(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト涙液リポカリンの所定の非天然型リガンドに対し検出可能な結合親和性を有する、ヒト涙液リポカリンの変異タンパク質（ｈＴＬｃ）であって、前記非天然型リガンドが、ヒトＭｅｔ受容体のチロシンキナーゼ（ｃ−Ｍｅｔ）であり、前記変異タンパク質が、成体ヒト涙液リポカリンのアミノ酸配列（ＳＷＩＳＳＰＲＯＴ  ＤＡＴＡＢＡＮＫ  ＥＮＴＲＹ  Ｐ３１０２５；配列番号３６）について少なくとも６個のアミノ酸置換を含み、Ａｒｇ２６→Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ；Ｇｌｕ２７→Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ；Ｐｈｅ２８→Ｍｅｔ、Ａｓｐ；Ｐｒｏ２９→Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｔｒｐ；Ｇｌｕ３０→Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ；Ｍｅｔ３１→Ｓｅｒ；Ａｓｎ３２→Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３３→Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ；Ｇｌｕ３４→Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ａｌａ；Ｌｅｕ５６→Ａｓｎ；Ｉｌｅ５７→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ５８→Ｉｌｅ、Ｖａｌ；Ａｓｐ８０→Ｔｙｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｌａ；Ｇｌｕ１０４→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０５→Ｔｈｒ；Ｈｉｓ１０６→Ｔｒｐ；及びＬｙｓ１０８→Ｇｌｙ；からなる群から選択されることを特徴とする変異タンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載の変異タンパク質において、当該変異タンパク質がアミノ酸置換：Ｃｙｓ６１→Ｓｅｒ；Ｃｙｓ１０１→Ｓｅｒ；及びＣｙｓ１５３→Ｓｅｒ；のうちの少なくとも１つを更に含むことを特徴とする変異タンパク質。
【請求項３】
請求項１又は２に記載の変異タンパク質において、当該変異タンパク質が、Ａｒｇ１１１→Ｐｒｏ及びＬｙｓ１１４→Ｔｒｐから選択される、少なくとも１の更なるアミノ酸置換を含むことを特徴とする変異タンパク質。
【請求項４】
請求項１ないし３のいずれか１項に記載の変異タンパク質において、当該変異タンパク質がそのＮ末端又はそのＣ末端で、酵素、タンパク質若しくはタンパク質ドメイン、ペプチド、シグナル配列、及び／又は親和性標識に動作可能に融合されることを特徴とする変異タンパク質。
【請求項５】
請求項１ないし４のいずれか１項に記載の変異タンパク質において、当該変異タンパク質が有機薬剤の分子と、酵素標識と、毒素と、分裂停止剤（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）と、光活性化でき、かつ光線力学的治療に好適な標識と、薬学的に好適な放射性標識と、ハプテンと、ジゴキシゲニンと、ビオチンと、化学療法用金属錯体又は金属と、コロイド金と、前記変異タンパク質の血清半減期を延長する部分とからなる群から選択される接合相手に接合することを特徴とする変異タンパク質。
【請求項６】
請求項５に記載の変異タンパク質において、前記血清半減期を延長する部分がポリアルキレングリコール分子、ヒドロキシエチルデンプン、パルミチン酸又は他の脂肪酸分子、免疫グロブリンのＦｃ部分、免疫グロブリンのＣＨ３ドメイン、免疫グロブリンのＣＨ４ドメイン、アルブミン又はアルブミンフラグメント、アルブミン結合ペプチド、アルブミン結合タンパク質、及びトランスフェリンからなる群から選択されることを特徴とする変異タンパク質。
【請求項７】
請求項６に記載の変異タンパク質において、前記アルブミン結合タンパク質が、アルブミンに向けられる細菌性のアルブミン結合タンパク質、抗体、又は抗体フラグメントか、あるいはアルブミンに対し結合活性を有するリポカリンの変異タンパク質であることを特徴とする変異タンパク質。
【請求項８】
請求項７に記載の変異タンパク質において、細菌性のアルブミンドメインが連鎖球菌性プロテインＧのアルブミン結合ドメインであることを特徴とする変異タンパク質。
【請求項９】
請求項６に記載の変異タンパク質において、前記アルブミン結合ペプチドが式Ｃｙｓ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｃｙｓを有し、Ｘａａ１がＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、又はＴｒｐであり、Ｘａａ２がＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、又はＬｙｓであり、Ｘａａ３がＡｌａ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、又はＴｙｒであり、Ｘａａ４がＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒであることを特徴とする変異タンパク質。
【請求項１０】
請求項６に記載の変異タンパク質において、前記ポリアルキレングリコールがポリエチレン（ＰＥＧ）又はその活性誘導体であることを特徴とする変異タンパク質。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の変異タンパク質において、前記非天然型リガンドが、前記ヒトＭｅｔ受容体のチロシンキナーゼの細胞外領域又はドメインであることを特徴とする変異タンパク質。
【請求項１２】
請求項５に記載の変異タンパク質において、前記毒素が百日咳毒素、ジフテリア毒素、リシン、サポリン、緑膿菌外毒素、カリチアマイシン又はその誘導体、タキソイド、マイタンシノイド、ツブリシン、及びドラスタチンアナログからなる群から選択されることを特徴とする変異タンパク質。
【請求項１３】
請求項１２に記載の変異タンパク質において、前記ドラスタチンアナログがアウリスタチンＥ、モノメチルアウリスタチンＥ、アウリスタチンＰＹＥ、及びアウリスタチンＰＨＥからなる群から選択されることを特徴とする変異タンパク質。
【請求項１４】
請求項５に記載の変異タンパク質において、前記分裂停止剤がシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、５−フルオロウラシル、タキソテール（ドセタキセル）、パクリタキセル、アントラサイクリン（ドキソルビシン）、メトトレキサート、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ダカルバジン、シクロホスファミド、エトポシド、アドリアマイシン、カンプトテシン、コンブレタスタチンＡ−４関連化合物、スルホンアミド、オキサジアゾリン、ベンゾ［ｂ］チオフェン、合成型スピロケタールピラン、モノテトラヒドロフラン化合物、クラシン及びクラシン誘導体、メトキシエストラジオール誘導体、及びロイコボリンからなる群から選択されることを特徴とする変異タンパク質。
【請求項１５】
請求項１ないし１４のいずれか１項に記載の変異タンパク質において、当該変異タンパク質が、ヒト肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）又はヒト散乱因子（ＳＦ）のアンタゴニストとして作用しないことを特徴とする変異タンパク質。
【請求項１６】
請求項１ないし１５のいずれか１項に記載の変異タンパク質において、当該変異タンパク質が２００ｎＭ以下のＫＤで細胞外領域又はＭｅｔ受容体のドメインを結合することを特徴とする変異タンパク質。
【請求項１７】
請求項１６に記載の変異タンパク質において、当該変異タンパク質が１００ｎＭ以下のＫＤで細胞外領域又はＭｅｔ受容体のドメインを結合することを特徴とする変異タンパク質。
【請求項１８】
請求項１７に記載の変異タンパク質において、当該変異タンパク質が２０ｎＭ以下のＫＤで細胞外領域又はＭｅｔ受容体のドメインを結合することを特徴とする変異タンパク質。
【請求項１９】
請求項１８に記載の変異タンパク質において、当該変異タンパク質が１ｎＭ以下のＫＤで細胞外領域又はＭｅｔ受容体のドメインを結合することを特徴とする変異タンパク質。
【請求項２０】
請求項１ないし１９のいずれか１項に記載の変異タンパク質が、Ｔｈｒ３７→Ｓｅｒ；Ｍｅｔ３９→Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｎ４８→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ５２→Ｔｈｒ、Ｍｅｔ；Ｍｅｔ５５→Ｌｅｕ；Ｌｙｓ６５→Ａｒｇ、Ｌｅｕ；Ａｌａ７９→Ｌｅｕ、Ｓｅｒ；Ａｌａ８６→Ｔｈｒ；及びＩｌｅ８９→Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ；からなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸置換を更に含むことを特徴とする変異タンパク質。
【請求項２１】
請求項１ないし２０のいずれか１項に記載の変異タンパク質において、当該変異タンパク質がアミノ酸置換：Ａｒｇ２６→Ｔｈｒ；Ｇｌｕ２７→Ｇｌｎ；Ｇｌｕ３０→Ｌｅｕ；Ｍｅｔ３１→Ｓｅｒ；Ａｓｎ３２→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ３３→Ｔｙｒ；Ｇｌｕ３４→Ｖａｌ；Ｌｅｕ５６→Ａｓｎ；Ｉｌｅ５７→Ｇｌｎ；Ａｓｐ８０→Ｔｙｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｌａ；Ｇｌｕ１０４→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０５→Ｔｈｒ；Ｈｉｓ１０６→Ｔｒｐ；及びＬｙｓ１０８→Ｇｌｙ；を含むことを特徴とする変異タンパク質。
【請求項２２】
請求項１ないし２０のいずれか１項に記載の変異タンパク質において、当該変異タンパク質がアミノ酸置換：Ｍｅｔ３１→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ５６→Ａｓｎ；Ｉｌｅ５７→Ｇｌｎ；Ａｓｐ８０→Ｔｙｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｌａ；Ｇｌｕ１０４→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０５→Ｔｈｒ；Ｈｉｓ１０６→Ｔｒｐ；及びＬｙｓ１０８→Ｇｌｙ；を含むことを特徴とする変異タンパク質。
【請求項２３】
請求項１ないし２２のいずれか１項に記載の変異タンパク質において、当該変異タンパク質がアミノ酸置換：Ｃｙｓ６１→Ｓｅｒ；Ｃｙｓ１０１→Ｓｅｒ；Ａｒｇ１１１→Ｐｒｏ；Ｌｙｓ１１４→Ｔｒｐ；及びＣｙｓ１５３→Ｓｅｒ；を含むことを特徴とする変異タンパク質。
【請求項２４】
請求項１ないし２３のいずれか１項に記載の変異タンパク質において、当該変異タンパク質がアミノ酸置換の集合：
（１）Ａｒｇ２６→Ｔｈｒ；Ｇｌｕ２７→Ｇｌｎ；Ｐｈｅ２８→Ｍｅｔ；Ｇｌｕ３０→Ｌｅｕ；Ｍｅｔ３１→Ｓｅｒ；Ａｓｎ３２→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ３３→Ｔｙｒ；Ｇｌｕ３４→Ｖａｌ；Ｌｅｕ５６→Ａｓｎ；Ｉｌｅ５７→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ５８→Ｉｌｅ；Ａｓｐ８０→Ｔｙｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｌａ；Ｇｌｕ１０４→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０５→Ｔｈｒ；Ｈｉｓ１０６→Ｔｒｐ；及びＬｙｓ１０８→Ｇｌｙ；
（２）Ａｒｇ２６→Ｔｈｒ；Ｇｌｕ２７→Ｇｌｎ；Ｐｈｅ２８→Ａｓｐ；Ｇｌｕ３０→Ｌｅｕ；Ｍｅｔ３１→Ｓｅｒ；Ａｓｎ３２→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ３３→Ｔｙｒ；Ｇｌｕ３４→Ｖａｌ；Ｌｅｕ５６→Ａｓｎ；Ｉｌｅ５７→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ５８→Ｖａｌ；Ａｓｐ８０→Ｔｙｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｌａ；Ｇｌｕ１０４→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０５→Ｔｈｒ；Ｈｉｓ１０６→Ｔｒｐ；及びＬｙｓ１０８→Ｇｌｙ；
（３）Ａｒｇ２６→Ｔｈｒ；Ｇｌｕ２７→Ｇｌｎ；Ｐｈｅ２８→Ａｓｐ；Ｇｌｕ３０→Ｌｅｕ；Ｍｅｔ３１→Ｓｅｒ；Ａｓｎ３２→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ３３→Ｔｙｒ；Ｇｌｕ３４→Ｖａｌ；Ｌｅｕ５６→Ａｓｎ；Ｉｌｅ５７→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ５８→Ｉｌｅ；Ａｓｐ８０→Ｔｙｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｌａ；Ｇｌｕ１０４→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０５→Ｔｈｒ；Ｈｉｓ１０６→Ｔｒｐ；及びＬｙｓ１０８→Ｇｌｙ；
（４）Ａｒｇ２６→Ｖａｌ；Ｇｌｕ２７→Ｇｌｙ；Ｐｈｅ２８→Ａｓｐ；Ｐｒｏ２９→Ｌｅｕ；Ｇｌｕ３０→Ｇｌｙ；Ｍｅｔ３１→Ｓｅｒ；Ａｓｎ３２→Ａｒｇ；Ｌｅｕ３３→Ｖａｌ；Ｇｌｕ３４→Ｖａｌ；Ｌｅｕ５６→Ａｓｎ；Ｉｌｅ５７→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ５８→Ｉｌｅ；Ａｓｐ８０→Ｔｙｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｌａ；Ｇｌｕ１０４→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０５→Ｔｈｒ；Ｈｉｓ１０６→Ｔｒｐ；及びＬｙｓ１０８→Ｇｌｙ；
（５）Ａｒｇ２６→Ｐｒｏ；Ｇｌｕ２７→Ｇｌｙ；Ｐｈｅ２８→Ａｓｐ；Ｐｒｏ２９→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ｓｅｒ；Ａｓｎ３２→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ３３→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ３４→Ｖａｌ；Ｌｅｕ５６→Ａｓｎ；Ｉｌｅ５７→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ５８→Ｉｌｅ；Ａｓｐ８０→Ｔｙｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｌａ；Ｇｌｕ１０４→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０５→Ｔｈｒ；Ｈｉｓ１０６→Ｔｒｐ；及びＬｙｓ１０８→Ｇｌｙ；
（６）Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ；Ｐｈｅ２８→Ａｓｐ；Ｐｒｏ２９→Ａｌａ；Ｇｌｕ３０→Ｐｈｅ；Ｍｅｔ３１→Ｓｅｒ；Ａｓｎ３２→Ｖａｌ；Ｌｅｕ３３→Ｔｈｒ；Ｇｌｕ３４→Ｖａｌ；Ｌｅｕ５６→Ａｓｎ；Ｉｌｅ５７→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ５８→Ｉｌｅ；Ａｓｐ８０→Ｔｙｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｌａ；Ｇｌｕ１０４→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０５→Ｔｈｒ；Ｈｉｓ１０６→Ｔｒｐ；及びＬｙｓ１０８→Ｇｌｙ；
（７）Ａｒｇ２６→Ｖａｌ；Ｇｌｕ２７→Ｖａｌ；Ｐｈｅ２８→Ａｓｐ；Ｐｒｏ２９→Ｔｒｐ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ｓｅｒ；Ａｓｎ３２→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３３→Ｖａｌ；Ｇｌｕ３４→Ａｒｇ；Ｌｅｕ５６→Ａｓｎ；Ｉｌｅ５７→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ５８→Ｉｌｅ；Ａｓｐ８０→Ｔｙｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｌａ；Ｇｌｕ１０４→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０５→Ｔｈｒ；Ｈｉｓ１０６→Ｔｒｐ；及びＬｙｓ１０８→Ｇｌｙ；ならびに、
（８）Ａｒｇ２６→Ｇｌｙ；Ｇｌｕ２７→Ｓｅｒ；Ｐｈｅ２８→Ａｓｐ；Ｐｒｏ２９→Ｔｒｐ；Ｍｅｔ３１→Ｓｅｒ；Ａｓｎ３２→Ｖａｌ；Ｌｅｕ３３→Ｐｈｅ；Ｇｌｕ３４→Ａｌａ；Ｌｅｕ５６→Ａｓｎ；Ｉｌｅ５７→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ５８→Ｉｌｅ；Ａｓｐ８０→Ｔｙｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｌａ；Ｇｌｕ１０４→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０５→Ｔｈｒ；Ｈｉｓ１０６→Ｔｒｐ；及びＬｙｓ１０８→Ｇｌｙ；
のうちの１つを含むことを特徴とする変異タンパク質。
【請求項２５】
請求項１ないし２４のいずれか１項に記載の変異タンパク質が、Ｔｈｒ４０→Ｃｙｓ；Ｇｌｕ７３→Ｃｙｓ；Ａｒｇ９０→Ｃｙｓ；Ａｓｐ９５→Ｃｙｓ；Ｌｙｓ１２１→Ｃｙｓ；Ａｓｎ１２３→Ｃｙｓ；及びＧｌｕ１３１→Ｃｙｓ；からなる群から選択される、成熟野生型の配列に対する突然変異のうちの少なくとも１つを更に含むことを特徴とする変異タンパク質。
【請求項２６】
請求項２５に記載の変異タンパク質が、配列位置４０、７３、９０、９５、１２１、１２３、又は１３１でのＣｙｓ残基のいずれかを介して前記変異タンパク質に結合されている接合相手を更に含むことを特徴とする変異タンパク質。
【請求項２７】
請求項２６に記載の変異タンパク質において、前記接合相手が、有機分子と、酵素標識と、毒素と、分裂停止剤と、薬学的に好適な放射性標識と、蛍光標識と、色素標識と、発光標識と、ハプテンと、ジゴキシゲニンと、ビオチンと、金属錯体と、金属と、コロイド金と、前記変異タンパク質の血清半減期を延長する部分とからなる群から選択されることを特徴とする変異タンパク質。
【請求項２８】
請求項１ないし２４のいずれか１項に記載の変異タンパク質において、当該変異タンパク質が配列番号１、配列番号４ないし９、配列番号２２ないし２６、配列番号３２ないし３５、又は配列番号３７ないし４９のうちのいずれか１つに示されるようなアミノ酸配列を有することを特徴とする変異タンパク質。
【請求項２９】
請求項１ないし２８のいずれか１項に記載の変異タンパク質が、２．５から９．５までの範囲のｐＨで安定することを特徴とする変異タンパク質。
【請求項３０】
請求項２９に記載の変異タンパク質が、３．０から９．３までの範囲のｐＨで安定することを特徴とする変異タンパク質。
【請求項３１】
請求項１ないし４、請求項７ないし９、請求項１１、請求項１５ないし２５および請求項２８ないし３０のいずれか１項に記載の変異タンパク質をコード化するヌクレオチド配列を含むことを特徴とする核酸分子。
【請求項３２】
ベクタに含まれることを特徴とする、請求項３１に記載の核酸分子。
【請求項３３】
ファージミドベクタに含まれることを特徴とする、請求項３１に記載の核酸分子。
【請求項３４】
請求項３１ないし３３のいずれか１項に記載の核酸分子を含むことを特徴とする宿主細胞。
【請求項３５】
請求項１ないし３０のいずれか１項に記載のヒト涙液リポカリンの変異タンパク質と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含むことを特徴とする医薬組成物。
【請求項３６】
請求項１ないし３０のいずれかに記載のヒト涙液リポカリンの変異タンパク質を産生する方法であって、前記変異タンパク質が、遺伝子工学的方法によって、細菌性又は真核の宿主生物において前記変異タンパク質をコード化する核酸から産生され、前記宿主生物又はその培養物から分離されることを特徴とする方法。
【請求項３７】
疾患又は障害の治療用医薬品の製造における、請求項１ないし３０のいずれかに記載の変異タンパク質、あるいは請求項３５に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３８】
請求項３７に記載の使用において、前記疾患又は障害が細胞増殖性障害であることを特徴とする使用。
【請求項３９】
請求項３７又は３８に記載の使用において、前記疾患又は障害が癌であることを特徴とする使用。
【請求項４０】
請求項３９に記載の使用において、前記癌が肝臓癌、結腸癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、乳頭型腎がん、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ）、又は頭頸部扁平上皮癌のリンパ節転移であることを特徴とする使用。
【請求項４１】
ヒトＭｅｔ受容体のチロシンキナーゼ（Ｍｅｔ）あるいはそのドメイン又はフラグメントの生体外検出のための、請求項１ないし３０のいずれか１項に記載のヒト涙液リポカリンの変異タンパク質の使用であって、
ａ）好適な条件下で、ヒトＭｅｔ受容体のチロシンキナーゼ（Ｍｅｔ）あるいはそのドメイン又はフラグメントを有するとされるサンプルと前記変異タンパク質を接触させ、これによって前記変異タンパク質と、ヒトＭｅｔ受容体のチロシンキナーゼ（Ｍｅｔ）あるいはそのドメイン又はフラグメントとの間での複合体形成を可能にするステップと、
ｂ）好適なシグナルによって、複合体形成された前記変異タンパク質を検出するステップと、
を具えることを特徴とする使用。
【請求項４２】
ヒトＭｅｔ受容体のチロシンキナーゼ（Ｍｅｔ）あるいはそのドメイン又はフラグメントの生体外分離のための、請求項１ないし３０のいずれか１項に記載のヒト涙液リポカリンの変異タンパク質の使用であって、
ａ）好適な条件下で、ヒトＭｅｔ受容体のチロシンキナーゼ（Ｍｅｔ）あるいはそのドメイン又はフラグメントを有するとされるサンプルと前記変異タンパク質を接触させ、これによって前記変異タンパク質と、ヒトＭｅｔ受容体のチロシンキナーゼ（Ｍｅｔ）あるいはそのドメイン又はフラグメントとの間での複合体形成を可能にするステップと、
ｂ）前記サンプルから前記変異タンパク質／Ｍｅｔの複合体を分離するステップと、
を具えることを特徴とする使用。
【請求項４３】
請求項４１又は４２に記載の使用であって、前記変異タンパク質／ｃ−Ｍｅｔの複合体が固体担体上に結合されることを特徴とする使用。
【請求項４４】
ヒトｃ−Ｍｅｔ受容体のチロシンキナーゼ（ｃ−Ｍｅｔ）機能に関連する疾病又は障害の生体外診断のための請求項１ないし３０のいずれか１項に記載のヒト涙液リポカリンの変異タンパク質の使用であって、
ａ）好適な条件下で、ヒトＭｅｔ受容体のチロシンキナーゼ（ｃ−Ｍｅｔ）あるいはそのドメイン又はフラグメントを有するとされるサンプルと前記変異タンパク質を接触させ、これによって前記変異タンパク質と、前記ヒトＭｅｔ受容体のチロシンキナーゼ（ｃ−Ｍｅｔ）あるいはそのドメイン又はフラグメントとの間での複合体形成を可能にするステップと、
ｂ）好適なシグナルによって、複合体形成された前記変異タンパク質を検出するステップと、
を具えることを特徴とする使用。
【請求項４５】
生物又は組織中の事前選択された部位を、薬学的に能動的な化合物が標的とするために使用される、請求項１ないし３０のいずれか１項に記載のヒト涙液リポカリンの変異タンパク質において、
前記変異タンパク質は前記化合物と接合されており、
前記変異タンパク質／化合物の複合体は前記事前選択された部位に送達される、
ことを特徴とする変異タンパク質。
【請求項４６】
請求項４５に記載の変異タンパク質において、前記薬学的に能動的な化合物が、毒素、分裂停止剤、又はｃ−Ｍｅｔアンタゴニストからなる群から選択されることを特徴とする変異タンパク質。
【請求項４７】
請求項４６に記載の変異タンパク質において、前記毒素が百日咳毒素、ジフテリア毒素、リシン、サポリン、緑膿菌外毒素、カリチアマイシン又はその誘導体、タキソイド、マイタンシノイド、ツブリシン、及びドラスタチンアナログからなる群から選択されることを特徴とする変異タンパク質。
【請求項４８】
請求項４７に記載の変異タンパク質において、前記ドラスタチンアナログが、アウリスタチンＥ、モノメチルアウリスタチンＥ、アウリスタチンＰＹＥ、及びアウリスタチンＰＨＥからなる群から選択されることを特徴とする変異タンパク質。
【請求項４９】
請求項４６の変異タンパク質において、前記分裂停止剤が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、５−フルオロウラシル、タキソテール（ドセタキセル）、パクリタキセル、アントラサイクリン（ドキソルビシン）、メトトレキサート、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ダカルバジン、シクロホスファミド、エトポシド、アドリアマイシン、カンプトテシン、コンブレタスタチンＡ−４関連化合物、スルホンアミド、オキサジアゾリン、ベンゾ［ｂ］チオフェン、合成型スピロケタールピラン、モノテトラヒドロフラン化合物、クラシン及びクラシン誘導体、メトキシエストラジオール誘導体、及びロイコボリンからなる群から選択されることを特徴とする変異タンパク質。
【請求項５０】
請求項４６に記載の変異タンパク質において、前記ｃ−Ｍｅｔアンタゴニストが、モノクローナル抗体と、１，３，５，トリアジン−２，４−ジアミン誘導体と、２−（２，６−ジクロロフェニル−イミダゾール誘導体と、窒素含有型で二環式の誘導体と、５−ベンジルスルホニル及びスルホンアミド置換型のピロールインドリン（ｐｙｒｒｏｌｅ  ｉｎｄｏｌｉｎｅ）とからなる群から選択されることを特徴とする変異タンパク質。
【請求項５１】
請求項１ないし２４のいずれか１項に記載の変異タンパク質において、当該変異タンパク質が配列番号４２に示されるようなアミノ酸配列を有することを特徴とする変異タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は２００８年１月３０日付出願の米国仮特許出願第６１／０２４，６５８号の優先権の利益を主張し、これによってその内容はすべての目的のために全体として引用によって組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ヒトＭｅｔ受容体のチロシンキナーゼ（ｃ−Ｍｅｔ）に対する検出可能な結合親和性を有するヒト涙液リポカリンの変異タンパク質（ｈＴＬｃ）、あるいはそのドメイン又はフラグメントに関する。このような変異タンパク質は、ｈＴＬＣの配列位置２６ないし３４、５６ないし５８、８０、８３、１０４ないし１０６、及び１０８に対応する配列位置のうちの少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。本発明は更に、このような変異タンパク質をコード化する対応する核酸分子と、その産生方法に関する。本発明は更に、このような変異タンパク質を産生する方法に関する。最終的には、本発明はこのようなリポカリンの変異タンパク質を含む医薬組成物、ならびに変異タンパク質の様々な使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｍｅｔ受容体のチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）は最初、ヒト癌遺伝子Ｔｐｒ−Ｍｅｔ（Ｐａｒｋら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８４，ページ６３７９−６３８３，１９８７）の産物として同定された。ｃ−Ｍｅｔに対するリガンドは肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）として同定された。ＨＧＦは最初は、培養における肝細胞用のマイトジェンとして同定された。ＨＧＦは散乱因子（ＳＦ）、上皮細胞のシートの分散を促進する線維芽細胞由来因子、ならびに三次元培養で成長する上皮の枝管形成と同一である。ＨＧＦ／ＳＦは従って、有糸分裂誘発、細胞運動性、及び形態発生を含む複数の細胞応答を誘発する固有の成長因子である。
【０００４】
ＨＧＦ／ＳＦ及びｃ−Ｍｅｔは、成体の多くの組織に発現する。ｃ−Ｍｅｔタンパク質は多くの場合上皮細胞に発現するが、更に内皮細胞、神経系細胞、肝細胞、造血細胞、メラノサイトにもある。ｃ−Ｍｅｔは最も重要な膜受容体のうちの１つとなりうる。その活性は有糸分裂誘発、運動原性の発生（ｍｏｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）、形態発生といった細胞生理で重要な役割を果たす。ＨＧＦ／ＳＦは間葉系起源の細胞によって実質的に産生されるように思われる。
【０００５】
ＨＧＦ／ＳＦがｃ−Ｍｅｔを活性化する場合、下流で作用すべき最初のタンパク質はＧｒｂ２（成長因子受容体結合タンパク質２）、及びＧａｂ１（成長因子受容体結合タンパク質２関連型の結合剤１）である。Ｇｒｂ２は順々に多数のキナーゼ経路を活性化でき、ＲａｓないしＲａｆ、ないしＭｅｋ、ないしＭＡＰＫ（マイトジェンで活性化されたタンパク質キナーゼ）の経路を含む。Ｇａｂ１はＰＩ３Ｋ（ホスホイノシチド３キナーゼ）を活性化し、ＳＴＡＴ３（シグナル伝達性転写因子）を活性化する。ｃ−Ｍｅｔ活性は更に、核に移行し、かつ転写制御に関与するＷｎｔ経路の主要な成分であるβカテニンの活性化を誘発する。
【０００６】
ＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔ経路は、癌の発生に重要な役割を果たす。第１に主要な発癌過程（Ｒａｓ、ＰＩ３Ｋ／ＳＴＡＴ３、βカテニン）の活性化を通して、第２に内皮細胞増殖（血管新生）を通して、第３にプロテアーゼ産生の増加を通して、細胞解離は転移を導く。
【０００７】
一部が第Ｉ相又は第ＩＩ相臨床試験にある、様々な新しい治療アプローチはＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔ経路を目標とする。これらのアプローチはＡＶＥＯ社のヒト化した形態のＡＶ２９９といった抗ＨＧＦモノクローナル抗体、あるいはＡｍｇｅｎ社のもの（ＡＭＧ１０２）といったＡＭＢ１０２と称される完全ヒト抗体を含む。別のアプローチはデコイとして作用するｃ−Ｍｅｔの切断型異性体の使用である。一のこのような例はＣＯＭＰＵＧＥＮ社のＣＧＥＮ２４１と呼ばれる切断型である。更にｃ−Ｍｅｔ誘発性経路を遮断するタンパク質キナーゼ阻害剤（小分子）は治療目的で用いられる。このような小分子のタンパク質キナーゼ阻害剤の例は、ＡＲＱＵＬＥ社のＡＲＱ１９７、ＥＸＥＬＩＸＩＳ社のＸＬ８８０、ＳＧＸ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社のＳＧＸ５２３、ＳＵＰＥＲＧＥＮ社のＭＰ４７０、又はＰＦＩＺＥＲ社のＰＦ２３４１０６６を含む。
【０００８】
しかしながら、ｃ−Ｍｅｔを結合し、例えば治療目的のために用いられうる利用可能な更なる化合物を有することは更に所望される。
【０００９】
従って、所定の標的に対し高い結合親和性を有するヒト涙液リポカリンの変異タンパク質を提供することが本発明の目的である。
【００１０】
この目的は例えば、ヒトＭｅｔ受容体のチロシンキナーゼ（ｃ−Ｍｅｔ）、あるいはそのドメイン又はフラグメントに対して検出可能な結合親和性を有するヒト涙液リポカリン（ｈＴｌｃ）変異タンパク質によって実現され、このような変異タンパク質は、ｈＴＬＣの配列位置２６ないし３４、５６ないし５８、８０、８３、１０４ないし１０６、及び１０８に対応する少なくとも１の配列位置でのアミノ酸置換を含む。
【００１１】
関連する態様においては、本発明はヒト涙液リポカリンの変異タンパク質の産生方法を提供し、変異タンパク質は検出可能な結合親和性を有し、ｃ−Ｍｅｔを結合する。この方法は、
（ａ）ヒト涙液リポカリンをコード化する核酸分子を、天然型の成体ヒト涙液リポカリンの、直鎖状のポリペプチド配列のアミノ酸配列位置２６ないし３４、５６ないし５８、８０、８３、１０４ないし１０６、及び１０８のうちのいずれかの少なくとも１のコドンでの突然変異誘発のために供するステップであって、成体ヒト涙液リポカリンの直鎖状のポリペプチド配列の配列位置６１及び１５３で、システイン残基をコード化するコドンのうちの少なくとも１つが、その他のアミノ酸残基をコード化するように突然変異されており、これによって、ヒト涙液リポカリンの変異タンパク質をコード化する複数の核酸を得るステップと、
（ｂ）発現系において、（ａ）で得られた１又はそれ以上の変異タンパク質の核酸分子を発現するステップであって、これによって、１又はそれ以上の変異タンパク質を得るステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた１又はそれ以上の変異タンパク質の核酸分子を濃縮し、選択及び／又は分離によって、Ｍｅｔに対し検出可能な結合親和性を有するステップと
を具える。
【００１２】
この状況において、驚くべきことに、システイン残基６１及び１５３によって形成される野生型の涙液リポカリンの（各々の未処理の核酸ライブラリの段階での）構造的なジスルフィド結合の除去によって（Ｂｒｅｕｓｔｅｄｔら（２００５），Ｔｈｅ  １．８−Å  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｅａｒ  ｌｉｐｏｃａｌｉｎ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａｎ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｃａｖｉｔｙ  ｗｉｔｈ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｆｏｒ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｌｉｇａｎｄｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０，４８４−４９３参照）、安定して折り畳まれるだけではなく、更に、低ピコモルの範囲で親和性を有して、所定の非天然型リガンドを結合することが可能な涙液リポカリンの変異タンパク質を提供することを発明者が見出したことは留意すべきである。
【００１３】
本明細書中で用いられる用語「突然変異誘発（ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）」は、ヒト涙液リポカリンの所定の配列位置で天然に存在するアミノ酸（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ｄａｔａ  ｂａｎｋ  ｅｎｔｒｙ：Ｐ３１０２５）が、各々の天然ポリペプチド配列中のこの特異的な位置に存在しない少なくとも１のアミノ酸によって置換できるように、実験条件が選択されることを意味する。用語「突然変異誘発」は更に、１又はそれ以上のアミノ酸の欠失又は挿入による配列セグメントの長さの（追加の）修飾を含む。従って、例えば、選択された配列位置での１のアミノ酸が伸長する３のランダムな突然変異によって置換され、野生型タンパク質の各セグメントの長さと比較して２のアミノ酸残基の挿入を引き起こすことは本発明の範囲内のことである。このような欠失の挿入は、本発明において突然変異誘発に供されうるペプチドセグメントのいずれかに互いに別個に導入してもよい。本発明の１の例示的な実施形態においては、数個の突然変異の挿入は、選択されたリポカリンの骨格のループＡＢに導入してもよい（引用によって本明細書中に全体が取り込まれる国際公開第２００５／０１９２５６号参照）。用語「ランダムな突然変異誘発（ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）」は、所定の単一アミノ酸（突然変異）が特定の配列位置に存在しないが、少なくとも２のアミノ酸が突然変異誘発中に、既定の配列位置にある確率で取り込まれうることを意味する
【００１４】
ヒト涙液リポカリンのコード配列（Ｒｅｄｌ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７，２０２８２−２０２８７）は、本発明で選択されるペプチドセグメントの突然変異誘発のための開始点として用いられる。列挙されたアミノ酸位置の突然変異誘発について、当該技術分野の当業者は自由裁量で、部位特異的突然変異誘発のための様々に確立された標準的な方法を有する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）、上記を参照）。通常用いられる技術は、合成オリゴヌクレオチドの混合物を用いた、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）による突然変異の導入であり、所望の配列位置に変性した塩基組成物を有する。例えば、コドンＮＮＫ又はＮＮＳ（ここで、Ｎ＝アデニン、グアニン、又はシトシン、あるいはチミン；Ｋ＝グアニン又はチミン；Ｓ＝アデニン又はシトシン）の使用は、２０の総てのアミノ酸に加え、終止コドンであるアンバの取り込みを、突然変異誘発中に可能にするが、一方、コドンＶＶＳはアミノ酸Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｖａｌがポリペプチド配列の選択された位置に取り込まれるのを排除するために、取り込まれるアミノ酸の最大数を１２に限定し、例えば、コドンＮＭＳ（ここで、Ｍ＝アデニン又はシトシン）の使用は、アミノ酸Ａｒｇ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｖａｌが選択された配列位置に取り込まれるのを排除するために、選択された配列位置でのアミノ酸の最大数を１１に限定する。この点において、セレノシステインあるいはピロールリジンといった（天然に存在する通常の２０のアミノ酸以外の）アミノ酸用のコドンは更に、変異タンパク質の核酸に取り込んでもよいことは留意すべきである。更に、Ｗａｎｇ，Ｌ．ら（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２９２，４９８−５００、又はＷａｎｇ，Ｌ．及びＳｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（２００２）Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．１，１−１１に記載されるように、他の特異的なアミノ酸、例えば、ｏ−メチル−Ｌ−チロシン又はｐ−アミノフェニルアラニンを挿入するために、終止コドンとして通常認識される、ＵＡＧといった「人工的な（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ）」コドンを用いることは可能である。
【００１５】
例えば、イノシン、８−オキソ−２’デオキシグアノシン、又は６（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−３，４−ジヒドロ−８Ｈ−ピリミド（ｐｙｒｉｍｉｎｄｏ）−１，２−オキサジン−７−オン（Ｚａｃｃｏｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５，５８９−６０３）のような、還元型の塩基対特異性を有するヌクレオチド構成要素の使用は、選択された配列セグメントへの突然変異の導入のための、他の選択肢である。
【００１６】
更なる可能性はいわゆる三塩基組での突然変異誘発（ｔｒｉｐｌｅｔ−ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）である。この方法は、別個のヌクレオチドの三塩基組の混合物を用いており、その各々が１のアミノ酸について、コード配列への取り込みのためにコードされる（Ｖｉｒｎｅｋａｓ  Ｂ，Ｇｅ  Ｌ，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ａ，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ＫＣ，Ｗｅｌｌｎｈｏｆｅｒ  Ｇ，Ｍｏｒｏｎｅｙ  ＳＥ．１９９４  Ｔｒｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ：ｉｄｅａｌ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｍｉｘｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ２２，５６００−５６０７）。
【００１７】
各ポリペプチドの選択された領域に突然変異を導入するための１の可能なストラテジは、４のオリゴヌクレオチドの使用に基づいており、その各々は、変異導入すべき対応する配列セグメントのうちの１つから部分的に得られる。これらのオリゴヌクレオチドを合成する場合、当該技術分野の当業者は、総ての天然アミノ酸をコード化するコドンがランダムに生じるように、変異導入すべきアミノ酸位置に対応する、ヌクレオチドの三塩基組の合成用の核酸構成要素の混合物を用いることができ、最終的にはリポカリンのペプチドライブラリを産生する。例えば、第１のオリゴヌクレオチドはその配列中において、変異導入された位置から離れ、ペプチドセグメントがリポカリンのポリペプチドの最もＮ末端の位置で変異導入される、コーディング鎖に対応する。従って、第２のオリゴヌクレオチドは、ポリペプチド配列に続く第２の配列セグメント用の非コーディング鎖に対応する。第３のオリゴヌクレオチドは更に、対応する第３の配列セグメント用のコーディング鎖に対応する。最後に第４のオリゴヌクレオチドは、第４の配列セグメント用の非コーディング鎖に対応する。ポリメラーゼ連鎖反応は、第１及び第２のオリゴヌクレオチドの各々で実行でき、別個に必要に応じて、第１及び第２のオリゴヌクレオチドの各々で実行してもよい。
【００１８】
これらの反応の双方の増幅産物は、第１ないし第４の配列セグメントの配列を含む単一核酸に、様々な所定の方法によって結合でき、突然変異は選択された位置で導入されていた。このため、産物の双方は、例えば隣接するオリゴヌクレオチド、ならびに１又はそれ以上のメディエータの核酸分子を用いて、新しいポリメラーゼ連鎖反応に供することができ、第２及び第３の配列セグメント間の配列を提供する。突然変異誘発に用いられるオリゴヌクレオチドの配列内の数及び配列の選択において、当該技術分野の当業者は自由裁量で、数多くの選択肢を有する。
【００１９】
上に規定された核酸分子は、リポカリンのポリペプチドをコード化する、欠損した核酸の５’−及び３’−配列及び／又はベクタでの核酸連結によって結合でき、周知の宿主生物中でクローン化できる。多数の確立した手順が核酸連結及びクローン化用に利用可能である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）上記参照）。例えば、クローニングベクタの配列中に更に存在する制限エンドヌクレアーゼの認識配列は、合成オリゴヌクレオチドの配列で操作されうる。従って、各々のＰＣＲ産物の増幅及び酵素切断後に、得られたフラグメントは対応する認識配列を用いて容易にクローン化されうる。
【００２０】
突然変異誘発用に選択されたタンパク質のためにコード化する遺伝子内の長い配列セグメントは更に、例えば、誤差率の増加条件下でのポリメラーゼ連鎖反応の使用によって、化学的な突然変異誘発によって、あるいは細菌性の突然変異誘発株を用いることによって、周知の方法を介してランダムな突然変異誘発に供されうる。このような方法は更に、リポカリンの変異タンパク質の標的の親和性又は特異性の更なる最適化のために用いられうる。実験的な突然変異誘発のセグメント外部に場合により生じる突然変異は多くの場合許容され、例えばリポカリンの変異タンパク質の折り畳みの効率又は折り畳みの安定性の改善に貢献する場合、利点にさえなりうる。
【００２１】
本明細書中で用いられる用語「ヒト涙液リポカリン（ｈｕｍａｎ  ｔｅａｒ  ｌｉｐｏｃａｌｉｎ）」は、受入番号Ｐ３１０２５でＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋで供託された成体ヒト涙液リポカリン、かつ本明細書で配列番号３６で示されるアミノ酸配列のことである。
【００２２】
本発明の一実施形態においては、ヒト涙液リポカリンの変異タンパク質の産生方法は、成体ヒト涙液リポカリンの直鎖状のポリペプチド配列の、アミノ酸配列位置２６ないし３４、５６ないし５８、８０、８３、１０４ないし１０６、及び１０８のいずれかのコドンのうち、少なくとも２、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、１５、１６、又は１７個を変異導入するステップを含む。別の実施形態においては、成体ヒト涙液リポカリンの直鎖状のポリペプチド配列の、アミノ酸配列位置２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、５６、５７、５８、８０、８３、１０４、１０５、１０６、及び１０８の、総ての１８のコドンは変異導入される。従って、本発明のＭｅｔ結合型の変異タンパク質は、成体ヒト涙液リポカリンの直鎖状のポリペプチド配列の、アミノ酸配列位置２６ないし３４、５６ないし５８、８０、８３、１０４ないし１０６、及び１０８の位置のうち、任意の２、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、１５、１６、１７、又は１８個での突然変異を含みうる。しかしながら、配列位置を突然変異誘発に供することが、選択された最大限のアミノ酸置換が本発明の変異タンパク質中に実際に生じることを必ずしも意味しないことは当該技術分野の当業者に明確である。逆突然変異又は構造機能相関によって、野生型の涙液リポカリン配列のアミノ酸残基は更に、本発明の変異タンパク質中に保持されうる。
【００２３】
別の態様においては、本発明はヒト涙液リポカリンの変異タンパク質の産生方法を含み、変異タンパク質は、検出可能な結合親和性を有するヒト涙液リポカリンの所定の非天然型リガンドとしてｃ−Ｍｅｔを結合し、
（ａ）成体ヒト涙液リポカリンの直鎖状のポリペプチド配列のアミノ酸配列位置３４、８０、及び１０４のいずれかのうち少なくとも１のコドンで、ヒト涙液リポカリンをコード化する核酸分子を突然変異誘発に供するステップであって、これによってヒト涙液リポカリンの変異タンパク質をコード化する複数の核酸を得るステップと、
（ｂ）発現系において、（ａ）で得られた１又はそれ以上の変異タンパク質の核酸分子を発現するステップであって、これによって、１又はそれ以上の変異タンパク質を得るステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）で得られた１又はそれ以上の変異タンパク質の核酸分子を濃縮し、選択及び／又は分離によって、ヒト涙液リポカリンの所定の非天然型リガンドとしてのｃ−Ｍｅｔに対し、検出可能な結合親和性を有するステップと、
を具える。
【００２４】
上述の方法の一実施形態においては更に、成体ヒト涙液リポカリンの直鎖状のポリペプチド配列の、アミノ酸配列位置２６ないし３３、５６ないし５８、８３、１０５ないし１０６、及び１０８のいずれかのコドンのうち、少なくとも２、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、又は１５個が変異導入された。
【００２５】
本発明の更なる実施形態においては、本発明による方法は、成体ヒト涙液リポカリンの直鎖状のポリペプチド配列中の位置６１及び１５３でシステインをコード化する、双方のコドンの突然変異を含む。双方の位置は例えば、セリン残基をコード化するのに変異導入されうる。
【００２６】
本明細書中に記載の本発明の別の実施形態においては、成体ヒト涙液リポカリンの直鎖状のポリペプチド配列のアミノ酸配列位置１１１及び／又は１１４をコード化するコドンは、例えば位置１１１でのプロリンと、位置１１４でのトリプトファンとをコード化するのに変異導入される。
【００２７】
本発明の方法の別の実施形態は、成体ヒト涙液リポカリンの直鎖状のポリペプチド配列の位置１０１でシステインをコード化するコドンの突然変異誘発を含み、このコドンがその他のアミノ酸をコード化する。一実施形態においては、位置１０１をコード化する変異導入されたコドンはセリンをコード化する。従って、いくつかの実施形態においては、位置６１、１０１、及び１５３でのシステインコドンのうちの２個又は３個総ては、別のアミノ酸のコドンによって配置される。
【００２８】
本発明の方法によると、変異タンパク質はヒト涙液リポカリンをコード化する核酸から得られる。このような核酸は突然変異誘発に供されて、組換えＤＮＡ技術によって、好適な細菌性又は真核性の宿主生物に導入される。涙液リポカリンの核酸ライブラリを得ることは、抗体様の特性を有するリポカリンの変異タンパク質、すなわち、所定の標的に対する親和性を有する変異タンパク質を産生するのに好適な、当該技術分野の当業者に周知の任意の技術を用いて行われうる。このような組合せ型の方法の実施例は例えば、開示内容全体が本明細書中に引用によって取り込まれる、国際公開第９９／１６８７３号、国際公開第００／７５３０８号、国際公開第０３／０２９４７１号、国際公開第０３／０２９４６２号、国際公開第０３／０２９４６３号、国際公開第２００５／０１９２５４号、国際公開第２００５／０１９２５５号、国際公開第２００５／０１９２５６号、国際公開第２００６／５６４６４号、及び国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５７９７１に詳細に記載されている。適切な宿主中で突然変異誘発に供された核酸配列の発現後、複数の各リポカリンの変異タンパク質用の遺伝情報を保有するクローンは、所定の標的を結合し、得られたライブラリから選択されうる。ファージディスプレイ（Ｋａｙ，Ｂ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）上記を参照；Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．（１９９７）上記を参照；又はＲｏｄｉ，Ｄ．Ｊ．及びＭａｋｏｗｓｋｉ，Ｌ．（１９９９）上記参照；に概説）、コロニースクリーニング（Ｐｉｎｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ．５，５０３−５１０；に概説）、リボソームディスプレイ（Ａｍｓｔｕｔｚ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ，Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２，４００−４０５；に概説）、又はＷｉｌｓｏｎ，Ｄ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８，３７５０−３７５５；に報告されるようなｍＲＮＡディスプレイ、あるいは、開示内容全体が本明細書中に引用によって取り込まれる、国際公開第９９／１６８７３号、国際公開第００／７５３０８号、国際公開第０３／０２９４７１号、国際公開第０３／０２９４６２号、国際公開第０３／０２９４６３号、国際公開第２００５／０１９２５４号、国際公開第２００５／０１９２５５号、国際公開第２００５／０１９２５６号、国際公開第２００６／５６４６４号、及び国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５７９７１に明確に記載された方法といった公知の技術は、これらのクローンの選択用に用いられうる。
【００２９】
この開示によると、ｃ−Ｍｅｔ結合型の涙液リポカリンの変異タンパク質を得る方法のステップ（ｃ）は更に、上の方法の別の実施形態においては、
（ｉ）所定のリガンドとして、ｃ−Ｍｅｔ又はそのドメイン又はフラグメントを提供するステップと、
（ｉｉ）前記リガンドと、当該リガンドに対し結合親和性を有する変異タンパク質との間で複合体の形成を可能にするように、複数の変異タンパク質を前記リガンドと接触させるステップと、
（ｉｉｉ）結合親和性を有さない、あるいは実質的に有さない変異タンパク質を除去するステップと、
を具える。
【００３０】
ｃ−Ｍｅｔ結合型の涙液リポカリンの変異タンパク質の産生のために、ヒトＭｅｔ受容体のチロシンキナーゼ（ｃ−Ｍｅｔ）の細胞外ドメインの任意の部分（例えば、フラグメント又は単一ドメイン）、あるいは細胞外ドメイン全体（成熟受容体全体のＮ末端のアミノ酸残基である、位置１のメチオニンないし位置９３２のスレオニンを含む（ＳＷＩＳＳ  Ｐｒｏｔ：Ｐ０８５８１））は、これらの変異タンパク質をコード化する（未処理の）核酸ライブラリの発現から得られた（複数の）変異タンパク質と接触できる。商業上利用可能な細胞外ドメインを用いることは可能であり、例えば、（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、米国、品番３５８−ＭＴ）といったポリペプチドリンカを介したヒトＩｇＧのＦｃ領域に融合された残基１ないし９３２として例えば提供される。本明細書に記載の変異タンパク質を得るのに用いられうるｃ−Ｍｅｔのフラグメントの更なる実施例は限定しないが、７のセマドメインを含む、Ｓｔａｍｏｓら，Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．１２，２００４，２３２５−２３３５ページ；に記載されるようなＭｅｔの残基２５ないし５６７からなるフラグメントか、あるいは残基２５ないし５６７を含む、より大きなフラグメントを含む。セマドメインを結合するフラグメントは、本発明の変異タンパク質がＨＧＦのセマドメインへの結合と競合すると推定される場合に用いられうる。このような変異タンパク質はＨＧＦのアンタゴニストであってもよい（しかし、必ずしも有しなければならない訳ではない、実施例参照）。残基５６８ないし９３２を含むものといったフラグメントを用いることは、セマドメインへの結合が回避されるべき場合に更に可能である。スクリーニングは更に、フラグメント、あるいはｃ−ＭｅｔのＰＳＩドメイン又はＩｇＧ様ドメインといった他のドメインを用いて行われうる。スクリーニング目的で、例えば、ヒトｃ−Ｍｅｔの（細胞外ドメインの）代わりに、通常のチンパンジーの相同体（学名：ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー）、ヒトｃ−Ｍｅｔと９９％同一）、マカクの相同体（学名：ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ（アカゲザル）、９８％同一）、イヌの相同分子種（学名：ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（カニスファミリアリス）、８８％同一）、マウスの相同分子種（ＳＷＩＳＳ  Ｐｒｏｔ：Ａ１Ａ５９７、８７％同一）、又はラットの相同分子種（学名：ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ドブネズミ）、８６％同一）を用いることは更に可能である。このようなアプローチは、例えばヒトと、マウス又はラットの相同分子種との間で交差反応性を有する変異タンパク質（又は、例えば細胞外ドメイン）が所望される場合に取られるであろう。上から明確なように、本発明においてＨＧＦに対し拮抗作用を有しうる涙液リポカリンの変異タンパク質を産生することは可能である。代替的に、変異タンパク質はそれぞれ非拮抗結合モードを有してもよい（この点については実施例参照）。
【００３１】
本発明の方法の一実施形態においては、ステップ（ｃ）における選択は、競合条件下で行われる。本明細書中で用いられるような競合条件は、変異タンパク質及びヒト涙液リポカリンの所定の非天然型リガンド（標的）がＨＧＦといった更なるリガンドの存在時に接触する少なくとも１のステップを、変異タンパク質の選択が含みうることを意味し、それは変異タンパク質の標的への結合と競合する。この更なるリガンドは、ＨＧＦといったｃ−Ｍｅｔの生理学的リガンドか、抗ｃ−Ｍｅｔ抗体といったｃ−Ｍｅｔのその他の非生理学的リガンドか、又は本発明の変異タンパク質を認識するエピトープに、重複する若しくは部分重複するエピトープを少なくとも結合し、ひいては変異タンパク質の標的結合と干渉する、低分子タンパク質のチロシンキナーゼ阻害剤であってもよい。代替的に、この更なるリガンドは、アロステリック効果により、変異タンパク質のｃ−Ｍｅｔへの結合部位と異なるエピトープを複合体化することによって、変異タンパク質の結合と競合してもよい。
【００３２】
溶原性のＭ１３ファージを用いた、ファージディスプレイ技術の、ある実施形態（Ｋａｙ，Ｂ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）上記を参照；Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）上記を参照；又は、Ｒｏｄｉ，Ｄ．Ｊ．及びＭａｋｏｗｓｋｉ，Ｌ．（１９９９）上記を参照；に概説）は、本発明で用いられうる選択方法のある実施例として提供される。本発明の変異タンパク質の選択に用いられうるファージディスプレイ技術の別の実施形態（実験の項参照）は、Ｂｒｏｄｅｒｓによって記載のようなハイパーファージ（ｈｙｐｅｒｐｈａｇｅ）のファージ技術である（Ｂｒｏｄｅｒｓら（２００３）“Ｈｙｐｅｒｐｈａｇｅ．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．”Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２０５：２９５−３０２）。ｆ１といった他の溶原性ファージ、又はＴ７といった溶菌性ファージは同様に用いてもよい。例示的な選択方法について、Ｎ末端でシグナル配列、好適にはＯｍｐＡシグナル配列を有し、かつ、Ｃ末端でファージカプシドに組み込まれうる、ファージＭ１３のカプシドタンパク質ｐＩＩＩ、又はそのフラグメントを有するシグナル配列融合タンパク質として、変異導入されるリポカリンの核酸配列の発現を可能にするＭ１３ファージミドが産生される。野生型の配列のアミノ酸２１７ないし４０６を含むファージカプシドタンパク質のＣ末端のフラグメントΔｐＩＩＩは、融合タンパク質を産生するのに好適に用いられる。一実施形態において特に好適であるのは、ｐＩＩＩのＣ末端のフラグメントであり、位置２０１でのシステイン残基は欠損しているか、あるいは別のアミノ酸に置換される。
【００３３】
従って、本発明の方法の更なる実施形態は、ヒト涙液リポカリンの複数の変異タンパク質をコード化する核酸を動作可能に融合するステップと、ｃ−Ｍｅｔの結合用の少なくとも１の変異タンパク質を選択するように、Ｍ１３ファミリの線維状ファージのコートタンパク質ｐＩＩＩか、あるいはこのコートタンパク質のフラグメントをコード化する遺伝子で、３’末端での突然変異誘発を生じさせるステップとを含む。
【００３４】
融合タンパク質は親和性標識といった更なる成分を含んでもよく、融合タンパク質又はその一部分の固定化、検出、及び／又は精製を可能にする。更に、終止コドンは、リポカリン又はその変異タンパク質をコード化する配列領域と、ファージカプシド遺伝子又はそのフラグメントとの間に配置でき、終止コドン、好適にはアンバの終止コドンは、好適なサプレッサー株における翻訳時に、アミノ酸に少なくとも部分的に翻訳される。
【００３５】
例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５７９７１に記載の、ｐＴｌｃ２７とも呼ばれるファスミドベクタｐＴＬＰＣ２７は、ヒト涙液リポカリンの変異タンパク質をコード化するファージミドライブラリの調製に用いられうる。涙液リポカリンの変異タンパク質をコード化する本発明の核酸分子は、２のＢｓｔＸＩ制限部位を用いてベクタに挿入されうる。核酸連結後、大腸菌のＸＬ１−Ｂｌｕｅといった好適な宿主株は、多数の別個のクローンを産生するために、得られた核酸混合物で形質転換される。各ベクタは必要に応じて、ハイパーファージミド（ｈｙｐｅｒｐｈａｇｅｍｉｄ）ライブラリの調製のために産生できる。代替的に、例えば本出願の実施例に用いられるベクタｐＴＬＰＣ５９といった、その他の好適なファージミドベクタ（実施例１及び図１参照）は更に、ファージミドライブラリの調製のために用いられうる。ベクタｐＴＬＰＣ５９は、ファージディスプレイ用のライブラリ遺伝子コントラクトが、ｔｅｔプロモータ（ｔｅｔ  ｐ／ｏ）の代わりにｌａｃプロモータ（ｌａｃ  ｐ／ｏ）の制御下に置かれ、ＶＣＳＭ１３ファージの全長遺伝子ＩＩＩに遺伝学的に融合されることを除いては、ベクタｐＴＬｃ２７と同一である。
【００３６】
得られたライブラリはその後、機能的なファージミドを産生するために、液体培養中に適切なＭ１３ヘルパーファージ又はハイパーファージに重感染できる。組換え型ファージミドは、コートタンパク質ｐＩＩＩ又はそのフラグメントを有する融合物としてその表面上にリポカリンの変異タンパク質を表示する一方、融合タンパク質のＮ末端のシグナル配列は通常切断される。他方、ヘルパーファージによって供給される天然型カプシドタンパク質ｐＩＩＩの１又はそれ以上のコピーを更に有し、従ってレシピエント、一般的にはＦ−又はＦ’−プラスミドを保有する菌種を感染させることができる。ハイパーファージディスプレイの場合において、ハイパーファージミドは感染性のコートタンパク質ｐＩＩＩを有するが、天然型カプシドタンパク質を有しない融合物として、その表面にリポカリンの変異タンパク質を表示する。ヘルパーファージ又はハイパーファージの感染中又はその後に、リポカリンの変異タンパク質とカプシドタンパク質との間での融合タンパク質の遺伝子発現が、例えばアンヒドロテトラサイクリンの添加によって誘発できる。誘発条件は、実質的に一部分の得られたファージミドが、その表面上に少なくとも１のリポカリンの変異タンパク質を表示するように選択される。ハイパーファージディスプレイの場合においては、誘発条件は、リポカリンの変異タンパク質とカプシドタンパク質ｐＩＩＩとからなる、３ないし５の融合タンパク質を保有するハイパーファージミドの集団を生じさせる。様々な方法がポリエチレングリコールでの沈殿といったファージミドを分離することで知られる。分離は一般的に、６ないし８時間のインキュベーション期間後に生じる。
【００３７】
分離されたファスミドはその後、所望の標的（すなわち、ｃ−Ｍｅｔの細胞外ドメイン、あるいはその一部又はフラグメント）とのインキュベーションによって選択に供することができ、標的はそれらのコート中の融合タンパク質として、所望の結合活性を有する変異タンパク質を保有する、そのファージミドの少なくとも一時的な固定化を可能にする形態で示される。当該技術分野の当業者に周知の様々な実施形態の間で、標的は例えば、血清アルブミンといった担体タンパク質と接合され、この担体タンパク質を介してタンパク質結合面、例えばポリスチレンに結合されうる。ＥＬＩＳＡ技術に好適なマイクロタイタープレート、又はいわゆる「イムノスティック」は好適には、このような標的の固定化のために用いられうる。代替的に、ビオチンといった他の結合基での標的の接合が用いられうる。標的はその後、例えばマイクロタイタープレート、あるいはストレプトアビジン、ニュートラアビジン、又はアビジンでコーティングされた常磁性粒子といった、この群を選択的に結合する表面に固定化できる。標的が免疫グロブリンのＦｃ部分に融合される場合、固定化は更に、例えばマイクロタイタープレート又は常磁性粒子といった、プロテインＡ又はプロテインＧでコーディングされた表面で得られうる。
【００３８】
表面上にある非特異的なファージミド結合部位は、ＥＬＩＳＡ法で知られるようにブロッキング溶液で飽和できる。ファージミドは次いで、一般的には、生理学的バッファの存在下で表面に固定化される標的と接触する。結合されないファージミドは複数の洗浄によって除去される。表面上に残ったファージミド粒子はその後溶出される。溶出では、いくつかの方法が可能である。例えば、ファージミドはプロテアーゼの添加によって、あるいは酸、塩基、界面活性剤、又はカオトロピック塩の存在下で、あるいは適度な変性条件下で溶出できる。好適な方法は、ｐＨ２．２のバッファを用いた溶出であり、溶出物はその後中和される。代替的に、遊離型の標的（すなわち、ｃ−Ｍｅｔの細胞外ドメイン、あるいはその一部又はフラグメント）の溶液は、ファージミドへの結合用に固定化された標的と競合するように添加でき、標的特異性のファージミドは、対象の標的に特異的に結合する免疫グロブリン又は天然型リガンドのタンパク質との競合によって溶出できる。
【００３９】
その後、大腸菌細胞は溶出されたファージミドに感染する。代替的に、核酸は溶出されたファージミドから抽出でき、別の方法においては細胞の配列解析、増幅、又は形質転換のために用いられうる。この方法で得られた大腸菌クローンから、新しいファージミド又はハイパーファージミドが上述の方法によって、Ｍ１３ヘルパーファージ又はハイパーファージでの重感染によって更に産生され、この方法で増幅されたファージミドは再度、固定化された標的の選択に供される。複数の選択サイクルは多くの場合、十分に濃縮された形態での本発明の変異タンパク質で、ファージミドを得るために必要である。選択サイクルの数は、その後の機能解析において、少なくとも０．１％の調査されたクローンが所定の標的に対する検出可能な親和性を有する変異タンパク質を産生するように、好適に選択される。用いられるライブラリの大きさ、すなわち、複雑度に依存して、２ないし８のサイクルが一般的にはこのために要求される。
【００４０】
選択された変異タンパク質の機能解析では、大腸菌株はその後、選択サイクルから得られるファージミドに感染でき、対応する二本鎖のファスミドＤＮＡが分離される。このファスミドＤＮＡから、あるいは更にファージミドから抽出される単鎖ＤＮＡから、本発明の選択された変異タンパク質の核酸配列は、当該技術分野に周知の方法によって決定でき、アミノ酸配列はそれから推定されうる。変異導入された領域、又は涙液リポカリンの変異タンパク質全体の配列は、別の発現ベクタでサブクローン化され、好適な宿主生物で発現されうる。例えば、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５７９７１に記載のベクタｐＴｌｃ２６は、大腸菌ＴＧ１といった大腸菌株中の発現のために用いられうる。このように産生された涙液リポカリンの変異タンパク質は、様々な生化学的方法によって調製されうる。例えばｐＴｌｃ２６で産生された涙液リポカリンの変異タンパク質は、そのＣ末端で親和性ペプチドのＳｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）ＩＩ（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．上記参照）を保有し、従ってストレプトアビジン親和性クロマトグラフィよって好適に調製されうる。
【００４１】
選択は更に、他の方法によって行われうる。多くの対応する実施形態が当該技術分野の当業者に周知であるか、あるいは文献中に記載されている。更に、方法の組合せが適用されうる。例えば、「ファージディスプレイ」によって選択されるか、あるいは少なくとも濃縮されるクローンは更に、「コロニースクリーニング」に供されうる。この手順は、別個のクローンがｃ−Ｍｅｔに対する検出可能な結合親和性を有する涙液リポカリンの変異タンパク質、あるいは例えば、ｃ−Ｍｅｔの細胞外ドメインの産生に対し、直接的に分離されうるといった利点を有する。
【００４２】
「ファージディスプレイ」技術又は「コロニースクリーニング」法における宿主生物としての大腸菌の使用に加えて、他の菌種、酵母、あるいは更に昆虫細胞又は哺乳類細胞はこの目的に用いられうる。上述のようなランダム（未処理）のライブラリからの、涙液リポカリンの変異タンパク質の選択に加えて、突然変異誘発の限定を含む発展的方法は更に、スクリーニングサイクルの反復後の標的に対する親和性又は特異性について、標的に対する結合活性を既に有する変異タンパク質を最適化するために適用できる。
【００４３】
ｃ−Ｍｅｔに対し親和性を有する変異タンパク質、あるいはそのドメイン又はフラグメントは一度選択されると、更に高い親和性の変異体、あるいは、高い熱安定性、血清安定性の改善、熱力学的安定性、溶解性の改善、単量体の挙動の改善、熱変性、化学変性、タンパク質分解、又は界面活性剤に対する耐性の改善等といった改善された特性を有する変異体を次に選択するために、このような変異タンパク質を別の突然変異誘発に供することが更に可能である。この更なる突然変異誘発は、高親和性を目的とする場合においては生体内での「親和性成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）」とみなしうるが、合理的設計に基づく部位特異的な突然変異、又はランダムな突然変異によって得られる。より高い親和性又は改善された特性を得るための別の可能なアプローチは、エラープローンＰＣＲの使用であり、リポカリンの変異タンパク質の配列位置の選択した範囲にわたる点突然変異が生じる。エラープローンＰＣＲはＺａｃｃｏｌｏら（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５，５８９−６０３：で記載されるものといった任意の周知のプロトコルによって行われうる。この目的に好適な他のランダムな突然変異誘発方法は、Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０，７６−８１：で記載のようなランダムな挿入／欠失（ＲＩＤ）か、あるいはＢｉｔｔｋｅｒ，Ｊ．Ａら（２００２）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０，１０２４−１０２９：で記載のような非相同性のランダムな組換えを含む。必要に応じて、親和性成熟は更に、国際公開第００／７５３０８号、又はＳｃｈｌｅｈｕｂｅｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９７，１１０５−１１２０：に記載の手順によって行うことができ、ジゴキシゲニンに対し高親和性を有するビリン結合型のタンパク質の変異タンパク質が得られた。親和性を改善する更なるアプローチは、位置的な飽和突然変異誘発を行うことである。このアプローチにおいて、「小さな」核酸ライブラリは、アミノ酸交換／突然変異が本明細書で規定される任意の４のループセグメント内の単一位置にのみ導入されて産生されうる（実施例２１参照）。これらのライブラリはその後、更なるパニングのラウンドなしに、選択ステップ（親和性スクリーニング）に直接的に供される。このアプローチによって、所望の標的の結合の改善に寄与する残基の同定が可能となり、結合に重要な「ホットスポット（ｈｏｔ  ｓｐｏｔ）」の同定が可能となる。このようなアプローチがあれば、最初の２のセグメント（配列位置２４ないし３６、又は５６ないし５８）内のキー残基の同定が例えば可能である。
【００４４】
更なる態様においては、本発明はｃ−Ｍｅｔに対し検出可能な結合親和性を有するヒト涙液リポカリンの変異タンパク質、あるいはそのドメイン又は一部に関し、上に詳述した本発明の方法によって取得可能であるか、あるいは取得される。
【００４５】
一実施形態においては、上の方法によって得られたヒト涙液リポカリンの変異タンパク質は、別のアミノ酸によって配列位置６１及び１５３の各々で生じるシステイン残基のうちの少なくとも１つ又は双方の置換と、成体ヒト涙液リポカリンの直鎖状のポリペプチド配列の配列位置２６ないし３４、５６ないし５８、８０、８３、１０４ないし１０６、及び１０８のうちのいずれか１つでの、少なくとも１のアミノ酸残基の突然変異とを含む。位置２４ないし３６はＡＢループに含まれ、位置５３ないし６６はＣＤループに含まれ、位置６９ないし７７はＥＦループに含まれ、位置１０３ないし１１０は涙液リポカリンのβバレル構造の開放端での結合部位におけるＧＨループに含まれる。これらの４のループの定義は、Ｆｌｏｗｅｒ（Ｆｌｏｗｅｒ，Ｄ．Ｒ．（１９９６）上記を参照、及びＦｌｏｗｅｒ，Ｄ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）上記を参照）に従って本明細書中で用いられる。通常、このような変異タンパク質は、成体ヒト涙液リポカリンの直鎖状のポリペプチド配列の配列位置２６ないし３４、５６ないし５８、８０、８３、１０４ないし１０６、及び１０８で、少なくとも２、３、４、５、６、８、１０、１２、１４、１５、１６、１７、又は１８個の変異導入されたアミノ酸残基を含む。特定の実施形態においては、変異タンパク質はアミノ酸置換Ｃｙｓ６１→Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、又はＴｒｐと、Ｃｙｓ１５３→Ｓｅｒ又はＡｌａとを含む。このような置換は天然に存在するジスルフィド架橋結合Ｃｙｓ６１及びＣｙｓ１５３の形成を防ぎ、ひいては変異タンパク質の処理を促進するのに有用であった。
【００４６】
更に別の実施形態においては、Ａｒｇ１１１→Ｐｒｏ及びＬｙｓ１１４→Ｔｒｐから選択される少なくとも１の更なるアミノ酸置換を含む。本発明の変異タンパク質は更に、別のアミノ酸によって置換された天然型の成体ヒト涙液リポカリンの配置位置１０１でシステインを含んでもよい。置換は例えば、突然変異Ｃｙｓ１０１→Ｓｅｒ又はＣｙｓ１０１→Ｔｈｒであってもよい。
【００４７】
本発明のリポカリンの変異タンパク質は、変異導入されたアミノ酸配列位置の外部に野生型（天然型）アミノ酸配列を含んでもよい。他方、本明細書中に開示されたリポカリンの変異タンパク質は更に、その突然変異が結合活性及び変異タンパク質の折り畳み構造と干渉しない限りにおいては、突然変異誘発に供される配列位置の外部にアミノ酸突然変異を含んでもよい。このような突然変異は、確立した標準的な方法を用いてＤＮＡレベルで非常に容易に得られうる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）。可能なアミノ酸配列の変質は挿入又は欠失ならびにアミノ酸置換である。このような置換は保存的であってもよく、すなわち、アミノ酸残基は化学的に同様のアミノ酸残基で置換される。保存的置換の例は、以下の群：
１）アラニン、セリン、及びスレオニン；
２）アスパラギン酸及びグルタミン酸；
３）アスパラギン及びグルタミン；
４）アルギニン及びリジン；
５）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、及びバリン；
ならびに、
６）フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン；
の要素間での置換である。他方では、アミノ酸配列中で非保存的変質を誘導することは更に可能である。更に、単一アミノ酸残基を置換する代わりに、涙液リポカリンの一次構造の１又はそれ以上の連続的なアミノ酸を挿入する、あるいは欠失させることは更に、この欠失又は挿入が安定して折り畳まれた／機能的な変異タンパク質（例えば、切断型のＮ及びＣ末端を有する変異タンパク質が産生される実験上の切片を参照）を生じさせる限りにおいては可能である。
【００４８】
アミノ酸配列のこのような修飾は、特定の制限酵素に対し切断部位を組み込むことによって、変異導入されたリポカリン遺伝子又はその一部のサブクローン化を単純化するために、単一アミノ酸位置の定方向の突然変異誘発を含む。更に、これらの突然変異は所定の標的に対するリポカリンの変異タンパク質の親和性を更に改善するために、更に組み込まれうる。更に、突然変異は必要に応じて、折り畳みの安定性、血清安定性、タンパク質の耐性、又は水溶解性を改善するために、あるいは凝集傾向を低減するために、といった変異タンパク質の特定の特徴を調節するために導入できる。例えば、天然に存在するシステイン残基を他のアミノ酸に変異導入して、ジスルフィド架橋を防いでもよい。しかしながら、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ビオチン、ペプチド、又はタンパク質といった他の化合物への接合用に、あるいは非天然に存在するジスルフィド結合の形成用に新しい反応基を導入するために、他のアミノ酸配列位置をシステインに計画的に変異することは更に可能である。システイン残基をヒト涙液リポカリンの変異タンパク質のアミノ酸配列に導入するための、このような突然変異の例示的な可能性は、置換Ｔｈｒ４０→Ｃｙｓ、Ｇｌｕ７３→Ｃｙｓ、Ａｒｇ９０→Ｃｙｓ、Ａｓｐ９５→Ｃｙｓ、Ｌｙｓ１２１→Ｃｙｓ、Ａｓｎ１２３→Ｃｙｓ、及びＧｌｕ１３１→Ｃｙｓを含む。アミノ酸位置４０、７３、９０、９５、１２１、１２３及び／又は１３１のいずれかの側で産生されたチオール部分は、変異タンパク質をＰＥＧ化又はＨＥＳ化するために、例えば各々の涙液リポカリンの変異タンパク質の血清半減期を増加させるために用いてもよい。システインがこれらの任意の配列位置で導入される変異タンパク質Ｓ２４４．２−Ｈ０８（実施例９参照）は、本発明のこのような変異タンパク質の例示的な実施例である。システイン残基のいずれかの側鎖は当然ながら血清半減期を増加させる化合物の接合のためだけではなく、数例の連結例を挙げると、有機分子、酵素標識、毒素、分裂停止剤（ｃｙｓｔｏｓｔａｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）、薬学的に好適な放射性標識、蛍光標識、色素標識、発光標識、ハプテン、ジゴキシゲニン、ビオチン、金属錯体、金属、又はコロイド金といった任意の所望の接合相手の接合のためにも同様に用いることができる。接合は当該技術分野に周知の従来の結合方法を用いて行うことができ（例えば、実施例１８参照）、システイン残基はトリス［２−カルボキシエチル］ホスフィン（ＴＣＥＰ）又はジチオトレイトール（ＤＴＴ）といった試薬によって活性化でき、更には、３−Ｎ−マレイミド−６−ヒドラジニウムピリジン塩酸塩（ＨＹＮＩＣ）といった試薬と反応させうる。
【００４９】
本発明は更に、上に規定されるような切断型の変異タンパク質（すなわちフラグメント）を含み、例えば、成体ヒト涙液リポカリンの配列の最初の４のＮ末端のアミノ酸残基（Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ；位置１ないし４）及び／又は成体ヒト涙液リポカリンの配列の最後の２のＣ末端のアミノ酸残基（Ｓｅｒ−Ａｓｐ；位置１５７ないし１５８）は、欠失している（実施例及び添付の配列表を更に参照のこと）。
【００５０】
本発明のリポカリンの変異タンパク質は、検出可能な親和性、すなわち、少なくとも２００ｎＭの解離定数を有する所望の標的、すなわちｃ−Ｍｅｔ受容体のチロシンキナーゼ、あるいはそのドメイン又はフラグメントを結合できる。いくつかの実施形態において現在好適なのはリポカリンの変異タンパク質であり、少なくとも１００、２０、１ｎＭ、又は更にそれ未満の所定の標的に対する解離定数で所望の標的を結合する。所望の標的に対する変異タンパク質の結合親和性は、蛍光滴定、競合ＥＬＩＳＡ、又は表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）といった多数の方法によって測定できる。
【００５１】
複合体形成が結合相手の濃度、競合相手の存在、バッファ系のイオン強度等といった多くの因子に依存することは当業者に容易に明らかとなろう。選択及び濃縮は一般的には、リポカリンの変異タンパク質の分離が所望の標的（ｃ−Ｍｅｔ、あるいはそのドメイン又はフラグメント）と複合して、少なくとも２００ｎＭの解離定数を有することが可能な条件下で行われる。しかしながら、洗浄及び溶出ステップは、可変のストリンジェンシ下で行われうる。動的特性に関連する選択は同様に可能である。例えば、選択は複数の条件下で行うことができ、その条件は標的からの遅い解離、あるいは言い換えると低いｋｏｆｆ速度を示す、変異タンパク質と標的との複合体形成を支持する。代替的には、選択は複数の条件下で行うことができ、その条件は、変異タンパク質と標的との間の速い複合体形成、あるいは言い換えると高いｋｏｎ速度を支持する。更なる例示的な選択肢として、スクリーニングは、変異タンパク質の熱安定性の（野生型の涙液リポカリン又は事前選択された標的に対する親和性を既に有する変異タンパク質のいずれかと比較した）改善のためか、あるいは変異タンパク質のｐＨ安定性のために選択される条件下で行うことができる。
【００５２】
本発明の涙液リポカリンの変異タンパク質は一般的には、単量体タンパク質として存在する。しかしながら、本発明のリポカリンの変異タンパク質は自発的に二量体化するか、あるいは更に高次の低重合体を形成しうることは更に可能である。安定した単量体を形成するリポカリンの変異タンパク質の使用は、例えば更に速い拡散と良好な組織浸透のためといった、いくつかの用途に好適にできるが、安定した同質二量体又は多量体を自発的に形成するリポカリンの変異タンパク質の使用は、このような多量体が所定の標的に対する親和性及び／又は結合活性の（更なる）増加を提供できるため、その他の場合に有利になりうる。更に、リポカリンの変異タンパク質の低重合体の形成は更に遅い解離速度、あるいは長期の血清半減期を有しうる。安定した単量体を形成する変異タンパク質の二量体化又は多量体化が所望される場合、これは例えば、本発明の変異タンパク質にｊｕｎ−ｆｏｓドメイン又はロイシンジッパーといった各々の低重合体ドメインを融合することによって、あるいは「デュオカリン（Ｄｕｏｃａｌｉｎ）の使用によって得られうる（更に以降を参照のこと）。
【００５３】
本発明の涙液リポカリンの変異タンパク質は、ｃ−Ｍｅｔあるいはそのドメイン又はフラグメントとの複合体形成のために、例えば試験管内での生体外診断目的で、あるいは生体内での治療目的で用いてもよい。
【００５４】
一般的には、ｃ−Ｍｅｔに対し本明細書中で用いられる用語「フラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）」は、Ｎ末端及び／又はＣ末端で短縮されたタンパク質又はペプチドのリガンドと関連し、本発明による変異タンパク質で認識及び／又は結合すべき全長型リガンドの性能を保持する。ｃ−Ｍｅｔに対する用語「ドメイン」は当該技術分野で用いられる通常の意味に従って理解すべきである。例えば、用語「ドメイン」は、Ｓｔａｍｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．２３，ページ２３２５−２３３５，２００４（例えば、Ｓｔａｍｏｓらの図３ａ又は４を参照）；に構造上規定されるようなセマドメイン、ＰＳＩドメイン、ＩｇＧ様ドメイン、膜貫通ドメイン、又は更に、Ｓｃｈｉｅｒｉｎｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，Ｖｏｌ．１００，Ｎｏ．２２，ページ１２６５４−１２６５９，２００３；に構造上規定されるようなチロシンキナーゼドメインを含む。用語「ドメイン」は更に、全長型受容体タンパク質の残基Ｍｅｔ１ないしＴｈｒ９３２によって形成されるｃ−Ｍｅｔの細胞外部分全体か、あるいは、例えば全長型受容体の残基２、３、４、５、６ないし残基９２０、９２５、９３０、又は９３１によって形成される切断型フラグメントを含む。上述のように、例えば細胞外ドメイン全体、又は、例えばセマドメインといった細胞外ドメインの一部のみの使用によって、ＨＧＦ結合部位に結合する（その後、ＨＧＦに対しアンタゴニスト結合モードを有しうる）変異タンパク質か、ＨＧＦ結合に対し非アンタゴニスト結合モードを有する変異タンパク質か、のいずれかを産生することが可能である。
【００５５】
この文脈においては、各々の変異タンパク質と、ｃ−Ｍｅｔ、あるいはそのドメイン又はフラグメントとの間での複合体形成は、各々の結合相手の濃度、競合相手の存在、用いられるバッファ系のｐＨ及びイオン強度、及び、解離定数ＫＤの決定に用いられる実験的方法（数例だけを挙げると、例えば蛍光滴定、競合ＥＬＩＳＡ、又は表面プラズモン共鳴）又は実験データの評価に用いられる数学的アルゴリズムといった多くの異なる因子によって影響されることは更に留意されよう。
【００５６】
従って、本明細書で提供されるＫＤ値（各々の変異タンパク質とそのリガンドとの間に形成される複合体の解離定数）は、特定の実験範囲内で変更してもよく、所定のリガンドに対する特定のリポカリンの変異タンパク質の親和性を決定するのに用いられる方法及び実験設定に依存することは更に、当業者に明らかである。このことは測定されたＫＤ値にわずかな偏差、又は、例えば、ＫＤ値が表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）によって、あるいは競合ＥＬＩＳＡによって決定されるかどうかに依存する許容範囲があり得ることを示す。
【００５７】
本発明の特定の実施形態においては、成体ヒト涙液リポカリンのアミノ酸配列について少なくとも６、８、１０、１２、１４、１６、又は１７個のアミノ酸置換を含み、Ａｒｇ２６→Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ；Ｇｌｕ２７→Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ；Ｐｈｅ２８→Ｍｅｔ、Ａｓｐ；Ｐｒｏ２９→Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｔｒｐ；Ｇｌｕ３０→Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｐｈｅ；Ｍｅｔ３１→Ｓｅｒ；Ａｓｎ３２→Ｌｅｕ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３３→Ｔｙｒ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｔｈｒ、Ｐｈｅ；Ｇｌｕ３４→Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ａｌａ；Ｌｅｕ５６→Ａｓｎ；Ｉｌｅ５７→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ５８→Ｉｌｅ、Ｖａｌ；Ａｓｐ８０→Ｔｙｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｌａ；Ｇｌｕ１０４→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０５→Ｔｈｒ；Ｈｉｓ１０６→Ｔｒｐ；及びＬｙｓ１０８→Ｇｌｙ；からなる群から選択される。
【００５８】
更なる特定の一実施形態においては、本発明の変異タンパク質は更に、Ｔｈｒ３７→Ｓｅｒ；Ｍｅｔ３９→Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｎ４８→Ｓｅｒ；Ｌｙｓ５２→Ｔｈｒ、Ｍｅｔ；Ｍｅｔ５５→Ｌｅｕ；Ｌｙｓ６５→Ａｒｇ、Ｌｅｕ；Ａｌａ７９→Ｌｅｕ、Ｓｅｒ；Ａｌａ８６→Ｔｈｒ；及び、Ｉｌｅ８９→Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ｈｉｓ；からなる群から選択される少なくとも１個のアミノ酸置換を含む。
【００５９】
別の更なる特定の実施形態においては、変異タンパク質は、アミノ酸置換：Ａｒｇ２６→Ｔｈｒ；Ｇｌｕ２７→Ｇｌｎ；Ｇｌｕ３０→Ｌｅｕ；Ｍｅｔ３１→Ｓｅｒ；Ａｓｎ３２→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ３３→Ｔｙｒ；Ｇｌｕ３４→Ｖａｌ；Ｌｅｕ５６→Ａｓｎ；Ｉｌｅ５７→Ｇｌｎ；Ａｓｐ８０→Ｔｙｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｌａ；Ｇｌｕ１０４→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０５→Ｔｈｒ；Ｈｉｓ１０６→Ｔｉｐ；及び、Ｌｙｓ１０８→Ｇｌｙ；を含む。
【００６０】
本発明の更に別の特定の実施形態においては、本発明の変異タンパク質は、アミノ酸置換：Ｍｅｔ３１→Ｓｅｒ；Ｌｅｕ５６→Ａｓｎ；Ｉｌｅ５７→Ｇｌｎ；Ａｓｐ８０→Ｔｙｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｌａ；Ｇｌｕ１０４→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０５→Ｔｈｒ；Ｈｉｓ１０６→Ｔｒｐ；及び、Ｌｙｓ１０８→Ｇｌｙ；を含む。
【００６１】
別の実施形態においては、本発明の変異タンパク質は、以下のアミノ酸置換の集合：
（１）Ａｒｇ２６→Ｔｈｒ；Ｇｌｕ２７→Ｇｌｎ；Ｐｈｅ２８→Ｍｅｔ；Ｇｌｕ３０→Ｌｅｕ；Ｍｅｔ３１→Ｓｅｒ；Ａｓｎ３２→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ３３→Ｔｙｒ；Ｇｌｕ３４→Ｖａｌ；Ｌｅｕ５６→Ａｓｎ；Ｉｌｅ５７→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ５８→Ｉｌｅ；Ａｓｐ８０→Ｔｙｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｌａ；Ｇｌｕ１０４→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０５→Ｔｈｒ；Ｈｉｓ１０６→Ｔｒｐ；、及びＬｙｓ１０８→Ｇｌｙ；
（２）Ａｒｇ２６→Ｔｈｒ；Ｇｌｕ２７→Ｇｌｎ；Ｐｈｅ２８→Ａｓｐ；Ｇｌｕ３０→Ｌｅｕ；Ｍｅｔ３１→Ｓｅｒ；Ａｓｎ３２→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ３３→Ｔｙｒ；Ｇｌｕ３４→Ｖａｌ；Ｌｅｕ５６→Ａｓｎ；Ｉｌｅ５７→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ５８→Ｖａｌ；Ａｓｐ８０→Ｔｙｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｌａ；Ｇｌｕ１０４→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０５→Ｔｈｒ；Ｈｉｓ１０６→Ｔｒｐ；、及びＬｙｓ１０８→Ｇｌｙ；
（３）Ａｒｇ２６→Ｔｈｒ；Ｇｌｕ２７→Ｇｌｎ；Ｐｈｅ２８→Ａｓｐ；Ｇｌｕ３０→Ｌｅｕ；Ｍｅｔ３１→Ｓｅｒ；Ａｓｎ３２→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ３３→Ｔｙｒ；Ｇｌｕ３４→Ｖａｌ；Ｌｅｕ５６→Ａｓｎ；Ｉｌｅ５７→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ５８→Ｉｌｅ；Ａｓｐ８０→Ｔｙｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｌａ；Ｇｌｕ１０４→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０５→Ｔｈｒ；Ｈｉｓ１０６→Ｔｒｐ；、及びＬｙｓ１０８→Ｇｌｙ；
（４）Ａｒｇ２６→Ｖａｌ；Ｇｌｕ２７→Ｇｌｙ；Ｐｈｅ２８→Ａｓｐ；Ｐｒｏ２９→Ｌｅｕ；Ｇｌｕ３０→Ｇｌｙ；Ｍｅｔ３１→Ｓｅｒ；Ａｓｎ３２→Ａｒｇ；Ｌｅｕ３３→Ｖａｌ；Ｇｌｕ３４→Ｖａｌ；Ｌｅｕ５６→Ａｓｎ；Ｉｌｅ５７→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ５８→Ｉｌｅ；Ａｓｐ８０→Ｔｙｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｌａ；Ｇｌｕ１０４→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０５→Ｔｈｒ；Ｈｉｓ１０６→Ｔｒｐ；、及びＬｙｓ１０８→Ｇｌｙ；
（５）Ａｒｇ２６→Ｐｒｏ；Ｇｌｕ２７→Ｇｌｙ；Ｐｈｅ２８→Ａｓｐ；Ｐｒｏ２９→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ３０→Ａｒｇ；
Ｍｅｔ３１→Ｓｅｒ；Ａｓｎ３２→Ｌｅｕ；Ｌｅｕ３３→Ｉｌｅ；Ｇｌｕ３４→Ｖａｌ；Ｌｅｕ５６→Ａｓｎ；
Ｉｌｅ５７→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ５８→Ｉｌｅ；Ａｓｐ８０→Ｔｙｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｌａ；Ｇｌｕ１０４→Ａｓｐ；
Ｌｅｕ１０５→Ｔｈｒ；Ｈｉｓ１０６→Ｔｒｐ；、及びＬｙｓ１０８→Ｇｌｙ；
（６）Ａｒｇ２６→Ｓｅｒ；Ｐｈｅ２８→Ａｓｐ；Ｐｒｏ２９→Ａｌａ；Ｇｌｕ３０→Ｐｈｅ；Ｍｅｔ３１→Ｓｅｒ；Ａｓｎ３２→Ｖａｌ；Ｌｅｕ３３→Ｔｈｒ；Ｇｌｕ３４→Ｖａｌ；Ｌｅｕ５６→Ａｓｎ；Ｉｌｅ５７→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ５８→Ｉｌｅ；Ａｓｐ８０→Ｔｙｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｌａ；Ｇｌｕ１０４→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０５
→Ｔｈｒ；Ｈｉｓ１０６→Ｔｒｐ；、及びＬｙｓ１０８→Ｇｌｙ；
（７）Ａｒｇ２６→Ｖａｌ；Ｇｌｕ２７→Ｖａｌ；Ｐｈｅ２８→Ａｓｐ；Ｐｒｏ２９→Ｔｒｐ；Ｇｌｕ３０→
Ａｒｇ；Ｍｅｔ３１→Ｓｅｒ；Ａｓｎ３２→Ｇｌｎ；Ｌｅｕ３３→Ｖａｌ；Ｇｌｕ３４→Ａｒｇ；Ｌｅｕ５６
→Ａｓｎ；Ｉｌｅ５７→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ５８→Ｉｌｅ；Ａｓｐ８０→Ｔｙｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｌａ；Ｇｌｕ１０４
→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０５→Ｔｈｒ；Ｈｉｓ１０６→Ｔｒｐ；、及びＬｙｓ１０８→Ｇｌｙ；ならびに、
（８）Ａｒｇ２６→Ｇｌｙ；Ｇｌｕ２７→Ｓｅｒ；Ｐｈｅ２８→Ａｓｐ；Ｐｒｏ２９→Ｔｒｐ；Ｍｅｔ３１→
Ｓｅｒ；Ａｓｎ３２→Ｖａｌ；Ｌｅｕ３３→Ｐｈｅ；Ｇｌｕ３４→Ａｌａ；Ｌｅｕ５６→Ａｓｎ；Ｉｌｅ５７→Ｇｌｎ；Ｓｅｒ５８→Ｉｌｅ；Ａｓｐ８０→Ｔｙｒ；Ｌｙｓ８３→Ａｌａ；Ｇｌｕ１０４→Ａｓｐ；Ｌｅｕ１０５→Ｔｈｒ；Ｈｉｓ１０６→Ｔｒｐ；、及びＬｙｓ１０８→Ｇｌｙ；
のうちの少なくとも１つを含んでもよい。
【００６２】
ｃ−Ｍｅｔあるいはそのドメイン又はフラグメントを結合するヒト涙液リポカリンの変異タンパク質は、配列番号１、配列番号４ないし９、配列番号２２ないし２６、あるいは配列番号３２ないし３５及び３７ないし４９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列あるいはそのフラグメント又は変異体のうちのいずれか１つを含むか、そのいずれか１つで実質的に構成されるか、あるいはいずれか１つで構成してもよい。一実施形態においては、本発明による変異タンパク質は配列番号１、４、５、６、７、８、９、２２ないし２６、３２ないし３５、又は４２ないし４９に記載のアミノ酸配列あるいはそのフラグメント又は変異体を含むか、そのいずれか１つで実質的に構成されるか、あるいはいずれか１つで構成してもよい。この点においては、本明細書中に開示された総ての変異タンパク質は、Ｎ又はＣ末端のいずれかで、ペンタヒスチジンタグ、ヘキサヒスチジンタグ、又はＳｔｒｅｐｔａｇ（登録商標）といった親和性標識に結合できることは留意すべきである（例えば、配列番号３７ないし４１参照、ヘキサヒスチジンタグが変異タンパク質に融合されている）。従って、本出願は更に、このようなタグが具備される総ての明確かつ一般的に記載される変異タンパク質を含む。
【００６３】
本発明の変異タンパク質に関連して、本発明中で用いられる用語「フラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）」は、Ｎ末端及び／又はＣ末端で短縮された、すなわち、Ｎ末端及び／又はＣ末端のアミノ酸のうちの少なくとも１つを欠失する全長の成体ヒト涙液リポカリンから得られたタンパク質又はペプチドに関連する。このようなフラグメントは、成体ヒト涙液リポカリンの一次配列である、好適には少なくとも１０個の、より好適には２０個の、最も好適には３０個以上のアミノ酸を含み、成体ヒト涙液リポカリンの免疫測定において通常検出可能である。
【００６４】
本発明で用いられる用語「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」は、例えば置換、欠失、挿入、又は化学修飾による、アミノ酸配列の修飾を含むタンパク質又はペプチドの誘導体に関連する。好適には、このような修飾はタンパク質又はペプチドの官能性を低減しない。このような変異体はタンパク質を含み、１又はそれ以上のアミノ酸は、各々のＤ型の立体異性体によって、あるいは、例えばオルニチン、ヒドロキシプロリン、シトルリン、ホモセリン、ヒドロキシリジン、ノルバリンといった、天然に存在する２０個のアミノ酸以外のアミノ酸によって置換されている。しかしながら、このような置換は保存的であってもよく、すなわち、アミノ酸残基は化学的に同様のアミノ酸残基に置換される。保存的置換の例は、以下の群：
１）アラニン、セリン、及びスレオニン；
２）アスパラギン酸及びグルタミン酸；
３）アスパラギン及びグルタミン；
４）アルギニン及びリジン；
５）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、及びバリン；
ならびに、
６）フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン；
の要素間での置換である。
【００６５】
この文脈においては、本発明の変異タンパク質は、ｐＨ約２．５ないしｐＨ約９．５の大きなｐＨ範囲内、例えばｐＨ約３．０ないしｐＨ約９．２の範囲内のｐＨで安定であることが見出されてきたことに留意すべきである。
【００６６】
本発明の範囲に更に含まれるのが、上の変異タンパク質であり、その潜在的な免疫原性について変更されてきた。
【００６７】
細胞毒性のＴ細胞は、クラスＩの主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）分子と関連して、抗原呈示細胞の細胞表面でペプチド抗原を認識する。ＭＨＣ分子に結合すべきペプチドの性能はアレル特異的であり、その免疫原性と相関する。所定のタンパク質の免疫原性を低減するために、タンパク質中のどのペプチドが所定のＭＨＣ分子に結合する可能性を有するかを予測する性能は、価値が大きい。潜在的なＴ細胞エピトープを同定する計算機でのスレッディングアプローチを用いたアプローチは、ＭＨＣのクラスＩ分子に対する所定のペプチド配列の結合を予測するために既に述べられている（Ａｌｔｕｖｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４９：２４４−２５０）。
【００６８】
このようなアプローチを更に用いて、本発明の変異タンパク質における潜在的なＴ細胞エピトープを同定し、免疫原性の予測による特異的な変異タンパク質の選択をその使用目的に依存させてもよい。更には、Ｔ細胞エピトープを含むのを予測させるペプチド領域を、更なる突然変異誘発に供して、これらのＴ細胞エピトープを低減又は除去し、ひいては免疫原性を最小化することが可能であってもよい。遺伝学的に操作された抗体からの両親媒性のエピトープの除去は述べられてきており（Ｍａｔｅｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ１９（６）：４６３−４７１）、本発明の変異タンパク質に適用してもよい。こうして得られた変異タンパク質は、最小限の免疫原性を有することができ、以下に記載のような治療及び診断用途での使用が所望される。
【００６９】
いくつかの用途においては、接合形態で本発明の変異タンパク質を用いることは更に有用である。従って、本発明は更に、酵素標識と、呈色標識と、分裂停止剤と、光活性化でき、かつ光線力学的治療で用いるのに好適な標識と、ハプテンと、ジゴキシゲニンと、ビオチンと、化学療法用金属（ａ  ｃｈｅｍａｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍｅｔａｌ，ｏｒ  ａ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍｅｔａｌ）と、コロイド金とからなる群から選択できる接合相手に接合される、リポカリンの変異タンパク質に関連する。変異タンパク質は更に、有機薬剤の分子に接合してもよい。本明細書中に用いられる用語「有機分子（ｏｒｇａｎｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は好適には、少なくとも２の炭素原子と、好適には７又は１２以下の回転可能な炭素結合とを含み、１００ないし２０００ダルトン、好適には１００ないし１０００ダルトンの範囲に分子量を有し、選択的に１又は２の金属原子を含む有機分子を意味する。
【００７０】
一般的には、適切な化学物質又は酵素で本明細書中に記載の涙液リポカリンの変異タンパク質を標識することは可能であり、化学的、物理的、光学的又は酵素学的な反応で検出可能な化合物又はシグナルを直接的又は間接的に産生する。物理的反応及び同時の光学的反応／標識の例は、照射での蛍光の放出である。アルカリホスファターゼ、ホースラディシュペルオキシダーゼ、又はβ−ガラクトシダーゼは、発色反応産物の形成を触媒する酵素標識（及び同時の光標識）の例である。一般的に、抗体に通常用いられる総ての標識は更に（免疫グロブリンのＦｃ部分内の糖部分で排他的に用いられるものを除いて）、本発明の変異タンパク質への接合のために用いてもよい。本発明の変異タンパク質は更に、例えば、所定の細胞、組織又は器官への標的送達のために、あるいは周囲の正常細胞に影響を与えることなく細胞、例えば腫瘍細胞を選択的に標的化するために、このような薬剤の任意の好適な治療用活性剤と接合させてもよい。このような治療用活性剤の例は、放射性核種、毒素、小さな有機分子、及び（細胞表面受容体のアゴニスト／アンタゴニストとして作用するペプチド、あるいは所定の細胞内標的にタンパク質結合部位に対し競合するペプチドといった）治療用ペプチドを含む。好適な毒素の例は限定しないが、百日咳毒素、ジフテリア毒素、リシン、サポリン、緑膿菌外毒素、カリチアマイシン又はその誘導体、タキソイド、マイタンシノイド、ツブリシン、又はドラスタチンアナログを含む。ドラスタチンアナログは、アウリスタチンＥ、モノメチルアウリスタチンＥ、アウリスタチンＰＹＥ、及びアウリスタチンＰＨＥであってもよい。分裂停止剤の例は限定しないが、シスプラチンと、カルボプラチンと、オキサリプラチンと、５−フルオロウラシルと、タキソテール（ドセタキセル）と、パクリタキセルと、アントラサイクリン（ドキソルビシン）と、メトトレキサートと、ビンブラスチンと、ビンクリスチンと、ビンデシンと、ビノレルビンと、ダカルバジンと、シクロホスファミドと、エトポシドと、アドリアマイシンと、カンプトテシンと、コンブレタスタチンＡ−４関連化合物と、スルホンアミドと、オキサジアゾリンと、ベンゾ［ｂ］チオフェンと、合成型スピロケタールピランと、モノテトラヒドロフラン化合物と、クラシン及びクラシン誘導体と、メトキシエストラジオール誘導体と、ロイコボリンとを含む。本発明のリポカリンの変異タンパク質は更に、アンチセンス核酸分子、低分子干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、又はリボザイムといった治療用活性核酸で接合させてもよい。このような接合体は当該技術分野で周知の方法によって産生できる。
【００７１】
一実施形態においては、本発明の変異タンパク質は更に、本発明の変異タンパク質を身体内の所望の領域又は区域に送達するために、特異的な身体領域を標的とする標的部分に結合してもよい。このような修飾が所望されうる一実施例は、血液脳関門の通過である。血液脳関門を通過するために、本発明の変異タンパク質はこのバリアを通過する能動輸送を促進する部分に結合できる（Ｇａｉｌｌａｒｄ  ＰＪ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ−ｔｏｘｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｂｒａｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓ  Ｓｅｒｉｅｓ．２００５  １２７７；１８５−１９８、又はＧａｉｌｌａｒｄ  ＰＪ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｃｒｏｓｓ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．２００５  ２（２）：２９９−３０９参照）。このような部分は例えば、商品名２Ｂ−Ｔｒａｎｓ（登録商標）（オランダ国ライデンのｔｏ−ＢＢＢ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＢＶ５社）で入手可能である。
【００７２】
上述のように、本発明の変異タンパク質はいくつかの実施形態においては、変異タンパク質の血清半減期を延長する部分に接合されうる（これに関しては、更に、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５７９７１、又は国際公開第２００６／５６４６４号参照のこと。このような接合ストラテジは、ＣＴＬＡ−４に対する結合親和性を有するヒト好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリンの変異タンパク質について述べられている）。血清半減期を延長する部分は数例のみを挙げると、ポリアルキレングリコール分子、ヒドロキシエチルデンプン、パルミチン酸といった脂肪酸分子（Ｖａｊｏ＆Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ２０００，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ．５２，１−９）、免疫グロブリンのＦｃ部分、免疫グロブリンのＣＨ３ドメイン、免疫グロブリンのＣＨ４ドメイン、アルブミン又はそのフラグメント、アルブミン結合ペプチド、アルブミン結合タンパク質、ＩｇＧ−Ｆｃ部結合タンパク質、あるいはトランスフェリンであってもよい。アルブミン結合タンパク質は、細菌性のアルブミン結合タンパク質、抗体、ドメイン抗体を含む抗体フラグメント（例えば、米国特許第６，６９６，２４５号参照）、リポカリンの変異タンパク質、あるいはアルブミンに対し結合活性を有する別のタンパク質又はタンパク質ドメインを含む。従って、本発明のリポカリンの変異タンパク質の半減期を延長するための好適な接合相手は、アルブミン（Ｏｓｂｏｒｎ，Ｂ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ａｌｐｈａ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ  Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３０３，５４０−５４８）、又は、例えば、連鎖球菌性プロテインＧのもののような細菌性アルブミン結合ドメインといった、アルブミン結合タンパク質（Ｋｏｎｉｇ，Ｔ．及びＳｋｅｒｒａ，Ａ．（１９９８）Ｕｓｅ  ｏｆ  ａｎ  ａｌｂｕｍｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｃａｐｔｕｒｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｏｎ  ＥＬＩＳＡ  ｐｌａｔｅｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２１８，７３−８３）を含む。接合相手として用いられうるアルブミン結合ペプチドの別の例は、例えばＣｙｓ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｃｙｓの共通配列を有するものであり、米国特許出願第２００３／００６９３９５号又はＤｅｎｎｉｓら（Ｄｅｎｎｉｓ，Ｍ．Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｍ．，Ｍｅｎｇ，Ｙ．Ｇ．，Ｋａｄｋｈｏｄａｙａｎ，Ｍ．，Ｋｉｒｃｈｈｏｆｅｒ，Ｄ．，Ｃｏｍｂｓ，Ｄ．＆Ｄａｍｉｃｏ，Ｌ．Ａ．（２００２）“Ａｌｂｕｍｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｓ  ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．”Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ２７７，３５０３５−３５０４３）に記載のように、Ｘａａ１はＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、又はＴｒｐであり、Ｘａａ２はＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、又はＬｙｓであり、Ｘａａ３はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、又はＴｙｒであり、Ｘａａ４はＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒである。
【００７３】
他の実施形態においては、アルブミン自体又はアルブミンの生物学的活性のフラグメントは、本発明のリポカリンの変異タンパク質の接合相手として用いられうる。用語「アルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）」は、ヒト血清アルブミン、又はウシ血清アルブミン、又はラットアルブミンといった総ての哺乳類アルブミンを含む。アルブミン又はそのフラグメントは、米国特許第５，７２８，５５３号、又は欧州特許出願ＥＰ０３３０４５１及びＥＰ０３６１９９１に記載のように組換えて産生されうる。Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ｄｅｌｔａ社（英国、ノッティンガム）の組換えヒトアルブミン（Ｒｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（登録商標））は、変異タンパク質の半減期を延長するために、リポカリンの変異タンパク質に接合又は融合できる。
【００７４】
アルブミン結合タンパク質が抗体フラグメントである場合は、ドメイン抗体であってもよい。ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）は生物物理学的な特性にわたる正確な制御を可能にするように操作され、生体内での半減期は、最適な安全性及び産生効率特性を生成するように設計される。ドメイン抗体は例えば、Ｄｏｍａｎｔｉｓ社（英国ケンブリッジ及び米国マサチューセッツ州）から商業上入手可能である。
【００７５】
本発明の変異タンパク質の血清半減期を延長する部分としてトランスフェリンを使用する場合、変異タンパク質は非グリコシル化トランスフェリンのＮ又はＣ末端、あるいはその双方に遺伝学的に融合できる。非グリコシル化トランスフェリンは１４ないし１７日の半減期を有し、トランスフェリン融合タンパク質は延長された半減期を同様に有する。担体であるトランスフェリンは更に、高いバイオアベイラビリティ、体内分布、及び循環安定性を提供する。この技術はＢｉｏＲｅｘｉｓ（米国ペンシルベニア州のＢｉｏＲｅｘｉｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社）から商業上入手可能である。タンパク質安定剤／半減期延長相手として用いるための組換えヒトトランスフェリン（ＤｅｌｔａＦｅｒｒｉｎ（登録商標））は更に、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ｄｅｌｔａ社（英国ノッティンガム）から商業上入手可能である。
【００７６】
免疫グロブリンのＦｃ部分が本発明の変異タンパク質の血清半減期を延長するために用いられる場合、Ｓｙｎｔｏｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社（米国マサチューセッツ州）から商業上入手可能なＳｙｎＦｕｓｉｏｎ（登録商標）の技術を用いてもよい。このＦｃ融合技術の使用によって、長時間作用する生物製剤の産生が可能となり、例えば抗体のＦｃ領域に結合される変異タンパク質の２のコピーからなり、薬物動態、溶解性、及び産生効率を改善できる。
【００７７】
本発明の変異タンパク質の半減期を延長するための更に別の選択肢は、本発明の変異タンパク質のＮ又はＣ末端に、長く不定形でフレキシブルなグリシンリッチな配列（例えば、約２０ないし８０個の連続的なグリシン残基を有するポリグリシン）を融合することである。国際公開第２００７／０３８６１９号に公開されたこのアプローチは更に、例えば、用語「ｒＰＥＧ（組換えＰＥＧ）」等である。
【００７８】
ポリアルキレングリコールが接合相手として用いられる場合、ポリアルキレングリコールは置換型、非置換型、直鎖型、又は分岐鎖型にできる。ポリアルキレングリコールは更に、活性化したポリアルキレン誘導体にできる。好適な化合物の例はインターフェロンに関連して、国際公開第９９／６４０１６号、米国特許第６，１７７，０７４号、又は米国特許第６，４０３，５６４号に記載のような、あるいは、ＰＥＧ修飾アスパラギナーゼ、ＰＥＧ−アデノシンデアミナーゼ（ＰＥＧ−ＡＤＡ）、又はＰＥＧ−スーパーオキシドジスムターゼといった他のタンパク質について記載されたような（例えば、Ｆｕｅｒｔｇｅｓら（１９９０）Ｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ）−Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌｅａｓｅ１１，１３９−１４８参照）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子である。このような高分子、好適にはポリエチレングリコールの分子量は、約３００ないし約７０．０００ダルトンの範囲にでき、例えば約１０．０００、約２０．０００、約３０．０００、又は約４０．０００ダルトンの分子量を有するポリエチレングリコールを含む。更に、例えば米国特許第６，５００，９３０号、又は６，６２０，４１３号に記載されるように、デンプン又はヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）といった炭水化物の低重合体及び高分子は血清半減期延長のために本発明の変異タンパク質に接合できる。
【００７９】
上述の部分のうちの１つが本発明のヒト涙液リポカリンの変異タンパク質に接合される場合、アミノ酸側鎖に対する接合が有利になりうる。好適なアミノ酸側鎖はヒト涙液リポカリンのアミノ酸配列中に自然発生させてもよく、あるいは突然変異誘発によって導入してもよい。好適な結合部位が突然変異誘発を介して導入される場合、一の可能性はシステイン残基による適切な位置でのアミノ酸置換である。一実施形態においては、このような突然変異は、Ｔｈｒ４０→Ｃｙｓ、Ｇｌｕ７３→Ｃｙｓ、Ａｒｇ９０→Ｃｙｓ、Ａｓｐ９５→Ｃｙｓ、Ｌｙｓ１２１→Ｃｙｓ、Ａｓｎ１２３→Ｃｙｓ、又はＧｌｕ１３１→Ｃｙｓの置換のうちの少なくとも１つを含む。これらの位置のいずれかで新しく産生されたシステイン残基は、以下のようにＰＥＧ又はその活性化された誘導体といった変異タンパク質の血清半減期を延長する部分に接合するように用いることができる。
【００８０】
別の実施形態においては、上述の部分のうちの１つを本発明の変異タンパク質に接合すべく好適なアミノ酸側鎖を提供するために、人工アミノ酸は突然変異誘発によって導入してもよい。一般的に、このような人工アミノ酸はより反応性に、ひいては所望の部分への接合を促進するように設計される。人工ｔＲＮＡを介して導入できるこのような人工アミノ酸の一例はパラアセチルフェニルアラニンである。
【００８１】
本明細書中で開示される変異タンパク質のいくつかの用途について、融合タンパク質の形態で用いることは有利になりうる。いくつかの実施形態においては、本発明のヒト涙液リポカリンの変異タンパク質は、そのＮ末端又はＣ末端で、タンパク質、タンパク質ドメイン、又はシグナル配列及び／又は親和性標識といったペプチドに融合される。
【００８２】
薬学的な用途のために、本発明の変異タンパク質は、変異タンパク質の生体内での血清半減期を延長する融合相手に融合されうる（国際公開第２００６／５６４６４号を再度参照。好適な融合相手は、ＣＴＬＡ−４に対し結合親和性を有するヒト好中球ゼラチナーゼ結合性リポカリンの変異タンパク質について記載されている）。上述の接合と同様に、融合相手は数例のみを挙げると、免疫グロブリンのＦｃ部分、免疫グロブリンのＣＨ３ドメイン、免疫グロブリンのＣＨ４ドメイン、アルブミン、アルブミン結合ペプチド、又はアルブミン結合タンパク質であってもよい。また、アルブミン結合タンパク質は細菌性のアルブミン結合タンパク質、又はアルブミンに対し結合活性を有するリポカリンの変異タンパク質であってもよい。従って、本発明のリポカリンの変異タンパク質の半減期を延長するための好適な融合相手はアルブミン（Ｏｓｂｏｒｎ，Ｂ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）上記を参照、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．３０３，５４０−５４８）、例えば、連鎖球菌性プロテインＧのもののような細菌性アルブミン結合ドメインといった、アルブミン結合タンパク質（Ｋｏｎｉｇ，Ｔ．及びＳｋｅｒｒａ，Ａ．（１９９８）上記を参照、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２１８，７３−８３）を含む。Ｃｙｓ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｃｙｓの共通配列を有し、Ｘａａ１はＡｓｐ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、又はＴｒｐであり、Ｘａａ２はＡｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、又はＬｙｓであり、Ｘａａ３はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、又はＴｙｒであり、Ｘａａ４はＡｓｐ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、又はＴｈｒである、Ｄｅｎｎｉｓ（２００２）ら、上記を参照、又は米国特許出願第２００３／００６９３９５号に記載のアルブミン結合ペプチドは更に、融合相手として用いられうる。本発明のリポカリンの変異タンパク質の融合相手としてアルブミン自体、又はアルブミンの生物学的な活性フラグメントを用いることは更に可能である。用語「アルブミン」はヒト血清アルブミン、又はウシ血清アルブミン、又はラット血清アルブミンといった総ての哺乳類アルブミンを含む。アルブミン又はそのフラグメントの組換え産生は当該技術分野の当業者に公知であり、例えば米国特許第５，７２８，５５３号、欧州特許出願ＥＰ０３３０４５１又はＥＰ０３６１９９１に記載されている。
【００８３】
融合相手は、他の分子用の酵素活性又は結合親和性といった新しい特性を、本発明のリポカリンの変異タンパク質に与えてもよい。好適な融合タンパク質の例は、アルカリホスファターゼ、ホースラディシュペルオキシダーゼ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ、プロテインＧのアルブミン結合ドメイン、プロテイン、抗体フラグメント、低重合体化ドメイン、同一又は異なる結合特異性（「デュオカリン」の形成を得る。Ｓｃｈｌｅｈｕｂｅｒ，Ｓ．及びＳｋｅｒｒａ，Ａ．（２００１），Ｄｕｏｃａｌｉｎｓ，ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｄｕａｌ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｌｉｐｏｃａｌｉｎ  ｆｏｌｄ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８２，１３３５−１３４２参照。）のリポカリンの変異タンパク質、又は毒素である。
【００８４】
特に、得られた融合タンパク質の双方の「要素（ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」が互いに所定の治療標的に作用するような、別個の酵素活性部位を有する本発明のリポカリンの変異タンパク質を融合することは可能である。リポカリンの変異タンパク質の結合ドメインは病気を引き起こす標的に付着し、酵素ドメインは標的の生物学的機能を破壊するのを可能にする。
【００８５】
Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）又はＳｔｒｅｐ−ｔａｇ（登録商標）ＩＩ（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｔ．Ｇ．Ｍ．ら（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５５，７５３−７６６）、ｍｙｃ−ｔａｇ、ＦＬＡＧ−ｔａｇ、Ｈｉｓ６−ｔａｇ、又はＨＡ−ｔａｇといった親和性標識、あるいはグルタチオンＳトランスフェラーゼといったタンパク質は更に簡単な検出を可能にし、及び／又は組換えタンパク質の精製は好適な融合相手の更なる例である。最後に、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又は黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）といった、発色又は蛍光特性を有するタンパク質は、同様に本発明のリポカリンの変異タンパク質に対する好適な融合相手である。
【００８６】
本明細書中で用いられる用語「融合タンパク質（ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」は、シグナル配列を有する、本発明によるリポカリンの変異タンパク質を更に含む。ポリペプチドのＮ末端でのシグナル配列は、このポリペプチドを、特定の細胞内区画、例えば大腸菌のペリプラズム又は真核細胞の小胞体に向かわせる。大多数のシグナル配列は当該技術分野において周知である。ポリペプチドの大腸菌のペリプラズム内への分泌のための好適なシグナル配列は、ＯｍｐＡシグナル配列である。
【００８７】
本発明は更に、本明細書中に記載のように、変異タンパク質用にコード化したヌクレオチド配列を含む核酸分子（ＤＮＡ及びＲＮＡ）に関する。遺伝コードの縮重は同一のアミノ酸を特定する他のコドンによって、特定のコドンの置換を可能にするため、本発明は、本発明の変異タンパク質をコード化する特異的な核酸分子に限定されず、機能的な変異タンパク質をコード化するヌクレオチド配列を含む総ての核酸分子を含む。
【００８８】
従って、本発明は更に、天然型の成体ヒト涙液リポカリンの直鎖状のポリペプチド配列の、アミノ酸配列位置２６ないし３４、５６ないし５８、８０、８３、１０４ないし１０６、及び１０８のいずれかの少なくとも１のコドンに突然変異を有する、本発明により変異タンパク質をコード化する核酸配列を含み、成体ヒト涙液リポカリンの直鎖状のポリペプチド配列の、配列位置６１及び１５３でのシステイン残基のうちの少なくとも１つをコード化するコドンは、その他のアミノ酸残基をコード化するために変異導入されている。
【００８９】
本明細書中に開示される発明は更に、涙液リポカリンの変異タンパク質をコード化する核酸分子を含み、実験的な突然変異誘発の確定配列位置の外側に更なる突然変異を含む。このような突然変異は、例えば変異タンパク質の折り畳み効率、血清安定性、熱安定性、又はリガンド結合親和性の改善に寄与する場合、多くの場合許容されるか、あるいは更に有利にもなり得る。
【００９０】
本出願に開示された核酸分子は、この核酸分子の発現を可能にするように、制御配列（又は複数の制御配列）に「動作可能に結合（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」できる。
【００９１】
ＤＮＡといった核酸分子は、転写及び／又は翻訳制御に関する情報を有する配列要素を含む場合、「核酸分子を発現可能である」と見なされるか、あるいは「ヌクレオチド配列の発現を許容」できると見なされ、このような配列はポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列に「動作可能に結合」される。動作可能な結合は、制御配列要素及び発現すべき配列が遺伝子発現を可能にする方法で結合される結合部のことである。遺伝子発現に必要な制御領域の詳細な性質は種の間で変りうるが、一般的にはこれらの領域は、原核生物においてはプロモータ自体、すなわち、転写の開始に関するＤＮＡ要素、ならびにＲＮＡに転写されるときに翻訳の開始を伝えるＤＮＡ要素の双方を有するプロモータを含む。このようなプロモータ領域は通常、原核生物における−３５／−１０ボックス及びシャインダルガノ配列、あるいは真核生物におけるＴＡＴＡボックス、ＣＡＡＴ配列、及び５’キャッピング配列といった、転写及び翻訳に関連する５’非コード配列を含む。これらの領域は更に、エンハンサ又はリプレッサ配列、ならびに宿主細胞の特異的な区画を天然型ポリペプチドが標的にするための翻訳シグナル及びリーダ配列を含みうる。
【００９２】
更に、３’非コード配列は転写終結又はポリアデニル化に関する制御配列を含んでもよい。しかしながら、これらの終結配列が特定の宿主細胞において十分に機能的ではない場合、その細胞内で機能的な信号と置換されうる。
【００９３】
従って、本発明の核酸分子は制御配列、好適にはプロモータ配列を含むことができる。別の好適な実施形態においては、本発明の核酸分子はプロモータ配列と、転写終結配列とを含む。好適な原核生物のプロモータは例えば、ｔｅｔプロモータ、ｌａｃＵＶ５プロモータ、又はＴ７プロモータである。真核細胞の発現に有用なプロモータの例は、ＳＶ４０プロモータ又はＣＭＶプロモータである。
【００９４】
本発明の核酸分子は更に、プラスミド、ファージミド、ファージ、バキュロウイルス、コスミド、又は人工染色体といった、ベクタの一部又は任意のその他のクローニング媒体にできる。
【００９５】
一実施形態において、核酸分子はファスミドに含まれる。ファスミドベクタは、Ｍ１３又はｆ１といった溶原性ファージの遺伝子間領域をコード化するベクタか、あるいは対象のｃＤＮＡに融合されるその機能的部分を意味する。このようなファージミドベクタ、及び好適なヘルパーファージ（例えば、Ｍ１３Ｋ０７、ＶＣＳ−Ｍ１３、又はＲ４０８）での細菌性宿主細胞の重感染後に、無傷のファージ粒子が産生され、これによってファージ表面に表示されたその対応するポリペプチドへの、コード化した異種ｃＤＮＡの物理的結合を可能にする（例えば、Ｋａｙ，Ｂ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１ｓｔ  Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ＮＹ；Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．（１９９７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２６，４０１−４２４；又はＲｏｄｉ，Ｄ．Ｊ．，  及びＭａｋｏｗｓｋｉ，Ｌ．（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０，８７−９３に概説）。
【００９６】
このようなクローニング媒体は、上述の制御配列、及び本発明のリポカリンの変異タンパク質をコード化する核酸配列とは別に、発現用に用いられる宿主細胞と種から得られる互換性のある複製及び制御配列と、形質転換又は形質移入された細胞上に選択可能な表現型を与える選択マーカとを含みうる。多数の好適なクローニングベクタは当該技術分野で周知であり、商業上利用可能である。
【００９７】
本発明のリポカリンの変異タンパク質をコード化するＤＮＡ分子、特にこのようなリポカリンの変異タンパク質を含むクローニングベクタは、遺伝子を発現可能な宿主細胞に形質転換されうる。形質転換は標準的な技術を用いて行われうる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）、上記を参照）。従って、本発明は本明細書中に記載のように、核酸分子を含む宿主細胞に関する。
【００９８】
形質転換された宿主細胞は本発明の融合タンパク質をコード化するヌクレオチド配列の発現に好適な条件下で培養される。好適な宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）又は枯草菌といった原核細胞か、あるいはサッカロマイセスセレビシエ、ピキアパストリス、ＳＦ９若しくはＨｉｇｈ５昆虫細胞、哺乳類の不死化細胞株（例えば、ＨｅＬａ細胞若しくはＣＨＯ細胞）、又は哺乳類の初代細胞といった真核細胞にできる。
【００９９】
本発明は更に、本発明の変異タンパク質の産生方法に関し、変異タンパク質、変異タンパク質のフラグメント、又は変異タンパク質と別のポリペプチドとの融合タンパク質は、遺伝子工学的方法によって、変異タンパク質をコードする核酸から産生される。本方法は生体内で行うことができ、変異タンパク質は例えば細菌性又は真核の宿主生物で産生し、次いでこの宿主生物又はその培養物から分離できる。生体外、例えば生体外の翻訳系の使用によって、タンパク質を産生することは更に可能である。
【０１００】
生体内で変異タンパク質を産生する場合、本発明の変異タンパク質をコード化する核酸は、（上に既に概説したように）組換えＤＮＡ技術によって、好適な細菌性又は真核の宿主生物に導入される。この目的のために、確立した標準的な方法を用いて（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）、上記を参照）、宿主細胞は、本発明の変異タンパク質をコード化する核酸分子を含むクローニングベクタで最初に形質転換される。宿主細胞は次いで、複数の条件下で培養され、異種ＤＮＡの発現、ひいては対応するポリペプチドの合成を可能にする。その後、ポリペプチドは細胞から、又は培養培地のいずれかから回収される。
【０１０１】
いくつかの本発明の涙液リポカリンの変異タンパク質においては、Ｃｙｓ６１とＣｙｓ１５３との間に天然に存在するジスルフィド結合が除去される。従って、このような変異タンパク質（又は分子内ジスルフィド結合を含まないその他の涙液リポカリンの変異タンパク質）は、還元した酸化還元環境を有する細胞区画中、例えばグラム陰性菌の細胞質中に産生できる。本発明のリポカリンの変異タンパク質が分子内ジスルフィド結合を含む場合、適切なシグナル配列を用いて、酸化した酸化還元環境を有する細胞区画に新生ポリペプチドを向けることが好ましい。このような酸化環境は、グラム陽性菌の細胞外環境において、あるいは真核細胞の小胞体の内腔において、大腸菌といったグラム陰性菌のペリプラズムによって提供してもよく、通常、構造的なジスルフィド結合の形成を支持する。しかしながら、宿主細胞、好適には大腸菌の細胞質ゾルにおいて本発明の変異タンパク質を産生することは更に可能である。この場合においては、ポリペプチドは溶解可能及び折り畳まれた状態で直接的に得られるか、あるいは封入体の形態で回収して、その後生体外で復元するかのいずれかにできる。更なる選択肢は酸化した細胞内環境を有する特異的な宿主株の使用であり、このように細胞質ゾル中のジスルフィド結合の形成を可能にする（Ｖｅｎｔｕｒｉ  Ｍ，Ｓｅｉｆｅｒｔ  Ｃ，Ｈｕｎｔｅ  Ｃ．（２００２）“Ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆａｂ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ａｎ  ｏｘｉｄｉｚｉｎｇ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍ．”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１５，１−８）。
【０１０２】
しかしながら、本発明の変異タンパク質は、遺伝子工学の使用のみによって産生又は生成されるとは限らない。逆に、リポカリンの変異タンパク質は更に、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相ポリペプチド合成といった化学合成によって、あるいは生体外での転写及び翻訳によって得ることができる。例えば、有望な突然変異は分子モデリングを用いて同定され、その後、生体外で所望の（設計された）ポリペプチドを合成し、所定の標的に対する結合活性を検討することが可能である。タンパク質の固相及び／又は溶液相合成のための方法は当該技術分野に公知である（例えば、Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ；Ｆｉｅｌｄｓ，Ｇ．Ｂ．及びＣｏｌｏｗｉｃｋ，Ｓ．Ｐ．（１９９７）Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；又はＢｒｕｃｋｄｏｒｆｅｒ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５，２９−４３に概説）。
【０１０３】
別の実施形態においては、本発明の変異タンパク質は、当該技術分野の当業者に周知の確立した方法を用いて、生体外での転写／翻訳によって産生してもよい。
【０１０４】
本発明は更に、少なくとも１の本発明のヒト涙液リポカリンの変異タンパク質あるいはその融合タンパク質又は接合体と、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物に関する。
【０１０５】
本発明によるリポカリンの変異タンパク質は、タンパク薬剤で治療上有効である任意の非経口的又は非経口的ではない（腸内）経路を介して投与できる。非経口的な適用方法は例えば、注射液、輸液、又はチンキ剤の形態といった皮内、皮下、筋肉内、気管内、鼻腔内、硝子体内、又は静脈内の注射及び注入技術と、煙霧混合物、噴霧、又は粉末の形態でといった煙霧導入及び吸入とを含む。すなわち、煙霧の吸入（鼻腔内投与で用いることができる）又は気管内導入のいずれかを介した肺内薬剤送達についての概要は、例えば：Ｊ．Ｓ．Ｐａｔｔｏｎら、Ｔｈｅ  ｌｕｎｇｓ  ａｓ  ａ  ｐｏｒｔａｌ  ｏｆ  ｅｎｔｒｙ  ｆｏｒ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｐｒｏｃ．Ａｍｅｒ．Ｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｓｏｃ．２００４  Ｖｏｌ．１、ページ３３８−３４４；によって提供される。非経口ではない送達モードは、例えば経口的に、丸剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、又は懸濁剤といった形態、あるいは直腸的に坐剤といった形態である。本発明の変異タンパク質は、従来の非毒性で薬学的に許容可能な、所望されるような賦形剤又は担体、添加剤、及び媒体を含む剤形で全身的又は局所的に投与できる。
【０１０６】
本発明の一実施形態においては、医薬品は哺乳類、特にヒトに非経口的に投与される。対応する投与方法は限定しないが、例えば、注射液、輸液、又はチンキ剤の形態といった皮内、皮下、筋肉内、気管内、又は静脈内の注射及び注入技術と、煙霧混合物、噴霧、又は粉末の形態といった煙霧導入及び吸入とを含む。静脈内及び皮下の注入及び／又は注射の組合せは、比較的短い血清半減期を有する化合物の場合に最も好都合になりうる。医薬組成物は水溶液、水中油型乳剤、又は油中水型乳剤であってもよい。
【０１０７】
この関連で、Ｍｅｉｄａｎ  ＶＭ及びＭｉｃｈｎｉａｋ  ＢＢ（２００４）Ａｍ．Ｊ．Ｔｈｅｒ．１１（４）：３１２−３１６；に記載の、例えばイオン導入、超音波導入、又はマイクロニードル式の経皮送達技術は更に、本明細書中に記載の変異タンパク質の経皮送達に用いられうることは留意すべきである。非経口ではない送達モードは例えば経口的に、丸剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、又は懸濁剤といった形態の経口投与、あるいは坐剤といった形態の直腸投与である。本発明の変異タンパク質は、従来の非毒性で薬学的に許容可能な、種々の賦形剤又は担体、添加剤、及び媒体を含む剤形で全身的又は局所的に投与できる。
【０１０８】
適用される変異タンパク質の用量は、所望の予防効果又は治療反応を得るために、広範な範囲で変えてもよい。例えば、選択したリガンド用の化合物の親和性と、生体内での変異タンパク質とリガンドとの間の複合体の半減期とに依存する。更に、最適な用量は変異タンパク質又はその融合タンパク質若しくはその接合体の体内分布と、投与モードと、治療中の疾患／障害の重症度と、患者の医学的状態とに依存する。例えば、局所塗布用に軟膏で用いられる場合、高濃度の涙液リポカリンの変異タンパク質が用いられうる。しかしながら所望される場合、変異タンパク質は更に、例えば、ＰｏｌｙＡｃｔｉｖｅ（登録商標）又はＯｃｔｏＤＥＸ（登録商標）（Ｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｂｒｉｅｆｉｎｇ：Ｐｈａｒｍａｔｅｃｈ２００３：１−６参照）といった、リポソーム分散液又はヒドロゲルを基剤とした高分子ミクロスフェアなどの徐放性製剤で提供してもよい。入手可能な他の徐放性製剤は例えば、ＰＬＧＡを基剤とした高分子（ＰＲ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社）、ＰＬＡ−ＰＥＧを基剤としたヒドロゲル（Ｍｅｄｉｎｃｅｌｌ社）、及びＰＥＡを基剤とした高分子（Ｍｅｄｉｖａｓ社）である。
【０１０９】
従って、本発明の変異タンパク質は、薬学的に許容可能な成分ならびに確立された調整方法を用いた組成物に調剤できる（Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｌ．及びＧｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）。医薬組成物を調製するために、薬学的に不活性な無機又は有機賦形剤が用いられうる。例えば、丸剤、粉末、ゼラチンカプセル剤、又は坐剤を調製するために、例えばラクトース、滑石、ステアリン酸及びその塩、脂肪、ろう、固体又は液体ポリオール、天然及び硬化油は用いることができる。使用前に溶剤又は煙霧混合物に再構成するための溶剤、懸濁剤、乳剤、煙霧混合物、又は粉末の産生に好適な賦形剤は、水、アルコール、グリセロール、及びその好適な混合物、ならびに植物油を含む。
【０１１０】
医薬組成物は更に、例えば充填剤、結合剤、湿潤剤、流動促進剤、安定剤、保存剤、乳化剤といった添加剤と、更なる溶剤若しくは可溶化剤、又は畜性効果を得るための薬剤とを含んでもよい。後者は、リポソーム及びマイクロカプセルといった緩効系若しくは徐放系又は標的送達系に取り込まれてもよいものである。
【０１１１】
製剤は細菌保持性フィルタを通した濾過を含む多数の手段によって、あるいは、使用の直前に滅菌水又は他の滅菌手段で溶解又は分散できる無菌の固体組成物の形態で、滅菌剤を組み込むことによって滅菌できる。
【０１１２】
本発明の別の態様は、それを必要とする対象の疾患又は障害を治療する方法に関する。この疾患はｃ−Ｍｅｔ受容体のチロシンキナーゼの結合／相互作用を含んでも含まなくともよい。疾患はＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔ経路が関連する発達中の疾患であってもよい。このような疾患又は障害は細胞増殖性障害であってもよい。細胞増殖性疾患の例が癌である。治療すべき癌の例は限定しないが、例えば肝臓癌、結腸癌（例えば原発性結腸癌、例として、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００３，９（４），ページ１４８０−１４８８について参照）、結腸直腸癌（Ｚｅｎｇら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，２００００４，２１（５），ページ４０９−４１７参照）、肝細胞癌、乳頭型腎癌、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ）、頭頸部扁平上皮癌のリンパ節転移（例えば、Ｓｃｈｉｅｒｉｎｇら，ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．１００，Ｎｏ．２２，ページ１２６５４−１２５５９，２００３；あるいはＴｒｕｓｏｌｉｎｏ  ＆  Ｃｏｍｏｇｌｉｏ（２００２），Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，２８９−３００；又はＭａｕｌｉｋら（２００２）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｋｔｏｒ  Ｒｅｖ．１３，４１−５９；の概説参照）。このような治療目的のために、ＨＧＦ／ｃ−Ｍｅｔ経路と拮抗する涙液リポカリンの変異タンパク質、及び／又は涙液リポカリンの変異タンパク質の毒素融合物又は接合体、あるいは上述したような分裂停止剤を有する涙液リポカリンの変異タンパク質の接合体は用いられうる。
【０１１３】
このような治療を必要とする対象はいくつかの例示のみを挙げると、ヒト、イヌ、マウス、ラット、豚、カニクイザルのようなサルであってもよい。
【０１１４】
上の開示から明らかなように、本発明の変異タンパク質、あるいはその融合タンパク質又は接合体は、多くの用途に用いられうる。一般的に、このような変異タンパク質は、Ｆｃ部分の糖鎖付加に特異的に依拠するものを除いて、抗体が用いられる総ての用途で用いられうる。
【０１１５】
従って本発明の別の態様においては、本発明のヒト涙液リポカリンの変異タンパク質は、生体外での所定のリガンド、すなわちｃ−Ｍｅｔ受容体又はそのドメイン又はフラグメントの検出のために用いられうる。このような使用は、好適な条件下で所定のリガンドを有するとされるサンプルと変異タンパク質を接触させて、これによって、変異タンパク質と所定のリガンドとの間の複合体の形成を可能にして、好適なシグナルによって複合体化された変異タンパク質を検出するステップを具えてもよい。
【０１１６】
検出可能なシグナルは、上に説明されるような標識によって、あるいは結合、すなわち複合体形成そのものによる物理的特性の変化によって生じうる。一例は表面プラズモン共鳴であり、その値は、一方が金箔といった表面上に固定される結合相手の結合時に変更される。
【０１１７】
本明細書中に開示されるヒト涙液リポカリンの変異タンパク質は更に、ヒト涙液リポカリンの所定のリガンドの生体外での分離のために用いてもよい。このような使用は、好適な条件下で前記リガンドを含むとされるサンプルと変異タンパク質を接触させ、これによって、変異タンパク質と所定のリガンドとの間で複合体の形成を可能にし、サンプルから変異タンパク質／リガンドの複合体を分離するステップを具えてもよい。
【０１１８】
所定のリガンドの検出ならびに所定のリガンドの分離のための変異タンパク質の使用の双方において、変異タンパク質及び／又は標的は好適な固相に固定化してもよい。
【０１１９】
ヒト涙液本発明のリポカリンの変異タンパク質は更に、事前選択された部位を化合物が標的とするように用いてもよい。このような一実施形態においては、ヒト涙液リポカリンの変異タンパク質は、生物又は組織中の事前選択された部位を薬学的に能動的な化合物が標的にするのに用いられ、
ａ）変異タンパク質を前記化合物と接合するステップと、
ｂ）変異タンパク質／化合物の複合体を事前選択された部位に送達するステップと、
を具える。
【０１２０】
薬学的に能動的な化合物は、毒素、分裂停止剤、又はｃ−Ｍｅｔアンタゴニストからなる群から選択してもよい。ｃ−Ｍｅｔアンタゴニストの例は、モノクローナル抗体（一般的にはｃ−Ｍｅｔの細胞外ドメインを結合する）か、あるいは細胞内ドメイン（特に、チロシンキナーゼドメイン）を標的にする阻害剤を含む。低分子阻害剤の例は限定しないが、国際公開第２００４／０３１１８４号に記載のような１，３，５，トリアジン−２，４−ジアミン誘導体と、２−（２−，６−ジクロロフェニル−イミダゾール誘導体と、窒素含有型で二環式の誘導体と、５−ベンジルスルホニル及びスルホンアミド置換型のピロールインドリン（ｐｙｒｒｏｌｅ  ｉｎｄｏｌｉｎｅ：例えば、Ｓｕｇｅｎによって開発され、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｏｎ  Ｊ．Ｇ．ＡＡＣＲ，Ａｂｓｔ  ４９６３及び６２００，２００３；又はＳａｔｔｌｅｒ  Ｍら，ＡＡＣＲ，Ａｂｓｔ  １００５，２００３；によって記載された化合物ＰＨＡ−６６５７５２）とを含む
【０１２１】
このような目的のために、変異タンパク質は複合体形成を可能にするようにｃ−Ｍｅｔ受容体のチロシンキナーゼ又はドメインと接触する。次いで、変異タンパク質と、対象の化合物とを含む複合体は事前選択された部位に送達される。この使用は限定しないが、薬剤で治療されることとなる、感染した身体部分、組織又は器官といった、生物における事前選択された部位に（選択的に）薬剤を送達するのに特に好適である。変異タンパク質と対象の化合物との間での複合体の形成の他に、変異タンパク質は更に所定の化合物と反応させて、変異タンパク質と化合物との接合体を提供できる。上の複合体と同様に、このような接合体は化合物を事前選択された標的部位に送達するのに好適であってもよい。変異タンパク質と化合物とのこのような複合体は更に、変異タンパク質と化合物とを相互に共有結合するリンカを含んでもよい。選択的に、このようなリンカは血流中で安定であるが、細胞内環境においては切断可能である。
【０１２２】
本明細書中で開示される変異タンパク質及びその誘導体は従って、抗体又はそのフラグメントと同様、多くの分野で用いられうる。担体に結合させる使用に加えて、所定の変異タンパク質の標的、あるいはこの標的の接合体又は融合タンパク質を固定化又は分離するのが可能であるため、変異タンパク質は酵素、抗体、放射性物質、あるいは生化学的活性又は規定される結合特性を有するその他の群で標識されるように用いられうる。そのようにすることによって、各々の標的、あるいはその接合体又は融合タンパク質は検出又は接触できる。例えば、本発明の変異タンパク質は確立した分析方法（例えば、ＥＬＩＳＡ又はＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ）によって、あるいは顕微鏡又は免疫センサによって、化学的構造を検出するのに役立つ。ここで検出シグナルは、好適な変異タンパク質、接合体、又は融合タンパク質の使用によって直接的に、あるいは抗体を介して結合された変異タンパク質の免疫化学的検出によって間接的に、のいずれかで産生できる。
【０１２３】
本発明の変異タンパク質について可能な多数の用途が更に医学に存在する。生体外での診断及び薬剤送達における使用に加えて、本発明の変異ポリペプチドは、例えば組織特異型又は腫瘍特異型の細胞表面分子を結合して産生されうる。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
本発明は以下の限定されない実施例及び添付の図面によって更に例示される。
【０１２５】
【図１】図１は、ファスミドベクタｐＴＬＰＣ５９のマップを示し、図１ａはベクタの制御配列の概略的な表示を示し、図１ｂは未処理のライブラリを発現するために用いられる、涙液リポカリンの変異タンパク質の遺伝子構造の概略的な拡張を示す。
【図２】図２は、発現ベクタｐＴＬＰＣ１０のマップを示す。
【図３】図３は、野生型涙液リポカリンのポリペプチド配列と一直線になる、涙液リポカリンの変異タンパク質Ｓ２２５．４−Ｋ２４（配列番号１）のポリペプチド配列を示す。
【図４】図４は、ＥＬＩＳＡを介した親和性スクリーニングの方法と、ｃ−Ｍｅｔに対し親和性を有する変異タンパク質について得られた結果とを示す。
【図５】図５は、涙液リポカリンの変異タンパク質Ｓ２２５．４−Ｋ２４（配列番号１）、及びＳ２４４．２−Ｈ０８、Ｓ２４４．２−Ｌ０１、Ｓ２４４．４−Ｎ０５、Ｓ２４４．５−Ｊ０５、Ｓ２４４．８−Ｉ２０、Ｓ２４４．８−Ｉ０７（配列番号４ないし９）のポリペプチド配列の配列比較を示す。
【図６】図６は、本発明のヒト涙液リポカリンの変異タンパク質（Ｓ２４４．２−Ｈ０８；配列番号４）のｃ−Ｍｅｔへの結合のＢＩＡｃｏｒｅ測定値を示す。
【図７】図７は、ＨＴ−２９細胞の細胞内状況におけるｃ−Ｍｅｔ結合型の変異タンパク質Ｓ２４４．２−Ｈ０８、Ｓ２４４．２−Ｌ０１、Ｓ２４４．４−Ｎ０５、Ｓ２４４．５−Ｊ０５、Ｓ２４４．８−Ｉ２０、Ｓ２４４．８−Ｉ０７（配列番号４ないし９）の親和性評価の結果を示す。
【図８】図８は、ＥＬＩＳＡを介した親和性スクリーニングの方法と、ｃ−Ｍｅｔに対し親和性を有する変異タンパク質について得られた結果とを示す。
【図９】図９は、涙液リポカリンの変異タンパク質Ｓ２２５．４−Ｋ２４（配列番号１）、Ｓ２４４．２−Ｈ０８（配列番号４）、Ｓ２６１．１−Ｌ１２、Ｓ２６１．１−Ｊ０１、及びＳ２６１．１−Ｌ１７（配列番号３２ないし３４）のポリペプチド配列の配列比較を示す。
【図１０】図１０は、発現ベクタｐＴＬＰＣ４７のマップを示す。
【図１１】図１１は、ＨＴ−２９細胞の細胞内状況におけるｃ−Ｍｅｔ結合型の変異タンパク質Ｓ２６１．１−Ｌ１２、Ｓ２６１．１−Ｊ０１、及びＳ２６１．１−Ｌ１７（配列番号３２ないし３４）の親和性評価の結果を示す。
【図１２】図１２は、本発明のヒト涙液リポカリンの変異タンパク質（Ｓ２６１．１−Ｌ１７；配列番号３４）のｃ−Ｍｅｔへの結合の競合ＥＬＩＳＡ測定値を示す。
【図１３】図１３は、ＨＴ−２９細胞の細胞内状況におけるｃ−Ｍｅｔ結合型の変異タンパク質Ｓ２６１．１−Ｌ１２＿Ｃ１２３（配列番号３５）の親和性評価の結果を示す。
【図１４】図１４は、涙液リポカリンの変異タンパク質Ｓ２６１．１−Ｊ０１（配列番号３３）のｐＨ安定性試験の結果を示す。
【図１５】図１５は、ｃ−Ｍｅｔへの結合に対するＫＤ値とともに（更なる単一の突然変異が導入された）更なる本発明の涙液リポカリンの変異タンパク質のポリペプチド配列の配列比較を示す。
【図１６】図１６は、ＨＴ−２９細胞の細胞内状況におけるｃ−Ｍｅｔ結合型の変異タンパク質Ｓ３１８．１−Ｃ１０、Ｓ３１８．１−Ｌ１３、Ｓ３１８．１−Ａ１６、Ｓ３１８．２−Ｉ２４、及びＳ３１８．１−Ｏ１２（配列番号４２、４４、４５、４６、及び４９）の親和性評価の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１２６】
［実施例］
他に示されない限り、確立された組換え遺伝子技術の方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（上記を参照）に記載のように用いられた。
【実施例１】
【０１２７】
［実施例１：１．６×１０１０の別個のＴｌｃ変異タンパク質を有するライブラリの産生］
高い複雑性を有する涙液リポカリン（Ｔｌｃ）のランダムライブラリは本質的にはＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５７９７１に記載のように調製され、その開示は、ファージディスプレイｐＴＬＰＣ５９用のライブラリ遺伝子コントラクト（図１ａ及び１ｂ）がｔｅｔプロモータの代わりにｌａｃプロモータの制御下に置かれ、ＶＣＳＭ１３ファージの全長遺伝子ＩＩＩに遺伝学的に融合されることを除いて、全体として本明細書中に引用によって組み込まれる。
【０１２８】
多価性ファージディスプレイフォーマットにおける涙液リポカリンの変異タンパク質のファージ産生は、文献（Ｍ．Ｋｉｒｓｃｈら／Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ３０１（２００５）１７３−１８５）に記載のような標準的な方法で、大腸菌感染に対しＭ１３Ｋ０７Ｈｙｐｅｒｐｈａｇｅ（Ｐｒｏｇｅｎ社）を用いて実現された。
【実施例２】
【０１２９】
［ｃ−Ｍｅｔ受容体に対し親和性を有するＴｌｃ変異タンパク質のファージミドの提示又及び選択］
ファージミドの提示及び選択は以下の修飾で、国際公開第２００５／０１９２５６号の実施例３に記載のように実質的に、実施例１で得られたファージミドを用いて行われた：標的タンパク質（ｃ−Ｍｅｔ受容体−Ｆｃ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社）は２００ｎＭの濃度で用いられ、プロテインＧビーズ（Ｄｙｎａｌ社）を用いた、ファージと標的との複合体の後の捕捉とともに、Ｆｃ融合タンパク質としてライブラリに提示された。天然リガンドＨＧＦに対し非拮抗に作用する結合剤を選択するために、更なる洗浄ステップは、ｃ−Ｍｅｔ結合型ライブラリのファージが塩基性条件下で溶出される前に、２００ｎＭの可溶性のＨＧＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて導入された。４回の選択が行われた。
【実施例３】
【０１３０】
［実施例３：高スループットＥＬＩＳＡスクリーニングを用いたｃ−Ｍｅｔ受容体特異的な変異タンパク質の同定］
実施例２により選択された変異タンパク質のスクリーニングは、国際公開第２００６／５６４６４号の実施例３に記載のように実質的に行われた。修飾プロトコルは以下に述べられる：発現ベクタはｐＴＬＰＣ１０であった（図２）。用いられた標的タンパク質は１μｇ／ｍｌのｃ−Ｍｅｔ受容体−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）であり、３％の乳状液がヒト血清アルブミンの代わりに関連づけられないコントロールの標的として用いられた。
【０１３１】
実施例２に記載されるように選択される２８８０のクローンの選択は、ライブラリからの変異タンパク質の完全な分離が生じたことを示す３４２のプライマリヒットの同定を導いた。このアプローチを用いて、クローンＳ２２５．４−Ｋ２４（配列番号１）が同定された。Ｓ２２５．４−Ｋ２４の配列は更に図３に示される。
【実施例４】
【０１３２】
［実施例４：エラープローンＰＣＲを用いた変異タンパク質Ｓ２２５．４−Ｋ２４の親和性成熟］
変異タンパク質Ｓ２２５．４−Ｋ２４（配列番号１）に基づく変異体のライブラリの産生は、平均して構造遺伝子につき５の置換を有するライブラリに生じる、オリゴヌクレオチドＴＬ５０  ｂｉｏ：ＴＡＴＣＴＧＡＡＧＧＣＣＡＴＧＡＣＧＧＴＧＧＡＣ（配列番号２）とＴＬ５１  ｂｉｏ：ＴＧＣＣＣＡＣＧＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＣＴＧＧＧＡ（配列番号３）とを有する国際公開第２００６／５６４６４号の実施例５に記載のように実質的に実行される。
【０１３３】
ファージミドの選択は実施例２に記載のように行われるが、限定された標的濃度（２ｎＭ、０．５ｎＭ、及び０．１ｎＭ）のｃ−Ｍｅｔ受容体−Ｆｃを用いて行い、ポリスチロールプレートに固定化された抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃに特異的なｍＡｂを介して、標的及びファージミドの複合体を捕捉する。同一条件下であるが、結合した標的の限定（１ｎＭ）及び短いインキュベーション時間（５分）で、あるいはｐＨ３、６０℃で１５分間の、又はｐＨ１０、ＲＴで３０分間のファージミドのインキュベーションと組合わせた標的の限定（５ｎＭ、０．５ｎＭ、及び０．１ｎＭ）での更なる選択が行われた。４回の選択が行われた。
【実施例５】
【０１３４】
［実施例５：高スループットＥＬＩＳＡスクリーニングを用いたｃ−Ｍｅｔ受容体結合型の変異タンパク質の親和性スクリーニング］
スクリーニングは、２．５μｇ／ｍｌ又は０．６μｇ／ｍｌの濃度のｃ−Ｍｅｔ受容体−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）が用いられる修飾で、実施例３に記載のように行った。全部で２８８０のクローンがスクリーニングされ、１５１０のヒットを生じさせ、ライブラリからの成熟した変異タンパク質の完全な濃縮が生じていることを示した。更に、代替的なスクリーニング設定においては、モノクローナル抗Ｔ７抗体は、ポリスチロールプレート上にコーディングされ、発現された変異タンパク質は限定された濃度のｃ−Ｍｅｔ受容体−Ｆｃ（６０ｎＭ、１５ｎＭ、及び２．５ｎＭ）でインキュベーション前に、Ｔ７タグを介して捕捉された。ｃ−Ｍｅｔ受容体−Ｆｃの結合は、ヒトＩｇＧ−Ｆｃドメインに対するＨＲＰ接合型のポリクローナル抗体を用いて検出された。
【０１３５】
このようなスクリーニングの結果は図４に示される。実施例４及び５に記載されるように選択される大多数の変異タンパク質は、親和性成熟のための基剤として作用する変異タンパク質Ｓ２２５．４−Ｋ２４（配列番号１）と比較されるように、ｃ−Ｍｅｔ受容体に対する親和性を改善して同定された。このアプローチを用いて、変異タンパク質Ｓ２４４．２−Ｈ０８、Ｓ２４４．２−Ｌ０１、Ｓ２４４．４−Ｎ０５、Ｓ２４４．５−Ｊ０５、Ｓ２４４．８−Ｉ２０、Ｓ２４４．８−Ｉ０７（配列番号４ないし９）が同定された。Ｓ２４４．２−Ｈ０８、Ｓ２４４．２−Ｌ０１、Ｓ２４４．４−Ｎ０５、Ｓ２４４．５−Ｊ０５、Ｓ２４４．８−Ｉ２０、Ｓ２４４．８−Ｉ０７の配列は更に、図５に示される。
【実施例６】
【０１３６】
［実施例６：ｃ−Ｍｅｔ受容体結合型の変異タンパク質の産生］
ｃ−Ｍｅｔ受容体型の変異タンパク質の産生の調製のために、発現ベクタｐＴＬＰＣ１０（図２）上にコード化される各々の変異タンパク質を有する大腸菌Ｋ１２株ＪＭ８３は、２Ｌ振盪フラスコの培養において、Ｓｃｈｌｅｈｕｂｅｒ，Ｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００），２９７，１１０５−１１２０）に記載されるプロトコルによるＬＢアンピシリン培地で成長させた。多量のタンパク質が必要とされる場合、各々の発現ベクタを有する大腸菌株Ｗ３１１０は、Ｓｃｈｉｗｅｃｋ，Ｗ．及びＳｋｅｒｒａ，Ａ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９９５）２３，５６１−５６５；に記載のプロトコルに基づいて、１ｌ又は１０ｌ容器中の卓上の発酵培養を介した周辺質の産生に用いられた。
【０１３７】
変異タンパク質は、Ｓｋｅｒｒａ，Ａ．及びＳｃｈｍｉｄｔ，Ｔ．Ｇ．Ｍ．（２０００）（Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ａｎｄ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２６Ａ，２７１−３０４）により記載の手順により、好適な総容積のカラムを用いたストレプトアビジン親和性クロマトグラフィを介する単一ステップで、周辺質画分から精製された。高純度を得るために、かつ、任意の凝集性組換えタンパク質を除去するために、変異タンパク質のゲル濾過は最終的に、ＰＢＳバッファの存在下で、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５ＨＲ１０／３０カラム（２４ｍｌの総容積、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）上で行われた。単量体タンパク質の画分は貯蔵され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって純度について点検され、更なる生化学的特徴に用いられた。
【実施例７】
【０１３８】
［実施例７：表面プラズモン共鳴分光法（ＳＰＲ）を用いた親和性測定］
親和性測定は、約９０００ＲＵのｃ−Ｍｅｔ受容体−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）が（国際公開第２００６／５６４６４号において標的として用いられる２０００ＲＵのヒトＣＴＬＡ−４又はマウスＣＴＬＡ−４−Ｆｃの代わりに）、ＣＭ５チップの表面上に直接的に固定化され、かつ、８０μｌの変異タンパク質が（国際公開第２００６／５６４６４号における標的として用いられるような、５ないし０．３μＭの濃度で調製されたリポカリンの変異タンパク質の４０μｌのサンプルの代わりに）、０．２ないし０．５μＭの濃度で注入された修飾とともに、国際公開第２００６／５６４６４号の実施例９に記載のように実質的に行われた。チップの表面は測定の間に、ｐＨ１０の５０ｍＭのＮａＯＨ、２．５ＭのＮａＣｌの５ないし１０μｌの注入によって再生された。流速は１０μｌ／分で一定に維持された。
【０１３９】
Ｓ２４４．２−Ｈ０８、Ｓ２４４．２−Ｌ０１、Ｓ２４４．４−Ｎ０５、Ｓ２４４．５−Ｊ０５、Ｓ２４４．８−Ｉ２０、Ｓ２４４．８−Ｉ０７を用いる親和性測定による結果は、表１に要約され、Ｓ２４４．２−Ｈ０８の例のセンサグラムの評価は図６に示される。
【０１４０】
【表１】
0005562257.tif 000002
【０１４１】
表１は、ＳＰＲによって決められるようなｃ−Ｍｅｔ受容体用に選択された本発明の変異タンパク質の親和性である。平均値は少なくとも３の別個の測定から算出される。
【実施例８】
【０１４２】
［実施例８：フローサイトメトリによる未処理細胞におけるリポカリンの変異タンパク質の親和性順位］
リポカリンの変異タンパク質は、ＨＧＦＲ／ｃ−Ｍｅｔの内在性発現を示すＨＴ−２９細胞（ＡＴＣＣ）上で滴定された。リポカリンの変異タンパク質は、総容積３０μｌで１０μＭの濃度から開始して２４の１：２の希釈で試験された。各々の結合反応用に、１００，０００の細胞が、２％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むＰＢＳ中で、４℃で２時間インキュベートされた。細胞はＰＢＳ、２％のＦＣＳで２回洗浄され、反応につき３０分間、３７５ｎｇのビオチン化され、親和的に精製されたヤギ抗涙液リポカリンの抗血清でインキュベートされた。洗浄後の更なる３０分のストレプトアビジンフィコエリトリンでのインキュベーション後に、検出が得られた。細胞は洗浄され、蛍光はＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメータで分析された。平均蛍光強度（ＭＦＩ）はリポカリンの変異タンパク質の濃度に対してプロットされ、Ｓ字形の用量反応曲線に合致し、ＥＣ５０値はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて決定された。
【０１４３】
Ｓ２４４．２−Ｈ０８、Ｓ２４４．２−Ｌ０１、Ｓ２４４．４−Ｎ０５、Ｓ２４４．５−Ｊ０５、Ｓ２４４．８−Ｉ２０、Ｓ２４４．８−Ｉ０７に対するＥＣ５０値が決定される滴定曲線は図７に示され、計算されたＥＣ５０値は表２に要約される。
【０１４４】
【表２】
0005562257.tif 000003
【０１４５】
表２は、ＨＴ−２９細胞上のＦＡＣＳ滴定によって決定されるような、ｃ−Ｍｅｔ受容体に対して選択された本発明の変異タンパク質のＥＣ５０値及び標準偏差である。
【実施例９】
【０１４６】
［実施例９：リポカリンの変異タンパク質−Ｃｙｓ変異体のスクリーニング］
例えば、活性化したＰＥＧ又は薬学的に関連する標識との部位特異的結合用の反応基を提供するために、不対のシステイン残基は部位特異的突然変異誘発によって導入された。遊離Ｃｙｓ残基を保有する組換え型の変異タンパク質は次いで、実施例６に記載のように大腸菌中で産生され、発現収量が決定され、親和性は実施例７に記載のように実質的にＳＰＲによって測定された。
【０１４７】
システインは、対でのオリゴヌクレオチド：
Ｈ０８＿Ｔ４０Ｃ  ｆｏｒｗａｒｄ  ＣＧＴＣＴＣＧＧＴＡＡＣＡＣＣＣＡＴＡＴＧＣＣＴＣＡＣＧＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧＧＧ（配列番号１０）、
及び、
Ｈ０８  Ｔ４０Ｃ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ＣＣＣＴＴＣＣＡＧＧＧＴＣＧＴＧＡＧＧＣＡＴＡＴＧＧＧＴＧＴＴＡＣＣＧＡＧＡＣＧ（配列番号１１）；
Ｈ０８＿Ｄ９５Ｃ  ｆｏｒｗａｒｄ  ＣＡＧＧＴＣＧＣＡＣＧＴＧＡＡＧＴＧＣＣＡＣＴＡＣＡＴＣＴＴＴＴＡＣＴＣＴＧＡＧＧＧ（配列番号１２）、
及び、
Ｈ０８＿Ｄ９５Ｃ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ＣＣＣＴＣＡＧＡＧＴＡＡＡＡＧＡＴＧＴＡＧＴＧＧＣＡＣＴＴＣＡＣＧＴＧＣＧＡＣＣＴＧ（配列番号１３）；
Ｈ０８＿Ｒ９０Ｃ  ｆｏｒｗａｒｄ  ＣＧＴＧＧＣＡＴＡＣＡＴＣＡＧＣＴＧＣＴＣＧＣＡＣＧＴＧＡＡＧＧＡＴＣＡＣ（配列番号１４）、
及び、
Ｈ０８＿Ｒ９０Ｃ  ＧＴＧＡＴＣＣＴＴＣＡＣＧＴＧＣＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＴＧＴＡＴＧＣＣＡＣＧ（配列番号１５）；
Ａ２２＿Ｋ１２１Ｃ  ｆｏｒｗａｒｄ  ＧＧＣＡＧＡＧＡＣＣＣＣＴＧＣＡＡＣＡＡＣＣＴＧＧＡＡＧＣＣＴＴＧ（配列番号１６）、
及び、
Ａ２２＿Ｋ１２１Ｃ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ＣＡＡＧＧＣＴＴＣＣＡＧＧＴＴＧＴＴＧＣＡＧＧＧＧＴＣＴＣＴＧＣＣ（配列番号１７）；
Ａ２２＿Ｎ１２３Ｃ  ｆｏｒｗａｒｄ  ＧＧＣＡＧＡＧＡＣＣＣＣＡＡＧＡＡＣＴＧＣＣＴＧＧＡＡＧＣＣＴＴＧＧＡＧ（配列番号１８）、
及び、
Ａ２２＿Ｎ１２３Ｃ  ｆｏｒｗａｒｄ  ＧＧＣＡＧＡＧＡＣＣＣＣＡＡＧＡＡＣＴＧＣＣＴＧＧＡＡＧＣＣＴＴＧＧＡＧ（配列番号１９）；
あるいは、
Ｈ０８＿Ｖ９３Ｃ  ｆｏｒｗａｒｄ  ＣＡＴＣＡＧＣＡＧＧＴＣＧＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＡＴＣＡＣＴＡＣＡＴＣＴＴＴＴＡＣ（配列番号２０）、
及び、
Ｈ０８＿Ｖ９３Ｃ  ｒｉｖｅｒｓｅ  ＧＴＡＡＡＡＧＡＴＧＴＡＧＴＧＡＴＣＣＴＴＧＣＡＧＴＧＣＧＡＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧ（配列番号２１）；
をそれぞれ用いて、アミノ酸Ｔｈｒ４０、Ａｓｐ９５、Ａｒｇ９０、Ｌｙｓ１２１、Ａｓｎ１２３、又はＶａｌ９３の代わりに導入された。
【０１４８】
例示的には、ｃ−Ｍｅｔ受容体型の変異タンパク質Ｓ２４４．２−Ｈ０８（配列番号４）のＣｙｓスクリーニングによる結果は、以下の表３に与えられる。
【０１４９】
【表３】
0005562257.tif 000004
【０１５０】
表３は、アミノ酸交換Ｔｈｒ４０→Ｃｙｓ（配列番号２２）、Ａｓｎ１２３→Ｃｙｓ（配列番号２３）、Ａｓｐ９５→Ｃｙｓ（配列番号２４）、Ａｒｇ９０→Ｃｙｓ（配列番号２５）、及びＬｙｓ１２１→Ｃｙｓ（配列番号２６）を含む変異タンパク質Ｓ２４４．２−Ｈ０８及びその変異体のｃ−Ｍｅｔ受容体に対するＳＰＲ親和性である。
【実施例１０】
【０１５１】
［実施例１０：部位特異的なランダムアプローチを用いた変異タンパク質Ｓ２２５．４−Ｋ２４の親和性成熟］
変異タンパク質Ｓ２２５．４−Ｋ２４（配列番号１）に基づく変異体のライブラリは、残基位置２８、３９、５２、５、５８、６５、及び８９のランダム化によって設計されて、これらの位置の総ての２０のアミノ酸を準備した。ライブラリは、３のランダム化されたＰＣＲフラグメントが、対でのデオキシヌクレオチド：
Ｋ２４＿１：ＧＣＣＡＴＧＡＣＧＧＴＧＧＡＣＡＣＧＣＡＧＮＮＳＣＣＧＣＴＧＡＧＣＣＴＣＴＡＣ（配列番号２７）（被覆位置２８）、
及び、
Ｋ２４＿２：ＣＡＧＧＧＴＣＧＴＧＡＧＧＧＴＳＮＮＧＧＧＴＧＴＣＡＣＣＧＡＧＡＣ（配列番号２８）（被覆位置３９）；
Ｋ２４＿３：ＧＧＧＧＧＣＡＡＣＣＴＧＧＡＡＧＣＣＮＮＳＧＴＣＡＣＣＮＮＳＡＡＣＣＡＧＮＮＳＧＧＣＣＧＧＴＣＣＣＡＧＧＡＧＧＴＧ（配列番号２９）（被覆位置５２、５５、及び５８）、
及び、
Ｋ２４＿４：ＧＴＡＴＴＴＴＣＣＣＧＧＣＴＣＡＴＣＡＧＴＴＴＴＣＴＣＣＡＧＧＡＣＧＧＣＳＮＮＣＡＣＣＴＣＣＴＧＧＧＡＣＣＧＧＣＣ（配列番号３０）（被覆位置６５）；
Ｋ２４＿５：ＧＴＧＣＴＣＡＣＧＴＧＧＣＡＴＡＣＡＴＣＮＮＳＡＧＧＴＣＧＣＡＣＧＴＧＡＡＧＧＡＣ（配列番号３１）（被覆位置８９）、
及び、
ＴＬ５１ｂｉｏ（配列番号３）；
をそれぞれ、ＴＬ４６、ＴＬ４７、ＴＬ４８、及びＴＬ４９の代わりに用いて産生される修飾とともに、実施例１に記載のように実質的に構成された。ファージミドの表示及び選択は、標的タンパク質が標的の捕捉を可能にするビオチン化された形態における、Ｆｃ部分のない単量体ｃ−Ｍｅｔ受容体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社）であり；ニュートラアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ社）を介したファージミドの複合体はポリスチロールプレートで固定化される；という修飾とともに、実施例２に記載のように実質的にファージミドを用いて行われた。選択は限定された標的濃度（１．５ｎＭ、０．５ｎＭ、及び０．１ｎＭのビオチン化されたｃ−Ｍｅｔ受容体）、あるいは限定された標的濃度（３μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、及び０．３μｇ／ｍｌ）のいずれかを用いて行われ、実施例５に示したようなエラープローン性の成熟で得られる、高過剰（１０μＭ）の精製されたｃ−Ｍｅｔ特異性の変異タンパク質Ｓ２４４．２−Ｈ０８（配列番号４）を用いて、短いインキュベーション時間（１０分）又は競合的アプローチと組合わせられた。３回の選択が行われた。
【実施例１１】
【０１５２】
［実施例１１：高スループットＥＬＩＳＡスクリーニングを用いたｃ−Ｍｅｔ受容体結合型の変異タンパク質の親和性スクリーニング］
スクリーニングは実質的に実施例５に記載のように、
ｉ）モノクローナル抗Ｔ７抗体はポリスチロールプレートにコーティングされ、発現した変異タンパク質は、限定された濃度の単量体ｃ−Ｍｅｔ受容体−ｂｉｏ（５０ｎＭ、１０ｎＭ、及び２．５ｎＭ）で、インキュベートする前にＴ７タグを介して捕捉された。標的の結合はＨＲＰ（ホースラディシュペルオキシダーゼ）接合型のＥｘｔｒａｖｉｄｉｎを用いて検出された；
ｉｉ）ビオチン化されたｃ−Ｍｅｔ受容体（１μｇ／ｍｌ）はニュートラアビジンプレートに捕捉された。発現されたｃ−Ｍｅｔ特異性の変異タンパク質の結合は無制限（６０分）又は限定された（５分）のインキュベーション時間の後のいずれかにＨＲＰ接合型の抗Ｔ７ｍＡｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を介して検出された；
ｉｉｉ）ｃ−Ｍｅｔ結合する変異タンパク質を含む抽出物は７０℃で１時間加熱された；
ｉｖ）ビオチン化されたｃ−Ｍｅｔ受容体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、２．５μｇ／ｍｌ）はニュートラアビジンプレートで捕捉された。変異タンパク質の抽出物は標的結合の競合相手として、実施例５による高過剰（１μＭ）の精製されたｃ−Ｍｅｔ特異性の変異タンパク質Ｓ２４４．２−Ｈ０８（配列番号４）でプレインキュベートされた。発現されたｃ−Ｍｅｔ特異性の変異タンパク質の結合はＨＲＰ接合型の抗Ｔ７ｍＡｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社）を介して検出された；
といった修飾とともに、代替的なスクリーニング設定で行われた。
【０１５３】
このようなスクリーニングの結果は図８に示されている。実施例１２及び１３に記載のように選択される、多数の変異タンパク質は、親和性成熟に対する基剤として作用する変異タンパク質Ｓ２２５．４−Ｋ２４（配列番号１）と比較されるように、ｃ−Ｍｅｔ受容体に対する親和性を改善して同定された。このアプローチを用いて、変異タンパク質Ｓ２６１．１−Ｌ１２、Ｓ２６１．１−Ｊ０１、Ｓ２６１．１−Ｌ１７（配列番号３２ないし３４）が同定された。Ｓ２６１．１−Ｌ１２、Ｓ２６１．１−Ｊ０１、Ｓ２６１．１−Ｌ１７の配列は更に、Ｓ２２５．４−Ｋ２４（配列番号１）と、実施例５に記載のようなエラープローン性の成熟で得られる変異タンパク質であるＳ２４４．２−Ｈ０８（配列番号４）との配列とともに、図９に示される。
【実施例１２】
【０１５４】
［実施例１２：Ｈｉｓタグを付けたフォーマットにおけるｃ−Ｍｅｔ受容体結合型の変異タンパク質の産生］
発酵培養を介した０．７５ｌのバイオリアクタ中の周辺質産生は実質的に、各々の変異タンパク質がｐＴＬＰＣ１０の代わりに発現ベクタｐＴＬＰＣ４７（図１０）でコード化されるという修飾とともに、実施例６によって実行された。ｐＴＬＰＣ４７のベクタ成分は、ヘキサＨｉｓタグ及びＮ末端融合型のＴ７タグにＣ末端で融合されるＴｌｃ変異タンパク質に対するｐＴＬＰＣ４７コードが除去されるという修飾とともに、ｐＴＬＰＣ１０と同一となる。
【０１５５】
変異タンパク質は、生産者の推奨による適切な総容積及び好適な装備を用いて、Ｎｉ−ＮＴＡセファロース（ＧＥ）を有する単一ステップのクロマトグラフプロトコルで、周辺質画分から精製された。
【０１５６】
高純度を得るために、かつ任意の凝集型の組換えタンパク質を除去するために、変異タンパク質のゲル濾過は最終的にＰＢＳバッファの存在下でＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ＨＲ１０／３０カラム（２４ｍｌの総容積、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社）上で行われた。単量体タンパク質の画分は貯蔵され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって純度について点検され、更なる生化学的特徴に用いられた。
【実施例１３】
【０１５７】
［実施例１３：表面プラズモン共鳴分光法（ＳＰＲ）を用いた親和性測定］
親和性測定は、実施例７に記載のように実質的に行われた。
【０１５８】
Ｓ２６１．１−Ｌ１２、Ｓ２６１．１−Ｊ０１、Ｓ２６１．１−Ｌ１７（配列番号３２ないし３４）と、実施例４及び５に記載のエラープローン性の成熟で得られた変異タンパク質であるＳ２４４．２−Ｈ０８（配列番号４）とを用いた親和性測定による結果は、表４に要約される。
【０１５９】
【表４】
0005562257.tif 000005
【０１６０】
表４は、ＳＰＲによって決定された第１の親和性成熟サイクルで、変異タンパク質Ｓ２４４．２−Ｈ０８と比較した実施例１０及び１１に記載のような、第２の親和性成熟により選択された変異タンパク質の親和性改善である。
【実施例１４】
【０１６１】
［実施例１４：フローサイトメトリによる未処理細胞上のリポカリンの変異タンパク質の親和性順位］
リポカリンの変異タンパク質は、実施例８に記載のように実質的にＨＴ−２９細胞（ＡＴＣＣ）上で滴定された。
【０１６２】
Ｓ２６１．１−Ｌ１２、Ｓ２６１．１−Ｊ０１、Ｓ２６１．１−Ｌ１７（配列番号３２ないし３４）に対するＥＣ５０値が決定される滴定曲線が図１１に示され、計算されたＥＣ５０値は表５に要約される。
【０１６３】
【表５】
0005562257.tif 000006
【０１６４】
表５は、ＨＴ−２９細胞上でＦＡＣＳ滴定によって決定されるような、ｃ−Ｍｅｔ受容体に対し選択された、本発明の変異タンパク質のＥＣ５０値である。
【実施例１５】
【０１６５】
［実施例１５：ＨＧＦ競合ＥＬＩＳＡを用いたｃ−Ｍｅｔ受容体型の変異タンパク質の非拮抗性の結合モードの同定］
選択されたｃ−Ｍｅｔ特異性の変異タンパク質による、ＨＧＦ（肝細胞増殖因子、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）とｃ−Ｍｅｔ受容体との間の相互作用のモードは、競合ＥＬＩＳＡで評価された。従って、一定濃度の２．５μｇ／ｍｌのｃ−Ｍｅｔ受容体−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）は、前にポリスチロールプレートの表面に固定化された抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃに特異的なｍＡｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社）を介して捕捉された。以下において、標的は室温で１時間インキュベートされ、ｃ−Ｍｅｔ特異性の変異タンパク質の希釈系列は、２ステップの希釈系列で１００ｎＭから開始し、結合は競合相手として３００ｎＭのＨＧＦがある場合、ない場合のいずれでも生じる。結合したｃ−Ｍｅｔ受容体特異性の変異タンパク質は、ポリクローナル性のビオチン化された抗リポカリン１抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて検出され、結合したＨＧＦはポリクローナル性の抗ＨＧＦ−ｂｉｏ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて検出された。双方の場合において、ＨＲＰ接合型のＥｘｔｒａｖｉｄｉｎ（Ｓｉｇｍａ社）は第２の検出試薬として用いられた。
【０１６６】
変異タンパク質Ｓ２６１．１−Ｌ７（配列番号３４）を用いる測定の結果は例として作用し、図１２に示される。変異タンパク質の滴定曲線によって決定されるＫＤ値は表６に要約される。
【０１６７】
【表６】
0005562257.tif 000007
【０１６８】
表６は、競合ＥＬＩＳＡによって決定されるような本発明の選択された涙液リポカリンの変異タンパク質Ｓ２６１．１−Ｌ１７のｃ−Ｍｅｔ受容体に対する非拮抗性の能力及び親和性である。
【実施例１６】
【０１６９】
［実施例１６：ＣＤスペクトル測定の使用によるｃ−Ｍｅｔ結合された変異タンパク質の熱変性の決定］
円偏光二色性測定は、用いられる波長が２３０ｎＭであり、変異タンパク質濃度が２５０μｇ／ｍｌであるという修飾とともに、国際公開第２００６／０５６４６４号の実施例１４に記載のように実質的に行われた。涙液リポカリンの変異タンパク質Ｓ２６１．１−Ｌ１２、Ｓ２６１．１−Ｊ０１、Ｓ２６１．１−Ｌ１７（配列番号３２ないし３４）及びＳ２４４．２−Ｈ０８（配列番号４）の融解温度Ｔｍは、表６−１に要約される。
【０１７０】
【表６−１】
0005562257.tif 000008
【０１７１】
表６−１は、円偏光二色性測定によって決定されるような、ｃ−Ｍｅｔ受容体に対し選択される本発明の変異タンパク質の融解温度である。
【実施例１７】
【０１７２】
［実施例１７：位置１２３で不対のシステインを有するｃ−Ｍｅｔ特異性の変異タンパク質Ｓ２６１．１−Ｌ１２＿Ｃ１２３の産生］
ｃ−Ｍｅｔ特異性の変異タンパク質Ｓ２６１．１−Ｌ１２＿Ｃ１２３（配列番号３５）の産生の調製は、アミノ酸Ａｓｎ１２３が後の部位特異的な接合に対し不対のシステインを導入するために、システインに変更されるという修飾とともに、実施例６に記載のように実質的に行われた。システイン１２３は不対のシステインのない元の変異タンパク質Ｓ２６１．１−Ｌ１２（配列番号３２）と比較して、良好な発現収量及び親和性を示す、実施例９に記載のシステインのスクリーニングによる結果を伝達することにより選択された。
【実施例１８】
【０１７３】
［実施例１８：ｃ−Ｍｅｔ特異性の変異タンパク質Ｓ２６１．１−Ｌ１２＿Ｃ１２３に対するＨＹＮＩＣの部位特異的な接合］
実施例１７で精製された変異タンパク質Ｓ２６２．１−１１２＿Ｃ１２３（配列番号３５）は、ｐＨ７．４のＰＢＳバッファ中で０．８ｍｇ／ｍｌの濃度で用いられ、不対のシステインは１００ｍＭのＴＣＥＰ（Ｓｉｇｍａ社）の１ｍＭの最終濃度への添加によって活性化させた。室温で２時間のインキュベーション後、未反応のＴＣＥＰの過剰量は生産者の推奨によるＮＡＰ−５カラム（ＧＥ）を用いたゲル濾過により除去された。過剰量の１０モルのＨＹＮＩＣ（ＳｏｌｕＬｉｎｋ社から購入した３−Ｎ−マレイミド−６−ヒドラジニウムピリジン塩酸塩）が添加され、室温で２時間インキュベートされた。接合型の変異タンパク質から未反応のＨＹＮＩＣを除去するために、反応混合物はＵｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（Ａｍｉｃｏｎ社）中に濃縮され、適切な量のＰＢＳバッファを用いて少なくとも５回洗浄された。
【実施例１９】
【０１７４】
［実施例１９：フローサイトメトリによる未処理細胞上のＨＹＮＩＣ接合型でｃ−Ｍｅｔ特異性の変異タンパク質Ｓ２６１．１−Ｌ１２＿Ｃ１２３の親和性測定］
接合型のＨＹＮＩＣを有する及び有しないｃ−Ｍｅｔ特異性の変異タンパク質Ｓ２６１．１−Ｌ１２＿Ｃ１２３（配列番号３５）は、実施例８に記載のように実質的にＨＴ−２９細胞（ＡＴＣＣ）上で滴定された。
【０１７５】
ＥＣ５０値が決定された滴定曲線は図１３に示され、計算したＥＣ５０値は表７に要約された。
【０１７６】
【表７】
0005562257.tif 000009
【０１７７】
表７は、ＨＴ−２９細胞上でＦＡＣＳ滴定によって決定されるように、ｃ−Ｍｅｔ受容体に対し選択された本発明の変異タンパク質のＥＣ５０値及び標準偏差である。
【実施例２０】
【０１７８】
［実施例２０：ｃ−Ｍｅｔ特異性の変異タンパク質のｐＨ安定性］
実施例１２により精製された変異タンパク質Ｓ２６１．１−Ｊ０１は、ｐＨ３ないしｐＨ９．２の範囲の異なるｐＨで６０分間インキュベートされた。変異タンパク質は、ｐＨ７．４に中和後、製造者の推奨による分析用のＳｕｐｅｒｄｅｘ７５カラム（ＧＥ）を用いることによって、分子ふるいクロマトグラフィを介して分析された。
【０１７９】
変異タンパク質の変質は、図１４に示したようにある程度の二量体形成を生じた変異タンパク質のｐＩの範囲にあるｐＨ５ないし６を除いては、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによって判定されるように、インキュベーション期間中に検出できる。
【実施例２１】
【０１８０】
［実施例２１：位置的な飽和突然変異誘発］
部位特異的な突然変異誘発は、結合親和性が有意に影響を及ぼしうるかどうかを評価するために、親和性成熟された涙液リポカリンの変異タンパクＬ１７、Ｏ２４、Ｍ０２、Ｋ２２、Ａ２２、Ｋ１５、Ｌ０３、Ｏ０７、及びＫ０６の配列位置２６、２７、及び２９で行われた。図１５に示されるように、総ての産生された変異体は本質的に同一の親和性を示す。
【実施例２２】
【０１８１】
［実施例２２：部位特異的なランダムアプローチを用いた変異タンパク質Ｓ２６１．１−Ｌ１７の親和性成熟］
変異タンパク質Ｓ２６１．１−Ｌ１７（配列番号３４）に基づく８×１０８の変異体のライブラリは、位置２６、２７、２９、３０、３２、３３、３４、及び７９のランダム化によって設計されて、これらの位置で総ての２０のアミノ酸を準備した。ライブラリは、ランダム化のために、デオヌクレオチド：
Ｌ１２−１：ＧＡＡＧＧＣＣＡＴＧＡＣＧＧＴＧＧＡＣＮＮＫＮＮＫＧＡＣＮＮＫＮＮＫＡＧＣＮＮＫＮＮＫＮＮＫＴＣＧＧＴＧＡＣＡＣＣＣＡＴＣＡＣＣ（配列番号５０）；
Ｌ１２−２：ＣＡＣＧＴＧＡＧＣＡＣＣＴＣＣＧＴＡＭＮＮＣＧＴＧＴＡＴＴＴＴＣＣＣＧＧＣＴＣ（配列番号５１）；
及び、
Ｌ１２−３：ＡＣＧＧＡＧＧＴＧＣＴＣＡＣＧＴＧＧＣＡＴＡＣＡＴＣＣＡＧＡＧＧ（配列番号５２）；
が国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５７９７１に開示されたものの代わりに用いられるという修飾とともに、国際公開第２００８／０１５２３９号として公表された、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００７／０５７９７１の実施例１に記載されるように実質的に構成された。ファージミドの表示及び選択は、標的タンパク質（ｃ−Ｍｅｔ受容体Ｆｃ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社）が限定した濃度（４０ｐＭ、及び６ｐＭ、及び１ｐＭ）で用いられ、プロテインＧビーズ（Ｄｙｎａｌ社）を用いたファージと標的との複合体の後の捕捉とともに、Ｆｃ融合タンパク質としてライブラリに提示されるか、あるいは、標的はライブラリのファージミドに標的とビーズの複合体を提示する前に、限定された濃度（５０ｎｇ／ｍｌ、及び１０ｎｇ／ｍｌ、及び１ｎｇ／ｍｌ）で最初にプロテインＧビーズに捕捉されるかのいずれか；という修飾とともに、国際公開第２００５／０１９２５６号の実施例３に記載のように実質的にファージミドを用いて行われた。ｃ−Ｍｅｔ結合型のライブラリのファージは酸性条件下で、次いで塩基性条件下で溶出された。３回の選択が行われた。
【実施例２３】
【０１８２】
［実施例２３：高スループットＥＬＩＳＡスクリーニングを用いたｃ−Ｍｅｔ受容体結合型の変異タンパク質の親和性スクリーニング］
スクリーニングは実質的に実施例５に記載のように、
ｉ）モノクローナル抗Ｔ７抗体は５μｇ／ｍｌの濃度でポリスチロールプレートにコーティングされ、発現した変異タンパク質は、限定された濃度のｃ−Ｍｅｔ受容体−Ｆｃ（１ｎＭ、０．２ｎＭ、及び０．１ｎＭ）で、インキュベートする前にＴ７タグを介して捕捉された。標的の結合はＨＲＰ（ホースラディシュペルオキシダーゼ）接合型のヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃに特異的な抗体を用いて検出された；
ｉｉ）ｃ−Ｍｅｔ結合する変異タンパク質を含む抽出物は、ｃ−Ｍｅｔ受容体−Ｆｃの標的と複合体形成する前に、７０℃まで１時間加熱された。この設定において、ｃ−Ｍｅｔ受容体−Ｆｃはマウス抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃに特異的なモノクローナル抗体を介して捕捉され、５μｇ／ｍｌの濃度でポリスチロールプレートに固定化される；
といった修飾とともに、代替的なスクリーニング設定で行われた。
【０１８３】
上述のように選択された多数の変異タンパク質は、親和性成熟に対する基剤として作用する変異タンパク質Ｓ２６１．１−Ｌ１７（配列番号３４）と比較して、ｃ−Ｍｅｔ受容体に対する親和性を改善して同定された。このアプローチを用いて、変異タンパク質Ｓ３１８．１−Ｃ１０、Ｓ３１８．１−Ｎ２１、Ｓ３１８．１−Ｌ１３、Ｓ３１８．１−Ａ１６、Ｓ３１８．２−Ｉ２４、Ｓ３１８．４−Ｍ１１、Ｓ３１８．１−Ｇ１８、及びＳ３１８．１−Ｏ１２（配列番号４２ないし４９）が同定された。
【実施例２４】
【０１８４】
［実施例２４：フローサイトメトリによる未処理細胞上のｃ−Ｍｅｔ特異性の変異タンパク質の親和性測定］
各々の変異タンパク質（実施例６参照）のＣ末端に融合されるＳｔｒｅｐ−Ｔａｇを用いて、親和性クロマトグラフィを介した変異タンパク質の発現及び精製後に、ｃ−Ｍｅｔ特異性の変異タンパク質Ｓ３１８．１−Ｃ１０、Ｓ３１８．１−Ｌ１３、Ｓ３１８．１−Ａ１６、Ｓ３１８．２−Ｉ２４、及びＳ３１８．１−Ｏ１２（配列番号４２、４４、４５、４６、及び４９）は実質的に実施例８に記載されるように、ＨＴ−２９細胞（ＡＴＣＣ）に滴定され、その結合親和性はそのＣ末端でＨｉｓ６タグを保有する変異タンパク質Ｓ２６１．１−Ｌ１７（配列番号３４）の親和性と比較した。
【０１８５】
ＥＣ５０値が決定される滴定曲線は図１３に示され、計算されたＥＣ５０値は表８に要約される。
【０１８６】
【表８】
0005562257.tif 000010
【０１８７】
表８はＨＴ−２９細胞上でＦＡＣＳ滴定によって決定されるようなｃ−Ｍｅｔ受容体に対し選択された本発明の変異タンパク質のＥＣ５０値及び標準偏差である。
【実施例２５】
【０１８８】
［ＣＤスペクトル測定の使用によるｃ−Ｍｅｔ結合する変異タンパク質の熱変性の決定］
円偏光二色性測定は、用いられる波長が２３０ｎＭであり、変異タンパク質濃度が２５０μｇ／ｍｌであるという修飾とともに、国際公開第２００６／０５６４６４号の実施例１４に記載のように実質的に行われた。涙液リポカリンの変異タンパク質Ｓ３１８．１−Ｃ１０（配列番号４２）及びＳ３１８．１−Ｏ１２（配列番号４９）の融解温度Ｔｍは表９に要約され、それが得られる（Ｈｉｓ６タグを具備する）変異タンパク質Ｓ２６１．１−Ｌ１７（配列番号３４）の融解温度と比較された。
【０１８９】
【表９】
0005562257.tif 000011
【０１９０】
表９は円偏光二色性測定によって決定されるような、ｃ−Ｍｅｔ受容体に対し選択される本発明の変異タンパク質の融解温度である。
【０１９１】
実施例２４及び２５の結果は、変異タンパク質Ｓ３１８．１−Ｃ１０がその再生のための基剤として作用する変異タンパク質Ｓ２６１．１−Ｌ１７と同一の結合親和性を実質的に有するが、同時に変異タンパク質Ｓ１３８．１−Ｃ１０は変異タンパク質Ｓ２６１．１−Ｌ１７より高い安定性を有することを示す。
【０１９２】
本明細書中に例示的に述べられた本発明は、本明細書に特に開示されない、任意の要素又は複数の要素、限定又は複数の限定なしに、好適に実行できる。従って、例えば用語「含む、具える（“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”、“ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ”、“ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ”）」などは、拡張して、及び限定することなく読むべきである。更に、本明細書中で用いられる用語及び表現は記載の用語かつ限定しない用語として用いられ、図示及び記載された特徴の任意の等価物又はその一部を排除するような用語及び表現の使用の意図はなく、様々な変更が特許請求の範囲の範囲内で可能であることは理解されよう。従って、本発明は好適な実施形態及び選択的な特徴によって特に開示されてきたが、本明細書で例示され、開示された本発明の変更及び変形は当該技術分野の当業者に依拠されること、及び、このような変更及び変形が本発明の範囲内にあると見なされることは理解すべきである。本発明は本明細書中で広範かつ一般的に記載されている。一般的な開示内にある、より限定した種及び亜属の群の各々は更に、本発明の一部を形成する。摘出された材料が本明細書中に特に列挙されているか否かに拘わらず、その属から任意の材料を除去する条件付き又は消極的な限定を有する本発明の一般的な記載を含む。更に、本発明の特徴又は態様がマーカッシュ形式の群の用語で記載される場合に、当該技術分野の当業者は、本発明が更にこれによって任意の独立した要素、又はマーカッシュ形式の群の要素の部分群の用語で記載されることが分かるであろう。本発明の更なる実施形態は、以下の特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【図１】
0005562257.tif 000012
【図２】
0005562257.tif 000013
【図３】
0005562257.tif 000014
【図４】
0005562257.tif 000015
【図５】
0005562257.tif 000016
【図６】
0005562257.tif 000017
【図７】
0005562257.tif 000018
【図８】
0005562257.tif 000019
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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