(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
pH10以上のアルカリ条件下で生育する、エンテロコッカス・キャセリフラバス(Enterococcus casseliflavus)に属し、且つ受託番号FERM BP-11295で特定される、好アルカリ性乳酸菌。
【請求項２】
請求項１記載の好アルカリ性乳酸菌を非滅菌且つpH9〜11下でセルロース糖化液を含む培地において培養した後、pH5〜9下でさらに培養する工程を含む、乳酸製造方法。
【請求項３】
セルロース糖化液が、植物の非可食部から得られたものである、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記植物の非可食部が、稲ワラ、麦ワラ又はトウモロコシ茎である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
植物バイオマスをアルカリ溶液に浸漬し、リグニンを除去する工程と、セルロース繊維をセルラーゼと接触させ、セルロース糖化液を得る工程とを含む、請求項２〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
アルカリ溶液が苛性ソーダ溶液である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
上記浸漬した植物バイオマスを室温で放置するか又は加熱処理に供することを含む、請求項５又は６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、例えば好アルカリ性の新規乳酸菌及び非滅菌発酵による乳酸製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
環境に優しい生分解性プラスチックであるポリ乳酸は乳酸を原料とする。ポリ乳酸の品質を高めるためには、L体又はD体の光学純度の高い乳酸が必要である。この点、発酵により得られる乳酸は高い光学純度を有し、石油から合成する乳酸よりも有利である。【０００３】
また今後、石油資源の枯渇が予想されるため、将来的に石油由来のプラスチックをポリ乳酸に置き換える必要がある。しかしながら、ポリ乳酸は石油由来プラスチックと比較して高価であるため、乳酸発酵コストの低減が求められている。【０００４】
一般的に、乳酸発酵は、トウモロコシ等の食用植物バイオマスを炭素源として行われるため、(安易な)食料資源を原料とした乳酸の生産は食料の高騰を引き起こす原因となる。このため、食料と競合しない非食用植物バイオマスを用いた乳酸発酵技術の開発も求められている。【０００５】
非食用植物バイオマスの代表的なものとして稲ワラ及び麦ワラ等の稲及び麦の非可食部が知られている。地域によって異なるものの、稲ワラは野焼きや農地へのすき込みによって処分され、半分程度しか利用されていない未利用資源である。しかしながら、稲ワラを糖化するセルラーゼが高価であることから、稲ワラは利用されにくい。【０００６】
木質バイオマスの糖化には、濃硫酸による加水分解法が用いられている。しかしながら、当該方法によれば、濃硫酸処理後の中和コストや濃硫酸を使うことによる環境負荷の増大が問題となっている。さらに、濃硫酸処理液からグルコースを精製する必要があり、更なるコスト上昇の一因となっている。【０００７】
公知の乳酸発酵では、乳酸菌を植菌する前に培地を120℃で20分間熱殺菌する。この滅菌操作のために、培養装置にはボイラー等の高価な施設が必要となるだけでなく、滅菌操作にかかるコストが大きい。また、滅菌に圧力をかけるため、容器も頑丈なものが求められ、高い初期コストを要する。【０００８】
一方、滅菌操作を行わない開放系において植物バイオマスを原料とした乳酸発酵が知られている(特許文献１及び２)。大量の乳酸菌を植菌する方法(特許文献１)では、3日間で培養液当たり2.5％程度のL-乳酸を得ることができる。また、45℃程度の高温での乳酸発酵(特許文献２)では、2日間で培養液当たり4％程度のL-乳酸を得ることができる。【０００９】
しかしながら、大量に乳酸菌を植菌する方法では乳酸発酵を行う際に大量の菌体を培養する必要がありコストと手間がかかる。一方、高温(45℃程度)で乳酸発酵を行う場合、発酵槽を高温に保つためのコストが必要である。さらにこれらの乳酸発酵では、最高でも培養液当たり4％程度の乳酸しか得られず、発酵に続く乳酸精製コストが高くなる欠点がある。【００１０】
従って、滅菌操作を行わずに少ない植菌量で室温において植物バイオマスから乳酸発酵を行う方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開2000-245491号公報
【特許文献２】特開2005-73549号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、上述した実情に鑑み、例えば滅菌操作を必要とせずに、植物バイオマスから乳酸を製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、稲ワラ由来グルコースから高濃度の乳酸を生成する好アルカリ性乳酸菌を単離し、当該好アルカリ性乳酸菌によれば非滅菌の植物非可食部バイオマス由来の糖化液から高濃度の乳酸を製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１４】
本発明は以下を包含する。【００１５】
（１）配列番号１に記載の塩基配列から成るか又は配列番号１に記載の塩基配列と95％以上の相同性を有する16S リボソームRNA遺伝子を有し、且つpH10以上のアルカリ条件下で生育するエンテロコッカス(Enterococcus)に属する好アルカリ性乳酸菌。【００１６】
（２）エンテロコッカス・キャセリフラバス(Enterococcus casseliflavus)に属する、（１）記載の好アルカリ性乳酸菌。【００１７】
（３）受託番号FERM BP-11295で特定される微生物である、（１）又は（２）記載の好アルカリ性乳酸菌。【００１８】
（４）（１）〜（３）のいずれか１記載の好アルカリ性乳酸菌を非滅菌且つpH9〜11下でセルロース糖化液を含む培地において培養した後、pH5〜9下でさらに培養する工程を含む、乳酸製造方法。【００１９】
（５）セルロース糖化液が、植物の非可食部から得られたものである、（４）記載の方法。【００２０】
（６）前記植物の非可食部が、稲ワラ、麦ワラ又はトウモロコシ茎である、（５）記載の方法。【００２１】
（７）植物バイオマスをアルカリ溶液に浸漬し、リグニンを除去する工程と、セルロース繊維をセルラーゼと接触させ、セルロース糖化液を得る工程とを含む、（４）〜（６）のいずれか１記載の方法。【００２２】
（８）アルカリ溶液が苛性ソーダ溶液である、（７）記載の方法。【００２３】
（９）上記浸漬した植物バイオマスを室温で放置するか又は加熱処理に供することを含む、（７）又は（８）記載の方法。【００２４】
（１０）植物バイオマスをアルカリ溶液に浸漬し、リグニンを除去する工程と、セルロース繊維をセルラーゼと接触させる工程とを含む、グルコースを生成する方法。【００２５】
（１１）植物バイオマスが植物の非可食部である、（１０）記載の方法。【００２６】
（１２）前記植物の非可食部が、稲ワラ、麦ワラ又はトウモロコシ茎である、（１１）記載の方法。【００２７】
（１３）アルカリ溶液が苛性ソーダ溶液である、（１０）〜（１２）のいずれか１記載の方法。【００２８】
（１４）上記浸漬した植物バイオマスを室温で放置するか又は加熱処理に供することを含む、（１０）〜（１３）のいずれか１記載の方法。【００２９】
（１５）（１０）〜（１４）のいずれか１記載の方法により得られたグルコースを含む乳酸発酵用組成物。【００３０】
（１６）おからを含む、（１５）記載の乳酸発酵用組成物。【００３１】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2009-244894号の明細書及び/又は図面に記載される内容を包含する。
【発明の効果】
【００３２】
本発明によれば、滅菌操作無しにセルロース系植物バイオマスから高収量で乳酸を得ることできる。また本発明によれば、従来における高圧蒸気滅菌等の煩雑でコストの高い工程を省略でき、乳酸製造における低コスト化を図ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】L-120株の培養液中に産生された乳酸の光学純度を示すHPLC分析の結果である。
【図２】脱リグニン稲ワラの添加量と生成した糖(グルコース)濃度(g/L)との関係を示すグラフである。
【図３】L-120株によるキシロース代謝を示すグラフである。
【図４】L-120株による乳酸発酵促進物質存在下での乳酸生成を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３５】
本発明に係る乳酸菌は、配列番号１に記載の塩基配列から成るか又は配列番号１に記載の塩基配列と95％以上(好ましくは96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、最も好ましくは100％)の相同性を有する16S リボソームRNA(rRNA)遺伝子を有するエンテロコッカス(Enterococcus)に属する好アルカリ性乳酸菌である。ここで、「好アルカリ性乳酸菌」とは、例えば、pH9以上(好ましくはpH10以上)のアルカリ条件下で生育することができる乳酸菌を意味する。pH10程度のアルカリ条件下で生育できる微生物(雑菌)が少ないことに起因して、アルカリ条件下で生育する本発明に係る乳酸菌によれば、植物バイオマス由来のグルコース及びキシロースを含む糖化液を滅菌処理することなく乳酸発酵(特に、アルカリ条件下の乳酸発酵)に使用できる。
【００３６】
配列相同性は、例えばDNA Data Bank of Japan(DDBJ)のホームページ(http://blast.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html)に掲載のプログラム又はClustalX等のDNA配列解析ソフトを使用して決定することができる。
【００３７】
本発明に係る乳酸菌としては、例えばエンテロコッカス・キャセリフラバスに属する上記特性を有する乳酸菌が挙げられ、特にエンテロコッカス・キャセリフラバスL-120株(以下、「L-120株」と称する)が挙げられる。また、自然的又は人工的手段によって変異させて得られ且つアルカリ条件下で生育し、乳酸発酵を行う、上記乳酸菌の変異株は、本発明に係る乳酸菌に含まれる。
【００３８】
本発明に係る乳酸菌の単離方法としては、例えば、排水口、土壌、草木等の自然界由来の試料を10％グルコース、1％酵母エキス及び100mM 炭酸バッファー(pH10)を含む培養液(培地)に添加し、非通気条件下で良好に生育する菌を本発明に係る乳酸菌として単離する方法が挙げられる。当該方法によれば、L-120株を単離することができた。
【００３９】
以下に単離したL-120株の菌学的性質を説明する。
【００４０】
〔形態的性質〕
(1)グラム染色：陽性
(2)芽胞：無し
(3)運動性：無し
(4)菌形：球菌
〔培養的性質〕
コロニーの色調は白色半透明であり、コロニーの形状は小さな円形であり、コロニーの表面は平滑である。液体培養時には、培養後期に黄色の色素を生産する。
【００４１】
〔生理学的性質〕
生育可能pHは5〜12（最適生育pHは6〜9であり、pH10においてもpH7での生育速度の50%以上を有する）である。また、生育可能温度は25℃〜46℃(最適生育温度は35〜40℃）である。
【００４２】
〔化学分類学的性質〕
L-120株のDNAを抽出し、PCR法により16S rRNA遺伝子を増幅し、増幅して得られた16S rRNA遺伝子の塩基配列(配列番号１)をオートシークエンサーで解析し、ブラストサーチにより類似した塩基配列を調べた。
【００４３】
その結果、16S rRNA遺伝子について、L-120株はエンテロコッカス・キャセリフラバス(Enterococcus casseliflavus)と99.9％(1245塩基中1244塩基が一致)の高い相同性が示された。
【００４４】
以上より、L-120株はエンテロコッカス・キャセリフラバスに属する新菌株であると判断した。
【００４５】
これまで報告されているエンテロコッカス・キャセリフラバス(IFO 12256株)は、グルコースを基質とした場合の乳酸の収率が78％で、L-乳酸の光学純度が99％であることが報告されている(Taniguchi, M., T. Tokunaga, K. Horiuchi, K. Hoshino, K. Sakai, T. Tanaka (2004) Production of L-lactic acid from a mixture of xylose and glucose by co-cultivation of lactic acid bacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol. 66: 160-165)。また、従来において、エンテロコッカス・キャセリフラバスに関して、pH9.6での生育が報告されているが、pH10における生育は報告されていない（Ludwig, W., Schleifer, K.-H., Whtman W. B. In P. De Vos et al. eds, Bwegey’s Manual of Systematic Bacteriology Second edition Vol. 3 The Frimicutes. Springer, Dordrecht, Heidelberg, London, New York, pp. 594-607）。さらに、上記バージェーズマニュアル（Bwegey’s Manual of Systematic Bacteriology）を初めその他の文献による記載において、エンテロコッカス属細菌がpH10以上で生育し、乳酸を産生する記載は無い。
【００４６】
一方、L-120株は後述の実施例で示す様にグルコースに対する乳酸収率が96〜100％で得られるL-乳酸の光学純度が100％であり、pH10で良好な生育（24時間培養で明らかな生育が認められる）を示すことから、従来知られているエンテロコッカス・キャセリフラバス又はその他のエンテロコッカス属細菌と比較して、乳酸産生の利用性の面から明らかな優位性が認められる。
【００４７】
L-120株は、平成21年(2009年)9月14日付けで独立行政法人 産業技術総合研究所特許生物寄託センター(日本国 茨城県つくば市東1丁目1番地1 中央第6)に受託番号FERM P-21847として寄託され、さらに平成22年(2010年)9月8日付けで受託番号FERM BP-11295として国際寄託へ移管されている。
【００４８】
本発明に係る乳酸製造方法は、上述の本発明に係る乳酸菌を、滅菌の有無を問わず、例えばpH5〜11のpH条件下においてセルロース糖化液と接触させ、培養し、且つ乳酸発酵を行う方法である。特に、本発明に係る乳酸製造方法を非滅菌下で行うことができる。例えば、本発明に係る乳酸製造方法では、本発明に係る乳酸菌を、非滅菌且つpH9〜11(好ましくはpH10〜11)のアルカリ条件下でセルロース糖化液を含む培地において培養し、菌体増殖後に、例えばpH5〜9(好ましくはpH7)のpH条件下でさらに培養し、乳酸発酵に供することで、乳酸を製造できる。ここで、「非滅菌下」とは、本発明に係る乳酸製造方法の工程を通じて滅菌操作を行わないことを意味する。特に、原料となるセルロース糖化液(培地)は通常滅菌処理を要するが、本発明においてはpH10程度のアルカリ条件下で生育できる微生物(雑菌)が少ないこと及び本発明に係る乳酸菌がアルカリ条件下で生育できることにより、滅菌処理を行うことなく、セルロース糖化液を培養及び乳酸発酵(特にアルカリ条件下の培養及び乳酸発酵)に使用することができる。
【００４９】
本発明に係る乳酸製造方法では、先ず本発明に係る乳酸菌とセルロース糖化液を準備する。本発明に係る乳酸菌については、例えば以下の組成(10％グルコース、1％酵母エキス及び100mM 炭酸バッファー(pH10))から成る培地において、温度25〜45℃(好ましくは30〜37℃)及びpH7〜10(好ましくはpH9〜10)下で十分な時間培養することで、植菌すべき十分な量の本発明に係る乳酸菌を準備することができる。
【００５０】
一方、グルコースを含むセルロース糖化液の準備については、グルコースから乳酸を収率100％で生成した場合、グルコースと乳酸濃度の比は理論上1対1となる。このことは加えたグルコース濃度以上の乳酸濃度は得られないことを示している。また、乳酸発酵に続く乳酸の精製過程では高濃度乳酸溶液が求められる。さらに、稲ワラ等の植物バイオマスに含まれるリグニンは発酵阻害物質を多く含むため、乳酸発酵前に除去する必要がある。
【００５１】
そこで、本発明者等は、植物バイオマスからの高濃度のグルコースの生成方法を見出した。具体的には、植物バイオマスをアルカリ溶液に浸漬することでリグニンを除去し、リグニン除去後のセルロース繊維をセルラーゼと接触させることで、高濃度のグルコースを含むセルロース糖化液を得ることができる。使用するアルカリ溶液としては、例えば苛性ソーダ(水酸化ナトリウム)溶液、水酸化カリウム溶液、炭酸ナトリウム溶液、水酸化カルシウム溶液等が挙げられ、好ましくは苛性ソーダ溶液である。
【００５２】
植物バイオマスは、セルロース繊維の結晶構造とリグニンとの複合体を含み、セルロース、ヘミセルロース、リグニン等から構成されている。植物バイオマスとしては、例えば草本系バイオマス、ソフトセルロース等が挙げられる。さらに、草本系バイオマス又はソフトセルロースとしては、例えば稲ワラや麦ワラ、ペーパースラッジ、トウモロコシの茎、サトウキビの搾りかす、籾殻等の植物の非可食部(非食用セルロース系植物バイオマス)が挙げられる。特に、本発明においては稲ワラや麦ワラ、トウモロコシ茎等の栽培上一年生植物である植物体の非食用セルロース系植物バイオマスが好ましい。
【００５３】
例えば、植物バイオマスが稲ワラである場合には、稲ワラ50g当たり1Lの0.1〜2 N(好ましくは0.2N以上)の苛性ソーダ等のアルカリ溶液を加え、稲ワラをアルカリ溶液に浸漬し、良く撹拌する。次いで、当該混合物を室温で半日以上(例えば1日)放置するか、又は50℃以上の高温(例えば50℃〜120℃)で10分以上(例えば20分間)の加熱処理に供する。この操作により溶媒にリグニンが溶出する。得られるセルロース繊維を水で十分に洗浄し、pHを2〜6に調整した後、圧縮して脱水する。
【００５４】
次いで、得られた湿潤セルロース50ｇ当たり200mlの水を入れ、セルラーゼを添加して25〜70℃(例えば37℃)で2時間以上(例えば10時間)反応させる。ここで、使用するセルラーゼとしては、例えばノボザイムズ社製のCellic CTec等の市販のバイオマス用セルラーゼやトリコデルマ・リーセイ(Trichoderma reesei)由来セルラーゼが挙げられる。湿潤セルロースに添加するセルラーゼ量としては、例えば湿潤セルロース50g当たり500〜3,000EGU(Endo Glucanase Unit)、好ましくは2,000〜3,000EGUが挙げられる。なお、β-グルカナーゼ活性を有するキシラナーゼ(例えば、ノボザイムズ社製のCellic HTec)をさらに添加することにより糖化を促進することができる。湿潤セルロースに添加するキシラナーゼ量としては、例えば湿潤セルロース50g当たり500〜3,000FXU(Farvet Xylan Unit)、好ましくは2,000〜3,000FXUが挙げられる。
【００５５】
湿潤セルロースとセルラーゼ(又はセルラーゼとキシラナーゼとの組合せ)との反応後、反応液に新たに湿潤セルロースを添加し、反応させることを数回(例えば5回)繰り返すことで、高濃度のグルコース溶液を得ることができる。このようにして得られたセルロース糖化液(グルコース)は、本発明に係る乳酸製造方法に使用するセルロース糖化液として、又は乳酸発酵用組成物(培地)として使用することができる。なお、窒素源として、例えば150g/Lのグルコース含有セルロース糖化液500ml当たり30gのおから又は5gの酵母エキスを加えることが好ましい。さらに、乳酸発酵促進物質として、ビタミン及びミネラル源であるセルラーゼ加水分解により得られたふすま分解物(例えば、培地全体に対して1.5重量％)、並びに窒素源である魚肉由来ペプトン(例えば、培地全体に対して0.3重量％)を加えることができる。
【００５６】
本発明に係る乳酸製造方法では、滅菌操作を行わずに、準備した本発明に係る乳酸菌を、セルロース糖化液を含む培地に植菌し、培養し、乳酸発酵を行うことができる。具体的には、本発明に係る乳酸菌を、例えばセルロース糖化液中のグルコース100g当たり湿潤菌体0.01g以上(好ましくは湿潤菌体0.05g以上)で植菌し、pH9〜11(例えば、pH9以上、好ましくはpH10以上)及び温度20〜40℃(例えば30℃)下で12〜24時間(例えば24時間)培養し、その後pH5〜9(好ましくはpH7)下でさらに1〜5日間（好ましくは3日間)培養することで、乳酸発酵を行う。当該乳酸発酵によれば、高濃度(例えば、培養液中12％(W/V))の95％以上の高い光学純度を有するL乳酸を得ることができる。また、本発明に係る乳酸菌によれば、セルロース系バイオマスの糖化により得られるキシロースから乳酸を製造することもできる。従って、セルロース糖化液は、グルコースだけでなくキシロースも含んでいてもよい。
【００５７】
あるいは、滅菌処理の有無に関係なく、本発明に係る乳酸菌を、セルロース糖化液を含む培地に植菌し、培養及び乳酸発酵を中性程度のpH条件(例えばpH6〜8、好ましくはpH7)下で行うことでも、高濃度の乳酸を得ることができる。
【００５８】
培養後、菌体から遠心分離等によって回収した培養液それ自体を乳酸として使用してもよく、あるいはさらに一般的な精製手段や抽出手段に供すことで、乳酸を精製/抽出することができる。
【実施例】
【００５９】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。【００６０】
［実施例１］
＜好アルカリ性乳酸菌の単離＞
排水口の水垢を、10％グルコース、1％酵母エキス及び100mM 炭酸バッファー(pH10)を含む培養液に添加し、嫌気条件下で良好に生育する菌を単離し、L-120株と命名した。具体的な細菌の単離は、後述する脱リグニンした稲ワラ糖化液を嫌気条件下、pHコントローラでpH10に維持した培養において、非滅菌で、空気を窒素で置換した嫌気条件下で且つpHコントローラでpHを10に維持した条件下で自然発生的に生育した細菌を分離することによって行った。以上の単離の経緯から得られたL-120株は、脱リグニンした稲ワラ糖化液を基質とした培地に他の菌株を接種しても同種の細菌が生育することから、稲ワラ糖化液を基質とした培地に非常に適合性の高い菌株であるものと考えられる。【００６１】
［実施例２］
＜L-120株の一般的な培養条件下における乳酸産生性＞
L-120株を、グルコース16.2wt％(フスマ加水分解によるグルコースを含む)、酵母エキス0.8wt％、魚肉由来ペプトン0.3wt％及びふすま分解物（天野エンザイム社製セルラーゼによって分解したもの）1.5wt％を含む培地において、pHコントローラで10N NaOHによりpH9に維持し、35℃における嫌気条件下で培養した。67時間の培養後、1L当たり16.9wt％の乳酸が得られ、培地に投入したグルコースに対して約100％の回収率であった。【００６２】
得られた乳酸の光学純度を、カラムSUMICHIRAL OA-500 (4.6 mm × 150 mm)を使用し、液相として1mM硫酸銅を使用した高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で測定した。結果を図１に示す。図１において、左側のパネルは、乳酸のL体及びD体を50%ずつ含んだスタンダードのHPLC分析結果であり、右側のパネルは、L-120株が産生したL-乳酸のHPLC分析結果である。図１に示すように、D-乳酸が示す25.71分にピークが出ないことから、L-120株により産生された乳酸は100％がL体であった。【００６３】
［実施例３］
＜稲ワラセルロースの糖化＞
10cm以下程度の長さに切断した稲ワラ50g当たり1Lの1N苛性ソーダを加え、120℃で20分間加熱した。【００６４】
得られた脱リグニン稲ワラ10g当たりに水50ml及び市販のセルラーゼとキシラナーゼ(ノボザイムズ社製：Cellic CTec及びCellic HTecをそれぞれ0.2ml(それぞれ200EGU及び200FXUに相当))を加えて37℃で1日反応させた。反応後、さらに脱リグニン稲ワラ10gを添加し1日反応を繰り返した。反応物(糖化液)における糖(グルコース)量を、DNS(3,5-dinitro salicylic acid)法により測定した。結果を図２に示す。【００６５】
図２は、脱リグニン稲ワラの添加量とセルラーゼ及びキシラナーゼにより生成した糖(グルコース)の濃度(g/L)を示す。図２に示すように、合計80gの脱リグニン稲ワラを加えることで得られた糖化液には160g/Lの糖(グルコース)が検出された。【００６６】
［実施例４］
＜L-120株を用いたアルカリ条件下での乳酸発酵１＞
10cm以下程度の長さに切断した稲ワラ50g当たり1Lの1N苛性ソーダを加え、120℃で20分間加熱した。冷却後、カーゼでろ過したセルロースを水で十分に洗浄した後、絞って水分を良く除き、湿潤セルロースを得た。このようにして、稲ワラ50g当たり100gの湿潤セルロースが得られた。【００６７】
得られた湿潤セルロース50g当たり200mlの水を入れ、pHを2〜6程度にした後、バイオマス用セルラーゼCellic CTec及びキシラナーゼCellic HTec(いずれもノボザイムズ社製)をそれぞれ1.5ml(それぞれ1500EGU及び1500FXUに相当)添加し、37℃で12時間反応させ糖化した。得られた糖化液に上記湿潤セルロース50g並びに上記セルラーゼ及びキシラナーゼ各1.5mlを添加し、37℃で12時間反応させた。この湿潤セルロース50gを添加する操作を4回繰り返すことで、150g/Lグルコース溶液(糖化液)を500ml作製した。【００６８】
得られたグルコース溶液500ml当たり30gのおからを入れ、pHを10にした後、滅菌操作を行わずに、L-120株の終夜培養液10ml(湿潤菌体0.1g)を植菌した。当該培養物を通気せずに30℃で1日間培養し、その後培養液をpH7にしてさらに2日間培養した。【００６９】
培養日数に対する上記培養(乳酸発酵)により得られた培養液中の乳酸濃度(W/V％)を表１に示す。
【表１】
0005629876.tif 000002
【００７０】
表１に示すように、3日間の培養により、12％(W/V)の乳酸を得た。【００７１】
［実施例５］
＜L-120株を用いた中性条件下での乳酸発酵２＞
滅菌操作を行わずに、グルコース20％(W/V)及び酵母エキス5％(W/V)を含む培地にL-120株(湿潤菌体0.1g)を植菌し、中性条件(pH7)下で30℃において3日間培養した。3日間の培養後、得られた培養液において17％(W/V)の乳酸を得た。なお、滅菌操作を行っても同様の高濃度の乳酸を得ることができた。【００７２】
[実施例６]
＜L-120株のキシロース代謝＞
セルロース系バイオマスを糖化した場合、全還元糖の約2割はキシロースである。このためセルロース系バイオマスを有効に利用するために、キシロースの利用が不可欠となる。しかしながら、キシロースはグルコースと比較して非常に利用されにくく、例えばほとんどの酵母ではキシロースを利用できない。【００７３】
図３は、16wt％グルコース及び2.4wt％キシロースを炭素源とする培地(5wt％酵母エキス含有)を用いてL-120株によって生成する有機酸濃度を示す。なお、図３において、各グラフは、以下の糖及び有機酸の濃度を示す：
黒塗りの四角のドットで示されたグラフ：グルコースの濃度
黒塗りの丸のドットで示されたグラフ：キシロースの濃度
白抜きの丸のドットで示されたグラフ：乳酸の濃度
白抜きの三角のドットで示されたグラフ：酢酸の濃度
×のドットで示されたグラフ：蟻酸の濃度
種菌が十分に成育するまで通気せずに、pH9で雑菌の成育を抑制しながら当該培地でL-120株を20時間培養した。その後、乳酸の生産性が高くキシロースを代謝しやすいpH7.5下でL-120株を8日間培養した。この結果、図３に示すように、11wt％の乳酸が得られ、残存キシロース濃度は0.2wt％となった。【００７４】
このように、L-120株はグルコースだけでなくキシロースも代謝して乳酸発酵でき、セルロース系バイオマスの糖化液からの乳酸生産に適した特徴を有する。【００７５】
[実施例７]
＜乳酸発酵促進物質の探索＞
乳酸発酵にはグルコース以外に窒素源、各種ビタミン及びミネラルの添加が必要となる。これらの栄養素を添加するために酵母エキスの添加が一般的だが、高コストなため、その代替となる物質の探索を行った。【００７６】
結果を図４に示す。図４は、グルコース18wt％、酵母エキス0.8wt％及び魚肉由来ペプトン0.3wt％を含む培地で、L-120株をpH9下で27℃(黒塗りの四角のドットで示されるグラフ)又は35℃(黒塗りの三角のドットで示されるグラフ)において培養し、あるいはさらに当該培地にふすま分解物1.5wt％を添加し、当該ふすま分解物含有培地で、L-120株をpH9下で35℃において培養した(黒塗りの丸のドットで示されるグラフ)際の生成された乳酸の濃度(g/L)を示す。【００７７】
図４に示すように、ビタミン及びミネラル源としてセルラーゼで加水分解したふすま、窒素源として魚肉由来ペプトンを添加することで、L-120株の乳酸生産性を向上させることができた。さらに、培養温度を35℃にすることで乳酸生成速度を向上させることができる。18wt％グルコース、1.5wt％ふすま分解物及び0.3wt％魚肉ペプトンを含み、pH9とした培地において、L-120株を35℃で6日間培養することで15wt％の乳酸を得ることができる(図４における黒塗りの丸のドットで示されるグラフ)。
【産業上の利用可能性】
【００７８】
本発明によれば、稲ワラ等の非食用植物バイオマスから乳酸発酵に適した培地を作製できるため、食料と競合せずに安価に乳酸生産用原料を入手できる。また、乳酸製造において、高温高圧による滅菌操作が不要となるため、乳酸発酵装置の大幅な簡素化が可能となる。
【受託番号】
【００７９】
FERM BP-11295
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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