(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
蜜炙沙参抽出物および蜜炙藁本抽出物のみからなる抽出混合物を有効成分として含有することを特徴とする化粧料組成物。
【請求項２】
蜜炙沙参抽出物および蜜炙藁本抽出物と、蜜炙されていない地骨皮の抽出物および蜜炙されていない牧丹皮の抽出物のうちいずれか１種以上との抽出混合物を有効成分として含有することを特徴とする化粧料組成物。
【請求項３】
前記蜜炙沙参抽出物および蜜炙藁本抽出物のみからなる抽出混合物、又は蜜炙沙参抽出物および蜜炙藁本抽出物と、前記蜜炙されていない地骨皮の抽出物および蜜炙されていない牧丹皮の抽出物のうちいずれか１種以上との抽出混合物は、組成物総重量に対して０.０００１〜３０重量％の量で含まれることを特徴とする請求項１または２に記載の化粧料組成物。
【請求項４】
前記蜜炙沙参抽出物および蜜炙藁本抽出物はそれぞれ、抽出混合物の総重量に対して３０〜７０重量％の量で含まれることを特徴とする請求項１または２に記載の化粧料組成物。
【請求項５】
前記蜜炙されていない地骨皮の抽出物および蜜炙されていない牧丹皮の抽出物はそれぞれ、抽出混合物の総含量に対して１０〜２０重量％の量に含まれることを特徴とする請求項２に記載の化粧料組成物。
【請求項６】
抗酸化用化粧料組成物であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の化粧料組成物。
【請求項７】
皮膚保湿用化粧料組成物であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の化粧料組成物。
【請求項８】
角質形成細胞の形成促進用化粧料組成物であることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の化粧料組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、漢方加工技術である炮製を活用して加工された沙参および藁本抽出物の混合物と、地骨皮または牧丹皮抽出物とを有効成分として含む抗酸化用および保湿用の化粧料組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
炮製法は、漢方の伝統製薬技術であって、合和（Po-je）、合薬（Hap-hwa）、修治（Su-chi）、匍炙（Po-ja）、法製（Beob-Je）および修事（Su-sa）などと称され、漢方理論に基づいて薬材を加工処理することによって、薬材本来の性質を変化させる製薬技術といえる。
【０００３】
漢薬材を炮製する目的は、薬物を清潔にして貯蔵を容易にし、薬物の毒性および副作用を低下または除去し、薬性を変化させて薬をより効果的に作製し、薬物の治療効果を増強させ、薬材の悪い臭いと味をなくして服用しやすくすることにある。
【０００４】
一方、化粧品を製造するとき、美白、シワ改善、皮膚保護など多様な効能を有した原料がスクリーニングされ、化粧品の製造時に添加される。その中でも抗酸化効果は、皮膚老化の原因物質である活性有害酸素を除去して皮膚老化を遅延させることによって、相対的に皮膚老化を予防し、くすんでいて弾力のない皮膚をさわやか且つきれいで透明にして、皮膚を健康的に見せる。しかし、抗酸化効能を有した物質は制限的であるだけでなく、効能を有した物質もあまり知られておらず、現在使用されている数少ない物質も化学的に合成して使用されている。
【０００５】
一方、皮膚は、外部から個体を保護する障壁機能という極めて重要な役割を遂行する。障壁機能は、外部からの多様な刺激（化学物質、大気汚染物質、乾燥した環境、紫外線など）に対する防御と、皮膚を通した体内水分の過度の損失を防ぐ保護機能であり、このような保護機能は、角質形成細胞から構成された角質層が正常に形成されている場合のみに、その機能を維持することができる。
【０００６】
表皮のうち最も外側に存在する角質層（stratum corneum, horney layer）は、角質形成細胞から形成され、分化が完結した角質細胞とそれを囲んだ脂質層とから構成されている（Marcelo C. L. et al, J. Invest. Dermatol., 80, pp37-44, 1983）。
【０００７】
角質細胞は、表皮最下層で持続的に増殖（proliferation）する基底細胞（basal cell）が段階的に形態および機能上の変化を経て、皮膚表面まで上昇した特徴的な細胞であり、一定期間が経過すれば、古くなった角質細胞は皮膚から脱落し、新しい角質細胞がその機能の代わりをすることになるが、このような反復的な一連の変化過程を「表皮細胞の分化（differentiation）」または「角化（keratinization）」という。
【０００８】
また、角化過程において、角質形成細胞は、天然保湿因子（Natural moisturizing factor；NMF）と細胞間脂肪質（セラミド、コレステロール、脂肪酸など）を生成しながら角質層を形成し、角質層に堅さと柔軟性を持たせて皮膚障壁（skin barrier）としての機能を保有するようにする。
【０００９】
このような角質層は、過度な洗顔や入浴などの生活習慣的要素、乾燥した大気汚染物質などの環境的な要因、またはアトピー性皮膚炎や老人性痒み症のような内因性疾患などによって、容易にその機能が失われる可能性があり、実際に現代に入って一層増えた多様な要因によって、最近、乾燥皮膚症状及びこれによる様々な障害を訴える患者がますます増加している傾向である。
【００１０】
したがって、適切な皮膚水分を維持するために、外部から水分を供給し、体内からの水分損失を防止するための研究が多様に進められてきており、実際に水分保有能力のある多様な保湿剤（moisturizer）が開発されている。皮膚保湿剤としては、セラミド等の脂質成分と、必須脂肪酸および脂質錯体などの角質層における水分保有を増加させることができる物質とを使用することが一般的である（Rawlings A. V. et al, J. Invest. Dermatol., 5, pp731-741, 1994）。
【００１１】
しかし、最近、皮膚に対する危害要因がますます増加しており、食生活様相の変化によって角質層の生成および脱落速度が遅くなり、角質形成細胞の機能低下によって角質層の保湿因子と脂質の量が減少し、角質層が正常的な皮膚障壁機能を発揮できない皮膚を有した人々が増加している傾向である。こういう皮膚障壁機能の低下は、皮膚乾燥症、アトピー皮膚炎、接触性皮膚炎、乾癬（psoriasis）などの多様な皮膚疾患を誘発するようになる。このような疾患は、既存の通常の水分保有機能を有する保湿剤だけでも症状緩和は期待できるが、根本的な治癒は難しい実情である。
【００１２】
最近、様々な化学物質などによる皮膚刺激を減らすために、天然物を用いた化粧品が多様に開発されており、天然材料は皮膚に副作用が少ないだけでなく、消費者の関心が高くなるにつれて、化粧品原料として開発価値が一層増えている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
これにより、本発明者は、上記した問題点を解決し、より優れた抗酸化および皮膚保湿原料を探そうと研究した結果、蜜炙沙参（honey-roasted Adenophora triphylla var. japonica Hara）抽出物と、蜜炙藁本（honey-roasted Angelica tenuissima）抽出物と、地骨皮（Lycium chinense Mill.）や牧丹皮（Paeonia suffruticosa Andrews）などの生薬抽出物との複方混合物が、抗酸化および皮膚保湿效果に極めて優れていることを発見して本発明を完成するに至った。
【００１４】
したがって、本発明の目的は、炮製加工された漢方薬材抽出物および生薬抽出物を含有して、優れた抗酸化効果および皮膚保湿效果を奏する化粧料組成物を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、蜜炙沙参抽出物および蜜炙藁本抽出物のみからなる抽出混合物を有効成分として含有する。また、本発明は、蜜炙沙参抽出物および蜜炙藁本抽出物と、蜜炙されていない地骨皮の抽出物および蜜炙されていない牧丹皮の抽出物のうちいずれか１種以上との抽出混合物を有効成分として含有する。
【００１６】
以下、本発明を詳しく説明する。
本発明で用いられる沙参（Adenophora triphylla var. japonica Hara, Adenophora polyantha Naka, Adenophora triphylla var. hirsuta Naka, Adenophora lilifolia Ledeb., Adenophora stricta Miq., Adenophora taquetii Lev., Adenophora palustris Kom.）は、方錐形ないしは長い円錐形であり、曲がっていて、稀には枝根がある。上側に輪状の横シワの根茎があり、長さは５〜２０ｃｍである。根元の上側の直径は１〜３ｃｍである。根元の外側面は、薄い黄白色ないしは薄い灰褐色を帯びて、上側は明確な輪状の横シワがあり、下側の部分は縦および横のシワがある。根元は軽くて折れやすく、折れた面は乳白色を帯びて隙間が多い。
【００１７】
本発明で使用される藁本（Angelica tenuissima Nakai, Ligusticum sinense Oliv, Ligusticum jeholense Nakai et Kitagaw）は、均一でなく分かれた長い円柱形であり、長さ５〜９ｃｍ、直径７〜２０ｍｍ、根頭部には茎の細い枝が残っている。外側面は灰褐色ないしは茶色であり、質は堅い。折れた面は、黄白色であってざらざらとし、中心部が空いているものもある。この薬は特異な香りがあり、味は辛い。
【００１８】
本発明で使用される牧丹皮（Paeonia suffruticosa Andrews, Paeonia suffruticosa var. spontanea Rehd, Paeonia szechuanica Fang.）は、管状ないしは半管状の樹皮であり、長さ５〜８ｃｍ、直径１０〜１５ｍｍ、厚さ２〜６ｍｍである。外側面は、暗い茶色ないしは紫色を帯びた茶色であり、横で長くて小さい楕円形の支根の跡と縦シワがあり、内側面は、薄い灰褐色ないしは暗い紫色を帯びており、平坦であり、折れた面は粗い。内側面および折れた面には、度々白色の結晶がついている。
【００１９】
本発明で使用される地骨皮（Lycium chinense Mill., Lycium barbarum L.）は、管状ないしは半管状、または切れ端であり、厚さは１〜３ｍｍである。外側面は黄色ないしは灰褐色であり、内面は灰色ないしは灰褐色であり、周皮はうろこ形であって剥がれやすい。折れた面は灰白色ないしは灰褐色を示し、繊維性ではなく、質は軽くて粗い。
【００２０】
本発明で使用される抽出物の製造方法は、下記の通りである。
ａ）炮製を通した漢薬材の加工ステップ
本願発明で使用する沙参と藁本は、炮製法の中でも蜜炙法を用いて加工する。蜜炙法は、まず、煉蜜を適当量のお湯に希釈した後、薬材にハチミツをスプレーするか浸して（３０分〜３時間）、文火（weak fire）で規定された程度（１００〜１８０℃の温度で１０分〜１時間程度）まで炒め、乾燥する。通常、１００ｋｇの薬材に蜂蜜２５〜３０ｋｇを使用する。
【００２１】
本発明では、まず、沙参または藁本に、蜂蜜を薬材使用量の２０〜３０重量％の量にして、３０分〜１時間程度吸収させ、１００〜１８０℃の温度で１０分〜１時間程度炒めて加工することができ、前記温度と時間は、これに限定されるものではなく、容易に選定して実施することができる。
【００２２】
b）抽出物を得るステップ
前記ａ）ステップを経た沙参及び藁本と、乾燥した牧丹皮または地骨皮とに、水または有機溶媒を入れて、還流抽出して沈積させる。その後、濾布濾過および遠心分離によって残渣（residue）と濾液を分離し、分離した濾液を減圧濃縮して蜜炙沙参と蜜炙藁本との抽出物、および牧丹皮または地骨皮の生薬抽出物を得る。
【００２３】
本発明に使用される有機溶媒は、エタノール、メタノール、ブタノール、エーテル、エチルアセテート、クロロホルム、およびこれらの有機溶媒と水との混合溶媒からなる群より選ばれることができ、好ましくは８０％のエタノールが使用される。
【００２４】
このとき、抽出温度は１０〜８０℃が好ましく、６〜２４時間抽出することができる。前記抽出温度および抽出時間を外れると、抽出効率が劣ったり成分の変化が起こったりする場合がある。
【００２５】
上記において溶媒を用いて抽出物を得た以後、当業界で知られた通常の方法によって常温で浸漬させ、加熱および濾過して液状物を得ることができ、または、追加で溶媒を蒸発、噴霧乾燥または凍結乾燥することによって、抽出物を製造することができる。
【００２６】
本発明の化粧料組成物は、蜜炙沙参および蜜炙藁本の抽出物の混合物、または、これに地骨皮および牧丹皮のうち１種以上の抽出物をさらに含有した混合物を、組成物総重量に対して０.０００１〜３０重量％の量で含有する。その含量が０.０００１重量％未満であれば、前記抽出物による期待される効果などを得ることができず、３０重量％を超過すれば、含量増加に比べてその効果の増加が大きくない。
【００２７】
また、前記混合物は、混合物総重量に対して蜜炙沙参抽出物を３０〜７０重量％、蜜炙藁本抽出物を３０〜７０重量％、地骨皮抽出物を１０〜２０重量％、および牧丹皮抽出物を１０〜２０重量％の量に含有し、好ましくは蜜炙沙参、蜜炙藁本、地骨皮および牧丹皮の抽出物を、２〜４:２〜４:１:１の比率で含有する。
【００２８】
本発明の化粧料組成物は、上記した漢薬材抽出物を有効成分として含有することによって、優れた抗酸化効果および皮膚保湿效果を提供する。
【発明の効果】
【００２９】
本発明の化粧料組成物は、蜜炙沙参と蜜炙藁本抽出物の混合物を含有し、または、これに地骨皮または牧丹皮の抽出物をさらに含有することによって、優れた抗酸化効果および皮膚保湿效果を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、本発明で使用されるHaCaT細胞株に、PPREプロモーター／レポータープラスミドとPPARα発現プラスミドとを使用してトランスフェクションさせた後、薬物で処理してルシフェラーゼ（luciferase）活性を測定した結果を示す図である。
【図２】図２は、PPARγ発現プラスミドとPPREプロモーター／レポータープラスミドとを同時に使用してトランスフェクションさせた後、薬物で処理してルシフェラーゼ活性を測定した結果を示す図である。
【図３】図３は、本発明に係る複方生薬抽出物が、損傷された皮膚障壁の回復に及ぼす効果を示すグラフである。
【図４】図４は、本発明に係る複方生薬抽出物が、皮膚水分量に及ぼす効果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
以下、実施例および試験例を挙げて、本発明をより具体的に説明するが、これらの実施例および試験例は本発明に対する理解を助けるためのもので、本発明の範囲がこれらの例に限定されるものではない。
【００３２】
［製造例１］沙参抽出物の製造
乾燥した沙参１ｋｇに８０％のエタノール水溶液５リットルを入れて、３回還流抽出した後、１５℃で１日間沈積させた。その後、濾布濾過および遠心分離によって残渣と濾液を分離し、分離した濾液を減圧濃縮して沙参抽出物３００ｇを得た。
【００３３】
［製造例２］藁本抽出物の製造
乾燥した藁本１ｋｇに８０％のエタノール水溶液５リットルを入れて、３回還流抽出した後、１５℃で１日間沈積させた。その後、濾布濾過および遠心分離によって残渣と濾液を分離し、分離した濾液を減圧濃縮して藁本抽出物２５０ｇを得た。
【００３４】
［製造例３］地骨皮抽出物の製造
乾燥した地骨皮１ｋｇに８０％のエタノール水溶液５リットルを入れて、３回還流抽出した後、１５℃で１日間沈積させた。その後、濾布濾過および遠心分離によって残渣と濾液を分離し、分離した濾液を減圧濃縮して地骨皮抽出物２１５ｇを得た。
【００３５】
［製造例４］牧丹皮抽出物の製造
乾燥した牧丹皮１ｋｇに８０％のエタノール水溶液５リットルを入れて、３回還流抽出した後、１５℃で１日間沈積させた。その後、濾布濾過および遠心分離によって残渣と濾液を分離し、分離した濾液を減圧濃縮して牧丹皮抽出物２１５ｇを得た。
【００３６】
［製造例５］蜜炙沙参抽出物の製造
乾燥した沙参１ｋｇに蜂蜜３００ｇ（薬材使用量の２０〜３０％）を薬材に十分に吸収させた後、１５０℃で１５分間炒めた後に陰干しをした。８０％のエタノール水溶液５リットルを入れて、３回減圧抽出した後、１５℃で１日間沈積させた。その後、濾布濾過および遠心分離によって残渣と濾液を分離し、分離した濾液を減圧濃縮して蜜炙沙参抽出物４００ｇを得た。
【００３７】
［製造例６］蜜炙藁本抽出物の製造
乾燥した藁本１ｋｇに蜂蜜３００ｇ（薬材使用量の２０〜３０％）を薬材に十分に吸収させた後、１５０℃で１５分間炒めた後に陰干しをした。８０％のエタノール水溶液５リットルを入れて、３回減圧抽出した後、１５℃で１日間沈積させた。その後、濾布濾過および遠心分離によって残渣と濾液を分離し、分離した濾液を減圧濃縮して蜜炙藁本抽出物３５０ｇを得た。
【００３８】
［製造例７］蜜炙地骨皮抽出物の製造
乾燥した地骨皮１ｋｇに蜂蜜３００ｇ（薬材使用量の２０〜３０％）を薬材に十分に吸収させた後、１５０℃で１５分間炒めた後に陰干しをした。８０％のエタノール水溶液５リットルを入れて、３回減圧抽出した後、１５℃で１日間沈積させた。その後、濾布濾過および遠心分離によって残渣と濾液を分離し、分離した濾液を減圧濃縮して蜜炙地骨皮抽出物２７０ｇを得た。
【００３９】
［製造例８］蜜炙牧丹皮抽出物の製造
乾燥した牧丹皮１ｋｇに蜂蜜３００ｇ（薬材使用量の２０〜３０％）を薬材に十分に吸収させた後、１５０℃で１５分間炒めた後に陰干しをした。８０％のエタノール水溶液５リットルを入れて、３回減圧抽出した後、１５℃で１日間沈積させた。その後、濾布濾過および遠心分離によって残渣と濾液を分離し、分離した濾液を減圧濃縮して蜜炙牧丹皮抽出物３２０ｇを得た。
【００４０】
［製造例９］複方混合抽出物１の製造
それぞれ製造例１、２、３および４の方法によって抽出した乾燥された沙参、藁本、地骨皮および牧丹皮の抽出物を、１：１：１：１の重量比で混合して２ｋｇを準備し、８０％のエタノール水溶液５リットルを入れて、３回還流抽出した後、１５℃で１日間沈積させた。その後、濾布濾過および遠心分離によって残渣と濾液を分離し、分離した濾液を減圧濃縮して複方生薬抽出物２００ｇを得た。
【００４１】
［製造例１０］複方混合抽出物２の製造
それぞれ製造例１、２、３および４の方法によって抽出した乾燥された沙参、藁本、地骨皮および牧丹皮の抽出物を、３：３：１：１の重量比で混合して２ｋｇを準備し、８０％のエタノール水溶液５リットルを入れて、３回還流抽出した後、１５℃で１日間沈積させた。その後、濾布濾過および遠心分離によって残渣と濾液を分離し、分離した濾液を減圧濃縮して複方生薬抽出物２３０ｇを得た。
【００４２】
［製造例１１］複方混合抽出物３の製造
それぞれ製造例５、６、７および８の方法によって抽出した乾燥された蜜炙沙参、蜜炙藁本、蜜炙地骨皮および蜜炙牧丹皮の抽出物を、１：１：１：１の重量比で混合して２ｋｇを準備し、８０％のエタノール水溶液５リットルを入れて、３回還流抽出した後、１５℃で１日間沈積させた。その後、濾布濾過および遠心分離によって残渣と濾液を分離し、分離した濾液を減圧濃縮して複方生薬抽出物２６０ｇを得た。
【００４３】
［実施例１］複方混合抽出物４の製造
それぞれ製造例５および６の方法によって抽出した乾燥された蜜炙沙参および蜜炙藁本の抽出物を、１：１の重量比で混合して２ｋｇを準備し、８０％のエタノール水溶液５リットルを入れて、３回還流抽出した後、１５℃で１日間沈積させた。その後、濾布濾過および遠心分離によって残渣と濾液を分離し、分離した濾液を減圧濃縮して複方生薬抽出物３５０ｇを得た。
【００４４】
［実施例２］複方混合抽出物５の製造
それぞれ製造例５、６および３の方法によって抽出した乾燥された蜜炙沙参、蜜炙藁本および地骨皮の抽出物を、３：３：１の重量比で混合して２ｋｇを準備し、８０％のエタノール水溶液５リットルを入れて、３回還流抽出した後、１５℃で１日間沈積させた。その後、濾布濾過および遠心分離によって残渣と濾液を分離し、分離した濾液を減圧濃縮して複方生薬抽出物３３５ｇを得た。
【００４５】
［実施例３］複方混合抽出物６の製造
それぞれ製造例５、６および４の方法によって抽出した乾燥された蜜炙沙参、蜜炙藁本および牧丹皮の抽出物を、３：３：１の重量比で混合して２ｋｇを準備し、８０％のエタノール水溶液５リットルを入れて、３回還流抽出した後、１５℃で１日間沈積させた。その後、濾布濾過および遠心分離によって残渣と濾液を分離し、分離した濾液を減圧濃縮して複方生薬抽出物３１５ｇを得た。
【００４６】
［実施例４］複方混合抽出物７の製造
それぞれ製造例５、６、３および４の方法によって抽出した乾燥された蜜炙沙参、蜜炙藁本、地骨皮、牧丹皮の抽出物を、３：３：１：１の重量比で混合して２ｋｇを準備し、８０％のエタノール水溶液５リットルを入れて、３回還流抽出した後、１５℃で１日間沈積させた。その後、濾布濾過および遠心分離によって残渣と濾液を分離し、分離した濾液を減圧濃縮して複方生薬抽出物２４８ｇを得た。
【００４７】
［試験例１］抗酸化効果試験（ＤＰＰＨテスト）
本発明に係る組成物の抗酸化効能を確認するために、ＤＰＰＨ酸化抑制効能を測定した。対照群として合成抗酸化剤であるトロロクス（Trolox）を使用した。
【００４８】
有機ラジカルであるＤＰＰＨ（1,1-ジフェニル-2-ピクリルヒドラジル、1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）の還元によって（抗酸化剤は酸化される）生じる吸光度の変化に基づいて、抗酸化能を評価する方法を使用した。前記製造例１〜１１で得られた抽出物および混合物と、実施例１〜４で得られた混合物に対して、ＤＰＰＨの酸化が抑制されて吸光度が対照群に比べて減少する程度を測定し、対照群の吸光度に比べて５０％の吸光度を示す濃度を有効抗酸化濃度として評価した。
【００４９】
１００μＭ（inエタノール）ＤＰＰＨ溶液１９０μｌに、製造例１〜１１または実施例１〜４で得られた試料をそれぞれ１０μｌずつ入れて反応液を作製した。当該反応液を３７℃で３０分間反応させた後、５４０ｎｍで吸光度を測定した。対照試料としては広く使用されている合成抗酸化剤であるトロロクス（Trolox）を使用した。各資料のＤＰＰＨ分析結果は下記表１に示し、ＩＣ50は添加した試料によって吸光度が５０％減少した時の試料濃度を意味する。
【００５０】
【表１】
0005577347.tif 000002
【００５１】
前記表１から確認できるように、本発明によって生薬抽出物を適切に混合した実施例１〜４の混合物は、製造例１〜１１に比べて、優れた抗酸化能を示す。特に、蜜炙沙参、蜜炙藁本、地骨皮および牧丹皮の抽出物を適切に混合した実施例４の混合物が、最も優れた抗酸化効能を示すことが分かる。また、実施例４の混合物は、合成抗酸化剤のトロロクスに比べて非常に高い抗酸化能を示すことが分かる。
【００５２】
［試験例２］ＰＰＡＲの活性化確認
人体角質形成細胞株（human keratinocyte）のHaCaTを、１０％ウシ胎児血清（Fetal bovine serum；FBS）を含むＤＭＥＭ培地に継代培養し、フェノールレッド（phenol red）のエストロゲン（estrogen）による効果を除去するために、フェノールレッド・フリー（phenol red-free）培地を使用した。以下の３つの異なったプラスミド（plasmid）が使われ、それは、一般的な培養条件でも発現されるユニバーサルプロモーター（universal promoter）の下流（downstream）に、PPARα、PPARβ／δ、及びPPARγ遺伝子を有するプラスミドと、リガンド結合型のPPARsとが結合して活性化するPPAR反応要素（PPARs Response Element、「PPRE」）をプロモーターに有し、尚且つ下流にレポーターとしての役割をするホタルルシフェラーゼ（firefly luciferase）遺伝子を有するプラスミドと、ユニバーサルプロモーターにβ-ガラクトシダーゼ（β-galactosidase）遺伝子が結合された参照（reference）プラスミドとが使用された（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 (1994) 7355-7359）。
【００５３】
HaCaT細胞を５×１０4の濃度で２４ウェル（well）型プレートに蒔いて２４時間培養した後、前記プラスミド遺伝子を用いて一時的なトランスフェクション（transient transfection）をした。２４時間培養した後にリン酸緩衝溶液（PBS）で洗浄した後、7,3',4'-トリヒドロキシイソフラボンと、陽性対照群として既に知られたPPARsリガンド（PPARαリガンドのWy-14,643、又はPPARγリガンドのトログリタゾン（troglitazone、TGZ））とを、特定の濃度で用いて処理した。陰性対照群としては試料を溶かす時に使用したエタノールで処理した群を利用した。２４時間培養した後にＰＢＳで洗浄し、細胞を収穫ルシフェラーゼ活性を測定した。その測定結果を表２〜３および図１〜２に示した。
【００５４】
【表２】
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【００５５】
【表３】
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【００５６】
表２および図１は、研究に使用されるHaCaT細胞株に、PPREプロモーター／レポータープラスミドとPPARα発現プラスミドとを用いてトランスフェクションさせた後、薬物を処理してルシフェラーゼ活性を測定した結果である。表３および図２は、PPARγ発現プラスミドとPPREプロモーター／レポータープラスミドとを同時にトランスフェクションさせた後、薬物を処理してルシフェラーゼ活性を測定した結果である。
【００５７】
各グラフの最初のコラムは、陰性対照群としてエタノール処理した群のルシフェラーゼ活性を示したものであり、二番目コラムは、陽性対照群としてPPARαリガンドであるWy-14,643、又はPPARγリガンドのトログリタゾンを処理したものである。
【００５８】
表２〜３および図１〜２を見れば、製造例１〜１１よりもこれらを適切に混合した実施例１〜４が有意の程度のPPARαおよびPPARγの活性を誘導して高いルシフェラーゼ活性を示し、特に、蜜炙沙参、蜜炙藁本、地骨皮および牧丹皮の抽出物を適切に混合した実施例４は、最も高い活性度を示すことを確認することができる。
【００５９】
［試験例３］角質形成細胞の分化促進効果
前記試料の角質形成細胞の分化促進効果を調べてみるために、下記のように角質形成細胞の分化時に生成される角化膜（Cornified Envelope、CE）量を吸光度を用いて測定した。
【００６０】
まず、新生児の表皮から分離して一次培養した人の角質形成細胞を培養用フラスコに入れて、底に付着させた後、下記表４の試験物質を培養液に１ｐｐｍ濃度で入れて処理した後、細胞が底面積の７０〜８０％程度に育つまで５日間培養した。このとき、低カルシウム（０.０３ｍＭ）処理群と高カルシウム（１.２ｍＭ）処理群を、それぞれ陰性対照群、陽性対照群とした。次いで、前記培養した細胞を収穫してＰＢＳ（Phophate buffered saline）で洗浄した後、２％ ＳＤＳ（sodium dodecyl sulfate）と２０ｍＭの濃度のジチオスレイトール（Dithiothreitol；DTT）とを含有した１０ｍＭ濃度のトリス-塩酸緩衝液（Tris-HCl, pH7.4）１ｍｌを加えて、超音波処理（sonication）をし、ボイリング（boiling）、遠心分離した後、沈殿物を再び１ｍｌのＰＢＳに懸濁させて３４０ｎｍでの吸光度を測定した。これとは別途に前記超音波処理後の溶液を一部取ってタンパク質含量を測定し、細胞分化程度を評価する時に基準とした。その結果を下記表４に示した。
【００６１】
【表４】
0005577347.tif 000005
【００６２】
前記表４に示したように、製造例１〜１１の効能よりもこれらを本発明によって適切に混合した実施例１〜４が、有意の程度の角質形成細胞の分化を促進することが分かり、特に、実施例４の場合、最も優れた効能を確認することができる。
【００６３】
［試験例４］無毛マウス皮膚における皮膚障壁機能の回復および皮膚保湿力増加の効果の測定
前記試料が皮膚損傷によって損傷された皮膚障壁機能の回復に及ぼす効果、および、皮膚保湿力増加に及ぼす効果を測定するために、下記のような実験を遂行した。
【００６４】
まず、出生後８〜１０週経過した無毛マウス（Charles River, Japan）の背中にアセトンを１日２回ずつ５日間周期的に塗布し、実験動物の背中の皮膚の障壁機能損失を誘導した後、蒸発計（Evaporimeter）で経皮水分喪失（Transepidermal water loss、ＴＥＷＬ）を測定し、４０ｇ／ｍ2／ｈｒ以上の経皮水分喪失を示す皮膚を有した実験動物のみを対象とした。選択した実験動物に対して試験物質でプロピレングリコールとエタノールを７：３の比率で混合したビヒクル（Vehicle）（ビヒクル処理群）と、実施例１〜４および製造例１〜１１をそれぞれ１％含有した試料を、皮膚面積５ｃｍ2当たり２００μlの容量で１日２回ずつ３日間連続塗布しながら、一定時間ごとにＴＥＷＬを測定して、その結果を表５および図３に示した。
【００６５】
【表５】
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【００６６】
また、コルネオメーター（Corneometer, ドイツCourage Khazaka 社）を使用して皮膚水分量を同時に測定し、その結果を表６および図４に示した。このとき、無処理群の皮膚水分量も共に測定した。
【００６７】
【表６】
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【００６８】
表５および図３に示したように、前記実施例１〜４の処理群が、ビヒクルおよび製造例１〜１１の処理群よりもさらに早く皮膚の障壁損傷が回復したことが分かり、特に、実施例４の場合、最も優れた皮膚障壁損傷の回復効果を奏することを確認することができた。
【００６９】
また、表６および図４に示したように、皮膚水分量においても実施例１〜４の処理群が、ビヒクルおよび製造例１〜１１の処理群よりも高いことを確認することができる。
【００７０】
したがって、これによって、前記複方生薬抽出物を処理した場合、皮膚障壁損傷の回復と共に皮膚水分量も増加することが分かる。
【００７１】
前記試験例１〜４の結果を通じて、本発明の組成物は、角質形成細胞の形成を促進して角質層が正常な皮膚障壁機能を発揮させることによって、皮膚保湿效果も増進させることが可能であることが分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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