(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
酵素的に活性なハイブリッドアミラーゼであって、Ｎ末端からＣ末端まで式（Ｉ）を有するポリペプチドを含み、
Ａ−ｘ−ｙ−Ｂ  （Ｉ）
ここで、
Ａ−ｘは、古細菌アルファ‐アミラーゼ由来第一アミノ酸配列であり、ここで、ｘは、第一アミノ酸配列のＣ末端残基
ｙ−Ｂは、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼ又はバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼに少なくとも９０％の配列同一性を有するバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼの変異体由来第二アミノ酸配列であり、ここで、ｙは、第二アミノ酸配列のＮ末端残基であり、
第一及び第二アミノ酸配列が合わせて４００から５００のアミノ酸残基を含み、
ハイブリッドアミラーゼの全アミノ酸の１０％から８０％が、古細菌アルファ‐アミラーゼにより寄与され、
バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼ三次元構造との構造アライメントにおいて、残基ｘとｙにおけるアルファ炭素間の二乗平均平方根距離が、１Å以下であり、及び
前記バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼがバシルス  ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼ、バシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ‐アミラーゼ、バシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルファ‐アミラーゼ、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−Ｋ３８アルファ‐アミラーゼ、又はバシルス  ハルマパルス（Ｂ．  ｈａｌｍａｐａｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼである、
ことを特徴とするハイブリッドアミラーゼ。
【請求項２】
バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼ三次元構造との構造アライメントにおいて、残基ｘとｙにおけるアルファ炭素間の二乗平均平方根距離が、０．５Å以下であることを特徴とする請求項１に記載のハイブリッドアミラーゼ。
【請求項３】
バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼ三次元構造との構造アライメントにおいて、残基ｘとｙにおけるアルファ炭素間の二乗平均平方根距離が、０．３Å以下であることを特徴とする請求項１に記載のハイブリッドアミラーゼ。
【請求項４】
バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼが、バシルス  ステアロテルモフィルス（Ｂ．  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼであることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記載のハイブリッドアミラーゼ。
【請求項５】
バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼが、バシルス  ステアロテルモフィルス（Ｂ．  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼの変異体であり、デンプン結合ドメインが、バシルス  ステアロテルモフィルス（Ｂ．  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼのＣ末端から除かれることを特徴とする請求項１から４のいずれかに記載のハイブリッドアミラーゼ。
【請求項６】
古細菌アルファ‐アミラーゼが、配列番号９のアルファ‐アミラーゼであることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載のハイブリッドアミラーゼ。
【請求項７】
（ｉ）第一及び第二アミノ酸配列が６０％未満の配列同一性を共有するアミラーゼ由来である；及び/又は
（ｉｉ）残基ｘとｙがＢドメイン中にある；及び/又は
（ｉｉｉ）第一アミノ酸配列が、Ｂドメインのアミノ酸残基の少なくとも８０％に寄与する；及び/又は
（ｉｖ）第一アミノ酸配列が、Ｚｎ２＋結合部位を含む；及び/又は
（ｖ）バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼのＣａ２＋結合部位における少なくとも一つのアミノ酸が、第一アミノ酸配列由来のアミノ酸残基で置換される；及び/又は
（ｖｉ）ハイブリッドアミラーゼがアルファ‐アミラーゼ活性を有し、ここで、活性が、Ｃａ２＋濃度により影響されない、
ことを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載のハイブリッドアミラーゼ。
【請求項８】
ハイブリッドアミラーゼが、配列番号１、２、６、又は８のいずれかひとつのアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載のハイブリッドアミラーゼ。
【請求項９】
ハイブリッドアミラーゼが、精製されることを特徴とする請求項１から８のいずれかに記載のハイブリッドアミラーゼ。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載のハイブリッドアミラーゼをコードする核酸。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１２】
請求項１０に記載の核酸又は請求項１１に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
宿主細胞が、細菌又は真菌であることを特徴とする請求項１２に記載の宿主細胞。
【請求項１４】
細菌がバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）であることを特徴とする請求項１３に記載の宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
配列番号１から２７を含む配列表を添付し、参照によりその全体が取り込まれる。
【０００２】
優先権
本出願は、２００８年１２月１５日出願の米国仮出願番号６１／１２２，６２８に対して優先権を主張し、参照により、本明細書に取り込まれる。
【０００３】
発明の分野
本発明は、古細菌（ａｒｃｈａｅ）アルファ‐アミラーゼ及びターマミル（Ｔｅｒｍａｍｙｌ）様アルファ‐アミラーゼ配列を含むハイブリッドアミラーゼを提供する。ハイブリッドアミラーゼは、野生型ターマミル様アミラーゼと比較して、改変された特性を有してよい。
【背景技術】
【０００４】
背景
共通の機能を有する関連酵素は、顕著な配列同一性を有してよくあるいは有さなくてよい。例えば、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼ（１，４−α−Ｄ-グルカン  グルカノヒドロラーゼ、ＥＣ  ３．２．１．１）は、それらのアミノ酸配列が、バシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ‐アミラーゼに対して６０％以上の同一性を有する場合、“ターマミル様”として区分される。WO  96/23874を参照願いたい。ハイブリッドアミラーゼは、６２％以上の配列同一性を共有するアミラーゼとの間で創製される。Gray他、  J.  Bacteriology  166:  635-43  (1986);  米国特許第６，１４３，７０８を参照願いたい。例えば、バシルス  アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）の１−３００残基及びバシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）の３０１−４８３残基を含むキメラアミラーゼは、組み換えにより発現し結晶化された。Brzozowski他、Biochemistry  39:  9099-107  (2000)を参照願いたい。また、ＷＯ  ９６／２３８７４;  ＷＯ  ９７／４１２１３も参照願いたい。しかしながら、バシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）など、２５％未満の配列同一性を共有するアミラーゼであっても、共通の触媒機能及び全体的に保存される３次元（３Ｄ）の折りたたみを共有できる。
【０００５】
多くのアミラーゼの結晶構造が、現在入手可能である。前述のBrzozowski他(2000)を参照願いたい。例えば、プロテインデータバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）（ＰＤＢ）、は表１に示すアミラーゼ以上の３Ｄ構造を含む。
【０００６】
【表１】
0005548698.tif 000002
【０００７】
これらの結晶構造の比較により、顕著な配列類似性が存在しなくても、高い３次元（３Ｄ）構造の保存が明らかとなる。すべて報告されるアルファ‐アミラーゼ構造は、（β／α）８触媒コアドメインである、ドメインＡを共有する。「（β／α）８」は、保存されるタンパク質３Ｄ構造として定義される、いわゆる「ＴＩＭバレル構造」といい、あるいは、ペプチド骨格に沿って交互に入れ替わる８つのアルファ‐へリックス及び８つのベータ‐ストランドからなる「折りたたみ」をいう。Lolis  他、Biochemistry  29:  6609-18  (1990)を参照願いたい。ＢドメインはドメインＡのバレルストランドβ‐３及びへリックスα‐３の間の可動域、又は延長構造である。Ｃドメインは、典型的に８のストランドβ‐シートであり、アミラーゼの残りのＣ末端部分を形成する。アミラーゼのドメイン構造は、下記により詳しく説明する。
【０００８】
タンパク質のアミノ酸配列又は３Ｄ構造に大規模な変更をする必要性がなくて、正確に折りたたみ、安定性を維持し、及び組み換え宿主細胞に効率的な発現を実施するアミラーゼ変異体を提供するという継続的な必要性が当分野に存在する。
【発明の概要】
【０００９】
趣旨
ターマミル様アルファ‐アミラーゼの３Ｄ構造が、ガイドとして用いられ、新規なハイブリッドアルファ‐アミラーゼを構築する。ハイブリッドアミラーゼにおいては、ターマミル様Ｎ末端の一部が古細菌アミラーゼ由来の配列で置き換わる。二つのアミラーゼは、保存される３Ｄ構造を共有する。さらにアミラーゼ間の配列同一性は、６０％未満でよい。ある実施態様においては、ハイブリッドアミラーゼは、約４００から約５００アミノ酸残基を含む。ハイブリッドアミラーゼにおいては、全アミノ酸の約１０％と約８０％の間が古細菌アルファ‐アミラーゼにより寄与される。ハイブリッド酵素における置換された部分は、ターマミル様アミラーゼと全部又は一部が構造的に保存される３Ｄ構造を有するように予測される。ある実施態様においては、少なくとも古細菌アミラーゼ配列のＣ末端残基（残基「ｘ」）とターマミル様アミラーゼ配列のＮ‐末端残基（残基「ｙ」）が構造的に保存される。ハイブリッドアミラーゼは、構成要素であるアミラーゼ配列の所望の特性、例えば組み換え発現の改変されたレベル、改変された溶解度、及び所望の性能特性、例えば最適ｐＨ活性プロファイル、基質特異性、生産物の特性及び特異的活性などを有利に組み合わせてよい。
【００１０】
タンパク質ドメインは、しばしば独立ユニットとして折りたたむと考えられるので、ハイブリッド酵素において適切な折りたたみを維持するために、ドメインが全体ユニットとして置換されなければならないことが予期される。しかしながら、ハイブリッドを野生型バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）酵素の保存された折りたたみを維持するように設計することにより、アルファ‐アミラーゼ配列がドメインの境界にて融合される必要はない。幾つかの実施態様においては、ハイブリッドアミラーゼは、第一アルファ‐アミラーゼ由来のＢドメインの一部を含む第一アミノ酸配列を含み、第一アミノ酸配列は、Ｂドメインの残りの部分を含むバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼ由来第二アミノ酸配列に融合する。このようにして、共に融合するＢドメインのある部分次第で、独特な特性を有するハイブリッドアミラーゼを設計することができる。
【００１１】
例えば、ある実施態様は、「ウルトラシン（Ｕｌｔｒａｔｈｉｎ）」、Richardson他、  J.  Biol.  Chem.  277:  26501-07  (2002)  (ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号（Accession  No.）ＡＡＭ４８１１４)に記載される古細菌アルファ‐アミラーゼ由来の配列と融合するバシルス  ステアロテルモフィルス（Ｂ．  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼ（ＡｍｙＳ；またゲオバシルス  ステアロテルモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）として当分野で知られる）由来の配列を含むハイブリッドアミラーゼに関する。本明細書に記載の多様な実施態様においては、ハイブリッドのＮ末端はウルトラシン（言い換えると、第一アミノ酸配列）を含み、一方Ｃ末端はＡｍｙＳ（言い換えると、第二アミノ酸配列）由来の残基を含む。具体的なウルトラシン残基を「ＵＴｎ」で表し、ここで、ｎはＮ末端からのアミノ酸残基数である。例えば、ウルトラシンの残基１０４は「ＵＴ１０４」で表す。用語「des-Met  ウルトラシン」はＮ末端メチオニン残基を欠失しているウルトラシンをいう。例えば、ウルトラシン残基１−１０４とＡｍｙＳ残基１００−４８３間のハイブリッドアミラーゼは、「UT  1-104:  AmyS  100-483」と表す。
【００１２】
他の古細菌アミラーゼのように、ウルトラシンは、ＢドメインにＺｎ２+結合部位を有する。それに対して、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼのＢドメインはＣａ２＋‐Ｎａ＋‐Ｃａ２＋結合部位を有する。バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼ由来の残りのＢドメインに融合するウルトラシンのＺｎ２+結合部位を含むハイブリッドは、酵素活性にＣａ２＋を要求せずにバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼの性能特性を有することができる。そのようなハイブリッドアミラーゼは、グルコアミラーゼなど、野生型バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼ由来と異なるカルシウム要求性を有する別の酵素と組み合わせて用いる時に特に有用である。例えば、ハイブリッドアミラーゼは、例えば、グルコアミラーゼと同じ反応容器でデンプンを糖化するために用いてよく、Ｃａ２＋濃度をグルコアミラーゼの性能に最適化できる。
【００１３】
従って、本発明は、ハイブリッドアミラーゼであって、Ｎ末端からＣ末端まで式（Ｉ）を有するポリペプチドを含み、
Ａ−ｘ−ｙ−Ｂ  （Ｉ）
ここで、
Ａは、古細菌アルファ‐アミラーゼ由来第一アミノ酸配列、
Ｂは、野生型ターマミル様アルファ‐アミラーゼ又はその変異体由来第二アミノ酸配列、
ｘは、第一アミノ酸配列のＣ末端残基、及び
ｙは、第二アミノ酸配列のＮ末端残基である、
ハイブリッドアミラーゼを提供する。ターマミル様アルファ‐アミラーゼ変異体は、野生型ターマミル様アルファ‐アミラーゼに少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は約９９％配列同一性を有してよい。第一及び第二アミノ酸配列が共に約４００、約４１０、約４２０、約４３０、約４４０、約４５０、約４６０、約４７０、約４８０、約４９０、又は約５００のアミノ酸残基を含んでよい。ハイブリッドアミラーゼ中アミノ酸の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、又は約８０％が、古細菌アルファ‐アミラーゼにより寄与されてよい。残基ｘ及びｙ両方が、野生型ターマミル様アルファ‐アミラーゼと比較してハイブリッドアミラーゼ中に構造的に保存される。ハイブリッドアミラーゼは、配列番号１−８のいずれか一つを示すアミノ酸配列を含んでよい。さらなる態様においては、ハイブリッドアミラーゼを精製してよい。
【００１４】
ある態様においては、野生型ターマミル様アルファ‐アミラーゼ３Ｄ構造と比較して残基ｘとｙにおけるアルファ炭素間の二乗平均平方根距離が、約０．５Å、約０．４Å、約０．３Å、約０．２Å、又は約０．１Å以下である。別の態様においては、第一アミノ酸配列Ａが、野生型ターマミル様アルファ‐アミラーゼと比較してハイブリッドアミラーゼ中に構造的に保存される。野生型ターマミル様アルファ‐アミラーゼが、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼでよい。バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼが、バシルス  ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼ、バシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ‐アミラーゼ、バシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルファ‐アミラーゼ、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＫＳＭ−Ｋ３８アルファ‐アミラーゼ、又はバシルス  ハルマパルス（Ｂ．  ｈａｌｍａｐａｌｕｓ  ）アルファ‐アミラーゼでよい。ターマミル様アルファ‐アミラーゼ変異体が、親酵素のＣ末端を除くことにより、バシルス  ステアロテルモフィルス（Ｂ．  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼ由来でよい。古細菌アルファ‐アミラーゼが、ウルトラシン（Ｕｌｔｒａｔｈｉｎ）アルファ‐アミラーゼでよい。ハイブリッドアミラーゼの第一及び第二アミノ酸配列が、約６０％、約５５％、５０％、約４５％、約４０％、約３５％、又は約３０％未満の配列同一性を共有してよいアミラーゼ由来である。また、本発明は、ハイブリッドアミラーゼの第一アミノ酸配列内にＺｎ２＋結合部位を含むハイブリッドアミラーゼを意図する。ハイブリッドアミラーゼは、第一アミノ酸配列由来のアミノ酸残基で置換される野生型ターマミル様アルファ‐アミラーゼのＣａ２＋結合部位の少なくとも一つのアミノ酸を有してよい。
【００１５】
更なる態様においては、残基ｘとｙがＢドメイン中にある。第一アミノ酸配列が、Ｂドメインのアミノ酸残基の少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９８％に寄与してよい。
【００１６】
別の態様においては、本発明は、野生型ターマミル様アルファ‐アミラーゼと比較して、改変された組み換え発現のレベル、溶解度、ｐＨ活性プロファイル、基質特異性、又は特異的活性を有するハイブリッドアミラーゼを意図する。ハイブリッドアミラーゼは、活性がＣａ２＋濃度により影響されないアルファ‐アミラーゼ活性を有してよい。
【００１７】
また、本発明は、本明細書に記載のハイブリッドアミラーゼをコードする核酸を意図する。更なる態様においては、その核酸を含むベクターを意図する。更なる態様においては、その核酸又はそのベクターを含む宿主細胞を意図する。宿主細胞が、細菌又は真菌でよい。さらに別の態様においては、細菌がバシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）でよい。
【００１８】
更なる態様においては、本発明はハイブリッド酵素をコードする核酸を設計する方法を意図する。方法は、
コンピューター実行方法において、古細菌アルファ‐アミラーゼ及び野生型ターマミル様アルファ‐アミラーゼの３Ｄ構造をアライメントする工程、
構造的に保存されるアミノ酸残基ｘ及びｙを選択する工程、及び
ハイブリッド酵素をコードする核酸を設計する工程、
を含む。コンピューター実行方法がコンピューターモニター上に３次元構造アライメントを表示することを含んでよい。野生型ターマミル様アルファ‐アミラーゼ３Ｄ構造と比較して残基ｘとｙにおけるアルファ炭素間の二乗平均平方根距離が、約０．５Å、約０．４Å、約０．３Å、約０．２Å、又は約０．１Å以下である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
添付の図は本明細書にとりこまれ本明細書の一部を構成し、多様な実施態様を説明する。
【図１】図１は、バシルス  ステアロテルモフィルス（Ｂ．  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼの成熟型（言い換えると、シグナル配列の欠損）（「MatAmyS」：配列番号１０）及びdes-Metウルトラシン（Ｕｌｔｒａｔｈｉｎ）アミラーゼ(「MatUltrathin」:配列番号９)の成熟型間のアミノ酸配列アライメント及びコンセンサス配列を示す。
【図２】図２は、比色分析ファデバス（商標）（Ｐｈａｄｅｂａｓ）アミラーゼ試験（Ｍａｇｌｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いる多様なアミラーゼの相対的な活性を示す。基質は、水溶性である青色染料に化学的に付着した不溶性デンプンマイクロスフェアからなる。アミラーゼはデンプンを加水分解し、６２０ｎｍにて吸収の変化により測定される青色染料を放出する。培養上清サンプルの一連の希釈をｐＨ７（パネルＡ）及びｐＨ１０（パネルＢ）にて試験した。吸光度の任意の単位をアミラーゼ試験サンプルの希釈を関数としてプロットした。下記のハイブリッドアミラーゼを分析した。ハイブリッドA:  UT  1-104:  AmyS  100-483  (配列番号1)、ハイブリッドB:  UT  1-113:  AmyS  109-483  (配列番号2)、ハイブリッドC:  UT  1-128:  AmyS  140-483  (配列番号3)、ハイブリッドD:  UT  1-145:  AmyS  161-483  (配列番号4)、ハイブリッドE:  UT  1-163:  AmyS  203-483  (配列番号5)、ハイブリッドF:  UT  1-175:  AmyS  215-483  (配列番号6)、ハイブリッドG:  UT  1-191:  AmyS  228-483  (配列番号7)、及びハイブリッドH:  UT  1-209:  AmyS  246-483  (配列番号8)。
【図３】図３は、des-Metウルトラシン（Ｕｌｔｒａｔｈｉｎ）アミラーゼ（配列番号９）のアミノ酸配列を示す。太字で下線の引いたアミノ酸残基は、図２で示すハイブリッドにおけるウルトラシン部分の多様なＣ末端残基を示す。ウルトラシンにおける「クロスオーバーする位置」は太字かつ下線部である。
【図４】図４は、デンプン結合ドメイン（配列番号１１）を除くＣ末端欠失を有するＡｍｙＳ変異体のアミノ酸配列を示す。太字で下線の引いたアミノ酸残基は、図２で示すハイブリッドにおけるＡｍｙＳ部分のＮ末端残基を示す。ＡｍｙＳにおける「クロスオーバーする位置」は太字かつ下線部である。
【図５Ａ】図５Ａは、Ｂドメインが黒色である、ＡｍｙＳの二つの立体視を示す。Ｂドメインの後ろの球体は、結合したＮａ＋及びＣａ２＋の原子を表す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＵＴ  １−１０４残基が黒色である、ＵＴ  １−１０４:  ＡｍｙＳ  １００‐４８３の二つの立体視を示す。Ｂドメインの後ろの球体は、結合したＮａ＋及びＣａ２＋の原子を表す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＵＴ  １−２０９残基が黒色である、ＵＴ  １−２０９:  ＡｍｙＳ  ２４６‐４８３の二つの立体視を示す。Ｂドメインの後ろの球体は、結合したＮａ＋及びＣａ２＋の原子を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
詳細な記載
本発明は、例えば、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アミラーゼなど、野生型ターマミル様アルファ‐アミラーゼの全部又は部分的に保存された３Ｄ構造を共有するハイブリッドアルファ‐アミラーゼを提供する。ハイブリッドアミラーゼにおいては、ターマミル様アルファ‐アミラーゼのＮ末端部分が、古細菌アルファ‐アミラーゼ由来の配列で置き換わる。その二つのアミラーゼの間の配列類似性は、６０％未満でよい。ハイブリッドアルファ‐アミラーゼにおける野生型３Ｄ構造を保存することは、酵素的に活性なアミラーゼを得ることを容易にする。ある実施態様においては、一つ又は両方のアミラーゼ配列が、Ｂドメインへの残基に寄与し、特に有益な特性をもたらす。例えば、ターマミル様アルファ‐アミラーゼのＢドメイン中のＣａ２＋結合部位をＣａ２＋を結合しない古細菌アルファ‐アミラーゼのＢドメインを用いた置換が、Ｃａ２＋非存在下で完全に活性であるハイブリッドを生成することができる。
【００２１】
１．  定義及び略語
本明細書の詳細な説明に従って、次の略語及び定義を適用する。本明細書にて使用する単数形「ａ」「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、内容が明らかに他の事を指し示していない限り、複数の指示対象を含む。すなわち、例えば、「酵素」の意味は該当酵素の複数を含み、「製剤（ｔｈｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）」の意味は一以上の製剤及び当業者に公知のこれらに均等な製剤を含む。
【００２２】
別段の指示がない限り、本明細書にて用いるすべての技術用語及び科学用語は当業者が通常理解するものと同様の意味を有する。次の用語を以下に示す。
【００２３】
１．１  定義
本明細書にて用いる「古細菌（Ａｒｃｈａｅ）」は、原核生物及び真核生物と異なる界の単細胞有機体をいう。古細菌は、好熱細菌、好塩性生物、及びメタン細菌を含む。
【００２４】
アミラーゼ類は、デンプン中のアルファ‐Ｄ‐（１→４）Ｏ‐グリコシド結合を切断する加水分解酵素であり、グルコアミラーゼ類及びベータ‐アミラーゼ並びにアルファ‐アミラーゼを含む。しかしながら、本明細書では、「アミラーゼ」は、特段の定めがない限り、アルファ‐アミラーゼをいう。アルファ‐アミラーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１；  α‐Ｄ‐（ｌ→４）‐グルカン  グルカノヒドロラーゼ（ｇｌｕｃａｎ  ｇｌｕｃａｎｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ））は不規則的にデンプン分子内のアルファ‐Ｄ（１→４）Ｏ‐グリコシド結合を切断するエンド作用酵素として定義される。それに対して、エキソ作用デンプン分解酵素は、基質の非還元末端からデンプン分子を切断し、例えば、ベータ‐アミラーゼ（ＥＣ  ３．２.１．２．α‐Ｄ‐（ｌ→４）−グルカン  マルトヒドロラーゼ（ｇｌｕｃａｎ  ｍａｌｔｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ））及びマルトジェニックアルファ‐アミラーゼ（ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ  α‐ａｍｙｌａｓｅ）（ＥＣ  ３．２．１．１３３）のようなある産物特異的アミラーゼ類である。ベータ‐アミラーゼ、アルファ‐グルコシダーゼ  (ＥＣ  ３．２．１．２０;  α‐Ｄ‐グルコシド  グルコヒドロラーゼ（ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ  ｇｌｕｃｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ)）、グルコアミラーゼ  (ＥＣ  ３．２．１．３;  α‐Ｄ‐（ｌ→４）-グルカン  グルコヒドロラーゼ（ｇｌｕｃａｎ  ｇｌｕｃｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ)）、及び産物特異的アミラーゼ類はデンプンから特定の長さの麦芽オリゴ糖を生産する。
【００２５】
「ターマミル様」アミラーゼは、野生型バシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ‐アミラーゼに対して少なくとも約６０％配列同一性を有する。
【００２６】
「野生型」酵素は、自然に生じる酵素を言う。つまり、「野生型」ターマミル様アルファ‐アミラーゼは、野生型バシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ‐アミラーゼに対して少なくとも約６０％配列同一性を有する自然に生じるアルファ‐アミラーゼをいう。
【００２７】
「パーセント配列同一性」は、二つの配列をアライメントし、国立医学図書館（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）の全米バイオテクノロジー情報センター（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）(ＮＣＢＩ)のウェブサイトにて入手できるデフォルトアライメント値を用いてＢＬＡＳＴプログラムを用いてそれらを比較することにより決定される。
【００２８】
「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」、又は「変異体（複数）」は、ポリペプチドや核酸をいう。本明細書では、「変異体」は、二つの異なる親アミラーゼ由来のアミノ酸配列を含むハイブリッドタンパク質を含む。「変異体」という用語は、「ミュータント（ｍｕｔａｎｔ）」という用語と互換可能に用いてよい。変異体は、野生型配列と比較して、アミノ酸又はヌクレオチド配列中の一以上の位置にて、挿入、置換、トランスバージョン、及び欠失及び／又はインバージョンをそれぞれ含む。従って、「変異体ポリペプチド」及び「変異体酵素」という語句は、野生型タンパク質のアミノ酸配列から修飾されたアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する。変異体ポリペプチドは、親酵素と特定のパーセント、例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９９％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。変異体は、野生型配列と比較して、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、又は３０アミノ酸置換、追加、又は欠失、或いは１−３０の範囲内の任意の整数値のアミノ酸置換、追加、又は欠失を有してよい。変異体は、異種のポリペプチドを含む融合タンパク質として発現されてよい。例えば、変異体は、別のタンパク質のシグナルペプチド又はＨｉｓ−タグ配列など発現融合タンパク質の同定又は精製を助ける配列を含むことができる。
【００２９】
用語「融合タンパク質」は、当分野で知られている任意の手段により一緒に結合した二以上のポリペプチドをいう。これらは、化学的合成又は組み換え技術によりコードする核酸をスプライシングすることを含む。
【００３０】
本明細書にて用いる用語「ハイブリッドタンパク質」は、融合タンパク質の特別な形態である。融合タンパク質のように、第一タンパク質である古細菌アルファ‐アミラーゼ由来のアミノ酸配列は、第二タンパク質であるターマミル様アルファ‐アミラーゼ由来のアミノ酸配列に融合又は結合し、ハイブリッドタンパク質を形成する。本明細書に記載のハイブリッドアルファ‐アミラーゼにおいては、ターマミル様アルファ‐アミラーゼの置換した部分の３Ｄ構造のすべて又は一部を保存しながら、古細菌アルファ‐アミラーゼ由来第一アミノ酸配列がターマミル様アルファ‐アミラーゼの一部を置換する。ハイブリッドアミラーゼを導き出す古細菌アルファ‐アミラーゼ及び／又はターマミル様アルファ‐アミラーゼは、野生型アミラーゼの「変異体」でよい。
【００３１】
「アルファ炭素」は、ポリペプチド鎖における骨格炭素をいい、その炭素は、カルボニル炭素に結合される。
【００３２】
本明細書にて用いるように、第一の３Ｄ構造又は折りたたみ又はその部分は、アルファ炭素の二乗平均平方根距離（ＲＭＳＤ）が約１Å以下であるように構造がアライメントされる時、第二の３Ｄ構造又はその部分を用いて「構造的に保存される」。また、Orengo  他、Protein  Eng.  6:  485-500  (1993)を参照願いたい。
【００３３】
本明細書にて用いる用語、「フラグメント」は、完全長より短いポリヌクレオチド又はポリペプチド配列をいい、二以上のアミノ酸又は核酸残基、例えば、５、１０、１５、２０、３０、又は５０残基を含む配列である。
【００３４】
本明細書にて用いる用語「発現」は、遺伝子の核酸配列に基づいて、ポリペプチドが生成される過程をいう。過程は、転写及び翻訳両方を含む。
【００３５】
「単離される」は、配列が、その配列が自然に結合している及び自然に存在する、例えば、ゲノム配列など、少なくとも一つの他の成分から少なくとも実質的に除去されることを意味する。
【００３６】
「精製される」は、物質が相対的に純粋状態、例えば少なくとも約９０％純粋、又は少なくとも約９５％純粋、又は少なくとも約９８％純粋であることを意味する。
【００３７】
「熱安定性」は、高い温度にさらされた後、酵素が活性を維持することを意味する。酵素の熱安定性はその半減期（ｔ１／２）によって測定され、半減期により半分の酵素活性が消失する。半減期の値は、所定の条件下にて残存するアミラーゼ活性を測定することにより計算される。酵素の半減期を決定するために、サンプルは、１−１０分間、試験温度に加熱され、酵素の活性の標準的なアッセイを用いて測定される。
【００３８】
本明細書にて用いる「アミノ酸配列」は用語「ポリペプチド」及び／又は用語「タンパク質」と同義語である。ある場合は、用語「アミノ酸配列」は用語「ペプチド」と同義語である。ある場合は、用語「アミノ酸配列」は用語「酵素」と同義語である。
【００３９】
本明細書にて用いる用語「ヌクレオチド配列」又は「核酸配列」は、オリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列及び変異体、相同体、フラグメント、及びそれらの誘導体をいう。ヌクレオチド配列は、ゲノムの、合成の又は組み換え体のオリジンをいい、センス鎖又はアンチセンス鎖を表すかどうかで、二本鎖又は一本鎖でよい。本明細書にて用いるように、その用語「ヌクレオチド配列」はゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、及びＲＮＡをいう。
【００４０】
「相同体」は、対象アミノ酸配列及び対象ヌクレオチド配列とある度合いの同一性を有する物を意味する。「相同配列」は別の配列に対してある％配列同一性を有するポリヌクレオチド又はポリペプチドを含み、例えば、別の配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％同一性を有する。一般的に、相同体は対象アミノ酸配列と同様の活性部位残基を含みうる。また、相同体が、野生型酵素より異なる酵素的特性を有するけれども、相同体は、酵素活性も維持する。
【００４１】
本明細書にて用いる「ハイブリダイゼーション」は、核酸の一本鎖が塩基対を通して相補鎖に結合する過程及びポリメラーゼチェーン反応（ＰＣＲ）法において実施する場合の増幅する過程も含む。変異体核酸は、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡへテロ二本鎖又はＲＮＡ／ＤＮＡコポリマーとして存在してよい。本明細書にて用いる「コポリマー」は、リボヌクレオチド及びデオキシヌクレオチド両者を含む１本鎖核酸ストランドをいう。変異体核酸は、発現をさらに増加するためにコドン最適化を行ってよい。
【００４２】
本明細書にて用いる「合成の」化合物は、インビトロで化学的又は酵素的合成によって生産されるものいう。酵母細胞宿主又は他の選択される発現宿主など、宿主生物にとって最適化コドンを使用した変異体核酸を含むが、これらに限定されない。
【００４３】
本明細書に用いる「形質転換細胞」は組み換えＤＮＡ技術を用いて形質転換された細菌及び真菌両方の細胞を含む。一般的に形質転換は細胞への一以上のヌクレオチド配列の挿入により起こる。挿入されたヌクレオチド配列は異種のヌクレオチド配列、即ち、融合タンパク質のような形質転換された細胞に本来有していない配列でもよい。
【００４４】
本明細書にて用いる「作動可能に結合する」は、記載する成分が意図する機能を行うような関係であることを意味する。例えば、コード配列に作動可能に結合する調節配列は、コード配列の発現がコントロール配列に適合する条件下に行われるようなライゲーションである。
【００４５】
本明細書にて用いる「生物学的活性な」とは、同じ程度とは必ずしも限らないが、自然に発生する配列と同様な構造機能、調節機能又は生物学的機能を有する配列をいう。
【００４６】
本明細書にて用いる用語「デンプン（ｓｔａｒｃｈ）」は、トウモロコシなど、植物性ポリサッカライドの炭水化物の複合体を含み、化学式（Ｃ６Ｈ１０Ｏ５）ｘで表すアミロース及びアミロペクチンを含む任意の原料をいい、ここで「ｘ」は任意の数字である。
【００４７】
１．２．  略語
次の略語は、他に示していない限り、以下の意味を有する。
3-D又は3D    ３次元の
ADA    アゾジカルボナミド（ａｚｏｄｉｃａｒｂｏｎａｍｉｄｅ）
AmyS    バシルス  ステアロテルモフィルス（Ｂ．  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）(ａ/ｋ/ａ  ゲオバシルス  ステアロテルモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）)アミラーゼ
AmyS  n    AmySの残基ｎ、配列番号９のナンバリング配列を用いる
AmyS  n-483    AmyS  残基n-483,  配列番号９のナンバリング配列を用いる
cDNA    相補DNA
DEAE    ジエチルアミノエタノール（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ  ｅｔｈａｎｏｌ）
DNA    デオキシリボ核酸（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）
EC    酵素委員会（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）
HPLC    高速液体クロマトグラフィー（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）
mRNA    メッセンジャーリボ核酸（ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）  
PCR    ポリメレースチェーン反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）
PDB    プロテインデータベース（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ）
PEG    ポリ（エチレングリコール）（ｐｏｌｙ  （ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ））
ppm    百万分の一（ｐａｒｔｓ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ）
RMSD    二乗平均平方根距離（ｒｏｏｔ  ｍｅａｎ  ｓｑｕａｒｅ  ｄｉｓｔａｎｃｅ）
RT-PCR    リバーストランスクリプターゼポリメラーゼチェーン反応（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）
SDS-PAGE    ドデシル硫酸ナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）
1X  SSC    ０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ  クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０
t1/2  半減期（ｈａｌｆ  ｌｉｆｅ）
Tm    ５０％の対象タンパク質が溶解する融点（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）  (℃)  
ΔTm    融点での℃変化
Ultrathin    受託番号ＡＡＭ４８１１５．１（配列番号１０）としてＧｅｎＢａｎｋ（商標）に開示の古細菌アミラーゼ
UT  n    配列番号１０のナンバリング配列をもちいるＵｌｔｒａｔｈｉｎアミラーゼの残基ｎ
UT  1-n    配列番号１０のナンバリング配列を用いるＵｌｔｒａｔｈｉｎ残基１‐ｎ
UT  1-x:  AmyS  y-483    AmyS残基y-483に融合Ｕｌｔｒａｔｈｉｎ残基1-x  
w/v    重量／体積（ｗｅｉｇｈｔ/ｖｏｌｕｍｅ）
w/w    重量／重量（ｗｅｉｇｈｔ/ｗｅｉｇｈｔ）
【００４８】
２．  保存される３Ｄ構造を用いる融合タンパク質のエンジニアリング
ハイブリッド酵素を作成するために似ていないアミノ酸配列を融合するとき、特に二つの配列がドメインの中央に結合される時、ドメイン構造は、崩壊されうる。順々にドメイン構造の崩壊は、低い活性及び／又はタンパク質の折りたたみの困難性をもたらし得、発現融合タンパク質の収量の減量の結果となる。この問題は、第一のタンパク質由来のアミノ酸配列とバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）タンパク質由来のアミノ酸配列間で融合の適切なポイントを選択することにより対処される。すなわち、二つの配列が、二つのアミラーゼ配列の３Ｄ構造が保存されるポイントで融合される。このようにして、その二つの配列が、ハイブリッド酵素中に結合される時、最少の３Ｄ構造の変化が生じる。さらに、このアプローチは、アミラーゼが６０％未満配列同一性を共有するときでさえ、活性ハイブリッドの構築に役立つ。
【００４９】
二つのタンパク質の構造アライメントは、３Ｄ構造のすべて又は一部が二つのタンパク質の間で保存されているかどうかを決定するために用いてよい。この目的のために、第一タンパク質の３Ｄ構造が、第二タンパク質の３Ｄ構造上に重ね合わせるまたはアライメントすることができる。重ね合わせ又はアライメントは、全体のタンパク質構造又は第二構造の要素にわたってなされてよい。例えば、β‐バレル中のセントラルβ‐ストランドなど、第二構造要素をアライメントできる。構造を重ね合わせる又はアライメントする方法は、当分野で周知である。ある実施態様においては、アライメントすることは、ケミカルコンピューティンググループ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ）により提供されるモレキュラーオペレーティングエンバイロメントアライメントアルゴリズム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）などコンピューター‐実行方法で導入される。別の実施態様においては、アライメントのアウトプットは、コンピューターのモニター上又はディスプレイシステム上に表示される。
【００５０】
二つの構造のアライメント上、二つの構造でのアルファ炭素鎖のアライメントの空間を測定できる。構造的に保存されるアミノ酸が選択される。本明細書の目的のために、第一３Ｄ構造又は折りたたみが、構造中のアルファ炭素のＲＭＳＤが約１Å以下の場合、第二３Ｄ構造と「構造的に保存される」。構造の保存は、少なくとも二以上のアミノ酸残基を通して拡張してよく、古細菌アルファ‐アミラーゼにより寄与されるハイブリッドアミラーゼの全体部分を含んでよい。ある実施態様においては、構造の保存度合いは、十分高く、アルファ炭素のＲＭＳＤが約０．５Å以下である。
【００５１】
ハイブリッドアミラーゼは、式（Ｉ）に示す、Ｎ末端からＣ末端の一般的な構造を有する。
Ａ−ｘ−ｙ−Ｂ  （Ｉ）
ここで、
Ａは、古細菌アルファ‐アミラーゼ由来第一アミノ酸配列、Ｂは、野生型ターマミル様アルファ‐アミラーゼ又はその変異体由来第二アミノ酸配列、ｘは、第一アミノ酸配列のＣ末端残基、及びｙは、第二アミノ酸配列のＮ末端残基である。ある実施態様においては、少なくとも残基ｘ及びｙが、野生型ターマミル様アルファ‐アミラーゼと構造的に保存される。つまり、残基ｘ及びｙ中のアルファ炭素のＲＭＳＤが、約１Å以下である。別の実施態様においては、残基ｘ及びｙ中のアルファ炭素のＲＭＳＤが、約０．５Å以下である。
【００５２】
式（Ｉ）中、ｘに相当する代表的なアミノ酸残基を図３に記載の太字かつ下線のアミノ酸残基として示す。式（Ｉ）中、ｙに相当する代表的なアミノ酸残基を図４に記載の太字かつ下線のアミノ酸残基として示す。残基ｘ及びｙは「クロスオーバーする位置」にて起こる。
【００５３】
ハイブリッドアミラーゼを形成するために二つのアミラーゼの配列を結合する方法は、当分野で周知な方法により行ってよい。例えば、アミノ酸配列は、ポリペプチド配列の末端にてアミノ酸の化学的結合を通して結合され得る。或いは、核酸をコードすることにより、発現宿主細胞中ハイブリッドアミラーゼタンパク質をコードするために遺伝子組み換えをすることができる。組み換え操作の方法は、当分野に周知である。適切な方法は、例えば、任意の現在入手できる実験マニュアル中に記載され、例えば、Sambrook他、MOLECULAR  CLONING:  A  LABORATORY  MANUAL,  3rd  ed.,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  Cold  Spring  Harbor,  New  York  (2001)である。
【００５４】
３．バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アミラーゼのドメイン構造
バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アミラーゼは三つの球状ドメインＡ、Ｂ、及びＣから形成される。ＷＯ  ９６／２３８７４の詳細な説明を参照願いたい。ドメインは、ドメインＡとして、残基１−１０３と２０６−３９５、ドメインＢとして残基１０４−２０５、及びドメインＣとして残基３９６−４８３として定義され、残基の数字は、バシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ‐アミラーゼに基づく。バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼは長い分子であり、最も長い軸は、約８５Åである。この軸に垂直な最も広いポイントは、約５０Åであり、セントラルドメインＡに及ぶ。バシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アルファ‐アミラーゼの活性部位残基は、Ｄ３２３、Ｄ２３１及びＥ２６１である。
【００５５】
３．１  ドメインＡ
ドメインＡは、最も大きなドメインであり、酵素表面に深い割れ目中に３つのアミノ酸残基のクラスターを含む活性部位含む。すべて知られているアルファ‐アミラーゼ構造のドメインＡは、同じ全体的な折りたたみ、すなわち、８つのセントラルβ‐ストランド及び８つのフランキングα‐ヘリックスを伴う（β／α）８バレルを有する。β‐ストランド１のＣ末端は、ループ１で示されるループによりヘリックス１へ接続し、同一のパターンが、他のループでみられる。これらのループは、サイズにいくつか変化があり、幾つかは、かなり広くてよい。
【００５６】
（β／α）８バレルにおける８つのセントラルβ‐ストランドは、多様に知られているアルファ‐アミラーゼ構造の間で良く重なり、構造のこの部分は、β‐ストランドのＣ末端に位置する活性部位の閉ざされた環境を含み、異なるアミラーゼ間で高い類似性を示す。
【００５７】
β‐ストランド及びα‐ヘリックスを接続するループは、ターマミル様アルファ‐アミラーゼ及び真菌類のアルファ‐アミラーゼの間で高い変化を示す。これらのループは、活性部位の構造的内容を構築し、基質への接触の多くが、これらのループに位置する残基間でみられる。基質特異性、基質結合、ｐＨ／活性プロファイル、デンプン分解パターンなど重要な特徴が、これらのループ内の同じ位置のアミノ酸により決定される。
【００５８】
３．２  ドメインＢ
ドメインＢは、多くの荷電した残基を含むコンパクトなドメインである。Ｂドメインは、ドメインＡのストランド３及びヘリックス３の間のループの延長として生じ、少なくとも一つの長いループ構造を含み、‐１、＋３、‐１Ｘ、＋２の結合性を有する５‐ストランド逆平行β‐シート構造を含む。Richardson,  Adv.  Protein  Chem.  34,  167-339  (1981)を参照願いたい。
【００５９】
ドメインＢの最初の４つのストランドは、二つのヘアピンループを形成し、ヘアピンループは、一対の交叉した指（右手まき）のように互いにまきつく。主鎖はβ‐ストランドへ折りたたみ、二つの小さなβ‐シート構造に接続する。一つのシートで一回転した後、それは、折りたたみ、ドメインＡとアルファ‐アミラーゼ構造中内部の穴に接続する二つのストランドシートを作る。主鎖は、第一の二つのシートにほとんど垂直に小さなシート構造まで折りたたむ。β‐ストランド３の頂点でヘリックス３に入る前に、ドメインＢにおける最後の約２４アミノ酸は、ドメインＡへの接触領域で、二つのカルシウム結合部位を形成する。
【００６０】
ドメインＢは、二つのペプチドストレッチによりドメインＡと接続し、二つのペプチドストレッチは、ドメイン‐ドメイン接触領域を二つに分割する。ドメインＢは、カルシウム結合領域及び水分子を含む内部に埋め込まれる穴によりドメインＡと接触する。分子接触の多くのタイプが存在する。酸アミノ酸と塩基アミノ酸の間でのイオン性相互作用は可能であり、これらの相互作用は、高いｐＨにて全体的な安定性にかなり重要であり、カルシウム結合部位を損なわないよう維持するために重要である。
【００６１】
３．３.  ドメインＣ
ドメインＣは、アミノ酸３９４−４８３からなるタンパク質のＣ末端部分である。ドメインＣは、もっぱらβ‐ストランドからなり、それ自身で折りたたむ単一な８−ストランドシート構造を形成する。従って、そのシート構造は、β‐サンドウィッチ構造として記載されてよい。ストランド６及び７がゆるく接続しているのみであるが、連結性は、＋１，＋１，＋５，−３，＋１，＋１，−３である。β‐シートのある部分は、ドメインＡの接触部分を形成する。
【００６２】
３．４．  Ｃａ２＋結合部位及びＮａ＋結合部位
カルシウムイオンの一つが、大変弱い配位を表すけれども、ターマミル様アルファ‐アミラーゼの構造は、４つのカルシウム結合部位及び一つのナトリウム‐結合部位を含む。カルシウムイオンの二つは、三つのイオンの直線クラスターの部分を形成し、中央のイオンは、ドメインＡとＢの接合点に存在するナトリウムに寄与する。
【００６３】
活性部位に最も近いカルシウムについて、His235及びAsp194からのカルボニル骨格、Asp194、Asn102及びAsp200残基からの側鎖原子、及び１水分子がカルシウムに結合する。ナトリウムイオンについて、結合部位は、Asp194、Asp200、Asp183及びAsp159及びVal201からのカルボニル骨格を含む。ドメインＡとＢ間のカルシウム結合部位は、Asp204とAsp159、Asp183とAla181からのカルボニル骨格、Asp202からの原子、及び１水分子を含む。
【００６４】
あるカルシウムイオンはドメインＡとＣの間に位置し、別のカルシウムは、ドメインＣに位置する。第一に述べたカルシウムは、Gly300、Tyr302及びHis406からのカルボニル骨格、Asp430からの原子、Asp407からの原子、及び１水分子と結合する。弱く配位されるカルシウム部位は、４つの水分子、及びGlu447とAsn444からの原子を含む。
【００６５】
４．  ハイブリッドアミラーゼ
本発明のハイブリッドアミラーゼは、単離された及び／又は精製されたものでよい。ハイブリッドアミラーゼは、第一のアルファ‐アミラーゼのＮ末端フラグメント及び第二のアルファ‐アミラーゼであって、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼのＣ末端フラグメントを含む。ある実施態様においては、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼは、ターマミル様アミラーゼである。具体的な実施態様においては、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼは、ＡｍｙＳである。ある実施態様においては、第一の及び第二のアミラーゼは、約６０％未満の配列同一性を共有してよい。例えば、それらのアミラーゼは、約５０％、４０％、３０％、又は２０％未満の配列同一性を共有してよい。第一のアルファ‐アミラーゼ配列は、ハイブリッドアミラーゼのアミノ酸配列の少なくとも約１０％、しかし８０％以下を含む。多様な実施態様においては、第一のアルファ‐アミラーゼ配列は、ハイブリッドアミラーゼのアミノ酸残基の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は１０％−８０％の間の任意の整数値を含む。
【００６６】
ハイブリッドアミラーゼを用いる時、第一のアルファ‐アミラーゼ配列は、ハイブリッドアミラーゼ中に置換されるバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼの一部又はすべてに対応する部分と保存される３Ｄ構造を維持する。第一のアルファ‐アミラーゼは、古細菌アルファ‐アミラーゼでよい。古細菌アルファ‐アミラーゼは、ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＡＡＭ４８１１５．１  (配列番号１１)に記載されるウルトラシン（Ｕｌｔｒａｔｈｉｎ）を含む。ウルトラシン（Ｕｌｔｒａｔｈｉｎ）のような古細菌アルファ‐アミラーゼは、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アミラーゼ中のＣａ２＋‐Ｎａ＋‐Ｃａ２＋結合部位のようにドメインＢの同じ一般的な位置にてＺｎ２＋結合部位を有する。Ｃａ２＋は、古細菌アルファ‐アミラーゼの安定性又は活性に全く影響しない。ウルトラシン（Ｕｌｔｒａｔｈｉｎ）は、図１に示すようにＡｍｙＳと比較的弱い配列同一性を示す。しかし、ウルトラシン（Ｕｌｔｒａｔｈｉｎ）は、３Ｄ構造レベルにてＡｍｙＳに比較的高い類似性を表示する。
【００６７】
図５は、代表的なハイブリッドアミラーゼの３Ｄ構造の立体構造を示す。構造は、実施例中下記に説明する一連のモデリングアルゴリズムにより作成される。図５Ａにおいて、ドメインＢを黒で示す。図５Ｂにおいて、ＡｍｙＳのＮ末端残基をウルトラシン（Ｕｌｔｒａｔｈｉｎ）の１−１０４残基により置換する。ドメインＢの小さなフラクションのみが、この実施態様において置換される。図５Ａにおける野生型ＡｍｙＳ構造と図５Ｂにおけるハイブリッドアミラーゼの３Ｄの構造の比較により、ハイブリッドアミラーゼに保存される高い割合の３Ｄ構造を実証する。図５Ｃに記載のハイブリッドアミラーゼ構造は、Ｎ末端ＡｍｙＳ残基がウルトラシン（Ｕｌｔｒａｔｈｉｎ）の１−２０９残基で置換されるハイブリッドを示す。ハイブリッドアミラーゼの全部の構造が、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）酵素に類似しながら、ハイブリッドアミラーゼ構造のすべてが、上記に定義される用語のように、必ずしも「保存される」必要はない。
【００６８】
ある実施態様においては、ハイブリッドアミラーゼは、ウルトラシンアルファ‐アミラーゼなど、古細菌アルファ‐アミラーゼのＺｎ２＋結合領域を含む。従って、ハイブリッドアミラーゼが、野生型バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アルファ‐アミラーゼの活性及び構造の安定性特性を維持しながら、ハイブリッドアミラーゼは、Ｃａ２＋の濃度への感受性が低くなってよい。例えば、ハイブリッドアミラーゼは、Ｚｎ２＋結合部位を含むウルトラシンの部分に融合するＡｍｙＳのＣ末端部分を含む。この線に沿う、具体的なハイブリッドは、ウルトラシン（ＵＴ）アルファ‐アミラーゼのドメインＢの多様な部分を含む。
ハイブリッドA:  UT  1-104:  AmyS  100-483  (配列番号1);
ハイブリッドB:  UT  1-113:  AmyS  109-483  (配列番号2);
ハイブリッドC:  UT  1-128:  AmyS  140-483  (配列番号3);
ハイブリッドD:  UT  1-145:  AmyS  161-483  (配列番号4);
ハイブリッドE:  UT  1-163:  AmyS  203-483  (配列番号5);
ハイブリッドF:  UT  1-175:  AmyS  215-483  (配列番号6);
ハイブリッドG:  UT  1-191:  AmyS  228-483  (配列番号7);及び
ハイブリッドH:  UT  1-209:  AmyS  246-483  (配列番号8)。
【００６９】
ハイブリッドアミラーゼは、アミラーゼに改変されたＣａ２＋要求性、増加した熱安定性、改変された特異的活性、改変されたエンド‐又はエキソ‐アミラーゼ活性、又は改変された最適ｐＨなど、改善された特性を提供するように組み換え操作されてよい。
【００７０】
また、本発明は、ハイブリッドアミラーゼをコードする核酸も提供する。ハイブリッドアミラーゼをコードする核酸は、配列番号１、配配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、又は配列番号８のタンパク質をコードするｃＤＮＡでよいが、これらに限定されない。当業者が周知なように、遺伝子コドンは縮重し、ある場合複数のコドンが同じアミノ酸をコードしてよい。核酸は、ハイブリッドアミラーゼをコードするゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びｃＤＮＡを含む。ハイブリッドアミラーゼをコードする核酸の例は、配列番号２０−２７を含み、それぞれ、配列番号１−８のハイブリッドアミラーゼをコードする。
【００７１】
４．１．  変異体配列を有するハイブリッドアミラーゼ
ある実施態様においては、ハイブリッドアミラーゼを含む配列は、天然の又は野生型配列の変異体である。ある態様においては、第一アミラーゼに対応するハイブリッドのフラグメントのみが、同じ隣接する残基についてその天然配列に対して変異体である。別の態様においては、バシルス  （Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アミラーゼに対応するハイブリッドのフラグメントのみが、同じ隣接する残基についてその天然配列に対して変異体である。例えば、ＡｍｙＳ配列は、配列番号１１に記載のＣ末端欠失を有するＡｍｙＳから選択されてよく、欠失は、デンプン結合ドメインを除去している。いくつかの実施態様においては、宿主細胞は、配列番号１−８と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一性を有するアミノ酸配列を用いて折りたたみセグメント融合変異体を発現するように遺伝子組み換えされる。
【００７２】
アミラーゼ及びその変異体の遺伝子的修飾及び組換え体の生産の方法は、当分野で周知であり、米国特許第７，１６６，４５３、６，８９０，５７２、及び６，６６７，０６５に記載されるものを含む。コードポリヌクレオチド配列の調製、プライマー、ベクター、選別方法、宿主細胞、発現されたアミラーゼ変異体の精製及び再構築、並びに有用な緩衝液、ｐＨ範囲、酵素試験のための基質濃度及び酵素濃度を含む変異体の特徴づけは、すべて当分野に周知である。変異体配列を含むハイブリッドアミラーゼは、本明細書に記載のように、当分野で周知な方法に従って、合成的に又は宿主細胞中の組換え体の発現を通しても生産できる。
【００７３】
５．０  折りたたみセグメント融合の精製
５．１  ベクター
いくつかの実施態様においては、上記に記載のものなど、ハイブリッドアミラーゼの変異体を含むハイブリッドアミラーゼをコードする核酸を含むＤＮＡ構築体は、ハイブリッドアミラーゼコード配列に作動可能に結合する調節配列を含む発現ベクターの宿主細胞に形質転換される。ベクターは、宿主細胞へ組み込むことができる及び宿主細胞へ導入される時複製することができる任意のベクターでよい。好適な発現及び／又は組み込みベクターの追加的例は、Sambrook他、MOLECULAR  CLONING:  A  LABORATORY  MANUAL,  3rd  ed.,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  Cold  Spring  Harbor,  New  York  (2001);  Bennett他、MORE  GENE  MANIPULATIONS  IN  FUNGI,  Academic  Press,  San  Diego  (1991),  pp.  396-428;  及び米国特許第5,874,276に記載される。ベクターの例は、pFB6、pBR322、PUC18、pUC100及びpENTR/D、pDON（商標）201、pDONR（商標）221、pENTR（商標）、pGEM（商標）3Z及びpGEM（商標）4Zを含む。細菌細胞中で用いる例は、pBR322及びpUC19を含み、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）及びpE194に複製でき、例えば、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）中に複製できる。
【００７４】
いくつかの実施態様においては、ハイブリッドアミラーゼをコードする核酸は、適切なプロモーターに作動可能に結合し、宿主細胞において転写を可能とする。プロモーターは、宿主細胞に相同的でもあるいは非相同的でもタンパク質をコードする遺伝子由来でよい。好適なプロモーターの例は、cbh1、cbh2、egl1、及びegl2プロモーターを含むが、これらに限定されない。ある実施態様においては、プロモーターは、宿主細胞に本来あるものでよい。例えば、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞は発現宿主細胞の場合、プロモーターは、本来あるバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロモーターである。「誘導プロモーター」は、環境的調節又は発生的調節下にて活性であるプロモーターである。別の実施態様においては、プロモーターは、宿主細胞に異種のものである。
【００７５】
幾つかの実施態様においては、コード配列は、シグナル配列に作動可能に結合する。シグナル配列をコードするＤＮＡは、発現されるハイブリッドアミラーゼ核酸と自然に結合するＤＮＡ配列でよい。他の実施態様においては、シグナル配列をコードするＤＮＡは、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）以外の種由来のシグナル配列をコードするヌクレオチド配列で置換される。本実施態様においては、シグナル配列をコードするポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのすぐ上流およびイン‐フレームである。シグナル配列は、宿主細胞と同じ種から選択されてよい。例えば、シグナル配列は、バシルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）由来シクロデキストリングルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ；ＥＣ  ２．４.１．１９）シグナル配列であるが、これに限定されず、ハイブリッドアミラーゼはバシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主細胞中に発現される。メチオニン残基をシグナル配列のＮ末端に加えてよい。
【００７６】
追加的な実施態様においては、真菌宿主細胞へ導入されるＤＮＡ構築体又はベクターを含むシグナル配列及びプロモーター配列は、同じ起源由来である。幾つかの実施態様においては、発現ベクターは、ターミネーション配列も含む。ある実施態様においては、ターミネーション配列及びプロモーター配列は、同じ起源由来である。別の実施態様においては、ターミネーション配列は、宿主細胞と相同的である。
【００７７】
幾つかの実施態様においては、発現ベクターは、選択マーカーを含む。好適な選択マーカーの例は、例えば、ハイグロマイシン又はフレオマイシンのような抗菌剤に抵抗性を与えるものを含む。また、栄養選択マーカーも適しており、amdS、argB、及びpyr4を含む。ある実施態様においては、選択マーカーは、amdS遺伝子であり、これは、酵素アセタミダーゼをコードし、形質転換細胞が栄養源としてアセトアミド上で成長することができる。選択マーカーとしてアスペルギルス  ニドゥラン（Ａ．  ｎｉｄｕｌａｎｓ）amdS遺伝子の使用が、Kelley他、(1985)  EMBO  J.  4:  475-479及びPenttila他、(1987)  Gene  61:  155-164に記載される。
【００７８】
ハイブリッドアミラーゼをコードするポリヌクレオチドを用いたＤＮＡ構築体を含む好適な発現ベクターは、所定の宿主生物中に自己複製できる又は宿主生物のＤＮＡに組み込むことができる任意のベクターでよい。幾つかの実施態様においては、発現ベクターはプラスミドである。幾つかの実施態様においては、ｃＤＮＡの発現を獲得するための発現ベクターの二つのタイプが考えられる。第一の発現ベクターは、ＤＮＡ配列を含み、プロモーター、ハイブリッドアミラーゼコード領域、及びターミネーターすべてが発現されるべきｃＤＮＡ由来である。幾つかの実施態様においては、それ自身の転写及び翻訳調節配列の制御下にて発現されるべきドメインを残すために、遺伝子欠失は、例えば、Ｃ末端デンプン結合ドメインコードするＤＮＡなど、望まないＤＮＡを欠失することにより得られる。発現ベクターの第二のタイプは、組み込み済みであり、高いレベルの転写及び選択マーカーを必要とする配列を含む。幾つかの実施態様においては、ハイブリッドアミラーゼｃＤＮＡ又はその一部のコーディング領域は、発現構築プロモーター及びターミネーター配列の転写制御下になるようにこの汎用の発現ベクターへ挿入される。幾つかの実施態様においては、遺伝子又はその一部は、強いｃｂｈ１プロモーターの下流に挿入される。
【００７９】
５．２  宿主細胞の形質転換、発現、及び培養
宿主細胞へＤＮＡ構築体又はベクターの導入は、形質転換、エレクトロポレーション、核マイクロインジェクション、形質導入、例えば、リポフェクション仲介トランスフェクション及びＤＥＡＥ‐デキストリン仲介トランスフェクションのようなトランスフェクション、リン酸カルシウムでインキュベーションするＤＮＡ沈殿、ＤＮＡコートマイクロプロジェクタイルを用いる高速衝撃、及びプロトプラスト融合などの方法を含む。一般的な形質転換技術は、当分野で周知である。Ausubel他、(1987),  上記,  chapter  9;  Sambrook他、  (2001),  上記;  及びCampbell他、  (1989)  Curr.  Genet.  16:  53-56を参照願いたい。トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）における異種のタンパク質の発現は、例えば、米国特許第６，０２２，７２５;米国特許第６，２６８，３２８;  Harkki他、(1991)  Enzyme  Microb.  Technol.  13:  227-233;  Harkki他、(1989)  BioTechnol.  7:  596-603;  ＥＰ  ２４４，２３４;  及びＥＰ  ２１５，５９４に記載される。ある実施態様においては、一般的に好適な形質転換体は、ベクター系で構築され、それによりハイブリッドアミラーゼをコードする核酸が宿主細胞染色体へ安定的に組み込まれる。形質転換体は、それから周知の方法により精製される。
【００８０】
amdSマーカーを含む安定な形質転換体は、アセトアミドを含む固相培養培地の上で、速い成長速度及びデコボコの輪郭よりむしろデコボコのない円状のコロニーの形成という点で非安定的な形質転換体と異なるが、これらに限定されない。追加的に、ある場合、安定性の更なる試験は、例えば、アセトアミド欠損培地など、固相非選択的培地上で形質転換体を成長し、この培養培地から胞子を採取し、その次に、アセトアミド含有選択培地上で発芽し成長するこれらの胞子の割合を決定することにより導入される。当分野で知られている他の方法を形質転換体を選別するために用いてよい。
【００８１】
宿主細胞の例は、バシルス  スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシルス  レンツス（Ｂ．  ｌｅｎｔｕｓ）、バシルス  ブレビス（Ｂ．  ｂｒｅｖｉｓ）、バシルス  ステアロテルモフィルス（Ｂ．  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バシルス  アルカロフィリス（Ｂ．  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バシルス  アミロリケファシエンス（Ｂ．  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バシルス  コアグランス（Ｂ．  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バシルス  サーキュランス（Ｂ.  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バシルス  ラウツス（Ｂ．  ｌａｕｔｕｓ）、バシルス  ツリンギエンシス（Ｂ．  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、ストレプトミセス  リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）又はストレプトミセス  ムリナス（Ｓ．  ｍｕｒｉｎｕｓ）など、グラム陽性菌又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）又はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種などグラム陰性菌を含む。
【００８２】
６．０  ハイブリッドアミラーゼの生成及び特徴
６．１．  ハイブリッドアミラーゼを精製する方法
一般的に、細胞培養で生成されるハイブリッドアミラーゼは、培地へ分泌され、例えば、細胞培養培地から不必要な成分を除去することにより、精製及び単離されてよい。ある場合、ハイブリッドアミラーゼは、細胞溶解物から除かれてよい。そのような場合、ハイブリッドアミラーゼは、当業者により通常使用される方法を用いてハイブリッドアミラーゼが細胞内で生成された細胞から精製される。タンパク質精製の例は、親和性クロマトグラフィー、高分解能イオン交換を含むイオン交換クロマトグラフィー法、疎水性相互作用クロマトグラフィー、二相分配、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上又はＤＥＡＥなど陽イオン交換樹脂上のクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫酸アンモニウム、及び例えばセファデックスＧ−７５を用いるゲルろ過を含むが、これらに限定されない。タンパク質精製の他の方法は、当分野で周知であり、広く入手可能である。
【００８３】
６．２．  ハイブリッドアミラーゼ活性の同定
宿主細胞中のハイブリッドアミラーゼの発現を評価するために、アッセイを発現タンパク質、対応するｍＲＮＡ、又はアルファ‐アミラーゼ活性を測定するために用いることができる。アッセイの例は、ノーザン及びサザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ（リバーストランスクリプターゼポリメラーゼチェーン反応）、及び適切なラベル化ハイブリダイズプローブを用いるインサイチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーションを含む。また、アッセイは、サンプル中のハイブリッドアミラーゼ活性を測定することも含む。発現されたハイブリッドアミラーゼのエキソ‐活性用のアッセイは、ベタミル（商標）（Ｂｅｔａｍｙｌ）アッセイ(Ｍｅｇａｚｙｍｅ,  Ｉｒｅｌａｎｄ)を含むが、これに限定されない。ハイブリッドアミラーゼのエンド‐活性の好適なアッセイは、ファデバス（商標）（Ｐｈａｄｅｂａｓ）アミラーゼ試験(Ｍａｇｌｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ)を含むが、これに限定されない。アッセイは、ハイブリッドアミラーゼ存在下で調製される液体のＨＰＬＣ分析も含む。ＨＰＬＣは、アッセイの他の成分からＤＰ−３及びＤＰ−４を分離することによりアミラーゼ活性を測定するために用いることもできる。
【００８４】
６．３  ハイブリッドアミラーゼ変異体特徴
ハイブリッドアミラーゼは、それらの核酸及びプライマリーポリペプチド配列により、３次元構造モデリングにより、及び／又はそれらの特異的活性により特徴づけられ得る。ハイブリッドアミラーゼの追加的な特徴は、例えば、安定性、ｐＨ範囲、酸化安定性、及び熱安定性を含む。発現及び酵素活性のレベルは、当業者に知られる標準アッセイを用いて評価され得る。別の態様においては、変異体は、高温、例えば、６５−８５℃にて、改善された安定性など、野生型酵素と比較して、改善された性能特性を実証される。ハイブリッドアミラーゼは、液化又は焼成など高温を要求する他の方法において用いるのに有用である。例えば、熱安定性ハイブリッドアミラーゼは、約５５℃から約８５℃以上の温度にてデンプンを分解できる。
【００８５】
発現特徴は、変異体が特定の宿主細胞で生成される時、変異体の発現の改変されたレベルを意味する。一般的に、発現は、所定の一回の量以上の周知の標準方法を用いて発酵ブロスから回収できる活性変異体の量に関連する。発現は、宿主細胞内で生成され又は宿主細胞により分泌される変異体の量又は速度にも関連する。発現は、変異体酵素をコードするｍＲＮＡの翻訳の速度にも関連できる。
【００８６】
本発明は、本明細書に記載の任意のハイブリッドアミラーゼをコードする核酸に相補的な核酸を提供する。さらに、本発明は、相補体にハイブリダイズすることができる核酸も提供する。別の実施態様においては、本明細書に記載の方法及び組成物に用いるための配列は、合成の配列である。配列は、酵母など宿主生物体に発現するために最適コドン使用を用いてつくられる配列を含むが、これに限定されない。
【００８７】
７．  ハイブリッドアミラーゼの組成物及び使用
本明細書に記載の方法によって生成されかつ精製されたハイブリッドアミラーゼは、様々な工業的利用に有用である。特定のハイブリッドアミラーゼを使用するのがどれ程望ましいかは、特定用途における必要性に関してハイブリッドアミラーゼによって表示される全体的な特性に依存するだろう。
【００８８】
ある実施態様においては、ハイブリッドアミラーゼは、デンプン変換方法に、特に、デンプン、例えばコーンスターチ、小麦デンプン、大麦デンプンの液化方法に役立つ。所望の最終生成物は、デンプン基質の酵素変換によって生産されてよい任意の生成物でよい。例えば、所望の生成物は、発酵に有用な糖類、特にマルトトリオース、グルコースおよび／またはマルトースが豊富なシロップでよい。
【００８９】
バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アミラーゼは、通常３０−４０％ｗ／ｗ乾燥固体（ｄｓ）を含んでよいデンプン懸濁液のマルトデキストランへの分解を触媒するために用いられる。典型的に、液化は、高い温度、例えば、９０−１００℃にて導入されるので、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アミラーゼなど熱安定アルファ‐アミラーゼが、この工程に好ましい。典型的に、バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アミラーゼは、大量のグルコースを生成しない。そのかわりに、得られる液化物は、低いデキストロース当量（ＤＥ）を有し、高い重合度（ＤＰｎ）でマルトース及び糖を含む。
【００９０】
従って、液化物は通常追加的な糖化反応であり、グルコアミラーゼ及び／又はマルトジェニックアルファ‐アミラーゼより触媒されてよい。これらの酵素は、液化後、形成されたマルトデキストランの非還元末端の加水分解を触媒し、Ｄ‐グルコース、マルトース、及びイソマルトースを放出する。糖化はグルコースに富んだまたは高マルトースシロップを生成する。前者の場合、グルコアミラーゼは、典型的に酸性条件下、高温にて、例えば、６０℃、ｐＨ４．３で糖化を触媒する。典型的に、この方法に用いるグルコアミラーゼは、例えば、Ｏｐｔｉｄｅｘ（商標）Ｌ４００において用いられるアスペルギルス  ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ又はフミコーラ  グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）グルコアミラーゼなど、菌類から得られる。脱‐分岐酵素、プルラナーゼなどは、糖化に添加することができる。しかしながら、一般的にグルコアミラーゼは、Ｃａ２＋存在下十分に働かない。この理由のために、液化工程でのバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）アミラーゼの最適な活性をサポートするために用いるＣａ２＋は、時間を費やす操作で糖化前に除去しなければならない。
【００９１】
本明細書に記載のハイブリッドアミラーゼは、デンプンを液化する方法に用いる場合に特に、有益性がある。本発明のハイブリッドアミラーゼの幾つかは、活性にＣａ２＋を必要としないので、それらは、添加されるＣａ２＋非存在下デンプンを液化するために用いることができる。それから、液化デンプンは、グルコアミラーゼで、最初のＣａ２＋除去の必要性無しに、全体の反応を速くし、糖生産の効率を増加して、直接的に糖化することができる。
【００９２】
多様な修飾及び変更が、意図する使用の精神又は範囲を逸脱せずに、同じものを使用する組成物及び方法になされることは当業者に明らかである。従って、その修飾及び変更は添付された特許請求の範囲及びそれらの均等物の範囲内である。
【実施例】
【００９３】
実施例１
１．１．  アミラーゼ構造のアライメント
予備段階において、バイロコッカス  ヴェッセイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｅｉ）アミラーゼ（ＰＤＰ  受託番号  １ＭＸＧ）の３Ｄ構造をＡｍｙＳ（ＰＤＢ  受託番号  １ＨＶＸ）の３Ｄ構造とアラインした。それから、古細菌アルファ‐アミラーゼｄｅｓ−Ｍｅｔ  Ｕｌｔｒａｔｈｉｎ  (ＧｅｎＢａｎｋ（商標）受託番号ＡＡＭ４８１１５．１;  配列番号９)３Ｄ構造をガイドとしてバイロコッカス  ヴェッセイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｅｉ）構造を用いて決定した。ウルトラシン（Ｕｌｔｒａｔｈｉｎ）は、正確な３Ｄ構造モデルの構築を容易にする、バイロコッカス  ヴェッセイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｅｉ）アミラーゼと高いレベルの配列同一性（８６．７％）を共有している。モデリングをＣｌｕｓｔａｌＷプログラムで実施した。Thompson他、Nucleic  Acids  Res.  22:  4673-46  (1994)を参照願いたい。
【００９４】
最終的に、des-Met  Ｕｌｔｒａｔｈｉｎ構造をＣｌｕｓｔａｌＷを用いてＡｍｙＳとアラインした。最後の重ね合わせは、互いに約１ÅのＲＭＳＤとアラインしたアルファ炭素に基づいた。０．５ÅのＲＭＳＤを有するアルファ炭素を有するアラインした残基は、ハイブリッドアミラーゼにおけるＡｍｙＳ配列及びウルトラシンを結合する好ましい位置として同定した。
【００９５】
１．２．  ハイブリッド構築及び発現
ハイブリッドアミラーゼをコードする核酸を設計し、構築した。この実施例においては、配列番号１−８のハイブリッドアミラーゼは表２に示す省略形を有する。残基数の前及び後の括弧は、融合タンパク質において結合するアミノ酸残基を示す。ウルトラシン及びＡｍｙＳの完全長配列に関してこれらの残基の位置は、それぞれ、図３及び図４に示す。括弧内のウルトラシン残基は、式（Ｉ）、Ａ−ｘ−ｙ−Ｂ中の残基ｘを表し、ここで、括弧内のＡｍｙＳ残基は、式（Ｉ）中の残基ｙを表す。
【００９６】
【表２】
0005548698.tif 000003
【００９７】
ハイブリッドＡを当分野で周知な標準的方法を用いて化学的に合成した。ハイブリッドＡは、残りのハイブリッド中のクローンに対して骨格として用いた。ハイブリッドＡをコードする核酸は、１５５１塩基の長さであり、１１９９位にてＢｓｓＨＩＩ制限酵素部位を含む。残りのハイブリッド遺伝子をＢｓｓＨＩＩ制限酵素部位まで合成した。なぜなら、それらがすべてこの制限酵素部位から遺伝子の終わりまでＤＮＡの同じ配列を含むからである。これにより、ＢｓｓＨＩＩ部位までハイブリッドＡ骨格を含むベクターへクローニングすることが容易になる。
【００９８】
プラスミドを下記の要素を含むように構築した。
ベータ  ラクタマーゼ遺伝子であって、アンピシリン／カルベニシリン耐性を獲得する、
バシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡｐｒＥ（アルカリプロテアーゼ）プロモーターであって、宿主ゲノムへの組み込みを促進するバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）宿主染色体に相同的な領域を有する、
バシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡｐｒＥシグナル配列、
ハイブリッドアミラーゼコード核酸、
バシルス  リチェニフォルミス（Ｂ．  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＬＡＴ（リチェニフォルミス（ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）アミラーゼ熱耐性）ターミネーター、
クロラムフェニコール耐性のためのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、及び
複製の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）オリジン
【００９９】
ハイブリッドアミラーゼをコードする核酸を下記のプライマーでＰＣＲを用いて増殖した。
PstI-NheI-F:    ctcagctctgcagctagcgcagcaa    (配列番号12)
BssHII-Ethyl  Rev:    gtgtggaattgtgagcggcca    (配列番号13)
ＰＣＲ反応内容物は、５μＬのｐＦＵ  ウルトラバッファー（ＵｌｔｒａＢｕｆｆｅｒ）  (１０Ｘ)、42μＬのＨ２Ｏ、０．５μＬのプライマー:  PstI-NheI-F、０．５μＬのプライマー:  BssHII-Ethyl  Rev、１μＬのロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）  ｄＮＴＰ‘ｓ(５ｍＭ  保存溶液)、１μＬのハイブリッドＤＮＡ及び１μＬのｐＦＵ  Ｕｌｔｒａ  ＨＦ  ＤＮＡポリメラーゼを含んだ。ＰＣＲプログラムサイクルは、サーマルサイクラー(ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（商標）  ＰＴＣ−２００  Ｐｅｌｔｉｅｒ)を用いて、９５℃にて１分、１８ｘ  (1分９５℃、１分６０℃、２分、２０秒６８℃)、続いて６８℃にて７分及び４℃にてホールドであった。
【０１００】
増幅された１．５Ｋｂフラグメントをキアゲン（商標）キアクイック（Ｑｉａｇｅｎ  Ｑｉａｑｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。プラスミドｐＪＨ１０１、バシルス  スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中の発現のための組み込みベクター（Ferrari  他、J.  Bacteriol.  154:  1513-15  (1983)）をすべてのハイブリッドアミラーゼの発現のために使用した。ハイブリッドＡ遺伝子及び組み込みベクター（ｐＪＨ１０１）を付着末端を作成するためにＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｈｅＩ制限酵素で両者をダブル消化し、ハイブリッドＡ遺伝子をＴ４  ＤＮＡリガーゼＤＮＡライゲーションキット(タカラバイオ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）カタログ番号６０２３  ｋｉｔ)を用いてｐＪＨ１０１にライゲートした。トップ１０コンピテント大腸菌（Ｅ.  ｃｏｌｉ）細胞(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)の１００μＬを５μＬライゲーション反応で形質転換し、ＬＡ(Ｌｕｒｉａアガー)＋５０ｐｐｍカルベニシリン上に移し、３７℃にて一晩インキュベーションした。細菌のコロニーが成長した後、個々のコロニーをＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ製ｐｕＲｅＴａｑ  Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ＰＣＲ  Ｂｅａｄｓ（商標）を用いてコロニーＰＣＲを実施するために選択した。コロニーを採取し、直接ＰＣＲチューブに移した。ＰＣＲプライマーは下記を用いた。
pAprBbsGTG-201-fwd:  agcgagagatgatataccta    (配列番号14)
pJH101-end-rev:  tttcggcgtgggtatggtggc    (配列番号15)
各ＰＣＲ反応由来のＤＮＡをアガロースゲル上で分離し、コロニーＰＣＲがうまくいっていることを確認した。
【０１０１】
コロニーを下記のプライマーを用いてＤＮＡ配列分析のためにＱｕｉｎｔａｒａＢｉｏ  (Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，  ＣＡ)へ送付した。
pAprBbsGTG-201-fwd:  agcgagagatgatataccta    (配列番号14)
pJH101-end-rev:  tttcggcgtgggtatggtggc    (配列番号15)
Et538-fwd:  ggtggacgccgtcgaagtcaat    (配列番号16)
Et1130-F:  cgcacgttaatgaccaatacac    (配列番号17)
【０１０２】
残りのハイブリッドをハイブリッドＡベクターを用いてクローン化した。ハイブリッドＢ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、及びＨの遺伝子を直接Ｇｅｎｅ  Ｏｒａｃｌｅ  Ｉｎｃ．により供給されたベクターから切断した。手短に言うと、Ｇｅｎｅ  Ｏｒａｃｌｅ  Ｉｎｃ．より供給された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）突刺培養をＬＡ＋５０ｐｐｍカルベニシリンプレート上へストリークし、培地を３７℃にて終夜培養した。これらの培地からのＤＮＡをキアゲンミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ）を用いて調製した。
【０１０３】
ハイブリッドＢ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、及びＨを付着末端を作成するためにＢｓｓＨＩＩ及びＮｈｅＩ制限酵素で両者をダブル消化した。これらの付着末端によりハイブリッド遺伝子がハイブリッドＡの骨格ベクターへ直接ライゲーションできる。ハイブリッド遺伝子をキアゲンゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いてゲルから抽出しかつ精製をした。ハイブリッド遺伝子をＴ４  ＤＮＡリガーゼＤＮＡライゲーションキット(タカラバイオ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）カタログ番号６０２３  ｋｉｔ)を用いてハイブリッドＡの骨格ベクターにライゲートした。
【０１０４】
ハイブリッドＤの遺伝子は下記プライマーを用いて増殖した。
PstI-NheI-F:  ctcagctctgcagctagcgcagcaa    (配列番号18)
BssHII-Eth-new2R:  gacgacgagcgcgcgatcagaag    (配列番号19)
ＰＣＲ反応内容物は、５μＬのpFU  ウルトラバッファー（ＵｌｔｒａＢｕｆｆｅｒ）  (１０Ｘ)、４２μＬのＨ２Ｏ、０．５μＬのプライマー:  PstI-NheI-F、０．５μＬのプライマー:BssHII-Eth-new2R、1μＬのロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）  ｄＮＴＰ‘ｓ(５ｍＭ  保存溶液)、1μＬのUltra-EthylハイブリッドＤＮＡ及び1μＬの  ｐＦＵ  Ｕｌｔｒａ  ＨＦ  ＤＮＡポリメラーゼを含んだ。ＰＣＲプログラムサイクルは、サーマルサイクラー(ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（商標）  ＰＴＣ−２００  Ｐｅｌｔｉｅｒ)を用いて、９５℃にて２分、１８ｘ(１分９５℃、１分５６℃、１分、１５秒、６８℃にて)、１分、１５秒、６８℃に続いて４℃にてホールドであった。
【０１０５】
一般的に、特定の遺伝子のＰＣＲ実施後、反応物ごとに約２−５μＬのみをアガロースゲル上にて分析しＤＮＡが正確に増幅したことを確認する。もとの反応物の残りをキアゲンＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いて精製した。しかし、この場合、二つのバンドが、分析したゲル上に見られた。従って、全ＰＣＲ反応物をアガロースゲルに投与して正確なＤＮＡの長さ（〜１１００塩基ペア）に対応するバンドを抽出し精製した。ＤＮＡをキアゲンゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いてゲルから単離した。
【０１０６】
続いて、精製した直線フラグメント（〜１１００塩基ペア）をBssHII及びNheI酵素を用いて連続的に消化した。全サンプルをキアゲンＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いて精製した。ハイブリッドＡの骨格ベクターも同様に消化し、キアゲンゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を用いてゲル抽出した。ハイブリッドＤ遺伝子をタカラバイオ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ）―ロット番号６０２３  ｋｉｔを用いてハイブリッドＡの骨格ベクターにライゲートした。トップ１０コンピテント大腸菌（Ｅ.  ｃｏｌｉ）細胞(Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)を５μＬの各ライゲーション反応物で形質転換し、形質転換反応物をＬＡ＋５０ｐｐｍカルベニシリンプレート上に移し、３７℃にて一晩インキュベーションした。
【０１０７】
ハイブリッドＢ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、及びＨのライゲーション反応物を取扱説明書に従って、ローリングサークルアンプリフィケーション  テンプリフィキット（Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  （ＲＣＡ）  ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ  ｋｉｔ）(AmershaＭ４１Ｓ  カタログ番号  ２５  ６４００)を用いて増幅した。トップ１０コンピテント大腸菌（Ｅ.  ｃｏｌｉ）細胞  (Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)を５μＬの各ライゲーション反応物で形質転換し、形質転換反応物をＬＡ＋５０ｐｐｍカルベニシリンプレート上に移し、３７℃にて一晩インキュベーションした。
【０１０８】
単一なクローンをすべてのハイブリッド構築体の培地から選択した。コロニーＰＣＲをｐｕＲｅＴａｑ  Ｒｅａｄｙ−Ｔｏ−Ｇｏ  ＰＣＲ  Ｂｅａｄｓ  (ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ)を用いて単一コロニー上で行った。コロニーをＰＣＲ管へ直接採取した。用いたＰＣＲプライマーは、
pAprBbsGTG-201-fwd:  agcgagagatgatataccta    (配列番号14)
pJH101-end-rev:  tttcggcgtgggtatggtggc      (配列番号15)
であった。
【０１０９】
アガロースゲルで分析を行って、コロニーＰＣＲ反応がうまく行われたことを確認した。それから、下記プライマーを用いてシーケンシング分析をするためにコロニーをＱｕｉｎｔａｒａＢｉｏへ送付した。
pAprBbsGTG-201-fwd:  agcgagagatgatataccta    (配列番号14)
pJH101-end-rev:  tttcggcgtgggtatggtggc    (配列番号15)
Et538-fwd:  ggtggacgccgtcgaagtcaat    (配列番号16)
Et1130-F:  cgcacgttaatgaccaatacac    (配列番号17)
正しいＤＮＡ配列を有するクローンの液体培地を−８０℃にて全体積の１５％グリセロール中で凍らせた。
【０１１０】
プラスミドミニプレップをキアゲンミニプレップ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）キットを用いてクローンにて行った。５μＬプラスミドＤＮＡ(０．４-０．５μｇ)を１００μＬのBG6006バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細胞へ(フェノタイプ:  DaprE,  DnprE,  Depr,  DispA,  Dbpr,  Dvpr,  DwprA,  Dmpr-ybfJ,  DnprB,  degUHy32,  oppA,  DspoIIE3501,  amyE::xylRPxylAcomK-ermC)形質転換した。反応混合液を１時間３７℃にてシェーカーでインキュベーションし、１％不溶性コーンスターチ＋５ｐｐｍクロラムフェニコールプレート上に移し、３７℃にて終夜（少なくとも１６時間）インキュベーションした。プラスミドｐＪＨ１０１は組み換えベクター（バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）用複製のオリジンを欠損）であり、従って、宿主ゲノムへそれ自身を組み換えする能力を有する。プラスミド組み換えは、抗生剤の高い濃度で生存させるために、ベクターにそれ自身の複数のコピーをゲノムへ挿入させ、高い濃度の抗生剤上に細胞をプレート培養することにより達成された。特に、コロニーを１％不溶性コーンスターチ＋２５ｐｐｍクロラムフェニコールプレートＬＢプレート上に数回再ストリークした。この場合、ハイブリッドを全部で４回再ストリークした後、コロニーは、高い濃度の抗生剤に耐えるようになった。この段階にて、下記に記載のようにデンプンプレートアッセイを用いるアミラーゼ活性の試験がハイブリッドに対して行えるようになった。下記に記載するデンプンプレートアッセイは、プレートマトリックス内のデンプン濁り度の変化をデンプン加水分解の尺度として用いる。
【０１１１】
実施例２
２．１．  ハイブリッドアミラーゼの調製
バシルス  スブチリス（Ｂ．  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＧ６００６宿主細胞中にクローン化された異なるハイブリッドアミラーゼの新鮮なグリセロールストックを１％不溶性コーンスターチ＋２５ｐｐｍクロラムフェニコールプレートを含むＬＢプレート上にストリークし、３７℃にて終夜インキュベーションした。翌朝、出発培養物を５ｍＬの２５ｐｐｍクロラムフェニコールを含む培地中で培養した。出発培養物を３７℃にてシェーカー（２５０ｒｐｍ）で８時間１５分間培養させた。それから、３０μＬのこの前培養物を２５ｐｐｍクロラムフェニコールと５ｍＭ  ＣａＣｌ２を供給した３０ｍＬの培養培地（下記に記載）で満たした２５０ｍＬフラスコ中に加えた。振盪フラスコを２５０ｒｐｍにて混合しながら、３７℃にて６０−６５時間インキュベーションした。培養培地は主要な窒素源として尿素及び主要な炭素源としてグルコースを用い、丈夫な細胞成長のために１％ソイトンを補給したＭＯＰＳ緩衝液に基づく富栄養半‐規定培地であった。細胞培養後、培養物を二つのセットに分割した。セット１を本来のｐＨ７に維持し、セット２のｐＨを約１０．５へ上げた。各セット１からの２５ｍＬの細胞懸濁液を２０分間５０００ｒｐｍにて遠心分離し、細胞ペレットから上清中のタンパク質を分離した。セット２については、各培養物の１．５ｍＬを２ｍＬ遠心管へアリコートし、１−３μＬのＮａＯＨを添加しｐＨを１０．５へ上げた。サンプルを５分間１４，０００ｒｐｍにて遠心分離した。上清（目的タンパク質を含む）を清潔なチューブへ移し、アッセイの直前まで冷蔵庫に置いた。
【０１１２】
２．２．  アミラーゼ活性でのファデバスアッセイ
上記にように調製したハイブリッドアミラーゼを比色ファデバスアッセイを用いてアミラーゼ活性として試験し、ここでウルトラシンをコントロールとして用いた。アッセイの結果を図２に記載した。異なるアミラーゼハイブリッド（上記に記載のように調製）の振盪フラスコからの培養上清をデンプン基質結合ファデバス（商標）染色を用いるミリポアマルチスクリーン‐ＨＶプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ−ＨＶ  ｐｌａｔｅｓ）(＃ＭＡＨＶＮ４５５０)でアミラーゼ活性を試験した。Ｍａｇｌｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製ファデバス（商標）アミラーゼアッセイ錠剤を時折５‐１０分間ボルテックス混合を用いてアッセイ緩衝液（５０ｍｍ  マレイン酸Ｎａ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ５．２）に溶解した。タンパク質サンプルの各セットからの培養上清１５μＬを９６穴プレートの一番上の列にある１３５μＬアッセイ緩衝液に添加し（１：１０希釈）、サンプルをピペッティングにより混合した。これらのウェルそれぞれから５０μＬのアリコートを１００μＬアッセイ緩衝液を含む下の列に移し（１：３希釈）、ピペッティングにより混合し、それから続けて希釈するために一連の移しの５０μＬをプレートの下へ行った。基質溶液の１００μＬを各ウェルに添加した。プレートに蓋をしてプレートローター／ミキサー上で手短に混合し、４５分間３７℃にてインキュベーターに置いた。このインキュベーション後、プレートをミリポアバキュームマニフォールド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｖａｃｕｕｍ  ｍａｎｉｆｏｌｄ）において、内容物を標準平底プレートにろ過し、マイクロプレートリーダーで６２０ｎｍにて光学密度を測定した。
【０１１３】
２．３．  アミラーゼ活性でのデンプンプレートアッセイ
このアッセイにおいては、異なるアミラーゼハイブリッドを発現する細胞によるアミラーゼ生成を１％不溶性スターチ＋２５ｐｐｍクロラムフェニコールを補ったＬＡプレート上にバシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）クローンを移植し、３７℃にて終夜（少なくとも１６時間）プレートをインキュベーションすることにより試験した。次の日クローンをデンプンプレート上の透明なゾーンの存在を観察し、相対的なハロサイズを評価することにより定量的にランク付けした。ウルトラシンをコントロールとして用いた。ウルトラシンは一般的に３７℃にて培養されるが、アッセイプレートをハローをみるために７０℃にて培養しなければならなかった。
【０１１４】
２．４．  結果
実施例２．２及び２．３に記載のアッセイの結果を図２及び表３に示し、コントロールとしてウルトラシンを用いる。ハローアッセイの結果を表３の二番目のカラムに示し、比色アッセイの結果を三番目のカラムに示す。
【０１１５】
【表３】
0005548698.tif 000004
【０１１６】
ハイブリッドＢはＡｍｙＳ残基１０９−４８３を含み、それはカルシウム結合に関与するＢドメイン残基１０２を有していないことを意味する。にもかかわらず、このハイブリッドは、顕著なアミラーゼ活性を示し、Ｂドメインの一部をおのおの含むアミラーゼ配列由来のハイブリッドを形成することが可能であることを実証する。アミラーゼ活性測定（図２のパネルＡとパネルＢ両方に示すように）は、ハイブリッドＡ及びハイブリッドＨなどのハイブリッドが、試験された両方のｐＨの条件下にてウルトラシン野生型酵素よりかなり効果的に不溶性デンプンを加水分解できる。
【０１１７】
ハイブリッドＧ及びＨにより示させる相対的に高い活性は特に興味深い。これらのハイブリッドは、それぞれＡｍｙＳの残基２１５−４８３及び残基２４６−４８３を含み、それらが、ウルトラシンの全Ｂドメイン並びにウルトラシン触媒Ａドメインの重要な部分を有することを意味する。２９アミノ酸Ｃ末端デンプン結合ドメインを欠損するＡｍｙＳ変異体がハイブリッドＨにおいてＡｍｙＳ配列に寄与するために用いられる場合、このハイブリッドの残基の約５０％が、ウルトラシン残基だろう。ＡｍｙＳのカルシウム結合部位が完全にウルトラシン由来の亜鉛結合部位に置き換わるので、これらのハイブリッドアミラーゼはＣａ２＋を必要としないだろうと考えられる。
【０１１８】
多様な修飾及びバリエーションが、本明細書にて意図する使用の範囲又は精神を逸脱せずに組成物及びそれを使用する方法になされることは当業者にとって明らかである。つまり修飾及びバリエーションは添付した特許請求の範囲及びその均等の範囲内である。
【０１１９】
配列表
配列番号１：ハイブリッドA:  AAM48115.1  A1からI104/  AmyS  A100からR483．  残基  1-488.
1-104  =  AAM48115.1  (w/o  N-末端  Met)残基を太字で示す
105-488  =  AmyS残基  100-483
0005548698.tif 000005
【０１２０】
配列番号２:  ハイブリッドB:  AAM48115.1  A1からA113/  AmyS  G109からR483.  
残基  1-488.    
1-113  =  AAM48115.1  (w/o  N-末端  Met)  残基を太字で示す
114-488  =  AmyS  残基  109-483
0005548698.tif 000006
0005548698.tif 000007
【０１２１】
配列番号3:  ハイブリッドC:  AAM48115.1  A1  から  W128/  AmyS  T140  から  R483.
残基  1-472.  
1-128  =  AAM48115.1  (w/o  N-末端  Met)  残基を太字で示す
129-472  =  AmyS残基140-483
0005548698.tif 000008
【０１２２】
配列番号4:  ハイブリッドD:  AAM48115.1  A1  から  D145/  AmyS  F161  から  R483.  
残基  1-468.  
1-145  =  AAM48115.1  (w/o  N-末端  Met)  残基を太字で示す
146-468  =  AmyS  残基  161-483
0005548698.tif 000009
0005548698.tif 000010
【０１２３】
配列番号5:  ハイブリッドE:  AAM48115.1  A1からP163/  AmyS  D203からR483
残基  1-444.  
1-163  =  AAM48115.1  (w/o  N-末端  Met)  残基を太字で示す
164-444  =  AmyS残基  203-483
0005548698.tif 000011
【０１２４】
配列番号6:  ハイブリッドF:  AAM48115.1  A1からW175/  AmyS  L215からR483
残基  1-444.  
1-175  =  AAM48115.1  (w/o  N-末端  Met)  残基を太字で示す
176-444  =  AmyS  残基215-483
0005548698.tif 000012
【０１２５】
配列番号7:  ハイブリッドG:  AAM48115.1  A1からG191/  AmyS  I228から483
残基  1-447.  
1-191  =  AAM48115.1  (w/o末端  Met)  残基を太字で示す.
192-447  =  AmyS  残基  228-483
0005548698.tif 000013
0005548698.tif 000014
【０１２６】
配列番号8:  ハイブリッドH:  AAM48115.1  A1からK209/  AmyS  A246からR483
残基  1-447.
1-209  =  AAM48115.1  (w/o  N-末端  Met)  残基を太字で示す
210-447  =  AmyS残基246-483
0005548698.tif 000015
【０１２７】
配列番号9:  ウルトラシン（Ultrathin）アルファ‐アミラーゼ(受託番号（Accession  Number）AAM48115.1)
0005548698.tif 000016
【０１２８】
配列番号10:    AmyS、完全長タンパク質配列(バシルス  ステアロテルモフィルス（Ｂ．  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）アミラーゼ)  (NCBI  PDB  構造番号  1HVX,  タンパク質番号  1HVX.A)
0005548698.tif 000017
【０１２９】
配列番号11:    AmyS、Ｃ末端欠失(ゲオバシルス  ステアロテルモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）アミラーゼ)  (NCBI    PDB  構造番号1HVX,  タンパク質番号  1HVX.A)
0005548698.tif 000018
0005548698.tif 000019
【０１３０】
配列番号12:
合成配列
ctcagctctgcagctagcgcagcaa
【０１３１】
配列番号13:
合成配列
gtgtggaattgtgagcggcca
【０１３２】
配列番号14:
合成配列
agcgagagatgatataccta
【０１３３】
配列番号15:
合成配列
tttcggcgtgggtatggtggc
【０１３４】
配列番号16:
合成配列
ggtggacgccgtcgaagtcaat    
【０１３５】
配列番号17:
合成配列
cgcacgttaatgaccaatacac    
【０１３６】
配列番号18:
合成配列
ctcagctctgcagctagcgcagcaa    
【０１３７】
配列番号19:
合成配列
gacgacgagcgcgcgatcagaag
【０１３８】
配列番号20:  ハイブリッドAヌクレオチド配列:  AAM48115.1/AmyS
0005548698.tif 000020
0005548698.tif 000021
【０１３９】
配列番号21:  ハイブリッドBヌクレオチド配列
0005548698.tif 000022
0005548698.tif 000023
【０１４０】
配列番号22:  ハイブリッドCヌクレオチド配列
0005548698.tif 000024
【０１４１】
配列番号23:  ハイブリッドDヌクレオチド配列
0005548698.tif 000025
【０１４２】
配列番号24:  ハイブリッドEヌクレオチド配列
0005548698.tif 000026
0005548698.tif 000027
【０１４３】
配列番号25:  ハイブリッドFヌクレオチド配列
0005548698.tif 000028
0005548698.tif 000029
【０１４４】
配列番号26:  ハイブリッドGヌクレオチド配列
0005548698.tif 000030
【０１４５】
配列番号27:  ハイブリッドHヌクレオチド配列
0005548698.tif 000031
【図１】
0005548698.tif 000032
【図２】
0005548698.tif 000033
【図３】
0005548698.tif 000034
【図４】
0005548698.tif 000035
【図５Ａ】
0005548698.tif 000036
【図５Ｂ】
0005548698.tif 000037
【図５Ｃ】
0005548698.tif 000038
【配列表】
0005548698000001.app