(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
２−アミノフェノキサジン−３−オンか、又は、２−アミノ−１０−（Ｎ−４′−アミノブチル）−フェノキサジン−３−オン、２−アミノ−７−ヒドロキシ−フェノキサジン−３−オン、２−アミノ−３，４−ジメトキシ−６，７−ジメトキシカルボニル−フェノキサジン−３−オン、２−アミノ−７−メトキシ−フェノキサジン−３−オン及び２−（Ｎ−ヒドロキシ）アセチルアミノ−フェノキサジン−３−オンから選ばれる２−アミノフェノキサジン−３−オン誘導体を有効成分として含有する骨形成促進剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は骨形成促進剤に関するものであり、とりわけ、２−アミノフェノール又はその誘導体を有効成分とする骨形成促進剤に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
生体内の骨組織は、破骨細胞による骨破壊（骨吸収）と骨芽細胞による骨形成とで絶えず更新されており、健常者では、そのバランスが保たれているので、一定の骨量が維持されている。一方、閉経後骨粗鬆症においては、骨破壊量が骨形成量を上回るために骨量の減少を生じている。破骨細胞は、単球／マクロファージ系前駆細胞が分化したものであるが、成熟破骨細胞への分化は生理的には、マクロファージ−コロニー刺激因子（以下、「Ｍ−ＣＳＦ」と略記する。）や、骨芽細胞、ストローマ細胞、それに活性化Ｔ細胞上に発現されたＬｉｇａｎｄ  ｏｆ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦ−κＢ（以下、「ＲＡＮＫＬ」と略記する。）が関与していることが明らかとなっている。また、慢性関節リューマチでは、炎症により活性化した滑膜細胞やＴ細胞から産生されるインターロイキン−１（以下、「ＩＬ−１」と略記する。）や腫瘍壊死因子（以下、「ＴＮＦ−α」と略記する。）などの炎症性サイトカインにより骨芽細胞が活性化され、破骨細胞への分化に必須の生理的因子であるＲＡＮＫＬの発現が亢進すると共に、インターロイキン−６（以下、「ＩＬ−６」と略記する。）や一酸化窒素（以下、「ＮＯ」と略記する。）の産生を誘導する。この産生誘導されたＮＯは、軟骨細胞のアポトーシスを亢進したり、軟骨基質合成を低下させることにより軟骨破壊を促進する。またＮＯにより単球／マクロファージが活性化され、破骨細胞へと分化が誘導され骨破壊が進行する。さらにＴＮＦ−αやＩＬ−６自身による破骨前駆細胞の破骨細胞への分化誘導や、これら炎症性サイトカインにより誘導される骨芽細胞からのプロスタグランジンＥ２（以下、「ＰＧＥ２」と略記する。）の産生による破骨細胞の形成などが、骨代謝異常に関与していることもわかっている（例えば、クゾクレア  サルバトーレ（ＣＵＺＺＯＣＲＥＡ  ＳＡＬＶＡＴＯＲＥ）ら著、『エンドクリノロジー』、第１４４巻、第３号、第１０９８乃至１１０７頁、２００３年、コバヤシ  ヤスヒロら著、『ザ  ジャーナル  オブ  バイオロジカル  ケミストリー』、第２８０巻、第１２号、第１１３９５乃至１１４０３頁、２００５年を参照）。このように、骨粗鬆症や慢性関節リューマチなどの骨代謝異常により引き起こされる疾患（以下、「骨代謝異常疾患」という。）では、幾つかの要因が重なり合って骨破壊という病態が形成されるものと考えられている。【０００３】
骨粗鬆症や慢性関節リューマチなどの骨代謝異常疾患の治療には、通常、ビスフォスフォネート化合物、カルシトニン製剤、活性型ビタミンＤ３製剤、カルシウム製剤、イソフラボン製剤、選択的エストロジェン受容体調節剤（ＳＥＲＭ製剤）、エストラジオール含有のホルモン製剤、ビタミンＫ２等の医薬品が一般に使用されている。また、副作用の少ない優れた治療薬をめざして、活性型ビタミンＤ３誘導体、エストラジオール誘導体、第３世代ビスフォスフォネート系化合物等の開発がおこなわれている。しかし、前記薬剤を用いた骨代謝異常疾患の治療法は必ずしも満足できるものではなく、しかも、ホルモン製剤は副作用を惹起することがあるので、その使用には医師の処方が欠かせず、副作用の面から使用対象が限定される場合もある。したがって、これらの治療剤は、健常者が予防剤として普段から常用するなどということはできなかった。また、骨代謝異常疾患、とりわけ、骨粗鬆症や変形関節炎などの発症率は加齢に伴って急激に増大し、高齢者のクオリティーオブライフ（ＱＯＬ）低下の大きな要因となっている。本格的な高齢化社会を迎えた今日では、健康にして快適な老後を過ごすためにも、骨代謝異常疾患を予防乃至治療する目的で、家庭で手軽に常用でき、効果的で、且つ、穏やかな作用を有する骨形成促進剤の開発が鶴首されている。【０００４】
一方、２−アミノフェノール（別名：クエスチオマイシンＢ）は、下記化学式１で示される化合物であり、酸化重合して、下記化学式２で示される２−アミノフェノキサジン−３−オン（別名：クエスチオマイシンＡ）に比較的容易に変換する。２−アミノフェノール又はその誘導体は、抗菌活性を持つ物質として古くから知られており、特に、２−アミノフェノキサジン−３−オンは、強力な抗癌剤であるアクチノマイシンＤの基本骨格としても知られている。また、モトハシら著、『メディカル・リサーチ・レビュー』、第１１巻、第２５０乃至２５４頁、１９９１年には、２−アミノフェノキサジン−３−オン及びその誘導体が抗腫瘍活性を有していることが開示されており、特にシマモトら著、『クリニカル・キャンサー・リサーチ』、第７巻、第７０４乃至７０８頁、２００１年にはその誘導体の一つの２−アミノ−４，４α−ジヒドロ−４α，７−ジメチル−フェノキサジン−３−オンが、各種の腫瘍細胞に対して細胞障害活性を示すことが開示されている。さらに近年、２−アミノフェノキサジン−３−オンは、特開２００４−１４３１０１号公報ではウイルス性疾患の治療に、特開２００５−２７２３３４号公報ではクラミジア症の治療に、特開２００５−６０３２５号公報ではヘリコバクター属が関与する消化器疾患の治療に有効であることが開示されている。また、本願と同じ出願人は、国際特許出願ＰＣＴ／ＪＰ２００７／７００７７号明細書において、２−アミノフェノール及びその誘導体が、ＰＧＥ２の産生を抑制することから、炎症性の疾患に有効であることを開示している。【０００５】
化学式１：
【化１】
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【０００６】
化学式２：
【化２】
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、従来の骨形成促進剤よりも副作用が少なく、骨代謝異常疾患の予防乃至改善効果の高い骨形成促進剤を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者等が鋭意研究したところ、２−アミノフェノール又はその誘導体は、前骨芽細胞を骨芽細胞へと分化誘導し、石灰化を促進する作用を有することを発見した。さらに、これらの化合物は、マクロファージからの破骨細胞の分化誘導を抑制することで、骨破壊を抑制する作用も併せ持つことを発見し、これらの化合物が、骨代謝異常疾患の予防乃至治療に有効な骨形成促進作用と骨吸収抑制作用の両方を併せ持っていることを見いだして本発明を完成した。【０００９】
すなわち、本発明は、２−アミノフェノール又はその誘導体を有効成分として含有する骨形成促進剤を提供することにより上記課題を解決するものである。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、従来の骨形成促進剤よりも副作用が少なく、また、骨形成促進効果に優れる骨形成促進剤を提供することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明でいう２−アミノフェノールとは、下記化学式１で示される化合物であり、本発明の効果を発揮する限り、その起源や由来を問わず、市販品を用いることもできる。本発明でいう２−アミノフェノールの誘導体とは、２−アミノフェノールの酸化重合体である下記化学式２で示される２−アミノフェノキサジン−３−オン及びそれを基本骨格とする誘導体を意味し、２−アミノフェノールと同等以上の効果を発揮する。２−アミノフェノキサジン−３−オンは、その起源や由来を問わず、それを豊富に含む植物、細菌などから適宜の抽出・精製方法により製造したり、前駆体の２−アミノフェノールを酸化重合させて合成することができる。例えば、特開２００３−２８７８号公報に記載の、２−アミノフェノールとフェリシアン化カリウムなどの３価の鉄イオンとを反応させる方法や、特開平２−１９３９８４号公報に記載の、２−アミノフェノールとヒト又はウシのヘモグロビンとを反応させる方法により合成することができる。【００１２】
化学式１：
【化３】
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【００１３】
化学式２：
【化４】
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【００１４】
本発明で用いられる２−アミノフェノキサジン−３−オンの誘導体としては、例えば、下記一般式１又は一般式２で表されるものがあり、これらの塩類であってもよい。また、本発明の効果を発揮する限り、その起源や由来を問わず、市販品を用いることもできる。具体的には、下記一般式１で表されるものとしては、２−アミノ−７−ヒドロキシ−フェノキサジン−３−オン（下記一般式１において、Ｒ５がヒドロキシ基、Ｒ１乃至Ｒ４が水素原子）、２−アミノ−７−メトキシ−フェノキサジン−３−オン（下記一般式１において、Ｒ５がメトキシ基、Ｒ１乃至Ｒ４が水素原子）、２−アミノ−３，４ジメトキシ−６，７−ジメトキシカルボニル−フェノキサジン−３−オン（下記一般式１において、Ｒ３及びＲ４がメトキシ基、Ｒ６及びＲ７がメトキシカルボニル基、Ｒ１、Ｒ２及びＲ５が水素原子）、２−アセチルアミノ−フェノキサジン−３−オン（下記一般式１において、Ｒ１がアセチル基、Ｒ２乃至Ｒ５が水素原子）、２−アセチルアミノ−７−ヒドロキシ−フェノキサジン−３−オン（下記一般式１において、Ｒ１がアセチル基、Ｒ５がヒドロキシ基、Ｒ２乃至Ｒ４が水素原子）、２−（Ｎ−ヒドロキシ）アセチルアミノ−フェノキサジン−３−オン（下記一般式１において、Ｒ１がアセチル基、Ｒ２がヒドロキシ基、Ｒ３乃至Ｒ５が水素原子）、２−（２−ヒドロキシアセチル）アミノ−フェノキサジン−３−オン（下記一般式１において、Ｒ１がヒドロキシアセチル基、Ｒ２乃至Ｒ５が水素原子）、２−アセチルアミノ−７−メトキシ−フェノキサジン−３−オン（下記一般式１において、Ｒ１がアセチル基、Ｒ５がメトキシ基、Ｒ２乃至Ｒ４が水素原子）、７−ヒドロキシ−２−（２−ヒドロキシアセチル）アミノ−フェノキサジン−３−オン（下記一般式１において、Ｒ１がヒドロキシアセチル基、Ｒ５がヒドロキシ基、Ｒ２乃至Ｒ４が水素原子）、２−アミノ−４，６，７−トリメトキシ−フェノキサジン−３−オン（下記一般式１において、Ｒ３乃至Ｒ５がメトキシ基、Ｒ１及びＲ２が水素原子）、２−（Ｎ−ヒドロキシ）アセチルアミノ−フェノキサジン−３−オン（下記一般式１において、Ｒ１がヒドロキシ基、Ｒ２がアセチル基、Ｒ３乃至Ｒ７が水素原子）などが挙げられる。また、下記一般式２で表されるものとしては、２−アミノ−１０−（Ｎ−４′−アミノブチル）−フェノキサジン−３−オン（一般式２のＲ１乃至Ｒ７及びＲ９が水素原子、Ｒ８がアミノブチル基）、２−アミノ−７−ヒドロキシ−１０−（Ｎ−４′−アミノブチル）−フェノキサジン−３−オン（一般式２のＲ１乃至Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７及びＲ９が水素原子、Ｒ５がヒドロキシ基、Ｒ８がアミノブチル基）、２−アミノ−７−メトキシ−１０−（Ｎ−４′−アミノブチル）−フェノキサジン−３−オン（一般式２のＲ１乃至Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７及びＲ９が水素原子、Ｒ５がメトキシ基、Ｒ８がアミノブチル基）などやこれらの塩類を挙げることができ、２−アミノ−１０−［４′−（Ｎ−ジエチルアミノ）ブチル］−フェノキサジン−３−オン（一般式２のＲ１乃至Ｒ７及びＲ９が水素原子、Ｒ８がジエチルアミノブチル基）や２−アミノ−１０−（４′−Ｎ−ピペリジノブチル）−フェノキサジン−３−オン（一般式２のＲ１乃至Ｒ７及びＲ９が水素原子、Ｒ８がピペリジノブチル基）などの２−アミノ−１０−（Ｎ−４′−アミノブチル）−フェノキサジン−３−オンの誘導体が挙げられる。また、前記２−アミノフェノキサジン−３−オンやその誘導体の塩類や、これらの化合物に、さらに、人工的な手法により、糖を付加して配糖体にしたり、ポリエチレングリコールやプルランなどの水溶性ポリマーを結合させたものも含む。【００１５】
一般式１： 
【化５】
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（但し、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子（Ｈ）、ヒドロキシ基（ＯＨ）、アセチル基（ＣＯＣＨ３）、ヒドロキシアセチル基（ＣＯＣＨ２ＯＨ）から選ばれ、Ｒ３乃至Ｒ７は、それぞれ独立して、水素原子（Ｈ）、ヒドロキシ基（ＯＨ）、メトキシ基（ＯＣＨ３）、エトキシ基（ＯＣ２Ｈ５）、メトキシカルボニル基（ＣＯＯＣＨ３）、エトキシカルボニル基（ＣＯＯＣ２Ｈ５）から選ばれる。）【００１６】
一般式２：
【化６】
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（但し、Ｒ１及びＲ２は、それぞれ独立して、水素原子（Ｈ）、ヒドロキシ基（ＯＨ）、アセチル基（ＣＯＣＨ３）、ヒドロキシアセチル基（ＣＯＣＨ２ＯＨ）から選ばれ、Ｒ３乃至Ｒ７及びＲ９は、それぞれ独立して、水素原子（Ｈ）、ヒドロキシ基（ＯＨ）、メトキシ基（ＯＣＨ３）、エトキシ基（ＯＣ２Ｈ５）、メトキシカルボニル基（ＣＯＯＣＨ３）、エトキシカルボニル基（ＣＯＯＣ２Ｈ５）から選ばれ、Ｒ８は、アミノプロピル基（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、アミノブチル基（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）から選ばれる。【００１７】
本発明でいう骨代謝異常疾患とは、破骨細胞による骨破壊と骨芽細胞による骨形成とのバランスがくずれて、骨量が健常者よりも減少する疾患をいい、骨量が健常者よりも低い状態にある場合や、その予備軍を含む。具体的には、骨粗鬆症、慢性関節リューマチ、リューマチ様脊椎炎、骨ページェット病、変形性関節炎、痛風性関節炎、歯肉炎、歯周病やその予備軍などを例示することができる。【００１８】
本発明でいう骨形成促進作用とは、骨芽細胞による骨形成が促進されて、骨量が増加する作用を意味し、骨量の減少を停止乃至改善する場合を含む。具体的には、骨芽細胞の活性の上昇や分化の促進、或いは、その細胞数の増加などによって、カルシウムの沈着を促進し、骨形成を促進する作用を意味する。また、本発明でいう破骨抑制作用とは、破骨細胞における骨破壊（骨吸収）の亢進による骨量減少を抑制する作用を意味し、ＲＡＮＫＬ刺激によるマクロファージからの破骨細胞の分化誘導の抑制、骨芽細胞からのＩＬ−６の産生の抑制、さらには、シクロオキシゲナーゼ（以下、「ＣＯＸ」と略記する。）の活性を阻害することでＰＧＥ２の合成の阻害、及び、誘導型一酸化窒素合成酵素（以下、「ｉＮＯＳ」と略記する。）の産生を抑制することでマクロファージによるＮＯの合成を阻害するなどの作用に基づき、マクロファージの破骨細胞への分化誘導を抑制する作用を含む。【００１９】
本発明でいうＮＯの合成阻害作用は、細胞におけるｉＮＯＳが量的に減少することによって発揮され、ＮＯの合成活性を有する細胞、例えば、マクロファージ細胞に本発明の化合物を添加して、当該細胞のｉＮＯＳの作用により産生するＮＯ量を測定することにより調べることができる。マクロファージ細胞としては、マウス由来の細胞株ＲＡＷ２６４．７細胞や、マウスなどの実験動物から採取したものを用いることができる。産生するＮＯ量は常法のＧｒｉｅｓｓ法により測定できる。Ｇｒｉｅｓｓ法とは、ＮＯをスルファニルアミドとＮ−（１−ナフチル）エチレンジアミンの混合物（Ｇｒｉｅｓｓ試薬）中に添加し、ジアゾ化カップリング反応により生成する赤色のアゾ色素を５４０ｎｍの吸光度を測定することにより、ＮＯの代謝物のＮＯ２−を定量する方法である。【００２０】
本発明でいうシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）活性阻害作用は、ＣＯＸ−１又はＣＯＸ−２及びアラキドン酸共存下において、試験試料としての本発明の化合物を添加することによって、ＰＧＥ２の生成量を測定し、対照試料と比較することによって確認することができる。５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）は、非阻害の対照試料と比較し、ＰＧＥ２合成を５０％阻害するために必要な試験試料の濃度を表す。また、シクロオキシゲナーゼ活性を有する細胞に試験試料を添加して、ＰＧＥ２の生成量を測定することによっても確認することができる。また、ＣＯＸ−１／ＣＯＸ−２比とは、ＣＯＸ−１に対してのＩＣ５０値とＣＯＸ−２に対してのＩＣ５０値の比であり、この値が大きいほど、ＣＯＸ−２に対しての選択的阻害剤であることを意味する。【００２１】
上記のとおり、本発明で用いられる２−アミノフェノール又はその誘導体は、骨形成促進作用を有する。しかも、これらの化合物は、ＮＯ合成阻害作用、ＰＧＥ２産生抑制作用、シクロオキシゲナーゼ活性阻害作用、ＩＬ−６などの炎症性サイトカインの産生抑制作用などの、骨破壊の亢進に関与する生理活性物質の産生を抑制する作用を有している。しかも、２−アミノフェノール又はその誘導体は、骨や軟骨の基質を構成するコラーゲン産生を増強する作用も有していることから、骨形成促進剤を目的とする食品、化粧品、医薬部外品、医薬品としての多種多様の用途を有している。また、本発明の骨形成促進剤は、経口的に摂取、或いは、カテーテルや座剤等により経胃又は経腸的に投与することができる。経口摂取物又は経胃・経腸投与物の形態の場合、骨形成促進剤に含まれる有効成分としての２−アミノフェノール又はその誘導体の含有量は、骨形成促進剤の総質量に対して、通常、０．０１乃至１００質量％、好ましくは０．１乃至５０質量％、より好ましくは０．５乃至１０質量％であり、使用量としては、骨代謝異常疾患の症状の程度に応じて適宜決定すればよく、隔日で摂取しても、毎日摂取してもよく、１日１回乃至数回に分けて摂取してもよい。摂取量は、通常、２−アミノフェノール又はその誘導体としての一回の摂取量が、０．０５乃至１００ｍｇ／ｋｇ・体重、好ましくは０．５乃至５０ｍｇ／ｋｇ・体重、より好ましくは２．５乃至２５ｍｇ／ｋｇ・体重である。【００２２】
本発明の骨形成促進剤には、２−アミノフェノール又はその誘導体の作用効果を阻害しない範囲で、他の骨形成促進作用乃至骨破壊抑制作用を有する物質を適宜配合することができる。具体的には、例えば、ビスフォスフォネート化合物、カルシトニン製剤、活性型ビタミンＤ３製剤、エストラジオール含有のホルモン製剤、ＳＥＲＭ製剤、イソフラボン製剤、ビタミンＫ２、ミネラル（カルシウム、マグネシウムなど）製剤、トレハロース、ラクトスクロースなどの骨破壊を抑制、及び／又は、骨形成促進する作用を有する物質を例示することができ、なかでも、ビスフォスフォネート化合物、エストラジオール含有のホルモン製剤、ＳＥＲＭ製剤、イソフラボン製剤、カルシウム製剤などは、本発明の骨形成促進剤の骨形成促進作用を相乗的乃至相加的に高めるので特に好ましい。【００２３】
上記成分の他に通常食品、医薬部外品や医薬品等に用いられる各種任意の成分を必要に応じて適宜配合することができる。例えば、水、エタノール、グリセリン、保湿剤、油性成分、乳化剤、乳化安定剤、増粘剤、抗酸化剤、防腐剤、ｐＨ調整剤、香料、生理活性物質、薬効成分、動・植物エキス等が挙げられる。また、本発明で使用する２−アミノフェノール又はその誘導体は、疎水性が非常に強いので、溶液の形態で使用する場合には、予め、オイル、レシチン、ポリエチレングリコール、糖類等と混合した後、少量の或いは適量の水と混合して、乳化乃至懸濁液として使用すればよい。また、リポソームに封入したり、親−疎水性ポリマーと共にアセトンなどの有機溶媒に溶解した後、有機溶媒を除去して、水と混合し、該ポリマーに封入したミセルの形態としてもよい。【００２４】
本発明の骨形成促進剤の剤形は、経口摂取又は経胃・経腸投与に適した形態であればよく、例えば、液状、錠剤、トローチ、丸薬、水性懸濁液、油性懸濁液、分散性粉末又は顆粒、乳剤、ハードカプセル、ソフトカプセル、シロップ、エリキシルなどの形態が挙げられる。また、経口・経胃・経腸投与以外にも皮下、皮内、筋肉内などの局所投与、血管内や腹腔内などへの投与、又は、吸飲、噴霧等による経気道、経肺投与などの非経口投与によることもでき、これらに適した剤形とすることも随意である。また、その所定量を飲食品に添加した形態で摂取することもできる。非経口的投与の場合の投与量としては、骨代謝異常疾患の症状の程度に応じて適宜決定すればよく、隔日で投与しても、毎日投与してもよく、１日１回乃至数回に分けて投与してもよい。その場合の投与量は、通常、２−アミノフェノール又はその誘導体としての一回の投与量が、０．０００５乃至２０ｍｇ／ｋｇ・体重、好ましくは０．００５乃至５ｍｇ／ｋｇ・体重、より好ましくは０．０５乃至２．５ｍｇ／ｋｇ・体重である。【００２５】
また、本発明の骨形成促進剤は、所期の効果が得られる範囲で、骨代謝異常疾患に伴う痛みや炎症などを改善乃至抑制する目的で、本発明の骨形成促進剤の有効成分以外の薬剤と併用することができる。具体的には、例えば、アセトアミノフェン、フェナセチンなどの鎮痛剤、カフェインなどの鎮痛剤の鎮痛作用の増強剤、Ｈ２−アンタゴニスト、水酸化アルミニウム、水酸化マグネシウム、シメチコン、利尿薬、鎮痛性抗ヒスタミン薬、非鎮痛性抗ヒスタミン薬などが挙げられ、これらの１種又は２種以上と併用すればよい。【００２６】
本発明の骨形成促進剤は、例えば、関節リューマチ、リューマチ様脊椎炎、変形性関節炎、痛風性関節炎、歯肉炎、歯周病、骨粗鬆症などの骨破壊を伴う骨代謝異常疾患、とりわけ骨破壊に炎症性反応を伴う骨代謝異常疾患の予防剤、改善剤、治療剤として利用することができる。また、本発明の骨形成促進剤は、骨形成促進作用に加えて、抗炎症作用なども併せ持つので、炎症性疾患や鎮痛剤、解熱剤などの用途でも利用できる。さらに本発明の骨形成促進剤は、ＣＯＸ−２が過剰発現している各種の癌の治療剤として利用することもできる。【００２７】
本発明の骨形成促進剤は、製剤学上許容可能な基材や添加剤や賦形剤を含む投与単位調合物の形で投与される。また、ヒトの骨代謝異常疾患の治療又は予防のみならず、マウス、ラット、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ニワトリなどの家畜、家禽やペット等にも適用できる。【００２８】
以下、実験で本発明の詳細を説明する。【００２９】
＜実験１：２−アミノフェノキサジン−３−オンの合成＞
２−アミノフェノールを原料にして２−アミノフェノキサジン−３−オンを合成した。すなわち、５５０ｍｇ（５ｍｍｏｌ）の２−アミノフェノール（和光純薬工業株式会社販売）を５０ｍｌの蒸留水に懸濁し、それに０．１規定（Ｎ）の塩酸２２５ｍｌを加えた後、０．１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ７．０に調整した。この溶液に５００ｍｌの５ｍＭフェリシアン化カリウム水溶液を撹拌しながら５分間かけて滴下し、さらに２６℃で３０分間反応させた。反応液を減圧下で乾燥して得られた固形物を４５０ｍｌのメタノールに溶解し、遠心分離して未溶解の固形分を除去した後、再度減圧下で乾燥した。得られた固形物を２００ｍｌの酢酸エチルに溶解し、２００ｍｌの０．００５Ｎ塩酸水溶液を加え、撹拌した後、分液ロートで酢酸エチル層を回収した。この操作を３回繰り返した後、得られた酢酸エチル層を減圧下で液量が１５ｍｌになるまで濃縮し、これを常法にしたがい、シリカゲルクロマトグラフィーカラム（和光純薬工業株式会社販売、商品名『ワコーゲルＣ２００』）及び逆相Ｃ３０クロマトグラフィーカラム（野村化学株式会社販売、商品名『デベロシルＣ３０』、又は、東ソー株式会社販売、商品名『ＨＷ−４０Ｆ』）により精製し、乾燥して、粉末状の２−アミノフェノキサジン−３−オン２２０ｍｇを得た。【００３０】
＜実験２：マウス前骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に及ぼす影響＞
２４穴プレート（ベクトンデキンソン社販売）に、１０容量％のウシ胎児血清（ＪＲサイエンティフィック社販売、以下、ウシ胎児血清を「ＦＣＳ」と略記する。）を含むα−ＭＥＭ培地（ギブコ  インビトロジェン社販売）（以下、「１０容量％ＦＣＳ加α−ＭＥＭ培地」という。）に浮遊させたマウス前骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞（以下、「ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞」という。）を５．０×１０４細胞／２ｍｌ／ウエルで播種後、３７℃、５容量％ＣＯ２下で３日間培養した。セミコンフレント状態になった細胞の培養上清を除去後、被験物質として実験１で調製した粉末状の２−アミノフェノキサジン−３−オン又はその始発原料の２−アミノフェノールをエタノールに溶解して使用した。また陽性対照として、骨粗鬆症治療剤として使用され、且つ、骨へのカルシウム（Ｃａ）の沈着を促進する作用を有するビタミンＫ２を使用した。この被験物質又は陽性対照を、表１に示す濃度となるように添加した分化誘導培地（１０容量％ＦＣＳ加α−ＭＥＭ培地＋１０ｍＭ  β‐グリセロフォスフェート（シグマ社販売）＋１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ＤＯＪＩＮＤＯ  和光純薬工業株式会社販売））を２ｍｌ／ウエルで添加した。さらに、陰性対照として、溶媒として使用したエタノールを最終濃度が０．１質量％となるように添加した分化誘導培地を添加して培養した。骨芽細胞の分化前期の指標となるアルカリフォスファターゼ活性（ＡＬＰ）、骨芽細胞の分化後期の指標となるオステオカルシンの分泌量、骨芽細胞による骨形成の指標となるＣａ沈着量、及び、細胞の生存率を下記方法により、それぞれ測定した。なお、表１における「ＡＰ」は２−アミノフェノール、「ＱＡ」は２−アミノフェノキサジン−３−オン（クエスチオマイシンＡ）、「ＶＫ」はビタミンＫ２を意味する。また、培養は、３日又は４日に一度、全てのウエルについて同じ日に、最初に添加したものと同じ濃度の被験物質又は陽性対照を含む分化誘導培地、或いは、陰性対照の分化誘導培地による培地交換をおこないながら、酵素活性及びオステオカルシンの分泌量測定用の細胞は９日間、Ｃａ沈着量の測定用の細胞は２０日間培養した。試験は１サンプルにつき３ウエルで実施した。
＜ＡＬＰ活性の測定方法＞
培養開始９日目に、培養上清を除去後、各ウエルに付着した細胞を０．２５Ｍスクロースで３回洗浄後、市販のＡＬＰ活性測定キット（和光純薬工業株式会社販売、商品名「ラボアッセイＴＭＡＬＰ」）を使用して測定した。この培養上清を除去したウエルに、まず酵素反応緩衝液として、２５ｍＭのスクロースと１ｍＭのＭｇＣｌ２とを含有する５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．８）を０．９ｍｌ／ウエルで添加した。さらに、この反応緩衝液に、基質として２．５ｍＭ  ｐ−ニトロフェノールリン酸溶液を０．１ｍｌ／ウエルで添加し、２５℃で１０分間反応した。０．２ＮのＮａＯＨで２倍希釈（反応停止）後、遊離したｐ−ニトロフェノールを４０５ｎｍの吸光度で測定した。被験物質又は陽性対照を添加した場合の測定値を、陰性対照の測定値で除し、１００倍して、陰性対照の測定値を１００％とした相対値を求め、ＡＬＰ活性の上昇率（％）として表１に併せて示す。
＜オステオカルシンの測定方法＞
培養開始９日目に、細胞培養上清を回収し、市販のマウスオステオカルシン測定用のＥＩＡキット（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．社販売、ＭＡ．ＵＳＡ）を使用して測定した。被験物質又は陽性対照を添加した場合の測定値を、陰性対照の測定値で除し、１００倍して、陰性対照の測定値を１００％とした相対値を求め、オステオカルシンの分泌量の上昇率（％）として表１に併せて示す。
＜沈着Ｃａ量測定方法＞
培養開始２０日目に、培養上清を除去した各ウエルに、ダルベッコＰＢＳ（−）（日水製薬株式会社販売）を加えて、細胞を洗浄した。ダルベッコのＰＢＳ（−）を除去後、２Ｎの塩酸を０．５ｍｌ／ウエル加えて、細胞に沈着したカルシウムを溶解し、市販のカルシウム測定キット（和光純薬工業株式社販売、商品名「カルシウムＣテストワコー」）を使用して測定した。被験物質又は陽性対照を添加した場合の測定値を、陰性対照の測定値で除し、１００倍して、陰性対照の測定値を１００％とした相対値を求め、カルシウムの沈着量上昇率（％）として表１に併せて示す。
＜細胞の生存率＞
細胞を、常法によりアラマーブルー（ａｌａｍａｒＢｌｕｅ）色素（トレック  ダイアゴノスティック  システムズ社販売、商品名「アラマーブルーアッセイ」）で染色し、蛍光プレートリーダー（モレキュラー  デバイス社販売）により測定して、被験物質又は陽性対照を添加した場合の測定値を、陰性対照の測定値で除し、１００倍して、陰性対照の測定値を１００％とした相対値を求めて、細胞の生存率（％）として表１に併せて示す。【００３１】
【表１】
0005507445.tif 000008
【００３２】
表１から明らかなように、培地に２−アミノフェノール（ＡＰ）又は２−アミノフェノキサジン−３−オン（ＱＡ）を添加して培養したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のＡＬＰ活性及びカルシウム沈着量は、溶媒として使用したエタノールのみを添加して培養した場合（陰性対照）に比して、添加した濃度に依存して上昇した。オステオカルシンの分泌量は、培地に２−アミノフェノール（ＡＰ）又は２−アミノフェノキサジン−３−オン（ＱＡ）を１又は２μＭ添加した場合に、溶媒として使用したエタノールのみを添加して培養した場合（陰性対照）に比して、上昇した。また、陽性対照として使用したビタミンＫ２も、エタノールのみを培地に添加した場合（陰性対照）に比して、ＡＬＰ活性及びカルシウム沈着量が、添加した濃度に依存して上昇したものの、１０μＭの添加では、ＡＬＰ活性が逆に抑制された。また、オステオカルシンの分泌量は、ビタミンＫ２を１０μＭとなるように添加した場合に、陰性対照に比して、上昇が認められた。カルシウムの沈着量の上昇率で比較すると、２−アミノフェノキサジン−３−オンは、陽性対照として使用したビタミンＫ２よりも強いカルシウム沈着の増強作用を示した。これらの結果は、２−アミノフェノール及びその誘導体は、前骨芽細胞の骨芽細胞への分化を誘導して、該細胞におけるカルシウム沈着を促進する作用を有し、これらの物質が、慢性関節リューマチ、骨粗鬆症、歯周病等の骨代謝異常疾患やその予備軍に骨形成促進剤、或いは、カルシウム沈着促進剤として利用できることを物語っている。また、骨形成促進作用の強さの点では、２−アミノフェノール（ＡＰ）よりも２−アミノフェノキサジン−３−オン（ＱＡ）の方が優れていることを物語っている。さらに、本実験で使用した２−アミノフェノール及び２−アミノフェノキサジン−３−オンは、実験に使用した何れの濃度においても、細胞の生存率に影響を与えることはなかったことから、２−アミノフェノール及び２−アミノフェノキサジン−３−オンの細胞毒性は弱いと判断した。【００３３】
＜実験３：マウス前骨芽細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のカルシウム沈着に及ぼす２−アミノフェノキサジン−３−オンの誘導体の影響＞
実験２で、２−アミノフェノキサジン−３−オンが、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のカルシウム沈着を強く増強することが確認されたので、２−アミノフェノキサジン−３−オンの誘導体に同様の活性があることを確認する試験をおこなった。表２に示す５種類の２−アミノフェノキサジン−３−オンの誘導体を常法により合成し、被験物質として使用した。実験２で使用したものと同じ分化誘導培地に被験物質を各々最終濃度が２μＭとなるように溶解した。実験２と同様に２４穴プレートにＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を播種して、セミコンフレントの状態になった細胞に、被験物質を溶解した分化誘導培地のいずれかを、２ｍｌ／ウエルで添加した。３日又は４日に一度、全てのウエルについて同じ日に、最初に添加したものと同じ種類、濃度の被験物質を含む分化誘導培地による培地交換をおこないながら２０日間培養した。実験２と同じ方法で、培養開始２０日目の細胞のカルシウム沈着量を測定し、２−アミノフェノキサジン−３−オンの誘導体を添加した培地で培養した細胞のカルシウム沈着量を、２−アミノフェノキサジン−３−オンを添加した培地で培養した細胞のカルシウム沈着量で除し、１００倍して、２−アミノフェノキサジン−３−オン添加時のカルシウム沈着量を１００％とする相対値を求め、Ｃａ（カルシウム）沈着率（％）として表２に併せて示す。また、実験２と同じ方法で細胞生存率（％）を求めて表２に併せて示す。なお、細胞生存率（％）は、２−アミノフェノキサジン−３−オンを添加した培地で培養した細胞の生存率を１００％とした相対値で示した。また、試験は１サンプルにつき３ウエルで実施した。【００３４】
【表２】
0005507445.tif 000009
【００３５】
表２から明らかなように、試験に使用した５種類の２−アミノフェノキサジン−３−オンの誘導体は、何れも、２−アミノフェノキサジン−３−オンと同様に、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のカルシウム沈着を増強する作用を示した。このカルシウム沈着増強作用の強さの点からは、２−アミノフェノキサジン−３−オンが最も強く、２−アミノ−７−ヒドロキシ−フェノキサジン−３−オン、２−アミノ−３，４−ジメトキシ−６，７−ジメトキシカルボニル−フェノキサジン−３−オン及び２−アミノ−１０−（Ｎ−４′−アミノブチル）−フェノキサジン−３−オンがそれに次ぐ強さを示した。【００３６】
＜実験４：マクロファージからのＮＯ、ＰＧＥ２産生抑制活性＞
骨量減少の原因となる骨破壊の進行には、ＮＯや炎症性のサイトカインなどが関与していることが知られている。そこでマウスマクロファージ細胞株を用いて、マクロファージからのＮＯ、ＰＧＥ２産生に及ぼす２−アミノフェノール誘導体の影響を調べる試験を以下のようにおこなった。すなわち、マウスマクロファージ細胞株ＲＡＷ−２６４．７を、細胞濃度１×１０６細胞／ｍｌになるように、１０容量％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地（シグマ  アルドリッチ社販売）に浮遊させて、細胞浮遊液を調製した。これを９６穴マイクロプレートに５０μｌ／ウエル添加し、表３に示す濃度となるように被験物質の２−アミノフェノキサジン−３−オンを添加し、さらに、ＮＯ及びＰＧＥ２産生の誘導剤としてリポ多糖を２μｇ／ｍｌ及びＩＦＮ−γを１０ＩＵ／ｍｌとなるように添加し、１０容量％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４０培地を加えて液量を２００μｌとした。これを、３７℃で２日間培養した後、培養上清を常法のＧｒｉｅｓｓ法に供してＮＯ量を、また、市販の抗ＰＧＥ２抗体による測定キット（アマシャムバイオサイエンス社販売、商品名「ＰＧＥ２ＥＩＡキット」）に供してＰＧＥ２量を測定した。陽性対照として、ＣＯＸ阻害剤であるインドメタシン（和光純薬工業株式会社販売）、アスピリン（和光純薬工業株式会社販売）、ＣＯＸ−２選択的阻害剤であるＮＳ−３９８（和光純薬工業株式会社販売）を用意し、上記と同様にして実験をおこなった。また陰性対照（表３の濃度０μＭ）として、上記被験物質又は陽性対照を添加しない系を設けた。結果を表３に示す。なお、表３における「ＱＡ」は２−アミノフェノキサジン−３−オン（クエスチオマイシンＡ）、「ＮＳ」はＮＳ−３９８、「ＩＮ」はインドメタシン、「ＡＳ」はアスピリンを意味し、被験物質又は陽性対照を加えたときのＮＯ産生量（％）、ＰＧＥ２産生量（％）、マクロファージの増殖（％）は、被験物質又は陽性対照添加時の各々の測定値を陰性対照の測定値で除し、１００倍して、陰性対照の測定値を１００％とした相対値で示した。【００３７】
【表３】
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【００３８】
表３から明らかなように、２−アミノフェノキサジン−３−オン（表３における「ＱＡ」）は、マクロファージの増殖を低下させることなく、ＮＯの産生及びＰＧＥ２の産生を抑制した。また、本実験で得られた各細胞抽出液に含まれるｉＮＯＳの量を、抗ｉＮＯＳ抗体を用いるウエスタンブロッティング解析により調べたところ、濃度依存的に２−アミノフェノキサジン−３−オンによりｉＮＯＳ量が減少した。よって、２−アミノフェノキサジン−３−オンによるＮＯの産生阻害活性は、ｉＮＯＳの量を減少させることによって発揮されるものと考えられた。この結果は、２−アミノフェノール又はその誘導体を経口的又は非経口的に患者に投与した場合、ＮＯ及びＰＧＥ２の産生を抑制することにより、骨破壊を抑制できることを示している。【００３９】
＜実験５：ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２阻害活性＞
上記実験４の結果を検証するために、ＰＧＥ２の合成系に必須の酵素であるＣＯＸの酵素活性が阻害されるかどうか調べた。『ＣＯＸインヒビタースクリーニングアッセイキット』（ケイマン社販売）により、ＣＯＸ−１又はＣＯＸ−２、及び、基質としてのアラキドン酸が存在する反応系に、試験試料として２−アミノフェノキサジン−３−オン又は２−アミノフェノールを表４に示す濃度となるように添加し、抗ＰＧＥ２抗体を用いたＥＩＡにより、生成したＰＧＥ２の量を測定し、ＣＯＸの活性量とした。なお、対照として試験試料を添加しない系を設け、２−アミノフェノキサジン−３−オン又は２−アミノフェノールを添加したときの活性量を、対照の活性量で除し、対照の測定値を１００％とした相対値を求めて、ＣＯＸ−１又はＣＯＸ−２の残存活性率として表４に併せて示す。また試験試料の各濃度での残存活性率をグラフにプロットし、ＣＯＸ−１又はＣＯＸ−２の活性を５０％阻害するときの２−アミノフェノキサジン−３−オン又は２−アミノフェノールの濃度（ＩＣ５０）を算出した。結果を表４に示す。【００４０】
【表４】
0005507445.tif 000011
【００４１】
表４から明らかなように、２−アミノフェノール及び２−アミノフェノキサジン−３−オンは、ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２の活性を阻害した。その効果はＩＣ５０値で比較すると、モル比で４乃至６倍（≒２８÷６．４４乃至４．８３）、質量比で２乃至３倍程度、２−アミノフェノールよりも２−アミノフェノキサジン−３−オンの方が優れていた。また、ＣＯＸ−１／ＣＯＸ−２比は、ＩＣ５０値から計算すると２−アミノフェノールが約１（≒２８．０÷２７．７）、２−アミノフェノキサジン−３−オンが約１．３（≒６．４４÷４．８３）であり、アスピリン（ＣＯＸ−１／ＣＯＸ−２比＝０．２４）やインドメタシン（ＣＯＸ−１／ＣＯＸ−２比＝０．０３）などの非ステロイド系のＣＯＸ阻害剤よりもＣＯＸ−２に対する選択性が高く、ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２活性に対するＩＣ５０値はほぼ同じとなった。この結果は、２−アミノフェノール又は２−アミノフェノキサジン−３−オンを経口又は非経口的に患者に投与した場合、ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２の活性の両方を阻害することにより、骨破壊を促進する作用を有するＰＧＥ２の産生を抑制して、骨破壊を抑制できることを示している。【００４２】
＜実験６：マウス骨髄細胞とＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の共培養によるマウスマクロファージの破骨細胞への分化に及ぼす影響＞
実験４及び５により、２−アミノフェノール及びその誘導体に、マクロファージの破骨細胞への分化を抑制し骨破壊を抑制する作用があることが示された。そこで、破骨細胞形成の主要な経路として知られている、マクロファージ−コロニー刺激因子（以下、「Ｍ−ＣＳＦ」という場合がある。）の共存下におけるＲＡＮＫＬリガンド刺激により骨髄細胞が破骨細胞に分化する系に及ぼす、２−アミノフェノキサジン−３−オンの影響を調べる試験を、ＲＡＮＫＬリガンドとしてこれを発現しているＣ５７ＢＬ／６マウス由来の骨芽前駆細胞株ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を使用して、以下のようにおこなった。すなわち、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雌、７週齢、日本チャールスリバー社販売）の大腿骨より、常法により骨髄細胞を採集して、α−ＭＥＭ培地にて２回洗浄後、１０容量％ＦＣＳ加α−ＭＥＭ培地に浮遊させて、４×１０６細胞／ｍｌの濃度に調製した。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は、予め５０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ（以下、「ＭＭＣ」と略記する場合がある。）溶液に浮遊させて、３７℃のウオーターバスで３０分間保持した後、α−ＭＥＭ培地にて３回洗浄して、１０容量％ＦＣＳ加α−ＭＥＭ培地に浮遊させて、４×１０５細胞／ｍｌの濃度に調製した。４８ウエルプレート（ベクトンデキンソン社販売、商品名「マルチウエルＴＭ４８ウエル」）に、この骨髄細胞の浮遊液を１００μｌ／ウエルと、ＭＭＣ処理したＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の浮遊液を５０μｌ／ウエルで加え、組換型ヒトＭ−ＣＳＦ（１２０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ社販売）を５０μｌ／ウエル添加した。さらに、このウエルに表５に示す濃度となるように、１０容量％ＦＣＳ加α−ＭＥＭ培地に溶解した被験物質の２−アミノフェノキサジン−３−オンを５０μｌ／ウエルで加えて、３７℃で培養を開始した。陰性対照としてＭ−ＣＳＦのみを添加した培地で９日間培養した。培養開始９日後に、培養上清を全量除去し、破骨細胞を選択的に染色するＴＲＡＰ（Ｔａｒｔａｒａｔｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）染色キット（シグマ  アルドリッチ社販売、商品名「Ａｃｉｄ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｋｉｔ」）を用いて、各ウエルの細胞を染色し、顕微鏡下で、染色されたＴＲＡＰ陽性細胞数を計測した結果を表５に併せて示す。さらに、培養開始３日目に培養上清の一部をサンプリングして、上清中のＩＬ−６産生量を酵素抗体法（ＥＩＡ）により測定して表５に併せて示す。また、陽性対照として、骨粗鬆症治療剤として使用されているアレンドネート（Ａｌｅｎｄｒｏｎａｔｅ、ＬＫＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社販売）又は塩酸ラロキシフェン（Ｒａｌｏｘｉｆｅｎｅ、ＬＫＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社販売）を、アミノフェノキサジン−３−オンに替えて添加し、同様に培養して試験をおこなった結果を表５に併せて示す。なお、培養は、３日又は４日に一度、全てのウエルについて同じ日に、最初に添加したものと同じ濃度のＭ−ＣＳＦと、被験物質又は陽性対照とを含む培地、或いは、Ｍ−ＣＳＦを含む陰性対照の培地による培地交換をおこないながら９日間培養した。試験は１サンプルあたり３ウエルで実施した。【００４３】
【表５】
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【００４４】
表５から明らかなように、マウス骨髄細胞は、Ｍ−ＣＳＦとＲＡＮＫＬリガンドを発現しているＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のみの共存下（２−アミノフェノキサジン−３−オンの濃度０μＭ参照）で、ＴＲＡＰ陽性細胞へ分化した。これに対して、Ｍ−ＣＳＦとＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の共存下に、２−アミノフェノキサジン−３−オンを加えて培養した場合には、陽性対照として添加したアレンドネート又は塩酸ラロキシフェンの場合と同様に、Ｍ−ＣＳＦとＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のみの共存下で培養した場合に比して、その濃度に依存したＴＲＡＰ陽性細胞数の増加の抑制が認められた。また、マウス骨髄細胞は、Ｍ−ＣＳＦとＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞とのみの共存下（２−アミノフェノキサジン−３−オンの濃度０μＭ）では、ＩＬ−６を産生したのに対して、２−アミノフェノキサジン−３−オンを添加した場合には、その産生の抑制が認められた。この結果は、２−アミノフェノキサジン−３−オンは、陽性対照として使用したアレンドネート又は塩酸ラロキシフェンと同様に、骨髄細胞の破骨細胞への分化を抑制できるので、慢性関節リューマチ、骨粗鬆症、歯周病等の骨代謝異常疾患やその予備群における骨破壊を抑制できることを物語っている。また、２−アミノフェノキサジン−３−オンによるこの抑制効果は、骨粗鬆症治療剤のアレンドネートより強いことを物語っている。【００４５】＜実験７：マウス脾臓マクロファージのＭ−ＣＳＦ及び可溶性ＲＡＮＫＬ共存下での破骨細胞への分化に及ぼす影響＞
実験６においてＲＡＮＫＬリガンドを発現しているＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞との共培養により、骨髄細胞から破骨細胞を誘導できることが確認されたので、マウス脾臓マクロファージを使用してＭ−ＣＳＦの共存下における可溶性のＲＡＮＫＬ（以下、可溶性のＲＡＮＫＬを「ｓＲＡＮＫＬ」と略記する。）による、マクロファージの破骨細胞への分化に及ぼす２−アミノフェノキサジン−３−オンの影響を調べる試験を以下のようにおこなった。すなわち、ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、７週齢、日本チャールスリバー社販売）より、常法により脾臓細胞を採集し、α−ＭＥＭ培地（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社販売）にて２回洗浄後、４８ウエルプレート（ベクトンデキンソン社販売、商品名「マルチウエルＴＭ４８ウエル」）に、１０容量％ＦＣＳ加α−ＭＥＭ培地に浮遊させて、８×１０４細胞／ウエルとなるように播種した。５容量％ＣＯ２、３７℃で２時間インキュベーションして、プレートに付着させたマクロファージを、α−ＭＥＭ培地にて２回洗浄後、新鮮な１０容量％ＦＣＳ加α−ＭＥＭ培地を２００μｌ／ウエルと、１０容量％ＦＣＳ加α−ＭＥＭ培地に溶解したヒト組換型Ｍ−ＣＳＦ（６０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ社販売）を１００μｌ／ウエルとを添加して、５容量％ＣＯ２、３７℃で５日間培養した。各ウエルの培養上清を完全に吸引除去して、２０ｎｇ／ｍｌの組換型ヒトＭ−ＣＳＦと、２．５ｎＭのｓＲＡＮＫＬ（オリエンタル酵母株式会社販売）を含む破骨細胞の分化誘導用の１０容量％ＦＣＳ加α−ＭＥＭ培地を３００μｌ／ウエルで添加した。さらに、この分化誘導用の培地には、表６に示す濃度となるように被験物質のアミノフェノキサジン−３−オンを加えて、培養を継続した。培養開始１４日後に、培養上清を全量除去後、実験５と同様に、破骨細胞を選択的に染色するＴＲＡＰ染色キットを用いて、各ウエルの細胞を染色し、顕微鏡下で、染色されたＴＲＡＰ陽性細胞数を計測した。結果を表６に併せて示す。陰性対照として、Ｍ−ＣＳＦのみを添加した培地及びＭ−ＣＳＦとｓＲＡＮＫＬとを添加した培地で同様に骨髄細胞を培養した。また、陽性対照として、骨粗鬆症治療剤として使用されているリセドロネート（Ｒｉｓｅｄｒｏｎａｔｅ、ＬＫＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社販売）を、アミノフェノキサジン−３−オンに替えて添加し、同様に培養をおこなった。なお、培養は、３日又は４日に一度、全てのウエルについて同じ日に、最初に添加したものと同じ濃度の被験物質又は陽性対照を含む培地、或いは、陰性対照の培地による培地交換をおこないながら１４日間培養した。試験は１サンプルにつき３ウエルで実施した。【００４６】
【表６】
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【００４７】
表６から明らかなように、マウスマクロファージは、Ｍ−ＣＳＦのみの共存下では、ＴＲＡＰ陽性細胞への分化は認められず、Ｍ−ＣＳＦとｓＲＡＮＫＬとを共存（２−アミノフェノキサジン−３−オンの濃度０μＭ参照）させると、ＴＲＡＰ陽性細胞へ分化した。これに対して、Ｍ−ＣＳＦとｓＲＡＮＫＬと共に、２−アミノフェノキサジン−３−オンを添加した場合には、陽性対照として使用したリセドロネートを添加して培養した場合と同様に、Ｍ−ＣＳＦとｓＲＡＮＫＬとの共存下で培養した場合に比して、その濃度に依存したＴＲＡＰ陽性細胞数の増加の抑制が認められた。この結果は、２−アミノフェノキサジン−３−オンは、骨粗鬆症治療剤として使用されているリセドロネートと同様に、生理的なリガンドのｓＲＡＮＫＬの共存下で誘導される、マクロファージの破骨細胞への分化を抑制できるので、骨芽細胞などが活性化されてＲＡＮＫＬの発現が過剰となった場合でも、慢性関節リューマチ、骨粗鬆症、歯周病等の骨代謝異常疾患における骨破壊を阻止できることを物語っている。また、２−アミノフェノキサジン−３−オンによるこの抑制効果は、市販の骨粗鬆症治療剤のリセドロネートよりも強いことを物語っている。【００４８】
＜実験８：ＴＮＦ−α又はＩＬ−１による骨芽細胞活性化に及ぼす影響＞
慢性関節リューマチや歯周病は、通常、炎症を伴っているので、その炎症部位では、活性化した滑膜細胞やＴ細胞から産生される炎症性サイトカイン（ＩＬ−１、ＴＮＦ−α）が分泌されて、骨芽細胞が活性化され、破骨細胞への分化に必須の生理的因子であるＲＡＮＫＬの発現が亢進すると共に、ＩＬ−６やＮＯの産生が亢進されている。この産生誘導されたＮＯは、軟骨細胞のアポトーシスを亢進したり、軟骨基質合成を低下させるので、炎症部位では軟骨の破壊が促進される。またＮＯにより単球／マクロファージが活性化され、破骨細胞へと分化が誘導され骨破壊（骨吸収）が進行する。さらにＴＮＦ−α自身による破骨前駆細胞から破骨細胞への直接の分化誘導の経路も存在する。このように、慢性関節リューマチでは、幾つかの経路が重なり合って骨破壊という病態が形成されるものと考えられている。そこで、ＴＮＦ−α又はＩＬ−１による骨芽細胞の活性化に及ぼす２−アミノフェノキサジン−３−オンの影響を調べる試験を、骨芽細胞として、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を使用して以下のようにおこなった。すなわち、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を、１０容量％ＦＣＳ加α−ＭＥＭ培地にて５×１０５細胞／ｍｌの濃度に調製したものを９６穴マイクロプレート（ベクトンデキンソン社販売、商品名「マイクロテストＴＭ９６」）に５０μｌ／ウエルで添加した。次に表７又は８に示す濃度となるように、同培地で希釈した２−アミノフェノキサジン−３−オンを５０μｌ／ウエル添加した。さらに、同培地に溶解した組換型ヒトＴＮＦ−α又は組換型ヒトＩＬ−１βを１００μｌ／ウエル（各々の終濃度２０ｎｇ／ｍｌ）添加して、５容量％ＣＯ２、３７℃で３日間培養した。陰性対照として培地のみ、或いは、ＩＬ−１β又はＴＮＦ−αのみを添加した培地を使用した。陽性対照として表７又は８に示す濃度のリセドロネートを、２−アミノフェノキサジン−３−オンに替えて添加して同様に培養をおこなった。培養後、上清中のＮＯ産生量をＧｒｉｅｓｓ試薬にて、ＩＬ−６産生量を特異的ＥＩＡにて測定した。細胞の増殖は、アラマーブルー原液を同培地にて４倍希釈したものを、１００μｌ／ウエル添加して、５容量％ＣＯ２、３７℃で２〜３時間インキュベーションした後、５４４／５９０ｎｍの吸光度を測定した。試験は１サンプルにつき３ウエルで実施した。組換型ヒトＩＬ−１β共存下でのＮＯ産生量及びＩＬ−６産生量の測定結果を表７に、組換型ヒトＴＮＦ−α共存下での測定結果を表８に併せて示す。【００４９】
【表７】
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【００５０】
【表８】
0005507445.tif 000015
【００５１】
表７及び８から明らかなように、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は、組換型ヒトＩＬ−１β又は組換型ヒトＴＮＦ−αのみの共在下（２−アミノフェノキサジン−３−オンの濃度０μＭ参照）で、ＮＯ及びＩＬ−６の産生が認められた。組換型ヒトＩＬ−１βと共に２−アミノフェノキサジン−３−オンを添加して培養した場合には、組換型ヒトＩＬ−１βのみを添加して培養した場合に比して、ＮＯ及びＩＬ−６の産生が強く抑制された。また、組換型ヒトＴＮＦ−αと共に２−アミノフェノキサジン−３−オンを添加して培養した場合には、組換型ヒトＴＮＦ−αのみを添加して培養した場合に比して、ＩＬ−６の産生が強く抑制された。陽性対照として使用したリセドロネートは、２μＭの添加の場合に、組換型ヒトＩＬ−１βとの共存下で誘導されるＮＯの産生を抑制したものの、抑制の程度は、２−アミノフェノキサジン−３−オンよりも弱かった。この結果は、２−アミノフェノキサジン−３−オンが、ＩＬ−１βにより、骨芽細胞が活性化されて産生するＮＯやＩＬ−６の産生や、ＴＮＦ−αによって誘導されるＩＬ−６の産生を効果的に抑制することにより、マクロファージから破骨細胞への分化誘導を抑制できることを物語っている。また、２−アミノフェノキサジン−３−オンによるこの抑制効果は、市販の骨粗鬆症治療剤のリセドロネートよりも強いことを物語っている。さらに、具体的なデータは示さないが、本実験で使用した２−アミノフェノキサジン−３−オンは、何れの濃度においても、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の生存率に影響を与えることはなかったことから、２−アミノフェノキサジン−３−オンの細胞毒性は弱いと判断した。【００５２】
＜実験９：マウス脾臓マクロファージのＭ−ＣＳＦ及びＴＮＦ−α共存下における破骨細胞への分化に及ぼす影響＞
マクロファージから破骨細胞への分化誘導は、骨芽細胞による経路のみではなく、特に慢性関節リューマチや歯周病のような疾患では慢性的に産生されたＴＮＦ−αやＩＬ−１が、Ｍ−ＣＳＦの共存下で直接マクロファージに作用して破骨細胞へと分化を誘導する経路もあることが明らかとなっている。そこで、ＴＮＦ−α及びＭ−ＣＳＦ共存下におけるマクロファージからの破骨細胞への分化誘導に及ぼす２−アミノフェノキサジン−３−オンの影響を調べる試験を以下のようにおこなった。すなわち、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雌、７週齢、日本チャールスリバー社販売）より、常法により脾臓細胞を採集し、α−ＭＥＭ培地にて２回洗浄後、１０％ＦＣＳ加α−ＭＥＭ培地に浮遊させ、４８ウエルプレート（ベクトンデキンソン社販売、商品名「マルチウエルＴＭ４８ウエル」）に、６×１０４細胞／ウエルとなるように播種した。５容量％ＣＯ２、３７℃で２時間インキュベーションして、プレートに付着させたマウス脾臓マクロファージを、α−ＭＥＭ培地にて２回洗浄後、新鮮な１０容量％ＦＣＳ加α−ＭＥＭ培地を２００μｌ／ウエルと、組換型ヒトＭ−ＣＳＦ（６０ｎｇ／ｍｌ、Ｐｅｐｒｏ  Ｔｅｃｈ社販売）を１００μｌ／ウエルとを添加した後、３７℃で５日間培養した。各ウエルの培養上清を完全に吸引除去して、２０ｎｇ／ｍｌのヒト組換型Ｍ−ＣＳＦと、２０ｎｇ／ｍｌの組換型ヒトＴＮＦ−αを含む１０容量％ＦＣＳ加α−ＭＥＭ培地を２００μｌ／ウエルで添加した。さらに、この培地中に、表９に示す濃度となるように被験物質として２−アミノフェノキサジン−３−オンを加えて、培養を１４日間継続した。陰性対照としてＭ−ＣＳＦとＴＮＦ−αを添加した培地で培養を１４日間継続した。培養上清を除去後、実験６と同様に、破骨細胞を選択的に染色するＴＲＡＰ染色キットを用いて、各ウエルの細胞を染色し、顕微鏡下で、染色されたＴＲＡＰ陽性細胞数を計測した結果を表９に併せて示す。陽性対照として、リセドロネートをアミノフェノキサジン−３−オンに替えて添加し、同様に培養をおこなった。なお、培養は、３日又は４日に一度、全てのウエルについて同じ日に、最初に添加したものと同じ濃度の被験物質又は陽性対照を含む培地、或いは、陰性対照の培地による培地交換をおこないながら１４日間培養した。試験は１サンプルにつき３ウエルで実施した。【００５３】
【表９】
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【００５４】
表９から明らかなように、マウス脾臓マクロファージは、Ｍ−ＣＳＦとＴＮＦ−αとの共存下（２−アミノフェノキサジン−３−オンの濃度０μＭ参照）で、ＴＲＡＰ陽性細胞へ分化した。これに対して、Ｍ−ＣＳＦとＴＮＦ−αと共に、２−アミノフェノキサジン−３−オンを添加した場合には、陽性対照として使用したリセドロネートを添加して培養した場合と同様に、Ｍ−ＣＳＦとＴＮＦ−αとのみの共存下で培養した場合に比して、その濃度に依存したＴＲＡＰ陽性細胞数の増加の抑制が認められた。この結果は、２−アミノフェノキサジン−３−オンは、陽性対照として使用したリセドロネートと同様に、ＴＮＦ−αなどの炎症性サイトカインにより誘導されるマクロファージの破骨細胞への分化を抑制できることを物語っている。なお、具体的なデータは示さないが、マクロファージ細胞株のＲＡＷ−２６４．７細胞を組換型ヒトＴＮＦ−αで刺激して、破骨細胞に分化誘導させる系においても、２−アミノフェノキサジン−３−オンは、リセドロネートと同様に、その濃度に依存したＴＲＡＰ陽性細胞数の増加の抑制が認められた。【００５５】＜実験１０：骨粗鬆症モデルマウスに及ぼす影響＞
実験２乃至９において、２−アミノフェノール又はその誘導体が、骨形成の促進作用と骨破壊の抑制作用を併せ持つことが確認されたので、２−アミノフェノールの誘導体の及ぼす骨粗鬆症への影響を調べる試験を、骨粗鬆症モデルマウスを使用して以下のようにおこなった。すなわち、被験物質として１Ｎの塩酸１．５質量％とカルボキシメチルセルロース０．５質量％を含む水溶液に溶解した２−アミノフェノキサジン−３−オンを使用した。４０匹のｄｄｙマウス（８週齢、雌、日本チャールスリバー株式会社販売）を、ランダムに４群各１０匹に分けて、３群各１０匹の卵巣を摘出した。残りの１群１０匹は、対照１として、卵巣を摘出することなく開腹のみを実施した。卵巣を摘出した翌日から、２群各１０匹には２−アミノフェノキサジン−３−オンを、３ｍｇ／ｋｇ・体重又は１０ｍｇ／ｋｇ・体重のいずれかの量で、胃ゾンデを使用して、５回／週投与して、４週間飼育した。卵巣を摘出した残りの１群１０匹（対照２）及び対照１の１群１０匹には、１Ｎの塩酸１．５％とカルボキシメチルセルロース０．５質量％を含む水溶液を、各々、胃ゾンデを使用して、５回／週投与して、４週間飼育した。卵巣摘出手術２９日後に、エーテル麻酔下で、腹大静脈から全採血した後、マウスを解剖して、右大腿骨を摘出した。この大腿骨を、７０容量％エタノールに一晩浸漬後、付着した筋肉などの組織を除去し、１１０℃のオーブンで一晩乾燥した。乾燥後の大腿骨をるつぼに入れ、９５０℃のオーブンで６時間加熱して灰化して、その質量を測定した。さらに、各マウスの大腿骨の骨灰分中のカルシウム（Ｃａ）、マグネシウム（Ｍｇ）、リン（Ｐ）量を、ＩＣＰ発光分析法（株式会社リガク販売、商品名「ＩＣＰ−ＡＥＳ  ＣＩＲＯＳ１２０」）により測定した。その結果を表１０に示す。また、採血した血液から血清を分離して、実験２と同じ方法で、血清中のオステオカルシン量を測定した結果を表１０に併せて示す。なお、マウスへの被験物質又は対照の投与は、全てのマウスに対して同じ日におこなった。【００５６】
【表１０】
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【００５７】
表１０から明らかなように、卵巣を摘出していない開腹のみのマウス（対照１）に比べて、卵巣を摘出後、１Ｎの塩酸１．５質量％とカルボキシメチルセルロース０．５質量％を含む水溶液を４週間胃ゾンデで投与したマウス（対照２）では、大腿骨の骨灰化質量、Ｃａ、Ｍｇ及びＰの含有量が何れも減少した。これに対して、卵巣を摘出後、２−アミノフェノキサジン−３−オンを、胃ゾンデで３ｍｇ／ｋｇ・体重又は１０ｍｇ／ｋｇ・体重投与したマウスでは、卵巣を摘出後、１Ｎの塩酸１．５％とカルボキシメチルセルロース０．５質量％を含む水溶液を４週間胃ゾンデで投与したマウス（対照２）に比して、投与量に依存して、大腿骨の骨灰化質量、Ｃａ、Ｍｇ及びＰの含有量の減少が何れも抑制された。また、血清中のオステオカルシン量は、卵巣を摘出しない開腹のみのマウス（対照１）に比べて、卵巣を摘出後、１Ｎの塩酸１．５質量％とカルボキシメチルセルロース０．５質量％を含む水溶液を４週間経胃ゾンデで投与したマウス（対照２）で、その濃度が低下した。これに対して、卵巣を摘出後、２−アミノフェノキサジン−３−オンを、胃ゾンデで３ｍｇ／ｋｇ・体重又は１０ｍｇ／ｋｇ・体重投与したマウスでは、卵巣を摘出後１Ｎの塩酸１．５質量％とカルボキシメチルセルロース０．５質量％を含む水溶液を４週間胃ゾンデで投与したマウス（対照２）よりも、投与量に依存して、さらにその濃度が低下した。この結果は、２−アミノフェノキサジン−３−オンが、骨形成促進剤として骨粗鬆症などの骨代謝異常疾患の改善に優れた効果を発揮できることを物語っている。また、血清中のオステオカルシン量が、２−アミノフェノキサジン−３−オンの投与量に依存して減少することは、骨粗鬆症のエストロジェンによる治療の場合と同様に、オステオカルシンがカルシウムと結合して効率よく細胞に取り込まれて、骨形成が促進されていることを物語っている。なお、試験期間中、マウスの体重を計測したところ、試験期間を通じて、体重の増減に、４群間で差は認められず、２−アミノフェノキサジン−３−オンは経口摂取しても毒性の低い、安全な化合物であると判断した。【００５８】＜実験１１：コラーゲン産生に及ぼす影響＞
骨形成には、骨や軟骨の基質としてコラーゲンが重要な役割を担っている。そこで、コラーゲン産生に及ぼす２−アミノフェノールの誘導体の影響を調べる試験を、２−アミノフェノールの誘導体として２−アミノフェノキサジン−３−オンを使用して、以下のようにおこなった。すなわち、１０容量％ＦＣＳ加ダルベッコのＭＥＭ培地（日本水産株式会社販売、以下、ダルベッコのＭＥＭ培地を「Ｄ−ＭＥＭ」と略記する。）にヒト胎児由来正常繊維芽細胞（倉敷紡績株式会社販売、細胞名「ＮＨＤＦ」）を５．０×１０５細胞／ｍｌとなるように浮遊させ、９６穴マイクロプレート（ベクトンデキンソン社販売）に、５０μｌ／ウエル添加して、３７℃、５容量％ＣＯ２下で１日間培養した。この各ウエルの培養上清を除去し、１００μＭのアスコルビン酸２−グルコシド（株式会社林原生物化学研究所販売、商品名「ＡＡ２Ｇ」）を含む１０容量％ＦＣＳ加Ｄ−ＭＥＭを１００μｌ／ウエルで添加した。さらに、被験物質として実験１で調製した２−アミノフェノキサジン−３−オンを４ｍＭとなるようにＤＭＳＯに溶解した溶液を、１０容量％ＦＣＳ加Ｄ−ＭＥＭで希釈して、１００μｌ／ウエル添加して、各ウエルの最終濃度が表１１に示す濃度となるように調整した。３７℃、５容量％ＣＯ２下で３日間培養後、同じ組成の培地に交換して、さらに、３日間培養を継続した。この各ウエルのＮＨＤＦ細胞中のコラーゲン量を測定するために、培養上清を除去後、ペプシン（シグマ社販売）の１ｍＭ酢酸溶液（ペプシン濃度１ｍｇ／ｍｌ）を、５０μｌ／ウエル添加し、室温で４時間振とうして、ペプシン消化物を得た。この消化物をピペッティングして、１．５ｍｌ容の遠心用チューブに回収し、市販のコラーゲン定量キット（Ｂｉｏｃｏｌｏｒ社販売、商品名「Ｓｉｒｃｏｌ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ」）の発色用試薬を２００μｌ／チューブ添加して、室温で３０分間、転倒混和した。混和後、遠心用チューブを、そのまま、４℃で１０分間遠心後（１５０００ｒｐｍ）、上清を除去し、１ＮのＮａＯＨを５０μｌ添加して沈殿を溶解して、５６０／６５０ｎｍの吸光度を測定した。標準品として既知量のコラーゲンを適宜希釈して、同様にペプシン消化し、同様に発色用試薬を加えて処理して、その吸光度を測定して標準曲線を作成した。この標準曲線に基づき、ＮＨＤＦ細胞中のコラーゲン量を計算した結果を表１１に併せて示す。【００５９】
【表１１】
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【００６０】
表１１から明らかなように、２−アミノフェノキサジン−３−オンは、アスコルビン酸存在下でのコラーゲン産生を、濃度依存的に増強した。この結果は、２−アミノフェノール及びその誘導体は、骨や軟骨を構成するコラーゲンの産生を、アスコルビン酸の存在下で増強する作用を有する点からも、骨形成促進剤として優れていることを物語っている。なお、この実験で使用した濃度では、２−アミノフェノキサジン−３−オンのＮＨＤＦ細胞に対す細胞毒性は認められなかった。【００６１】
以上の実験結果は、２−アミノフェノールやその誘導体が、骨芽細胞を活性化して骨形成を促進すると共に、破骨細胞による骨吸収を抑制する作用を併せ持っているので、効果的に、骨代謝異常疾患やその予備軍の骨量の減少を抑制乃至骨量を増加させることができることを物語っている。また、２−アミノフェノールやその誘導体のもつ破骨細胞による骨吸収抑制は、ＲＡＮＫＬリガンドなどにより誘導されるマクロファージの破骨細胞への分化の抑制や、その分化を誘導する炎症性サイトカインの産生を抑制して、マクロファージの破骨細胞への分化を抑制する作用によることを物語っている。さらに、２−アミノフェノールやその誘導体は、細胞毒性も弱いことから、骨形成促進剤、骨代謝改善剤、カルシウムの沈着促進剤、或いは、骨代謝異常疾患治療剤として有用であることを物語っている。【００６２】
以下、実施例で本発明の実施の形態を具体的に説明するが、本発明の技術範囲は、この実施例により、何ら限定的に解釈されるべきものではない。
【実施例１】
【００６３】
＜骨形成促進剤＞
無水結晶α−マルトース粉末（商品名『ファイントース』、株式会社林原商事販売）７５質量部に対して、実験１に記載の方法で合成した２−アミノフェノキサジン−３−オン、又は、その合成原料として使用した２−アミノフェノールを２５質量部の割合で添加して均一に混合して、粉末状の骨形成促進剤を調製した。本品は、そのままで、打錠して、カプセルに封入して、或いは、清涼飲料等に添加して利用することができる。本品は、骨形成促進剤として、骨粗鬆症、慢性関節リューマチ、リューマチ様脊椎炎、骨ページェット病、変形性関節炎、痛風性関節炎、歯肉炎、歯周病をはじめとする骨代謝異常疾患やその予備軍の骨量の減少の抑制乃至骨量の増加促進に適している。
【実施例２】
【００６４】
＜骨形成促進剤＞
実施例１で使用した２−アミノフェノキサジン−３−オン２５質量部に替えて、実験３で合成した２−アミノフェノキサジン−３−オンの誘導体の２−アミノ−７−ヒドロキシ−フェノキサジン−３−オン、２−アミノ−７−メトキシ−フェノキサジン−３−オン、２−アミノ−３，４ジメトキシ−６，７−ジメトキシカルボニル−フェノキサジン−３−オン、２−（Ｎ−ヒドロキシ）アセチルアミノ−フェノキサジン−３−オン、又は、２−アミノ−１０−（Ｎ−４′−アミノブチル）−フェノキサジン−３−オンを２５質量部添加した以外は、実施例１と同じ方法で粉末状の骨形成促進剤を調製した。本品は、そのままで、打錠して、カプセルに封入して、或いは、清涼飲料等に添加して利用することができる。本品は、骨形成促進剤として、骨粗鬆症、慢性関節リューマチ、リューマチ様脊椎炎、骨ページェット病、変形性関節炎、痛風性関節炎、歯肉炎、歯周病をはじめとする骨代謝異常疾患やその予備軍の骨量の減少の抑制乃至骨量の増加促進に適している。
【実施例３】
【００６５】
＜骨形成促進剤＞
実施例１又は２で調製した粉末状の骨形成促進剤のいずれか９９質量部に対して１質量部のシュガーエステルを添加し均質に混合し、常法により打錠して、一錠２００ｍｇ当り、２−アミノフェノキサジン−３−オン又はその誘導体を約５０ｍｇ、或いは、２−アミノフェノールを５０ｍｇ含む錠剤を得た。本品は、骨形成促進剤として、骨粗鬆症、慢性関節リューマチ、リューマチ様脊椎炎、骨ページェット病、変形性関節炎、痛風性関節炎、歯肉炎、歯周病をはじめとする骨代謝異常疾患やその予備軍の骨量の減少の抑制乃至骨量の増加促進に適している。また、本品は、ＣＯＸ阻害活性及び一酸化窒素合成阻害活性を有していることから、経口投与により、リューマチ、胃炎などの各種炎症性疾患、癌、アルツハイマー病の治療又は予防剤、鎮痛剤や解熱剤としても利用できる。
【実施例４】
【００６６】
＜骨形成促進剤＞
下記の成分を配合し、粉末状の骨形成促進剤を得た。
実施例１又は２で調製した粉末状の骨形成促進剤              ４１質量部
のいずれか１種
ラクトスクロース（粉末、ラクトスクロース純度９０％）        ５質量部
粉飴                                                      ４１質量部
糖転移アスコルビン酸（株式会社林原商事販売、                １質量部
商品名「アスコフレッシュ」）
コタラヒム抽出物粉末                                    ０．２質量部
ミネラル酵母（亜鉛、セレン、クロム、銅、マンガン、          １質量部
モリブデン、ヨウ素含有）
カルニチン                                                  適量
ビタミンＡ                                                  適量
ビタミンＤ                                                  適量
塩酸チアミン                                                適量
リボフラビン                                                適量
塩酸ピリドキシン                                            適量
シアノコバラミン                                            適量
酒石酸水素コリン                                            適量
ニコチン酸アミド                                            適量
パントテン酸カルシウム                                      適量
酢酸トコフェロール                                          適量
コエンザイムＱ１０                                            適量
α−リポ酸                                                  適量
硫酸鉄                                                      適量
リン酸水素カルシウム                                        適量
アラビアガム                                                適量
本品は、そのままで、打錠して、カプセルに封入して、或いは、清涼飲料などに添加して、骨形成促進剤として摂取することにより、骨粗鬆症、慢性関節リューマチ、リューマチ様脊椎炎、骨ページェット病、変形性関節炎、痛風性関節炎、歯肉炎、歯周病をはじめとする骨代謝異常疾患やその予備軍の骨量の減少の抑制乃至骨量の増加促進に適している。また、本品は、血糖の上昇抑制剤、糖質や脂質の吸収抑制剤、糖や脂質の代謝改善剤として、生活週間病全般の予防や治療に利用することもできる。
【実施例５】
【００６７】
＜骨形成促進剤＞
以下の処方で歯磨を製造した。
不溶性メタリン酸ナトリウム                            ２６．０質量％
グリセリン                                            ２５．０質量％
第２リン酸カルシウム                                  １５．０質量％
ラウリル硫酸ナトリウム                                  １．５質量％
トラガントガム                                          １．４質量％
香料                                                    １．０質量％
実験１で製造した２−アミノフェノキサジン−              ０．１質量％
３−オン又は２−アミノフェノール
（和光純薬工業株式会社販売）
サッカリン                                              ０．１質量％
銅クロロフィリンナトリウム                              １．０質量％
水                                                    ２８．９質量％
本品は、骨形成促進剤として、骨粗鬆症、慢性関節リューマチ、リューマチ様脊椎炎、骨ページェット病、変形性関節炎、痛風性関節炎、歯肉炎、歯周病をはじめとする骨代謝異常疾患やその予備軍の骨量の減少の抑制乃至骨量の増加促進に適している。
【実施例６】
【００６８】
＜骨形成促進剤＞
植物油２０ｇと２−アミノフェノキサジン−３−オン又は２−アミノフェノール０．５ｇとを加温下に混合して混和した。この混和した溶液に、精製卵黄レシチン０．６ｇ、及びグリセリン５．５ｇを添加し、加温しながら激しく撹拌して溶解した後、適量の蒸留水を加えポリトロンホモジナイザーで撹拌し乳化液を調製した。この乳化液をさらにマイクロフルイダイザーにより乳化した後、乳化液に蒸留水を加えて１００ｍｌとし、ポワサイズが０．４５μｍのフィルターで濾過することにより、２−アミノフェノキサジン−３−オン又は２−アミノフェノールを約４００μｇ／ｍｌ含む脂肪粒子が分散した注射剤を調製した。本品は、骨形成促進剤として、骨粗鬆症、慢性関節リューマチ、リューマチ様脊椎炎、骨ページェット病、変形性関節炎、痛風性関節炎、歯肉炎、歯周病をはじめとする骨代謝異常疾患やその予備軍の骨量の減少の抑制乃至骨量の増加促進に適している。
【実施例７】
【００６９】
＜骨形成促進剤＞
２−アミノフェノキサジン−３−オン又は２−アミノフェノールを１５μｇ／ｍｌ、α，α−トレハロース（株式会社林原生物化学研究所製造、パイロジェンフリー）を１４０ｍｇ／ｍｌ、ツイーン２０を２ｍｇ／ｍｌとなるように生理食塩水に溶解して、常法により、精密濾過して滅菌して、１００ｍｌずつ分注し、パイロジェンフリーの液剤を得た。本品は、点滴液とし使用することができる。本品は、骨形成促進剤として、骨粗鬆症、慢性関節リューマチ、リューマチ様脊椎炎、骨ページェット病、変形性関節炎、痛風性関節炎、歯肉炎、歯周病をはじめとする骨代謝異常疾患やその予備軍の骨量の減少の抑制乃至骨量の増加促進に適している。また、本品は、ＣＯＸ阻害活性及び一酸化窒素合成阻害活性を有していることから、リューマチなどの各種炎症性疾患、癌、アルツハイマー病の治療又は予防剤、鎮痛剤や解熱剤としても利用できる。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
叙述のとおり、２−アミノフェノール又はその誘導体は、前骨芽細胞を骨芽細胞に分化させて、該細胞へのカルシウム沈着を促進する。しかも、２−アミノフェノール又はその誘導体は、ＮＯ合成阻害作用、ＩＬ−６産生抑制及びＰＧＥ２合成阻害作用により、破骨細胞の活性を抑制して骨吸収を抑制する作用を有している。さらに、２−アミノフェノール又はその誘導体は経口或いは非経口的に摂取しても毒性が低く、長期間連用しても、安全なので、骨形成促進剤として有用である。