(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
第ＶＩＩ因子ポリペプチド生産の全プロセスの最終段階において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含有する組成物中における二量体の含有量を低減する方法であって、
(ａ)該組成物のｐＨが(５℃で測定して)４．５−１０．０の範囲の値にない場合に、該組成物のｐＨを該範囲の値に調節する工程と；
(ｂ)５分から７２時間の間、２０−５０℃の範囲の温度まで組成物を加熱する工程と；
(ｃ)続いて、組成物を高くとも１０℃の温度まで冷却する工程
を含む方法。
【請求項２】
工程(ａ)において、ｐＨが５．０−１０．０の値に調節される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程(ａ)において、ｐＨが５．０−６．５の値に調節される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
(ｂ)５時間から７２時間の間、２０−３０℃の範囲の温度まで組成物を加熱することを含む請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
(ｂ)１０分から１２０分の間、３７℃の範囲の温度まで組成物を加熱することを含む請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
(ａ)前記組成物のｐＨを５．０−６．５の範囲の値に調節する工程と；
(ｂ)２０分から６００分の範囲の間、３０−４５℃の範囲の温度まで組成物を加熱する工程と；
(ｃ)続いて、組成物を高くとも５℃の温度まで冷却する工程
を含む請求項２に記載の方法。
【請求項７】
(ａ)前記組成物のｐＨを９．０−１０．０の範囲の値に調節する工程と；
(ｂ)２０分から６００分の範囲の間、３０−４５℃の範囲の温度まで組成物を加熱する工程と；
(ｃ)続いて、組成物を高くとも５℃の温度まで冷却する工程
を含む請求項２に記載の方法。
【請求項８】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドが第ＶＩＩ因子変異体である請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
組成物がカルシウム塩を含有している請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドの全プールに対する％-ポイントとして表される前記組成物中の二量体レベルが、少なくとも２倍、低減している請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドが、工程(ｂ)に続く工程で活性化される請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
陰イオン交換クロマトグラフィー工程が工程(ａ)に先行する請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第ＶＩＩ因子ポリペプチド組成物、特に第ＶＩＩ因子変異体を含有する組成物における二量体含有量を低減させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液凝固カスケードに関する第ＶＩＩ因子は、多様な病的状態を処置するための有益な治療剤であることが証明されている。従って、製薬的に許容可能であり、均一で所定の臨床的効果を示す、活性化した第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含有する処方物が、ますます必要とされている。
第ＶＩＩ因子ポリペプチドを商業的に製造する間、関心あるポリペプチドの二量体及びオリゴマー等の凝集体の形成を回避することは、難しい課題である。このような生成物に関連した不純物は、それらの潜在的抗原性の故に、所望されないものである。典型的には、生成中の凝集体／二量体の形成を制御するために、極度のｐＨ及び高温が回避される。
【０００３】
国際公開第２００７／０２６０２０Ａ１号は、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩａ因子の自己分解生成物の同時形成を最小にしつつ、第ＶＩＩ因子及び第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの生成副産物を含有する組成物の精製方法に関する。
【０００４】
よって、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの製造に関し、生成工程において、あまり収率を損なうことなく、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの二量体(高級オリゴマーを含む)の存在性を減じることが必要とされている。これにより、さらに安全で安定した薬剤基質、結果として、さらに安全で安定した薬剤に至るであろう。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、二量体(及び高級オリゴマー)の含有量を低減するために、加熱処理工程を適用することにより、上述した問題を解決するものである。
特に、本発明は、第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含有する組成物における、二量体の含有量を低減する方法を提供するものであって、該方法は、
(ａ)必要に応じて、(５℃で測定して)４．５−１０．０の範囲の値に、組成物のｐＨを調節し；
(ｂ)少なくとも５分の期間、２０−５０℃の範囲の温度まで組成物を加熱し；
(ｃ)続いて、高くとも１０℃の温度まで、組成物を冷却する；
工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、３７℃で１２０分加熱処理した、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ組成物サンプルにおける、二量体含有量の変化を例証する。スケール：時間は分。
【図２】図２は、２３℃又は３７℃で加熱、もしくは５-８℃(対照体)で、４８時間保存した、他が同一である３つのＶ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ組成物サンプルにおける、二量体含有量の変化を例証する。スケール：時間はｈｒ。
【図３】図３は、ここに記載する本発明の終了後に残存している、ＨＭＷＰ(ポリマー及びオリゴマー)、単量体及び塩の量を例証する。
【図４】図４は、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ組成物サンプルにおける二量体含有量の変化を例証し、ここでｐＨは９．５に調節され、その後、３７℃で１６８時間加熱処理される。スケール：時間はｈｒ。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
上述したように、本発明は、第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含有する組成物における、二量体含有量を低減させる方法に関する。本方法は、加熱、ｐＨ変化、クロマトグラフィー材料との接触等を含む組成物のさらなる操作が二量体の新たな形成を引き起こしうる点で、第ＶＩＩ因子ポリペプチド生産の全プロセスの最終段階で有利に利用される。
【０００８】
本方法は、工程(ａ)が必須ではない、以下の：
(ａ)必要に応じて、(５℃で測定して)４．５-１０．０の範囲の値に、組成物のｐＨを調節し；
(ｂ)少なくとも５分の期間、２０−５０℃の範囲の温度まで組成物を加熱し；
(ｃ)続いて、高くとも１０℃の温度まで、組成物を冷却する；
工程を含む。
【０００９】
ここで使用される場合「組成物」なる表現は、液状組成物、特に水性の液状組成物、すなわち非水性溶媒が５％未満である組成物を意味することを意図している。本方法で使用される組成物は、第ＶＩＩ因子ポリペプチド、並びに二量体形態のある種の不純物を含有する。
【００１０】
「二量体」なる用語は、任意の第ＶＩＩ因子ポリペプチドの真性二量体並びに高級オリゴマー及び凝集体(例えば、トリマー、テトラマー等)を含むことを意図している。いくつかの第ＶＩＩ因子ポリペプチド変異体は、野生型第ＶＩＩ因子と比較して、二量体を形成する傾向が高いことが観察されている。第ＶＩＩ因子ポリペプチド変異体は、野生型第ＶＩＩ因子とは異なる構造、よって異なる特性を有しているという事実により、二量体形成の増加性が説明される。このような異なる特性の具体例は、それらがアンフォールドされる温度、すなわちそれらの融点である。第ＶＩＩ因子ポリペプチドがアンフォールドされる場合、それらの表面はより疎水性になり、よって他のアンフォールドされた疎水性第ＶＩＩ因子ポリペプチドと相互作用し、二量体が形成される傾向となる。この理由のため、本発明は、排他的ではないが、このような第ＶＩＩ因子ポリペプチド変異体の組成物への適用が考慮され得る。
【００１１】
本発明の方法は、二量体の含有量が比較的高い組成物、すなわち未処理の組成物(すなわち、工程(ｂ)の前)の二量体含有量が、少なくとも３％、例えば少なくとも４％、例えば少なくとも５％、例えば少なくとも６％、例えば少なくとも８％、又は少なくとも１０％である組成物に特に有用である。
【００１２】
「第ＶＩＩ因子ポリペプチド」なる用語を、以下にさらに詳細に記載する。予備観察に基づき、この群に入るポリペプチドが二量体を形成するより高い傾向を有していることが明らかであるため、本発明では、非天然形態の第ＶＩＩ因子、例えば第ＶＩＩ因子変異体に特に適していると考えられる。よって、一実施態様において、本発明の方法に使用される第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、非野生型ヒト第ＶＩＩａ因子、例えば第ＶＩＩ因子変異体である。
【００１３】
組成物における第ＶＩＩａ因子の濃度は、便宜的にｍｇ／ｍＬ、又は通常１ｍｇが４３０００-５６０００ＩＵ又はそれ以上を表す、ＩＵ／ｍＬとして表される。組成物における第ＶＩＩ因子ポリペプチドの濃度は、典型的には、少なくとも０．０１ｍｇ／ｍＬ、又は少なくとも０．１ｍｇ／ｍＬである。異なる実施態様において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、０．１−９０ｍｇ／ｍＬ；０．５−８０ｍｇ／ｍＬ；１．０−８０ｍｇ／ｍＬ；１．５−７０ｍｇ／ｍＬ；２−６０ｍｇ／ｍＬ；３−５０ｍｇ／ｍＬ；又は５-５０ｍｇ／ｍＬの濃度で、組成物に存在している。
【００１４】
本組成物は、工程(ａ)の前、特に工程(ａ)の任意の適用に続いて、特定の範囲、すなわち４．５−１０．の範囲内にｐＨを維持できるよう、緩衝剤(単一薬剤又は薬剤の組合せとして理解される)を含有してよい。
【００１５】
一実施態様において、緩衝剤は、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、トリス、ヒスチジン、イミダゾール、グリシン、グリシルグリシン、グリシンアミド、リン酸、酢酸(例えば、酢酸ナトリウム又は酢酸カリウム)、乳酸、グルタル酸、クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、マレイン酸、及びコハク酸等の酸及びその塩からなる群から選択される、少なくとも一の成分である。緩衝剤は、２又はそれ以上の成分の混合物を含んでいてもよく、ここで該混合物は、特定の範囲のｐＨ値を提供可能なものであると理解されるべきである。具体例として、酢酸及び酢酸ナトリウム等を挙げることができる。
緩衝剤の濃度は、組成物が好ましいｐＨを維持できるように選択される。種々の実施態様において、緩衝剤の濃度は、１-１００ｍＭ；１-５０ｍＭ；１-２５ｍＭ；又は２-２０ｍＭである。
【００１６】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、ｐＨが上昇すると、自己活性化及び-分解する傾向にあることが観察されている。他方、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、ｐＨが低下すると、二量体化及び凝集すると思われる。第ＶＩＩ因子ポリペプチド組成物のｐＨ範囲は、最良の妥協案がこれら２つのｐＨ関連問題を解決する間に見出されるように選択される。このようなｐＨ範囲は、その化学的、よって構造的特徴が互いに異なる、異なった第ＶＩＩ因子ポリペプチド間の差異であると予期される。本発明の一実施態様において、組成物のｐＨは、４．５-１０の範囲、例えば５−１０の範囲；例えば９−１０の範囲に保持される。本発明の他の実施態様において、組成物のｐＨは、４．５−９．５の範囲；例えば４．５−８．５の範囲；例えば４．５−７．５の範囲；例えば４．５−６．５の範囲；例えば４．５−６．０の範囲；例えば５．０−６．５の範囲；例えば５．０−６．０の範囲；例えば５．２〜約５．９の範囲に保持される。
ｐＨ値が参照される場合、約５℃で測定された値が適用される。
【００１７】
組成物は、加熱処理(工程(ｂ))の適用前、最大１０℃、特に最大５℃の温度で保持されていることが好ましい。
【００１８】
好ましい実施態様において、組成物は、カルシウム又はマグネシウムの塩、例えば塩化カルシウム又は酢酸カルシウムを含有する。カルシウムイオンは第ＶＩＩ因子ポリペプチドに結合しており、第ＶＩＩ因子ポリペプチド、特にそのＧｌａドメインが、自己-タンパク質分解から保護されるように、第ＶＩＩ因子ポリペプチドのＧｌａドメインの正確な折り畳みに必要である。マグネシウムイオンは、カルシウムイオンと同様の方式で、第ＶＩＩ因子ポリペプチドを保護可能であると予期される。
【００１９】
組成物は、さらなる成分、例えば溶液の浸透圧に寄与する浸透圧調節剤を含有していてもよい。このような浸透圧調節剤には、典型的には、中性塩、アミノ酸、２〜５のアミノ酸残基のペプチド、単糖類、二糖類、多糖類、及び糖アルコールからなる群から選択される、少なくとも一の薬剤が含まれる。いくつかの好ましい実施態様において、組成物は、２又はそれ以上のこのような薬剤の組合せを含有する。「中性塩」とは、水溶液に溶解したときに、酸でも塩基でもない塩を意味する。
一実施態様において、少なくとも一の浸透圧調節剤は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、及びマグネシウム塩、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、カルシウムラエブラート(laevulate)、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム、グルコン酸マグネシウム、及びマグネシウムラエブラートからなる群から選択される中性塩である。
好ましい一実施態様において、浸透圧調節剤には、塩化カルシウム、酢酸カルシウム、塩化マグネシウム、及び酢酸マグネシウムからなる群から選択される少なくとも一と組合せて、塩化ナトリウムを含有する。
他の好ましい実施態様において、浸透圧調節剤は、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、スクロース、グルコース、及びマンニトールからなる群から選択される少なくとも一である。
【００２０】
典型的には、浸透圧調節剤は、少なくとも１ｍＭ、少なくとも５ｍＭ、少なくとも１０ｍＭ、少なくとも２０ｍＭ、少なくとも５０ｍＭ、少なくとも１００ｍＭ、少なくとも２００ｍＭ、少なくとも４００ｍＭ、少なくとも８００ｍＭ、少なくとも１０００ｍＭ、少なくとも１２００ｍＭ、少なくとも１５００ｍＭ、少なくとも１８００ｍＭ、少なくとも２０００ｍＭ、又は少なくとも２２００ｍＭの濃度で存在している。
一連の実施態様において、浸透圧調節剤は、５−２２００ｍＭ、例えば２５−２２００ｍＭ、５０−２２００ｍＭ、１００−２２００ｍＭ、２００−２２００ｍＭ、４００−２２００ｍＭ、６００−２２００ｍＭ、８００−２２００ｍＭ、１０００−２２００ｍＭ、１２００−２２００ｍＭ、１４００−２２００ｍＭ、１６００−２２００ｍＭ、１８００−２２００ｍＭ、又は２０００−２２００ｍＭ；５−１８００ｍＭ、２５−１８００ｍＭ、５０−１８００ｍＭ、１００−１８００ｍＭ、２００−１８００ｍＭ、４００−１８００ｍＭ、６００−１８００ｍＭ、８００−１８００ｍＭ、１０００−１８００ｍＭ、１２００−１８００ｍＭ、１４００−１８００ｍＭ、１６００−１８００ｍＭ；５−１５００ｍＭ、２５−１４００ｍＭ、５０−１５００ｍＭ、１００−１５００ｍＭ、２００−１５００ｍＭ、４００−１５００ｍＭ、６００−１５００ｍＭ、８００−１５００ｍＭ、１０００−１５００ｍＭ、１２００−１５００ｍＭ；５−１２００ｍＭ、２５−１２００ｍＭ、５０−１２００ｍＭ、１００−１２００ｍＭ、２００−１２００ｍＭ、４００−１２００ｍＭ、６００−１２００ｍＭ、又は８００−１２００ｍＭの濃度で存在している。
【００２１】
多くの場合、第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含有する組成物は、上述した精製工程から得られる。特定の関連実施態様において、陰イオン交換クロマトグラフィー工程が、工程(ａ)に先行する。この陰イオン交換工程中に、高濃度の第ＶＩＩ因子ポリペプチド二量体が生成されることが観察されている。よって、共同して残存二量体を低減させるｐＨの調節、本発明の加熱及び冷却工程の前に、この工程を位置づけることが特に有用である。
【００２２】
第ＶＩＩ因子ポリペプチド
ここで使用される場合「第ＶＩＩ因子ポリペプチド」又は「ＦＶＩＩポリペプチド」なる用語は、野生型ヒト第ＶＩＩａ因子(すなわち、米国特許第4,784,950号に開示されているアミノ酸配列を有するポリペプチド)のアミノ酸配列１-４０６を含有する任意のタンパク質、その変異体、並びに第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド、第ＶＩＩ因子誘導体、及び第ＶＩＩ因子コンジュゲートを意味する。これには、第ＶＩＩ因子変異体、第ＶＩＩ因子誘導体、及び第ＶＩＩ因子コンジュゲートで、野生型ヒト第ＶＩＩａ因子に対して、実質的に同等又は改善された生物活性を示すものが含まれる。
【００２３】
「第ＶＩＩ因子」なる用語は、それらの未切断(チモーゲン)形態にある第ＶＩＩ因子ポリペプチド、並びに第ＶＩＩａ因子と命名されてもよい、それぞれの生物活性形態が生じるようにタンパク質分解的にプロセシングされたものを含むことを意図している。典型的には、第ＶＩＩ因子は残基１５２と１５３の間が切断されて、第ＶＩＩａ因子、すなわち第ＶＩＩ因子活性化形態を生じる。第ＶＩＩ因子のこのような変異体は、安定性、リン脂質結合性、特定の活性の変化等を含む、ヒト第ＶＩＩ因子とは異なる特性を示し得る。
【００２４】
上述した定義における「第ＶＩＩ因子」又は「第ＶＩＩａ因子」には、存在し、一個体から他方を生じ得る、天然の対立遺伝子変異体も含まれる。さらに、グリコシル化又は他の翻訳後修飾の程度及び位置は、選択される宿主細胞及び宿主細胞環境の性質に応じて変化する可能性がある。
ここで使用される場合、「野生型ヒトＦＶＩＩａ」とは、米国特許第4,784,950号に開示されているアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００２５】
ここで使用される場合、「第ＶＩＩ因子関連ポリペプチド」には、第ＶＩＩａ因子の生物活性が実質的に修飾されている、例えば野生型第ＶＩＩａ因子の活性に対して低下している変異体を含むポリペプチドが含まれる。これらのポリペプチドには、限定されるものではないが、ポリペプチドの生物活性を修飾又は破壊する、特定のアミノ酸配列の変化が導入された、第ＶＩＩ因子又は第ＶＩＩａ因子が含まれる。
【００２６】
ここで使用される場合「第ＶＩＩ因子誘導体」なる用語は、親ペプチドの一又は複数のアミノ酸が、例えばアルキル化、グリコシル化、ペグ化、アシル化、エステル形成又はアミド形成等により、遺伝的及び／又は化学的及び／又は酵素的に修飾されている、野生型第ＶＩＩ因子に対して、実質的に同等又は改善された生物活性を示す、ＦＶＩＩポリペプチドを命名することを意図している。これには、限定されるものではないが、ペグ化したヒト第ＶＩＩａ因子、システイン-ペグ化されたヒト第ＶＩＩａ因子、及びそれらの変異体が含まれる。第ＶＩＩ因子誘導体の非限定的例には、国際公開第０３／３１４６４号及び米国特許出願第２００４００４３４４６号、米国特許第２００４００６３９１１号、米国特許第２００４０１４２８５６号、米国特許第２００４０１３７５５７号、米国特許第２００４０１３２６４０号、国際公開第２００７０２２５１２号、及び米国特許第２００７０１０５７５５号(Neose Technologies, Inc.)に開示されたグリコペグ化されたＦＶＩＩ誘導体；国際公開第０１／０４２８７号、米国特許出願第２００３０１６５９９６号、国際公開第０１／５８９３５号、国際公開第０３／９３４６５号(Maxygen ApS)、及び国際公開第０２／０２７６４号、米国特許出願第２００３０２１１０９４号(ミネソタ大学)に開示されているＦＶＩＩコンジュゲートが含まれる。
【００２７】
「改善された生物活性」なる用語は、ｉ）組換え野生型ヒト第ＶＩＩａ因子と比較して、実質的に同等又は増加したタンパク質分解活性を有するＦＶＩＩポリペプチド、又はｉｉ）組換え野生型ヒト第ＶＩＩａ因子と比較して、実質的に同等又は増加したＴＦ結合活性を有するＦＶＩＩポリペプチド、又はｉｉｉ）組換え野生型ヒト第ＶＩＩａ因子と比較して、血漿における半減期が実質的に同等又は増加したＦＶＩＩポリペプチドを称する。
【００２８】
「ペグ化されたヒト第ＶＩＩａ因子」なる用語は、ヒト第ＶＩＩａ因子ポリペプチドにコンジュゲートしたＰＥＧ分子を有する、ヒト第ＶＩＩａ因子を意味する。ＰＥＧ分子は、任意のアミノ酸残基又は第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの炭水化物部分を含む、第ＶＩＩａ因子ポリペプチドの任意の部分に結合していてもよい。
「システイン-ペグ化されたヒト第ＶＩＩａ因子」なる用語は、ヒト第ＶＩＩａ因子に導入されたシステインのスルフヒドリル基にコンジュゲートしたＰＥＧ分子を有する第ＶＩＩａ因子を意味する。
【００２９】
ここで使用される場合「第ＶＩＩ因子変異体」なる用語は、野生型第ＶＩＩ因子と実質的に同等又は良好な生物活性を示す、又は野生型第ＶＩＩ因子に対して実質的に変化又は低減した生物活性を示す、ＦＶＩＩポリペプチドを命名することを意図しており、一又は複数のアミノ酸の挿入、欠失、又は置換による、野生型第ＶＩＩ因子の配列とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００３０】
組換え野生型ヒト第ＶＩＩａ因子と比較して実質的に同等又は増加したタンパク質分解活性を有する第ＶＩＩ因子変異体の非限定的例には、Ｓ５２Ａ-ＦＶＩＩａ、Ｓ６０Ａ-ＦＶＩＩａ(Linoら, Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998)；米国特許第５５８０５６０号に開示されたような、増加したタンパク質分解安定性を示すＦＶＩＩａ変異体；残基２９０と２９１の間、又は残基３１５と３１６の間が、タンパク質分解的に切断された第ＶＩＩａ因子(Mollerupら, Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995)；第ＶＩＩａ因子の酸化形態(Kornfeltら, Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999)；ＰＣＴ／ＤＫ０２／００１８９(国際公開第０２／０７７２１８号に相当)に開示されているＦＶＩＩ変異体；及び国際公開第02/38162号に開示されたような、増加したタンパク質分解安定性を示すＦＶＩＩ変異体(Scripps Research Institute)；国際公開第９９／２０７６７号、米国特許第６０１７８８２号及び米国特許第６７４７００３号、米国特許出願第２００３０１００５０６号(ミネソタ大学)及び国際公開第００／６６７５３号、米国特許出願第２００１００１８４１４号、米国特許第２００４２２０１０６号、及び米国特許第２００１３１００５号、米国特許第６７６２２８６号及び米国特許第６６９３０７５号(ミネソタ大学)に開示されたような、高められた膜結合性を示し、修飾されたＧｌａ-ドメインを有するＦＶＩＩ変異体；及び国際公開第０１／５８９３５号、米国特許第６８０６０６３号、米国特許出願第２００３００９６３３８号(Maxygen ApS)、国際公開第０３／９３４６５号(Maxygen ApS)、国際公開第０４／０２９０９１号(Maxygen ApS)、国際公開第０４／０８３３６１号(Maxygen ApS)、及び国際公開第０４／１１１２４２号(Maxygen ApS)、並びに国際公開第０４／１０８７６３号(Canadian Blood Services)に開示されたようなＦＶＩＩ変異体が含まれる。
【００３１】
野生型ＦＶＩＩａと比較して増加した生物活性を有するＦＶＩＩ変異体の非限定的例には、国際公開第０１／８３７２５号、国際公開第０２／２２７７６号、国際公開第０２／０７７２１８号、国際公開第０３／０２７１４７号、国際公開第０４／０２９０９０号、国際公開第０５／０７５６３５号、出願番号０５１０８７１３．８を有する欧州特許出願(Novo Nordisk A/S)、国際公開第０２／３８１６２号(Scripps Research Institute)；及び日本国特許第２００１０６１４７９号(Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.)に開示されているような高められた活性を有するＦＶＩＩａ変異体が含まれる。
【００３２】
第ＶＩＩ因子の変異体の例には、限定されるものではないが、Ｐ１０Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３２Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｐ１０Ｑ／Ｋ３２Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｍ３０６Ｄ／Ｄ３０９Ｓ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｉ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｐ-ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ１５７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｋ-ＦＶＩＩ、及びＳ３３６Ｇ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３１６Ｈ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３１６Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３��Ａ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｓ３１４Ｅ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｈ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ���Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｋ３１６Ｑ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｖ１５８Ｔ-Ｆ���ＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｍ２９８Ｑ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｋ３３７Ａ／Ｅ２９６Ｖ／Ｖ１５８Ｄ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｅ２９６Ｖ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶ
ＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｔ／Ｅ２９６Ｖ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｖ１５８Ｔ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｆ３７４Ｙ／Ｌ３０５Ｖ／Ｖ１５８Ｄ／Ｅ２９６Ｖ／Ｍ２９８Ｑ／Ｋ３３７Ａ／Ｓ３１４Ｅ-ＦＶＩＩ、Ｓ５２Ａ-第ＶＩＩ因子、Ｓ６０Ａ-第ＶＩＩ因子；Ｒ１５２Ｅ-第ＶＩＩ因子、Ｓ３４４Ａ-第ＶＩＩ因子、Ｔ１０６Ｎ-ＦＶＩＩ、Ｋ１４３Ｎ／Ｎ１４５Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｖ２５３Ｎ-ＦＶＩＩ、Ｒ２９０Ｎ／Ａ２９２Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｇ２９１Ｎ-ＦＶＩＩ、Ｒ３１５Ｎ／Ｖ３１７Ｔ-ＦＶＩＩ、Ｋ１４３Ｎ／Ｎ１４５Ｔ／Ｒ３１５Ｎ／Ｖ３１７Ｔ-ＦＶＩＩ；及び２３３Ｔｈｒから２４０Ａｓｎのアミノ酸配列に、置換、付加又は欠失を有するＦＶＩＩ；３０４Ａｒｇから３２９Ｃｙｓのアミノ酸配列に、置換、付加又は欠失を有するＦＶＩＩ；１５３Ｉｌｅから２２３Ａｒｇのアミノ酸配列に、置換、付加又は欠失を有するＦＶＩＩが含まれる。
【００３３】
例えば、第ＶＩＩ因子ポリペプチドにおける置換変異体には、限定されるものではないが、位置Ｐ１０、Ｋ３２、Ｌ３０５、Ｍ３０６、Ｄ３０９、Ｖ１５８、Ｅ２９６、Ｋ３３７、Ｍ２９８、Ｓ３３６、Ｓ３１４、Ｋ３１６、Ｆ３７４、Ｓ５２、Ｓ６０、Ｒ１５２、Ｓ３４４、Ｔ１０６、Ｋ１４３、Ｎ１４５、Ｖ２５３、Ｒ２９０、Ａ２９２、Ｇ２９１、Ｒ３１５、Ｖ３１７における置換、及びＴ２３３からＮ２４０、又はＲ３０４からＣ３２９；又はＩ１５３からＲ２２３のアミノ酸配列における置換、付加又は欠失、又はその組合せ、特に例えば、Ｐ１０Ｑ、Ｋ３２Ｅ、Ｌ３０５Ｖ、Ｍ３０６Ｄ、Ｄ３０９Ｓ、Ｌ３０５Ｉ、Ｌ３０５Ｔ、Ｆ３７４Ｐ、Ｖ１５８Ｔ、Ｍ２９８Ｑ、Ｖ１５８Ｄ、Ｅ２９６Ｖ、Ｋ３３７Ａ、Ｍ２９８Ｑ、Ｍ２９８Ｋ、Ｓ３３６Ｇ、Ｓ３１４Ｅ、Ｋ３１６Ｈ、Ｋ３１６Ｑ、Ｆ３７４Ｙ、Ｓ５２Ａ、Ｓ６０Ａ、Ｒ１５２Ｅ、Ｓ３４４Ａ、Ｔ１０６Ｎ、Ｋ１４３Ｎ、Ｎ１４５Ｔ、Ｖ２５３Ｎ、Ｒ２９０Ｎ、Ａ２９２Ｔ、Ｇ２９１Ｎ、Ｒ３１５Ｎ、Ｖ３１７Ｔでの変異体、及びＴ２３３からＮ２４０、又はＲ３０４からＣ３２９、又はＩ１５３からＲ２２３のアミノ酸配列における置換、付加又は欠失、又はそれらの組合せが含まれる。
【００３４】
血液凝固における第ＶＩＩａ因子の生物活性は、(ｉ)組織因子(ＴＦ)へ結合し、及び(ｉｉ)第ＩＸ因子又は第Ｘ因子のタンパク質分解的切断を触媒し、活性化した第ＩＸ因子又は第Ｘ因子(それぞれ第ＩＸａ因子又は第Ｘａ因子)を生成する能力に由来する。
本発明の目的について、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの生物活性は、例えばここに記載されるアッセイ４等、血液凝固を促進させる調製物の能力を測定するアッセイにより定量化されてよい。このアッセイにおいて、生物活性は対照サンプルに対する凝固時間の低減度合いとして表され、１単位／ｍＬの第ＶＩＩ因子活性を有するプールされたヒト血清標準体と比較することにより、「第ＶＩＩ因子単位」に転換される。また、第ＶＩＩａ因子の生物活性は、(ｉ)第Ｘ因子、及び脂質膜に包埋したＴＦを含む系において、活性化した第Ｘ因子(第ｘａ因子)を生成する、第ＶＩＩａ因子又は第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドの能力を測定し(Perssonら, J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997)；(ｉｉ)水系における第Ｘ因子の加水分解度を測定し(「インビトロタンパク質分解アッセイ」、以下のアッセイ２を参照)；(ｉｉｉ)表面プラズモン共鳴をベースにした装置を使用し、ＴＦに対する第ＶＩＩａ因子又は第ＶＩＩ関連ポリペプチドの物理的結合度を測定し(Persson, FEBS Letts. 413:359-363, 1997)；(ｉｖ)第ＶＩＩａ因子及び／又は第ＶＩＩ関連ポリペプチドによる合成基質の加水分解度を測定し(「インビトロ加水分解アッセイ」、以下のアッセイ１を参照)；又は(ｖ)インビトロ系における、ＴＦ-非依存性での、トロンビン生成度を測定する(以下のアッセイ３を参照)ことにより定量化されてよい。
【００３５】
野生型第ＶＩＩａ因子に対して実質的に同等又は改善された生物活性を有する第ＶＩＩ因子変異体には、一又は複数の上述した凝血アッセイ(アッセイ４)、タンパク質分解アッセイ(アッセイ２)、又はＴＦ結合アッセイでテストされる場合、同じ細胞系で生成される第ＶＩＩａ因子の特異的活性の少なくとも約２５％、好ましくは少なくとも約５０％、さらに好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９０％を示すものが含まれる。野生型第ＶＩＩａ因子に対して実質的に低減した生物活性を有する第ＶＩＩ因子変異体には、一又は複数の上述した凝血アッセイ(アッセイ４)、タンパク質分解アッセイ(アッセイ２)、又はＴＦ結合アッセイでテストされる場合、同じ細胞系で生成される野生型第ＶＩＩａ因子の特異的活性の少なくとも約２５％未満、好ましくは少なくとも約１０％未満、さらに好ましくは少なくとも約５％未満、最も好ましくは少なくとも約１％未満を示すものが含まれる。
【００３６】
工程(ａ)−ｐＨの調節
最初の必須ではない工程(ａ)において、必要に応じて、組成物のｐＨを、４．５-１０．０の範囲に値に調節する。上述したように、このことは、一又は複数の緩衝剤を添加することにより典型的には達成される。既に特定の範囲のｐＨを有している組成物は−もちろん−ｐＨに関して調節する必要はないが、例えば任意の後続する活性化及び形成工程に関し、ｐＨを調節することが所望されるかもしれない。
また、組成物のｐＨを調節する工程には、組成物の希釈又は濃縮(例えば、溶媒の蒸発)も含まれてよい。
工程(ａ)中、組成物は、好ましくは最大で１０℃、特に最大で５℃、さらには０℃近傍の温度で保持される。
【００３７】
工程(ｂ)−加熱処理
加熱処理は、組成物の二量体含有量を低減させる方法において極めて重要な工程である。
加熱温度は、二量体含有量の低減を生じさせるために、少なくとも２０℃、少なくとも適当な時間枠の範囲内、例えば７２時間内とすべきことが見出されている。他方、５０℃以上の加熱温度では、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの変性(よって、不活性化)の危険性が引き起こされると考えられている。
所望の温度までの加熱は、温度制御槽、例えば油浴又は水浴、もしくはオーブンに、組成物を収容する容器を配することにより達成可能である。所望の温度に達するまでに必要な時間は、容器対周囲媒体の熱伝達係数に依存するであろう。多くの場合、所望の温度に可能な限り素早く達すること、又は少なくとも２０℃の温度、もしくはセットポイントの約５℃下の温度に、可能な限り素早く達することが所望されている。
【００３８】
他の実施態様において、加熱処理は、流通式反応器において、バッチ又は連続方式で実施され、ここで流通時間は、加熱処理時間の所望の期間に相当する。実用例の数は、当業者には明らかであろう。
加熱処理に所望される温度及び必要な時間は、例えば以下の実施態様２に記載されているような、モデル実施例で決定することができる。加熱処理の最小必要時間は、典型的には約５分、例えば１０分であるが、原則上、最大時間は、数日又は多くの日数、例えば１６８時間であってよい。実施理由により、処理時間は、１０分〜７２時間が好ましい。
【００３９】
長時間にわたる加熱処理は、加熱処理により低減される種類とは異なる種類の二量体の形成を引き起こす可能性があると考えられている。この仮説は実施例２の観察でも支持されており、ここで３７℃で１０時間加熱処理すると、実際に、二量体の有意な(再)形成に至る。
３０−４５℃での加熱処理にとって好ましい時間は、典型的には１０−６００分であると言われている。２０−３０℃での加熱処理にとって好ましい時間は、典型的には５−７２時間、３５−５０℃での加熱処理にとって好ましい時間は、典型的には１０−３００分である。現在、最も好ましい実施態様において、加熱処理は、約３７℃で１０−１２０分でなされる。
本発明の方法を最適化すると、一定温度を必ずしも含まない加熱処理に至るかも知れないが、２０−５０℃の全体的な温度範囲内で、温度の徐々の又は段階的な増加、及び／又は温度の徐々の段階的な減少を利用することが有利となるかも知れないことが理解されなければならない。
【００４０】
加熱処理の目的は、第ＶＩＩ因子ポリペプチドを含有する組成物における、二量体含有量を低減させることである。特に、全体の生産プロセスにおける付加工程を正当化するためには有意な低減が期待されなければならない。よって、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの全プールに対する％-ポイントで表される、前記組成物における二量体レベル(ここに記載したＨＭＷＰ ＧＰＣ法により測定)は、少なくとも１．２倍、例えば少なくとも１．５倍、特に少なくとも２倍、又は少なくとも３倍、低減することが好ましい。
二量体含有量は、５％以下のレベル、特に４％以下のレベル、好ましくは３％以下のレベル、又は２％以下のレベル、さらに好ましくは１．５％以下のレベルまで低減可能であると予想される。
【００４１】
工程(ｃ)−冷却
続いて、組成物は、最大で１０℃、特に最大で５℃の温度まで冷却される。例えば氷浴(約０℃)で冷却、又は組成物に氷を添加することにより、極めて急速に冷却することが有利である。また上述したように、流通式反応器において、冷却を実施してもよい。急速冷却により、二量体が再形成される条件(例えば５-１５℃の温度)が長時間存在することが回避できるようになる。
冷却後、組成物はさらなるプロセス工程を受けてもよい。このようなプロセス工程は、好ましくは、二量体の任意の有意な再形成の原因とならないように考慮される。好ましい実施態様において、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、工程(ｂ)に続く工程で活性化され、すなわち、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、組成物の冷却の前後で活性化されると言われている。加熱中に活性化を制御することは困難であるため、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、加熱プロセスの後の工程で活性化されることが好ましい。
【００４２】
好ましい実施態様
特に好ましい一実施態様において、本発明は、第ＶＩＩ因子変異体を含有する組成物における二量体含有量を低減させる方法に関し、該方法は：
(ａ)必要に応じて、５．０-６．５の範囲の値に、組成物のｐＨを調節し；
(ｂ)２０-６００分の範囲の期間、３０-４５℃の範囲の温度まで組成物を加熱し；
(ｃ)続いて、最大５℃の温度まで、組成物を冷却する；
工程を含む。
【００４３】
好ましい実施態様
特に好ましい第２の実施態様において、本発明は、第ＶＩＩ因子変異体を含有する組成物における二量体含有量を低減させる方法に関し、該方法は：
(ａ)必要に応じて、９．０-１０．０の範囲の値に、組成物のｐＨを調節し；
(ｂ)２０-６００分の範囲の期間、３０-４５℃の範囲の温度まで組成物を加熱し；
(ｃ)続いて、最大５℃の温度まで、組成物を冷却する；
工程を含む。
【００４４】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドの調製及び精製
本発明の方法に適用される精製されたヒト第ＶＩＩ因子は、好ましくは、例えばHagenら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83: 2412-2416, 1986に記載されたような、又は欧州特許第0200421号(ZymoGenetics, Inc.)に記載されたような、ＤＮＡ組換え技術により作製される。
【００４５】
また第ＶＩＩ因子は、Broze及びMajerus, J. Biol.Chem. 255 (4): 1242-1247, 1980、Hedner及びKisiel, J. Clin.Invest. 71: 1836-1841, 1983により記載されているような方法により生成されてよい。これらの方法により、検出可能な量の他の血液凝固因子を用いることなく、第ＶＩＩ因子が生じる。さらに精製された第ＶＩＩ因子調製物は、最終精製工程として、付加的なゲル濾過を含むことにより得られる。ついで、第ＶＩＩ因子は、公知の手段、例えばいくつかの異なる血漿タンパク質、特に第ＸＩＩａ因子、第ＩＸａ因子又は第Ｘａ因子により、活性化した第ＶＩＩａ因子に転換される。また、Bjoernら(Research Disclosure, 269 9月, 1986, pp. 564-565)により記載されているように、第ＶＩＩ因子は、イオン交換クロマトグラフィー用カラム、例えばモノＱ(登録商標)(Pharmacia fine Chemicals)に通すことにより、又は溶液における自己活性化により活性化されてもよい。本発明の方法の工程は、好ましくは第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性化の直前に適用される。
【００４６】
第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、野生型第ＶＩＩ因子を修飾、又は組換え技術により生成されてもよい。野生型第ＶＩＩ因子と比較した場合、変化したアミノ酸配列を有する第ＶＩＩ因子関連ポリペプチドは、公知の手段、例えば部位特異性突然変異生成により、天然の第ＶＩＩ因子をコードする核酸中のアミノ酸コドンのいくつかを除去することにより、又はアミノ酸コドンを変化させることにより、野生型第ＶＩＩ因子をコードする核酸配列を修飾することで生成され得る。
【００４７】
置換が、第ＶＩＩａ因子分子の機能にとって重要な領域害でなされ、さらに活性化ポリペプチドに至ることは、当業者には明らかであろう。第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性化に必須であり、よって好ましくは置換を受けないアミノ酸残基は、当該問題で公知に手順、例えば部位指向性突然変異生成又はアラニン-スキャンニング突然変異生成(例えば、Cunningham及びWells, 1989, Science 244:1081-1085)により同定されてよい。後者の技術において、突然変異は、分子の全ての正に帯電した残基に導入され、得られた突然変異分子は、血液凝固性、それぞれの架橋結合活性についてテストされ、分子の活性に対して重要なアミノ酸残基が同定される。また、基質-酵素相互作用の部位は、核磁気共鳴、結晶学、又は光親和性標識等の技術により決定される三次元構造を分析することで、決定することができる(Vosら,1992, Science 255:306-312; Smithら, 1992, Journal of Molecular Biology 224:899-904; Wlodaverら, 1992, FEBS Lett. 309:59-64を参照)。
【００４８】
一つのヌクレオチドを別のヌクレオチドに交換するために、核酸配列に変異を導入することは、当該技術で公知の任意の方法を使用する、部位指向性突然変異生成により達成される。特に有用なのは、関心ある挿入物、及び所望の突然変異を有する２つの合成プライマーと共に、スーパーコイル状(super-coiled)の二本鎖ＤＮＡベクターを利用する手順である。それぞれベクターの他方のストランドを補完する、オリゴヌクレオチドプライマーは、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼの手段により、温度サイクルの間、伸長する。プライマーの導入において、ねじれ型ニックを有する突然変異プラスミドが生じる。温度サイクルに続き、メチル化、及びヘミメチル化されたＤＮＡに特異的なＤｐｎＩを用いて、生成物を処理し、親ＤＮＡテンプレートを消化させ、突然変異含有の合成ＤＮＡについて選択する。ベクターの生成、同定及び単離について、当該技術で公知の他の手順、例えば遺伝子シャッフリング又はファージディスプレイ技術を使用してもよい。
【００４９】
起源となる細胞からのポリペプチドの分離は、限定されるものではないが、接着細胞培養からの、所望の生成物を含有する細胞培養培地の除去；非接着細胞を除去する遠心分離又は濾過を含む、当該技術で公知の任意の方法により達成される。
【００５０】
場合によっては、第ＶＩＩ因子ポリペプチドはさらに精製されてよい。精製は、限定されるものではないが、例えば、抗-第ＶＩＩ因子抗体カラムにおけるアフィニティークロマトグラフィー(例えば、Wakabayashiら, J. Biol. Chem. 261:11097, 1986; 及びThimら, Biochem. 27:7785, 1988を参照)；疎水性相互作用クロマトグラフィー；イオン交換クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；電気泳動手順(例えば調製用の電点電気泳動(ＩＥＦ)、微分溶解度(例えば、硫酸アンモニウム沈降)、又抽出等を含む、当該技術で公知の任意の方法を使用して達成され得る。一般的には、Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, New York, 1982; 及びProtein Purification, J.C. Janson及びLars Ryden,編, VCH Publishers, New York, 1989を参照。精製後、調製物は、好ましくは約１０重量％未満、さらに好ましくは約５重量％未満、最も好ましくは約１重量％未満の、宿主細胞から誘導された非-第ＶＩＩ因子タンパク質を含有する。
【００５１】
第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、第ＸＩＩａ因子、又はトリプシン様特異性を有する他のプロテアーゼ、例えば第ＩＸａ因子、カリクレイン、第Ｘａ因子、及びトロンビンを使用し、タンパク質分解的切断により活性化させてもよい。例えば、Osterudら, Biochem. 11:2853 (1972); Thomas, 米国特許第4,456,591号;及びHednerら, J. Clin. Invest. 71:1836 (1983)を参照。また、第ＶＩＩ因子ポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィーカラム、例えばモノＱ(登録商標)(Pharmacia)等に通すことにより、又は溶液における自己活性化によって活性化されてもよい。本発明の方法の工程−上述したようなもの−は、第ＶＩＩ因子ポリペプチドの活性化の直前に適用されることが好ましい。
ついで、得られた活性化第ＶＩＩ因子は、以下に記載するように処方され、投与されてよい。
以下の実施例は本発明の実施を例証するものである。これらの実施例は、例証することのみを目的としており、請求される本発明の範囲を何ら制限するものではない。
【実施例】
【００５２】
方法
二量体含有量の測定−ＨＭＷＰ ＧＰＣ法
非解離条件下で、ＦＶＩＩａサンプルを分析するために、ＳＥ-ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー法を使用した。ＨＭＷＰ(高分子量タンパク質)、すなわち二量体形態のＦＶＩＩａ凝集体、オリゴマー及びポリマーの含有量を、単量体標的生成物のピークに対する領域％として測定した。
使用されるカラムを、ウォーターズ(Waters)タンパク質パックＳＷ(７．５＊３００ｍｍで、１３．２５ｍＬのカラム容量に相当)、又は同様の仕様を有するカラムとした。一般的な分析条件を以下の通りにした：
温度：ＲＴ(２１-２５℃)；検出：２１５ｎｍでのカラム流出のＵＶ検出；流速：２．２５ＣＶ／時間に相当する０．５ｍｌ／分。
次の組成：０．２Ｍの硫酸アンモニウム、５％のイソプロパノールを含有する操作用バッファー、ｐＨ７．０に調節、を使用して、分析を実施した。
カラムの平衡化の後、０．５ＣＶの操作用バッファーを使用し、約１ｍｇのＦＶＩＩａ／ｍｌを含有するＦＶＩＩａサンプルを解凍し、２５マイクロリットル(カラム容量に対して０．２％のサンプル容量に相当)のサンプル容量を注入することにより、濃縮分析した。
ついで、サンプルを１．５ＣＶ溶出させた。
クロマトグラムは、典型的には、図３に例証されているように、２つの大きなピークと、２つの小さなピークからなる。左から見て、２つの小さなピークが、ＨＭＷＰ(ポリマーと二量体／オリゴマーのピーク)を表すと観察される。最初の大きなピークがＦＶＩＩａの単量体を表し、第２の大きなピークが塩のピークを表す。
【００５３】
実施例１  −  ３７℃での第ＶＩＩａ因子変異体の加熱処理
１５ｍＭのＣａＣｌ２、３０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．０(５℃)中に１．５ｍｇ／ｍＬのＦＶＩＩａ変異体溶液を、７００ｍＬのＨＤＰＥボトルにおいて、０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過した。１ＭのＨＣｌ又は１ＭのＮａＯＨを使用し、ｐＨを５．８(５℃)に調節した。ボトルを３７℃の温度の水浴に配した。ＨＤＰＥボトルの温度を３７℃まで上昇させるのに、約２０分かかった。溶液が３７℃に達して４５分後、ボトルを氷に配することにより、反応を停止させた。
最初の二量体含有量はＧＰＣにより７．３％と測定され、加熱処理後には２．８％まで低減した。よって、二量体含有量は２倍以上低減するため、３７℃で４５分の加熱処理で十分であることが明らかとなった。
全体で１２０分実施した、同様の実験についての、二量体含有量の低減度合いの変化を、図１に例証する。サンプルを頻繁に収集することにより、実験をモニターし；サンプルを−８０℃まで急速冷凍し；続いて分析した(以下参照)。
【００５４】
比較例１  −  ５−８℃での第ＶＩＩａ因子変異体の保存
１５ｍＭのＣａＣｌ２、３０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．０(５℃)中に１．５ｍｇ／ｍＬのＦＶＩＩａ変異体溶液を、７００ｍＬのＨＤＰＥボトルにおいて、０．２２ミクロンのフィルターを通して濾過した。１ＭのＨＣｌ又は１ＭのＮａＯＨを使用し、ｐＨを５．８(５℃)に調節した。ボトルを５-８℃の温度の水浴に配した。６０分後、ボトルを氷に配することにより、反応を停止させた。
最初の二量体含有量は７．７％であった−処理後は７．９％であった。
【００５５】
実施例２  −  ２３℃及び３７℃での第ＶＩＩａ因子変異体の長時間にわたる加熱処理
本質的に、実施例１(ｐＨ５．７)に記載されたような、３７℃での加熱処理実験を、全体で４８時間実施し、２３℃での同様の実験を、全体で４８時間実施した。双方の実験をサンプルを頻繁に収集することによりモニターし；サンプルを−８０℃まで急速冷凍し；続いて分析した(以下参照)。２つの異なる温度を使用する、二量体含有量の低減度合いの変化を、図２に例証する。３７℃では、二量体含有量の急速な低下が観察されたが、２３℃のサンプルでの二量体含有量の低減度合いはゆっくりであり、４８時間後でも、二量体含有量は、その可能な最小値に達することができなかった。この種の実験は、他の第ＶＩＩ因子ポリペプチド及び他の選択された温度についての最適条件(加熱処理に十分な時間)を決定するのに使用することができる。
比較すると、サンプル(比較例１と同様；ｐＨ５．７)を、５-８℃で、全体で４８時間放置した。この例においては、二量体含有量の僅かな増加が観察された(図２を参照；上部曲線)
【００５６】
実施例３  −  ｐＨ９．５での第ＶＩＩａ因子変異体の長時間にわたる加熱処理
本質的に、実施例１に記載されたような加熱処理実験を、全体で１６８時間実施した；しかしながら、最初のｐＨ調節は、ｐＨ５．８からｐＨ９．５に高めた。サンプルを頻繁に収集することにより、実験をモニターし；サンプルを−８０℃まで急速冷凍し；続いて分析した。高ｐＨでの二量体含有量の低減度合いの変化を、図４に例証する。ｐＨ９．５では、二量体含有量の同様の急速な低下が観察され、その後、ゆっくりとした二量体形成がなされた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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