(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類由来のＡＴＦ４および／またはＧＡＤＤ３４をコードするヌクレオチドを含有する発現ユニットを哺乳類細胞に導入することにより、導入前と比較してＡＴＦ４およびＧＡＤＤ３４を除く目的タンパク質の発現を増強させる工程を含む、哺乳類細胞における目的タンパク質の製造方法であって、目的タンパク質は分泌タンパク質である製造方法。
【請求項２】
増強工程において、ＡＴＦ４および／またはＧＡＤＤ３４の発現量が、発現ユニット導入前の哺乳類細胞における内在性のＡＴＦ４および／またはＧＡＤＤ３４の発現量に比べて１．１〜１０倍増加している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
目的タンパク質が哺乳類細胞に導入された外来遺伝子産物である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
分泌タンパク質がＡＴ  ＩＩＩまたはｈＧＭ−ＣＳＦである、請求項１〜３いずれかに記載の方法。
【請求項５】
哺乳類細胞がCHO細胞、BHK細胞、HEK293細胞、COS細胞、NS0細胞、SP2/0細胞またはPER.C6TM細胞である、請求項１〜４いずれかに記載の方法。
【請求項６】
哺乳類細胞がCHO細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
哺乳類がハムスターである、請求項１〜６いずれかに記載の方法。
【請求項８】
ＡＴＦ４をコードするヌクレオチド配列がハムスター由来のＡＴＦ４をコードするヌクレオチド配列と少なくとも95％の同一性を有し、ＧＡＤＤ３４をコードするヌクレオチド配列がハムスター由来のＧＡＤＤ３４をコードするヌクレオチド配列と少なくとも95％の同一性を有する、請求項１〜７いずれかに記載の方法。
【請求項９】
哺乳類由来のＡＴＦ４および／またはＧＡＤＤ３４をコードするヌクレオチドを含有する発現ユニットをＸＢＰ−１および／またはＡＴＦ６が活性化されている哺乳類細胞に導入することにより、導入前と比較してＡＴＦ４およびＧＡＤＤ３４を除く目的タンパク質の発現を増強させる工程を含む、哺乳類細胞における目的タンパク質の製造方法であって、目的タンパク質は分泌タンパク質である製造方法。
【請求項１０】
増強工程において、ＡＴＦ４および／またはＧＡＤＤ３４の発現量が、発現ユニット導入前の哺乳類細胞における内在性のＡＴＦ４および／またはＧＡＤＤ３４の発現量に比べて１．１〜１０倍増加している、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
目的タンパク質が哺乳類細胞に導入された外来遺伝子産物である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
分泌タンパク質がＡＴ  ＩＩＩまたはｈＧＭ−ＣＳＦである、請求項９〜１１いずれかに記載の方法。
【請求項１３】
哺乳類細胞がCHO細胞、BHK細胞、HEK293細胞、COS細胞、NS0細胞、SP2/0細胞またはPER.C6TM細胞である、請求項９〜１２いずれかに記載の方法。
【請求項１４】
哺乳類細胞がCHO細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
哺乳類がハムスターである、請求項９〜１４いずれかに記載の方法。
【請求項１６】
ＡＴＦ４をコードするヌクレオチド配列がハムスター由来のＡＴＦ４をコードするヌクレオチド配列と少なくとも95％の同一性を有し、ＧＡＤＤ３４をコードするヌクレオチド配列がハムスター由来のＧＡＤＤ３４をコードするヌクレオチド配列と少なくとも95％の同一性を有する、請求項９〜１５いずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物細胞を用いた組換えタンパク質の製造分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換えタンパク医薬品の製造において、抗体などの糖鎖を有するタンパク質に対して通常は動物細胞が宿主として使用される。その生産性の向上のために、従来では強力なプロモーターの使用やエンハンサー配列の使用、さらには遺伝子増幅現象を利用した染色体中の導入遺伝子のコピー数の増加といった技術が開発されてきたが、これらの技術の多くは目的遺伝子のｍＲＮＡ量を増加させるものであった。これらの技術は組換えタンパク質の生産性を向上させるために効果的ではあるものの、すべての組換えタンパク質の高生産を約束するものではない。一方で、ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳過程においてタンパク質のフォールディングにミスが生じることが知られている。ミスフォールディングによって生じたタンパク質は疎水性残基を表面に露出して凝集しやすくなっており、それらが過剰に蓄積すると細胞にとって極めて危険な状態となる。細胞はこのような危険な状態を回避するため、タンパク質の翻訳を調節する機構、タンパク質を分泌する能力や不適切なタンパク質を処理する能力を増強するＵＰＲ（Unfolded protein response）と呼ばれる機構を備えている（これらを総じてＥＲストレス応答と呼ぶ）。
【０００３】
近年、ＵＰＲに関わる転写因子ＸＢＰ１（X box binding protein）の活性型やＡＴＦ６（Activating transcription factor 6）の細胞質側ドメインを細胞内で過剰発現させることにより細胞自身の分泌機能を向上させ、動物細胞による分泌タンパク質の生産量を増加させる技術が開発されてきている（特許文献１、２および３）。
【０００４】
ＡＴＦ４（Activating transcription factor 4）は、前記転写因子ＸＢＰ１およびＡＴＦ６とは異なるシス配列を認識する転写因子である。ＡＴＦ４はアミノ酸代謝や抗酸化ストレスに関わる遺伝子を活性化させることが知られている（非特許文献１）。ＡＴＦ４に関しては、以下のような翻訳調節に関わるメカニズムが報告されている。ＥＲストレスにより、タンパク質の翻訳開始に関わる因子ｅＩＦ２（Eukaryotic translation initiation factor）がリン酸化されると、タンパク質の翻訳が停止され、ＡＴＦ４による転写活性が活性化される。またそれに従って、ＡＴＦ４の下流遺伝子であるＧＡＤＤ３４遺伝子（Growth arrest and DNA damage gene）が発現誘導される（非特許文献２）。ＧＡＤＤ３４はＰＰ１ｃ（Catalytic subunit of protein phosphatase 1）に結合し、リン酸化ｅＩＦ２を脱リン酸化することにより、停止していた翻訳を再開させることが報告されている（非特許文献３）。
【特許文献１】ＷＯ２００４／１１１１９４号パンフレット
【特許文献２】ＷＯ２００５／０９４３５５号パンフレット
【特許文献３】ＵＳ２００６／００５３５０２号公報
【非特許文献１】Mol. Cell, 11, 619-633, 2003
【非特許文献２】J. Biol. Chem., 278, 34864-34873, 2003
【非特許文献３】J. Cell Biol., 153, 1011-1022, 2001
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、動物細胞を用いた組換えタンパク質の産生系で、目的タンパク質のさらなる増産が可能な手段の提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、前記問題点に鑑み、鋭意検討した結果、ＸＢＰ１の活性化では効果のなかった組換えタンパク質の産生系において、ＥＲストレス応答におけるＸＢＰ１とは別の経路にも着目して当該応答に関与する別の因子を過剰発現させることにより、前記目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。即ち、本願発明は、以下に示す通りである。
〔１〕ＡＴＦ４および／またはＧＡＤＤ３４をコードするヌクレオチドを含有する発現ユニットを動物細胞に導入し、目的タンパク質の発現を増強させる工程を含む、動物細胞における目的タンパク質の製造方法。
〔２〕増強工程において、ＡＴＦ４および／またはＧＡＤＤ３４の発現量が、発現ユニット導入前の動物細胞における内在性のＡＴＦ４および／またはＧＡＤＤ３４の発現量に比べて増加している、〔１〕に記載の方法。
〔３〕目的タンパク質が動物細胞に導入された外来遺伝子産物である、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕目的タンパク質が分泌タンパク質である、〔１〕〜〔３〕いずれかに記載の方法。
〔５〕動物細胞が哺乳類の細胞である、〔１〕〜〔４〕いずれかに記載の方法。
〔６〕哺乳類細胞がCHO細胞、BHK細胞、HEK293細胞、COS細胞、NS0細胞、SP2/0細胞またはPER.C6TM細胞である、〔５〕に記載の方法。
〔７〕哺乳類細胞がCHO細胞である、〔５〕に記載の方法。
〔８〕ＡＴＦ４および／またはＧＡＤＤ３４をコードするヌクレオチドを含有する発現ユニットを、ＸＢＰ−１および／またはＡＴＦ６が活性化されている動物細胞に導入し、目的タンパク質の発現を増強させる工程を含む、動物細胞における目的タンパク質の製造方法。
〔９〕ＡＴＦ４および／またはＧＡＤＤ３４をコードするヌクレオチドを導入してなる、タンパク質高産生用動物細胞株。
〔１０〕動物細胞が哺乳類の細胞である、〔９〕に記載の細胞株。
〔１１〕哺乳類細胞がCHO細胞、BHK細胞、HEK293細胞、COS細胞、NS0細胞、SP2/0細胞またはPER.C6TM細胞である、〔１０〕に記載の細胞株。
〔１２〕哺乳類細胞がCHO細胞である、〔１０〕に記載の細胞株。
【発明の効果】
【０００７】
本発明の製造方法によると、本来は翻訳停止時に活性化される転写因子ＡＴＦ４および／またはＧＡＤＤ３４を強制発現させることによって、動物細胞における目的タンパク質の生産性を向上させることができる。目的タンパク質をコードするヌクレオチドからのｍＲＮＡ発現量を増加させる手段を本発明の方法と組み合わせることにより、単独の手段では得られなかった目的タンパク質の高い生産性が達成される。また、本発明の製造方法は、ＸＢＰ１やＡＴＦ６とは異なる転写因子を利用するため、ＸＢＰ１やＡＴＦ６による転写活性化で生産性向上が達成できなかった細胞株に対しても生産性の向上が達成される。さらには、既にＸＢＰ１やＡＴＦ６による転写活性化により生産性が向上した細胞株に対しても、生産性の向上が期待できる。さらに、本発明の動物細胞株によると、ＡＴＦ４および／またはＧＡＤＤ３４遺伝子を導入したことにより、目的タンパク質の高生産に適する系を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
本発明は、ＡＴＦ４および／またはＧＡＤＤ３４をコードするヌクレオチドを含有する発現ユニットを動物細胞に導入し、目的タンパク質の発現を増強させる工程を含む、動物細胞における目的タンパク質の製造方法を提供する。
【０００９】
本発明において、ＡＴＦ４とは、ＥＲストレス応答などのストレス応答において、ｅＩＦ２のリン酸化に伴って翻訳が停止することにより活性化される転写因子をいう。
【００１０】
本発明において、ヌクレオチドとは、２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成するセンス鎖およびアンチセンス鎖といった各１本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡなどを包含する趣旨で用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。
【００１１】
「ＡＴＦ４をコードするヌクレオチド」は、いかなる動物由来のものであってもよく、ヒト、サル等の霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ等の家畜もしくは実験動物、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類を始めとする哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類に由来するものなどがあげられるが、これらに限定されるものではない。具体的には、例えば、ヒトＡＴＦ４をコードするヌクレオチド配列は、Genbank Accession No.NM_001675、NM_182810、BC073754などで公表されている。また、マウスＡＴＦ４をコードするヌクレオチド配列は、Genbank Accession No.BC085169などで公表されており、ラットＡＴＦ４をコードするヌクレオチド配列は、Genbank Accession No.NM_024403などで公表されている。前記ヌクレオチド配列は、本発明の目的を達成しうる限りにおいて、前記Genbankに登録された配列と少なくとも70％、好ましくは80％、より好ましくは95％、さらにより好ましくは97％同一な配列であってもよい。配列の同一性は、公知のアラインメントアルゴリズムにより決定することができ、例えば、NCBIホームページで利用可能なBLASTNを初期(default)設定で用いることにより決定できる。同一性％はまた、Smith-Watermanのアルゴリズムを使用して、ギャップ・オープン・ペナルティー（gap open penalty）：１２、ギャップ・エクステンション・ペナルティー（gap extension penalty）：１によりアフィン・ギャップ検索（affine gap search）を行うことにより決定してもよい。これらヌクレオチドは、自体公知の方法により単離または製造することができる。
【００１２】
「ＡＴＦ４」には、その同族体（ホモログやスプライスバリアント）、変異体、誘導体、成熟体およびアミノ酸修飾体などが包含される。ここでホモログとしては、例えば、ヒトＡＴＦ４に対応する他生物種のタンパク質が例示でき、これらはHomoloGene（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene/）により同定された遺伝子の塩基配列から演繹的に同定することができる。また変異体には、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、および人為的に欠失、置換、付加または挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお、前記変異体としては、前記Genbank Accession No.で公表されているアミノ酸配列と、少なくとも70％、好ましくは80％、より好ましくは95％、さらにより好ましくは97％同一なものを挙げることができる。アミノ酸配列の同一性は、前記ヌクレオチド配列の同一性と同様に決定することができる。またアミノ酸修飾体には、天然に存在するアミノ酸修飾体、天然に存在しないアミノ酸修飾体が包含され、具体的にはアミノ酸のリン酸化体が挙げられる。
【００１３】
本発明において、ＧＡＤＤ３４とは、ＥＲストレス応答などのストレス応答において、ｅＩＦ２のリン酸化に伴って活性化されるＡＴＦ４から発現誘導されるタンパク質であって、ＰＰ１ｃ（Catalytic subunit of protein phosphatase 1）に結合し、リン酸化ｅＩＦ２を脱リン酸化する作用を有するタンパク質をいう。
【００１４】
「ＧＡＤＤ３４をコードするヌクレオチド」は、いかなる動物由来のものであってもよく、ヒト、サル等の霊長類、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ等の家畜もしくは実験動物、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類を始めとする哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類に由来するものなどがあげられるが、これらに限定されるものではない。具体的には、例えば、ヒトＧＡＤＤ３４をコードするヌクレオチドは、Genbank Accession No.U83981などで公表されている。また、ラットＧＡＤＤ３４をコードするヌクレオチドは、Genbank Accession No.AY128642、AH011730などで公表されており、ハムスターＧＡＤＤ３４をコードするヌクレオチドは、Genbank Accession No.L28147などで公表されている。前記ヌクレオチド配列は、本発明の目的を達成しうる限りにおいて、前記Genbankに登録された配列と少なくとも70％、好ましくは80％、より好ましくは95％、さらにより好ましくは97％同一な配列であってもよい。これらヌクレオチドは、自体公知の方法により単離または製造することができる。
【００１５】
「ＧＡＤＤ３４」には、その同族体（ホモログやスプライスバリアント）、変異体、誘導体、成熟体およびアミノ酸修飾体などが包含される。ここでホモログとしては、例えば、ヒトＧＡＤＤ３４に対応する他生物種のタンパク質が例示でき、これらはHomoloGene（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/HomoloGene/）により同定された遺伝子の塩基配列から演繹的に同定することができる。また変異体には、天然に存在するアレル変異体、天然に存在しない変異体、および人為的に欠失、置換、付加または挿入されることによって改変されたアミノ酸配列を有する変異体が包含される。なお、前記変異体としては、前記Genbank Accession No.で公表されているアミノ酸配列と、少なくとも70％、好ましくは80％、より好ましくは95％、さらにより好ましくは97％同一なものを挙げることができる。アミノ酸配列の同一性は、前記ヌクレオチド配列の同一性と同様に決定することができる。またアミノ酸修飾体には、天然に存在するアミノ酸修飾体、天然に存在しないアミノ酸修飾体が包含され、具体的にはアミノ酸のリン酸化体が挙げられる。
【００１６】
本発明の目的タンパク質の製造方法は、ＡＴＦ４および／またはＧＡＤＤ３４をコードするヌクレオチドを含有する発現ユニットを動物細胞に導入し、目的タンパク質の発現を増強させる工程を含むことを特徴とする。
【００１７】
本発明で用いられる発現ユニットは、ＡＴＦ４および／またはＧＡＤＤ３４をコードするヌクレオチドを含有し、導入された動物細胞で発現可能なものであればいかなるものであってもよく、当該動物細胞に応じて適宜選択することができる。ＡＴＦ４およびＧＡＤＤ３４をコードするヌクレオチドは、１つの発現ユニット中に含まれていてもよく、別々の発現ユニット中に含まれていてもよい。
【００１８】
発現ユニットは、遺伝子工学的な取り扱いが容易で、動物細胞への導入効率のよい発現ベクターが好ましい。かかる発現ユニット（ベクター）には、プロモーター／ターミネーターがＡＴＦ４および／またはＧＡＤＤ３４をコードするヌクレオチドに作動可能に連結されていることが好ましい。ＡＴＦ４は通常はＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）上流の特異的な配列（ｕＯＲＦ）の存在により翻訳レベルでの発現調節を受けるタンパク質である（Proc. Natl. Acad. Sci., Vol.101, pp11269-11274 (2004)）ことから、この翻訳調節を解除するような発現ユニットであれば、タンパク質の発現に利用されるすべてのプロモーター／ターミネーターを用いることができる。１つの発現ユニット中にＡＴＦ４およびＧＡＤＤ３４をコードする２種のヌクレオチドが含まれる場合、これらヌクレオチドは、１つのプロモーター／ターミネーターの制御下に転写、翻訳されてもよく、別々のプロモーター／ターミネーターの制御下に転写、翻訳されてもよい。
【００１９】
プロモーターとしては、構成的に発現可能なプロモーターでも、温度変化や薬剤などにより誘導可能なプロモーターでも使用することができる。これらのプロモーターは、導入対象の細胞に対して内因性のプロモーターであっても異種プロモーターであってもよい。例えば、哺乳類の細胞を用いる場合、構成的に発現可能なプロモーターとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ-１αプロモーター、ＣＡＧプロモーター等があげられ、温度変化（温度感受性）プロモーターとしては、ＳＶ４０ｔｓプロモーター等があげられ、薬剤により誘導可能なプロモーターとしては、Tet‐On/Offシステム、Ecdysoneシステム、Rapamycinシステム等があげられる。
【００２０】
本発明の製造方法における動物細胞としては、タンパク質の製造に通常使用されるあらゆる細胞を限定なく使用することができる。前記細胞が由来する動物の例として、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫などがあげられる。ヒト細胞と同様の糖鎖の修飾がなされ、ヒトでの活性を保持したタンパク質の製造のためには、哺乳類由来の細胞が好ましく、例えば、CHO細胞、BHK細胞等のハムスター細胞、NS0細胞、SP2/0細胞等のマウス細胞、COS細胞等のサル細胞、HEK293細胞、PER.C6TM細胞等のヒト細胞が好適な例としてあげられる。
【００２１】
前記発現ユニットの前記動物細胞への導入は、細胞染色体への安定な組込みを目的とするものであっても、一過性の導入であってもよい。導入は、自体公知の方法で行えばよく、例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム法（ＣａＰｉ）、ポリフェクション法（ＰＥＩ）、塩化カルシウム法（カルフェクション）等のトランスフェクションがあげられる。
【００２２】
目的タンパク質は、内在性のタンパク質であっても、外来性の遺伝子産物（タンパク質）であってもよい。外来性のタンパク質の場合、動物細胞にあらかじめ前記発現ユニットを安定的に導入しておき、外来性タンパク質発現ベクターを後から安定的にまたは一過性に導入してもよく、同時に安定的に導入してもよい。あるいは、前記発現ユニットと外来性タンパク質発現ベクターとを一過性に同時に導入してもよい。
【００２３】
一実施形態として、目的タンパク質をコードするヌクレオチドと当該ヌクレオチドからのｍＲＮＡの発現量を増加させる手段を組込んだ発現ベクターを、動物細胞に安定的に導入して得た外来性タンパク質発現細胞株に、前記発現ユニットを安定的または一過性に導入することが好ましい。このような例として、外来性タンパク質をコードするヌクレオチドとdhfrをコードするヌクレオチドとを連結した発現ベクターを導入した動物細胞を、Methotrexateを添加した培地中で培養し、外来性タンパク質コード遺伝子が増幅された外来性タンパク質発現細胞株を選択する。次に、前記遺伝子増幅した細胞株に、前記発現ユニットを一過性または安定的に導入して、目的タンパク質の発現を増強させる手段があげられる。
【００２４】
前記発現ユニットを導入した動物細胞は、目的タンパク質とＡＴＦ４および／またはＧＡＤＤ３４とが共発現するように、常法により培養することができる。誘導可能なプロモーターの制御下で発現させる場合、当該プロモーターに応じた条件下で、例えば、温度感受性プロモーターの場合は培養温度を調節することによって、薬剤誘導性プロモーターの場合は培地中に所定の濃度の薬剤を添加することによって、ＡＴＦ４および／またはＧＡＤＤ３４を発現させる。
【００２５】
ＡＴＦ４および／またはＧＡＤＤ３４の発現量は、目的タンパク質の発現を増強させるためには、発現ユニット導入前の動物細胞（対照）における内在性のＡＴＦ４および／またはＧＡＤＤ３４の発現量に比べて増加していることが好ましい。動物細胞の種類や培養条件により異なり一概には言えないが、ＡＴＦ４および／またはＧＡＤＤ３４のｍＲＮＡ発現量の増加は、対照と比べて、約１．１〜１０倍程度が例示され、好ましくは約１．１〜２．５倍である。前記発現量は、例えば、常法により細胞からタンパク質を抽出して、ウエスタンブロッティングまたはＥＬＩＳＡ等により測定することができる。また、前記ｍＲＮＡ発現量は、ｍＲＮＡのレベルをＰＣＲ法により測定することによって確認することができる。
【００２６】
また、ＡＴＦ４および／またはＧＡＤＤ３４の発現量の増加の目安は、動物細胞の種類や培養条件により異なり一概には言えないが、ＡＴＦ４および／またはＧＡＤＤ３４の発現量の増加によって動物細胞のアポトーシスが誘導されない程度に調節することが好ましい。アポトーシスの誘導がないことは、発現ユニットを導入した動物細胞と対照とを同様の条件下で培養し、培養中の細胞生存率に有意差がないことを指標にすればよい。
【００２７】
前記増強工程によりその生産性が向上する目的タンパク質は、特に限定されるものではなく、分泌タンパク質、膜タンパク質、細胞質または核内に局在するタンパク質等があげられる。培養後の回収の容易さから、目的タンパク質は分泌タンパク質であることが好ましい。分泌タンパク質は、目的タンパク質をコードするヌクレオチドの上流にシグナルペプチドをコードするヌクレオチドを連結させた遺伝子組換え体を発現させることにより動物細胞外への分泌能を獲得したタンパク質であってもよい。
【００２８】
分泌タンパク質としては、アンチトロンビンIII（AT III）、血清アルブミン、プロウロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、フィブリノーゲン、トロンビン、第VIII因子、第IX因子等の血漿タンパク質；各種抗体もしくはその断片；ＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、エリスロポエチン等のサイトカイン；成長ホルモン、インスリン等のペプチドホルモン；上皮成長因子、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング成長因子、血小板由来成長因子、神経成長因子等の成長因子；グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ等の酵素等があげられる。
【００２９】
別の態様において、本発明の目的タンパク質の製造方法は、ＡＴＦ４および／またはＧＡＤＤ３４をコードするヌクレオチドを含有する発現ユニットを、ＸＢＰ−１および／またはＡＴＦ６が活性化されている動物細胞に導入し、目的タンパク質の発現を増強させる工程を含む。本態様において、導入対象の動物細胞は、ＸＢＰ−１および／またはＡＴＦ６が活性化されている。
【００３０】
ＸＢＰ−１および／またはＡＴＦ６が活性化されている動物細胞とは、細胞の培養またはクローニングを通じて得られたＸＢＰ−１および／またはＡＴＦ６が自発的に活性化されている細胞であってもよく、国際公開第２００４／１１１１９４号パンフレット、国際公開第２００５／０９４３５５号パンフレットまたはＵＳ２００６／００５３５０２号公報等に記載の外来性のＸＢＰ−１および／またはＡＴＦ６が活性化されている細胞であってもよい。あるいは、ＡＴＦ４および／またはＧＡＤＤ３４をコードするヌクレオチドを含有する発現ユニットと同時または別々に、ＸＢＰ−１および／またはＡＴＦ６をコードするヌクレオチドを含有する発現ユニットを動物細胞に導入することによって、ＸＢＰ−１および／またはＡＴＦ６が活性化されている細胞であってもよい。ＸＢＰ−１および／またはＡＴＦ６をコードするヌクレオチドを含有する発現ユニットは、前記国際公開第２００４／１１１１９４号パンフレットまたは国際公開第２００５／０９４３５５号パンフレットに記載の方法に準じて調製し、動物細胞に導入することができる。
【００３１】
ＸＢＰ−１および／またはＡＴＦ６の活性化体の発現量は、例えば、常法により細胞からタンパク質を抽出して、ウエスタンブロッティングまたはＥＬＩＳＡ等により測定することができる。また、ＸＢＰ−１および／またはＡＴＦ６のｍＲＮＡのレベルをＰＣＲ法により測定することによっても確認することができる。活性化の程度は、対照細胞と比べてＸＢＰ−１および／またはＡＴＦ６の活性化体の転写量または翻訳量よりも多いことを指標にする。ここで、対照細胞とは、自発的にＸＢＰ−１および／またはＡＴＦ６が活性化する前の細胞、あるいは、ＸＢＰ−１および／またはＡＴＦ６をコードするヌクレオチドを含有する発現ユニットを導入する前の細胞である。
【００３２】
本発明は、ＡＴＦ４および／またはＧＡＤＤ３４をコードするヌクレオチドを導入してなる、タンパク質高産生用動物細胞を提供する。前記細胞は、本発明の目的タンパク質の製造方法に好適に用いられる。前記細胞は、前述したＡＴＦ４および／またはＧＡＤＤ３４をコードするヌクレオチドを含有する発現カセットを動物細胞に導入し、ＡＴＦ４および／またはＧＡＤＤ３４を発現するクローンを選択することによって得られる。クローンの選択は、前記発現ユニットに選択マーカー（薬剤耐性遺伝子、栄養要求性遺伝子等）をさらに含有させることによって、容易に実施できる。
【００３３】
本発明のタンパク質高産生用動物細胞としては、タンパク質の製造に通常使用されるあらゆる細胞を限定なく使用することができる。前記細胞が由来する動物の例として、哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫等があげられる。ヒト細胞と同様の糖鎖の修飾がなされ、ヒトでの活性を保持したタンパク質の製造のためには、哺乳類由来の細胞が好ましく、例えば、CHO細胞、BHK細胞等のハムスター細胞、NS0細胞、SP2/0細胞等のマウス細胞、COS細胞等のサル細胞、HEK293細胞、PER.C6TM細胞等のヒト細胞が好適な例としてあげられる。
【実施例】
【００３４】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
【００３５】
１．実験材料
１−１．使用細胞株
導入対象の宿主株としてアンチトロンビン III(以下AT IIIと省略する)産生低血清（0.5%FBS）馴化細胞13D-35D 株（Yamauchi et al., Biosci. Biotech. Biochem.56:600-604, 1992）を使用した。また、ＡＴＦ４ｃＤＮＡおよびＸＢＰ１ｃＤＮＡのクローニングにはＣＨＯ−Ｋ１(RCB0285)株を使用した。
【００３６】
１−２．使用培地
すべての培地は、0.22μMのメンブレンフィルター(Nalgen Nunc  595-4520)を用いて濾過滅菌した後、使用した。特に表記していない場合は特級試薬を用いた。
(1)低血清(0.5%)α-MEM培地
CHO13D-35D株の培地として、α-MEM粉末（GIBCO）10.03gおよびNaHCO32.2gを超純水１Ｌに溶解し、HClでpH7.2に調整したα-MEM培地に下記MTX液、Trace metal液および表１に示す種々の物質を添加したものを用いた。
2mM Methotrexate (MTX)液
NaCl（818mg）、HEPES（559mg）およびNa2HPO4・12H2O（50mg）を超純水50mLに溶解し、HClでpH7.1に調整した溶液を調製し、Methotrexate(Sigma M-0269)を50.8mg加えた。
Trace metal液
CoCl2・6H2O（1.1mg）、CuSO4・5H2O（2.5mg）、FeSO4・7H2O（23.8mg）、MnSO4・4H2O（0.8mg）、(NH4)6Mo7O24・4H2O（1.25mg）およびZnSO4・7H2O（1.5mg）を超純水50mLに溶解し、オートクレーブ滅菌したものを使用した。
【００３７】
【表１】
0005548932.tif 000002
【００３８】
(2)10%血清添加RDF培地
チャイニーズハムスター卵巣細胞CHO-K1株は、RDF培地を用いて培養した。RDF培地は、RDF(HO)粉末（日本製薬、8.44g）、グルコース（2.58g）、NaHCO3（2.0g）、グルタミン（0.333g）、ペニシリンG(1700units／mg、58.8mg)およびストレプトマイシン（120mg）を超純水１Ｌに溶解した。培養に使用する際には、牛胎児血清(fetal bovine serum (FBS); JRH bioscience)を培地容量の10vol%相当量加えた。
【００３９】
２．測定・解析方法
２−１．AT III濃度測定
サンドイッチELISA法を用いてAT III濃度を測定した。測定に用いた試薬を以下に示す。
Rabbit anti-human AT III(DAKO A296)
Sheep anti-human AT III affinity purified IgG-peroxidase conjugate（POD-抗AT‐III）(cederlane CL20015HP)
ELISAmate for peroxidase conjugate (KPL 54-62-00)
Coating buffer concentrate、Diluent／blocking solution conjugate、ABTS peroxidase substrate、Peroxidase solution B、Peroxidase stop solution concentrateは上記キットに付属の試薬である。
【００４０】
固層化抗体液
Coating buffer concentrate（1mL）およびRabbit anti-human AT III（14.3μL）に蒸留水を加えて全量を10mLとした。
1×Diluent／blocking液
Diluent／blocking solution conjugateを蒸留水で10倍に希釈して用いた。
洗浄液
NaCl（4.5g）およびTween 20（250μL）を蒸留水500mLに溶解したものを用いた。
POD-抗AT III抗体液
Sheep anti-human AT III（2.5μL）を1×Diluent／blocking液10mLで希釈して用いた。
酵素反応基質液
ABTS peroxidase substrate          5mL
Peroxidase solution B              5mL
反応停止液
Peroxidase stop solution concentrateを蒸留水で５倍に希釈したものを用いた。
【００４１】
測定手順は以下のようにして行った。
1)  固層化抗体液をELISA用96穴プレート(Coster 3590)に各ウェルに100μL分注し、室温で1時間インキュベートした。
2)  1×Diluent／blocking液を各ウェルに300μL分注し、室温で1時間インキュベートした。
3)  標準サンプル（天然型AT III）及び適当な濃度に希釈した培養上清サンプル（1×Diluent／blocking液で希釈）を各ウェルに100μL加え、室温で1.5時間インキュベートした。
4)  プレートを洗浄液で5回洗浄した後、POD-抗AT III抗体液を各ウェルに100μL加え、室温で1時間インキュベートした。
5)  プレートを洗浄液で5回洗浄した後、酵素反応基質液を各ウェルに100μL加え、室温で15分間インキュベートした。
6)  反応停止液を酵素反応基質液を加えた順に各ウェルに100μLずつ分注し、マイクロプレートリーダー(東ソーMRP-A4)で405nmの吸光度を測定した。
【００４２】
２−２．細胞数計数法
細胞数は、Burker-Turk型 (ERMA 4296)血球計算盤を用いて、色素排除法を用いて算出した。
1)  培地とPBSで適度に希釈した細胞懸濁液を調製した。
2)  0.20％(W／V)トリパンブルー水溶液：4.25％(W／V)NaCl水溶液＝4：1の割合で混合した。
3)  1)と2)等量ずつをピペッティングでよく混合し、血球計算盤とカバーガラスのすきまに静かにしみ込ませた。
4)  倒立位相差顕微鏡で細胞数を計測し、細胞濃度を算出した。
【００４３】
２−３．構築した細胞の各比速度評価法
構築した細胞のAT III比生産速度、比増殖速度は、Omasa et al., Effect of lactate concentration on hybridoma culture in lactate-controlled fed-batch operation. Biotechnol. Bioeng. 39, 556-564（1992）に従って算出した。
培地は低血清(0.5%)α-MEM培地を用いた。
1)  培養直前の植え継ぎでは、G418を除いた培地に植え継いだ。
2)  細胞の継代方法に従って調製した細胞懸濁液中の細胞数を色素排除法により計測した。
3)  1×105 cells／wellとなるように細胞を6well plateに播種し、細胞濃度に偏りが起こらないようによく懸濁した。
4)  細胞を播種した時間を培養開始時間とし、培養開始後、24、48、72、96、120、144時間の６回、サンプリングを行った。
これらの実験における各細胞の比増殖速度μ (h-1)およびAT III比生産速度ρAT III (mol・cell-1・h-1)を算出した。
【００４４】
比較例１
ＸＢＰ１遺伝子を導入したCHO 13D-35D株におけるAT IIIの産生
３．ＸＢＰ１発現ベクターの構築と発現ベクター導入株構築結果
３−１．RT-PCRによるCHO XBP1 cDNAの調製とベクター構築
(a)細胞培養
10%血清添加RDF培地を用いて25cm2 T-フラスコに5×105cellsのＣＨＯ−Ｋ１細胞株を播種し、36時間培養した。さらに、5μg／mL Tunicamycin (Sigma)を加えたRDF培地6時間培養した。
(b)RNA抽出
RNeasy Mini Kit (Qiagen; 74104)を用いて、前記ＣＨＯ−Ｋ１株よりRNAの抽出を行った。抽出方法は付属のマニュアルに従った。試薬として、2-Mercapto ethanol (Sigma; M-7522)、Ethanol [99.5%] (Wako; 057-00456)、DNaseI[RNase-free] (Takara; 2215A)およびRibonuclease Inhibitor（ヒト胎盤由来）(Takara; 2310A)を用いた。抽出したRNAは0.1μg／μLに調節した。
(c)RT-PCR
チャイニーズハムスターのXBP1 cDNA遺伝子のプライマーは、CHOのXBP1 cDNA配列(WO 2004／111194 A2)を参考にして設計した。以下に、使用機器、プライマーの配列、反応溶液、反応条件を示す。
使用機器：GeneAmp（登録商標）PCR System 5700
Omniscript RT Kits 200 (Qiagen; 205113)を用いて、試薬として、oligo-(dT)12-18primer (Invitrogen; 18418-012)およびRibonuclease Inhibitor（ヒト胎盤由来）(Takara; 2310A)などを用いて反応を行った。
【００４５】
RT反応は、約１μgの全RNAを含むRT反応液を用いて、37℃、60分および99℃、5分で行い、反応液を４℃に冷却した。得られた反応液を、下記のプライマー：
Forward primer 5’-ggaggaaactgaaaaacagagtagcag-3’（配列番号１）
Reverse primer 5’-ttagacactaatcagctgggggaaaagt-3’（配列番号２）
を用いて、下記温度サイクル：
94℃２分で変性後、94℃30秒、55℃30秒、72℃1分の温度サイクルを30サイクル繰り返し、72℃2分でさらに伸長反応を行い、4℃に冷却にてEx Taq (TaKaRa製)を用いてPCR反応を行った。
【００４６】
（d）DNAの精製とベクターの構築
GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Biosystems; 27-9602-01)を用いて約1.0kbのバンドを抽出、精製した。精製方法は付属のマニュアルに従った。また、全長cDNAに欠けている5’側の202bpについてはオリゴヌクレオチドを合成後、つなぎ合わせることにより、全長cDNAを得た。得られたXBP1cDNAをpCDNA3.1（Invitrogen）に挿入し、シークエンスにより配列を確認した（日立ハイテクノロジーに委託）。得られた発現ベクターをpcDNA3.1-XBP1sと命名した。
【００４７】
３−２．構築した発現ベクター(pcDNA3.1-XBP1s)のCHO  13D-35D株への導入
構築したベクターの細胞株への導入にはTransIT-LTＩ(Takara Mirus MIR 2300)を用いたリポフェクション法によって行った。実験操作は付属のマニュアルに従って、以下のように行った。
1)  導入の24時間前に2×105 cells／well（培地量1mL）となるように6well plateに播種した。
2)  200μLの培地にTransIT-LT1 Transfection Reagentを9μL加え(TransIT 2〜8μL／μg DNA)、ボルテックスを用いて混合した。
3)  室温にて10分間インキュベートした。
4)  これにベクターDNA3μgを加え、穏やかにピペッティングした。
5)  室温にて15分間インキュベートした。
6)  前記5)で調製したものを、前記1)で準備した細胞培地に滴下した。plateをゆっくりと揺すって混合させた。
7)  そのまま3日間コンフルエントになるまで37℃で培養した。
8)  継代操作を行った後、培地にG418を250μg／mLとなるように添加し、約2週間選択した。
9)  得られた細胞株をクローニングリングもしくは限界希釈法を用いてクローニングし、3株のG418耐性株を得た。
【００４８】
３−３．構築した細胞株のＸＢＰ１染色体導入確認とAT III生産性確認
構築した3株について、それぞれＸＢＰ１染色体導入確認と、AT III生産性確認を行った。構築した細胞株よりGenomic Prep Cells and Tissue DNA Isolation Kit (Amersham; 27-5237-01)を用いてゲノムDNAの抽出を行い、0.5μgのゲノムDNAを鋳型として、Ex Taqを用いてPCRを行い、挿入確認を行った。
【００４９】
プライマーの配列は、以下の通りであった。
Forward primer 5’-ggaggaaactgaaaaacagagtagcag-3’  （配列番号３）
Reverse primer 5’-ttagacactaatcagctgggggaaaagt-3’  （配列番号４）
温度サイクルは、下記の通りであった。
94℃2分で変性後、94℃30秒、55℃30秒、72℃1分の温度サイクルを30サイクル繰り返し、72℃2分でさらに伸長反応を行い、4℃に冷却。
PCR産物を電気泳動に付したところ、全ての構築株に挿入が確認された。
【００５０】
前記細胞株のうち、13D-35D-XBP1-B株を用いて培養実験を行い、各細胞の比増殖速度μ(h-1)およびAT III比生産速度ρAT III (mol・cell-1・h-1)を算出し、細胞濃度の経時変化およびAT III濃度の経時変化を検証した。その結果を図１に示す。
図１Ａおよび１Ｂに示されるように、13D-35D-XBP1-B株と13D-35D株を比較した場合、細胞濃度およびAT III濃度に差はなかった。すなわち、ＸＢＰ１遺伝子導入によって生産性向上は確認できなかった。
【００５１】
実施例１
ＡＴＦ４遺伝子を導入したCHO 13D-35D株におけるAT IIIの産生
４．ＡＴＦ４発現ベクターの構築と発現ベクター導入株構築
４−１．RT-PCRによるCHO ATF4 cDNAの調製とベクター構築
【００５２】
(a)細胞培養
10%血清添加RDF培地を用いて25cm2 T-フラスコに5×105cellsのCHO-K1細胞株を播種し、36時間培養した。次に、5μg／mL Tunicamycin(Sigma)を加えたRDF培地で6時間培養した。
(b)RNA抽出
RNeasy Mini Kit (Qiagen; 74104)を用いて、前記ＣＨＯ−Ｋ１株よりRNAの抽出を行った。抽出方法は付属のマニュアルに従った。試薬として、2-Mercapto ethanol (Sigma; M-7522)、Ethanol [99.5%] (Wako; 057-00456)、DNaseI[RNase-free] (Takara; 2215A)およびRibonuclease Inhibitor（ヒト胎盤由来）(Takara; 2310A)を用いた。抽出したRNAは0.1μg／μLに調節した。
(c)RT-PCR
ATF4遺伝子のプライマーは、ラットのATF4 cDNA配列(Genbank NM024403)を参考にして、ATF4 cDNAの全長が増幅されるように設計した。以下に、使用機器、プライマーの配列、反応溶液、反応条件を示す。
使用機器：GeneAmp（登録商標）PCR System 5700
Omniscript RT Kits 200 (Qiagen; 205113)を用いて、試薬として、oligo-(dT)12-18primer (Invitrogen; 18418-012)およびRibonuclease Inhibitor（ヒト胎盤由来）(Takara; 2310A)を用いて、下記条件で反応を行った。
【００５３】
RT反応は、約１μgの全RNAを含むRT反応液を用いて、37℃、60 minおよび99℃、5minで行い、反応液を４℃に冷却した。得られた反応液を、下記のプライマー：
Forward primer 5’-atgaccgagatgagcttcctgaaca-3’（配列番号５）
Reverse primer 5’-ttacggaactctcttcttccccctt-3’（配列番号６）
を用いて、下記温度サイクル：
94℃2分で変性後、94℃30秒、58℃30秒、72℃1分の温度サイクルを30サイクル繰り返し、72℃2分でさらに伸長反応を行い、4℃に冷却にてEx Taqを用いてPCR反応を行った。
【００５４】
(d)DNAの精製とベクターの構築
GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (Amersham Biosystems; 27-9602-01)を用いて約1kbのバンドを抽出、精製した。精製方法は付属のマニュアルに従った。得られたATF4 cDNAを含む断片をDNA ligation kit(Takara 6023)を用いて、16℃で5時間反応させ、pCR2.1（Invitrogen）にサブクローニングし、pCR2.1-ATF4ベクターを構築し、シークエンスにて配列を確認した。その後、ATF4 cDNAを含む断片をKpnIおよびXbaIサイトを用いてpCDNA3.1（Invitrogen）にクローニングした(図２)。
【００５５】
４−２．構築した発現ベクター(pcDNA3.1-ATF4)のCHO 13D-35D株への導入
構築したベクターの細胞株への導入にはTransIT-LTI(Takara Mirus MIR 2300)を用いたリポフェクション法によって行った。実験操作は付属のマニュアルに従って、以下のように行った。
1)  導入の24時間前に2×105 cells／well（培地量1mL）となるように6well plateに播種した。
2)  200μLの培地にTransIT-LT1 Transfection Reagentを9μL加え(TransIT 2〜8mL／μg DNA)、ボルテックスを用いて混合した。
3)  室温にて10分間インキュベートした。
4)  これにベクターDNA3μgを加え、穏やかにピペッティングした。
5)  室温にて15分間インキュベートした。
6)  前記5)で調製したものを、前記1)で準備した細胞培地に滴下した。plateをゆっくりと揺すって混合させた。
7)  そのまま3日間コンフルエントになるまで37℃で培養した。
8)  継代操作を行った後、培地にG418を250μg／mLとなるように添加し、約2週間選択した。
9)  得られた細胞株をクローニングリングもしくは限界希釈法を用いてクローニングし、５株のG418耐性株を得た。
【００５６】
４−３．構築した細胞株のＡＴＦ４染色体導入確認とAT III生産性確認
構築した５株について、それぞれＡＴＦ４遺伝子の染色体導入確認と、AT III生産性確認を行った。構築した細胞株よりGenomic Prep Cells and Tissue DNA Isolation Kit (Amersham; 27-5237-01)を用いてゲノムDNAの抽出を行い、0.5μgのゲノムDNAを鋳型として、Ex Taqを用いてPCRを行い、挿入確認を行った。
【００５７】
プライマーの配列は、以下の通りであった。
T7 primer 5’-tagagaacccactgcttactggctta-3’（配列番号７）
BGH primer 5’-tagaaggcacagtcgaggctgat-3’（配列番号８）
温度サイクルは、下記の通りであった。
94℃2分で変性後、94℃30秒、48℃30秒、72℃1.5分の温度サイクルを40サイクル繰り返し、72℃2分でさらに伸長反応を行い、4℃に冷却。
PCR産物を電気泳動に付したところ、２株の構築株に挿入が確認された。
【００５８】
得られた13D-35D-ATF4-A株と13D-35D-ATF4-G株を用いて培養実験を行い、各細胞の比増殖速度およびAT III比生産速度を算出し、細胞濃度の経時変化およびAT III濃度の経時変化を検証した。その結果を図３および４に示す。
13D-35D株は、AT III遺伝子の増幅によりAT IIIの発現が上昇した株として単離されたものである。このようなAT III高産生株に対して、ＡＴＦ４遺伝子を導入すると、さらなるAT IIIの産生が確認された。13D-35D株と比較した場合、約２倍以上の生産速度および生産量の増大が認められた。具体的には、20pg/cell/dayを超える高い生産速度が達成された。
【００５９】
AT III高産生株をさらに得る目的で、前記ＡＴＦ４発現ベクター（pcDNA3.1-ATF4）を用いて同様の手順で13D-35D株へトランスフェクションを行った。同様の手順にて構築した細胞株のＡＴＦ４染色体導入確認とAT III生産性確認を行った。得られた細胞株のうち、６株にＡＴＦ４遺伝子の挿入が確認された。そこで、これらの細胞株を用いて同様に培養実験を行い、比増殖速度および、ＡＴＦ４導入によるAT III比生産速度への効果を検証した。その結果を表２および図５に示す。
【００６０】
【表２】
0005548932.tif 000003
【００６１】
表２および図５に示されるように、新たにJ2、J3、K4株においてAT III比生産速度の上昇がみられた。
【００６２】
実施例２
ＡＴＦ４遺伝子を導入したCHO DR1000L-4N株におけるhGM-CSFの産生
５．実験材料
５−１．使用細胞株
導入対象の宿主株としてhuman granulocyte-macrophage colony-stimulating factor（以下hGM-CSFと省略）産生CHO細胞DR1000L-4N株（以下、4N株  Yoshikawa et al., Biotechnology Progress, Vol.16, No. 5, pp.710 -715, 2000）を使用した。
【００６３】
５−２．使用培地
すべての培地は、0.22μMのメンブレンフィルター(Nalgen Nunc 595-4520)を用いて濾過滅菌した後、使用した。特に表記してない場合は特級試薬を用いた。
CHO細胞DR1000L-4N株の培養には表３記載のRPMI1640、DMEM、F12培地の2:1:1混合培地を使用した。培養の際には、MTXを終濃度1000nMとなるように加えた。
【００６４】
【表３】
0005548932.tif 000004
【００６５】
６．測定・解析方法
６−１．ｈＧＭ−ＣＳＦ濃度測定
サンドイッチELISA法を用いてｈＧＭ−ＣＳＦ濃度を測定した。測定に用いた試薬を以下に示す。
標準物質
E.coli由来human GM-CSF (R&D Systems 215-GM)
使用試薬
Coating Solution Concentrate (KPL 50-84-00)
BSA Diluent / Blocking Solution Concentrate (KPL 50-61-00)
ABTS Peroxidase Substrate System (KPL 50-62-00)
ABTS Peroxidase Stop Solution (KPL 50-85-01)
使用抗体
Mouse anti-human GM-CSF（R&D Systems MAB615）
Biotin標識mouse anti-human GM-CSF (R&D Systems BAM215)
使用酵素
Streptavidin HRP (R&D Systems DY998)
固層化抗体液
Coating Buffer Concentrate          0.7      mL
Mouse anti-human GM-CSF            10       μL
蒸留水                              7        mL
1×Diluent/Blocking液
BSA Diluent/Blocking Solution Concentrateを蒸留水で１０倍に希釈して用いた。
洗浄液
NaCl（9.0g）およびTween20（500μL）を蒸留水１Lに溶解したものを用いた。
Biotin標識抗体液
Biotin標識anti-human GM-CSF（2.5μL）を1×Diluent/Blocking液10mLで希釈して用いた。
検出酵素液
Streptavidin HRP                35    mL
1×Diluent/Blocking液           10    mL
ABTS基質液
ABTS Peroxidase Substrate Solution A        5    mL
ABTS Peroxidase Substrate Solution B        5    mL
反応停止液
ABTS Peroxidase Stop Solutionを蒸留水で５倍に希釈したものを用いた。
【００６６】
測定手順は以下のようにして行った。
1)  固層化抗体液をEIA/RIA 96 well plate(Corning 3590)に各ウェルに100μL分注し、室温で12時間インキュベートした。
2)  1×Diluent/blocking液を各ウェルに300μL分注し、室温で1時間インキュベートした。
3)  標準サンプル（E.coli由来human GM-CSF）及び適当な濃度に希釈した培養上清サンプル（1×Diluent/blocking液で希釈）を各ウェルに100μL加え、室温で1.5時間インキュベートした。
4)  プレートを洗浄液で5回洗浄した後、Biotin標識抗体液を各ウェルに100μL加え、室温で1時間インキュベートした。
5)  プレートを洗浄液で5回洗浄した後、検出酵素液を各ウェルに100mL加え、室温で1時間インキュベートした。
6)  プレートを洗浄液で5回洗浄した後、酵素反応基質液を各ウェルに100μL加え、室温で15分間インキュベートした。
7)  反応停止液を酵素反応基質液を加えた順に各ウェルに100μLずつ分注し、マイクロプレートリーダー(東ソーMRP-A4)で405nmの吸光度を測定した。
【００６７】
６−２．細胞数計数法
細胞数は、Burker-Turk型(ERMA 4296)血球計算盤を用いて、色素排除法を用いて算出した。
1)  培地とPBSで適度に希釈した細胞懸濁液を調製した(小T-フラスコ：約40倍、中-Tフラスコ：約15倍)。
2)  0.20％(W/V)トリパンブルー水溶液：4.25％(W/V)NaCl水溶液＝4：1の割合で混合した。
3)  1)と2)等量ずつをピペッティングでよく混合し、血球計算盤とカバーガラスのすきまに静かにしみ込ませた。
4)  倒立位相差顕微鏡で細胞数を計測し(誤差が少なくなるよう、10〜20個の間でカウントできるよう希釈する)、細胞濃度を算出した。
【００６８】
６−３．構築した細胞の各比速度評価法
構築した細胞のhGM-CSF比生産速度、比増殖速度は下記の手法を用いて算出した。(Omasa et al.,上述 1992)
1)  培養直前の植え継ぎでは、G418を除いた培地に植え継いだ。
2)  細胞の継代方法に従って調製した細胞懸濁液中の細胞数を色素排除法により計測した。
3)  1×105 cells/wellとなるように細胞を6 well plateに播種し、細胞濃度に偏りが起こらないようによく懸濁した。
4)  細胞を播種した時間を培養開始時間とし、培養開始後、24、48、72、96、120、144時間の６回、サンプリングを行い、Omasaらの手法を用いて算出した。
【００６９】
６−４．構築した発現ベクター(pcDNA3.1-ATF4)のCHO 4N株への導入
構築したベクターの細胞株への導入にはTransIT-LTI(Takara Mirus MIR 2300)を用いたリポフェクション法によって行った。実験操作は付属のマニュアルに従って、以下のように行った。
1)  導入の24時間前に2×105 cells/well（培地量１mL）となるように6 well plateに播種した。
2)  200μLの培地にTransIT-LT1 Transfection Reagentを9μL加え(TransIT 2〜8μL/μgDNA)、ボルテックスを用いて混合した。
3)  室温にて10分間インキュベートした。
4)  これにベクターDNA3μgを加え、穏やかにピペッティングした。
5)  室温にて15分間インキュベートした。
6)  5)で調製したものを、1)で準備した細胞培地に滴下した。plateをゆっくりと揺すって混合させた。
7)  そのまま3日間コンフルエントになるまで37℃で培養した。
8)  継代操作を行った後、培地にG418を250μg/mLとなるように添加し、約2週間選択した。
9)  得られた細胞株をクローニングリングもしくは限界希釈法を用いてクローニングし、18株のG418耐性株を得た。
【００７０】
６−５．構築した細胞株のＡＴＦ４染色体導入確認とhGM-CSF生産性確認
構築したＡＴＦ４発現ベクター（pcDNA3.1-ATF4）を、リポフェクション法を用いてhGM-CSF生産CHO細胞4N株へトランスフェクションした。トランスフェクション後、G418を終濃度400μg/mLとなるよう培地に加え、2週間かけて選択を行った。選択後、限界希釈法により、G418耐性クローン株を18株得た。得られたG418耐性株に対してPCRを行い、ＡＴＦ４発現ベクターの導入によるrecombinant ATF4（以下rATF4）のＡＴＦ４染色体への導入確認をおこなった。プライマーとして、pcDNA3.1側の非翻訳領域に設計したpcDNA3.1_forwardとpcDNA3.1_reverseを用いることで、ＡＴＦ４発現ベクターが染色体に導入された場合にのみ検出できるように設計した。
調製したcDNAを鋳型にPCRを行った。使用酵素には、PrimeSTAR HS DNA Polymerase（TaKaRa R010A）を用いた。反応液組成、反応条件および使用プライマーは以下に示す。
【００７１】
使用機器：Gene Amp PCR System 2400（Perkin Elmer）又はT3000 Thermocycler（Biometra）
【００７２】
【表４】
0005548932.tif 000005
【００７３】
プライマーの配列は、以下の通りであった。
pcDNA3.1_forward 5’-tagagaacccactgcttactggctta-3’（配列番号７）
pcDNA3.1_reverse 5’-tagaaggcacagtcgaggctgat-3’（配列番号８）
温度サイクルは、下記の通りであった。
98℃2分で変性後、98℃10秒、72℃2分の温度サイクルを40サイクル繰り返し、4℃に冷却。
【００７４】
その結果、18株のG418耐性株のうち6株でrATF4の染色体への導入を確認できた。この6株をＡＴＦ４過剰発現4N株とし、hGM-CSFの生産への影響について解析した。
【００７５】
７．結果
７−１．ＡＴＦ４過剰発現によるhGM-CSF生産性への影響
得られたＡＴＦ４過剰発現4N株（6株）に対して、4日間の回分培養を行いhGM-CSF生産性の評価を行った。コントロールには、4N株を用いた。
ＡＴＦ４過剰発現4N株のhGM-CSF生産性評価の代表例として、4N-ATF4-A1株と4N-ATF4-C1株のhGM-CSF生産実験の結果を図６に示す。その結果、4N-ATF4-A1株および4N-ATF4-C1株では増殖が悪くなっていたものの、hGM-CSF生産量は培養時間96時間の時点で4N株と比べ約1.4倍および約2.0倍に増加した。またhGM-CSF比生産速度（培養時間24〜96時間の間、一定とした場合）を比較すると、4N株と比較して約2.3倍および約3.4倍に増加した。
同様に、他のＡＴＦ４過剰発現4N株に対してもhGM-CSF生産性評価を行い、hGM-CSF比生産速度を求めた（表５、図７）。その結果、6株のＡＴＦ４過剰発現株中4株ではhGM-CSF比生産速度が増加しており、2株ではhAT-III比生産速度が減少する結果となった。2株でhGM-CSF比生産速度の減少が見られたものの、高い確率でＡＴＦ４の過剰発現によりhGM-CSF生産性が向上することが示唆された。
【００７６】
【表５】
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【００７７】
以上の結果より、ＡＴＦ４の過剰発現はhAT-IIIだけでなく、hGM-CSFの生産性向上にも効果的であることが示唆された。
【００７８】
実施例３
ＧＡＤＤ３４遺伝子を導入したCHO 13D-35D株におけるAT IIIの産生
８．実験材料
８−１．使用細胞株
導入対象の宿主株としてAT III産生低血清（0.5%FBS）馴化細胞13D-35D株（Yamauchi et al., Biosci. Biotech. Biochem. 56:600-604, 1992）を使用した。また、GADD34cDNAのクローニングにはＣＨＯ―Ｋ１(RCB0285)株を使用した。
【００７９】
８−２．使用培地
前記「１．実験材料、１−２．使用培地」と同様のものを用いた。
【００８０】
９．測定・解析方法
９−１．AT III濃度測定
前記「２−１. AT III濃度測定」と同様に行った。
【００８１】
９−２．細胞数計数法
前記「２−２. 細胞数計数法」と同様に行った。
【００８２】
９−３．構築した細胞の各比速度評価法
前記「２−３. 構築した細胞の各比速度評価法」と同様に行った。
【００８３】
１０．結果：ＧＡＤＤ３４発現ベクターの構築と発現ベクター導入株構築
１０−１．RT-PCRによるCHO GADD34 cDNAの調製とベクター構築
(a)細胞培養
10%血清添加RDF培地を用いてＣＨＯ―Ｋ１細胞株を25 cm2 T-フラスコに5×105cellsのCHO-K1細胞を播種し、36時間培養した。さらに、5μg/mL Tunicamycin(Sigma)を加えたRDF培地で6時間培養した。
(b)RNA抽出
RNeasy Mini Kit (Qiagen; 74104)を用いて、上記ＣＨＯ−Ｋ１株よりRNAの抽出を行った。抽出方法は付属のマニュアルに従った。試薬として、2-Mercapto ethanol(Sigma; M-7522)、Ethanol[99.5%](Wako; 057-00456)、DNaseI[RNase-free](Takara; 2215A),およびRibonuclease Inhibitor（ヒト胎盤由来）(Takara; 2310A)を用いた。抽出したRNAは0.1μg/μLに調節した。
(c)RT-PCR
ＧＡＤＤ３４遺伝子のプライマーは、ハムスターのGADD34cDNA配列(Genbank L28147)を参考にして、GADD34 cDNAの全長が増幅されるように設計した。以下に、使用機器、プライマーの配列、反応溶液、反応条件を示す。
使用機器：GeneAmp（登録商標）PCR System 5700
Omniscript RT Kits 200 (Qiagen; 205113)を用いて、試薬として、oligo-(dT)12-18primer (Invitrogen; 18418-012)およびRibonuclease Inhibitor（ヒト胎盤由来）(Takara; 2310A)を用いて下記の反応を行った。
【００８４】
RT反応は、約１μgの全RNAを含むRT反応液を用いて、37℃、60分および99℃、5分で行い、反応液を4℃に冷却した。得られた反応液を、下記のプライマー：
Forward primer 5’-gtggaagattgcatgcga-3’（配列番号９）
Reverse primer 5’-tgtataaatcaaaaggct-3’（配列番号１０）
を用いて、下記温度サイクル：
94℃2分で変性後、94℃30秒、60℃30秒、72℃1分の温度サイクルを30サイクル繰り返し、72℃2分でさらに伸長反応を行い、4℃に冷却にてEx Taq(TaKaRa製)を用いてPCR反応を行った。
【００８５】
(d)DNAの精製とベクターの構築
GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit(Amersham Biosystems; 27-9602-01)を用いて約2kbのバンドを抽出、精製した。精製方法は付属のマニュアルに従った。得られたGADD34cDNAを含む断片をDNA ligation kit(Takara 6023)を用いて、16℃で5時間反応させpCR2.1（Invitrogen）にサブクローニングし、pCR2.1-GADD34ベクターを構築し、シークエンスにて配列を確認した。その後にKpnIおよびXbaIサイトを用いてpCDNA3.1（Invitrogen）にクローニングした(図８)。
【００８６】
１０−２．構築した発現ベクター(pcDNA3.1-GADD34)のCHO 13D-35D株への導入
構築したベクターの細胞株への導入にはTransIT-LTI(Takara Mirus MIR 2300)を用いたリポフェクション法によって行った。実験操作は付属のマニュアルに従って、以下のように行った。
1)  導入の24時間前に2×105 cells/well（培地量1mL）となるように6 well plateに播種した。
2)  200μLの培地にTransIT-LT1 Transfection Reagentを9μL加え(TransIT 2〜8μL/μg DNA)、ボルテックスを用いて混合した。
3)  室温にて10分間インキュベートした。
4)  これにベクターDNA3μgを加え、穏やかにピペッティングした。
5)  室温にて15分間インキュベートした。
6)  前記5)で調製したものを、前記1)で準備した細胞培地に滴下した。plateをゆっくりと揺すって混合させた。
7)  そのまま3日間コンフルエントになるまで37℃で培養した。
8)  継代操作を行った後、培地にG418を250μg/mLとなるように添加し、約2週間選択した。
9)  得られた細胞株をクローニングリングもしくは限界希釈法を用いてクローニングし、４株のG418耐性株を得た。
【００８７】
１０−３．構築した細胞株のＧＡＤＤ３４染色体導入確認とAT III生産性確認
構築した4株について、それぞれＧＡＤＤ３４染色体導入確認と、AT III生産性確認を行った。構築した細胞株よりGenomicPrep Cells and Tissue DNA Isolation Kit(Amersham;27-5237-01)を用いてゲノムDNAの抽出を行い、0.5μgのゲノムDNAを鋳型として、EX Taqを用いてPCRを行い、挿入確認を行った。
【００８８】
プライマーの配列は、以下の通りであった。
Forward primer 5’-tagagaacccactgcttactggctta-3’  （配列番号７）
Reverse primer 5’-tagaaggcacagtcgaggctgat-3’  （配列番号８）
温度サイクルは、下記の通りであった。
94℃2分で変性後、94℃30秒、60℃30秒、72℃1.5分の温度サイクルを40サイクル繰り返し、72℃2分でさらに伸長反応を行い、4℃に冷却。
【００８９】
その結果、２株に挿入が確認された。そこで、この細胞株を用いて培養実験を行い、比増殖速度および、AT III比生産速度のＡＴＦ４導入による発現効果を検証した。結果を図９に示す。図９に示されるように、ＧＡＤＤ３４導入株において、AT III生産量、比生産速度共に増加した。すなわち、ＧＡＤＤ３４導入によって生産性向上が確認できた。
【００９０】
実施例４
ＡＴＦ４遺伝子を導入した13D-35D株におけるeIF2αのリン酸化抑制
CHO-K1、13D-35Dおよび13D-35D-ATF-G細胞を72時間培養後、各細胞から、Halt protease inhibitor cocktail (PIERCE Biotechnology 社製)を補足したPhosphoSafe extraction buffer (Novagen社製)を用いてそれぞれ全タンパク質を抽出した。全タンパク質の濃度は、BCA protein assay kit (PIERCE Biotechnology 社製)を用いて決定した。タンパク抽出物15μｇを、SDS-PAGEで分析し、PVDF(ポリビニリデンジフルオリド)膜に移した。ウサギ抗eIF2α(真核細胞翻訳開始因子2のαサブユニット)抗体（Cell Signaling社製）または抗ホスホeIF2α（Ser51）抗体（Cell Signaling社製）を、ウエスタンブロット解析の一次抗体として用いた。ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギIgG抗体（Cell Signaling社製）を、二次抗体として用いた。前記膜を、LumiGLO(登録商標) ウエスタンブロッティング検出試薬（KPL社製）で現像した。化学発光を、Imagemaster(登録商標)ソフトウエア（GE ヘルスケア製）を用いて定量した。統計学的解析は、両側性独立ｔ検定により行った。タプシガルギン（thapsigargin、Sigma-Aldrich社製）を用いて、CHO細胞のeIF2αのリン酸化を活性化させた。結果を図１０に示す。
【００９１】
eIF2αのリン酸化は、ERストレス応答における翻訳減衰という結果につながる。ER Ca2+ ATPase阻害剤であるタプシガルギンも、CHO細胞においてeIF2αのリン酸化を活性化させることが報告されている（Mol. Biol. Cell 17: 3095-3107, 2006）。CHO細胞におけるeIF2αのリン酸化を、抗ホスホeIF2α（Ser51）抗体を用いるウエスタンブロット解析により調べた。図１０Ａに示すように、CHO-K1細胞におけるリン酸化eIF2αに対応するバンドは、弱いが、当該細胞におけるリン酸化eIF2αのレベルは、2.5μmol/Lのタプシガルギンでの処理によって有意に上昇した。それに比べ、13D-35D細胞は、タプシガルギン処理なしでもリン酸化eIF2αのレベルが上昇していた。この上昇したレベルは、13D-35D-ATF-G細胞において見られるように、ＡＴＦ４の過剰発現により有意に減少した。13D-35D-ATF-G細胞におけるeIF2αに対するリン酸化eIF2αの比は、13D-35D細胞に比べて、約60％に低下していた（図１０Ｂ）。ＡＴＦ４の過剰発現は、13D-35D細胞におけるリン酸化eIF2αの脱リン酸化を促進することにより、翻訳減衰状態の解除を誘導し、結果としてAT III生産を高めたと考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明によれば、目的タンパク質を高生産可能な製造方法およびそれに用いられる動物細胞を提供し、動物細胞を用いた組換えタンパク質の産生系で、目的タンパク質のさらなる増産が可能である。
本出願は、特願２００６−２５９２１４（出願日：２００６年９月２５日）を基礎としており、それらの内容は本明細書に全て包含される。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図１は、ＸＢＰ１を導入した細胞株（13D-35D-XBP1-B）と対照細胞（13D-35D）における細胞濃度の経時変化（１Ａ）およびAT III濃度の経時変化（１Ｂ）を示すグラフである。
【図２】図２は、発現ベクターpcDNA3.1-ATF4の構築の概略図である。
【図３】図３は、ＡＴＦ４を導入した細胞株（13D-35D-ATF4-A）と対照細胞（13D-35D）における細胞濃度の経時変化（３Ａ）、AT III濃度の経時変化（３Ｂ）およびAT III比生産速度比較（３Ｃ）を示すグラフである。
【図４】図４は、ＡＴＦ４を導入した細胞株（13D-35D-ATF4-G）と対照細胞（13D-35D）における細胞濃度の経時変化（４Ａ）、AT III濃度の経時変化（４Ｂ）およびAT III比生産速度比較（４Ｃ）を示すグラフである。
【図５】図５は、ＡＴＦ４を導入した種々の細胞株におけるAT III比生産速度比較を示すグラフである。
【図６】図６は、ＡＴＦ４を導入した細胞株（4N-ATF4-A1、4N-ATF4-C1）と対照細胞（4N）における細胞濃度の経時変化（６Ａ）およびhGM-CSF濃度の経時変化（６Ｂ）を示すグラフである。
【図７】図７は、ＡＴＦ４を導入した種々の細胞株におけるhGM-CSF比生産速度比較を示すグラフである。
【図８】図８は、発現ベクターpcDNA3.1-GADD34の構築の概略図である。
【図９】図９は、ＧＡＤＤ３４を導入した細胞株（13D-35D-GADD34-F、13D-35D-GADD34-L）と対照細胞（13D-35D）における細胞濃度の経時変化（９Ａ）、AT III濃度の経時変化（９Ｂ）およびAT III比生産速度比較（９Ｃ）を示すグラフである。
【図１０】図１０は、ＡＴＦ４を導入した細胞株（13D-35D-ATF-G）と対照細胞（CHO-K1、13D-35D）におけるｅＩＦ２αおよびリン酸化ｅＩＦ２αのウエスタンブロット解析の電気泳動写真（１０Ａ）およびリン酸化ｅＩＦ２αのｅＩＦ２αに対する比を示すグラフ（１０Ｂ）である。
【図１】
0005548932.tif 000007
【図２】
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【図６】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
0005548932.tif 000014
【図９】
0005548932.tif 000015
【図１０】
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【配列表】
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