(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
アメリカ培養細胞系統保存機関に受け入れ番号ＰＴＡ−８２４６で寄託されたハイブリドーマ６Ｂ８により産生されるモノクローナル抗体６Ｂ８。
【請求項２】
生物学的標本においてＨ５亜型トリインフルエンザウイルスを検出するための方法であって、標本を、請求項１に記載のモノクローナル抗体と接触させることを含む方法であって、ここで生物学的標本が、採取され、または保存されたものである、方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、標本をトリインフルエンザウイルスのＨ５亜型のエンベロープ糖タンパク質に特異的に結合する結合タンパク質と接触させることを含み、ここでモノクローナル抗体が捕捉抗体であり、結合タンパク質が、検出可能な要素を含むか、または検出可能な要素にコンジュゲートした検出結合タンパク質である方法。
【請求項４】
請求項３に記載の方法であって、結合タンパク質がモノクローナル抗体である方法。
【請求項５】
請求項３に記載の方法であって、モノクローナル抗体が固体表面に固定される方法。
【請求項６】
請求項３に記載の方法であって、結合タンパク質が放射性原子を含むか、蛍光性の分子にコンジュゲートしているか、または酵素にコンジュゲートしている方法。
【請求項７】
生物学的標本においてＨ５亜型トリインフルエンザウイルスを検出するためのキットであって、請求項１に記載のモノクローナル抗体を、トリインフルエンザウイルスのＨ５亜型のエンベロープ糖タンパク質への前記モノクローナル抗体の結合を検出するための試薬と共に含むキット。
【請求項８】
請求項７に記載のキットであって、トリインフルエンザウイルスのＨ５亜型のエンベロープ糖タンパク質に特異的に結合する結合タンパク質を含み、モノクローナル抗体が捕捉抗体であり、結合タンパク質が、検出可能な要素を含むか、または検出可能な要素にコンジュゲートした検出結合タンパク質であるキット。
【請求項９】
請求項８に記載のキットであって、結合タンパク質がモノクローナル抗体であるキット。
【請求項１０】
請求項８に記載のキットであって、モノクローナル抗体が固体表面に固定されるキット。
【請求項１１】
請求項８に記載のキットであって、結合タンパク質が放射性原子を含むか、蛍光性の分子にコンジュゲートしているか、または酵素にコンジュゲートしているキット。
【請求項１２】
Ｈ５亜型トリインフルエンザウイルスに感染した対象を処置するための、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１３】
Ｈ５亜型トリインフルエンザウイルスに感染した対象を処置するための医薬の製造のための、請求項１に記載のモノクローナル抗体の使用。
【請求項１４】
トリインフルエンザウイルスＨ５Ｎ３株の中和回避変異体であって、モノクローナル抗体６Ｂ８により認識される前記株のＨＡ配列のエピトープの内部に、変異ウイルスを前記抗体により中和できなくなるような変異を含む中和回避変異体であって、前記変異がアミノ酸２０５におけるものである中和回避変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この発明は、トリインフルエンザウイルス（”ＡＩＶ”）の検出のための抗体および関連する結合タンパク質に関する。より詳細には、本発明は、ＡＩＶの高病原性Ｈ５亜型の検出に有用なモノクローナル抗体および関連する結合タンパク質、ならびに動物およびヒトにおけるそのＡＩＶ感染症の診断および監視のための方法および製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
トリインフルエンザは鳥類における一般的な疾患である。亜型Ｈ５Ｎ１のＡＩＶはトリインフルエンザの大発生を引き起こし、それは世界の多くの地域へと止むことなく広がりつつある（１４）（参考文献一覧は開示の最後に提供する）。影響を受けた地域には、ヨーロッパ、中東および特にアジアが含まれる。世界保健機構（”ＷＨＯ”）によれば、２００６年４月現在で、Ｈ５Ｎ１トリインフルエンザの結果として約１００件のヒトの死亡が起こっており、状況は悪化しつつあるようである。ＷＨＯのウェブサイトを参照（１１）。ＡＩＶの感染はヒトでは稀であるが、種の壁（ｓｐｅｃｉｅｓ  ｂａｒｒｉｅｒ）を越えることのできる新しいＡＩＶの亜型の出現が致命的なインフルエンザの世界的流行を引き起こした時期が過去にあった（２、８、１０）。
【０００３】
インフルエンザウイルスはそれらの核タンパク質およびマトリックスタンパク質の抗原特異性に従って分類される。これらのウイルスは主にＡ、ＢおよびＣ血清型に類別され、タイプＡは８個のＲＮＡ分節を有し、それは１０個のウイルスタンパク質をコードしている。全ての既知のタイプＡインフルエンザウイルスは鳥類に由来する。このカテゴリーのウイルスは他の種、例えばウマ、ブタ、フクロウおよびアザラシに感染することができ、ヒトにも同様に脅威を与えている（２２）。インフルエンザＡウイルスはさらにエンベロープの糖タンパク質、ヘマグルチニン類（”ＨＡ類”）、Ｈ１〜Ｈ１６、およびノイラミニダーゼ類（”ＮＡ類”）、Ｎ１〜Ｎ９（１０、１２、１９）、の抗原性の性質によって亜型へと分けられる。ＨＡタンパク質のＨＡ１−ＨＡ２接合部におけるタンパク質分解による切断はトリの株における病原性と関連しており、この切断部位周辺の疎水性アミノ酸の存在はＨ５亜型に特徴的であると信じられている。加えて、ＨＡタンパク質は宿主細胞のシアロシド受容体への付着およびそれに続く膜融合による侵入を仲介していると信じられており（１７）、ＨＡタンパク質は中和抗体のための主要な標的として機能していると考えられている（１９）。
【０００４】
この発明は、ＡＩＶに特異的に結合するモノクローナル抗体および関連する結合タンパク質に関する。モノクローナル抗体（”ｍＡｂ類”）は、単一の抗体産生細胞に由来する実質的に均質な抗体の集団である。従って、集団における全ての抗体は同一であり、所与のエピトープに関して同じ特異性を有する（５）。ｍＡｂ反応の特異性は、有効な診断用試薬のための基礎を提供する。モノクローナル抗体およびそれに由来する結合タンパク質には、治療薬としての有用性も見出される。
【０００５】
ＡＩＶの感染が野生生物、家畜化された動物およびヒトにもたらす危険のため、組織標本においてウイルスを検出するための迅速、特異的かつ信頼できる方法が緊急に必要とされている。特に、保存された標本、例えばパラフィンに埋め込まれた、ホルマリンで固定された標本において、および凍結切片においてウイルスを検出する能力は、その疾患を診断しその進行を監視するための能力にとって重要である。現在まで、Ｈ５亜型モノクローナル抗体を用いる高病原性Ｈ５Ｎ１  ＡＩＶ株の診断のための有効な方法の報告は存在しない。従って、本発明はＨ５Ｎ１および他のＨ５株の診断および監視における画期的躍進を表す。
【発明の概要】
【０００６】
本発明に従って、Ｈ５亜型のヘマグルチニン糖タンパク質の線状および三次元（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ）エピトープに特異的なモノクローナル抗体および関連する結合タンパク質を提供する。線状Ｈ５エピトープに対するｍＡｂ類は、変性した標本、例えばホルマリンで固定された組織標本においてＨ５Ｎ１ウイルスおよび他のＨ５亜型ウイルスを優れた特異性および感度で検出することができ、一方で三次元エピトープを標的とするｍＡｂ類は凍結された標本および他の生物学的流体におけるウイルスの検出に有用である。
【０００７】
特に、７Ｈ１０と名付けられたｍＡｂはヘマグルチニンの線状エピトープを標的とし、ホルマリン固定された組織中のウイルス抗原に高い有効性および感度を示しており、一方で凍結組織切片には最小限の効力しか有しない。６Ｂ８と名付けられたｍＡｂは三次元ヘマグルチニンエピトープを標的とし、前処理していない組織、例えば凍結組織標本ならびに他の生物学的な組織および流体においてウイルス抗原に結合、ならびにそれを認識することができる。８Ｆ１０および２Ｄ１０と名付けられたモノクローナル抗体も三次元ヘマグルチニンエピトープを標的とし、ｍＡｂ  ６Ｂ８と類似した用途を提供する。
【０００８】
従って、本発明は、実質的にｍＡｂ  ７Ｈ１０のような線状Ｈ５亜型ヘマグルチニンエピトープへの免疫学的結合特性を有する結合タンパク質を含む。本発明はさらに、実質的にｍＡｂ  ６Ｂ８、８Ｆ１０または２Ｄ１０の免疫学的結合特性のような三次元Ｈ５亜型ヘマグルチニンエピトープへの免疫学的結合特性を有する結合タンパク質を含む。
【０００９】
別の観点において、本発明は、標本においてＨ５亜型ＡＩＶを検出するための方法であって、ＡＩＶの、実質的にｍＡｂ  ７Ｈ１０の免疫学的結合特性を有するｍＡｂまたは結合タンパク質との結合を検出することを含む方法を含む。さらに別の観点において、本発明は、標本においてＡＩＶを検出するための方法であって、ＡＩＶの、実質的にｍＡｂ  ６Ｂ８、８Ｆ１０または２Ｄ１０の免疫学的結合特性を有するｍＡｂまたは結合タンパク質との結合を検出することを含む方法を含む。特に、本発明は、その結合タンパク質を利用する免疫蛍光アッセイ、免疫組織化学的アッセイおよびＥＬＩＳＡ法に関する。
【００１０】
別の観点において、本発明は、実質的にｍＡｂ  ７Ｈ１０またはｍＡｂ  ６Ｂ８、８Ｆ１０もしくは２Ｄ１０の免疫学的結合特性を有する結合タンパク質を含むＡＩＶの検出のためのキットに関する。
【００１１】
本発明はさらに、Ｈ５  ＡＩＶ株、例えばＨ５Ｎ１  ＡＩＶ株に感染した対象を処置する方法であって、その対象に有効量の実質的にｍＡｂ  ６Ｂ８、８Ｆ１０または２Ｄ１０の免疫学的結合特性を有する１種類以上のモノクローナル抗体または結合タンパク質を投与することを含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】９０日間の期間に渡るｍＡｂの力価の分布。図１のデータは、ｍＡｂがかなりの期間に渡って安定なままであることができたことを示す。
【図２】ＨＩアッセイで測定した、Ｈ５亜型ｍＡｂ類の、非Ｈ５亜型ウイルスおよびＨ５亜型ウイルスとの交差反応性。それぞれのウイルスに対する血清の抗体の力価を下記に示す：薄い影−ＨＩ活性無し、濃い影−＞１６。
【図３】ウエスタンブロット分析。それぞれのｍＡｂ類と、Ｅ．Ｃｏｌｉの総細胞溶解産物中で発現させたＨ５Ｎ１ウイルスのＨＡ１タンパク質との反応性。ｍＡｂ類に対する対照として、ＲＰＭＩ  １６４０を用いた。
【図４】異なる組織標本におけるシグナルの強度の分布。標本はＨ５Ｎ１  ＡＶＩに感染したシキチョウ（Ｍａｇｐｉｅ  Ｒｏｂｉｎ）であった。（シグナル／病変を図中に矢印で示す）。
【００１３】
ａ）脳の凍結切片。組織をｍＡｂ  ６Ｂ８と共に保温した。大きな強度の陽性シグナルが、多数の赤い点として観察された。神経細胞において病変が見られる。
ｂ）脳の凍結切片。ＲＰＭＩ  １６４０をｍＡｂ  ６Ｂ８に対する対照として用いた。シグナルは見られなかった。
【００１４】
ｃ）肝臓のパラフィン切片。組織をｍＡｂ  ７Ｈ１０と共に保温した。胆管の内皮において最小限の病変が見られた。
ｄ）肝臓のパラフィン切片。ＲＰＭＩ  １６４０をｍＡｂ  ７Ｈ１０に対する対照として用いた。シグナルは見られなかった。
【００１５】
ｅ）肺のパラフィン切片。組織をｍＡｂ  ７Ｈ１０と共に保温した。病変は上皮組織の裏打ち（ｌｉｎｉｎｇ）においてのみ見られた。
ｆ）肺のパラフィン切片。ＲＰＭＩ  １６４０をｍＡｂ  ７Ｈ１０に対する対照として用いた。シグナルは見られなかった。
【００１６】
ｇ）肺のパラフィン切片。組織をｍＡｂ  ７Ｈ１０と共に保温した。肺胞組織において病変が見られた。
ｈ）肺のパラフィン切片。ＲＰＭＩ  １６４０をｍＡｂ  ７Ｈ１０に対する対照として用いた。シグナルは見られなかった。
【００１７】
ｉ）腎臓のパラフィン切片。組織をｍＡｂ  ７Ｈ１０と共に保温した。腎細胞の至る所に大量の高い強度のシグナルが分布していた。
ｊ）腎臓のパラフィン切片。ＲＰＭＩ  １６４０をｍＡｂ  ７Ｈ１０に対する対照として用いた。シグナルは見られなかった。
【００１８】
ｋ）肝臓のパラフィン切片。組織をｍＡｂ  ７Ｈ１０と共に保温した。肝細胞において病変が見られた。
ｌ）肝臓のパラフィン切片。ＲＰＭＩ  １６４０をｍＡｂ  ７Ｈ１０に対する対照として用いた。シグナルは見られなかった。
【図５】Ｈ５亜型ｍＡｂ類は、２００２年にさかのぼりＨ５Ｎ１に感染した組織からシグナルを検出することができた。
【００１９】
ａ）イエガラスの脳組織。
ｂ）アカガシラサギ（Ｐｏｎｄ  Ｈｅｒｏｎ）の肺組織。
ｃ）アオサギ（Ｇｒｅｙ  Ｈｅｒｏｎ）の脳組織。
【００２０】
ｄ）ニワトリの脳組織。
【図６】ＡＣ−ＥＬＩＳＡ形式における捕捉および検出抗体の反応性。（ａ）様々なＡＩＶ亜型を、ＡＣ  ＥＬＩＳＡ試験を用いて試験した。Ｈ５  ＡＩＶのみが陽性の結果をもたらす場合、この試験の特異性が示される。”Ｎ  Ｃｔｒｌ”は、ウェルにウイルスを添加しなかった陰性対照である。（ｂ）様々なＨ５  ＡＩＶをＰＢＳで系列希釈し、ＡＣ  ＥＬＩＳＡで試験した。０．１００を、陽性および陰性の結果の間のカットオフ値として用いて、ＡＣ  ＥＬＩＳＡ試験で検出することのできるＨ５  ＡＩＶの最小量は平均しておおよそ０．５ＨＡ単位となった（７Ｈ１０および６Ｂ８）；
【図７】７Ｈ１０に関するエピトープのマッピング。Ａ．ヘマグルチニンタンパク質１の概略図、様々な長さのＨＡ１断片の発現のためのクローンコンストラクトおよびそれらのＭａｂ  ７Ｈ１０との反応性を示す。ａａ、アミノ酸。Ｂ．Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１で発現させた１２種類の組換え融合タンパク質のウエスタンブロット。試料は総細胞溶解産物からのものであった。Ｍ、マーカー；ＮＣ、陰性対照；ＨＡ１、完全長ＨＡ１タンパク質；Ａ〜Ｋ、様々な断片。Ｃ．変異ヘマグルチニン１断片の概略図、ＨＡ１断片上の様々な変異体の発現のためのクローンコンストラクトおよびそれらのＭａｂ  ７Ｈ１０との反応性を示す。Ｄ．Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１で発現させた９種類の組み換え融合タンパク質のウエスタンブロット。試料は総細胞溶解産物からのものであった。Ｍ、マーカー；ＮＣ、陰性対照；Ｊ、Ｂにおける断片Ｊ。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、ＡＩＶのＨ５亜型のヘマグルチニンエンベロープ糖タンパク質に特異的に結合するｍＡｂ類および関連する抗原結合タンパク質に向けられている。特に、そのｍＡｂ類または関連する抗原結合タンパク質は、次のものの免疫学的結合特性を有する：２００７年３月２０日にアメリカ培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）に寄託され、受け入れ番号ＰＴＡ−８２４３を割り当てられた、ハイブリドーマ７Ｈ１０により産生されるｍＡｂ  ７Ｈ１０、２００７年３月２０日にＡＴＣＣに寄託され、受け入れ番号ＣＲＬ  ＰＴＡ−８２４６を割り当てられた、ハイブリドーマ６Ｂ８により産生されるｍＡｂ  ６Ｂ８、２００７年３月２０日にＡＴＣＣに寄託され、受け入れ番号ＰＴＡ−８２４５を割り当てられた、ハイブリドーマ８Ｆ１０により産生されるｍＡｂ  ８Ｆ１０、または２００７年３月２０日にＡＴＣＣに寄託され、受け入れ番号ＰＴＡ−８２４８を割り当てられた、ハイブリドーマ２Ｄ１０により産生されるｍＡｂ  ２Ｄ１０。本発明はさらに、それらのハイブリドーマを包含し、本発明のｍＡｂ類および結合タンパク質の継続的な源を提供する。本発明はさらに、Ｈ５亜型ＡＩＶの感染の検出および診断のための方法ならびに本発明のｍＡｂ類または結合タンパク質を含むアッセイキットに関する。加えて本発明は、Ｈ５  ＡＩＶ株に感染した対象の、有効量の本発明の１種類以上の抗体または関連する結合タンパク質の投与による処置の方法に関する。特に、この態様において、対象はＡＩＶのＨ５Ｎ１亜型に感染している。この発明の抗体は、起こり得るインフルエンザの大発生の到来の際に予防策として対照に投与することもできる。この場合、投与される抗体の有効量は、Ｈ５  ＡＩＶ感染を処置するのに用いられる量の約半分である。
【００２２】
様々な用語が本明細書で用いられ、それは下記の意味を有する：
ｍＡｂまたは関連する結合タンパク質の”免疫学的結合特性”という用語は、その文法形式の全てにおいて、ｍＡｂまたは関連する結合タンパク質のその抗原に対する特異性、親和性および交叉反応性を指す。
【００２３】
用語”線状エピトープ”は、抗体結合部位を形成する約４から約１２アミノ酸までの連続した配列を指す。この発明のｍＡｂ類の線状エピトープは、好ましくはＨＡ１ウイルス遺伝子によりコードされるヘマグルチニンタンパク質のおよそアミノ酸２４４からおよそアミノ酸２５１までの領域の中にある。ｍＡｂまたは結合タンパク質に結合する形の線状エピトープは、実質的に三次構造を失っている変性したタンパク質の中にあってよい。
【００２４】
用語”三次元エピトープ”は、Ｈ５亜型ヘマグルチニン糖タンパク質の中に、その未変性の三次元の形で存在する、ｍＡｂまたは関連する結合タンパク質の結合部位を指す。
用語”結合タンパク質”は本発明のｍＡｂまたは本発明のｍＡｂの免疫学的結合特性を有するｍＡｂの抗原結合部位を含むタンパク質を指し、下記で記述するそれらを含む。
【００２５】
本発明は好都合なことに、動物をＡＩＶ亜型Ｈ５Ｎ１（ＰＲ８）で免疫することによりｍＡｂ類８Ｆ１０または２Ｄ１０の結合特性を有するモノクローナル抗体を調製する、動物をＨ５Ｎ３タンパク質で免疫することにより６Ｂ８の結合特性を有するモノクローナル抗体を調製する、動物をＨ５  ＨＡ１タンパク質で免疫することにより７Ｈ１０の結合特性を有するモノクローナル抗体を調製するための方法を提供する。あらゆるその抗原は、望まれる免疫学的結合特性を有する抗体を生じさせるための免疫原として用いられてよい。その抗体には、ｍＡｂ  ７Ｈ１０、６Ｂ８、８Ｆ１０または２Ｄ１０の抗原結合配列を含むモノクローナル抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、およびタンパク質が含まれるが、それらに限定されない。
【００２６】
本発明のｍＡｂは、培養中の連続継代性細胞株（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ）による抗体分子の産生を提供するあらゆる技法により産生されてよい。その方法には、元はＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎにより開発されたハイブリドーマの技法(1975, Nature 256:495-497)、さらにトリオーマの技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマの技法(Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72)、およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマの技法(Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)が含まれるが、それらに限定されない。ヒトの抗体を用いることができ、それはヒトのハイブリドーマを用いることにより(Cote et al., 1983, Proc. Nat ’l. Acad. Sci. U.S.A., 80:2026-2030)、または生体外でヒトＢ細胞をＥＢＶウイルスを用いて形質転換することにより(Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, pp. 77-96)得ることができる。さらに、本発明のマウス抗体分子、例えばｍＡｂ  ７Ｈ１０、６Ｂ８、８Ｆ１０または２Ｄ１０からの配列を導入して適切な生物学的活性を有するヒト抗体分子からの遺伝子と一緒にすることによる”キメラ抗体”または”ヒト化抗体”の産生のために開発された技法(Morrison et al., 1984, J. Bacteriol. 159-870; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454)を用いることができる。キメラ抗体は、ヒトのＦｃ部分およびマウス（または他のヒト以外）のＦｖ部分を含む抗体である。ヒト化抗体は、マウス（または他のヒト以外）の相補性決定領域（ＣＤＲ）がヒト抗体の中に組み込まれた抗体である。キメラおよびヒト化抗体は共にモノクローナルである。そのヒトまたはヒト化キメラ抗体は、ヒトの疾患または障害の生体内診断または治療における使用に好ましい。
【００２７】
本発明に従って、単鎖抗体の産生に関して記述された技法（米国特許第４，９４６，７７８号）を、本発明の単鎖抗体を提供するように適合させることができる。本発明の追加の態様は、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築に関して記述された技法(Huse et al., 1989, Science 246: 1275-1281)を利用して、本発明の抗体、またはその誘導体、もしくは類似体に望ましい特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速かつ容易な同定を可能とする。
【００２８】
抗体分子のイディオタイプを含む抗体断片は既知の技法により生成することができる。例えば、その断片は次のものを含むがそれらに限定されない：抗体分子のペプシン消化により生成することができるＦ（ａｂ’）２断片；Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することにより生成することができるＦａｂ’断片、ならびに抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することにより生成することができるＦａｂ断片。その抗体断片は、本発明のポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれから生成することもできる。
【００２９】
抗体の産生において、望ましい抗体のスクリーニングは当分野で既知の技法、例えば放射性免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酸素結合免疫吸着アッセイ）、”サンドイッチ”免疫アッセイ、免疫放射定量アッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、生体内免疫アッセイ（例えば金コロイド、酵素または放射性同位体標識を用いる）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えばゲル凝集アッセイ、血球凝集アッセイ）、免疫蛍光アッセイおよび免疫電気泳動アッセイ等により成し遂げることができる。１態様において、抗体の結合は一次抗体上の標識を検出することにより検出される。別の態様において、一次抗体は二次抗体または他の試薬の一次抗体への結合を検出することにより検出される。さらに別の態様において、二次抗体は標識されている。免疫アッセイにおいて結合を検出するための手段は当分野で既知であり、本発明の範囲内である。
【００３０】
前述の抗体を、ＡＩＶのＨ５亜型の検出または位置測定に関して当分野で既知の方法、例えば、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、放射性免疫アッセイ、免疫蛍光アッセイ、免疫組織化学的アッセイ、および同様のものにおいて用いることができる。本明細書で開示される技法は、ＡＩＶのＨ５亜型の質的および定量的測定に、ならびにそのウイルスに感染した動物またはヒトの診断および監視に用いることができる。
【００３１】
本発明には、ＡＩＶのＨ５亜型の質的および／または定量的測定のためのアッセイおよび検査キットも含まれる。そのアッセイ系および試験キットは、例えば放射性原子、蛍光性の基または酵素を用いた標識、本発明のｍＡｂもしくは関連する結合タンパク質への、またはその結合パートナーへの標識のカップリングにより調製される標識された構成要素を含んでいてよい。そのアッセイまたは試験キットは、さらに使用のための免疫アッセイの技法の技術者に周知の試薬、希釈剤および説明書を含んでいてよい。
【００３２】
本発明の特定の態様において、そのキットは、選択された方法、例えば”競合的”、サンドウィッチ””、”ＤＡＳＰ”および同様のものに依存して、少なくとも本発明のｍＡｂまたは関連する結合タンパク質、生物学的試料中のＡＩＶへのそのｍＡｂまたは関連する結合タンパク質の免疫特異的結合の検出のための手段、および使用のための説明書を含むであろう。キットは陽性および陰性対照を含んでいてもよい。それらは自動化された分析器または自動化された免疫組織化学的スライド染色機器と共に使用されるように設計されてもよい。
【００３３】
本発明のアッセイキットはさらに二次抗体または結合タンパク質を含んでいてよく、それは標識されていてよく、または固体支持体への付着のために提供されて（または固体支持体に付着させて）よい。その抗体または結合タンパク質は、例えば、ＡＩＶに結合するものであってよい。その二次抗体または結合タンパク質は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であってよい。
【００３４】
Ｈ５亜型ヘマグルチニンタンパク質に対するモノクローナル抗体は、動物をＡＩＶまたはＨ５タンパク質またはその断片で免疫することにより調製することができる。好ましい方法には、Ｈ５亜型ＨＡ１遺伝子の増幅とそれに続く遺伝子の発現、Ｈ５亜型組み換えタンパク質の回収および精製ならびに精製したタンパク質の免疫原としての使用が含まれる。例えば、Ｈ５Ｎ１  ＡＩＶを、ニワトリ胚にそのウイルスの利用可能な株を接種することにより増殖させ、続いてウイルスＲＮＡを分離する。ＨＡ１遺伝子を逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により増幅し、次いでバキュロウイルスベクターの中にクローン化することができ、それを昆虫細胞中でＨ５タンパク質を発現させるために用いる。そのように生成されたタンパク質を、次いでハイブリドーマの生成のためにマウスまたは他の適切な種を免疫するのに用いることができる。
【００３５】
ハイブリドーマを、Ｈ５タンパク質に特異的に結合することができ、それらを他のＡＩＶ亜型から識別する高親和性ｍＡｂ類を安定して産生するそれらの能力に関してスクリーニングする。本発明に従って、ウイルス中和能力を有する抗体はＨ５亜型ヘマグルチニンタンパク質中の三次元エピトープを認識することができることを見出した。この発見は、それぞれの中和ｍＡｂの存在下でのメイディン・ダービー・イヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞における１〜２回の選択の後の、ウイルス回避変異体の発生の結果であった。ＨＡ１遺伝子をこれらの中和回避変異体からＲＴ−ＰＣＲによりクローニングし、配列決定して点変異を同定した。このグループの抗体において、ｍＡｂ類６Ｂ８、８Ｆ１０および２Ｄ１０において３種類の中和エピトープ、すなわち１、２および３が見つかった。中和回避能力は血球凝集阻害アッセイを用いて確認した。
【００３６】
ＨＡ１は３３８アミノ酸を含む。タンパク質上の線状エピトープの分布を研究するためには、切り詰めた（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）、および変異導入した断片を、ｍＡｂ類との結合に関して、例えばウェスタンブロットまたは類似の技法により試験するのが好都合である。線状エピトープは、変性したＨ５亜型タンパク質、例えばホルマリン固定された組織において生じるＨ５亜型タンパク質の、免疫組織化学的染色法を用いた検出において優れた性能を示すｍＡｂ類の結合標的として同定することができる。Ｈ５亜型ｍＡｂ類のこのやり方でのマッピングは、感染性Ｈ５Ｎ１  ＡＩＶのさらなる研究およびより有効な臨床診断のためのプラットホームを提供する。
【００３７】
本発明はまた、ＡＩＶのＨ５亜型のヘマグルチニン分子の抗原構造のよりよい理解を提供した。本発明のｍＡｂ類および関連する結合タンパク質は、パラフィン中で固定された変性した組織において、さらに凍結切片および生物学的標本においてこの高病原性ウイルスを検出するための手段を提供する。
【００３８】
パラフィン切片中でウイルスを検出する能力は非常に重要である。ほとんどの状況下では、感染した組織切片中のＨ５Ｎ１抗原は固定の過程で破壊される。ホルマリンおよびエタノールは脂質のエンベロープおよびエンベロープの糖タンパク質を、ヘマグルチニンを含めて除去する可能性を有しており、従ってウイルス抗原の検出の難度を増大させる。従って、この形の診断は、Ｈ５に感染した動物およびヒトの組織におけるより安全かつより正確な診断を提供する可能性を有する。
【００３９】
下記に示す実施例により説明するように、ｍＡｂ  ７Ｈ１０はホルマリン固定された組織中のウイルス抗原に対して非常に有効かつ感度が高いが、一方で凍結組織切片には最小限の効力しか有しない。この抗体は感染した領域を光学顕微鏡の下で容易に視認することを可能にする。抗体７Ｈ１０はヘマグルチニン阻害またはウイルス中和活性を持たない；しかし、それは免疫蛍光アッセイおよびウェスタンブロット分析において陽性の結果を示し、組み換えＨ５Ｎ１−ＨＡタンパク質（ＭＷ  ３６ｋＤａ）に対応する強いバンドが観察される。
【００４０】
それに対し、ｍＡｂ類６Ｂ８、８Ｆ１０および２Ｄ１０は凍結組織切片に対して非常に有効であるが、ホルマリン固定された組織中の抗原は検出しない。これらの結果は、２個のグループのｍＡｂが異なるウイルスエピトープと反応していることを意味する。エピトープマッピングによって、ｍＡｂ  ７Ｈ１０は線状エピトープを標的としていることが明らかになった。それは組織が強烈な熱処理を受けた場合にのみウイルス抗原を検出できた。そのきつい抗原回復法の下では、ウイルスの表面タンパク質は破壊され、Ｈ５Ｎ１ウイルスの核タンパク質が露出された。従って、線状エピトープを標的とするｍＡｂ類は、凍結組織切片に対しては同様には働かない。
【００４１】
モノクローナル抗体６Ｂ８、８Ｆ１０および２Ｄ１０は、エピトープマッピングにより、Ｈ５Ｎ１ウイルスの三次元エピトープを標的としていることが明らかになった。これらの抗体は、組織切片への事前の処理無しでこれらのウイルス抗原に結合し、認識することができた。
【００４２】
免疫組織化学的分析において観察された異なる組織標本での染色の強度の違いは、ウイルスの浸入（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）のレベルが組織間で異なることを反映している。例えば、脳および腎組織では、個々の細胞が濃く染色され、染色された細胞の大きな分布（ｌａｒｇｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）も脳および腎組織に存在した。これらの発見は、肺はウイルス血症の後期において最もひどく感染した器官ではない可能性があることを示す。以前に、Ｈ５Ｎ１に感染した動物の肺における強烈な病変が報告された（２、１３、１４）。しかし、本発見は、肺は腎臓よりも少ない病変を有することを示している。この発明につながった実験で利用された組織標本は感染の後期における鳥類から得たものであるため、これらの結果は、肺が通常は感染の初期において高レベルのウイルス血症を有しており、後期の間にウイルスが拡散して腎臓に集中するであろうことを示唆している可能性がある。従って、これらの結果は、Ｈ５Ｎ１  ＡＩＶの感染が疑われる動物からの診断標本は肺組織だけでなく脳および腎組織も含むべきであることを示している。
【００４３】
この発明は、Ｈ５亜型ＡＩＶの検出のための便利で非常に特異的かつ感度の高い手段を提供する。その手段の１つはＥＬＩＳＡ形式である。好ましい態様において、ｍＡｂ  ７Ｈ１０および６Ｂ８が捕捉抗体として用いられる。この組み合わせは、どちらかの抗体単独または他の組み合わせと比較してＨ５亜型ＡＩＶの検出において高い光学密度の読みを提供することが分かっている。特定の理論に縛られるわけでは全く無いが、これらの結果のありうる説明は、２種類の抗体がＨＡ１タンパク質上で異なるエピトープと反応し、異なる抗体のサブクラスに属し、従って多数の結合部位を提供する、というものである。
【００４４】
三次元エピトープに対するモノクローナル抗体は重要な生物学的機能、例えば血球凝集の阻害および中和の活性を維持し、一方線状エピトープに対するｍＡｂ類も診断における使用に都合がよい。従って、それぞれ線状および三次元エピトープに対するものであり、抗原−抗体相互作用においてＩｇＧおよびＩｇＭの免疫学的特性を兼ね備えるｍＡｂ類７Ｈ１０および６Ｂ８の使用は、高い感度のＥＬＩＳＡの手順に大きく貢献する可能性がある。２種類のｍＡｂ類を用いるアプローチは、Ｈ５ウイルスを検出するための、例えばドットブロットおよびインサイチュハイブリダイゼーション形式によるような他の免疫学的方法を開発するために用いられてもよい。
【００４５】
この発明の好ましいＥＬＩＳＡ検査は、Ｈ５Ｎ１トリインフルエンザウイルスに感染している中国の家禽およびベトナムのヒトからのＨＡ抗原を検出することが可能であり、これはトリおよびヒト両方のＨ５Ｎ１感染症の検出に本発明が有用であることを示す。
【００４６】
この発明のＨ５亜型ｍＡｂ類は、診断の手段として他の一般に行われている方法に対して少なくとも３個の利点を有する。第１に、そのｍＡｂ類は高感染性Ｈ５亜型ＡＩＶに非常に特異的である。この特異性は、２００２年から２００６年までに様々な入手元から得られた、各種取り揃えたＨ５Ｎ１に感染した組織標本において実証された。その非常に特異的なモノクローナル抗体は、トリインフルエンザの診断の分野における画期的躍進を表す。第２に、これらのｍＡｂ類の、Ｈ５ウイルス抗原を感染したホルマリン固定された組織において、ならびに血清検査、例えばＨＩおよびＩＦＡにおいて検出し、正確に位置を測定する能力は、異なる利点を表す。第３に、これらのｍＡｂ類は、Ｈ５  ＡＩＶの検出に安全かつ便利な診断アプローチを提供する。パラフィン切片中でウイルス抗原を検出するそれらの能力は、ヒトに感染させず、または感染性のウイルス粒子を環境中に放出する可能性を有しないであろう感染した標本の輸送および診断を容易にする。さらに、凍結切片のスライドは、極低温で長期間保管することができ、感染症のさらなる診断および監視を容易にする。
【００４７】
本発明の別の態様は、Ｈ５トリインフルエンザの中和回避変異体に関する。用語”中和回避変異体”は、Ｈ５ウイルスにおいて抗原連続変異を引き起こし、中和エピトープに影響を及ぼす、ヘマグルチニンをコードする遺伝子における点変異により高められた（ｒａｉｓｅｄ）変異ウイルスを指す。中和回避変異体は、その親ウイルスを中和するのに有効な特定のモノクローナル抗体による中和を逃れることができる。回避変異体の手動のスクリーニングでは、親ウイルスを特定の中和抗体と共に保温し、宿主、例えばＭＤＣＫ細胞またはニワトリ胚の中に接種する。２〜３回のスクリーニングの後、その中和ｍＡｂに関する回避変異体をクローニングし、ＨＡ１遺伝子の配列決定を行う。変異したアミノ酸は親ウイルスの配列とのアラインメントにより決定され、変異した部位は中和ｍＡｂにより認識される中和エピトープを構成するアミノ酸の１個を正確に示す。
【００４８】
本発明において、６Ｂ８回避変異体はＨ５Ｎ３  ＡＩＶから、６Ｂ８中和モノクローナル抗体により生じた。８Ｆ１０回避変異体はＨ５Ｎ１（ＰＲ８）ＡＩＶから８Ｆ１０中和抗体により生じ、２Ｄ１０回避変異体はＨ５Ｎ１（ＰＲ８）ＡＩＶから２Ｄ１０中和モノクローナル抗体により生じた。変異部位を下記の実施例３、表３で一覧にする。
【００４９】
中和回避変異体は、それらが親ウイルスに特異的に結合する特定の中和抗体ではもはや認識することができない点においてそれらの親ウイルスと異なる。これゆえに、これらの変異体は上記の教えに従う新規モノクローナル抗体の産生のためにマウスを免疫するのに用いることができる。新規ｍＡｂ類の中から、変異したエピトープを正確に認識するモノクローナル抗体を選別することができ、次いでそれを用いて親ウイルス以外のトリインフルエンザウイルスへの相補的監視（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ）を提供することができる。この過程を数世代通して繰り返すことにより、さらなる回避変異体を見つけることができ、さらなる中和抗体を得ることができる。これらの抗体を本発明の方法において用いることができる。
【００５０】
本発明の別の態様において、本発明の抗体および関連する結合タンパク質は、Ｈ５  ＡＩＶ感染症、特にＡＩＶのＨ５Ｎ１亜型からの感染症を患う対象を処置するために投与することができる。本発明の抗体および関連する結合タンパク質は、インフルエンザの世界的流行または世界的流行の前兆の場合に予防措置として対象に投与することもできる。抗体および関連する結合タンパク質は、１回量で、または繰り返しの投与で、場合により放出が遅い形で投与することができる。投与は処置される対照の体におけるその作用部位に抗体を到達させることのできるあらゆる手段により、例えば静脈内に、筋肉内に、皮内に、経口で、または鼻に、なされることができる。通常は、抗体は医薬的に許容できる希釈剤またはキャリヤー、例えば無菌の水溶液中で投与され、組成物はさらに１種類以上の安定化剤、抗原性補強剤、可溶化剤、緩衝液等を含むことができる。厳密な投与の方法、組成物および個別の投与量は、治療の時に、対象の個々の必要性に依存して、対象の年齢、体重、全身の健康、ならびに彼のまたは彼女の症状の性質および程度、さらに与える処置の頻度のような要素を考慮して決定され、調整されるであろう。一般に、抗体がＨ５  ＡＩＶ感染症を患う患者を処置するために投与される場合、投与される抗体の投与量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内である。通常、予防措置として投与される場合、投与量は約半分、すなわち約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約０．５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内に減少する。
【００５１】
本発明の単一の抗体または結合タンパク質を療法上の目的のために投与することができ、または２種類以上の組み合わせを投与することができる。もし１世代以上の中和回避変異体に対する抗体が産生された場合、その抗体および上記の６Ｂ８、８Ｆ１０および／または２Ｄ１０抗体を治療用抗体”カクテル”として投与することができる。
【００５２】
下記の実施例を、本発明を実行する好ましいやり方を説明するために提供する。本発明は実施例の詳細に限定されるのではなく、添付した特許請求の範囲の全範囲と等しい。
【実施例】
【００５３】
実施例１
ハイブリドーマの作製
Ｈ５Ｎ１／ＰＲ８と名づけられたウイルスを、疾病対策センター（米国）から得た。それは非病原性組み換えＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスであり、それはベトナムでヒトに感染したＡＩＶ  Ｈ５Ｎ１ウイルスのＨＡおよびＮＡ遺伝子を含む（Ａ／ベトナム／１２０３／２００４）。別のＡＩＶ亜型、Ｈ５Ｎ３（Ａ／ニワトリ／シンガポール／９７）を、シンガポールの農産食品＆家畜管理局（ＡＶＡ）から得た。これらの２種類のウイルスストックを用いて９〜１１日齢の発育鶏卵（Ｃｈｅｗ’ｓ  Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｆａｒｍ，シンガポール）に感染させ、２世代複製させた。次いで発育鶏卵から尿膜腔液を吸出し、血球凝集アッセイ（ＨＡ）を用いてウイルスの力価を測定した。これらのＨ５Ｎ１およびＨ５Ｎ３ウイルスの精製を、ウイルスを含む尿膜腔液を１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して破片を除去し、続いて上清を４０，０００ｒｐｍで３時間超遠心することにより実施した。ウイルスのペレットをＰＢＳ中で再懸濁した。
【００５４】
モノクローナル抗体（ＩｇＧおよびＩｇＭ）を、透明になった流体から、プロテインＡ親和性カラム（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ；  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ，  ＵＳＡ）およびＩｍｍｕｎｏｐｕｒｅ（登録商標）  ＩｇＭ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，  ＵＳＡ）を用いて、製造者の説明書に従って精製した。ＩｇＧおよびＩｇＭの濃度を、ＮＤ−１０００分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；  Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  Ｄｅｌａｗａｒｅ，  ＵＳＡ）を用いることにより測定した。
【００５５】
不活化したＨ５Ｎ１  ＡＶＩ（Ａ／ガチョウ／広東省／９７）をＲＮＡの入手元として用いて、エピトープマッピングのためにＲＴ  ＰＣＴによりＨＡ１遺伝子を増幅した。ウイルスＲＮＡをウイルスに感染した細胞から、ＬＳ  Ｔｒｉａｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者に指定されるように分離した。逆転写およびＰＣＲは、Ｈ５亜型のＨＡ１遺伝子に特異的なプライマーを用いて実施した。次いでＰＣＲ産物を標準的な手順により配列決定した。増幅したＤＮＡをｐＱＥ−３０ベクターの中にクローニングし、それを今度はＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ−２１コンピテント細胞の形質転換に用いた。バキュロウイルスを介したタンパク質発現のために、次いで遺伝子をｐＦＡＳＴＢＡＣ  Ｔａベクターの中にクローニングし、Ｈ５Ｎ１  ＨＡ１遺伝子を含む組み換えバキュロウイルスを構築した。続いてバキュロウイルスを用いて組み換えウイルスの増幅のためにＳＦ９昆虫細胞株に感染させた。回避変異体の選択のため、Ｈ５Ｎ１  ＡＩＶ（Ａ／ベトナム／１２０３／２００４／Ｈ５Ｎｌ）をＲＮＡの入手元として用いた。
【００５６】
次いでこれらの精製したＨ５亜型ウイルスまたはバキュロウイルスからの精製したＨ５  ＨＡ１タンパク質を用いて、６〜８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスを、筋内で、２週間の間隔で２回免疫した。それぞれの動物に、等体積の抗原性補強剤（ＳＥＰＰＩＣ，フランス）で乳化した２０〜６０μｇの精製したＨ５亜型ＡＩＶを接種した。次いで、細胞融合の３日前、マウスに同じ投与量のウイルスの腹膜内追加抗原刺激を与えた。次いでマウスからの血清をウェスタンブロットによりスクリーニングし、最も高い抗体の力価を有するマウスを細胞融合のために選択した。選択したマウスから得られた脾細胞をＳＰ２／０ミエローマ細胞と１：１０の比率で、５０％ポリエチレングリコール（Ｓｉｇｍａ，分子量３３５０）中で混合し、細胞を融合させてハイブリドーマを作製した（２１）。
【００５７】
生ウイルスを用いた全ての実験は、微生物学的および生物医学的実験室における生物学的安全性（Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories）（ＢＭＢＬ）第４版において指定されるＣＤＣ／ＮＩＨの生物学的安全性要件を満たした生物学的安全性レベル３の封じ込め実験室（２０）中で実施した。実験は適切なＷＨＯ要件、ならびにシンガポールのＡＶＡおよび保健省（Ｍｉｎｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）（ＭＯＨ）により認可された要件も満たした。
【００５８】
実施例２
ハイブリドーマのスクリーニング
ハイブリドーマの培養上清を、下記のように血球凝集阻害（ＨＩ）試験および免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）によりスクリーニングした。
【００５９】
血球凝集阻害試験。ＣＤＣから得たＨ５Ｎ１／ＰＲ８ウイルスを用いて９〜１１日齢の発育鶏卵（Ｃｈｅｗ’ｓ  Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｆａｒｍ，シンガポール）に感染させ、３５℃で７２〜９６時間保温した。ウイルスの増殖の後、ニワトリ胚から尿膜腔液を採取し、Ｈ５Ｎ１ウイルス抗原として用いた。それぞれのハイブリドーマの培養上清を、凝集反応のためにニワトリ赤血球を、およびＨ５Ｎ１／ＰＲ８ウイルス株の４血球凝集単位を用いて、以前に記述されたようにして（１５）ＨＩ試験を行った。ハイブリドーマの上清の系列希釈液をまず１：５０に希釈し、次いでこれをウェルあたり４ＨＡ単位のニワトリ胚で増殖させたＨ５Ｎ１／ＰＲ８ウイルス（０．１％ベータ−プロピオラクトンで不活化した）およびニワトリ赤血球の０．５％（体積／体積）懸濁液と共に保温した。血球凝集を阻害した最も高い希釈度の逆数に相当する抗体の力価を、幾何平均力価（ＧＭＴ）として表した。
【００６０】
免疫蛍光アッセイ：９６ウェルプレートで２４時間増殖させたメイディン・ダービー・イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）細胞に、それぞれの尿膜腔液からのＨ５Ｎ１／ＰＲ８、Ｈ５Ｎ２およびＨ５Ｎ３ウイルスを感染させた。別の列のウェルを陰性対照（感染していないＭＤＣＫ細胞）に用いた。９６ウェルプレートを、加湿した３５℃、５％ＣＯ２のインキュベーター中に１８〜２２時間置いた。感染した細胞が７５％の細胞変性作用（ＣＰＥ）に達したら、それらを１００μｌの無水エタノールで１０分間室温で固定した。次いで９６ウェルプレート中の細胞をＰＢＳ、ｐＨ７．４で３回洗浄した。続いて、固定した細胞を５０μｌのそれぞれのハイブリドーマの上清と共に１時間、３７℃で保温した。３回洗浄した後、抗原をフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−コンジュゲート抗マウスＩｇ（１：１００  ＤＡＫＯ，デンマーク）と共に、３７℃で１時間保温した。ＩＦＡによりｍＡｂ類をスクリーニングするより識別力のある方法のため、追加の対照を用いた。前述したように、感染していないＭＤＣＫ細胞を陰性対照として用いた。追加の陰性対照として、細胞をＲＰＭＩ１６４０と共に保温した。陽性対照として、１００倍希釈した免疫したマウスからの血清を用いた。それぞれのハイブリドーマの上清と共に保温したＭＤＣＫ細胞を異なる対照と比較することにより、陽性の染色結果を与えたハイブリドーマの上清を限界希釈によるクローニングのために選択した。安定なｍＡｂ産生ハイブリドーマをこの手順により得た。
【００６１】
実施例３
Ｈ５亜型モノクローナル抗体の特性づけ
ｍＡｂ類の安定性。血球凝集阻害試験を、異なる期間（７、３０、４５、６０、７０、および９０日目）において得たそれぞれのハイブリドーマの上清について実施し、細胞株の安定性を評価した。希釈を行ってエンドポイントを算出した。ｍＡｂ  ６Ｂ８のハイブリドーマの上清は、ＨＩ力価２９を有していた。その力価は９０日目においてさえも安定なままであった（図１参照）。このように、Ｈ５抗原に対するｍＡｂを分泌するハイブリドーマクローンは、長期間の間高い力価の値を維持することができた。
【００６２】
ｍＡｂのアイソタイプ同定。
ｍｏｕｓｅ  ｍＡｂ  ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  ｋｉｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，イギリス）を用いてアイソタイプ同定を実施した。（データは示していない。）６Ｂ８、８Ｆ１０および２Ｄ１０のアイソタイプはＩｇＭであると決定され、７Ｈ１０はＩｇＧ１であると決定された。
【００６３】
ｍＡｂ類の特異性の分析。Ｈ５亜型ｍＡｂ類は、関連するＨ５亜型、ＡＩＶ  Ｈ５Ｎ２およびＨ５Ｎ３と、ならびに非Ｈ５亜型インフルエンザウイルス、Ｈ３Ｎ２、Ｈ４Ｎ１、Ｈ７Ｎ１、Ｈ９Ｎ２およびＨ１０Ｎ５とも交叉反応した。ＨＩ試験を用いて交叉反応性を試験した。図２に図説する結果は、Ｈ５亜型ｍＡｂ類が非Ｈ５亜型ウイルスＨ３Ｎ２、Ｈ４Ｎ１、Ｈ７Ｎ１、Ｈ９Ｎ２およびＨ１０Ｎ５にさらされた際に交叉反応が無かったことを示した。ｍＡｂ類６Ｂ８、２Ｄ１０および８Ｆ１０はＨ５Ｎ２およびＨ５Ｎ３との交叉反応性を有していた。表１は、それぞれのＨ５亜型ｍＡｂ類の凍結された、およびホルマリン固定された組織に対する有効性を示す。表１では、感染した組織において観察されたシグナルの強度に、次のように半定量的な点数を割り当てた：無し（−）、弱い（＋）、中程度（＋＋）、強い（＋＋＋）および非常に強い（＋＋＋＋）。ＲＰＭＩ１６４０を、Ｈ５亜型ｍＡｂ類に関する対象として用い、ニューカッスル病に感染したニワトリ組織をＨ５Ｎ１に感染した組織に関する対象として用いた。他の入手元からのＡＩおよびＨ５ｍＡｂ類を、本発明のＨ５亜型ｍＡｂ類に対する比較のために用いた。
【００６４】
表１
【００６５】
【表１】
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【００６６】
下記で論じる免疫組織化学的染色は、これらのＨ５亜型ｍＡｂ類のＨ５Ｎ  ＡＩＶに対する特異性をさらに確証した。
ｍＡｂ類のウイルス中和。ＭＤＣＫ細胞および１０日齢の胚を、それぞれ５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）および５０％胚感染量（ＥＩＤ５０）の測定のために用いた。ＭＤＣＫ細胞（２ｘ１０４／ｍｌ）を、７０％〜９０％コンフルエンスまで増殖させた。それぞれのウイルスに感染した尿膜腔液を、１０−１から１０−８までの一連の希釈比を用いて、それらの対数期（ウイルス感染への感受性が最も高い）におけるＭＤＣＫ細胞および１０日齢のニワトリ胚の両方に感染させることで、ＴＣＩＤ５０およびＥＩＤ５０に関して試験した。感染していないＭＤＣＫ細胞および尿膜腔液を陰性対照として用いた。細胞を３５℃で培養し、ＣＰＥを観察した。ＲｅｅｄおよびＭｕｅｎｃｈの数学的技法（９）を用いて、感染価をＴＣＩＤ５０／１００μｌおよび１０００ＥＩＤ５０／２００μｌとして表し、それぞれのウイルスを、それぞれ５０μｌおよび１００μｌ中に１００ＴＣＩＤ５０および５００ＥＩＤ５０を有するようにそれぞれ希釈した。系列希釈したｍＡｂ  ６Ｂ８は、感染したＭＤＣＫ細胞および胚中で終濃度１００ＴＣＩＤ５０および５００ＥＩＤ５０のウイルスを中和することができた。表２参照。表２に示したデータは、ｍＡｂ  ６Ｂ８がＨ５Ｎ１ウイルスを中和する活性を生み出すことができたことも示している。表２における数は、感染したＭＤＣＫ細胞および胚中でウイルスの終濃度１００ＴＣＩＤ５０および５００ＥＩＤ５０において、ｍＡｂ類がウイルスをなお検出および中和することができた最も高いＨ５Ｎ１ウイルスの希釈率を表している。
【００６７】
表２
【００６８】
【表２】
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【００６９】
回避変異体の選択。親ウイルスの１０倍系列希釈液を等体積のｍＡｂと混合した。室温で１時間保温した後、混合物を２００μｇ／ｍｌのＴＰＣＫ処理トリプシン（Ｓｉｇｍａ）および０．００１％  ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭＥＭ培地中のＭＤＣＫ細胞の単層の上に接種した。３５℃において７日間の後、ウイルス上清を集めてさらなる選択を行った。回避変異体の選択のため、Ｈ５Ｎ１  ＡＩＶ（Ａ／ベトナム／１２０３／２００４／Ｈ５Ｎ１）をＲＮＡの入手元として用いた。回避変異体をクローニングし、親の配列と比較した。回避変異体を、中和ｍＡｂ  ６Ｂ８を用いて選択した。ｍＡｂ  ６Ｂ８の中和に対する耐性の原因である点変異は、ＨＡ１配列上のヌクレオチド６１４において生じていることが明らかになった。変異はヌクレオチド６１４の”Ａ”から”Ｃ”への変化を伴っており、それは結果としてアミノ酸２０５のリシンからスレオニンへの変異をもたらす。変異ウイルスがｍＡｂ  ６Ｂ８の中和を回避することを可能にするこの変異の能力を、中和アッセイおよびヘマグルチニン阻害アッセイにより実証した。この結果は、ｍＡｂ  ６Ｂ８がヘマグルチニン上のアミノ酸２０５を含むエピトープを標的としていることを示した。他の２種類の中和エピトープがｍＡｂ類８Ｆ１０および２Ｄ１０に関して、それぞれ同じ方法により同定された。結果を表３に示し、それはＡＩＶ（Ａ／ベトナム／１２０３／２００４／Ｈ５Ｎ１）のヘマグルチニン分子上のｍＡｂ中和エピトープの位置を示す。
【００７０】
表３
【００７１】
【表３】
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【００７２】
ウェスタンブロット。組み換えＨ５Ｎ１−ＨＡ１タンパク質を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理した。分離したタンパク質をニトロセルロース紙に固定した。膜をＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中の５％脱脂乳で１時間ブロッキングした。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回、それぞれ５分間洗浄した後、膜をそれぞれのｍＡｂ類、続いてＨＲＰ−コンジュゲートウサギ抗マウスＩｇ（１：２０００）と共に保温した。次いで膜を３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）で５分間現像した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎですすいで反応を停止した。それぞれの保温の後、試薬をＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで３回、それぞれ５分間洗浄した。後者は精製した組み換えＨＡ１に由来するため、ｍＡｂ  ７Ｈ１０を陽性対照として用い、一方でＲＰＭＩ１６４０を陰性対照として用いた。図３に図説するように、Ｈ５亜型ＭＡｂ  ７Ｈ１０は組み替えＨ５Ｎ１−ＨＡ１タンパク質と反応することができる。ニトロセルロース膜上に形成されたバンドは３６ｋＤａであった。これは組み替えタンパク質の分子量と等しい。一方、ｍＡｂ類６Ｂ８、８Ｆ１０、２Ｄ１０およびＲＰＭＩ１６４０は陰性の結果を与えた。６Ｂ８および他のｍＡｂ類はその未変性の形のウイルスタンパク質を標的とするため、このグループのｍＡｂ類はウェスタンブロットではウイルスタンパク質を検出できないであろう。ウェスタンブロットで用いられるＳＤＳ−ＰＡＧＥは未変性のタンパク質の折りたたみをほどき（ｕｎｆｏｌｄ）、それらを線状にし、従って検出を不可能にするであろう。
【００７３】
実施例４
ｍＡｂ  ７Ｈ１０の線状エピトープのマッピング
Ｈ５亜型ＡＩＶのＨＡ１遺伝子をＰＣＲにより３種類の重なり合う断片に切り分け、ヒスチジン融合タンパク質として発現させた。ｍＡｂ  ７Ｈ１０を用いたウェスタンブロットによる分析は、そのエピトープが主に断片ＢおよびＣの重なり合う領域（アミノ酸２０１〜２６６）中に見出されることを明らかにした。このエピトープのＣ末端の位置を決定するため、８種類の切り詰めた断片を設計し、ｍＡｂ  ７Ｈ１０を用いてウェスタンブロットによりスクリーニングした（図７ａおよびｂ）。ＨＡ１上のアミノ酸２５１が７Ｈ１０に関するエピトープのＣ末端のアミノ酸であることが分かった。このエピトープのＮ末端の位置を決定するため、８種類の変異導入した断片を設計し、ｍＡｂ  ７Ｈ１０を用いてスクリーニングした。８種類の変異体の間で、ＨＡ１上のアミノ酸２４０〜２４７を特定のプライマーにより個別にアラニンへと変更した。ウェスタンブロットの結果によると、エピトープ中のＮ末端のアミノ酸はＨＡ１上のアミノ酸２４４である（図７ｃおよびｄ）。これらの結果は、Ｍａｂ  ７Ｈ１０により標的とされる線状エピトープがＨ５亜型ＡＩＶのヘマグルチニン上のアミノ酸２４４〜２５１（２４４および２５１を含む）に位置していることを示した。
【００７４】
実施例５
免疫組織化学
２００２〜２００６年からの３０個のＨ５Ｎ１に感染した組織標本を試験した。それらは様々なタイプの組織、器官、例えば脳、腎臓、肝臓、肺および膵臓を含んでいた。それらはパラフィン切片にされた標本または凍結切片のどちらかの形であった。商業的に入手できる免疫ペルオキシダーゼ染色系（Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＋  Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ  （ＡＥＣ））を、これらの標本に用いた。染色技法は、二次抗体とコンジュゲートしたホースラディッシュペルオキシダーゼ標識ポリマーに基づいた、結合した抗体（２０）を認識するための２個の工程を含んでいる（１６）。このキットはアビジンまたはビオチンを含んでいないため、非特異的内因性アビジン−ビオチン活性はかなり軽減される。
【００７５】
パラフィン切片。パラフィン切片にした標本の染色の結果を図４に示す。非常に強い陽性シグナルが、感染した腎組織において観察された。腎組織の至る所にシグナルの広い分布が見られ、それぞれのシグナルが非常に高い強度を有していた。逆に、肺は分布および強度の点でそのような強いシグナルを示さなかった。肺組織の上皮の裏打ちのみがかすかに染色された。肝組織に関しては、シグナルは散在して分布していた。しかし、検出されたそれぞれのシグナルは強かった。感染した肝組織に関して、シグナルが通常は胆管の上皮に沿って検出されたことにも注意すべきである。より綿密な実験では、胆管は吸虫類に感染していることが観察された。これらの結果は、ｍＡｂ  ７Ｈ１０がＨ５Ｎ１に感染したホルマリン固定された組織からＨ５抗原を見つけ出す（ｒｅｔｒｉｅｖｅ）ことのできるＨ５亜型ＡＩＶモノクローナル抗体であることを示している。
【００７６】
凍結切片。凍結切片にした標本の染色の結果を図５に示す。抗体６Ｂ８は様々な年からの全ての標本において強い陽性シグナルを検出することができた。これらの染色された組織の顕微鏡写真は、染色されたのがこれらの感染した脳組織の神経細胞であったことを明確に示している。凍結およびパラフィン切片の両方に関して、組織のタイプに関わらず組織の中で核のみが染色されたことがはっきりと見えた。Ｈ５Ｎ１ウイルスに感染した鳥類の主な病変（２０）は腎および脳組織であった。上記の表１のデータは、Ｈ５亜型ＡＩＶを他の源からのトリインフルエンザと識別する本発明のｍＡｂ類の能力を示している。
【００７７】
実施例６
ＡＣ−ＥＬＩＳＡの発展
モノクローナル抗体７Ｈ１０および６Ｂ８を、次のようなＥＬＩＳＡの手順で評価した：６Ｂ８（ＩｇＭ）を半対数増加（ｈａｌｆ−ｌｏｇ  ｉｎｃｒｅｍｅｎｔｓ）で系列希釈し、９６ウェル平底マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ，  Ｄｅｍａｒｋ）をコートするのに用いた。捕捉抗体を５０μｌの炭酸緩衝液（７３ｍＭ炭酸水素ナトリウムおよび３０ｍＭ炭酸ナトリウム）に懸濁した。次いでマイクロタイタープレートを３７℃で１時間、または４℃で一夜保温した。全ての続く保温工程の間にプレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄し、全ての希釈液は１％脱脂乳を含むＰＢＳＴ中で作った。プレートを５０μｌのブロッキング溶液（ＰＢＳ−Ｔ中５％脱脂乳）と共に３７℃で１時間保温してブロッキングし、すすいで５０μｌの精製した組み換えＨ５Ｎ１組み換えＨＡ１（１００ｎｇ）またはＨ５  ＡＩＶと共に３７℃で１時間保温した。すすいだ後、５０μｌのモルモット単一特異性抗体ＩｇＧ（１：４８０で希釈）を添加し、３７℃で１時間保温し、洗浄し、５０μｌの１：１０００に希釈したＨＲＰコンジュゲートウサギ抗モルモット免疫グロブリンと共に保温した。５０μｌの新しく調製した基質溶液（ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ））の添加により色を現し、ＥＬＩＳＡリーダー（Ｔｅｃａｎ，スイス）で４９０ｎｍの吸光度を読み取った。ｍＡｂ類および単一特異性抗体の最適な実用希釈度は、交差力価測定により決定した。Ｈ５  ＡＩＶ（Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ５Ｎ３）および非Ｈ５  ＡＩＶ（Ｈ７Ｎ１およびＨ９Ｎ２）の反応を比較することにより最適化の条件を決定し、このアッセイに関する最も高いシグナル対ノイズ比を得た。シグナル対ノイズ比は対応抗原の吸光度を異種抗原の吸光度で割ることにより算出される。
【００７８】
モノクローナル抗体６Ｂ８は、ＡＣ−ＥＬＩＳＡにおいて捕捉抗体として、および検出抗体としても用いられた。モノクローナル抗体６Ｂ８は、ＥＬＩＳＡにおいて他のモノクローナル抗体よりも強い反応性を示した。６Ｂ８によるそのＡＣ−ＥＬＩＳＡは、特にＨ５亜型ＡＩＶの検出に適用でき、他のいずれのＡＩＶ亜型とも反応しない（図６ａ）。ＡＣ−ＥＬＩＳＡの検出限界は０．５ＨＡ単位未満である（図６ｂ）。交差力価測定の後、捕捉ＥＬＩＳＡのための最適抗体濃度は捕捉抗体としてのそれぞれのｍＡｂにつきウェルあたり６００ｎｇ、およびウェルあたり８００ｎｇの検出ポリクローナル抗体であると決定された。
【００７９】
参考文献
【００８０】
【化１】
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【００８１】
【化２】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
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【図４Ｋ】
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【図４Ｌ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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