(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者における前立腺細胞増殖性障害の検出を補助する方法であって、該被験者から単離した生体サンプルのＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子発現レベルを決定することを含み、低発現及び／又はＣｐＧメチル化が該障害の存在の指標となる、方法。
【請求項２】
ＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子と、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子との発現レベルを決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子の発現レベル決定に加えて、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ遺伝子の発現レベルを決定する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
遺伝子内のＣｐＧメチル化の有無を検出することによって遺伝子発現を決定し、メチル化の存在が癌の存在を示す、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
（ｉ）ＲＡＳＳＦ２Ａ遺伝子のＣｐＧが、配列番号１の少なくとも１６個の連続したヌクレオチドの配列を含むか、又は高ストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする配列内に位置する、
（ｉｉ）ＴＦＡＰ２Ｅ遺伝子のＣｐＧが、配列番号２の少なくとも１６個の連続したヌクレオチドの配列を含むか、又は高ストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする配列内に位置する、
（ｉｉｉ）ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ遺伝子のＣｐＧが、配列番号３の少なくとも１６個の連続したヌクレオチドの配列を含むか、又は高ストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする配列内に位置する、
（ｉｖ）ＧＳＴＰｉ遺伝子のＣｐＧが、配列番号４の少なくとも１６個の連続したヌクレオチドの配列を含むか、又は高ストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする配列内に位置する、
請求項４に記載の方法。
【請求項６】
被験者から得られた生体サンプルから単離したゲノムＤＮＡを、該ゲノムＤＮＡの少なくとも１つの標的領域内のメチル化ＣｐＧジヌクレオチドと非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドとを識別する、少なくとも１つの試薬又は試薬群に接触させることを含み、該標的領域が、配列番号１（ＲＡＳＳＦ２Ａ用）、配列番号２（ＴＦＡＰ２Ｅ用）、配列番号３（ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ用）、配列番号４（ＧＳＴＰｉ用）で規定される配列の少なくとも１６個の連続したヌクレオチド配列であって少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含むか、又は高ストリンジェントな条件下で当該ヌクレオチド配列とハイブリダイズする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
被験者から得られた生体サンプルが、細胞株、組織断片、生検、パラフィン包埋組織、体液、射精液、尿、血漿、血清、全血、単離血球、血液から単離した細胞及びこれらの組合せを含む群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
生体サンプルが血漿、血清、全血、射精液及び尿からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
以下（ａ）〜（ｃ）を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法を行うのに適したキット；
（ａ）重亜硫酸試薬；
（ｂ）該重亜硫酸試薬及び前記被験者の生体サンプルを収容するのに適したコンテナ；
（ｃ）
（１）（ｉ）に記載の一組のオリゴヌクレオチド、又は
（２）（ｉ）に記載の一組のオリゴヌクレオチド及び（ｉｉ）〜（ｉｖ）からなる群から少なくとも１つ選択される一組のオリゴヌクレオチド：
（ｉ）配列番号５、６、１３及び１４から選択されるいずれか１つの配列の１８塩基長のセグメントと同一であるか、又は相補的であるか、又は高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ＲＡＳＳＦ２Ａのメチル化検出に用いられる２つのオリゴヌクレオチドを含有する少なくとも一組のオリゴヌクレオチド、
（ｉｉ）配列番号７、８、１５及び１６から選択されるいずれか１つの配列の１８塩基長のセグメントと同一であるか、又は相補的であるか、又は高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ＴＦＡＰ２Ｅのメチル化検出に用いられる２つのオリゴヌクレオチドを含有する少なくとも一組のオリゴヌクレオチド、
（ｉｉｉ）配列番号９、１０、１７及び１８から選択されるいずれか１つの配列の１８塩基長のセグメントと同一であるか、又は相補的であるか、又は高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋのメチル化検出に用いられる２つのオリゴヌクレオチドを含有する少なくとも一組のオリゴヌクレオチド、
（ｉｖ）配列番号１１、１２、１９及び２０から選択されるいずれか１つの配列の１８塩基長のセグメントと同一であるか、又は相補的であるか、又は高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ＧＳＴＰｉのメチル化検出に用いられる２つのオリゴヌクレオチドを含有する少なくとも一組のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
以下（ａ）〜（ｃ）又は（ａ）〜（ｄ）を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法を行うのに適したキット；
（ａ）メチル化感受性制限酵素試薬；
（ｂ）該試薬及び被験者の生体サンプルを収容するのに適したコンテナ；
（ｃ）
（１）（ｉ）に記載の一組のオリゴヌクレオチド、又は
（２）（ｉ）に記載の一組のオリゴヌクレオチド及び（ｉｉ）に記載の一組のオリゴヌクレオチド：
（ｉ）配列番号１（ＲＡＳＳＦ２Ａ用）の少なくとも１８塩基長のセグメントと同一であるか、又は相補的であるか、又は高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、１つ若しくは複数の核酸又はペプチド核酸を含有する少なくとも一組のオリゴヌクレオチド、
（ｉｉ）配列番号２（ＴＦＡＰ２Ｅ用）、配列番号３（ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ用）及び配列番号４（ＧＳＴＰｉ用）からなる群から選択される配列の少なくとも１８塩基長のセグメントと同一であるか、又は相補的であるか、又は高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、１つ若しくは複数の核酸又はペプチド核酸を含有する少なくとも一組のオリゴヌクレオチド；
（ｄ）キット結果を利用及び解釈するための取扱説明書。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、正常な状態に比べて疾患状態において発現パターンの変化を示すゲノムＤＮＡ配列に関する。特定の実施の形態が、前立腺癌を検出又は診断するのに有用な方法、核酸、核酸アレイ及びキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺癌は、アメリカの男性において最も一般的な癌であり、３番目の主な死亡原因である（非特許文献１）。この疾患の罹患率及び致死率は、歳を取るごとに大きく増大し、全前立腺癌の症例の６５％超が６５歳を超える男性で診断されている（非特許文献１）。診断時の疾患状態は、生存率全体にも影響を与える。前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）のスクリーニング検査の広範使用によって、新たな患者の９０％近くが局限性疾患又は局所性疾患であると診断される（非特許文献２）。診断時に局限性疾患又は局所性疾患である患者は、５年相対生存率が１００％に近づきつつある（非特許文献１）。
【０００３】
米国癌協会によれば、前立腺癌スクリーニングの現行のガイドラインは、５０歳から毎年、ＰＳＡ上昇の検査及び直腸指診を勧めている。前立腺癌を発症している危険性が高い男性（アフリカ系アメリカ人男性及び若年齢で診断された一等親血縁者がいる男性）に対しては、スクリーニングは４５歳から始めたほうがよい。これらの試験のいずれかの陽性結果は、前立腺生検で確認される。ＰＳＡスクリーニングの出現によって、前立腺癌の診断の展望が変化した。前立腺癌の罹患率はここ２０年で劇的に増大したが、６５歳を超える男性での診断は横ばいである。ＰＳＡ検査には２つの欠点がある。１つ目は、ＰＳＡが前立腺癌に加えて多くの良性状態で上昇するため、特異度が低いことである。このため、前立腺癌ではない男性で多くの前立腺生検が行われることになる。２つ目の欠点は、ＰＳＡは比較的感度が高いにもかかわらず、ＰＳＡの上昇（４ｎｇ／ｍｌ超）のない隠れ前立腺癌の男性が存在することである（非特許文献３）。また、現行のガイドライン下では最大で１０％の前立腺生検が偽陰性になり、これにより生検であっても感度が低減することが推測されている（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）。特異度及び感度を増大させる検査の改善は明らかに必要である。
【０００４】
多元的アプローチ。  伝統的に癌診断は、単一分子マーカーの検出（例えば遺伝子突然変異、ＰＳＡレベルの上昇）に頼ってきた。残念なことに、癌は、典型的に単一のマーカーでは多くの疾患形態を検出又は識別できない疾患状態である。したがって、単一マーカーのみを認識するアッセイでは、予測値が限定されていた。本発明の基本となる考察は、メチル化に基づく癌診断法、及びこのような疾患のスクリーニング、診断及び治療的モニタリングによって、複数のマーカーの選択を利用することで、単一マーカー解析を利用する技術水準を超える著しい改善が与えられることである。癌は単純な疾患ではないので、多重解析アプローチは、癌診断法に特に適しており、この多元的「パネル」アプローチは、細胞学的且つ臨床的に癌の不均一性と一致している。
【０００５】
メチル化に基づく診断検査へのパネルアプローチの成功実現の鍵は、疾患状態を特徴付け、且つ識別することができる最適化マーカーパネルの設計及び開発である。本発明は、複数の特に有効且つ特有の遺伝子パネル、特に高い感度、特異度及び／又は予測値での結腸細胞増殖性障害の検出を可能にするパネルの成員の１つ又は組合せのメチル化解析を記載している。
【０００６】
医学的検査の発展。  任意の医学的スクリーニング又は診断検査の２つの鍵となる評価基準は、感度及び特異度であり、これらによって、どのくらい良好に試験を行い、例外なく、また誤って標的疾患ではない（予測値を有しない）個体を包含することなく、全ての罹患個体を正確に検出することができるかが評価される。歴史的に、感度及び特異度が低いため、多くの診断検査が批判されている。
【０００７】
真陽性（ＴＰ）結果は、検査が陽性であり、且つ症状がある場合である。偽陽性（ＦＰ）結果は、検査が陽性であるが、症状がない場合である。真陰性（ＴＮ）結果は、検査が陰性であり、且つ症状がない場合である。偽陰性（ＦＮ）結果は、検査が陰性であるが、症状がない場合である。これに関して、感度＝ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＮ）、特異度＝ＴＮ／（ＦＰ＋ＴＮ）、及び予測値＝ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＰ）である。
【０００８】
感度は、検査する個体において標的疾患を正確に検出する検査能の評価基準である。感度が低い検査では、偽陰性、即ち疾患であるのに、この特定の疾患ではないと誤って同定される個体の割合が高くなる。偽陰性の潜在的な危険性は、罹患個体が一定期間、診断及び治療されず、その間に疾患が後期に進行し、そのようなことになったら治療の効果が低くなる可能性があることである。感度が低い検査の例は、ＨＩＶに関するタンパク質ベースの血液検査である。この種の検査は、疾患が確定され、相当数のウイルスが血流に侵入するまでウイルスの存在を検出することができないため、低感度を示す。これに対して、感度が高い検査の例は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用したウイルス量（viral-load）検出である。この種の検査は、ごく少量のウイルスを検出することができるために、高感度が達成される。結果として診断を誤る可能性が高い場合に、高感度は特に重要である。
【０００９】
他方で特異度は、疾患状態にない患者を正確に同定する検査能の評価基準である。特異度が低い検査では、偽陽性、即ち疾患であるとして誤って同定される個体の割合が高くなる。偽陽性の難点は、付帯リスク、感情及び金銭的なストレスを伴い、且つ患者の健康に対して悪影響を与える可能性がある、不必要な医療処置、治療を受けることを患者に強いることである。特異度が高い診断検査を開発することを難しくしている疾患の特徴は、特に癌における疾患機構に複数の遺伝子及びタンパク質が関与することが多いことである。さらに、疾患状態に関係のない理由から或る特定のタンパク質が上昇する可能性があることから、特異度が高い検査の例は、ｐ５３突然変異を検出することができる遺伝子ベースの検査である。さらなる診断法又はさらなる医学的介入に伴うコスト又はリスクが非常に高い場合に、特異度は重要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Jemal et al., 2006
【非特許文献２】Jemal et al., 2005
【非特許文献３】Thompson et al., 2004
【非特許文献４】Djavan et al., 2000
【非特許文献５】Mian et al., 2002
【非特許文献６】Gupta et al., 2005
【非特許文献７】Hanley et al., 2006
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１に従ったＨＭアッセイによって測定した対数平均メチル化の概要を示す図である。それぞれの解析遺伝子（図の左側に表示）に対して、２つのプロットが与えられ、左側のプロットはマルチクラス解析を表し、感度をＹ軸に示し、（ｌｏｇ１０ｎｇ／ｍＬ）で測定したＤＮＡメチル化をＸ軸に示す。右側のプロットは、ＲＯＣ（感度をＹ軸に示し、１−特異度をＸ軸に示す）を表す。
【図２】実施例１に従ったＰＣａ及び陰性クラスＩ（健康な個体）の前立腺マッサージ後の尿のＨＭリアルタイムＰＣＲアッセイによって測定した対数平均メチル化の概要を示す図である。それぞれの解析遺伝子（それぞれのプロットの上に標識）に対して、感度をＹ軸に示し、（ｌｏｇ１０ｎｇ／ｍＬ）で測定したＤＮＡメチル化をＸ軸に示す。
【図３】実施例１に従ったＰＣａ及び陰性クラスＩＩ（健康な個体及び生検陰性個体）の前立腺マッサージ後の尿のＨＭリアルタイムＰＣＲアッセイによって測定した対数平均メチル化の概要を示す図である。それぞれの解析遺伝子（それぞれのプロットの上に標識）に対して、感度をＹ軸に示し、（ｌｏｇ１０ｎｇ／ｍＬ）で測定したＤＮＡメチル化をＸ軸に示す。
【図４】ＰＣａ及び陰性クラスＩ（健康な個体）の血漿のＨＭリアルタイムＰＣＲアッセイによって測定した対数平均メチル化を示す図である。それぞれの解析遺伝子（それぞれのプロットの上に標識）に対して、感度をＹ軸に示し、（ｌｏｇ１０ｎｇ／ｍＬ）で測定したＤＮＡメチル化をＸ軸に示す。
【図５】ＰＣａ及び陰性クラスＩＩ（健康な個体及び生検陰性個体）の血漿のＨＭリアルタイムＰＣＲアッセイによって測定した対数平均メチル化を示す図である。それぞれの解析遺伝子（それぞれのプロットの上に標識）に対して、感度をＹ軸に示し、（ｌｏｇ１０ｎｇ／ｍＬ）で測定したＤＮＡメチル化をＸ軸に示す。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、被験者において前立腺細胞増殖性障害、最も好ましくは前立腺癌を検出する方法であって、当該被験者から単離した生体サンプルにおいて、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定することを含み、低発現（underexpression：過小発現）及び／又はＣｐＧメチル化が当該障害の存在の指標となる、被験者において前立腺細胞増殖性障害、最も好ましくは前立腺癌を検出する方法を提供する。
【００１３】
好ましくは複数の遺伝子（本明細書中で「遺伝子パネル」とも称される）を解析する。好ましくは２つ、３つ又は４つの遺伝子を解析する。この方法の一実施の形態では、当該パネルは、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子、及び／又はそのプロモータ又は調節領域を含む。好ましくは、当該群はＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ遺伝子を含む。
【００１４】
以下の遺伝子の組合せが特に好ましい：
ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ＋ＲＡＳＳＦ
ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ＋ＧＳＴＰｉ。
【００１５】
本発明の様々な態様は、有効且つ特有の遺伝子マーカーを提供し、これにより当該マーカーの発現解析によって、特に高い感度、特異度及び／又は予測値での前立腺細胞増殖性障害、最も好ましくは前立腺癌の検出を可能にする。
【００１６】
一実施の形態において、本発明は、被験者において前立腺細胞増殖性障害、最も好ましくは前立腺癌を検出する方法であって、上記被験者から単離した生体サンプルにおいて、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定することを含み、低発現及び／又はＣｐＧメチル化が当該障害の存在の指標となる、被験者において前立腺細胞増殖性障害、最も好ましくは前立腺癌を検出する方法を提供する。一実施の形態では、上記発現レベルは、上記遺伝子から転写されたｍＲＮＡの有無又はレベルを検出することによって決定する。さらなる実施の形態では、上記発現レベルは、上記遺伝子によってコードされるポリペプチド又はその配列の有無又はレベルを検出することによって決定する。
【００１７】
さらなる好ましい実施の形態において、上記発現は、上記遺伝子内のＣｐＧメチル化の有無を検出することによって決定し、メチル化の存在が、前立腺細胞増殖性障害、より具体的には前立腺癌の存在を示す。
【００１８】
上記方法は、Ａ）少なくとも１つ、及びより好ましくは複数のゲノムＤＮＡ標的領域内（当該標的領域のヌクレオチド配列が、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む）のメチル化ＣｐＧジヌクレオチドと非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドとを識別する少なくとも１つの試薬又は試薬群と、被験者から得られた生体サンプル（好ましくは射精液、血漿、血清、全血、単離血球、血液から単離した細胞から成る群から選択される）から単離したゲノムＤＮＡを、接触させる工程と、Ｂ）少なくとも部分的に癌を検出する工程とを含む。
【００１９】
好ましくは複数の遺伝子（本明細書中で「遺伝子パネル」とも称される）を解析する。好ましくは２つ、３つ又は４つの遺伝子を解析する。この方法の一実施の形態では、当該パネルは、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子、及び／又はそのプロモータ又は調節領域を含む。好ましくは、当該群はＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ遺伝子を含む。
【００２０】
以下の遺伝子の組合せが特に好ましい：
ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ＋ＲＡＳＳＦ
ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ＋ＧＳＴＰｉ。
【００２１】
好ましくは、標的領域が、配列番号１〜配列番号４から成る群から選択される少なくとも１つの配列の少なくとも１６個、５０個、１００個又は５００個の連続したヌクレオチドの配列を含むか、又はストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする。
【００２２】
遺伝子の発現解析、ｍＲＮＡ発現解析、又はタンパク質発現解析によって、上記遺伝子の使用が可能になり得る。しかし、本発明の最も好ましい実施の形態では、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子、及び／又はそのプロモータ又は調節要素のメチル化状況（status）の解析によって、前立腺細胞増殖性障害、最も好ましくは前立腺癌の検出が可能になる。
【００２３】
好ましくは複数の遺伝子（本明細書中で「遺伝子パネル」とも称される）を解析する。好ましくは２つ、３つ又は４つの遺伝子を解析する。この方法の一実施の形態では、当該パネルは、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子、及び／又はそのプロモータ又は調節領域を含む。好ましくは、当該群はＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ遺伝子を含む。
【００２４】
以下の遺伝子の組合せが特に好ましい：
ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ＋ＲＡＳＳＦ
ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ＋ＧＳＴＰｉ。
【００２５】
本発明は、癌の発症に関連する特徴に関して生体サンプルを解析する方法であって、配列番号１〜配列番号４から成る群から選択される少なくとも１つの配列の核酸又はその断片を、ゲノム配列内のメチル化ＣｐＧジヌクレオチドと非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドとを識別することが可能な試薬又は試薬群と、接触させることを特徴とする、癌の発症に関連する特徴に関して生体サンプルを解析する方法を提供する。
【００２６】
本発明は、前立腺癌の発症に関連するゲノムＤＮＡのエピジェネティックパラメータを確かめる方法を提供する。この方法は、上記疾患の検出及び診断の改善に有用である。
【００２７】
好ましくは、検査サンプル源は、細胞又は細胞株、組織断片、生検、パラフィン包埋組織、体液、射精液、尿、血液及びこれらの組合せから成る群から選択される。より好ましくは、このサンプル源は、被験者から得られた、射精液、尿、血漿、血清、全血、単離血球、血液から単離した細胞から成る群から選択される。
【００２８】
特に、本発明は、診断ツールでの使用に適した前立腺癌を検出する以下を含む方法を提供する：ゲノム核酸（複数可）を含む生体サンプルを得ること；核酸（複数可）又はその断片を、被験者の核酸の少なくとも１つ及びより好ましくは複数の標的配列（複数可）（当該標的配列のそれぞれが、配列番号１〜配列番号４から成る群から選択される配列の少なくとも１６個、５０個、１００個又は５００個の連続したヌクレオチド（当該連続したヌクレオチドが、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む）を含む配列を含むか、又はストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする。）内のメチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列と非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列とを識別するのに十分な１つ又は複数の試薬に接触させること；並びに少なくとも一部当該識別に基づき、少なくとも１つ及びより好ましくは複数の標的ＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態、又は平均、又は複数の標的ＣｐＧジヌクレオチド配列の平均メチル化状態を反映する値を決定すること。
【００２９】
好ましくは、標的配列内のメチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列と非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列との識別は、少なくとも１つのこのようなＣｐＧジヌクレオチド配列の、配列番号５〜配列番号２０から成る群から選択される配列内の対応する変換ジヌクレオチド配列又は非変換ジヌクレオチド配列、及び標的配列に対応するその連続した領域へのメチル化状態依存的変換又は非変換を含む。
【００３０】
さらなる実施の形態は、前立腺細胞増殖性障害、最も好ましくは前立腺癌を検出する以下を含む検出方法を提供する：被験者のゲノムＤＮＡを有する生体サンプルを得ること；ゲノムＤＮＡを抽出すること；５位の非メチル化シトシン塩基を、ウラシル残基又はハイブリダイゼーション特性に関してシトシンと異なることが検出可能な別の塩基に変換するために、ゲノムＤＮＡ又はその断片を１つ又は複数の試薬で処理すること；処理ゲノムＤＮＡ又はその処理断片を、増幅酵素及びそれぞれの場合、配列番号５〜配列番号２０から成る群から選択される配列に相補的であるか、又は適度にストリンジェントな条件若しくはストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする少なくとも９ヌクレオチド長の連続した配列及びその相補体を含む少なくとも２つのプライマーに接触させること（当該処理ＤＮＡ又はその断片のいずれかを増幅して増幅産物を産生するか、又は増幅しない）；並びに当該増幅産物の有無又は特性に基づき、メチル化状態若しくは平均、又は配列番号１〜配列番号４から成る群から選択される配列の少なくとも１つ、しかしより好ましくは複数のＣｐＧジヌクレオチドの平均メチル化レベルを反映する値を決定すること。
【００３１】
好ましくは、決定には、以下のＡ）〜Ｄ）から成る群から選択される少なくとも１つの方法の使用が含まれる。Ａ）配列番号５〜配列番号２０から成る群から選択される配列に相補的であるか、又は適度にストリンジェントな条件若しくはストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする少なくとも９ヌクレオチド長の連続した配列及びその相補体を含む少なくとも１つの核酸分子をハイブリダイズすること、Ｂ）固相と結合し、配列番号５〜配列番号２０から成る群から選択される配列に相補的であるか、又は適度にストリンジェントな条件若しくはストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする少なくとも９ヌクレオチド長の連続した配列及びその相補体を含む少なくとも１つの核酸分子をハイブリダイズすること、Ｃ）配列番号５〜配列番号２０から成る群から選択される配列に相補的であるか、又は適度にストリンジェントな条件若しくはストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする少なくとも９ヌクレオチド長の連続した配列及びその相補体を含む少なくとも１つの核酸分子をハイブリダイズすること、および、少なくとも１つのこのようなハイブリダイズする核酸分子を、少なくとも１ヌクレオチド塩基伸長させること、並びにＤ）増幅産物をシークエンシングすること。
【００３２】
さらなる実施の形態は以下を含む癌の解析（即ち分類の検出）方法を提供する。被験者のゲノムＤＮＡを有する生体サンプルを得ること、ゲノムＤＮＡを抽出すること、配列番号１〜配列番号４から成る群から選択される１つ又は複数の配列、或いはストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする配列を含むゲノムＤＮＡ又はその断片を、１つ又は複数のメチル化感受性制限酵素と接触させること（それによってゲノムＤＮＡを消化し消化断片を産生するか、又はそれによっては消化しない）、並びに少なくとも１つのこのような断片の有無又は特性に基づき、配列番号１〜配列番号４から成る群から選択される少なくとも１つの配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態、又は平均、又は複数のＣｐＧジヌクレオチド配列の平均メチル化状態を反映する値を決定することを含む、癌の解析（即ち分類の検出）方法が与えられる。好ましくは、当該決定前に、消化ゲノムＤＮＡ又は非消化ゲノムＤＮＡを増幅する。
【００３３】
さらなる実施の形態によって、配列番号１〜配列番号４から成る群由来の配列内のシトシンのメチル化パターンの解析のために、新規のゲノム的、化学的に修飾した核酸配列、及びオリゴヌクレオチド、及び／又はＰＮＡ−オリゴマーが与えられる。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
定義
用語「実測値／期待値の比（Expected Ratio）」（「Ｏ／Ｅ比」）は、特定のＤＮＡ配列内のＣｐＧジヌクレオチドの頻度を表し、それぞれの断片に関して［ＣｐＧ部位の数／（Ｃ塩基の数×Ｇ塩基の数）］／バンド長に対応する。
【００３５】
用語「ＣｐＧアイランド」は、（１）０．６を超えた「実測値／期待値の比」に対応するＣｐＧジヌクレオチド頻度を有し、且つ（２）「ＧＣ含量」が０．５を超える基準を満たすゲノムＤＮＡの連続した領域を表す。ＣｐＧアイランドの長さは、いつもというわけではないが、典型的に、約０．２ｋｂ〜約１ｋｂ又は約２ｋｂである。
【００３６】
用語「メチル化状態」又は「メチル化状況」は、ＤＮＡ配列内の１つ又は複数のＣｐＧジヌクレオチドでの５−メチルシトシン（「５−ｍＣｙｔ」）の有無を表す。ＤＮＡ配列内の１つ又は複数の特定のＣｐＧメチル化部位（それぞれが２つのＣｐＧジヌクレオチド配列を有する）でのメチル化状態としては、「非メチル化」、「完全メチル化」及び「ヘミ−メチル化」が挙げられる。
【００３７】
用語「ヘミ−メチル化」又は「ヘミメチル化」は、１つだけの鎖がメチル化している二本鎖ＤＮＡのメチル化状態を表す。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「ＡＵＣ」は、曲線下面積の略語である。特に、ＡＵＣは、受信者動作特性（Receiver Operating Characteristic）（ＲＯＣ）曲線下面積を表す。ＲＯＣ曲線は、診断検査の異なり得る切点に関する、偽陽性率に対する真陽性率のプロットである。このプロットは、選択された切点に応じた感度と特異度との間のトレードオフを示す（任意の感度増大は、特異度の減少を伴う）。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）は、診断検査の正確性の評価基準である（面積が大きければ大きいほど良好であり、最適値は１であり、無作為検査は、面積が０．５の傾きに基づくＲＯＣ曲線を有する；J.P. Egan. Signal Detection Theory and ROC Analysis, Academic Press,New York, 1975を参照されたい）。
【００３９】
用語「高メチル化」は、正常な対照ＤＮＡサンプル内の対応するＣｐＧジヌクレオチドで見出される５−ｍＣｙｔの量に対する、検査ＤＮＡサンプルのＤＮＡ配列内の１つ又は複数のＣｐＧジヌクレオチドでの５−ｍＣｙｔの存在の増大に対応する平均メチル化状態を表す。
【００４０】
用語「低メチル化」は、正常な対照ＤＮＡサンプル内の対応するＣｐＧジヌクレオチドで見出される５−ｍＣｙｔの量に対する、検査ＤＮＡサンプルのＤＮＡ配列内の１つ又は複数のＣｐＧジヌクレオチドでの５−ｍＣｙｔの存在の低減に対応する平均メチル化状態を表す。
【００４１】
用語「マイクロアレイ」は、当該技術分野で認識されるように、広く「ＤＮＡマイクロアレイ」と「ＤＮＡチップ（複数可）」の両方を表し、当該技術分野で認識される固体支持体を全て包含し、またその固体支持体に核酸分子を付加する方法、又はその固体支持体上で核酸を合成する方法を全て包含する。
【００４２】
「遺伝的パラメータ」は、その調節にさらに必要となる遺伝子及び配列の突然変異及び多型である。突然変異と規定されるものは、特に挿入、欠失、点突然変異、反転及び多型、特に好ましくは一塩基変異多型（ＳＮＰ）である。
【００４３】
「エピジェネティックパラメータ」は特に、シトシンのメチル化である。しかし、さらなるエピジェネティックパラメータには、例えば記載の方法を使用して直接解析することはできないが、同様にＤＮＡメチル化と相関するヒストンのアセチル化が含まれる。
【００４４】
用語「重亜硫酸試薬」は、本明細書に開示されるようにメチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列と非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列とを識別するのに有用である、重亜硫酸塩、二亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、又はこれらの組合せを含む試薬を表す。
【００４５】
用語「メチル化アッセイ」は、ＤＮＡの配列内の１つ又は複数のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態を決定する任意のアッセイを表す。
【００４６】
用語「ＭＳ．ＡＰ−ＰＣＲ」（メチル化感受性任意プライムポリメラーゼ連鎖反応（Methylation-Sensitive Arbitrarily-Primed Polymerase Chain Reaction））は、ＣｐＧジヌクレオチドを含有する可能性が最も高く、且つGonzalgo et al., Cancer Research 57:594-599, 1997で記載された領域に焦点を当てるのに高ＣＧプライマーを使用して、ゲノムの広域精査を可能にする当該技術分野で認識される技術を表す。
【００４７】
用語「ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）」は、Eads et al., Cancer Res. 59:2302-2306, 1999で記載された当該技術分野で認識される蛍光ベースのリアルタイムＰＣＲ法を表す。
【００４８】
本明細書で実施される、その実施の形態における用語「ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）」アッセイは、増幅プライマー間のＣｐＧ位置をカバーする、又は増幅プライマーによってカバーされる、メチル化特異的な遮断プローブ（本明細書でブロッカー（blocker）とも称される）によって、核酸サンプルのメチル化特異的な選択増幅が可能になるアッセイを表す。
【００４９】
本明細書で実施される、その実施の形態における用語「ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）」アッセイは、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイを、増幅プライマー間のＣｐＧ位置をカバーするメチル化特異的な遮断プローブと組合せたＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイの変法である、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイを表す。
【００５０】
用語「Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ」（メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長）は、Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997で記載された当該技術分野で認識されるアッセイを表す。
【００５１】
用語「ＭＳＰ」（メチル化特異的ＰＣＲ）は、Herman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996及び米国特許第５,７８６,１４６号明細書で記載された当該技術分野で認識されるメチル化アッセイを表す。
【００５２】
用語「ＣＯＢＲＡ」（複合重亜硫酸制限解析）は、Xiong & Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997で記載された当該技術分野で認識されるメチル化アッセイを表す。
【００５３】
用語「ＭＣＡ」（メチル化ＣｐＧアイランド増幅）は、Toyota et al., Cancer Res. 59:2307-12, 1999、及び国際公開第００／２６４０１号で記載されたメチル化アッセイを表す。
【００５４】
用語「ハイブリダイゼーション（hybridisation）」は、オリゴヌクレオチドと、二本鎖構造を形成するサンプルＤＮＡにおいて一連のワトソン−クリック塩基対合に沿った相補的な配列との結合と理解される。
【００５５】
本明細書で規定される場合、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、５×ＳＳＣ／５×デンハート溶液／１．０％ＳＤＳ中、６８℃でハイブリダイズすること、及び０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、室温で洗浄することを伴うか、又は当該技術分野で認識されるその等価物（例えば、２．５×ＳＳＣバッファー中、６０℃でハイブリダイゼーションを行った後に、低いバッファー濃度における３７℃での幾つかの洗浄工程を行い、安定状態を保つ条件）を伴う。本明細書で規定される場合、適度にストリンジェントな条件は、３×ＳＳＣ中、４２℃での洗浄、又は当該技術分野で認識されるその等価物を含むことを伴う。塩濃度及び温度のパラメータを変更し、プローブと標的核酸との間に最適な同一性レベルを達成することができる。このような条件に関するガイダンスが、例えばSambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ColdSpring Harbor Press, N.Y.、及びAusubel et al.（eds.）, 1995, Current Protocols in MolecularBiology,（John Wiley & Sons, N.Y.）at Unit 2.10によって当該技術分野で利用可能である。
【００５６】
用語「メチル化特異的制限酵素」又は「メチル化感受性制限酵素」は、その認識部位のメチル化状態によって選択的に核酸を消化する酵素を意味するものとする。認識部位がメチル化又はヘミメチル化されていないと特異的に切断するこのような制限酵素の場合、切断が起こらないか、又は認識部位がメチル化されると効率は大幅に低減する。認識部位がメチル化されると特異的に切断するこのような制限酵素の場合、切断が起こらないか、又は認識部位がメチル化されていないと効率が大幅に低減する。メチル化特異的制限酵素が好ましく、その認識配列は、ＣＧジヌクレオチド（例えばｃｇｃｇ又はｃｃｃｇｇｇ）を含有する。シトシンがこのジヌクレオチドにおいて炭素原子Ｃ５でメチル化されている場合、切断しない制限酵素が幾つかの実施の形態でさらに好ましい。
【００５７】
「非メチル化特異的制限酵素」又は「非メチル化感受性制限酵素」は、効率がほぼ同一であるメチル化状態に関係なく核酸配列を切断する制限酵素である。これらは、「メチル化非特異的制限酵素」とも呼ばれる。
【００５８】
複合アレイ配列に関して、語句「連続したヌクレオチド」は、複合アレイの任意の個々の連続した配列の連続した配列領域を表すが、本明細書中の上記で規定されるように、「ノード」を含む複合アレイ配列領域は含まれない。
【００５９】
用語「ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉ」は、その全ての転写変異型と、その全てのプロモータ及び調節要素とを含むものとする。さらに、複数のＳＮＰが当該遺伝子内で知られているので、この用語は、その全ての配列変異型を含むものとする。
【００６０】
概略：
本発明は、被験者において癌を検出する方法であって、当該被験者から単離した生体サンプルにおいて、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現レベルを決定することを含み、低発現及び／又はＣｐＧメチル化が当該障害の存在又はクラスの指標となる、被験者において癌を検出する方法を提供する。上記マーカーは、前癌疾患状態中の早期検出を含む前立腺癌の診断に使用し得る。本発明のマーカーは、前立腺癌等の悪性の前立腺細胞増殖性障害を検出し、それにより当該障害の早期検出、分類及び治療に対する改善手段を与えるのに特に有効である。
【００６１】
ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化解析を行う上記の実施の形態に加えて、本発明は、細胞増殖性障害、特に前立腺癌の検出に新規の有用性がある、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子を含むさらなる遺伝子パネルを提示する。好ましくは複数の遺伝子（本明細書中で「遺伝子パネル」とも称される）を解析する。好ましくは２つ、３つ又は４つの遺伝子を解析する。この方法の一実施の形態では、当該パネルは、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子、及び／又はそのプロモータ又は調節領域を含む。好ましくは、当該群はＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ遺伝子を含む。
【００６２】
以下の遺伝子の組合せが特に好ましい：
ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ＋ＲＡＳＳＦ
ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ＋ＧＳＴＰｉ。
【００６３】
ＤＮＡの重亜硫酸修飾は、ＣｐＧメチル化状況を評価するのに使用される当該技術分野で認識されるツールである。５−メチルシトシンは、真核細胞のＤＮＡにおける最も高頻度な共有結合的な塩基修飾である。５−メチルシトシンは、例えば転写調節、遺伝子刷り込み（imprinting）、及び腫瘍形成に関与する。したがって、遺伝子情報の構成要素としての５−メチルシトシンの同定は非常に興味深い。しかし、５−メチルシトシンがシトシンと同じ塩基対合挙動をするので、シーケンシングでは５−メチルシトシンの位置を同定することはできない。さらに、５−メチルシトシンが保持するエピジェネティック情報は、例えばＰＣＲ増幅中に完全に失われる。
【００６４】
５−メチルシトシンの存在に関してＤＮＡを解析する最も頻繁に使用される方法は、重亜硫酸塩とシトシンとの特異的反応に基づき、その後のアルカリ加水分解の際に、シトシンは、塩基対合挙動においてチミンに対応するウラシルに変換される。しかし重要なことに、５−メチルシトシンは、これらの条件下で非修飾のままである。結果として、ここでは標準的な当該技術分野で認識される分子生物学的技法を使用して（例えば増幅及びハイブリダイゼーション、又はシークエンシングによって）、そのままではハイブリダイゼーション挙動ではシトシンと区別することができないメチルシトシンを、残存シトシンとしてのみ検出することができるように、元のＤＮＡを変換する。全てのこれらの技法は、異なる塩基対合性に基づいており、ここで十分に利用することができる。
【００６５】
感度に関して、従来技術は、アガロースマトリクスで解析するＤＮＡを内包すること、それによりＤＮＡの拡散及び再生を防ぐこと（重亜硫酸塩のみが一本鎖ＤＮＡと反応する）、及び全ての析出工程と精製工程とを迅速透析に置き換えることを含む方法によって規定される（Olek A, et al., A modified and improved method for bisulfite basedcytosine methylation analysis, Nucleic Acids Res. 24:5064-6, 1996）。このようにして、メチル化状況に関して個々の細胞を解析することが可能になり、方法の有用性及び感度が示される。当該技術分野で認識される５−メチルシトシンを検出する方法の概略は、Rein, T., et al., Nucleic Acids Res., 26:2255, 1998で与えられる。
【００６６】
幾つかの例外を除いて（例えばZeschnigk M, et al., Eur J Hum Genet. 5:94-98, 1997）、重亜硫酸技法は、現在研究においてのみ使用されている。全ての場合で、重亜硫酸処理後に、既知の遺伝子の短く特異的な断片を増幅し、完全にシークエンシングして（Olek & Walter, Nat Genet. 1997 17:275-6, 1997）、１つ又は複数のプライマー伸長反応を行い（Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res., 25:2529-31, 1997、国際公開第９５／００６６９号、米国特許第６，２５１，５９４号明細書）、個々のシトシン位置を解析するか、又は酵素消化によって処理する（Xiong & Laird, Nucleic Acids Res., 25:2532-4, 1997）。ハイブリダイゼーションによる検出も、当該技術分野で記載されている（Olek et al.,国際公開第９９／２８４９８号）。さらに、個々の遺伝子に対するメチル化検出のための重亜硫酸技法の使用が記載されている（Grigg & Clark, Bioessays, 16:431-6, 1994、Zeschnigk M, et al., Hum Mol Genet., 6:387-95, 1997、Feil R, et al., Nucleic Acids Res., 22:695-, 1994、Martin V, et al., Gene, 157:261-4, 1995、国際公開第９７４６７０５号及び国際公開第９５１５３７３号）。
【００６７】
本発明は、配列番号１〜配列番号４内のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状況を決定するための１つ又は複数のメチル化アッセイと組合せた重亜硫酸技法の使用を提供する。ゲノムＣｐＧジヌクレオチドをメチル化又は非メチル化（代替的には、それぞれ上方メチル化及び下方メチル化として知られている）することができる。しかし、本発明の方法は、不均一性を有する生体サンプル（例えば血液又は精液のバックグラウンド内の低濃度の腫瘍細胞）の解析に好適である。したがって、このようなサンプル内のＣｐＧ位置のメチル化状況を解析する際、当業者は、メチル化状態に対して特定のＣｐＧ位置のメチル化のレベル（例えばパーセント、分数、比、割合又は程度）を決定するのに定量的アッセイを使用してもよい。したがって、用語「メチル化状況」又は「メチル化状態」は、ＣｐＧ位置のメチル化度を反映する値も意味するものとする。特に記述がない限り、用語「高メチル化」又は「上方メチル化」は、特定のカットオフ点のメチル化レベルを超えるメチル化レベルを意味するものとし、当該カットオフは、所定の集団に対する平均若しくは中央値のメチル化レベルを表す値であり得るか、又は最適化されたカットオフレベルであるのが好ましい。「カットオフ」は、本明細書で「閾値」とも称される。本発明に関して、用語「メチル化」、「高メチル化」又は「上方メチル化」は、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉ遺伝子内、及び（例えばプロモータ又は調節領域において）この遺伝子に関連する全てのＣｐＧ位置に対して、カットオフを超えるメチル化レベルが、０％（又はそれと同等の）メチル化であることを含むものとする。
【００６８】
好ましくは複数の遺伝子（本明細書中で「遺伝子パネル」とも称される）を解析する。好ましくは２つ、３つ又は４つの遺伝子を解析する。この方法の一実施の形態では、当該パネルは、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子、及び／又はそのプロモータ又は調節領域を含む。好ましくは、当該群はＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ遺伝子を含む。
【００６９】
以下の遺伝子の組合せが特に好ましい：
ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ＋ＲＡＳＳＦ
ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ＋ＧＳＴＰｉ。
【００７０】
本発明によれば、配列番号１〜配列番号４内のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状況の決定は、前立腺癌の診断に有用である。
【００７１】
メチル化アッセイ法。  様々なメチル化アッセイ法が当該技術分野で既知であり、本発明と併せて使用することができる。これらのアッセイによって、ＤＮＡ配列内の１つ又は複数のＣｐＧジヌクレオチド（例えばＣｐＧアイランド）のメチル化状態の決定が可能になる。このようなアッセイは、数ある技法の中でも重亜硫酸処理ＤＮＡのＤＮＡシークエンシング、（配列特異的な増幅のための）ＰＣＲ、サザンブロット解析、及びメチル化感受性制限酵素の使用を伴う。
【００７２】
例えば、重亜硫酸処理を利用することによって、ＤＮＡメチル化パターンの解析及び５−メチルシトシン分布のためのゲノムシークエンシングを単純化している（Frommer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831, 1992）。さらに、重亜硫酸変換されたＤＮＡから増幅したＰＣＲ産物の制限酵素消化、例えばSadri & Hornsby（Nucl. Acids Res.24:5058-5059, 1996）に記載されている方法、又は複合重亜硫酸制限解析（ＣＯＢＲＡ）（Xiong& Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997）を利用する。
【００７３】
ＣＯＢＲＡ。  ＣＯＢＲＡ（商標）解析は、少量のゲノムＤＮＡで特定遺伝子座のＤＮＡメチル化レベルを決定するのに有用である定量的メチル化アッセイである（Xiong & Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997）。要するに、制限酵素消化を利用して、重亜硫酸ナトリウム処理したＤＮＡのＰＣＲ産物においてメチル化依存的配列差異を明らかにする。初めに、Frommer et al.（Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:1827-1831, 1992）で記載された手法に従った標準的な重亜硫酸処理によって、ゲノムＤＮＡにメチル化依存的配列差異を導入する。それから、対象となるＣｐＧアイランドに特異的なプライマーを使用して、重亜硫酸変換したＤＮＡのＰＣＲ増幅を行った後、制限エンドヌクレアーゼ消化、ゲル電気泳動、及び特異的な標識ハイブリダイゼーションプローブを使用した検出を行う。元のＤＮＡサンプルのメチル化レベルは、広範なＤＮＡメチル化レベルにわたって一次定量的に、消化及び非消化ＰＣＲ産物の相対量で表す。また、この技法は確実に、顕微解剖したパラフィン包埋組織サンプルから得られたＤＮＡに適用することができる。
【００７４】
ＣＯＢＲＡ（商標）解析に典型的な試薬（例えば典型的なＣＯＢＲＡ（商標）ベースキットで見出され得るような）には、これらに限定されないが、特定遺伝子（又は重亜硫酸処理ＤＮＡ配列若しくはＣｐＧアイランド）に関するＰＣＲプライマー、制限酵素及び適切なバッファー、遺伝子ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチド、対照ハイブリダイゼーションオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドプローブのためのキナーゼ標識キット、及び標識ヌクレオチドが含まれ得る。また、重亜硫酸変換試薬には、ＤＮＡ変性バッファー、スルホン化バッファー、ＤＮＡ回収試薬又はキット（例えば析出カラム、限外濾過カラム、アフィニティカラム）、脱スルホン化バッファー、及びＤＮＡ回収成分が含まれ得る。
【００７５】
好ましくは、「ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）」等のアッセイ（蛍光ベースのリアルタイムＰＣＲ法）(Eads et al., Cancer Res. 59:2302-2306, 1999）、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ（商標）（メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長）反応（Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997）、メチル化特異的ＰＣＲ（「ＭＳＰ」、Herman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996、米国特許第５，７８６，１４６号明細書）、及びメチル化ＣｐＧアイランド増幅（「ＭＣＡ」、Toyota et al., Cancer Res. 59:2307-12, 1999）を、単独で又は他のこれらの方法と組合せて使用する。
【００７６】
「ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）」アッセイ法は、重亜硫酸処理ＤＮＡのメチル化特異的増幅に基づき、メチル化の差異を評価する定量的方法である。増幅プライマー間のＣｐＧ位置をカバーする、又は増幅プライマーによってカバーされる、メチル化特異的な遮断プローブ（本明細書でブロッカーとも称される）によって、核酸サンプルのメチル化特異的な選択増幅が可能になる。
【００７７】
本明細書で実施される、その実施の形態における用語「ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）」アッセイは、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイを、増幅プライマー間のＣｐＧ位置をカバーするメチル化特異的な遮断プローブと組合せたＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイの変法である、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイを表す。ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）アッセイは、メチル化特異的な増幅プライマーと組合せて使用することもできる。
【００７８】
ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）解析に典型的な試薬（例えば典型的なＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）ベースキットで見出され得るような）には、これらに限定されないが、特定遺伝子（又は重亜硫酸処理ＤＮＡ配列若しくはＣｐＧアイランド）に関するＰＣＲプライマー、遮断オリゴヌクレオチド、最適化したＰＣＲバッファー及びデオキシヌクレオチド、並びにＴａｑポリメラーゼが含まれ得る。
【００７９】
ＭＳＰ。  ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）によって、メチル化感受性制限酵素の使用と関係なく、ＣｐＧアイランド内の実質的に任意の群のＣｐＧ部位のメチル化状況の評価が可能になる（Herman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996、米国特許第５，７８６，１４６号明細書）。要するに、メチル化シトシンではなく、全ての非メチル化シトシンをウラシルに変換する重亜硫酸ナトリウムによってＤＮＡを修飾し、その後、非メチル化ＤＮＡに対してメチル化ＤＮＡに特異的なプライマーで増幅する。ごく少量のＤＮＡしか必要としないＭＳＰは、所定のＣｐＧアイランド座の０．１％メチル化対立遺伝子に感受性であり、パラフィン包埋サンプルから抽出したＤＮＡで行うことができる。ＭＳＰ解析に典型的な試薬（例えば典型的なＭＳＰベースキットで見出され得るような）には、これらに限定されないが、特定遺伝子（又は重亜硫酸処理ＤＮＡ配列若しくはＣｐＧアイランド）に関するメチル化ＰＣＲプライマー及び非メチル化ＰＣＲプライマー、最適化したＰＣＲバッファー及びデオキシヌクレオチド、並びに特異的プローブが含まれ得る。
【００８０】
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）。  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイは、ＰＣＲ工程後にさらに操作を必要としない蛍光ベースのリアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ（登録商標））法を利用するハイスループット定量的メチル化アッセイである（Eadset al., Cancer Res. 59:2302-2306, 1999）。要するに、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）プロセスはゲノムＤＮＡの混合サンプルから始め、これは、標準的な手法に従って、重亜硫酸ナトリウム反応中にメチル化依存的な配列差異がある混合プールに変換される（重亜硫酸プロセスによって、非メチル化シトシン残基がウラシルに変換される）。それから、蛍光ベースのＰＣＲを「偏向（biased：バイアス）」（既知のＣｐＧジヌクレオチドと重複するＰＣＲプライマーによる）反応中に行う。配列識別（discrimination）は、増幅プロセスのレベルと蛍光検出プロセスのレベルとの両方で行うことができる。
【００８１】
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイは、ゲノムＤＮＡサンプルにおけるメチル化パターンに関する定量的検査として使用してもよく、配列識別はプローブハイブリダイゼーションのレベルで起こる。この定量的なバージョンでは、ＰＣＲ反応によって、特定の推定メチル化部位と重複する蛍光プローブの存在下でメチル化特異的な増幅が与えられる。プライマーもプローブも全くＣｐＧジヌクレオチドに重ならない反応によって、ＤＮＡの導入量に対する不偏制御が与えられる。代替的に、既知のメチル化部位を「カバー」しない対照オリゴヌクレオチド（ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）法及びＭＳＰ法の蛍光ベースのバージョン）、又は潜在的なメチル化部位をカバーするオリゴヌクレオチドのいずれかで偏向ＰＣＲプールをプローブ化することによって、ゲノムメチル化に関する定性的検査を行う。
【００８２】
例えば「ＴａｑＭａｎ（登録商標）」、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）等の任意の好適なプローブを使用することによって、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）プロセスを行うことができる。例えば、二本鎖ゲノムＤＮＡを重亜硫酸ナトリウムで処理し、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを使用して、例えばＭＳＰプライマー及び／又はＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌブロッカーオリゴヌクレオチド及びＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブで、２組のＰＣＲ反応の１つを行う。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、蛍光「レポータ」及び「消光（quencher：クエンサ）」分子で二重標識し、このプローブは、フォワードプライマー又はリバースプライマーよりも約１０℃高い温度でＰＣＲサイクル中に溶融するように、比較的ＧＣ含量が高い領域に特異的になるように設計する。これによって、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブをＰＣＲアニーリング／伸長工程中、十分なハイブリダイズ状態に維持することが可能になる。Ｔａｑポリメラーゼが、ＰＣＲ中に新規の鎖を酵素的に合成するので、最終的には、アニーリングしたＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに達する。それから、Ｔａｑポリメラーゼ５’→３’エンドヌクレアーゼ活性によって、リアルタイム蛍光検出システムを使用して、現時点で消光していないシグナルを定量的に検出するために、蛍光レポータ分子を放出するように消化することによって、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが置き換わる。
【００８３】
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）解析に典型的な試薬（例えば典型的なＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）ベースキットで見出され得るような）には、これらに限定されないが、特定遺伝子（又は重亜硫酸処理ＤＮＡ配列若しくはＣｐＧアイランド）に関するＰＣＲプライマー、ＴａｑＭａｎ（登録商標）又はＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）プローブ、最適化したＰＣＲバッファー及びデオキシヌクレオチド、並びにＴａｑポリメラーゼが含まれ得る。
【００８４】
ＱＭ（商標）（定量的メチル化）アッセイは、ゲノムＤＮＡサンプルにおけるメチル化パターンに関する代替的な定量的検査であり、配列識別はプローブハイブリダイゼーションのレベルで起こる。この定量的なバージョンでは、ＰＣＲ反応によって、特定の推定メチル化部位と重複する蛍光プローブの存在下で不偏増幅が与えられる。プライマーもプローブも全くＣｐＧジヌクレオチドに重ならない反応によって、ＤＮＡの導入量に対する不偏制御が与えられる。代替的に、既知のメチル化部位を「カバー」しない対照オリゴヌクレオチド（ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）法及びＭＳＰ法の蛍光ベースのバージョン）、又は潜在的なメチル化部位をカバーするオリゴヌクレオチドのいずれかで偏向ＰＣＲプールをプローブ化することによって、ゲノムメチル化に関する定性的検査を行う。
【００８５】
増幅プロセスにおいて例えば「ＴａｑＭａｎ（登録商標）」、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）等の任意の好適なプローブを使用することによって、ＱＭ（商標）プロセスを行うことができる。例えば、二本鎖ゲノムＤＮＡを重亜硫酸ナトリウムで処理し、不偏プライマー及びＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに曝す。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、蛍光「レポータ」及び「消光」分子で二重標識し、このプローブは、フォワードプライマー又はリバースプライマーよりも約１０℃高い温度でＰＣＲサイクル中に溶融するように、比較的ＧＣ含量が高い領域に特異的になるように設計する。これによって、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブをＰＣＲアニーリング／伸長工程中、十分なハイブリダイズ状態に維持することが可能になる。Ｔａｑポリメラーゼが、ＰＣＲ中に新規の鎖を酵素的に合成するので、最終的には、アニーリングしたＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブに達する。それから、Ｔａｑポリメラーゼ５’→３’エンドヌクレアーゼ活性によって、リアルタイム蛍光検出システムを使用して、現時点で消光していないシグナルを定量的に検出するために、蛍光レポータ分子を放出するように消化することによって、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブが置き換わる。
【００８６】
ＱＭ（商標）解析に典型的な試薬（例えば典型的なＱＭ（商標）ベースキットで見出され得るような）には、これらに限定されないが、特定遺伝子（又は重亜硫酸処理ＤＮＡ配列若しくはＣｐＧアイランド）に関するＰＣＲプライマー、ＴａｑＭａｎ（登録商標）又はＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）プローブ、最適化したＰＣＲバッファー及びデオキシヌクレオチド、並びにＴａｑポリメラーゼが含まれ得る。
【００８７】
Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ。  Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ（商標）法は、ＤＮＡの重亜硫酸処理に基づき、特定のＣｐＧ部位でのメチル化差異を評価した後に、単一ヌクレオチドプライマー伸長を行う、定量的方法である（Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997）。要するに、ゲノムＤＮＡを重亜硫酸ナトリウムと反応させ、非メチル化シトシンをウラシルに変換させるが、５−メチルシトシンは変わらない。それから、重亜硫酸変換したＤＮＡに特異的なＰＣＲプライマーを使用して、所望の標的配列の増幅を行い、得られた産物を、対象となるＣｐＧ部位（複数可）のメチル化解析のための鋳型として単離及び使用する。少量のＤＮＡ（例えば顕微解剖した病理切片）を解析することができ、ＣｐＧ部位のメチル化状態を決定するのに、制限酵素の利用を回避する。
【００８８】
Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ（商標）解析に典型的な試薬（例えば典型的なＭｓ−ＳＮｕＰＥ（商標）ベースキットで見出され得るような）には、これらに限定されないが、特定遺伝子（又は重亜硫酸処理ＤＮＡ配列若しくはＣｐＧアイランド）に関するＰＣＲプライマー、最適化したＰＣＲバッファー及びデオキシヌクレオチド、ゲル抽出キット、陽性対照プライマー、特定遺伝子に対するＭｓ−ＳＮｕＰＥ（商標）プライマー、（Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ反応のための）反応バッファー並びに標識ヌクレオチドが含まれ得る。さらに、重亜硫酸変換試薬には、ＤＮＡ変性バッファー、スルホン化バッファー、ＤＮＡ回収試薬又はキット（例えば析出カラム、限外濾過カラム、アフィニティカラム）、脱スルホン化バッファー、及びＤＮＡ回収成分が含まれ得る。
【００８９】
配列番号１〜配列番号４のゲノム配列、及び配列番号５〜配列番号２０のその非天然処理変異型は、細胞増殖性障害、特に前立腺癌の早期検出、分類及び／又は治療に新規の有用性があると決定された
一実施の形態において、本発明の方法は、Ａ）被験者から得られた（好ましくは体液から単離した）ゲノムＤＮＡ細胞を、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉ（プロモータ及び調節領域を含む）から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子内のメチル化ＣｐＧジヌクレオチドと非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドとを識別する、少なくとも１つの試薬又は試薬群に接触させる工程と、Ｂ）前立腺細胞増殖性障害、最も好ましくは前立腺癌を検出する工程とを含む。
【００９０】
好ましくは複数の遺伝子（本明細書中で「遺伝子パネル」とも称される）を解析する。好ましくは２つ、３つ又は４つの遺伝子を解析する。この方法の一実施の形態では、当該パネルは、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子、及び／又はそのプロモータ又は調節領域を含む。好ましくは、当該群はＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ遺伝子を含む。
【００９１】
以下の遺伝子の組合せが特に好ましい：
ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ＋ＲＡＳＳＦ
ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ＋ＧＳＴＰｉ。
【００９２】
ゲノムＤＮＡは、市販のキットの使用を含む、当該技術分野で標準的な任意の手段によって単離してもよい。要するに、対象となるＤＮＡが、細胞膜によってその中に封入され、生体サンプルは、酵素的手段、化学的手段又は機械的手段によって破壊及び溶解する必要がある。それから、例えばプロテイナーゼＫによる消化で、ＤＮＡ溶液からタンパク質及び他の汚染物質を除去してもよい。その後、溶液からゲノムＤＮＡを回収する。塩析、有機抽出、又はＤＮＡと固相支持体との結合を含む様々な方法によって、これを行ってもよい。方法の選択は、時間、費用、要求されるＤＮＡ量を含む幾つかの因子の影響を受ける。腫瘍性物質又は前腫瘍性物質を含む全ての種類の臨床サンプルが、本発明の方法での使用に好適であり、好ましくは細胞株、組織断片、生検、パラフィン包埋組織、体液、射精液、尿、血漿、血清、全血、単離血球、血液から単離した細胞及びこれらの組合せである。体液は、好ましいＤＮＡ源であり、射精液、血漿、血清、全血、単離血球、血液から単離した細胞が特に好ましい。
【００９３】
それから、ゲノムＤＮＡサンプルを、ゲノムＤＮＡの少なくとも１つ及びより好ましくは複数の標的領域（複数可）内のメチル化ＣｐＧジヌクレオチドと非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドとを識別する、少なくとも１つの試薬又は試薬群で処理し、各標的領域はそれぞれ、配列番号１〜配列番号４から成る群から選択される少なくとも１つの配列の少なくとも１６個、５０個、１００個又は５００個の連続したヌクレオチドの配列を含むか、又はストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズし、当該連続したヌクレオチドは少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む。
【００９４】
上記試薬が、５’位非メチル化シトシン塩基を、ウラシル、チミン、又はハイブリダイゼーション挙動に関してシトシンと異なる別の塩基に変換するのが特に好ましい。しかし、代替的な実施の形態では、当該試薬は、メチル化感受性制限酵素であってもよい。
【００９５】
５’位で非メチル化シトシン塩基を、ウラシル、チミン、又はハイブリダイゼーション挙動に関してシトシンと異なる別の塩基に変換するように、ゲノムＤＮＡサンプルを処理する。この処理を重亜硫酸塩（亜硫酸水素塩、二亜硫酸塩）で行い、その後アルカリ加水分解するのが好ましい。このような処理によって、配列番号１〜配列番号４が、配列番号５〜配列番号１２（当該ＣｐＧジヌクレオチドはメチル化されている）（表１を参照されたい）、又は配列番号１３〜配列番号２０（当該ＣｐＧジヌクレオチドはメチル化されていない）に変換される。
【００９６】
それから、処理前に、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化状態を決定するために、処理ＤＮＡを解析する。
【００９７】
好ましくは複数の遺伝子（本明細書中で「遺伝子パネル」とも称される）を解析する。好ましくは２つ、３つ又は４つの遺伝子を解析する。この方法の一実施の形態では、当該パネルは、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子、及び／又はそのプロモータ又は調節領域を含む。好ましくは、当該群はＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ遺伝子を含む。
【００９８】
以下の遺伝子の組合せが特に好ましい：
ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ＋ＲＡＳＳＦ
ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ＋ＧＳＴＰｉ。
【００９９】
各標的領域は、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される遺伝子の少なくとも１６個、５０個、１００個又は５００個の連続したヌクレオチドを含むか、又はストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズするのが特に好ましい。表１及び添付の配列表で与えられるように、配列番号１〜配列番号４の上記遺伝子配列を解析するのが好ましい。解析方法は、本明細書に列挙されるものを含む当該技術分野で既知の方法から選択され得る。本明細書に記載されるように、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）、ＭＳＰ及び遮断オリゴヌクレオチド（ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標））の使用が特に好ましい。このような解析に使用する任意のオリゴヌクレオチド（プライマー、遮断オリゴヌクレチド及び検出プローブを含む）は、１つ又は複数の配列番号５〜配列番号２０の塩基配列及びこれに相補的な配列の少なくとも１６塩基対長のセグメントと、逆相補的であるか、同一であるか、又はストリンジェントな条件若しくは高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【０１００】
異常なメチル化、より具体的にはＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉ（並びにそのプロモータ及び／又は調節領域）の高メチル化は、前立腺細胞増殖性障害、特に前立腺癌の存在に関連する。したがって生体サンプルは、任意のメチル化度内にあり、当該サンプルは、細胞増殖性障害、特に癌であると決定される。
【０１０１】
当該方法は、これから転写されたＲＮＡ、又は当該ＲＮＡから翻訳されたポリペプチド若しくはタンパク質の任意の発現解析によって、好ましくはｍＲＮＡ発現解析又はポリペプチド発現解析によって可能になり得る。したがって本発明は、被験者においてＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の発現を検出するため、及びこれから当該被験者において前立腺細胞増殖性障害、最も好ましくは前立腺癌の有無を決定するために定量的且つ定性的な診断アッセイ及び方法も提供する。
【０１０２】
ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子から転写されたｍＲＮＡの異常な発現は、被験者における前立腺細胞増殖性障害、特に前立腺癌の存在に関連する。本発明によれば、低発現（及び／又はメチル化の存在）は、癌の存在に関連し、逆に過剰発現（及び／又はメチル化の非存在）は、癌の非存在に関連する。
【０１０３】
好ましくは複数の遺伝子（本明細書中で「遺伝子パネル」とも称される）のｍＲＮＡ発現を解析する。好ましくは２つ、３つ又は４つの遺伝子を解析する。この方法の一実施の形態では、当該パネルは、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子、及び／又はそのプロモータ又は調節領域を含む。好ましくは、当該群はＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ遺伝子を含む。
【０１０４】
以下の遺伝子の組合せが特に好ましい：
ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ＋ＲＡＳＳＦ
ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ＋ＧＳＴＰｉ。
【０１０５】
遺伝子又はゲノム配列をコードするｍＲＮＡの存在を検出するために、患者からサンプルを得る。サンプルは、腫瘍の細胞性物質を含む任意の好適なサンプルであり得る。好適なサンプルの種類としては、細胞株、組織断片、生検、パラフィン包埋組織、体液、射精液、尿、血漿、血清、全血、単離血球、血液から単離した細胞及びこれらの可能な全ての組合せが挙げられる。当該サンプルの種類は、射精液、尿、血漿、血清、全血、単離血球、血液から単離した細胞から成る群から選択される射精液又は体液であるのが好ましい。
【０１０６】
サンプルを処理して、そこに含有されるＲＮＡを抽出することができる。それから、サンプルから得られる核酸を解析する。遺伝子発現の絶対レベル及び相対レベルを決定する多くの技法が最先端技術で知られており、本発明に使用するのに適した一般的に使用される技法としては、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（例えばＦＩＳＨ）、ノーザン解析、ＲＮａｓｅ保護アッセイ（ＲＰＡ）、マイクロアレイ及びＰＣＲベースの技法（定量的ＰＣＲ及び示差表示ＰＣＲ又は任意の他の核酸検出法等）が挙げられる。
【０１０７】
逆転写／ポリメラーゼ連鎖反応法（ＲＴ−ＰＣＲ）の使用が特に好ましい。ＲＴ−ＰＣＲの方法は当該技術分野で既知である（例えば、Watson and Fleming（上記）を参照されたい）。
【０１０８】
ＲＴ−ＰＣＲ法は、以下のように行うことができる。例えば標準的なイソチオシアネートグアニジウム法によって総細胞ＲＮＡを単離し、総ＲＮＡを逆転写する。逆転写法は、逆転写酵素及び３’末端オリゴヌクレオチドｄＴプライマー及び／又はランダム六量体プライマーを使用したＲＮＡ鋳型上でのＤＮＡ合成を伴う。それから、このようにして産生したｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅する（Belyavsky et al, Nucl Acid Res 17:2919-2932, 1989、Krug and Berger, Methods in Enzymology, Academic Press, N.Y., Vol.152,pp. 316-325, 1987、参照により援用される）。ＰＣＲ産物をハイブリダイゼーションプローブ（例えばＴａｑＭａｎ、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ及びＳｃｏｒｐｉｏｎ）又はＳＹＢＲグリーンで検出する、ＲＴ−ＰＣＲの「リアルタイム」変法がさらに好ましい。それから、検量線を参照するか、又はＣｔ値と較正基準の値とを比較することによって、プローブ又はＳＹＢＲグリーンから検出されるシグナルを定量化する。結果を正規化するのには、ハウスキーピング遺伝子解析が使用されることが多い。
【０１０９】
ノーザンブロット解析において、総ｍＲＮＡ又はポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡを変性アガロースゲル上に泳動し、乾燥ゲル自体における又は膜上の標識プローブに対するハイブリダイゼーションによって検出する。得られたシグナルは、ＲＮＡ集団において標的ＲＮＡの量に比例する。
【０１１０】
２つ以上の細胞集団又は組織からのシグナルを比較することによって、遺伝子発現レベルの相対的差異が明らかになる。シグナルと、標的ＲＮＡに対応する既知の量のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写産物を使用して作成した検量線とを比較することによって、絶対的定量化を行うことができる。発現レベルが条件に関係なく相対的に一定のままであると予測される遺伝子である、ハウスキーピング遺伝子の解析は、結果を正規化し、ＲＮＡの膜への不均衡な移動、又はゲル上のＲＮＡの不均衡な充填によって引き起こされるいかなる見掛けの差異も取り除くのに使用されることが多い。
【０１１１】
ノーザン解析の第１工程は、対象となる細胞又は組織から純粋で無傷のＲＮＡを単離することである。ノーザンブロットは、サイズによってＲＮＡを識別するので、サンプルの完全性は、シグナルが単一バンドに局在化する度合に影響を与える。部分的に分解したＲＮＡサンプルによって、シグナルが塗抹されるか、又は幾つかのバンドにわたって分散され、全体的に感度が失われ、データが誤って解釈される可能性がある。ノーザンブロット解析では、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びオリゴヌクレオチドプローブを使用することができ、これらのプローブは標識するのが好ましい（例えば放射線標識、質量標識又は蛍光標識）。プローブではない標的ＲＮＡのサイズによって、検出バンドのサイズが決定されるため、可変長のプローブを作製するランダムプライム化標識のような方法がプローブ合成に好適である。プローブの比活性によって、感度レベルが決定されるため、比活性が高いプローブを使用するのが好ましい。
【０１１２】
ＲＮａｓｅ保護アッセイにおいて、ＲＮＡ標的及び規定長のＲＮＡプローブを溶液中でハイブリサイズする。ハイブリダイゼーション後、一本鎖核酸に特異的なＲＮａｓｅでＲＮＡを消化し、任意のハイブリダイズしていない一本鎖の標的ＲＮＡ及びプローブを除去する。ＲＮａｓｅを不活性化し、例えば、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって、ＲＮＡを分離する。無傷のＲＮＡプローブの量は、ＲＮＡ集団における標的ＲＮＡの量に比例する。ＲＰＡは、遺伝子発現の相対的及び絶対的定量化、並びにまたＲＮＡ構造（イントロン／エキソン境界及び転写開始部位等）のマッピングに使用することができる。ＲＮａｓｅ保護アッセイは、一般的に検出限界がより低いのでノーザンブロット解析よりも好ましい。
【０１１３】
ＲＰＡに使用するアンチセンスＲＮＡプローブは、規定の終点を有するＤＮＡ鋳型のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって作製し、典型的に５０ヌクレオチド〜６００ヌクレオチドの範囲内である。標的ＲＮＡと相同ではない付加的配列を含むＲＮＡプローブの使用によって、保護断片を完全長プローブと識別することが可能になる。一本鎖ＲＮＡプローブを作製するのが容易であり、且つＲＮａｓｅによるＲＮＡ：ＲＮＡ二本鎖消化に再現性及び信頼性があるので（Ausubel et al. 2003）、典型的にＤＮＡプローブの代わりにＲＮＡプローブを使用し、比活性が高いプローブが特に好ましい。
【０１１４】
マイクロアレイの使用が特に好ましい。マイクロアレイ解析プロセスは、２つの主要部に分けることができる。初めに、スライドガラス又は他の固体支持体上に既知の遺伝子配列を固定した後、スライドガラス（又は他の固相）上に固定した既知の遺伝子に対して、蛍光標識したｃＤＮＡ（検索する配列を含む）をハイブリダイゼーションする。ハイブリダイゼーション後、蛍光マイクロアレイスキャナを使用して、アレイを精査する。異なる遺伝子の相対的蛍光強度を解析することは、遺伝子発現の差異の評価基準を与える。
【０１１５】
調製スライドガラス又は他の固体表面上に前合成したオリゴヌクレオチドを固定化することによって、ＤＮＡアレイを作製することができる。この場合、標準的なオリゴヌクレオチド合成法及び精製法を使用して、代表的な遺伝子配列を製造及び調製する。これらの合成遺伝子配列は、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉ遺伝子のＲＮＡ転写産物（複数可）に相補的であり、２５〜７０ヌクレオチドの範囲内でより短い配列である傾向がある。代替的に固定化オリゴは、スライド表面上にｉｎ  ｓｉｔｕで化学合成することができる。ｉｎ  ｓｉｔｕオリゴヌクレオチド合成は、適切なヌクレオチドをマイクロアレイ上のスポットに逐次付加することを伴い、ヌクレオチドを受けていないスポットは、物理的マスク又は仮想マスクを使用して、各プロセス段階中で保護される。好ましくは、当該合成核酸は、ロックド（locked）核酸である。
【０１１６】
発現プロファイリングマイクロアレイの実験において、使用するＲＮＡ鋳型は、研究中の細胞又は組織の転写プロファイルの代表的なものである。初めに、比較する細胞集団又は組織からＲＮＡを単離する。それから逆転写反応を介して蛍光標識ｃＤＮＡを作製するために、各ＲＮＡサンプルを鋳型として使用する。ｃＤＮＡの蛍光標識は、直接標識法又は間接標識法のいずれかで達成することができる。直接標識中、蛍光修飾ヌクレオチド（例えばＣｙ（登録商標）３−ｄＣＴＰ又はＣｙ（登録商標）５−ｄＣＴＰ）は、逆転写中にｃＤＮＡに直接組み込む。代替的に、間接標識は、ｃＤＮＡ合成中、アミノアリル修飾ヌクレオチドを組み込み、それから逆転写反応が完了した後、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル色素と、アミノアリル修飾ｃＤＮＡとを結合することによって達成することができる。代替的に、プローブは、標識しなくてもよく、直接又は間接的に標識したリガンドとの特異的結合によって検出することもできる。リガンド（及びプローブ）を標識するのに適した標識及び方法は当該技術分野で既知であり、例えば既知の方法（例えばニックトランスレーション又はキナージング（kinasing））によって組み込まれ得る放射性標識が含まれる。他の好適な標識としては、ビオチン、蛍光基、化学発光基（例えばジオキセタン、特に誘発ジオキセタン）、酵素、抗体等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１７】
様々な遺伝子の発現解析を行うために、様々なＲＮＡサンプルから作製したｃＤＮＡをＣｙ（登録商標）３で標識する。得られた標識ｃＤＮＡを精製し、組み込まれなかったヌクレオチド、遊離色素及び残留ＲＮＡを除去する。精製後、標識ｃＤＮＡサンプルをマイクロアレイとハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション中、及び洗浄手順中、多くの因子（温度、イオン強度、時間の長さ、ホルムアミド濃度を含む）によって、ハイブリダイゼーションの緊縮性を決定する。これらの因子は、例えばSambrook et al.（Molecular Cloning: ALaboratory Manual, 2nd ed., 1989）で概説される。ハイブリダイゼーション後、蛍光マイクロアレイスキャナを使用して、マイクロアレイを精査する。各スポットの蛍光強度は解析遺伝子の発現レベルを示し、明るいスポットは強く発現する遺伝子に対応し、暗いスポットは弱い発現を示す。
【０１１８】
画像を得たら、生データを解析する必要がある。初めに、各スポットの蛍光からバックグラウンド蛍光を差し引く必要がある。それから、データを制御配列（外から加えられた核酸（好ましくはＲＮＡ又はＤＮＡ）、又は任意の非特異的ハイブリダイゼーション、アレイセットアップにおけるアレイ不完全性又は変動性、ｃＤＮＡ標識、ハイブリダイゼーション又は洗浄の原因となる（account for）ハウスキーピング遺伝子パネル等）に正規化する。データの正規化によって、複数のアレイ結果の比較が可能になる。
【０１１９】
本発明の別の態様は、本発明の方法に従って、被験者における前立腺細胞増殖性障害、最も好ましくは前立腺癌の診断に使用するキットであって、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の転写レベルを測定する手段を含む、キットに関する。好ましい実施の形態では、転写レベルを測定する手段は、ストリンジェントな条件又は適度にストリンジェントな条件下で、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される遺伝子の転写産物とハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む。最も好ましい実施の形態では、ノーザンブロット解析、逆転写酵素ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＲＮａｓｅ保護、及びマイクロアレイの群から選択される技法によって転写レベルを決定する。本発明の別の実施の形態ではキットは、患者の生体サンプルを得る手段をさらに含む。転写レベル及び患者の生体サンプルを測定する手段を収容するのに好適であるのが最も好ましいコンテナをさらに含み、最も好ましくはキット結果を利用及び解釈するための取扱説明書をさらに含むキットが好ましい。
【０１２０】
好ましい実施の形態において、キットは、（ａ）ストリンジェントな条件又は適度にストリンジェントな条件下で、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の転写産物とハイブリダイズすることができる複数のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドと、（ｂ）好ましくは、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド及び転写産物を含む患者の生体サンプルを収容するのが好適であるコンテナであって、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件又は適度にストリンジェントな条件下で転写産物とハイブリダイズすることができる、コンテナと、（ｃ）（ｂ）のハイブリダイゼーションを検出する手段と、任意で（ｄ）キット結果を利用及び解釈するための取扱説明書とを含む。
【０１２１】
キットは、別々のコンテナに入った状態で、ハイブリダイゼーションバッファー等の他の成分（オリゴヌクレオチドはプローブとして使用する）を含有してもよい。代替的に、標的領域を増幅するのにオリゴヌクレオチドを使用する場合、キットは、ポリメラーゼによって媒介されるプライマー伸長（ＰＣＲ等）のために最適化したポリメラーゼと反応バッファーとを別々のコンテナに入った状態で含有してもよい。当該ポリメラーゼは逆転写酵素であるのが好ましい。当該キットはＲＮａｓｅ試薬を含有するのがさらに好ましい。
【０１２２】
本発明は、患者から得られたサンプルにおいて上記遺伝子配列によってコードされるポリペプチドの存在を検出する方法をさらに提供する。
【０１２３】
ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子によってコードされるポリペプチドの異常なポリペプチド発現レベルは、癌の存在に関連する。
【０１２４】
本発明によれば、上記ポリペプチドの低発現は、前立腺細胞増殖性障害、特に前立腺癌の存在に関連する。
【０１２５】
ポリペプチドを検出する当該技術分野で既知の任意の方法を使用することができる。このような方法としては、質量分析法、免疫拡散法、免疫電気泳動法、免疫化学法、バインダ−リガンドアッセイ、免疫組織化学技法、凝集及び補体アッセイ（例えばBasic and Clinical Immunology, Sites and Terr, eds., Appleton &Lange, Norwalk, Conn. pp 217-262, 1991（参照により援用される）を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。抗体をエピトープ（複数可）と反応させること、及び標識ポリペプチド又はその誘導体を相補的に置き換えることを含むバインダ−リガンドイムノアッセイ法が好ましい。
【０１２６】
本発明のある特定の実施の形態は、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉ遺伝子によってコードされるポリペプチド（複数可）に特異的な抗体の使用を含む。
【０１２７】
このような抗体は、癌診断に有用である。ある特定の実施の形態では、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の産生は、抗原としてＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される遺伝子のポリペプチドによってコードされるエピトープの使用によって誘導することができる。同様に、このような抗体を使用して、癌診断用のマーカーとして発現ポリペプチドを検出することができる。存在するこのようなポリペプチドレベルは従来方法によって定量化し得る。抗体−ポリペプチド結合は、当該技術分野で既知の様々な手段（蛍光リガンド又は放射性リガンドによる標識等）によって検出及び定量化し得る。本発明は、上述の手順を行うためのキットをさらに含み、このようなキットは、研究するポリペプチドに特異的な抗体を含有する。
【０１２８】
多くの競合ポリペプチド結合イムノアッセイ及び非競合ポリペプチド結合イムノアッセイが、当該技術分野で既知である。このようなアッセイで利用する抗体は、例えば凝集検査で使用される場合、標識されず、又は多種多様なアッセイ法を使用する場合は標識され得る。使用することができる標識としては、放射性核種、酵素、蛍光因子（fluorescers）、化学発光因子（chemiluminescers）、酵素基質又は補因子、酵素阻害剤、粒子、色素等が挙げられる。好ましいアッセイとしては、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ、例えば酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、蛍光イムノアッセイ等が挙げられるが、これらに限定されない。当該技術分野で既知の多くの方法のいずれかによってイムノアッセイに使用するために、ポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体又はそのエピトープを作製することができる。
【０１２９】
この方法の代替的な実施の形態において、タンパク質をウェスタンブロット解析で検出してもよい。当該解析は、当該技術分野で標準的なものであり、簡潔に電気泳動（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によってタンパク質を分離する。それから、分離タンパク質を好適な膜（又は紙）、例えばニトロセルロースに移し、電気泳動によって空間的分離を維持する。その後、膜上で粘性の残る場所と結合させるために、膜を遮断剤とインキュベートし、一般的に使用される作用物質には一般のタンパク質（例えば乳タンパク質）が含まれる。それから、対象となるタンパク質に特異的な抗体を添加し、当該抗体は、例えば色素又は酵素的手段（例えばアルカリホスファターゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼ）によって検出可能に標識する。その後、膜上の抗体位置を検出する。
【０１３０】
この方法の代替的な実施の形態において、タンパク質を免疫組織化学法（サンプルにおけるプローブ特異的な抗原に抗体を使用すること）によって検出してもよい。当該解析は、当該技術分野で標準的なものであり、組織における抗原の検出が免疫組織化学法として知られている一方で、培養細胞における検出は一般的に、免疫細胞化学法と呼ばれている。簡潔に一次抗体は、その特異的な抗原と結合することで検出する。それから、抗体−抗原複合体は、酵素結合した二次抗体によって結合する。必要となる基質及び色原体の存在下では、抗体−抗原結合部位での発色沈殿物によって、結合酵素を検出する。広範で好適な種類のサンプル、抗原−抗体親和性、抗体の種類、及び検出増大法が存在する。したがって、免疫組織化学的検出又は免疫細胞化学的検出に最適な条件は、各々の場合で当業者が決定しなければいけない。
【０１３１】
ポリペプチドに対する抗体を調製するアプローチの１つは、アミノ酸配列を化学的に合成し、それを適切な動物（通常ウサギ又はネズミ）に注射する、ポリペプチドの全て又は一部のアミノ酸配列の選択及び調製である（Milstein and Kohler Nature 256:495-497, 1975、Gulfre and Milstein, Methods in Enzymology: ImmunochemicalTechniques 73:1-46, Langone and Banatis eds., Academic Press, 1981、その全体が参照により援用される）。ポリペプチド又はそのエピトープを調製する方法としては、化学合成、組み換えＤＮＡ技法、又は生体サンプルからの単離が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３２】
この方法の最終工程において、患者の診断が決定し、（ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉのｍＲＮＡ又はポリペプチドの）低発現は、癌の存在の指標となる。用語「低発現」は、平均値、中央値又は最適化した閾値から成る群から選択され得る既定のカットオフ未満の検出レベルでの発現を意味するものとする。
【０１３３】
本発明の別の態様は、本発明の方法による被験者における癌の診断に使用するキットであって、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子のポリペプチドを検出する手段を含む、キットを提供する。ポリペプチドを検出する手段は、抗体、抗体誘導体、又は抗体断片を含むのが好ましい。標識抗体を利用するウェスタンブロッティングによって、ポリペプチドを検出するのが最も好ましい。本発明の別の実施の形態ではキットは、患者の生体サンプルを得る手段をさらに含む。患者の生体サンプルにおいてポリペプチドを検出する手段を収容するのに適したコンテナをさらに含み、最も好ましくはキット結果を利用及び解釈するための取扱説明書をさらに含むキットが好ましい。好ましい実施の形態ではキットは、（ａ）ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子のポリペプチドを検出する手段と、（ｂ）当該手段及びポリペプチドを含む患者の生体サンプルを収容するのに適したコンテナであって、この手段は、ポリペプチドと複合体を形成することができる、コンテナと、（ｃ）（ｂ）の複合体を検出する手段と、任意で（ｄ）キット結果を利用及び解釈するための取扱説明書とを含む。
【０１３４】
キットは、別々のコンテナに入った状態で、遮断、洗浄又はコーティングに適したバッファー又は溶液等の他の成分を含有してもよい。
【０１３５】
本発明の特定の実施の形態は、前立腺癌の正確な検出、特徴付け及び／又は治療を可能にする上記配列内のメチル化レベル及び／又はメチル化パターンの解析の新規適用を提供する。癌の早期検出は、疾患の予後に直接関係し、そのため開示方法によって、医師及び患者がより良好に且つより多くの情報に基づき治療法を決定することが可能になる。
【０１３６】
さらなる改善点
本発明は、配列番号１〜配列番号４のゲノム配列の新規の使用を提供する。さらなる実施の形態は、配列番号１〜配列番号４内のシトシンのメチル化パターンの解析のために、配列番号１〜配列番号４の修飾変異体、及びオリゴヌクレオチド及び／又はＰＮＡ−オリゴマーを提供する。
【０１３７】
本発明の目的は、配列番号１〜配列番号４及びこれに相補的な配列内の１つ又は複数のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態の解析を含む。
【０１３８】
開示された本発明は、ゲノムの配列番号１〜配列番号４に由来する処理核酸であって、この処理が、ゲノムＤＮＡ配列の少なくとも１つの非メチル化シトシン塩基を、ウラシル、又はハイブリダイゼーションに関してシトシンと異なることが検出可能な別の塩基に変換するのに適した、ゲノムの配列番号１〜配列番号４に由来する処理核酸を提供する。対象となるゲノム配列は、１つ又は複数の連続したメチル化ＣｐＧ位置を含み得る。当該処理は、重亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、二亜硫酸塩及びその組合せから成る群から選択される試薬の使用を含むのが好ましい。本発明の好ましい実施の形態では本発明は、配列番号５〜配列番号２０から成る群から選択される配列の少なくとも１６ヌクレオチド塩基長の連続した配列を含む非天然修飾核酸を提供する。本発明のさらに好ましい実施の形態では、当該核酸は、配列番号５〜配列番号２０で開示された核酸配列のセグメントの少なくとも５０塩基対長、１００塩基対長、１５０塩基対長、２００塩基対長、２５０塩基対長又は５００塩基対長である。特に好ましくは、配列番号１〜配列番号４若しくは他の天然ＤＮＡではなく、配列番号５〜配列番号２０の配列の全て若しくは一部と同一若しくは相補的ではない核酸分子である。
【０１３９】
上記配列は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド、ＴｐＡジヌクレオチド又はＣｐＡジヌクレオチド及びこれに相補的な配列を含むことが好ましい。配列番号５〜配列番号２０の配列によって、配列番号１〜配列番号４の核酸の非天然修飾型が与えられ、各ゲノム配列の修飾によって、以下のように当該ゲノム配列に特有で、且つこれとは異なる配列を有する核酸が合成される。各センス鎖のゲノムＤＮＡ（例えば配列番号１）に対して、４つの変換型が開示される。「Ｃ」が「Ｔ」に変換するが、「ＣｐＧ」は「ＣｐＧ」のままである（即ち、ゲノム配列に関して、ＣｐＧジヌクレオチド配列の全ての「Ｃ」残基がメチル化し、したがって変換しない場合に対応する）第１の型が与えられ、第２の型は、開示されたゲノムＤＮＡ配列の相補体（即ちアンチセンス鎖）を開示し、「Ｃ」が「Ｔ」に変換するが、「ＣｐＧ」は「ＣｐＧ」のままである（即ち、ＣｐＧジヌクレオチド配列の全ての「Ｃ」残基がメチル化し、したがって変換しない場合に対応する）。配列番号１〜配列番号４の「上方メチル化」変換配列は、配列番号５〜配列番号１２に対応する。「ＣｐＧ」ジヌクレオチド配列のものを含む全ての「Ｃ」残基に関して「Ｃ」が「Ｔ」に変換される（即ちゲノム配列に関して、ＣｐＧジヌクレオチド配列の全ての「Ｃ」残基がメチル化していない場合に対応する）各ゲノム配列の化学変換した第３の型が与えられ、各配列の化学変換した最後の型は、開示されたゲノムＤＮＡ配列の相補体（即ちアンチセンス鎖）を開示し、「ＣｐＧ」ジヌクレオチド配列のものを含む全ての「Ｃ」残基に関して「Ｃ」が「Ｔ」に変換される（即ち各ゲノム配列の相補体（アンチセンス鎖）に関して、ＣｐＧジヌクレオチド配列の全ての「Ｃ」残基がメチル化していない場合に対応する）。配列番号１〜配列番号４の「下方メチル化」変換配列は、配列番号１３〜配列番号２０に対応する。さらなる詳細に関しては表１を参照されたい。
【０１４０】
重要なことにこれまでは、配列番号５〜配列番号２０の核酸配列及び分子は、癌の検出、分類又は治療に関与又は関連がなかった。
【０１４１】
代替的な好ましい実施の形態において、本発明は、配列番号１〜配列番号４〜配列番号２０によって、ゲノムＤＮＡ又は処理（化学修飾）ＤＮＡ内のシトシンのメチル化状態を検出するために、本発明の方法で使用するのに適したオリゴヌクレオチド又はオリゴマーをさらに提供する。当該オリゴヌクレオチド又はオリゴマー核酸は、新規の診断手段を提供する。当該オリゴヌクレオチド又はオリゴマーは、配列番号５〜配列番号２０の処理核酸配列及び／又はこれに相補的な配列、若しくは配列番号１〜配列番号４のゲノム配列及び／又はこれに相補的な配列、と同一であるか又は（本明細書で上記で規定のように）適度にストリンジェントな条件又はストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする少なくとも９ヌクレオチド長の核酸配列を含む。
【０１４２】
したがって本発明は、適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件及び／又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号１〜配列番号４〜配列番号２０の配列の全て若しくは一部、又はその相補体とハイブリダイズする核酸分子（例えばオリゴヌクレオチド及びペプチド核酸（ＰＮＡ）分子（ＰＮＡ−オリゴマー））を含む。適度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件及び／又はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１〜配列番号４若しくは他のヒトゲノムＤＮＡではなく、配列番号５〜配列番号２０の配列の全て若しくは一部とハイブリダイズする核酸分子が特に好ましい。
【０１４３】
ハイブリダイズする核酸の同一部分又はハイブリダイズ部分は典型的に、少なくとも９ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長又は３５ヌクレオチド長である。しかし、より長い分子が本発明に有用であり、このため本発明の範囲内である。
【０１４４】
好ましくは、本発明のハイブリダイズする核酸のハイブリダイズ部分は、配列番号１〜配列番号４〜配列番号２０の配列若しくはその一部、又はその相補体に対して少なくとも９５％、又は少なくとも９８％、又は１００％同一である。
【０１４５】
本明細書に記載されたタイプのハイブリダイズする核酸は、例えばプライマー（例えばＰＣＲプライマー）、又は診断及び／又は予後のプローブ若しくはプライマーとして使用することができる。好ましくは、ストリンジェントな条件下で、オリゴヌクレオチドプローブと核酸サンプルとのハイブリダイゼーションを行い、プローブは、標的配列と１００％同一である。核酸二本鎖又はハイブリッド安定性は、溶融温度即ちＴｍで表し、これはプローブが標的ＤＮＡから解離する温度である。この溶融温度は、要求されるストリンジェントな条件を規定するのに使用する。
【０１４６】
同一ではなく、配列番号１〜配列番号４の対応配列に関連し、実質的にこれと同一である標的配列（対立遺伝子変異型及びＳＮＰ等）に関して、特定塩濃度（例えばＳＳＣ又はＳＳＰＥ）で相同ハイブリダイゼーションだけが起こる最小温度を初めに確立することが有用である。それから、ミスマッチが１％であると仮定すると、Ｔｍが１℃減少し、そのためハイブリダイゼーション反応の最終洗浄の温度が減少する（例えば、プローブとの同一性が９５％を超える配列が求められる場合、最終洗浄温度は５℃減少する）。実際、Ｔｍの変化は、１％のミスマッチ当たり０．５℃〜１．５℃であり得る。
【０１４７】
長さＸ（ヌクレオチド）の本発明のオリゴヌクレオチドの例には、長さがＸの連続した重複オリゴヌクレオチドの組（センス及びアンチセンス組）に対応するものが含まれ（例えば配列番号２を参照してポリヌクレオチド位置によって示す）、ここで、連続して重複した各組のオリゴヌクレオチド（所定のＸ値に対応する）は、ヌクレオチド位置：ｎ〜（ｎ＋（Ｘ−１））からのＺ個のオリゴヌクレオチドの有限の組と規定される。式中、
ｎ＝１、２、３、・・・（Ｙ−（Ｘ−１））、
Ｙは配列番号２の（ヌクレオチド又は塩基対の）長さに等しく（６０９６）、
Ｘは、この組における各オリゴヌクレオチドの一般的な（ヌクレオチドの）長さに等しく（例えば、連続して重複した２０−ｍｅｒの組ではＸ＝２０）、
長さがＹの所定の配列番号１に対する、長さがＸの連続して重複したオリゴマーの数（Ｚ）は、Ｙ−（Ｘ−１）に等しい。例えばＸ＝２０の場合、配列番号２のセンス又はアンチセンス組のいずれかに関して、Ｚ＝６０９６−１９＝６０７７である。
【０１４８】
好ましくはこの組は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド、ＴｐＧジヌクレオチド又はＣｐＡジヌクレオチドを含むこれらのオリゴマーである。
【０１４９】
本発明の２０−ｍｅｒオリゴヌクレオチドの例としては、配列番号１〜配列番号４を参照してポリヌクレオチド位置で示される以下の組の２２６１個のオリゴマー（及びこれに相補的なアンチセンス組）が挙げられる：
１〜２０、２〜２１、３〜２２、４〜２３、５〜２４、・・・及び６０７７〜６０９６。
【０１５０】
好ましくはこの組は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド、ＴｐＧジヌクレオチド又はＣｐＡジヌクレオチドを含むこれらのオリゴマーである。
【０１５１】
同様に、本発明の２５−ｍｅｒオリゴヌクレオチドの例としては、配列番号２を参照してポリヌクレオチド位置で示される以下の組の２２５６個のオリゴマー（及びこれに相補的なアンチセンス組）が挙げられる：
１〜２５、２〜２６、３〜２７、４〜２８、５〜２９、・・・及び６０７２〜６０９６。
【０１５２】
好ましくはこの組は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド、ＴｐＧジヌクレオチド又はＣｐＡジヌクレオチドを含むこれらのオリゴマーである。
【０１５３】
本発明は、配列番号１〜配列番号４〜配列番号２０（センス及びアンチセンス）のそれぞれに対して、複数の連続して重複したオリゴヌクレオチド組又は長さがＸ（例えばＸ＝９、１０、１７、２０、２２、２３、２５、２７、３０又は３５ヌクレオチド）の修飾オリゴヌクレオチド組を包含する。
【０１５４】
本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴマーは、配列番号１〜配列番号４に対応するゲノム配列の遺伝的パラメータ及びエピジェネティックパラメータを確かめるのに有用な効果的ツールを構成する。このような好ましいオリゴヌクレオチド組又は長さがＸの修飾オリゴヌクレオチド組は、配列番号１〜配列番号４〜配列番号２０（及びその相補体）に対応する、連続して重複したオリゴマー組である。好ましくは、当該オリゴマーは、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド、ＴｐＧジヌクレオチド又はＣｐＡジヌクレオチドを含む。
【０１５５】
特に好ましい本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴマーは、ＣｐＧジヌクレオチド（又は対応する変換ＴｐＧ若しくはＣｐＡジヌクレオチド）配列のシトシンが、オリゴヌクレオチドの中央部３分の１内にある、即ちオリゴヌクレオチドが、例えば１３塩基長であり、ＣｐＧジヌクレオチド、ＴｐＧジヌクレオチド又はＣｐＡジヌクレオチドが、５’末端から５番目〜９番目のヌクレオチド内に位置しているものである。
【０１５６】
本発明のオリゴヌクレオチドはまた、オリゴヌクレオチドと１つ又は複数の成分又は複合体とを化学結合させることによって修飾して、オリゴヌクレオチドの活性、安定性又は検出を高めることができる。このような成分又は複合体としては、クロモフォア、フルオロフォア、コレステロール等の脂質、胆汁酸、チオエーテル、脂肪族鎖、リン脂質、ポリアミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、パルミチル部分、及び例えば米国特許第５，５１４，７５８号明細書、同第５，５６５，５５２号明細書、同第５，５６７，８１０号明細書、同第５，５７４，１４２号明細書、同第５，５８５，４８１号明細書、同第５，５８７，３７１号明細書、同第５，５９７，６９６号明細書、及び同第５，９５８，７７３号明細書で開示されるような他のものが挙げられる。プローブはまた、特に好ましい対合性があるペプチド核酸（ＰＮＡ）形態で存在し得る。このように、オリゴヌクレオチドは、ペプチド等の他の付加群を含んでもよく、ハイブリダイゼーション誘起切断剤（Krol et al., BioTechniques 6:958-976, 1988）又は挿入剤（Zon, Pharm. Res. 5:539-549, 1988）を含んでもよい。このために、オリゴヌクレオチドは、別の分子、例えばクロモフォア、フルオロフォア、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘起架橋剤、輸送剤、ハイブリダイゼーション誘起切断剤等と複合体を形成してもよい。
【０１５７】
オリゴヌクレオチドはまた、少なくとも１つの当該技術分野で認識される修飾糖及び／又は塩基部分を含み得るか、又は修飾骨格若しくは非天然ヌクレオチド間連結を含み得る。
【０１５８】
本発明の特定の実施の形態のオリゴヌクレオチド又はオリゴマーは典型的に、「組」で使用し、配列番号１〜配列番号４から成る群から選択されるゲノム配列及びこれに相補的な配列の各ＣｐＧジヌクレオチドの解析のために、又は配列番号５〜配列番号２０の処理核酸の配列及びこれに相補的な配列内の対応するＣｐＧジヌクレオチド、ＴｐＧジヌクレオチド若しくはＣｐＡジヌクレオチドの解析のために少なくとも１つのオリゴマーを含有する。しかし、経済的要因又は他の要因のために、好ましくは、上記配列内のＣｐＧジヌクレオチドの制限選択を解析してもよく、それに応じてオリゴヌクレオチド組の含有量が変わることが予測される。
【０１５９】
したがって、特定の実施の形態では本発明は、処理ゲノムＤＮＡ（配列番号５〜配列番号２０）、又はゲノムＤＮＡ（配列番号１〜配列番号４及びこれに相補的な配列）においてシトシンのメチル化状態を検出するのに有用な、少なくとも２つの（オリゴヌクレオチド及び／又はＰＮＡ−オリゴマー）組を提供する。これらのプローブによって、前立腺細胞増殖性障害、最も好ましくは前立腺癌の診断及び検出が可能になる。オリゴマー組はまた、処理ゲノムＤＮＡ（配列番号５〜配列番号２０）、又はゲノムＤＮＡ（配列番号１〜配列番号４及びこれに相補的な配列）において一塩基多型（ＳＮＰ）を検出するのに使用してもよい。
【０１６０】
好ましい実施の形態において、オリゴヌクレオチド組の少なくとも１つ、及びより好ましくは全ての成員が固相に結合する。
【０１６１】
さらなる実施の形態において、本発明は、配列番号１〜配列番号４〜配列番号２０の内の１つのＤＮＡ配列及びこれに相補的な配列、又はそのセグメントを増幅するための「プライマー」オリゴヌクレオチドとして使用する、少なくとも２つのオリゴヌクレオチド組を提供する。
【０１６２】
オリゴヌクレオチドは、「アレイ」又は「ＤＮＡチップ」（即ち固相に結合した様々なオリゴヌクレオチド及び／又はＰＮＡ−オリゴマーの配置）の全て又は一部を構成し得ることが予測される。様々なオリゴヌクレオチド配列及び／又はＰＮＡ−オリゴマー配列のこのようなアレイは、例えば四角形又は六方の格子の形態で固相上に配置されることを特徴とし得る。固相表面は、ケイ素、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、スチール、鉄、銅、ニッケル、銀、又は金で構成され得る。また、ニトロセルロース、並びにペレット状で存在し得るナイロン、又は樹脂マトリクス等のプラスチックを使用してもよい。オリゴマーアレイの製造における従来技術の概説は、Nature Genetics（Nature Genetics Supplement,Volume 21, January 1999、およびそこで引用される文献から）の特別版から収集することができる。固定化ＤＮＡアレイの精査に、蛍光標識プローブを使用することが多い。Ｃｙ３色素及びＣｙ５色素と、特異的なプローブの５’−ＯＨとの単純な連結は、蛍光標識に特に好適である。例えば、共焦点顕微鏡によって、ハイブリダイズするプローブの蛍光の検出を行ってもよい。他の多くのものに加えて、Ｃｙ３色素及びＣｙ５色素が市販されている。
【０１６３】
オリゴヌクレオチド又はその特定の配列は、「仮想アレイ」（オリゴヌクレオチド又はその特定の配列は、例えば「指定子」として検体の複合混合物を解析するために、多様な特別に標識したプローブ集団の一部として、又はこれと組合せて使用する）の全て又は一部を構成し得ることも予測される。例えば、このような方法は、米国特許出願公開第２００３／００１３０９１号明細書（２００３年１月１６日に公開された米国特許出願第０９／８９８，７４３号）に記載されている。このような方法において、複合混合物における各核酸（いわゆる各検体）が、特有の標識と独自に結合し、それにより検出することができるように、十分な標識が生成される（各標識を直接計測し、それにより混合物中の各分子種をデジタルで読み取る）。
【０１６４】
本発明のオリゴマーは、前立腺細胞増殖性障害、最も好ましくは前立腺癌を検出又は診断するのに利用するのが特に好ましい。
【０１６５】
この方法の最も好ましい実施の形態において、前立腺細胞増殖性障害、最も好ましくは前立腺癌の有無を決定する。このことは、少なくとも１つ及びより好ましくは複数の標的配列の少なくとも１つのＣｐＧ位置を含むメチル化状況を解析することによって達成され、当該配列は、配列番号１〜配列番号４から成る群から選択される配列及びその相補体の少なくとも１６個、５０個、１００個又は５００個の連続したヌクレオチドを含むか、又はストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする。
【０１６６】
好ましくは複数の標的領域（本明細書中で「遺伝子パネル」とも称される）を解析する。好ましくは２つ、３つ又は４つの標的領域を解析する。この方法の一実施の形態では、当該パネルは、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の標的領域、及び／又はそのプロモータ又は調節領域を含む。好ましくは、当該パネルはＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ遺伝子の標的領域を含む。
【０１６７】
以下の遺伝子の標的領域の組合せが特に好ましい：
ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ＋ＲＡＳＳＦ
ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ＋ＧＳＴＰｉ。
【０１６８】
本発明は、シトシンのメチル化及び一塩基多型を解析することによって、被験者内の配列番号１〜配列番号４のゲノム配列の遺伝的パラメータ及び／又はエピジェネティックパラメータを確かめる方法をさらに提供する。当該方法は、当該被験者から得られた生体サンプルにおいて、配列番号１〜配列番号４から成る群から選択される少なくとも１つのゲノム配列を含む核酸を、少なくとも１つの試薬又は試薬群に接触させることを含み、当該試薬又は試薬群は、標的核酸（複数可）内のメチル化ＣｐＧジヌクレオチドと非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドとを識別する。
【０１６９】
好ましい実施の形態において、上記方法は、以下の工程を含む。第１の工程では、解析する組織のサンプルが得られる。供給源は、任意の好適な供給源（細胞株、組織断片、生検、パラフィン包埋組織、体液、射精液、尿、血漿、血清、全血、単離血球、血液から単離した細胞及びこれらの可能な全ての組合せ等）であり得る。ＤＮＡの当該供給源は、射精液、尿、血漿、血清、全血、単離血球、血液から単離した細胞から成る群から選択される、射精液又は体液であるのが好ましい。
【０１７０】
その後、サンプルからゲノムＤＮＡを単離する。ゲノムＤＮＡは、市販のキットの使用を含む、当該技術分野で標準的な任意の手段によって単離してもよい。要するに、対象となるＤＮＡが、細胞膜によってその中に封入されており、生体サンプルは、酵素的手段、化学的手段又は機械的手段によって破壊及び溶解する必要がある。それから、例えばプロテイナーゼＫによる消化で、ＤＮＡ溶液からタンパク質及び他の汚染物質を除去してもよい。その後、溶液からゲノムＤＮＡを回収する。塩析、有機抽出、又はＤＮＡと固相支持体との結合を含む様々な方法によって、これを行ってもよい。方法の選択は、時間、費用、要求されるＤＮＡ量を含む幾つかの因子の影響を受ける。
【０１７１】
サンプルＤＮＡは膜中に封入されていない場合（例えば血液サンプル由来の循環ＤＮＡ）、ＤＮＡの単離及び／又は精製のために当該技術分野で標準的な方法を利用してもよい。このような方法としては、タンパク質変性剤（例えばカオトロピック塩、例えば塩酸グアニジン又は尿素）、又は界面活性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、臭化シアン）の使用が挙げられる。代替的な方法としては、エタノール析出又はプロパノール析出、特に遠心分離による減圧濃縮が挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、濾過装置（例えば限外濾過、シリカ表面又はシリカ膜、磁性粒子、ポリスチロール粒子、ポリスチロール表面、正に荷電した表面、及び正に荷電した膜、荷電膜、荷電表面、荷電スイッチ膜（charged switch membranes）、荷電切り替え表面（chargedswitched surfaces））等の装置を使用してもよい。
【０１７２】
核酸を抽出したら、ゲノム二本鎖ＤＮＡを解析に使用する。
【０１７３】
この方法の第２の工程において、５’位で非メチル化したシトシン塩基を、ウラシル、チミン、又はハイブリダイゼーション挙動に関してシトシンと異なる別の塩基に変換するように、ゲノムＤＮＡサンプルを処理する。これは、本明細書中では「前処理」又は「処理」と理解される。
【０１７４】
重亜硫酸試薬による処理によってこれを達成するのが好ましい。用語「重亜硫酸試薬」は、本明細書に開示されるようにメチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列と非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列とを識別するのに有用である、重亜硫酸塩、二亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、又はこれらの組合せを含む試薬を表す。当該治療方法は、当該技術分野で既知である（例えば国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５号明細書、その全体が参照により援用される）。これらに限定されないが、ｎ−アルキレングリコール、特にジエチレングリコールジメチルエーテル（ＤＭＥ）等の変性溶媒の存在下、又はジオキサン若しくはジオキサン誘導体の存在下で重亜硫酸処理を行うのが好ましい。好ましい実施の形態では、変性溶媒は、１％〜３５％（ｖ／ｖ）の濃度で使用する。これらに限定されないが、クロマン誘導体（例えば、６−ヒドロキシ−２，５，７，８，−テトラメチルクロマン２−カルボン酸、又はトリヒドロキシ安息香酸及びその誘導体（例えば没食子酸）等のスカベンジャの存在下で重亜硫酸反応を行うのも好ましい（国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５号明細書（その全体が参照により援用される）を参照されたい）。重亜硫酸変換は、３０℃〜７０℃の反応温度で行うのが好ましく、反応中、短時間で８５℃を超えるまで温度が上昇する（国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５号明細書（その全体が参照により援用される）を参照されたい）。定量化の前に重亜硫酸処理ＤＮＡを精製するのが好ましい。これらに限定されないが、限外濾過等、当該技術分野で既知の任意の手段によって、これを行ってもよく、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ（商標）カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）製）によって行うのが好ましい。改良した製造業者のプロトコルに従って精製を行う（国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５号明細書（その全体が参照により援用される）を参照されたい）。
【０１７５】
この方法の第３の工程において、本発明によるプライマーオリゴヌクレオチド組と、増幅酵素とを使用して、処理ＤＮＡ断片を増幅する。１つの同じ反応容器で、幾つかのＤＮＡセグメントの増幅を同時に行うことができる。典型的に、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、増幅を行う。好ましくは、当該増幅産物は、１００塩基対長〜２０００塩基対長である。プライマーオリゴヌクレオチド組は、それぞれの配列が、配列番号５〜配列番号２０の内の１つの塩基配列及びこれに相補的な配列の少なくとも１６塩基対長のセグメントと逆相補的、同一又はストリンジェントな条件又は高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含む。
【０１７６】
この方法の代替的な実施の形態において、配列番号１〜配列番号４から成る群から選択される少なくとも１つのゲノム配列内の予め選択されたＣｐＧ位置のメチル化状況は、メチル化特異的なプライマーオリゴヌクレオチドの使用によって検出し得る。この技法（ＭＳＰ）は、Hermanへの米国特許第６，２６５，１７１号明細書に記載されている。重亜硫酸処理ＤＮＡの増幅のためのメチル化状況に特異的なプライマーの使用によって、メチル化核酸と非メチル化核酸との識別が可能になる。ＭＳＰプライマー対は、重亜硫酸処理ＣｐＧジヌクレオチドとハイブリダイズする少なくとも１つのプライマーを含有する。したがって、当該プライマー配列は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。非メチル化ＤＮＡに特異的なＭＳＰプライマーは、ＣｐＧにおけるＣ位の位置で「Ｔ」を含有する。好ましくはしたがって、当該プライマーの塩基配列は、配列番号５〜配列番号２０の内の１つによる処理核酸配列及びこれに相補的な配列とハイブリダイズする少なくとも９ヌクレオチド長の配列を含むことが要求され、上記オリゴマーの塩基配列は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。この方法のさらなる好ましい実施の形態は、ブロッカーオリゴヌクレオチド（ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）アッセイ）の使用を含む。このようなブロッカーオリゴヌクレオチドの使用は、Yu et al., BioTechniques 23:714-720, 1997に記載されている。遮断プローブオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲプライマーと同時に重亜硫酸処理核酸とハイブリダイズする。遮断プローブに相補的な配列が存在する場合に核酸の増幅が抑制されるように、核酸のＰＣＲ増幅は遮断プローブの５’位で終結する。プローブは、メチル化状況に特異的に重亜硫酸処理核酸とハイブリダイズするように設計し得る。例えば非メチル化核酸集団内のメチル化核酸の検出のために、メチル化核酸の増幅抑制が望まれる場合、「ＣｐＧ」に対して対象となる位置で「ＣｐＡ」又は「ＴｐＡ」を含む遮断プローブを使用することによって、対象となる位置で非メチル化核酸の増幅抑制を起こす。
【０１７７】
ブロッカーオリゴヌクレオチドを使用したＰＣＲ法のために、ポリメラーゼ媒介性増幅の効果的破壊には、ブロッカーオリゴヌクレオチドがポリメラーゼでは伸長しないことが要求される。好ましくは、３’−デオキシオリゴヌクレオチド、又は「遊離」ヒドロキシル基以外で３’位で誘導体化したオリゴヌクレオチドであるブロッカーを使用することによって、これを達成する。例えば、３’−Ｏ−アセチルオリゴヌクレオチドは、好ましいブロッカー分子クラスの代表的なものである。
【０１７８】
さらに、ブロッカーオリゴヌクレオチドのポリメラーゼ媒介性分解を防ぐ必要がある。好ましくは、このような防止には、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を失ったポリメラーゼの使用、又は例えばブロッカー分子をヌクレアーゼ耐性にする、その５’末端にチオエート架橋を有する修飾ブロッカーオリゴヌクレオチドの使用のいずれかが含まれる。特定の適用には、このようなブロッカーの５’修飾は要求され得ない。例えば、ブロッカー結合部位及びプライマー結合部位が重複し、それによりプライマーの結合が妨げられる（例えば過剰なブロッカーにより）場合、ブロッカーオリゴヌクレオチドの分解が実質的に防がれる。これは、ポリメラーゼがプライマーをブロッカーに向かって（５’−３’方向に）伸長（通常ハイブリダイズするブロッカーオリゴヌクレオチドの分解をもたらすプロセス）させないためである。
【０１７９】
本発明のために、及び本明細書中で行われるように、特に好ましいブロッカー／ＰＣＲの実施の形態には、遮断オリゴヌクレオチドとしてのペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーの使用が含まれる。このようなＰＮＡブロッカーオリゴマーは、ポリメラーゼでは分解も伸長もしないので理想的に適している。
【０１８０】
好ましくはしたがって、上記遮断オリゴヌクレオチドの塩基配列には、配列番号５〜配列番号２０の内の１つの処理核酸配列及びこれに相補的な配列とハイブリダイズする少なくとも９ヌクレオチド長の配列を含むことが要求され、当該オリゴヌクレオチドの塩基配列が、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド、ＴｐＧジヌクレオチド又はＣｐＡジヌクレオチドを含む。
【０１８１】
増幅によって得られる断片は、直接又は間接的に検出可能な標識を保有し得る。蛍光標識、放射性核種、又は質量分析計で検出することができる典型的な質量を有する分離型分子断片の形態での標識が好ましい。当該標識が質量標識である場合、標識された増幅産物が、質量分析計でのより良好なディレクタビリディ（delectability：検出能）を可能にする、単一の正の正味電荷又は負の正味電荷を有することが好ましい。例えばマトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ）によって、又は電子噴霧（electron spray）質量分析（ＥＳＩ）を使用して、検出を行い可視化し得る。
【０１８２】
マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）は、生体分子の解析に非常に効果的な進歩である（Karas & Hillenkamp, Anal Chem., 60:2299-301, 1988）。検体は吸光マトリクスに包埋される。マトリクスは、短レーザーパルスで蒸発し、これにより検体分子を非断片化して気相に移す。マトリクス分子による衝突によって、検体をイオン化する。印加電圧が、フィールドフリー飛行管へとイオンを加速させる。これらの異なる質量により、イオンが異なる速度で加速する。小さいイオンは、大きいイオンよりも早く検出器に到達する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計は、ペプチド及びタンパク質の解析に十分適している。核酸の解析は幾らか難しくなる（Gut & Beck, Current Innovations and Future Trends, 1:147-57,1995）。核酸解析に対する感度は、ペプチドに対する感度のおよそ１００分の１であり、断片の大きさが増大するにつれ不均衡に減少する。さらに、複合的に負に荷電した骨格を有する核酸に対しては、マトリクスを介したイオン化プロセスはほとんど有効ではない。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析では、マトリクスの選択は、極めて重要な役割を果たす。ペプチドの脱離に対して、非常に精細な結晶体を作製する非常に効果的なマトリクスが幾つか見出されている。現在、ＤＮＡに対して幾つかの反応性マトリクスが存在するが、ペプチドと核酸との感度の差は低減されていない。しかし、ペプチドと類似になるようにＤＮＡを化学修飾することによって、この感度の差を低減することができる。例えば、骨格の通常のリン酸塩をチオリン酸塩に置換したホスホロチオエート核酸は、単純なアルキル化化学反応を用いて電荷が中性のＤＮＡに変換させることができる（Gut & Beck, Nucleic Acids Res. 23: 1367-73, 1995）。荷電タグとこの修飾ＤＮＡとのカップリングによって、ペプチドで見出されるのと同じレベルまでＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ感度が増大する。荷電タグ化のさらなる利点は、非修飾基質の検出を非常に困難なものにする不純物に対する解析の安定性の増大である。
【０１８３】
この方法の第４の工程において、処理前にＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状況を確かめるために、この方法の第３の工程中に得られた増幅産物を解析する。
【０１８４】
ＭＳＰ増幅によって、増幅産物が得られた実施の形態において、増幅産物の有無自体が、プライマーの塩基配列に従って、当該プライマーがカバーするＣｐＧ位置のメチル化状態の指標となる。
【０１８５】
標準的なＰＣＲ及びメチル化特異的ＰＣＲの両方によって得られた増幅産物は、これらに限定されないが、アレイ技法及びプローブベースの技法等の基本的方法に基づいた手法によって、並びにシークエンシング及び鋳型指向性伸長等の技法によってさらに解析してもよい。
【０１８６】
この方法の一実施の形態において、工程３で合成された増幅産物を次に、アレイ又はオリゴヌクレオチド組、及び／又はＰＮＡプローブ組とハイブリダイズする。これに関して、ハイブリダイゼーションは以下のように行う：ハイブリダイゼーション中に使用されるプローブ組は、少なくとも２つのオリゴヌクレオチド又はＰＮＡ−オリゴマーから構成されるのが好ましく；プロセス中、増幅産物は、予め固相と結合したオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするプローブとして有用であり；続いて、ハイブリダイズしなかった断片を除去し；当該オリゴヌクレオチドは、本発明の配列表で指定される塩基配列のセグメントと逆相補的又は同一である少なくとも９ヌクレオチド長の少なくとも１つの塩基配列を含有し；このセグメントは、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド、ＴｐＧジヌクレオチド又はＣｐＡジヌクレオチドを含む。ハイブリダイズする核酸のハイブリダイズ部分は典型的に、少なくとも９ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長又は３５ヌクレオチド長である。しかし、より長い分子が本発明に有用であり、このため本発明の範囲内である。
【０１８７】
好ましい実施の形態において、上記ジヌクレオチドがオリゴマーの中央部３分の１内にある。例えば、オリゴマーは、１つのＣｐＧジヌクレオチドを含み、当該ジヌクレオチドは、１３−ｍｅｒの５’末端から５番目〜９番目のヌクレオチドであるのが好ましい。配列番号１〜配列番号４から成る群から選択される配列、及び配列番号５〜配列番号２０内の等価位置内の各ＣｐＧジヌクレオチドの解析に対して、１つのオリゴヌクレオチドが存在する。当該オリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸形態でも存在し得る。その後、ハイブリダイズしなかった増幅産物を除去する。次いで、ハイブリダイズする増幅産物を検出する。これに関して、増幅産物に付着する標識は、オリゴヌクレオチド配列が位置する各固相位置で同定可能であるのが好ましい。
【０１８８】
この方法のまたさらなる実施の形態において、ＣｐＧ位置のゲノムメチル化状況は、ＰＣＲ増幅プライマー（当該プライマーは、メチル化に特異的、又は標準的なものであり得る）と同時に重亜硫酸処理ＤＮＡとハイブリダイズする（上記で詳述された）オリゴヌクレオチドで確かめることができる。
【０１８９】
この方法の特に好ましい実施の形態は、二重標識蛍光オリゴヌクレオチドプローブ（ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００配列検出システム（Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, California）を使用するＴａｑＭａｎ（商標）ＰＣＲ）を利用した蛍光ベースのリアルタイム定量ＰＣＲの使用である（Heid et al., Genome Res. 6:986-994, 1996、米国特許第６，３３１，３９３号も参照されたい）。ＴａｑＭａｎ（商標）ＰＣＲ反応は、好ましい実施の形態でフォワード増幅プライマーとリバース増幅プライマーとの間に位置する高ＣｐＧ配列とハイブリダイズするように設計した、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブと呼ばれる非伸長性検索オリゴヌクレオチドの使用を利用する。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブは、ＴａｑＭａｎ（商標）オリゴヌクレオチドのヌクレオチドに付着したリンカー部分（例えばホスホルアミダイト（phosphoramidites））と共有結合する蛍光「レポータ部分」と「消光部分」とをさらに含む。重亜硫酸処理後の核酸内のメチル化解析のために、プローブが、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイとしても知られる米国特許第６，３３１，３９３号明細書（その全体が参照により援用される）で記載されるように、メチル化特異的であることが要求される。また、記載の本発明と共に使用するのに適したＴａｑＭａｎ（商標）検出法の変法には、二重プローブ技法（Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（商標））又は蛍光増幅プライマー（Ｓｕｎｒｉｓｅ（商標）法）の使用が含まれる。これらの技法の両方は、重亜硫酸処理ＤＮＡとの使用、さらにＣｐＧジヌクレオチド内のメチル化解析に好適になるように適合し得る。
【０１９０】
この方法のさらに好ましい実施の形態において、この方法の第４の工程には、鋳型指向性のオリゴヌクレオチド伸長（Gonzalgo & Jones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997に記載されるＭＳ−ＳＮｕＰＥ等）の使用が含まれる。
【０１９１】
この方法のまたさらなる実施の形態において、この方法の第４の工程には、この方法の第３の工程で生成した増幅産物のシークエンシング及びその後の配列解析が含まれる（Sanger F., et al., Proc Natl Acad Sci USA 74:5463-5467, 1977）。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１９２】
最良の形態
この方法の最も好ましい実施形態において、上記で概説された方法の最初の３つの工程に従ってゲノム核酸を単離及び処理する、即ち：
ａ）被験者のゲノムＤＮＡを有する生体サンプルを被験者から得ること、
ｂ）ゲノムＤＮＡを抽出、又はそうでなければ単離すること、
ｃ）ｂ）のゲノムＤＮＡ又はその断片を１つ又は複数の試薬で処理することであって、５位の非メチル化シトシン塩基を、ウラシル残基又はハイブリダイゼーション特性に関してシトシンと異なることが検出可能な別の塩基に変換する処理をすること、また
ｄ）ｃ）での処理後に、メチル化特異的に、即ちメチル化特異的プライマー又は遮断オリゴヌクレオチドを使用することによって増幅を行い、
ｅ）上記のように、リアルタイム検出プローブによって、増幅産物の検出を行う。
【０１９３】
好ましくは、上記のように、メチル化特異的プライマーによって、ｄ）のその後の増幅が行われ、当該メチル化特異的プライマーは、配列番号５〜配列番号２０の内の１つの処理核酸配列及びこれに相補的な配列とハイブリダイズする少なくとも９ヌクレオチド長の配列を含み、上記オリゴマーの塩基配列は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレチドを含む。
【０１９４】
この方法の工程ｅ）、即ち配列番号１〜配列番号４から成る群から選択される少なくとも１つのゲノム配列の１つ又は複数のＣｐＧ位置のメチル化状況の指標となる特定の増幅産物の検出は、上記のようなリアルタイム検出法によって行われる。
【０１９５】
本発明のさらなる実施形態は、重亜硫酸変換を必要とせずに、本発明のゲノムＤＮＡ（配列番号１〜配列番号４、及びその相補体）のメチル化状況を解析する方法を提供する。メチル化感受性制限酵素試薬、又は標的領域内でメチル化ＣｐＧジヌクレオチドと非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドとを識別するメチル化感受性制限酵素試薬を含む制限酵素試薬群をメチル化を決定するのに利用する方法、例えばこれに限定されないが、ＤＭＨ等が当該技術分野で既知である。
【０１９６】
このようなさらなる実施形態の第１の工程において、組織源又は細胞源からゲノムＤＮＡサンプルを単離する。ゲノムＤＮＡは、市販のキットの使用を含む、当該技術分野で標準的な任意の手段によって単離してもよい。要するに、対象となるＤＮＡが、細胞膜によってその中に封入され、生体サンプルは、酵素的手段、化学的手段又は機械的手段によって破壊及び溶解する必要がある。次いで、例えばプロテイナーゼＫによる消化で、ＤＮＡ溶液からタンパク質及び他の汚染物質を除去してもよい。その後、溶液からゲノムＤＮＡを回収する。塩析、有機抽出、又はＤＮＡと固相支持体との結合を含む様々な方法によって、これを行ってもよい。方法の選択は、時間、費用、要求されるＤＮＡ量を含む幾つかの因子の影響を受ける。腫瘍性物質又は前腫瘍性物質を含む全ての種類の臨床サンプルは、本発明の方法での使用に好適であり、好ましくは細胞株、組織断片、生検、パラフィン包埋組織、体液、射精液、尿、血漿、血清、全血、単離血球、血液から単離した細胞及びこれらの組合せである。体液は、好ましいＤＮＡ源であり、射精液、血漿、血清、全血、単離血球、血液から単離した細胞が特に好ましい。
【０１９７】
核酸を抽出したら、ゲノム二本鎖ＤＮＡを解析に使用する。
【０１９８】
好ましい実施形態において、ＤＮＡは、メチル化感受性制限酵素による処理の前に切断し得る。このような方法は、当該技術分野で既知であり、物理的手段及び酵素的手段の両方を含み得る。メチル化感受性ではない１つ又は複数の制限酵素の使用が特に好ましく、その認識部位は高ＡＴであり、ＣＧジヌクレオチドを含まない。このような酵素の使用によって、断片化ＤＮＡにおけるＣｐＧアイランド及び高ＣｐＧ領域の変換が可能になる。非メチル化特異的制限酵素は、ＭｓｅＩ、ＢｆａＩ、Ｃｓｐ６Ｉ、Ｔｒｕ１Ｉ、Ｔｖｕ１Ｉ、Ｔｒｕ９Ｉ、Ｔｖｕ９Ｉ、ＭａｅＩ及びＸｓｐＩから成る群から選択されるのが好ましい。２つ又は３つのこのような酵素の使用が特に好ましい。ＭｓｅＩ、ＢｆａＩ及びＣｓｐ６Ｉの組合せの使用が特に好ましい。
【０１９９】
それから、その後の酵素増幅を容易にするために、断片化ＤＮＡをアダプタオリゴヌクレオチドにライゲートしてもよい。平滑末端ＤＮＡ断片及び付着末端ＤＮＡ断片へのオリゴヌクレオチドのライゲーションは、当該技術分野で既知であり、（例えば仔ウシ又はエビのアルカリホスファターゼを使用した）末端の脱リン酸化手段、及びその後のｄＡＴＰの存在下でリガーゼ酵素（例えばＴ４  ＤＮＡリガーゼ）を使用したライゲーションによって行われる。アダプタオリゴヌクレオチドは典型的に、少なくとも１８塩基対長である。
【０２００】
次いで、第３の工程において、１つ又は複数のメチル化感受性制限酵素で、ＤＮＡ（又はその断片）を消化する。制限部位でのＤＮＡの加水分解が、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の特定ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状況の情報を与えるように、消化が行われる。
【０２０１】
好ましくは複数の遺伝子（本明細書中で「遺伝子パネル」とも称される）を解析する。好ましくは２つ、３つ又は４つの遺伝子を解析する。この方法の一実施の形態では、当該パネルは、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子、及び／又はそのプロモータ又は調節領域を含む。好ましくは、当該群はＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ遺伝子を含む。
【０２０２】
以下の遺伝子の組合せが特に好ましい：
ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ＋ＲＡＳＳＦ
ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ＋ＧＳＴＰｉ。
【０２０３】
好ましくは、メチル化特異的制限酵素は、Ｂｓｉ  Ｅ１、Ｈｇａ  Ｉ  ＨｉｎＰ１、Ｈｐｙ９９Ｉ、Ａｖａ  Ｉ、Ｂｃｅ  ＡＩ、Ｂｓａ  ＨＩ、ＢｉｓＩ、ＢｓｔＵＩ、ＢｓｈＩ２３６Ｉ、ＡｃｃＩＩ、ＢｓｔＦＮＩ、ＭｃｒＢＣ、ＧｌａＩ、ＭｖｎＩ、ＨｐａＩＩ（ＨａｐＩＩ）、ＨｈａＩ、ＡｃｉＩ、ＳｍａＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＥａｇＩ及び２つ以上の上記酵素の組合せから成る群から選択される。制限酵素ＢｓｔＵＩ、ＨｐａＩＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ及びＨｉｎＰ１Ｉを含有する混合物が好ましい。
【０２０４】
任意ではあるが、好ましい実施形態である第４の工程において、制限断片を増幅する。ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、これを行うのが好ましく、当該増幅産物は、上述のように好適な検出可能な標識、即ちフルオロフォア標識、放射性核種及び質量標識を保有し得る。それぞれの場合で配列番号１〜配列番号４から成る群から選択される配列及びその相補体に、相補的であるか、又は適度にストリンジェントな条件又はストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする少なくとも１６ヌクレオチド長の連続した配列を含む少なくとも２つのプライマーと、増幅酵素とによる増幅が特に好ましい。好ましくは、当該連続した配列は、少なくとも１６ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長又は２５ヌクレオチド長である。代替的な実施形態では、当該プライマーは、断片と連結した任意のアダプタに相補的であり得る。
【０２０５】
第５の工程において、増幅産物を検出する。これらに限定されないが、ゲル電気泳動解析、ハイブリダイゼーション解析、ＰＣＲ産物内の検出可能なタグの組み込み、ＤＮＡアレイ解析、ＭＡＬＤＩ又はＥＳＩ解析等の当該技術分野で標準的な任意の手段によって検出が行われ得る。好ましくは、それぞれの場合で配列番号１〜配列番号４から成る群から選択される配列及びその相補体に、相補的であるか、又は適度にストリンジェントな条件又はストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする少なくとも１６ヌクレオチド長の連続した配列を含む少なくとも１つの核酸又はペプチド核酸とのハイブリダイゼーションによって、当該検出が行われる。好ましくは、当該連続した配列は、少なくとも１６ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長又は２５ヌクレオチド長である。
【０２０６】
ゲノム核酸のメチル化状態又はメチル化レベルを決定した後に、配列番号１〜配列番号４の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態若しくはメチル化レベル、又は平均、又は配列番号１〜配列番号４の複数のＣｐＧジヌクレオチド配列の平均メチル化状態を反映する値に基づき、前立腺細胞増殖性障害、最も好ましくは前立腺癌の有無を推測し、メチル化は、前立腺細胞増殖性障害、最も好ましくは前立腺癌の存在に関連がある。定量的手段によって当該メチル化を決定し、当該メチル化の存在を決定するためのカットオフ値は０であるのが好ましい（即ち、サンプルは任意のメチル化度を示し、解析されたＣｐＧ位置でメチル化状況を有すると決定される）。それにもかかわらず、当業者は、特に好ましい感度又は特異度のアッセイを与えるために、当該カットオフ値を調整することを望み得ると予測される。したがって、当該カットオフ値は増大してもよく（このようにして特異度を増大させる）、当該カットオフ値は、０％〜５％、５％〜１０％、１０％〜１５％、１５％〜２０％、２０％〜３０％及び３０％〜５０％から成る群から選択される範囲内にあり得る。カットオフ値は、１０％、１５％、２５％及び３０％が特に好ましい。
【０２０７】
キット
さらに、本発明のさらなる態様は、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化を決定する手段を含むキットである。当該メチル化を決定する手段は、重亜硫酸塩含有試薬と、それぞれの場合で配列が、配列番号５〜配列番号２０から選択される配列の９塩基長、又はより好ましくは１８塩基長のセグメントと同一であるか、又はこれに相補的であるか、又はストリンジェントな条件若しくは高ストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする、１つ又は複数のオリゴヌクレオチドと、任意で記載のメチル化解析方法を実施及び評価するための取扱説明書とを含むのが好ましい。一実施形態では、当該オリゴヌクレオチドの塩基配列は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド、ＣｐＡジヌクレオチド又はＴｐＧジヌクレオチドを含む。
【０２０８】
さらなる実施形態において、上記キットは、ＣｐＧ位置特異的なメチル化解析を行うのに標準的な試薬をさらに含んでもよく、当該解析は、１つ又は複数の以下の技法を含む：ＭＳ−ＳＮｕＰＥ、ＭＳＰ、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ、ＣＯＢＲＡ、及び核酸シークエンシング。しかし、本発明に沿ったキットは、上述の成分の一部分だけを含有することもできる。
【０２０９】
好ましい実施形態において、キットは、ＤＮＡ変性バッファー、スルホン化バッファー、ＤＮＡ回収試薬又はキット（例えば析出カラム、限外濾過カラム、アフィニティカラム）、脱スルホン化バッファー、及びＤＮＡ回収成分から成る群から選択される、さらなる重亜硫酸変換試薬を含み得る。
【０２１０】
さらなる代替的な実施形態において、キットは、ポリメラーゼと、ポリメラーゼによって媒介されるプライマー伸長（ＰＣＲ等）のために最適化した反応バッファーとを別々のコンテナに入った状態で含有し得る。本発明の別の実施形態では、キットは、患者の生体サンプルを得る手段をさらに含む。患者の生体サンプルにおいて、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化を決定する手段を収容するのに適したコンテナをさらに含み、最も好ましくはキット結果を利用及び解釈するための取扱説明書をさらに含むキットが好ましい。好ましい実施形態では、キットは、（ａ）重亜硫酸試薬と、（ｂ）当該重亜硫酸試薬及び患者の生体サンプルを収容するのに適したコンテナと、（ｃ）それぞれの場合で配列が、配列番号５〜配列番号２０から選択される配列の９塩基長、又はより好ましくは１８塩基長のセグメントと同一であるか、又はこれに相補的であるか、又はストリンジェントな条件若しくは高ストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする、２つのオリゴヌクレオチドを含有する少なくとも１つのプライマーオリゴヌクレオチド組と、任意で（ｄ）キット結果を利用及び解釈するための取扱説明書とを含む。代替的な好ましい実施形態では、キットは、（ａ）重亜硫酸試薬と、（ｂ）当該重亜硫酸試薬及び患者の生体サンプルを収容するのに適したコンテナと、（ｃ）少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、及び／又は配列番号５〜配列番号２０の内の１つの前処理核酸配列及びこれに相補的な配列と同一であるか、又はこれとハイブリダイズする少なくとも９ヌクレオチド長又は１６ヌクレオチド長のＰＮＡ−オリゴマーと、任意で（ｄ）キット結果を利用及び解釈するための取扱説明書とを含む。
【０２１１】
代替的な実施形態では、キットは、（ａ）重亜硫酸試薬と、（ｂ）当該重亜硫酸試薬及び患者の生体サンプルを収容するのに適したコンテナと、（ｃ）それぞれの場合で配列が、配列番号５〜配列番号２０から選択される配列の９塩基長、又はより好ましくは１８塩基長のセグメントと同一であるか、又はこれに相補的であるか、又はストリンジェントな条件若しくは高ストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする、２つのオリゴヌクレオチドを含有する少なくとも１つのプライマーオリゴヌクレオチド組と、（ｄ）少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、及び／又は配列番号５〜配列番号２０の内の１つの前処理核酸配列及びこれに相補的な配列と同一であるか、又はこれとハイブリダイズする少なくとも９ヌクレオチド長又は１６ヌクレオチド長のＰＮＡ−オリゴマーと、任意で（ｅ）キット結果を利用及び解釈するための取扱説明書とを含む。
【０２１２】
またキットは、別々のコンテナに入った状態で、遮断、洗浄又はコーティングに適したバッファー又は溶液等の他の成分を含有してもよい。
【０２１３】
本発明の別の態様は、前立腺細胞増殖性障害、最も好ましくは前立腺癌の存在を決定する際に、及び／又はこれを診断する際に使用されるキットであって、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の転写レベルを測定する手段と、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化を決定する手段とを含む、前立腺細胞増殖性障害、最も好ましくは前立腺癌の存在を決定する際に、及び／又はこれを診断する際に使用されるキットに関する。
【０２１４】
ＣＯＢＲＡ（商標）解析に典型的な試薬（例えば典型的なＣＯＢＲＡ（商標）ベースキットで見出され得るような）には、これらに限定されないが、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉに関するＰＣＲプライマー、制限酵素及び適切なバッファー、遺伝子ハイブリダイゼーションオリゴ、対照ハイブリダイゼーションオリゴ、オリゴプローブのためのキナーゼ標識キット、及び標識ヌクレオチドが含まれ得る。ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）解析に典型的な試薬（例えば典型的なＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）ベースキットで見出され得るような）には、これらに限定されないが、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の重亜硫酸変換配列に関するＰＣＲプライマー、重亜硫酸特異的プローブ（例えばＴａｑＭａｎ（商標）又はＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（商標））、最適化したＰＣＲバッファー及びデオキシヌクレオチド、並びにＴａｑポリメラーゼが含まれ得る。
【０２１５】
Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ（商標）解析に典型的な試薬（例えば典型的なＭｓ−ＳＮｕＰＥ（商標）ベースキットで見出され得るような）には、これらに限定されないが、特定遺伝子（又は重亜硫酸処理ＤＮＡ配列又はＣｐＧアイランド）に関するＰＣＲプライマー、最適化したＰＣＲバッファー及びデオキシヌクレオチド、ゲル抽出キット、陽性対照プライマー、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の重亜硫酸変換配列に対するＭｓ−ＳＮｕＰＥ（商標）プライマー、（Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ反応のための）反応バッファー並びに標識ヌクレオチドが含まれ得る。
【０２１６】
ＭＳＰ解析に典型的な試薬（例えば典型的なＭＳＰベースキットで見出され得るような）には、これらに限定されないが、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の重亜硫酸変換配列に対するメチル化及び非メチル化ＰＣＲプライマー、最適化したＰＣＲバッファー及びデオキシヌクレオチド、並びに特異的プローブが含まれ得る。
【０２１７】
さらに、本発明のさらなる態様は、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子のメチル化を決定する手段を含む代替的キットであり、当該手段は、少なくとも１つのメチル化特異的制限酵素と、配列番号１〜配列番号４から成る群から選択される配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む配列の増幅に適した、１つ又は複数のプライマーオリゴヌクレオチド（好ましくは１つ又は複数のプライマー対）と、任意で記載のメチル化解析方法を実施及び評価するための取扱説明書とを含むのが好ましい。一実施形態では、当該オリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１〜配列番号４から成る群から選択される配列の少なくとも１８塩基長のセグメントと同一であるか、又はこれに相補的であるか、又はストリンジェントな条件若しくは高ストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする。
【０２１８】
さらなる実施形態において、上記キットは、消化断片の解析のための１つ又は複数のオリゴヌクレオチドプローブを含んでもよく、好ましくは当該オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜配列番号４から成る群から選択される配列の少なくとも１６塩基長のセグメントと同一であるか、又はこれに相補的であるか、又はストリンジェントな条件若しくは高ストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする。
【０２１９】
好ましい実施形態において、キットは、バッファー（例えば制限酵素、ＰＣＲ、保存バッファー又は洗浄バッファー）、ＤＮＡ回収試薬又はキット（例えば析出カラム、限外濾過カラム、アフィニティカラム）及びＤＮＡ回収成分から成る群から選択されるさらなる試薬を含み得る。
【０２２０】
さらなる代替的な実施形態において、キットは、ポリメラーゼと、ポリメラーゼによって媒介されるプライマー伸長（ＰＣＲ等）のために最適化した反応バッファーとを別々のコンテナに入った状態で含有し得る。本発明の別の実施形態では、キットは、患者の生体サンプルを得る手段をさらに含む。好ましい実施形態では、キットは、（ａ）メチル化感受性制限酵素試薬と、（ｂ）当該試薬及び患者の生体サンプルを収容するのに適したコンテナと、（ｃ）配列番号１〜配列番号４から成る群から選択される少なくとも１つの配列の少なくとも９塩基長のセグメントと同一であるか、又はこれに相補的であるか、又はストリンジェントな条件若しくは高ストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする、１つ又は複数の核酸又はペプチド核酸を含有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチド組と、任意で（ｄ）キット結果を利用及び解釈するための取扱説明書とを含む。
【０２２１】
代替的な好ましい実施形態において、キットは、（ａ）メチル化感受性制限酵素試薬と、（ｂ）当該試薬及び患者の生体サンプルを収容するのに適したコンテナと、（ｃ）配列番号１〜配列番号４から成る群から選択される配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む配列の増幅に適した少なくとも１つのプライマーオリゴヌクレオチド組と、任意で（ｄ）キット結果を利用及び解釈するための取扱説明書とを含む。
【０２２２】
代替的な実施形態では、キットは、（ａ）メチル化感受性制限酵素試薬と、（ｂ）当該試薬及び患者の生体サンプルを収容するのに適したコンテナと、（ｃ）配列番号１〜配列番号４から成る群から選択される配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む配列の増幅に適した少なくとも１つのプライマーオリゴヌクレオチド組と、（ｄ）配列番号１〜配列番号４から成る群から選択される配列の少なくとも９塩基長のセグメントと同一であるか、又はこれに相補的であるか、又はストリンジェントな条件若しくは高ストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする、１つ若しくは複数の核酸又はペプチド核酸を含有する少なくとも１つのオリゴヌクレオチド組と、任意で（ｅ）キット結果を利用及び解釈するための取扱説明書とを含む。
【０２２３】
またキットは、別々のコンテナに入った状態で、遮断、洗浄又はコーティングに適したバッファー又は溶液等の他の成分を含有してもよい。
【０２２４】
本発明はさらに、メチル化感受性制限酵素解析によって、被験者における前立腺細胞増殖性障害、最も好ましくは前立腺癌の存在の診断を与える際に使用するキットに関する。当該キットは、コンテナとＤＮＡマイクロアレイ成分とを含む。当該ＤＮＡマイクロアレイ成分は、複数のオリゴヌクレオチドが指定位置で固定化される表面であり、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＣｐＧメチル化部位を含む。当該オリゴヌクレオチドの少なくとも１つは、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＴＦＡＰ２Ｅ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＧＳＴＰｉから成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子に特異的であり、配列番号１〜配列番号４から成る群から選択される配列の２００ｂｐ未満であるが、少なくとも１５塩基対長の配列を含む。好ましくは、当該配列は、配列番号１〜配列番号４から成る群から選択される配列の８０ｂｐ未満であるが、少なくとも１５塩基対長である。当該配列は、配列番号１〜配列番号４から成る群から選択される配列の３０ｂｐ未満であるが、少なくとも２０塩基対長であるのがさらに好ましい。
【０２２５】
上記検査キットは、１つ又は複数のメチル化感受性制限酵素を含む制限酵素成分をさらに含むのが好ましい。
【０２２６】
さらなる実施形態において、上記検査キットはさらに、少なくとも１つのメチル化特異的制限酵素を含むことを特徴とし、オリゴヌクレオチドは、当該少なくとも１つのメチル化特異的制限酵素の制限部位を含む。
【０２２７】
キットは、ＤＮＡ濃縮に関して当該技術分野で知られている以下の成分の１つ又は幾つかをさらに含む：タンパク質成分（当該タンパク質は、メチル化ＤＮＡと選択的に結合する）、任意で好適な溶液中の三重鎖形成核酸成分である１つ又は複数のリンカー、ライゲーションを行うための物質又は溶液（例えばリガーゼ、バッファー）、カラムクロマトグラフィを行うための物質又は溶液、免疫学に基づく濃縮（例えば免疫沈降）を行うための物質又は溶液、核酸増幅（例えばＰＣＲ）を行うための物質又は溶液、カップリング試薬に適用される場合、溶液中で適用される場合の色素又は幾つかの色素、ハイブリダイゼーションを行うための物質又は溶液、及び／又は洗浄工程を行うための物質又は溶液。
【０２２８】
記載の本発明は、前立腺癌を検出又は診断するのに有用である物質の組成物をさらに提供する。当該組成物は、配列番号５〜配列番号２０で開示される核酸配列のセグメントの１８塩基対長の少なくとも１つの核酸と、１ｍＭ〜５ｍＭの塩化マグネシウム、１００μＭ〜５００μＭのｄＮＴＰ、０．５単位〜５単位のｔａｑポリメラーゼ、ウシ血清アルブミン、オリゴマー、特にオリゴヌクレオチド又はペプチド核酸（ＰＮＡ）−オリゴマー（当該オリゴマーは、それぞれの場合で、配列番号５〜配列番号２０の内の１つの前処理ゲノムＤＮＡ及びこれに相補的な配列と相補的であるか、又は適度にストリンジェントな条件若しくはストリンジェントな条件下でこれとハイブリダイズする少なくとも９ヌクレオチド長の少なくとも１つの塩基配列を含む）を含む群から選択される、１つ又は複数の物質とを含む。当該物質の組成物は、水溶液中で当該核酸を安定化するのに適切であり、且つ当該溶液内でのポリメラーゼベースの反応を可能にするバッファー溶液を含むことが好ましい。好適なバッファーは、当該技術分野で既知であり、市販されている。
【０２２９】
本発明のさらに好ましい実施形態において、上記少なくとも１つの核酸は、配列番号５〜配列番号２０で開示される核酸配列のセグメントの少なくとも５０塩基対長、１００塩基対長、１５０塩基対長、２００塩基対長、２５０塩基対長又は５００塩基対長である。
【０２３０】
本発明は、或る特定のその好ましい実施形態に従って具体的に記載されているが、以下の実施例は、本発明を例示しているにすぎず、その最も広範な解釈及び等価構成の原理及び範囲内に本発明を限定するようには意図されない。
【実施例】
【０２３１】
本発明の研究目的は、遠隔生体液中の前立腺癌（以下ＰＣａとも称する）に関するＤＮＡメチル化マーカーの測定の可能性を決定することであった。このプロセスでは、尿での高度なワークフロー流を利用して、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）（ＨＭ）法によって候補マーカーを解析し（Cottrell et al., Nucleic Acids Res. 2004 Jan 13;32(1):e10.）、ＰＣａが、血漿及び尿の両方でメチル化解析によって高感度に検出することができるＤＮＡを保有していることが実証された。このようにして、解析マーカーが、ＤＮＡメチル化解析に基づくＰＣａに関するスクリーニング検査の開発に適していたことが確定した。
【０２３２】
研究目的
本発明の研究目的は、ＰＣａのＤＮＡメチル化マーカーを遠隔体液で測定することができるか否かの検証を行うことであった。研究は、このような検査に最適な検体を確認し、且つ候補マーカーに関する特異度及び分析性能データを生じるように設計した。
【０２３３】
アッセイの候補マーカー及び位置
予備研究で決定されたように（本明細書では記載していない）、前立腺癌組織におけるそのメチル化に基づいて、ＲＡＳＳＦ２及びＴＦＡＰ２Ｅマーカーを同定した。ＧＳＴＰｉ及びＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋマーカーは、国際公開第２００５／０５４５１７号で公開された出願人による研究でこれまでに同定されている。
【０２３４】
ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）によってメチル化解析を行った。単離ゲノムを重亜硫酸処理し、非メチル化シトシンをウラシルに変換し、ここではメチル化シトシンは保存されている。それから、潜在的にメチル化されたＣｐＧジヌクレオチドを含む重亜硫酸処理ＤＮＡの断片をＰＣＲによって増幅する。プライマーは、潜在的にメチル化されたシトシン位置を全くカバーしない（即ちゲノムＣｐＧジヌクレオチドとハイブリダイズしない）。ＴＧジヌクレオチドとハイブリダイズする遮断オリゴヌクレオチドによって非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む断片の増幅を抑制する。したがって、ゲノムサンプルでメチル化したＤＮＡのみを増幅する。リアルタイム検出プローブ等のＰＣＲ反応での使用に適した、検出可能に標識されたプローブによって、増幅産物断片を検出する。
【０２３５】
アッセイのプライマー及びプローブは、表２に従い添付の配列表に挙げる。
【０２３６】
ＧＳＴＰｉ
染色体位置：１１ｑ１３
近傍の遺伝子（複数可）：ＧＳＴＰｉ  ＨＭフォワードプライマーは、エキソン１のすぐ上流にあり、リバースプライマーは、ＧＳＴＰｉのエキソン１のすぐ下流にある
ＲＡＳＳＦ２Ａ
染色体位置：２０ｐｔｅｒ−ｐ１２．１
近傍の遺伝子（複数可）：ＲＡＳＳＦ２のｖ．１転写物のイントロン１のＣｐＧアイランド内
ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ
染色体位置：６ｐ２２−２１．３
近傍の遺伝子（複数可）：イントロンがなくＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋと重複
ＴＦＡＰ２Ｅ
染色体位置：１ｐ３４．３
近傍の遺伝子（複数可）：ＴＦＡＰ２Ｅのイントロン３（ｔｘｎ開始点の下流約１１ｋｂ）及びＫＩＡＡ０３１９Ｌ  ｔｘｎ開始点の上流約２０ｋｂ（ＰＫＤ−１様遺伝子）内
【０２３７】
組織研究
最初に、正常組織、ＮＡＴ及びＰＣａでアッセイを検査した。ＨＭ組織検査で解析した候補マーカーは全て、正常血液及び正常前立腺組織に対して非常に特異的であった。これまでの研究と対照的に、前立腺の正常隣接腫瘍（ＮＡＴ）由来のＤＮＡが、前立腺腫瘍ＤＮＡとほぼ同程度メチル化することを観察した。ＮＡＴ（ＢＰＨを含有し得る）は、ＰＳＡ上昇がない前立腺腫瘍を保有しない患者から得られたＢＰＨ組織（ＭＳＰ組織検査における多くのＢＰＨ組織サンプル源）とは明らかに異なる。実際、ＮＡＴでのＧＳＴＰｉがメチル化しているということは、文献（Hanson et al.,2006）によって証明されている。
【０２３８】
ＰＣａに対する正常＋ＢＰＨにおけるマーカーの性能は、表３及び図１に挙げる。
【０２３９】
遠隔検体解析
リアルタイムＰＣＲアッセイにおいて検体均等物（１．５ｍｌ均等物）を最大にするために、各サンプルに対して各アッセイを二重で行い、この研究におけるアッセイの最大数を４とした。
【０２４０】
サンプル採取
この研究のために、本発明者らは、前立腺癌が生検で確認された９１人の男性、生検では癌が検出されなかった（その後ＢＰＨと診断された）５１人の男性、及び５０人の若くて健康な男性を含む、総数１９１人の男性から適合血漿及び尿を採取した。全ての検体では陽性クラスは、ＰＣａサンプルで構成されている。
【０２４１】
本発明の研究を設計する際に、１００％確実にＰＣａの存在を排除する検出方法は存在しないため、陰性クラスの定義が問題であった。生検は、少なくとも１０％の偽陰性診断率を有し（Djavan et al., 2000、Mian et al., 2002、Gupta et al., 2005、Hanley et al., 2006）、ＰＳＡ評価基準は、偽陰性及び偽陽性の両方を起こしやすい。この研究の第一目的は、遠隔生体液におけるＰＣａのメチル化マーカーの測定の実行可能性を明らかにすることであったので、本発明者らは、偽陽性の可能性が最小であった陰性クラスに注目した。結果として、若くて健康な男性は、「真」陰性クラスとして選抜した。前立腺癌の家族歴がない若くて健康な男性は、ＰＣａに関して真陰性であるはずであるということは合理的なものであった。
【０２４２】
ＰＣａ検査の一実施形態が、ＰＳＡに続く診断であるために、本発明者らは、生検陰性ＢＰＨサンプルの第２の陰性クラスを包含させた。このクラスにおける潜在的な交絡因子は、偽陰性生検の存在である可能性がある。
【０２４３】
５つのＰＣａ症例では、血漿サンプルのみを採取し、１０個のさらなる症例では、尿サンプルのみを採取した。複数部位でサンプルを採取した。前立腺マッサージの後に尿を採取し、ＰＣａの任意の治療前に、血漿サンプル及び尿サンプルの両方を得た。解析患者が、ＰＣａスクリーニング検査を使用する潜在的な患者を反映することを確かめるために、包含基準及び排除基準を設計した。
【０２４４】
生検を行った患者に、以下の包含基準及び排除基準を適用した：
包含基準：
・生検での兆候（ＰＳＡの上昇及び／又はＤＲＥによる疑い）
・生検をサンプル採取後１週間以内に予定した
・年齢４０歳〜８０歳
排除基準：
・前立腺癌の任意の前治療
・過去５年での癌又は重篤な病気の病歴
・尿道感染の症状
【０２４５】
対照群の健康な男性に、以下の基準を適用した：
包含基準：
・男性
・年齢１８歳〜３０歳
排除基準：
・前立腺癌又は前立腺疾患の症状の任意の前治療
・過去５年での癌又は重篤な病気の病歴
・尿道感染の症状
【０２４６】
患者データ及び腫瘍特徴
患者サンプルのグリーソンスコア（必要に応じて）は表４に列挙する。前立腺癌、ＨＧＰＩＮ及び生検陰性サンプルに対する平均ＰＳＡ値はそれぞれ、１８．２±３３．１、７．０±３．０及び８．８±５．２であった。前立腺の生検を介してサンプル採取後に、前立腺癌、ＨＧＰＩＮ及び生検陰性クラスを診断した。全てのサンプルクラスに対する生検コアの平均数は８であったが、提供者の間には幾らかの偏差が存在した。
【０２４７】
標準的なプロトコルに従って、ＤＮＡ抽出及び重亜硫酸処理を行った。各アッセイに対して、１．５ｍｌの検体均等物を二重に測定した。
【０２４８】
マーカー性能、概論
この研究の第一目的は、前立腺癌を非癌性状態と識別するために、５０歳を超える男性に２．５ｎｇ／ｍｌ以上のＰＳＡ検査に続く診断として標的化されたマーカーのパネルを開発することであった。このような検査は、優れた性能のために、ＰＳＡ検査と競合するより特異的な前立腺癌スクリーニング検査としてさらに展開することができる。本発明の研究では本発明者らは、２つの異なる方法でデータを解析した：（Ａ）本発明者らは、ＰＳＡ検査の後でマーカー性能を評価するために、前立腺癌及び生検陰性サンプルを使用し（診断的適用）、（Ｂ）本発明者らは、スクリーニング検査におけるマーカー性能を評価するために、前立腺癌及び全ての非癌（生検陰性及び健康な）サンプルを使用した（スクリーニング適用）。本発明者らは、血漿及び尿に対するマーカー性能を別々に報告し、また、個々のマーカー及びマーカーパネルに関するデータ解析を与える。全てのデータは、対数平均した生のメチル化値として表す。
【０２４９】
一次スクリーニング検査として、５０歳を超える男性でマーカーパネルは、ＰＳＡに比較して特異度が改善され、ＰＣａ同定に好ましい。全てのスクリーニング適用解析では、陽性クラスとしてＰＣａサンプルを使用する。本発明の研究のために、本発明者らは、２つの代替的な陰性クラスへのスクリーニング適用に関するデータを解析した。第１の陰性クラスでは、非検出ＰＣａの見込みが最小である５０人の若くて健康な男性を解析した。この陰性クラスは、「真」の検査陰性を示すが、標的となるＰＣａスクリーニング集団に年齢が適合せず、偽陽性の可能性があるクラス、例えばＢＰＨを全く含まない。したがって本発明者らは、５０人の若くて健康な対照全てと５１人の生検陰性の対照全てとを１０１人のサンプルサイズ陰性クラスとして解析した第２の解析を行った。
【０２５０】
平均すると、米国では毎年およそ20,000,000回ＰＳＡ検査が行われ、およそ1,000,000症例のみが生検へと移行する（そのおよそ750,000生検は不必要なものである）。したがって、現在ＰＳＡによってスクリーニングされている個体の５％未満が、ＰＳＡの上昇−ＢＰＨ陽性によって表される陰性クラスになるが、標的となるスクリーニング集団の大部分は、低ＰＳＡ陰性クラスになる。若くて健康な男性のみの陰性クラスでは、本発明者らのマーカーの識別能が過大評価される可能性があるが、若くて健康な男性と年齢を適合した生検陰性の男性との複合陰性クラスでは、本発明者らのマーカーの識別能が過小評価される可能性がある。
【０２５１】
前立腺癌患者 vs. 生検陰性患者及び健康な対照個体由来の前立腺マッサージ後の尿におけるリアルタイムＰＣＲによって検査した、個々の（単一）マーカーの感度及び特異度を表５に示す。図２は、ＰＣａ及び陰性クラス1（健康な個体）の前立腺マッサージ後の尿のＨＭリアルタイムＰＣＲアッセイを示している。図３は、ＰＣａ及び陰性クラス11（健康な個体及び生検陰性個体）の前立腺マッサージ後の尿のＨＭリアルタイムＰＣＲアッセイを示している。
【０２５２】
前立腺癌患者 vs. 生検陰性患者、及び健康な対照個体由来の血漿におけるリアルタイムＰＣＲによって検査した、個々の（単一）マーカーの感度及び特異度を表６に示す。図４は、ＰＣａ及び陰性クラス1（健康な個体）の血漿のＨＭリアルタイムＰＣＲアッセイを示している。図５は、ＰＣａ及び陰性クラス11（健康な個体及び生検陰性個体）の血漿のＨＭリアルタイムＰＣＲアッセイを示している。
【０２５３】
表７で示されるように、全ての陰性クラスの比較において、及び全てのマーカーに対して、尿はより感度が高い検体であった。
【０２５４】
マーカーとグリーソンスコアとの相関関係
メチル化マーカーＤＮＡの量の増大は、血漿中の全てのマーカーでグリーソンスコアの増大と相関があった。このことは、尿中のメチル化マーカーＤＮＡの量が高いサンプルでは真実であったが（特にＴＦＡＰ２Ｅ及びＲＡＳＳＦ２Ａマーカーを参照されたい）、概して相関関係は、血漿由来のＤＮＡよりも尿由来のＤＮＡのほうが強くなかった。ＰＳＡが上昇した（４ｎｇ／ｍｌ超）患者におけるＰＣａのマーカーとして、ＰＳＡはグリーソンスコアの増大とも相関関係があった。
【０２５５】
尿においてＰＣａを陰性クラスＩ（健康な男性）と識別する、スクリーニングマーカーパネルの性能は表８に示される。
【０２５６】
尿においてＰＣａを陰性クラスＩＩ（健康な男性及び生検陰性の男性）と識別する、スクリーニングマーカーパネルの性能は表９に示される。
【０２５７】
血漿においてＰＣａを陰性クラスＩ（健康な男性）と識別する、スクリーニングマーカーパネルの性能は表１０に示される。
【０２５８】
血漿においてＰＣａを陰性クラスＩＩ（健康な男性及び生検陰性の男性）と識別する、スクリーニングマーカーパネルの性能は表１１に示される。
【０２５９】
診断的適用におけるマーカー性能：ＰＳＡ後
ＰＳＡ検査に続く診断として、マーカーによって、ＰＳＡの上昇（２．５ｎｇ／ｍｌ超）のために危険性が高い個体として分類された５０歳を超える男性においてＰＣａが同定されるのが好ましい。これは、異なる適用及び解析であり、スクリーニング検査に比べて識別の増大を必要とする。この適用における偽陽性は、ＰＳＡの上昇、生検陰性ＢＰＨクラスから生じる。また、ＰＣａサンプルは陽性クラスを表す。適用後の診断のために、本発明者らは、５１個の生検陰性サンプルから構成される単一陰性クラスを使用してデータを解析した。前立腺癌患者及び生検陰性患者由来の前立腺マッサージ後の尿及び血漿におけるリアルタイムＰＣＲによって検査したマーカーのＡＵＣは、表１２に示される。
【０２６０】
上記表から、解析した全てのメチル化マーカーに対して、尿はより感度が高い検体であったことが分かる。総ＰＳＡ（生検のための＞４ｎｇ／ｍｌ指標以外に提供される任意のさらなる情報が与えられるかどうかを決定するために、ここでさらなるマーカーとして処理した）に対して、尿と血漿との感度に違いはなかった。
【０２６１】
マーカーパネルの性能
正確性の改善を与えるために、マーカーの組合せを定性的に且つ定量的に評価した。
【０２６２】
表１３は、尿においてＰＣａを生検陰性と識別する、診断マーカーパネルの性能を示す。
【０２６３】
表１４は、血漿においてＰＣａを生検陰性と識別する、診断マーカーパネルの性能を示す。
【０２６４】
考察
９１人のＰＣａ患者、５１人の生検陰性患者（ＢＰＨと診断された）及び５０人の若くて健康な男性から採取した血漿サンプル及び／又は尿サンプルで研究を行った。ＨＭ（商標）リアルタイムＰＣＲアッセイを使用して、候補マーカーのＤＮＡメチル化を測定した。メチル化したマーカーＤＮＡの量は、血漿及び尿の両方のＰＣａと相関関係にあり、尿のＤＮＡはより大きい感度を示した。スクリーニング検査（尿検体を使用した、ＰＣａ癌と、健康な対照由来との識別）として、候補アンカーマーカーＧＳＴＰｉ、ＲＡＳＳＦ２Ａ、ＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋ及びＴＦＡＰ２Ｅはそれぞれ、９６％の特異度で６３％、７４％、６９％及び４７％の感度を有する。ＰＳＡ検査に続く診断（全てＰＳＡが上昇した、ＰＣａと生検陰性対照との識別）として、マーカーはそれぞれ、９５％の特異度で２３％、１８％、２８％及び２３％の感度を有する。ＲＡＳＳＦ２Ａ及びＨＩＳＴ１Ｈ４Ｋマーカーの定量スクリーニングパネルによって、健康な個体に対して８８％の特異度で９４％の感度が得られた。ＧＳＴＰｉ及びＰＳＡマーカーの定量診断パネルによって、４５％の特異度で８３％の感度が得られた。これらのマーカーの性能を、スクリーニング集団におけるＰＳＡの性能と十分比較する（６０歳未満の男性に関して９８％の特異度で１８％の感度、及び６０歳を超える男性に関して９４％の特異度で１９％の感度）（Punglia et al., 2003）。全てのマーカーのメチル化が、血漿ＤＮＡにおけるグリーソンスコアと十分相関関係があったが、その相関は、尿ＤＮＡではあまり強くなかった。
【０２６５】
結論
本発明の研究の完了により、メチル化ＤＮＡに基づく前立腺癌バイオマーカーを血漿及び尿で測定することができ、尿のＤＮＡが血漿のＤＮＡよりも大きい感度を示すことが実証された。さらに、ＰＣａ患者を健康な対照及び良性前立腺過形成（ＢＰＨ）を伴う患者と識別するＤＮＡメチル化マーカーを同定した。本発明の研究の主な結論は以下のようなものである：
・前立腺癌のメチル化マーカーは、ＰＣａ患者由来の血漿及び尿の両方で測定することができる。
・ＰＣａ患者とＰＣａを伴わない患者とを識別するマーカーの同定。
【０２６６】
【表１】
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【０２６７】
【表２】
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【０２６８】
【表３】
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【０２６９】
【表４】
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【０２７０】
【表５】
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【０２７１】
【表６】
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【０２７２】
【表７】
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【０２７３】
【表８】
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【０２７４】
【表９】
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【０２７５】
【表１０】
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【０２７６】
【表１１】
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【０２７７】
【表１２】
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【０２７８】
【表１３】
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【０２７９】
【表１４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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