(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合ＤＮＡ構成物であって、
プロモーター、
シグナル配列をコードする第一ＤＮＡ分子、
キャリアタンパク質をコードする第二ＤＮＡ分子、
ＫＥＸ２部位及び前記ＫＥＸ２部位の５’末端に直結したＫＥＸ２部位プレ配列を含むＫＥＸ２領域をコードする第三ＤＮＡ分子であり、前記ＫＥＸ２部位がＫＲであり、前記ＫＥＸ２部位プレ配列がＶＡＶＥ（配列番号８４）、ＶＡＶＹ（配列番号８７）、ＬＡＶＥ（配列番号８８）、ＶＡＩＥ（配列番号９０）、ＶＡＬＥ（配列番号９１）、ＶＡＦＥ（配列番号９２）、ＶＷＶＥ（配列番号９３）、及びＶＥＶＥ（配列番号９４）から成る群より選ばれることを特徴とする第三ＤＮＡ分子、並びに
目的タンパク質をコードする第四ＤＮＡ分子
を前記構成物の５’末端から操作可能な結合で含み、
前記第一ＤＮＡ分子及び第二ＤＮＡ分子が、トリコデルマＣＢＨ１シグナル配列及びキャリアタンパク質又はトリコデルマエンドグルカナーゼシグナル配列及びキャリアタンパク質をコードすることを特徴とする、前記融合ＤＮＡ構成物。
【請求項２】
目的タンパク質が酵素である、請求項１に記載の融合ＤＮＡ構成物。
【請求項３】
目的タンパク質が治療用タンパク質である、請求項１に記載の融合ＤＮＡ構成物。
【請求項４】
治療用タンパク質が抗体である、請求項３に記載の融合ＤＮＡ構成物。
【請求項５】
抗体がＬ鎖又はＨ鎖モノクローナル抗体である、請求項４に記載の融合ＤＮＡ構成物。
【請求項６】
第一ＤＮＡ分子及び第二ＤＮＡ分子がＣＢＨ１シグナル配列及びキャリアタンパク質をコードし、第四ＤＮＡ分子が抗体Ｌ鎖又はその断片をコードする、請求項１に記載の融合ＤＮＡ構成物。
【請求項７】
請求項１に記載の融合ＤＮＡ構成物にコードされる融合タンパク質。
【請求項８】
請求項１に記載の融合ＤＮＡ構成物を含むトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞。
【請求項９】
トリコデルマ細胞がトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）細胞である、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１に記載の融合ＤＮＡ構成物を含むベクター。
【請求項１１】
請求項１０に記載のベクターを含むトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞。
【請求項１２】
トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞において目的タンパク質を生成する方法であって、
ａ）請求項１に記載の融合ＤＮＡ構成物を含むトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞を得る工程、
ｂ）目的タンパク質の発現及び生成を可能にするのに適した条件で宿主細胞を培養する工程、並びに
ｃ）目的タンパク質を回収する工程
を含む方法。
【請求項１３】
トリコデルマ細胞がトリコデルマ・リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）宿主細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
目的タンパク質が免疫グロブリンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
免疫グロブリンがモノクローナル抗体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
モノクローナル抗体がＬ鎖若しくはＨ鎖モノクローナル抗体又はそれらの断片である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
目的タンパク質がＬ鎖抗体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
組換え融合ポリペプチドから目的タンパク質を切断する方法であって、
ａ）トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞において、請求項１に記載の融合ＤＮＡ構成物にコードされる融合ポリペプチドを発現する工程であり、前記ＫＥＸ２領域がタンパク質切断部位を提供することを特徴とする工程、及び
ｂ）発現した融合ポリペプチドから切断される目的タンパク質を得る工程、
を含む方法。
【請求項１９】
目的タンパク質が治療用タンパク質である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
目的タンパク質が抗体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
目的タンパク質の切断がＫＥＸ２部位プレ配列を欠く同等な融合ポリペプチド由来の前記目的タンパク質の切断と比較して増加している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞からの抗体生成を増加させる方法であって、請求項４又は５に記載の融合ＤＮＡ構成物を含むトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞を得る工程、融合ポリペプチドの発現及び融合ポリペプチドの分泌を可能にするのに適した条件下で真菌細胞を培養する工程を含み、目的タンパク質の分泌がＫＥＸ２プレ配列を含まない同等な融合ポリペプチドの分泌と比較して増加している、前記方法。
【請求項２３】
目的タンパク質の分泌が前記同等な融合ポリペプチド由来の目的タンパク質の分泌と比較して少なくとも３０％増加している、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
融合ポリペプチドであって、前記融合ポリペプチドのアミノ末端から
ａ）分泌配列として機能的なシグナル配列を含む第一アミノ酸配列、
ｂ）キャリアタンパク質を含む第二アミノ酸配列、
ｃ）ＫＥＸ２部位及び前記ＫＥＸ２部位の５’末端に直結したＫＥＸ２部位プレ配列を含むＫＥＸ２領域を含む第三アミノ酸配列であり、前記ＫＥＸ２部位がＫＲであり、前記ＫＥＸ２部位プレ配列がＶＡＶＥ（配列番号８４）、ＶＡＶＹ（配列番号８７）、ＬＡＶＥ（配列番号８８）、ＶＡＩＥ（配列番号９０）、ＶＡＬＥ（配列番号９１）、ＶＡＦＥ（配列番号９２）、ＶＷＶＥ（配列番号９３）、及びＶＥＶＥ（配列番号９４）から成る群より選ばれることを特徴とする、第三アミノ酸配列、並びに
ｄ）目的タンパク質を含む第四アミノ酸配列を含み、
前記シグナル配列及び前記キャリアタンパク質がトリコデルマＣＢＨ１シグナル配列及びキャリアタンパク質又はトリコデルマエンドグルカナーゼシグナル配列及びキャリアタンパク質であることを特徴とする、前記融合ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府が提供する研究開発による発明の権利に関する記述
本願発明の一部は、米国の国防総省国防高等研究事業局（ＤＡＲＰＡ）によるコントラクトナンバーＷ９１１ＮＦ−０５−Ｃ−００７２により資金が提供されている。従って、米国政府は、本願発明において所定の権利を有し得る。
【０００２】
本願発明は、糸状菌からの機能的抗体タンパク質及び商業用酵素等の目的タンパク質における分泌の増加及び切断に関する。本願発明は、タンパク質切断に用いられるＫＥＸ２領域を組み込んだ融合ＤＮＡ構成物、ベクター及び融合ポリペプチド及び目的タンパク質の生成方法を開示する。
【背景技術】
【０００３】
真菌細胞でのタンパク質分泌の間、特定のタンパク質は、ＫＥＸ２又はセリンペプチダーゼの「ケキシン（ｋｅｘｉｎ）」ファミリー（ＥＣ３．４．２１．６１）のメンバーである、ＫＥＸ２により切断される。ＫＥＸ２は、当該タンパク質の分泌においてタンパク質基質で基本アミノ酸対（すなわち、「ＫＥＸ２部位」）のＣ末端側に直結しているペプチド結合を切断する、高度に特異的なカルシウム依存的エンドペプチダーゼである。ＫＥＸ２タンパク質は一般的に、活性部位のヒスチジン残基に近いシステイン残基を含有し、ｐ−安息香酸水銀により抑制される。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＫＥＸ２ペプチダーゼ（Ｆｕｌｌｅｒ他、１９８９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国８６：１４３４−１４３８ページ）であるこのグループの基礎的メンバーは、それらの分泌の間、α−因子フェロモン及びキラー・トキシン前駆体を切断する。
【０００４】
融合ポリペプチドの生成は、大腸菌、酵母及び糸状菌を含む多くの微生物で報告されてきた。例えば、ウシキモシンは、全長グルコアミラーゼ（ＧＡＩ）（Ｗａｒｄ他、（１９９０年）Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：４３５−４４０ページ、米国特許第６，２６５，２０４号及び米国特許第６，５９０，０７８号）への融合としてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒで生成される。ヒトインターロイキン６（ｈＩＬ６）は、全長Ａ．ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ（ＧＡＩ）（Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ他、（１９９１年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：３７８−３８１ページ）への融合としてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓで生成される。ニワトリ卵白リゾチーム（Ｊｅｅｎｅｓ他、（１９９３年）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１０７：２６７−２７３ページ）及びヒトラクトフェリン（Ｗａｒｄ他、（１９９５年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１３：４９８−５０３ページ）は、グルコアミラーゼの１−４９８残基への融合としてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒで生成される。ウシキモシンは、全長野生型アルファアミラーゼ（Ｋｏｒｍａｎ他、（１９９０年）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１７：２０３−２１２ページ）との融合としてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒで、及びＡ．ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼ（Ｔｓｕｃｈｉｙａ他、（１９９４年）Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５８：８９５−８９９ページ）の切断型との融合によりＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅで生成される。さらに、Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ他、１９８１年、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１：６９１−６９６ページ、Ｎｕｎｂｅｒｇ他、（１９８４年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２３０６−２３１５ページ及びＢｏｅｌ他、（１９８４年）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１０９７−１１０２ページも参照される。いくつかのこれらの融合タンパク質において、ＫＥＸ２プロテアーゼ認識部位（Ｌｙｓ−Ａｒｇ）は、グルコアミラーゼと目的タンパク質（例えば、Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ他、１９９１年及びＷａｒｄ他、１９９５年）との間に挿入される。本願に係る発明者は、ＫＥＸ２認識部位が、アミノ酸ＫＥＸ２部位プレ配列を含むように操作すると、タンパク質分泌及び／又はタンパク質切断が融合タンパク質で増進され得ることを見出した。
【０００５】
関連する具体的な文献には、次が含まれる。すなわち、Ｗａｒｄ他、（２００４年）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０：２５６７−２５７６ページ、Ｇｏｌｌｅｒ他、（１９９８年）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４：３２０２−３２０８ページ、ＬａＧｒａｎｇｅ他、（１９９６年）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６２：１０３６−１０４４ページ、Ｂｅｒｇｑｕｉｓｔ他、（２００２年）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１００：１６５−１７６ページ、Ｓｐｅｎｃｅｒ他、（１９９８年）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５８：１０７−１１２ページ、Ｊａｌｖｉｎｇ他、（２０００年）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６６：３６３−３６８ページ、Ｂｒｅｎｎｅｒ及びＦｕｌｌｅｒ（１９９２年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：９２２−９２６ページ、Ｄｕｒａｎｄ他、（１９９９年）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５２：２０８−２１４ページ、Ａｈｎ他、（２００４年）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６４：８３３−８３９ページ、Ｇｏｕｋａ他、（１９９７年）ＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４７：１−１１ページ、Ｂｒｏｅｋｈｕｉｊｓｅｎ他、（１９９３年）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：１３５−１４５ページ、ＭａｃＫｅｎｚｉｅ他、（１９９８年）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６３：１３７−１４６ページ及び公開特許出願第２００４００１８５７３号及び第２００５０１５８８２５号である。米国特許第４，８１６，５６７号及び米国特許第６，３３１，４１５号も、組換え宿主細胞での免疫グロブリン分子の生成方法を開示する。上述の引用文献は、全ての目的において参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
多数の方法が産業用酵素及び治療用タンパク質の生成に利用可能である一方で、バイアルによる汚染又は他の偶発的要因における危険性を制限した、相対的に迅速かつ高レベルに生成されたタンパク質を結果として生じる、タンパク質生成及び特に抗体生成等の治療用タンパク質生成の代替的方法の必要性が残る。本願発明は当該必要性に答えるものである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
融合ＤＮＡ構成物、ベクター、融合ポリペプチド、融合ＤＮＡ構成物を含む細胞、及び細胞からの目的タンパク質の分泌及び／又は切断を増加する方法が提供される。さらに具体的に、本願発明に包含されるＫＥＸ２領域は、融合ポリペプチドに含まれ、融合ポリペプチド由来の目的タンパク質を切断する部位を与える。従って、本願発明は、タンパク質切断に用いられるＫＥＸ２領域に関連する。
【０００８】
いくつかの実施形態において、本願発明は、融合ポリペプチドをコードする融合ＤＮＡ構成物であって、プロモーター、シグナル配列をコードする第一ＤＮＡ分子、キャリアタンパク質をコードする第二ＤＮＡ分子、ＫＥＸ２部位及び前記ＫＥＸ２部位の５’末端に直結したＫＥＸ２部位プレ配列を含むＫＥＸ２領域をコードする第三ＤＮＡ分子、及び目的タンパク質をコードする第四ＤＮＡ分子を５’末端から操作可能な結合で含む前記融合ＤＮＡ構成物に関する。この実施形態のいくつかの態様において、本願発明は、融合ＤＮＡ構成物を含む、発現ベクター等のベクターに関連し、他の態様において本願発明は、ベクターを用いて形質転換されたか、又は融合ＤＮＡ構成物を含む、宿主細胞に関する。
【０００９】
他の実施形態において、本願発明は、融合ポリペプチドのアミノ末端から、分泌配列として機能的なシグナル配列を含む第一アミノ酸配列、キャリアタンパク質を含む第二アミノ酸配列、ＫＥＸ２部位及び前記ＫＥＸ２部位のＮ末端に直結したＫＥＸ２部位プレ配列を含むＫＥＸ２領域を含む第三アミノ酸配列、及び目的タンパク質を含む第四アミノ酸配列を含む融合ポリペプチドに関する。
【００１０】
別の実施形態において、本願発明は、ＫＥＸ２部位（Ｂ１Ｂ２）及び前記ＫＥＸ２部位のＮ末端に直結したＫＥＸ２部位プレ配列（Ｘ４Ｘ３Ｘ２Ｘ１）を含むＫＥＸ２領域（Ｘ４Ｘ３Ｘ２Ｘ１Ｂ１Ｂ２）に関する。
【００１１】
他の実施形態において、本願発明は、糸状真菌宿主細胞及び特にトリコデルマ細胞で目的タンパク質を生成する方法であって、本願発明に係る融合ＤＮＡ構成物を含む糸状真菌宿主細胞を得る工程及び目的タンパク質の発現及び分泌を可能にする適した条件下で前記糸状真菌宿主細胞を培養する工程を含む。この実施形態のいくつかの態様において、目的タンパク質は、回収される。この実施形態の他の態様において、融合ポリペプチド由来の目的タンパク質の切断が、ＫＥＸ２部位プレ配列を欠いた同等な融合ポリペプチド由来の同じ目的タンパク質の切断より多い。この実施形態の他の態様において、融合ポリペプチド由来の目的タンパク質の分泌が、ＫＥＸ２部位プレ配列を欠いた同等な融合ポリペプチド由来の同じ目的タンパク質の分泌より多い。
【００１２】
追加的な実施形態において、本願発明は、ａ）シグナル配列を含む親融合ポリペプチドのＫＥＸ２部位プレ配列、ＫＥＸ２部位及び前記ＫＥＸ２部位のＮ末端に直結したＫＥＸ２部位プレ配列を含むＫＥＸ２領域、及び目的タンパク質を含むアミノ酸配列を変異させ、前記ＫＥＸ２部位プレ配列以外前記親融合ポリペプチドと同一な試験融合ポリペプチドのセットを生成する工程、ｂ）糸状真菌細胞による前記試験融合ポリペプチド及び前記親融合ポリペプチドの分泌を評価する工程、ｃ）前記親融合ポリペプチドと比較して分泌及び／又は切断が増加された試験融合ポリペプチドを特定する工程を含む分泌及び／又は切断の増加された目的タンパク質を特定する方法に関する。
【００１３】
この実施形態の別の態様において、本願発明は、上述のように得られた複数の異なる試験融合ポリペプチドを試験する工程、及びどの前記異なる試験融合ポリペプチドがより多い分泌及び／又はタンパク質切断を有するかを決定する工程を含み、前記最適化されたＫＥＸ２部位プレ配列が、最も多い分泌及び／又はタンパク質切断を有する試験融合ポリペプチドの変異したＫＥＸ２部位プレ配列である、最適化されたＫＥＸ２部位プレ配列を特定する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
下記の詳細な説明の特定の態様は、添付の図と併せて読むことで最も良く理解される。慣行に従って、それらの図に記載される様々な特徴は一定の縮尺でないことが、強調される。つまり、様々な特徴の寸法は、明確にするために任意に拡大又は縮小される。添付される図面は以下である
【図１】図１は、キャリアタンパク質、ＫＥＸ２領域及び目的タンパク質を含めた本願発明に係る融合ポリペプチドの実施形態を概略的に図解している。ここでキャリアタンパク質は、触媒ドメイン及びセロビオ加水分解酵素Ｉ（ＣＢＨ１）タンパク質のリンカー領域部分を含むＣＢＨ１コア／リンカーとして図解され、前記目的タンパク質は、抗体Ｌ鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）又はＨ鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ）として図解される。
【図２】図２は、融合ポリペプチドの発現に用いられるｐＴｒｅｘ４−ｈｅｒ２  Ｌ鎖ＤＮＡ２．０プラスミドの遺伝子地図を表す。前記プラスミドは、トリコデルマ・リーセイｃｂｈ１プロモーター、ＣＢＨ１シグナル配列及びキャリアタンパク質をコードするポリヌクレオチド、ＳｐｅI部位の後ろに直結するＫＥＸ２領域、抗体（トラスツズマブ）Ｌ鎖として図解される目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド、トリコデルマ・リーセイセロビオ加水分解酵素（ｃｂｈ１）ターミネータ、ａｍｄＳ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ（ａｃｅｔａｍｉｄａｓｅ）マーカーを含む。
【図３】図３Ａ−Ｅは、図２のｐＴｒｅｘ４−ｈｅｒ２  Ｌ鎖ＤＮＡ２．０プラスミドのヌクレオチド配列（配列番号１０３）（１０８８５ｂｐ）を提供する。
【図４】図４は、後に実施例１、２、３及び４で記載されるＫＥＸ２領域配列を含む培養されたトリコデルマ・リーセイ細胞の上清のウエスタンブロット法を示す。レーン１は、分子量マーカー（Ｂｌｕｅ  Ｐｌｕｓ  ２、インビトロジェン参照）を表す。レーン２及び３は、ＧＧＧＫＲ変異体（配列番号５）を表し、レーン４は、ＧＧＧＫＲＧＧＧ変異体（配列番号７）を表し、レーン５は、本願発明に包含されるＶＡＶＥＫＲ変異体（配列番号９）ＫＥＸ２領域を表し、レーン６及び７は、ＫＲＧＧＧ変異体（配列番号２）を表す。
【図５】図５は、後に実施例５で記載される本願発明に包含されるＫＥＸ２領域を含む培養されたトリコデルマ・リーセイ細胞の上清のウエスタンブロット法を示す。レーン１は、上述の分子量マーカーを示す。レーン２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２及び１３は、それぞれＶＡＶＥＫＲ（配列番号９）、ＶＡＶＷＫＲ（配列番号２５）、ＶＡＶＧＫＲ（配列番号２６）、ＶＡＶＲＫＲ（配列番号２７）、ＶＡＶＴＫＲ（配列番号２８）、ＶＡＶＶＫＲ（配列番号２９）、ＶＡＶＡＫＲ（配列番号３０）、ＶＡＶＬＫＲ（配列番号３１）、ＶＡＶＤＫＲ（配列番号３２）、ＶＡＶＮＫＲ（配列番号３３）、ＶＡＶＹＫＲ（配列番号３４）、ＶＡＶＨＫＲ（配列番号３５）ＫＥＸ２領域を示す。
【図６】図６は、後に実施例５、６、及び７で記載されるＫＥＸ２領域配列を含む培養されたトリコデルマ・リーセイ細胞の上清のウエスタンブロット法を示す。レーン１及び１０は、上述の分子量マーカーを示す。レーン２、３、４、５、６、７、８、９、１１、１２、１３、１４、１５及び１６は、それぞれＡＡＶＥＫＲ（配列番号３８）、ＧＡＶＥＫＲ（配列番号３７）、ＭＡＶＥＫＲ（配列番号３６）、ＬＡＶＥＫＲ（配列番号３９）、ＷＡＶＥＫＲ（配列番号４０）、ＫＡＶＥＫＲ（配列番号４１）、ＰＡＶＥＫＲ（配列番号４２）、ＤＡＶＥＫＲ（配列番号５１）、ＶＡＶＥＫＲ（配列番号９）、ＨＡＶＥＫＲ（配列番号５２）、ＱＡＶＥＫＲ（配列番号４７）、ＳＡＶＥＫＲ（配列番号４６）、ＮＶＩＳＫＲ（配列番号２２）、及びＳＤＶＴＫＲ（配列番号２４）ＫＥＸ２領域を示す。
【図７】図７は、後に実施例５で記載されるＫＥＸ２領域配列を含む培養されたトリコデルマ・リーセイ細胞の上清のウエスタンブロット法を示す。レーン１は、上述の分子量マーカーを示す。レーン２、３、４、５、６、７、８、９、１０及び１１は、それぞれＶＡＶＥＫＲ（配列番号９）、ＶＧＶＥＫＲ（配列番号５６）、ＶＴＶＥＫＲ（配列番号６５）、ＶＥＶＥＫＲ（配列番号５５）、ＶＰＶＥＫＲ（配列番号６２）、ＶＷＶＥＫＲ（配列番号６７）、ＶＫＶＥＫＲ（配列番号５８）、ＶＲＶＥＫＲ（配列番号６３）、ＶＶＶＥＫＲ（配列番号６６）、及びＶＩＶＥＫＲ（配列番号５７）ＫＥＸ２領域を示す。
【図８】図８は、後に実施例５で記載されるＫＥＸ２領域配列を含む培養されたトリコデルマ・リーセイ細胞の上清のウエスタンブロット法を示す。レーン１−１１は、それぞれＶＡＤＥＫＲ（配列番号７０）、ＶＡＡＥＫＲ（配列番号６９）、ＶＡＦＥＫＲ（配列番号７２）、ＶＡＧＥＫＲ（配列番号７３）、ＶＡＩＥＫＲ（配列番号７４）、ＶＡＮＥＫＲ（配列番号７６）、ＶＡＬＥＫＲ（配列番号７５）、ＶＡＳＥＫＲ（配列番号７９）、ＶＡＲＥＫＲ（配列番号７８）及びＶＡＰＥＫＲ（配列番号８３）ＫＥＸ２領域を示す。
【図９】図９は、後に実施例８で記載されるＶＡＶＥＫＲ（配列番号９）ＫＥＸ２領域を含む培養されたＡ．ｎｉｇｅｒ細胞の上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。レーン１は、分子量マーカー、Ｍａｒｋｅｒ  １２分子量基準（インビトロジェン）を示す。レーン２、３、及び４は、３つの形質転換体を示し、それぞれ形質転換体Ａ１０、Ａ１１及びＡ１２に対応している。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
定義
他で定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び化学的用語は、本願発明が属する技術分野の当業者に通常理解されるものと同様の意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ他、微生物学及び分子生物学事典（ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ）、第二版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ発行、ニューヨーク州（１９９４年）、及びＨａｌｅ及びＭａｒｋｈａｍ、ハーパー・コリンズ生物学事典（ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ）、Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ発行、ニューヨーク州（１９９１年）は、本明細書で使用される多くの語の一般的意味を含む技術の一部を提供する。それ以外に、特定の語は、明確さの目的及び容易な参照を可能とするため、以下に定義される。
【００１６】
細胞、核酸、タンパク質又はベクターに関連して使用される「組換え」の語は、細胞、核酸、タンパク質又はベクターが異種核酸又はタンパク質の導入により、又は野生型核酸又はタンパク質の変異により修飾されたか、又は細胞がそのように修飾された細胞に由来することを指す。従って、例えば、組換え細胞は、野生型（非組換え型）の細胞で見られない核酸又はポリペプチドを発現するか、又は他に異常に発現した、不十分に発現した、過剰に発現した、又は発現のない野生型遺伝子を発現する。
【００１７】
「遺伝子」は、ポリペプチド生成を伴い、個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）と同様に、例えば、プロモーター及びターミネータ等のコード領域に前後した領域を含むＤＮＡセグメントを示す。
【００１８】
「核酸」の語は、単鎖又は二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそれらの化学修飾を包含する。「核酸」及び「ポリヌクレオチド」の語は、本明細書で置換可能に使用され得る。遺伝子情報は変質組織であることから、２以上のコドンが、所定のアミノ酸をコードするために用いられ得る。そのため、本願発明は、所定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを包含する。
【００１９】
「ＤＮＡ構成物」の語は、適した宿主でタンパク質の発現に効果的な適したコントロール配列と操作可能に連結したＤＮＡ配列を意味する。このようなコントロール配列は、転写をもたらすプロモーター、転写をコントロールするための随意のオペレーター配列、ｍＲＮＡ上の適したリボソーム結合部位をコードする配列、転写及び翻訳の終結をコントロールするエンハンサー及び配列を含む。
【００２０】
「融合ＤＮＡ構成物」又は「融合核酸」の語は、５’末端から３’末端に共に操作可能に連結され、融合ポリペプチドをコードする多くのポリヌクレオチド配列（例えば、シグナル配列をコードするＤＮＡ分子、キャリアタンパク質をコードするＤＮＡ分子、ＫＥＸ２部位をコードするＤＮＡ分子及び目的タンパク質をコードするＤＮＡ分子）を含む核酸を示す。
【００２１】
「ベクター」は、１以上の細胞型へ核酸を導入するよう設計されたポリヌクレオチド配列を示す。ベクターは、クローニングベクター、発現ベクター、シャトルベクター、プラスミド、ファージ粒子、カセット等を含む。
【００２２】
「発現ベクター」は、外来細胞で異種ＤＮＡ断片を組み込み、発現する性質を有するベクターを示す。多くの原核生物起源及び真核生物起源の発現ベクターは、商業的に入手可能である。
【００２３】
「プロモーター」は、結合ＲＮＡポリメラーゼに含まれる制御配列であり、遺伝子の転写を開始する。
【００２４】
「シグナル配列」の語は、細胞からの分泌に用いられる分泌系にタンパク質を導くタンパク質のアミノ末端におけるアミノ酸の配列を示す。当該シグナル配列は、分泌前にタンパク質から切断される。特定の場合において、シグナル配列は、「シグナルペプチド」又は「リーダーペプチド」と称される。シグナル配列の定義は、機能的なものである。シグナル配列は分泌工程中に切除され、細胞外タンパク質の成熟形態はシグナル配列を欠く。
【００２５】
「転写コントロール下」の語は、転写の開始又は促進に寄与する要素へ操作可能に連結されることに依存したポリヌクレオチド配列、通常ＤＮＡ配列の転写として当該技術分野によく理解される。
【００２６】
「翻訳コントロール下」の語は、ｍＲＮＡが形成された後に起こる制御方法を示すとして当該技術分野によく理解される。
【００２７】
「操作可能に連結された」の語は、複数の要素が機能的に関連するように配列された並列状態を示す。例えば、配列の転写をコントロールする場合、プロモーターは、コード配列に操作可能に連結されている。「選択マーカー」の語は、導入された核酸又はベクターを含有する宿主を容易に選択することを可能にする、宿主で発現可能なタンパク質を示す。選択可能マーカーの例は、宿主細胞で栄養性優位等の代謝性優位を与える抗微生物剤（例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、又はクロラムフェニコール）及び／又は遺伝子を含むが、これらに限られない。
【００２８】
「タンパク質」及び「ポリペプチド」の語は、本明細書で置換可能に使用される。本明細書で従来の１文字又は３文字コードがアミノ酸残基に使用される。
【００２９】
「キャリアタンパク質」の語は、自然に分泌された真菌ポリペプチド由来のポリペプチド配列又はそれらの機能的部分を示す。
【００３０】
免疫グロブリン（Ｉｇ）と置換可能に使用される「抗体タンパク質」の語は、抗原に特異的に結合する１以上のポリペプチドを含有するタンパク質を示す。当該語は、任意のアイソタイプの抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２抗体を含むが、これらに限られない抗原への特定の結合を保持する抗体の断片、抗原への特定の結合を保持する抗体断片、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、二機能的（ｂｉ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）（すなわち二特異的（ｂｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ））ハイブリッド抗体及び抗体の抗原−結合部分を含む融合タンパク質及び非抗体タンパク質が含まれる。
【００３１】
抗体の単量体型は、Ｈ（ｈｅａｖｙ）及びＬ（ｌｉｇｈｔ）の２つの異なる型の４つのポリペプチド鎖を含む。Ｈ及びＬ鎖の異なる型が認識される。当該Ｌ鎖は、構造的に２つのドメイン、可変領域（ＶＬ）及び定常領域（ＣＬ）に分割される。Ｈ鎖も別個の構造ドメインに分割される。例えば、γ‐Ｈ鎖は、アミノ末端から、可変領域（ＶＨ）、定常領域（ＣＨ１）、ヒンジ領域、第二定常領域（ＣＨ２）及び第三定常領域（ＣＨ３）を含む。
【００３２】
「同等な融合ポリペプチド」の語は、ＫＥＸ２部位プレ配列を除き、参照融合ポリペプチドと比較して同一のアミノ酸配列を有する融合ポリペプチドを示す。複数のポリペプチドがＫＥＸ２部位プレ配列での相違を除き、同一のアミノ酸配列を有する場合、第一ＫＥＸ２部位プレ配列を有する第一融合ポリペプチドは、異なるＫＥＸ２部位プレ配列を有する第二融合ポリペプチドと同等である。
【００３３】
「由来する」の語は、「に起源する」、「得られた」又は「から得られる」、及び「から単離される」の語を包含する。
【００３４】
「宿主株」又は「宿主細胞」は、本願発明に包含されるポリペプチド、特に、組換え融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及び発現ベクター又はＤＮＡ構成物に適した宿主を意味する。特定の実施形態において、前記宿主株は、糸状真菌細胞とすることが出来る。「宿主細胞」の語は、細胞及びプロトプラストの両方を含む。
【００３５】
「糸状菌」は、Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａの一部である全ての糸状体を示す（Ｃ．Ｊ．Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｕｓ（１９６２年）、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ、ウィリー、ニューヨーク州参照）。これらの糸状菌は、キチン、グルカン、及びその他の複合多糖類よりなる細胞壁を有する栄養菌糸体によって、特徴付けられる。本発明の糸状菌は、形態学的に、生理学的に、及び遺伝学的に酵母とは区別される。糸状菌による栄養成長は、菌糸伸長によるものであり、炭素異化は、絶対嫌気性である。
【００３６】
「培養」の語は、適した条件下液体又は固形培地中で微生物細胞の個体数を増加させることを示す。
【００３７】
ポリヌクレオチド又はポリペプチドに関して「異種」の語は、宿主細胞で自然に起こらないポリヌクレオチド又はポリペプチドを示す。いくつかの実施形態において、前記タンパク質は、商業的に重要な産業用タンパク質であり、いくつかの実施形態において、前記異種タンパク質は、治療用タンパク質である。当該語は、自然発生の遺伝子、変異遺伝子、及び／又は合成遺伝子によりコードされるタンパク質を包含することが意図される。
【００３８】
ポリヌクレオチド又はタンパク質に関した「同種」の語は、宿主細胞で自然に起こるポリヌクレオチド又はタンパク質を示す。
【００３９】
本願発明で使用される「回収される」、「単離される」、及び「分離される」の語は、自然に関連付けられる少なくとも１の成分から移動される化合物、タンパク質、細胞、核酸又はアミノ酸を示す。
【００４０】
本願発明で細胞に関連して用いられる「形質転換された」、「安定に形質転換された」及び「遺伝子組換え」の語は、前記細胞が、そのゲノムに結合した非野生型（例えば、異種）核酸配列又は野生型（例えば、同種）核酸配列の付加的コピーを有するか、又は複数の世代に渡って維持されるエピソームプラスミドを有する。
【００４１】
本明細書において、「発現」という語は、ポリペプチドが遺伝子の核酸配列に基づいて生産される工程をいう。当該工程には、転写及び翻訳の両方が含まれる。
【００４２】
本明細書において、「グリコシル化」タンパク質の語は、タンパク質上の特定のアミノ酸残基に付加されたオリゴ糖分子を有するタンパク質を意味する。
【００４３】
「非グリコシル化」タンパク質は、タンパク質に付加されるオリゴ糖分子を有していないタンパク質をいう。
【００４４】
細胞への核酸配列の挿入の文脈で「導入された」の語は、「トランスフェクション」、又は「形質転換」又は「形質導入」を意味し、及び真核又は原核細胞への核酸配列を組み込むことを含む。ここで前記核酸配列は、細胞ゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチド、又はミトコンドリアＤＮＡ）へ組み込まれるか、自律レプリコンへ転化されるか、又は一時的に発現され得る（例えば、トランスフェクトｍＲＮＡ）。
【００４５】
「ＫＥＸ２」の語は、ＩＵＢＭＢ酵素命名法に従ってＥＣ３．４．２１．６１として定義され、活性を有するカルシウム依存的エンドペプチダーゼを示す。ＫＥＸ２は、タンパク質分泌の間、基本アミノ酸対のＣ−末端に直結するペプチド結合（ＫＥＸ２切断部位）を切断する。
【００４６】
「ＫＥＸ２領域」の語は、キャリアタンパク質のＣ−末端と融合ポリペプチド中の目的タンパク質のＮ−末端との間に位置する隣接した４から８のアミノ酸残基領域を示す。前記ＫＥＸ２領域は、ＫＥＸ２部位及び前記ＫＥＸ２部位プレ配列を含む。
【００４７】
「ＫＥＸ２部位」の語は、タンパク質中の２のアミノ酸ＫＥＸ２切断モチーフを示す。ＫＥＸ２部位は、２の隣接する基本アミノ酸（例えば、リジン、ヒスチジン及び／又はアルギニン）を任意の順序（例えば、ＫＫ、ＲＲ、ＫＲ又はＲＫ）で含有する。
【００４８】
「ＫＥＸ２部位プレ配列」の語は、ＫＥＸ２部位の直前（すなわち、Ｎ−末端に直結した）２から６の隣接するアミノ酸［（Ｘ）ｎ、ここでｎは２から６］を示す。例えば、ＫＥＸ２領域がＶＡＶＥＫＲとして定義される場合、「ＫＲ」モチーフは前記領域のＫＥＸ２部位、ｎは４であり、前記「ＶＡＶＥ」モチーフは前記領域のＫＥＸ２部位プレ配列に対応する。
【００４９】
「変異体」の語は、参照タンパク質と比較して１以上の異なるアミノ酸を含有するタンパク質の領域を示す。
【００５０】
「分泌タンパク質」の語は、タンパク質分泌の間、細胞から放出されるポリペプチドの領域を示す。いくつかの実施形態において、前記分泌タンパク質は、本願発明に係る組換え融合ポリペプチドから放出又は切断されるタンパク質である。
【００５１】
「分泌」の語は、宿主細胞における膜から細胞外スペース及び周囲の培地へのタンパク質の選択的移動を示す。「決定」、「測定」、「評価（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）」、「評価（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」及び「分析」の語は、本明細書で置換可能に使用され、測定の任意の形態を示し、要素の存在又は非存在の決定を含む。これらの語は、定量的及び／又は定性的測定の両方を含む。評価は、相対的又は絶対的であることが出来る。
【００５２】
「の存在を評価する」は、そのものの存在又は非存在の決定と同様に存在するものの量の決定を含む。
【００５３】
他の用語の定義は、明細書を通じて記載され得る。
【００５４】
発明の詳細な記載
典型的な実施形態がより詳細に記載される前に、本願発明は、記載される所定の実施形態に限定されず、当然に多様化され得ることが理解される。本願発明の範囲は、添付の請求項によってのみ限定されることから、本明細書で使用される専門用語は、所定の実施形態を記載する目的のみで用いられるものであり、限定することを意図しない。
【００５５】
数値範囲が与えられた場合、その数値範囲の上限値と下限値の間に介在する数値の全てが、文脈から明確に別段の理解が得られない限り、下限値の単位の十分の一まで、本明細書に具体的に開示される。所定の数値範囲内の一定の数値又は介在数値と他の一定の数値又は介在数値の間の狭い数値範囲も全て本発明に含まれる。これらの狭い範囲の上限及び下限数値は、独立的にその狭い範囲に含まれ得る本発明の範囲となり得るか、又は範囲から除外される。また、上限、下限のいずれか又は両方が前記狭い範囲に含まれるか又は含まれない場合であっても、特別に除外される場合を除いて、これらの狭い範囲を含む各範囲も本願発明の中に包含される。記載される範囲が、上限、下限の一方又は両方の値を含む場合、これらのいずれか又は両方の値を除外する範囲も、本願発明に含まれる。
【００５６】
ここで、典型的及び好ましい方法及び構成要素が記載されるが、本明細書で記載される方法及び構成要素と類似又は同等な任意の方法及び構成要素が、本願発明に係る実施又は試験において使用され得る。本明細書で言及される全ての刊行物は、当該刊行物の引用に関連した方法及び／又は構成要素を開示又は記載するものとして参照により本明細書に組み込まれる。
【００５７】
本願発明及び添付される請求項で使用される単数形（英文で「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」）は、文脈で明確に指示されない限り、複数の対象を含む。従って、例えば、「一遺伝子」の言及は、複数のこれらの候補物質を含み、「細胞」の言及は、１以上の細胞及び当業者に知られるそれらの同等物等の言及を含む。
【００５８】
本明細書で開示される刊行物は、専らそれらの本願出願前に開示があったとの想定のみに基づいて記載されている。本明細書に記載されるいかなる事項も、本発明がそのような刊行物より後に出願されたことを認めるものと解釈されてはならない。さらに、提供される発行物の日付は、実際の公開日と異なる可能性があり、実際の公開日は別途確認を要するものである。
【００５９】
融合ポリペプチド−
上述の通り、対象融合ポリペプチドは、ａ）シグナル配列、ｂ）キャリアタンパク質、ｃ）ｉ）ａＫＥＸ２部位及びｉｉ）ＫＥＸ２部位のＮ末端に直結したＫＥＸ２部位プレ配列を含むＫＥＸ２領域、及びｄ）目的タンパク質を含む。
【００６０】
図１は、本願発明に係る対象融合ポリペプチドを図解する。対象ポリペプチドの各部位（すなわち、「シグナル配列」、「キャリアタンパク質」、「ＫＥＸ２領域」及び「目的タンパク質」）は、専ら明快さ及び便宜のために表示する。一般的に分泌中に切断されるＮ−末端領域及び分泌されるＣ−末端領域を含有することから、対象融合ポリペプチドは、「プロ（ｐｒｏ）タンパク質」又は「前駆体タンパク質」として言及される。
【００６１】
シグナル配列及びキャリアタンパク質−
対象融合ポリペプチドのシグナル配列は、糸状真菌細胞からのタンパク質分泌を促進する任意のシグナル配列とすることが出来る。所定の実施形態において、当該対象融合ポリペプチドは、融合タンパク質が生成される糸状細胞から多く分泌されたことで知られるタンパク質に用いるシグナル配列を含むことが出来る。当該使用されるシグナル配列は、融合ポリペプチドが生成される細胞の内因性又は非内因性であるとすることが出来る。一定の態様においては、前記シグナル配列は、Ｎ−末端でシグナル配列を含有する「キャリア」を含むことができ、当該キャリアは、細胞内因性であり、細胞によって効率的に分泌されるタンパク質の少なくともＮ−末端の一部となる。
【００６２】
適したシグナル配列及びキャリアは、当該技術分野で知られている（例えば、Ｗａｒｄ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１９９０年８：４３５−４４０ページ及びＰａｌｏｈｅｉｍｏ他、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ２００３年６９：７０７３−７０８２ページ参照）。適したシグナル配列及びキャリアタンパク質の例は、セロビオ加水分解酵素Ｉ、セロビオ加水分解酵素ＩＩ、エンドグルカナーゼＩ、ＩＩ及びＩＩＩ、α−アミラーゼ、アスパルチルプロテアーゼ、グルコアミラーゼ、フィターゼ、マンナナーゼ、α及びβグルコシダーゼ、ウシキモシン、ヒトインターフェロン及びヒト組織プラスミノーゲン活性剤のシグナル配列及びキャリアタンパク質及びＧｗｙｎｎｅ他、（１９８７）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ５：７１３−７１９ページにより記載されるような合成コンセンサス真核シグナル配列を含む。
【００６３】
いくつかの実施形態において、トリコデルマ（例えばトリコデルマ・リーセイ）が宿主細胞として使用される場合、トリコデルマ・リーセイマンナナーゼＩ（Ｍａｎ５Ａ、又はＭＡＮＩ）、トリコデルマ・リーセイセロビオ加水分解酵素ＩＩ（Ｃｅｌ６Ａ又はＣＢＨＩＩ）、エンドグルカナーゼＩ（Ｃｅｌ７ｂ又はＥＧＩ）、エンドグルカナーゼＩＩ（Ｃｅｌ５ａ又はＥＧＩＩ）、エンドグルカナーゼＩＩＩ（Ｃｅｌ１２Ａ又はＥＧＩＩＩ）、キシラナーゼＩ又はＩＩ（ＸｙｎＩＩａ又はＸｙｎＩＩｂ）又はトリコデルマ・リーセイセロビオ加水分解酵素Ｉ（Ｃｅｌ７ａ又はＣＢＨＩ）のシグナル配列又はキャリアが、融合ポリペプチドに使用され得る。
【００６４】
他の実施形態において、アスペルギルス（例えばＡ．ｎｉｇｅｒ）が宿主細胞として使用される場合、前記Ａ．ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ（ＧｌａＡ）又はアルファアミラーゼのシグナル配列又はキャリアは、融合ポリペプチドに使用され得る。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼは、同一のアミノ酸配列を有する。当該酵素の２つの形態は、一般的に培養上清で認められる。ＧＡＩは、全長形態（アミノ酸残基１−６１６）であり、ＧＡＩＩは、アミノ酸残基１−５１２を含む天然のタンパク質分解断片である。ＧＡＩは、伸張されたリンカー領域により連結される２つの分離ドメインとして折り畳まれることが知られている。２つのドメインは、４７１残基の触媒ドメイン（アミノ酸１−４７１）及び１０８残基のでんぷん結合ドメイン（アミノ酸５０９−６１６）で、この２つのドメイン間のリンカー領域は３６残基（アミノ酸４７２−５０８）である。ＧＡＩＩは、でんぷん結合ドメインを欠く。Ｌｉｂｂｙ他、（１９９４年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ７：１１０９−１１１４ページを参照にされたい。いくつかの実施形態において、キャリアタンパク質として使用され、シグナル配列を含むグルコアミラーゼは、アスペルギルス又はトリコデルマグルコアミラーゼの触媒ドメインと９５％、９６％、９７％、９８％及び９９％より多い配列同一性を有する。「触媒ドメイン」の語は、タンパク質の触媒活性を有するタンパク質のアミノ酸配列の構造部分又は領域を示す。
【００６５】
特定の実施形態において、前記シグナル配列及び前記キャリアタンパク質は同じ遺伝子から得られる。いくつかの実施形態において、前記シグナル配列及び前記キャリアタンパク質は異なる遺伝子から得られる。
【００６６】
キャリアタンパク質は、分泌ポリペプチドの成熟配列の全部又は一部を含み得る。いくつかの実施形態において、全長分泌ポリペプチドが使用される。しかし、分泌ポリペプチドの機能部分が使用され得る。本願発明で使用される、分泌ポリペプチド又は文法上同等物の「部分」は、端を切断された（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）分泌ポリペプチドであり、切断されたにも関わらず、正常な構造に折り畳まれる能力を保持する分泌ポリペプチドである。
【００６７】
いくつかの場合において、分泌ポリペプチドの切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）は、機能的タンパク質が生物学的機能を保持することを意味する。いくつかの実施形態において、分泌ポリペプチドの前記触媒ドメインが使用されるが、他の機能的ドメイン、例えば基質結合ドメイン等も使用され得る。一の実施形態において、グルコアミラーゼが、前記キャリアタンパク質（すなわち、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒからのグルコアミラーゼ）として使用された場合、好ましい機能的部分は、酵素の触媒ドメインを保持し、アミノ酸１−４７１を含む（ＷＯ０３０８９６１４、例えば、実施例１０参照）。他の実施形態において、ＣＢＨＩが、キャリアタンパク質（すなわち、トリコデルマ・リーセイからのＣＢＨＩ）として使用された場合、好ましい機能的部分は、酵素の触媒ドメインを保持する。ＷＯ０５０９３０７３の図２の配列番号１を参照すると、ここでトリコデルマ・リーセイＣＢＨＩシグナル配列、トリコデルマ・リーセイＣＢＨＩ触媒ドメイン（触媒コア又はコアドメインとしても呼ばれる）及びトリコデルマ・リーセイＣＢＨＩリンカーをコードする配列が開示される。いくつかの実施形態において、シグナル配列を含めた、ＣＢＨＩキャリアタンパク質は、ＷＯ０５０９３０７３の図２の配列番号１と９５％、９６％、９７％、９８％及び９９％より多い配列同一性を有する。
【００６８】
一般に、キャリアタンパク質が切断されたタンパク質である場合、Ｃ−末端が切断されている（すなわち、無傷のＮ−末端を含有する）。或いは、前記キャリアタンパク質は、Ｎ−末端が切断されるか、又は随意に両端が切断され、機能的部分が残される。一般的に、キャリアタンパク質を含む分泌タンパク質のこのような部分は、５０％より多い、７０％より多い、８０％より多い及び９０％より多い分泌タンパク質、好ましくは分泌タンパク質のＮ−末端部分を含む。いくつかの実施形態において、前記キャリアタンパク質は、触媒ドメインに加えてリンカー領域を含む。本明細書での実施例の融合構成物において、ＣＢＨＩタンパク質のリンカー領域部分の一部をキャリアタンパク質に使用した。
【００６９】
本願発明で使用される、分泌配列として機能的なシグナル配列を含む第一アミノ酸配列は、第一ＤＮＡ分子によりコードされる。キャリアタンパク質を含む第二アミノ酸配列は、第二ＤＮＡ配列によりコードされる。しかし、上述の通りシグナル配列及びキャリアタンパク質は、同じ遺伝子から得ることが出来る。
【００７０】
ＫＥＸ２領域−
ＫＥＸ２領域は、ＫＥＸ２部位（Ｂ１Ｂ２）及び前記ＫＥＸ２部位のＮ末端に直結したＫＥＸ２部位プレ配列（（Ｘ）ｎ＝２−６）を含む。いくつかの実施形態において、ＫＥＸ２領域は、ｉｎ  ｖｉｖｏで融合ポリペプチドから目的タンパク質のアミノ末端で切断（分離）する手段を提供する。本願発明に包含される融合ポリペプチドのＫＥＸ２領域は、キャリアタンパク質と目的タンパク質との間に自然発生する領域ではない。
【００７１】
ＫＥＸ２領域のＣ−末端で起こるＫＥＸ２切断部位は、野生型糸状真菌プロテアーゼ（例えば、野生型アスペルギルスＫＥＸＢ様プロテアーゼ又は野生型トリコデルマＫＥＸ２プロテアーゼ）によって切断され得る。目的タンパク質は、ＫＥＸ２部位の下流での部位に直結する箇所において本願発明にかかる融合ポリペプチドから切断される。
【００７２】
ＫＥＸ２部位は、アミノ酸配列「Ｂ１Ｂ２」を含有し、ここでＢ１及びＢ２は、それぞれ独立に基本アミノ酸である。好ましくは、ＫＥＸ２部位は、ＫＫ、ＫＲ、ＲＫ又はＲＲのいずれか、好ましくはＫＲ、を含む。
【００７３】
ＫＥＸ２部位プレ配列は、アミノ酸配列（Ｘ）ｎ＝２−６を含み、ここでＸは、任意のアミノ酸及びｎは、２から６、好ましくは４である。本明細書で定義されるＫＥＸ２領域は、本願発明に係る融合ポリペプチドを含むキャリアタンパク質において前記キャリアタンパク質のＣ−末端では自然に見られない。いくつかの実施形態において、前記ＫＥＸ２部位プレ配列は、キャリアタンパク質のＣ−末端上にある自然に発生する隣接する（Ｘ）ｎ＝２−６アミノ酸残基と異なるアミノ酸配列である。しかし、隣接する（Ｘ）ｎ＝２−６アミノ酸残基は、キャリアタンパク質の他の部分で見られることがあり、ＫＥＸ２部位（Ｂ１Ｂ２）と連結され得るが、前記ＫＥＸ２領域は、目的タンパク質のＮ−末端とは、付着しない。
【００７４】
いくつかの実施形態において、ＫＥＸ２部位プレ配列が、Ｘ４Ｘ３Ｘ２Ｘ１Ｂ１Ｂ２として定義される場合、
ａ）Ｘ１、Ｘ２及びＸ３はＧではないか、
ｂ）Ｘ２及びＸ３がＧ、Ｘ４がＡ、又はＸ３がＳである場合、Ｘ１はＳではないか、
ｃ）Ｘ３がＡ及びＸ２がＳである場合、Ｘ４がＴではないか、又は
ｄ）Ｘ１はＤではない。
【００７５】
いくつかの好ましい実施形態において、ＫＥＸ２領域は、Ｘ４Ｘ３Ｘ２Ｘ１Ｂ１Ｂ２であり、ここでＢ１Ｂ２は、ＫＲであり、さらに
ａ）Ｘ１、Ｘ２及びＸ３はＧではないか、
ａ）Ｘ２及びＸ３はＧ、Ｘ４はＡ、又はＸ３はＳである場合、Ｘ１はＳではないか、
ｂ）Ｘ３はＡ及びＸ２はＳである場合に、Ｘ４はＴではないか、又は
ｃ）ｄ）Ｘ１はＤではない。
【００７６】
他の実施形態において、ＫＥＸ２部位プレ配列はＸ４Ｘ３Ｘ２Ｘ１と定義され、ここで
ａ）Ｘ４はＶ、Ｓ、Ｎ、Ｌ、又はＫであり、
ａ）Ｘ３はＡ、Ｖ、Ｄ、Ｗ、Ｅ又はＰであり、
ｂ）Ｘ２はＶ、Ｉ、Ｌ又はＦであり、さらに
ｃ）Ｘ１はＥ、Ｓ、Ｔ又はＹである。
【００７７】
さらに他の実施形態において、ＫＥＸ２部位プレ配列はＸ４Ｘ３Ｘ２Ｘ１として定義され、ここで、
ａ）Ｘ４はＶ、Ｎ、又はＬであり、
ａ）Ｘ３はＡ、Ｖ、Ｄ、Ｗ、Ｅ又はＰであり、
ｂ）Ｘ２はＶ、Ｉ、Ｌ又はＦであり、さらに
ｃ）Ｘ１はＥ又はＹである。
【００７８】
さらに別の実施形態において、前記Ｘ４Ｘ３Ｘ２Ｘ１ＫＲより成るＫＥＸ２領域は、Ｘ４がＶであり、Ｘ３がＡであり、Ｘ２がＶであり、Ｘ１がＥ又はＹ及びそれらの組み合わせである群から選択され得る。
【００７９】
いくつかの実施形態において、前記ＫＥＸ２部位プレ配列は、ＶＡＶＥ（配列番号８４）、ＮＶＩＳ（配列番号８５）、ＳＤＶＴ（配列番号８６）、ＶＡＶＹ（配列番号８７）、ＬＡＶＥ（配列番号８８）、ＫＡＶＥ（配列番号８９）、ＶＡＩＥ（配列番号９０）、ＶＡＬＥ（配列番号９１）、ＶＡＦＥ（配列番号９２）、ＶＷＶＥ（配列番号９３）、ＶＥＶＥ（配列番号９４）、及びＶＰＶＥ（配列番号９５）から成る群より選択され得る。
【００８０】
いくつかの実施形態において、前記ＫＥＸ２部位プレ配列は、ＫＳＲＳ（配列番号１０９）、ＳＲＩＳ（配列番号１１１）、ＧＧＧＳ（配列番号１１０）、ＴＳＴＹ（配列番号９６）、ＡＳＩＳ（配列番号９７）、ＡＴＡＳ（配列番号９８）、ＴＡＳＱ（配列番号９９）、ＴＡＳＬ（配列番号１００）、ＳＶＩＳ（配列番号１０１）、ＮＶＩＳ（配列番号８５）、ＧＧＧ、ＴＳＲＤ（配列番号１０２）、ＳＰＭＤ（配列番号１０６）、ＤＬＧＥ（配列番号１０７）、又はＴＰＴＡ（配列番号１０８）ではない。
【００８１】
好ましいＫＥＸ２領域は、上述の通りＸ４Ｘ３Ｘ２Ｘ１Ｂ１Ｂ２として定義される一方、前記ＫＥＸ２部位プレ配列は、６アミノ酸残基を含むことができ、いくつかの実施形態において、前記ＫＥＸ２領域は、１以上のアミノ酸残基を含むことが出来る。他の実施形態において、前記ＫＥＸ２部位プレ配列は、たったの２又は３アミノ酸残基（Ｘ３Ｘ２Ｘ１Ｂ１Ｂ２又はＸ２Ｘ１Ｂ１Ｂ２）のみを含むことが出来る。この実施形態において、
ａ）Ｘ１、Ｘ２及びＸ３はＧ（例えばＧＧＧＢ１Ｂ２又はＧＧＢ１Ｂ２）でなく、
ａ）Ｘ２及びＸ３はＧ、又はＸ３はＳ（例えばＳＸ２Ｓ又はＳＧＳ）である場合、Ｘ１はＳではなく、さらに
ｂ）Ｘ１はＤではない。
【００８２】
いくつかの実施形態において、前記ＫＥＸ２部位プレ配列は、ＫＥＸ２部位プレ配列を欠く同等な融合ポリペプチド由来の目的タンパク質の切断及び／又は分泌と比較して促進された宿主細胞由来の目的タンパク質の切断及び／又は分泌を提供する。
【００８３】
いくつかの実施形態において、前記ＫＥＸ２部位プレ配列は、最適化されたＫＥＸ２部位プレ配列である。最適化されたＫＥＸ２プレ配列は、本願発明に包含されるが、他の変異体ＫＥＸ２部位プレ配列と比較してより多い又はより効率的な宿主細胞からの切断又は分泌を提供するＫＥＸ２プレ配列である。
【００８４】
いくつかの実施形態において、本願発明に包含される前記融合ポリペプチドは、ＫＥＸ２プレ配列として最適化されたＫＥＸ２プレ配列を含む。前記最適化されたＫＥＸ２プレ配列は、任意のシグナル配列、分泌タンパク質由来の任意のキャリア領域、任意のＫＥＸ２部位、又は任意の目的タンパク質と共に使用され得る。最適化されたＫＥＸ２部位プレ配列を含有する対象ＫＥＸ２領域は、非自然発生であることが出来る。特定の実施形態において、最適化されたＫＥＸ２部位プレ配列を含有する対象ＫＥＸ２領域は、糸状真菌細胞から分泌された任意のタンパク質では見られない。
【００８５】
目的タンパク質−
前記目的タンパク質（又は前記キャリアタンパク質）は、糸状真菌細胞から分泌されることが出来るタンパク質の任意の部分であることができ、当該タンパク質は、いわゆる産業用酵素、治療用タンパク質、ホルモン、構造タンパク質、プラズマタンパク質、食品添加物及び食料等を含む。目的タンパク質は、異種又は同種タンパク質とすることができ、それぞれ真菌発現宿主に関して同種又は異種であり得る部分的又は完全なポリペプチドの組み合わせを含むハイブリッドポリペプチドを含むことが出来る。前記目的分泌タンパク質は、細菌（例えばバチルス属及びシュードモナス属）、真菌（例えばアスペルギルス、トリコデルマ、フミコーラ、又はケカビ種）、ウイルス（例えば肝炎ウイルスＡ又はＢ又はアデノウイルス）、哺乳類（例えばヒト又はマウス）、及び植物源に由来することが出来る。目的タンパク質は、遺伝子操作された変異と同様に自然発生のタンパク質の対立遺伝子変異を含む。
【００８６】
一の実施形態において、前記目的タンパク質は、例えば、でんぷん加水分解α−アミラーゼ、アルカリ性α−アミラーゼ、β−アミラーゼ、セルラーゼ等のカルボヒドラーゼ、デキストラナーゼ、α−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペントサナーゼ（ｐｅｎｔｏｓａｎａｓｅ）、キシラナーゼ、インベルターゼ、ラクトース、ナリンガナーゼ（ｎａｒｉｎｇａｎａｓｅ）、ペクチナーゼ又はプルラナーゼ、酸性プロテアーゼ、アルカリプロテアーゼ、ブロメライン、フィシン、中性プロテアーゼ、パパイン、ペプシン、ペプチダーゼ、レンネット、レンニン、キモシン、ズブチリシン、サーモリシン、アスパラギン酸プロテイナーゼ、又はトリプシン等のプロテアーゼ、グルコアミラーゼ又はアルファアミラーゼ等の粒状でんぷん加水分解酵素、トリグリセリダーゼ、ホスホリパーゼ、プレガストリックエステラーゼ、ホスファターゼ、フィターゼ、アミダーゼ、イミノアシラーゼ、グルタミナーゼ、リゾチーム、又はペニシリンアシラーゼ等のリパーゼ又はエステラーゼ、グルコース異性体等の異性体、例えば、ラッカーゼ等のフェノール酸化酵素、例えば、アミノ酸オキシダーゼ、カタラーゼ、クロロペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、水酸化ステロイドデヒドロゲナーゼ又はペルオキシダーゼ等の酸化還元酵素、アセト乳酸デカルボキシラーゼ、アスパラギン酸β−デカルボキシラーゼ、フマラーゼ又はヒスタダーゼ（ｈｉｓｔａｄａｓｅ）等のリアーゼ、サイクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ又はアシルトランスフェラーゼ等のトランスフェラーゼ、又はリガーゼ等の酵素とすることが出来る。所定の実施形態において、前記タンパク質は、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ、キチナーゼ、グルコアミラーゼ、アルファアミラーゼ、クチナーゼ、フィターゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ラッカーゼ、マンノシダーゼ、ミュータン分解酵素（ｍｕｔａｎａｓｅ）、ペクチン分解酵素、ポリフェノールオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ又はトランスグルタミナーゼとすることが出来る。
【００８７】
他の実施形態において、当該目的タンパク質は、治療用タンパク質（すなわち、治療用生物学的活性を有するタンパク質）とすることが出来る。適した治療用タンパク質の例は、エリスロポエチン、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、インターフェロン−ｏ等のサイトカイン、及び顆粒球−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸ、及びヒトタンパク質Ｃ等の凝固因子、アンチトロンビンＩＩＩ、トロンビン、可溶性ＩｇＥ受容体α鎖、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、ＩｇＧ断片、ＩｇＧ融合体、ＩｇＭ又はＩｇＡ等の免疫グロブリン、インターロイキン、ウロキナーゼ、キマーゼ、及び尿素トリプシン抑制剤、ＩＧＦ−結合タンパク質、表皮成長因子、成長ホルモン−放出因子、アネキシンＶ融合タンパク質、アンギオスタチン、血管内皮成長因子−２、骨髄前駆抑制因子−１、破骨細胞分化抑制因子、α−１−抗トリプシン、α−胎児タンパク質、ＤＮａｓｅ  ＩＩ、ヒトプラスミノーゲンのクリングル３、グルコセレブロシダーゼ、ＴＮＦ結合タンパク質１、卵胞刺激ホルモン、細胞傷害Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ、膜貫活性剤及びカルシウムモジュレータ及びサイクロフィリンリガンド、可溶性ＴＮＦ受容体Ｆｃ融合体、グルカゴン様タンパク質１及びＩＬ−２受容体作用薬を含む。
【００８８】
いくつかの好ましい実施形態において、前記目的タンパク質は、クラスＧ、Ａ、Ｍ、Ｅ又はＤのいずれかの免疫グロブリンである。（米国特許第４，８１６，５６７号及びその免疫グロブリン構造に関する引用文献参照）。他の好ましい実施形態において、モノクローナル抗体等の前記抗体タンパク質は、Ｈ又はＬ鎖及びそれらの断片を含む。別の実施形態において、ヒト化抗体は、目的タンパク質（例えばトラスツズマブ（ハーセプチン））としての所定の目的物である。いくつかの好ましいモノクローナル抗体断片の具体例は、Ｈ鎖の切断型であり、例えば、Ｈ鎖（Ｆｄ）がヒンジ領域及びＣＨ２及びＣＨ３ドメインを欠くＦａｂ断片、Ｈ鎖がヒンジ領域を含むが、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを欠くＦａｂ’断片、及びヒンジ領域に連結したＦａｂ部分を含むＦ（ａｂ’）２断片等の一部の定常領域を除去する。（Ｖｅｒｍａ他、（１９９８年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ２１６：１６５−１８１ページ及びＰｅｎｎｅｌｌ及びＥｌｄｉｎ（１９９８年）Ｒｅｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：５９９−６０３ページ）。また、目的物は、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）及び単一ドメイン抗体（例えば、ラクダ抗体）である。
【００８９】
いくつかの特に好ましい実施形態において、本願発明に係る融合ポリペプチドは、操作可能な結合で、シグナル配列、キャリアタンパク質、ＫＥＸ２領域及び以下の目的タンパク質を含む。
【００９０】
融合ＤＮＡ構成物及びベクター−
いくつかの実施形態において、本願発明は、上述の融合ポリペプチドをコードする融合ＤＮＡ構成物であって、プロモーター、シグナル配列をコードする第一ＤＮＡ分子、キャリアタンパク質をコードする第二ＤＮＡ分子、ＫＥＸ２部位及び前記ＫＥＸ２部位の５’末端に直結したＫＥＸ２部位プレ配列を含むＫＥＸ２領域をコードする第三ＤＮＡ分子、及び目的タンパク質をコードする第四ＤＮＡ分子を５’末端から操作可能な結合で含む融合ＤＮＡ構成物を提供する。遺伝子コードが知られていることから、対象融合ポリペプチドの描写が与えられれば、これらの核酸の設計及び生成は、当業者の間で明白である。特定の実施形態において、前記核酸は所定の宿主細胞で融合ポリペプチドの発現のためにコドン最適化（ｃｏｄｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ）される。コドン使用表は多くの糸状菌種に有用なことから、対象融合ポリペプチドをコードするコドン最適化された核酸の設計及び生成は当業者に明白である。
【００９１】
プロモーター−
糸状真菌宿主細胞で対象核酸の転写を導くのに適したプロモーターの例は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アルファ−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ酸性安定アルファ−アミラーゼ（Ｋｏｒｍａｎ他（１９９０年）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１７：２０３−２１２ページＧｉｎｅｓ他、（１９８９年）Ｇｅｎｅ７９：１０７−１１７ページ）、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ又はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）（Ｎｕｎｂｅｒｇ他、（１９８４年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４：２３０６−２３１５ページ、Ｂｏｅｌ  Ｅ．他、（１９８４年）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：１５８１−１５８５ページ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅアルカリ性プロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸異性体、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ（Ｈｙｎｅｒ他、（１９８３年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：１４３０−１４３９ページ）、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍアミログルコシダーゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ（ＷＯ９６／００７８７）、トリコデルマ・リーセイセロビオ加水分解酵素Ｉ（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ他（１９８４年）欧州特許公開第０１３７２８０号）、トリコデルマ・リーセイセロビオ加水分解酵素ＩＩ、トリコデルマ・リーセイエンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・リーセイエンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーセイエンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・リーセイエンドグルカナーゼＩＶ、トリコデルマ・リーセイエンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・リーセイキシラナーゼＩ、トリコデルマ・リーセイキシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーセイベータ−キシロシダーゼ、さらに、ＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アルファ−アミラーゼ及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸異性体の遺伝子に由来するプロモーターのハイブリッド、及びそれらの変種、切断されたプロモーター、及びハイブリッドプロモーターの遺伝子から得られる。Ｙｅｌｔｏｎ他、（１９８４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国８１：１４７０−１４７４ページ、Ｍｕｌｌａｎｅｙ他、（１９８５年）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：３７−４５ページ、Ｌｏｃｋｉｎｇｔｏｎ他、（１９８６年）Ｇｅｎｅ３３：１３７−１４９ページ、Ｍａｃｋｎｉｇｈｔ他、（１９８６年）Ｃｅｌｌ４６：１４３−１４７ページ、Ｈｙｎｅｓ他、（１９８３年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：１４３０−１４３９ページも参照にされる。ＳＶ４０早期プロモーター（Ｂａｒｃｌａｙ他（１９８３年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ３：２１１７−２１３０ページ）等のより精度の高い真核プロモーターも有用である。プロモーターは、構成的又は誘導的プロモーターとすることが出来る。いくつかの好ましいプロモーターは、トリコデルマ・リーセイ��ロビオ加水分解酵素Ｉ又はＩＩ、トリコデルマ・リーセイエンドグルカナーゼＩ、ＩＩ又はＩＩＩ、及びトリコデルマ・リーセイキシラナーゼＩＩを含む。
【００９２】
ベクター−
対象ポリヌクレオチドは、例えば、ファージ、プラスミド、ウイルス、又はレトロベクター等のベクターで提供され得る。特定の実施形態において、前記ベクターは、糸状真菌細胞で対象融合ポリペプチドを発現する発現ベクターとすることが出来る。組換えタンパク質の発現に用いられるベクターは、当該技術分野でよく知られている（Ａｕｓｕｂｅｌ他、分子生物学における簡易プロトコール（Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、第３版、Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ出版、１９９５年、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、分子クローニング：研究マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第二版、（１９８９年）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ出版、ニューヨーク州）。
【００９３】
本願発明に係る融合ＤＮＡ構成物は、例えば、欧州特許公開第０２１５５９４号等に一般的に記載されるような公知技術を用いて構成され得る。
【００９４】
目的タンパク質（例えば、免疫グロブリン）をコードする天然又は合成ポリヌクレオチド断片は、糸状真菌細胞で導入及び複製が可能な異種核酸構成物又はベクターに組み込まれることが出来る。
【００９５】
本願発明に包含されるＤＮＡ構成物又はより具体的な融合ＤＮＡ構成物が生成された場合、それは当該技術分野で知られる任意の数のベクターに組み込まれ得る。好ましいＤＮＡ構成物はプロモーター配列を含む一方、いくつかの実施形態において前記ベクターは、形質転換されるために、リボソーム結合部位、転写開始及び終了配列、ターミネータ配列、ポリアデニル化シグナル、エンハンサー及び又は活性剤等の宿主で機能的な他の制御配列を含む。いくつかの実施形態において、目的タンパク質及びＫＥＸ２領域をコードするポリヌクレオチドは、適切な制限エンドヌクレアーゼ部位で標準的処理により、プロモーター、シグナル配列及びキャリアタンパク質を含むベクターへ挿入される。このような処理及び関連サブクローニング処理は、当業者の知識の範囲内であると思われる。
【００９６】
転写が終了するために発現宿主により認識されるターミネータ配列は、発現する融合タンパク質をコードする融合ＤＮＡ構成物の３’末端に操作可能に連結され得る。当業者は、糸状菌と共に使用される多様なターミネータ配列をよく認識している。非限定的な例は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  ｔｒｐＣ遺伝子（Ｙｅｌｔｏｎ  Ｍ．他、（１９８４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：１４７０−１４７４ページ）由来のターミネータ又はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ遺伝子（Ｎｕｎｂｅｒｇ他（１９８４年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２３０６−２３５３ページ）由来のターミネータ又はトリコデルマ・リーセイセロビオ加水分解酵素Ｉ遺伝子由来のターミネータを含む。
【００９７】
ポリアデニル化配列は、ポリアデノシン残基を転写されたｍＲＮＡに添加するため、転写物が発現宿主により認識される場合のＤＮＡ配列である。例は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  ｔｒｐＣ遺伝子（Ｙｅｌｔｏｎ  Ｍ．他、（１９８４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：１４７０−１４７４ページ）又はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ遺伝子（Ｎｕｎｂｅｒｇ他（１９８４年）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２３０６−２３１５ページ）、Ａ．ｏｒｙｚａｅ又はＡ．ｎｉｇｅｒアルファアミラーゼ遺伝子及びＲｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉカルボキシルプロテアーゼ遺伝子由来のポリアデニル化配列である。いずれの真菌ポリアデニル化配列も、本願発明において機能的であることが多い。
【００９８】
別の実施形態において、前記融合ＤＮＡ構成物を含む融合ＤＮＡ構成物又はベクターは、選択可能マーカー遺伝子を含有し、形質転換された宿主細胞の選択を可能にする。選択マーカー遺伝子は、当該技術分野で知られ、使用する宿主細胞によって変更される。選択可能マーカーの例は、抗微生物耐性を与えるもの（例えばハイグロマイシン、ブレオマイシン、クロロアンフェニコール（ｃｈｌｏｒｏａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）及びフレオマイシン）を含むがそれらに限られない。栄養選択マーカー等の代謝優位を与える遺伝子も本願発明で使用される。いくつかのこれらのマーカーは、ａｍｄＳを含む。栄養要求性欠損を補完する遺伝子をコードする配列も、選択マーカーとして使用され得る（例えば、ｐｙｒ４欠損Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａ．ａｗａｍｏｒｉ又はトリコデルマ・リーセイのｐｙｒ４補完（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）及びａｒｇＢ欠損株のａｒｇＢ補完）。Ｋｅｌｌｅｙ他、（１９８５年）ＥＭＢＯ  Ｊ．４：４７５−４７９ページ、Ｐｅｎｔｔｉｌａ他、（１９８７年）Ｇｅｎｅ６１：１５５−１６４ページ及びＫｉｎｇｈｏｒｎ他（１９９２年）糸状菌の応用分子遺伝学（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  Ｆｕｎｇｉ）、Ｂｌａｃｋｉｅ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  ａｎｄ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ、Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ出版、ロンドンが参考にされる。
【００９９】
宿主細胞−
本願発明に係る融合ＤＮＡ構成物を含む宿主細胞も提供される。特定の実施形態において、前記宿主細胞は、糸状真菌宿主細胞とすることが出来る。いくつかの実施形態において、前記細胞は、ＧＲＡＳの地位である、すなわち、ＦＤＡにより安全であると認証された（Ｇｅｎｅｒａｌｌｙ  Ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ａｓ  Ｓａｆｅ）タンパク質の生成に使用された経歴を有する株の糸状真菌細胞であることが出来る。所定の実施形態において、前記対象真菌細胞は、以下の種の細胞であり得る。すなわち、トリコデルマ属（例えば、トリコデルマ・リーセイ（従来Ｔ．ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍとして分類され、現在Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａとしても知られている）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ、及びＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ））、ペニシリン属種：フミコーラ属種（例えば、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ及びＨｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅα）、クリソスポリウム属種（例えば、Ｃ．ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、グリオクラディウム属種、アスペルギルス属種（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｋａｗａｃｈｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ、及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、フザリウム属種、ケカビ属種、アカパンカビ属種、ボタンタケ属種、又はエメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）属種（Ｉｎｎｉｓ他、（１９８５年）Ｓｃｉ．２２８：２１−２６ページ）等である。いくつかの実施形態において、対象真菌細胞は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ、ＡＴＣＣ１１４９０、ＡＴＣＣ２２３４２、ＡＴＣＣ４４７３３、ＡＴＣＣ１４３３１、ＮＲＲＬ３１１２を含むＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒの株及びそれらに由来する株であることが出来る。いくつかの実施形態において、対象真菌細胞は、ＲＬ−Ｐ３７（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ他（１９８４年）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２０：４６−５３ページ）の機能的同等物を含むトリコデルマ属株であることが出来る。有用なトリコデルマ宿主株は、ＮＲＲＬ１５７０９、ＡＴＣＣ１３６３１、ＡＴＣＣ２６９２１（ＱＭ９４１４）ＡＴＣＣ３２０９８、ＡＴＣＣ３２０８６、及びＡＴＣＣ５６７６５（ＲＵＴＣ−３０）を含む。
【０１００】
いくつかの実施形態において、宿主細胞は、野生型遺伝子が欠損又は不活性化されたものとすることが出来る。いくつかの実施形態において、好ましい宿主細胞は、不活性化されたプロテアーゼ遺伝子（例えばアスパルチルプロテアーゼ）を有し、Ｂｅｒｋａ他（１９９０年）Ｇｅｎｅ８６：１５３−１６２ページ及び米国特許第６，５０９，１７１号が参照にされる。いくつかの実施形態において、好ましい宿主細胞は、不活性化されたセルラーゼ遺伝子（例えばｃｂｈ１、ｃｂｈ２及びｅｇｌ１、及びｅｇｌ２）を有し、ＷＯ０５／００１０３６で開示されるトリコデルマ・リーセイのクワド欠損（ｑｕａｄ  ｄｅｌｅｔｅｄ）株が参照される。
【０１０１】
上述の融合ＤＮＡ構成物は、例えば、宿主細胞の核ゲノムに存在するか、又は宿主細胞で複製するプラスミドに存在することが出来る。
【０１０２】
形質転換−
ＤＮＡ構成物又はベクターの宿主細胞への導入は、形質転換、エレクトロポレーション、核マイクロインジェクション、形質導入、トランスフェクション、（例えば、リポフェクション介在及びＤＥＡＥ−デキストリン介在トランスフェクション）、カルシウムリン酸ＤＮＡ沈殿物とのインキュベーション、ＤＮＡコートマイクロ入射核の高速度砲撃、及びプロトプラスト融合等の技術を含む。一般的な形質転換技術が当該技術分野で知られている（例えば、上記Ａｕｓｕｂｅｌ他、（１９８７年）、第９章、及び上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９年）及びＣａｍｐｂｅｌｌ他、（１９８９年）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３−５６ページ参照）。ＷＯ０５／００１０３６、米国特許第６，０２２，７２５号、米国特許第６，１０３，４９０号、米国特許第６，２６８，３２８号、［公開米国特許出願第２００６００４１１１３号、第２００６００４０３５３号、第２００６００４０３５３号、及び第２００５０２０８６２３号］も参照にされ、これらの発行物は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０３】
トリコデルマ属に組換えで導入されたタンパク質の発現は、米国特許第６，０２２，７２５号、米国特許第６，２６８，３２８号、Ｈａｒｋｋｉ他（１９９１年）、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１３：２２７−２３３ページ、Ｈａｒｋｋｉ他、（１９８９年）Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．７：５９６−６０３ページ、欧州特許第２４４，２３４号、第２１５，５９４号、及びＮｅｖａｌａｉｎｅｎ他、「トリコデルマ属の分子生物学及び同異種両方の遺伝子発現への応用（Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｏｔｈ  Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｄ  Ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  Ｇｅｎｅｓ）」、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ  ＭＹＣＯＬＯＧＹ、Ｌｅｏｎｇ及びＢｅｒｋａ編集、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ社出版、ニューヨーク州（１９９２年）１２９−１４８ページ）に開示される。Ｃａｏ他、（２０００年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．９：９９１−１００１ページ、Ｙｅｌｔｏｎ他、（１９８４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：１４７０−１４７１ページ、米国特許第６，５９０，０７８号、及びＢｅｒｋａ他、（１９９１年）が参照にされ、アスペルギルス株の形質転換には、酵素生物工学の応用（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｋｅｌｌｙ及びＢａｌｄｗｉｎ編集、Ｐｌｅｎｕｍ発行、ニューヨーク州も参照にされる。
【０１０４】
一の実施形態において、トリコデルマ属種の形質転換への調整は、真菌菌糸からのプロトプラストの調整を含む（Ｐｅｎｔｔｉｌａ他、（１９８７年）Ｇｅｎｅ６１：１５５−１６４ページ参照）。いくつかの実施形態において、前記菌糸体は発芽増殖性胞子から得られる。
【０１０５】
一般的に、細胞は、生理塩及び栄養素を含有する標準的培地で培養される（例えば、Ｐｏｕｒｑｕｉｅ，Ｊ．他、（ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ＡＮＤ  ＧＥＮＥＴＩＣＳ  ＯＦ  ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ  ＤＥＧＲＡＤＡＴＩＯＮ）、Ａｕｂｅｒｔ，Ｊ．Ｐ．他編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ発行、７１−８６ページ、１９８８年及びＩｌｍｅｎ，Ｍ．他、（１９９７年）Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：１２９８−１３０６ページ参照）。一般的な商業用に調製された培地（例えば、酵母麦芽エキス（ＹＭ）ブロス、Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ブロス及びサブローデキストロース（ＳＤ）ブロスも本願発明で使用される。前記糸状真菌に用いられる好ましい培養条件は、当該技術分野で知られ、科学文献で及び／又はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）及びＦｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ等の菌源から見つけることが出来る。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、免疫グロブリンが目的タンパク質免疫グロブリンである場合、発現細胞は親細胞系統の培養に通常使用される条件下で培養される。一般的に、細胞は、上記Ｉｌｍｅｎ他、（１９９７年）で開示される等の生理塩及び栄養素を含有する標準的培地で培養される。目的レベルの免疫グロブリンを発現するまで、培養条件も標準的（例えば、２５−３０℃における回転式振盪培養機上の振盪フラスコでのインキュベーション）である。
【０１０７】
タンパク質生成方法−
糸状真菌細胞における目的タンパク質の生成方法も本願発明に包含される。いくつかの実施形態において、これらの方法は、本願発明に係る融合ＤＮＡ構成物又はベクターを含む糸状宿主細胞を得る工程及び目的タンパク質の発現及び分泌を可能にする適した条件下で糸状宿主細胞を培養する工程を含む。宿主細胞の培養地（すなわち、対象宿主細胞及び成長培地を含有する組成）が、上述の融合ポリペプチドの分泌タンパク質を含有し得る一方で、いくつかの実施形態において前記目的タンパク質は、培養地から回収される。他の実施形態において、前記目的タンパク質は精製される。タンパク質は、任意の便宜的な方法により成長培地から回収され得る。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、対象真菌細胞は、バッチ式又は継続的発酵条件下で培養され得る。従来のバッチ式発酵は、閉鎖系であり、ここで前記培地の組成は発酵の開始で準備が完了され、発酵中は人為的変更が行われない。従って、発酵の開始で前記培地は、目的微生物が接種される。この方法において、発酵は前記系への任意成分の追加なしに行われることが可能とされる。通常、バッチ式発酵は、炭素源の追加に関して「バッチ式」であると見なされ、ｐＨ及び酸素濃度等のコントロール因子において頻繁に試みられる。バッチ式系の代謝及びバイオマス組成は、発酵が終了する時間まで常に変化する。バッチ式培養内において、細胞は静的誘導期から対数高成長期を通り、最終的に成長が減少又は停止する静止期まで発育する。非処理の場合、静止期の細胞は最終的に死滅する。一般に、対数期の細胞は、最終生成物の生成バルク量に影響する。
【０１０９】
標準的バッチ式系の変形は、本願発明で使用される「流加発酵」系である。この典型的バッチ式系の変形において、前記基質は発酵が進行するにつれて徐々に添加される。異化代謝産物抑制により細胞の代謝が抑制される傾向がある場合、及び培地における基質量の制限が望ましい場合に、流加系は有益である。流加系における実際の基質濃度の測定は、困難であり、従って、ｐＨ、溶解酸素等の測定可能な因子及びＣＯ２等の消耗気体の分圧の変化に係る基準について試算される。バッチ式及び流加発酵は一般的であり、当該技術分野に知られている。
【０１１０】
継続的発酵は開放系であり、指定発酵培地は継続的にバイオリアクターへ添加され、等量の条件培地が過程において同時に回収される。継続的発酵は、一般的に一定高密度での培養で維持され、細胞は主に対数期成長にある。
【０１１１】
継続的発酵は、細胞成長及び／又は最終生成物濃度に影響する一因子又は任意数の因子の調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）を可能にさせる。例えば、一の実施形態において、炭素源又は窒素源等の栄養素の限定は、定率で維持され、他の全てのパラメーターは、加減され得る。他の系において、成長に影響する多くの因子は、継続的に変化し得る一方、培地濁度により測定される前記細胞の濃度は一定に保たれる。継続的な系は、定常状態の成長条件を維持する。従って、培地が取り除かれたための細胞の損失は、発酵における細胞成長率とバランスが保たれるようにする。生成物の形成率を最大にする技術と同様に継続的発酵方法に用いる栄養素及び成長因子の調節方法は、公知である。
【０１１２】
発現及び分泌−
融合ポリペプチドをコードする融合ＤＮＡ構成物を含む糸状真菌細胞における目的タンパク質の生成は、融合ポリペプチドの目的タンパク質の分泌をもたらす。菌における分泌工程の間、糖鎖は、分泌されるタンパク質に付着し、グリコシル化タンパク質を生成し得る。本願発明において、目的タンパク質（例えば、抗体）の生成は、グリコシル化又は非グリコシル化タンパク質を含み得る。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、対象融合ポリペプチドの前記分泌タンパク質は一般的に、同等な（すなわち、同じ細胞型、同じ条件で成長した）糸状真菌細胞により生成されるが、ＫＥＸ２部位プレ配列を欠く同等な融合ポリペプチドの目的分泌タンパク質の量より多い量で糸状真菌細胞の培養地に存在する。本願発明に係る融合ポリペプチド由来の目的タンパク質を生成する対象細胞の培養は、別の同等タンパク質を発現するが、本願発明に包含されるＫＥＸ２部位プレ配列を有さない同等な細胞培養と比較して成長培地における目的タンパク質を５％より多く、１０％より多く、２０％より多く、４０％より多く、６０％より多く、８０％より多く、１００％より多く、１５０％より多く、２００％より多く、３００％より多く、５００％より多く、及び１０００％より多く含有し得る。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、目的タンパク質（例えば、全長抗体）の発現及び分泌レベルは、０．５ｇ／Ｌより多い。通常１．０ｇ／Ｌより多い目的タンパク質が、培養地から回収され得る。１．５、２．０及び３．０ｇ／Ｌより多い再現可能なレベルが達成される。いくつかの実施形態において、目的タンパク質の発現及び分泌レベルは、１０ｇ／Ｌより多く、さらに２０ｇ／Ｌより多い。
【０１１５】
本願発明に係るいくつかの実施形態において、前記組換え融合ポリペプチド由来の目的タンパク質の切断は、ＫＥＸ２部位プレ配列を欠く同等な組換え融合ポリペプチド由来の同じ目的タンパク質の切断より多い。いくつかの実施形態において、前記ＫＥＸ２部位プレ配列は少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の効率で切断された融合タンパク質をもたらす。ここで、効率１００％は、完全に切断された融合ポリペプチド由来の目的分泌タンパク質をもたらす。
【０１１６】
特定の実施形態において、タンパク質切断効率は、生じた切断量の決定、例えば、切断タンパク質量対非切断タンパク質量の決定等により算出される。一の実施形態において、タンパク質切断量は、成長培地で細胞培養の体積当たり、成長培地における切断タンパク質量対非切断融合タンパク質量の割合を決定することにより算出され得る。
【０１１７】
ＫＥＸ２部位プレ配列又は最適化されたＫＥＸ２部位プレ配列を含有する融合ポリペプチドは、特定の実施形態において、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の効率で切断される融合ポリペプチドをもたらす。ここで効率１００％は、完全に切断された目的タンパク質である。
【０１１８】
他の実施形態において、前記対象融合ポリペプチドの分泌効率は、前記タンパク質を分泌する細胞の成長培地において前記融合ポリペプチドの分泌部分の量を決定することにより算出され得る。この測定は、定量的、定性的、相対的又は絶対的に行い得る。一の実施形態において、対象融合体を分泌する細胞の成長培地における分泌タンパク質の量は、最適化されたＫＥＸ２プレ配列を含有しない同等な融合ポリペプチドを生成する細胞により分泌された分泌タンパク質量より、少なくとも１０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも９０％、少なくとも２倍、少なくとも５倍、又は少なくとも１０倍多い。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、分泌及び／又は切断の増加は、ＧＧＧＢ１Ｂ２で定義される基準ＫＥＸ２領域に対して測定され得る。ここでＢ１Ｂ２はＫＫ、ＫＲ、ＲＫ又はＲＲ及び好ましくはＫＲである。１つの実施形態において、対象融合体を分泌する細胞の成長培地中の分泌タンパク質又は目的タンパク質の量は、本質的に同等な条件下、同等な宿主で同等な融合ポリペプチドにより分泌タンパク質又は分泌された目的タンパク質の量より、少なくとも１０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、及び少なくとも１０倍多い。
【０１２０】
スクリーニング方法−
最適化されたＫＥＸ２部位プレ配列を特定するスクリーニング方法も提供される。これらの方法は、ａ）親融合ポリペプチドのＫＥＸ２部位プレ配列を変異し、試験ポリペプチドを生成する工程及びｂ）糸状真菌細胞による試験融合ポリペプチドの分泌を評価する工程を含み得る。特定の実施形態において、試験融合ポリペプチド由来の目的タンパク質の分泌及び／又は切断は、親融合タンパク質の分泌及び／又は切断と比較される。所定の実施形態において、当該方法は、培養の体積当たり、成長培地で融合ポリペプチドの分泌タンパク質の量と細胞で融合ポリペプチドの分泌部分の量とを比較して評価する工程、又は成長培地で組換え融合ポリペプチドの分泌タンパク質の量を評価する工程を含む。他の実施形態において、前記方法は、成長培地で融合ポリペプチドから放出された又は切断された分泌タンパク質（目的タンパク質）の量と（例えば、キャリアタンパク質に付着した）融合ポリペプチドの型に残る分泌タンパク質の量とを比較して、評価する工程を含む。
【０１２１】
これらのスクリーニング分析において、前記親融合タンパク質は、図１で概略的に図解される、アミノ酸配列を有し、ここでＸはアミノ酸である。特定の実施形態において、前記親融合タンパク質及び前記試験融合タンパク質は、それらのＫＥＸ２部位プレ配列を除き、同一である。親組換え融合タンパク質及び試験組換え融合タンパク質は、ＫＥＸ−２部位プレ配列の１つ、２つ、３つ又は４つのアミノ酸で異なることが出来る。変異は、アミノ酸置換、挿入又は欠失とすることができ、さらに、２又は３の変異がある場合、前記変異は、隣接アミノ酸、非隣接アミノ酸、又は隣接及び非隣接アミノ酸の組み合わせとすることが出来る。
【０１２２】
一の実施形態において、親融合ポリペプチドの前記ＫＥＸ２部位プレ配列は、変異され、それぞれ異なるＫＥＸ２部位プレ配列を含有する複数の異なる試験融合ポリペプチドを生成することができる。その後、糸状真菌細胞による前記試験融合ポリペプチド及び前記親融合ポリペプチドの分泌及び／又は切断が評価される。
【０１２３】
これらの方法は、一般的に知られるプロトコール（例えば、Ｗａｒｄ他（１９９０年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ８：４３５−４４０ページ及びＳｐｅｎｃｅｒ（１９９８年）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５８：１０７−１１２ページ等参照）を用いて実施され得る。当該プロトコールでは、ベクターは細胞へ導入され、前記細胞は培養され、前記細胞培養の細胞タンパク質の存在が分析される。一の実施形態において、本願発明に係る融合体をコードする組換え核酸（その構造は図１に示される）は、変異され、試験ポリペプチドをコードする核酸を生成し、２つの核酸は、同等な糸状真菌細胞（上の一覧に示される任意の宿主細胞とすることが出来る）の形質転換に使用される。２つの細胞系統は、同等な条件下で培養され、タンパク質の分泌部分の分泌及び／又は切断効率が評価される。前記親融合タンパク質のシグナル配列、分泌タンパク質、ＫＥＸ２部位及びＫＥＸ２部位プレ配列は、上の一覧に示されるものを含め任意の知られたシグナル配列、分泌タンパク質、ＫＥＸ２部位又はＫＥＸ２部位プレ配列とすることが出来る。
【０１２４】
上述の通り、前記タンパク質分泌又は切断効率は、例えば、異なる培養間で成長培地の分泌部分の絶対量又はノーマライズされた量の比較、又はタンパク質の分泌部分の量と、タンパク質の非分泌部分の量との比較による等、多くの異なる方法により評価され得る。当該評価は、例えば、定量的、定性的、相対的又は絶対的に行うことが出来る。
【０１２５】
最適化されたＫＥＸ２部位プレ配列は、上述の方法に係る複数の異なる試験融合タンパク質を試験する工程、及びどの異なる試験融合タンパク質が最も効率的に分泌された及び／又は切断されたかを決定する工程により特定されることができる。ここで前記最適化されたＫＥＸ２部位プレ配列は、最も効率的に分泌された試験組換え融合タンパク質のＫＥＸ２部位プレ配列である。
【０１２６】
コントロール培養より少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７０％及び少なくとも９５％より多くの分泌タンパク質又はより多くの目的タンパク質を含有する細胞の培養は、ＫＥＸ２部位プレ配列によりこれらの細胞からのタンパク質分泌及び／又は切断が増加されることを示す。
【実施例】
【０１２７】
以下の実施例は、当業者に本願発明をどのように生成し、使用するかの完全な開示及び記載を提供するためにある。そして、発明者が彼らの発明として見なす範囲を限定することを意図せず、また、以下の実験が全て又は実施された唯一の実験であると述べるものではない。使用される数（例えば、量、温度等）に関して正確さを保証にする取り組みがされているが、若干の実験誤差及び偏差のあり得ることも考慮すべきである。別段の表示がない限り、パーツは重量によるパーツ、分子量は重量平均分子量、温度は摂氏（℃）、圧力は大気圧又はそれに近い。また、以下の略記が適用される。すなわち、Ｍ（モル）、μＭ（マイクロモル）、Ｎ（ノーマル）、ｍｏｌ（モル）、ｍｍｏｌ（ミリモル）、μｍｏｌ（マイクロモル）、ｎｍｏｌ（ナノモル）、ｇ（グラム）、ｍｇ（ミリグラム）、ｋｇ（キログラム）、μｇ（マイクログラム）、Ｌ（リットル）、ｍｌ（ミリリットル）、ｈ（時間）、ｍｉｎ（分間）、ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）、ｋＤａ（キロダルトン）、及びｂｐ（塩基対）である。以下の分析及び方法が下記の実施例で使用される。
【０１２８】
Ａ．ｐＴｒｅｘ４ベクターの構成：
合成ＤＮＡは、トリコデルマ発現ベクター（ｐＴｒｅｘ４）へクローン化され、以下で記載される実施例での使用に適切な発現プラスミドを産生した。
【０１２９】
ｐＴｒｅｘ４はｐＴｒｅｘ２の修飾形であり、ｐＴｒｅｘ３ｇ発現ベクターに由来する。ｐＴｒｅｘ３ｇの構成は、ＷＯ０５／００１０３６の実施例６で詳細に記載される。つまり、前記ｐＴｒｅｘ３ｇは、大腸菌ベクターｐＳＬ１１８０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）に基づき、当該ベクターは、６４六量体制限酵素認識配列を含有する拡張された複数のクローニング部位を有するｐＵＣ１１８プラスミドに基づいたベクターである。Ｇａｔｅｗａｙ  ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  ベクター（Ｈａｒｔｌｅｙ、Ｊ．Ｌ．他、（２０００年）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ１０：１７８８−１７９５ページ）として設計され、トリコデルマ・リーセイｃｂｈ１遺伝子のプロモーターとターミネータ領域との間の任意の目的オープンリーディングフレームのＧａｔｅｗａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（インビトロジェン）を用いた挿入を可能にした。
【０１３０】
ｐＴｒｅｘ４−ｈｅｒ２Ｌ鎖ＤＮＡ２．０の詳細は、以下（図２及び図３）である。前記プラスミドのサイズは、１０８８５ｋｂ（配列番号１０３）である。ｐＳＬ１１８０のポリリンカー領域へ挿入されたものは、ＤＮＡの以下のセグメントである。
【０１３１】
トリコデルマ・リーセイｃｂｈ１のプロモーター領域由来のＤＮＡの２．２ｂｐセグメント、
トリコデルマ・リーセイｃｂｈ１シグナル配列（下線）、触媒ドメイン、リンカー（イタリック体）（１５７０塩基）（配列番号１０４）のＤＮＡ配列
ＡＴＧＴＡＴＣＧＧＡＡＧＴＴＧＧＣＣＧＴＣＡＴＣＴＣＧＧＣＣＴＴＣＴＴＧＧＣＣＡＣＡＧＣＴＣＧＴＧＣＴＣＡＧＴＣＧＧＣＣＴＧ
ＣＡＣＴＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＡＧＡＣＴＣＡＣＣＣＧＣＣＴＣＴＧＡＣＡＴＧＧＣＡＧＡＡＡＴＧＣＴＣＧＴＣＴＧＧＴＧＧＣＡＣＴＴＧＣＡＣＴＣＡＡＣＡＧＡＣＡＧＧＣＴＣＣＧＴＧＧＴＣＡＴＣＧＡＣＧＣＣＡＡＣＴＧＧＣＧＣＴＧＧＡＣＴＣＡＣＧＣＴＡＣＧＡＡＣＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＡＣＴＧＣＴＡＣＧＡＴＧＧＣＡＡＣＡＣＴＴＧＧＡＧＣＴＣＧＡＣＣＣＴＡＴＧＴＣＣＴＧＡＣＡＡＣＧＡＧＡＣＣＴＧＣＧＣＧＡＡＧＡＡＣＴＧＣＴＧＴＣＴＧＧＡＣＧＧＴＧＣＣＧＣＣＴＡＣＧＣＧＴＣＣＡＣＧＴＡＣＧＧＡＧＴＴＡＣＣＡＣＧＡＧＣＧＧＴＡＡＣＡＧＣＣＴＣＴＣＣＡＴＴＧＧＣＴＴＴＧＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴＧＣＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＧＴＴＧＧＣＧＣＴＣＧＣＣＴＴＴＡＣＣＴＴＡＴＧＧＣＧＡＧＣＧＡＣＡＣＧＡＣＣＴＡＣＣＡＧＧＡＡＴＴＣＡＣＣＣＴＧＣＴＴＧＧＣＡＡＣＧＡＧＴＴＣＴＣＴＴＴＣＧＡＴＧＴＴＧＡＴＧＴＴＴＣＧＣＡＧＣＴＧＣＣＧＴＡＡＧＴＧＡＣＴＴＡＣＣＡＴＧＡＡＣＣＣＣＴＧＡＣＧＴＡＴＣＴＴＣＴＴＧＴＧＧＧＣＴＣＣＣＡＧＣＴＧＡＣＴＧＧＣＣＡＡＴＴＴＡＡＧＧＴＧＣＧＧＣＴＴＧＡＡＣＧＧＡＧＣＴＣＴＣＴＡＣＴＴＣＧＴＧＴＣＣＡＴＧＧＡＣＧＣＧＧＡＴＧＧＴＧＧＣＧＴＧＡＧＣＡＡＧＴＡＴＣＣＣＡＣＣＡＡＣＡＣＣＧＣＴＧＧＣＧＣＣＡＡＧＴＡＣＧＧＣＡＣＧＧＧＧＴＡＣＴＧＴＧＡＣＡＧＣＣＡＧＴＧＴＣＣＣＣＧＣＧＡＴＣＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＡＡＴＧＧＣＣＡＧＧＣＣＡＡＣＧＴＴＧＡＧＧＧＣＴＧＧＧＡＧＣＣＧＴＣＡＴＣＣＡＡＣＡＡＣＧＣＡＡＡＣＡＣＧＧＧＣＡＴＴＧＧＡＧＧＡＣＡＣＧＧＡＡＧＣＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＡＧＡＴＧＧＡＴＡＴＣＴＧＧＧＡＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＴＣＣＧＡＧＧＣＴＣＴＴＡＣＣＣＣＣＣＡＣＣＣＴＴＧＣＡＣＧＡＣＴＧＴＣＧＧＣＣＡＧＧＡＧＡＴＣＴＧＣＧＡＧＧＧＴＧＡＴＧＧＧＴＧＣＧＧＣＧＧＡＡＣＴＴＡＣＴＣＣＧＡＴＡＡＣＡＧＡＴＡＴＧＧＣＧＧＣＡＣＴＴＧＣＧＡＴＣＣＣＧＡＴＧＧＣＴＧＣＧＡＣＴＧＧＡＡＣＣＣＡＴＡＣＣＧＣＣＴＧＧＧＣＡＡＣＡＣＣＡＧＣＴＴＣＴＡＣＧＧＣＣＣＴＧＧＣＴＣＡＡＧＣＴＴＴＡＣＣＣＴＣＧＡＴＡＣＣＡＣＣＡＡＧＡＡＡＴＴＧＡＣＣＧＴＴＧＴＣＡＣＣＣＡＧＴＴＣＧＡＧＡＣＧＴＣＧＧＧＴＧＣＣＡＴＣＡＡＣＣＧＡＴＡＣＴＡＴＧＴＣＣＡＧＡＡＴＧＧＣＧＴＣＡＣＴＴＴＣＣＡＧＣＡＧＣＣＣＡＡＣＧＣＣＧＡＧＣＴＴＧＧＴＡＧＴＴＡＣＴＣＴＧＧＣＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＣＧＡＴＧＡＴＴＡＣＴＧＣＡＣＡＧＣＴＧＡＧＧＡＧＧＣＡＧＡＡＴＴＣＧＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＴＴＴＣＴＣＡＧＡＣＡＡＧＧＧＣＧＧＣＣＴＧＡＣＴＣＡＧＴＴＣＡＡＧＡＡＧＧＣＴＡＣＣＴＣＴＧＧＣＧＧＣＡＴＧＧＴＴＣＴＧＧＴＣＡＴＧＡＧＴＣＴＧＴＧＧＧＡＴＧＡＴＧＴＧＡＧＴＴＴＧＡＴＧＧＡＣＡＡＡＣＡＴＧＣＧＣＧＴＴＧＡＣＡＡＡＧＡＧＴＣＡＡＧＣＡＧＣＴＧＡＣＴＧＡＧＡＴＧＴＴＡＣＡＧＴＡＣＴＡＣＧＣＣＡＡＣＡＴＧＣＴＧＴＧＧＣＴＧＧＡＣＴＣＣＡＣＣＴＡＣＣＣＧＡＣＡＡＡＣＧＡＧＡＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＡＣＣＣＧＧＴＧＣＣＧＴＧＣＧＣＧＧＡＡＧＣＴＧＣＴＣＣＡＣＣＡＧＣＴＣＣＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＣＴＣＡＧＧＴＣＧＡＡＴＣＴＣＡＧＴＣＴＣＣＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＧＴＣＡＣＣＴＴＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＴＴＣＧＧＡＣＣＣＡＴＴＧＧＣＡＧＣＡＣＣＧＧＣＡＡＣＣＣＴＡＧＣＧＧＣＧＧＣＡＡＣＣＣＴＣＣＣＧＧＣＧＧＡＡＡＣＣＣＧＣＣＴＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＡＧＣＣＡＣＴＡＣＣＡＣＴＧＧＡＡＧＣＴＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＴＡＣＴＡＧＴ
トリコデルマ・リーセイｃｂｈ１シグナル配列、触媒ドメイン、リンカー（４８０アミノ酸）のアミノ酸配列が以下に表される（配列番号１０５）。
【０１３２】
ＭＹＲＫＬＡＶＩＳＡＦＬＡＴＡＲＡＱＳＡＣＴＬＱＳＥＴＨＰＰＬＴＷＱＫＣＳＳＧＧＴＣＴＱＱＴＧＳＶＶＩＤＡＮＷＲＷＴＨＡＴＮＳＳＴＮＣＹＤＧＮＴＷＳＳＴＬＣＰＤＮＥＴＣＡＫＮＣＣＬＤＧＡＡＹＡＳＴＹＧＶＴＴＳＧＮＳＬＳＩＧＦＶＴＱＳＡＱＫＮＶＧＡＲＬＹＬＭＡＳＤＴＴＹＱＥＦＴＬＬＧＮＥＦＳＦＤＶＤＶＳＱＬＰＣＧＬＮＧＡＬＹＦＶＳＭＤＡＤＧＧＶＳＫＹＰＴＮＴＡＧＡＫＹＧＴＧＹＣＤＳＱＣＰＲＤＬＫＦＩＮＧＱＡＮＶＥＧＷＥＰＳＳＮＮＡＮＴＧＩＧＧＨＧＳＣＣＳＥＭＤＩＷＥＡＮＳＩＳＥＡＬＴＰＨＰＣＴＴＶＧＱＥＩＣＥＧＤＧＣＧＧＴＹＳＤＮＲＹＧＧＴＣＤＰＤＧＣＤＷＮＰＹＲＬＧＮＴＳＦＹＧＰＧＳＳＦＴＬＤＴＴＫＫＬＴＶＶＴＱＦＥＴＳＧＡＩＮＲＹＹＶＱＮＧＶＴＦＱＱＰＮＡＥＬＧＳＹＳＧＮＥＬＮＤＤＹＣＴＡＥＥＡＥＦＧＧＳＳＦＳＤＫＧＧＬＴＱＦＫＫＡＴＳＧＧＭＶＬＶＭＳＬＷＤＤＹＹＡＮＭＬＷＬＤＳＴＹＰＴＮＥＴＳＳＴＰＧＡＶＲＧＳＣＳＴＳＳＧＶＰＡＱＶＥＳＱＳＰＮＡＫＶＴＦＳＮＩＫＦＧＰＩＧＳＴＧＮＰＳＧＧＮＰＰＧＧＮＰＰＧＴＴＴＴＲＲＰＡＴＴＴＧＳＳＰＧＰＴＳ
前記プラスミドは、ｃｂｈ１ターミネータ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ  ａｍｄＳ選択マーカー及び抗体Ｌ鎖をコードするヌクレオチドも含有する。
【０１３３】
Ｂ．トリコデルマ・リーセイの微粒子銃形質転換：
以下の全ての実施例において、形質転換はクオド（ｑｕａｄ）欠損誘導体（Δｃｈｂ１、Δｃｂｈ２、Δｅｇｌ１、及びΔｅｇｌ２）で行われ、適切なｐＴｒｅｘ４ベクターを有するＲＬ−Ｐ３７（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ他、（１９８４年）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：４６−５３ページ、米国特許第４，７９７，３６１号）に本来由来するトリコデルマ・リーセイ株（ＷＯ０５／００１０３６）が以下に概要されるプロトコールで使用された。
【０１３４】
トリコデルマ株由来の胞子の懸濁液（およそ５×１０８胞子／ｍｌ）を調整した。１００μｌ−２００μｌの胞子懸濁液をＭＭアセトアミド培地プレートの中央に広げた。ＭＭアセトアミド培地は、以下の組成を有した。すなわち、０．６ｇ／Ｌアセトアミド、１．６８ｇ／ＬＣｓＣｌ、２０ｇ／Ｌグルコース、２０ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、０．６ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、１ｍｌ／Ｌ１０００×微量元素塩溶液、２０ｇ／Ｌ  Ｎｏｂｌｅ寒天、ｐＨ５．５である。１０００×微量元素塩溶液は、５．０ｇ／ｌ  ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、１．６ｇ／ｌ  ＭｎＳＯ４−Ｈ２Ｏ、１．４ｇ／ｌ  ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ及び１．０ｇ／ｌ  ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏを含有した。前記胞子懸濁液をＭＭアセトアミド培地の表面で乾燥させた。
【０１３５】
微粒子銃形質転換方法によるトリコデルマ株の形質転換をＢｉｏ−Ｒａｄ（ハーキュリーズ、カルフォルニア州）からのＢｉｏｌｉｓｔｉｃ（登録商標）ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて生産者の説明書に従って行った（ＷＯ０５／００１０３６及びＵＳ２００６／０００３４０８参照）。
【０１３６】
Ｃ．アスペルギルスの形質転換−
アスペルギルス形質転換プロトコールは、キャンベル法（Ｃａｍｐｂｅｌｌ他、（１９８９年）、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３−５６ページ）の改良である。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒの形質転換法の詳細は、ＷＯ０３０８９６１４及び米国特許公開第２００５０１５３３９９号にも開示される。形質転換体を、ＳＤＳゲル及びウェスターンブロットでタンパク質生成のために分析し、生成されたタンパク質の量に基づいて形質転換体を選択した。
【０１３７】
Ｄ．発現ベクターを用いて形質転換されたトリコデルマ・リーセイ及びＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ株の発酵：
通常Ｆｏｒｅｍａｎ他、（２００３年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３１９８８−３１９９７ページに記載される発酵プロトコールに従った。
【０１３８】
Ｅ．プロフロ（Ｐｒｏｆｌｏ）培地は、３０ｇ／Ｌ  α−ラクトース、６．５ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、０．３ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、０．２ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２、１ｍｌ／Ｌ１０００×微量元素塩溶液、２ｍｌ／Ｌ  １０％Ｔｗｅｅｎ８０、２２．２５ｇ／Ｌ  プロフロコットンシード−フラワー（Ｔｒａｄｅｒｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ、メンフィス、テネシー州）、０．７２ｇ／Ｌ  ＣａＣＯ３を含有した。
【０１３９】
Ｆ．指定培地は、５ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、３３ｇ／Ｌ  ＰＩＰＰＳバッファー、９ｇ／Ｌカザミノ酸、４．５ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、１ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２、１ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、５ｍｌ／Ｌ  Ｍａｚｕ  ＤＦ６０−Ｐ消泡剤（Ｍａｚｕｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ガーニー、イリノイ州）、１ｍｌ／Ｌ  １０００×微量元素塩溶液を含有した。加圧滅菌の後、４０ｍｌの４０％ラクトースを添加した。
【０１４０】
Ｇ．１０００×微量元素塩溶液は、５．０ｇ／ｌ  ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ、１．６ｇ／ｌ  ＭｎＳＯ４．Ｈ２Ｏ、１．４ｇ／ｌ  ＺｎＳＯ４．７Ｈ２Ｏ及び１．０ｇ／ｌ  ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏを含有した。
【０１４１】
Ｈ．タンパク質分析は、標準的ＳＤＳゲル及びウェスターンブロット分析により行った。
【０１４２】
実施例１
トラスツズマブ（ＫＲＧＧＧ（配列番号２）を含有するＬ鎖発現株）ＫＥＸ２切断部位の構成
抗体４Ｄ５−８の公知アミノ酸配列（Ｃａｒｔｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９２年、８９：４２８５−４２８９ページ）に係るトラスツズマブのＬ鎖をコードするＤＮＡ（配列番号１）を、ＤＮＡ２．０インク（１４５５Ａｄａｍｓ  Ｄｒｉｖｅ、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ９４０２５）を用いて合成した。
【０１４３】
ＡＣＴＡＧＴＡＡＡＣＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＡＴＡＴＴＣＡＡＡＴＧＡＣＡＣＡＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＴＣＴＧＴＣＡＧＣＣＴＣＡＧＴＧＧＧＣＧＡＣＣＧＴＧＴＧＡＣＧＡＴＴＡＣＴＴＧＣＣＧＣＧＣＣＴＣＴＣＡＧＧＡＣＧＴＴＡＡＣＡＣＴＧＣＣＧＴＣＧＣＡＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＣＣＡＧＧＣＡＡＧＧＣＧＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＧＡＴＴＴＡＣＡＧＣＧＣＴＴＣＧＴＴＣＣＴＧＴＡＣＴＣＴＧＧＣＧＴＧＣＣＡＴＣＣＣＧＣＴＴＣＴＣＴＧＧＣＡＧＣＣＧＡＡＧＣＧＧＣＡＣＧＧＡＴＴＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＴＴＣＧＴＣＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＡＧＧＡＴＴＴＣＧＣＣＡＣＧＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＴＡＣＡＣＣＡＣＴＣＣＡＣＣＣＡＣＣＴＴＴＧＧＣＣＡＡＧＧＡＡＣＧＡＧＡＧＴＣＧＡＡＡＴＣＡＣＴＣＧＣＡＣＧＧＴＣＧＣＴＧＣＣＣＣＴＴＣＡＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＧＡＡＣＡＧＣＴＧＡＡＧＴＣＴＧＧＴＡＣＧＧＣＣＡＧＣＧＴＣＧＴＴＴＧＣＴＴＧＣＴＴＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＧＣＧＡＧＡＧＧＣＧＡＡＧＧＴＣＣＡＡＴＧＧＡＡＧＧＴＴＧＡＴＡＡＣＧＴＴＣＴＧＣＡＧＴＣＣＧＧＣＡＡＴＴＣＧＣＡＧＧＡＧＡＧＣＧＴＧＡＣＣＧＡＧＣＡＧＧＡＴＴＣＡＡＡＧＧＡＴＡＧＣＡＣＣＴＡＣＴＣＡＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＴＴＧＴＣＣＡＡＧＧＣＣＧＡＴＴＡＣＧＡＧＡＡＧＣＡＴＡＡＧＴＴＧＴＡＴＧＣＡＴＧＣＧＡＧＧＴＣＡＣＣＣＡＣＣＡＧＧＧＡＣＴＧＴＣＡＡＧＣＣＣＡＧＴＴＡＣＣＡＡＧＴＣＧＴＴＣＡＡＴＣＧＡＧＧＣＧＡＧＴＧＣＴＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣ（配列番号１）。
【０１４４】
ＤＮＡによりコードされるＬ鎖は、Ｎ−末端でＫＲＧＧＧ（配列番号２）ＫＥＸ２切断部位を含有した。制限部位ＳｐｅI及びＡｓｃIを、クローニングを目的として含めた。前記合成ＤＮＡを、トリコデルマ発現ベクター（ｐＴｒｅｘ４）にクローニングし、ｐＴｒｅｘ４−ｈｅｒ２  Ｌ鎖ＤＮＡ２．０と名づけた発現プラスミドを産生した（図２）。結果として得られたプラスミドは、ＫＥＸ２部位から分離されたトリコデルマＣＢＨＩコア／リンカー領域及び抗体Ｌ鎖を含有する融合タンパク質をコードした。前記プラスミドは、Ｘｂａｌ制限酵素を用いて設計し、ＷＯ０５００１０３６、実施例５で記載されるクワド削除株に由来するトリコデルマ・リーセイ株へ微粒子銃で形質転換した。２０以上の形質転換体が得られ、それらを新しいプレートへ移した。２０の安定した形質転換体を選択し、プロフロ培地で２日間３０℃で成長させた。５ｍｌの２日間後のプロフロ培養を、５０ｍｌの指定培地へ移した。当該培養を、５日間２８℃で成長させた。培養ブロスを遠心分離し、上清をタンパク質分析に用いた。ウェスターンブロットデータ（図４）は、９０％以上の融合タンパク質が最良のＬ鎖生成株（形質転換体１０１０−１８、ＫＲＧＧＧ変異体）で切断されていることを示した。しかし、ＧＧＧは、好ましくない切断抗体Ｌ鎖のＮ−末端に残る。ウェスターンブロットで２つのＬ鎖分子の二量化による結果である約５０ｋｄのバンドが検出された。
【０１４５】
実施例２
ＧＧＧＫＲ（配列番号５）ＫＥＸ２切断部位を含有するトラスツズマブＬ鎖発現株の構成
２つのプライマー（ＧＧＡＣＴＡＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＡＡＡＣＧＣＧＡＴＡＴＴＣＡＡＡＴＧＡＣＡＣＡＡＴＣＴＣ、配列番号３及びＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＡＧＣＡＣＴＣＧＣＣＴＣＧＡＴＴＧ、配列番号４）をインビトロジェン（１６００  Ｆａｒａｄａｙ  Ａｖｅｎｕｅ、カールズバッド、ＣＡ９２００８）により合成し、トラスツズマブＬ鎖ＤＮＡの増幅に用いた。
【０１４６】
結果として得られたＰＣＲ断片は、Ｎ−末端でＧＧＧＫＲ（配列番号５）配列ｋｅｘ２部位を含有する抗体Ｌ鎖をコードした。前記ＰＣＲ断片を制限酵素ＳｐｅI及びＡｓｃIを用いて消化し、ｐＴｒｅｘ４−ＧＧＧＫＲ−ｈｅｒ２  ＤＮＡ２と名づけられたプラスミドを産生するため、発現ベクターｐＴｒｅｘ４にクローニングした。前記ＰＣＲ断片の適合度を、ＤＮＡシークエンスにより分析した。前記プラスミドを、Ｘｂａｌ制限酵素を用いて消化し、上述のトリコデルマ・リーセイ株へ標準的技術を用いて微粒子銃で形質転換した。２０以上の形質転換体が得られ、新しいプレートへ移された。全部で２１の安定した形質転換体を選択し、それらをプロフロ培地中２日間３０℃で成長させた。５ｍｌの２日間後のプロフロ培養を、５０ｍｌの指定培地へ移した。当該培養を、５日間２８℃で成長させた。培養ブロスを遠心分離し、上清を用いた。形質転換体１０１０−Ｂ５（ＧＧＧＫＲ変異体）及び形質転換体１０１０−Ｂ６（ＧＧＧＫＲ変異体）からの９５％以上のタンパク質が、未切断融合タンパク質であったことがウェスターンブロットにより示された（図４）。１５０ｋｄのバンドもウェスターンブロットで検出された。それは、２つのＣＢＨ１コア−Ｌ鎖融合分子の二量体化による結果の可能性がある。
【０１４７】
実施例３
ＧＧＧＫＲＧＧＧ（配列番号７）ＫＥＸ２切断部位を含有するトラスツズマブＬ鎖発現株の構成
２つのオリゴ、ＧＧＡＣＴＡＧＴＧＧＣＧＧＴＧＧＣＡＡＡＣＧＣＧＧＴＧＧＣＧＧＴＧＡＴＡＴＴＣ（配列番号６）及びＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＡＧＣＡＣＴＣＧＣＣＴＣＧＡＴＴＧ（配列番号４）を、インビトロジェンにより合成し、Ｌ鎖ＤＮＡの増幅に使用した。結果として得られたＰＣＲ断片は、Ｌ鎖及びＫＥＸ２切断に用いられるＧＧＧＫＲＧＧＧ（配列番号７）配列をコードした。前記ＰＣＲ断片を制限酵素ＳｐｅI及びＡｓｃIを用いて消化し、ｐＴｒｅｘ４−ＧＧＧＫＲＧＧＧ−ｈｅｒ２  Ｌ鎖ＤＮＡ２．０と名づけられたプラスミドを産生するため、発現ベクターｐＴｒｅｘ４にクローニングした。前記ＰＣＲ断片の適合度を、ＤＮＡシークエンスにより分析した。前記プラスミドを、Ｘｂａｌ制限酵素を用いて消化し、上述の通りトリコデルマ・リーセイ株へ微粒子銃で形質転換した。１０以上の形質転換体が得られ、新しいプレートへ移された。３の安定した形質転換体を選択し、それらをプロフロ培地中２日間３０℃で成長させた。５ｍｌの２日間後のプロフロ培養を、５０ｍｌの指定培地へ移した。当該培養を、５日間２８℃で成長させた。培養ブロスを遠心分離し、上清をタンパク質分析に用いた。ウェスターンゲルデータは、形質転換体１０１１−１（ＧＧＧＫＲＧＧＧ変異体）において、９０％以上の融合タンパク質が切断されたことを示した（図４）。しかし、好ましくない切断抗体Ｌ鎖のＮ−末端でＧＧＧが残った。
【０１４８】
実施例４
ＶＡＶＥＫＲ（配列番号９）ＫＥＸ２領域を含有するトラスツズマブＬ鎖発現株の構成
ＶＡＶＥＫＲ（配列番号９）ＫＥＸ２領域は、トリコデルマ・リーセイ高ｐＩキシラナーゼ、Ｘｙｎ２のプロ領域（Ｔｏｒｒｏｎｅｎ他、（１９９２年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：１４６１−１４６５ページ）に自然に見られる。本願発明に係る融合ポリペプチドを構成するために、２つのオリゴ、ＧＧＡＣＴＡＧＴＧＴＣＧＣＣＧＴＴＧＡＧＡＡＡＣＧＣＧＡＴＡＴＴＣＡＡＡＴＧＡＣＡＣＡＡＴＣＴＣＣ（配列番号８）及びＡＡＧＧＣＧＣＧＣＣＴＴＡＧＣＡＣＴＣＧＣＣＴＣＧＡＴＴＧ（配列番号４）を、インビトロジェンにより合成し、Ｌ鎖ＤＮＡの増幅に使用した。
【０１４９】
結果として得られたＰＣＲ断片は、Ｌ鎖及びＫＥＸ２切断に用いられるＶＡＶＥＫＲ（配列番号９）配列をコードする。前記ＰＣＲ断片を制限酵素ＳｐｅI及びＡｓｃIを用いて消化し、ｐＴｒｅｘ４−ＶＡＶＥ−ｈｅｒ２Ｌ鎖ＤＮＡ２．０と名づけられたプラスミドを産生するため、発現ベクターｐＴｒｅｘ４にクローニングした。前記ＰＣＲ断片の適合度を、ＤＮＡシークエンスにより分析した。前記プラスミドを、Ｘｂａｌ制限酵素を用いて消化し、上述の通りトリコデルマ・リーセイ株へ微粒子銃で形質転換した。２０以上の形質転換体が得られ、新しいプレートへ移された。６の安定した形質転換体を選択し、それらをプロフロ培地中２日間３０℃で成長させた。５ｍｌの２日間後のプロフロ培養を、５０ｍｌの指定培地へ移した。当該培養を、５日間２８℃で成長させた。培養ブロスを遠心分離し、上清をタンパク質分析に用いた。ウェスターンゲルデータは、形質転換体１０１２−２（ＶＡＶＥＫＲ変異体、配列番号９）において、９５％以上の融合タンパク質が切断されたことを示した（図４）。
【０１５０】
実施例５
ＶＡＶＥＫＲ（配列番号９）ＫＥＸ２領域の変異体を含有するトラスツズマブＬ鎖発現株の構成
トラスツズマブ抗体Ｌ鎖をコードするＤＮＡ（配列番号１０）をＧｅｎｅａｒｔ（Ｊｏｓｅｆ−Ｅｎｇｅｒｔ−Ｓｔｒａｓｓｅ１１、９３０５３  Ｒｅｇｅｓｂｕｒｇ、ドイツ）により合成した。
【０１５１】
ＡＣＴＡＧＴＡＡＧＣＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＣＧＴＣＧＡＧＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＴＣＧＴＣＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＣＴＣＣＧＣＣＴＣＡＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＴＴＣＡＡＣＡＴＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＡＴＣＣＡＣＴＧＧＧＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＧＧＣＣＴＣＧＡＧＴＧＧＧＴＣＧＣＣＣＧＣＡＴＣＴＡＣＣＣＣＡＣＣＡＡＣＧＧＣＴＡＣＡＣＣＣＧＣＴＡＣＧＣＣＧＡＣＡＧＣＧＴＣＡＡＧＧＧＣＣＧＣＴＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＧＣＣＧＡＣＡＣＣＡＧＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＣＴＣＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＣＣＧＣＧＣＣＧＡＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＧＴＣＴＡＣＴＡＣＴＧＣＡＧＣＣＧＣＴＧＧＧＧＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＴＴＣＴＡＣＧＣＣＡＴＧＧＡＣＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＣＣＴＣＧＴＣＡＣＧＧＴＣＴＣＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＣＣＡＡＧＣＧＴＣＴＴＴＣＣＣＣＴＣＧＣＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＡＣＣＧＣＣＧＣＣＣＴＣＧＧＣＴＧＣＣＴＣＧＴＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＴＴＣＣＣＣＧＡＧＣＣＣＧＴＣＡＣＴＧＴＣＡＧＣＴＧＧＡＡＣＡＧＣＧＧＣＧＣＴＣＴＣＡＣＣＡＧＣＧＧＣＧＴＣＣＡＣＡＣＣＴＴＣＣＣＣＧＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＧＴＣＧＴＣＡＣＣＧＴＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴＣＧＧＣＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＣＧＴＣＡＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＣＣＡＡＧＧＴＣＧＡＣＡＡＧＣＧＣＧＴＣＧＡＧＣＣＣＡＡＧＡＧＣＴＧＣＧＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＣＡＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＣＴＧＣＣＣＣＧＣＣＣＣＣＧＡＧＣＴＧＣＴＣＧＧＣＧＧＣＣＣＣＴＣＣＧＴＣＴＴＴＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＣＡＡＧＣＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＣＡＧＣＣＧＣＡＣＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＡＣＣＴＧＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＡＴＧＴＣＡＧＣＣＡＣＧＡＧＧＡＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＧＴＡＣＧＴＣＧＡＣＧＧＣＧＴＣＧＡＧＧＴＣＣＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＣＣＣＣＧＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＣＧＣＧＴＣＧＴＣＡＧＣＧＴＣＣＴＧＡＣＣＧＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧＧＣＴＣＡＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＧＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＣＴＣＣＣＣＧＣＣＣＣＣＡＴＣＧＡＡＡＡＧＡＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＣＧＣＧＡＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＴＡＣＡＣＣＣＴＣＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＧＣＧＡＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＡＧＧＴＣＴＣＣＣＴＣＡＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＣＧＣＣＧＴＣＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＣＡＡＣＧＧＣＣＡＧＣＣＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＡＣＣＡＣＣＣＣＣＣＣＣＧＴＣＣＴＣＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＧＣＡＧＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＣＴＣＡＣＣＧＴＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＣＧＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＣＧＴＣＴＴＴＡＧＣＴＧＣＡＧＣＧＴＣＡＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＣＣＡＣＴＡＣＡＣＣＣＡＧＡＡＧＡＧＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＣＣＣＧＧＣＡＡＧＴＡＡＧＧＣＧＣＧ（配列番号１０）
当該ＤＮＡは、ＫＲＧＧＧ（配列番号２）及びヒト抗体Ｌ鎖をコードする。２つの制限部位ＳｐｅI及びＡｓｃIをクローニングの目的のために含めた。前記ヌクレオチド配列を変異させ、部位特異的突然変異生成により内部ＫＥＸ２部位を取り去った（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、１１０１１Ｎｏｒｔｈ  Ｔｏｒｒｅｙ  Ｐｉｎｅｓ  Ｒｏａｄ、ラ・ホーヤ、ＣＡ９２０３７）。また、ＰＣＲ反応で前記突然変異生成に用いた２つのプライマーは、ＴＣＧＡＧＡＴＣＡＣＣＣＧＣＡＣＣＧＴＣＧＣＧＧＣＧＣＣＡＡＧ（配列番号１１）及びＣＧＡＣＧＧＴＧＣＧＧＧＴＧＡＴＣＴＣＧＡＣＣＴＴＧＧＴＧＣＣＣＴＧＧ
ＣＣＧ（配列番号１２）である。結果として得られたＬ鎖をコードするＤＮＡは、ＤＮＡ配列で２つの置換ヌクレオチドを含有し、それによりアミノ酸がＫからＴに変更した。２つのオリゴ、ＧＧＡＣＴＡＧＴＧＴＣＧＣＣＧＴＴＧＡＧＡＡＡＣＧＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣ（配列番号１３）及びＣＴＡＡＡＧＧＧＡＡＣＡＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣ（配列番号１４）を、インビトロジェンにより合成し、Ｌ鎖ＤＮＡの増幅に使用した。結果として得られたＰＣＲ断片は、Ｌ鎖及びＶＡＶＥＫＲ（配列番号９）をコードした。前記ＰＣＲ断片を制限酵素ＳｐｅI及びＡｓｃIを用いて消化し、ｐＴｒｅｘ４−ＶＡＶＥ−ｈｅｒ２Ｌ鎖Ｇｅｎｅａｒｔ（ＫＲ−ＴＲ）と名づけられたプラスミドを産生するため、発現ベクターｐＴｒｅｘ４にクローニングした。前記ＰＣＲ断片の適合度を、ＤＮＡシークエンスにより分析した。前記プラスミドを、Ｘｂａｌ制限酵素を用いて消化し、Ｈ鎖発現プラスミドを有するトリコデルマ・リーセイ株へ微粒子銃で同時形質転換した。４０以上の形質転換体が得られ、新しいプレートへ移された。２０の安定した形質転換体を選択し、それらをプロフロ培地中２日間３０℃で成長させた。５ｍｌの２日間後のプロフロ培養を、５０ｍｌの指定培地へ移した。当該培養を、４日間２８℃で成長させた。培養ブロスを遠心分離し、上清をタンパク質分析に用いた。ウェスターンゲルデータは、ＶＡＶＥＫＲ変異体（形質転換体１７−４３）において、９０％以上の融合タンパク質が切断されたことを示した（図５）。
【０１５２】
ＶＡＶＥＫＲ（配列番号９）のＫＥＸ２部位プレ配列のグルタミン残基におけるアミノ酸変異を産生するために、変性プライマー（ＧＧＡＣＴＡＧＴＧＴＣＧＣＣＧＴＴＮＮＳＡＡＡＣＧＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧ（配列番号１５）を合成し、ＰＣＲ反応でリバースプライマー（配列番号１４）と共に、ＰＣＲ断片プールを産生するためのＤＮＡ増幅に用いた。前記混合ＰＣＲ断片を、トリコデルマ発現ベクター（ｐＴｒｅｘ４）にクローニングした。１３のクローンをシークエンスし、７の変異体を生成した（表１）。全ての７プラスミドをトリコデルマ・リーセイ株へ微粒子銃で形質転換した。４０以上の形質転換体を、それぞれの変異体から得、新しいプレートに移した。３つの変異体（ＶＡＶＷＫＲ（配列番号２５）、ＶＡＶＧＫＲ（配列番号２６）及びＶＡＶＲＫＲ（配列番号２７））の第一セットとして、それぞれの変異体から１５の安定した形質転換体を選択した。４つの変異体（ＶＡＶＴＫＲ（配列番号２８）、ＶＡＶＶＫＲ（配列番号２９）、ＶＡＶＡＫＲ（配列番号３０）及びＶＡＶＬＫＲ（配列番号３１））の第二セットとして、それぞれの変異体から１１の安定した形質転換体を選択した。選択した形質転換体を、プロフロ培地中２日間２８℃で成長させた。５ｍｌの２日間後のプロフロ培養を、５０ｍｌの指定培地へ移した。当該培養を、４日間２８℃で成長させた。培養ブロスを遠心分離し、上清をタンパク質分析に用いた。
【０１５３】
新しいプライマー（ＧＧＡＣＴＡＧＴＧＴＣＧＣＣＧＴＴＮＡＣＡＡＡＣＧＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧ配列番号１６）を合成し、ＰＣＲ反応でリバースプライマー（配列番号１４）と共に、複合配列（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）を有するＰＣＲ断片を産生するためのＤＮＡ増幅に用いた。前記混合ＰＣＲ断片を、トリコデルマ発現ベクター（ｐＴｒｅｘ４）にクローニングした。１０のクローンをシークエンスし、４の変異体（ＶＡＶＤＫＲ（配列番号３２）、ＶＡＶＮＫＲ（配列番号３３）、ＶＡＶＹＫＲ（配列番号３４）及びＶＡＶＨＫＲ（配列番号３５））を生成した。前記プラスミドを上述の通りトリコデルマ株へ微粒子銃で形質転換した。４０以上の形質転換体を、それぞれの変異体から得、新しいプレートに移した。それぞれの変異体から１０の安定した形質転換体を選択し、プロフロ培地中２日間２８℃で成長させた。５ｍｌの２日間後のプロフロ培養を、５０ｍｌの指定培地へ移した。当該培養を、４日間２８℃で成長させた。培養ブロスを遠心分離し、上清をタンパク質分析に用いた。
【０１５４】
それぞれのグルタミン残基変異体から１つの形質転換体（最良のＬ鎖生成形質転換体）を比較のために選択した。ウェスターン分析により、変異体ＶＡＶＹＫＲ（配列番号３４）が他のいずれの変異体よりも多くのＬ鎖を生成したことが示された。ＶＡＶＴＫＲ（配列番号２８）及びＶＡＶＤＫＲ（配列番号３２）変異体は、より多くの融合タンパク質を有していたことから非効率的な切断であることが示された（図５）。
【０１５５】
ＫＥＸ２プレ配列部位（ＶＡＶＥＫＲ、配列番号９）の第一バリン残基でのアミノ酸変異を産生するため、変性プライマー（ＧＧＡＣＴＡＧＴＮＮＳＧＣＣＧＴＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧ、配列番号１７）を合成し、ＰＣＲ反応でリバースプライマーＣＴＡＡＡＧＧＧＡＡＣＡＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣ（配列番号１４）と共に、複合配列を有するＰＣＲ断片を産生するためのＤＮＡ増幅に用いた。前記混合ＰＣＲ断片を、トリコデルマ発現ベクター（ｐＴｒｅｘ４）にクローニングした。３０のクローンをシークエンスし、１３の変異体（ＭＡＶＥＫＲ（配列番号３６）、ＧＡＶＥＫＲ（配列番号３７）、ＡＡＶＥＫＲ（配列番号３８）、ＬＡＶＥＫＲ（配列番号３９）、ＷＡＶＥＫＲ（配列番号４０）、ＫＡＶＥＫＲ（配列番号４１）、ＰＡＶＥＫＲ（配列番号４２）、ＲＡＶＥＫＲ（配列番号４３）、ＮＡＶＥＫＲ（配列番号４４）、ＴＡＶＥＫＲ（配列番号４５）、ＳＡＶＥＫＲ（配列番号４６）、ＱＡＶＥＫＲ（配列番号４７）及びＥＡＶＥＫＲ（配列番号４８））を生成した。新しいプライマー（ＧＧＡＣＴＡＧＴＮＷＣＧＣＣＧＴＣＧＡＧＡＡＧＣＧＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧ配列番号１８）を設計、合成し、ＰＣＲ反応でリバースプライマーＣＴＡＡＡＧＧＧＡＡＣＡＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣ（配列番号１４）と共に、複合配列を有するＰＣＲ断片を産生するためのＤＮＡ増幅に用いた。前記混合ＰＣＲ断片を、トリコデルマ発現ベクター（ｐＴｒｅｘ４）にクローニングした。１９のクローンをシークエンスし、５の変異体（ＹＡＶＥＫＲ（配列番号４９）、ＦＡＶＥＫＲ（配列番号５０）、ＤＡＶＥＫＲ（配列番号５１）、ＨＡＶＥＫＲ（配列番号５２）及びＩＡＶＥＫＲ（配列番号５３））を生成した。以下の１１変異体（ＭＡＶＥＫＲ（配列番号３６）、ＧＡＶＥＫＲ（配列番号３７）、ＡＡＶＥＫＲ（配列番号３８）、ＬＡＶＥＫＲ（配列番号３９）、ＷＡＶＥＫＲ（配列番号４０）、ＫＡＶＥＫＲ（配列番号４１）、ＰＡＶＥＫＲ（配列番号４２）、ＨＡＶＥＫＲ（配列番号５２）、ＤＡＶＥＫＲ（配列番号５１）、ＳＡＶＥＫＲ（配列番号４６）及びＱＡＶＥＫＲ（配列番号４７））を含有する前記プラスミドをトリコデルマ・リーセイ株へ微粒子銃で形質転換した。
【０１５６】
２０以上の形質転換体を、それぞれの変異体から得、新しいプレートに移した。それぞれの変異体から８の安定した形質転換体を選択し、プロフロ培地中２日間２８℃で成長させた。５ｍｌの２日間後のプロフロ培養を、５０ｍｌの指定培地へ移した。当該培養を、４日間２８℃で成長させた。培養ブロスを遠心分離し、上清をタンパク質ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。それぞれの変異体から１つの形質転換体（最良の生成形質転換体）を選択した。ウェスターン分析により、全ての変異体がＬ鎖を生成したことが示された（図６）。ＬＡＶＥＫＲ（配列番号３９）を除いて、全ての変異体が９５％未満の切断を示した。当該変異体は、ＶＡＶＥＫＲ（配列番号９）変異体より効果的なＫＥＸ２切断を示した。
【０１５７】
ＫＥＸ２領域（ＶＡＶＥＫＲ、（配列番号９））のアラニン残基におけるアミノ酸変異を産生するために、変性プライマー（ＧＧＡＣＴＡＧＴＧＴＣＮＮＳＧＴＴＧＡＧＡＡＡＧＧＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣ、配列番号１９）を合成し、ＰＣＲ反応でリバースプライマー（配列番号１４）と共に、複合配列を有するＰＣＲ断片を産生するためのＤＮＡ増幅に用いた。前記混合ＰＣＲ断片を、トリコデルマ発現ベクター（ｐＴｒｅｘ４）にクローニングした。９６のクローンをシークエンスし、１５の変異体（ＶＤＶＥＫＲ（配列番号５４）、ＶＥＶＥＫＲ（配列番号５５）、ＶＧＶＥＫＲ（配列番号５６）、ＶＩＶＥＫＲ（配列番号５７）、ＶＫＶＥＫＲ（配列番号５８）、ＶＬＶＥＫＲ（配列番号５９）、ＶＭＶＥＫＲ（配列番号６０）、ＶＮＶＥＫＲ（配列番号６１）、ＶＰＶＥＫＲ（配列番号６２）、ＶＲＶＥＫＲ（配列番号６３）、ＶＳＶＥＫＲ（配列番号６４）、ＶＴＶＥＫＲ（配列番号６５）、ＶＶＶＥＫＲ（配列番号６６）、ＶＷＶＥＫＲ（配列番号６７）及びＶＹＶＥＫＲ（配列番号６８））を生成した。５のプラスミドをトリコデルマ・リーセイ株へ微粒子銃で形質転換した。２０以上の形質転換体を、それぞれの変異体から得、新しいプレートに移した。５の変異体（ＶＧＶＥＫＲ（配列番号５６）、ＶＴＶＥＫＲ（配列番号６５）、ＶＷＶＥＫＲ（配列番号６７）、ＶＥＶＥＫＲ（配列番号５５）及びＶＰＶＥＫＲ（配列番号６２））の第一セットとして、１０の安定した形質転換体を選択した。４の変異体（ＶＫＶＥＫＲ（配列番号５８）、ＶＲＶＥＫＲ（配列番号６３）、ＶＶＶＥＫＲ（配列番号６６）及びＶＩＶＥＫＲ（配列番号５７））の第二セットとして、１０の安定した形質転換体を選択した。選択した形質転換体を、プロフロ培地中２日間２８℃で成長させた。５ｍｌの２日間後のプロフロ培養を、５０ｍｌの指定培地へ移した。当該培養を、４日間２８℃で成長させた。培養ブロスを遠心分離し、上清をタンパク質ＳＤＳゲルにより分析した。それぞれの変異体から１の形質転換体（最良の生成形質転換体）を比較のために選択した（表１）。ウェスターン分析（図７）は、３つの変異体ＶＧＶＥＫＲ（配列番号５６）、ＶＥＶＥＫＲ（配列番号５５）及びＶＷＶＥＫＲ（配列番号６７）で唯一遊離Ｌ鎖が検出されたことを示した。前記変異体ＶＰＶＥＫＲ（配列番号６２）は、より少ない遊離Ｌ鎖及びいくつかの切断されていないＣＢＨＩ−軽融合（ｌｉｇｈｔ  ｆｕｓｉｏｎ）を生成した。
【０１５８】
ＫＥＸ２部位（ＶＡＶＥＫＲ、配列番号９）の第二バリン残基におけるアミノ酸変異を産生するために、変性プライマー（ＧＧＡＣＴＡＧＴＧＴＣＧＣＣＮＮＳＧＡＧＡＡＡＣＧＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧ、配列番号２０）を合成し、ＰＣＲ反応でリバースプライマー（配列番号１４）と共に、複合配列を有するＰＣＲ断片を産生するためのＤＮＡ増幅に用いた。前記混合ＰＣＲ断片を、トリコデルマ発現ベクター（ｐＴｒｅｘ４）にクローニングした。３６のクローンをシークエンスし、１５の変異体（ＶＡＡＥＫＲ（配列番号６９）、ＶＡＤＥＫＲ（配列番号７０）、ＶＡＥＥＫＲ（配列番号７１）、ＶＡＦＥＫＲ（配列番号７２）、ＶＡＧＥＫＲ（配列番号７３）、ＶＡＩＥＫＲ（配列番号７４）、ＶＡＬＥＫＲ（配列番号７５）、ＶＡＮＥＫＲ（配列番号７６）、ＶＡＱＥＫＲ（配列番号７７）、ＶＡＲＥＫＲ（配列番号７８）、ＶＡＳＥＫＲ（配列番号７９）、ＶＡＴＥＫＲ（配列番号８０）、ＶＡＷＥＫＲ（配列番号８１）、ＶＡＹＥＫＲ（配列番号８２）及びＶＡＰＥＫＲ（配列番号８３））を生成した。プラスミドをトリコデルマ・リーセイ株へ微粒子銃で形質転換した。２０以上の形質転換体を、それぞれの変異体から得、新しいプレートに移した。８の変異体（ＶＡＡＥＫＲ（配列番号６９）、ＶＡＤＥＫＲ（配列番号７０）、ＶＡＥＥＫＲ（配列番号７１）、ＶＡＦＥＫＲ（配列番号７２）、ＶＡＧＥＫＲ（配列番号７３）、ＶＡＮＥＫＲ（配列番号７６）、ＶＡＬＥＫＲ（配列番号７５）及びＶＡＩＥＫＲ（配列番号７４））の第一セットとして、１０の安定した形質転換体を選択した。２の変異体（ＶＡＳＥＫＲ（配列番号７９）及びＶＡＲＥＫＲ（配列番号７８）の第二セットとして、８の安定した形質転換体を選択した。４個の形質転換体のみをＶＡＰＥＫＲ（配列番号８３）変異体に選択した。選択した形質転換体を、プロフロ培地中２日間２８℃で成長させた。５ｍｌの２日間後のプロフロ培養を、５０ｍｌの指定培地へ移した。当該培養を、４日間２８℃で成長させた。培養ブロスを遠心分離し、上清を分析した。それぞれの変異体から１の形質転換体（最良の生成形質転換体）を比較のために選択した（表１）。ウェスターン分析（図８）により融合体のバンドがゲル上で観察されなかったことから、ＶＡＩＥＫＲ（配列番号７４）及びＶＡＬＥＫＲ（配列番号７５）が融合ポリペプチドの完全な切断を産生したことが示された。切断は１００％ではなかったが、ＶＡＦＥＫＲ（配列番号７２）が最も量の多い抗体Ｌ鎖を生成したことがウェスターンブロット（図８）により示された。
【表１】
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【０１５９】
実施例６
ＮＶＩＳＫＲ（配列番号２２）ＫＥＸ２領域を含有するトラスツズマブＬ鎖発現株の構成
ＮＶＩＳＫＲＫＥＸ２領域は、Ａ．ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）のプロ配列において自然に見られる。融合ポリペプチドを構成するために、オリゴ、ＧＧＡＣＴＡＧＴＡＡＣＧＴＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＣＧＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣ（配列番号２１）をインビトロジェンにより合成し、リバースプライマー（配列番号１４）と共にＬ鎖ＤＮＡの増幅に使用した。結果として得られたＰＣＲ断片は、Ｌ鎖及びｋｅｘ２切断に用いられるＮＶＩＳＫＲ（配列番号２２）配列をコードする。前記ＰＣＲ断片を制限酵素ＳｐｅI及びＡｓｃIを用いて消化し、ｐＴｒｅｘ４−ＮＶＩＳ−ｈｅｒ２  Ｌ鎖ｇｅｎｅａｒｔ（ＫＲ−ＴＲ）と名づけられたプラスミドを産生するため、発現ベクターｐＴｒｅｘ４にクローニングした。前記ＰＣＲ断片の適合度を、ＤＮＡシークエンスにより分析した。前記プラスミドをトリコデルマ・リーセイ株へ微粒子銃で形質転換した。２０以上の形質転換体が得られ、新しいプレートへ移された。１０の安定した形質転換体を選択し、それらをプロフロ培地中２日間３０℃で成長させた。５ｍｌの２日間後のプロフロ培養を、５０ｍｌの指定培地へ移した。当該培養を、５日間２８℃で成長させた。培養ブロスを遠心分離し、上清をタンパク質分析に用いた。ウェスターンゲル分析により、９５％以上の融合タンパク質が切断されたことを示した（図６）。
【０１６０】
実施例７
ＳＤＶＴＫＲ（配列番号２４）ＫＥＸ２領域を含有するトラスツズマブＬ鎖発現株の構成
オリゴ、ＧＧＡＣＴＡＧＴＡＧＣＧＡＣＧＴＣＡＣＣＡＡＧＣＧＣＧＡＣＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＣ（配列番号２３）をインビトロジェンにより合成し、リバースプライマー（配列番号１４）と共にＬ鎖ＤＮＡの増幅に使用した。結果として得られたＰＣＲ断片は、Ｌ鎖及びｋｅｘ２切断に用いられるＳＤＶＴＫＲ（配列番号２４）配列をコードする。前記ＰＣＲ断片を制限酵素ＳｐｅI及びＡｓｃIを用いて消化し、ｐＴｒｅｘ４−ＳＤＶＴ−ｈｅｒ２  Ｌ鎖ｇｅｎｅａｒｔ（ＫＲ−ＴＲ）と名づけられたプラスミドを産生するため、発現ベクターｐＴｒｅｘ４にクローニングした。前記ＰＣＲ断片の適合度を、ＤＮＡシークエンスにより分析した。前記プラスミドをトリコデルマ・リーセイ株へ微粒子銃で形質転換した。２０以上の形質転換体が得られ、新しいプレートへ移された。１０の安定した形質転換体を選択し、それらをプロフロ培地中２日間３０℃で成長させた。５ｍｌの２日間後のプロフロ培養を、５０ｍｌの指定培地へ移した。当該培養を、５日間２８℃で成長させた。培養ブロスを遠心分離し、上清をタンパク質分析に用いた。ウェスターンゲル分析により、５０％以上の融合タンパク質が切断されたことを示した（図６）。
【０１６１】
実施例８
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒにおけるＶＡＶＥＫＲ（配列番号９）ＫＥＸ２領域を含有するトラスツズマブＬ鎖発現株の構成
前記実施例５からのプラスミド（ｐＴｒｅｘ４−ＶＡＶＥ−ｈｅｒ２  Ｌ鎖ｇｅｎｅａｒｔ（ＫＲ−ＴＲ）をＳｐｅI及びＡｓｃIを用いて消化した。ＡｓｃI切断部位のＤＮＡ断片の末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑にした。前記断片を１．２％アガロースゲル上で単離し、Ａ．ｎｉｇｅｒ発現プラスミド（米国特許公開番号第２００５０１５３３９９号で開示されるｐＳＬＧＡＭｐＲ２−ＢＢI）へ連結した。当該プラスミドを、ＮｈｅI及びＢｓｔＥIIを用いて切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いてＢｓｔＥII切断末端を平滑にした。ｐＳＬＧＡＭｐＲ２−ＶＡＶＥ−ｈｅｒ２  ＬＣ  ｇｅｎｅａｒｔと名づけられた新しいプラスミドを米国特許公開番号第２００５０１５３３９９号で開示されるｄｇｒ２４６：ΔＧＡＰ：ｐｙｒ−株に由来するＡ．ｎｉｇｅｒ株ｄｇｒ２４６：Δａｍｙ５；ｐｙｒ−に形質転換した。α−アミラーゼのタンパク質レベルの相違は、変異により当該プラスミド中で大幅に減少する。
【０１６２】
ｐｅｐＡ遺伝子欠損を有するｄｇｒ２４６Ｐ２株に由来するｄｇｒ２４６ΔＧＡＰ：ｐｙｒ２−はｐｙｒＧマイナスであり、突然変異生成及びスクリーニングの様々な処理又は異種遺伝子生成物（Ｗａｒｄ、Ｍ．他、１９９３年、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３９：７３８−７４３ページ及びそれの引用文献）の改善された生成の選択を経ている。ｄｇｒ２４６ΔＧＡＰ：ｐｙｒ２−株を構築するため、ｇｌａＡ（グルコアミラーゼ）遺伝子を、全く同じ欠失プラスミド（ｐΔＧＡＭ  ＮＢ−Ｐｙｒ）及びＦｏｗｌｅｒ、Ｔ．他（１９９０年）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１８：５３７−５４５ページにより報告された工程を用いてｄｇｒ２４６  Ｐ２株で欠失した。つまり、選択可能マーカーとしてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ  ｐｙｒＧ遺伝子により置換されたｇｌａＡ遺伝子のプロモーター及びコード領域の末端又は一部のいずれかにおいてｇｌａＡ隣接配列を有する直鎖ＤＮＡ断片を用いた形質転換により、欠失した。ｇｌａＡ隣接配列及びｐｙｒＧ遺伝子を含有する直鎖断片が染色体ｇｌａＡ部位において結合する形質転換体を、サザーンブロット分析により特定した。この変異は、形質転換株ｄｇｒ２４６ΔＧＡＰで起こった。当該形質転換体からの胞子をフッ化オロチン（ｆｌｕｏｒｏｏｒｏｔｉｃ）酸を含有する培地へプレートし、自然耐性変種をｖａｎ  Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ，Ｗ．（１９８７年）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０６：７１−７５ページで開示されるように得た。これらのうちの１つ、ｄｇｒ２４６ΔＧＡＰ：ｐｙｒ２−は、野生型ｐｙｒＧ遺伝子を持つプラスミドを用いて形質転換により補足され得るウリジン栄養要求株として示される。
【０１６３】
２０以上の形質転換体が得られ、新しいプレートへ移された。１７の形質転換体をＰｒｏｍｏｓｏｙ培地中５日間２８℃で成長させた。培養ブロスを遠心分離し、上清をタンパク質ＳＤＳＰＡＧＥ及びウェスターン分析に用いた。全ての形質転換体が、抗体Ｌ鎖を生成したことがデータにより示された。形質転換体＃Ａ１２は、ほとんどの抗体Ｌ鎖を生成し、６０−７０％の融合タンパク質が切断された（図９）。
【０１６４】
前述の記載は、典型的な実施形態の本質を単に説明している。本明細書で明確に記載又は示されていないが、本願発明に係る本質を具体化し、その概念及び範囲に含まれる様々なアレンジが当業者により、考案されることが理解される。さらに、本明細書で列挙される全ての実施例及び条件用語は、原則として、本願発明に係る本質及び当該技術分野の促進が発明者により与えられるコンセプトの理解について読者を助けること、また、具体的に列挙される実施例及び条件に限定することなしに解釈されることを意図している。
【０１６５】
その上、特定の実施例と同様に本願発明に係る本質、態様、及び実施形態を列挙する本明細書の全ての記載は、それらの構造的及び機能的同等物の両方を包含することを意図している。加えて、これらの同等物は、現在知られている同等物及び将来開発される同等物、すなわち、構造に関わらず同等に機能するよう開発されたすべての要素、の両方を含むことを意図される。従って、本願発明に係る範囲は、本明細書で示され、記載される典型的実施形態に限られることを意図しない。
【図１】
0005548448.tif 000003
【図２】
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【図３Ａ】
0005548448.tif 000005
【図３Ｂ】
0005548448.tif 000006
【図３Ｃ】
0005548448.tif 000007
【図３Ｄ】
0005548448.tif 000008
【図３Ｅ】
0005548448.tif 000009
【図４】
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【図５】
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【図６】
0005548448.tif 000012
【図７】
0005548448.tif 000013
【図８】
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【図９】
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