(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
焙煎カカオ豆中のアクリルアミドの濃度を低減するための方法であって、
ａ）アスパラギンを含有するカカオ豆を提供する工程と
ｂ）前記カカオ豆をえり分けてニブを形成する工程と、
ｃ）前記ニブにアスパラギナーゼを添加して、前記ニブとアスパラギナーゼとを十分な時間反応させて、アスパラギン濃度を少なくとも１０％低減する工程と、
ｄ）前記ニブを焙煎して低減したアクリルアミド濃度を有する焙煎カカオ豆を形成する工程
とを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カカオ製品におけるアクリルアミドの低減、特に、チョコレート及びチョコレート製品におけるアクリルアミドの低減に関する。本発明は、更に、商品に関する。
【背景技術】
【０００２】
「神の食物」として知られているチョコレートは、世界で最も贅沢な食物の１つである。
３０００年以上もの間、人類はチョコレートを味わってきたが、ごく最近になって、研究者らは、チョコレート及び他の焙煎カカオ豆製品がアクリルアミドを含有することを見出した。
【０００３】
２００２年４月、スウェーデン国立食品局及びストックホルム大学の研究者らは、癌を引き起こす可能性のある化学物質であるアクリルアミドが、熱処理を受ける多くの種類の食品及び飲料中で生成されるという研究結果を発表した。次いで、チョコレートなどの焙煎カカオ豆製品がアクリルアミドを含有することが見出された。ラットでは、アクリルアミドは、食品中の他の発癌性物質の発癌可能性に類似の発癌性を有するが、ヒトについて、食品及び飲料におけるその潜在能力は知られていない。アクリルアミドについては限られた人口集団のデータしかなく、これらのデータは、職業に携わることに起因した癌危険性の証拠を示してはいない。（食品中のアクリルアミドが健康に及ぼす影響に関するＦＡＯ／ＷＨＯ会議：概要報告書（FAO/WHO Consultation on the Health Implications of Acrylamide in Food:Summary Report）；スイス、ジュネーブ、２００２年６月２５〜２７日。、。ｍ）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
カカオ製品中に通常見られる濃度のアクリルアミドを人間が消費することによって、どのような健康への影響が（もしあれば）生じるのかを見極めるためには更なる研究が必要とされるが、多くの消費者は懸念を口にしている。従って、本発明の目的は、焙煎カカオ豆中のアクリルアミドの濃度を低減するための方法を提供することである。また、本発明の目的は、アクリルアミドの濃度が低減されている焙煎カカオ豆を提供することである。更に、本発明の目的は、焙煎カカオ製品のアクリルアミドの濃度が低減されているか、又は低いことを消費者に伝える商品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様において、本発明は、焙煎カカオ豆中のアクリルアミドの濃度を低減するための方法を提供する。一実施形態において、当該方法は、アスパラギン低減酵素をカカオ豆に添加することを含む。
【０００６】
別の態様において、本発明は、カカオ豆中のアスパラギンの濃度を低減するための方法を提供する。一実施形態において、当該方法は、アスパラギン低減酵素をカカオ豆に添加することを含む。
別の態様において、本発明は、アクリルアミドの濃度が低減されている焙煎カカオ豆を提供する。
別の態様において、本発明は、アスパラギンの濃度が低減されているカカオ豆を提供する。
【０００７】
更に別の態様において、本発明は、焙煎カカオ豆を含む製品のアクリルアミド濃度が低減されているか、又は低いことを消費者に伝える商品を提供する。
更に別の態様において、本発明は、カカオ豆を含む製品のアスパラギン濃度が低減されているか、又は低いことを消費者に伝える商品を提供する。
【０００８】
本明細書で引用される全ての文献は、関連部分において本明細書に参考として組み込まれるが、いかなる文献の引用も、それが本発明に関する先行技術であることの容認として解釈されるべきでない。
本明細書で使用する時、特に指定しない限り、百分率（％）は全て重量によるものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本出願人らは、すべての生物システムに実質上見られる天然由来のアミノ酸であるアスパラギンが、加熱されたときにアクリルアミドを形成する場合があることを見出した。故に、アスパラギンの豊富な材料ほど、加熱されたときに、含有するアクリルアミドの濃度が高くなる傾向があり、特に、還元糖の存在下でアスパラギン含有材料が加熱される場合にこのような傾向がある。
【００１０】
理論に拘束されるものではないが、アクリルアミドは、図１に記載される反応機構によって生成すると考えられている。遊離アスパラギンのα−アミン基がカルボニル源と反応して、シッフ塩基を形成すると考えられている。熱が加わると、このシッフ塩基付加物が脱カルボキシル化（decarboxylates）して生成物を形成するが、この生成物が、（１）加水分解してβ−アラニンアミドを形成し（熱が加わるとこれが更に減成（degrade）してアクリルアミドを形成し得る）、又は（２）分解（decompose）してアクリルアミドとそれに対応するイミンとを形成する可能性がある。（本出願人らは、丸で囲んだ前駆原子がアクリルアミド中の炭素及び窒素を含むことを見出した。）
従って、最終的に豆を焙煎する前に、アスパラギンを除去するか、又はカカオ豆中のアスパラギンを別の物質に転換することによって焙煎カカオ豆におけるアクリルアミドの形成を低減することができる。アスパラギンの濃度が低減されているこのような豆が最終の焙煎を受けると、生成するアクリルアミドの量が低減する。
【００１１】
カカオ豆の最終焙煎の前に、アスパラギンの側鎖上にあるアミド基を加水分解する酵素を添加すると、焙煎カカオ豆中に存在するアクリルアミドの濃度が低減される。理論に制限されるものではないが、このような酵素の添加が、アスパラギンの側鎖を分解し、それによってアスパラギンがアクリルアミドを形成するのを妨げると考えられている。その際、アミド結合が加水分解され、アスパラギンがアスパラギン酸に転換される。この反応機構を図２に記載する。
【００１２】
本明細書中の方法で使用するのに好ましい酵素類には、これだけに限定するものではないが、アスパラギナーゼが含まれる。ただし、遊離アスパラギンのアミド基を加水分解してアクリルアミドの形成を防ぐことが可能な酵素は、いずれも本発明の範囲内である。
【００１３】
酵素を使用する利点は数多くある。これらの利点としては、（ａ）酵素が天然の非毒性物質であることと、（ｂ）一般に、不要な副反応を引き起こさずに所与の反応を触媒することと、（ｃ）非常に穏やかな温度及びｐＨ条件下で活性であることと、（ｄ）低濃度で活性であることと、（ｅ）温度、ｐＨ及び使用する酵素の量を調整することによって、反応速度を制御できることと、（ｆ）反応が所望の程度まで進んだ後に不活性化できることと、が含まれる。（食品化学（Food Chemistry）、第４版、オーウェンＲ．フェネマ（Owen R.Fennema）編、マーセル・デッカー社（Marcel Dekker,Inc.）、ニューヨーク、１９８５、４２７頁、４３３頁。）
【００１４】
Ａ．焙煎カカオ豆中のアクリルアミドを低減するための方法
一態様において、本発明は、焙煎カカオ豆中のアクリルアミドを低減するための方法を提供する。一実施形態において、当該方法は、カカオ豆中のアスパラギンの濃度を低減することを含む。別の態様において、当該方法は、アスパラギン低減酵素をカカオ豆に添加することを含む。好ましい酵素は、アスパラギナーゼである。
【００１５】
好ましい実施形態において、本発明は、焙煎カカオ豆中のアクリルアミドの濃度を低減するための方法を提供し、当該方法は、
（１）アスパラギンを含有するカカオ豆の提供；
（２）任意選択的に、該カカオ豆を低温で乾燥；
（３）任意選択的に、該カカオ豆を焙煎；
（４）該カカオ豆をえり分けてニブを形成；
（５）任意選択的に、該ニブを焙煎；
（６）任意選択的に、該ニブを粉砕してカカオ液を形成；
（７）任意選択的に、該カカオ液を焙煎；
（８）任意選択的に、該カカオ液を圧搾してカカオケークとカカオバターとを形成；
（９）任意選択的に、該カカオケークを粉砕してカカオ粉末を作製；
（１０）任意選択的に、上記工程１〜９のいずれかの前、最中、又は後にベースを添加；及び
（１１）上記工程１〜６のいずれかの前、最中、又は後に酵素を添加する工程を含む。
【００１６】
１．アスパラギンを含有するカカオ豆を提供する工程
カカオ豆の源であるカカオの木は、熱帯及び亜熱帯気候に生育する。摘み取ったら、豆を覆う粘液が除去される。豆は、収穫した後何日もの間発酵され、次いで乾燥される。多様な種類の豆の混合物を含む、あらゆる好適な乾燥したカカオ豆を、本発明に従って使用することができる。本明細書で使用する時、用語「カカオ豆」又は「豆」は、当該技術分野において既知のあらゆる好適な形態をなすカカオ豆を包含する。好適なカカオ豆としては、ベルナルドＷ．ミニフィー（Bernard W.Minifie）の「チョコレート、カカオ、及び菓子類（Chocolate,Cocoa,and Confectionery）」（ＡＶＩ出版社（AVI Publishing Co.）／ヴァン・ノストランド・レインホールド（Van Nostrand Reinhold）、ニューヨーク、ニューヨーク州、１９８９年）（以下、「チョコレート、カカオ、及び菓子類」）に記載されるものが挙げられる。
【００１７】
２．任意選択的に、カカオ豆を低温で乾燥させること
任意選択的に、カカオ豆をあらゆる好適な手段によって低温で乾燥することができる。好適な乾燥方法としては、「チョコレート、カカオ、及び菓子類」に開示されているものなどの当該技術分野において既知の方法が挙げられる。本明細書で使用する時、低温での乾燥は、豆を乾燥させるのには十分低いが、豆を焙煎する程高くない温度での乾燥を意味する。
【００１８】
３．任意選択的に、カカオ豆を焙煎すること
任意選択的に、カカオ豆を焙煎してもよい。焙煎を含むあらゆる好適なプロセスを使用することができる。本明細書で使用する時、用語「焙煎」は、カカオが示す香味を生成するための、あらゆる好適なカカオ豆の熱処理を包含する。好適な焙煎技法としては、「チョコレート、カカオ、及び菓子類（Chocolate,Cocoa,and Confectionery）」に記載されているものなどの当該技術分野において既知の技法が挙げられる。別の実施形態において、カカオ豆は、当該技術分野において既知であるように低温で焙煎される。
【００１９】
４．カカオ豆をえり分けてニブを形成すること
当該技術分野において既知であるように、次いで、乾燥したカカオ豆をえり分けてニブを形成する。ニブの大きさはいずれかの所望の大きさであり得る。しかしながら、ニブの全体にわたる酵素の移動を促進するためには、表面積が大きく、移動距離が減るので、より小さい大きさのニブが好ましい。
【００２０】
５．任意選択的に、ニブを焙煎すること
次いで、任意選択的に、いずれかの好適な手段によってニブを焙煎することができる。好適な焙煎技法としては、「チョコレート、カカオ、及び菓子類」に開示されているものなどの当該技術分野において既知の技法が挙げられる。
【００２１】
６．任意選択的に、ニブを粉砕してカカオ液を形成すること
次いで、当該技術分野において既知であるようないずれかの好適な手段によってニブを粉砕し、カカオ液を形成することができる。好適な粉砕技法としては、「チョコレート、カカオ、及び菓子類」に開示されているものなどの当該技術分野において既知の技法が挙げられる。
【００２２】
７．任意選択的に、カカオ液を焙煎すること
カカオ液を、任意選択的に焙煎することができる。カカオ豆がカカオ液を形成する前に、当該カカオ豆を非常に穏やかに焙煎し、水分量が比較的多い場合、酵素を添加し、反応させることができる。カカオ液は、次いで更に焙煎されて風味を発する。
【００２３】
８．任意選択的に、カカオ液を圧搾してカカオケークとカカオバターとを形成すること
任意選択的に、カカオ液を圧搾してカカオケークとカカオバターにすることができる。好適な圧搾方法としては、「チョコレート、カカオ、及び菓子類」に開示されているものなどの当該技術分野において既知の方法が挙げられる。
【００２４】
９．任意選択的に、カカオケークを粉砕してカカオ粉末を作製する
任意選択的に、いずれかの好適な手段によってカカオケークを粉砕することができる。好適な粉砕方法としては、「チョコレート、カカオ、及び菓子類」に開示されているものなどの当該技術分野において既知の方法が挙げられる。
【００２５】
１０．任意選択的に、上記工程１〜９のいずれかの前、最中、又は後にベースを添加すること
任意選択的に、当該技術分野において既知であるように、カカオ豆の処理中にベースを添加することができる。例えば、「チョコレート、カカオ、及び菓子類（Chocolate,Cocoa,and Confectionery）」を参照のこと。
【００２６】
１１．上記工程１〜６のいずれかの前、最中、又は後にアスパラギン低減酵素を添加すること
本明細書で使用する時、「アスパラギン低減酵素」は、カカオ豆中のアスパラギンの濃度を低減することができるあらゆる酵素を包含する。一実施形態では、アスパラギン低減酵素は、遊離アスパラギンのアミド基を加水分解可能な酵素である。本明細書で使用するのに好ましい酵素は、アスパラギナーゼである。好ましいアスパラギナーゼ供給元は、シグマ・アルドリッチ（Sigma-Aldrich）、カタログ番号Ａ２９２５である。
【００２７】
本明細書で使用する時、用語「アスパラギン低減酵素」及び「酵素」には、１つ又は複数の酵素が含まれており；例えば、２つ以上の酵素の混合物は、この用語に包含される。例えば、アスパラギン低減作用を有するデアミダーゼは、この用語に含まれる。
【００２８】
酵素は、いずれかの好適な形態でカカオ豆に添加してもよい。例えば、酵素を、粉末として、又は溶液の形態で添加してもよい。更に、酵素は、直接的（例えば、カカオ豆の上に振りかける、注ぐ又は噴霧する。あるいは、カカオ豆を酵素溶液中に浸漬することができる）又は間接的などのいずれかの好適な様式でカカオ豆に添加されてもよい。本明細書で使用する時、酵素をカカオ豆に「添加する」ことには、アスパラギンと酵素を１つに合わせるあらゆる手段が含まれるが、これらに限定されない。
【００２９】
一実施形態において、酵素をニブに添加する。この実施形態において、酵素は、好ましくは溶液の形態をなし、ニブに染み込ませるか、若しくは噴霧する、又はこれらの組み合わせにより適用される。
【００３０】
焙煎カカオ豆を形成する最終の焙煎が完了する前に、当該方法のいずれかの好適な段階で酵素を添加してもよい。更に、当該方法の２以上の段階中に、酵素を添加することができる。一実施形態において、発酵の前又は最中に、酵素を豆に添加する。別の実施形態において、酵素溶液を乾燥した豆に染み込ませる。
【００３１】
酵素は、重量又は体積ではなく、活性単位で市販される。故に、所望のアクリルアミド低減レベルを達成するのに必要な酵素の有効量は、使用する特定の酵素製品の活性に応じて異なる。
【００３２】
添加する酵素の量は、アスパラギン低減レベル、従って、所望するアクリルアミド低減レベルに依存する可能性がある。添加する酵素の量も、カカオ豆中に存在するアスパラギンの量に応じて異なる可能性があり、一般に、アスパラギンが多いカカオ豆程、同じアクリルアミド低減割合を達成するのに高い酵素濃度又は長い反応時間を必要とする。また、添加すべき酵素の量は、使用する特定の酵素（例えば、特定の酵素の酵素活性）及び処理される特定のカカオ豆の種類に応じて異なる可能性がある。当業者は、具体的なカカオの種類、具体的な酵素、酵素の具体的な活性、及び所望の結果に基づいて、酵素の有効量を決定することができる。
【００３３】
酵素をカカオ豆に添加する好ましい方法としては、噴霧、浸漬、振りかけ及び主浴（dominant bath）が挙げられる。一実施形態において、酵素溶液は、全ての豆の表面に均一に適用されるべく、豆をやさしく攪拌しながら当該溶液を豆の上に噴霧することによって適用される。
【００３４】
別の実施形態において、カカオ豆を酵素溶液に浸漬し、当該豆を水和させる。使用する溶液の量は、所望する豆の最終含水量に応じて異なる。酵素溶液は、全ての液体が豆に吸収されるような量で、又はカカオ豆により溶液が吸収された後に余分な溶液が残るような量で使用することができる。更に別の実施形態において、カカオ豆を溶液中で水和させ、次いで、水和したカカオ豆の上に酵素粉末を振りかける。スクリーニングなどの、溶液から粒子を分離するいずれかの好適な手段によって、溶液から豆を除去することができる。
【００３５】
更に別の実施形態において、主浴を用いて豆に酵素を添加する。続いて、豆から抽出する可溶性材料が当該溶液と平衡を保つか、又は平衡に近くなるまで、２〜３の豆のバッチを酵素含有溶液に浸漬させる。一実施形態において、主浴中の酵素は、アスパラギンをアスパラギン酸に転換し、それにより豆のバッチを後で追加する際、更にアスパラギンを抽出するための駆動力を生み出す。抽出可能な材料は、酵素によって反応し、転換され続けるアスパラギン以外の、追加の可溶性カカオ成分がすっかり抽出されてしまわないように、豆と平衡に達することができる。アスパラギンから形成されるアスパラギン酸は、浸漬されて豆中に戻り、平衡に達する。豆の前のバッチに入る溶液を補うように、豆の各バッチごとに追加の水及び／又は酵素含有溶液を追加して元のようにし、これによって、主浴の一定容積が維持される。
【００３６】
一実施形態において、アスパラギンの少なくとも一部分がカカオ豆から抽出され、結果生じる抽出物が酵素で処理され、次いで、抽出物の少なくとも一部分がカカオ豆の少なくとも一部分に戻される。例えば、酵素を抽出物に添加してもよく、あるいは、ポンプ作用によって当該抽出物を固定化酵素のベッド又はカラム（酵素が、基材、好ましくは不活性基材、例えばカラム内のプラスチック片若しくはビーズに吸着され、又は化学結合している）に通過させてもよい。
【００３７】
酵素がアスパラギンと反応するのに必要な時間量は、所望のアスパラギン（及び、故にアクリルアミド）低減レベル、特定のカカオ豆の特徴（例えば、化学組成、存在するアスパラギンの量、粒径）及び添加される特定の酵素を含むが、これらに限定されない因子に応じて異なる。好ましくは、アスパラギンの濃度が少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約５０％、更に好ましくは少なくとも約７０％、及び更に好ましくは少なくとも約９０％低減されているカカオ豆をもたらすのに十分な時間量にわたって、酵素を反応させる。一般に、酵素を長く反応させる程、アスパラギン低減レベルは大きく、したがって焙煎カカオ豆中のアクリルアミド低減レベルが大きくなる。酵素に十分な時間反応させる工程は、いずれかの好適な様式で実施することができる。例えば、酵素をカカオ豆に添加することと同時に、酵素をカカオ豆と混合することと同時に、カカオ豆による酵素溶液の吸収と同時に、又はこれらの組み合わせで行うことができる。
【００３８】
当該技術分野において既知のように、ｐＨ及び温度は、酵素活性に影響を及ぼす因子である。当業者は、これら及び他のパラメータ（例えば、水分含有量）の最適条件を容易に決定可能なはずである。加えて、具体的な酵素についての最適なｐＨ及び温度条件は、通常、文献及び／又は酵素の供給元から入手可能である。
【００３９】
酵素が所望の程度まで反応した後、任意選択的に当該酵素を不活性化させ、又はカカオ豆から除去することができる。摂取が安全な酵素（例えば、天然のもの又は一般の食物に見出されるもの）が使用されるとき、酵素の失活又は除去を選択しなくてもよい。或いは、酵素を不活性化させるいずれか好適な手段によって酵素を失活させることもできる。例えば、熱、ｐＨ調整、プロテアーゼによる処理、又はこれらの組み合わせを用いて酵素を失活させることができる。更に、抽出を含むがこれに限定されないあらゆる好適な手段で、酵素をカカオ豆から除去することができる。酵素を失活させることができ、若しくは除去することができ、又は酵素に失活と除去との組み合わせを実施することができる。
【００４０】
酵素の失活は、加熱を通じて起こることもあり、故に、任意選択的な失活工程及びカカオ豆の焙煎を同時に実施してもよい。焙煎カカオ豆が継続する酵素活性に曝されないように、熱処理で酵素を変性させ、不活性化することができる。更に、酵素反応のために見込まれた時間の少なくとも一部分は、焙煎工程の間に実施することも可能である。
【００４１】
酵素の失活は、加熱を通じて起こることもあり、故に、任意選択的な失活工程及びカカオ豆の焙煎を同時に実施してもよい。焙煎カカオ豆が継続する酵素活性に曝されないように、熱処理で酵素を変性させ、不活性化することができる。更に、酵素反応のために見込まれた時間の少なくとも一部分は、焙煎工程の間に実施することも可能である。
【００４２】
１２．焙煎カカオ豆を含む製品
焙煎カカオ豆は、チョコレートキャンディー類、キャンディーバー類、コーティング類、液体濃縮物類、インスタント又は粉末カカオ類、カカオ飲料類（例えば、温かい及び冷たい即席（ready to serve）カカオ類、販売用（vended）カカオ類、市販及び家庭用カカオ類）、混合物類、菓子類（例えば、キャンディー）、デザート類（例えば、ケーキ、アイスクリーム、ムース、カスタード）、パン菓子類（例えば、デニッシュ、ドーナツ）、ソース類及びスープ類（例えば、チリ）などの多様な焙煎カカオ製品を製造するのに使用されるように、又は使用可能なように使用することができる。
【００４３】
本発明の焙煎カカオ豆を含む焙煎カカオ豆製品は、そのアクリルアミド濃度が少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも約５０％、更に好ましくは少なくとも約７０％、及び更に好ましくは少なくとも約９０％低減されたものにすることができる。
【００４４】
一実施形態において、ダークカカオ粉末は、約３５０ｐｐｂ未満、好ましくは約２５０ｐｐｂ未満、より好ましくは約１００ｐｐｂ未満のアクリルアミドを含む。
【００４５】
Ｂ．方法を実施する手段
本発明を、いずれか好適な手段によって実施することができる。例えば、本明細書の方法を、バッチ式、半バッチ式、又は連続式に実施することができる。
【００４６】
Ｃ．商品
別の態様において、本発明は商品を提供する。一実施形態において、当該商品は、
（ａ）アクリルアミドの濃度が低減されている焙煎カカオ豆を含む製品；
（ｂ）当該製品を収容するための容器；及び
（ｃ）当該容器に付随するメッセージを含む。
【００４７】
容器に付随するメッセージは、製品のアクリルアミド濃度が低減されていることを消費者に知らせる。一実施形態において、メッセージは、製品が、アスパラギン濃度が低減されているか、又は低いカカオ豆で製造されていることを消費者に知らせる。メッセージは、容器に直接若しくは間接的に付着されるか、又は容器の近くに直接若しくは間接的に付着される印刷物であってもよいし、あるいは容器に付随する印刷されたメッセージ、電子メッセージ、又は放送メッセージであってもよい。好適なメッセージとしては、これらに限定するものではないが、アクリルアミドの濃度が「低減されている」か、又は「低い」ことを伝えるメッセージ、規定量未満のアクリルアミドが存在することを伝えるメッセージ、及び焙煎カカオ豆を含む焙煎カカオ豆製品及び／又は商品が推奨レベル若しくは必須レベル（例えば、規制閾値若しくはシグナルレベル（signal level））を満たす又は上回ることを伝えるメッセージが挙げられる。
【００４８】
焙煎カカオ豆を含む製品を分配する、提供する、陳列する又は貯蔵することができるいかなる容器も、好適である。好適な容器としては、これらに限定するものではないが、袋、キャニスター、箱、ボウル、プレート、桶、及び缶が挙げられる。
【００４９】
（分析方法）
本発明の要素を特性評価するために使用されるパラメータは、特定の分析方法によって定量化される。これらの方法を以下で詳細に説明する。
【００５０】
１．アクリルアミド
食品中のアクリルアミド（ＡＡ）の測定方法
（概要）
食品に１−13Ｃ−アクリルアミド（13Ｃ−ＡＡ）を加え、熱水で抽出する。水性の上澄みをエチルアセテートで３回抽出し、このエチルアセテート抽出物を組み合わせ、濃縮し、ＡＡ及び13Ｃ−ＡＡの特異的検出のための選択イオンモニタリングを用いたＬＣ／ＭＳによって分析する。
【００５１】
（試料の抽出）
１．試料６．００±０．０１ｇを１２５ｍＬ三角フラスコに量り入れる。注記：粒度が約３．２ｍｍ（１／８インチ）以下になるように、試料をフードプロセッサに入れて、３０秒間脈動させる。試料が小さすぎてフードプロセッサでは効果的に挽くことができない場合、試料を新しいビニール袋（例えば、ワールパック（Whirl-Pak）（商標）又は同等のもの）に入れ、粒径が３．２ｍｍ（１／８インチ）以下になるまでゴム製マレット（mallet）で粉末状にする。
２．脱イオン蒸留水（内部標準２）中で１００ｎｇ／μＬの13Ｃ−ＡＡを１２０μＬ、調節可能な１０００μＬのピペット（目盛り付き）を用いて、試料に直接添加する。
３．ディスペンサーを使用して、脱イオン蒸留水４０ｍＬをフラスコに加え、箔で覆う。
４．３０分間、６５℃の水浴に入れる。
５．ディスペンサーを用いて、二塩化エチレン１０ｍＬをフラスコに添加し、テクマー・ティシューマイザー（Tekmer Tissumizer）（商標）（ＳＤＴ−１８１０）又はウルトラ・ターラックス（Ultra-Turrax）（登録商標）（Ｔ１８ベーシック）で３０秒間、均質になるまで均質化する。プローブをフラスコに入れ、脱イオン蒸留水ですすぐ。
６．ホモジネート２５ｇを３０ｍｌ（８ドラム）のバイアル瓶に入れる。
７．チューブを密栓し、３０分間、２５００〜５２００ＲＰＭで遠心分離する。
８．固体粒子が入らないように注意して、上澄み８ｇを別の３０ｍｌ（８ドラム）のバイアル瓶に移す。
９．エチルアセテート１０ｍＬをディスペンサーで添加し、蓋をして、１０秒間攪拌する。
１０．エマルションを分離させる：１、２回渦動又は振盪することによって補助してから層を分離させる。
１１．界面から液体（水）を移すことなく、上層（エチルアセテート）をできるだけ多く、シンチレーションバイアル瓶に移す。エチルアセテート１回分５ｍＬで更に２回抽出し、同じシンチレーションバイアル瓶に加える。次いで、無水硫酸ナトリム約２ｇを加える。
１２．窒素をゆっくり流して６０〜６５℃の水浴中で抽出物を約１ｍＬに濃縮する。抽出物をピアス・リアクティ・バイアル（Pierce REACTI-VIAL）（商標）又は同等の円錐形ガラスバイアル瓶に移し、抽出物を約１００〜２００μＬの最終容積まで更に濃縮する。この抽出物を円錐スリーブ付きオートサンプラーバイアル瓶に入れる。
【００５２】
（標準の調製）
【００５３】
【表１】
0005425366.tif 000002
【００５４】
【表２】
0005425366.tif 000003
【００５５】
【表３】
0005425366.tif 000004
【００５６】
（ホモジナイザー洗浄手順）
試料ごとにこの洗浄手順を使用する。
１．１Ｌの三角フラスコに高温の水道水を充填し（約８０％充填）、ダウン（Dawn）（商標）食器洗い用液体洗剤（プロクター・アンド・ギャンブル社（Procter & Gamble Co.）から入手可能）又は同等物を１滴加える。
２．分散要素プローブを水中にできるだけ深く入れる。
３．溶液を約１０〜１５秒間均質化する。
４．洗浄溶液を捨てて三角フラスコを空にし、フラスコを高温の水道水ですすいで再充填する。
５．再び約１０〜１５秒間均質化する。
６．フラスコを空にし、高温の水道水で再充填し、再び約１０〜１５秒間均質化する。
７．水が透明ではなく粒子を含まない状態ではない場合、水が透明で粒子を含まない状態に達するために必要な回数に亘ってきれいな高温の水道水を均質化し続ける。
８．高温の水道水が透明で、粒子を含まない状態のとき、プローブを脱イオン蒸留水ですすぐ。
【００５７】
（ＬＣ／ＭＳによる分析）
マイクロマス（Micromass）ＬＣＺ質量分析計にインターフェース接続されたウォーターズ（Waters）２６９０ＬＣを使用して、試料を分析する。
【００５８】
【表４】
0005425366.tif 000005
【００５９】
（データ分析）
エチルアセテート中の一連の５つの標準について、応答比（ＡＡピークの面積／13Ｃ−ＡＡピークの面積）を、対応する濃度比に対してプロットする。標準は全て、４．５μｇ／ｍＬ13Ｃ−ＡＡを含有し、ＡＡ濃度は０〜５μｇ／ｍＬの範囲である。線形回帰によって検量線が得られ、この検量線を用いて、測定された応答比から抽出物中の濃度比が決定される。この濃度比に、抽出手順の第２工程で試料に添加された精密に既知の13Ｃ−ＡＡの濃度（公称２ｐｐｍ）を乗じると、ＡＡの濃度がｐｐｍで得られる。
【００６０】
ＬＣ／ＭＳについての試料計算：
応答比（ｍ／ｚ７２の面積  ／  ｍ／ｚ７３の面積）をｙ軸に、濃度比（［ＡＡ］／［１３Ｃ−ＡＡ］）をｘ軸にプロットすることによって検量線を作成する。この例では、その線の式は、ｙ＝０．８９９ｘ＋０．０１２３となる。
【００６１】
４．０分において測定されたＡＡピーク（ｍ／ｚ７２）の面積：１００，０００
４．０分において測定された１３Ｃ−ＡＡピーク（ｍ／ｚ７３）の面積：５００，０００
応答比Ｒr＝０．２００。検量線の傾き及び切片から、濃度比Ｒcが計算される：Ｒc＝（０．２００−０．０１２３）／０．８９９＝０．２０９
試料中の１３Ｃ−ＡＡの添加レベルが（２ｐｐｍ）の場合、測定されるＡＡレベルは、０．２０９×２ｐｐｍ＝０．４１８ｐｐｍとなる。
【００６２】
（品質保証／品質管理（ＱＡ／ＱＣ））
１．標準及び／又は試料の調製に使用される天秤は、すべて検定済みの１組の限定された分銅を用いて毎週較正検査されなければならない。測定される試料／標準の重量の範囲をカバーする少なくとも３つの分銅を用いて天秤を検査すべきである。
２．６点検量線を毎日実施しなければならない。
３．試料の組ごとに作業標準物質（ＷＲＭ）を分析しなければならない。この物質の濃度は、移動平均の２σ以内に入るはずである。そうでない場合、機器を較正し直し、ＷＲＭを計算し直さなければならない。
【００６３】
２．アスパラギン
（食品及び飲料製品中のアスパラギン及びアスパラギン酸の決定）
（原理）
一定量の試料を５％ＨＣｌと混合し、３０分間加熱してから均質化させる。ホモジネートの一部を遠心分離した後、上澄みの一部を希釈して、ＦＭＯＣ試薬（９−フルオレニルメチルクロロホルメート）で処理するが、このＦＭＯＣ試薬がアスパラギン及びアスパラギン酸と反応して高蛍光性誘導体を生成する。次いで、逆相ＨＰＬＣを使用して、他の試料マトリックス構成成分からＦＭＯＣ−アスパラギンを分離する。検出は、２６０ｎｍで励起させた３１３ナノメートル（ｎｍ）での蛍光発光による。既知の濃度の標準を分析することにより定量化できる。
【００６４】
（線形性）
４つの標準（５０−６００ｐｐｍ）の使用する検量線で、０．９９８以上の相関が得られる。２０００ｐｐｍまでの検量線でも０．９９８の相関が得られる。
【００６５】
（精度）
ジャガイモ製品：
ジャガイモデンプンに４つのレベル（４０、２００、４００及び６００ｐｐｍ）のアスパラギン及びアスパラギン酸の両方を加える。アスパラギンの回収は１００％（相対標準偏差４％未満）であり、アスパラギン酸の回収は１１０％（相対標準偏差４％未満）である。
【００６６】
（参考文献）
１．ハーバート（Herbert），Ｐ．；サントス（Santos），Ｌ；アルヴェス（Alves），Ａ．食品化学誌（Journal of Food Science）（２００１年）、６６（９）１３１９〜１３２５頁
２．ヘームス・ダニー（Heems,Dany）、ラック・ジュヌビエーブ（Luck,Geneviewe）、フラウド・クリストフ（Fraudeau,Chrisophe）、ベレッテ・エリック（Verette,Eric）。クロマトグラフィー誌Ａ（Journal of Chromatography,A）（１９９８年）、７９８（１＋２）、９〜１７頁
【００６７】
（系の再現性）
ポテトチップの作業標準物質は、複製されて５日に亘って実行される。結果は、以下の通りである。
【００６８】
【表５】
0005425366.tif 000006
【００６９】
以下は、推奨される化学物質及び機器であるが、同等物質の代用も許容可能である。
【００７０】
【表６】
0005425366.tif 000007
【００７１】
（機器）
トランスファーピペット、ポリエチレン（サムコ（Samco）  ＃２２２）
メスフラスコ（２５、１００、２５０、１０００ｍｌ）
メスピペット（１０ｍｌ）
メスシリンダー（１００〜１０００ｍｌ）
ＨＰＬＣリザーバ（５００ｍｌ、１又は２リットル）
ビーカー
磁性撹拌器／攪拌棒
分析（４桁（4-place））天秤
シンチレーションバイアル瓶
遠心管、スクリューキャップ（１００×１６ｍｍ）、キャップ付き
オートサンプラーバイアル瓶（８×３０ｍｍ、１ｍｌ）、クリンプキャップ付き
安全：この方法では、ドラフトの使用が必要であり、化学物質への暴露を伴う。ドラフトの使用及び化学物質のこぼれに関する安全規定（Safe Practices for Fume Hood Use and Chemical Spills）を再検討されたい。
【００７２】
【表７】
0005425366.tif 000008
【００７３】
（カラム）
フェノメネックス・ルナ（Phenomenex Luna）１００×４．６ｍｍＣ−１８（２）３ミクロン＃００Ｄ−４２５１−ＥＯ
【００７４】
（試薬の調製）
希釈剤（ｐＨ８．３〜８．５；１０００ｍｌ）
１．乾燥し風袋を測定したビーカーに、ホウ酸ナトリウム３．０ｇ、ホウ酸３．０ｇ、及び重炭酸ナトリウム８．０ｇを量り入れる。
２．磁性撹拌器上に空の８００ｍｌビーカーを載せる。ミリＱ（Milli-Q）（商標）水約５００ｍｌ及び攪拌棒を加える。はねないように水を激しく攪拌する。
３．工程１の試薬を水に定量的に移し、完全に溶解するまで攪拌する。
４．工程３の溶液を１リットルの容積測定フラスコに定量的に移し、ミリＱ（Milli-Q）（商標）水で希釈して定容にし、十分に混合する。６ヶ月まで安定である。
【００７５】
塩化カルシウム溶液（１００グラム）
１．風袋を測定した２５０ｍｌビーカーに塩化カルシウム二水和物４０ｇを量り入れる。
２．ミリＱ（Milli-Q）（商標）水６０ｇを加える。十分に混合する。周囲条件で蓋付きのガラス瓶に保存する。１年まで安定である。
【００７６】
抽出溶媒（ペンタン：エチルアセテート  ８０：２０；５００ｍＬ）
安全：ペンタン及びエチルアセテートは、揮発性且つ可燃性である。以下の操作はドラフト内で実施する。
【００７７】
１．ペンタン４００ｍｌを５００ｍｌのＨＰＬＣリザーバボトルに移す。
２．酢酸エチル１００ｍｌを添加する。十分に混合する。ドラフト内／下で蓋をして保存する。
【００７８】
移動相（緩衝剤：メタノール：アセトニトリル  ６０：５：３５、ｐＨ３．２、２Ｌ））
１．乾燥し風袋を測定したビーカーに、テトラメチルアンモニウムクロリド１．３５ｇ、クエン酸３．６５ｇ、及びクエン酸ナトリウム１．６０ｇを量り入れる。
２．磁性撹拌器上に空の８００ｍｌビーカーを載せる。ミリＱ（Milli-Q）（商標）水約５００ｍｌ及び攪拌棒を加える。はねないように水を激しく攪拌する。
３．工程１の試薬を水に定量的に移し、完全に溶解するまで攪拌する。
４．工程３の溶液を１リットルのメスシリンダーに定量的に移し、ミリＱ（Milli-Q）（商標）水で１０００ｍｌまで希釈し、十分に混合する。
５．２リットルのＨＰＬＣ移動相リザーバに移す。
６．ミリＱ（Milli-Q）（商標）水２００ｍｌ、メタノール１００ｍｌ、及びアセトニトリル７００ｍｌを添加する。激しく攪拌しながら、後の２つの溶媒をゆっくり加える。この操作はフード内で行い、身体用防護具を着用する。具体的な詳細は、関連する材料安全データシート（Material Safety Data Sheets）（ＭＳＤＳ）を参照する。
７．攪拌しながら真空吸引して移動相を脱気する。
【００７９】
ＦＭＯＣ試薬溶液（アセトン中）
１．風袋を測定した１００ｍｌメスフラスコに、ＦＭＯＣ試薬０．１０ｇを量り入れる。
２．アセトンを添加して溶解させ、アセトンで希釈し、定容にする。十分に混合する。この操作はフード内で実施する。該化学物質についてＭＳＤＳに指定されている身体防護具（ＰＰＥ）を着用する。
３．６ヶ月以下冷蔵庫で保存する。
【００８０】
試料抽出用の酸溶液（５％ＨＣｌ）
１．ミリＱ（Milli-Q）（商標）水１００ｍｌを２００ｍｌの容積測定用容器に添加する。
２．１Ｎ  ＨＣｌを４ｍｌ、容積測定用容器に添加する。
ミリＱ（Milli-Q）（商標）水で定容にする。
【００８１】
（内部標準（アミノイソ酪酸）の調製）
ＩＳＴＤ  Ａ−内部標準原液Ａ
１．風袋を測定した２５０ｍｌの容積測定用容器に、アミノイソ酪酸０．５ｇを量り入れる。
２．１．０ＮのＨＣｌを２５ｍｌとミリＱ（Milli-Q）（商標）水約１００ｍｌを添加する。溶解するまで渦動させることによって混合する。
ミリＱ（Milli-Q）（商標）水で希釈して定容にし、十分に混合する。６ヶ月以下冷蔵庫で保存する。
ＩＳＴＤ  Ｂ−作業内部標準溶液Ｂ（この溶液を較正標準に加える）
１．内部標準原液Ａを１ｍｌ、ピペットで分取し、１００ｍｌのメスフラスコに入れる。
２．ミリＱ（Milli-Q）（商標）水で希釈し、定容にする。１ヶ月間安定である。
【００８２】
（較正標準（１又は複数）の調製）
較正溶液原液
風袋を測定した５０ｍｌの容積測定用容器に、アスパラギン０．１００ｇ（＋／−０．００１ｇ）及びアスパラギン酸０．１００ｇ（＋／−０．００１ｇ）を量り入れる。ミリＱ（Milli-Q）（商標）水２５ｍｌ及び１ＮのＨＣｌを１ｍｌ加える。溶解するまで超音波浴に入れた後、ミリＱ（Milli-Q）（商標）Ｈ２Ｏで定容にする。溶液は６ヶ月間、良好に冷蔵される。
【００８３】
作業標準
以下の作業較正標準を調製する。
【００８４】
【表８】
0005425366.tif 000009
これらの溶液は、１ヶ月間、良好に冷蔵される。
【００８５】
（試料の調製）
１．試料１ｇを計量して１２５ｍｌの三角フラスコに入れる。
２．５％のＨＣｌ溶液４８．０ｍｌを各試料に添加する。
３．内部標準Ａを２ｍｌ、各試料に添加する。
４．各フラスコをアルミニウム箔で被覆し、６０℃の水浴に３０分間入れる。
５．ジクロロエタン１０ｍＬを各試料に加える。
６．試料を６０秒間均質化させる。
７．試料の一部を３０ｍｌの遠心管に注ぐ。
８．５℃、１００００ｒｐｍで３２分間、遠心分離する。上澄みは、「試料−希釈」の工程１で使用される。
【００８６】
（標準及び試料の調製）
３つのマイクロラボ（Microlab）（登録商標）方法を実行して、試料／標準を希釈し、内部標準を加え、ＦＭＯＣ誘導体を形成する。これらを以下に要約する。
【００８７】
【表９】
0005425366.tif 000010
【００８８】
（マイクロラボ（Microlab）（登録商標）ロボットを使用する試料及び標準の調製）
工程１：標準−ＩＳＴＤの添加及び希釈工程
１．標準ごとに２組のチューブを準備する。１組の管に標準約２ｍｌを入れ、充填されたこれらの管をマイクロラボ（Microlab）（登録商標）の最も左の位置に置く。
２．空の管を有するラックをマイクロラボ（Microlab）（登録商標）の最も右の位置に置く。
３．２０ｍｌのガラス（シンチレーション）バイアル瓶に使用する内部標準溶液Ｂを充填し、マイクロラボ（Microlab）（登録商標）の作業空間に置く。
４．ＡＤＤＩＳＴＤ方法を選択する。（ＩＳＴＤ  Ｂ２００μＬ、標準溶液５０μＬを混合して、ミリ−Ｑ（Milli-Q）（商標）水で全体積を４０００μＬにする。）
５．該方法を実行する。
６．左の位置からチューブの組を取り出し、取っておき、捨てる。
７．マイクロラボ（Microlab）（登録商標）の作業空間から使用する内部標準溶液を取り出し、冷蔵する。
【００８９】
工程３のために、右側のチューブを取っておく。
【００９０】
工程２：試料−希釈工程（ＩＳＴＤは、試料調製中に既に添加されている）
１．試料ごとに２組のチューブを準備する。１組の管に試料約２ｍｌを入れ、充填されたこれらの管をマイクロラボ（Microlab）（登録商標）の最も左の位置に置く。
２．空の管を有するラックをマイクロラボ（Microlab）（登録商標）の最も右のラック位置に入れる。
３．ＴＲＡＮＳＤＩＬ方法を選択する。試料の数、試料の量に対して５０μｌ、ミリＱ（Milli-Q）（商標）水を用いた最終希釈量に４０００μｌを設定する。
４．該方法を実行する。
５．左の位置からチューブの組を取り出し、取っておき、捨てる。
【００９１】
工程３のために、右側のチューブを取っておく。
【００９２】
工程３：ＦＭＯＣ試薬の添加−蛍光性誘導体の作製
１．  １００×１６ｍｍのスクリューキャップ付チューブのラックを準備する。
２．  ラックをマイクロラボ（Microlab）（登録商標）の最も右のラック位置に置く。
３．  前記希釈工程の標準及び試料の管をマイクロラボ（Microlab）（登録商標）の最も左の位置に置く
４．  ガラス製シンチレーションバイアル瓶にＦＭＯＣ試薬溶液のアリコート（２２ｍＬ）を移す。４０％塩化カルシウム溶液約１００μＬを添加し、十分に混合する。（塩化カルシウムを添加し、ＦＭＯＣ試薬を「装填」する−マイクロラボ（Microlab）（登録商標）による検出に必要）
５．  バイアル瓶をマイクロラボ（Microlab）（登録商標）の作業空間に置く。
６．  ＡＤＤＦＭＯＣ方法を選択する。
７．  シリンジ（syringe）１及び２を水から希釈剤（ｐＨ８．３〜８．５）に切り替える。
８．  シリンジ（syringe）１及び２について希釈剤（ｐＨ８．３〜８．５）を使用して少なくとも５サイクルの洗浄を実施する。
９．  ＡＤＤＦＭＯＣ方法を実行する。（ＦＭＯＣ溶液４５０μｌ、前記ＡＤＤＩＳＴＤの試料２５０μｌを混合し、希釈剤溶液で最終容積１３００μｌにする。）
１０．  試料ラックの位置からチューブの組を取り出し、取っておく。
１１．  マイクロラボ（Microlab）（登録商標）の作業空間からＦＭＯＣ試薬溶液を取り出し、冷蔵する。
１３．  最も右の位置からチューブの組を取り出し、ドラフト内に置く。少なくとも１０分間、又は溶液が清澄になるまで（ただし２０分以下）静置する。
１４．  抽出溶媒２ｍｌを各管に入れる。未反応のＦＭＯＣ試薬を抽出するために、蓋をして２分間高速で攪拌する。
１５．  ５５×１６ｍｍチューブの別のチューブの組を準備する。移動相溶液１ｍｌを各管に添加する。
１６．  遠心管から水（下）層１．０ｍＬを５５×１６ｍｍチューブに移す。
１７．  上（有機）層を捨てる。
１８．  試料をオートサンプラーバイアル瓶に移し、密封する。
【００９３】
（クロマトグラフィー）
運転条件
ケムステーション（Chem Station）ソフトウェアを備えたＨＰ１１００
検出器：ウォーターズ（Waters）４７４走査蛍光検出器
モード：通常
信号：０．００００
波長：励起２６０
発光３１３
ゲイン：１０
減衰：１
応答：ＦＳＴ
カラム：フェノメックス・ルナ（Phenomex Luna）Ｃ１８（２）１００×４．６ｍｍ  ３ｕ
【００９４】
（ＬＣ方法）
流量：１．０００ｍｌ／分
アイソクラチック運転（試薬の調製−移動相を参照）
注入容積：１０．０μｌ
温度設定：管理せず
【００９５】
（計算）
試料溶液は、面積カウントを使用し、既知量の標準曲線に対して計算される：
ｙ＝ｍｘ＋ｂ
ｙ（アスパラギン／ＩＳＴＤ比）＝ｍ（傾き）×（アスパラギン濃度）＋ｂ（ｙ−切片）
（ｙ−ｂ）／ｍ＝ｘ
アスパラギンｐｐｍ＝（アスパラギン面積／内部標準面積−切片）／傾き
例：
アスパラギン（ｐｐｍ）＝（２１５．４５４３６／５５１．８２８  −  −０．０１６５）／０．００２３＝１７６．９３（ｐｐｍ）
［ｐｐｍ＝μｇ／ｍＬ］
試料調製工程における希釈／均質化の補正
【００９６】
【数１】
0005425366.tif 000011
［ｐｐｍ＝μｇ／ｍＬ］
例：
【００９７】
【数２】
0005425366.tif 000012
【００９８】
（運転許容基準）：
・  作業標準物質の試料検査精度は、アスパラギンについての既知の結果の１０％以内でなければならない。
・  較正曲線の直線性（ｒ2）は、０．９９５以上でなければならない。
（ＬＣ分析の試料クロマトグラム）
図３は、ＬＣ分析の試料クロマトグラムを示す。
【００９９】
【表１０】
0005425366.tif 000013
【０１００】
３．アクリルアミドの低減％
アクリルアミドの低減（％）＝［（対照試料中のアクリルアミド濃度−酵素処理試料中のアクリルアミド濃度）／対照試料中のアクリルアミド濃度］×１００
対照試料は、酵素が添加されないことを除いて、酵素で処理された試料と正確に同一の方式で調製される。
【０１０１】
４．アスパラギンの低減％
アスパラギンの低減（％）＝［（対照試料中のアスパラギン濃度−酵素で処理された試料中のアスパラギン濃度）／対照試料中のアスパラギン濃度］×１００
対照試料は、酵素が添加されないことを除いて、酵素で処理された試料と正確に同一の方式で調製される。
【実施例】
【０１０２】
以下の実施例は、本発明を例示するものであって、本発明を制限しようとするものではない。
【０１０３】
（実施例１）
溶液形態のアイボリー・コースト（コートジボアール：Ivory Coast）のカカオ豆に有効量のアスパラギナーゼを添加し、得られる焙煎カカオ豆のアクリルアミドが１０％を超えて低減されるように十分な時間にわたって反応させる。次いで、酵素処理したカカオ豆を当該技術分野において既知であるように焙煎、粉砕、及び圧搾してカカオ液を形成する。３０％の過酸化水素溶液２部を１００部のアイボリー・コースト（Ivory Coast）のカカオ液に添加し、１時間攪拌しながら１００℃まで加熱する。この時間中、水は蒸発し、得られた液の色は所望の薄い色である。
【０１０４】
（実施例２）
実施例１のアイボリー・コースト（Ivory Coast）のカカオ液を使用して、従来の方法によりミルクチョコレートを調製する。このミルクチョコレートのアクリルアミド濃度は１０％を超えて低減されている。
【０１０５】
（実施例３）
溶液形態のガーナ（Ghana）のカカオ豆に有効量のアスパラギナーゼを添加し、得られる焙煎カカオ豆のアクリルアミドが１０％を超えて低減されるように十分な時間にわたって反応させる。次いで、処理したカカオ豆を当該技術分野において既知であるように焙煎及び粉砕し、カカオニブを形成する。ガーナ（Ghana）のカカオニブを３０％の過酸化水素に３０％浸漬させ、水で数回すすぎ、次いでオーブン内で６５℃で乾燥させる。当該技術分野において既知であるようにニブを粉砕して、カカオ液を形成する。次いで、ガーナ（Ghana）のカカオ液を使用して、従来の方法によりダークチョコレートを調製する。このダークチョコレートのアクリルアミド濃度は１０％を超えて低減されている。
【０１０６】
（実施例４）
従来の方法を用いて、実施例３のガーナ（Ghana）のカカオ液を圧搾し、カカオバターとカカオケークにする。カカオケークを粉砕し、カカオ粉末を形成する。カカオ粉末のアクリルアミド濃度は１０％を超えて低減されている。
【０１０７】
（実施例５）
実施例２のミルクチョコレートを使って、当該技術分野で既知であるようにチョコレートキャンディーバーを製造する。消費者への小売販売用にキャンディーバーを包装する。キャンディーバーのラベルには、「アクリルアミドが入っていないチョコレート」と書かれている。
【０１０８】
（実施例６）
実施例４のカカオ粉末を商品流通用に包装する。カカオ粉末に関する販売用パンフレット及び製品仕様シートには、カカオ粉末のアクリルアミドが１０％を超えて低減されていることが記載されている。
【０１０９】
本発明の特定の実施形態について説明し記載したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、他の様々な変更及び修正を実施できることが、当業者には明白であろう。したがって、本発明の範囲内にあるそのような全ての変更及び修正を、添付の特許請求の範囲で扱うものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】アスパラギン及びカルボニル源（グルコースなど）からアクリルアミドが形成される、反応機構の提案を示す。Ｒ1及びＲ2は、Ｈ、ＣＨ3、ＣＨ2ＯＨ、ＣＨ2（ＣＨ2）nＣＨ3、又は還元糖を構成する他のいずれかの構成要素にすることができ、ｎは、１０未満の任意の整数にすることができる。
【図２】アスパラギナーゼがアスパラギンと反応してアクリルアミドの形成を阻止する、反応機構の提案を示す。
【図３】図３は、アスパラギン及びアスパラギン酸のＬＣ分析についての試料のクロマトグラムを示す。ｘ軸は保持時間を表し、ｙ軸は応答を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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