(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−１５タンパク質へ連結されたＩｇＥシグナルペプチドを含む非免疫原性融合タンパク質をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子、または、ＩＬ−１５タンパク質へ連結されたＩｇＥシグナルペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子であって、ＩｇＥシグナルペプチドはＩＬ−１５と同一の種からの遺伝子からであり、そして前記核酸配列が配列番号８及び配列番号９のコーディング配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２】
融合タンパク質がＩＬ−１５タンパク質へ連結されたＩｇＥシグナルペプチドから成る、請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
前記ＩＬ−１５タンパク質が、ＩＬ−１５シグナルペプチドを含んでいないＩＬ−１５タンパク質である、請求項１または２に記載の単離された核酸分子。
【請求項４】
ＩＬ−１５タンパク質をコードする核酸配列が、ＩＬ−１５コザック領域および／またはＩＬ−１５  ５’非翻訳領域および／またはＩＬ−１５  ３’非翻訳領域を含んでいない、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項５】
さらにＣＤ４０Ｌをコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項６】
さらに免疫原をコードする核酸配列を含む、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項７】
前記免疫原が病原体抗原、癌関連抗原または自己免疫疾患に関連した細胞に連結された抗原である、請求項６に記載の単離された核酸分子。
【請求項８】
前記免疫原が病原体抗原である、請求項７に記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
前記病原体抗原が、ＨＩＶ、ＨＳＶ、ＨＣＶおよびＷＮＶから成る群より選択される病原体からである、請求項８に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】
ＩＬ−１５コード配列が、ＩＬ−１５シグナルペプチドを含んでいない、請求項１ないし９のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項１１】
ＩＬ−１５コード配列が、ＩＬ−１５コザック領域および／またはＩＬ−１５  ５’非翻訳領域および／またはＩＬ−１５  ３’非翻訳領域を含んでいない、請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項１２】
前記単離された核酸分子がプラスミドである、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項１３】
ウイルスベクター内へ組み込まれた、請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
【請求項１４】
請求項１ないし１３のいずれか１項に記載の核酸分子および免疫原をコードする核酸配列を含む核酸分子を含む組成物。
【請求項１５】
前記免疫原が病原体抗原、癌関連抗原または自己免疫疾患に関連した細胞に連結された抗原である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記免疫原が病原体抗原である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記病原体抗原が、ＨＩＶ、ＨＳＶ、ＨＣＶおよびＷＮＶから成る群より選択される病原体からである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１ないし１７のいずれか１項に記載の核酸分子およびＣＤ４０Ｌをコードするヌクレオチド配列をさらに含む核酸分子を含む組成物。
【請求項１９】
請求項６ないし１３のいずれか１項に記載の核酸分子または請求項１４−１８のいずれか１項に記載の組成物を含む、注射可能な医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１４ないし１９のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、組換えワクチン。
【請求項２１】
前記組換えワクチンが組換えワクシニアワクチンである、請求項２０に記載の組換えワクチン。
【請求項２２】
請求項１ないし１１のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、生弱毒化病原体。
【請求項２３】
ＩＬ−１５タンパク質配列へ連結されたＩｇＥシグナル配列を含む非免疫原性融合タンパク質、または、ＩＬ−１５タンパク質配列へ連結された非ＩＬ−１５シグナル配列を含む融合タンパク質であって、ＩｇＥシグナル配列はＩＬ−１５タンパク質配列と同一の種からであり、そして配列番号８及び配列番号９のコーディング配列によりコードされる、融合タンパク質。
【請求項２４】
ＩＬ−１５タンパク質配列へ連結されたＩｇＥシグナル配列から成る、請求項２３に記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
ＩＬ−１５タンパク質配列がＩＬ−１５シグナル配列を含んでいない、請求項２３または２４に記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
ヒト以外の動物の免疫応答を調節する方法であって、請求項６に記載の単離核酸分子を含む組成物をヒト以外の前記動物へ投与することを含む、前記方法。
【請求項２７】
免疫原に対するヒト以外の動物の免疫応答を誘導する方法であって、請求項７に記載の単離核酸分子を含む組成物をヒト以外の前記動物へ投与することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改良されたワクチン、免疫原に対して個体を予防的および／または療法的に免疫化するための改良された方法、そして改良された免疫療法的組成物および改良された免疫療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫療法とは、望ましい療法効果を与えるためにヒトの免疫応答を調節することを指している。免疫療法剤とは、個体に投与された場合、望ましくない免疫応答に関連する症状を最終的に減少させるため、あるいは望ましい免疫応答の増加により症状を最終的に緩和するために十分である個体の免疫系を調節する組成物を指している。ある場合、免疫療法は、免疫原（それに対して個体が免疫応答を発生する）へ個体を暴露するワクチンを個体に投与する、ワクチン接種プロトコールの一部である。こうした場合において、免疫療法は、免疫応答を増加させ、および／または、特定の状態、感染または疾患を処置するまたは予防するために望ましい免疫応答（細胞性部門または体液性部門のごとき）の一部を選択的に増進する。
【０００３】
ワクチンは、アレルゲン、病原体抗原またはヒト疾患に関与する細胞に関連する抗原のごとき標的抗原に対して、個体を免疫化するために有用である。ヒト疾患に関与する細胞に関連する抗原には、癌関連の腫瘍抗原および自己免疫疾患に関与する細胞に関連する抗原が含まれる。
【０００４】
こうしたワクチンを設計することにおいて、ワクチン接種された個体の細胞中で標的抗原を産生するワクチンが、免疫系の細胞性部門を誘導することに有効であると認められてきた。具体的には、生弱毒化ワクチン、非病原性ベクターを使用する組換えワクチン、およびＤＮＡワクチンは、各々、ワクチン接種された個体の細胞中で抗原の産生を導き、免疫系の細胞性部門の誘導を生じる。一方、死菌または不活化ワクチン、そしてタンパク質のみを含むサブユニットワクチンは、体液性応答を誘導するが、良好な細胞性免疫応答を誘導しない。
【０００５】
病原体感染に対する防御を提供するため、および病原体感染、癌、自己免疫疾患の処置のために有効な免疫仲介療法を提供するためには、細胞性免疫応答が多くの場合必要である。したがって、生弱毒化ワクチン、非病原性ベクターを使用する組換えワクチンおよびＤＮＡワクチンのごとき、ワクチン接種された個体の細胞中に標的抗原を産生するワクチンが、しばしば好ましい。
【０００６】
こうしたワクチンは、病原体感染またはヒト疾患に対して予防的あるいは療法的に個体を免疫化するためにしばしば有効であるが、改良されたワクチンが必要とされている。促進された免疫応答を産生する組成物および方法が必要とされている。
【０００７】
同様に、いくつかの免疫療法は、患者の免疫応答を調節するために有用であるが、改良された免疫療法的組成物および方法に対する要求が残っている。
【０００８】
遺伝子療法とは、タンパク質によってコードされたタンパク質を必要とする、または利益を得ることが可能な個体への遺伝子の搬送を指している。タンパク質（それに対し個体は十分なおよび／または完全に機能的なタンパク質を産生する、対応する遺伝子を有していない）を搬送するために多くの戦略が開発されてきた。それ故、遺伝子療法は、十分完全に機能する内因性タンパク質の不足を補償している。ある遺伝子療法戦略では、患者に、療法的に有効なタンパク質の量を産生するために設計された構築物を使用して、療法的に有効なタンパク質を提供する。遺伝子療法は、タンパク質療法剤を搬送するための代替法を提供する。改良された遺伝子療法組成物および方法に対する要求が残っている。
【０００９】
個体への核酸分子の直接投与に加えて、タンパク質がしばしば搬送される。組換え法によるこうしたタンパク質の産生は、しばしばそれらを製造する最も効果的な方法である。改良されたタンパク質を製造する組成物および方法に対する要求が残っている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ho, D., 1996, ＨＩＶ感染の治療：問題および見通し. Bull. New York Acad. Med. 73, 37-45 。
【非特許文献２】Finzi, D., Hermankova, M., Pierson, T., Carruth, LM., Buck C., 1997, 高度に能動的な抗ウイルス療法のＨＩＶ−１患者のための貯蔵庫の同定, Science, 278: 1295-1300 。
【非特許文献３】Wong, J., Hezareh, M., Gunthard, H., Havlir, DV., 1997, 血漿ウイルス血症の遷延性抑制にも関わらない複製適格性ＨＩＶの回復, Science, 278: 1291-1294 。
【非特許文献４】Rosenberg, ES., Altfeld, M., Poon, SH., Phillips, MN., Wilkes, BM., Eldridge, RL., Robbins, GK., D Aquilia R, T. Goulder, PJR, Walker, BD, 2000, 急性感染の早期処置後のＨＩＶ−１の免疫制御, Nature, 407: 523 。
【非特許文献５】Koup R, Safrit J, Cao Y, 1994, 原発性ヒト免疫不全ウイルス１型症候群におけるウイルス血症の初期制御に伴う免疫応答の時間的関連. J of Virol, 68: 4650-4655 。
【非特許文献６】Rinaldo C, Huang X, Fan Z, 1995, 高レベルの抗ヒト免疫不全ウイルス１型  （ＨＩＶ−１）記憶細胞障害性Ｔリンパ球活性および低ウイルス量はＨＩＶ−１感染長期非進行者における疾患の欠如に関連する, J Virol., 69: 5838-5842 。
【非特許文献７】Cao, H., Kanki, P., Sankale, J., 1997, 異なったＨＩＶ−１型クレイド間の細胞障害性Ｔリンパ球交叉反応性：ワクチン開発のための意味,J Virol; 71: 8615-8623 。
【非特許文献８】Rowland-Jones S, Nixon D, Aldhous M., 1993, ＨＩＶ−暴露されたしかし非感染の幼児におけるＨＩＶ−特異的細胞障害性Ｔ細胞活性. Lancet, 341: 860-86 。
【非特許文献９】Rowland-Jones S, Sutton J, Ariyoshi K, 1995. ＨＩＶ−暴露されたしかし非感染のガンビア女性におけるＨＩＶ−特異的Ｔ細胞．Nature Medicine, 1: 59-64 。
【非特許文献１０】Borrow, P, Lewicki, H, Wei, S, 1997, ＣＴＬ逃避ウイルスの迅速選択により示された、一次感染間にＨＩＶ−１特異的細胞障害性Ｔリンパ球により発揮された抗ウイルス圧力，Nature Medicine, 3: 205-211 。
【非特許文献１１】Borrow, R. Shaw GM, 1998, 細胞障害性リンパ球逃避ウイルス変異体は、インビボでの免疫クリアランスのウイルス逃避において重要である，Immunology Rev, 164:37-51 。
【非特許文献１２】Goulder PJ, Phillips RE, Colbert RA 1997, 免疫優性細胞障害性Ｔリンパ球応答からの後期回避はＡＩＤＳへの進行と関連する，Nature Medicine, 3; 212-217 。
【非特許文献１３】Goulder PJ, Sewell AK, Lalloo DG, 1997, ＨＬＡ  Ａ０２０１を有する二つのヒト組織適合性白血球抗原ＨＬＡ同一同胞におけるＨＩＶ−１特異的細胞障害性Ｔリンパ球応答の免疫優性パターンは、エピトープ変異により影響される．J Exp Med, 185: 1423-1433 。
【非特許文献１４】Phillips RE, Rowland-Jones, S Nixon, DF, 1991, 細胞障害性Ｔ細胞認識を回避可能なヒト免疫不全ウイルス遺伝子変動，Nature, 354; 453-459 。
【非特許文献１５】Koup, RA, 1994, ＣＴＬ認識からのウイルス回避，J Exp Med, 180; 779-782 。
【非特許文献１６】Ayyavoo, V., Mahboubi, A., Mahalingam, S., Ramalingam R., Kudchodkar, S., Williams, WV., Green, DR., Weiner, DB, 1997, ＨＩＶ−１  ｖｐｒは、核因子ＫＢの制御を通して免疫活性化およびアポトーシスを抑制する，Nature Medicine, 3: 1117-1122 。
【非特許文献１７】Kerkau, T., Bacik I., Bennink, JR., Yewdell,J W., Huning, T., Schimpll, A., Schubert, U, 1997, ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−１）ｖｐｕタンパク質は主組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子の生合成の初期工程を妨げる，J Exp Med., 185: 1295-1305 。
【非特許文献１８】Lenburg, M. E., and Landau N.R., 1993, ＣＤ４のＶＰＵ誘導分解：ＣＤ４の細胞質ドメインの特異的アミノ酸要求性，J Virol, 67: 6542-6550 。
【非特許文献１９】Anderson, S., Shugar, D.C., Swanstrom, R., Garcia, J.V., 1993, ヒト免疫不全ウイルスＩ型の一次単離物からのＮｅｆは、ヒトおよびマウスＴ細胞における表面ＣＤ４発現を抑制した，J Virol 67: 4923-4931 。
【非特許文献２０】Rosenberg, ES, Billings, JM, Caliendo, AM et al., ウイルス血症の制御に関連した活発なＨＩＶ−１特異的ＣＤ４  Ｔ細胞応答，Science, 278: 1447-1450, (1997) 。
【非特許文献２１】Kalam, SA, Walker BD., 2000, 有効な細胞障害性Ｔの維持におけるＣＤ４支援の決定的要求性；Shankar P. Russo M. Harnisch B. Patterson M. Skolnik P. Lieberman J. 慢性ヒト免疫不全ウイルス感染における循環ＨＩＶ−特異的ＣＤ８（＋）Ｔ細胞の損なわれた機能，Blood. 96(9): 3 094-101 。
【非特許文献２２】Murali-Krishna, K., Lau., LL., Sambliara, S., Lemonnier, F., Altman, J., Ahmed, R., 1999, ＭＨＣクラスＩ−欠損マウスにおける記憶ＣＤ８  Ｔ細胞の残留性，Science, 286: 1377-1383 。
【非特許文献２３】Tagaya, Y., Bamford, RN., Defilippis, AP, Waldmann, TA., 1996, ＩＬ−１５：その発現が複数の経路で制御されている、多様なレセプター／シグナリング経路を有する多面的サイトカイン，Immunity 4: 329-336 。
【非特許文献２４】Chang, KH, Kim, JM, Kim HY, Sorig, YG, Choi, YH, Park, YS, Cho, JH, Hong, SK., 2000, ＨＩＶ−１感染人間からの末梢血単球細胞の自発的、プログラムされた細胞死はＩＬ−１５で減少する，Yonsei Medical Journal, 41: 112-118 。
【非特許文献２５】Naora H., Gougeon, ML., 1999, 外来性ｌ−１５によるＨＩＶ感染個体のナチュラルキラー集団の増進した生存および強力な拡大，ImmunologyLetters, 68: 359-367 。
【非特許文献２６】Lin, SJ, Roberts, RL, Ark, BJ, Nguyen, OH, Thomas, EH, Stichn, ER., 1997, ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１型ＧＰ１２０−特異的細胞仲介細胞障害性インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５，Clin. Imm. Immpath, 82: 163-173 。
【非特許文献２７】Loubeau, M., Ahmad A., Toma E , Menezes, J., 1997, Jo. 組換えＩＬ−１５によるＨＩＶ−感染患者の末梢単核細胞のナチュラルキラーおよび抗体依存性細胞障害性活性の増進，AIDS 16: 137-145 。
【非特許文献２８】Kacani, L., Sprizl GM., Erdei, A., Dierich, MP, 1999, インビトロにおいてインターロイキン−１５はＨＩＶ−１駆動ポリクローナルＢ細胞応答を増進する，Exp and Clin Immun, 16: 167-179 。
【非特許文献２９】Kacani, L., Stoiber H., Dierich, MP, 1997, ＨＩＶ−１関連高ガンマグロブリン貧血症におけるＩＬ−１５の役割，Clin Exp Imm 108: 14-18 。
【非特許文献３０】Agostini, C., Zambello, R., Perrin A., Piazzo, F., Siviero, M., Basso, U., Borfolin, M., Trentin L., Semenatao, G., 1999, ヒト免疫不全ウイルス感染の患者の血管外組織におけるＣＤ８  Ｔ細胞浸潤。インターロイキン１５はＴ細胞相互作用の抗原提示細胞に関係する同時刺激経路を上方調節する，Blood,93: 1277-1286 。
【非特許文献３１】Patki, AH., Quinone S., Mateo, ME., Dorazio, D., Yen-Lieberman B., Boom WH, Thomas, EK., Ledermann MM, 1996, ヒト免疫不全ウイルス−１拡大を誘導することができるインターロイキン−２の分裂促進的効果を伴わない、インターロイキン−１５による抗原誘導リンパ球増殖の活性化，JCI, 98: 616-621 。
【非特許文献３２】Lucey DR., Pinto LA, Bethke, FR., Rusnak J., Mekher GP, Hashemi, FN, Landay, AL., Kessler, HA, Paxton, RJ., Grabstein, K., Shearer GM., 正常ドナーおよびヒト免疫不全ウイルス１型感染患者からの末梢血単核細胞に対するインターロイキン−１５のインビトロでの免疫学的およびウイルス学的効果，Clin Diagn Lab Imm, 4: 43-48 。
【非特許文献３３】Kim, JJ. Trivedi, NN., Nottingham, LK., Morrison, L., Tsai, A., Hu, Y., Mahalingarn, S., Dang, K., Alm, L., Doyle, NK., Wilson, D., Chattergoon, MA., Chalian, AA., Boyer, JD., Agadjanyan, M., Weiner, DB., 1998, ＤＮＡ免疫原を含むカセットの同時投与によるインビボ免疫応答の振幅および方向性の調節，Eur.J Immunol. 28: 1089-1103 。
【非特許文献３４】Kim JJ. Tsai A. Nottingham LK. Morrison L. Cunning DM. Oh J. Lee DJ. Dang K. Dentchev T. Chalian AA. Agadjanyan MG. Weiner DB, 1999, 細胞内接着分子−１はインビボでベータ−ケモカインを調節しそして直接Ｔ細胞を同時刺激する，Journal of Clinical Investigation. 103: 869-77 。
【非特許文献３５】Mata, M., Travers, PJ. Liu, Q., Frankel, FR., Paterson, Y., 1998, Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＨＩＶ−１  ｇａｇへのＭＨＣクラスＩ制限免疫応答は、予想可能なＭＨＣ結合モチーフを有していない単一エピトープを選択し、そしてＰＳのグルタミンおよびポケットＤ間の相互作用を通してＫｄへ結合する，J of Immun., 161: 2985-2993 。
【非特許文献３６】McCarrick III JW, Parties JR, Seong RH, Solter D, Knowles BB. 1993, マウス胚性幹細胞におけるジフテリア毒素Ａ鎖遺伝子で標的化されている陽性−陰性選択遺伝子，Transgenic Res 2: 183-190 。
【非特許文献３７】Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ，Ｃ．，Ｒｏｃｈａ，Ｂ．，Ｔａｎｃｈｏｔ，Ｃ．，ＣＤ８＋  Ｔ細胞記憶の発生におけるＣＤ８＋  Ｔ細胞上のＣＤ４０拡大のための役割，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：２０６０−２０６３。
【非特許文献３８】Sin JI. Kim JJ. Zhang D. Weiner DB. プラスミドＣＤ４０Ｌによる細胞性応答の調節：ＣＤ４０Ｌプラスミドベクターはインビボでヘルペス単純ウイルス２型に対する、抗原特異的ヘルパーＴ細胞１型ＣＤ４＋  Ｔ細胞仲介保護的免疫を増進する，Human Gene Therapy. 12: 1091-102, 2001 。
【非特許文献３９】Zhang, X., Sun, S., Hwang, I., Tough, DF. Sprent, 1998, J. Immunity, 8: 591-599 。
【非特許文献４０】Ku, CC., Murakami, M., Sakamoto, A., Kappler, J., Marrack. P., 2000, 対抗するサイトカインによるＣＤ８記憶Ｔ細胞のホメオスタシスの制御，Science, 288: 675-678 。
【非特許文献４１】Manjunath, N., Shankar,P., Wan,J., Weninger,W., Crowley,MA. Hieshmina, K., Springer,TA., Fan, X., Shen, H., Lieberman, J., von Andrian, UH., 2001,記憶細胞障害性Ｔリンパ球の発生のためには、エフェクター分化は必須ではない，Journal of Clinical Investigation,108:871-878 。
【非特許文献４２】Moore AC. Kong WP. Chakrabarti BK. Nabel GJ. マウスにおいてのヒト免疫不全ウイルスＤＮＡワクチンに対する免疫応答における抗原および遺伝子アジュバントの効果，Journal of Virology.76(1):243-50, ２００２年１月。
【非特許文献４３】Serbina NV. Lazarevic V.Flynn JL 2001, ＣＤ４（＋）Ｔ細胞は結核菌感染間の細胞障害性ＣＤ８（＋）Ｔ細胞の発生に必要とされる，Journal of Immunology. 167: 6991-7000 。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、免疫原をコードする核酸配列およびＩＬ−１５タンパク質配列へ連結された非ＩＬ−１５シグナル配列を含む融合タンパク質をコードする核酸配列、および所望により、ＣＤ４０Ｌをコードする核酸配列、を含む核酸分子を含む組換えワクチン；およびこうした組換えワクチンを個体に投与することを含む、免疫原に対する個体を免疫化する方法に関する。
【００１２】
本発明は、ＩＬ−１５タンパク質配列へ連結された非ＩＬ−１５シグナル配列を含む融合たんぱく質をコードする核酸配列、および所望により、ＣＤ４０Ｌをコードする核酸配列を含む核酸分子、を含む生弱毒化病原体；個体を免疫化する方法；およびこうした生弱毒化病原体を個体に投与することを含む、病原体に対して個体を免疫化する方法に関する。
【００１３】
本発明は、ＩＬ−１５タンパク質をコードする核酸配列およびＣＤ４０Ｌタンパク質をコードする核酸配列、および所望により、免疫原をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子に関する。
【００１４】
本発明は、ＩＬ−１５タンパク質配列をコードする核酸配列を含む核酸分子およびＣＤ４０Ｌタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子、そして免疫原をコードする核酸分子を、どちらかまたは両方の核酸分子上に含む組成物に関する。
【００１５】
本発明は、ＩＬ−１５タンパク質をコードする核酸配列およびＣＤ４０Ｌタンパク質をコードする核酸配列を含む、一つまたはそれより多い核酸分子を含む組成物を個体に投与することを含む、個体において免疫応答を調節する方法に関する。多様な異なったタンパク質をコードする多様な核酸配列は、同一核酸分子および／または異なった核酸分子、あるいは両方に存在することができる。
【００１６】
本発明は、ＩＬ−１５タンパク質配列をコードする核酸配列および免疫原をコードする核酸配列、およびＣＤ４０Ｌタンパク質をコードする核酸配列を含む一つまたはそれより多い核酸分子を含む組成物を個体に投与することを含む、個体において免疫原に対する免疫応答を誘導する方法に関する。多様な異なるタンパク質をコードする多様な核酸配列は、同一核酸分子および／または異なる核酸分子、あるいはその組合せに存在することができる。
【００１７】
本発明は、免疫原をコードする核酸配列、ＩＬ−１５タンパク質配列をコードする核酸配列およびＣＤ４０Ｌをコードする核酸配列を含む核酸分子、を含む組換えワクチン；そしてこうした組換えワクチンを個体に投与することを含む、免疫原に対して個体を免疫化する方法に関する。
【００１８】
本発明は、ＩＬ−１５タンパク質配列をコードする核酸配列およびＣＤ４０Ｌをコードする核酸配列を含む核酸分子を含む生弱毒化病原体；そしてこうした生弱毒化病原体を個体に投与することを含む、病原体に対して個体を免疫化する方法に関する。
【００１９】
本発明は、非ＩｇＥタンパク質配列へ連結されたＩｇＥシグナルペプチドからなる融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子に関し、ここにおいてＩｇＥシグナルペプチドおよび非ＩｇＥタンパク質配列は同一動物種に由来する。
【００２０】
本発明は、非ＩｇＥタンパク質配列へ連結されたＩｇＥシグナルペプチドからなる融合タンパク質をコードする核酸配列を含むインビトロ宿主細胞で機能可能な発現ベクターを含むインビトロ宿主細胞培養；こうした核酸分子；そしてこうしたベクターを含む宿主細胞に関する。
【００２１】
本発明は、発現に必要とされる制御要素へ機能可能なように連結された非ＩｇＥタンパク質配列へ連結されたＩｇＥシグナルペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸配列、および発現に必要とされる制御要素へ機能可能なように連結された免疫原をコードする核酸配列を含む核酸分子に関する。
【００２２】
本発明は、非ＩｇＥタンパク質配列へ連結されたＩｇＥシグナルペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子および免疫原をコードする核酸配列を含む核酸分子、を含む組成物に関し、ここにおいて融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子は、免疫原をコードする核酸配列を含む核酸分子と同一ではない。
【００２３】
本発明は、非ＩｇＥタンパク質配列へ連結されたＩｇＥシグナルペプチドを含む単離された融合タンパク質に関する。
【００２４】
本発明は、免疫調節タンパク質へ連結されたＩｇＥシグナルペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子を含む組成物を、個体に投与することを含む、個体において免疫応答を調節する方法に関する。
【００２５】
本発明は、免疫調節タンパク質へ連結されたＩｇＥシグナルペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸配列および免疫原をコードする核酸配列、を含む核酸分子を個体に対する投与することを含む、個体において免疫原に対する免疫応答を誘導する方法に関する。異なったタンパク質の多様なコード配列は、同一核酸分子および／または異なった核酸分子に存在することができる。
【００２６】
本発明は、免疫原をコードする核酸配列および免疫調節タンパク質へ連結されたＩｇＥシグナル配列を含む融合タンパク質をコードする核酸配列、を含む核酸分子を含む組換えワクチン；そしてこうした組換えワクチンを個体に投与することを含む、免疫原に対して個体を免疫化する方法に関する。
【００２７】
本発明は、免疫調節タンパク質へ連結されたＩｇＥシグナル配列を含む融合タンパク質をコードする核酸配列、を含む核酸分子を含む生弱毒化病原体；そしてこうした生弱毒化病原体を個体に投与することを含む、病原体に対して個体を免疫化する方法に関する。
【００２８】
本発明は、ＩＬ−１５タンパク質配列へ連結されたＩｇＥシグナルペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子；こうした核酸分子を含むベクター；そしてこうしたベクターを含む宿主細胞に関する。
【００２９】
本発明は、ＩＬ−１５タンパク質配列へ連結されたＩｇＥシグナルペプチドを含む融合タンパク質に関する。
【００３０】
本発明は、ＩＬ−１５タンパク質配列へ連結されたＩｇＥシグナルペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子、および免疫原をコードする核酸配列を含む核酸分子を含む、組成物に関する。所望により、ＣＤ４０Ｌをコードする核酸配列は、融合タンパク質および／または免疫原をコードする核酸配列を含む核酸分子中、あるいは別の核酸分子中に存在することができる。
【００３１】
本発明は、ＩＬ−１５タンパク質配列へ連結されたＩｇＥシグナルペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸配列、および所望により、ＣＤ４０Ｌをコードする核酸配列を含む、一つまたはそれより多い核酸分子を含む組成物を個体に対する投与することを含む、個体において免疫応答を調節する方法に関する。多様な異なったタンパク質をコードする多様な核酸配列は、同一核酸分子および／または異なった核酸分子、あるいは両方に存在することができる。
【００３２】
本発明は、ＩＬ−１５タンパク質配列へ連結されたＩｇＥシグナルペプチドを含む融合タンパク質をコードする核酸配列、免疫原をコードする核酸配列、そして所望により、ＣＤ４０Ｌをコードする核酸配列を含む、一つまたはそれより多い核酸分子を含む組成物を個体に対する投与することを含む、個体において免疫原に対する免疫応答を誘導する方法に関する。多様な異なったタンパク質をコードする多様な核酸配列は、同一核酸分子および／または異なった核酸分子またはその組み合わせに存在することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１はＩＬ−１５およびＣＤ３に対するモノクローナル抗体でヒトＰＢＭＣを刺激した後のＩＦＮ−γの産生を示している、実施例１からのデータを示す。ＰＢＭＣは、三重療法（ＨＡＡＲＴ）で処置されているＨＩＶ−１慢性感染対象から得た。すべてのドナーのウイルス量は５００コピー／ｍｌ以下であり、そしてそのＣＤ計数は５００細胞／ｍｌより上であった。エフェクタ−機能の指標として、ＩＬ−１５がＩＦＮ−γ産生を増進しているかどうかを決定するため、細胞をＩＬ−１５および抗ＣＤ３で刺激し、そして標準ＥＬＩｓｐｏｔアッセイにより分析した。
【図２】図２はＩＬ−１５およびＣＤ３に対するモノクローナル抗体でのヒトＰＢＭＣ刺激後のＩＦＮ−γの産生が主にＣＤ８仲介であることを示している、実施例１からのデータを示す。図１で説明されたように、三重療法（ＨＡＡＲＴ）で処置されているＨＩＶ−１慢性感染対象からのＰＢＭＣのＣＤ４かまたはＣＤ８を枯渇させ、そして次ぎにＩＬ−１５および抗ＣＤ３で刺激し、そして標準ＥＬＩｓｐｏｔアッセイにより分析した。
【図３Ａ】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄは、ＨＩＶ−１ペプチドおよびＩＬ−１５でのヒトＰＢＭＣ刺激後のＩＦＮ−γの抗原特異的産生を示している、実施例１からのデータを示す。三重療法（ＨＡＡＲＴ）で処置されているＨＩＶ−１慢性感染対象から得たＰＢＭＣを、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５（図３Ａおよび３Ｃ）およびＩＬ−１５と組み合わせたＨＩＶ−１  Ｇａｇタンパク質（図３Ｂおよび３Ｃ）に応答してＩＦＮ−γを分泌する能力で、標準ＥＬＩｓｐｏｔアッセイにより分析した。
【図３Ｂ】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄは、ＨＩＶ−１ペプチドおよびＩＬ−１５でのヒトＰＢＭＣ刺激後のＩＦＮ−γの抗原特異的産生を示している、実施例１からのデータを示す。三重療法（ＨＡＡＲＴ）で処置されているＨＩＶ−１慢性感染対象から得たＰＢＭＣを、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５（図３Ａおよび３Ｃ）およびＩＬ−１５と組み合わせたＨＩＶ−１  Ｇａｇタンパク質（図３Ｂおよび３Ｃ）に応答してＩＦＮ−γを分泌する能力で、標準ＥＬＩｓｐｏｔアッセイにより分析した。
【図３Ｃ】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄは、ＨＩＶ−１ペプチドおよびＩＬ−１５でのヒトＰＢＭＣ刺激後のＩＦＮ−γの抗原特異的産生を示している、実施例１からのデータを示す。三重療法（ＨＡＡＲＴ）で処置されているＨＩＶ−１慢性感染対象から得たＰＢＭＣを、２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５（図３Ａおよび３Ｃ）およびＩＬ−１５と組み合わせたＨＩＶ−１  Ｇａｇタンパク質（図３Ｂおよび３Ｃ）に応答してＩＦＮ−γを分泌する能力で、標準ＥＬＩｓｐｏｔアッセイにより分析した。
【図３Ｄ】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃおよび３Ｄは、ＨＩＶ−１ペプチドおよびＩＬ−１５でのヒトＰＢＭＣ刺激後のＩＦＮ−γの抗原特異的産生を示している、実施例１からのデータを示す。ＣＤ８を枯渇させ、そしてＨＩＶ−１ペプチドおよびＩＬ−１５での刺激後のＩＦＮ−γ産生を同様に評価した（図３Ｄ）。
【図４】図４、パネルＡ、ＢおよびＣは、ＨＩＶ−１  ＤＮＡワクチンおよびＩＬ−１５で免疫化後の、ＨＩＶ−１抗原特異的細胞性免疫応答を示している、実施例１からのデータを示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスは、５０μｇのｐＣｅｎｖまたはｐＣｇａｇと共に５０μｇのｐＩＬ−１５、ＩＬ−１５発現プラスミドを、０および２週目に同時注射した。脾臓細胞を、最終免疫化の２週間後に採取した。図４、パネルＡにおいて、ＨＩＶ−１外被組換えワクシニア感染Ｐ８１５細胞に対するＣＴＬ活性を、標準クロム放出アッセイにより、脾臓細胞を試験した。図４、パネルＢにおいて、ＨＩＶ−１抗原特異的ケモカイン分泌のレベルを分析した。脾臓細胞は、ＨＩＶ−１外被組換えワクシニア感染Ｐ８１５細胞で刺激した。３日目に上清を採取し、ＭＩＰ−１βの分泌を試験した。図４、パネルＣにおいて、ＩＦＮ−ガンマの抗原特異的分泌のレベルを評価した。脾臓細胞を５ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。１００μｌを９６ウェルマイクロタイター平底プレートの各ウェルへ加えた。組換えｐ２４タンパク質をウェルに三通りで加えると、５μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌの最終濃度を生じる。細胞は５％ＣＯ２中、３７℃で３日間インキュベートし、そして上清を採取した。分泌されたサイトカインのレベルは、商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキットを使用して決定した。
【図５】図５、パネルＡおよびＢは、Ｔｈ１サイトカインの細胞内染色を示している、実施例１からのデータを示す。マウスにｐＣｇａｇ単独かまたはｐＣｇａｇにｐＩＬ−１５を加えたものを２回注射した。一週間後、脾臓細胞を採取し、そしてｐ５５ペプチドプール（１１ａａの重複でＨＩＶ−１  ｐ５５に広がる１２２の１５ｍｅｒを含んでいる）およびブレフェルジンＡを含んでいる培地中で５時間、インビトロで培養した。刺激後、細胞を、抗マウスＣＤ３および抗マウスＣＤ８抗体で細胞外から、そして次ぎに抗マウスで細胞内的に染色した。図５、パネルＡはＩＦＮ−γのデータを示している。図５、パネルＢは、腫瘍壊死因子−αのデータを示している。ドットプロットはＣＤ３＋／ＣＤ８＋リンパ球からの応答を示している。
【図６】図６は、マウスＴヘルパー細胞増殖アッセイにおける、実施例１からのデータを示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスは、０および２週目に、５０μｇのｐＣｇａｇまたはｐＣｅｎｖ、およびＩＬ−２Ｒ依存性Ｔｈ１サイトカインＩＬ−２またはＩＬ−１５を発現する５０μｇのプラスミドを同時ワクチン接種した。５ｘ１０５細胞を含んでいる１００μｌを直ちに９６ウェルマイクロタイター平底プレートの各ウェルへ加えた。組換えｐ２４タンパク質をウェルに三通りで加えると、５μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌの最終濃度を生じる。刺激指数を決定した。自発的カウントウェルは無関係タンパク質対照として働く１０％ウシ胎児血清を含んでいる。同様に、ｐＣＧａｇまたは対照は、無関係ｇｐ１２０タンパク質に対して１のＳＩを常に有している。細胞が健康であるのを確かめるため、ＰＨＡまたはｃｏｎＡ（Ｓｉｇｍａ）をポリクローナル刺激物質陽性対照として使用した。
【図７】図７は、ＤＮＡワクチンｐＣｇａｇでの免疫化後の、Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＧａｇのエピトープマッピングにおける、実施例１からのデータを示す。Ｂａｌｂ／ｃマウスは、０および２週目に、５０μｇのｐＣｇａｇおよび５０μｇのｐＩＬ−１５プラスミドまたは、遺伝子ＩＬ−１５を発現するベクター主鎖あるいはベクター主鎖とを同時注射した。脾臓細胞を単離し、そして一連のペプチドを使用する標準ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ用に設定した。ペプチドを、マトリックス形式で一連の２２のプールに混合し、ＩＦＮ−γを産生するように細胞を活性化する能力で試験した。
【図８】図８、パネルＡ、ＢおよびＣは、ＣＤ４ノックアウトマウス由来の脾臓細胞刺激後の、ＩＦＮ−γの産生を示している、実施例１からのデータを示す。図８、パネルＡにおいて、Ｂａｌｂ／ｃマウスは、５０μｇのｐＣｅｎｖまたはｐＣｇａｇと共に５０μｇのｐＩＬ−１５、ＩＬ−１５発現プラスミドを、０および２週目に同時注射した。脾臓細胞を、最終免疫化の２週間後に採取し、そしてＥＬＩＳＰＯＴによりＩＦＮ−γのＨＩＶ−１特異的産生を試験した。図８、パネルＢにおいては、Ｃｄ４ｔｍ１Ｋｍｖマウスを、ＩＬ−１５と共にまたはなしで、ｐＣｇａｇで免疫した。図８、パネルＢにおいては、Ｃｄ４ｔｍ１Ｋｍｖマウスを、ＩＬ−１５かまたはＣＤ４０Ｌ、またはその両方と組み合わせたｐＣｇａｇで免疫した。脾臓細胞を最終免疫化の２週間後に採取し、そしてＨＩＶ−１  Ｇａｇペプチドでのインビトロ刺激後に、ＩＦＮ−ガンマのＨＩＶ−１  Ｇａｇ特異的産生をアッセイした。
【図９】図９は、ワクチン部位でのＩＬ−１５およびＣＤ４０Ｌの局所的産生が、ＣＤ８エフェクターＴ細胞の拡大のためのＴ細胞支援の要求性と置換可能であることを示している、実施例２のデータを示す。
【図１０】図１０は実施例３に示した開示を参照されたい。
【図１１】図１１は実施例３に示した開示を参照されたい。
【図１２】図１２、パネルＡ−Ｃは実施例３に示した開示を参照されたい。
【図１３】図１３、パネルＡ−Ｂは実施例３に示した開示を参照されたい。
【図１４】図１４は実施例３に示した開示を参照されたい。
【図１５】図１５は実施例３に示した開示を参照されたい。
【図１６】図１６は実施例４に示した開示からのデータを参照されたい。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
好ましい態様の詳細な説明
定義
本明細書において、用語「標的タンパク質」とは、免疫応答のための標的タンパク質として働く本発明の遺伝子構築物によりコードされているペプチドとタンパク質を指すことを意味する。用語「標的タンパク質」および「免疫原」は同義的に用いられ、免疫応答を惹起可能であるタンパク質を指している。標的タンパク質は、病原体または、癌細胞のごとき望ましくない細胞型あるいは免疫応答が望まれる自己免疫疾患に関与する細胞からのタンパク質と、少なくとも一つのエピトープを共有する免疫原性タンパク質である。標的タンパク質に対する免疫応答は、標的タンパク質が関連する特定の感染または疾患に対して個体を保護するおよび／または個体を処置するであろう。
【００３５】
本明細書において、用語「遺伝子の構築物」とは、標的タンパク質または免疫調節タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子に関する。コード配列は、核酸分子が投与された個体の細胞中での発現を指示可能なプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む制御要素に機能可能であるように連結された開始および終止シグナルを含む。
【００３６】
本明細書において、用語「発現可能形」とは、個体の細胞中に存在する場合にコード配列が発現されるであろうように、標的タンパク質または免疫調節タンパク質をコードしているコード配列へ機能可能なように連結された必須制御要素を含んでいる遺伝子構築物を指している。
【００３７】
本明細書において、用語「エピトープを共有している」とは、別のタンパク質のエピトープと同一であるまたは実質的に同じである少なくとも一つのエピトープを含むタンパク質を指している。
【００３８】
本明細書において、用語「実質的に同じであるエピトープ」とは、タンパク質のエピトープとは同一の構造を持ってはいないが、それにも関わらず、そのタンパク質と交叉反応する細胞性または体液性免疫応答を引き起こすエピトープを指すことを意味している。
【００３９】
本明細書において、用語「細胞内病原体」とはその生殖または生活環の少なくとも一部で、宿主細胞内に存在し、そしてその中で病原性タンパク質を産生するまたは産生を引き起こすウイルスまたは病原性生物体を指すことを意味している。
【００４０】
本明細書において、用語「過増殖性疾患」とは細胞の過増殖により特徴付けられるような疾患および障害を指していることを意味している。
【００４１】
本明細書において、用語「過増殖性関連タンパク質」とは過増殖性疾患に関連するタンパク質を指していることを意味している。
【００４２】
本明細書において、用語「免疫調節タンパク質」とは、免疫調節タンパク質が搬送されるヒトの免疫システムを調節するタンパク質を指している。免疫調節タンパク質の例には次のものが含まれる：ＩＬ−１５、ＣＤ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ；ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ  ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０  ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、Ｆ４６１８１１またはＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＣＤ３０、ＣＤ１５３（ＣＤ３０Ｌ）、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ１、ＪＮＫ２、ＪＮＫ１Ｂ２、ＪＮＫ１Ｂ１、ＪＮＫ２Ｂ２、ＪＮＫ２Ｂ１、ＪＮＫ１Ａ２、ＪＮＫ２Ａ１、ＪＮＫ３Ａ１、ＪＮＫ３Ａ２、ＮＦ−カッパ−Ｂ２、ｐ４９スプライス形、ＮＦ−カッパ−Ｂ２、ｐ１００スプライス形、ＮＦ−カッパ−Ｂ２、ｐ１０５スプライス形、ＮＦ−カッパ−Ｂ  ５０Ｋ鎖前駆体、ＮＦｋＢ  ｐ５０、ヒトＩＬ−１  α、ヒトＩＬ−２、ヒトＩＬ−４、マウスＩＬ−４、ヒトＩＬ−５、ヒトＩＬ−１０、ヒトＩＬ−１５、ヒトＩＬ−１８、ヒトＴＮＦ−α、ヒトＴＮＦ−β、ヒトインターロイキン１２、ＭａｄＣＡＭ−１、ＮＧＦ  ＩＬ−７、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ−Ｒ、Ｆａｓ、ＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−４、ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−３、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−１、ＰＥＣＡＭ、Ｐ１５０．９５、Ｍａｃ−１、ＬＦＡ−１、ＣＤ３４、ＲＡＮＴＥＳ、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１α、Ｅ−セレクトン、ＣＤ２、ＭＣＰ−１、Ｌ−セレクトン、Ｐ−セレクトン、ＦＬＴ、Ａｐｏ−１、Ｆａｓ、ＴＮＦＲ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４（ＴＲＡＩＬ）、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、ＩＣＥ、ＶＬＡ−１およびＣＤ８６（Ｂ７．２）。
【００４３】
概説
本発明は以下の発見に起因する。１）ＩＬ−１５タンパク質発現レベルは、発現されるＩＬ−１５タンパク質が、「一部切除されている（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）」ＩＬ−１５タンパク質であろうと、あるいは非ＩＬ−１５シグナルペプチド、特にＩｇＥシグナルペプチドに連結されたＩＬ−１５タンパク質配列を含む融合タンパク質であろうと、ＩＬ−１５シグナルペプチドが存在しない場合により高い。ＩＬ−１５シグナルペプチドを含まないＩＬ−１５タンパク質は、「一部切除されている」ＩＬ−１５タンパク質であろうと、非ＩＬ−１５シグナルペプチド、特にＩｇＥシグナルペプチドに連結されたＩＬ−１５タンパク質配列を含む融合タンパク質であろうと、ワクチンにおいてそして免疫調節タンパク質として、ＩＬ−１５タンパク質の搬送のための構築物において特に有用である。２）ＣＤ４０Ｌと組み合わされたＩＬ−１５の搬送を含む、ワクチンおよび免疫調節組成物は特に有用である。３）ＩｇＥシグナルペプチドを含む融合タンパク質は増進された発現を容易にし、そして中でも、タンパク質産生、ワクチンおよび免疫調節タンパク質ごときタンパク質の搬送のための遺伝子治療学において特に有用である。いくつかの好ましい態様において、本発明は、ＩＬ−１５シグナルペプチドを含まないそして好ましくはＩＬ−１５コザック（Ｋｏｚａｋ）領域および非翻訳領域を含まない、ヒトＩＬ−１５コード配列を含むタンパク質；あるいはヒトＩＬ−１５コード配列が非ＩＬ−１５シグナルペプチド、好ましくはＩｇＥシグナル配列と共に提供されている融合タンパク質、をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む、ベクター、ワクチンおよび免疫調節組成物および方法を提供する。ＩＬ−１５コード配列は、好ましくはＩＬ−１５コード配列を含まず、そして好ましくはＩＬ−１５コザック領域および非翻訳領域を含んでいない。いくつかの好ましい態様において、本発明は、ＩＬ−１５シグナルペプチド含んでいないＩＬ−１５タンパク質、あるいはヒトＣＤ４０Ｌをコードするヌクレオチド配列と組み合わされた、ＩｇＥシグナルペプチドのごとき非ＩＬ−１５シグナルペプチドに連結されたＩＬ−１５タンパク質配列を含む融合タンパク質のごとき、ＩＬ−１５をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む、ベクター、ワクチンおよび免疫調節組成物および方法を提供する。ＩＬ−１５コード配列は、好ましくはＩＬ−１５コード配列を含まず、そして好ましくはＩＬ−１５コザック領域および非翻訳領域を含んでいない。いくつかの好ましい態様において、本発明は、ＩｇＥシグナルペプチドが非ＩｇＥタンパク質配列、好ましくはヒトＩＬ−１５タンパク質配列へ連結された融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む、ベクター、ワクチンおよび免疫調節組成物および方法を提供する。
【００４４】
非ＩｇＥタンパク質と連結されたＩｇＥシグナル配列を含む融合タンパク質およびその配列をコードする遺伝子構築物
本発明の一般的側面は、非ＩｇＥタンパク質と連結されたＩｇＥシグナル配列を含む融合タンパク質および、その配列をコードする遺伝子構築物、そして発現ベクター、ワクチンおよび免疫調節組成物におけるこうした構築物の使用に関する。この側面に関していくつかの異なった態様および形態が提供される。
【００４５】
いくつかの態様に従うと、非ＩｇＥタンパク質配列に機能可能であるように連結されたＩｇＥシグナル配列を含む融合タンパク質をコードする核酸配列を含む単離された核酸分子を含む組成物が提供される。
【００４６】
非ＩｇＥタンパク質の性質は、構築物の意図された使用に依存する。例えば、遺伝子療法態様のためには、タンパク質配列は、機能するまたは完全に機能するタンパク質の十分な量が患者には欠乏しているタンパク質のごとき、望まれるタンパク質の配列であろう。この型の例には、ＤＮＡｓｅのごとき酵素、成長ホルモン（ヒト、ウシ、ブタ）のごとき成長因子、凝固因子、インスリン、ジストロフィンなどが含まれる。望まれるタンパク質はまた、患者で発現された場合、エリスロポエチン、ＩＬ−２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＰＡなどのごとき、治療的な利益を提供するものであることができる。いつくかの態様において、非ＩｇＥタンパク質配列は免疫原である。こうした構築物は、免疫原の発現が免疫応答の標的として提供されるワクチンにおいて有用である。いくつかの態様において、非ＩｇＥタンパク質配列は免疫調節タンパク質である。こうした構築物は、免疫原の発現が免疫応答の標的として提供されるワクチン、ならびに望まれる効果が、患者の免疫系または、処置されている患者の状態に依存して上方制御または下方制御された免疫系の特定の側面を有するための免疫調節組成物、において有用である。免疫系を上方制御する免疫調節剤は、例えば、免疫抑制または感染性疾患を罹患している患者を処置するために有用であり、一方、免疫系を下方制御する剤は、例えば、免疫抑制が望まれる自己免疫疾患、臓器移植、移植組織片または細胞療法を受けている患者を処置するために有用である。いくつかの態様において、ＩｇＥシグナルペプチドを、ＩｇＥタンパク質の産生が望まれるシステムにおける使用のために、非ＩｇＥタンパク質配列に連結する。好ましい態様において、ＩｇＥシグナルペプチドは、それが連結されるタンパク質配列と同一の動物種から誘導する。好ましい方法において、こうした構築物を投与されている動物は、ＩｇＥシグナルペプチドおよびタンパク質配列が誘導された動物と同一種である。こうした融合タンパク質は、非免疫性であると考えられるであろう。
【００４７】
いくつかの態様において、免疫調節タンパク質である非ＩｇＥタンパク質配列に連結された、ＩｇＥシグナルのコード配列を含む構築物を含む組成物はまた、免疫原をコードする核酸配列である同一の核酸分子または異なる核酸分子も含むことができる。一般に、以下に議論される免疫原は、アレルゲン、病原体抗原、癌関連抗原または自己免疫疾患に関連する細胞に連結された抗原を含む任意の免疫原性タンパク質である。好ましい態様において、免疫原は病原体抗原、最も好ましくは、ＨＩＶ、ＨＳＶ、ＨＣＶおよびＷＮＶから成る群より選択された病原体である。
【００４８】
上で述べたように、非ＩｇＥタンパク質配列は、好ましくはＩＬ−１５タンパク質、より好ましくはＩＬ−１５シグナル配列を含まないＩＬ−１５タンパク質、より好ましくはＩＬ−１５シグナル配列を含まず、ＩＬ−１５コザック領域を含まずそしてＩＬ−１５非翻訳領域配列を含まないＩＬ−１５タンパク質である。いくつかの好ましい態様において、こうした組成物は、さらにＣＤ４０Ｌをコードするヌクレオチド配列を含む。このヌクレオチド配列は、融合タンパク質として同一の核酸分子上、または異なる分子上に含まれていてもよい。ＣＤ４０Ｌは、免疫原をコードする配列を含むワクチン組成物中に含ませることができ、改良されたワクチンが得られる。他の態様において、ＣＤ４０Ｌは、免疫原をコードする配列を含んでいない免疫調節組成物中に含まれていてもよく、改良された免疫調節組成物が得られる。
【００４９】
いくつかの好ましい態様において、核酸構築物はプラスミドである。いくつかの好ましい態様において、核酸分子は、ワクシニア、アデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルス、レトロウイルスあるいはワクチンまたは遺伝子療法ベクターとして有用な、任意の他の受容可能なウイルスベクターのごとき、ウイルスベクターに組み入れられている。
【００５０】
免疫調節タンパク質である非ＩｇＥタンパク質配列に連結されているＩｇＥシグナル配列を含む遺伝子構築物は、本発明のいくつかの態様に従って、生弱毒化病原体内に直接組み入れることができる。ワクチンとして有用なこうした病原体の例が以下に示されている。好ましい態様において、免疫調節タンパク質はＩＬ−１５、より好ましくはＩＬ−１５シグナル配列を含まないＩＬ−１５タンパク質、より好ましくはＩＬ−１５シグナル配列を含まず、ＩＬ−１５コザック領域を含まずそしてＩＬ−１５非翻訳領域配列を含まないＩＬ−１５タンパク質である。いくつかの態様において、こうした弱毒化病原体はさらに、ＣＤ４０Ｌをコードするヌクレオチド配列と共に提供される。
【００５１】
非ＩｇＥタンパク質配列に機能可能なように連結されたＩｇＥシグナル配列を含む融合タンパク質もまた、本発明の側面である。いくつかの態様において、融合タンパク質の非ＩｇＥタンパク質配列部分は免疫調節タンパク質である。好ましい非ＩｇＥタンパク質配列は、ＩＬ−１５タンパク質であり、最も好ましくはＩＬ−１５シグナル配列を含んでいない。
【００５２】
ＩＬ−１５タンパク質に連結されたＩＬ−１５シグナル配列を含む融合タンパク質およびその配列をコードする遺伝子構築物
本発明の一つの一般的側面は、ＩＬ−１５タンパク質に連結された非ＩＬ−１５シグナル配列を含む融合タンパク質およびその配列をコードする遺伝子構築物、そしてワクチンおよび免疫調節組成物におけるこうした構築物の使用に関する。いくつかの異なった態様および形態をこの側面に関して提供する。一般に、ＩＬ−１５はヒトＩＬ−１５を指している。しかしながら、構築物はまた、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタまたはヒツジのごとき他の種からのＩＬ−１５を指すことも可能である。
【００５３】
本発明のこの側面は、天然のＩＬ−１５  ｍＲＮＡにより発現されたタンパク質中の配列が、発現を阻害するシグナルまたは要素を含んでいるという観察に起因する。これらの阻害要素を除去することにより、改良された発現が達成される。好ましい態様において、ＩＬ−１５コード配列はＩＬ−１５シグナルペプチドのコード配列を含んでおらず、そして好ましくは、ＩｇＥシグナルタンパク質のごとき別のシグナルタンパク質をその場所に提供する。さらに、阻害要素を除去するため、ＩＬ−１５コザック領域および非翻訳領域も同様に除去する。好ましくは、ＩＬ−１５配列のみを含んでいる構築物が、ＩＬ−１５シグナルペプチドを含んでいない成熟ＩＬ−１５タンパク質のアミノ酸配列をコードするＩＬ−１５配列である。
【００５４】
いくつかの態様に従うと、ＩＬ−１５タンパク質に連結された非ＩＬ−１５シグナル配列を含む融合タンパク質をコードする、核酸配列を含む単離された核酸分子を含む組成物を提供する。いくつかの好ましい態様において、融合タンパク質は、ＩＬ−１５タンパク質へ連結された非ＩＬ−１５シグナル配列から成っている。いくつかの好ましい態様において、ＩＬ−１５タンパク質はＩＬ−１５シグナル配列を含んでいない。いくつかの好ましい態様において、融合タンパク質は、ＩＬ−１５配列が誘導された種に関して非免疫原性である。それ故、ヒトＩＬ−１５を含む非免疫原性融合タンパク質は、ヒトにおいて非免疫原性であろう。
【００５５】
いくつかの態様に従うと、ＩＬ−１５タンパク質に連結された非ＩＬ−１５シグナル配列を含む融合タンパク質のためのコード配列、を含む構築物を含むように提供される組成物はまた、免疫原をコードする核酸配列を同一の核酸分子上に、または異なった核酸分子上に含むことができる。一般に、以下に議論される免疫原は、アレルゲン、病原体抗原、癌関連抗原または自己免疫疾患に関連する細胞に連結された抗原を含む任意の免疫原性タンパク質である。好ましい態様において、免疫原は病原体抗原、最も好ましくは、ＨＩＶ、ＨＳＶ、ＨＣＶおよびＷＮＶから成る群より選択された病原体である。
【００５６】
好ましい態様において、組成物は、さらにＣＤ４０Ｌをコードするヌクレオチド配列を含む。このヌクレオチド配列は、融合タンパク質として同一の核酸分子上、または異なる分子上に含まれていてもよい。ＣＤ４０Ｌは、免疫原をコードする配列を含むワクチン組成物中に含ませることができ、改良されたワクチンが得られる。他の態様において、ＣＤ４０Ｌは、免疫原をコードする配列を含んでいない免疫調節組成物中に含まれていてもよく、改良された免疫調節組成物が得られる。
【００５７】
いくつかの好ましい態様において、核酸構築物はプラスミドである。いくつかの好ましい態様において、核酸分子は、ワクシニア、アデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルス、レトロウイルスあるいはワクチンまたは遺伝子療法ベクターとして有用な、任意の他の受容可能なウイルスベクターのごとき、ウイルスベクターに組み入れられている。
【００５８】
ＩＬ−１５タンパク質に連結されている非ＩＬ−１５シグナル配列を含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物は、本発明のいくつかの態様に従って、生弱毒化病原体内に直接組み入れることができる。ワクチンとして有用なこうした病原体の例が以下に示されている。好ましい態様において、ヒトＩＬ−１５（好ましくはＩＬ−１５シグナル配列を含んでいない）をヒトＩｇＥシグナル配列に連結する。いくつかの態様において、こうした弱毒化病原体はさらに、ＣＤ４０Ｌをコードするヌクレオチド配列と共に提供される。
【００５９】
ＩＬ−１５タンパク質に連結された非ＩＬ−１５シグナル配列を含む融合タンパク質は本発明の一つの側面である。いくつかの好ましい態様において、融合タンパク質はＩＬ−１５タンパク質に連結された非ＩＬ−１５シグナル配列から成っている。いくつかの好ましい態様において、ＩＬ−１５タンパク質はＩＬ−１５シグナル配列を含んでいない。いくつかの好ましい態様において、シグナル配列はＩｇＥシグナル配列である。配列は、好ましくはヒトである。いくつかの好ましい態様において、融合タンパク質は非免疫原性である。非免疫原性とは、ＩＬ−１５配列が誘導された種に関して非免疫原性であるタンパク質を指している。
【００６０】
ＩＬ−１５およびＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子構築物を含む組成物そしてその使用
本発明の別の一般的な側面は、ＩＬ−１５およびＣＤ４０Ｌをコードする遺伝子構築物を含む組成物、そしてワクチンおよび免疫調節組成物におけるこうした構築物の使用に関する。いくつかの異なった態様および形態をこの側面に関して提供する。一般に、ＩＬ−１５はヒトＩＬ−１５を指している。しかしながら、構築物はまた、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタまたはヒツジのごとき他の種からのＩＬ−１５を指すことも可能である。ＩＬ−１５は天然の形、即ち、ＩＬ−１５シグナル配列を伴うことができる。好ましくは、ＩＬ−１５は非ＩＬ−１５シグナル配列を含む融合タンパク質の一部であり、そして最も好ましくはさらにＩＬ−１５シグナル配列を含んでいない。好ましい態様において、ＩＬ−１５はＩｇＥシグナル配列へ連結されている。
【００６１】
いくつかの態様に従うと、ＩＬ−１５およびＣＤ４０Ｌをコードする核酸配列を含む単離された核酸分子、あるいは、ＩＬ−１５をコードする核酸配列を含む第一の配列そしてＣＤ４０Ｌをコードする核酸配列を含む第二の配列を含んでいる単離された核酸分子、を含む組成物を提供する。いくつかの好ましい態様において、ＩＬ−１５を含むタンパク質は、ＩＬ−１５配列が誘導された種に関して非免疫原性である。
【００６２】
いくつかの態様に従うと、ＩＬ−１５およびＣＤ４０Ｌのためのコード配列を含む構築物を含むように提供される組成物はまた、免疫原をコードする核酸配列を同一の核酸分子上に、または異なった核酸分子上に含むことができる。一般に、以下に議論される免疫原は、アレルゲン、病原体抗原、癌関連抗原または自己免疫疾患に関連する細胞に連結された抗原を含む任意の免疫原性タンパク質である。好ましい態様において、免疫原は病原体抗原、最も好ましくは、ＨＩＶ、ＨＳＶ、ＨＣＶおよびＷＮＶから成る群より選択された病原体である。
【００６３】
免疫原のためのコード配列を含む組成物は、ワクチンとして有用である。免疫原のためのコード配列を含んでいない組成物は、免疫調節組成物として有用であることができる。いくつかの態様において、タンパク質免疫原はまた、ＩＬ−１５およびＣＤ４０Ｌの組み合わせにより増進される免疫応答の標的としても提供する。
【００６４】
いくつかの好ましい態様において、核酸構築物はプラスミドである。いくつかの好ましい態様において、核酸分子は、ワクシニア、アデノウイルス、アデノウイルス関連ウイルス、レトロウイルスあるいはワクチンまたは遺伝子療法ベクターとして有用な、任意の他の受容可能なウイルスベクターのごとき、ウイルスベクターに組み入れられている。
【００６５】
ＩＬ−１５およびＣＤ４０Ｌをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物は、本発明のいくつかの態様に従って、生弱毒化病原体内に直接組み入れることができる。ワクチンとして有用なこうした病原体の例が以下に示されている。好ましい態様において、ヒトＩＬ−１５（好ましくはＩＬ−１５シグナル配列を含んでいない）をヒトＩｇＥシグナル配列に連結する。
【００６６】
ワクチンおよび免疫調節組成物
本発明のいくつかの態様に従うと、本発明の組成物は、免疫原および／または免疫原性タンパク質のためのコード配列を含む遺伝子構築物を含む。こうした組成物は、個体の免疫系の活性を調節し、そしてそれにより免疫原に対する免疫応答を増進するために個体へ搬送する。免疫調節タンパク質をコードする核酸分子が、個体の細胞により取り込まれた場合、免疫調節タンパク質をコードするヌクレオチド配列が細胞中で発現され、前記タンパク質がそれにより個体へ搬送されたことになる。本発明の側面は、組換えワクチンの一部としてあるいは弱毒化ワクチンの一部として、一つまたはそれより多くの多様な転写因子または中間体因子をコードする、異なった核酸分子を含む組成物中に、シグナル核酸分子上のタンパク質のコード配列を搬送する方法を提供する。
【００６７】
本発明のいくつかの側面に従うと、病原体あるいは異常な疾患関連細胞に対して個体を予防的及び／又は療法的に免疫化する組成物および方法を提供する。ワクチンは、生弱毒化ワクチン、細胞ワクチン、組換えワクチンまたは核酸またはＤＮＡワクチンのごとき任意の型であることができる。
【００６８】
本発明は、免疫調節タンパク質を搬送するための組成物、そしてそれを使用するための方法に関する。
【００６９】
核酸分子は、ＤＮＡ注射（ＤＮＡワクチン接種とも称されている）、組換えアデノウイルスのごとき組換えベクター、組換えアデノウイルス関連ウイルスそして組換えワクシニアを含む、いくつかのよく知られている技術のいずれかを使用して搬送することができる。
ＤＮＡワクチンは、各々が本明細書において援用される、米国特許第５，５９３，９７２、５，７３９，１１８、５，８１７，６３７、５，８３０，８７６、５，９６２，４２８、５，９８１，５０５、５，５８０，８５９、５，７０３，０５５、５，６７６，５９４号に記載されており、そして優先出願がそこに引用されている。これらの出願に記載されている搬送プロトコールに加え、ＤＮＡ搬送の代替方法が米国特許第４，９４５，０５０号および５，０３６，００６号（両方とも本明細書において援用される）に記載されている。
投与経路には筋肉内、鼻腔内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、動脈内、眼内および経口ならびに局所、経皮、吸入または坐剤により、または膣、直腸、尿管、口腔および舌下組織への潅注によるごとき粘膜組織へ、などが含まれるが、それらに限定されるわけではない。好ましい投与経路には粘膜組織、筋肉内、腹腔内、皮内および皮下注射が含まれる。遺伝子構築物は、限定されるわけではないが、伝統的注射器、針無し注入装置または「微小弾丸衝撃遺伝子銃」を含む手段により投与することができる。
【００７０】
細胞により取り込まれた場合、遺伝子構築物は機能的染色体外分子として残存し、および／または細胞の染色体ＤＮＡへ組み込まれる。ＤＮＡは細胞内へ導入することができ、そこでプラスミド形で別の遺伝子物質として残存する。もしくは、染色体内へ組み込むことが可能な直鎖状ＤＮＡを細胞内へ導入することができる。ＤＮＡが細胞内へ導入された場合、染色体内へのＤＮＡ組込みを促進する試薬を加えることができる。組込みを促進するために有用なＤＮＡ配列もまたＤＮＡ分子に含ませることができる。もしくは、ＲＮＡを細胞に投与することができる。遺伝子構築物は動原体、テロメアおよび複製起点を含んでいる線状ミニ染色体として提供されることも意図されている。遺伝子構築物は弱毒化生ワクチン中の遺伝子物質または細胞中で生きている組換え体微生物ベクターの一部として残存することができる。遺伝子構築物は組換えウイルスワクチンのゲノムの一部であることもでき、遺伝子物質は細胞の染色体内へ組み込まれるかまたは染色体外に残存する。遺伝子構築物は核酸分子の遺伝子発現に必要な制御要素を含んでいる。その要素には：プロモーター、開始コドン、終止コドンおよびポリアデニル化シグナルが含まれる。加えて、標的タンパク質または免疫調節タンパク質をコードする配列の遺伝子発現にエンハンサーがしばしば必要とされる。これらの要素は所望のタンパク質をコードする配列へ機能可能なように連結されていること、そして制御要素はそれらが投与された個体中で機能可能であることが必要である。
【００７１】
開始コドンおよび終止コドンは一般的に所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部であるべきと考えられている。しかしながら、これらの要素は遺伝子構築物が投与された個体中で機能的であることが必要である。開始および終止コドンはコード配列の読み枠内に存在しなければならない。
【００７２】
使用されるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルは個体の細胞内で機能的でなければならない。
【００７３】
本発明の実施に有用なプロモーターの例としては、特にヒトのための遺伝子ワクチン  の製造において、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）（ＨＩＶの長い末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーターのごとき）、モロニーウイルス、ＡＬＶ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ＣＭＶ前初期プロモーターのごとき）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、ならびにヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンおよびヒトメタロチオネインのごときヒト遺伝子からのプロモーター類が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００７４】
本発明の実施に有用なポリアデニル化シグナルの例としては、特にヒトのための遺伝子ワクチンの製造において、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびＬＴＲポリアデニル化シグナルが含まれるが、これらに限定されるわけではない。特に、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルと称される、ｐＣＥＰ４プラスミド中に存在するＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州サンディエゴ）を使用する。
【００７５】
ＤＮＡ発現に必要とされる制御要素に加え、他の要素もＤＮＡ分子に含ませることができる。こうした追加の要素にはエンハンサーが含まれる。エンハンサーは：ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンおよびＣＭＶ、ＲＳＶおよびＥＢＶからのエンハンサーのごときウイルスエンハンサーから成る群より選択することができる。
【００７６】
遺伝子構築物を染色体外に維持するためおよび細胞中で構築物の多数のコピーを生成するために、構築物は哺乳動物複製起点とともに提供可能である。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州サンディエゴ）からのプラスミドｐＶＡＸ１、ｐＣＥＰ４およびｐＲＥＰ４はエプスタインバーウイルス複製起点、そして組込みなしで高コピーエピソーム複製を生成する核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含んでいる。
【００７７】
免疫化応用に関するいくつかの好ましい態様において、標的タンパク質、免疫調節タンパク質、そして加えて、こうした標的タンパク質に対する免疫応答をさらに促進するタンパク質のための遺伝子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子が搬送される。こうした遺伝子の例はアルファ−インターフェロン、ガンマ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびシグナル配列が欠失されそしてＩｇＥからのシグナル配列を所望により含んでいるＩＬ−１５を含むＩＬ−１５のごとき他のサイトカインおよびリンホカインをコードするものである。
【００７８】
何らかの理由で遺伝子構築物を受けている細胞を除去することが望ましいのであれば、細胞破壊の標的として働く追加の要素を加えることができる。発現可能形のヘルペスチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を遺伝子構築物に含ませることが可能である。薬剤ガングシクロビルが個体へ投与可能であり、そして本薬剤はｔｋを産生している細胞を選択的に殺すので、遺伝子構築物を含む細胞を選択的に破壊する手段が提供される。
【００７９】
タンパク質産生を最大にするため、構築物が投与された細胞内での遺伝子発現にうまく適している制御配列を選択することができる。さらに、細胞内で最も効率的に転写されるコドンを選択することができる。当業者は細胞内で機能的であるＤＮＡ構築物を製造することが可能である。
【００８０】
本発明の一つの方法は、筋肉内、鼻孔内、腹腔内、皮下、皮内または局所的に、あるいは吸入、膣、直腸、バッカルまたは舌下から成る群より選択される粘膜組織の洗浄により、核酸分子を投与する工程を含む。
【００８１】
いくつかの態様において、核酸分子をポリヌクレオチド機能増進剤または遺伝子ワクチン促進剤の投与と組み合わせて細胞へ搬送する。ポリヌクレオチド機能増進剤は、各々が本明細書において援用される米国特許第５，５９３，９７２、５，９６２，４２８号、および１９９４年１月２６日に提出された国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００８９９号に記載されている。遺伝子ワクチン促進剤は、本明細書において援用される１９９４年４月１日に提出された米国特許番号第０２１，５７９号に記載されている。核酸分子と組み合わせて投与される共薬剤は、核酸分子との混合物として投与するか、または核酸分子と同時に、投与前にまたは投与後に別々に投与することができる。加えて、トランスフェクト剤および／または複製剤および／または催炎物質として機能することができ、そしてＧＶＦと同時投与することができる他の物質にはα−インターフェロン、ガンマ−インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦ、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬＡ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５ならびに線維芽細胞成長因子のごとき成長因子、サイトカインおよびリンホカイン、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）のごとき表面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Ａ（ＷＬ）を含むＬＰＳ類似体、ムラミールペプチド、キノン類似体およびスクアレンおよびスクアレンのようなベシクル、が含まれ、そしてヒアルロン酸もまた遺伝子構築物と組み合わせて投与するのに使用することができる。いくつかの態様において、免疫調節タンパク質はＧＶＦとして使用することができる。いくつかの態様において、搬送／取り込みを増進させるために核酸をＰＬＧに結合して提供する。
【００８２】
本発明に従った医薬組成物は約１ナノグラムから約２０００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい態様において、本発明に従った医薬組成物は約５ナノグラムから約１０００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい態様において、本医薬組成物は約１０ナノグラムから約８００マイクログラムのＤＮＡを含んでいる。いくつかの好ましい態様において、本医薬組成物は約０．１から約５００マイクログラムのＤＮＡを含んでいる。いくつかの好ましい態様において、本医薬組成物は約１から約３５０マイクログラムのＤＮＡを含んでいる。いくつかの好ましい態様において、本医薬組成物は約２５から約２５０マイクログラムのＤＮＡを含んでいる。いくつかの好ましい態様において、本医薬組成物は約１００から約２００マイクログラムのＤＮＡを含んでいる。
【００８３】
本発明に従った医薬組成物は、使用されるべき投与様式に従って処方する。医薬組成物が注射可能な医薬組成物である場合、それらは無菌であり、発熱物質および粒子状物質を含んでいない。好ましくは等張処方を使用する。一般に、等張性のための添加物は塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースを含むことが可能である。いくつかの場合、リン酸緩衝液のごとき等張溶液が好ましい。安定化剤にはゼラチンおよびアルブミンが含まれる。いくつかの態様において、処方に血管収縮剤を添加する。
【００８４】
本発明のいくつかの態様に従うと、免疫原に対して免疫応答を誘導する方法を、個体へ本発明の組成物を搬送することにより提供する。ワクチンは生弱毒化ワクチン、細胞ワクチン、組換えワクチンあるいは核酸またはＤＮＡワクチンであることができる。
【００８５】
遺伝子ワクチンを改良するために免疫調節タンパク質コード配列の発現可能形を使用するのに加え、本発明は抗原をコードする外来遺伝子を搬送するための、改良された弱毒化生ワクチンおよび組換えベクターを使用する改良されたワクチンに関する。外来抗原を搬送するために弱毒化生ワクチンおよび組換えベクターを使用するワクチンの例は、各々が本明細書において援用される、米国特許第４，７７２，８４８；５，０１７，４８７；５，０７７，０４４；５，１１０，５８７；５，１１２，７４９；５，１７４，９９３；５，２２３，４２４；５，２２５，３３６；５，２４０，７０３；５，２４２，８２９；５，２９４，４４１；５，２９４，５４８；５，３１０，６６８；５，３８７，７４４；５，３８９，３６８；５，４２４，０６５；５，４５１，４９９；５，４５３，３６４；５，４６２，７３４；５，４７０，７３４および５，４８２，７１３号に記載されている。発現を達成するためにワクチン中で機能可能である、制御配列へ機能可能なように連結されている免疫調節タンパク質をコードしている、ヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を提供する。遺伝子構築物を弱毒化生ワクチンおよび組換えワクチンへ取り込み、本発明に従った改良されたワクチンを製造する。
【００８６】
本発明は、遺伝子構築物が、ＤＮＡワクチン、弱毒化生ワクチンおよび組換えワクチンを含むワクチン組成物の一部として提供され、個体の細胞へ遺伝子構築物を搬送する工程を含む、個体を免疫化する改良された方法を提供する。遺伝子構築物は免疫調節タンパク質をコードし、そして発現を達成するためにワクチン中で機能可能である、制御配列へ機能可能なように連結されたヌクレオチド配列を含む。改良されたワクチンは増進された細胞性免疫応答を生じる。
【００８７】
免疫原
本発明は標的タンパク質に対する増進された免疫応答を惹起するのに有用である、即ち、具体的には病原体、アレルゲンまたは個体自身の「異常な」細胞に関連するタンパク質。本発明は病原体タンパク質に対する免疫応答が、病原体に対する保護的免疫性を与えるように、病原性因子および生物体に対して個体を免疫化するのに有用である。本発明は、具体的には過増殖性細胞に関連する標的タンパク質に対する免疫応答を惹起することにより、癌のごとき過増殖性疾患および障害と戦うために有用である。本発明は具体的には自己免疫状態に関与する細胞に関連する標的タンパク質に対する免疫応答を惹起することにより、自己免疫疾患および障害と戦うために有用である。
【００８８】
本発明のいくつかの態様に従うと、標的タンパク質および免疫調節タンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡが個体の組織細胞内へ導入され、そこで発現され、コードされたタンパク質を産生する。標的タンパク質および一つまたは両方の免疫調節タンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ配列は、個体の細胞中での発現に必要とされる制御要素に連結されている。ＤＮＡ発現のための制御要素にはプロモーターおよびポリアデニル化シグナルが含まれる。加えて、コザック領域のごとき他の要素もまた遺伝子構築物に含ませることができる。
【００８９】
いくつかの態様において、標的タンパク質をコードしている発現可能形配列および両方の免疫調節タンパク質をコードする発現可能形配列は、個体へ搬送される同一の核酸分子上に見られる。
【００９０】
いくつかの態様において、標的タンパク質をコードしている発現可能形配列は、一つまたはそれより多くの免疫調節タンパク質をコードする配列の発現可能形を含む核酸分子は別の核酸分子上に存在する。いくつかの態様において、標的タンパク質をコードする配列の発現可能形、および一つまたはそれより多くの免疫調節タンパク質をコードする配列の発現可能形は、一つまたはそれより多くの免疫調節タンパク質をコードする配列の発現可能形を含む核酸分子とは別の一つの核酸分子上に見いだされる。本発明に従って複数の異なった核酸分子を産生しそして搬送することが可能であり、そして個体へ搬送する。例えば、いくつかの態様において、標的タンパク質をコードする配列の発現可能形は、一つまたはそれより多くの免疫調節タンパク質をコードする配列の発現可能形を含む核酸分子とは別の核酸分子上に見いだせる、一つまたはそれより多くの免疫調節タンパク質をコードする配列の発現可能形を含む核酸分子とは別の核酸分子上に見いだせる。こうした場合、三つの分子全てを個体へ搬送する。
【００９１】
核酸分子は、プラスミドＤＮＡ、組換えベクターの核酸分子として、あるいは弱毒化ワクチンまたは細胞ワクチンで提供される遺伝子物質の一部として提供することができる。あるいは、いくつかの態様において、標的タンパク質および／または両方の免疫調節タンパク質はことによると、それらをコードする核酸分子に加え、あるいはそれらをコードする核酸分子に代わりに、タンパク質として搬送する。
【００９２】
遺伝子構築物は、遺伝子発現に必要とされる制御要素へ機能可能なように連結された、標的タンパク質または免疫調節タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。本発明に従うと、標的タンパク質をコ−ドするヌクレオチド配列の発現形を含む構築物、そして免疫調節タンパク質をコ−ドするヌクレオチド配列の発現形を含む構築物、を含む遺伝子構築物の組み合わせを提供する。遺伝子構築物の組み合わせを含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子の生きている細胞内への組込は、ＤＮＡまたはＲＮＡの発現そして標的タンパク質および一つまたはそれより多くの免疫調節タンパク質の産生を生じる。標的タンパク質に対する増進した免疫応答を生じる。
【００９３】
本発明はウイルス、原核生物そして単細胞病原性生物体および多細胞寄生虫のような病原性真核生物体のごときすべての病原体に対して、個体を免疫化するために使用することができる。本発明は、細胞に感染し、およびウイルスおよび原核生物（淋菌、リステリアおよび赤痢菌のような）のような被包性でない病原体に対して個体を免疫化するのに特に有用である。加えて、本発明はまた、それらが細胞内病原体である生活環の段階を含む原虫病原体に対して個体を免疫化するのにも有用である。表１に、本発明に従ってワクチンが作製できるいくつかのウイルスファミリーおよび属の一覧を提供する。表に収載した抗原のごとき病原体抗原上に示されるエピトープと同一かまたは実質的に同じである少なくとも一つのエピトープを含むペプチドをコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物はワクチンに有用である。さらに、本発明はまた、原核生物および真核生物原虫病原体ならびに表２に収載されているような多細胞寄生虫を含む他の病原体に対して、個体を免疫化するのにも有用である。
【００９４】
病原体感染に対して保護するための遺伝子ワクチンを製造するため、保護的免疫応答を開始することが可能な免疫原性タンパク質をコードする遺伝子物質は、標的のためのコード配列として遺伝子構築物中に含まれていなければならない。病原体感染が細胞内（それに対して本発明は特に有用である）であるにせよあるいは細胞外であるにせよ、すべての病原体抗原が保護的応答を惹起することはありそうもない。ＤＮＡおよびＲＮＡは両方とも比較的小さくそして比較的容易に製造可能であるので、本発明は多病原体抗原を備えたワクチン接種を可能にする追加の利点を提供する。遺伝子ワクチンに使用される遺伝子構築物は、多くの病原体抗原をコードする遺伝子物質を含むことが可能である。例えば、数個のウイルス遺伝子を単一の構築物に含ませることができ、それにより複数の標的を提供する。
【００９５】
表１および２は、感染から個体を保護するために遺伝子ワクチンが調製可能であるいくつかの病原性因子および生物体の一覧表を含んでいる。いくつかの好ましい態様において、病原体に対して個体を免疫化する方法はＨＩＶ、ＨＳＶ、ＨＣＶ、ＷＮＹまたはＨＢＶに対するものである。
【００９６】
本発明の別の側面は、過増殖性疾患に特徴的である過増殖している細胞に対する保護的免疫応答を与える方法、および過増殖性疾患に罹患している個体を処置する方法を提供する。増殖性疾患の例にはすべての形の癌および乾癬が含まれる。
【００９７】
免疫原性の「過増殖している細胞」関連タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を個体の細胞内へ導入すると、ワクチン接種された個体の細胞にこれらのタンパク質の産生を生じることが発見されている。過増殖性疾患に対して免疫するため、過増殖性疾患に関連したタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子構築物を個体に投与する。
【００９８】
過増殖性関連タンパク質が有効な免疫原性標的であるためには、それは正常な細胞と比較して、過増殖性細胞中で独占的にまたは高レベルで産生されるタンパク質でなければならない。標的抗原は、こうしたタンパク質に観察される少なくとも一つのエピトープを含むタンパク質、その断片およびペプチドを含んでいる。いくつかの場合、過増殖性関連タンパク質は、タンパク質をコードする遺伝子の突然変異の生成物である。突然変異した遺伝子は、正常のタンパク質とほとんど同一であるが、正常タンパク質では観察されない、異なったエピトープを生じるわずかに異なったアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしている。こうした標的タンパク質には、ｍｙｂ、ｍｙｃ、ｆｙｎのごとき癌遺伝子、そして転座遺伝子ｂｃｒ／ａｂｌ、ｒａｓ、ｓｒｃ、Ｐ５３、ｎｅｕ、ｔｒｋおよびＥＧＲＦによりコードされているタンパク質が含まれる。標的抗原としての癌遺伝子生成物に加え、抗癌処置および保護的計画のための標的タンパク質には、Ｂ細胞リンパ球により作られる抗体の可変領域およびＴ細胞リンパ球のＴ細胞レセプター可変領域が含まれ、それらはいくつかの態様において自己免疫疾患のための標的抗原としても使用される。モノクローナル抗体１７−１Ａにより認識されるタンパク質および葉酸結合タンパク質またはＰＳＡを含む、腫瘍細胞において高レベルで観察されるタンパク質のごとき他の腫瘍関連タンパク質が標的タンパク質として使用可能である。
【００９９】
本発明は一つまたはそれより多くの癌のいくつかの形に対して個体を免疫化するために使用されるであろうが、本発明は特定の癌が発現し易い人または以前に癌を発病し、従って再発しやすい人のような個体を予防的に免疫化するのに特に有用である。遺伝学および技術ならびに疫学の発展は、個体における癌の発生の可能性および危険事前評価の決定を可能にしている。遺伝子スクリーニングおよび／または家族健康履歴を用いて、特定の個人がいくつかの型の癌のいずれか一つを発生する可能性を予測することが可能である。
【０１００】
同様に、すでに癌が発生した、そして癌を取り除く処置を受けた、またはさもなければ寛解期にある個体は特に再発そして再発現し易い。処置計画の一部として、こうした個体は再発と戦うために、有していたと診断された癌に対して免疫可能である。それ故、個体が癌の一つの型を有していたことがあり、再発の危険性があることが解ったら、癌の将来の出現と戦う免疫系を準備するために免疫化可能である。
【０１０１】
本発明は過増殖性疾患を罹患している個体を処置する方法を提供する。こうした方法において、遺伝子構築物の導入は、標的タンパク質を産生する過増殖性細胞と戦うために個体の免疫系を向けさせるおよび促進する免疫療法剤として働く。
【０１０２】
本発明は、細胞レセプターおよび「自己」指向性抗体を産生する細胞を含む、自己免疫性に関連した標的に対して広範囲な保護的免疫応答を与えることにより、自己免疫疾患および障害を患っている個体を処置する方法を提供する。
【０１０３】
Ｔ細胞仲介自己免疫疾患にはリウマチ様関節炎（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インシュリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、脈管炎、ヴェグナー肉芽腫症、クローン病および潰瘍性大腸炎が含まれる。これらの疾患の各々は、内因性抗原に結合し、自己免疫疾患に関連した炎症性カスケードを開始させるＴ細胞レセプターにより特徴付けられる。Ｔ細胞の可変領域に対するワクチン接種は、これらのＴ細胞を除去するためにＣＴＬを含む免疫応答を惹起するであろう。
【０１０４】
ＲＡにおいて、この疾患に関与するＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）のいくつかの特異的可変領域が特徴付けられている。これらのＴＣＲにはＶβ−３、Ｖβ−１４、Ｖβ−１７、およびＶα−１７が含まれる。それ故、これらのタンパク質の少なくとも一つをコードするＤＮＡ構築物を用いるワクチン接種は、ＲＡに関与するＴ細胞を標的とするであろう免疫応答を惹起するであろう。Howell, M. D. et al., 1991 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10921-10925; Paliard, X., et al., 1991 Science 253: 325-329; Williams, W. V., et al.，1992 J. Clin. Invest. 90: 326-333 (これらの各々は本明細書において援用される）を参照されたい。ＭＳにおいて、この疾患に関与するＴＣＲのいくつかの特異的可変領域が特徴付けられている。これらのＴＣＲにはＶｆｐおよびＶα−１０が含まれる。それ故、これらのタンパク質の少なくとも一つをコードするＤＮＡ構築物を用いるワクチン接種はＭＳに関与するＴ細胞を標的とするであろう免疫応答を惹起するであろう。Wucherpfennig, K. W., et al., 1990 Science 248: 1016-1019; Oksenberg, J. R., et al.,1990 Nature 345: 344-346 （これらの各々は本明細書において援用される）を参照されたい。
【０１０５】
強皮症において、この疾患に関与するＴＣＲのいくつかの特異的可変領域が特徴付けられている。これらのＴＣＲにはＶβ−６、Ｖβ−８、Ｖβ−１４およびＶα−１６、Ｖα−３Ｃ、Ｖα−７、Ｖα−１４、Ｖα−１５、Ｖα−１６、Ｖα−２８およびＶα−１２が含まれる。それ故、これらのタンパク質の少なくとも一つをコードするＤＮＡ構築物を用いるワクチン接種は強皮症に関与するＴ細胞を標的とするであろう免疫応答を惹起するであろう。
【０１０６】
特にＴＣＲの可変領域がまだ同定されていない場合、Ｔ細胞仲介自己免疫疾患を罹患している患者を処置するためには、滑液生検が実施可能である。存在するＴ細胞の試料を取り出すことが可能で、そしてそれらのＴＣＲの可変領域が標準法を使用して同定される。遺伝子ワクチンはこの情報を用いて製造可能である。
【０１０７】
Ｂ細胞仲介自己免疫疾患には狼蒼（ＳＬＥ）、グレーブス病、重症筋無力症、自己免疫性血小板減少症、喘息、クリオグロブリン血症、原発性胆汁性硬化症、および悪性貧血が含まれる。これらの疾患の各々は、内因性抗原に結合し、自己免疫疾患に関連した炎症性カスケードを開始させる抗体により特徴付けられる。抗体の可変領域に対するワクチン接種は、この抗体を産生するＢ細胞を除去するためにＣＴＬを含む免疫応答を惹起するであろう。
【０１０８】
Ｂ細胞仲介自己免疫疾患を罹患している患者を処置するためには、自己免疫活性に関与する抗体の可変領域を同定しなければならない。生検が実施可能であり、炎症部位に存在する抗体の試料を取り出すことが可能である。抗体の可変領域が標準法を使用して同定可能である。遺伝子ワクチンはこの情報を用いて製造可能である。
【０１０９】
ＳＬＥの場合、一つの抗原がＤＮＡであると信じられている。それ故ＳＬＥに対して免疫化されるべき患者においては、血清を抗ＤＮＡ抗体でスクリーニングし、血清中に観察されたこうした抗ＤＮＡ抗体の可変領域をコードするＤＮＡ構築物を含むワクチンが製造可能である。
【０１１０】
ＴＣＲおよび抗体両方の可変領域間に共通の構造的特色はよく知られている。特定のＴＣＲまたは抗体をコードするＤＮＡ配列は一般的にKabat, et al., 1987 Sequence of Proteins of Immunological Interest, 米国保健社会福祉省，メリーランド州ベセスダ（本明細書において援用される）に記載されているごとく、よく知られた方法に従って見出すことができる。加えて、抗体からの機能的可変領域クローニングの一般法は、本明細書において援用されるChaudhary, V. K., et al.,1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1066 、に見ることができる。
【０１１１】
組換えタンパク質産生
本発明は、インビトロ宿主細胞培養物、前記培養物は、非ＩｇＥタンパク質配列へ連結されたＩｇＥシグナルペプチドから成る融合タンパク質をコードする核酸配列を含む、こうした宿主細胞中で機能可能な発現ベクターを含む；こうした核酸分子；そしてこうしたベクターを含む宿主細胞、に関する。本発明はまた、宿主細胞を培養する工程を含む、単離された融合タンパク質を産生する方法にも関する。本発明は、非ＩｇＥタンパク質配列へ連結されたＩｇＥシグナルペプチドを含む、単離された融合タンパク質に関する。
【０１１２】
融合タンパク質は、上述のように、容易に入手可能な出発物質を使用し、日常的手段により産生することができる。所望のタンパク質をコードする、適したＤＮＡ配列の供給は、当該技術分野で現在知られている技術を使用するタンパク質の産生を可能にする。
【０１１３】
当業者は、周知の技術を使用し、周知の発現系で使用するための商業的に入手可能な発現ベクター内へ、融合タンパク質をコードするＤＮＡを挿入することが可能である。商業的に入手可能なプラスミドｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州サンディエゴ）を、酵母のＳ．セレビジエ株における産生のために使用することができる。商業的に入手可能なＭａｘＢａｃ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州サンディエゴ）、完全バキュロウイスル発現系、を昆虫細胞における産生に使用することができる。商業的に入手可能なプラスミドｐｃＤＮＡ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カリフォルニア州サンディエゴ）は、チャイニーズハムスター卵巣細胞のごとき哺乳動物細胞における産生に使用することができる。当業者は、日常的技術そして商業的に入手可能な出発物質を使用し、融合タンパク質を産生するため、これらの商業的発現ベクターまたは他のものを使用することが可能である。
【０１１４】
当業者は、周知の方法および容易に入手可能な出発物質を使用し、他の商業的に入手可能な発現ベクターおよび系を使用する、あるいはベクターを産生することができる。プロモーターおよびポリアデニル化シグナル、そして好ましくはエンハンサーのごとき必須の制御配列を含んでいる発現系は、容易に入手可能であり、そして多様な宿主のために当該技術分野で知られている。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, 第二版,Cold Spring Harbor Press (1989) を参照されたい。それ故、所望のタンパク質は、原核生物および真核生物の両方で調製することが可能であり、一連のタンパク質の加工形を生じる。
【０１１５】
広範囲の真核生物宿主もまた、組換え外来タンパク質の産生のために現在利用可能である。真核生物宿主は、ＩｇＥシグナルペプチドを使用して直接所望のタンパク質を産生する発現ベクターで、形質転換することが可能である。
【０１１６】
普通に使用される真核生物系には、限定されるわけではないが、酵母、真菌細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、鳥細胞そして高等植物の細胞が含まれる。適したプロモーターは入手可能であり、例えば、バキュロウイスルポリヘドロンプロモーターのような、それはこれらの宿主型各々での使用に適合性でありそして機能可能であり、ならびに終止配列およびエンハンサーである。上記のように、プロモーターは構成的または誘導可能であることが可能である。例えば、哺乳動物系において、マウスメタロチオネインプロモーターは、重金属イオンの添加により誘導することが可能である。
【０１１７】
所望の宿主に適した発現系の構築についての詳細は、当業者にはよく知られている。タンパク質の組換え産生には、それをコードするＤＮＡを、選択された発現ベクター内へ適切にライゲートし、そして次ぎに、適合性宿主を形質転換するために使用し、それは次ぎに、外来遺伝子の発現が起こる条件下で培養および維持する。このようにして産生された本発明のタンパク質は、適切にそして当業者には既知であるように、細胞を溶解することにより、または好ましくは培養培地から回収する。
【０１１８】
当業者は、周知の技術を使用し、こうした発現系を使用して産生された融合レセプタータンパク質またはその断片を単離する。
【実施例】
【０１１９】
実施例１
序
感染対象においてウイルス負荷を減少させるための、組み合わせ抗レトロウイルス療法の成功は、多くのＨＩＶ−１陽性個体に対して改良された予後を生じた。しかしながら、多くの研究室は、確立されたウイルス蓄積が、組み合わせ薬剤投与計画によってあまり影響を受けないことを報告している（下記参考文献１−３）。現在まで、組み合わせ療法アプローチはウイルスクリアランスを生じておらず、そして患者のコンプライアンス（ｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ）に最終的に影響するそして疾患過程に影響する現在の療法投与計画に関連する著しい副作用が存在する。従って、ＨＩＶ−１のための有望な免疫療法的アプローチを含む、療法の代替形を探索する大きな要求が存在する。ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答が、ＨＩＶ−１感染を制御するために、そして疾患進行を遅くすることにおいて重要であると信じられている。ウイルス複製を制御することにおける、ＨＩＶ−１特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答の正確な機能は未だ完全には解明されていないが、ＨＩＶ−１に対する個体の血清陽性の長期非進行と特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞仲介細胞応答との間の相関が確立されている（下記参考文献４−７）。加えて、高度に暴露されたコホート（ｃｏｈｏｒｔ）、しかしＨＩＶ陰性のガンビアの個体は、抗体応答を示さなかったが、抗ＨＩＶ−１ＣＤ８＋  Ｔ細胞免疫応答を示した（下記参考文献８および９）。実際、ＨＩＶ−１感染後、強い細胞性免疫応答が、ウイルス負荷における同時的低下とともに誘導される。さらに、高レベルのＨＩＶ特異的細胞障害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の存在にもかかわらず、ＨＩＶ−１感染は除去されない。高ＣＤ８仲介応答と継続した疾患進行間の矛盾は重要である。ウイルスを除去するＣＤ８の無力さは、一部にはＣＴＬ逃避変異体（下記参考文献１０−１４）、多分、ＭＨＣクラスＩのＮｅｆ−関連下方制御あるいは宿主免疫性に対するＶｐｒまたはＥｎｖ効果（下記参考文献１５−１８）のごときウイルスの免疫病原性によるものであろう。追加の問題点は、ＣＤ８＋  Ｔリンパ球を支援する有効なＣＤ４＋  Ｔ細胞の欠如である（下記参考文献１９および２０）。循環しているＣＤ８＋細胞は障害性機能を有するかもしれないことが観察されている（下記参考文献２１）。もしＨＩＶ−１免疫病原性が有効なＣＤ８応答の発生を制限しているとすると、抗レトロウイルス療法に関連したＨＩＶ−１抗原の提示は、ＣＤ８記憶およびエフェクター細胞を制限された様式でブーストすることがありうる。これらの出来事は、疾患の結末に潜在的影響を有することができる。しかしながら、ＣＤ８＋  Ｔ細胞増殖に支援を提供することが重要であろう。これに関し、ＣＤ８＋記憶Ｔ細胞の生存は、継続した抗原提示には付随的ではないことが観察されており（下記参考文献２２）、それはむしろ、末梢環境における特異的サイトカインの産生に依存しているであろう。
【０１２０】
ＣＤ８＋  Ｔ細胞に著しく影響すると思われる、こうしたサイトカインの一つはインターロイキン−１５（ＩＬ−５）である。Ｗａｌｄｍａｎｎおよび共同研究者は、シグナルＴ細胞に独特なアルファ鎖と協調した、ＩＬ−２レセプター複合体のガンマおよびベータ鎖を使用する、１５ｋＤａタンパク質であることを最初に報告している（下記参考文献２３）。ＩＬ−１５は抗アポトーシス活性を現し、そして記憶ＣＤ８＋  Ｔ細胞表現型を刺激することに役割を果たしているようである。ＨＩＶ−１感染に果たしているＩＬ−１５の役割は、多数のグループにより調べられている。ＩＬ−１５は、ＨＩＶ−１感染対象から単離されたリンパ球のアポトーシスを減少させること（下記参考文献２４）、そしてナチュラルキラー細胞の活性および増殖を増加させること（下記参考文献２５−２７）が示されている。ＩＬ−１５はまた、ＨＩＶ−１感染対象のＢ細胞増殖（下記参考文献２８および２９）、およびマクロファージの活性化（下記参考文献３０）にも関係づけられている。重要なことは、ＩＬ−１５はまた、ＨＩＶ−１エフェクターＴ細胞増殖およびインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）産生に対して直接的な役割を有しているようである（下記参考文献３１および３２）。さらに、ＩＬ−１５は、ＨＩＶ−１に対して血清陽性である、試験された多くの対象においてＩＦＮ−ガンマを刺激することができなかった。抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞性免疫応答に対するＩＬ−１５の効果がそれ故に探索された。
【０１２１】
慢性的に感染しているＨＩＶ−１血清陽性対象から単離されたＴ細胞に対するＩＬ−１５の効果が試験された。ｒｈＩＬ−１５はＣＤ８  Ｔ細胞の増殖を増進し、そして重要なことには、ＩＬ−１５は、全ての対象においてエフェクター抗原特異的ＣＤ８＋  ＩＦＮ−ガンマ産生を拡大させたことが見出された。免疫化モデルにおいて、ＩＬ−１５はＣＤ８＋エフェクター機能をブーストし、それは免疫化モデル系において探索された。マウスからのＣＤ８＋リンパ球は、ＩＬ−１５がトランス（ｔｒａｎｓ）で提供された場合、より高いレベルで標的発現ＨＩＶ−１抗原を溶解することが可能であった。この効果は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の強い増殖なしで起こった。しかしながら、ＣＤ４ノックアウト（ＫＯ）マウスにおいて、ＩＬ−１５は、ＣＤ８エフェクター応答の発生におけるＣＤ４支援のための要求を完全にはバイパス（ｂｙ−ｐａｓｓ）できなかった。これらの結果は、ＩＬ−１５はＣＤ８記憶細胞の拡大に高度に有効であるが、ＩＬ−１５単独ではその初期発生には十分でないことを示唆している。
【０１２２】
材料および方法
ヒトＰＢＭＣのＥＬＩｓｐｏｔアッセイ
基本フィコール−ハイパーク技術によりＨＩＶ−１陽性ボランティアから単離されたＰＢＭＣについて、標準ＥＬＩｓｐｏｔアッセイによりエフェクター機能を評価した。ＰＢＭＣを、１０％ＦＣＳを含んだＲＰＭＩ（Ｍ１０）に、１ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。抗体１−ＤＩＫ（Ｍａｂｔｅｃｈ，オハイオ州マリーモント；ナクカ，ＳＥ）を、０．１Ｍ炭酸塩−重炭酸塩溶液（ｐＨ９．６）中、１５μｇ／ｍｌに希釈し、そして９６ウェルニトロセルロース膜プレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，マサチューセッツ州ベッドフォード）を被覆するために使用した。プレートを４℃で一夜インキュベートした。プレートを２００μｌのＰＢＳで６回洗浄した。１２２の無菌ペプチドの混合物を、ＤＭＳＯ中、５０μｇ／μｌの濃度（各ペプチドについて）でカクテルとして調製した。ペプチドは、すべてのＨＩＶ−１  Ｇａｇを包含する、１５アミノ酸長の一連の重複したペプチドである（AIDS Reagent and Reference Repository, ARRR ）。５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５（最終濃度２５ｎｇ／ｍｌ）を含むまたは含まない、Ｒ１０で１：２００に希釈したペプチドカクテルの１００μｌとともに、１００，０００のＰＢＭＣを、ニトロセルロース抗体被覆プレートの各ウェルへ加えた（１００μｌ＠１．０ｘ１０６細胞／ｍｌ）。各試料は三重にアッセイした。５μｇ／ｍｌのＰＨＡを陽性対照として使用した。プレートは３７℃でおよそ２４時間インキュベートした。プレートは次ぎに、２００μｌのＰＢＳで６回洗浄した。１００μｌの抗体７−Ｂ６−１−ビオチン（Ｍａｂｔｅｃｈ）を、ＰＢＳ中、１μｇ／ｍｌの濃度で各ウェルへ加えた。プレートを室温で２−４時間インキュベートした。プレートを２００μｌのＰＢＳで６回洗浄した。１００μｌのストレプトアビジン−ＡＬＰ（Ｍａｂｔｅｃｈ）を、ＰＢＳ中、１μｇ／ｍｌの濃度で各ウェルへ加えた。プレートを室温で１−２時間インキュベートした。プレートを２００μｌのＰＢＳで６回洗浄した。１００μｌの基質溶液（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ，Ｓｉｇｍａ）を各プレートへ加えた。発色溶液を水道水で除去した。ＣＤ８かまたはＣＤ４に特異的なモノクローナル抗体と共役させたＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ニューヨーク州レイクサクセス；オスロ，ＮＯ）を、ＣＤ８およびＣＤ４集団を枯渇させるために使用した。
【０１２３】
ＣＤ３に対するモノクローナル抗体によるＰＢＭＣの同時刺激
ＨＩＶ−１に対して血清陽性の対象からの単離ＰＢＭＣを、ＩＬ−１５（５０ｎｇ／ｍｌ）と共にまたは無しで、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）へ結合されたＣＤ３に特異的なモノクローナル抗体で刺激し、上記のようにＥＬＩＳＰＯＴにより、ＩＦＮ−ガンマの産生を分析した。ＣＤ８かまたはＣＤ４に特異的なモノクローナル抗体と共役させたＤｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を、ＣＤ８およびＣＤ４集団を枯渇させるために使用した。
【０１２４】
ＣＤ４０ＬによるＰＢＭＣの同時刺激
ＣＤ４０Ｌタンパク質を、２５０μｇ／ｍｌの濃度で、ＩＬ−１５およびペプチド混合物と組み合わせて試験し、そして上記のようなＥＬＩＳＰＯＴにより、ＩＦＮ−ガンマの産生を分析した。
【０１２５】
マウスにおけるプラスミド免疫化
メスＢａｌｂ／ｃマウスは、以前に記載されているように、０および２週目に、５０μｇのｐＣｇａｇまたはｐＣｅｎｖ、および５０μｇのＩＬ−２Ｒ依存性Ｔｈ１サイトカインＩＬ−１５を同時ワクチン接種した（下記参考文献３３）。Ｃｄ４ｔｍ１Ｋｍｖ標的化変異体のホモ接合性マウスもまた使用した。これらのマウスは、ＣＤ４遺伝子における変異のため、ＣＤ４＋  Ｔ細胞発生が完全に阻止されている；それらの循環Ｔ細胞の９０％はＣＤ８＋である。ホモ接合性マウスはまた、ヘルパーＴ細胞活性および他のＴ細胞応答におけるクラスＩＩ制限欠損も示す。Ｂ６．１２９Ｓ６−は、０および２週目に、５０μｇのｐＣｇａｇおよび５０μｇのＣＤ４０Ｌ、ＩＬ−１５または両方を組み合わせて発現するプラスミドを同時ワクチン接種した。すべてのＤＮＡはＱｉａｇｅｎカラムを使用して作製し、そして最終処方は、０．２５％ブピバカインを含む等張クエン酸緩衝液であった。脾臓を二回目の注射から一週間後に採取した。
【０１２６】
マウス細胞毒性Ｔリンパ球アッセイ
ＣＴＬ応答は、標的として組換えワクシニア感染細胞を使用する、５時間５１Ｃｒ放出ＣＴＬアッセイで評価した。脾臓細胞は、ワクチン接種して一週間後に単離し、そしてインビトロで刺激した。エフェクターは、関連ワクシニア感染細胞で刺激した。Ｐ８１５を、ｇａｇ／ｐｏｌのためのｖＤＫ１（ＡＲＲＲ）またはｅｎｖのためのｖＭＮ４６２（ＡＲＲＲ）で感染させた。以前に記載されているように刺激細胞を０．１％グルタルアルデヒドで固定し、そしてＣＴＬ培養培地中で４から５日、１：２０の比で脾臓細胞とインキュベートした。ＣＴＬ培養培地は、イスコブ（Ｉｓｃｏｖｅ）変法ダルベッコ培地（Ｇｉｂｃ−−ＢＲＬ，ニューヨーク州グランドアイランド）、そして１０％ウシ胎児血清１６４０（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）およびＣｏｎＡを含まない１０％ＲＡＴ−Ｔ−ＳＴＩＭ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｌａｂｗａｒｅ，マサチューセッツ州ベッドフォード）を加えたハンクス平衡塩類溶液（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）の１：１の比から成っている。ワクシニア感染標的は、３ｘ１０６Ｐ８１５細胞を１０の感染効率（ＭＯＩ）で、３７℃にて１２時間感染させることにより調製した。標準クロム放出アッセイは、標的細胞を２０μＣｉ／ｍｌ  Ｎａ２５１ＣｒＯ４で１２０分標識し、そして刺激されたエフェクター脾臓細胞と３７℃で６時間インキュベートすることにより実施した。ＣＴＬ溶解は５０：１から１２．５：１の範囲のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比で決定した。上清を採取し、ＬＫＢ  ＣｌｉｎｉＧａｍｍａガンマ−カウンターで計数した。パーセント特異的溶解は式：
１００ｘ｛（実験的放出−自発的放出）／（最大放出−自発的放出）｝
から決定する。最大放出は１％トリトンＸ−１００含有培地中の標的細胞の溶解により決定した。「自発的放出」のカウントが「最大放出」の２０％を超えたならば、アッセイは正当とは考えなかった。
ＣＤ８＋Ｔ細胞の補体溶解
ＣＤ８＋Ｔ細胞は抗−ＣＤ８モノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，カリフォルニア州サンディエゴ）での処理により脾臓細胞から取り出され、続いてウサギ補体（Ｓｉｇｍａ）と３７℃で４５分間インキュベートした（下記参考文献３３）。
【０１２７】
マウスＴヘルパー細胞増殖アッセイ
リンパ球増殖アッセイは、リンパ球の全体の免疫適格性を評価するため、および抗原特異的分裂細胞を検出するために使用した。リンパ球を脾臓から採取し、記載されているように、赤血球を除去しそして新鮮な培地で数回洗浄することにより調製した（下記参考文献３４）。単離された細胞懸濁液を５ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。５ｘ１０５細胞を含んでいる１００μｌを直ちに９６ウェルマイクロタイター平底プレートの各ウェルへ加えた。組換えｐ２４タンパク質をウェルに三通りで加えると、５μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌの最終濃度を生じる。細胞は５％ＣＯ２中、３７℃で３日間インキュベートした。各ウェルに１μＣｉのトリチウム化チミジンを加え、そして細胞を３７℃で１２から１８時間インキュベートした。プレートを採取し、取り込まれたトリチウム化チミジンの量をＢｅｔａ  Ｐｌａｔｅリーダー（Ｗａｌｌａｃ，トゥルク，フィンランド）で測定した。刺激指数は式：
刺激指数（ＳＩ）＝（実験的カウント／自発的カウント）
から決定した。自発的カウントウェルは無関係タンパク質対照として働く１０％ウシ胎児血清を含んでいる。同様に、ｐＣＧａｇまたは対照免疫化マウスからの脾臓細胞は、無関係タンパク質標的に対して１のＳＩを有している。細胞が健康であるのを確かめるため、ＰＨＡまたはｃｏｎＡ（Ｓｉｇｍａ）をポリクローナル刺激物質陽性対照として使用した。
【０１２８】
刺激マウス細胞のサイトカインおよびケモカイン分析
リンパ球を脾臓から採取し、そして単離した細胞を１ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。５ｘ１０６細胞／ｍｌを含んでいる１００μｌを９６ウェルマイクロタイター平底プレートの各ウェルへ加えた。組換えｐ２４または外被タンパク質をウェルに三通りで加えると、５μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌの最終濃度を生じる。細胞を５％ＣＯ２中、３７℃で３日間インキュベートし、そして上清を採取した。サイトカインおよびケモカインは商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキットで測定した。
【０１２９】
刺激マウス細胞インターフェロン−γの細胞内染色
マウスにｐＣｇａｇ  ＤＮＡかまたはｐＣｇａｇ  ＤＮＡにｐＩＬ−１５を加えたものを２回注射した。一週間後、脾臓細胞を採取し、そしてｐ５５ペプチドカクテル（１１ａａの重複でＨＩＶ−１  ｐ５５に広がる１２２の１５ｍｅｒを含んでいる）およびブレフェルジンＡを含んでいる培地中で５時間、インビトロで培養した。刺激後、細胞を、抗マウスＣＤ３および抗マウスＣＤ８抗体で細胞外から、そして次ぎに抗マウスＩＦＮ−γで細胞内的に染色した。ドットプロットはＣＤ３＋／ＣＤ８＋リンパ球からの応答を示している。
【０１３０】
エピトープマッピング（ｍａｐｐｉｎｇ）
脾臓細胞を、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ（Ｒ１０）に、１ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。AIDS Reference and Reagent Repository から得られた一連の１２２のペプチドを、プール当たり１０ペプチドのプールとして２０μｇ／ｍｌ／ペプチドの最終濃度で混合した。各ペプチドは総計で２２ペプチドプールの二つの異なったプールに含まれていた。プールをマトリックス形式で配置し、そして脾臓細胞刺激に使用した。ＩＦＮ−ガンマ産生を、ＥＬＩＳＰＯＴ（Ｒ  ａｎｄ  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）により評価した。プレートは３７℃でおよそ２４時間インキュベートした。各試料は三重にアッセイした。
【０１３１】
結果
ＣＤ３およびＩＬ−１５によるリンパ球の刺激
ＩＬ−１５は、Ｔ細胞レセプター刺激と相乗的様式で、Ｔ細胞エフェクター活性化を増加させる能力で評価した。ＰＢＭＣはＨＩＶ−１感染個体から単離した。ＰＢＭＣは、ＣＤ３に対する表面結合抗体で刺激し、そして次ぎにＩＬ−１５と一夜インキュベートした。予測されたように、ＰＢＭＣのＣＤ３刺激単独でＩＦＮ−γの産生が誘導され、一方、ＩＬ−１５補給単独では低い応答が誘導されるかまたは無応答であった。しかしながら、リンパ球をＣＤ３およびＩＬ−１５で一緒に刺激した場合、ＩＦＮ−γを分泌している細胞数の、数倍の増加が観察された（図１）。刺激された集団のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞を枯渇させ、次ぎにＩＬ−１５を補給し、そして活性を再び試験した。再び、ＣＤ８細胞の喪失は、活性化シグナルを枯渇させた。データは、慢性感染ＨＩＶ−１個体からのＣＤ８＋エフェクターＴ細胞が、ＩＬ−１５／ＣＤ３刺激により拡大可能であることを示している（図２）。
【０１３２】
ＩＬ−１５刺激後のＨＩＶ−１陽性試料の抗原特異的ＩＦＮ−γ産生
ＨＩＶ−１抗原特異的ＣＤ８＋応答を増進するＩＬ−１５の能力を、インビトロで評価した。試料は、組み合わせ抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）で処置されている、慢性感染ＨＩＶ−１＋対象から採集した。ＰＢＭＣは、ＩＬ−１５存在下あるいは非存在下、ＨＩＶ−１特異的ペプチドでの刺激後に、ＩＦＮ−ガンマを分泌する能力で評価した。ＰＢＭＣを、ＨＩＶ−１ｇａｇタンパク質の全読み取り枠を包含する、重複ＨＩＶ−１  １５アミノ酸ペプチドで刺激した。ペプチドで刺激された対象からのＰＢＭＣは、ＩＬ−１５で処理した場合、拡大されたＩＦＮ−ガンマ産生を示し（図３Ａおよび３Ｂ）、ＩＬ−１５存在下および非存在下でのＩＦＮ−ガンマ産生間に有意な相違が存在した（ｐ＝．００９）（図３Ｃ）。幾人かの対象は、ＩＬ−１５刺激単独でＩＦＮ−ガンマ分泌の高いレベルを有しており（図３Ａ）、阻止されそして有効であるにはサイトカイン補給を必要とする、部分的Ｔ細胞活性化を有していたことを示唆している。この活性は、ＩＦＮ−ガンマ産生がＣＤ８細胞集団を枯渇した場合に消失するので、明らかにＣＤ８仲介であった（図３Ｄ）。
【０１３３】
ＩＬ−１５はインビトロでマウスにおけるＣＤ８＋ＣＴＬ応答を増進する
ＨＩＶ−１応答およびＩＬ−１５の上記の研究は、ＩＬ−１５が刺激されたＴ細胞集団においてＩＦＮ−ガンマ産生を増進できることを確立した。しかしながら、インビボでのＣＤ８＋Ｔ細胞の機能的誘導に対して、ＩＬ−１５がどのような効果を有しているのかは明らかではない。この質問に取り組むため、マウスモデル系を使用した。ＨＩＶ−１抗原を搬送する、そしてインビボでのＣＤ８免疫性の誘導を研究する手段としてＨＩＶ−１プラスミドをマウスにワクチン接種した。ＨＩＶ−１発現プラスミドは、ＩＬ−１５を発現するプラスミドかまたは対照プラスミドと同時注射し、生じる免疫応答を比較した。大量ＣＴＬアッセイにおいて、ＨＩＶ−１外被およびＩＬ−１５を発現するプラスミドとの同時注射は、外被プラスミドおよび対照ベクターで観察された１１％の溶解と比較し、５０：１のエフェクター：標的比で、ＨＩＶ−１外被発現標的のほとんど４０％の溶解を生じた（図４、パネルＡ）。これらの結果はＣＤ８Ｔ細胞依存性であり、そしてエフェクターＴ細胞応答に対するＩＬ−１５の有意な効果を示している。
【０１３４】
マウスにおいて、ＩＬ−１５は抗原刺激後にＭＩＰ−１βおよびＩＦＮ−γ分泌を誘導する
ワクチン誘導細胞性免疫応答を、免疫活性化のマーカーとしてβ−ケモカインＭＩＰ−１βの発現プロフィールを試験することによりさらに拡張した。ケモカインは免疫および炎症性応答の重要な調節剤である。それらは、宿主防御の血管から末梢部位への白血球輸送の分子制御において特に重要である。さらに、ＭＩＰ−１βを含むＴ細胞産生ケモカインが、細胞性免疫拡大に決定的な役割を果たしていることが以前に報告されている（下記参照文献２４）。それ故、刺激されたＴ細胞により産生されたケモカインのレベルは、抗原特異的細胞性免疫応答のレベルおよび質についての追加の洞察を提供することができる。刺激されたＴ細胞からの上清（材料および方法に記載されているような）を分析し、そしてＭＩＰ−１βの放出を試験した。ＩＬ−１５との同時免疫化は、高レベルのＭＩＰ−１βの分泌を生じた（図４、パネルＢ）。
【０１３５】
上清はまた、Ｔｈ１サイトカイン、ＩＦＮ−γの産生も評価した。試料は、ＨＩＶ−１外被を発現する組換えワクシニアを感染させた刺激細胞による、３日間のリンパ球刺激後にＣＴＬアッセイで使用される細胞からその直前に得られた。図４、パネルＣは、プラスミドワクチン単独または対照を注射したマウスと比較して、ＩＬ−１５を同時注射したマウスからの脾臓細胞はより高いレベルのＩＦＮ−γ（１２０ｐｇ／ｍｌ）を誘導したことを示している。対照的に、これらの研究において、いずれの培養物によっても有意なＩＬ−４産生は観察されなかった（データは示されていない）。
【０１３６】
ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの細胞内染色
ＨＩＶ−１ワクチンに対するＴ細胞応答を定量するため、細胞内サイトカイン染色を実施した。免疫化動物を殺し、脾臓細胞を採取し、そしてｐ５５カクテル混合物およびブレフェルジンＡを含んでいる培地中で、５時間インビトロ培養した。ＣＤ８＋  ＣＤ３＋Ｔ細胞のＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの産生について、フローサイトメトリーによりアッセイした（図５、パネルＡおよび図５、パネルＢ）。ＩＬ−１５を同時ワクチン接種した動物では、２．６％のＣＤ８＋Ｔ細胞がＩＦＮ−γを産生し、３．７％がＴＮＦ−αを産生しているという高いＣＤ８エフェクターＴ細胞応答を示した。これらのデータは、ＩＬ−１５が機能的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答に対して著明な効果を示していることを例証している。
【０１３７】
ＩＬ−１５およびＨＩＶ−１ワクチンで同時免疫化したマウス脾臓細胞のリンパ球増殖
Ｔヘルパーリンパ球の活性化および増殖は、体液性および細胞性免疫拡大に重要である。免疫化マウスからの脾臓細胞は、組換えＨＩＶ−１抗原での刺激に応答して増殖する能力について、基礎リンパ球増殖アッセイにおいて評価した。ＩＬ−１５は、増殖性応答に対して劇的な影響を有していないようである（図６）。しかしながら、ＩＬ−２を対照として使用し、ＩＬ−２プラスミドを同時注射したマウスにおいては、ｇｐ１２０ｅｎｖタンパク質への脾臓細胞増殖の有意な増加が明瞭に観察された。ＩＬ−２を同時注射したマウスの脾臓細胞の刺激指数は、対照（ｐＣｇａｇ単独）またはｐＣＥｎｖ＋ＩＬ−１５で免疫化したマウスの指数よりも少なくとも３倍以上高い指数を生じた（図６）。このデータはさらに、ＩＬ−１５が、Ｔ細胞支援の劇的拡大なしでＣＤ８Ｔ細胞機能を増進させると思われることを例証している。このことは、こうした場合における、ＣＤ４ならびにＣＤ８エフェクター機能の拡大を示唆している。
【０１３８】
エピトープマッピング
ＩＬ−１５処理によるＣＤ８＋Ｔ細胞応答の増進が、応答するエピトープの数の増加によるものか（即ち、エピトープスプレッディング）、または同一のエピトープに特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞の全体数の増加によるものかという問題を解決するため、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイおよびAIDS Reference and Reagent Repository から得られた一連のペプチド（マトリックス形式のプールとして混合されている）を利用した。二つのエピトープを同定した。優位なエピトープはＧａｇアミノ酸１９７から２１１に位置づけられた（AMQMLKETMEEAAE −配列番号１）（図７）。Ｐａｔｅｒｓｏｎらは以前に、組換えＬ．モノサイトジェネスＨＩＶ−１ワクチンでの免疫化後の優位なＣＤ８エピトープをAMQMLKETI −配列番号２と定義している（下記参考文献３５）。準優位なエピトープ、Ｇａｇアミノ酸２９３−３０７（FRDVDRFYKTRAE −配列番号３）（図７）をさらに定義した。Ｇａｇでのみ免疫化された群において、両方のエピトープに対して、応答したエピトープの数の増加は観察されなかった。しかしながら、ＩＬ−１５はこれらのエピトープへの応答の大きさを劇的に拡大した。ＩＬ−１５同時ワクチン接種動物においてのみ、準優位のエピトープが明瞭に明らかであった。ＩＬ−１５はエフェクターＣＤ８細胞の拡大に強い影響を与える。
【０１３９】
ＣＤ４ノックアウトマウス
我々は、ＩＬ−１５がＨＩＶ−１感染個体からのＰＢＭＣにおいて抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞拡大を可能にすることを観察した。我々はまた、我々のワクチンモデルにおいて、ＣＤ４拡大に依存しない、有意なＣＤ８エフェクター細胞誘導も観察した。それ故、ＩＬ−１５免疫拡大に対するＣＤ４ヘルパーＴ細胞の寄与が問題となった。この問題に立ち向かうために、ＣＤ４細胞が完全に非存在下での、ＣＤ８エフェクター集団を誘導するＩＬ−１５の能力を調べた。Ｃｄ４ｔｍ１Ｋｍｖ標的化変異体のホモ接合性マウスを免疫した。これらのマウスは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞発生が完全に阻止されており、そしてそれ故、循環リンパ球のほとんどはＣＤ８細胞である。正常マウスにおいて、百万の脾臓細胞当たり平均およそ２００のＩＦＮ−ガンマ産生細胞が誘導される、プラスミド同時免疫化モデルを利用し、ＣＤ４細胞の完全非存在下では、ＩＬ−１５は誘導されたＣＤ８エフェクター機能を救出することはできなかった（図８、パネルＢ）。ＩＬ−１５の効果はＣＤ４拡大には関与していないと思われたので（図６）、欠損はＴヘルパー細胞により提供される別の機能の欠如によると理由づけられた。ＣＤ４  Ｔヘルパー細胞はまた抗原提示細胞（ＡＰＣ）の活性化を通してＣＤ８拡大のための支援を提供する。ＡＰＣ活性化のこのモデルにおいて、ＡＰＣ上の、Ｔ細胞ＣＤ４０リガンドへのＣＤ４０のライゲーションは、Ｔ細胞活性化を可能にするＢ７発現を上方制御する。Ｂ７分子は、ＭＨＣクラスＩペプチド提示の関連において、ＣＤ８  Ｔ細胞拡大のための同時刺激を提供する。また、Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓらは（下記参考文献３７）、ＣＤ４０Ｌが直接ＣＤ８記憶細胞発生に強く影響を与えることが可能であることを示している。
【０１４０】
ＣＤ４支援における欠損が、それ自身同時刺激の欠如のレベルを示していることを次ぎに考慮しそして探求した。この仮説を試験するため、ＩＬ−１５およびＣＤ４０Ｌの両方、ならびにｐＣｇａｇを含んでいるプラスミドでマウスを免疫した。固着ＣＤ４０Ｌ分子を使用した。固着ＣＤ４０Ｌは局所的におよび免疫細胞の輸送において発現されるであろうが、実験を複雑化する分泌は行われないであろう（下記参考文献３８）。こうしたワクチン接種は、プラスミドモデルにおいて、トランスでの同時刺激を提供することが可能である（下記参考文献３８）。実際、ｐＣｇａｇがｐＣＤ４０Ｌと組み合わされて研究された場合、Ｇａｇ特異的ＣＤ８免疫応答がＣＤ４０  ＫＯマウスにおいて誘導された（図８）。このデータはさらに、ＩＬ−１５が記憶ＣＤ８リンパ球に直接強い影響を与えることを示している。ＣＤ４細胞非存在下では、ＩＬ−１５は未処理の細胞から抗原特異的ＣＤ８細胞性応答を誘導することができなかった。
【０１４１】
議論
ＨＩＶ−１特異的ＣＤ８免疫応答の維持および増進は、多くの研究の源であった。最近の研究は、ＩＬ−１５が、記憶細胞生存を支援することにおいて重要な役割を果たすことができることを報告している。マウスモデルにおいて、ＩＬ−１５の存在は記憶細胞分裂を導くことが可能であることを観察している（下記参考文献３９）。生体外機能分析、ならびに遺伝的にＩＬ−１２、ＩＬ−１５またはその特異的レセプターを欠いているトランスジェニックマウスを使用する研究が、ＩＬ−１５により果たされている役割の特徴づけに重要であった。実際、Ｚｈａｎｇおよび共同研究者（下記参考文献３９）は、インビボマウスモデルにおいて、ＩＬ−１５が記憶表現型、ＣＤ４４ｈｉ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞の有効でそして区別を示す刺激を提供することを示している。そして、Ｋｕら（下記参考文献４０）は、記憶ＣＤ８＋  Ｔ細胞の分裂がＩＬ−１５により刺激されるが、ＩＬ−２によっては阻害されることを報告している。ＩＬ−２がＣＤ８＋記憶Ｔ細胞の増殖を阻害することも観察されている。
【０１４２】
本明細書で開示した研究は、インビトロおよびインビボでＣＤ８＋エフェクターＴ細胞を誘導することにも特に有効であることを示している。ＨＩＶ−１感染患者から単離されたＣＤ８＋  Ｔ細胞は、ペプチドおよびＩＬ−１５とインキュベートした場合、抗原特異的様式でＩＦＮ−ガンマを分泌することが可能である。ＩＬ−１５はＴＣＲと協力してリンパ球を刺激してＩＦＮ−γを産生するように働き、そしてエフェクター表現型を呈している。幾人かの対象において、ＩＬ−１５は、抗原非存在下で、ＩＦＮ−γの産生を導いた。このことは、ＨＩＶ感染において、ある細胞が部分的に活性化され、そしてこの活性化状態がＩＬ−１５により救助できることを示唆している。しかしながら、重要なことは、ＰＢＭＣがＩＬ−１５およびＨＩＶ−１抗原の両方で刺激された場合の、すべての対象におけるエフェクター機能の有意な増加である。
【０１４３】
最近、ｖｏｎ  Ａｄｒｉａｎおよび共同研究者（下記参考文献４１）は、リンパ球のＩＬ−１５刺激が、未処理の細胞から直接、記憶細胞表現型へ進行しているＣＤ８＋  Ｔ細胞を生じることが可能であることを示唆した。しかしながら、本明細書のデータは、ＴＣＲの関与がＣＤ８＋  Ｔリンパ球のより完全な活性化を導くことができることを示唆しており、未処理細胞に対するＩＬ−１５単独の影響は最小であろうことを示している。加えて、ＩＬ−１５は非機能的である記憶細胞へ導いたことが示唆されている（下記参考文献４１）。本明細書のデータは、ヒトならびにマウス研究の両方で評価されるように、ＩＬ−１５拡大が完全に機能的なＣＤ８＋  Ｔ細胞を生じることを示している。マウスにおいて、ＩＬ−１５はＣＤ８＋  Ｔ細胞応答ならびにβ−ケモカインおよびＩＦＮ−ガンマ応答の増進を劇的に増加し、抗原特異的拡大を明瞭に示しており、そして従来の研究（下記参考文献３３および４２）を樹立している。ＣＤ８＋  Ｔ細胞機能のこの拡大は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞拡大の非存在下で観察された。さらに、ＣＤ８応答の発生において、ＣＤ４  Ｔ細胞の重要な役割が存在する。ＣＤ４ノックアウトマウスの研究において、ＣＤ４  Ｔ細胞に対する要求は、ＣＤ４０Ｌを利用することにより回避することができた。この発見は、ウイルス感染の免疫療法に決定的に重要であることができる。
【０１４４】
多くの免疫療法戦略は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答の拡大に焦点を当ててきた。ＨＩＶ−１感染は、効果的なＣＤ４＋  Ｔ細胞支援の欠如へ寄与する、ウイルス誘導免疫抑制を通して免疫療法を複雑にしている。順に、この支援の欠如は、非生産性ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答の原因であると考えられている。一般に、慢性感染は、ウイルス複製の制御を維持するためのＣＤ４＋支援を必要とし、そしてこのことはＨＩＶ−１感染の場合に可能性がある。Ｓｅｒｂｉｎａら（下記参考文献４３）は、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞の発生は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞に依存していることを示した。彼らはさらに、ＣＤ４  Ｔ細胞ノックアウトマウスは減少したＩＬ−１５産生を有していたことも観察した。さらに、ＩＬ−１５はＣＤ４＋  Ｔ細胞により産生されない。それは主として間質細胞、単球およびマクロファージにより産生される。ＣＤ４＋  Ｔ細胞がＩＬ−１５の産生を増進する場合、いくらのフィードバック機構が存在することが可能であり、そして減少したＣＤ４支援の場合、最終的にＣＤ８＋  Ｔ細胞機能は減少する。このフィードバック機構は、ＩＬ−１５単独の添加後、６人の対象中の３人においてなぜＩＦＮ−γの産生があったかを説明することができる。ＣＤ４非存在下、そしてそれ故に低レベルのＩＬ−１５で、残存ウイルスは、ＨＩＶ−１に血清陽性な対象においてＣＤ８＋  Ｔリンパ球を部分的にのみ活性化することができる。重要なことは、ここで、ウイルス免疫抑制により起こされた欠損を置換するため、ＩＬ−１５をトランスで加えることが可能であると思われる。この仮説からの意味を、ＨＩＶ−１の免疫療法の領域で考慮すべきである。
【０１４５】
要約すると、ＩＬ−１５はマウスにおいてＣＤ８＋  Ｔ細胞エフェクター機能を拡大し、そしてＨＩＶ−１感染に陽性な対象から単離されたＣＤ８＋  Ｔ細胞の機能性を拡大した。有効な免疫療法への補給物としてのＩＬ−１５の使用を、ＨＡＡＲＴへの補助療法として考慮すべきである。
１．  Ho, D., 1996, ＨＩＶ感染の治療：問題および見通し. Bull. New York Acad. Med. 73, 37-45。
２．  Finzi, D., Hermankova, M., Pierson, T., Carruth, LM., Buck C., 1997, 高度に能動的な抗ウイルス療法のＨＩＶ−１患者のための貯蔵庫の同定, Science, 278: 1295-1300。
３．  Wong, J., Hezareh, M., Gunthard, H., Havlir, DV., 1997, 血漿ウイルス血症の遷延性抑制にも関わらない複製適格性ＨＩＶの回復, Science, 278: 1291-1294。
４．  Rosenberg, ES., Altfeld, M., Poon, SH., Phillips, MN., Wilkes, BM., Eldridge, RL., Robbins, GK., D Aquilia R, T. Goulder, PJR, Walker, BD, 2000, 急性感染の早期処置後のＨＩＶ−１の免疫制御, Nature, 407: 523 。
５．  Koup R, Safrit J, Cao Y, 1994, 原発性ヒト免疫不全ウイルス１型症候群におけるウイルス血症の初期制御に伴う免疫応答の時間的関連. J of Virol, 68: 4650-4655。
６．  Rinaldo C, Huang X, Fan Z, 1995, 高レベルの抗ヒト免疫不全ウイルス１型  （ＨＩＶ−１）記憶細胞障害性Ｔリンパ球活性および低ウイルス量はＨＩＶ−１感染長期非進行者における疾患の欠如に関連する, J Virol., 69: 5838-5842。
７．  Cao, H., Kanki, P., Sankale, J., 1997, 異なったＨＩＶ−１型クレイド間の細胞障害性Ｔリンパ球交叉反応性：ワクチン開発のための意味,J Virol; 71: 8615-8623。
８．  Rowland-Jones S, Nixon D, Aldhous M., 1993, ＨＩＶ−暴露されたしかし非感染の幼児におけるＨＩＶ−特異的細胞障害性Ｔ細胞活性. Lancet, 341: 860-86 。
９．  Rowland-Jones S, Sutton J, Ariyoshi K, 1995. ＨＩＶ−暴露されたしかし非感染のガンビア女性におけるＨＩＶ−特異的Ｔ細胞．Nature Medicine, 1: 59-64 。
１０．  Borrow, P, Lewicki, H, Wei, S, 1997, ＣＴＬ逃避ウイルスの迅速選択により示された、一次感染間にＨＩＶ−１特異的細胞障害性Ｔリンパ球により発揮された抗ウイルス圧力，Nature Medicine, 3: 205-211 。
１１．  Borrow, R. Shaw GM, 1998, 細胞障害性リンパ球逃避ウイルス変異体は、インビボでの免疫クリアランスのウイルス逃避において重要である，Immunology Rev, 164:37-51 。
１２．  Goulder PJ, Phillips RE, Colbert RA 1997, 免疫優性細胞障害性Ｔリンパ球応答からの後期回避はＡＩＤＳへの進行と関連する，Nature Medicine, 3; 212-217 。
１３．  Goulder PJ, Sewell AK, Lalloo DG, 1997, ＨＬＡ  Ａ０２０１を有する二つのヒト組織適合性白血球抗原ＨＬＡ同一同胞におけるＨＩＶ−１特異的細胞障害性Ｔリンパ球応答の免疫優性パターンは、エピトープ変異により影響される．J Exp Med, 185: 1423-1433 。
１４．  Phillips RE, Rowland-Jones, S Nixon, DF, 1991, 細胞障害性Ｔ細胞認識を回避可能なヒト免疫不全ウイルス遺伝子変動，Nature, 354; 453-459 。
１５．  Koup, RA, 1994, ＣＴＬ認識からのウイルス回避，J Exp Med, 180; 779-782 。
１６．  Ayyavoo, V., Mahboubi, A., Mahalingam, S., Ramalingam R., Kudchodkar, S., Williams, WV., Green, DR., Weiner, DB, 1997, ＨＩＶ−１  ｖｐｒは、核因子ＫＢの制御を通して免疫活性化およびアポトーシスを抑制する，Nature Medicine, 3: 1117-1122 。
１７．  Kerkau, T., Bacik I., Bennink, JR., Yewdell,J W., Huning, T., Schimpll, A., Schubert, U, 1997, ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ＨＩＶ−１）ｖｐｕタンパク質は主組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子の生合成の初期工程を妨げる，J Exp Med., 185: 1295-1305 。
１８．  Lenburg, M. E., and Landau N.R., 1993, ＣＤ４のＶＰＵ誘導分解：ＣＤ４の細胞質ドメインの特異的アミノ酸要求性，J Virol, 67: 6542-6550 。
１９．  Anderson, S., Shugar, D.C., Swanstrom, R., Garcia, J.V., 1993, ヒト免疫不全ウイルスＩ型の一次単離物からのＮｅｆは、ヒトおよびマウスＴ細胞における表面ＣＤ４発現を抑制した，J Virol 67: 4923-4931 。
２０．  Rosenberg, ES, Billings, JM, Caliendo, AM et al., ウイルス血症の制御に関連した活発なＨＩＶ−１特異的ＣＤ４  Ｔ細胞応答，Science, 278: 1447-1450, (1997) 。
２１．  Kalam, SA, Walker BD., 2000, 有効な細胞障害性Ｔの維持におけるＣＤ４支援の決定的要求性；Shankar P. Russo M. Harnisch B. Patterson M. Skolnik P. Lieberman J. 慢性ヒト免疫不全ウイルス感染における循環ＨＩＶ−特異的ＣＤ８（＋）Ｔ細胞の損なわれた機能，Blood. 96(9): 3 094-101 。
２２．  Murali-Krishna, K., Lau., LL., Sambliara, S., Lemonnier, F., Altman, J., Ahmed, R., 1999, ＭＨＣクラスＩ−欠損マウスにおける記憶ＣＤ８  Ｔ細胞の残留性，Science, 286: 1377-1383 。
２３．  Tagaya, Y., Bamford, RN., Defilippis, AP, Waldmann, TA., 1996, ＩＬ−１５：その発現が複数の経路で制御されている、多様なレセプター／シグナリング経路を有する多面的サイトカイン，Immunity 4: 329-336 。
２４．  Chang, KH, Kim, JM, Kim HY, Sorig, YG, Choi, YH, Park, YS, Cho, JH, Hong, SK., 2000, ＨＩＶ−１感染人間からの末梢血単球細胞の自発的、プログラムされた細胞死はＩＬ−１５で減少する，Yonsei Medical Journal, 41: 112-118 。
２５．  Naora H., Gougeon, ML., 1999, 外来性ｌ−１５によるＨＩＶ感染個体のナチュラルキラー集団の増進した生存および強力な拡大，ImmunologyLetters, 68: 359-367 。
２６．  Lin, SJ, Roberts, RL, Ark, BJ, Nguyen, OH, Thomas, EH, Stichn, ER., 1997, ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１型ＧＰ１２０−特異的細胞仲介細胞障害性インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５，Clin. Imm. Immpath, 82: 163-173 。
２７．  Loubeau, M., Ahmad A., Toma E , Menezes, J., 1997, Jo. 組換えＩＬ−１５によるＨＩＶ−感染患者の末梢単核細胞のナチュラルキラーおよび抗体依存性細胞障害性活性の増進，AIDS 16: 137-145 。
２８．  Kacani, L., Sprizl GM., Erdei, A., Dierich, MP, 1999, インビトロにおいてインターロイキン−１５はＨＩＶ−１駆動ポリクローナルＢ細胞応答を増進する，Exp and Clin Immun, 16: 167-179 。
２９．  Kacani, L., Stoiber H., Dierich, MP, 1997, ＨＩＶ−１関連高ガンマグロブリン貧血症におけるＩＬ−１５の役割，Clin Exp Imm 108: 14-18 。
３０．  Agostini, C., Zambello, R., Perrin A., Piazzo, F., Siviero, M., Basso, U., Borfolin, M., Trentin L., Semenatao, G., 1999, ヒト免疫不全ウイルス感染の患者の血管外組織におけるＣＤ８  Ｔ細胞浸潤。インターロイキン１５はＴ細胞相互作用の抗原提示細胞に関係する同時刺激経路を上方調節する，Blood,93: 1277-1286 。
３１．  Patki, AH., Quinone S., Mateo, ME., Dorazio, D., Yen-Lieberman B., Boom WH, Thomas, EK., Ledermann MM, 1996, ヒト免疫不全ウイルス−１拡大を誘導することができるインターロイキン−２の分裂促進的効果を伴わない、インターロイキン−１５による抗原誘導リンパ球増殖の活性化，JCI, 98: 616-621 。
３２．  Lucey DR., Pinto LA, Bethke, FR., Rusnak J., Mekher GP, Hashemi, FN, Landay, AL., Kessler, HA, Paxton, RJ., Grabstein, K., Shearer GM., 正常ドナーおよびヒト免疫不全ウイルス１型感染患者からの末梢血単核細胞に対するインターロイキン−１５のインビトロでの免疫学的およびウイルス学的効果，Clin Diagn Lab Imm, 4: 43-48 。
３３．  Kim, JJ. Trivedi, NN., Nottingham, LK., Morrison, L., Tsai, A., Hu, Y., Mahalingarn, S., Dang, K., Alm, L., Doyle, NK., Wilson, D., Chattergoon, MA., Chalian, AA., Boyer, JD., Agadjanyan, M., Weiner, DB., 1998, ＤＮＡ免疫原を含むカセットの同時投与によるインビボ免疫応答の振幅および方向性の調節，Eur.J Immunol. 28: 1089-1103 。
３４．  Kim JJ. Tsai A. Nottingham LK. Morrison L. Cunning DM. Oh J. Lee DJ. Dang K. Dentchev T. Chalian AA. Agadjanyan MG. Weiner DB, 1999, 細胞内接着分子−１はインビボでベータ−ケモカインを調節しそして直接Ｔ細胞を同時刺激する，Journal of Clinical Investigation. 103: 869-77 。
３５．  Mata, M., Travers, PJ. Liu, Q., Frankel, FR., Paterson, Y., 1998, Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるＨＩＶ−１  ｇａｇへのＭＨＣクラスＩ制限免疫応答は、予想可能なＭＨＣ結合モチーフを有していない単一エピトープを選択し、そしてＰＳのグルタミンおよびポケットＤ間の相互作用を通してＫｄへ結合する，J of Immun., 161: 2985-2993 。
３６．  McCarrick III JW, Parties JR, Seong RH, Solter D, Knowles BB. 1993, マウス胚性幹細胞におけるジフテリア毒素Ａ鎖遺伝子で標的化されている陽性−陰性選択遺伝子，Transgenic Res 2: 183-190 。
３７．  Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ，Ｃ．，Ｒｏｃｈａ，Ｂ．，Ｔａｎｃｈｏｔ，Ｃ．，ＣＤ８＋  Ｔ細胞記憶の発生におけるＣＤ８＋  Ｔ細胞上のＣＤ４０拡大のための役割，２００２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：２０６０−２０６３。
３８．  Sin JI. Kim JJ. Zhang D. Weiner DB. プラスミドＣＤ４０Ｌによる細胞性応答の調節：ＣＤ４０Ｌプラスミドベクターはインビボでヘルペス単純ウイルス２型に対する、抗原特異的ヘルパーＴ細胞１型ＣＤ４＋  Ｔ細胞仲介保護的免疫を増進する，Human Gene Therapy. 12: 1091-102, 2001 。
３９．  Zhang, X., Sun, S., Hwang, I., Tough, DF. Sprent, 1998, J. Immunity, 8: 591-599 。
４０．  Ku, CC., Murakami, M., Sakamoto, A., Kappler, J., Marrack. P., 2000, 対抗するサイトカインによるＣＤ８記憶Ｔ細胞のホメオスタシスの制御，Science, 288: 675-678 。
４１．  Manjunath, N., Shankar,P., Wan,J., Weninger,W., Crowley,MA. Hieshmina, K., Springer,TA., Fan, X., Shen, H., Lieberman, J., von Andrian, UH., 2001,記憶細胞障害性Ｔリンパ球の発生のためには、エフェクター分化は必須ではない，Journal of Clinical Investigation,108:871-878 。
４２．  Moore AC. Kong WP. Chakrabarti BK. Nabel GJ. マウスにおいてのヒト免疫不全ウイルスＤＮＡワクチンに対する免疫応答における抗原および遺伝子アジュバントの効果，Journal of Virology.76(1):243-50, ２００２年１月。
４３．  Serbina NV. Lazarevic V.Flynn JL 2001, ＣＤ４（＋）Ｔ細胞は結核菌感染間の細胞障害性ＣＤ８（＋）Ｔ細胞の発生に必要とされる，Journal of Immunology. 167: 6991-7000 。
【０１４６】
実施例２
免疫易感染性個体ならびに抗腫瘍免疫学において、ウイルス複製を制御するためにＣＤ４（＋）Ｔｈ細胞およびＩＦＮ−ガンマの産生が必要とされている。実施された実験からのデータは、ＣＤ８エフェクターまたはＴ細胞の拡大のためのＴ細胞支援の要求性が、ワクチン部位でのＩＬ−１５およびＣＤ４０Ｌの局所産生により置き換えることが可能であることを示している。ＣＤ４（＋）Ｔ細胞がＭＨＣクラスＩＩベータ鎖の遺伝子ノックアウト（ＭＨＣ  ＩＩ  ＫＯ）により除去されているマウスを使用した実験は、抗原ｇａｇ＋ＩＬ−１５＋ＣＤ４０Ｌで動物を抗原刺激すると、ＣＤ８Ｔ細胞の活性化を導くことを明らかにした。活性化はスポット（ｓｐｏｔ）としてＩＦＮ−ガンマ産生を測定した。このアッセイにおいて、５０スポットより多いものが陽性である。図９に示されたこれらのデータは、ＣＤ４（＋）Ｔ細胞支援に非依存性である、エフェクターＣＤ８Ｔ細胞の活性化のための簡単な方法を例示している。これらの研究は、免疫無防備状態の個体の処置に重要である。
【０１４７】
実施例３
ヒト、マウスおよびサルＩＬ−１５  ｃＤＮＡは、４８アミノ酸（ａａ）リーダーを含んでいる１６２ａａ残基前駆体タンパク質をコードしており、それは切断されて１１４ａａ残基の成熟ＩＬ−１５を発生する。ヒトＩＬ−１５は、サルおよびマウスＩＬ−１５と各々、およそ９７％および７３％の配列同一性を共有している。ヒトおよびサルＩＬ−１５の両方ともマウス細胞に対して活性である。ＩＬ−１５の構造は決定されていないが、ＩＬ−２および４本へリックスバンドルサイトカインファミリーの他のメンバーと類似していると予測されている。(Grabstein, K. et al. (1994) Science 264: 965, Anderson, D. M. et al. (1995) Genomics 25: 701 ;およびBamford, R. N. et al. (1995) Cytokine 7: 595, Brandhuber, B. J. et al. (1987) Science 238: 1707, 両方とも本明細書において援用される)。
【０１４８】
ＩＬ−１５  ｍＲＮＡは心臓、肺、肝臓、胎盤、骨格筋、接着性末梢血単核細胞、ＡＰＣ（樹状細胞）そして上皮および繊維芽細胞株において検出されている。しかしながら、ＩＬ−１５  ｍＲＮＡは高レベルのＩＬ−２  ｍＲＮＡを含む活性化末梢血Ｔ細胞では検出されていない。ＩＬ−１５はナチュラルキラー細胞、活性化末梢血Ｔリンパ球、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）およびＢ細胞の増殖を刺激することが示されている。加えて、ＩＬ−１５はまた、ヒト血液Ｔリンパ球に対して化学誘引物質であり、ＮＫ細胞においてリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）活性を誘導し、そして細胞溶解性エフェクター細胞の発生を誘導することも示されている。(Armitage, R. J. et al. (1995) J. Immunol. 154: 483 ; P. Wilkinson and F. Liew (1995) J. Exp. Med. 181: 1255 ; Grabstein, K. et al. (1994) Science 264: 965 ;Giri, J. G. et al. (1994) EMBO J. 13: 2822 ;およびGiri, J. G. et al. (1995) EMBO J. 15: 3654,  各々が本明細書において援用される)。
【０１４９】
ＩＬ−１５はプロトタイプＴｈ１サイトカインであるので、そしてＴ細胞、ＮＫ細胞、ＬＡＫ細胞およびＴＩＬの刺激剤としてのその活性のため、ＩＬ−１５は、細胞性免疫応答を増進させるために、ＨＩＶワクチンのごときＤＮＡワクチンと共に分子補助剤として使用するための刺激的な候補である。ＩＬ−１５はＨＩＶ特異的ＣＴＬを拡大し、そしてＩＬ−１５の過剰産生は、クローン病のごとき炎症性疾患と関連している。
【０１５０】
ノーザンブロット分析は、ＩＬ−１５の広範囲に広がった構成的発現を示している。発現の制御は、翻訳およびトランスロケーション（細胞内輸送）のレベルで、転写後に起こっている。ＩＬ−１５  ｍＲＮＡはタンパク質へのその翻訳を妨害する多くの要素を含んでおり、以下のものが含まれる：１）効果的なＩＬ−１５翻訳を妨害する、５’ＡＵＧが上流ＡＵＧとともに負担となる（マウスで５、ヒトで１２）；２）ＩＬ−１５コード配列のための開始コドンは弱いコザック含有物(GTAATGA) を有している；３）ＩＬ−１５成熟タンパク質コード配列のＣ末端における負の要素の存在。(Grabstein et al., (1994) Science 264: 965-968, Bamford et al., (1996) PNAS 93: 2897-2902; Bamford et al., (1998) J. Immunol 160: 4418-4426 ;およびKozak et al., (1991) J. Cell Biol. 115: 887-903, これらは各々、本明細書において援用される）。これら三つの制御の各々は、発現を改良するために除去することができる。
【０１５１】
天然のＩＬ−１５アイソフォームは二つのリーダーペプチドを含んでいる：２１ａａシグナルペプチド（ＳＳＰ）または４８ａａシグナルペプチド（ＬＳＰ）（Waldmannら，Ann. Rev．Immunol. (1999) 17: 19-49, 本明細書において援用される）。
【０１５２】
免疫化のためのＩＬ−１５  ＤＮＡ構築物の最適化を通して、ＩＬ−１５の発現を増加させるため、以下の戦略に従った。プライマーはシグナルペプチドの開始からＩＬ−１５を増幅するように設計し、それ故上流抑制性ＡＵＧは最終ＩＬ−１５メッセージ中には存在しない。プライマーは強力なコザック含有物(GCCGCCACC) を含むように設計した。ＰＣＲアンチセンスプライマー設計を使用して、Ｃ末端負の制御要素を除去した。プライマーは図１０に示されている。
【０１５３】
ＩｇＥリーダーでの４８アミノ酸ＩＬ−１５シグナルペプチド（ＬＳＰ）の置換を通した、ＩＬ−１５の発現を増加させるための以下の戦略を実施した。センスプライマーは４８ａａＬＳＰ後に開始するように設計し、一方アンチセンスプライマーは終止部位から増幅した。プライマーは強力なコザック含有物(GCCGCCACC−配列番号４)を含むように設計した。センスプライマーは、ＡＴＧ開始部位を加えたＩｇＥリーダー配列のための配列を含むように設計した。プライマーは図１１に示されている。
【０１５４】
多様な構築物を調製し、そしてＲＤ細胞をトランスフェクトするために使用した。ＩＬ−１５タンパク質産生を、多様な構築物について測定した。データは図１２、パネルＡ−Ｃに示されている。図１３ＡはＩＬ−１５へ連結された２１アミノ酸シグナルペプチドのためのコード配列（ＩＬ−１５  ＳＳＰ−左）およびヒト４８アミノ酸シグナルペプチドのためのコード配列（ＩＬ−１５  ＬＳＰ−右）を含むヒト構築物による発現の比較を示している。図１２，パネルＢは、４８アミノ酸シグナルペプチドのためのコード配列（ヒトＩＬ−１５  ＬＳＰ−左）およびＩｇＥシグナルペプチドのためのコード配列（ヒトＩＬ−１５−ＩｇＥ−右）を含むヒト構築物による発現の比較を示している。図１２、パネルＣは、４８アミノ酸シグナルペプチドのためのコード配列（ＭａｃＩＬ−１５  ＬＳＰ−左）およびＩｇＥシグナルペプチドのためのコード配列（ＭａｃＩＬ−１５−ＩｇＥ−右）を含むマカク構築物による発現の比較を示している。
【０１５５】
ＩＬ−１５生物活性は、多様な構築物から産生されたＩＬ−１５タンパク質を測定した。データは図１３パネルＡおよびＢに示されている。図１３、パネルＡは、４８アミノ酸シグナルペプチド（ヒトＩＬ−１５  ＬＳＰ−左）およびＩｇＥシグナルペプチドのためのコード配列（ヒトＩＬ−１５−ＩｇＥ−右）を含むヒト構築物間のＩＬ−１５生物活性の比較を示している。図１３、パネルＢは、４８アミノ酸シグナルペプチドのためのコード配列（ＭａｃＩＬ−１５  ＬＳＰ−左）およびＩｇＥシグナルペプチドのためのコード配列（ＭａｃＩＬ−１５−ＩｇＥ−右）を含むマカク構築物間のＩＬ−１５生物活性の比較を示している。
【０１５６】
ＩｇＥシグナルペプチドのためのコード配列に連結されたＩＬ−１５コード配列の挿入を含む発現ベクターｐＶＡＸを使用して構築物を作製した。ＨＩＶ−１  Ｇａｇをコードする構築物も発生させた。ＨＩＶ−１  Ｇａｇと組み合わせたＩＬ−１５操作プラスミドを使用して、免疫応答に対する効果を比較する免疫学的実験を実施した。図１４に示された免疫化スケジュールに従って、Ｂａｌｂ／ｃマウスをワクチン接種した。
【０１５７】
免疫応答は、３回目の免疫化から５週後に、抗原特異的ＩＦＮ−γ産生の再刺激を比較することにより研究した。データは図１５に示されている。ワクチン群には、未処理マウス、ベクターｐＣＤＮ３をワクチン接種したマウス、ＨＩＶ−１  Ｇａｇをコードする構築物をワクチン接種したマウス、ＨＩＶ−１  Ｇａｇおよび４８アミノ酸シグナルペプチドへ連結されたＩＬ−１５をコードする構築物をワクチン接種したマウス、そしてＩｇＥシグナルペプチドへ連結されたＨＩＶ−１  Ｇａｇをコードする構築物をワクチン接種したマウスが含まれていた。
【０１５８】
実施例４
操作されたＩＬ−１５プラスミドワクチンを、天然のＩＬ−１５コザック領域、ＡＵＧおよびＵＴＲを除去することにより構築した。操作されたＩＬ−１５プラスミドは、ＩｇＥシグナルペプチドのためのコード配列と共に提供した。操作されたＩＬ−１５は、匹敵する野生型プラスミドで観察されたレベルより、３０から５０倍のレベルで発現した。操作されたＩｇＥシグナル−ＩＬ−１５およびＨＩＶ−１  ｇａｇ構築物で同時免疫されたマウスで観察された免疫応答は、ＨＩＶ−１  ｇａｇ構築物単独で免疫されたマウスよりも著しい倍数で大きかった。データは図１６に示されている。
【０１５９】
実施例５
免疫調節タンパク質をコードする単離されたｃＤＮＡは、免疫調節タンパク質を産生可能である構築物の構築において出発物質として有用である。いくつかの態様において、以下の免疫調節タンパク質の一つのコード配列がＩｇＥシグナルペプチドへ連結されている構築物を提供する。いくつかの態様において、こうした構築物を本明細書に記載されているようなワクチンおよび免疫調節組成物の一部として提供する。
【０１６０】
標準技術および容易に入手可能な出発物質を使用して、免疫調節タンパク質をコードする核酸分子を調製し、そして本明細書に記載されているような構築物、ベクター、ワクチンその他の中へ組み込むことができる。
【０１６１】
Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ０３１１６７は、ヒトＩＬ−１５  ｍＲＮＡの完全コード配列を示している。Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｙ０９９０８、Ｘ９１２３３、Ｘ９４２２３およびＸ９４２２２もまたヒトＩＬ−１５配列を示している。各々の配列は本明細書において援用される。
【０１６２】
Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｌ０７４１４は、ヒトＣＤ４０−リガンド  ｍＲＮＡを示している。本配列は本明細書において援用される。
【０１６３】
Ｂａｘのためのヌクレオチドおよびアミノ酸配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＬ２２４７３であり、本明細書において援用される。
【０１６４】
ＴＲＡＩＬのためのヌクレオチドおよびアミノ酸配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＵ３７５１８またはＡＦ０２３８４９であり、本明細書において援用される。
【０１６５】
ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５のためのヌクレオチドおよびアミノ酸配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＵ９０８７５またはＡＦ０１６２６６であり、本明細書において援用される。また、本明細書において援用されるのは、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２  ＡＦ０１６８４９；ＴＲＡＩＬ−Ｒ３  ＡＦ０１４７９４；およびＴＲＡＩＬ−Ｒ４  ＡＦ０２１２３２である。
【０１６６】
ＲＡＮＫのためのヌクレオチドおよびアミノ酸配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＡＦ０１８２５３であり、本明細書において援用される。
【０１６７】
ＲＡＮＫ  ＬＩＧＡＮＤのためのヌクレオチドおよびアミノ酸配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＡＦ０１９０４７またはＡＦ３３３２３４であり、本明細書において援用される。
【０１６８】
Ｏｘ４０のためのヌクレオチドおよびアミノ酸配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＸ７５９６２であり、本明細書において援用される。
【０１６９】
Ｏｘ４０  ＬＩＧＡＮＤのためのヌクレオチドおよびアミノ酸配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＸ７９９２９またはＡＢ００７８３９であり、本明細書において援用される。
【０１７０】
ＮＫＧ２Ｄのためのヌクレオチドおよびアミノ酸配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＡＦ４６１８１１またはＸ５４８７０であり、本明細書において援用される。
【０１７１】
ＭＩＣＡのためのヌクレオチドおよびアミノ酸配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＸ９２８４１であり、本明細書において援用される。
【０１７２】
ＭＩＣＢのためのヌクレオチドおよびアミノ酸配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＵ６５４１６であり、本明細書において援用される。
【０１７３】
ＮＫＧ２Ａのためのヌクレオチドおよびアミノ酸配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＸ５４８６７であり、本明細書において援用される。
【０１７４】
ＮＫＧ２Ｂのためのヌクレオチドおよびアミノ酸配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＸ５４８６８であり、本明細書において援用される。
【０１７５】
ＮＫＧ２Ｃのためのヌクレオチドおよびアミノ酸配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＸ５４８６９またはＡｊ００１６９８４であり、本明細書において援用される。
【０１７６】
ＮＫＧ２Ｅのためのヌクレオチドおよびアミノ酸配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＬ１４５４２であり、本明細書において援用される。
【０１７７】
ＮＫＧ２Ｆのためのヌクレオチドおよびアミノ酸配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＡＨ００６１７３、Ｕ９６８４５またはＵ９６８４６であり、本明細書において援用される。
【０１７８】
ＣＤ３０のためのヌクレオチドおよびアミノ酸配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＭ８３５５４であり(Durkop, H et al. Cell 68 (3), 421-427 (1992)) 、本明細書において援用される。
【０１７９】
ＣＤ１５３（ＣＤ３０Ｌ）のためのヌクレオチドおよびアミノ酸配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＬ０９７５３であり(Smith, C. A. , et al. Cell 73 (7), 1349-1360 (1993))  、本明細書において援用される。
【０１８０】
Ｆｏｓのためのヌクレオチド配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＫ００６５０またはＶ０１５１２であり、各々が本明細書において援用される。
【０１８１】
ｃ−ｊｕｎのためのヌクレオチド配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＪ０４１１１またはＭ２９０３９であり、各々が本明細書において援用される。
【０１８２】
Ｓｐ−１のためのヌクレオチド配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＢＣ０２１１０１、ＢＣ００５２５０、ＢＣ００２８７８、Ｍ３１１２６、Ｊ０２８９３またはＸ１５１０２であり、各々が本明細書において援用される。
【０１８３】
Ａｐ１のためのヌクレオチド配列は、Lee et al, 1987 Cell 49: 741-752, Rauscher et al. 1988 Science 240: 1010-1016, およびChiu et al, 1988 Cell 54: 541- 552 に記載されているように同定することが可能であり、各々が本明細書において援用される。
【０１８４】
Ａｐ−２のためのヌクレオチド配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＭ３６７１１であり、本明細書において援用される。
【０１８５】
ｐ３８のためのヌクレオチド配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＵ６６２４３であり、本明細書において援用される。
【０１８６】
ｐ３８のためのヌクレオチド配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＵ６６２４３であり、本明細書において援用される。
【０１８７】
ｐ６５Ｒｅｌのためのヌクレオチド配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＬ１９０６７であり、本明細書において援用される。
【０１８８】
ＭｙＤ８８のためのヌクレオチド配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＵ７０４５１であり、本明細書において援用される。
【０１８９】
ＩＲＡＫのためのヌクレオチド配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＮＭ００１５６９であり、本明細書において援用される。
【０１９０】
ＴＲＡＦ６のためのヌクレオチド配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＵ７８７９８であり、本明細書において援用される。
【０１９１】
ＩｋＢのためのヌクレオチド配列は、Gilmore et al. Trends Genet 1993 Dec; 9 (12): 427-33 、に記載されているように見出すことが可能であり、本明細書において援用される。
【０１９２】
ＮＩＫのためのヌクレオチド配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＹ１０２５６であり、本明細書において援用される。
【０１９３】
ＳＡＰ  Ｋのためのヌクレオチド配列は、Franklin et al. Oncogene. 1995 Dec 7; 11 (11) : 2365-74 、に記載されているように見出すことが可能であり、本明細書において援用される。
【０１９４】
ＳＡＰ１のためのヌクレオチド配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＭ８５１６４またはＭ８５１６５であり、各々が本明細書において援用される。
【０１９５】
ＪＮＫ２のためのヌクレオチド配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＬ３１９５１であり、本明細書において援用される。
【０１９６】
ＪＮＫ１Ｂ２のためのヌクレオチド配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＵ３５００５である；本明細書において援用される。
【０１９７】
ＪＮＫ１Ｂ１のためのヌクレオチド配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＵ３５００４である；本明細書において援用される。
【０１９８】
ＪＮＫ２Ｂ２のためのヌクレオチド配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＵ３５００３である；本明細書において援用される。
【０１９９】
ＪＮＫ２Ｂ１のためのヌクレオチド配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＵ３５００２である；本明細書において援用される。
【０２００】
ＪＮＫ１Ａ２のためのヌクレオチド配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＵ３４８２２である；本明細書において援用される。
【０２０１】
ＪＮＫ２Ａ１のためのヌクレオチド配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＵ３４８２１である；本明細書において援用される。
【０２０２】
ＪＮＫ３Ａ１のためのヌクレオチド配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＵ３４８２０である；本明細書において援用される。
【０２０３】
ＪＮＫ３Ａ２のためのヌクレオチド配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＵ３４８１９であり、本明細書において援用される。
【０２０４】
ＮＦ−カッパ−Ｂ２、ｐ４９スプライス形のためのヌクレオチド配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＡ５７０３４であり、本明細書において援用される。
【０２０５】
ＮＦ−カッパ−Ｂ２、ｐ１００スプライス形のためのヌクレオチド配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＡ４２０２４であり、本明細書において援用される。
【０２０６】
ＮＦ−カッパ−Ｂ２、ｐ１０５スプライス形のためのヌクレオチド配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＳ１７２３３であり、本明細書において援用される。
【０２０７】
ＮＦ−カッパ−Ｂ２  ５０Ｋ鎖前駆体のためのヌクレオチド配列のＧＥＮＢＡＮＫ受入番号はＡ３７８６７であり、本明細書において援用される。
【０２０８】
ＮＦｋＢ  ｐ５０のためのヌクレオチド配列は、Meyer R. , et al. (1991) Proc. 
Natl. Acad. Sci. USA 88 (3), 966 970 、に記載されており、本明細書において援用される。
【０２０９】
ヒトＩＬ−１  αのヌクレオチドおよびアミノ酸配列はよく知られており、そしてTelford, et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14: 9955-9963, Furutani, et al. (1985) Nucl. Acids Res. 14: 3167-3179, March, et al. (1985) Nature 315: 641-647 、および受入コードＳｗｉｓｓｐｒｏｔ  Ｐ０１５８３に示されており、各々が本明細書において援用される。
【０２１０】
ヒトＩＬ−２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はよく知られており、そしてHolbrook, et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1634-1638, Fujita, et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 7437-7441, Fuse, et al. (1984) Nucl. Acids Res. 12: 9323- 9331, Taniguchi, et al. (1983) nature 302: 305-310, Meada, et al. (1983) Biochem. Biophys. Res. Comm. 115: 1040-1047, Devos, et al. (1983) Nucl. Acids Res. 11: 4307-4323, および受入コードＳｗｉｓｓｐｒｏｔ  Ｐ０１５８５に示されており、各々が本明細書において援用される。
【０２１１】
ヒトＩＬ−４のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はよく知られており、そしてArai, et al. (1989) J. Immunol. 142: 274-282 Otsuka, et al. (1987) Nucl. Acids Res. 15: 333- 344, Yokota, et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci USA 83: 5894-5898, Noma, et al. (1984) Nature 319: 640-646, Lee, et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2061-2063 およびＳｗｉｓｓｐｒｏｔ  ０５１１２（マウスＩＬ−４の受入コードはＳｗｉｓｓｐｒｏｔ  ０７７５０である）に示されており、各々が本明細書において援用される。
【０２１２】
ヒトＩＬ−５のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はよく知られており、そしてCampbell, et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 6629-6633, Tanabe, et al. (1987) J. Biol. Chem. 262: 16580-16584, Campbell, et al. (1988) Eur. J. Biochem. 174: 345-352, Azuma, et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14: 9149-9158, Yokota, et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7388-7392 、および受入コードＳｗｉｓｓｐｒｏｔ  Ｐ０５１１３に示されており、各々が本明細書において援用される。
【０２１３】
ヒトＩＬ−１０のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はよく知られており、そしてViera, et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1172-1176 7392 、および受入コードＳｗｉｓｓｐｒｏｔ  Ｐ２２３０１に示されている。
【０２１４】
ヒトＩＬ−１５のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はよく知られており、そしてGrabstein, et. al. (1994) Science 264: 965-968 、および受入コードＳｗｉｓｓｐｒｏｔ  ＵＯ３０９９に示されており、各々が本明細書において援用される。
【０２１５】
ヒトＩＬ−１８のヌクレオチドおよびアミノ酸配列はよく知られており、そしてUshio, et al. (1996) J. Immunol. 156: 4274-4279 、および受入コードＳｗｉｓｓｐｒｏｔ  Ｄ４９９５０に示されており、各々が本明細書において援用される。
【０２１６】
ヒトＴＮＦ−αのヌクレオチドおよびアミノ酸配列はよく知られており、そしてPennica, (1984) Nature 312: 724-72 、および受入コードＳｗｉｓｓｐｒｏｔ  ＰＯ１３７５に示されており、各々が本明細書において援用される。
【０２１７】
ヒトＴＮＦ−βのヌクレオチドおよびアミノ酸配列はよく知られており、そしてGray, (1984) Nature 312: 721-724 、および受入コードＳｗｉｓｓｐｒｏｔ  ＰＯ１３７４に示されており、各々が本明細書において援用される。
【０２１８】
ヒトインターロイキン１２  ｍＲＮＡの完全コード配列はＧＥＮＢＡＮＫ受入番号ＡＦ１８０５６３（Ｐ４０  ｍＲＮＡ）およびＡＦ１８０５６２（Ｐ３５  ｍＲＮＡ）および米国特許第５，８４０，５３０号に示されており、各々が本明細書において援用される。
【０２１９】
ＭａｄＣＡＭ−１のための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｕ８００１６に見出せ(Leung, E. , et al, Immunogenetics 46 (2), 111-119 (1997)) 、各々が本明細書において援用される。
【０２２０】
ＭａｄＣＡＭ−１のための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｕ４３６２８に見出せ(Shyjan, A. M. , et al, J. Immunol. 156 (8), 2851-2857 (1996)) 、各々が本明細書において援用される。
【０２２１】
ＮＧＦのための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ５７３９９に見出せ(Kretschmer, P. J. , et al., Growth Factors 5,99-114 (1991)) 、各々が本明細書において援用される。
【０２２２】
ＩＬ−７のための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｊ０４１５６に見出せ(Goodwin, R. G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86 (1), 302-306 (1989) ) 、各々が本明細書において援用される。
【０２２３】
ＶＥＧＦのための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ３２９７７に見出せ(Leung, D. W. , et al., Science 246,1306-1309 (1989) ) 、各々が本明細書において援用される。
【０２２４】
ＴＮＦ−Ｒのための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ６０２７５に見出せ(Gray, P. W. , et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 87,7380-7384 (1990) ) 、各々が本明細書において援用される。
【０２２５】
ＴＮＦ−Ｒのための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ６３１２１に見出せ(Himmler, A., et al. DNA Cell Biol. 9,705-715 (1990)) 、各々が本明細書において援用される。
【０２２６】
Ｆａｓのための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ６７４５４に見出せ(Itoh, N. , et al. , Cell 66 (2), 233-243 (1991)) 、各々が本明細書において援用される。
【０２２７】
ＣＤ４０Ｌのための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｌ０７４１４に見出せ(Gauchat, J. F. M., et al. FEBS Lett, 315,259-266 (1992)) 、各々が本明細書において援用される。
【０２２８】
ＩＬ−４のための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ２３４４２に見出せ(Arai, N. , et al. , J. Immunol. 142 (1), 274-282 (1989)) 、各々が本明細書において援用される。
【０２２９】
ＩＬ−４のための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ１３９８２に見出せ(Yokota, T., et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83 (16), 5894-5898 (1986)) 、各々が本明細書において援用される。
【０２３０】
ＣＳＦのための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ３７４３５に見出せ(Wong, G. G. , et al. Science 235 (4795), 1504-1508(1987)) 、各々が本明細書において援用される。
Ｇ−ＣＳＦのための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｘ０３６５６に見出せ  (Nagata, S., et al, EMBO J. 5 (3), 575-581 (1986)) 、本明細書において援用される。
【０２３１】
Ｇ−ＣＳＦのための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｘ０３６５５に見出せNumber (Nagata, S. , et al., EMBO J. 5 (3), 575-581 (1986))  、本明細書において援用される。
【０２３２】
ＧＭ−ＣＳＦのための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ１１２２０に見出せ(Lee, F. , et al., Proc. Ntl. Acad. Sci. U. S. A. (13), 4360-4364 (1985)) 、本明細書において援用される。
【０２３３】
ＧＭ−ＣＳＦのための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ１０６６３に見出せ(Wong, G. G. , et al. , Science 228 (4701), 810-815 (1985)) 、本明細書において援用される。
【０２３４】
Ｍ−ＣＳＦのための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ２７０８７に見出せ(Takahashi, M., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 161 (2), 892-901 (1989)) 、本明細書において援用される。
【０２３５】
Ｍ−ＣＳＦのための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ３７４３５５に見出せM37435 (Wong G. G. , et al., Science 235 (4795), 1504-1508(1987)) 、本明細書において援用される。
【０２３６】
ＬＦＡ−３のための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｙ００６３６に見出せ(Wallner, B. P. , et al. , J. Exp. Med. 166 (4), 923-932 (1987)) 、本明細書において援用される。
【０２３７】
ＩＣＡＭ−３のための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｘ６９８１９に見出せ、本明細書において援用される。
【０２３８】
ＩＣＡＭ−２のための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｘ１５６０６に見出せ(Staunton, D. E. , et al. , Nature 339 (6219), 61-64 (1989)) 、本明細書において援用される。
【０２３９】
ＩＣＡＭ−１のための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｊ０３１３２に見出せ(Staunton, D. E. , et al., Cell 52 (6), 925-933 (1988)) 、本明細書において援用される。
【０２４０】
ＰＥＣＡＭのための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ２８５２６に見出せ(Newman, P. J. , et al. , Science 247,1219-1222 (1990)) 、本明細書において援用される。
【０２４１】
Ｐ１５０．９５のための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｙ０００９３に見出せ(Corbi, A. L. , et al. , EMBO J. 6 (13), 4023-4028 (1987)) 、本明細書において援用される。
【０２４２】
Ｍａｃ−１のための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｊ０３９２５に見出せ(Corbi, A. L. , et al. , J. Biol. Chem. 263 (25), 12403-12411 (1988)) 、本明細書において援用される。
【０２４３】
ＬＦＡ−１のための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｙ００７９６に見出せ(Larson. R. , et al. , J. Cell Biol. 108 (2), 703-712 (1989)) 、本明細書において援用される。
【０２４４】
ＣＤ３４のための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ８１１０４に見出せ(Simmons, D. L. et al. , J. Immunol. 148,267-271 (1992)) 、本明細書において援用される。
【０２４５】
ＲＡＮＴＥＳのための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ２１１２１に見出せ(Schall, T. J. , et al. , J. Immunol. 141,1018-1025 (1988)) 、本明細書において援用される。
【０２４６】
ＩＬ−８のための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ２８１３０に見出せ(Mukaida, N. , et al. , J. Immunol. 143 (4), 1366-1371 (1989)) 、本明細書において援用される。
【０２４７】
ＭＩＰ−１αのための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｕ７２３９５に見出せ(Fridell, R. A. , et al. , J. Cell. Sci 110 (pt 11), 1325-1331 (1997)) 、本明細書において援用される。
【０２４８】
Ｅ−セレクトンのための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ２４７３６に見出せ(Bevilacqua, M. P. , et al. , Science 243 (4895), 1160-1165 (1989)) 、本明細書において援用される。
【０２４９】
ＣＤ２のための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ１４３６２に見出せ(Sewell, W. A. , et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83,8718-8722 (1986); Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 84,7256-7256 (1987)) 、本明細書において援用される。
【０２５０】
ＭＣＰ−１のための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｓ６９７３８に見出せ(Li, Y. S. , et al. , Mol. Cell. Biochem. 126 (1), 61-68 (1993)) 、本明細書において援用される。
【０２５１】
Ｌ−セレクトンのための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｘ１６１５０に見出せ(Tedder, T. F. , et al. , J. Exp. Med. 170 (1), 123-133 (1989)) 、本明細書において援用される。
【０２５２】
Ｐ−セレクトンのための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ２５３２２に見出せ(Johnston, G. I. , et al., Cell 56,1033-1044 (1989)) 、本明細書において援用される。
【０２５３】
ＦＬＴのための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｘ９４２６３に見出せ(Mandriota, S. J. , et al. , J. Biol. Chem. 271 (19), 11500-11505 (1996)) 、本明細書において援用される。
【０２５４】
ＦＬＴのための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｘ５１６０２に見出せ(Shibuya, M. et al. Oncogene 5 (4), 519-524 (1990) Han, H. J. , et al. Hum. Mol. Genet. 2 (12), 2204 (1993)) 、本明細書において援用される。
【０２５５】
Ａｐｏ−１のための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｘ６３７１７に見出せ(Oehm, et al, J. Biol. Chem., (1992), 267 (15), 10709-15) 、本明細書において援用される。
【０２５６】
Ｆａｓのための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ６７４５４に見出せ(Itoh, et al. , Cell, (1991), 66 (2), 233-43) 、本明細書において援用される。
【０２５７】
ＴＮＦＲ−１ための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ６７４５４に見出せ(Nophar, et al. , EMBO J. , 1990,9 (10), 3269-78) 、本明細書において援用される。
【０２５８】
ｐ５５のための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ５８２８６に見出せ(Loetscher, et al., Cell, 1990,61, 351-359) 、本明細書において援用される。
【０２５９】
ＷＳＬ−１のための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｙ０９３９２に見出せ(Kitson, et al. , Nature, 1996,384 (6607), 372-5) 、本明細書において援用される。
【０２６０】
ＤＲ３のための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｕ７２７６３に見出せ(Chinnaiyan, et al. , Science, 1996,274 (5829), 990-2) 、本明細書において援用される。
【０２６１】
ＴＲＡＭＰのための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｕ７５３８１に見出せ(Bodmer, et al. , Immunity, 1997,6 (1), 79-88) 、本明細書において援用される。
【０２６２】
Ａｐｏ−３のための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｕ７４６１１に見出せ(Marsters, et al. , Curr. Biol. , 1996,6 (12), 1669-76) 、本明細書において援用される。
【０２６３】
ＡＩＲのための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｕ７８０２９に見出せ、本明細書において援用される。
【０２６４】
ＬＡＲＤのための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｕ９４５１２に見出せ(Screaton, et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997,94 (9), 4615-19) 、本明細書において援用される。
【０２６５】
ＮＧＲＦのための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｍ１４７６４に見出せ(Johnson, et al. , Cell, 1986,47 (4), 545-554) 、本明細書において援用される。
【０２６６】
ＤＲ４（ＴＲＡＩＬ）のための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｕ９０８７５に見出せ(Pan, et al., Science, 1997,276 (5309), 111-113) 、本明細書において援用される。
【０２６７】
ＤＲ５のための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ０１２５３５に見出せ(Sheridan, et al. , Science, 1997,1 227 (5327), 818-821) 、本明細書において援用される。
【０２６８】
ＫＩＬＬＥＲのための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ０２２３８６に見出せ(Wu, et al. , Nat. Genet. 17 (2), 141-143 (1997)) 、本明細書において援用される。
【０２６９】
ＴＲＡＩＬ−Ｒ２のための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ０２０５０１に見出せ、本明細書において援用される。
【０２７０】
ＴＲＩＣＫ２のための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ０１８６５７に見出せ、本明細書において援用される。
【０２７１】
ＤＲ６のための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＦ０６８８６８に見出せ、本明細書において援用される。
【０２７２】
ＩＣＥのための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｕ１３６９７、Ｕ１３６９８およびＵ１３６９９に見出せ(Alnemri, E. S., et al. , J. Biol. Chem. 270 (9), 4312-4317 (1995)) 、本明細書において援用される。
【０２７３】
ＶＬＡ−１のための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｘ１７０３３に見出せ(Takada. , et al. , J. Biol. Chem. 109 (1), 397-407 (1989)) 、本明細書において援用される。
【０２７４】
ＣＤ８６（Ｂ７．２）のための配列情報は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｕ０４３４３に見出せ(Azuma, et al. , Nature. 366 (6450), 76 (1993)) 、本明細書において援用される。
【０２７５】
【表１】
0005623444.tif 000002
【０２７６】
【表２】
0005623444.tif 000003
【０２７７】
【表３】
0005623444.tif 000004
【０２７８】
【表４】
0005623444.tif 000005
【０２７９】
【表５】
0005623444.tif 000006
【図１】
0005623444.tif 000007
【図２】
0005623444.tif 000008
【図３Ａ】
0005623444.tif 000009
【図３Ｂ】
0005623444.tif 000010
【図３Ｃ】
0005623444.tif 000011
【図３Ｄ】
0005623444.tif 000012
【図４】
0005623444.tif 000013
【図５】
0005623444.tif 000014
【図６】
0005623444.tif 000015
【図７】
0005623444.tif 000016
【図８】
0005623444.tif 000017
【図９】
0005623444.tif 000018
【図１０】
0005623444.tif 000019
【図１１】
0005623444.tif 000020
【図１２】
0005623444.tif 000021
【図１３】
0005623444.tif 000022
【図１４】
0005623444.tif 000023
【図１５】
0005623444.tif 000024
【図１６】
0005623444.tif 000025
【配列表】
0005623444000001.app