(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚バリアー機能回復促進物質のスクリーニング方法であって、皮膚バリアー機能回復促進物質の候補物質の存在下、カスパーゼ−１４とプロサポシンとをインキュベートする工程、及び対照物質と比較してプロサポシンからサポシンＡへの分解が有意に促進されている場合に当該候補化合物を皮膚バリアー機能回復促進物質として選定する工程を含んで成る方法。
【請求項２】
前記分解が抗サポシンＡ抗体を用いたウェスタンブロット法により評価される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カスパーゼ−１４によるプロサポシンの分解を指標とする皮膚バリアー機能回復促進物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ケラチノサイトは終末分化することで、有害な環境に対する「角層」と称される保護バリアーを形成する。角層細胞間脂質はこの保護バリアーにおいて重要な役割を担っている。角層細胞間脂質は、表皮ケラチノサイトにおいて分化とともに生合成され、オドランド小体に蓄積される。角層細胞間脂質の主成分あるセラミドは、オドランド小体の開口分泌により角層細胞間に放出されたグルコシルセラミドの糖鎖が、グルコセレブロシダーゼにより切断されることで生じる。また、別の経路として、スフィンゴミエリナーゼによるスフィンゴミエリンからセラミドへの分解も知られている。
【０００３】
スフィンゴ脂質活性化タンパク質であるサポシンは、スフィンゴ脂質の加水分解に必須のタンパク質であり、４種類のサポシン（サポシンＡ、サポシンＢ、サポシンＢ、サポシンＤ）の存在が知られている。サポシンは、角層間脂質の生成に必要なセラミド合成酵素、例えばグルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ等の補酵素として働く因子であることから、サポシンは皮膚バリアー機能にとって重要であると考えられる。
【０００４】
これまで、サポシンＡ、Ｃ、Ｄが臓器に集積するとリソソーム蓄積病（例えば、ゴーシュ病、ニーマンピック病）が生じることや、プロサポシン遺伝子の突然変異が神経障害性の表現型をもたらすことが確認されている。皮膚との関連では、アトピー性皮膚炎や乾癬に罹患している患者において、プロサポシンが低下しているとの報告がある（それぞれ、Tezuka et al., Journal of Investigative Dermatology (1997) 109, 319-323及びAlessandrini et al., Journal of Investigative Dermatology (2001) 116, 394-400を参照のこと）。
【０００５】
種々の皮膚疾患、例えば、アトピー性皮膚炎、乾癬、接触性皮膚炎等に見られる肌荒れ症状においては、皮膚からの水分の消失が、健常な皮膚に比べて盛んであることが知られている。このいわゆる経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）の増加には、皮膚内において水分の保持やバリアーとしての機能を担っていると考えられる成分の減少が関与しているものと考えられてきた。
【０００６】
これまでに、皮膚バリアー機能の低下に伴い皮膚の皮膚機能が低下し、その結果皮膚増殖性異常等が起こることが報告されている。特に高齢者の場合、低下した皮膚バリアー機能の回復には長い時間がかかるため、加齢に伴う皮膚の皮膚機能の低下による皮膚増殖性異常等を防止するのに有効な、新たな皮膚バリアー機能回復剤が要望されている。
【０００７】
皮膚バリアー機能回復促進製剤等の化粧料に含めることが検討される物質は、動物実験においてその効果が確認される必要がある。しかしながら、近年化粧品開発の現場においては、倫理上の観点から動物実験が制限される傾向にあり、動物に適用することなく候補物質をスクリーニングする方法についての要求も高まっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Tezuka et al., Journal of Investigative Dermatology (1997) 109, 319-323
【非特許文献２】Alessandrini et al., Journal of Investigative Dermatology (2001) 116, 394-400
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、新規な指標を用いた皮膚バリアー機能回復物質のスクリーニング方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
カスパーゼ−１４はカスパーゼファミリーの最新メンバーであり、専ら分化したケラチノサイトにおいて発現される。カスパーゼ−１４はカスパーゼファミリーメンバー間で相同なＥＳＴとして同定された。最近の研究が示したところによれば、角化細胞中のカスパーゼ−１４はプロセッシングされてヘテロダイマーになり、そしてカスパーゼ−１に対応する合成基質Trp-Glu-His-Asp-AFCに対し酵素活性を示す、とのことである（Mikolajczyk J. et al., Biochemistry 43, 10560-9 (2004)）。この加水分解活性はタンパク質分解切断及びコスモトロピック塩の存在を必要とする。カスパーゼ−１４の一次構造は、炎症性カスパーゼ、例えばカスパーゼ−１、−４及び−５と極めて近いものの、分化されたケラチノサイトに限定されるカスパーゼ−１４の発現は、ケラチノサイト終末分化における別の態様での関与を示唆する(Lippens S. et al., Cell Death Differ. 7, 1218-24(2000))。しかしながら、カスパーゼ−１４の活性化メカニズム、天然の基質又は調節因子は解明されていなかった。
【００１１】
そこで、本発明者らが、分化した培養ヒト表皮角化細胞（ＮＨＥＫ）抽出物等からカスパーゼ−１４と結合するタンパク質を単離してＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析にかけたところ、カスパーゼ−１４と結合するタンパク質の中から、プロサポシンが同定された。
【００１２】
本発明者は、プロサポシンが基底層から顆粒層にかけて発現しており、そしてサポシンＡが顆粒層の最上層部で発現していること、また、カスパーゼ−１４がプロサポシンのプロセシングに関与し、サポシンの中間体及びサポシンＡを産生することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【００１３】
従って、本願は以下の発明を包含する：
（１）皮膚バリアー機能回復促進物質のスクリーニング方法であって、皮膚バリアー機能回復促進物質の候補物質の存在下、カスパーゼ−１４とプロサポシンとをインキュベートする工程、及び対照物質と比較してプロサポシンからサポシンＡへの分解が有意に促進されている場合に当該候補化合物を皮膚バリアー機能回復促進物質として選定する工程を含んで成る方法。
（２）前記分解が抗サポシンＡ抗体を用いたウェスタンブロット法により評価される、（１）に記載の方法。
【発明の効果】
【００１４】
従来、in vitro試験において、カスパーゼ−１４は、高濃度のコスモトロピック塩、例えばクエン酸の存在下でのみ活性化作用を示すことが知られていた。その結果、in vivoでカスパーゼ−１４が果たす機能は長らく不明であった。今回、カスパーゼ−１４がコスモトロピック塩を添加することなくプロサポシンを限定分解し、サポシンの中間体及びサポシンＡを産生することが本発明者によって初めて明らかにされた（図１）。更に本発明者は、免疫染色により、プロサポシンが基底層から顆粒層にかけて発現しており、また、サポシンＡが皮膚の顆粒層上部に存在することを明らかにした（図２）。以上の結果から、カスパーゼ−１４は、生体内でプロサポシンのプロセシングに寄与しているものと考えられる。
【００１５】
プロサポシンの分解産物であるサポシンは角層間脂質の生成に必要なセラミド合成酵素の補因子として働き、表皮バリアー形成に必須であることから、本発明の方法によれば、カスパーゼ−１４によるサポシンＡへの分解を指標とすることで、動物実験を行うことなく新規皮膚バリアー機能回復促進物質の探索が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】カスパーゼ−１４存在下又は不在下でのプロサポシンのプロセシングを示すウェスタンブロット図。
【図２】ヒト正常皮膚におけるプロサポシン及びサポシンＡの局在を示す免疫染色図。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、皮膚バリアー機能回復促進物質のスクリーニング方法であって、皮膚バリアー機能回復促進物質の候補物質の存在下、カスパーゼ−１４とプロサポシンとをインキュベートする工程、及び対照物質と比較してプロサポシンからサポシンＡへの分解が有意に促進されている場合に当該候補化合物を皮膚バリアー機能回復促進物質として選定する工程を含んで成る方法、を提供する。
【００１８】
本発明の方法で使用する候補物質は、限定しないが、例えば、カスパーゼ−１４を活性化し、これによりプロサポシンの分解が促進されるような物質が考えられる。カスパーゼ−１４はシステインプロテアーゼであるため、例えば、還元剤若しくは還元作用を持つ物質、例えばメルカプトエタノール、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）等の試薬や、グルタチオン等の生体内物質、還元作用を有する植物抽出液はかかる候補物質となり得る。当該候補物質の存在下でカスパーゼ−１４とプロサポシンとをインキュベートし、プロサポシンからサポシンＡへの分解が対照物質と比較して有意に促進されている場合に当該候補物質を皮膚バリアー機能回復促進物質として選択することができる。その評価基準として、例えばプロサポシンからサポシンＡへの分解が、コントロールを作用させた場合と比べ10％以上、又は20％以上、又は30％以上、又は50％以上、又は70％以上、又は100％促進されていたなら「プロサポシンからサポシンＡへの分解が有意に促進されている」、と判断してよい。
【００１９】
プロサポシンからサポシンＡへの分解は、抗サポシンＡ抗体を用いたウェスタンブロット法により評価することができる。当該抗体は、抗サポシンＡ特異的抗体であることが好ましい。しかしながら、本発明はこの手法に限定されない。
【００２０】
本発明のスクリーニング方法により選択された薬剤は、皮膚バリアー機能の回復が必要な皮膚、例えば皮膚疾患、種々のストレス、そして肌荒れ等により皮膚バリアー機能が低下した肌、移植皮膚で皮膚バリアー層の形成が充分でないため皮膚バリアー機能が低い肌、あるいは移植によって皮膚バリアー機能が低下した肌等の改善に有効であると考えられる。
【００２１】
本明細書で使用する用語「皮膚バリアー機能」とは、皮膚のなかでも表皮による体内の水分保持及びウイルス、細菌等の進入阻止、などを意味する。ここで、当該機能は、発汗しない条件下で経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）（単位：ｇ／ｍ2・ｈ）を測定することにより評価することができる。よって、本発明により皮膚バリアー機能回復促進物質として選択された薬剤を皮膚に適用し、ＴＥＷＬを測定することで、当該薬剤が実際に皮膚バリアー機能を回復させるか否かを決定することができる。
【００２２】
以下、具体例を挙げて、本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
【実施例】
【００２３】
１．カスパーゼ−１４と相互作用する因子の解析
方法：
１．  カスパーゼ−１４を、抗カスパーゼ−１４抗体固定化したアガロースビーズに結合させ、増殖期および、コンフルエント後、空気暴露し2 mMカルシウムを加えて培養を続けた分化誘導後の、ヒト正常表皮細胞（ＮＨＥＫ）抽出液と反応させた。ＰＢＳで洗浄後、Glycine-HCl緩衝液（pH2.3）で結合蛋白を溶出した。また、抗カスパーゼ−１４抗体固定化したアガロースビーズに、正常表皮角層抽出液および、乾癬患者より採取した鱗屑抽出液を反応させ、ＰＢＳで洗浄後、同様にGlycine-HCl緩衝液（pH2.3）で結合蛋白を溶出した。これらの４つのサンプルを、LC/MS/MS分析にかけた。
【００２４】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ解析
内径１００μｍ、長さ１２０ｍｍの未充填のキャピラリーカラム（Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｔｉｖｅ社製）のテーパー状の出口側の端部に、充填剤を保持するために、シリカ製のフリットを作製した。得られたキャピラリーカラムに、平均粒径が５μｍのオクタデシル化シリカ型充填剤Ａｑｕａ  Ｃ１８（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）を、高さが１００ｍｍとなるように充填し、分析用逆相キャピラリーカラムを得た。
【００２５】
内径２５０μｍ、長さ１５０ｍｍの未充填のキャピラリーカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）の出口側の端部に、充填剤を保持するために、シリカ製のフリットを作製した。得られたキャピラリーカラムの出口側に、平均粒径が５μｍのカチオン交換樹脂型充填剤Ｐａｒｔｉｓｐｈｅｒｅ  ＳＣＸ  ｒｅｓｉｎｓ（Ｗｈａｔｍａｎ社製）と、平均粒径が５μｍのアニオン交換樹脂型充填剤ＰｏｌｙＷＡＸ  ＬＰ（ＰｏｌｙＬＣ社製）を質量比２：１で混合したもの、入口側に、平均粒径が５μｍのオクタデシル化シリカ型充填剤Ａｑｕａ  Ｃ１８（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）を、それぞれ高さが２５ｍｍとなるように充填し、トラップ用逆相キャピラリーカラム及びＳＣＸ−ＷＡＸ混合キャピラリーカラムからなる二相型キャピラリーカラムを得た。
【００２６】
なお、分析用逆相キャピラリーカラム及び二相型キャピラリーカラムを作製する際には、高圧窒素ガス及び加圧型充填容器を用いて、スラリー充填法により充填剤を充填した。
【００２７】
続いて、６ステップのＭｕｄＰＩＴ型分析（二次元ＨＰＬＣ／ＥＳＩ  ＭＳ／ＭＳ）により、上記４つのサンプルを分析した。
【００２８】
まず、ペプチドを約４μｇ含む上清を、加圧法により、二相型キャピラリーカラムにロードした後、試料溶液の１０倍以上の体積の移動相Ａ（水、アセトニトリル及びギ酸の体積比９５：５：０．１の混合液；ｐＨ〜２．６）を用いて、洗浄、脱塩した。この二相型キャピラリーカラム１０を、貫通孔型ユニオン（Ｕｐｃｈｕｒｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）（不図示）を介して、分析用逆相キャピラリーカラム２０と接続した。次に、内径が１００μｍのキャピラリーを配管として用いたＮａｎｏｓｐａｃｅ  ＳＩ−２型ＨＰＬＣ装置（資生堂社製）に接続した。このとき、トラップ用逆相キャピラリーカラム１１は、ＳＣＸ−ＷＡＸ混合キャピラリーカラム１２及び分析用逆相キャピラリーカラム２０の上流側に配置した。
【００２９】
移動相としては、移動相Ａ、移動相Ｂ（水、アセトニトリル及びギ酸の体積比２０：８０：０．１の混合液）、移動相Ｃ（５００ｍＭの酢酸アンモニウムを含む移動相Ａ；ｐＨ〜６．８）を用い、ペプチドの溶出法は、矩形状に加える移動相Ｃの体積％をステップ毎に漸増させた、計６ステップのグラジエント溶出法とした。
【００３０】
ステップ１のグラジエントプロファイルは、５分間移動相Ａを流し、次の５分間で移動相Ｂの比率を０体積％から１５体積％まで増加させ、次の６０分間で移動相Ｂの比率を４５体積％まで増加させ、次の１０分間で移動相Ｂの比率を７５体積％まで増加させた後、この比率で５分間流すものである。
【００３１】
ステップ２〜６のグラジエントプロファイルは、１分間移動相Ａを流し、次の４分間移動相Ｃの比率をＸ［体積％］として流し、次の５分間で移動相Ｃの比率を０体積％から１５体積％まで増加させ、次の６０分間で移動相Ｃの比率を４５体積％まで増加させ、次の１０分間で移動相Ｃの比率を７５体積％まで増加させた後、この比率で５分間流すものである。このとき、ポンプの送液の流速を２５０μＬ／分とし、抵抗型キャピラリーによるスプリットにより、カラムの流速を３００〜４００ｎＬ／分に調整した。
【００３２】
また、ＥＳＩ  ＭＳ／ＭＳを測定する際には、イオントラップ型質量分析計ＬＣＱ−Ｄｅｃａ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いた。このとき、分析用逆相キャピラリーカラムから溶出されたペプチドは、スプリットすることなく、質量分析計に直接導入した。
【００３３】
なお、質量電荷比（ｍ／ｚ）が４００〜１４００のフルスキャンＭＳスペクトル測定１回及びデータ依存型ＭＳ／ＭＳスペクトル測定３回を、各ステップを通じて繰り返した。このとき、標準化解裂エネルギーは３５％とした。また、マイクロスキャンは、ＭＳスペクトル測定及びＭＳ／ＭＳ測定ともに３とした。さらに、動的排除設定は、リピートカウント１、リピート期間０．５０分、排除リストサイズ２５、排除期間１０．００分とした。
【００３４】
得られたＭＳ／ＭＳスペクトルは、Ｂｉｏｗｏｒｋｓソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）上で動くＳＥＱＵＥＳＴアルゴリズムにより、非冗長ヒトデータベース（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｄｂ／ＦＡＳＴＡ／ｎｒ．ｇｚ、２００７／２／８版）に対して、検索した。
【００３５】
分析の結果、分化誘導後のＮＨＥＫとの反応サンプル、および、正常表皮角層抽出液との反応後のサンプルにのみ共通して、プロサポシンの存在が認められた。
【００３６】
２．カスパーゼ−１４によるプロサポシンのプロセッシング
プロサポシンは通常のケラチノサイトの単層培養系では、プロセッシングを受けず、前駆体のままで存在する。これを利用して、前駆体であるプロサポシンとカスパーゼ−１４の反応を検討した。プロサポシンを含む、ヒト正常表皮細胞（ＮＨＥＫ）抽出液と活性化カスパーゼ−１４を、1.2Mのコスモトロピックイオン（クエン酸イオン）のあるなしの条件下で、３７℃で１時間反応させ、水に対して透析後、凍結乾燥した。これをＳＤＳ電気泳動サンプルバッファーに溶解し、ＳＤＳ電気泳動後、Western blotにより、それぞれのサポシンの生成について検討した。それぞれ用いた抗体は、抗プロサポシン抗体（PSAP polyclonal antibody(A01):Abnova社）、抗Saposin A特異抗体（自家製）、抗Saposin B抗体（E-15, sc-27014: Santa Cruz社）、抗Saposin C抗体（Ｈ-81, sc-32875: Santa Cruz社）、抗Saposin D抗体（E-14, sc-27024R: Santa Cruz社）である。希釈率はいずれも1/1000を用いた。尚、抗Saposin A特異抗体を除き、いずれの抗体もプロサポシンを認識する。結果を図１に示す。
【００３７】
図１の結果から、カスパーゼ−１４の存在下で、プロサポシンは複数の中間体に分解されたことが分かる。中でも、プロサポシンの最終分解産物の１つであるサポシンＡが抗Saposin A特異的抗体により認識されたことから、カスパーゼ−１４はプロサポシンをサポシンＡに分解する役割を果たすと考えられる。
【００３８】
３．免疫染色
形成外科手術により得られた正常皮膚切片を用いてプロサポシンおよびサポシンＡの局在を明らかにするため、免疫染色を行なった。パラフィン切片をキシレンにより脱パラフィンを行い、PBS溶液に戻した後、10%ヤギ血清によりブロッキングを行なった。PBS洗浄後、抗プロサポシン抗体（PSAP mouse polyclonal antibody(A01):Abnova社、希釈率：1/200）もしくは、抗saposin A特異抗体（自家製）（希釈率：1/200）と室温で１時間反応させた。PBSで３回の洗浄後、Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG（プロサポシン）、もしくは、Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG（サポシンＡ）、と室温で１時間反応させた。PBSで３回洗浄後、VectorShield mounting medium (DAPI)（Vector Laboratories社）を用いて封入し、蛍光顕微鏡による観察を行なった。結果を図２に示す。
【００３９】
図２の結果から、プロサポシンは、正常なヒト表皮の基底層から顆粒層にかけて存在し、そしてサポシンＡが顆粒層の最上層で発現していることが分かる。この結果は、上記ウェスタンブロットの結果とともに、専らケラチノサイトで発現するカスパーゼが、ヒトの皮膚においてプロサポシンを分解し、皮膚バリアー機能において重要な役割を果たすことを裏付けるものである。
【図１】
0005562015.tif 000002
【図２】
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