(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
電荷注入コンタクトを有するトップコンタクト型の有機電界効果トランジスタ(OFET)を含む、医療用センサおよび／または医療用細胞刺激デバイスとしてのデバイスであって、前記有機電界効果トランジスタが、式(I)
【化１】
0005577473.tif 000005
に従う、窒素原子がアルキル基で置換されたペリレンジイミド誘導体(PTCDI)によって形成される半導体層を含有し、
前記電荷注入コンタクトを被覆して堆積した、式(I)に従う、窒素原子がアルキル基で置換されたペリレンジイミド誘導体(PTCDI)、及びペンタセンからなる群から選択される有機化合物のキャッピング層を含むことを特徴とするデバイス。
【請求項２】
前記窒素原子における2つのアルキル基が同じ数の炭素原子を有するn−アルキル基である、請求項1に記載のデバイス。
【請求項３】
前記n−アルキル基が、5、8、12、13、14、又は、18個の炭素原子を有する、請求項2に記載のデバイス。
【請求項４】
式(I)に従う、窒素原子がアルキル基で置換された前記ペリレンジイミド誘導体(PTCDI)が、N,N'−ジトリデシルペリレン−3,4,9,10−テトラカルボン酸ジイミド(P13)である、請求項1に記載のデバイス。
【請求項５】
前記キャッピング層が、N,N'−ジトリデシルペリレン−3,4,9,10−テトラカルボン酸ジイミド(P13)から作製される、請求項1に記載のデバイス。
【請求項６】
前記キャッピング層が均一の厚さを有する、請求項1に記載のデバイス。
【請求項７】
前記キャッピング層が、35から100nmまでの最大厚さを有する、請求項1に記載のデバイス。
【請求項８】
前記最大厚さが、40から70nmまでの範囲に含まれる、請求項7に記載のデバイス。
【請求項９】
OFETの境界に対応して、不活性材料の枠構造堆積物が前記キャッピング層上に存在する、請求項1〜8のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１０】
同時に、医療用センサであり、且つ医療用細胞刺激デバイスである、請求項1〜9のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１１】
前記有機電界効果トランジスタが、有機発光トランジスタである、請求項1〜10のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１２】
生物学的細胞活性のin vitroでの感知システムとしての請求項1又は10に記載のデバイスの使用。
【請求項１３】
生物学的細胞活性に対するin vitroでの刺激デバイスとしての請求項1又は10に記載のデバイスの使用。
【請求項１４】
生物学的細胞活性に対するin vitroでの刺激デバイスとしての、且つ、生物学的細胞活性のin vitroでの感知システムとしての請求項10に記載のデバイスの使用。
【請求項１５】
前記生物学的細胞活性がニューロンのものである、請求項12〜14のいずれか一項に記載のデバイスの使用。
【請求項１６】
生物学的細胞活性をモニターする方法であって、
・請求項1に記載のデバイスを準備するステップ、
・前記キャッピング層上に、生物学的細胞材料を堆積させるステップ、
・前記デバイスを水系システムに接触させるステップ、及び
・前記生物学的細胞材料の活性をモニターするステップ
を含む方法。
【請求項１７】
生物学的細胞活性を刺激する方法であって、
・請求項1に記載のデバイスを準備するステップ、
・前記キャッピング層上に、生物学的細胞材料を堆積させるステップ、
・前記デバイスを水系システムに接触させるステップ、及び
・前記生物学的細胞材料の活性を刺激するために前記デバイスを運転するステップ
を含む方法。
【請求項１８】
生物学的細胞活性を刺激し、且つ生物学的細胞材料をモニターする方法であって、
・請求項10に記載のデバイスを準備するステップ、
・前記キャッピング層上に、生物学的細胞材料を堆積させるステップ、
・前記デバイスを水系システムに接触させるステップ、
・前記生物学的細胞材料の活性を刺激するために前記デバイスを運転するステップ、及び
・前記生物学的細胞材料の活性をモニターするステップ
を含む方法。
【請求項１９】
前記生物学的細胞材料がニューロンを含む、請求項16〜18のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
広範囲の可能な応用及び用途を考慮すると、有機電界効果トランジスタ(OFET)及び有機発光トランジスタ(OLET)は興味を引くデバイスである。これらのデバイスの構造に対するさらなる詳細は、その教示が参照により本明細書に組み込まれる特許文献１において見い出すことができる。
【０００２】
特に、有機半導体デバイスを使用して、神経細胞の生体電気活動をリアルタイムでモニタするための有機マルチトランジスタアレイを首尾よく作り出すことができるが、幹細胞分化及び神経突起伸展に作用し、且つ伸長している軸索の方向性に影響することが示されている、電流への直接的曝露による、又は、電界を介した、神経細胞の電気刺激にも利用することができる。
【０００３】
本発明によるデバイスの特徴は、健康産業、環境モニタリングにおいて広く可能性を有する、水中で機能し得るOFETベースのセンサのための基盤プラットフォームとして、生物学関係を離れても実に将来有望である。
【背景技術】
【０００４】
種々様々な微細加工されたデバイスが、例えば非特許文献１に記載されているように医学及び生物学における応用のために開発されてきた。
【０００５】
生物電子工学の分野における重要な挑戦の1つは、細胞の生体電気活動の定量的シグナルへの変換、又は、選択的な電気刺激の供給を可能にし、侵襲性のモニタリング及び攪乱するアプローチを回避するデバイスの開発である。
【０００６】
これらのデバイスは、機能的な電気刺激による損傷後の体の機能を回復するために、in vitroでの生体系のリアルタイムモニタリングにおいて、又は、神経プロテーゼ等のin vivoでの生物医用マイクロインプラントとして適用されている。治療的処置としての電気刺激は、特に神経への適用のための生体組織工学の分野において急速に発展している領域であり、例えば、非特許文献２に記載されているように、電気刺激がin vitroでの神経突起及び軸索伸長、並びに、in vivoでの神経再生を増大させるということを数多くの報告が示している。
【０００７】
無機半導体に基づくいくつかのバイオインターフェイス(bio-interfaced)デバイスがすでに実現されている。例えば、神経科学における電気生理学的応用のためのマルチアレイ電極及び電界効果デバイスが、市販のデバイスが入手可能になる程度まで製作及び開発されてきた。シリコンベーストランジスタによる神経の単細胞又は切片からの記録が報告されている。さらに、高密度のSiナノワイヤトランジスタアレイが作り出されてきており、シナプスレベルでの心筋細胞又はニューロンにおける電気信号の検出及び調節を可能にしている。これらの観察の重要性にもかかわらず、報告されたアプローチは、低容量性カップリングよる制限された感度に直面し、ニューロンの付着のために表面の化学的コーティングを必要としている。さらに、シリコンベースの電子デバイスは、最終的な応用システムの費用を上げている。最後に、シリコンベース微小電極はin vitroで優れた性能を示すにもかかわらず、in vivoでの神経組織への長い曝露の間、著しい生物付着及び低い生体適合性が観察されてきた。
【０００８】
有機材料を利用するマイクロ電子システムは、従来のシリコンベースのシステムと比較して多くの利点を示す。非特許文献３に記載されているように、有機電子デバイスは、低減された費用で大規模な製作を可能にする溶液処理を含む可能性のある製造の利点を有する。
【０００９】
マイクロ電子デバイスが直接生物と相互作用する場合、(1)細胞の生物学的活性が維持されるべきである、(2)デバイスは、少なくともin vitroで生物学的環境を模倣する状態で作動することができるべきであるという2つの主な条件を満たすべきである。
【００１０】
第1の要件は、主に、第1の例において例えば神経細胞等の生物学的試料との界面である有機半導体層に向けられている。しかし、神経細胞は、その生理学的機能を維持するために混乱のない環境を必要とする非常に高度に組織化され且つ複雑なシステムである。特に、有機半導体との相互作用による神経細胞の電気生理学的特性(すなわち、興奮性膜特性)の変化は、デバイスの作動中に信頼できる結果を得るために回避するべきである。さらに、細胞の生体電気機能をモニター及び制御することは、in vitroでの細胞界面相互作用間の力学的関係を定めることに関連している。この状況において、現在まで、有機半導体材料上での増殖及び付着に関するデータが報告されてきたにもかかわらず、神経の生物学的機能を支持する、ニューロン発火能、又は、電気生理学的な膜の特性に対する有機層の効果に関する証拠は報告されていないということを強調しなければならない。
【００１１】
上記の第2の要件を満たすために、非特許文献４に教示されているように、再吸収可能な電子的活性材料を一体化したデバイスが、電子的機能を有する一時的な医療用インプラントとしての使用のために実現されてきた。さらに、空気及び水に対して安定なOFETが作り出され、報告されている。
【００１２】
非特許文献６及び非特許文献７には、P13で形成された半導体層を含む電荷注入コンタクトを備えた有機電界効果トランジスタが開示されている。
【００１３】
特許文献２には、追加の多孔性(細胞の)の平面電位感知型電極に有効に接触している生細胞を含む、生体電子センサとして適している生体電子デバイス、および、例えば薬物スクリーニングのための、刺激に対する細胞の反応を測定する方法が開示されている。
【００１４】
非特許文献７には、生理環境に近い環境中での神経電極を通す刺激電流を発生させるのに用いられる、ペンタセンベースの有機電界効果トランジスタマイクロマシン化されたポリイミドベースの神経刺激電極アレイが開示されている。
【００１５】
有機電界効果トランジスタ(OFET)において、活性材料は有機半導体薄膜であり、電荷の蓄積及び輸送は、有機層と誘電体層との界面にて最初の数ナノメートルで生じる。細胞がOFET内の有機膜上に付着し増殖する場合、細胞膜及び電荷輸送領域の近くを通じて薄膜型トランジスタの反応を増大することができることが予想される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】国際特許出願WO2004086526号
【特許文献２】米国特許出願公報第2009/0032411号
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Poghossianら、「Field-effect devices for detecting cellular signals」、Seminars in Cell & Developmental Biology、2009年、41〜48頁
【非特許文献２】Sujithら、「Functional electrical stimulation in neurological disorders」、European journal of neurology、2008年、437頁
【非特許文献３】Bystrenovaら、「Neural Networks Grown on Organic Semiconductors」、Advanced Functional Materials、2008年、1751〜1756頁
【非特許文献４】Bettingerら、「Organic thin-film transistors fabricated on resorbable biomaterial substrates」、Advanced Materials、2010年、651頁
【非特許文献５】Min-Junら、「Air stable, ambipolar organic transistors and inverters based upon a heterojunction structure of pentacene on N, N’ ditridecylperylene-3,4,9,10-tetracarboxylic di-imide」、App. Phys. Lett.、AIP American Institute of Physics、Melville、NY、US、vol.97、No.2、2010年7月13日、23506-1〜23506-3頁
【非特許文献６】Michele Muccini、「A bright future for organic field-effect transistors」、Nature Materials、vol.5、No.8、2006年8月1日、605〜613頁
【非特許文献７】Dara Feiliら、「Matrix-addressable, active electrode arrays for neural simulation using organic semiconductors-cytotoxicity and pilot experiments in vivo」、Journal of Neural Engineering、Vol.5、No.1、2008年3月1日、68〜74頁
【非特許文献８】Cumminsら、「Voltage-clamp and current-clamp recordings from mammalian DRG neurons」、Nature Protocols、2009年、1103〜1112頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
したがって、本発明の目的は、既知のシステム及びデバイスに比較して改善された運転の能力がある、水系システムにおいて使用されることになるデバイスである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明は、その第1の態様において、本願の請求項１で定義される通り、式(I)に従う、窒素原子がアルキル基で置換されたペリレンジイミド誘導体(PTCDI)で作製される層を含有する電荷注入コンタクトを有する有機電界効果トランジスタ(OFET)を含む水系システムセンサから成る。
【００２０】
【化１】
0005577473.tif 000002
【００２１】
好ましくは、式(I)のペリレンジイミド誘導体の窒素原子における2つのアルキル基は、n−アルキル基である。
【００２２】
本発明を実行するのに最も有用なペリレンジイミド誘導体化合物は、窒素原子上に同じ数の炭素原子を有する2つのアルキル基を有する。
【００２３】
好ましくは、アルキル基は、5、8、12、13、14、又は、18個の炭素原子を有し、さらに好ましくは、ペリレンジイミド誘導体は、N,N'−ジトリデシルペリレン−3,4,9,10−テトラカルボン酸ジイミド(P13)層である。
【００２４】
本発明は、さらに、以下の図及び図面の助けをかりて例示される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】図1Aは、P13膜の形態を示す図である。
【図１Ｂ】図1Bは、P13膜の形態を示す図である。
【図２】図2Aは、本明細書におけるOFETに対する概略図を示し、図2B〜2Fは、デバイスの異なる部分における光ルミネセンス発光を示す図である。
【図３】図3Aは、初代DRG培養における神経細胞の立証のための略図を示し、図3B〜3Fは、試験的特性評価の結果を示す図である。
【図４】図4は、DRG神経の電気生理学的特性における種々の特性評価の結果を示す図である。
【図５】図5A〜5Cは、細胞培養処置前後のP13OFETの電気的特性評価を示す図である。
【図６】図6a及び6bは、適した有機層で覆われる前後の、本明細書におけるOFETに対するn型電荷の増幅特性曲線の比較を示す図である。
【図７】図7は、適した有機層で覆われる前後の、本発明によらないOFETのp型電荷の増幅特性曲線の比較を示す図である。
【図８ａ】図8aは、本発明により実現されたP13で覆われたOFETに対する細胞刺激の結果を示す図である。
【図８ｂ】図８bは、本発明により実現されたP13で覆われたOFETに対する細胞刺激の結果を示す図である。
【図８ｂ−１】図8b-1は、図8bの単一信号の拡大図を示す図である。
【図８ｃ】図８cは、本発明により実現されたP13で覆われたOFETに対する細胞刺激の結果を示す図である。
【図９】本発明により実現されたペンタセンで覆われたOFETに対する細胞刺激の結果を示す図である。
【図１０】本発明により実現されていないP13で覆われたOFETに対する細胞刺激の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の実施形態によると、本発明によるOFETは、電極を保護するためのキャッピング層を含む。上述のキャッピング層も、好ましくは、式(I)に従う、窒素原子がアルキル基で置換されたペリレンジイミド誘導体(PTCDI)、又は、ペンタセンから作製される。好ましくは、キャッピング層はP13から作製される。
【００２７】
キャッピング層の最大厚さは、35nmから100nm、好ましくは40から70nmまでの範囲に含まれるものとする。最大厚さは、有機半導体層に対応するキャッピング層の厚さであるが、一般的に、デバイスの電荷注入電極に対応する厚さは、この状況がデバイスに均一の高さをもたらすため、これらの要素の高さによって低減される。代わりの実施形態において、キャッピング層は電荷注入コンタクトに対応してのみ置くことができる。この後者の解決策は、製造プロセスにおける必要とされるより高度な寸法制御に関連したいくつかの欠点を示し、より劣化の傾向がある境界領域又は縁を保護するということにおいてより能率的ではないという状態も生じる。
【００２８】
また、デバイスはさらに、OFETの境界に対応して、樹脂、好ましくはエポキシ樹脂等の適した不活性材料から作製された枠構造堆積物(framing deposit)をキャッピング層上に含み、試験中に水系の環境を維持するために「くぼ地」を作り出してもよい。
【００２９】
本発明によると、生物学的活性を感知する、又は細胞中に機能的及び構造的修正を誘導する手段を、OFET構造物に提供できる新規のアプローチ及び技術の使用が提供され、さらにより好ましい実施形態において、極めて注目すべきデバイスの使用は、感知機能と刺激機能とを組み合わせる。実際のところ、本発明のデバイスを用いて、細胞に刺激を提供すること(デバイスの駆動機能)、及び、そのような刺激が細胞に対して引き起こす効果をモニターし、且つ観察すること(デバイスの感知機能)が同時に可能である。さらにより好ましい実施形態において、デバイスは、式(I)に従い、窒素原子がアルキル基で置換されたペリレンジイミド誘導体(PTCDI)を用いて作製された発光OFET(OLET)であり、その中では、デバイスによる発光によって刺激が与えられ、さらに、デバイスによる電気信号又は発光若しくは発光における変化によって感知が与えられる。
【００３０】
特に、現在、実際のin vitroでの細胞培養環境、すなわち、5%のCO2、95%の湿度、及び37℃の温度の有機電子デバイスに対する効果は、首尾よく報告されていない。
【００３１】
式(I)に従う、窒素原子がアルキル基で置換されたペリレンジイミド誘導体(PTCDI)は、生体適合性デバイスへの一体化に適した化合物である。生細胞染色に対する蛍光色素として利用される場合、海馬ニューロン(hyppocampal neuron)を用いたとしても優れた生体適合性を表示した。さらに、たとえ液体環境においてこれらのデバイスを首尾よく利用する可能性が、後に正確に定められる通り、最も興味深い液体環境の特性も考慮に入れて、まったく予想外且つ不測のものだと分るとしても、近年に至って、安定した単極のOFTE及び二極性のOFTEを実現するためにペリレンジイミド誘導体が使用されてきた。
【００３２】
説明の以下の部分において、通常、構造物及び結果は、ペリレン誘導体としてP13を参照して示すが、そのような化合物は、式(I)に従う、窒素原子がアルキル基で置換されたペリレンジイミド誘導体(PTCDI)を参照して、本発明の実現に適した最も広い部類のペリレン誘導体の一例にすぎないということが理解及び強調される。
【００３３】
水系システムとして、実際のin vitroでの細胞培養環境(すなわち、5%のCO2、95%の湿度、及び37℃の温度)又は、これらの状態が保たれるいかなる環境等の、生理溶液を含有する、トランジスタが曝露されるあらゆる液体環境が意図される。水系システムは、細胞培養のための水系溶液、すなわち、10%のウシ胎児血清(FBS)及び成長因子(50ng/mlの神経成長因子(NGF)として、グリア由来の神経成長因子又は一般的にニューロトロフィン若しくはプレイオトロフィン(pleiotrofin))、さらに最終的には特定の細胞増殖の阻害剤(すなわち、シトシンb-D−アラビノフラノシド(AraC、Sigma)(1.5μg/ml))を含む、DMEM又はDMEMを追加したMEMでもある。水系システムへの抗生物質(ペニシリン及びストレプトマイシン(streptomicine)等)の追加も可能である。水系システムとして、細胞の生体電気特性を分析するために使用される種々のイオン塩組成物を有するいかなる生理食塩水(例えば、リンゲル溶液、リン酸緩衝生理食塩水、人工脳脊髄液(Artificial Crebro Spinal Fluid)、標準細胞外生理食塩水(Standard extracellular saline)等)も意図される。
【００３４】
本発明の主要な知見は、以下である。(1)DRGニューロンが、数日(2週間)後、PDL+ラミニン層で被覆されたP13(N,N'−ジトリデシルペリレン−3,4,9,10−テトラカルボン酸ジイミド)薄膜上で、高密度なネットワーク結合で付着、成長、及び分化する、(2)ニューロン発火能を保持しているP13半導体層が、完全な有効な生体適合性を示す、(3)DRG一次神経生細胞が、P-13OFETデバイス上で残存する、(4)驚くべきことに、in vitroでの細胞培養に現在適用されている標準状態への数日(16日)の曝露の後でさえも、電界効果トランジスタは依然としてよく機能する、(5)生理溶液及び細胞培養培地において行われたCLSM(共焦点レーザー走査顕微鏡)及びAFM(原子間力顕微鏡)分析からの補足的な情報は、生細胞を用いた試験に必要とされる水性環境への長期の曝露に耐えるのにP13が構造的及び形態学的に適していることを強く示している。
【００３５】
本発明者による結果は、出生後のラットからの一次感覚DRGニューロンが、P13-PDL−ラミニン被覆された表面上で多くの日数生存可能なままであり、さらに、神経突起の伸長を示したことを明確に示している。重要なことに、P-13薄膜上で成長した末梢神経は発火し、さらに、例えば、Cumminsら、学術論文「Voltage-clamp and current-clamp recordings from mammalian DRG neurons」、Nature Protocols、2009年、1103〜1112頁によって従来技術において以前に報告されたものに似た興奮性特性を保持した。加えて、本発明者は、P-13-n型OFETの電気性能に対するin vitroでの神経細胞培養環境の影響を測定する。驚くべきことに、P13ベースのOFETは、16日間のin vitroでの処置後、電子移動度及び閾値電圧値の点におけるその特徴を維持しており、5%のCO2、95%の湿度、及び37℃の温度(典型的な実際のin vitroでの状態)との相互作用後に本デバイスが作動する能力を示している。極めて重要なのは、P13薄膜の形態は、生理溶液への曝露後に著しく変わることはないということである。
【００３６】
まとめると、本発明者等の結果は、(式(I)に従う、窒素原子がアルキル基で置換されたペリレンジイミド誘導体(PTCDI)の好ましい代表物としての)P13に基づく新規の有機半導体プラットフォームを開示しており、当該有機半導体プラットフォームは、細胞活性の変換及び電気刺激の供給のための完全に生体融和型(bio-integrated)有機電子デバイスを開発するという目標に向かう重要なステップを表している。
【００３７】
単離したラットDRGニューロンの培養物は、in vivoでの神経損傷前部分(
pre-nerve injured lesion)の存在下又は非存在下での末梢神経系の個々のニューロンの再生伸長能力を決定するために正しいと証明されたモデルである。さらに、in vivoでの侵害受容のニューロンの機能的特性の多くは、DRGからの小規模で培養されたニューロンにおいて再現されることが知られている。
【００３８】
したがって、本発明者は、カバーガラス上に設けられた50nmのP13薄膜上で、出生後のマウスからのDRG一次ニューロンを培養しようと努めた。表面への細胞標本の適切な付着を確実にするために、ポリ−D−リシン(PDL)及びラミニンでP13層を処理した。最初は、全体として負の表面電荷を有する、細胞が同様に荷電したガラス表面に付着するのを可能にするために現在使用されているポリカチオン分子であり、その鏡像異性配置は、ポリカチオン分子がタンパク質分解活性に耐えるのを可能にし、細胞生理に干渉しない。細胞外マトリックス由来のタンパク質であるラミニンはPDLと相互作用し、その電荷を保護し、さらに、神経細胞にとってより生物学的な表面を提供する。
【００３９】
次に、デバイスの作動に対する細胞培養処置の効果を検証するために、異なる時点での上記の処置前後でデバイスの性能を評価し、電界効果トランジスタの挙動に対するイオン種の起こり得る影響を回避するために水を用いて繰り返し洗浄した後で処置後測定を行った。
【００４０】
本発明者は、Bystrenovaが、閾値電圧が2日間の特徴的な時間と共に35Vという定常状態の値まで漸近的に近づいたのに対し、数日間室温で水に浸漬したペンタセンOFETが約1桁分減った移動度を示したことを報告したことを言及した。本発明のデバイスを用いて、本発明者は、処置前後の移動度の値にほぼ差はないが、閾値電圧は、異なる温度(37℃対室温)での水におけるより長期間(16対6日)の曝露後にペンタセンOFETの閾値電圧と同等の値まで上がるということを発見した。
【００４１】
さらに、本発明者等の解決策は、Bettigerらによる上述の文献に最近開示された、吸収性の有機デバイスに関して、明確な根本的な利点を有する。実際、その場合、nPVA及びxPVA誘電体を利用するデバイスの水又はリン酸緩衝生理食塩水への曝露は、構造物の層間剥離によって直ちにデバイスの故障を生じた。
【００４２】
最後に、細胞培養培地への曝露に対するP13薄膜の形態が、AFMを行うことによって測定された(図1)。P13膜の形態は、中間（メゾスコピック）の長さスケールでDMEM-Mediaの細胞培養において保持され、rms粗さは空気中で測定されたものと同等である(図1A及び1B)。
【００４３】
本発明を用いて、OFETに基づく電子トランスデューサの開発における困難なステップを克服することが可能である。実際、本発明者は、電界効果輸送も神経の生理学的発火特性も維持する単一のデバイス構成において有機半導体層及び神経細胞を結合することができるということを初めて証明した。
【実施例】
【００４４】
＜実施例１＞
N,N'−ジトリデシルペリレン−3,4,9,10−テトラカルボン酸ジイミドOFETを、トップコンタクト及びボトムゲートの構成で製作した(図2Aを参照)。基板は、ゲート電極として作用する150nm厚の酸化インジウムスズ(ITO)の層で被覆された2.54cm(1インチ)角のガラスから成る。基板洗浄手順は、起こり得る有機汚染を取り除くために、ジクロロメタン、アセトン、エタノール、及びUHP水の複数の超音波処理から成った。基板を窒素グローブボックス(O2及びH2Oの濃度は1ppm未満)内に導入すると、600nm厚のPMMA膜をその上にスピンコーディングした。次に、グローブボックスにおいて12時間120℃でPMMA膜をアニールし、膜の厚さを約450nmまで減らした。
【００４５】
PMMA/ITO/ガラス上及び顕微鏡カバーガラス基板上の両方での細胞プレーティング前の試料の空気曝露を防ぐために、窒素グローブボックスに直接接続されたKurt J. Lesker Spectroチャンバにおいて10〜8mバールのベース圧力で高真空での昇華によって、P13薄膜を生成した。半導体層は、水晶微量天秤を用いて測定された15nmというごくわずかの厚さを有した。成長速度は、0.1Å/sにて固定した。
【００４６】
P13OFETの場合、試料を室温で保ったまま、0.5Å/sの成長速度にて10-6mバールのベース圧力での高真空でAu電極を蒸着させた。電極の厚さは50nmであった。チャネルの長さ及び幅は、それぞれ70μm及び15mmであった。OFETの電子的特性解析を、B1500AのAgilent半導体に結合された光電子調査を行うために適応させたSUSSプローブステーションを使用してグローブボックス内で行った。
【００４７】
DRGニューロンの初代培養物を、一般的に使用されるプロトコルに従い、出生後のp14〜p18のラットから調製した。ラットの子(Wistar)は、アロタン(alotan)によって麻酔をかけ、さらに、断頭によって殺した。ラットから約30個の神経節を取り出し、顕微解剖はさみを用いて根元を切断し、次に、氷冷PBS内に置いた。ダルベッコー修飾イーグル培地(DMEM、Gibco)中ですすいだ後、60〜75分間37℃、5%のCO2にて、5000U/mlのタイプIVコラゲナーゼ(Wentinghton)を含有するDMEM内に神経節を置き、次に、0.5mm及び0.6mmの殺菌した針に何度か通過させて穏やかに分離させた。再懸濁及び遠心分離によって細胞を2回洗浄し、次に、10%のウシ胎児血清(FBS)を含有する1mlのDMEM培地において適切に希釈した。細胞懸濁液を、50nmのP13薄膜が生成される19mmの丸いカバーガラス上、又は、P13-OFETデバイスの上面（トップ）に滴下した。膜又はデバイスを、50mg/mlのポリ−D−リシンで予め被覆し、続いて10mg/mlのラミニン(Sigma)で被覆し、37℃、5%のCO2インキュベータ内に置いた。50ng/mlの神経成長因子(NGF)及びシトシンb-D−アラビノフラノシド(AraC、Sigma)(1.5μg/ml))の存在下で、10%FBSを添加したDMEM(Gibco)中に細胞を維持し、グリア細胞の発現を減らした。20Xの油浸対物レンズ及びHamamatsu ORCA CCDカメラを備えたNikon Eclipse2000−Eレーザースキャン共焦点顕微鏡を用いて任意選択で画像化することによって、in vitro(div, days in vitro)で3日、5日、9日、及び15日後、細胞培養物を任意選択で可視化した。報告した画像は、3つの異なる細胞培養調製物の代表物である。
【００４８】
P13-OFET上に蒔かれたDRG細胞培養を、カスタム・メードの試料ホルダーに載せ、フルオレセイン二酢酸エステル(Sigma Aldrich)と共に5分間インキュベートした。生理食塩水溶液ですすいだ後、Nikon Eclipse2000-Eレーザースキャン共焦点顕微鏡(40X油浸対物レンズ)を使用して一連の共焦点レーザー走査画像を撮った。ガラス基板を通して、P13OFET上に蒔かれた細胞の蛍光、及び、P13膜の光ルミネセンス信号を収集した。
【００４９】
P13-PDL+ラミニンで培養した細胞が、異なる細胞体の直径を有する広がったニューロンの存在(図3B、矢印)、及び、グリア細胞の層上で伸長が一列に並ぶプロセスによって特徴づけられることが3日後の形態学的観察によって明らかになった。数日後に密なネットワークの接続で発展する(図3D)マークされた神経突起伸長を5日のin vitro(div)後に観察した(図3C)。
【００５０】
＜実施例２＞
初代DRG培養における神経細胞の存在を検証するために、成熟ニューロンによって発現される典型的なマーカーである神経細胞の核タンパク質(NeuN)に対する抗体の使用によって免疫蛍光染色を行った。PDL+ラミニンからのNeuN陽性細胞の平面共焦点画像(図3E)によって、DRGニューロンに対して報告された形態学的表現型を有する丸い細胞のほとんどがNeuN陽性細胞であったということが明らかになった。
【００５１】
成長関連タンパク質GAP-43は、細胞体、胎仔及び新生仔のラット脳の伸長する神経突起、並びにDRG感覚ニューロンにおいて発現される典型的な軸索伸長マーカーである。図3Fに示された、5div後のP13で培養された細胞からのGAP43の免疫染色の代表的な共焦点画像は、GAP43の高レベルの発現が細胞体及びDRGニューロンの神経突起において明白であるということを示し、PDL+ラミニンで被覆されたP13薄膜上で培養された細胞における軸索の分化/再生プロセスの発生を確証している。
【００５２】
異なるP13被覆カバーガラス上に蒔かれたDRG培養物を、10〜15分間室温(RT、20〜24℃)にて0.1Mリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の4% p/vパラホルムアルデヒドで固定した。15分間室温にてPBS中3%ウシ血清アルブミン(BSA)でブロックした後、0.1%Triton X100を加えたブロッキング溶液中、1:100に希釈したマウス抗NeuN(Millipore)又はマウス抗GAP43(Sigma-Aldrich、Milan、Italy)のアフィニティー精製抗体と共に一晩細胞をインキュベートした。翌日、細胞をそれぞれ、0.1%Triton X100を含有するブロッキング溶液中、1:1000に希釈したAlexa Fluor 488コンジュゲートロバ抗マウス又はAlexa Fluor 595コンジュゲートロバ抗マウスの抗体(Molecular Probes-In vitrogen、Carlsbad、CA、USA)と共にインキュベートした。次に、カバーガラスにProlong Anti-Fade(Molecular Probes-In vitrogen)を据え付け、共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)調査を、励起光源として40X又は60X油浸及び400nmダイオード、488nm Ar+及び543nm He-Neレーザーを備えた後方散乱の状態でNikon Eclipse 2000-Eレーザースキャン共焦点顕微鏡によって実行した。
【００５３】
＜実施例３＞
P13薄膜の効果もまた、DRGニューロンの電気生理学的特性に関して解析した。この目的のために、PDL+ラミニンで被覆されたP13薄膜上での培養の10〜12日後、DRGニューロンに対して全細胞型パッチクランプ試験を実行した(図4)。DRG一次ニューロンは不均一な集団であるため、小径(＜30μm)を有するニューロンを努めて選んだ[5]。
【００５４】
収集した電気生理学的データは全て、この細胞培養タイプに対して以前に報告されたものと一致した値で、P13+PDL+ラミニン上のプレーティングがDRGニューロンの機能性を維持するということを示した。
【００５５】
全細胞型構成のパッチクランプ技術を用いて最新の記録を得た。内部標準液で満たされた場合に2〜4MΩの尖端抵抗を有するよう、薄壁のホウケイ酸ガラス毛細管からパッチピペットを調製した。膜電流を増幅し(List EPC-7)、オフライン分析(pClamp 6、Axon Instrument and Origin 6.0、MicroCal)のためにコンピュータ上に記憶した。大きな電流振幅のため、アクセス抵抗(10MΩ未満)を70〜90%補正した。室温(20〜24℃)にて試験を行った。活動電位(AP)及び神経発火特性を、100msの継続時間の-0.05から0.350nAまでの繰り返しの増加する電流パルスを注入することによって、電流固定モードで記録した。過渡容量を、記録増幅器の零調回路によって補正した。静止膜電位(Vmem)を、安定した記録を得た1分後に測定した(図4A)。閾値電流(Ith)を、APを誘起するのに必要とされる最小電流として定めた。APの電圧閾値(Vth、図4Ab)を、APの上昇行程に関する第1の点として定めた。APの振幅(図4Ac)を、ピーク(図4Ad)とAPの閾値との間で測定した。ピークまでのAPの上昇時間を、ベースラインからAPのピークまで上昇するための時間として定めた。後過分極(AHP)振幅(図4Af)を、最大過分極と最終プラトー電圧との間で測定し、AHPの継続時間は、これら2点間の時間だった(図4Af)。APのない細胞はどれも、研究から除外した。
【００５６】
発火の最大数を、1sパルスの電流注入に応じた超過のAPの数を数えることによって計算した。個々のニューロンに対する全細胞型電流−電圧(I-V)曲線を、各試験電位(以下参照)での平均ピーク内向き電流を計算することによって作成し、相対的な細胞容量値に対して標準化した。
【００５７】
＜実施例４＞
対照の細胞内及び細胞外の生理食塩水を用いて、-60mVにて細胞を保持し、50pAの増加する電流パルス群を、50から350pA振幅まで100ms(図4A)又は1s(図4B-C)の間注入した。極めて重要なのは、ニューロンの脱分極及び活動電位の生成が、閾値電流注入に応じて発生するということである。以前の研究と一致して、パッチしたニューロンの発火パターンは不定であり、1つの活動電位(位相性発火)(図4B)、並びに、繰り返しの発火(図4C)のニューロンを、長期にわたるパルス刺激(1s)後に観察した。
【００５８】
いくつかのパッチしたニューロンにおいて記録した異なる生体電気特性の平均の分析が、Table1(表1)において報告されている。分析した受動的膜特性は、細胞の電気容量及び静止膜電位(Vmem)であった。記録した細胞の電気容量及び静止Vmem値の平均は、小径(≦30μm)のDRGニューロンに対して予想したものと一致した。測定した興奮性のパラメータは、APの閾値電流(Ith)及びAPの電圧閾値(Vth)、APのピーク及び振幅、ピークまでの時間、1秒あたりの発火の数、並びに、後過分極(AHP)振幅及び継続時間を含む。
【００５９】
【表１】
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【００６０】
＜実施例５＞
さらに、P13ベースのOFETデバイスの性能に対する「in vitroでの細胞培養」の影響も解析した。
【００６１】
実際、一般に有機材料が、電荷トラッピングを促進し、最終的には深刻なデバイスの性能の低下を誘発する酸素及び湿気への曝露に悩まされるということはよく知られている。これが事実であった場合、神経ネットワークの機能的な成長には適しているが生体適合性の電界効果電子プラットフォームとしては適していないシステムを発見したであろう。
【００６２】
細胞培養条件を用いて本発明のデバイスの適合性を検証するために、DRG神経の初代培養を直接PDL+ラミニン被覆されたボトム−ゲート/トップ−コンタクトのP13OFET(図2A)上に蒔いた。上面（トップ）に液滴で濡れた細胞を有するデバイスを、生物学的試料の適した成長及び維持を確実にするために使用される37℃、5%のCO2、及び95%の湿度の標準的なin vitro条件にて生物学的インキュベータ内に保持した。ガラス/ITO/PMMA基板を通るPL信号を収集するCLSM調査を行った。図2では、5div後に行ったFDA(フルオレセイン二酢酸エステル)アッセイの平面共焦点画像が報告され、分化したDRGニューロンの形態学的表現型を有する生細胞がP13ベースのデバイス上で増殖したことを示した。後方散乱の状態及びデバイスの透明な基板を介してCLSMを行うことによって、P13デバイスの作用面積上だけでなく金の接点上でも増殖した生細胞の存在を観察することができたということは興味深い。
【００６３】
デバイスの活性物質及びFDAアッセイのPL発光はスペクトルでよく分離される(赤色及び緑色発光がそれぞれ、別個のCLSM光電子倍増管検出チャネルの中央に置かれる)ため、単一チャネルCLSM画像のマージ(図2B-D)は、P13膜のスペクトル的及び形態学的特徴がDRG神経の初代培養との相互作用によって修正されなかったことを裏付けている。さらに、緑色発光は、ほぼ完全に神経細胞内に局在化している。興味深いことに、金の電極からデバイスの活性層までの神経突起の突出を観察した(図2E)。さらに、ニューロンを支えるグリア細胞の密なネットワークも、デバイスの異なる部分において観察された(図2F)。
【００６４】
＜実施例６＞
図5では、細胞培養処置の前(図5A)並びに6日後(5B)及び16日後(5C)のペリレンOFETの電気的特性解析が報告される。特に、VDSは、ソース電極とドレイン電極との間の電圧であり、VGSは、ソース電極とゲート電極との間の電圧である。左のパネルにおいて報告した軌跡曲線は、0Vから100VまでVGSを変え、且つVGS=VDSを維持することによって得られ、一方、右のパネルにおいて報告した出力曲線は、0Vから100VまでVDSを変え、且つ各曲線に対してVGSを一定に維持することによって得られる。
【００６５】
各時点にて軌跡曲線から計算した閾値電圧及び電子移動度の値が表2において報告される。
【００６６】
【表２】
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【００６７】
驚くべきことに、P13-OFETは、16div後にも依然として完璧に機能している。電子移動度の値(μn)は、培養処置による影響を受けず、PMMA薄層(1.3nm)で機能化されたSiO2上に生成されたPTCDI-C13に基づくトップ−コンタクト/ボトム−ゲートのOFETに対して報告された移動度に匹敵する。
【００６８】
閾値電圧の値(Vth)は6div後に増加するが、6divから16divまでは一定のままである。電気曲線ヒステリシスはどの時点にも存在しない。ほぼ不変の電荷キャリア移動度と共にOFETにおけるストレス(stress)の現象の欠乏は、デバイスの劣化が、電荷注入プロセスを決定する有機/金属界面におそらく関連づけられるということが考察される。実際、本発明者は、何回かの水での洗浄後に金の接点上に最初のピンホール及びダメージの形成を観察する。この問題は、非常に疎水性の層で金属接点を覆うことによって防ぐことができる。
【００６９】
実施例5及び6は、OFETがその環境及び生物医学的応用と完全に適合性があることを示し、デバイスが劣化しない又は生物学的試料の増殖に干渉しないこと(実施例5の結果)、及び、細胞培養処置に対する条件への曝露の16日後でさえもOFETは依然としてよく機能していること(実施例6の結果)を意味している。
【００７０】
＜実施例７＞
この実施例の目的は、生理食塩液中でP13OFETを作動させることによってP13OFETの性能を評価することである。そのシステムは短時間作動する能力を持っているが、その電気的性能の低下を示し、特に、低いゲート電圧(Vg=12V)に対して高いドレイン−ソースの電流が検出された。この現象は、生理食塩水とのドレイン及びソース電極材料の好ましくない相互作用に関連づけられた。
【００７１】
したがって、この実施例は、デバイスが診断ツールとして使用される場合等、デバイスが作動させられていない、又は、所与の時間作動した場合に(実施例6の結果に従って)、そのシステムとの適合性がはるかに長期にわたったとしても、OFETをこの環境において首尾よく作動させることができるが、限られた長さの時間のみ作動させることができるということを示している。
【００７２】
＜実施例８＞
OFETデバイスを実施例1と同様に作製するが、この例では、生理食塩水環境で作動させたときの経時的なデバイスの性能を保護し、強化するために、ソース電極およびドレイン電極の両方並びにP13層の上に、さらなる保護被覆キャッピング層を堆積させる。
【００７３】
2つの異なるデバイスが、50nmの最大厚さを有するキャッピング層を用いて作製され、デバイス8AはP13キャッピング層を用いて作製され、デバイス8B(比較)が、ペンタセンキャッピング層を用いて作製される。図6A及び6Bにおいて、キャッピング層の堆積前(8A1、8B1、標準の線)及び後(8A2、8B2、より太い線)のデバイス8A及び8Bのn型電荷に対する増幅特性曲線の比較が示される。
【００７４】
これらの曲線は、デバイスのn型電荷キャリアに対する増幅特性曲線に対して有意な影響がないことを示す。
【００７５】
＜実施例９＞（比較）
OFETデバイス9を、実施例1の場合と同様に製作するが、P13を使用する代わりに、ペンタセンを、ソース電極及びドレイン電極並びにPMMA誘電体層と接触して配置される有機半導体層として使用した。
【００７６】
この場合、デバイスは、50nmの最大厚さを有するP13のキャッピング層で被覆される。実施例8の場合に従って、図7には、この場合p型電荷キャリアに対して増幅特性曲線の比較が示され、したがって、X軸にはマイナスVgがプロットされ、Y軸上にマイナスIdがプロットされており、これはペンタセン層の性質によるためであり、線9A1(標準の太さ)は、キャッピング層の追加前のp−増幅特性曲線を表し、線9A2(より太い線)は、その後を表している。
【００７７】
この場合においても、有機キャッピング層の追加に由来する影響があるが、デバイスの作動パラメータは依然として容認可能なものである。
【００７８】
＜実施例１０＞
キャッピング層がデバイスの電気特性に干渉しないことを検証するために、デバイス8Aを、生理食塩水の環境、P13キャッピング層上にニューロンが付着した生理食塩水の環境、並びに、P13キャッピング層上にニューロン及びカプサゼピン(薬理学的薬剤、ニューロン活性のモジュレーター)が付着した生理食塩水の環境において作動させた。
【００７９】
OFETには、0.2msec毎に0.02増加させる0から1Vの範囲、且つ1Vの一定のドレイン−ソース電圧を維持するゲート電圧が供給される。
【００８０】
デバイスの電気出力が記録され、図8A(生理食塩水のみ)、8B(生理食塩水+ニューロン)、8C(食塩水+ニューロン+カプサゼピン)において描写される。図8Bの次には、0.8Vの所与の電圧で得られた単一信号の拡大図が示されている。
【００８１】
デバイスは、刺激する能力も、ニューロンに対するその刺激の影響を記録する能力も持つだけでなく、加えられた医療薬剤の効果を観察する能力も持つということが確認できる。
【００８２】
＜実施例１１＞
デバイス8Bを、デバイス8Aと同じ条件で試験し、非常に類似した結果を得た。この場合、図9に示されたただ1つのプロットは、(生理食塩水+ニューロン)で得たものである。
【００８３】
実施例10及び実施例11は、キャッピング層としてのペンタセン及び(式(I)族に従い、窒素原子がアルキル基で置換されたペリレンジイミド誘導体(PTCDI)の代表として選ばれた)P13が同等のものであることを示している。
【００８４】
＜実施例１２＞（比較）
さらに、デバイス9も実施例11において概説された条件(生理食塩水+ニューロン)で試験されたが、この場合、図10から観察できるように有意な信号は記録されていない。
【００８５】
この結果は、P13の層等の適したキャッピング層の存在でさえ、有機半導体層が式(I)に従い、窒素原子がアルキル基で置換されたペリレンジイミド誘導体(PTCDI)でない場合に、作動するOFETにできないということを示している。
【図１Ａ】
0005577473.tif 000006
【図１Ｂ】
0005577473.tif 000007
【図５Ａ】
0005577473.tif 000008
【図５Ｂ】
0005577473.tif 000009
【図５Ｃ】
0005577473.tif 000010
【図６ａ】
0005577473.tif 000011
【図６ｂ】
0005577473.tif 000012
【図７】
0005577473.tif 000013
【図８ａ】
0005577473.tif 000014
【図８ｂ】
0005577473.tif 000015
【図８ｃ】
0005577473.tif 000016
【図９】
0005577473.tif 000017
【図１０】
0005577473.tif 000018
【図２】
0005577473.tif 000019
【図３】
0005577473.tif 000020
【図４】
0005577473.tif 000021
【図８ｂ−１】
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