Vol. 4, No. 6, 2003）が、熱可逆性ゲル化に関与しているゼラチン中のアミノ酸基は、Proと Hypである（Haug et al. Food Hydrocolloids 18 (2004) 203-213）。このように、ｍＴＧ架橋による架橋ゲルの形成能力を害することなく熱可逆的ゲル化を行うゼラチンの傾向を低減する可能性がある。換言すると、ゼラチン−ｍＴＧ混合物に使用するゼラチンの溶解度を上げて、融点を下げ、形成される架橋ゼラチン−ｍＴＧゲルに負の影響を与えることなく、室温でｍＴＧとの溶液を形成できるようにする。
【０１７２】
本発明の実施例によれば、このゼラチン−ｍＴＧ混合物の成分が提供されており、この混合物はゼラチンの溶解度を上げる様々な方法の一つによって修飾されており、ゼラチンが標準的な動物性ゼラチンの自然融点より低い温度でｍＴＧを含む溶液を形成することができる。これらの組成物は、（i）融点を低減するように修飾された標準ゼラチンを用いて作製したゼラチン−ｍＴＧ混合物；（ii）ゼラチン−ｍＴＧ溶液自体のゼラチンの溶解度を上げる添加剤を含むゼラチン−ｍＴＧ混合物；（iii）より低い転移温度を持つように処理した商業的に入手可能なゼラチンを用いて作製したゼラチン−ｍＴＧ混合物；及び（iv）特別に注意深く制御されたゼラチンの融点より低い環境条件（温度、ｐＨ、イオン濃度、その他）下で溶液を形成するゼラチン−ｍＴＧ混合物；を具える。
【０１７３】
これらの新規な組成物は、ゼラチン−ｍＴＧの有用性を大きく増やし、特に医療の分野において、室温でゼラチンとｍＴＧを混合することによって形成できゼラチン−ｍＴＧを用いるて幅広いアプリケーションを可能にする。更に、多くの場合、より融点の低いゼラチンを含むゼラチン溶液を用いて形成したゼラチンとゼラチン−ｍＴＧ溶液は、溶液の初期の粘度を下げて、ｍＴＧの移動度を増やし、ゼラチン−ｍＴＧ反応が生じる速度を上げるという追加の利点がある。
【０１７４】
本発明の実施例によれば、ゼラチン−ｍＴＧベースの製品の特性を改良する可能性があるゼラチン−ｍＴＧ混合物に更なる強化を提供している。例えば、本発明は、その保存期間を長くするために、ゼラチン−ｍＴＧ中のｍＴＧを更に安定させる方法を特徴としている。
【０１７５】
本発明の別の実施例では、可塑化剤がゼラチン−ｍＴＧ溶液に組み入れられている。可塑化剤は、ゼラチンの融点を下げることが知られており、熱可逆的ゲル化を行うことなく、より低い温度で溶液を形成することができる。一又はそれ以上の可塑化剤をゼラチン顆粒、あるいはゼラチン溶液に加えて、ゼラチン溶液がｍＴＧまたはｍＴＧ溶液と混合する前にその融点を下げることが好ましい。ゼラチンとｍＴＧの溶液が凍結乾燥されている場合は、一又はそれ以上の可塑化剤を凍結乾燥させる前にゼラチン溶液に加える。代替の実施例では、上述したとおり、一又はそれ以上の可塑化剤をゼラチン溶液に加えて、ｍＴＧがあまり反応しない低温でｍＴＧを加えられるようにする。次いで、ゼラチン−ｍＴＧ−可塑化剤溶液をすでに混合した形で凍結乾燥させるかあるいは乾燥させる。
【０１７６】
好ましい実施例では、多価アルコール、あるいはポリオールを可塑化剤として使用している。このようなポリオールは、グリセリン、グリセロール、キシリトール、スクロース、及びソルビトールを含む。ソルビトールは、ゼラチン−ｍＴＧゲルをより弾性的にして、粘着性を上げる。グリセロールは、ゼラチン−ｍＴＧゲルの剛性を上げ、ゼラチンのｍＴＧ架橋を促進する。グリセロールの好ましい濃度比率範囲は、約０．５：１乃至約５：１グリセロール：ゼラチン、より好ましくは、約１：１乃至約２：１、グリセロール：ゼラチン重量／重量である。ソルビトールの好ましい濃度比率範囲は、約０．５：１乃至約５：１、ソルビトール：ゼラチン、より好ましくは、約１：１乃至約３：１、ソルビトール：ゼラチン、重量／重量である。
【０１７７】
多価アルコールは、同じ大きさの一価アルコールに比べて沸点が高い。多価アルコールの溶解度は、水の分子に対してより多くの水酸基が付いているので、同じ大きさの一価アルコールに比べて高い。食品業界では、ここに引用によって組み込まれている米国特許第２，５５８，０６５号に記載されているように、グリセリンなどの多価アルコールを用いて、ゼラチンの水溶性を上げている。ここでは、グリセリンなどの多価アルコールをゼラチン顆粒に注ぎ入れており、ここに引用によって組み込まれている米国特許第３，９３９，００１号では、ゼラチン顆粒が溶解する前に膨張するのに十分な時間、ゼラチンに多価アルコールを吸収させるようにしている。これらの特許に記載されている技術及びこの技術の変形は、本発明の一部として述べられているポリオールの使用の好ましい実施例であると考えられる。
【０１７８】
ゼラチンの転移点を下げる可塑剤である、様々な濃度のグリセロール、キシリトール、ソルビトール、スクロース、及びトレハロースの効果は、文献に良く記載されている（D’Cruz NM, Bell LN.  Thermal Unfolding of Gelatin in Solid as Affected by the Glass Transition.  J Food Science 2005: 70(2), Kozlov PV, Burdygina GI.  He structure and properties of solid gelatin and the principles of their modification.  Polymer, 1983(24): p.651-666）。
【０１７９】
ゼラチンの融点についての多価アルコールの影響は、文献に記載されているが、本発明以前には、多価アルコールが、ｍＴＧ、あるいはゼラチン−ｍＴＧ溶液と混合する前にゼラチンと、あるいはゼラチン溶液と共に用いられたことはなかった。
【０１８０】
ポリオール可塑剤を加える実施例では、可塑剤とゼラチンの重量比の好ましい範囲は、約０．５：１乃至約１：１  可塑剤：ゼラチンである。
【０１８１】
ゼラチン可塑剤を用いて溶液中のゼラチンの融点を下げる別の実施例では、使用される可塑剤のタイプに、トリエタノールアミン、レソルシン、チオジグリコール、トルエンスルホン酸ナトリウム塩、ブチレングリコール、硝酸尿素、チオ尿素、尿素、グルタミン酸、アスパラギン酸、バリン、グリシン、ＫＳＣＮ、ＫＩ及びＬｉＢｒが含まれる。
【０１８２】
ゼラチン溶液への尿素の添加は、以前に研究されており、高分子量ゼラチン（９９ｋＤａ）が２５℃で熱可逆性ゲルを形成することを防止する能力が示されていた（Otani Y, Tabata Y, Ikada Y.  Effect of additives on gelation and tissue adhesion of geltin-poly(L-glutamin acid) mixture.  Biomaterials 19 (1998) 2167-2173）。
【０１８３】
自然の融点より低い温度でゼラチン又はゼラチン−ｍＴＧ溶液の熱可逆性ゲル化を防ぐために尿素を用いた好ましい実施例では、尿素：ゼラチン比を０．２５−２．０、重量／重量として、溶液に尿素を加える。より好ましくは、尿素：ゼラチン比が約１：２乃至約２：２、重量／重量として尿素を溶液に加える。
【０１８４】
本発明の別の実施例では、水溶液のｐＨレベルとイオン濃度を変えて、溶液中に溶解させゼラチンの溶解度を上げるようにしている。この製品のｐＨが等イオンｐＨから遠いほど、ゼラチンの溶解度が良い。この技術で使用する好ましい溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。その他の好ましい緩衝剤は、硼酸塩、リン酸塩、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル]ピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸]）などである。
【０１８５】
一般的に、生体内に使用する組成物では、ｐＨ５．５−９．０で緩衝され、イオン強度を低くした（約１乃至１０００ｍＭ  ＮａＣｌ、好ましくは１００乃至１５０ｍＭ  ＮａＣｌと等価に）水溶液中にゼラチンを溶解させることが好ましい。より好ましくは、溶液のｐＨは約６．０−８．０、より好ましくは約７．４である。ゼラチンはこのｐＨとイオン濃度で溶けるが、溶液のｐＨとゼラチンの等イオンｐＨの差を大きくすることによって、その溶解度を上げることができる。
【０１８６】
ゼラチンの転位温度を下げるために一又はそれ以上の塩を選択的に加えても良い。好ましくは、この塩は、転位温度を下げる、より好適には室温より低くするために好適な濃度レンジで加えられる。例えば、表示した濃度範囲で以下の塩がゼラチンの転位点を室温より低くすることがわかった。臭化ナトリウム（１−２Ｍ）、窒化ナトリウム（１−２Ｍ）、チオシアン酸ナトリウム（０．５−１．５Ｍ）、ヨウ化ナトリウム（０．５−１．５Ｍ）、ベンゼンスルホン酸ナトリウム（０．５−１．５Ｍ）、サリチル酸ナトリウム（０．２５−１Ｍ）、ジクロロ酢酸ナトリウム（１−２Ｍ）、トリクロロ酢酸ナトリウム（０．５−１．５Ｍ）、ジブロモ酢酸ナトリウム（０．５−１．５Ｍ）、トリブロモ酢酸ナトリウム（０．２５−１Ｍ）、ジヨード酢酸ナトリウム（０．５−１．５Ｍ）、アセチルトリプトファンナトリウム（０．５−１．５Ｍ）、アセチレンジカルボン酸ナトリウム（１−２Ｍ）、サリチル酸リチウム（１−２Ｍ）、ジヨードサリチル酸リチウム（０．２−１Ｍ）（Bello J, Riese HCA, Vinograd JR. Mechanism of Gelation of Gelatin.  Influence of Certain Electrolytes on the Melting Points of Gels of Gelatin and Chemically Modified Gelatins.  Am Chem Soc.  Sept 1956 (60). P. 1299-1306参照）。
【０１８７】
選択的に及び好ましくは、一又はそれ以上の酸性物質を組成物に加えてｐHを下げる。ゼラチン溶液のｐＨを下げることで、その転移点を下げる。一般的に、ゼラチンの転移点を下げることは、３７℃の身体中でゼラチンを再構築するのに有益である。ここで用いられている好ましいタイプのゼラチンは、例えば、哺乳類起源のものでは、ｐＨの低減がゼラチンの転移点に良い結果をもたらす。しかしながら、いくつかのタイプのゼラチンでは、選択的に、ｐＨが上がることで良い結果が生じることがある。
【０１８８】
ゼラチン溶液とゼラチンの等イオン点間のｐＨの差が大きい別の実施例では、ゼラチン自体が修飾される。これは、ここに引用によって組み込まれている米国特許第６，８６３，７８３号にあるように、ゼラチンを溶液に溶かす前に処理を行って、静電チャージしたゼラチンを作ることで、あるいは、ここに引用によって組み込まれている米国特許第２，３９８，００４号にあるように、ゼラチンの等電点を制御することによって行われる。
【０１８９】
ゼラチン溶液のｐＨが下がる代わりに上がると、溶液のｐＨはゼラチンの等イオン点に近くなり、転位点が上がる。この修飾は、選択的に、非架橋ゼラチンを、身体にインプラントした後に熱可逆性ゲルとして維持するのに使用することができる。
【０１９０】
本発明の別の実施例では、ゼラチン、ｍＴＧあるいは両物質を、トレハロース糖質あるいはその他の糖質と混合した後に乾燥させ、活性フォーム中のタンパク質または酵素を安定化させ、容易に再構築できるようにしている。乾燥の例は、凍結乾燥、スプレー乾燥、ドラム乾燥、空気乾燥、加熱乾燥、真空乾燥、あるいはゼラチン−トレハロース又はゼラチン−ｍＴＧ−トレハロース溶液を乾燥させるその他の方法である。
【０１９１】
空気乾燥及び凍結乾燥におけるトレハロースの優れた安定化能力は文献に報告されている。乾燥させる物質は、特定の材料あるいは溶液にトレハロースを加えた後に乾燥を行うと、再構築がより早くなることが示されている。（Crowe LM, Reid DS, Crowe JH.  Is Trehalose Special for Preserving Dry Biomaterials?  BiophysialJournal 1996(71): 2087-2093）。
【０１９２】
周囲温度及び大気圧でのトレハロースを含むタンパク質溶液の乾燥は、米国特許第４，８９１，３１９号に完全に記載されている。ここに述べられている例では、乾燥させたタンパク質の機能が保存されていた。
【０１９３】
特別なケースのゼラチンでは、ゼラチン溶液へのトレハロースの組み入れが、ゼラチンゲルの強度を上げるという更なる利点を有する。（Norie N, Kazuhiro M, Masami N, Yusuke O, Takashi O, Keiko N.  Factors Affecting the Gelation of a Gelatin Sokution in the Presence of Sugar.  Journal of Home Economics of Japan.  5582）: p.159-166 (2004))。
【０１９４】
さらに、ゼラチン−ｍＴＧ架橋反応は、自然な血液因子の架橋反応と多くの類似点がある。血液因子を安定化させるトレハロース染色が最近実証されて（米国特許第６，６４９，３８６号及び第７，２２０，８３６号）おり、これは、容易に再構築できる血液たんぱく（ProFibrix（商標）、Leiderdorp）を用いて製品を作製するのに商業的に用いられているプロセスで行われている。
【０１９５】
本発明の別の実施例では、糖の存在下でゼラチンを乾燥させる。これは、糖、マルトデキストリン、あるいはスターチなどの様々な支持体上のゼラチンをスプレー霧化するステップを具える。
【０１９６】
本発明の選択的な実施例では、ＰＢ  Gelatines社（Tessenderlo Group, Belgium）によって製造されるCryogel（商標）と呼ばれる商業的なゼラチン製品が用いられている。Cryogel（商標）は、等量の非処理ゼラチンより５乃至６℃低い温度で溶解する。Cryogelの製造に用いられる詳細な処理手順は特許で守られている。
【０１９７】
本発明の更に別の実施例においては、組成物が選択的に一又はそれ以上の追加物質を具える。例えば、この組成物は、選択的に変性剤を具えており、この変性剤は、限定するものではないが、一またはそれ以上の塩酸グアジニンまたは尿素を具える。この組成物は、選択的に、代替的に、あるいは追加で、還元剤を具えていても良く、この還元剤は、限定するものではないが、一又はそれ以上の塩化マグネシウムまたはハイドロキノンを具える。また、この組成物は、選択的に、代替的に、あるいは追加で、水素結合形成を増やすためにイソプロパノールなどの物質を具えていても良い。また、この組成物は、選択的に、代替的に、あるいは追加で、極性プロトン性溶媒を具えていても良く、タンパク質と構造的に相互作用して、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）などのように、ゼラチン中のらせん形成を防止することが好ましい。また、この組成物は、選択的に、代替的に、あるいは追加で、例えば、塩化カルシウムなどのような、溶液に入れたときに発熱する乾燥剤を具えていても良い。
【０１９８】
実施例によれば、本発明は又、ゼラチンを分子鎖に迅速に分解することができ、自然なフィブリンベース血栓ネットワークに逆に作用しない、酵素あるいは酵素混合物を具える、ゼラチン特異的プロテアーゼを特徴とする。
【０１９９】
ゼラチン特異的プロテアーゼは、選択的に、自然な内因性フィブリン血栓を傷つけることなく、また再出血を起こすことなく創傷部位からバンデージ／ドレッシング／吸収可能な止血剤／シーラントの除去に使用することができる。この特徴は、現存の製品に比べて本発明の追加的な利点であり、フィブリン血栓によく付いて、出血をとめるのに十分な接着性のある止血ドレッシングが、フィブリン血栓を除去したり壊したりすることなく、除去することができないという問題を解決するものである。本発明のバンデージの少なくともいくつかの実施例は、再吸収可能ではあるが、医師が創傷部位を手術したい場合、創傷から取り除いて他の場所にバンデージを移す必要がある。
【０２００】
例示的で、非限定的なプロテアーゼは、プロテイナーゼＫ（Chen, et al. Biomacromolecules 2003, 4, 1558-1563）である。しかしながら、その他のプロテアーゼ、特に、より早く反応する酵素を代替的に使用することもできる。
【０２０１】
その他の実施例によれば、一又はそれ以上のプロテアーゼ阻害剤が選択的に加えられている。これは、限定するものではないが、アプロチニン、トラネキサム酸、α−２プラズミン阻害剤、α−１抗トリプシン、あるいはα−１抗トリプシンのピッツバーグ突然変異体を含む（Arg-358 alpha-1-antitrypsin; Owen et al. N. Engl. J. Med. 309: 694-698, 1983 及び米国特許第４，７１１，８４８号参照。この特許は、本明細書中に引用されている）。好ましい実施例においては、１５００−２０，０００ＫＩＵ／ｍＬの実際に使える最終濃度を提供するのに十分な量のアプロチニンが開示されている。
【０２０２】
その他の実施例によれば、本発明の止血材料は更に、ゼラチン及びＴＧに加えて、追加の止血物質を含んでいても良い。このような物質は、天然の生物製剤であっても合成したものであっても良く、限定するものではないが、アルブミン、コラーゲン、フィブリン、トロンビン、キトサン、硫酸鉄、あるいはその他の硫酸塩を含んでいても良い。
【０２０３】
更に別の実施例によれば、本発明の止血材料は、更に、例えば、トランスグルタミナーゼなどの架橋剤とゼラチンを合わせたときの架橋率を促進する促進剤を含んでいても良い。このような促進剤は、選択的に、例えばカルシウムを含んでいる。
【０２０４】
カルシウムはトランスグルタミナーゼ／ゼラチン架橋反応の好適な成分である。様々な研究が、カルシウム濃度の変化及び／又はカルシウム可動化薬剤（限定するものではないが、マイトトキシン（ＭＴＸ）を含む）が、トランスグルタミナーゼ血栓反応を促進することを示している。従って、本発明の実施例によれば、カルシウム及び／又はカルシウム可動化薬剤が含まれているが、代替的にカルシウム及び／又はカルシウム可動化薬剤を使用しなくとも良い。これらのカルシウムを使用するための修飾は、カルシウム−非依存性トランスグルタミナーゼではなく、カルシウム−依存性トランスグルタミナーゼで行うことが有益である。
【０２０５】
更に別の実施例によれば、本発明の止血材料は、更に、好ましくは、例えばトランスグルタミナーゼなどの架橋剤とゼラチンを合わせる際に、発熱反応を起こす材料を更に具えていても良い。発熱反応の誘発は、選択的におよび好ましくは、周囲環境条件の下でも架橋を支持することができる。ここで、「周囲」とは、約３０℃より低い温度を有する環境であると定義される。このような発熱剤は、選択的に、カルシウム、塩素含有分子（塩化カルシウムあるいは塩化マグネシウム）、あるいは、例えば、金属酸化物／ゼオライト、あるいはこれらの組み合わせを含むものでも良い。
【０２０６】
組成物の調整
ここに述べた組成物は、本発明の様々な実施例の一又はそれ以上の異なる方法に従って選択的に調整することができる。本発明の一実施例では、ゼラチン−ｍＴＧ混合物中のゼラチンを、ｍＴＧとの混合の前に加熱する使用を含む非常に特別な乾燥法を施す。これらの乾燥法は、ゼラチンの融点を好ましくは、操作を行う室温より低い温度まで下げることによって、ゼラチンの溶解度を上げている。この乾燥法は、添加物を加えることなく、またゼラチン又はゼラチン−ｍＴＧ溶液が形成される環境条件を変えることなく、ゼラチンの溶解度を上げることができる。それにもかかわらず、可塑化剤あるいは安定化剤などのある種の添加物を加える、あるいはゼラチンまたはゼラチン−ｍＴＧの温度、イオン濃度、浸透圧などのある種の環境因子を操作することによって、融点を低くする技術を用いてゼラチンを乾燥させることを含む、ゼラチン−ｍＴＧ混合物の特性をさらに強化することができる。
【０２０７】
低くした温度でｍＴＧとの溶液を形成することができるゼラチンを調整する熱−依存性ゼラチン乾燥の好ましい実施例は、水分約３５％の純粋なゼラチン溶液をゲル化温度及び個化温度を超える温度で、水分が８％より低い過剰な最終的に分離された固体ゼラチン粒子にスプレーする。次いで、この粒子を、流動床で水分８乃至１３％に乾燥させる。このプロセス、並びに本発明の範囲に含まれるこのプロセスの変形は、米国特許第４，８８９，８２９号に開示されており、この特許は、ここに引用されている。
【０２０８】
低温でｍＴＧとの溶液を形成することができるゼラチンを調整する熱−依存性ゼラチンの別の好ましい実施例は、ゼラチンと水の総重量に基づいて、水分が８重量％より多いゼラチンをマイクロウエーブで加熱して、前記水分の少なくとも３５％を除去し、ゼラチンと水の総重量に基づいて水分が１６％より多くない処理ゼラチンを得ることである。このプロセス、並びに本発明の一部として考えるべきであるこのプロセスの変形例は、ここに引用されている米国特許第４，２２４，３４８号に詳細に記載されている。
【０２０９】
低温でｍＴＧとの溶液を形成することができるゼラチンを調整する熱−依存性ゼラチンの別の好ましい実施例では、ここに引用されている米国特許第２，８０３，５４８号に記載されているように、減圧下、１００℃でゼラチンを乾燥させる。このプロセスは、ゼラチン鎖自体を変性させて、熱可逆的にゲル化できるようにする。ゼラチンのｍＴＧ架橋は、ゼラチンの熱可逆的なゲルを作る能力に依存するものではないが、この乾燥プロセスによって、ゼラチンの鎖が弱くなり、このようなゼラチンを用いて作ったゲルのゼラチン−ｍＴＧ架橋が弱くなる。
【０２１０】
本発明の別の実施例では、ゼラチン−ｍＴＧ混合物中のゼラチンを、ｍＴＧとの混合前凍結乾燥の使用を含む非常に特別な乾燥方法で乾燥させる。これらの乾燥方法は、ゼラチンの融点を好ましくは操作室温以下に下げることによってゼラチンの溶解度を上げる。この乾燥方法は、添加剤を加えることなく、また、ゼラチンあるいはゼラチン−ｍＴＧ溶液が形成される環境条件を変更することなくゼラチンの溶解度を上げることができる。それにもかかわらず、可塑剤や安定化剤などのある種の添加物を加える、あるいは、ゼラチン又はゼラチン−ｍＴＧ溶液の温度、イオン濃度、浸透圧などのある種の環境因子を操作することで、ゼラチンの融点を下げる凍結乾燥法を用いて乾燥させたゼラチンをすでに組み入れているゼラチン−ｍＴＧ混合物の特性をさらに強化することができる。
【０２１１】
低くした温度でｍＴＧとの溶液を形成できるゼラチンを調整するためにゼラチンを凍結乾燥させる実施例では、０．１−２重量％の濃度で水に溶解させたゼラチンを減圧下で凍結乾燥させる。このプロセス、並びに本発明の一部であると考えるこのプロセスの変形は、米国特許第２，１６６，０７４号に記載されており、これは本明細書に引用されている。
【０２１２】
本発明の別の実施例では、ゼラチンとｍＴＧが溶液中ですでに混合されて、ゼラチン−ｍＴＧ混合物を凍結乾燥させる。これは、乾燥状態にあるゼラチンが乾燥状態にあるｍＴＧと接触している、まんべんなく混合された凍結乾燥ゼラチン−ｍＴＧ混合物となり、ゼラチンの融点を下げる。この実施例では、ゼラチンとｍＴＧが凍結乾燥した状態から同時に戻り、戻った部位で即時に溶液を形成する。この技術は、標準的なゼラチンより低い融点をすでに有しているゼラチンあるいはゼラチン混合物に好適に使用することができる。なぜなら、低温（約３７℃以下）では、ｍＴＧの活性が急激に下がるためである。
【０２１３】
従って、急激な架橋とゲル化が生じることなく、融点が低くなったゼラチンとｍＴＧの溶液を低温で形成することができる。この溶液は、次いで凍結乾燥させて、均質に分散したゼラチンとｍＴＧの乾燥した混合物とすることができる。このような混合物は、より暖かい溶液と接触したときに、迅速に戻ってゲルを形成する。このような技術は、自然温度が３７℃である身体流体がゼラチンとｍＴＧを戻すことができる創傷ドレッシングに好ましく使用することができる。
【０２１４】
本発明の別の実施例では、止血または組織シーラントを目的とするゼラチン−ｍＴＧ粒子混合物が提供されており、ここでは、ゼラチン−ｍＴＧが共にスプレー乾燥されて、止血又は組織シーラントに提供するのに好適な濃度でゼラチンとｍＴＧを含む良好に分散した粒体を形成している。
【０２１５】
本発明の別の実施例では、ゼラチン−ｍＴＧ混合物の一部として使用されているゼラチンを凍結乾燥させ、部分的に凍結乾燥させ、あるいはあるパーセントのゼラチン混合物を凍結乾燥させあるいは溶解度を増やすために部分的に凍結乾燥させている。このような技術の一例では、凍結乾燥させたゼラチンフィルムでの標準的なゼラチン顆粒の被覆を含むプロセスにおいてうまく示されている。（米国特許第４，７２９，８９７号、本明細書に引用されている）。この実施例は、可塑剤の存在下で凍結乾燥させたあるいは部分的に乾燥させたゼラチンの使用を具えており、この可塑剤は、上述したような、多価アルコール、炭水化物、あるいはその他の可塑剤であってもよい。
【０２１６】
本発明の別の実施例では、予め混合したｍＴＧとゼラチン、あるいはその他のタンパク質加水分解質を含む溶液を凍結乾燥させ、組成物の安定性を上げるようにしている。この技術は、食物加工に用いる組成物の調整に使用されているものとして、ここに引用されている米国特許第６，０３０，８２１号に記載されている。
【０２１７】
本発明の別の実施例では、ゼラチン−ｍＴＧ混合物の一部として使用されたゼラチンを酸と混合した後にスプレー乾燥させて、酸がゼラチンのレベルの５−２０％に維持されている希釈した酸性ゼラチン溶液を形成して、強化乾燥用に微細な液滴を形成している。このプロセスは、ここに引用されているカナダ特許第８９６，９６５号に記載されている。
【０２１８】
本発明の別の実施例では、ゼラチンとｍＴＧを含む製品を強化するための上述した技術の一又はそれ以上を、ユニゾンでまたは一連で使用している。これは、好ましくは、ゼラチンまたはゼラチン−ｍＴＧ溶液中に二又はそれ以上の可塑剤を使用する、上述した乾燥法の一つを使用してゼラチンを乾燥させる前に、ゼラチンまたはゼラチン−ｍＴＧ溶液中に一又はそれ以上の可塑剤を使用することを含む。これは、また、一の乾燥法を用いてゼラチンあるいはゼラチン−ｍＴＧを乾燥させるステップと、乾燥したゼラチンまたはゼラチン−ｍＴＧを溶液中に溶解させ、その後ゼラチン又はゼラチン−ｍＴＧを再乾燥させるステップとを含む。
【０２１９】
これらの方法は、また、選択的に、熱可逆性ゲル化を行う組成物に使用することができ、この組成物は、好ましくは、例えば非ゲル化タンパク質の様々な組み合わせ、及び、選択的にその他の架橋剤（トランスグルタミナーゼ以外）を含む。
【０２２０】
バンデージ
本発明の例示的実施例は、例えば、患者の創傷組織を治療するための、止血ドレッシングに関し、これは、バンデージの活性化のために相互反応が必要とされるあるいは望ましくなるまで、好ましくは分離されているゼラチンとトランスグルタミナーゼを具える。このバンデージは、選択的に、プラスチック支持部などの非吸収性支持部を特徴としている。バンデージは、また、選択的に再吸収可能な材料層を特徴としている。
【０２２１】
本発明の別の実施例は、患者の創傷組織を治療する止血ドレッシングに関連し、これは、選択的に及び好ましくは：（i）ゼラチン層；（ii）このゼラチン層に隣接するトランスグルタミナーゼ層を具え、このトランスグルタミナーゼ層はゼラチン層と同延、あるいは非同延である。
【０２２２】
本発明の別の実施例は、患者の創傷組織を治療する止血ドレッシングに関連し、これは、選択的に及び好ましくは：（i）再吸収可能なあるいは再吸収不可能な材料層と；（ii）この材料層に隣接するゼラチン層と、（iii）このゼラチン層に隣接するトランスグルタミナーゼ層を具え、このトランスグルタミナーゼ層は、ゼラチン層と同延、あるいは非同延である。
【０２２３】
本発明の別の実施例は、患者の創傷組織を治療する止血ドレッシングに関連し、これは、（i）第１のゼラチン層；（ii）この第１のゼラチン層に隣接する再吸収可能な材料層；（iii）この再吸収可能な材料層に隣接するトランスグルタミナーゼ層；及び（iv）このトランスグルタミナーゼに隣接する第２のゼラチン層；を具え、トランスグルタミナーゼ層が第１及び／第２のゼラチン層と非同延である。
【０２２４】
いくつかの実施例によれば、本発明は第１及び第２のゼラチン層に挟まれたトランスグルタミナーゼ層を具える止血ドレッシング（例えば、バンデージ）を提供しており、このトランスグルタミナーゼ層は、第１及び／又は第２のゼラチン層と同延又は非同延である。このような止血ドレッシングは、創傷の治療に有益である。非同延モデルは、トランスグルタミナーゼが第１及び第２のゼラチン層全体と同延であるドレッシングと比較して、これらの層の層間剥離を阻害する利点がある。しかしながら、同延モデルの止血性能は、非同延モデルの止血性能に対して優れている。
【０２２５】
本発明のその他の実施例によれば、本発明のドレッシングが提供されており、これは、選択的に及び好ましくは：（i）再吸収可能なあるいは再吸入不可能なマトリックスと；（ii）ゼラチンと；（iii）トランスグルタミナーゼを具え、このゼラチンとトランスグルタミナーゼがマトリックス内に組み込まれている。
【０２２６】
別の実施例では、止血デバイスが：（i）多孔性の再吸収可能なあるいは再吸収不可能なマトリックスと；（ii）ゼラチンと；（iii）トランスグルタミナーゼを具え、このゼラチンとトランスグルタミナーゼがマトリックス内に接着されている。
【０２２７】
様々な実施例において、トランスグルタミナーゼは、様々な形状とパターンのいずれかに形成することができる。例えば、限定することなく、トランスグルタミナーゼ層を、トランスグルタミナーゼを具えるスポットアレイとして、あるいは、トランスグルタミナーゼを具えるシングルスポットとして、構成することができる。代替的に、トランスグルタミナーゼ層は、トランスグルタミナーゼを具える複数のラインとして構成することができる。
【０２２８】
また、止血ドレッシングの各層は、選択的に、一又はそれ以上の好適な充填剤、結合材、及び／又は可溶化剤を含むものでも良い。更に、各止血ドレッシングは、剥離剤及び／又は支持材を含む剥離層を更に具えていても良い。
【０２２９】
好ましい実施例によれば、止血ドレッシングの各層は、選択的に、スクロースなどの一又はそれ以上の好適な充填材を含む。止血ドレッシングの各層は、また、選択的に、剥離剤を含む剥離層を更に具えていても良い。例示的な剥離剤はスクロースである。また、止血ドレッシングの各層は、選択的に、一又はそれ以上のスクロースなどの好適な可溶化剤を含んでいても良い。
【０２３０】
一仮定によって限定することを望むものではないが、本発明の一部としてのスクロースの特性は、選択的に、少なくとも部分的に、加える量によって決まる。比較的高い濃度（２０−３０％スクロース溶液）では、表面（バンデージなど）にスプレーして、その表面に接着する別の溶液（ゼラチンまたはｍＴＧ溶液など）へのアプリケーション用に調整することができる。より低い濃度（例えば、約２％）では、スクロースをゼラチン又はｍＴＧ溶液に加えて、このような溶液表面（バンデージ）への接着を助けることができる。
【０２３１】
止血ドレッシングの各層は、また、選択的に、酢酸と重炭酸ナトリウムの混合物などの、一又はそれ以上の好適な発泡剤を具えていても良い。
【０２３２】
各止血ドレッシングは、また、ドレッシングを使用するときに創傷面側と反対側のドレッシング側部に支持材を更に具えていても良い。この支持材は、生理学的に受容可能な接着剤で固定するか、あるいは、（例えば、静電荷電表面を持たせることによって）自己接着するようにしても良い。支持材は、シリコンパッチまたはプラスチックパッチなどの、再吸収性材料であっても、非再吸収性材料であってもよく、及び／又は、血管カテーテルなどのデバイス、及び／又は、選択的に身体に挿入することのできるその他のタイプの医療デバイスであってもよい。
【０２３３】
トランスグルタミナーゼ層は、第２のゼラチン層の装着時に第１のゼラチン層と非同延になる、及び／又は、第２のゼラチン層と非同延になるように、第１のゼラチン層に装着することができる。例えば、このトランスグルタミナーゼ層は、第１のゼラチン層の表面積の約５％乃至９５％を、及び／又は第２のゼラチン層の表面積の約５％乃至約９５％を占めていても良い。トランスグルタミナーゼは、トランスグルタミナーゼスポットが、第1のゼラチン層の表面積の約５％乃至約９５％、及び／又は、第２のゼラチン層の表面積の約５％乃至約９５％を占めるようにして、ゼラチン層に単一スポットで装着しても良く、あるいは、ゼラチン層に一連のスポットとして装着することができる。
【０２３４】
このようなトランスグルタミナーゼのスポットは、例えば、黒丸または白丸、矩形、三角形、ライン、非晶質形状、あるいはこれらの組み合わせといった、どのような幾何学的形状であっても良い。このようなスポットは、順次のパターンあるいはランダムなパターンで第１のゼラチン層に装着することができる。複数のスポットは、トランスグルタミナーゼの総面積が、第１のゼラチン層の表面積の約５％乃至９５％、あるいは、第２のゼラチン層の表面積の約５％乃至約９５％であれば、アレイ、グリッド、一連の同心スポット（例えば同心円、同心矩形など）、重なり合った一連のスポット（例えば、重なり合った円）、軸から広がるスポーク、あるいはその他の形状など、様々な形状及びパターンのいずれかを形成することができる。一般的に、小数の大きいスポットより、多数の小さいスポットが好ましい。例えば、同じ総表面積を占める２０×２０アレイのスポットは、１０×１０アレイのスポットより好ましい。しかしながら、スポットは、トランスグルタミナーゼの総表面積が第１のゼラチン層の表面積の約５％乃至９５％、及び／又は、第２のゼラチン層の表面積の約５％乃至９５％であれば、どのような大きさのものでもよい。例えば、ドレッシング全体のサイズに応じて、このスポットは、限定することなく、直径、幅あるいは長さが少なくとも約０．０１、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｍｍ又はそれ以上である。一の実施例では、例えば、直径２−３ｍｍの４つの円形スポットで、１平方センチメートルのドレッシングを占めている。当業者が容易に利用することができる様々なその他の構成が、本発明の範囲内である。
【０２３５】
ドレッシングは、選択的に、様々なサイズと形状に調整することができる。典型的には、ドレッシングは、当業者が容易に操作できるサイズと形状であり、通常、例えば１インチ×１インチ、１インチ×２インチ、４インチ×４インチのように、側辺長さが１２インチより短い。ドレッシングの水分レベルは、通常８％より低い（例えば、７、６、５、４、３、２、または１％より低い）。
【０２３６】
当業者に知られている様々な再吸収可能な材料の一つを、本発明に選択的に使用することができる。例えば、吸収可能な材料は、フィブリン、ケラチン、コラーゲン及び／又はゼラチンなどのタンパク質性物質、アルギン酸塩、キチン、セルロース、プロテオグリカン（例えば、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンなど）、グリコール酸ポリマ、酢酸ポリマ、グリコール酸／酢酸コポリマなどの、炭水化物であっても良い。例えば、再吸収可能な材料は、糖質であっても良い。再吸収可能な材料の例は、商品名VICRYL （商標）及びDEXON（商標）で売られている。
【０２３７】
一般的に、止血ドレッシングの様々な層は、当業者に知られており、入手可能な手段で互いに固定することができる。例えば、選択的に及び好ましくは、ゼラチン層及び／又はトランスグルタミナーゼ層は、一連の急速冷凍された水溶液層として適用され、次いで、例えば、各層を適用した後、及び、ドレッシング全体を組み立てて、凍結乾燥される。これらの層は、スプレー、ピペット（例えば、多チャンネルピペットによって）、散水、マスクを用いて、静電沈着、マイクロシリンジアレイシステムを用いて、あるいは、高密度アレイを作るためのポートを含む分注マニホールドを用いた分注を含む、様々な技術を用いて適用することができる。
【０２３８】
本発明の実施例では、ドレッシングをモールドを用いて作る場合、ドレッシングの第１層を提供する前に、スクロースなどの離型剤を塗布する。このような実施例では、止血ドレッシングは、この離型剤を含む離型層を更に具えている。
【０２３９】
代替的に、生理学的に許容可能な接着剤を再吸収可能な材料及び／又は（ある場合には）支持材に塗布し、次いでゼラチン層及び／又はトランスグルタミナーゼ層をこれに固定する。
【０２４０】
ドレッシングの一実施例では、生理学的に許容可能な接着剤は、吸収可能な材料及び／又は支持材が、創傷組織へドレッシングを適用した後ゼラチン層から分離できるような剪断強度及び／又は構造を有する。別の実施例では、生理学的に許容可能な接着剤が、吸収可能な材料及び／又は支持材が、創傷組織へドレッシングを適用した後ゼラチン層から分離できないような剪断強度及び／又は構造を有する。
【０２４１】
創傷の面積当たりのゼラチン濃度は、限定するものではないが、バンデージの最終的な構造、使用した材料など、様々な要因に依存している。
【０２４２】
本発明の別の実施例によれば、第１のゼラチン層を選択的及び好適に提供し、この第１のゼラチン層にトランスグルタミナーゼ層を適用し、このトランスグルタミナーゼ層に第２のゼラチン層を適用することによって、止血ドレッシングを調整する方法であって、トランスグルタミナーゼ層が、第１のゼラチン層及び／又は第２のゼラチン層と同延でない方法を提供している。
【０２４３】
同様に、本発明の別の実施例は、第１のゼラチン層を取り付けた、再吸収性のまたは非再吸収性の支持層を提供し、トランスグルタミナーゼ層を、ゼラチン層の再吸収性のまたは非再吸収性の支持層が取り付けられている側の反対側で前記第１のゼラチン層に適用し、このトランスグルタミナーゼ層に第２のゼラチン層を適用することによって、止血ドレッシングを調整する方法であって、トランスグルタミナーゼ層が、第１のゼラチン層と非同延であり、及び／又は、第２のゼラチン層と非同延である。
【０２４４】
止血デバイス
本発明の別の例示的実施例は、例えば、急激に出血している患者の手術環境における止血用といった止血デバイスに関し、このデバイスは、（i）多孔性の再吸収性または非再吸収性マトリックスと；（ii）粉状、粒子状、あるいはその他の固形フォームのゼラチンと；（iii）粉状、粒子状、あるいはその他の固形フォームのトランスグルタミナーゼと；を具え、ゼラチンとトランスグルタミナーゼが前記マトリックス中で合体する。
【０２４５】
本発明の別の実施例は、例えば、急激に出血している患者の手術環境における止血用といった止血デバイスに関し、このデバイスは、（i）多孔性の再吸収性または非再吸収性マトリックスと；（ii）ゼラチンと；（iii）トランスグルタミナーゼと；を具え、ゼラチンとトランスグルタミナーゼが前記マトリックスに接着される。
【０２４６】
本発明の別の実施例は、シーラントアプリケーションの受け入れられている方法を介して、止血／シーラント混合物の適用を含む。このような方法は、選択的に、ゲル、泡、またはスプレーの一部としてこの混合物を適用することを含む。これらの方法を用いる止血／シーラントの適用は、選択的に、例えば、混合物成分を別に保存するステップと、これを適用する直前に混合するステップで行われる；及び／又は、例えば、選択的に、これらの成分を互いに非活性な形態で保存するステップと、適用の直前にこれらを活性化させるステップとによって行われる。シーラント成分の非活性な形態は、選択的に、凍結溶液、再構築を要する凍結乾燥粉体、再構築を要するスプレー乾燥粉体、及び／又は非活性シーラント混合物のその他の好適な形態のうちの一又はそれ以上として提供され得る。
【０２４７】
止血デバイスの調製
本発明のいくつかの実施例によれば、フリーズドライ法及び／又は凍結乾燥法を選択的に適用して、本発明によるシーラント成分を、カテーテル、トロカールまたはインプラント、あるいはその他のこのような医療デバイスの表面に接着させるあるいは固定させることができる。これは、貫通創傷における止血とその閉塞を容易にし、例えば、動脈カテーテル／デバイスに選択的に有益である。動脈手術後の止血は、抗凝血薬で治療を行っている患者、あるいは出血性合併症にかかりやすい患者にとって重要である。本発明の止血成分は、血栓と無関係であり、従って、過剰出血を防止するさらなる補助を提供する。
【０２４８】
デバイス、組成物、またはバンデージの使用
止血ドレッシング、デバイスあるいは止血剤を使用する間、ゼラチンとトランスグルタミナーゼは、ドレッシング、デバイスあるいは粒状混合物が、出血している創傷あるいは漏れが生じている創傷から出ている患者の内部から生じる流体（例えば、血液、空気、胆汁、腸液など）によって創傷組織に適用される時点で、活性化され得る。代替的に、創傷組織からの流体ロスがタンパク質層の水和を適度に提供するのに十分でないような場合、ゼラチンとトランスグルタミナーゼは、選択的に、必要な共通因子及び／又はタンパク質を含む生理学的に受容可能な液体（例えば、水、緩衝液、生理食塩水）を、止血ドレッシング、デバイスあるいは止血剤を創傷組織に適用する前、あるいは、適用時に、適用することによって活性化することができる。
【０２４９】
本発明の原理及び操作は、図面と以下の説明を参照するとよりよく理解することができる。
【０２５０】
ここで図面を参照すると、図１は、本発明の例示的なバンデージの概略ブロック図である。図に示すように、バンデージ１００は、少なくとも一の、好ましくは複数のゼラチン層１０２を特徴としており、説明だけの目的で、なんら限定することなく、二つの層が示されている。少なくとも一層のトランスグルタミナーゼ１０４を設けることが好ましく、本例では、トランスグルタミナーゼ層１０４が、説明だけの目的で、なんら限定することなく、複数のゼラチン層１０２の間に挟まれて示されている。適当な支持体１０６も示されており、これは、バンデージ１００に機械的な強度を好適に提供している。支持体１０６は、選択的に、例えば、Ｄｅｘｏｎ（商標）またはＶｉｃｒｙｌ（商標）として提供されているような、ポリグリコール酸メッシュまたはパッチとして、実装することができる。
【０２５１】
図２は、本発明の例示的なバンデージの正面図である。このバンデージは、選択的な吸収性支持体と、選択的なプラスチックラッピングで覆われている。
【０２５２】
図３は、多孔性マトリックスを組み入れた本発明に係る止血デバイスの一例を示す概略ブロック図である。図に示すように、止血デバイス３００は、好ましくは、少なくとも一の、及び好ましくは複数のゼラチン層３０２を特徴としており、説明だけの目的で、なんら限定することなく、二つの層が示されている。好ましくは、少なくとも一のトランスグルタミナーゼ層３０４が示されており、本例では、トランスグルタミナーゼ層３０４は、説明だけの目的で、なんら限定することなく、複数のゼラチン層３０２の間に挟まれて示されている。好適な支持体３０６も示されており、これは、バンデージ３００に好適に機械的強度を提供している。支持体３０６は、いずれかのタイプの生体分解性材料として選択的に実装することができる。
【０２５３】
以下に述べる例を参照すると、本発明に係る様々な組成物が構築されて、出血を低減し、止血を誘発するその能力が試験されている。試験を行った組成物は、非常に強力であり、動物実験では、たとえ動脈の出血でも、出血を止めることができることがわかった。
【０２５４】
例１
具体的な接着剤の調製
本例は、本発明に係る、具体的かつ非限定的な接着剤の調製に関する。本例では、カルシウム非依存性の微生物トランスグルタミナーゼ（ロットＮｏ．Ｌ−０４２０７、Ajinomoto USA, Chikago, IL）を、１００Ｕ／ｇｍの特別な活性レベルで使用した。試験を行ったゼラチンは、豚の表皮から取ったゼラチンタイプＡ、３００ブルーム（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO）であった。
【０２５５】
以下の方法を用いて、具体的な接着剤を調製した。ＰＢＳ中２０％ｗ／ｗのゼラチン（リン酸緩衝生理食塩水：８０ｇのＰＢＳに２０ｇのゼラチンを入れた）を調製した。次いで、２０％ｗ／ｖｍＴＧ溶液をＰＢＳ中で調製した（１ｇｍ  ｍＴＧを５ｍＬ  ＰＢＳに入れた）。次いで、５ｇのゼラチン溶液を、０．５ｍＬのｍＴＧ溶液と混合した（換言すると、１０：１の比）。
【０２５６】
図４は、接着剤の接着強度に関する、パーセンテージの異なるゼラチンの効果を示す図である。豚の表皮サンプルを、第2の豚の表皮サンプルに接着させ、接合部に４７．５ｇの重りを付けて、直後に水中に１２０分間沈めて、接着強度を測定した。この水中に浸した期間の後、５ｍｍ／分で張力を掛けて、最終的な接着強度を測定した（Mcdermott et al. Biomacromolecules 2004, 5, 1270-1279）。
【０２５７】
図５に示すように、微生物トランスグルタミナーゼの最適反応レベルは、５０−５５℃の範囲である。３７℃の生理的レベルでは、この反応レベルは、最適レベルの約６０％にすぎない。このように、発熱剤を用いた反応温度の上昇が、反応レベルを上げて、ゼラチンの架橋速度があがる。従って、選択的に及び好ましくは、発熱剤は本発明の一部である。
【０２５８】
塩化カルシウムは、溶解時に熱を放出するので、このような発熱剤の一部として選択的に使用することができるが、組織にダメージを与える加熱には不十分である。また、上述したように、カルシウムは、発熱溶解から独立した、別の方法で反応を加速することがある。
【０２５９】
選択的に、非毒性の発熱物質を、一又はそれ以上の架橋因子と共にバンデージに含ませることができる。上述したように、代替的に、あるいは、追加で、バンデージ支持体の後に、一又はそれ以上の非再吸収性発熱剤を選択的に加えることができる。
【０２６０】
例２
インビトロでの破裂圧力テスト
本例は、本発明に係る組成物の、高圧の動脈血流の耐性能力の代用としての破裂耐性能力を示す。破裂圧力システムは、以下に述べるように、血液に代えて暖かいＰＢＳを用いて豚の表皮サンプルの創傷に圧力を加えて高圧血流を擬するために開発された。２分間２００ｍｍＨｇの耐圧が、常にほぼ２００ｍｍＨｇより低い生理的血圧としての成功基準であると考えられる。これらの破裂テストの結果、本発明の組成物は、高圧の動脈流を含む血流の治療に好適であることがわかった。
【０２６１】
ほとんどのサンプル（１０例中８例）が、２分間、２００ｍｍＨｇの加圧に耐えた。パスしなかったサンプルは、人的あるいはシステムエラーによるものであった。平均破裂圧力は、３２０±５０ｍｍＨｇであったが、破裂しなかったサンプルは３５４ｍｍＨｇの数値となっており、これは実験装置によって測定可能な最大圧であるので、この数字は控えめな数字である。これらの結果は、厳密な試験条件下であったとしても、止血用に使用される本発明のいくつかの実施例による接着剤組成物の能力を示している。
【０２６２】
材料
ゼラチン（豚から採取したタイプＡ、ブルーム値３００）をSigma-Aldrich(St. Louis, MO)から得た。カルシウム依存性の微生物トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）混合物ＴＧ−ＴＩをAjinomotoから得て、更に精製することなく使用した。この酵素は、製造者によって、１００Ｕ／ｇの特別な活性を有すると報告されている。豚の表皮組織を、地域の食料品店から購入した。
【０２６３】
サンプルの調製
豚の表皮を、希釈水酸化ナトリウムで１時間処理した後、直径約６−６．５ｃｍのディスク形状に切断した。表皮の上の脂肪をメスで除去した。表皮の中央に２ｍｍの孔を開けて、創傷をシュミレートした。表皮を大量の水とＰＢＳ緩衝液で洗浄し、約１ｍｌのＰＢＳ緩衝液と共にペトリ皿に保存して、使用するまで表皮を湿った状態に保った。ここに述べる全ての実験について、ＰＢＳ緩衝液として、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水をｐＨ７．４で用いた。
【０２６４】
ＰＢＳ緩衝液中のゼラチン溶液（２５％ｗ／ｗ）を毎日新しく調製して、使用前に６５℃で保存した。ＰＢＳ緩衝液中のｍＴＧ（２０％ｗ／ｗ）ストック溶液を調製して、２ｍｌのバイアルにアリコートし、−１８℃で保存した。この酵素溶液は、使用前に室温で解かした。
【０２６５】
この表皮表面を、接着剤を適用する前に実験組織ワイプ（lab tissue wipe）を用いて手で触れられる程度に乾燥させた。１ｍｌのゼラチンと、０．５ｍｌのｍＴＧを混合して、２ｍｌのバイアルに接着剤を調製した。二つの組成物を比較した。組成物Ａを、Ajinomotoのトランスグルタミナーゼに使用し、組成物Ｂを（Yiming Biological Products Co., (Jiangsu, China)からのトランスグルタミナーゼに使用して、上述の好ましい製品とした。０．６ｍｌの結果混合物（本発明による、例示的な組織接着組成物）を孔の上から豚の表皮に適用した。この接着剤を適用した後、皮膚組織を３７℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後直ちに破壊試験を行った。
【０２６６】
破壊試験
組み立て前に自家製デバイスを暖かい緩衝液（〜４４℃）中で平衡化させた。インキュベートした皮膚をこのデバイスに素早く組み入れた後、約５０ｍｌの４２℃ＰＢＳ緩衝液をデバイス中の皮膚組織の上に注ぎ入れた。窒素ストリームを手動で制御して圧力を上げた。破壊試験の全手順は以下の通りであった：
ステップ１    圧力を２００ｍｍＨｇに上げて、２分間維持する
ステップ２    圧力を３００ｍｍＨｇに上げて、２分間維持する
ステップ３    圧力を３５４ｍｍＨｇ（測定可能な最大圧力）まで上げる
【０２６７】
制御として、純粋なゼラチン溶液を表皮の上に適用し、物理的なゲルを形成することによって、室温で３０分間ゲル化（すなわち、設定）させた。ゼラチン−暖は、物理的なゼラチンゲルを溶かすことができる、４２℃の緩衝液の使用を意味する。
【０２６８】
結果
図６は、組成物Ａに基づく組織接着剤の代表的な破裂圧力測定を示す。図６にはサンプル＃４と＃５のデータが示されている。組成物Ａについての破裂テスト結果の概要を表２に示し、サンプルの全リストを表３に示す。
【０２６９】
0005581056.tif 000003
＊「破裂なし」のサンプルには、３５４ｍｍＨｇの数値（測定可能な最大圧力）を適用した。
【０２７０】
0005581056.tif 000004
＊２００ｍｍＨｇ以上で、デバイスが漏れ始めた。デバイスをきつく閉めることで、圧力が上がるが、皮膚も歪み、２３２ｍｍＨｇで接着失敗が生じた。
【０２７１】
図７は、組成物Ｂの組織接着の代表的な破裂圧力測定値を示す。図７のサンプル番号＃４と＃５についてのデータが示されている。サンプルの全リストの結果を図４に示す。
【０２７２】
0005581056.tif 000005
＊これらのサンプルの圧力は、圧力放出バルブがないため、圧力を手動で制御して、何らかの形で２００ｍｍＨｇに設定した。
【０２７３】
例３
ラットモデルにおける止血
本例は、生きた動物において止血を行う、本発明によるゼラチン−ｍＴＧ組成物の初期インビボでの実証を提供する。ラットは、成体雌シリアンラットである。
【０２７４】
材料
ＰＢＳ中の２５％ｗ／ｗゼラチン（Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)から入手した、豚、タイプＡ、３００ブルーム）のゼラチン溶液を用いた。加熱した（５０℃）ＰＢＳをゼラチンパウダーに混ぜて溶液を混合した。これは、手動でへらを用いて攪拌した。適用前に、ゼラチン溶液を、５０℃のウオーターバスに漬けたキャップをした５ｍＬシリンジで保存して、その液相を維持した。
【０２７５】
トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）溶液を、ＰＢＳ中の２０％ｗ／ｗ微生物トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）（Activa WM, Ajinomoto）溶液とした。ｍＴＧ溶液を室温で維持した。
【０２７６】
適用前に、２ｍＬのエッペンドルフ型試験管中で、０．５ｍＬのｍＴＧ溶液に１ｍＬのゼラチン溶液を加えた。この試験管を２、３回反転させて溶液を混合させ、１ｍＬのピペット先端を用いて創傷部位に適用した。これは、実験溶液である。
【０２７７】
コントロール溶液として、ｍＴＧ溶液を加えることなくこのプロトコルを繰り返して、ゼラチン単独で処理を行った。
【０２７８】
実験溶液とコントロール溶液の双方について、ピペット先端を端部から約１／２ｃｍカットして開口を広げ、粘性のあるゼラチン−ｍＴＧ溶液が通過できるようにした。
【０２７９】
肝臓創傷
実験アプリケーションとコントロールアプリケーションの双方について、肝臓の左葉を吻側から尾側へ向かう方向にメスで切除して、長さ１ｃｍ、深さ１／２ｃｍの矢状切断部を作った。約１０秒の出血後、ゼラチン（コントロール）またはゼラチン−ｍＴＧ（実験）溶液の適用前に、綿ガーゼを用いてたまった血液を除去した。
【０２８０】
まず、実験溶液を葉の左側の切断部に適用した。適用後約２分でゲルが形成され、適用後約２．５分経たないうちに出血か完全に止まった。５分後、組織を良く動かして、かん子を用いて創傷部位、さらに無傷で残っているゲル、及び閉じた創傷に張力をかけた。図８は、ゲルの形成と、止血の誘発を示す写真である（図８Ａは、全領域を示し、図８Ｂはこの領域の一部を更に詳細に見るために拡大して示す）。
【０２８１】
その後、コントロール溶液を葉の右側の切断部位に適用した。ゲルが形成されず、ほとんどの溶液が血液の流れによって創傷部位の外に押し流された。６−７分後も、血栓ができることなく、肝臓が出血し続けた（図９Ａ）。
【０２８２】
コントロール溶液を取り除き、次いで実験溶液を貯まった血液を取り除くことなく創傷部位に適用した。貯留した血液は肝臓への実験溶液の接着を目に見えて妨害したが、ゲルが形成され、約１分後に血流が非常に遅くなり、４．５分後に完全に止まった（図９Ｂ）。このことは、本発明の組成が血流を遅くして、貯留した血液が存在していても止血を誘発することがわかった。
【０２８３】
大腿動脈切断
ラットの左大腿動脈をメスで切断した。約１０秒の大量出血の後、ゼラチン−ｍＴＧ（実験）溶液の適用直前に、綿ガーゼで貯留した血液を除去した。溶液が適用されると、ゲル化が行われているときに血液が実験ゲルと混ざった。これらの厳しい条件下で、３分経たないうちにゲルが完全に出血を止めた。５分後に、かん子を用いてゲルを手動で試験した。ゲルは、著しく剛性が低く、血液と良く混ざった時の接着性は低かったが、切断された動脈部位上に強い血栓を形成した。図１０Ａ−Ｄは、切断時の動脈の写真であり（図１０Ａ）、切断した動脈は多量に出血しており（図１０Ｂ）、本発明の組成物を切断した動脈に適用し（１０Ｃ）、生体模倣血栓の形成により止血した（図１０Ｄ）。
【０２８４】
次いで、ラットの右大腿動脈をメスで切断した。約１０秒の出血の後、ゼラチン−ｍＴＧ（実験）溶液の適用直前に、綿ガーゼで貯留した血液を除去した。大量の出血が観察されたが、ほぼすぐにゲルによって止まり、一分経たないうちに出血が止まった。ゲルが非常に強力に効力を奏し、ゲルによって捉えられた血液を容易に観察することができた。５分後に、かん子を用いてゲルを手動で試験した。捉えた血液が形成したゲル中に存在するにもかかわらず、ゲルは、非常に強力に動脈領域の組織に接着されていた。
【０２８５】
このように、本発明に係る組成物は、（例えば、動脈、及び／又は、限定するものではないが、例えば、肝臓、胃、腎臓、心臓、肺及び／又は皮膚などを含む血管新生器官などから）貯留した血液及び／又は大量出血が存在したとしても、明らかに、出血速度を遅くし、インビボモデルで止血を誘発する。
【０２８６】
例４
豚モデルにおける止血
本例は、大きな動物モデルにおいて止血を行うための本発明によるゼラチン−ｍＴＧ組成物の初期インビボでの実証を提供する。大きな動物モデルにおける止血作用の潜在性を明らかに示した。
【０２８７】
材料
ＰＢＳ（ｐH７．４）中の２５％ｗ／ｗゼラチン（Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)から入手した、豚、タイプＡ、３００ブルーム）のゼラチン溶液を以下に示すように調製した。ＰＢＳをホットプレート磁気攪拌機を用いて６０℃で連続的に攪拌し、ゼラチンパウダーを徐々に追加した。ガラス棒を用いて手動で時々攪拌し、パウダーの溶解率をあげて、均質な溶液を作った。全実験を通じて、ゼラチン溶液を、〜５０℃に調整したサーマルバスに保存してその液相を維持し、熱可逆性ゲルの形成を防止した。
【０２８８】
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に溶かした２０％ｗ／ｗ微生物トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）（Activa WM, Ajinomoto）溶液とした。これは、以下の通り調製した。室温（ＲＴ）のＰＢＳ溶液を磁気攪拌機で攪拌して、ｍＴＧパウダーを徐々に加えた。実際に使用する場合を除き、全実験を通して、ｍＴＧ溶液を〜３０℃に調製したサーマルバスで保持した。
【０２８９】
成体の体重４５ｋｇのメス豚に、実験開始前に通常の麻酔を行った。実験を通じて、この豚に酸素を供給して、生体信号をモニタした。
【０２９０】
以下に述べるような創傷部位への適用の前に、本発明のゼラチン−ｍＴＧ溶液を調製して、アプリケータを用いて創傷部位にシーラントを配置した。いくつかの異なるアプリケータを、バンデージ支持材料として実験した。記載していない限り、創傷部位へ即座に適用する前に、６ｍＬの新規な外科用シーラント溶液をアプリケータ上に散布し、ＲＴで１分間冷却した。このシーラント含有パッドは、「バンデージ原型」と考えられる。「コントロールバンデージ」として、同じであるが、アプリケータ上にコントロール溶液を散布したプロトコルを行った。
【０２９１】
新規な外科用シーラント溶液−２：１のゼラチンとｍＴＧ混合物を調製した。記載していない限り、この混合物は、１５ｍＬの試験管中で、２ｍＬのｍＴＧ溶液を４ｍＬのゼラチン溶液に加えることによって調製され、この試験管を５回反転させて、溶液を混合させた。
【０２９２】
コントロール溶液−コントロール溶液として、ｍＴＧ溶液に代えてＰＢＳを用いること以外の、新規な外科用シーラント調製の手順を繰り返した。従って、ゼラチンは２：１の非でＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）で希釈され、〜３０℃のサーマルバスに漬けた。記載していない限り、１５ｍＬの試験管中で、２ｍＬのＰＢＳ溶液を４ｍＬのゼラチン溶液に加えることによって混合物を調製し、この試験管を５回反転させて、溶液を混合させた。
【０２９３】
アプリケータを以下の通り使用した：
１．４ｃｍ×４ｃｍの綿ガーゼパッド
２．４ｃｍ×４ｃｍの使い捨てプラスチックバック吸収パッド。溶液をこのパッドのプラスチックの非吸収側に散布した。
３．シリコンモールド
４．シリコンモールド内に配置した４ｃｍ×４ｃｍの使い捨てプラスチックバック吸収パッド。溶液をこのパッドのプラスチックの非吸収側に散布した。
５．大きな縁のある透明フレキシブルプラスチックモールド
６．シリンジを用いて、あるいは１５ｍＬ試験管から流出させて、創傷部位へのシーラントの直接適用
【０２９４】
この研究における新規な外科用シーラントの適用は、外科医が様々なアプリケータを用いて創傷部位にシーラントを手動で配置することによって行われる。必要があれば、綿ガーゼを用いて、貯留した血液を適用直前に除去する。バンデージの反対側に３分間止血圧をかけた。３分後、外科医が圧力を緩め、創傷部位を止血したかどうか観察した。完全な止血が生じない場合は、受容される外科的止血技術で創傷部位を閉じる。コントロールバンデージを除去した後、止血が観察されなければ、受容される止血技術を直ちに適用して、同技術の後にコントロール溶液を適用した。
【０２９５】
殿筋の創傷
動物を腹臥位にして、殿筋の上の皮膚を除去した。全体で、７回実験を行い、止血及び組織接着を試験した。記載されていない限り、各トライアルで、３ｃｍ×３ｃｍの筋肉を、＃１５のメスで筋肉内２ｃｍの深さに切った。必要に応じて創傷領域からの過剰な血液を除去して、新規な外科用シーラント溶液またはコントロール溶液を上述したとおり適用した。
【０２９６】
表５及び６は、実験手順と各実験結果を要約して述べたものである。表５は止血に関するものであり、表６は組織接着特性に関する。
【０２９７】
まず止血に関して言えば、コントロール溶液を綿ガーゼパッドを用いて創傷部位に適用した（表５、コントロール＃１）。このコントロール溶液は、即座に適用する前に綿ガーゼの上に適用して、１分２０秒間おいて冷却した。創傷部位は軽く出血しており、コントロールバンデージの提供後２分で完全な止血が観察された。創傷部位に生体模倣血栓は観察されなかったが、創傷部位に掛けた止血圧は止血するのに十分であった。
【０２９８】
使用するアプリケータが使い捨てで、裏がプラスチックでできた吸収パッドであり、コントロール溶液を適用前に３０秒間おいた（表５、コントロール＃２）点が異なる実験を、別の創傷部位に繰り返した。創傷部位はわずかに出血しており、コントロールバンデージ適用後２分で完全な止血が観察された。前の場合と同様に、止血はおそらくバンデージを適用しつつ、創傷部位に止血圧をかけたことによる。創傷部位に生体模倣血栓は観察されなかった。
【０２９９】
最初の二つのコントロール実験で観察されたのは少量の出血であったため、より深い、深さ４ｃｍ（表５、コントロール＃３）に切って、実験を繰り返した。この結果、大量の出血が観察された。吸収パッドの上からコントロール溶液を適用して、５０秒間置いた。外科医が創傷領域から過剰な血液を取り除き、コントロールバンデージを適用した。３分後、出血は減ったが、完全な止血は観察されなかった。
【０３００】
綿ガーゼを用いて前の実験で作った創傷部位からコントロール溶液を除去した。出血がまだ観察されていた。新しい外科用シーラントをこの創傷領域に適用して、止血を行った（表５、シーラント＃１）。このシーラント溶液を、吸収パッドの上において、１分間置き、創傷部位に適用した。３分後、完全な止血が観察された。このシーラントは、創傷部位の上に生体模倣血栓を形成した。かん子を用いてゲルを攪拌し、組織への強い接着が観察された。このゲルを、力を加えて取り除くとフィルムができた。このように、これらの結果は、本発明の組成物の止血特性を示した。
【０３０１】
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【０３０２】
殿筋モデルにおいてシーラントの止血容量を示した後、組織接着力を実験した（表６）。外科的切除を行って、創傷部位を開き筋肉床から組織セグメントを取り出した。
【０３０３】
最初の接着力実験（表６、シーラント＃２）では、シーラントを創傷部位に直接適用し、外科医が組織の上側部分に強い当面の圧力を３分間かけたところ、創傷部位からシーラントが移動して接着されなかった。
【０３０４】
シーラントの適用後、外科医が中程度の圧力をかけたことが異なる以外、上記の実験を繰り返した（表６、シーラント＃３）。３分後、組織の接着が見られた。組織の上側部分を動かすと、この部分を完全に除去するのに中程度の抵抗があった。
【０３０５】
圧力をかけたときに創傷部位からシーラントが動かないように特に注意して実験を繰り返した（表６、シーラント＃４）。別の創傷部位において、シーラントを組織の両部分に適用し、１０分間置いた。次いで、組織の上側部分を元に戻して、中程度の圧力をかけた。３分後に、強い組織接着が観察された。その後、接着した組織を分離するには相当の力を必要とした。
【０３０６】
0005581056.tif 000007
【０３０７】
肝臓の止血
豚を背臥位にして、正中線を開腹して肝臓を露出させた。連続的に切り開いて徐々に肝臓の深いところの生検組織を除去し、より大きな血管を露出させた。全部で、５個の生検組織を作製した。必要があれば、綿ガーゼを用いて本発明の組成物を適用する直前に貯留した血液を除去した。
【０３０８】
最初の一連の生検組織について、コントロールバンデージを、バンデージの反対側に止血圧をかけると共に３分間適用した。３分後、外科医が圧力を開放して、創傷部位が止血しているか観察した。完全な止血が生じていない場合は、より深く生検組織を採取して、新規な外科用シーラントを適用した。再び、バンデージの反対側にシーラントを止血圧と共に３分間適用して、止血を試験した。完全な止血が観察されたら、より深く生検組織を採取して、このシーラントで実験を繰り返した。この実験は、より高い血圧に対するシーラントの止血能力を示した。表７は、実験手順と各実験の結果をまとめたものである。
【０３０９】
肝臓の左葉から深さ４ｃｍの生検組織を採取した（表７、コントロール＃１）。シリコンモールドに配置した吸収パッドにコントロール溶液を適用して、１分間置いた。コントロールバンデージを止血圧と共に創傷部位に適用した。３分後、圧力を解除したところ、止血が観察されなかった。
【０３１０】
コントロールバンデージの適用で止血されなかった後、深さ１ｃｍの生検組織を採取して、３０秒置いた。次いで、新規なシーラントを用いて実験を繰り返した（表７、シーラント＃１）。新規なシーラントをシリコンモールドのパッドの上に配置して、１分後に止血圧と共に創傷部位に適用した。３分後、圧力を開放し、プロトタイプのバンデージをはがし、止血を実験した。シーラントが、目に見える生体模倣膜を形成した。止血が行われたが、シーラントが創傷全体をカバーしていなかったので完全ではなかった。シーラントで覆った領域の出血が止まったことを目で見ることができた。数分後、生体模倣膜を取ると、出血が再開した。
【０３１１】
次に、深さ１ｃｍの生検組織を採取したところ、多量の出血が生じた。シリコンモールドをアプリケータとして用いて、過剰な血液を適用前に除去したこと以外、上記実験を繰り返した（表７、シーラント＃２）。次いで、外科医が創傷部位に３分間圧力をかけた。外科医が手を離すと、創傷部位に生体模倣血栓を見ることができた。血圧がこの生体模倣血栓を押していることが明らかであり、更に数分後、生体模倣シーラントの縁から血液のブリーチングがあった。このブリーチングは、シーラントでカバーされていなかった創傷部位の側部から生じた。このことは、この段階で、シーラントの止血能力が全創傷部位を覆うことに依存していることを示した。
【０３１２】
ブリーチングを防止するために、より多量のシーラントを創傷部位に適用したことを以外、先の実験を繰り返した（表７、シーラント＃３）。深さ０．５ｃｍの生検組織を肝臓葉から採取した。創傷部位に９ｍＬのシーラントを圧力と共に適用した。残念ながら、適用中、ほぼ全てのシーラントが創傷部位の側部からこぼれてしまい、外科医が圧力をかけた後は、認識できるシーラントが創傷部位に残っていなかった。
【０３１３】
この実験を繰り返した（表７、シーラント＃４）。別の深さ１ｃｍの生検組織を採取して、大量出血が観察された。今回は、１５ｍＬのシーラントを、余白の多い透明プラスチックモールドを用いて創傷部位に適用し、シーラントを適所に保持した。シーラントをアップリケータに乗せて、２０秒置いて冷やした。シーラントを創傷部位に適用して、４分後に生体模倣血栓の厚い層が観察され、完全な止血が行われた。５０分後に組織を再検査すると、まだ止血が観察された。このことは、十分なシーラントが創傷部位に適用され、適所に維持された場合の、シーラントの強力な止血能力を示している。形成された生体模倣膜は、組織表面に強力に接着されているので除去することが難しく、膜を除去すると、少量の出血が生じた。
【０３１４】
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【０３１５】
大腿動脈の止血
次いで、動脈、特に大腿動脈の創傷あるいは外傷に止血を誘発する本発明の組成物の能力を試験した。動物の右大腿動脈を露出させた。次いで、外科用メスの刃で、円形、長さ２ｍｍにカットした。大量の出血が観察され、止血かん子が使用された。シーラントを適用する直前に、綿ガーゼパッドで過剰な血液を除去した。約９ｍＬの新規な外科用シーラントを調製し、創傷領域の上にシリンジで適用した。４分後、止血かん子をゆっくり取り除くと、シーラントを介して止血が見られた。生体模倣血栓が観察され、完全な止血がなされた。表９は、実験手順と、この実験結果をまとめたものである。
【０３１６】
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【０３１７】
例５
ゼラチン上の塩酸グアジニンのプロトコル−効果及び架橋
本例は、例示的な変成剤である塩酸グアニジン（以下「ＧｕＣｌ」という）の、本発明のいくつかの実施例に係る組成物に対する効果に関する。好ましい濃度比範囲は、約１：２乃至約２：２  ＧｕＣｌ：ゼラチン、重量／重量である。
【０３１８】
溶液調製
１）１０ｇのＧｕＣｌ（Fluka, St. Louis, MO）を、室温で３０ｍＬのダルベッコＰＢＳ(Biological Indutries, Israel)に溶かした。１０ｇのタイプＡ、３００ブルーム、豚ゼラチンパウダ(Sigma, St. Louis, MO)を別に計量した。ゼラチンとＧｕＣｌ溶液を通常の攪拌によって混合し、均質な溶液を作った。結果物である溶液は、ゼラチン：ＧｕＣｌ比（ｗ：ｗ）が１：１であった。
【０３１９】
ＧｕＣｌの分子量（ＭＷ）は、９５．５３である。従って、この溶液のＧｕＣｌの最終濃度は３．４８９であった。最終溶液はゼラチン２０％ｗ／ｗであるが、体積では、ＰＢＳ中の２５％ｗ／ｗゼラチン溶液と同等であった。
【０３２０】
２）２ｇのＧｕＣｌを３０ｍＬのＰＢＳに室温で溶解させた。１０ｇのタイプＡ、３００ブルーム豚ゼラチンパウダを別に計量した。ゼラチンとＧｕＣｌ溶液を通常の攪拌により混合して、均質な溶液を形成した。結果物の溶液はゼラチン：ＧｕＣｌ比（ｗ／ｗ）が５：１であった。ＧｕＣｌの最終濃度は６９８ｍＭであった。最終濃度は２３．８％ｗ／ｗのゼラチンであるが、体積では、ＰＢＳ中の２５％ｗ／ｗゼラチン溶液と同等であった。
【０３２１】
３）６ｇのＧｕＣｌを３０ｍＬのＰＢＳに室温で溶解させた。１０ｇのタイプＡ、３００ブルーム豚ゼラチンパウダを別に計量した。ゼラチンとＧｕＣｌ溶液を通常の攪拌により混合して、均質な溶液を形成した。結果物の溶液はゼラチン：ＧｕＣｌ比（ｗ／ｗ）が５：３であった。ＧｕＣｌの最終濃度は２．０９Ｍであった。最終濃度は２１．７％ｗ／ｗのゼラチンであるが、体積では、ＰＢＳ中の２５％ｗ／ｗゼラチン溶液と同等であった。
【０３２２】
４）４ｇのＧｕＣｌを３０ｍＬのＰＢＳに室温で溶解させた。１０ｇのタイプＡ、３００ブルーム豚ゼラチンパウダを別に計量した。ゼラチンとＧｕＣｌ溶液を通常の攪拌により混合して、均質な溶液を形成した。結果物の溶液はゼラチン：ＧｕＣｌ比（ｗ／ｗ）が５：２であった。ＧｕＣｌの最終濃度は１．４０Ｍであった。最終濃度は２２．７％ｗ／ｗのゼラチンであるが、体積では、ＰＢＳ中の２５％ｗ／ｗゼラチン溶液と同等であった。
【０３２３】
５）８ｇのＧｕＣｌを３０ｍＬのＰＢＳに室温で溶解させた。１０ｇのタイプＡ、３００ブルーム豚ゼラチンパウダを別に計量した。ゼラチンとＧｕＣｌ溶液を通常の攪拌により混合して、均質な溶液を形成した。結果物の溶液はゼラチン：ＧｕＣｌ比（ｗ／ｗ）が５：１であった。ＧｕＣｌの最終濃度は２．７９Ｍであった。最終濃度は２０．８％ｗ／ｗのゼラチンであるが、体積では、ＰＢＳ中の２５％ｗ／ｗゼラチン溶液と同等であった。
【０３２４】
ｍＴＧの添加
ＰＢＳ中の１％の微生物トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）（Ajinomoto Activa TI-WM, Japan）、２０％ｗ／ｗ溶液を調製した。
【０３２５】
Ａ）透明な、４ｍＬのプラスチック試験管中で、２ｍＬの各ゼラチン−ＧｕＣｌ溶液を１ｍＬのｍＴＧ溶液と混合した。ｍＴＧ溶液をゼラチン−ＧｕＣｌ溶液中に注入した。各試験管を数回反転させて、立てた。
【０３２６】
Ｂ）プラスチック秤量皿中で、２ｍＬの各ゼラチン−ＧｕＣｌ溶液を１ｍＬのｍＴＧ溶液と混合した。混合物はピペット先端を用いて、手動で混合した。
【０３２７】
Ｃ）ゼラチン−ＧｕＣｌ溶液を４３℃に温めて、プラスチック秤量皿でゼラチン−ＧｕＣｌ溶液のアリコート２ｍＬを１ｍＬのｍＴＧ溶液と混合した。混合物は、ピペット先端を用いて、手動で混合した。
【０３２８】
Ｄ）ゼラチン−ＧｕＣｌ溶液１（１０ｇＧｕＣｌ）と５（８ｇＧｕＣｌ）を４３℃に温めて、プラスチック秤量皿でゼラチン−ＧｕＣｌ溶液のアリコート２ｍＬを２ｍＬのｍＴＧ溶液と混合した。混合物は、ピペット先端を用いて、手動で混合した。
【０３２９】
結果
１）１：１のゼラチン：ＧｕＣｌ溶液は、２分以内に室温で均質な溶液を形成した。溶液形成直後は、溶液が多くの気泡を含んでいた。室温で２時間置いた後、この気泡はほとんど全て溶液からなくなった。溶液は液体で残り、標準的なゼラチン溶液同様、黄色がかった透明であった。２４時間後、溶液の特性は変わらず、気泡はもう見えなかった。
【０３３０】
２）５：１のゼラチン：ＧｕＣｌ溶液は室温では均質な溶液を形成しなかった。室温でＰＢＳ中のゼラチンに通常生じるように、ゼラチン粒が膨張したが、溶解しなかった。溶液を形成するまで、溶液を４２℃に温めた。室温に冷却すると、約３２℃でゲルを形成した。
【０３３１】
３）５：３のゼラチン：ＧｕＣｌ溶液は、５−６分激しく攪拌した後、室温で均質な溶液を形成した。溶液形成直後は、溶液が多くの気泡を含んでいた。室温で２時間置いた後、この気泡はほとんど全て溶液からなくなった。溶液は液体で残り、標準的なゼラチン溶液同様、黄色がかった透明であった。溶液は液体であったが、１：１のゼラチン：ＧｕＣｌ溶液より粘性があった。しかし、困難を伴うことなくピペットで吸うことができた。２４時間後、溶液の特性は変わらず、気泡はもう見えなかった。
【０３３２】
４）５：２のゼラチン：ＧｕＣｌ溶液は、１０分激しく攪拌した後も、室温でやや粒状の溶液を形成した。溶液形成直後は、溶液が非常に多くの気泡を含んでいた。溶液形成直後は、この溶液は非常に粘性があるように見えたが、それでも液体であった。しかし、室温で２時間置いた後も、この気泡が溶液中に見られ、溶液はゲル状であった。溶液は、ピペットで吸うことが困難であり、他の溶液と混合するには粘性が高すぎた。２４時間後も、多くの気泡が残っており、この溶液は熱可逆性ゲルを形成していた。
【０３３３】
５）５：４のゼラチン：ＧｕＣｌ溶液は、２−３分攪拌した後、室温で均質な溶液を形成した。溶液形成直後は、溶液が多くの気泡を含んでいた。室温で２時間置いた後も、この気泡はほとんどが溶液中に残っていた。溶液は液体で残っており、標準的なゼラチン溶液同様、黄色がかった透明であった。溶液は液体であり、１：１のゼラチン：ＧｕＣｌ溶液より粘性があったが、５：３のゼラチン：ＧｕＣｌ溶液より粘性が低く、困難を伴うことなくピペットで吸うことができた。２４時間後、溶液の特性は変わらず、気泡はもう見えなかった。
【０３３４】
ｍＴＧ結果
Ａ）室温、４ｍＬ試験管中の２ｍＬゼラチン−ＧｕＣｌ溶液、１ｍＬｍＴＧ溶液
１）１：１のゼラチン：ＧｕＣｌ溶液については、４分後、試験管の上端に小さなゲル化した塊が形成された。この塊を除去して、更に１ｍＬのｍＴＧ溶液を加えた。３５分後、柔軟な媒体ゲルが形成された。マイクロウエーブで加熱して確認したところ、この塊は熱可逆性でなかった。しかしながら、この塊は架橋したゲルのように強く結合したものではなかった。この柔軟な媒体ゲルは、マイクロウエーブ加熱で、熱的に不可逆であることを確認した。
【０３３５】
２）５：１のゼラチン：ＧｕＣｌ溶液は、ｍＴＧと混合するには粘性が高すぎた。
【０３３６】
３）５：３のゼラチン：ＧｕＣｌ溶液については、４分後、試験管の上端に小さなゲル化した塊が形成された。この塊は除去しなかった。２０分後、溶解する間にゲル媒質が形成された。この塊は、残りのゲルと明らかに濃度が異なっていた。上述したとおり、この塊はマイクロウエーブで加熱して確認したところ熱可逆性でなかったが、それほど強く結合したものでもなく、さわると容易に崩れた。この形成されたゲル媒質は、マイクロウエーブで暖めると若干柔らかくなったが、熱的に不可逆であった。
【０３３７】
４）５：２のゼラチン：ＧｕＣｌ溶液の結果は、熱可逆性ゲル化の結果（ｍＴＧを加えなかったコントロール溶液によって示す）、ｍＴＧを添加した後最初の数分間は溶液が非常に粘性が高く、非常に不均一であった。１５分後、ほどほどの硬さのゲルが形成されたが、これは部分的に熱可逆性であり、加熱するとより柔らかくなった。
【０３３８】
５）５：４のゼラチン：ＧｕＣｌ溶液については、４分後、試験管の上端に小さなゲル化した塊が形成された。この塊は除去しなかった。３０分後、溶解する間にゲル媒質が形成された。この塊は、残りのゲルと明らかに濃度が異なっていた。上述したとおり、この塊はマイクロウエーブで加熱して確認したところ熱可逆性でなかったが、それほど強く結合したものでもなく、さわると容易に崩れた。この形成されたゲル媒質は、マイクロウエーブで暖めると若干柔らかくなったが、熱的に不可逆であった。
【０３３９】
Ｂ）室温、プラスチック皿の２ｍＬゼラチン−ＧｕＣｌ溶液、１ｍＬｍＴＧ溶液
プラスチック皿で混合した溶液のゲル化時間は、４ｍＬプラスチック試験管で混合した溶液のゲル化時間とほぼ同じであった。１：１のゼラチン：ＧｕＣｌは、３５分後に柔軟−中位のゲルを形成し、５：３のゼラチン：ＧｕＣｌは、２０分後に中位のゲルを形成し、５：４のゼラチン：ＧｕＣｌは、３０分後に中位のゲルを形成した。
【０３４０】
しかしながら、ｍＴＧをゼラチン−ＧｕＣｌ溶液に注入したときに観察されたゲル状塊は、これらの実験では観察されなかった。
【０３４１】
Ｃ）プラスチック皿での、４３℃の２ｍＬゼラチン−ＧｕＣｌ溶液、１ｍＬｍＴＧ溶液
この結果：１：１のゼラチン：ＧｕＣｌ溶液は、３５分後もゲルが形成されず、５：３のゼラチン：ＧｕＣｌ溶液は、１７分後に中位のゲルを形成し、５：４のゼラチン：ＧｕＣｌ溶液は、２５分後に中位のゲルを形成した。
【０３４２】
Ｄ）プラスチック皿での、４３℃の２ｍＬゼラチン−ＧｕＣｌ溶液、２ｍＬｍＴＧ溶液
この結果：１：１のゼラチン：ＧｕＣｌ溶液は、２５分後もゲルが形成されず、５：４のゼラチン：ＧｕＣｌ溶液は、９分後に中位のゲルを形成した。
【０３４３】
上記結果より、ＧｕＣｌはＰＢＳ中のゼラチンの溶解度を有意に改善することがわかった。ＰＢＳ中２５％ｗ／ｗゼラチン濃度では、５：４及び１：１のゼラチン：ＧｕＣｌ比でＧｕＣｌを添加することで、室温のＰＢＳ中にほぼ即座にゼラチンが溶解する。この効果は、５：３のゼラチン：ＧｕＣｌ比では有意に低減する。ＰＢＳ中２５％ｗ／ｗのゼラチン濃度では、５：３、５：４及び１：１のゼラチン：ＧｕＣｌ比でＧｕＣｌを追加することで、ゼラチン−ＧｕＣｌ溶液をいつまでも液体に保つことができる。５：２のゼラチン：ＧｕＣｌ比では、溶液が遅れて熱可逆性ゲル化され、２時間後には完全なゲルを形成する。２：１のゼラチン−ＧｕＣｌ溶液：ｍＴＧ溶液では、ゼラチン：ＧｕＣｌ溶液比が１：１であれば、ゲルが形成されなかった。より低いＧｕＣｌ濃度では、架橋ゲルが形成された。ゲル化時間は、ＧｕＣｌ濃度に依存しているように見える。
【０３４４】
ｍＴＧと混合する前にゼラチン−ＧｕＣｌ溶液を４３℃に温めることで、ゼラチン：ＧｕＣｌ比が５：４及び５：３の場合に、架橋プロセスを促進する。このことは、ｍＴＧ活性が５５℃までの反応温度で上がることが予期された。これは、おそらく、ｍＴＧ活性が上がると、ゼラチン：ＧｕＣｌ溶液がｍＴＧによってより迅速に架橋されるからである。
【０３４５】
ゼラチン−ＧｕＣｌ溶液：ｍＴＧ溶液比１：１では、ゼラチン：ＧｕＣｌ溶液比が１：１であっても、架橋ゲルが形成された。ｍＴＧ量の増加は、ゼラチン：ＧｕＣｌ溶液：ｍＴＧ溶液比１：２の場合の、ゲルのゲル化時間を著しく短くした。ゲル化時間は、ＧｕＣｌ濃度に依存していることが観察された。これは、同様に、ＧｕＣｌがおそらくある量のｍＴＧを変性させることによると考えられる。上記の量を加えたｍＴＧは、自由にゼラチンを架橋する。
【０３４６】
一つの仮定によって限定されることなく、より多くのｍＴＧ酵素が加わると、ゼラチン：ＧｕＣｌ溶液はｍＴＧによって、より迅速に架橋され得る。このことは、例えば、選択的にｍＴＧパウダからキャリアを除去して、この酵素自体の濃縮溶液を形成することによって、行うことができる。
【０３４７】
例６
プロトコル：  ゼラチンへＭｇＣｌ２を添加  −  ゲル化と架橋への影響
本例は、例示的な還元剤である塩化マグネシウムの、本発明のいくつかの実施例による組成物への影響に関する。ゼラチンを塩化マグネシウムに溶かす好ましい濃度範囲  −  ＰＢＳ溶液が約２乃至約４Ｍ、より好ましくは約２．５乃至約３．５Ｍである。
【０３４８】
材料と方法
材料
タイプＡ３００ブルーム豚ゼラチンとＭｇＣｌ２パウダ、−３２５メッシュをSigma-Aldrich Corporation (St, Louis, MO)から入手した。Activata TI-WM微生物トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）は、Ajinomoto(Japan)から供給された。ダルベッコＰＢＳ（ｐＨ７．４）をBiological Industries (Kibbutz Beit HaEmer, Israel)から入手した。
【０３４９】
ｍＴＧ溶液の調整：
新鮮なActiva TI-WM(Ajinomoto, Japan)微生物トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）混合物を、ダルベッコＰＢＳに溶かして調製し、２０％ｗ/ｗ溶液を作った。この溶液は、実験を通して室温（ＲＴ）に維持した。
【０３５０】
ゼラチン−ＭｇＣｌ２溶液の調製：
ゼラチンを濃度が異なるＭｇＣｌ２溶液に以下のとおり溶かした。
【０３５１】
溶液Ａ−５ｇのＭｇＣｌ２を１５ｍｌのダルベッコＰＢＳに溶かして、最終濃度３．５Ｍとした。ＭｇＣｌ２の溶解反応は、発熱し、９０℃に達する。この溶液を放置して、室温まで冷やした。５ｇのゼラチンを１５ｇの３．５Ｍ  ＭｇＣｌ２溶液に溶かして、室温で攪拌し、２５％のゼラチンアリコート(ｗ／ｗ)を調製した。
【０３５２】
溶液Ｂ−２．５ｇのＭｇＣｌ２を１５ｍｌのダルベッコＰＢＳに溶かして、最終濃度１．７５Ｍとした。ＭｇＣｌ２の溶解反応は、発熱し、６３℃に達する。この溶液を放置して、室温まで冷やした。５ｇのゼラチンを６３℃、１．７５Ｍ  ＭｇＣｌ２溶液１５ｇに溶かして、攪拌し、２５％のゼラチンアリコート(ｗ／ｗ)を調製した。
【０３５３】
ゼラチンのゲル化におけるＭｇＣｌ２の影響
異なる濃度のＭｇＣｌ２に溶かしたゼラチンを放置して室温に冷やした。温度計で各溶液の温度を測定した。ゼラチン−ＭｇＣｌ２溶液の外観と粘度は、温度が下がったときに観察し、ガラス棒で溶液を触ることによって評価した。
【０３５４】
ｍＴＧを用いたゼラチン溶液の化学架橋におけるＭｇＣｌ２の影響
ゼラチン−ＭｇＣｌ２「溶液Ａ」を、ｍＴＧを用いた化学架橋について試験した。１または２ｍｌの２０％ｗ／ｗｍＴＧ溶液を、４ｍｌのテクニコン社の試験管で、２ｍｌのゼラチン−ＭｇＣｌ２溶液と混合した。ゼラチン−ＭｇＣｌ２溶液を室温か、あるいはウオーターバスを用いて予め５０℃に暖めて加えた。この溶液をピペット先端でゆっくりとかき回して混合し、試験管を４回反転させてゲル化時間を測定した。ｍＴＧと混合した後のゼラチン−ＭｇＣｌ２溶液の外観と粘度を観察し、ガラス棒で溶液を触ることによって評価した。ゲルが形成されたときに、ウオーターバスを用いてこのゲルを５０℃に加熱することによって、熱可逆性を試験した。
【０３５５】
結果
ゼラチンのゲル化におけるＭｇＣｌ２の影響
溶液Ａ−３．５Ｍ  ＭｇＣｌ２溶液は、ゼラチンの転移点を下げた。ゼラチン−ＭｇＣｌ２溶液は室温では粘性があった。この溶液は、むしろ不透明に見え、小さな黒い粒子が存在した。これらの粒子は、おそらく酸化したマグネシウム粒子である。溶液Ｂ−１．７５Ｍゼラチン−ｍｇＣｌ２溶液は室温でゲル化した。転移点は２９℃であった。ゲルは不透明であり、おそらくマグネシウムの酸化によって形成された少量の黒い粒子が存在した。
【０３５６】
ｍＴＧを用いたゼラチン溶液の化学架橋におけるＭｇＣｌ２の影響
架橋に対するＭｇＣｌ２の影響を、溶液Ａを用いて以下のとおり試験した。２ｍｌのＲＴ溶液Ａを、１ｍＬのｍＴＧ溶液と混合した。９０分後に不加逆性ゲルができた。このゲルは非常に粘性が高く、いくらか柔かかった。２ｍＬの５０度に暖めた溶液Ａを、２ｍＬのｍＴＧ溶液と混合した。２５分後に不可逆性ゲルができた。このゲルはやや弱かった。このゲルを５０℃のウオーターバスで暖めると、粘性が上がった。
【０３５７】
上記より、ゼラチン溶液への塩化マグネシウムの添加は、ゼラチンの転移点を著しく下げるようである。この転移点は、塩化マグネシウムの濃度に反比例しているようである。この転移点は、３．５Ｍの塩化マグネシウムの添加により室温以下に下がる。１．７５Ｍの塩化マグネシウムでは、ゼラチン溶液の転移点は室温より若干高い。ゼラチンへの塩化マグネシウムの添加は、ゼラチン転移点を室温以下に下げる最小濃度を見つけるように最適化すべきである。
【０３５８】
塩化マグネシウムの存在下でｍＴＧを用いてゼラチンを架橋できることも示されている。塩化マグネシウムは、ゼラチンの架橋率に不利な影響を与える。この影響をなくすために、より多量のｍＴＧを選択的に加えるようにしても良い。
【０３５９】
５０℃でのｍＴＧ活性は、室温でのｍＴＧ活性よりはるかに大きい。これは、理論データを確認するものであり、発熱エレメントをゼラチン−ｍＴＧ混合物に加えて、反応温度がＲＴより確実に高くなることの有用性を示している。
【０３６０】
上述のデータから、塩化マグネシウムの発熱溶解を選択的に用いて、ゼラチンを液状化するとともに、ｍＴＧ活性を上げることができる。
【０３６１】
例７
プロトコル：  ゼラチンへハイドロキノンの添加−ゲル化と架橋への影響
本例は、例示的な還元剤であるハイドロキノンの、本発明のいくつかの実施例による組成物への影響に関する。ハイドロキノンは天然に存在する、水溶性還元剤である。還元剤は、ゼラチンの溶解度を上げて、室温（ＲＴ）で液体に維持することができる。ゼラチンをハイドロキノン−ＰＢＳ溶液に溶かす好ましい濃度範囲は約０．２乃至約０．５Ｍであり、より好ましくは、約０．３乃至約０．４Ｍである。
【０３６２】
材料と方法
材料
タイプＡ３００ブルーム豚ゼラチンとハイドロキノン（ReagentPlusTM, ＞99%）をSigma-Aldrich Corporation (St, Louis, MO)から入手した。Activata TI-WM微生物トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）は、Ajinomoto(Japan)から供給された。ダルベッコＰＢＳ（ｐＨ７．４）をBiological Industries (Kibbutz Beit HaEmer, Israel)から入手した。
【０３６３】
ｍＴＧ溶液の調整：
新鮮なActiva TI-WM(Ajinomoto, Japan)微生物トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）混合物を、ダルベッコＰＢＳに溶かして調製し、２０％ｗ/ｗ溶液を作った。この溶液は、実験を通して室温（ＲＴ）に維持した。
【０３６４】
ゼラチン−ハイドロキノン溶液の調製：
ゼラチンを濃度が異なるハイドロキノン溶液に以下のとおり溶かした。
【０３６５】
溶液Ａ−２．７５ｇのハイドロキノンをダルベッコＰＢＳに溶かして、最終濃度０．５Ｍとした。この実験を通して、この溶液を密封したビーカで保持し、アルミニウムフォイルに包んで溶液が空気と光に露出しないようにした。５ｇのゼラチンを１５ｇの０．５Ｍハイドロキノン溶液に混合して、攪拌し、０．５Ｍハイドロキノン中の２５％のゼラチンアリコート(ｗ／ｗ)を、調製した。
【０３６６】
溶液Ｂ−１．３２ｇのハイドロキノンをダルベッコＰＢＳに溶かして、最終濃度０．４Ｍとした。この実験を通して、この溶液を密封したビーカで保持し、アルミニウムフォイルに包んで溶液が空気と光に露出しないようにした。５ｇのゼラチンを１５ｇの０．５Ｍハイドロキノン溶液に混合して、攪拌し、０．４Ｍハイドロキノン中の２５％のゼラチンアリコート(ｗ／ｗ)を、調製した。この混合物を攪拌して５０℃のウオーターバスで暖めた。
【０３６７】
ゼラチンのゲル化におけるハイドロキノンの影響
異なる濃度のハイドロキノンに溶かしたゼラチン溶液を室温に保つか、５０度のウオーターバスで暖めて、室温に冷やした。温度計で各溶液の温度を測定した。ゼラチン−ハイドロキノン溶液の外観と粘度は、温度が下がったときに観察し、ガラス棒で溶液を触ることによって評価した。
【０３６８】
ｍＴｇを用いたゼラチン溶液の化学架橋におけるハイドロキノンの影響
ゼラチン−ハイドロキノン「溶液Ｂ」を、ｍＴＧを用いた化学架橋について試験した。１ｍｌの２０％ｗ／ｗｍＴＧ溶液を、４ｍｌのテクニコン社の試験管で、２ｍｌのゼラチン−ハイドロキノン溶液と混合した。この溶液をピペット先端でゆっくりとかき回して混合し、試験管を４回反転させてゲル化時間を測定した。ｍＴＧと混合した後のゼラチン−ハイドロキノン溶液の外観と粘度を、観察と、ガラス棒で溶液を触ることによって評価した。ゲルが形成されたときに、ウオーターバスを用いてこのゲルを５０℃に加熱することによって、熱可逆性を試験した。
【０３６９】
結果
ゼラチンのゲル化におけるハイドロキノンの影響
溶液Ａ−室温、０．５Ｍ  ハイドロキノン溶液は、ゼラチンを溶解しなかった。ハイドロキノン溶液に吸収されたゼラチンパウダは、粒状で、茶色の不均一溶液を作る。溶液Ｂ−０．４Ｍ  ハイドロキノン溶液は、ゼラチンの転移点を下げた。ハイドロキノン溶液は、室温ではゼラチンを溶解しなかった。５０℃のウオーターバスで混合物を暖めると、ゼラチンがとけ、均質な溶液が得られた。この溶液を室温に冷やした。２８度で、ゼラチンは可溶性を保つが、非常に粘性があった。室温に冷やすとゲルが形成された。ゲルは茶色であった。
【０３７０】
ｍＴＧを用いたゼラチン溶液の化学架橋におけるハイドロキノンの影響
架橋に対する影響を、溶液Ｂを用いて試験した。５０度に暖めた２ｍｌの溶液Ｂを、１ｍＬのｍＴＧ溶液と混合した。４分後に不加逆性ゲルができた。このゲルは強く、２５％(ｗ／ｗ)のゼラチンを単独で２０％(ｗ／ｗ)のｍＴＧと混合してできた架橋ゲルと似ていた。
【０３７１】
上記より、ゼラチン溶液へのハイドロキノンの添加は、ゼラチンの転移点を下げるようである。０．４Ｍのハイドロキノンで、このゼラチンの転移点は、室温（２８℃）より若干高い。
【０３７２】
ゼラチンの転移点を下げる方法として試験されたその他の物質と逆に、ハイドロキノンは、ゼラチンとｍＴＧの架橋について有意な抑制効果がなかった。
【０３７３】
上述のデータに示すように、ハイドロキノンは、ゼラチンのｍＴＧ架橋にマイナスの影響を与えることなく、ゼラチンのゾル−ゲル転移温度を下げるのに選択的に使用することができる。このことは、すでに述べたとおり、本発明の多くの実施例にとってたいへん望ましい。
【０３７４】
例８
プロトコル：  ゼラチンへＣａＣｌ２の添加−ゲル化と架橋への影響
本例は、例示的な乾燥剤である塩化カルシウムの、本発明のいくつかの実施例による組成物への影響に関する。ゼラチンの転移点を下げるためにゼラチンを塩化カルシウム−ＰＢＳ溶液に溶かす好ましい濃度範囲は約１乃至約２Ｍである。ゼラチンの溶解を助ける、あるいはｍＴＧ活性を上げる発熱反応を作るための正確な量はいくつかの要因に依存するが、室温以上にセ氏温度を上げるために、溶液１ｍＬあたり０．２−０．７ｇの塩化カルシウムを選択的に及び好適に加える。
【０３７５】
ＤＰＢＳ中のゼラチン−塩化カルシウム溶液を以下のとおり調製した。１００ｍＬのダルベッコＰＢＳ（Biological Industries）中に、４４．３９６ｇのＣａＣｌ２（９７％、ＭＷ＝１００．９９、Alfa Aesar, lancaster）を攪拌しながら溶解させて、４Ｍ  ＣａＣｌ２ストック溶液を調整した。溶解後、この溶液は、発熱性ＣａＣｌ２溶解反応の結果、８０℃のピーク温度に達した。
【０３７６】
溶液１を以下のとおり調製した。５ｇのタイプＡ、３００ブルーム豚ゼラチンパウダ（Sigma, St. Louis, MO）を計量した。５ｇのゼラチンに、濃度の異なるＰＢＳ−ＣａＣｌ２溶液１５ｇを加えて、ＰＢＳ−ＣａＣｌ２中の２５％ｗ／ｗ溶液を形成した。ゼラチン−ＣａＣｌ２は、場合により手動攪拌と同様に、攪拌バーを用いて混合し、塊を分散させた。試験したＣａＣｌ２濃度は：
ａ．ＰＢＳ中の２Ｍ  ＣａＣｌ２溶液
ｂ．ＰＢＳ中の２Ｍ  ＣａＣｌ２溶液
ｃ．ＰＢＳ中の１Ｍ  ＣａＣｌ２溶液
【０３７７】
ａ及びｂの両方については、それぞれ、４ｍＬのプラスチック試験管で、２ｍＬのゼラチン−ＣａＣｌ２溶液を１ｍＬの２０％ｗ／ｗ微生物トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）パウダ溶液と混合した。使用したｍＴＧ製品（Activa TI-WM, Ajinomoto, Japan）は、ｍＴＧ製品パウダの約１００U／ｇの特定の活性を有していた。
【０３７８】
溶液２を以下のとおり調製した。１０ｇのｍＴＧパウダを４０ｍＬのＰＢＳに溶かして、２０％ｗ／ｗｍＴＧのベース溶液を形成した。
【０３７９】
ａ．５ｇのゼラチンを１５ｍＬのＰＢＳに溶かして、ゼラチン−ＰＢＳ混合物をマイクロウエーブで５秒間、次いで１５秒暖めて、２５％ｗ／ｗゼラチン溶液を調製した。各マイクロウエーブ加熱期間後、溶液を直ちに攪拌した。２回目の加熱後の温度は、７２℃であった。３．３２５ｇのＣａＣｌ２を加えて、２Ｍ  ＣａＣｌ２溶液を形成した。ＣａＣｌ２を加えた後の温度は７４℃であった。直後にＣａＣｌ２が溶解し、温度を測定し、４ｍＬのプラスチック試験管で２ｍＬのゼラチン−ＣａＣｌ２溶液を１ｍＬの２０％ｗ／ｗ微生物トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）パウダ溶液と混合した。
【０３８０】
ｂ．５ｇのゼラチンパウダを３．３３ｇのＣａＣｌ２パウダと混合した。３０ｍＬのＰＢＳをこの混合物中で攪拌して、溶液を形成した。溶解時の溶液の温度は４２℃に達した。均質な溶液が形成された後、２ｍＬのゼラチン−ＣａＣｌ２を、４ｍＬのプラスチック試験管で、１ｍＬの２０％ｗ／ｗ微生物トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）パウダ溶液と混合した。
【０３８１】
溶液３を、以下のとおり調製した。２Ｍ  ＣａＣｌ２−ＰＢＳ中の２５％ゼラチン溶液（上述の１ａ）を２時間置いた。次いで、２ｍＬのゼラチン−ＣａＣｌ２溶液を、４ｍＬのプラスチック試験管で２ｍＬの２０％ｗ／ｗｍＴＧ溶液と混合した。
【０３８２】
溶液４を、以下のとおり調製した。２時間攪拌した後、２Ｍ  ＣａＣｌ２−ＰＢＳ中の２５％ゼラチン溶液（上述の１ａ）を４３℃に暖めた。次いで、２ｍＬのゼラチン−ＣａＣｌ２溶液を、それぞれ４ｍＬのプラスチック試験管で、ａ．１ｍＬの２０％ｗ／ｗｍＴＧ溶液と、あるいは、ｂ．２ｍＬの２０％ｗ／ｗｍＴＧ溶液と、混合した。
【０３８３】
結果
ＣａＣｌ２の全濃度で溶液を形成した。２Ｍ  ＣａＣｌ２溶液（１ａ）を用いて、均質な溶液を形成し、液体に維持した。この溶液は、中程度の粘性であり、多くの気泡を含んでいた。ｍＴＧ溶液と混合する前に、ゼラチン−ＣａＣｌ２溶液を３０分間置いて、気泡を分散させた。
【０３８４】
第２の２Ｍ溶液（１ｂ）は、形成されたゼラチンの塊りを分散させるために手動で攪拌することがより必要となることを除き、第１の２Ｍ溶液と同じである。
【０３８５】
１Ｍ  ＣａＣｌ２溶液（１ｃ）を用いて、均質な溶液を形成したが、数分後にゲル化が始まった。２時間後、完全な熱可逆性ゲルが形成された。しかし、このゲルは室温でゼラチンによって通常形成される熱可逆性ゲルより柔らかであった。この溶液は、半時間後にｍＴＧ溶液と混合するには粘性が高すぎた。
【０３８６】
２Ｍ  ゼラチン−ＣａＣｌ２溶液にｍＴＧ溶液を加えた後、この溶液は２０分間、徐々に粘性が高くなったが、凝集性ゲルは形成されなかった。
【０３８７】
ゼラチン−ＣａＣｌ２溶液を温めることで、ｍＴＧのゲル効果が上がった。マイクロウエーブで加熱した溶液は、徐々に粘性が高くなった。２０分後に、非常にやわらかく、非可逆性（５０℃に加熱することによって確認した）ゲルが形成された。ＣａＣｌ２加熱溶液は、徐々に粘性が高くなった。２０分後に、非常にやわらかく、非可逆性（５０℃に加熱することによって確認した）ゲルが形成された。
【０３８８】
２ｍＬの２０％ｗ／ｗｍＴＧ溶液と混合したゼラチン−ＣａＣｌ２（２Ｍ）については、１０分後に柔軟なゲルが形成された。２０分後は、中程度の強さのゲルが形成された。３５分後には、中程度に固い強度のゲルが形成された。
【０３８９】
４３℃に暖めたゼラチン−ＣａＣｌ２（２Ｍ）については、１ｍＬの２０％ｗ／ｗｍＴＧ溶液と混合した後、１０分後に柔軟なゲルが形成され、２０分後に、中程度の強さのゲルが形成された。しかし、２ｍＬの２０％ｗ／ｗｍＴＧ溶液と混合した後は、１０分後に中程度の強度のゲルが形成され、２０分後に、中程度に固い強度のゲルが形成された。
【０３９０】
例９
プロトコル：  ゼラチンのマイクロウエーブ乾燥−ゲル化と架橋への影響
本例は、溶解度に関して、マイクロウエーブでのゼラチンの乾燥の影響を調べるものである。溶解度の上昇が観察された。選択的であるが、好ましいマイクロウエーブ放射のエネルギィレンジは、全体の比吸収率（ＳＡＲ）が、約１乃至約１００ｍＷ／立方センチメートル、より好ましくは、約３０乃至約６０ｍＷ／立方センチメートルであった。この方法は、以下のとおり実行した。
【０３９１】
ゼラチンの調製と乾燥
タイプＡ、３００ブルーム豚ゼラチンパウダ（Sigma, St. Louis, MO）の一部１０ｇを計量し、５０ｍＬあるいは２５０ｍＬのビーカへ移した。このゼラチンを７００Ｗ、２，４５０ＭＨｚのマイクロウエーブ（kennedy model KN-949, China）で、以下の時間暖めた。
サンプルＡ：  ３０秒、５０ｍＬビーカ
サンプルＢ：  ６０秒、２５０ｍＬビーカ
サンプルＣ：  １２０秒、２５０ｍＬビーカ
サンプルＤ：  １８０秒、２５０ｍＬビーカ
コントロール：  マイクロウエーブで加熱しなかったゼラチン
【０３９２】
加熱後、３７℃、３０ｍＬのダルベッコＰＢＳ(Biological Industries, Israel)をゼラチンに加えて、混合物を３７℃で攪拌した。サンプルＡについては、マイクロウエーブからゼラチンを取り出した後すぐにＰＢＳを加えた。残りのサンプルについては、ＰＢＳを加える前に、ゼラチンを室温（ＲＴ）に冷やした。
【０３９３】
サンプルＣについては、ゼラチンをＰＢＳと混合した後、混合物の一部を別にして５０℃に加熱し、次いで、２０％ｗ／ｗ微生物トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）（Ajinomoto Activa TI-WM, Japan）溶液と、２：１のゼラチン溶液：ｍＴＧ溶液比で混合した。
【０３９４】
ゼラチン／ＰＢＳ混合物のマイクロウエーブ加熱
サンプルＦでは、ゼラチンはパウダ形状で加熱しなかった。むしろ、ゼラチンを、５０ｍＬビーカ中の３０ｍＬのＲＴ  ＰＢＳに直接注ぎ、次いで、混合物をマイクロウエーブで１５秒間、連続して２回、この加熱期間の間に５秒の休みを取って、加熱した。加熱後、手動で攪拌した。次いで、ゼラチン溶液を、２０％ｗ／ｗｍＴＧ溶液と、２：１のゼラチン溶液：ｍＴＧ溶液比で混合した。
【０３９５】
ｍＴＧの加熱
２０％ｗ／ｗｍＴＧ溶液をマイクロウエーブで１５秒間、連続して２回、この加熱期間の間に５秒の休みを取って、加熱した。次いで、ｍＴＧを２５％ｗ／ｗゼラチン溶液と、１：２のｍＴＧ溶液：ゼラチン溶液比で混合した。
【０３９６】
結果
サンプルＡ：  ゼラチンがＰＢＳ中に容易に溶けて、粘性のある溶液を形成した。室温に冷やすと、ゼラチン溶液は、室温での標準的なゲル化溶液によって形成した熱可逆的ゲルに比較可能な、固い、熱可逆性ゲルを形成した。
【０３９７】
コントロール：  ゼラチンはＰＢＳに完全に溶けなかった。ＰＢＳに完全に吸収されたが、ゼラチンは非常に粒状であった。
【０３９８】
サンプルＢ：  ゼラチンはＰＢＳに完全に溶けなかった。ＰＢＳに完全に吸収されたが、ゼラチンは非常に粒状であった。
【０３９９】
サンプルＣ：  ゼラチンはＰＢＳに完全に溶けなかった。ＰＢＳに完全に吸収されたが、ゼラチンは非常に粒状であった。この粒状のゼラチン−ＰＢＳ混合物を、次いでマイクロウエーブで３０秒間加熱した。マイクロウエーブから取り出したときの温度は７６℃であった。この混合物を、次いで手動で攪拌して、均質な溶液を形成した。この溶液を室温に冷やして、室温での標準的なゲル化溶液によって形成した熱可逆的ゲルと比較可能な熱可逆性ゲルを形成した。
【０４００】
この溶液を５０℃に温めて、ｍＴＧと混合すると、３分後に固く、ねばねばしたゲルが形成された。このゲルをマイクロウエーブで１０秒間暖めて、その非可逆性を確認した。マイクロウエーブから出したときは、ゲルはよりねばねばしていたが、より強力であった。これは、若干ドライであるように見えた。
【０４０１】
サンプルＤ：  加熱中に、ゼラチンは炭化した泡（ｃａｒｂｏｎｉｚｅｄ  ｂｕｂｂｌｅ）を形成した。この泡は、こげたゼラチンによってゼラチンパウダ内部に形成された。強いこげたにおいがした。
【０４０２】
加熱したゼラチン／ＰＢＳ混合物：  ゼラチン／ＰＢＳ混合物をマイクロウエーブで加熱することによって液状溶液を形成した。ｍＴＧをこの溶液に加えることで、固い、非可逆性ゲルができた。
【０４０３】
加熱したｍＴＧ：  マイクロウエーブで加熱したｍＴＧは、ゼラチンを架橋しなかった。
【０４０４】
上記より、マイクロウエーブでのゼラチンパウダの加熱は、ゼラチンの重量が有意に提言している（データは示さず）ことによってわかるように、ゼラチンの水分を減らすようである。マイクロウエーブでのゼラチンパウダの加熱直後に、３７℃のＰＢＳを加えることが、ゼラチンの溶解時間を短くする。しかしながら、ゼラチンパウダがＲＴに冷やされると、ゼラチンの溶解時間になんら改善は生じなかった。
【０４０５】
マイクロウエーブで加熱したゼラチンが、ＰＢＳと混合した後にマイクロウエーブで加熱されると、形成された溶液はｍＴＧによって架橋することができる。ＲＴ  ＰＢＳ中にゼラチンを溶かして、次いで、マイクロウエーブで１５秒間、次いで再び１５秒間加熱することができる。この方法による溶解は、ｍＴＧの架橋にマイナスに影響しない。
【０４０６】
乾燥ゼラチンは、マイクロウエーブで２分以上加熱すると燃えるであろう。マイクロウエーブでのｍＴＧの加熱は、その活性を劇的に下げる。
【０４０７】
例１０
プロトコル：  ゼラチンのゲル化と架橋への尿素の影響
本例は、本発明の例示的な組成物の一部である尿素の影響に関する。尿素はゼラチンの転移点を下げることがわかった。以下のデータは、尿素が、高濃度のゼラチン溶液であってもその転移点を室温以下に下げ、室温で溶液を液状にすることを確認している。トランスグルタミナーゼは、尿素が存在しても、ゼラチンを架橋できることがわかった。
【０４０８】
ゼラチン溶液の調製
タイプＡ、３００ブルーム豚ゼラチンパウダ（Sigma, St. Louis, MO）を用いた。２５％及び１５％のｗ／ｗゼラチン溶液を、５０ｇと３０ｇのゼラチンを１５０ｍｌと１７０ｍｌのダルベッコＰＢＳ（Biological Industries，Israel）中に、５０℃のホットプレートの上で攪拌しながら溶かしてそれぞれ調製した。ゼラチンをＰＢＳに徐々に加え、ガラス棒で手動で攪拌した。ゼラチン溶液は、実験中ずっと５０℃のウオーターバス中に保持した。
【０４０９】
トランスグルタミナーゼ溶液の調製
Activa TI-WA (Ajinomoto, Jaoan)微生物トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）混合物をダルベッコＰＢＳに溶かして、２０％ｗ／ｗ溶液を形成した。この溶液は、実験中ずっと室温に維持した。
【０４１０】
ゼラチン−尿素溶液の調製
２５％または１５％ｗ／ｗゼラチン溶液の４０ｇアリコートを１００ｍＬビーカに移し、５０℃で攪拌した。尿素（９８％、ＡｌｆａＡｅｓａｒ，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，ＵＫ）を、以下の表に詳細を示すような異なる比率でこれらのビーカに加えた。
【０４１１】
0005581056.tif 000010
【０４１２】
尿素を加えた後、ゼラチン−尿素溶液を５０℃で５分間攪拌し、確実に均質にした後、３７℃のウオーターバスに移した。
【０４１３】
ゼラチンの熱可逆的ゲル化への尿素の影響
次いで、３７℃のウオーターバスから各ゼラチン−尿素溶液を取り出して、室温に冷やした。温度計で、各溶液の温度低下を追跡した。ゼラチン−尿素溶液の外観と粘度は、温度が低下したときに、観察と、ガラス棒で溶液に触れて評価した。この実験結果を以下の表に示す。
【０４１４】
0005581056.tif 000011
【０４１５】
ｍＴＧを用いたゼラチン−尿素溶液の架橋
ゼラチン−尿素溶液をｍＴＧを用いて架橋した。１または２ｍＬの、２０％ｗ／ｗｍＴＧ溶液を、プラスチック皿で２ｍＬのゼラチン−尿素溶液と、手動で混合した。ゼラチン−尿素溶液を、室温又は予め５０℃に暖めて加えた。いくつかの試験では、この溶液を５０℃に暖めて、ｍＴＧと混合するのに暖める必要があるゼラチン単独の場合との比較を容易にした。この溶液を、ピペット先端でゆっくり攪拌して混合し、架橋するまで数分間放置した。熱可逆性ゲル形成の試験と同様に、ｍＴＧと混合した後のゼラチン−尿素溶液の外観と粘度を、観察と、ガラス部で溶液に触れることによって評価した。その結果を以下の表にまとめた。
【０４１６】
0005581056.tif 000012
【０４１７】
上記の研究は、ゼラチン溶液への尿素の添加は、ゼラチンの転移点を優位に下げることを示している。１５％及び２５％ｗ／ｗゼラチン溶液について、１：１の尿素：ゼラチン比で尿素と上記を加えることによって、室温以下に下がる。尿素：ゼラチン比０．５：１では、ゼラチン溶液の転移点は、室温より若干高い。おそらく、尿素：ゼラチン比０．５：１乃至１：１で、ゼラチンの転移点を室温以下に下げるのに十分である。
【０４１８】
また、尿素の存在下で、ｍＴＧを用いたゼラチンの架橋が可能であることを示した。しかし、尿素はｍＴＧ活性に悪い影響を与える。この影響は、尿素濃度に関係し、尿素が存在するときのｍＴＧ活性は、尿素の濃度に逆比例する。
【０４１９】
考えられるとおり、５０℃でのトランスグルタミナーゼ活性は、室温でのｍＴＧ活性よりはるかに大きい。ゼラチンへの尿素の添加は、ゼラチンの転移点を室温以下に下げる最小濃度を見つけるために最適化することができる。十分な量のｍＴＧを加えると、尿素の悪い影響を克服することができる。
【０４２０】
例１１
ゼラチン転移点についてのｐＨの影響
本例は、ゼラチン溶液のｐＨの変化がもたらすこれらのゼラチン溶液の転移点に対する影響を示す。
【０４２１】
溶液の調製
９９％のクエン酸ナトリウム二水和物（Alfa Aesar, Lancaster, UK）５８．８２ｇを、１００ｍＬの二重に蒸留した水に溶かし、２Ｍのクエン酸ナトリウムストック溶液を作った。ダルベッコＰＢＳ（Biological Industries, Israel）中の２５％ｗ／ｗゼラチン溶液のベース溶液を、タイプＡ、３００ブルーム豚ゼラチンパウダ（Sigma, St. Louis, MO）を用いて調製した。ゼラチン溶液を連続的に攪拌して、５０℃に維持した。１９．２１ｇの無水クエン酸（Frutarom, Israel）を、５０ｍＬの二重蒸留水に溶かし、２Ｍのクエン酸ストック溶液を作った。
【０４２２】
ｐＨ測定
ガラス電極を用いたｐＨ計（Eutech pH510, Singapore）で、溶液のｐＨを測定した。ｐＨ計は、４．０１、７及び１０．０１のｐＨ値のキャリブレーション溶液を用いて実験の前にキャリブレートした。ｐＨ測定の精度を実験中定期的に測定した。２Ｍクエン酸ナトリウム溶液のｐＨは８．５４であった。２Ｍクエン酸溶液のｐＨは１．４であった。
【０４２３】
クエン酸ナトリウムの添加
２５％ｗ／ｗゼラチン溶液の２０ｍＬアリコートを１００ｍＬビーカに取り分けた。このビーカは中程度の攪拌で５０℃に維持しておいた。ゼラチン溶液の初期のｐＨを測定すると、４．８９であった。異なる量の２Ｍクエン酸ナトリウム溶液を２０ｍＬのゼラチン溶液に加えて、以下の溶液を形成した。
溶液１：  ｐＨ５．８７  −  ２ｍＬのクエン酸ナトリウム溶液
溶液２：  ｐＨ６．５５  −  ４ｍＬのクエン酸ナトリウム溶液
溶液３：  ｐＨ６．７    −  ６ｍＬのクエン酸ナトリウム溶液
次いで、各溶液を室温に冷やした。
【０４２４】
クエン酸の添加
２５％ｗ／ｗゼラチン溶液の１００ｍＬアリコートを２５０ｍＬビーカに取り分けた。このビーカは中程度の攪拌で５０℃に維持しておいた。ゼラチン溶液の初期のｐＨを測定すると、５．１９であった。
【０４２５】
異なる量の２Ｍクエン酸溶液をゼラチン溶液に加えて、以下の溶液を形成した。
溶液１：  ｐＨ３．９９  
溶液２：  ｐＨ３．５４  
溶液３：  ｐＨ２．７２
溶液４：  ｐＨ２．３５
溶液５：  ｐＨ２．１７  
溶液６：  ｐＨ２．０４  
溶液７：  ｐＨ１．７
【０４２６】
次いで、各溶液を室温に冷やした。
【０４２７】
クエン酸ナトリウムの結果
クエン酸ナトリウムを加えると、この添加により、ゼラチン溶液に曇った、白い塊が形成された。激しく攪拌すると、この塊が、最初は小さな塊に分散し、次いで均質な溶液になった。この形成された均質な溶液は、曇っており、不透明であった。
【０４２８】
ｐＨ値５．８７では、冷却されたゼラチン溶液アリコートが、ゼラチン単独で熱可逆性ゲルを作る時間とほぼ同じ時間で熱可逆性ゲルを形成した。
【０４２９】
ｐＨ値６．５５では、冷却されたゼラチン溶液アリコートが、１分以下で、非常に迅速に熱可逆性ゲルを形成した。これは、ゼラチン単独の場合よりはるかに速い。
【０４３０】
ｐＨ値６．７０では、このアリコートがほぼ即時に熱可逆性ゲルを形成した。ゼラチン−クエン酸ナトリウム溶液を５０℃で数分間放置した後は、全溶液がゲルを形成した。転移点は、５０℃以上に上がった。
【０４３１】
すべてのｐＨ値で、６０度の水につけると、ゲルが全て液体に変わったため、ゲルが熱可逆性であることが示された。
【０４３２】
クエン酸の結果
転移点の明らかな違いは、ｐＨ値３．５４以上では観察されなかった。ｐＨ値３．５４において、ゼラチン溶液は５０℃から、非常にねばねばしたゲルが形成された３２℃まで液体のままであった。
【０４３３】
ｐＨ値２．７２では、転移点が約３１℃であり、形成されたゲルは、多くの気泡があって、多孔性：粒状であった。
【０４３４】
ｐＨ値２．０４では、転移点が２９℃に下がった。形成されたゲルは、ｐＨ値２．７２で形成されたゲルより一層多孔性であった。
【０４３５】
ｐＨ値１．７では、転移点が２７−２８℃に下がった。形成されたゲルは、かなり多孔性であった。
【０４３６】
すべてのｐＨ値で、５０度の水につけた後、ゲルが全て液体に変わったため、ゲルが熱可逆性であることが示された。
【０４３７】
しかしながら、ゲルを５０℃の水に３０分間置いた後は、液体に変わらなかったゲルが形成された。このことは、５０℃で、３０分後に、クエン酸によってゼラチンが架橋したことを示す。
【０４３８】
上記の研究は、クエン酸の添加によるゼラチン溶液のｐＨの低下によって、ゲル転移点が有意に下がることを示している。ゼラチン溶液のｐＨを２まで下げるクエン酸の添加は、ゼラチンを架橋させない。更にクエン酸を追加してｐＨを２以下に下げることで、５０℃、３０分後に架橋する。
【０４３９】
例１２
ゼラチンのゲル化と架橋における多価アルコールの影響
本例は、ゼラチンの架橋における、ソルビトールなどの多価アルコールの影響に関する。
【０４４０】
材料及び方法
材料
タイプＡ、３００ブルーム豚ゼラチンと、９７％Ｄ−ソルビトールをSigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO)から入手した。グリセロール９９％をFrutarom (Israel)から購入した。Activata TI-WM微生物トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）をAjinomoto(Japan)から入手した。ダルベッコＰＢＳ（ｐＨ７．４）をBiological Industries (KibbutzBeit HaEmek, Israel)から入手した。
【０４４１】
ｍＴＧ溶液の調整
新鮮なActiva TI-WM(Ajinomoto, Japan)微生物トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）混合物を、ダルベッコＰＢＳに溶かして調整し、２０％ｗ／ｗ溶液を形成した。この溶液を、実験中室温（ＲＴ）に保った。
【０４４２】
ゼラチン−多価アルコール溶液の調整
溶液Ａ−１０ｇのグリセロールを３０ｍＬのＰＢＳに溶かした。１０ｇのゼラチンをこのグリセロール溶液に室温で１．５時間浸けた。１．５時間の浸漬後、１０ｍＬのＰＢＳを加えて、この混合物を５０℃に暖めた。均質な、液状溶液（１：１  グリセロール：ゼラチン比）ができるまで混合物を手で攪拌した。
【０４４３】
溶液Ｂ−２７．５ｍｌの２０％ｗ／ｗゼラチン溶液を、攪拌しながら５０℃に暖めた。このゼラチン溶液に１１ｇのグリセロールを加えた。（２：１グリセロール：ゼラチン比）。次いで、グリセロール−ゼラチン溶液を冷却した。２：１グリセロール−ゼラチン溶液を、１．５時間５０℃でソークさせた。溶液を取り出して、室温に冷却した。
【０４４４】
溶液Ｃ−２：１  グリセロール：ゼラチン比でグリセロールを含む２０％ゼラチン溶液を、攪拌しながら５０℃に加熱した。１１ｇのソルビトールを加え、均質な溶液を形成した（グリセロール：ソルビトール：ゼラチン比  ２：２：１）。
【０４４５】
溶液Ｄ−１２ｇのソルビトールを５０℃で２０ｍＬの２０％ｗ／ｗゼラチン溶液に加え、ソルビトール：ゼラチン比３：１の均質な溶液を形成した。ついで、この溶液を冷却した。
【０４４６】
溶液Ｅ−２５ｇのＲＴグリセロールを、５０℃で２０ｍＬの２０％ｗ／ｗゼラチン溶液に加えることによって、５：１  グリコール：ゼラチン溶液を、調整した。この混合物を攪拌して５０℃で混合した。
【０４４７】
溶液Ｆ−２０ｇのソルビトールを、２０ｍＬの２０％ｗ／ｗゼラチン溶液に加え、５：１  ソルビトール：ゼラチン比とした。この混合物を５０℃で混合した。混合物を、次いで室温に下げた。
【０４４８】
ゼラチンのゲル化に対する多価アルコールの影響
上述のように調整して、２ｍｌの多価アルコールを含むゼラチン溶液（溶液Ａ−Ｆを参照）を取り出して、室温に冷やした。温度計を用いて、各溶液の温度を測定した。ゼラチン−多価アルコール溶液の外観と粘度を、温度が下がった時に、観察とガラス棒で溶液に触れて評価した。
【０４４９】
ｍＴＧを用いたゼラチン溶液の架橋に対する多価アルコールの影響
ゼラチン−多価アルコール溶液の、ｍＴＧを用いた化学架橋を試験した。１ｍＬの２０％ｗ／ｗｍＴＧ溶液を、２ｍＬのゼラチン−多価アルコール溶液を、小さなプラスチック皿の中で混合した。ゼラチン−多価アルコール溶液を、室温で、あるいはウオーターバスで予め５０℃に暖めて、加えた。ピペット先端で溶液を手動でゆっくり攪拌して混合し、ゲル化時間を測定した。ｍＴＧと混合した後のゼラチン−多価アルコール溶液の外観と粘度を、観察とガラス棒で溶液に触れて評価した。ゲルが形成されたときに、ウオーターバスでゲルを５０℃に暖めて、熱可逆性を試験した。
【０４５０】
結果
ゼラチンのゲル化に対する多価アルコールの影響
溶液Ａ−グリセロールに漬けた後、ゼラチン粒子が互いに固まった、非常にもろく、固い、粒状物質を形成した。グリコールの存在は、熱可逆的ゼラチンのゲル化を示さなかった。熱可逆性ゲルは、グリセロールを含まない２０％ｗ／ｗゼラチン溶液で生じるため、２−３分で形成された。３５℃で、このゼラチン−グリセロール溶液は、縁の部分の粘度が非常に高かった。室温に冷やすと、ゼラチン−グリコール相転移は、ゼラチン単独の場合とほぼ同じであった。
【０４５１】
溶液Ｂ−１：１グリセロール−ゼラチン溶液であるため、２：１  グリセロール：ゼラチン比のグリセロールが、ゼラチンの転移点を下げることがなかった。溶液は、３５℃で非常に粘性が高く、３３−３４℃で結合性のあるゲルを形成した。２：１グリセロール：ゼラチン溶液を１．５時間ソークさせたことは、ゼラチンの転移点に影響しなかった。熱可逆性ゲルは、３４℃で形成され始めた。
【０４５２】
溶液Ｃ−５０℃で、ゼラチン−グリコール−ソルビトール溶液は、ゼラチン−グリコール溶液単独の場合より、粘性が高く、より白濁していた。この混合物を冷やすと、３５℃でゲルが形成された。転移点は、ソルビトールとグリコールがあるため、下がらなかった。
【０４５３】
溶液Ｄ−ゼラチン−ソルビトール溶液は４０℃でゲル化が始まり、ソルビトールの濃度が高いと、実際に、ゼラチンの転移点が上がることを示した。室温では、形成された熱可逆性ゲルは、ゼラチンゲル単独の場合より、非常に弾性があった。
【０４５４】
溶液Ｅ−５：１グリセロール：ゼラチン比の非常に高い濃度であっても、ゼラチンの転移点は下がらなかった。ゼラチン単独で形成するものと同様に、熱可逆性ゲルが形成された。
【０４５５】
溶液Ｆ−熱可逆性ゲルが４０℃で形成された。３：１及び５：１のソルビトール：ゼラチン溶液の特性に、非常に小さな差異が観察された。両溶液ともゼラチンの転移点を若干上げるが、非常にねばねばして、弾性のある熱可逆性ゲルとなった。
【０４５６】
ｍＴＧを用いたゼラチン溶液の架橋に対する多価アルコールの影響
溶液Ａ−ゼラチン−グリセロール溶液は、ｍＴＧによって３分で固いゲルに変わった。３分後に形成されたゲルは、同じ時間でグリセロールのないゼラチンとｍＴＧによって形成されたゲルより、より凝集性が高かった。このゲルを再度ウオーターバスで予め５０℃に暖めて、固相を維持しており、ｍＴＧ架橋がゲル化のメカニズムであることを確認した。
【０４５７】
溶液Ｂ−３分後に非可逆性ゲルが形成された。このゲルをウオーターバスで予め５０℃に暖めて、固相を維持しており、ｍＴＧ架橋がゲル化のメカニズムであることを確認した。１：１グリセロール：ゼラチン比の溶液で記載したとおり、グリセロールの存在により、３分後により固いゲルとなった。２：１グリセロール−ゼラチン比の溶液では、形成されたゲルが、１：１グリセロール：ゼラチン比で形成したゲルより、有意にもろいことも観察された。
【０４５８】
溶液Ｃ−３分後、固相で、ねばねばした、非常に弾性のあるゲルが形成された。このゲルは、もろくなく、容易に分離されなかった。これは、グリセロールのみの架橋ゼラチンゲルが非常にもろいため、非常に有意な結果であると考えられる。ソルビトールは、もろい材料の弾性を大きく上げる。このゲルをウオーターバスで予め５０℃に暖めて、固相を維持して、ｍＴＧ架橋がゲル化のメカニズムであることを確認した。
【０４５９】
溶液Ｅ−２：１  グリセロール：ゼラチンでのグリセロールと非常に似た結果となった。グリセロールが存在することで、ゼラチン単独で形成したゲルより、よりもろいゲルが形成される結果となった。しかし、ｍＴＧが存在する場合、３分後に、形成されたゲルは、ｍＴＧを伴うゼラチンのみで３分後に形成されたゲルより、より固相化していた。
【０４６０】
溶液Ｆ−３分後に、固相化され、非常に弾性があって、ねばねばしたゲルが、ゼラチン−ソルビトール溶液のｍＴＧ架橋によって形成された。ソルビトールは、ｍＴＧ架橋ゼラチンゲルの弾性とねばりを少し上げること以外は、ゼラチンのｍＴＧ架橋に影響しないように見える。
【０４６１】
上記結果より、ゼラチンにグリセロールを加えることは、ゼラチンの転移点を下げることにはならないようである。グリセロールへのゼラチンのソークは、熱可逆性ゲルを形成するための特性を有意に変えるものではないようである。グリセロールの存在は、ゼラチン溶液をｍＴＧと３分間混合した後に、よりねばねばしたゲルとなることのようである。これは、ゼラチンがグリセロールの存在下にあるとき、ゼラチンのｍＴＧ架橋を促進することを示すものであろう。
【０４６２】
ゼラチンのｍＴＧ架橋の間に高濃度のグリセロールが存在することは、明らかに、結果としての架橋ゲルを、ゼラチン単独での架橋によって形成されるゲルより、よりもろいものにする。グリセロールは、ゼラチンのｍＴＧ架橋を促進するようである。
【０４６３】
グリセロールと共にソルビトールを加えることは、ゼラチンの転移点を低減しない。しかし、ソルビトールは、ゼラチンゲルの弾性とねばりを大幅に上げる。ソルビトールを用いて、その他の物質を加えることによって、よりもろくなったゼラチンの弾性を上げることができることがある。ソルビトールは、ゼラチンのｍＴＧ架橋を阻害するものではないようである。ソルビトールは、ゼラチンの転移点をわずかに上げるが、ゼラチンゲルの弾性と粘りを非常に大きくする。
【０４６４】
グリセロール：ゼラチン比を５：１に上げることは、２：１  グリセロール：ゼラチン溶液を用いた架橋ゼラチンゲルより、架橋ゼラチンゲルをもろくしてしまうが、ゼラチンの転移点についてはそれ以上の影響はない。このより高いグリセロール；ゼラチン比は、若干架橋を促進するよう影響するが、グリセロール：ゼラチン比が１：１及び２：１での影響より、はっきりしたものではない。
【０４６５】
ソルビトール：ゼラチン比が５：１の溶液は、ゼラチンの転移点を上げるが、ソルビトール：ゼラチン比が３：１の溶液によって上がるほどではない。しかしながら、５：１の溶液で形成された架橋ゼラチンゲルは、より弾性と粘りがあった。このことは、更に、ソルビトールの量を変えて、架橋したゼラチンゲルの弾性を変えることができることを提言するものである。
【０４６６】
例１３
ゼラチンのゲル化と架橋におけるスプレー乾燥の影響
本例は、ゼラチンの架橋における、スプレー乾燥の影響に関する。スプレー乾燥を用いることで形成される粒子サイズの好適な範囲は、約２０乃至約１４０μｍ、より好ましくは約６０乃至約１００μｍ（直径）である。
【０４６７】
粒子形成の様々なやり方が選択的に考えられる。一つの潜在的な方法は、このための特別な乾燥法を用いて、あるいは、添加物を含め、次いで粒子に添加物のあるゼラチン及びｍＴＧを乾燥させることによって、ゼラチンとｍＴＧの再構築可能な粒子を別々に形成する方法である。別の潜在的な方法は、ゼラチンとｍＴＧの両方を含む再構築可能な粒子を容易に形成する方法である。これらの粒子は、単に、特別な乾燥法を用いることで、あるいは、これらの粒子の再構築性を改良する添加物を含めることで、形成することができる。更に、ゼラチンとｍＴＧが架橋しない場合、あるいはこれらが部分的に架橋した後に、これらの粒子を作ることができる。
【０４６８】
材料及び方法
材料
タイプＡ、３００ブルーム豚ゼラチンをSigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO)から入手した。Activata TI-WM微生物トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）をAjinomoto(Japan)から入手した。ダルベッコＰＢＳ（ｐＨ７．４）をBiological Industries (KibbutzBeit HaEmek, Israel)から入手した。尿素、９８％をAlfa Aesar (Lancaster, UK)から入手した。
【０４６９】
ｍＴＧ溶液の調整
４ｇのｍＴＧを、１６ｇのダルベッコＰＢＳに溶かして、２０％（ｗ／ｗ）微生物トランスグルタミナーゼ溶液（ｍＴＧ）を調整した。この溶液は、実験中室温（ＲＴ）に保った。
【０４７０】
４％（ｗ／ｗ）微生物トランスグルタミナーゼ（ｍＴＧ）溶液を、２．０４ｇのｍＴＧを５０ｇのダルベッコＰＢＳに溶かして調整した。この溶液を、実験中室温（ＲＴ）に保った。
【０４７１】
ゼラチン溶液の調整
５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液を、１０．５２ｇのゼラチンパウダを、２００ｇのダルベッコＰＢＳに溶かして、調整した。この混合物を５０℃に暖めて、均質な溶液ができるまで攪拌した。溶液１は、５０ｍｌの５％ゼラチン溶液である。溶液２は、１：１（ｗ／ｗ）ゼラチンであり、５０ｍｌの５％ゼラチン溶液に２．６３ｇのマンニトールを加えることによって、マンニトール溶液を調整した。この溶液を攪拌して、５０℃のウオーターバスで保持した。実験を通じて、この溶液を〜５０℃のウオータ皿に保持し、熱可逆的ゲル化を防いだ。
【０４７２】
溶液３−１：１（ｗ／ｗ）ゼラチン−２．６３ｇのトレハロースを５０ｍｌの５％ゼラチン溶液に溶かして、攪拌して、５０℃に暖めながら、トレハロース溶液を調整した。実験を通じて、この溶液を５０℃に維持した。
【０４７３】
溶液４−１：１（ｗ／ｗ）ゼラチン−２．６３ｇの尿素を５０ｍｌの５％ゼラチン溶液に溶かして、攪拌して、５０℃に暖めながら、尿素溶液を調整した。実験を通じて、この溶液を５０℃に維持した。
【０４７４】
溶液５−４０ｇの５％ゼラチン溶液を、２０ｇの４％ｍＴＧ溶液と混合した。実験を通じて、この溶液を５０℃に維持した。
【０４７５】
ゼラチン溶液のスプレー乾燥
スプレー乾燥させたゼラチン粒子を調整するために、異なるダルベッコＰＢＳ中の５％ゼラチン溶液を調整した（溶液１−５）。ＢＵＥＣＨＩマイクロスプレー乾燥機を用いて、ゼラチン溶液をスプレー乾燥させた。フロータイプは、ノズルヘッドでの気体と液体の混合による並流である。吸引率とインレット温度は１００％及び１００℃であり、一定に保たれていた。液体供給レートは、プロセス条件によって変わり、以下に述べるアウトレット温度に影響する。
【０４７６】
溶液１−５０ｍＬの５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液を温め続け、１５％の供給レート、アウトレット温度５７℃で、スプレー乾燥させた。
【０４７７】
溶液２−５０ｍＬの1：1（ｗ／ｗ）ゼラチン−マンニトール溶液を５０℃のウオータバスで溶解性に保った。液体供給レートが１５％であり、アウトレット温度が６２℃であった。
【０４７８】
溶液３−５０ｍＬの1：1（ｗ／ｗ）ゼラチン−トレハロース溶液を５０℃のウオータバスで溶解性に保った。液体供給レートが１５％であり、アウトレット温度が５４℃であった。
【０４７９】
溶液４−５０ｍＬの1：1（ｗ／ｗ）ゼラチン−尿素溶液を５０℃のウオータバスで溶解性に保った。液体供給レートが１５％であり、アウトレット温度が５７℃であった。実験を通じて、液体供給レートを２０％に、アウトレット温度を５４℃に変えて、パウダを形成できるようにした。
【０４８０】
溶液５−４％ｍＴＧ溶液と混合した、４０ｍＬの５％（ｗ／ｗ）ゼラチン溶液を、２０％の液体供給レート、アウトレット温度５６℃で、スプレー乾燥させた。実験を通じて、この溶液を３７℃のウオータ皿に保持した。
【０４８１】
ゼラチン溶液のゲル化に対するスプレー乾燥の影響
スプレー乾燥させたゼラチンパウダは、４ｍｌのバイアルでダルベッコＰＢＳを用いて溶解させて、４回反転させることで混合した。沈殿した溶液を５０℃のウオーターバスで暖めて、溶解するまで手動で混合した。この溶液を室温に下げて、温度が下がったときの各溶液の外観と粘度を、観察とガラス棒で溶液に触れることによって評価した。
【０４８２】
溶液１−５％のスプレー乾燥させたゼラチン溶液０．３３ｇを１ｍｌのＲＴダルベッコＰＢＳに溶解させて、最終的に２５％（ｗ／ｗ）ゼラチンとした。別の１ｍｌのダルベッコＰＢＳを加え、ゼラチン濃度を１２．５％（ｗ／ｗ）に下げた。
【０４８３】
溶液２−０．３３ｇのスプレー乾燥させた１：１のゼラチン−マンニトール溶液を１ｍｌのＲＴダルベッコＰＢＳに溶解させた。
【０４８４】
溶液３−０．３３ｇのスプレー乾燥させた１：１のゼラチン−トレハロース溶液を１ｍｌのＲＴダルベッコＰＢＳに溶解させた。
【０４８５】
溶液４−ゼラチン−尿素スプレー乾燥では、パウダができなかった。
【０４８６】
溶液５−０．２５ｇのスプレー乾燥させたゼラチン−ｍＴＧ溶液を０．７５ｍｌの３７℃ダルベッコＰＢＳに溶解させた。
【０４８７】
ｍＴＧを用いたゼラチン溶液の化学架橋に対するスプレー乾燥の影響
スプレー乾燥させたゼラチンパウダーを、上述した通り溶解させて、５０℃のウオーターバスで維持した。２０％のＲＴｍＴＧ溶液を、２：１ゼラチン：ｍＴＧ比で加えて、ピペット先端でゆっくり混ぜて、試験管を４回反転させて混合した。ゲル化時間を測定し、ｍＴＧと混合した後の溶液の外観と粘度を、観察とガラス棒で溶液に触れることによって評価した。ゲルが形成されたら、ウオーターバスを用いてゲルを５０℃に暖めて、熱可逆性を試験した。
【０４８８】
結果
ゼラチン溶液のスプレー乾燥
ゼラチン溶液のスプレー乾燥によって、様々な量の微細な白いパウダができた。溶液１−〜５０ｍｌの５％ゼラチン溶液は０．７８ｇのパウダを提供した。溶液２−マンニトールと、１：１の比（ｗ／ｗ）で混合した〜４０ｍｌの５％のゼラチン溶液は、０．７３ｇのパウダを提供した。溶液３−トレハロースと、１：１の比（ｗ／ｗ）で混合した〜５０ｍｌの５％のゼラチン溶液は、１．１３５ｇのパウダを提供した。溶液４−パウダができなかった。溶液５−４％のｍＴＧ溶液混合した〜４０ｍｌの５％のゼラチン溶液は、１．２７ｇのパウダを提供した。
【０４８９】
ゼラチン溶液のゲル化に対するスプレー乾燥の影響
溶液１−ゼラチンパウダは、ＲＴ  ＰＢＳに部分的に溶けて、最終２５％（ｗ／ｗ）のゼラチンとなり、白い非溶解性の沈殿を形成した。５０℃のウオーターバスで暖めると、このパウダが溶けて、均質な溶液ができた。ＲＴに冷やすと、この溶液がゲル化し、別の１ｍｌのＰＢＳを加えて、ゼラチンを１２．５％（ｗ／ｗ）に下げた。この１２．５％のゼラチン溶液は２６−２７℃でゲル化した。
【０４９０】
溶液２−ゼラチン−マンニトールパウダは、ＲＴ  ＰＢＳに部分的に溶けて、最終〜１２．５％（ｗ／ｗ）のゼラチンとなった（正確なゼラチンのパーセンテージはわからないが、ゼラチンはできたパウダの量の１／２となることが予測されている）。白い非溶解性の沈殿が形成された。５０℃のウオーターバスで暖めた後、このパウダが溶けて、均質な溶液ができた。ＲＴに冷やすと、この溶液は２８−２９℃でゲル化した。
【０４９１】
溶液３−ゼラチン−トレハロースパウダは、ＲＴ  ＰＢＳに部分的に溶けて、最終〜１２．５％（ｗ／ｗ）のゼラチンとなった（正確なゼラチンのパーセンテージはわからないが、ゼラチンはできたパウダの量の１／２となることが予測されている）。白い非溶解性の沈殿が形成された。５０℃のウオーターバスで暖めた後、このパウダが溶けて、均質な溶液ができた。ＲＴに冷やすと、この溶液は２５−２６℃でゲル化した。
【０４９２】
溶液４−溶液が架橋剤を含んでおり、従って、ゲル化ではなく架橋を試験した。
【０４９３】
ｍＴＧを用いたゼラチン溶液の化学架橋に対するスプレー乾燥の影響
溶液１−５００μｌの２０％ｍＴＧ溶液を、２ｍｌの１２．５％ゼラチン溶液に加えた。４分後、強い白色ゲルが形成された。このゲルは非可逆性であった。
【０４９４】
溶液２−２５０μｌの２０％ｍＴＧ溶液を、１ｍｌの１２．５％マンニトールを含むゼラチン溶液に加えた。２．５分後、強い白色ゲルが形成された。このゲルは非可逆性であった。
【０４９５】
溶液３−２５０μｌの２０％ｍＴＧ溶液を、１ｍｌの１２．５％トレハロースを含むゼラチン溶液に加えた。３分後、強い白色ゲルが形成された。このゲルは非可逆性であった。
【０４９６】
溶液４−ｍＴＧ−ゼラチン溶液を、３７℃にあたためた１ｍｌのダルベッコＰＢＳに溶かした。すぐに、弱いゲルが形成され、ＰＢＳに完全に溶けなかった。形成されたゲルは非可逆性であった。
【０４９７】
上記のことより、ゼラチン溶液のスプレー乾燥は可能であると考えられる。例えば、５％のゼラチン溶液をスプレー乾燥して、微細な白色パウダを作ることができる。ゼラチンは、１：１（ｗ／ｗ）ゼラチン：マンニトールまたはトレハロース比で、マンニトールやトレハロースと共にスプレー乾燥させることができる。スプレー乾燥させたゼラチン−マンニトール溶液は、ゼラチン単独をスプレー乾燥させたものに比べて、転移点が高い。スプレー乾燥させたゼラチン−トレハロースは、ゼラチン単独をスプレー乾燥させたものに比べて、転移点が低い。
【０４９８】
スプレー乾燥させた溶液の架橋は可能である。１：１（ｗ／ｗ）ゼラチン−マンニトール溶液のスプレー乾燥は、架橋を改善した。１：１（ｗ／ｗ）ゼラチン−トレハロース溶液のスプレー乾燥は、架橋に影響しなかった。
【０４９９】
ｍＴＧと混合したゼラチン溶液のスプレー乾燥は可能である。形成された粒子は、再構築時に即座にゲルを形成する。
【０５００】
例１４
シーラントを提供するためのアプリケータ
本例は、本発明のいくつかの実施例による止血シーラントを適用するための、例示的なアプリケータに関する。図１１Ａは、２重シリンジアプリケータ１７００の一例を示しており、これは、２本のシリンジ１７０２と１７０４を具え、各シリンジが、二成分止血シーラントの各成分を含有している。シリンジ１７０２は、選択的に、ゼラチンまたはここに記載した代替物を含むものであって良く、シリンジ１７０４は、選択的にトランスグルタミナーゼまたはここに記載した代替物を含むものであってよい。バイアル容量の差は、２つの成分間の混合比を反映する。この二つの成分は、ノズル１７０５で混合することができる。混合を改良するために、ノズル１７０５は、渦生成エレメント１７０６（詳細を図１１Ｂに示す）を具えるものでも良い。シリンジアプリケータ１７００は、選択的に、ノズル１７０５で加圧エアシステム１７０８に連結して、スプレー効果を作るようにしても良い。加圧エアは、所望されるアプリケーションに応じて、選択的に、ノズル１７０５の近位端あるいは遠位端に入る。
【０５０１】
例１５
カテーテル及びその使用方法
本例は、本発明のいくつかの実施例によるカテーテル及びその使用方法に関する。図１２Ａは、カテーテル１２００が好ましくはコーティング１２０２をもつ、脈管挿入点クロージャの一例を示しており、ここに述べたシーラント組成物を具える。コーティング１２０２は、選択的に及び好ましくは、少なくとも一のゼラチン層１２０４を有しており、そのうちの二つを例示の目的で、限定することなく示している。ゼラチン層１２０４は、選択的に、ここで述べた別のタイプのタンパク質基板で置き換えても良い。コーティング１２０２も、選択的に及び好ましくは少なくとも一のトランスグルタミナーゼ層１２０６を具えており、これも選択的に、ここで述べた別の架橋剤で置き換えても良い。コーティング１２０２は選択的に、脈管導入シース１２０８の周りをくるむものであってもよく、これは、トロカールとも呼ばれている。
【０５０２】
シース１２０８は、選択的に、さらに別の外側シース１２０９で覆われていても良い。このシースは、図１２Ｂに示すように、ドライシーラント成分と、身体流体との間に機械的なバリアを作る。外側シース１２０９を外すと、シーラント成分が身体流体によって活性化され、末梢血管エントリィ点閉塞プラグを作る。
【０５０３】
本発明は、上述の記載と好ましい実施例を参照して述べたが、上述の記載は説明のためのものであり、発明を限定するものではない。本発明は、特許請求の範囲によって規定される。その他の態様、利点、変更は、これらの特許請求の範囲の範囲内にある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０ＡＢ】
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【図１０ＣＤ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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