(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
正常線維芽細胞と比較してＩＬ−８遺伝子の発現が高い肝がん細胞に対するＩＬ−８発現抑制剤であって、
リファンピシン、リファンピシン誘導体、リファンピシンの薬理学的に許容しうる塩、又は、リファンピシン誘導体の薬理学的に許容しうる塩を含有し、
前記リファンピシン又はリファンピシン誘導体が、以下の一般式（Ｉ）で示されるリファンピシン系抗生物質である、ＩＬ−８発現抑制剤。
【化１】
0005496232.tif 000007
［式中Ｒ１は水素又はＣ１−３アルキルカルボニル基を示し、Ｒ２は水素、Ｃ１−３アルキルカルボニル基、ヒドロキシカルボニルメチレン基又は置換基を有していてもよいアミノカルボニルメチレン基を示し、Ｒ３は水素、ホルミル基、Ｃ１−１０アルコキシイミノ基又は置換基を有していてもよいピペラジニルイミノ基、２，４−ジニトロアニリノイミノ基を示す。］
【請求項２】
リファンピシン系抗生物質が、リファンピシン、リファマイシン−ＳＶ、３−フォルミルリファマイシン、リファペンチン、リファマイシンＢからなる群より選ばれる請求項１に記載のＩＬ−８発現抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＬ−８発現抑制剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン８（ＩＬ−８）は、ＣＸＣケモカインファミリーに属する、分子量８ＫＤａの塩基性ポリペプチドで、好中球、Ｔリンパ球に選択的に働く走化性因子である。ＩＬ−８は、ＬＰＳ、クレスチンなどのマイトゲンや、ＩＬ−１、ＴＮＦ−αなどの炎症性サイトカインなどの刺激によって、末梢血単球、組織マクロファージ、ＮＫ細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞など種々の細胞から産生される。ＩＬ−８は様々な生物活性を有しており、好中球、Ｔリンパ球に走化誘導性を示すほか、白血球の血管内皮細胞への接着を増加させる作用や、好中球機能を活性化する作用を有している。また、ＩＬ−８は、インビボ、インビトロの両方で血管新生促進因子として機能することも知られている（例えば、非特許文献１参照）。ＩＬ−８の発現抑制剤として、カルノシン酸を有効成分とするものが知られている（特許文献１参照）。
【０００３】
一方、リファンピシン（Rifampicin）は、リファマイシンＳＶを３−フォルミル（3-formyl）化したものから半合成される抗生物質であり、３−〔［（４−メチル−１−ピペラジニル）イミノ］メチル〕リファマイシン（3-〔[(4-methyl-1-piperazinyl)imino]methyl〕rifamycin）の構造を持つ。リファンピシンは、原核生物のＲＮＡポリメラーゼに直接作用して、ＲＮＡ合成の開始反応を阻害することにより抗菌力を発揮することがすでに知られている。リファンピシンは、結核やハンセン氏病などに対して優れた治療効果を有しているため、それらの疾患の治療剤として従来より広く使用されている。
【０００４】
リファンピシンはまた、核レセプターである薬物受容体（pregnane X receptor：ＰＸＲ）のアゴニストとして知られている。ＰＸＲは、内的・外的化学物質によって活性化され、代謝や輸送のためのセンサーとして働くことが知られている。また、リファンピシンは、肝臓癌の治療剤として用い得ることが知られており（特許文献２参照）、リファンピシンと肝臓癌との関係について、リファンピシンは正常内皮細胞において、血管内皮細胞増殖因子（vascular endothelial growth factor：ＶＥＧＦ）などに代表される血管新生（angiogenesis）関連因子の遺伝子群の発現を一様かつ速やかに抑制し、その結果、Ｃ型慢性肝炎患者の肝がん発症を抑制することが報告されている（非特許文献２及び３参照）。さらに、リファンピシンは強い活性酸素除去能を有することも報告されている（非特許文献４参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１１−２５６１１８号公報
【特許文献２】特開２０１０−１１１５８２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Koch AE, Polverini PJ, Kunkel SL, Harlow LA, DiPietro LA, Elner VM, Elner SG, Strieter RM.  Interleukin-8 as a macrophage-derived mediator of angiogenesis.  Science. 1992 Dec 11; 258 (5089):1798-1801.
【非特許文献２】Shichiri M, Fukai N, Kono Y, Tanaka Y.  Rifampicin as an oral angiogenesis inhibitor targeting hepatic cancers.  Cancer Res. 2009 Jun 1; 69 (11): 4760-4768.
【非特許文献３】Shichiri M, Tanaka Y.  Inhibition of cancer progression by rifampicin: involvement of antiangiogenic and anti-tumor effects.  Cell Cycle.  2010 Jan 1; 9 (1): 64-68.
【非特許文献４】Kataoka K, Kono Y, Sugimoto M, Furuichi Y, Shichiri M, Tanaka Y. Hepatocyte-protective and anti-oxidant effects of rifampicin on human chronic hepatitis C and murine acute hepatocyte disorder. Exp Ther Med. 1, 1041. 2010.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、ＩＬ−８発現抑制剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、上記課題を解決すべく、鋭意探索の結果、リファンピシンが、優れたＩＬ−８発現抑制作用を有することを新たに見いだし、本発明を完成するに至った。また、本発明においては、リファンピシン以外にも、リファマイシン−ＳＶや３−フォルミルリファマイシンなどのリファンピシン系抗生物質が、優れたＩＬ−８発現抑制作用を有することを確認し、本発明をなした。
【０００９】
すなわち本発明は、（１）リファンピシン、リファンピシン誘導体、リファンピシンの薬理学的に許容しうる塩、又は、リファンピシン誘導体の薬理学的に許容しうる塩を含有するＩＬ−８発現抑制剤や、（２）リファンピシン又はリファンピシン誘導体が、以下の一般式（Ｉ）で示されるリファンピシン系抗生物質である上記（１）に記載のＩＬ−８発現抑制剤：
【００１０】
【化１】
0005496232.tif 000002
【００１１】
［式中Ｒ１は水素又はＣ１−３アルキルカルボニル基を示し、Ｒ２は水素、Ｃ１−３アルキルカルボニル基、ヒドロキシカルボニルメチレン基又は置換基を有していてもよいアミノカルボニルメチレン基を示し、Ｒ３は水素、ホルミル基、Ｃ１−１０アルコキシイミノ基又は置換基を有していてもよいピペラジニルイミノ基、２，４−ジニトロアニリノイミノ基を示す。］や、（３）リファンピシン系抗生物質が、リファンピシン、リファマイシン−ＳＶ、３−フォルミルリファマイシン、リファペンチン、リファマイシンＢからなる群より選ばれる上記（２）に記載のＩＬ−８発現抑制剤に関する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のＩＬ−８発現抑制剤は、優れたＩＬ−８発現抑制作用を有しており、インビトロ、エクスビボ又はインビボにおいて、ＩＬ−８の発現を効果的に抑制することができる。本発明のＩＬ−８発現抑制剤の有効成分であるリファンピシンは、長期間にわたり抗菌性の医薬として利用されて来た経緯を持つものであるから、その安全性は確認されており、その製造方法や投与方法も確立されていて、比較的安価に入手できるものであるから、本発明のＩＬ−８発現抑制剤は、実用性の高いＩＬ−８発現抑制剤として期待できるものである。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の実施例において、２種類の正常線維芽細胞（ＴＩＧ−３、ＷＩ−３８）と１１種類の肝がん細胞株（ＨｕＨ−７、Ｈｅｐ−３Ｂ、Ｈｅｐ Ｇ２、Ｌｉ−７、ＳＫ−ＨＥＰ−１、ＫＩＭ−１、ＫＹＮ−１、ＫＹＮ−２、ＫＹＮ−３、ＨＡＫ−１Ａ、及びＨＡＫ−１Ｂ）（横軸）におけるＩＬ−８遺伝子のｍＲＮＡの発現量（縦軸）を解析した結果を示す図である。各細胞株におけるＩＬ−８遺伝子のｍＲＮＡの発現量は、βアクチン遺伝子の発現量を１とした場合の相対値で示す。
【図２】本発明の実施例において、２種類の肝がん細胞株（Ｈｅｐ−３Ｂ［左図］及びＳＫ−ＨＥＰ−１［右図］）におけるリファンピシンによるＩＬ−８遺伝子発現抑制効果を解析した結果を示す図である。各細胞株におけるＩＬ−８遺伝子のｍＲＮＡの発現量（縦軸）は、βアクチン遺伝子の発現量を１とした場合の相対値で示す。図中「ＦＢＳ（＋）」は、血清含有培養液を、「ＦＢＳ（−）」は、血清不含培養液を示す。また、図中０、２５、及び５０μｇ／ｍｌは、リファンピシンの濃度を示す。
【図３】本発明の実施例において、３種類の肝がん細胞株（Ｈｅｐ Ｇ２［左図］、ＫＹＮ−３［中図］、及びＨＡＫ−１Ｂ［右図］）における、ＬＰＳによるＩＬ−８遺伝子発現の亢進に対するリファンピシンの阻害効果を解析した結果を示す図である。各細胞株におけるＩＬ−８遺伝子のｍＲＮＡの発現量（縦軸）は、βアクチン遺伝子の発現量を１とした場合の相対値で示す。図中「ＮＴ」は、血清含有培養液を、「ＬＰＳ」は、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）を含む血清含有培養液を、「ＬＰＳ＋ＲＦＰ」は、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）及びリファンピシン（２５μｇ／ｍｌ）を含む血清含有培養液を示す。なお、「ＮＴ」、「ＬＰＳ」、及び、「ＬＰＳ＋ＲＦＰ」のいずれにも、０．１％ｖ／ｖのＤＭＳＯが含まれている。
【図４】本発明の実施例において、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株を用いてリファンピシンの誘導体（リファマイシンＳＶ［左図］及び３−フォルミルリファマイシンＳＶ［右図］）によるＩＬ−８遺伝子の発現抑制効果を解析した結果を示す図である。細胞におけるＩＬ−８遺伝子のｍＲＮＡの発現量（縦軸）は、βアクチン遺伝子の発現量を１とした場合の相対値で示す。図中「ＦＢＳ（＋）」は、血清含有培養液を、「ＦＢＳ（−）」は、血清不含培養液を示す。また、図中「０及び２５μｇ／ｍｌ」は、リファンピシンの濃度を示す。
【図５】本発明の実施例において、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株を用いてＩＬ−８遺伝子発現抑制におけるリファンピシンの作用濃度を検討した結果を示す図である。リファンピシンの各濃度（横軸）におけるＩＬ−８遺伝子のｍＲＮＡの発現量（縦軸）は、βアクチン遺伝子の発現量を１とした場合の相対値で示す。また、左右の図における各プロットは、それぞれ左から順に０、１、３、１０、３０、及び１００μｇ／ｍｌのリファンピシンのそれぞれの濃度におけるＩＬ−８遺伝子のｍＲＮＡの発現量の結果を示す。
【図６】本発明の実施例において、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株を用いてＩＬ−８遺伝子発現抑制におけるリファンピシンの作用時間を検討した結果を示す図である。リファンピシン添加後の各時間（横軸）におけるＩＬ−８遺伝子のｍＲＮＡの発現量（縦軸）は、βアクチン遺伝子の発現量を１とした場合の相対値で示す。また、図における各プロットは、リファンピシン添加後、それぞれ左から順に０、１０、３０、６０、１８０、及び３００分間培養した後のＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株におけるＩＬ−８遺伝子のｍＲＮＡの発現量の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のＩＬ−８発現抑制剤としては、リファンピシン、リファンピシン誘導体、リファンピシンの薬理学的に許容しうる塩、又は、リファンピシン誘導体の薬理学的に許容しうる塩（以下、まとめて「リファンピシン等」とも表示する。）を含有することを特徴とする。本発明のＩＬ−８発現抑制剤には、リファンピシン等の中の１種類のみを用いてもよいし、リファンピシン等に含まれる２種類以上の化合物を併用してもよい。
【００１５】
本発明に用いるリファンピシン等としては、リファンピシン、リファンピシン誘導体、リファンピシンの薬理学的に許容しうる塩、又は、リファンピシン誘導体の薬理学的に許容しうる塩であって、かつ、ＩＬ−８発現抑制作用を有している化合物である限り特に制限されないが、本発明に用いるリファンピシン又はリファンピシン誘導体としては、以下の一般式（Ｉ）で示されるリファンピシン系抗生物質を好適に例示することができる。
【００１６】
【化２】
0005496232.tif 000003
【００１７】
上記一般式（Ｉ）中、Ｒ１は水素又はＣ１−３アルキルカルボニル基を示し、Ｒ２は水素、Ｃ１−３アルキルカルボニル基、ヒドロキシカルボニルメチレン基又は置換基を有していてもよいアミノカルボニルメチレン基を示し、Ｒ３は水素、ホルミル基、Ｃ１−１０アルコキシイミノ基又は置換基を有していてもよいピペラジニルイミノ基、２，４−ジニトロアニリノイミノ基を示す。
【００１８】
Ｒ２における「置換基を有していてもよいアミノカルボニルメチレン基」は、以下の一般式（II）で示される基である。
【００１９】
【化３】
0005496232.tif 000004
【００２０】
上記一般式（II）中、Ｒ４、Ｒ５はそれぞれ、水素、Ｃ１−３アルキル基を示す。
【００２１】
Ｒ３における「置換基を有していてもよいピペラジニルイミノ基」は、以下の一般式（III）で示される基である。
【００２２】
【化４】
0005496232.tif 000005
【００２３】
上記一般式（III）中、Ｒ６〜Ｒ１３はそれぞれ、水素、Ｃ１−３アルキル基を示し、Ｒ１４は水素、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ３−８シクロアルキル基、ベンジル基、２，４−ジニトロフェニル基を示す。
【００２４】
ここで、「Ｃ１−６アルキル基」とは、炭素数１〜６個の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基を指し、具体的には、メチル基、エチル基、１−プロピル基、２−プロピル基、２−メチル−１−プロピル基、２−メチル−２−プロピル基、１−ブチル基、２−ブチル基、１−ペンチル基、２−ペンチル基、３−ペンチル基、２−メチル−１−ブチル基、３−メチル−１−ブチル基、２−メチル−２−ブチル基、３−メチル−２−ブチル基、２，２−ジメチル−１−プロピル基、１−へキシル基、２−へキシル基、３−へキシル基、２−メチル−１−ペンチル基、３−メチル−１−ペンチル基、４−メチル−１−ペンチル基、２−メチル−２−ペンチル基、３−メチル−２−ペンチル基、４−メチル−２−ペンチル基、２−メチル−３−ペンチル基、３−メチル−３−ペンチル基、２，３−ジメチル−１−ブチル基、３，３−ジメチル−１−ブチル基、２，２−ジメチル−１−ブチル基、２−エチル−１−ブチル基、３，３−ジメチル−２−ブチル基、２，３−ジメチル−２−ブチル基等が挙げられる。
【００２５】
「Ｃ１−３アルキル基」は、前記Ｃ１−６アルキル基のうち、炭素数が１〜３個のものを指す。
【００２６】
「Ｃ１−１０アルコキシイミノ基」とは、炭素数１〜１０個の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基を指すＣ１−１０アルキル基が、オキシム基の有する酸素原子に結合したものを指し、具体的には、メトキシイミノ基、エトキシイミノ基、１−プロピルオキシイミノ基、２−プロピルオキシイミノ基、２−メチル−１−プロピルオキシイミノ基、２−メチル−２−プロピルオキシイミノ基、１−ブチルオキシイミノ基、２−ブチルオキシイミノ基、１−ペンチルオキシイミノ基、２−ペンチルオキシイミノ基、３−ペンチルオキシイミノ基、２−メチル−１−ブチルオキシイミノ基、３−メチル−１−ブチルオキシイミノ基、２−メチル−２−ブチルオキシイミノ基、３−メチル−２−ブチルオキシイミノ基、２，２−ジメチル−１−プロピルオキシイミノ基、１−へキシルオキシイミノ基、２−へキシルオキシイミノ基、３−へキシルオキシイミノ基、１−オクチルオキシイミノ基、２−オクチルオキシイミノ基、３−オクチルオキシイミノ基、１−ノニルオキシイミノ基、２−ノニルオキシイミノ基、３−ノニルオキシ基、１−デシルオキシ基、２−デシルオキシ基、３−デシルオキシ基、２−メチル−１−ペンチルオキシイミノ基、３−メチル−１−ペンチルオキシイミノ基、４−メチル−１−ペンチルオキシイミノ基、２−メチル−２−ペンチルオキシイミノ基、３−メチル−２−ペンチルオキシイミノ基、４−メチル−２−ペンチルオキシイミノ基、２−メチル−３−ペンチルオキシイミノ基、３−メチル−３−ペンチルオキシイミノ基、２，３−ジメチル−１−ブチルオキシイミノ基、３，３−ジメチル−１−ブチルオキシイミノ基、２，２−ジメチル−１−ブチルオキシイミノ基、２−エチル−１−ブチルオキシイミノ基、３，３−ジメチル−２−ブチルオキシイミノ基、２，３−ジメチル−２−ブチルオキシイミノ基等が挙げられる。
【００２７】
「Ｃ３−８シクロアルキル基」とは、炭素数３〜８個の環状の脂肪族炭化水素基を指し、例えば、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、シクロヘプチル基、シクロオクチル基が挙げられる。
【００２８】
「Ｃ１−３アルキルカルボニル基」とはＣ１−３アルキル基が、カルボニル基のカルボニル炭素に結合したものを指し、例えば、メチルカルボニル基、エチルカルボニル基、１−プロピルカルボニル基、２−プロピルカルボニル基が挙げられる。
【００２９】
一般式（Ｉ）で示されるリファンピシン系抗生物質では、Ｒ１としては、水素、メチルカルボニル基が好ましく、メチルカルボニル基がより好ましく、Ｒ２としては、水素、ヒドロキシカルボニルメチレン基が好ましく、Ｒ３としては、水素、ホルミル基、オクタノキシイミノ基、４−メチルピペラジニルイミノ基、４−シクロペンチルピペラジニルイミノ基、４−ベンジルピペラジニルイミノ基、２，６−ジメチル−４−ベンジルピペラジニルイミノ基、２，４−ジニトロアニリノイミノ基が好ましく、水素、ホルミル基、４−メチルピペラジニルイミノ基、４−シクロペンチルピペラジニルイミノ基がより好ましい。
【００３０】
また、一般式（Ｉ）で示されるリファンピシン系抗生物質の中で好ましいものとして、リファンピシン（Ｒ１＝メチルカルボニル基、Ｒ２＝水素、Ｒ３＝４−メチルピペラジニルイミノ基）、リファマイシン−ＳＶ（Ｒ１＝メチルカルボニル基、Ｒ２＝水素、Ｒ３＝水素）、３−フォルミルリファマイシン（Ｒ１＝メチルカルボニル基、Ｒ２＝水素、Ｒ３＝ホルミル基）、リファペンチン（Ｒ１＝メチルカルボニル基、Ｒ２＝水素、Ｒ３＝４−シクロペンチルピペラジニルイミノ基）、リファマイシンＢ（Ｒ１＝メチルカルボニル基、Ｒ２＝ヒドロキシカルボニルメチレン基、Ｒ３＝水素）を好適に例示することができ、中でも、リファンピシン、リファマイシン−ＳＶ、３−フォルミルリファマイシンをより好適に例示することができる。
【００３１】
リファンピシンの薬理学的に許容しうる塩や、リファンピシン誘導体の薬理学的に許容しうる塩は、リファンピシンやその誘導体の溶媒（例えば、水）に対する溶解度を増加させ、身体への吸収効率を向上し得る場合があるなどの点で、好ましく用いることもできる。本発明における薬理学的に許容しうる塩には、便宜上、薬理学的に許容しうる塩の水和物も含まれる。かかる塩や水和物としては、特に限定されず、医薬の製剤化において一般的に用いられている塩や、これらの塩の水和物を用いることができる。ここで、薬理学的に許容しうる塩としては、酸付加塩や、塩基付加塩等を例示することができる。
【００３２】
上記の酸付加塩としては、特に限定されないが、例えば、塩酸塩、酢酸塩、硫酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸、酒石酸塩、クエン酸塩、炭酸塩、コハク酸塩、安息香酸、臭化水素塩、ヨウ化水素塩、リン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩などを例示することができる。
【００３３】
上記の塩基付加塩としては、特に限定されないが、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、エタノールアミン塩、トリエチルアミン塩、メチルアミン塩等の有機アミン塩、アンモニウム塩などを例示することができる。
【００３４】
本発明のＩＬ−８発現抑制剤は、単独で投与してもよいが、薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物を更に含む医薬組成物の形態で投与することが好ましい。薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物としては、例えば賦形剤、崩壊剤、崩壊補助剤、乳化剤、懸濁剤、分散剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素、希釈剤、基材、溶解剤、溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、噴射剤、粘着剤を例示することができる。
【００３５】
上記の賦形剤としては、ブドウ糖、乳糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、結晶セルロース等を例示することができ、上記の崩壊剤や崩壊補助剤としては、カルボキシメチルセルロース、デンプン、カルボキシメチルセルロースカリウム等を例示することができ、上記の乳化剤や、懸濁剤や、分散剤としては、ステアリン酸ポリオキシル、ショ糖脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム等を例示することができ、上記の結合剤としては、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン等を例示することができ、上記の滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ケイ酸アルミニウム、タルク等を例示することができ、上記のコーティング剤としては、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコール、酸化チタン等を例示することができ、上記の基材としては、ワセリン、流動パラフイン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、ハードファット等を例示することができる。
【００３６】
また、注射用又は点滴用の製剤に用いる際の添加物としては、特に限定されないが、溶解剤や溶解補助剤として、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール等を例示することができ、ｐＨ調整剤として、無機酸、有機酸、無機塩基、有機塩基等を例示することができる。
【００３７】
本発明に用いるリファンピシンやリファンピシン誘導体（リファマイシン−ＳＶ、３−フォルミルリファマイシン、リファペンチン、リファマイシンＢなど）は、公知の方法によって合成することができる。まず、リファマイシンＢは、ストレプトマイセス  メディターレーネイ（Streptomyces mediterranei）の培養液から、公知の方法で分離でき（特公昭３７−１６９７号公報、第２頁右段８行〜第４頁右段３２行参照）、リファンピシン、リファペンチン、リファマイシン−ＳＶ、３−フォルミルリファマイシン（３−フォルミルリファマイシンＳＶ）などは、リファマイシンＢから、公知の方法によって合成することができる（特公昭６２−４１６７１号公報  第２頁左段３０行〜右段２７行；特公昭６２−４１６７２号公報  第２頁左段３４行〜右段３１行；特公昭６２−４１６７３号公報  第２頁左段３２行〜右段２９行；特開平１−１４９７９０号公報  第３頁右下段１２行〜７頁右上段７行、第８頁左下段４行〜１０頁左下段１４行；特開平２−３０４０９０号公報  第９段９行〜第２１段２０行；特開平２−５６４８７号公報、第１３頁左上段１８行〜１８頁左上段９行、第１９頁右上段１５行〜２８頁左上段１３行；特開平３−１６９８８４号公報、第１７頁右下段１８行〜２２頁左下段３行、第２３頁右下段１０行〜３３頁左下段２０行；特開平４−１５９２８３号公報、段落番号００３８〜００７０、００８１〜０１０７；特開平４−２３０６８８号公報、段落番号００６５〜０１０３、０１１８〜０１４７；特開平４−２４７０８８号公報、段落番号００７６〜０１２０、０１３６〜０１３９；米国特許第４，００２，７５２号参照）。なお、リファンピシンとして「リファンピシン」（Alexis社製）、リファマイシンＳＶとして「リファマイシンＳＶナトリウム塩」（MP Biomedicals社製）、３−フォルミルリファマイシンとして「３−フォルミルリファミシン」（LKT BioLabs.社製）、リファペンチンとして「リファフチン錠（商品名）」（Sanofi-Aventis社製）等が市販されており、これらの製品を使用してもよい。
【００３８】
本発明のＩＬ−８発現抑制剤は、優れたＩＬ−８発現抑制作用を有しており、インビトロ、エクスビボ又はインビボにおいて、ＩＬ−８の発現を効果的に抑制することができる。したがって、本発明のＩＬ−８発現抑制剤は、ＩＬ−８が過剰発現することに起因する疾患の予防・治療薬としても用いることができる。
【００３９】
本発明のＩＬ−８発現抑制剤の投与に当たっては、その対象に応じて、経口投与又は非経口投与（静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、或いは点眼など）のいずれの形式でも投与することができる。投与形式は、投与を受ける患者の病状に応じて適宜選択できるが、利便性及び安全性の面から、経口投与が好ましい。
【００４０】
経口投与の場合、本発明のＩＬ−８発現抑制剤は、固体又は液体の製剤、具体的には、錠剤、顆粒剤、カプセル、粉末、トローチ、溶液、懸濁液、乳液等の形態で、投与することができる。また、非経口投与の場合、本発明のＩＬ−８発現抑制剤は、適当な溶媒に溶解させた形態で、投与することができる。そのような溶媒としては、例えば、水、水性溶媒（塩化ナトリウム溶液、ブドウ糖溶液など）、水混和性溶媒（エチルアルコール、ポリエチレングルコール、プロピレングリコールなど）、及び非水性溶媒（トウモロコシ油、綿実油、落花生油、ゴマ油など）を例示することができる。
【００４１】
本発明のＩＬ−８発現抑制剤の投与量は、対象となる疾患や投与方法等によって、適宜設定することができるが、経口投与のための単位投薬量として、リファンピシン等が例えば１０〜２０００ｍｇ、好ましくは３０〜１５００ｍｇとなるような投与量を例示することができる。本発明の有効成分であるリファンピシン等は、既に結核患者等、極めて多くの患者に使用されてきた薬剤であり、その用法や副作用も熟知されているところから、本発明のＩＬ−８発現抑制剤の使用に当たっては、それらの経験に基づいた、投与形態、投与方法を用いることが出来る。
【００４２】
本発明の他の態様には、リファンピシン等の、ＩＬ−８発現抑制剤の製造における使用や、本発明のＩＬ−８発現抑制剤を、哺乳動物に投与する工程を含む、
ＩＬ−８が過剰発現することに起因する疾患の予防・治療方法や、ＩＬ−８が過剰発現することに起因する疾患の予防・治療方法に使用するためのリファンピシン等なども含まれる。
【００４３】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００４４】
１．リファンピシンにより遺伝子発現が抑制される遺伝子のスクリーニング及び同定
肝がん細胞におけるリファンピシンの作用を調べるために、肝がん細胞株にリファンピシンを添加し、遺伝子発現レベルを解析した。
【００４５】
１−１  ＲＮＡの精製
［１］肝がん細胞株（ＳＫ−ＨＥＰ−１）を１．０ｘ１０４／ｃｍ２程度の密度で、６ウェルプレートに播種し、１０％ＦＢＳ含むＤＥＭＥ（ナカライテスク社製）又はＲＰＭＩ１６４０（ナカライテスク社製）（以下、「血清含有培養液」という）存在下で２４時間培養した。
［２］血清含有培養液又は血清不含のＯＰＴＩ−ＭＥＭ（GibcoBRL社製）（以下、「血清不含培養液」という）のそれぞれに、リファンピシン溶液（５０ｍｇ／ｍｌ又は２５ｍｇ／ｍｌ in ＤＭＳＯ）を１０００倍希釈になるように加え、かかるリファンピシン（２５μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌ）を含む血清含有又は血清不含の培養液を、工程［１］の血清含有培養液と置換した。なお、上記リファンピシン溶液は、和光純薬社製の粉末リファンピシン試薬を、和光純薬製のＤＭＳＯで当該濃度に溶解して調製した。
［３］インキュベータ内（３７℃、５％ＣＯ２条件下）で５時間培養を行った後、細胞を回収し、ＲＮＡの精製を行った。ＲＮＡの精製は、RNeasy Plus Mini Kit（Qiagen社製）を用いて製品付属のプロトコールにしたがって行った。なお、コントロールとしてリファンピシンを含まない血清含有又は血清不含の培養液で培養した細胞のＲＮＡを用いた。ただし、コントロールに用いたリファンピシン不含培養液にも、リファンピシン含有培養液と同濃度のＤＭＳＯが含まれるようにＤＭＳＯを添加した。
【００４６】
１−２  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡの定量
［１］以下の１）〜４）からなる反応液を調製した。
１）２０ｎｇ／μｌＲＮＡ；２．０μｌ
２）2×QuantiFast Probe RT-PCR Master Mix（Qiagen社製）；１０μｌ
３）TaqMan Gene Expression Assayプローブ・プライマーセット（Applied  Biosystems社製）；１．０μｌ
４）ＲＮａｓｅフリーの脱イオン水；７．０μｌ
５）Reverse Transcriptase；０．１μｌ
【００４７】
TaqMan Gene Expression Assayプローブ・プライマーセットとして、後述の表１に示す１０種類の炎症関連遺伝子（ＮＦＫＢＩＡ、ＲＥＬＡ、ＩＫＢＫＢ、ＩＫＢＫＧ、ＩＫＢＫＥ、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ１２Ｂ、及びＴＮＦ）、１０種類の血管新生関連遺伝子（ＶＥＧＦＡ、ＨＧＦ、ＩＣＡＭ１、ＶＣＡＭ１、ＩＴＧＢ３、ＩＴＧＡＶ、ＦＬＴ−１、ＫＤＲ、ＦＡＫ、及びＰＥＣＡＭ）、及び１種類の活性酸素関連遺伝子（ＮＯＳ２）の計２１種類の遺伝子のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを増幅し、検出するものを用いた。なお、内部標準としてβアクチン遺伝子（ＡＣＴＢ）を用いた。
【００４８】
【表１】
0005496232.tif 000006
【００４９】
上記表１中「Accession number」は、TaqMan Gene Expression Assayプローブ・プライマーセット製品由来のものであり、かかる「Accession number」を基に、Applied  Biosystems社のホームページ（http://www5.appliedbiosystems.com/tools/cnv/）からTaqMan Gene Expression Assayプローブ・プライマーセットを検索し、使用した。
【００５０】
［２］工程［１］で調製した反応液を用いて、ABI PRISM 7000 Sequence Detection system (Applied  Biosystems社製)によるリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを、以下の１）〜３）で示した条件で行った。
１）５０℃、２０分を１サイクル（ｍＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写反応）
２）９５℃、５分を１サイクル（ポリメラーゼの活性化）
３）９５℃と６０℃との往復を４０サイクル（TaqMan Gene Expression Assayプローブ・プライマーセットによるｃＤＮＡの増幅）
［３］Baselineソフトウェア(Applied  Biosystems社製)を用いてＰＣＲ産物が一定量になるＰＣＲのサイクル数（threshold cycle；Ｃｔ値）を測定し、比較Ｃｔ法（ΔΔＣｔ法）によりβアクチン遺伝子ＰＣＲ産物のＣｔ値を基準とした上記２１種類の遺伝子ＰＣＲ産物のＣｔ値の相対値を求め、かかるＣｔ値の相対値から、上記２１種類の遺伝子由来のＰＣＲ産物の相対量、すなわち上記２１種類の遺伝子のｍＲＮＡの相対量を算出した。
【００５１】
１−３  結果
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって、リファンピシン添加による上記２１種類の遺伝子の、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞中での発現量の変動を解析した結果、リファンピシンを添加しない場合と比べて、リファンピシンを添加した場合、ＩＬ−８遺伝子のｍＲＮＡの発現量は２倍抑制されることが明らかとなった。なお、ＩＬ−８以外の他の２０種類の遺伝子については、リファンピシン添加による有意なｍＲＮＡの発現量の変動は認められなかった。また、血清含有培養液を用いた場合と比べて、血清不含培養液を用いた場合、リファンピシンによるＩＬ−８遺伝子の発現抑制効果は２．５倍高かった。リファンピシンの濃度が血清含有及び血清不含培養液で同じであるにもかかわらず、血清不含培養液でリファンピシンによるＩＬ−８遺伝子の発現抑制効果が高かった理由としては、例えば培養液中に含まれる血清がリファンピシンの細胞内への浸透性を低下させたため、血清含有培養液においては、リファンピシンによるＩＬ−８遺伝子の発現抑制効果が抑制されたことが考えられる。
【実施例２】
【００５２】
２．ＩＬ−８遺伝子の発現が恒常的に亢進している細胞における、リファンピシンによるＩＬ−８遺伝子の発現抑制効果
がん細胞の中にはＩＬ−８遺伝子の発現が恒常的に亢進しているものが知られている。そこで、リファンピシンによるＩＬ−８遺伝子の発現抑制効果が、かかる細胞においても認められるかどうかについて解析を行った。まず、２種類の正常線維芽細胞株（ＴＩＧ−３、ＷＩ−３８）と、１１種類の肝がん細胞株（ＨｕＨ−７、Ｈｅｐ−３Ｂ、Ｈｅｐ Ｇ２、Ｌｉ−７、ＳＫ−ＨＥＰ−１、ＫＩＭ−１、ＫＹＮ−１、ＫＹＮ−２、ＫＹＮ−３、ＨＡＫ−１Ａ、及びＨＡＫ−１Ｂ）におけるＩＬ−８遺伝子のｍＲＮＡの発現量について、上記実施例１記載の方法により解析を行った（図１）。その結果、４種類の肝がん細胞株（ＨｕＨ−７、Ｈｅｐ−３Ｂ、Ｌｉ−７、及びＳＫ−ＨＥＰ−１）について、ＩＬ−８遺伝子の発現が恒常的に亢進していることが認められた（図１）。その中で特にＩＬ−８遺伝子発現量が高かったＨｅｐ−３Ｂ及びＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株を用いて、上記実施例１に記載の方法によりＩＬ−８遺伝子の発現量を解析したところ、Ｈｅｐ−３Ｂ細胞を用いた場合も、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞を用いた場合と同様に、ＩＬ−８遺伝子の発現抑制効果が認められた。すなわち、Ｈｅｐ−３Ｂ細胞株を用いた場合、リファンピシン（２５μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌ）を含む血清含有培養液を用いたときには約３０％、リファンピシン（２５μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌ）を含む血清不含培養液を用いたときには約８０％のＩＬ−８遺伝子の発現を抑制することが明らかとなった（図２の左図）。また、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株を用いた場合、リファンピシン２５μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌ）を含む血清含有培養液を用いたときには約５０％、リファンピシン２５μｇ／ｍｌ又は５０μｇ／ｍｌ）を含む血清不含培養液を用いたときには約８０％のＩＬ−８遺伝子の発現を抑制することが明らかとなった（図２の右図）。これらの結果は、ＩＬ−８遺伝子の発現が恒常的に亢進している細胞においても、リファンピシンによるＩＬ−８遺伝子の発現抑制効果が認められることを示している。
【実施例３】
【００５３】
３．ＬＰＳ（Lipopolysaccharide；リポ多糖）によるＩＬ−８遺伝子発現の亢進に対するリファンピシンの阻害効果
さらに、ＩＬ−８遺伝子の発現量が少ない細胞においても、ＬＰＳによりＩＬ−８遺伝子の発現量を亢進させた場合、同様にリファンピシンによるＩＬ−８遺伝子発現抑制効果が認められるかどうかを解析した。ＩＬ−８遺伝子の発現量が少ない細胞株として、上記実施例２で解析した１３種類の肝がん細胞株の中から、ＩＬ−８遺伝子の発現量が少ない３種類の肝がん細胞株（Ｈｅｐ Ｇ２、ＫＹＮ−３、及びＨＡＫ−１Ｂ）を選択した。なお、ＬＰＳを含む血清不含培養液を用いてかかる３種類の肝がん細胞株をＬＰＳ存在下で培養したところ、ＬＰＳによるＩＬ−８遺伝子発現の亢進はほとんど認められなかったため、血清含有培養液について解析を進めた。血清含有培養液に、ＬＰＳ（Lipopolysaccharides from E.coli 055:B5、SIGMA社製）（１ｍｇ／ｍｌ in ＰＢＳ）及びリファンピシン溶液（和光純薬社製）（２５ｍｇ／ｍｌ in ＤＭＳＯ）をそれぞれ１０００倍希釈になるように加え、かかるＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）及びリファンピシン（２５μｇ／ｍｌ）を含む血清含有培養液（「ＬＰＳ＋ＲＦＰ」）を用いて、上記３種類の肝がん細胞株（Ｈｅｐ Ｇ２、ＫＹＮ−３、及びＨＡＫ−１Ｂ）を５時間培養した。また、コントロールとして、血清含有培養液（「ＮＴ」）や、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）を含む血清含有培養液（「ＬＰＳ」）を用いた。なお、リファンピシンを含まないこれらのコントロール培養液（上記「ＮＴ」や、「ＬＰＳ」）には、リファンピシン含有培養液（上記「ＬＰＳ＋ＲＦＰ」）と同濃度のＤＭＳＯが含まれるようにＤＭＳＯを添加した。
【００５４】
それぞれを培養した後、上記実施例１に記載の方法でＲＮＡを回収し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによるｍＲＮＡの定量を行ったところ、上記３種類の肝がん細胞株いずれにおいてもＬＰＳ添加により亢進したＩＬ−８遺伝子の発現を、リファンピシンの同時添加により完全に抑制できることが明らかとなった（図３）。この結果は、ＬＰＳなどによるＩＬ−８遺伝子の発現の亢進が、リファンピシンにより阻害できることを示すとともに、ＬＰＳなどで亢進したＩＬ−８遺伝子の発現をリファンピシンが抑制できることを示している。
【実施例４】
【００５５】
４．リファンピシンの誘導体によるＩＬ−８遺伝子の発現抑制効果
次に、リファンピシンの誘導体についてもリファンピシンと同様のＩＬ−８遺伝子の発現抑制効果があるかどうかについて解析を行った。リファンピシンの誘導体として、リファマイシンＳＶナトリウム塩及び３−フォルミルリファマイシンＳＶナトリウム塩を用い、また、肝がん細胞株として、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株を用いて上記実施例１に記載の方法によりＩＬ−８遺伝子の発現量を解析したところ、リファンピシンを用いた場合と同様に、ＩＬ−８遺伝子の発現抑制効果が認められた。すなわち、リファマイシンＳＶ（２５μｇ／ｍｌ）を含む血清含有及び血清不含の培養液を用いた場合、それぞれ約５０％及び約８０％のＩＬ−８遺伝子の発現を抑制できることが明らかとなった（図４の左図）。また、３−フォルミルリファマイシンＳＶ（２５μｇ／ｍｌ）を含む血清含有及び血清不含の培養液を用いた場合、それぞれ約５０％のＩＬ−８遺伝子の発現を抑制できることが明らかとなった（図４の右図）。これらの結果は、リファンピシンの誘導体についてもリファンピシンと同様のＩＬ−８遺伝子の発現抑制効果があることを示している。
【実施例５】
【００５６】
５．ＩＬ−８遺伝子発現抑制におけるリファンピシンの作用濃度の検討
次に、肝がん細胞株（ＳＫ−ＨＥＰ−１）を用いて、ＩＬ−８遺伝子の発現抑制する、リファンピシンの作用濃度について検討を行った。リファンピシンを含む血清含有又は血清不含の培養液として、１、３、１０、３０、又は１００（μｇ／ｍｌ）のリファンピシン濃度のものを用いて上記実施例１に記載の方法によりＩＬ−８遺伝子の発現量を解析したところ、リファンピシンを含む血清含有の培養液を用いた場合、リファンピシン濃度３μｇ／ｍｌでＩＬ−８遺伝子の発現量は約５０％にまで減少しており、この結果は、リファンピシン濃度が１〜３μｇ／ｍｌの間に５０％のＩＬ−８遺伝子の発現を抑制する濃度（ＩＣ５０；Half maximal [50%] inhibitory concentration）値があることを示している（図５の左図）。また、リファンピシンを含む血清含有の培養液を用いた場合、少なくとも３μｇ／ｍｌのリファンピシン濃度でＩＬ−８遺伝子の発現を約５０％抑制できることが明らかとなった（図５の左図）。一方、リファンピシンを含む血清不含の培養液を用いた場合、リファンピシン濃度１μｇ／ｍｌでＩＬ−８遺伝子の発現量は５０％以下にまで減少しており、この結果はリファンピシン濃度が０〜１μｇ／ｍｌの間にＩＣ５０値があることを示している（図５の右図）。また、リファンピシンを含む血清不含の培養液を用いた場合、少なくとも３μｇ／ｍｌのリファンピシン濃度でＩＬ−８遺伝子の発現を約８０％抑制できることが明らかとなった（図５の右図）。
【実施例６】
【００５７】
６．ＩＬ−８遺伝子発現抑制におけるリファンピシンの作用時間の検討
次に、肝がん細胞株（ＳＫ−ＨＥＰ−１）を用いて、ＩＬ−８遺伝子の発現を抑制する、リファンピシンの作用時間について検討を行った。リファンピシンを含む血清含有又は血清不含の培養液として、１０（μｇ／ｍｌ）のリファンピシン濃度の血清不含の培養液を用い、０、１０、３０、６０、１８０、又は３００分間それぞれインキュベータ内（３７℃、５％ＣＯ２条件下）でＳＫ−ＨＥＰ−１細胞株を上記培養液存在下で培養を行い、上記実施例１に記載の方法によりＬ−８遺伝子の発現量を行ったところ、リファンピシン添加後６０〜１８０分の間にＩＬ−８遺伝子のｍＲＮＡの発現量が減少することが認められた（図６）。この結果は、リファンピシンによるＩＬ−８遺伝子の発現抑制効果は、少なくともリファンピシン添加後６０〜１８０分の間に認められることを示している。また、リファンピシンによるＩＬ−８遺伝子の発現抑制効果に即効性があることから、ＩＬ−８遺伝子のｍＲＮＡの代謝速度は速いことが予想される。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明のＩＬ−８発現抑制剤によれば、インビトロ、エクスビボ又はインビボにおいて、ＩＬ−８の発現を効果的に抑制することができる。したがって、本発明は、ＩＬ−８の発現抑制に関する分野に有用に利用することができる。
【図１】
0005496232.tif 000008
【図２】
0005496232.tif 000009
【図３】
0005496232.tif 000010
【図４】
0005496232.tif 000011
【図５】
0005496232.tif 000012
【図６】
0005496232.tif 000013