(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌細胞に特異的に結合する選択的高親和性リガンド（ＳＨＡＬ）であって、前記ＳＨＡＬは、前記癌細胞のマーカー上の第１の部位に結合する第１のリガンドと、第２のリガンドと、第３のリガンドとを含み、前記第１のリガンドは、前記癌細胞の同じマーカーまたは異なるマーカー上の第２の部位に結合する第２のリガンドに連結され、前記第１の部位と前記第２の部位は異なる部位であり；
少なくとも前記第１のリガンドは、（Ｒ）−２−［４−（５−クロロ−３−フルオロ−２−ピリジルオキシ）フェノキシ］プロピオン酸、２−（（（３−クロロ−５（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イルオキシ）フェノキシ）メチル）アクリレート、２−（（（３−クロロ−５（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イルオキシ）フェニル）メチル）アクリレート、２−（（（３−クロロ−５（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イルオキシ）フェニル）メチル）アクリロニトリル、３−（３−クロロ−４−｛［５−（トリフルオロメチル）−２−ピリジニル］オキシ｝アニリノ）−３−オキソプロパン酸、セトキシジム、クレトジム、５−（テトラデシルオキシ）−２−フロン酸、２−［（２，６−ジクロロフェニル）アミノ］ベンゼン酢酸、２−［４−（４−クロロフェノキシ）フェノキシ］プロパン酸、（ＲＳ）−２−｛４−［３−クロロ−５−（トリフルオロメチル）−２−ピリジニル］オキシ］フェノキシ｝プロパン酸、（ＲＳ）−２−［４−（６−クロロ−１，３−ベンゾオキサゾール−２−イルオキシ）フェノキシ］プロパン酸、（ＲＳ）−２−［４−（２，４−ジクロロフェノキシ）フェノキシ］プロパン酸、（ＲＳ）−２−｛４−［５−（トリフルオロメチル）−２−ピリジルオキシ］フェノキシ｝プロパン酸、（ＲＳ）−２−［４−（６−クロロキノキサリン−２−イルオキシ）フェノキシ］プロパン酸、（ＲＳ）−２−［４−（α，α，α−トリフルオロ−ｐ−トリルオキシ）フェノキシ］プロパン酸、３−［Ｎ−（４−アセチルフェニル）カルボモイル］ピリジン−２−カルボン酸、Ｌ−オルニチン−β−アラニン、２−メチル−１−（３−モルホリノプロピル）−５−フェニル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸、馬尿酸、ヒップリル−Ｄ−リジン、およびヒップリル−Ｌ−フェニルアラニンからなる群より選択されるリガンドであり、
前記第２のリガンドは、３−（２−（［３−クロロ−５−（トリフルオロメチル）−２−ピリジニル］オキシ）−アニリノ）−３−オキソプロパン酸（Ｃｔ）を含み、
前記第３のリガンドは、２−［２−［３−クロロ−５−（トリフルオロメチル）−２−ピリジニル］カルボヒドラゾノイル］ベンゼンカルボン酸；
ＢＯＣ−４−アミノメチル−Ｌ−Ｐｈｅ；
４［［５−（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イル］オキシ］フェニル］Ｎ−フェニルカルバメート；
７−アミノ−４−クロロメチルクマリン，グリシル−１−プロリンアミド，塩酸塩；
５−（［４，６−ジクロロトリアジン−２−イル］アミノ）−フルオレセイン塩酸塩；
４−［［２−（４−シアノ−３−フェニル−５−イソオキサゾリル）ビニル］アミノ］ベンゼンカルボン酸；
４−［２−（２，４−ジクロロフェニル）ヒドラジノ］−４−オキソ−２−フェニル−２−ブテン酸；
３−（２−［［３−クロロ−５−（トリフルオロメチル）−２−ピリジニル］オキシ］アニリノ）−３−オキソプロパン酸；
３−［（４−クロロベンジル）チオ］イミダゾ［１，５−ａ］ピリジン−１−カルボン酸；
２−［（［１，１’−ビフェニル］−４−イルアミノ）カルボニル］安息香酸；
ビス［４−（３−アミノフェノキシ）フェニル］スルホン；
４，４’−ビス（４−アミノフェノキシ）ビフェニル；
５（６）−カルボキシテトラメチルローダミンｎ−スクシンイミジルエステル；
１，４−フェニレンビス［［４−（４−アミノフェノキシ）フェニル］メタノン］；
Ｈ−Ｔｙｒ（Ｂｒ−Ｚ）−−ＯＥｔ
’７−アミノ−４−クロロメチルクマリン，１−アラニル−ｌ−プロリンアミド，塩酸塩；
’５−（Ｎ’−［２−アミノエチル］チオウレイドフルオレセイン）；
アカチンＩ，アンモニウム塩；
Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−ＯＨ；
Ｆｍｏｃ−Ｂｉｐ−ＯＨ；
Ｍｅｎａｉ  Ｈ５３５；
２’−メトキシ−５’−メチル−３，４，５，６−テトラクロロフタルアニリド酸；
４−ジメチルアミノアゾベンゼン−４’−スルホニル−ｌ−バリン；
Ｂｉｇｃｈａｐ；
Ａｒｇ−ｇｌｙ−ａｓｐ−ｔｈｒ（配列番号：２５）；
ｎ−アリル−２−［（１−ベンジル−２−オキソ−１，２−ジヒドロ−３−ピリジニル）カルボニル］−１−ヒドラジンカルボチオアミド；
ｎ’−メトキシｎ−［７−（４−フェノキシフェニル）［１，２，４］トリアゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−２−イル］イミノホルムアミド；
ｎ−［［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジル］カルボニル］−ｎ’−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］尿素；
ｎ−［［６−（４−クロロフェノキシ）−３−ピリジル］カルボニル］−ｎ’−［４−クロロフェニル）尿素；
ｎ，ｎ’−ジフェニルベンジジン；
Ｒｃｌｓ１６，９６３−３；
Ｎ，Ｎ’−ビス−（４−アミノ−２−クロロ−フェニル）−テレフタルアミド４−［［５−（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イル］オキシ］フェニルＮ−フェニルカルバメート；
メチジウムプロピルエチレンジアミン四酢酸；
Ｎ−（４−［［３−クロロ−５−（トリフルオロメチル）−２−ピリジニル］メチル］フェニル）−４−ヨードベンゼンカルボキサミド；
２−（４−クロロフェニル）−２−［６−［（４−クロロフェニル）スルファニル］−３−ピリダジニル］アセトアミド；
６−クロロ−ｎ４−（４−フェノキシフェニル）−２，４−ピリミジンジアミン；
４−アミノ−２−アニリノ−５−ベンゾイル−３−チオフェンカルボニトリル；
ｌｅｕ−エンケファリン；
４−［４−（４−クロロベンジル）ピペラジノ］−３−ニトロベンゼンカルボン酸；
β−カソモルフィン（１−２）；
Ｌ−アスパラギン酸，α−（４，５−ジメトキシ２−ニトロベンジル）エステル，塩酸塩；
セファドロキシル；
３，３’，５−トリヨード−ｄｌ−サイロニン；
Ｈ−Ｇｌｕ（アニリド）−ＯＨ；
Ｈ−Ｔｒｐ−ｐｈｅ−ＯＨ；
グリシルグリシル−Ｄ，Ｌ−フェニルアラニン；
サイモポイエチンＩＩ（３３−３６）；
チオリン酸Ｓ−（３−（３−アミノ−プロピルアミノ）−プロピル）エステル，二水和物；
ジノルフィンＡ（１３−１７），ブタ；
１−アラニル−ｌ−アラニル−１−トリプトファン；
Ａｓｐ−ａｒｇ−ｖａｌ−ｔｙｒ（配列番号：２６）；
Ａ−ＶＩ−５；
Ｇｌｕ−ｔｈｒ−ｐｒｏＮＨ２（配列番号：２７）；
（Ｄ−ａｌａ２）−β−カソモルフィン（１−５）（ウシ）；
Ｔｙｒ−Ｄ−ａｌａ−ｇｌｙ−ｐｈｅ−Ｄ−ｍｅｔ酢酸塩（配列番号：２８）；
Ａｒｇ−ｇｌｙ−ａｓｐ−ｔｈｒ（配列番号：２９）；
Ｎ−α，ｎ−ω−ジ−ｃｂｚ−１−アルギニン；
Ａｓｐ−ｌｙｓ酢酸塩
（＋）−アロ−オクトピン；
７−［（２−アミノ−２−フェニルアセチル）アミノ］−３−メチル−８−オキソ−５−チア−１−アザビシクロ［４．２．０］オクタ−２−エン−２−カルボン酸ナトリウム；
Ｖａｌ−ｉｌｅ−ｈｉｓ−ａｓｎ
２−アミノ−８−（ジフェニルホスフィニル）−オクタン酸；
Ｇｌｕ−Ｈｉｓ−ＰｒｏＮＨ２（配列番号：３０）；
Ｂａｐａｂａ
Ｈ−ｇｌｕ（ｌｙｓ）−ＯＨ；
Ｂｉｓ−ｂｏｃ−ｌ−ａｒｇ
Ｈ−ａｒｇ（ｍｔｒ）−ＯＨ；
４−アミノメチル−Ｌ−フェニルアラニンｂｏｃ；
Ｈ−ｍｅｔ−ｍｅｔ−ＯＨ；
Ｈ−ｔｒｐ−ｉｌｅ−ＯＨ；
Ｎ−αベンゾイル−アルギニン−４−アミノ安息香酸；
（Ｔｈｒ４６）−オステオカルシン（４５−４９）（ヒト）；
５（６）カルボキシテトラメチルローダミン−ｎ−スクシンイミジルエステル；
メチジウムプロピルＥＤＴＡ；
デオキシコール酸；
ＦＭＯＣ−アスパラギン酸（Ｏ−ベンジル）−ＯＨ；
４−［［５−（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イル］オキシ］フェニルＮ−フェニルカルバメート；
Ｎ−αベンゾイル−アルギニン−４−アミノ安息香酸
５−ｌｅｕ−エンケファリン（ＹＡＧＦＭ）；
ＮαＮωジカルボベンゾキシアルギニン；
アンギオテンシンＩＩ（ＤＲＶＹ）；
４−ジメチルアミノアゾベンゼン−４’−スルホニル−Ｌ−バリン；
ビス−ＢＯＣ−Ｌ−アルギニン；
３，３’，５−トリヨード−ｄｌ−サイロニン（推定部位２）（ＴＩ）；
２−（４−クロロフェニル）−２−［６−［（４−クロロフェニル）スルファニル］−３−ピリダジニル］アセトアミド（１２Ｆ）；
４−アミノ−２−アニリノ−５−ベンゾイル−３−チオフェンカルボニトリル（５Ｋ）；
６−クロロ−ｎ４−（４−フェノキシフェニル）−２，４−ピリミジンジアミン（７Ｌ）；および
Ｎ−（４−［［３−クロロ−５（トリフルオロメチル）−２−ピリジニル］メチル］フェニル）−４−ヨードベンゼンカルボキサミド（６Ｊ）
からなる群より選択される、ＳＨＡＬ。
【請求項２】
Ｃｔ−Ｄｖ−Ｃｂを含む、三座ＳＨＡＬであって、
前記Ｄｖが、４−（ジメチルアミノ）アゾベンゼン−４’−スルホニル−Ｌ−バリンであり；
前記Ｃｂが、４−［４−（４−クロロベンジル）ピペラジノ］−３−ニトロベンゼンカルボン酸であり；
前記Ｃｔが、３−（２−（［３−クロロ−５−（トリフルオロメチル）−２−ピリジニル］オキシ）−アニリノ）−３−オキソプロパン酸である、
三座ＳＨＡＬ。
【請求項３】
前記第１のリガンドと前記第２のリガンドが、Ｌｙｍ−１抗体によって認識されるエピトープ内の部位に結合する、請求項１または２に記載のＳＨＡＬ。
【請求項４】
前記第３のリガンドが、４−［４−（４−クロロベンジル）ピペラジノ］−３−ニトロベンゼンカルボン酸（Ｃｂ）である、請求項１または３に記載のＳＨＡＬ。
【請求項５】
前記第１のリガンドが、（ＲＳ）−２−｛４−［３−クロロ−５−（トリフルオロメチル）−２−ピリジニル］オキシ］フェノキシ｝プロパン酸である、請求項４に記載のＳＨＡＬ。
【請求項６】
伝達ペプチドに結合されている、請求項１〜５いずれか１項に記載のＳＨＡＬ。
【請求項７】
前記伝達ペプチドが、ヘキサアルギニン、ＳＶ４０の核局在シグナル、ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質のタンパク質伝達ドメイン、インテグリン結合ペプチド（ＲＧＤペプチド）、ビトロネクチン（ＶＮペプチド）のヘパリン結合ドメイン、ショウジョウバエのアンテナペディアタンパク質、ＶＰ２２、オリゴアルギニン、ラクトシル化ポリ−Ｌ−リジンまたは他のオリゴカチオン、
【化３】
0005623384.tif 000015
からなる群より選択される、請求項６に記載のＳＨＡＬ。
【請求項８】
前記ＳＨＡＬがエフェクターに結合されており、前記エフェクターが、エピトープタグ、抗体、第２のＳＨＡＬ、標識、細胞毒、リポソーム、放射性核種、薬物、プロドラッグ、酵素インヒビター、ウイルス粒子、サイトカイン、およびキレートからなる群より選択され、前記エフェクターは、
（ｉ）ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、リシン、アブリンおよびチミジンキナーゼからなる群より選択される細胞毒であるか、
（ｉｉ）９９Ｔｃ、２０３Ｐｂ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、１１１Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、９７Ｒｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、５２Ｆｅ、５２ｍＭｎ、５１Ｃｒ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、７７Ａｓ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、１６９Ｅｒ、１２１Ｓｎ、１２７Ｔｅ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、１６１Ｔｂ、１０９Ｐｄ、１６５Ｄｙ、１４９Ｐｍ、１５１Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５７Ｇｄ、１５９Ｇｄ、１６６Ｈｏ、１７２Ｔｍ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１０５Ｒｈ、および１１１Ａｇからなる群より選択される金属同位体を含むキレートであるか、
（ｉｉｉ）α放射体を含むキレートであるか、
（ｖ）ＤＯＴＡを含むキレートであるか、
（ｖｉ）脂質またはリポソームであるか、あるいは、
（ｖｉｉ）３−（２−（［３−クロロ−５−（トリフルオロメチル）−２−ピリジニル］オキシ）−アニリノ）−３−オキソプロパン酸（Ｃｔ）、４［［５−（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イル］オキシ］フェニル］Ｎ−フェニルカルバメート、（Ｒ）−２−［４−（５−クロロ−３−フルオロ−２−ピリジルオキシ）フェノキシ］プロピオン酸、２−（（（３−クロロ−５（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イルオキシ）フェノキシ）メチル）アクリレート、２−（（（３−クロロ−５（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イルオキシ）フェニル）メチル）アクリレート、２−（（（３−クロロ−５（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イルオキシ）フェニル）メチル）アクリロニトリル、３−（３−クロロ−４−｛［５−（トリフルオロメチル）−２−ピリジニル］オキシ｝アニリノ）−３−オキソプロパン酸、セトキシジム、クレトジム、５−（テトラデシルオキシ）−２−フロン酸、２−［（２，６−ジクロロフェニル）アミノ］ベンゼン酢酸、２−［４−（４−クロロフェノキシ）フェノキシ］プロパン酸、（ＲＳ）−２−｛４−［３−クロロ−５−（トリフルオロメチル）−２−ピリジニル］オキシ］フェノキシ｝プロパン酸、（ＲＳ）−２−［４−（６−クロロ−１，３−ベンゾオキサゾール−２−イルオキシ）フェノキシ］プロパン酸、（ＲＳ）−２−［４−（２，４−ジクロロフェノキシ）フェノキシ］プロパン酸、（ＲＳ）−２−｛４−［５−（トリフルオロメチル）−２−ピリジルオキシ］フェノキシ｝プロパン酸、（ＲＳ）−２−［４−（６−クロロキノキサリン−２−イルオキシ）フェノキシ］プロパン酸、および（ＲＳ）−２−［４−（α，α，α−トリフルオロ−ｐ−トリルオキシ）フェノキシ］プロパン酸からなる群より選択される、請求項１〜７いずれか１項に記載のＳＨＡＬ。
【請求項９】
同じまたは異なる標的に指向される請求項１〜８のいずれか１項に記載の２またはそれ以上のＳＨＡＬを含む多価ＳＨＡＬ。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載のＳＨＡＬまたは請求項９に記載の多価ＳＨＡＬを含み、薬学的に許容され得る担体をさらに含む、医薬組成物。
【請求項１１】
ＨＬＡ−ＤＲ１０マーカーを発現する癌細胞の成長または増殖を抑止する方法において使用するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の選択的高親和性多座リガンド（ＳＨＡＬ）、請求項９に記載の多価ＳＨＡＬ、または、請求項１０に記載の組成物であって、前記方法は、前記癌細胞を、前記選択的高親和性多座リガンド（ＳＨＡＬ）と接触させる工程を包含する、ＳＨＡＬ、多価ＳＨＡＬまたは組成物。
【請求項１２】
前記癌細胞が、転移性細胞、充実性腫瘍細胞、悪性Ｂリンパ球、あるいは、非ホジキンリンパ腫もしくは白血病もしくは他のＢ細胞由来悪性疾患と関連する癌細胞の１つ以上である、請求項１１に記載のＳＨＡＬ。
【請求項１３】
癌細胞の検出のための組成物であって、前記組成物は、エピトープタグに結合させた請求項１〜８いずれか１項に記載のＳＨＡＬまたは請求項９に記載の多価ＳＨＡＬを含むキメラ分子を含み、そして前記組成物は、癌細胞と接触され、検出可能な部分を含むキレートとさらに接触させられることを特徴とし、ここで、前記キレートが前記エピトープタグに結合し、それにより前記検出可能な部分が前記キレートと結合する、組成物。
【請求項１４】
前記検出可能な部分が、（ｉ）放射性核種、または、（ｉｉ）γ放射体、ポジトロン放射体、α放射体、Ｘ線放射体、および蛍光放射体からなる群より選択される検出可能な部分、または、（ｉｉｉ）９９Ｔｃ、２０３Ｐｂ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、１１１Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、９７Ｒｕ、６２Ｃｕ、６４１Ｃｕ、５２Ｆｅ、５２ｍＭｎ、５１Ｃｒ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、７７Ａｓ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、１６９Ｅｒ、１２１Ｓｎ、１２７Ｔｅ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１９８Ａｕ，１９９Ａｕ、１６１Ｔｂ、１０９Ｐｄ、１６５Ｄｙ、１４９Ｐｍ、１５１Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５７Ｇｄ、１５９Ｇｄ、１６６Ｈｏ、１７２Ｔｍ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１０５Ｒｈ、および１１１Ａｇからなる群より選択される金属同位体、の１つ以上を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記接触がインビトロで行われる、請求項１３または１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記癌細胞が、転移性細胞、充実性腫瘍細胞、悪性Ｂリンパ球、あるいは、非ホジキンリンパ腫もしくは白血病もしくは他のＢ細胞由来悪性疾患と関連する癌細胞の１つ以上である、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
癌細胞を検出する方法において使用するための、エピトープタグに結合させた請求項１〜８いずれか１項に記載のＳＨＡＬまたは請求項９に記載の多価ＳＨＡＬを含むキメラ分子であって、前記方法は、
癌細胞を、エピトープタグに結合させた請求項１〜８のいずれか１項に記載のＳＨＡＬまたは請求項９に記載の多価ＳＨＡＬを含むキメラ分子と接触させる工程、
前記キメラ分子を、検出可能な部分を含むキレートと接触させることにより、前記キレートが前記エピトープタグに結合し、それにより前記検出可能な部分が前記キレートと結合する、工程、および
前記検出可能な部分を検出する工程、
を包含する、キメラ分子。
【請求項１８】
前記検出可能な部分が、（ｉ）放射性核種、または、（ｉｉ）γ放射体、ポジトロン放射体、α放射体、Ｘ線放射体、および蛍光放射体からなる群より選択される検出可能な部分、または、（ｉｉｉ）９９Ｔｃ、２０３Ｐｂ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、１１１Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、９７Ｒｕ、６２Ｃｕ、６４１Ｃｕ、５２Ｆｅ、５２ｍＭｎ、５１Ｃｒ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、７７Ａｓ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、１６９Ｅｒ、１２１Ｓｎ、１２７Ｔｅ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１９８Ａｕ，１９９Ａｕ、１６１Ｔｂ、１０９Ｐｄ、１６５Ｄｙ、１４９Ｐｍ、１５１Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５７Ｇｄ、１５９Ｇｄ、１６６Ｈｏ、１７２Ｔｍ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１０５Ｒｈ、および１１１Ａｇからなる群より選択される金属同位体を含む、請求項１７に記載の分子。
【請求項１９】
前記癌細胞が、転移性細胞、充実性腫瘍細胞、悪性Ｂリンパ球、あるいは、非ホジキンリンパ腫もしくは白血病もしくは他のＢ細胞由来悪性疾患と関連する癌細胞の１つ以上である、請求項１７または１８に記載の分子。
【請求項２０】
前記第１のリガンドが前記第２のリガンドにリンカーによって連接されているか、または、前記第１のリガンド、前記第２のリガンドおよび前記第３のリガンドは互いにリンカーによって連接されており、前記リンカーが、ＰＥＧ型リンカー、ペプチドまたはペプチド類似体リンカー、アビジン／ビオチンリンカー、直鎖炭素リンカー、複素環式リンカー、分枝鎖炭素リンカー、デンドリマー、核酸リンカー、糖または糖質リンカー、チオールリンカー、エステルリンカー、アミンを含むリンカー、カルボキシルを含むリンカー、ポリエチレングリコール、およびポリエチレングリコールとリジンとを含むリンカーからなる群より選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＳＨＡＬ、または、請求項９に記載の多価ＳＨＡＬ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本願は、２００８年４月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／０４６，７１２号の優先権および利益を主張し、この米国仮特許出願は、その全体があらゆる目的のために本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
政府支援の研究および開発の下でなされた発明への権利に関する陳述
本研究は、国立衛生研究所、国立癌研究所からの助成金番号ＣＡ０４７８２９により一部支援された。加えて、Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙの事業のために、米国エネルギー省およびＬａｗｒｅｎｃｅ  Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｅｃｕｒｉｔｙ  ＬＬＣとの間の契約番号：ＤＥ−ＡＣ５２−０７ＮＡ２７３４４にしたがって、合衆国政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、標的化分子の開発に関する。より詳しくは、本発明は、親和性試薬として、または種々の疾患（例えば、癌）の診断および処置のために、抗体および／またはペプチドリガンドと同様に使用され得る多座選択的高親和性リガンド（ＳＨＡＬ）の開発に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
一般に、化学療法薬などの癌死滅薬は、正常組織の細胞に対しても毒性であることがわかっている。結果として、かかる薬物の副作用は、患者に対して悪性疾患それ自体とほぼ同等に破滅的であることがあり得る。モノクローナル抗体およびペプチドリガンドの出現により、薬物の特異性／選択性の改善のための新たな手段がもたらされた。例えば、悪性細胞上に存在するが正常細胞上には存在しない抗原に対する抗体またはペプチドリガンドに細胞傷害剤をコンジュゲートすることにより、悪性細胞の選択的な死滅が達成された。細胞傷害剤に結合させた抗体を含む多くの異なる免疫複合体が、さまざまな細胞表面抗原に対して創製されている。
【０００５】
かかる免疫複合体において使用される細胞傷害剤としては、放射性同位体、種々の植物毒素および細菌毒素（例えば、シュードモナス外毒素、ジフテリア毒素、リシン、アブリンなど）、種々の増殖因子、およびごく最近では、カスパーゼなどの薬剤が挙げられる。抗体による治療は、抗体単独の使用であれ免疫複合体の使用であれ、ある程度の好成績がリンパ腫および白血病において著しくみられているが、一般的には、期待されている潜在性は実現されていない。
【０００６】
悪性疾患の処置においては、相当な進歩がなされてきたが、患者のほとんどに対して治効的レジメンはまだ開発されていないか、または患者に対して魅力のない毒性を伴う。したがって、悪性疾患のほとんどが処置される新たなストラテジーが必要である。このようなストラテジーは、その目標として、治療効果の最大化とともに毒性の最小化を有するものであるのがよい。アプローチの一例は、薬物または放射性同位体を悪性細胞に標的化させる手段として、細胞表面受容体に特異的なリガンドまたは悪性細胞関連抗原に特異的な抗体の使用を伴うものである。悪性細胞がその細胞表面上に、さまざまな腫瘍限定的な、または腫瘍上方調節された抗原および／または受容体を示し、これらが標的化に利用可能であり得るため、該アプローチは多くの悪性疾患に対して魅力的である。これまで、抗体／抗原系は、受容体よりも限定的であり、悪性細胞上でのアバンダンスが大きいため、リガンド受容体系よりも好ましいことがわかっていた。
【０００７】
このような利点にもかかわらず、抗体は、多くの理由のため、その潜在性が実現されていない。その理由の中でもとりわけ、抗体は巨大分子（大分子）であり、多くの場合、悪性腫瘍に有効に到達および浸透しない。また、抗体は、多くの場合、免疫原性の大分子であり、患者において治療用薬剤に対する免疫応答を誘発することがあり得る。また、抗体は、多くの場合、標的（例えば、癌）組織に対して充分な特異性を示さず、したがって、限られた治療レジメンのみにおいて有用である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
一部の特定の実施形態において、本発明は、抗体結合と類似した方法で特定の標的分子に特異的に結合する機能を果たし得る新規な多座選択的高親和性リガンド（ＳＨＡＬ）を提供する。感染性および／または悪性疾患の基礎研究もしくは応用研究のため、または診断および処置のための親和性試薬としてのＳＨＡＬの設計および作製のための方法、ならびに感染性および／または悪性疾患を有する患者へのその投与を説明する。
【０００９】
ＳＨＡＬは、典型的には２つ以上のリガンド（結合部分）を含み、該リガンドは各々、対象標的上の異なる領域に結合し、互いに直接またはリンカーを介して結合されている。ＳＨＡＬが癌細胞上のマーカーに指向される場合、ＳＨＡＬは、正常細胞と比べて高い密度（アバンダンス）または到達度で標的細胞に結合する。したがって、ＳＨＡＬは、標的細胞の診断または処置に適切な選択性を提供する。種々の悪性細胞および悪性疾患に対する種々のＳＨＡＬは、容易に作製され得る。ＳＨＡＬはコア基礎単位（例えば、標的化部分）に相当し、これは、標的へのエフェクターの特異的送達に影響を及ぼすために、より大きな例えばキメラ分子内に組み込まれ得る。
【００１０】
したがって、一実施形態において、本発明は、標的分子に特異的に結合する選択的高親和性多座リガンド（ＳＨＡＬ）の作製方法を提供する。一部の特定の実施形態において、該方法は、典型的には、第１のリガンドのライブラリーをスクリーニングし、標的分子に結合する第１のリガンドを同定すること；第２のリガンドのライブラリーをスクリーニングし、標的分子に結合する第２のリガンドを同定すること、ここで、第２のリガンドは第１のリガンドと異なる；第１のリガンドを第２のリガンドに連結させ、ＳＨＡＬを形成すること；およびＳＨＡＬを標的分子に特異的に結合する能力に関してスクリーニングすることを伴う。一部の特定の実施形態において、標的分子はタンパク質である。一部の特定の実施形態において、標的分子は癌マーカー（例えば、Ｌｙｍ−１エピトープ、Ｍｕｃ−１、Ｃ−ｍｙｃ、ｐ５３、Ｋｉ６７、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ４、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＣＡ  １５−３、Ｇ２５０、ＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原、ＣＥＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、インテグリン、ｃｅａ、ｌ６、ＥＧＦｒ、ＡＲ、ＰＳＡ、および他の増殖因子受容体など）である。該方法は、任意選択で、さらに、ＳＨＡＬを構成するいずれかのリガンドよりも高いアビディティおよび／または特異性で標的に結合するＳＨＡＬを同定するためのＳＨＡＬのスクリーニングを伴うものであり得る。第１のリガンドのライブラリーおよび第２のリガンドのライブラリーは、同じライブラリーであってもよく、異なるライブラリーであってもよい。一部の特定の実施形態において、第１および／または第２のリガンドのライブラリーは、有機小分子のライブラリーである。一部の特定の実施形態において、第１のリガンドのライブラリーのスクリーニングおよび／または第２のリガンドのライブラリーのスクリーニングは、バーチャルインシリコスクリーニングを含む。バーチャルインシリコスクリーニングは、ＤＯＣＫプログラムに使用されているような１つ以上のアルゴリズムを用いた化合物データベース（例えば、ＭＤＬ（登録商標）Ａｖａｉｌａｂｌｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ，ＣｈｅｍＳｐｉｄｅｒ，ＧＮＵ−Ｄａｒｗｉｎ）のスクリーニングを含むものであり得る。バーチャルインシリコスクリーニングは、ＤＯＣＫプログラムを用いた化合物データベースのスクリーニングを含むものであり得る。バーチャルインシリコスクリーニングは、第１のリガンドおよび／またはタンパク質上のポケットに結合する多数のリガンドのスクリーニングを伴うものであり得る。一部の特定の実施形態において、ポケットは、ＳＰＨＧＥＮプログラムで使用されるアルゴリズムを用いて同定される。一部の特定の実施形態において、ポケットはＳＰＨＧＥＮプログラムを用いて同定される。バーチャルインシリコスクリーニングは、第１のリガンドのライブラリーのスクリーニングのときに同定されたリガンドと異なる標的領域に結合する第２または第３のリガンドのスクリーニングを伴うものであり得る。
【００１１】
一部の特定の実施形態において、第１のリガンドのライブラリーのスクリーニングおよび／または第２のリガンドのライブラリーのスクリーニングは、さらに、標的に対する結合能に関する物理的アッセイでのバーチャルインシリコスクリーニングで同定された１つ以上のリガンドのスクリーニングを含む。好適な物理的アッセイとしては、限定されないが、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ、飽和移動差核磁気共鳴分光分析、および移動（ｔｒａｎｓｆｅｒ）ＮＯＥ（ｔｒＮＯＥ）核磁気共鳴分光分析、ＥＬＩＳＡ、競合アッセイ、組織結合アッセイ、生細胞結合アッセイ、細胞抽出物アッセイなどが挙げられる。
【００１２】
リガンドの連結は、２つ以上のリガンドの直接連結、またはリンカー（例えば、ＰＥＧ型リンカー、ペプチドリンカー、アビジン／ビオチンリンカー、直鎖炭素リンカー、複素環式リンカー、分枝鎖炭素リンカー、デンドリマー、核酸リンカー、チオールリンカー、エステルリンカー、アミンを含むリンカー、カルボキシルを含むリンカーなど）による２つ以上のリガンドの連結を伴うものであり得る。該連結は、任意選択で、異なる長さのリンカーを有する２種類以上のリガンドを連結させ、異なる長さのリンカーを有するＳＨＡＬのライブラリーを作製すること；および任意選択で、異なる長さのリンカーを有するＳＨＡＬの該ライブラリーをスクリーニングし、標的に対して最も高いアビディティおよび／または特異性を有するライブラリー構成員を同定することを含むものであってもよい。一部の特定の実施形態において、該方法は、さらに、ＳＨＡＬを構成するいずれかのリガンドよりも高いアビディティおよび／または特異性で標的に結合するＳＨＡＬを同定するためのＳＨＡＬ（１つまたは複数）のスクリーニングを含むことを伴う。個々のリガンドおよび／または二価もしくは多価ＳＨＡＬ（１つまたは複数）のスクリーニングは、任意のさまざまな方法によるもの、例えば限定されないが、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ、飽和移動差核磁気共鳴分光分析、および移動ＮＯＥ（ｔｒＮＯＥ）核磁気共鳴分光分析、ＥＬＩＳＡ、競合アッセイ、組織結合アッセイ、生細胞結合アッセイ、細胞抽出物アッセイなどによるものであり得る。一部の特定の実施形態において、標的分子は、タンパク質および／または癌マーカー（例えば、Ｌｙｍ１エピトープ、Ｍｕｃ−１、Ｃ−ｍｙｃ、ｐ５３、Ｋｉ６７、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ４、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＣＡ  １５−３、Ｇ２５０、ＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原など）である。
【００１３】
また、酵素または他の結合性タンパク質または受容体のインヒビターの合成方法を提供する。一部の特定の実施形態において、該方法は、典型的には、酵素または他の結合性タンパク質または受容体内の第１のポケット（もしくは隆起（ｂｕｍｐ））と第２または第３のポケット（または隆起）を同定すること、ここで、第１、第２および第３のポケットは、該酵素または他の結合性タンパク質または受容体の活性部位または結合部位の対向する側に位置している；第１のリガンドのライブラリーをスクリーニングし、第１のポケット（または隆起）に結合する第１のリガンドを同定すること；第２のリガンドのライブラリーをスクリーニングし、第２のポケット（または隆起）に結合する第２のリガンドを同定すること；第３のリガンドのライブラリーをスクリーニングし、第３のポケットまたは隆起に結合する第３のリガンドを同定すること；第１のリガンドを第２および第３のリガンドに連結させ、多座選択的高親和性リガンド（ＳＨＡＬ）を形成すること；ならびにＳＨＡＬを、該酵素または他の結合性タンパク質に特異的に結合して阻害する能力に関してスクリーニングすることを伴う。一部の特定の実施形態において、ポケットまたは「隆起」は、酵素または結合性タンパク質または受容体の活性部位または結合部位の対向する側に存在している必要はなく、単に、ＳＨＡＬの結合により、天然のコグネートリガンドが該部位に結合することがブロックされるように存在させる。一部の特定の実施形態において、標的分子は、タンパク質、酵素、核酸、核酸結合性タンパク質および糖質からなる群より選択される分子を含む。一部の特定の実施形態において、該方法は、さらに、ＳＨＡＬを構成するいずれかのリガンドよりも高いアビディティおよび／または特異性で標的に結合するＳＨＡＬを同定するためのＳＨＡＬのスクリーニングを伴う。第１、第２および第３のリガンドのライブラリーは、同じライブラリーであってもよく、異なるライブラリーであってもよい。一部の特定の実施形態において、第１および／または第２および／または第３のリガンドのライブラリーは、有機小分子のライブラリーである。一部の特定の実施形態において、第１、第２および／または第３のリガンドのライブラリーのスクリーニングは、バーチャルインシリコスクリーニングを含む。バーチャルインシリコスクリーニングは、ＤＯＣＫプログラムに使用されているような１つ以上のアルゴリズムを用いた化合物データベース（例えば、ＭＤＬ（登録商標）Ａｖａｉｌａｂｌｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ）のスクリーニングを含むものであり得る。バーチャルインシリコスクリーニングは、ＤＯＣＫプログラムを用いた化合物データベースのスクリーニングを含むものであり得る。バーチャルインシリコスクリーニングは、タンパク質上のポケットに結合する第１、第２および／または第３のリガンドのスクリーニングを伴うものであり得る。一部の特定の実施形態において、ポケットは、ＳＰＨＧＥＮプログラムで使用されるアルゴリズムを用いて同定される。一部の特定の実施形態において、ポケットは、ＳＰＨＧＥＮプログラムを用いて同定される。バーチャルインシリコスクリーニングは、第１のリガン��のライブラリーのスクリーニングのときに同定されたリガンドと異なる標的領域に結合する第２のリガンドのスクリーニングを伴うものであり得る。
【００１４】
一部の特定の実施形態において、第１、第２または第３のリガンドのライブラリーのスクリーニングおよび／または第２のリガンドのライブラリーのスクリーニングは、さらに、標的に対する結合能に関する物理的アッセイでのバーチャルインシリコスクリーニングで同定された１つ以上のリガンドのスクリーニングを含む。好適な物理的アッセイとしては、限定されないが、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ、飽和移動差核磁気共鳴分光分析、および移動ＮＯＥ（ｔｒＮＯＥ）核磁気共鳴分光分析、ＥＬＩＳＡ、競合アッセイ、組織結合アッセイ、生細胞結合アッセイ、細胞抽出物アッセイなどが挙げられる。
【００１５】
リガンド連結は、２つ以上のリガンドの直接連結、またはリンカー（例えば、ＰＥＧ型リンカー、ペプチドリンカー、アビジン／ビオチンリンカー、直鎖炭素リンカー、複素環式リンカー、分枝鎖炭素リンカー、デンドリマー、核酸リンカー、チオールリンカー、エステルリンカー、アミンを含むリンカー、カルボキシルを含むリンカーなど）による２つ以上のリガンドの連結を伴うものであり得る。該連結は、任意選択で、異なる長さのリンカーを有するリガンドを連結させ、異なる長さのリンカーを有するＳＨＡＬのライブラリーを作製すること；および任意選択で、異なる長さのリンカーを有するＳＨＡＬの該ライブラリーをスクリーニングし、標的に対して最も高いアビディティおよび／または特異性を有するライブラリー構成員を同定することを含むものであってもよい。
【００１６】
また、本発明は、所望の標的（例えば、癌細胞）に特異的に結合する多座選択的高親和性リガンド（ＳＨＡＬ）を提供する。標的が癌細胞である場合、ＳＨＡＬは、典型的には、癌細胞のマーカー上の第１の部位に結合する第１のリガンドを、該癌細胞の同じマーカーまたは異なるマーカー上の第２または第３の部位に結合する第２または第３のリガンドに（直接またはリンカーを介して）連結された状態で含み、ここで、第１の部位、第２の部位および第３の部位は異なる部位である（例えば、３つのリガンドはすべて、標的（１つまたは複数）に同時に結合し得るものである）。一部の特定の実施形態において、第１の部位、第２の部位および／または第３の部位は、マーカー（１種類または複数種）上のポケット（または「隆起」）である。好適なマーカーとしては、限定されないが、Ｌｙｍ−１エピトープ、Ｍｕｃ−１、Ｃ−ｍｙｃ、ｐ５３、Ｋｉ６７、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ４、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＣＡ  １５−３、Ｇ２５０、ＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原、ＣＥＡ、ＣＤ２０、ＣＤ２２、インテグリン、ＣＥＡ、ｌ６、ＥＧＦｒ、ＡＲ、ＰＳＡ、他の増殖因子受容体などが挙げられる。
【００１７】
一部の特定の好ましい実施形態において、マーカーはＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原である。一部の特定の実施形態において、３つのリガンドは、Ｌｙｍ−１または他のＨＬＡ−ＤＲ特異的抗体によって認識されるエピトープ内の部位に結合する。一部の特定の実施形態において、３つのリガンドは各々、有機小分子である。一部の特定の実施形態（ｅｍｂｏｄｉｍｅｎ）において、第１のリガンドは、表１から選択されるリガンドであり、第２および第３のリガンドは、存在している場合、独立して、表１、５、６、７または８のリガンドから選択される。一部の特定の実施形態において、ＳＨＡＬは、表２、３または４から選択される第１、第２および／または第３のリガンドを含む。一部の特定の実施形態において、ＳＨＡＬは、表４から選択される第１、第２および／または第３のリガンドを含む。この３つのリガンドは、一緒に直接連接してもよく、第１のリガンドを第２および／または第３のリガンドにリンカー（例えば、ＰＥＧ型リンカー、ペプチドリンカー、アビジン／ビオチンリンカー、直鎖炭素リンカー、複素環式リンカー、分枝鎖炭素リンカー、デンドリマー、核酸リンカー、チオールリンカー、エステルリンカー、アミンを含むリンカー、カルボキシルを含むリンカーなど）によって結合させてもよい。一部の特定の実施形態において、ＳＨＡＬはマーカーに対して、約１０−６Ｍより高いアビディティを有するが、ＳＨＡＬを構成する個々のリガンドは各々、マーカーに対して約１０−６Ｍより低い結合親和性を有する。一部の特定の実施形態において、ＳＨＡＬは、本明細書および図面において示す式を有するもの、またはその類似体である。
【００１８】
また、本発明は、本明細書に記載のＳＨＡＬを、エフェクター（例えば、エピトープタグ、第２のＳＨＡＬ、抗体、標識、細胞毒、リポソーム、放射性核種、薬物、プロドラッグ、ウイルス粒子、サイトカイン、およびキレート）に結合された状態で含むキメラ分子を提供する。一部の特定の実施形態において、エフェクターは、アビジンおよびビオチンからなる群より選択されるエピトープタグである。一部の特定の実施形態において、エフェクターは、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、リシン、アブリンおよびチミジンキナーゼからなる群より選択される細胞毒である。一部の特定の実施形態において、エフェクターは、９９Ｔｃ、２０３Ｐｂ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、１１１Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、９７Ｒｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、５２Ｆｅ、５２ｍＭｎ、５１Ｃｒ、１８６、Ｒｅ、１８８Ｒｅ、７７Ａｓ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、１６９Ｅｒ、１２１Ｓｎ、１２７Ｔｅ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１９８Ａｕ，１９９Ａｕ、１６１Ｔｂ、１０９Ｐｄ、１６５Ｄｙ、１４９Ｐｍ、１５１Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５７Ｇｄ、１５９Ｇｄ、１６６Ｈｏ、１７２Ｔｍ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１０５Ｒｈ、および１１１Ａｇからなる群より選択される金属同位体を含むキレートである。一部の特定の実施形態において、エフェクターは、α放射体（例えば、ビスマス２１３）を含むキレートである。一部の特定の実施形態において、エフェクターは、ＤＯＴＡを含むキレートである。一部の特定の実施形態において、エフェクターは脂質またはリポソーム（例えば、薬物内包リポソーム）である。
【００１９】
さらに別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載の癌細胞に特異的に結合する多座選択的高親和性リガンド（ＳＨＡＬ）および薬学的に許容され得る賦形剤を含む製剤の医薬製剤を提供する。一部の特定の実施形態において、製剤は単位投薬製剤として提供され得る。一部の特定の実施形態において、製剤は時限放出製剤として提供され得る。
【００２０】
また、本発明は、薬学的に許容され得る賦形剤および本明細書に記載のＳＨＡＬを含むキメラ分子を含む製剤の医薬製剤を提供する。一部の特定の実施形態において、製剤は単位投薬製剤として提供され得る。一部の特定の実施形態において、製剤は時限放出製剤として提供され得る。
【００２１】
癌細胞の成長または増殖を抑止するための方法を提供する。該方法は、典型的には、癌細胞（例えば、転移性細胞、腫瘍細胞など）を、癌細胞に特異的に結合する多座選択的高親和性リガンド（ＳＨＡＬ）および／または癌細胞に特異的に結合する多座選択的高親和性リガンド（ＳＨＡＬ）をエフェクター（例えば、薬物、リポソーム、細胞毒、放射性核種もしくはキレート剤）に結合された状態で含むキメラ分子と接触させることを伴う。
【００２２】
一部の特定の実施形態において、本発明は、所望の標的に特異的に結合するＳＨＡＬを提供する。標的は、結合部分の作出が所望される任意の標的であり得る。ＳＨＡＬは、典型的には、直接またはリンカーを介して連接された２つ以上のリガンドを含み、ここで、第１のリガンドは標的上の第１の部位に結合（ｔｈａｔ  ｂｉｎｄ）し、第２および／または第３のリガンドは、同じ標的マーカー上の標的上の第２および／または第３の部位に結合し、ここで、第１、第２および／または第３の部位は異なる部位である（例えば、３つのリガンドはすべて、標的（１つまたは複数）に同時に結合し得るものである）。一部の特定の実施形態において、第１、第２および／または第３の部位は、標的（１つまたは複数）上のポケット（または「隆起」）である。一部の特定の実施形態において、第１、第２および／または第３の部位は同じ標的分子上にある。
【００２３】
また、本発明は、種々の検出方法を提供する。一部の特定の実施形態において、本発明は、癌細胞の検出方法を提供する。該方法は、典型的には、癌細胞を、該癌細胞（例えば、癌マーカー）に特異的に結合するＳＨＡＬを検出可能な標識（例えば、γ放射体、ポジトロン放射体、Ｘ線放射体、α放射体、蛍光放射体など）に結合された状態で含むキメラ分子と接触させること、および該検出可能な標識の有無を検出することを伴う。一部の特定の実施形態において、該方法は、典型的には、癌細胞を、該癌細胞（例えば、癌マーカー）に特異的に結合するエピトープタグに結合されたＳＨＡＬを含むキメラ分子（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と接触させること；該キメラ分子を、検出可能な部分を含むキレートと接触させること、ここで、該キレートが該エピトープタグに結合し、それにより該検出可能な部分が該キレートと結合する；および該検出可能な部分を検出することを伴う。一部の特定の実施形態において、検出可能な部分は、放射性核種（例えば、γ放射体、ポジトロン放射体、α放射体、Ｘ線放射体など）である。一部の特定の実施形態において、該検出は、外部からの画像化および／または内部からの画像化を含む。一部の特定の実施形態において、検出可能な部分は、９９Ｔｃ、２０３Ｐｂ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、１１１Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、９７Ｒｕ、６２Ｃｕ、６４１Ｃｕ、５２Ｆｅ、５２ｍＭｎ、５１Ｃｒ、１８６、Ｒｅ、１８８Ｒｅ、７７Ａｓ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、１６９Ｅｒ、１２１Ｓｎ、１２７Ｔｅ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１９８Ａｕ，１９９Ａｕ、１６１Ｔｂ、１０９Ｐｄ、１６５Ｄｙ、１４９Ｐｍ、１５１Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５７Ｇｄ、１５９Ｇｄ、１６６Ｈｏ、１７２Ｔｍ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１０５Ｒｈ、および１１１Ａｇからなる群より選択される金属同位体を含む。一部の特定の実施形態において、キレートはＤＯＴＡを含む。一部の特定の実施形態において、エピトープタグはアビジンまたはビオチンである。
【００２４】
また、本発明では、本発明のＳＨＡＬおよび／または本発明のＳＨＡＬを含むキメラ分子を作製および／または使用するためのキットが想定される。一部の特定の実施形態において、キットは、本明細書に記載のＳＨＡＬを収容する容器および／または本明細書に記載のＳＨＡＬに組み込むためのリガンドを収容する容器を含む。キット（ｌｉｋｅ）は、任意選択でさらに、１つ以上のリンカー、１つ以上のエフェクター（キレート、放射性核種など）などを含んでいてもよい。一部の特定の実施形態では、ＳＨＡＬを薬理学的に許容され得る賦形剤中に存在させる。
【００２５】
一部の特定の実施形態において、本発明は、ＳＨＡＬを構成する結合部分が抗体、単鎖抗体などであるＳＨＡＬを明白に除外する。一部の特定の実施形態において、ＳＨＡＬは多価抗体または多価単鎖抗体ではない。一部の特定の実施形態において、ＳＨＡＬを構成するリガンドはタンパク質ではない。一部の特定の実施形態において、本発明は、ＳＨＡＬを構成する結合部分が核酸に優先的および／または特異的に結合するＳＨＡＬを明白に除外する。一部の特定の実施形態において、ＳＨＡＬを構成するリガンドは有機小分子である。
【００２６】
定義
用語「特異的結合」または「優先的結合」は、酵素／基質、受容体／アゴニスト、抗体／抗原、およびレクチン／糖質などのペア形成種間に生成される結合であって、共有結合性および／または非共有結合性相互作用によって媒介され得る結合をいう。２つの種の相互作用によって非共有結合性複合体が典型的にもたらされる場合、生成される結合は、典型的には、静電結合および／または水素結合、および／または脂肪親和性相互作用の結果である。したがって、「特異的結合」は種のペア間に生じ、このとき、両者間に相互作用が存在することよって結合複合体がもたらされる。特に、特異的結合は、ペアの一方の構成員の特定の種に対する結合が、該種が属する化合物ファミリー内の他の種に対する該ペアの該構成員の結合と比べて優先的であることを特徴とする。したがって、例えば、リガンドは、ＨＬＡ−ＤＲ１０分子上の特定のポケットに対して、同じタンパク質または関連タンパク質上の異なるポケットに対する親和性よりも少なくとも２倍、好ましくは少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍、または少なくとも１００００倍大きい親和性を示すものであり得る。
【００２７】
用語「リガンド」または「結合部分」は、本明細書で用いる場合、一般的に、特定の標的分子に結合して、上記の結合複合体を形成する分子をいう。該結合は、高度に特異的結合であり得るが、一部の特定の実施形態では、標的分子に対する個々のリガンドの結合は、比較的低い親和性および／または特異性を伴うものであり得る。該リガンドおよびその対応する標的分子は、特異的結合ペアを形成する。例としては、限定されないが、所望の標的分子、標的分子集合体、標的受容体、標的細胞などに特異的に結合する有機小分子、糖類、レクチン、核酸、タンパク質、抗体、サイトカイン、受容体タンパク質、増殖因子、核酸結合性タンパク質などが挙げられる。
【００２８】
用語「有機小分子」は、医薬品に一般的に使用されている有機分子と同等のサイズの分子をいう。該用語は、天然の巨大生物学的分子（例えば、タンパク質、核酸など）を除外する。好ましい有機小分子は、約５０００Ｄａまで、より好ましくは２０００Ｄａまで、最も好ましくは約１０００Ｄａまでのサイズの範囲である。
【００２９】
用語「リガンドのライブラリー」は、リガンドまたは潜在的リガンドの集合体（例えば、複数のもの）をいう。リガンドのライブラリーは、リガンドの実際の物質ライブラリーおよび／またはデータベース（例えば、複数の潜在的リガンドの記述を含む化合物データベース、例えば、ＭＤＬ（登録商標）Ａｖａｉｌａｂｌｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ，ＣｈｅｍＳｐｉｄｅｒなど）であり得る。
【００３０】
用語「ＳＨＡＬ」は、複数のリガンドを含む分子であって、該リガンドの各々が、ＳＨＡＬが指向される標的分子の異なる領域に結合する分子をいう。該リガンドは直接またはリンカーを介してのいずれかで一緒に連接され、典型的には標的分子に対して高いアビディティを示す多座部分を形成する。一部の特定の実施形態において、ＳＨＡＬは、その標的に低親和性（例えば、＜１０−６Ｍ）で結合する（および／または、数秒以内に解離する）が、一緒にカップリングされると、標的に高親和性（例えば、＞１０−６Ｍもしくは＞１０−７Ｍもしくは＞１０−８Ｍ）で結合する（および／またはゆっくりと、例えば数時間から数日間で解離する）ＳＨＡＬを形成する２つ以上のリガンドを含む。
【００３１】
用語「多座」は、ＳＨＡＬに関して用いる場合、ＳＨＡＬが２つ以上のリガンドを含むことを示す。該リガンドは、典型的には、ＳＨＡＬが指向される標的の異なる部分に結合する。
【００３２】
用語「二座」、「三座」などは、ＳＨＡＬに関して用いる場合、２つのリガンドからなるＳＨＡＬ、３つのリガンドからなるＳＨＡＬなどをいう。
【００３３】
用語「多価ＳＨＡＬ」は、２つ以上のＳＨＡＬ（例えば、２つ以上の二座ＳＨＡＬ）が一緒に連接された分子をいう。したがって、例えば、二価ＳＨＡＬは、２つのＳＨＡＬが一緒に連接された分子をいう。三価ＳＨＡＬは、３つのＳＨＡＬが一緒に連接された分子をいう、などである。二価型の二座ＳＨＡＬ  ＪＰ４５９Ｂを図１４に示す。
【００３４】
「多重特異的ＳＨＡＬ」は、一緒に連接された２つ以上のＳＨＡＬであって、各ＳＨＡＬが多座であり、いずれかまたは両方が多価に合成（あるいは作製）されたものであり得、そのため、各ＳＨＡＬについて２種類以上の標的を有するようになっているものをいう（多リガンドの組）。例えば、ＳＨＡＬは、ＨＬＡ−ＤＲの空洞と、ＣＤＸＸ、例えばＣＤ２０もしくはＣＤ２２上の空洞、または３つ全部などに対する２つ以上のリガンドを有するように合成され得る。別の例は、一部リンパ腫が従来のＨＬＡ−ＤＲとＣＤ受容体とＭＵＣ−１（上方調節）を過剰発現しているため、ＭＵＣ−１  ＳＨＡＬと抗リンパ腫（ａｎｔｉｌｙｐｈｏｍａ）ＳＨＡＬとの連接を伴うものである。ＨＬＡ−ＤＲの空洞とキレート（例えば、ＤＯＴＡ）に対する空洞などに対して２つ以上のリガンドを有するように合成されたＳＨＡＬは、一価または二価のＳＨＡＬが悪性細胞を標的化し、第１のＳＨＡＬによって悪性細胞に輸送される該薬物を活性化することが意図された後で送達される薬剤（例えば、ＤＯＴＡキレート化放射性金属またはプロドラッグ）を、一価または二価の第２のモジュールが捕捉する。
【００３５】
用語「バーチャルインシリコ」は、例えばスクリーニング法に関して用いる場合、対象部分の実際の物質のスクリーニングなしで行なわれる方法をいう。典型的には、バーチャルインシリコスクリーニングは、コンピュータ処理により、例えば、目的の具体的な分子のモデルを用いて行なわれる。一部の特定の実施形態において、該バーチャル法は、対象分子の物理的モデルを用いて、および／または簡単な目視検査と操作によって行なわれ得る。
【００３６】
語句「ＳＨＡＬの標的」は、二座または多座ＳＨＡＬによって特異的に結合される部分をいう。
【００３７】
語句「〜に見られるアルゴリズム」、例えば、「ＳＰＨＧＥＮに見られるアルゴリズム」は、言及したソフトウェアによって実行される（言及したソフトウェアに見られる）アルゴリズムをいう。しかしながら、アルゴリズムは、手作業によるものであってもよく、言及したソフトウェア以外のプログラムによるものであってもよいが、やはり言及したソフトウェアに見られるアルゴリズムの使用に相当するものである。
【００３８】
用語「ポケット」は、タンパク質内のポケットに言及している場合、タンパク質が機能性となる３次元構造にペプチド鎖がフォールディングした結果として生じたタンパク質分子の表面における空洞、へこみまたは凹部をいう。ポケットは、タンパク質構造の検査によって、および／または市販のモデル設計ソフトウェア（例えば、ＤＯＣＫ）を使用することにより容易に認識され得る。
【００３９】
用語「癌マーカー」は、癌の診断および予後に有用なタンパク質などの生体分子をいう。本明細書で用いる場合、「癌マーカー」としては、限定されないが、ＰＳＡ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、α−フェトタンパク質、癌胎児抗原、癌抗原（ＣＡ）１２５、ＣＡ  １５−３、ＣＤ２０、ＣＤＨ１３、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、Ｄ１６Ｓ４２２ＨＥＲ−２、ホスファチジルイノシトール  ３−キナーゼ（ＰＩ  ３−キナーゼ）、トリプシン、α（１）−抗トリプシンと複合体形成したトリプシン−１、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、ｃ−ｅｒｂＢ−２、ｂｃｌ−２、Ｓ−期分画（ＳＰＦ）、ｐ１８５ｅｒｂＢ−２、低親和性インスリン様増殖因子結合タンパク質、尿路組織因子、血管内皮増殖因子、上皮増殖因子、上皮増殖因子受容体、アポトーシスタンパク質（ｐ５３、Ｋｉ６７）、第ＶＩＩＩ因子、接着タンパク質（ＣＤ−４４、シアリル−ＴＮ、血液型Ａ、細菌ｌａｃＺ、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、α−ジフルオロメチルオルニチン（ＤＦＭＯ）、チミジンホスホリラーゼ（ｄＴＨｄＰａｓｅ）、トロンボモジュリン、ラミニン受容体、フィブロネクチン、抗サイクリン、抗サイクリンＡ、ＢまたはＥ、増殖関連核抗原、レクチンＵＥＡ−１、ＣＥＡ、ｌ６、およびフォン・ビルブラント因子が挙げられる。
【００４０】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において互換的に用い、アミノ酸残基のポリマーをいう。該用語は、天然アミノ酸ポリマーと同様に、１つ以上のアミノ酸残基が対応天然アミノ酸の人工化学物質類似体であるアミノ酸ポリマーに適用される。また、該用語は、ポリペプチドを構成するアミノ酸を連接する従来のペプチド結合に対するバリアントを含む。
【００４１】
用語「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または文法的相当語句は、本明細書において、一緒に共有結合された少なくとも２つのヌクレオチドをいう。本発明の核酸は、好ましくは単鎖または二本鎖であり、一般的にはホスホジエステル結合を含むものであるが、一部の場合では、以下に概略を示す核酸類似体を包含し、該核酸類似体は、例えば，ホルホルアミド（Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９（１０）：１９２５）およびそこに挙げられた参考文献；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ（１９７０）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．３５：３８００；Ｓｐｒｉｎｚｌら（１９７７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１：５７９；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：３４８７；Ｓａｗａｉら（１９８４）Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５，Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０；およびＰａｕｗｅｌｓら（１９８６）Ｃｈｅｍｉｃａ  Ｓｃｒｉｐｔａ  ２６：１４１９）、ホスホロチオエート（Ｍａｇら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：１４３７；および米国特許第５，６４４，０４８号）、ホスホロジチオエート（Ｂｒｉｕら（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：２３２１、Ｏ−メチルホスホロ（ｐｈｏｐｈｏｒｏ）アミダイト結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ参照）、ならびにペプチド核酸主鎖および結合（Ｅｇｈｏｌｍ（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：１８９５；Ｍｅｉｅｒら（１９９２）Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３１：１００８；Ｎｉｅｌｓｅｎ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ，３６５：５６６；Ｃａｒｌｓｓｏｎら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：２０７参照）を含む代替的な主鎖を有するものであり得る。他の類似体核酸としては、プラスの主鎖（Ｄｅｎｐｃｙら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：６０９７；非イオン性主鎖（米国特許第５，３８６，０２３号，同第５，６３７，６８４号，同第５，６０２，２４０号，同第５，２１６，１４１号および同第４，４６９，８６３号；Ａｎｇｅｗ．（１９９１）Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌｉｓｈ  ３０：４２３；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８８）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１０：４４７０；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  １３：１５９７；第２章および第３章，ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０，“Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋ；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら（１９９４），Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：３９５；Ｊｅｆｆｓら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＮＭＲ  ３４：１７；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３７：７４３（１９９６））および非リボース主鎖（例えば、米国特許第５，２３５，０３３号および同第５，０��４，５０６号ならびに第６章および第７章，ＡＳＣ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  ５８０，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｅｄ．Ｙ．Ｓ．Ｓａｎｇｈｕｉ  ａｎｄ  Ｐ．Ｄａｎ  Ｃｏｏｋに記載のもの）を有するものが挙げられる。また、１つ以上の炭素環式糖類を含む核酸も核酸の定義に含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓら（１９９５），Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．ｐｐｌ６９−１７６参照）。いくつかの核酸類似体が、Ｒａｗｌｓ，Ｃ  ＆  Ｅ  Ｎｅｗｓ  Ｊｕｎｅ  ２，１９９７  第３５頁に記載されている。リボース−リン酸主鎖のこのような修飾は、標識などのさらなる部分の付加を容易にするため、または生理学的環境内でのかかる分子の安定性および半減期を増大させるために行なわれ得る。
【００４２】
用語「ビオチン」は、アビジンまたは種々のアビジン類似体に結合し得るビオチンおよび修飾ビオチンまたはビオチン類似体をいう。「ビオチン」は、とりわけ、１つ以上の付加末端の付加によって（通常、その遊離カルボキシル残基を介して）修飾され得る。有用なビオチン誘導体としては、限定されないが、付加された化合物またはポリマー上のアミン、アシルまたはアルキル基、カルボニル基、ハロゲン化アルキルまたはＭｉｃｈａｅｌ型アクセプターなどの相補的な（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）反応性基とカップリングされた活性エステル、アミン、ヒドラジドおよびチオール基が挙げられる。
【００４３】
アビジンは、典型的には卵白に見られ、Ｂ複合体ビタミンであるビオチンに対して非常に高い結合親和性を有する（Ｗｉｌｃｈｅｃｋら（１９８８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ、１７１：１）。ストレプトアビジンは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｉｄｉｎｉｉに由来し、アビジンと類似しているが非特異的組織結合性が低く、したがって多くの場合、アビジンの代わりに使用される。本明細書で用いる場合、「アビジン」は、天然状態または修飾形態のいずれかであるそのあらゆる生物学的形態を包含する。また、例えば、該タンパク質の糖質残基を除去する処理が施されたアビジン修飾形態（「脱グリコシル化アビジン」）、および／またはその高度塩基性電荷アビジン修飾形態（「ニュートラルアビジン」）も、本発明において有用である。
【００４４】
用語「残基」は、本明細書で用いる場合、天然、合成または修飾アミノ酸をいう。
【００４５】
本明細書で用いる場合、「抗体」は、実質的に免疫グロブリン遺伝子または免疫グロブリン遺伝子断片にコードされた１つ以上のポリペプチドからなるタンパク質をいう。認知されている免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、κまたはλのいずれかに分類される。重鎖は、γ、μ、α、δまたはεに分類され、これにより、それぞれ、さらに免疫グロブリン類型ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥが規定される。
【００４６】
典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体で構成されていることが知られている。各四量体は２つの同一のポリペプチド鎖ペアで構成されており、各ペアは、１つの「軽」（約２５ｋＤ）と１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端には、主に抗原認識を担う約１００〜１１０個またはそれ以上のアミノ酸の可変領域が画定される。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれ、このような軽鎖および重鎖をいう。
【００４７】
抗体は、インタクトな免疫グロブリンとして、または種々のペプチダーゼでの消化によって生成されるいくつかの充分特性評価された断片として存在する。したがって、例えば、ペプシンは抗体をヒンジ領域内のジスルフィド結合の下で消化し、Ｆａｂ（これ自体は、ＶＨ−ＣＨ１にジスルフィド結合によって連接された軽鎖である）の二量体であるＦ（ａｂ）’２を生成させる。Ｆ（ａｂ）’２は、ヒンジ領域内のジスルフィド結合を破壊する穏やかな条件下で還元され得、それにより（Ｆａｂ’）２二量体がＦａｂ’単量体に変換される。Ｆａｂ’単量体は、本質的にヒンジ領域の一部を有するＦａｂである（他の抗体断片のより詳細な説明については、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）参照）。種々の抗体断片は、インタクトな抗体の消化の観点から規定されるが、当業者には、かかるＦａｂ’断片が化学的に、または組換えＤＮＡ方法論の使用のいずれかでデノボ合成され得ることは認識されよう。したがって、抗体という用語はまた、本明細書で用いる場合、完全抗体の修飾または組換えＤＮＡ方法論を用いたデノボ合成のいずれかによって作製される抗体断片も含む。好ましい抗体としては、単鎖抗体（単一のポリペプチド鎖として存在する抗体）、より好ましくは単鎖Ｆｖ抗体（ｓＦｖまたはｓｃＦｖ）（可変重鎖と可変軽鎖が一緒に連接されており（直接またはペプチドリンカーを介して）、連続ポリペプチドを形成している）が挙げられる。単鎖Ｆｖ抗体は、共有結合されたＶＨ−ＶＬヘテロ二量体であり、これは、ＶＨコード配列とＶＬコード配列（直接連接されているか、またはペプチドコードリンカーによって連接されているかのいずれかである）を含む核酸から発現され得る。Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９−５８８３。ＶＨとＶＬは、各々に単一のポリペプチド鎖として連結されているが、ＶＨドメインとＶＬドメインは非共有結合により関連している。糸状ファージの表面上に発現される第１の機能性抗体分子は単鎖Ｆｖ’ｓ（ｓｃＦｖ）であったが、別の発現ストラテジーでも成功裡であった。例えば、Ｆａｂ分子は、一方の鎖（重鎖または軽鎖）がｇ３キャプシドタンパク質に融合しており、相補鎖がペリプラズム内に可溶性分子として移行されると、ファージ上にディスプレイされ得る。この２つの鎖は、同じレプリコンにコードされていてもよく、異なるレプリコンにコードされていてもよい；重要な点は、各Ｆａｂ分子内の２つの抗体鎖は翻訳後に合成され、該二量体はファージ粒子内に、一方の鎖が例えばｇ３ｐに結合することによって組み込まれるということである（例えば、米国特許第５７３３７４３号参照）。ｓｃＦｖ抗体、ならびに天然では集合しているが化学的に分離される抗体Ｖ領域由来の軽鎖および重鎖ポリペプチドを、抗原結合部位の構造と実質的に類似した３次元構造にフォールディングする分子に変換させるいくつかの他の構造は、当業者にはわかる（例えば、米国特許第５，０９１，５１３号、同第５，１３２，４０５号および同第４，９５６，７７８号参照）。特に好ましい抗体は、ファージまたは酵母上にデ��スプレイされたものすべて（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂおよびジスルフィド結合Ｆｖ（Ｒｅｉｔｅｒら（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８：１３２３−１３３１）を含むものであるのがよい。
【００４８】
用語「特異的に結合する」は、本明細書で用いる場合、ＳＨＡＬまたは生体分子（例えば、タンパク質、核酸、抗体など）に言及している場合、分子（例えば、タンパク質および他の生物学的物質）の不均一系集団内のＳＨＡＬまたは生体分子の存在に決定的な結合反応をいう。したがって、指定の条件（例えば、ＳＨＡＬの場合では結合アッセイ条件、あるいは核酸の場合ではストリンジェントハイブリダイゼーション条件）下では、明記したリガンドまたはＳＨＡＬは、その特定の「標的」分子に優先的に結合し、試料中に存在する他の分子には有意な量で優先的に結合しない。
【００４９】
「エフェクター」は、その活性が標的（例えば、特性マーカーをディスプレイしている細胞）に送達／および／または局在されることが所望される任意の分子または分子の組合せをいう。エフェクターとしては、限定されないが、標識、細胞毒、酵素、増殖因子、転写因子、薬物、脂質、リポソームなどが挙げられる。
【００５０】
「レポーター」は、検出可能なシグナルをもたらす（例えば、検出可能な標識である）エフェクターである。一部の特定の実施形態において、レポーターは、検出可能なシグナルそれ自体をもたらすものである必要はなく、単に、検出可能な標識に後で結合し得る部分をもたらすものであってもよい。
【００５１】
用語「同類置換」は、タンパク質またはペプチドに関して、分子の活性（特異性または結合親和性）を実質的に改変しないアミノ酸置換を反映するために用いる。典型的には、同類アミノ酸置換は、あるアミノ酸を、類似した化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する別のアミノ酸で置き換えることを伴う。以下の６つの群は、各々、互いに典型的な同類置換となるアミノ酸を含む：１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００５２】
用語「エピトープタグ」または「親和性タグ」は、本明細書において互換的に用い、通常、抗体または他の結合パートナーによって特異的に認識される分子または分子のドメインをいう。また、該用語は結合パートナー複合体も示す。したがって、例えば、ビオチンまたはビオチン／アビジン複合体は、どちらも親和性タグとみなされる。エピトープ／抗体相互作用において認識されるエピトープに加え、親和性タグは、他の結合分子によって認識される「エピトープ」（例えば、受容体によって結合されるリガンド）、他のリガンドによって結合され、ヘテロ二量体もしくはホモ二量体を形成するリガンド、Ｎｉ−ＮＴＡによって結合されるＨｉｓ６、アビジン、ストレプトアビジンまたは抗ビオチン抗体によって結合されるビオチンなども含む。
【００５３】
エピトープタグは、当業者には充分わかる。さらに、多種多様なエピトープタグに特異的な抗体が市販されている。このようなものとしては、限定されないが、ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１）エピトープに対する抗体、ｃ−ｍｙｃ抗体（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓから入手可能）、ＨＮＫ−１糖鎖エピトープ、ＨＡエピトープ、ＨＳＶエピトープ、Ｈｉｓエピトープ特異的抗体（例えば、Ｑｉａｇｅｎ参照）によって認識されるＨｉｓ４、Ｈｉｓ５およびＨｉＳ６エピトープなどが挙げられる。また、エピトープタグ化タンパク質に対するベクターも市販されている。したがって、例えば、ｐＣＭＶ−Ｔａｇ１ベクターは、哺乳動物細胞における遺伝子発現のために設計されたエピトープタグ化ベクターである。ｐＣＭＶ−Ｔａｇ１ベクター内に挿入される標的遺伝子は、ＦＬＡＧ（登録商標）エピトープ（Ｎ末端、Ｃ末端または内部タグ化）、ｃ−ｍｙｃエピトープ（Ｃ末端）またはＦＬＡＧ（Ｎ末端）エピトープとｃ−ｍｙｃ（Ｃ末端）の両エピトープでタグ化され得る。
【００５４】
ＰＥＧ型リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むリンカーをいう。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
癌細胞に特異的に結合する選択的高親和性リガンド（ＳＨＡＬ）であって、前記ＳＨＡＬは、前記癌細胞のマーカー上の第１の部位に結合する第１のリガンドを、前記癌細胞の同じマーカーまたは異なるマーカー上の第２の部位に結合する第２のリガンドに連結された状態で含み、前記第１の部位と前記第２の部位は異なる部位であり；
少なくとも前記第１のリガンドは、ＢＯＣ−４−アミノメチル−Ｌ−Ｐｈｅ、４［［５−（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イル］オキシ］フェニル］Ｎ−フェニルカルバメート、（Ｒ）−２−［４−（５−クロロ−３−フルオロ−２−ピリジルオキシ）フェノキシ］プロピオン酸、２−（（（３−クロロ−５（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イルオキシ）フェノキシ）メチル）アクリレート、２−（（（３−クロロ−５（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イルオキシ）フェニル）メチル）アクリレート、２−（（（３−クロロ−５（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イルオキシ）フェニル）メチル）アクリロニトリル、３−（３−クロロ−４−｛［５−（トリフルオロメチル）−２−ピリジニル］オキシ｝アニリノ）−３−オキソプロパン酸、セトキシジム、クレトジム、５−（テトラデシルオキシ）−２−フロン酸、２−［（２，６−ジクロロフェニル）アミノ］ベンゼン酢酸、２−［４−（４−クロロフェノキシ）フェノキシ］プロパン酸、（ＲＳ）−２−｛４−［３−クロロ−５−（トリフルオロメチル）−２−ピリジニル］オキシ］フェノキシ｝プロパン酸、（ＲＳ）−２−［４−（６−クロロ−１，３−ベンゾオキサゾール−２−イルオキシ）フェノキシ］プロパン酸、（ＲＳ）−２−［４−（２，４−ジクロロフェノキシ）フェノキシ］プロパン酸、（ＲＳ）−２−｛４−［５−（トリフルオロメチル）−２−ピリジルオキシ］フェノキシ｝プロパン酸、（ＲＳ）−２−［４−（６−クロロキノキサリン−２−イルオキシ）フェノキシ］プロパン酸、（ＲＳ）−２−［４−（α，α，α−トリフルオロ−ｐ−トリルオキシ）フェノキシ］プロパン酸、５−（［４，６−ジクロロトリアジン−２−イル］アミノ）フルオレセイン塩酸塩、３−［Ｎ−（４−アセチルフェニル）カルボモイル］ピリジン−２−カルボン酸、３−（２−｛［３−クロロ−５−（トリフルオロメチル）−２−ピリジニル］オキシ｝アニリノ）−３−オキソプロパン酸、Ｌ−オルニチン−β−アラニン、２−メチル−１−（３−モルホリノプロピル）−５−フェニル−１Ｈ−ピロール−３−カルボン酸、馬尿酸、ヒップリル−Ｄ−リジン、およびヒップリル−Ｌ−フェニルアラニンからなる群より選択されるリガンドである、ＳＨＡＬ。
（項目２）
前記第２のリガンドが有機小分子である、項目１に記載のＳＨＡＬ。
（項目３）
前記第１のリガンドが、第２のリガンドが結合する部位とは異なる部位に結合する、項目１に記載のＳＨＡＬ。
（項目４）
前記第１の部位が前記マーカー上のポケットである、項目１に記載のＳＨＡＬ。
（項目５）
前記第２の部位が前記マーカー上のポケットである、項目４に記載のＳＨＡＬ。
（項目６）
前記マーカーがＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原である、項目１に記載のＳＨＡＬ。
（項目７）
前記第１のリガンドと前記第２のリガンドが、Ｌｙｍ−１抗体によって認識されるエピトープ内の部位に結合する、項目１に記載のＳＨＡＬ。
（項目８）
前記第１のリガンドが有機小分子である、項目１に記載のＳＨＡＬ。
（項目９）
前記第２のリガンドが有機小分子である、項目８に記載のＳＨＡＬ。
（項目１０）
前記第２のリガンドが、表１、５、６、７または８から選択されるリガンドである、項目１に記載のＳＨＡＬ。
（項目１１）
さらに第３のリガンドを含む三座である、項目１に記載のＳＨＡＬ。
（項目１２）
前記第２のリガンドと前記第３のリガンドが、独立して、表１、５、６、７または８に示すリガンドの群から選択される、項目１１に記載のＳＨＡＬ。
（項目１３）
前記第１のリガンドが、４−（ジメチルアミノ）アゾベンゼン−４’−スルホニル−Ｌ−バリン（Ｄｖ）であり；
前記第２のリガンドが、４−［４−（４−クロロベンジル）ピペラジノ］−３−ニトロベンゼンカルボン酸（Ｃｂ）であり；
前記第３のリガンドが、４［［５−（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イル］オキシ］フェニル］Ｎ−フェニルカルバメート、（Ｒ）−２−［４−（５−クロロ−３−フルオロ−２−ピリジルオキシ）フェノキシ］プロピオン酸、２−（（（３−クロロ−５（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イルオキシ）フェノキシ）メチル）アクリレート、２−（（（３−クロロ−５（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イルオキシ）フェニル）メチル）アクリレート、２−（（（３−クロロ−５（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イルオキシ）フェニル）メチル）アクリロニトリル、３−（３−クロロ−４−｛［５−（トリフルオロメチル）−２−ピリジニル］オキシ｝アニリノ）−３−オキソプロパン酸、セトキシジム、クレトジム、５−（テトラデシルオキシ）−２−フロン酸、２−［（２，６−ジクロロフェニル）アミノ］ベンゼン酢酸、２−［４−（４−クロロフェノキシ）フェノキシ］プロパン酸、（ＲＳ）−２−｛４−［３−クロロ−５−（トリフルオロメチル）−２−ピリジニル］オキシ］フェノキシ｝プロパン酸、（ＲＳ）−２−［４−（６−クロロ−１，３−ベンゾオキサゾール−２−イルオキシ）フェノキシ］プロパン酸、（ＲＳ）−２−［４−（２，４−ジクロロフェノキシ）フェノキシ］プロパン酸、（ＲＳ）−２−｛４−［５−（トリフルオロメチル）−２−ピリジルオキシ］フェノキシ｝プロパン酸、（ＲＳ）−２−［４−（６−クロロキノキサリン−２−イルオキシ）フェノキシ］プロパン酸、および（ＲＳ）−２−［４−（α，α，α−トリフルオロ−ｐ−トリルオキシ）フェノキシ］プロパン酸からなる群より選択される、
項目１１に記載のＳＨＡＬ。
（項目１４）
表２に示すＳＨＡＬである、項目１２に記載のＳＨＡＬ。
（項目１５）
前記第１のリガンドが前記第２のリガンドに、ＰＥＧ型リンカー、ペプチドまたはペプチド類似体リンカー、アビジン／ビオチンリンカー、直鎖炭素リンカー、複素環式リンカー、分枝鎖炭素リンカー、デンドリマー、核酸リンカー、糖または糖質リンカー、チオールリンカー、エステルリンカー、アミンを含むリンカー、およびカルボキシルを含むリンカーからなる群より選択されるリンカーによって連接されている、項目１に記載のＳＨＡＬ。
（項目１６）
前記第１のリガンド、前記第２のリガンドおよび前記第３のリガンドは互いに、ＰＥＧ型リンカー、ペプチドリンカー、アビジン／ビオチンリンカー、直鎖炭素リンカー、複素環式リンカー、分枝鎖炭素リンカー、デンドリマー、核酸リンカー、糖または糖質リンカー、チオールリンカー、エステルリンカー、アミンを含むリンカー、およびカルボキシルを含むリンカーからなる群より選択される部分を含むリンカーによって連接されている、項目１１に記載のＳＨＡＬ。
（項目１７）
前記リンカーがポリエチレングリコールを含む、項目１５または１６に記載のＳＨＡＬ。
（項目１８）
前記リンカーがポリエチレングリコールとリジンを含む、項目１５または１６に記載のＳＨＡＬ。
（項目１９）
癌細胞に特異的に結合する選択的高親和性リガンド（ＳＨＡＬ）であって、前記ＳＨＡＬが、互いに結合している３つのリガンドを含み、
前記第１のリガンドが、４−（ジメチルアミノ）アゾベンゼン−４’−スルホニル−Ｌ−バリン（Ｄｖ）であり；
前記第２のリガンドが、４−［４−（４−クロロベンジル）ピペラジノ］−３−ニトロベンゼンカルボン酸（Ｃｂ）であり；
前記第３のリガンドが、３−（２−（［３−クロロ−５−（トリフルオロメチル）−２−ピリジニル］オキシ）−アニリノ）−３−オキソプロパン酸（Ｃｔ）またはその類似体からなる群より選択される、
ＳＨＡＬ。
（項目２０）
前記第１のリガンド、前記第２のリガンドおよび前記第３のリガンドは互いに、ＰＥＧ型リンカー、ペプチドリンカー、アビジン／ビオチンリンカー、直鎖炭素リンカー、複素環式リンカー、分枝鎖炭素リンカー、デンドリマー、核酸リンカー、糖または糖質リンカー、チオールリンカー、エステルリンカー、アミンを含むリンカー、およびカルボキシルを含むリンカーからなる群より選択される部分を含むリンカーによって連接されている、項目１９に記載のＳＨＡＬ。
（項目２１）
前記リンカーがポリエチレングリコールを含む、項目２０に記載のＳＨＡＬ。
（項目２２）
前記リンカーがポリエチレングリコールとリジンを含む、項目２０に記載のＳＨＡＬ。
（項目２３）
構造：
【化１】
0005623384.tif 000002
（式中、Ｒ１は、ＣＯＯＨ、リンカー、エフェクター、およびエフェクターに結合されたリンカーからなる群より選択される）
を含む、項目２０に記載のＳＨＡＬ。
（項目２４）
構造：
【化２】
0005623384.tif 000003
（式中、Ｒ２は、エフェクターを含む）
を含む、項目２３に記載のＳＨＡＬ。
（項目２５）
二価である、項目１〜２２いずれか１項に記載のＳＨＡＬ。
（項目２６）
伝達ペプチドに結合されている、項目１〜２５いずれか１項に記載のＳＨＡＬ。
（項目２７）
前記伝達ペプチドが、ＳＶ４０の核局在シグナル、ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質のタンパク質伝達ドメイン、インテグリン結合ペプチド（ＲＧＤペプチド）、ビトロネクチン（ＶＮペプチド）のヘパリン結合ドメイン、ショウジョウバエのアンテナペディアタンパク質、ＶＰ２２、オリゴアルギニン、ラクトシル化ポリ−Ｌ−リジンまたは他のオリゴカチオン、
【化３】
0005623384.tif 000004
からなる群より選択される、項目２６に記載のＳＨＡＬ。
（項目２８）
前記伝達ペプチドがヘキサアルギニンである、項目２６に記載のＳＨＡＬ。
（項目２９）
前記ＳＨＡＬがエフェクターに結合されている、項目１〜２７いずれか１項に記載のＳＨＡＬ。
（項目３０）
前記エフェクターが、エピトープタグ、抗体、第２のＳＨＡＬ、標識、細胞毒、リポソーム、放射性核種、薬物、プロドラッグ、酵素インヒビター、ウイルス粒子、サイトカイン、およびキレートからなる群より選択される、項目２９に記載のＳＨＡＬ。
（項目３１）
前記エフェクターが、アビジンおよびビオチンからなる群より選択されるエピトープタグである、項目２９に記載のＳＨＡＬ。
（項目３２）
前記エフェクターが、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、リシン、アブリンおよびチミジンキナーゼからなる群より選択される細胞毒である、項目２９に記載のＳＨＡＬ。
（項目３３）
前記エフェクターが、９９Ｔｃ、２０３Ｐｂ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、１１１Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、９７Ｒｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、５２Ｆｅ、５２ｍＭｎ、５１Ｃｒ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、７７Ａｓ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、１６９Ｅｒ、１２１Ｓｎ、１２７Ｔｅ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１９８Ａｕ，１９９Ａｕ、１６１Ｔｂ、１０９Ｐｄ、１６５Ｄｙ、１４９Ｐｍ、１５１Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５７Ｇｄ、１５９Ｇｄ、１６６Ｈｏ、１７２Ｔｍ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１０５Ｒｈ、および１１１Ａｇからなる群より選択される金属同位体を含むキレートである、項目２９に記載のＳＨＡＬ。
（項目３４）
前記エフェクターが、α放射体を含むキレートである、項目２９に記載のＳＨＡＬ。
（項目３５）
前記α放射体がビスマス２１３である、項目３４に記載のＳＨＡＬ。
（項目３６）
前記エフェクターが、ＤＯＴＡを含むキレートである、項目２９に記載のＳＨＡＬ。
（項目３７）
前記エフェクターが脂質またはリポソームである、項目２９に記載のＳＨＡＬ。
（項目３８）
前記エフェクターが、３−（２−（［３−クロロ−５−（トリフルオロメチル）−２−ピリジニル］オキシ）−アニリノ）−３−オキソプロパン酸（Ｃｔ）、４［［５−（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イル］オキシ］フェニル］Ｎ−フェニルカルバメート、（Ｒ）−２−［４−（５−クロロ−３−フルオロ−２−ピリジルオキシ）フェノキシ］プロピオン酸、２−（（（３−クロロ−５（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イルオキシ）フェノキシ）メチル）アクリレート、２−（（（３−クロロ−５（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イルオキシ）フェニル）メチル）アクリレート、２−（（（３−クロロ−５（トリフルオロメチル）ピリジン−２−イルオキシ）フェニル）メチル）アクリロニトリル、３−（３−クロロ−４−｛［５−（トリフルオロメチル）−２−ピリジニル］オキシ｝アニリノ）−３−オキソプロパン酸、セトキシジム、クレトジム、５−（テトラデシルオキシ）−２−フロン酸、２−［（２，６−ジクロロフェニル）アミノ］ベンゼン酢酸、２−［４−（４−クロロフェノキシ）フェノキシ］プロパン酸、（ＲＳ）−２−｛４−［３−クロロ−５−（トリフルオロメチル）−２−ピリジニル］オキシ］フェノキシ｝プロパン酸、（ＲＳ）−２−［４−（６−クロロ−１，３−ベンゾオキサゾール−２−イルオキシ）フェノキシ］プロパン酸、（ＲＳ）−２−［４−（２，４−ジクロロフェノキシ）フェノキシ］プロパン酸、（ＲＳ）−２−｛４−［５−（トリフルオロメチル）−２−ピリジルオキシ］フェノキシ｝プロパン酸、（ＲＳ）−２−［４−（６−クロロキノキサリン−２−イルオキシ）フェノキシ］プロパン酸、および（ＲＳ）−２−［４−（α，α，α−トリフルオロ−ｐ−トリルオキシ）フェノキシ］プロパン酸からなる群より選択される、項目２９に記載のＳＨＡＬ。
（項目３９）
ＨＬＡ−ＤＲ１０マーカーを発現する癌細胞の成長または増殖の抑止方法であって、前記癌を、項目１〜３８のいずれか１項に記載の選択的高親和性多座リガンド（ＳＨＡＬ）と接触させる工程を含む方法。
（項目４０）
前記細胞が転移性細胞である、項目３９に記載の方法。
（項目４１）
前記細胞が充実性腫瘍細胞である、項目３９に記載の方法。
（項目４２）
前記癌細胞が悪性Ｂリンパ球である、項目３９に記載の方法。
（項目４３）
前記癌細胞が、非ホジキンリンパ腫または白血病もしくは他のＢ細胞由来悪性疾患と関連している、項目３９に記載の方法。
（項目４４）
薬学的に許容され得る賦形剤および項目１〜３８いずれか１項に記載のＳＨＡＬを含む医薬製剤。
（項目４５）
前記製剤が単位投薬製剤である、項目４４に記載の医薬製剤。
（項目４６）
癌細胞を、検出可能な標識に結合させた項目１〜２５いずれか１項に記載のＳＨＡＬを含むキメラ分子と接触させる工程；および前記検出可能な標識の有無を検出する工程を含む、癌細胞の検出方法。
（項目４７）
前記検出可能な標識が、γ放射体、ポジトロン放射体、Ｘ線放射体、α放射体、および蛍光放射体からなる群より選択される、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
癌細胞を、エピトープタグに結合させた項目１〜２５いずれか１項に記載のＳＨＡＬを含むキメラ分子と接触させる工程；前記キメラ分子を、検出可能な部分を含むキレートと接触させる工程、ここで、前記キレートが前記エピトープタグに結合し、それにより前記検出可能な部分が前記キレートと結合する；および前記検出可能な部分を検出する工程を含む、癌細胞の検出方法。
（項目４９）
前記検出可能な部分が放射性核種である、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
前記検出可能な部分が、γ放射体、ポジトロン放射体、α放射体、Ｘ線放射体、および蛍光放射体からなる群より選択される、項目４８に記載の方法。
（項目５１）
前記検出が、外部からの画像化を含む、項目４８に記載の方法。
（項目５２）
前記検出が、内部からの画像化を含む、項目４８に記載の方法。
（項目５３）
前記検出可能な部分が、９９Ｔｃ、２０３Ｐｂ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、１１１Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、９７Ｒｕ、６２Ｃｕ、６４１Ｃｕ、５２Ｆｅ、５２ｍＭｎ、５１Ｃｒ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、７７Ａｓ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、１６９Ｅｒ、１２１Ｓｎ、１２７Ｔｅ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１９８Ａｕ，１９９Ａｕ、１６１Ｔｂ、１０９Ｐｄ、１６５Ｄｙ、１４９Ｐｍ、１５１Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５７Ｇｄ、１５９Ｇｄ、１６６Ｈｏ、１７２Ｔｍ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１０５Ｒｈ、および１１１Ａｇからなる群より選択される金属同位体を含む、項目４８に記載の方法。
（項目５４）
前記キレートがＤＯＴＡを含む、項目４８に記載の方法。
（項目５５）
前記エピトープタグがアビジン、ビオチンまたは酵素である、項目４８に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、標的（例えば、Ｌｙｍ−１エピトープ（赤、緑、黄色のアミノ酸）を含むＨＬＡ−ＤＲ１０）の表面上の２つの特殊な部位に結合する個々のリガンド（青）を同定し、これらを一緒に合成的に連結させ、両方の部位に結合する分子を生成させることによりＳＨＡＬを作製する方法を示す。
【図２】図２は、例えば、正常組織とリンパ球性新生物の両方を多数含む組織マイクロアレイの使用を示す。これらの組織は、ビオチンタグ化ＳＨＡＬで処理され、ローダミンタグ化ストレプトアビジンですすぎ洗いされ、ＳＨＡＬの結合が蛍光顕微鏡検査によって評価され得る。
【図３】図３は、ヘマトキシリン／エオシン染色され、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織コアを含むヒト組織マイクロアレイを示す。４つのパネルはすべて、１つのＳｃａｎＳｃｏｐｅデジタル画像から得たものである。これは、高解像度のアーカイブ画像を示す。同様の画像が、免疫組織化学試験またはＳＨＡＬ結合試験でも得られ得る。このように、該アレイを用いた研究者はすべて、該アレイに適用されるすべての試験を容易に利用可能であった。
【図４Ａ】図４Ａは、正常なＭＵＣ−１の構成を示す。同様に良好な標的である異常なＭＵＣ１は、グリコシル化度が低く、露出したＶＮＴＲおよび縦列反復単位：２０  ａａ  ＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨ（配列番号２）を有する。図４Ｂは、ＭＵＣ−１の縦列（ｔａｎｄｏｍ）反復ドメインの保存された構造的特徴を示す。この特徴は、縦列反復インターフェース（残基１７〜２７、３７〜４７）にまたがる連続逆ターンからなるこぶ（ｋｎｏｂ）様構造の反復および突出と、ポリプロリンＩＩおよびβ鎖構造（残基１０〜１５、３０〜３５、５０〜５５）からなる伸長領域とを含む。Ｎ末端およびＣ末端の２〜３個の残基は、縦列反復単位の連接がないため無秩序である。
【図４Ｂ】図４Ａは、正常なＭＵＣ−１の構成を示す。同様に良好な標的である異常なＭＵＣ１は、グリコシル化度が低く、露出したＶＮＴＲおよび縦列反復単位：２０  ａａ  ＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡＨ（配列番号２）を有する。図４Ｂは、ＭＵＣ−１の縦列（ｔａｎｄｏｍ）反復ドメインの保存された構造的特徴を示す。この特徴は、縦列反復インターフェース（残基１７〜２７、３７〜４７）にまたがる連続逆ターンからなるこぶ（ｋｎｏｂ）様構造の反復および突出と、ポリプロリンＩＩおよびβ鎖構造（残基１０〜１５、３０〜３５、５０〜５５）からなる伸長領域とを含む。Ｎ末端およびＣ末端の２〜３個の残基は、縦列反復単位の連接がないため無秩序である。
【図５】図５は、抗ｍｕｃ１モノクローナル抗体で染色した前立腺癌組織アレイを示す。
【図６】図６は、前立腺癌が、悪性度および病期に関連するＭＵＣ−１ペプチド染色の増大を有したことを示す。
【図７】図７は、悪性度４の前立腺癌内の標的エピトープを示す抗ＭＵＣ１ペプチドコアＭｏＡｂ  ＢｒＥ−３を示す。ＭＵＣ−１上のこぶは、前立腺癌の悪性度が違うことによって異なる。そのため、こぶに結合し、悪性組織の悪性度分類に使用され得るＳＨＡＬが設計され得る。
【図８】図８は、ＨＬＡ−ＤＲ分子と既知の結晶構造とのアミノ酸配列アラインメントを示す。ＰＤＢコードにより、ＨＬＡ−ＤＲ１（１ａｑｄ）、ＨＬＡ−ＤＲ２（１ｂｘ２）、ＨＬＡ−ＤＲ３（１ａ６ａ）およびＨＬＡ−ＤＲ４分子（１ｄｍ５）配列が同定される。１ｉ３ｒは、相同なＭＨＣ融合タンパク質である。Ｈ１ａ＿ＤＲ１０：（配列番号３）、１ａｑｄ＿Ｂ：（配列番号４）、１ｄ５ｍ＿Ｂ（配列番号５）、１ｂｘ２＿Ｂ：（配列番号６）、１ａ６ａ＿Ｂ：（配列番号７）、１ｉ３ｒ＿Ｂ：（配列番号８）。
【図９】図９は、ＨＬＡ−ＤＲ１０のβサブユニットの相同性モデルの図であり、２つの構造ドメインを示す（色の付表参照）。
【図１０】図１０は、ＨＬＡ−ＤＲ３結晶構造（薄い青、透明な原子）とＨＬＡ−ＤＲ１０の相同性モデル（濃い青、黒い原子）の重ね合わせを示し、Ｌｙｍ−１エピトープを含むβサブユニットの領域における構造的類似性を示す。Ｌｙｍ−１結合に不可欠なアミノ酸残基を空間充填原子として示す。
【図１１】図１１は、ＨＬＡ−ＤＲ１０のβサブユニットとＨＬＡ−ＤＲ３のβサブユニットのサーフェースプロットを示し、Ｌｙｍ−１エピトープを含む該タンパク質の領域内の「ポケット」の構造の違いを示す。電荷の分布を、濃い青（正または塩基性）、赤（負または酸性）および薄い青（中性または疎水性）で示す。システイン内のイオウ原子を黄色で示す。
【図１２】図１２は、部位１（赤）および部位２（青）と表示した２つの「ポケット」の位置を示す。これらは、ＨＬＡ−ＤＲ１０のβ−サブユニット上でのＬｙｍ−１結合に不可欠なアミノ酸（黄色）を囲んでいる。これらの２つの部位を、リガンド結合のために標的化し、コンピュータでのドッキング試験において使用した。
【図１３Ａ】図１３Ａおよび１３Ｂは、ＨＬＡ−ＤＲ１０に結合すると確認された個々のリガンドの適切なペアを結合することにより合成される二座ＳＨＡＬを示す。図１３Ａは、その３つの分子を示す。図１３Ｂは、孤立ＨＬＡ−ＤＲ１０にｎＭの親和性で結合することが示されたデオキシコール酸部と５−ｌｅｕ−エンケファリンを一緒に連結させることにより合成される２つのＳＨＡＬを示す。赤い部分は一方のリガンド（デオキシコール酸部）であり、緑は他方のリガンド（例えば、５−ｌｅｕ−エンケファリン）であり、青は、最も短いリンカーを作製するために使用されるリジンであり、黒は、以下のもの：２つのリガンド間のリンカーを長くするために使用されるＰＥＧ分子、および試験目的でＳＨＡＬに結合されるビオチン分子の組合せである。
【図１３Ｂ】図１３Ａおよび１３Ｂは、ＨＬＡ−ＤＲ１０に結合すると確認された個々のリガンドの適切なペアを結合することにより合成される二座ＳＨＡＬを示す。図１３Ａは、その３つの分子を示す。図１３Ｂは、孤立ＨＬＡ−ＤＲ１０にｎＭの親和性で結合することが示されたデオキシコール酸部と５−ｌｅｕ−エンケファリンを一緒に連結させることにより合成される２つのＳＨＡＬを示す。赤い部分は一方のリガンド（デオキシコール酸部）であり、緑は他方のリガンド（例えば、５−ｌｅｕ−エンケファリン）であり、青は、最も短いリンカーを作製するために使用されるリジンであり、黒は、以下のもの：２つのリガンド間のリンカーを長くするために使用されるＰＥＧ分子、および試験目的でＳＨＡＬに結合されるビオチン分子の組合せである。
【図１４】図１４は、二価型のＪＰ４５９Ｂの構造を示す。赤はデオキシコール酸部である；緑は５−ｌｅｕ−エンケファリンである；青はリジンリンカーである；および黒は、ＰＥＧリンカーとビオチンである。
【図１５】図１５は、相同性に基づいたタンパク質モデル設計の主な工程を説明するフローチャートを示す。
【図１６】図１６は、ＤＯＣＫアルゴリズムを示す。（１）「負の画像」は、ポケットに球を充填することにより作成される。（２）候補リガンドはデータベースから検索される。（３）内部間隔は、球中心のサブセットとリガンド原子間で適合させる（通常、３〜８個の中心を選択する）。（４）リガンドは活性部位内に向ける。（５）該向きに対する相互作用を、スコアリング関数によって評価する；このプロセスを、新たな向きについて繰り返す-典型的には、リガンド１つあたり１０，０００個の向きを生成させる。スコアリングが上位の向きを保持する。このプロセスを、データベース内の新たなリガンドについて繰り返す。
【図１７Ａ】図１７Ａおよび１７Ｂは、ＨＬＡ−ＤＲ１０をディスプレイしている細胞に対するＳＨＡＬ  ＪＰ４５９Ｂの結合を示す。図１７Ａは、小細胞型リンパ腫と比べて大細胞型リンパ腫上へのＳＨＡＬ  ＪＰ４５９ＢおよびＬｙｍ−１  Ｍａｂの結合の増大していること（パネルＡ〜Ｄ）、ならびにストレプトアビジンホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＳＨＲＰ）およびビオチン化ＳＨＡＬでコートしたプレート上でＲａｊｉ生細胞では選択的結合がみられる（クリスタルバイオレット染色）が、他の細胞型にはみられないこと（パネルＥ〜Ｈ）を示す。（パネルＡ〜Ｄ）ＳＨＡＬを、ＳＡＨＲＰとともにプレインキュベートし、ＤＡＢ試薬によって検出した。Ｌｙｍ−１結合は、ビオチン化抗マウスＭＡｂ、続いてＳＡＨＲＰおよびＤＡＢを用いて検出した。パネルＡ）大細胞型リンパ腫上のＳＨＡＬ  パネルＢ）小細胞型リンパ腫上のＳＨＡＬ  パネルＣ）大細胞型リンパ腫上のＬｙｍ−１  Ｍａｂ、およびパネルＤ）小細胞型リンパ腫上のＬｙｍ−１  Ｍａｂ。（パネルＥ〜Ｈ）画像は、Ｒａｊｉ生細胞に対するＳＨＡＬ  ＪＰ４５９Ｂの選択的結合を示す（パネルＥ）が、非リンパ腫ＬｎＣＡＰ（パネルＦ）、２２ＲＶ（パネルＧ）またはＤＵ１４５（パネルＨ）細胞株では示されていない。図１７Ｂは、ＳＨＡＬ  ＪＰ４５９Ｂが、ＨＬＡ−ＤＲ１０を含む培養腫瘍生細胞のみに結合することを示す。プレートをストレプトアビジン（ｓｔｅｐｔａｖｉｄｉｎ）で一晩コートし、洗浄し、次いで、ＳＨＡＬを添加し、２時間インキュベートし、次いで、プレートを再度洗浄し、未結合ＳＨＡＬを除去する。次いで、細胞を添加する。細胞を洗浄し、クレシルバイオレットで染色した。
【図１７Ｂ】図１７Ａおよび１７Ｂは、ＨＬＡ−ＤＲ１０をディスプレイしている細胞に対するＳＨＡＬ  ＪＰ４５９Ｂの結合を示す。図１７Ａは、小細胞型リンパ腫と比べて大細胞型リンパ腫上へのＳＨＡＬ  ＪＰ４５９ＢおよびＬｙｍ−１  Ｍａｂの結合の増大していること（パネルＡ〜Ｄ）、ならびにストレプトアビジンホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＳＨＲＰ）およびビオチン化ＳＨＡＬでコートしたプレート上でＲａｊｉ生細胞では選択的結合がみられる（クリスタルバイオレット染色）が、他の細胞型にはみられないこと（パネルＥ〜Ｈ）を示す。（パネルＡ〜Ｄ）ＳＨＡＬを、ＳＡＨＲＰとともにプレインキュベートし、ＤＡＢ試薬によって検出した。Ｌｙｍ−１結合は、ビオチン化抗マウスＭＡｂ、続いてＳＡＨＲＰおよびＤＡＢを用いて検出した。パネルＡ）大細胞型リンパ腫上のＳＨＡＬ  パネルＢ）小細胞型リンパ腫上のＳＨＡＬ  パネルＣ）大細胞型リンパ腫上のＬｙｍ−１  Ｍａｂ、およびパネルＤ）小細胞型リンパ腫上のＬｙｍ−１  Ｍａｂ。（パネルＥ〜Ｈ）画像は、Ｒａｊｉ生細胞に対するＳＨＡＬ  ＪＰ４５９Ｂの選択的結合を示す（パネルＥ）が、非リンパ腫ＬｎＣＡＰ（パネルＦ）、２２ＲＶ（パネルＧ）またはＤＵ１４５（パネルＨ）細胞株では示されていない。図１７Ｂは、ＳＨＡＬ  ＪＰ４５９Ｂが、ＨＬＡ−ＤＲ１０を含む培養腫瘍生細胞のみに結合することを示す。プレートをストレプトアビジン（ｓｔｅｐｔａｖｉｄｉｎ）で一晩コートし、洗浄し、次いで、ＳＨＡＬを添加し、２時間インキュベートし、次いで、プレートを再度洗浄し、未結合ＳＨＡＬを除去する。次いで、細胞を添加する。細胞を洗浄し、クレシルバイオレットで染色した。
【図１８】図１８は、ＮＨリンパ腫由来の組織切片を示し、リンパ腫細胞のＪＰ４５９Ｂ染色が細胞膜に局在していることを示す。
【図１９】図１９は、Ｒａｊｉ腫瘍含有マウスにおける１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ［ＳＨＡＬ  ０７０８０４（ＬｅａｃＰＬＤ）２ＬＰＤｏ］体内分布を示す。
【図２０】図２０は、Ｌｙｍ−１抗体の存在下および非存在下での、Ｒａｊｉ細胞に対する一価の二座ＳＨＡＬおよび二価の二座ＳＨＡＬ  ０７０８０４ＬｅａｃＰＬＤＢの結合を示す。
【図２１】図２１は、種々の類型のＳＨＡＬ標的を示す。
【図２２】図２２は、ＤＯＴＡに結合させたＳＨＡＬを示す。赤い部分は一方のリガンド（デオキシコール酸部）であり、緑は他方のリガンド（５−ｌｅｕ−エンケファリン）であり、青は、最も短いリンカーを作製するために使用されるリジンであり、黒は、以下のもの：２つのリガンド間のリンカーを長くするために使用されるＰＥＧ分子、放射性金属の結合のためにＳＨＡＬに結合させたＤＯＴＡ環の組合せである。
【図２３】図２３は、ＪＰ７００１．２およびトリヨードサイロニン−デオキシコール酸ＳＨＡＬの式を示す。
【図２４Ａ】図２４Ａおよび２４Ｂは、三座ＳＨＡＬ（図２４Ａ）ＤｖＬＰＬＬＣｔＰＣｂＰＬＤｏ；（ダブシル−Ｌ−バリンＰＥＧリジンリジン３−（２−（［３−クロロ−５−トリフルオロメチル）−２−ピリジニル］オキシ）−アニリノ）−３−オキソプロパニオン（ｐｒｏｐａｎｉｏｎｉｃ）酸ＰＥＧ４−［４−（４−クロロベンジル）ピペラジノ］−３−ニトロベンゼンカルボン酸リジン−ＤＯＴＡ、Ｃｔリガンド（図２４Ａ挿入図）を有する；および二量体の三座ＳＨＡＬ（図２４Ｂ）（ＤｖＬＰＬＬＣｔＰＣｂＰＰＰ）２ＬＬＤｏ；（（ダブシル−Ｌ−バリンＰＥＧリジンリジン３−（２−（［３−クロロ−５−トリフルオロメチル）−２−ピリジニル］オキシ）−アニリノ）−３−オキソプロパニオン酸ＰＥＧ４−［４−（４−クロロベンジル）ピペラジノ］−３−ニトロベンゼンカルボン酸ＰＥＧ  ＰＥＧ  ＰＥＧ）２リジンリジン−ＤＯＴＡの２次元の化学構造および頭字語を示す。種々の実施形態において、類似体ビオチン化ＳＨＡＬは、ＤＯＴＡキレートのためのビオチンに置換に関してのみ異なる（各ＳＨＡＬの右上）。
【図２４Ｂ】図２４Ａおよび２４Ｂは、三座ＳＨＡＬ（図２４Ａ）ＤｖＬＰＬＬＣｔＰＣｂＰＬＤｏ；（ダブシル−Ｌ−バリンＰＥＧリジンリジン３−（２−（［３−クロロ−５−トリフルオロメチル）−２−ピリジニル］オキシ）−アニリノ）−３−オキソプロパニオン（ｐｒｏｐａｎｉｏｎｉｃ）酸ＰＥＧ４−［４−（４−クロロベンジル）ピペラジノ］−３−ニトロベンゼンカルボン酸リジン−ＤＯＴＡ、Ｃｔリガンド（図２４Ａ挿入図）を有する；および二量体の三座ＳＨＡＬ（図２４Ｂ）（ＤｖＬＰＬＬＣｔＰＣｂＰＰＰ）２ＬＬＤｏ；（（ダブシル−Ｌ−バリンＰＥＧリジンリジン３−（２−（［３−クロロ−５−トリフルオロメチル）−２−ピリジニル］オキシ）−アニリノ）−３−オキソプロパニオン酸ＰＥＧ４−［４−（４−クロロベンジル）ピペラジノ］−３−ニトロベンゼンカルボン酸ＰＥＧ  ＰＥＧ  ＰＥＧ）２リジンリジン−ＤＯＴＡの２次元の化学構造および頭字語を示す。種々の実施形態において、類似体ビオチン化ＳＨＡＬは、ＤＯＴＡキレートのためのビオチンに置換に関してのみ異なる（各ＳＨＡＬの右上）。
【図２５】図２５Ａおよび２５Ｂは、二量体ＳＨＡＬ（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＬＤｏ（図２５Ａ）およびヘキサアルギニン類似体（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＡｒｇ６ＡｃＬＬＤｏ（図２５Ｂ）の構造を示す。
【図２６】図２６は、Ｒａｊｉ細胞に対する１１１Ｉｎ放射性標識ＳＨＡＬ（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＬＤｏおよびそのヘキサアルギニン類似体（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＡｒｇ６ＡｃＬＬＤｏの結合を示す。Ｒａｊｉ細胞に結合している全１１１Ｉｎ−（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＡｒｇ６ＡｃＬＬＤｏ（未洗浄）、黒四角；Ｒａｊｉ細胞に結合している全１１１Ｉｎ−（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＬＤｏ（未洗浄）、白四角。１０６個の細胞を含む細胞ペレットを０〜２５ｎｇの１１１Ｉｎ標識ＳＨＡＬを含有する１５０μｌの５％ＢＳＡ／ＰＢＳバッファー中に再懸濁させ、室温で１時間インキュベートした。試料を遠心分離して細胞を上清みから分離し、両者を較正済γウェル計数器にて計数し、結合ＳＨＡＬおよび未結合ＳＨＡＬを定量した。エラーバーを各データ点に含めているが、ほとんどの場合において、エラーはデータ点よりも小さく、エラーバーは目に見えない。
【図２７】図２７は、Ｒａｊｉ生細胞に対する親ＳＨＡＬ（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＬＤｏ（上段）の結合を、ヘキサアルギニン類似体（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＡｒｇ６ＡｃＬＬＤｏ（中段）と比較した蛍光３Ｄ共焦点顕微鏡検査を示す。Ｒａｊｉ細胞内の２つの中央細胞焦点面を示す（左から右）。（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＡｒｇ６ＡｃＬＬＤｏ（左パネル、下段）で処理したジャーカット細胞は最小のＳＨＡＬ取込みを示す。Ｌｙｍ−１（右パネル、下段）は、Ｒａｊｉ細胞に対して、主に細胞表面膜結合を示す。親ＳＨＡＬは細胞内結合を示すが、ヘキサアルギニン類似体は、顕著な細胞質結合だけでなく、核内標的化も示す。ＤＡＰＩを核染色剤として使用し、ＡｌｅｘａＦｌｏｒ  ６１０により、ＳＨＡＬの位置を、これらの連続マージレーザー画像にて示す。
【図２８】図２８は、Ｃｔリガンドを含む三座ＳＨＡＬの構造であり、２Ｄの模式的分子構造（上側）および３Ｄの空間充填分子構造（下側）で示す。このＳＨＡＬを作製するために使用したリガンドは、ダブシル−Ｌ−バリン（Ｄｖ）、４−［４−（４−クロロベンジル）ピペラジノ］−３−ニトロベンゼンカルボン酸（Ｃｂ）および（３−（２−（［３−クロロ−５−トリフルオロメチル）−２−ピリジニル］オキシ）−アニリノ）−３−オキソプロパニオン酸）（Ｃｔ）であった。第１のリジン残基により、部分間の共有結合（大環状物質とビオチンの金属結合など）のための遊離アミンがもたらされた。さらなるリジン残基を用いてリンカー内に分枝点を作出し、ＰＥＧ単量体を用いてリガンド間に適切な間隔を提供した。該３つのリガンドは、ＨＬＡ−ＤＲ１０のβサブユニット内の空洞へのドッキングによって同定し、フランキングアミノ酸のアルギニン７０は、Ｌｙｍ−１結合および細胞傷害性に不可欠であることが示された。さらなるリジン残基を挿入し、これを第１級リジンの遊離εアミンに結合させることにより、リンカーに沿った特定の位置に機能性分子が組み込まれ得る。
【図２９】図２９は、ＲａｊｉヒトＨＬＡ−ＤＲ１０発現リンパ腫細胞におけるＳＨＡＬの細胞傷害活性の滴定の図である。表示した濃度のＳＨＡＬの添加の１、２または３日後に観察された非バイアブル細胞の絶対数。ＳＨＡＬの閾値およびＩＣ５０濃度は、２日間において、それぞれ０．７および２．５ｎＭ（ｐｍ／ｍｌ培地）（平均±ＳＤ）であると決定した。
【図３０】図３０は、Ｒａｊｉ異種移植片を有するマウスにおける治癒の写真による証拠の図である。；ＳＨＡＬ処置前（上側）、初回用量の１週間後に２回目の１００ｎｇ用量のＳＨＡＬ  ｉ．ｐ．。初回用量後３週間までに、異種移植片は完全に退縮して治癒を示し、これは、マウスの観察期間中を通して持続した（＞８４日間；下側）。
【図３１】図３１は、確立されたＲａｊｉまたはジャーカットリンパ腫異種移植片を有するマウスにおけるＳＨＡＬの全体的な生存効果の図である。Ｒａｊｉまたはジャーカット異種移植片を有するマウスを、１００ｎｇのＳＨＡＬで連続３週間の各週に週１回ｉ．ｐ．処置するか、未処置とした。被処理Ｒａｊｉ異種移植片を有するマウス（黒丸）は生存期間が最も長かったが、被処理ジャーカット異種移植片を有するマウス（四角）は、５６日間を超えて生存したものはなかった。２匹の未処置マウス（白丸）は、異種移植片が大きくなり、８４日間生存した。
【図３２】図３２は、未処置マウスおよびＳＨＡＬ処置の２４時間後のマウスから切除したＲａｊｉ異種移植片の電子顕微鏡写真の図である。この未処置の進行性の異種移植片の細胞構造は、通常であった（左）が、ＳＨＡＬ処理異種移植片の細胞では、自食性死滅と整合するクロマチンの凝縮と断片化および細胞質構造の減損が示された（右）（バー、５μｍ）。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
詳細な説明
本発明は、おおむね任意の標的分子（１つまたは複数）に特異的に結合させるために使用され得る新たな類型の結合分子の開発に関する。この類型の結合分子を、本明細書では、選択的高親和性リガンド（Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｈｉｇｈ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ）または「ＳＨＡＬ」と称する。ＳＨＡＬは、多種多様な状況において抗体と同様に使用され得、該状況としては限定されないが、生物学的物質もしくは他の物質の精製のためのアフィニティカラムにおける捕捉試薬、バイオセンサーにおける結合剤、ナノ粒子合成のための薬剤またはナノ装置、診断薬、および治療薬が挙げられる。
【００５７】
また、ＳＨＡＬは、種々の病原体の型間または系統間の識別がなされ得る分子署名を検出するために使用され得る。また、ＳＨＡＬは、毒素中や病原性生物の表面上に存在する特殊なタンパク質署名の検出のため、およびこのような生体脅威因子を天然に存在する非有害物質から識別するための生体防御適用用途における用途を有する。ＳＨＡＬは、周囲環境に曝露されたとき比較的安定であり得るため、生体防御のバイオセンサー、診断用および他の適用用途における使用に特によく適している。
【００５８】
一部の特定の好ましい実施形態において、ＳＨＡＬは癌の診断および／または処置に使用される。かかる実施形態において、ＳＨＡＬは、癌（例えば、種々の悪性細胞）の表面上の特殊な部位および／または特異的部位（例えば、癌特異的マーカー）に指向される。
【００５９】
一部の特定の実施形態において、ＳＨＡＬは、これ自体を投与した場合に治療効果を有するものであり得る（例えば、抗体療法薬ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭと同様に）。ＳＨＡＬは、正常な経路に対するアゴニストとしての機能を果たし、それにより不可欠な細胞機能を起始または遮断し、悪性細胞の死をもたらすため、ＳＨＡＬは、抗体と同様、悪性細胞に対して直接的な効果を有し、細胞死をもたらすものであり得る。また、ＳＨＡＬは、異常な細胞表面マーカーの提示または通常の悪性細胞マーカーの増強のいずれかにより、悪性細胞の同定をもたらすため、ワクチンとしての機能を果たすものであり得る。
【００６０】
あるいはまたさらに、ＳＨＡＬ（１つまたは複数）は、（標的化対象細胞に結合させた場合）標的として、または他のエフェクターのための担体（標的化部分）として使用され得、該エフェクターとしては、限定されないが、細胞傷害剤などの薬剤、免疫機構による同定のためのマーカー、検出可能な標識（画像化のため）などが挙げられる。
【００６１】
放射性同位体は、放射線療法剤を悪性細胞（１つまたは複数）に選択的に送達するために担体ＳＨＡＬに結合され得る細胞傷害性エフェクターの魅力的な一例である。この治療薬は、単独薬物療法剤として投与してもよく、より大きな用量強度を得るための髄質再構築薬もしくは悪性疾患に対する放射線の効果を向上させ得る他の薬物と組み合わせて投与してもよい。ＳＨＡＬと組み合わせることができる薬物には、化学療法薬、生物製剤など多くの種々のものが存在するが、タキサン類は魅力的な例の１つである。
【００６２】
細胞傷害剤の例としては、放射性同位体、免疫毒素、化学療法薬、酵素インヒビター、生物製剤などが挙げられる。対象となるものの例としては、アポトーシスシグナルおよび酵素（カスパーゼなど）が挙げられる。放射性同位体は、抗体抗原系およびリガンド−受容体系との併用に有効であることが示されている対象となる細胞傷害剤の代表である。処置目的では、本発明によれば、一部の実施形態において、β−、β＋（ポジトロン）などの放射体粒子で標識することが好ましいと考えられる。一部の場合では、α放射体またはオージェ電子放射体での標識が適切である。治療用放射性同位体の例はたくさんあり、イットリウム−９０またはヨウ素−１３１が挙げられ、これらは現在、非常に重要である。
【００６３】
一部の特定の画像化目的では、本発明によれば、テクネチウム−９９、インジウム−１１１、ヨウ素−１２３、またはヨウ素−１３１が、シングルフォトン画像化に魅力的である、およびβ＋（ポジトロン）放射体（例えば、銅−６４、イットリウム−８６、ガリウム−６８など）が、診断目的でＳＨＡＬに結合させた場合に特に非常に魅力的であろうと考えられる。
【００６４】
ＳＨＡＬは、２つ以上のリガンド（結合部分とも称する）からなり、該リガンドは、本質的に任意の所望の標的（例えば、対象の標的悪性細胞表面分子上の特殊部位または特異的部位（ポケット））に特異的に結合するように設計されたコア「多座」分子（ＳＨＡＬ）が生成されるように直接またはリンカーを介して一緒に連結されている。ＳＨＡＬを構成するリガンド（結合部分）は、標的上の部位に結合し得る本質的に任意の部分を含むものであり得る。かかる結合部分としては、限定されないが、種々の化学物質（例えば、有機小分子）、タンパク質、糖類、糖質、レクチン、脂質、金属、核酸、ペプチドおよび核酸類似体などが挙げられ得る。
【００６５】
必要なことではないが、ＳＨＡＬを構成する個々のリガンドは、多くの場合、標的に対して比較的低い親和性を有する（例えば、約１０−６Ｍより低い）。対照的に、多座ＳＨＡＬ（複数のリガンドを含む）は、典型的には、比較的高いアビディティを示す（例えば、約１０−６Ｍより高い、好ましくは約１０−８または１０−９または１０−１０Ｍより高い、さらには約１０−１１Ｍより高い、最も好ましくは約１０−１２Ｍより高い）。
【００６６】
一部の特定の実施形態において、ＳＨＡＬが指向される標的がタンパク質である場合、ＳＨＡＬを構成するリガンドは、該タンパク質のある特定の非官能性部位に結合するように選択され得る。タンパク質は、多くの場合、その表面全体に分布したある個数（数個から＞５０）の「ポケット」または空洞を有する。このような空洞は、タンパク質が機能性となるために該タンパク質の鎖が３次元構造にフォールディングされたときに生じる。この観察結果により、所与のタンパク質に対してこれまで可能であったものよりもずっと高い結合特異性を示すＳＨＡＬの設計を検討することが可能になる。タンパク質の表面上の特殊なポケットにわずかマイクロモルの親和性で結合する２つの部分を一緒に連結させることにより、ナノモルからピコモルの親和性で結合し、高度に選択的で、他の機能的に関連する分子と交差反応しない多座分子（ＳＨＡＬ）を設計することが可能になる。既知の構造または予測される構造を有するタンパク質では、分子表面の３次元マップを作成するため、および本明細書に記載のような該タンパク質の構造的に特殊な適当なサイズのポケットを特定するために、コンピュータによる方法が使用され得る。
【００６７】
既知の小分子の構造を含むデータベースを、標的タンパク質上のポケット内への結合能に関して、「ドッキング」プログラムを用いてスクリーニングしてもよい。次いで、上位候補が、本明細書に記載のさまざまな実験手法を用いて試験され、実際に該タンパク質に結合する分子、ならびに正しい部位に結合する分子が同定され得る。次いで、該リガンドのペアまたはトリプレット（例えば、各組の１つ）を適切な長さのリンカーの対向する末端に、固相または液相化学反応を用いて結合させると、二座ＳＨＡＬ（図１）または三座ＳＨＡＬが作製され得る。次いで、慣用的な結合試験を行なうことにより、最も高い親和性かつ最も選択的なＳＨＡＬが同定され得る。
【００６８】
標的（例えば、タンパク質）に弱く結合し、選択性がほとんど示されないか、または不充分である２つ以上の小リガンドを一緒に連結させると、その対象標的（例えば、標的タンパク質）に、３〜６桁またはそれ以上強く結合し、高い選択性を有する分子の生成がもたらされ得ることは、驚くべき知見であった。
【００６９】
特定の理論に拘束されることを望まないが、ＳＨＡＬに２つ以上のリガンドが存在すると、該分子がより広範なさまざまなタンパク質に結合する確率が高くなることが予測され得るが、本発明者らは、観察の結果、この非特異的結合が弱く（遊離リガンドとほぼ同じ）、該リガンドのうちの１つだけによって非標的タンパク質に結合された分子は、結合されたままで長期間維持されないと考えた。二座ＳＨＡＬの両方のリガンドまたは多座ＳＨＡＬを構成するすべてのリガンドが、そのそれぞれの標的（例えば、標的タンパク質上のポケット）に結合した場合に観察される親和性および選択性の向上は、ＳＨＡＬ−標的相互作用の性質に関連する３つの要素に由来する。第１に、リンカーの存在により、標的から解離したＳＨＡＬを構成する個々のリガンドが標的表面から離れて拡散することが抑制され、遊離リガンドが再結合する速度が有意に増大する。第２に、二座または多座ＳＨＡＬの放出解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）が低いことは、ＳＨＡＬを構成するリガンド両方（または全部）がその標的から同時に放出される確率が、いずれか１つが放出される確率よりもかなり低いことによって決定される。ＳＨＡＬを構成するリガンド間の間隔は、結合化学成分（例えば、リンカー）によって決定され、リガンドが正しい間隔で離れている場合にのみ、ＳＨＡＬを構成するリガンドが標的に同時に結合することが可能になる。ＳＨＡＬ内のいずれかのリガンドが独立して別の標的に結合する場合、その低い親和性（本発明者らが同定したリガンドでは、１〜１０マイクロモルの親和性が典型的である）により、急速なリガンドの離脱がもたらされ得る（解離速度は高くなり得る）。したがって、二座または多座ＳＨＡＬが対象標的に強く結合し得る唯一の状況（ナノモルまたはそれより高い親和性）は、ＳＨＡＬを構成するリガンドの両方が標的分子（例えば、標的タンパク質）に同時に結合する場合であり得る。両方または全部のリガンドが結合されると、分子全体（ＳＨＡＬ）の解離速度は劇的に低くなり得る。リガンド結合部位が適正に選択された場合（例えば、タンパク質標的の場合、アミノ酸配列または構造が異なる領域を標的化することにより）、同一の部位が別の標的上に同じ間隔で離れて見られるということは非常に起こりにくくなる。この極めて起こりにくい事象が起こる場合は、さらなるリガンド結合部位（例えば、部位１および２に隣接する第３の結合部位）が同定され得、さらなるリガンドがＳＨＡＬ内に組み込まれ得る（例えば、三座、四座などのＳＨＡＬを作製するため）。
【００７０】
ＳＨＡＬは、抗体と比べ、特に治療用および／または診断用適用用途において一定の利点を有する。典型的には、ＳＨＡＬは抗体よりもかなり小さい。そのため、より大きな腫瘍浸透度が得られ得る。また、一部の特定の実施形態では、例えば脳腫瘍の処置のために、血液脳関門を通過させることができる。また、ＳＨＡＬは、多くの場合、抗体よりも免疫原性が低く、多くの場合、循環系からの排除があまり急速でないと考えられる。
【００７１】
一部の特定の実施形態において、本明細書に記載のＳＨＡＬは、典型的には多座である、すなわち、ＳＨＡＬは、直接または１つ以上のリンカーを介して一緒に連接された２つ以上のリガンドを含む。一部の特定の実施形態において、リガンドは、ＳＨＡＬが指向される標的の異なる部分（例えば、１つのタンパク質上の異なるエピトープ）に結合する。一部の特定の実施形態において、リガンドは、異なる分子、例えば、癌細胞上の異なる癌マーカー、受容体を構成する種々のタンパク質などに結合する。一部の特定の実施形態において、多重特異的ＳＨＡＬは、同じ細胞上の同じもしくは異なる抗原を架橋させ、それによりシグナル伝達を増強するため、あるいは、予備標的化して（例えば、ＳＨＡＬの１つを、悪性細胞を標的化し、かつ後で投与される細胞傷害剤（例えば、キレート化放射性金属など）の担体を「捕捉する」ように設計された他のＳＨＡＬに結合するように設計する）、免疫学的に活性な細胞（例えば、マクロファージ、Ｔ細胞など）を該部位に漸増させるため、標的化されたＳＨＡＬにおいてプロドラッグを活性化するためなどに使用され得る。
【００７２】
一部の特定の実施形態において、この「多重特異性」は、多価ＳＨＡＬの使用によって得られる。多価ＳＨＡＬは、２つ以上のＳＨＡＬ（例えば、２つ以上の二座ＳＨＡＬ）が一緒に連接された分子である。多価ＳＨＡＬを含む種々のＳＨＡＬが、例えば上記のようにして、同じ標的または異なる標的に指向され得る。
【００７３】
Ｉ．ＳＨＡＬの構築
本発明のＳＨＡＬは、標的分子（１つまたは複数）の異なる領域に結合する、一部の実施形態においては、特異的に（または優先的に）結合するリガンド（結合部分）を同定することにより作製される。次いで、標的分子の異なる領域に結合するリガンドを、直接またはリンカーを介して連接させ、２つの異なる結合部分を含む二座ＳＨＡＬまたは２つ以上の異なる結合部分を含む多座ＳＨＡＬを作製する。次いで、ＳＨＡＬは、対象標的に結合する能力についてスクリーニングされ得る。
【００７４】
異なる標的領域に結合するリガンドの最初の同定は、バーチャルインシリコ方法（例えば、コンピュータによる方法）および／または例えば本明細書に記載のもののような経験的方法を用いて行なわれ得る。
【００７５】
２つ以上の適当なリガンド（結合部分）が同定されたら、これらは、任意選択で、標的の異なる部位に結合する能力についてスクリーニング（検証）され得る。次いで、好適な結合リガンドを直接またはリンカーを介して一緒にカップリングさせると、二座または多座ＳＨＡＬを形成することができ、次いで、これは任意選択で、標的に結合する能力についてスクリーニングされ得る。
【００７６】
Ａ）標的の選択
事実上、任意の分子、受容体、分子組合せがＳＨＡＬの標的として供され得る（例えば、図２１参照）。標的の選択は、ＳＨＡＬに意図される適用用途によって決定される。したがって、例えば、ＳＨＡＬがアフィニティカラムに組み込まれる場合（例えば、タンパク質または核酸を精製するため）、標的は、ＳＨＡＬを含むアフィニティカラムを用いて精製される分子（例えば、タンパク質、核酸など）である。
【００７７】
ＳＨＡＬが癌の処置および／または診断に使用される場合では、標的は、典型的には、分子、分子集合体、受容体、酵素、または癌に特徴的な他の構造（例えば、ＳＨＡＬが正常健常細胞よりも癌細胞に優先的に結合することを可能にするもの）である。
【００７８】
いくつかの癌特異的マーカーが当業者にはわかる。かかるマーカーとしては、限定されないが、Ｌｙｍ−１エピトープ、Ｍｕｃ−１、Ｃ−ｍｙｃ、ｐ５３、Ｋｉ６７、ｅｒｂＢ−２、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ４、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＣＡ  １５−３、Ｇ２５０、ＨＬＡ−ＤＲ細胞表面抗原、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、インテグリン、ＥＧＦｒ、ＡＲ、ＰＳＡ、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、Ｌ６細胞表面抗原（例えば、Ｔｕｓｃａｎｏら（２００３）Ｎｅｏｐｌａｓｉａ，３６４１−３６４７；Ｈｏｗｅｌｌら（１９９５）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｍａｒｋｅｒｓ  １０：１２６−１３５；Ｍａｒｋｅｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：３５０３−３５０７，１９９２参照）、増殖因子受容体および／または種々の細胞内標的（例えば、受容体、核酸、ホスホキナーゼなど）などが挙げられる。
【００７９】
一部の特定の実施形態では、細胞表面膜の標的タンパク質に対するＳＨＡＬが作製され得、これは、他の分子の結合をブロックすることにより、あるいは細胞内シグナル（例えば、ホスホキナーゼシグナル伝達）の阻害または増強をもたらすことによって細胞内機能に影響を及ぼし、それにより、該機能を促進させるもの（アゴニスト）または該機能を阻害するもの（アンタゴニスト）である。細胞内にインターナライゼーションされ得る抗原および抗体などの細胞表面膜の標的タンパク質に対するＳＨＡＬを作製することが可能である。インターナライズ抗原を標的化する抗体およびインターナライズ受容体を標的化するペプチドリガンドと同様、このようなＳＨＡＬは、細胞内にインターナライゼーションされ、細胞内において、そのアゴニスト機能またはアンタゴニスト機能のため、あるいは有効負荷量の毒素または放射性同位体を送達するため、不可欠な細胞機能（癌原遺伝子、ホスホキナーゼ、リソソームおよびＤＮＡ／ＲＮＡ／ｍＲＮＡなど）に対してアゴニスト効果またはアンタゴニスト効果を有し得る。ＳＨＡＬは、抗体およびペプチドリガンドと比べていくつかの利点がある。該利点としては、サイズが小さいこと、ならびに使用され得る電荷の範囲が、細胞内分子が主標的である場合に該細胞内への、および該細胞内での自由な移動可能であるようなものであることが挙げられる。
【００８０】
ＳＨＡＬは、その膜標的によって特定の細胞を優先的に選択するために使用され得、標的対象細胞表面膜から解離すると、該細胞表面膜を通過して自由に移動し、該細胞の内部に到達し得る。ＳＨＡＬを多重特異性とし、インターナライゼーションされた場合、あるいは解離して細胞表面膜を透過した場合、第２の特異性によって細胞内の分子（例えば、ホスホキナーゼ、リソソーム酵素、ホルモン受容体、遺伝子および癌原遺伝子タンパク質産物、ＤＮＡ／ＲＮＡ／ｍＲＮＡなど）の標的化が可能となるようにしてもよい。一部の特定の実施形態では、単一特異性であるが多価のＳＨＡＬが作製され得、これは、細胞（ｃａｌｌ）表面分子の標的化と該分子の架橋の両方を行ない、架橋抗体−抗原系で報告されているような生物学的効果の向上をもたらす。
【００８１】
典型的には直接および容易に細胞表面膜を透過できない抗体およびペプチドリガンドとは対照的に、ＳＨＡＬはサイズが小さく、またＳＨＡＬのその疎水性特性もしくは親水性特性の選択能のため、細胞膜および種々の細胞内区画を透過し得るＳＨＡＬが作製され得る。これにより、細胞機能に重要な細胞内分子（癌原遺伝子、ホスホキナーゼ、リソソームおよび他の酵素、ＤＮＡ／ＲＮＡ／ｍＲＮＡなど）を標的化する目的に特異的なＳＨＡＬを作製することが可能になる。この能力により、細胞機能に不可欠に重要な類型全体の細胞内分子を標的化することが可能になり、該能力は、特異的標的化分子では、これまで達成可能でなかったものである。ＳＨＡＬは、このような直接的な効果に加え、本明細書に記載のような有効負荷量の担体として使用され得る。
【００８２】
癌原遺伝子産物は、ＳＨＡＬによって標的化され、癌処置において有用な効果をもたらし得る類型の細胞内標的の一例を示す。癌原遺伝子にコードされるＲａｓタンパク質は、細胞内に注入された抗体によってインビトロで標的化され、このブロックによって、それ以上分裂しない細胞がもたらされたことに注意されたい。変異は、該産物の活性の制御障害に関連している。
【００８３】
多くのシグナル伝達経路は、細胞内分子の一工程（直接細胞内）または二工程（膜標的化の後、インターナリゼーション）ＳＨＡＬ標的化による干渉を受けやすい。このようなものとしては、限定されないが、「Ｇ」タンパク質シグナル伝達などの重要な経路、およびチロシン特異的プロテインキナーゼ活性（例えば、ＥＧＦＲ、Ｎｅｕなど）が挙げられる。また、細胞機能および／または細胞成長において変化をもたらすため、多重ホルモン受容体介入もＳＨＡＬによって標的化され得る。ホルモン標的または酵素標的に結合させ、機能をブロックしてもよい。有用であり得るホルモン受容体ブロックとしては、ＥＲ（エストロゲン受容体）へのエストロゲン様分子の結合をブロックするためのＳＨＡＬの使用、およびＡＲ（アンドロゲン受容体）に対する同様の効果が挙げられる。これにより、次に該複合体のＤＮＡ結合が干渉され得、ホルモン感受性腫瘍細胞の成長およびバイアビリティが干渉されることになり得る。
【００８４】
また、本発明では、主に感染性因子に結合すること、および／または細胞侵入をブロックすること、および／または感染性因子の伝播に不可欠な代謝経路をブロックすること（例えば、細胞のＨＩＶ感染を抑制するためにＣＣＲ５をブロックすること）のいずれかにより、感染性疾患（例えば、ＡＩＤｓ、インフルエンザなど）を処置するためのＳＨＡＬの使用が想定される。
【００８５】
ＳＨＡＬが指向される標的がタンパク質を含む場合、一部の特定の実施形態において、ＳＨＡＬを構成するリガンド（結合部分）の少なくとも１つは、該タンパク質内のポケットに結合する。一部の特定の実施形態では、ＳＨＡＬを構成する結合部分の少なくとも２つがタンパク質のポケットに結合し、該２つのリガンドは異なるポケットに結合する。一部の特定の実施形態では、ＳＨＡＬを構成するすべてのリガンドが、標的タンパク質内のポケットに結合する。これは、ＳＨＡＬを構成するリガンドがすべて、タンパク質ポケットに結合しなければならないことを示すのではない。リガンドの１つがポケットに結合し、別のリガンドはポケットでない領域に結合する一部の特定の実施形態、またはいずれのリガンドもポケットに結合しない一部の特定の実施形態が想定される。
【００８６】
具体的な標的（例えば、癌マーカーまたは癌マーカー内のドメインもしくはエピトープ
）に関する構造の情報が入手可能でない場合、標的内の標的またはドメインをモデル設計し、この具体的な標的に対するＳＨＡＬの設計のためのリガンド結合部位を同定することができる。標的が構造的に特性評価されたものである場合、関連分子の結晶またはＮＭＲ構造をこのようにして使用してもよい。情報が入手可能でない場合（あまり通常の状況ではない）は、経験的アプローチを用いて、本明細書に記載のＳＨＡＬの構築のための適当なリガンドを同定してもよい。
【００８７】
また、本明細書に記載の経験的アプローチは、ＳＨＡＬの開発プロセスを加速するためにも使用され得る。この状況においては、ＳＨＡＬのより良好な理解のため、および／または後続のＳＨＡＬ作製の開発の手引きのために、所望により、ＳＨＡＬの経験的開発後にモデル設計および他の解析工程を行なってもよい。
【００８８】
実施例には、ＳＨＡＬが、診断および処置のための画像化用および治療用放射性同位体（インジウム−１１１およびイットリウム−９０など）の担体として意図され、対象標的が、悪性および正常なＢリンパ球上に見られるＨＬＡ−ＤＲ細胞表面分子であり、したがって、ほとんどのリンパ腫および白血病に有用である好ましい一実施形態を示すが、これは、Ｂ細胞リンパ腫および白血病においてであっても、多くの実施形態の一例にすぎないことを強調しておく。例えば、Ｂ細胞リンパ腫および白血病の抗体標的化に魅力的であることがわかっているいくつかの他の細胞表面抗原を同定するための抗体が知られている。このようなものも、ＨＬＡ−ＤＲに対するものと同じ目的で同様にして使用され得る。さらに重要なことは、ＨＬＡ−ＤＲ標的化のために設計されたＳＨＡＬによって標的化される領域が、免疫の確認および拒絶に重要なペプチド提示に関して知られているくぼみ（ｐｉｔ）の領域内であることである。さらにいっそう重要なことは、あらゆる型の腺癌（例えば、乳房、前立腺および結腸の悪性疾患）の抗原およびエピトープが特性評価されており、抗体標的化に重要であることが示されている。また、腺癌の異常ムチンおよび多くの腺癌で大量に見られるＣＥＡも魅力的な標的を提供し、これらは、かなり充分に特性評価されている。
【００８９】
一部の特定の実施形態において、ムチンのコア縦列反復タンパク質（ＭＵＣ１）（例えば、図４参照）は、癌指向ＳＨＡＬに対する良好な標的を示すと考えられる。ＭＵＣ−１は、上皮癌（前立腺、乳房、結腸および卵巣などの癌）において上方調節され、容易に利用可能となることが示されている（例えば、図５、６および７参照）。
【００９０】
さまざまなモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（例えば、ＭＵＣ−１に対するもの）に対してＹ−９０を用いる放射免疫療法（ＲＩＴ）は、患者での前臨床試験および治験において有望であることが示された。これらの試験では、上皮癌が放射性標識ｍＡｂを用いて有効に標的化され得ること、およびＭＵＣ−１は、より魅力的な標的の１つであることが示された。しかしながら、完全抗体は、充実性癌に容易に濃縮されず、典型的にはその内部に透過しない。そのため、かかる部分の治療指数は比較的低いことが示された。
【００９１】
しかしながら、例えば、本明細書に記載の方法に従って作製され、ＭＵＣ−１のタンパク質のコア縦列反復単位（患者での前臨床試験およびＲＩＴ治験において、上皮癌で上方調節される特殊な抗原エピトープであることが示されたエピトープ）に対して指向されるＭＵＣ１指向ＳＨＡＬは、非常に有効であることが予測される。ＳＨＡＬ（選択的高親和性リガンド）は、完全抗体（約１５０，０００Ｄ）と比べて、あるいは単鎖可変断片（約２５，０００Ｄ）と比べてもかなり小さく（約２０００ダルトン）、そのため、ＳＨＡＬは、悪性腫瘍を容易に透過し、その内部に濃縮され、あるいは腎臓によって速やかに排除または排出される。
【００９２】
一部の特定の実施形態において、対象エピトープ領域内のドッキング部位に対して選択された１つまたは２つ以外のさらなるリガンド（１つまたは複数）は、標的上の対象領域外のドッキング部位に対して選択される。これによって、より大きな選択性および「有効な」親和性がもたらされる。多量体標的、例えばＨＬＡ−ＤＲの場合、さらなるリガンドは、標的の同じサブユニットに指向されるものであっても、異なるサブユニットに指向されるものであってもよい。具体的には、ＨＬＡ−ＤＲの場合、１つまたは２つのリガンドは、Ｌｙｍ−１モノクローナル抗体反応性に対して規定されたエピトープ領域内の既知のドッキング部位に指向されるものであり得、さらなるリガンドは、同じまたは異なる多量体のドッキング部位（例えば、ＨＬＡ−ＤＲのβサブユニットまたはαサブユニット）に対して選択され得る。
【００９３】
他の例は、ムチンの縦列反復単位（上記のＭＵＣ−１など）と反応するように選択されたリガンドを有するＳＨＡＬである。この場合、コアタンパク質は１０量体間隔で反復性であり、そのため、類似または同一の性質のＳＨＡＬが連接され、同一または類似しているが異なる既知（または未知）間隔の反復単位に対する多価結合が得られ得る。あるいはまた、ＳＨＡＬは第３のリガンド有していてもよく、該リガンドは、最初からのリガンドの１つと同一であるが、ドッキング部位から間隔をあけて連結され、ＭＵＣ−１のコア縦列反復領域から遠隔部に存在させる。
【００９４】
また、ドッキング部位は、空洞以外に突出部であってもよいが、空洞の方が、より多く接触相互作用する可能性のため、より大きな（親和性）がもたらされやすい。
【００９５】
Ｂ）スクリーニング対象の化合物（推定リガンド／結合部分）
本発明の方法に従い、事実上任意の薬剤が、標的に結合する能力についてスクリーニングされ得、それにより、ＳＨＡＬへの組込み内への好適性についてスクリーニングされ得る。かかる薬剤としては、限定されないが、核酸、タンパク質／ペプチド、核酸またはペプチド類似体、金属、糖類、多糖類、糖タンパク質、脂質、レクチン、大小の有機分子、抗体ＣＤＲなどが挙げられる。
【００９６】
好ましい一実施形態において、ハイスループットスクリーニング法は、多数の潜在的リガンド（結合部分）を含むコンビナトリアル化学物質ライブラリーを準備することを伴う。かかる「コンビナトリアル化学物質ライブラリー」は、次いで、１つ以上のアッセイにおいてスクリーニングされ、本明細書に記載のように、所望の結合活性を示すライブラリー構成員（特定の化学的種または亜類型）が同定される。このようにして同定された化合物は、ＳＨＡＬの成分として供され得る。
【００９７】
コンビナトリアル化学物質ライブラリーは、いくつかの化学物質「基礎単位」（試薬など）を組み合わせることにより、化学的合成または生物学的合成のいずれかによって作製された多様な化学物質の集合体である。例えば、ポリペプチド（例えば、ムテイン）ライブラリーなどの線形コンビナトリアル化学物質ライブラリーは、アミノ酸と称される１組の化学物質基礎単位を、所与の化合物の長さ（すなわち、ポリペプチド化合物内のアミノ酸の数）について考えられ得るあらゆる様式で組み合わせることにより形成される。数百万の化学物質が、化学物質基礎単位のかかるコンビナトリアルミキシングによって合成され得る。例えば、ある業界関係者により、１００個の互換性化学物質基礎単位の系統的なコンビナトリアルミキシングにより、１億個の四量体化合物または１００億個の五量体化合物の理論的合成がもたらされることが観察された（Ｇａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３７（９）：１２３３−１２５０）。
【００９８】
コンビナトリアル化学物質ライブラリーの作製は、当業者には充分わかる。かかるコンビナトリアル化学物質ライブラリーとしては、限定されないが、ペプチドライブラリー（例えば、米国特許第５，０１０，１７５号；Ｆｕｒｋａ（１９９１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．，３７：４８７−４９３；Ｈｏｕｇｈｔｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８４−８８参照）が挙げられる。本発明での使用に想定および意図されるペプチド合成は、決して唯一のアプローチではない。多様な化学物質のライブラリーを作製するのに、他の化学物質もまた使用され得る。かかる化学物質としては、限定されないが：ペプトイド（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／１９７３５）、コードペプチド（ＰＣＴ公開ＷＯ９３／２０２４２）、ランダム生体オリゴマー（ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０００９１）、ベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチドなどのダイバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ）（Ｈｏｂｂｓら，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６９０９−６９１３）、ビニローグポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａら（１９９２）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：６５６８）、β−Ｄ−グルコース骨格を有する非ペプチド性ペプチド模倣物（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎら，（１９９２）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２１７−９２１８）、小化合物ライブラリーの同様の有機合成体（Ｃｈｅｎら（１９９４）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２６６１）、オリゴカルバメート（Ｃｈｏら，（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６１：１３０３）、および／またはペプチジルホスホネート（Ｃａｍｐｂｅｌｌら，（１９９４）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：６５８）が挙げられる。一般的には、Ｇｏｒｄｏｎら，（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１３８５、核酸ライブラリー（例えば、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，Ｃｏｒｐ．参照）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば、米国特許第５，５３９，０８３号参照）抗体ライブラリー（例えば、Ｖａｕｇｈｎら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４（３）：３０９−３１４参照）、およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７）、糖質ライブラリー（例えば、Ｌｉａｎｇら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４：１５２０−１５２２、および米国特許第５，５９３，８５３号参照）、ならびに有機小分子ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピン、Ｂａｕｍ（１９９３）Ｃ＆ＥＮ、Ｊａｎ  １８、第３３頁、イソプレノイド  米国特許第５，５６９，５８８号、チアゾリジノンおよびメタチアザノン（ｍｅｔａｔｈｉａｚａｎｏｎｅ）  米国特許第５，５４９，９７４号、ピロリジン  米国特許第５，５２５，７３５号および同第５，５１９，１３４号、モルホリノ化合物  米国特許第５，５０６，３３７号、ベンゾジアゼピン  ５，２８８，５１４などを参照）を参照のこと。
【００９９】
コンビナトリアルライブラリーの作製のためのデバイスが市販されている（例えば、３５７  ＭＰＳ，３９０  ＭＰＳ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ  ＫＹ，Ｓｙｍｐｈｏｎｙ，Ｒａｉｎｉｎ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ，４３３Ａ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，９０５０  Ｐｌｕｓ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ参照）。
【０１００】
一部の特定の実施形態において、ＳＨＡＬを構築するためのリガンド（結合部分）の初期スクリーニングは、バーチャルインシリコスクリーニング法として行なわれ得、この場合、実際の化合物を得る必要はない。かかる場合では、化学構造データベースにより、本明細書に記載のＳＨＡＬに含めるための好適性についてスクリーニングされ得る多種多様な部分が得られる。
【０１０１】
化学構造データベースは、当業者には充分わかる。例えば、ＭＤＬ（登録商標）Ａｖａｉｌａｂｌｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ（ＭＤＬ  ＡＣＤ）は、現在、世界中の市販されている最大の化学物質構造検索可能データベースであり、ＭＤＬ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能である。このデータベースは例示にすぎず、限定を意図しない。他の化学構造データベース（例えば、ＣｈｅｍＳｐｉｄｅｒ、ＺＩＮＣなど）は、当業者には充分わかり、限定されないが、種々の有機分子、ペプチド、糖質または核酸の構造データベースが挙げられる。
【０１０２】
Ｃ）標的に結合するリガンドのコンピュータによる同定
バーチャルインシリコアプローチを使用し、コンピュータによる方法を用いて、標的（例えば、標的タンパク質）を特性評価（例えば、モデル設計）すること、および標的の特定の領域に特異的に結合すると予測される分子（結合部分）を同定することができる。コンピュータによる方法の使用により特定の標的に特異的に結合する分子を同定することは、多くの場合、「ドッキング」と称される。
【０１０３】
ドッキング方法は、当業者には充分わかる。ドッキングには２つのアプローチがあり、関与する分子が、ドッキングプロセス中、その空間的形状を変えることができない剛性物体として扱われる「リジッド分子ドッキング」と、分子が、ドッキングの際に（コンピュータ処理により）形状を変化させることが可能なソフト（フレキシブル）ドッキングである。
【０１０４】
２つの分子間で相互作用する物理的および化学的な力がいくつかある。このような力を使用し、各解の品質の尺度となる種々のドッキングスコアを規定する。このスコアは、該力の強度およびドッキングの解の実現可能性を考慮したものである。ドッキングアルゴリズムにおいて典型的に考慮される最も重要な力としては、電気力、ファン・デル・ワールス力、および水素結合が挙げられる。
【０１０５】
ドッキング問題は、多くの場合、以前から次のように示されているものである。Ａ，Ｂを２つの剛体分子（例えば、標的と、標的に結合する潜在的リガンド）とし、その幾何学的表示をＲ３とする。本発明者らは、Ｔ・ＡとＢ間の接触表面が最大となるような剛体変換Ｔ：Ｒ３→Ｒ３を見い出したいと考えた。接触表面は、典型的には、分子間の間隔が所与の閾値よりも小さい表面と定義される。典型的には、ドッキングアルゴリズムは、「最大」ではなく「充分大きい」接触表面を得ようとするものであり、本発明者らは、接触表面の大きさではなく、提案されたドッキングの解の品質の尺度となるスコアを最大にしようと試みた。これらの２つのパラメータは相関しているが等価ではない。
【０１０６】
１．リジッドドッキング
リジッドドッキングアルゴリズムに対するアプローチの一例が、Ｋｕｎｔｚら（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１６１：２６９−２８８に報告された。Ｋｕｎｔｚらのアルゴリズムは、主に、分子の表面上の「目的の」部位に焦点をあてることを試みながら、リガンド−タンパク質ドッキング解を得るのに使用される。該アルゴリズムの基本ステージは、最初にＣｏｎｎｏｌｌｙ法を用いて分子表面をコンピュータ処理することを伴う（例えば、Ｃｏｎｎｏｌｌｙ（１９８３）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，１６：５４８−５５８；Ｃｏｎｎｏｌｌｙ（１９８３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２１：７０９−７１３）参照）。これにより、法線により「スムージングされた」分子表面上に１組の点が得られる。次いで、「球体作成系」（例えば、ＳＰＨＧＥＮ）を使用し、「偽原子」を用いて、標的（例えば、タンパク質）とリガンドの分子表面の新たな表示を作成し、次いで、この表示を用いて、該分子表面上の実現可能なドッキング部位を見い出す。ＳＰＨＧＥＮにより探索されるこのようなドッキング部位は、受容体の表面内の空洞である。
【０１０７】
ＳＰＨＧＥＮは、典型的には、以下の５つのステージからなる。まず、Ｃｏｎｎｏｌｌｙ点  ｐｉ，ｐｊの各ペアについて、法線上の点の１つが中心となるように、このペアを通る球体を描く。次いで、アルゴリズムにより、Ｓｎｏｒｍ（ｉ）＝｛中心がｐｊの法線上にある球体｝を規定する。Ｃｏｎｎｏｌｌｙ点がｎ個あると仮定し、各１＜＝ｉ＜＝ｎおよびｐｉが標的の表面上にあるとして、本発明者らは、Ｓｎｏｒｍ（ｉ）のすべての球体を除外し、最小半径のものだけを残す。これにより、標的の表面を透過する球体はすべて除外される。次いで、該アルゴリズムにより、典型的には、θ（例えば、π法線とｐｊから球体の中心までの半径との間の角度）＜９０°である球体だけが残る。それ以外のものは、球体を画定する点ｐｉとｐｊが互いに近すぎ、したがって、標的の表面上の空洞内に配置されない。次いで、該アルゴリズムにより、典型的には、各原子について最大半径の球体だけが残る。この工程により、原子の表面に「触れる」球体だけが残る。最後に、球体を画定する点ｐｉとｐｊが２つの異なる原子に属し、分子配列上でのこれらの原子間の間隔が４個未満である場合、球体は除外される。これは、α−ヘリックスのカーブの長さが３．６であり、このような部位は、典型的には可能なドッキング部位として扱われないために行なわれる。
【０１０８】
残りの球体は偽原子と称される。次のステージでは、交差している偽原子のクラスターを探索する。この種のクラスターの存在は、良好なドッキング部位とみなされる分子表面内の空洞の存在を示す。
【０１０９】
これらすべてを標的に対して行なった後、同じことをリガンドに対して行なうが、このとき、本発明者らは、表面の外側ではなく表面の内側に球体を作成するため、法線と反対側の点とベクトルを採用する。標的に関するＳＰＨＧＥＮの結果は、場合によっては「負の画像」と称され、リガンドに関するものは「正の画像」と称される。一部の特定の実施形態において、リガンドおよび標的に関するベクトルを逆にしてもよい（例えば、リガンドの空洞内でドッキングされる標的の要素を見い出すため）。
【０１１０】
次いで、典型的には「マッチング」が行なわれる。この操作では、各ドッキング部位について、アルゴリズムにより、標的の偽原子の中心とリガンドの中心の良好な一致がもたらされる変換Ｔを見い出すことを試みる（場合によっては、偽原子の中心の代わりに、リガンドの実際の原子の中心が使用される）。一部のバージョンのＤＯＣＫでは、このステージの複雑さを改善するため、偽原子のクラスターをサブクラスターに分ける。これを行なう方法の一例は、クラスター内の最大球体を除外することであり、場合によっては、これにより、クラスターは２つのサブクラスターに分けられる。
【０１１１】
リジッドドッキングマッチング問題では、両分子の目的の点間の良好なマッチングが形成されるような一分子の変換および回転を見い出すための検索を行なう。一部の特定の実施形態では、点の位置の代わりに点間の間隔が使用される。各分子、標的（Ｔ）とリガンド（Ｌ）について、適切な間隔の行列を、それぞれ、ｄＴｉ，ｊおよびｄＬｉ，ｊと規定する。次いで、ある程度の許容誤差を伴うが両者間の間隔が同じであるようなＴとＬの２つのサブセットを見い出すことを試みるための検索を行なう。この２つのサブセットにより、頂点間の間隔がほぼ類似した２つの部分グラフが得られる。これは、ＧｒｉｍｓｏｎおよびＬｏｚａｎｏ−Ｐｅｒｅｚによる解釈木（ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ  ｔｒｅｅ）と類似した方法を用いて行なわれ得る。
【０１１２】
マッチング問題の別の解法は、マッチンググラフ内に「充分大きい」クリーク（ｃｌｉｑｕｅ）を見い出すことである。標的にｎ個の点およびリガンドにｍ個の点が存在する場合、マッチンググラフはｎ＊ｍ個の頂点を有し、ここで、各頂点は、標的からの点およびリガンドからの点を表す。Ｇ＝（Ｖ，Ｅ）をマッチンググラフとし、ｕ，ｖをＶにおける頂点とし、ここで、ｕはｕＬおよびｕＴを表し（それぞれ、リガンドおよび標的内の点）、ｖはｖＬおよびｖＴを表す。ＡＢＳ［ｄＬ（ｕＬ，ｖＬ）−ｄＴ（ｕＴ，ｖＴ）］＜許容範囲の場合でのみ、端部ｅ＝（ｕ，ｖ）をＥに加える。したがって、マッチンググラフ内のクリークにより、類似した間隔を有するリガンド内の点のサブセットと受容体内の点のサブセットが規定される。
【０１１３】
マッチングしたものの品質を評価するため、スコアを計算する。該スコアは、好ましくは、分子間の接触表面の大きさを考慮したものであり、典型的には、一方の分子が他方を貫通することを可能にしないものである。ＤＯＣＫアルゴリズムでは立方格子が使用され、該格子には結合部位が充填され、この格子内のどのセルも、受容体の原子中心からの間隔に応じたスコア：間隔が２．８Å〜４．５Åである場合は１、間隔が２．８Å未満である場合は−１２７、および間隔が４．５Åより大きい場合は０を有する（場合によっては、２．８Åの間隔の代わりに２．４Åが使用される）。提案された各変換について、格子内のリガンドの点の位置（すなわち、その原子または偽原子の中心）を計算し、スコアを、これらの点のスコアの合計として計算する。該アルゴリズムの種々のバージョンでは、付加的または択一的なスコアが使用され得る。例えば、一例のバージョンでは、良好なマッチングスコアを有する変換について、ファン・デル・ワールスエネルギースコアが計算され得る。
【０１１４】
ＨＬＡ−ＤＲ１０のコンピュータモデルの構築。４種類の密接に関連するヒトＨＬＡ−ＤＲ分子（ＨＬＡ−ＤＲ１〜４）について測定された結晶構造を用いた、タンパク質表面上の特殊な「ポケット」の同定、一部の特定の特殊なポケットに結合するリガンドの同定、およびこのようなリガンドを用いたＳＨＡＬの構築を、本明細書の実施例に示す。
【０１１５】
前述の説明は、リジッドドッキングに対するアプローチの一例の例示を意図し、限定を意図しない。他のアプローチは当業者にはわかる。ＳＰＨＧＥＮおよびＤＯＣＫプログラムは市販されていることに注意されたい（例えば、カリフォルニア大学から直接、および種々の市販ソフトウェア製造業者）。
【０１１６】
２．ソフト（フレキシブル）ドッキング
ソフトドッキングアルゴリズムもまた、当業者には充分わかる（例えば、ＪｉａｎｇおよびＫｉｍ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１９：７９−１０２；Ｋａｔｃｈａｌｓｋｉ−Ｋａｔｚｉｒら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８９（６）：２１９５−２１９９などを参照のこと）。
【０１１７】
ＪｉａｎｇおよびＫｉｍ（上掲）に記載の方法では、剛体変換の６次元空間に対して列挙を行ない、この変換は、エネルギー値に従って与えられるスコアである。両方の分子を格子上に配置し、格子セル間の間隔、貫入数および点の法線の向きを用いてマッチングを評価する。このアルゴリズムは、Ｃｏｎｎｏｌｌｙのアルゴリズムの出力に対して適用され、分子全体表面（すなわち、ＤＯＣＫアルゴリズムとは反対に空洞は検索されない）に対して適用される。列挙を低減させるため、該アルゴリズムでは、典型的には、２つの解像度−低解像度と精密（ｆｉｎｅ）解像度が使用される。低解像度では約０．３点／平方オングストロームが使用され、精密解像度では約１点／平方オングストロームが使用される。
【０１１８】
格子内の各セルは、「表面」（少なくとも１つのＣｏｎｎｏｌｌｙ点を含む場合）または「体積」（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ点を全く含まない場合）と記される。通常、各表面セルは２〜３個のＣｏｎｎｏｌｌｙ点を含む。
【０１１９】
分子の一方（通常、小さい方）の回転に関する列挙が行なわれる。各回転について、以下のことが行なわれる。分子の表面および体積セルが計算される。変換に適合する表面セル（各分子から１つ）が少なくとも１対あると仮定し、このようなペア全部に対して列挙を行なう。各ペアについて、変換を計算し、これを、法線の向き、表面同士の適合数、および貫入数を確認することにより評価する。良好な変換は、貫入数が少なく、表面同士の適合が多いものである。これは、まず低解像度において行ない、精密解像度において、概算エネルギースコアを加算して、最良の結果を再度計算する。概算エネルギースコアは、「有利な」相互作用および「不利な」相互作用の数に従って計算される。各分子の原子にはいくつかのカテゴリーがあり、このカテゴリーの組合せについて、該適合のエネルギー的実現可能性に対して良好な寄与を有する場合は「有利な」と、そうでない場合は「不利な」と記す。
【０１２０】
例えば、正の電荷を有する原子を、正の電荷を有する別の原子の近くに配置することは不利であるが、一方がＨドナーであり他方がＨアクセプターである場合、２つの原子が隣接している場合は有利である。
【０１２１】
Ｋａｔｃｈａｌｓｋｉ−Ｋａｔｚｉｒら（上掲）のアプローチは、マッチングスコアを効率的に計算するためにＦＦＴを使用し、起こり得る変換に対して列挙するものである。先のアルゴリズムと同様、両方の分子は３次元格子上に配置されるが、この場合では、格子セルの３つの型を「体積」、「表面」および「中間」と規定する。分子がＡとＢである場合、行列Ａｌ，ｍ，ｎとＢｌ，ｍ，ｎを、以下のように定義する（ｌ，ｍ，ｎは、格子の座標である）：Ａｌ，ｍ，ｎ＝｛１−（ｌ，ｍ，ｎ）が「表面」セルである場合、ｑ−（ｌ，ｍ，ｎ）が「中間」セルである場合、０−その他の場合｝、およびＢｌ，ｍ，ｎ＝｛１−（ｌ，ｍ，ｎ）が「表面」セルである場合、ｒ−（ｌ，ｍ，ｎ）が「中間」セルである場合、０−その他の場合｝。
【０１２２】
一部の特定の実施形態において、パラメータは、ｑ＜０かつｒ＞０であるが、｜ｑ｜が大きく、｜ｒ｜が小さくなるように選択される。このような行列のスカラ積は、ＦＦＴを用いて効率的に計算することができ、したがって、該アルゴリズムの性能はかなり改善される。
【０１２３】
この場合も、前述の説明は、リジッドドッキングに対するアプローチの一例の例示を意図し、限定を意図しないことに注意されたい。他のアプローチは当業者にはわかる。例えば、さらなるアプローチ／プログラムとしては、限定されないが：ＴｒｉｐｏｓのＦｌｅｘＸ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｓｏｌｖｅｉｔ．ｄｅ／ＦｌｅｘＸ／）（これは、ハイスループットスクリーニングに一般的に使用されている）が挙げられる。これは、経験的スコアリング関数を使用するものであり、ねじれ結合のまわりに回転させることにより、フレキシブルドッキングが可能である。これは、Ｓｙｂｙｌプログラムのモジュールとして販売されている（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓにより配布）。ＣＣＤＣのＧＯＬＤ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｃｄｃ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｏｄｓ／ｇｏｌｄ／）では、遺伝的アルゴリズムを用いてリガンドの配座異性体が生成される。これもまた、分子の小断片内でのねじれエネルギーのカスタマイズ化が可能であり、局所タンパク質の柔軟性に順応し得る。Ａｕｔｏｄｏｃｋ  ＵＣＳＤ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｃｒｉｐｐｓ．ｅｄｕ／ｐｕｂ／ｏｌｓｏｎ−ｗｅｂ／ｄｏｃ／ａｕｔｏｄｏｃｋ／）では、Ｌａｍａｒｃｋｉａｎの遺伝的アルゴリズムを用いてリガンドの配座異性体が生成される。ＡｕｔｏＤｏｃｋは、リガンドが数個しかなく、結合エネルギーがより正確である必要がある場合、最良に使用される。ドッキングに関する充分な概説の一部は、Ｌｙｎｅ（２００２）Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ．７（２０）：１０４７、およびＴａｙｌｏｒら（２００２）Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．Ｄｅｓｉｇｎ．，１６：１５１に含まれている。
【０１２４】
Ｄ）リガンド結合の経験的アプローチおよび検証
コンピュータによる方法の使用によるＳＨＡＬの構築における使用のためのリガンドの同定には、標的分子（１つまたは複数）の構造に関して、少なくともある程度の情報が必要とされる。また、本発明では、ＳＨＡＬが指向される標的の構造に関する知識が必要とされない方法の使用が想定される。
【０１２５】
一部の特定の「経験的」実施形態では、個々のリガンドまたはリガンドライブラリーを、標的分子（１つもしくは複数）および／または標的分子（１つもしくは複数）をディスプレイしている細胞、細菌、ウイルスなどに対してスクリーニングし、所望の標的（少なくとも低親和性）に結合するリガンドを同定する。標的分子（１つまたは複数）の異なる領域に結合するリガンドが同定される。一部の特定の実施形態では、標的分子の異なる領域に結合し、かつ互いをかかる結合から除外しないリガンドが同定される。
【０１２６】
互いを排除することなく標的に同時に結合することができるリガンドは、次いで、直接またはリンカーを介して一緒に連接され、多座ＳＨＡＬが作製され得、これは、続いて、任意選択で、標的分子（１つまたは複数）に対して、例えば高い親和性で結合する能力についてスクリーニングされ得る。
【０１２７】
リガンド同定のための経験的アプローチにおける使用に加え、物理的スクリーニング法もまた、上記のバーチャルインシリコアプローチを用いて同定されたリガンドの結合の検証に望ましい。また、例えば、リガンドが標的上の異なる部位に結合することを確認するため、および／またはリガンドをＳＨＡＬに組み込む際の間隔を推定するため、２つ以上のリガンドの結合の向きをさらに調べることが望ましいこともあり得る。
【０１２８】
標的に対する１つ以上のリガンドの結合を検出するためのアッセイは、当業者には充分わかる。例えば、単純な一実施形態では、リガンドは、検出可能な標識で標識され得、基質上に固定化した標的分子（１つまたは複数）と接触させる。洗浄後、固定化した標的分子（１つまたは複数）と結合した標識の検出は、リガンドが標的に結合することを示す。一部の特定の実施形態では、異なるリガンドを異なる標識（例えば、異なる色の蛍光標識）で標識し、多数のリガンドの同時結合を可視化することができる。
【０１２９】
あるいはまた、競合的結合アッセイを行なってもよい。かかるアッセイでは、標的分子（１つまたは複数）を、標的に結合することがわかっている一方のリガンドと接触させる。また、標的を「試験」リガンドとも接触させ、試験リガンドが標的に第１のリガンドの存在下で結合する能力を評価する。
【０１３０】
また、液相アッセイを行なってもよい。例えば、リガンド（１つまたは複数）と標的は、異なる標識で標識され得る。リガンドは標的分子（１つまたは複数）に接触され得、両者の結合は、例えばフローサイトメトリーを用いて容易に評価され得る。フローサイトメトリー法は当業者には充分わかる（例えば、Ｏｍｅｒｏｄ（１９９４）Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ．；Ｓｈａｐｉｒｏ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．第３版．Ａｌａｎ  Ｒ  Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｇｉｖａｎ（１９９２）Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．Ｆｉｒｓｔ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ．Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ（１９９３）Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋなどを参照のこと）。
【０１３１】
リガンドの結合および向きの測定はまた、いくつかの異なる方法を用いて測定され得る。このようなものとしては、限定されないが、飽和移動差核磁気共鳴（ＭａｙｅｒおよびＭｅｙｅｒ（１９９９）Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄｉｔ，３８：１７８４−１７８８）ならびに移動ＮＯＥ（ｔｒＮＯＥ）核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光分析（Ｈｅｎｒｉｃｈｓｅｎら（１９９９）Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄｉｔ．，３８：９８−１０２；Ｃｏｓｍａｎら（２００２）Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  １５：１２１８−１２２８）が挙げられる。これらの方法は、１回の実験で数種類から数百種類のものの混合物中のリガンドをスクリーニングし、どのリガンドが、例えば生物学的に関連する条件下で標的分子（１つまたは複数）に結合するかを調べるため、およびどのリガンドが、同じ（または異なる）部位に結合するかを調べるために使用され得る。また、各化合物の相対結合親和性を評価するため、結合することが測定されたリガンドを用いて、拡散実験（Ｌｉｎら（１９９７）Ｊ．Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍ．，６２：８９３０−８９３１）を行なってもよい。
【０１３２】
標的分子（１つまたは複数）に対するリガンドの結合を検出するための他のアプローチとしては、限定されないが、表面プラスモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ）、飽和移動差核磁気共鳴分光分析、他の核磁気共鳴分光分析による測定、質量分析、捕捉マイクロアレイ、ビーズ系ライブラリーアッセイ、および他の物理的結合アッセイが挙げられる。
【０１３３】
前述のアッセイは例示を意図し、限定を意図しない。本明細書において提供した教示を用いると、標的分子（１つまたは複数）に対するリガンド結合を検出するための数多くの他のアッセイが、当業者にわかるであろう。
【０１３４】
標的分子（１つまたは複数）（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ１０）に結合する１組のリガンドの同定後、例えばＮＭＲによって競合実験を行ない、標的分子（１つまたは複数）を含むポケットの１つ（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ１０の場合は、Ｌｙｍ−１エピトープを含むポケットの１つ）に結合するかどうかを調べてもよい。
【０１３５】
上記のように、これは、標的と既知の結合リガンドとの複合体を調製し、第２のリガンドが該複合体に結合し得るかどうかを調べることにより容易に行なわれ得る。したがって、例えば、ＨＬＡ−ＤＲ１０標的の場合、Ｌｙｍ−１：ＨＬＡ−ＤＲ１０複合体が調製され、ＨＬＡ−ＤＲ１０に結合するリガンドの組が、Ｌｙｍ−１抗体に結合してもなお該タンパク質に結合するかどうかを調べるために再試験され得る。
【０１３６】
もはやＬｙｍ−１：ＨＬＡ−ＤＲ１０複合体に結合しないリガンドが同定され得（このようなリガンドは、ＨＬＡ−ＤＲ１０をその他のＨＬＡ−ＤＲ分子と識別する特殊な部位に結合する）、第２の組の競合実験で使用され、Ｌｙｍ−１エピトープ内の異なる部位に結合する分子が同定され得る。リガンドのペアを用いて行なわれる実験では、Ｌｙｍ−１抗体の非存在下で結合リガンドとＨＬＡ−ＤＲ１０タンパク質間に生じる移動差核オーバーハウザー効果（ｔｒＮＯＥ）（Ｃｏｓｍａｎら（２００２）Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  １５：１２１８−１２２８）を用いて、同じ部位および異なる部位に結合するリガンドが同定され得る。結合リガンドは負のＮＯＥシグナルを示すが、未結合リガンドは、正のシグナルを有する（同上）。ペア内の両方のリガンドが同時に該タンパク質に結合していることが観察された場合、この結果は、２つのリガンドが異なる部位に結合するはずであることを示す。したがって、スクリーニングにより、標的分子（１つまたは複数）内の異なる部位（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ１０のＬｙｍ−１エピトープ内の異なる部位（部位１と部位２））に結合するリガンドの組が容易に同定され得る。
【０１３７】
標的上の異なる部位に結合するリガンドの組が同定された後、任意選択で、結合部位内でのリガンドの向きが、古典的分子力学シミュレーションを用いてさらに評価され得る。分子力学シミュレーションの方法は本実施例に明白に記載している。例えば、各リガンドについて、結合ポケット内の１〜３つの向きが５００ピコ秒間シミュレーションされ得る。これにより、リガンド上のどの官能基が標的と接触し易く、どの官能基が溶媒によって利用可能であるかを判定することが補助される。この情報を用いて、標的に結合する能力について試験され得る修飾官能基または異なる官能基を有する類似体が同定され得、特定の官能基が、標的に対するリガンドの結合を破壊することなくリンカー結合のための部位として使用され得ることが確認され得る。
【０１３８】
このようなアプローチの使用によって、種々の標的上の特異的部位に結合するリガンドを同定することは文献に記載されている。例えば、このような方法は、破傷風神経毒の標的化ドメイン上の特異的部位に結合するリガンド（Ｃｏｓｍａｎら（２００２）Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  １５：１２１８−１２２８；Ｌｉｇｈｔｓｔｏｎｅら（２０００）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ，１３：３５６−３６２）ならびにＨＬＡ−ＤＲ１０に結合する本発明者らがすでに同定した１１種のリガンドを同定するために使用された。
【０１３９】
破傷風神経毒（同上）の標的化ドメイン上の２つの部位に結合するリガンドを同定するための、同様のアプローチを用いた本発明者らの以前の試験では、実験により３０種類未満のリガンドをスクリーニングすることが必要であった。該タンパク質に結合すると予想されたリガンドの半数超が、実験により結合することが観察された。したがって、本発明者らは、部位１つあたり１組３０個のリガンドをスクリーニングすることにより、結合してＳＨＡＬ合成を開始させる充分な数の化合物が得られるはずであると考える。しかしながら、一部の実施形態において、第１ラウンドのＮＭＲスクリーニングで結合する適当な数のリガンド（例えば、３〜５個）が同定されなかった場合、標的内の２つの異なる部位に結合する適当なリガンドが見い出されるまで、さらなる組のリガンドが選択され、スクリーニングされ得る。
【０１４０】
一部の特定の実施形態において、一緒に連結されるリガンドペア（または他の多リガンドの組合せ）の選択は、以下の基準（重要性の降順に）：１）結合部位（ペアを構成する２つのリガンドは、好ましくは異なる部位に結合する）；２）結合を破壊することなく該分子をリンカーに結合させるために使用され得る利用可能な官能基に関して得られた情報の信頼性（結合することが確認されており、特定の官能基の修飾は結合に影響しないことが示されている既知の誘導体を有する類似体が優先される）；３）リンカーへのリガンドの結合容易性が予測されるもの（リガンドは、好ましくは、異なるリガンドをリンカーの対向する末端に配置する非対称な結合化学反応を容易にする官能基を有する）；４）相対結合親和性（例えば、（ＮＭＲ拡散実験により測定される）（典型的には、該タンパク質に最も強い結合を示すリガンドが、まず選択される）；５）動物またはヒトにおけるその毒性に関する既知情報（典型的には、非毒性であることがわかっている、または他の医薬品における使用が既に認可されているリガンドの使用が優先される）；および６）リガンドのコストに基づく。
【０１４１】
個々のリガンド（結合部分）のいくつかは、他のタンパク質に弱く結合することがあり得るため、ＳＨＡＬの作製に使用する前に、循環系中に見られるかもしれない他のタンパク質に結合するかどうかを調べるための個々のリガンドの予備スクリーニングは必要（または有意義）ではない。他のタンパク質に対する任意の単一のリガンド（二座ＳＨＡＬの作製に使用されるペアの片方）の結合は、弱い（せいぜいマイクロモル）と予測される。そのため、該分子の解離速度は高く、一方のリガンドによって他のタンパク質に結合しているだけのＳＨＡＬは、組織および循環系から速やかに除去される。高親和性（および低解離速度）は、典型的には、ペア内の両方のリガンドが、適正な間隔離れた（これは、両者を連結するリンカーの長さによって決定される）部位に同時に結合している場合にのみ得られる。これらの２つの基準は、ＳＨＡＬが対象標的と接触する場合にのみ満たされる。結合したら、解離速度は、いずれかのリガンド単独で観察されるものよりも１０００〜１，０００，０００倍（以前の試験に基づいて）低下すると予測される。この理由のため、交差反応性が有意な障害になることは予測されない。
【０１４２】
Ｅ）コンピュータによるアプローチ／経験的アプローチの併用
対象領域（１つまたは複数）に対するＳＨＡＬの結合は、フィット性と電荷に基づき、結合部分の３Ｄ構造と構成成分に依存する。上記のコンピュータによるアプローチでは、ＳＨＡＬの作製は、標的分子上の魅力的な領域（１つまたは複数）の規定／同定を伴うものであり得る。したがって、例えば、ドッキング部位とリガンドを見い出すために、あらゆる型のタンパク質、例えば、抗原、受容体およびシグナル伝達タンパク質がモデル設計され得る。続いて、リガンドは、経験的方法を用いて試験され得る。この方法では、典型的には、モデル設計に含める構成成分分子の知識が必要とされる。
【０１４３】
上記の経験的方法は、適当な結合体を見い出すための潜在的リガンドのライブラリー（例えば、コンビナトリアルライブラリー）のスクリーニングに依存する。このアプローチでは、目的の標的（例えば、タンパク質、細胞など）の利用可能性を超える予知は必要とされない。ライブラリーは、実験により結合体に対して選択される。この後、標的化に選択された領域内の分子と反応することがわかっている分子（抗体、ペプチドまたは化学物質（リガンド）など）との競合が行なわれ得る。このアプローチにより、目的のものでなく、かつ対象領域に結合すると規定されない結合化学物質または結合ペプチドの除外が可能になる。
【０１４４】
第３のアプローチは、性質が中間であり、初期競合的スクリーニングおよびカウンタースクリーニングのために、魅力的な標的分子および該分子の領域の予知が使用される。したがって、例えば、最初の標的またはリガンドライブラリー構成成分が、コンピュータ処理により予測され得る。次いで、最適化された標的または標的集合体および／または最適化されたライブラリーが、本明細書に記載のようにしてスクリーニングおよびカウンタースクリーニングされ、最適な結合体が同定され得る。
【０１４５】
Ｆ）ビーズ系ライブラリーのスクリーニング
標的分子に結合するリガンドのスクリーニングのアプローチの一例は、各々を異なるビーズ／固相支持体に結合させた多数の潜在的リガンドを含むコンビナトリアルライブラリーの作製を伴うものである。このコンビナトリアルライブラリーは、「ランダム」ライブラリーであってもよく、例えば、特定の（例えば、最適化され）コア化学物質部を有するいくつものバリアントが提供されるように合成されたものであってもよい。
【０１４６】
コンビナトリアル合成方法はよく知られており、相違する化合物の大「ライブラリー」を速やかに作製するために使用される。種々の実施形態において、出発物質（例えば、アミノ酸）は、共有結合により固相支持体に固定させる。この後、単量体（典型的には保護された単量体）（例えば、アミノ酸、ヌクレオチド、有機小分子など）を段階的に添加する。工程数および反応体の数を変えることにより（例えば、スプリット・ミックス合成アプローチにて）、数百万の相違する分子を作出することができるが、典型的には、各ビーズには化合物を１つだけ含める。
【０１４７】
ライブラリーを構成する化合物は、ビーズに結合させたままスクリーニングしてもよい。比色分析法、蛍光分析法、Ｘ線撮影法または他の方法を用いて、陽性（結合）ビーズが可視化され得る。これは捕捉され得（例えば、ピペットにより、ビーズが磁性の場合は金属棒により）、次いで、該化合物が特性評価され得る。
【０１４８】
したがって、例えば、ＨＬＡ−ＤＲ１０分子に結合するペプチドリガンドのライブラリーを合成することができる。ペプチド合成化学は、充分に開発されている。しかしながら、インビボで長い半減期を有するペプチドリガンドを得るためには、ペプチドがＤ−アミノ酸を含むペプチドリガンドのライブラリーを作製することを選択するのがよい。かかるペプチドはインビボで、タンパク質分解に対してより抵抗性であると予測される。さらに、Ｄ−アミノ酸は、一般的に、非毒性であるとみなされている。
【０１４９】
ＨＬＡ−ＤＲ１０上のＬｙｍ−１エピトープは高度に極性である。したがって、潜在的結合体のライブラリーの合成では、極性のＤ−アミノ酸が合成に選択され得る（例えば、Ｓｅｒ、Ａｓｐなど）。スプリット／ミックス合成（例えば、米国特許第５，５７４，６５６号参照）を使用すると、ビーズに結合されたＤ−ペプチドのライブラリーが作出される。
【０１５０】
次いで、ＨＲＰタグ化ＨＬＡ−ＤＲ１０をビーズ混合物に添加する。ＨＲＰ色標識を可視化し、陽性ビーズを取り出す。次いで、陽性ビーズは、例えばＨＬＡ−ＤＲ１０陽性細胞株に対して試験され得る。このアッセイの試験で陽性であったビーズは、次いで、結合がＨＬＡ−ＤＲ１０特異的であることを確認するために、例えば組織パネルに対して試験され得る。次いで、このアッセイの特異的結合体は特性評価され得る（例えば、エドマン分解を用いた配列決定、質量分析など）。
【０１５１】
あるいはまた、ライブラリーの合成中に各化合物の実体をコード化するためのストラテジーがある（例えば、米国特許第５，５６５，３２４号；同第５，７２３，５９８号；同第５，８３４，１９５号；同第６，０６０，５９６号；同第６，５０３，７５９号；同第６，５０７，９４５号；同第６，７２１，６６５号；同第６，７１４，８７５号；などを参照のこと）。次いで、かかる「タグ化」ストラテジーを使用し、陽性結合体の実体が容易に決定され得る。
【０１５２】
Ｇ）リガンド（結合部分）の連結による多座ＳＨＡＬの作製
標的上の異なる部位に結合する２つ以上のリガンド（結合部分）が同定されたら、リガンドを直接またはリンカーを介してのいずれかで連結し、多座ＳＨＡＬを作製する。２つだけのリガンドを連接した場合、ＳＨＡＬは二座である。３つのリガンドを連接した場合、ＳＨＡＬは三座である、などである。
【０１５３】
分子を直接またはリンカーを介して連結させるためのいくつかの化学反応は、当業者には充分わかる。リガンド（結合部分）を互いに結合してＳＨＡＬを形成するのに使用される特異的化学反応は、リガンド（１つまたは複数）の化学的性質および所望される「リガンド間」間隔に依存する。リガンドは、典型的には、リンカー上またはリガンドと結合する他方のリガンド上の適当な官能基との反応に利用可能なさまざまな官能基（例えば、カルボン酸（ＣＯＯＨ）、遊離アミン（−ＮＨ２）基）を含む。
【０１５４】
あるいはまた、リガンド（１つまたは複数）を、さらなる反応性官能基を露出または結合させるために誘導体化してもよい。誘導体化は、任意のいくつかのリンカー分子（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓから入手可能なものなど）の結合を伴うものであり得る。
【０１５５】
「リンカー」は、本明細書で用いる場合、多座ＳＨＡＬを形成するために２つ以上のリガンド（結合部分）を連接するために使用される分子である。リンカーは、典型的には、ＳＨＡＬを構成する全部のリガンドに対して共有結合が形成され得るように選択される。好適なリンカーは、当業者には充分わかり、限定されないが、直鎖または分枝鎖炭素リンカー、複素環式炭素リンカー、アミノ酸、核酸、デンドリマー、合成ポリマー、ペプチドリンカー、ペプチドおよび核酸類似体、糖質、ポリエチレングリコールなどが挙げられる。ＳＨＡＬを構成するリガンドの１つ以上がポリペプチドである場合、リンカーは、構成成分アミノ酸に、その側鎖基により（例えば、システインとのジスルフィド結合により）、または末端アミノ酸のα炭素アミノ基もしくはカルボキシル基により連接され得る。
【０１５６】
一部の特定の実施形態では、第１のリガンド上の基と反応性の１つの官能基と、第２のリガンド上の官能基と反応性の別の基とを有する二官能性リンカーを用いて、所望のＳＨＡＬが形成され得る。あるいはまた、誘導体化は、リガンド（１つまたは複数）の化学的処理、例えば、（例えば、糖タンパク質、糖質または核酸の糖部分を過ヨウ素酸塩で切断して遊離アルデヒド基を生成させるグリコール切断）を伴うものであってもよい。遊離アルデヒド基はリンカー上の遊離アミンまたはヒドラジン基と反応し得、リンカーをリガンドに結合させる（例えば、米国特許第４，６７１，９５８号参照）。ポリペプチド（抗体または抗体断片など）に遊離スルフヒドリル基を生成させるための手順も知られている（米国特許第４，６５９，８３９号参照）。
【０１５７】
一部の特定の実施形態では、種々の長さのリジン、グルタミン酸、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）系リンカーが、リガンドのカップリングに使用される。いくつかのＳＨＡＬは、リジンとＰＥＧを組み合わせて作出したリンカーを用いて合成した（例えば、実施例および図１３参照）。ＰＥＧに分子をコンジュゲーションさせる化学反応は当業者には充分わかる（例えば、Ｖｅｒｏｎｅｓｅ（２００１）Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２２：４０５−４１７；ＺａｌｉｐｓｋｙおよびＭｅｎｏｎ−Ｒｕｄｏｌｐｈ（１９９７）Ｐｐ．３１８−３４１  Ｉｎ：Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｊ．Ｍ．ＨａｒｒｉｓおよびＸ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（編）．，Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．；Ｄｅｌｇａｄｏら（１９９２）Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．，９：２４９−３０４；Ｐｅｄｌｅｙら（１９９４）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７０：１１２６−１１３−０；ＥｙｒｅおよびＦａｒｖｅｒ（１９９１）Ｐｐ．３７７−３９０  Ｉｎ：Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｈｏｌｌｅｂら（編），Ａｍ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｏｃ，Ａｔｌａｎｔａ  ＧＡ；Ｌｅｅら（１９９９）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，１０：９７３−９８１；Ｎｕｃｃｉら（１９９１）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．，６：１３３−１５１；Ｆｒａｎｃｉｓら（１９９６）Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，３：３２１−３４０参照）。
【０１５８】
このようなＳＨＡＬを作出するのに使用される合成スキームの好都合な特徴の１つは、該アプローチにより、ほぼ任意の型の分子をリンカー上の第３の部位に結合させることが可能になることである。ＳＨＡＬ合成の第１ラウンドでは、インビトロ結合試験を容易にするために、ビオチンをこの部位に結合させた。ビオチンタグにより、単離したタンパク質に対する結合を表面プラスモン共鳴によって速やかに測定し、生細胞および組織切片への結合に対するＳＨＡＬの選択性を調べることが可能になる。
【０１５９】
ＳＨＡＬを試験し、標的（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ１０）結合することが確認されたら、標的を有する細胞（例えば、腫瘍細胞）への放射性核種または他のエフェクターの送達を可能にするため、合成の最終ラウンドで、ＤＯＴＡなどの金属キレート剤（または他のエフェクター）を結合させてもよい。
【０１６０】
エフェクター−ＳＨＡＬコンジュゲートを再試験して標的に結合する能力を再確認した後、任意選択で、標的に対して最良の選択性を示すコンジュゲートを試験生物（例えば、マウス）での体内分布について試験してもよい。また、さらなる試験において、他の特殊な分子もこの部位に結合させてもよく、それにより、同ＳＨＡＬはまた、例えば、放射性同位体送達のための予備標的化アプローチの有用性を試験するにも使用され得る。
【０１６１】
Ｈ）段階的固相ＳＨＡＬ合成
一部の特定の実施形態において、ＳＨＡＬ合成は、段階的固相合成アプローチによって進行させる。このアプローチでは、各リンカー成分またはリガンドを、樹脂表面に共有結合させた伸長中の分子（ＳＨＡＬ）上に結合させる。各化学反応後、樹脂を充分に洗浄すると、未反応生成物が除去され得る。
【０１６２】
アプローチの一例では、合成の開始時に、ＤＯＴＡをリンカーに結合させた。過剰のＤＯＴＡを洗浄除去した後、種々のリンカーおよびリガンドを付加するために樹脂上で多数のさらなる化学反応を行ない、各反応後、未反応生成物を再度洗浄除去した。ＨＰＬＣおよび質量分析によって調べたとき、ＳＨＡＬの合成が終了する時点まで、試料中に存在する遊離ＤＯＴＡの量は検出不可能であった。ＤＯＴＡ結合は極めて安定であり、そのため、いったん結合したらＳＨＡＬから離脱しない。
【０１６３】
Ｉ）親和性および選択性に関するＳＨＡＬのスクリーニング
一部の特定の実施形態において、異なるリガンド（結合部分）を含む、および／または異なる長さのリンカーを含むＳＨＡＬのライブラリーをスクリーニングし、標的に対して最良の親和性および／または選択性を有するＳＨＡＬを同定する。かかるスクリーニングアッセイは、いくつかの形式で行なわれ得、限定されないが、単離標的に対する結合に関するスクリーニング、培養細胞に対する結合に関するスクリーニング、組織アレイ内の細胞に対する結合に関するスクリーニング、および所望の標的に対するインビボ結合に関するスクリーニングが挙げられる。
【０１６４】
１．単離標的（例えば、タンパク質）に対するＳＨＡＬ結合
一部の特定の実施形態において、最良のＳＨＡＬの結合親和性は、ＳＨＡＬ−標的複合体の質量分析、続いて、例えば、ＩＡＳＹＳ  ＰｌｕｓまたはＢｉａＣｏｒｅ機器が使用されるＳＨＡＬ−標的の結合親和性のより正確な表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）分光分析（Ｓｈｕｃｋ（１９９７）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ．，２６：５４１−５６６；Ｖａｎ  Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔａｌ（２００１）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，５８：７９４−８００）測定によって評価され得る。ＳＰＲ測定を行なうためには、ビオチンをリンカーに第３の官能基（上記）によって付加させ、ＳＨＡＬを市販のストレプトアビジンコートチップに結合させ得る。一部の特定の好ましい実施形態では、ｎＭ以上の高結合親和性を示すＳＨＡＬのみが、有用であるとみなされ得る。次いで、最大親和性を示すＳＨＡＬが、選択性に関して試験され得る。実験は、標的に関連する分子の存在下で、標的に対するＳＨＡＬ結合の選択性を試験するために行なわれ得る。したがって、例えば、ＳＨＡＬがＨＬＡ−ＤＲ１０に指向される場合、ＳＨＡＬは、アフィニティクロマトグラフィーによって抽出および分離されたＲａｊｉ細胞表面タンパク質の存在下で、標的分子に結合する能力について評価され得る。ゲルをビオチン化ＳＨＡＬで処理し、過剰の未結合ＳＨＡＬをすすぎ洗いして除去した後、結合ＳＨＡＬの位置が、ローダミンタグ化ストレプトアビジンで染色することにより検出され得る。一部の特定の実施形態において、妥当なタンパク質選択性を示すとみなされたＳＨＡＬは、蛍光の９５％以上がＨＬＡ−ＤＲ１０単量体ピークおよび多量体ピークと関連している分子であり得る。
【０１６５】
２．培養細胞に対するＳＨＡＬ結合
ＳＨＡＬの標的が細胞上のマーカー（例えば、癌細胞マーカー）である場合、インタクト細胞に対するＳＨＡＬの結合の特異性を評価することが望ましい場合があり得る。
【０１６６】
細胞結合試験は、ビオチン化（あるいは別の様式で標識された）ＳＨＡＬを使用し、例えば、結合ローダミンタグ化ストレプトアビジンの蛍光を用いて標的（例えば、Ｒａｊｉ）細胞に対するＳＨＡＬ結合を確認することにより行なわれ得る。ＳＨＡＬの結合が観察された場合、ＳＨＡＬに対するインタクト細胞の親和性を測定するためにＳＰＲ測定が行なわれ得る。一部の特定の実施形態では、対照と比べて、標的（例えば、腫瘍）細胞の染色強度と少なくとも２倍、好ましくは少なくとも５倍、より好ましくは少なくとも１０倍の差を示すＳＨＡＬが、さらなる試験および開発に選択され得る。最も有望なＳＨＡＬの類似体は、リンカーに結合させたＤＯＴＡ分子を用いて合成され得、より定量的なデータを取得するため、また、ＳＨＡＬが細胞表面上に保持されるか、またはインターナライゼーションされるかの判定（ＮａｎｏＳＩＭＳもしくは他の方法を使用）を試みるための結合実験が、放射性核種タグ化ＳＨＡＬを用いて行なわれ得る。この情報は、キレート剤に負荷すべき放射性同位体の型に関する決定を行なうのに有用である。ＳＨＡＬが表面上に残存する場合、ＳＨＡＬは、典型的には、単独で、またはインターナリゼーションが必要とされないエフェクター（例えば、９０イットリウムなどのα放射体、種々の検出可能な標識など）とともに使用される。ＳＨＡＬが標的細胞に結合するとインターナライゼーションされることを示す証拠が得られた場合、ＳＨＡＬを、インターナライゼーションされると活性になるエフェクターとともに使用することが可能である。
【０１６７】
３．組織アレイを用いた細胞感受性の解析
組織アレイ手法は、ＳＨＡＬをスクリーニングし、組織特異性（例えば、抗腫瘍ＳＨＡＬの場合は、悪性組織反応性と正常組織反応性）を調べるために使用され得る。組織アレイは当業者には充分わかる（例えば、Ｋｏｎｏｎｅｎら（１９９８）Ｎａｔ  Ｍｅｄ．，４：８４４−８４７；Ｔｏｒｈｏｒｓｔら（２００１）Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．，１５９：２２４９−２２５６；Ｎｏｃｉｔｏら（２００１）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，９４：１−５などを参照のこと）。その基本形態では、組織マイクロアレイは、個々の各腫瘍の症例／ブロックの小さいコアを採用し、これらのコアを単一のブロックに集合させることにより形成される（同上）。この新たなブロックを切片に分けることにより、標準的な免疫組織化学反応およびインサイチュハイブリダイゼーション手法が使用され得る。したがって、数百の異なる実験を行なわなければならないのではなく、１回の実験で数百の組織試料がアッセイを行なうことができる。図２および３に、どのようにして組織アレイが使用され得るかの概要を示し、例示的な組織アレイのダイアグラムを示す。
【０１６８】
一実施形態において、正常組織アレイ用には、本発明者らは、８０種類の特殊な組織を同定した。これらとしては、口腔咽頭部、心臓、肺、胃、脾臓、肝臓、腎臓、腸、骨髄、膵臓、膀胱、筋肉、副腎、乳房、脳、正常前立腺および皮膚（組織マイクロアレイに配置のため）が挙げられる。リンパ球特異的組織アレイ用には、本発明者らは、新生物性リンパ球系統、異種移植片、およびＨｕｍａｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｐｅｃｉｍｅｎ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ（ＵＣ  Ｄａｖｉｓ）から収集した患者の物質を含めた。これらまたは類似した組織アレイを使用し、ＳＨＡＬの正常組織に対する非特異的結合およびリンパ球性および前立腺新生物に対する特異的結合を測定することができる。組織アレイへのＳＨＡＬのハイブリダイゼーションは直接的である。本明細書に記載のビオチン化ＳＨＡＬを使用し、標識ストレプトアビジン（例えば、ローダミンタグ化ストレプトアビジン）を用いて、ＳＨＡＬに結合する細胞が容易に同定され得る。必要な場合は、組織マイクロアレイの結果は、慣用的な組織学的検査および免疫組織学的検査によって検証され得る。
【０１６９】
例示的なアプローチの一例では、直径が０．６ｍｍの２〜４個の組織円柱体を、各「ドナー」組織ブロックの選択した領域からパンチングし、レシピエントパラフィンブロックに導入し、組織マイクロアレイ合成装置（例えば、Ｂｅｅｃｈｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）およびＫｏｎｏｎｅｎら（１９９８）Ｎａｔ  Ｍｅｄ．，４：８４４−８４７に記載の手法を用いて、組織マイクロアレイを合成する。次いで、例えば、２００〜４００個のコアを含むスライド上の組織マイクロアレイは、厚さ４μｍの切片に分けられ得る。各コアが選択した組織病理を示すことを確認するため、常套的なヘマトキシリン／エオシン染色が行なわれ得る。免疫組織化学検査では、抗原賦活のため、クエン酸バッファー中でマイクロ波が使用され得る。スライドの画像は、共焦点スキャナー（ＳｃａｎＳｃｏｐｅ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によって取得され、ＭｒＳｉｄ  Ｖｉｅｗｅｒ  ２．０（ＬｉｚａｒｄＴｅｃｈ，Ｉｎｃ．）により後述のようにして可視化され得る。顕微鏡ではなくコンピュータ上で組織アレイ画像を見られることは、解析の効率が劇的に高くなる。
【０１７０】
デジタル病理学的検査の大きな障害は、デジタル形式でのガラススライドの表示であった。ＣＴ、ＭＲＩ、または現在では「デジタル単純写真」に供した患者のデジタル表示から始める放射線学的検査とは異なり、病理学的検査では、すべての組織試料を処理し、染色組織切片を作製し、ガラススライドにマウントして解釈することが必要とされる。本新手法では、ガラススライド全体の画像が得られ、それにより、組織病理学的検査用被検物全体の忠実なデジタル表示（全スライド画像化）が得られる。現在の機器のほとんどは、数千枚の個々の画像を取得するためのデジタルカメラとロボット型ステージを備えた顕微鏡を使用するものである。各画像は、コンテンツエキスパートによって焦点を合わせる。これらの画像は、取得されたら、典型的には一緒にスティッチング（またはタイリング）され、スライドの最終表示を形成する。このプロセスは、非常に時間がかかり、かつ関与する画像の数が多いため、画像は多くの場合ずれる。
【０１７１】
ＳｃａｎＳｃｏｐｅ（Ａｐｅｒｉｏ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は、顕微鏡スライドを３〜５分でスキャンし、５０，０００ｄｐｉで８〜１２ギガバイトの画像が得られる新型のデジタルスライドスキャナーである。次いで、画像を圧縮し、処理し、プレゼンテーション用に保存する（下記参照）。Ｌｉｚａｒｄｔｅｃｈ（登録商標）によるＭｒＳｉｄ（登録商標）により、８〜１２ギガバイトの大容量画像が、プロプライエタリ多層ウェーブレットＪｐｅｇ形式を用いて、有意な画像劣化なく２０：１に近い圧縮比で圧縮される。次いで、画像は、その場で見るだけでも、ウェブサーバーから取得しても、いずれであってもよい。ブラウザー内で見るために典型的にはダウンロードする標準的なウェブシステムの静止画像とは異なり、ＭｒＳｉｄ処理画像はウェブで見られ、ブラウザーアプリケーションによって画像全体をダウンロードしない。画像は、その最大解像度で取得されるため、画像の「低」倍率画面は、サーバーによって構築される。ＳｃａｎＳｃｏｐｅとＺｏｏｍｉｆｙブラウザーの組合せを用いて、スライド全面（１２ギガバイト）が、２０分未満で取得および処理され得る。
【０１７２】
４．選択性のインビボ解析
もちろん、ＳＨＡＬのインビボ選択性も容易に測定され得る。これは、ＳＨＡＬが指向される標的をディスプレイしている細胞または組織を含む試験動物（例えば、実験用ラット）に、ＳＨＡＬを投与することにより行なわれ得る。充分な時間後、動物を致死させ、標的組織（１種類または複数種）および正常組織を検査し（例えば、組織学的に）、ＳＨＡＬ送達の特異性と量が評価され得る。一部の特定の実施形態において、ＳＨＡＬを画像化試薬とカップリングさせてもよく、これにより非観血的画像化が可能になり、それによりリアルタイムでの薬力学的評価が可能になる。
【０１７３】
一例として、患者における薬物動態学的検査および放射線量測定の臨床試験（確立された方法を使用）にどの薬物を選択するかに関するデータを得るため、例えば、本実施例に示したＳＨＡＬにおいて薬物動態学的および放射線量測定的マウス試験を行なってもよい。薬物動力学的検査は、確立された方法を使用し、規定の大きさのＲａｊｉヒトリンパ腫異種移植片を有する雌ヌードマウスにおいて行なわれ得る（ＤｅＮａｒｄｏら（１９９８）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４：２４８３−２４９０；Ｋｕｋｉｓら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５：８７８−８８４）。マウスには、１１１Ｉｎまたは９０Ｙを含むＤＯＴＡタグ化ＳＨＡＬが注射され得、解析用の試料を得るために、マウスは、例えば、少なくとも５つの時間点の各々で致死され得る。初期試験は、中間時間点が決定され得るように該小分子で予測される早期と後期の両極時間点で行なわれ得る。ペプチドに関するデータを用いて、両極時間点が規定され得る。１１１Ｉｎまたは９０Ｙがトレーサーとして使用される場合、最長時間点は、典型的には約５日間であり得る。全身クリアランスは、ヨウ化ナトリウム検出器システムを用いて測定され得る。血中クリアランスは、マウスの尾静脈から定期的に血液試料を採取することによってモニタリングされ得る。致死の時点で、異種移植片と正常組織を取り出し、重量計測し、γウェル計数器において計数し、臓器分布データが得られ得る。
【０１７４】
ＳＨＡＬ用量（質量）効果を評価するため、試験は、例えば、５つの用量レベルで行なわれ得る。この場合も、小ＳＨＡＬ量から始めて大ＳＨＡＬ量にし、試験対象の中間量の選択を導く。ＳＨＡＬの新規性のため、試験時間点および用量レベルの選択は、典型的には、マウスでの抗体（例えば、Ｌｙｍ−１）試験について、および例えば、ソマトスタチン受容体ペプチドリガンドについて入手可能な情報によって導かれる。
【０１７５】
一部の特定の実施形態において、本発明者らのＳＨＡＬを用いて行なわれる理想的な薬物動態学的検査および線量測定は、甲状腺腫瘍の処置においてヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）を用いて行なわれたアプローチである。ＳＨＡＬは、悪性腫瘍を完全に透過するのに充分に小さく、尿中に容易に排出されるものであるのがよい。典型的には、現在使用されている抗体よりも少なくとも１桁良好な標的認識ならびにリンパ腫および白血病に対する結合親和性により、所望の腫瘍細胞選択性がもたらされる。ＳＨＡＬなどの小分子が循環系から速やかにクリアランスを受けることは、不都合な点とみなされ得るが、甲状腺腫瘍の処置では、ＮａＩの著しい有効性が示され、この「不都合な点」は、該試薬が親和性と選択性の適切な組合せを有するものであれば、利点に変わり得る。ＳＨＡＬが充分に取り込まれ、特定の細胞ファミリー（例えば、Ｂリンパ球およびその悪性類縁体）のみを標的化し、低解離速度で強く結合し、系から速やかに排除されると、正常組織が（悪性と比べて）受ける用量は、既存の標的化抗体で得られるものよりも実質的に低くなるはずである。
【０１７６】
確立された方法（ＤｅＮａｒｄｏら（２０００）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，４１：９５２−９５８；ＤｅＮａｒｄｏら（１９９９）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，４０：１３１７−１３２６；ＤｅＮａｒｄｏら（１９９９）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，４０：３０２−３１０；Ｓｈｅｎら（１９９４）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，３５：１３８１−１３８９；Ｓｉｅｇｅｌ（１９９４）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，３５：１２１３−１２１６）をガイドラインとして使用し、Ｂ細胞型リンパ腫系疾患または他の癌を有する患者において薬物動態学的試験および放射線量測定試験を実施するためのプロトコルが容易に開発され得る。プロジェクト用のＳＨＡＬ用量（質量）レベルは、マウスで得られたデータを用いて決定され、既知の方法を用いてマウスと患者の相対ＢＳＡに対して調整され得る（例えば、Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈら（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐ．，５０：２１９−２４４参照）。一部の特定の実施形態において、非骨髄機能廃絶ストラテジーでは骨髄に対する腫瘍の、骨髄機能廃絶ストラテジーでは、用量制限非骨髄器官に対する腫瘍の治療指数に関する情報を用いて至適用量レベルが得られるプロトコルが選択される。
【０１７７】
Ｊ）リンカー長およびリンカーとリガンドの構造を変えることによるＳＨＡＬの親和性、選択性および代謝の最適化
ＳＨＡＬの親和性、選択性および代謝は、コンピュータモデル設計および実験による試験を用いて、リンカー長および／またはリンカーとリガンドの構造を変えることにより最適化され得る。リンカー長の増減により、標的に対するＳＨＡＬの親和性が改善され得る。また、ＳＨＡＬの作製に使用する個々のリガンドの変更または個々のリガンドの構造の改変を行なうことによっても結合、標的選択性が改善され、生物体からの未結合ＳＨＡＬのクリアランスが最適化され得る。また、必要であれば、正常組織および末梢血液からのＳＨＡＬクリアランスを容易にするため、キレート剤をＳＨＡＬに結合させる切断可能な結合（例えば、ペプチドまたは他の切断可能なリンカー）の組込みによるリンカー自体の構造の修飾も考慮され得る。
【０１７８】
特定のＳＨＡＬが非特異的結合を（例えば、細胞抽出物中の多くのタンパク質に対して、またはＲａｊｉ細胞と対照細胞の両方に対して）示すことが観察された場合、異なるリガンドペアを使用し、好適に特異的なＳＨＡＬが同定されるまで、さらなるＳＨＡＬが合成され得る。
【０１７９】
１．標的分子（１つまたは複数）に対するＳＨＡＬ結合親和性の最大化
タンパク質または細胞表面標的に対する多座試薬の結合親和性は、リガンド間に間隔をもたらすリンカーの長さを変更および最適化することにより、１桁から数桁増大され得る。特定の理論に拘束されることを望まないが、この増大は、リガンド間の最適な隔離の達成により、その個々の部位に結合することが可能になること、ならびにリンカー自体において充分な回転自由度がもたらされ、結合部位（例えば、結合ポケット）内での各リガンドの最適な相互作用が可能になることに関連していると考えられる。
【０１８０】
一部の特定の実施形態において、最初のＳＨＡＬにおける使用に選択される最初のリンカー長は、一緒に連結される２つ（またはそれ以上の）結合リガンド間の間隔を推定することによって特定される。特定の組合せの連結リガンドが実際に標的に結合することが測定されたら、リンカー長をさらに精緻化してＳＨＡＬの結合親和性を最適化するために、さらなるモデル設計が行なわれ得る。
【０１８１】
例えば、標的がＨＬＡ−ＤＲ１０である場合、ＨＬＡ−ＤＲ１０のβサブユニットの構造が、それぞれのポケット内に結合されたリガンドとリガンドを相互に連結する種々の長さのＰＥＧリンカーの両方を用いてモデル設計され得る（例えば、本明細書の実施例参照）。リンカー設計を改善するため、分子力学的試験により、結合リガンドの向きが評価され得る。リンカーとリガンドを含めたさらなる分子力学シミュレーションが行なわれ、これにより、多座リガンドと標的（例えば、本明細書に記載のものなど）との相互作用がシミュレーションされ得る。
【０１８２】
このようなモデル設計実験の結果が得られたら、最適と予測したサイズの範囲にまたがるリンカーを用いてさらなる組のＳＨＡＬが合成され得、その結合親和性が実験により試験され得る。
【０１８３】
２．ＳＨＡＬの標的選択性および代謝の最適化
コンピュータによる方法はまた、ＳＨＡＬを作製するために一緒に連結される個々のリガンドの構造の変更によって、標的選択性が改善され、ＳＨＡＬの代謝ならびに正常組織および末梢循環系からのクリアランスが最適化されるかどうかを調べるためにも使用され（ｓｕｅｄ）得る。これは、例えば、標的化結合ポケット内部に存在する官能基の型および結合リガンドに相対する位置を調べることにより行なわれ得る。
【０１８４】
分子力学的試験は、異なるコンホメーションのリガンドおよび選択したリガンド類似体を用いて行なわれ、各結合部位（例えば、ポケット）内に最適にフィットするリガンド誘導体の同定が補助され得る。拡散ＮＭＲ実験（Ｌｉｎら（１９９７）Ｊ．Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍ．，６２：８９３０−８９３１）は、リガンド類似体のサブセットの親和性を比較し、ランク付けするために行なわれ得る。解析に選択される具体的な類似体は、典型的には、コンピュータモデル設計によって得られた結果および類似体の市販入手可能性または合成の容易性に基づいて選択される。高親和性類似体が実験により同定された場合、１組の新たなＳＨＡＬが合成され、標的に対する結合における親和性、選択性、ならびに望ましい代謝特性（例えば、末梢循環系、肝臓および腎臓からの速やかなクリアランス）に関して試験され得る。
【０１８５】
一部の特定の実施形態では、ＳＨＡＬのサイズが小さいことにより、組織からのクリアランスが急速すぎて標的細胞への適当な量のエフェクターの送達が有効でなくなることになり得る。これが観察された場合、標的組織内でのＳＨＡＬの保持時間を最適にするための種々のアプローチが使用され得る。一例は、リンカーにおいてビオチン結合部位の使用によって標的上の別の部位に結合する第３のリガンドを付加することを伴うものである。これにより、ＳＨＡＬの親和性がピコモル以下のレベルまで増大し、結合分子の解離速度が劇的に低下することが予測される。あるいはまた、ＳＨＡＬの有効サイズは、より大型のマルチアーム型のＰＥＧ分子および／または他の分子に結合させることにより相当増大し得る。
【０１８６】
Ｋ）例示的なＳＨＡＬ
本明細書において提供した教示を使用し、例えば癌マーカー（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ１０）に結合するいくつかの異なるＳＨＡＬが容易に調製され得る。種々の実施形態において、ＳＨＡＬとしては、限定されないが、二座ＳＨＡＬ（２つの結合リガンドを含む）、三座ＳＨＡＬ（３つの結合リガンドを含む）、四座ＳＨＡＬ（４つの結合リガンドを含む）、五座ＳＨＡＬ（５つの結合リガンドを含む）などが挙げられる。種々の実施形態においては、多量体であり得る（例えば、２、３、４、５つまたはそれ以上のＳＨＡＬを含む構造および／または複合体）。ＳＨＡＬは、ホモ多量体（２、３、４、５つまたはそれ以上の同じ型のＳＨＡＬを含むもの）であっても、ヘテロ多量体（例えば、２、３、４または５つまたはそれ以上のＳＨＡＬを含み、少なくとも２つは異なる種のＳＨＡＬであるもの）であってもよい。
【０１８７】
一部の特定の実施形態において、ＳＨＡＬは、１つ以上、好ましくは２つ以上、または３つ以上の表１、５、６、７もしくは８のいずれかに記載のリガンドおよび／またはその類似体を含むものである。一部の特定の好ましいＳＨＡＬとしては、限定されないが、二座ＳＨＡＬ（例えば、図２２および２３参照）、三座ＳＨＡＬ（例えば、図２４Ａ参照）、二量体の二座ＳＨＡＬ、二量体の（ｂｉｓ）三座ＳＨＡＬ（例えば、図２４Ｂ参照）などが挙げられる。一部の特定の実施形態において、ＳＨＡＬは、表１に示したリガンドの１つ以上を含むものである。
【０１８８】
【表１】
0005623384.tif 000005
また、一部の特定の例示的なＳＨＡＬを表２にも示す。
【０１８９】
【表２】
0005623384.tif 000006
本明細書に記載の種々のＳＨＡＬは、癌細胞の成長および／または増殖を抑止するため、および一部の特定の場合では癌細胞を死滅させるために、単独で有効であることが見い出された。したがって、ＳＨＡＬは単独で、または１種類以上のエフェクター（例えば、本明細書に記載のものなど）に結合させて使用され得る。
【０１９０】
Ｌ）伝達ペプチドに結合させたＳＨＡＬ
一部の特定の実施形態において、ＳＨＡＬは、１種類以上の伝達ペプチドを含む（例えば、結合させる）。伝達ペプチドは、細胞内への該ペプチドの進入を容易にする（例えば、細胞膜への浸透を容易にする）「膜貫通シャトル」としての機能を果たすペプチドである。伝達ペプチドは、当業者には充分わかる。かかるペプチドとしては、限定されないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）Ｔ抗原の核局在シグナル（ＮＬＳ）（（Ｙｏｎｅｄａ（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２１：８１１−８１７）、ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質のタンパク質導入ドメイン（Ｔａｔペプチド）（Ｖｉｖｅｓら（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１６０１０−１６０１７；Ｓｃｈｗａｒｚｅら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１５６９−１５７２；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎら（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、１００：１９７２−１９７７．）、インテグリン結合ペプチド（ＲＧＤペプチド）（Ｈａｒｔら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１２４６８−１２４７４）、ビトロネクチンのヘパリン結合ドメイン（ＶＮペプチド）（Ｖｏｇｅｌら（１９９３）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２１：４６１−４６８）、ショウジョウバエのアンテナペディアタンパク質（例えば、Ｊｏｌｉｏｔら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ、８８：１８６４−１８６８参照）、ペネトラチン（Ｔｓｅｎｇら（２００２）Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，６２：８６４−８８７）、天然で細胞膜を通過するインタクトなタンパク質（ヘルペスウイルスタンパク質ＶＰ２２（Ｐｈｅｌａｎら（１９９８）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６：４４０−４４３）、合成カチオン性ペプチド輸送体（オリゴアルギニンなど）（ＴｕｎｇおよびＷｅｉｓｓｌｅｄｅｒ（２００３）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．，５５：２８１−２９４；Ｆｕｔａｋｉ（２００５）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．，５７：５４７−５５８）、ラクトシル化ポリ−Ｌ−リジン（Ｍｉｄｏｕｘら（１９９３）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：８７１−８７８）、既知のペプチドシャトルと配列類似性を示すファージディスプレイライブラリー（Ｋａｍａｄａら（２００７）Ｂｉｏｌ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ．３０：２１８−２２３；また、表３のペプチド１〜６も参照のこと）から選択される短鎖ペプチド配列などが挙げられる。
【０１９１】
【表３】
0005623384.tif 000007
前述の伝達ペプチドの一覧は例示を意図し、限定を意図しない。他の伝達ペプチドは、当業者にはわかり、容易に入手可能であり、本明細書において提供した教示を用いて、ＳＨＡＬに容易に組み込む／結合させることができよう。例示的な伝達ペプチドの概説は、Ｄｅｒｏｓｓｉら（１９９８）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８：８４−８７に示されている。
【０１９２】
ＩＩ．ＳＨＡＬ（例えば、癌特異的ＳＨＡＬ）を構成するキメラ部分
本発明のＳＨＡＬは、特定の標的に特異的に結合するように選択される。標的が特定の細胞型（例えば、腫瘍細胞）に特徴的なマーカーである場合、１種類以上のエフェクターを標的細胞に特異的に送達するＳＨＡＬが使用され得る。
【０１９３】
一部の特定の実施形態において、ＳＨＡＬは、癌細胞に特異的に結合するものである。このような実施形態では、ＳＨＡＬは、治療薬として単独で使用され得る（例えば、癌細胞の成長および／または増殖を抑止するため）、および／または種々の癌細胞（例えば、単離細胞、転移性細胞、充実性腫瘍細胞など）へのエフェクター（例えば、細胞毒、放射性標識などのエフェクター分子など）の効率的かつ特異的な送達をもたらすためにエフェクターにカップリングさせ得る。
【０１９４】
一部の特定の好ましい実施形態において、本発明のＳＨＡＬは、「予備標的化」ストラテジー（エフェクター部分の投与後、標的部位にキメラ部分の形成がもたらされる）または「標的化」ストラテジー（キメラ分子を得るために使用する前に、ＳＨＡＬをエフェクター分子にカップリングさせる）において使用される。
【０１９５】
キメラ分子またはキメラ組成物またはキメラ部分は、天然状態では別々に存在している２つ以上の分子が一緒に連接されて、その構成成分分子の所望の機能性を有する単一の分子を形成している分子または組成物をいう。典型的には、キメラ分子の構成成分分子の１つは「標的化分子」（本発明の場合は、１つ以上のＳＨＡＬ）である。標的化分子は、キメラ分子をその特定の標的（例えば、癌細胞）に指向させる機能を果たすものである。
【０１９６】
キメラ分子の別の構成成分は「エフェクター」である。エフェクター分子は、標的細胞（例えば、癌細胞）に特異的に輸送される分子または分子基をいう。これに関して、かかる特異的な輸送は、癌細胞へ、または癌細胞内への排他的なものである必要はないが、単に、正常健常細胞と比べて癌細胞へ、または癌細胞内へのエフェクターの優先的な送達がもたらされることが必要なことに注意されたい。
【０１９７】
エフェクター分子は、典型的には、標的細胞に送達される特徴的な活性を有する。エフェクター分子としては、限定されないが、細胞毒、標識、放射性核種、リガンド、抗体、薬物、リポソーム、ナノ粒子、ウイルス粒子、サイトカインなどが挙げられる。
【０１９８】
一部の特定の実施形態において、エフェクターは検出可能な標識であり、好ましい検出可能な標識としては放射性核種が挙げられる。本発明の放射性核種−キレート剤−（例えば、ビオチン）コンジュゲートに有用な放射性核種および標識の中でも、γ放射体、ポジトロン放射体、Ｘ線放射体および蛍光放射体は、位置確認、診断および／または病期分類および／または治療に好適であるが、βおよびα放射体ならびに電子および中性子捕捉剤（ホウ素およびウランなど）もまた治療に使用され得る。
【０１９９】
検出可能な標識は、外部からの検出用機器および／または内部からの検出用機器と併用して使用され得、前立腺癌細胞を有効に位置確認および／または可視化する手段をもたらす。かかる検出／可視化は、種々の状況（例えば限定されないが、術前および術中の状況）において有用であり得る。したがって、一部の特定の実施形態において、本発明は、哺乳動物の体内の癌を術中に検出する方法に関する。このような方法は、典型的には、哺乳動物に、検出器（例えば、γ検出プローブ）による検出に充分な量で、検出可能な標識で標識された癌特異的ＳＨＡＬを含む組成物（例えば、放射性同位体、例えば、１６１Ｔｂ、１２３Ｉ、１２５Ｉなどで標識された本発明の抗体）を投与すること、および、標的組織による活性物質の取込みを可能にした後、好ましくは標識の血中クリアランス後、体内の関連領域において、例えばγ検出プローブを使用することにより、哺乳動物を放射免疫検出手法に供することを伴う。
【０２００】
標識結合ＳＨＡＬは、ラジオガイド下（ｒａｄｉｏｇｕｉｄｅｄ）術手法（この場合、被検体の体内の該当組織は、術中に、検出器（例えば、γ検出プローブ）によって検出および位置確認され得る）において使用され得る。外科医は、術中にこのプローブを使用し、放射性同位体（すなわち、例えば、低エネルギーγ光子放射体）で標識された化合物の取込みが行なわれた組織を見い出すことができる。
【０２０１】
検出可能な標識に加え、好ましいエフェクターとしては、細胞毒（例えば、シュードモナス外毒素、リシン、アブリン、ジフテリア毒素など）、または細胞傷害薬もしくはプロドラッグが挙げられ、この場合、キメラ分子は、細胞毒を癌細胞に特異的に標的化させる強力な細胞死滅剤としての機能を果たし得る（ｃａｍ）。
【０２０２】
さらに他の実施形態において、エフェクターとしては、リポソーム封入薬（例えば、ドキソルビシン（ｄｏｘｉｒｕｂｉｃｉｎ）、ビンブラスチン、タキソールなどの抗癌薬物など）、免疫機構の成分による結合細胞の認識を刺激する抗原、免疫機構の成分に特異的に結合し、該成分を癌に指向する抗体などが挙げられ得る。
【０２０３】
Ａ）一部の特定の好ましいエフェクター
１）画像化組成物
一部の特定の実施形態において、本発明のキメラ分子は、検出可能な標識を腫瘍部位に指向させるために使用され得る。これにより、腫瘍の検出および／または位置確認が容易になり得る。一部の特定の特に好ましい実施形態では、キメラ分子のエフェクター成分は「放射線不透過性」標識、例えば、ｘ線を用いて容易に可視化され得る標識である。放射線不透過性物質は当業者には充分わかる。最も一般的な放射線不透過性物質としては、ヨウ化物、臭化物またはバリウム塩が挙げられる。他の放射線不透過性物質も知られており、限定されないが、有機ビスマス誘導体（例えば、米国特許第５，９３９，０４５号参照）、放射線不透過性のポリウレタン（米国特許第５，３４６，９８１号参照）、有機ビスマス複合材料（例えば、米国特許第５，２５６，３３４号参照）、放射線不透過性バリウムポリマー複合体（例えば、米国特許第４，８６６，１３２号参照）などが挙げられる。
【０２０４】
本発明のＳＨＡＬは、放射線不透過性部分に直接カップリングさせてもよく、放射線不透過性物質を担持ならびに含有する「パッケージ」（例えば、キレート、リポソーム、ポリマーマイクロビーズなど）に結合させてもよい（後述）。
【０２０５】
放射線不透過性標識に加えて、他の標識もまた、本発明における使用に適している。本発明のキメラ分子のエフェクター分子成分としての使用に適した検出可能な標識としては、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段によって検出可能な任意の組成物が挙げられる。本発明において有用な標識としては、磁性ビーズ（例えば、ＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭ）、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐ、１８Ｆなど）または他の画像化用タグ、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびＥＬＩＳＡで一般的に使用されている他のもの）、ならびに比色定量用標識、例えば、金コロイドまたは着色ガラスもしくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなどの）ビーズが挙げられる。
【０２０６】
種々の好ましい放射性標識としては、限定されないが、９９Ｔｃ、２０３Ｐｂ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、１１１Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、９７Ｒｕ、６２Ｃｕ、６４１Ｃｕ、５２Ｆｅ、５２ｍＭｎ、５１Ｃｒ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、７７Ａｓ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、１６９Ｅｒ、１２１Ｓｎ、１２７Ｔｅ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１９８Ａｕ，１９９Ａｕ、１６１Ｔｂ、１０９Ｐｄ、１６５Ｄｙ、１４９Ｐｍ、１５１Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５７Ｇｄ、１５９Ｇｄ、１６６Ｈｏ、１７２Ｔｍ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１０５Ｒｈ、および１１１Ａｇが挙げられる。
【０２０７】
かかる標識の検出手段は当業者には充分わかる。したがって、例えば、放射性標識は、写真用フィルム、シンチレーション検出器などを用いて検出され得る。蛍光マーカーは、放射照度を検出するための光検出器を用いて検出され得る。酵素標識は、典型的には、酵素に基質を提供し、基質に対する酵素の作用によって生成される反応生成物を検出することにより検出され、比色定量標識は、単に着色標識を可視化することにより検出される。
【０２０８】
２）放射線増感剤．
別の実施形態において、エフェクターは、細胞に対する電離放射線（例えば、６０Ｃｏまたはｘ線源によって生成され得るもの）の細胞傷害性効果を増強する放射線増感剤であり得る。数多くの放射線増感剤が知られており、限定されないが、ベンゾポルフィリン誘導体化合物（例えば、米国特許第５，９４５，４３９号参照）、１，２，４−ベンゾトリアジンオキシド（例えば、米国特許第５，８４９，７３８号参照）、一部の特定のジアミンを含有する化合物（例えば、米国特許第５，７００，８２５号参照）、ＢＣＮＴ（例えば、米国特許第５，８７２，１０７号参照）、放射線増感性ニトロ安息香酸アミド誘導体（例えば、米国特許第４，４７４，８１４号参照）、種々の複素環式誘導体（例えば、米国特許第５，０６４，８４９号参照）、白金複合体（例えば、米国特許第４，９２１，９６３号参照）などが挙げられる。
【０２０９】
３）放射性同位体
一部の特定の実施形態において、エフェクターは、標的細胞に送達されると放射線誘導型細胞死をもたらす１種類以上の放射性同位体を含むものである。
【０２１０】
医学目的のため、最も重要な型の崩壊は、γ放射、β崩壊、α崩壊、および電子捕捉である。放射性核種（１３１Ｉなど）によって放射されるγは身体から逸出し、外部からのシンチグラフィによる画像化の使用により、放射性標識抗体の体内分布の測定を可能にする（イムノシンチグラフィに最適なエネルギー範囲は１００〜２５０ｋｅＶである）。対照的に、β粒子は、そのエネルギーの大部分を崩壊点の数ミリメートル以内に沈着させる。抗原陽性腫瘍細胞を標的化した放射性核種（１３１Ｉまたは９０Ｙなど）からのβ放射線により、近傍の抗原陰性腫瘍細胞が「クロスファイア（ｃｒｏｓｓｆｉｒｅ）」効果によって死滅され得る。
【０２１１】
イットリウム−９０は純粋なβ放射体であり、放射免疫療法を魅力的な選択肢にするいくつかの特性：１）高いβエネルギー（Ｅｍａｘ＝２．２９ＭｅＶ；組織内での粒子エネルギーの最大範囲＝１１．９ｍｍ）、これは、隣接腫瘍細胞の死滅も可能である；２）金属化学、これにより、放射性同位体−抗体コンジュゲートの合成および予備標的化アプローチの使用が容易になる；ならびに３）インタクトなＳＨＡＬ（これは、腫瘍内でピーク濃度に達するのに１〜３日間かかり得る）との使用のための充分に長い体内半減期（２．６７日間）を有する。
【０２１２】
一部の特定の実施形態において、エフェクターは、α放射体、すなわちα粒子を放射する放射性同位体および／またはオージェ（ａｕｔｅｒ）電子放射体を含むものであり得る。α放射体およびオージェ電子放射体は、最近、癌の処置に有効であることが示された（例えば、Ｂｏｄｅｉら（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，１８：８６１参照）。好適なα放射体としては、限定されないが、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔなどが挙げられる。
【０２１３】
表４は、放射免疫療法に適した放射性核種の一例を示す。この一覧は例示を意図し、限定を意図しない。
【０２１４】
【表４】
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４）リガンド
種々の実施形態において、エフェクター分子はまた、リガンド、エピトープタグまたは抗体であってもよい。特に好ましいリガンドおよび抗体は、免疫細胞上の表面マーカーに結合するものである。エフェクター分子などの抗体が使用されたキメラ分子は、リガンドまたは抗体に対する結合パートナーを有する免疫細胞と、前立腺癌細胞（１つまたは複数）との結合を確立する二官能性リンカーとしての機能を果たす。
【０２１５】
５）キレート
本明細書に記載の医薬品および／または放射性標識の多くは、好ましくは、特に、予備標的化ストラテジーが使用される場合は、キレートとして提供される。キレート化分子は、典型的には、本発明の前立腺癌特異的抗体に結合させたエピトープタグに特異的に結合する分子（例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンなど）にカップリングさせる。
【０２１６】
キレート化基は、当業者には充分わかる。一部の特定の実施形態において、キレート化基は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、シクロヘキシル１，２−ジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、エチレングリコール−Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシベンジル）−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸（ＨＢＥＤ）、トリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’−，Ｎ”，Ｎ”’−四酢酸（ＤＯＴＡ）、ヒドロキシエチルジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、１，４，８，１１−テトラ−アザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−四酢酸（ＴＥＴＡ）、置換ＤＴＰＡ、置換ＥＤＴＡなどに由来するものである（例えば、図２２参照）。
【０２１７】
一部の特定の好ましいキレート剤の例としては、非置換または置換２−イミノチオランおよび２−イミノチアシクロヘキサン、特に、２−イミノ−４−メルカプトメチルチオランが挙げられる。
【０２１８】
キレート剤の一例である１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ，Ｎ”，Ｎ”’−四酢酸（ＤＯＴＡ）は、放射性核種および放射性標識などのいくつかの診断上および治療上重要な金属とキレートを形成する能力のため、特に重要である。
【０２１９】
ＤＯＴＡとタンパク質（抗体など）とのコンジュゲートは報告されている。例えば、米国特許第５，４２８，１５６号には、ＤＯＴＡを抗体および抗体断片にコンジュゲートさせるための方法が教示されている。このようなコンジュゲートを作製するため、ＤＯＴＡのカルボン酸基の１つを活性なエステルに変換させると、これが、抗体または抗体断片上のアミンまたはスルフヒドリル基と反応し得る。Ｌｅｗｉｓら（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：５６５−５７６にも同様の方法が記載されており、この場合では、ＤＯＴＡのカルボキシル基の１つを活性なエステルに変換させ、この活性化型ＤＯＴＡを抗体と混合し、該抗体をＤＯＴＡに、該抗体のリジン残基のε−アミノ基によって連結させ、それにより、ＤＯＴＡのカルボキシル基の１つをアミド部分に変換させる。
【０２２０】
あるいはまた、キレート剤を直接またはリンカーによって、エピトープタグまたはエピトープタグに結合する部分にカップリングさせてもよい。ＤＯＴＡとビオチンのコンジュゲートが報告されている（例えば、Ｓｕ（１９９５）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，３６（増刊５）：１５４Ｐ参照、これには、ＤＯＴＡをビオチンに、利用可能なアミノ側鎖ビオチン誘導体（ＤＯＴＡ−ＬＣ−ビオチンまたはＤＯＴＡ−ベンジル−４−（６−アミノ−カプロアミド）−ビオチンなど）によって結合させることが開示されている）。ＹａｕらのＷＯ９５／１５３３５には、ビオチンにコンジュゲートさせ得るニトロ−ベンジル−ＤＯＴＡ化合物の作製方法が開示されている。該方法は、ヒドロキシ基の一時的突出による環化反応；アミンのトシル化；一時的に保護したヒドロキシ基の脱保護；脱保護したヒドロキシ基のトシル化；および分子内トシレート環化を含む。Ｗｕら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，１９（２）：２３９−２４４には、タンパク質を１１１Ｉｎおよび９０Ｙで放射性標識するための大環状（ｍａｃｒｏｃｙｌｉｃ）キレート剤の合成が開示されている。Ｗｕらにより、試験用モデルタンパク質であるアビジンとのコンジュゲートの安定性および体内分布を試験するための標識ＤＯＴＡ−ビオチンコンジュゲートが作製される。このコンジュゲートは、インサイチュで生成される活性化型ＤＯＴＡ誘導体と反応する遊離アミノ基を含むビオチンヒドラジドを用いて作製された。
【０２２１】
大環状キレート剤１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”’−四酢酸（ＤＯＴＡ）は９０Ｙおよび１１１Ｉｎに、驚くべき安定性を伴って結合することに注目されたい。放射性標識反応時間を推定するために、予測的放射性医薬標識下で、選択したバッファー中での反応速度試験を行なうと、放射性医薬品のＦＤＡ要件に適合する高い生成物収率がもたらされる最適な放射性標識条件が決定され得る。また、イットリウム−９０−ＤＯＴＡキレートの作製のためのプロトコルは、Ｋｕｋｉｓら（１９９８）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，３９（１２）：２１０５−２１１０に詳細に記載されていることにも注目されたい。
【０２２２】
６）細胞毒
本発明のＳＨＡＬは、さまざまな細胞傷害薬、例えば、治療用薬物、放射線を放射する化合物、植物、真菌または細菌起源の分子、生物学的タンパク質、およびその混合物を送達するために使用され得る。細胞傷害薬は、細胞内作用性細胞傷害薬（ショートレンジ（ｓｈｏｒｔ−ｒａｎｇｅ）放射線放射体（例えば、上記のショートレンジ高エネルギーα放射体など）、または酵素インヒビターなど）であってもよい。
【０２２３】
酵素活性毒素およびその断片としては、例えば、ジフテリア毒素Ａ断片、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サクリン、一部の特定のＡｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、一部の特定のジアンチン（Ｄｉａｎｔｈｉｎ）タンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、Ｍｏｒｏｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａインヒビター、クルシン、クロチン、Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓインヒビター、ゲロニン、ミトギリン（ｍｉｔｏｇｉｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン（ｐｈｅｎｏｍｙｃｉｎ）、ならびにエノマイシン（ｅｎｏｍｙｃｉｎ）が例示される。
【０２２４】
特に好ましい細胞毒としては、シュードモナス外毒素、ジフテリア毒素、リシン、およびアブリンが挙げられる。シュードモナス外毒素Ａ（ＰＥ）は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａによって分泌される極めて活性な単量体タンパク質（分子量６６ｋＤ）であり、ＡＤＰ−リボシル化を触媒すること（酸化型ＮＡＤのＡＤＰリボシル部分のＥＦ−２への転移を触媒すること）により伸長因子２（ＥＦ−２）を不活化することによって、真核生物細胞におけるタンパク質合成を阻害する。
【０２２５】
この毒素は、協調して細胞傷害性を引き起こす機能を果たす３つの構造ドメインを含む。ドメインＩａ（アミノ酸１〜２５２）は、細胞結合を媒介する。ドメインＩＩ（アミノ酸２５３〜３６４）は細胞質ゾル内へのトランスロケーションを担い、ドメインＩＩＩ（アミノ酸４００〜６１３）は該タンパク質を不活化して細胞死を引き起こす伸長因子２のＡＤＰリボシル化を媒介する。ドメインＩｂ（アミノ酸３６５〜３９９）の機能は未だ不明であるがその大部分であるアミノ酸３６５〜３８０は、細胞傷害性が低下することなく欠失させ得る（例えば、Ｓｉｅｇａｌｌら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１４２５６−１４２６１参照）。
【０２２６】
ＳＨＡＬをＰＥに結合させる場合、好ましいＰＥ分子の一例は、ドメインＩａ（アミノ酸１〜２５２）が欠失させ、ドメインＩｂからアミノ酸３６５〜３８０が欠失させたものである。しかしながら、ドメインＩｂの全部およびドメインＩＩの一部（アミノ酸３５０〜３９４）が欠失させたものであってもよい（特に、欠失させた配列をＧＧＧＧＳ（配列番号２０）などの連結ペプチドで置き換える場合）。
【０２２７】
また、ＰＥ分子は、該分子を特定の所望の適用用途用に改変させるため、部位指向変異誘発または当該技術分野で知られた他の手法を用いてさらに修飾してもよい。本明細書に記載のＰＥ分子によってもたらされる機能上の利点に実質的に影響を及ぼさない様式でＰＥ分子を改変させる手段もまた、使用され得、結果として得られるかかる分子は本明細書に包含されるものとする。
【０２２８】
好ましいＰＥ分子の最大の細胞傷害特性のためには、該分子に対するいくつかの修飾が推奨される。組換え分子に対する適切なカルボキシル末端配列は、該分子を標的細胞の細胞質ゾル内にトランスロケーションさせるのに好ましい。有効であることがわかっているアミノ酸配列としては、ＲＥＤＬＫ（配列番号２１）（天然ＰＥの場合と同様）、ＲＥＤＬ（配列番号２２）、ＲＤＥＬ（配列番号２３）、またはＫＤＥＬ（配列番号２４）、これらの反復単位、またはタンパク質を小胞体内に維持もしくは再循環させる機能を果たす他の配列（本明細書では「小胞体保持配列」という）が挙げられる。例えば、Ｃｈａｕｄｈａｒｙら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：３０８−３１２およびＳｅｅｔｈａｒａｍら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１７３７６−１７３８１を参照のこと。好ましいＰＥの形態は、ＰＥ３８ＱＱＲで指定されるＰＥ分子（Ｄｅｂｉｎｓｋｉら  Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，５：４０（１９９４））、およびＰＥ４Ｅ（例えば、Ｃｈａｕｄｈａｒｙら（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１６３０６参照）を構成するものである。
【０２２９】
ＰＥをコードする遺伝子のクローニングおよびかかる細胞毒を標的化部分にカップリングさせるための方法は当業者には充分わかる（例えば、Ｓｉｅｇａｌｌら（１９８９）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，３：２６４７−２６５２；およびＣｈａｕｄｈａｒｙら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：４５３８−４５４２、ならびにそこに挙げられた参考文献を参照のこと）。
【０２３０】
ＰＥと同様、ジフテリア毒素（ＤＴ）は、伸長因子２をＡＤＰ−リボシル化し、それによりタンパク質合成を阻害することにより細胞を死滅させる。しかしながら、ジフテリア毒素は、ジスルフィド結合によって連結された２つの鎖ＡとＢに分けられる。ＰＥとは対照的に、カルボキシル末端側にあるＤＴの鎖Ｂは受容体結合を担い、アミノ末端側に存在する鎖Ａは酵素活性を含む（Ｕｃｈｉｄａら（１９７２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，１７５：９０１−９０３；Ｕｃｈｉｄａら（１９７３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４８：３８３８−３８４４）。
【０２３１】
好ましい実施形態において、本発明のＳＨＡＬ−ジフテリア毒素キメラ分子は、ジフテリア毒素Ｂ鎖の切断によって除去された天然の受容体結合ドメインを有する。特に好ましいものは、残基３８９から始まるカルボキシル末端配列が除去されたＤＴであるＤＴ３８８である。Ｃｈａｕｄｈａｒｙら（１９９１）Ｂｉｏｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１８０：５４５−５５１。ＰＥキメラ細胞毒と同様、ＤＴ分子を前立腺癌特異的抗体に化学的にコンジュゲートさせることができるが、一部の特定の好ましい実施形態では、該抗体をジフテリア毒素に組換え手段によって融合させる（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１１８８５−１１８８９参照）。
【０２３２】
７）ウイルス粒子
一部の特定の実施形態において、エフェクターはウイルス粒子を含むものである。ＳＨＡＬはウイルス粒子に、例えば、該ウイルス粒子（例えば、糸状ファージ）の表面上に発現されるタンパク質によってコンジュゲートされ得る。ウイルス粒子は、標的（前立腺癌）細胞送達される核酸をさらに含むものであり得る。核酸を細胞に送達するためのウイルス粒子の使用は、ＷＯ９９／５５７２０に詳細に記載されている。
【０２３３】
８）他の治療性部分
他の適当なエフェクター分子としては、薬理学的薬剤または種々の薬理学的薬剤を含有するカプセル封入系が挙げられる。したがって、ＳＨＡＬは、腫瘍に直接送達される薬物に直接結合させてもよい。かかる薬物は当業者には充分わかり、限定されないが、ドキソルビシン、ビンブラスチン、ゲニステイン、アンチセンス分子などが挙げられる。
【０２３４】
あるいはまた、エフェクター分子は、治療用組成物（薬物、核酸（例えば、アンチセンス核酸あるいは細胞に送達される別の核酸）など）、または別の治療性部分（好ましくは、循環系への直接的な曝露が遮蔽されたもの）を含むカプセル封入系、例えば、ウイルスキャプシド、リポソームまたはミセルなどを含むものであり得る。抗体に結合させるリポソームの調製方法は、当業者には充分わかり（例えば、米国特許第４，９５７，７３５号、Ｃｏｎｎｏｒら（１９８５）Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒ．，２８：３４１−３６５参照）、同様の方法がＳＨＡＬのカップリングに使用され得る。
【０２３５】
Ｂ）エフェクターへのＳＨＡＬの結合
当業者には、本発明のＳＨＡＬとエフェクター分子（１つまたは複数）を、任意の順で一緒に連接させ得ることは認識されよう。したがって、種々の実施形態において、エフェクターはＳＨＡＬを構成する任意のリガンドに、および／またはＳＨＡＬを構成する種々のリガンドを連接するリンカーに結合させ得る。
【０２３６】
ＳＨＡＬとエフェクターは、当業者には充分わかるいくつかの任意の手段によって結合させ得る。典型的には、エフェクターは、直接またはリンカー（スペーサー）を介してのいずれかでＳＨＡＬにコンジュゲートさせる。
【０２３７】
一実施形態において、ＳＨＡＬは、エフェクター分子（例えば、細胞毒、標識、リガンド、または薬物もしくはリポソームなど）に、化学的にコンジュゲートさせる。分子を化学的にコンジュゲートさせる手段は当業者には充分わかる。
【０２３８】
エフェクターをＳＨＡＬに結合させる手順は、エフェクターおよび／またはＳＨＡＬの化学構造に応じて異なる。ＳＨＡＬを構成するリガンドおよび／または該リガンドを連接するリンカーは、エフェクターをＳＨＡＬに有効に結合させるさまざまな官能基；例えば、カルボン酸（ＣＯＯＨ）、遊離アミン（−ＮＨ２）、ヒドロキシル（−ＯＨ）、チオール（−ＳＨ）、およびエフェクター分子上またはエフェクター分子に結合されたリンカー上の適当な官能基との反応に利用可能な他の基を含むものであり得る。
【０２３９】
あるいはまた、ＳＨＡＬを構成するリガンド（１つまたは複数）および／または該リガンドを連接するリンカーは、さらなる反応性官能基を露出または結合させるために誘導体化してもよい。誘導体化は、リガンドを互いにカップリングさせるための任意のいくつかのリンカー分子（上記のものなど）の結合を伴うものであり得る。
【０２４０】
一部の状況において、キメラ分子が標的部位に達したとき、エフェクターをＳＨＡＬから遊離させることが望ましい。したがって、エフェクターをＳＨＡＬから放出させる場合は、例えば標的部位の近傍で切断可能な結合を含むキメラコンジュゲートが使用され得る。該薬剤を抗体から放出させるための結合の切断は、酵素活性またはコンジュゲートが例えば、標的細胞内部または標的部位の近傍のいずれかで供される条件によって促進されることがあり得る。標的部位が腫瘍である場合、腫瘍部位に存在する条件下で（例えば、腫瘍関連酵素または酸性ｐＨに曝露された場合に）切断可能なリンカーが使用され得る。
【０２４１】
一部の特定の場合では、切断可能なリンカーは、タンパク質分解に供され得るペプチドであり得る。一部の特定の実施形態において、切断可能なリンカーは、プロテアーゼの認識部位を有するペプチドを含むものである。
【０２４２】
種々の切断可能なリンカーのいくつかは当業者にはわかる。米国特許第４，６１８，４９２号；同第４，５４２，２２５号、および同第４，６２５，０１４号参照。このようなリンカー基からの薬剤の放出の機構としては、例えば、光不安定性結合への放射線照射および酸触媒性加水分解が挙げられる。例えば、米国特許第４，６７１，９５８号には、患者の補体系のタンパク質分解性酵素によって標的部位でインビボで切断されるリンカーを含む免疫複合体の記載が含まれている。さまざまな放射性診断用化合物、放射性治療用化合物、薬物、毒素および他の薬剤を抗体に結合させるための多くの数の方法が報告されていることに鑑みて、当業者は、所与の薬剤を抗体または他のポリペプチドに結合させるための適当な方法を決定することができよう。
【０２４３】
１）キレートのコンジュゲーション
一部の特定の好ましい実施形態において、エフェクターは、抗体またはエピトープタグに結合させたキレートを含むものである。癌特異的ＳＨＡＬは、ＳＨＡＬが該キレートと単に接触することで、エフェクターへのＳＨＡＬの結合がもたらされるように、対応するエピトープタグまたは抗体を有する。該部分を使用する前に該結合工程を行なってもよく（標的化ストラテジー）、該キレートを送達する前に標的組織をＳＨＡＬに結合させてもよい。種々の標的化部分へのカップリングに適したキレートの作製方法は、当業者には充分わかる（例えば、米国特許第６，１９０，９２３号、同第６，１８７，２８５号、同第６，１８３，７２１号、同第６，１７７，５６２号、同第６，１５９，４４５号、同第６，１５３，７７５号、同第６，１４９，８９０号、同第６，１４３，２７６号、同第６，１４３，２７４号、同第６，１３９，８１９号、同第６，１３２，７６４号、同第６，１２３，９２３号、同第６，１２３，９２１号、同第６，１２０，７６８号、同第６，１２０，７５１号、同第６，１１７，４１２号、同第６，１０６，８６６号、同第６，０９６，２９０号、同第６，０９３，３８２号、同第６，０９０，８００号、同第６，０９０，４０８号、同第６，０８８，６１３号、同第６，０７７，４９９号、同第６，０７５，０１０号、同第６，０７１，４９４号、同第６，０７１，４９０号、同第６，０６０，０４０号、同第６，０５６，９３９号、同第６，０５１，２０７号、同第６，０４８，９７９号、同第６，０４５，８２１号、同第６，０４５，７７５号、同第６，０３０，８４０号、同第６，０２８，０６６号、同第６，０２２，９６６号、同第６，０２２，５２３号、同第６，０２２，５２２号、同第６，０１７，５２２号、同第６，０１５，８９７号、同第６，０１０，６８２号、同第６，０１０，６８１号、同第６，００４，５３３号、同第６，００１，３２９号などを参照のこと）。
【０２４４】
ＩＩＩ．受容体、酵素および他の（ｏｈｅｒ）生体分子を阻害するＳＨＡＬ
一部の特定の実施形態において、本発明は、酵素、受容体の活性、または他の生体分子の活性を阻害するＳＨＡＬを提供する。典型的には、かかるＳＨＡＬは、酵素または受容体の活性部位または結合部位の周囲または付近の異なる部位に結合するリガンドを含むものである。一部の特定の実施形態において、リガンドは、酵素、受容体または他の結合性タンパク質内の第１のポケットおよび第２のポケットに結合するように選択され、ここで、第１と第２のポケットは、前記酵素、受容体または他の結合性タンパク質の活性部位または結合部位の対向する側にフランキングしているか、あるいは第１のポケットが活性な部位を含むか、または該部位に存在しており、第２のポケットが、第１のポケットの付近に／隣接して存在しているか、あるいはいずれかまたは両方のポケットが、別の分子との結合のために該タンパク質、酵素または受容体によって使用される部位内に、または該部位の充分近くに、いずれかまたは両方のポケット内へのリガンドの結合によって、該酵素、受容体または他の生体分子のその（ｉｓ）コグネートリガンドへの結合が破壊または阻止されないように存在している。ＳＨＡＬは、標的と接触すると、該標的に結合して、活性部位および／または結合部位を有効にブロックし、それにより酵素、受容体または他の生体分子の活性を阻害（ｉｎ  ｈａｂｉｔｉｎｇ）する。
【０２４５】
ＩＶ）医薬組成物
本発明のＳＨＡＬおよび／またはキレートおよび／またはキメラ分子（特に、癌または他の病理細胞に特異的なもの）は、予防的処置のため、しかし主として治療的処置のための非経口、経表面、経口または局所投与（例えば、腫瘍部位内への注射）、エーロゾル剤投与、または経皮投与に有用である。医薬組成物は、投与方法に応じて、さまざまな単位投薬形態で投与され得る。例えば、経口投与に適した単位投薬形態としては、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤およびロゼンジ剤が挙げられる。本発明の医薬組成物は、経口投与される場合、消化から保護してもよいことは認識されよう。これは、典型的には、活性成分（例えば、ＳＨＡＬ、キメラ分子など）を、酸性加水分解もしくは酵素加水分解に対して抵抗性にする組成物とともに複合体形成すること、または活性成分（１種類もしくは複数種）を適切な抵抗性の担体内（リポソームなど）にパッケージングすることのいずれかによって行なわれる。成分を消化から保護する手段は当該技術分野でよく知られている。
【０２４６】
本発明の医薬組成物は、非経口投与（静脈内投与など）または体腔もしくは器官の内腔内への投与に特に有用である。該投与用組成物は、一般的には、薬学的に許容され得る担体、好ましくは水性担体に溶解させたＳＨＡＬおよび／またはキメラ分子の液剤を含む。さまざまな水性担体（例えば、緩衝生理食塩水など）が使用され得る。このような液剤は滅菌されており、一般的に、望ましくない物質を含まない。このような組成物は、慣用的でよく知られた滅菌手法によって滅菌され得る。該組成物には、必要に応じて、生理学的条件に近づけるための薬学的に許容され得る補助物質、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどが含まれ得る。このような製剤中のキメラ分子の濃度は、広く異なり得、選択される具体的な投与様式および患者の必要性に応じて、主に液容積、粘度、体重などに基づいて選択される。
【０２４７】
したがって、静脈内投与のための典型的な医薬組成物は、約０．１〜１０ｍｇ／患者／日であり得る。特に、薬物が、血液流でなく、計画された部位（体腔内または器官の内腔内など）に投与される場合、０．１から約１００ｍｇまで／患者／日の投薬量が使用され得る。非経口投与可能な組成物の実際の調製方法は当業者にはわかり、または自明であり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，第１５版，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９８０）などの刊行物に、より詳細に記載されている。
【０２４８】
本発明のＳＨＡＬおよび／またはキメラ分子あるいはそのカクテル（すなわち、他の治療薬との）を含む組成物は、治療的処置のために投与され得る。治療用適用用途では、該組成物は、疾患（例えば、癌）に苦しむ患者に、該疾患およびその合併症が治癒されるか、または少なくとも一部停止されるのに充分な量で投与される。これが達成されるのに充分な量を、「治療有効用量」と定義する。このような使用のための有効な量は、疾患の重症度および患者の一般健康状態に依存する。
【０２４９】
患者が必要とする、および患者に許容される投薬量および頻度に応じて、該組成物の単回投与または反復投与が施され得る。任意の事象において、該組成物は、患者が有効に処置されるのに充分な量のＳＨＡＬを提供するものであるのがよい。
【０２５０】
当業者には、激しく血管新生されない領域、あるいは血流中に存在する巨大分子の進入を低減または抑制する強固な連結によって連接された細胞および／または活発な輸送機構によって保護される領域がいくつか存在することが認識されよう。
【０２５１】
当業者には、このような場合、本発明の治療用組成物は、腫瘍部位に直接投与され得ることが認識されよう。したがって、例えば、脳腫瘍は、治療用組成物を直接腫瘍部位に（例えば、外科処置によって埋入したカテーテルによって）投与することにより処置され得る。
【０２５２】
あるいはまた、治療用組成物を標的部位に、低速放出製剤にて配置してもよい。かかる製剤としては、例えば、治療用組成物を含浸させた生体適合性のスポンジあるいは他の不活性もしくは吸収性マトリックス材料、低速溶解性時限放出カプセル剤またはマイクロカプセル剤などが挙げられ得る。
【０２５３】
典型的には、カテーテルまたは時限放出製剤を腫瘍部位に、外科処置の一部として配置する。したがって、例えば、大きな腫瘍塊を外科的に除去する場合、灌流カテーテルまたは時限放出製剤を腫瘍部位に、補助的療法として配置してもよい。もちろん、腫瘍塊の外科的除去が望ましくないか、必要でないか、または不可能であることもあり得、そのような場合は、本発明の治療用組成物の送達は、基本治療モダリティを含むものであり得る。
【０２５４】
Ｖ．キット
放射性または他のエフェクターが診断用および／または治療用薬剤として使用される場合、多くの場合、使用される放射性標識化合物の貯蔵寿命が不充分である、および／または使用される放射性核種の半減期が短いため、ユーザーが既製組成物を身近に置いておくことは、多くの場合、不可能である。かかる場合において、ユーザーは、病院、診察室または研究室で、放射性核種を用いて標識反応を行なうことができる。この目的または他の目的のため、種々の反応成分をユーザーに、いわゆる「キット」の形態で供給することができる。キットは、好ましくは、所望の反応を行なうのに必要な操作をできるだけ単純にし、ユーザーが自身の能力の範囲内で、所望の組成物をキットから調製することが可能であるように設計される。したがって、本発明はまた、本発明による組成物を調製するためのキットに関する。
【０２５５】
本発明によるかかるキットは、好ましくは、本明細書に記載のＳＨＡＬを含む。ＳＨＡＬには、所望により、不活性な薬学的に許容され得る担体が提供され得る、および／または製剤化剤および／または佐剤が添加される。また、キットは、任意選択で、適当な放射性核種（または他の活性薬剤）の塩またはキレートの溶液ならびに（ｉｉｉ）キット内に存在する成分を投与および／または反応させるための指示書とともに使用する使用説明書を含む。
【０２５６】
また、ユーザーに供給されるキットは、上記の成分（１種類または複数種）を、使用のための使用説明書とともに含むものであり得るが、限られた貯蔵寿命であり得る放射性核種の塩またはキレートの溶液は、別途、ユーザーの意思次第にしてもよい。
【０２５７】
キットは任意選択で、さらに還元剤および／または、所望によりキレート剤および／または組成物の使用のための使用説明書および／またはキットの成分を反応させて所望の生成物（１種類または複数種）を形成するための指示書を含むものであり得る。所望により、キットの成分は、適合性であれば合わせてもよい。
【０２５８】
一部の特定の実施形態において、ＳＨＡＬとの複合体形成反応は、単に、諸成分を中性媒体中で合わせて反応させることによりもたらされ得る。該目的のためには、エフェクターはＳＨＡＬに、キレートの形態で提示されるのがよい。
【０２５９】
キットの構成成分（１種類または複数種）が、医薬の投与のための成分（１種類または複数種）として（例えば、注射液として）使用される場合、好ましくは滅菌されている。該構成成分（１種類または複数種）が乾燥状態で提供される場合、ユーザーは、好ましくは、滅菌生理食塩水溶液を溶媒として使用するのがよい。所望により、該構成成分（１種類または複数種）は、適当な安定剤（例えば、アスコルビン酸、ゲンチシン酸またはこれらの酸の塩）を用いて慣用的な様式にて安定化させてもよく、他の補助剤（例えば、グルコース、ラクトース、マンニトールなどの充填剤）を含めてもよい。
【０２６０】
使用説明資料は、存在させる場合、典型的には、書面または印刷物を含むものであるが、かかるものに限定されない。かかる使用説明書を保存し得る、および該使用説明書をエンドユーザーに伝達し得る任意の媒体が、本発明で想定される。かかる媒体としては、限定されないが、電子保存媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ  ＲＯＭ）などが挙げられる。かかる媒体は、かかる使用説明資料が提供されるインターネットのサイトのアドレスを含むものであってもよい。
【実施例】
【０２６１】
実施例
以下の実施例は、例示のために提供し、特許請求の範囲に記載された発明を限定するものでない。
【０２６２】
実施例１
ＨＬＡ−ＤＲ１０特異的ＳＨＡＬの作製
前臨床試験および臨床試験により、ＨＬＡ−ＤＲ１０および関連ＨＬＡ−ＤＲ主要組織適合細胞表面タンパク質のβサブユニット上のエピトープ領域（抗体によって認識される特殊領域）は、Ｂ細胞リンパ腫および白血病のための全身性放射性同位体療法の標的として特に魅力的であり、癌の処置および予防のための他の機会を提供することが示された。ＨＬＡ−ＤＲ１０は、適当な標的となる他のＢ細胞表面タンパク質（ＣＤ２０など）と共通する特徴を有するが、大きな魅力をもたらすと本発明者らが考える異なる特徴を有する。
【０２６３】
ＣＤ２０抗原と共通して、ＨＬＡ−ＤＲ１０タンパク質はＢリンパ球の表面上に存在し、Ｂ細胞分化を通して存続するが、リンパ球が形質細胞段階への変換中に消失する（Ｅｐｓｔｅｉｎら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４７：８３０−８４０）。別個のＬｙｍ−１抗原エピトープは、免疫委任Ｂ細胞前駆細胞上に見られるが、Ｂ細胞発生中より前では発現されない。また、これは、一般的には、Ｔ細胞または他の正常細胞上には見られない。Ｂ細胞上でのクラス２ＭＨＣ分子の発現は、発生的に制御される。早期およびプレＢ細胞は、クラス２ｍＲＮＡ陰性であり、クラス２抗原の発現は誘導され得ない。ＨＬＡ−ＤＲ抗原は、後期プレＢ細胞段階中に獲得される。Ｂ細胞上でのクラス２発現の基底レベルは、悪性Ｂ細胞株上でみられるものより約１００倍低いため（Ｒｏｓｅら（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，４３：２６−３０．；Ｒｏｓｅら（１９９９）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３６：７８９−７９７）、これにより、脈管外悪性リンパ腫を標的化するのに、Ｌｙｍ−１抗体はわずか５ｍｇしか必要でないという観察結果の説明が示される（ＤｅＮａｒｄｏら（１９９８）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，１６：３２４６−３２５６）が、正常リンパ球上のＣＤ２２およびＣＤ２０抗原の密度のため、５０ｍｇのＣＤ２２と数百ミリグラムのＣＤ２０抗体が必要とされる（Ｐｒｅｓｓ（１９９９）Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，２６：５８−６５；Ｋｎｏｘら（１９９６）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２：４５７−４７０）。少量のＬｙｍ−１に結合させたヨウ素−１３１、銅−６７またはイットリウム−９０の処置用量で、Ｒａｊｉ異種移植片を有するマウスのほとんどが治癒された（ＤｅＮａｒｄｏら（１９９１）Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒ．，４：７７７−７８５；ＤｅＮａｒｄｏら（１９９７）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，３：７１−７９）、Ｌｙｍ−１の生成のための免疫原として、ヒトバーキット悪性リンパ腫細胞株を使用（Ｅｐｓｔｅｉｎら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４７：８３０−８４０）。同様に、この放射性医薬品（Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫を有する患者、および慢性リンパ球性白血病を有する患者のサブセットにおいてフェーズＩ／ＩＩ治験中）により、高くて持続性の応答速度が誘導され、単独薬物療法剤として使用した場合、多くの場合で完全な寛解がみられ、一部では生存期間が長くなった。ＨＬＡ−ＤＲにより細胞の同定がもたらされ、抗原ペプチドはＨＬＡ−ＤＲ上にディスプレイされる。これは、Ｒａｊｉ細胞およびＲａｊｉ腫瘍に対して細胞傷害性のヒトポリクローナル抗体を含むイディオタイプ抗体カスケードを記録した進行性リンパ腫を有する本発明者らの患者のサブセットにおいて、生存期間が異例に長いことの説明となり得る（ＤｅＮａｒｄｏら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．，１３：１−１２；Ｌａｍｂｏｒｎら（１９９７）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，３：１２５３−１２６０）。
【０２６４】
しかしながら、このような抗体の働きに加えて、なお改善の必要性が存在する。抗体は、血管障壁および腫瘍の透過が不充分な巨大分子であり、さまざまな受容体と相互作用し、そのため放射性同位体担体としての選択性が限定的となり、有害事象プロフィールが付加される。「ヒト化」抗体が使用された抗体系試薬は、免疫原性が最小限となり得るが排除はされない（Ｂｒｏｗｎら（２００１）Ｃｌｉｎ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ．，２：１８８−９０；Ｋｏｓｔｅｌｎｙら（２００１）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，９３：５５６−６５；Ｌｅｏｎａｒｄら（２００２）Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，２９：８１−６；Ｌｕｎｄｉｎら（２００２）Ｂｌｏｏｄ，１００：７６８−７３；ＬｉｇｉｂｅｌおよびＷｉｎｅｒ（２００２）Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，２９：３８−４３）。免疫原性は、非タンパク質系試薬を作製することにより回避され得る。また、完全抗体は、選択性を低下させ、有害事象を増大させる非標的細胞との認識可能な反応性（例えば、Ｆｃ相互作用）を示す。薬剤の選択性の標的化は、小さな改善であっても、付随的損傷を最小限にし、薬物の治療指数を向上させるために使用され得る。
【０２６５】
Ｌｙｍ−１は、マウスＩｇＧ−２ａモノクローナル抗体（ＭＡｂ）であり、悪性ヒトＢ細胞の表面上に高度に発現されるタンパク質に選択的に結合する（Ｅｐｓｔｅｉｎら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，４７：８３０−８４０）。本発明者らは、ＨＬＡ−ＤＲ１０上の離散したエピトープは、Ｌｙｍ−１  Ｍａｂを生成させるＲａｊｉ細胞内の起源的抗原であり、このエピトープは、すべてのＨＬＡ−ＤＲ亜型によって共有されているものではないことを示した（Ｒｏｓｅら（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，４３：２６−３０；Ｒｏｓｅら（１９９９）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３６：７８９−７９７）。本発明者らのデータは、この不可欠Ｌｙｍ−１結合残基が、反応性ＨＬＡ−ＤＲ１０のβサブユニットと非反応性で大部分が同一のＨＬＡ−ＤＲ  ３およびＨＬＡ−ＤＲ  ５２βサブユニットとのアミノ酸配列内の１９個の違いの中に含まれていることを示す。これは、ＨＬＡ−ＤＲ含有白血球の中でもＬｙｍ−１エピトープまたは結合部位に選択性があることの根拠となり、さらに、悪性Ｂ細胞を有する事実上すべての患者にこのタンパク質が存在することの根拠を提供する。不可欠Ｌｙｍ−１結合領域を含む１９個の残基のうち、アミノ酸Ｑ７０またはＲ７０と、その後のＲ７１のみが、すべてのＬｙｍ−１反応性被検物に見られ、Ｌｙｍ−１非反応性被検物には非存在であった。非反応性ＨＬＡ−ＤＲ分子の多くは、ほとんどの場合、これらの２つの残基がＤ７０および／またはＥ７１で置き換わっていた。推定不可欠Ｌｙｍ−１結合残基（Ｑ／Ｒ７０−Ｒ７１）を含む亜型が最も反応性であろうという仮説が、３１種類のＨＬＡ−ＤＲ遺伝子型が組み込まれたＢ細胞型およびＴ細胞型のリンパ芽球性細胞株で行なわれたさらなる細胞傷害性アッセイを含む一連の試験において確認された（Ｒｏｓｅら（１９９９）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３６：７８９−７９７）。反応性が大きい細胞はすべて、少なくとも１種類のＱ／Ｒ７０−Ｒ７１含有ＨＬＡ−ＤＲ対立遺伝子を発現したが、反応性が最小である細胞株はいずれも、β鎖の７０〜７１位の該配列を発現しなかった。また、細胞傷害性アッセイにより、前者は後者よりも劇的に大きく影響を受けることが示された（同上）。Ｌｙｍ−１は、健常ドナー由来の末梢血液リンパ球と反応したが、アビディティはずっと低く、正常リンパ球上のＨＬＡ−ＤＲタンパク質密度が低いこと、および二価ではなく一価の結合が起こっている可能性があるという仮説と整合し、リンパ腫を有する患者における悪性細胞に対するＬｙｍ−１の選択性がさらに説明された（同上）。したがって、不可欠Ｌｙｍ−１グルタミン／アルギニン残基と閾値抗原密度の両方が、正常リンパ球よりも悪性Ｂ細胞に対するＬｙｍ−１結合の選択性に寄与していると思われる。任意の事象において、このデータにより、Ｌｙｍ−１は、正常ＰＢＬよりもリンパ芽球性細胞に優先的に結合することが確認され、それにより、他の悪性Ｂ細胞標的化タンパク質との魅力的な違いがもたらされる（同上）。
【０２６６】
本発明らは、自身のＣＭＲＩＴでの経験により、実施の複雑さを認識し、進行ＮＨＬを有する多くの患者は、患者自身の疾患および不充分な骨髄採取のためＢＭＴに不適格であることを認識するに至った。このような理由のため、および治療指数を劇的に改善し得る標的化分子を開発するための新規なアプローチの使用を進展させる（ｄｏｓｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｆｙ）めったにない機会のため、本発明者らは、甲状腺癌において１３１Ｉ−ヨウ化物を模倣する高親和性リガンド（ＳＨＡＬ）を開発した。甲状腺癌における１３１Ｉ−ヨウ化物は、放射性同位体分子による標的化全身性放射線療法のプロトタイプであり、他の場合では治癒不可能な甲状腺癌の治癒がもたらされている。これは、１３１Ｉが、速やかに癌によって捕捉および保持されるか、または尿中に排出され、無限大に近い治療指数がもたらされ、有意な毒性なくほぼ無制限に放射性同位体を投与する機会がもたらされるためである。
【０２６７】
本発明者らは、小分子ＳＨＡＬの方が「ＲＩＴ」の潜在性に対してより良好に適合し得、全身性放射線療法を送達するための放射性同位体担体分子の標的としてのＨＬＡ−ＤＲが関与する本発明者らの進行中の翻訳作業を自然に拡張させるものと考える。後述するように、本発明者らはいくつかの二座ＳＨＡＬを合成し、これらのＳＨＡＬのうち少なくとも１種類は孤立ＨＬＡ−ＤＲ１０に結合することが測定された。
【０２６８】
Ａ）悪性Ｂ細胞に対するＬｙｍ−１抗体結合に不可欠であることが示された領域を含むＨＬＡ−ＤＲ１０のβサブユニットの分子構造のコンピュータモデルの開発、および他のＨＬＡ−ＤＲ分子との構造の比較
４種類の異なる密接に関連するＨＬＡ−ＤＲ分子（ＨＬＡ−ＤＲ１〜４）の結晶構造は、他者によって以前に測定されており、ＰＤＢ構造のデータベースに寄託されている（Ｊａｒｄｅｔｚｋｙら（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ，３６８：７１１−７１８；Ｂｏｌｉｎら（２０００）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４３：２１３５−２１４８；Ｓｍｉｔｈら（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８８：１５１１−１５２０；Ｇｈｏｓｈら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ，３７８：４５７−４６２）。これらの４種類のタンパク質、ＨＬＡ−ＤＲ１、ＨＬＡ−ＤＲ２、ＨＬＡ−ＤＲ３およびＨＬＡ−ＤＲ４のタンパク質配列は、ＨＬＡ−ＤＲ１０配列とアラインメントされ、比較され、可変アミノ酸の位置と、Ｌｙｍ−１抗体の不可欠エピトープと同定されたアミノ酸残基を含むＨＬＡ−ＤＲ１０分子の領域の位置の両方が同定された（Ｒｏｓｅら（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，４３：２６−３０；Ｒｏｓｅら（１９９９）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３６：７８９−７９７）。このアラインメントによって、この５種類のタンパク質はすべて非常に高度な配列類似性を示すことが明らかになったため（図８）、本発明者らは、相同性モデル設計によって、ＨＬＡ−ＤＲ１０のβサブユニットの充分正確な３Ｄモデルを作成し、このモデルの座標を使用し、プログラムＤＯＣＫを用いてリガンド結合についてスクリーニングすることが可能であった。
【０２６９】
リガンドドッキングにおける使用のためのＨＬＡ−ＤＲ１０のβサブユニットのモデル作成には、２つの異なるアプローチを使用した。第１のアプローチでは、ＨＬＡ−ＤＲ３の構造全体の座標を、相同性モデル作成のための鋳型として使用し、ＨＬＡ−ＤＲ３とＨＬＡ−ＤＲ１０間で異なる１９個のアミノ酸を、ＨＬＡ−ＤＲ３配列において変異させた（変更した）。ＨＬＡ−ＤＲ１０、ＨＬＡ−ＤＲ１およびＨＬＡ−ＤＲ２には存在するがＨＬＡ−ＤＲ３には存在しないアミノ末端の４個のアミノ酸の座標をＨＬＡ−ＤＲ１の構造から採用し、該モデルの完成に使用した。第２のアプローチでは、ＨＬＡ−ＤＲ１、ＨＬＡ−ＤＲ２およびＨＬＡ−ＤＲ４の結晶構造の異なるセグメントから採用した原子座標を使用し、ハイブリッドモデルを作成した。モデルに使用したこの３種類のＨＬＡの結晶構造の特定のセグメントは、２次構造の要素の類似性に基づいて選択した。配列構造アラインメントは、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４７：１９５−１９７）、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９１）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１１：６３５−６５０）、ＢＬＡＳＴならびにＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２）アルゴリズムを用いて行ない、モデルの主鎖は、ＡＳ２ＴＳシステムを用いて自動的に作成した（ｈｔｔｐ：／／ｓｂ９．ｌｌｎｌ．ｇｏｖ／ａｄａｍｚ／ＬＧＡ／ＡＬ２ＴＳ／ａｓ２ｔｓ．ｈｔｍｌウェブサイト参照）。該構造のアミノ末端の４個の残基の座標は、ＨＬＡ−ＤＲ１の１ｓｅＢ結晶構造から採用し、残基５〜１２２は、ＨＬＡ−ＤＲ１の１ａｑｄ構造から採用し、残基１２３〜１７０は、１ｄ５ｍ  ＨＬＡ  ＤＲ４構造から採用し、残りの残基（ａａ１７１〜１９３）は、ＨＬＡ−ＤＲ２の１ｂｘ２構造から採用した。末端領域およびループの構築、アミノ酸の挿入および欠失、ならびに鋳型モデル構造の比較は、ＬＬＮＬで開発されたＬＧＡプログラムを用いて行なった（ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｃｅｎｔｅｒ．ｌｌｎｌ．ｇｏｖ／ｌｏｃａｌ／ｌｇａ／ｌｇａ．ｈｔｍｌ参照）。側鎖原子の座標の大部分は、相同性が高いレベルであるため、該４つの構造鋳型（上記）から組み込んだ。タンパク質モデルの選択した領域の側鎖は、ＳＣＷＲＬプログラムを用いて構築した（同上）。不適切な側鎖接触を排除するため、両方の構造に対してエネルギー最小化を行ない、得られた構造を、分子動力学を用いて「最適化」した。
【０２７０】
得られたモデルの解析により、この２つのアプローチでは、非常に類似した構造が得られることが示された。さらに分子動力学実験を行なっても、さらなる改善はほとんど示されないと思われた。このモデル設計の結果により、ＨＬＡ−ＤＲ１０分子の構造は、ヒンジによって連結された２つのドメインで構成されており、Ｌｙｍ−１反応性残基の１つであるＶ８５が該ヒンジに直接隣接して配置されていることが明らかになった（図９）。
【０２７１】
ＨＬＡ−ＤＲ１０の弛緩した構造のコアの大部分は、ＨＬＡ−ＤＲ３結晶構造と比較すると、本質的に同一であることがわかった（図１０）。Ｌｙｍ−１結合に役割を果たしていることが観察されたその他の３つのアミノ酸、Ｒ７０、Ｒ７１およびＡ７４（この位置のＡまたはＥは、Ｌｙｍ−１結合に重要であると思われる）はすべて、ヒンジに直に隣接して存在する長鎖αヘリックス（図９および１０）の露出表面上に存在している。
【０２７２】
Ｂ）リガンド結合のために標的化され得るＬｙｍ−１エピトープ内のＨＬＡ−ＤＲ１０の表面上の特殊な部位の同定
ＨＬＡ−ＤＲ１０タンパク質の溶媒露出表面およびＨＬＡ−ＤＲ３の結晶構造を、ＨＬＡ−ＤＲ３に対してＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋおよび本発明者らのＨＬＡ−ＤＲ１０モデルから採用した原子座標を用いて計算した。Ｌｙｍ−１エピトープ内の該３つの重要なアミノ酸を囲む部位（６Å以内）を調べ、比較した。図１１に示されるように、ＨＬＡ−ＤＲ１０配列内のこれらの３つのアミノ酸変化（Ｑ７０Ｒ、Ｋ７１ＲおよびＲ７４Ａ）により、この領域において、電荷の分布と、タンパク質の露出表面のトポグラフィーの両方が変化する。
【０２７３】
タンパク質の表面上の「ポケット」を同定するために開発されたプログラム（ＳＰＨＧＥＮ）を用いて、リガンド結合のために標的化され得る潜在的空洞を同定した。使用したプログラムの詳細は実施例２に示す。モデル設計したＨＬＡ−ＤＲ１０の表面内の２つの隣接するポケット（空洞）を、互いの近接性、該３つのＬｙｍ−１反応性残基、およびポケットの内側のアミノ酸の特殊性に基づいて、リガンド結合に適切な部位として選択した（図１２）。また、その他の４つのＨＬＡ−ＤＲ分子の結晶構造を調べると、ポケットは各ＨＬＡ−ＤＲ分子内のこれらの部位または該部位の近傍に存在するが、予測どおり（ＨＬＡ−ＤＲ構造のこの領域内のペプチド鎖のアミノ酸配列の違いに基づいて）、各ＨＬＡ−ＤＲ上に存在する該ポケットは、サイズ、形状、および互いの間隔が異なることが示された。これらの２つの部位を囲むアミノ酸「ランドスケープ」は、ＨＬＡ−ＤＲ３とＨＬＡ−ＤＲ１０で有意に異なるため、両方の部位に対してドッキング実験を行なうと、ＨＬＡ−ＤＲ１０上のポケットに選択的に結合するが、ＨＬＡ−ＤＲ３上のポケットには選択的に結合しないリガンドが同定されることが予測され得る。これらの部位（部位１および部位２と特定し、図１２において、赤い球および青い球で充填された状態で示す）は、Ｌｙｍ−１エピトープ内の最も重要なアミノ酸Ｒ７０の両端にフランキングしている。また、部位１または部位２に結合する適当なリガンドが同定され得ない場合、バックアップとして標的化され得る第３の特殊な部位の位置も存在させ、特性評価した。
【０２７４】
Ｃ）Ｌｙｍ−１エピトープを含むＨＬＡ−ＤＲ１０上の特異的ポケットに結合し得る小分子を同定するための「バーチャル」リガンドのライブラリーのコンピュータによるスクリーニング
プログラムＤＯＣＫ（ＵＣＳＦ）を用いて、小分子のＡｖａｉｌａｂｌｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙデータベースの「バーチャル」スクリーニングを行ない、部位１と部位２と特定した（図１２）２つの特殊なポケット内に結合すると推定される上位ランク１，０００個の分子を同定した。コンピュータでのドッキング手順の詳細は、実施例２に示す。
【０２７５】
次いで、上位ランク２，５００個の分子を目視検査し、３５個の分子を実験結合アッセイに選出した（表５）。この最終選択プロセスは、化学的特性（例えば、疎水性相互作用、水素結合形成、分子サイズ）、ならびに実用性基準（例えば、市販入手可能性およびコスト、結合の合成の容易性、分子の組の全体的な構造的多様性）に基づいて行なった。
【０２７６】
【表５】
0005623384.tif 000009
この手順を、部位２に対する３５個の潜在的結合体の同定のために繰り返した。表６は、分子ドッキングにより部位２に結合すると推定されるリガンドのリストである。
【０２７７】
【表６】
0005623384.tif 000010
コンピュータでのドッキングの結果、部位１のリストと部位２のリストの両方からの３０種類の化合物を、ＮＭＲによって実験によりスクリーニングした。１１種類の化合物がＨＬＡ−ＤＲ１０に結合することがわかり、３７％という良好なヒット率が示された。これらのリガンドを表７に示す。
【０２７８】
【表７】
0005623384.tif 000011
表７から、異なる組の部位１と部位２のリガンドを含む５つの合成高親和性リガンド（ＳＨＡＬ）を合成した。これらの分子のうち３つ（図１３Ａ）は、すべてデオキシコール酸部と５−ｌｅｕ−エンケファリンのリガンドペアを含み、孤立ＨＬＡ−ＤＲ１０に結合することが示された。これらの３つのＳＨＡＬはいずれも、アルブミンまたはストレプトアビジンには結合しない。より充分に試験した３つのうち第１のものであるＪＰ４５９Ｂ（図１３Ｂ）は、Ｋｄ＝２３ｎＭでＨＬＡ−ＤＲ１０に結合することが測定された（表面プラスモン共鳴を使用）。Ｒａｊｉ膜抽出物を使用し、このＳＨＡＬをＬｙｍ−１と、ＨＬＡ−ＤＲ１０に対する結合について競合させた。生細胞を用いて行なった結合試験では、ＪＰ４５９Ｂは、Ｒａｊｉヒトリンパ腫細胞に結合するが、正常ＤＵ１４５、ＬｎＣＡＰまたは２２ＲＶ細胞には結合しないことが示された（図１７Ｅ〜Ｈ）。また、凍結ヒトリンパ腫組織切片を用いた実験では、大細胞型リンパ腫に対するＪＰ４５９Ｂの結合が充分に示されたが、小細胞型リンパ腫細胞に対してはあまり示されなかった（図１７Ａ〜Ｄ）。Ｌｙｍ−１抗体でも同様の結果が得られた。正常および腫瘍組織アレイを用いたさらなる試験は、現在進行中である。
【０２７９】
後続のスクリーニングでは、さらなるリガンドが、ＨＬＡ−ＤＲ１０に結合することが示された。これらを表８に示す。
【０２８０】
【表８】
0005623384.tif 000012
また、１，４−フェニレンビス［［４−（４−アミノフェノキシ）フェニル］メタノン］は、標的タンパク質上に沈着した。
【０２８１】
実施例２
ＳＨＡＬの作製における使用のためのコンピュータによる方法
Ａ）分子シミュレーションの役割と方法の概要
本明細書に記載のように、分子のモデル設計は、ＳＨＡＬの構築における使用のためのリガンドを最初に同定するため、および／またはＳＨＡＬの最適化に使用され得る。現在、標的分子をモデル設計し、結合リガンドについてスクリーニングし、多座ＳＨＡＬの結合をシミュレーションし、最適なＳＨＡＬの構造を推定するために使用し得る単独の分子のモデル設計方法論はない。しかしながら、これらの作業を容易にするため、本明細書に記載のように、いくつかの充分に確立されたモデル設計方法が使用され得る。
【０２８２】
最も高いレベルで開始するため、標的分子（例えば、タンパク質癌マーカー）の３次構造の推定は、典型的には、当該タンパク質と実験により既知の構造との１次配列相同性に基づき、高度に経験的な方法を用いて推定される。このようないわゆる相同性に基づいたタンパク質構造の推定法の精度は、相同タンパク質構造の入手可能性および個々のモデル設計者の専門技術に依存する。タンパク質ポケットに特異的に結合する小分子（リガンド）を同定するためには、本明細書に記載のように、コンピュータによる「ドッキング」が使用され得る。ドッキングは、リガンド−タンパク質相互作用を示す比較的単純な経験的力場を使用するものであり、したがって、これを使用すると、１００，０００個代の考えられ得るリガンドが迅速にスクリーニングされ得る。好ましい巨大分子のコンホメーションおよび相互作用を調べるためには、経験的ボール／スプリング（ｂａｌｌ−ａｎｄ−ｓｐｒｉｎｇ）力場を用いて分子をモデル設計する古典的分子動力学法が使用され得る。最後に、小分子の構造および相互作用の厳密な推定のため、分子内の電子と核の状態を示す量子機械的方程式の解がコンピュータ処理により得られ得る。このいわゆる第一原理アプローチは、分子の静止「スナップ写真」の構造およびエネルギーを調べるため、または分子の系の原子の運動をシミュレーションするためのいずれかに使用され得る。前者のアプローチは、アブイニシオ量子化学法と称され、一方、後者のアプローチは、第一原理分子動力学法（古典的分子動力学法とは対照的）と称され、自然状態のほぼ正確なシミュレーションを構成する。
【０２８３】
Ｂ）相同性に基づいたタンパク質構造の推定
相同性に基づいたタンパク質構造の推定の基本概念は、タンパク質の構造的特徴は、進化の間、その配列よりもずっと高度に保存されるという観察結果に依存し、したがって、配列類似性がほど遠くても関連するタンパク質は、類似した３Ｄ構造を有すると予測され得る（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（１９８６）ＥＭＢＯ  Ｊ．，５：８２３−８２６）。したがって、あるタンパク質ファミリーの少なくとも１つの代表例について３次元構造が決定されたら、他のファミリー構成員のモデルは、既知の構造を鋳型として用いて導くことができる。相同性に基づいたタンパク質モデル設計は、主に４つの工程：モデル設計対象のタンパク質配列に関連する既知構造を見い出すこと、該配列を該構造とアラインメントすること、３次元モデルを構築すること、および該モデルを評価することからなる（Ｍａｒｔｉ−Ｒｅｎｏｍら（２０００）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ．，２９：２９１−３２５）。
【０２８４】
相同性に基づいたタンパク質構造の推定（比較モデル設計とも称する）により、１種類以上の関連タンパク質構造とのアラインメントに基づいて、配列の全原子モデルが得られる。その３次元モデル自体の構築は、タンパク質のコア、ループおよび側鎖の逐次モデル設計または同時モデル設計のいずれかを含む。図１５は、相同性に基づいたタンパク質モデル設計の主な工程を説明するフローチャートを示す。
【０２８５】
比較モデル設計手法を用いて構築されるモデルの精度は、通常、基本となる構造との配列同一性の割合に関連する。高精度比較モデルは、その鋳型との配列同一性が５０％より高いことに基づくものである。該モデルは、主鎖原子で、約１Åの二乗平均平方根（ＲＭＳ）のエラーを有する傾向にある。かかる精度は、中解像度核磁気共鳴（ＮＭＲ）での構造または低解像度Ｘ線での構造と同等である。かかる場合におけるエラーは、通常、側鎖回転異性体の帰属ミス、コア主鎖領域内でのわずかなシフトまたはねじれ、および場合によってはループ内での大きなエラーを限定的にする。
【０２８６】
一般的なモデル設計アプローチの一例は、高相同性および低相同性の両標的タンパク質をモデル設計するために以前から成功裡に使用されているものと類似している（Ｖｅｎｃｌｏｖａｓら（１９９９）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，７３−８０）。本発明者らのモデル設計対象物（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ１０などの癌マーカー）は、高い配列相同性（＞５０％配列同一性）を有するものであり得るため、本発明者らは、最も近い構造鋳型を同定するのに、モデル設計対象（クエリー）と既知構造（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）から）のタンパク質とのペアワイズ配列比較に頼ることができる。これを行なうには、ＳＳＥＡＲＣＨプログラム（Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９１）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １１：６３５−６５０）に実装された高感度Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎペアワイズ配列比較アルゴリズム（ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１４７：１９５−１９７）が使用され得る。配列相同性が高いレベルの場合は、保存された構造的領域での構造アラインメントが直接、モデル構築に使用され得る。
【０２８７】
同等の類似性のいくつかの構造鋳型が利用可能である場合は、ＭＯＤＥＬＬＥＲが使用され得、これは、いくつかの鋳型構造を自動的に組み合わせ、より良好なクエリー構造の表示を行なうことができる比較モデル設計プログラムである。不可欠な領域が標的分子内に存在する場合、この領域にコンホメーションを帰属させる際、特に注意して行なわれ得る。この領域の候補コンホメーションは、この領域での立体拘束性も満たす同一長さの断片に相同な構造のデータベースを検索することにより得られ得る。配列類似性および該領域付近の構造的状況はともに、実際のコンホメーションを選択する際に考慮され得る。モデル内の側鎖は、主鎖依存性回転異性体ライブラリーを用いて位置決めされ得る（Ｂｏｗｅｒら（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６７：１２６８−１２８２）。
【０２８８】
得られたモデルの評価は、いくつかの手法を用いて行なわれ得る。その一例は、ＰｒｏｓａＩＩ（Ｓｉｐｐｌ（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，１７：３５５−３６２，；Ａｌｏｙら（２０００）Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ  Ｄｅｓ．１４：８３−９２）であり、これは、タンパク質構造におけるエラーを検出するために使用され、タンパク質の配列に沿ったエネルギープロフィールが得られる。ＰｒｏｓａＩＩにより高いエネルギー値が割り当てられた領域は、多くの場合、この特定の領域の構造の表示の際の良好なエラーインジケーターとしての機能を果たす。モデル設計された構造の詳細なチェックのため、ＷＨＡＴＩＦプログラムの構造検証モジュール（Ｖｒｉｅｎｄ（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｇｒａｐｈ  ８：５２−５６）が、目視検査とともに使用され得る。このようなモデルの品質評価で、モデル設計された構造に、なんらかの問題が確認された場合、許容され得る品質の３次元モデルが得られるまで、反復的様式で適切な工程（ループ帰属または側鎖の位置決めなど）が繰り返される。
【０２８９】
このような方法を用いて、悪性Ｂ細胞へのＬｙｍ−１抗体結合に不可欠であることが示された領域を含むＨＬＡ−ＤＲ１０のβサブユニットの分子構造のコンピュータモデルを開発し、その構造を、他のＨＬＡ−ＤＲ分子での構造と比較した（実施例１（上記）参照）。このモデルを用いて、本明細書に記載のＨＬＡ−ＤＲ１０特異的ＳＨＡＬを開発した。
【０２９０】
Ｃ）コンピュータでのドッキング
ドッキングなどのコンピュータによる方法は、多数の分子をスクリーニングし、標的タンパク質の活性部位内に結合するか否かを推定することによる新薬発見およびインヒビター設計のプロセスをスピードアップするために使用されている（Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７：６６４４−６６４８；Ｍａｏら（１９９８）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔｓ．，８：２２１３−２２１８；ＯｌｓｏｎおよびＧｏｏｄｓｅｌｌ（１９９８）Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｒｅｓ．，８：２７３−２８５；Ｒｕｔｅｎｂｅｒら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：１５３４３−１５３４６）。このような労力は、感染および疾患の伝染に不可欠なＨＩＶタンパク質に対して有効な新たな薬物の設計において、中程度の成功しか満たされていない。
【０２９１】
一部の特定の実施形態において、このアプローチは、一般的に、通常、標的分子（１つまたは複数）にマイクロモル範囲で結合するリガンド（結合部分）の同定における第１工程として有用である。ＳＰＨＧＥＮおよびＤＯＣＫを用いたドッキング方法の詳細なプロトコルは文献に記載されている。例えば、このような方法は、破傷風神経毒の標的化ドメイン上の特異的部位に結合するリガンドを同定するために使用されている（Ｃｏｓｍａｎら（２００２）Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  １５：１２１８−１２２８；Ｌｉｇｈｔｓｔｏｎｅら（２０００）Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，１３：３５６−３６２）。
【０２９２】
プログラムＤＯＣＫ  ４．０を用いてＡｖａｉｌａｂｌｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ（約３００，０００個）の小分子をコンピュータによりスクリーニングし、部位１と部位２に結合すると推定された上位ランク２，５００個の分子を同定した（図１２）。
【０２９３】
コンピュータでのドッキングは、１）タンパク質表面の部位同定；２）同定された結合部位内へのリガンドのドッキング；ならびに３）リガンドのスコアリングおよびランク付けの３工程プロセスであると考えられ得る（Ｈａｌｐｅｒｉｎら（２００２）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，４７：４０９−４４３）。部位同定では、一般的に、標的タンパク質の溶媒露出表面が計算される。ＤＯＣＫのユーティリティープログラムＳＰＨＧＥＮを使用し（ＭｏｕｓｔａｋａｓおよびＫｕｎｔｚ（２００２）．ＤＯＣＫ５．０（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＵＣＳＦ））、タンパク質表面上の凹形ポケットを、該ポケットに異なるサイズの半径の球を充填することにより同定した。本質的に、これにより、ポケットの容積が計算される。タンパク質の表面は、そのタンパク質のサイズと形状に基づいて、任意の箇所に３０個から数百個のポケットを有し得る。このようなポケットが同定されたら、ポケットの目視検査により、ポケットのサイズおよび入手可能な実験による証拠（結合または触媒作用に関与している既知のアミノ酸など）に基づいて結合部位を同定した。次いで、選択された結合ポケットを、後続のドッキング手順に使用した。
【０２９４】
ドッキング試験により、タンパク質上の選択した結合部位に特異的に結合するかもしれない小分子が同定される。ＤＯＣＫ  ５．０プログラムにより、コンピュータ上の化合物データベースがスクリーニングされ、どの分子が結合部位に強く結合しそうであるかが推定される。この手順を図１６に図解する。本発明者らは、ＭＤＬのＡｖａｉｌａｂｌｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ（ＡＣＤ）を、本発明者らの化合物データベースとしてスクリーニングに使用した。
【０２９５】
データベースは、プレフィルタリングによって石鹸および色素を除去することにより作製した。化合物の部分電荷を、Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ−Ｍａｒｓｉｌｉ電荷（ＧａｓｔｅｉｇｅｒおよびＭａｒｓｉｌｉ（１９７８）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｓ．，３４：３１８１−３１８４；ＧａｓｔｅｉｇｅｒおよびＭａｒｓｉｌｉ（１９８０）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３６：３２１９−３２８８；ＧａｓｔｅｉｇｅｒおよびＭａｒｓｉｌｉ（１９８１）Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  １５：３５３−３６０）を用いることによってＳｙｂｙｌにおいて計算した後、このデータベースを化合物の全電荷によって除算し、＞±３の形式電荷を有する化合物を除外した。また、＜１０および＞８０の化合物は、リード（予備）薬物化合物のサイズの範囲内の化合物に的を絞るため、重原子（水素でない）を除去した。このプレフィルタリングにより、該データベースはより効率的となり、絶対結合しないか、または無差別に結合するかのいずれかであることがわかっている化合物に関する不必要な計算が排除された。フレキシブルドッキング手法をシミュレーションするため、該データベースの各化合物について、２０個の特殊なコンホメーションを作成した。次いで、これらのコンホメーションの各々を、結合部位内にリジッドドッキングさせた。各リガンドの各コンホメーションについて、結合部位内での種々の向きを調べた。すべての化合物をエネルギー最小化（分子間ファン・デル・ワールスの項および静電の項はＡＭＢＥＲから誘導）によってスコアリングした（Ｗｅｉｎｅｒ（１９８４）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０６：７６５−７８４）。分子はスコアに基づいてランク付けされるが、スコアリング関数では、結合親和性は推定されない。
【０２９６】
次いで、実施例１に記載のように、上位ランクの２，５００個の分子を目視検査し、３５個の分子を実験結合アッセイに選出した。実施例１に記載のようにしてリガンドを選択し、二座ＳＨＡＬを構築し、試験した。
【０２９７】
標的に対するリード化合物の結合は、一緒に連結した複数（２〜３個）の化合物を使用することにより数桁改善され得る。インヒビターは、有効であるためには、標的タンパク質を特異的に認識して高親和性で結合することが必要である。
【０２９８】
Ｄ）量子化学的計算
多種多様な化学的シミュレーション方法が開発されており、経験的ボール／スプリング型分子力学モデルから、アブイニシオ（第一原理）量子化学的方法（電子と核の状態を示す量子機械的完全方程式の近似解を計算）までの範囲に及ぶ。典型的には、方法の選択は、精度、化学的系の大きさ、およびコンピュータのコスト間のトレードオフを伴う。このようなモデル設計方法は、化学的プロセスの経時的進化をシミュレーションする分子動力学法と、時間非依存的な分子特性（分子の最小エネルギーの立体配置または化学反応エネルギーなど）を推定する静態法に大別され得る。下記の３つ分子のモデル設計方法：アブイニシオ量子化学法、古典的分子動力学法および第一原理分子動力学法はすべて、本明細書に記載のＳＨＡＬの設計および最適化に使用され得る。
【０２９９】
１．アブイニシオ量子化学法（ＱＭ）
アブイニシオ量子化学法は、分子の系の状態を示す非相対論的なシュレディンガーの完全方程式に対する近似解のコンピュータ計算を伴うものである（Ｊｅｎｓｅｎ（１９９９）Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）。原理には、この方法では、任意の化学的系の特性が、自由裁量による精度まで推定することができるが、実際には、コンピュータのコストのため、この方法の精度および適用可能な分子の系の大きさは限定的である。それでもなお、アブイニシオ量子化学的計算法は、数百個に至る原子を含む分子の系の正確な構造および反応エネルギーの計算に常套的に適用されている。
【０３００】
種々のアブイニシオ量子化学的方法には、分子の核の周囲の電子の分布の数学的表示である電子波動関数の数学的記述の正確さの漸層を伴う階層が存在する（同上）。量子化学の応用は、典型的には、電子−電子相互作用の表示（理論レベル）と電子の空間的柔軟性（基底関数系）の両方の選択が必要とされる。密度汎関数理論（ＤＦＴ）と称されるかなり新しい類型の方法が開発されており、これは、電子−電子相互作用の経験的パラメータ化を含み、多くの場合、これまでの高レベル量子化学的方法（結合クラスター法など）と同等の精度が得られるが、コンピュータのコストがずっと低い。ＤＦＴ法は、通常、使用される経験的電子−電子「汎関数」で表示される。２つの広く使用されているＤＦＴ汎関数は、Ｂｅｃｋｅ  ３−パラメータハイブリッド交換汎関数（Ｂｅｃｋｅ（１９９３）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．９８：５６４８−５６５２）と、Ｌｅｅ−Ｙａｎｇ−Ｐａｒｒ勾配補正電子相関汎関数（Ｌｅｅら（１９８８）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  １２３：１−２５）である。これらは、充分な基底関数系で使用した場合、ほとんどの分子で、正確な化学構造および反応エネルギーが得られることが広く示されている（Ｊｅｎｓｅｎ（１９９９）Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ）。
【０３０１】
本明細書に記載した量子化学的シミュレーションを使用し、細胞外環境の近接部で起こる化学的プロセスが試験される。上記の量子化学的方法では、典型的には、孤立（通常、「気相」と示される）分子のみの状態が示され、したがって、多くの場合、生体分子の構造やエネルギー論に不可欠な化学的環境（溶媒分子や対イオンなど）は含まれない。周囲の水分子や対イオンを明白に含めることは、通常、コンピュータ処理では実用されていない；しかしながら、量子化学的アプローチにおいて、溶媒相互作用の効果を有効に含めるいくつかの方法が開発されている。典型的には、このような方法では、溶媒は、量子化学的に誘導された電荷に応答して分極する連続媒体としてモデル設計される。溶媒を明白に含めることが必要である状況は多く存在するが、このようないわゆる分極性連続体モデルは、溶媒相の化学的特性（例えば、全溶媒和エネルギーおよび酸定数）の推定において、妥当に正確であることが証明された（Ｓｃｈｕｅｕｅｒｍａｎｎら（１９９８）Ｊ．Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａ  １０２：６７０６−６７１２；ＴｒａｎおよびＣｏｌｖｉｎ（２０００）Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｔｈｅｏｃｈｅｍ  ５３２：１２７−１３７）。
【０３０２】
ＷａｒｓｈｅｌのＬａｎｇｅｖｉｎ双極子法は、この分極性連続体モデルと関連しているが、極性溶媒のより現実的な表示を含む。Ｌａｎｇｅｖｉｎ双極子法では、溶媒は、一定の３次元格子上の多数の分極性双極子の組としてモデルされる（ＬｕｚｈｋｏｖおよびＷａｒｓｈｅｌ（１９９２）Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：１９９−２１３）。このアプローチは、最近、アブイニシオにより誘導される溶質の電荷での使用のためにパラメータ化され、中性分子およびイオン性分子について、上記のＰＣＭ法と同等またはより良好な溶媒和エネルギーが得られることが示された（ＦｌｏｒｉａｎおよびＷａｒｓｈｅｌ（１９９７ａ）Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．、１１９：５４７３−５４７４）。
【０３０３】
２．第一原理分子動力学法（ＦＰＭＤ）
ＱＭ法により直接測定される力を組み合わせて、シミュレーション中のすべての原子の古典的運動を導くことにより、古典的分子動力学法の利点を伴って量子力学（ＱＭ）の精度を得ることができる。このアプローチは、電子の自由度を核運動方程式として同時に処理する密度汎関数理論（ＤＦＴ）（Ｋｏｈｎ  Ｓｈａｍ（１９６５）Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  １４０：Ａ１１３３）に基づいた新手法の開発により、コンピュータでの実現が可能となった（ＣａｒおよびＰａｒｒｉｎｅｌｌｏ（１９８５）Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５５：２４７１−２４７４；ＧａｌｌｉおよびＰａｒｒｉｎｅｌｌｏ（１９９１）Ｐｐ．２８３−３０４  Ｉｎ：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）。この方法では、系全体の状態を示すためにＱＭ理論を使用するため、しばしば第一原理分子動力学法（ＦＰＭＤ）と称される。ＦＰＭＤの典型的な実施において、化学的に活性な価電子のみが、平面−波基底関数における膨張で明白に示され、化学的に不活性なコア電子は偽ポテンシャルと表示される（ＧａｌｌｉおよびＰａｓｑｕａｒｅｌｌｏ（１９９３）Ｐｐ．２６１−３１３  Ｉｎ：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｄ．Ｊ．Ｔｉｌｄｅｓｌｅｙ編  Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，Ｋｌｕｗｅｒ；ＹｉｎおよびＣｏｈｅｎ（１９８２）Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂ（Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｍａｔｔｅｒ）２５：７４０３−７４１２）。偽ポテンシャルは、設計によって移動可能であるため、この方法では、新たな系を試験する場合、再パラメータ化が必要とさない。また、平面波基底関数系の使用により、自然に、周期的境界条件に適用されるため、該方法は、凝縮相におけるモデル設計システムに充分適している。この方法は、いくつかの他のコンピュータによる改善（Ｇｙｇｉ（１９９３）Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂ  ４８：１１６９２−１１７００；Ｈｕｔｔｅｒら（１９９４）Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２：２４４−２４８；Ｐａｙｎｅら（１９９２）Ｒｅｖ．Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ６４：１０４５−１０９７）と組み合わせると、ＱＭとＭＤの積分の問題の解を得るのに有益であった。
【０３０４】
ＦＰＭＤシミュレーションの最初の適用は、シリコンなどの小さい系に限定されていた（ＣａｒおよびＰａｒｒｉｎｅｌｌｏ（１９８５）Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５５：２４７１−２４７４；Ｓｔｉｃｈら（１９８９）Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ６３：２２４０−２２４３）。この方法は継続的に改善されており、最新式のコンピュータリソース（ＤＯＥテラフロップ規模のスーパーコンピュータなど）が利用可能となっているため、現在では、数百個のの原子を含む小さい生化学的系を、ピコ秒の時間枠で調べることが可能である（ＣａｒｌｏｎｉおよびＡｌｂｅｒ（１９９８）Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎ  ９／１１：１６９−１７９；Ｐａｎｔａｎｏら（２０００）Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｔｈｅｏｃｈｅｍ）５３０：１７７−１８１；ＲｏｖｉａおよびＰａｒｒｉｎｅｌｌｏ（２０００）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８０：１１７２−１１８０）。例えば、本発明者らは、最近、溶液中のＤＮＡ主鎖の小化学物質モデルのコンホメーション動力学のシミュレーションを行なった。この新たなアプローチで調べた系の数が増えるにつれて、コンピュータによる大きな費用は、構造的および動力学的特性が極めて正確であるという形で回収されていることが明らかになっている。特に、かかる方法により、化学的現象（例えば、キレート剤−金属イオン相互作用および酵素触媒性反応）の非常に正確な動力学的シミュレーションが潜在的に可能になる。
【０３０５】
Ｅ）古典的分子動力学法（ＭＤ）
古典的分子動力学法は、標的分子（１つまたは複数）の結合部位（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ１０の結合部位（部位１と部位２））内での厳密なリガンドの向きの確認において使用され得る。この情報は、放射性同位体を選択的に標的分子および／または標的分子をディスプレイしている細胞に運ぶための多価リガンドの設計に使用され得る。
【０３０６】
特に、この構造的データにより、リガンド（１つまたは複数）上のどの官能基が、合成によりリンカーを結合させるのに使用され得るかを特定することが補助される。実験により標的に結合することが検証されるすべてのリガンドについて、古典的分子動力学法は、標的結合部位内のリガンドに対して、コンホメーションおよびリガンドの向きならびに結合特異性を媒介する特異的相互作用（例えば、水素結合、静電的およびファン・デル・ワールス相互作用）を調べるために行なわれ得る。一部の特定の実施形態において、分子動力学シミュレーションでは、周期的な水分子を囲む箱（ｗａｔｅｒ  ｂｏｘ）中で溶媒和させた標的およびリガンドを含める。各リガンドについて、多数の開始向きを用いて５００ピコ秒から数ナノ秒でシミュレーションが行なわれ得る。
【０３０７】
本発明の多座ＳＨＡＬの重要な成分は、個々のＳＨＡＬを構成するリガンド（結合部分）間のリンカー分子である。典型的には、このリンカーには、２つ（またはそれ以上の）リガンドを適切な間隔で保持し、標的表面上の結合部位内に効率的に結合させる水相コンホメーション（またはコンホメーションの組）が採用される。このリンカーの設計を補助するため、古典的分子動力学法は、リンカー分子単独および特異的リガンド化合物に結合させたリンカーに対して行なわれ得る。
【０３０８】
プログラムＣＨＡＲＭＭは、種々のリンカーに関する古典的分子動力学シミュレーションを行なうために使用され得る。例えば、ＰＥＧリンカーを用いて行なうシミュレーションでは、分子内に異なる数のＰＥＧ単位（４、６および８）が使用され得る。４つのシミュレーションではすべて、出発構造は、完全に伸長したコンホメーションの分子を有するものであり得る。このような伸長分子は、水分子を囲む箱中で溶媒和され得、ナトリウムイオンを各水分子を囲む箱に添加すると系が中和された。このような溶媒和系を、例えば３００Ｋまで加熱すると、２００ピコ秒間平衡状態となった。典型的には、シミュレーションは一定温度（ＮＶＴアンサンブル）で行なわれ、静電的相互作用が粒子メッシュＥｗａｌｄ（ＰＭＥ）加算によって処理され得る。
【０３０９】
最初に、連結させる２つの化合物は、タンパク質に結合させた状態で一緒に目視検査され得、これは、コンピュータグラフィックスを用いたドッキングおよび分子動力学によって測定される。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーは、２つの化合物間において、分子描画ソフトウェア（ＡＭＰＡＣ）を用いて構築される。次いで、この構造は、古典的分子動力学法を使用し、周期的水分子を囲む箱中で、例えば、上記のように数ナノ秒間でシミュレーションされ得る。動力学的運動に関して得られたデータを解析すると、平均リガンド−リガンド間隔および相対的なリガンドの向きが測定され得る。このデータを、リガンド間の間隔および標的の１０個の表面での相対的な向きと比較すると、該リンカーの最適な長さが決定され得る。
【０３１０】
また、分子動力学シミュレーションは、治療有効性を最適化するために、ＳＨＡＬ全体に関するいくつかの他の特性を調べるためにも使用され得る。特に、分子動力学シミュレーションは、いくつかの修飾（例えば、リンカー自体の化学構造、および各末端の２つのリガンド）を調べるために使用され得る。このようなシミュレーションの目的は、高価な合成的修飾を行なう前に、標的結合効率および特異性に対して、かかる修飾がもたらし得る効果を確認することである。
【０３１１】
分子動力学法では、経験的に誘導される古典的力場を用いて、化学的系内での各原子の運動のシミュレーションが行われる。この方法論は、核酸（ＢｅｖｅｒｉｄｇｅおよびＭｃＣｏｎｎｅｌｌ（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：１８２−１９６）ならびにタンパク質（Ｂｒｏｏｋｓら（１９８３）Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４：１８７−２１７；ＣｈｅａｔｈａｍおよびＢｒｏｏｋｓ（１９９８）Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｃｃｏｕｎｔｓ  ９９：２７９−２８８；ＤｏｎｉａｃｈおよびＥａｓｔｍａｎ（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ９：１５７−１６３）のシミュレーションのために開発された高度なものである。公表されている典型的な分子動力学シミュレーションは、１０〜１００，０００個の原子（シミュレーション対称の生体分子と、水および対イオンの周囲殻の両方を含む）を伴うものであり、これは、ナノ秒単位の時間でシミュレーションが行なわれ、公表されている最長シミュレーションは、小タンパク質の１マイクロ秒間のシミュレーションである（ＤｕａｎおよびＫｏｌｌｍａｎ（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：７４０−７４４）。ナノ秒単位の時間枠は、構造の弛緩および溶媒再構成の獲得に充分であると考えられ、一部の場合において、種々の巨大分子のコンホメーション間の移行をシミュレーションするのに充分長い（ＣｈｅａｔｈａｍおよびＫｏｌｌｍａｎ（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２５９：４３４−４４４；ＹａｎｇおよびＰｅｔｔｉｔｔ（１９９６）Ｊ．Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａ  １００：２５６４−２５６６）。
【０３１２】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の分子動力学シミュレーションが最近、公表され、これは、ＳＨＡＬのＰＥＧリンカーの設計に重要である。ＨｅｙｍａｎｎおよびＧｒｕｂｍｕｌｌｅｒは、古典的分子動力学法を用いて、個々のＰＥＧ鎖のコンホメーション特性および弾性特性を示した（ＨｅｙｍａｎｎおよびＧｒｕｂｍｕｌｌｅｒ（１９９９）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３０７：４２５−４３２；ＹｏｕｎｇおよびＬｏｖｅｌｌ（１９９２）Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ）。彼らは、水相中（１５３９個の水分子で溶媒和）および気相中（ヘキサデカンなどの無極性溶媒中での溶媒和に近似）で、１８量体のＰＥＧ（約１ｋダルトン分子量）のシミュレーションを行なった。彼らにより、気相中では、ＰＥＧは急速に崩壊して、局所構造のないコンパクトな構造になる（これは、ＰＥＧが、らせん状局所構造を有する程度によって測定される）ことが見い出された。水中では、ＰＥＧは、非常に異なる挙動を示し、完全に伸長した構造と比べて回転半径の減少が示されるが、顕著ならせん度は保持しており、したがって、ある程度剛性である。このシミュレーションは、ＰＥＧ構造の局所硬直化が、ＰＥＧ鎖内の連続する酸素と水素結合架橋を形成する水分子によって引き起こされることを示す。彼らは、さらに、０〜５００ピコニュートンの範囲の力によるＰＥＧ鎖の引き伸ばしのシミュレーションを行なった（これは、原子間力顕微鏡を用いた実験による試験を模倣する）。彼らにより、彼らが推定した力は、単一のＰＥＧ分子において最近測定された値を有する伸長曲線に対して良好に整合することが見い出されている（Ｏｅｓｔｅｒｈｅｌｔら（１９９９）Ｎｅｗ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  １：６．１−６．１１）。
【０３１３】
このような結果は、ＰＥＧの古典的分子動力学シミュレーションによって、複合体特性（力／伸長曲線など）が正確に再現され得、提案ＰＥＧ化骨格シミュレーションの精度を強くサポートすることを示す。現在使用されているＰＥＧ化骨格（１３．６ｋダルトン  分子量）は、ＨｅｙｍａｎｎおよびＧｒｕｂｍｉｌｌｅｒによりシミュレーションされた１８量体ＰＥＧよりもかなり長いが、充分に常套的分子動力学シミュレーションの範囲内である。
【０３１４】
分子動力学シミュレーションは、バージョン２２パラメータセットが使用されるＣＨＡＲＭＭソフトウェアパッケージ（Ｂｒｏｏｋｓら（１９８３）Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４：１８７−２１７）を用いて容易に行なわれ得る（ＭａｃＫｅｒｅｌｌら（１９９８）Ｊ．Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂ  １０２：３５８６−３６１６）。解析は、ＣＨＡＲＭＭおよびＶＭＤにより流通されている、グラフ表示による分子動力学解析ツールである解析ツールを用いて行なわれ得る（Ｈｕｍｐｈｒｅｙら（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  １４：３３−３８）。
【０３１５】
典型的な設定状況およびシミュレーション実行における諸工程は、以下の通りである。
【０３１６】
Ａ．予備設定状況
１．原子型の部分電荷の計算はＣＨＡＲＭＭ力場に含めない。非パラメータ化原子型を含むモデル化合物は、６−３１Ｇ（ｄ）基底関数系を用いてＨａｒｔｒｅｅ−Ｆｏｃｋ理論レベルで最適化される。収束したら、各原子の部分電荷を、Ｍｅｒｚ−Ｋｏｌｌｍａｎ電荷フィッティングスキームを用いてコンピュータ計算する（Ｂｅｓｌｅｒら（１９９０）Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １１：４３１−４３９）。この電荷は、デフォルト原子電荷と交換され得る。
【０３１７】
２．シミュレーション対象分子：
ａ．分子構造の構築
シミュレーション対象分子はＱＵＡＮＴＡを用いて構築され得、原子電荷は上記工程１のようにして得られる。次いで、化合物全体の正味電荷がコンピュータ計算され得る。
【０３１８】
ｂ．分子構造の溶媒和：
工程２ａで構築した分子および分子の複合体は、ＳＯＬＶＡＴＥプログラムを用いて位置決めされるＮａ＋イオンを用いて中和される。次いで、系全体は水分子を囲む箱内で溶媒和され得、続いて、このシミュレーションの箱を、適切な密度が得られるように調整する。
【０３１９】
Ｂ．シミュレーションの実行：
１．分子／水／対イオン系の平衡：
ａ．最小化：構築時由来の分子構造内に残存する残留歪みを除くため、上記工程２ｂの溶媒和分子は、１０，０００工程に対して最小化され得、そのうち最初の１，０００回の反復は、鞍点法（ｓｔｅｅｐｅｓｔ  ｄｅｓｃｅｎｔ）を用いて行なわれ、残りは、ａｄｏｐｔｅｄ  ｂａｓｉｓ  Ｎｅｗｔｏｎ−Ｒａｐｈｓｏｎ法を用いて行なわれる。
【０３２０】
ｂ．平衡：最小化後、温度が０Ｋから３００Ｋまで１０ｐｓで上昇され得、その後は３００Ｋで一定に保持され得る。系は、一定温度で２００ｐｓ間平衡化され得る。ロングレンジの力は、粒子メッシュＥｗａｌｄ法（Ｅｓｓｍａｎｎら（１９９５）Ｊ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  １０３：８５７７−８５９３）によって処理される。水分子はＴＩＰ３Ｐである（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎら（１９８３）Ｊ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ７９：９２６−９３５）。２フェムト秒の積分時間工程が使用され得、ＳＨＡＫＥアルゴリズムを用いて、水素原子のすべての運動が拘束され得る（ＲｅｉｃｈｅｒｔおよびＷｅｌｃｈ（２００１）Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２１２：１１１−１３１）。
【０３２１】
ｃ．作製実行：作製シミュレーションのため、定温分子動力学法（ＮＶＴアンサンブルを使用）が使用され得る。粒子メッシュＥｗａｌｄ法（Ｅｓｓｍａｎｎら（１９９５）Ｊ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  １０３：８５７７−８５９３）が、ロングレンジ力に対して使用され得る。動力学法の実行中、完全関数系の原子座標が、後続の解析用に０．１ｐｓごとに保存され得る。予備シミュレーションでは、分子動力学シミュレーションがほぼ６２５ｃｐｕ時間（約４週間）／ナノ秒に相当する速度で本発明者らのＣｏｍｐａｃ  Ａｌｐｈａコンピュータで実行され、したがって、このような系のナノ秒単位のシミュレーションが、本発明者らの大型ネットワークのワークステーションで常套的に実現可能である。
【０３２２】
実施例３
二座ＳＨＡＬの合成および試験
二価ＳＨＡＬ（ＬｅａｃＰＬＤ）２ＬＰＤｏを合成し、ＨＰＬＣによって精製し、質量分析によって特性評価した。このＳＨＡＬは、リンカーによって相互連結された２つのＪＰ４５９Ｂ二座リガンドと、第３アーム上に結合させたＤＯＴＡとを有する（例えば、図１４参照）。
【０３２３】
ＳＨＡＬは、固相樹脂上での合成を容易にするため、オルソゴナルに保護したリジン残基の周囲を設計した。市販のＦｍｏｃ保護アミノ酸様ｍｉｎｉ−ｐｅｇ（２ＣＨ２Ｏ’ｓ）を、エンケファリン部とデオキシコール酸部分とのリンカーとして使用し、両者の間隔は漸増させた。ｂｉａｃｏｒｅ実験のためのＳＨＡＬへのビオチンの導入には、Ｆｍｏｃ−ビオチニル−リジンを使用した。ＳＨＡＬはすべて、同じ立体配置：ＣＯ２Ｈ：ビオチン−リジン：リジン：（ａ  リジンＮＨ２：０、１、２個のｍｉｎｉ−ｐｅｇリンカー、デオキシコール酸部）（ｇ  リジンＮＨ２：ＬＦＧＧＹ−ＮＨＡｃ）に従うものである。ビス二座ＳＨＡＬは従来型：ＣＯ２Ｈ：ビオチン−リジン：リジン：［（ａ  リジンＮＨ２：０、１、２  ｍｉｎｉ−ｐｅｇリンカー、デオキシコール酸部）（ｇ  リジンＮＨ２：ＬＦＧＧＹ−ＮＨＡｃ）］２に従うものであり、したがって、第２級リジン残基のまわりにおいて非対称である。
【０３２４】
使用した化学物質はすべて、ＡｌｄｒｉｃｈまたはＮｏｖａ  Ｂｉｏｃｈｅｍから購入した。ＳＨＡＬは、クロロトリチルクロリド樹脂上で、標準的なＦｍｏｃ固相合成を用いて合成した。リガンドを樹脂から切断し、適切な試薬を用いて保護基を除去した。樹脂からの切断中に、デオキシコール酸部の第１級アルコール部で形成されたトリフルオロ酢酸エステルを、重炭酸アンモニウム中で攪拌することにより除去した。ＳＨＡＬを、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて精製した。分析用ＨＰＬＣは、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００装置（Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８，５ｍｍ，４．２×１５０ｍｍカラム）にて１ｍＬ／分で行なった。分取用ＨＰＬＣは、Ｗａｔｅｒｓ分取装置（Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙｐｒｅｐ  Ｃ１８，７ｍｍ，１９×３００ｍｍカラム）にて１０ｍＬ／分で行なった。ＳＨＡＬを、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光分析およびエレクトロスプレー質量分析を用いて特性評価した。１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ  ＤＲＸ  ５００  ＭＨｚ  スペクトロメータにて記録した。質量スペクトルは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ  Ｍｉｃｒｏ  ＡＰＩ質量分析計（陽イオンモードで作動）において取得した。
【０３２５】
（ＬｅａｃＰＬＤ）２ＬＰＤｏの質量分析により、遊離ＤＯＴＡが含まれていないことが示された。遊離ＤＯＴＡは、ＳＨＡＬを合成するのに使用したプロセスに基づくと、存在することは予測され得なかった。（ＬｅａｃＰＬＤ）２ＬＰＤｏは、各リンカー成分またはリガンドを、樹脂表面に共有結合させた伸長中の鎖に結合させることにより合成した。各化学反応後、樹脂を充分に洗浄して未反応生成物を除去した。ＤＯＴＡは、合成の開始時にリンカーに結合させた。過剰のＤＯＴＡを洗浄除去した後、種々のリンカーおよびリガンドを付加するために樹脂上で多数のさらなる化学反応を行ない、各反応後、未反応生成物を再度洗浄除去した。ＨＰＬＣおよび質量分析によって調べたとき、ＳＨＡＬの合成が終了する時点まで、試料中に存在する遊離ＤＯＴＡの量は検出不可能であった。ＤＯＴＡ結合は極めて安定であり、そのため、いったん結合したらＳＨＡＬから離脱しない。
【０３２６】
放射化学試験中、放射性同位体標識に結合したかもしれない初期ランオフ（ｒｕｎｏｆｆ）ピークに存在し得た成分としては、緩衝塩（重炭酸アンモニウム）、場合によっては、最終合成工程中にＳＨＡＬのヒドロキシルから外れた微量のトリフルオロアセテート、およびＤＯＴＡに結合しなかった過剰のＥＤＴＡならびに遊離およびＥＤＴＡ錯体形成同位体が挙げられる。透析は、これらすべての物質を効率的に排除するには、単純に好ましい方法ではなかろう。逆透析は、好ましい精製方法の一例である。あるいはまた、放射化学試験後に、ＤＯＴＡキレート化されなかった、または非特異的様式でゆるく結合している放射性金属を除去するために、ＥＤＴＡビーズカラムを用いたキレート（ＥＤＴＡ）スクラビングが行なわれ得る。
【０３２７】
金属をＤＯＴＡ内に効率的に導入するため、反応ミックスを充分なアルカリ性ｐＨに調整することも重要である。分子としてのＳＨＡＬは、抗体−ＤＯＴＡ分子とはかなり異なるため、ＳＨＡＬ−ＤＯＴＡ複合体においてｐＨを上げるために使用される方法は、好ましくはＳＨＡＬにおいても充分にｐＨを上げるものである。ＤＯＴＡ中の他の金属は、任意の段階で存在していれば、容易に得ることができる。これは、該化合物の質量スペクトルを確認することにより検出され得る。本発明者らは、精製ＳＨＡＬに由来するスペクトルは観察したが、他の金属のものはほとんど、または全く見られなかった。
【０３２８】
ビオチン化デオキシコール酸−ヨードサイロニンＳＨＡＬは、同様の様式で合成される。
【０３２９】
ＥＬＩＳＡアッセイにより、ＳＨＡＬ、ＬｅａｃＰＬＢＤ（一価の二座ＳＨＡＬ）は、ＨＬＡ−ＤＲ１０を含む細胞に結合し、該細胞を、ＨＬＡ−ＤＲ１０を含まない細胞と識別することが示された（図２０参照）。
【０３３０】
いくつかの薬物動態学試験、体内分布試験および画像化試験を行なったところ、整合する結果が得られた。一部の特定の実施形態において、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ［ＳＨＡＬ  ０７０８０４（ＬｅａｃＰＬＤ）２ＬＰＤｏ］の体内分布を、Ｒａｊｉ腫瘍含有マウスにおいて調べた（例えば、図１９Ａ参照）。
【０３３１】
実施例４
腫瘍細胞受容体ＨＬＡ−ＤＲ１０上の構造的エピトープに結合する合成高親和性リガンドの開発
悪性癌細胞を正常対応細胞と識別するいくつかの細胞表面タンパク質受容体が同定された。これらの受容体のいくつかは、癌細胞上の方がアバンダントであることが示され（例えば、ＣＤ２０、ＣＤ２２）、他のものは、正常細胞上に存在する同じまたは密接に関連する受容体と、構造的に異なることが確認された（例えば、ＨＬＡ−ＤＲ１０、Ｍｕｃ−１）。これにより、放射免疫療法における使用のための、放射性同位体にコンジュゲートさせたさまざまな抗体系受容体特異的試薬の開発がもたらされた。ヒトリンパ腫および正常Ｂ細胞リンパ球のみに見られるアバンダント細胞表面受容体ＨＬＡ−ＤＲ１０上の特殊な構造的エピトープに結合させるために開発された抗体であるＬｙｍ−１を使用すると、ある程度の好成績が、非ホジキンリンパ腫の処置においてみられた。非ホジキンリンパ腫を処置するための、より小さくより有効な治療薬を開発するための取り組みにおいて、本発明者らは、まず、この同じＨＬＡ−ＤＲ１０構造的エピトープに結合する一連の小さい（＜３ｋＤ）選択的高親和性リガンド（ＳＨＡＬ）を合成した。関連するＨＬＡ−ＤＲ分子の４つの既知の結晶構造を使用し、ＨＬＡ−ＤＲ１０の相同性モデルを作成した。Ｌｙｍ−１結合に必要とされる重要なアミノ酸に隣接するタンパク質表面上に存在する２つの特殊な「ポケット」を同定し、コンピュータでのドッキング手法を用いて、小分子の大型ライブラリーを予備スクリーニングし、どの化合物が各部位に結合するかを推定した。少数のこのような化合物を、ＮＭＲ分光分析を用いて実験により試験し、孤立ＨＬＡ−ＤＲ１０タンパク質に対する結合を確認し、２つの異なる「ポケット」に結合する化合物のペアを、固相合成化学法を用いて一緒に連結し、異なる長さのリンカーを有する一連の二座試薬を作製した。孤立ＨＬＡ−ＤＲ１０に対して最も高い親和性を示すＳＨＡＬ（約２３ｎＭ）は、ＨＬＡ−ＤＲ１０を含む９種類の異なる培養細胞株ならびに小細胞型および大細胞型ヒトリンパ腫を有する患者から採取した凍結固定組織切片に選択的に結合することが示された。また、このＳＨＡＬの二価形態を合成すると、さらに向上した細胞結合が示された。
【０３３２】
実施例５
ヘキサアルギニンにより、Ｒａｊｉリンパ腫細胞による選択的高親和性リガンドの取込みおよび残存性が向上した
概要
ウイルスタンパク質に見られるものと類似したさまざまなアルギニン高含有ペプチド配列を、標的化対象細胞の細胞質および核内への該配列の輸送を助長する他の分子にコンジュゲートさせた。ＨＬＡ−ＤＲ１０発現細胞のみに結合するように開発した選択的高親和性リガンド（ＳＨＡＬ）（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＬＤｏを、このようなペプチド形質導入ドメインの１つであるヘキサアルギニンにコンジュゲートさせ、Ｂ細胞リンパ腫であるＲａｊｉ細胞によるＳＨＡＬ取込みおよびインターナリゼーションに対する該ペプチドの影響を評価した。
【０３３３】
ヘキサアルギニンペプチドを含むＳＨＡＬ（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＬＤｏ類似体を、６個のＤ−アルギニン残基を逐次、ＳＨＡＬのリンカー内に挿入したリジンに付加することにより作出した。ＨＬＡ−ＤＲ１０発現Ｒａｊｉ細胞によるＳＨＡＬ結合、インターナリゼーションおよび残存性を、全細胞結合アッセイおよび共焦点顕微鏡検査を用いて調べた。Ｒａｊｉ細胞は、親ＳＨＡＬで処理したＲａｊｉ細胞よりも２倍多くの１１１Ｉｎ−標識ヘキサアルギニンＳＨＡＬ類似体を結合することが観察された。洗浄後、３倍多くのヘキサアルギニンＳＨＡＬがＲａｊｉ細胞と結合したままであり、これは、該ペプチドが、細胞内に輸送された１１１Ｉｎの残存性も向上させたことを示す。共焦点顕微鏡検査により、Ｒａｊｉ細胞の細胞質内でのＳＨＡＬ局在とともに、核内に局在した一部の割合のヘキサアルギニンＳＨＡＬが示された。
【０３３４】
ＳＨＡＬ（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＬＤｏのリンカー内へのヘキサ−Ｄ−アルギニンペプチドの組込みにより、Ｒａｊｉ細胞によるＳＨＡＬ類似体の取込みと残存性の両方が向上した。Ｌｙｍ−１抗体で観察されるアバンダントな細胞表面結合とは対照的に、（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＡｒｇ６ＡｃＬＬＤｏおよび親ＳＨＡＬのほとんどはインターナライゼーションされた。また、インターナライゼーションされたヘキサアルギニンＳＨＡＬ類似体の一部のものは核と結合していた。この結果は、いくつかの重要なＳＨＡＬ特性（例えば、取込み、インターナリゼーション、保持、および場合によっては細胞内分布）が、ＳＨＡＬを短鎖ポリペプチドにコンジュゲートさせることによって向上または変更され得ることを示す。
【０３３５】
背景
いくつかのストラテジーが、毒性の化学物質または放射線を癌細胞に選択的に送達するため（ＤｅＮａｒｄｏ（２００５）Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，３２：Ｓ２７−３５；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ（２００７）ＡＡＰＳ  Ｊ．，９：Ｅ１２８−１４７）、遺伝子療法のため（Ｊｅｏｎｇら（２００５）Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １０７：５６２−５７０；Ｘｉａら（２００７）Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ  １０：３０６−３１５）または細胞のトランスフェクション（Ｓｈｉｇｅｔａ  Ｋ（２００７）Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １１８：２６２−２７０）および遺伝子のサイレンシング用ツールとして（Ｌｉｕ（２００７）Ｂｒｉｅｆ  Ｆｕｎｃｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ６：１１２−１１９）用いられてきた。治療薬ならびに他の分子（蛍光色素、酵素、抗体および他のタンパク質）の細胞内取込みを向上させるために使用された初期の一部のアプローチは、リポソームまたはミセル内に該分子の導入の使用を伴うものであった（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓら（２００８）Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ６０：７５７−７６７；Ｓａｍａｄら（２００７）Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  ４：２９７−３０５）。かかる構築物は細胞の膜と融合し、細胞内部の内容物を導入するか、または脂質結合成分を細胞の膜内に移行させることが示されている。別の高度に好成績なアプローチにより、細胞特異的膜タンパク質を標的化する抗体が開発され、このような抗体は、放射性核種または他の細胞傷害性分子を特異的細胞集団の表面に送達するために使用されている（Ｂｒｕｍｌｉｋら（２００８）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  ５：８７−１０３；ＤｅＮａｒｄｏら（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ  １３：２３９−２５４；Ｔｏｌｍａｃｈｅｖら（２００７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６７：２７７３−２７８２）。ごく最近では、輸送対象分子を、天然の膜貫通「シャトル」（細胞膜を容易に通過するペプチドまたはタンパク質）結合させることにより、細胞内送達が達成された。より好成績なシャトルの一例は、ＳＶ４０  Ｔ抗原に由来する核局在シグナルペプチドである（Ｙｏｎｅｄａ（１９９７）Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １２１：８１１−８１７）。この配列、ＨＩＶ−１タンパク質Ｔａｔの形質導入ドメインに由来する他のペプチド配列（Ｓｃｈｗａｒｚｅら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１５６９−１５７２；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎら（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，１００：１９７２−１９７７）、ペネトラチン（Ｔｓｅｎｇら（２００２）Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６２：８６４−８７２）、およびヘルペスウイルスタンパク質ＶＰ２２などのインタクトなタンパク質（Ｐｈｅｌａｎら（１９９８）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １６：４４０−４４３）ならびに抗ＤＮＡ抗体（Ａｖｒａｍｅａｓら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９５：５６０１−５６０６）は、現在、細胞内へのリポソーム、ウイルス、酵素、抗体およびさまざまな他のタンパク質の輸送を助長するために使用されている。また、かなりの好成績が、合成カチオン系ペプチド輸送体、例���ば、オリゴアルギニン（Ｆｕｔａｋｉ（２００５）Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ５７：５４７−５５８；Ｈａｎら（２００１）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌｓ  １２：２６７−２７１；Ｋｉｍら（２００７）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  ３３５：７０−７８；ＴｕｎｇおよびＷｅｉｓｓｌｅｄｅｒ（２００３）Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ５５：２８１−２９４）、ラクトシル化ポリ−Ｌ−リジン（Ｍｉｄｏｕｘら（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２１：８７１−８７８）およびファージディスプレイライブラリーから選択される短鎖ペプチド配列（Ｋａｍａｄａら（２００７）Ｂｉｏｌ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ  ２００７，３０：２１８−２２３）（これらは、既知のペプチドシャトルと配列類似性を示す）の使用によっても達成されている。
【０３３６】
最近、癌の画像化または治療のための標的化剤として有望であることが示されたいくつかの小分子抗体模倣物が合成された［２４−２８］。この分子は、抗体と類似した選択性および親和性（ｎＭ〜ｐＭ）を示すことに加え、タンパク質系薬物送達系の使用に伴う問題のいくつかを最小限にする可能性を有する。該分子は、小分子のより望ましい薬物動態学的特性を保持しているが、免疫原性となりにくく、経口送達に充分安定であることが示され得、薬物の製造に伴うコストは有意に低いものであり得る。また、抗体模倣物のＳＨＡＬファミリーは、放射性金属、画像化剤としての使用を可能にするさまざまなタグ、および他の小分子（例えば、毒素またはインヒビター）が運ばれるように容易に修飾され得る。別の潜在的に有用な修飾としては、標的化対象細胞によるＳＨＡＬの取込みおよびインターナリゼーションを助長する改変（これにより、腫瘍滞留時間が長くなるとともに、さらなる損傷が引き起こされ得る環境（細胞質または核）にＳＨＡＬが送達されることが予測され得る）が挙げられる。
【０３３７】
Ｂ細胞悪性腫瘍上で過剰発現されるアバンダント細胞表面受容体であるＨＬＡ−ＤＲ１０を標的化するために以前に開発されたＳＨＡＬを用いた研究により、本発明者らは、細胞内へのタンパク質および核酸の輸送を助長することが以前に示されているペプチドであるヘキサアルギニンへのコンジュゲーションによって、ＳＨＡＬのペプチド類似体を合成した。ＨＬＡ−ＤＲ１０過剰発現Ｒａｊｉ細胞を使用し、ＳＨＡＬおよびそのヘキサアルギニン類似体を用いてインビトロで行なわれた結合試験は、ヘキサアルギニン配列によってＳＨＡＬの特性が有意に変化し、ＳＨＡＬのインターナリゼーションと放射性核種の残存性の両方が向上したことを示す。
【０３３８】
方法
ＳＨＡＬの設計
ＨＬＡ−ＤＲ１０の相同性モデルを作製し、Ｌｙｍ−１エピトープ内の特殊な結合空洞を同定し、このような空洞内に結合するリガンドを選択し、（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＬＤｏ  ＳＨＡＬを作製するために使用される方法は、以前に報告されている（Ｂａｌｈｏｒｎら（２００７）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １３：５６２１ｓ−５６２８ｓ）。この親ＳＨＡＬである（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＡｒｇ６ＡｃＬＬＤｏのヘキサアルギニンペプチド類似体を作製するための方法を、該合成に対して、２つのＳＨＡＬ単量体を連結し、アルギニンヘキサペプチドをこのリジンの遊離アミンに結合させるリンカーの中央部にさらなるリジン残基の組込みを含める変更を行なうことにより開発した。
【０３３９】
ＳＨＡＬの合成
２つの二量体ＳＨＡＬ（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＬＡおよび（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＡｒｇ６ＡｃＬＬＡは、クロロトリチルクロリド樹脂上で、オルソゴナルに保護したリジン（Ｌ）残基およびｍｉｎｉＰＥＧｓ（Ｐ）（２つの小リガンドＤｖとＢａを連結する）を用いて、（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＬＡについて既報のとおりに合成した（Ｂａｌｈｏｒｎら（２００７）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １３：５６２１ｓ−５６２８ｓ；Ｈｏｋら（２００７）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  １８：９１２−９２１）。ヘキサアルギニンＳＨＡＬ（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＡｒｇ６ＡｃＬＬＡのアミン誘導体を作製するため、第２のＤｄｅ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨリジン残基をリンカー内に、ＳＨＡＬの合成中、２つの逐次Ｄｄｅ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨカップリング工程を行なうことにより挿入した。第３のリジンのα位に、６個の連続するアルギニン残基を、樹脂をＦｍｏｃ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨと６回反応させることにより挿入した。Ｎ，Ｎジイソプロピル−エチルアミン（ＤＩＥＡ）／ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で無水酢酸と反応させることにより、６番目のＡｒｇ残基をアセテート（Ａｃ）で保護した。６個すべてのアルギニン残基上のグアニジニウム基は、残りの合成中、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）感受性２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）保護基で保護されたままにする。次いで、合成の残りは、（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＬＡで先に記載のようにして終了した（同上）。分析用ＨＰＬＣおよびエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を行ない、（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＬＡおよび（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＡｒｇ６ＡｃＬＬＡ遊離アミンＳＨＡＬの純度および実体を確認した。
【０３４０】
（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＬＡ：
５０ｍｇ（０．０７ｍｍｏｌ）の樹脂および３０ｍｇ（０．０７ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨを出発材料とし、３４ｍｇの（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＬＡ（Ｒｔ＝７．８６分，Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８，５μｍ，４．２×１５０ｍｍカラム、ダイオードアレイ検出器、９５％Ｈ２Ｏ、１％ＴＦＡから８０％アセトニトリル（ＭｅＣＮ）、１％ＴＦＡの線形勾配、１２分間）を、精製後、赤色固体として単離した。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  計算値Ｃ１５０Ｈ２２４Ｎ３４Ｏ４１Ｓ２（Ｍ＋３Ｈ）３＋  １０７５．６０，実測値１０７５．６２；計算値（Ｍ＋４Ｈ）４＋  ８０６．９５，実測値８０６．９３；計算値（Ｍ＋５Ｈ）５＋  ６４５．７６，実測値６４５．６８；計算値（Ｍ＋６Ｈ）６＋  ５３８．３０，実測値５３８．２１。
【０３４１】
（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＡｒｇ６ＡｃＬＬＡ：
８１ｍｇの（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＡｒｇ６ＡｃＬＬＡ（Ｒｔ＝８．３０分）は、９０ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ）の樹脂および１５４ｍｇ（０．２９ｍｍｏｌ）のＦｍｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨを出発材料とし、精製後、赤色固体として単離した。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  計算値Ｃ１９４Ｈ３１０Ｎ６０Ｏ４９Ｓ２（Ｍ＋３Ｈ）３＋  １４４４．７１，実測値１４４４．６５；計算値（Ｍ＋４Ｈ）４＋  １０８３．７６，実測値１０８３．７８；計算値（Ｍ＋５Ｈ）５＋  ８６７．２３，実測値８６７．１８；計算値（Ｍ＋６Ｈ）６＋  ７２２．８６，実測値７２２．７８；計算値（Ｍ＋７Ｈ）７＋  ６１９．７４，実測値６１９．６２。
【０３４２】
ＳＨＡＬへのＤＯＴＡの結合
ＳＨＡＬのアミン類似体（第１リジンに遊離εアミンを有するＤＯＴＡ−ＳＨＡＬ前駆体）を、５００μｌの無水ＤＭＦおよび１００μｌのＤＩＥＡに溶解させた。ＤＯＴＡ  Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルのヘキサフルオロホスフェート（ＰＦ６）塩（９３３．３６ｇ／ｍｏｌ，１〜１．５当量）を、混合物に固体として添加した。混合物を１５分間下垂し、反応を分析用ＨＰＬＣによってモニタリングした。終了したら、反応溶液を３００μｌのＨ２Ｏおよび３００μｌのＭｅＣＮ（ともに１％ＴＦＡ含有）で希釈し、ＨＰＬＣ精製した（８５％Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）から７０％ＭｅＣＮ（０．１％ＴＦＡ）の勾配を使用、２５分間かけて流した）。得られた精製ＤＯＴＡ−ＳＨＡＬを凍結乾燥させ、続いて、分析用ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８，５μｍ，４．２×１５０ｍｍカラム、ダイオードアレイ検出器）（９５％Ｈ２Ｏ（１％ＴＦＡ）から８０％ＭｅＣＮ（１％ＴＦＡ）の線形勾配を使用、１２分間）によって解析し、ＥＳＩ−ＭＳによって特性評価した。
【０３４３】
（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＬＤｏ：
（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＬＡ  アミンＳＨＡＬ（６．０ｍｇ，１．８６μｍｏｌ）とＤＯＴＡ  ＮＨＳエステル（２．０ｍｇ，２．１４μｍｏｌ）との反応により、１００％（Ｒｔ＝７．６６４分）変換され（粗製物分析用ＨＰＬＣによる）、精製後、（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＬＤｏ（８．０ｍｇ，赤色固体）を得た。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  計算値Ｃ１６６Ｈ２５０Ｎ３８Ｏ４８Ｓ２（Ｍ＋２Ｈ）２＋  １８０６．０９，実測値１８０６．２２；計算値（Ｍ＋３Ｈ）３＋  １２０４．４０，実測値１２０４．４９；計算値（Ｍ＋４Ｈ）４＋  ９０３．５５，実測値９０３．６１；計算値（Ｍ＋５Ｈ）５＋  ７２３．０４，実測値７２３．０７；計算値（Ｍ＋６Ｈ）６＋  ６０２．７０，実測値６０２．６４。
【０３４４】
（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＡｒｇ６ＡｃＬＬＤｏ：
（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＡｒｇ６ＡｃＬＬＡアミンＳＨＡＬ（１５．０ｍｇ，３．４６μｍｏｌ）とＤＯＴＡ  ＮＨＳエステル（５．０ｍｇ，５．３６μｍｏｌ）との反応により、１００％（Ｒｔ＝７．７０分）変換され（粗製物分析用ＨＰＬＣによる）、精製後、（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＡｒｇ６ＡｃＬＬＤｏ（１２．０ｍｇ，赤色固体）を得た。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ  計算値Ｃ２１０Ｈ３３６Ｎ６４Ｏ５６Ｓ２（Ｍ＋３Ｈ）３＋  １５７３．５１，実測値１５７３．５４；計算値（Ｍ＋４Ｈ）４＋  １１８０．３８，実測値１１８０．４３；計算値（Ｍ＋５Ｈ）５＋  ９４４．５１，実測値９４４．５２；計算値（Ｍ＋６Ｈ）６＋  ７８７．２６，実測値７８７．２６；計算値（Ｍ＋７Ｈ）７＋  ６７４．９４，実測値６７４．８８；計算値（Ｍ＋８Ｈ）８＋  ５９０．６９，実測値５９０．５８。
【０３４５】
放射化学法
上記のように（同上）、ＤＯＴＡ−ＳＨＡＬを担体−遊離１１１ＩｎＣｌ３（ＭＤＳ  Ｎｏｒｄｉｏｎ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）で、次の方法（ＤｅＮａｒｄｏら（２００７）Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ４８：１３３８−１３４７）に従って標識した。１１１ＩｎＣｌ３のアリコート（１５〜２０μｌ）を、ＤＯＴＡ−ＳＨＡＬ（２５〜５０μｇ）の０．１Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃの溶液（ｐＨ５．３（５０μｌ））に添加した。４Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃを添加することにより反応混合物の最終ｐＨを６．５に調整し、混合物を３７℃で１時間インキュベートし、次いで、１０〜２０μｌの０．１Ｍエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を添加して、過剰の遊離１１１Ｉｎ３＋を封鎖した。ＨＰＬＣを用いて放射性標識生成物を精製した後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で透析した（１ｋＤカットオフ膜を使用）。１１１Ｉｎ−標識ＳＨＡＬの純度を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（１０％ＮＨ４ＯＡｃ−ＭｅＯＨ  １：１）、ＨＰＬＣおよび酢酸セルロース電気泳動（ＣＡＥ）によって測定した。ＣＡＥにより１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ＳＨＡＬと１１１Ｉｎ−ＥＤＴＡを分割した。放射性ピークは、それぞれ２．３〜３．０ｃｍおよび＞６．５ｃｍに観察された。同様の結果がＴＬＣアッセイにおいて観察された。１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ＳＨＡＬは、適用点からの移動をほとんど示さなかったが（ＲＦ＝０．２５〜０．３）、１１１Ｉｎ−ＥＤＴＡは溶媒先端まで移動した（ＲＦ＝０．５）。ＨＰＬＣにより、１１１Ｉｎ−ＥＤＴＡは２．５〜３．０ｍｌで、１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ＳＨＡＬは９．５〜１０ｍｌで溶出された。１１１Ｉｎ標識ＳＨＡＬを、ＲＰ−ＨＰＬＣまたは１ｋＤ透析膜（ＰＢＳ中）を用いて精製し、Ｓａｖａｎｔ  Ｓｐｅｅｄｖａｃ  ＳＣ１１０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を用いて濃縮した。最終の放射化学的純度を、Ｃ１８−ＲＰ−ＴＬＣ（ＥＭ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＤＣ−Ｐｌａｓｔｉｋｆｏｌｉｅｎ  ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ  ６０  Ｆ２５４，Ｃｈｅｒｒｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）、ＨＰＬＣおよびＣＡＥを用いて測定した。１１１Ｉｎ−ＤＯＴＡ−ＳＨＡＬ生成物の収率は７０〜９０％の範囲であり、生成物の純度は９０〜９５％の範囲であった。最終生成物を、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）含有ＰＢＳ中に溶解させると、室温で７２時間にわたって安定であることが示された。
【０３４６】
孤立ＨＬＡ−ＤＲ１０タンパク質に対するＳＨＡＬ結合
タンパク質結合実験は、表面プラスモン（ｐｌａｓｍａ）共鳴を使用し、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）において２５℃で行なった。試験等級のストレプトアビジン固定化チップ（ＳＡ  ｃｈｉｐ，Ｂｉａｃｏｒｅ）を、製造業者の使用説明書に従って事前に条件設定し、標準化した。ビオチン標識ＳＨＡＬをＤＭＳＯに溶解させ、１．０５×ＰＢＳ（Ｂｉａｃｏｒｅ）中で最終濃度１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４、５％ＤＭＳＯ）まで希釈し、泳動バッファーに適合させた。このＳＨＡＬをフローセルに注入し、５００〜１０００ＲＵ（応答単位）の表面密度を得た。ビオチン（５０μＭ  Ｅ−Ｚ  Ｌｉｎｋ  Ａｍｉｎｅ−ＰＥＯ２−ビオチン，Ｐｉｅｒｃｅ）を全部のセル全体に２０μｌ／分で１分間、非特異的結合を低減させるためのブロック剤として注入した。１つのフローセルを参照細胞として使用し、異なるＳＨＡＬをその他の３種類の各細胞上に固定化した。
【０３４７】
ＳＨＡＬに対するＨＬＡ−ＤＲ１０の結合を測定する実験を、流速３０μｌ／分で、ＰＢＳ  ｐＨ７．４の泳動バッファー中、全４種類のフローセルを用いて行なった。Ｒａｊｉ細胞から単離したＨＬＡ−ＤＲ１０（Ｒｏｓｅら（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ４３：２６−３０）を、泳動バッファー中で、１０ｎＭ〜１μＭの範囲の最終濃度まで希釈し、一連の濃度について、無作為に３連で実験した。タンパク質を３分間注入し、５分間解離させた後、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の１分間の注入、続いて、２分間の泳動バッファーの注入を伴う洗浄工程を用いて表面を再生させた。ブランク参照表面および５つのブランク注入の平均を差し引くことにより二重参照データを、プログラムＳＣＲＵＢＢＥＲ（ユタ大学）を用いて処理した。
【０３４８】
細胞結合アッセイ  
Ｒａｊｉヒトバーキットリンパ腫Ｂ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸（ＧＩＢＣＯ  ＃１１１４０−０５０）の１％溶液、および１００単位／ｍｌのペニシリンＧ、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、ならびに０．２５μｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢを補給したＲＰＭＩ−１６４０培地中に維持した（加湿５％ＣＯ２雰囲気中３７℃）。急性白血病Ｔ細胞株であるジャーカット細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を、１０ｍＭ  ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）を加えた同じ培地中に維持した。
【０３４９】
ＨＬＡ−ＤＲ１０バリアントを発現することが以前に示された細胞株であるＲａｊｉ細胞による１１１Ｉｎ−標識親ＳＨＡＬ（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＬＤｏおよびそのヘキサアルギニン類似体（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＡｒｇ６ＡｃＬＬＤｏの取込みを定量するための一連の実験を行なった。該アッセイは、１５０μｌのＰＢＳ中（５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有）に懸濁させた１０６細胞を含むアリコートを用いて行なった。細胞のアリコートを、０．１、１、５、１０または２５ｎｇの１１１Ｉｎ−標識（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＬＤｏまたは（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＡｒｇ６ＡｃＬＬＤｏで１時間、４℃および２２℃の両方で処理した。処理細胞を入れたチューブを遠心分離し、細胞ペレットを上清みから分離し、この２つの画分を較正済γウェル計数器にて計数し、結合ＳＨＡＬおよび遊離ＳＨＡＬの量を測定した。細胞ペレットの半量をＰＢＳで２回洗浄し、２２℃で１５分間インキュベートした後、再度遠心分離した。続いて、プールした洗浄液および洗浄済の細胞ペレットをγウェル計数器にて計数し、どれだけ多くの結合ＳＨＡＬが洗浄によって除去され得たかを評価した。
【０３５０】
３Ｄ共焦点顕微鏡検査
Ｒａｊｉ細胞およびジャーカット細胞によるＳＨＡＬ結合およびインターナリゼーションを、Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌらによる既報の方法を用いて評価した（Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌら（１９９８）Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ３７：９１−９７）。Ｒａｊｉ細胞に対する（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＬＤｏ（親ＳＨＡＬ）、そのヘキサアルギニン類似体（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＡｒｇ６ＡｃＬＬＤｏ、およびキメラＬｙｍ−１（ｃｈＬｙｍ−１）の結合を比較する実験を行なった。工程はすべて、特に記載のない限り２０℃で行なった。
【０３５１】
対数増殖期の４００万個のＲａｊｉ細胞（＞９２％バイアビリティ）を３００×ｇでペレット化し、洗浄し、１ｍｌの１％画分Ｖ  ＢＳＡ含有ＰＢＳ中で３０分間、一定回転下でブロックした。次いで、細胞を１００万個／２５０μｌで１時間、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳまたはビオチン化一次試薬：１０ｎＭ  ｃｈＬｙｍ−１、１０μＭ  親ＳＨＡＬ、もしくは１０μＭ  ヘキサアルギニンＳＨＡＬのいずれかとともにインキュベートした。４回の洗浄後（２回は１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中、２回はＰＢＳ中）、５０μｌの細胞懸濁液を新鮮ポリ−Ｌ−リジンコートスライドに塗布し、細胞を、加湿チャンバ内で１０分間付着させた。４分間のメタノールへの曝露を使用することにより、固定および浸透化を−２０℃で行なった。ジャーカット細胞は対照と同じ様式で処理した。
【０３５２】
次いで、スライドをＰＢＳ中で２回洗浄し、１０％ｆｅｔａｐｌｅｘ血清（Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｗｅｓｔ  Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）含有ＰＢＳ中で１５分間ブロックし、ＰＢＳ中で１回洗浄した。検出試薬、ストレプトアビジンＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、希釈剤中で１／５００に希釈し、１００μｌを適用した。パラフィルムカバースリップを溶液上に重層して蒸発を防いだ。スライドを加湿チャンバ内で３０分間インキュベートし、ＰＢＳ中で５回、各々５分間洗浄し、２回蒸留Ｈ２Ｏ中で短時間すすぎ洗いした。スライドを乾燥させた後、カバースリップを、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を加えたＰｒｏｌｏｎｇＧｏｌｄとともにマウントした。スライドをＯｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ１０００レーザー走査共焦点顕微鏡で観察し、データを１６０倍のＺ−スキャンとして収集し、焦点切断面（ｆｏｃａｌ  ｓｅｃｔｉｏｎ）を細胞全体において１μｍずつ離して取得した。
【０３５３】
統計学的解析
データを平均±ＳＤで報告する。統計学的比較は、２つの試験群の値の順位決定を基本とする手順であるウィルコクソン順位和検定（ＨｏｌｌａｎｄｅｒおよびＷｏｌｆｅ（１９７３）Ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｗｉｌｅｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）に基づくものとした。ｐ値が≦０．０５である場合、差は統計学的に有意であるとみなした。ｐ値は、相関係数をＺ＝ＴＡＮＨ−１ｒとする変換によって求めた（ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｔａｂｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．第２版  Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；１９６８）。
【０３５４】
結果
ＳＨＡＬの設計および合成
遊離アミンＳＨＡＬの２つの形態、（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＬＡと、ヘキサアルギニン類似体（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＡｒｇ６ＡｃＬＬＡを、ミリグラム量単位で合成し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した。ビオチンを、（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＬＡおよび（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＡｒｇ６ＡｃＬＬＡの両方の末端アミン（Ａ）ε−アミノ基に結合させ、細胞およびタンパク質結合実験における使用のためのビオチン化形態を作製した。１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）を、（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＬＡおよび（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＡｒｇ６ＡｃＬＬＡの両方の同じ部位に結合させ、ＳＨＡＬを１１１Ｉｎで標識することを可能にした。ＤＯＴＡ  ＳＨＡＬ（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＬＤｏ（図２５Ａ）およびヘキサアルギニンＳＨＡＬ類似体（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＡｒｇ６ＡｃＬＬＤｏ（図２５Ｂ）は１１１Ｉｎで、高効率（＞９０％）で標識され、比活性は、７０〜８５μＣｉ／μｇ  ＳＨＡＬの範囲であった。得られた放射性標識ＳＨＡＬのＨＰＬＣおよび酢酸セルロース電気泳動（ＣＡＥ）による解析により、生成物の純度は９０％より高いことが示された。ペプチドのタンパク質分解感受性を最小限にするため、（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＡｒｇ６ＡｃＬＬＤｏ内のヘキサアルギニン配列の合成時にアルギニンのＤ−異性体の組込みを使用した。ＳＨＡＬのインビボでの安定性を充分に評価するためには、より詳細な実験を行なう必要があるが、ヘキサ−Ｄ−アルギニンＳＨＡＬ類似体をヒト血漿中で３７℃にて２４時間インキュベートした１回のＣＡＥ予備実験で得られたデータでは、分解の形跡は示されなかった（データ示さず）。
【０３５５】
ＨＬＡ−ＤＲ１０タンパク質に対するＳＨＡＬの親和性
孤立ＨＬＡ−ＤＲ１０タンパク質に対する該２つのＳＨＡＬの親和性を推定して比較するため、両方のＳＨＡＬを用いて表面プラスモン共鳴結合試験を行なった。ビオチン化型のＳＨＡＬをストレプトアビジンチップの表面上に固定化させた一連の反応速度論実験において、親ＳＨＡＬ（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＬＤｏはＨＬＡ−ＤＲ１０に、Ｋｄ約２１ｎＭで結合することが観察された。ヘキサアルギニン含有類似体（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＡｒｇ６Ａ  ｃＬＬＤｏでも同様のＫｄ約３４ｎＭが得られた。
【０３５６】
ＨＬＡ−ＤＲ１０発現Ｒａｉｉ細胞によるＳＨＡＬ取込みの解析
ＳＨＡＬ取込みを定量し、ヘキサアルギニンタグの付加の効果を評価するため、１１１Ｉｎ−標識親ＳＨＡＬおよびヘキサアルギニンＳＨＡＬ類似体を用いてインビトロ細胞結合実験行なった。取込みは、ＨＬＡ−ＤＲ１０を発現するリンパ腫細胞株であるＲａｊｉ細胞を用いて評価した。１０６個の細胞を含むアリコートを、トレーサーとして１１１Ｉｎ標識ＳＨＡＬを含む漸増量のＳＨＡＬとともにインキュベートし、細胞に結合した１１１Ｉｎを、細胞ペレットを洗浄する前と後に測定した。
【０３５７】
未洗浄細胞ペレットの解析では、親ＳＨＡＬとヘキサアルギニンＳＨＡＬの両方がＲａｊｉ細胞に結合されることが示された。細胞結合ＳＨＡＬは、両方のＳＨＡＬで、培地中のＳＨＡＬ濃度が増大するにつれて線形に増大し（図２６）、結合ＳＨＡＬの量は、試験したＳＨＡＬ濃度範囲において飽和に達する形跡は示されなかった。ヘキサアルギニンＳＨＡＬで処理したＲａｊｉ細胞では、親ＳＨＡＬで処理したものとは対照的に、２倍多くのＳＨＡＬと結合した（表９）。また、ヘキサアルギニンＳＨＡＬのより大きい割合（６７％）が、洗浄後、細胞に保持され（親ＳＨＡＬ（約４６％）と比較して）、親よりも３倍高い最終ヘキサアルギニンＳＨＡＬ含有量がもたらされた。
【０３５８】
【表９】
0005623384.tif 000013
３Ｄ共焦点顕微鏡検査によるＳＨＡＬの局在
親およびヘキサアルギニンＳＨＡＬのビオチン化形態で１時間だけ処理したＲａｊｉ細胞の中心付近の焦点面において収集した蛍光画像により、どちらのＳＨＡＬもＲａｊｉ細胞に取り込まれることが確認された（図２７）。細胞表面上のＨＬＡ−ＤＲ１０に結合するＬｙｍ−１抗体とは対照的に、細胞の中心から取得した断面画像により、どちらのＳＨＡＬも、Ｒａｊｉ細胞内部に局在しており、細胞質全体に分布していることが示された。Ｒａｊｉ細胞は、親ＳＨＡＬよりも有意に多くのヘキサアルギニンＳＨＡＬを取り込んだ。これは、同等の濃度の２つのＳＨＡＬで処理した細胞の細胞質の染色強度が、より高いことによって示される。ＳＨＡＬ取込みは、対照ジャーカット細胞（ＨＬＡ−ＤＲ１０がない細胞）では観察されなかった。また、ヘキサアルギニンＳＨＡＬの一部は、核とも結合しているようであった。核染色は、親ＳＨＡＬで処理した細胞では観察されなかった。
【０３５９】
考察
細胞および核膜を通過するウイルスタンパク質および他のタンパク質由来の数多くの細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）が、細胞の細胞質および核内へのリポソーム、外来タンパク質および核酸ならびに他の分子の輸送効率を改善するためのシャトルとして使用されている（Ｓｃｈｗａｒｚｅら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：１５６９−１５７２；Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎら（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，１００：１９７２−１９７７；Ｔｓｅｎｇら（２００２）Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６２：８６４−８７２；Ｐｈｅｌａｎら（１９９８）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １６：４４０−４４３；Ａｖｒａｍｅａｓら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９５：５６０１−５６０６；Ｆｕｔａｋｉ（２００５）Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ５７：５４７−５５８；Ｈａｎら（２００１）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌｓ  １２：２６７−２７１；Ｋｉｍら（２００７）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  ３３５：７０−７８；ＴｕｎｇおよびＷｅｉｓｓｌｅｄｅｒ（２００３）Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ  ５５：２８１−２９４；Ｍｉｄｏｕｘら（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２１：８７１−８７８；Ｋａｍａｄａら（２００７）Ｂｉｏｌ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ  ２００７，３０：２１８−２２３）。種々のＣＰＰ配列（これらはすべて、高い含有量のアルギニン残基を有する）のインターナライゼーションの効率を特性評価する試験（Ｆｕｔａｋｉ（２００６）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ８４：２４１−２４９）では、アルギニン残基を６個程度の少数しか含まないアルギニンホモポリマーが、細胞内への有機小分子（Ｋｉｒｓｃｈｂｅｒｇら（２００３）Ｏｒｇ  Ｌｅｔｔ  ５：３４５９−３４６２；Ｒｏｔｈｂａｒｄら（２０００）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ６：１２５３−１２５７）および大きなタンパク質（Ｆｕｔａｋｉら（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：５８３６−５８４０）の輸送に非常に有効であることが示されている。
【０３６０】
標的化対象細胞によって、より効率的にインターナライゼーションされ、残存するＳＨＡＬを開発する取り組みにおいて、本発明者らは、ＨＬＡ−ＤＲ１０発現細胞株に選択的に結合することが以前に示されていた（Ｂａｌｈｏｒｎら（２００７）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １３：５６２１ｓ−５６２８ｓ）ダブシルバリン（Ｄｖ）およびＮ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニル−４−アミノ安息香酸（Ｂａ）の２つのリガンドを含むＳＨＡＬである（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＬＤｏのヘキサアルギニンコンジュゲートを合成した。ヘキサアルギニンは、二量体ＳＨＡＬに分子量を有意に変更させることなくコンジュゲートされ得、それによりＳＨＡＬの小分子治療薬としての望ましい特性が保持されるため、細胞内へのＳＨＡＬ輸送を助長する能力について試験するための第１シャトル配列として選択した。精製ＨＬＡ−ＤＲ１０タンパク質に対するＳＨＡＬとヘキサアルギニンＳＨＡＬ類似体の結合を比較した表面プラスモン共鳴実験では、二量体ＳＨＡＬへのヘキサアルギニンペプチドの付加は、該タンパク質に対するＳＨＡＬ結合を妨げないことが示された。
【０３６１】
３Ｄ共焦点顕微鏡検査実験では、親ＳＨＡＬおよびそのヘキサアルギニン類似体はともに、ＨＬＡ−ＤＲ１０発現Ｒａｊｉ細胞によって取り込まれ、インターナライゼーションされることが示された。ＳＨＡＬ取込みは、ＨＬＡ−ＤＲ１０のない細胞株であるジャーカット細胞では観察されなかった。Ｒａｊｉ細胞から取得した光学的断面により、Ｌｙｍ−１抗体結合に特徴的なＳＨＡＬの結合は細胞表面に限定されないことが示された。ＳＨＡＬで処理した細胞から取得した中央平面切断面では、ＳＨＡＬ関連蛍光が細胞の内側に分布していることが示された。一部の画像では、ところどころに小さい細胞小器官様構造と関連している細胞質内の高いＳＨＡＬ濃度の領域がみられた。細胞質関連蛍光は、ヘキサアルギニンＳＨＡＬ類似体で処理したＲａｊｉ細胞において有意に高く、これは、ヘキサアルギニンペプチドの付加によってＳＨＡＬの細胞取込みが向上したことを示す。
【０３６２】
Ｒａｊｉ生細胞に対する１１１Ｉｎ−標識（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＬＤｏおよび（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＡｒｇ６ＡｃＬＬＤｏの結合を比較した実験では、ヘキサアルギニンタグによりＳＨＡＬ取込みが向上することが確認された。また、このタグの存在により、Ｒａｊｉ細胞によって保持される１１１Ｉｎ−標識ＳＨＡＬの量が増大した。洗浄後も保持されたＳＨＡＬの量は、試験した濃度範囲において飽和に達することはなく、これは、ＳＨＡＬが、この実験で使用したものよりさらに高い濃度であってもＨＬＡ−ＤＲ１０発現細胞内部に蓄積され得ることを示す。細胞結合試験で試験した最も高いヘキサアルギニンＳＨＡＬ濃度では、残存したＳＨＡＬの量は、各Ｒａｊｉ細胞の表面上に存在する既報のＨＬＡ−ＤＲ１０分子の数と同じである約１．１×１０６  ＳＨＡＬ分子／細胞に相当した（Ｅｐｓｔｅｉｎら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４７：８３０−８４０）。この結果は、ヘキサアルギニンＳＨＡＬの大部分がインターナライゼーションされることを示す共焦点画像と総合すると、有意な割合のＳＨＡＬが、細胞内部に存在することがわかっているＨＬＡ−ＤＲ１０プールに結合されているのであろうことを示す。
【０３６３】
また、放射性同位体のインターナライゼーションおよび残存性は、癌治療に非常に好都合であることが示されているため、観察されたＲａｊｉ細胞による１１１Ｉｎ−標識ヘキサアルギニンＳＨＡＬの残存性の向上、および一部の割合の１１１Ｉｎ−標識が核と結合する可能性は重要である（Ｂｒｏｕｗｅｒｓら（２００３）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ９：３９５３Ｓ−３９６０Ｓ；Ｃｈｅｎら（２００６）Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ２００６，４７：８２７−８３６；Ｍｉｃｈｅｌら（２００２）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ８：２６３２−２６３９；Ｓｔｅｉｎら（２９９５）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１：２７２７−２７３４）。癌治療薬は、β粒子、α粒子またはオージェ電子を放射するさまざまな放射性同位体に連結されている。放射免疫療法において常套的に使用されている同位体（ヨウ素−１３１、イットリウム−９０、およびレニウム−１８８など）からのβ放射の範囲は、数ミリメートルにわたり、このような放射性核種を有する治療薬は、標的化剤が直接結合されない悪性細胞を破壊する「クロスファイア」（ＤｅＮａｒｄｏ（２００５）Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，３２：Ｓ２７−３５；Ｂｉｓｃｈｏｆ  ９２００３）Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ４４  Ｓｕｐｐｌ  ４：Ｓ２９−３６）または「バイスタンダー」（Ｂｏｙｄら（２００６）Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ４７：１００７−１０１５）効果をもたらす。このように、β放射体は、抗原陰性腫瘍細胞により抵抗性を潜在的に克服し得る。このような特徴により、β−粒子療法は、大きな腫瘍または大容積腫瘍（ｌａｒｇｅ−ｖｏｌｕｍｅ）疾患の処置に対してより適したものとなっている。しかしながら、よりロングレンジのβ放射は、近傍の正常細胞も破壊することがあり得る。
【０３６４】
ヘキサアルギニンＳＨＡＬ（ＤｖＬＰＢａＰＰＰ）２ＬＡｒｇ６ＡｃＬＬＤｏなどの標的化剤のインターナライゼーションは、オージェ電子放射性１１１Ｉｎを、細胞の細胞質および核内（ここでは、オージェ電子は、非常に短い細胞下パス長および高い線エネルギー付与を有する）に導入する手段として利用することができる（Ｂｏｄｅｉら（２００３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ  １８：８６１−８７７；Ｋａｓｓｉｓ（２００３）Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ４４：１４７９−１４８１；ＭｃＤｅｖｉｔｔら（１９９８）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ２５：１３４１−１３５１）。核に吸収された線量の放射線は、１１１Ｉｎが核内で崩壊すると、崩壊が細胞質内または細胞表面上で崩壊する場合と比べて、それぞれ、２倍および３５倍大きくなると推定されている（Ｇｏｄｄｕら（１９９４）Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ３５：３０３−３１６；Ｈｉｎｄｏｒｆら（２００７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ  ２２：３５７−３６６）。このような特性により、１１１Ｉｎおよび他のオージェ電子放射体は、細胞核の近傍で崩壊すると、ＤＮＡに対して高度に細胞傷害性および損傷性となる（Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｉら（２００７）Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ４８：１３５７−１３６８）。オージェ放射体を、腫瘍細胞内部に高濃度まで蓄積される高度に選択的な残存性標的化剤にカップリングさせることによって、多くの型の転移性の癌の処置により有効な非常に強力な類型の治療薬が開発され得る。
【０３６５】
結論
ＨＬＡ−ＤＲ１０発現リンパ腫細胞によるヘキサアルギニンＳＨＡＬのインターナライゼーションの向上、およびヘキサアルギニンペプチドをＳＨＡＬにコンジュゲートすることによって達成されるＳＨＡＬの残存性の増大の大きさは、これらが、放射性核種を悪性細胞に細胞内部に有意な濃度の放射性核種の残存をもたらす条件下で送達する小分子（ＳＨＡＬなど）が設計され得ることを示すため、重要である。オージェ放射性の放射性核種を担持するＳＨＡＬは、ＳＨＡＬで得られる治療指数を、腫瘍細胞の表面上への放射性核種タグ化標的化剤の蓄積によって得られるものより高くするための代替アプローチを提供し得る。また、この結果は、他の形態の癌を処置するＳＨＡＬ系アプローチにも重要であるため、胸躍るものである。グリコシル化度が低いＭＵＣ１、担持している放射性同位体を残存させるアンドロゲン受容体および他の腫瘍特異的細胞表面タンパク質を標的化するインターナライゼーションされるＳＨＡＬもまた、多種多様な他の型の転移性の癌のための小分子治療薬として開発され得る。
【０３６６】
本実施例で使用する略語
Ａｃ、アセテート；Ｂａ、Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニル−４−アミノ安息香酸；Ｂｏｃ、第３級ブチルオキシカルボニル；ＢＳＡ、ウシ血清アルブミン；ＣＡＥ、酢酸セルロース電気泳動；ＣＰＰ、細胞透過性ペプチド；ＤＡＰＩ、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール；Ｄｄｅ、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシ（ｄｉｘｏｘｃｙｃｌｏｈｅｘ）−１−イリデン）エチル；ＤＩＥＡ、Ｎ，Ｎジイソプロピル−エチルアミン；ＤＭＦ、ジメチルホルムアミド；ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＤＯＴＡ、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸；Ｄｖ、ダブシルバリン；ＥＤＴＡ、エチレンジアミン四酢酸；ＥＳＩ−ＭＳ、エレクトロスプレーイオン化質量分析；Ｆｍｏｃ、フルオレニルメチルオキシ；ＨＥＰＥＳ、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸；ＨＰＬＣ、高速液体クロマトグラフィー；ＭｅＣＮ、アセトニトリル；ＮＨＳ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド；Ｐｂｆ、２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル；ＰＢＳ、リン酸緩衝生理食塩水；ＰＦ６、ヘキサフルオロホスフェート；ＲＰ−ＨＰＬＣ、逆相高速液体クロマトグラフィー；ＳＤＳ、ドデシル硫酸ナトリウム；ＳＨＡＬ、選択的高親和性リガンド；ＴＦＡ、トリフルオロ酢酸；ＴＬＣ、薄層クロマトグラフィー。
【０３６７】
実施例６
リンパ腫および白血病のための新規な合成ＨＬＡ−ＤＲ抗体模倣体によって誘導される分子特異的および細胞選択的細胞傷害性
概要
リツキシマブなどの、ヒト白血球抗原と反応性のモノクローナル抗体は、強力な抗リンパ腫活性を有する。しかしながら、その大きさにより、血管および組織への浸透は制限される。モノクローナル抗体結合を模倣させるため、ＨＬＡ−ＤＲ１０のβサブユニットに特異的であることが示され、このタンパク質を発現する細胞に選択的なナノ分子が合成された。３−（２−（［３−クロロ−５−トリフルオロメチル）−２−ピリジニル］オキシ）−アニリノ）−３−オキソプロパニオン酸（Ｃｔ）リガンドを含む選択的高親和性リガンド（ＳＨＡＬ）は、発現細胞内に残存し、該細胞に対して抗リンパ腫活性を有した。本明細書において、本発明者らは、ヒトリンパ腫異種移植片を有するマウスにおいて、このリガンドを含む三座ＳＨＡＬの並はずれた効力を示す。細胞培養物において抗リンパ腫活性を滴定後、Ｃｔリガンドを含む三座ＳＨＡＬの無作為化前臨床試験を、確立された進行性ヒトリンパ腫異種移植片を有するマウスにおいて行なった。ＨＬＡ−ＤＲ１０発現Ｒａｊｉ  Ｂ−またはジャーカットＴ−リンパ腫異種移植片を有するマウスを、１００ｎｇのｉ．ｐ．用量のＳＨＡＬでの処置を毎週連続３週間、または未処置のいずれかの施術に無作為に割り当てた。主要エンドポイントは、治癒、奏効率および生存率とした。また、これらのマウスにおいて毒性も評価し、健常Ｂａｌｂ／ｃマウスにおいて、ＵＳＦＤＡの一般的な安全性試験を行なった。Ｒａｊｉ細胞培養物において、細胞傷害活性の閾値およびＩＣ５０濃度は、それぞれ、０．７および２．５ｎｍｏｌ（ｐｍ／ｍｌ培地）とした。被処置ジャーカット異種移植片または未処置異種移植片と比較すると、ＳＨＡＬで処置したＲａｊｉ異種移植片は、死の危険度の８５％低下を示した（Ｐ＝０．０１４；９５％信頼区間では３２〜９５％低下）。Ｒａｊｉ異種移植片を有するマウスの大部分の治癒と関連する処置用量よりも２０００倍大きいｉ．ｐ．用量後であっても、毒性の徴候はなかった。対照群と比較した場合、処置により、患者において有害事象と関連しない容易に達成可能な用量で、ＨＬＡ−ＤＲ１０発現ヒトリンパ腫異種移植片を有するマウスにおいて、応答速度および生存率が選択的に改善された。
【０３６８】
序論
ＣＤ２０、ＣＤ２２およびＭＨＣＩＩ  ＨＬＡ−ＤＲなどの細胞表面タンパク質は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の治療薬のための魅力的な標的であることが示されている。このようなタンパク質の１つであるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）は、正常なＢリンパ球と比べ、悪性Ｂリンパ球の表面上で上方調節される。さらに、細胞内ＨＬＡ−ＤＲタンパク質は、さらにいっそうアバンダントである。ＨＬＡ−ＤＲタンパク質は、膜貫通および細胞質のシグナル伝達受容体としての機能を果たし、免疫機構に対してペプチドシャトルとしての機能を果たす（Ｌｅｖｅｉｌｌｅら（２００２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３２：２２８２−２２８９；Ｋｌｅｍｍら（１９９８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：５６９−５９２；Ｌａｎｅら（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４４：３６８４−３６９２）。モノクローナル抗体（ＭＡｂ）であるＬｙｍ−１は、ＨＬＡ−ＤＲのβサブユニット上の充分特性評価されたエピトープに結合し、Ｂ細胞リンパ腫および白血病を有する患者のそれぞれ約９０％および５０％のリンパ腫組織と反応する（ＤｃＮａｒｄｏら（１９９８）Ｊ、Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１６：３２４６−３２５６：Ｒｏｓｅら  ９１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，４３：２６−３０；Ｒｏｓｅら（１９９９）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３６：７８９−７９７）。結合は細胞表面に限定的であるが（Ｅｐｓｔｅｉｎら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４７：８３０−８４０）、Ｌｙｍ−１は、培養状態およびマウスの悪性Ｂ細胞に対して高度に活性である（ＤｃＮａｒｄｏら（２００５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１１：７０７５−７０７９；Ｔｏｂｉｎら（２００７）Ｌｅｕｋ．Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ４８：９４４−９５６、２００７：Ｚｈａｎｇら（２００７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ．Ｒａｄｉｏｐｈａｎｎ．，２２：３４２−３５６）。
【０３６９】
サイズを小さくしてＨＬＡ−ＤＲ１０に対するＭＡｂ結合を模倣させるため、インシリコモデル設計および実験による試験に基づいて、サイズが＜５ｋＤａの一連の選択的高親和性リガンド（ＳＨＡＬ）を合成し、ＨＬＡ−ＤＲタンパク質のβサブユニットのＬｙｍ−１エピトープ領域内に結合させた。このような新規なナノ分子の二座型は、多くの所望の特性をインビトロおよびマウスにて示した（Ｂａｌｈｏｒｎら（２００７）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，，１３（Ｓｕｐｐｌ．１８）：Ｓ５６２１−Ｓ５６２８；ＤｅＮａｒｄｏら（２００７）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，４８：１３３８−１３４７）が、抗リンパ腫活性は示さなかった（Ｗｅｓｔら（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．．２１：６４５−６５４）。注目すべきことには、Ｃｔリガンドを含む三座ＳＨＡＬ（３−（２−（［３−クロロ−５−トリフルオロメチル）−２−ピリジニル］オキシ）−アニリノ）−３−オキソプロパニオン酸）は、Ｂリンパ腫の培養細胞内部に残存し、該細胞に対して細胞傷害性であった。ここでは、本発明者らは、このＳＨＡＬの細胞選択的な抗リンパ腫活性を滴定し、その著しい有効性、選択性および安全性を、ヒトリンパ腫異種移植片を有するマウスにおいて示し、ＳＨＡＬ誘導性の自家融解の電子顕微鏡による証拠を示す。
【０３７０】
材料および方法
試薬および細胞株
マウス（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｔｕｓｔｉｎ，ＣＡ）およびキメラ（Ａ．Ｅｐｓｔｅｉｎ，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）Ｌｙｍ−１（悪性Ｂ細胞上に発現されるＨＬＡ−ＤＲ１０のβサブユニットに結合する）（Ｅｐｓｔｅｉｎら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４７：８３０−８４０）、ならびにＲａｊｉバーキットＢ細胞から単離したＨＬＡ−ＤＲ１０タンパク質（既報のとおりにＬｙｍ−１アフィニティカラムを用いて）（Ｂａｌｈｏｒｎら（２００７）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１３（増刊号１８）：Ｓ５６２１−Ｓ５６２８）を参照として使用した。ＨＬＡ−ＤＲ１０発現ヒトＢリンパ腫細胞株Ｒａｊｉ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）（１０％ウシ胎仔血清を含み、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸および抗生物質（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を補給したＲＰＭＩ−１６４０中、３７℃で加湿５％ＣＯ２雰囲気中で培養）、ならびに非発現ヒトＴリンパ腫細胞株ジャーカット（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）（ＡＴＣＣによる推奨どおりに培養）を、この実験に使用した。
【０３７１】
薬物の設計および化学法
相同性モデル設計を使用し、Ｌｙｍ−１結合に不可欠なＨＬＡ−ＤＲアミノ酸残基を、ＨＬＡ−ＤＲ１０のβサブユニットの３Ｄモデル上にマッピングした（Ｂａｌｈｏｒｎら（２００７）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１３（増刊号１８）：Ｓ５６２１−Ｓ５６２８）。該タンパク質のＬｙｍ−１エピトープ表面内の空洞は、ＳＰＨＧＥＮを用いて同定した（Ｋｕｎｔｚら（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６１：２６９−２８８：Ｄｅｓｊａｒｌａｉｓら（１９８８）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３１：７２２−７２９）。各空洞についてコンピュータによるリガンドドッキング後、ＮＭＲ分光分析、表面プラスモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ３０００；Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）および競合的結合実験の組合せを使用し、ＨＬＡ−ＤＲ１０タンパク質に対するリガンド結合を確認した。次いで、既報のとおりにリガンドの組を連結し、ＳＨＡＬを作製した（Ｂａｌｈｏｒｎら（２００７）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，ｌ３（Ｓｕｐｐｌ．１８）：Ｓ５６２１−Ｓ５６２８）。各ＳＨＡＬは、ポリエチレンカラム（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）内のクロロトリチルクロリド樹脂上で、Ｆｍｏｃ固相化学法を用いて合成し、ＰＥＧ単量体単位と選択したリガンドをＮ末端リジンのαおよびεアミンによってコンジュゲートさせた。三座ＳＨＡＬを合成するため、ダブシルバリン（Ｄｖ）リガンドを、第２リジン残基のαアミンにコンジュゲートさせたＰＥＧスペーサーの末端アミンに結合させ、４−［４−（４−クロロベンジル）ピペラジノ］−３−ニトロベンゼンカルボン酸（Ｃｂ）リガンドを、第３リジンのαアミンにコンジュゲートさせたＰＥＧの末端アミンに結合させた。最後に、Ｃｔリガンドも第３リジンのεアミンに結合させた（図２８）。ＤＯＴＡ（またはビオチン化）ＳＨＡＬ誘導体への変換は、既報のとおりに行なった。反応は、分析用高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってモニタリングし、ＤＯＴＡ（またはビオチン化）誘導体は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いて精製した。分析用エレクトロスプレーイオン化−質量分析（Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８カラム）を使用し、ＳＨＡＬの元素組成および質量組成を確認した（理論的分子量の０．０７％以内の分子量）。孤立または組換えＨＬＡ−ＤＲ１０タンパク質に対するＳＨＡＬ結合を調べるため、表面プラスモン共鳴実験を既報のとおりに行なった（同上）。ＳＨＡＬ結合は、ナノモル以上であり、Ｌｙｍ−１の添加によってブロックされた。
【０３７２】
細胞傷害性アッセイ
対数増殖期に収集したＲａｊｉ細胞を、既報のとおりに、遠心分離し、新鮮培地中に再懸濁させ、１０％トリパンブルー色素中で計数し、初期およびその後のバイアビリティを測定した（Ｗｅｓｔら（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ．Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．，２１：６４５−６５４）。未処理の場合、細胞は増殖を継続し、非バイアブル細胞であり（初期では全細胞の＜５％）、アッセイ過程の間中そのままであった。細胞傷害活性を滴定するため、０〜７ｎＭ（ｐｍ／ｍｌ培地）の範囲の濃度のビオチン化三座ＳＨＡＬを、０．５×１０６細胞／ｍｌとともに、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中、３７℃でインキュベートした（ＮＡＰＣＯ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）。１、２および３日後、細胞をトリパンブルー色素中に再懸濁させ、血球計で計数した。バイアブル細胞および非バイアブル細胞／ｍｌのバイアビリティの割合および絶対数を測定した。
【０３７３】
マウスにおける有効性および毒性
７〜９週齢の雌の胸腺欠損Ｂａｌｂ／ｃ  ｎｕ／ｎｕマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を、カリフォルニア大学動物保護ガイドラインに従って、無菌条件下および随意の通常の食事下に維持した。対数増殖期に収集し、＞９５％のバイアビリティを有するＲａｊｉまたはジャーカット細胞（６×ｌ０６細胞）を、異種移植片拒絶を抑制するためにマウスに放射線照射（４００ｃＧｙ）した３〜４日後に下腹部の皮下に移植した。異種移植片がカリパスによる測定で２０〜５００ｍｍ３に達したら、マウスを、異種移植片の体積によって４つの群：Ｒａｊｉ異種移植片を有するＳＨＡＬ処理マウス、ジャーカット異種移植片を有するＳＨＡＬ処理マウス、Ｒａｊｉ異種移植片を有する未処置マウス、またはジャーカット異種移植片を有する未処置マウスに分類した。各マウスに、１００μｌのＰＢＳまたは１００ｎｇのＤＯＴＡ−キレート化三座ＳＨＡＬをｉ．ｐ．で、０、７および１４日目に注射した。異種移植片の体積および生存率を≧８４日間モニタリングした。また、マウスの体重測定を、週に２〜３回４週間、次いで毎週行なった。血球数を、各ＳＨＡＬまたはＰＢＳの投与前および最終投与後、毎週４週間、Ｚ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｈｉａｌｅａｈ，ＦＬ）および位相差顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，Ｊｅｎａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定した。
【０３７４】
異種移植片の体積を半楕円の式によって計算した（ＤｅＮａｒｄｏら（１９９７）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．３：７１−７９）。応答は、治癒、異種移植片は完全に消失して８４日までに再生なし、正式（ｆｏｒｍａｌ）打ち切り日（＞２１０日間から現在まで）は完全に寛解（ＣＲ）、異種移植片は少なくとも７日間消失したが再生して部分寛解（ＰＲ）、異種移植片の体積は少なくとも７５％縮小して少なくとも７日間安定状態が維持として特性評価した。ＳＨＡＬ処理マウスの８４日目に全例治癒は、マウスの２１０日間の観察期間中、持続された。異種移植片が＞２０００ｍｍ３になった場合、マウスは、カリフォルニア大学動物保護ガイドラインに従って安楽死させ、疾患関連死としてスコアリングした。
【０３７５】
マウスにおける安全性
７匹の健常Ｂａｌｂ／ｃマウスの３群の各々に、ＰＢＳ、２０または２００μｇのＤＯＴＡキレート化ＳＨＡＬをｉ．ｐ．で、すなわち、ＳＨＡＬ有効用量の２００倍または２，０００倍を投与した。介入の直前に、マウスを観察し、体重測定し、血球数（赤血球、白血球および血小板）を得、次いで、介入後は、４週間、マウスを毎日観察し、週３回体重測定し、血球数を毎週測定した。
【０３７６】
電子顕微鏡検査（ＥＭ）
Ｒａｊｉ異種移植片（５３〜１３２ｍｍ３）をＥＭのために、未処置（対照）および１００ｎｇのビオチン化ＳＨＡＬの２、４または２４時間後のマウスから収集した。異種移植片を記載（１８）のようにして、４％パラホルムアルデヒド含有０．１Ｍ  Ｓｏｒｅｎｓｏｎリン酸バッファー（ｐＨ７．３５）を用いて固定した。４％ウラニルアセテート含有７０％エタノールで１時間およびＬＲ  Ｗｈｉｔｅアクリル樹脂で一晩処理した後、マイクロ波（Ｐｅｌｃｏ  ３４７００  ＢｉｏＷａｖｅ，Ｐｅｌｌａ  Ｉｎｃ．，Ｒｅｄｄｉｎｇ，ＣＡ）にて重合を行なった。超薄切片（Ｌｅｉｃａ  Ｕｌｔｒａｃｕｔ  ＵＣＴ、Ｌｅｉｃａ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）を金格子上に捕捉し、ストレプトアビジン−２０ｎｍ金（ＢＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｆｒｏｍ  Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ  Ｉｎｃ．）上に浮遊させ、すすぎ洗いし、ウラニルアセテートおよびクエン酸鉛で染色した後、Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＣＭ１２０  Ｂｉｏｔｗｉｎ  Ｌｅｎｓ（ＦＥＩ，Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ，ＯＲ，Ｅｉｎｄｈｏｖｅｎ製，Ｔｈｅ  ＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓおよびＧａｔａｎ  ＭｅｇａＳｃａｎ，モデル７９４／２０，デジタルカメラ（２Ｋ×２Ｋ），Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ．Ｇａｔａｎ  ＢｉｏＳｃａｎ，モデル７９２，Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ，ＣＡ）を用いて観察した。
【０３７７】
生物統計学法
初期解析で、未処置のＲａｊｉおよびジャーカットマウスについて、正確確率検定による応答速度、およびログランク検定による生存期間を比較すると、有意差は見られなかったため、これらの群は、その後の解析のためにプールした。処理Ｒａｊｉ、処理ジャーカットおよび未処置のマウスの応答速度を、χ２検定および正確確率検定によって比較した。死亡しなかったマウスまたは安楽死させなかったマウスでは、腫瘍が成長し続けたため、生存期間は８４日目に打ち切った。時間はカプラン・マイヤー曲線によって記述的に要約し、メジアン生存率および９５％信頼限界を、積極限推定量によって得た。２つの処置群を未処置群と、群間の均質性についてログランク検定を用いて比較した後、比例ハザードモデルと比較し、未処置と比較した処置の効果を評価した。解析は、ＳＡＳ／ＳＡＴ（登録商標）ソフトウェア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．ＳＡＳ／ＳＴＡＴ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．０．２００４．Ｇａｒｙ，ＮＣ：ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を用いて行なった。検定はすべて、レベル０．０５の両側検定で行なった。
【０３７８】
結果
細胞傷害性アッセイ
未処置の場合、非バイアブル（死）Ｒａｊｉ細胞は、３日間の観察中、全細胞の＜５％が残った。ＳＨＡＬ（０〜７０ｎＭ（ｐｍ／ｍｌ培地）の濃度範囲の）で処理したＲａｊｉ細胞では、該３日間で、未処置対照と比べ、部分的および絶対的の両方で、より多くの死細胞が示された。非バイアブル細胞の最大数は、２日目に２．３〜７ｎＭのＳＨＡＬ濃度で観察され、閾値およびＩＣ５０  ＳＨＡＬ細胞傷害性濃度は、それぞれ０．７および２．５ｎＭ（ｐｍ／ｍｌ培地）であった（図２９）。
【０３７９】
有効性および毒性
処理Ｒａｊｉ異種移植片における退縮は、典型的には、最初のＳＨＡＬ処理から約７日後に始まり、約３０日後に完全寛解に達した（図３０）。８４日目に打ち切ったが、ＳＨＡＬ処理Ｒａｊｉ異種移植片の全治癒例は、現在まで持続しており、永続的な治癒を示しているようである。未処置のＲａｊｉおよびジャーカットマウスは、応答および生存率に有意な差はみられなかったため（Ｐ＞０．０８）、これらを合わせ、処置マウスと比較した。Ｒａｊｉ異種移植片を有し、ＳＨＡＬで処置したマウスは、６９％の治癒率および７７％の奏効率を有し、ジャーカット異種移植片を有する処置マウス（０％）および未処置マウス（１５％応答）（Ｐ＜０．００１）よりも有意に良好であった（表１０）。メジアン生存期間は、未処置マウスで２５日間、およびジャーカット異種移植片を有する処置マウスでは２１日間であった。Ｒａｊｉ異種移植片を有する処置マウスのメジアン生存期間は、ほぼすべてのマウスが８４日目に生存していたため、推定不可能であった（図３１）。比例ハザードモデルにより、Ｒａｊｉマウスは、未処置および処理ジャーカットマウスと比べて、死の危険度が約８５％低下したことが推定された（Ｐ＜０．００１）。
【０３８０】
【表１０】
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マウスにおける安全性
一般的な安全性試験において、マウスはすべて（有効性試験で用いた２０００倍用量のＳＨＡＬを投与したものを含む）、４週間の観察中、体重が増加し、安定な血球数を示し、有害効果は示さず、それにより、ＵＳ  ＦＤＡの「一般的な安全性」試験ガイドラインの必要条件を超えていた。
【０３８１】
電子顕微鏡検査
未処置マウスのＲａｊｉ異種移植片のＥＭでは、良好に画定された細胞膜および核膜、ならびに細胞質の細胞小器官（例えば、細網内皮、ゴルジ体、およびリポソーム）を有する健常細胞が示された（図３２）。対照的に、ＳＨＡＬ処理後に収集したＲａｊｉのＥＭは、高度に凝縮した核クロマチンおよび断片化された細胞小器官を特徴とし、自食性（プログラムされた）細胞死と整合する所見であった。
【０３８２】
考察
悪性細胞の表面上のタンパク質は、それ自体を同定するため、ならびに治療および画像化のための標的として供するために使用されている。クラスＩＩ主要組織適合性ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）は、悪性Ｂリンパ球の表面上および内部のどちらにもアバンダントである（Ｅｐｓｔｅｉｎら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４７：８３０−８４０）。このタンパク質は、細胞死の主要なシグナル伝達受容体である（Ｌｅｖｅｉｌｌｅら（２００２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：２２８２−２２８９；Ｌａｎｅら（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４４：３６８４−３６９２）。インタクトなＭａｂは、悪性細胞を選択的に認識するが、その大きさにより、血中クリアランスおよび組織浸透は制限される。インシリコモデル設計および経験的試験からの推定に基づき、ＨＬＡ−ＤＲ１０のＬｙｍ−１  ＭＡｂエピトープ領域内の部位に結合させる小分子有機リガンドを選択した。このようなリガンドの組を一緒に共有結合させることにより、Ｂ細胞由来リンパ腫および白血病を標的化するＳＨＡＬが作製された（Ｈｏｋら（２００７）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，１８：９１２−９２１）。この新規なナノ分子は、ＳＨＡＬ内の多数のリガンドと標的タンパク質のエピトープ内に存在する多数の部位との間に生じる３次元相互作用のため、ＭＡｂの親和性と選択性を模倣する。ＳＨＡＬは、免疫グロブリンＧ分子よりも約５０倍小さいため、ＳＨＡＬはＨＬＡ−ＤＲ発現異種移植片によって速やかに取り込まれ、正常組織からは速やかに排除される（ＤｅＮａｒｄｏら（２００７）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，４８：１３３８−１３４７）。組織化学的解析により、ＳＨＡＬは、患者由来およびマウス由来のＮＨＬ組織に結合することが示された（Ｂａｌｈｏｒｎら（２００７）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，１３（増刊号１８）：Ｓ５６２１−Ｓ５６２８）。先の試験では、ＳＨＡＬは細胞内に容易に進入するが、ＨＬＡ−ＤＲ１０および関連ＨＬＡ−ＤＲを発現する細胞からは退去せず、ロブスターおよびその捕捉のような挙動を示すことが示された。
【０３８３】
このようなＳＨＡＬは細胞障壁を効率的に通過し、ＨＬＡ−ＤＲ１０発現細胞内では細胞内ポンプ機構による影響は受けないようである。Ｃｔ（３−（２−（［３−クロロ−５−トリフルオロメチル）−２−ピリジニル］オキシ）−アニリノ）−３−オキソプロパニオン酸）リガンドを含むＳＨＡＬは、ヒトＨＬＡ−ＤＲ１０発現リンパ腫の生細胞内部に残存し、該細胞に対して強力な抗リンパ腫活性を示す（ＤｅＮａｒｄｏら（２００７）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，４８：１３３８−１３４７）。本実験は、ＨＬＡ−ＤＲ１０発現培養細胞に対して２．５ｎＭ（ｐｍ／ｍｌ培地）のＩＣ５０を有するＣｔリガンド含有三座ＳＨＡＬもまた、Ｒａｊｉ異種移植片を有するマウスにおいて著しい有効性があることを示す。永続的治癒は、試験した最大用量の２０００倍低いＳＨＡＬ処理用量において、このマウスの６９％で達成され、健常マウスでは安全であることが確認された。抗リンパ腫効果は、ＨＬＡ−ＤＲ１０を発現する異種移植片を有するマウスのみで観察され、ジャーカット異種移植片は、ＳＨＡＬ処理の影響を受けなかった。２０００倍多いＳＨＡＬで処置したマウスは有害事象の徴候を示さなかったため、ＳＨＡＬは、潜在的治療薬として並はずれた安全性の幅を有するようである。将来的に、三座ＳＨＡＬを用いてマウスにおいて用量応答試験を行ない、ＳＨＡＬ用量を上げるにつれて治癒率が増大し得るか否かを確認することは重要である。
【０３８４】
ＳＨＡＬで処置したマウス由来の異種移植片組織の電子顕微鏡写真では、Ｒａｊｉリンパ腫細胞に対するＳＨＡＬの細胞傷害性が確認された。広範な空胞形成および細胞構造の減損は、ＨＬＡ−ＤＲに対するＳＨＡＬ結合によって、最終的にアポトーシスおよび自食性細胞死に至る細胞シグナル伝達が誘導された可能性を示す。この仮説を確認し、ＳＨＡＬの作用機序を特定するために、より充分な試験が必要である。
【０３８５】
本結果は、ＳＨＡＬが分子療法でリンパ腫および白血病を標的化するための新規なナノ分子として並はずれた潜在性を有するという説得力のある証拠を示す。ＳＨＡＬは、この化学物質が約５０倍小さく、あまり高価でなく、一貫性を伴った製造が容易であり、安定であり、長期貯蔵寿命を有し、経口投与した場合に有効であることが予測されるため、生物学的相当薬の魅力的な代替薬を代表する。さらに、ＳＨＡＬ系治療薬は、他の薬剤を、このような悪性細胞内部の不可欠な部位に輸送し、残存させることができる。ＳＨＡＬ製造の基本骨格は、効率的で柔軟性があり、迅速な合成および修飾が可能である。
【０３８６】
本明細書に記載の実施例および実施形態は、例示の目的にすぎず、これらに鑑みて種々の修正または変更が、当業者に示唆され、本出願書類の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲の範囲に含まれることは理解されよう。本明細書に挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、あらゆる目的のために、引用により、その全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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