(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体試料に
(i)  RO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H
［式中a、b、およびcは整数を表し、Rは水素原子または直鎖、分岐のアルキルを表す］であるポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体及びリポプロテインリパーゼの存在下にコレステロールエステラーゼならびにコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼからなるコレステロール測定用酵素を添加し、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体をリポ蛋白質のうちsmall,dense LDLに選択的に作用させ、生成したコレステロール量を測定することを特徴とするsmall,dense LDLコレステロールの選択的定量方法。
【請求項２】
さらに非イオン性および／または陰イオン性界面活性剤を添加することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体をリポ蛋白質のうちsmall,dense LDLに選択的に作用させる前に、small,dense LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールをsmall,dense LDLコレステロール定量反応系外に導くことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
被検体試料に
(i)  RO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H
［式中a、b、およびcは整数を表し、Rは水素原子または直鎖、分岐のアルキルを表す］であるポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体及びリポプロテインリパーゼの存在下でコレステロールエステラーゼならびにコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼからなるコレステロール測定用酵素を添加し、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体をリポ蛋白質のうちsmall,dense LDLに選択的に作用させ、生成したコレステロール量を測定するための、上記のポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体とリポプロテインリパーゼとコレステロールエステラーゼならびにコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼからなるコレステロール測定用酵素を含むsmall,dense LDLコレステロールの定量用キット。
【請求項５】
さらに非イオン性および／または陰イオン性界面活性剤を含む請求項４記載のsmall,dense LDLコレステロール定量用キット。
【請求項６】
ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体をリポ蛋白質のうちsmall,dense LDLに選択的に作用させる前に、small,dense LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールをsmall,dense LDLコレステロール定量反応系外に導くための試薬を含む請求項４または５に記載のsmall,dense LDLコレステロール定量用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動脈硬化の診断に重要なsmall,dense LDL中のコレステロール測定方法と測定試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
低密度リポ蛋白（LDL）は血液中におけるコレステロール運搬の主役であり、動脈硬化性疾患の危険因子であるが、LDLの中でも特に粒子サイズが小さく平均的なLDLより高比重な、small,dense LDLは動脈硬化惹起性が通常のLDLより数倍高くなることが知られている。small,dense LDLの増加は動脈硬化性疾患の主要な危険因子の１つであり、分別測定することは臨床上極めて重要である。
【０００３】
従来のsmall,dense LDL測定法は、超遠心法、電気泳動法、高速液体クロマトグラフィーを用いる方法などがあるが、この方法は高価な設備を必要とし、測定に非常に時間を要するため簡便ではない。
【０００４】
自動分析装置を用いてsmall,dense LDLを測定する方法としては、イオン強度の差により小粒子LDLを混濁または溶解させ吸光度の差により小粒子LDLを測定する方法（特開2003-28882号公報）がある。しかし、この方法では濁りによる吸光度差を測定しているため、特異性や精度が不十分であった。
【０００５】
また、small,dense LDL中のコレステロールや中性脂肪を、ポリアニオンと二価陽イオンからなる分離剤と自動分析装置対応の試薬の組み合わせて測定する方法（WO2004/053500）が知られている。この方法では、超遠心法や電気泳動法に比べ簡便にsmall,dense LDL中の脂質成分が測定でき、特異性や精度に優れているが、検体を前処理しLDLをsmall,dense LDLとそれ以外のLDLに分離する操作が必要であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2003-28882号公報
【特許文献２】WO2004/053500号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、検体の前処理操作をすることなしに、迅速かつ簡便な自動分析装置対応のsmall,dense LDLの分別測定法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは種々のリポ蛋白を含有する被検体試料中のコレステロールをコレステロールエステラーゼならびにコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼにて測定する際、あらかじめsmall,dense LDLとそれ以外のLDLに対する反応性が異なる界面活性剤を作用させることによりsmall,dense LDL中のコレステロールを選択的に測定することを検討し、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体がsmall,dense LDLに選択的に作用し、small,dense LDL中のコレステロールを測定できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の方法およびキットを提供する。
（１）  被検体試料にポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体の存在下にコレステロール測定用酵素を添加し、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体をリポ蛋白質のうちsmall,dense LDLに選択的に作用させ、生成したコレステロール量を測定することを特徴とするsmall,dense LDLコレステロールの定量方法。
（２）  さらに非イオン性および／または陰イオン性界面活性剤を添加することを特徴とする（１）の方法。
（３）  コレステロール測定用酵素がコレステロールエステラーゼならびにコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼからなることを特徴とする（１）または（２）の方法。
（４）  さらにホスホリパーゼおよび／またはリポプロテインリパーゼを添加することを特徴とする（１）〜（３）のいずれかの方法。
（５）  ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体をリポ蛋白質のうちsmall,dense LDLに選択的に作用させる前に、small,dense LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールをsmall,dense LDLコレステロール定量反応系外に導くことを特徴とする（１）〜（４）のいずれかの方法。
【００１０】
（６）  被検体試料にポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体の存在下でコレステロール測定用酵素を添加し、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体をリポ蛋白質のうちsmall,dense LDLに選択的に作用させ、生成したコレステロール量を測定するための、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体ならびにコレステロール測定用酵素を含むsmall,dense LDLコレステロールの定量用キット。
（７）  さらに非イオン性および／または陰イオン性界面活性剤を含む（６）のsmall,dense LDLコレステロール定量用キット。
（８）  コレステロール測定用酵素がコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼからなる（６）または（７）のsmall,dense LDLコレステロール定量用キット。
（９）  さらにホスホリパーゼおよび／またはリポプロテインリパーゼを含む（６）〜（８）のいずれかのsmall,dense LDLコレステロール定量用キット。
（１０）  ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体をリポ蛋白質のうちsmall,dense LDLに選択的に作用させる前に、small,dense LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールをsmall,dense LDLコレステロール定量反応系外に導くための試薬を含む（６）〜（９）のいずれかのsmall,dense LDLコレステロール定量用キット。
【００１１】
（１１）  被検体試料中のsmall,dense LDLコレステロールを定量する方法において、被検体試料にポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体の存在下にコレステロール測定用酵素を添加し、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体をリポ蛋白質のうちsmall,dense LDLに選択的に作用させ、生成したコレステロールを測定する工程からなる方法。
（１２）  small,dense LDLコレステロールを含む被検体試料中のsmall,dense LDLコレステロールを定量するための、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体を含むsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬。
（１３）  small,dense LDLコレステロールを含む被検体試料中のsmall,dense LDLコレステロールを定量するための、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体のsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬としての使用。
【発明の効果】
【００１２】
ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体をリポ蛋白質を含む被検体試料に添加することにより、リポ蛋白中のsmall,dense LDLをフィルターや遠心分離を用いた分離操作をすることなく、直接、選択的に測定することができる。
【００１３】
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2005-252091号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】リポプロテインリパーゼを添加した場合の、Large LDLおよびsmall,dense LDLに対する反応性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明について詳細に説明する。
リポタンパク質は大きくVLDL、LDLおよびHDLの分画に分けられ、LDLはさらにsmall,dense LDLとそれ以外の亜分画に分けられる。small,dense LDLを小粒子LDL 、SLDL(small LDL)、dense LDLと呼ぶこともあり、またそれ以外のLDLをLLDL(large LDL)、Light LDLと呼ぶこともある。これらの分画および亜分画は、粒子サイズまたは比重により区別できる。その粒子サイズの直径は、報告者により異なるがVLDLが30nm〜80nm（30nm〜75nm）で、LDLが22nm〜28nm(19nm〜30nm)、HDLが直径７〜10nmである。比重は、VLDLが1.006以下、LDLが1.019〜1.063、HDLが1.063〜1.21である。LDL粒子直径はグラジエントゲル電気泳動（GGE）(JAMA, 260, p.1917-21, 1988)、NMR（HANDBOOK OF LIPOPROTEIN TESTING 2nd Edition、 Nader Rifai他編、p.609-623、AACC PRESS：TheFats of Life Summer 2002、LVDD 15 YEAR ANNIVERSARY ISSUE、Volume AVI No.3、p.15-16）により測定でき、比重は超遠心分離による分析(Atherosclerosis, 106, p.241-253, 1994: Atherosclerosis, 83, p.59, 1990)に基づいて決定できる。
【００１６】
本発明の方法で測定しようとするsmall,dense LDLは、一般的にはLDL画分のうち直径が約22.0〜約25.5nmの亜分画、比重1.040〜1.063の亜分画を指す。LDLを大きさにより亜分画に分けているのは、LDLのうち粒子径が小さいものが動脈硬化惹起性が高く、LDLの中でもより悪性度が高いので、LDLの中でも小さいものを分別測定する必要があったからである。LDL内で直径分布や比重分布は連続しており、比重がどの程度以上のものが特に悪性度が高いというように明確に区別できるものではない。従って、上記の比重1.040〜1.063という値もsmall,dense LDLの特性として確立したものではなく、広く用いられており確立した値といえるLDLの比重範囲1.019〜1.063を中央点で分けたものである。例えば、別の報告では1.044〜1.060に分画される（Atherosclerosis:106 241-253 1994）。small,dense LDLの比重をどの範囲にするかは、報告者により若干の違いがあるが、いずれもその範囲で分別した場合のsmall,dense LDLの存在が臨床的な悪性度と関連している。
【００１７】
本発明において、small,dense LDLという場合、LDLのうち比重が小さいものであって、臨床的に動脈硬化惹起性がそれ以外のLDLよりも大きいもの、好ましくはLDLの比重範囲のうち中央点より上の比重範囲に属するもの、さらに好ましくは比重1.040〜1.063の範囲に属するLDLをいう。
【００１８】
本発明の方法は通常、自動分析装置内で行われる。本発明の方法ではLarge LDLコレステロールから分離、差別化してsmall,dense LDLコレステロールを測定するために、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼ等のコレステロール測定用酵素をsmall,dense LDLに選択的に作用させる界面活性剤の存在下で行う。また、コレステロール測定用酵素をsmall,dense LDL以外のリポ蛋白に作用するのを抑制する界面活性剤の存在下で行うこともできる。コレステロール測定用酵素をsmall,dense LDLに選択的に作用させることは、見方を変えればコレステロール測定用酵素をsmall,dense LDL以外のリポ蛋白への作用を抑制することとも言えるので、結果的に同じことを意味し、両目的を達成する界面活性剤は同一のものを指す場合がありうる。前記界面活性剤はコレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼまたはコレステロールデヒドロゲナーゼ等のコレステロール測定用酵素の活性を上昇させる界面活性剤と共に用いても良いし、単独で用いることができる。
【００１９】
上記small,dense LDLに対するコレステロール測定用酵素を選択的に作用させる界面活性剤としてはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体が挙げられる。ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体はsmall,dense LDLに選択的に作用し、結果的にコレステロールエステラーゼならびにコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼのsmall,dense LDL以外のリポ蛋白への作用を抑制する。ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体を被検体試料中のsmall,dense LDLに選択的に作用させることでsmall,dense LDL中のコレステロールが選択的に遊離し、次いでコレステロール測定用酵素をsmall,dense LDL中のコレステロールに反応させる。「ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体をリポ蛋白質の中のsmall,dense LDLに選択的に作用させる」とは、リポ蛋白質の中のsmall,dense LDL中のコレステロールをポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体の作用により選択的に遊離させることをいう。「small,dense LDLに選択的に作用させる」とは、リポ蛋白質の中のsmall,dense LDLに主に作用させること、好ましくはsmall,dense LDLのみに作用させることをいう。遊離したコレステロールにコレステロール測定用酵素を反応させることにより、コレステロールを測定することができる。
【００２０】
ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体としては、例えば一般式（I）および（II）および（III）
RO-(C2H4O)a-(C3H6O)b-(C2H4O)c-H（I）
RO-(C3H6O)d-(C2H4O)e-(C3H6O)f-H（II）
［式中a、b、およびcならびにd、e、およびfは整数を表し、Rは水素原子または直鎖、分岐のアルキルを表す］
0005548733.tif 000002
【００２１】
［式中x、yは整数を表す］
で表される化合物が挙げられる。（I）においてポリオキシプロピレンの数（式中のb）は1〜200が好ましく、20〜150がより好ましく、30〜100が特に好ましい。ポリオキシエチレンの数（式中のaおよびc）はそれぞれ1〜200が好ましく、1〜100がより好ましく、1〜60が特に好ましい。Rで示される直鎖または分岐のアルキル基としては炭素数1〜30が好ましく、炭素数2〜25が特に好ましい。（II）においてポリオキシプロピレンの数（式中のe）は20〜100が好ましく、ポリオキシエチレンの数（式中のdおよびf）はそれぞれ1〜60が好ましい。（III）においてポリオキシプロピレンの数（式中のy）は2〜30が好ましい。ポリオキシエチレンの数（式中のx）は1〜50が好ましく、1〜30が特に好ましい。
【００２２】
ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体の濃度としては0.1〜10g／Lが好ましく、0.3〜5g／Lがより好ましく、0.5〜3g／Lが特に好ましい。あるいは、0.01〜1％（w/w)が好ましく、0.03〜0.5％(w/w)がより好ましく、0.05〜0.3％（w/w)が特に好ましい。
【００２３】
ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体は、疎水基の分子量およびエチレンオキシド付加量を変えることにより、作用するリポ蛋白の比重が変化し得る。例えば、疎水基分子量が950〜3850であり、総エチレンオキシド％が10〜80％のポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体は好適にsmall,dense LDLに作用し得る。
【００２４】
ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体がsmall,dense LDL以外のLDLに作用する場合は、あらかじめポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体が作用するLDLをsmall,dense LDLコレステロール定量反応系外に導けばよい。
【００２５】
ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体またはその誘導体として、例えばプルロニック17R-4、プルロニックL-64、プルロニックPE3100、プルロニックP-85、プルロニックF-88、プルロニックP-103、プルロニックF-127等のプルロニック（登録商標）系界面活性剤（BASF社、旭電化工業株式会社）などが挙げられる。
【００２６】
また、上記界面活性剤にさらに非イオン界面活性剤および陰イオン界面活性剤を加えることができる。これらの界面活性剤は、コレステロールエステラーゼならびにコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼの活性を上昇させる。
【００２７】
前記非イオン界面活性剤および陰イオン界面活性剤の親水性親油性バランス（HLB）は１２〜１４が好ましい。
【００２８】
非イオン性界面活性剤としてはポリオキシエチレン誘導体等が挙げられ、特にポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルが好ましく、アルキル基としては炭素数8以上が好ましく、例えばオクチル基、ノニル基が好ましい。具体的には、エマルゲン（登録商標）909、エマルゲン100シリーズ、エマルゲン210P、220、306P、320P、404、408、409P、420、430、705、707、709、1108、1118S-70、1135S-70、1150S-70、4085、2020G-HA、2025G、PI-20T（花王株式会社）、パーソフトNK60（日本油脂株式会社）などのポリオキシエチレンアルキルエーテル、エマルゲンLS-106、LS-110、LS-114、MS-110（花王株式会社）等のポリオキシエチレンアルキレンアルキルエーテル、ノニオンHS-208、HS-210、NS-208.5、NS210（日本油脂株式会社）などのポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、その他ノニオンL-4、O-6（日本油脂株式会社）などのポリオキシエチレン誘導体が挙げられる。その中でも、エマルゲン909、109P、409P、709P、PI-20T、LS110（花王株式会社）、パーソフトNK60、ノニオンHS-208、HS-210、L-4、NS-208.5、NS-210、O-6（日本油脂株式会社）が好ましい。
【００２９】
ポリオキシエチレン誘導体の濃度は0.1〜50g／Lが好ましく、0.5〜10g／Lが特に好ましい。あるいは、0.01〜5％(w/w)が好ましく、0.05〜1％(w/w)が特に好ましい。
【００３０】
陰イオン性界面活性剤としてはアルキル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム、アルキルベンゼンスルフォン酸ナトリウムが好ましい。具体的には、トラックスH-45（日本油脂株式会社）、ポリオキシエチレンスルホコハク酸ラウリル２ナトリウムであるサクシニード３LN（日本油脂株式会社）が好ましい。
【００３１】
陰イオン性界面活性剤の濃度は0.1〜20g／Lが好ましく、0.5〜10g／Lが特に好ましい。あるいは、0.01〜2％(w/w)が好ましく、0.05〜1％(w/w)が特に好ましい。
【００３２】
本発明のsmall,dense LDLコレステロールの測定は水溶液中、好ましくは緩衝液中で行われる。緩衝液に使用する緩衝剤としてはトリス、トリエタノールアミン、グットの緩衝液等のアミンを含む緩衝液が好ましく、特にグッドの緩衝液としてはBis-Tris、PIPES、BES、MOPSO、HEPESおよびPOPSOが好ましい。緩衝液のpHは5〜9が好ましく、緩衝液の濃度は10〜500mmol/Lが好ましい。
【００３３】
リポ蛋白質に界面活性剤を作用させることにより、リポ蛋白質中のコレステロールが遊離し、該コレステロールに酵素（コレステロールエステラーゼならびにコレステロールオキシダーゼもしくはコレステロールデヒドロゲナーゼ）を反応させることによりコレステロールが分解、酸化される。
【００３４】
本発明におけるコレステロールエステラーゼとしてはコレステロールエステルを加水分解する酵素であれば特に限定されず、動物または微生物由来のコレステロールエステラーゼを用いることができる。コレステロールエステラーゼの濃度は0.01〜50U/mLが好ましく、0.1〜10U/mLが特に好ましい。
【００３５】
コレステロールオキシダーゼとしては、コレステロールを酸化する能力を有する酵素であれば特に限定されず、動物または微生物由来のコレステロールオキシダーゼを用いることができる。コレステロールオキシダーゼの濃度は0.01〜20U/mLが好ましく、0.1〜1U/mLが特に好ましい。
【００３６】
コレステロールデヒドロゲナーゼとしてはコレステロールを酸化して酸化型補酵素を還元する能力を有する酵素であれば特に限定されず、動物または微生物由来のコレステロールデヒドロゲナーゼを用いることができる。コレステロールデヒドロゲナーゼの濃度は0.01〜200U/mLが好ましく、0.1〜100U/mLが特に好ましい。
【００３７】
本発明ではsmall,dense LDLに対する反応選択性を高めるためにさらにホスホリパーゼおよび／またはリポプロテインリパーゼを用いることができる。
【００３８】
ホスホリパーゼとしてはホスホリパーゼA2、ホスホリパーゼC、ホスホリパーゼD、リゾホスホリパーゼ等を用いることができ、使用濃度は0.01〜10U/mLが好ましく、0.01〜5U/mLがさらに好ましく、0.01〜1U/mLが特に好ましい。
【００３９】
リポプロテインリパーゼはリポタンパク質を分解する能力を有する酵素であれば特に限定されず動物または微生物由来のリポプロテインリパーゼを用いることができる。リポプロテインリパーゼの使用濃度は0.01〜10U/mLが好ましく、0.01〜5U/mLがさらに好ましく、0.01〜1U/mLが特に好ましい。
【００４０】
コレステロール測定用酵素としてコレステロールエステラーゼおよびコレステロールオキシダーゼを用いる場合、酵素反応により過酸化水素が生成する。発生した過酸化水素はペルオキシダーゼの存在下で水素供与体と水素受容体とのカップリング反応により形成される色素（有色キノン）により波長400〜700nmで測定することにより定量することができる。
【００４１】
水素供与体としてはアニリン誘導体が好ましく、アニリン誘導体としてはN−エチル−N−（2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル）−3−メチルアニリン（TOOS）、N−エチル−N−（2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル）−3，5−ジメチルアニリン（MAOS）、N−エチル−N−（3−スルホプロピル）−3−メチルアニリン（TOPS）、N−（2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル）−3，5−ジメトキシアニリン（HDAOS）、N−（3−スルホプロピル）アニリン（HALPS）、N−（3−スルホプロピル）−3−メトキシ−5−アニリン（HMMPS）等があげられる。水素供与体の使用濃度は最終濃度で0.1〜1.5mmol/Lが好ましい。
【００４２】
水素受容体としては4−アミノアンチピリンやメチルベンゾチアゾロンヒドラゾン等を用いることができる。
【００４３】
コレステロール測定用酵素としてコレステロールエステラーゼおよびコレステロールデヒドロゲナーゼを用いる場合、酵素反応によりNAD（P）からNAD（P）Hが発生する。発生したNAD（P）Hは330〜400nmでの吸光度を測定することにより定量することができる。
【００４４】
本発明ではsmall,dense LDLに対する反応選択性をさらに高めるために被検体試料中のsmall,dense LDL以外のリポ蛋白であるHDLやVLDL、Large LDLなどに含まれるコレステロールをsmall,dense LDLコレステロール定量反応系外に導いてもよい。small,dense LDLコレステロール定量反応系外に導くとは、HDLやVLDL、Large LDLなどに含まれるコレステロールがsmall,dense LDLコレステロールの定量に影響を及ぼさないように、HDL、VLDL、Large LDLなどに含まれるコレステロールを消去、凝集させたり、後の工程で反応しないよう阻害したりする等のことを言う。
【００４５】
消去とは被検体試料中の物質を分解し、その分解物が次の工程において検出されないようにすることを意味する。この場合、small,dense LDL以外に作用する界面活性剤としてHDL値が13以上15以下のポリオキシエチレン誘導体が挙げられ、具体例としては、ポリオキシエチレンラウリルエーテル、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリオキシエチレン高級アルコールエーテル、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンベンジルフェニルエーテル等でHLB値が13以上15以下の化合物がある。上記界面活性剤の濃度は、0.1〜10g/L程度が好ましく、さらに好ましくは0.3〜5.0g/L程度である。あるいは、0.01〜1％(w/w)程度が好ましく、さらに好ましくは0.03〜0.5％(w/w)程度である。
【００４６】
この場合、small,dense LDL以外のリポ蛋白中コレステロールの消去には上記界面活性剤の他、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオキシダーゼを作用させ発生した過酸化水素を、カタラーゼを用いて水と酸素に分解する方法、およびペルオキシダーゼを用いて水素供与体と過酸化水素を反応させ無色キノンに転化する方法を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００４７】
本発明にはイオン強度調整剤として1価の陽イオンおよび／または2価の陽イオンおよびその塩を用いることができる。イオン強度調整剤を添加することにより、small,dense LDLが分離しやすくなる。具体的には塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化マンガン、塩化カルシウム、塩化リチウム、塩化アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸カリウム、硫酸リチウム、硫酸アンモニウム、酢酸マグネシウム等を用いることができる。濃度は0〜100mmol／Lで使用される。
【００４８】
反応温度は2℃〜45℃で行うことが好ましく、25℃〜40℃で行うことがさらに好ましい。
反応時間は1〜30分間で行うことが好ましく、3〜15分で行うことがさらに好ましい。
【００４９】
本発明の被検体試料として血清、血漿を使用することができるが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
凝集とは、被検体試料中の物質を凝集させる凝集剤や、被検体試料中の物質に対する抗体等を用いその凝集物が次の工程において検出されないようにすることを意味する。ここで凝集剤とは、化学反応によって凝集を惹起させるものであり、また抗体とは、特定のリポ蛋白分画に対する抗体であって、免疫凝集反応を生じさせるものである。例えば反応液には必要に応じてリポ蛋白凝集剤を含有させることができる。リポ蛋白凝集剤としてはリンタングステン酸、ヘパリン、デキストラン硫酸などのポリアニオンやその塩、およびマグネシウム、マンガン、カルシウム等の2価陽イオンが挙げられる。
【００５１】
本発明で用いる自動分析装置として、例えば、TBA-120FR・200FR(東芝)、JCA-BM1250・1650・2250（日本電子）、HITACHI7180・7700（日立）、AU2700（OLYMPUS）等が挙げられる。
【００５２】
本発明の方法においては、第１工程において被検体試料にポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体ならびにコレステロール測定用酵素を添加し、small,dense LDL中のコレステロールを遊離、分解し、第２工程において、コレステロールの分解物を定量する。ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体はsmall,dense LDLへの選択性が高いため、上記工程により、small,dence LDLを選択的に定量することができる。第１工程の前に、被検体試料中のsmall,dense LDL以外のリポ蛋白であるHDLやVLDL、Large LDLなどに含まれるコレステロールをsmall,dense LDLコレステロール定量反応系外に導く工程を含んでいてもよい。small,dense LDLコレステロール定量反応系外に導く工程とは、HDLやVLDL、Large LDLなどに含まれるコレステロールがsmall,dense LDLコレステロールの定量に影響を及ぼさないように、HDL、VLDL、Large LDLなどに含まれるコレステロールを消去、凝集させたり、後の工程で反応しないよう阻害したりする等の工程のことである。
【００５３】
第１工程の前の被検体試料中のsmall,dense LDL以外のリポ蛋白であるHDLやVLDL、Large LDLなどに含まれるコレステロールをsmall,dense LDLコレステロール定量反応系外に導く工程においては、例えば、コレステロールエステラーゼやコレステロールオキシダーゼ等のコレステロール測定用酵素を添加し、small,dense LDL以外のリポ蛋白であるHDLやVLDL、Large LDLなどに含まれるコレステロールに作用させ、発生した過酸化水素をカタラーゼにより分解することにより、small,dense LDL以外のリポ蛋白であるHDLやVLDL、Large LDLなどに含まれるコレステロールをsmall,dense LDLコレステロール定量反応系外に導くことができる。その後、系にポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体を、必要に応じて界面活性剤と共に添加すればよい。系中のコレステロール測定用酵素、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体、あるいはさらに界面活性剤の作用で、small,dense LDLコレステロールから過酸化水素が発生し、該過酸化水素を定量すればよい。
【００５４】
本発明の測定方法を実施するに当たり、用いる試薬を複数の試薬組成物に分けてもよい。本発明においては、試薬としてはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体、コレステロールエステラーゼやコレステロールオキシダーゼ等のコレステロール測定用酵素、界面活性剤、過酸化水素を分解するカタラーゼ、過酸化水素からカップリング反応により色素を形成させるためのペルオキシダーゼ、水素供与体、緩衝液等が用いられる。これらの試薬の各試薬組成物への振り分けは、試薬の安定性等を考慮して適宜分配される。例えば、試薬を第１試薬組成物と第２試薬組成物の２つに分け、第１試薬組成物にコレステロールエステラーゼやコレステロールオキシダーゼ等のコレステロール測定用酵素等を含ませ、第２試薬組成物にポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体、コレステロール測定用酵素の活性を上昇させるための界面活性剤等が含ませることができる。第２試薬組成物には、さらにホスホリパーゼ又はリポプロテインリパーゼを含ませてもよい。このような２つの試薬組成物を用いる場合、被検体試料に第１試薬組成物を添加し、１〜10分間、好ましくは５分間程度反応させたのち、第２試薬組成物を添加し、さらに１〜10分間、好ましくは５分間程度反応させ、形成された色素を定量すればよい。
【００５５】
また、あらかじめsmall,dense LDL以外のリポ蛋白であるHDLやVLDL、Large LDLなどに含まれるコレステロールを消失させた被検体試料を用いて、本発明の上記第１工程及び第２工程を実施してもよい。例えば、被検体から遠心分離によりsmall, dense LDL分画を分離し、測定してもよい。
【００５６】
本発明は、small,dense LDLコレステロールを含む被検体試料中のsmall,dense LDLコレステロールを定量するための、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体を含むsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬をも包含する。
【００５７】
本発明は、small,dense LDLコレステロールの定量用キットをも包含する。該キットは、少なくともポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体もしくはその誘導体を含む。該キットは、さらにコレステロール測定用酵素を含んでいてもよい。該キットは、さらに非イオン性および／または陰イオン性界面活性剤を含んでいてもよい。該キットは、さらに、small,dense LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールをsmall,dense LDLコレステロール定量反応系外に導くための試薬を含んでいてもよい。small,dense LDLコレステロール定量反応系外に導くための試薬は、上記の、small,dense LDL以外のリポ蛋白中のコレステロールを消去、凝集、阻害するための試薬である。
【００５８】
本発明は、さらにsmall,dense LDLコレステロールを含む被検体試料中のsmall,dense LDLコレステロールを定量するための、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体のsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬としての使用をも包含する。
【実施例】
【００５９】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【００６０】
実施例１
第２試薬組成物中に各種ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体を用いた以下の試薬組成物を調製した。
第１試薬組成物
PIPES緩衝液，pH7.0                                50mmol/L
コレステロールエステラーゼ                        0.6U/mL
コレステロールオキシダーゼ                        0.5U/mL
カタラーゼ                                        600U/mL
牛血清アルブミン                                  0.5%
TOOS                                              2.0mmol/L
第２試薬組成物
PIPES緩衝液，pH7.0                                50mmol/L
ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体  0.3%
４−アミノアンチピリン                            4.0mmol/L
ペルオキシダーゼ                                  4.0単位/mL
アジ化ナトリウム                                  0.05%
被検体試料としてヒト血清30例を使用した。
【００６１】
血清試料4μLに第１試薬組成物300μLを加え、37℃で5分間反応させた後に、第２試薬組成物100μLを加え5分間反応させ、600nmにおける吸光度を測定した。
【００６２】
デンカ生研社製のsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬キットsd LDL-C「生研」を比較対照として用いてsmall,dense LDLコレステロール濃度を一次回帰分析により比較した。その結果を表１に示す。表１は、各種ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体を用いた本発明品とsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬キットsd LDL-C「生研」との相関係数一覧を示す表である。
【００６３】
表１に示すように、各種ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体を含む試薬組成物を用いた場合の測定値はsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬キットsd LDL-C「生研」を用いた場合の測定値と良好な相関性を示した。これは、本発明の方法によりsmall,dense LDLコレステロールを精度よく測定できることを示している。
【００６４】
【表１】
0005548733.tif 000003
【００６５】
実施例２
実施例１の第２試薬組成物中に、更に非イオン性界面活性剤を添加した以下の試薬組成物を調製した。
第１試薬組成物
PIPES緩衝液，pH7.0                                50mmol/L
コレステロールエステラーゼ                        0.6U/mL
コレステロールオキシダーゼ                        0.5U/mL
カタラーゼ                                        600U/mL
牛血清アルブミン                                  0.5%
TOOS                                              2.0mmol/L
第２試薬組成物
PIPES緩衝液，pH7.0                                50mmol/L
ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体  0.3%
ポリオキシエチレンノニルフェノールエーテル
エマルゲン909     [花王株式会社社製]                    1%
４−アミノアンチピリン                            4.0mmol/L
ペルオキシダーゼ                                  4.0単位/mL
アジ化ナトリウム                                  0.05%
【００６６】
超遠心法により分離したコレステロール含有量100mg/dLのsmall,dense LDL分画および同含有量100mg/dLのLarge LDL分画、各4μLに第１試薬組成物300μLを加え、37℃で5分間反応させた後に、第２試薬組成物100μLを加え5分間反応させ、600nmにおける吸光度を測定した。
【００６７】
その結果、small,dense LDL分画のうち大部分が反応して測定されたのに対し、Large LDL分画は67%のみしか測定されなかった。つまり、試薬組成物中に非イオン性界面活性剤を加えることにより、small,dense LDLの反応性が、加えない場合に比べて増加する。
【００６８】
また、非イオン性界面活性剤である109P、409P、709P、PI-20T、LS110（花王株式会社）、パーソフトNK60、ノニオンHS-208、210、L-4、NS-208.5、210、O-6（日本油脂株式会社）をエマルゲン909の代わりに用いて同様の実験を行い、試薬組成物中に非イオン性界面活性剤を加えることにより、small,dense LDLの反応性が、加えない場合に比べて増加することも確認できた。
【００６９】
従って、非イオン性界面活性剤を添加することによりsmall,dense LDL中のコレステロールを効率的に測定することができる。
【００７０】
実施例３
被検体試料としてのヒト血清30例に対し、実施例２で使用した試薬組成物を用いて測定を行った。
【００７１】
血清試料4μLに第１試薬組成物300μLを加え、37℃で5分間反応させた後に、第２試薬組成物100μLを加え5分間反応させ、600nmにおける吸光度を測定した。
【００７２】
デンカ生研社製のsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬キットsd LDL-C「生研」を比較対照として用いてsmall,dense LDLコレステロール濃度を一次回帰分析により比較した。その結果を表２に示す。表２は、各種ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体と非イオン性界面活性剤を用いた本発明品とsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬キットsd LDL-C「生研」との相関係数一覧を示す表である。
【００７３】
表２に示すように、各種ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体と非イオン性界面活性剤を用いた場合の測定値はsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬キットsd LDL-C「生研」を用いた場合の測定値と良好な相関性を示した。また、実施例１の場合に比べ、相関係数が良好になっていることがわかる。これは、非イオン性界面活性剤を添加した本発明の方法によりsmall,dense LDLコレステロールを精度よく測定できることを示している。
【００７４】
【表２】
0005548733.tif 000004
【００７５】
実施例４
実施例１の第２試薬組成物中に、更に陰イオン性界面活性剤を添加した以下の試薬組成物を調製した。
第１試薬組成物
PIPES緩衝液，pH7.0                                50mmol/L
コレステロールエステラーゼ                        0.6U/mL
コレステロールオキシダーゼ                        0.5U/mL
カタラーゼ                                        600U/mL
牛血清アルブミン                                  0.5%
TOOS                                              2.0mmol/L
第２試薬組成物
PIPES緩衝液，pH7.0                                50mmol/L
ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体  0.3%
ポリオキシエチレンノニルフェノールエーテル
トラックスH-45                  [日本油脂株式会社製]                    1%
４−アミノアンチピリン                            4.0mmol/L
ペルオキシダーゼ                                  4.0単位/mL
アジ化ナトリウム                                  0.05%
【００７６】
超遠心法により分離したコレステロール含有量100mg/dLのsmall,dense LDL分画および同含有量100mg/dLのLarge LDL分画、各4μLに第１試薬組成物300μLを加え、37℃で5分間反応させた後に、第２試薬組成物100μLを加え5分間反応させ、600nmにおける吸光度を測定した。
【００７７】
その結果、small,dense LDL分画のうち大部分が反応して測定されたのに対し、Large LDL分画は69%のみしか測定されなかった。つまり、試薬組成物中に陰イオン性界面活性剤を加えることにより、small,dense LDLの反応性が、加えない場合に比べて増加する。
【００７８】
また、陰イオン性界面活性剤であるサクシニード3LN（日本油脂株式会社）をトラックスH-45の代わりに用いて同様の実験を行い、試薬組成物中に陰イオン性界面活性剤を加えることにより、small,dense LDLの反応性が、加えない場合に比べて増加することも確認できた。
【００７９】
従って、陰イオン性界面活性剤を添加することによりsmall,dense LDL中のコレステロールを効率的に測定することができる。
【００８０】
実施例５
被検体試料としてのヒト血清30例に対し、実施例４で使用した試薬組成物を用いて測定を行った。
【００８１】
血清試料4μLに第１試薬組成物300μLを加え、37℃で5分間反応させた後に、第２試薬組成物100μLを加え5分間反応させ、600nmにおける吸光度を測定した。
【００８２】
デンカ生研社製のsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬キットsd LDL-C「生研」を比較対照として用いてsmall,dense LDLコレステロール濃度を一次回帰分析により比較した。その結果を表３に示す。表３は、各種ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体と陰イオン性界面活性剤を用いた本発明品とsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬キットsd LDL-C「生研」との相関係数一覧を示す表である。
【００８３】
表３に示すように、各種ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体と陰イオン性界面活性剤を用いた場合の測定値はsmall,dense LDLコレステロール測定用試薬キットsd LDL-C「生研」を用いた場合の測定値と良好な相関性を示した。また、実施例１の場合に比べ、相関係数が良好になっていることがわかる。これは、陰イオン性界面活性剤を添加した本発明の方法によりsmall,dense LDLコレステロールを精度よく測定できることを示している。
【００８４】
【表３】
0005548733.tif 000005
【００８５】
実施例６
実施例１の第２試薬組成物中に、更にリポプロテインリパーゼを各0、2、4、5U/mL添加した以下の試薬組成物を調製した。
第１試薬組成物
PIPES緩衝液，pH7.0                                50mmol/L
コレステロールエステラーゼ                               0.6U/mL
コレステロールオキシダーゼ                        0.5U/mL
カタラーゼ                                        600U/mL
牛血清アルブミン                                  0.5%
TOOS                                              2.0mmol/L
第２試薬組成物
PIPES緩衝液，pH7.0                                50mmol/L
ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレン共重合体
プルロニック17R-4またはプルロニックL-64［旭電化工業(株)社製］0.3%
４−アミノアンチピリン                            4.0mmol/L
ペルオキシダーゼ                                  4.0単位/mL
リポプロテインリパーゼ  LPL-311［東洋紡績(株)社製］0, 2, 4, 5U/mL
アジ化ナトリウム                                  0.05%
【００８６】
超遠心法により分離したコレステロール含有量100mg/dLのsmall,dense LDL分画、Large LDL分画、各4μLに第１試薬組成物300μLを加え、37℃で5分間反応させた後に、第２試薬組成物100μLを加え5分間反応させ、600nmにおける吸光度を測定した。
その結果を図１に示す。
【００８７】
図１に示すように、試薬組成物中にリポプロテインリパーゼを加えることにより、small,dense LDLの反応性がLarge LDL反応性に比べて著しく増加する。従って、リポプロテインリパーゼを添加することによりsmall,dense LDL中のコレステロールを効率的に測定することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
【図１】
0005548733.tif 000006