(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
リステオロジンＯ（ＬＬＯ）タンパク質またはそのＮ末端断片を含む組換えタンパク質であって、
前記リステオロジンＯ（ＬＬＯ）タンパク質またはＮ末端断片がコレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）に突然変異を有し、前記突然変異が、配列番号３７の残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、及びＷ４９２の突然変異を含み、
前記組換えタンパク質の溶血作用が野生型のＬＬＯと比較して１００倍を上回る減少を示す、組換えタンパク質。
【請求項２】
請求項１の組換えタンパク質であって、
前記ＬＬＯタンパク質またはＮ末端ＬＬＯ断片がそのシグナルペプチド配列の欠失を含む、組換えタンパク質。
【請求項３】
請求項１の組換えタンパク質であって、
前記ＬＬＯタンパク質またはＮ末端ＬＬＯ断片がそのシグナルペプチド配列を含む、組換えタンパク質。
【請求項４】
請求項１の組換えタンパク質であって、
前記組換えタンパク質が、異種ペプチドを含む、組換えタンパク質。
【請求項５】
請求項４の組換えタンパク質であって、
前記異種ペプチドが抗原ペプチドである、組換えタンパク質。
【請求項６】
請求項５の組換えタンパク質であって、
前記抗原ペプチドがＨｅｒ／２−ｎｅｕペプチドである、組換えタンパク質。
【請求項７】
請求項５の組換えタンパク質であって、
前記抗原ペプチドがＢ細胞受容体（ＢＣＲ）ペプチドである、組換えタンパク質。
【請求項８】
請求項５の組換えタンパク質であって、
前記抗原ペプチドが、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）−１６−Ｅ６、ＨＰＶ−１６−Ｅ７、ＨＰＶ−１８−Ｅ６、ＨＰＶ−１８−Ｅ７、前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、角質層キモトリプシン様酵素（ＳＣＣＥ）抗原、ウィルムス腫瘍抗原１（ＷＴ−１）、テロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、プロテイナーゼ３、チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ２）、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、滑膜肉腫、Ｘ（ＳＳＸ）−２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＭＡＧＥ−Ａ、インターロイキン−１３受容体アルファ（ＩＬ１３−Ｒアルファ）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、スルビビン、ＧＰ１００、テスチシン、またはＮＹ−ＥＳＯ−１である、組換えタンパク質。
【請求項９】
請求項４の組換えタンパク質とアジュバントとを含むワクチン。
【請求項１０】
請求項９のワクチンであって、
前記アジュバントが、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＧＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリル脂質Ａ、または非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む、ワクチン。
【請求項１１】
請求項１の組換えタンパク質と異種ペプチドとを含む免疫原性の組成物であって、
前記組換えタンパク質が前記異種ペプチドに共有結合していない、組成物。
【請求項１２】
請求項１１の組成物であって、
アジュバントを更に含む、組成物。
【請求項１３】
請求項１２の組成物であって、
前記アジュバントが、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＧＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリル脂質Ａ、または非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項１４】
請求項１の組換えタンパク質をコードする組換えワクチンベクター。
【請求項１５】
請求項１の組換えタンパク質をコードするヌクレオチド分子。
【請求項１６】
請求項１５のヌクレオチド分子とアジュバントを含むワクチン。
【請求項１７】
請求項１の組換えタンパク質を含む組換えリステリア菌株。
【請求項１８】
被験体において抗原ペプチドに対する免疫応答を誘導する医薬を製造するための、請求項５の組換えタンパク質の使用であって、
前記被験体に前記医薬を投与することで、前記抗原ペプチドに対する免疫応答が誘導される、使用。
【請求項１９】
被験体において異種ペプチドに対する免疫応答を誘導する医薬を製造するための、請求項１１の組換えタンパク質の使用であって、
前記被験体に前記医薬を投与することで、前記異種ペプチドに対する免疫応答が誘導される、使用。
【請求項２０】
卵巣メラノーマ細胞および肺癌細胞から選択されるＮＹ−ＥＳＯ−１発現癌細胞に対する被験体の免疫応答を誘導する医薬を製造するための、請求項５の組換えタンパク質の使用。
【請求項２１】
被験体の卵巣黒色腫および肺癌腫から選択されるＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍を処置、阻害、または抑制する医薬を製造するための、請求項５の組換えタンパク質の使用。
【請求項２２】
子宮頸癌細胞および頭頸部癌細胞から選択されるＨＰＶＥ７発現癌細胞に対する被験体の免疫応答を誘導する医薬を製造するための、請求項５の組換えタンパク質の使用。
【請求項２３】
被験体の子宮頸癌腫および頭頸部癌腫物から選択されるＨＰＶＥ７発現腫瘍を処置、阻害、または抑制する医薬を製造するための、請求項５の組換えタンパク質の使用。
【請求項２４】
請求項１の組換えタンパク質であって、
前記変異が欠失変異である、組換えタンパク質。
【請求項２５】
請求項１の組換えタンパク質であって、
前記変異が点突然変異である、組換えタンパク質。
【請求項２６】
請求項１の組換えタンパク質であって、
前記変異が置換突然変異である、組換えタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コレステロール結合ドメインまたはその一部の置換または内部欠失を含む変異リステリオリジンＯ（ＬＬＯ）タンパク質またはその断片を含む組換えタンパク質またはペプチドと、同一のものを含む融合タンパク質またはペプチドと、同一のものをコードするヌクレオチド分子と、同一のものを含むかコードするワクチンベクターとを提供する。また、本発明は、目的のペプチドに対する免疫応答を誘導するために、本発明の組換えタンパク質、ペプチド、ヌクレオチド分子、およびワクチンベクターを利用する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
免疫応答の刺激は、宿主免疫系によって外来性のものと認識された抗原の存在に依存する。サルモネラ菌（Salmonella enterica）およびウシ型結核菌（Mycobacterium bovis）ＢＣＧ等の細菌抗原はファゴソームに残り、主要組織適合クラスＩＩ分子による抗原提示を介してＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激する。一方、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）等の細菌抗原は、ファゴソームから細胞質内に出る。リステリア・モノサイトゲネス（L. monocytogenes）のファゴリソゾーム回避はユニークなメカニズムであり、リステリア菌抗原の主要組織適合クラスＩ抗原提示を促進する。この回避は、孔形成スルフヒドリル活性化細胞溶解素であるリステリオリジンＯ（ＬＬＯ）に依存する。
【０００３】
抗原、特に腫瘍および細胞内病原体の予防および処置に有用な抗原の免疫原性を高める組成物および方法を開発する必要性が、長い間存在している。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、コレステロール結合ドメインの変異、置換または内部欠失を含む変異リステリオリジンＯ（ＬＬＯ）タンパク質またはその断片を含む組換えタンパク質と、同一のものを含む融合タンパク質またはペプチドと、同一のものをコードするヌクレオチド分子と、同一のものを含むかコードするワクチンベクターとを提供する。また、本発明は、目的のペプチドに対する免疫応答を誘導するために、本発明の組換えタンパク質、ペプチド、ヌクレオチド分子、およびワクチンベクターを利用する方法を提供する。
【０００５】
本発明は、リステリオリジンＯ（ＬＬＯ）タンパク質またはそのＮ末端断片を含む組換えタンパク質を提供するもので、前記ＬＬＯタンパク質またはＮ末端断片は、コレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）に突然変異を含み、前記突然変異は、１〜５０アミノ酸非ＬＬＯペプチドが配列番号１８に記載のＣＢＤを含む１〜５０アミノ酸ペプチドに置換されており、前記組換えタンパク質は、野生型のＬＬＯに比べて、溶血作用の減少が１００倍を超えることを示す。
【０００６】
別の実施形態では、本発明はリステリオリジンＯ（ＬＬＯ）タンパク質またはそのＮ末端断片を含む組換えタンパク質を提供するもので、式中前記ＬＬＯタンパク質またはＮ末端断片は、コレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）に突然変異を含み、前記突然変異は、配列番号３７の残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、Ｗ４９２、またはそれらの組み合わせの置換を含み、前記組換えタンパク質は、野生型のＬＬＯに比べて、溶血作用の減少が１００倍を超えることを示している。
【０００７】
別の実施形態では、本発明は、組換えタンパク質を提供するもので、該組換えタンパク質は、（ａ）リステリオリジンＯ（ＬＬＯ）タンパク質またはそのＮ末端断片であり、配列番号１８に記載のＬＬＯタンパク質のコレステロール結合ドメイン内に１〜５０アミノ酸内部欠失を含む前記ＬＬＯタンパク質またはそのＮ末端断片と、（ｂ）目的の異種ペプチドとを含み、前記組換えタンパク質は、野生型のＬＬＯに比べて、溶血作用の減少が１００倍を超えることを示す。
【０００８】
一実施形態では、変異ＬＬＯタンパク質または変異Ｎ末端ＬＬＯタンパク質断片は、そのシグナルペプチド配列の欠失を含む。別の実施形態では、変異ＬＬＯタンパク質または変異Ｎ末端ＬＬＯ断片は、そのシグナルペプチド配列を含む。別の実施形態では、組換えタンパク質は目的の異種ペプチドを含む。別の実施形態では、組換えタンパク質は非ＬＬＯペプチドを含み、一実施形態では、該非ＬＬＯペプチドは前記目的の異種ペプチドを含む。別の実施形態では、目的の異種ペプチドは完全長タンパク質であり、一実施形態では、該完全長タンパク質は抗原ペプチドを含む。一実施形態では、このタンパク質はＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質である。別の実施形態では、このタンパク質はヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７タンパク質である。別の実施形態では、このタンパク質はＢ細胞受容体（ＢＣＲ）タンパク質である。別の実施形態では、目的の異種ペプチドは抗原ペプチドである。別の実施形態では、抗原ペプチドはＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドである。別の実施形態では、抗原ペプチドはヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７ペプチドである。別の実施形態では、抗原ペプチドはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）ペプチドである。別の実施形態では、抗原ペプチドは、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）−１６−Ｅ６、ＨＰＶ−１６−Ｅ７、ＨＰＶ−１８−Ｅ６、ＨＰＶ−１８−Ｅ７、Ｈｅｒ／２−ｎｅｕ抗原、前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、角質層キモトリプシン様酵素（ＳＣＣＥ）抗原、ウィルムス腫瘍抗原１（ＷＴ−１）、テロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）、プロテイナーゼ３、チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ２）、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、滑膜肉腫、Ｘ（ＳＳＸ）−２、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＭＡＧＥ−Ａ、インターロイキン−１３受容体アルファ（ＩＬ１３−Ｒアルファ）、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）、スルビビン、ＧＰ１００、またはテスチシンペプチドである。
【０００９】
別の実施形態では、本発明は、組換えタンパク質とアジュバントとを含むワクチンを提供する。別の実施形態では、アジュバントは顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質、ＧＭ−ＧＳＦタンパク質をコードするヌクレオチド分子、サポニンＱＳ２１、モノホスホリル脂質Ａ、または非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態では、本発明は、組換えタンパク質と目的の異種ペプチドとを含む組成物を提供するもので、前記組換えタンパク質は、前記目的の異種ペプチドに共有結合していない。別の実施形態では、本発明は、そのような組成物およびアジュバントを含むワクチンを提供する。別の実施形態では、本発明は、組換えタンパク質をコードする組み換えワクチンベクターを提供する。別の実施形態では、本発明は、組換えタンパク質をコードするヌクレオチド分子を提供する。
【００１０】
別の実施形態では、本発明は、ヌクレオチド分子を含むワクチンを提供する。別の実施形態では、本発明は、組換えタンパク質またはペプチドを含む組換えリステリア菌株を提供する。別の実施形態では、本発明は、被験体に組換えタンパク質またはペプチドを投与することを含む、前記被験体の免疫応答を誘導する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、被験体に組成物を投与することを含む、前記被験体の免疫応答を誘導する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、被験体に組換えワクチンベクターを投与することを含む、被験体の免疫応答を誘導する方法を提供するもので、前記非ＬＬＯタンパク質または前記組換えタンパク質のペプチドまたはペプチドは、目的の抗原ペプチドを含むことで、目的の前記抗原ペプチドに対する免疫応答を誘導する。別の実施形態では、本発明は、被験体に組換えワクチンベクターを投与することを含む、前記被験体の免疫応答を誘導する方法を提供するもので、該方法は、目的の異種ペプチドをさらに含む組換えワクチンベクターを被験体に投与することで、目的の前記異種ペプチドに対する免疫応答を誘導することを含む。別の実施形態では、本発明は、被験体に組換えリステリア菌株を投与することを含む、被験体の免疫応答を誘導する方法を提供するもので、前記非ＬＬＯタンパク質または前記組換えタンパク質のペプチドは、目的の抗原ペプチドを含むことで、目的の前記抗原ペプチドに対する免疫応答を誘導する。別の実施形態では、本発明は、被験体の免疫応答を誘導する方法を提供するもので、前記被験体に組換えリステリア菌株と目的の異種ペプチドをコードするベクターとを投与することを含むことで、目的の前記異種ペプチドに対する免疫応答を誘導する。
【００１１】
別の実施形態では、本発明は、卵巣メラノーマ細胞および肺癌細胞から選択されるＮＹ−ＥＳＯ−１発現癌細胞に対する被験体の免疫応答を誘導する方法を提供するもので、該方法は、前記被験体に本発明の組換えタンパク質を投与するステップを含む。別の実施形態では、本発明は、被験体の卵巣黒色腫および肺癌腫から選択されるＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍を処置、阻害、または抑制する方法を提供するもので、該方法は、前記被験体に本発明の組換えタンパク質を投与するステップを含む。
【００１２】
別の実施形態では、本発明は、子宮頸癌細胞および頭頸部癌細胞から選択されるＨＰＶＥ７発現癌細胞に対する被験体の免疫応答を誘導する方法を提供するもので、該方法は、前記被験体に本発明の組換えタンパク質を投与するステップを含む。別の実施形態では、本発明は、被験体の子宮頸癌腫および頭頸部癌腫物から選択されるＨＰＶＥ７発現腫瘍を処置、阻害、または抑制する方法を提供するもので、該方法は、前記被験体に本発明の組換えタンパク質を投与するステップを含む。別の実施形態では、本発明は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）発現リンパ腫に対する被験体の免疫応答を誘導する方法を提供するもので、該方法は、前記被験体に本発明の組換えタンパク質を投与するステップを含む。別の実施形態では、本発明は、被験体のＢ細胞受容体（ＢＣＲ）発現リンパ腫を処置、阻害、または抑制する方法を提供するもので、該方法は、前記被験体に本発明の組換えタンパク質を投与するステップを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】ＳＯＥ突然変異誘発戦略。ＬＬＯの第４ドメインを変異させることで、ＬＬＯの毒性の減少／低下が達成された。この領域は、該領域が膜に結合することを可能にするコレステロール結合部位を含み、その膜上でオリゴマー化することで孔が形成される。
【図１Ｂ】ＳＯＥ突然変異誘発戦略。ＬＬＯの第４ドメインを変異させることで、ＬＬＯの毒性の減少／低下が達成された。この領域は、該領域が膜に結合することを可能にするコレステロール結合部位を含み、その膜上でオリゴマー化することで孔が形成される。
【図２Ａ】クーマシー染色（Ａ）およびウェスタンブロット（Ｂ）による突然変異体ＬＬＯタンパク質の発現。
【図２Ｂ】クーマシー染色（Ａ）およびウェスタンブロット（Ｂ）による突然変異体ＬＬＯタンパク質の発現。
【図３Ａ】ｐＨ５．５（Ａ）およびｐＨ７．４（Ｂ）での突然変異体ＬＬＯ（ｍｕｔＬＬＯおよびｃｔＬＬＯ）タンパク質の溶血作用。
【図３Ｂ】ｐＨ５．５（Ａ）およびｐＨ７．４（Ｂ）での突然変異体ＬＬＯ（ｍｕｔＬＬＯおよびｃｔＬＬＯ）タンパク質の溶血作用。
【図４】ＴＣ−１増殖に対して影響を及ぼす化学的に結合した解毒ｒＬＬＯ＋ｒＥ７および一緒に混合したｒＬＬＯ＋ｒＥ７の能力。
【図５】ＴＣ−１増殖に対して影響を及ぼすｒＥ７およびｒＬＬＯタンパク質の能力。
【図６】ＴＣ−１増殖に対して影響及ぼす組換え解毒ＬＬＯＥ７（ｒＤＴＬＬＯ−Ｅ７；全配列）およびｒＤＴＬＬＯ−Ｅ７（キメラ）の能力。
【図７】ｒＥ７、ｒＬＬＯ、ｒＬＬＯ＋Ｅ７およびｒＤＴＬＬＯ−Ｅ７による免疫化後のＴＣ−１腫瘍緩解。
【図８】ｒＤＴＬＬＯ−キメラによる免疫化後のＴＣ−１腫瘍緩解。
【図９】ｒＥ７、ｒＤＴＬＬＯ、ｒＤＴＬＬＯ＋ｒＥ７およびｒＤＴＬＬＯ−Ｅ７による免疫化後のＴＣ−１腫瘍緩解。
【図１０】ＡｃｔＡ−Ｅ７およびＥ７タンパク質によって免疫化されたＴＣ−１腫瘍緩解。
【図１１】ＡｃｔＡ＋Ｅ７およびＥ７タンパク質によって免疫化されたＴＣ−１腫瘍緩解。
【図１２】ＡｃｔＡおよびＥ７タンパク質によって免疫化されたＴＣ−１腫瘍緩解。
【図１３Ａ】解毒ＬＬＯは、骨髄（ＢＭ）マクロファージによるサイトカインｍＲＮＡ発現を誘導する。８ｅ５  ７日目のＢＭＤＣをＲＦ１０培地中、３７℃で一晩解凍した。次に、ＢＭＤＣを遠心し、３７℃で１時間かけて、１ｍＬの新鮮なＲＦ１０に再懸濁した。ＢＭＤＣを４０ｍｃｇ／ｍＬのＬＬＯＥ７とモル等量のＥ７およびＬＬＯとによって処理した（または陰性対照としてＰＢＳで、もしくは陽性対照として１ｍｃｇ／ｍＬのＬＰＳで処理）。２時間後および２４時間後に、遠心により細胞を回収し、培地をＥＬＳＡ用に保存した。ＲＮＡを細胞から抽出し、ｃＤＮＡに変換した。次に、ｃＤＮＡを種々のサイトカイン用プライマーを用いるｑＰＣＲ分析にかけた。
【図１３Ｂ】解毒ＬＬＯは、骨髄（ＢＭ）マクロファージによるサイトカインｍＲＮＡ発現を誘導する。８ｅ５  ７日目のＢＭＤＣをＲＦ１０培地中、３７℃で一晩解凍した。次に、ＢＭＤＣを遠心し、３７℃で１時間かけて、１ｍＬの新鮮なＲＦ１０に再懸濁した。ＢＭＤＣを４０ｍｃｇ／ｍＬのＬＬＯＥ７とモル等量のＥ７およびＬＬＯとによって処理した（または陰性対照としてＰＢＳで、もしくは陽性対照として１ｍｃｇ／ｍＬのＬＰＳで処理）。２時間後および２４時間後に、遠心により細胞を回収し、培地をＥＬＳＡ用に保存した。ＲＮＡを細胞から抽出し、ｃＤＮＡに変換した。次に、ｃＤＮＡを種々のサイトカイン用プライマーを用いるｑＰＣＲ分析にかけた。
【図１３Ｃ】解毒ＬＬＯは、骨髄（ＢＭ）マクロファージによるサイトカインｍＲＮＡ発現を誘導する。８ｅ５  ７日目のＢＭＤＣをＲＦ１０培地中、３７℃で一晩解凍した。次に、ＢＭＤＣを遠心し、３７℃で１時間かけて、１ｍＬの新鮮なＲＦ１０に再懸濁した。ＢＭＤＣを４０ｍｃｇ／ｍＬのＬＬＯＥ７とモル等量のＥ７およびＬＬＯとによって処理した（または陰性対照としてＰＢＳで、もしくは陽性対照として１ｍｃｇ／ｍＬのＬＰＳで処理）。２時間後および２４時間後に、遠心により細胞を回収し、培地をＥＬＳＡ用に保存した。ＲＮＡを細胞から抽出し、ｃＤＮＡに変換した。次に、ｃＤＮＡを種々のサイトカイン用プライマーを用いるｑＰＣＲ分析にかけた。
【図１３Ｄ】解毒ＬＬＯは、骨髄（ＢＭ）マクロファージによるサイトカインｍＲＮＡ発現を誘導する。８ｅ５  ７日目のＢＭＤＣをＲＦ１０培地中、３７℃で一晩解凍した。次に、ＢＭＤＣを遠心し、３７℃で１時間かけて、１ｍＬの新鮮なＲＦ１０に再懸濁した。ＢＭＤＣを４０ｍｃｇ／ｍＬのＬＬＯＥ７とモル等量のＥ７およびＬＬＯとによって処理した（または陰性対照としてＰＢＳで、もしくは陽性対照として１ｍｃｇ／ｍＬのＬＰＳで処理）。２時間後および２４時間後に、遠心により細胞を回収し、培地をＥＬＳＡ用に保存した。ＲＮＡを細胞から抽出し、ｃＤＮＡに変換した。次に、ｃＤＮＡを種々のサイトカイン用プライマーを用いるｑＰＣＲ分析にかけた。
【図１３Ｅ】解毒ＬＬＯは、骨髄（ＢＭ）マクロファージによるサイトカインｍＲＮＡ発現を誘導する。８ｅ５  ７日目のＢＭＤＣをＲＦ１０培地中、３７℃で一晩解凍した。次に、ＢＭＤＣを遠心し、３７℃で１時間かけて、１ｍＬの新鮮なＲＦ１０に再懸濁した。ＢＭＤＣを４０ｍｃｇ／ｍＬのＬＬＯＥ７とモル等量のＥ７およびＬＬＯとによって処理した（または陰性対照としてＰＢＳで、もしくは陽性対照として１ｍｃｇ／ｍＬのＬＰＳで処理）。２時間後および２４時間後に、遠心により細胞を回収し、培地をＥＬＳＡ用に保存した。ＲＮＡを細胞から抽出し、ｃＤＮＡに変換した。次に、ｃＤＮＡを種々のサイトカイン用プライマーを用いるｑＰＣＲ分析にかけた。
【図１４Ａ】解毒ＬＬＯはＢＭマクロファージによってサイトカイン分泌を誘導する。処置後に培地をＥＬＩＳＡ分析にかけたことを除いて、図１３に関する記載と同様の処置プロトコール。
【図１４Ｂ】解毒ＬＬＯはＢＭマクロファージによってサイトカイン分泌を誘導する。処置後に培地をＥＬＩＳＡ分析にかけたことを除いて、図１３に関する記載と同様の処置プロトコール。
【図１５Ａ】解毒ＬＬＯは、ＬＬＯ、ＬＬＯ＋Ｅ７、およびＬＬＯＥ７グループのＤＣ成熟マーカーＣＤ８６、ＣＤ４０、およびＭＨＣＩＩをアップレギュレートする。
【図１５Ｂ】解毒ＬＬＯは、ＬＬＯ、ＬＬＯ＋Ｅ７、およびＬＬＯＥ７グループのＤＣ成熟マーカーＣＤ８６、ＣＤ４０、およびＭＨＣＩＩをアップレギュレートする。
【図１５Ｃ】解毒ＬＬＯは、ＬＬＯ、ＬＬＯ＋Ｅ７、およびＬＬＯＥ７グループのＤＣ成熟マーカーＣＤ８６、ＣＤ４０、およびＭＨＣＩＩをアップレギュレートする。
【図１６】Ｄｔ−ＬＬＯによる刺激後のＮＦｋａｐｐａＢの核移行。抗原提示細胞（ＡＰＣ）用のモデル系として用いられたＪ７７４マクロファージ細胞株。１ウェルあたり５×１０＾５細胞（６穴ディッシュ）を、全量１ｍＬで播種した。抗ＮＦ−κＢ（Ｐ６５）−ＦＩＴＣ（緑色蛍光）と、核用にＤＡＰＩ（青色蛍光）とを用いて細胞の染色をおこなった。Ｂ、Ｄ、およびＦでは、細胞は２４時間後にも抗ＣＤ１１Ｂ−ＰＥ（Ｍ１／１７０、eBioscence）で染色した。倍率４０倍で蛍光顕微鏡写真を示す。ＮＦ−カッパＢは、培地のみで細胞を処理した後に、細胞質に局在する（非活性化）（Ａ）。媒体処理細胞は、弱いＣｄ１１ｂ染色を示す（Ｂ）。Ｄｔ−ＬＬＯ（３０ｍｃｇ）によって一晩（２４時間）刺激した後、ＮＦカッパＢが細胞質から出て核の中に入り（Ｃ）、ＣＤ１１ｂ染色の増加がみられる（Ｄ）。同様に、ＬＰＳ（１０ｍｃｇ／ｍＬ、陽性対照）によって一晩（２４時間）刺激した後、ＮＦカッパＢが核へ移動した（Ｅ）。このことは、原形質膜のＣＤ１１ｂ＋染色が高まったことよって生じるハローにより、よりいっそう認識される（Ｆ）。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、コレステロール結合ドメインの置換または内部欠失を含む変異リステリオリジンＯ（ＬＬＯ）タンパク質またはその断片を含む組換えタンパク質およびペプチドと、同一のものを含む融合ペプチドと、同一のものをコードするヌクレオチド分子と、同一のものを含むかコードするワクチンベクターとを提供する。また、本発明は、免疫応答を誘導するために、本発明の組換えペプチド、ヌクレオチド分子、およびワクチンベクターを利用する方法を提供する。
【００１５】
一実施形態では、本発明はリステリオリジンＯ（ＬＬＯ）タンパク質を含む組換えタンパク質またはポリペプチドを提供するもので、前記ＬＬＯタンパク質は、前記ＬＬＯタンパク質のコレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）の残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２の変異体、またはそれらの組み合わせを含む。一実施形態では、前記Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２残基は、配列番号３７の残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２であり、一方、別の実施形態ではそれらは、当業者には公知のように、配列アラインメントを用いて推定できるように、対応する残基である。一実施形態では、残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２が変異している。一実施形態では突然変異は置換、別の実施形態では欠失である。一実施形態では、ＣＢＤ全体が変異しており、一方、別の実施形態ではＣＢＤの一部が変異しており、一方、別の実施形態では、ＣＢＤ内の特定の残基のみが変異している。
【００１６】
一実施形態では、本発明の組成物および方法で使用される任意のＬＬＯ断片は、Ｎ末端ＬＬＯ断片である。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は少なくとも４９２のアミノ酸（ＡＡ）長である。別の実施形態では、ＬＬＯ断片は４９２〜５２８ＡＡ長である。
【００１７】
一実施形態では、本発明の組成物および方法で使用される変異領域は、１〜５０アミノ酸長である。
【００１８】
一実施形態では、本発明の組成物および方法で使用される任意の非ＬＬＯポリペプチドは、１〜５０アミノ酸長である。別の実施形態では、非ＬＬＯポリペプチドは変異領域と同じ全長である。別の実施形態では、非ＬＬＯポリペプチドは変異領域よりも短く、または別の実施形態では、変異領域よりも長い。
【００１９】
一実施形態では、本発明の組成物および方法で使用される置換は、溶血作用に関して不活性化突然変異である。
【００２０】
別の実施形態では、本発明の組成物および方法で使用される組換えペプチドは、野生型ＬＬＯに関して溶血作用の減少を示す。別の実施形態では、組み換えのペプチドは非溶血性である。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【００２１】
一実施形態では、本発明は、変異ＬＬＯタンパク質またはその断片を含む組換えタンパク質またはポリペプチドを提供するもので、変異ＬＬＯタンパク質またはその断片は、該変異ＬＬＯタンパク質またはその断片の変異領域が非ＬＬＯペプチドによって置換されており、該変異領域にはＣ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２から選択される残基が含まれる。
【００２２】
本明細書中に提供されるように、ＬＬＯの残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２がアラニン残基によって置換された変異ＬＬＯタンパク質を生成した（実施例１）。変異ＬＬＯ変異タンパク質であるｍｕｔＬＬＯは、大腸菌（E. coli）発現系で発現および精製することが可能であり（実施例３）、また野生型ＬＬＯと比較して溶血作用の実質的な減少を示した（実施例４）。
【００２３】
別の実施形態では、本発明は、変異ＬＬＯタンパク質またはその断片とを含む組換えタンパク質またはポリペプチドを提供するもので、変異ＬＬＯタンパク質またはその断片は、該変異ＬＬＯタンパク質またはその断片の変異領域が非ＬＬＯペプチドによって置換されており、変異領域には変異ＬＬＯタンパク質またはその断片のコレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）が含まれる。
【００２４】
別の実施形態では、本発明は、変異ＬＬＯタンパク質またはその断片とを含む組換えタンパク質またはポリペプチドを提供するもので、変異ＬＬＯタンパク質またはその断片は、該変異ＬＬＯタンパク質またはその断片の変異領域が非ＬＬＯペプチドによって置換されており、変異領域は変異ＬＬＯタンパク質またはその断片のＣＢＤの断片である。
【００２５】
別の実施形態では、本発明は、変異ＬＬＯタンパク質とその断片とを含む組換えタンパク質またはポリペプチドを提供するもので、変異ＬＬＯタンパク質またはその断片は、該変異ＬＬＯタンパク質またはその断片の１〜５０アミノ酸変異領域が１〜５０アミノ酸非ＬＬＯペプチドによって置換されており、変異領域が変異ＬＬＯタンパク質またはその断片のＣＢＤと重複する。
【００２６】
別の実施形態では、本発明は組換えタンパク質またはポリペプチドを提供するもので、該組換えタンパク質またはポリペプチドは、（ａ）内部欠失を有し、該内部欠失に変異ＬＬＯタンパク質のコレステロール結合ドメインが含まれる変異ＬＬＯタンパク質と、（ｂ）目的の異種ペプチドと、を含む。別の実施形態では、コレステロール結合ドメインの配列は配列番号１８に記述されている。別の実施形態では、内部欠失は１１〜５０アミノ酸内部欠失である。別の実施形態では、内部欠失は、組換えタンパク質またはポリペプチドの溶血作用に関して不活性化している。別の実施形態では、組換えタンパク質またはポリペプチドは、野生型ＬＬＯに関する溶血作用の減少を示す。各々の可能性は、本発明の別の実施形態を表わす。
【００２７】
別の実施形態では、本発明は組換えタンパク質またはポリペプチドを提供するもので、該組換えタンパク質またはポリペプチドは、（ａ）内部欠失を有し、該内部欠失に変異ＬＬＯタンパク質のＣ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２から選択される残基が含まれる変異ＬＬＯタンパク質と、（ｂ）目的の異種ペプチドと、を含む。別の実施形態では、内部欠失は１〜５０アミノ酸内部欠失である。別の実施形態では、コレステロール結合ドメインの配列は配列番号１８に記述されている。別の実施形態では、内部欠失は、組換えタンパク質またはポリペプチドの溶血作用に関して不活性化している。別の実施形態では、組換えタンパク質またはポリペプチドは、野生型ＬＬＯに関する溶血作用の減少を示す。各々の可能性は、本発明の別の実施形態を表わす。
【００２８】
別の実施形態では、本発明は組換えタンパク質またはポリペプチドを提供するもので、該組換えタンパク質またはポリペプチドは、（ａ）内部欠失を有し、該内部欠失に変異ＬＬＯタンパク質のコレステロール結合ドメインの断片が含まれる変異ＬＬＯタンパク質と、（ｂ）目的の異種ペプチドと、を含む。別の実施形態では、内部欠失は１〜１１アミノ酸内部欠失である。別の実施形態では、コレステロール結合ドメインの配列は配列番号１８に記述されている。別の実施形態では、内部欠失は、組換えタンパク質またはポリペプチドの溶血作用に関して不活性化している。別の実施形態では、組換えタンパク質またはポリペプチドは、野生型ＬＬＯに関する溶血作用の減少を示す。各々の可能性は、本発明の別の実施形態を表わす。
【００２９】
別の実施形態では、本発明は、アジュバントを含むワクチン、本発明の組換えタンパク質またはポリペプチド、および目的の異種ペプチドを提供する。別の実施形態では、本発明は、アジュバントを含む組成物、本発明の組換えタンパク質またはポリペプチド、および目的の異種抗原ペプチドを提供する。別の実施形態では、組換えタンパク質またはポリペプチドは、目的の異種ペプチドに共有結合していない。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【００３０】
本発明の方法および組成物の変異領域は、別の実施形態では、配列番号３７の残基Ｃ４８４を含む。別の実施形態では、変異領域は、相同ＬＬＯタンパク質の対応するシステイン残基を含む。別の実施形態では、変異領域は、配列番号３７の残基Ｗ４９１を含む。別の実施形態では、変異領域は、相同ＬＬＯタンパク質の対応するトリプトファン残基を含む。別の実施形態では、変異領域は、配列番号３７の残基Ｗ４９２を含む。別の実施形態では、変異領域は、相同ＬＬＯタンパク質の対応するトリプトファン残基を含む。相同タンパク質の対応する残基を識別する方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、配列アラインメントが挙げられる。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【００３１】
別の実施形態では、変異領域は残基Ｃ４８４およびＷ４９１を含む。別の実施形態では、変異領域は残基Ｃ４８４およびＷ４９２を含む。別の実施形態では、変異領域は残基Ｗ４９１およびＷ４９２を含む。別の実施形態では、変異領域は残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２を含む。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【００３２】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物の変異領域は、変異ＬＬＯタンパク質またはその断片のコレステロール結合ドメインを含む。例えば、配列番号３７の残基４７０〜５００、４７０〜５１０、または４８０〜５００からなる変異領域は、そのＣＢＤ（残基４８３〜４９３）を含む。別の実施形態では、変異領域は、変異ＬＬＯタンパク質またはその断片のＣＢＤの断片である。例えば、本明細書中で提供されるように、各々がＣＢＤの断片である残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２をアラニン残基に変異させた（実施例１）。さらに、本明細書中に提供されるように、残基４８４〜４９２であるＣＢＤの断片を、ＮＹ−ＥＳＯ−１由来の異種配列と置き換えた（実施例２）。別の実施形態では、変異領域が変異ＬＬＯタンパク質またはその断片のＣＢＤと重複する。例えば、配列番号３７の残基４７０〜４９０、４８０〜４８８、４９０〜５００、または４８６〜５１０からなる変異領域は、そのＣＢＤを含む。別の実施形態では、単一のペプチドはシグナル配列に欠失を有し、ＣＢＤに突然変異または置換を有するものであってもよい。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【００３３】
一実施形態では、変異領域の全長、または別の実施形態では内部欠失の長さは、一実施形態では、１〜５０ＡＡである。別の実施形態では、全長は１〜１１ＡＡである。別の実施形態では、全長は２〜１１ＡＡである。別の実施形態では、全長は３〜１１ＡＡである。別の実施形態では、全長は４〜１１ＡＡである。別の実施形態では、全長は５〜１１ＡＡである。別の実施形態では、全長は６〜１１ＡＡである。別の実施形態では、全長は７〜１１ＡＡである。別の実施形態では、全長は８〜１１ＡＡである。別の実施形態では、全長は９〜１１ＡＡである。別の実施形態では、全長は１０〜１１ＡＡである。別の実施形態では、全長は１〜２ＡＡである。別の実施形態では、全長は１〜３ＡＡである。別の実施形態では、全長は１〜４ＡＡである。別の実施形態では、全長は１〜５ＡＡである。別の実施形態では、全長は１〜６ＡＡである。別の実施形態では、全長は１〜７ＡＡである。別の実施形態では、全長は１〜８ＡＡである。別の実施形態では、全長は１〜９ＡＡである。別の実施形態では、全長は１〜１０ＡＡである。別の実施形態では、全長は２〜３ＡＡである。別の実施形態では、全長は２〜４ＡＡである。別の実施形態では、全長は２〜５ＡＡである。別の実施形態では、全長は２〜６ＡＡである。別の実施形態では、全長は２〜７ＡＡである。別の実施形態では、全長は２〜８ＡＡである。別の実施形態では、全長は２〜９ＡＡである。別の実施形態では、全長は２〜１０ＡＡである。別の実施形態では、全長は３〜４ＡＡである。別の実施形態では、全長は３〜５ＡＡである。別の実施形態では、全長は３〜６ＡＡである。別の実施形態では、全長は３〜７ＡＡである。別の実施形態では、全長は３〜８ＡＡである。別の実施形態では、全長は３〜９ＡＡである。別の実施形態では、全長は３〜１０ＡＡである。別の実施形態では、全長は１１〜５０ＡＡである。別の実施形態では、全長は１２〜５０ＡＡである。別の実施形態では、全長は１１〜１５ＡＡである。別の実施形態では、全長は１１〜２０ＡＡである。別の実施形態では、全長は１１〜２５ＡＡである。別の実施形態では、全長は１１〜３０ＡＡである。別の実施形態では、全長は１１〜３５ＡＡである。別の実施形態では、全長は１１〜４０ＡＡである。別の実施形態では、全長は１１〜６０ＡＡである。別の実施形態では、全長は１１〜７０ＡＡである。別の実施形態では、全長は１１〜８０ＡＡである。別の実施形態では、全長は１１〜９０ＡＡである。別の実施形態では、全長は１１〜１００ＡＡである。別の実施形態では、全長は１１〜１５０ＡＡである。別の実施形態では、全長は１５〜２０ＡＡである。別の実施形態では、全長は１５〜２５ＡＡである。別の実施形態では、全長は１５〜３０ＡＡである。別の実施形態では、全長は１５〜３５ＡＡである。別の実施形態では、全長は１５〜４０ＡＡである。別の実施形態では、全長は１５〜６０ＡＡである。別の実施形態では、全長は１５〜７０ＡＡである。別の実施形態では、全長は１５〜８０ＡＡである。別の実施形態では、全長は１５〜９０ＡＡである。別の実施形態では、全長は１５〜１００ＡＡである。別の実施形態では、全長は１５〜１５０ＡＡである。別の実施形態では、全長は２０〜２５ＡＡである。別の実施形態では、全長は２０〜３０ＡＡである。別の実施形態では、全長は２０〜３５ＡＡである。別の実施形態では、全長は２０〜４０ＡＡである。別の実施形態では、全長は２０〜６０ＡＡである。別の実施形態では、全長は２０〜７０ＡＡである。別の実施形態では、全長は２０〜８０ＡＡである。別の実施形態では、全長は２０〜９０ＡＡである。別の実施形態では、全長は２０〜１００ＡＡである。別の実施形態では、全長は２０〜１５０ＡＡである。別の実施形態では、全長は３０〜３５ＡＡである。別の実施形態では、全長は３０〜４０ＡＡである。別の実施形態では、全長は３０〜６０ＡＡである。別の実施形態では、全長は３０〜７０ＡＡである。別の実施形態では、全長は３０〜８０ＡＡである。別の実施形態では、全長は３０〜９０ＡＡである。別の実施形態では、全長は３０〜１００ＡＡである。別の実施形態では、全長は３０〜１５０ＡＡである。各々の可能性は、本発明の別の実施形態を表わす。
【００３４】
本発明の方法および組成物の置換突然変異は、別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質またはその断片の変異領域が等しい数の異種ＡＡと置き換わる突然変異である。別の実施形態では、変異領域のサイズよりも多い数の異種ＡＡが導入される。別の実施形態では、変異領域のサイズよりも少ない数の異種ＡＡが導入される。各々の可能性は、本発明の別の実施形態を表わす。
【００３５】
別の実施形態では、置換突然変異は単一の残基の点突然変異である。別の実施形態では、置換突然変異は２つの残基の点突然変異である。別の実施形態では、置換突然変異は３つの残基の点突然変異である。別の実施形態では、置換突然変異は３つを超える残基の点突然変異である。別の実施形態では、置換突然変異はいくつかの残基の点突然変異である。別の実施形態では、点突然変異に含まれた多数の残基が連続する。別の実施形態では、多数の残基は連続しない。各々の可能性は、本発明の別の実施形態を表わす。
【００３６】
本発明の組換えタンパク質またはポリペプチドの変異領域に取って代わる非ＬＬＯペプチドの全長は、別の実施形態では、１〜５５ＡＡである。別の実施形態では、全長は１〜１１ＡＡである。別の実施形態では、全長は２〜１１ＡＡである。別の実施形態では、全長は３〜１１ＡＡである。別の実施形態では、全長は４〜１１ＡＡである。別の実施形態では、全長は５〜１１ＡＡである。別の実施形態では、全長は６〜１１ＡＡである。別の実施形態では、全長は７〜１１ＡＡである。別の実施形態では、全長は８〜１１ＡＡである。別の実施形態では、全長は９〜１１ＡＡである。別の実施形態では、全長は１０〜１１ＡＡである。別の実施形態では、全長は１〜２ＡＡである。別の実施形態では、全長は１〜３ＡＡである。別の実施形態では、全長は１〜４ＡＡである。別の実施形態では、全長は１〜５ＡＡである。別の実施形態では、全長は１〜６ＡＡである。別の実施形態では、全長は１〜７ＡＡである。別の実施形態では、全長は１〜８ＡＡである。別の実施形態では、全長は１〜９ＡＡである。別の実施形態では、全長は１〜１０ＡＡである。別の実施形態では、全長は２〜３ＡＡである。別の実施形態では、全長は２〜４ＡＡである。別の実施形態では、全長は２〜５ＡＡである。別の実施形態では、全長は２〜６ＡＡである。別の実施形態では、全長は２〜７ＡＡである。別の実施形態では、全長は２〜８ＡＡである。別の実施形態では、全長は２〜９ＡＡである。別の実施形態では、全長は２〜１０ＡＡである。別の実施形態では、全長は３〜４ＡＡである。別の実施形態では、全長は３〜５ＡＡである。別の実施形態では、全長は３〜６ＡＡである。別の実施形態では、全長は３〜７ＡＡである。別の実施形態では、全長は３〜８ＡＡである。別の実施形態では、全長は３〜９ＡＡである。別の実施形態では、全長は３〜１０ＡＡである。別の実施形態では、全長は１１〜５０ＡＡである。別の実施形態では、全長は１２〜５０ＡＡである。別の実施形態では、全長は１１〜１５ＡＡである。別の実施形態では、全長は１１〜２０ＡＡである。別の実施形態では、全長は１１〜２５ＡＡである。別の実施形態では、全長は１１〜３０ＡＡである。別の実施形態では、全長は１１〜３５ＡＡである。別の実施形態では、全長は１１〜４０ＡＡである。別の実施形態では、全長は１１〜６０ＡＡである。別の実施形態では、全長は１１〜７０ＡＡである。別の実施形態では、全長は１１〜８０ＡＡである。別の実施形態では、全長は１１〜９０ＡＡである。別の実施形態では、全長は１１〜１００ＡＡである。別の実施形態では、全長は１１〜１５０ＡＡである。別の実施形態では、全長は１５〜２０ＡＡである。別の実施形態では、全長は１５〜２５ＡＡである。別の実施形態では、全長は１５〜３０ＡＡである。別の実施形態では、全長は１５〜３５ＡＡである。別の実施形態では、全長は１５〜４０ＡＡである。別の実施形態では、全長は１５〜６０ＡＡである。別の実施形態では、全長は１５〜７０ＡＡである。別の実施形態では、全長は１５〜８０ＡＡである。別の実施形態では、全長は１５〜９０ＡＡである。別の実施形態では、全長は１５〜１００ＡＡである。別の実施形態では、全長は１５〜１５０ＡＡである。別の実施形態では、全長は２０〜２５ＡＡである。別の実施形態では、全長は２０〜３０ＡＡである。別の実施形態では、全長は２０〜３５ＡＡである。別の実施形態では、全長は２０〜４０ＡＡである。別の実施形態では、全長は２０〜６０ＡＡである。別の実施形態では、全長は２０〜７０ＡＡである。別の実施形態では、全長は２０〜８０ＡＡである。別の実施形態では、全長は２０〜９０ＡＡである。別の実施形態では、全長は２０〜１００ＡＡである。別の実施形態では、全長は２０〜１５０ＡＡである。別の実施形態では、全長は３０〜３５ＡＡである。別の実施形態では、全長は３０〜４０ＡＡである。別の実施形態では、全長は３０〜６０ＡＡである。別の実施形態では、全長は３０〜７０ＡＡである。別の実施形態では、全長は３０〜８０ＡＡである。別の実施形態では、全長は３０〜９０ＡＡである。別の実施形態では、全長は３０〜１００ＡＡである。別の実施形態では、全長は３０〜１５０ＡＡである。各々の可能性は、本発明の別の実施形態を表わす。
【００３７】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＬＬＯ断片の全長は、少なくとも４８４ＡＡである。別の実施形態では、全長は４８４ＡＡを超える。別の実施形態では、全長は少なくとも４８９ＡＡである。別の実施形態では、全長は４８９を超える。別の実施形態では、全長は少なくとも４９３ＡＡである。別の実施形態では、全長は４９３を超える。別の実施形態では、全長は少なくとも５００ＡＡである。別の実施形態では、全長は５００を超える。別の実施形態では、全長は少なくとも５０５ＡＡである。別の実施形態では、全長は５０５を超える。別の実施形態では、全長は少なくとも５１０ＡＡである。別の実施形態では、全長は５１０を超える。別の実施形態では、全長は少なくとも５１５ＡＡである。別の実施形態では、全長は５１５を超える。別の実施形態では、全長は少なくとも５２０ＡＡである。別の実施形態では、全長は５２０を超える。別の実施形態では、全長は少なくとも５２５ＡＡである。別の実施形態では、全長は５２０を超える。ＬＬＯ断片の全長をここに参照する場合、シグナル配列が含まれている。したがって、ＣＢＤの最初のシステインに４８４の番号が付され、ＡＡ残基の総数は５２９である。各々の可能性は、本発明の別の実施形態を表わす。
【００３８】
別の実施形態では、本発明のペプチドは融合ペプチドである。別の実施形態では、「融合ペプチド」は、ペプチド結合または他の化学結合によって連結した２つ以上のタンパク質を含むペプチドまたはポリペプチドのことをいう。別の実施形態では、タンパク質は、ペプチド結合または他の化学結合によって、直接連結されている。別の実施形態では、タンパク質は、２つ以上のタンパク質間で、１つ以上のＡＡ（例えば「スペーサー」）によって連結されている。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【００３９】
本明細書中に提供されるように、ＬＬＯの残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２が抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１由来のＣＴＬエピトープによって置換された変異ＬＬＯタンパク質を生成した（実施例２）。変異ＬＬＯ変異タンパク質であるｍｕｔＬＬＯは、大腸菌（E. coli）発現系で発現および精製することが可能であり（実施例３）、また野生型ＬＬＯと比較して溶血作用の実質的な減少を示した（実施例４）。
【００４０】
別の実施形態では、内部欠失を含む本発明の変異ＬＬＯタンパク質は、内部欠失を除いて完全長である。別の実施形態では、変異ＬＬＯタンパク質は付加的な内部欠失を含む。別の実施形態では、変異ＬＬＯタンパク質は２つ以上の付加的な内部欠失を含む。別の実施形態では、変異ＬＬＯタンパク質はＣ末端からトランケートされる。別の実施形態では、変異ＬＬＯタンパク質はＮ末端からトランケートされる。各々の可能性は、本発明の別の実施形態を表わす。
【００４１】
本発明の方法および組成物の内部欠失は、別の実施形態では、配列番号３７の残基Ｃ４８４を含む。別の実施形態では、内部欠失は、相同ＬＬＯタンパク質の対応するシステイン残基を含む。別の実施形態では、内部欠失は、配列番号３７の残基Ｗ４９１を含む。別の実施形態では、内部欠失は、相同ＬＬＯタンパク質の対応するトリプトファン残基を含む。別の実施形態では、内部欠失は、配列番号３７の残基Ｗ４９２を含む。別の実施形態では、内部欠失は、相同ＬＬＯタンパク質の対応するトリプトファン残基を含む。相同タンパク質の対応する残基を識別する方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、配列アラインメントが挙げられる。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【００４２】
別の実施形態では、内部欠失は残基Ｃ４８４およびＷ４９１を含む。別の実施形態では、内部欠失は残基Ｃ４８４およびＷ４９２を含む。別の実施形態では、内部欠失は残基Ｗ４９１およびＷ４９２を含む。別の実施形態では、内部欠失は残基Ｃ４８４、Ｗ４９１およびＷ４９２を含む。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【００４３】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物の内部欠失は変異ＬＬＯタンパク質またはその断片のＣＢＤを含む。例えば、配列番号３７の残基４７０〜５００、４７０〜５１０、または４８０〜５００からなる内部欠失は、そのＣＢＤ（残基４８３〜４９３）を含む。別の実施形態では、内部欠失は、変異ＬＬＯタンパク質またはその断片のＣＢＤの断片である。例えば、残基４８４〜４９２、４８５〜４９０、および４８６〜４８８はすべて配列番号３７のＣＢＤの断片である。別の実施形態では、内部欠失が変異ＬＬＯタンパク質またはその断片のＣＢＤと重複する。例えば、配列番号３７の残基４７０〜４９０、４８０〜４８８、４９０〜５００、または４８６〜５１０からなる内部欠失は、そのＣＢＤを含む。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【００４４】
別の実施形態では、「溶血性」とは真核細胞を溶解する能力のことをいう。別の実施形態では、真核細胞は赤血球である。別の実施形態では、真核細胞は当該技術分野で公知である任意の別の種類の真核細胞である。別の実施形態では、溶血作用は酸性ｐＨで測定される。別の実施形態では、溶血作用は生理学的ｐＨで測定される。別の実施形態では、溶血作用はｐＨ５．５で測定される。別の実施形態では、溶血作用はｐＨ７．４で測定される。別の実施形態では、溶血作用は当該技術分野で公知である任意の他のｐＨで測定される。
【００４５】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物の組換えタンパク質またはポリペプチドは、野生型のＬＬＯに比べて、溶血作用の減少が１００倍を超えることを示す。別の実施形態では、組換えタンパク質またはポリペプチドは、溶血作用において５０倍を超える減少を示す。別の実施形態では、減少は３０倍を上回る。別の実施形態では、減少は４０倍を上回る。別の実施形態では、減少は６０倍を上回る。別の実施形態では、減少は７０倍を上回る。別の実施形態では、減少は８０倍を上回る。別の実施形態では、減少は９０倍を上回る。別の実施形態では、減少は１２０倍を上回る。別の実施形態では、減少は１５０倍を上回る。別の実施形態では、減少は２００倍を上回る。別の実施形態では、減少は２５０倍を上回る。別の実施形態では、減少は３００倍を上回る。別の実施形態では、減少は４００倍を上回る。別の実施形態では、減少は５００倍を上回る。別の実施形態では、減少は６００倍を上回る。別の実施形態では、減少は８００倍を上回る。別の実施形態では、減少は１０００倍を上回る。別の実施形態では、減少は１２００倍を上回る。別の実施形態では、減少は１５００倍を上回る。別の実施形態では、減少は２０００倍を上回る。別の実施形態では、減少は３０００倍を上回る。別の実施形態では、減少は５０００倍を上回る。
【００４６】
別の実施形態では、減少は少なくとも１００倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも５０倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも３０倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも４０倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも６０倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも７０倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも８０倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも９０倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも１２０倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも１５０倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも２００倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも２５０倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも３００倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも４００倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも５００倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも６００倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも８００倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも１０００倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも１２００倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも１５００倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも２０００倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも３０００倍である。別の実施形態では、減少は少なくとも５０００倍である。
【００４７】
溶血作用を測定する方法は、当該技術分野において周知であり、例えば本明細書中の実施例と Portnoy DA et al, （J Exp Med Vol 167:1459-1471, 1988） およびDancz CE et al （J Bacteriol. 184: 5935-5945, 2002）とに記述されている。
【００４８】
溶血作用に関する「不活性化突然変異」は、別の実施形態では、検出可能な溶血作用を止める突然変異のことをいう。別の実施形態では、この用語は、ｐＨ５．５で溶血作用を止める突然変異のことをいう。別の実施形態では、この用語は、ｐＨ７．４で溶血作用を止める突然変異のことをいう。別の実施形態では、この用語は、ｐＨ５．５で溶血作用を著しく減少させる突然変異のことをいう。別の実施形態では、この用語は、ｐＨ７．４で溶血作用を著しく減少させる突然変異のことをいう。別の実施形態では、この用語は、ｐＨ５．５で溶血作用を著しく減少させる突然変異のことをいう。別の実施形態では、この用語は、溶血作用に関して他の種類の不活性化突然変異のことをいう。各々の可能性は、本発明の別の実施形態を表わす。
【００４９】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物のコレステロール結合ドメインの配列は配列番号１８に記述されている。別の実施形態では、ＣＢＤは当該技術分野で公知の任意の他のＬＬＯＣＢＤである。各々の可能性は、本発明の別の実施形態を表わす。
【００５０】
本発明の方法および組成物の非ＬＬＯ配列は、別の実施形態では、異種配列である。別の実施形態では、非ＬＬＯ配列は合成配列である。別の実施形態では、非ＬＬＯ配列は非天然の配列である。別の実施形態では、非ＬＬＯ配列は非リステリア菌配列である。別の実施形態では、非ＬＬＯ配列は非リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）配列である。一実施形態では、本発明の組成物は、非ＬＬＯペプチドを含み、かつ前記変異ＬＬＯに融合した異種抗原をさらに含む１つのアミノ酸からＣＢＤを含むアミノ酸ペプチドへの置換が存在する変異ＬＬＯを含む。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【００５１】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物の変異ＬＬＯタンパク質またはその断片は、そのシグナルペプチド配列を含む。別の実施形態では、変異ＬＬＯタンパク質またはその断片は、野生型のＬＬＯタンパク質のシグナルペプチドを含む。別の実施形態では、シグナルペプチドは、タンパク質の翻訳後輸送を指図する、短い（３〜６０アミノ酸長）ペプチド鎖である。別の実施形態では、シグナルペプチドはさらに信号、シグナル配列、輸送ペプチド、または局在化信号を標的としている。別の実施形態では、シグナルペプチドのアミノ酸配列は、核、ミトコンドリア基質、小胞体、葉緑体、アポプラスト、またはペルオキシソーム等の特定の細胞器官にタンパク質を導く。別の実施形態では、変異ＬＬＯタンパク質は、野生型のＬＬＯタンパク質のシグナル配列を含む。別の実施形態では、変異ＬＬＯタンパク質はシグナルペプチドを欠く。別の実施形態では、変異ＬＬＯタンパク質はシグナル配列を欠く。別の実施形態では、シグナルペプチドは、変異ＬＬＯタンパク質またはその断片が由来した野生型のＬＬＯタンパク質に関して不変である。別の実施形態では、シグナルペプチドが組換えタンパク質またはポリペプチドのＮ末端にある。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【００５２】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物の変異ＬＬＯタンパク質またはその断片は、ＰＥＳＴ様ペプチド配列を含む。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様ペプチド配列はＬＬＯ  ＰＥＳＴ様ペプチド配列である。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様ペプチド配列のアミノ酸配列は配列番号６３に記述されている。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【００５３】
一実施形態では、ＰＥＳＴ配列は、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、およびスレオニン（Ｔ）に富んだ配列であり、この配列は、正に帯電したアミノ酸を数個含むクラスターによって、一般に、しかし常にではないが、フランキングされており、また細胞内半減期が短い（Rogers et al., 1986, Science 234:364-369）。別の実施形態では、PEST配列によってタンパク質が、分解を目的としたユビキチン・プロテオソーム経路の標的になる（Rechsteiner and Rogers TIBS 1996 21:267-271）。この経路は、一実施形態では、ＭＨＣクラスＩに結合する免疫原性ペプチドを生成させるために、真核細胞によっても用いられる。PEST配列は、免疫原性ペプチドを生じさせる真核生物のタンパク質に豊富に存在する （Realini et al. FEBS Lett. 1994 348:109-113）。ＰＥＳＴ配列は通常、真核生物のタンパク質に見出されるが、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、およびスレオニン（Ｔ）というアミノ酸に富んだＰＥＳＴ様配列は、原核生物のリステリアＬＬＯタンパク質のアミノ末端で確認されており、リステリア菌（L. monocytogenes）の病原性にとって必須であることが示された（Decatur, A. L. and Portnoy, D. A. Science 2000 290:992-995）。一実施形態では、このＲＥＳＴ様配列がＬＬＯに存在することで、タンパク質が宿主細胞のタンパク質分解機構による破壊の標的になることから、ひとたびＬＬＯがその機能を果たしてファゴリソゾームの小胞からリステリア菌（L. monocytogenes）が逃避するのを促すと、細胞が傷つけられる前にリステリア菌（L. monocytogenes）を破壊する。
【００５４】
ＰＥＳＴ様配列の同定は当該技術分野において周知であり、例えば、Rogers S et al （Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis. Science 1986; 234（4774）:364-8）およびRechsteiner M et al （PEST sequences and regulation by proteolysis. Trends Biochem Sci 1996; 21（7）:267-71）に記述されている。別の実施形態では、「ＰＥＳＴ様配列」は、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、およびスレオニン（Ｔ）残基が豊富な領域のことをいう。別の実施形態では、PEST様配列は、正に帯電したアミノ酸を数個含むクラスター１個以上によって、フランキングされる。別の実施形態では、PEST様配列は、それを含んでいるタンパク質の迅速な細胞内の分解に関与する。別の実施形態では、PEST様配列はロジャーズ他（Rogers et al. ）に開示されたアルゴリズムに適合する。別の実施形態では、PEST様配列はレッチステイナー他（Rechsteiner et al.）に開示されたアルゴリズムに適合する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は、１つ以上の内部リン酸化部位を有しており、これらの部位でのリン酸化はタンパク質の分解に先行して生ずる。
【００５５】
一実施形態では、原核生物のPEST様配列は、例えばＬＭに関してはRechsteiner and Rogers （1996, Trends Biochem. Sci. 21:267-271）によって記載された方法、およびRogers S et al （Science 1986; 234（4774）:364-8）に記載の方法等の方法にもとづいて、同定される。あるいは、他の原核生物由来のＰＥＳＴ様ＡＡ配列もまた、この方法に基づいて同定することができる。ＰＥＳＴ様ＡＡ配列が期待される他の原核生物として、限定されるものではないが、他のリステリア菌種が挙げられる。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列はロジャーズ他（Rogers et al. ）に開示されたアルゴリズムに適合する。別の実施形態では、PEST様配列はレッチステイナー他（Rechsteiner et al.）に開示されたアルゴリズムに適合する。別の実施形態では、ＰＥＳＴ発見プログラムを用いてＰＥＳＴ様配列の同定がおこなわれる。
【００５６】
別の実施形態では、ＰＥＳＴモチーフの同定は、特定のタンパク質配列内の正に帯電したＡＡであるＲ、Ｈ、およびＫの初期走査によって、達成される。正に帯電したフランキング領域間の全ＡＡ数を数え、それらのモチーフだけが、ウィンドウ・サイズ・パラメータに等しいか、それよりも多い多くのＡＡを含むと、さらに考える。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様配列は少なくとも１つのＰ、１つのＤまたはＥ、および少なくとも１つのＳまたはＴを含まなければならない。
【００５７】
別の実施形態では、ＰＥＳＴモチーフの質を、クリティカルなＡＡの局所的濃縮とモチーフの疎水性とに基づいて、スコアリングパラメータによって、改善する。Ｄ、Ｅ、Ｐ、Ｓ、およびＴの濃縮は、質量百分率（ｗ／ｗ）で表現され、ＤまたはＥの１当量、Ｐの１当量、およびＳまたはＴの１当量に対して補正される。別の実施形態では、疎水性の計算は、原則的に、J. Kyte and R.F. Doolittle （Kyte, J and Dootlittle, RF. J. Mol. Biol. 157, 105 （1982）の方法に従う。簡略化された計算については、アルギニンの−４．５からイソロイシンの＋４．５までが本来の範囲であるカイト・ドーリトル（Kyte-Doolittle）の疎水性指標を、以下の一次変換を用いて正の整数に変換することで、アルギンの０からイソロイシンの９０までの値を生ずる。
【００５８】
疎水性指標  ＝  １０  ＊  カイト・ドーリトル疎水性指標  ＋  ４５
【００５９】
別の実施形態では、潜在的なＰＥＳＴモチーフの疎水性を、各ＡＡ種についてのモルパーセントおよび疎水性指標の積の総和として計算する。所望のＰＥＳＴスコアは、以下の方程式によって表されるように局所的濃縮項および疎水性項の組合せとして得られる。
【００６０】
ＰＥＳＴスコア  ＝  ０．５５  ＊  ＤＥＰＳＴ  −  ０．５  ＊  疎水性指標
【００６１】
別の実施態様において、「ＰＥＳＴ配列」、「ＰＥＳＴ様配列」、「ＰＥＳＴ様配列ペプチド」とは、上記アルゴリズムを用いて少なくとも＋５のスコアを有するペプチドをいう。別の実施形態では、該用語は少なくとも６のスコアを有するペプチドをいう。別の実施形態では、該ペプチドのスコアが少なくとも７である。別の実施形態では、スコアは少なくとも８である。別の実施形態では、スコアは少なくとも９である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１０である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１１である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１２である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１３である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１４である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１５である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１６である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１７である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１８である。別の実施形態では、スコアは少なくとも１９である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２０である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２１である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２２である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２２である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２４である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２４である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２５である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２６である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２７である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２８である。別の実施形態では、スコアは少なくとも２９である。別の実施形態では、スコアは少なくとも３０である。別の実施形態では、スコアは少なくとも３２である。別の実施形態では、スコアは少なくとも３５である。別の実施形態では、スコアは少なくとも３８である。別の実施形態では、スコアは少なくとも４０である。別の実施形態では、スコアは少なくとも４５である。各々の可能性は、本明細書中に提供される方法および組成物の個々の実施形態を表わす。
【００６２】
別の実施態様では、ＰＥＳＴ様配列は、当該技術分野で公知のいずれかの他の方法またはアルゴリズム、例えば、CaSPredictor（Garay-Malpartida HM,Occhiucci JM,Alves J,Belizario JE. Bioinformatics.2005 Jun;21 Suppl 1:i169-76）を用いて同定される。もう１つの実施態様において、以下の方法が用いられる。
【００６３】
ＰＥＳＴ指標は、ＡＡのＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、またはＧｌｎに１の値を割り当てることで、適当な長さの各々の一配列（例えば、３０〜３５ＡＡの一配列）について計算する。ＰＥＳＴ残基の各々についての係数値（ＣＶ）は１であり、他のＡＡ（非ＰＥＳＴ）の各々については０である。
【００６４】
ＰＥＳＴ様配列を同定するための各方法は、本明細書中に提供される別の実施態様を表わす。
【００６５】
別の実施形態において、ＰＥＳＴ様配列は、当該技術分野で公知の任意の他のＰＥＳＴ様配列である。ＰＥＳＴ様配列またはその種類は、本明細書中に提供される別の実施形態を表す。
【００６６】
別の実施形態では、抗原に対する免疫応答は、リステリオリジンＯ（ΔＬＬＯ）の非溶血性切断型に対する抗原の融合によって、増強し得る。一実施形態では、観察された増強細胞媒介免疫および融合タンパク質の抗腫瘍免疫は、処理のための抗原を標的とするＬＬＯに存在するＰＥＳＴ様配列に起因する。
【００６７】
別の実施形態では、組換えタンパク質またはポリペプチドの変異領域と置き換わる非ＬＬＯペプチドは、目的の抗原ペプチドを含む。別の実施形態では、抗原ペプチドは細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）エピトープである。別の実施形態では、抗原ペプチドはＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープである。別の実施形態では、抗原ペプチドは当該技術分野で公知の他の種類のペプチドである。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【００６８】
別の実施形態では、本発明は、アジュバントと、本発明の組換えタンパク質またはポリペプチドとを含み、目的の抗原ペプチドが変異領域と置き換わるワクチンを提供する。別の実施形態では、本発明は、組換えタンパク質またはポリペプチドを含む免疫原性組成物を提供する。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【００６９】
別の実施形態では、本発明は、本発明の組換えタンパク質またはポリペプチドをコードし、目的の抗原ペプチドが変異領域と置き換わるヌクレオチド分子を提供する。
【００７０】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物の組換えタンパク質またはポリペプチドは、さらに目的の異種ペプチドを含む。別の実施形態では、目的の異種ペプチドと変異ＬＬＯまたはその断片とを融合させる。別の実施形態では、目的の異種ペプチドと変異ＬＬＯまたはその断片のＣ末端とを融合させる。別の実施形態では、例えば、ＣＢＤに含有または重複する変異領域以外の場所で、変異ＬＬＯまたはその断片に、目的の異種ペプチドが埋め込まれる。別の実施形態では、例えば、ＣＢＤに含有または重複する変異領域以外の位置で、変異ＬＬＯまたはその断片の配列に、目的の異種ペプチドが挿入される。別の実施形態では、例えば、ＣＢＤに含有または重複する変異領域以外の位置で、変異ＬＬＯまたはその断片の配列の代わりに、目的の異種ペプチドが用いられる。したがって、一実施形態では、本発明の組換えタンパク質またはポリペプチドは、抗原ペプチドまたはタンパク質に融合また結合した変異ＬＬＯまたはその断片を含む。
【００７１】
別の実施形態では、本発明は、アジュバントと、本発明の組換えタンパク質またはポリペプチドとを含み、該組換えタンパク質またはポリペプチドがさらに目的の異種ペプチドを含むワクチンを提供する。別の実施形態では、本発明は、組換えタンパク質またはポリペプチドを含む免疫原性の組成物を提供する。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【００７２】
別の実施形態では、本発明は、本発明の組換えタンパク質またはポリペプチドをコードし、該組換えタンパク質またはポリペプチドがさらに目的の異種ペプチドを含むヌクレオチド分子を提供する。
【００７３】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＬＬＯタンパク質または断片が、本発明の組換えタンパク質またはポリペプチドのＮ末端上にある。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質または断片は組換えタンパク質またはポリペプチド内の他の位置にある。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【００７４】
別の実施形態では、本発明は、本発明の組換えタンパク質またはポリペプチドと目的の異種ペプチドとを含む組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明の組換えタンパク質またはポリペプチドと目的の異種抗原ペプチドとを含む組成物を提供する。別の実施形態では、組換えタンパク質またはポリペプチドは、目的の異種ペプチドに共有結合していない。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【００７５】
別の実施形態では、本発明は、アジュバントを含むワクチン、本発明の組換えタンパク質またはポリペプチド、および目的の異種ペプチドを提供する。別の実施形態では、本発明は、アジュバントを含む組成物、本発明の組換えタンパク質またはポリペプチド、および目的の異種抗原ペプチドを提供する。別の実施形態では、組換えタンパク質またはポリペプチドは、目的の異種ペプチドに共有結合していない。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【００７６】
別の実施形態では、本発明は、アジュバントと、本発明の組換えタンパク質またはポリペプチドとを含むワクチンを提供する。別の実施形態では、本発明は、組換えタンパク質またはポリペプチドを含む免疫原性組成物を提供する。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【００７７】
別の実施形態では、本発明は、本発明の組換えタンパク質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド分子を提供する。
【００７８】
別の実施形態では、本発明は、本発明のヌクレオチド分子とアジュバントとを含むワクチンを提供する。
【００７９】
別の実施形態では、本発明は、本発明のヌクレオチド分子を含む組換えワクチンベクターを提供する。
【００８０】
別の実施形態では、本発明は、本発明の組換えタンパク質またはポリペプチドをコードする組換えワクチンベクターを提供する。
【００８１】
別の実施形態では、本発明は、本発明の組換えタンパク質またはポリペプチドを含む組換えリステリア菌株を提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明の組換えタンパク質またはポリペプチドを発現する組換えリステリア菌株を提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明の組換えタンパク質またはポリペプチドをコードする組換えリステリア菌株を提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明の組換えポリペプチドをコードする組換えヌクレオチドを含む組換えリステリア菌株を提供する。別の実施形態では、リステリア菌ワクチン株はリステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）（ＬＭ）種である。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【００８２】
別の実施形態では、本発明は、本発明のベクターを含む細胞を提供する。ベクターおよび（または）外因性の核酸を含む細胞を生ずる方法は、当該技術分野において周知でありある。例えば、Sambrook et al. （1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York）およびAusubel et al. （1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York）を参照する。
【００８３】
別の実施形態では、本発明は、本発明のヌクレオチド分子を含むワクチンを提供する。
別の実施形態では、本発明は、ヌクレオチド分子を含む免疫原性組成物を提供する。
各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【００８４】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物で利用されるアジュバントは、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）タンパク質にある。別の実施形態では、アジュバントはＧＭ−ＣＳＦタンパク質を含む。別の実施形態では、アジュバントはＧＭ−ＣＳＦをコードするヌクレオチド分子である。別の実施形態では、アジュバントは、ＧＭ−ＣＳＦをコードするヌクレオチド分子を含む。別の実施形態では、アジュバントはサポニンＱＳ２１である。別の実施形態では、アジュバントはサポニンＱＳ２１を含む。別の実施形態では、アジュバントはモノホスホリル脂質Ａである。別の実施形態では、アジュバントはモノホスホリル脂質Ａを含む。別の実施形態では、アジュバントはＳＢＡＳ２である。別の実施形態では、アジュバントはＳＢＡＳ２を含む。別の実施形態では、アジュバントは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、アジュバントは非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドを含む。別の実施形態では、アジュバントは免疫の刺激的なサイトカインである。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激性サイトカインを含む。別の実施形態では、アジュバントは免疫刺激性サイトカインをコードするヌクレオチド分子である。別の実施形態では、アジュバントは、免疫刺激性サイトカインをコードするヌクレオチド分子を含む。別の実施形態では、アジュバントはクイル（quill）グリコシドであるか、または該クイルグリコシドを含む。別の実施形態では、アジュバントは細菌マイトジェンであるか、または該細菌マイトジェンを含む。別の実施形態では、アジュバントは細菌毒素であるか、または該細菌毒素を含む。別の実施形態では、アジュバントは当該技術分野で公知の任意の他のアジュバントであるか、または該アジュバントを含む。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【００８５】
別の実施形態では、本発明は、本発明の組換えタンパク質またはポリペプチドを被験体に投与することを含む、該被験体の免疫応答を誘導する方法を提供するもので、該組換えタンパク質またはポリペプチドは、目的の抗原ペプチドを含むことで、目的の該抗原ペプチドに対する免疫応答を誘導する。
【００８６】
別の実施形態では、本発明は、本発明の組換えタンパク質またはポリペプチドを被験体に投与することを含む、該被験体の免疫応答を誘導する方法を提供するもので、該組換えタンパク質またはポリペプチドは目的の異種ペプチドを含むことで、目的の該異種ペプチドに対する免疫応答を誘導する。
【００８７】
別の実施形態では、本発明は、本発明の組換えワクチンベクターを被験体に投与することを含む、該被験体の免疫応答を誘導する方法を提供するもので、組換えワクチンベクターは、目的の異種抗原ペプチドを含む組換えタンパク質またはポリペプチドを含むかコードすることで、目的の該抗原ペプチドに対する免疫応答を誘導する。
【００８８】
別の実施形態では、本発明は、本発明の組換えワクチンベクターを被験体に投与することを含む、該被験体の免疫応答を誘導する方法を提供するもので、組換えワクチンベクターは、目的の異種ペプチドを含む組換えタンパク質またはポリペプチドを含むかコードすることで、目的の該異種ペプチドに対する免疫応答を誘導する。
【００８９】
別の実施形態では、本発明は、本発明の組換えリステリア菌株を被験体に投与することを含む、該被験体の免疫応答を誘導する方法を提供するもので、組換えリステリア菌株は、目的の異種ペプチドを含む組換えタンパク質またはポリペプチドを含むかコードすることで、目的の該異種ペプチドに対する免疫応答を誘導する。
【００９０】
別の実施形態では、本発明は、被験体に本発明の組換えリステリア菌株を投与することを含む、該被験体の免疫応答を誘導する方法を提供するもので、組換えリステリア菌株は、目的の異種抗原ペプチドを含む組換えタンパク質またはポリペプチドを含むかコードすることで、目的の該異種ペプチドに対する免疫応答を誘導する。
【００９１】
本発明の方法および組成物の別の実施形態では、本発明のペプチドまたはヌクレオチド分子を、本発明の標的抗原を発現するリンパ腫、癌細胞、または感染症を有する被験体に投与する。別の実施形態では、ペプチドまたはヌクレオチド分子を、被験体の細胞へ生体外（ex vivo）投与する。別の実施形態では、ペプチドをリンパ球ドナーに投与し、別の実施形態では、その後、該ドナーからのリンパ球を被験体に投与する。別の実施形態では、ペプチドを抗体またはリンパ球のドナーに投与し、別の実施形態では、その後、該ドナーからの抗血清またはリンパ球を被験体に投与する。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【００９２】
別の実施形態では、本発明は、本発明の組換えタンパク質またはポリペプチドを生産する方法を提供するもので、該方法は、前記目的の異種ペプチドを含むペプチドに、前記変異ＬＬＯタンパク質または変異Ｎ末端ＬＬＯ断片を含むペプチドを化学的に結合させるステップを含む。本発明は別の実施形態では、本発明の組換えタンパク質またはポリペプチドを生産する方法を提供するもので、該方法は、前記組換えタンパク質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド分子から前記組換えタンパク質またはポリペプチドを翻訳するステップを含む。別の実施形態では、本発明は、ここに記述されたプロセスの１つ以上によって作られた生成物を提供する。
【００９３】
別の実施形態では、目的の異種ペプチドは完全長タンパク質であり、一実施形態では、該完全長タンパク質は抗原ペプチドを含む。一実施形態では、このタンパク質はＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質である。別の実施形態では、このタンパク質はヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７タンパク質である。別の実施形態では、このタンパク質はＢ細胞受容体（ＢＣＲ）タンパク質である。別の実施形態では、目的の異種ペプチドは抗原ペプチドである。
【００９４】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物の目的の抗原ペプチドはＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドである。
【００９５】
別の実施形態では、本発明は、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１含有ペプチドをコードする組換えヌクレオチド分子を提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明の組換えタンパク質またはポリペプチドを含む変異ＬＬＯおよびＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドを含む組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１含有ペプチドをコードする組換えワクチンベクターを提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１含有ペプチドをコードする組換えリステリア菌株を提供する。
【００９６】
一実施形態では、ＮＹ−ＥＳＯ−１は、上皮の卵巣癌（ＥＯＣ）で発現された「癌精巣」抗原である。別の実施形態では、ＮＹ−ＥＳＯ−１は、転移性黒色腫、乳癌、肺癌、食道癌（一実施形態では食道扁平上皮癌である）、またはそれの組み合わせにおいて発現する。一実施形態では、ＮＹ−ＥＳＯ−１は最も免疫原性のある癌精巣抗原の１つである。別の実施形態では、ＮＹ−ＥＳＯ−１は、患者の腫瘍による天然または自然発生的な誘導を介して、または所定のペプチドエピトープを用いる特定のワクチン接種後に、ＮＹ−ＥＳＯ−１発現癌を有する患者において強力な液性（抗体）および細胞性（Ｔ細胞）免疫応答を誘導することができる。別の実施形態では、ＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドエピトープはＭＨＣクラスＩＩ分子によって提示される。したがって、一実施形態では、ＮＹ−ＥＳＯ−１を含む本発明の組成物および方法は、上記癌の予防または処置に特に有用である。
【００９７】
別の実施形態では、本発明は、ＮＹ−ＥＳＯ−１発現癌細胞に対する被験体の免疫応答を誘導する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１抗原含有組換えペプチド、タンパク質、またはポリペプチドを、被験体に投与することによって、ＮＹ−ＥＳＯ−１発現癌細胞に対する免疫応答を誘導するステップを含む。別の実施形態では、癌細胞は卵巣メラノーマ細胞である。別の実施形態では、癌細胞は肺癌細胞である。別の実施形態では、癌細胞は、当該技術分野で公知の任意の他のＮＹ−ＥＳＯ−１発現癌細胞である。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【００９８】
別の実施形態では、本発明は、被験体のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍を処置する方法を提供するもので、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１抗原含有組換えペプチド、タンパク質、またはポリペプチドを被験体に投与して、該被験体のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍を処置するステップを含む。
【００９９】
別の実施形態では、本発明は、被験体のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍を阻害する方法を提供するもので、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１抗原含有組換えペプチド、タンパク質、またはポリペプチドを被験体に投与して、該被験体のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍を阻害するステップを含む。
【０１００】
別の実施形態では、本発明は、被験体のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍を抑制する方法を提供するもので、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１抗原含有組換えペプチド、タンパク質、またはポリペプチドを被験体に投与して、該被験体のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍を抑制するステップを含む。
【０１０１】
別の実施形態では、本発明は、被験体のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍の緩解を誘導する方法を提供するもので、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１抗原含有組換えペプチド、タンパク質、またはポリペプチドを被験体に投与して、該被験体のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍の緩解を誘導するステップを含む。
【０１０２】
別の実施形態では、本発明は、被験体のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍の発生率を減少させる方法を提供するもので、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１抗原含有組換えペプチド、タンパク質、またはポリペプチドを被験体に投与して、該被験体のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍の発生率を減少させるステップを含む。
【０１０３】
別の実施形態では、本発明は、ＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍から被験体を守る方法を提供するもので、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１抗原含有組換えペプチド、タンパク質、またはポリペプチドを被験体に投与して、ＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍から該被験体を守るステップを含む。
【０１０４】
別の実施形態では、本発明は、ＮＹ−ＥＳＯ−１発現癌細胞に対する被験体の免疫応答を誘導する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１抗原発現ワクチンベクターを、被験体に投与することによってＮＹ−ＥＳＯ−１発現癌細胞に対する免疫応答を誘導するステップを含む。別の実施形態では、癌細胞は卵巣メラノーマ細胞である。別の実施形態では、癌細胞は肺癌細胞である。別の実施形態では、癌細胞は、当該技術分野で公知の任意の他のＮＹ−ＥＳＯ−１発現癌細胞である。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０１０５】
別の実施形態では、本発明は、被験体のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍の発生率を処置する、または減少させる方法を提供するもので、該方法は、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１抗原発現ワクチンベクターを被験体に投与して、該被験体のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍の発生率を処置する、または減少させるステップを含む。
【０１０６】
別の実施形態では、本発明は、被験体のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍を阻害する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１抗原発現ワクチンベクターを被験体に投与して、該被験体のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍を阻害するステップを含む。
【０１０７】
別の実施形態では、本発明は、被験体のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍を抑制する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１抗原発現ワクチンベクターを被験体に投与して、該被験体のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍を抑制するステップを含む。
【０１０８】
別の実施形態では、本発明は、被験体のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍の発生率の処置、阻害、抑制、または削減をおこなう方法を提供するもので、該方法は、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１抗原発現ワクチンベクターを被験体に投与して、該被験体のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍の発生率の処置または削減をおこなうステップを含む。
【０１０９】
別の実施形態では、本発明は、被験体のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍の緩解を誘導する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１抗原発現ワクチンベクターを被験体に投与して、該被験体のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍の緩解を誘導するステップを含む。
【０１１０】
別の実施形態では、本発明は、ＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍から被験体を守る方法を提供するもので、該方法は、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１抗原発現ワクチンベクターを被験体に投与して、ＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍から該被験体を守るステップを含む。
【０１１１】
別の実施形態では、本発明は、ＮＹ−ＥＳＯ−１発現癌細胞に対する被験体の免疫応答を誘導する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１抗原コード化ヌクレオチド分子を、被験体に投与することによって、ＮＹ−ＥＳＯ−１発現癌細胞に対する免疫応答を誘導するステップを含む。別の実施形態では、癌細胞は卵巣メラノーマ細胞である。別の実施形態では、癌細胞は肺癌細胞である。別の実施形態では、癌細胞は、当該技術分野で公知の任意の他のＮＹ−ＥＳＯ−１発現癌細胞である。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０１１２】
別の実施形態では、本発明は、被験体のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍の発生率を処置する、または減少させる方法を提供するもので、該方法は、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１抗原コード化ヌクレオチド分子を被験体に投与して、該被験体のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍の発生率の処置または削減をおこなうステップを含む。
【０１１３】
別の実施形態では、本発明は、被験体のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍を阻害する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１抗原コード化ヌクレオチド分子を被験体に投与して、該被験体のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍を阻害するステップを含む。
【０１１４】
別の実施形態では、本発明は、被験体のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍を抑制する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１抗原コード化ヌクレオチド分子を被験体に投与して、該被験体のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍を阻害するステップを含む。
【０１１５】
別の実施形態では、本発明は、被験体のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍の緩解を誘導する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１抗原コード化ヌクレオチド分子を被験体に投与して、該被験体のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍の緩解を誘導するステップを含む。
【０１１６】
別の実施形態では、本発明は、ＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍から被験体を守る方法を提供するもので、該方法は、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１抗原コード化ヌクレオチド分子を被験体に投与して、ＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍から該被験体を守るステップを含む。
【０１１７】
別の実施形態では、本発明は、ＮＹ−ＥＳＯ−１発現癌細胞に対する被験体の免疫応答を誘導する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１抗原発現組換えリステリア菌株を、被験体に投与することによって、ＮＹ−ＥＳＯ−１発現癌細胞に対する免疫応答を誘導するステップを含む。別の実施形態では、癌細胞は卵巣メラノーマ細胞である。別の実施形態では、癌細胞は肺癌細胞である。別の実施形態では、癌細胞は、当該技術分野で公知の任意の他のＮＹ−ＥＳＯ−１発現癌細胞である。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０１１８】
別の実施形態では、本発明は、被験体のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍の発生率を処置する、または減少させる方法を提供するもので、該方法は、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１抗原発現組換えリステリア菌株を被験体に投与して、該被験体のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍の発生率の処置または削減をおこなうステップを含む。
【０１１９】
別の実施形態では、本発明は、被験体のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍を阻害する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１抗原発現組換えリステリア菌株を被験体に投与して、該被験体のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍の発生率の処置または削減をおこなうステップを含む。
【０１２０】
別の実施形態では、本発明は、被験体のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍を抑制する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１抗原発現組換えリステリア菌株を被験体に投与して、該被験体のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍の発生率の処置または削減をおこなうステップを含む。
【０１２１】
別の実施形態では、本発明は、被験体のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍の緩解を誘導する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１抗原発現組換えリステリア菌株を被験体に投与して、該被験体のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍の緩解を誘導するステップを含む。
【０１２２】
別の実施形態では、本発明は、ＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍から被験体を守る方法を提供するもので、該方法は、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１抗原発現組換えリステリア菌株を被験体に投与して、ＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍から該被験体を守るステップを含む。
【０１２３】
別の実施形態では、腫瘍は卵巣黒色腫である。別の実施形態では、腫瘍は肺癌腫である。別の実施形態では、腫瘍は、当該技術分野で公知の任意の他のＮＹ−ＥＳＯ−１発現腫瘍である。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０１２４】
別の実施形態では、本発明は、ＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープに対する免疫応答を誘導する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１抗原含有組換えペプチド、タンパク質、またはポリペプチドを、被験体に投与することによって、ＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープに対する免疫応答を誘導するステップを含む。
【０１２５】
別の実施形態では、本発明は、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原に対する免疫応答を誘導する方法を提供するもので、該方法は、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原を含む本発明の組換えペプチド、タンパク質、またはポリペプチドを、被験体に投与することによって、ＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープに対する免疫応答を誘導するステップを含む。
【０１２６】
一実施形態では、本発明の組成物および方法で使用されるＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープは、ＡＳＧＰＧＧＧＡＰＲ：５３〜６２（Ａ３１）、ＡＲＧＰＥＳＲＬＬ：８０〜８８（Ｃｗ６）、ＬＡＭＰＦＡＴＰＭ：９２〜１００（Ｃｗ３）、ＭＰＦＡＴＰＭＥＡ：９４〜１０２（Ｂ３５、Ｂ５１）、ＴＶＳＧＮＩＬＴＲ：１２７〜１３６（Ａ６８）、ＴＶＳＧＮＩＬＴ：１２７〜１３５（Ｃｗ１５）、ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ：１５７〜１６５（Ａ２；実施例２）、または別の当該技術分野で公知のＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープである。
【０１２７】
別の実施形態では、本発明は、ＮＹ−ＥＳＯ−１発現標的細胞に対する免疫応答を誘導する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＮＹ−ＥＳＯ−１抗原含有組換えペプチド、タンパク質、またはポリペプチドを、被験体に投与することによって、ＮＹ−ＥＳＯ−１発現標的細胞に対する免疫応答を誘導するステップを含む。別の実施形態では、標的細胞は卵巣メラノーマ細胞である。別の実施形態では、標的細胞は肺癌細胞である。別の実施形態では、標的細胞は、当該技術分野で公知の任意の他のＮＹ−ＥＳＯ−１発現細胞である。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０１２８】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物の標的ＮＹ−ＥＳＯ−１発現癌細胞または腫瘍は、肺非小細胞癌（ＮＳＣＬＣ）細胞または腫瘍である。別の実施形態では、ＮＹ−ＥＳＯ−１発現癌細胞は肺腺癌細胞または腫瘍である。別の実施形態では、ＮＹ−ＥＳＯ−１発現癌細胞は細気管支肺胞上皮癌（ＢＡＣ）細胞または腫瘍である。別の実施形態では、ＮＹ−ＥＳＯ−１発現癌細胞は、細気管支肺胞的特徴（アデノＢＡＣ）を備えた腺癌由来の細胞または腫瘍である。別の実施形態では、ＮＹ−ＥＳＯ−１発現癌細胞または腫瘍は、肺の扁平上皮癌に由来する。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０１２９】
本発明の方法および組成物のＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドは、別の実施形態では、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質由来のペプチドであり、該ペプチドの配列は以下の配列である。
【０１３０】
ＭＱＡＥＧＲＧＴＧＧＳＴＧＤＡＤＧＰＧＧＰＧＩＰＤＧＰＧＧＮＡＧＧＰＧＥＡＧＡＴＧＧＲＧＰＲＧＡＧＡＡＲＡＳＧＰＧＧＧＡＰＲＧＰＨＧＧＡＡＳＧＬＮＧＣＣＲＣＧＡＲＧＰＥＳＲＬＬＥＦＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡＱＤＡＰＰＬＰＶＰＧＶＬＬＫＥＦＴＶＳＧＮＩＬＴＩＲＬＴＡＡＤＨＲＱＬＱＬＳＩＳＳＣＬＱＱＬＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬＡＱＰＰＳＧＱＲＲ。（配列番号１；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００１３２７）別の実施形態では、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質は配列番号１の同族体である。別の実施形態では、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質は配列番号１の変異体である。別の実施形態では、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質は配列番号１の異性体である。別の実施形態では、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質は配列番号１の断片である。別の実施形態では、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質は配列番号１の同族体の断片である。別の実施形態では、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質は配列番号１の変異体の断片である。別の実施形態では、ＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質は配列番号１の異性体の断片である。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０１３１】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物のＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドは、当該技術分野で公知のＮＹ−ＥＳＯ−１タンパク質に由来するものである。各々の可能性は、本発明の別の実施形態を表わす。別の実施形態では、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原は配列：ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号２）を有するペプチドである。別の実施形態では、配列はＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬ（配列番号３）である。別の実施形態では、配列はＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰ（配列番号４）である。別の実施形態では、配列はＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶ（配列番号５）である。別の実施形態では、配列はＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦ（配列番号６）である。別の実施形態では、配列はＳＬＬＭＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬ（配列番号７）である。別の実施形態では、配列はＷＩＴＱＣＦＬＰＶＦＬＡＱＰＰＳＧＱＲＲ（配列番号８）である。別の実施形態では、配列はＹＬＡＭＰＦＡＴＰＭＥＡＥＬＡＲＲＳＬＡ（配列番号９）である。別の実施形態では、配列はＡＳＧＰＧＧＧＡＰＲ（配列番号１０）である。別の実施形態では、配列はＭＰＦＡＴＰＭＥＡ（配列番号１１）である。別の実施形態では、配列はＬＡＭＰＦＡＴＰＭ（配列番号１２）である。別の実施形態では、配列はＡＲＧＰＥＳＲＬＬ（配列番号１３）である。別の実施形態では、配列はＬＬＭＷＩＴＱＣＦ（配列番号１４）である。別の実施形態では、配列はＳＬＬＭＷＩＴＱＶ（配列番号１５）である。一実施形態では、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原は、野生型であるＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドの位置１５７〜１６５を含むペプチドである。別の実施形態では、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原は、野生型であるＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドの位置５３〜６２を含むペプチドである。別の実施形態では、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原は、野生型であるＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドの位置９４〜１０２を含むペプチドである。別の実施形態では、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原は、野生型であるＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドの位置９２〜１００を含むペプチドである。別の実施形態では、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原は、野生型であるＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドの位置８０〜８８を含むペプチドである。別の実施形態では、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原は、野生型であるＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドの位置１５８〜１６６を含むペプチドである。別の実施形態では、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原は、野生型であるＮＹ−ＥＳＯ−１ペプチドの変異体である。変異体の一例はＳＬＬＭＷＩＴＱＶ（配列番号１６）である。各々の可能性は、本発明の別の実施形態を表わす。
【０１３２】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物の目的の抗原ペプチドは、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７ペプチドである。別の実施形態では、抗原ペプチドはＥ７タンパク質の全体である。別の実施形態では、抗原ペプチドはＥ７タンパク質の断片である。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０１３３】
一実施形態では、タンパク質Ｅ６およびＥ７は、７つある初期非構造タンパク質のうちの２つであり、該初期非構造タンパク質のいくつかは、ウイルス複製の役割を果たすもの（Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４）および／またはウイルス成熟の役割を果たすもの（Ｅ４）がある。別の実施形態では、タンパク質Ｅ６およびＥ７は、ウイルス複製に重要なものであり、また宿主細胞免疫化および形質転換にも重要なものである癌タンパク質である。一実施形態では、Ｅ６およびＥ７ウイルスタンパク質は、正常子宮頚部扁平上皮組織では発現しない。別の実施形態では、粘膜の上皮幹細胞内でのＥ６およびＥ７遺伝子の発現は子宮頚部発癌の開始および維持に必要とされる。さらに、またいくつかの実施形態では、浸潤子宮頸癌への前腫瘍性病変の進行には、Ｅ６およびＥ７癌タンパク質の持続的な増強された発現が関係している。したがって、別の実施形態では、Ｅ６およびＥ７は子宮頸癌で発現する。別の実施形態では、Ｅ６およびＥ７の発癌能は、宿主細胞タンパク質に対するそれらの結合特性により生ずると考えられる。例えば、また一実施形態では、Ｅ６は腫瘍抑制タンパク質ｐ５３に結合することで、該タンパク質のユビキチン依存分解を引き起こし、また別の実施形態では、Ｅ７は、腫瘍抑制網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）に結合して該タンパク質の分解を促進する。したがって、一実施形態では、ＨＰＶＥ７を含む本発明の組成物および方法は、前述の癌の予防および処置に、特に有用である。
【０１３４】
別の実施形態では、本発明は、本発明のＥ７含有ペプチドをコードする組換えヌクレオチド分子を提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明の変異ＬＬＯ含有組換えペプチド、タンパク質、またはポリペプチドと、Ｅ７ペプチドとを含む組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明のＥ７含有ペプチドをコードする組換えワクチンベクターを提供する。別の実施形態では、本発明は、本発明のＥ７含有ペプチドをコードする組換えリステリア菌株を提供する。
【０１３５】
別の実施形態では、本発明は、ＨＰＶＥ７エピトープに対する被験体の免疫応答を誘導する方法を提供するもので、該方法は、本発明の組換えペプチド、タンパク質、またはポリペプチドを被験体に投与することで、ＨＰＶＥ７エピトープに対する免疫応答を誘導するステップを含む。
【０１３６】
一実施形態では、本発明の組成物および方法に用いられるＨＰＶＥ７エピトープは、ＴＬＨＥＹＭＬＤＬ：７−１５（Ｂ８）、ＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴ：１１−２０（Ａ２）、ＬＬＭＧＴＬＧＩＶ：８２−９０（Ａ２）、ＴＬＧＩＶＣＰＩ：８６−９３（Ａ２）、または当該技術分野で公知の別のＨＰＶＥ７エピトープである。
【０１３７】
別の実施形態では、本発明は、ＨＰＶＥ７抗原に対する被験体の免疫応答を誘導する方法を提供するもので、本発明のＨＰＶＥ７含有組換えペプチド、タンパク質、またはポリペプチドを含有するＨＰＶＥ７を被験体に投与することによって、ＨＰＶＥ７抗原に対する免疫応答を誘導するステップを含む。
【０１３８】
別の実施形態では、本発明は、ＨＰＶＥ７発現標的細胞に対する被験体の免疫応答を誘導する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＨＰＶＥ７含有組換えペプチド、タンパク質、またはポリペプチドを、被験体に投与することによって、ＨＰＶＥ７発現標的細胞に対する免疫応答を誘導するステップを含む。
【０１３９】
別の実施形態では、本発明は、ＨＰＶＥ７発現標的細胞に対する被験体の免疫応答を誘導する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＨＰＶＥ７含有組換えペプチド、タンパク質、またはポリペプチドをコードするワクチンベクターを被験体に投与することによって、ＨＰＶＥ７発現標的細胞に対する免疫応答を誘導するステップを含む。
【０１４０】
別の実施形態では、本発明は、ＨＰＶＥ７発現標的細胞に対する被験体の免疫応答を誘導する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＨＰＶＥ７コード化ヌクレオチド分子を、被験体に投与することによって、ＨＰＶＥ７発現標的細胞に対する免疫応答を誘導するステップを含む。
【０１４１】
別の実施形態では、本発明は、ＨＰＶＥ７発現標的細胞に対する被験体の免疫応答を誘導する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＨＰＶＥ７含有ペプチドをコードするリステリア菌株を被験体に投与することで、ＨＰＶＥ７発現標的細胞に対する免疫応答を誘導するステップを含む。
【０１４２】
一実施形態では、標的細胞は子宮頸癌細胞である。別の実施形態では、標的細胞は頭頸部癌細胞である。別の実施形態では、標的細胞は、当該技術分野で公知の任意の他の種類のＨＰＶＥ７発現細胞である。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０１４３】
別の実施形態では、本発明は、被験体のＨＰＶＥ７発現腫瘍を処置する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＨＰＶＥ７含有組換えペプチド、タンパク質、またはポリペプチドを被験体に投与して、該被験体のＨＰＶＥ７発現腫瘍を処置するステップを含む。
【０１４４】
別の実施形態では、本発明は、被験体のＨＰＶＥ７発現腫瘍を阻害または抑制する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＨＰＶＥ７含有組換えペプチド、タンパク質、またはポリペプチドを被験体に投与して、該被験体のＨＰＶＥ７発現腫瘍を阻害するステップを含む。
【０１４５】
別の実施形態では、本発明は、被験体のＨＰＶＥ７発現腫瘍の緩解を誘導する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＨＰＶＥ７含有組換えペプチド、タンパク質、またはポリペプチドを被験体に投与して、該被験体のＨＰＶＥ７発現腫瘍の緩解を誘導するステップを含む。
【０１４６】
別の実施形態では、本発明は、被験体のＨＰＶＥ７発現腫瘍の発生率を減少させる方法を提供するもので、該方法は、本発明のＨＰＶＥ７含有組換えペプチド、タンパク質、またはポリペプチドを被験体に投与して、該被験体のＨＰＶＥ７発現腫瘍の発生率を減少させるステップを含む。
【０１４７】
別の実施形態では、本発明は、被験体のＨＰＶＥ７発現腫瘍から被験体を保護する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＨＰＶＥ７含有組換えペプチド、タンパク質、またはポリペプチドを被験体に投与して、該被験体のＨＰＶＥ７発現腫瘍に対して被験体を保護するステップを含む。
【０１４８】
別の実施形態では、本発明は、被験体のＨＰＶＥ７発現腫瘍の発生率を処置する、または減少させる方法を提供するもので、該方法は、本発明のＨＰＶＥ７コード化ワクチンベクターを被験体に投与して、該被験体のＨＰＶＥ７発現腫瘍の発生率を処置する、または減少させるステップを含む。
【０１４９】
別の実施形態では、本発明は、被験体のＨＰＶＥ７発現腫瘍を阻害または抑制する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＨＰＶＥ７コード化ワクチンベクターを被験体に投与して、該被験体のＨＰＶＥ７発現腫瘍の発生率を阻害または抑制するステップを含む。
【０１５０】
別の実施形態では、本発明は、被験体のＨＰＶＥ７発現腫瘍の緩解を誘導する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＨＰＶＥ７コード化ワクチンベクターを被験体に投与して、該被験体のＨＰＶＥ７発現腫瘍の緩解を誘導するステップを含む。
【０１５１】
別の実施形態では、本発明は、被験体のＨＰＶＥ７発現腫瘍から被験体を保護する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＨＰＶＥ７コード化ワクチンベクターを被験体に投与して、被験体のＨＰＶＥ７発現腫瘍から被験体を保護するステップを含む。
【０１５２】
別の実施形態では、本発明は、被験体のＨＰＶＥ７発現腫瘍の発生率を処置する、または減少させる方法を提供するもので、該方法は、本発明のＨＰＶＥ７コード化ヌクレオチド分子を被験体に投与して、該被験体のＨＰＶＥ７発現腫瘍の発生率を処置する、または減少させるステップを含む。
【０１５３】
別の実施形態では、本発明は、被験体のＨＰＶＥ７発現腫瘍を阻害または抑制する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＨＰＶＥ７コード化ヌクレオチド分子を被験体に投与して、該被験体のＨＰＶＥ７発現腫瘍の発生率を阻害または抑制するステップを含む。
【０１５４】
別の実施形態では、本発明は、被験体のＨＰＶＥ７発現腫瘍の緩解を誘導する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＨＰＶＥ７コード化ヌクレオチド分子を被験体に投与して、該被験体のＨＰＶＥ７発現腫瘍の緩解を誘導するステップを含む。
【０１５５】
別の実施形態では、本発明は、被験体のＨＰＶＥ７発現腫瘍から被験体を守る方法を提供するもので、該方法は、本発明のＨＰＶＥ７コード化ヌクレオチド分子を被験体に投与して、該被験体のＨＰＶＥ７発現腫瘍に対して被験体を守るステップを含む。
【０１５６】
別の実施形態では、本発明は、被験体のＨＰＶＥ７発現腫瘍の発生率を処置する、または減少させる方法を提供するもので、該方法は、本発明のＨＰＶＥ７コード化リステリア菌株を被験体に投与して、該被験体のＨＰＶＥ７発現腫瘍の発生率を処置する、または減少させるステップを含む。
【０１５７】
別の実施形態では、本発明は、被験体のＨＰＶＥ７発現腫瘍を阻害または抑制する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＨＰＶＥ７コード化リステリア菌株を被験体に投与して、該被験体のＨＰＶＥ７発現腫瘍を阻害または抑制するステップを含む。
【０１５８】
別の実施形態では、本発明は、被験体のＨＰＶＥ７発現腫瘍の緩解を誘導する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＨＰＶＥ７コード化リステリア菌株を被験体に投与して、該被験体のＨＰＶＥ７発現腫瘍の緩解を誘導するステップを含む。
【０１５９】
別の実施形態では、本発明は、被験体のＨＰＶＥ７発現腫瘍から被験体を守る方法を提供するもので、該方法は、本発明のＨＰＶＥ７コード化リステリア菌株を被験体に投与して、該被験体のＨＰＶＥ７発現腫瘍に対して被験体を守るステップを含む。
【０１６０】
一実施形態では、腫瘍は子宮頚癌である。別の実施形態では、腫瘍は頭頚部腫瘍である。別の実施形態では、腫瘍は、当該技術分野で公知の任意の他の種類のＨＰＶＥ７発現腫瘍である。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０１６１】
本発明の方法によって標的化された子宮頚癌は、別の実施形態では、扁平上皮癌である。別の実施形態では、子宮頚癌は腺癌である。別の実施形態では、子宮頚癌は腺扁平上皮癌である。別の実施形態では、子宮頚癌は小細胞癌である。別の実施形態では、子宮頚癌は当該技術分野で公知の任意の他の種類の子宮頚癌である。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０１６２】
一実施形態では、本発明の方法によって標的化された腫瘍は、頭頚部腫瘍である。別の実施形態では、腫瘍は肛門癌である。別の実施形態では、腫瘍は外陰部癌である。別の実施形態では、腫瘍は膣癌である。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０１６３】
一実施形態では、本明細書中に提供される方法は、子宮頸癌を処置、阻害、または抑制する方法を用いてもよく、該方法として、とりわけ、手術、放射線治療、化学療法、サーベイランス、アジュバント（付加的）、またはこれらの処置の組み合わせが挙げられる。
【０１６４】
利用されるＥ７タンパク質（全体として、または断片のもととして）、別の実施形態では、以下の配列を有する。
【０１６５】
ＭＨＧＤＴＰＴＬＨＥＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴＤＬＹＣＹＥＱＬＮＤＳＳＥＥＥＤＥＩＤＧＰＡＧＱＡＥＰＤＲＡＨＹＮＩＶＴＦＣＣＫＣＤＳＴＬＲＬＣＶＱＳＴＨＶＤＩＲＴＬＥＤＬＬＭＧＴＬＧＩＶＣＰＩＣＳＱＫＰ（配列番号１７）。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号１７の同族体である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号１７の変異体である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号１７の異性体である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号１７の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号１７の同族体の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号１７の変異体の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号１７の異性体の断片である。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０１６６】
一実施形態では、ＬＬＯのコレステロール結合ドメイン（ＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲ；配列番号１８）は、Ｅ７エピトープ（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ；配列番号１９）と置き換えられる。
【０１６７】
別の実施形態では、Ｅ７タンパク質の配列は次のとおりである。
【０１６８】
ＭＨＧＰＫＡＴＬＱＤＩＶＬＨＬＥＰＱＮＥＩＰＶＤＬＬＣＨＥＱＬＳＤＳＥＥＥＮＤＥＩＤＧＶＮＨＱＨＬＰＡＲＲＡＥＰＱＲＨＴＭＬＣＭＣＣＫＣＥＡＲＩＥＬＶＶＥＳＳＡＤＤＬＲＡＦＱＱＬＦＬＮＴＬＳＦＶＣＰＷＣＡＳＱＱ（配列番号２０）。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号２０の同族体である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号２０の変異体である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号２０の異性体である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号２０の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号２０の同族体の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号２０の変異体の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は配列番号２０の異性体の断片である。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０１６９】
別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋエントリー：Ｍ２４２１５、ＮＣ＿００４５００、Ｖ０１１１６、Ｘ６２８４３、またはＭ１４１１９のうちの１つに記述される配列を有する。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリーのうちの１つからの配列の同族体である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリーのうちの１つからの配列の変異体である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリーのうちの１つからの配列の異性体である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリーのうちの１つからの配列の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリーのうちの１つからの配列の同族体の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリーのうちの１つからの配列の変異体の断片である。別の実施形態では、Ｅ７タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリーのうちの１つからの配列の異性体の断片である。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０１７０】
一実施形態では、ＨＰＶ１６Ｅ７抗原は配列ＴＬＧＩＶＣＰＩ（配列番号２１）を有するペプチドである。別の実施形態では、ＨＰＶ１６Ｅ７抗原は配列ＬＬＭＧＴＬＧＩＶ（配列番号２２）を有するペプチドである。別の実施形態では、ＨＰＶ１６Ｅ７抗原は配列ＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴ（配列番号２３）を有するペプチドである。一実施形態では、ＨＰＶ１６Ｅ７抗原は、野生型ＨＰＶ１６Ｅ７抗原の位置８６〜９３を含むペプチドである。一実施形態では、ＨＰＶ１６Ｅ７抗原は、野生型ＨＰＶ１６Ｅ７抗原の位置８２〜９０を含むペプチドである。一実施形態では、ＨＰＶ１６Ｅ７抗原は、野生型ＨＰＶ１６Ｅ７抗原の位置１１〜２０を含むペプチドである。別の実施形態では、ＨＰＶ１６Ｅ７抗原は野生型ＨＰＶ１６Ｅ７抗原の位置８６〜９３、８２〜９０、または１１〜２０からなるペプチドである。別の実施形態では、ＨＰＶ１６Ｅ７抗原は野生型ＨＰＶ１６Ｅ７ペプチドの変異体である。別の実施形態では、ＨＰＶ１６Ｅ７抗原は、その全体を参照により本明細書中に援用されるRessing at al., J Immunol 1995 154（11）:5934-43に記述された任意のＨＰＶ１６Ｅ７抗原である。
【０１７１】
各々の可能性は、本発明の別の実施形態を表わす。
【０１７２】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物の目的の抗原ペプチドは、ＨＰＶ  Ｅ６ペプチドである。別の実施形態では、抗原ペプチドは、Ｅ６タンパク質全体である。別の実施形態では、抗原ペプチドはＥ６タンパク質の断片である。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０１７３】
利用されるＥ６タンパク質は（全体として、または断片のもととして）、別の実施形態では、以下の配列を有する。
【０１７４】
ＭＨＱＫＲＴＡＭＦＱＤＰＱＥＲＰＲＫＬＰＱＬＣＴＥＬＱＴＴＩＨＤＩＩＬＥＣＶＹＣＫＱＱＬＬＲＲＥＶＹＤＦＡＦＲＤＬＣＩＶＹＲＤＧＮＰＹＡＶＣＤＫＣＬＫＦＹＳＫＩＳＥＹＲＨＹＣＹＳＬＹＧＴＴＬＥＱＱＹＮＫＰＬＣＤＬＬＩＲＣＩＮＣＱＫＰＬＣＰＥＥＫＱＲＨＬＤＫＫＱＲＦＨＮＩＲＧＲＷＴＧＲＣＭＳＣＣＲＳＳＲＴＲＲＥＴＱＬ（配列番号２４）。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号２４の同族体である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号２４の変異体である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号２４の異性体である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号２４の断片である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号２４の同族体の断片である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号２４の変異体の断片である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号２４の異性体の断片である。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０１７５】
別の実施形態では、Ｅ６タンパク質の配列は次のとおりである。
【０１７６】
ＭＡＲＦＥＤＰＴＲＲＰＹＫＬＰＤＬＣＴＥＬＮＴＳＬＱＤＩＥＩＴＣＶＹＣＫＴＶＬＥＬＴＥＶＦＥＦＡＦＫＤＬＦＶＶＹＲＤＳＩＰＨＡＡＣＨＫＣＩＤＦＹＳＲＩＲＥＬＲＨＹＳＤＳＶＹＧＤＴＬＥＫＬＴＮＴＧＬＹＮＬＬＩＲＣＬＲＣＱＫＰＬＮＰＡＥＫＬＲＨＬＮＥＫＲＲＦＨＮＩＡＧＨＹＲＧＱＣＨＳＣＣＮＲＡＲＱＥＲＬＱＲＲＲＥＴＱＶ（配列番号２５）。別の実施形態では、別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号２５の同族体である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号２５の変異体である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号２５の異性体である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号２５の断片である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号２５の同族体の断片である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号２５の変異体の断片である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は配列番号２５の異性体の断片である。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０１７７】
別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は次のＧｅｎＢａｎｋエントリーのうちの１つに示される配列を有する。Ｍ２４２１５、Ｍ１４１１９、ＮＣ＿００４５００、Ｖ０１１１６、Ｘ６２８４３、またはＭ１４１１９。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリーのうちの１つからの配列の同族体である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリーのうちの１つからの配列の変異体である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリーのうちの１つからの配列の異性体である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリーのうちの１つからの配列の断片である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリーのうちの１つからの配列の同族体の断片である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリーのうちの１つからの配列の変異体の断片である。別の実施形態では、Ｅ６タンパク質は、上記のＧｅｎＢａｎｋエントリーのうちの１つからの配列の異性体の断片である。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０１７８】
本発明の方法の異種抗原の源であるＨＰＶは、別の実施形態では、ＨＰＶ  １６である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−１８である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８から選ばれる。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−３１である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−３５である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−３９である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−４５である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−５１である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−５２である。別の実施形態では、ＨＰＶはＨＰＶ−５８である。別の実施形態では、ＨＰＶはハイリスクのＨＰＶタイプである。別の実施形態では、ＨＰＶは粘膜のＨＰＶタイプである。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０１７９】
一実施形態では、子宮頚癌の発症における主な病因は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）による感染であり、一実施形態では、該ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は皮膚または粘膜のいずれかの上皮細胞に感染する小さなＤＮＡウイルスである。一実施形態では、ＨＰＶ関連悪性腫瘍として、口腔、頸部、肛門性器および子宮頚癌、さらには呼吸器乳頭腫症が挙げられる。一実施形態では、ＨＰＶは６または７種類の非構造タンパク質と２種類の構造タンパク質とを発現し、各々が本明細書中に記載された免疫予防的または免疫治療的アプローチにおける標的としての機能を果たすものであってもよい。一実施形態では、ウイルスのカプシドタンパク質Ｌ１およびＬ２は、後期構造タンパク質である。一実施形態では、Ｌ１は主カプシドタンパク質であり、そのアミノ酸配列は異なるＨＰＶタイプのなかでも高度に保存されている。
【０１８０】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物の目的の抗原ペプチドは、ＢＣＲイディオタイプである。
【０１８１】
一実施形態では、「Ｂ細胞受容体（B-cell receptor）」または「ＢＣＲ」は、特異性抗原に対するＢ細胞の細胞表面受容体である。別の実施形態では、ＢＣＲは、非共有結合複合体の不変なＩｇαおよびＩｇβ鎖に結合した膜貫通免疫グロブリン分子からなる。別の実施形態では、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）シグナル伝達は、発生の過程全体にわたって、いくつかのＢ細胞運命決定を調整する。別の実施形態では、ＢＣＲのシグナル伝達サブユニットの継続的な発現は、成熟Ｂ細胞の生存に必要である。別の実施形態では、ＢＣＲシグナル伝達の変化はリンパ腫発生をサポートする。一実施形態では、細胞は該細胞の外側にＣＤ２０タンパク質を有する。別の実施形態では、癌性Ｂ細胞はさらにＣＤ２０タンパク質を担持する。別の実施形態では、ＣＤ２０は、少なくともＢ細胞リンパ腫の９５％で高度に発現される。一実施形態ではＢＣＲはＢ細胞リンパ腫で発現される。別の実施形態では、ＢＣＲは、濾胞性リンパ腫、小型非分割細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、有毛リンパ球を伴う脾リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、大細胞型リンパ腫、びまん性大細胞型リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、地方病性バーキットリンパ腫、散発性バーキットリンパ腫、非バーキットリンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫ＭＡＬＴ／ＭＡＬＴリンパ腫（結節外）、単球様Ｂ細胞、リンパ腫（結節点）、びまん性混合細胞、免疫芽球性リンパ腫、原発性縦隔B細胞性リンパ腫、血管中心性リンパ腫−肺Ｂ細胞で発現される。別の実施形態では、ＣＤ２０は、ＢＣＲで発現され、濾胞性リンパ腫、小型非分割細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、有毛リンパ球を伴う脾リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、大細胞型リンパ腫、びまん性大細胞型リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、地方病性バーキットリンパ腫、散発性バーキットリンパ腫、非バーキットリンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫ＭＡＬＴ／ＭＡＬＴリンパ腫（結節外）、単球様Ｂ細胞、リンパ腫（結節点）、びまん性混合細胞、原発性縦隔B細胞性リンパ腫、血管中心性リンパ腫−肺Ｂ細胞で発現される。したがって、一実施形態では、ＢＣＲを含む本発明の組成物および方法は、前述の癌の予防または治療に特に有用である。
【０１８２】
一実施形態では、細胞遺伝学的研究によって、ＮＨＬのいくつかの組織学的および免疫学的サブタイプが相互転座を伴う染色体異常を有しており、高い頻度でＢ細胞受容体の遺伝子および腫瘍遺伝子が含まれることが示された。リンパ腫発生は、細胞表面上にＢＣＲを発現する娘細胞とＭＨＣクラスＩおよびＩＩ分子が結合したＢＣＲ由来ペプチドとにより、形質転換Ｂ細胞のクローン性増殖をもたらす。ＢＣＲは、重鎖および軽鎖の超変異部によって形成されたユニークな構成（これを「イディオタイプ」という）を有し、腫瘍内のすべての娘細胞で同じであり、さらに、著しい数の正常細胞には存在していない。したがって、イディオタイプは特異的な腫瘍抗原であり、リンパ腫治療の標的である。
【０１８３】
本明細書中に提供されるように、本発明は、ＬＬＯタンパク質およびＢＣＲイディオタイプを含む高次構造的に無傷の融合タンパク質を生産した（本明細書中の実験的詳細の項目）。
【０１８４】
別の実施形態では、本発明は、リンパ腫に対する被験体の免疫応答を誘導する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＢＣＲイディオタイプ含有組換えペプチド、タンパク質、またはポリペプチドを被験体に投与することで、リンパ腫に対する免疫応答を誘導するステップを含む。
【０１８５】
別の実施形態では、本発明は、リンパ腫に対する被験体の免疫応答を誘導する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＢＣＲイディオタイプコード化ヌクレオチド分子を被験体に投与することで、リンパ腫に対する免疫応答を誘導するステップを含む。
【０１８６】
別の実施形態では、本発明は、リンパ腫に対する被験体の免疫応答を誘導する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＢＣＲイディオタイプ発現組換えワクチンベクターを被験体に投与することで、リンパ腫に対する免疫応答を誘導するステップを含む。
【０１８７】
別の実施形態では、本発明は、リンパ腫に対する被験体の免疫応答を誘導する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＢＣＲイディオタイプ発現リステリア菌株を被験体に投与することで、リンパ腫に対する免疫応答を誘導するステップを含む。
【０１８８】
別の実施形態では、本発明は、被験体のリンパ腫を処置、阻害、または抑制する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＢＣＲイディオタイプ含有ペプチドを被験体に投与することで、リンパ腫を処置するステップを含む。
【０１８９】
別の実施形態では、本発明は、被験体のリンパ腫を処置、阻害、または抑制する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＢＣＲイディオタイプコード化ヌクレオチド分子を被験体に投与することで、リンパ腫を処置するステップを含む。
【０１９０】
別の実施形態では、本発明は、被験体のリンパ腫を処置、阻害、または抑制する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＢＣＲイディオタイプ発現組換えワクチンベクターを被験体に投与することで、被験体のリンパ腫を処置するステップを含む。
【０１９１】
別の実施形態では、本発明は、被験体のリンパ腫を処置、阻害、または抑制する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＢＣＲイディオタイプ発現リステリア菌株を被験体に投与することで、被験体のリンパ腫を処置するステップを含む。
【０１９２】
別の実施形態では、本発明は、リンパ腫に対する被験体の緩解を誘導する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＢＣＲイディオタイプ含有ペプチドを被験体に投与することで、リンパ腫の緩解を誘導するステップを含む。
【０１９３】
別の実施形態では、本発明は、リンパ腫に対する被験体の緩解を誘導する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＢＣＲイディオタイプコード化ヌクレオチド分子を被験体に投与することで、リンパ腫の緩解を誘導するステップを含む。
【０１９４】
別の実施形態では、本発明は、リンパ腫に対する被験体の緩解を誘導する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＢＣＲイディオタイプ発現組換えワクチンベクターを被験体に投与することで、被験体のリンパ腫の緩解を誘導するステップを含む。
【０１９５】
別の実施形態では、本発明は、リンパ腫に対する被験体の緩解を誘導する方法を提供するもので、該方法は、本発明のＢＣＲイディオタイプ発現リステリア菌株を被験体に投与することで、被験体のリンパ腫の緩解を誘導するステップを含む。
【０１９６】
本明細書中の実験の詳細に関する項目で提供されるように、ＬＬＯが抗原に融合することで免疫原性が高まる。さらに、本発明の融合タンパク質の投与は、腫瘍誘発（tumor challenge）に対する保護をもたらす。
【０１９７】
さらに、本明細書中に提供されるように、本発明は、ＬＬＯタンパク質およびＢＣＲイディオタイプを含む高次構造的に無傷の融合タンパク質を生産し、マウスおよび動物モデルにおいて抗リンパ腫ワクチンを試験するための正確かつ有効な方法を実証し、さらに、リンパ腫に対する保護における本発明のワクチンの有効性と現在許容されている抗リンパ腫ワクチンに対する優位性とを示した（実験の詳細に関する項目）。
【０１９８】
一実施形態では、本発明のワクチンは、投与後に、ある抗原に対する抗体産生または細胞性免疫を刺激する組成物抗体産生または細胞性免疫を刺激する組成物である。
【０１９９】
別の実施形態では、ワクチンは死滅化または弱毒化微生物として投与され、一方、別の実施形態では、ワクチンは天然の抗体または遺伝学的に改変された抗体を含む。一実施形態では、有効なワクチンは免疫系を刺激して、抗体の発生を促進するもので、該抗体は、被験体内で産生されると、該被験体になされたワクチン接種の対象である抗原を産生する細胞、微生物、またはウイルスを迅速かつ効果的に攻撃することで、疾患の発症を防ぐ。
【０２００】
一実施形態では、本発明のワクチンは予防的であり、一方、別の実施形態では、本発明のワクチンは治療的である。一実施形態では、環境暴露または遺伝的素因を介するであろうとなかろうと、特定の疾患または症状の発生または罹患を生じやすい個体群に、予防ワクチンが投与される。そのような感受性因子は、疾患依存的であり、当業者に周知である。例えば、喫煙者（一実施形態では、たばこ、葉巻、パイプ等）を含む個体群は、当該技術分野では肺癌になりやすいことが知られている。ＢＲＣＡ−１およびＢＲＣＡ−２に変異を含む個体群は、当該技術分野では、乳癌および／または卵巣癌になりやすいことが知られている。ニコチン性アセチルコリン受容体αサブユニット３および５の遺伝子を含む第１５染色体の特定の一塩基変異多型（ＳＮＰ）を含む個体群は、当該技術分野では、肺癌になりやすいことが知られている。他の同様の感受性因子は当該技術分野で公知であり、そのような感受性の個体群を、一実施形態では、本発明の予防ワクチンが最も有用である個体群であると、想定する。
【０２０１】
したがって、本発明のワクチンは、免疫応答の誘導、リンパ腫の予防、リンパ腫の処置、およびリンパ腫の寛解の誘導において、有効である。別の実施形態では、本発明は、被験体のリンパ腫に対する免疫寛容を克服する方法を提供するもので、該方法は、本発明のペプチドを被験体に投与することで、リンパ腫に対する免疫寛容を克服するステップを含む。
【０２０２】
別の実施形態では、本発明は、被験体のリンパ腫に対する免疫寛容を克服する方法を提供するもので、該方法は、本発明のヌクレオチド分子を被験体に投与することで、リンパ腫に対する免疫寛容を克服するステップを含む。
【０２０３】
別の実施形態では、「寛容（tolerance）」は、抗原に対する宿主の反応性が欠如していることをいう。別の実施形態では、この用語は、抗原に対する宿主の検出可能な反応性が欠如していることをいう。別の実施形態では、この用語は、宿主の抗原の免疫原性が欠如していることをいう。別の実施形態では、寛容は、生体外（in vitro）ＣＴＬ殺害アッセイにおける反応性の欠如で測定される。別の実施形態では、寛容は遅延型過敏症アッセイにおける反応性の欠如で測定される。別の実施形態では、寛容は、当該技術分野で公知の任意の他の適当なアッセイにおける反応性の欠如で測定される。別の実施形態では、寛容は、本明細書中の実施例に示されるように、決定または測定される。各々の可能性は、本発明の別の実施形態を表わす。
【０２０４】
別の実施形態では、「克服」は、ワクチンによって寛容が覆されることをいう。別の実施形態では、この用語は、ワクチンによって検出可能な免疫応答が付与されることをいう。別の実施形態では、免疫寛容を克服することは、本明細書中の実施例に示されるように、決定または測定される。各々の可能性は、本発明の別の実施形態を表わす。
【０２０５】
別の実施形態では、本発明は、リンパ腫の寛解状態にある被験者のリンパ腫再発の発生率を減少させる方法を提供するもので、該方法は、本発明のペプチドを被験体に投与することで、リンパ腫の寛解状態にある被験者のリンパ腫再発の発生率を減少させるステップを含む。
【０２０６】
別の実施形態では、本発明は、リンパ腫の寛解状態にある被験者のリンパ腫再発の発生率を減少させる方法を提供するもので、該方法は、本発明のヌクレオチド分子を被験体に投与することで、リンパ腫の寛解状態にある被験者のリンパ腫再発の発生率を減少させるステップを含む。
【０２０７】
別の実施形態では、本発明は、リンパ腫の形成を抑制する方法を提供するもので、該方法は、本発明の組換えペプチド、タンパク質、またはポリペプチドを被験体に投与することで、リンパ腫の形成を抑制するステップを含む。
【０２０８】
別の実施形態では、本発明は、リンパ腫の形成を抑制する方法を提供するもので、該方法は、本発明のヌクレオチド分子を被験体に投与することで、リンパ腫の形成を抑制するステップを含む。
【０２０９】
別の実施形態では、本発明は、残留Ｂ細胞リンパ腫疾患に対する被験体の寛解を誘導する方法を提供するもので、該方法は、本発明のペプチドを投与して、残留Ｂ細胞リンパ腫疾患の寛解を誘導することを含む。
【０２１０】
別の実施形態では、本発明は、残留Ｂ細胞リンパ腫疾患の寛解を誘導する方法を提供するもので、本発明のヌクレオチド分子を投与して、残留Ｂ細胞リンパ腫疾患の寛解を誘導することを含む。
【０２１１】
別の実施形態では、本発明は、最小残留Ｂ細胞リンパ腫疾患を除去する方法を提供するもので、該方法は、本発明のペプチドを投与して、最小残留Ｂ細胞リンパ腫疾患を除去することを含む。
【０２１２】
別の実施形態では、本発明は、最小残留Ｂ細胞リンパ腫疾患を除去する方法を提供するもので、該方法は、本発明のヌクレオチド分子を投与して、最小残留Ｂ細胞リンパ腫疾患を除去することを含む。
【０２１３】
別の実施形態では、本発明は、Ｂ細胞リンパ腫の大きさを減少する方法を提供するもので、該方法は、本発明のペプチドを投与することで、Ｂ細胞リンパ腫の大きさを減少することを含む。
【０２１４】
別の実施形態では、本発明は、Ｂ細胞リンパ腫の大きさを減少する方法を提供するもので、該方法は、本発明のヌクレオチド分子を投与することで、Ｂ細胞リンパ腫の大きさを減少することを含む。
【０２１５】
別の実施形態では、本発明は、Ｂ細胞リンパ腫の体積を減少する方法を提供するもので、該方法は、本発明のペプチドを投与することで、Ｂ細胞リンパ腫の体積を減少することを含む。
【０２１６】
別の実施形態では、本発明は、Ｂ細胞リンパ腫の体積を減少する方法を提供するもので、該方法は、本発明のヌクレオチド分子を投与することで、Ｂ細胞リンパ腫の体積を減少することを含む。
【０２１７】
別の実施形態で本発明の方法の標的であるリンパ腫は、別の実施形態では非ホジキンリンパ腫である。別の実施形態では、リンパ腫はＢ細胞リンパ腫である。別の実施形態では、リンパ腫は低悪性度リンパ腫である。別の実施形態では、リンパ腫は低悪性度ＮＨＬである。別の実施形態では、リンパ腫は上記種類のリンパ腫のうちの１つに由来する残留病変である。別の実施形態では、リンパ腫は当該技術分野において公知の任意の他の種類のリンパ腫である。別の実施形態では、リンパ腫はバーキットリンパ腫である。別の実施形態では、リンパ腫は濾胞性リンパ腫である。別の実施形態では、リンパ腫は辺縁帯リンパ腫である。別の実施形態では、リンパ腫は脾性辺縁帯リンパ腫である。別の実施形態では、リンパ腫はマントル細胞リンパ腫である。別の実施形態では、リンパ腫は無痛性のマントル細胞リンパ腫である。別の実施形態では、リンパ腫はＢＣＲを発現する任意の他の種類のリンパ腫である。各種のリンパ腫は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０２１８】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物によって標的化される腫瘍の細胞は、ＢＣＲを発現する。別の実施形態では、腫瘍はＢＣＲを伴う。別の実施形態では、ＢＣＲは腫瘍に典型的なイディオタイプを有する。別の実施形態では、腫瘍細胞によって発現されるＢＣＲは、本発明の方法および組成物によって誘導される免疫応答の標的である。
【０２１９】
別の実施形態では、標的細胞によって発現されるＢＣＲは、腫瘍の表現型に必須である。別の実施形態では、ＢＣＲは腫瘍細胞の形質転換に必要である。別の実施形態では、ＢＣＲの発現を失う腫瘍細胞は、該腫瘍細胞の無制限の増殖、侵襲性、または悪性度の別の特徴を失う。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０２２０】
本発明の方法および組成物は、非ホジキンリンパ腫の任意のＢＣＲとその任意のイディオタイプとに等しく適用される。ＢＣＲの配列は、当該技術分野において周知であり、容易にリンパ腫試料から得られる。
【０２２１】
ＢＣＲ免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖前駆体の典型的な配列は次のとおりである。
【０２２２】
ＭＫＬＷＬＮＷＩＦＬＶＴＬＬＮＧＩＱＣＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＳＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＴＤＹＹＭＳＷＶＲＱＰＰＧＫＡＬＥＷＬＡＬＩＲＮＫＡＮＧＹＴＴＥＹＳＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＱＳＩＬＹＬＱＭＮＡＬＲＡＥＤＳＡＴＹＹＣＡＲＤＰＮＹＹＤＧＳＹＥＧＹＦＤＹＷＡＱＧＴＴＬＴＶＳＳ（配列番号２６；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ１４０９６）。
【０２２３】
ＢＣＲＩｇ軽鎖前駆体の典型的な配列は次のとおりである。
【０２２４】
ＬＬＬＩＳＶＴＶＩＶＳＮＧＥＩＶＬＴＱＳＰＴＴＭＡＡＳＰＧＥＫＩＴＩＴＣＳＡＳＳＳＩＳＳＮＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＦＳＰＫＬＬＩＹＲＴＳＮＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＧＴＭＥＡＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＧＳＳＩＰＲＧＶＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫＲ（配列番号２７；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ１４０９７）。
【０２２５】
ＢＣＲＩｇ軽鎖前駆体の別の典型的な配列は次のとおりである。
【０２２６】
ＧＦＬＬＩＳＶＴＶＩＬＴＮＧＥＩＦＬＴＱＳＰＡＩＩＡＡＳＰＧＥＫＶＴＩＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＰＧＳＳＰＫＩＷＩＹＧＩＳＮＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＦＳＦＴＩＮＳＭＥＡＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＲＳＳＹＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫＲＡＤＡＡＰＴＶＳＨＬＰ（配列番号２８；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ１４０９８）。
【０２２７】
ＢＣＲＩｇ軽鎖前駆体の別の典型的な配列は次のとおりである。
【０２２８】
ＬＬＬＩＳＶＴＶＩＶＳＮＧＥＩＶＬＴＱＳＰＴＴＭＡＡＳＰＧＥＫＩＴＩＴＣＳＡＳＳＳＩＳＳＮＹＬＨＷＹＱＱＫＰＧＦＳＰＫＬＬＩＹＲＴＳＮＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＧＴＭＥＡＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＧＳＳＩＰＲＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＫＲＡ（配列番号２９；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ１４０９９）。
【０２２９】
ＢＣＲＩｇ重鎖の別の典型的な配列は次のとおりである。
【０２３０】
ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣＥＭＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＳＦＳＧＳＴＩＨＷＶＲＱＡＳＧＲＧＬＥＷＶＧＲＳＲＳＫＡＤＮＦＭＴＳＹＡＰＳＩＫＧＫＦＩＩＳＲＤＤＳＳＮＭＬＹＬＱＭＮＮＬＫＴＥＤＴＡＶＹＦＣＴＲＮＦＴＳＬＤＳＴＧＮＳＦＧＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＳＡＳＡＰＴＬＦＰＬＶＳ（配列番号３０；ヒト濾胞性リンパ腫ＩｇＭ重鎖；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ７０２００）。
【０２３１】
ＢＣＲＩｇ重鎖の別の典型的な配列は次のとおりである。
【０２３２】
ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣＥＭＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＥＳＦＫＬＳＣＡＡＳＧＦＳＦＳＧＳＴＩＨＷＶＲＱＡＳＧＲＧＬＥＷＶＧＲＳＲＳＫＡＤＮＦＭＴＳＹＡＰＳＩＫＧＫＦＩＩＳＲＤＤＳＳＮＭＭＹＬＱＭＮＮＬＫＮＥＤＴＡＶＹＦＣＴＲＮＦＴＳＬＤＳＴＧＮＳＦＧＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＳＡＳＡＰＴＬＦＰＬＶＳ（配列番号３１；ヒト濾胞性リンパ腫ＩｇＭ重鎖；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ７０１９９）。
【０２３３】
ＢＣＲＩｇ重鎖の別の典型的な配列は次のとおりである。
【０２３４】
ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＶＳＳＮＹＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＶＩＹＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＨＴＶＲＧＧＨＣＡＰＲＨＫＰＳＬＱＥＲＷＧＮＱＲＱＧＡＬＲＳ（配列番号３２；ヒト濾胞性リンパ腫ＩｇＭ重鎖；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ７０２０８）。
【０２３５】
ＢＣＲＩｇ重鎖の別の典型的な配列は次のとおりである。
【０２３６】
ＭＥＦＧＬＳＷＶＦＬＶＡＩＬＫＧＶＱＣＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＧＳＡＭＨＷＶＲＱＡＳＧＫＧＬＥＷＶＧＨＩＲＤＫＡＮＳＹＡＴＴＹＡＡＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＫＩＥＤＴＡＶＹＦＣＴＲＮＦＴＳＬＤＳＴＧＮＳＦＧＰＷ（配列番号３３；ヒト濾胞性リンパ腫ＩｇＭ重鎖；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ７０２０７）。
【０２３７】
ＢＣＲＩｇ軽鎖の別の典型的な配列は次のとおりである。
【０２３８】
ＳＥＬＴＱＤＰＶＶＳＶＡＬＧＱＴＶＲＩＴＣＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＩＹＧＫＮＮＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＳＳＧＮＴＡＳＬＴＩＴＧＡＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＮＳＲＤＳＳＧＮＬＰＬＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧ（配列番号３４；ヒト、リンパ形質細胞性／リンパ形質細胞様免疫細胞腫軽鎖；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＤ１４０８８）。
【０２３９】
ＢＣＲＩｇ軽鎖の別の典型的な配列は次のとおりである。
【０２４０】
ＤＩＱＭＴＱＳＰＤＳＬＴＶＳＬＧＥＲＡＴＩＮＣＫＳＳＱＳＩＬＹＳＳＮＤＫＮＹＬＡＷＹＱＱＫＡＧＱＰＰＫＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＡＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＡＥＤＶＡＩＹＹＣＱＱＹＹＳＴＰＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号３５；  ヒト濾胞性リンパ腫軽鎖；  ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｙ０９２５０）。
【０２４１】
ＢＣＲＩｇ軽鎖の別の典型的な配列は次のとおりである。
【０２４２】
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＴＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＴＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＥＡＳＳＬＥＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＦＶＴＹＹＣＱＱＹＮＴＦＳＳＹＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号３６；ヒト脾性辺縁帯リンパ腫軽鎖；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＸ９３８０５）。
【０２４３】
他の典型的なＢＣＲＩｇ軽鎖の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＸ９３７６９−９３８０２、ＣＡＡ２５４７７、ＡＡＢ３１５０９、ＣＡＥ５２８２９〜ＣＡＥ５２８３２、ＡＡＦ７９１３２〜７９１４３、およびＧｅｎＢａｎｋで見出される他の配列に見出される。各々の配列は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０２４４】
他の典型的なＢＣＲＩｇ重鎖の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＣＡＡ７３０４４〜７３０５９、ＡＡＸ９３８０９〜ＡＡＸ９３８４２、ＡＡＱ７４１２９、ＣＡＣ３９３６９、ＡＡＢ５２５９０〜ＡＡＢ５２５９７、およびＧｅｎＢａｎｋで見出される他の配列で見つかる。各々の配列は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０２４５】
ＢＣＲの相補性決定領域（ｃｄｒ）を決定する方法は当該技術分野において周知でありある。例えば、配列番号２６のＣＤＲ１は残基５０〜５４からなる。ＣＤＲ２は残基６６〜８７からなる。Ｄ部位は残基１２０〜１３０からなる。また、Ｊ部位は残基１３１〜１４５からなる。配列番号３０のＣＤＲ１は残基１４８〜１６２からなる。ＦＲ２は残基１６３〜２０４からなる。ＣＤＲ２は残基２０５〜２６１からなる。ＦＲ３は残基２６２〜３５７からなる。ＣＤＲ３は残基３５８〜４３２からなる。また、ＣＨ１は残基４３３〜４７３からなる。別の実施形態では、フレームワーク領域（非ｃｄｒ領域）は、同じ種に由来の他の免疫グロブリン分子の公知のフレームワーク領域との相同性によって、決定される。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０２４６】
別の実施形態では、イディオタイプは、本発明の方法および組成物のＢＣＲのｃｄｒを決定することによって、識別される。
【０２４７】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物では、完全ＢＣＲが含まれているか利用される。別の実施形態では、ＢＣＲの断片が含まれているか利用される。別の実施形態では、このＢＣＲ断片はそのイディオタイプを含む。別の実施形態では、このＢＣＲ断片はＴ細胞エピトープを含む。別の実施形態では、このＢＣＲ断片は抗体エピトープを含む。別の実施形態では、「抗原」は、本発明の方法および組成物によって誘導される免疫応答の標的であるＢＣＲまたはその断片のことに言及するために、本明細書中で使用される。
【０２４８】
別の実施形態では、本発明のペプチドに含まれるＢＣＲの断片は、該ＢＣＲの可変領域（ｓｃＦＶ）の単鎖断片である。別の実施形態では、ＢＣＲ断片は高次構造的に完全である。別の実施形態では、ＢＣＲ断片は、ＢＣＲのイディオタイプを含む。別の実施形態では、ＢＣＲイディオタイプは高次構造的に完全である。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０２４９】
「イディオタイプ（ideiotype）」とは、別の実施形態では、ＢＣＲの相補性決定領域（ｃｄｒ）によって形成された構造のことをいう。別の実施形態では、この用語は、ＢＣＲのユニークな領域を指す。別の実施形態では、この用語は、ＢＣＲの抗原結合部位を指す。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０２５０】
「高次構造的に完全（conformationally intact）」とは、別の実施形態では、本来の立体構造と比べて著しく変更されていない立体構造のことをいう。別の実施形態では、この用語は、天然タンパク質に比べて著しく変更されない抗体反応性を指す。別の実施形態では、この用語は、天然タンパク質と実質的にオーバーラップする抗体反応性を指す。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０２５１】
別の実施形態では、本発明の方法で利用されるペプチドは、リンパ腫の細胞によって発現されたイディオタイプと相同のイディオタイプを含む。別の実施形態では、このペプチドは、リンパ腫の細胞によって発現されたイディオタイプと同一のイディオタイプを含む。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０２５２】
別の実施形態では、本発明の方法の中で利用されたヌクレオチド分子は、リンパ腫の細胞によって発現されたイディオタイプと相同のイディオタイプをコードする。別の実施形態では、このヌクレオチド分子は、リンパ腫の細胞によって発現されたイディオタイプと同一のイディオタイプをコードする。別の実施形態では、抗原は、腫瘍細胞によって発現された抗原に高度に相同である。「高度に相同（highly homologous）」とは、別の実施形態では、９０％以上の相同のことをいう。別の実施形態では、この用語は、９２％以上の相同を指す。別の実施形態では、この用語は、９３％以上の相同を指す。別の実施形態では、この用語は、９４％以上の相同を指す。別の実施形態では、この用語は、９５％以上の相同を指す。別の実施形態では、この用語は、９６％以上の相同を指す。別の実施形態では、この用語は、９７％以上の相同を指す。別の実施形態では、この用語は、９８％以上の相同を指す。別の実施形態では、この用語は、９９％以上の相同を指す。別の実施形態では、この用語は、１００％の相同を指す。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０２５３】
別の実施形態では、本発明の方法によって処置された残留Ｂ細胞リンパ腫疾患または最小残留Ｂ細胞リンパ腫疾患は、デバルキング治療の後に残るものである。デバルキング治療を実施するための方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Winter JN et al （Low-grade lymphoma. Hematology （Am Soc Hematol Educ Program）. 2004;:203-20）および Buske C et al （Current status and perspective of antibody therapy in follicular lymphoma. Haematologica. 2006 Jan;91（1）:104-12）に記載されている。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０２５４】
本発明の方法および組成物の異種抗原ペプチドは、別の実施形態では、抗原タンパク質である。別の実施形態では、抗原ペプチドは抗原タンパク質の断片である。別の実施形態では、抗原ペプチドは腫瘍に由来した免疫原性ペプチドである。別の実施形態では、抗原ペプチドは転移に由来した免疫原性ペプチドである。別の実施形態では、抗原ペプチドは癌細胞に由来した免疫原性ペプチドである。別の実施形態では、抗原ペプチドは血管形成支持免疫原性ペプチドである。
【０２５５】
別の実施形態では、抗原ポリペプチドは、一実施形態であるヒト乳頭腫ウイルスＥ７（ＨＰＶＥ７）抗原であり、該抗原はＨＰＶ１６（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＤ３３２５３）由来であり、別の実施形態ではＨＰＶ１８（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｐ０６７８８）由来である。別の実施形態では、抗原ポリペプチドはＨＰＶ−Ｅ６であり、これは、一実施形態では、ＨＰＶ１６（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＤ３３２５２、ＡＡＭ５１８５４、ＡＡＭ５１８５３、またはＡＡＢ６７６１５）由来であり、別の実施形態ではＨＰＶ１８（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｐ０６４６３）由来である。別の実施形態では、抗原ポリペプチドはＨｅｒ／２−ｎｅｕ抗原である。別の実施形態では、抗原ポリペプチドは、前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＣＡＤ３０８４４、ＣＡＤ５４６１７、ＡＡＡ５８８０２、またはＮＰ＿００１６３９）である。別の実施形態では、抗原ポリペプチドは、角質層キモトリプシン様酵素（ＳＣＣＥ）抗原（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＫ６９６５２、ＡＡＫ６９６２４、ＡＡＧ３３３６０、ＡＡＦ０１１３９、またはＡＡＣ３７５５１）である。別の実施形態では、抗原ポリペプチドはウィルムス腫瘍抗原１であり、別の実施形態ではＷＴ−１テロメラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｐ４９９５２、Ｐ２２５６１、ＮＰ＿６５９０３２、ＣＡＣ３９２２０．２あるいはＥＡＷ６８２２２．１）である。別の実施形態では、抗原ポリペプチドはｈＴＥＲＴまたはテロメラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ００３２１９（変異体１）、ＮＭ１９８２５５（変異体２）、ＮＭ１９８２５３（変異体３）、またはＮＭ１９８２５４（変異体４）である。別の実施形態では、抗原ポリペプチドは、プロテイナーゼ３（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ２９１４２、Ｍ７５１５４、Ｍ９６８３９、Ｘ５５６６８、ＮＭ  ００２７７、Ｍ９６６２８、またはＸ５６６０６）である。別の実施形態では、抗原ポリペプチドは、チロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ２）（一実施形態、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿００１９１３、ＡＢＩ７３９７６、ＡＡＰ３３０５１、またはＱ９５１１９）である。別の実施形態では、抗原ポリペプチドは、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿００１８８８、ＡＡＩ２８１１１、またはＡＡＱ６２８４２）である。別の実施形態では、抗原ポリペプチドは、テスチシン（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＦ７９０２０、ＡＡＦ７９０１９、ＡＡＧ０２２５５、ＡＡＫ２９３６０、ＡＡＤ４１５８８、またはＮＰ＿６５９２０６）である。別の実施形態では、抗原ポリペプチドは、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＣＡＡ０５９０８、Ｐ７８３５８、ＡＡＢ４９６９３、またはＮＰ＿６４０３４３）である。別の実施形態では、抗原ポリペプチドは、ＰＳＣＡ（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＨ６５１８３、ＮＰ＿００５６６３、ＮＰ＿０８２４９２、Ｏ４３６５３、またはＣＡＢ９７３４７）である。別の実施形態では、抗���ポリペプチドは、インターロイキン（ＩＬ）１３受容体アルファ（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿０００６３１、ＮＰ＿００１５５１、ＮＰ＿０３２３８２、ＮＰ＿５９８７５１、ＮＰ＿００１００３０７５、またはＮＰ＿９９９５０６）である。別の実施形態では、抗原ポリペプチドは、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＣＡＩＸ）（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＣＡＩ１３４５５、ＣＡＩ１０９８５、ＥＡＷ５８３５９、ＮＰ＿００１２０７、ＮＰ＿６４７４６６、またはＮＰ＿００１１０１４２６）である。別の実施形態では、抗原ポリペプチドは、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＡ６６１８６、ＣＡＡ７９８８４、ＣＡＡ６６９５５、ＡＡＡ５１９６６、ＡＡＤ１５２５０、またはＡＡＡ５１９７０）である。別の実施形態では、抗原ポリペプチドは、ＭＡＧＥ−Ａ（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿７８６８８５、ＮＰ＿７８６８８４、ＮＰ＿００５３５２、ＮＰ＿００４９７９、ＮＰ＿００５３５８、またはＮＰ＿００５３５３）である。別の実施形態では、抗原ポリペプチドは、スルビビン（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＣ５１６６０、ＡＡＹ１５２０２、ＡＢＦ６０１１０、ＮＰ＿００１００３０１９、またはＮＰ＿００１０８２３５０）である。別の実施形態では、抗原ポリペプチドは、ＧＰ１００（一実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＣ６０６３４、ＹＰ＿６５５８６１あるいはＡＡＢ３１１７６）である。別の実施形態では、抗原ポリペプチドは当該技術分野で公知の任意の他の抗原ポリペプチドである。別の実施形態では、本発明の組成物および方法の抗原ペプチドは、抗原ポリペプチドの免疫原性部分を含む。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０２５６】
他の実施形態では、抗原は、菌類病原体、細菌、寄生虫、蠕虫、またはウイルスに由来する。他の実施形態では、抗原は、破傷風トキソイド、インフルエンザウイルスからの赤血球凝集素分子、ジフテリアトキソイド、ＨＩＶｇｐ１２０、ＨＩＶｇａｇタンパク質、ＨＩＶｅｎｖタンパク質、ＩｇＡプロテアーゼ、インシュリンペプチドＢ、粉状そうか病菌（Spongospora subterranea）抗原、ビブリオ症抗原、サルモネラ抗原、肺炎双球菌抗原、ＲＳウイルス抗原、ヘモフィルス属インフルエンザ外膜タンパク質、ヘリコバクターピロリ・ウレアーゼ、髄膜炎菌ピリン、淋菌（N.gonorrhoeae）ピリン、タイプＨＰＶ−１６からのヒト乳頭腫ウイルス抗原ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１、−３３、ＨＰＶ−３５、またはＨＰＶ−４５型のヒトパピローマウイルス由来のヒトパピローマウイルス抗原Ｅ１およびＥ２、腫瘍抗原ＣＥＡ、ラスタンパク質（変異、あるいはその反対）、ｐ５３タンパク質（変異、あるいはその反対）から選択される。
【０２５７】
種々の実施形態では、本発明の方法および組成物の抗原は、以下の感染性疾患に由来する抗原に限定されるものではないが、麻疹、耳下腺炎、風疹、小児麻痺、ＡおよびＢ型肝炎（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｅ０２７０７）およびＣ（例えばＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｅ０６８９０）、同様に他の肝炎ウイルス、Ａ型インフルエンザ、他の型のインフルエンザ、アデノウイルス（例えば４および７型）、狂犬病（例えばＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ３４６７８）、黄熱病、日本脳炎（例えばＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｅ０７８８３）、デング熱（例えばＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ２４４４４）、ハンタウイルス、およびＨＩＶ（例えばＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｕ１８５５２）が挙げられる。細菌および寄生虫抗原は、疾患に関与する原因物質である公知の病原体に由来すると考えられ、限定されるものではないが、ジフテリア、百日咳（例えばＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ３５２７４）、破傷風（例えばＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ６４３５３）、細菌性肺炎および真菌性肺炎（例えばインフルエンザ菌、ニューモシスティス・カリニなど）、コレラ、腸チフス、疫病、細菌性赤痢、サルモネラ症（例えばＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｌ０３８３３）、レジオネラ症、ライム病（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｕ５９４８７）、マラリア（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ５３８３２）、十二指腸虫、回旋系状虫症（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ２７８０７）、住血吸虫症（例えばＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｌ０８１９８）、トリパノソーマ症、リーシュマニア症、ジアルジア症（例えばＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ３３６４１）、アメーバ症、フィラリア症（例えばＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｊ０３２６６）、ボレリア症、および旋毛虫症が挙げられる。
【０２５８】
他の実施形態では、抗原は次の腫瘍抗原のうちの１つである。すなわち、ＭＡＧＥ１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ７７４８１）、ＭＡＧＥ２（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｕ０３７３５）、ＭＡＧＥ３、ＭＡＧＥ４、ＴＲＰ−２、ｇｐ−１００、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ−１、ＨＳＰ−７０、およびベータ−ＨＣＧを含む種々のＭＡＧＥ（メラノーマ関連抗原Ｅ）のいずれか；チロシナーゼ；変異ラス；変異ｐ５３；（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ５４１５６およびＡＡ４９４３１１）；ならびにｐ９７メラノーマ抗原。（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ１２１５４）である。他の腫瘍特異抗原として、進行癌に関連したＲａｓペプチドおよびｐ５３ペプチド、子宮頸癌に関連したＨＰＶ１６／１８およびＥ６／Ｅ７抗原、乳癌に関連したＭＵＣ１抗原（例えばＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｊ０３６５１）、結腸直腸癌に関連したＣＥＡ（癌胎児性抗原）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ９８３１１）、メラノーマに関連したｇｐ１００（例えばＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｓ７３００３）またはＭＡＲＴ１抗原、および前立腺癌（例えばＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ１４８１０）に関連した前立腺特異抗原（ＫＬＫ３）が挙げられる。ｐ５３遺伝子配列は公知であり（例えば、Harris  et  al.（1986）Mol.Cell.Biol.,6:4650-4656を参照せよ）、ＧｅｎＢａｎｋに寄託番号Ｍ１４６９４で寄託されている。本発明によって包含される腫瘍抗原として、限定されるものではないが、さらに、Ｈｅｒ−２／Ｎｅｕ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｍ１６７８９．１、Ｍ１６７９０．１、Ｍ１６７９１．１、Ｍ１６７９２．１）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（例えばＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｕ８７４５９））、ＷＴ−１（例えばＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ０００３７８（変異体Ａ）、ＮＭ０２４４２４（変異体Ｂ）、ＮＭ０２４４２５（変異体Ｃ））、およびＮＭ０２４４２６（変異体Ｄ））、ＬＡＧＥ−１（例えばＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＣＡＡ１１０４４）、滑膜肉腫、Ｘ（ＳＳＸ）−２；（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿００３１３８、ＮＰ＿７８３６２９、ＮＰ＿７８３７２９、ＮＰ＿０６６２９５）、ならびに角質層キモトリプシン酵素（ＳＣＣＥ；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００５０４６およびＮＭ＿１３９２７７）が挙げられる。したがって、本発明は、頚部癌、乳癌、結腸直腸癌、前立腺癌、肺癌等の癌およびメラノーマの免疫治療薬として使用することができる。
【０２５９】
各々の抗原は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０２６０】
一実施形態では、ある抗原に対する被験体による免疫応答の生成を評価する方法は、当該技術分野において公知であり、一実施形態では、本明細書中において実施例の項目で以下に説明する。
【０２６１】
本発明のワクチン構成に利用されるＬＬＯタンパク質（別の実施形態では、ワクチンに取り込まれるＬＬＯ断片の供給源として使用）は、別の実施形態では、配列：ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＰＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤＰＥＧＮＥＩＶＱＨＫＮＷＳＥＮＮＫＳＫＬＡＨＦＴＳＳＩＹＬＰＧＮＡＲＮＩＮＶＹＡＫＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲＴＶＩＤＤＲＮＬＰＬＶＫＮＲＮＩＳＩＷＧＴＴＬＹＰＫＹＳＮＫＶＤＮＰＩＥ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｐ１３１２８；配列番号３７；ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｘ１５１２７に記述された核酸配列）である。この配列に対応する前駆タンパク質の最初の２５ＡＡはシグナル配列であり、細菌から分泌される時にＬＬＯから切断される。したがって、この実施形態では、完全長活性成分ＬＬＯタンパク質は５０４残基長である。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は配列番号３７の同族体である。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は配列番号３７の変異体である。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は配列番号３７の異性体である。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は配列番号３７の断片である。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は配列番号３７の同族体の断片である。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は配列番号３７の変異体の断片である。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は配列番号３７の異性体の断片である。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０２６２】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物のワクチンを構成するために利用されるＬＬＯタンパク質は、配列番号４６（以下の実施例１）に記載の配列を有する。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は配列番号４６の変異体である。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は配列番号４６の異性体である。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は配列番号４６の断片である。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は配列番号４６の同族体の断片である。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は配列番号４６の変異体の断片である。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質は配列番号４６の異性体の断片である。
【０２６３】
別の実施形態では、本明細書に提供される方法および組成物のワクチンを構成するために利用されるＬＬＯタンパク質は、解毒ＬＬＯ（ＤＴＬＬＯ）である。別の実施形態では、ＤＴＬＬＯはその完全タンパク質の断片である。別の実施形態では、ＬＬＯは、コレステロール結合領域を抗原ペプチドまたはそのエピトープで置き換えることによって、解毒される。別の実施形態では、ＬＬＯは、コレステロール結合領域をＥ７エピトープで置き換えることによって、解毒される。別の実施形態では、ＬＬＯはコレステロール結合領域／ドメインの削除により解毒される。別の実施形態では、ＬＬＯはＬＬＯのシグナル配列部分の削除により解毒される。別の実施形態では、ＬＬＯはＬＬＯのシグナル配列およびコレステロール結合領域／ドメインの削除により解毒される。別の実施形態では、ＤＴＬＬＯは、抗原免疫原性を高めるために、標的抗原に対する遺伝的または化学的融合に用いられる。別の実施形態では、解毒ＬＬＯを抗原に融合させる。別の実施形態では、ＤＴＬＬＯは、本明細書中に記載された方法および組成物の抗原ペプチドに融合される。
【０２６４】
一実施形態では、コレステロール結合領域またはコレステロール結合ドメインは、ＬＬＯに関しては知られているか、あるいは当該技術分野で公知の方法を用いて推定されるものと考えられ（本明細書中に参照により援用されるAlouf, Int J Med Microbiol. 2000 Oct;290（4-5）:351-6に総説されている）、コレステロール結合アッセイが後に続く部位特異的変異誘発または類似のコレステロール結合機能を有するタンパク質の配列保存が挙げられる。
【０２６５】
別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質はｃｔＬＬＯである。別の実施形態では、ｃｔＬＬ０は、抗原ペプチドまたはそのエピトープによってＣＢＤが置き換わっている完全長ＬＬＯである。別の実施形態では、「置換、置き換わった（replaced）」は、置換を介すること、または欠失変異を介することを、意味し得る。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質はｍｕｔＬＬＯである。別の実施形態では、ｍｕｔＬＬＯはＣＢＤが変異しているものである。別の実施形態では、ｍｕｔＬＬＯはＣＢＤ内のアミノ酸が変異しているものである。別の実施形態では、突然変異は、点突然変異、欠失、逆位、置換、またはそれの組み合わせである。別の実施形態では、当該技術分野で公知の任意の突然変異である。別の実施形態では、変異ＬＬＯタンパク質は、ＣＢＤ内での欠失、置換、または点突然変異および／またはＬＬＯのシグナル配列の欠失の任意の組み合わせを含む。別の実施形態では、ＣＢＤを変異させることによって、ＬＬＯの溶血作用が減少する。別の実施形態では、ＣＢＤは、ワクチンとして使用される公知のＨＬＡクラスＩ制限エピトープと置き換わる。別の実施形態では、変異ＬＬＯは大腸菌（E. coli）発現系から発現および精製される。
【０２６６】
本明細書中に記載されるように、一実施形態では、「解毒（detox）ＬＬＯ」または「ＤＴＬＬＯ」とは、コレステロール結合ドメインに点突然変異を有する本明細書中に記載されるＬＬＯのことをいう。
【０２６７】
別の実施形態では、「ＬＬＯ断片（LLO fragment）」または「ΔＬＬＯ」とは、そのＰＥＳＴ様ドメインを含むＬＬＯの断片のこという。別の実施形態では、この用語は、ＰＥＳＴ配列を含むＬＬＯ断片を指す。各々の可能性は、本発明の別の実施形態を表わす。
【０２６８】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は、上記ＡＡ範囲の１つに一致する相同ＬＬＯタンパク質の残基を含む。別の実施形態では、例えば、もし本明細書中で利用されるＬＬＯタンパク質と比較して相同ＬＬＯタンパク質が挿入または欠失を有する場合、残基番号は上記に列挙された残基番号と正確に一致する必要はない。
【０２６９】
別の実施形態では、ＬＬＯ断片は当該技術分野中で既知の他のＬＬＯ断片である。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０２７０】
別の実施形態では、総ＬＬＯタンパク質は本発明の方法および組成物で利用される。別の実施形態では、総ＬＬＯタンパク質は非溶血性ＬＬＯタンパク質である。
【０２７１】
別の実施形態では、本発明の組換えペプチド、タンパク質、またはポリペプチドは、検出可能なタグポリペプチドをさらに含む。別の実施形態では、検出可能なタグポリペプチドは含まれていない。他の実施形態では、このタグポリペプチドは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ｍｙｃ、ｍｙｃ−ピルビン酸キナーゼ（ｍｙｃ−ＰＫ）、Ｈｉｓ６、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、インフルエンザウイルス赤血球凝集素タグポリペプチド、ｆｌａｇタグポリペプチド（ＦＬＡＧ）、およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグポリペプチドである。しかし、本発明は上記に列挙されたタグポリペプチドをコードする核酸に限定されると解釈されるべきではない。別の実施形態では、本発明は、これらのタグポリペプチドに実質的に類似した方法で機能するポリペプチドをコードする任意の核酸配列を利用する。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０２７２】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物の組換えワクチンベクターは、プラスミドである。別の実施形態では、本発明は、細胞内へ本発明のヌクレオチド分子を導入するための方法を提供する。組換えベクターを構築して利用する方法は当該技術分野において周知であり、例えば、Sambrook et al. （2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York）および Brent et al. （2003, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York）に記述されている。別の実施形態では、ベクターは細菌ベクターである。他の実施形態では、ベクターはサルモネラ種（Salmonella sp.）、赤痢菌種（Shigella sp.）、ＢＣＧ、リステリア・モノサイトゲネス（L. monocytogenes）、およびストレプトコッカス・ゴルドニ（S. gordonii）から選択される。別の実施形態では、融合タンパク質は、ファゴリソソーム的な融合を回避し、かつ細胞の細胞質にとどまるために修正済の組換え細菌ベクトルによって伝えられる。別の実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。他の実施形態では、ベクターは、牛痘、アビポックス、アデノウイルス、ＡＡＶ、牛痘ウイルスＮＹＶＡＣ、改変牛痘株アンカラ（ＭＶＡ）、セムリキ森林熱ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレトロウイルスから選択される。別の実施形態では、ベクターは裸ＤＮＡベクターである。別の実施形態では、ベクターは当該技術分野で公知の任意の他のベクターである。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０２７３】
別の実施形態では、本発明のヌクレオチドはプロモーター／調節配列に機能的に連結しており、該プロモーター／調節配列はベクターが導入された細胞のコード化ペプチドの発現を促進する。原核細胞内での遺伝子の構成的発現を促進するのに有用なプロモーター／調節配列は、当該技術分野において周知であり、例えば、リステリア菌ｐ６０プロモーター、ｉｎｌＡ（インターナリンをコードする）プロモーター、ｈｌｙプロモーター、およびＡｃｔＡプロモーターが挙げられる。別の実施形態では、任意の他のグラム陽性菌プロモーターが用いられる。真核細胞での遺伝子（例えば、ＤＮＡワクチンに関する）の構成的発現を駆動するのに有用なプロモーター／調節配列は、当該技術分野において周知であり、例えばこれに限定されるものではないが、サイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーターエンハンサー配列、ＳＶ４０初期プロモーター、およびラウス肉腫ウイルス プロモーターが挙げられる。別の実施形態では、本発明のペプチドをコードする核酸の誘導可能かつ組織特異的な発現は、誘導性または組織特異的なプロモーター／調節配列の制御下に、該ペプチドをコードする核酸を置くことにより達成される。この目的に有用である組織特異的または誘導性プロモーター／調節配列の例として、限定されるものではないが、ＭＭＴＶＬＴＲ誘導性プロモーターおよびＳＶ４０後期エンハンサー／プロモーターが挙げられる。別の実施形態では、金属、グルココルチコイド等の誘発剤に応じて誘導されるプロモーターが利用される。したがって、本発明は、任意のプロモーター／調節配列を用いることを含むもので、該プロモーター／調節配列は既知または未知であり、それに機能的に結合した所望のタンパク質の発現を促進することができる。
【０２７４】
別の実施形態では、本発明のペプチドは、その増大した免疫原性の少なくとも一部を介して、ＡＰＣ（例えば、ＤＣ）を活性化する。別の実施形態では、不活性化ＬＬＯは、免疫原性を増強するためにイディオタイプ含有タンパク質に結合する必要はない。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０２７５】
別の実施形態では、本発明は抗原の免疫原性を高める方法を提供するもので、該抗原にＬＬＯタンパク質またはその断片を融合させることを含む。本明細書に開示されたデータによって実証されるように、変異ＬＬＯタンパク質と抗原との融合は、該抗原の免疫原性を高める。
【０２７６】
本発明の方法および組成物の別の実施形態では、ＰＥＳＴ様ＡＡ配列は本発明のＬＬＯ融合タンパク質に含まれている。本明細書中に提供されるように、増強された細胞性免疫は、抗原と、ＰＥＳＴ様ＡＡ配列ＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫ（配列番号６３）を含むＬＬＯとを含む融合タンパク質に関して、実証された。別の実施形態では、ＰＥＳＴ様ＡＡ配列（配列番号１）を含む非溶血性ＬＬＯと抗原との融合は、該抗原の細胞性免疫および抗腫瘍免疫を増強することができる。
【０２７７】
別の実施形態では、非溶血性ＬＬＯタンパク質または断片は、本明細書中に記載した配列内に正確に記載されたものである必要はなく、むしろ、本明細書中の他のところに記載されているように、抗原に融合したＬＬＯの機能的特徴を保持する他の改変、修飾、または変化を施すことができるものである。別の実施形態では、本発明のＬＬＯタンパク質の類似体またはその断片を利用する。類似体は、別の実施形態では、保守的なＡＡ配列の違いによって、または配列に影響を及ぼさない修飾によって、あるいはそれらの両方によって、天然タンパク質またはペプチドとは異なる。
【０２７８】
一実施形態では、本発明は、サイトカインの発現が増加する組成物または方法を提供する（例えば、実施例９を見よ）。一実施形態では、このサイトカインはＴＮＦ−アルファであり、一方、別の実施形態では、このサイトカインはＩＬ−１２である。一方、別の実施形態では、このサイトカインはＩＳＧ１５である。一方、別の実施形態では、このサイトカインは当業者に公知の別のサイトカインである。一実施形態では、上記増加はサイトカインｍＲＮＡ発現においてであってもよく、一方、別の実施形態では、それはサイトカイン分泌においてであってもよい。一方、別の実施形態では、上記増加はｍＲＮＡ発現およびサイトカイン分泌の両方であってもよい。別の実施形態では、本発明の組成物および方法は樹状細胞成熟マーカーを増加させるものであってもよく、該マーカーは、一実施形態ではＣＤ８６であり、別の実施形態ではＣＤ４０であり、また別の実施形態ではＭＨＣＩＩ、別の実施形態では、当該技術分野で公知の別の樹状細胞成熟マーカーであり、または別の実施形態では、それらの組み合わせである（例えば、実施例１０を見よ）。一実施形態では、本発明の組成物および方法は転写因子の核移行を引き起こすものであってもよく、一実施形態では、該転写因子は、ＮＦ−カッパ−Ｂ（例えば、実施例１１を見よ）、または別の実施形態では、当該技術分野で公知の別の転写因子である。別の実施形態では、本発明の組成物および方法は、細胞表面マーカーの上方調節を引き起こすものであってもよく、一実施形態では、該マーカーはＣＤ１１ｂであり、一実施形態では、該ＣＤ１１ｂは、インテグリン−アルファＭ（ＩＴＧＡＭ）；分化分子１１Ｂのクラスター；補体受容体３Ａ（ＣＲ３Ａ）；またはマクロファージ１抗原（ＭＡＣ−１）Ａである。別の実施形態では、免疫細胞によって発現される別の細胞表面マーカーが、当業者に理解されるように、上方制御されてもよい。
【０２７９】
一実施形態では、本発明の組成物および方法の構成要素、例えば一実施形態では、ＬＬＯ配列、コレステロール結合ドメイン配列、または抗原配列（例えば一実施形態ではＮＹ−ＥＳＯ−１、Ｅ７配列、もしくはＢＣＲ配列）は、本明細書に記載する特定の配列に対して相同であってもよいと理解される。一実施形態では、「相同」は、７０％以上の同一性を指す。別の実施形態では、「相同（homology）」は、７２％以上の同一性を指す。別の実施形態では、「相同」は、７５％以上の同一性を指す。別の実施形態では、「相同」は、７８％以上の同一性を指す。別の実施形態では、「相同」は、８０％以上の同一性を指す。別の実施形態では、「相同」は、８２％以上の同一性を指す。別の実施形態では、「相同」は、８３％以上の同一性を指す。別の実施形態では、「相同」は、８５％以上の同一性を指す。別の実施形態では、「相同」は、８７％以上の同一性を指す。別の実施形態では、「相同」は、８８％以上の同一性を指す。別の実施形態では、「相同」は、９０％以上の同一性を指す。別の実施形態では、「相同」は、９２％以上の同一性を指す。別の実施形態では、「相同」は、９３％以上の同一性を指す。別の実施形態では、「相同」は、９５％以上の同一性を指す。別の実施形態では、「相同」は、９６％以上の同一性を指す。別の実施形態では、「相同」は、９７％以上の同一性を指す。別の実施形態では、「相同」は、９８％以上の同一性を指す。別の実施形態では、「相同」は、９９％以上の同一性を指す。別の実施形態では、「相同」は、１００％の同一性を指す。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０２８０】
本発明の別の実施形態では、「核酸（nucleic acid）」または「ヌクレオチド（nucleotide）」とは、塩基−糖−リン酸の組み合わせが少なくとも２つ連なったものをいう。一実施形態では、この用語はＤＮＡおよびＲＮＡを含む。一実施形態では、「ヌクレオチド」は核酸ポリマーの単量体単位を指す。一実施形態では、ＲＮＡは、ｔＲＮＡ（転移ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、およびリボザイムの形態である。ｓｉＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの使用については、記述されている（Caudy AA et al, Genes & Devel 16: 2491-96およびその引用文献）。他の実施形態では、ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、直鎖状ＤＮＡ、または染色体ＤＮＡ、あるいはそれらのグループの誘導体である。さらに、ＤＮＡおよびＲＮＡのこれらの形態は、一本鎖、二本鎖、三本鎖、または四本鎖である。この用語は、別の実施形態では、塩基は同じではあるが別の種類の骨格を含む人工核酸も含む。一実施形態では、人工核酸はＰＮＡ（ペプチド核酸）である。ＰＮＡはペプチド骨格およびヌクレオチド塩基を含み、一実施形では、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子の両方に結合することができる。別の実施形態では、ヌクレオチドは修飾オキシタンである。別の実施形態では、このヌクレオチドは、１つ以上のホスホジエステル結合がホスホロチオエート結合と置換することによって、修飾される。別の実施形態では、人工核酸は、当該技術分野で公知の天然核酸のリン酸骨格の任意の他の変異体を含む。ホスホチオラート核酸およびＰＮＡの使用は、当業者に公知であり、例えばNeilsen PE, Curr Opin Struct Biol 9:353-57;および Raz NK et al Biochem Biophys Res Commun. 297:1075-84に記載されている。核酸の生産および使用は、当業者に公知であり、例えば、Molecular Cloning, （2001）, Sambrook and Russell, eds.およびMethods in Enzymology: Methods for molecular cloning in eukaryotic cells （2003） Purchio and G. C. Fareedに記載されている。各々の核酸誘導体は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０２８１】
本明細書中に列挙される任意のＡＡ配列に関するタンパク質および／またはペプチド相同性は、一実施形態では、免疫ブロット分析を含む当該技術分野で十分に記載された方法によって、あるいは確立された方法を介して、免疫ブロット分析、または任意のいくつかのソフトウェアパッケージを利用して、ＡＡ配列のコンピュータアルゴリズムを通して、決定される。これらのパッケージのいくつかには、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＭＰｓｒｃｈ、またはＳｃａｎｐｓパッケージが含まれ、別の実施形態では、例えば、分析のためのスミスとウォーターマン（Smith and Waterman）のアルゴリズムおよび／またはグローバル／ローカルもしくはブロックス（BLOCKS）アラインメントが使用される。ホモロジーを決定する各方法は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０２８２】
別の実施形態では、本発明の組換えペプチド、タンパク質、およびポリペプチドは、ＬＬＯタンパク質またはその断片を含むペプチドを、抗原を含むペプチドと化学的に結合させるステップを含むプロセスによって作られる。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質またはその断片を、抗原を含むペプチドに化学的に結合させる。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質またはその断片を含むペプチドを、抗原に化学的に結合させる。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質またはその断片を、抗原に化学的に結合させる。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０２８３】
別の実施形態では、「ペプチド（peptide）」とはペプチド結合によって結合したＡＡからなる一本の鎖のことをいう。一実施形態では、ペプチドはＡＡの短鎖である。別の実施形態では、この用語は、本明細書中に開示または列挙された任意の修飾を含む変異体ペプチド分子を指す。別の実施形態では、この用語は、化学架橋剤によって導入された１つ以上の部分を含む分子を指す。別の実施形態では、この用語はペプチド模倣分子を指す。別の実施形態では、この用語は、当該技術分野で公知のペプチド分子の変異体の任意の他の種類を指す。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０２８４】
一実施形態では、用語「タンパク質」または「ポリペプチド」は、多数のペプチドサブユニットを含むアミノ酸鎖であり、完全長タンパク質、オリゴペプチド、およびそれらの断片が含まれ、該アミノ酸残基はペプチド共有結合によって連結している。一実施形態では、本発明に記述されたタンパク質は、二者択一的に、本発明のポリペプチドであってもよい。
【０２８５】
本明細書で用いられるように、明細書中および以下の実施例の項目中、用語「ペプチド」は、天然ペプチド（分解産物、合成的に合成されたペプチド、または組換えペプチド）と、ペプチド類似体であるペプトイドおよびセミペプトイド等のペプチド模倣薬（一般に、合成的に合成されたペプチド）とが挙げられ、該ペプチド類似体は、例えば、該ペプチドを体内にありながら、よりいっそう安定させる、または細菌細胞内に入り込むことができる修飾を有するものであってもよい。そのような修飾として、限定されるものではないが、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ペプチド結合修飾（限定されるものではないが、ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨ、ＣＦ＝ＣＨを含む）、骨格修飾、および残基修飾が挙げられる。例えば、ペプチド模倣薬化合物を調製する方法は当該技術分野において周知であり、例えば、本明細書中にあたかも完全に記載されているものとして援用される定量薬物設計（Quantitative Drug Design）、C.A. Ramsden Gd., Chapter 17.2, F. Choplin Pergamon Press （1992）に特定されている。この点に関してさらに詳しいことは、以下に示す。
【０２８６】
ペプチド内のペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、例えば、Ｎ−メチル化結合（−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）、α−アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）（ここでＲは任意のアルキル、例えばメチル）、カルバ結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）、オレフィン二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、レトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、ペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ２−ＣＯ−）（ここでＲは炭素原子上に本来示される「正常」側鎖）によって、置換される。
【０２８７】
これらの修飾は、ペプチド鎖に沿う結合のいずれかで生じ得るもので、またいくつか（２〜３）でも同時に起こり得る。
【０２８８】
合成の非天然酸、例えばＴＩＣ、ナフチルエラニン（Ｎｏｌ）、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体、またはｏ−メチル−Ｔｙｒを、天然芳香族アミノ酸であるＴｒｐ、Ｔｙｒ、およびＰｈｅによって置き換えてもよい。
【０２８９】
上記のものに加えて、本発明のペプチドはまた、１つ以上の修飾アミノ酸または１つ以上の非アミノ酸モノマー（例えば、脂肪酸、複合糖質）を含むものであってもよい。
【０２９０】
本明細書中で使用されるように、本明細書および以下の特許請求の範囲の項目では、用語「アミノ酸」は、２０種類の天然アミノ酸、しばしば、生体内（in vivo）で翻訳後修飾されたそれらのアミノ酸（例えばヒドロキシプロリン、ホスホセリン、およびホスホスレオニン）、ならびに、限定されるものではないが、その他の異常アミノ酸として２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリジン、イソデスモシン、ｎｏｒ−バリン、ｎｏｒ−ロイシン、およびオルニチンを含むものと理解される。さらに、用語「アミノ酸」はＤアミノ酸とＬアミノ酸の両方を包含する。
【０２９１】
一実施形態では、組成物中および本発明で使用されるアミノ酸は、当該技術分野において公知である天然のアミノ酸または非従来的もしくは修飾されたアミノ酸であってもよい。
【０２９２】
別の実施形態では、非溶血性ＬＬＯタンパク質またはその断片を抗原に結合させるために用いられる方法は、実施例１１に記載されたものである。別の実施形態では、当該技術分野で公知の別の方法が利用される。ペプチドを互いに化学的に結合させる方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、（Biragyn, A and Kwak, LW （2001） Mouse models for lymphoma in Current Protocols in Immunology 20.6.1-20.6.30）および（Collawn, J. F. and Paterson, Y. （1989） Preparation of Anti-peptide antibodies. In Current Protocols in Molecular Biology. Supplement 6. Ed. F.M. Ausubel et.al. Greene Publishing/Wiley 11.14.1 - 11.15.3）に記載されている。
【０２９３】
別の実施形態では、非溶血性ＬＬＯタンパク質またはその断片もしくはＮ末端ＬＬＯ断片は、化学的な結合によって、抗原またはその断片に付着している。別の実施形態では、非溶血性ＬＬＯタンパク質またはその断片もしくはＮ末端ＬＬＯ断片は、化学的な結合によって、異種ペプチドに付着している。別の実施形態では、グルタルアルデヒドが結合に用いられる。別の実施形態では、結合は当該技術分野で公知の任意の適切な方法を用いて実行される。各々の可能性は、本発明の別の実施形態を表わす。
【０２９４】
別の実施形態では、本発明の融合ペプチドは、標準的な化学ペプチド合成技術を用いて、合成される。別の実施形態では、キメラ分子が単一の連続したポリペプチドとして合成される。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質またはその断片と、ＢＣＲまたはその断片とを別々に合成し、一方の分子のアミノ末端を他方の分子のカルボキシル末端で縮合することでペプチド結合を形成することによって融合する。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質および抗原の各々をペプチドスペーサー分子の一端と縮合することで、連続した融合タンパク質を形成する。
【０２９５】
別の実施形態では、本発明の融合タンパク質は、任意の適当な方法によって調製されるもので、該方法として、例えば、適当な配列のクローニングおよび制限または以下に議論する方法による直接的な化学合成が挙げられる。別の実施形態では、準配列をクローニングし、適当な準配列を、適当な制限酵素を用いて切断する。続いて、別の実施形態では、断片を連結して所望のＤＮＡ配列を生産する。別の実施形態では、融合タンパク質をコードするＤＮＡを、ＤＮＡ増幅法、例えばポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、生産する。最初に、新たな終端のいずれの末端にもある天然ＤＮＡの断片を別個に増幅する。一方の増幅された配列の５'末端はペプチドリンカーをコードする一方で、他方の増幅された配列の３'末端もまた、ペプチドリンカーをコードする。第１の断片の５'末端は第２の断片の３'末端に相補的であるので、これら２つの断片（例えばＬＭＰアガロース上での部分精製後）を、３番目のＰＣＲ反応において、重複する鋳型として使用することができる。増幅配列は、コドン、開口部位のカルボキシ側上の断片（現在アミノ配列を形成）、リンカー、および開口部位のアミノ側上の配列（現在カルボキシル配列を形成）を含む。その後、挿入物はプラスミドに連結する。
【０２９６】
別の実施形態では、本発明の組換えペプチド、タンパク質、またはポリペプチドは、標準的な化学ペプチド合成技術を用いて合成される。別の実施形態では、キメラ分子が単一の連続したポリペプチドとして合成される。別の実施形態では、非溶血性ＬＬＯタンパク質またはその断片と抗原とを別々に合成し、一方の分子のアミノ末端を他方の分子のカルボキシル末端で縮合することでペプチド結合を形成することによって融合する。別の実施形態では、ＬＬＯタンパク質および抗原の各々をペプチドスペーサー分子の一端と縮合することで、連続した融合タンパク質を形成する。
【０２９７】
別の実施形態では、本発明のペプチドおよびタンパク質は、Stewart et al. in Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd Edition, 1984, Pierce Chemical Company, Rockford, Illに記載されているような、またはBodanszky and Bodanszky （The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag, New York）に記載されているような、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）によって、調製される。別の実施形態では、適当に保護されたＡＡ残基は、そのカルボキシル基を介して、誘導化かつ不溶化された高分子支持体、例えば架橋ポリスチレンまたはポリアミド樹脂に付着している。「適当に保護された（suitably protected）」とは、アミノ酸のアルファアミノ基上と任意の側鎖官能基上との両方に保護基が存在することをいう。側鎖保護基は、合成の全体にわたって使用される溶媒、試薬、および反応条件に対して、一般に安定しており、また最終ペプチド生成物に影響を及ぼさない条件下で、除去可能である。オリゴペプチドの段階的合成は、Ｎ保護基を初期ＡＡからの除去と、所望のペプチドの配列にある次のＡＡのあるカルボキシル末端へのカップリングとによって、行われる。このＡＡもまた、適当に保護される。反応基内への形成、例えばカルボジイミド、対称酸無水物、または「活性エステル」基、例えばヒドロキシベンゾトリアゾールエステルまたはペンタフルオロフェニルエステルへの形成によって、取り込まれるＡＡのカルボキシルが活性化されて支持体結合ＡＡのＮ末端と反応する。
【０２９８】
固相ペプチド合成法の例として、アルファアミノ保護基としてｔｅｒｔ−ブチロクスカルボニルを利用するＢＯＣ法と、ＡＡ残基のアルファアミノを保護するために９−フルオレニルメチルオキシカルボニルを利用するＦＭＯＣ法とが挙げられ、これらの方法は当業者に周知である。
【０２９９】
別の実施形態では、Ｎ−および／またはＣ−保護基は、固相ペプチド合成方法にとっておきまりのプロトコールを用いて、達成される。Ｃ末端保護基を取り込むために、例えば、所望のペプチドの合成は、固相として、樹脂からの切断が所望のＣ末端保護基を持つペプチドをもたらすように化学的に修飾された支持用樹脂を用いることによって、通常、おこなわれる。Ｃ末端が１級アミノ保護基を有するペプチドを提供するために、例えば、合成は、ペプチド合成が完了した時にフッ化水素酸による処理によって所望のＣ末端アミド化ペプチドを放出するように、ｐ−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）樹脂を用いることで、おこなわれる。同様に、Ｃ末端のＮメチルアミン保護基の取り込みは、Ｎ−メチルアミノエチル誘導化ＤＶＢ樹脂（ＨＦ処置によってＮ−メチルアミド化Ｃ末端を有するペプチドを放出する）を用いて、達成される。エステル化によるＣ末端の保護も従来の手順を用いて達成することができる。このことは、樹脂から側鎖ペプチドの放出を可能にする樹脂／保護基組み合わせの使用を要する。所望のアルコールとの後続反応を可能にしてエステル基を形成する。メトキシアルコキシベンジルアルコールまたは等価なリンカーによって誘導されたＤＶＢ樹脂と一緒にＦＭＯＣ保護基は、ジクロロメタン中ＴＦＡの作用を受けた支持体から切断することで、この目的のために用いられる。次に、ＤＣＣ等による適切に活性化されたカルボキシル基のエステル化を、所望のアルコールの添加によって進行させた後、脱保護とエステル化ペプチド産物の単離がおこなわれる。
【０３００】
Ｎ末端保護基の取り込みは、合成ペプチドが依然として樹脂に付着している間に、例えば適当な無水物およびニトリルによる処理によって、達成することができる。Ｎ末端でアセチル保護基を取り込むために、例えば、樹脂結合ペプチドをアセトニトリル中の２０％無水酢酸で処理することができる。次に、Ｎ保護ペプチド産物を樹脂から切断し、脱保護し、その後単離することができる。
【０３０１】
別の実施形態では、ペプチド組成物の分析をおこなって、生成されたペプチドの同一性を確認する。別の実施形態では、高解像度質量分析を用いてＡＡ組成分析をおこなうことで、該ペプチドの分子量を測定する。あるいは、またはさらに、ペプチドのＡＡ含有量は、酸性水溶液中でペプチドを加水分解し、分離し、同定し、さらにＨＰＬＣまたはＡＡ分析器を用いて混合物の構成成分を定量することによって、確認される。ペプチドの配列を明確に決定するために、該ペプチドを連続して分解して順次ＡＡを同定するタンパク質配列分析装置を用いることもできる。
【０３０２】
別の実施形態では、その使用に先立って、ペプチドを精製することで汚染物質を取り除く。別の実施形態では、該ペプチドの精製は、適当な規制機関およびガイドラインによって設定された基準を満たすようにして、行われる。要求される精製水準を達成するために、多くある従来の精製手順の任意の１つが用いられる。該手順としては、例えば、Ｃ４−、Ｃ８−、またはＣ１８−シリカ等のアルキル化シリカを用いる逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が挙げられる。一般に、有機含有量を高めた勾配移動相、例えばアセトニトリル含有水性緩衝液（通常は小量のトリフルオロ酢酸を含む）を用いることで、精製を達成する。電荷に基づいたペプチドの分離をおこなうために、イオン交換クロマトグラフィーを用いることもできる。
【０３０３】
別の実施形態では、この発明のペプチドの化学合成のために、配列のＣ末端ＡＡが不溶性支持体に付着した後に該配列の残りのＡＡが連続的に付加される固相合成が用いられる。固相合成の技術は、Barany and Merrifield in Solid-Phase Peptide Synthesis; pp. 3-284 in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A., Merrifield, et al. J. Am. Chem. Soc., 85: 2149-2156 （1963）と、Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed. Pierce Chem. Co., Rockford, Ill. （1984）とに記載されている。
【０３０４】
別の実施形態では、本発明の融合タンパク質は組換ＤＮＡ方法論を用いて合成される。別の実施形態では、本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡは、任意の適当な方法によって調製されるもので、該方法として、例えば、適当な配列のクローニングおよび制限あるいは Narang et al. （1979, Meth. Enzymol. 68: 90-99）のホスホトリエステル法、Brown et al. （1979, Meth. Enzymol 68: 109-151）のホスホジエステル法、Beaucage et al. （1981, Tetra. Lett., 22: 1859-1862）のジエチルホスホラミダイト法、および米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体等の方法による直接化学合成が挙げられる。
【０３０５】
別の実施形態では、本発明のペプチドは、活性に影響を及ぼすことなく修飾されるＡＡ残基を取り込む。別の実施形態では、末端を誘導して保護基、すなわち、「望ましくない分解」からＮ末端およびＣ末端を保護および／または安定化させるのに適した化学的置換基を含むもので、用語「望ましくない分解（undesirable degradation）」は化合物がその末端で任意の種類の酵素的、化学的、または生化学的分解を包含することを意味するもので、化合物の機能に影響を及ぼす可能性、すなわち末端で化合物が連続的に分解される可能性がある。
【０３０６】
別の実施形態では、保護基として、ペプチドの生体内（in vivo）活性に悪影響を及ぼさないペプチド化学の分野で従来用いられた保護基が挙げられる。例えば、適当なＮ末端保護基は、Ｎ末端のアルキル化またはアシル化によって導入することができる。適当なＮ末端保護基の例として、Ｃ１〜Ｃ５分岐または非分岐アルキル基、ホルミルおよびアセチル基等のアシル基、さらにその置換形態、例えばアセトアミドメチル（Ａｃｍ）基が挙げられる。デスアミノＡＡ類似体もまた、有用なＮ末端保護基であり、ペプチドのＮ末端に連結すること、またはＮ末端残基に置き換わって用いられることができる。Ｃ末端のカルボキシル基が取り込まれているか取り込まれていない適当なＣ末端保護基として、エステル、ケトン、またはアミドが挙げられる。エステルまたはケトン形成アルキル基、特にメチル、エチル、およびプロピル等の低級アルキル基と、アミド形成アミノ基、例えばメチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、メチルエチルアミノ等のモノおよびジアルキルアミノ基とが、Ｃ末端保護基の例である。アグマチン等のデスカルボキシル化ＡＡ類似体もまた有用なＣ末端保護基であり、ペプチドのＣ末端に連結またはその代わりに用いられることができる。別の実施形態では、末端のアミノおよびカルボキシル基をすべてペプチドから取り除くことで、ペプチド活性に影響を及ぼすことなくそのデスアミドおよびデスカルボキシル化形態を生ずる。
【０３０７】
別の実施形態では、活性に悪影響を及ぼすことなく、他の修飾が取り込まれる。別の実施形態では、そのような修飾として、限定されるものではないが、天然Ｌ異性体形態の１つ以上のＡＡをＤ異性体ＡＡによって置換することが挙げられる。別の実施形態では、ペプチドは１つ以上のＤアミノ酸残基を含むか、すべてがＤ型であるＡＡから構成される。本発明にもとづくペプチドのレトロ−インベルソ（retro inverso）形態、例えばアミノ酸全てがＤアミノ酸形態によって置換されている反転ペプチドもまた、検討される。
【０３０８】
別の実施形態では、本発明の酸付加塩ペプチドはそれらの機能的等価物として利用される。別の実施形態では、ペプチドの水溶性塩を提供するために、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸、または酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリシル酸等の有機酸によって処理された本発明にもとづくペプチドは、本発明での使用に適する。
【０３０９】
別の実施形態では、修飾（通常、一次配列を変更しない）として、ポリペプチドの生体内（in vivo）または生体外（in vitro）化学誘導、例えばアセチル化またはカルボキシル化が挙げられる。さらに、グリコシル化の修飾、例えば合成および処理過程で、またはさらなる処理ステップでのポリペプチドのグリコシル化パターンを修飾することによってなされる修飾や、また例えば、グリコシル化に影響を及ぼす酵素（哺乳類のグリコシル化酵素もしくは脱グリコシル化酵素等）にポリペプチドをさらすことによってなされる修飾が挙げられる。さらに、リン酸化ＡＡ残基（例えばホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホスレオニン）を有する配列もまた包含される。
【０３１０】
別の実施形態では、ポリペプチドの修飾は、タンパク質分解に対する耐性が改善または溶解性を最適化されるように、または治療薬としてより適するように、通常の分子生物学的技術を用いておこなわれる。そのようなポリペプチドの類似体として、天然のＬアミノ酸以外の残基、例えばＤアミノ酸または非天然の合成アミノ酸を含むものが挙げられる。本発明のペプチドは、本明細書に列挙した特定の典型的なプロセスのいずれかの産物に限定されるものではない。
【０３１１】
別の実施形態では、本明細書中に記載されているように抗原と融合した非溶血性ＬＬＯタンパク質またはその断片と、アプリケーターと、本発明の方法の使用を説明する教材とを含むキットを提供する。モデルキットを以下に説明するが、本開示に照らして他の有用なキットの含有物が当業者に明らかになる。これらのキットの各々は、本発明が企図する範囲内である。
【０３１２】
別の実施形態では、本発明の方法および組成物のリステリア菌株は組換えリステリア・シリゲリ（Listeria seeligeri）株である。別の実施形態では、リステリア菌株は組換えリステリア・グレイー（Listeria grayi）株である。別の実施形態では、リステリア菌株は組換えリステリア・イバノビ（Listeria ivanovii）株である。別の実施形態では、リステリア菌株は組換えリステリア・ムライ（Listeria murrayi）株である。別の実施形態では、リステリア菌株は組換えリステリア・ウェルシュメリ（Listeria welshimeri）株である。別の実施形態では、リステリア菌株は、当該技術分野で公知の任意の他のリステリア種の組換えリステリア菌株である。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０３１３】
別の実施形態では、本発明の組換えリステリア菌株を、動物宿主を介して継代した。別の実施形態では、ワクチンベクターとしての株の有効性を継代によって最大限にする。別の実施形態では、リステリア菌株の免疫原性を継代によって安定させる。別の実施形態では、リステリア菌株の毒性を継代によって安定させる。別の実施形態では、リステリア菌株の免疫原性を継代によって増加させる。別の実施形態では、リステリア菌株の毒性を継代によって増加させる。別の実施形態では、リステリア菌株の不安定な準菌株を継代によって取り除く。別の実施形態では、リステリア菌株の不安定な準菌株の普及を継代によって縮小させる。別の実施形態では、リステリア菌株は、本発明の組換えペプチド、タンパク質、またはポリペプチドをコードする遺伝子のゲノム挿入を含む。別の実施形態では、リステリア菌株は、本発明の組換えペプチド、タンパク質、またはポリペプチドをコードする遺伝子を含むプラスミドを運ぶ。動物宿主を介して組換えリステリア菌株を継代する方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、本明細書中に参照により援用される米国特許出願第２００６／０２３３８３５号に記載される。別の実施形態では、継代は当該技術分野で公知の他の方法によって実施される。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０３１４】
別の実施形態では、本発明の方法で利用される組換えリステリア菌株は、冷凍細胞バンクに保存された。別の実施形態では、組換えリステリア菌株は凍結乾燥細胞バンクに保存された。例えば、リステリア菌ワクチンベクターを生産、増殖、および保存する方法は、当該技術分野において周知であり、参照により本明細書中に援用されるＰＣＴ国際公開公報ＷＯ２００７／０６１８４８に記述されている。各々の可能性は、本発明の個々の実施形態を表わす。
【０３１５】
一実施形態では、本明細書中に記載される本発明の組成物および方法は、本明細書中に記載される特定の要素またはステップを含み、一方、他の実施形態では、これらは本質的に前記要素またはステップからなり、一方、別の実施形態では、それらは、前記要素またはステップからなる。いくつかの実施形態では、用語「含む（comprise）」とは、医薬品工業界で公知であるように、指示活性剤の含有、同様に他の活性剤の含有、さらに医薬的に許容し得る担体、賦形剤、皮膚軟化剤、安定化剤等の含有のことをいう。いくつかの実施形態では、用語「本質的に〜からなる（consisting essentially of）」とは、唯一の活性成分が指示活性成分である組成物のことをいうが、指示活性成分の治療効果に直接関与しない製剤安定化、保存等のための他の化合物も含んでもよい。いくつかの実施形態では、用語「本質的に〜からなる（consisting essentially of）」は、活性成分の放出を促進する組成物に言及するものであってもよい。いくつかの実施形態では、用語「からなる（consisting）」とは、活性成分および医薬的に許容し得る担体または賦形剤を含む組成物のことをいう。
【０３１６】
一実施形態では、「処置する（treating）」とは、治療上の処置または予防的もしくは防止的対策のことをいい、目的は、上記した標的化された病理学的状態または疾患を防いだり、軽減することである。したがって、一実施形態では、処置には、疾患、障害、もしくは状態に関連した症状に直接影響を及ぼすこともしくは治療すること、抑制すること、阻害すること、防止すること、その重症度を減少させること、その発症を遅らせること、その症状を減少させること、またはそれらを組み合わせておこなうことが含まれると考えられる。したがって、一実施形態では、「処置する（treating）」とは、とりわけ、進行を遅らせること、寛解を促進すること、寛解を誘導すること、寛解を増進すること、回復を早めること、代替治療の有効性を高めることもしくは代替治療に対する耐性を減少させること、あるいはこれらの組み合わせのことをいう。一実施形態では、「予防する、または防ぐ（preventing）」とは、とりわけ、症状の発症を遅らせること、疾患の再発を防ぐこと、再発が起こる回数もしくは頻度を減少させること、症候性出現間の潜伏期を伸ばすこと、またはそれらの組み合わせのことをいう。一実施形態では、「抑える（suppressing）」または「阻害する（inhibiting）」とは、とりわけ、症状の重症度を低下させること、急性発症の重症度を減少させること、症状の数を減少させること、疾患関連症状の発生率を減少させること、症状の潜伏期を短くすること、症状を改善すること、二次的症状を減少させること、二次感染を減少させること、患者生存を延ばすこと、あるいはこれらの組み合わせのことをいう。
【０３１７】
一実施形態では、本発明の任意の配列の相同体および／または本明細書に記載されたものは、本発明の一部であると考えられることが理解される。
【０３１８】
一実施形態では、本発明の意味の範囲内で「機能的な（functional）」は、本明細書中において、生物学的活性または機能を示すタンパク質、ペプチド、核酸、断片、またはそれらの変異体の本来持っている能力に言及するものである。一実施形態では、そのような生物学的機能は、相互作用する相手（例えば膜結合受容体）に対する結合特性であり、別の実施形態では、三量化特性である。本発明の機能的断片および機能的変異体の場合、これらの生物学的機能を、実際に、例えば、それらの特異性または選択性に関して、しかし基本的生物学的機能を保持しながら、変更することが可能である。
【０３１９】
一実施形態では、「遺伝的に融合する（genetically fused）」とは、本明細書中に示すように、個々の実施形態において、プロモーターおよび、本来は関連しないコード化配列を含むキメラＤＮＡを生じることをいう。
【０３２０】
[発明の詳細な説明]
材料および実験的方法
【０３２１】
細胞系統
【０３２２】
Ｃ５７ＢＬ／６同系ＴＣ−１腫瘍はＨＰＶ−１６Ｅ６およびＥ７で不死化し、ｃ−Ｈａラス癌遺伝子で形質転換した。ＴＣ−１はＥ６およびＥ７の発現が低レベルであり、発癌性が高い。ＴＣ−１をＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＣＳ、２ｍＭＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、１００μＭ可欠アミノ酸、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５０マイクロモル（ｍｃＭ）２−ＭＥ、４００マイクログラム（ｍｃｇ）／ｍＬＧ４１８、および１０％ナショナル・コレクション・タイプ・カルチャー（National Collection Type Culture）−１０９培地、３７℃、１０％ＣＯ２で増殖させた。Ｃ３は、ＨＰＶ１６の完全ゲノムによって不死化させたＣ５７ＢＬ／６マウス由来のマウス胚細胞をｐＥＪ−rasで形質転換した。ＥＬ−４／Ｅ７はＥ７をレトロウイルスで導入した胸腺腫ＥＬ−４である。
【０３２３】
リステリア・モノサイトゲネス（L. monocytogenes）株および増殖
【０３２４】
使用したリステリア株は、Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（エピソーム発現系のｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子；図１）、Ｌｍ−Ｅ７（リステリアゲノムに組み込まれた単一コピーＥ７遺伝子カセット）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（「ＤＰ−Ｌ２０２８」；エピソーム発現系のｈｌｙ−ＮＰ融合遺伝子）、およびＬｍ−Ｇａｇ（「ＺＹ−１８］；染色体に組み込まれた単一コピーＨＩＶ−１Ｇａｇ遺伝子カセット）である。Ｅ７を、プライマー５´−ＧＧＣＴＣＧＡＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣ−３´（配列番号３８；ＸｈｏＩ部位に下線）および５´−ＧＧＧＧＡＣＴＡＧＴＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡ−３´（配列番号３９；ＳｐｅＩ部位に下線）を用いてＰＣＲで増殖し、ｐＣＲ２．１（Invitrogen, San Diego, CA）にライゲーションした。Ｅ７をＸｈｏＩ／ＳｐｅＩ消化によってｐＣＲ２．１から切り出し、ｐＧＧ−５５にライゲーションした。ｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子および多能性転写因子ｐｒｆＡを、多重コピーシャトルプラスミドであるｐＡＭ４０１（Wirth R et al, J Bacteriol, 165: 831, 1986），にクローニングし、ＰＧＧ−５５を得た。ｈｌｙプロモーターは、ＸｈｏＩ部位でＥ７遺伝子と連結して、ＬＬＯ−Ｅ７として転写および分泌されるｈｌｙ−Ｅ７融合遺伝子を生ずるｈｌｙ遺伝子産物（以下で「ΔＬＬＯ」と呼ぶ溶血性Ｃ末端を欠き、配列番号１７に記載された配列を有する）の最初の４４１ＡＡの発現を促進する。生体内（in vivo）でプラスミドを保持するために、ｐＧＧ−５５によるリステリア菌ＸＦＬ−７（ペンシルバニア大学ハオ・シェン（Hao Shen）博士が提供）のｐｆＡ陰性株の形質転換を選んだ（図１Ａ〜Ｂ）。ｈｌｙプロモーターおよび遺伝子断片をプライマー５´−ＧＧＧＧＧＣＴＡＧＣＣＣＴＣＣＴＴＴＧＡＴＴＡＧＴＡＴＡＴＴＣ−３´（配列番号４０；ＮｈｅＩ部位に下線）および５´−ＣＴＣＣＣＴＣＧＡＧＡＴＣＡＴＡＡＴＴＴＡＣＴＴＣＡＴＣ−３´（配列番号４１；ＸｈｏＩ部位に下線）を用いて生成した。ｐｒｆ遺伝子を、プライマー５´−ＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＴＧＡＣＣＧＡＣＡＡＧＴＧＡＴＡＡＣＣＣＧＧＧＡＴＣＴＡＡＡＴＡＡＡＴＣＣＧＴＴＴ−３´（配列番号４２；ＸｂａＩ部位に下線）および５´−ＣＣＣＧＴＣＧＡＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＧＡＡＧ−３´（配列番号４３；ＳａｌＩ部位に下線）を用いてＰＣＲ増幅した。ｈｌｙプロモーターとＥ７の発現および分泌を促進するシグナル配列とを含む発現カセットをＬＭゲノムのｏｒｆＺドメインに導入することで、Ｌｍ−Ｅ７を生成した。プライマー５´−ＧＣＧＧＡＴＣＣＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣ−３´（配列番号４４；ＢａｍＨＩ部位に下線）および５´−ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧ−３´（配列番号４５；ＸｂａＩ部位に下線）を用いたＰＣＲによって、Ｅ７を増幅した。その後、Ｅ７をｐＺＹ−２１シャトルベクターにライゲーションした。結果として得られるプラスミドｐＺー２１−Ｅ７を用いて、ＬＭ株１０４０３Ｓの形質転換をおこなった。このプラスミドｐＺー２１−Ｅ７は、ＬＭゲノムのｏｒｆＸ、Ｙ、Ｚドメインに相当する１．６ｋｂ配列の中間に挿入された発現カセットを有する。相同ドメインは、相同組換えによるｏｒｆＺドメイン内へのＥ７遺伝子カセット���挿入を可能にする。クローンを、ｏｒｆＺドメインへのＥ７遺伝子カセットの組み込みについてスクリーニングした。クロラムフェニコール（２０μｇ／ｍＬ）を含むブレインハートインフュージョン培地（Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７およびＬｍ−ＬＬＯ−ＮＰ）または含まないブレインハートインフュージョン培地（Ｌｍ−Ｅ７およびＺＹ−１８）で、細菌の増殖をおこなった。細菌を等分量に分けて−８０℃で凍結した。発現をウェスタンブロッティングで確認した（図２）。
【０３２５】
ウェスタンブロッティング
【０３２６】
リステリア菌株を３７℃でＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔｏｎｉ培地で増殖させ、６００ｎｍで同一光学密度で集菌した。上清をＴＣＡ沈殿させ、０．１ＮのＮａＯＨを加えた１ｘ試料緩衝液に再懸濁した。同一量の各細胞ペレットまたは各ＴＣＡ沈殿上清を、４〜２０％Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（NOVEX, San Diego, CA）に載せた。ゲルをポリフッ化ビニリデンに移して、抗Ｅ７モノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Zymed Laboratories, South San Francisco, CA）をプローブとして調べ、次にＨＲＰ結合抗マウス二次Ａｂ（Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, U.K.）とともにインキュベートし、アマーシャム（Amersham）ＥＣＬ検出試薬で現像し、ハイパーフィルム（Amersham Pharmacia Biotech）に露光した。
【０３２７】
腫瘍増殖の測定
【０３２８】
カリパスを用いて一日おきに腫瘍を測定し、最短および最長の表面直径を測った。これらの２つの測定の平均値を、種々の時点に対してミリメートルで平均腫瘍直径として、プロットした。腫瘍直径が２０ｍｍに達した時にマウスを犠牲にした。各時点の腫瘍測定は、生き残っているマウスのみ示される。
【０３２９】
定着腫瘍の増殖に対するリステリア菌組み換え体の作用
【０３３０】
６ないし８週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Charles River）の左脇腹に２×１０５ＴＣ−１細胞を皮下注射（ｓ．ｃ）した。腫瘍接種１週間後に、腫瘍は直径４〜５ｍｍの目に見える大きさに達した。次に、８匹のマウスからなるグループに対して、７日目および１４日目に、０．１ＬＤ５０腹腔内（ｉ．ｐ．）Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７（１０７ＣＦＵ）、Ｌｍ−Ｅ７（１０６ＣＦＵ）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ（１０７ＣＦＵ）、またはＬｍ−Ｇａｇ（５×１０５ＣＦＵ）による処理を施した。
【０３３１】
５１Ｃｒ放出アッセイ
【０３３２】
６ないし８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを、０．１ＬＤ５０Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ、またはＬｍ−Ｇａｇの腹腔内投与（ｉ．ｐ．）によって免疫化した。免疫１０日後、脾臓を採った。脾細胞を、フィーダー細胞として照射ＴＣ−１細胞を含む培地中（１００：１、脾細胞：ＴＣ−１）に確立し、５日間にわたって生体外（in vitro）で刺激し、次に以下の標的を用いて標準的な５１Ｃｒ放出アッセイに用いた。Ｅ７Ｈ−２ｂペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ；配列番号１９）でパルスしたＥＬ−４、ＥＬ−４／Ｅ７、またはＥＬ−４。３回反復して得たＥ：Ｔ細胞比率は、８０：１、４０：１、２０：１、１０：１、５：１、および２．５：１であった。３７℃で４時間インキュベーションした後、細胞をペレット化し、５０μＬ上清を各ウェルから取り除いた。ワラック（Ｗａｌｌａｃ）１４５０シンチレーションカウンター（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて、試料を分析した。特異的溶解の百分率を、［（１分あたりの実験カウント  −  １分あたりの自発的カウント）／（１分あたりのカウント合計  −  １分あたりの自発的カウント）］  ×  １００として、決定した。
【０３３３】
ＴＣ−１特異的増殖
【０３３４】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを０．１ＬＤ５０によって免疫化し、２０日後に１ＬＤ５０Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７、Ｌｍ−Ｅ７、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＮＰ、またはＬｍ−Ｇａｇによる腹腔内（ｉ．ｐ）注射によって、追加免疫した。追加免疫６日後に、免疫化マウスおよび未処理のマウスから脾臓を採取した。脾細胞を、Ｅ７Ａｇの源として２．５×１０４、１．２５×１０４、６×１０３、または３×１０３個の照射ＴＣ−１細胞／ウェルを有する、またはＴＣ−１細胞を有さない、または１０μｇ／ウェルのＣｏｎＡを有する平底９６穴プレート中、５×１０５／ウェルで、培地中に確立した。細胞は４５時間後に０．５μＣｉ[3H]チミジン/ウェルでパルスした。トムテク（Tomtec）ハーベスター（Orange, CT）を用いて、１８時間後にプレートを回収し、ワラック（Wallac）１４５０シンチレーションカウンターを用いて増殖の評価をおこなった。１分間あたりのカウントの変化を１分間あたりの実験カウント−１分間あたりの非Ａｇカウントとして計算した。
【０３３５】
フローサイトメトリー分析
【０３３６】
Ｃ５７ＢＬ６マウスを０．１ＬＤ５０Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７またはＬｍ−Ｅ７で、静脈注射（ｉ．ｖ．）により免疫化し、３０日後に追加免疫した。ＣＤ８（５３−６．７、ＰＥ結合）、ＣＤ６２リガンド（ＣＤ６２Ｌ；ＭＥＬ−１４、ＡＰＣ結合）、およびＥ７Ｈ−２Ｄｂテトラマーの３色フローサイトメトリーを、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（登録商標）（Becton Dickinson, Mountain View, CA）．とともにＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）フローサイトメーターを用いて、おこなった。追加免疫５日後に採った脾細胞を室温（ｒｔ）で、Ｅ７ペプチド（ＲＡＨＹＮＩＶＴＦ、配列番号１９）または対称（ＨＩＶ−Ｇａｇ）ペプチドによって載せられたＨ−２Ｄｂテトラマーにより、染色した。テトラマーは、１／２００希釈で用い、Dr. Larry R. Pease （Mayo Clinic, Rochester, MN） ならびにNational Institute of Allergy and Infectious Diseases Tetramer Core Facility およびNational Institutes of Health AIDS Research and Reference Reagent Programから得た。テトラマー＋、ＣＤ８＋、ＣＤ６２ＬＬＯｗ＋細胞を分析した。
【０３３７】
特定の免疫成分の枯渇
【０３３８】
腫瘍誘発（tumor challenge）後、６、７、８、１０、１２および１４日目に、マウス１匹あたり０．５ｍｇのｍＡｂ、すなわち、２．４３、ＧＫ１．５、またはｘｍｇ１．２を各々、マウスに注射することにより、ＴＣ−１担持マウスでＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋細胞、およびＩＦＮの枯渇が生じた。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞集団では、９９％減少した（フローサイトメトリー分析）。４および６日目に、０．５ｍｇ／マウス抗ＣＤ２５ｍＡｂ（ＰＣ６１、Andrew J. Catonが提供）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって、ＣＤ２５＋細胞の枯渇が生じた。６、７、８、１０、１２、１４、１６、１８、および２０日目に、ＴＣ−１担持マウスに抗ＴＧＦ−ｍＡｂ（２Ｇ７、H. I. Levitskyが提供）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射することにより、ＴＧＦの枯渇が生じた。腫瘍誘発後７日目に、マウスを１０７Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７またはＬｍ−Ｅ７で処理した。
【０３３９】
養子免疫細胞移入
【０３４０】
０．１ＬＤ５０ＬｍＥ７またはＬｍ−Ｇａｇにより、ドナーＣ５７ＢＬ／６マウスを免疫し、さらに７日後に追加免疫した。ドナー脾細胞を回収し、ナイロンウールカラムに通して、Ｔ細胞を濃縮した。０．１μｇの２．４３抗ＣＤ８ｍＡｂとともに室温（ｒｔ）、３０分間にわたりインキュベートすることで、ＣＤ８＋Ｔ細胞を生体外（in vitro）で枯渇させた。次に、標識細胞をウサギ補体で処理した。ドナー脾細胞は、＞６０％ＣＤ４＋Ｔ細胞であった（フローサイトメトリー分析）。ＴＣ−１腫瘍担持レシピエントマウスを、腫瘍移植７日後、０．１ＬＤ５０で免疫した。ＣＤ４＋濃縮ドナー脾細胞（１０７）を、腫瘍移植９日後に、静脈注射（ｉ．ｖ．）によってレシピエントマウスに移した。
【０３４１】
Ｂ１６Ｆ０卵子実験
【０３４２】
２４匹のＣ５７ＢＬ／６マウスに対して、５×１０５個のＢ１６Ｆ０卵細胞を接種した。３、１０、および１７日目に、８匹のマウスからなるグループを０．１ＬＤ５０Ｌｍ−ＯＶＡ（１０６ｃｆｕ）、Ｌｍ−ＬＬＯ−ＯＶＡ（１０８ｃｆｕ）で免疫し、８匹の動物を未処理とした。
【０３４３】
統計
【０３４４】
腫瘍の直径を比較するために、各グループの腫瘍サイズを測定し、平均値および標準偏差を求め、統計的有意差をスチューデントｔ検定によって決定した。ｐ≦０．０５を有意であるとした。
【０３４５】
実施例１：ＬＬＯコレステロール結合ドメインの部位特異的変異誘発
【０３４６】
以下の戦略を用いて、部位特異的変異誘発をＬＬＯに実施することで、ＣＢＤに不活性化点突然変異を導入した。結果として得られるタンパク質を「ｍｕｔＬＬＯ」と名付けた。
【０３４７】
ｐＥＴ２９ｂへのＬＬＯのサブクローニング
【０３４８】
野生型ＬＬＯのアミノ酸配列は以下の通り。
【０３４９】
ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＶＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＳＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤＰＥＧＮＥＩＶＱＨＫＮＷＳＥＮＮＫＳＫＬＡＨＦＴＳＳＩＹＬＰＧＮＡＲＮＩＮＶＹＡＫＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲＴＶＩＤＤＲＮＬＰＬＶＫＮＲＮＩＳＩＷＧＴＴＬＹＰＫＹＳＮＫＶＤＮＰＩＥ（配列番号４６）。シグナルペプチドおよびコレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）には下線を施し、該ＣＢＤの３つの重要な残基（Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２）はイタリックの太字とした。
【０３５０】
６×Ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ）をＬＬＯのＣ末端領域に付加した。Ｈｉｓ標識ＬＬＯのアミノ酸配列は以下の通りである。ＭＫＫＩＭＬＶＦＩＴＬＩＬＶＳＬＰＩＡＱＱＴＥＡＫＤＡＳＡＦＮＫＥＮＳＩＳＳＶＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫＹＩＱＧＬＤＹＮＫＮＮＶＬＶＹＨＧＤＡＶＴＮＶＰＰＲＫＧＹＫＤＧＮＥＹＩＶＶＥＫＫＫＫＳＩＮＱＮＮＡＤＩＱＶＶＮＡＩＳＳＬＴＹＰＧＡＬＶＫＡＮＳＥＬＶＥＮＱＰＤＶＬＰＶＫＲＤＳＬＴＬＳＩＤＬＰＧＭＴＮＱＤＮＫＩＶＶＫＮＡＴＫＳＮＶＮＮＡＶＮＴＬＶＥＲＷＮＥＫＹＡＱＡＹＳＮＶＳＡＫＩＤＹＤＤＥＭＡＹＳＥＳＱＬＩＡＫＦＧＴＡＦＫＡＶＮＮＳＬＮＶＮＦＧＡＩＳＥＧＫＭＱＥＥＶＩＳＦＫＱＩＹＹＮＶＮＶＮＥＰＴＲＰＳＲＦＦＧＫＡＶＴＫＥＱＬＱＡＬＧＶＮＡＥＮＰＰＡＹＩＳＳＶＡＹＧＲＱＶＹＬＫＬＳＴＮＳＨＳＴＫＶＫＡＡＦＤＡＡＶＳＧＫＳＶＳＧＤＶＥＬＴＮＩＩＫＮＳＳＦＫＡＶＩＹＧＧＳＡＫＤＥＶＱＩＩＤＧＮＬＧＤＬＲＤＩＬＫＫＧＡＴＦＮＲＥＴＰＧＶＰＩＡＹＴＴＮＦＬＫＤＮＥＬＡＶＩＫＮＮＳＥＹＩＥＴＴＳＫＡＹＴＤＧＫＩＮＩＤＨＳＧＧＹＶＡＱＦＮＩＳＷＤＥＶＮＹＤＰＥＧＮＥＩＶＱＨＫＮＷＳＥＮＮＫＳＫＬＡＨＦＴＳＳＩＹＬＰＧＮＡＲＮＩＮＶＹＡＫＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲＴＶＩＤＤＲＮＬＰＬＶＫＮＲＮＩＳＩＷＧＴＴＬＹＰＫＹＳＮＫＶＤＮＰＩＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号４７）
【０３５１】
Ｈｉｓ標識ＬＬＯタンパク質をコードする遺伝子をＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩで消化し、該ＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩを、ＮｄｅＩ部位とＢａｍＨＩ部位との間で、発現ベクターｐＥＴ２９ｂにサブクローニングした。ＬＬＯタンパク質をコードする遺伝子の配列は以下の通りである。
【０３５２】
ｃａｔａｔｇａａｇｇａｔｇｃａｔｃｔｇｃａｔｔｃａａｔａａａｇａａａａｔｔｃａａｔｔｔｃａｔｃｃｇｔｇｇｃａｃｃａｃｃａｇｃａｔｃｔｃｃｇｃｃｔｇｃａａｇｔｃｃｔａａｇａｃｇｃｃａａｔｃｇａａａａｇａａａｃａｃｇｃｇｇａｔｇａａａｔｃｇａｔａａｇｔａｔａｔａｃａａｇｇａｔｔｇｇａｔｔａｃａａｔａａａａａｃａａｔｇｔａｔｔａｇｔａｔａｃｃａｃｇｇａｇａｔｇｃａｇｔｇａｃａａａｔｇｔｇｃｃｇｃｃａａｇａａａａｇｇｔｔａｃａａａｇａｔｇｇａａａｔｇａａｔａｔａｔｔｇｔｔｇｔｇｇａｇａａａａａｇａａｇａａａｔｃｃａｔｃａａｔｃａａａａｔａａｔｇｃａｇａｃａｔｔｃａａｇｔｔｇｔｇａａｔｇｃａａｔｔｔｃｇａｇｃｃｔａａｃｃｔａｔｃｃａｇｇｔｇｃｔｃｔｃｇｔａａａａｇｃｇａａｔｔｃｇｇａａｔｔａｇｔａｇａａａａｔｃａａｃｃａｇａｔｇｔｔｃｔｃｃｃｔｇｔａａａａｃｇｔｇａｔｔｃａｔｔａａｃａｃｔｃａｇｃａｔｔｇａｔｔｔｇｃｃａｇｇｔａｔｇａｃｔａａｔｃａａｇａｃａａｔａａａａｔａｇｔｔｇｔａａａａａａｔｇｃｃａｃｔａａａｔｃａａａｃｇｔｔａａｃａａｃｇｃａｇｔａａａｔａｃａｔｔａｇｔｇｇａａａｇａｔｇｇａａｔｇａａａａａｔａｔｇｃｔｃａａｇｃｔｔａｔｔｃａａａｔｇｔａａｇｔｇｃａａａａａｔｔｇａｔｔａｔｇａｔｇａｃｇａａａｔｇｇｃｔｔａｃａｇｔｇａａｔｃａｃａａｔｔａａｔｔｇｃｇａａａｔｔｔｇｇｔａｃａｇｃａｔｔｔａａａｇｃｔｇｔａａａｔａａｔａｇｃｔｔｇａａｔｇｔａａａｃｔｔｃｇｇｃｇｃａａｔｃａｇｔｇａａｇｇｇａａａａｔｇｃａａｇａａｇａａｇｔｃａｔｔａｇｔｔｔｔａａａｃａａａｔｔｔａｃｔａｔａａｃｇｔｇａａｔｇｔｔａａｔｇａａｃｃｔａｃａａｇａｃｃｔｔｃｃａｇａｔｔｔｔｔｃｇｇｃａａａｇｃｔｇｔｔａｃｔａａａｇａｇｃａｇｔｔｇｃａａｇｃｇｃｔｔｇｇａｇｔｇａａｔｇｃａｇａａａａｔｃｃｔｃｃｔｇｃａｔａｔａｔｃｔｃａａｇｔｇｔｇｇｃｇｔａｔｇｇｃｃｇｔｃａａｇｔｔｔａｔｔｔｇａａａｔｔａｔｃａａｃｔａａｔｔｃｃｃａｔａｇｔａｃｔａａａｇｔａａａａｇｃｔｇｃｔｔｔｔｇａｔｇｃｔｇｃｃｇｔａａｇｃｇｇａａａａｔｃｔｇｔｃｔｃａｇｇｔｇａｔｇｔａｇａａｃｔａａｃａａａｔａｔｃａｔｃａａａａａｔｔｃｔｔｃｃｔｔｃａａａｇｃｃｇｔａａｔｔｔａｃｇｇａｇｇｔｔｃｃｇｃａａａａｇａｔｇａａｇｔｔｃａａａｔｃａｔｃｇａｃｇｇｃａａｃｃｔｃｇｇａｇａｃｔｔａｃｇｃｇａｔａｔｔｔｔｇａａａａａａｇｇｃｇｃｔａｃｔｔｔｔａａｔｃｇａｇａａａｃａｃｃａｇｇａｇｔｔｃｃｃａｔｔｇｃｔｔａｔａｃａａｃａａａｃｔｔｃｃｔａａａａｇａｃａａｔｇａａｔｔａｇｃｔｇｔｔａｔｔａａａａａｃａａｃｔｃａｇａａｔａｔａｔｔｇａａａｃａａｃｔｔｃａａａａｇｃｔｔａｔａｃａｇａｔｇｇａａａａａｔｔａａｃａｔｃｇａｔｃａｃｔｃｔｇｇａｇｇａｔａｃｇｔｔｇｃｔｃａａｔｔｃａａｃａｔｔｔｃｔｔｇｇｇａｔｇａａｇｔａａａｔｔａｔｇａｔｃｃｔｇａａｇｇｔａａｃｇａａａｔｔｇｔｔｃａａｃａｔａａａａａｃｔｇｇａｇｃｇａａａａｃａａｔａａａａｇｃａａｇｃｔａｇｃｔｃａｔｔｔｃａｃａｔｃｇｔｃｃａｔｃｔａｔｔｔｇｃｃｔｇｇｔａａｃｇｃｇａｇａａａｔａｔｔａａｔｇｔｔｔａｃｇｃｔａａａｇａａｔｇｃａｃｔｇｇｔｔｔａｇｃｔｔｇｇｇａａｔｇｇｔｇｇａｇａａｃｇｇｔａａｔｔｇａｔｇａｃｃｇｇａａｃｔｔａｃｃａｃｔｔｇｔｇａａａａａｔａｇａａａｔａｔｃｔｃｃａｔｃｔｇｇｇｇｃａｃｃａｃｇｃｔｔｔａｔｃｃｇａａａｔａｔａｇｔａａｔａａａｇｔａｇａｔａａｔｃｃａａｔｃｇａａｃａｃｃａｃｃａｃｃａｃｃａｃｃａｃｔａａｔａａｇｇａｔｃｃ（配列番号４８）
下線を引いた配列は、配列の先頭から始まり、ＮｄｅＩ部位、ＮｈｅＩ微、ＣＢＧコード領域、６×Ｈｉｓタグ、およびＢａｍＨＩ部位である。次のステップで変異させるＣＢＤ残基をイタリック体の太字とした。
【０３５３】
スプライシング・バイ・オーバーエクスプレッション（ＳＯＥ）ＰＣＲ
【０３５４】
ステップ１：ＰＣＲ反応＃１および＃２をｐＥＴ２９ｂ−ＬＬＯテンプレート上で実行した。プライマー＃１および＃２を用いるＰＣＲ反応＃１は、同一の変異をＣＢＤに導入することを含め、ＮｈｅＩ部位とＣＢＤとの間の断片を増幅した。プライマー＃３および＃４を用いるＰＣＲ反応＃２は、同一の変異をＣＢＤに導入することを含め、ＣＢＤとＢａｍＨＩ部位との間の断片を増幅した（図１Ａ）。
【０３５５】
ＰＣＲ反応＃１サイクル：Ａ）９４℃２分３０秒、Ｂ）９４℃３０秒、Ｃ）５５℃３０秒、Ｄ）７２℃１分、ＢからＤまでのステップを２９回繰り返し（合計３０サイクル）、Ｅ）７２℃１０分。
【０３５６】
ＰＣＲ反応＃２サイクル：Ａ）９４℃２分３０秒、Ｂ）９４℃３０秒、Ｃ）６０℃３０秒、Ｄ）７２℃１分、ＢからＤまでのステップを２９回繰り返し（合計３０サイクル）、Ｅ）７２℃１０分。
【０３５７】
ステップ２：ＰＣＲ反応＃１および＃２の生成物を混合し、アニーリングさせ（変異ＣＢＤコード領域で）、さらにＰＣＲをプライマー＃１および＃４を用いて２５サイクル以上にわたって実施した（図１Ｂ）。ＰＣＲ反応サイクル：Ａ）９４℃２分３０秒、Ｂ）９４°Ｃ３０秒、Ｃ）７２℃１分、ステップＢからＣを９回実施（合計１０サイクル）、プライマー＃１および＃４を付加、Ｄ）９４℃３０秒、Ｅ）５５°Ｃ３０秒、Ｆ）７２°Ｃ１分、ステップＤないしＦを２４回繰り返し（合計２５サイクル）、Ｇ）７２℃１０分。
【０３５８】
プライマー配列：
【０３５９】
プライマー１：ＧＣＴＡＧＣＴＣＡＴＴＴＣＡＣＡＴＣＧＴ（配列番号４９；ＮｈｅＩ配列に下線）。
【０３６０】
プライマー２：ＴＣＴＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＣＡＡＧＣＴＡＡＡＣＣＡＧＴＣＧＣＴＴＣＴＴＴＡＧＣＧＴＡＡＡＣＡＴＴＡＡＴＡＴＴ（配列番号５０；ＣＢＤコード配列に下線；変異コドンをイタリック体の太文字とする）。
【０３６１】
プライマー３：ＧＡＡＧＣＧＡＣＴＧＧＴＴＴＡＧＣＴＴＧＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＣＧＧＴＡＡＴＴＧＡＴＧＡＣＣＧＧＡＡＣ（配列番号：５１；ＣＢＤコード配列に下線；変異コドンをイタリック体の太文字とする）。
【０３６２】
プライマー４：ＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＣＧＡＴＴＧＧ（配列番号５２；ＢａｍＨＩ配列に下線）。
【０３６３】
野生型ＣＢＤ配列は、ＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲ（配列番号：１８）。
【０３６４】
変異ＣＢＤ配列は、ＥＡＴＧＬＡＷＥＡＡＲ（配列番号：５３）。
【０３６５】
変異ＮｈｅＩ−ＢａｍＨＩ断片の配列は、以下のとおり。
【０３６６】
ＧＣＴＡＧＣＴＣＡＴＴＴＣＡＣＡＴＣＧＴＣＣＡＴＣＴＡＴＴＴＧＣＣＴＧＧＴＡＡＣＧＣＧＡＧＡＡＡＴＡＴＴＡＡＴＧＴＴＴＡＣＧＣＴＡＡＡＧＡＡＧＣＧＡＣＴＧＧＴＴＴＡＧＣＴＴＧＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＡＧＡＡＣＧＧＴＡＡＴＴＧＡＴＧＡＣＣＧＧＡＡＣＴＴＡＣＣＡＣＴＴＧＴＧＡＡＡＡＡＴＡＧＡＡＡＴＡＴＣＴＣＣＡＴＣＴＧＧＧＧＣＡＣＣＡＣＧＣＴＴＴＡＴＣＣＧＡＡＡＴＡＴＡＧＴＡＡＴＡＡＡＧＴＡＧＡＴＡＡＴＣＣＡＡＴＣＧＡＡＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＡＡＴＡＡＧＧＡＴＣＣ（配列番号：５４）。
【０３６７】
実施例２：ＣＴＬエピトープによるＬＬＯＣＢＤの一部分の置換
【０３６８】
部位特異的変異誘発をＬＬＯに対しておこない、ＣＢＤの９個のアミノ酸（ＡＡ）を抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１由来のＣＴＬエピトープに置き換えた。ＣＢＤの配列（配列番号：１８）を、「ｃｔＬＬＯ」と名付けたＮＹ−ＥＳＯ−１由来ＨＬＡ−Ａ２制限エピトープ１５７〜１６５を含む配列ＥＳＬＬＭＷＩＴＱＣＲ（配列番号５５；変異残基に下線）に、置き換えた。
【０３６９】
用いたサブクローニング戦略は、先の実施例と同様のものとした。
【０３７０】
用いたプライマーは以下のとおりである。
【０３７１】
プライマー１：ＧＣＴＡＧＣＴＣＡＴＴＴＣＡＣＡＴＣＧＴ（配列番号５６；ＮｈｅＩ配列に下線）。
【０３７２】
プライマー２：ＴＣＴＧＣＡＣＴＧＧＧＴＧＡＴＣＣＡＣＡＴＣＡＧＣＡＧＧＣＴＴＴＣＴＴＴＡＧＣＧＴＡＡＡＣＡＴＴＡＡＴＡＴＴ（配列番号５７；ＣＢＤ−コード配列に下線；変異（ＮＹ−ＥＳＯ−１）コドンはイタリック体の太文字である）。
【０３７３】
プライマー３：ＧＡＡＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧＴＧＧＡＴＣＡＣＣＣＡＧＴＧＣＡＧＡＡＣＧＧＴＡＡＴＴＧＡＴＧＡＣＣＧＧＡＡＣ（配列番号５８；ＣＢＤ−コード配列に下線；変異（ＮＹ−ＥＳＯ−１）コドンはイタリック体の太文字である）。
【０３７４】
プライマー４：ＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＣＧＡＴＴＧＧ（配列番号５９；ＢａｍＨＩ配列に下線）。
【０３７５】
結果として得られるＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩ断片の配列は以下のとおりである。ＧＣＴＡＧＣＴＣＡＴＴＴＣＡＣＡＴＣＧＴＣＣＡＴＣＴＡＴＴＴＧＣＣＴＧＧＴＡＡＣＧＣＧＡＧＡＡＡＴＡＴＴＡＡＴＧＴＴＴＡＣＧＣＴＡＡＡＧＡＡＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧＴＧＧＡＴＣＡＣＣＣＡＧＴＧＣＡＧＡＡＣＧＧＴＡＡＴＴＧＡＴＧＡＣＣＧＧＡＡＣＴＴＡＣＣＡＣＴＴＧＴＧＡＡＡＡＡＴＡＧＡＡＡＴＡＴＣＴＣＣＡＴＣＴＧＧＧＧＣＡＣＣＡＣＧＣＴＴＴＡＴＣＣＧＡＡＡＴＡＴＡＧＴＡＡＴＡＡＡＧＴＡＧＡＴＡＡＴＣＣＡＡＴＣＧＡＡＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＡＡＴＡＡＧＧＡＴＣＣ（配列番号６０）。
【０３７６】
実施例３：ｍｕｔＬＬＯおよびｃｔＬＬＯは大腸菌（E. coli）発現系で発現および精製可能
【０３７７】
ｍｕｔＬＬＯとｃｔＬＬＯとが大腸菌（E. coli）で発現し得ることを示すために、大腸菌（E. coli）をｐＥＴ２９ｂで形質転換し、０．５ｍＭＩＰＴＧとともに誘導し、続いて４時間後に細胞溶解物を回収し、総タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離してクーマシー染色し（図２Ａ）、さらにモノクローナル抗体Ｂ３−１９を用いて抗ＬＬＯウェスタンブロットにかけた（図２Ｂ）。したがって、ＣＢＤに点突然変異または置換を含むＬＬＯタンパク質を、大腸菌（E. coli）発現系で発現および精製することができる。
【０３７８】
実施例４：ｍｕｔＬＬＯおよびｃｔＬＬＯによって示される溶血作用の著しい減少
材料と実験的方法
【０３７９】
溶血試験
【０３８０】
１．野生型および変異ＬＬＯを、９００μＬの１×ＰＢＳ−システイン（０．５Ｍシステイン塩酸塩でｐＨ５．５に調整またはｐＨ７．４に調整したＰＢＳ）で、図３Ａ〜図３Ｂに示す希釈まで希釈した。２．ＬＬＯを３７℃で３０分間インキュベートすることで、活性化させた。３．上清が比較的透き通るまで、ヒツジ赤血球（２００μＬ／試料）をＰＢＳ−システインで２回洗い、１×ＰＢＳで３ないし５回洗った。４．ヒツジ赤血球の最終ペレットをＰＢＳ−システインで再懸濁し、１００μＬの細胞懸濁液を９００μＬのＬＬＯ溶液（１０％最終溶液）に添加した。５．５０μＬのヒツジ赤血球を９５０μＬの水＋１０％ｔｗｅｅｎ２０に添加した（溶解の陽性対照、溶解細胞量の５０％を他の試験管に添加する細胞の全量として含む；「５０％対照」）。６．全試験管をゆっくりと混合し、３７℃で４５分間インキュベートした。７．赤血球を微小遠心で１５００ｒｐｍ、１０分間遠心した。８．上清の２００μＬ等分量を９６穴ＥＬＩＳＡプレートに移し、５７０ｎｍで読み取ることで、溶血後に放出されたヘモグロビン濃度を測定し、試料の力価を５０％対照にもとづいて測定した。
【０３８１】
結果
【０３８２】
ヒツジ赤血球分析を用いて、ｍｕｔＬＬＯおよびｃｔＬＬＯの溶血作用を測定した。ｍｕｔＬＬＯは、ｐＨ５．５で溶血力価が著しく減少することを示した（１００倍から１０００倍の間で）（図３Ａ）。また、ｐＨ７．４では溶血力価が検出不能であった（図３Ｂ）。ｃｔＬＬＯは、いずれのｐＨでも溶血作用が検出不能であった（図３Ａ〜Ｂ）。
【０３８３】
したがって、Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２を含むＬＬＯＣＤＢ残基の点突然変異（ｍｕｔＬＬＯ）または置換突然変異（ｃｔＬＬＯ）は、溶血作用を止めるか、著しく減少させる。さらに、異種抗原ペプチドによるＣＢＤの置換は、野生型ＬＬＯに比べて溶血作用が著しく減少した異種エピトープの免疫原性担体を作成する有効な手段である。
【０３８４】
実施例５：ｍｕｔＬＬＯ−３８Ｃ１３ＢＣＲおよびｃｔＬＬＯ−３８Ｃ１３ＢＣＲワクチンの構築および試験
【０３８５】
ｍｕｔＬＬＯ−３８Ｃ１３ＢＣＲおよびｃｔＬＬＯ−３８Ｃ１３ＢＣＲワクチンを、本明細書に参照により援用される米国特許公報第２００６−０２６９５６１号に記載されたｍｕｔＬＬＯコード化ＤＮＡ、ｃｔＬＬＯコード化ＤＮＡ、および３８Ｃ１３コード化ＤＮＡから構築する。米国特許公報第２００６−０２６９５６１号に記載されているように該ワクチンを試験すると、保護的な抗リンパ腫作用を示すことがわかる。
【０３８６】
実施例６：ｍｕｔＬＬＯ−Ｅ７およびｃｔＬＬＯ−Ｅ７ワクチンの構築および試験
【０３８７】
ｍｕｔＬＬＯ−Ｅ７およびｃｔＬＬＯ−Ｅ７ワクチンを、米国特許公報第２００６−０２６９５６１号に記載されたｍｕｔＬＬＯコード化ＤＮＡ、ｃｔＬＬＯコード化ＤＮＡ、およびＥ７コード化ＤＮＡから構築する。米国特許公報第２００６−０２６９５６１号に記載されているように該ワクチンを試験すると、保護的な抗腫瘍作用を示すことがわかる。
【０３８８】
実施例７：ＴＣ−１増殖での対照と比較した解毒ＬＬＯ−Ｅ７による免疫化の効果
ワクチン調製
【０３８９】
ＣＢＤに突然変異または欠失を有す組換えＥ７および解毒ＬＬＯ−Ｅ７を、製造元の指示に従って、ニッケルカラム上で精製し、ＬＰＳをノルジェンプロテオスピン（Norgen Proteospin）カラム上で取り除いた。２ｍｇの解毒ＬＬＯと５００μｇのＥ７とを混合することで、Ｅ７をＬＬＯに化学的に結合させ、パラホルムアルデヒドを添加することで最終濃度を１％とした。この混合物をローター上４０分間、室温で振とうさせた後、４℃で一晩、ＰＢＳ中で透析した。
【０３９０】
腫瘍緩解
【０３９１】
１×１０５ＴＣ−１を各々のマウスの脇腹に確立し、３日目および１０日目に、５０μｇのＥ７、５０μｇのＥ７と混合した２００μｇの解毒ＬＬＯ、２５０μｇの解毒ＬＬＯ−Ｅ７複合体を含む２５０μＬのＰＢＳ、またはＰＢＳのみ（未処理）により、背中に沿って皮下免疫した。
【０３９２】
ＴＣ−１増殖に対するＥ７に化学的に結合した解毒ＬＬＯおよび解毒ＬＬＯ＋Ｅ７による免疫化の効果
【０３９３】
マウスを、Ｅ７（５０μｇ）、Ｅ７（５０μｇ）と混合した解毒ＬＬＯ（２００μｇ）、解毒ＬＬＯ−Ｅ７複合体（２５０μｇ）を含む２５０μＬのＰＢＳ、またはＰＢＳのみ（未処理）により、背中に沿って皮下免疫した。
【０３９４】
結合ＬＬＯ−Ｅ７を投与されたマウスでは、未処理の対照と比較して、腫瘍サイズの増加が軽減されていることが示された。混合したＬＬＯ＋Ｅ７を投与されたマウスでは、腫瘍サイズの増加が軽減されていることが示された（図４）。全ての未処理動物が７日目までに腫瘍を持ったが、解毒ＬＬＯ−Ｅ７複合体の投与後、２／８匹のマウスは腫瘍を持たず、また４／８匹のマウスは４９日目ではＥ７と混合した解毒ＬＬＯの投与後、腫瘍を持たなかった（図４、表１）。
【０３９５】
ＴＣ−１増殖に対するＥ７またはＬＬＯタンパク質による免疫化の効果
【０３９６】
マウスを、Ｅ７（５０μｇ）、解毒ＬＬＯ（２５０μｇ）を含む２５０μＬのＰＢＳ、またはＰＢＳのみ（未処理）により、背中に沿って皮下免疫した。
【０３９７】
腫瘍緩解は、解毒ＬＬＯまたはＥ７単独のいずれかによって免疫されたマウスでは腫瘍緩解が示されなかった。各々の場合、０／８および１／８匹のマウスは、それぞれＬＬＯおよびＥ７グループから４５日目で腫瘍がなかった。解毒ＬＬＯによる免疫化は腫瘍の発症を遅らせ、またＥ７による免疫化は、より大きな程度で、腫瘍の発症を遅らせた（図５）。
【０３９８】
ＴＣ−１増殖に対する全Ｅ７配列に遺伝的に融合したＤＴＬＬＯによる免疫化とＥ７エピトープによるコレステロール結合領域の置換によって解毒化されたＬＬＯの効果
【０３９９】
マウスを、組換えＤＴＬＬＯ−Ｅ７全体（ＤＴＬＬＯに遺伝的に融合した全Ｅ７配列；２５０μｇ）、ＤＴＬＬＯ−Ｅ７キメラ（Ｅ７エピトープによるＣＢＤの置換によって解毒化されたＬＬＯ；２５０μｇ）を含む２５０μＬのＰＢＳ、またはＰＢＳのみ（未処理）により、背中に沿って皮下免疫した。
【０４００】
ＤＴＬＬＯ−Ｅ７全体およびＤＴＬＬＯ−Ｅ７キメラは、未処理対照と比較して、腫瘍の出現を遅らせた（図６）。ＤＴＬＬＯ−Ｅ７全体（腫瘍移植後４９日目で腫瘍なし５／８匹；図６および表１）と比較して、ＤＴＬＬＯ−Ｅ７キメラでは腫瘍の増殖を強力に阻害することが示された（腫瘍接種後４９日目で腫瘍なし８／８匹）。比較可能な結果は、実験を繰り返して得た（図７〜９）。２×１０＾５ＴＣ−１腫瘍細胞を、１つのワクチングループあたり８匹のマウスで、皮下注射（ｓ．ｃ）により確立した。マウスを、５０μｇのＥ７、２００μｇのＤＴＬＬＯ、２５０μｇのＤＴＬＬＯＥ７、または５０μｇのＥ７＋２００ｇのＤＴＬＬＯによって、３日目および１０日目に、皮下注射（ｓ．ｃ）により免疫化した（図９）。結合ＤＴＬＬＯ−Ｅ７を投与されたマウスでは、未処理の対照と比較して、腫瘍サイズの増加が軽減されていることが示された。ＤＴＬＬＯ単独または混合したＤＴＬＬＯ＋Ｅ７を投与されたマウスでは、腫瘍サイズの増加が軽減されていることが示された（図９）。全ての未処理動物が７５日目までに腫瘍を持っていたが、ＤＴＬＬＯ＋Ｅ７で処理した５／８匹のマウスとＤＴＬＬＯＥ７で処理した７／８匹のマウスでは、７５日目では腫瘍がなかった（図９）。
【０４０１】
実施例８：ＡＣＴＡ、Ｅ７、または混合したＡＣＴＡ＋Ｅ７もしくは伝学的に融合したＡＣＴＡ−Ｅ７による免疫後のＴＣ−１腫瘍緩解
【０４０２】
ワクチン製剤
【０４０３】
組換え体Ｅ７および組換え体ＡｃｔＡまたはＡｃｔＡ−Ｅ７融合タンパク質を、製造元の指示に従って、ニッケルカラム上で精製し、ＬＰＳをノルジェンプロテオスピン（Norgen Proteospin）カラム上で取り除いた。
【０４０４】
腫瘍緩解
【０４０５】
１×１０５ＴＣ−１を各々のマウスのフラスコで確立し、６日目および１３日目に、該マウスをＥ７（５０μｇ）を含む２５０μＬのＰＢＳ、Ｅ７（５０μｇ）と混合したＡｃｔＡ（２００μｇ）、遺伝学的に融合したＡｃｔＡ−Ｅ７（２５０μｇ）、またはＰＢＳのみ（未処理）により、背中に沿って皮下免疫した。
【０４０６】
結果
【０４０７】
ＡｃｔＡ単独、Ｅ７単独、ＡｃｔＡ−Ｅ７、またはＡｃｔＡ＋Ｅ７で免疫化したマウスでは、対照群と比較して、腫瘍の発症に至るまでの時間が延びることが示された（図１０〜１２）。ＡｃｔＡ−Ｅ７（遺伝学的に融合）で免疫化したマウスでは、免疫化後５５日目に７／８匹のマウスで腫瘍がなくなるという強力な腫瘍緩解を示した（図１０、表１）。ＡｃｔＡ＋Ｅ７によって免疫化したマウスでは、Ｅ７および未処理の対照群と比較して、免疫化後５５日目に７／８匹のマウスで腫瘍がなくなるという強力な腫瘍緩解を示した（図１１、表１）。ＡｃｔＡ単独で免疫化したマウスでは、Ｅ７またはＰＢＳ注射対照群と比較して、強力な腫瘍緩解を示した（Ｅ７または未処理のグループでは全くないのと比較して、免疫化後に腫瘍が無くなったのは３／８匹のマウスであった；図１２、表１）。
【０４０８】
【表１】
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【０４０９】
実施例９：解毒ＬＬＯによるサイトカインｍＲＮＡ発現および骨髄（ＢＭ）マクロファージによるサイトカイン分泌の誘導
【０４１０】
８ｅ５  ７日目のＢＭＤＣをＲＦ１０培地中、３７℃で一晩解凍した。次に、ＢＭＤＣを遠心し、３７℃で１時間かけて、１ｍＬの新鮮なＲＦ１０に再懸濁した。ＢＭＤＣを４０ｍｃｇ／ｍＬのＬＬＯＥ７とモル等量のＥ７およびＬＬＯとによって処理した（または陰性対照としてＰＢＳで、もしくは陽性対照として１ｍｃｇ／ｍＬのＬＰＳで処理）。２時間後および２４時間後に、遠心により細胞を回収し、培地をＥＬＳＡ用に保存して、サイトカイン分泌に関して分析した。ＲＮＡを細胞から抽出し、ｃＤＮＡに変換した。次に、ｃＤＮＡを、種々のサイトカイン用のプライマーを用いるｑＰＣＲ分析にかけ、サイトカインｍＲＮＡ発現量を評価した。
【０４１１】
結果
【０４１２】
解毒ＬＬＯを単独投与した場合、Ｅ７とともに投与した場合、またはＥ７と融合させて投与した場合、２時間後（図１３Ａおよび１３Ｃ）および２４時間後（図１３Ｂ、１３Ｄ、および１３Ｅ）にＢＭマクロファージによって、対照群と比較して、ＴＮＦ−α（図１３Ａ〜Ｂ）、ＩＬ−１２（図３Ｃ〜Ｄ）、およびＩＳＧ１５（図１３Ｅ）のｍＲＮＡの発現が誘導された。同様に、解毒ＬＬＯによって、２時間後および２４時間後にＢＭマクロファージによるＴＮＦ−α（図１４Ａ）およびＩＬ−１２（図１４Ｂ）の分泌が誘導された。
【０４１３】
実施例１０：解毒ＬＬＯによる樹状細胞成熟マーカーのアップレギュレーション
【０４１４】
６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの大腿部から骨髄を回収した。マウス４匹の骨髄細胞をプールし、１００×１５ｍｍペトリ皿において１０％ＦＣＳおよび１００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地で細胞の培養をおこなった。３７℃、１０％ＣＯ２で２時間インキュベートした後、温かい培地で洗うことで非接着性細胞を取り除いた。滅菌された細胞スクレーパーでこすることで、残留接着細胞を回収した。洗浄後、細胞を０．５×１０＾６／ｍＬに調節し、２０ｎｇ／ｍＬ組換えマウスＧＭ−ＣＳＦ（R&D Systems, Minneapolis, MN）とともに２４穴プレートに入れた。培地を２〜３日毎に交換した。培養７日後、非接着性細胞を回収して洗い、実験で用いた。
【０４１５】
これらの骨髄由来樹状細胞（７日目）を２×１０＾６／ｍＬで播種した後、３７℃、５％ＣＯ２で１６時間にわたり、Ｅ７（１０ｍｃｇ／ｍＬ）、ＬＬＯ（４０ｍｃｇ／ｍＬ）、またはＬＬＯＥ７（５０ｍｃｇ／ｍＬ）＋ＬＬＯ（４０ｍｃｇ／ｍＬ）でパルスした。このプロトコールを用いて得たＤＣの表現型を、ＦＡＣＳ分析によって分析した。上記のように、１６時間後にＤＣを回収した。マウスＣＤ１１ｃに特異的なＡＰＣ標識ｍＡｂまたはマウスＣＤ８６、マウスＣＤ８６に特異的なＦＩＴＣ標識ｍＡｂ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０で、細胞を染色した。アイソタイプが一致したマウスＩｇＧを陰性対照として用い、バックグラウンドから差し引いた。Ａｍｂとともに細胞を暗所で３０分、４℃でインキュベートした。ＰＢＳを用いて２回洗浄した後、細胞をＦＡＣＳフローサイトメトリーで分析する前に、１０μＬの７ＡＡＤ（Beckman Coulter, Marseille, France）を１０分間添加した。
【０４１６】
結果
【０４１７】
６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの大腿部から骨髄を回収した。培養７日後、非接触性細胞を回収して洗い、２×１０＾６／ｍＬで播種した後、３７℃、５％ＣＯ２で１６時間にわたり、Ｅ７（１０ｍｃｇ／ｍＬ）、ＬＬＯ（４０ｍｃｇ／ｍＬ）、またはＬＬＯＥ７（５０ｍｃｇ／ｍＬ）＋ＬＬＯ（４０ｍｃｇ／ｍＬ）でパルスした。マウスＣＤ１１ｃに特異的なＡＰＣ標識ｍＡｂまたはマウスＣＤ８６に特異的なＦＩＴＣ標識ｍＡｂ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０で、細胞を染色した。アイソタイプが一致したマウスＩｇＧを陰性対照として用い、バックグラウンドから差し引いた。Ａｍｂとともに細胞を暗所で３０分、４℃でインキュベートした。ＰＢＳを用いて２回洗浄した後、細胞をＦＡＣＳフローサイトメトリーで分析する前に、１０μＬの７ＡＡＤ（Beckman Coulter, Marseille, France）を１０分間添加した。ＣＤ１１ｃ陽性細胞の割合として、生細胞集団を示す。対照群と比較して、解毒ＬＬＯの投与（ＬＬＯ、ＬＬＯ＋Ｅ７、およびＬＬＯＥ７グループで）がアップレギュレートした（図１５Ａ〜Ｃ）。
【０４１８】
実施例１１：ＤＴ−ＬＬＯによる刺激後のＮＦ−カッパＢの核転座
【０４１９】
Ｊ７７４マクロファージ細胞株を、抗原提示細胞（ＡＰＣ）のモデル系として用いた。１ウェルあたり５×１０＾５細胞（６穴ディッシュ）を、全容量１ｍＬで播種した。細胞を抗ＮＦ−κＢ（Ｐ６５）−ＦＩＴＣで染色（緑色蛍光）し、核をＤＡＰＩで染色（青色蛍光）で染色した。図１７Ｂ、Ｄ、およびＦでもまた、２４時間後に細胞を抗ＣＤ１１Ｂ−ＰＥ（Ｍ１１７０、eBioscence）で染色した。該抗ＣＤ１１Ｂ−ＰＥはマクロファージ細胞の細胞表面上で発現し、接着細胞相互作用に関与する。
【０４２０】
結果
【０４２１】
ＮＦ−カッパＢは、培地単独で細胞を処理した後に細胞質内に局在する（活性化なし）（図１６Ａ）。培地処理細胞は、弱いＣｄ１１ｂ染色を示した（図１６Ｂ）。Ｄｔ−ＬＬＯ（３０ｍｃｇ）によって一晩（２４時間）刺激した後、ＮＦカッパＢが細胞質から出て核の中に入り（図１６Ｃ）、ＣＤ１１ｂ染色の増加がみられる（図１６Ｄ）。同様に、ＬＰＳ（１０ｍｃｇ／ｍＬ、陽性対照）によって一晩（２４時間）刺激した後、ＮＦカッパＢが核へ移動した（図１６Ｅ）。このことは、原形質膜のＣＤ１１ｂ＋染色が高まったことよって、強調される（図１６Ｆ）。
【０４２２】
したがって、一実施形態では、データは、マクロファージおよびＤＣを介して先天性免疫を刺激する解毒ＬＬＯの能力を示す。
【０４２３】
本発明の特定の特徴が本明細書中に例証かつ記述される一方で、多くの修飾、置換、変更、および等価物を今や当業者は容易に思いつくであろう。したがって、添付された請求の範囲がそのような修飾および変更のすべてが本発明の真の精神の範囲内に入ることを意図していることが理解される。
0005597197.tif 000003
【図１Ａ】
0005597197.tif 000004
【図１Ｂ】
0005597197.tif 000005
【図２Ａ】
0005597197.tif 000006
【図２Ｂ】
0005597197.tif 000007
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
0005597197.tif 000009
【図４】
0005597197.tif 000010
【図５】
0005597197.tif 000011
【図６】
0005597197.tif 000012
【図７】
0005597197.tif 000013
【図８】
0005597197.tif 000014
【図９】
0005597197.tif 000015
【図１０】
0005597197.tif 000016
【図１１】
0005597197.tif 000017
【図１２】
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【図１３Ａ】
0005597197.tif 000019
【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
0005597197.tif 000021
【図１３Ｄ】
0005597197.tif 000022
【図１３Ｅ】
0005597197.tif 000023
【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
0005597197.tif 000026
【図１５Ｂ】
0005597197.tif 000027
【図１５Ｃ】
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【図１６】
0005597197.tif 000029
【配列表】
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