(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト糖蛋白質ｇｐ１３０の全細胞外部分を含むポリペプチドであって、作動性の複合体ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒの活性を阻害することができ、
以下の置換：Ｔｈｒ１０２Ｔｙｒ（Ｔ１０２Ｙ）、Ｇｌｎ１１３Ｐｈｅ（Ｑ１１３Ｆ）、及びＡｓｎ１１４Ｌｅｕ（Ｎ１１４Ｌ）、の少なくとも１つによって特徴づけられる、前記ポリペプチド。
【請求項２】
Ｔｈｒ１０２Ｔｙｒ（Ｔ１０２Ｙ）、Ｇｌｎ１１３Ｐｈｅ（Ｑ１１３Ｆ）、又はＡｓｎ１１４Ｌｅｕ（Ｎ１１４Ｌ）の変異うちの任意の２つが組合されて、二重変異蛋白質Ｔｈｒ１０２Ｔｙｒ／Ｇｌｎ１１３Ｐｈｅ（Ｔ１０２Ｙ／Ｑ１１３Ｆ）、Ｔｈｒ１０２Ｔｙｒ／Ａｓｎ１１４Ｌｅｕ（Ｔ１０２Ｙ／Ｎ１１４Ｌ）、及びＧｌｎ１１３Ｐｈｅ／Ａｓｎ１１４Ｌｅｕ（Ｑ１１３Ｆ／Ｎ１１４Ｌ）を生じる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
３つの変異Ｔｈｒ１０２Ｔｙｒ（Ｔ１０２Ｙ）、Ｇｌｎ１１３Ｐｈｅ（Ｑ１１３Ｆ）、及びＡｓｎ１１４Ｌｅｕ（Ｎ１１４Ｌ）の全てが組合されて、三重変異蛋白質Ｔｈｒ１０２Ｔｙｒ／Ｇｌｎ１１３Ｐｈｅ／Ａｓｎ１１４Ｌｅｕ（Ｔ１０２Ｙ／Ｑ１１３Ｆ／Ｎ１１４Ｌ）を生じる、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが直接又はポリペプチドリンカーを介してタグに融合されている、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の変異したｇｐ１３０ポリペプチド。
【請求項５】
前記変異したｇｐ１３０ポリペプチドと、その融合パートナーとを連結しているポリペプチドリンカーが、柔軟であり、グリシン、セリン、アスパラギン、トレオニン、及びアラニンからなる群より独立して選択される２ないし５０個のアミノ酸残基を含む、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
１つ以上のＮ−グリコシル化部位が、変異したｇｐ１３０ポリペプチドとタグとの間、変異したｇｐ１３０ポリペプチドとリンカーとの間、及び／又は、リンカーとタグとの間に挿入されている、請求項１ないし５のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドがＰＥＧ付加されている、請求項１ないし６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、化学的又は物理的結合により互いに結合されている２つの単量体をもつ二量体である、請求項１ないし７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記２つの単量体が同一である、請求項８に記載のポリペプチド二量体。
【請求項１０】
前記２つの単量体が、単純な共有結合、柔軟なポリペプチドリンカー、又は１個以上のジスルフィド架橋によって互いに結合されている、請求項８又は９に記載のポリペプチド二量体。
【請求項１１】
前記単量体が、ジスルフィド架橋により連結されており、これらは前記単量体を１個以上の遊離のアクセス可能なシステイン残基を含む天然産又は人工のポリペプチドに融合させることにより生成される、請求項１０に記載のポリペプチド二量体。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが、免疫グロブリン蛋白質のＦｃドメインに融合されている、請求項８ないし１１のいずれか１項に記載のポリペプチド二量体。
【請求項１３】
前記免疫グロブリンがＩｇＧである、請求項１２に記載のポリペプチド二量体。
【請求項１４】
前記ＩｇＧ蛋白質がＩｇＧ１である、請求項１３に記載のポリペプチド二量体。
【請求項１５】
請求項１ないし１４のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記ポリヌクレオチドの配列が、原核生物若しくは真核生物宿主細胞における、又は無細胞発現系における、コードされたポリペプチドの産生についてコドン最適化されている、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項１５又は１６に記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載の発現ベクターを含有する、宿主細胞又は無細胞発現系。
【請求項１９】
請求項１ないし１４のいずれか１項に記載のポリペプチド単量体又は二量体を製造する方法であって、宿主細胞を培養し、又は請求項１８に記載の無細胞発現系を使用し、そして、前記宿主細胞、培地、又は無細胞発現系から前記ポリペプチド単量体又は二量体を回収及び精製することを含む前記方法。
【請求項２０】
請求項１ないし１４のいずれか１項に記載のポリペプチド単量体若しくは二量体、請求項１５若しくは１６に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１７に記載の発現ベクターを含有する医薬組成物。
【請求項２１】
作動性の複合体ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒのブロックが有益な効果をもつ疾患又は障害の、治療及び／又は予防用の医薬組成物の調製のための、請求項１ないし１４のいずれか１項に記載のポリペプチド単量体若しくは二量体、請求項１５若しくは１６に記載のポリヌクレオチド、又は請求項１７に記載の発現ベクターの使用であって、ここで、前記疾患が、骨再吸収、高カルシウム血症、悪液質、腫瘍若しくは他のタイプの癌、自己免疫疾患、炎症性又はアトピー性疾患、感染症、敗血症、内分泌障害、又は代謝性若しくは異化性疾患である前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターロイキン−６（ＩＬ−６）とその可溶性受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）から構成されるリガンド複合体に対して改善された結合活性をもつ、糖蛋白質ｇｐ１３０ポリペプチドの変異蛋白質（ｍｕｔｅｉｎ）に関する。特に、各々がＩｇＧ蛋白質のＦｃドメインに融合している、ｇｐ１３０細胞外ドメイン（可溶性ｇｐ１３０、ｓｇｐ１３０）の２つの同一の変異蛋白質を含むポリペプチド二量体（ｓｇｐ１３０Ｆｃ）は、改善された生物学的活性を示す。本発明はまた、変異したｓｇｐ１３０ポリペプチド（ｓｇｐ１３０変異蛋白質）又はその二量体を含有する医薬組成物、及び様々な医療用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
多面発現性サイトカインであるインターロイキン−６（ＩＬ−６）は、広範囲の生物学的機能を示し、その中で最も顕著なものは、Ｂ細胞を刺激し、肝臓において急性期の蛋白質合成を誘導することである。ＩＬ−６は、４−ヘリックスバンドル型サイトカインのファミリーに属する。このサイトカインの構造は、１本の長いループ（ＡＢ）、１本の短いループ（ＢＣ）、及び再び１本の長いループ（ＣＤ）によって連結された、４つのヘリックス（Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤ）からなる。ＩＬ−６は、細胞表面で、ＩＬ−６、ＩＬ−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）、及び２つのｇｐ１３０分子から構成される複合体を介してシグナルを伝達する（非特許文献１）。この複合体のリガンド誘導性の活性化は、会合したヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）の活性化につながり、これは、それら自身及びｇｐ１３０の細胞質部分をリン酸化する（非特許文献２）。可溶性型のＩＬ−６Ｒ（ｓＩＬ−６Ｒ）は、交互スプライシング又はシェディングのいずれかにより産生され、これもまたＩＬ−６と複合体形成した場合、ｇｐ１３０の二量体化及びシグナリングを誘発することができる。
【０００３】
ＩＬ−６Ｒの細胞質部分はシグナル伝達に寄与しないことから、ｇｐ１３０ホモ二量体によるシグナリングは、膜結合型又は可溶性のＩＬ−６Ｒと複合体形成したＩＬ−６によって誘導することができる。しかしながら、ｓＩＬ−６Ｒの存在は、ＩＬ−６反応性細胞にリガンドに対する感受性化をもたらす。さらに、ＩＬ−６に厳密に依存するハイブリドーマ細胞は、培地中に存在するｓＩＬ−６Ｒが連続的に除去される場合、ごく少量のＩＬ−６に応答して増殖しない。
【０００４】
ＩＬ−６の他にも、ｇｐ１３０は、４−ヘリックスバンドルサイトカインファミリーの別のメンバー、例えば、ＩＬ−１１、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、カルディオトロピン様サイトカイン（ＣＬＣ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、カルディオトロピン−１（ＣＴ−１）、及びニューロポエチン（ＮＰＮ）、又は最近記載されたサイトカインＩＬ−２７によっても使用される。これらのサイトカインは全て、２つ又は３つの部分からなる受容体複合体を介して作用し、シグナリングは、ホモ二量体化（ＩＬ−６及びＩＬ−１１について）、又はｇｐ１３０の、例えばＬＩＦ−Ｒとのヘテロ二量体化（ＬＩＦについては、ＣＴ−１、ＯＳＭ、ＣＬＣ、及びＣＮＴＦ）によって誘発される。したがって、これらのサイトカインは、様々な組織において、同様の生物学的活性を媒介する。
【０００５】
ｇｐ１３０は、ほとんど全ての細胞タイプに見出すことができるが、ＩＬ−６Ｒは、はるかに制限された発現を示す。１つの細胞タイプによるｓＩＬ−６Ｒの放出は、ｇｐ１３０のみ発現する別の細胞を、ＩＬ−６に対して反応性にさせる。このプロセスは、トランスシグナリングと呼ばれる。実際、ｓＩＬ−６ＲとＩＬ−６との複合体を必要とし、ＩＬ−６単独では観察されない、いくつかの細胞活性が記載されている。デザイナーサイトカインであるＨｙｐｅｒ−ＩＬ−６（Ｈ−ＩＬ−６）では、ｓＩＬ−６ＲのＣ−末端は、柔軟なペプチドリンカーにより、成熟ＩＬ−６のＮ−末端に共有結合によって融合されている（非特許文献３）。ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒの複合体に見られるように、Ｈ−ＩＬ−６もｇｐ１３０のみを発現する細胞に対して作用する。別々の成分であるＩＬ−６及びｓＩＬ−６Ｒとは対照的に、この融合分子は、同等の生物学的シグナルを誘導するのに１００ないし１０００倍低い濃度で充分である。ＩＬ−１１は、ｇｐ１３０ホモ二量体を介してシグナリングする別のサイトカインである。ＩＬ−１１受容体は可溶性型では存在しないことから、トランスシグナリングを示さない。可溶性のｇｐ１３０蛋白質は、ヒト血漿中に高濃度で構成的に見出され、ＩＬ−６トランスシグナリングの天然の緩衝剤及び阻害剤として機能する。
【０００６】
種々の疾患又は障害の治療には、可溶性ＩＬ−６Ｒに依存するＩＬ−６応答の特異的ブロックが望ましいであろう。このような疾患としては、骨再吸収、高カルシウム血症、悪液質、腫瘍又は他のタイプの癌（例えば、結腸癌、多発性骨髄腫、リンパ腫、白血病、ホジキン病、又はキャッスルマン病）、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症（ＭＳ）、１型糖尿病、又は紅斑性狼瘡）、炎症性又はアトピー性疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、リウマチ様関節炎、若年性リウマチ様関節炎、喘息、乾癬、サルコイドーシス、ぶどう膜炎、又はアレルギー性結膜炎）、感染症（例えば、細菌、ウイルス、真菌、又は他の病原体による）、敗血症、並びに内分泌障害、及び代謝性若しくは異化性疾患（例えば、２型糖尿病、肥満症、高血糖症、又は高コレステロール血症）が挙げられる。例えば、ｓｇｐ１３０二量体又はｓｇｐ１３０Ｆｃ二量体は、作動性の（ａｇｏｎｉｓｔｉｃ）ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ複合体の作用を阻害するべくデザインされた治療用途に有用であることが見出された。
【０００７】
ＩＬ−６の、（可溶性又は膜結合型の）ＩＬ−６Ｒ及びｇｐ１３０と接触している領域は、部位Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩと呼ばれる。ＩＬ−６Ｒは、ＩＬ−６の部位Ｉに結合する。コレセプターであるｇｐ１３０は、背の高いサイトカイン受容体のクラスに属し、この受容体のリガンド結合ドメインと膜貫通領域との間に、３つのフィブロネクチンドメイン（Ｄ４−Ｄ６）を示す（非特許文献４）。ｇｐ１３０のリガンド結合ドメインもまた、３つのドメイン（Ｄ１−Ｄ３）、すなわち、Ｎ−末端免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン（Ｄ１）、及び２つのフィブロネクチン・タイプＩＩＩ様ドメイン（Ｄ２及びＤ３）から構成され、このうちの後者は、サイトカイン結合モジュールと呼ばれる（非特許文献５）。ｇｐ１３０のＮ末端Ｉｇ様ドメインはＩＬ−６の部位ＩＩＩと接触するのに対し、ｇｐ１３０のサイトカイン結合モジュールは部位ＩＩに結合する。六量体複合体（ＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ／ｇｐ１３０）2の三次元構造が解明された（非特許文献６）。しかしながら興味深いことに、ＩＬ−６の部位ＩＩＩはまだ完全には解明されていない。ヘリックスＡのＣ−末端部分及びＡＢループのＮ−末端部分は解明されていないが、この領域は、ＩＬ−６とｇｐ１３０との間の相互作用部位の部分である。改善された結合活性をもつｓｇｐ１３０変異体は、これまでに記載されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏら、Ｂｌｏｏｄ、１９９５年、第８６巻、ｐ．１２４３−５４。
【非特許文献２】Ｄａｒｎｅｌｌ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９９７年、第２７７巻、ｐ．１６３０−５。
【非特許文献３】Ｆｉｓｃｈｅｒら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７年、第１５巻、ｐ．１４２−５。
【非特許文献４】Ｓｐｒａｎｇ及びＢａｚａｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１９９３年、第３巻、ｐ．８１５−２７。
【非特許文献５】Ｇｒｏｔｚｉｎｇｅｒら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９９年、第３８０巻、ｐ．８０３−１３）。
【非特許文献６】Ｂｏｕｌａｎｇｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００３年、第３００巻、ｐ．２１０１−４）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明の根底にある技術的問題は、改善された結合活性をもつｓｇｐ１３０変異蛋白質を提供することであり、これを用いて、高い生物学的活性をもち、したがって、高い治療効果と低い有効治療用量及び医薬製造における低い製品コストをもつ、治療用のｓｐｇ１３０ポリペプチド又は二量体、例えば、ｓｇｐ１３０Ｆｃを構築することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記の技術的問題は、クレームにおいて特徴づけた態様を提供することにより解決される。ｇｐ１３０のＮ−末端Ｉｇ様ドメインの３つのアミノ酸残基（Ｔｈｒ102、Ｇｌｎ113、及びＡｓｎ114）は、上記記載の未知の相互作用領域の方に向いており、これらを、より強い相互作用の可能性を検出する目的で、変異誘発用に選んだ（図１に示した変異を参照）。驚いたことに、３つの明らかに非保存的なアミノ酸の交換（Ｔｈｒ102をＴｙｒ102に変異、略してＴｈｒ１０２Ｔｙｒ、若しくはＴ１０２Ｙ；Ｇｌｎ113をＰｈｅ113に変異、略してＧｌｎ１１３Ｐｈｅ、若しくはＱ１１３Ｆ；又は、Ａｓｎ114をＬｅｕ114に変異、略してＡｓｎ１１４Ｌｅｕ、若しくはＮ１１４Ｌ）により、結合活性及び親和性における顕著な相加的増加が発見された。このことは、野生型の相互作用部位は、ＩＬ−６／（ｓ）ＩＬ−６Ｒ複合体に対して、最適よりもずっと下の親和性レベルまでしか進化していなかったことを示している。ｇｐ１３０は、多くの多様なリガンドに結合することから、このことは、全てのリガンドに適応するべく進化した構造上の妥協の結果であるのかもしれない。さらに、本発明に記載される変異の効果は、ヒトＩＬ−６／（ｓ）ＩＬ−６Ｒ／ｇｐ１３０構造に特異的であることが示される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、ｇｐ１３０のＮ−末端ドメインの変異蛋白質を示す。ｇｐ１３０のＮ−末端免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインの、アミノ酸残基Ｔｈｒ102、Ｇｌｎ113、及びＡｓｎ114を変異させた。Ｔｈｒ102のＴｙｒ102への（変異Ｔ１０２Ｙ）、Ｇｌｉｎ113のＰｈｅ113への（変異Ｑ１１３Ｆ）；及びＡｓｎ114のＬｅｕ114への（変異Ｎ１１４Ｌ）非保存的変化は、単独及び組合せのいずれとも、ｓｇｐ１３０Ｆｃ二量体の結合活性を改善した（図３参照）。
【図２】図２は、野生型及び変異蛋白質ｓｇｐ１３０Ｆｃ二量体の蛋白質標品の未変性ポリアクリルアミドゲルの銀染色を示す。野生型ｓｇｐ１３０Ｆｃと比較して、改善された結合活性を示す変異体は、凝集体（副産物）の形成を増大しなかった。３つのシングル変異蛋白質（Ｔｈｒ１０２Ｔｙｒ又はＴ１０２Ｙ；Ｇｌｎ１１３Ｐｈｅ又はＱ１１３Ｆ；Ａｓｎ１１４Ｌｅｕ又はＮ１１４Ｌ）、１つの二重変異蛋白質（Ｔｈｒ１０２Ｔｙｒ／Ｇｌｎ１１３Ｐｈｅ、又はＴ１０２Ｙ／Ｑ１１３Ｆ）、及び三重変異蛋白質（Ｔｈｒ１０２Ｔｙｒ／Ｇｌｎ１１３Ｐｈｅ／Ａｓｎ１１４Ｌｅｕ、又はＴ１０２Ｙ／Ｑ１１３Ｆ／Ｎ１１４Ｌ）についての代表的なデータを示す。
【図３】図３は、野生型及び変異蛋白質ｓｇｐ１３０Ｆｃ二量体による、ＢＡＦ３／ｇｐ１３０細胞のＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ誘導性増殖の阻害を示す。ｓｇｐ１３０Ｆｃ変異蛋白質は、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６および５０ｎｇ／ｍＬのｓＩＬ−６Ｒ（Ａ）又は１ｎｇ／ｍＬのＨｙｐｅｒ−ＩＬ−６（Ｂ）によって誘発されるＢＡＦ３／ｇｐ１３０細胞増殖のブロックについて、野生型ｓｇｐ１３０Ｆｃよりも有意に高い生物学的活性をもつ。三重変異蛋白質Ｔｈｒ１０２Ｔｙｒ／Ｇｌｎ１１３Ｐｈｅ／Ａｓｎ１１４Ｌｅｕ（Ｔ１０２Ｙ／Ｑ１１３Ｆ／Ｎ１１４Ｌ）のＩＣ50は、全てのアッセイにおいて、野生型のＩＣ50の少なくとも３倍低い。（Ａ）比色ＭＴＳアッセイ。（Ｂ）ｓｇｐ１３０Ｆｃ変異蛋白質間の、ほぼ３オーダーを超える活性差異の一貫性を例示すための、より高感度の蛍光測定セルタイター−ブルー（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ）アッセイ。略語及び記号：セルタイター−ブルー、蛍光性レゾルフィン（励起５３０ｎｍ、発光５９０ｎｍ）、セルタイター−ブルーの基質であるレザズリンの細胞代謝による変換産物として；ＩＣ50、５０％の阻害効力をもつ濃度；ＩＬ−６、インターロイキン−６；Ｉ／Ｒ、ＩＬ−６プラスｓＩＬ−６Ｒ；ＭＴＳ、代謝活性のある細胞により４９０ｎｍに吸収をもつ可溶性のフォルマザン産物へ変換される基質；ＯＤ、４９０ｎｍにおける光学密度；ｓＩＬ−６Ｒ、可溶性のインターロイキン−６受容体。
【図４】図４は、野生型ｓｇｐ１３０Ｆｃ及び変異蛋白質Ｔ１０２Ｙ／Ｑ１１３Ｆ／Ｎ１１４Ｌによる、細胞アッセイにおける急性期応答の阻害を示す。  ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒに対する急性期応答を、ハプトグロビンＥＬＩＳＡにより、５ｎｇ／ｍＬのＨｙｐｅｒ−ＩＬ−６で刺激したヒトＨｅｐＧ２肝癌細胞の上清を用いて測定した。ハプトグロビン分泌は、野生型ｓｇｐ１３０Ｆｃ（斜線）又は三重変異蛋白質Ｔ１０２Ｙ／Ｑ１１３Ｆ／Ｎ１１４Ｌ（塗り潰し）の量を増やしていくことにより用量依存的に阻害され、後者は有意に強い阻害活性を示した（***、ｐ＜０．００１；**、ｐ＜０．０１；*、ｐ＜０．０５）。Ａｂｓ．［Ａ．Ｕ．］、４５０ｎｍにおける吸収。
【図５】図５は、Ｈｙｐｅｒ−ＩＬ−６の、野生型ｓｇｐ１３０Ｆｃ及び三重変異蛋白質Ｔ１０２Ｙ／Ｑ１１３Ｆ／Ｎ１１４Ｌに対する反応速度定数及び親和性を示す。反応速度定数は、表面プラズモン共鳴を用いて、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６蛋白質相互作用アレイシステム（バイオラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））にて測定した。
【図６】図６は、全ヒト、又はマウス／ヒト複合体における、ｇｐ１３０、ＩＬ−６、及びｓＩＬ−６Ｒの相互作用部位の分子モデリングを示す。左のパネル（「ヒト」）では、ヒト野生型（ｗｔ）ｇｐ１３０及び変異体Ｑ１１３Ｆと、ヒトＩＬ−６及びヒトｓＩＬ−６Ｒとの間の相互作用が示されている。右パネル（「マウス」）は、マウスＩＬ−６及びｓＩＬ−６との、各相互作用を示す。全ヒト複合体では、芳香族クラスターが形成され、これが、Ｑ１１３Ｆを含有する変異蛋白質の親和性増大の原因であると仮定される。
【図７】図７は、ＢＡＦ３／ｇｐ１３０細胞のＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ誘導性増殖の阻害：野生型ｓｇｐ１３０Ｆｃ及び三重変異蛋白質Ｔ１０２Ｙ／Ｑ１１３Ｆ／Ｎ１１４Ｌ、並びにヒト及びマウスＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒの比較を示す。ＢＡＦ３／ｇｐ１３０細胞の増殖と、野生型ｓｇｐ１３０ＦＣ又は変異蛋白質Ｔ１０２Ｙ／Ｑ１１３Ｆ／Ｎ１１４Ｌによるその阻害を、ヒト又はマウスＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ複合体に対する応答において測定した（ＭＴＳアッセイ）。ＯＤ、４９０ｎｍにおける光学密度。
【図８】図８は、急性炎症のマウス空気嚢モデルにおける、野生型ｓｇｐ１３０Ｆｃ及び三重変異蛋白質Ｔ１０２Ｙ／Ｑ１１３Ｆ／Ｎ１１４Ｌの比較を示す。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、１０μｇの野生型ｓｇｐ１３０Ｆｃ、１０μｇの三重変異蛋白質Ｔ１０２Ｙ／Ｑ１１３Ｆ／Ｎ１１４Ｌ、又は担体コントロールとしてのＰＢＳを腹腔内注射し、６時間後にカラギーナンを注射した。カラギーナン注射の７２時間後、全細胞数（Ａ）、及び好中球及び単核食細胞数（Ｂ）を、フローサイトメトリーにより測定した。炎症性空気嚢中の、組換えｓｇｐ１３０Ｆｃ蛋白質レベル（Ｃ）、及びケモカインＭＣＰ−１レベル（Ｄ）を、ＥＬＩＳＡによって測定した。全ての値は、５ないし９匹の動物の平均値±ＳＤを表わす。ＭＣＰ−１、単球化学的誘引蛋白質−１。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
したがって本発明は、作動性のＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ複合体の活性を阻害することができ、糖蛋白質ｇｐ１３０の全細胞外部分、又はその変異体若しくはフラグメントを含むポリペプチドであって、ここで、ｇｐ１３０のＮ−末端Ｉｇ様ドメインの３つのアミノ酸残基、Ｔｈｒ102、Ｇｌｎ113、又はＡｓｎ114の少なくとも１つが別のアミノ酸残基によって置換されている該ポリペプチドに関する。ｇｐ１３０の完全な細胞外ドメインの変異蛋白質又はその変異体若しくはフラグメントは、可溶性の単量体又は二量体として存在し、作動性の複合体ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒを、野生型の可溶性ｇｐ１３０と比較して高い結合活性をもって阻害することができ、かつ、直接又はポリペプチドリンカーを介して免疫グロブリン重鎖のＦｃドメイン又は他のタグに融合させることができる。
【００１３】
本発明のポリペプチドの１つの好ましい態様においては、
（ａ）Ｔｈｒ102は、大きい中性のアミノ酸残基、例えば、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、又はＭｅｔによって置換されており；
（ｂ）Ｇｌｎ113は、疎水性及び非極性のアミノ酸残基、例えば、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、又はＡｌａによって置換されており；及び／又は
（ｃ）Ａｓｎ114は、疎水性及び非極性アミノ酸残基、例えば、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、又はＡｌａによって置換されている。
【００１４】
さらに好ましい態様においては、本発明の可溶性ｇｐ１３０変異蛋白質は、ｇｐ１３０のＮ−末端Ｉｇ様ドメインに以下の変異の少なくとも１つを含む：Ｔｈｒ102をＴｙｒ102に変異（略してＴｈｒ１０２Ｔｙｒ、又はＴ１０２Ｙ）、Ｇｌｎ113をＰｈｅ113に変異（略してＧｌｎ１１３Ｐｈｅ、又はＱ１１３Ｆ）、又は、Ａｓｎ114をＬｅｕ114に変異（略してＡｓｎ１１４Ｌｅｕ、又はＮ１１４Ｌ）。
【００１５】
用語「可溶性」は、本明細書で用いるとき、細胞内ドメインを欠失している、好ましくは膜貫通ドメインを欠失している、ｇｐ１３０ポリペプチドを指す。
【００１６】
本発明の可溶性ｇｐ１３０（ｓｇｐ１３０）単量体又は二量体は、既知の方法を用いて加工することができる。利用されるドメインは、ｇｐ１３０の全細胞外ドメインから構成されていてもよく、又は、作動性の複合体ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒの活性を阻害する能力を維持している、そのさらなる変異体若しくはフラグメントから構成されていてもよい。好ましいフラグメントは、少なくとも細胞外ドメインＤ１ないしＤ３からなるフラグメントである。
【００１７】
本発明のｓｇｐ１３０変異蛋白質のさらに好ましい態様は、２つの変異、Ｇｌｎ１１３Ｐｈｅ（Ｑ１１３Ｆ）又はＡｓｎ１１４Ｌｅｕ(Ｎ１１４Ｌ)、の一方を含む。
【００１８】
本発明の変異蛋白質の特に好ましい態様においては、３つの変異Ｔｈｒ１０２Ｔｙｒ(Ｔ１０２Ｙ)、Ｇｌｎ１１３Ｐｈｅ（Ｑ１１３Ｆ）、又はＡｓｎ１１４Ｌｅｕ(Ｎ１１４Ｌ)のうち、２つが組合されて、二重変異蛋白質Ｔｈｒ１０２Ｔｙｒ／Ｇｌｎ１１３Ｐｈｅ（Ｔ１０２Ｙ／Ｑ１１３Ｆ）、Ｔｈｒ１０２Ｔｙｒ／Ａｓｎ１１４Ｌｅｕ(Ｔ１０２Ｙ／Ｎ１１４Ｌ)、又はＧｌｎ１１３Ｐｈｅ／Ａｓｎ１１４Ｌｅｕ（Ｑ１１３Ｆ／Ｎ１１４Ｌ)を生じる。
【００１９】
本発明の変異蛋白質の最も好ましい態様においては、３つの変異Ｔｈｒ１０２Ｔｙｒ(Ｔ１０２Ｙ)、Ｇｌｎ１１３Ｐｈｅ（Ｑ１１３Ｆ）、及びＡｓｎ１１４Ｌｅｕ(Ｎ１１４Ｌ)の全てが組合されて、三重変異蛋白質Ｔｈｒ１０２Ｔｙｒ／Ｇｌｎ１１３Ｐｈｅ／Ａｓｎ１１４Ｌｅｕ(Ｔ１０２Ｙ／Ｑ１１３Ｆ／Ｎ１１４Ｌ)を生じる。
【００２０】
さらに、ポリペプチドが直接又はポリペプチドリンカーを介してタグに融合されている、変異したｓｇｐ１３０ポリペプチドが好ましい。用語「タグ」は、任意の天然産又は人工のポリペプチド、又は他の分子構造を意味する。これは、変異したｓｇｐ１３０ポリペプチドの精製及び／又は検出を可能とし、及び／又は、変異したｓｇｐ１３０ポリペプチドの薬力学的及び／又は薬物動態学的特性がさらに改善される。ポリペプチドリンカーは、完全に人工的（例えば、グリシン、セリン、アスパラギン、トレオニン、及びアラニンからなる群より選択される２−５０アミノ酸残基を含む）であってもよく、又は天然産蛋白質から取り入れてもよい。
【００２１】
本発明のｓｇｐ１３０変異蛋白質のさらに好ましい態様においては、ｓｇｐ１３０変異蛋白質、その変異体、又はフラグメントと、タグ（例えば、免疫グロブリンＦｃドメイン）との間、及び／又はｓｇｐ１３０変異蛋白質とリンカーとの間、及び／又はリンカーとタグとの間に、１つ以上のＮ−グリコシル化部位が挿入されている。コア配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ又はＡｓｎ−Ｘ−ＴｈｒをもつＮ−グリコシル化部位のアミノ酸モチーフは、蛋白質中のモチーフの状況に依存し、当業者により、例えば、ＮｅｔＮＧｌｙｃ（デンマーク工科大学（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｅｎｍａｒｋ）生物学的配列解析センター（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ））のようなフリーソフトウェアを使用することにより、予測及び設計が可能である。本発明の変異蛋白質用の好ましいＮ−グリコシル化リンカーエレメントは、Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅである。
【００２２】
本発明の別の目的は、ＰＥＧ付加されているか、又は他の化学的に修飾された形態の、ｓｇｐ１３０変異蛋白質、その変異体、フラグメント、又は融合構築物である。ｓｐｇ１３０分子のＰＥＧ付加は、例えば、ヒトＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＬ−１５、又はＩＬ−２について記載された方法（Ｙｏｕｎｇｓｔｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．２００２年、第８巻、ｐ．２１３９−５７；Ｇｒａｃｅら、Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．２００１年、第２１巻、ｐ．１１０３−１５；Ｐｅｐｉｎｓｋｙら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２００１年、第２９７巻、ｐ．１０５９−６６；Ｐｅｔｔｉｔら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７年、第２７２巻、ｐ．２３１２−８；Ｇｏｏｄｓｏｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１９９０年、第８巻、ｐ．３４３−６；Ｋａｔｒｅ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９０年、第１４４巻、ｐ．２０９−１３）に従って行なうことができる。
【００２３】
ＰＥＧ−ポリペプチド又はＰＥＧ−ポリペプチド二量体がｓＩＬ−６Ｒに依存性のＩＬ−６応答のブロックが可能であるかぎり、いかなる種類のポリエチレングリコールも本発明に適しており、これは、当該技術分野において技術上既知の方法に従ってアッセイすることができる。好ましくは、本発明のポリペプチド又はポリペプチド二量体のポリエチレングリコールは、ＰＥＧ１０００、２０００、３０００、５０００、１００００、１５０００、２００００、又は４００００であり、ＰＥＧ２００００又は４００００が特に好ましい。
【００２４】
二量体を形成するためには、２つのｓｇｐ１３０変異蛋白質、その変異体、フラグメント、又は融合構築物は、単純な共有結合、柔軟なペプチドリンカー、又は、好ましくは、１つ以上のジスルフィド架橋により、互いに連結させる。ペプチドリンカーは、完全に人工的（例えば、グリシン、セリン、アスパラギン、トレオニン、及びアラニンからなる群より選択される２−５０アミノ酸残基を含む）であってもよく、又は天然産蛋白質から取り入れてもよい。ジスルフィド架橋形成は、例えば、免疫グロブリンＦｃ融合蛋白質としての組換え発現により達成することができ、ここで、ｓｇｐ１３０Ｆｃ単量体をコードしている核酸配列は、システインをコードしている１つ以上のコドンを、好ましくはＦｃドメインのヒンジ領域中に含有する。
【００２５】
本発明はまた、ポリペプチドが免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインに融合されている、上記記載のポリペプチド二量体に関する。「免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインに融合された（．．．）」という表現は、全ての免疫グロブリンクラス及びサブクラスを含む。好ましくは、ｓｇｐ１３０変異蛋白質の融合パートナーは、ＩｇＧ蛋白質の、さらに好ましくは、ＩｇＧ１蛋白質のＦｃドメインからなる。しかしながら、任意のＦｃ部分はまた、２つ以上の免疫グロブリンクラス又はサブクラスからの配列を含んでいてもよく、所望のエフェクター機能を最適化するために特定の配列モチーフを選択することは、当該技術分野における通常の技術の範囲内である。
【００２６】
免疫グロブリンＦｃ部分との融合に加えて、又はその代わりに、本発明の、ｇｐ１３０細胞外ドメイン（可溶性ｇｐ１３０）変異蛋白質は、それに対する抗体若しくは他の結合性分子が入手可能であり、迅速な精製、ウエスタンブロット若しくはＥＬＩＳＡ等における検出、免疫沈降、又は他のバイオアッセイにおける活性喪失／ブロックが可能な他の天然産又は人工のポリペプチド及び／又はタグ、例えば、ポリ（Ｈｉｓ）、Ｍｙｃ、Ｓｔｒｅｐ、ポリアルギニン、Ｆｌａｇ、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）又はその加工された誘導体、ＴＡＰ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＨＡ、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、マルトース結合蛋白質（ＭＢＰ）、Ｖ５、ＨＳＶ、Ｓ、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、プロテインＣ、ルシフェラーゼ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、Ｅ、ベータ−ＧＡＬ、Ｔ７、又は、他のエピトープと融合させてもよい。
【００２７】
ｓｇｐ１３０変異蛋白質又はその変異体若しくはフラグメントの、好ましくはＣ−末端における、免疫グロブリンＦｃ部分のヒンジ領域又は他のタグへの融合は、直接的であってもよく、或いは、種々の長さ及びアミノ酸の組合せの柔軟なポリペプチドリンカードメインを使用してもよい。これらのリンカーは、完全に人工的（例えば、グリシン、セリン、アスパラギン、トレオニン、及びアラニンからなる群より選択される２−５０アミノ酸残基を含んでなる）であってもよく、又は天然産蛋白質から取り入れてもよい。このようなリンカーは、変異蛋白質の単量体又は二量体のフレキシビリティ及び結合特性を増強することができる。
【００２８】
本発明のｓｇｐ１３０変異蛋白質の単量体及び二量体は、好ましくは、前記変異蛋白質、その変異体、フラグメント、若しくは融合構築物をコードするポリヌクレオチドを用いることにより、組換え的に製造される。
【００２９】
したがって、本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにベクター、好ましくは、前記ポリヌクレオチドを含有する発現ベクター、及び宿主細胞、又はかかるベクターを含有する無細胞発現系に関する。
【００３０】
本発明の変異蛋白質単量体及び二量体を製造するためには、既存のクローン、すなわち、好ましくは天然産ポリペプチド若しくはその一部をコードしているクローンからポリヌクレオチドを得る（ヒトｇｐ１３０／ＩＬ６ＳＴ：ＧｅｎＢａｎｋ配列ＮＭ ００２１８４及びサポーティングクローン；ヒト免疫グロブリンの定常領域、例えば、ＩｇＧ１／ＩＧＨＧ１、ＧｅｎＢａｎｋ配列ＡＫ０５７７５４）。高度にストリンジェントな、又は中程度にストリンジェントな条件（定義については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング、実験室マニュアル）」、１９８９年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｎ．Ｙ．参照）の下で、天然のＤＮＡ又はＲＮＡの相補鎖に対しハイブリダイズする任意のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドもまた、当該ポリペプチドがその天然の配列の生物学的活性を維持する限り、本発明の変異蛋白質単量体及び二量体を製造するのに有用である。
【００３１】
組換えベクターは、当業者に周知の方法に従って構築することができる；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、１９８９年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｎ．Ｙ．参照。多様な発現ベクター／宿主系を利用して、本発明のｓｇｐ１３０変異蛋白質、その変異体、フラグメント、又は融合構築物をコードする配列を、含有させ発現させることができる。例としては、無細胞発現系、例えば、インビトロの小麦胚芽発現系；微生物、例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミド、又はコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌；真菌（例えば、酵母）の発現ベクターで形質転換した真菌（例えば、酵母）；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）で、若しくは細菌発現ベクター（例えば、Ｔｉ又はｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系；又は、動物細胞系が挙げられるが、これらに制限されない。
【００３２】
細菌系では、本発明の変異蛋白質単量体及び二量体について意図した使用に依存して、多くの発現ベクターを選択することができる。本発明における使用に適したベクターとしては、細菌での発現のためのｐＳＫＫ発現ベクターが挙げられるが、これに制限されない。
【００３３】
野生型又は修飾された（例えば、糖が改変された）酵母種、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、又はピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）において、例えば、アルファ因子、アルコールオキシダーゼ、ＰＧＨ、テトラサイクリングルコースなどの、構成的若しくは誘導可能なプロモーター若しくはプロモーター系を含有する多数のベクターを使用することができる；総説については、Ｇｒａｎｔら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７年、第１５３巻、ｐ．５１６−４４；Ｓｉａｍら、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００４年、第３３巻、ｐ．１８９−９８；Ｍａｃａｕｌｅｙ−Ｐａｔｒｉｃら、Ｙｅａｓｔ、２００５年、第２２巻、ｐ．２４９−７０、Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎら、ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．２００５年、第５巻、ｐ．１０７９−９６；Ｗｉｌｄｔ及びＧｅｒｎｇｒｏｓｓ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００５年、第３巻、ｐ．１１９−２８を参照。
【００３４】
植物発現系が使用される場合（総説については、Ｓｔｏｇｅｒら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５年、第１６巻、ｐ．１６７−７３；Ｇｏｍｏｒｄら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５年、第２３巻、ｐ．５５９−６５を参照）、本発明の変異蛋白質、又はその変異体若しくはフラグメント若しくは融合構築物をコードしている配列の発現は、多数のプロモーターのいずれかによって駆動することができる。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ及び１９Ｓプロモーターのようなウイルスプロモーターを、単独で、又はＴＭＶからのオメガ・リーダー配列と組合せて使用してもよい（Ｔａｋａｍａｔｓｕ、ＥＭＢＯ  Ｊ．１９８７年、第６巻、ｐ．３０７−１１）。別法として、植物プロモーター、例えばＲＵＢIＳＣＯの小サブユニット又は熱ショックプロモーターを使用してもよい（Ｃｏｒｕｚｚｉら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１９８４年、第３巻、ｐ．１６７１−８０；Ｂｒｏｇｌｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８４年、第２２４巻、ｐ．８３８−４３；Ｗｉｎｔｅｒら、Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ  Ｄｉｆｆｅｒ．１９９１年、第１７巻、ｐ．８５−１０５）。これらの構築物は、直接的なＤＮＡ形質転換、又は病原体介在性のトランスフェクションにより、植物細胞中に導入することができる。かかる技術は、数多くの一般に入手可能な総説に記載されている（例えば、Ｈｏｂｂｓ及びＭｕｒｒｙ、「ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ  Ｙｅａｒｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．１９９２年、ｐ．１９１−６を参照）。
【００３５】
昆虫細胞系もまた、本発明の変異蛋白質単量体及び二量体を発現するために使用することができる。例えば、かかる系の１つでは、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を、スポドペトラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞において、又はキクキンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）幼虫において、外来遺伝子を発現するためのベクターとして使用する。配列は、ウイルスの非必須領域、例えば、ポリヘドリン遺伝子中にクローニングして、ポリヘドリンプロモーターの支配下に配置することができる。ｓｇｐ１３０変異蛋白質、又はそのフラグメント若しくは変異体若しくは融合構築物、例えばｓｇｐ１３０Ｆｃ融合蛋白質をコードしているＤＮＡ配列を首尾よく挿入すると、ポリヘドリン遺伝子が不活性化され、コート蛋白質を欠く組換えウイルスが産生される。次に組換えウイルスを用いて、例えばＳ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞又はＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ幼虫に感染させ、ここで、本発明のｓｇｐ１３０変異蛋白質単量体及び二量体を発現させることができる（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９４年、第９１巻、ｐ．３２２４−７）。
【００３６】
哺乳類の宿主細胞では、例えば、脂質系の細胞のトランスフェクション又はウイルス性形質導入等の、数多くの発現系を利用することができる。発現ベクターとしてアデノウイルスを使用する場合、本発明のｓｇｐ１３０変異蛋白質、又はそのフラグメント若しくは変異体若しくは融合構築物をコードしている配列を、後期プロモーター及びトリパータイトリーダー配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体中に連結する。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１又はＥ３領域内への挿入を使用して、感染した宿主細胞内で本発明の変異蛋白質単量体及び二量体を発現することができる生きたウイルスを得てもよい（Ｌｏｇａｎ及びＳｈｅｎｋ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９８４年、第８１巻、ｐ．３６５５−９）。加えて、転写エンハンサー、例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーを使用して、哺乳類宿主細胞における発現を増大してもよい。
【００３７】
組換えベクターの導入後、宿主細胞を、ベクター含有細胞の増殖を選択することができる選択培地中で増殖させる。多くの選択系の任意のものを用いて、形質転換した細胞系を回収することができる。例えば、限定されないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ、１９７７年、第１１巻、ｐ．２２３−３２）及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙら、Ｃｅｌｌ、１９８０年、第２２巻、ｐ．８１７−２３）遺伝子が挙げられ、これらは各々、ｔｋ．ｓｕｐ．−、又はａｐｒｔ．ｓｕｐ．−細胞において使用することができる。また、代謝拮抗物質、抗生物質、又は除草剤抵抗性を、選択の基盤として使用することができる；例えば、メトトレキサートに対する抵抗性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９８０年、第７７巻、ｐ．３５６７−７０）；アミノグリコシド類である、ネオマイシン及びＧ−４１８に対し抵抗性を付与するｎｐｔ（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９８１年、第１５０巻、ｐ．１−１４）；及び、クロルスルフロン及びホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する抵抗性を各々付与する、ａｌｓ又はｐａｔ。さらに別の選択可能な遺伝子が記載されている。例えば、ｔｒｐＢは細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにし、或いはｈｉｓＤは細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用できるようにする（Ｈａｒｔｍａｎ及びＭｕｌｌｉｇａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９８８年、第８５巻、ｐ．８０４７−５１）。アントシアニド、ベータ−グルクロニダーゼ及びその基質ＧＵＳ、ルシフェラーゼ及びその基質ルシフェリン等の可視マーカーの使用が一般的になってきており、形質転換体を同定するためのみならず、特定のベクター系に帰せられる、一過性の又は安定した蛋白質発現を定量するために広く使用されている（Ｒｈｏｄｅｓら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９５年、第５５巻、ｐ．１２１−３１）。
【００３８】
組換えポリペプチドの精製は、この目的のための既知の方法、例えば、抽出、沈降、クロマトグラフィー、電気泳動などの任意の通常の方法によって行なわれる。使用することができるさらに別の精製法は、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、又はモノクローナル抗体（これらは標的ポリペプチドに結合し、カラム内に含有されるゲルマトリックス上に固定される）を使用した、アフィニティクロマトグラフィーである。組換えポリペプチドを含有する不純物を含む標品をカラムに通す。ポリペプチドは、アフィニティゲルマトリックスとの特異的相互作用により、カラムに結合するが、不純物は通過する。洗浄後、ｐＨ又はイオン強度の変化により、ポリペプチドをゲルから溶出し、次に、単量体として生成される場合には、二量体化し、所望であればＰＥＧ付加する。
【００３９】
したがって、本発明はまた、本発明のｓｇｐ１３０変異蛋白質単量体及び二量体を製造する方法に関し、この方法は、無細胞発現系を使用するか、又はｓｇｐ１３０変異蛋白質、又はそのフラグメント若しくは変異体若しくは融合構築物をコードしているＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞を培養し、そして、変異蛋白質単量体又は二量体を、前記系、宿主細胞、又は培養物から回収することを含む。
【００４０】
本発明のｓｇｐ１３０変異蛋白質単量体及び二量体は、作動性のＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ複合体の活性を阻害すべきである全ての病状の治療及び／又は予防において有用である。したがって、本発明はまた、本発明のｓｇｐ１３０変異蛋白質単量体又は二量体の治療上有効量を、好ましくは薬学的に許容される担体と組合せて含有する医薬組成物にも関する。「薬学的に許容される」とは、活性成分の生物学的活性の有効性を妨害せず、かつ投与される宿主に対し有毒ではない、任意の担体を包含することを意味する。適当な薬学的担体の例は当該技術分野において知られており、例えば、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルジョン、例えば油／水型エマルジョン、種々のタイプの湿潤剤、無菌液などが挙げられる。このような担体は、通常の方法により製剤可能であり、有効用量で患者に投与することができる。
【００４１】
「有効量」とは、疾患の経過及び重篤性に影響を及ぼし、かかる病状の予防、軽減、又は寛解をもたらすのに充分な活性成分の量を指す。
【００４２】
これらの疾患又は障害を治療及び／又は予防するために有用な有効用量は、当業者に既知の方法を用いて測定することができる（例えば、Ｆｉｎｇｌら、「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（治療の薬理学的基礎）」、Ｇｏｏｄｍａｎ及びＧｉｌｍａｎ編、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７５年、ｐ．１−４６参照）。
【００４３】
組成物の投与は、様々な方法、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、関節内、経口、経肺、吸入、経鼻、直腸内、経膣、局所、又は皮内投与により実施することができる。用量用法は、主治医及び他の臨床因子によって決定されるであろう。医学の分野では周知のように、任意の１人の患者のための投薬量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、性別、投与される特定の化合物、投与の時間及び経路、療法の種類、全身の健康、及び同時投与される他の薬剤等の多くの因子に依存する。
【００４４】
本発明はまた、作動性の複合体であるＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒのブロックが有益な効果をもつ疾患又は障害の治療及び／又は予防用の医薬組成物の調製のための、上記に定義したｓｇｐ１３０変異蛋白質単量体及び二量体の使用にも関する。
【００４５】
本発明の変異蛋白質単量体及び二量体の好ましい医療用途は、骨再吸収、高カルシウム血症、悪液質、腫瘍若しくは他のタイプの癌（例えば、結腸癌、多発性骨髄腫、リンパ腫、白血病、ホジキン病、又はキャッスルマン病）、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症、１型糖尿病、又は紅斑性狼瘡）、炎症性又はアトピー性疾患（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、リウマチ様関節炎、若年性リウマチ様関節炎、喘息、乾癬、サルコイドーシス、紅斑性狼瘡、ぶどう膜炎、又はアレルギー性結膜炎）、感染症（例えば、細菌、ウイルス、真菌、又は他の病原体による）、敗血症、並びに内分泌障害、及び代謝性若しくは異化性疾患（例えば、２型糖尿病、肥満症、高血糖症、又は高コレステロール血症）の治療及び／又は予防である。
【００４６】
最後に、本発明は、本発明のポリペプチドに結合することができる抗体であって、前記ポリペプチドの変異したペプチドモチーフ又は特異的リンカー領域に特異的である該抗体を提供する。用語「抗体」は、この文脈において用いる場合、好ましくは、個別のモノクローナル抗体標品に関する。前記ポリペプチドの変異したペプチドモチーフ又は特異的リンカー領域に対するモノクローナル抗体は、当業者に周知の方法により、これらのペプチド／ポリペプチドの適当なフラグメントを抗原として使用することによって作成される（例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，１９７５年、第２５６巻、ｐ．４９５−７参照）。本明細書で用いる場合、用語「抗体」（Ａｂ）又は「モノクローナル抗体」（Ｍａｂ）は、特異的に蛋白質に結合することができる無傷の分子並びに抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）2フラグメントのような）を含むことを意味する。無傷の抗体からＦｃフラグメントが欠失したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）2フラグメントは、より迅速に循環から排出され、かつ、無傷の抗体よりも非特異的な組織結合が少ない（Ｗａｈlら，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．１９８３年、第２４巻、ｐ．３１６−２５）。したがって、これらのフラグメント、並びにＦａｂ又は他の免疫グロブリン発現ライブラリーの生成物が好ましい。さらに、本発明の抗体には、キメラ抗体、単鎖抗体、及びヒト化抗体が含まれる。このような抗体は、種々の目的のために有用であり、例えば、迅速な精製、例えばウエスタンブロット若しくはＥＬＩＳＡにおける検出、免疫沈降、又は、バイオアッセイにおける活性喪失／ブロックを可能にするであろう。
【００４７】
したがって、本発明はまた、本発明のポリペプチドに対する、本発明の抗体の特異的結合の検出に基づく診断法にも関する。
【００４８】
以下の実施例は、本発明をさらに詳細に説明する。
【実施例１】
【００４９】
ｓｇｐ１３０Ｆｃ変異蛋白質の構築及び製造
【００５０】
（Ａ）材料
ゲートウェイ（Ｇｅｔｅｗａｙ）クローニングシステム（ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ、ドナーベクターｐＤＯＮＲ２２1、ＣＭＶプロモータ制御下の発現ベクターｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０、ＢＰ、及び、インサート移入のためのＬＲリコンビナーゼ、及びコンピテント大腸菌細胞）は、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（カールスルーエ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）、ドイツ）から購入した。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ及びＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ部位特異的変異誘発キットは、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（アムステルダム、オランダ）から購入した。ＰＡＧＥ精製変異誘発プライマーは、マイクロシンス（Ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈ）（バルガッハ（Ｂａｌｇａｃｈ）、スイス）から入手した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、ドイツ微生物及び細胞培養コレクション（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ブラウンシュバイク（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）、ドイツ）から入手した。培地成分は、以下の通り購入した：ハムＦ１２培地、低ＩｇＧＦＢＳ及びダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ）ＰＢＳ（ＰＡＡラボラトリーズ；コルベ（Ｃｏｌｂｅ）、ドイツ）、ＦＢＳ（バイオクロム（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）；ベルリン、ドイツ）、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液（インビトロジェン）、及びＧ４１８溶液（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、タウフキルヒェン（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ）、ドイツ）。トランスフェクション試薬、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００は、インビトロジェンから入手した。免疫沈降用のプロテインＡ／Ｇプラスアガロース（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ／Ｇ  Ｐｌｕｓ  Ａｇａｒｏｓｅ）は、サンタ・クルズ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ハイデルベルグ、ドイツ）から供給された。ウエスタンブロットの１次検出用には、マウス抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）モノクローナル抗体を使用した（ＣＢＬ１０２；ケミコン（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）；ホフハイム（Ｈｏｆｈｅｉｍ）、ドイツ）。ウエスタンブロット２次検出は、抗マウスＩｇＧ  ＨＲＰ結合抗体、ＥＣＬ−プラス（Ｐｌｕｓ）ウエスタンブロッティング基質、及びハイパーフィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ）ＥＣＬ（全て、ＧＥヘルスケア（Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）から；ムーニッヒ（Ｍｕｎｉｃｈ）、ドイツ）を用いて行なった。ローラーボトル（２．１Ｌ、２．５Ｘ表面）は、グライナー・バイオワン（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）（フリッケンハウゼン（Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ）、ドイツ）から購入した。真空フィルターユニット用のセルロースアセテートフィルター（０．４５μｍ）は、ザルトリウス（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）（ゲッティンゲン（Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ）、ドイツ）から購入した。ＸＫ１６／２０カラム及びＰＤ−１０脱塩カラム中の、ＭａｂＳｅｌｅｃｔプロテインＡアフィニティマトリックス（製品コード  １７−５１９９−０１）は、ＧＥ  ヘルスケア（ムーニッヒ（Ｍｕｎｉｃｈ）、ドイツ）から入手した。アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）ウルトラ（Ｕｌｔｒａ）−１５  ５０ｋＤａ  ウルトラセル（Ｕｌｔｒａｃｅｌ）−ＰＬ膜濃縮ユニットは、ミリポア（Ｍ��ｌｌｉｐｏｒｅ）（エシュボーン（Ｅｓｃｈｂｏｒｎ）、ドイツ）から購入した。ＰＡＧＥ用の既製アクリルアミド−ビス溶液（１９：１、３０％）は、バイオラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）（ムーニッヒ、ドイツ）から供給された。
【００５１】
（Ｂ）ｓｇｐ１３０Ｆｃ変異蛋白質の構築
ｇｐ１３０の完全な細胞外ドメインと、野生型ヒトＩｇＧ１Ｆｃとを含む、完全長ｓｇｐ１３０Ｆｃ用のｃＤＮＡを合成し（供給源：ヒトｇｐ１３０／ＩＬ６ＳＴ用には：ＧｅｎＢａｎｋ配列ＮＭ ００２１８４、及びサポーティングクローン；ヒトＩｇＧ１／ＩＧＨＧ１の定常領域用には：例えば、ＧｅｎＢａｎｋ配列ＡＫ０５７７５４）、ＣＨＯ−Ｋ１細胞における発現用にコドン最適化し、そして標準的なゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）クローニング法において、Ｇａｔｅｗａｙプライマー、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ、及びＢＰリコンビナーゼを使用して、ｐＤＯＮＲ２２１にサブクローニングした。サブクローニングされた挿入物は、２５０ないし３００ｂｐごとのスタックされた前向き及び逆向きシーケンシングプライマーを使用して、完全に配列を検証した。クイックチェンジ・マルチ（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｍｕｌｔｉ）及びクイックチェンジＩＩキットを使用した多部位特異的変異誘発では、ｇｐ１３０の３つのアミノ酸残基、Ｔｈｒ102、Ｇｌｎ113、及びＡｓｎ114を、図１に描かれた変異スキームに従って変異させた。変異したクローンは、上記記載のような完全シーケンシングにより検証した。続いて、挿入物を発現ベクターｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０に、Ｇｅｔｅｗａｙ  ＬＲ組換えによって移入した。挿入物は、Ｆｃ部位の後に２つの停止コドンをコードしていることから、ｐｃＤＮＡ−ＤＥＳＴ４０中にコードされたタグ（Ｖ５及び６ｘＨｉｓエピトープ）は、変異蛋白質中には存在しない。ポジティブクローンをＡｌｗＮＩ制限消化により同定し、そして配列を再度検証した。
【００５２】
（Ｃ）細胞培養及びトランスフェクション
ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、１０％ＦＢＳを補足したハムＦ１２培地中で、水飽和雰囲気下に、３７℃及び５％ＣＯ2で増殖させた。維持培養は、３ないし４日毎に継代し、そして２０代までのみ使用した。細胞は、リポフェクタミン２０００と、インビトロジェンにより供給されたＣＨＯ−Ｋ１用の標準的な条件とを使用して、発現構築物でトランスフェクトした。１回目の一過性発現の試験には、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を６ウェルプレート中でトランスフェクトし、そして細胞及び上清の双方を、トランスフェクションの２４時間後に回収した。ｓｇｐ１３０Ｆｃ又はｓｇｐ１３０Ｆｃ変異蛋白質は、プロテインＡ／Ｇプラスアガロースを製造業者の指示に従って使用して、上清から免疫沈降させた。全細胞蛋白質を抽出し、そして細胞溶解物及び免疫沈降物について、抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を用いたウエスタンブロットを、Ｗａｅｔｚｉｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２年、第１６８巻、ｐ．５３４２−５１に記載のように行なった。
【００５３】
（Ｄ）ＣＨＯ−Ｋ１細胞におけるｓｇｐ１３０Ｆｃ及びｓｇｐ１３０Ｆｃ変異蛋白質の産生
一過性発現が成功した後、ＣＨＯ−Ｋ１細胞をトランスフェクトし、１０ｃｍの細胞培養プレート中で４００μｇ／ｍＬのＧ４１８を使用してポジティブクローンを選択した。生成物の質及び特性を測定するため、予め選択されたポリクローナルＣＨＯ−Ｋ１プールをローラーボトルに移し、そして低ＩｇＧＦＢＳで培養した。コンフルエントな細胞の上清を１週間に３回回収し、５００ｘｇ及び４℃で２０分間遠心分離して細胞を除去し、３，５００ｘｇ及び４℃で４０分間遠心分離して細胞片を除去し、そして次に、直ちに加工するか、又は−８０℃で凍結した。並行して、予め選択されたプールから、限界希釈法を使用して安定な細胞クローンを選択し、そして上記記載のように、ウエスタンブロット発現分析により特性決定した。発現が最も高く、かつ最も安定しているクローンを、ローラーボトルに移し、そして永続的な製造に使用した。
【００５４】
（Ｅ）アフィニティクロマトグラフィー精製及び品質管理
ローラーボトル培養物からの、ｓｇｐ１３０Ｆｃ−又はｓｇｐ１３０Ｆｃ変異蛋白質含有上清を、Ｐ−１ペリスタポンプ及びアクタ・ピュリファイア（ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ）１００システム（双方とも、ＧＥヘルスケア；ムーニッヒ、ドイツ、より）を使用して、４℃で精製した。プロトコールは、モノクローナル抗体の精製のための製造業者の推奨に基づくものであった。遠心分離後、新たな又は融解した（氷上で）上清のｐＨを、６．７ないし７．０に調整した。２ラウンドの真空濾過（０．４５μｍ）の後、上清を脱気し、そして、必要であればｐＨを再度６．７ないし７．０の値に調整した。続いて、ＰＢＳで平衡化したアフィニティクロマトグラフィーカラム（ＸＫ１６／２０カラム中、１０ｍＬ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ）に、Ｐ−１ポンプを使用して、３−１０ｍＬ／分の流速で、２−４Ｌの上清を負荷した。ＰＢＳで洗浄後、カラムをアクタ・ピュリファイアに移し、そして再度ＰＢＳで、未結合蛋白質の定量的な除去の後にＡ280が安定するまで洗浄した。溶出用には、アクタシステムに、各々ｐＨ３．２５及び５．５の、２つの５０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液をセットし、これらを混合して所望のｐＨ条件（ｓｇｐ１３０Ｆｃ及びｓｇｐ１３０Ｆｃ変異蛋白質の溶出にはｐＨ３．７）を作り出した。１０ｍＬの分画を、２ｍＬの１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ１１）を含有する１５ｍＬチューブに収集した。ピーク分画をプールし、ｐＨを測定し、そして必要であれば７．５に調整した。プール蛋白質濃度をＡ280によって測定し、そしてプールを、アミコン  ウルトラ−１５  ５０ｋＤａ  ウルトラセル−ＰＬ膜濃縮ユニットを使用して２−５ｍｇ／ｍＬに濃縮した。ＰＢＳで平衡化したＰＤ−１０脱塩カラムを使用して、クエン酸緩衝液をＰＢＳで置き換え、続いて蛋白質濃度を２８０ｎｍでもう一度測定した。品質管理用に試料を調達し、未変性及び変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（７．５％）及びそれに続く銀染色により分析した（図２）。最終的なプール蛋白質濃度を測定し、ＰＢＳ中で２−３ｍｇ／ｍＬに設定し、そして１回使用（シングルユース）アリコートを、長期間の貯蔵用に−８０℃で凍結した。
【００５５】
（Ｆ）結果
ｓｇｐ１３０Ｆｃ変異蛋白質二量体の精製性は、野生型ｓｇｐ１３０Ｆｃと異なっていなかった。図２に示したように、凝集体の質及び量は、点変異によって有意に影響されなかった（本発明の代表的な変異蛋白質のみを示す、図１参照）。
【実施例２】
【００５６】
標準化された細胞増殖アッセイにおけるｓｇｐ１３０変異蛋白質の生物学的活性
（Ａ）材料
安定にトランスフェクトされたＢ細胞前駆体細胞系ＢＡＦ３／ｇｐ１３０を、Ｈｙｐｅｒ−ＩＬ−６（共有結合したＩＬ−６とｓＩＬ−６Ｒから構成されるデザイナーサイトカイン；Ｆｉｓｃｈｅｒら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７年、第１５巻、ｐ．１４２−５）を使用して維持した。ＤＭＥＭ細胞培地及びダルベッコＰＢＳは、ＰＡＡラボラトリーズ（コルベ、ドイツ）から購入し、ＦＢＳはバイオクロム（ベルリン、ドイツ）から入手した。インターロイキン−６（ＩＬ−６）及び可溶性のインターロイキン−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）は、バイオソース（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ）（ゾーリンゲン（Ｓｏｌｉｎｇｅｎ）、ドイツ）及びＲ＆Ｄシステム（ヴィースバーデン（Ｗｅｉｓｂａｄｅｎ）、ドイツ）から各々入手した。比色による、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ９６（セルタイター９６）Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（水性非放射性細胞増殖アッセイ）（ＭＴＳ）、及び蛍光測定による、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（セルタイター−ブルー）Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（細胞生存アッセイ）は、共にプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（マンハイム（Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、ドイツ）から入手し、製造業者の指示に従って実施した。
【００５７】
（Ｂ）ｓｇｐ１３０Ｆｃ又はｓｇｐ１３０Ｆｃ変異蛋白質による、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ−誘導性のＢＡＦ３／ｇｐ１３０細胞増殖のブロック
ＢＡＦ３／ｇｐ１３０細胞は、培地中のＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ複合体又はＨｙｐｅｒ−ＩＬ−６の存在に依存して増殖及び生存する。維持用には、ＢＡＦ３／ｇｐ１３０細胞を、１０％ＦＢＳ及び１０ｎｇ／ｍＬのＨｙｐｅｒ−ＩＬ−６を加えたＤＭＥＭ中で、５ｘ１０5細胞／ｍＬ未満の密度で培養した。１０ｎｇ／ｍＬのＨｙｐｅｒ−ＩＬ−６の代わりに、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６プラス５０ｎｇ／ｍＬのｓＩＬ−６Ｒを使用してもよい。細胞は、週２回継代した。アッセイには、細胞を、Ｈｙｐｅｒ−ＩＬ−６（又はＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ）のない培地で２回洗浄し、そして次に、５，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。野生型ｓｇｐ１３０Ｆｃ又はｓｇｐ１３０Ｆｃ変異蛋白質を、９００ないし１０ｎｇ／ｍＬの範囲の種々の濃度で添加した（１：３又は１：１０希釈シリーズ；図３）。続いて細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６及び５０ｎｇ／ｍＬのｓＩＬ−６Ｒ、又は１ｎｇ／ｍＬのＨｙｐｅｒ−ＩＬ−６の存在下で、３日間インキュベートした。コントロールとしては、最大濃度のｓｇｐ１３０Ｆｃ又はｓｇｐ１３０Ｆｃ変異蛋白質を含むかまたは含まない未刺激の細胞、並びにＩＬ−６及びｓＩＬ−６Ｒのみとインキュベートした細胞を用いた（図３）。
【００５８】
（Ｃ）結果
細胞培養における野生型ｓｇｐ１３０Ｆｃ又はｓｇｐ１３０Ｆｃ変異蛋白質の生物学的活性を、３日後の生存可能なＢＡＦ３／ｇｐ１３０細胞の数の減少によって測定した（製造業者の情報に従い、代謝活性のある細胞による、ＭＴＳ基質若しくはセルタイター−ブルー試薬の変換により測定）。ＭＴＳ基質（図３Ａ）及びセルタイター−ブルー試薬（図３Ｂ）は、別個の、しかし範囲の重複する感受性をカバーしており、セルタイター−ブルーの蛍光（励起波長５３０ｎｍ、発光波長５９０ｎｍ）は、１オーダー感度が良い。双方のアッセイシステムからの結果は、（１）単一の変異Ｔｈｒ１０２Ｔｙｒ（Ｔ１０２Ｙ）を含有する変異蛋白質の結合活性は、野生型よりも優れていたが、Ｇｌｎ１１３Ｐｈｅ（Ｑ１１３Ｆ）又はＡｓｎ１１４Ｌｅｕ（Ｎ１１４Ｌ）のいずれかの単一変異を含有する変異蛋白質よりも劣っていたこと、（２）Ｔｈｒ１０２Ｔｙｒ（Ｔ１０２Ｙ）、Ｇｌｎ１１３Ｐｈｅ（Ｑ１１３Ｆ）、又はＡｓｎ１１４Ｌｅｕ（Ｎ１１４Ｌ）の群からの、２つの変異の組合せは、いずれの単一の変異よりも優れていたこと（例として、二重変異蛋白質Ｔｈｒ１０２Ｔｙｒ／Ｇｌｎ１１３Ｐｈｅ（Ｔ１０２Ｙ／Ｑ１１３Ｆ）を、図３に示す）、及び（３）３つの変異全てを組合せて、三重変異蛋白質Ｔｈｒ１０２Ｔｙｒ／Ｇｌｎ１１３Ｐｈｅ／Ａｓｎ１１４Ｌｅｕ（Ｔ１０２Ｙ／Ｑ１１３Ｆ／Ｎ１１４Ｌ）とすることにより、最適な結合活性が得られること（図３）を示した。三重変異蛋白質のＩＣ50は、全てのアッセイにおいて、野生型ＩＣ50の少なくとも３倍低い。このことは、変異蛋白質Ｔ１０２Ｙ／Ｑ１１３Ｆ／Ｎ１１４Ｌは、野生型化合物の治療濃度の三分の一未満で使用し得ることを示している。
【実施例３】
【００５９】
急性期応答細胞アッセイにおける、野生型ｓｇｐ１３０Ｆｃ及び三重変異蛋白質Ｔ１０２Ｙ／Ｑ１１３Ｆ／Ｎ１１４Ｌの比較
（Ａ）材料
ＨｅｐＧ２細胞は、ＤＳＭＺ（ブラウンシュヴァイク、ドイツ）から入手した。Ｈｙｐｅｒ−ＩＬ−６（共有結合したＩＬ−６とｓＩＬ−６Ｒから構成されるデザイナーサイトカイン；Ｆｉｓｃｈｅｒら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７年、第１５巻、ｐ．１４２−５）は、既に記載された通りに生成した。ＤＭＥＭ高グルコース培地及びダルベッコＰＢＳは、ＰＡＡラボラトリーズ（コルベ、ドイツ）から購入し、ＦＢＳはバイオクロム（ベルイン、ドイツ）から入手した。マキシソープ（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）ＥＬＩＳＡプレートは、ヌンク（Ｎｕｎｃ）（ヴィースバーデン、ドイツ）から入手した。抗ハプトグロビン抗体は、リー・バイオソリューションズ（Ｌｅｅ  Ｂｉｏｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）（セントルイス、ミズーリ州、米国）から入手し、ヤギ抗ウサギＰＯＤ抗体は、ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）（ロックフォード、イリノイ州、米国）から入手し、ＢＭブルーＰＯＤ基質は、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）（マンハイム、ドイツ）から入手した。他の全ての化学物質は、ＶＷＲ／メルク（Ｍｅｒｃｋ）（ダームスタット、ドイツ）から購入した。
【００６０】
（Ｂ）細胞培養及びハプトグロビンＥＬＩＳＡ
ヒト肝癌細胞系ＨｅｐＧ２を、１０％ＦＢＳを補足したＤＭＥＤ高グルコース培地中で培養した。ヒト急性期蛋白質ハプトグロビンについてのＥＬＩＳＡは、既に記載された通り行なった（Ｏｐｐｍａｎｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９６年、第１９５巻、ｐ．１５３−９）。簡単には、ウェルあたり１０5個のＨｅｐＧ２細胞を、９６ウェルプレートに播種し、そして一晩接着させた。細胞をＰＢＳ（３７℃）で２回洗浄し、そしてＦＢＳを含まないＤＭＥＭ中で２時間飢餓とした。その間に、野生型ｓｇｐ１３０Ｆｃ又は変異蛋白質Ｔ１０２Ｙ／Ｑ１１３Ｆ／Ｎ１１４Ｌを希釈し、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭ中の５ｎｇ／ｍＬのＨｙｐｅｒ−ＩＬ−６と混合し、そして少なくとも３０分間インキュベーター内に置いた。続いて、ＨｅｐＧ２細胞を、この混合物２００μＬと共に２０時間インキュベートし、細胞上清中のハプトグロビンの相対量を、ＥＬＩＳＡによって測定した。ＥＬＩＳＡプレートは、１：１，０００の炭酸塩緩衝液ｐＨ９．０中のヤギ抗ハプトグロビン抗体で一晩コーティングし、そしてＰＢＳ中の５％ＦＢＳで、室温で２時間ブロックした。試料を、ブロッキング溶液中で１：１０に希釈し、そして１００μＬ／ウェルを、室温で１時間インキュベートした。０．０５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を加えたＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で４回洗浄した後、ブロッキング溶液中で１：１，０００に希釈した１００μＬのウサギ抗ハプトグロビン抗体を添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳＴで４回洗浄した後、ブロッキング溶液中で１：３０，０００に希釈した１００μＬのヤギ抗ウサギＰＯＤ抗体を添加し、そして３７℃で３０分間インキュベートした。ＴＢＳＴで４回洗浄した後、１００μＬのＢＭブルーＰＯＤ基質を添加し、そしてこの発色は、最終的に１Ｍ  Ｈ2ＳＯ4で停止した。プレートを４５０ｎｍにおいて読み取り、各々の値を四重に測定した。
【００６１】
（Ｃ）結果
ＢＡＦ３／ｇｐ１３０細胞増殖アッセイ（実施例２）で得た結果を確認するため、ＨｅｐＧ２細胞肝癌細胞を、第２のモデル系として使用した。ＩＬ−６刺激（Ｒｏｓｅ−Ｊｏｈｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９０年、第１９０巻、ｐ．７９−８３）、又は、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ複合体若しくはＨｙｐｅｒ−ＩＬ−６（Ｐｅｔｅｒｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９８年、第１６１巻、ｐ．３５７５−８１）を用いた刺激により、ＨｅｐＧ２細胞は、急性期蛋白質の誘導を示し、肝臓の炎症性プロセスに対する応答のモデル系として使用することができる。Ｈｙｐｅｒ−ＩＬ−６に対する応答においてこれらの細胞により分泌される急性期蛋白質、ハプトグロビンを、ＥＬＩＳＡによって定量化した（Ｏｐｐｍａｎｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９６年、第１９５巻、ｐ．１５３−９）。図４は、三重変異蛋白質であるＴ１０２Ｙ／Ｑ１１３Ｆ／Ｎ１１４Ｌが、用量依存性の様式で、野生型ｓｇｐ１３０Ｆｃよりも有意に強く、Ｈｙｐｅｒ−ＩＬ−６応答を阻害することを示している。
【実施例４】
【００６２】
野生型ｓｇｐ１３０Ｆｃ及び三重変異蛋白質Ｔ１０２Ｙ／Ｑ１１３Ｆ／Ｎ１１４Ｌの反応速度定数及び親和性
（Ａ）材料
Ｈｙｐｅｒ−ＩＬ−６（共有結合したＩＬ−６とｓＩＬ−６Ｒから構成されるデザイナーサイトカイン；Ｆｉｓｃｈｅｒら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９７年、第１５巻、ｐ．１４２−５）を既に記載された通り生成した。ダルベッコＰＢＳは、ＰＡＡラボラトリーズ（コルベ、ドイツ）から購入した。他の全ての化学物質は、ＶＷＲ／メルク（Ｍｅｒｃｋ）（ダームスタット、ドイツ）から購入した。
【００６３】
（Ｂ）表面プラズモン共鳴測定
表面プラズモン共鳴実験は、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６蛋白質相互作用アレイシステム（バイオラド、ハーキュリーズ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）、カリフォルニア州、米国）を用いて、製造業者の指示に従って行なった。ランニング緩衝液は、０．００５％  ツイーン２０を含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４（ＰＢＳＴ）であり、実験は２５℃で行なった。表面を活性化し（４ｍＭ  ＥＤＡＣ／１ｍＭ  スルホ−ＮＨＳ）、そして蛋白質は、１０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）中１０μｇ／ｍＬで共有結合させた。それぞれの固定化のレベルは、野生型ｓｇｐ１３０Ｆｃで１．３３０ＲＵ（レゾナンスユニット）、及び変異蛋白質Ｔ１０２Ｙ／Ｑ１１３Ｆ／Ｎ１１４Ｌで１．１２０ＲＵであった。Ｈｙｐｅｒ−ＩＬ−６の濃度は、ＰＢＳＴ中で８０ないし２．５ｎＭの範囲であった（流速：１００μＬ／分）。結合及び解離は、各々６０秒間又は６００秒間モニターした。各センサーグラム・セットは、参照チャンネルを用いて標準化し、ベースラインに揃えた。センサーグラムは、ＰｒｏｔｅＯｎマネージャー（Ｍａｎａｇｅｒ）２．０ソフトウェアを使用して分析した。
【００６４】
（Ｃ）結果
三重変異蛋白質Ｔ１０２Ｙ／Ｑ１１３Ｆ／Ｎ１１４Ｌに代表される変異蛋白質の、改善された生物学的活性（実施例２及び３参照）が、結合動態に反映されているかどうかを調べる目的で、表面プラズモン共鳴を行ない、Ｋon−及びＫoff−比を定量化した。野生型ｓｇｐ１３０Ｆｃ又はＴ１０２Ｙ／Ｑ１１３Ｆ／Ｎ１１４Ｌ変異蛋白質蛋白質を、アフィニティセンサーチップ上に固定し、そしてＨｙｐｅｒ−ＩＬ−６（ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ複合体を表わす）の結合を測定した。センサーグラムから、Ｋon及びＫoff定数と、親和定数ＫDとを計算した。変異蛋白質Ｔ１０２Ｙ／Ｑ１１３Ｆ／Ｎ１１４Ｌの、より高い阻害能は、同様のＫon及び低いＫoffに、かつその結果として４倍増大された親和定数ＫDに反映されている。Ｋoffの変化は、エネルギー的により安定な複合体からの結果であるのに対し、複合体形成は、野生型ｓｇｐ１３０Ｆｃと比較してごくわずかに影響を受けるにすぎない。
【実施例５】
【００６５】
マウスＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ及びヒトｇｐ１３０の複合体の分子モデリング及び細胞アッセイにおける仮説検定
（Ａ）モデリング
マウスＩＬ−６／マウスＩＬ−６Ｒ／ヒトｇｐ１３０複合体のモデルを、ヒトＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ／ｇｐ１３０複合体の構造を鋳型として用いて構築した（Ｂｏｕｌａｎｇｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００３年、第３００巻、ｐ．２１０１−４）。公開された配列に従い、ＩＬ−６及びＩＬ−６Ｒのアミノ酸残基を、鋳型中で交換した（Ｇｒｏｔｚｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９９７年、第２７巻、ｐ．９６−１０９）。分子における挿入及び欠失は、データベース検索法（Ｖｒｉｅｎｄ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈ．１９９０年、第８巻、ｐ．５２−６）を使用してモデル化した。
【００６６】
（Ｂ）細胞アッセイの材料及び方法
標準化されたＢＡＦ／ｇｐ１３０細胞増殖アッセイは、実施例２に記載されている。マウスＩＬ−６及びｓＩＬ−６Ｒは、Ｒ＆Ｄシステム（ヴィースバーデン、ドイツ）から入手し、３００ｎｇ／ｍＬ（ＩＬ−６）及び１５０ｎｇ／ｍＬ（ｓＩＬ−６Ｒ）にて、細胞に添加した。
【００６７】
（Ｃ）結果
実施例２−４に記載される全ての実施例において、ヒトＩＬ−６プラスヒトＩＬ−６受容体、又は、ヒトＩＬ−６及びｓＩＬ−６Ｒ配列をベースとするＨｙｐｅｒ−ＩＬ−６を使用した。ヒトｇｐ１３０におけるＱ１１３／Ｎ１１４の相互作用部位の詳細なモデリングは、変異Ｑ１１３Ｆ及びＮ１１４Ｌについて観察された有益な効果の妥当な説明として、疎水性及び非極性のアミノ酸のクラスターを示唆した（図６）。マウスにおけるインビボ研究の前提条件として、ヒトＩＬ−６／ＩＬ−６Ｒ／ｇｐ１３０複合体の三次元構造を使用して、マウスＩＬ−６／マウスＩＬ−６Ｒ／ヒトｇｐ１３０からなるモデル複合体を、比較のために生成した。このマウス／ヒト複合体の検査により、マウスＩＬ−６Ｒが芳香族残基の１つ（Ｆ１５５）を欠くことが示され（図６）、全ヒトについて見られたＱ１１３Ｆ変異蛋白質の結合親和性の増強が、マウス／ヒト系では観察されるはずがないことを示唆している。この仮説を試験するため、本発明者らは、ＢＡＦ３／ｇｐ１３０標準化細胞増殖アッセイを使用して（ヒトｇｐ１３０をＢＡＦ３細胞表面で用いて）、野生型ｓｇｐ１３０Ｆｃ及び三重変異蛋白質Ｔ１０２Ｙ／Ｑ１１３Ｆ／Ｎ１１４Ｌの阻害活性を、マウスＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ複合体を刺激用に使用して検査した。予想通り、変異蛋白質Ｔ１０２Ｙ／Ｑ１１３Ｆ／Ｎ１１４Ｌは、マウスＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒに関して、野生型ｓｇｐ１３０Ｆｃよりも効果が低かった（図７）。同じことが、変異蛋白質  Ｎ１１４Ｌにも当てはまる（データは示さず）。ヒトの系におけるＮ１１４Ｌ変異の疎水性の増大は、ヒトＩＬ−６と比較したマウスＩＬ−６におけるアミノ酸の交換（Ｒ１１７／Ｍ１１６）によって相殺される（データは示さず）。したがって、ｓｇｐ１３０Ｆｃ変異蛋白質Ｔ１０２Ｙ／Ｑ１１３Ｆ／Ｎ１１４Ｌの増強された活性は、ヒトのＩＬ６／ｓＩＬ６複合体に限定される。興味深いことに、ＢＡＦ３／ｇｐ１３０細胞においてヒトＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒによるものと同じ増殖シグナルを誘発するのに、約３倍多いマウスＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒが必要であり、このことは、ＢＡＦ細胞表面上の、マウスＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ及びヒトｇｐ１３０からなるマウス／ヒト複合体（並びに、ｓｇｐ１３０Ｆｃ野生型及び変異蛋白質中に含有されるヒトｇｐ１３０）は、全ヒトの対応物より効果が低いことを示している。
【実施例６】
【００６８】
急性炎症のマウス空気嚢モデルを用いた種特異仮説のインビボ検定
（Ａ）動物の処置
動物及びそのケアに関する全ての手順は、国内及び国際法、並びにキール大学の動物ケアに関するガイドライン（受理番号：Ｖ  ７４２−７２２４１．１２１−３（２０−２／０４）及び（７６−７／００）に従って行なった。マウスは、標準的な条件下で、１２時間の明／暗サイクル中に維持され、餌及び水は自由に取らせた。血液は、尾放血によるか、又は全身麻酔下での心臓穿刺により得た。
【００６９】
（Ｂ）材料
カラギーナンは、シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（タウフキルヒェン（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ）、ドイツ）から入手した。ダルベッコＰＢＳは、ＰＡＡラボラトリーズ（コルベ、ドイツ）から購入した。単球化学的誘引蛋白質−１（ＭＣＰ−１）用のデュオセット（ＤｕｏＳｅｔ）ＥＬＩＳＡキット及びｓｇｐ１３０は、Ｒ＆Ｄシステム（ヴィースバーデン、ドイツ）から入手した。モノクローナル抗体Ｌｙ−６Ｇ及びＦ４／８０は、各々、ＢＤ  バイオサイエンセズ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（ハイデルベルグ、ドイツ）及びインビインビトロジェン（カールスルーエ、ドイツ）から入手した。
【００７０】
（Ｃ）空気嚢モデル
局部炎症の空気嚢モデルを、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスで実施した（Ｅｄｗａｒｄｓら、Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９８１年、第１３４巻、１４７−５６）。簡単には、マウスを麻酔し、そして無菌空気６ｍｌを注入することにより、皮下背部嚢を作成した。３日後、４ｍＬの空気を再度嚢に注入した。６日目、無菌のＰＢＳ中の１％カラギーナン１ｍｌを、嚢内に注入した。野生型ｓｇｐ１３０Ｆｃ蛋白質、又は三重変異蛋白質Ｔ１０２Ｙ／Ｑ１１３Ｆ／Ｎ１１４Ｌ（５０μｇ／マウス）、又はコントロールとしてのＰＢＳを、カラギーナン注入の６時間前に腹腔内投与した。処置の７２時間後、動物を犠牲死させ、そして嚢をＰＢＳ  ３ｍｌで洗浄した。洗浄液を直ちに氷上で冷却し、５，０００ｒｐｍで４℃で１０分間遠心分離した。上清を、ＭＣＰ−１及びｓｇｐ１３０Ｆｃについて、ＥＬＩＳＡにより分析した。２ｘ１０5細胞を含有する空気嚢洗浄液のアリコートを、ＦＡＣＳ分析に使用した（ＦＡＣＳ−Ｃａｎｔｏ、ベクトン−ディッキンソン（Ｂｅｃtｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ハイデルベルグ、ドイツ）。モノクローナル抗体Ｌｙ−６Ｇ及びＦ４／８０を使用して、各々、好中球及び単球をカウントした。データは、１０，０００ゲートイベントから得た。
【００７１】
（Ｄ）結果
空気嚢モデルを用いて、（１）三重変異蛋白質Ｔ１０２Ｙ／Ｑ１１３Ｆ／Ｎ１１４Ｌのインビボ活性を調べ、そして（２）野生型ｓｇｐ１３０Ｆｃを、変異蛋白質と比較して、種特異性仮説を試験し、実施例５に記載されるインビトロデータをインビボで確認した。本発明者らは、最近、マウス空気嚢モデルにおいて、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６複合体が、急性の好中球性状態から、単核細胞に支配されるさらに慢性の状態（Ｃｈａｌａｒｉｓら、Ｂｌｏｏｄ、２００７年、第１１０巻、ｐ．１７４８−５５；Ｒａｂｅら、Ｂｌｏｏｄ、２００８年、第１１１巻、ｐ．１０２１−８）へ、炎症プロセスを動かすのに重要であることを示した。このモデルでは、単核細胞の浸潤は、ケモカインＭＣＰ−１によって媒介され、これは、ライニング細胞においてＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ複合体により誘導されるが、ＩＬ−６単独では誘導されない。したがって、このモデルを使用して、マウスにおいて、細胞の浸潤及びＭＣＰ−１の分泌が、野生型ｓｇｐ１３０Ｆｃ及び変異蛋白質Ｔ１０２Ｙ／Ｑ１１３Ｆ／Ｎ１１４Ｌによって調整され得るのかを調べた。双方のｓｇｐ１３０Ｆｃ蛋白質の注射により、浸潤性細胞の数は、同程度まで明らかに減少した（図８Ａ）。さらに、浸潤性の好中球及び単球の割合は、同じであった（図８Ｂ）。炎症領域内の変異蛋白質Ｔ１０２Ｙ／Ｑ１１３Ｆ／Ｎ１１４Ｌの濃度は、野生型ｓｇｐ１３０Ｆｃに比べてやや高かった（図８Ｃ）が、変異蛋白質Ｔ１０２Ｙ／Ｑ１１３Ｆ／Ｎ１１４Ｌは、ＭＣＰ−１の濃度に対し、同じ阻害効果を示す（図８Ｄ）。したがって、本発明者らの構造モデル（図６）及びインビトロデータ（図７）から導かれる結論は、インビボの状況と充分に一致し、ｓｇｐ１３０Ｆｃ変異蛋白質Ｔ１０２Ｙ／Ｑ１１３Ｆ／Ｎ１１４Ｌの活性増強が、ヒトのＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ複合体に限られることを示している。
【図１】
0005581214.tif 000002
【図２】
0005581214.tif 000003
【図３】
0005581214.tif 000004
【図４】
0005581214.tif 000005
【図５】
0005581214.tif 000006
【図６】
0005581214.tif 000007
【図７】
0005581214.tif 000008
【図８】
0005581214.tif 000009
【配列表】
0005581214000001.xml