(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
西ナイル熱ウイルスの哺乳動物宿主細胞の複製を阻止する際の使用のためのオリゴヌクレオチド化合物であって、
（ｉ）ヌクレアーゼ耐性骨格を有すること、
（ｉｉ）哺乳動物宿主細胞による取込みが可能であること、
（ｉｉｉ）１５から４０の間のヌクレオチド塩基を含有すること、
（ｉｖ）配列番号４に相補的である少なくとも１５の連続する塩基のターゲティング配列を有すること、
（ｖ）少なくとも４５℃の解離Ｔｍで西ナイル熱ウイルスゲノムとヘテロ二重鎖構造を形成でき、かつ前記ウイルスのプラス鎖ＲＮＡ鎖の５’末端領域におけるステムループ二次構造を破壊する活性を有することを特徴とする化合物。
【請求項２】
黄熱病ウイルスの哺乳動物宿主細胞の複製を阻止する際の使用のためのオリゴヌクレオチド化合物であって、
（ｉ）ヌクレアーゼ耐性骨格を有すること、
（ｉｉ）哺乳動物宿主細胞による取込みが可能であること、
（ｉｉｉ）１５から４０の間のヌクレオチド塩基を含有すること、
（ｉｖ）配列番号５に相補的である少なくとも１５の連続する塩基のターゲティング配列を有すること、
（ｖ）少なくとも４５℃の解離Ｔｍで黄熱病ウイルスゲノムとヘテロ二重鎖構造を形成でき、かつ前記ウイルスのプラス鎖ＲＮＡ鎖の５’末端領域におけるステムループ二次構造を破壊する活性を有することを特徴とする化合物。
【請求項３】
デング熱ウイルス２型の哺乳動物宿主細胞の複製を阻止する際の使用のためのオリゴヌクレオチド化合物であって、
（ｉ）ヌクレアーゼ耐性骨格を有すること、
（ｉｉ）哺乳動物宿主細胞による取込みが可能であること、
（ｉｉｉ）１５から４０の間のヌクレオチド塩基を含有すること、
（ｉｖ）配列番号６に相補的である少なくとも１５の連続する塩基のターゲティング配列を有すること、
（ｖ）少なくとも４５℃の解離Ｔｍでデング熱ウイルス２型ゲノムとヘテロ二重鎖構造を形成でき、かつ前記ウイルスのプラス鎖ＲＮＡ鎖の５’末端領域におけるステムループ二次構造を破壊する活性を有することを特徴とする化合物。
【請求項４】
ダニ媒介性脳炎ウイルスの哺乳動物宿主細胞の複製を阻止する際の使用のためのオリゴヌクレオチド化合物であって、
（ｉ）ヌクレアーゼ耐性骨格を有すること、
（ｉｉ）哺乳動物宿主細胞による取込みが可能であること、
（ｉｉｉ）１５から４０の間のヌクレオチド塩基を含有すること、
（ｉｖ）配列番号８に相補的である少なくとも１５の連続する塩基のターゲティング配列を有すること、
（ｖ）少なくとも４５℃の解離Ｔｍでダニ媒介性脳炎ウイルスゲノムとヘテロ二重鎖構造を形成でき、かつ前記ウイルスのプラス鎖ＲＮＡ鎖の５’末端領域におけるステムループ二次構造を破壊する活性を有することを特徴とする化合物。
【請求項５】
ブタ生殖及び呼吸器症候群ウイルスの哺乳動物宿主細胞の複製を阻止する際の使用のためのオリゴヌクレオチド化合物であって、
（ｉ）ヌクレアーゼ耐性骨格を有すること、
（ｉｉ）哺乳動物宿主細胞による取込みが可能であること、
（ｉｉｉ）１５から４０の間のヌクレオチド塩基を含有すること、
（ｉｖ）配列番号３５に相補的である少なくとも１５の連続する塩基のターゲティング配列を有すること、
（ｖ）少なくとも４５℃の解離Ｔｍでブタ生殖及び呼吸器症候群ウイルスゲノムとヘテロ二重鎖構造を形成でき、かつ前記ウイルスのプラス鎖ＲＮＡ鎖の５’末端領域におけるステムループ二次構造を破壊する活性を有することを特徴とする化合物。
【請求項６】
非荷電リン含有サブユニット間連結により連結している複数のモルホリノサブユニットを含み、その連結部位が、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接サブユニットの５’環外炭素に連ねるものである、請求項１〜５までのいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド化合物。
【請求項７】
前記サブユニット間連結部がホスホロジアミデート連結部である、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド化合物。
【請求項８】
前記モルホリノサブユニットが、以下の構造に従ってホスホロジアミデート連結部により結合されている、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド化合物
【化２】
0005425396.tif 000017
［式中、Ｙ１＝Ｏ、Ｚ＝Ｏ、Ｐｊは、ポリヌクレオチド中の塩基に対して、塩基特異的水素結合により、結合するプリン又はピリミジン塩基対部分であり、Ｘは、アルキル、アルコキシ、チオアルコキシ又はアルキルアミノである］。
【請求項９】
Ｘ＝ＮＲ２であり、ここで、各Ｒは、独立して水素又はメチルである、請求項８に記載のオリゴヌクレオチド化合物。
【請求項１０】
前記オリゴヌクレオチド化合物が、前記ウイルス標的配列への結合に関して、５０℃を超えるＴｍを有し、前記化合物が、哺乳動物細胞により能動的に吸収される、請求項１〜５までのいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド化合物。
【請求項１１】
前記オリゴヌクレオチド化合物と、前記化合物の宿主細胞への取込みを増強するアルギニンに富むポリペプチドの共有結合複合体である、請求項１〜５までのいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド化合物。
【請求項１２】
前記アルギニンに富むポリペプチドが、配列番号１２１〜１２６と同定されている配列の１つを有する、請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド化合物。
【請求項１３】
前記ターゲッティング配列が配列番号４７を含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド化合物。
【請求項１４】
前記ターゲッティング配列が配列番号５１を含む、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド化合物。
【請求項１５】
前記ターゲッティング配列が配列番号５５を含む、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド化合物。
【請求項１６】
ターゲッティング配列が配列番号１０９を含む、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド化合物。
【請求項１７】
オリゴヌクレオチドが配列番号４９を含む、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド化合物。
【請求項１８】
オリゴヌクレオチドが配列番号４７からなる、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド化合物。
【請求項１９】
オリゴヌクレオチドが配列番号４９からなる、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド化合物。
【請求項２０】
オリゴヌクレオチドが配列番号５１からなる、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド化合物。
【請求項２１】
オリゴヌクレオチドが配列番号５５からなる、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド化合物。
【請求項２２】
オリゴヌクレオチドが配列番号１０９からなる、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド化合物。
【請求項２３】
前記ウイルスにより感染したホストの感染を治療するための医薬の調製における、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチド化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フラビウイルス、ヘパシウイルス、エンテロウイルス、リノウイルス、ヘパトウイルス、アプトウイルス、ヘペウイルス、コロナウイルス、アルテリウイルス、ベシウイルス、ノロウイルス、ママストロウイルス、アルファウイルス、及びルビウイルス感染の治療の際に使用するアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物並びに該化合物を使用する抗ウイルス治療方法に関する。
【０００２】
引用文献：
以下の引用文は、本分野の背景又は本発明に関する。
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【背景技術】
【０００３】
一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスは、野生動物、家畜及びヒトにおいて多くの疾患を引き起こす。これらのウイルスは、遺伝的及び抗原的多様性があり、幅広い組織向性並びに広範囲の病原可能性を示す。いくつかの最も病原性のウイルス、例えば、カリシウイルスのインキュベーション期間は非常に短い。ウイルス複製及び毒性因子の発現は、早期防御機構（Ｘｕ１９９１年）を圧倒し、急性並びに重篤な症状を引き起こす可能性がある。
【０００４】
多くのウイルス感染に特定の治療措置はない。この感染は、血清型特異的であり、自然免疫は、しばしば短期であるか、又は欠いている（Ｍｕｒｒａｙら、１９９８年）。これらの病原性ウイルスに対する免疫化は、多様な血清型のため実行不可能である。ＲＮＡウイルス複製過程は、有効な遺伝子修復機構を欠き、ＲＮＡウイルス複製誤差率の現在の推定値は、各ゲノム複製が、１つから１０の誤差を生じることが予想でき、したがって多数の変異体数を生じるようである（Ｈｏｌｌａｎｄ１９９３年）。しばしば、これらの血清型は、交差防御を示さないため、いずれか１つの血清型による感染が、他の血清型による感染に対して防御を行わない。例えば、カリシウイルスのベシウイルス属に対するワクチンは、４０超の種々の中和血清型に対する防御を提供しなければならないと考えられ（Ｓｍｉｔｈ、Ｓｋｉｌｌｉｎｇら、１９９８年）、カリシウイルス科の他の属に対するワクチンにも、同じ限界があることが予想される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、フラビウイルス科、ピコルノウイルス科、カリシウイルス科、トガウイルス科、アルテリウイルス科、コロナウイルス科、アストロウイルス科又はヘペウイルス科ファミリーにおける小型一本鎖のプラス鎖ＲＮＡウイルスなどを含む、いくつかのウイルスファミリーにおいて有効な抗ウイルス療法の必要性が残されている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一態様において、本発明は、一本鎖のプラス鎖ゲノムを有し、フラビウイルス科、ピコルノウイルス科、カリシウイルス科、トガウイルス科、アルテリウイルス科、コロナウイルス科、アストロウイルス科又はヘペウイルス科のウイルスファミリーの中の１種から選択されるＲＮＡウイルスの宿主細胞内の複製を阻止するのに有効な抗ウイルス化合物を製造する方法を含む。該方法は最初に、感染ウイルスのプラス鎖の５’末端４０塩基内の領域を、内部ステムループ二次構造を形成できる、ウイルス標的配列として同定することを含む。次に：
（ｉ）ヌクレアーゼ耐性骨格、
（ｉｉ）哺乳動物宿主細胞による取込みが可能であること、
（ｉｉｉ）１２から４０の間のヌクレオチド塩基を含有すること、
（ｉｖ）内部二重鎖構造を形成できるウイルスゲノム領域に相補的である少なくとも１２のサブユニットのターゲティング配列を有すること、並びに
（ｖ）（ｉ）該ウイルスのプラス鎖及び該オリゴヌクレオチド化合物からなり、（ｉｉ）少なくとも４５℃の解離Ｔｍ及びこのようなステムループ構造の破壊を特徴とするヘテロ二重鎖構造を、ウイルス標的配列と共に形成する能力を特徴とする、オリゴヌクレオチド類縁化合物を段階的固相合成によって構築する。
【０００７】
該標的配列は、５’末端配列の分析、例えば、入力された最小ＲＮＡ配列の自由エネルギー状態に関する探索に基づき二次構造予測を実施できるコンピュータプログラムにより５’末端４０塩基の分析を得ることにより同定できる。
【０００８】
別の態様において、本発明は、一本鎖のプラス鎖ゲノムを有し、フラビウイルス科、ピコルノウイルス科、カリシウイルス科、トガウイルス科、アルテリウイルス科、コロナウイルス科、アストロウイルス科又はヘペウイルス科のウイルスファミリーの中の１種から選択される感染ＲＮＡウイルスの複製を哺乳動物宿主細胞内において阻止する方法を含む。該方法は：
（ｉ）ヌクレアーゼ耐性骨格、
（ｉｉ）哺乳動物宿主細胞による取込みが可能であること、
（ｉｉｉ）１２から４０の間のヌクレオチド塩基を含有すること、
（ｉｖ）内部ステムループ二次構造を形成できるプラス鎖ウイルスゲノムの５’末端４０塩基内の領域に相補的である少なくとも１２のサブユニットのターゲティング配列を有することを特徴とするオリゴヌクレオチド類縁化合物のウイルス抑制量を感染宿主細胞に投与することを含む。（ｉ）該ウイルスのプラス鎖及び該オリゴヌクレオチド化合物からなり、（ｉｉ）少なくとも４５℃の解離Ｔｍ及びこのようなステムループ二次構造の破壊を特徴とする、ヘテロ二重鎖構造を形成するために、該化合物を宿主細胞に投与すると有効である。該化合物は、ウイルスに感染した、又はウイルス感染の危険性のある哺乳動物対象に投与できる。
【０００９】
該化合物は、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接サブユニットの５’環外炭素に結合させている非荷電リン含有サブユニット間連結部により結合させたモルホリノサブユニットから構成できる。一実施形態において、該サブユニット間連結部は、構造：
【化１】
0005425396.tif 000002
を有するものなどのホスホロジアミデート連結部であり、
式中、Ｙ１＝Ｏ、Ｚ＝Ｏ、Ｐｊは、ポリヌクレオチド中の塩基に対する塩基特異的水素結合による結合に有効なプリン又はピリミジン塩基対部分であり、Ｘは、アルキル、アルコキシ、チオアルコキシ、又は各Ｒが、独立して水素又はメチルである、例えば、Ｘ＝ＮＲ２のアルキルアミノである。
【００１０】
該化合物は、該ウイルスのプラス鎖とこのようなヘテロ二重鎖構造を形成できるオリゴヌクレオチド類縁部分及び該化合物の感染宿主細胞への取込みを促進させるのに有効なアルギニンに富むポリペプチドの共有結合複合体であり得る。
【００１１】
関連する一態様において、本発明は：
（ａ）一本鎖のプラス鎖ＲＮＡゲノムを有し、フラビウイルス科、ピコルノウイルス科、カリシウイルス科、トガウイルス科、アルテリウイルス科、コロナウイルス科、アストロウイルス科又はヘペウイルス科ファミリーの中の１種から選択されるＲＮＡウイルスの該プラス鎖ＲＮＡの５’末端４０塩基内の領域であって、内部ステムループ二次構造を形成できる領域と、
（ｂ）（ｉ）ヌクレアーゼ耐性骨格、
（ｉｉ）哺乳動物宿主細胞による取込みが可能であること、
（ｉｉｉ）１２から４０の間のヌクレオチド塩基を含有すること、
（ｉｖ）該ウイルスのプラス鎖ＲＮＡ鎖の５’末端４０塩基内のこのようなステムループ二次構造を伴う領域に相補的である少なくとも１２のサブユニットのターゲティング配列を有することを特徴とし、
ヘテロ二重鎖複合体が、少なくとも４５℃の解離Ｔｍを有し、このようなステムループ二次構造を破壊することを特徴とするオリゴヌクレオチド類縁化合物との間で形成されるヘテロ二重鎖複合体を含む。
【００１２】
代表的な化合物は、非荷電リン含有サブユニット間連結により連結している複数のモルホリノサブユニットから構成され、その連結部位が、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接サブユニットの５’環外炭素に連ねている。該化合物が、構造：
【化２】
0005425396.tif 000003
のようなホスホロジアミデート連結部を有してもよく、
式中、Ｙ１＝Ｏ、Ｚ＝Ｏ、Ｐｊは、ポリヌクレオチド中の塩基に対する塩基特異的水素結合による結合に有効なプリン又はピリミジン塩基対部分であり、Ｘは、アルキル、アルコキシ、チオアルコキシ又はアルキルアミノである。好ましい化合物において、Ｘ＝ＮＲ２であり、ここで、各Ｒは、独立して水素又はメチルである。該化合物は、オリゴヌクレオチド類縁体単独又は該類縁体と、該化合物の宿主細胞への取込みを増強できるアルギニンに富むポリペプチドとの複合体であり得る。
【００１３】
本発明はまた、一本鎖のプラス鎖ＲＮＡゲノムを有し、哺乳動物対象中のフラビウイルス科、ピコルノウイルス科、カリシウイルス科、トガウイルス科、アルテリウイルス科、コロナウイルス科、アストロウイルス科又はヘペウイルス科ファミリーの中の１種から選択されるＲＮＡウイルスによるウイルス感染の存在を検出するか、又は哺乳動物対象を感染するようなウイルスと、該ウイルスに対し特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチド類縁化合物との間の有効な相互作用の存在を確認する方法に関する。該方法を実施する際に、（ａ）該ウイルスのプラス鎖ＲＮＡ鎖の５’末端４０塩基内のステムループ二次構造を伴う領域に相補的である少なくとも１２のサブユニットのターゲティング配列を含む１２〜４０のサブユニットの配列、（ｂ）各々の連結部が１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接サブユニットの５’環外炭素に結合させている、非荷電リン含有サブユニット間連結部により結合されたモルホリノサブユニット、及び（ｃ）プラス鎖ウイルスｓｓＲＮＡゲノムにより形成でき、少なくとも４５℃の解離Ｔｍ並びに該ステムループ二次構造の破壊を特徴するヘテロ二重鎖構造を有するオリゴヌクレオチド類縁化合物を該対象に投与する。
【００１４】
該化合物が投与された後の選択された時間に、対象からの体液サンプルを得て；該ウイルスのプラス鎖ＲＮＡの相補的配列５’末端領域により複合化されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むヌクレアーゼ耐性のヘテロ二重鎖の存在に関してサンプルをアッセイする。
【００１５】
さらに別の態様において、本発明は、一本鎖のプラス鎖ＲＮＡゲノムを有し、前記化合物を投与することにより、フラビウイルス科、ピコルノウイルス科、カリシウイルス科、トガウイルス科、又はコロナウイルス科ファミリー及びＥ型肝炎ウイルスから選択されるＲＮＡウイルスの哺乳動物宿主細胞における複製を阻止する際の使用のためのオリゴヌクレオチド類縁化合物を含む。該化合物は：
（ｉ）ヌクレアーゼ耐性骨格、
（ｉｉ）哺乳動物宿主細胞による取込みが可能であること、
（ｉｉｉ）１２から４０の間のヌクレオチド塩基を含有すること、
（ｉｖ）前記ウイルスのプラス鎖ＲＮＡ鎖の５’末端４０塩基内のステムループ二次構造を伴う領域に相補的である少なくとも１２のサブユニットのターゲティング配列を有すること、
（ｖ）プラス鎖ウイルスｓｓＲＮＡゲノムにより形成でき、ヘテロ二重鎖構造が、少なくとも４５℃の解離Ｔｍ及び前記ステムループ二次構造の破壊を有することを特徴とする。
【００１６】
代表的な化合物は、非荷電リン含有サブユニット間連結により連結している複数のモルホリノサブユニットから構成され、その連結部位が、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接サブユニットの５’環外炭素に連ねている。該化合物は、構造：
【化３】
0005425396.tif 000004
のようなホスホロジアミデート連結部を有することができ、
式中、Ｙ１＝Ｏ、Ｚ＝Ｏ、Ｐｊは、ポリヌクレオチド中の塩基に対する塩基特異的水素結合による結合に有効なプリン又はピリミジン塩基対部分であり、Ｘは、アルキル、アルコキシ、チオアルコキシ又はアルキルアミノである。好ましい化合物において、Ｘ＝ＮＲ２であり、ここで、各Ｒは、独立して水素又はメチルである。該化合物は、オリゴヌクレオチド類縁体単独であるか、又は該類縁体と該化合物の宿主細胞への取込みを増強できるアルギニンに富むポリペプチドとの複合体であり得る。
【００１７】
以下に記載されたフラビウイルス又はヘパシウイルスの治療のために、ターゲティング配列は、以下の配列のうちの１つにステムループ二次構造を伴う領域に相補的である：
（ｉ）セントルイス脳炎ウイルスに対する配列番号１；
（ｉｉ）日本脳炎ウイルスに対する配列番号２；
（ｉｉｉ）マリーバレー脳炎ウイルスに対する配列番号３；
（ｉｖ）西ナイル熱ウイルスに対する配列番号４；
（ｖ）黄熱病ウイルスに対する配列番号５；
（ｖｉ）デング熱２型ウイルスに対する配列番号６；
（ｖｉｉ）Ｃ型肝炎ウイルスに対する配列番号７；
（ｖｉｉｉ）ダニ媒介性脳炎ウイルスに対する配列番号８；
（ｉｘ）オムスク出血性熱ウイルスに対する配列番号９；
（ｘ）ポーワッサン（Ｐｏｗａｓｓａｎ）ウイルスに対する配列番号１０。
【００１８】
これらのウイルスに対する代表的なターゲティング配列は、以下の配列を含むか、又は関連標的配列における二重鎖二次構造の１つ又は複数の領域と重なるこれらの配列の一部を含む：
（ｉ）セントルイス脳炎ウイルスに対する配列番号４１及び４２；
（ｉｉ）日本脳炎ウイルスに対する配列番号４３及び４４；
（ｉｉｉ）マリーバレー脳炎ウイルスに対する配列番号４５及び４６；
（ｉｖ）西ナイル熱ウイルスに対する配列番号４７及び４８；
（ｖ）黄熱病ウイルスに対する配列番号４９及び５０；
（ｖｉ）デング熱ウイルスに対する配列番号５１、５２；
（ｖｉｉ）Ｃ型肝炎ウイルスに対する配列番号５３及び５４；
（ｖｉｉｉ）ダニ媒介性脳炎ウイルスに対する配列番号５５及び５６；
（ｉｘ）オムスク出血性熱ウイルスに対する配列番号５７及び５８；
（ｘ）Ｐｏｗａｓｓａｎウイルスに対する配列番号５９及び６０。
【００１９】
エンテロウイルス、リノウイルス、ヘパトウイルス又はアフトウイルスの治療のため、ターゲティング配列は、以下の配列のうちの１つにステムループ二次構造を伴う領域に相補的である：
（ｉ）マホニイ及びセービン株のポリオウイルスに対する配列番号１１；
（ｉｉ）ヒト腸内ウイルスＡに対する配列番号１２；
（ｉｉｉ）ヒト腸内ウイルスＢに対する配列番号１３；
（ｉｖ）ヒト腸内ウイルスＣに対する配列番号１４；
（ｖ）ヒト腸内ウイルスＤに対する配列番号１５；
（ｖｉ）ヒト腸内ウイルスＥに対する配列番号１６；
（ｖｉｉ）ウシ腸内ウイルスに対する配列番号１７；
（ｖｉｉｉ）ヒトライノウイルス８９に対する配列番号１８；
（ｉｘ）ヒトライノウイルスＢに対する配列番号１９；
（ｘ）口蹄疫ウイルスに対する配列番号２０；
（ｘｉ）Ａ型肝炎ウイルスに対する配列番号２１。
【００２０】
これらのウイルスに対する代表的なターゲティング配列は、以下の配列を含むか、又は関連標的配列における二重鎖二次構造の１つ又は複数の領域と重なるこれらの配列の一部を含む：
（ｉ）マホニイ及びセービン株のポリオウイルスに対する配列番号６１及び６２；
（ｉｉ）ヒト腸内ウイルスＡに対する配列番号６３及び６４；
（ｉｉｉ）ヒト腸内ウイルスＢに対する配列番号６５及び６６；
（ｉｖ）ヒト腸内ウイルスＣに対する配列番号６７及び６８；
（ｖ）ヒト腸内ウイルスＤに対する配列番号６９及び７０；
（ｖｉ）ヒト腸内ウイルスＥに対する配列番号７１及び７２；
（ｖｉｉ）ウシ腸内ウイルスに対する配列番号７３及び７４；
（ｖｉｉｉ）ヒトライノウイルス８９に対する配列番号７５及び７６；
（ｉｘ）ヒトライノウイルスＢに対する配列番号７７及び７８；
（ｘ）口蹄疫ウイルスに対する配列番号７９及び８０；
（ｘｉ）Ａ型肝炎ウイルスに対する配列番号８１及び８２。
【００２１】
カリシウイルス又はノロウイルスの治療のため、ターゲティング配列は、以下の配列のうちの１つにステムループ二次構造を伴う領域に相補的である：
（ｉ）ネコのカリシウイルスに対する配列番号２２；
（ｉｉ）イヌのカリシウイルスに対する配列番号２３；
（ｉｉｉ）ブタの腸内カリシウイルスに対する配列番号２４；
（ｉｖ）カリシウイルス株ＮＢに対する配列番号２５；
（ｖ）ノーウォークウイルスに対する配列番号２６。
【００２２】
これらのウイルスに対する代表的なターゲティング配列は、以下の配列を含むか、又は関連標的配列における二重鎖二次構造の１つ又は複数の領域と重なるこれらの配列の一部を含む：
（ｉ）ネコのカリシウイルスに対する配列番号８３及び８４；
（ｉｉ）イヌのカリシウイルスに対する配列番号８５及び８６；
（ｉｉｉ）ブタの腸内カリシウイルスに対する配列番号８７及び８８；
（ｉｖ）カリシウイルス株ＮＢに対する配列番号８９及び９０；
（ｖ）ノーウォークウイルスに対する配列番号９１及び９２。
【００２３】
ヘペウイルス、Ｅ型肝炎ウイルスの治療のため、ターゲティング配列は、配列番号２７と同定されている配列内のステムループ二次構造を伴う領域に相補的である。代表的なターゲティング配列は、配列番号９３及び９４を含むか、又は関連標的配列における二次構造の１つ又は複数の領域と重なるこれらの一部を含む。
【００２４】
ルビウイルス又はアルファウイルスの治療のため、ターゲティング配列は、以下の配列のうちの１つにステムループ二次構造を伴う領域に相補的である：
（ｉ）風疹ウイルスに対する配列番号２８；
（ｉｉ）東部ウマ脳炎ウイルスに対する配列番号３８；
（ｉｉｉ）西部ウマ脳炎ウイルスに対する配列番号３９；
（ｉｖ）ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスに対する配列番号４０。
【００２５】
これらの各ウイルスに対する代表的なターゲティング配列は、以下の配列番号、又は関連標的配列における二重鎖二次構造の１つ又は複数の領域と重なるこれら配列の一部により同定される：
（ｉ）風疹ウイルスに対する配列番号９５及び９６；
（ｉｉ）東部ウマ脳炎ウイルスに対する配列番号１１５及び１１６；
（ｉｉｉ）西部ウマ脳炎ウイルスに対する配列番号１１７及び１１８；
（ｉｖ）ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルスに対する配列番号１１９及び１２０。
【００２６】
コロナウイルス又はアルテリウイルスの治療のため、ターゲティング配列は、以下の配列のうちの１つにステムループ二次構造を伴う領域に相補的である：
（ｉ）ＳＡＲＳコロナウイルスＴＯＲ２に対する配列番号２９；
（ｉｉ）ブタ流行性下痢ウイルスに対する配列番号３０；
（ｉｉｉ）伝染性胃腸炎ウイルスに対する配列番３１；
（ｉｖ）ウシコロナウイルスに対する配列番号３２；
（ｖ）ヒトコロナウイルス２２９Ｅに対する配列番号３３；
（ｖｉ）マウス肝炎ウイルスに対する配列番号３４；
（ｖｉｉ）ブタ生殖及び呼吸症候群ウイルスに対する配列番号３５。
【００２７】
これらの各ウイルスに対する代表的なターゲティング配列は、以下の配列番号、又は関連標的配列における二重鎖二次構造の１つ又は複数の領域と重なるこれら配列の一部により同定される：
（ｉ）ＳＡＲＳコロナウイルスＴＯＲ２に対する配列番号９７及び９８；
（ｉｉ）ブタ流行性下痢ウイルスに対する配列番号９９及び１００；
（ｉｉｉ）伝染性胃腸炎ウイルスに対する配列番１０１及び１０２；
（ｉｖ）ウシコロナウイルスに対する配列番号１０３及び１０４；
（ｖ）ヒトコロナウイルス２２９Ｅに対する配列番号１０５及び１０６；
（ｖｉ）マウス肝炎ウイルスに対する配列番号１０７及び１０８；
（ｖｉｉ）ブタ生殖及び呼吸症候群ウイルスに対する配列番号１０９及び１１０。
【００２８】
ママストロウイルス、ヒトアストロウイルスの治療のため、ターゲティング配列は、配列番号３７と同定される配列内のステムループ二次構造を伴う領域に相補的である。代表的なターゲティング配列は、配列番号１１３及び１１４であるか、又は関連標的配列における二重鎖二次構造の１つ又は複数の領域と重なるこれらの配列の一部である。
【００２９】
ウマ動脈炎ウイルスの治療のため、ターゲティング配列は、配列番号３６と同定される配列内のステムループ二次構造を伴う領域に相補的である。代表的なターゲティング配列は、配列番号１１１、１１２、又は関連標的配列における二重鎖二次構造の１つ又は複数の領域と重なるこれらの配列の一部を含む。
【００３０】
本発明のこれら及び他の対象並びに特徴は、本発明の以下の詳細な説明が、添付の図面と関連して読み出すとより完全に認識される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
Ｉ．定義
本明細書に用いられる下記の用語は、他に指定されない限り以下の意味を有する。
【００３２】
用語の「オリゴヌクレオチド類縁体」とは、（ｉ）修飾された骨格構造、例えば、天然のオリゴ−及びポリヌクレオチドに見られる標準的ホスホジエステル連結部以外の骨格、及び（ｉｉ）場合によっては修飾された糖部分、例えば、リボース又はデオキシリボース部分ではなくてモルホリノ部分を有するオリゴヌクレオチドを指す。該類縁体は、標準的ポリヌクレオチド塩基と対のワトソン−クリック塩基により水素結合できる塩基を支持し、類縁骨格は、オリゴヌクレオチド類縁体分子と、標準的ポリヌクレオチド（例えば、一本鎖ＲＮＡ又は一本鎖ＤＮＡ）における塩基との間の配列特異的様式でこのような水素結合を可能にする様式で塩基を提供する。好ましい類縁体は、本質的に非荷電リン含有骨格を有するものである。
【００３３】
オリゴヌクレオチド類縁体における本質的に非荷電リン含有骨格は、サブユニット連結部の大部分、例えば、６０％から１００％の間が、生理的ｐＨで非荷電であり、単一のリン原子を含有する。該類縁体は、８つから４０の間のサブユニット、典型的には約８〜２５のサブユニット、及び好ましくは約１２から２５のサブユニットを含有する。該類縁体は、下記に定義されるように標的配列に相補性の完全配列又は相補性に近い配列を有することができる。
【００３４】
オリゴヌクレオチド類縁体の「サブユニット」とは、該類縁体の１つのヌクレオチド（又はヌクレオチド類縁体）単位を指す。この用語は、結合したサブユニット間連結部のありなしでのヌクレオチド単位を指すことができるが、「荷電サブユニット」を指す場合、荷電は、典型的にサブユニット間連結部（例えば、リン酸連結部又はホスホロチオエート連結部）内に存する。
【００３５】
「モルホリノオリゴヌクレオチド類縁体」は、図２Ａ〜２Ｄに示される形体のモルホリノサブユニット構造からなるオリゴヌクレオチド類縁体であり、（ｉ）この構造は、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接サブユニットの５’環外炭素に結合させて、１個から３個の原子長のリン含有連結部により一緒に結合されており、（ｉｉ）Ｐｉ及びＰｊは、ポリヌクレオチド内の塩基に対する塩基特異的水素結合による結合に有効なプリン又はピリミジン塩基対部分である。プリン又はピリミジン塩基対部分は、典型的にはアデニン、シトシン、グアニン、ウラシル又はチミンである。モルホリノオリゴマーの合成、構造、及び結合特性は、米国特許第５，６９８，６８５号、米国特許第５，２１７，８６６号、米国特許第５，１４２，０４７号、米国特許第５，０３４，５０６号、米国特許第５，１６６，３１５号、米国特許第５，５２１，０６３号、及び米国特許第５，５０６，３３７号に詳述され、それらのすべては、参照として本明細書に組み込まれている。
【００３６】
図２Ｂに示されたサブユニット及び連結部は、図３Ｂ（６個の原子は：１個のモルホリノ窒素、１個の結合されたリン原子、リン原子の５’環外炭素に結合する原子（通常酸素）、５’環外炭素、及び次のモルホリノ環の２個の炭素原子を含む）に示されているように、６個の原子の反復単位骨格用に使用される。これらの構造において、５’環外モルホリノ炭素をリン基に結合させる原子Ｙ１は、硫黄、窒素、炭素又は好ましくは酸素であり得る。リンからの側基のＸ部分は、塩基特異的な水素結合を妨げない任意の安定な基である。好ましいＸ基としては、フルオロ、アルキル、アルコキシ、チオアルコキシ、環状アミンを含むアルキルアミノが挙げられ、それらのすべては、塩基特異的結合が破壊されない限り、種々置換できる。アルキル、アルコキシ及びチオアルコキシは、好ましくは１〜６個の炭素原子を含む。アルキルアミノとは、好ましくは低級アルキル（Ｃ１からＣ６まで）置換を称し、環状アミン類は、場合によっては、酸素、窒素、及び硫黄から選択された１〜２個のさらなるヘテロ原子を含有する、好ましくは、５員環から７員環窒素のヘテロ環である。Ｚは、硫黄又は酸素であり、酸素であることは好ましい。
【００３７】
好ましいモルホリノオリゴマーは、ホスホロジアミデート結合モルホリノオリゴマーであり、本明細書ではＰＭＯと称される。このようなオリゴマーは、図２Ｂに示されるようなモルホリノサブユニット構造からなり、Ｘ＝ＮＨ２、ＮＨＲ、又はＮＲ２（式中Ｒは、低級アルキル、好ましくはメチルである）であり、Ｙ＝Ｏ、及びＺ＝Ｏであり、Ｐｉ及びＰｊは、塩基特異的水素結合により、ポリヌクレオチドにおける塩基を結合させるのに有効なプリン又はピリミジン塩基対部分である。また、交互ホスホロジアミデート連結部を有する構造が好ましく、図２Ｂにおいて、メトキシ又はエトキシなど、Ｘ＝低級アルコキシであり、Ｙ＝ＮＨ又はＲが低級アルキルであるＮＲであり、Ｚ＝０である。
【００３８】
特に、アルキル基、アルコキシ基、チオアルコキシ基、又はアルキルアミノ基に関して用語の「置換されている」とは、例えば、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、チオール、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、イミノ、オキソ（ケト）、ニトロ、シアノ、又はカルボン酸、スルホン酸、又はホスホン酸のような種々の酸、又はエステル類などのヘテロ原子含有置換基を有する炭素上の水素原子の交換を指す。それはまた、アルキル基、カルボニル基又は他の炭素含有基を有するヘテロ原子上の水素原子（アミン水素など）の交換を指すことができる。
【００３９】
ウイルスゲノムＲＮＡに関連する、本明細書に用いられる用語の「標的」は、ウイルスゲノムＲＮＡを称し、特に本明細書に記載された一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスのプラス鎖ＲＮＡ鎖の５’末端４０の塩基内のステムループ二次構造を伴う領域を指す。
【００４０】
用語の「標的配列」とは、オリゴヌクレオチド類縁体が特異的である標的ＲＮＡの一部であり、即ち、オリゴヌクレオチド類縁体が、相補的配列のワトソン−クリック塩基対によりハイブリダイズする配列を指す。以下から分かるとおり、標的配列は、ウイルスのプラス鎖ＲＮＡの連続領域であり得るか、二次構造に関与する５’配列と３’配列の両方の相補的断片からなり得る。
【００４１】
用語の「ターゲティング配列」は、ＲＮＡゲノム内の標的配列に相補的である（さらに本質的に相補的を意味する）オリゴヌクレオチド類縁体における配列である。類縁化合物の全配列、又は一部だけは、標的配列に相補的であり得る。例えば、２０の塩基を有する類縁体において、１２〜１４だけが、ターゲティング配列となり得る。典型的に、ターゲティング配列は、類縁体の連続塩基で形成されるが、例えば、類縁体の反対端から一緒に置かれる場合、標的配列にかける配列を構成する非連続配列から交互に形成できる。以下に見られるように、標的配列及びターゲティング配列は、ウイルスのプラス鎖ＲＮＡ鎖の５’末端４０の塩基内の領域に対する類縁体の結合が、二次構造、特にこの領域における３’ステムループ構造の大部分を破壊するために作用するように選択される。
【００４２】
標的配列及びターゲティング配列は、ハイブリダイゼーションが逆平行配位で生じる場合、互いに「相補的」であると記載される。ターゲティング配列は、標的配列に「ほとんど」又は「本質的な」相補性及び本発明の目的のための機能をなお有し得、即ち、なお「相補的」であり得る。本発明に使用されるオリゴヌクレオチド類縁化合物は、１０のヌクレオチドから標的配列を有しながら多くて１つのミスマッチを有することが好ましく、２０から多くて１つのミスマッチを有することが好ましい。代わりに、使用されたアンチセンスオリゴマー類は、本明細書に明示された代表的なターゲティング配列を有して、少なくとも９０％配列相同性、好ましくは少なくとも９５％配列相同性を有する。
【００４３】
本質的に４５℃超、好ましくは少なくとも５０℃、典型的には６０℃〜８０℃又はそれ以上のＴｍによる生理的条件下で、オリゴマーが標的にハイブリダイズする場合、オリゴヌクレオチド類縁体は、標的ポリヌクレオチドに「特異的にハイブリダイズする」。このようなハイブリダイゼーションは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に対応することが好ましい。所与のイオン強度及びｐＨにおいて、Ｔｍは、標的配列の５０％が、相補的ポリヌクレオチドにハイブリダイズする温度である。繰り返すが、このようなハイブリダイゼーションは、標的配列にアンチセンスオリゴマーの「ほとんど」又は「本質的な」相補性を生じ得、並びに正確な相補性を生じ得る。
【００４４】
「ヌクレアーゼ耐性」のオリゴマー分子（オリゴマー）は、その骨格が、体内で共通の細胞外及び細胞内ヌクレアーゼにより非ハイブリダイズ又はハイブリダイズの形態で、ヌクレアーゼ開裂に本質的に耐性であるものを指す；即ち、該オリゴマーが曝される体内の通常のヌクレアーゼ条件下でヌクレアーゼ開裂がほとんどないか、又はまったくないことを示す。
【００４５】
「ヘテロ二重鎖」とは、オリゴヌクレオチド類縁体と標的ＲＮＡの相補的部分との間の二重鎖を指す。「ヌクレアーゼ耐性ヘテロ二重鎖」とは、該ヘテロ二重鎖が、二重鎖ＲＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡ複合体を切断できるＲＮＡｓｅＨなどの細胞内及び細胞外ヌクレアーゼによりインビボ分解に本質的に耐性になるように、アンチセンスオリゴマーのその相補的標的への結合により形成されるヘテロ二重鎖を指す。
【００４６】
「標的ＲＮＡに関与する塩基特異的細胞内結合事象」とは、オリゴヌクレオチド類縁体の細胞内標的ＲＮＡ配列への特異的結合を指す。このような結合の塩基特異性は、配列特異性である。例えば、一本鎖ポリヌクレオチドは、配列に相補的である一本鎖ポリヌクレオチドに特異的に結合できる。
【００４７】
感染ｓｓＲＮＡウイルスに対して標的にされたアンチセンスオリゴマーの「有効量」は、感染ウイルスの複製率、及び／又はウイルス負荷、及び／又はウイルス感染を伴う症状を減少させるのに有効な量である。
【００４８】
本明細書に用いられる用語の「体液」は、尿、唾液、血漿、血液、髄液、など、対象から得られた種々のサンプルタイプ、或いは皮膚細胞又は皮膚細片などの生体起源の他のサンプルを包含し、細胞又はそれに懸濁された細胞断片、又は液体培地及びその溶液を指すことができる。
【００４９】
用語の「相対量」は、試験測定と対照測定との間で比較が成される際に使用される。反応で複合体を形成する試薬の相対量は、対照種と反応する量と比較して試験種と反応する量である。対照種は、同じアッセイで別々に操作し得るか、同じサンプルの一部（例えば、組織断片中の悪性領域周囲の正常な組織）であり得る。
【００５０】
個体又は細胞の「処置」は、個体又は細胞の自然過程を変更するための手段として提供される本発明の任意のタイプである。処置は、限定はしないが、例えば、製薬組成物の投与を含み、予防的実施、又は病的事象の開始に続く実施、或いは病因薬剤との接触を実施できる。特定のウイルスによる感染と診断された患者に関する関連用語の「治療成績の改善」とは、ウイルス増殖、又はウイルス負荷、或いはその特定のウイルスによる感染に伴う検出可能な症状の遅速化又は減少を指す。
【００５１】
薬剤が、細胞膜を通過して通過拡散以外のメカニズムにより細胞に入ることができる場合、薬剤は「哺乳動物細胞により能動的に吸収」される。この薬剤は、例えば、「能動輸送」により輸送でき、例えばＡＴＰ依存輸送メカニズムにより、或いは「輸送促進」により、哺乳動物の細胞膜を通過して薬剤の輸送に関連し、薬剤の輸送タンパク質への結合を必要とする輸送メカニズムによって細胞膜を通過してアンチセンス薬剤の輸送に関連し、次いで膜を通過した結合薬剤の通過を促進する。能動的輸送及び促進輸送の双方に関して、オリゴヌクレオチド類縁体は、下記に定義されるように、本質的に非荷電骨格を有することが好ましい。或いは、アンチセンス化合物は、飲食作用メカニズムにより細胞内に取り込むことができるカチオン性脂質又はリポソームで複合化されたアニオン性骨格を有する薬剤などの複合化形態で製剤化できる。この類縁体はまた、例えば５’末端又は３’末端でアルギニンに富むペプチド、例えば、ＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質の一部、又はポリアルギニンに複合し、記載された標的宿主細胞への輸送を促進できる（Ｍｏｕｌｔｏｎ、Ｎｅｌｓｏｎら２００４年）。本発明を実施する上で有用な代表的なアルギニンに富むペプチドは、配列リスト表において配列番号１２１〜１２６として記載されている。
【００５２】
生理的条件下で自発的に、一本鎖ＲＮＡの１つ又は複数の領域によって分離される二本鎖（二重鎖）ＲＮＡの１つ又は複数の領域を形成できる場合、配列は、「内部ステムループ二次構造を形成可能」である。この構造におけるステム及びループは、ループ化一本鎖領域において終端する二重鎖ＲＮＡ領域（ステム）を言う。本発明により包含されるいくつかのウイルスの５’末端領域のステムループ構造は、図４Ａ〜４Ｅに見られる。西ナイルウイルス（ＷＮＶ）又はＨＣＶに見られるように、例えば（図４Ａ）、ステムループ構造は、単独ステム、単独ループ、及び非二重鎖末端領域を含むことができる。他の場合において、例えば、黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）又はデング熱−２ウイルス（図４Ａ）、ステムループ二次構造は、非二重鎖領域により散在された２つ以上の二本鎖「ステム」領域及び単独ループを含み得る。
【００５３】
「このようなステムループ構造の破壊」とは、本発明のオリゴヌクレオチド類縁化合物と、ウイルスゲノムの５’末端領域内の二重鎖形成配列との間で安定なヘテロ二重鎖複合体を形成することにより、この領域内の二重鎖ＲＮＡ形成を妨げることによる、ＲＮＡウイルスプラス鎖ゲノムの５’末端領域のステムループ構造の任意の部分の破壊を意味する。ウイルスゲノムの５’末端領域内の二次ステムループ構造を破壊できるターゲティング配列の選択則は、以下に考察される。
【００５４】
ＩＩ．標的ウイルス
本発明は、一本鎖のプラス鎖ＲＮＡウイルスの有効性は、（ｉ）プラス鎖ウイルスＲＮＡ鎖の５’末端配列に対し、特にこの領域のステムループ二次構造に寄与する標的配列に対して標的にし、（ｉｉ）アンチセンス化合物と宿主細胞内のウイルスとの間の有効な相互作用を可能にする、物理的及び薬物動態学的特徴を有する、アンチセンスオリゴヌクレオチド類縁化合物に、ウイルスにより感染した細胞を曝露させることによって達成できるという発見に基づいている。一態様において、オリゴマーは、ウイルスにより感染した哺乳動物対象を治療する際に使用できる。
【００５５】
本発明は、（ｉ）一本鎖、（ｉｉ）正極性、及び（ｉｉｉ）３２ｋｂ未満であるゲノムを有するＲＮＡウイルスを標的にする。標的ウイルスはまた、ウイルスＲＮＡ複製における第１ステップとして負極性、マイナス鎖又は陰方向ＲＮＡを有するゲノムＲＮＡ鎖を合成する。特に標的ウイルスファミリーとしては、フラビウイルス科、ピコルノウイルス科、カリシウイルス科、トガウイルス科、アルテリウイルス科、コロナウイルス科、アストロウイルス科及びヘペウイルス科ファミリーが挙げられる。ファミリー、属及び種により組織化された標的ウイルスは、表１に記載されている。これら８つのファミリー及びそれらのメンバーの各々の種々の物理的、形態学的、及び生物学的特徴は、例えば、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｒ．Ｂｅｌｓｈｅ編集、第２版、Ｍｏｓｂｙ、１９９１年及びｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｖｉｒｕｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓ（ｗｗｗ，ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＩＣＴＶｄｂ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍ）に見ることができる。各ファミリーの重要な生物学的特徴のいくつかは、以下に要約している。
【００５６】
Ａ．フラビウイルス科。このファミリーのメンバーはいくつかの重大なヒト病原体を含み、それらの中で、フラビウイルス属の蚊媒介性メンバーは、黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）、西ナイル熱ウイルス（ＷＮＶ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、セントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥＶ）、マリーバレー脳炎ウイルス、クンジン（Ｋｕｎｊｉｎ）ウイルス、及び４つの血清型のデング熱ウイルス（ＤＥＮ１〜４）を含む。
【００５７】
フラビウイルス属のダニ媒介性メンバーとしては、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥＶ）及びオムスク出血性熱ウイルス（ＯＨＦＶ）、跳躍病ウイルス、ポーワッサン（Ｐｏｗａｓｓａｎ）ウイルス、キャサヌール森林病ウイルス及びアルカーマ（Ａｌｋｈｕｒｍａ）ウイルスが挙げられる。
【００５８】
フラビウイルス科はまた、ヘパシウイルス属のメンバーであるＣ型肝炎ウイルスを含む。
【００５９】
Ｂ．ピコルナウイルス科。これは、医学的に重要なファミリーであり、そのメンバーは、ヒト及び動物双方を感染させ、重篤な麻痺（麻痺性ポリオ）、アスペクト髄膜炎、肝炎、胸側痛、心筋炎、皮膚発疹、及び風邪を引き起こすことがあり；不明瞭な感染が共通している。いくつかの医学的に重要な属は、このファミリーのメンバー；ポリオウイルス（ＰＶ）及びヒト腸内ウイルス（例えば、コクサッキーウイルス）などの腸内ウイルス；Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）を含む肝炎ウイルス；ライノウイルス；及び口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）を含むアフタウイルスである。
【００６０】
ヒトライノウイルス８９（ＨＲＶ−８９）及びヒトライノウイルスＢ（ＨＲＶ−Ｂ）などのライノウイルス類は、ヒトの感冒の素因として認められている。血清型は、１Ａから１００まで指定されている。伝播は、主としてエアロゾル経路であり、ウイルスは鼻内で複製する。
【００６１】
すべてプラス鎖ＲＮＡウイルスのように、ピコルナウイルスのゲノムＲＮＡは、感染性であり；即ち、ゲノムＲＮＡは、宿主の転写事象なしで直接ウイルスタンパク質の合成を指示することができる。
【００６２】
Ｃ．カリシウイルス科。カリシウイルス科のメンバーは、ヒト及び動物双方を感染させる。ベシウイルス属は、上皮水疱形成を含み、動物の流産急発の原因の疑い、並びにいくつかの形態のヒト肝炎（非ＡからＥを通して）の疑いのある哺乳動物において、疾患発現を生じる（Ｓｍｉｔｈら、１９９８年）。他のカリシウイルス科属としては、ノーウォーク様及びサッポロ様ウイルスが挙げられ、ヒトカリシウイルス、及びウサギ出血性疾患ウイルス、特に急性且つ致死的ウイルスを含むウサギウイルスを共に含む。
【００６３】
ヒトカリシウイルスは、成人において世界中に広がったウイルス性下痢発生、並びに乳児の重要な病原体の最も共通した原因である（Ｏ’Ｒｙａｎ１９９２年）。消化管に棲息する少なくとも５つのタイプのヒトカリシウイルスがある。ノーウォークウイルスは、急性流行性胃腸炎を生じる一般に広まったヒト作用物質であり、ヒトにおける全発生胃腸炎のおよそ１０％の原因となっている（Ｍｕｒｒａｙら、１９９８年）。
【００６４】
ベシウイルスは現在、いくらかあいまいで宿主特異的として見なされているものから、より可変域群の既知のウイルス病原体の１つとして認められているものまで出現する。例えば、単一血清型は、海水魚（オパールアイ）、アシカ、ブタ、及びヒトを含む１６種の多様な群の動物種を感染させることが示されている。
【００６５】
Ｄ．トガウイルス。このファミリーのメンバーは、ヒト及び動物双方を感染させる蚊媒介性ウイルスを含む。該ファミリーは、アルファウイルス属及びルビウイルス（風疹）を含む。代表的なアルファウイルスとしては、シンドブス、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）及びベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）が挙げられる。
【００６６】
Ｅ．Ｅ型肝炎様ウイルス。Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）は、１９８７年に最初に記載され、１９９１年米国で初めて報告された、該ウイルスは、小型一本鎖ＲＮＡ特性に基づきカリシウイルス科のメンバーとして最初に記載された。いくつかは、ＨＥＶを依然としてカリシウイルス科に属するものとして分類されるが、最近では、ヘペウイルス科ファミリーのメンバーとしてのみ分類されている。感染は、Ａ型肝炎ウイルス感染に非常に似ていると考えられている。この疾患は、初期感染約２０日後に現れる急性ウイルス感染であり、ウイルスは、血清中に約２０日間見ることができる。伝染は、汚染水を介して生じ、地理的には、未開発国に限定される。
【００６７】
Ｆ．コロナウイルス科、アルテリウイルス科及びアストロウイルス科。コロナウイルス科のメンバーは、通常の風邪の１０％から３０％及び他の呼吸器系感染を引き起こすヒトコロナウイルス並びにマウス肝炎ウイルスを含む。さらに最近、重度急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）のウイルス原因が、コロナウイルスであると確認されている。アルテリウイルス科としては、２種の重要な動物ウイルス、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）及びブタ生殖並びに呼吸器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）が挙げられる。アストロウイルス科としては、ヒトアストロウイルス（ＨＡｓｔＶ）が挙げられる。
【００６８】
下表１は、ファミリー及び属により組織化された本発明の標的ウイルスを記載している。
【００６９】
【表１】
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【００７０】
ＩＩＩ．ウイルス標的領域
ＲＮＡテンプレート上でＲＮＡを合成する能力において、すべてのＲＮＡウイルスのような一本鎖のプラス鎖ＲＮＡウイルスは独特である。このタスクを達成するために、それらのウイルスは、独特なＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）の合成、可能性としてウイルスＲＮＡの３’及び５’末端の複数未翻訳領域（ＵＴＲ）に特異的結合する他のタンパク質の合成をコードし、誘導する。ウイルスＲＮＡ類は、線状分子であるので、ＲｄＲｐ類は、それらのゲノムの５’末端の完全性を保持しながらデノボＲＮＡ複製を開始させるために独特な方法を使用しなければならない。プラス鎖（＋鎖）ウイルスＲＮＡ複製は、以下の経路を経て進行することが一般に受け入れられている：
＋鎖ＲＮＡ→−鎖ＲＮＡ合成→ＲＦ→＋鎖ＲＮＡ合成
式中、「−鎖ＲＮＡ」は、「＋鎖ＲＮＡ」に相補的なマイナスセンス又はマイナス鎖ＲＮＡであり、「ＲＦ」（複製形態）は、二本鎖ＲＮＡである。マイナス鎖ＲＮＡは、ウイルスタンパク質への翻訳又は新たに形成されたビリオンへの取込みを予定するプラス鎖ＲＮＡの複数コピーの複製用のテンプレートとして用いられる。ポリオウイルス感染細胞内のプラス鎖対マイナス鎖ＲＮＡの比率は、Ｃ型肝炎細胞においておよそ５０：１であり、各マイナス鎖ＲＮＡは、多数のプラス鎖ＲＮＡ分子の合成用のテンプレートとして役立つことを示している。
【００７１】
本発明は、プラス鎖ＲＮＡウイルスのいくつかのクラスは、ウイルスプラス鎖の５’ＵＴＲ内の配列、特に５’ＵＴＲ内の１つ又は複数のシス作用性因子（ステムループ構造）を破壊するようにデザインされた配列に結合できるアンチセンス化合物にウイルスを曝すことによって有効に阻止できるという発見に基づいている。
【００７２】
したがって、有効な標的領域（アンチセンス化合物が結合するプラス鎖５’ＵＴＲの配列）を同定する際の第１のステップとして、１つは、ステムループ二次構造に関与する５’ＵＴＲ内のこれらの領域を同定する。これは、例えば、インプットＲＮＡ配列の最小自由エネルギー状態に関する検索に基づくコンピュータアシスト二次構造予測により成すことができる（Ｚｕｋｅｒ２００３年）。この分析を、種々の標的ウイルスの５’ＵＴＲ領域の末端４０の塩基に適用すると、図４Ａ〜４Ｂに示されている二次構造又はステムループが得られる。図に見られるように、二次構造（シス作用性因子を形成）の領域は、典型的に末端２０〜２５の塩基に見られるが、多くの場合、４０位までの塩基に見られる。したがって、好ましい標的配列は、最末端４０までのヌクレオチド、典型的には５’末端５〜３５のヌクレオチドを含むプラス鎖ＲＮＡの５’末端領域である。好ましい標的領域は、図４Ａ〜４Ｄに示されているように、これらの領域の二次構造に関与するこれらの塩基を含む。特にターゲティング配列は、プラス鎖ＲＮＡの５’末端領域に相補的であり、ＲＮＡに対する化合物のハイブリダイゼーションが、この領域のステムループ二次構造、好ましくは大抵の５’末端ステムループ二次構造を破壊するのに有効になるように選択される少なくとも１２の塩基配列を含む。例として、図４Ａは、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋのデータベースなどのよく知られた出所源から入手できるウイルスゲノム配列の二次構造を示している。或いは、当業者は、開示された文献において、例えば、指定されたウイルスに関する配列情報を開示している参考文献を検索することにより、多数の対象ウイルスに関する配列を見つけることができる。完全又は部分的ウイルス配列が得られたら、ウイルスの５’末端配列が同定される。
【００７３】
８つのウイルスファミリーの各々の一般的ゲノム構成は下記に考察され、次いで代表的な標的配列が、各ファミリー内の選択メンバー（属、種又は株）に関して得られる。
【００７４】
Ａ．ピコルナウイルス科。典型的なピコルナウイルスであるヒトライノウイルス８９のゲノム（図３Ａ）は、一本鎖、プラス鎖、およそ７．２ｋｂのポリアデニル化ＲＮＡの単一分子である。該ゲノムは、第１のポリタンパク質の上流、単一のＯＲＦ、及びその５’末端に共有結合で連結しているＶＰｇ（結合ウイルスゲノム）タンパク質に位置している長い６１８のヌクレオチドＵＴＲを含む。ＯＲＦは、２つのセグメントに細分され、その各々は、ポリタンパク質をコードする。第１のセグメントは、開裂され、続いてＶＰ１からＶＰ４のウイルスタンパク質を形成するポリタンパク質をコードし、第２のセグメントは、プロテアーゼ及びポリメラーゼを含むウイルスタンパク質の前駆体であるポリタンパク質をコードする。ＯＲＦはポリＡ終止配列で終結する。
【００７５】
Ｂ．カリシウイルス科。図３Ｂは、カリシウイルスのゲノム、この場合はノーウォークウイルスを示している。該ゲノムは、感染、一本鎖、およそ７．６ｋｂのプラス鎖ＲＮＡの単一分子である。図に示されるように、該ゲノムは、非修飾の第１のオープンリーディングフレームの小型ＵＴＲ上流を含む。該ゲノムの３’末端は、ポリアデニル化されている。該ゲノムは、３つのオープンリーディングフレームを含んでいる。第１のオープンリーディングフレームは、ポリタンパク質をコードし、続いて開裂してヘリカーゼ、プロテアーゼ、ＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ、及びウイルスゲノムＲＮＡの５’末端に結合するタンパク質の「ＶＰｇ」を含むウイルス非構造的タンパク質を形成する（Ｃｌａｒｋ及びＬａｍｂｄｅｎ、２０００年）。第２のオープンリーディングフレームは、単一カプシドタンパク質をコードし、第３のオープンリーディングフレームは、実在する塩基性であって、恐らくＲＮＡと結合できる構造的タンパク質であると報告されているものをコードする。
【００７６】
Ｃ．トガウイルス科。図３Ｃは、トガウイルスのゲノムの構造、この場合トガウイルスゲノムの風疹ウイルスである。該ゲノムは、感染している一本鎖、およそ９．８ｋｂのプラス鎖ＲＮＡの単一線状分子である。５’末端は、７−メチルＧ分子によりキャップされ、３’末端は、ポリアデニル化されている。完全長且つサブゲノムのメッセンジャーＲＮＡを示しており、翻訳後のポリタンパク質の開裂は、ＲＮＡ複製中に生じる。該ゲノムはまた、２つのオープンリーディングフレームを含んでいる。第１のオープンリーディングフレームは、ポリタンパク質をコードし、続いて４つの機能性タンパク質、ｎｓＰ１からｎｓＰ４に開裂する。第２のオープンリーディングフレームは、ウイルスカプシドタンパク質をコードし、３つの他のウイルスタンパク質、ＰＥ２、６Ｋ及びＥ１に開裂する。
【００７７】
Ｄ．フラビウイルス科。図３Ｄは、ヘパシウイルス属のＣ型肝炎のゲノム構造を示している。ＨＣＶゲノムは、約９．６ｋｂの一本鎖のプラス鎖ＲＮＡの単一線状分子であり、３４１のヌクレオチド５’ＵＴＲを含有する。５’末端は、ｍ７ＧｐｐＡｍｐ分子によりキャップされ、３’末端は、ポリアデニル化されていない。該ゲノムは、１つだけのオープンリーディングフレームを含んでおり、前駆体ポリタンパク質をコードして６つの構造的且つ機能的タンパク質に分離できる。
【００７８】
Ｅ．コロナウイルス科。図３Ｅは、ヒトコロナウイルス２２９Ｅのゲノム構造を示している。このコロナウイルスは、コロナウイルス科及び２９２ヌクレオチド５’ＵＴＲに典型的なおよそ２７．４ｋｂの大型ゲノムを有している。該ウイルスゲノムの大抵の５’−ＯＲＦは、ウイルスコード化プロテアーゼにより開裂されて、ＲｄＲｐ及びヘリカーゼなどのいくつかの非構造的タンパク質を放出する大型ポリタンパク質に翻訳される。次にこれらのタンパク質は、ウイルスゲノムを複製させ、並びに他のウイルスタンパク質の合成に使用される入れ子型転写を発生させる。
【００７９】
５’末端を表す代表的なウイルス核酸配列、対応するウイルスゲノムに関する第１の（大抵は５’末端）４０塩基のプラス鎖配列についてのＧｅｎＢａｎｋ参照は、下表２に記載している。表２のヌクレオチド配列番号は、プラス鎖ＲＮＡのＧｅｎＢａｎｋ参照から引用されている。これらの配列は、文献又は特許情報源の入手できる遺伝子配列データベースから利用できる５つのウイルスファミリーにおいて、他の配列の単なる説明だけであることを認識するであろう。配列番号１〜４０として同定されている下記の配列もまた、本明細書の最後に配列表、表４に記載している。
【００８０】
表２の標的配列は、表示されたウイルスＲＮＡ類のプラス鎖配列の５’末端における４０塩基である。示しているこの配列は、５’から３’への配向にあるので、３’末端ヌクレオチドは、記載された配列の末端にある。塩基記号「Ｎ」は、これらの位置のヌクレオチドが現在知られていないことを示している。ステムループ二次構造を伴う各配列内の領域は、図４Ａ〜４Ｄに示しているこれらの配列における予測された二次構造から見ることができる。
【００８１】
【表２−１】
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【表２−２】
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【００８２】
ターゲティング配列を選択するために、プラス鎖ＲＮＡ（配列番号１〜４０）の５’末端領域の相補的配列にハイブリダイズさせる場合、この領域内のステムループ二次構造、好ましくはこの領域内の最初のステム構造を破壊するのに有効である配列を探す。例として、西部ナイル熱ウイルス（図４ＡのＷＮＶ）に関する好適なターゲティング配列は、図に示されたステムループ構造を破壊するであろう。３つの一般的なクラスの配列は、好適と思われる（代表的な１２〜１４の塩基ターゲティング配列は、説明目的のために示す）：
（１）ステム及びその周囲塩基の大抵の５’塩基（１〜１４）を標的にする５’−ＡＣＡＧＧＣＧＡＡＣＴＡＣＴ−３’などの配列；
（２）ステム及びその周囲塩基（１３〜２４）の相補的塩基を標的にする５’−ＧＴＣＡＧＣＴＣＡＣＡＣ−３’などの配列；
（３）ステムループ及び周囲塩基（７〜２０）の片側又は両「側」の部分を標的にする５’−ＧＣＴＣＡＣＡＣＡＧＧＣＧＡ−３’などの配列であって、典型的にはこの配列は、すべてを破壊するはずであるが、少なくともステム構造を形成する２〜４の対塩基を破壊する。
【００８３】
この選択手法は、表２に示される他の配列に適用できる方法であることを認識するであろう。例えば、図４Ａに示される黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）に関して、上記３つの一般的なクラス後にパターン化される代表的な１４〜１８の塩基配列としては、以下の配列を挙げることができる：
（１）最初のステム及び周囲塩基の大抵の５’塩基（１〜１６）を標的にする５’−ＧＣＡＣＡＣＡＧＧＡＴＴＴＡＣＴ−３’などの配列；
（２）最初のステム及びその周囲塩基（２２〜３５）の相補的塩基を標的にする５’−ＧＴＣＣＡＡＴＧＣＡＣＣＴＣ−３’などの配列；
（３）ステム及び周囲塩基（１５〜３２）の両側の一部を標的にする５’−ＣＡＡＴＧＣＡＣＣＴＣＡＡＴＴＡＧＣ−３’などの配列。
【００８４】
当然のことながら、このように選択されたターゲティング配列は、例えば、１２塩基のようにより短くできるか、又は例えば、２０塩基のように長くでき、この配列が、標的とのハイブリダイゼーションの際にステム構造を破壊するのに十分に相補的で、ウイルスプラス鎖により４５℃以上のＴｍを有するヘテロ二重鎖を形成する限り、少数のミスマッチを含むであろう。
【００８５】
より一般的に、標的とターゲティング配列との間の相補性度は、安定な二重鎖を形成するのに十分である。アンチセンスオリゴマーと標的ＲＮＡ配列との相補性領域は、８〜１１塩基と短くてもよいが、好ましくは１２〜１５以上の塩基、例えば、１２〜２０の塩基、又は１２〜２５の塩基である。約１４〜１５の塩基のアンチセンスオリゴマーは、一般にウイルスゲノムに独特な相補性配列を有するほど十分に長い。さらに、相補性塩基の最短長は、下記に考察されるように、必要な結合Ｔｍを達成するために要求され得る。
【００８６】
４０塩基と長いオリゴマーは、好適となり得るが、少なくとも最少数の塩基、例えば、８〜１１、好ましくは１２〜１５の塩基が、標的配列に相補的である。しかしながら、一般に細胞内への促進又は能動的取込みは、約３０未満、好ましくは２５未満、より好ましくは、２０又はそれ以下の塩基のオリゴマーが最適である。さらに以下に記載されているＰＭＯオリゴマーに関して、結合安定性と取込みの最適バランスは、一般に、１４〜２２の塩基長で生じる。
【００８７】
該オリゴマーは、ウイルス核酸標的配列に対して１００％相補的であり得るか、又は例えば、オリゴマーとウイルス核酸標的配列との間で形成されたヘテロ二重鎖が、細胞ヌクレアーゼの作用及びインビボで発生し得る他の分解様式に耐えるほど十分に安定である限り変異体を収容させるためにミスマッチを含み得る。ヌクレアーゼによる開裂に対して感受性が低いオリゴマー骨格を下記に考察する。ミスマッチが存在する場合、ハイブリッド二重鎖の中央よりも末端領域に対する不安定化が少ない。許されるミスマッチ数は、よく理解された二重鎖安定性の原理に従って、オリゴマーの長さ、二重鎖中のＧ：Ｃ塩基対のパーセンテージ、二重鎖中のミスマッチの位置に依る。このようなアンチセンスオリゴマーは、ウイルス核酸標的配列に対して必ずしも１００％相補的ではないが、核酸標的の生物活性、例えば、ウイルスタンパク質の発現が調節されるように、標的配列に安定且つ特異的に結合することが有効である。
【００８８】
オリゴマーと標的配列との間で形成された二重鎖の安定性とは、結合Ｔｍの機能及び細胞酵素的開裂に対する二重鎖の感受性である。相補的配列ＲＮＡに関するアンチセンス化合物のＴｍは、Ｈａｍｅｓらによる、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８５年、１０７〜１０８頁に記載されたもの、又はＭｉｙａｄａ  Ｃ．Ｇ．及びＷａｌｌａｃｅ  Ｒ．Ｂ．、１９８７年、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４巻、９４〜１０７頁に記載されたものなど、従来の方法により測定できる。各アンチセンスオリゴマーは、体温超、好ましくは５０℃超の相補的配列ＲＮＡに関する結合Ｔｍを有する必要がある。Ｔｍは、６０〜８０℃の範囲又はそれ以上が好ましい。よく知られた原理によれば、相補的ベースのＲＮＡハイブリッドに関するオリゴマー化合物のＴｍは、二重鎖におけるＣ：Ｇ対塩基の比率を増加させることにより、及び／又はヘテロ二重鎖の長さ（塩基対における）を増やすことにより上昇できる。同時に、細胞取込みを最適にする目的のために、オリゴマーのサイズを制限することが有利となり得る。この理由について、２０以下の塩基長で高いＴｍ（５０℃以上）を示す化合物は、一般に、高いＴｍ値に関して２０塩基よりも大きいことを必要とするものよりも好ましい。
【００８９】
下表３は、表示されたウイルスのプラス鎖の５’末端４０塩基領域の上流及び下流部分に相補的である５’から３’への配向性における代表的なターゲティング配列を示す。この配列は、ターゲティング配列が、上記に考察された一般的な分類則に従って選択され得る１つ又は複数のターゲティング配列のコレクションをここに提供する。したがって、例えば、セントルイス脳炎ウイルスに対する標的を選択する際に、配列番号４０又は４１、或いはウイルスの５’末端ＵＴＲにおける二次構造形成を阻止するのに有効な配列の一部のいずれかを選択できるであろう。
【００９０】
【表３−１】
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【表３−２】
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【００９１】
ＩＶ．アンチセンスオリゴヌクレオチド類縁化合物
Ａ．性質
上記に詳述されたように、アンチセンスオリゴヌクレオチド類縁化合物（用語の「アンチセンス」とは、化合物がウイルスのセンス又はプラス鎖ＲＮＡに対して標的にされることを表す）は、マイナス鎖ＲＮＡの二次的構造を伴う５’末端４０塩基の領域を標的にする塩基配列を有している。さらに、宿主細胞、例えば、感染哺乳動物対象に投与された場合、該オリゴマーは感染ウイルスを有効に標的にできる。この要件は、オリゴマー化合物が（ａ）哺乳動物細胞による能動的に吸収される能力を有し、（ｂ）吸収されたら、約４５℃超のＴｍを有する標的ｓｓＲＮＡとで二重鎖を形成する場合に合致する。
【００９２】
下記に記載されるように、細胞により吸収される能力は、オリゴマー骨格が本質的に変化せず、好ましくは、オリゴマー構造が、細胞膜を通過する能動的又は促進輸送のための基質として認識されることを必要とする。標的ＲＮＡとで安定な二重鎖を形成するオリゴマーの能力はまた、オリゴマーの骨格、並びに上記の因子、標的に関するアンチセンスオリゴマーの長さ及び相補性度、Ｇ：Ｃ対Ａ：Ｔ塩基マッチの比率、及びミスマッチ塩基のいずれかの位置に依存する。細胞ヌクレアーゼに耐えるアンチセンスオリゴマーの能力は、細胞の細胞質への薬剤の残存及び究極の送達を促進する。
【００９３】
任意の所与の本質的に非荷電骨格を、これらの要件に合致させる能力に関して試験する方法を下記に開示する。
【００９４】
Ａ１．細胞による能動的又は促進的取込み
アンチセンス化合物は、遊離（非複合体化）形態で投与された場合は、宿主の細胞膜を越える促進的若しくは能動的輸送によって、又は複合体形態で投与された場合は、エンドサイトーシスの機構によって宿主細胞に取り込まれ得る。
【００９５】
薬剤が遊離形態で投与される場合は、アンチセンス化合物は実質的に非荷電であるはずで、これは、そのサブユニット間連結部の大多数が、生理学的ｐＨで非荷電であることを意味している。実施された実験は、本発明を支持して、１５量体から２０量体のオリゴマーでは、少数の、例えば、１〜２の正味荷電は、実質的に非荷電の骨格を有する一定のオリゴマーの細胞取込みを実際に増強できることを示している。荷電は、オリゴマー自体に、例えば、骨格連結部内に担持できるか、又は末端荷電基付属体にあり得る。荷電連結部の数は、４つの非荷電連結部につき、１以下の荷電連結部であることが好ましい。その数は、１０の非荷電連結部につき１以下の荷電連結部、又は２０の非荷電連結部につき１以下の荷電連結部であることがより好ましい。一実施形態において、オリゴマーは完全に非荷電である。
【００９６】
また、オリゴマーは、反対電荷がおよそ等しい数で存在する限り、陰電荷と陽電荷双方の骨格連結部を含有できる。該オリゴマーは、いずれかの電荷の３〜５連続サブユニット超の連なりを含有しないことが好ましい。例えば、該オリゴマーは、所与の数のアニオン性連結部、例えば、ホスホロチオエート又はＮ３’→Ｐ５’ホスホラミデート連結部、それに匹敵する数のＮ，Ｎ−ジエチレンジアミンホスホラミデートなどのカチオン性連結部を有し得る（Ｄａｇｌｅ、２０００年）。正味の荷電は、中性であるか、又はオリゴマー１つにつき、せいぜい１〜２の正味荷電であることが好ましい。
【００９７】
該アンチセンス剤は、実質的に又は完全に非荷電であることに加えて、細胞膜を越えたオリゴマーの輸送を促進するか、又は能動輸送することのできる膜輸送系に関する基質（即ち、１つ又は複数の膜タンパク質）であることが好ましい。この特徴は、オリゴマー相互作用又は細胞取込みに関する多数の試験うちの１つによって、以下のとおり判定できる。
【００９８】
第１の試験は、細胞表面で置換するか、又は選択された荷電オリゴマー、例えば、ホスホロチオエートオリゴマーによって置換されるオリゴマー化合物の能力を調べることによって、細胞表面受容体における結合を評価する。約１０〜３００ｎＭの間の最終オリゴマー濃度で、典型的には蛍光標識されている所与の量の試験オリゴマーと共に細胞をインキュベートする。その少し後、例えば１０〜３０分後（試験オリゴマーの有意な内在化が生じる前に）、置換性化合物を、漸増させた濃度で加える。試験化合物が細胞表面受容体に結合できるならば、置換性化合物は試験化合物と入れ替わるのが見られるであろう。置換性化合物が１０×試験化合物濃度以下の濃度で５０％の置換を生じることが示されれば、該試験化合物は、細胞輸送系に関して、置換性化合物と同じ認識部位で結合すると考えられる。
【００９９】
第２の試験では、標識レポーター、例えば、蛍光レポーターを細胞内に輸送する試験化合物の能力を調べることによって、細胞輸送が測定される。約１０〜３００ｎＭの間の最終濃度で加えられた標識試験化合物の存在下で細胞をインキュベートする。３０〜１２０分のインキュベーション後、細胞内標識に関して、例えば顕微鏡で細胞を検査する。有意な細胞内標識が存在すれば、該試験化合物が促進的又は能動的輸送によって輸送されることの証拠となる。
【０１００】
アンチセンス化合物もまた複合形態で投与でき、複合化剤は、典型的にはポリマー、例えば、カチオン性脂質、ポリペプチド、又は非生物学的カチオン性ポリマーであり、アンチセンス化合物上の何らかの正味荷電と反対の荷電を有する。アニオン性オリゴヌクレオチド類とカチオン性脂質又は他のポリマー成分との間の二重層複合体などの複合体を形成する方法がよく知られている。例えば、カチオン性脂質ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）及び中性リン脂質ＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）を含有するリポソーム組成物、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（Ｆｅｌｇｎｅｒら、１９８７年）が広く使用されている。投与後、典型的にはエンドソーム体における粒子封入化に関与するエンドサイトーシス機構によって、該複合体は細胞に取り込まれる。
【０１０１】
また、アンチセンス化合物は、アンチセンスオリゴマーの５’又は３’末端に共有結合で連結したアルギニンに富んだペプチドとの複合形態で投与することもできる。該ペプチドは、典型的には８〜１６のアミノ酸であり、アルギニンとフェニアラニンやシステインなどの他のアミノ酸との混合物からなる。アルギニンに富んだペプチド−ＰＭＯ複合体は、アンチセンスオリゴマーの細胞取込みを増強させるために使用できる（例えば、Ｍｏｕｌｔｏｎ、Ｎｅｌｓｏｎら、２００４年を参照）。
【０１０２】
いくつかの例では、細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの取込みを促進するために、リポソームが使用できる（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｓ．Ａ．、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １０（１２）：１９８０〜１９８９頁、１９９６年；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．２３：１１９頁、１９９４年；Ｕｈｌｍａｎｎら、ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ  ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ：Ａ  ＮＥＷ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＰＲＩＮＣＩＰＬＥ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、第９０巻、第４号、５４４〜５８４頁、１９９０年；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．、第１４章、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ、Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｃｉｎｅ、２８７〜３４１頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９７９年を参照）。例えば、国際公開第９３／０１２８６号などのヒドロゲル類もまた、アンチセンスオリゴマー投与のための媒体として使用できる。或いは、オリゴヌクレオチドは、ミクロスフェア又はミクロ粒子において投与できる（例えば、Ｗｕ，Ｇ．Ｙ．及びＷｕ，Ｃ．Ｈ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９〜４４３２頁、１９８７年を参照）。或いは、米国特許第６，２４５，７４７号に記載されているとおり、アンチセンスオリゴマーと複合化した気体充填微小泡の使用により、標的組織への送達を増強できる。
【０１０３】
或いは、また、本発明の他の態様により、任意の所与の骨格を有するオリゴマーの必要な性質は、単純なインビボ試験によって確認でき、該試験では、標識化合物をある動物に投与し、オリゴマー投与の数時間後にその動物から採取した体液サンプルを、標的ＲＮＡとのヘテロ二重鎖の存在に関してアッセイする。この方法は、下記の小節Ｄに詳述されている。
【０１０４】
Ａ２．ＲＮアーゼＨに対する実質的抵抗性
アンチセンスオリゴヌクレオチドによる発現抑制を説明する２つの一般的機構が提案されている（例えば、Ａｇｒａｗａｌら、１９９０年；Ｂｏｎｈａｍら、１９９５年；及びＢｏｕｄｖｉｌｌａｉｎら、１９９７年を参照）。第１に、オリゴヌクレオチドとウイルスＲＮＡとの間に形成されたヘテロ二重鎖は、ＲＮアーゼＨに対する基質として働き、ウイルスＲＮＡの開裂を導く。このクラスに属するか、又は属すると提案されているオリゴヌクレオチドとしては、ホスホロチオエート類、ホスホトリエステル類、及びホスホジエステル類（非修飾「天然」オリゴヌクレオチド）が挙げられる。このような化合物は、オリゴマー：ＲＮＡ二重鎖構造におけるウイルスＲＮＡをＲＮアーゼＨによって加水分解し、したがって、機能を失わせる。
【０１０５】
「立体的ブロッカー」或いは「ＲＮアーゼＨ不活性」又は「ＲＮアーゼＨ抵抗性」と呼ばれるオリゴヌクレオチド類縁体の第２のクラスは、ＲＮアーゼＨの基質として働くことは観察されておらず、標的ＲＮＡ核細胞質輸送、スプライシング又は翻訳を立体的に妨害することによって作用していると考えられる。このクラスには、メチルホスホネート類（Ｔｏｕｌｍｅら、１９９６年）、モルホリノオリゴヌクレオチド類、ペプチド核酸（ＰＮＡ類）、一定の２’−Ｏ−アリル又は２’−Ｏ−アルキル修飾オリゴヌクレオチド類（Ｂｏｎｈａｍ、１９９５年）、及びＮ３’→Ｐ５’ホスホラミデート類（Ｇｅｅ、１９９８年；Ｄｉｎｇ、１９９６年）が含まれる。
【０１０６】
試験オリゴマーとＲＮＡ−オリゴマー二重鎖を形成し、次いでＳｔｅｉｎらに記載された標準的なアッセイ条件下、ＲＮアーゼＨと共に該二重鎖をインキュベートすることによって、試験オリゴマーを、そのＲＮアーゼＨ抵抗性に関してアッセイすることができる。ＲＮアーゼＨに曝露後、完全な二重鎖の存在又は不在を、ゲル電気泳動又は質量分析によってモニターできる。
【０１０７】
Ａ３．インビボ取込み
本発明の他の態様によって、所与のアンチセンスオリゴマータイプが、上述の特徴、即ち、高Ｔｍ、宿主細胞によって能動的に取り込まれる能力、及びＲＮアーゼＨに対する実質的抵抗性を提供することを確認するための簡単で迅速な試験が提供される。この方法は、適切にデザインされたアンチセンス化合物は、哺乳動物対象に投与された際、ウイルスＲＮＡ標的の相補的部分と安定なヘテロ二重鎖を形成し、この二重鎖が引き続き尿（又は他の体液）中に現れるという発見に基づいている。この方法の詳細はまた、その開示が参照として本明細書に組み込まれている標題が「標的ＲＮＡ検出のための非侵襲的方法」（非侵襲的方法）の共有の米国特許出願第０９／７３６，９２０号にも述べられている。
【０１０８】
簡単に述べると、評価される骨格を含有し、知られたＲＮＡに対して標的化された塩基配列を有する試験オリゴマーを哺乳動物対象に注入する。宿主ＲＮＡ又は感染ウイルスのＲＮＡなどの何らかの細胞内ＲＮＡに対してアンチセンスオリゴマーを指向させ得る。投与数時間（典型的には８〜７２時間）後、アンチセンス−ＲＮＡヘテロ二重鎖の存在に関して尿をアッセイする。ヘテロ二重鎖が検出される場合、該骨格は、本発明のアンチセンスオリゴマーにおける使用に好適である。
【０１０９】
引き続いての分析を促進するために、哺乳動物対象にとって適切な場合は、例えば、蛍光タグ又は放射性タグによって試験オリゴマーを標識できる。該アッセイは、任意の好適な固相又は液体フォーマットにおけるものであり得る。一般に、固相アッセイは、先ず、ヘテロ二重鎖検体を固相支持体、例えば、粒子又はポリマー又は試験ストリップ基質に結合し、結合したヘテロ二重鎖の存在／量を検出する。液体相アッセイにおいては、妨害性のサンプル成分を除去するために、典型的には、検体サンプルを前処理する。オリゴマーが標識されている場合、ヘテロ二重鎖の存在は標識タグを検出することによって確認される。非標識化合物では、ヘテロ二重鎖は、固相フォーマットにおける場合は免疫アッセイによって、溶液又は懸濁液フォーマットにおける場合は、質量分析又は他の知られた方法によって検出できる。
【０１１０】
アンチセンスオリゴマーがウイルスゲノムのウイルス特異的領域（上記のようなウイルスＲＮＡの５’末端領域など）に相補的である場合、所与のｓｓＲＮＡウイルスの存在、又は治療方法時におけるウイルス量の減少を検出するために、該方法を用いることができる。
【０１１１】
Ｂ．オリゴマー骨格の例
オリゴヌクレオチド類縁体に使用できる非イオン性連結部の例を図１Ａ〜１Ｇに示す。これらの図で、Ｂは好ましくは、アデニン、シトシン、グアニン及びウラシルから選択された、ポリヌクレオチドにおける塩基への、塩基特異的水素結合による結合に有効なプリン又はピリミジン塩基対部分を表す。好適な骨格構造としては、カルボネート連結部（図１Ａ、Ｒ＝Ｏ）及びカルバメート連結部（図１Ａ、Ｒ＝ＮＨ２）（Ｍｅｒｔｅｓ及びＣｏａｔｓ、１９６９年；Ｇａｉｔ、Ｊｏｎｅｓら、１９７４年）；アルキルホスホネート連結部及びホスホトリエステル連結部（図１Ｂ’、Ｒ＝アルキル又は−Ｏ−アルキル）（Ｌｅｓｎｉｋｏｗｓｋｉ、Ｊａｗｏｒｓｋａら、１９９０年）；アミド結合（図１Ｃ）（Ｂｌｏｍｍｅｒｓ、Ｐｉｅｌｅｓら、１９９４年）；スルホン連結部及びスルホンアミド連結部（図１Ｄ、Ｒ１、Ｒ２＝ＣＨ２）（Ｒｏｕｇｈｔｅｎ、１９９５年；ＭｃＥｌｒｏｙ、１９９４年）；及びチオホルムアセチル連結部（図１Ｅ）（Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ、１９９０年；Ｃｒｏｓｓ、１９９７年）が挙げられる。後者は、ホスホロチオエートアンチセンス化合物との増強された二重鎖及び三重鎖安定性を有することが報告されている（Ｃｒｏｓｓ、１９９７年）。また、図１Ｆにおける構造の３’−メチレン−Ｎ−メチルヒドロキシアミノ化合物が報告されている（Ｍｏｈａｎ、１９９５年）。
【０１１２】
ペプチド核酸（ＰＮＡ）（図１Ｇ）は、骨格が、ピリミジン又はプリン塩基が結合しているＮ−（２−アミノエチル）グリシン単位からなるデオキシリボース骨格と構造的に同形である、ＤＮＡの類縁体である。天然のピリミジン及びプリン塩基を含有するＰＮＡは、ワトソン−クリック塩基対則に従って相補的なオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、塩基対認識に関してＤＮＡによく似ている（Ｅｇｈｏｌｍら、１９９３年）。ＰＮＡの骨格は、ホスホジエステル結合ではなく、ペプチド結合によって形成されているため、それらはアンチセンス適用にまさに好適である。該骨格は非荷電であるため、通常よりも大きな熱的安定性を示すＰＮＡ／ＤＮＡ又はＰＮＡ／ＲＮＡ二重鎖が生じる。ＰＮＡは、ヌクレアーゼ又はプロテアーゼによっては認識されない。
【０１１３】
好ましいオリゴマー構造には、上記のとおり、非荷電連結部によって結合した、塩基対部分を有するモルホリノベースのサブユニットが用いられる。特に好ましいものは、図２Ａ〜２Ｄに示されたような、実質的に非荷電のホスホロジアミデートが結合したモルホリノオリゴマーである。アンチセンスオリゴマーを含むモルホリノオリゴヌクレオチドは、例えば、共有の米国特許第５，６９８，６８５号、第５，２１７，８６６号、第５，１４２，０４７号、第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，５２１，０６３号、及び第５，５０６，３３７号に詳述されており、これらはすべて参照として本明細書に明示的に組み込まれている。
【０１１４】
モルホリノベースのサブユニットの重要な性質には、安定な非荷電骨格連結部によりオリゴマー形体において結合される能力；形成されたポリマーが、標的ＲＮＡなどの相補的塩基標的核酸と、１０〜１４塩基ほどの短いオリゴマーとも、高Ｔｍでハイブリダイズできるように、ヌクレオチド塩基（例えば、アダニン、シトシン、グアニン又はウラシル）を支持する能力；哺乳動物細胞内に能動輸送されるオリゴマーの能力；及びＲＮアーゼ分解に抵抗するオリゴマー：ＲＮＡヘテロ二重鎖の能力、が含まれる。
【０１１５】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに対する骨格構造の例としては各々が非電荷のリン含有サブユニット結合によって連結部した、図２Ａ〜２Ｄに示されたβ−モルホリノサブユニットのタイプが挙げられる。図２Ａは、モルホリノ環が１原子ホスホアミド連結部によって結合している、５原子反復単位の骨格を形成するリン含有連結部を示している。図２Ｂは、６原子反復単位の骨格を生じる連結部を示している。この構造で、５’モルホリノ炭素をリン基に結合する原子Ｙは、イオウ、窒素、炭素又は、好ましくは酸素であり得る。リンから懸垂しているＸ部分は、フッ素、アルキル又は置換アルキル、アルコキシ又は置換アルコキシ、チオアルコキシ又は置換チオアルコキシ、或いはモルホリン又はピペリジンなどの非置換、一置換、又は二置換窒素であり得る。アルキル、アルコキシ及びチオアルコキシは、１〜６個の炭素を含むことが好ましい。Ｚ部分は、イオウ又は酸素であり、好ましくは、酸素である。
【０１１６】
図２Ｃ及び２Ｄに示された連結部は、７原子単位長の骨格にデザインされたものである。構造３Ｃにおいて、Ｘ部分は構造３Ｂにおけるものであり、Ｙ部分は、メチレン、イオウ、又は好ましくは、酸素であり得る。構造２Ｄにおいて、Ｘ及びＹ部分は、構造２Ｂにおけるものである。特に好ましいモルホリノオリゴヌクレオチドとしては、図２Ｂに示された形体のモルホリノサブユニット構造からなるものが挙げられ、ここで、Ｘ＝ＮＨ２又はＮ（ＣＨ３）２、Ｙ＝Ｏ、及びＺ＝Ｏである。
【０１１７】
上述のように、実質的に非荷電のオリゴマーは、限定数、例えば、５つの非荷電連結部各々につき約１つまで、より好ましくは、１０の非荷電連結部各々につき約１つまでの荷電連結部を含むことが有利であると考えられる。したがって、少数の荷電連結部、例えば、荷電ホスホルアミデート又はホスホロチオエートもまた該オリゴマーに組み込むことができる。
【０１１８】
アンチセンス化合物は上記に挙げた文献に詳述された方法を用いて、段階的固相合成によって調製することができる。いくつかの場合、例えば薬物動態を増強するために、又は該化合物の捕捉又は検出を促進するために、該アンチセンス化合物に追加の化学的部分を加えることが望ましいと考えられる。このような部分は、標準的な合成法に従って、典型的には、該オリゴマーの末端に共有結合で連結できる。例えば、ポリエチレングリコール部分又は他の親水性ポリマー、例えば、１０〜１００の単量体サブユニットを有するものが、溶解度の増大に有用であり得る。１つ又は複数の荷電基、例えば、有機酸などのアニオン性荷電基は細胞の取込みを増強させ得る。検出を目的に、フルオレセイン又は放射性標識基などのレポーター部分を結合できる。或いは、オリゴマーに結合したレポーター部分は、標識抗体又はストレプトアビジンを結合できる抗原又はビオチンなどのリガンドであり得る。アンチセンスオリゴマーの結合又は修飾のための部分の選択においては、生体適合性であり、望ましくない副作用なしに対象によって忍容される可能性の高い群の化学的化合物を選択することが一般に望ましいことは勿論である。
【０１１９】
Ｖ．ウイルス複製の阻害
上記に詳述されたアンチセンス化合物は、フラビウイルス科、ピコルノウイルス科、カリシウイルス科、トガウイルス科、アルテリウイルス科、コロナウイルス科、アストロウイルス科及びヘペウイルス科ファミリーのｓｓＲＮＡウイルスの複製阻害に有用である。一実施形態において、このような阻害は、これらのウイルスによる宿主動物の感染症の治療に有効である。したがって、一実施形態において、該方法は、ウイルスに感染した細胞を、特定のウイルスの複製を阻害する上で有効なアンチセンス剤に接触させることを含む。この実施形態において、アンチセンス剤は、好適な製薬的担体中、所与のウイルスに感染した哺乳動物対象、例えば、ヒト又は家畜に投与される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、宿主内ＲＮＡウイルスの増殖を制止すると考えられる。宿主の正常な増殖又は発達に対する有害な影響がほとんど、又はまったくなしで、ＲＮＡウイルスの数を減少させることができるか、又は除去できる。
【０１２０】
Ａ．感染物質の同定
感染を引き起こす特定のウイルスを、当業界に既知の方法、例えば、血清学的方法若しくは培養方法、又は本発明のアンチセンスオリゴマーを用いる方法によって決定できる。
【０１２１】
血清学的同定には、対象の生物学的検体、例えば、糞便、尿、脳脊髄液、血液などから単離したウイルスサンプル又は培養物が用いられる。ウイルス検出用の免疫アッセイは、一般に、当業者によってルーチン的に用いられている方法、例えば、ＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロットによって実施される。また、特定のウイルス株又はウイルス種に特異的なモノクローナル抗体は、市販されていることが多い。
【０１２２】
特定のタイプのウイルスを単離及び同定するために、限定はしないが、種々の培養条件下で、増殖率及び形体などの特徴を比較することなどの方法を用いることにより、培養法が使用できる。
【０１２３】
感染対象におけるウイルス感染物質を同定する他の方法では、ウイルスの広範囲のファミリー及び／又は属、例えば、ピコルノウイルス科、カリシウイルス科、トガウイルス科及びフラビウイルス科を標的にする１種又は複数のアンチセンスオリゴマーが用いられる。任意の特徴的なウイルスＲＮＡを標的にする配列が使用できる。所望の標的配列は、（ｉ）広範囲のウイルスファミリー及び／又は属に共通であり、（ｉｉ）ヒトには見られないものであることが好ましい。多数の感染性ウイルスに関する特徴的な核酸配列は、公開データベースにおいて入手でき、特定のオリゴマーデザインのベースとして役立ち得る。
【０１２４】
複数の各オリゴマーに関し、以下のステップが実施される：（ａ）該オリゴマーを対象に投与する；（ｂ）前記投与後の選択された時間に、該対象から体液サンプルを得る；及び（ｃ）アンチセンスオリゴマー及びウイルスゲノムの相補的部分を含むヌクレアーゼ抵抗性ヘテロ二重鎖の存在に関して、サンプルをアッセイする。ステップ（ａ）〜（ｃ）は、このようなオリゴマーの少なくとも１種のオリゴマー、又は該ウイルス又はウイルスファミリーの同定に必要な数のオリゴマーに関して実施する。オリゴマーは連続的に、又はより簡便には同時に、投与でき、アッセイできる。アンチセンスオリゴマー及び所与の知られたウイルス又はウイルスのファミリーのウイルスゲノムの相補的部分を含むヘテロ二重鎖の存在（又は不在）に基づいて、ウイルスを同定する。
【０１２５】
広範囲のファミリーを標的にするオリゴマーの第１群を先ず利用し、続いて広範囲のファミリー／属内の特定の属及び／又は種及び／又は株に相補的な、選択されたオリゴマーを利用することによって同定することが好ましい。オリゴマーのこの第２の群は、広範囲のファミリー／属内の特定の属及び／又は種及び／又は株に特異的なターゲティング配列を含む。いくつかの異なる第２のオリゴマーの集合、即ち、第１段階で試験された広範囲のウイルスファミリー／属各々に関するものが一般に提供される。（ｉ）試験される個々の属／種／株に特異的で、且つ（ｉｉ）ヒトには見られない、配列が選択される。
【０１２６】
Ｂ．アンチセンスオリゴマーの投与
標的核酸へのアンチセンスオリゴマーの効果的な送達は処置の重要な態様である。本発明によるアンチセンスオリゴマーの送達経路としては、限定はしないが、経口及び非経口経路を含む種々の全身的経路、例えば、静脈内、皮下、腹腔内、及び筋肉内送達、並びに吸入、経皮及び局所送達が挙げられる。適切な経路は、治療下の対象の病態に適切なものが、当業者により決定できる。例えば、皮膚のウイルス感染の治療におけるアンチセンスオリゴマーの送達に適切な経路は局所送達であり、一方、ウイルス呼吸器感染の治療におけるアンチセンスオリゴマーの送達は吸入による。また、オリゴマーをウイルス感染部位へ、又は血流へ、直接送達することもできる。
【０１２７】
アンチセンスオリゴマーは、生理学的に許容できる任意の簡便な媒体中で投与できる。このような組成物としては、当業者によって用いられる種々の標準的な製薬的に許容できる担体を挙げることができる。例としては、限定はしないが、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、水、水性エタノール、油／水乳液又はトリグリセリド乳液などの乳液、錠剤及びカプセル剤が挙げられる。生理学的に許容できる好適な担体の選択は、選択された投与様式に依って変わる。
【０１２８】
いくつかの例では、細胞内へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの取込みを促進するために、リポソームが使用できる（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｓ．Ａ．、Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １０（１２）：１９８０〜１９８９頁、１９９６年；Ｌａｐｐａｌａｉｎｅｎら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．２３：１１９頁、１９９４年；Ｕｈｌｍａｎｎら、ＡＮＴＩＳＥＮＳＥ  ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ：Ａ  ＮＥＷ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣ  ＰＲＩＮＣＩＰＬＥ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、第９０巻、第４号、５４４〜５８４頁、１９９０年；Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｇ．、第１４章、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ、Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｃｉｎｅ、２８７〜３４１頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９７９年を参照）。ヒドロゲルもまた、アンチセンスオリゴマー投与のための媒体として、例えば、国際公開第９３／０１２８６号に記載されるとおりに使用できる。或いは、オリゴヌクレオチドは、ミクロスフェア又はミクロ粒子において投与できる（例えば、Ｗｕ，Ｇ．Ｙ．及びＷｕ，Ｃ．Ｈ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９〜４４３２頁、１９８７年を参照）。或いは、米国特許第６，２４５，７４７号に記載されているとおり、アンチセンスオリゴマーと複合化した気体充填微小泡の使用により、標的組織への送達を増強できる。
【０１２９】
持続放出組成物もまた使用できる。これらには、フィルム又はミクロカプセルなどの形状化製品の形体における半透過性ポリマー基質が含まれる。
【０１３０】
本発明の一態様において、対象はヒト対象、例えば、局所又は全身のウイルス感染と診断された患者である。また、患者の病態によっても、本発明のアンチセンスオリゴマーの予防的投与を指示できる。例えば、（１）免疫無防備状態である；（２）火傷被害者である；（３）留置カテーテルを有する、又は（４）手術を受けようとしているか、又は最近、手術を受けた、患者の場合である。好ましい一実施形態において、該オリゴマーは、製薬的に許容できる担体中に含有され、経口送達されるホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである。他の好ましい実施形態において、該オリゴマーは、製薬的に許容できる担体中に含有され、静脈内（ｉ．ｖ．）送達されるホスホロジアミデートモルホリノオリゴマーである。
【０１３１】
本方法の他の適用において、対象は、家畜動物、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、ブタ、ウシ又はヤギなどであり、処置は予防的又は治療的である。本発明にはまた、上記のタイプの抗ウイルスアンチセンス化合物のサブ治療的量を添加した食料穀物を含有する家畜及び家禽食料組成物が含まれる。抗ウイルス剤のサブ治療的濃度を添加した食料穀物を家畜及び家禽に給餌する方法において、該食料穀物が上記の抗ウイルスオリゴヌクレオチド組成物のサブ治療的量を添加した改善も考慮される。
【０１３２】
アンチセンス化合物は、一般に、少なくとも２００〜４００ｎＭのアンチセンスオリゴマーの最高血中濃度をもたらす上で有効な量及び様式で投与される。典型的には、１つ又は複数の用量のアンチセンスオリゴマーが、一般に規則的な間隔で、約１週間から２週間の期間投与される。経口投与に好ましい用量は、７０ｋｇ当たり、約１〜１００ｍｇのオリゴマーである。いくつかの場合、１００ｍｇオリゴマー／患者超の用量が必要であり得る。ｉ．ｖ．投与では、好ましい用量は、７０ｋｇ当たり、約０．５ｍｇから１００ｍｇのオリゴマーである。アンチセンスオリゴマーは、短い期間、例えば、２週間又はそれ未満の間、毎日、規則的間隔で投与できる。しかし、いくつかの場合、該オリゴマーは、より長い期間にわたって間欠的に投与される。投与に引き続いて、又は投与と同時に、抗生物質又は他の治療処置が与えられる。治療法は、治療下の対象の免疫アッセイ、他の生物学的試験及び生理学的検査の結果に基づいて、指示されたとおりに調整（用量、回数、経路など）できる。
【０１３３】
Ｃ．治療のモニタリング
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた有効なインビボ治療法は、投与の期間、用量、回数及び経路、並びに治療下の対象の病態（即ち、予防的投与対局所的又は全身的感染に応じた投与）によって変わり得る。したがって、このようなインビボ療法は、最適な治療結果を達成するために、治療下のウイルス感染の具体的タイプにとって適切な試験によるモニタリング、及び用量又は治療法における対応する調整をしばしば必要とする。例えば、全血算（ＣＢＣ）、核酸検出法、免疫診断試験、ウイルス培養、又はヘテロ二重鎖の検出など、感染の全身的指標によって、治療をモニターできる。
【０１３４】
１つ又は複数のタイプのＲＮＡウイルスの増殖阻害、又は除去における、本発明のインビボ投与されたアンチセンスオリゴマーの有効性を、アンチセンスオリゴマーの投与前、投与中及び投与後に対象から採取した生物学的サンプル（組織、血液、尿など）から、判定できる。このようなサンプルのアッセイとしては、（１）当業者に既知の方法、例えば、電気泳動ゲル移動アッセイを用いて、標的配列及び非標的配列とのヘテロ二重鎖形成の存在又は不在のモニタリング；（２）ＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロットなどの標準的方法により決定されたウイルスタンパク質産生量のモニタリング、又は（３）例えば、スピアマン−カーバーの方法によるウイルス滴定に及ぼす効果の測定、が挙げられる（例えば、Ｐａｒｉ、Ｇ．Ｓ．ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ３９（５）：１１５７〜１１６１頁、１９９５年；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．Ｐ．ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ４０（９）：２００４〜２０１１頁、１９９６年、Ｃｏｔｔｒａｌ，Ｇ．Ｅ．（編）：Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、６０〜９３頁、１９７８年を参照）。
【０１３５】
アンンチセンスオリゴマー処置の有効性をモニタリングする好ましい方法は、アンチセンスＲＮＡヘテロ二重鎖の検出による。アンンチセンスオリゴマー投与後の選択時間において、サンプル中のヘテロ二重鎖種の存在を検出、及び／又はそのレベルを測定するために、体液を採取する。典型的に、体液サンプルを、投与３〜２４時間後、好ましくは投与６〜２４時間後に採取する。上記に示されたように、体液サンプルは、尿、唾液、血漿、血液、髄液、又は他の生体起源のサンプルであり得、それに懸濁した細胞又は細胞断片、或いは液体媒体及びその溶液を含み得る。採取されたサンプル量は、典型的には０．１ｍｌから１０ｍｌの範囲、好ましくは約１ｍｌ以下である。
【０１３６】
このサンプルは、望ましくない成分を除くために処理でき、及び／又はサンプル中のヘテロ二重鎖種を処理して、例えば、ＲＮアーゼと処理することによって、望ましくないｓｓＲＮＡのオーバーハング領域を除く。もちろん、ヘテロ二重鎖検出は、サイズ分離、例えば、質量分析の電気泳動に依りオーバーハングを除去することが特に重要である。
【０１３７】
種々の方法は、サンプルから望ましくない成分を除去するために利用できる。例えば、ヘテロ二重鎖は、ネットで陰電荷を有することから、電気泳動又はイオン交換技術は、中性又は陽電荷物質からヘテロ二重鎖を分離するために使用できる。また、サンプルは、表面に結合した抗体又はヘテロ二重鎖を特異的に結合できる他の試剤を有する固体支持体と接触できる。未結合物質を除去するために支持体を洗浄後、ヘテロ二重鎖は、例えば、電気泳動、質量分析又は免疫アッセイにより、さらなる分析のために本質的に精製された形態で遊離できる。
【０１３８】
ＶＩ．ヘテロ二重鎖複合体
別の態様において、本発明は、
（ａ）一本鎖のプラス鎖ＲＮＡゲノムを有し、フラビウイルス科、ピコルノウイルス科、カリシウイルス科、トガウイルス科、アルテリウイルス科、コロナウイルス科、アストロウイルス科又はヘペウイルス科ファミリーの中の１種から選択されるＲＮＡウイルスのプラス鎖ＲＮＡの５’末端４０塩基内の領域であって、内部ステムループ二次構造を形成できる領域と、
（ｂ）（ｉ）ヌクレアーゼ耐性骨格、
（ｉｉ）哺乳動物宿主細胞による取込みが可能であること、
（ｉｉｉ）１２から４０の間のヌクレオチド塩基を含有すること、
（ｉｖ）該ウイルスのプラス鎖ＲＮＡ鎖の５’末端４０塩基内のこのようなステムループ二次構造を伴う領域に相補的である少なくとも１２のサブユニットのターゲティング配列を有することを特徴とし、
前記ヘテロ二重鎖複合体が、少なくとも４５℃の解離Ｔｍを有し、このようなステムループ構造を破壊する、オリゴヌクレオチド類縁化合物と
の間で形成されるヘテロ二重鎖複合体を含む。
【０１３９】
代表的な化合物は、非荷電リン含有サブユニット間連結により連結している複数のモルホリノサブユニットから構成され、その連結部位が、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接サブユニットの５’環外炭素に連ねている。該化合物は、構造
【化４】
0005425396.tif 000010
のようなホスホロジアミデート連結部を有し、
式中、Ｙ１＝Ｏ、Ｚ＝Ｏ、Ｐｊは、ポリヌクレオチド中の塩基に対する塩基特異的水素結合による結合に有効なプリン又はピリミジン塩基対部分であり、Ｘは、アルキル、アルコキシ、チオアルコキシ又はアルキルアミノである。好ましい化合物において、Ｘ＝ＮＲ２であり、ここで、各Ｒは、独立して水素又はメチルである。該化合物は、オリゴヌクレオチド類縁体単独であるか、又は該類縁体と該化合物の宿主細胞への取込みを増強できるアルギニンに富むポリペプチドとの複合体である。
【０１４０】
一実施形態において、宿主細胞に投与された場合、該化合物は、（ｉ）ウイルスのプラス鎖及びオリゴヌクレオチド化合物からなり、（ｉｉ）少なくとも４５℃の解離Ｔｍ及びこのようなステムループ二次構造の破壊を特徴とするヘテロ二重鎖構造を形成するのに有効である。
【実施例】
【０１４１】
以下の実施例を説明するが、本発明を限定する意図は決してない。
【０１４２】
材料及び方法
標準的な組換えＤＮＡ技術は、Ａｕｓｕｂｅｌ，ＦＭら、「ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ社、ペンシルバニア州メディア、１９９２年、及びＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊら、「ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー、２巻、１９８９年に記載されているように、すべて構築のために使用された。
【０１４３】
すべてのペプチドは、Ｇｌｏｂａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（コロラド州フォートコリンズ）又はＡＶＩ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ（オレゴン州コルバリス）により注文合成され、＞９０％純度に精製された（下記実施例２を参照）。ＰＭＯ類は、例えば、（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ及びＷｅｌｌｅｒ１９９７年）及び米国特許第５，１８５，４４４号に記載されている既知の方法に従ってＡＶＩ  ＢｉｏＰｈａｒｍａで合成された。
【０１４４】
ＰＭＯオリゴマー類は、記載された細胞取込みを増強させるためにアルギニンに富むペプチド（Ｒ９Ｆ２Ｃ−５’ＰＭＯ）と５’末端で複合した（米国特許出願第６０／４６６，７０３号及びＭｏｕｌｔｏｎ、Ｎｅｌｓｏｎら、２００４年）。
【０１４５】
（実施例１）
フラビウイルス科（黄熱病ウイルス）のインビトロでのアンチセンス阻止作用
黄熱病ウイルス（ＹＦＶ）に対する有効なワクチンは、長年にわたって入手できたが、このウイルスは、５０％と高い死亡率を有する出血熱の主要原因となり続けている。世界中で、年間の黄熱病が２００，０００症例（３０，０００人の死者）と推測されている。少数の移入症例もまた、黄熱病のない国で発生している（ＷＨＯ、データ表１００、２００１年）。
【０１４６】
ＹＦＶ（配列番号４９）の５’プラス鎖末端を標的にしたＰＭＯアンチセンスオリゴマーは、４−濃縮試験で評価された。標準的なＣＰＥ試験は、ベロ細胞の１８時間の単層（８０〜１００％集密的）を用い、培地を排出し、ＰＭＯ又はスクランブル対照配列の各濃度を加え、次いでウイルス又はウイルス希釈液を１５分以内で加えた。抗ウイルス試験及び細胞毒性試験の双方に対して、２つのウェルを各濃度の化合物に用いる。プレートを密封し、ほぼ最大のウイルスＣＰＥを誘導するために必要な標準時間でインキュベートした。次いでプレートを、下記の方法によりニュートラルレッドで染色し、生存細胞を示す取込みパーセンテージは、バックグランドを除くために取られた差を用いる４０５ｎｍと５４０ｎｍの二波長でマイクロプレートのオートリーダー上で読み取った。およそウイルス阻止濃度が５０％のエンドポイント（ＥＣ５０）及び細胞阻止濃度が５０％のエンドポイント（ＩＣ５０）として判定され、それらから一般的な選択指標（Ｓ．Ｉ．）が算出された：Ｓ．Ｉ．＝（ＩＣ５０）／（ＥＣ５０）。ＳＩが３以上は、有意な抗ウイルス活性を示している。５’プラス鎖末端領域（配列番号４９）を標的にするＰＭＯは、このアッセイにおいて２１のＳＩを生じた。
【０１４７】
（実施例２）
フラビウイルス科（デング熱ウイルス血清型１〜４）のインビトロでのアンチセンス阻止作用
デング熱／デング出血熱（ＤＦ／ＤＨＦ）は、過去２０年にわたって世界中の主要な健康問題の１つとなっている。デングウイルス（ＤＥＮ）の地理的分布、その媒介動物の蚊及び疾患の負担が増え続けている。世界保健機構では、年間５千万〜１億人の新たな感染があると推測している。ＤＦ／ＤＨＦは、現在、南アジアにおける幼児の間で入院及び死亡の主要原因となっており、アメリカでも急増している。ワクチン又は有効な治療法は現在ない。好結果となるワクチン又は治療法における１つの要件は、ＤＥＮの４つのヒト血清型すべてに対して有効であることである。この試験の目的は、培養ベロ細胞におけるＤＥＮの４つの血清型の複製の阻止において、５’プラス鎖末端ステムループを標的にするＰＭＯの有効性及び特異性を評価することであった。ＰＭＯは、ウイルス転写及び／又は翻訳において重要となり得るプラス鎖ＤＥＮ２  ＲＮＡの配列要素を標的にするようにデザインされた（Ｍａｒｋｏｆｆ２００３年）。本試験のＰＭＯは、ベロＥ６細胞への侵入を促進させるために、アルギニンに富むペプチドに複合させた（Ｍｏｕｌｔｏｎ、Ｎｅｌｓｏｎら、２００４年；Ｎｅｕｍａｎ、Ｓｔｅｉｎら、２００４年）。
【０１４８】
デング２ウイルス（ＤＥＮ２）の５’プラス鎖末端領域にハイブリダイズさせるためにデザインされたＰＭＯ、５’ＳＬ（配列番号５１）は、哺乳動物細胞培養におけるデングウイルス複製を阻止する能力を評価した。培養細胞への侵入を促進させるために、ＰＭＯ類を短いアルギニンに富むペプチド（Ｒ９Ｆ２Ｃ−５’ＰＭＯ）と複合させた。ベロＥ６細胞は、ＤＥＮ血清型１〜４（それぞれＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３、ＤＥＮ４）で接種してＰＭＯ剤と共にインキュベートし、ウイルス力価を、５〜８日後にプラークアッセイにより測定した。５’プラス鎖末端（５’ＳＬ）を標的にする化合物は、図５Ａに示されるように、４日間にわたって用量依存及び配列特異的な様式で対照と比較して、４オーダー超の大きさでＤＥＮ２力価を減少させた。５’ＳＬ  ＰＭＯの１０μＭ溶液は、図５Ａ〜５Ｂに示されるように、２超から４オーダーの大きさで、いくつかの場合では検出限界未満で４つのデング血清型すべての力価を減少させた。５’ＳＬ  ＰＭＯ間の２つの塩基対ミスマッチであり、ＤＥＮ４の標的配列であるため、５’ＳＬ  ＰＭＯは、ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３に対して（対数減少４）よりもＤＥＮ４（対数減少２）に対して効果が小さかった。有効な抗ＤＥＮ化合物は、ベロＥ６細胞で増殖した西ナイルウイルス（ＷＮＶ）の力価を変化させなかった。このデータは、５’ＳＬ  ＰＭＯ化合物は、ＤＥＮ１〜４の治療薬としての可能性があることを示している。
【０１４９】
（実施例３）
コロナウイルス科（ブタ生殖及び呼吸器症候群ウイルス、ＰＲＲＳＶ）のインビトロでのアンチセンス阻止作用
ブタ生殖及び呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）は、若齢ブタにおける雌ブタにおける生殖不良及び呼吸器疾患を特徴とする接触性ウイルス伝染病である。原因物体であるＰＲＲＳＶは、コロナウイルス科の他のメンバーと同様のゲノム構成を有する一本鎖ＲＮＡウイルスである。ＰＲＲＳは、ブタ産業に対して重大な経済的損失をもたらすが、ワクチンはこの数年間広く使用されている。特異的な抗ＰＲＲＳＶ薬物は、ＰＲＲＳＶ感染を予防し、制御するために一体化した方法の１つとして緊急に必要である。ＰＲＲＳＶの５’プラス鎖末端領域を標的にするＰＭＯ（ＰＲＲＳＶ−１ａ、配列番号１０９）は、下記のようにウイルス複製を阻止する能力を試験した。
【０１５０】
第１の試験は、ＰＲＲＳＶ−１ａ  ＰＭＯが、ウイルス誘導の細胞病原性作用（ＣＰＥ）の発生を阻止できるかどうかを判定するためにデザインされた。以前に報告されたように、この実験に対してＡＴＣＣ  ＣＲＬ１１１７１細胞を用いた。ＣＲＬ１１１７１単層細胞は、ＤＭＥＭ中、３７℃で４時間、ＰＲＲＳＶ−１ａ  ＰＭＯ（配列番号１０９）と共に処理した。ＰＭＯ類を細胞から除き、感染多重度（ＭＯＩ）１におけるＰＲＲＳＶ株ＶＲ２３８５で接種した。細胞を培養し、ＣＰＥ発生について毎日観測した。ブランク対照及び対照ＰＭＯ（ＤＳｓｃｒ、スクランブル配列のＰＭＯ）を、陰性対照として含んだ。また、細胞培養培地を採取し、ＰＲＲＳＶ力価を測定するためにＣＲＬ１１１７１細胞中で滴定した。
【０１５１】
未翻訳領域（ＵＴＲ）の５’プラス鎖末端を標的にするＰＲＲＳＶ−１ａ  ＰＭＯは、ＰＲＲＳＶ複製を阻止するのに有効であることが分かった（図６）。１６μＭでＰＲＲＳＶ−１ａ  ＰＭＯで処理した細胞は、対照よりも細胞病原性作用（ＣＰＥ）発生がはるかに小さかった（図７）。ＰＲＲＳＶ感染後、ＣＰＥは明瞭に認識できた（陽性）が、未感染対照細胞は、単層が無傷のままであった（ブランク）。ＰＭＯ  ＰＲＲＳＶ−１ａは、ＣＰＥ発生を減少させたが、対照ＰＭＯを含む他のＰＭＯ類は、ＣＰＥを阻止する上で大きな効果がなかった。細胞及び培地を、ＰＲＲＳＶ収量の滴定のために収穫した。組織培養感染用量（ＴＣＩＤ５０）を、異なる希釈液におけるＣＰＥ発生に基づいて算出した。ＰＲＲＳＶ−１ａは、９０％超までウイルス収量を減じた（図示せず）。
【０１５２】
ＰＲＲＳＶ−１ａ  ＰＭＯによるＰＲＲＳＶ複製の阻止もまた、用量依存であることを示した。上記のＰＭＯ処理及びウイルス培養条件を用いて、ＰＲＲＳＶ−１ａ及びＤＳｓｃｒ対照ＰＭＯの３つの異なる濃度（４、８及び１６ｍＭ）を、ウイルス滴定により測定されたウイルス複製を阻止する能力についてＰＲＲＳＶ感染ＣＲＲＬ１１１７１細胞に対して試験した。図６に示されるように、ＰＲＲＳＶ−１ａ  ＰＭＯは、用量依存様式でＰＲＲＳＶ複製を阻止する。
【０１５３】
（実施例４）
ダニ媒介性脳炎ウイルスのアンチセンス阻止作用
本実施例は、２種のフラビウイルス：ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥ）及び西ナイルウイルス（ＷＮＶ）に対して本発明のアンチセンスＰＭＯ化合物の抗ウイルス活性を試験するために工夫された。２種のＰＭＯオリゴマーを、抗ウイルス活性；ＴＢＥ  ５’ＳＬ、配列番号５７及び；スクランブル対照配列ＤＳｓｃｒ（５’−ＡＧＴＣＴＣＧＡＣＴＴＧＣＴＡＣＣＴＣＡ−３’配列番号１３３）について評価した。双方のＰＭＯオリゴマーは、アルギニンに富むペプチド（Ｒ９Ｆ２Ｃ−５’−ＰＭＯ）と５’末端で複合させて、記載されている（米国特許出願第６０／４６６，７０３号及びＭｏｕｌｔｏｎ、Ｎｅｌｓｏｎら２００４年）細胞取込みを増強させた。ＷＮＶとＴＢＥ５’ＳＬ標的ＰＭＯとの間の相同性がないので、ＷＮＶ感染は陰性制御感染を呈した。この制御は、各ＰＭＯ類の非特異的ウイルス抑制レベルを示す。ＰＭＯ化合物は、２ｍＭストック溶液を提供するために調製し、次いで組織培養細胞についてウイルスの標準的な用量に対して滴定した。細胞を、感染多重度（ＭＯＩ）１で感染させ、ウイルス収量は、１８時間感染後に採取された上澄液培地のサンプル中で評価した。
【０１５４】
本実施例では２種のウイルス株を用いた：
１）ＴＣ４０１西ナイル９９−３４９４０−３１Ａ（ニューヨーク株）継代２
２）ＴＣ３３９ダニ媒介脳炎ウイルス（Ｈｙｐｒ株）継代４９
【０１５５】
継代１３０のＳＷ  １３細胞（ＲＰＭＩ  １６４０培地プラス５％ＦＢＳにおいて増殖させたヒト白人副腎皮質腺癌細胞系ＥＣＡＡＣ８７０３１８０１）の４つのＴ１７５組織培養フラスコ（ＮＵＮＣ）を、トリプシン−ＥＤＴＡ（１×）で２回洗浄し、３７℃で２〜３分間インキュベートした。該細胞を、フラスコ１つ当たり、１１．５ｍｌの増殖培地に再懸濁し、プールした。プールした細胞懸濁液で細胞のカウントを実施すると、結果は、１．７４×１０６細胞／ｍｌで、９９％の生存度を有した。４つのＴ１７５フラスコに播種するために６ｍｌの細胞懸濁液を用い、４０ｍｌの細胞懸濁液を２７０ｍｌに希釈した。これを、１５の６ウェルプレートにおいて、１ウェル当たり３ｍｌのアリコートに分配した。該プレートを一晩インキュベートして、集密化した細胞単層を形成させた。
【０１５６】
各ＰＭＯ化合物を、４ｍｌの無血清ＲＰＭＩ  １６４０培地中、２５、２０、１５、１０及び５μＭに希釈した。２つの６ウェルプレートのウェルから培地を取り出した。適切な化合物希釈液の２ｍｌを、プレートのすべてのウェルに分配し、これを、双方のＰＭＯ化合物に関し、別個のプレートで反復した。該プレートを３７℃で５時間インキュベートした。２種のウイルスを−７０℃の冷凍庫から取り出して速やかに解凍した。各ウイルスを２×１０６ｐｆｕ／ｍｌに希釈し、４２ｍｌの無血清培地を作製した。該６ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、前処理培地を、全ウェルから吸引した。対照プレート（化合物なし）の各ウェルに、１ｍｌの培地を加えた。プレートの各組は、２×１０６ｐｆｕ／ｍｌに希釈したＴＢＥ又はＷＮのいずれかを受けた。該プレートを室温で１時間インキュベートし、次いで培地を取り出し、２ｍｌのＲＰＭＩ  １６４０プラス１％ＦＢＳプラス細胞の前処理に用いたのと同じ濃度の試験化合物と取り替えた。該プレートを３７℃で１８時間インキュベートした。
【０１５７】
ウイルス滴定決定用の２４ウェルプレートを調製するために、継代１３１のＳＷ  １３細胞の８つのＴ１７５組織培養フラスコ（ＮＵＮＣ）を、トリプシン−ＥＤＴＡ（１×）で２回洗浄し、３７℃で２〜３分間インキュベートした。該細胞を、フラスコ１つ当たり、１１．５ｍｌの増殖培地に再懸濁し、プールした。プールした細胞懸濁液で細胞のカウントを実施すると、結果は、１．７×１０６細胞／ｍｌで、９９％の生存度を有した。８０ｍｌの細胞懸濁液を６８０ｍｌに希釈した。これらの細胞を、８つの２４ウェルプレートにおいて、１ウェル当たり１ｍｌのアリコートに分配した。該プレートを一晩インキュベートして、集密化した細胞単層を形成させた。
【０１５８】
感染１８時間後、ＰＭＯ処理し、ウイルス感染した６ウェルプレートの培地上澄液を、各個のウェルから採取した。２７０マイクロリットルの無血清培地を有する９６ウェルプレートの単一カップに、各採取物の３０マイクロリットルを入れた。サンプルの残りをクリオチューブに入れ、−７０℃で保存した。２４ウェルプレートから培地を取り、２５０μｌの滴定希釈液を９６ウェルプレートから２４ウェルプレートに移し、これを３７℃で１時間インキュベートした。１ｍｌのアガロースオーバーレイ培地を各ウェルに加え、アガロースを室温でゲル化させた後、該プレートを３７℃で５日間インキュベートした。５日後、インキュベーターからプレートを取り出し、各ウェルに１ｍｌの１０％ホルモル生理食塩水を加え、該プレートを室温で３日間放置した。アガロース培地を除去するために流水下で該プレートを洗浄し、逆さにして排液しながら残りのプレートを洗浄した。次いで、各ウェルに１ｍｌの０．１％ナフタレン黒色染色を受けさせ、プレートを３０分間置いてから、染色を取り出し、プレートを流水下で洗浄した。次いでそれらを３時間乾燥した（逆さに）。ウイルスプラークをカウントし、滴定を決定した。
【０１５９】
図８は、未処置対照のパーセンテージとして、ＰＭＯ処置感染物から得られたウイルス滴定を示しており、ウイルス感染細胞は、ＴＢＥＶ又はＷＮＶのいずれかによって感染させ、ＴＢＥＶアンチセンス化合物で処置したものであり、ここで、ＰＭＯ化合物は、５’ＳＬ（配列番号５７）か又は対照ＰＭＯ（ＤＳｓｃｒ、スクランブル塩基配列）である。図８におけるウイルス滴定の比較から見られるように、化合物濃度の増加と共にすべての細胞（処置及び対照）でウイルス滴定のかなりの減少があり、これは、アンチセンス化合物と対照化合物の双方に存在するアルギニンに富んだ結合ペプチドの細胞毒性効果によると考えられる。しかし、化合物濃度が５μＭ以上では、ＷＮＶ（図８）に対して、また、ＤＳｓｃｒスクランブル対照配列に対して、ＴＢＥＶ阻害の配列特異的増加が見られる。
【０１６０】
（実施例５）
マウスにおける西ナイルウイルス（ＷＮＶ）感染に及ぼすＰＭＯの効果
ＰＭＯは、ホスホロジアミデートサブユニット間連結部によって結合したモルホリン環からなる骨格に結合したプリン及びピリミジン塩基を含有する約２０サブユニットの長さに典型的に合成された、非荷電、水溶性、ヌクレアーゼ抵抗性のアンチセンス剤である。本発明を支持する実験では、ＰＭＯの５’端へのアルギニンに富んだペプチド（Ｐ００７を指す；配列番号１２２）の複合が、培養細胞内へのＰＭＯの送達を大きく促進することが示された。ウイルスゲノムの種々の標的にするＰ００７−ＰＭＯは、種々の程度にＷＮＶウイルス感染を阻害した。それらの中でも、５’末端の２０のヌクレオチド（５’端；配列番号４７）を標的にするＰＭＯは強力な抗ウイルス活性を示した。
【０１６１】
観察値をインビボ条件に拡張するために、マウスで実験を行った。メスのＢＡＬＢ／ｃマウスを用いた。該マウスはＳｉｍｏｎｓｅｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ギルロイ、カリフォルニア州）から入手した。実験の開始時点で、マウスは動物施設で１週間を過ごしており、６週齢超であった。該マウスの体重は、１２．３ｇから１９．８ｇ、平均は１６．１ｇであった。実験は、ユタ州立大学実験動物研究センター（ＬＡＲＣ）においてＢＳＬ−３動物スーツで行われた。２種のＰＭＯ化合物が用いられた：１）５’末端（ＮＧ０４０００６；配列番号４７）を標的にするＰＭＯ及び；２）同じＰＭＯが５’端でＰ００７アルギニンに富んだペプチド（配列番号１２２）と複合し、ＮＧ０４０００５と称されるもの。ＮＧ０４０００７は、非結合のスクランブル対照ＰＭＯである。アンプリゲン（Ａｍｐｌｉｇｅｎ）（登録商標）は、陽性対照の抗ウイルス化合物として使用され、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｍ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ（Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、バンダービルト大学、ナッシュビル、ＴＮ  ３７２４０）から入手した。アンプリゲンはＲＮＡ様分子であるため、ＲＮアーゼフリーの材料及びＤＥＰＣ処理水を使用することにより、ＲＮアーゼの汚染を防ぐように注意した。
【０１６２】
２０匹の動物を有するプラセボ群１１を除いて、１０匹の動物を各処置群に無作為に割り当てた。腹腔内処置を開始してから２４時間後に、引き続きＷＮＶ接種を行った。ＰＭＯ処置は、ウイルス接種の４時間前、ウイルス注入の１、２、３、４、５及び５日後（ｄｐｉ）に、毎日続けた。アンプリゲンを毎日−１、１、３及び５ｄｐｉで腹腔内処置した。投与量及び処置群を、生存率及び死亡までの平均日数（ＭＤＤ）と共に下表に示す。ＮＧ０４０００５及びアンプリゲンは、プラセボ対照に比較して、ＷＮＶ感染マウスのＭＤＤを増加させた（表４）。
【０１６３】
【表４】
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ａ  ２１日目前のマウス死亡日に対する平均日。スチューデントｔ−検定を、解析用に用いた。
ｂ  Ｌｏｇランク生存分析
毒性対照は、化合物量が限定されていたので、この最初の実験では実施しなかった。
＊Ｐ≦０．０５、＊＊Ｐ≦０．０１、＊＊＊Ｐ≦０．００１、プラセボと比較。
【０１６４】
【表５−１】
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【表５−２】
0005425396.tif 000013
【表５−３】
0005425396.tif 000014
【０１６５】
【表６】
0005425396.tif 000015
【０１６６】
【表７】
0005425396.tif 000016
【図面の簡単な説明】
【０１６７】
【図１Ａ】非荷電骨格を有する種々のオリゴヌクレオチド類縁体の骨格構造を示す図である。
【図１Ｂ】非荷電骨格を有する種々のオリゴヌクレオチド類縁体の骨格構造を示す図である。
【図１Ｃ】非荷電骨格を有する種々のオリゴヌクレオチド類縁体の骨格構造を示す図である。
【図１Ｄ】非荷電骨格を有する種々のオリゴヌクレオチド類縁体の骨格構造を示す図である。
【図１Ｅ】非荷電骨格を有する種々のオリゴヌクレオチド類縁体の骨格構造を示す図である。
【図１Ｆ】非荷電骨格を有する種々のオリゴヌクレオチド類縁体の骨格構造を示す図である。
【図１Ｇ】非荷電骨格を有する種々のオリゴヌクレオチド類縁体の骨格構造を示す図である。
【図２Ａ】代表的なモルホリノオリゴヌクレオチドの反復サブユニットセグメントを示す図である。
【図２Ｂ】代表的なモルホリノオリゴヌクレオチドの反復サブユニットセグメントを示す図である。
【図２Ｃ】代表的なモルホリノオリゴヌクレオチドの反復サブユニットセグメントを示す図である。
【図２Ｄ】代表的なモルホリノオリゴヌクレオチドの反復サブユニットセグメントを示す図である。
【図３Ａ】代表的なウイルス及びウイルス標的部位のゲノムを示す略図である。
【図３Ｂ】代表的なウイルス及びウイルス標的部位のゲノムを示す略図である。
【図３Ｃ】代表的なウイルス及びウイルス標的部位のゲノムを示す略図である。
【図３Ｄ】代表的なウイルス及びウイルス標的部位のゲノムを示す略図である。
【図３Ｅ】代表的なウイルス及びウイルス標的部位のゲノムを示す略図である。
【図４Ａ】代表的なウイルスに関する５’末端プラス鎖領域の予測された二次構造の例を示す図である。
【図４Ｂ】代表的なウイルスに関する５’末端プラス鎖領域の予測された二次構造の例を示す図である。
【図４Ｃ】代表的なウイルスに関する５’末端プラス鎖領域の予測された二次構造の例を示す図である。
【図４Ｄ】代表的なウイルスに関する５’末端プラス鎖領域の予測された二次構造の例を示す図である。
【図４Ｅ】代表的なウイルスに関する５’末端プラス鎖領域の予測された二次構造の例を示す図である。
【図５Ａ】デング熱ウイルスタイプ１〜４の５’プラス鎖末端領域を標的とするアンチセンスオリゴマーの存在下、感染ベロ細胞においてデング熱ウイルス複製の阻止を示す図である。
【図５Ｂ】デング熱ウイルスタイプ１〜４の５’プラス鎖末端領域を標的とするアンチセンスオリゴマーの存在下、感染ベロ細胞においてデング熱ウイルス複製の阻止を示す図である。
【図５Ｃ】デング熱ウイルスタイプ１〜４の５’プラス鎖末端領域を標的とするアンチセンスオリゴマーの存在下、感染ベロ細胞においてデング熱ウイルス複製の阻止を示す図である。
【図５Ｄ】デング熱ウイルスタイプ１〜４の５’プラス鎖末端領域を標的とするアンチセンスオリゴマーの存在下、感染ベロ細胞においてデング熱ウイルス複製の阻止を示す図である。
【図６】ＰＭＯが、ウイルス力価により測定されるＰＲＲＳＶ複製を減少できることを示す図である。
【図７】ＰＲＲＳＶで接種されたＣＲＬ１１１７１細胞のインビトロＰＭＯ処理により細胞病原性作用が減じられていることを示す図である。
【図８】ＴＢＥＶの５’末端領域を標的とするＰＭＯの存在下、インビトロＴＢＥＶ複製の減少を示す図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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