(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料載置側電極と対向電極との間に、組織標本に対して一次抗体を滴下した一次試料を載置し、前記対向電極が前記試料載置側電極よりもマイナスになるようにして変動電界を６０〜１８０分印加し、前記一次試料を非接触にて撹拌し、
その後、前記一次試料に対して標識でラベルした二次抗体を滴下した二次試料に、前記対向電極が前記試料載置側電極よりもマイナスになるように変動電界を３０秒〜５分印加して前記二次試料を非接触にて撹拌し、
滴下する前記一次抗体の濃度は、０．２５〜１．０μｇ／ｍＬである、
ことを特徴とする免疫組織染色方法。
【請求項２】
試料載置側電極と対向電極との間に、組織標本に対して一次抗体を滴下した一次試料を載置し、前記対向電極が前記試料載置側電極よりもマイナスになるようにして変動電界を１〜５分印加し、前記一次試料を非接触にて撹拌し、
その後、前記一次試料に対して標識でラベルした二次抗体を滴下した二次試料に、前記対向電極が前記試料載置側電極よりもマイナスになるように変動電界を３０秒〜５分印加して前記二次試料を非接触にて撹拌し、
滴下する前記一次抗体の濃度は、４．０〜６．０μｇ／ｍＬである、
ことを特徴とする免疫組織染色方法。
【請求項３】
前記変動電界は、矩形波と、１０〜３００Ｈｚの周波数信号とが重畳している、
ことを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の免疫組織染色方法。
【請求項４】
印加する前記変動電界の強度は、０．３５〜２．５０ｋＶ／ｍｍである、
ことを特徴とする請求項１から請求項３の何れか１つに記載の免疫組織染色方法。
【請求項５】
前記標識が、酵素標識、蛍光標識、放射性同位元素標識、金コロイド粒子標識のいずれかである、
ことを特徴とする請求項１から請求項４の何れか１つに記載の免疫組織染色方法。
【請求項６】
試料載置側電極と対向電極との間に、組織標本に対して０．２５〜１．０μｇ／ｍＬの濃度の一次抗体を滴下した一次試料を載置する試料室を備え、
この試料室内に、
前記対向電極が前記試料載置側電極よりもマイナスになるようにして変動電界を６０〜１８０分印加し、前記一次試料を非接触にて撹拌する第１撹拌手段と、
非接触にて撹拌された前記一次試料に対して標識でラベルした二次抗体を滴下した二次試料に、前記対向電極が前記試料載置側電極よりもマイナスになるように変動電界を３０秒〜５分印加して前記二次試料を非接触にて撹拌する第２撹拌手段と、
を設けたことを特徴とする免疫組織染色装置。
【請求項７】
試料載置側電極と対向電極との間に、組織標本に対して４．０〜６．０μｇ／ｍＬの濃度の一次抗体を滴下した一次試料を載置する試料室を備え、
この試料室内に、
前記対向電極が前記試料載置側電極よりもマイナスになるようにして変動電界を１〜５分印加し、前記一次試料を非接触にて撹拌する第１撹拌手段と、
非接触にて撹拌された前記一次試料に対して標識でラベルした二次抗体を滴下した二次試料に、前記対向電極が前記試料載置側電極よりもマイナスになるように変動電界を３０秒〜５分印加して前記二次試料を非接触にて撹拌する第２撹拌手段と、
を設けたことを特徴とする免疫組織染色装置。
【請求項８】
前記変動電界は、矩形波と、１０〜３００Ｈｚの周波数信号とが重畳している、
ことを特徴とする請求項６又は請求項７に記載の免疫組織染色装置。
【請求項９】
印加する前記変動電界の強度は、０．３５〜２．５０ｋＶ／ｍｍである、
ことを特徴とする請求項６から請求項８の何れか１つに記載の免疫組織染色装置。
【請求項１０】
前記標識が、酵素標識、蛍光標識、放射性同位元素標識、金コロイド粒子標識のいずれかである、
ことを特徴とする請求項６から請求項９の何れか１つに記載の免疫組織染色装置。
【請求項１１】
前記第１撹拌手段と、前記第２撹拌手段とは同一のものである、
ことを特徴とする請求項６から請求項１０の何れか１つに記載の免疫組織染色装置。
【請求項１２】
前記試料室に載置する前記組織標本の直上となる前記対向電極の箇所に凸部を設けた、
ことを特徴とする請求項６から請求項１１の何れか１つに記載の免疫組織染色装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体組織内の特定タンパク質の発現や局在を明らかにするための免疫組織染色方法および免疫組織染色装置に関し、一連の作業の迅速化を可能とし、例えば、手術中の癌特異タンパク質の検出などによる術中迅速病理診断に利用することができるほか、用いる抗体を節約することができ、コストダウンを果たすこと等も可能な免疫組織染色方法および免疫組織染色装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
手術の際にその方針を決定する方法として、術中迅速病理診断が知られている。この術中迅速病理診断は、手術を一時中止して行われるために時間的な制約が厳しく、従来から生体組織の形態学的特徴に基づいて、その病理を判断することに留まっている。このため、しばしば誤診が起こる原因となって、診断精度の向上が要求されている。
【０００３】
例えば、乳ガンや悪性黒色腫等の術中迅速病理診断では、癌病巣からリンパ液が流入する最も近いリンパ節であるセンチネルリンパ節を用いて形態学的に転移の有無を確認し、センチネルリンパ節よりも癌病巣から遠いリンパ節を摘出するか否かの判断に用いられている。このセンチネルリンパ節を用いた術中迅速病理診断では、ＨＥ（ヘマトキシリン・エオジン）染色によって組織形態学的に病理診断しているものの、リンパ節への微小転移が見逃されることが散見されていた。
【０００４】
一方、生体組織内の特定タンパク質の発現や局在を明らかにするための手段として、免疫組織染色という手法が知られている。免疫組織染色は、特異性の高い抗体を用いて特定タンパク質を検出するために、非常に高精度な診断を行うことができる。しかし、従来の免疫組織染色法は、例えば、図６に示すように、対象とする組織の抽出から、標本への固定、洗浄、ブロッキング、一次抗体による抗原抗体反応、二次抗体による抗原抗体反応、発色液による発色等の一連の工程に少なくとも二時間以上要するため、時間的な制約が厳しい術中の迅速病理診断に不向きであった。
【０００５】
ただし、術中迅速病理診断への免疫組織染色を活用するニーズは高く、例えば、下記特許文献１にて、超音波撹拌技術を利用して免疫組織染色の一連の工程の時間短縮を図る発明が提案されている。
【０００６】
本発明者らは、これらとは別に、μＬオーダーの微少量液滴での、核酸ハイブリダイゼーション反応、ＥＬＩＳＡ反応等において、高電圧の交流電界を印加することにより、反応時間を短縮する方法を開発している（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開平８−３０４３８８号公報
【特許文献２】特開２０１０−１１９３８８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、上記特許文献１にて提案される発明では、２０〜４０ｋＨｚの超音波によって組織標本を撹拌することによって、キャビテーションによる温度上昇が起こり、温度変化等に敏感なタンパク質の検出には不向きであるという問題がある。また、キャビテーションによって組織標本が散逸し、免疫組織染色自体を実行できないという虞もある。なお、超音波による急激な撹拌によって、分子衝突が突如として高まることによりタンパク質が変性、損傷し、免疫組織染色の精度が低下する虞もあった。このほか、超音波を用いた場合には騒音が発生するという問題もある。したがって、実施上の問題、騒音の問題等により、術中迅速病理診断に利用することが困難となる虞があった。
【０００９】
本発明は、上記実情に鑑み提案されたもので、時間的な制約の厳しい術中迅速病理診断に適用することができ、その診断精度を飛躍的に向上させることができるほか、免疫組織染色に用いる抗体の量を格段に減らすことにより、コストダウンを果たすこと等も可能な免疫組織染色方法および免疫組織染色装置を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記目的を達成するために鋭意検討した結果、免疫組織染色法において、高電圧の変動電界を所定の向きに印可し、しかも、１次抗体に加えて２次抗体を用いた免疫組織染色法とすることにより、抗原を迅速に検出することが可能となるだけでなく、使用する抗体の量を格段に減らすことができるという予想外の効果をもたらす方法を見い出し、本発明に至った。
すなわち、本発明に係る免疫組織染色方法は、試料載置側電極と対向電極との間に、組織標本に対して一次抗体を滴下した一次試料を載置し、前記対向電極が前記試料載置側電極よりもマイナスになるようにして変動電界を６０〜１８０分印加し、前記一次試料を非接触にて撹拌し、その後、前記一次試料に対して標識でラベルした二次抗体を滴下した二次試料に、前記対向電極が前記試料載置側電極よりもマイナスになるように変動電界を３０秒〜５分印加して前記二次試料を非接触にて撹拌し、滴下する前記一次抗体の濃度は、０．２５〜１．０μｇ／ｍＬであり、発色液を滴下して前記組織標本を染色することを特徴とする。
また、本発明に係る免疫組織染色方法は、試料載置側電極と対向電極との間に、組織標本に対して一次抗体を滴下した一次試料を載置し、前記対向電極が前記試料載置側電極よりもマイナスになるようにして変動電界を１〜５分印加し、前記一次試料を非接触にて撹拌し、その後、前記一次試料に対して標識でラベルした二次抗体を滴下した二次試料に、前記対向電極が前記試料載置側電極よりもマイナスになるように変動電界を３０秒〜５分印加して前記二次試料を非接触にて撹拌し、滴下する前記一次抗体の濃度は、４．０〜６．０μｇ／ｍＬであり、発色液を滴下して前記組織標本を染色することを特徴とする。
【００１１】
特に、上記変動電界は、矩形波と、１０〜３００Ｈｚの周波数信号とが重畳していることが好ましく、印加する変動電界の強度は、０．３５〜２．５０ｋＶ／ｍｍであることがさらに好ましい。また、印加する変動電界の上記第１所定時間は６０〜１８０分であり、及び／又は、印加する上記変動電界の第２所定時間は３０秒〜５分であることが好ましく、さらにまた、印加する上記変動電界の上記第１所定時間は１〜５分であり、及び／又は、印加する上記変動電界の前記第２所定時間は３０秒〜５分であってもよい。このほか、滴下する一次抗体の量は、抗体量の節約を図るときは濃度を０．２５〜１．０μｇ／ｍＬとし、迅速な反応を促すときは濃度を４．０〜６．０μｇ／ｍＬとすることが望ましい。また、標識としては、酵素標識、蛍光標識、放射性同位元素標識、金コロイド粒子標識のいずれかを使用することが好ましい。
【００１２】
本発明に係る免疫組織染色装置は、試料載置側電極と対向電極との間に、組織標本に対して０．２５〜１．０μｇ／ｍＬの濃度の一次抗体を滴下した一次試料を載置する試料室を備え、この試料室内に、前記対向電極が前記試料載置側電極よりもマイナスになるようにして変動電界を６０〜１８０分印加し、前記一次試料を非接触にて撹拌する第１撹拌手段と、非接触にて撹拌された前記一次試料に対して標識でラベルした二次抗体を滴下した二次試料に、前記対向電極が前記試料載置側電極よりもマイナスになるように変動電界を３０秒〜５分印加して前記二次試料を非接触にて撹拌する第２撹拌手段とを設けたことを特徴とする。
また、本発明に係る免疫組織染色装置は、試料載置側電極と対向電極との間に、組織標本に対して４．０〜６．０μｇ／ｍＬの濃度の一次抗体を滴下した一次試料を載置する試料室を備え、この試料室内に、前記対向電極が前記試料載置側電極よりもマイナスになるようにして変動電界を１〜５分印加し、前記一次試料を非接触にて撹拌する第１撹拌手段と、非接触にて撹拌された前記一次試料に対して標識でラベルした二次抗体を滴下した二次試料に、前記対向電極が前記試料載置側電極よりもマイナスになるように変動電界を３０秒〜５分印加して前記二次試料を非接触にて撹拌する第２撹拌手段と、を設けたことを特徴とする。
【００１３】
特に、上記変動電界は、矩形波と、１０〜３００Ｈｚの周波数信号とが重畳していることが好ましく、印加する変動電界の強度は、０．３５〜２．５０ｋＶ／ｍｍであることがさらに好ましい。また、印加する変動電界の上記第１所定時間は６０〜１８０分であり、及び／又は、印加する上記変動電界の第２所定時間は３０秒〜５分であることが好ましく、さらにまた、印加する上記変動電界の上記第１所定時間は１〜５分であり、及び／又は、印加する上記変動電界の上記第２所定時間は３０秒〜５分であってもよい。このほか、滴下する一次抗体の量は、抗体量の節約を図るときは濃度を０．２５〜１．０μｇ／ｍＬとし、迅速な反応を促すときは濃度を４．０〜６．０μｇ／ｍＬとすることが望ましい。
【００１４】
このほか、本発明に係る免疫組織染色装置は、第１撹拌手段と、第２撹拌手段とは同一のものとすればよく、試料室に載置する組織標本の直上となる対向電極の箇所に凸部を設けることも望ましい構成である。
【発明の効果】
【００１５】
本発明に係る免疫組織染色方法では、試料載置側電極と対向電極との間に、組織標本に対して一次抗体を滴下した一次試料を載置し、対向電極が試料載置側電極よりもマイナスになるようにして変動電界を第１所定時間印加し、一次試料を非接触にて撹拌し、その後、一次試料に対して標識をラベルした二次抗体を滴下した二次試料に、対向電極が試料載置側電極よりもマイナスになるように変動電界を第２所定時間印加して二次試料を非接触にて撹拌し、発色液を滴下して組織標本を染色する。したがって、非接触による撹拌により、抗原抗体反応を活発にすることができ、時間的な制約の厳しい術中迅速病理診断においても適用することができる。また、接触による撹拌により、抗原抗体反応を活発にすることができるので、免疫組織染色に用いる抗体の量を格段に減らすことができ、一次抗体の価格に依存するといわれる免疫組織染色方法のコストダウンを果たすことが可能となる。
【００１６】
特に、上記変動電界は、矩形波と、可聴域以下の周波数信号とが重畳することとすれば、穏やかで効率的な撹拌を行うことができるほか、キャビテーションによる問題を起こすようなこともない。印加する変動電界の強度は、０．３５〜２．５０ｋＶ／ｍｍであるので、放電が発生することがなく、かつ、穏やかな撹拌を起こすことができ、免疫組織染色を効率的に実行することができる。また、印加する変動電界の第１所定時間を６０〜１８０分とし、及び／又は、印加する変動電界の第２所定時間を３０秒〜５分とすれば、一次抗体の使用量を格段に少なくした条件にて免疫組織染色を実行することができ、さらにまた、印加する変動電界の第１所定時間を１〜５分とし、及び／又は、印加する変動電界の第２所定時間は３０秒〜５分とすれば、時間的な制約の厳しい術中迅速病理診断においても適用することができる。このほか、滴下する一次抗体の量は、濃度を０．２５〜１．０μｇ／ｍＬとすれば、一次抗体の使用量が格段に少なくなるし、コストダウンを図ることができ、また、濃度を４．０〜６．０μｇ／ｍＬとすれば、時間的な制約の厳しい術中迅速病理診断においても適用することができる。
【００１７】
本発明に係る免疫組織染色装置は、試料載置側電極と対向電極との間に、組織標本に対して一次抗体を滴下した一次試料を載置する試料室を備え、この試料室内に、対向電極が試料載置側電極よりもマイナスになるようにして変動電界を第１所定時間印加し、一次試料を非接触にて撹拌する第１撹拌手段と、非接触にて撹拌された一次試料に対して標識でラベルした二次抗体を滴下した二次試料に、対向電極が前記試料載置側電極よりもマイナスになるように変動電界を第２所定時間印加して二次試料を非接触にて撹拌する第２撹拌手段と、を設け、非接触にて撹拌された二次試料に対して発色液を滴下する滴下手段を設けて構成されている。したがって、上記免疫組織染色方法における効果を具備する免疫組織染色装置として提供することができる。
【００１８】
特に、上記変動電界は、矩形波と、可聴域以下の周波数信号とが重畳することとすれば、穏やかで効率的な撹拌を行うことができるほか、キャビテーションによる問題を起こすようなこともない。印加する変動電界の強度は、０．３５〜２．５０ｋＶ／ｍｍであるので、放電が発生することがなく、かつ、穏やかな撹拌を起こすことができ、免疫組織染色を効率的に実行することができる。また、印加する変動電界の第１所定時間を６０〜１８０分とし、及び／又は、印加する変動電界の第２所定時間を３０秒〜５分とすれば、一次抗体の使用量を格段に少なくした条件にて免疫組織染色を実行することができ、さらにまた、印加する変動電界の第１所定時間を１〜５分とし、及び／又は、印加する変動電界の第２所定時間は３０秒〜５分とすれば、時間的な制約の厳しい術中迅速病理診断においても適用することができる。このほか、滴下する一次抗体の量は、濃度を０．２５〜１．０μｇ／ｍＬとすれば、一次抗体の使用量が格段に少なくなるし、コストダウンを図ることができ、また、濃度を４．０〜６．０μｇ／ｍＬとすれば、時間的な制約の厳しい術中迅速病理診断においても適用することができる。尚、抗体量の節約を図りつつ迅速に検出したいときには、抗体の濃度を１．０〜４．０μｇ／ｍＬとすることもできる。
【００１９】
このほか、本発明に係る免疫組織染色装置は、第１撹拌手段と、第２撹拌手段とを同一とすれば、装置の小型化、簡略化を達成することができる。対向電極の組織標本の直上となる箇所に凸部を設ければ、印加する変動電界の強度を抑えることができ、放電の発生を確実に防止することができる装置として提供することができる。
【００２０】
本発明では、試料載置側電極と対向電極との間に載置した組織標本に対し、対向電極が試料載置側電極よりもマイナスになるように変動電界による印加し、変動電界のクーロン力によって組織標本と各抗体との抗原抗体反応を、非接触に撹拌させた状態で進行ことができる。そうすると、分子の衝突が起こり、ファンデルワールス力が作用しやすい環境になって抗原抗体反応が迅速化される。また、本発明では、回転子や撹拌子を用いないため、コンタミネーションを起こし難く、工程時間の短縮化が図れ、ばらつきが抑制された明瞭な結果が得られる。超音波撹拌に比べて騒音の発生がないという利点もある。装置が単純な構成のため、小型化も容易であるほか、透明電極を用いると、溶液の発色反応の進行度等の観察を同時に進めることができる。なお、温度、湿度、真空状態、ガス雰囲気などの各種の環境下によって、撹拌が制限を受けるものでもない。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明に係る免疫組織染色装置について説明する模式図である。
【図２】本発明に係る免疫組織染色装置において変動電界に重畳させる周波数について説明する説明図である。
【図３】本発明に係る免疫組織染色方法のプロトコルを説明するブロック図であって、ａ）は抗体節約法であり、ｂ）は迅速法である。
【図４】本実施例に係る免疫組織染色方法を用いて行った免疫組織染色された癌組織を説明する説明図である。
【図５】本発明に係る他の免疫組織染色装置について説明する説明図である。
【図６】従来の免疫組織染色方法のプロトコルを説明するブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ詳述する。
【００２３】
本実施形態に係る免疫組織染色装置は、図１に示すように、例えば、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）電極である試料載置側電極１１と対向電極１２との間に、スライドグラスに固定した組織標本ｔを載置する試料室１を備えている。特に、この試料室１では、対向電極１２が試料載置側電極１１よりもマイナスになるような変動電界が発生するようにされ、この変動電界が、組織標本ｔに滴下した一次抗体Ｉｇ１、二次抗体Ｉｇ２を非接触にて撹拌する第１撹拌手段および第２撹拌手段として機能している。また、試料載置側電極１１と対向電極１２との間のクリアランスは、本実施形態において６ｍｍである。このほか、対向電極１２は、試料室１に載置する組織標本ｔの直上となる箇所を、組織標本ｔに向けて突出する凸状とすることが、変動電界の強度を抑え、放電の可能性を最小化する観点から好ましい構成となる。なお、試料室１内は作動中、断熱密閉空間となるものである。また、図示を省略したが、試料室１に載置された組織標本ｔへ向け、発色液を滴下する滴下手段も設けても、好ましい実施形態となる。
【００２４】
本実施形態に係る免疫組織染色装置において、組織標本ｔに対して印加する変動電界は、電界の波に変化をもたせた（＝バースト波形を構成させた）態様にて生成される。具体的には、湿度６０±１０％の環境下において、印加電圧の主電圧としてプラス側に０．３５〜２．５ｋＶ／ｍｍだけ偏った振幅を有する方形波に、オフセット電圧０．２〜２．２５ｋＶ／ｍｍを加え、さらに、外部から０．１〜８００Ｈｚの周波数を２〜４０本束ねて重畳させて生成される。なお、印加電界強度（ｋＶ／ｍｍ）は、プラス側に２．５ｋＶ／ｍｍより大きく偏ると放電が起こる可能性があるので、方形波の振幅と、加えるオフセット電圧との和が、プラス側に２．５ｋＶ／ｍｍより大きく偏らないように調整される。また、印加電界強度（ｋＶ／ｍｍ）は、プラス側に０．３５ｋＶ／ｍｍより小さい偏りとなれば、撹拌が生じない虞があるので、方形波の振幅と加えるオフセット電圧との和が、プラス側に０．３５ｋＶ／ｍｍより小さい偏りにならないように調整される。
【００２５】
なお、図２に示すように、非接触にて撹拌を生じさせるための周波数は、変動電界の方形波に、外部から２〜４０本束ねて重畳させる周波数が０．１〜８００Ｈｚ、好ましくは、１０〜４００Ｈｚとすればよい。また、一般の免疫組織染色に用いる試料サイズ、試薬量、印加電界を考慮すれば、１０〜３００Ｈｚとすることが望ましい。さらにまた、液滴の量（一次抗体を含む溶液、二次抗体を含む溶液）により、重畳させる周波数の振動数を上記の範囲内で適宜調整してもよい。また、変動電界をプラス側に偏らせたのは、電界にて液滴吸引することが可能となり、効率的な撹拌が実行されるからである。さらに、このような変動電界を約２〜２０サイクル程度、ひとまとめに束ねてＯＮ／ＯＦＦすれば、液滴の波面に緩やかな振動を供給することができるので、液滴内の内容物がよりよく撹拌運動を示すようになるので好ましい実施形態となる。
【００２６】
本発明で用いる生体試料は、例えば、生検検体である腫瘍組織、細胞、臓器などが好適に用いられ、切片等にしてそのまま用いることもできるが、必要に応じ固定化することもできる。組織の固定化には、パラホルムアルデヒド、ホルマリンなどを用いることができる。また、パラフィンなどで包埋した上で切片にすることもできる。凍結切片を作成する場合には、必要により凍結包埋剤に埋め込んだ後、液体窒素などで急速凍結し、クリオスタッドなどで切片を作成することができる。
本発明で用いる二次抗体をラベルする標識としては、例えば、酵素標識、蛍光標識、放射性同位元素標識、金コロイド粒子標識などを用いることができるが、検出感度等の点から、酵素標識を用いることが好ましい。
酵素標識としては、例えば、パーオキシターゼ、ホースラディッシュパーオキシターゼ、アルカリホスファターゼ等を用いることができる。酵素標識を用いる場合には、基質となる発色液を滴下する。蛍光標識としては、例えば、フルオレセインイソシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート等、放射性同位元素としては、131Ｉ、125Ｉなどのヨウ素性放射性同位体等を用いることができる。
【００２７】
以下、本実施形態に係る免疫組織染色装置を用いて行う免疫組織染色方法を、図３を参照しつつ説明する。なお、本実施形態では、周囲温度を２５±２℃とし、湿潤下６０±１０％で行っている。
【００２８】
まず、マイクロオーダーの厚さに薄切りした組織標本ｔを、スライドグラスに貼り付け、室温でアセトン中に２分間浸し、組織標本ｔをスライドグラスに固定する。次に、スライドグラスに固定した組織標本ｔを、適宜の濃度に調製したリン酸緩衝生理食塩水（以下、「ＰＢＳ」という。）にて約３０秒前後洗浄する。
【００２９】
次に、免疫組織染色装置の試料室１の試料載置側電極１１と対向電極１２との間に、スライドグラスに固定した組織標本ｔを載置し、続いて、この組織標本ｔに対して一次抗体Ｉｇ１を滴下し、スライドグラスに固定した一次試料ｓ１とし、対向電極１１が試料載置側電極１２よりもマイナスになるようにして変動電界を、迅速な免疫組織染色を実施したい場合には１〜５分、一次抗体Ｉｇ１を節約した免疫組織染色を実施したい場合には６０分〜１８０分、それぞれ印加し、一次試料ｓ１を非接触にて撹拌する。滴下する一次抗体Ｉｇ１の濃度は、迅速な免疫組織染色を実施したい場合には４．０〜６．０μｇ／ｍＬ、一次抗体Ｉｇ１を節約した免疫組織染色を実施したい場合には０．２５〜１．０μｇ／ｍＬとする。また、一次抗体Ｉｇ１は、例えば、上皮性組織のサイトケラチン上の特定アミノ酸配列を抗原とした抗サイトケラチン抗体（ＡＥ１／ＡＥ３）を例示することができる。
【００３０】
また、本発明に係る免疫組織染色装置の実施で想定される一次抗体Ｉｇ１は、抗サイトケラチン抗体（ＡＥ１／ＡＥ３）のほか、ＨＥＲ−２上の特定アミノ酸配列、ＣＥＡ上の特定アミノ酸配列、ｐ５３上の特定アミノ酸配列、α−フェトプロテイン上の特定アミノ酸配列を抗原とする一次抗体等が特に有効であると見込める。
【００３１】
次に、非接触撹拌した一次試料ｓ１をＰＢＳにて約１〜６０秒前後洗浄し、この一次試料ｓ１に対して二次抗体Ｉｇ２を滴下して、スライドグラスに固定した二次試料ｓ２とし、対向電極１１が試料載置側電極１２よりもマイナスになるようにして変動電界を２分印加し、二次試料ｓ２を非接触にて撹拌する。滴下する二次抗体Ｉｇ２は、一次抗体Ｉｇ１との組み合わせを考慮しつつ、適宜市販のものを選択すればよい。本実施形態では、例えば、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（ＤＯＫＯ社）を用いている。
【００３２】
次に、非接触撹拌した二次試料ｓ２をＰＢＳにて約１〜６０秒前後洗浄し、この二次試料ｓ２に対して発色液を滴下して染色する。発色液についても、二次抗体Ｉｇ２との組み合わせを考慮しつつ適宜市販のものを選択すればよい。本実施形態では、例えば、二次抗体Ｉｇ２として用いたＥｎＶｉｓｉｏｎ（ＤＯＫＯ社）がパーオキシダーゼを多数結合させたものであるので、ジアミノベンチジン溶液であるＤＡＢ液を用いている。発色時間は約１〜５分である。
【００３３】
最後に、発色させた二次試料ｓ２をスライドグラスに固定させたまま、顕微鏡にて発色状況を観察、確認すればよい。
【実施例】
【００３４】
以下、本実施形態に係る免疫組織染色装置を用いて行った免疫組織染色方法の実施例を、２つ例示して説明する（図３参照）。
【００３５】
１）抗体節約法
【００３６】
まず、動物又はヒトの上皮性細胞組織を、凍結組織包埋剤（ＯＣＴコンパウンド）に凍結包埋するとともに、適宜の切片化器械、例えば、クリオスタットで厚さ５〜１０μｍの薄切り切片とし、この切片をスライドグラスに貼り付け、室温でアセトン中に２分間浸してスライドグラスに固定した。次に、スライドグラスに固定した切片を、ＰＢＳにて３０秒洗浄し、ＯＣＴコンパウンドを除去した。なお、切片の周囲には、一次抗体、二次抗体を滴下したとき、これらの表面張力を保つためにダコペン（ＤＯＫＯｐｅｎ）でマークした。
【００３７】
一次抗体には、抗サイトケラチン抗体（ＡＥ１／ＡＥ３）を用い、１％牛血清アルブミン添加ＰＢＳに、後述する濃度で溶解した。
【００３８】
次に、免疫組織染色装置の試料室１の試料載置側電極１１と対向電極１２との間に、スライドグラスに固定した切片を載置し、続いて、この切片に対してサイトケラチン抗体（ＡＥ１／ＡＥ３）を滴下し、対向電極１１が試料載置側電極１２よりもマイナスになるようにして変動電界を印加し、非接触にて撹拌した。なお、このときの抗体濃度は、１．０〜０．２５μｇ／ｍＬであり、１５０〜２００μＬ滴下した。また、変動電界を印加した時間は、６０〜１８０分間である。電界条件は、電圧３．４ｋＶ（３．０〜３．８）、オフセット２．４ｋＶ（２．０〜２．８）、周波数１８Ｈｚ（±２）、電界間距離６ｍｍ、電界強度０．５３３ｋＶ/ｍｍ、バースト１５サイクル（１５〜３０）、波形矩形波である。
【００３９】
次に、サイトケラチン抗体と非接触撹拌により抗原抗体反応させた切片をＰＢＳにて１０秒間洗浄し、サイトケラチン抗体（ＡＥ１／ＡＥ３）を除去し、続いて、二次抗体としてのＥｎＶｉｓｉｏｎを２００μＬ滴下し、対向電極１１が試料載置側電極１２よりもマイナスになるようにして変動電界を２分印加し、非接触にて撹拌した。なお、このときの抗体濃度は、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（ＤＯＫＯ社）キットに示されたとおりである。また、電界条件は、一次抗体を滴下したときと同一条件とした。
【００４０】
次に、ＥｎＶｉｓｉｏｎと非接触撹拌により抗原抗体反応させた切片をＰＢＳにて１０秒間洗浄し、発色液のＤＡＢ液によりＥｎＶｉｓｉｏｎを発色させた。そして、発色させた切片をスライドグラスに固定させたまま、顕微鏡にて発色状況を観察した。
【００４１】
観察結果は、図４に示した。
【００４２】
２）迅速法
【００４３】
２）迅速法では、免疫組織染色装置の試料室１の試料載置側電極１１と対向電極１２との間に、スライドグラスに固定した切片を載置し、続いて、この切片に対してサイトケラチン抗体（ＡＥ１／ＡＥ３）を滴下するまで、上記１）抗体節約法と同様な工程を経た。
【００４４】
そして、対向電極１１が試料載置側電極１２よりもマイナスになるようにして変動電界を印加し、非接触にて撹拌した。なお、このときの抗体濃度は、５．０μｇ／ｍＬであり、１５０〜２００μＬ滴下した。また、変動電界を印加した時間は、２分間である。電界条件は、上記１）抗体節約法と同様である。
【００４５】
その後の工程は、上記１）抗体節約法と同様である。観察結果は図４に示した。
【００４６】
コントロールとして、一次抗体濃度５．０μｇ／ｍＬ、一次抗体による抗原抗体反応を静置で６０分行い、ＥｎＶｉｓｉｏｎによる抗原抗体反応を静置で３０分行った従来法を実施し、観察結果を図４に併せて示している。
【００４７】
図４中、アルファベット（Ａ−Ｆ）を付した写真の説明は、下記［表１］に示した。
【００４８】
【表１】
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【００４９】
観察結果について述べると、図４とこれに対応する［表１］に示すように、一次抗体濃度５．０μｇ／ｍＬ、一次抗体による抗原抗体反応を静置下で６０分行い、ＥｎＶｉｓｉｏｎによる抗原抗体反応を静置下で３０分行った従来法では、癌細胞が染色された（写真Ａ）。上記２）迅速法のネガティブコントロールとした一次抗体濃度５．０μｇ／ｍＬ、一次抗体による抗原抗体反応を静置下で２分行い、ＥｎＶｉｓｉｏｎによる抗原抗体反応を静置下で２分行った方法では、癌細胞が染色されなかった（写真Ｂ）。上記２）迅速法のように、一次抗体濃度５．０μｇ／ｍＬ、一次抗体による抗原抗体反応を電界下で２分行い、ＥｎＶｉｓｉｏｎによる抗原抗体反応を電界下で２分行った方法では、癌細胞が染色された（写真Ｃ）。上記１）抗体節約法では、一次抗体による抗原抗体反応を電界下で６０〜１８０分、ＥｎＶｉｓｉｏｎによる抗原抗体反応を電界下で２分行いつつ、一次抗体濃度を１μｇ／ｍＬから０．２５μｇ／ｍＬまで濃度を振って行うと、ＤＡＢ発色は徐々に薄くなるものの、陽性と判定可能なレベルまで癌が染色された（写真Ｄ〜Ｆ）。
【００５０】
また、上記２）迅速法で行った免疫組織染色は、一連の作業時間が３０分以内、特に２１分以内で済み、術中迅速病理診断における時間的制約を十分にクリアするものであることが分かった。
【００５１】
したがって、本発明に係る免疫組織染色装置および免疫組織染色方法では、試料載置側電極と対向電極との間に載置した組織標本に対し、対向電極が試料載置側電極よりもマイナスになるように変動電界による印加し、変動電界のクーロン力によって組織標本と一次抗体、二次抗体との抗原抗体反応を非接触に撹拌させた状態で進行することができる。そうすると、撹拌によって分子の衝突が起こり、上記２）迅速法のように、抗原抗体反応を迅速化することができ、術中迅速病理診断に適用することができる。また、変動電界のクーロン力によって組織標本と一次抗体、二次抗体との抗原抗体反応を非接触に撹拌させた状態で進行することができ、上記１）抗体節約法のように、一次抗体の使用量を従来に比べ１０分の１以上減らしても、免疫組織染色を良好に実施することができる。また、上記１）抗体節約法により、実施後の廃液処理量も軽減することから、環境への配慮という付加価値を得ることもできる。
【００５２】
ここで、図５に示すように、本発明に係る免疫組織染色装置では、試料室に、例えば、５枚のスライドグラスを載置することができる構成とし、１回の作動によって複数の試料標本を同時に処理することができる構成とすることも可能である。具体的には、一組の電極の間に複数枚のスライドグラスを並べて配置する構成として変動電界を印加すれば、複数の試料標本を同時に処理することができる。また、試料室内を複数に区画してそれぞれに電極を備えさせ、各区画にスライドグラスを一枚ずつ配置する構成として変動電界を印加してもよい。図５からは、５枚のスライドグラス上の試料のすべてで発色が確認されていることが理解される。したがって、術中病理診断の細胞診において求められる、いわゆる多数枚処理に対応することができ、臨床現場の要求に応える免疫組織染色装置として提供することができる。
【００５３】
以上、本発明に係る各種の実施形態を説明したが、本発明は、上記実施形態に限定されるものではない。そして、本発明は、特許請求の範囲に記載された事項を逸脱することがなければ、種々の設計変更を行うことができる。また、特許請求の範囲に記載された事項を逸脱しなければ、本発明を構成する要素（例えば、装置を構成する部品、実施に必要な備品等）は、公知又は周知のもの若しくはこれらを改良したものが使用可能である。
【００５４】
また、本発明は、術中迅速病理診断に用いる場合、上記実施例のように、リンパ節の微小がん検出に係るものに限定されず、肝癌、乳癌、大腸癌、食道癌などの消化器系の癌等の術中迅速病理診断に利用できることはいうまでもない。さらに、抗体節約法として活用する場合には、一般に医歯薬学分野や生物学分野の研究開発で行われている免疫組織染色に、ほぼ例外なく適用することができるものである。
【符号の説明】
【００５５】
１・・・試料室
１１・・載置側電極
１２・・対向電極
Ｉｇ１・一次抗体
Ｉｇ２・二次抗体
ｓ１・・一次試料
ｓ２・・二次試料
ｔ・・・組織標本
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図４】
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【図５】
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