(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
［（Ｘ）ｎ−Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−（Ｘ）ｍ］ｋ−支持体    （Ｉ）
［式中、
−  各Ｘは独立に任意のアミノ酸を表わし；
−  ｎは０又は１であり；
−  ｍは０から３の間の整数であり；
−  ｋは少なくとも３の整数であり；
−  ΨはＬｙｓとＰｒｏの間のペプチドアミド結合に代わる式（−ＣＨ２Ｎ−）の還元された結合である］
の化合物であって、
前記式（Ｉ）の化合物の［（Ｘ）ｎ−Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−（Ｘ）ｍ］偽ペプチド単位におけるＬｙｓ残基が全てＬ立体配置又は全てＤ立体配置のいずれかである、化合物。
【請求項２】
ｎが０であり、ｍが０である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ｋが３から８の間である、請求項１又は２に記載の化合物。
【請求項４】
ｋが５又は６である、請求項１から３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
前記支持体が、少なくともｋ個のＬｙｓ残基を含む直鎖ペプチドである、請求項１から４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
前記直鎖支持ペプチドが、Lys-Lys-Lys-Gly-Pro-Lys-Glu-Lys-Gly-Cys （配列番号１）、Lys-Lys-Lys-Lys-Gly-Cys（配列番号２）、Lys-Lys-Lys-Lys-Gly-Pro- Lys-Lys-Lys-Lys-Gly-Ala（配列番号３）、Lys-Lys-Gly-Pro-Lys-Glu-Lys-AhxCONH2（配列番号４）、及びAc-Lys-Ala-Lys-Pro-Gly-Lys-Ala-Lys-Pro-Gly-Lys-Ala-Lys-Pro-Gly-CONH2（配列番号５）からなる群から選択される配列を有する、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
前記直鎖支持ペプチドがらせん構造を示す、請求項５に記載の化合物。
【請求項８】
前記らせん状の直鎖支持ペプチドが、少なくとも３のAib-Lys-Aib-Gly（配列番号６）又はLys-Aib-Gly（配列番号７）の単位を含む、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
前記らせん状の直鎖支持ペプチドが、３から８のAib-Lys-Aib-Gly（配列番号６）又はLys-Aib-Gly（配列番号７）の単位を含む、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
前記らせん状の直鎖支持ペプチドが、５又は６のAib-Lys-Aib-Gly（配列番号６）又はLys-Aib-Gly（配列番号７）の単位を含む、請求項８に記載の化合物。
【請求項１１】
前記らせん状の直鎖支持ペプチドが、Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly（配列番号８）、Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly（配列番号９）、Ac-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-CONH2（配列番号１０）、Ac-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-CONH2（配列番号１１）、Ac-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-CONH2（配列番号１２）、又はAc-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys- Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-CONH2（配列番号１３）からなる群から選択される配列からなる、請求項８に記載の化合物。
【請求項１２】
【化１Ａ】
0005548866.tif 000024
【化１Ｂ】
0005548866.tif 000025
【化１Ｃ】
0005548866.tif 000026
【化１Ｄ】
0005548866.tif 000027
からなる群から選択され、式（Ｉ）の［（Ｘ）ｎ−Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−（Ｘ）ｍ］単位におけるＬｙｓ残基が全てＬ立体配置又は全てＤ立体配置のいずれかである、請求項１に記載の化合物。
【請求項１３】
ａ）式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）： 
Ｌ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ  （ＩＩ）
Ｄ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ  （ＩＩＩ）
のジペプチドを調製する工程、
ｂ）式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の前記ジペプチドをボレートＢＨ３と反応させて、式（ＩＶ）又は（Ｖ）： 
Ｌ−Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏ  （ＩＶ）
Ｄ−Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏ  （Ｖ）
のジペプチドを得る工程、
ｃ）固相に結合させた、少なくともｋ個のリジン残基を有する直鎖支持ペプチドを提供する工程、
ｄ）Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ方法論を使用する固相合成によって、（Ｘ）ｍ残基、Ａｒｇ残基、Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏジペプチド、及び（Ｘ）ｎ残基を支持ペプチドに連続的にカップリングさせる工程
を含む、請求項５に記載の化合物の製造方法。
【請求項１４】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の化合物及び製薬学的許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
癌又は炎症性疾患を治療するための、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
創傷治癒を改善するための、請求項１４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、既知の立体異性体の複雑な混合物と比較して改善した抗癌活性を示す、新規の光学的に純粋な化合物に関する。そのような化合物は、式（Ｉ）:
［（Ｘ）ｎ−Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−（Ｘ）ｍ］ｋ−支持体  （Ｉ）
［式中、各Ｘは任意のアミノ酸を独立に表し；ｎは０又は１であり；ｍは０から３の間の整数であり；ｋは少なくとも３の整数であり；ΨはＬｙｓとＰｒｏとの間のペプチドアミド結合に代わる式（−ＣＨ２Ｎ−）］の還元された結合である］のものであって、式（Ｉ）の前記化合物の［（Ｘ）ｎ−Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−（Ｘ）ｍ］という偽ペプチド単位中のＬｙｓ残基は、全てＬ立体配置又は全てＤ立体配置のいずれかである。そのような化合物を調製するための方法及びその治療的使用も提供する。
【背景技術】
【０００２】
細胞分裂又は有糸分裂は、組織の修復又は再生及び死細胞の置換をするために、細胞の複製を可能にするプロセスである。癌細胞では、このプロセスの制御に問題があり、そのため、細胞が無秩序に分裂し、腫瘍を生じさせる。かくして、癌の発生を予防するための効果的な治療経路のひとつは、抗有糸分裂特性を有する分子を使用して癌細胞の分裂を妨げることからなる。
【０００３】
加えて、全ての腫瘍は、増殖するために栄養及び酸素を必要とする。これらの要素は、血管新生として知られるメカニズムによってもたらされる腫瘍内血管によって提供される。事実、これらの血管が存在しない場合は、腫瘍細胞が細胞壊死プロセスを受け、腫瘍増殖が遅くなり、次いで、停止する。したがって、癌と闘う他の治療経路の例は、このメカニズムを調節する分子を妨害することによって血管新生プロセスを妨げることからなる。
【０００４】
したがって、腫瘍細胞増殖及び腫瘍における血管新生プロセスの双方を阻害することができる新規抗癌分子を得ることは非常に有用である。
【０００５】
さらに、現在の抗癌剤の大半は真に腫瘍細胞に特異的であるわけではなく、そのため、健康な細胞も標的とし、かくして、多数かつ特に深刻な副作用を生じさせる。
【０００６】
パクリタキセルなどの従来の抗癌剤に関連するさらなる他の問題は、これらの分子は高度に疎水性である場合が多く、このことは複雑かつ高価な医薬製剤を開発して、許容できるインビボバイオアベイラビリティーを達成することが必要とする。インビボバイオアベイラビリティーの問題は、有効かつ特異的な態様で標的細胞に核酸を到達させることは非常に困難であるため、核酸を使用する治療の場合にとりわけ深刻である。
【０００７】
したがって、以下の特徴：
−  従来の化学療法又は放射線療法を使用することなく、単独で有効であることが可能であり、かつ、そのためこれらタイプの治療に関連する副作用を大きく制限することが可能であるような、腫瘍増殖及び血管新生に対する二重の阻害作用による、より改善された効力、
−  治療に対する抵抗を妨げる、血管新生因子に対する非常に広範な活性、
−  腫瘍細胞に対するより大きな特異性による、非常に少ない副作用、
−  工業規模に容易に適合可能な合成方法、
−  水性媒体中における良好な可溶性及びインビボ分解プロセスに対する改善された耐久性とともに、使用、特に、より良好なバイオアベイラビリティー及び／又はより長期のインビボ半減期を受けての使用、とりわけ、腫瘍細胞への直接的な特異性を受けての使用がより容易であること
を示す、新規抗癌分子を得ることが非常に有用であろう。
【０００８】
参照によって本明細書にその全体を取り込むＷＯ ２００７／１２５２１０（１）は、特に癌治療に有用である有望な化合物を開示している。
【０００９】
これらの化合物は、いくつかの有利な特性を示す：
−  それらは、腫瘍増殖及び血管新生に対する二重の効果を受けて単独で高い抗腫瘍効果を有することが可能であり、その効果は、タキソールなどの従来の化学療法分子と組み合わせることなく単独療法を予期することを可能にする；
−  それらは、特定のタイプの癌に特異性を有しないが、腫瘍細胞及び活性化された内皮細胞に対する広範な活性を有する；
−  それらは、健康な細胞よりも、腫瘍細胞及び活性化された内皮細胞への特異性のために、インビボ副作用が非常に少ない；
−  それらは、工業規模に容易に適合させることが可能な合成方法を有する；
−  それらは、特定の医薬形態を開発することを必要としない、十分なインビボバイオアベイラビリティーを有する。
【００１０】
かくして、これらの化合物は、新規の、より単純で、安く、かつ、有効な抗癌治療の開発に必要な多数の利点を兼ね備えているため、非常に興味深い。それらは、新規の、より単純で、安く、かつ、有効な抗炎症剤の開発のための良好な候補であるとも解された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＷＯ ２００７／１２５２１０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
しかしながら、現存する化合物の抗腫瘍効果を改善することは常に必要である。かくして、より高い効果を有するが、これらの有望な化合物の他の利点の全てを維持している、最適化された化合物を発見することが非常に有用であろう。
【００１３】
ＷＯ ２００７／１２５２１０の化合物は、少なくとも３つの偽ペプチドがカップリングした支持体からなる新規偽ペプチド化合物である。その様な化合物は、表面ヌクレオリンに結合し、抗癌（抗血管形成及び抗有糸分裂）及び抗炎症活性を示す。
【００１４】
これらの化合物は、支持体に接合した少なくとも３つの偽ペプチド単位と表面ヌクレオリンのＲＧＧドメインとの相互作用によって作用すると解される。
【００１５】
好ましい化合物は、少なくとも３つの［Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ］（ＫΨＰＲとも称される）単位がカップリングしたペプチド支持体、特にらせん構造を有する直鎖ペプチド支持体を有する。
【００１６】
本明細書において、従来の方法を、ＫΨＰＲ単位を調製するために、ＵＳ２００４０００２４５７Ａ１（２）及びＮｉｓｏｌｅ ｅｔ ａｌ（３）に開示されているように使用した。その様な従来の方法では、二級アミンを含有するプロリン誘導体が、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＣＨＯ（アルデヒド）と反応して、Ｌｙｓ残基の対掌性を部分的に損失（５から１０％）しながらエナミンを形成する。かくして、その様な従来の反応の最後に、反応混合物は、９０から９５％のＬ−Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ単位及び５から１０％のＤ−Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ単位を含む。
【００１７】
結果として、当該混合物を支持ペプチドのＬｙｓ残基の側鎖のεアミノ基にカップリングさせるために使用する際は、立体異性体の混合物が得られる。各Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ単位がＬ又はＤリジンのいずれかを有し得るため、得られる立体異性体の数は、ＫΨＰＲ単位の数とともに指数関数的に増大する。５又は６単位を有する好ましい化合物については、得られ得る立体異性体の数は３２及び６４の各々である。
【００１８】
同様に、ヒドリド試薬の存在下で固体支持体上に接合されたプロリン残基の二級アミンとのＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＣＨＯとの反応によって樹脂上で直接的に還元アミノ化を実施することによっても、立体異性体の混合物の生成が生じる。
【００１９】
従来の方法を使用すると、得られる偽ペプチド化合物は光学的に純粋ではなく、それとは対照的に、立体異性体の非常に複雑な混合物からなり、混合物の複雑さのために単離又は精製することができない。事実、前記混合物は、非常に多数の非常に近縁の立体異性体のからなり、かくして、通常の精製技術では各々を単離することができない。興味ある化合物の個々の立体異性体は、かくして、これらの化合物を調製するための従来の方法を使用して得られた複雑な混合物から精製することはできない。
【００２０】
本発明者は、光学的に純粋なＬ−Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏ又はＤ−Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏ化合物を得ることを可能にする、ＫΨＰジペプチドを調製する新規方法を使用した。当該方法は、従来の方法を使用してＰｈｅ−Ψ−Ｐｒｏジペプチドを調製する際のエピマー化効果及び純粋なＬ−Ｐｈｅ−Ψ−Ｐｒｏジペプチドの調製のための新規方法を開示するＣｕｓｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌによる文献（４）から採用した。
【００２１】
次いで、本発明者は、少なくとも３つのＬ−Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ又はＤ−Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ単位がカップリングした直鎖支持ペプチドからなる光学的に純粋な化合物を調製した。その様な光学的に純粋な化合物では、各種のＬｙｓ−Ψ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ単位のリジン残基が全てＬ立体配置又は全てＤ立体配置のいずれかである。
【００２２】
驚くべきことに、本発明者は、これらの光学的に純粋な化合物が、同一の化合物の立体異性体の混合物を含む組成物よりも顕著に高い抗癌効果を示すことを見出した。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明は、かくして、式（Ｉ）：
［（Ｘ）ｎ−Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−（Ｘ）ｍ］ｋ−支持体    （Ｉ）
［式中、
−  各Ｘは独立に任意のアミノ酸を表わし；
−  ｎは０又は１であり；
−  ｍは０から３の間の整数であり；
−  ｋは少なくとも３の整数であり；
−  ΨはＬｙｓとＰｒｏの間のペプチドアミド結合に代わる式（−ＣＨ２Ｎ−）の還元された結合である］
の化合物であって、
前記式（Ｉ）の化合物の［（Ｘ）ｎ−Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−（Ｘ）ｍ］偽ペプチド単位におけるＬｙｓ残基が全てＬ立体配置又は全てＤ立体配置のいずれかである、化合物に関する。
【００２４】
本発明において、用語「支持体」は、式（Ｉ）の少なくとも３つの偽ペプチド単位が接合することができる、任意の製薬学的に許容される、すなわち、内因性の毒性を有しない分子である。したがって、許容される支持体は、式（Ｉ）の少なくとも３つの偽ペプチド単位、好ましくは式（Ｉ）の３から８の偽ペプチド単位を接合させるのに十分な大きさのものである。その様な許容される支持体は、好ましくは、式（Ｉ）の少なくとも３、好ましくは３から８の偽ペプチド単位が一緒になって１つ又は複数のヌクレオリン分子のＲＧＧドメインに相互作用し得るのに十分なほど大きいものでもあるべきである。加えて、前記支持体は免疫原性であってはならない。
【００２５】
その様な支持体は、特に、直鎖ペプチド、直鎖又は環状であるペプトイド（Ｎ置換グリシンオリゴマー）、フォルダマー（コンパクトな特定の予測可能なコンフォメーションを溶液中でとる強い傾向があるオリゴマー又はポリマー）、直鎖ポリマー、又は球状デンドリマー（多官能性の中心コアの周囲に樹状プロセスによって結合しているポリマー／オリゴマーからなる巨大分子）、糖、又はナノ粒子から選択することができる。
【００２６】
有利には、前記支持体は直鎖ペプチドである。直鎖ペプチドの使用は、事実、前記支持体を容易に合成することを可能にする。
【００２７】
本発明における支持体として働く直鎖ペプチドは、有利には、２５％超の割合のリジンを含有することができる。より正確には、直鎖ペプチドを本発明の支持体として使用する際は、偽ペプチド単位が、好ましくは、リジンのε位に接合する。直鎖ペプチドを本発明の支持体として使用する際は、したがって、接合する偽ペプチド単位の数ほど多くのリジンを少なくとも含むことが好ましい。かくして、本発明に係る化合物の好ましい実施態様では、前記支持体は、少なくともｋ個のＬｙｓ残基を含む直鎖ペプチドである。
【００２８】
本発明において、偽ペプチド単位についての用語「接合」は、直接又は偽ペプチドと支持体との間のスペーサー化合物からなる中間物を介する共有結合による支持体への結合を意味する。これにより、１つの特定の実施態様では、偽ペプチド単位が、それらと支持体との間のスペーサー化合物なしで支持体に直接接合する。他の実施態様では、偽ペプチド単位が、スペーサーからなる中間物を介して支持体に接合する。許容されるスペーサーの例は、エチレングリコールのタイプの化合物、ピペラジン、アミノへキサン酸若しくはアラニンのタイプのアミノ酸を含む。
【００２９】
支持体が直鎖又は環状のペプチドであり、かつ、前記ペプチドに偽ペプチド単位が直接接合している場合は、前記ペプチドと偽ペプチド単位との間の結合は、好ましくは、ペプチド支持体のリジン残基でα又はε位のアミノ基で、好ましくは、リジンの側鎖上のε位のアミノ基で実施される。かくして、ペプチド支持体上の偽ペプチドの直接接合は、有利には、偽ペプチド単位のＣ末端位のアミノ酸の酸基であるＣＯＯＨと、リジン残基のアミノ基、好ましくは、リジンの（側鎖上の）ε位のアミノ基との間のアミド結合によって実施する。
【００３０】
適切な直鎖支持ペプチドは、Lys-Lys-Lys-Gly-Pro-Lys-Glu-Lys-Gly-Cys （配列番号１）、Lys-Lys-Lys-Lys-Gly-Cys（配列番号２）、Lys-Lys-Lys-Lys-Gly-Pro- Lys-Lys-Lys-Lys-Gly-Ala（配列番号３）、Lys-Lys-Gly-Pro-Lys-Glu-Lys-AhxCONH2（配列番号４）、及びAc-Lys-Ala-Lys-Pro-Gly-Lys-Ala-Lys-Pro-Gly-Lys-Ala-Lys-Pro-Gly-CONH2（配列番号５）からなる群から選択される配列を有するものを含み、上記配列中、「AhxCONH2」はヘキサンアミノ酸であり、CONH2は、酸基がアミド基であるAhxCONH2（（２Ｓ）−２−アミノヘキサンアミドを表わす）によって置換されたという事実を表わす。
【００３１】
直鎖ペプチドのうち、幾つかはらせん構造をとることが知られている。好ましい実施態様では、直鎖支持ペプチドは、そのようならせん構造をしめす。事実、らせん構造によって、ＫΨＰＲ偽ペプチド単位が非常に規則正しく提示され、表面ヌクレオリンの反復ＲＧＧドメインに対する結合に有用であり得る。
【００３２】
らせん構造を有するその様な直鎖支持ペプチドは、少なくとも３、好ましくは３から２０の間、好ましくは３から１５の間、より好ましくは３から１２の間、より好ましくは３から１０の間、さらに好ましくは３から８、最も好ましくは５又は６のAib-Lys-Aib-Gly（配列番号６）又はLys-Aib-Gly（配列番号７）［配列中、Ａｉｂはα−アミノイソ酪酸である］の配列の単位を含むペプチドを含む。
【００３３】
有利な実施態様では、前記らせん状直鎖支持ペプチドは、Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly（配列番号８）、Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly（配列番号９）、Ac-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-CONH2（配列番号１０）、Ac-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-CONH2（配列番号１１）、Ac-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-Aib-Lys-Aib-Gly-CONH2（配列番号１２）、又はAc-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys- Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-CONH2（配列番号１３）［これらの配列中、「Ａｃ」はアセチル基であり、任意の「アミノ酸−ＣＯＮＨ２」はＣＯＯＨ酸官能基のＯＨ基がＮＨ２基によって置換されており、かくして、酸ＣＯＯＨ官能基の代わりにアミドであるＣＯＮＨ２官能基を生じたアミノ酸を表わす］からなる群から選択される配列からなる。
【００３４】
本発明の化合物において、ヌクレオリンのＲＧＧドメインに対する結合に必須の偽ペプチド単位は、式（ＩＩ）：
Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ    （ＩＩ）
のサブユニットである。
【００３５】
それにもかかわらず、上述の幾つかのアミノ酸からなるこの必須のサブユニットの一方又は他方の末端の存在は、ヌクレオリンに対する結合を妨げるようなものではない。そのため、前記必須の式（ＩＩ）のサブユニットは、一方及び／又は他方の末端に、（Ｘ）ｎおよび（Ｘ）ｍ［ｎは０又は１であり、ｍは０から３の間の整数である］の各々によって式（Ｉ）において示されている０から３個の任意のアミノ酸を含むことができる。有利には、必須の式（ＩＩ）のサブユニットの一方及び／又は他方の末端に存在するアミノ酸の数は小さく、すなわち、ｎは有利には０であり、ｍは有利には０から２の間の整数であり、有利には０又は１であり、有利には０である。かくして、有利な実施態様では、ｎ及びｍは０である。
【００３６】
本発明において、用語「任意のアミノ酸」は、１つ又は複数の置換基の存在によって修飾され得る、任意の自然又は合成のアミノ酸である。より詳細には、アミノ酸なる用語は、αアミノ化されたアミノ酸であり、以下の一般式：
【化１】
0005548866.tif 000002
［式中、Ｒはアミノ酸の側鎖である］
を有する。したがって、本発明において、Ｒは、天然又は非天然のアミノ酸の側鎖である。用語「天然のアミノ酸」は、生物においてインビボで天然に認められる任意のアミノ酸を意味する。天然のアミノ酸は、したがって、翻訳の間にタンパク質に取り込まれる、ｍＲＮＡによってコードされているアミノ酸を含み、例えば尿素生産プロセスによってＬａ−アルギニンからアルギナーゼによって生成されるオルニチンなどの、代謝プロセスの産物又は副産物であるインビボで天然に認められる他のアミノ酸も含む。本発明では、したがって、使用されるアミノ酸は天然であるか又はそうでなくてよい。すなわち、天然アミノ酸は一般的にＬ立体配置を有するが、本発明によれば、アミノ酸はＬ又はＤ立体配置を有することができる。さらに、言うまでも無く、Ｒは天然のアミノ酸の側鎖に限定されることなく、自由に選択することができる。
【００３７】
本発明に係る化合物では、少なくとも３つの偽ペプチド単位が前記支持体に接合されている。事実、ＷＯ ２００７／１２５２１０における光学的に純粋でない化合物を用いて得られた結果は、これらの化合物の優れた抗腫瘍効果に関して、ヌクレオリンのＲＧＧドメインに対する結合の重要性を示している。ヌクレオリンのＲＧＧドメインに対する結合は、式（Ｉ）に組み込まれるものなどの幾つかの偽ペプチド単位の多価の提示によって得られる。特に、３未満の単位（ｋ＜３）では、ヌクレオリンに対する結合の効力がより低く、抗腫瘍効果がより劣る可能性があることが示されている。したがって、本発明に係る化合物は、前記支持体に接合した少なくとも３つの偽ペプチド単位を含み、ｋは３以上の整数である。本発明に係る化合物は、有利には、３から２０（３≦ｋ≦２０）、好ましくは３から１５、好ましくは３から１２、より好ましくは３から１０、さらに好ましくは３から８の、前記支持体に接合した偽ペプチド単位を提示する。さらに、ヌクレオリンに対する結合の効果がより大きい数の偽ペプチド単位ではヌクレオリンに対する結合効力が増大しないため、本発明者は、支持体に接合された５又は６の偽ペプチド単位（ｋ＝５）で活性が最適であることを示している。したがって、有利には、式（Ｉ）の化合物では、ｋは少なくとも３、好ましくは３から２０の間、好ましくは３から１５の間、好ましくは３から１２の間、より好ましくは３から１０の間、好ましくは３から８の間、さらに好ましくは４から７の間、４から６の間、４から５の間、又は５から６の間である。さらに有利には、式（Ｉ）の化合物ではｋは５又は６である。
【００３８】
通常のペプチド単位では、アミノ酸は式（−ＣＯＮＨ−）のアミド結合により結合する。そのような結合はプロテアーゼの作用に感受性を有する。用語「プロテアーゼ」は、「ペプチダーゼ」又は「タンパク質分解酵素」としても知られており、タンパク質の標準的なペプチド結合を切断する任意の酵素を意味する。このプロセスは、タンパク質分解的切断としても知られている。これは水分子の使用を伴い、このことが、プロテアーゼが加水分解酵素に分類される所以である。すなわち、プロテアーゼは、タンパク質のＮ末端の切断を実施するＮ−ペプチダーゼとして知られるプロテアーゼを含む。これらのプロテアーゼは、修飾されたペプチド結合を有しないペプチドのインビボ安定性に関して特に不都合である。そのため、式（Ｉ）の化合物の偽ペプチド単位が、ＬｙｓとＰｒｏとの間の式（−ＣＨ２Ｎ−）の還元されたΨを含み、ヌクレオリンに対する結合に必須の式Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＩＩ）のサブユニットの耐性が、これらのＮ−ペプチダーゼに対して顕著に増大される。これにより、式（Ｉ）の化合物のインビボ及びインビトロ半減期を顕著に増大させることができる。リジン残基とプロリン残基との間の還元されたΨ結合の存在は、かくして、非常に重要である。
【００３９】
偽ペプチド単位のＬｙｓとＰｒｏとの間のΨ結合のみが式（Ｉ）の化合物中に体系的に存在するが、前記偽ペプチド単位の他のペプチド結合が修飾されて、式（−ＣＯＮＨ−）の標準的なペプチド結合よりも、少なくとも１つのプロテアーゼに対する顕著な耐性を有する結合を得てよい。そのような結合は、式（−ＣＨ２Ｎ−）（又は、アミノ酸がプロリンとは違って、第一級アミノ基を示す場合は（−ＣＨ２ＮＨ−））のＹ結合を含むが、レトロインバルソ結合（−ＮＨＣＯ−）、メチレンオキシ結合（−ＣＨ２−Ｏ−）、チオメチレン（−ＣＨ２−Ｓ−）、カルバ結合（−ＣＨ２−ＣＨ２−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨＯＨ−ＣＨ２−）、（−Ｎ−Ｎ−）結合、Ｅ−アルケン結合、または（−ＣＨ＝ＣＨ−）結合などの他の修飾された結合も含む。追加の修飾された結合の存在は、式（Ｉ）の化合物のプロテアーゼに対する耐性をさらに増大させることを可能にする。それにもかかわらず、ＬｙｓとＰｒｏとの間の第一のΨ結合の存在に関連する増大は、既に十分に顕著であり、他の修飾された結合の追加は偽ペプチド単位の合成を複雑にするため、可能ではあるが好ましくはない。
【００４０】
事実、背景技術の欄で述べたように、ＷＯ ２００７／１２５２１０において使用されているＫΨＰＲの古典的な合成方法は、９０から９５％のＬ−Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ単位（すなわち、リジン残基が通常のＬ立体配置にある単位）及び５から１０％のＤ−Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ単位（すなわち、リジン残基がＤ立体配置にある単位）を含む、最終的に複雑な反応混合物をもたらす。結果として、支持ペプチドのＬｙｓ残基の側鎖のεアミノ基に対するカップリングのために当該混合物が使用される際に、分離不可能な立体異性体の複雑な混合物が得られる。
【００４１】
対照的に、本願に記載の新規方法を使用して、本発明者は、式（Ｉ）の化合物の［（Ｘ）ｎ−Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−（Ｘ）ｍ］偽ペプチド単位におけるＬｙｓ残基が全てＬ立体配置又はＤ立体配置のいずれかである、光学的に純粋な化合物を合成することができた。
【００４２】
上述のように、アミノ酸は、以下の一般構造：
【化２】
0005548866.tif 000003
［式中、Ｒはアミノ酸の側鎖である］
を有するαアミノ化アミノ酸として定義する。
【００４３】
側鎖ＲがＨであるグリシンの例外を除いて、全てのアミノ酸は不斉中心を有し、Ｌ及びＤと称される２つの異なるエナンチオマーとして存在する可能性がある。「Ｌ」及び「Ｄ」立体配置は、アミノ酸自体ではなく対応するグリセルアルデヒドの左旋性及び右旋性立体配置に関連している。アミノ酸がＬ又はＤ立体配置のいずれにあるか決定するために、対応するグリセルアルデヒドの絶対的な立体配置が分析される：グリセルアルデヒドのＬ体に対応する場合はアミノ酸がＬ−アミノ酸と称され、グリセルアルデヒドのＤ体に対応する場合はアミノ酸がＤ−アミノ酸と称される。特定のアミノ酸については、対応するグリセルアルデヒドは以下：
【化３】
0005548866.tif 000004
である。
【００４４】
特に、リジン残基については、Ｌ及びＤ立体配置は、以下：
【化４】
0005548866.tif 000005
のように表わすことができる。
【００４５】
天然のアミノ酸はＬ立体配置である。特に、［（Ｘ）ｎ−Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−（Ｘ）ｍ］偽ペプチド単位のリジン残基以外の、式（Ｉ）の化合物（支持体中又は［（Ｘ）ｎ−Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−（Ｘ）ｍ］偽ペプチド単位中）の全てのアミノ酸は、Ｌ立体配置である。
【００４６】
結果として、式（Ｉ）の化合物において、［（Ｘ）ｎ−Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−（Ｘ）ｍ］偽ペプチド単位は、全て同一の下式：
【化５】
0005548866.tif 000006
のである。
【００４７】
本発明に係る光学的に純粋な化合物の有利な実施態様では、前記化合物は、
【化６Ａ】
0005548866.tif 000007
【化６Ｂ】
0005548866.tif 000008
【化６Ｃ】
0005548866.tif 000009
【化６Ｄ】
0005548866.tif 000010
［式中、式（Ｉ）の［（Ｘ）ｎ−Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−（Ｘ）ｍ］単位中のＬｙｓ残基は、全てＬ立体配置であるか又は全てＤ立体配置のいずれかである］
からなる群から選択される。
【００４８】
有利には、前記化合物は、
【化７Ａ】
0005548866.tif 000011
【化７Ｂ】
0005548866.tif 000012
【化７Ｃ】
0005548866.tif 000013
［式中、式（Ｉ）の［（Ｘ）ｎ−Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−（Ｘ）ｍ］単位中のＬｙｓ残基は、全てＬ立体配置であるか又は全てＤ立体配置のいずれかである］
からなる群から選択される。
【００４９】
本発明に係る好ましい化合物は、
【化８】
0005548866.tif 000014
［式中、式（Ｉ）の［（Ｘ）ｎ−Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−（Ｘ）ｍ］単位中のＬｙｓ残基は、全てＬ立体配置であるか又は全てＤ立体配置のいずれかである］
の化合物である。さらに好ましい化合物は、下式：
【化９】
0005548866.tif 000015
［式中、式中、式（Ｉ）の［（Ｘ）ｎ−Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−（Ｘ）ｍ］単位中のＬｙｓ残基は、全てＬ立体配置である］
のＮｕｃａｎｔ ６Ｌと称される化合物である。
【００５０】
背景技術の欄で説明したように、本発明に係る光学的に純粋な化合物を調製し得るために、特定の従来のものではない方法を使用してＫΨＰジペプチドを調製する必要がある。
【００５１】
光学的に純粋な（Ｌ）Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏ又は（Ｄ）Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏジペプチドの合成は、以下のスキーム１Ａ及び１Ｂに示し、かつ、実施例１に詳細に説明しているように、通常のペプチドアミド結合を有する、純粋な（Ｌ）Ｌｙｓ−Ｐｒｏ又は（Ｄ）Ｌｙｓ−Ｐｒｏジペプチドの調製、次いで、ボレートＢＨ３を使用するアミノのアミドの還元を伴う。
【化１０】
0005548866.tif 000016
【化１１】
0005548866.tif 000017
【００５２】
本願で使用する化学的な略語は、
Ｂｏｃ  ブトキシカルボニル
Ｂｚｌ  ベンジル
ＤＣＨＡ  ジシクロヘキシルアミン
ＤＣＭ  ジクロロメタン
ＤＩＥＡ  ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ  ジメチルホルムアミド
ＨＯＢｔ  ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＩＰＥ  ジイソプロピルエーテル
ＮＭＲ  核磁気共鳴
ｔ−Ｂｕ  ｔｅｒｔ−ブチル
ＴＬＣ  薄層クロマトグラフィー
ＴＨＦ  テトラヒドロフラン、
１−エチル−３−［３−（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）−プロピル］カルボジイミド−
ＷＳＣＤ  Ｚ ベンジルオキシカルボニル
を含む。
【００５３】
光学的に純粋な（Ｌ）Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏ又は（Ｄ）Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏジペプチドを合成すると、それらを本発明に係る化合物の調製にしようすることができ、式（Ｉ）の［（Ｘ）ｎ−Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−（Ｘ）ｍ］単位中のＬｙｓ残基が、全てＬ立体配置であるか又は全てＤ立体配置のいずれかである。
【００５４】
特に、支持体がｋ個のリジン残基を有する直鎖ペプチドである際は、最終的な本発明に係る光学的に純粋な化合物が、固相ペプチド合成を使用し、Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ方法論にしたがって調製され得る。
【００５５】
かくして、本発明は、
ａ）式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）のジペプチドを調製する工程
Ｌ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ  （ＩＩ）
Ｄ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ  （ＩＩＩ）
ｂ）式（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の前記ジペプチドをボレートＢＨ３と反応させて、式（ＩＶ）又は（Ｖ）のジペプチドを得る工程
Ｌ−Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏ  （ＩＶ）
Ｄ−Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏ  （Ｖ）
ｃ）固相に結合させたｋ個のリジン残基を有する直鎖支持ペプチドを提供する工程
ｄ）（Ｘ）ｍ残基、Ａｒｇ残基、Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏジペプチド、及び（Ｘ）ｎ残基を支持ペプチドにＦｍｏｃ／ｔＢｕ方法論を使用する固相合成によって連続的にカップリングさせる工程
を含む、支持体がｋ個のＬｙｓ残基を有する本発明に係る化合物を調製するための方法にも関する。
【００５６】
そのような方法を実施するためのより具体的な反応条件は、実施例１．３に開示する。
【００５７】
前記単位が（Ｘ）ｍ及び（Ｘ）ｎ残基を含まない、すなわち、ｎ及びｍが０であり、前記単位がＫΨＰＲ単位である際に、そのような方法は特に実施され得る。
【００５８】
前記方法は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、又は配列番号４の配列のペプチドを含む、上記の好ましい直鎖支持ペプチド、及び３から８、好ましくは５又は６の配列番号６又は配列番号７の配列の単位を含むペプチドを含む、らせん構造を有する直鎖ペプチドを用いて特に使用されてよく、特にらせん状の直鎖支持ペプチドは、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、及び配列番号１３からなる群から選択される配列からなる。
【００５９】
本発明は、上述の本発明に係る任意の化合物を含む医薬、並びに上述の本発明に係る任意の化合物及び製薬学的に許容される担体を含む医薬組成物にも関連する。
【００６０】
「製薬学的に許容される」担体又は賦形剤は、投与する患者において有害な作用を生じない担体又は賦形剤を意味する。そのような製薬学的に許容される担体及び賦形剤は、当該技術分野においてよく知られている。
【００６１】
医薬組成物又は医薬は、希釈剤、賦形剤、又は本発明に係る化合物と併用し得るさらなる他の活性分子などの追加の化合物も含んでよい。
【００６２】
医薬又は医薬組成物は、幾つかの本発明に係る化合物を組み合わせてよい。特に、医薬組成物の前記医薬は、式（Ｉ）の前記化合物の［（Ｘ）ｎ−Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−（Ｘ）ｍ］偽ペプチド単位中のＬｙｓ残基が全てＬ立体配置であるか又は全てＤ立体配置のいずれかである、上述のＨＢ１９、Ｎｕｃａｎｔ ２、Ｎｕｃａｎｔ ３、Ｎｕｃａｎｔ ４、Ｎｕｃａｎｔ ６、Ｎｕｃａｎｔ ７、Ｎｕｃａｎｔ ８、及びＮｕｃａｎｔ ９化合物の１つ又は複数を特に含んでよい。
【００６３】
本発明に係る医薬又は医薬組成物は、本発明の化合物がある治療効果を有する任意の疾患の治療のために使用され得る。
【００６４】
特に、本発明に係る医薬又は医薬組成物は、細胞増殖及び／又は血管新生の脱制御を伴う任意の疾患を治療するために使用され得る。
【００６５】
用語「細胞増殖及び／又は血管新生の脱制御を伴う疾患」は、本発明において、１つ若しくは複数の異常な細胞増殖現象が認められる１つ若しくは複数の器官、及び細胞若しくは組織の群に影響を与える任意のヒト又は動物の疾患、並びに／又は異常な新血管形成を意味する。
【００６６】
明らかに、そのような疾患は、全てのタイプの癌、例えば、腺腫、肉腫、癌、リンパ腫、特に、卵巣、胸、膵臓、リンパ節、皮膚、血液、肺、脳、腎臓、肝臓、鼻咽頭腔、甲状腺、中枢神経系、前立腺、結腸、直腸、子宮、頸部、頭及び首、睾丸、又は膀胱を含む。それらは、癌ではない皮膚の疾患、例えば、表皮または真皮の嚢胞、乾癬、血管種、及び眼疾患、例えば、加齢性黄斑変性症（ＡＲＭＤ）、糖尿病性網膜症、又は血管新生緑内障、神経変性症、例えば、多発性硬化症、パーキンソン病、及びアルツハイマー病、又は自己免疫疾患、例えば、紅斑性狼瘡、乾癬、クローン病、若しくはリウマチ性多発関節炎、並びにアテローム性動脈硬化症に関連する疾患も含む。
【００６７】
好ましい実施態様では、本発明に係る医薬又は医薬組成物は、かくして、癌を治療するために使用し得る。
【００６８】
事実、本発明に係る化合物は、癌を治療するための非常に高い有効性を有することを示す（実施例２参照のこと）。本発明に係る光学的に純粋な化合物を使用して治療し得る癌の例は、上述のもの全てを含む。
【００６９】
加えて、過去に開示されている立体異性体混合物は抗炎症特性を有すると開示されており、本発明に係る化合物も炎症性疾患を治療するために使用し得る。かくして、他の好ましい実施態様では、本発明に係る医薬又は医薬組成物は炎症性疾患の治療に使用し得る。
【００７０】
用語「炎症性疾患」は、炎症反応が生物の病理的帰結を有する任意の疾患を意味する。特に、本発明において炎症性疾患は自己免疫疾患（例えば、紅斑性狼瘡又はリウマチ性多発関節炎）、敗血症、敗血症ショック、心臓炎症性疾患（心臓炎、特に心内膜炎、心膜炎、心筋炎、特に黄色ブドウ球菌によって生じるものなどの感染起源のもの）、移植片拒絶、外傷、関節の炎症性疾患（特に、関節炎の各種の異なる形態）、胃腸系の炎症性疾患（特に、結腸炎、腸炎、胃炎、胃腸炎、及び腸の慢性炎症性疾患、例えば、クローン病及び出血性直腸結腸炎（ＨＲＣ））、皮膚の炎症性疾患（皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、乾癬、皮膚病）、呼吸器系の炎症性疾患、特に、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、及びアレルギーを含む。
【００７１】
有利な実施態様では、前記炎症性疾患は、自己免疫疾患、特に、紅斑性狼瘡又は関節リウマチである。他の有利な実施態様では、前記炎症性疾患は敗血症ショックである。さらなる他の有利な実施態様では、前記炎症性疾患は、心内膜炎、特に黄色ブドウ球菌によって生じるものなどの感染起源の心内膜炎である。
【００７２】
本発明に係る医薬又は医薬組成物は、創傷治癒のためにも使用され得る。
【００７３】
本発明において予期される典型的な創傷は、開放創及び閉鎖創の双方であり、慢性的な創傷、例えば、慢性下腿潰瘍、糖尿病潰瘍、褥瘡、急性の創傷（例えば、擦り傷、ナイフによる切傷）、創傷治癒促進から利益が得られるもの、並びに感染創、壊死性の傷、日焼けを含む火傷（各種の異なる程度のもの）、術後創部、皮膚移植、及び外傷であるが、それらに限らない治癒の困難な創傷を含む。
【００７４】
特に、それらは、皮膚の創傷の瘢痕形成を改善するために使用し得る。
【００７５】
本発明に係る医薬又は医薬組成物は、経口、皮下、静脈内、脳内、鼻内、局所、経皮、腹腔内、筋肉内、肺内、膣、直腸、眼内、又は任意の他の許容される態様を含むが、それらに限らない、任意の適切な投与経路によって投与され得る。
【００７６】
本発明は、上述の本発明に係る化合物の治療上有効量を投与する工程を含む、必要な患者における細胞増殖及び／又は血管新生の脱制御を伴う疾患の治療方法にも関する。
【００７７】
好ましい実施態様では、本発明は、上述の本発明に係る化合物の治療上有効量を投与する工程を含む、必要な対象における癌の治療方法に関する。
【００７８】
他の好ましい実施態様では、本発明は、上述の本発明に係る化合物の治療上有効量を投与する工程を含む、必要な対象の上述の任意の炎症性疾患を治療するための方法にも関する。
【００７９】
本発明は、上述の本発明に係る化合物の治療上有効量を投与する工程を含む、必要な対象における創傷治癒を改善するための方法にも関する。
【００８０】
本発明を、添付の図面及び実験例によってさらに説明する。これらのデータは、説明のためにのみ提供するのであって、本発明の範囲を制限するものと解されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１は、ＮｕｃＡｎｔ ６、６Ｄ、及び６ＬのＮＩＨ３Ｔ３細胞における３Ｈ−チミジン取り込みに対する活性を示す。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞（２×１０５）を４８マルチウェルプレートに播種して、２４時間インキュベートして接着させた。細胞を２４時間血清飢餓状態にした後に、１８時間にわたってペプチドともに又はそれなしで５％ＦＢＳを用いて刺激した。次いで、１μＣｉの［３Ｈ］−チミジンを各ウェルに添加して、インキュベーションを６時間にわたって持続させた。ウェルをＰＢＳで洗浄し、氷冷１０％トリクロロ酢酸を用いてＤＮＡを沈殿させた。次いで、細胞を０．２Ｎ ＮａＯＨ中で溶解し、取り込まれた［３Ｈ］−チミジンをシンチレーションカウンターで測定した。全ての実験は三回重複して実施した。バー、±ｓｅｍ（ｎ＝３）、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、対照と比較して統計的に有意（スチューデントのｔ試験）。
【図２】図２は、ＮｕｃＡｎｔ ６、６Ｄ、及び６ＬのＭＤＡ−ＭＢ ４３５増殖に対する活性を示す。細胞（２×１０４）を２４マルチウェルプレートに播種して、２４時間にわたってインキュベートして接着させた。細胞を３日間にわたり培地を除去して毎日処理した。５日目に、細胞をクリスタルバイオレット染色によって計数した。そして、それらをＰＢＳで二回洗浄し、無水エタノールで５分間にわたって固定化した。次いで、細胞を０．２％クリスタルバイオレット、２％エタノール溶液で１５分間にわたって染色し、蒸留水で二回洗浄して、室温で４５分間にわたって乾燥させた。次いで、クリスタルバイオレットを５００μｌのＳＤＳ １％で可溶化した。５９５ｎｍの吸光を１００μｌの各サンプルを用いてマイクロプレートリーダーを使用して評価した。
【図３】図３は、ＮｕｃＡｎｔ ６、６Ｄ、及び６ＬのＴ２９増殖に対する活性を示す。Ｔ２９細胞は、２４ウェルプレートに播種した（５０００細胞／ウェル）。細胞をペプチドで一回処理し、３日間にわたって３７℃で５％ＣＯ２の条件下に置いた。次いで、細胞をトリパンブルーで染色し、Ｍａｌｌａｓｓｅｚ ｃｅｌｌで計数した。バー、±ｓｅｍ（ｎ＝３）、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、対照と比較して統計的に有意（スチューデントのｔ試験）。
【実施例】
【００８２】
実施例１．式（Ｉ）のＬｙｓ残基の全てがＬ立体配置又は式（Ｉ）のＬｙｓ残基の全てがＤ立体配置のいずれかであるＮｕｃａｎｔ ６化合物の合成
１．１．Ｎｕｃａｎｔ ６、Ｎｕｃａｎｔ ６Ｌ、及びＮｕｃａｎｔ ６Ｄ化合物の定義
Ｎｕｃａｎｔ ６は、６ＫΨＰＲ単位が直鎖支持ペプチドの６リジン残基の側鎖にカップリングしたAc-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-CONH2 （配列番号１３）の配列の直鎖支持ペプチドを有する偽ペプチドを表わす。Ｎｕｃａｎｔ ６は、下式：
【化１２】
0005548866.tif 000018
［式中、各ＫΨＰＲのリジン残基はＬ又はＤ立体配置であり得る］
を表わす。
【００８３】
一般的な説明において説明したように、Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＣＨＯ（アルデヒド）及びプロリン（アミノ基を有する）の還元アミノ化に基づくＫΨＰ単位を調製する従来の方法は、リジン残基のエピマー化をもたらす。得られるＫΨＰ単位は、かくして、（Ｌ）ＫΨＰ及び（Ｄ）ＫΨＰジペプチド単位の分離不可能な混合物である。これらのＫΨＰ単位を支持体にカップリングさせるために、そのような混合物を使用することは、各種のＫΨＰ単位が各々Ｌ又はＤ立体配置のいずれかであり得る偽ペプチドを生じさせる。前記偽ペプチドのジアステレオ異性体の混合物が得られるだろう。
【００８４】
以下においては、Ｎｕｃａｎｔ ６は、そのようなジアステレオ異性体の混合物に相当する。
【００８５】
対照的に、Ｎｕｃａｎｔ ６Ｌは、ＫΨＰ単位中の全てのリジン残基がＬ立体配置である上式を有する偽ペプチドであり、Ｎｕｃａｎｔ ６Ｄは、ＫΨＰ単位中の全てのリジン残基がＤ立体配置である上式を有する偽ペプチドである。
【００８６】
１．２．Ｋ−Ψ−Ｐ単位のジアステレオ異性体の混合物の合成
従来の方法（参考文献２及び３参照のこと）を使用して、Ac-Lys(Mtt)-Aib-Gly-Lys(Mtt)-Aib-Gly-Lys(Mtt)-Aib-Gly-Lys(Mtt)-Aib-Gly-Lys(Mtt)-Aib-Gly-Lys(Mtt)-Aib-Gly-RinkアミドMBHA樹脂の式のＭｔｔ保護直鎖支持ペプチドを最初に調製した。
【００８７】
次いで、Ｍｔｔ−保護基を、ジクロロメタン（ＤＭＣ）−トリイソプロピルシラン−トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（９３：５：２容量）の混合物を使用して切断し（５回、各５分）、ＤＣＭ及びＤＭＦを用いて樹脂を複数回洗浄した。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨカップリング及びＭｔｔ脱保護を３回繰り返して上述のように実施した。次いで、Ｎα−Ｆｍｏｃ保護基をＤＭＦ中の２５％ピペリジンを用いて除去した。次いで、遊離アミノ官能基を１５倍過剰量のＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ及びＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨでアシル化した。
【００８８】
次いで、ＬｙｓとＰｒｏとの間の還元されたアミド結合を、１％酢酸を含有するジメチルホルムアミド中において、プロリンとともにＮ保護アミノアルデヒドであるＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＣＨＯ（２．５倍過剰、２回）の１時間の還元アミノ化によって樹脂上で形成した。
【００８９】
１．３．純粋な（Ｌ）Ｋ−Ψ−Ｐ単位の合成
全てのリジン残基がＬ立体配置である（Ｌ）Ｋ−Ψ−Ｐ単位の合成は、スキーム１Ａ（１７ページを参照のこと）に記載のように実施した。
【００９０】
より詳細には、以下のプロトコールを使用した。
【００９１】
工程１：Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−ＯＢｚｌ（化合物１）の合成
Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ．ＤＣＨＡ（７５ｇ、０．１４２モル）をＡｃＯＥｔ（３７５ｍｌ）及びＫＨＳＯ４（１Ｍ）（３７５ｍｌ）の混合物に溶解する。有機相をＫＨＳＯ４（１Ｍ）（２００ｍｌ）、水（２００ｍｌ）、及びＮａＣｌ飽和水溶液（１００ｍｌ）を用いて洗浄した。得られた生成物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させて、乾燥するまで濃縮させる。
【００９２】
残留物をＤＭＦ（２００ｍｌ）に溶解する。ＨＣｌ．Ｈ−Ｐｒｏ−ＯＢｚｌ（３２．６ｇ、０．１３５モル）、ＨＯＢｔ．Ｈ２Ｏ（２３．９ｇ、０．１５６モル）、及びＤＩＥＡ（２３．２ｍｌ、０．１３５モル）を添加した。媒体を０から５℃まで冷却した。ＷＳＣＤ（３２．７ｇ、０．１７１モル）を少しずつ導入し、反応混合物を室温で３時間にわたって攪拌する。
【００９３】
混合物をＮａＨＣＯ３（５％）（２Ｌ）に注ぎ入れる。生成物をＡｃＯＥｔ（７５０ｍｌ）で抽出する。有機相を３×ＮａＨＣＯ３（５％）（３００ｍＬ）、２×Ｋ２ＣＯ３（５％）（３００ｍｌ）、２×ＫＨＳＯ４（１Ｍ）（３００ｍｌ）、及びＮａＣｌ飽和水溶液（２００ｍｌ）で洗浄する。得られた生成物をＮａ２ＳＯ４で乾燥させて、乾燥するまで濃縮させる。残留物をシクロヘキサン（２００ｍｌ）と２回共蒸発させる。７８ｇの油が得られる。収率＞１００％。ＨＰＬＣ：９６．９％。ＭＳ ＥＳ＋ ５３３．９（Ｍ＋１）。
【００９４】
工程２：Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ψ（ＣＨ２−Ｎ）−Ｐｒｏ−ＯＢｚｌ（化合物２）の合成
Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｐｒｏ−ＯＢｚｌ（３３．４ｇ、６２．６ミリモル）を無水ＴＨＦ（５０ｍｌ）に溶解してＣまで冷却する。ＢＨ３／ＴＨＦ（１Ｍ）（１２５ｍｌ、１２５ミリモル）の溶液を、温度を０から４℃に維持しながら３０分間で滴下して加える。３０分間で０から４℃、次いで、２０℃で２１時間にわたってインキュベートする。ＨＰＬＣ対照（４０から１００％）：３９．３％
【００９５】
媒体を０℃まで冷却する。温度を１０℃未満に維持しながらＫＨＳＯ４（１Ｍ）（３００ｍｌ）の溶液を添加し、次いで、媒体を２０℃で１時間にわたって攪拌する。次いで、濃縮してＴＨＦを除去する。Ｋ３ＣＯ３溶液（８３ｇ／１００ｍｌ水）によって媒体をｐＨ９．８まで中和する。
【００９６】
４５０ｍｌのＤＣＭを使用して生成物を抽出し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、乾燥するまで濃縮させる（２８．１ｇ）。粗生成物をシリカカラム（８００ｇ）でＡｃＯＥｔ／シクロヘキサン（４／６）を溶離液として使用して精製する。適切な画分を回収して、乾燥するまで濃縮させる。１１．８ｇの油が得られる（収率３７％）。
【００９７】
分析：ＨＰＬＣ ６８．２及び２９．９％のベンジルアルコール（ｓ／ｓ）。９２％の推定純度（ｐ／ｐ）。
【００９８】
工程３：Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ψ（ＣＨ２−Ｎ）−Ｐｒｏ−ＯＨ（化合物３）の合成
化合物２（１１．８ｇ、２２．７ミリモル、９２％ｐ／ｐと推定）をエタノール（１２０ｍｌ）に溶解する。
【００９９】
Ｐｄ／Ｃ（５０％の水）（６００ｍｇ）を添加する。ボイド窒素を２回脱気して、混合物を水素雰囲気下で一晩にわたって水素化する。
【０１００】
ＴＬＣ対照：ＡｃＯＥｔ／シクロヘキサン（５／５）
【０１０１】
触媒は濾過によって除去し、濾液を乾燥するまで濃縮させる。ＩＰＥ（１００ｍｌ）を添加する。
【０１０２】
沈殿物をろ過し、ＩＰＥ（５０ｍｌ）で２回洗浄する。９．２ｇの固体が得られる（９４％の収率）。ＨＰＬＣ分析８７％。
【０１０３】
粗生成物をＤＣＭ（５０ｍｌ）に溶解する。不溶物を濾過して除き、ＩＰＥを濾液に添加して沈殿させて、４．５ｇの生成物が得られる。１ｓｔＣ：ＨＰＣＬ ９９．３％；ＭＳ ＥＳ＋ ４３０．１（Ｍ＋１）。残りの溶液をシクロヘキサン及びＩＰＥで沈殿させる。これにより２．４ｇが得られる。２ｎｄ Ｖ（ＨＰＬＣ ７５．４％）。全体収率：７０．７％。
【０１０４】
結果
２回の水素化実験を実施した。結果を以下の表１にまとめる。
【表１】
0005548866.tif 000019
【０１０５】
ＵＶ（２１０ｎｍ）の化合物３の低い吸光度のために、化合物３が９５％超のＨＰＬＣ純度で得ることができる。
【０１０６】
１．４．純粋な（Ｄ）Ｋ−Ψ−Ｐ単位の合成
スキーム１Ｂ（１７ページ参照のこと）に示すように、Ｂｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ．ＤＣＨＡをＢｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ．ＤＣＨＡの代わりに使用したことを除き、Ｂｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ψ（ＣＨ２−Ｎ）−Ｐｒｏ−ＯＨを上述のプロトコールを使用して調製した。
【０１０７】
２７．７ｇのＢｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ψ（ＣＨ２−Ｎ）−Ｐｒｏ−ＯＨが、１００ｇのＢｏｃ−Ｄ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ．ＤＣＨＡから得られる。全体の収率は３６％である。ＵＶ（２１０ｎｍ）の化合物３の低い吸光度のため及び（Ｄ）誘導体を沈殿させることが困難であるために、９５％超のＨＰＬＣ純度の生成物を得ることができなかった。生成物の質は、ＴＬＣ及びＮＭＲ １Ｈを使用して評価した。ＮＭＦ １Ｈによってベンジルアルコールの量は２％であると推定される。
【０１０８】
１．５．２つの（Ｌ）及び（Ｄ）誘導体の違い
２つの化合物３（Ｌ及びＤ）のＨＰＬＣにおける共注入は、２つのジアステレオ異性体の明確な分離をもたらす。
【０１０９】
１．６．Ｎｕｃａｎｔ ６、Ｎｕｃａｎｔ ６Ｌ、及びＮｕｃａｎｔ ６Ｌの合成
導入
ＫΨＰ単位のジアステレオ異性体の混合物（１．２参照のこと）、純粋な（Ｌ）ＫΨＰ単位（１．３参照のこと）、又は純粋な（Ｄ）ＫΨＰ単位（１．４参照のこと）のいずれかを使用して、固相合成を使用してＦｍｏｃ／ｔＢｕ方法論にしたがって３つの偽ペプチドを合成した。アミノ酸のカップリングは、ＲｉｎｋアミドＰＳ樹脂に対して段階的に実施した。リジンのＭｔｔ基を除去した後に、Ａｒｇ及びＬｙｓ−Ψ（ＣＨ２Ｎ−Ｐｒｏ）を直鎖支持ペプチドの６つのリジンの側鎖にカップリングさせた。ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ中で切断を実施した。粗生成物をＲＰ−ＨＰＬＣで精製して、純粋なペプチドを得た。
【０１１０】
Ｍｔｔ保護直鎖支持ペプチド：
Ac-Lys(Mtt)-Aib-Gly-Lys(Mtt)-Aib-Gly-Lys(Mtt)-Aib-Gly-Lys(Mtt)-Aib-Gly-Lys(Mtt)-Aib-Gly-Lys(Mtt)-Aib-Gly-RinkアミドMBHA樹脂
の調製
固体支持体である１ミリモルのＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂（０．３３ミリ当量／ｇ）に直鎖ペプチドを構築した。Ｆｍｏｃ−アミノ酸のカップリング及び脱保護は以下に記載する。
【０１１１】
２当量のＦｍｏｃ−アミノ酸、２当量のカップリング剤をＤＭＦ（アミノ酸１ミリモルあたり２から３ｍＬ）に溶解した。樹脂を含有する反応混合物に溶液を注ぎ入れて、４から５当量のＤＩＥＡを添加した。
【０１１２】
【表２】
0005548866.tif 000020
【０１１３】
構築には、以下の条件を使用した（表３）：
【表３】
0005548866.tif 000021
【０１１４】
Ｍｔｔの脱保護
直鎖ペプチド
Ac-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-Lys-Aib-Gly-RinkアミドMBHA樹脂
２０％のヘキサフルオロイソプロパノール／ＤＣＭ（１ｇの樹脂あたり１０ｍｌ）を使用して２時間で６つのＭｔｔ基を除去した。
【０１１５】
Ｎｕｃａｎｔ ６Ｌの最終的な合成
側鎖に対するアミノ酸のカップリング
【表４】
0005548866.tif 000022
【０１１６】
２当量のアミノ酸、ＨＡＴＵ及びＤＩＥＡを使用して、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ及びＢｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ψ（ＣＨ２Ｎ−Ｐｒｏ）−ＯＨをリジンの側鎖にカップリングさせた。
【０１１７】
切断
保護ペプチドの樹脂からの切断は、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ（９５／５）を使用して実施し、４．６７ｇの粗生成物を得た。
【０１１８】
精製
粗生成物（４．６７ｇ）は、ＲＰ−ＨＰＬＣによって０．１％ＴＦＡを含有する水／アセトニトリルを溶離液として使用して精製した。９５％超の精製度を有する画分を回収し、凍結乾燥して６５７ｍｇの粉末をＴＦＡ塩として得た。精製の収率：１４．１％。Ｄｏｗｅｘ １×２を使用してＴＦＡ塩をＡｃＯＨと交換し、５２４ｍｇの粉末（正味のペプチド含量：７６．７％）を得た。
【０１１９】
Ｎｕｃａｎｔ ６及びＮｕｃａｎｔ ６Ｄの最終的な合成
Ｎｕｃａｎｔ ６及びＮｕｃａｎｔ ６Ｄの最終的な合成は、類似の手法を使用して実施した。
【０１２０】
Ｎｕｃａｎｔ ６Ｄについては、２９３ｍｇのＡｃＯＨ塩を１ミリモルの樹脂から得た（正味のペプチド含量：７７．２％）。最終的な収率：５．９％。
【０１２１】
実施例２．Ｎｕｃａｎｔ ６、Ｎｕｃａｎｔ ６Ｌ、及びＮｕｃａｎｔ６Ｄのインビトロ腫瘍増殖に対する効果
２．１．材料及び方法
使用する化合物
実施例１のＮｕｃａｎｔ ６、Ｎｕｃａｎｔ ６Ｌ、及びＮｕｃａｎｔ ６Ｄとして定義した化合物を使用した。
【０１２２】
ＮＩＨ３Ｔ３細胞のインビトロ増殖に対する阻害効果の試験
ＮＩＨ−３Ｔ３細胞（２×１０５）を４８マルチウェルプレートに播種し、２４時間にわたってインキュベートして接着させた。細胞を２４時間にわたって血清飢餓状態にした後に、ペプチドとともに又はそれなしで５％ＦＢＳで１８時間にわたって刺激した。次いで、１μＣｉの［３Ｈ］−チミジンを各ウェルに添加し、インキュベートを６時間にわたって続けた。ウェルをＰＢＳで洗浄し、氷冷１０％トリクロロ酢酸を使用してＤＮＡを沈殿させた。次いで、細胞を０．２ ＮａＯＨで溶解し、取り込まれた［３Ｈ］−チミジンをシンチレーションカウンターで測定した。
【０１２３】
ＭＤＡ−ＭＢ ４３５細胞のインビトロ増殖に対する阻害活性の試験
ＭＤＡ−ＭＢ ４３５細胞（２×１０４）を２４マルチウェルプレートに播種し、２４時間にわたってインキュベートして接着させた。細胞を３日間にわたって培地を除去して毎日処理した。５日目に、クリスタルバイオレット染色によって細胞を計数した。そして、それらをＰＢＳで２回洗浄し、無水エタノールを用いて５分間にわたって固定化した。次いで、０．２％のクリスタルバイオレット、２％エタノール溶液で１５分間にわたって細胞を染色し、蒸留水で２回洗浄して、室温で４５分間にわたって乾燥させた。次いで、クリスタルバイオレットを５００μｌのＳＤＳ１％中で可溶化した。５９５ｎｍにおける吸光度を１００μｌの各サンプルを用いてマイクロプレートリーダーを使用して評価した。
【０１２４】
Ｔ２９細胞のインビトロ増殖に対する阻害効果の試験
Ｔ２９細胞を２４ウェルプレートに播種した（ウェルあたり５０００細胞）。ペプチドを用いて細胞を一度処理して、３日間にわたって３７℃で５％ＣＯ２の条件下に置いた。次いで、細胞をトリパンブルーで染色し、Ｍａｌｌａｓｓｅｚ ｃｅｌｌで計数した。
【０１２５】
２．２．結果
各種のＮｕｃａｎｔ ６化合物（従来の合成方法を使用して得られる複雑な未定義の分離不可能な混合物、Ｌ、Ｄ）の、ＮＩＨ ３Ｔ３（図１）、ＭＤＡ−ＭＢ ４３５（図２）、又はＴ２９（図３）の細胞増殖に対する阻害効果について試験した
【０１２６】
ＮＩＨ３Ｔ３（図１）、ＭＤＡ−ＭＢ ４３５（図２）、及びＴ２９（図３）について、結果は、化合物Ｎｕｃａｎｔ ６Ｌ及びＮｕｃａｎｔ ６Ｄは、化合物Ｎｕｃａｎｔ ６（従来の合成方法を使用して得られる複雑な未定義の分離不可能な混合物）と比較して、細胞増殖に対して増大した活性を有することを示す。
【０１２７】
これらの結果は、［（Ｘ）ｎ−Ｌｙｓ−Ψ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−（Ｘ）ｍ］偽ペプチド単位中のＬｙｓ残基が全てＬ立体配置であるか又は全てＤ立体配置のいずれかである、光学的に純粋な化合物が、光学的に純粋なものではないＮｕｃａｎｔ ６化合物と比較して増大した抗増殖活性を有することを明示する。
【０１２８】
２．３．結論
上記の結果は、本発明に係る化合物Ｎｕｃａｎｔ６Ｌ又はＤが、従来の合成方法を使用して体系的に得られる立体異性体の複雑な定義されない分離できない混合物からなるＮｕｃａｎｔ ６化合物と比較して、増大した抗増殖能を有することを明示する。
（参考文献）
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【図１】
0005548866.tif 000028
【図２】
0005548866.tif 000029
【図３】
0005548866.tif 000030
【配列表】
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