(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
熱ショックをかけ、そして熱で殺した１もしくは複数の非アポトーシス性のヒトメラノーマ癌細胞に樹状細胞を暴露することにより感作された、単離され、そして精製された樹状細胞を含んでなる、患者の癌に対する免疫を誘導するための組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は癌に対する免疫を誘導するための組成物および方法、そしてより詳細には免疫原性癌特異的抗原の調製、処置および作成法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景は本発明の範囲を限定するわけではないが、ワクチン接種と関連して説明される。特異的な標的に対する適応免疫応答の賦活化は、免疫学において最も複雑で、しかも求められることが多い目標の１つである。免疫賦活化プロセスにおいて重要な細胞は、主要組織適合抗原（ＭＨＣ）クラスＩおよびＩＩ分子の両方に関する抗原を効果的にプロセシングし、そして提示するその能力から樹状細胞である。遺伝的および環境的な多くの因子が、樹状細胞のような抗原提示細胞（ＡＰＣ）により提示されるプロセシングされた抗原を認識し、そして応答するための免疫応答の能力に影響を与える。
【０００３】
細胞傷害性免疫応答の場合、古典的なクラスＩ経路のモデルはＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘導するためのインフルエンザウイルスの使用であり、これには正しい抗原性エピトープを持つペプチドの正確なプロセシング、トランジットおよび細胞表面への送達が必要である。十分なＴ細胞受容体（ＴｃＲ）による認識および正しい同時刺激で、抗原特異的な免疫応答が可能である。樹状細胞は効率的にクラスＩ−拘束ＣＴＬを活性化するが、ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導するためのＭＨＣクラスＩ経路へのアクセスには通常、抗原の合成を要する。多くのモデルが抗原をＭＨＣクラスＩ−拘束抗原提示経路に効率的に送達して抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生成する、抗原および抗原送達系の使用を含む。
【０００４】
抗原提示に関する他の取り組みには、例えば抗原の有力なアジュバントへのカップリング、浸透圧溶解、エンドサイトーシスされた抗原、および抗原のｐＨ感受性リポソームへの挿入による、外因性抗原の、樹状細胞のＭＨＣＩプロセシング経路への送達を含む。インビトロ分析について有用であるが、このような取り組みは治療的応用には難しいことが分かった。今日まで、樹状細胞は、生存可能な、または照射された状態の全細胞、膜調製物、アポトーシス細胞または細胞体、および天然資源から精製された、または組換え産物として発現された抗原を使用して、外因性抗原で直接パルスされる（ｐｕｌｓｅｄ）ことができる（例えば特許文献１および２を参照にされたい）。しかしこれらの従来技術は細胞死の形態、または樹状細胞に接近している死んだ、または死につつある細胞からのプロセシング経路の抗原を認識しない。
【０００５】
樹状細胞の使用の１例は、宿主における寛容原性（ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を強化するための寛容原性樹状細胞の使用、およびその作成法に関するＲｏｂｂｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．へ発行された特許文献３に教示されている。簡単に説明すると、寛容原性の哺乳動物の樹状細胞（ＤＣ）および寛容原性ＤＣの生産法が開示されている。宿主における寛容原性の強化法は、寛容原性の哺乳動物のＤＣを宿主に投与することにより提供される。寛容原性ＤＣには、１もしくは複数のＮＦ−κＢ結合部位を有するオリゴデオキシリボヌクレオチド（ＯＤＮ）を含む。寛容原性ＤＣにはウイルスベクター、例えばアデノウイルスベクターも含むことができ、これは寛容原性ＤＣ中に存在する場合、寛容原性ＤＣの寛容原性に影響を及ぼさない。宿主における強化された寛容原性は、外来移植片の生存を延長し、そして自己免疫疾患のような炎症に関連する疾患の処置に有用であると述べている。
【０００６】
樹状細胞のさらに別の使用は、樹状細胞を形質転換し、そしてＴ細胞を活性化するため
の方法および組成物に関してＨｗｕ，ｅｔ  ａｌ．に発効された特許文献４に教示されている。簡単に説明すると、組換え樹状細胞が、幹細胞を形質転換し、そして幹細胞を樹状細胞に分化させることにより作成される。生じた樹状細胞はＭＨＣクラスＩ抗原標的に対してＴ細胞を活性化する抗原提示細胞になると述べている。またこの開示は組換え樹状細胞によるＴ細胞活性化に基づくキット、アッセイおよび治療薬も含む。癌、ウイルス感染および寄生生物感染が組換え樹状細胞により、または対応する活性化Ｔ細胞により緩和されると述べている。
【０００７】
樹状細胞の装填（ｌｏａｄｉｎｇ）に使用する抗原は、例えばＡｌｂｅｒｔ，ｅｔ  ａｌ．に発行された特許文献２に教示されている。この特許はＴ細胞の誘導または寛容化（ｔｏｌｅｒｉｚａｔｉｏｎ）のために抗原を樹状細胞に送達するためのアポトーシス細胞の使用方法を教示する。この方法および組成物は、抗原特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球およびＴヘルパー細胞の誘導に有用な樹状細胞に抗原を送達するために有用になると述べている。この開示には細胞傷害性Ｔリンパ球の活性を評価するためのアッセイを含む。樹状細胞を標的とする抗原は、樹状細胞に提示するために非天然抗原を発現するように修飾されることもできるアポトーシス細胞である。樹状細胞は、プロセシングされた抗原をプロセシングし、そして提示し、そして細胞傷害性Ｔリンパ球活性を誘導することができるアポトーシス細胞（およびその断片）により感作されるか、またはワクチン療法に使用できるとも述べられている。
【０００８】
最後にＳｔｅｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．に発行された特許文献５は、抗原を樹状細胞に送達するためのウイルスベクターの使用方法を教示する。方法および組成物は、抗原を樹状細胞に送達するために有用であり、これは次いでＴ抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の誘導に有用であると述べている。この開示は細胞傷害性Ｔリンパ球の活性を評価するためのアッセイを提供する。抗原は、樹状細胞へ提示するための非天然抗原を発現するように修飾され得るインフルエンザウイルスのようなウイルスベクターを使用して樹状細胞に提供される。樹状細胞はベクターで感染され、そして抗原を提示し、そして細胞傷害性Ｔリンパ球活性を誘導することができるか、またはワクチンとしても使用できると述べられている。
【特許文献１】国際公開第９４／０２１５６号パンフレット
【特許文献２】米国特許第６，６０２，７０９号明細書
【特許文献３】米国特許第第６，９３６，４６８号明細書
【特許文献４】米国６，７３４，０１４号明細書
【特許文献５】米国６，４５５，２９９号明細書
【発明の開示】
【０００９】
発明の要約  
今、熱ショックで殺した腫瘍細胞、または熱ショックタンパク質またはペプチドを過剰発現している殺した腫瘍体（ｔｕｍｏｒ  ｂｏｄｙ）のいずれかを装填した単球誘導化（ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ）ＤＣが、ナイーブなＴ細胞を感作し、そしてそれらのより有力な高度に効率的な抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）への分化を誘導するために使用できることが見いだされた。これらＤＣの組成物、使用法および調製法を本明細書に開示する。
【００１０】
本発明は、熱ショックをかけ、そして殺した１もしくは複数の癌細胞に暴露することにより感作された、単離され、そして精製された抗原提示細胞を使用することにより、患者に癌に対する免疫を誘導するための組成物および方法を含む。抗原提示細胞は専門的な抗原提示細胞、例えば樹状細胞でよい。一般に抗原提示細胞には、熱ショックをかけ、熱で殺した癌細胞が装填され、例えば癌細胞は患者から単離され、かつ／または同種異系癌細胞もしくは細胞系（ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）である。熱ショックをかけ、そして殺した癌細
胞はインターナライズされ、そして抗原提示細胞により少なくとも２時間、プロセシングされる。
【００１１】
また本発明は、１もしくは複数の癌細胞に少なくとも約４２℃の温度で少なくとも２時間、熱ショックをかけて、熱ショックをかけた癌細胞を形成し；熱ショックをかけた癌細胞を殺して、熱ショックをかけ、殺した癌細胞を形成し；患者から単離した１もしくは複数の抗原提示細胞を、熱ショックをかけ、殺した癌細胞と少なくとも３時間インキュベーションし；そして１もしくは複数の単離され、装填された抗原提示細胞を患者に投与することにより患者に癌に対する免疫を誘導する方法を含む。抗原提示細胞は、患者に投与される前に１もしくは複数のサイトカインで成熟化されることができる。
【００１２】
本発明の別の方法は、患者から抗原提示細胞を得；同種異系（ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ）癌細胞を少なくとも約４２℃の温度で少なくとも２時間インキュベーションして、熱ショックをかけた同種異系癌細胞を形成し；熱ショックをかけた同種異系癌細胞を殺して、熱ショックをかけ、殺した同種異系癌細胞を形成し；抗原提示細胞を、熱ショックをかけ、殺した同種異系癌細胞に少なくとも３時間暴露して装填された抗原提示細胞を形成し；単離された装填抗原提示細胞を成熟させ；そして単離された、装填抗原提示細胞を患者に投与することにより患者に癌に対する免疫を誘導することを含む。抗原提示細胞は１もしくは複数のサイトカインにより成熟化されるので、当業者は抗原提示細胞が種々の成熟段階の樹状細胞でよく、そして熱ショックをかけ、殺した癌細胞は抗原提示細胞（例えば樹状細胞）によりインターナライズされることができると認識している。同種異系の癌細胞の例は表ＩＩから選択することができる。
【００１３】
さらに別の免疫原性の単離された抗原提示細胞の調製法は、個体から抗原提示細胞を単離し；１もしくは複数の癌細胞にストレスをかけ、そして癌細胞を殺すことにより抗原を調製し；抗原提示細胞に抗原を少なくとも３時間装填し；そして装填された抗原提示細胞を単離し、そして精製する工程を含むことができる。癌細胞には癌細胞を殺す前に熱ショック、低温ショック、グルコース欠乏、酸素欠乏、細胞代謝を改変する少なくとも１つの薬剤への暴露、および少なくとも１つの細胞傷害剤への暴露からなる群から選択される方法によりストレスをかけることができる。癌細胞はオートロガス（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）または同種異系癌細胞であることができる。実際には抗原提示細胞に抗原を装填する工程も、熱ショック条件下で行うことができる。１つの単純な工程では、本発明は癌細胞を殺す前に癌細胞にストレスをかけることにより、ストレスをかけ、そして殺した癌細胞における腫瘍抗原の発現を上昇させる方法を含む。癌細胞には癌細胞を殺す前に熱ショック、低温ショック、グルコース欠乏、酸素欠乏、細胞代謝を改変する少なくとも１つの薬剤への暴露、および／または少なくとも１つの細胞傷害剤への暴露によりストレスをかけることができる。
【００１４】
本発明のさらに別の態様は、抗原提示細胞を、ストレスをかけ、そして殺した癌細胞に暴露する前に、癌細胞にストレスをかけ、そして癌細胞を殺すことにより、ストレスをかけ、そして殺した癌細胞を装填した抗原提示細胞の腫瘍抗原の抗原性を上げる方法を含む。癌細胞の抗原性は、癌細胞を殺す前に熱ショック、低温、グルコース欠乏、酸素欠乏、細胞代謝を改変する少なくとも１つの薬剤への暴露、および少なくとも１つの細胞傷害剤への暴露により癌細胞にストレスをかけることにより上げることができる。このように本発明は熱ショックをかけた癌細胞およびその部分を含む抗原を含む。
【００１５】
本発明の抗原は、１もしくは複数の癌細胞系を熱処理し、そして細胞を細胞死誘導剤で殺すことを含む方法により調製することができる。細胞死は、ベツリン酸、パクリタキセル、カンプトテシン、エリプチシン、ミトラマイシンＡ、エトポシド、ビンブラスチン、ビンクリスチン、イオノマイシンおよびそれらの組み合わせを含んでなる致死剤（ｋｉｌ
ｌｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）により行うことができる。別法として、あるいは一緒に、細胞死は癌細胞を照射、熱、低温、浸透圧ショック、圧、研削、剪断、超音波、乾燥、凍結噴霧、穿刺、栄養不足およびそれらの組み合わせに暴露することにより達成することができる。癌細胞は２、４、６または８時間、熱処置されることができ、そして殺した後に、凍結乾燥され、加熱乾燥され、吸引乾燥され、加熱吸引乾燥され、水溶液への蒸発沈殿により凍結され（ＥＰＡＳ）、液体へ噴霧乾燥され（ＳＦＬ）、貧溶媒沈殿され、または凍結噴霧された状態で使用前に保存することができる。キットの一部として使用する場合、抗原はさらに抗原を再懸濁するための希釈剤、例えば塩水、ｐＨ緩衝化塩水、１もしくは複数のサイトカインを含む塩水、アジュバントまたは抗原および／または再懸濁のための任意の他の溶液を含んだものを含むことができる。
【００１６】
１つの態様では、癌細胞は高温メラノーマおよびその部分としてさらに定義される。抗原は熱ショックをかけ、そして殺した癌細胞およびその部分、例えば１もしくは複数の抗原提示細胞および／またはアジュバントを含むことができる。癌細胞は熱で殺してもよく、または種々の既知の方法により殺してもよい。１つの方法は化学的、機械的および照射的方法により細胞を直接的に殺すことである。さらに別の態様にはプログラムされた細胞死またはアポトーシスの使用を含み、これは癌細胞の抗原性を上げるために細胞の熱ショック後に、本発明と使用することができる。熱ショックをかけた癌細胞およびその部分は、ベツリン酸、パクリタキセル、カンプトテシン、エリプチシン、ミトラマイシンＡ、エトポシド、ビンブラスチン、ビンクリスチン、イオノマイシンおよびそれらの組み合わせにより殺すことができる。熱ショックをかけた癌細胞およびその部分は、照射、熱、低温、浸透圧ショック、圧、研削、剪断、超音波、乾燥、凍結噴霧、穿刺、栄養不足およびそれらの組み合わせ、または化学的および非化学的工程の両方により殺すことができる。１つの態様では、細胞はナチュラルキラー細胞を使用して殺す。
【００１７】
また本発明は熱ショックをかけた同種異系癌細胞を形成するために、少なくとも４２℃の温度で少なくとも２時間、熱ショックをかけて殺した、同種異系癌細胞を含むワクチンを含む。癌ワクチンは、癌細胞を少なくとも４２℃の温度で少なくとも２時間、インキュベーションし；熱ショックをかけた癌細胞を殺し；そして抗原提示細胞に癌細胞を装填する工程を含む方法により製造することができる。一般にこの方法およびワクチンは、単離され、装填された抗原提示細胞を患者に投与するために適合されている。１つの態様では患者に使用する癌ワクチンはまた、非アポトーシス性の、熱ショックをかけ、そして殺した癌細胞を装填した１もしくは複数の少なくとも部分的には成熟した抗原提示細胞を含むことができる。
【００１８】
本明細書で教示するワクチンおよび抗原は、熱ショックをかけ、そして殺した癌細胞を装填した１もしくは複数の少なくとも部分的に成熟した抗原提示細胞を含む癌ワクチンで患者を免疫感作することにより、癌患者を処置する方法に使用することができる。少なくとも部分的に成熟した抗原提示細胞はオートロガスであることができ、そして熱ショックをかけ、そして殺した癌細胞はオートロガスまたは同種異系であることができる。例えば本発明は以下に列挙する細胞から選択される熱ショックをかけ、そして殺した癌細胞を用いた特定の用途を見いだし、そしてこれは殺す前の癌細胞の熱ショックタンパク質、例えばＨＳＰ６０、ＨＳＰ９０およびｇｐ９６の発現のモジュレーション（例えばアップレギュレーション）を測定し、そして検出するために有用となり得る。特定の場合では、癌細胞はＨＳＰ６０、ＨＳＰ９０およびｇｐ９６を過剰発現するようにトランスフェクトされ、これにより実際の熱ショックの必要性を下げ、または排除するが、これらの細胞は本発明の癌細胞の抗原性の上昇に役立つ１もしくは複数の熱ショックタンパク質および／またはシャペロンを発現するので、そのような細胞は本発明の範囲に入る。
【００１９】
また別の態様は、抗原提示のために１もしくは複数の抗原をインターナライズすること
ができる樹状細胞を、１もしくは複数の抗原がインターナライズされて免疫細胞へ提示できるために十分な時間、接触させることにより、インビトロで抗原を樹状細胞に送達する方法を含み、ここで抗原は熱ショックをかけ、そして殺した癌細胞を含んでなる。樹状細胞はヒトの細胞であることができ、そして熱ショックをかけた細胞は例えば細胞系、外来抗原を発現するように形質転換された細胞、腫瘍細胞系、異種細胞または腫瘍細胞でよい。熱ショックをかけた細胞は表ＩＩに列挙された細胞系およびその組み合わせからなる群から選択され、そして化学処理、照射、熱、低温、浸透圧ショック、圧、研削、剪断、超音波、乾燥、凍結噴霧、穿刺、栄養不足およびそれらの組み合わせにより殺すことができる。任意の細胞または細胞断片を樹状細胞、例えば熱ショックをかけ、殺した、および／またはアポトーシス細胞断片、泡状突起、またはボディと接触させることができる。しばしば樹状細胞は未成熟であり、そして食作用性（ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ）である。当業者は正確な比率を調整しなければならないかもしれないが、熱ショックをかけた細胞  対  樹状細胞の通常の割合の１例は、約１〜１０個の熱ショックをかけた細胞  対  約１００個の樹状細胞である。
【００２０】
抗原と接触した後、抗原提示細胞は例えば樹状細胞の成熟化を誘導するために十分な時間、１もしくは複数の成熟因子に暴露することによりさらに成熟され得る。１例として樹状細胞を使用することにより、成熟化工程はＣＤ８３、ＴＮＦα、ＩＬ−１β，ＩＬ−６、ＰＧＥ２、ＩＦＮα、ＣＤ４０リガンドを発現するようにＣＤ８３ネガティブ樹状細胞を成熟させる単球コンディショニング培地、および熱ショックをかけ、そして殺した細胞からなる群から選択される少なくとも１つの成熟化因子とＣＤ８３ネガティブ樹状細胞を接触させることを含んでなることができる。他の抗原提示細胞は単球コンディショニング培地；ＩＦＮα、およびＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＴＮＦαからなる群から選択される少なくとも１つの他の因子；および熱ショックをかけた細胞の使用により成熟化されることができる。
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明の様々な態様を作成し、そして使用することを以下に詳細に検討するが、これは本発明が広い種々の具体的内容において具現することができる多くの応用可能な革新的概念を提供すると考えるべきである。本明細書で検討する具体的態様は、本発明を作成し、そして使用するための単なる具体的説明であり、そして本発明の範囲を定めるものではない。
【００２２】
本発明の理解を容易にするために、多数の用語を以下に定義する。本明細書で定義する用語は、本発明に関連する分野の当業者により通常に理解されている意味を有する。“ａ”、“ａｎ”および“ｔｈｅ”のような用語は、単数の物体を指すことのみを意図せず、特別な例を具体的説明に使用することができる一般的種類を含むことをも意図する。本明細書の用語は本発明の具体的態様を記載するために使用するが、それらの使用は特許請求で境界を引く場合を除き、本発明を限定しない。
【００２３】
本明細書で使用する用語「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」は、Ｔ細胞に抗原を提示する、ＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子を発現するオートロガスな細胞を指す。抗原提示細胞の例には例えば、専門的または非専門的な抗原プロセシングおよび提示細胞を含む。専門的なＡＰＣの例には例えばＢ細胞、全脾臓細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、繊維芽細胞、または非分画の末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）を含む。造血ＡＰＣの例には、樹状細胞、Ｂ細胞およびマクロファージがある。もちろん当業者は他の抗原提示細胞も本発明に有用であり、そして本発明が本明細書に記載する例示的な細胞型に限定されないと認識している。
【００２４】
ＡＰＣは抗原を「装填（ｌｏａｄｅｄ）」することができる。抗原性ペプチドまたは１
もしくは複数の抗原に由来する組換えペプチドによりパルスされる又は装填する、即ち１つの態様ではペプチドは抗原であり、そして一般に悪性または哺乳動物による感染に対して向けられるヘルパーＴ細胞、細胞溶解性Ｔリンパ球（細胞溶解性Ｔ細胞またはＣＴＬ）の活性化を特徴とする免疫応答を誘導することができる抗原性断片である。１つの態様では、ペプチドはクラスＩ  ＭＨＣまたはクラスＩＩ  ＭＨＣ分子により提示される抗原の１もしくは複数のペプチド断片を含む。ペプチド断片は肉腫、リンパ腫、メラノーマまたは他のオートロガスもしくはヘテロロガスな腫瘍または癌により発現される抗原でよい。もちろん当業者は他の抗原の１もしくは複数の断片であるペプチドまたはタンパク質断片を本発明で使用することができ、そして本発明が本明細書に記載する例示的ペプチド、腫瘍細胞、細胞クローン、細胞系、細胞上清、細胞膜および／または抗原に限定されないと認識している。
【００２５】
本明細書で使用する用語「樹状細胞」または「ＤＣ」は本発明で有用なすべてのＤＣを指し、すなわちＤＣは分化、成熟および／または活性化の様々な段階にある。本発明の１つの態様では、樹状細胞および応答するＴ細胞は健康なボランティアに由来する。別の態様では、樹状細胞およびＴ細胞は癌または他の状態の腫瘍疾患の患者に由来する。さらに別の態様では、樹状細胞はオートロガスまたは同種異系のいずれかに適用するために使用される。
【００２６】
本明細書で使用するように、「有効量」とは腫瘍抗原、例えば腫瘍細胞に対する免疫応答を誘導または増幅するために十分な抗原またはエピトープの量を指す。
【００２７】
本明細書で使用する用語「ワクチン」は適応免疫応答の細胞、すなわちＢ細胞および／またはＴ細胞に影響を及ぼすことにより疾患の経過に影響を与える組成物を指す。ワクチンの効果には例えば、細胞性免疫の誘導またはＴ細胞のその抗原への応答の改変を含む。
【００２８】
本明細書で使用する用語「免疫学的に有効な」とは、癌を防止または処置するための免疫応答において、変化を誘導する抗原、および熱ショックをかけ、かつ／または殺した１もしくは複数の腫瘍細胞を装填した抗原提示細胞の量を指す。患者に挿入または再挿入される、装填される抗原および／または抗原を装填したＡＰＣの量（ａｍｏｕｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｌｏａｄｅｄ  ａｎｄ／ｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｌｏａｄｅｄ  ＡＰＣｓ）は多くの因子に依存して個々の間で変動する。例えば異なる用量が充実性腫瘍または転移性腫瘍をもつヒトの有効な免疫応答に必要となるかもしれない。
【００２９】
本明細書で使用する用語「癌細胞」は、異常な形態学的または増殖的表現型を現す細胞を指す。癌細胞は腫瘍の一部を形成することができ、この場合、腫瘍細胞と定義することができる。インビトロで癌細胞は当業者に知られているような足場非依存性の（ａｎｃｈｏｒａｇｅ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）細胞増殖、接触阻害の喪失等を特徴とする。正常細胞と比較して、癌細胞は異常な組織の新規増殖、例えば周囲の組織に侵襲し、そして他の身体部位へ転移する充実性腫瘍または細胞を示す。腫瘍または癌「細胞系」は一般に不死であり、そしてインビトロで成長することができる細胞を説明するために使用する。初代細胞は初代培養中の細胞、すなわち患者、組織または腫瘍から単離されたばかりの細胞を記載するためにしばしば使用される。細胞クローンは一般に単一の細胞から単離され、またはクローン化され、そしてインビトロ培養を通してもよいし、通さなくてもよい細胞を記載するために使用する。
【００３０】
本明細書で使用する用語「癌細胞抗原」は、本発明に従いストレスをかけ、そして殺した細胞を指す。簡単に説明すると、癌細胞には癌細胞がＨＳＰ７０、ＨＳＰ６０およびＧＰ９６のような熱ショックタンパク質（これらは分解（ｄｅｇｒａｄｅｄ）されるか、または分解されることができるタンパク質の分子シャペロンとして作用することが知られて
いる種類のタンパク質である）の発現を増すように処理またはストレスをかけることができる。一般にこれらの熱ショックタンパク質は癌細胞がより高い免疫原性の癌細胞特異的抗原を含むことができるように、内部の癌細胞抗原を安定化する。
【００３１】
本明細書で使用するように、抗原およびＡＰＣに適用する場合、用語「接触した」または「暴露した」とは、抗原がＡＰＣと直接隣接して置かれる工程を記載するために本明細書では使用する。ＡＰＣによる抗原提示を達成するために、抗原は、ＡＰＣを「感作（ｐｒｉｍｅ）」して抗原を装填したＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ抗原を細胞表面上に発現するために有効な量で提供される。
【００３２】
本明細書で使用する用語「殺す」とは、例えばベツリン酸、パクリタキセル、カンプトテシン、エリプチシン、ミトラマイシンＡ、エトポシド、ビンブラスチン、ビンクリスチン、イオノマイシンおよびそれらの組み合わせを使用した化学的致死のような多数の因子により引き起こされる細胞死を引き起こすことを指す。任意の数の方法または作用物質、（例えば任意の、または広い種類の照射（ガンマ、紫外線、マイクロ波、超音波等）、熱、低温、浸透圧ショック、圧、研削、剪断、乾燥、凍結噴霧、吸引乾燥、穿刺、栄養不足およびそれらの組み合わせ）を、本発明の抗原として役立つ熱ショックをかけた癌細胞を殺すために使用することができる。別の種類の細胞の致死または死は、通常の「アポトーシス」を指し、これには例えば細胞核の退縮および核ＤＮＡの断片化を導く細胞内プロテアーゼおよびヌクレアーゼの活性化が関与する。種々の細胞内分子が相互作用して細胞死を達成する正確なメカニズムの理解は、本発明の実施にかならずしも必要ではない。
【００３３】
本明細書で使用する句「治療に有効な量」とは、組み合わせて動物に投与した時に癌細胞を動物内で殺すために効果的な抗原装填ＡＰＣの量を指す。本発明の方法および組成物は癌細胞（１もしくは複数）をインビトロおよびインビボの両方で殺すために等しく適している。殺すべき細胞が動物内に存在する場合、本発明は１もしくは複数の抗腫瘍剤、例えば化学薬品、照射、Ｘ−線、ＵＶ−照射、マイクロ波、放電等も含むことができる処置の過程と一緒に、またはその一部として一緒に使用することができる。当業者は本発明が、アドリアマイシン、５−フルオロウラシル、エトポシド、カンプトテシン、アクチノマイシン−Ｄ、マイトマイシンＣ、シスプラチン等を初めとするＤＮＡ傷害化合物のような治療に有効量の製薬学的組成物と一緒に使用できると認識するだろう。しかし本発明はＤＮＡ傷害剤により影響を受ける可能性がある他の免疫細胞を活性化することになっている生きている細胞を含む。そのように任意の化学的および／または他の処置過程は一般に適用免疫応答を最大とするための時期を合わせられるが、同時にできるだけ多くの癌細胞を殺す手助けをする。
【００３４】
本明細書で使用する用語「抗原装填樹状細胞」、「抗原でパルスされた樹状細胞」等の用語は、抗原、この場合、熱ショックをかけた癌細胞と接触したＤＣを指す。しばしば樹状細胞は、ナイーブおよび記憶Ｔ細胞に抗原を提示する抗原をプロセシングするために数時間から最高１日間を要する。抗原の取り込みおよびプロセシングを強化するために、１日または２日後にＤＣに抗原を再度パルスし、かつ／またはＤＣの成熟のレベルを変化させる１もしくは複数のサイトカインを提供することが望ましいかもしれない。いったんＤＣが抗原を包み込めば（例えば、プレプロセシングされた（ｐｒｅ−ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ）熱ショックをかけ、かつ／または殺した癌細胞）、「抗原を感作したＤＣ（ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｉｍｅｄ  ＤＣ）」と呼ぶ。抗原の感作は例えば適用に使用した特異的癌細胞に対する抗体で免疫染色することによりＤＣ中に見ることができる。
【００３５】
抗原装填またはパルスされたＤＣ群は、洗浄し、濃縮し、そして１つの型のワクチンとして、または抗原がそこから派生した病原体または腫瘍細胞に対する処置として患者に直接注入することができる。一般に抗原装填ＤＣはインビボでナイーブおよび／または記憶
Ｔリンパ球と相互作用すること、すなわちそれらの表面に抗原を提示する細胞の認識、および破壊を引き起こすことが期待される。１つの態様では、抗原装填ＤＣは患者への再導入前にインビトロでＴ細胞と相互作用することもできる。当業者は注入あたりの抗原装填ＤＣの数、注入の回数および時期をどのように至適化するかを知っている。例えば注入あたり１〜２百万個の抗原でパルスされた細胞を患者に注入することが通常であろうが、より少数の細胞でも所望の免疫応答を誘導するかもしれない。
【００３６】
抗原装填ＤＣはＴリンパ球と共存培養されて、抗原特異的Ｔ細胞を生産することができる。本明細書で使用する用語「抗原特異的Ｔ細胞」とは、本発明の抗原装填ＡＰＣに暴露されると増殖し、ならびにそれらの表面に特異的抗原を有する細胞を攻撃する能力を発達させるＴ細胞を指す。そのようなＴ細胞、例えば細胞傷害性Ｔ細胞は標的細胞を多くの方法、例えばグランザイムおよびパーフォリンのような毒性酵素を標的細胞の表面上に放出する多数の方法により、またはこれら溶解酵素を標的細胞の内部に入れることにより標的細胞を溶解する。一般に細胞傷害性Ｔ細胞はＣＤ８をそれらの細胞表面に発現する。通常、「ヘルパー」Ｔ細胞として知られるＣＤ４抗原ＣＤ４を発現するＴ細胞も、特異的な細胞傷害活性を促進するために役立ち、そして本発明の抗原装填ＡＰＣにより活性化され得る。特定の態様では、癌細胞、ＡＰＣそしてさらにＴ細胞はＤＣを生産するＭＮＣと同じドナーに由来することができ、これは患者またはＨＬＡ−もしくは処置する予定の個体から得たものであることができる。あるいは癌細胞、ＡＰＣおよび／またはＴ細胞は同種異系であることができる。
【００３７】
本発明者は、癌患者を腫瘍細胞抗原を装填した抗原提示細胞、例えば樹状細胞（ＤＣ）でワクチン接種すると、腫瘍特異的な免疫応答を導くことができることを見いだした。しかし免疫応答を臨床的成果と相関させることは難しいことが示された。Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）；およびＰａｌｕｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）は、第ＩＶ段階のメラノーマを有する１８名のＨＬＡ−Ａ＊０２０１患者にペプチドを装填したＣＤ３４−ＤＣをワクチン接種し、そしてメラノーマ抗原に由来するペプチドにインビトロで暴露した時、ＩＦＮ−γ生産（ＥＬＩＳＰＯＴ）により測定されるメラノーマ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫が上昇したことが報告された。これらの実験は、免疫応答が初期の臨床的応答と相関することを示した。さらにＣＤ３４−ＤＣでのワクチン接種は、メラノーマ特異的ＣＤ＋８記憶Ｔ細胞を誘導することができ、これはリコールアッセイ（ｒｅｃａｌｌ  ａｓｓａｙ）、すなわちインビトロでペプチドでパルスしたＤＣでの単回の再刺激で拡大することができ、ここでそれらは特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に成熟する。疾患の進行はメラノーマ特異的ＣＤ８＋記憶Ｔ細胞の誘導の欠如と関連して示された。これらの努力にもかかわらず、臨床において改良されたワクチン法がこのメラノーマ特異的免疫の選択的欠如を克服するために必要とされる。
【００３８】
例えばＤＣは健康なボランティアおよび第ＩＶ段階のメラノーマ患者では免疫リザーバーまたはアジュバントとして作用することが示された（Ｎｅｓｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｄｈｏｄａｐｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｔｈｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；およびＤｈｏｄａｐｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。今日まで一つの限定された臨床的応答が報告されただけであり、これは免疫感作エピトープの選択または１つのエピトープの標的化によるかもしれない。実際には、多くの腫瘍抗原の使用が多くの特異性を有するＴ細胞の活性化／誘導を促進し、これは疾患をより良く制御し、そして腫瘍のエスケープを防止できるかもしれない。これに関して、幾つかの系を使用してＤＣに腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が装填された（Ｇｉｌｂｏａ，Ｅ，１９９９）。ＭＨＣクラスＩ分子に定めた抗原に由来するペプチドを装填することは最も通常に行われ、そしてまた最近同定されたＭＨＣクラスＩＩヘルパーエピトープにも適用される（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；およびＫｉｅｒｓｔｅａｄ，ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【００３９】
「概念の実証」実験には重要であるが、ペプチドの使用には：（ｉ）所定のＨＬＡ型に対するそれらの制限；（ｉｉ）定めたＴＡＡの限定された数；および（ｉｉｉ）限定されたレパートリーのＴ細胞クローンの誘導からくる制限があり、これが腫瘍抗原の変化を制御するための免疫系の能力を限定する。ＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩエピトープの両方を提供し、そしてＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＴＬの多くのクローンが関与する多様な免疫応答を導く代替的な方法が必要である。報告された方法には組換えタンパク質、エキソーム（Ｚｉｔｖｏｇｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８）、ウイルスベクター（Ｒｉｂａｓ，ｅｔ  ａｌ．，２００２）、プラスミドＤＮＡまたはＲＮＡトランスフェクション（Ｂｏｃｚｋｏｗｓｋｉ，ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ａｓｈｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；およびＨｅｉｓｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，２００２）、免疫複合体（Ｒｅｇｎａｕｌｔ，１９９９）、そしてさらに最近ではＤＣ表面分子に対する抗体（Ｇｉｌｂｏａ，Ｅ．１９９９；およびＦｏｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，２０００）の使用が関与する。
【００４０】
免疫応答を多様化するさらに別の方法は、ＤＣが食作用したアポトーシス腫瘍細胞からペプチドを提示する能力、すなわちいわゆる交差感作（ｃｒｏｓｓ−ｐｒｉｍｉｎｇ）を活用することである（Ａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８ａ；Ａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８ｂ；Ｎｏｕｒｉ−Ｓｈｉｒａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｂｅｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；およびＬａｂａｒｒｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。本発明者は全抗原をＤＣへ導入することがＤＣのＴ細胞へ提示するペプチドの選択および調整（ｔａｉｌｏｒ）を可能とし、すなわち既知のＭＨＣ拘束がある腫瘍特異的ペプチドを同定する必要性を回避することを見いだした。殺した同種異系のメラノーマ細胞を装填したＤＣは、ナイーブなＣＤ８＋Ｔ細胞を交差感作してメラノーマ特異的ＣＴＬに分化させることができることが示された（Ｂｅｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。殺した同種異系メラノーマまたは前立腺癌細胞系を装填したＤＣは、ナイーブなＣＤ８Ｔ細胞を共有する腫瘍抗原に対して感作する（Ｎｏｕｒｉ−Ｓｈｉｒａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；およびＢｅｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。しかし、Ｔ細胞は樹立されるべき腫瘍特異的応答について数回の刺激を要する。したがって腫瘍または癌細胞の免疫原性を上げるための組成物および方法を同定し、そして開発することが重要である。
【００４１】
本発明者は熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）が、ポリペプチドのそれらの産出（ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）から、例えば小胞体（ＥＲ）中のＭＨＣクラスＩへの結合へとポリペプチドをトランジットさせるための分子シャペロンを構成すると認識している（Ｂａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；およびＦｒｙｄｍａｎ，Ｊ．２００１）。ＨＳＰ７０、ＨＳＰ６０およびＧＰ９６は、抗原性タンパク質またはペプチドで交差感作するための免疫アジュバントとして最近確立された（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，ｅｔ  ａｌ．，１９９４；およびＳｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｐ．，２００２）。このプロセスでは、再構成されたｈｓｐ７０−ペプチド複合体またはｇｐ９６−ペプチド複合体が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によりＣＤ９１（Ｂａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、ＣＤ４０（Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，２００２）、ＬＯＸ−１（Ｄｅｌｎｅｓｔｅ，ｅｔ  ａｌ．，２００２）またはＴＬＲ２／４（Ａｓｅａ，ｅｔ  ａｌ．，２００２）を介する受容体媒介型の食作用を通してインターナライズされる。ＨＳＰ：ペプチド複合体はワクチンとして使用されてきた（米国特許第６，４６８，５４０号明細書；およびＮｏｅｓｓｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．２００２。「腫瘍由来熱ショックタンパク質７０のペプチド複合体はヒト樹状細胞により交差提示される」Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９：５４２４−５４３２）。ＨＳＰ７０：ペプチド複合体は患者の腫瘍細胞から精製され、そして患者に投与され得る（米国特許第６，４６８，５４０号明細書）。ＨＳＰ７０：ペプチド複合体は抗原提示細胞に結合し、そして細胞傷害性Ｔ細胞を活性化することができると測定された（Ｃａｓｔｅｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，２００１。「ヒト熱ショックタンパク質７０ペプチド複合体は、抗メラノーマＴ細胞を特異的に活性化する」Ｃａｎ  Ｒｅｓ  ６１：２２２−２２７；およびＮｏｅｓｓｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９：５４２４−５４２３）。またＨＳＰ７０は樹状細胞を刺激して成熟させるためにも使用されてきた（米国特許出願第２００２０１２７７１８号明細書）。
【００４２】
さらに詳細には、本発明は抗原提示細胞、例えばストレスをかけ、かつ／または熱ショックをかけて殺した腫瘍細胞、または熱ショックタンパク質を発現する殺した腫瘍細胞を装填した樹状細胞（ＤＣ）を含み、そしてそのような抗原提示細胞の作成法が本明細書に記載される。これらの装填されたＤＣは、ヒトおよび動物における予防的免疫応答および治療的免疫応答の両方を誘導するために有用である。特にそのような装填されたＤＣは癌および感染性疾患の管理に有用である。
【００４３】
１つの態様では、本発明は以下の免疫原的現象を組み込むメラノーマを処置する樹状細胞（ＤＣ）ワクチンを含む：（ｉ）メラノーマ特異的ＣＴＬを交差感作するＤＣの能力；（ｉｉ）抗原の供給源として殺した腫瘍細胞を利用する；（ｉｉｉ）ペプチドの保護および輸送におけるＨＳＰの好ましい役割；および（ｉｖ）本明細書で示すように、熱ショックによる腫瘍抗原発現のアップレギュレーション。１つの態様では、本発明のＤＣワクチンには、熱ショックで殺した腫瘍細胞を装填したＤＣを含み、ここでＤＣは抗原特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球を交差感作することができる。別の態様では、本発明のＤＣワクチンはＨＳＰを過剰発現するように誘導した殺した腫瘍細胞を装填したＤＣを含み、ここでＤＣは抗原特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球を交差感作することができる。他に特定しない限り、本明細書で言う場合には、熱ショックをかけて殺した腫瘍細胞を装填したＤＣを含んでなるＤＣワクチン、ＨＳＰを過剰発現するようにトランスフェクトまたは誘導された殺した腫瘍細胞を装填したＤＣを含んでなるＤＣワクチンも使用できると理解される。
【００４４】
本発明に有用なＤＣには種々の分化段階（前駆体、未成熟樹状細胞および成熟樹状細胞）の樹状細胞、限定するわけではないが単球を含む血液前駆体から誘導される樹状細胞、ＣＤ３４−造血祖先細胞から誘導される樹状細胞、ランゲルハンス細胞、腸のＤＣおよびリンパ節のＤＣのような樹状細胞のサブセットを含む。１つの態様では、樹状細胞は単球に由来する樹状細胞（ＭＤＤＣ）であり、例えばＤＣはヒト起源である。
【００４５】
ワクチンの処方および投薬。任意のワクチン接種処方にしたがって本発明を使用することができるが、当業者により知られているように以下の例示的処方が大きな効果を上げるために使用された。１もしくは複数のワクチン接種を、数秒から数時間から数日、さらに数週間の範囲の間隔で、ペプチドでパルスしたＡＰＣの投与に先行して、またはさらにそれに続けることができる。１つの態様では、細胞屑でパルスしたＡＰＣおよび１もしくは複数のリンホカインおよび／またはサイトカインが患者に別個に投与される。しばしば２つの抗原でパルスしたＡＰＣの組み合わせおよび／または重複が受容者に有利な効果を発揮するように、各免疫感作の間には有意な期間（１、２、３または４週間）が選択される。
【００４６】
例えばＴｈ１からＴｈ２型の応答、またはその逆のＴ細胞免疫応答を駆動する１もしくは複数のリンホカインと組み合わせる特定の状況で、例えばペプチドでパルスしたＡＰＣの投与が望ましい。種々の組み合わせを使用することができ、例えばここでペプチドでパルスしたＡＰＣは“Ａ”であり、そしてリンホカインは“Ｂ”である。
【００４７】
【表１】
0005623004.tif 000002
【００４８】
効果的な腫瘍の致死は、ワクチン処方の前、最中および／または後に測定することができる。腫瘍細胞の致死を達成するために、抗原装填ＡＰＣは腫瘍細胞を殺すために効果的な組み合わせ量で患者に送達される。これらの処置サイクルは多回繰り返されるか、または１回のみ送達することができる。例えば、種、年齢、体重、性別、健康、妊娠、依存症、アレルギー、人種、事前の医学的状態、現行の医学的状態、抗炎症物質での処置、化学療法および処置の長さを含め、当業者は種々の因子がワクチン接種に対する患者の応答に影響を及ぼすことを良く知っている。すなわち当業者は、細胞の致死（例えば癌細胞に対して）または望ましくない免疫応答（例えば悪液質）の減少であっても、最適な免疫応答を達成するために容易に変動させることができる各患者に対する投薬用量および様々なパラメーターを個別化する必要を理解している。また当業者は、適切な投薬用量を選択する前に処置すべき状態も考慮することができる。例えば癌の処置に適切なワクチン接種用量は、引き続き癌の再発を防止するために計画される監視的治療用には望ましい投薬用量とならないかもしれない。
【００４９】
ワクチン接種は静脈内に、動脈内に、腫瘍内に、非経口に、腹腔内に、筋肉内に、腎臓の包下に、眼内に、骨内に、膣内に、直腸に、硬膜外に、硬膜内などに投与することができる。しばしば最も多いワクチン接種の経路は皮下（ＳＣ）、静脈内（ＩＶ）、動脈内、および腹腔内（ＩＰ）である。ワクチンがバッファーおよび／または薬理学的に許容され得る塩と適合性がある程度まで、これらは１もしくは複数の添加剤と適当に混合された水溶液に調製することができる。通常の保存および使用条件下で、これらの調製物には微生物の増殖を防止するために制限された量の保存剤および／または抗生物質を含むことができる。
【００５０】
注射用の使用に適する製剤の形態には滅菌水溶液または分散物を含む。すべての場合で、形態は滅菌されなければならず、そして容易なシリンジの操作性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流体でなければならない。あるとすれば保存条件は、製造および保存条件下で安定なＤＣの送達と適合しなければならず、そしてバクテリアおよび菌・カビのような微生物の混入作用に対して保護されなければならない。ほとんどの場合、１または等張性の作用物質、例えば糖または塩化ナトリウムを含むことが通例となり得る。ＡＰＣを含む抗原の長期吸収は、抗原の吸収を遅らせる例えばモノステアリン酸アルミニウム、リン酸カルシウムおよびゼラチンの使用によりもたらすことができる。
【００５１】
滅菌された注射可能な溶液は、活性化合物を必要な量で適切な溶媒中に、例えば濾過滅菌され得る上に挙げた種々の他の成分と包含させることにより調製することができる。一般に、分散物は種々の滅菌された有効成分を、基本的な分散媒質および上に挙げたものから他の必要な成分を含む滅菌された賦形剤に包含することにより調製される。抗原の調製用の滅菌粉末の場合、抗原を調製し、そして吸引乾燥し、凍結乾燥し、かつ／または凍結噴霧して、有効成分の粉末に、事前に滅菌濾過した溶液から所望する成分をさらに加えた粉末を得ることができる。
【００５２】
本明細書で使用するように、「製薬学的に許容され得る担体」にはありとあらゆる溶媒
、分散物、媒質、コーティング、抗バクテリア性および抗菌・カビ剤、等張性および吸収遅延剤等を含む。製薬学的に活性な物質にそのような媒体および作用物質を使用することは当該技術分野では周知である。任意の通例の媒体または作用物質が癌抗原と適合しない場合を除き、作用物質はワクチン生産工程の一部に使用され得る。
【００５３】
本明細書で使用するように、「タンパク質複合体の形成を可能とするために効果的な条件下」という句は、ＡＰＣ、例えば樹状細胞のＭＨＣに「装填する」必要がある熱で殺した、殺した、またはそうではなく処理した腫瘍細胞、腫瘍細胞屑、プロセシングした腫瘍抗原、プロセシングした腫瘍細胞、熱で殺した腫瘍細胞および／または抗原のそれら条件および量を指す。本明細書で使用する用語、抗原の装填に「適する」とは、細胞内または細胞表面上であってもＤＣのＭＨＣ上の１もしくは複数の腫瘍抗原との接触、プロセシングおよび提示を可能とするそれら条件である。本開示および本明細書の実施例に基づき、当業者は効果的な結合、プロセシングおよび装填を可能とする十分なインキュベーション、温度および期間を知っている。インキュベーション工程は典型的には約１〜２〜４時間の間で、約２５度〜３７度Ｃ（またはそれより高い）の温度であり、かつ／または約４度Ｃで一晩等となり得る。
【００５４】
本発明の１例では、ＡＰＣは死んだ、または死につつある腫瘍細胞（本明細書では「殺した腫瘍細胞」と呼ぶ）を装填したＤＣであり、限定するわけではないが腫瘍細胞系および単離されたオートロガスまたは同種異系の腫瘍細胞を含む。患者から単離された、または他の供給源から入手可能な任意の腫瘍または癌細胞を本発明の態様に使用することができると予想できる。実施例はメラノーマ細胞系の使用を開示するが、本発明の態様は他の癌、および樹状細胞に装填するために使用される癌細胞の種類に依存して、本発明の態様により処置できる種類の癌の処置に使用できることを企図している。
【００５５】
本明細書に示す実施例では、腫瘍細胞の死はベツリン酸（ＢＡ）での処理により達成される。ＢＡはカスパーゼ−８およびカスパーゼ−３の活性化を通してミトコンドリア−依存的な死を誘導する、メラノーマに対して特に活性な作用物質である。ベツリン酸（ＢＡ）は本明細書で提示する実施例で使用されるメラノーマ細胞系のアポトーシスまたは細胞死を誘導するために使用されるが、本発明の態様において他の細胞死誘導剤をＢＡの代わりに使用してもよい。他の細胞死誘導剤には、限定するわけではないがベツリン酸、パクリタキセル、カンプトテシン、エリプチシン、ミトラマイシンＡ、エトポシド、ビンブラスチンおよびビンクリスチンがある。
【００５６】
本発明のＤＣワクチンは、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）の発現を誘導するように処理されたか、またはＨＳＰを過剰発現するようにトランスフェクトされたいずれかの殺した腫瘍細胞を装填したＤＣを含んでなる。好適な態様では、ＤＣワクチンはＨＳＰ発現を誘導するために、少なくとも４２度Ｃで（本明細書では「熱ショック」と呼ぶ）、少なくとも４時間、事前にインキュベーションし、殺した腫瘍細胞を装填した単球由来の樹状細胞（ＭＤＤＣ）を含んでなる。別の好適な態様では、ＤＣワクチンはＨＳＰ過剰発現遺伝子を含んでなるベクター、例えば本明細書に記載するようなＲＲＬ−ｐｇｋ−ＨＳＰ７０−ＥＧＦＰレンチウイルスベクターでトランスフェクトされた腫瘍細胞体を装填したＭＤＤＣを含んでなる。本発明に使用することができる他のＨＳＰには、限定するわけではないがＨＳＰ６０、ＨＳＰ９０およびｇｐ９６がある。実施例では腫瘍体または細胞に熱ショックを与えるために４２度Ｃが使用されているが、ＨＳＰの発現を上げ、しかもＨＳＰの機能を保持するために十分な任意の温度を本発明の態様で使用することができる（例えば約３９〜５５度Ｃ）。細胞中のＨＳＰの発現を上げる他の方法には、限定するわけではないが低温、グルコース欠乏または酸素欠乏、細胞代謝を改変する薬剤への暴露、細胞傷害剤への暴露および他のストレスシグナルがある。さらに実施例は２、４または８時間の熱ショッキングを示すが、ＨＳＰ７０または他のＨＳＰの発現を上げるために十分な期間を本発明の態様に使用することができる。
【００５７】
本発明に従い、殺した腫瘍細胞を装填したＤＣは、腫瘍細胞ならびに腫瘍関連抗原に由来するペプチドを装填した標的細胞を殺すことができる細胞傷害性細胞（ＣＴＬ）を誘導することができる。細胞傷害性細胞には限定するわけではないが、ＣＤ８Ｔ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、およびナチュラルキラーＴ細胞を含む。今後、特に言及しない限り、細胞傷害性Ｔ細胞については１もしくは複数の細胞傷害性細胞を指す。本発明に従い、ＣＴＬはＣＤ８＋Ｔ細胞のような細胞傷害性細胞を、熱ショックで殺した腫瘍細胞を装填したＤＣと共存培養することにより調製される。１つの方法では、熱ショックで殺した腫瘍細胞はＭＤＤＣと１：１の比率で３７度Ｃでコー（ｃｏ）インキュベーションされ；３時間のコーインキュベーション後、細胞は０．０５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡ  ＰＢＳ溶液に５分間再懸濁されて、細胞−細胞結合が破壊され；ＣＤ１１ｃ＋ＤＣが分類され（ｓｏｒｔｅｄ）、ｓＣＤ４０Ｌ（１ミリリットルあたり２００ナノグラム）で２４時間、成熟化され、次いで細胞傷害性細胞を感作するために使用される。免疫学の当業者は知っているように、本発明に従いＤＣによるＨＳＰ：腫瘍抗原複合体の取り込みを可能とする装填された樹状細胞の共存培養（ｃｏ−ｃｕｌｔｕｒｅ）の任意のインキュベーション温度および時間を使用することができる。
【００５８】
熱ショックで殺した腫瘍細胞を装填したＤＣは、ナイーブなＴ細胞を感作して、樹状細胞を装填するために使用される腫瘍細胞および／または他の腫瘍細胞上に発現される特異的抗原または多くの（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）および／または共有する腫瘍抗原のいずれかを認識することができるエフェクター細胞に分化させることができる。異なる細胞間、例えば腫瘍細胞間で共有される多くの抗原に対するこの交差感作は、広い免疫応答を誘導するために重要である。本発明では、１つの特異的な同種異系腫瘍源に由来する細胞体を装填したＤＣにより誘導されるＣＴＬが、他の腫瘍に致死効果を提供するために使用することができる。例えばＭｅ２７５のような特異的な同種異系のメラノーマ癌腫細胞系から誘導された殺した腫瘍細胞を装填したＤＣにより誘導されるＣＴＬは、Ｍｅ２９０のような他の腫瘍細胞系を殺すことができる。
【００５９】
また本発明の方法は、ワクチン接種に適当なベクター中に本発明の抗原、例えば熱ショックをかけて殺した腫瘍細胞を装填したオートロガスな樹状細胞で患者を処置することよる患者の腫瘍の処置を含む。１つの態様では、患者は同じ患者に由来する熱ショックをかけて殺した腫瘍細胞を装填したＤＣで処置される。別の態様では、患者は事前にＨＳＰを過剰発現するように誘導された、殺した腫瘍細胞を装填されたＤＣで処置される。別の態様では、患者はオートロガスまたは同種異系の熱ショックをかけ、殺した腫瘍細胞を装填したオートロガスまたは同種異系の樹状細胞により感作されたオートロガスなＴ細胞で処置される。さらに別の態様では、患者は事前に熱ショックをかけ、かつ／またはＨＳＰを過剰発現するようにトランスフェクトされた殺した腫瘍細胞を装填したオートロガスまたは同種異系の樹状細胞により感作されたオートロガスなＴ細胞で処置される。同様のプロトコールに予防的処置も従う。本発明におけるワクチン投与の経路には、限定するわけではないが皮下、皮内（ｉｎｔｒａｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、腎臓包内、眼内または皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）注射を含む。
【００６０】
ワクチン投与の頻度は、初回ワクチン接種後の血中免疫応答の評価に基づき個別化することができる。そのような早い段階での免疫応答の存在は、頻度が低いワクチン接種、例えば月に１回基準のワクチン接種を要する患者を同定する。この段階で免疫応答が無ければ、より頻繁なワクチン接種、例えば隔週毎のワクチン接種を要する患者を同定する。本発明では、患者は一生、あるいは悪性疾患に進行するまでワクチン接種を受けるべきである。同様のプロトコールが予防的処置にもあてはまる。
【００６１】
本発明では、腫瘍抗原に対して誘導された免疫の包括的評価を、当該技術分野で知られている任意の方法により測定することができる。例えば本発明のＤＣの免疫原性は以下を含め、ＣＤ８＋Ｔ細胞の交差感作の幾つかのパラメーターにより測定されることができる：（ｉ）ナイーブなＣＤ８＋Ｔ細胞の分化に必要な装填されたＤＣでの刺激数；（ｉｉ）標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイにおいて、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１メラノーマ細胞の致死；（ｉｉｉ）腫瘍退縮アッセイにおいて、インビトロでの腫瘍細胞の増殖を防止する能力；（ｉｖ）メラノーマペプチド−でパルスされたＴ２細胞の致死；および（ｖ）メラノーマ四量体の結合。
【００６２】
本発明の組成物および使用法は、以下に提供する実施例でさらに詳細に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲をどのようにも限定するものではないとは解釈される。これらの実施例は本発明を説明するが、組成物および方法に対する修飾も当業者の技術の範囲であり、そしてそのような修飾は本発明の範囲内にあると考える。
【実施例】
【００６３】
実施例１．細胞系および細胞培養。ヒトメラノーマ細胞系：ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋Ｍｅ２７５およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋Ｍｅ２９０系は、ローザンヌのルードヴィヒガン研究所（Ｌｕｄｗｉｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）で樹立され、そしてＪ−Ｃ．Ｃｅｒｏｔｔｉｎｉ博士およびＤ．Ｒｉｍｏｌｄｉ博士の好意により贈られた。乳癌細胞系ＭＣＦ−７（ＨＬＡ−Ａ２＋）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＨＴＢ−２２）およびＴ２（ＨＬＡ−Ａ２＋）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１９２２）はアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ；バージニア州、マナッサス）からであった、。Ｋ５６３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ−２４３）は多型潜在性の造血悪性細胞系である。Ｃｏｌｏ８２９（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１９７４）は悪性メラノーマ細胞系である。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１ｎｅｇＳＫＭｅｌ２８およびＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋ＳＫＭｅｌ２４はＡＴＣＣから得た悪性メラノーマ細胞系である。すべてのこれらの細胞系は、ＲＰＭＩ１６４０（ＧＵＢＣＯ
ＢＲＬ）、１％Ｌ−グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）からなるを完全培養基（ＣＭ）で維持された。Ｔ細胞培養に関して、ＦＣＳは１０％の熱不活化ヒトＡＢ血清に代えた。
【００６４】
実施例２．ＥＧＦＰ＋細胞系の産出。ＨＬＡ−Ａ２０１＋同種異系細胞系Ｔ２、Ｋ５６２、Ｍｅ２７５、Ｍｅ２９０およびＭＣＦ７は、延長因子１αプロモーターの制御下に置かれたＥＧＦＰをコードするレンチウイルスベクターｐＨＲＥＦ１α−ＥＧＦＰ（Ｐａｔｒｉｃｅ  Ｍａｎｎｏｎｉ博士の好意により提供された）でトランスフェクトされた。細胞系の形質導入は１５の感染多重度（ＭＯＩ）で６時間、１ミリリットルのポリブレン（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、セントルイス、ミズーリ州）あたり８マイクログラムを用いて、３７度Ｃで５％ＣＯ２インキュベーター中で行った。新しい培地を加え、そして培養を再開した。形質導入から２日後に、ＥＧＦＰ発現をフローサイトメトリーで監視した。細胞を拡大し、そして＞９５％ＥＧＦＰ＋細胞の純度に分類した。それらを計数し、そしてｃＲＰＭＩ＋１０％ＡＢ中に５．１０４／ｍｌで再懸濁した。
【００６５】
実施例３．試薬およびペプチド。使用した組換えヒトサイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦ（イムネックス：Ｉｍｍｕｎｅｘ）、可溶性ＣＤ４０リガンド（ｓＣＤ４０Ｌ）、ＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−４（Ｒ＆Ｄシステムズ、ミネアポリス、ミネソタ州）であった。ベツリン酸（ＢＡ）およびＤＮＡ色素７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）をシグマ−アルドリッチ（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。ペプチド：ｇｐ１００２０９−２１７（ＩＭＤＱＶＰＦＳＶ；配列番号１）、チロシナーゼ３６８−３７６（ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ；配列番号２）、ＭＡＲＴＩ２７−３５（ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ；配列番号３）、ＭＡＧＥ３２７１−２７９（ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ；配列番号４）、およびＰＳＡ１
１４１−１５０（ＦＬＴＰＫＫＬＱＣＶ；配列番号５）を、Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（ルイスヴィル、テキサス州）により合成した。凍結乾燥したペプチドをＤＭＳＯに溶解し、発熱物質を含まない水中に１ミリリットルあたり１マイクログラムに希釈し、そして−８０度Ｃで保存した。
【００６６】
実施例４．熱ショックで殺したメラノーマ細胞の調製。メラノーマ細胞系を２５０ｍｌのフラスコにＣＭ中、１ミリリットルあたり３ｘ１０５細胞の濃度で播いた。熱ショックをかけ、および殺した両方のメラノーマ細胞系を以下のように調製した。３７度Ｃで２４時間の培養後、細胞を４２度Ｃのインキュベーターに２時間または４時間移した。次いで細胞は１ミリリットルあたり１０マイクログラムのＢＡ（アポトーシスまたは細胞死を誘導することが報告されている化合物）を加えて３７度Ｃでインキュベーションし、そしてさらに２４時間インキュベーションした。今後、これらの細胞を「高温メラノーマ体（ｈｏｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｂｏｄｙ）」と呼ぶ。高温メラノーマ体を装填したＤＣで感作したＣＤ８＋Ｔ細胞を今後、「ＣＴＬｈｏｔ」と呼ぶ。
【００６７】
殺したが、熱ショックをかけなかったメラノーマ細胞について、細胞は１ミリリットルあたり１０マイクログラムのＢＡで３７度Ｃで２４または４８時間処理した。今後これらの細胞を「低温メラノーマ体（ｃｏｌｄ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｂｏｄｙ）」と呼ぶ。低温メラノーマ体を装填したＤＣで感作したＣＤ８＋Ｔ細胞を今後、「ＣＴＬｃｏｌｄ」と呼ぶ。熱ショックをかけたが、ＢＡで処理しなかったメラノーマ細胞については、この細胞を４２度Ｃのインキュベーターに２時間または４時間移し、次いでＢＡを加えずにさらに２４時間、３７℃でインキュベーションした。今後、これらの細胞を「熱ショックをかけたメラノーマ細胞」と呼ぶ。
【００６８】
非装填ＤＣで感作したＣＤ８＋Ｔ細胞は、本明細書に提示する多くの実験において対照として使用した。これらの対照は「ＣＴＬｕｎ」と呼ぶ。ＡＰＣ−結合アネキシン−Ｖおよびプロピジウムヨージド（ＰＩ）染色を使用して、種々の条件下で腫瘍細胞のアポトーシスの割合を検出した。
【００６９】
実施例５．ＨＳＰ発現の測定。メラノーマ細胞系、ＳＫＭｅｌ２８、ＳＫＭｅｌ２４、Ｍｅ２７５、Ｍｅ２９０およびＣｏｌｏ８２９は、熱ショックをかけたか、熱ショックをかけてさらにＢＡ処理したか、またはＢＡ処理したかのいずれかであった。代表的な細胞を集め、そして冷リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した。細胞ペレットは、プロテアーゼインヒビターカクテル（０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ミリリットルあたり１マイクログラムのロイペプチン、１ミリリットルあたり１マイクログラムのアプロチニン、および１ミリリットルあたり１マイクログラムのペプスタチン）を補充した適当容量の溶解バッファーに再懸濁し、そして氷上で３０分間、細胞懸濁液が均一になり、そして固まりが見えなくなるまで時折混合しながらインキュベーションした。細胞溶解物を１２，０００ｒｐｍで２０分間、４度Ｃで遠心した。上清のＨＳＰ６０およびＨＳＰ７０レベルは、ＥＬＩＳＡキットにより検出した（ストレッスジーンズ（Ｓｔｒｅｓｓｇｅｎｅｓ）、カナダ）（図１Ａおよび１Ｂ）。細胞上清の全タンパク質は、Ｍｉｃｒｏ  ＢＳＡ（商標）タンパク質アッセイ試薬キットで調査した（ピアス  バイオテクノロジー社（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）、ロックフォード、イリノイ州）。細胞溶解物中のＨＳＰ６０またはＨＳＰ７０の濃度は、上清中、１マイクログラムのタンパク質あたりナノグラムのＨＳＰと定めた（ｎｇ／ｍｇ  Ｐｒ）。図１Ａに示すように、各メラノーマ細胞系におけるＨＳＰ７０発現は、熱ショックをかけたメラノーマ細胞および熱ショックをかけてさらにＢＡ処理した細胞（高温メラノーマ体）で４倍に大きく上昇した。図１Ｂでは、ＨＳＰ６０の発現における上昇を、２時間および４時間熱ショックをかけたメラノーマ細胞および熱ショックをかけてさらにＢＡ処理した細胞（高温メラノーマ体）について示す。
【００７０】
またウエスタンブロッティングを使用して、熱ショック細胞（２時間または４時間）、熱ショックをかけてさらにＢＡ処理した細胞（高温メラノーマ体）、およびＢＡ処理した細胞（低温メラノーマ体）（２４時間）についてＳＫＭｅｌ２８細胞系でのＨＳＰ７０、ＨＳＰ６０およびＧＰ９６発現パターンを測定した。３０マイクログラムの全タンパク質を含有する各細胞溶解物を乗せ、そして８％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離し、そしてＰＶＤＦ膜（ノベックス（Ｎｏｖｅｘ）、サンディエゴ）に移した。膜は４度Ｃで一晩、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇバッファー（ピアス  バイオテクノロジー社）を使用することによりブロッキングし、そして１ミリリットルあたり１マイクログラムのマウス抗ヒトＨＳＰ６０（ＳＰＡ６０）、ＨＳＰ７０（ＳＰＡ８１０）またはｇｐ９６（ＳＰＡ８５１）モノクローナル抗体（ストレッスジーン）と２時間、室温でインキュベーションした。膜をＰＢＳ−Ｔバッファーで洗浄した後、ＨＲＰ結合ヤギ抗マウスＩｇＧを１時間のインキュベーションに加え、そしてタンパク質のブロットをＦｌｕｏｒｏ  Ｂｌｏｔ（商標）ペルオキシダーゼ基質（ピアス  バイオテクノロジー社）で明らかにした。結果は４時間熱ショックをかけたメラノーマ細胞および熱ショックをかけてさらにＢＡ処理した細胞（高温メラノーマ体）について、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０およびｇｐ９６発現に上昇が示された（データは示さず）。
【００７１】
実施例６．単球由来樹状細胞の産出および抗原装填。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋健康ドナーまたはＧ−ＣＳＦ可動化ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋健康ドナーに由来するＰＢＭＣを６ウェルプレートに播き、そして３７度Ｃで２時間、接着させた。非接着細胞を除去し、そして接着細胞をＧＭ−ＣＳＦ（１ミリリットルあたり１００ナノグラム）およびＩＬ−４（１ミリリットルあたり２５ナノグラム）を補充したＣＭ中で培養した。ＤＣは新しいＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４培地を２日毎に加えることにより供給した。５日目に、未成熟単球由来樹状細胞（ＭＭＤＤＣ）を回収し、そしてＰＢＳで洗浄し、次いで４度Ｃで３０分間、ＣＤ１１ｃ−ＡＰＣで標識した。
【００７２】
殺した腫瘍細胞を標識したＭＤＤＣと１：１の比率で３７度Ｃでコーインキュベーションした。３時間のコーインキュベーション後、細胞は０．０５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡ  ＰＢＳ溶液に５分間懸濁して、細胞−細胞結合を破壊した。ＣＤ１１ｃ＋ＤＣを分類し、ｓＣＤ４０Ｌ（１ミリリットルあたり２００ナノグラム）で２４時間成熟させ、そしてナイーブなＣＤ８＋Ｔ細胞を感作するために使用した。
【００７３】
樹状細胞による腫瘍体の食作用の確認。殺した腫瘍細胞が未成熟ＭＤＤＣにより捕捉されたことを確認するために、殺した腫瘍細胞をＤＮＡ特異的色素、７ＡＡＤで３０分間、４度Ｃで染色し、次いでＣＤ１１ｃ−ＡＰＣ標識未成熟ＭＤＤＣと異なる比率（３：１、１：１または１：３）で４度Ｃまたは３７度Ｃのいずれかでコーインキュベーションした。２時間の培養後、殺した腫瘍体のＤＣによる食作用は、全ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ群における二重−ポジティブＤＣ（すなわちＣＤ１１ｃに＋７ＡＡＤ＋）の割合としてＦＡＣＳにより証明された（データは示さず）。また殺した腫瘍体のＤＣによるインターナリゼーションも、共焦点顕微鏡により確認された。簡単に説明すると、ＤＣと腫瘍体との共存培養混合物をポリ−リシンを被覆したスライドに乗せ（バクスター  ダイアグノスティック（Ｂａｘｔｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、ディアフィールド、イリノイ州）、４％パラホルムアルデヒドで固定し、そして０．５％サポニン／０．２％ＢＳＡ／０．２％ゼラチン溶液で透過した。ｇｐ１００モノクローナル抗体（ＮＫＩ／ｂｅｔｅｂ、バイオデザイン  インターナショナル（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、サコ、メリーランド州）およびＣＤ１ａ−ＦＩＴＣ結合ｍＡｂを使用して、腫瘍体およびＤＣを各々同定した。細胞質中で起こるＣＤ１ａ＋標識ＭＤＤＣのｇｐ１００染色は、殺した腫瘍体がＭＤＤＣにより捕捉されたことの指標であった（データは示さず）。
【００７４】
実施例７．ナイーブなＣＤ８＋Ｔ細胞の精製および感作。熱ショックをかけて殺した腫瘍細胞を装填した単球由来樹状細胞（ＭＤＤＣ）が、ナイーブなＣＤ８＋Ｔリンパ球を感作する能力を調査した。
【００７５】
ＣＤ８＋Ｔ細胞は、マウス抗ヒトＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ５６、ＣＤ１９およびグリコホリン（ｇｌｙｃｏｐｈｏｒｉｎ）Ａマイクロビーズ（ミルテニー  バイオテック社（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｉｎｃ．）、オーバン、カリフォルニア州）を使用して他の細胞の除去（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）よりＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋の健康なドナーのＰＢＭＣから濃縮した。除去の実行はＡｕｔｏＭＡＣＳシステム（ミルテニー  バイオテック社）により行った。濃縮したＣＤ８＋Ｔ細胞は抗−ＣＤ２７−ＦＩＴＣ、ＣＤ４５ＲＡ−ＰＥ、ＣＤ８−ＱＲおよびＣＤ４５ＲＯ−ＡＰＣで染色し、そしてＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２７ＣＤ４５ＲＯ−ナイーブＴ細胞で染色した（＞９５％純度）。ナイーブなＴ細胞を、１週目は１０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−７を、そして２週目はＩＬ−２を１０：１比で補充した成熟した非装填ＤＣまたは装填ＤＣと共存培養した。Ｔ細胞は７日目に再刺激した。
【００７６】
実施例８．５１Ｃｒ放出アッセイ。標的細胞はＮａ５１ＣｒＯ４で１時間、３７度Ｃで標識した。Ｔ２細胞には４種のメラノーマペプチド（ｇｐ１００、Ｔｙｒ、ＭＡＲＴ１およびＭＡＧＥ３）を３時間パルスさせた後に標識した。４時間の標準致死アッセイは以前に記載されたように行った（Ｐａｃｚｅｓｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。簡単に説明すると、エフェクター細胞（３０ｘ１０３／ウェル）を９６ウェルの丸底プレートに５１Ｃｒ標識標的細胞と一緒に播いた。４時間後、上清は回収フレームを使用して回収し、そしてクロムで標識したタンパク質をγ−カウンター（パッカード  インスツルメンツ社（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏ）、メリデン、コネチカット州、米国）を使用して測定した。次いで抗原特異的溶解の割合を決定した。
【００７７】
ブロッキングに関しては、５１Ｃｒ標識標的を１ミリリットルあたり１０マイクログラムの精製されたマウス抗ヒトＨＬＡ−ＡＢＣ  ｍＡｂ（クローンＷ６／３２、ＤＡＫＯ、カルピンテリア、カリフォルニア州）、またはＨＬＡ−ＤＲ  ｍＡｂ（クローンＧ４６−６、ＢＤ  バイオサイエンス  ファミンゲン（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、サンディエゴ、カリフォルニア州）、または対合するマウスＩｇＧアイソタイプ（クローンＧ１５５−１７８またはＧ４６−６、ＢＤ  バイオサイエンス  ファミンゲン）と、９６ウェルプレート中で３０分間コーインキュベーションし、次いでＴ細胞を４時間の標準致死アッセイに加えた。各サンプルについて３連ウェルの平均を算出し、そして特異的な５１Ｃｒ放出の割合を以下の式に従い決定した：
【００７８】
【数１】
0005623004.tif 000003
【００７９】
実施例９．腫瘍退縮アッセイ。腫瘍細胞系は以前に記載され（Ｐａｃｚｅｓｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、そして実施例２で簡単に提示したようにＥＧＦＰをコードするレンチウイルスベクターでトランスフェクトした。細胞系を５ｘ１０４細胞／ｍｌの濃度で、１０％ＡＢ血清を含有するＲＰＭＩ１６４０培地と懸濁した。感作したＴ細胞系を１０６細胞／ｍｌで懸濁した。標的およびＴ細胞は、９６ウェルのＵ底プレート中に全容量２００マイクロリットルで、０時間、４時間、２４時間、４８時間および７２時間、コーインキュベーションした。各時点で、細胞混合物を回収し、そして０．０５％トリプシン／０．０２％ＥＤＴＡ  ＰＢＳ溶液で５分間処理した。細胞ペレットをＰＥ−結合ＣＤ８ｍＡｂで染色し、そしてＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ（商標）（ベクトン  デッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、サン  ホセ、カリフォルニア州）を使用して分析した。各サンプルについて、５０，０００個の細胞を得た。全集団（ゲートなし）中のＥＧＦＰ＋集団（ゲートＲ１）の割合は、ＣＥＬＬＱｕｅｓｔ（商標）ソフトウェア（ベクトン  デッキンソン）により定量した。腫瘍の増殖率は以下の式を使用して算出した：
【００８０】
【数２】
0005623004.tif 000004
【００８１】
０時間の腫瘍の増殖率を１００％と定めた。光学顕微鏡を使用して生きている細胞を計数するために、トリパンブルー排除を使用した。
【００８２】
実施例１０．四量体の染色。ｉＴＡｇＴＭＭＨＣ四量体：ＨＬＡ−Ａ０２０１／ｇｐ１００（ＩＭＤＱＶＰＦＳＶ）、ＨＬＡ−Ａ０２０１／ＭＡＧＥ３（ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ）、ＨＬＡ−Ａ０２０１／チロシナーゼ（ＹＭＤＧＴＭＳＱＶ）、およびＨＬＡ−Ａ０２０１／ＭＡＲＴＩ（ＥＬＡＧＩＧＩＬＴＶ）ペプチド四量体は、ベックマン−コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）から購入した。感作したＴ細胞系は、ＰＥ−結合四量体で３０分間染色し、そしてＰｅｒＣＰ−もしくはＦＩＴＣ結合抗ＣＤ８ｍＡｂでさらに３０分間、室温で染色した。細胞はフローサイトメトリーで分析した。
【００８３】
実施例１１．リコールアッセイ（Ｒｅｃａｌｌ  Ａｓｓａｙ）。メラノーマ体を装填したＤＣで２回刺激した後、ＣＤ８Ｔ細胞はペプチドを適用したオートロガスＤＣと１０：１の比率で播いた。Ｔ細胞はメラノーマ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度について７日後の培養物を分析した。
【００８４】
実施例１２．メラノーマ特異的ＣＴＬの交差感作。図２に具体的に説明するように、未成熟ＤＣは、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４と培養することによりＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋の健康なボランティアに由来する単球から産出した。メラノーマ細胞系は４時間、４２度Ｃ（熱ショック）でインキュベーションした後に殺した。メラノーマ体は、実施例４に与え、そして以前に記載されたように（Ｂｅｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、非加熱（低温メラノーマ体）または加熱（高温メラノーマ体）メラノーマ細胞のいずれかから、ベツリン酸（ＢＡ）を用いた２４時間の処理により産出した。これらの殺した腫瘍細胞を未成熟ＭＤＤＣと１：１の比率で３時間、共存培養して低温メラノーマ体を装填したＤＣおよび高温メラノーマ体を装填したＤＣを実施例６に記載したように産出した。非装填ＤＣ、低温メラノーマ体を装填したＤＣ、および高温メラノーマ体を装填したＤＣを分類し、そして精製したＣＤ８＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２７＋ＣＤ４５ＲＯ−ナイーブＴ細胞と培養した。ＤＣ／Ｔ細胞（１：１０比率）の共存培養には、可溶性ＣＤ４０リガンド（１ミリリットルあたり２００ナノグラム）、ＩＬ−７（培養を通して１０Ｕ／ｍｌ）、および２週目のＩＬ−２（１０Ｕ／ｍｌ）を補充した。細胞は外に示さない限り抗原を装填したＤＣで１回、再刺激した。２回目の刺激から７日後、４時間の５１Ｃｒ放出アッセイならびにメラノーマ特異的エフェクターＴ細胞の頻度で検出されるように、細胞を回収して細胞傷害性致死活性を検出した。実施例７で示したこの工程は、非装填ＤＣ（ＣＴＬｕｎ）、低温メラノーマ体を装填したＤＣ（ＣＴＬｃｏｌｄ）および高温メラノーマ体を装填したＤＣ（ＣＴＬｈｏｔ）で感作されたＴ細胞を生じた。
【００８５】
実施例１３：高温メラノーマ体を装填したＤＣは、４時間の５１Ｃｒ放出アッセイでメラノーマ細胞を殺すことができるＣＴＬを急速に生じる。以前にナイーブなＣＤ８＋Ｔ細胞
はメラノーマ特異的ＣＴＬに分化するために低温メラノーマ体を装填したＤＣでの３回の刺激を要する（Ｂｅｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）ことが報告された。したがって高温メラノーマ体を装填することが装填したＤＣの免疫原性を強化するかどうかに取り組むために、２回の刺激後のＣＴＬ分化を測定した。図３Ａ〜３Ｃに示すように、高温メラノーマ体を装填したＤＣで２回刺激したＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、メラノーマ体の供給源として使用したＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋Ｍｅ２７５メラノーマ細胞を、３０：１のＥ：Ｔで３３％±３の特異的溶解で殺すことができた（ｎ＝３、図３Ａ）。この致死はＫ５６２細胞の溶解が見られなかったので特異的であった。予想どおり、低温メラノーマ体を装填したＤＣで２回刺激したＣＤ８＋Ｔ細胞は、メラノーマ細胞を殺すことができなかった（図３Ａ）。さらに２回の刺激の後、高温Ｍｅ２７５メラノーマ体を装填したＤＣで感作したＣＤ８＋Ｔ細胞はＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋Ｍｅ２９０メラノーマ細胞を殺すことができ（ｎ＝３、図３Ｂ）、これら２つのメラノーマ細胞系の間で共有される抗原に対する感作が示唆された。メラノーマ細胞を殺すことは、標的細胞をＭＨＣクラスＩブロッキングｍＡｂ  Ｗ６／３２を用いて前処理することにより、異なるＥ：Ｔ比率でＭｅ２７５およびＭｅ２９０の致死＞６０％阻害を生じるので（Ｗ６／３２ｍＡｂ無しでは１５：１のＥ：Ｔ比率で１５％の溶解、そしてＷ６／３２ｍＡｂ有りでは４％の溶解、図３Ｃ、データは示さず）、それらのＭＨＣクラスＩの発現により制限される。
【００８６】
さらにＨＬＡ−Ａ＊０２０１ｎｅｇＳｋ−Ｍｅｌ２８メラノーマ細胞から誘導された高温メラノーマ体を装填したＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋ＤＣは、低い効率であるがＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋Ｓｋ−Ｍｅｌ２４メラノーマ細胞を殺すことができるＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導した（３０：１のＥ：Ｔ比率で１６％の特異的溶解、図４）。これらの結果は共通するメラノーマ抗原に対する交差感作を示す。すなわち２回の刺激がナイーブなＣＤ８＋Ｔ細胞の、メラノーマ細胞系を殺すことができるＣＴＬへの分化を誘導するに十分であるので、高温メラノーマ体のＤＣへの装填はそれらの免疫原性を強化する。
【００８７】
実施例１４．高温メラノーマ体を装填したＤＣは、メラノーマ細胞の生存／増殖を制御することができるＣＴＬを急速に生じる。本発明者は腫瘍退縮アッセイ（ＴＲＡ）が、再発を防止するＴ細胞能の尺度として役立つ腫瘍の生存／増殖のＴ細胞依存的阻害の検出を可能にすることを示した（Ｐａｃｚｅｓｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。したがってＴＲＡは高温メラノーマ体を装填したＤＣの強化された免疫原性の別の尺度として使用された。このために、低温または高温メラノーマ体を装填したＤＣを含む培養物に由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＥＧＦＰ標識メラノーマ細胞と（２０：１のＥ：Ｔ比率で）共存培養し、そして培養物を異なる時点で回収し、抗ＣＤ８−ＰＥで標識し、そしてフローサイトメトリーにより分析した。
【００８８】
図５Ａ〜５Ｄは、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋Ｍｅ２９０メラノーマ細胞に対して２週間の培養で感作したＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋Ｔ細胞を、それらがＭｅ２９０メラノーマおよび対照Ｋ５６２細胞の生存／増殖を阻害する能力について試験した代表的な実験を示す。予想どおり、低温Ｍｅ２９０体で感作したＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｍｅ２９０増殖の制御にそれほど効率的ではなかった。実際に４時間の共存培養後、ＥＧＦＰ＋（生存）メラノーマ細胞の画分は共存培養の開始と比べてほぼ同一であった（図５Ａ）。２４時間後、約２０％の減少が生存メラノーマ細胞の画分で観察された（図５Ａ）。対照的に、高温メラノーマ体を装填したＤＣで感作したＣＤ８＋Ｔ細胞は、Ｍｅ２９０細胞の生存／増殖の制御に大変効率的であった（図５Ｂ）；４時間の培養後、ＥＧＦＰ＋メラノーマ細胞の画分は＞８０％減少し、そして共存培養の４８時間にわたり低いままであった。ＮＫ−感受性Ｋ５６２細胞の生存／増殖は変化しなかったので、生存腫瘍細胞の画分において観察された減少はメラノーマに特異的であった（図５Ｃ）。
【００８９】
メラノーマ細胞系に特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の感作は、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋Ｍｅ２
７５メラノーマ細胞に対して感作したＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞がＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋Ｍｅ２９０メラノーマ細胞の増殖を阻害する能力によりさらに確認した（図５Ｄ）。すなわちメラノーマ細胞の生存／増殖はトリパンブルー排除および光学顕微鏡を使用した生存細胞の計数により測定した。３回の実験ではＭｅ２９０メラノーマ細胞の増殖／生存の制御において、高温Ｍｅ２７５メラノーマ体を装填したＤＣで感作したＣＤ８＋Ｔ細胞が低温Ｍｅ２７５体を装填したＤＣよりもかなり効率的であった（図５Ｄ）。すなわちナイーブなＣＤ８＋Ｔ細胞の、メラノーマ細胞系の増殖／生存を制御することができるＣＴＬへの分化を誘導するためにわずか２回の刺激が必要であるので、ＤＣに高温メラノーマ体を装填することはそれらの免疫原性を強化する。
【００９０】
実施例１５．高温メラノーマ体を装填したＤＣは、メラノーマ分化抗原由来ペプチドを認識することができるＣＴＬを急速に生じる。さらに高温体を装填したＤＣで感作したＣＤ８＋Ｔ細胞がメラノーマ分化抗原：ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ、ｇｐ１００、チロシナーゼおよびＭＡＧＥ−３に特異的であるかどうかについても決定された。Ｔ細胞の特異性は２つのアッセイでＴ２細胞上に提示されるメラノーマペプチドを認識するそれらの能力により評価された：１）分化抗原から誘導された４種のメラノーマペプチドの混合物でパルスされた５１Ｃｒ標識Ｔ２細胞と４時間共存培養した後の５１Ｃｒ放出、および２）ＴＲＡにおけるメラノーマペプチドでパルスされたＥＧＦＰ発現Ｔ２細胞の生存。高温ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋Ｍｅ２９０メラノーマ体で感作したＣＤ８＋Ｔ細胞は、４０：１のＥ：Ｔ比率で５１Ｃｒ放出アッセイにおいてメラノーマ−ペプチドでパルスされたＴ２細胞を４０％の特異的溶解で殺すことができることが分かった（図６Ａ）。この致死は、対照ＰＳＡペプチドでパルスされたＴ２細胞が殺されなかったので特異的であった。予想どおり低温Ｍｅ２９０メラノーマ体を装填したＤＣで感作したＣＤ８＋Ｔ細胞は、ペプチドでパルスされたＴ２細胞を殺すことができず（図６Ａ）、３回の刺激が必要であるという我々の以前の考察と一致した（Ｂｅｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。メラノーマ分化抗原特異的Ｔ細胞の誘導は、さらに交差感作実験で確認した。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１ｎｅｇＳｋ−Ｍｅｌ２８細胞から誘導された高温メラノーマ体を装填したＤＣで２回刺激した。図６Ｂに示すように、感作したＣＤ８＋Ｔ細胞はメラノーマ−ペプチドでパルスされたＴ２細胞を４８％±８の特異的溶解で殺したが（４０：１のＥ：Ｔ比率、ｎ＝３）、ＰＳＡペプチドでパルスされたＴ２細胞を殺さず、これは交差感作を示す。
【００９１】
感作したＣＤ８＋Ｔ細胞がメラノーマ抗原を認識する能力も、腫瘍退縮アッセイで確認した。装填したＤＣでの２週間の培養に由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を、対照ＰＳＡペプチドでパルスしないか、またはでパルスされた、あるいは４種のメラノーマペプチドの混合物でパルスされたいずれかのＥＧＦＰ発現Ｔ２細胞と共存培養した。Ｔ２細胞の生存は種々の時点で、フローサイトメトリーにおけるＥＧＦＰ＋細胞の画分として測定した。図６Ｅに示すように、感作したＣＤ８＋Ｔ細胞はすでに４時間の共存培養後にＥＧＦＰ＋メラノーマペプチドでパルスされたＴ２細胞の画分にかなりの低下（約７０％）を誘導し、そしてＥＧＦＰ＋Ｔ２細胞の画分は４８時間の共存培養にわたり低いままであった。対照Ｔ２細胞の生存（パルスされないかまたはＳＰＡでパルスされたのいずれか）は変化しなかったので、この効果は特異的であった（それぞれ図６Ｃおよび６Ｄ）。ＦＡＣＳデータに従い、ペプチドでパルスされたＴ２−ＥＧＦＰ細胞の増殖率は、以下の式を使用することにより算出した：
【００９２】
【数２】
0005623004.tif 000005
【００９３】
式中、０時間での腫瘍増殖率を１００％と定めた。図６Ｆに示すように、高温メラノーマ体を装填したＤＣで感作したＣＤ８＋Ｔ細胞は、低温メラノーマ体を装填したＤＣで感作した細胞よりもさらに一層効率的であったが、低温メラノーマ体装填ＤＣで感作したＣＤ８＋Ｔは、３回の独立した実験でメラノーマペプチドでパルスされたＴ２細胞の生存／増殖を制御することができなかった。このようにＤＣに高温メラノーマ体を装填することは、それらの免疫原性を強化し、そしてナイーブなＣＤ８＋Ｔ細胞のメラノーマ特異的ＣＴＬへの分化を誘導するために２回の刺激で十分であった。
【００９４】
実施例１６．高温メラノーマ体を装填したＤＣは、ＣＤ８＋Ｔ細胞に結合するメラノーマ四量体を即座に生じる。メラノーマ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度は、４種のメラノーマペプチド、すなわちｇｐ１００、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ、チロシナーゼおよびＭＡＧＥ−３を装填した４量体を使用して測定した。図７Ａ−７Ｃは四量体染色の代表的パターンを示す。高温ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋Ｍｅ２９０メラノーマ体装填ＤＣで２回刺激した後、０．４％のでＣＤ８＋Ｔ細胞はＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡに対して特異的であった（図７Ａ）。しかし他の特異性は分析に関する５ｘ１０５Ｔ細胞の取得ではほとんど検出することができず、Ｔ細胞がＭＡＲＴ−１に対してのみ感作されたか、または誘導されたレパートリーは広かったが所定のペプチドに関する頻度は低く、したがって特定の特異性を持つＴ細胞を検出することを難しくしているかのいずれかを示す。
【００９５】
これに取り組むため、リコール記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞（すなわち定めたペプチドでパルスされたＤＣでの１回の再刺激が発現に必要なＴ細胞）の存在を分析した。上記のように、ナイーブなＣＤ８＋Ｔ細胞を２週間の培養で高温Ｍｅ２９０メラノーマ体を装填したＤＣで感作した。２回目の刺激から７日後、Ｔ細胞を洗浄し、各４種のいずれかのメラノーマペプチドを、または対照ＰＳＡペプチドでパルスされたオートロガスＤＣで再刺激し、そしてさらに７日培養した後に分析した。図７Ｂに示すように、ＣＤ８＋Ｔ細胞に結合するメラノーマ四量体の頻度は、ＰＳＡペプチドでパルスされたＤＣで再刺激した後に安定なままであった。しかしメラノーマペプチドでパルスされたＤＣでの追加免疫でメラノーマ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の拡大がもたらされた（図７Ｃ）。このようにＣＤ８＋Ｔ細胞に結合するＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡの頻度は１．４９％まで上昇し、そして他の特異性を有するＴ細胞が明らかに検出可能となった：０．３５％のＭＡＧＥ−３特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞、０．２５％のｇｐ１００特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞および０．１６％のチロシナーゼ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞。
【００９６】
同様の結果が、高温ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋Ｍｅ２９０メラノーマ細胞に対して感作したＣＤ８＋Ｔ細胞を用いた実験、ならびにＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋Ｔ細胞がＨＬＡ−Ａ＊０２０１ｎｅｇＳｋ−Ｍｅｌ２８メラノーマ細胞に対して感作された交差感作の状況の２つで得られた（表Ｉ）。後者の場合、メラノーマ体を装填したＤＣにより感作され、そしてメラノーマペプチドでパルスされたＤＣでの追加免疫により拡大したリコール記憶Ｔ細胞は、明らかにＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ、チロシナーゼおよびＭＡＧＥ−３に対して優勢な特異性で検出可能であった（表Ｉ）。最後に両方の場合で、Ｔ細胞がＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋Ｍｅ２９０メラノーマ体で感作されているか、またはＨＬＡ−Ａ＊０２０１ｎｅｇＳｋ−Ｍｅｌ２８メラノーマ体で感作されていても、高温体を装填したＤＣは低温体を装填したＤＣよりもメラノーマ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の感作においてさらに一層効率的であった（表Ｉ）。
【００９７】
【表２】
0005623004.tif 000006
【００９８】
実施例１７．熱処理は、腫瘍抗原をコードする遺伝子の転写のアップレギュレーションを介して交差感作を上昇させる。熱処理が腫瘍抗原をコードする遺伝子の転写に及ぼす効果を、リアルタイム逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析を使用して調査した。
【００９９】
目的とする所定の細胞系について、全ＲＮＡをＲＮｅａｓｙキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、バレンシア、カリフォルニア州）を使用して製造元の使用説明に従い抽出し、そしてＡｇｉｌｅｎｔ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（アギレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）、パロ  アルト、カリフォルニア州）を使用して評価した。ＲＮＡはＴＵＲＢＯ  ＤＮＡ−フリーキット（アンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）、オースチン、テキサス州）を用いて２回目のＤＮａｓｅ処理にかけた。１００ナノグラムのＲＮＡから、ｃＤＮＡをＴｗｏ−Ｃｙｃｌｅ  ｃＤＮＡ合成キットを使用して合成し（アフィメトリックス社（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．）、サンタクラーラ、カリフォルニア州）、続いてインビトロ転写にかけた（ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７キット、アンビオン社）。２工程のＲＴ−ＰＣＲは、アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のＴａｑＭａｎ  Ａｓｓａｙ  ｏｎ  Ｄｅｍａｎｄプローブおよびプライマーの組を使用して製造元の使用説明に従い行った（アプライドバイオシステムズ社、フォスターシティ、カリフォルニア州）。逆転写は、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ａｒｃｈｉｖｅキット（アプライドバイオシステムズ）を使用して行った。リアルタイムＰＣＲは、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７７００Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍで行った。相対的なｍＲＮＡ発現を、アフィメトリックスユーザーニュースレター（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕｓｅｒ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ）＃２（２００１年１０月更新）に記載されている比較用Ｃｔ法を使用して算出した。結果は未処理メラノーマ細胞に対して熱処理メラノーマ細胞に関するＣｔにおいて標準化された差異として算出した（ΔΔＣｔ，ｑ）。
【０１００】
実験の結果は図９Ａ−９Ｆに与える。ＭＡＧＥ−Ｂ３（図９Ａ）、ＭＡＧＥ−Ｂ４（図９Ｃ）、またはＭＡＧＥ−Ａ８（図９Ｅ）のｍＲＮＡ発現のリアルタイム分析前に、ＳｋＭｅｌ２８細胞は加熱しなかったか（「非」）；４２度Ｃで４時間加熱したか（「４時間加熱」）；４２度Ｃで４時間の熱処理中にアクチノマイシンＤ（既知の転写インヒビター）に暴露されたか（「加熱プラスＡＤ」）；対照ベクターＥＧＦＰでトランスフェクトされたか（「ＥＧＦＰ」）；またはベクター発現ＨＳＰ７０でトランスフェクトされた（「ＨＳＰ７０」）。加熱処理細胞に対して非加熱細胞を比べると、腫瘍抗原ＭＡＧＥ−Ｂ３、ＭＡＧＥ−Ｂ４およびＭＡＧＥ−Ａ８の転写の明らかなアップレギュレーションが熱処理後に観察された。アクチノマイシンＤの添加はアップレギュレーションを阻害し、転写調節を確認した。ＨＳＰ７０の過剰発現はメラノーマ抗原の転写を増加させなかった。類似の結果がＭｅ２９０細胞系で得られた。細胞はＭＡＧＥ−Ｂ３（図９Ｂ）、ＭＡＧＥ−Ｂ４（図９Ｄ）、またはＭＡＧＥ−Ａ８（図９Ｆ）のｍＲＮＡ発現のリアルタイム分析前に、加熱しなかったか（「非」）；４２度Ｃで４時間加熱したか（「４時間加熱」）；４２度Ｃで４時間の熱処理中にアクチノマイシンＤ（既知の転写インヒビター）に暴露されたか（「加熱プラスＡＤ」）のいずれかであった。加熱処理細胞に対して非加熱細胞を比べると、腫瘍抗原ＭＡＧＥ−Ｂ３、ＭＡＧＥ−Ｂ４およびＭＡＧＥ−Ａ８の転写の明らかなアップレギュレーションが熱処理後に観察された。アクチノマイシンＤの添加はアップレギュレーションを阻害し、転写調節を確認した。すなわち加熱処理または高体温（ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ）は、メラノーマ抗原をコードする遺伝子の転写のアップレギュレーションを介して交差感作を上昇させた。
【０１０１】
まとめると、本発明による方法に従いメラノーマ細胞死の誘導前にメラノーマ細胞の熱処理、およびＤＣワクチンに装填されるメラノーマ体の生成（ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）は、そのようなＤＣワクチンの免疫原性にかなりの増強をもたらす。増強された免疫原性、すなわちそのような治療に対する患者の応答は、ナイーブなＣＤ８＋Ｔ細胞の感作を測定する幾つかのアッセイで容易に検出することができる：ｉ）ナイーブなＣＤ８＋Ｔ細胞の分化に必要な装填されたＤＣでの刺激数；ｉｉ）標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイにおいて、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１メラノーマ細胞の致死、ｉｉｉ）腫瘍退縮アッセイにおいてインビトロで腫瘍増殖を防止する能力、ｉＶ）メラノーマペプチド適用Ｔ２細胞の致死、およびｖ）メラノーマ四量体の結合。すべてのアッセイで、加熱したメラノーマ体を装填したＤＣは、非加熱または低温のメラノーマ体を装填したＤＣに優る。これらの結果は加熱したメラノーマ細胞がＤＣワクチンに装填されるメラノーマ抗原の供給源として使用される場合に、感作したＴ細胞の量だけでなく質も優れていることを示唆している。ＤＣに基づく、またはＴ細胞に基づく腫瘍免疫治療について、本発明の方法の臨床的応用は、１）養子Ｔ細胞療法のプロトコールにＴ細胞の顕在化／拡大に必要な時間を短くするために、そして２）ＤＣに基づく免疫療法のプロトコールにおける注射あたりのＤＣの数および／またはＤＣ注射の回数を制限するために、本発明のＤＣワクチンの増大した免疫原性の使用を含む。
【０１０２】
本発明で使用することができるさらなるヒト腫瘍細胞系の例は、例えば以下を含む：
表ＩＩ．癌細胞
細胞系                        腫瘍型
Ｊ８２                        移行性−細胞癌腫、膀胱
ＲＴ４                        移行性−細胞乳頭腫、膀胱
ＳｃａＢＥＲ                    鱗状癌腫、膀胱
Ｔ２４                          移行性−細胞癌腫、膀胱
ＴＣＣＳＵＰ                    移行性−細胞癌腫、膀胱，１次段階ＩＶ
５６３７                        癌腫、膀胱、１次  
ＳＫ−Ｎ−ＭＣ                  神経芽腫、眼窩上の領域への転移
ＳＫ−Ｎ−ＳＨ                  神経芽腫、骨髄への転移
ＳＷ１０８８                    星状細胞腫
ＳＷ１７８３                    星状細胞腫
Ｕ−８７  ＭＧ                  多形グリア芽腫、星状細胞腫、段階ＩＩＩ
Ｕ−１１８  ＭＧ                多形グリア芽腫
Ｕ−１３８  ＭＧ                多形グリア芽腫
Ｕ−３７３  ＭＧ                多形グリア芽腫、星状細胞腫、段階ＩＩＩ
Ｙ７９                          網膜芽腫
ＢＴ−２０                      癌腫、乳房
ＢＴ−４７４                    腺癌腫、乳房
ＭＣＦ７                        乳房腺癌、胸水
ＭＤＡ−ＭＢ−１３４−Ｖ        乳房、腺管癌（ｄｕｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍ    
ａ）、
胸膜Ｉ滲出
ＭＤＡ−ＭＤ−１５７            乳房髄質、癌腫、胸水
ＭＤＡ−ＭＢ−１７５−Ｖ        乳房、腺管癌（ｄｕｃｔａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍ    
ａ）、
胸膜ＩＩ
滲出
ＭＤＡ−ＭＢ−３６１            腺癌、乳房、脳への転移
ＳＫ−ＢＲ−３                  腺癌、乳房、悪性胸水
Ｃ−３３Ａ                      癌腫、頚  
ＨＴ−３                        癌腫、頚、リンパ節への転移
ＭＥ−１８０                    類表皮癌、頚、網への転移
ＭＥＬ−１７５                  メラノーマ  
ＭＥＬ−２９０                  メラノーマ
ＨＬＡ−Ａ＊０２０１            メラノーマ細胞
ＭＳ７５１                      類表皮癌、頚、リンパ節への転移
ＳｉＨａ                        鱗状癌腫、頚
ＪＥＧ−３                      絨毛癌、
Ｃａｃｏ−２                    腺癌、結腸
ＨＴ−２９                      腺癌、結腸、穏やかに十分分化した段階ＩＩ
ＳＫ−ＣＯ−１                  腺癌、結腸、腹水
ＨｕＴｕ８０                    腺癌、十二指腸
Ａ−２５３                      類表皮癌、顎下腺
ＦａＤｕ                        鱗状細胞癌腫、咽頭
Ａ−４９８                      癌腫、腎臓
Ａ−７０４                      腺癌、腎臓  
Ｃａｋｉ−１                    澄んだ細胞癌腫、腎性原始に一致、皮膚への転移
Ｃａｋｉ−２                    澄んだ細胞癌腫、腎性原始に一致
ＳＫ−ＮＥＰ−１                ウィルムス腫瘍、胸水
ＳＷ８３９                      腺癌、腎臓
ＳＫ−ＨＥＰ−１                腺癌、肝臓、腹水
Ａ−４２７                      癌腫、肺
Ｃａｌｕ−１                    類表皮癌段階ＩＩＩ、肺、胸膜への転移
Ｃａｌｕ−３                    腺癌、肺、胸水
Ｃａｌｕ−６                    未分化癌、恐らく肺
ＳＫ−ＬＵ−１                  腺癌、不十分な分化と一致、段階ＩＩＩ
ＳＫ−ＭＥＳ−１                鱗状癌腫、肺、胸水
ＳＷ９００                      鱗状細胞癌腫、肺
ＥＢ１                          バーキットリンパ腫、上顎骨
ＥＢ２                          バーキットリンパ腫、卵巣
Ｐ３ＨＲ−１                    バーキットリンパ腫、腹水
ＨＴ−１４４                    悪性メラノーマ、皮下組織への転移
Ｍａｌｍｅ−３Ｍ                悪性メラノーマ、肺への転移
ＲＰＭＩ−７９５１              悪性メラノーマ、リンパ節への転移
ＳＫ−ＭＥＬ−１                悪性メラノーマ、リンパ系への転移
ＳＫ−ＭＥＬ−２                悪性メラノーマ、大腿の皮膚への転移
ＳＫ−ＭＥＬ−３                悪性メラノーマ、リンパ節への転移
ＳＫ−ＭＥＬ−５                悪性メラノーマ、腋窩節への転移
ＳＫ−ＭＥＬ−２４              悪性メラノーマ、節への転移
ＳＫ−ＭＥＬ−２８              悪性メラノーマ
ＳＫ−ＭＥＬ−３１              悪性メラノーマ
Ｃａｏｖ−３                    腺癌、卵巣、１次に一致
Ｃａｏｖ−４                    腺癌、卵巣、ファローピウス管の漿膜下組織への転移ＳＫ−ＯＶ−３                  腺癌、卵巣、悪性腹水
ＳＷ６２６                      腺癌、卵巣
Ｃａｐａｎ−１                  腺癌、膵臓、肝臓への転移  
Ｃａｐａｎ−２                  腺癌、膵臓、
ＤＵ１４５                      癌腫、前立腺、脳への転移
Ａ−２０４                      横紋筋肉腫
Ｓａｏｓ−２                    骨原性肉腫、１次  
ＳＫ−ＥＳ−１                  未分化骨肉腫  対  スイング肉腫、骨
ＳＫ−ＬＮＳ−１                平滑筋肉腫、外陰部、１次  
ＳＷ６８４                      繊維肉腫
ＳＷ８７２                      脂肪肉腫
ＳＷ９８２                      腋窩滑液肉腫
ＳＷ１３５３                    軟骨肉腫、上腕骨
Ｕ−２ＯＳ                      骨原性肉腫、骨１次
Ｍａｌｍｅ−３                  皮膚繊維芽細胞  
ＫＡＴＯＩＩＩ                  胃癌腫
Ｃａｔｅ−１Ｂ                  胎生期癌、精巣、リンパ節への転移
Ｔｅｒａ−１                    胎生期癌、肺への転移と一致する悪性
Ｔｅｒａ−２                    胎生期癌、肺への転移と一致する悪性
ＳＷ５７９                      甲状腺癌腫  
ＡＮ３  ＣＡ                    子宮内膜腺癌、転移性
ＨＥＣ−１−Ａ                  子宮内膜腺癌
ＨＥＣ−１−Ｂ                  子宮内膜腺癌
ＳＫ−ＵＴ−１                  子宮、混合中胚葉腫瘍、平滑筋肉腫段階ＩＩＩと一致ＳＫ−ＵＴ−１Ｂ                子宮、混合中胚葉腫瘍、平滑筋肉腫段階ＩＩＩと一致Ｓｋ−Ｍｅｌ２８                メラノーマ
ＳＷ９５４                      鱗状細胞癌腫、外陰部
ＳＷ９６２                      癌腫、外陰部、リンパ節転移
ＮＣＩ−Ｈ６９                  小細胞癌腫、肺
ＮＣＩ−Ｈ１２８                小細胞癌腫、肺
ＢＴ−４８３                    腺管癌、乳房
ＢＴ−５４９                    腺管癌、乳房
ＤＵ４４７５                    転移性皮膚小節、乳房癌腫
ＨＢＬ−１００                  乳房
Ｈｓ５７８Ｂｓｔ                乳房、正常
Ｈｓ５７８Ｔ                    腺管癌、乳房
ＭＤＡ−ＭＢ−３３０            癌腫、乳房
ＭＤＡ−ＭＢ−４１５            腺癌、乳房  
ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ          腺管癌、乳房
ＭＤＡ−ＭＢ−４３６            腺癌、乳房
ＭＤＡ−ＭＢ−４５３            癌腫、乳房
ＭＤＡ−ＭＢ−４６８            腺癌、乳房
Ｔ−４７Ｄ                      腺管癌、乳房、胸水
Ｈｓ７６６Ｔ                    癌腫、膵臓、リンパ節への転移
Ｈｓ７４６Ｔ                    癌腫、胃、左脚への転移
Ｈｓ６９５Ｔ                    メラニン欠乏性メラノーマ、リンパ節への転移
Ｈｓ６８３                      神経膠腫
Ｈｓ２９４Ｔ                    メラノーマ、リンパ節への転移
Ｈｓ６０２                      リンパ腫、頚部
ＪＡＲ                          絨毛癌、胎盤
Ｈｓ４４５                      リンパ系、ホジキン病  
Ｈｓ７００Ｔ                    腺癌、骨盤への転移
Ｈ４                            ニューログリオーマ（ｎｅｕｒｏｇｌｉｏｍａ）、
脳
Ｈｓ６９６                      腺癌１次、未知、骨−仙骨への転移
Ｈｓ９１３Ｔ                    繊維肉腫、肺への転移
Ｈｓ７２９                      横紋筋肉腫、左脚  
ＦＨｓ７３８Ｌｕ                肺、正常胎児  
ＦＨｓ１７３Ｗｅ                全胚、正常
ＦＨｓ７３８Ｂ１                膀胱、正常胎児
ＮＩＨ：ＯＶＣＡＲ−３          卵巣、腺癌
Ｈｓ６７                        胸腺、正常
ＲＤ−ＥＳ                      ユーイング肉腫
ＣｈａＧｏ  Ｋ−１              気管支癌腫、皮下転移、ヒト
ＷＥＲＩ−Ｒｂ−１              網膜芽腫
ＮＣＩ−Ｈ４４６                小細胞癌腫、肺
ＮＣＩ−Ｈ２０９                小細胞癌腫、肺
ＮＣＩ−Ｈ１４６                小細胞癌腫、肺
ＮＣＩ−Ｈ４４１                乳頭腺癌、胚
ＮＣＩ−Ｈ８２                  小細胞癌腫、肺
Ｈ９                            Ｔ細胞リンパ腫
ＮＣＩ−Ｈ４６０                大細胞癌腫、肺
ＮＣＩ−Ｈ５９６                腺偏平上皮癌、肺
ＮＣＩ−Ｈ６７６Ｂ              腺癌、肺
ＮＣＩ−Ｈ３４５                小細胞癌腫、肺
ＮＣＩ−Ｈ８２０                乳頭腺癌、胚
ＮＣＩ−Ｈ５２０                偏平上皮癌、肺
ＮＣＩ−Ｈ６６１                大細胞癌腫、肺
ＮＣＩ−Ｈ５１０Ａ              小細胞癌腫、肺外起源、転移性
Ｄ２８３  Ｍｅｄ                髄芽種
Ｄａｏｙ                        髄芽種
Ｄ３４１  Ｍｅｄ                髄芽種
ＡＭＬ−１９３                  急性単球白血病
ＭＶ４−１１                    白血病、２形質性
【０１０３】
本明細書に記載する特定の態様は、具体的説明を示すものであり、そして本発明を限定するものではないと理解される。本発明の原理的特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく種々の態様に使用することができる。当業者は日常的な実験を行うだけで本明細書に記載する具体的手順に対する多数の均等物を認識し、または確認することができるだろう。そのような均等物は本発明の範囲内にあると考えられ、そして特許請求の範囲に網羅される。
【０１０４】
本明細書中で言及したすべての刊行物および特許出願は、本発明に関係する当業者の技
術レベルを示す。すべての刊行物および特許出願は、各々個別の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に引用により包含されるならば、それと同程度に引用により本明細書に編入される。
【０１０５】
特許請求の範囲において、「含んでなる」、「含む」、「持つ」、「有する」、「含有する」、「関与する」等のようなすべての接続句（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎａｌ  ｐｈｒａｓｅ）は、制限を設けないと理解され、すなわち含むが限定しないことを意味する。それぞれ「〜からなる」および「本質的に〜からなる」という接続句のみが閉鎖型または半閉鎖型の接続句である。
【０１０６】
本明細書に開示し、そして特許請求するすべての組成物および／または方法は、本開示に照らして過度な実験を行わなくても作成し、そして実行することができる。本発明の組成物および方法は好適な態様という意味で記載してきたが、当業者には本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく本明細書に記載する組成物および／または方法に、および方法の工程または工程の順序に変更を適用できることが明らかである。より詳細には、化学的および生理学的の両方で関連する特定の作用物質を、本明細書に記載する作用物質と置き換えることができると同時に、同じか、または類似する結果を達成することは明らかである。当業者には明白なすべてのそのような類似する置換または修飾は、添付する特許請求の範囲に定める本発明の精神、範囲および概念の中にあると見なされる。
【０１０７】
【表３】
0005623004.tif 000007
【０１０８】
【表４】
0005623004.tif 000008
【０１０９】
【表５】
0005623004.tif 000009
【０１１０】
【表６】
0005623004.tif 000010
【０１１１】
本発明の特徴および利点をより完全に理解するために、これから添付する図面と一緒に本発明の詳細な説明に対する参照を以下に作成する：
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、メラノーマ細胞系における熱ショック後のＨＳＰの発現パターンを表す。左から右に示すように、メラノーマ細胞系、ＳＫＭｅｌ２８、ＳＫＭｅｌ２４、Ｍｅ２７５、Ｍｅ２９０およびＣｏｌｏ８２９を３７度Ｃでインキュベーションし、４２度Ｃで２時間、４時間または８時間熱ショックにかけるか（本明細書では示さない）：あるいは加熱後、１０μｇ／ｍｌのベツリン酸（ＢＡ）で２４時間処理するか、または１０μｇ／ｍｌのＢＡ単独で２４時間および４８時間処理した。異なる時点で、細胞を回収し、そして冷ＰＢＳで２回洗浄した。細胞ペレットを抽出試薬で溶解した。左から右に、図１Ａおよび１Ｂは結果を示し、ここで図１Ａは熱ショックまたはＢＡ処理後のＨＳＰ７０発現を表す。ＨＳＰ７０発現はＥＬＩＳＡキットで測定した。図１Ｂは熱ショックまたはＢＡ処理後のＨＳＰ６０発現を表す。ＨＳＰ６０発現はＥＬＩＳＡキットで測定した。結果は２回の独立した実験の平均値を表す。
【図２】実施例６および７に提示する実験に関する実験計画を表す。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋単球由来樹状細胞に、非加熱（低温）または加熱処理（高温）メラノーマ体と１：１の比率で３時間装填し、ＣＤ１１ｃ発現に基づき分類し、ｓＣＤ４０Ｌで成熟させ、そしてナイーブなオートロガスＣＤ８＋Ｔ細胞を感作するために１０：１の比率で２週間の培養に使用した。
【図３】図３Ａから３Ｃは、メラノーマ細胞系を殺すことができるＣＴＬの感作を表す。代表的な細胞系はＢＡで４８時間処理するか（「低温」と示す）、または４２度Ｃで４時間の熱ショックにかけ、次いでＢＡで２４時間処理する（「高温」と示す）いずれかであった。これらのメラノーマ体を未成熟ＭＤＤＣと１：１の比率で３時間共存培養し、次いでＣＤ１１ｃ＋ＭＤＤＣを分類し、そしてｓＣＤ４０Ｌ（１ミリリットルあたり２００ナノグラム）で２４時間、成熟させた。オートロガスのナイーブなＣＤ８Ｔ細胞を、第１週の刺激のために１０：１比率で１０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−７と加え、そして７日目に刺激はＩＬ−７をＩＬ−２に代えることを除いて第１週のように反復した。７日の２回目の刺激後、Ｔ細胞を回収し、そして細胞傷害性の致死活性を標準的な４時間の５１Ｃｒ放出アッセイで検出した。図３Ａは、感作したＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞と４時間共存培養した後に、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋Ｍｅ２７５メラノーマ細胞および対照Ｋ５６２細胞からの５１Ｃｒの放出を表す。ＣＴＬｕｎ＝非装填ＤＣと２週間培養したＴ細胞、ＣＴＬｃｏｌｄ＝低温Ｍｅ２７５体を装填したＤＣと２週間培養したＴ細胞、およびＣＴＬｈｏｔ＝高温Ｍｅ２７５体を装填したＤＣと２週間培養したＴ細胞。結果は３回の実験の平均およびＳＤを表す。図３ＢはＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋Ｍｅ２９０メラノーマ細胞からの５１Ｃｒ放出を表し、高温Ｍｅ２７５体ＤＣにより感作されたＴ細胞がＭｅ２９０細胞系を交差致死（ｃｒｏｓｓ−ｋｉｌｌ）できることを示す。Ｔ細胞は図３Ａについて記載したものと同じである。結果は３回の実験の平均およびＳＤを表す。図３Ｃは示したｍＡｂでの標的細胞の前処理による特異的溶解の阻害を表し、高温Ｍｅ２７５体で感作したＴ細胞の細胞傷害活性は、ＭＨＣクラスＩ経路により主に媒介されたことを示す。この結果は２回の独立した実験の平均値を表す。
【図４】メラノーマ細胞系を殺すことができるＣＴＬの交差感作を表す。Ｔ細胞は図３Ａ−３Ｃに記載したように感作し、ただしＤＣにはＨＬＡ−Ａ＊０２０１ｎｅｇＳＫＭｅｌ２８メラノーマ細胞を装填し、そして結果はＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋ＳＫＭｅｌ２４メラノーマ細胞からの５１Ｃｒの放出を示し（２つの実験の代表）、高温ＳＫＭｅｌ２８体により感作されたＴ細胞がＳＫＭｅｌ２４細胞を交差致死できることを示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｄは、メラノーマ細胞系の生存／増殖を制御することができるＣＴＬの感作を表す。ナイーブなＣＤ８＋Ｔ細胞を図３Ａ〜３Ｃに記載したように感作した。ＥＧＦＰ−レンチウイルスベクターでトランスフェクトしたメラノーマおよびＫ５６２細胞系を腫瘍退縮アッセイで標的として使用した。図５Ａ〜５Ｃに示すように、２回の刺激後、非装填ＤＣ（ＣＴＬｕｎ）（本明細書では示さず）、低温Ｍｅ２９０体を装填したＤＣ（ＣＴＬｃｏｌｄ）、または高温Ｍｅ２９０体を装填したＤＣ（ＣＴＬｈｏｔ）と培養したＴ細胞を、２０：１の比率でＭｅ２９０−ＥＧＦＰ標的細胞と共存培養した。共存培養物を示した時点で回収し、ＰＥ結合抗ＣＤ８ｍＡｂで染色し、そしてフローサイトメトリーにより分析した。右上の値は、生存ＥＧＦＰ＋腫瘍細胞のパーセンテージを示す。結果は３回の実験の代表である。図５Ｄは低温Ｍｅ２７５細胞装填ＤＣ（ＣＴＬｃｏｌｄ）、または高温Ｍｅ２９０細胞装填ＤＣ（ＣＴＬｈｏｔ）により感作し、そしてＭｅ２９０−ＥＧＦＰ標的細胞と、２０：１の比率で４時間、２４時間、４８時間または７２時間、共存培養したＴ細胞を表す。生存腫瘍細胞をトリパンブルー排除により光学顕微鏡を使用して計数した。結果は３回の実験の平均およびＳＤを表す。
【図６】図６Ａ〜６Ｆはメラノーマ特異的ＣＴＬの感作を表す：Ｔ２致死アッセイ。４時間の５１Ｃｒ放出アッセイでは、図６ＡはＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋Ｍｅ２９０細胞に対して図３Ａ〜３Ｃで表すような感作をして、４種のメラノーマペプチド：ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ  Ａ、ｇｐ１００、チロシナーゼおよびＭＡＧＥ−３の混合物によりパルスされたＴ２細胞（Ｔ２＋４Ｐ）、または対照ＰＳＡペプチドによりパルスされたＴ２細胞（Ｔ２＋ＰＳＡ）または使用したパルスされない（ｕｓｅｄ  ｕｎｐｕｌｓｅｄ）（Ｔ２）からの５１Ｃｒ放出が与えられたことを示す。結果は３回の実験の平均およびＳＤである。図６ＢはＨＬＡ−Ａ＊０２０１ｎｅｇＳｋ−Ｍｅｌ２８細胞に対して図４に記載するような感作を表し、図６Ａに与えたように読んだ。結果は３回の実験の平均およびＳＤである。図６Ｃ〜６Ｅは、それぞれＴ２−ＥＧＦＰ細胞（３０：１のエフェクター：標的比率）、ＳＰＡペプチドでパルスされたＴ２−ＥＧＦＰ細胞（３０：１のエフェクター：標的比率）、または４種のメラノーマペプチド（ｇｐ１００、Ｔｙｒ、ＭＡＲＴ１およびＭＡＧＥ３）でパルスされたＴ２−ＥＧＦＰ細胞（２０：１のエフェクター：標的比率）と共存培養した高温アポトーシスＭｅ２９０体を装填したＭＤＤＣにより感作されたＴ細胞の、０時間、４時間、２４時間および４８時間の間標的とした、腫瘍退縮アッセイに関するフローサイトメトリーの結果を表す。結果は２回の実験の代表である。図６Ｃ〜６ＥからのＦＡＣＳデータに従い、図６Ｆは以下の式を使用することにより計算されるペプチドでパルスされたＴ２−ＥＧＦＰ細胞の増殖率を表す：％増殖率＝（％ＥＧＦＰ＋その時点の集団／％ＥＧＦＰ＋０時間での集団）ｘ１００％。腫瘍増殖率は０時間を１００％と定めた。結果は２回の実験の平均値である。
【図７】図７Ａ〜７Ｃはメラノーマ特異的ＣＴＬ：四量体結合アッセイの感作を表し、感作は図３Ａ〜３Ｃに記載したようにＨＬＡ−Ａ＊０２０１＋Ｍｅ２９０細胞に対する。図７Ａに示すように、四量体染色は２回目の刺激後７日目に行い、そして５０，０００個の細胞が各サンプルについて得られた。結果は、全ＣＤ８群（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）における２重陽性群（ｄｏｕｂｌｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）（ＣＤ８＋四量体＋）のパーセンテージを示す。図７Ｂに示すように、感作したＴ細胞はＰＳＡ１でパルスされたＤＣにより１回、再刺激し（ＣＴＬｈｏｔ−２Ｒ／ＰＳＡ＋ＤＣ）、そして再刺激から７日に分析した。図７Ｃに示すように、感作したＴ細胞は４種の各メラノーマペプチドでパルスされたＤＣにより１回、再刺激し（ＣＴＬｈｏｔ−２Ｒ／Ｍｅｌ＋ＤＣ）、そして再刺激から７日後に分析した。結果は２回の実験の代表である。
【図８】図８Ａおよび８ＢはＳＫＭｅｌ２８メラノーマ細胞系におけるＨＳＰ７０過剰発現の構築を示す。図８ＡはレンチウイルスベクターＲＲＬ−ｐｇｋ−ｈｓｐ７０−ＥＧＦＰの概略地図を表す（腫瘍退縮アッセイで使用した）。図８Ｂはトランスフェクトされ、そしてｍｏｃｋトランスフェクトされたＳＫＭｅｌ２８メラノーマ細胞系におけるＨＳＰ７０発現レベルを表す。ＳＫＭｅｌ２８、ＳＫＭｅｌ２８／ＲＲＬ−ｐｋｇ−ＥＧＦＰ（「ＳＫＭｅｌ２８−ＥＧＦＰ」と略す）およびＳＫＭｅｌ２８／ＲＲＬ−ｐｋｇ−ＨＳＰ７０−ＥＧＦＰ（「ＳＫＭｅｌ２８−ＨＳＰ７０−ＥＧＦＰ」と略す）をＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロッティングにより検出した。結果は３回の独立した実験の平均値を表す。有意なＨＳＰ７０過剰発現が観察された（ＳＫＭｅｌ２８／ＲＲＬ−ｐｇｋ−ＥＧＦＰまたはＳＫＭｅｌ２８細胞系と比べた時のＳＫＭｅｌ２８／ＲＲＬ−ｐｇｋ−ｈｓｐ７０−ＥＧＦＰ細胞系におけるＨＳＰ７０レベルＰ＜０．００１）。
【図９】図９Ａ〜９Ｆは実施例１７に記載した３種のメラノーマ抗原、ＭＡＧＥ−Ｂ３、ＭＡＧＥ−Ｂ４およびＭＡＧＥ−Ａ８のｍＲＮＡ発現という意味で、メラノーマ細胞系ＳＫＭｅｌ２８およびＭｅ２９０のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析からの相対的発現データを示す。図９Ａ〜９Ｆに示すように、メラノーマ細胞はメラノーマ抗原のｍＲＮＡ発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析前に、未処理（「非」）；４２度Ｃで４時間の加熱処理（「４時間加熱」）；４２度Ｃで４時間の加熱中にアクチノマイシンＤ（既知の転写インヒビター）へ暴露（「加熱プラスＡＤ」；対照ベクターＥＧＦＰでトランスフェクト（「ＥＧＦＰ」）；またはベクター発現ＨＳＰ７０でトランスフェクト（「ＨＳＰ７０」）された。図９Ａは、ＭＡＧＥ−Ｂ３のｍＲＮＡ発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析前に、上記のように未処理、加熱処理、またはトランスフェクトしたいずれかのＳＫＭｅｌ２８細胞を表す。図９ＢはＭＡＧＥ−Ｂ３のｍＲＮＡ発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析前に、上記のように未処理または加熱処理したＭｅ２９０細胞を表す。図９ＣはＭＡＧＥ−Ｂ４のｍＲＮＡ発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析前に、上記のように未処理、加熱処理、またはトランスフェクトしたＳＫＭｅｌ２８細胞を表す。図９ＤはＭＡＧＥ−Ｂ４のｍＲＮＡ発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析前に、上記のように未処理または加熱処理したいずれかのＭｅｌ２９０細胞を表す。図９ＥはＭＡＧＥ−Ａ８のｍＲＮＡ発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析前に、上記のように未処理、加熱処理、またはトランスフェクトしたＳＫＭｅｌ２８細胞を表す。図９ＦはＭＡＧＥ−Ａ８のｍＲＮＡ発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析前に、上記のように未処理または加熱処理したいずれかのＭｅ２９０細胞を表す。
【図１Ａ−１Ｂ】
0005623004.tif 000011
【図２】
0005623004.tif 000012
【図３Ａ−３Ｃ】
0005623004.tif 000013
【図４】
0005623004.tif 000014
【図５Ａ−５Ｄ】
0005623004.tif 000015
【図６Ａ−６Ｂ】
0005623004.tif 000016
【図６Ｃ−６Ｆ】
0005623004.tif 000017
【図７Ａ−７Ｃ】
0005623004.tif 000018
【図８Ａ−８Ｂ】
0005623004.tif 000019
【図９Ａ−９Ｂ】
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【図９Ｃ−９Ｄ】
0005623004.tif 000021
【図９Ｅ−９Ｆ】
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