(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
処置の必要な哺乳動物被験体におけるストレス性尿失禁を処置するための医薬品の製造のための方法であって、該方法は、
（ａ）ヒト由来の骨格筋細胞を、１０℃より低い温度に冷却し、該細胞を１〜７日間保存する工程；
（ｂ）該ヒト骨格筋細胞を、第１の細胞培養容器中で３０〜１２０分間懸濁して、細胞を該第１の細胞培養容器に接着させる工程；
（ｃ）該第１の細胞培養容器から第２の細胞培養容器へと、非接着細胞を含む培地を移す工程；
（ｄ）該培地中の該非接着細胞を、該第２の細胞培養容器の壁に付着させる工程；
（ｅ）該第２の細胞培養容器の壁から該細胞を単離する工程であって、ここで該単離される細胞は、筋由来前駆細胞（ＭＤＣ）である、工程；
（ｆ）該細胞を培養して、該細胞数を増やす工程；
（ｇ）該ＭＤＣを、−３０℃より低い温度に凍結する工程；および
（ｈ）該ＭＤＣを融解する工程；
を包含する、方法。
【請求項２】
前記哺乳動物被験体はヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ヒト骨格筋細胞は、尿路疾患を有さないヒト被験体に由来する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヒト骨格筋細胞は、尿路疾患を有すヒト被験体に由来する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
処置の必要な哺乳動物被験体における、ストレス性尿失禁と関連した症状を改善するための医薬品の製造のための方法であって、該方法は、
（ａ）ヒト由来の骨格筋細胞を、第１の細胞培養容器中で３０〜１２０分間懸濁して、細胞を該第１の細胞培養容器に接着させる工程；
（ｂ）該第１の細胞培養容器から第２の細胞培養容器へと、非接着細胞を含む培地を移す工程；
（ｃ）該培地中の該非接着細胞を、該第２の細胞培養容器の壁に付着させる工程；および
（ｄ）該第２の細胞培養容器の壁から該細胞を単離する工程であって、ここで該単離される細胞は、ＭＤＣである、工程；
を包含する、方法。
【請求項６】
前記哺乳動物はヒトである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＭＤＣを培養して、該ＭＤＣの数を増やす、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
哺乳動物被験体におけるストレス性尿失禁を処置するために投与するのに有用な、筋由来細胞（ＭＤＣ）を含む細胞集団を調製するための方法であって、該方法は、
（ａ）ヒト骨格筋から単離された細胞を、第１の細胞培養容器において、第１の細胞集団を該容器に接着させかつ第２の細胞集団を接着させずに該容器中の培養培地中に残しておくようにするに十分な持続時間にわたって、懸濁する工程；
（ｂ）該培養培地および第２の細胞集団を、該第１の細胞培養容器から第２の細胞培養容器へと移す工程；
（ｃ）該第２の細胞集団由来の細胞を、該第２の細胞培養容器に付着させる工程；
（ｄ）該第２の細胞培養容器に付着した該細胞を単離して、該ＭＤＣを含む細胞集団を得る工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連する出願）
本願は、２００７年１月１１日に出願された米国仮特許出願第６０／８８４，４７８号からの優先権を主張する。米国仮特許出願第６０／８８４，４７８号は、その全体が本明細書中に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、筋肉由来前駆細胞（ＭＤＣ）およびＭＤＣの組成物、ならびに身体組織（特に、尿道の筋肉および尿道周囲の筋肉のような軟組織）の増大におけるそれらの使用に関する。特に、本発明は、軟組織への導入後に長期生存を示す筋肉由来前駆細胞、ＭＤＣを単離するための方法、およびヒトもしくは動物の軟組織（上皮組織、脂肪組織、神経組織、器官、筋組織、靱帯、および軟骨組織が挙げられる）の増大のためにＭＤＣ含有組成物を使用するための方法に関する。本発明はまた、機能状態（例えば、ストレス性尿失禁もしくは尿失禁）の処置のための筋肉由来前駆細胞の新規な使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ストレス性尿失禁（ＳＵＩ）は、よくある状態であり、動作、作業、嚔もしくは咳の際に尿が不随意に漏れることとして特徴付けられる（非特許文献１）。ＳＵＩの原因は、機能不全的な、関係する損傷ならびに／もしくは加齢、ホルモン状態、および経膣分娩から生じる骨盤底部損傷の結果として生じ得る筋肉と関連神経の機能障害である。多くの要素からなる原因に起因して、ある様式に限定される単一の処置選択肢は、現在では存在しない。
【０００４】
最小限に侵襲性の処置選択肢としての尿道周囲の注射可能物質の使用は、局所麻酔下で外来患者を基本に行われ得る。この処置方法は、侵襲性外科手術的アプローチ（例えば、尿道吊り上げ術）と比較した場合、近い期間でよりコスト効率的であり、入院期間がより短く、手術室使用時間が短くなり、そして一般に、合併症が少ない（非特許文献２）。しかし、分解、再吸収、および／もしくは移動、ならびに他の障害（例えば、膀胱出口閉塞およびアレルギー反応）が原因の、長期間の容積を増す効果の喪失に起因して、複数回注射の必要性のような欠点を有する。従って、長期間持続する、広い範囲の宿主組織と適合性であり、かつ最小限の炎症、瘢痕、および／もしくはインプラント部位を取り囲む組織の硬直をもたらす、他の異なる泌尿器の増強物質が必要である。
【０００５】
ラットから単離された筋由来細胞は、尿失禁のためのいくつかの成功したモデルを示した（非特許文献３および非特許文献４）。本発明は、ＳＵＩ、および他の尿路病状のための注射可能な処置として、ヒト骨格筋由来細胞（ＭＤＣ）の使用を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ａｂｒａｍｓ  Ｐら，Ｎｅｕｒｏｕｒｏｌ  Ｕｒｏｄｙｎ  ２００２；２１（２）：１６７−１７８
【非特許文献２】Ｂｅｒｍａｎ  ＣＪら，Ｊ  Ｕｒｏｌ  １９９７；１５７（１）：１２２−１２４
【非特許文献３】Ｃａｎｎｏｎ  ＴＷら，Ｕｒｏｌｏｇｙ  ２００３；６２（５）：９５８−９６３
【非特許文献４】Ｌｅｅ  ＪＹら．  Ｉｎｔ  Ｕｒｏｇｙｎｅｃｏｌ  Ｊ  Ｐｅｌｖｉｃ  Ｆｌｏｏｒ  Ｄｙｓｆｕｎｃｔ  ２００３；１４（１）：３１−３７；ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ３７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明の目的は、移植後に長期生存を示す、新規なヒト筋肉由来前駆細胞（ＭＤＣ）およびヒトＭＤＣ組成物を提供することである。本発明のＭＤＣおよび上記ＭＤＣを含む組成物は、早期前駆筋細胞（すなわち、前駆細胞マーカー（例えば、デスミン、Ｍ−カドヘリン、ＭｙｏＤ、ミオゲニン、ＣＤ３４およびＢｃｌ−２）を発現する筋由来幹細胞）を含む。さらに、これら初期前駆筋細胞は、Ｆｌｋ−１、Ｓｃａ−１、ＭＮＦおよびｃ−ｍｅｔ細胞マーカーを発現するが、ＣＤ４５細胞マーカーもｃ−Ｋｉｔ細胞マーカーも発現しない。
【０００８】
本発明の別の目的は、出発筋細胞集団からヒト筋肉由来前駆細胞を単離しかつ富化するための方法を提供することである。これら方法は、軟組織の部位への移植もしくは導入の後に長期間の生存性を有するヒトＭＤＣの富化を生じる。本発明に従うＭＤＣ集団は、前駆細胞マーカー（例えば、デスミン、Ｍ−カドヘリン、ＭｙｏＤ、ミオゲニン、ＣＤ３４、およびＢｃｌ−２）を発現する細胞が特に富化されている。このＭＤＣ集団はまた、Ｆｌｋ−１、Ｓｃａ−１、ＭＮＦ、およびｃ−ｍｅｔ細胞マーカーを発現するが、ＣＤ４５もｃ−Ｋｉｔ細胞マーカーも発現しない。
【０００９】
本発明のさらに別の目的は、移植のためのポリマーキャリアの必要性も特別な培養培地の必要性もなしに、ＭＤＣを使用するための方法、ならびに筋肉軟組織もしくは非筋肉軟組織（平滑筋を含む）、および種々の器官組織の増大のための、ＭＤＣを含む組成物を提供することである。このような方法としては、軟組織への導入によって、例えば、組織への直接注射によって、もしくは組成物の全身分布によって、ＭＤＣ組成物の投与を包含する。好ましくは、軟組織としては、非骨性身体組織が挙げられる。より好ましくは、軟組織としては、非横紋筋および非骨性身体組織が挙げられる。最も好ましくは、軟組織としては、非筋肉身体組織、非骨性身体組織が挙げられる。本明細書で使用される場合、増大とは、身体組織の大きさもしくは重量を満たすか、容積を高めるか、支持するか、大きくするか、拡げるか、または増加させることをいう。
【００１０】
本発明の別の目的は、皮膚においてまたは内部軟組織もしくは器官において、裂溝、開口部、くぼみ（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）、創傷などを生じる傷害、創傷、外科手術、外傷、非外傷、もしくは他の手順の後に、軟組織（筋由来軟組織もしくは非筋由来軟組織のいずれか）を増大させるための方法を提供する。
【００１１】
本発明のさらに別の目的は、尿路疾患および関連症状のためのヒトＭＤＣに基づく処置を提供することである。ＭＤＣを含む薬学的組成物およびＭＤＣを含む組成物は、尿路病状の処置のために使用され得る。これら薬学的組成物は、単離されたヒトＭＤＣを含む。これらＭＤＣはその後、単離後の細胞培養によって増大させられ得る。本発明の一実施形態において、これらＭＤＣは、上記薬学的組成物が必要な被験体に送達する前に凍結される。
【００１２】
一実施形態において、上記ヒトＭＤＣおよびその組成物が尿失禁を処置するために使用される場合、これらは、上記尿道に直接注射される。好ましくは、上記ヒトＭＤＣおよびその組成物は、尿道周囲の筋肉に注射され得る。別の実施形態において、ヒトＭＤＣおよびその組成物は、尿路疾患の少なくとも１つの症状を改善するために使用され得る。これらの症状としては、尿失禁、尿路感染、頻尿症、疼痛性排尿、排尿時の灼熱感、疲労、振戦、混濁尿、血尿および腎疾患が挙げられる。
【００１３】
ヒトＭＤＣは、骨格筋の生検から単離される。一実施形態において、上記生検由来の骨格筋は、１〜６日間保存され得る。この実施形態の一局面において、上記生検由来の骨格筋は、４℃で保存される。次いで、上記ＭＤＣは、予備平板培養（ｐｒｅ−ｐｌａｔｅ）もしくは単一平板培養（ｓｉｎｇｌｅ  ｐｌａｔｅ）技術を使用して単離される。上記予備平板培養技術を使用して、骨格筋組織由来の骨格筋細胞の懸濁物は、上記骨格筋細胞懸濁物の線維芽細胞が接着する第１の容器において平板培養される。次いで、非接着性細胞は、第２の容器に再平板培養され、再平板培養する工程は、細胞の１５〜２０％が上記第１の容器に接着した後に行われる。この再平板培養する工程は、少なくとも１回反復されなければならない。上記ＭＤＣは、それによって単離され、そして上記哺乳動物被験体の食道に投与され得る。
【００１４】
上記単一平板培養技術を使用して、上記細胞は細かく分けられ、コラゲナーゼ、ディスパーゼ、別の酵素もしくは酵素の組み合わせを使用して消化される。上記細胞から酵素を洗浄した後に、上記細胞は、約３０分間〜約１２０分間の間にわたって、培養培地中、フラスコの中で培養される。この期間の間、上記「迅速に接着する細胞」とは、上記フラスコもしくは容器の壁に貼り付く一方で、上記「ゆっくりと接着する細胞」もしくはＭＤＣは、懸濁物の中に残っている。上記「ゆっくりと接着する細胞」は、第２のフラスコもしくは容器に移され、そしてその中で１〜３日間の期間にわたって培養される。この第２の期間の間、上記「ゆっくりと接着する細胞」もしくはＭＤＣは、上記第２のフラスコもしくは容器の壁に貼り付く。
【００１５】
本発明の別の実施形態において、これらＭＤＣは、任意の細胞数にまで増加させられる。この実施形態の好ましい局面において、上記細胞は、約１０〜２０日間の間にわたって、新たな培養培地中で増加させられる。より好ましくは、上記細胞は、１７日間にわたって増加させられる。
【００１６】
上記ＭＤＣは、増加させられようと増加させられなかろうと、使用前に一定期間にわたって輸送もしくは保存するために、保護され得る。一実施形態において、上記ＭＤＣは凍結される。好ましくは、上記ＭＤＣは、約−２０℃〜−９０℃の間で凍結される。より好ましくは、上記ＭＤＣは、約−８０℃で凍結される。これら凍結ＭＤＣは、薬学的組成物として使用される。
【００１７】
本発明によって与えられるさらなる目的および利点は、詳細な説明および本明細書中以下の例示から明らかである
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
処置の必要な哺乳動物被験体における尿路疾患処置をするための方法であって、該方法は、
（ａ）ヒトから骨格筋細胞を単離する工程；
（ｂ）該細胞を、１０℃より低い温度に冷却し、該細胞を１〜７日間保存する工程；
（ｃ）該ヒト骨格筋細胞を、第１の細胞培養容器中で３０〜１２０分間懸濁する工程；
（ｄ）該第１の細胞培養容器から第２の細胞培養容器へと、培地を移す工程；
（ｅ）該培地中に残っている細胞を、該第２の細胞培養容器の壁に付着させる工程；
（ｆ）該第２の細胞培養容器の壁から該細胞を単離する工程であって、ここで該単離される細胞は、筋由来前駆細胞（ＭＤＣ）である、工程；
（ｇ）該細胞を培養して、該細胞数を増やす工程；
（ｈ）該ＭＤＣを、−３０℃より低い温度に凍結する工程；および
（ｉ）該ＭＤＣを融解し、該ＭＤＣを、該哺乳動物被験体の尿路に投与する工程；
を包含し、それによって、処置の必要な哺乳動物被験体における尿路疾患を処置する、方法。
（項目２）
前記哺乳動物被験体はヒトである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ヒト骨格筋細胞は、前記尿路疾患が前記ヒト被験体において始まる前に、該ヒト被験体から単離される、項目２に記載の方法。
（項目４）
前記ヒト骨格筋細胞は、前記尿路疾患が前記ヒト被験体において始まった後に、該ヒト被験体から単離される、項目２に記載の方法。
（項目５）
前記ＭＤＣは、該ＭＤＣを尿道に注射することによって投与される、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記ＭＤＣは、尿道周囲の筋肉に注射される、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記尿路疾患は、尿失禁である、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記尿失禁は、ストレス性尿失禁である、項目６に記載の方法。
（項目９）
処置の必要な哺乳動物被験体における、尿路疾患と関連した少なくとも１つの症状を改善するための方法であって、該方法は、
（ａ）骨格筋細胞をヒトから単離する工程；
（ｂ）該ヒト骨格筋細胞を、第１の細胞培養容器中で３０〜１２０分間懸濁する工程；
（ｃ）該第１の細胞培養容器から第２の細胞培養容器へと、培地を移す工程；
（ｄ）該培地中に残っている細胞を、該第２の細胞培養容器の壁に付着させる工程；
（ｅ）該第２の細胞培養容器の壁から該細胞を単離する工程であって、ここで該単離される細胞は、ＭＤＣである、工程；および
（ｆ）該ＭＤＣを、該哺乳動物被験体の尿路に投与する工程；
を包含し、
それによって、処置の必要な哺乳動物被験体における尿路疾患と関連した少なくとも１つの症状を改善する、方法。
（項目１０）
前記症状は、尿失禁、尿路感染、頻尿症、疼痛性排尿、排尿時の灼熱感、疲労、振戦、混濁尿、血尿、および腎感染からなる群より選択される、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記ＭＤＣは、該ＭＤＣを前記尿道に注射することによって投与される、項目９に記載の方法。
（項目１２）
前記ＭＤＣは、尿道周囲の筋肉に注射される、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記哺乳動物はヒトである、項目９に記載の方法。
（項目１４）
前記哺乳動物被験体の尿路に投与される前に、前記ＭＤＣを培養して、該ＭＤＣの数を増やす、項目９に記載の方法。
（項目１５）
処置の必要な哺乳動物被験体における尿路疾患を処置するための方法であって、該方法は、
（ａ）ヒト骨格筋組織由来の骨格筋細胞の懸濁物を、該骨格筋細胞懸濁物の線維芽細胞が接着する第１の容器の中に平板培養する工程、
（ｂ）工程（ａ）からの非接着細胞を第２の容器の中に再平板培養する工程であって、ここで該再平板培養する工程は、細胞の１５〜２０％が該第１の容器に接着した後に行われる、工程；
（ｃ）工程（ｂ）を少なくとも１回反復する工程；
（ｄ）該骨格筋由来ＭＤＣを単離し、そして該ＭＤＣを、該哺乳動物被験体の尿路に投与する工程；
を包含し、それによって、処置の必要な哺乳動物被験体における尿路疾患を処置する、方法。
（項目１６）
前記哺乳動物被験体はヒトである、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
前記骨格筋細胞は、前記尿路疾患が前記ヒト被験体において始まる前に、該ヒト被験体から単離される、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記骨格筋細胞は、前記尿路疾患が前記ヒト被験体において始まった後に、該ヒト被験体から単離される、項目１６に記載の方法。
（項目１９）
前記ＭＤＣは、該ＭＤＣを前記尿道に注射することによって投与される、項目１５に記載の方法。
（項目２０）
前記ＭＤＣは、尿道周囲の筋肉に注射される、項目１５に記載の方法。
（項目２１）
前記尿路疾患は尿失禁である、項目１５に記載の方法。
（項目２２）
前記尿失禁はストレス性尿失禁である、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
処置の必要な哺乳動物被験体における尿路疾患と関連する少なくとも１つの症状を改善するための方法であって、該方法は、
（ａ）骨格筋組織由来の骨格筋細胞の懸濁物を、該骨格筋細胞懸濁物の線維芽細胞が接着する第１の容器の中に平板培養する工程；
（ｂ）工程（ａ）からの非接着細胞を、第２の容器の中に再平板培養する工程であって、ここで該再平板培養する工程は、細胞の１５〜２０％が該第１の容器に接着した後に行われる、工程；
（ｃ）工程（ｂ）を少なくとも１回反復する工程；
（ｄ）該骨格筋由来ＭＤＣを単離し、該ＭＤＣを該哺乳動物被験体の尿路に投与する工程；を包含し、それによって、処置の必要な哺乳動物被験体における尿路疾患と関連する少なくとも１つの症状を改善する、方法。
（項目２４）
前記症状は、尿失禁、尿路感染、頻尿症、疼痛性排尿、排尿時の灼熱感、疲労、振戦、混濁尿、血尿および腎感染からなる群より選択される、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記ＭＤＣは、該ＭＤＣを前記尿道に注射することによって投与される、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
前記ＭＤＣは、尿道周囲の筋肉に注射される、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
前記哺乳動物はヒトである、項目２３に記載の方法。
（項目２８）
前記哺乳動物被験体の尿路に投与される前に、前記ＭＤＣを培養して、該ＭＤＣの数を増す、項目２３に記載の方法。
（項目２９）
処置の必要な哺乳動物被験体における尿路疾患を処置するための方法であって、該方法は、筋由来細胞（ＭＤＣ）を含む細胞集団を、該哺乳動物被験体の尿路に投与する工程を包含し、ここで該ＭＤＣを含む細胞集団は、以下の工程：
（ａ）ヒト骨格筋から単離される細胞を、第１の細胞培養容器中で、第１の細胞集団を該容器に接着させかつ第２の細胞集団を接着させずに該容器中の培養培地中に残しておくようにするに十分な持続時間にわたって、懸濁する工程；
（ｂ）該培養培地および第２の細胞集団を、第１の細胞培養容器から第２の細胞培養容器へと移す工程；
（ｃ）該第２の細胞集団由来の細胞を、該第２の細胞培養容器に付着させる工程；
（ｄ）該第２の細胞培養容器に付着した該細胞を単離して、ＭＤＣを含む該細胞集団を得る工程、
を包含するプロセスによって得られたものである、方法。
（項目３０）
哺乳動物被験体における尿路疾患を処置するために投与するのに有用な、筋由来細胞（ＭＤＣ）を含む細胞集団を調製するための方法であって、該方法は、
（ａ）ヒト骨格筋から単離された細胞を、第１の細胞培養容器において、第１の細胞集団を該容器に接着させかつ第２の細胞集団を接着させずに該容器中の培養培地中に残しておくようにするに十分な持続時間にわたって、懸濁する工程；
（ｂ）該培養培地および第２の細胞集団を、該第１の細胞培養容器から第２の細胞培養容器へと移す工程；
（ｃ）該第２の細胞集団由来の細胞を、該第２の細胞培養容器に付着させる工程；
（ｄ）該第２の細胞培養容器に付着した該細胞を単離して、該ＭＤＣを含む細胞集団を得る工程、
を包含する、方法。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
特許もしくは特許出願のファイルは、少なくとも１つの、カラーで製作される写真複製物を含む。カラーの写真複写物を有するこの特許もしくは特許出願のコピーは、要求および必要な費用の支払いに応じて、米国特許商標庁によって提供される。
【００１９】
添付された図面の図は、本発明をさらに記載するためにかつその種々の局面の明確化を介してその理解を補助するために提示される。
【図１】図１は、ヒトＭＤＣで処置したラットにおいて、コントロールより高い漏出時圧を示す棒グラフである。
【図２Ａ】図２Ａは、コントロールラットにおける近位尿道括約筋の光学顕微鏡写真である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ヒトＭＤＣで処置したラットにおける近位尿道括約筋の光学顕微鏡写真である。
【図３】図３は、ヒト特異的核抗体（ｌａｍｉｎｓ  Ａ／Ｃ）での免疫蛍光標識を示し、ヒトＭＤＣ注射組織（１００×）における横紋括約筋層内に組み込まれるヒト核の存在を明らかにする。矢印は、個々の核を指す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ヒトＭＤＣおよびこのような細胞を使用して、損傷した組織を再構築することによって、接合および内在する括約筋機能を改善する可能性を有する、容積を増す特性を有する組織を生成するための方法を提供する。本発明は、尿路障害（失禁およびストレス性尿失禁が挙げられる）を処置するための方法をさらに提供する。ヒト筋由来細胞（ＭＤＣ）の成体組織からの単離は、確立された尿道括約筋傷害モデル内で機能的成功を達成することができる。
【００２１】
（筋由来細胞および組成物）
本発明は、身体組織（好ましくは、軟組織）への移植の後に長期間の生存率を示す初期前駆細胞（本明細書において、筋肉由来前駆細胞もしくは筋由来幹細胞ともいわれる）から構成されるＭＤＣを提供する。本発明のＭＤＣを得るために、筋外植片（好ましくは、骨格筋）は、動物ドナーから（好ましくは、哺乳動物（ラット、イヌおよびヒトが挙げられる））から得られる。この外植片は、筋前駆細胞の「残り」を含む構造的かつ機能的合胞細胞として働く（Ｔ．Ａ．Ｐａｒｔｒｉｄｇｅら，１９７８，Ｎａｔｕｒｅ  ７３：３０６−８；Ｂ．Ｈ．Ｌｉｐｔｏｎら，１９７９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０５：１２９２４）。
【００２２】
初代筋組織から単離された細胞は、線維芽細胞、筋原細胞、脂肪細胞、造血性前駆細胞、および筋肉由来前駆細胞の混合物を含む。筋由来集団の前駆細胞は、Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒらの米国特許第６，８６６，８４２号に記載されるような、コラーゲンコーティング組織フラスコ上で、初代筋細胞の示差的接着特性を使用して、富化され得る。接着するのが遅い細胞は、形態的に丸く、高レベルのデスミンを発現し、そして多核性筋管へと融合しかつ分化する能力を有する傾向がある（Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒらの米国特許第６，８６６，８４２号）。これら細胞の亜集団は、３’，５’−ｃＡＭＰ、ならびに骨形成系統および筋形成系統に依存して、アルカリホスファターゼ、上皮小体ホルモンの増大したレベルをインビトロで発現することによって、組換えヒト骨形態タンパク質２（ｒｈＢＭＰ−２）に応答することが示された（Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒらの米国特許第６，８６６，８４２号；Ｔ．Ｋａｔａｇｉｒｉら，１９９４，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１２７：１７５５−１７６６）。本発明の一実施形態において、予備平板培養手順は、迅速に接着する細胞をゆっくりと接着する細胞（ＭＤＣ）から区別するために使用され得る。本発明によれば、迅速に接着する細胞（ＰＰ１−４）およびゆっくりと接着する丸いＭＤＣ（ＰＰ６）の集団は、骨格筋外植片から単離および富化し、ゆっくりと接着する細胞の中で多能性細胞の存在を決定するために免疫組織化学を使用して、種々のマーカーの発現について試験した（実施例１；Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒらの米国特許出願第０９／３０２，８９６号）。上記ＰＰ６細胞は、筋形成マーカー（デスミン、ＭｙｏＤ、およびミオゲニンが挙げられる）を発現した。上記ＰＰ６細胞はまた、ｃ−ｍｅｔおよびＭＮＦを発現した。この２つの遺伝子は、筋発生の初期段階において発現される（Ｊ．Ｂ．Ｍｉｌｌｅｒら，１９９９，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．４３：１９１−２１９）。上記ＰＰ６は、Ｍ−カドヘリン（サテライト細胞特異的マーカー）を発現する細胞のより低いパーセンテージを示した（Ａ．Ｉｒｉｎｔｃｈｅｖら，１９９４，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  １９９：３２６−３３７）が、Ｂｃｌ−２（筋発生の初期段階における細胞に限定されるマーカー）を発現する細胞のより高いパーセンテージを示した（Ｊ．Ａ．Ｄｏｍｉｎｏｖら，１９９８，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１４２：５３７−５４４）。上記ＰＰ６細胞はまた、ＣＤ３４（ヒト造血性前駆細胞、および骨髄における間質細胞前駆体で同定されるマーカー）を発現した（Ｒ．Ｇ．Ａｎｄｒｅｗｓら，１９８６，Ｂｌｏｏｄ  ６７：８４２−８４５；Ｃ．Ｉ．Ｃｉｖｉｎら，１９８４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：１５７−１６５；Ｌ．Ｆｉｎａら，１９９０，Ｂｌｏｏｄ  ７５：２４１７−２４２６；Ｐ．Ｊ．Ｓｉｍｍｏｎｓら，１９９１，Ｂｌｏｏｄ  ７８：２８４８−２８５３）。上記ＰＰ６細胞はまた、Ｆｌｋ−１（幹細胞様特性を有する造血性細胞のマーカーとして近年同定された、ヒトＫＤＲ遺伝子のマウスホモログ）を発現した（Ｂ．Ｌ．Ｚｉｅｇｌｅｒら，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１５５３−１５５８）。同様に、上記ＰＰ６細胞は、Ｓｃａ−１��幹細胞様特性を有する造血性細胞に存在するマーカー）を発現した（Ｍ．ｖａｎ  ｄｅ  Ｒｉｊｎら，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：４６３４−８；Ｍ．Ｏｓａｗａら，１９９６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：３２０７−１４）。しかし、上記ＰＰ６細胞は、ＣＤ４５もｃ−Ｋｉｔ造血性幹細胞マーカーも発現しなかった（Ｌ  Ｋ．Ａｓｈｍａｎ，１９９９，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３１：１０３７−５１；Ｇ．Ａ．Ｋｏｒｅｔｚｋｙ，１９９３，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．７：４２０−４２６において総説されている）。
【００２３】
本発明の一実施形態は、本明細書で記載される特性を有する筋肉由来前駆細胞のＰＰ６集団である。これら筋肉由来前駆細胞は、デスミン、ＣＤ３４、およびＢｃｌ−２細胞マーカーを発現する。本発明によれば、上記ＰＰ６細胞は、移植後に長期間の生存性を有する筋肉由来前駆細胞の集団を得るために、本明細書に記載される技術によって単離される（実施例１）。上記ＰＰ６筋肉由来前駆細胞集団は、前駆細胞マーカー（例えば、デスミン、ＣＤ３４、およびＢｃｌ−２）を発現する細胞の顕著なパーセンテージを含む。さらに、ＰＰ６細胞は、Ｆｌｋ−１およびＳｃａ−１細胞マーカーを発現するが、ＣＤ４５もｃ−Ｋｉｔマーカーも発現しない。好ましくは、９５％を超える上記ＰＰ６細胞が、デスミン、Ｓｃａ−１、およびＦｌｋ−１マーカーを発現するが、ＣＤ４５もｃ−Ｋｉｔマーカーも発現しない。上記ＰＰ６細胞が、最後に平板培養した後、約１日または約２４時間以内に利用されることが好ましい。
【００２４】
好ましい実施形態において、上記迅速に接着する細胞およびゆっくりと接着する細胞（ＭＤＣ）は、単一平板培養技術を使用して、互いに分離される。１つのこのような技術は、実施例２に記載される。最初に、細胞は、骨格筋生検から提供される。必要とされる生検は、約１００ｍｇの細胞を含むのみである。約５０ｍｇ〜約５００ｍｇの大きさの範囲に及ぶ生検は、本発明の予備平板培養法および単一平板培養法の両方に従って使用され得る。５０ｍｇ、１００ｍｇ、１１０ｍｇ、１２０ｍｇ、１３０ｍｇ、１４０ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇおよび５００ｍｇのさらなる生検は、本発明の予備平板培養法および単一平板培養法の両方に従って使用され得る。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態において、上記生検由来の組織は、次いで、１〜７日間保存される。この保存は、約室温〜約４℃の温度である。この待機期間は、生検で得た骨格筋組織にストレスを受けさせる。このストレスは、この単一平板培養技術を使用するＭＤＣの単離に必須ではないが、上記待機期間を使用することは、ＭＤＣのより大きな収量を生じると思われる。
【００２６】
上記生検からの組織は、細かく挽かれて遠心分離される。そのペレットは再懸濁され、消化酵素を使用して消化される。使用され得る酵素としては、コラゲナーゼ、ディスパーゼもしくはこれら酵素の組み合わせが挙げられる。消化後、上記酵素は、細胞から洗い出される。上記細胞は、上記迅速に接着する細胞の単離のためにフラスコの培養培地中に移される。多くの培養培地が使用され得る。特に好ましい培養培地としては、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍを含む内皮細胞の培地用に設計されているものが挙げられる。この培地は、他の成分（ウシ胎児血清、ＩＧＦ−Ｉ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ヒドロコルチゾン、ヘパリン、および／もしくはアスコルビン酸が挙げられる）が補充され得る。上記単一平板培養技術において使用され得る他の培地としては、ＩｎＣｅＩｌ  Ｍ３１０Ｆ培地が挙げられる。この培地は、上記のように補充されてもよいし、補充されずに使用されてもよい。
【００２７】
上記迅速に接着する細胞を単離するための工程は、約３０〜約１２０分間の期間にわたって、フラスコ中での培養を要し得る。上記迅速に接着する細胞は、３０分間、４０分間、５０分間、６０分間、７０分間、８０分間、９０分間、１００分間、１１０分間もしくは１２０分間でフラスコに接着する。それらが接着した後、上記ゆっくりと接着する細胞は、上記迅速に接着する細胞が付着しているフラスコから上記培養培地を取り出すことによって、上記迅速に接着する細胞から分離される。
【００２８】
このフラスコから取り出された培養培地は、第２のフラスコに移される。上記細胞は、遠心分離され得、上記第２のフラスコに移される前の培養培地中に再懸濁され得る。上記細胞は、１〜３日間の間にわたって、この第２のフラスコ中で培養される。好ましくは、上記細胞は、２日間にわたって培養される。この期間の間に、上記ゆっくりと接着する細胞（ＭＤＣ）は、上記フラスコに接着する。上記ＭＤＣが接着した後に、上記培養培地は除去され、上記ＭＤＣの数が増加させられ得るように、新たな培養培地が添加される。上記ＭＤＣは、それらを約１０〜約２０日間にわたって培養することによって、数が増加させられ得る。上記ＭＤＣは、それらを１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間もしくは２０日間にわたって培養することによって、数が増大させられ得る。好ましくは、上記ＭＤＣは、１７日間にわたって拡大培養に供される。
【００２９】
予備平板培養法および単一平板培養法の代替として、本発明のＭＤＣは、上記ＭＤＣによって発現される上記細胞表面マーカーのうちの１つ以上に対する標識抗体を使用して、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）分析によって単離され得る（Ｃ．Ｗｅｂｓｔｅｒら，１９８８，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．１７４：２５２−６５；Ｊ．Ｒ．Ｂｌａｎｔｏｎら，１９９９，Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ  ２２：４３−５０）。例えば、ＦＡＣＳ分析は、上記宿主組織に導入される場合に長期間の生存性を示すＰＰ６様細胞の集団を選択するために、ＣＤ３４、Ｆｌｋ−１、Ｓｃａ−１、および／もしくは本明細書に記載される他の細胞表面マーカーに対する標識抗体を使用して行われ得る。異なる細胞マーカータンパク質の抗体検出のために１種以上の蛍光検出標識（例えば、フルオレセインもしくはローダミン）を使用することもまた、本発明によって包含される。
【００３０】
上記に記載されるＭＤＣ単離法のいずれかを使用して、移される予定であるか、または一定期間にわたって使用する予定がないＭＤＣは、当該分野で公知の方法を使用して、保護され得る。より具体的には、上記単離されたＭＤＣは、約−２５〜約−９０℃の範囲に及ぶ温度へと凍結され得る。好ましくは、上記ＭＤＣは、後の使用もしくは輸送のために、ドライアイス上で約−８０℃において凍結される。上記凍結は、当該分野で公知の任意の低温保存媒体で行われ得る。
【００３１】
（筋由来細胞ベースの処置）
本発明の一実施形態において、上記ＭＤＣは、骨格筋源から単離され、目的の筋性軟組織部位もしくは非筋性軟組織部位へ、または骨構造へ導入もしくは移植される。有利なことには、本発明のＭＤＣは単離され、そして移植後に長期生存を示す多数の前駆細胞を含むように富化される。さらに、本発明の筋肉由来前駆細胞は、多くの特徴的な細胞マーカー（例えば、デスミン、ＣＤ３４、およびＢｃｌ−２）を発現する。さらに、本発明の筋肉由来前駆細胞は、Ｓｃａ−１、およびＦｌｋ−１細胞マーカーを発現するが、ＣＤ４５もｃ−Ｋｉｔ細胞マーカーも発現しない。
【００３２】
本発明のＭＤＣおよびＭＤＣを含む組成物は、筋性軟組織もしくは非筋性軟組織の増大を介して、種々の審美的状態もしくは機能状態（例えば、欠損）を修復、処置もしくは改善するために使用され得る。特に、このような組成物は、尿失禁、および平滑筋虚弱、疾患、傷害、もしくは機能不全の他の場合の処置のための軟組織容積増強剤（ｓｏｆｔ−ｔｉｓｓｕｅ  ｂｕｌｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）として使用され得る。さらに、このようなＭＤＣおよびその組成物は、疾患もしくは外傷の存在下で、例えば、「平滑化する」ために、軟組織領域、開口部、くぼみ、もしくは空隙（ｖｏｉｄ）へ塊（ｂｕｌｋ）を追加することによって、傷害と関連しない軟組織を増大させるために使用され得る。ＭＤＣの複数回の連続投与はまた、本発明によって包含される。
【００３３】
ＭＤＣベースの処置のために、骨格筋外植片は、好ましくは、自己もしくは異種のヒトもしくは動物の供給源から得られる。自己の動物もしくはヒトの供給源がより好ましい。次いで、ＭＤＣ組成物が調製され、本明細書に記載されるように単離される。本発明に従うＭＤＣおよび／もしくは上記ＭＤＣを含む組成物をヒトもしくは動物のレシピエントに導入もしくは移植するために、単核の筋細胞の懸濁物が調製される。このような懸濁物は、生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤、もしくは希釈剤中の本発明の筋肉由来前駆細胞の濃縮物を含む。例えば、被験体に投与するためのＭＤＣの懸濁物は、上記被験体の血清、代替としてはウシ胎児血清を含むように改変された完全培地の滅菌溶液中に、１０８〜１０９細胞／ｍｌを含み得る。あるいは、ＭＤＣ懸濁物は、無血清滅菌溶液（例えば、低温保存溶液（Ｃｅｌｏｘ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，Ｍｉｎｎ．））中に存在し得る。次いで、上記ＭＤＣ懸濁物は、例えば、注射を介して、ドナー組織の１つ以上の部位に導入され得る。
【００３４】
記載される細胞は、生理学的に受容可能なキャリア、賦形剤、もしくは希釈剤を含む薬学的にもしくは生理学的に受容可能な調製物もしくは組成物として投与され得、そして目的のレシピエント生物（ヒトおよび非ヒト動物を含む）の組織に投与され得る。上記ＭＤＣ含有組成物は、適切な液体もしくは溶液（例えば、滅菌生理食塩水もしくは他の生理学的に受容可能な注射可能水性液体）中で上記細胞を懸濁することによって、調製され得る。このような組成物中で使用されるべき成分の量は、当業者によって慣用的に決定され得る。
【００３５】
上記ＭＤＣもしくはその組成物は、上記ＭＤＣ懸濁物を、吸収性物質もしくは接着性物質（すなわち、コラーゲンスポンジマトリクス）上に配置し、そして上記ＭＤＣ含有物質を目的の部位の中もしくはその上に挿入することによって、投与され得る。あるいは、上記ＭＤＣは、非経口注射経路（皮下、静脈内、筋肉内および胸骨内が挙げられる）によって投与され得る。他の投与経路としては、鼻内、クモ膜下、皮内、経皮的、経腸的、および舌下が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の一実施形態において、上記ＭＤＣの投与は、内視鏡手術によって仲介され得る。
【００３６】
注射による投与のために、上記組成物は、滅菌溶液もしくは滅菌懸濁物で存在するか、または薬学的にかつ生理学的に受容可能な水性もしくは油性のビヒクル中に再懸濁され得、これは、保存剤、安定化剤、および上記溶液もしくは懸濁物を上記レシピエントの体液（すなわち、血液）と等張性にするための物質を含み得る。使用するのに適した賦形剤の非限定的例としては、水、リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ  塩化ナトリウム水溶液、デキストロース、グリセロール、希エタノールなど、およびこれらの混合物が挙げられる。例示的な安定化剤は、ポリエチレングリコール、タンパク質、サッカリド、アミノ酸、無機酸、および有機酸であり、これらは、単独でもしくは混合物としてのいずれかで使用し得る。使用される投与量（ａｍｏｕｎｔ  ｏｒ  ｑｕａｎｔｉｔｙ）、および投与経路は、個体ベースで決定され、当業者に公知の適用もしくは適応症の類似のタイプにおいて使用される量に対応する。
【００３７】
移植供給源を最適化するために、ドナートとレシピエントとの間の最も近い考えられる免疫学的適合が望ましい。自己供給源が利用可能でない場合、ドナーおよびレシピエントのクラスＩおよびクラスＩＩの組織適合性抗原が、利用可能な最も近い適合性を決定するために分析され得る。このことによって、免疫拒絶を最小化もしくは排除し、そして免疫抑制治療もしくは免疫調節治療の必要性を減少させる。要求される場合、免疫抑制治療もしくは免疫調節治療は、上記移植手順の前、その間、および／もしくはその後に開始され得る。例えば、シクロスポリンＡもしくは他の免疫抑制薬物は、上記移植レシピエントに投与され得る。免疫学的耐性はまた、当該分野で公知の代替法によって移植の前に誘導され得る（Ｄ．Ｊ．Ｗａｔｔら，１９８４，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５５：４１９；Ｄ．Ｆａｕｓｔｍａｎら，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：１７０１）。
【００３８】
本発明と一致して、上記ＭＤＣは、身体組織（上皮組織（すなわち、皮膚、管腔など）、筋組織（すなわち、平滑筋）、および種々の器官組織（例えば、泌尿器系（すなわち、膀胱、尿道、尿管、腎臓など）と関連する器官）が挙げられる）に投与され得る。
【００３９】
ＭＤＣ懸濁物中の細胞数および投与様式は、処置される部位および状態に依存して変動し得る。非限定的例として、本発明によれば、約３〜５×１０５個のＭＤＣが、尿失禁の処置のために注射される（実施例３を参照のこと）。本明細書に開示される実施例と一致して、当業者は、各症例について決定される要件、制限、および／もしくは最適化に従って、ＭＤＣベースの処置の量および方法を調節し得る。
【００４０】
管腔の状態：別の実施形態において、本発明に従うＭＤＣおよびその組成物は、動物もしくは哺乳動物被験体（ヒトを含む）における管腔の状態のための処置としてさらに利用性を有する。具体的には、上記筋肉由来前駆細胞は、身体内の種々の生物学的管腔もしくは空隙を、完全にもしくは部分的にブロックするか、増強するか、拡大するか、シールするか、修復するか、体積を増大させるか、または満たすために使用され得る。管腔としては、尿道が挙げられるが、これに限定されない。空隙としては、種々の組織創傷（すなわち、外傷に起因する、筋肉および軟組織体積の喪失；投射物の貫通に起因する軟組織の破壊（例えば、刺傷もしくは弾丸創）；乳癌のための乳房切除術後の乳房組織の喪失もしくは肉腫などを処置するための手術後の筋組織の喪失を含む、組織の外科手術的除去に起因する、疾患もしくは組織死から生じる軟組織の喪失）、病変、裂溝、憩室、嚢胞、フィステル、動脈瘤、および動物もしくは哺乳動物（ヒトを含む）の身体内に存在し得る他の望ましくないもしくは所望されないくぼみもしくは開口部が挙げられ得るが、これらに限定されない。管腔の状態の処置のために、上記ＭＤＣは、本明細書に開示されるように調製され、次いで、上記空隙を満たすかもしくは修復するために、管腔組織に例えば、注射もしくは静脈内送達を介して投与される。導入されるＭＤＣの数は、要求されるように、軟組織環境における大きなもしくは小さな空隙を修復するために調節される。
【００４１】
括約筋の状態：本発明に従うＭＤＣおよびその組成物はまた、動物もしくは哺乳動物（ヒトを含む）における括約筋傷害、虚弱、疾患もしくは機能障害の処置のために使用され得る。特に、上記ＭＤＣは、泌尿器の括約筋の組織を増大させるために使用される。より具体的には、本発明は、尿失禁のための軟組織増大処置を提供する。括約筋欠損の処置のために、上記ＭＤＣは、本明細書に記載されるように調製され、次いで、例えば、注射を介して括約筋組織に投与されて、さらなる容積、充填物もしくは支持を提供する。導入されるＭＤＣの数は、必要とされる場合、容積を増加させる物質の種々の量を提供するために調節される。例えば、約３〜５×１０５個のＭＤＣは、尿失禁の処置のために注射される（実施例３を参照のこと）。
【００４２】
さらに、上記ＭＤＣおよびその組成物は、平滑筋組織（例えば、泌尿器組織もしくは膀胱組織）における収縮性に影響を及ぼすために使用され得る。従って、本発明はまた、筋収縮を修復することにおいておよび／または平滑筋収縮性問題を改善もしくは克服することにおいて、本発明のＭＤＣの使用を包含する。
【００４３】
（遺伝子操作された筋由来細胞）
本発明の別の局面において、本発明のＭＤＣは、１種以上の活性生体分子をコードする核酸配列を含むように、およびこれら生体分子（タンパク質、ポリペプチド。ペプチド、ホルモン、代謝産物、薬物、酵素などが挙げられる）を発現するように、遺伝子操作され得る。このようなＭＤＣは、レシピエント（ヒトを含む）に対して組織適合性（自己）であってもよいし、非組織適合性（同種異系）であってもよい。これら細胞は、種々の処置（例えば、尿失禁）のための長期間の局所送達系として働き得る。
【００４４】
上記レシピエントに対して外来のものであると認識されない自己筋肉由来前駆細胞が、本発明において好ましい。この点に関して、細胞媒介性遺伝子移入もしくは遺伝子送達のために使用されるＭＤＣは、望ましくは、主要組織適合遺伝子座（ヒトにおけるＭＨＣもしくはＨＬＡ）を一緒にマッチさせる。このようなＭＨＣもしくはＨＬＡマッチした細胞は、自己のものであり得る。あるいは、上記細胞は、同じもしくは類似のＭＨＣもしくはＨＬＡ抗原プロフィールを有するヒト由来であり得る。上記患者はまた、同種異系ＭＨＣ抗原に対して耐性であり得る。本発明はまた、ＭＨＣクラスＩおよび／もしくはクラスＩＩ抗原を欠いている細胞の使用を包含する（例えば、米国特許第５，５３８，７２２号に記載される）。
【００４５】
上記ＭＤＣは、種々の分子技術および当業者に公知の方法（例えば、トランスフェクション、感染、もしくは形質導入）によって、遺伝子操作され得る。形質導入は、本明細書において使用される場合、一般に、ウイルスベクターもしくは非ウイルスベクターを細胞に導入することを介して外来遺伝子もしくは異種遺伝子を含むように、遺伝子操作された細胞に言及する。トランスフェクションとは、より一般に、プラスミド、もしくは非ウイルスベクターに保有された外来遺伝子を含むように遺伝子操作された細胞に言及する。ＭＤＣは、異なるベクターによってトランスフェクトもしくは形質導入され得るので、その発現される産物を筋肉に移入するための遺伝子送達ビヒクルとして働き得る。
【００４６】
ウイルスベクターが好ましいが、当業者は、望ましいタンパク質もしくはポリペプチド、サイトカインなどをコードする核酸配列を含むための細胞の遺伝子操作は、例えば、米国特許第５，５３８，７２２号に記載されるように、当該分野で公知の方法（融合、トランスフェクション、リポソームの使用によって媒介されるリポフェクチン、エレクトロポレーション、ＤＥＡＥ−デキストランもしくはリン酸カルシウムとの沈降、核酸コーティング粒子（例えば、金粒子）を用いた微粒子銃（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）（微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ））、マイクロインジェクションなどが挙げられる）によって行われ得ることが認識される。
【００４７】
異種（すなわち、外来の）核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）を生体活性生成物の発現のために筋細胞に導入するためのベクターは、当該分野で周知である。このようなベクターは、プロモーター配列、好ましくは、細胞特異的でありかつ発現されるべき配列の上流に配置されるプロモーターを有する。上記ベクターはまた、必要に応じて、上記ベクターに含まれる核酸配列の成功したトランスフェクションおよび発現の指標として発現させるために、１種以上の発現可能なマーカー遺伝子を含み得る。
【００４８】
本発明の筋由来細胞のトランスフェクションもしくは感染のためのビヒクルもしくはベクター構築物の例示的な例は、複製欠損ウイルスベクター、ＤＮＡウイルスもしくはＲＮＡウイルス（レトロウイルス）ベクター（例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、およびアデノ随伴ウイルスベクター）が挙げられる。アデノ随伴ウイルスベクターは、一本鎖であり、細胞核への核酸の複数コピーの効率的送達を可能にする。アデノウイルスベクターが好ましい。上記ベクターは、通常は、いかなる原核生物ＤＮＡをも実質的に含まず、多くの異なる機能的核酸配列を含み得る。このような機能的配列の例としては、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ）、転写調節配列、ならびに翻訳開始調節配列および翻訳終結調節配列を含む配列（筋細胞において活性なプロモーター（例えば、強力なプロモーター、誘導性プロモーターなど）およびエンハンサーが挙げられる）が挙げられる。
【００４９】
目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ポリヌクレオチド配列）もまた、機能的配列の一部として含まれる；隣接配列はまた、部位特異的組み込みのために含まれ得る。いくつかの場合において、その５’隣接配列は、相同組換えを可能にするので、誘導性もしくは非誘導性の転写を提供して、例として転写のレベルを増大もしくは減少させるように、転写開始領域の性質を変化させる。
【００５０】
一般に、上記筋肉由来前駆細胞によって発現されることが望まれる核酸配列は、上記筋肉由来前駆細胞に対して異種であり、かつ例えば、望ましいタンパク質もしくはポリペプチド生成物をコードする構造遺伝子、または上記遺伝子の機能的フラグメント、セグメントもしくは一部のものである。上記コードされかつ発現される生成物は、細胞内に存在し得る、すなわち、細胞の細胞質、核、もしくはオルガネラに保持され得るか、または上記細胞によって分泌され得る。分泌に関して、上記構造遺伝子に存在する天然のシグナル配列が保持されていてもよいし、または上記構造遺伝子に天然には存在しないシグナル配列が使用されてもよい。上記ポリペプチドもしくはペプチドが、より大きいタンパク質のフラグメントである場合、シグナル配列は、分泌およびプロセシング部位でプロセシングされる際に、その望ましいタンパク質が天然の配列を有するように提供され得る。本発明に従って使用するための目的の遺伝子の例としては、細胞増殖因子、細胞分化因子、細胞シグナル伝達因子およびプログラムされた細胞死因子をコードする遺伝子が挙げられる。具体的例としては、ＢＭＰ−２（ｒｈＢＭＰ−２）、ＩＬ−ＩＲａ、第ＩＸ因子、およびコネキシン４３をコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
上記のように、マーカーは、上記ベクター構築物を含む細胞を選択するために存在し得る。上記マーカーは、誘導性遺伝子であっても、非誘導性遺伝子であってもよく、一般に、それぞれ、誘導下での、または誘導なしでの陽性選択を可能にする。一般に使用されるマーカー遺伝子の例としては、ネオマイシン、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、グルタミンシンセターゼなどが挙げられる。
【００５２】
使用されるベクターはまた、一般に、複製起点、および当業者によって慣用的に使用されるように、宿主細胞における複製に必須である他の遺伝子を含む。例としては、上記複製起点および特定のウイルスによってコードされる複製と関連する任意のタンパク質を含む複製系は、構築物の一部として含められ得る。上記複製系は、複製に必須の生成物をコードする遺伝子が上記筋由来細胞を最終的に形質転換しないように、選択され得る。このような複製系は、例えば、Ｇ．Ａｃｓａｄｉら，１９９４，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ  ３：５７９−５８４によって記載されるように複製欠損アデノウイルス構築物によって、およびエプスタイン−バーウイルスによって示される。複製欠損ベクター、特に複製欠損であるレトロウイルスベクターの例は、Ｐｒｉｃｅら，１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：１５６；およびＳａｎｅｓら，１９８６，ＥＭＢＯ  Ｊ．，５：３１３３によって記載されるＢＡＧである。最終遺伝子構築物が１種以上の目的の遺伝子（例えば、生体活性代謝分子をコードする遺伝子）を含み得ることが理解される。さらに、ｃＤＮＡ、合成によって生成されるＤＮＡもしくは染色体ＤＮＡは、当業者によって公知かつ実施される方法およびプロトコルを利用して、使用され得る。
【００５３】
望ましい場合、感染性の複製欠損ウイルスベクターは、上記細胞のインビボ注入の前に上記細胞を遺伝子操作するために使用され得る。この点に関して、上記ベクターは、広宿主性（ａｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃ）のパッケージングのために、レトロウイルスプロデューサー細胞に導入され得る。隣接領域への筋肉由来前駆細胞の自然の拡大は、目的の部位への多数回の注射を不要にする。
【００５４】
別の局面において、本発明は、望ましい遺伝子生成物をコードする異種遺伝子を含むように操作されたアデノウイルスベクターを使用してウイルス形質導入されたＭＤＣ（例えば、初期前駆筋細胞）の使用を介して、レシピエント哺乳動物宿主（ヒトを含む）の細胞および組織へのエキソビボ遺伝子送達を提供する。このようなエキソビボアプローチは、直接遺伝子移入アプローチより優れた、効率的ウイルス遺伝子移入の利点を提供する。上記エキソビボ手順は、筋組織の単離された細胞に由来する筋肉由来前駆細胞の使用を要する。筋肉由来前駆細胞の供給源として働く筋生検は、傷害部位から、もしくは臨床外科医からより容易に得られ得る別の領域から得られ得る。
【００５５】
本発明によれば、クローン単離物は、当該分野で公知の種々の手順（例えば、組織培養培地中での限界希釈培養）を使用して、筋肉由来前駆細胞（すなわち、ＰＰ６細胞もしくはゆっくりと接着する細胞）の集団から得られ得ることが認識される。クローン単離物は、単一の孤立性細胞から由来する遺伝的に同一の細胞を含む。さらに、クローン単離物は、上記のようにＦＡＣＳ分析を使用して、続いて、限界希釈を使用して得られ、クローン的に単離された細胞株を樹立するために、１ウェルあたり単一の細胞を達成し得る。
【００５６】
上記ＭＤＣに、望ましい遺伝子生成物をコードする少なくとも１種の異種遺伝子を含む操作されたウイルスベクターを最初に感染させ、生理学的に受容可能なキャリアもしくは賦形剤（例えば、生理食塩水もしくはリン酸緩衝化生理食塩水）中に懸濁し、次いで、上記宿主における適切な部位に投与される。本発明と一致して、上記ＭＤＣは、身体組織（骨、上皮組織、結合組織、筋組織、および本明細書に記載される種々の器官組織（例えば、消化器系、心血管系、呼吸器系、生殖器系、泌尿器系、および神経系と関連する器官）が挙げられる）に投与され得る。上記望ましい遺伝子生成物は、上記注射される細胞によって発現され、従って、上記細胞は、上記宿主へ上記遺伝子産物を導入する。上記導入されかつ発現される遺伝子産物は、それによって、上記宿主において長期生存性を有する本発明のＭＤＣによって長期間にわたって発現されることに起因して、上記傷害、機能不全、もしくは疾患を処置、修復もしくは改善するために利用され得る。
【００５７】
筋原細胞媒介性遺伝子治療の動物モデル研究において、１００ｍｇ筋肉あたりの１０６個の筋原細胞の埋め込みは、筋酵素欠損の部分的補正に必要とされた（Ｊ．Ｅ．Ｍｏｒｇａｎら，１９８８，Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ．Ｓｃｉ．８６：１３７；Ｔ．Ａ．Ｐａｒｔｒｉｄｇｅら，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：１７６を参照のこと）。このデータから外挿すると、生理学的に適合性の培地中で懸濁される約１０１２個のＭＤＣは、７０ｋｇのヒトについての遺伝子治療のために、筋組織へと埋め込まれ得る。本発明のＭＤＣの数は、ヒト供給源から単一の１００ｍｇ骨格筋生検から生成し得る（以下を参照のこと）。特定の傷害部位の処置のために、特定の組織もしくは傷害部位へ遺伝子操作されたＭＤＣの注射は、溶液もしくは懸濁物において治療上有効量の細胞（好ましくは、生理学的に受容可能な培地において、処置されるべき組織の１ｃｍ３あたり約１０５〜１０６個の細胞）を含む。
【実施例】
【００５８】
（実施例１．予備平板培養法に従うＭＤＣ富化、単離および分析）
ＭＤＣの富化および単離：ＭＤＣを、記載されるように（Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒらの米国特許第６，８６６，８４２号）調製した。筋外植片を、多くの供給源、すなわち、３週齢ｍｄｘ（ジストロフィー性）マウス（Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ  ｍｄｘ／ｍｄｘ，Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、４〜６週齢正常雌性ＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）ラット、もしくはＳＣＩＤ（重症複合免疫不全症）マウスからの後肢から得た。上記動物供給源の各々からの筋組織を、任意の骨を除去するために切開し、細かく切り刻んで、スラリーにした。次いで、上記スラリーを、３７℃において、０．２％  タイプＸＩコラゲナーゼ、ディスパーゼ（ＩＩ等級，２４０単位）、および０．１％  トリプシンと１時間連続インキュベーションによって消化した。得られた細胞懸濁物を、１８ゲージ、２０ゲージ、および２２ゲージの針を通過させ、３０００ｒｐｍで５分間にわたって遠心分離した。その後、細胞を、増殖培地（１０％  ウシ胎児血清、１０％  ウマ血清、０．５％  ニワトリ胚抽出物、および２％  ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ）中に再懸濁した。次いで、細胞を、コラーゲンコーティングフラスコ（Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒらの米国特許第６，８６６，８４２号）に再平板培養した。約１時間後、その上清を、上記フラスコから取り出し、新たなコラーゲンコーティングフラスコに再平板培養した。この１時間のインキュベーション内で迅速に接着した細胞は、大部分が線維芽細胞であった（Ｚ．Ｑｕら，前出；Ｃｈａｎｃｅｌｌｏｒらの米国特許第６，８６６，８４２号）。上記上清を取り出し、上記細胞の３０〜４０％が各フラスコに接着した後に再平板培養した。約５〜６回の連続平板培養の後、上記培養物は、ＰＰ６細胞と称される小さく丸い細胞を富化させ、この細胞を、出発細胞集団から単離し、さらなる研究において使用した。初期平板培養において単離された接着細胞を、一緒にプールし、そしてＰＰ１−４細胞と称した。
【００５９】
上記ｍｄｘ  ＰＰ１−４集団、ｍｄｘ  ＰＰ６集団、正常ＰＰ６集団、および線維芽細胞集団を、細胞マーカーの発現について免疫組織化学分析することによって試験した。この分析の結果を、表１に示す。
【００６０】
【表１】
0005425641.tif 000002
Ｍｄｘ  ＰＰ１−４細胞、ｍｄｘ  ＰＰ６細胞、正常ＰＰ６細胞、および線維芽細胞を予備平板培養技術によって得、そして免疫組織化学分析によって試験した。「−」は、発現を示した細胞が２％未満であることを示す；「（−）」；「−／＋」は、発現を示した細胞が５〜５０％であることを示す；「＋／−」は、発現を示した細胞が約４０〜８０％であることを示す；「＋」は、発現を示した細胞が＞９５％であることを示す；「ｎｏｒ」は、正常細胞を示す；「ｎａ」は、免疫組織化学データが入手可能でないことを示す。
【００６１】
ｍｄｘマウスおよび正常マウスの両方が、このアッセイにおいて試験した細胞マーカーの全ての同一の分布を示したことが注意される。従って、上記ｍｄｘ変異の存在は、上記単離されたＰＰ６筋細胞由来集団の細胞マーカー発現に影響を及ぼさない。
【００６２】
ＭＤＣを、ＤＭＥＭ（１０％  ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、１０％  ＨＳ（ウマ血清）、０．５％  ニワトリ胚抽出物、および１％  ペニシリン／ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地）を含む増殖培地、または２％  ウシ胎児血清および１％  抗生物質溶液を補充したＤＭＥＭを含む融合培地中で増殖させた。全ての培地供給物を、Ｇｉｂｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．）を通して購入した。
【００６３】
（実施例２．単一平板培養法に従うＭＤＣ富化、単離および分析）
（ＭＤＣの富化および単離）
迅速に接着するＭＤＣおよびゆっくりと接着するＭＤＣの集団を、哺乳動物被験体の骨格筋から単離した。上記被験体は、ヒト、ラット、イヌもしくは他の哺乳動物であり得る。生検の大きさは、４２〜２４７ｍｇの範囲に及んだ。
【００６４】
骨格筋生検組織は、硫酸ゲンタマイシン（１００ｎｇ／ｍｌ，Ｒｏｃｈｅ））を補充した冷たい低温培地（ＨＹＰＯＴＨＥＲＭＯＳＯＬ（登録商標）（ＢｉｏＬｉｆｅ）中に直ぐ置き、４℃で保存した。３〜７日後、生検組織を、保存から取り出し、生成を開始した。任意の結合組織もしくは非筋性組織を、上記生検サンプルから切開した。単離のために使用した残りの筋組織を、秤量する。上記組織を、ハンクス平衡化塩類溶液（ＨＢＳＳ）中で細かく切り刻み、コニカルチューブに移し、そして遠心分離した（２，５００×ｇ，５分間）。次いで、上記ペレットを、消化酵素溶液（Ｌｉｂｅｒａｓｅ  Ｂｌｅｎｄｚｙｍｅ  ４（０．４〜１．０Ｕ／ｍＬ，Ｒｏｃｈｅ））中に再懸濁した。生検組織１００ｍｇあたり２ｍＬの消化酵素溶液を使用し、回転プレート上で、３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、上記サンプルを遠心分離した（２，５００×ｇ，５分間）。上記ペレットを、培養培地中で再懸濁し、７０μｍ細胞ストレーナーを通過させた。この実施例に記載される手順のために使用される培養培地を、以下の成分：ｉ．１０％（ｖ／ｖ）  ウシ胎児血清、およびｉｉ．Ｃａｍｂｒｅｘ  ＥＧＭ−２  ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔ  Ｋｉｔ（これは、以下を含む：インスリン増殖因子−１（ＩＧＦ−Ｉ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヒドロコルチゾン、ヘパリン、およびアスコルビン酸）を補充したＣａｍｂｒｅｘ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ  ＥＧＭ−２基礎培地であった。次いで、上記濾過した細胞溶液をＴ２５培養フラスコに移し、５％  ＣＯ２中、３７℃で３０〜１２０分間インキュベートした。このフラスコに付着した細胞を、「迅速に接着する細胞」と称した。
【００６５】
インキュベートした後、上記細胞培養上清をＴ２５フラスコから取り出し、１５ｍＬコニカルチューブの中に配置した。上記Ｔ２５培養フラスコを、２ｍＬの温めた培養培地ですすぎ、前述の１５ｍＬコニカルチューブに移した。上記１５ｍＬコニカルチューブを遠心分離した（２，５００×ｇ，５分間）。上記ペレットを培養培地中に再懸濁し、新たなＴ２５培養フラスコに移した。上記フラスコを、５％  ＣＯ２中、３７℃で約２日間インキュベートした（このフラスコに付着する細胞を、「ゆっくりと接着する細胞」と称した）。インキュベーション後、上記細胞培養上清を吸引し、新たな培養培地を上記フラスコに添加した。次いで、上記フラスコを増大させるためにインキュベーター中に戻した。標準的な継代培養をそこで行って、上記培養フラスコにおける細胞コンフルエンシーを５０％未満に維持した。トリプシン−ＥＤＴＡ（０．２５％，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、継代の間に上記フラスコから接着細胞を剥離させた。上記「ゆっくりと接着する細胞」の代表的な拡大は、３千７百万個の細胞の平均生存総細胞数を達成するために、平均１７日かかった（その日から出発して、生成が開始される）。
【００６６】
一旦、望ましい細胞数が達成された場合、上記細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡを使用して上記フラスコから採取し、遠心分離した（２，５００×ｇ，５分間）。上記ペレットをＢＳＳ−Ｐ溶液（ヒト血清アルブミン（２％  ｖ／ｖ，Ｓｅｒａ  Ｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ）を補充したＨＢＳＳ）中に再懸濁し、計数した。次いで、上記細胞溶液を再び遠心分離し（２，５００×ｇ，５分間）、ヒト血清アルブミン（２％  ｖ／ｖ，  Ｓｅｒａ  Ｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を補充した低温保存培地（ＣＲＹＯＳＴＯＲＴＭ（Ｂｉｏｌｉｆｅ））で望ましい細胞濃度に再懸濁し、低温保存のために適切なバイアル中にまとめた。上記低温バイアルを、凍結容器の中に入れ、−８０℃の冷凍庫の中に入れた。上記凍結細胞懸濁物を等量の生理食塩水で室温において融解することによって細胞を処理し、直接注射した（さらなる操作なしで）。上記ゆっくりと接着する細胞の集団の系統特徴を、示した：筋原性（８７．４％  ＣＤ５６＋、８９．２％  デスミン＋）、内皮（０．０％  ＣＤ３１＋）、造血性（０．３％  ＣＤ４５＋）、および線維芽細胞（６．８％  ＣＤ９０＋／ＣＤ５６−）。
【００６７】
（富化および単離されたＭＤＣの特徴付けのための分析）
上記骨格筋生検組織の剥離の後に、細胞の２つの部分を、上記のように、上記培養フラスコへの迅速なもしくはゆっくりとした接着に基づいて回収した。次いで、上記細胞を、増殖培地を用いて培養で増加させ、次いで、上記に記載されるように、１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ中の低温保存培地中で凍結した（１５μｌ中の３×１０５個の細胞）。コントロール群については、１５μｌの凍結保存培地単独を、上記チューブの中に入れた。これらチューブを、注射までに−８０℃に保存した。注射の直前に、チューブを保存庫から取り出し、室温で融解し、そして１５μｌの０．９％  塩化ナトリウム溶液で再懸濁した。次いで、得られた３０μｌの溶液を、０．５ｃｃの３０ゲージ針付きインスリンシリンジの中に引き込んだ。外科手術および注射を行う調査者は、上記チューブの中身に対して目隠しした。
【００６８】
細胞数および生存性を、ＧｕａｖａフローサイトメーターおよびＶｉａｃｏｕｎｔアッセイキット（Ｇｕａｖａ）を用いて測定した。ＣＤ５６を、ＰＥ結合体化抗ＣＤ５６抗体（１：５０，ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）およびＰＥ結合体化アイソタイプコントロールモノクローナル抗体（１：５０，ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いるフローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ）によって測定した。デスミンを、モノクローナルデスミン抗体（１：１００，Ｄａｋｏ）およびアイソタイプコントロールモノクローナル抗体（１：２００，ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、パラホルムアルデヒド固定細胞（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に対してフローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ）によって測定した。Ｃｙ３結合体化抗マウスＩｇＧ抗体（１：２５０，Ｓｉｇｍａ）を用いて、蛍光標識を行った。工程の間に、上記細胞を、透過化緩衝液（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて洗浄した。クレアチンキナーゼ（ＣＫ）アッセイに関しては、分化誘導培地中、１２ウェルプレートに、１ウェルあたり１×１０５個の細胞を平板培養した。４〜６日後に、上記細胞を、トリプシン処理によって回収し、ペレットへと遠心分離した。ＣＫ  ＬＩＱＵＩ−ＵＶ（登録商標）キット（Ｓｔａｎｂｉｏ）を用いて、上記細胞溶解上清をＣＫ活性についてアッセイした。
【００６９】
（実施例３．ラットモデルにおける、ヒトＭＤＣを用いた尿失禁の処置）
ヒトＭＤＣでの処置は、ｌつのストレス性尿失禁（ＳＵＩ）の実験モデルにおいて、正常なレベルへの漏出時圧（ＬＰＰ）の回復をもたらした。注射されたヒトＭＤＣは、十分に確立されたラットモデルにおいて尿失禁を軽減した。
【００７０】
これらの実験は、泌尿器科用途のためにヒト細胞治療を使用する概念および実現可能性の証明を示す。上記ヒトＭＤＣを臨床的に得られる大きさの筋生検から回収し、ＳＵＩの免疫損傷したラットモデルにおいて最大４週間まで生理学的結果を改善した。組織学的評価によって、尿道周囲の筋肉の萎縮は偽群のみにおいて実証された。ヒトＭＤＣは、注射の４週間後に、ヌードラットの尿道括約筋に存在した。ヒトＭＤＣでの処置は、ヌードラットのＳＵＩの実験モデルにおいてほぼ正常レベルにまでのＬＰＰ回復をもたらした。
【００７１】
動物：以下に記載される実験を、６〜８週齢の雌性無胸腺ヌードラット（Ｈｓｄ：ＲＨ−ｒｎｕ，Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用いて行った。手順上のプロトコルは、Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  ＰｉｔｔｓｂｕｒｇｈのＡｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃａｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。動物実験の方針および手順は、米国のＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓによって発表された「Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ」のガイドにおいて詳述されたものに従っている。
【００７２】
坐骨神経の神経支配除去（ＳＵＩモデル）：十分に確立されたＳＵＩモデルを、坐骨神経の両方を横断して切ることを通して作った。イソフルラン麻酔（２Ｌ／分）をラットに与え、適切な誘導の後に、両方の垂直方向の背側切開を坐骨直腸窩に対して行った。手術用顕微鏡下で、各側の坐骨神経を同定し、その神経幹の２ｍｍを、脊柱からのその起始に対して遠位であるが、陰部神経の分枝に対して近位で摘出した。
【００７３】
ヒトＭＤＣ単離：この研究において使用されるヒトＭＤＣを、単一ドナーの腹直筋から採取したヒト骨格筋組織（約２５０ｍｇ）から単離し、上記単一平板培養技術に従って単離した。培養拡大を、１０％  ウシ胎児血清を補充した抗生物質非含有の市販培地で行った。上記ＭＤＣ懸濁物のフローサイトメトリー分析を行って、ＣＤ５６発現の抗体標識（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を介して筋含有量を評価した。ＭＤＣを、１×１０６個の生細胞／１０μＬの濃度で低温保存した。キャリア培地単独の別個のアリコートもまた、偽注射のために調製した。
【００７４】
注射手順：イソフルラン麻酔（２Ｌ／分）下で神経支配除去した後７日で、下部正中線切開を作製して、膀胱および尿道を曝した。低温保存したＭＤＣ懸濁物もしくは偽懸濁物を等量の生理食塩水で注射直前に融解した。３／１０ｍＬインスリンシリンジを使用して、顕微鏡ガイドによって、ＭＤＣ懸濁物の１０μＬ（５×１０５個細胞）もしくは偽アリコートのいずれかを尿道中間部の各側壁に注射した。神経除去せず、注射していない年齢を適合させた動物をコントロールとして供した。
【００７５】
インビボ膀胱内圧測定（ＣＭＧ）および漏出時圧（ＬＰＰ）測定：インビボ機能測定を、注射の４週間後に行った。ウレタン麻酔（１．２ｇ／ｋｇ  皮下注射）下で、腹部正中切開を作製して、尿管を結紮した。火炎加熱先端（ｆｉｒｅ−ｆｌａｒｅｄ  ｔｉｐ）を備える経膀胱カテーテル（ＰＥ−９０）を、膀胱充満および圧力記録のために膀胱の天井に挿入し、腹部を閉じた。三方コックを、シストメトリー（０．０４ｍＬ／分の速度で通常生理食塩水の連続注入）の間に膀胱圧をモニターするために経膀胱チューブに接続した。空隙容積、膀胱容量、および最大排尿圧をモニターした。シストメトリーの後、全てのラットで、漸増する膀胱内圧に応答して自発的膀胱活動を排除するために、Ｔ９の高さで脊髄を横断して切断した。次いで、上記ラットを傾斜テーブルの上に載せ、垂直位置に配置した。大きな５０ｍＬシリンジを膀胱カテーテルに、ならびにＰＥ−１９０チュービングおよび三方コックを介して圧力変換器に接続することによって、膀胱内圧を強制した。レザバを、制御された高さ調節のために測定垂直ポールに取り付けた。漏出が視覚的に同定されるまで、膀胱内圧をゼロから１〜３ＣｍＨ２Ｏずつ上昇させた；この圧力を、ＬＰＰとして同定した。３回の連続読み取りを得、各動物について平均し、単一のＬＰＰとして示した。
【００７６】
組織回収および組織学：上記ＬＰＰ測定の直後に、尿道−膀胱複合体全体を取り出した。液体窒素中で予め冷却しておいた２−メチルブタンを使用して、組織を急速凍結した。上記尿道の凍結切片を、一般的組織学についてヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）で標識し、そしてまた、ヒト特異的抗ラミンＡ／Ｃ抗体（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ，Ｕ．Ｋ．）で免疫蛍光標識して、注射したＭＤＣの最終結果を追跡した。
【００７７】
統計分析：データを平均±ＳＥとして表す。群間の全体の比較を、一元配置分散分析（チューキー法多重比較テストを使用して行った。０．０５未満のｐ値を有意として許容した。
【００７８】
上記注射したＭＤＣ懸濁物は、８７．７％の筋原性（ＣＤ５６陽性）細胞を含んでいた；上記細胞の残りは、線維芽細胞であった。コントロール群、偽群およびＭＤＣ注射群のいかなるラットにおいても、重篤な副作用は認められなかった。しかし、会陰領域における感染に起因して、外尿道口の部分的閉塞が、偽群およびヒトＭＤＣ注射群両方において各々１匹ずつ認められた。従って、これら動物を、関数解析から除外した。
【００７９】
ＣＭＧおよびＬＰＰ測定：上記コントロール群、偽群およびヒトＭＤＣ注射群間では、測定されたいかなるシストメトリーパラメーターにも差異は認められなかった（表２）。
【００８０】
【表２】
0005425641.tif 000003
上記尿道括約筋の神経支配除去は、コントロール群から偽群へとＬＰＰの顕著な低下を生じた（図１）（それぞれ、４３．４±０．６から２７．８±０．７ＣｍＨ２Ｏ；ｐ＜０．０５）。ＬＰＰを、上記偽群と比較したときにＭＤＣ注射後に有意に高いレベルに回復した（３５．７±２．０  ＣｍＨ２Ｏ）（ｐ＜０．０５）；しかし、４週間の時点で、このレベルの回復は、コントロール群のものより有意に低いままであった（ｐ＜０．０５）。
【００８１】
組織学的分析：神経支配除去したラットにおいて、上記近位尿道括約筋を、コントロールと比較して、４週間で萎縮性であった（図２）。ラット括約筋組織内で存在するヒト核は、核エンベロープタンパク質ラミンＡおよびラミンＣに対するヒト特異的抗体を使用する免疫蛍光標識を介して、明らかになった。ＭＤＣ注射群からの組織は、外部（横紋）括約筋内に組み込まれる多くのヒト核の陽性標識を示した（図３）。
【００８２】
本明細書において引用される全ての特許出願、特許、教科書および学術文献は、本発明が属する分野の技術水準をより完全に記載するために、その全体が本明細書に参考として援用される。
【００８３】
種々の変更が、記載されるような本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、上記の方法および組成物においてなされ得るので、上記の説明に含まれるか、添付の図面に示されるか、または添付の特許請求の範囲に定義される全ての主題が、例示として解釈されるのであって、限定する意味ではないことが意図される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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