(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
高分子担体に共役結合する少なくとも１つのハプテンを備える免疫原性の分子実体であって、ここで、
前記ハプテンは環状ペプチドを含み、
前記環状ペプチドは４乃至１９のアミノ酸残基を備え、
前記環状ペプチドは、アミノ酸配列ＹＳＴ（Ｘａ＋２）ＤＦＩＭ（ＳＥＱ ＩＤ：９２）、ＹＳＴ（Ｘａ＋２）ＹＦＩＭ（ＳＥＱ ＩＤ：９３）、ＩＮ（Ｘａ＋２）ＤＦＬＬ（ＳＥＱ ＩＤ：９４）、またはＧＶＮＡ（Ｘａ＋２）ＳＳＬＦ（ＳＥＱ ＩＤ：９５）を含み、
ここで、
各配列の最後のアミノ酸残基はＸ１であり、
Ｘ１はそれぞれのカルボニル基によってＲ基に共役結合したアミノ酸残基であり、
Ｘａ＋２は任意のアミノ酸であり、前記任意のアミノ酸のそれぞれの炭素原子はＲと共役結合し、
Ｒは−ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）Ｏ−、−ＣＨ２−フェニル−Ｏ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｓ−、または、−（ＣＨ２）ｎＮＨ−からなり、
ｎが１乃至４であり、および、
前記環状ペプチドは少なくともＸ１、Ｘａ＋２及びＲによって形成される大環状環を含み、
前記アミノ酸配列の最初のアミノ酸残基と前記高分子担体が結合していることを特徴とする免疫原性の分子実体。
【請求項２】
前記高分子担体がタンパク質、ポリマー、又はナノ粒子を備えることを特徴とする請求項１に記載の分子実体。
【請求項３】
前記高分子担体がタンパク質を備えることを特徴とする請求項１または２に記載の分子実体。
【請求項４】
以下の構造（化２、化３、化４、又は、化５）を有する免疫原性の分子実体であって、
式中、ＣＰＬはシステインチオル基と共役結合したリンカーを有する高分子担体であることを特徴とする免疫原性の分子実体。
【化１】
0005581490.tif 000081
【化２】
0005581490.tif 000082
【化３】
0005581490.tif 000083
【化４】
0005581490.tif 000084
【請求項５】
請求項１乃至４のいずれかの前記免疫原性の分子実体と特異的に結合する抗体。
【請求項６】
前記抗体が中和抗体であることを特徴とする請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
請求項５または６の少なくとも１つの抗体と、薬学的に許容可能な担体とを備える組成物。
【請求項８】
請求項１乃至４の少なくとも１つの免疫原性の分子実体と、薬学的に許容可能な担体とを備える組成物。
【請求項９】
黄色ブドウ球菌による感染症にかかりやすい哺乳類の免疫反応を誘発するのに効果的な量で投与するための組成物を製造するための、請求項１乃至４のいずれか一つに記載の前記免疫原性の分子実体の使用。
【請求項１０】
前記組成物が、静脈内、腹腔内、皮下、皮内、又は、筋肉内注射によって前記哺乳類に投与されることを特徴とする請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
哺乳類においてクオラムセンシングを阻害するのに効果的な量で投与するための組成物を製造するための、請求項５又は６の少なくとも１つの抗体の使用。
【請求項１２】
哺乳類において、免疫反応を誘発するとともにクオラムセンシングを阻害するために効果的な量で投与するための組成物を製造するための、請求項１乃至４のいずれか１つに記載の免疫原性の分子実体の使用。
【請求項１３】
黄色ブドウ球菌による哺乳類の感染症を予防又は治療するために効果的な量を投与するための組成物を製造するための、請求項１乃至４のいずれか一つに記載の免疫原性の分子実体あるいは請求項５又は６に記載の少なくとも１つの抗体の使用。
【請求項１４】
前記免疫原性の分子実体、又は、抗体が、静脈内、腹腔内、皮下、皮内、又は、筋肉内注射によって前記哺乳類に投与されることを特徴とする請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
ワクチンとして使用するための、請求項１乃至４のいずれか１つに記載の前記免疫原性の分子実体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書に記載の発明は、国立衛生研究所の認可番号ＡＩ０５５７７８で米国政府の支援によってなされたものである。米国政府は本発明の特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
疾病を引き起こす多くの菌が菌を制御するために用いられる抗生物質に対する耐性を進化させつつあるため、細菌感染症が急増している。例えば、黄色ブドウ球菌は、皮膚感染及び食中毒から生死にかかわる院内感染症まで様々な疾病又は疾患を招く院内感染の共通原因である。黄色ブドウ球菌分離株のグリコペプチド系抗生物質（とりわけ顕著なのはバンコマイシン）に対する増大する耐性は、今日の集中治療室における主要な関心事である。したがって、感染症と戦う別の戦略の必要に迫られている。
【０００３】
【特許文献１】米国特許出願第２００８０１８１２４８号（Haran et al.）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明はクオラムセンシングの減衰に対する免疫薬物療法的手法の発見に関する。特に、本発明は、インビボでの腫瘍形成マウスモデルにおいて、クオラムセンシングを阻害し、細菌病原性を抑制し、さらに致死的な細菌の攻撃に対して保護することが可能な、理性的に設計されたハプテンに対して誘発されたモノクローナル抗体の発見に関する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
ある実施形態において、本発明は、少なくとも１つのハプテンを備える免疫原性の分子実体であって、前記ハプテンは任意でリンカー部分を介して高分子担体と共役結合し、  前記ハプテンは環状ペプチド又はその類似体を備え、前記環状ペプチド又はその類似体は大環状環を備え、前記環状ペプチド又はその類似体は、約４乃至１９のアミノ酸残基を備え、前記環状ペプチド又はその類似体は、以下の化学式（Ｉ）（化１）で表される構造を有し、
【０００６】
【化１】
0005581490.tif 000002
【０００７】
式中、各々のＸは独立した任意のアミノ酸残基であり、Ｘ１はそれぞれのカルボニル基によってＲに共役結合したアミノ酸残基であり、Ｘａ＋２は内部アミノ酸であり、該内部アミノ酸のそれぞれの炭素原子はＲと共役結合し、ＲはＸ１及びＸａ＋２を共役的に結合する大環状部分であり、これによって前記大環状環を形成し、Ｒはエステル、チオエステル、アミド、カルバミド、セミカルバジド、又は他のアミド代替基、あるいはこれらの組み合わせを備え、ａは１乃至約９であり、ｂは１乃至約８であり、及び、波線で切断される結合が、任意で前記リンカー部分を介する前記環状ペプチド又はその類似体のＮ−末端アミノ酸残基と前記高分子担体との結合点を示す。
【０００８】
実施形態によっては、免疫原性の分子実体は上記構造を有し、式中、ａが２乃至８であり、ＲがＸａ＋２をＸ１カルボニル基と共役結合させるアルキルオキシ又はアルカリルオキシ、アルキルチオ、あるいは、アルキルアミノ基を備え、これによりエステル、チオエステル、又はアミド結合を各々形成することによって、ラクトン、チオラクトン、又はラクタム大環状環を各々形成する。実施形態によっては、免疫原性の分子実体は上記構造を有し、式中、Ｒが−CH2O−、−CH2CH2O−、−CH2CH(CH3)O−、−CH2−フェニル−O−、 −CH2S−、 −CH2CH2S−、 又は−(CH2)nNH−を備え、ｎが１乃至約４である。実施形態によっては、免疫原性の分子実体は上記構造を有し、式中、ａが２乃至８であり、Ｒが少なくとも１つのアミド、尿素、又は、セミカルバジド基、あるいは少なくとも１つのアミド代替結合を備える。
【０００９】
実施形態によっては、Ｒが以下の化学式（ＩＩａ）（化２）又は化学式（ＩＩｂ）（化３）によって表され、
【００１０】
【化２】
0005581490.tif 000003
【００１１】
【化３】
0005581490.tif 000004
【００１２】
式中、ｎは１乃至約４であり、Ｒ１は自然発生的なアミノ酸又はその類似体の側鎖であり、波線で切断される結合が、結合点を示し、（ｉ）で指定された結合点がカルボニル基Ｘ１と結合し、（ｉｉ）で指定される結合点がＸａ＋２のα−炭素と結合する
【００１３】
実施形態によっては、Ｒが以下の化学式（ＩＩａ）（化４）を有する。
【００１４】
【化４】
0005581490.tif 000005
【００１５】
実施形態によっては、Ｒが以下の化学式（ＩＩｂ）（化５）を有する。
【００１６】
【化５】
0005581490.tif 000006
【００１７】
実施形態によっては、免疫原性の分子実体は上記構造を有し、式中、Ｘ１及びＸ２が疎水性アミノ酸残基であり、実施形態によっては、Ｘ１及びＸ２が、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、又は、トリプトファン、あるいはその類似体からなるアミノ酸残基の群から独立して選択される。実施形態によっては、Ｘ１及びＸ２の各々が独立してメチオニン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、アラニン、イソロイシン、又は、トリプトファンである。
【００１８】
実施形態によっては、免疫原性の分子実体の環状ペプチド又はその類似体が、アミノ酸配列YST(Xa+2)DFIM (SEQ ID: 92)、YST(Xa+2)YFIM (SEQ ID: 93)、IN(Xa+2)DFLL (SEQ ID: 94)、GVNA(Xa+2)SSLF (SEQ ID: 95)、GVNP(Xa+2)GGWF (SEQ ID: 96)、KAKT(Xa+2)TVLY (SEQ ID: 97)、KTKT(Xa+2)TVLY (SEQ ID: 98)、GANP(Xa+2)OLYY (SEQ ID: 99)、GANP(Xa+2)ALYY (SEQ ID: 100)、GYST(Xa+2)SYYF (SEQ ID: 101)、GYRT(Xa+2)NTYF (SEQ ID: 102)、YNP(Xa+2)VGYF (SEQ ID: 103)、GGKV(Xa+2)SAYF (SEQ ID: 104)、SVKP(Xa+2)TGFA (SEQ ID: 105)、DSV(Xa+2)ASYF (SEQ ID: 106)、KYNP(Xa+2)SNYL (SEQ ID: 107)、KYNP(Xa+2)ASYL (SEQ ID: 108)、KYNP(Xa+2)ANYL (SEQ ID: 109)、RIPT(Xa+2)TGFF (SEQ ID: 110)、DI(Xa+2)NAYF (SEQ ID: 111)、DM(Xa+2)NGYF (SEQ ID: 112)、KYNP(Xa+2)LGFL (SEQ ID: 113)、KYYP(Xa+2)FGYF (SEQ ID: 114)、GARP(Xa+2)GGFF (SEQ ID: 115)、GAKP(Xa+2)GGFF (SEQ ID: 116)、YSP(Xa+2)TNFF (SEQ ID: 117)、YSP(Xa+2)TNF (SEQ ID: 118)、又はQN(Xa+2)PNIFGQWM (SEQ ID: 119)を備え、各々の配列の最後のアミノ酸残基はＸ１であり、（Ｘａ＋２）はＸ１のカルボニル基がＲを介して共役結合する前記内部アミノ酸である。
【００１９】
実施形態によっては、高分子担体はタンパク質、ポリマー、又はナノ粒子を備える。実施形態によっては、ポリマーはデンドリマーである。実施形態によっては、デンドリマーがＭＡＰデンドリマーである。実施形態によっては、高分子担体はタンパク質を備える。実施形態によっては、タンパク質が、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）、ロコガイヘモシアニン（Concholepas concholepas hemocyanin）（ＣＣＨ）、コレラ毒素Ｂサブユニット、大腸菌毒素Ｂサブユニット、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、破傷風毒素Ｃ−フラグメント、組み換え緑膿菌エキソタンパク質Ａ、ＣＲＭ１９７（交差反応性材料）、カオチン化ウシ血清アルブミン（ｃＢＳＡ）、サイログロブリン（Ｔｇ）、アビジン、ウシサイログロブリン（ＢＴＧ）、ウシＧグロブリン、ウシ免疫グロブリンＧ（ＢｉｇＧ）、コンアルブミン（ＣＯＮＡ）、コロイド金、エデスチン、タラバガニヘモシアニン（ＨＣ）、リンゴマイマイヘモシアニン（helix promatia haemocyanin、ＨＰＨ）、クニッツ大豆トリプシンインヒビター（ＫＴＩ）、アメリカカブトガニヘモシアニン（ＬＰＨ）、オボアルブミン（ＯＡ）、Pam3Cys−Th（リポペプチド／Ｔｈ細胞エピトープ）、ポリリシン、ブタサイログロブリン（ＰＴＧ）、精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、ダイズトリプシン阻害因子（ＳＴＩ）、又は、ヒマワリグロブリン（ＳＦＧ）からなる群から選択される。
【００２０】
実施形態によっては、環状ペプチド類似体は、環状ペプチド類似体のＮ−末端アミノ酸残基のアミノ基、又は、環状ペプチド類似体のＮ−末端システイン又はホモシステイン残基のチオル基を介して、高分子担体と共役結合する。
【００２１】
実施形態によっては、本発明の分子実体は環状ペプチド類似体を前記高分子担体と共役結合させるリンカー部分をさらに備える。実施形態によっては、環状ペプチド類似体は、環状ペプチド類似体のＮ−末端アミノ酸残基のアミノ基を介して、又は、環状ペプチド類似体のＮ−末端システイン又はホモシステイン残基のチオル基を介して、リンカー部分と結合し、リンカー部分は高分子担体と共役結合する。実施形態によっては、リンカー部分は、ＭＢＳ、スルホ−ＭＢＳ、ＳＭＣＣ、又はスルホ−ＳＭＣＣの反応によって産生された部分を備える。実施形態によっては、リンカー部分は、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）、スペーサーペプチド、ヒドロキシメチルヘミサクシネート、又は、ポリエチレングリコール誘導体を備える。
【００２２】
実施形態によっては、高分子実体は以下の構造（化６、化７、化８、又は、化９）を有し、
【００２３】
【化６】
0005581490.tif 000007
【００２４】
【化７】
0005581490.tif 000008
【００２５】
【化８】
0005581490.tif 000009
【００２６】
【化９】
0005581490.tif 000010
【００２７】
式中、ＣＰＬはシステインチオル基と任意で共役結合したリンカーを有する高分子担体である。
【００２８】
別の態様において、本発明は本発明の免疫原性の分子実体を備える超分子集合体を提供する。実施形態によっては、超分子集合体は、リポソーム、ビロソーム、バクテリオファージ、ウィルス粒子、又は、ポリマーナノ粒子送達システムを備える。
【００２９】
別の態様において、本発明は、アミノ酸配列YST(Xa+2)DFIM (SEQ ID: 92)、YST(Xa+2)YFIM (SEQ ID: 93) 、IN(Xa+2)DFLL (SEQ ID: 94) 、GVNA(Xa+2)SSLF (SEQ ID: 95)、GVNP(Xa+2)GGWF (SEQ ID: 96)、KAKT(Xa+2)TVLY (SEQ ID: 97) 、KTKT(Xa+2)TVLY (SEQ ID: 98) 、GANP(Xa+2)OLYY (SEQ ID: 99) 、GANP(Xa+2)ALYY (SEQ ID: 100) 、GYST(Xa+2)SYYF (SEQ ID: 101) 、GYRT(Xa+2)NTYF (SEQ ID: 102) 、YNP(Xa+2)VGYF (SEQ ID: 103) 、GGKV(Xa+2)SAYF (SEQ ID: 104) 、SVKP(Xa+2)TGFA (SEQ ID: 104) 、DSV(Xa+2)ASYF (SEQ ID: 106) 、KYNP(Xa+2)SNYL (SEQ ID: 107) 、KYNP(Xa+2)ASYL (SEQ ID: 108) 、KYNP(Xa+2)ANYL (SEQ ID: 109) 、RIPT(Xa+2)TGFF (SEQ ID: 110) 、DI(Xa+2)NAYF (SEQ ID: 111) 、DM(Xa+2)NGYF (SEQ ID: 112) 、KYNP(Xa+2)LGFL (SEQ ID: 113) 、KYYP(Xa+2)FGYF (SEQ ID: 114) 、GARP(Xa+2)GGFF (SEQ ID: 115) 、GAKP(Xa+2)GGFF (SEQ ID: 116)、YSP(Xa+2)TNFF (SEQ ID: 117) 、YSP(Xa+2)TNF (SEQ ID: 118) 、又は、QN(Xa+2)PNIFGQWM (SEQ ID: 119)を有する環状ペプチドと特異的に結合する抗体を提供し、このとき、各々の配列の最後のアミノ酸残基はＸ１であり、（Ｘａ＋２）はＸ１のカルボニル基がＲを介して共役結合する内部アミノ酸であり、ＲはＸ１のカルボニル基と共役結合したＸａ＋２の側鎖部分であり、Ｒは−CH2O−、−CH2CH2O−、−CH2CH(CH3)O−、−CH2−フェニル−O−、 −CH2S−、 −CH2CH2S−、 又は−(CH2)nNH−を備え、このとき、ｎは１乃至約４である。
【００３０】
別の態様において、本発明は、グラム陽性菌の環状ペプチドシグナル伝達分子と特異的に結合する抗体を提供する。
【００３１】
実施形態によっては、抗体は、配列YSTCDFIM (SEQ ID: 120); GVNACSSLF (SEQ ID: 121); INCDFLL (SEQ ID: 122); YSTCYFIM (SEQ ID: 123); GVNPCGGWF (SEQ ID: 124); KAKTCTVLY (SEQ ID: 125); KTKTCTVLY (SEQ ID: 126); GANPCOLYY (SEQ ID: 127); GANPCALYY (SEQ ID: 128); GYSTCSYYF (SEQ ID: 129); GYRTCNTYF (SEQ ID: 130);YNPCVGYF (SEQ ID: 131); GGKVCSAYF (SEQ ID: 132); SVKPCTGFA (SEQ ID: 133); DSVCASYF (SEQ ID: 134); KYNPCSNYL (SEQ ID: 135); KYNPCASYL (SEQ ID: 136); KYNPCANYL (SEQ ID: 137); RIPTSTGFF (SEQ ID: 138); DICNAYF (SEQ ID: 139); DMCNGYF (SEQ ID: 140); KYNPCLGFL (SEQ ID: 141); KYYPCFGYF (SEQ ID: 142); VGARPCGGFF (SEQ ID: 143); GAKPCGGFF (SEQ ID: 144); YSPCTNFF (SEQ ID: 145); 又は、QNSPNIFGQWM (SEQ ID: 146)を有する環状ペプチドシグナル伝達分子と特異的に結合し、このとき、下線を引いた残基の前記α−カルボニル基は、ボールド体の内部システイン又はセリン残基のスルフヒドリル又はヒドロキシル基各々とのチオラクトン又はラクトン結合を形成する。
【００３２】
実施形態によっては、抗体は中和抗体、例えば、交差中和抗体である。実施形態によっては、抗体は、単鎖の可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、又はＦ（ａｂ’）２フラグメントである。実施形態によっては、抗体は、SEQ ID NOs: 35−53のいずれかひとつのアミノ酸配列を備える。実施形態によっては、抗体はモノクローナル抗体である。実施形態によっては、抗体は、SEQ ID NOs: 19−26、及び、１４７−１５４のいずれか１つのアミノ酸配列を備える。実施形態によっては、抗体は、１４７−１５４のいずれか１つのアミノ酸配列と共有結合性相互作用するSEQ ID NOs: 19−26のいずれか１つのアミノ酸配列を備える。実施形態によっては、抗体は、マウス抗体、ウシ抗体、又は、ヒト抗体である。実施形態によっては、抗体はヒト化抗体、又は、キメラ抗体である。実施形態によっては、抗体は、AP4−24H11である。
【００３３】
別の態様において、本発明は、少なくとも１つの本発明の抗体、及び、薬学的に許容可能な担体を備える組成物を提供する。実施形態によっては、組成物は、配列YSTCDFIM (SEQ ID: 120)、GVNACSSLF (SEQ ID: 121)、INCDFLL (SEQ ID: 122)、及び、YSTCYFIM (SEQ ID: 123)を有する２乃至４の環状ペプチドシグナル伝達分子と特異的に結合する２乃至４の抗体を備え、このとき、下線の残基の前記α−カルボニル基はボールド体の内部システイン残基のスルフヒドリル基とのチオラクトン結合を形成する。
【００３４】
別の態様において、本発明は、少なくとも１つの本発明の免疫原性の分子実体及び、薬学的に許容可能な担体を備える組成物を提供する。実施形態によっては、免疫原性の分子実体は、配列YST(Xa+2)DFIM (SEQ ID: 92)、YST(Xa+2)YFIM (SEQ ID: 93)、IN(Xa+2)DFLL (SEQ ID: 94)、GVNA(Xa+2)SSLF (SEQ ID: 95)、GVNP(Xa+2)GGWF (SEQ ID: 96)、KAKT(Xa+2)TVLY (SEQ ID: 97)、KTKT(Xa+2)TVLY (SEQ ID: 98)、GANP(Xa+2)OLYY (SEQ ID: 99)、GANP(Xa+2)ALYY (SEQ ID: 100)、GYST(Xa+2)SYYF (SEQ ID: 101)、GYRT(Xa+2)NTYF (SEQ ID：102)、YNP(Xa+2)VGYF (SEQ ID: 103)、GGKV(Xa+2)SAYF (SEQ ID: 104)、SVKP(Xa+2)TGFA (SEQ ID: 105)、DSV(Xa+2)ASYF (SEQ ID: 106)、KYNP(Xa+2)SNYL (SEQ ID: 107)、KYNP(Xa+2)ASYL (SEQ ID: 108)、KYNP(Xa+2)ANYL (SEQ ID: 109)、RIPT(Xa+2)TGFF (SEQ ID: 110)、DI(Xa+2)NAYF (SEQ ID: 111)、DM(Xa+2)NGYF (SEQ ID: 112)、KYNP(Xa+2)LGFL (SEQ ID: 113)、KYYP(Xa+2)FGYF (SEQ ID: 114)、GARP(Xa+2)GGFF (SEQ ID: 115)、GAKP(Xa+2)GGFF (SEQ ID: 116)、 YSP(Xa+2)TNFF (SEQ ID: 117)、YSP(Xa+2)TNF (SEQ ID: 118)、又は、QN(Xa+2)PNIFGQWM (SEQ ID: 119)を有する環状ペプチドを備え、各々の配列の最後のアミノ酸残基がＸ１であり、（Ｘａ＋２）はＸ１のカルボニル基がＲを介して共役結合する内部アミノ酸であり、Ｒは−CH2O−、−CH2CH2O−、−CH2CH(CH3)O−、−CH2−フェニル−O−、 −CH2S−、 −CH2CH2S−、又は−(CH2)nNH−を備え、ｎは１乃至約４である。
【００３５】
実施形態によっては、組成物は、２乃至４の免疫原性の分子実体を備え、免疫原性の分子実体の環状ペプチドは、配列YST(Xa+2)DFIM (SEQ ID: 92)、YST(Xa+2)YFIM (SEQ ID: 93)、IN(Xa+2)DFLL (SEQ ID: 94)、GVNA(Xa+2)SSLF (SEQ ID: 95)、GVNP(Xa+2)GGWF (SEQ ID: 96)、KAKT(Xa+2)TVLY (SEQ ID: 97)、KTKT(Xa+2)TVLY (SEQ ID: 98)、GANP(Xa+2)OLYY (SEQ ID: 99)、GANP(Xa+2)ALYY (SEQ ID: 100)、GYST(Xa+2)SYYF (SEQ ID: 101)、GYRT(Xa+2)NTYF (SEQ ID: 102)、YNP(Xa+2)VGYF (SEQ ID: 103)、GGKV(Xa+2)SAYF (SEQ ID: 104)、SVKP(Xa+2)TGFA (SEQ ID: 105)、DSV(Xa+2)ASYF (SEQ ID: 106)、KYNP(Xa+2)SNYL (SEQ ID: 107)、KYNP(Xa+2)ASYL (SEQ ID: 108)、KYNP(Xa+2)ANYL (SEQ ID: 109)、RIPT(Xa+2)TGFF (SEQ ID: 110)、DI(Xa+2)NAYF (SEQ ID: 111)、DM(Xa+2)NGYF (SEQ ID: 112)、KYNP(Xa+2)LGFL (SEQ ID: 113)、KYYP(Xa+2)FGYF (SEQ ID: 114)、GARP(Xa+2)GGFF (SEQ ID: 115)、GAKP(Xa+2)GGFF (SEQ ID: 116)、 YSP(Xa+2)TNFF (SEQ ID: 117)、YSP(Xa+2)TNF (SEQ ID: 118)、又は、QN(Xa+2)PNIFGQWM (SEQ ID: 119)を有し、各々の配列の最後のアミノ酸残基がＸ１であり、（Ｘａ＋２）はＸ１のカルボニル基がＲを介して共役結合する内部アミノ酸であり、Ｒは−CH2O−、−CH2CH2O−、−CH2CH(CH3)O−、−CH2−フェニル−O−、 −CH2S−、 −CH2CH2S−、又は−(CH2)nNH−を備え、ｎは１乃至約４である。
【００３６】
実施形態によっては、組成物は４つの免疫原性の分子実体を備え、免疫原性の分子実体の環状ペプチドが配列YSTCDFIM (SEQ ID: 120)、GVNACSSLF (SEQ ID: 121)、INCDFLL (SEQ ID: 122)、及び、YSTCYFIM (SEQ ID: 123)を有し、下線の残基のα−カルボニル基はボールド体のシステイン残基のスルフヒドリル基とのチオラクトン結合を形成する。
【００３７】
実施形態によっては、組成物は、少なくとも１つの追加的な免疫原をさらに備える。実施形態によっては、少なくとも１つの追加的な免疫原はＢ型肝炎、ヘモフィルスインフルエンザｂ菌、ジフテリア、はしか、おたふく風邪、百日咳、ポリオ、風疹、強縮、結核、水痘、又は、それらの組み合わせに対する免疫反応を誘発する。
【００３８】
別の態様において、本発明は、本発明の免疫原性の分子実体、超分子集合体、抗体、又は、組成物、及び、その使用説明書を備える。
【００３９】
別の態様において、本発明は、哺乳類の免疫反応を誘発する方法を提供し、この方法は、本発明の免疫原性の分子実体、又は、超分子集合体を備える組成物を、哺乳類の免疫反応を誘発するのに効果的な量をこの哺乳類に投与する段階を備える。実施形態によっては、哺乳類はヤギ、ウサギ、ヒツジ、ブタ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウシ、ウマ、サル、又は、ヒトである。実施形態によっては、組成物は、静脈内、腹腔内、皮下、皮内、又は、筋肉内注射によって哺乳類に投与される。実施形態によっては、その方法は、哺乳類から生体サンプルを採取する段階をさらに備え、生体サンプルは、環状ペプチドシグナル伝達分子及び／又は免疫原性の分子実体の環状ペプチドと特異的に結合する抗体を備える。実施形態によっては、その方法は、哺乳類から抗体を生産する細胞を単離させる段階、及び、
ハイブリドーマを生じさせるために骨髄腫細胞と抗体を生産する細胞を融合する段階をさらに備え、ハイブリドーマは、環状ペプチドシグナル伝達分子及び／又は免疫原性の分子実体の環状ペプチドと特異的に結合する抗体を産生する。
【００４０】
実施形態によっては、哺乳類はグラム陽性菌による感染症にかかりやすいか、又は、グラム陽性菌に関連する疾患にかかりやすい。実施形態によっては、グラム陽性菌は黄色ブドウ球菌又は表皮ブドウ球菌などのブドウ球菌である。実施形態によっては、哺乳類はヒトである。
【００４１】
実施形態によっては、その方法は、選択された期間に、免疫原性の分子実体を備える少なくとも１度以上の追加容量の組成物を哺乳類に投与する段階をさらに備える。
【００４２】
別の態様において、本発明は哺乳類のクオラムセンシングを阻害するための方法を提供し、この方法は、本発明の抗体を備える組成物を、哺乳類のクオラムセンシングを阻害するために効果的な量だけ哺乳類に投与する段階を備える。
【００４３】
別の態様において、本発明は哺乳類のクオラムセンシングを阻害するため方法を提供し、この方法は、本発明の免疫原性の分子実体又は超分子集合体を、哺乳類の免疫反応を誘発するとともにクオラムセンシングを阻害するために効果的な量だけ哺乳類に投与する段階を備える。
【００４４】
別の態様において、本発明はグラム陽性菌による哺乳類の感染症を予防又は治療するための方法を提供し、この方法は、本発明の免疫原性の分子実体、超分子集合体、又は、抗体を、グラム陽性菌による哺乳類の感染症を予防又は治療するために効果的な量だけ哺乳類に投与する段階を備える。実施形態によっては、哺乳類はヒトである。実施形態によっては、疫原性の分子実体、超分子集合体、又は抗体は、静脈内、腹腔内、皮下、皮内、又は、筋肉内注射によって前記哺乳類に投与される。
【００４５】
別の態様において、本発明は環状ペプチドシグナル伝達分子と特異的に結合する抗体を同定する方法を提供し、この方法は、高分子担体と共役結合したシグナル伝達分子の環状ペプチド類似体を備える免疫原性の分子実体を組み換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーと接触させる段階、及び、免疫原性の分子実体と特異的に結合する組み換え免疫グロブリンを、環状ペプチドシグナル伝達分子と特異的に結合する抗体として同定する段階を備える。
【００４６】
別の態様において、本発明はバイオフィルム形成を防ぐための方法を提供し、この方法は、カテーテルの表面を含む表面を本発明の抗体で被覆する段階を備える。
【００４７】
別の態様において、本発明は、本明細書で議論された抗体をコードする配列を有する単離核酸を提供する。実施形態の中には、核酸がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４−９１、２７−３４、及び、１５５−１８１のいずれかの１つの配列を有するものもある。本明細書で用いられる「核酸」という用語は、リボ酸（ＲＮＡ）だけでなく、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のポリマーのことを言う。この用語は閉鎖共有結合環状分子だけでなく、直鎖状分子を含む。この用語は日本鎖分子と同様に一本鎖分子も含む。
【００４８】
核酸分子に関連して本明細書で用いられる「単離した」という用語は、核酸分子には、関係のない核酸配列が存在しないこと、又は、本発明の核酸が由来する有機体の自然発生的なゲノムの５’及び３’末端に隣接する他の遺伝子の発現に関与する配列が存在しないことを意味している。これに応じて、本発明の「単離核酸分子」は、任意の自然発生的な核酸とは異なる構造、又は、３以上の異なる遺伝子にまたがる１つの自然発生的なゲノム核酸の任意の断片とは異なる構造を有する。したがって、「単離核酸」という用語は、例えば、以下の（１）乃至（４）を含む。すなわち、（１）自然発生的なゲノムのＤＮＡ分子の一部の配列を含むが、ＤＮＡ分子が自然発生する有機体のゲノム分子の一部に隣接する両方のコード配列には隣接しないＤＮＡ分子、（２）結果として生じる分子が任意の自然発生的なベクター又はゲノムＤＮＡとは同一にならない手法で、原核生物又は真核生物のベクター又はゲノムＤＮＡに組み込まれる核酸、（３）ｃＤＮＡ、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成される断片、又は、制限酵素断片などの別の分子、及び、（４）ハイブリッド遺伝子、すなわち、融合タンパク質をコードする遺伝子の一部である組み換え型ヌクレオチド配列、である。特異的にこの定義から除外されるのは、（１）ＤＮＡ分子、（２）トランスフェクト細胞、及び（３）細胞クローン（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリーなどのＤＮＡライブラリーで発生するもの）の混合物中に存在する核酸である。
【００４９】
別の態様において、本発明は本明細書に記載の抗体をコードする核酸を有する発現ベクターを提供する。
【００５０】
実施例によっては、抗体をコードする核酸は、発現制御配列に操作可能なように結合している。実施形態によっては、発現制御配列はプロモーターである。実施形態によっては、プロモーターはファージプロモーター、ウィルスプロモーター、細菌プロモーター、又は、哺乳類プロモーターである。
【００５１】
本明細書で用いられる「発現ベクター」という用語は、核酸がその核酸と結合した別の核酸の発現を輸送及び／又は可能にすることができる核酸分子のことを言う。このような発現の産物は、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）の転写と言う。したがって、発現ベクターは、核酸の発現を指示する適切な発現制御配列を含み、この核酸は、転写をもたらす発現制御配列と操作可能なように結合している。ゆえに、「発現制御配列」は、別の核酸配列の直接的な転写に十分な核酸配列を意味する。この別の核酸配列は、転写活性化因子タンパク質などの適切な分子が発現制御配列と結合している際に、ＲＮＡ転写をもたらすための発現制御配列と操作可能なように結合する。さらに、「操作可能なように結合」という用語は、転写活性化因子タンパク質などの適切な分子発現制御配列と結合する際に、発現制御配列が核酸の配列を指示するような手法で核酸及び発現制御配列が配されることを意味する。
【００５２】
別の態様において、本発明は上記の抗体をコードする核酸、又は、上記の発現ベクターを有する細胞を提供する。この細胞は細菌細胞又は哺乳類の細胞でも可能である。
【００５３】
本発明の他の特徴又は効果は、以下の詳細な記載、及び、特許請求の範囲から明白である。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１】図１は黄色ブドウ球菌によって用いられる自己誘導ペプチド（ＡＩＰ）の構造を示す。オリゴペプチドは翻訳後に環化して、保存システイン（※）のチオール部分とＣ末端残基のカルボキシル基との間でチオエステル結合を形成する（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１２０−１２３）。
【図２】図２のＡ乃至Ｋは、合成されたＡＩＰ、すなわち、ＡＩＰ−１（純粋チオラクトン）（Ａ＆Ｂ）、ＡＩＰ−２（純粋チオラクトン）（Ｃ＆Ｄ）、ＡＩＰ−３（純粋チオラクトン）（Ｅ＆Ｆ）、ＡＩＰ−４（純粋チオラクトン）（Ｇ＆Ｈ）、ＡＩＰ−ＩＶ（純粋ラクトン）（Ｉ＆Ｊ）のＥＳＩ−ＭＳスペクトル及びＨＰＬＣクロマトグラムである。ＨＰＬＣは、２０％Ｂ勾配を３分間用い、その後３０分以内に５０％Ｂに増加させて、紫外線吸収によって２１４ｎｍで監視されたＣ１８カラム上で実行された。ＢはＨＰＬＣ等級水に対抗するアセトニトリルである。図２ＫはＡＰ４−ＢＳＡ共役物のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析である。
【図３】図３Ａ及びＢは、ＲＮ４８５０におけるエキソタンパク質（exoprotein）の分泌を示すデータである。（Ａ）ＲＮ４８５０におけるエキソタンパク質の分泌の分析。図のように選択されたｍＡｂｓ（２００μｇ／ｍＬ）の存在下で３７℃で２０乃至２４時間細胞を成長させた後、この細胞を２分間、１３，０００ｒｐｍで遠心分離させた。浮遊物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。ゲルはGelCode（登録商標）Blue Stain Reagent （Pierce, Rockford IL）を用いて染色した。実線の矢印は、ＡＰ４−２４Ｈ１１によって生じたエキソタンパク質レベルの潜在的な差を意味する。（Ｂ）黄色ブドウ球菌の生育培地の浮遊物の溶血作用。上記の如く準備された浮遊物（１５０μＬ）を羊血液寒天平板に滴下する。この平板を３７℃で２４時間インキュベートし、さらに２４時間室温下で保管する。
【図４】図４Ａ乃至Ｅは、ＡＰ４−２４Ｈ１１による黄色ブドウ球菌中のクオラムセンシングの阻害を示す結果である。（Ａ）黄色ブドウ球菌（ＲＮ４８５０及びＷｏｏｄ４６）中のα溶血素及びタンパク質Ａの発現のウエスタンブロット分析。黄色ブドウ球菌の培養上清を実施例に示されるごとく準備する。（Ｂ）ＡＰ４−２４Ｈ１１の存在下／不在下で２０乃至２４時間インキュベーションした後のＲＮ４８５０、ＮＲＳ１６８、及び、Ｗｏｏｄ４６の相対的ＯＤ６００（％）。（Ｃ）ＲＮ４８５０における静的バイオフィルム形成の解析。（Ｄ）リアルタイムＰＣＲ解析。選択されたｍＲＮＡの量が、ＡＰ４−２４Ｈ１１の存在下又は不在下で生育したＲＮ４８５０において測定された。相対的な定量化はｇｙｒＡを標準物質として用いて行われた。少なくとも２つの独立した実験を２つの組の各々の実験に関して行う。折り畳み変化の実際の数は、ｒｎａＩＩＩ（−７７±４８）、ｅｔａ（−８．１±１）、ｈｌａ（５．２±３．１）、ｓｐａ（＋５．７±３．６）、ｓａｒＡ（−２．１±０．６）、及び、ｓａｅＲ（−１．４±０．４）である。（Ｅ）ＡＩＰ−４による黄色ブドウ球菌におけるＡＰ４−２４Ｈ１１介在性のＱＳ阻害の抑圧。ＡＰ４−２４Ｈ１１（≒１．３μＭ）を、室温下で２０分間、ＣＹＰＧ培地で天然のＡＩＰ−４（２．５μＭ）でインキュベートした。一晩培養した黄色ブドウ球菌細胞を上記培地に希釈し（ＯＤ６００≒０．０３）、静的状況下の３７℃で２０乃至２４時間生育した。浮遊物を準備し、解析する。実験手順の詳細な論議については実施例を参考にされたい。
【図５】図５Ａ及びＢは、ＡＰ４−２４Ｈ１１による黄色ブドウ球菌誘発性のＰＡＲＰ切断の阻害を示すデータである。黄色ブドウ球菌ＲＮ４８５０（Ａ）及びＷｏｏｄ（Ｂ）からの浮遊物で処理後のジャーカット細胞におけるＰＡＲＰ切断。ヒトのジャーカット白血病Ｔ細胞は、１０％加熱不活性化したウシ胎仔血清、１０ｍＭ（Ｌ）−グルタミン、及び、５０ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン並びにペニシリンで補完されたＲＰＭＩ１６４０で維持される（GIBCO, Invitrogen Corp.）。黄色ブドウ球菌の浮遊物を実施例に記載のごとく準備し、ＲＮ４８５０の浮遊物は、Amicon Ultra−4（5,000 NMWL）遠心ろ過装置（MILLIPORE, Billerica MA）を用いて、さらに元々の量の三分の一まで濃縮される。集密した細胞を新鮮な培地（０．５ｍＬ）の２４ウェルプレートに分けて、黄色ブドウ球菌の浮遊物を加える前に６時間インキュベートする。指示された量の黄色ブドウ球菌の浮遊物で４時間インキュベートした後、細胞抽出物を準備し、抗ＰＡＲＰ抗体を用いてウエスタンブロット法で解析した。
【図６】図６Ａ及びＢは、マウスモデルにおけるＡＰ４−２４Ｈ１１による黄色ブドウ球菌誘発性の膿瘍形成の阻害を示す結果である。（Ａ）黄色ブドウ球菌（１×１０７）＋ＰＢＳ（上部パネル）；黄色ブドウ球菌（１×１０７）＋ＡＰ４−２４Ｈ１１（０．６ｍｇ）（下部パネル）。（Ｂ）黄色ブドウ球菌（１×１０８）＋制御ｍＡｂ（０．６ｍｇ）（上部パネル）；黄色ブドウ球菌（１×１０８）＋ＡＰ４−２４Ｈ１１（０．６ｍｇ）（下部パネル）。
【図７】図７Ａ乃至Ｄは、マウスモデルにおけるＡＰ４−２４Ｈ１１による黄色ブドウ球菌誘発性の膿瘍形成の阻害を図示する結果である。ＳＫＨ１寛解した無毛マウス（生後６乃至８週間）は、黄色ブドウ球菌（１×１０８細菌）、４μＬの濃縮したCytodexビーズ、ＤＰＢＳ、ｍＡｂ  ＡＰ４−２４Ｈ１１又は制御ＩｇＧ（０．００６ｍｇ又は０．６ｍｇ）を含む２００μＬの皮内側腹注射を受ける。別の対照動物はCytodexビーズ又はビーズに加えて抗体を含む２００μＬの皮内注射を受ける。注射後、マウスを４乃至７日間にわたって少なくとも一日３回監視した。監視の最後に、マウスを安楽死させ、組織を細菌学的分析及び組織学的分析のために摘出した。（Ａ）黄色ブドウ球菌＋ＰＢＳ；（Ｂ）黄色ブドウ球菌＋ＡＰ４−２４Ｈ１１（０．０６ｍｇ）；（Ｃ）黄色ブドウ球菌＋ＡＰ４−２４Ｈ１１（０．６ｍｇ）；（Ｄ）Cytodex ＋ＡＰ４−２４Ｈ１１（０．６ｍｇ）。
【図８】図８は黄色ブドウ球菌感染に対するＡＰ４−２４Ｈ１１（０．６ｍｇ）を有するマウスの受動免疫から獲得された生存データを示す。ｍＡｂ  ＡＰ４−２４Ｈ１１又は制御ＩｇＧで前処理され、その２時間後に黄色ブドウ球菌感染（３×１０８ i.p.）で処理されたマウスの生存率。括弧内の数字は生存数／群ごとの数を示す。対数の順位統計量は、各群について、ｐ＝０．００１、ｎ＝６である。
【図９】図９は抗ＡＰ１モノクローナル抗体によるａｇｒ群Ｉ株におけるα溶血素発現の抑制を示す。
【図１０】図１０Ａ及びＢは、抗ＡＩＰ１ ｍＡｂｓの生化学的評価の結果である。（Ａ）抗ＡＩＰ１ ｍＡｂｓの存在下（０．２ｍｇ／ｍＬ）でのａｇｒＩの黄色ブドウ球菌ＲＮ６３９０Ｂにおけるα溶血素の発現。１：ＡＰ１−２Ｃ２；２：ＡＰ１−９Ａ９；３：ＡＰ１−９Ｆ９；４：ＡＰ１−１５Ｂ４  ※（１）制御ｍＡｂ；  ※（２）抗体無し。（Ｂ）抗ＡＩＰ１ ｍＡｂｓの存在下での黄色ブドウ球菌ＲＮ６３９０Ｂの静的バイオフィルム形成。
【図１１】図１１はα溶血素に対するヒトの抗ＡＩＰ４ ｓｃＦｖ４−２０抗体の存在下で生育した黄色ブドウ球菌ＲＮ４８５０の培養上清のウェスタン分析の結果である。
【図１２】図１２は、ｍＡｂ ＡＰ１−１５Ｂ４による致死的なＭＲＳＡ  ＵＳＡ３００抗原投与からのマウスの保護を実証する実験結果である。マウスは黄色ブドウ球菌を注射（１−３×１０８ i.p.）して２時間後に、ＡＰ１−１５Ｂ４（１ｍｇ）又は制御ＩｇＧ（１ｍｇ）で処理する。括弧内の数は群あたりの生存を表し、各群についてｐ＝０．０２、ｎ＝６である。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
本発明は、黄色ブドウ球菌ＡＰ−４シグナル伝達ペプチドに特異的な抗体がクオラムセンシングを阻害するとともに、マウスにおけるブドウ球菌感染を予防することが可能であるという発見に関する。したがって、本発明は免疫原性の分子実体を提供するものである。この分子実体は、クオラムセンシングを介して病原因子の発現を制御するグラム陽性菌によって生じた天然で環状のシグナル伝達ペプチドに対する免疫反応の生成物を引き起こすために使用可能である。免疫原性の分子実体は、任意でリンカー部分を介して少なくとも１つのハプテンを備え、このハプテンは高分子担体と共有結合するものである。このとき、リンカー部分はハプテン及び高分子担体と共有結合し、ハプテンは環状ペプチド又はその類似体を備え、この環状ペプチド又はその類似体は大環状環を備える。この環状ペプチド又はその類似体は、本発明で定義されたように約４乃至１９のアミノ酸残基を備える。
【００５６】
本発明は環状ペプチドシグナル伝達分子と特異的に結合する抗体も提供する。この抗体は哺乳類のクオラムセンシングを阻害するために使用可能な中和抗体である。さらに、本発明は、免疫原性の分子実体又は中和抗体、及び、薬学的に許容可能な担体を含む組成物を提供する。本発明の別の実施形態は、哺乳類において環状ペプチドシグナル伝達分子に対する免疫反応を誘発するための方法、及び、哺乳類において細菌のクオラムセンシングを阻害するための方法を提供するものである。
【００５７】
本発明の免疫原性の分子実体は、任意でリンカー部分を介して高分子担体と共有結合した環状ペプチド又はその類似体からなる。免疫原性の分子実体はウィルス粒子などの超分子集合体内にも含まれることが可能である。したがって、本発明の免疫原性の分子実体は、この分子実体を投与された動物から免疫反応を誘発することが可能である。動物とは、例えば、ヤギ、ブタ、ウサギ、マウス、ラット、ウマ、又は、ヒトなどの任意の哺乳動物でもかまわない。
【００５８】
＜定義＞
本明細書で用いられているように、「免疫原性の」という用語は、脊椎動物（例えば、マウス、ラット、霊長類、又は、ヒトを含む哺乳類）において免疫反応を生じさせるための分子実体の適切性のことを言う。分子実体が十分な大きさであり、抗体が分子実体で抗原投与された動物によってもたらされるような免疫反応を生じさせるために、分子実体が必要な他の分子特性を有していれば、その分子実体は免疫原性である。免疫原性であるために、タンパク質などの分子実体が少なくとも約１０ｋＤａの分子重量でなければならないことは当該技術分野では周知のことである。
【００５９】
「分子実体」という用語によって、分子、又は１つの化学構造により定義される分子の集合体、又は化学構造の集合体の各々を意味する。例えば、本発明の分子実体は、担体タンパク質、又は、任意でリンカー部分を介してハプテンと共有結合した免疫原性に適したポリマー（デンドリマーなど）であってもよい。「超分子集合体」とは、免疫原性の分子実体を備えるウィルス感染症粒子などの免疫原性の分子実体を含む異なる高分子集合体であってもかまわない。超分子集合体はその外部表面上に免疫原性の分子実体のハプテン部分を表示するビロソームであってもよい。
【００６０】
本明細書で用いられるように、「ハプテン」とは、それ自体では、例えば、動物の免疫反応を刺激するには大きさ及び重量が足りない分子部分又は断片である。しかしながら、担体と結合すると、このハプテンと特異的に結合する抗体が産生可能である。
【００６１】
本明細書で用いられているように、「環状ペプチド又はその類似体」とは、多数のアミノ酸残基の少なくとも一部又は直鎖状のオリゴマー型で共有結合した類似体単位で形成される有機体の構造のことを言う。このとき、直鎖は大環状環を形成するためにさらに内側に環化している。直鎖状のオリゴマー型は単量体単位を備える。各々の単量体単位はアミノ酸残基で構成され、直線状に結合しているが、直鎖のカルボキシ末端側のアミノ酸残基と内部のアミノ酸残基の側鎖との共有結合によってループがさらに形成される。例えば、図１を参照されたい。
【００６２】
「アミノ酸残基」との用語は、当該技術分野でよく知られているように、アミノ酸又はオリゴマー鎖、例えば、天然ペプチドで共有結合されるその類似体を意味する。アミノ酸残基は同様に「無水アミノ酸単位」としても周知である。これは、アミノ酸残基のアミノ基又はカルボン酸基と、オリゴマーにおける隣接するアミノ酸残基のカルボン酸基又はアミノ基の各々との間でアミド結合が形成されているためである。アミノ酸又はアミノ酸類似体のアミノ基及びカルボン酸基は、オリゴマー中の隣接するアミノ酸残基とのアミド又はアミド類似体結合によって結合可能である。しかしながら、環状ペプチド又はその類似体は、本明細書に記載の如く、自然発生的なアミノ酸の残基のみから構成される必要はない。
【００６３】
本明細書で用いられる環状ペプチドは、リボソームのアミノ酸残基、すなわち、翻訳後修飾することなくＤＮＡ中でコード可能なおよそ２０Ｌ−αアミノ酸から形成される一方で、この環状ペプチドは、天然アミノ酸の鏡像異性のＤアミノ酸形状だけでなく、およそ２０リボソームのアミノ酸以外の側鎖を有するアミノ酸などの非天然アミノ酸を含むことも可能である。環状ペプチドは、β−又はγ−アミノ酸などαアミノ酸以外の種類のアミノ酸、あるいは、カルボン酸及びアミノ基が多数の原子によって分離しているアミノ基を含むことも同様に可能である。例えば、環状ペプチド又はその類似体はアミノ酸を備えることも可能であり、このとき、アルキルアミノ基及びカルボキシル酸基が様々な長さのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖又は単なるアルキレン鎖によって分離される。上記はすべて本明細書において意味される範囲内で「アミノ酸残基」とみなされる。したがって、本発明の環状ペプチド又はその類似体は、遺伝的にコードされたアミノ酸、自然発生し、遺伝的にコードされていないアミノ酸、又は、合成アミノ酸から精製可能である。遺伝的にコードされた２０のＬ−アミノ酸、及び、非コードされたアミノ酸の実施例に関して本明細書で用いられるアミノ酸の表記が、表１に記載されている。
【００６４】
【表１−１】
0005581490.tif 000011
【００６５】
【表１−２】
0005581490.tif 000012
【００６６】
【表１−３】
0005581490.tif 000013
【００６７】
アミノ酸の構造に関係なく、環状ペプチド又はその類似体の構造は大環状環を備える。本明細書で用いられているように、この環状ペプチド又はその類似体という用語は、アミノ酸残基の側鎖と共有結合したＣ−末端アミノ酸残基を備える。このアミノ酸残基の側鎖は鎖内部、すなわち、「内部」のアミノ酸残基に配される。したがって、環状ペプチド又はその類似体を備える免疫原性の分子実体は、環状様の「ラッソ（lasso）」を有する分子として、概念化可能である。このとき、ラッソ環は遊離しているが、一方で、ラッソのテイルは高分子担体と結合している。以下に記載のごとく、ラッソのテイルはリンカー部分によって高分子担体と結合可能であるだけでなく、直接結合も可能である。
【００６８】
本明細書で用いられる環状ペプチド又はその類似体は、アミノ酸残基を含まない分子セグメントを含むこともある。例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）セグメントなどのスペーサーセグメントは、環状ペプチド又はその類似体に含まれることもある。一般的にラッソ様ループに配されるこのスペーサーセグメントは、抗体への接近可能性を高めるために、高分子担体の表面から離れてハプテンを維持するのに役立つことが可能である。
【００６９】
ループは、共有結合した一組の原子によって完了し、本明細書では「大環状部分」と呼ばれ、化学式（Ｉ）では「Ｒ」として示され、Ｃ−末端アミノ酸のカルボニル基（すなわち、アミノ酸のカルボニル基のカルボニル基）と内部アミノ酸の炭素原子との間で干渉する。
【００７０】
本明細書で用語として用いられる「大環状部分」とは、炭素、窒素、酸素、硫黄、及び、水素を含む共役結合した原子群のことを言い、この原子群はＣ−末端アミノ酸残基のカルボキシ末端側のカルボニル基と、内部アミノ酸残基のα炭素などの原子との間で架橋を形成する。大環状部分はアミド結合を含み、例えば、この部分はカルボン酸基を含む基であってもよく、このカルボン酸基は、内部アミノ酸残基の側鎖のアミノ基とのアミド結合によって共役結合可能であるとともに、Ｃ−末端アミノ酸残基のカルボン酸基のカルボニルとのアミド結合によって共役結合可能なアミノ基を含むことも可能である。化学式（Ｉ）で「Ｒ」と指定された大環状部分は、他の種類の基、例えば、エステル、チオエステル、エーテル、チオエーテル、カルボニル、オレフィン、又は、炭化水素基などを含む。大環状部分は、任意のアミド代替基、又は“Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins,”（volume 7, by Arno F. Spatola, (1983) Marcel Dekker, New York / Basel）などに記載されている複数の基を含んでもかまわない。この文献は引用されることにより全体として本明細書に組み込まれるものとする。アミド代替基は、ケトン、アミン、エーテル、チオエーテル、スルホン、スルホキシド、スルホンアミド、スルホン酸塩、アリール、ヘテロアリール、アルキル、ヒドラジン、アミジン、グアニジン、尿素、チオ尿素、セミカルバジド、ボロン酸塩（boronates）、ホスホン酸塩などを含むこともある。
【００７１】
本明細書で用いられる「大環状部分」とは、共有結合した原子で全体的に形成される環を意味し、このとき、環の大きさは約９原子以上である。大環状部分は２０原子、又は、３０原子以上を備えることも可能である。大環状部分は、炭素−炭素結合だけでなく、炭素−窒素結合、炭素−酸素結合、炭素−硫黄結合、窒素−窒素結合、及び、それ以外の１以上の原子価を備える原子を含む共有結合を備えることも可能である。本発明に関する環状ペプチド又はその類似体において、大環状環は、少なくとも３、及び約１０のアミノ酸残基の原子だけでなく、大環状環の構造を完成させる上記の大環状部分を備える。
【００７２】
本明細書に記載の「高分子担体」は、十分な大きさの高分子実体のことを言い、結合するハプテンと組み合わせて、組成物により攻撃される有機体によって免疫反応の開始を誘発する。典型的には、ハプテンは、免疫反応を誘発するとともに、攻撃された有機体によって結合したハプテンに対する抗体の形成を引き起こすために、タンパク質と結合する（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン）。したがって、高分子担体はタンパク質、特に、ハプテンを提供するための優れた担体として周知のタンパク質であってもよい。すなわち、列挙された抗体のほとんどがハプテンを有するが、抗体構造としての担体タンパク質を有していない場合である。しかしながら、本発明の高分子担体は、タンパク質以外の実体であってもかまわない。例えば、高分子実体は、免疫システムに対してハプテンを与えるための多抗原性ペプチド（ＭＡＰ）デンドリマー（J. Tam et al.によって開発された。例えば、Posnett, D., McGrath, H., and Tam, J. P.“A novel method for producing anti-peptide antibodies”J. Biol. Chem. 263, 1719-1725 (1988)，and Tam，J.P.“Synthetic peptide vaccine design：synthesis and properties of a high-density multiple antigenic peptide system”PNAS USA 85, 5409−5413 (1988)参照。上記は、本明細書に引用されることによって全体として組み込まれるものとする）などのデンドリマーを備えることも可能である。このようなデンドリマーは、リジンなどの多官能性モノマーの星型重合によって形成可能であるが、ハプテンが結合可能な球状高分子の表面上に多官能基を与える。
【００７３】
さらに、高分子実体は高分子の超分子集合体（ウィルス粒子など）の一部でも可能である。例えば、ファージ表面が環状ペプチド又はその類似体の共有結合に適している場合に、
ファージディスプレイシステムが使用可能である。あるいは、高分子担体はビロソーム、（すなわち、膜貫通タンパク質が埋め込まれるとともにハプテンが結合する高分子担体として機能する場合のリン脂質形状のミセル構造）を備えてもかまわない。
【００７４】
本明細書で用いられる「リンカー部分」という用語は、環状ペプチド又はその類似体と高分子担体との間で組み込まれる分子セグメントのことである。ハプテンはリンカー部分を備え、このリンカー部分は、互いの反応によって環状ペプチド又はその類似体のＮ−終端を担体に結合するのに役立つ二官能性試薬として取り込まれる。場合によっては、環状ペプチド又はその類似体は、タンパク質などの高分子担体に直接結合可能であることを理解されたい。例えば、環状ペプチドのＮ−末端アミノ基は、ＥＤＣ（エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド）などの脱水試薬を用いることによって、タンパク質（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸などの酸性側鎖を有するタンパク質アミノ酸のカルボン酸基）に直接結合可能であり、これによって介在リンカー部分を有さない直接的なアミド結合が形成される。しかしながら、二官能性試薬からなるリンカー試薬は当該技術分野では周知であるが、同じ機能を実行することができる。このリンカー試薬の原子は、本発明の免疫原性の分子実体に取り込まれる際、本明細書で用いられる用語である、「リンカー部分」を形成する。
【００７５】
リンカー試薬の大部分の種類は、熟練した技術者にとっては周知である。実施例は、チオル基と反応するよう構成された１つの官能基を有する。このチオル基は、例えば、本発明の環状ペプチド又はその類似体のＮ−末端システイン又はホモシステイン残基と反応可能なＮ−アルキルマレイミド誘導体である。このリンカー試薬は、高分子担体の表面上に位置する群と反応にするのに適した第２の官能基を有する。例えば、タンパク質のアミノ酸側鎖のカルボキシレート基又はアミノ基である。例えば、アシル基のＮ−ヒドロキシこはく酸イミドエステルはタンパク質表面のリジン残基と結合するアミドを形成するよう反応可能である。このリンカー基の２つの官能基は、２つの終端での反応がリンカー部分を介して互いに反応分子と共役結合するのに役立つように、原子への介在を通じて共役結合する。リンカー化学の実施例は、Pierce, P.O. Box 117, Rockford, IL 61105  のカタログを参照されたい。次のウェブサイト（http://piercenet.com/products/browse.cfm?fldID=0203）でも閲覧可能であり、引用することにより本明細書に組み込まれるものとする。リンカー実体を形成するように反応可能なリンカー試薬の実施例は、当該技術分野では周知のことだが、MBS、スルフォ−MBS、 SMCC、又は、スルフォ−SMCCを備えることもある。
【００７６】
「クオラムセンシング」という用語は、特定の細菌種の特定の個体群水準が毒性因子などの特定の形質の発現に影響を与える、開始させる、又は増幅させる際に、この特定の細菌種がその個体群水準を検知する現象のことを言う。
【００７７】
「免疫原」という用語は、活性ワクチンの活性成分のことで、ポリペプチド、本明細書に記載されているように担体と結合するハプテン、又は免疫源に暴露又は接触した哺乳類の免疫反応を誘発可能な任意の高分子実体又は集合体であってもよい。
【００７８】
＜本発明の免疫原性の分子実体＞
本発明は少なくとも１つのハプテンを備える免疫原性の分子実体を提供し、このハプテンは任意でリンカー部分を介して高分子担体と共役結合し、このハプテンは環状ペプチド又はその類似体を備え、この環状ペプチド又はその類似体は大環状環を備える。このとき、環状ペプチド又はその類似体は約４乃至１９のアミノ酸残基を備え、この環状ペプチド又はその類似体は以下の化学式（Ｉ）によって示される構造を有する。
【００７９】
【化１０】
0005581490.tif 000014
【００８０】
このとき、各々のＸは独立した任意のアミノ酸残基であり、Ｘ１はそれぞれのカルボニル基によってＲに共役結合されるアミノ酸残基であり、Ｘａ＋２は内部アミノ酸であり、これらの炭素原子の各々はＲと共有結合し、ＲはＸ１及びＸａ＋２と共役結合することによって大環状環を形成する大環状分子部分であり、このとき、Ｒはエステル、チオエステル、アミド、カルバミド、セミカルバジド、又は他のアミド代替基、又は、これらの任意の組み合わせを備え、ａは１乃至約９、ｂは１乃至約８、及び、波線によって切断されている結合は、環状ペプチド又はその類似体のＮ−末端アミノ酸残基が任意でリンカー部分を介して高分子担体と結合している点を示す。
【００８１】
ある実施形態において、環状ペプチド又はその類似体は、化学式（Ｉ）の構造を含み、このとき、ａは２乃至８、又はその代わりに２乃至４であってもよく、ＲはＸａ＋２をＸ１カルボニル基と共役結合させるアルキルオキシ又はアルカリールオキシ、アルキルチオ、又はアルキルアミノ基を備えることによって、エステル、チオエステル、又はアミド結合を各々もたらすことで、ラクトン、チオラクトン、又はラクタム大環状環を各々形成する。
【００８２】
より特異的には、環状ペプチド又はその類似体は、化学式（Ｉ）の構造を備え、このとき、Ｒは−CH2O−、−CH2CH2O−、−CH2CH(CH3)O−、−CH2−フェニル−O−、−CH2S−、−CH2CH2S−、又は、−(CH2)nNH−を備え、このとき、ｎは１乃至約４である。このような実施形態において、環状ペプチド又はその類似体は、大環状環を備えるとみなすことができ、このとき、カルボキシ末端側のカルボニル基は、セリン、ホモセリン、トレオニン、又は、 チロシン残基各々の側鎖と結合し、ラクトン環を形成するか、あるいは、システイン又はホモシステイン残基各々の側鎖と結合し、チオラクトンを形成するか、あるいは、ジアミノプロプロピオネート（diaminopropropionate） （n＝１）、 ジアミノブチレート（n=2）、オルニチン（n=3）、又はリジン（n＝4）残基各々の側鎖と結合し、ラクタムを形成する。
【００８３】
別の実施形態では、環状ペプチド又はその類似体は、化学式（Ｉ）の構造を備え、このとき、ａは２乃至８であり、又はその代わりに２乃至４でも可能であり、大環状基Ｒは少なくとも１つのアミド、尿素、又はセミカルバジド基、又は少なくとも１つのアミド代替結合を備える。例えば、Ｒは化学式（ＩＩａ）（化１１）又は化学式（ＩＩｂ）（化１２）で示されても構わない。
【００８４】
【化１１】
0005581490.tif 000015
【００８５】
【化１２】
0005581490.tif 000016
【００８６】
このとき、ｎは１乃至約４であり、Ｒ１は自然発生的なアミノ酸又はその類似体の側鎖であり、波線で切断された結合は結合点を示し、このとき、指定された（ｉ）はＸ１のカルボニル基と結合し、示された（ｉｉ）の結合点はＸａ＋２のα−炭素と結合する。自然発生的なアミノ酸の側鎖は、リボソームのアミノ酸又はその類似体のいずれかの側鎖であってもかまわない。したがって、Ｒ１によって示される側鎖は、アラニン、フェニルアラニン、ヒスチジン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、トリプトファンなどのようなリボソームのアミノ酸の側鎖であってもかまわない。あるいは、この側鎖は、上記の自然発生的な側鎖（例えば、アラニンメチル基の代わりのエチル基、フェニルアラニンベンジル基の代わりのフェネチル基など）と類似している構造体であってもよい。本明細書で用いられるアミノ酸残基又はアミノ酸側鎖の類似体とは、自然構造と同一ではないが、短いアルキル基を加えること又は側鎖の基本的な物理的特性を変化させない置換基を加えることでのみ異なる化学構造のことをいう。例えば、アラニンの類似体は、その残基の大きさ、毒性、及び、疎水性が置換によっては著しく変化しないため、アラニンのフッ素化誘導体（トリフルオロアラニンなど）を含むこともある。
【００８７】
化学式（ＩＩａ）の非限定的な実施例は、以下の（化１３）である
【００８８】
【化１３】
0005581490.tif 000017
【００８９】
Ｒ１基はメチオニン側鎖に対応することを理解されたい。これに対応して、Ｒはメチオニン側鎖を有する化学式（ＩＩｂ）（化１４）の基であってもかまわない。
【００９０】
【化１４】
0005581490.tif 000018
【００９１】
本発明の別の実施形態において、環状ペプチド又はその類似体は、疎水性のＣ−末端アミノ酸残基を備えることが可能である。例えば、１つの実施例において、化学式（Ｉ）のＸ１及びＸ２は、疎水性のアミノ酸残基である。より特異的には、Ｘ１及びＸ２は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、又は、トリプトファン、又はそれらの類似体からなるアミノ酸残基の基から独立して選択可能である。さらに特異的には、Ｘ１及びＸ２の各々は、独立してメチオニン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、アラニン、イソロイシン、又はトリプトファンであってもかまわない。
【００９２】
さらなる実施形態において、環状ペプチド又はその類似体は、配列YST(Xa+2)DFIM (SEQ ID NO: 92)、YST(Xa+2)YFIM (SEQ ID NO：93)、 IN(Xa+2)DFLL (SEQ ID NO：94)、GVNA(Xa+2)SSLF (SEQ ID NO：95)、GVNP(Xa+2)GGWF (SEQ ID NO：96)、 KAKT(Xa+2)TVLY (SEQ ID NO：97)、KTKT(Xa+2)TVLY (SEQ ID NO：98)、GANP(Xa+2)OLYY (SEQ ID NO：99)、 GANP(Xa+2)ALYY (SEQ ID NO：100)、GYST(Xa+2)SYYF (SEQ ID NO：101) 、GYRT(Xa+2)NTYF (SEQ ID NO：102) 、 YNP(Xa+2)VGYF (SEQ ID NO：103) 、GGKV(Xa+2)SAYF (SEQ ID NO：104) 、 SVKP(Xa+2)TGFA (SEQ ID NO：105) 、DSV(Xa+2)ASYF (SEQ ID NO：106) 、 KYNP(Xa+2)SNYL (SEQ ID NO：107) 、 KYNP(Xa+2)ASYL (SEQ ID NO：108) 、 KYNP(Xa+2)ANYL (SEQ ID NO：109) 、 RIPT(Xa+2)TGFF (SEQ ID NO：110)、 DI(Xa+2)NAYF (SEQ ID NO：111)、DM(Xa+2)NGYF (SEQ ID NO：112)、 KYNP(Xa+2)LGFL (SEQ ID NO：113)、KYYP(Xa+2)FGYF (SEQ ID NO：114) 、GARP(Xa+2)GGFF (SEQ ID NO：115)、GAKP(Xa+2)GGFF (SEQ ID NO：116)、YSP(Xa+2)TNFF (SEQ ID NO：117)、YSP(Xa+2)TNF (SEQ ID NO：118)、又はQN(Xa+2)PNIFGQWM (SEQ ID NO：119)を備えることが可能であり、このとき、各配列の最後のアミノ酸残基はＸ１であり、（Xa+2）は内部アミノ酸であり、Ｘ１のカルボニル基はＲを介してこの内部アミノ酸と共役結合する。
【００９３】
１つの実施形態において、環状ペプチド又はその類似体は、以下の表に記載の如く、自然発生的な環状ペプチドシグナル伝達分子に関して決定された配列のいずれかを模倣可能である。
【００９４】
【表２−１】
0005581490.tif 000019
【００９５】
【表２−２】
0005581490.tif 000020
【００９６】
下線の残基のα−カルボニル基は、ボールド体の内部システイン残基のスルフヒドリル基とチオラクトン結合を形成することを理解されたい。
【００９７】
ハプテンの環状ペプチド及びその類似体は、標準的な固相ペプチド合成技術を用いて直鎖形状で合成可能であり、このとき、Ｘ１のカルボニル基が化学式（ＩＩａ）及び（ＩＩｂ）の基などのより複雑な大環状部分を介して又は直接的に結合する内部アミノ酸残基の側鎖は、適切に阻害される。これによって、このアミノ酸残基側鎖の選択的な非ブロック化が実行可能となる。選択的に非ブロック化された側鎖は、直接的に、Ｃ−末端カルボキシル基と反応可能であり、これによってＣ−末端側カルボキシル基と側鎖が結合し、このとき、側鎖は化学式（Ｉ）のＲ基によって表されるか、又は、その間に大環状環を形成するためにより複雑な大環状部分と反応可能であるかのいずれかである。合成の実施例が以下に示される。
【００９８】
ハプテンが共役結合する、又は、結合する高分子担体は、ハプテン−担体複合物で攻撃される動物の免疫反応を促すのに十分な大きさ、分子量、及び、組成をしている。環状ペプチド又は環状ペプチド類似体を含むハプテンは、高分子担体に直接的に結合可能である。例えば、カルボン酸などの担体の官能基と、Ｎ−末端アミノ基間などの環状ペプチド又はその類似体の官能基との間で、任意でＮ−ヒドロキシこはく酸イミドでＥＤＣ（エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド）などのアミド形成試薬を用いて、共役結合は形成可能である。あるいは、環状ペプチドのＮ−末端アミノ酸残基はカルボン酸官能基を有する、例えば、Ｎ−末端残基はアスパラギン酸残基又はグルタミン酸残基であってもかまわない。その際、Ｎ−末端アミノ酸残基は、同じ化学合成手法を用いて担体上でアミノ基と直接結合が可能である。例えば、アミノ基はタンパク質の表面上でリジン残基の側鎖内に存在可能である。あるいは、ペプチドカルボン酸塩が結合可能なアミノ基は、ＭＡＰ構造などの合成デンドリマーの表面上に存在可能である。環状ペプチド又はその類似体を高分子担体に直接結合するための他の概要は、当業者には明らかである。
【００９９】
高分子担体はポリペプチドを備えてもかまわない。例えば、高分子担体はタンパク質でも可能であり、このような適切な担体の非限定的な実施例は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）、ロコガイヘモシアニン（Concholepas concholepas hemocyanin）（ＣＣＨ）、コレラ毒素Ｂサブユニット、大腸菌毒素Ｂサブユニット、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、破傷風毒素Ｃ−フラグメント、緑膿菌エキソタンパク質Ａ、ＣＲＭ１９７（交差反応性材料）、カチオン化ウシ血清アルブミン（ｃＢＳＡ）、サイログロブリン（Ｔｇ）、アビジン、ウシサイログロブリン（ＢＴＧ）、ウシＧグロブリン、ウシ免疫グロブリンＧ（ＢｉｇＧ）、コンアルブミン（ＣＯＮＡ）、コロイド金、エデスチン、タラバガニヘモシアニン（ＨＣ）、リンゴマイマイヘモシアニン（helix promatia haemocyanin、ＨＰＨ）、クニッツ大豆トリプシンインヒビター（ＫＴＩ）、アメリカカブトガニヘモシアニン（ＬＰＨ）、オボアルブミン（ＯＡ）、Pam3Cys−Th（リポペプチド／Ｔｈ細胞エピトープ）、ポリリシン、ブタサイログロブリン（ＰＴＧ）、精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、ダイズトリプシン阻害因子（ＳＴＩ）、又は、ヒマワリグロブリン（ＳＦＧ）を含む。したがって、実施例によっては、免疫原性の分子実体は、上記に例示したポリペプチドなど（限定するわけではない）のポリペプチドに共役結合するハプテンを備える。
【０１００】
高分子担体は、ハプテンの共役結合に適した直鎖ポリマーなどのポリマー、又は、合成担体の別の種類（例えば、デンドリマー）であってもかまわない。２以上の反応基とのモノマーの星型重合によって生成されるデンドリマーは、合成環状ペプチド又はその類似体が当業者にとって周知の化学を用いて結合可能な官能基を提供するために使用可能である。例えば、表面上で複数のアミノ基を提供するＭＡＰデンドリマーは、本発明の環状ペプチドのＮ−末端アミノ酸残基の側鎖カルボキシル基と結合可能である。例として、Sakarellos-Daitsiotis et al.. Current Topics in Medicinal Chemistry 6：1715−35（2006）； Saupe et al., Expert Opin. Drug.Deliv. 3：345−354（2006）；McDermott et al., Immunology and Cell Biology 76：256−62（1998）；and Shahiwala et al., Recent Patents on Drug Delivery & Formulation 1：1−9（2007）を参照されたい。
【０１０１】
別の実施形態において、免疫原性の分子実体は、環状ペプチド又はその類似体と高分子担体との間に配されたリンカー部分を備えることも可能である。リンカー部分を用いて、抗体が特異的であることが望ましいハプテン領域（すなわち、環状ペプチド又はその類似体）を高分子担体の表面から物理的に分離させることが可能である。リンカー部分は当該技術分野ではよく知られているように、ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイルＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、 スルホ−ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイルＮ−ヒドロキシ−２−スルホスクシンイミドエステル）、ＳＭＣＣ（サクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸塩)、スルホ−ＳＭＣＣ（２−スルホサクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸塩）などのリンカー試薬に由来することもある。リンカー試薬の環状ペプチド及びその担体との反応の結果、両方に結合するリンカー部分が生じる。例えば、上記のリンカー試薬は、マレイイミド基にチオル基を加えることを介して、及び、Ｎ−ヒドロキシエステル基による担体アミノ基のアシル化によって、環状ペプチドのチオル含有Ｎ−末端アミノ酸残基と、高分子担体のアミノ基を共役させるために適用される。他のリンカー試薬は様々な方法で異なる基と反応させるために適用される。他の構造はリンカー部分内部に含まれることもある。例えば、リンカー部分は、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）、スペーサーペプチド、ヒドロキシメチルヘミサクシネート、又は、ポリエチレングリコール誘導体を含むこともある。所望の手法で、特定の環状ペプチドＮ−末端及び特定の高分子担体で反応させるよう適合したリンカー試薬を選択することは、通常の技術の範囲内である。
【０１０２】
高分子担体及び共役結合したハプテンは超分子集合体の範囲内に含まれる。超分子集合体は、リポソーム又はビロソーム、すなわち、膜貫通タンパク質を含むミセル構造でもかまわない。例えば、Westerfeld & Zurbriggen, J. Peptide Sci. 11：707−712（2005）and Felnerova et al., Current Opinion in Biotechnology 15：518−29（2004）を参照されたい。超分子集合体はファージディスプレイシステムなどにおけるウィルス粒子であってもよく、このとき、バクテリオファージは表面の官能基を発現させるために適用される。
【０１０３】
別の実施形態においては、高分子担体及び共役結合したハプテンは、免疫原性のある超分子集合体内に含まれる必要はない。
【０１０４】
本発明の免疫原性の分子実体の特定の実施例は、例示目的として以下（化１５、化１６、化１７、又は化１８）に示される。
【０１０５】
【化１５】
0005581490.tif 000021
【０１０６】
【化１６】
0005581490.tif 000022
【０１０７】
【化１７】
0005581490.tif 000023
【０１０８】
【化１８】
0005581490.tif 000024
【０１０９】
このとき、ＣＰＬは、システインチオル基に共役結合した任意のリンカーを有する高分子担体である。このような実施例においては、大環状環は、内部セリンアミノ酸残基及びカルボキシ末端との間で形成されるラクトン基（すなわち、メチオニン、フェニルアラニン、又はロイシン残基）を備えることが分かる。上記実施例の各々の大環状環は、５つのアミノ酸残基、４つの追加的な天然アミノ酸残基、ＰＥＧ基を備える合成アミノ酸残基、及び、任意のリンカー基を介して高分子担体（例えば、高分子ポリペプチド）と共役したＮ−末端システイン残基を備える。このような組成物は、哺乳類において抗体形成を誘発するために使用可能な構造の範例となるものであり、このとき、反応時に形成される抗体の少なくともいくつかは、ハプテンの環状ペプチド類似体に特異的なものである。
【０１１０】
本発明の免疫原性の分子実体は、天然の環状シグナル伝達ペプチドに特異的な抗体に関して、組み換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングするために使用可能である。例えば、黄色ブドウ球菌ＡＩＰ  ＩＶ環状シグナル伝達ペプチドのラクトン、ラクタム、カルバミド、又はセミカルバジド類似体に対応するハプテンを有する本発明の免疫原性の分子実体を用いて、ＡＩＰ  ＩＶ環状シグナル伝達ペプチドと特異的に結合する抗体に関して、組み換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーをスクリーニングすることが可能である。環状シグナル伝達ペプチドと特異的に結合する抗体の使用については、以下に議論されている。
【０１１１】
本発明の免疫原性の分子実体を用いて、選択された環状シグナル伝達ペプチドに対する哺乳類の免疫反応を誘発することが可能である。例えば、黄色ブドウ球菌ＡＩＰ  ＩＶ環状シグナル伝達ペプチドのラクトン、ラクタム、カルバミド、又はセミカルバジド類似体に対応するハプテンを有する本発明の免疫原性の分子実体を用いて、哺乳類のＡＩＰ  ＩＶ環状シグナル伝達ペプチドに対する免疫反応を誘発することが可能である。
【０１１２】
結果として生じた哺乳類は、環状シグナル伝達ペプチドに特異的な抗体源となることが可能である。例えば、ＡＩＰ−ＩＶに対する抗体は、その哺乳類の血液から分離可能である。加えて、抗体を生産する細胞は分離可能であるとともに、以下に議論されるモノクローナル抗体の生産のために抗体を生産するハイブリドーマを産生するために使用可能である。
【０１１３】
哺乳類で起こる免疫反応がクオラムセンシング及び病原性遺伝子の発現において選択された環状シグナル伝達ペプチドを利用するグラム陽性菌による感染症から哺乳類を保護するか、又は、哺乳類がその感染症に関連する疾病又は疾患にかからないようにすることが可能となるように、本発明の免疫原性の分子実体をワクチンとしても使用することができる。例えば、黄色ブドウ球菌ＡＩＰ  ＩＶ環状シグナル伝達ペプチドのラクトン、ラクタム、カルバミド、又はセミカルバジド類似体に対応するハプテンを有する本発明の免疫原性の分子実体を用いて、ＡＩＰ  ＩＶ環状シグナル伝達ペプチドに対する免疫反応を誘発することが可能であり、これによって、哺乳類が黄色ブドウ球菌の病原性遺伝子に関連する疾病状態又は合併症にかからずにすむようにする。
【０１１４】
本発明の免疫原性の分子実体の使用については、例えば、方法及び実施例の個所で以下の如く記載されている。
【０１１５】
＜本発明の抗体＞
本発明の抗体は、環状シグナル伝達ペプチドと特異的に結合する抗体である。本明細書で用いられているように、「環状シグナル伝達ペプチド」という用語は、クオラムセンシングを利用して病原性遺伝子の発現を制御するグラム陽性菌によって産生された環状ペプチドのことを言う。環状シグナル伝達ペプチドは膜結合型ヒスチジンキナーゼセンサー分子と結合し、その後、細胞内応答制御因子と相互作用するシグナル伝達分子である。
【０１１６】
環状シグナル伝達ペプチドは、様々なブドウ球菌種及び大便連鎖球菌を含む（限定されるわけではない）クオラムセンシングを利用するグラム陽性菌によって生成される。環状シグナル伝達ペプチド及び産生細菌の非限定的な実施例が以下の表に示される。シグナル伝達ペプチドはＮ−末端テイル及び、チオラクトン−又はラクトンを含有する環からなり、このような環は内部アミノ酸（ボールド体）の側鎖スルフヒドリル又はヒドロキシル基とＣ−末端アミノ酸残基（下線部）のα−カルボキシル基との反応によって形成される。
【０１１７】
【表３−１】
0005581490.tif 000025
【０１１８】
【表３−２】
0005581490.tif 000026
【０１１９】
したがって、環状シグナル伝達ペプチドは３乃至１１のアミノ酸の環及び１乃至約９のアミノ酸テイルを有することもある。その環構造は、「Ｃ−末端アミノ酸残基」のα−カルボニル基（すなわち、対応する直鎖ペプチドのカルボキシ末端側アミノ酸）と、内部セリン又はシステイン残基の側鎖上のアルキルオキシ又はアルキルチオ基（特に、カルボキシ末端アミノ酸からの４、５、６、７、８、又は９番目の残基）との間で、形成される。例えば、黄色ブドウ球菌ＡＩＰ４シグナル伝達分子は、アミノ酸配列YSTCYFIM （SEQ ID NO：123）からなる環状チオラクトンペプチド類似体である。環状チオラクトンの環構造は、メチオニン（Ｍ）のα−カルボキシル基である「Ｃ−末端側アミノ酸残基」と、システインＨＡＳのスルフヒドリル基であるＣ−末端側メチオニン（Ｍ）残基から５番目のアミノ酸との結合に由来する。
【０１２０】
したがって、環状シグナル伝達ペプチドは、５つのアミノ酸環（例えば、チオラクトン又はラクトン環）、及び、直鎖型の２乃至５のアミノ酸テイルを有することもある。
【０１２１】
抗体は、免疫グロブリン分子、又は、特定の抗原と特異的に結合する免疫学的に活性のそのフラグメントであってもよい。本発明の抗体は、天然の環状シグナル伝達ペプチドと特異的に結合する抗体、又はその環状シグナル伝達ペプチドのラクトン、ラクタム、カルバミド、又はセミカルバジド類似体を含むハプテンである。本明細書で用いられているように、本発明の抗体に関連して「特異的に結合する」という用語は、本発明の抗体が環状シグナル伝達ペプチド又は対応するハプテンと結合するが、担体タンパク質のみを含むその他の無関係な分子、あるいは、哺乳類の免疫原性の分子実体、超分子集合体、又は生体サンプルに存在するその他の無関係な分子とは実質的に結合しないということを意味する。例えば、本発明の免疫原性の分子実体と特異的に結合する抗体は（本発明では、ハプテンは黄色ブドウ球菌ＡＩＰ  ＩＶの環状ペプチドシグナル伝達分子のラクトン、ラクタム、カルバミド、又はセミカルバジド類似体である）、黄色ブドウ球菌ＡＩＰ  ＩＶ環状ペプチドと結合するが、担体のみ又は無関係な分子とは実際に結合しない抗体である。
【０１２２】
本発明の抗体は中和抗体でもある。本明細書で用いられているように、中和抗体という用語は、環状シグナル伝達ペプチドと結合するとともに、その環状シグナル伝達ペプチドが膜結合型受容体と結合するのを防ぐ抗体のことを言う。「中和抗体」という用語はさらに、交差中和抗体を備え、交差中和抗体とは、少なくとも２つの環状シグナル伝達ペプチドをその受容体（例えば、様々なａｒｇ基からの環状シグナル伝達ペプチド）と結合させるとともに、該環状シグナル伝達ペプチドがその受容体（例えば、様々なａｒｇ基からの環状シグナル伝達ペプチド）と結合させることを防ぐ抗体のことである。抗体が中和抗体かどうかは、以下に記載（例えば、実施例の個所で）の方法を含む、当業者にとっては周知の方法で決定することが可能である。
【０１２３】
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であってもかまわない。ポリクローナル抗体は、本発明の免疫原性の分子実体を哺乳類に与え、その後、標準的な技術（例えば、抗体を含有するＩｇＧフラクションを獲得するために抗体力価及びタンパク質Ａクロマトグラフィを決定する酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ））を用いて、哺乳類の血液から抗体を分離させることによって得られる。
【０１２４】
モノクローナル抗体は、特定の抗原エピトープと特異的に結合する共通の抗原結合部位を有する分子の個体群である。本発明の免疫原性の分子実体を与えられた哺乳類から抗体を生産する細胞を選択し、抗体を生産するハイブリドーマを産生するためにその抗体生産細胞（例えば、Ｂ細胞）を骨髄腫と融合させることによって、モノクローナル抗体は得られる。本発明のモノクローナル抗体は、例えば、本発明の免疫原性の分子実体を用いて、抗体のファージディスプレイライブラリーなどの組み換えコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによっても獲得可能である。例えば、Barbas, C.F., 3rd, D.R. Burton, J.K. Scott, and G.J. Silverman, Phage Display −A Laboratory Manual. 2001, Cold Spring Harbor, New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press；and Kontermann，R.,Dueel, S., Antibody Engineering, 2001, Berlin, Heidelberg：Springer−Verlag  を参照されたい。
【０１２５】
抗体の免疫学的に活性なフラグメントは、免疫グロブリン分子の生物活性フラグメント、例えば、ペプシンなどの酵素で抗体の開裂によって生じるＦ（ａｂ）又はＦ（ａｂ’）２である。免疫学的に活性なフラグメントは、重鎖及び軽鎖の様々なフラグメントを加えることによって生じる単鎖可変フラグメントであってもよい。
【０１２６】
本発明の抗体は、マウスの、キメラの、ヒト化の、又は、完全なヒト抗体であってもよい。マウス抗体はマウス源に完全に由来する抗体である。例えば、マウスの骨髄腫細胞とマウスのＢリンパ球細胞との融合から生じるマウスハイブリドーマに由来する抗体である。キメラ抗体はヒト以外の供給源（例えば、マウス又は霊長類）に由来する可変領域、及び、ヒト供給源に由来する定常領域を有する抗体である。ヒト化抗体は、マウス供給源由来の抗原結合領域（例えば、相補性決定領域）、及び、ヒト供給源由来の残りの可変領域並びに定常領域を有する。完全なヒト抗体は、ヒト細胞から又はヒト抗体遺伝子を運ぶ遺伝子導入マウス由来の抗体である。
【０１２７】
抗体を生み出す方法は当該技術分野ではよく知られている。例えば、本発明のポリクローナル抗体は、本発明の免疫原性の分子実体を適切な哺乳類に与えて免疫化することによって調製可能である。哺乳類は、例えば、ウサギ、ヤギ、又はマウスでもいい。免疫化後の適切な時間に、抗体分子を哺乳類から（例えば哺乳類の血液又は他の体液から）分離可能であり、さらに、標準的な技術（硫酸アンモニウムを用いる沈殿、ゲル濾過クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、又はタンパク質Ａを用いるアフィニティークロマトグラフィーを含むが、これらに限定されるわけではない）を用いて、分子を精製可能である。加えて、哺乳類の抗体を生産する細胞は単離可能であるとともに、本発明のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を調製するために使用可能である。モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマ細胞を調製するための技術は、当該技術分野では周知である。例えば、Kohler and Milstein, Nature 256：495−97 （1975）and Kozbor et al. Immunol Today 4： 72 （1983）を参照されたい。本発明のモノクローナル抗体は、当該技術分野で周知の他の技術（例えば、組み換え型ＤＮＡ分子からの発現、又は、上記に記載の本発明の免疫原性の分子実体を利用する組み換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーのスクリーニング）を用いて調製可能である。
【０１２８】
キメラ及びヒト化のモノクローナル抗体を産生させる方法は、当該技術分野ではよく知らており、例えば、組み換え型ＤＮＡ技術を含む方法を備える。キメラ抗体は、ヒト以外の可変領域及び抗体分子のヒト定常領域をコードする核酸の発現によって産生可能である。例えば、Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 86：6851（1984）を参照されたい。ヒト化抗体は、ヒト以外の抗原結合領域（相補性決定領域）、ヒトの可変領域（抗原結合領域を含まない）及び、ヒトの定常領域をコードする核酸の発現によって調製可能である。例えば、Jones et al., Nature 321:522-24 (1986)；and Verhoeven et al., Science 239:1534-36 （1988）を参照されたい。完全なヒト抗体は、ヒトの重鎖及び軽鎖遺伝子のみを発現させる改変した遺伝子導入マウスに免疫を与えることによって調製可能である。この場合、治療に有用なモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を用いて獲得可能である。例えば、Lonberg & Huszar, Int. Rev. Immunol. 13：65−93 （1995）を参照されたい。核酸及び抗体の設計及び調製に関する技術は、当該技術分野ではよく知られている。例えば、Batra et al., Hybridoma 13：87-97 （1994）；Berdoz et al., PCR Methods Appl. 4：256−64 （1995）；Boulianne et al. Nature 312：643−46 （1984）；Carson et al., Adv. Immunol. 38：274−311（1986）；Chiang et al., Biotechniques 7：360−66 （1989）；Cole et al., Mol. Cell. Biochem. 62：109−20 （1984）；Jones et al., Nature 321：522−25 （1986）；Larrick et al., Biochem Biophys. Res. Commun. 160：1250−56 （1989）；Morrison, Annu. Rev. Immunol．10：239−65 （1992）；Morrison et al., Proc. Nat’l Acad．Sci．USA 81：6851−55 （1984）；Orlandi et al., Pro. Nat’l Acad．Sci．U.S.A．86：833−37 （1989）；Sandhu, Crit. Rev. Biotechnol. 12：437−62 （1992）； Gavilondo ＆ Larrick, Biotechniques 29：128−32 （2000）；Huston ＆ George, Hum. Antibodies. 10：127−42 （2001）；Kipriyanov ＆Le Gall, Mol. Biotechnol. 26：39−60 （2004）を参照されたい。
【０１２９】
本発明のモノクローナル抗体、及び、単鎖可変フラグメントの実施例は、コードするヌクレオチド配列と同様に以下に示す。
【０１３０】
【表４−１】
0005581490.tif 000027
【０１３１】
【表４−２】
0005581490.tif 000028
【０１３２】
0005581490.tif 000029
【０１３３】
0005581490.tif 000030
【０１３４】
0005581490.tif 000031
【０１３５】
0005581490.tif 000032
【０１３６】
0005581490.tif 000033
【０１３７】
0005581490.tif 000034
【０１３８】
0005581490.tif 000035
【０１３９】
0005581490.tif 000036
【０１４０】
0005581490.tif 000037
【０１４１】
0005581490.tif 000038
【０１４２】
0005581490.tif 000039
【０１４３】
0005581490.tif 000040
【０１４４】
0005581490.tif 000041
【０１４５】
0005581490.tif 000042
【０１４６】
0005581490.tif 000043
【０１４７】
0005581490.tif 000044
【０１４８】
0005581490.tif 000045
【０１４９】
0005581490.tif 000046
【０１５０】
本発明の抗体を用いて、生体サンプル中の環状シグナル伝達ペプチドの存在を検知するか、又は、該環状シグナル伝達ペプチドの量を決定することが可能である。哺乳類がグラム陽性菌に感染しないようにしたり、又は、グラム陽性菌によって引き起こされる疾病又は疾患にかからないようにしたりするための予防的な目的で本発明の抗体を用いることも可能である。
【０１５１】
＜本発明の医薬組成物＞
免疫原性の分子実体、その免疫原性の分子実体を含む超分子集合体、又は、本発明の抗体（本明細書では本発明の「活性薬剤」）は、哺乳類に投与するために、医薬組成物に組み込むことが可能である。本発明の医薬組成物は、本発明の１以上の活性薬剤（例えば、１以上の抗体、免疫原性の分子実体、超分子集合体、又はそれらの組み合わせ）を備えてもかまわない。本発明の医薬組成物は、他のポリペプチド又は抗体ワクチンと組み合わせて本発明の１以上の活性薬剤を同様に備えることもある。
【０１５２】
例えば、本発明の医薬組成物は１以上の免疫原性の分子実体を備え、それらのハプテンは、黄色ブドウ球菌ＡＩＰ−Ｉ、ＡＩＰ−ＩＩ、ＡＩＰ−ＩＩＩのラクトン、ラクタム、カルバミド、又はセミカルバジドの類似体、またはそれらの組み合わせを備える。したがって、本発明の医薬組成物は、本発明の２以上の免疫原性の分子実体の組み合わせを備え、その各々が黄色ブドウ球菌ＡＩＰ環状ペプチドシグナル伝達分子のラクトン、ラクタム、カルバミド、又はセミカルバジドの類似体を含むハプテンを有する。
【０１５３】
本発明の医薬組成物は、本発明の２つの異なる免疫原性の分子実体を含む。すなわち、（１）第１の免疫原性の分子実体が、黄色ブドウ球菌ＡＩＰ−Ｉ環状シグナル伝達ペプチドのラクトン、ラクタム、カルバミド、又はセミカルバジドの類似体に対応するハプテンを有し、第２の免疫原性の分子実体が、黄色ブドウ球菌ＡＩＰ−ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶのラクトン、ラクタム、カルバミド、又はセミカルバジドの類似体に対応するハプテンを有し、（２）第１の免疫原性の分子実体が、黄色ブドウ球菌ＡＩＰ−ＩＩ環状シグナル伝達ペプチドのラクトン、ラクタム、カルバミド、又はセミカルバジドの類似体に対応するハプテンを有し、第２の免疫原性の分子実体が、黄色ブドウ球菌ＡＩＰ−ＩＩＩ又はＩＶ環状シグナル伝達ペプチドのラクトン、ラクタム、カルバミド、又はセミカルバジドの類似体に対応するハプテンを有し、（３）第１の免疫原性の分子実体が、黄色ブドウ球菌ＡＩＰ−ＩＩＩ環状シグナル伝達ペプチドのラクトン、ラクタム、カルバミド、又はセミカルバジドの類似体に対応するハプテンを有し、第２の免疫原性の分子実体が、黄色ブドウ球菌ＡＩＰ−ＩＶのラクトン、ラクタム、カルバミド、又はセミカルバジドの類似体に対応するハプテンを有する。
【０１５４】
本発明の医薬組成物は、本発明の３つの異なる免疫原性の分子実体を同様に含むこともある。例えば、（１）第１の免疫原性の分子実体が、黄色ブドウ球菌ＡＩＰ−Ｉ環状シグナル伝達ペプチドのラクトン、ラクタム、カルバミド、又はセミカルバジドの類似体に対応するハプテンを有し、第２の免疫原性の分子実体が、黄色ブドウ球菌ＡＩＰ−ＩＩのラクトン、ラクタム、カルバミド、又はセミカルバジドの類似体に対応するハプテンを有し、第３の免疫原性の分子実体が、黄色ブドウ球菌ＡＩＰ−ＩＩＩのラクトン、ラクタム、カルバミド、又はセミカルバジドの類似体に対応するハプテンを有し、（２）第１の免疫原性の分子実体が、黄色ブドウ球菌ＡＩＰ−Ｉ環状シグナル伝達ペプチドのラクトン、ラクタム、カルバミド、又はセミカルバジドの類似体に対応するハプテンを有し、第２の免疫原性の分子実体が、黄色ブドウ球菌ＡＩＰ−ＩＩのラクトン、ラクタム、カルバミド、又はセミカルバジドの類似体に対応するハプテンを有し、第３の免疫原性の分子実体が、黄色ブドウ球菌ＡＩＰ−ＩＶのラクトン、ラクタム、カルバミド、又はセミカルバジドの類似体に対応するハプテンを有し、（３）第１の免疫原性の分子実体が、黄色ブドウ球菌ＡＩＰ−Ｉ環状シグナル伝達ペプチドのラクトン、ラクタム、カルバミド、又はセミカルバジドの類似体に対応するハプテンを有し、第２の免疫原性の分子実体が、黄色ブドウ球菌ＡＩＰ−ＩＩＩのラクトン、ラクタム、カルバミド、又はセミカルバジドの類似体に対応するハプテンを有し、第３の免疫原性の分子実体が、黄色ブドウ球菌ＡＩＰ−ＩＶのラクトン、ラクタム、カルバミド、又はセミカルバジドの類似体に対応するハプテンを有し、（４）第１の免疫原性の分子実体が、黄色ブドウ球菌ＡＩＰ−ＩＩ環状シグナル伝達ペプチドのラクトン、ラクタム、カルバミド、又はセミカルバジドの類似体に対応するハプテンを有し、第２の免疫原性の分子実体が、黄色ブドウ球菌ＡＩＰ−ＩＩＩのラクトン、ラクタム、カルバミド、又はセミカルバジドの類似体に対応するハプテンを有し、第３の免疫原性の分子実体が、黄色ブドウ球菌ＡＩＰ−ＩＶのラクトン、ラクタム、カルバミド、又はセミカルバジドの類似体に対応するハプテンを有する。
【０１５５】
本発明の医薬組成物は、本発明の４つの異なる免疫原性の分子実体を同様に含むこともある。すなわち、第１の免疫原性の分子実体が、黄色ブドウ球菌ＡＩＰ−Ｉ環状シグナル伝達ペプチドのラクトン、ラクタム、カルバミド、又はセミカルバジドの類似体に対応するハプテンを有し、第２の免疫原性の分子実体が、黄色ブドウ球菌ＡＩＰ−ＩＩのラクトン、ラクタム、カルバミド、又はセミカルバジドの類似体に対応するハプテンを有し、第３の免疫原性の分子実体が、黄色ブドウ球菌ＡＩＰ−ＩＩＩのラクトン、ラクタム、カルバミド、又はセミカルバジドの類似体に対応するハプテンを有し、第４の免疫原性の分子実体が、黄色ブドウ球菌ＡＩＰ−ＩＶのラクトン、ラクタム、カルバミド、又はセミカルバジドの類似体に対応するハプテンを有する。
【０１５６】
同様に、本発明の医薬組成物は、１以上の環状ペプチドシグナル伝達分子と特異的に結合する１以上の抗体を備えることも可能である。例えば、本発明の医薬組成物は、黄色ブドウ球菌ＡＩＰ−Ｉ、ＡＩＰ−ＩＩ、ＡＩＰ−ＩＩＩ、又はＡＩＰ−ＩＶ環状シグナル伝達ペプチドのいずれか一つと特異的に結合する抗体を備えてもよい。本発明の医薬組成物は、２以上の環状シグナル伝達ペプチド、例えば、黄色ブドウ球菌ＡＩＰ−Ｉ、ＡＩＰ−ＩＩ、ＡＩＰ−ＩＩＩ、又はＡＩＰ−ＩＶ環状シグナル伝達ペプチドの任意の２、３、又は４の環状シグナル伝達ペプチドと特異的に結合する２以上の抗体を備えることもある。
【０１５７】
本発明の医薬組成物は、１以上のグラム陽性菌からの環状シグナル伝達ペプチドに対応するハプテンを有する１以上の免疫原性の分子実体だけでなく、クオラムセンシングを用いて１以上のグラム陽性菌からの１以上の環状シグナル伝達ペプチドと特異的に結合する１以上の抗体を備えることも可能である。
【０１５８】
本発明の医薬組成物は、異なる感染病原体（Ｂ型肝炎、ヘモフィルスインフルエンザｂ菌、ジフテリア、はしか、おたふく風邪、百日咳、ポリオ、風疹、強縮、結核、及び、水痘を含む。ただしこれらに限定されるわけではない）に対する１以上のワクチンと組み合わせて、本発明の活性薬剤を備えることもある。
【０１５９】
上記に加え、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体を備える。本明細書で用いられているように、「薬学的に許容可能な担体」とは、哺乳類に投与するのに適した、１以上の溶媒、分散媒、被膜、抗菌薬又は抗真菌薬、抗酸化剤、安定剤、等張剤、アジュバントなどをいずれかひとつまたは複数備える（ただし、これらに限定されるわけではない）。薬学的に許容可能な担体は当該技術分野ではよく知られており、従来の担体が本発明の免疫原性の分子実体又は抗体、あるいは投与経路と不適合でない限り、本発明の組成物の使用法は熟慮されるものとする。
【０１６０】
本発明の医薬組成物は、選択された投与経路に対応するように処方される。投与経路の実施例は、静脈内、皮内、皮下、吸入、経皮、経皮粘膜、及び、直腸投与を含む非経口投与の任意の経路を含む。
【０１６１】
非経口、皮内、又は、皮下への適用に用いられる溶液又は懸濁液は、（１）注射用蒸留水、食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は、他の合成溶媒などの無菌希釈剤、（２）ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌薬、（３）アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、（４）エチレンジアミン四酢酸などのキレート薬、（５）酢酸、クエン酸、又は、リン酸塩などの緩衝剤、及び、塩化ナトリウム又はブドウ糖などの毒性を調整するための薬剤を含むこともある。ｐＨは塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調節することもある。非経口製剤はアンプル、使い捨て注射器、又は、複数回投与用のバイアルに入れられてもかまわない。
【０１６２】
注射に適切な医薬組成物は、無菌の水溶液又は分散液、及び、無菌の注射剤又は注射分散液の即時調整のための無菌パウダーを備える。静脈内投与に関して、適切な担体は生理食塩水、静菌水、又は、リン酸緩衝食塩水を備える。組成物は無菌でなければならず、かつ、製造及び貯蔵条件下で無菌及び安定していなければならず、かつ、細菌及び真菌などの微生物による雑菌混入に対して保護されなければならない。担体は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール）、及び、これらの適切な混合物を含む溶媒又は分散媒であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆剤を用いること、分散液の場合は所望の粒子サイズを維持すること、及び、界面活性剤を用いることによって、獲得される。微生物の作用を防ぐことは、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノル、アスコルビン酸、及び、チメロサールなどの様々な抗菌薬及び抗真菌薬を用いて実行可能である。等張剤又は吸収を遅らせる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）などの他の成分も含まれる。
【０１６３】
適切な溶媒中の所望の量の活性薬剤を上記の１つの成分又は複数成分の組み合わせと併用することによって（必要とあれば、この後にろ過滅菌を行う）、無菌の注射剤は精製される。分散液は、活性化合物を基本的な分散媒及び他に必要な上記成分を含む無菌賦形剤と組み合わせることによって精製される。注射剤の精製のための無菌パウダーの場合、好適な精製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥を備え、これらによって事前に滅菌ろ過した溶液から活性成分及び任意の追加の所望成分の粉末が産生される。
【０１６４】
経口用組成物は不活性希釈剤又は食用担体を備える。これらはゼラチンカプセルに入れられるか、又は、タブレットに圧縮されても構わない。経口用の治療的投与のために、活性化合物は賦形剤に組み込まれるとともに、タブレット、トローチ、又はカプセルの形状で用いられることもある。経口用組成物も同様に液体担体を用いて精製される。薬学的に適合する結合薬及び／又はアジュバント材料は組成物の一部として含まれてもかまわない。タブレット、錠剤、カプセル、トローチなどは、以下の成分又は類似の性質の化合物のいずれかを含んでもかまわない。すなわち、微結晶セルロース、トラガント又はゼラチンなどの結合剤；スターチ又はラクトースなどの賦形剤；アルギン酸又はコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロース又はサッカリンなどの甘味料；あるいは、ペパーミント、サリチル酸メチル、又はオレンジ香味料などの香味料である。
【０１６５】
吸入による投与に関して、組成物は、二酸化炭素などの適切な高圧ガス又は噴霧器を収容する押圧された容器又はディスペンサーからエアゾールスプレーの形状で送達される。
【０１６６】
経粘膜的又は経皮投与に関して、浸透する障壁に適切な当該技術分野で周知の浸透剤を用いる。このような浸透剤は、経粘膜的投与用の界面活性剤、胆汁酸塩、フシジン酸誘導体を備え、これらは例えば、点鼻薬を用いて行われる。経皮投与に関しては、本発明の活性薬剤が当該技術分野で周知の軟膏剤、軟膏、ゲル、クリームで処方される。
【０１６７】
本発明の組成物は体内からの迅速除去から保護する担体で調製される。移植及びマイクロカプセル化した送達システムなどの放出制御製剤は、例えば、本発明の活性薬剤の徐放を可能にするとともに、場合によっては、免疫賦活剤の放出を同様に可能にする。このような処方の実施例は、リポソーム、エチレン酢酸ビニル共重合体（EVAc）（see Niemi et al., Laboratory Animal Science 35：609−612（1985）を参照）、及び、分解性ポリマーに封入される本発明の活性薬剤を備える。カプセル封入に用いられる生分解性高分子、生体適合性高分子は、ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）を含むが（Eldridge et al., Molecular Immunology 28：287−294（1991）を参照されたい）、これに限定されるわけではない。使用可能なポリマーのさらなる実施例は、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及び、ポリ乳酸を備える。上記のような製剤を調製するための方法は、当業者にとっては自明である。ウィルス抗原に対するモノクローナル抗体に感染した細胞をターゲットにした懸濁液を含むリポソーム懸濁液を薬学的に許容可能な担体として用いることもある。このような懸濁液は当該技術分野で周知の方法を用いて調製される。
【０１６８】
したがって、免疫反応を誘発するために処方された製剤は、他の担体及び賦形剤だけでなく、アジュバントを含むことも可能である。アジュバント、担体、及び、賦形剤の非限定的な実施例は、フロイント不完全アジュバント；フロイント完全アジュバント； アルミニウム塩（例えば、硫酸カリウム、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム）；細菌性リポ多糖；合成ポリヌクレオチド（ポリIC／ポリAU）；モンタニド（Montanide） ISA アジュバント（Seppic, Paris, France）；リビアジュバント（Ribi’s Adjuvants）（Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT）；ハンターのタイターマックス（Hunter’s TiterMax）（CytRx Corp., Norcross, GA）；ニトロセルロース−吸収タンパク質；ゲルブアジュバント（Gerbu Adjuvant） （Gerbu Biotechnik GmbH, Gaiberg, Germany/C-C Biotech, Poway, CA）；サポニン；ムラミルジ−及びトリペプチド；モノホスホリルリピドＡ；百日咳菌；サイトカイン； 細菌トキソイド；脂肪酸；生存ベクター；鉱物油エマルション；生分解性油エマルション（例えば、落花生油、スクアレン、又はスクアランを含む）； 非イオン性ブロック共重合体界面活性剤；リポソーム及び生分解性重合体ミクロスフェアを含む。例えば、Eldridge et al., Mol Immunol. 28:287-94 (1991)を参照されたい。ワクチン送達システムのさらなる実施例が、Felnerova et al., Current Opinion in Biotechnology 15:518-29 (2004); Saupe et al., Expert Opin. Drug Deliv. 3:345-54 (2006); Sakarellos-Daitsiotis et al., Current Topics in Medicinal Chemistry 6:1715-1735 (2006); Chen & Huang, Advances in Genetics 54: 315-37 (2005); Westerfeld and Zurbriggen, J. Peptide Sci 11: 707-712 (2005); Shahiwala et al., Recent Patents on Drug Delivery & Formulation 1: 1-9 (2007); and McDermott et al., Immunology and Cell Biology 76:256-62 (1998)で議論され、これらの内容に関しては本明細書引用することにより組み込まれるものとする。
【０１６９】
組成物は用量を投与及び均一にしやすくするための用量単位形状で処方される。「用量単位形状」という用語は、治療を受ける患者に単一容量として物理的な適切な単位のことで、各単位は、所望の医薬担体と併用して所望の治療効果をもたらすよう計算された所定量の活性化合物を含む。用量単位形状の仕様書は活性化合物の独自特性、及び、達成される治療効果次第である。
【０１７０】
＜製造キット及び製品＞
本発明における活性薬剤あるいは医薬組成物は、使用指示書と共にコンテナやパック、ディスペンサーに含まれていてもよい。そのようなキットは、免疫原性分子実体や、抗体、または医薬組成物の計画的使用の必要に応じて、試薬を追加することができる。例えば、本発明の抗体は診断目的として使用することができるが、そのような場合において、検知と視覚化を可能にする１以上の試薬を、キットに、（本発明の抗体を保持するよう分けられたコンテナ、パック、ディスペンサーにあるのが望ましい）含むことができる。その製造キット及び製品は、下記に述べるように、診断や予防薬、及び／または治療の目的においてその使用指示書を含むことができる。
【０１７１】
＜本発明の方法＞
本発明は、グラム陽性菌、またはそれに関係する疾病や病気による感染を防ぐ方法と同様に、感染しやすい、またはグラム陽性菌感染に関係する疾病や病気を保持している哺乳動物を識別する方法を提供する。本発明はまた、哺乳動物において免疫反応を導き出す方法と、哺乳動物においてクオラムセンシングを防ぐ方法を提供する。
【０１７２】
本発明に関連して、哺乳動物はどれも混血脊椎動物である。例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、テンジクネズミ、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、そしてヒトもそうである。グラム陽性菌は、どれもクオラムセンシングにおいて環状ペプチドをシグナル伝達分子として活用する菌であり、例えばフェカリス菌やブドウ球菌種がある。それらには例えば、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、スタフィロコッカス・アウリクラーリス、スタフィロコッカス・キャピティス、スタフィロコッカス・カプラ、スタフィロコッカス・カルノーサス、スタフィロコッカス・アーレッタエ、スタフィロコッカス・コーニイ、スタフィロコッカス・エピデルミディス、スタフィロコッカス・インターメディウス、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス、スタフィロコッカス・シミュランス、スタフィロコッカス・ガリナルム、スタフィロコッカス・キシローサス、スタフィロコッカス・ワーネリがある。そのような菌による感染に関係する疾病や病気は、例えば食中毒、毒素性ショック症候群、熱傷様皮膚症候群、手術創傷、尿路感染症、化膿症、肺炎などがある。
【０１７３】
（診断法）
本発明の診断法は、必要としているあるいは免疫原性分子実体や本発明の抗体を使用する治療から利益を得ることができる哺乳動物を識別するのに使用することができる。必要としているあるいは免疫原生分子実体や本発明の抗体を使用する治療から利益を得ることができる哺乳動物は、グラム陽性菌感染している、あるいはグラム陽性菌感染やそれに関係する疾病や病気にかかりやすい哺乳動物である。そのような哺乳動物を識別するために、それらの哺乳動物から生体サンプルを得られる。
生体サンプルは、組織サンプルや細胞サンプル、尿やリンパ液といった体液がなりうる。本発明の抗体は、生体サンプルが環状ペプチドシグナル伝達分子を含むかどうかを決定するために使用することができ、その存在はその哺乳動物がグラム陽性菌感染しているか、あるいはグラム陽性菌感染症に関係する疾病や病気にかかりやすいか、かかっていることを示す。例えば、本発明の抗体、特に黄色ブドウ球菌AIP-IVシグナル伝達ペプチドと結合する抗体は、黄色ブドウ球菌に関係する疾病や病気にかかりやすい、あるいは感染していると疑われる哺乳動物から得た生体サンプル中の黄色ブドウ球菌AIP-IVの存在を検知するために使用することができる。サンプル内の黄色ブドウ球菌AIP-IVの存在は、その哺乳動物が黄色ブドウ球菌感染症にかかっている、あるいは黄色ブドウ球菌感染症に関係する疾病や病気にかかりやすいか、かかっていることを示す。このように本発明の抗体は、哺乳動物から得られた生体サンプル中の環状ペプチドシグナル伝達分子を、診断によってその存在を検知する、あるいはその量を決定するために使用できる。
【０１７４】
哺乳動物から得られた生体サンプル中の環状ペプチドシグナル伝達分子の存在または量は、適切に標識された本発明の抗体を使用している競合アッセイにおいて検知できる。例えば、本発明の免疫原性分子実体（ポリペプチドなどの高分子担体と結びつけられたハプテンなど）は表面に固定される。哺乳動物から得られた生体サンプルの存在下あるいは非存在下において、適切に標識された本発明の抗体の固定化された免疫原性分子実体との結合を測定する。生体サンプル存在下の標識された抗体のその表面との結合の増加は、環状ペプチドシグナル伝達分子が存在することを示す。その生体サンプルは、部分的に精製されたあるいは処理されたサンプルとなり、その中で関係ない哺乳動物の細胞が除去される。その抗体は検出可能な分子で標識され、その分子はアルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼなどの酵素、すなわちストレプトアビジン、ビオチン、アビジンなどの補欠分子族や、塩化ダンジル、ジクロロトリアジニルアミン、ジクロロトリアジニルアミン-フルオレセイン、フルオレセイン、フルオレセイン-イソチオシアネート、フィコエリトリン、ローダミン、ウンベリフェロンなどの蛍光基、ルミナールなどの発光基、エクオリン、ルシフェラーゼ、ルシフェリンなどの生物発光基、あるいは３Ｈ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓなどの放射性同位元素となりうる。
【０１７５】
（治療方法）
本発明の免疫原性分子実体や抗体は、グラム陽性菌による哺乳動物の感染を防御あるいは治療するために使用できる。グラム陽性菌は、例えばブドウ球菌種などであり、これはクオラムセンシングにおいて環状ペプチドシグナル伝達分子を活用する。本発明の免疫原性分子実体や抗体を用いての治療から利益を得られる哺乳動物は、（１）グラム陽性菌により感染の危険にさらされている、あるいは感染しやすい哺乳動物、（２）感染しやすいグラム陽性菌との接触を行った哺乳動物、又は、（３）グラム陽性菌により感染している哺乳動物のいずれかである。グラム陽性菌感染を防御し治療するために、本発明の免疫原性分子実体を、免疫反応を導き出すためにその哺乳動物に投与できる。加えて、本発明の抗体は、環状シグナル伝達ペプチドの活性を阻害するために投与され、その結果、菌感染や菌感染に関係する疾病を促進する毒性遺伝子または毒素の産生を防ぐ。
【０１７６】
本発明の免疫原性分子実体や抗体を用いての治療から利益を得られる哺乳動物は、上記で議論された環状ペプチドシグナル伝達分子の存在及び／又は量を測定する方法を用いて識別できる。哺乳動物から得たサンプルからの培養、すなわち血液培養などによるグラム陽性菌感染症の存在を検知する他の方法が使用できる。ヒトなどの哺乳動物は、本発明の免疫原性分子実体や抗体を用いての治療から利益を得られるが、弱められた免疫システムを持つ個体、抑制された免疫システムを持つ個体、手術を経験したことがあるまたは経験するであろう個体、年老いた個体、非常に不健康な個体、入院あるいは医療処置を受けている個体となりうる。本発明の免疫原性分子実体や抗体を用いての治療から利益を得られる哺乳動物は、院内感染を広げてしまう危険にさらされる入院患者、あるいは、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、バンコマイシン中間耐性ブドウ球菌、バンコマイシン耐性ブドウ球菌や、肺炎球菌を含む他の抗生物質耐性腸球菌などの抗生物質耐性菌に感染している、あるいはさらされているとされる哺乳動物となりうる。
【０１７７】
本発明の抗体または免疫原性分子実体は、感染の前や、感染の後であるが感染に関係する症候の発現の前に、さらなる菌の増殖を防ぐため、そしてさらなる毒性遺伝子の出現を防ぐために、症候の発現の後に投薬され、その結果、疾病やその進行を妨げることができる。哺乳動物に投与された場合、本発明の免疫原性分子実体は、菌によって産生された環状ペプチドシグナル伝達分子を結合あるいは中和することにより、疾病や病気あるいはその進行を防ぐ抗体の産生を導き出し、その結果、感染あるいは菌感染に関係する病状の促進を助ける毒性遺伝子や毒素の産生を防ぐ。加えて、本発明の中和抗体はまた、哺乳動物に投与することもできる。中和抗体は、菌によって産生された環状ペプチドシグナル伝達分子を結合でき、その細胞結合型受容体との結合を防ぐことができる。そうすることで、感染を促進する毒性遺伝子または毒素の産生、あるいは菌感染に関係する病状の悪化を防ぐ。加えて、本発明の免疫原性分子実体を含む構成物は、生ワクチンとして使用され、一方、本発明の抗体を含む構成物は、菌感染や菌感染に関係する疾病や病気を防ぐために、不活性ワクチンとして使用できる。
【０１７８】
本発明の活性薬剤は、ここで議論されたどの投与法によっても投与することができる。免疫原性分子実体の投与量、あるいは哺乳動物に投与されるべき超分子集合体は、環状シグナル伝達ペプチドに対する免疫反応を導き出すのに適当な量であればよい。哺乳動物に投与されるべき抗体の投与量は、環状シグナル伝達ペプチドの活性を中和するのに適切な量であればよい。
【０１７９】
その投与量は、効果的な量、あるいはそれの適切な割合であればよい。これは、年齢や健康状態、身長、体重、治療状況、病状の重篤度、同時進行している治療はないか、など患者個々の要素に依存する。適切な投与量を決定する要因は、当業者には既知であり、通常の実験と共に記述されてもよい。例えば、物理化学、毒物学、薬物動力学的性質の決定は、通常の化学的、生物学的検定法を用いて、そして化学、薬理学、毒物学においてよく知られる数学モデリング技術を用いて行ってもよい。治療的有用性や投与計画は、そのような結果に基づいて、そして適切な薬物動力学及び／または薬力学モデルを用いて推定してもよい。
【０１８０】
患者に投与されるべき正確な量は、主治医の責任となる。本発明の免疫原性分子実体や抗体は、注射によって、哺乳動物の重量（ｋｇ）当たり、約０．０５  ｍｇ  〜２０００  ｍｇ  、好ましくは哺乳動物の重量（ｋｇ）当たり、約１  ｍｇ  〜２００  ｍｇ  投与すればよい。本発明の薬剤は長時間効果があるので、初日の初期投与量を８０〜４０００  ｍｇ  投与し、その後は２０  ｍｇ  〜１０００  ｍｇ  という低用量で投与するのが良い。患者は、また、医学的理由、心理的理由、あるいは他の理由で、低用量あるいは耐容量を主張するかもしれない。免疫原性分子実体または抗体の１以上の追加抗原投与量は、最初の投与の後の選択された期間に投与される。
【０１８１】
本発明の抗体あるいは免疫原性分子実体を使用する治療は、有効な中和免疫反応を導き出すために必要とされる間、行うことができる。
【０１８２】
（本発明の抗体の生成方法）
本発明の免疫原性分子実体あるいは超分子集合体は、環状シグナル伝達ペプチドへの抗体を生成するのに使用できる。本発明の免疫原性分子実体あるいは超分子集合体は、組み換え免疫グロブリンライブラリーを選別して、特に選択された環状シグナル伝達分子と結合する抗体を識別するのに使用できる。組み換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーを生成し選別する方法は、Barbas, C.F., 3rd, D.R. Burton, J.K. Scott, and G.J. Silverman, Phage Display −A Laboratory Manual2001,Cold Spring Harbor,New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，and Kontermann，R., Duebel, S., Antibody Engineering, 2001, Berlin, Heiderberg：Springer−Verlagで述べられている。
【０１８３】
本発明の免疫原性分子実体あるいは超分子集合体はまた、哺乳動物において免疫反応を導き出すのに使用できる。その哺乳動物からポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が得られる。本発明の免疫原性分子実体あるいは超分子集合体は、ヤギ、ヒツジ、ラット、マウス、あるいはウサギなどの哺乳動物に投与できる。ポリクローナル抗体は、当技術分野において知られる方法を使用して哺乳動物の血液から単離することができる。モノクローナル抗体は、抗体産生細胞を哺乳動物から単離することと、抗体産生ハイブリドーマを生成することによって得られる。哺乳動物から抗体を産生し獲得する方法は、当技術分野において知られる。  （Harlow, D. and D. Lane, Antibodies A laboratory manual. Cold spring harbor laboratory, New York (1988), and Tramontano, A. and D. Schloeder, Production of antibodies that mimic enzyme catalytic activity. Methods Enzymol 178: p. 531-550 (1989)）を参照。
【０１８４】
本発明は、さらに、以下の非限定的な実施例によって説明する。
【０１８５】
＜実施例＞
（実施例１−材料）
RN4850はDr. Richard P. Novick (Skirball Institute, New York University Medical Center)  から入手した。純化されたモノクローナル抗体はTSRI Antibody Production Core Facility から入手した。臨床分離株ＮＲＳ１６８は、Network on Antimicrobial Resistance in Staphylococcus aureus (NARSA) Program supported by NIAID/NIH (N01-AI-95359)  から入手した。
【０１８６】
（実施例２−天然ＡＩＰｓ  １−４の合成）
以下の一般的手順を、すべての天然産物を合成するのに使用した。バッチ合成を、標準Boc固相ペプチド合成プロトコルに従い、ＤＭＦ中で膨張した０．２５  ｍｍｏｌ  のＭＢＨＡ樹脂の下で実行した。４ｍＬのＤＭＦ中にＳ−トリチル−３−メルカプトプロピオン酸 (２ｅｑ)、ＨＢＴＵ (３．９ｅｑ)、ＤＩＥＡ (０．５ｍＬ) が含まれた溶液を準備し、事前の活性化のため3分間放置した。その混合物を、カップリングのため樹脂に加えた。この工程は一般的に１時間で完了する。それからその樹脂をＤＭＦで洗浄し、ＴＦＡ中の５％  ＴＩＳ用いて（２×１０  分）、トリチル基の脱保護にかける。一旦ＤＭＦで洗浄し、ペプチド配列は、４  ｅｑ  Ｂｏｃ  アミノ酸と３．９  ｅｑ  ＨＢＴＵ、０．５ ｍｌ ＤＩＥＡを使用して起こる結合反応によって完了した。合成が完了すると、その樹脂はＤＭＦ、それからＣＨ２Ｃｌ２、最後にエーテルで洗浄し、デシケーターに収納した。
【０１８７】
開裂：  その樹脂は、捕捉剤としてアニソールを使用し、１時間、５−１０ｍＬ  のＨＦにかけた。その結果できた混合物を、エーテルで洗浄し、１：１アセトニトリル水溶液で抽出した。この溶液を冷凍し、凍結乾燥した。できた固形物は、前処理したＨＰＬＣによって純化した。純留分を集め、冷凍、凍結乾燥した。
【０１８８】
チオラクトン化：  分子内チオラクトン化は、８０％  ＭＯＰＳ緩衝材  (１００ｍＭ、  ｐＨ  ７．０) と２０％アセトニトリル混合物の中で、純化された固体直鎖ペプチドを溶解することで達成され、ペプチド濃度を１ｍＭ未満にした。その反応をＥＳＩ−ＭＳによって観測し、通常２４−４８時間で完了した。産生物を、前処理したＨＰＬＣによって純化した。純留分を集め、冷凍し、凍結乾燥した。（ESI-MS：m /z calcd for AIP-1, Ｃ４３Ｈ６０Ｎ８Ｏ１３Ｓ２ (Ｍ+Ｈ), 961.4；found 961.8: m／z calcd for AIP-2, Ｃ３８Ｈ５８Ｎ１０Ｏ１２Ｓ (Ｍ+Ｈ), 879.4; found, 879.6: m／z calcd for AIP-3, Ｃ３８Ｈ５８Ｎ８Ｏ１０Ｓ (Ｍ +Ｈ), 819.4; found, 819.7: m ／z calcd for AIP-4, Ｃ４８Ｈ６４Ｎ８Ｏ１２Ｓ２, 1009.4; found 1009.7.）図２Ａ乃至Ｈ参照。
【０１８９】
（実施例３  ＡＩＰ４  ハプテン５の合成  −  ＡＩＰ４ラクトン類似体）
ＡＩＰ４ハプテン５の合成のための配列を、下記化合式1で示す。直鎖ペプチドＹＳＴＳＹＦＬＭ  (ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、保護基は含まない)  を、カップリング試薬としてＤＩＣ／ＨＯＢｔを用いる標準Ｆｍｏｃ化学を使用することで、Ｆｍｏｃ−メチオニンで前負荷をかけた２−クロロトリチル樹脂の下で合成した。Ｎ末端ペンダントシステインは、共役のために運搬体タンパク質に取り込まれ、短いフレキシブルなリンカーはハプテンと運搬体タンパク質の間にスペーサーとして加えられた。保護された直鎖ペプチドは、クロロホルム中の４  ％  トリフルオロ酢酸を使用することで、樹脂から解放され、また選択的にセリンからトリチル保護基を取り除いた。希薄条件における分子内ラクトン化は、ＥＤＣ／４−ＤＭＡＰを使用して行われ、続いて起こる側鎖脱保護が、ＡＰ４ハプテン５を提供した。合成法の詳細は、以下に記述する。
【０１９０】
0005581490.tif 000047
【０１９１】
（直鎖保護ペプチド（３）の合成）
すべてのＮ−α−Ｆｍｏｃ保護アミノ酸、カップリング試薬、そしてペプチド合成のための樹脂は、EMD Biosciences, Inc. (San Diego, CA)  から入手した。すべての他の化学薬品は、Sigma-Aldrich Corp. (St. Louis, MO)  で入手した。ＥＳＩ−ＭＳ分析は、API150EX (PE SCIEX, Foster City, CA)  を用いて行われ、HITACHI L-7300  や  SHIMADZU SCL-10A  はそれぞれ、分析のＨＰＬＣ予備実験に使用された。
【０１９２】
ペプチドを、Ｆｍｏｃ  ＳＰＰＳによって、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ  １で前負荷をかけた２−クロロトリチル樹脂の下で合成した。Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ(Ｔｒｔ)−ＯＨは、ラクトン化の位置で組み込まれた。すべての他の残基は、希薄ＴＦＡ中では安定し９５％ＴＦＡ中では不安定な直鎖保護基を用いて選択された。短いフレキシブルなリンカーは、Ｆｍｏｃ−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタンをカップリングすることによりＮ末端から２番目で結合した。Ｎ末端残基は、運搬体タンパク質と共役する際に最終的に用いられるＢｏｃ−Ｃｙｓ(Ｓｅｔ)−ＯＨである。
【０１９３】
特定条件：  バッチ合成は、ＤＭＦ中で膨張した１ｍｍｏｌの樹脂の下で、少なくとも１時間行った。５ｍＬのＤＭＦ中の保護アミノ酸とＤＩＣ、ＨＯＢｔ(それぞれ４  ｅｑ) 溶液を準備し、事前活性化のために５分間置いておいた。続いて、０．５ｍＬのｓｙｍ−コリジンを追加した。混合物をカップリングのためにその樹脂に加えた。この工程は一般的に１時間で完了する。それからその樹脂をＤＭＦで洗浄し、ＤＭＦ中の２０  ％（ｖ／ｖ）ピペリジンを用いてＦｍｏｃ脱保護にかけた（２×７  分）。それから樹脂をＤＭＦで洗浄し、次のカップリング反応を行った。合成が完了すると、樹脂をＤＭＦ、それからＣＨ２Ｃｌ２、最後にエーテルで洗浄し、デシケーターに収納した。
【０１９４】
開裂  (トリチル脱保護)：  その樹脂を、クロロホルム中に４  ％  ＴＦＡ、４  ％  トリイソプロピルシラン (ＴＩＳ)  と０．５  ％  Ｈ２０を含む混合物に加え、６時間攪拌した。その混合物をろ過し、ペプチドを沈殿させるために、ろ液を冷エーテルの中へ滴下させた。そのエーテル混合物を遠心分離機にかけ、上澄みを別の容器へ静かに移した。そのペプチドをエーテルへ再懸濁し、遠心分離機にかけ、上澄みを移すことで、２回洗浄した。その結果得られた固形物をデシケーターに収納した。
【０１９５】
純化：完全に保護されたペプチド３を塩化メチレンに溶かし、塩化メチル中の５％メタノールを用いて溶出された順相シリカゲルクロマトグラフィーによって純化した。
【０１９６】
（Ｂ．（３）のラクトン化）
保護された直鎖ペプチド３を、最終的に１．０ ｍＭ以下の濃度になるように、１，２−ジクロロエタン（事前に無水ＭｇＳＯ４の上で乾燥させておく）に溶かした。その溶液を攪拌、８０℃まで加熱し、ＥＤＣと４−ＤＭＡＰを当量で３度加えた。反応液に、別途当量のＥＤＣと４−ＤＭＡＰそれぞれを２４時間後と４８時間後に加えた。その反応をＨＰＬＣにより観察した。４日後、その反応混合物を室温まで冷却し、２×２００ｍＬの０．２ Ｍ  ＫＨＳＯ４（ａｑ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４の上で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させる。環状ペプチド４は前処理したＨＰＬＣにより純化した。収率は、分析的ＨＰＬＣによって決定されるように、３０％から６０％の範囲となる。
【０１９７】
（Ｃ．（４）の包括的脱保護とジスルフィド脱保護）
固体の純化されたペプチドを、２％ＴＩＳを含むＴＦＡに溶かし、１時間攪拌する。それから、その混合物を乾燥するまで蒸発させた。水を加え、混合物を冷凍、凍結乾燥した。それから、凍結乾燥した固形物を、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）を用いて、Ｈ２Ｏに溶かす。その混合物を１時間攪拌し、ＡＰ４ハプテン５の精製のため、前処理したＨＰＬＣの中へ直接投入する。採取した純留分を収集し、冷凍、凍結乾燥した。ESI-MS: m／z calcd for C57H80N10O17S2 (M + H), 1241.5; found, 1242.2.  図２Ｉ及びＪを参照。
【０１９８】
（Ｄ．（５）のＫＬＨ／ＢＳＡとの共役）
ハプテン５のＫＬＨ／ＢＳＡとの共役は、下記の概要２に描かれているように行った。その手順は、以下において述べる。
【０１９９】
0005581490.tif 000048
【０２００】
（Ｓｕｌｐｈｏ−ＳＭＣＣの連結）
５ｍｇの運搬体タンパク質を、ｐＨ７．４、０．９ｍＬのＰＢＳ中で再懸濁する。この溶液へ、１ｍｇのリンカースルホ−ＳＭＣＣ （スルホサクシニミジル−4−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−1−カルボキシレート）を加えた。その溶液を６−８時間攪拌し、タンパク質リンカー共役物は、４℃でのＰＢＳ中での透析によって純化される。
【０２０１】
（ハプテン５の共役）
ＰＢＳにおけるタンパク質リンカー共役物に、２ｍｇのハプテン５を含む１００μＬのＤＭＦを加えた。その溶液を一晩中攪拌し、タンパク質−ハプテン５共役物を透析によって純化した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析で、ＢＳＡ分子当たり平均約６ハプテンの接着を確認する（ＢＳＡ−ＡＩＰ４共役物の分子量＝７５５８１ダルトン、ＢＳＡ＝６７０００ダルトン、ハプテン＝１４６１．１５ダルトン）。図２Ｋを参照。
【０２０２】
＜実施例４−合成ハプテンとハプテン−タンパク質担体共役物としてのＡＰ１、ＡＰ２、ＡP３、ＡＰ４ラクトン類似体の調製＞
免疫反応、活性ワクチン、モノクローナル抗体の生成の免疫化と誘出のために、ＡＰ１、ＡＰ２、ＡP３、ＡＰ４ラクトン類似体とハプテン−タンパク質担体共役物の形状の合成ハプテンを、上記ＡＰ４ハプテン５の調合のために説明されるような手順を用い調製する。調製図は以下の通りである。
【０２０３】
0005581490.tif 000049
【０２０４】
0005581490.tif 000050
【０２０５】
0005581490.tif 000051
【０２０６】
0005581490.tif 000052
【０２０７】
0005581490.tif 000053
【０２０８】
＜実施例５−合成ハプテンとしてのＡＰ４ラクトン、カルバミド、セミカルバジド類似体の調製＞
タンパク質分解性の安定な環状ラクタム、ガルバミド、セミカルバジドＡＩＰペプチドハプテンは、塩基不安定カイザー・オキシム・レジン上でのペプチド環化に関する頻繁に文書化された方法論を使用して調製される。（DeGrado et al., J. Org. Chem. 1980, 45, 1295-1300; DeGrado et al., J. Org. Chem. 1982, 47, 3258-3261； Nakagawa et al., J. Org. Chem. 1983, 48, 678-685；Nakagawa et al., J. Am. Chem. Soc. 1985, 107, 7087-7092；Kaiser et al., Science 1989, 243, 187-192.）を参照。この合成アプローチはＢｏｃを基盤とする固相ペプチド合成に基づいており、それによると、ペプチド環化は固体担体から離れた環状ペプチドの開裂と同時に起こり、（Osapay et al., J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 6966-6973；Taylor et al., Biopolymers 2002, 66, 49-75； and Li et al., Curr. Org. Chem. 2002, 6, 411−440.）環状カルバミドペプチドの合成は、論文で述べられているように、レトロインベルソ型モチーフ（retro-inverso motiv）を必要とする（Chorev et al., Biopolymers 2005, 80, 67-84.）。ブロックを形成する事前に必要な１−Ｎ−Ｂｏｃ−４−（メチルチオ）ブタン−１，２−ジアミンは、広く利用されているＢｏｃ−メチオニノールより合成され、論文の前例によると、ニトロフェニルカルバメートプロトコルを介し、ペプチド鎖に結合する。（Vince et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999, 9, 853-856.）  以下の図は、タンパク質分解性において安定な環状ラクタム、カルバミド、ＡＩＰ−４  ペプチドのセミカルバジド類似体の合成を概説する。これらの合成方法論は、ＡＩＰ−１、ＡＩＰ−２、ＡＩＰ−３や他のブドウ球菌クオラムセンシングペプチドなどの他の環状ペプチドハプテンの調製に適用できる。
【０２０９】
環状ラクタムＡＩＰ４ハプテンの合成は、概要８に要約されている。概要９及び１０は、それぞれ、中間体１−Ｎ−Ｂｏｃ−４−（メチルチオ）ブタン−１，２−ジアミン ｐ−ニトロフェニルカルバメートと、環状カルバミドＡＩＰ４ハプテンと環状セミカルバジドＡＩＰ４ハプテンの合成に使用されるＮ−Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ヒドラジド ｐ−ニトロフェニルカルバメートとの合成を概説している。カルバミドとセミカルバジドＡＩＰ４ハプテンの合成を、それぞれ概要１１及び１２に示す。
【０２１０】
0005581490.tif 000054
【０２１１】
0005581490.tif 000055
【０２１２】
0005581490.tif 000056
【０２１３】
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【０２１４】
＜実施例６−黄色ブドウ球菌におけるエキソタンパク質の分泌の分析＞
黄色ブドウ球菌（ＲＮ４８５０又はＷｏｏｄ４６）の単一コロニーを、３７℃で一晩寒天プレートの上で増殖させた後、ＣＹＧＰ培地へ植菌し、一晩（１８時間）増殖させた。（Novick, Methods Enzymol 204：587−636 (1991)）を参照。一晩培養された細胞を、新たなＣＹＧＰ培地にてＯＤ６００≒０．０３まで希釈し、５ｍＬポリスチレン細胞培養管へ分配した。各管は０．５ｍＬの希薄細胞と適切な抗体（０．２ｍｇ／ｍＬ）を含む。３７℃にて２０乃至２４時間、攪拌せずに湿った培養器の中で増殖させた後、微小遠心管へ送り（１．５ｍＬ）、５分間で１３０００ｒｐｍの速さで遠心分離した。上澄みをＭｉｌｌｅｘ−ＧＶフィルター・ユニット（０．２２μｍ：Millipore，Ireland）を用いたろ過によって殺菌し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（10 ％のBis-Tris gel, Invitrogen, Carlsbad CA)によって分析した。α溶血素とタンパク質Ａの発現を確認するために、ＨＲＰ共役したヒツジポリクローナルα溶血素抗体(abcam Inc., Cambridge MA) と抗タンパク質マウスＡモノクローナル抗体(Sigma-Aldrich, St. Louis MO)を用いてウェスタンブロット分析を行い、ネズミ  ｍＡｂ  ＳＰ２−６Ｅ１１(Park and Janda, unpublished data)を対照抗体として使用した。溶血作用を試験するために、黄色ブドウ球菌の上澄み（７５  μＬ  ｘ  ３）をヒツジ血液寒天プレートに加え、プレートを、３７℃で１８時間、そして室温でさらに２４時間培養した。
【０２１５】
＜実施例７−静的なバイオフィルム解析＞
バイオフィルムアッセイを、次の論文の手順を少し修正することによって、実施した。（O’Toole, Methods Enzymol 310:91-109 (1999))を参照。抗体（０．２  ｍｇ／ｍＬ）の有無にかかわらず、ポリスチレン９６ウェルプレートの中に０．２％グルコースを含むトリプティックソイ血液（ＴＳＢ）培地で、黄色ブドウ球菌細胞（２００μＬ）を攪拌することなく、２０−２４時間増殖させた。その後、プレートを水の中に沈め洗浄し、乾燥させた。クリスタル・バイオレット溶液（２００μＬ，ａｑ  ０．１％）をバイオフィルムに染色するために加え、その後、プレートを水で丁寧に洗浄した後、酢酸（２５０μＬ，ａｑ  ３０％）を残ったクリスタル・バイオレットを可溶性にするために加えた。吸光度を、５７０ｎｍで、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  ２５０（Molecular Devices, Sunnyvale CA）を用い、測定した。
【０２１６】
＜実施例８−リアルタイムＰＣＲ分析＞
一晩培養された黄色ブドウ球菌ＲＮ４８５０細胞を、抗体を含む新たなＣＹＧＰ培地  （１ｍＬ）で、ＯＤ６００≒０．０３まで希薄し、２０乃至２４時間（ＯＤ６００≒２）、３７℃で攪拌せずに増殖させる。その細胞からのＲＮＡを、Rneasy（登録商標） Mini Kit (QIAGEN Inc., Valencia CA)を使用して、製造者指示に従い、単離する。単離されたＲＮＡを、室温で３０分間Rnase−Free Dnase (QIAGENE Inc.)を使用し、さらに純化する。ファーストストランドＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲ用SuperScript（商標）ファーストストランド合成システム(Invitrogen)を用い、約３００ｎｇの純ＲＮＡを用いて合成した。ＲＴ−ＰＣＲ試験を、少なくとも独立した２つのサンプルで行い、各試験は、LightCycler（登録商標） FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green I (Roche Applied Science, Indianapolis, IN)を用い、正副２回行った。Generic SYBR Green Protocol (Roche)は、ＰＣＲ法のために使用した。相対定量解析は、参照としてハウスキーピング・ジャイレース遺伝子を用いるLightCycler（登録商標）2.0 system (Roche Applied Science)を用いて行った。使用されるプライマーの配列は以下の通りである。
【０２１７】
gyrA F: 5’-TGGCCCAAGACTTTAGTTATCGTTATCC-3’(SEQ ID NO：5);
gyrA R: 5’-TGGGGAGGAATATTTGTAGCCATACCTAC-3’(SEQ ID NO：6);
rnaIII F: 5’-GCACTGAGTCCAAGGAAACTAACTC-3’(SEQ ID NO：7);
rnaIII R: 5’-GCCATCCCAACTTAATAACCATGT-3’(SEQ ID NO：8);
hla F: 5’-CTGAAGGCCAGGCTAAACCACTTT-3’(SEQ ID NO：9);
hla R: 5’-GAACGAAAGGTACCATTGCTGGTCA-3’(SEQ ID NO：10);
spa F: 5’-GCGCAACACGATGAAGCTCAACAA-3’(SEQ ID NO：11);
spa R: 5’-ACGTTAGCACTTTGGCTTGGATCA-3’(SEQ ID NO：12);
eta F: 5’-GTTCCGGGAAATTCTGGATCAGGT-3’(SEQ ID NO: 13);
eta R: 5’-GCGCTTGACATAATTCCCAATACC-3’(SEQ ID NO: 14);
sarA F: 5’-CTGCTTTAACAACTTGTGGTTGTTTG-3’(SEQ ID NO：15)
sarA R: 5’-CGCTGTATTGACATACATCAGCGA-3’(SEQ ID NO：16);
saeR F: 5’-CGCCTTAACTTTAGGTGCAGATGAC-3’(SEQ ID NO：17);
saeR R: 5’-ACGCATAGGGACTTCGTGACCATT-3’(SEQ ID NO：18).
【０２１８】
＜実施例９−マウスにおける皮膚感染＞
マウスでのすべての試験は、ＴＳＲＩガイドライン及びレギュレーションに従い行った。生後６乃至８週間のＳＫＨ１の寛解期の無毛マウスは、Charles River Laboratoriesから入手し、試験で使用する直前１週間は、生物学的飼育器に入れておく。脳−心臓浸出物寒天培地は、Novickの Methods Enzymol 204: 587-636 (1991)で説明されるように、１％  カザミノ酸（Fisher BP1424）と１％酵母エキス(EMD 1.03753)、０．５９％塩化ナトリウム、０．５  ％ブドウ糖、６０ｍＭのβ−グリセロール酸ニナトリウム塩(Fluka 50020)を含んだＢＢＲ（♯２１１０６５）とＣＹＧＰ培養液からなる。Cytodex１ ビーズ(GE Healthcare 17-0448-01)を、カルシウム／マグネシウム(Gibco)を含まないダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水中で、２０℃で一晩中懸濁する（５０ｍＬ中に１グラム）。上澄みを別の容器に移し、ビーズをＤＰＢＳ中で懸濁及び１Ｇ沈殿法によって３度洗浄し、高圧蒸気殺菌（１２１℃、１５ｐｓｉ、１５分）を行った。黄色ブドウ球菌  ＲＮ４８５０（ＡＩＰ４）は、脳−心臓浸出物寒天培地プレート上で一晩３５℃で、冷凍したストック（BHI + 20%  グリセロール）から増殖させた。２ｍＬのＣＹＧＰ培養液を植菌するために３つの代表コロニーを組合せ、そして攪拌せずに一晩インキュベーションの後、０．２５ｍＬの培養物を用いて５ｍＬのＣＹＧＰを植菌し、３５℃にて３時間２００ｒｐｍでインキュベーションした。培養物を１３００×Ｇで、４℃で２０分間、遠心分離機にかけ、上積みを捨て、菌ペレットを、カルシウム／マグネシウムを含まない１ｍＬのＤＰＢＳ中で懸濁した。ＳＫＨ１マウスに、２００μＬの黄色ブドウ球菌（1×１０７ 又は 1×１０８ 細菌）、４μＬの血中容積のCytodexビーズ、ＤＰＢＳ、抗ＡＩＰ４抗体、あるいは対照ＩｇＧ（０．６又は０．０６ｍｇ）を含む皮内側腹注射を受けさせた。追加の対照動物に、Cytodexビーズあるいは抗体をプラスしたビーズを含む２００μＬの皮内側腹注射を受けさせた。注射後、マウスを４乃至７日間、少なくとも各３時間観測した。観測の終わりにあたり、マウスを安楽死させ、組織を細菌学、組織学的解析のために採取した。
【０２１９】
＜実施例１０−ＡＰ４−２４Ｈ１１を用いたマウスの受動免疫化＞
黄色ブドウ球菌ＲＮ４８５０を−８０℃で２０％グリセロールＢＨＩ培地で保管し、解凍してから、ＢＨＩ寒天培地プレート上で一晩増殖させた。そして、２ｍＬのＣＹＧＰ培地に植菌するために、３つの分けられたコロニー採取した。摂取培養物を、攪拌せずに１時間３５℃で維持し、続いて３時間２００ｒｐｍで攪拌した。新たに増殖した植菌培養物を、５０ｍＬの円錐ポリプロピレン管（１／２０に希釈）中の５ｍＬのＣＹＧＰ培地に送り、２００ｒｐｍで３５℃、３時間攪拌した。菌を３０００ｒｐｍ（１３００×Ｇ）で１０分間、４℃で遠心分離機にかけ、沈殿させた。その菌ペレットをカルシウム／マグネシウムを含まないダルベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）中で再懸濁し、ペトロフハウザーカウンティングチャンバー（Petroff-Hausser counting chamber）を用いて数をカウントした。３×１０８の菌を０．５ｍＬ腹腔内投与するために、最後の希釈は、ＤＰＢＳ中で行った。生存能力を維持するために、菌は採取後２時間以内に投与した。
【０２２０】
Mab AP4-24H11, アイソタイプ適合対照ＩｇＧ (各１ｍｇ)又はＤＰＢＳを、ＤＰＢＳ中で、ＳＫＨ１マウス（生後６−９週間、治療群毎に６匹）へ腹腔内投与し、続いて２時間後、３×１０８黄色ブドウ球菌を含んだ０．５ｍＬのＤＰＢＳを腹腔内投与した。マウスは、注射した日には複数回観測し、その後、１日２回、歩行、警戒、手で触れたときの応答、胸骨下直径１ｃｍの皮膚部位を用いて赤外線温度計（Raytek MiniTemp MT4）によって測定された肌温度を観察した。表面温度が常に３０℃未満を示し、また手で触れたときの応答が小さくなり、立直り反射が弱くなっている動物は、瀕死であると考えられ、安楽死させた。
【０２２１】
＜実施例１１−競合ＥＬＩＳＡ分析＞
ＡＰ４−ＢＳＡ共役物と各ｍＡｂの最適な濃度を測定した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、適切な量のＡＰ４−ＢＳＡ共役物でそれぞれ被覆した。プレートを、４％スキムミルクでブロック、洗浄し、ｍＡｂをあらかじめ決められた最適な濃度で加えた。プレートを洗浄し、フリーな抗原、すなわち天然ＡＩＰｓ１−４を、１００μｍで始まる濃度系列において、ウェルへ添加した。プレートは、１時間、３７℃でインキュベーションし、よく洗浄し、ヤギ抗マウス西洋わさびペルオキシターゼ（ＨＲＰ）共役物（Pierce, Rockford, IL）を加えた。ＲＴで１時間インキュベーション後、プレートを再びよく洗浄し、ＨＲＰ基質（TMB substrate kit; Pierce）を加え、反応が１５分間進んだら、２ＭのＨ２ＳＯ４を追加することで反応を停止させた。４５０ｎｍで吸光度が読み込み、その値がＧｒａｆｉｔ（Erithacus Software Ltd）を用いてプロットされる。吸光度値が最大値の５０％となる抗原を含まない濃度は、その抗原にとっての抗体の解離定数と考えられる。
【０２２２】
＜実施例１２−抗ＡＰ４モノクローナル抗体の生成＞
報告されているＡＩＰ−４（Mayville et al．，Proc． Natl．Ncad. Sci. U.S.A. 96:1218-1223 (1999)）の構造情報に基づき、ハプテンＡＰ４−５は、マウスにおいて、抗ＡＩＰ−４抗体免疫反応を誘発するために設計及び合成された（概要１）。天然チオラクトンからラクトン含有ハプテンへの化学スイッチのための論拠は、ラクトンのアミノリシス安定度が大きくなることに基づいた。このストラテジーは、ハプテン共役物が免疫化プロセスと続く免疫反応の間、構造的に未変化のままであることを保証した。このようにして、他のＱＳ分子にとって過去に把握できていないような未知の化学物質や生物学的性質を持った分解物の生成を避けた。この置換は、保護されたチオラクトンとペンダントシステインチオールの間での分子内チオール交換の可能性を防いだ。それゆえに、Fmoc-セリン(Trt)-OHは、天然システイン残基の位置において、４の位置で組み込まれた。
【０２２３】
ハプテン５は、二官能性リンカーを経由して、担体タンパク質キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と、ウシ血清アルブミンと共役した（概要２）。ＢＡＬＢ/ｃマウスは、標準プロトコルを用いてＫＬＨ共役物で免疫化された（Kaufmann et al., J. Am. Chem. Soc. 128:2802-03 (2006)を参照）。全体として、免疫化は中力価（１６００−３２００）をもたらし、ＥＬＩＳＡ解析に基づき、２０モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）が選択された。
【０２２４】
もちろん、３つのＡＰ４−ｍＡｂｓの結合親和力も測定した。これらの結合親和力は、次の表で示され、４つの天然ＡＩＰｓすべてに対し、競合ＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。
【０２２５】
【表５】
0005581490.tif 000058
【０２２６】
すべての結合定数は少なくとも２回測定され、その平均値が示してある。ＡＰ４−２９Ｅ１０がＡＩＰ−４へ高い親和力を持つ一方、タンパク質産生段階に直面する技術的困難のため、さらなる生物学的評価に対しては選択されなかった。
【０２２７】
ＡＰ４−２４Ｈ１１は、強い結合親和力（ＫｄＡＩＰ−４≒９０ｎＭ）とＡＩＰ−４との高い選択性を持つ一方、他のＡＩＰｓ（ＫｄＡＩＰ−１≒５μＭ、ＫｄＡＩＰ−２ ＝＞２５μＭ、ＫｄＡＩＰ−３ ＝＞２５μＭ）にとってわずかな交差反応性しか示さなかった。そのＡＩＰ１とＡＩＰ４との間を識別するＡＰ４−２４Ｈ１１の能力は注目に値する。なぜなら、これらの２つのオリゴペプチドは、ＡＩＰ−１中にアスパラギン酸残基、ＡＩＰ−４中にチロシン部を持ったポジション５のみで異なるためである。ＡＰ４−２４Ｈ１１は、さらなる生物学的評価にために選択された。
【０２２８】
＜実施例１３−黄色ブドウ球菌においてＡＰ４−２４Ｈ１１が病原性因子の発現を変化させる＞
黄色ブドウ球菌においてα溶血素とタンパク質Ａは２つの主要な病原性因子であり、これらタンパク質の発現は、ＡＩＰに基づくａｇｒ  ＱＳシステムを含む黄色ブドウ球菌シグナル伝達ネットワークによってしっかりと制御されている。ａｇｒ  ＱＳシステムは、確実にα溶血素の発現を制御する一方、タンパク質Ａ産生はＱＳシグナル伝達によって下方制御される。
【０２２９】
抗ＡＩＰ抗体が黄色ブドウ球菌においてＱＳシグナル伝達を妨害することができるかどうか、抗ＡＩＰ−４ｍＡｂ  ＡＰ４−２４Ｈ１１がａｇｒグループＩＶストレイン、ＲＮ４８５０及びＮＲＳ１６８内のα溶血素とタンパク質Ａの発現を調整できるかどうか、を測定するために試験を行った。図３Ａの結果は、ＡＰ４−２４Ｈ１１が、黄色ブドウ球菌エキソタンパク質の発現と分泌の両方あるいはどちらか一方に影響を与えるということを示しており、それらのいくつかはまた、ａｇｒ  ＱＳ回路によって制御されている。図４Ａで見られるように、ＡＰ４−２４Ｈ１１は黄色ブドウ球菌内のα溶血素の発現を減らすことに成功しており、図３Ｂで示すように、ＡＰ４−２４Ｈ１１が上澄みを処理した状態の血液寒天培地上では溶血作用は観察されなかった。反対に、タンパク質Ａの発現は、ＲＮ４８５０中でｍＡｂ  ＡＰ４−２４Ｈ１１により著しく増大し、それはまた、ａｇｒ  ＱＳ抑制と一致した。
【０２３０】
ＡＩＰ−１とＡＩＰ−４間の構造的のみの相違はポジション５であり、そのデータは中程度の親和力（約５μＭ）でＡＰ４−２４Ｈ１１がＡＩＰ−１と結合できることを意味する。それゆえに、ＡＰ４−２４Ｈ１１がａｇｒグループＩストレイン、すなわちＷｏｏｄ  ４６においてＱＳシグナル伝達に影響を与えるかどうかを調査した。ＡＰ４−２４Ｈ１１は、Ｗｏｏｄ４６中では、ＲＮ４８５０中ほどは効果的にα溶血素の発現をブロックできなかった。しかしながら、ＡＰ４−２４Ｈ１１の存在下で増殖されたＷｏｏｄ４６中のα溶血素の産生が顕著に減少しているのは明らかである（図４Ａ）。これらのデータは、２以上の異なるａｇｒグループの黄色ブドウ球菌ＱＳシグナル伝達を抑制する交差反応性ｍＡｂｓを生成することが可能であることを意味する。
【０２３１】
毒素産生とタンパク質分泌全体の減少が、抗体媒介増殖欠陥によって起こることは可能であり、結果は、黄色ブドウ球菌の著しい増殖変化は、ＡＰ４−２４Ｈ１１の存在下において２４時間の増殖期間では観察されなかった、ということを示している（図４Ｂ）。加えて、認識できる増殖効果は、ＡＰ４−２４Ｈ１１にとっては無関係なアイソタイプコントロール（κγ２ａ）であるＳＰ２−６Ｅ１１では観察されなかった。
【０２３２】
ＱＳによって制御される重要な細菌病原因子の一つは、バイオフィルム形成である。黄色ブドウ球菌において、バイオフィルム形成はａｇｒ  ＱＳシグナル伝達によってマイナスに制御され、それはａｇｒ  ＱＳ抑制を通して黄色ブドウ球菌毒性を制御する際に問題となる。過去の論文と一致して、ＡＰ４−２４Ｈ１１媒介ＱＳ抑制は、ＲＮ４８５０におけるバイオフィルム形成の増加を導いた（図４Ｃ）。バイオフィルム形成の増加は、黄色ブドウ球菌の慢性感染症において深刻な問題をかかえているが、それは、急性感染においては小さな問題であることを意味し、このように、ｍＡｂ  ＡＰ４−２４Ｈ１１は、黄色ブドウ球菌感染を制御するには効果的な方法である。
【０２３３】
＜実施例１４−ａｇｒ  ＱＳシステムの干渉によりＡＰ４−２４Ｈ１１が病原性因子の発現を変化させる＞
ＡＰ４−２４Ｈ１１を用いたａｇｒ  ＱＳ抑制をさらに試験するために、病原因子発現において観察される変化がａｇｒ  ＱＳシステム干渉によって確かに起こるかどうか、すなわち、ＡＰ４−２４Ｈ１１の存在が黄色ブドウ球菌において、ｒｎａＩＩＩの転写、ａｇｒ自己誘導の即時生成物、そして主なＱＳエフェクターに影響を与えるかどうかを評価するために、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）分析を行った。予想通り、ＲＮ４８５０中の定常増殖段階間のｒｎａＩＩＩ自己誘導レベルは、ＡＰ４−２４Ｈ１１によって著しく（５０倍以上）減少した。このように、α溶血素とタンパク質Ａの発現の変化は、ＡＩＰ−４−媒介ＱＳシグナル伝達の干渉に直接的な結果となる（図４Ｄ）。だが、エキソタンパク質発現全体における僅かな変化（図３参照）は、ＡＰ４−２４Ｈ１１がＱＳシグナル伝達を効果的にブロックしないことを意味すると誤解されるかもしれない。しかしながら、ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＡＰ４−２４Ｈ１１が黄色ブドウ球菌ＲＮ４８５０中のＡＩＰに基づくＱＳを著しく抑制する、という論拠を提供するものである。
【０２３４】
黄色ブドウ球菌において抗体に基づくＱＳ干渉の特異性を分析するため、２つの追加病原性制御因子の転写レベルを調査した。すなわちこの因子とはsarA (ブドウ球菌アクセサリー調節因子)とsaeR (ブドウ球菌アクセサリータンパク質エフェクター)であり、これらは黄色ブドウ球菌における病原因子発現と同様に環境ストレスへの応答を制御する。重要なことに、sarAあるいはsaeR転写においても著しい変化（２倍未満）は観察されず、ＡＰ４−２４Ｈ１１はａｇｒ  ＱＳシステムに影響を与えるだけであることを示している（図４Ｄ）。
【０２３５】
α溶血素とタンパク質Ａの転写は上記ＲＴ−ＰＣＲによって分析された。先に述べたように（上記参照）、タンパク質の発現レベルにおいて著しい変化が見られた。転写の観点において、hla 及び spa遺伝子は、抑制され、それぞれ３倍から５倍増加させられた。このことはｒｎａＩＩＩが転写だけでなく、これらのタンパク質の翻訳にも影響を与えることを確認した。最終的に、表皮剥脱毒素（Exofoliatin）はＡＩＰ−４活用黄色ブドウ球菌ストレインによって独占的に産生された他のａｇｒ  ＱＳ制御毒素である。そのデータはＡＰ４−２４Ｈ１１がまたeta転写を約１０倍まで減少させることを示した（図４Ｄ）。
【０２３６】
＜実施例１５−合成ＡＩＰ−４によるＡＰ４−２４Ｈ１１の不活性化＞
ＡＰ４−２４Ｈ１１が、ＡＩＰ−４との結合と細胞増殖培地からの隔離を通してａｇｒ  ＱＳを阻害したかどうか、あるいはＡＰ４−２４Ｈ１１がａｇｒ  ＱＳネットワークに順に影響を与える直鎖ペプチドＲＮＡＩＩＩ−阻害ペプチド（ＲＡＰ）を含む黄色ブドウ球菌中の他のシグナル伝達システムに影響を与えたかどうかを測定するために、次の試験を行い、ＡＩＰ−４の外部添加が黄色ブドウ球菌中ＲＮ４８５０中のａｇｒ  ＱＳシグナル伝達ネットワークをＡＰ４−２４Ｈ１１の存在下で修復できたかどうかを確認した。簡潔にいうと、ＡＰ４−２４Ｈ１１を等モル量の合成ＡＩＰ−４で化学処理した後、ＡＩＰ−４ペプチドとの抗体結合部位の飽和を確認するために、黄色ブドウ球菌増殖培地へ合成ＡＩＰ−４を添加した。図４Ｅで示すように、合成ＡＩＰ−４の添加はＡＰ４−２４Ｈ１１のクオラムクエンチング効果を効果的に減らし、その結果、黄色ブドウ球菌ＲＮ４８５０中のα溶血素の発現を完全に回復した。この発見は、ＡＰ４−２４Ｈ１１が黄色ブドウ球菌増殖培地中のＡＩＰ−４を隔離し、完全にＡＩＰ−４依存した様式において、黄色ブドウ球菌中のＡＩＰ依存ＱＳシグナル伝達を阻害するということを新たに確認した。
【０２３７】
＜実施例１６−ＡＰ４−２４Ｈ１１は哺乳動物細胞中の黄色ブドウ球菌誘導アポトーシスを阻害する＞
最近の研究によって、黄色ブドウ球菌培養によってできた上澄み液を用いたジャーカットＴ細胞のインキュベーションはアポトーシス誘導をもたらすということが示されてきている。ジャーカット細胞は、ＡＰ４−２４Ｈ１１の有無にかかわらず、黄色ブドウ球菌（ＲＮ４８５０やＷｏｏｄ４６）培養増殖の上澄み液を用いて化学処理される。上澄み液を用いた４時間のインキュベーションの後、アポトーシス誘導を指し示す生物学マーカーである、ポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の開裂を、ジャーカット細胞抽出タンパク質において評価した。図５で示されるように、ＡＰ４−２４Ｈ１１は、ジャーカット細胞におけるＲＮ４８５０上澄み（１％）誘導ＰＡＲＰ開裂を防ぎ、また部分的にＷｏｏｄ４６上澄み液の効果を阻害した。その結果（図４Ａ及び図５）は、α溶血素の発現と黄色ブドウ球菌誘導アポトーシスとの間の正相関を示している。
【０２３８】
＜実施例１７−ＡＰ４−２４Ｈ１１は、マウスにおいて黄色ブドウ球菌誘導皮膚外傷を妨げる＞
次に、ｍＡｂ  ＡＰ４−２４Ｈ１１がインビボで黄色ブドウ球菌誘導外傷を軽減する可能性を、マウス皮下感染モデルを用いて調査した。新たに増殖した対数期黄色ブドウ球菌を、Cytodexビーズ 、ＡＰ４−２４Ｈ１１又は対照ＩｇＧを含むＰＢＳ中で懸濁した。菌液の皮下注射または媒体制御は、7日間に亘り緊密な観測によって、ＳＫＨ１無毛マウスの側腹に行った。投与量は、１０７あるいは１０８の菌（コロニー形成単位；ｃｆｕ）と０．６または０．０６ｍｇのＡＰ４−２４Ｈ１１あるいは対照ＩｇＧであった。１０７ｃｆｕ  を受け取ったマウスは、７日間に亘る限界硬化により、微小な充血／浮腫を発達させる（図６参照）。しかしながら、注射後６時間、生理食塩水中あるいは対照ＩｇＧ中で攪拌された１０８ｃｆｕを受け取ったマウスは、注射を打った箇所に初期段階の充血／発赤を示し、これは側腹に沿って対角のパターンで３−５ｍｍ水平に、５−１０ｍｍ垂直に広がっている（図７Ａ）。１８時間の再試験において、注射を打った周辺の同じ領域は生命力を奪われ、肌は脆性の、赤褐色の痂皮に変化した。７日間の観察期間中に、硬くなった痂皮が比較的正常に見える肌の周辺から脱離し始め、少量の化膿した滲出液が正常な／壊死性の接合部で観察された。反対に、肌外傷は０．６  ｍｇのＡＰ４−２４Ｈ１１を持った１０８の菌を受け取ったマウスでは抑制された（図７Ｃ）。予想されたように、低用量のＡＰ４−２４Ｈ１１（０．０６ｍｇ）は、保護に適したものではなく（図７Ｂ）、０．６ｍｇ対照ＩｇＧを持った１０８ｃｆｕを受け取った対照マウスは保護されなかった（図６参照）。ＰＢＳ／Ｃｙｔｏｄｅｘのみ、又は０．６ｍｇのＡＰ４−２４Ｈ１１を含む注射を受けたマウスは、観察期間中、偶発的局所硬化を例外として正常のままであった。黄色ブドウ球菌ＲＮ４８５０との組み合わせで０．６ｍｇの保護量を受けた動物は、７日間の観察期間において重大な損傷を発症することはなかった。
【０２３９】
＜実施例１８−ＡＰ４−２４Ｈ１１を用いた受動免疫化はマウスを黄色ブドウ球菌誘導性致死から保護した＞
致死的攻撃に対しＡＰ４−２４Ｈ１１を用いる受動免疫化法の効果を評価するために、ＳＫＨ１無毛マウスに１ｍｌのＡＰ４−２４Ｈ１１、対照ＩｇＧあるいは媒体（ＤＰＢＳ）の腹腔内注射を与え、２時間後、３×１０８黄色ブドウ球菌ＲＮ４８５０を含む０．５ｍＬ  のＤＰＢＳで腹腔内注射した。図８で示すように、ＡＰ４−２４Ｈ１１を受けたすべてのマウス（６／６）は、８日間の観察期間を通して生き続けた。反対に、ＤＰＢＳを投与された対照マウスは１匹（１／６）しか生存できず、対照ＩｇＧを投与されたマウスは１匹も（０／６）２４時間以上生き続けられなかった。これらのデータは、さらに急性黄色ブドウ球菌感染症と戦うための私たちの免疫薬物治療学的（immunopharmacothereutic）アプローチを立証した。
【０２４０】
＜実施例１９−ＡＰ−１、ＡＰ−３、ＡＰ−４に対するモノクローナル抗体の競合ＥＬＩＳＡ分析＞
ＡＰ−１、ＡＰ−３、ＡＰ−４ハプテンとこれらのハプテンに特定の抗体を、上記実施例４及び１２にて説明したように調製した。
【０２４１】
競合ＥＬＩＳＡ分析のため、ＡＰ１−ＢＳＡ、ＡＰ３−ＢＳＡ、又はＡＰ４−ＢＳＡ共役物と各ｍＡｂの最適濃度を測定した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートは、それぞれ最適な量のＡＰ１−ＢＳＡ、ＡＰ３−ＢＳＡ、またはＡＰ４−ＢＳＡ共役物で被覆されている。プレートを、４ｖ％スキムミルクでブロックし、洗浄し、ｍＡｂｓをあらかじめ決めた最適濃度で添加した。プレートを洗浄し、フリーな抗原すなわち天然ＡＩＰｓ１−４を、１００μＭで始まる濃度系列において、ウェルに添加した。プレートを１時間、３７℃でインキュベーションし、よく洗浄して、ヤギ抗マウス−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）共役物（Pierce, Rockford, IL）を添加した。ＲＴで１時間のインキュベーションの後、プレートを再び丁寧に洗浄し、ＨＲＰ基質（TMB substrate kit；Pierce）を添加すると、反応は１５分間続き、２ＭのＨ２ＳＯ４を添加することにより停止した。４５０ｎｍで吸光度を読みこみ、値はＧｒａｆｉｔ（Erithacus Software Ltd）を使用してプロットした。吸光度が吸光度の最大値の５０％であるときの抗原を含まない濃度は、その抗原にとっての抗体の解離定数であると考えられた。
【０２４２】
その親和性と交差反応性データを次の表で示す。これらのデータは、ここで公開されたハプテン設計ストラテジーを使用して、モノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）が、ハプテンとして天然チオラクトンのラクトン類似体に対して得られたということを証明する。ｍＡｂｓの親和性は低ナノモル濃度から高マイクロモル濃度の範囲にわたり、すべてではなくいくつかのｍＡｂｓが交差反応性を示した。いくつかのＡｂｓは、１又は２つの他の自然発生ＡＩＰｓだけでなく、元々のハプテンが設計されたときに基づいた天然のＡＩＰも認識する。
【０２４３】
0005581490.tif 000059
【０２４４】
0005581490.tif 000060
【０２４５】
0005581490.tif 000061
【０２４６】
すべての雑種細胞競合を再テストし、その平均を示す。ＡＰ４−２９Ｅ１０は５回テストし、２ｎＭから１１０ｎＭの範囲でばらつきを示すが、ほとんどは２４ｎＭあたりの値であった。
【０２４７】
アミノ酸とヌクレオチド配列を、選択したモノクローナル抗体に対して測定し、それらの配列を下記表に示す。
【０２４８】
0005581490.tif 000062
【０２４９】
0005581490.tif 000063
【０２５０】
0005581490.tif 000064
【０２５１】
0005581490.tif 000065
【０２５２】
0005581490.tif 000066
【０２５３】
＜実施例２０−他の抗ＡＩＰ抗体の評価＞
新しく得られた抗ＡＩＰ抗体、例えば抗ＡＩＰ１や抗ＡＰ３抗体のいくつかのクオラムクエンチング能力を評価した。グループＩストレイン（ＲＮ６３９０ＢとＷｏｏｄ４６）のために、競合ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＡＩＰ−１に対し高い親和性を示す２つのモノクローナル抗体、ＡＰ１−２Ｃ２とＡＰ１−１５Ｂ４をテストした。図９は、抗ＡＰ１抗体が病原性因子の発現において変化をもたらすグループＩストレインのクオラムセンシングも効果的に阻害していることを示している。加えて、グループＩＩＩストレインの一つに対する抗ＡＰ３抗体であるＲＮ８４６５をテストした。ＲＮ４８５０中のエキソタンパク質の発現が少なかったため、クオラムクエンチング効果は正確に測定されなかった。
【０２５４】
＜実施例２１−環状ペプチドに基づくワクチンの治療効果＞
環状ペプチドに基づくワクチンの効果を評価するために、以下の試験を行った。活性及び不活性ワクチン接種スケジュールは次の通りである。
【０２５５】
（活性ワクチン接種スケジュール）
初期力価：      前日（−１日）
初期免疫化：    当日（０日）                          ５０−２００μｇタンパク質
力価事前追加１：６日
追加１：        ７−１４日（初期免疫化後１−２週間）  ５０−２００μｇタンパク質
力価事前追加２：２０日
追加２：        ２１−２８日（追加１の後、１−２週間）５０−２００μｇタンパク質
攻撃前の力価：  Ｘ日（攻撃前日）
攻撃：          Ｘ日（追加２の前１週間）
（不活性ワクチン接種スケジュール）
初期力価：      前日（−１日）
免疫化：        当日（０日）                １００−１０００μｇのＩｇＧ／マウス
攻撃前の力価：  １日
攻撃：          ２日
【０２５６】
ワクチンは、静脈注射、筋肉内注射、腹腔内注射、あるいは皮下注射によって、オスで２５−３０ｇ、生後８−１２週のＢＡＬＢ／ｃラットに投与される。２０匹の動物が各治療グループに含まれる。
【０２５７】
ワクチンがその動物を致死システム攻撃から保護するかどうかを測定するために、任意の既知のａｇｒグループを伴った黄色ブドウ球菌ストレインを使用する。約１０８−１０９  Ｃ．Ｆ．Ｕ．の菌を腹腔内注射により投与する。体温と生存を１２時間ごとに測定する。１０日後の生死を本研究の終点とする。追加の詳細は上に記述する。
【０２５８】
ワクチンが動物を敗血症から保護するかどうかを決定するために、任意の既知のａｇｒグループを伴ったどれかの黄色ブドウ球菌ストレインを使用する。約１０７  −１０８  Ｃ．Ｆ．Ｕの菌を腹腔内注射により投与する。このように、黄色ブドウ球菌は、直接血液に投与され、体中へ血行性に広がる。体温と生存を１２時間ごとに測定する。１０日後の生死を本研究の終点とする。
【０２５９】
ワクチンがその動物を化膿性関節炎から保護するかどうかを決定するために、黄色ブドウ球菌ストレインＬＳ−１（ａｇｒグループに所属するネズミ順応ストレイン）、または自然に関節炎を引き起こす能力を持つ既知のａｇｒグループを持つ任意のストレインを使用する。約１０６−１０７Ｃ．Ｆ．Ｕ．の菌を腹腔内注射により投与する。体温と１２時間ごとの生存、関節腫脹（点数化）、発赤、動作パターンの変化、罹患を測定する。２８日目の生死を本研究の終点とする。
【０２６０】
ワクチンがその動物を腎膿瘍から保護するかどうかを決定するために、任意の既知のａｇｒグループの黄色ブドウ球菌を使用する。約１０６−１０７Ｃ．Ｆ．Ｕ．の菌を腹腔内注射により投与する。動物は日常生活動作、注意力、毛の状態（正常、わずかに異常、異常を０−２で記録する）に基づき評価される。加えて、腎臓は無菌的に除去され、組織学的に評価される（膿瘍形成；  ０：−視認できる膿瘍無し、１：−１つの小さな膿瘍有り、２：−いくつかの膿瘍有り、３：−激しい膿瘍腎臓）。そしてＣ．Ｆ．Ｕ数は、均質化された腎臓から回復される。７日目の生死を本研究の終点とする。
【０２６１】
同じモデルを、ワクチンが腎膿瘍を阻止できるかどうかを測定するのに使用できる。この場合、一般行動と腎臓の組織学的評価に基づく腎膿瘍が考えられる。
【０２６２】
ワクチンが体内に拡散しないように（カテーテルを定着させるのと同様に）動物を保護するかどうかを測定するために、異物モデルが使用される。カテーテルの一部はマウスの皮下スペースに埋め込まれる。２４時間後、任意の既知のａｇｒグループの黄色ブドウ球菌ストレインの懸濁液が、カテーテル用ベッドにおいて約１０６−１０８Ｃ．Ｆ．Ｕ．の皮下注射によって投与される。菌が体中に拡散し、カテーテルを定着させる能力は、体温、１２時間ごとの生存、皮下膿瘍形成、そしてさまざまな時点でカテーテルから取り出されるＣ．Ｆ．Ｕ．数を決定することによって評価される。７日目の生死を本研究の終点とする。もう一つの方法として、このモデルで定着させたカテーテルを使用できる。
【０２６３】
ワクチンがその動物を乳腺炎から保護するかどうかを測定するために、ラクティングＣＤ１マウスは、任意の既知のａｇｒグループからなる約１０２−１０４Ｃ．Ｆ．Ｕ．の黄色ブドウ球菌ストレインの乳房下部注射により投与される。乳腺からのＣ．Ｆ．Ｕ．数は、さまざまな時点で決定され、乳腺組織のＣ.Ｆ.Ｕ.／腺又はＣ.Ｆ.Ｕ.／ｇｒａｍで表される。腺中に存在する乳の量と生存を評価し、５日目の生死を本研究の終点とする。これは乳腺の炎症を引き起こす微生物乳房下部感染によって起こるウシ乳房炎の確立されたモデルである。黄色ブドウ球菌は臨床型乳房炎を引き起こすが、慢性的になりやすく従来の抗菌治療では根絶するのが難しい無症状感染は、より頻繁に起こる。
【０２６４】
＜実施例２２−ＡＰ４−ＫＬＨ保護マウスを用いた活性ワクチン接種は、致死全身黄色ブドウ球菌攻撃からマウスを保護する＞
アジュバントとしてオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮｓ）を含む非メチル−シトシン−グアノシン−ジヌクレオチド配列を含む菌ＤＮＡとともに、１００μｇの免疫抱合体を用いてマウスの腹腔内に免疫を与えた（Chuang et al., J Leukoc Biol 71：538-44 (2002).）。動物に初期のワクチン接種の７日と２１日後に追加免疫を受けさせた。血清サンプルは、抗ＡＩＰ−４抗体価分析のためにすべての動物から感染実験の前に取り除いた。
【０２６５】
３×１０８黄色ブドウ球菌ＲＮ４８５０（Park et al., Chem Biol 14: 1119-1127 (2007)）を含む０．５ｍＬのＰＢＳを腹腔内に受けたＳＫＨ１無毛マウスにおけるワクチン接種の保護効果を明らかにする結果を次の表にて要約する。
【０２６６】
0005581490.tif 000067
【０２６７】
上記で示すように、ＡＰ４−ＫＬＨ共役物を受けた６匹中４匹のマウスが、８日間の観察期間中生き続けた。反対に、ＫＬＨワクチン接種した対照マウスは６匹中１匹のみ、ＰＢＳのニセの免疫化されたマウスは６匹中２匹しか観察期間を生き延びなかった。
【０２６８】
抗体価の分析により、共役と免疫化プロトコルは、１：１０００の範囲（すなわち標準的なＥＬＩＳＡ法を使用してテストされた際に、最大シグナル強度の５０％がまだ観測される希釈物）の抗体価により免疫反応を引き起こすことが明らかとなった。この分析はまた、免疫化が、ＡＩＰ１とＡＩＰ３（抗ＡＩＰ４力価：１：６４００まで；抗ＡＩＰ１力価：１：６４００まで；抗ＡＩＰ３力価：１：３２００まで）に対する交差反応性を持ったＡＩＰ−４固有の免疫反応を引き起こすことを示した。
【０２６９】
＜実施例２３−抗ＡＩＰ抗体の評価＞
得られたすべての抗ＡＩＰ１  ｍＡｂｓを、再びグループＩ黄色ブドウ球菌ストレインＲＮ６３９０Ｂに対してテストした。図１０Ｂの結果は、多数の抗ＡＰ１抗体が、効果的に溶血素の発現の変化をもたらすグループＩ黄色ブドウ球菌のクオラムセンシングを阻害したことを示す。ｍＡｂ  ＡＰ１−１５Ｂ４（＃４）は、免疫化実験において最も強力な活性を示した。
【０２７０】
バイオフィルム形成の増加は、黄色ブドウ球菌におけるａｇｒ  ＱＳシグナル伝達阻害への応答において記述されているので、黄色ブドウ球菌ストレインＲＮ６３９０Ｂによるバイオフィルム形成をｍＡｂ  ＡＰ１−１５Ｂ４の存在下においても評価した。図１０の結果は、ｍＡｂ  ＡＰ１−１５Ｂ４の存在下における黄色ブドウ球菌ストレインＲＮ６３９０Ｂによるバイオフィルム形成の増加を示している。
【０２７１】
＜実施例２４−ファージディスプレイテクノロジーを用いたヒトｓｃＦｖ抗体の選択＞
Gao et al. (Proc Natl Acad Sci U S A. 99:12612-6 (2002))が説明する方法を用いて生成されるファージディスプレイライブラリーは、ＡＰ１−ＢＳＡ、ＡＰ３−ＢＳＡ、ＡＰ４−ＢＳＡ共役物を用いてスクリーニングされ、ヒト抗ＡＩＰ−１、ＡＩＰ−３、及び、抗ＡＩＰ−４ｓｃＦｖ抗体を識別した。抗体ディスプレイングファージ粒子を、非特異バインダーと同様に、ＢＳＡ特有クローンを除去するために最初にＢＳＡに対して除去した。４周のパニングの後、選択されたクローンを、ＢＳＡ、ＡＰ１−ＢＳＡ、ＡＰ３−ＢＳＡ、ＡＰ４−ＢＳＡに対してＤＮＡシークエンシングとＥＬＩＳＡによって分析した。ｓｃＦｖ抗体のアミノ酸配列は、可変重鎖と可変軽鎖をコード化するＤＮＡ配列であり、またｓｃＦｖ抗体をコード化するＤＮＡ配列でもあるが、これを以下に示す。
【０２７２】
0005581490.tif 000068
【０２７３】
0005581490.tif 000069
【０２７４】
0005581490.tif 000070
【０２７５】
0005581490.tif 000071
【０２７６】
0005581490.tif 000072
【０２７７】
0005581490.tif 000073
【０２７８】
0005581490.tif 000074
【０２７９】
0005581490.tif 000075
【０２８０】
0005581490.tif 000076
【０２８１】
0005581490.tif 000077
【０２８２】
0005581490.tif 000078
【０２８３】
0005581490.tif 000079
【０２８４】
0005581490.tif 000080
【０２８５】
＜実施例２５−抗ＡＩＰ４ヒトｓｃＦｖであるＡＰ４−４−２０によるＮ４８５０における溶血素発現の抑制＞
抗体ファージディスプレイライブラリーをパニングして得られた２０クローンのうち、最も強力なクローンであるＡＰ４−４−２０が大腸菌中のｓｃＦｖ抗体として発現した。発現したｓｃＦｖ抗体を純化し、黄色ブドウ球菌ＲＮ４８５０中のその溶血素発現の抑制能力を、以下の通り評価した。
【０２８６】
黄色ブドウ球菌ＲＮ４８５０を、ｓｃＦｖ  ＣＹＧＰ培地にＡＰ４−４−２０（２．７  μｍ）の存在下で、２４時間インキュベーションし、α溶血素の発現を黄色ブドウ球菌培養上澄み液を用いるウェスタン分析によって評価した。結果を図１１に示す。ｍＡｂ  ＡＰ４−２４Ｈ−１１（１．３μＭ）と無関係なｓｃＦｖ抗体対照（１０μＭ）をそれぞれ正及び負の対照として使用した。ＡＩＰ−４に特異的な抗体４−２０とＡＰ４−２４Ｈ−１１の存在下では、溶血素分泌の明らかな減少が検知でき、黄色ブドウ球菌中のＡＩＰ依存ＱＳの阻害の顕著な指標となる。
【０２８７】
＜実施例２６−抗ＡＩＰ１  ｍＡｂ  ＡＰ１−１５Ｂ４は、暴露後の治療において、マウスを致死全身性ＭＲＳＡ  ＵＳＡ３００攻撃から保護する＞
私たちの受動免疫化法の効果は、致死ブドウ球菌攻撃マウスモデルにおいて、ｍＡｂ  ＡＰ１−１５Ｂ４を用いて、暴露後のシナリオにおいて実証された。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、少なくとも１×１０８黄色ブドウ球菌ＵＳＡ３００（ａｇｒ  Ｉ  ＭＲＳＡストレイン）に感染した２時間後に、１ｍｇのＡＰ１−１５Ｂ４（腹腔内）、アイソタイプ対照ＩｇＧ又はＰＢＳを受けた。（Diep et al., Lancet 2006, 367, (9512), 731-739.）を参照。ＵＳＡ３００は事実、最も一般的な地域感染型のＭＲＳＡ（ＣＡ−ＭＲＳＡ）ストレインの一つであり、一般人と軍人にとって危険な兆候が増えていることを示す（Hageman et al., Diagn Microbiol Infect Dis 2008; James et al., Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed 2008, 93, (1), F40-4；Tenover et al., J Clin Microbiol 2006, 44, (1), 108-18; Beilman et al., Surg Infect (Larchmt) 2005, 6, (1), 87-92.）。図１２で示すように、ＡＰ１−１５Ｂ４を受けたマウス６匹のうち４匹が、４８時間の観察期間を通して生き延びた。一方、ＰＢＳ治療を受けた対照マウスは６匹中２匹、対照ＩｇＧ治療を受けたマウスでも２４時間以上は生き延びたのは、６匹中２匹しかいなかった。これらのデータは、黄色ブドウ球菌においてクオラムセンシングストラテジーにとっての治療手段の存在を初めて証明するものである。これはさらに、我々のクオラムクエンチング抗体が患者の感染後に投与できることを示すものであるため、黄色ブドウ球菌感染を予防するための我々の免疫薬物治療学アプローチの正当性を立証するものである。
【０２８８】
本明細書で引用又は言及されたすべての特許と出版物は、本発明に関連する当業者の技術レベルを指標としており、各参照特許や出版物は、全体として個々に引用することにより組み込まれるか、またはここで全体として詳細を説明される同じ範囲で引用されることにより本明細書に組み込まれているものである。出願人は、引用された特許または出版物からの任意の及び全ての資料と情報を、本明細書に物理的に含む権利を保有する。
【０２８９】
ここで述べられた特定の方法と構成は、好ましい実施形態の代表的なものであるとともに模範的なものであり、本発明の範囲を限定するように意図したものではない。他の対象物、態様、実施形態は、本明細書を考慮すればすぐに当業者に容易に思いつくものであり、特許請求の範囲により定義されたように本発明の精神の範囲内で包含される。様々な代用及び修正が本発明の範囲と精神から逸脱することなく本明細書に記載の本発明になされるということは当業者にとって自明なことである。本明細書で適切な実例として述べられた本発明は、不可欠なものとして開示されていない要素や限定がない場合でも実施してもよい。本明細書で実例として適切に述べられた方法と工程は、異なる順番や段階にて実施してもよく、本明細書又は請求項で示された順番や段階に必ずしも制限されない。本明細書又は添付の請求項で使用されたように、文脈で明確に決定できない限り、単数形  “ａ”，  “ａｎ”、“ｔｈｅ”は、複数形の引用を含む。このように、例えば、“ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ”への言及は、複数の上記抗体などを含む（例えば抗体の溶液、一連の抗体製剤）。本特許は、いかなる状態でも、特に本明細書で明らかにされた特定の実施例、実施形態又は方法に制限されると解釈されるべきものではない。いかなる状況でも、特許商標局の審査官、他の公官、職員による陳述が、特別に及び留保なく、出願人によって応答書で明確に承認されない限り、本特許は制限されるべきと解釈されるものではない。
【０２９０】
用いてきた用語と表現は、説明のための用語として使用したのであり、限定のためではない。そのような用語や表現の使用は、記載ならびに説明してきた特徴と同等あるいはそれについての一部の排除を意図するものではない。しかし、請求項として本発明の範囲内で様々な修正が可能であることは認められるものである。このように、現在の発明が好ましい実施形態と任意の特性によりはっきりと明らかになってきているが、本明細書で開示した概念の修正と変更は、当業者により行ってもかまわないものと理解される。上記の修正及び変更は、添付の請求項によって定義されるように、本発明の範囲内だと考えられる。
【０２９１】
本発明は、ここで広範及び一般的に説明されてきた。狭範な種及び一般公開される亜属の分類の各々は、本発明の一部を形成する。これは、切り取られた題材が特異的に本明細書で列挙されるべきか否かにかかわらず、任意の主題を類概念から除去するような但し書き又は消極的限定を伴う本発明の一般的記述を含む。
【０２９２】
他の実施例は以下の請求項の範囲内のものである。加えて、本発明の特徴や態様はマルクーシュグループの観点において記載されている場合、本発明はまたマルクーシュグループの個々のメンバーあるいは下位集団のメンバーの観点において記載されることを、当業者は認識する。
【０２９３】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図２Ｋ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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