(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝的に修飾された植物細胞であって、遺伝的に修飾されていない対応する野生型植物細胞と比較して、ＯＫ１タンパク質およびＲ１タンパク質の増大した活性を有することを特徴とし、
ここで、遺伝的修飾が、植物ゲノム中へのＲ１タンパク質をコードする核酸配列およびＯＫ１タンパク質をコードする核酸配列を含む外来性核酸分子の導入からなり、
ＯＫ１タンパク質をコードする外来性核酸分子が、
ａ）配列番号２または配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸分子；
ｂ）プラスミドＡ．ｔ．−ＯＫ１−ｐＧＥＭ中の挿入またはプラスミドｐＭＩ５０中の挿入によってコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸分子；
ｃ）配列番号２または配列番号４で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性がある配列を有するタンパク質をコードする核酸分子；
ｄ）プラスミドＡ．ｔ．−ＯＫ１−ｐＧＥＭ中の挿入のコード領域またはプラスミドｐＭＩ５０中の挿入のコード領域によってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも９５％の同一性がある配列を有するタンパク質をコードする核酸分子；
ｅ）配列番号１または配列番号３で表されるヌクレオチド配列または相補的配列を含む核酸分子；
ｆ）プラスミドＡ．ｔ．−ＯＫ１−ｐＧＥＭまたはプラスミドｐＭＩ５０に含まれる挿入ヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｇ）ａ）、ｂ）、ｅ）またはｆ）に記載される核酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する核酸分子；
ｈ）ストリンジェントな条件下で、ａ）、ｂ）、ｅ）またはｆ）に記載される核酸分子の少なくとも１つの鎖とハイブリダイズする核酸分子；および
ｉ）遺伝子コードの縮退によりａ）、ｂ）、ｅ）またはｆ）で特定される核酸分子の配列と相違したヌクレオチド配列を有する核酸分子
からなる群より選ばれ、
ＯＫ１タンパク質は、リン酸残基をＡＴＰからデンプンに転移させ、基質としてリン酸化されたデンプンを必要とし、そして
２個のヒスチジン残基を含むホスホヒスチジンドメインを有するタンパク質であり、
ここで、Ｒ１タンパク質をコードする前記外来性核酸分子が、ジャガイモ、コムギ、トウモロコシ、イネ、ダイズ、柑橘類、またはシロイヌナズナ（Arabidopsis）のＲ１タンパク質をコードする、
遺伝的に修飾された植物細胞。
【請求項２】
遺伝的に修飾されていない対応する野生型植物細胞と比較して、修飾されたデンプンを合成し、
ここで、デンプンが、増大したデンプンリン酸の濃度を有することを特徴とする、および／またはデンプンが、Ｃ−６位置に対してＣ−３位置においてグルコース分子に結合したデンプンリン酸の比率が変更することを特徴とする、請求項１記載の遺伝的に修飾された植物細胞。
【請求項３】
請求項１または２項記載の遺伝的に修飾された植物細胞を含む植物。
【請求項４】
デンプン貯蔵植物である、請求項３記載の植物。
【請求項５】
トウモロコシ植物またはコムギ植物である、請求項４記載の植物。
【請求項６】
請求項１または２記載の遺伝的に修飾された植物細胞を含む、請求項３〜５のいずれか１項記載の植物の、繁殖材料。
【請求項７】
請求項１または２記載の遺伝的に修飾された植物細胞を含む、請求項３〜５のいずれか１項記載の植物の、収穫可能な植物部分。
【請求項８】
請求項３〜５のいずれか１項記載の遺伝的に修飾された植物の作製のための方法であって、
Ａ）植物細胞を遺伝的に修飾し、ここで、遺伝的修飾は、遺伝的に修飾されていない対応する野生型植物細胞と比較して、ＯＫ１タンパク質およびＲ１タンパク質の酵素活性の増大をもたらし、
遺伝的修飾が、Ｒ１タンパク質をコードする配列およびＯＫ１タンパク質をコードする配列を含む外来性核酸分子の導入からなり、そして
ＯＫ１タンパク質をコードする外来性核酸分子が、
ａ）配列番号２または配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸分子；
ｂ）プラスミドＡ．ｔ．−ＯＫ１−ｐＧＥＭ中の挿入またはプラスミドｐＭＩ５０中の挿入によってコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸分子；
ｃ）配列番号２または配列番号４で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性がある配列を有するタンパク質をコードする核酸分子；
ｄ）プラスミドＡ．ｔ．−ＯＫ１−ｐＧＥＭ中の挿入またはプラスミドｐＭＩ５０中の挿入によってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも９５％の同一性がある配列を有するタンパク質をコードする核酸分子；
ｅ）配列番号１または配列番号３で表されるヌクレオチド配列または相補的配列を含む核酸分子；
ｆ）プラスミドＡ．ｔ．−ＯＫ１−ｐＧＥＭまたはプラスミドｐＭＩ５０に含まれる挿入ヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｇ）ａ）、ｂ）、ｅ）またはｆ）に記載される核酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する核酸分子；
ｈ）ストリンジェントな条件下で、ａ）、ｂ）、ｅ）またはｆ）に記載される核酸分子の少なくとも１つの鎖とハイブリダイズする核酸分子；および
ｉ）遺伝子コードの縮退によりａ）、ｂ）、ｅ）またはｆ）で特定される核酸分子の配列と相違したヌクレオチド配列を有する核酸分子
からなる群より選ばれ、
ここで、ＯＫ１タンパク質は、リン酸残基をＡＴＰからデンプンに転移させ、基質としてリン酸化されたデンプンを必要とし、そして
２個のヒスチジン残基を含むホスホヒスチジンドメインを有するタンパク質であり、
Ｂ）工程Ａ）からの植物細胞から植物を再生し；そして
Ｃ）必要ならば、工程Ｂ）による植物を利用してさらなる植物を生成する、
作成方法。
【請求項９】
請求項８記載の遺伝的に修飾された植物の作成方法であって、遺伝的に修飾されていない対応する野生型植物細胞と比較して、遺伝的に修飾された植物が、修飾されたデンプンを合成し、
ここで、デンプンが、増大したデンプンリン酸の濃度を有することを特徴とする、および／またはデンプンが、Ｃ−６位置に対してＣ−３位置においてグルコース分子に結合したデンプンリン酸の比率が変更することを特徴とする、方法。
【請求項１０】
請求項１または２記載の遺伝的に修飾された植物細胞由来のデンプンの抽出を含む修飾デンプンの作製のための方法。
【請求項１１】
請求項３〜５のいずれか１項記載の植物からデンプンを抽出する工程を含む、修飾デンプンの作製のための方法。
【請求項１２】
請求項３〜５のいずれか１項記載の植物の、修飾デンプンの作製のための使用。
【請求項１３】
請求項３〜５のいずれか１項記載の植物からのまたは請求項６記載の繁殖材料からの植物部分、あるいは請求項７記載の収穫可能な材料、を摩砕する工程を含む、穀粉の作製のための方法。
【請求項１４】
請求項１または２項記載の遺伝的に修飾された植物細胞の、または請求項３〜５のいずれか１項記載の植物の、穀粉の作製のための使用。
【請求項１５】
ＯＫ１タンパク質をコードする核酸分子およびＲ１タンパク質をコードする核酸分子を含む組換え核酸分子であって、
ここで、ＯＫ１タンパク質をコードする核酸分子が、
ａ）配列番号２または配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸分子；
ｂ）プラスミドＡ．ｔ．−ＯＫ１−ｐＧＥＭ中の挿入またはプラスミドｐＭＩ５０中の挿入によってコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸分子；
ｃ）配列番号２または配列番号４で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性がある配列を有するタンパク質をコードする核酸分子；
ｄ）プラスミドＡ．ｔ．−ＯＫ１−ｐＧＥＭ中の挿入のコード領域またはプラスミドｐＭＩ５０中の挿入のコード領域によってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも９５％の同一性がある配列を有するタンパク質をコードする核酸分子；
ｅ）配列番号１または配列番号３で表されるヌクレオチド配列または相補的配列を含む核酸分子；
ｆ）プラスミドＡ．ｔ．−ＯＫ１−ｐＧＥＭまたはプラスミドｐＭＩ５０に含まれる挿入ヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｇ）ａ）、ｂ）、ｅ）またはｆ）に記載される核酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する核酸分子；
ｈ）ストリンジェントな条件下で、ａ）、ｂ）、ｅ）またはｆ）に記載される核酸分子の少なくとも１つの鎖とハイブリダイズする核酸分子；および
ｉ）遺伝子コードの縮退によりａ）、ｂ）、ｅ）またはｆ）で特定される核酸分子の配列と相違したヌクレオチド配列を有する核酸分子
からなる群より選ばれ、
ＯＫ１タンパク質は、リン酸残基をＡＴＰからデンプンに転移させ、基質としてリン酸化されたデンプンを必要とし、そして
２個のヒスチジン残基を含むホスホヒスチジンドメインを有するタンパク質である、
組換え核酸分子。
【請求項１６】
請求項１５記載の組換え核酸分子を含むベクター。
【請求項１７】
組換え核酸分子が、原核生物のまたは真核生物の細胞中で転写を開始する調節配列と連結されている、請求項１６記載のベクター。
【請求項１８】
請求項１５記載の組換え核酸分子により、または請求項１６または１７のいずれか１項記載のベクターにより遺伝的に修飾されている宿主細胞。
【請求項１９】
請求項１５記載の組換え核酸分子を含むかまたは請求項１６または１７のいずれか１項記載のベクターを有する組成物。
【請求項２０】
ＯＫ１タンパク質をコードする核酸およびＲ１タンパク質をコードする核酸を含む組成物であって、
ここで、ＯＫ１タンパク質をコードする外来性核酸分子が、
ａ）配列番号２または配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸分子；
ｂ）プラスミドＡ．ｔ．−ＯＫ１−ｐＧＥＭ中の挿入またはプラスミドｐＭＩ５０中の挿入によってコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸分子；
ｃ）配列番号２または配列番号４で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性がある配列を有するタンパク質をコードする核酸分子；
ｄ）プラスミドＡ．ｔ．−ＯＫ１−ｐＧＥＭ中の挿入のコード領域またはプラスミドｐＭＩ５０中の挿入のコード領域によってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも９５％の同一性がある配列を有するタンパク質をコードする核酸分子；
ｅ）配列番号１または配列番号３で表されるヌクレオチド配列または相補的配列を含む核酸分子；
ｆ）プラスミドＡ．ｔ．−ＯＫ１−ｐＧＥＭまたはプラスミドｐＭＩ５０に含まれる挿入ヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｇ）ａ）、ｂ）、ｅ）またはｆ）に記載される核酸配列と少なくとも９５％の同一性を有する核酸分子；
ｈ）ストリンジェントな条件下で、ａ）、ｂ）、ｅ）またはｆ）に記載される核酸分子の少なくとも１つの鎖とハイブリダイズする核酸分子；および
ｉ）遺伝子コードの縮退によりａ）、ｂ）、ｅ）またはｆ）で特定される核酸分子の配列と相違したヌクレオチド配列を有する核酸分子 
からなる群より選ばれ、
ＯＫ１タンパク質は、リン酸残基をＡＴＰからデンプンに転移させ、基質としてリン酸化されたデンプンを必要とし、そして
２個のヒスチジン残基を含むホスホヒスチジンドメインを有するタンパク質である、
組成物。
【請求項２１】
請求項１９または２０のいずれか１項記載の組成物の、植物細胞の形質転換への使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝的に修飾された植物細胞および植物であって、遺伝的修飾が、遺伝的修飾のなかった対応する野生型植物細胞または野生型植物と比較して、デンプンリン酸化ＯＫ１タンパク質およびデンプンリン酸化Ｒ１タンパク質の活性の増大をもたらす、植物細胞および植物に関する。さらに本発明は、そのような植物細胞および植物の作製のための手段および方法に関する。この型の植物細胞および植物は修飾デンプンを合成する。したがって、本発明はまた、本発明による植物細胞および植物によって合成されるデンプン、このデンプンの作製方法、およびこの修飾デンプンのデンプン誘導体の作製、ならびに本発明によるデンプンを含む穀粉の作製に関する。
【０００２】
さらに、本発明は、ＯＫ１タンパク質およびＲ１タンパク質をコードする配列を含む核酸分子およびベクター、ならびにこれらの核酸分子を含む宿主細胞に関する。
【０００３】
再生可能な原料源としての植物構成成分に現在帰せられて増大している重要性に関連して、バイオテクノロジー研究の課題の１つは、これらの植物原料を加工産業の必要条件に合致するよう適応させる努力をすることである。さらに、できるだけ多くの応用分野で用いられることになる原料の再生を可能にするために、種々様々の材料を実現することが必要である。
【０００４】
多糖類デンプンは、化学的に一定の基本成分、グルコース分子から構成されるが、種々の分子形の複雑な混合物を構成する。それらは重合と分岐の程度に関して差異を示し、したがってそれらの物理的・化学的特性において、互いに著しく異なる。
【０００５】
α−１，４−グリコシド結合したグルコース単位から構成される本質的に分岐のないポリマーであるアミロースデンプンと、α−１，６−グリコシド結合が加わって分岐が形成される分岐ポリマーであるアミロペクチンデンプンとが区別されている。アミロースとアミロペクチン間のさらに本質的な差は分子量である。デンプンの起源に依存して、アミロースは５×１０5〜１０6Daの分子量を有するのに対し、アミロペクチンの分子量は１０7〜１０8Daである。２つの巨大分子を、その分子量および種々の物理的・化学的特性によって区別することができ、それらは異なるヨウ素結合特性によって、最も容易に可視化することができる。
【０００６】
アミロースは長い間、α−１，４−グリコシド結合したα−Ｄ−グルコースモノマーから成る直鎖状ポリマーであると見なされてきた。最近の研究において、しかし、α−１，６−グリコシド分岐点（約０．１％）の存在が示された（Hizukuri and Takagi, Carbohydr. Res.134,(1984),1-10; Takeda et al., Carbohydr.Res. 132,（1984）, 83-92）。
【０００７】
デンプンの機能的持性、例えば溶解度、劣化挙動、水結合能力、皮膜形成特性、粘性、粘着特性、凍結融解安定性、酸安定性、ゲル化強度、デンプンのデンプン粒サイズ、その他などは、アミロース／アミロペクチン比率、分子量、側鎖分布のパターン、イオン濃度、脂質およびタンパク質の含量、デンプンの平均デンプン粒子サイズ、デンプンの粒子形態、などの影響を受ける。デンプンの機能的持性はまた、デンプンの非炭素成分であるリン酸の含量にも影響される。モノエステルの形で共有結合によりグルコース分子に結合しているリン酸（以下デンプンリン酸と呼ぶ）と、デンプンが結合しているリン脂質の形のリン酸とを区別する。
【０００８】
デンプンリン酸の濃度は植物の型に依存して変化する。例えば、あるトウモロコシ突然変異体は、デンプンリン酸濃度が増大したデンプン（モチトウモロコシ０．００２％、および高アミローストウモロコシ０．０１３％）を合成するが、従来型のトウモロコシ種は痕跡量のデンプンリン酸のみを有する。同様に小量のデンプンリン酸がコムギで見出される（０．００１％）が、エンバクとモロコシにはデンプンリン酸が検出されていない。同様に、イネの突然変異体では、従来種のイネ（０．０１３％）よりも少ないデンプンリン酸が見出される。有意の量のデンプンリン酸が、タピオカ（０．００８％）、サツマイモ（０．０１１％）、クズウコン（０．０２１％）またはジャガイモ（０．０８９％）のような、鱗茎デンプンまたは貯蔵根デンプンを合成する植物に検出された。上に引用されたデンプンリン酸含量の百分率値は、それぞれのデンプンの乾燥重量当たりを示し、Jane et al.(1996, Cereal Foods World 41 (11), 827-832)によって測定された。
【０００９】
デンプンリン酸は、重合されたグルコースモノマーのＣ−２、Ｃ−３またはＣ−６位置のモノエステルの形で存在することができる（Takeda and Hizukuri, 1971, Starch/ Starke 23, 267-272）。植物により合成されるデンプン中のリン酸のリン酸分布は、一般にリン酸残基の約３０％から４０％が共有結合によりＣ−３位置に結合されており、およびリン酸残基の約６０％から７０％が共有結合によりグルコース分子のＣ−６の位置に結合されていることを示す（Blennow et al., 2000, Int. J. of Biological Macromolecules 27, 211- 218）。Blennow et al. (2000, Carbohydrate Polymers 41, 163-174)は、様々なデンプン、例えば、ジャガイモデンプン（種に依存して、デンプンmg当たり７．８〜３３．５nMol）、様々なCurcuma種のデンプン（mg当たり１．８〜６３nMol）、タピオカデンプン（デンプンmg当たり２．５nMol）、コメデンプン（デンプンmg当たり１．０nMol）、リョクトウデンプン（デンプンmg当たり３．５nMol）およびモロコシデンプン（デンプンmg当たり０．９nMol）の、グルコース分子のＣ−６位置に結合しているデンプンリン酸濃度を測定した。これらの著者は、オオムギデンプンおよびトウモロコシの種々のモチ突然変異体からのデンプン中には、Ｃ−６の位置に結合されたデンプンリン酸を検出することができなかった。これまで、植物の遺伝子型とデンプンリン酸濃度の間の関係を確立することはできなかった（Jane et al., 1996, Cereal Foods World 41 (11), 827-832）。したがって、現在、育種手段によって植物中のデンプンリン酸の濃度に影響を及ぼすことはできない。
【００１０】
これまでに、デンプンのグルコース分子へのリン酸残基の共有結合の導入を引き起こすタンパク質がただ１つだけ報告された。このタンパク質は、αグルカン水ジキナーゼ（ＧＷＤ，Ｅ．Ｃ．：２．７．９．４）酵素活性を有し（Ritte et al., 2002, PNAS 99, 7166-7171）、科学文献にしばしばＲ１と記されており、ジャガイモ塊茎中の貯蔵デンプンのデンプン粒に結合している（Lorberth et al., 1998, Nature Biotechnology 16, 473-477）。Ｒ１に触媒される反応において、遊離体α−１，４−グルカン（デンプン）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、および水が、生成物であるグルカンリン酸（デンプンリン酸）、一リン酸、およびアデノシン一リン酸に変換される。また、ＡＴＰのγリン酸残基は水に転移され、ＡＴＰのβリン酸残基はグルカン（デンプン）に転移される。Ｒ１は、インビトロでβリン酸残基をＡＴＰからα−１，４−グルカンのグルコース分子のＣ−６およびＣ−３位置へ転移する。インビトロの反応で得られる、Ｃ−６リン酸とＣ−３リン酸の比率が、植物から分離されたデンプン中に存在する比率に一致する（Ritte et al., 2002, PNAS 99, 7166-7171）。ジャガイモデンプン中に存在するデンプンリン酸の約７０％がＣ−６位置で、また約３０％がＣ−３位置でデンプンのグルコースモノマーへ結合しているので、これはＲ１がグルコース分子のＣ−６の位置を好んでリン酸化することを意味する。さらに、トウモロコシからのアミロペクチンを用いて、特にＲ１が、まだ共有結合で結合したリン酸を含んでいないα−１，４−グルカンをリン酸化することができることが示された（Ritte et al., 2002, PNAS 99, 7166-7171）、即ちＲ１はα−１，４−グルカンへ新たにリン酸を導入することができる。
【００１１】
ジャガイモからのＲ１遺伝子の過剰発現の結果ＲＩタンパク質の増大した活性を示すコムギ植物についてＷＯ ０２ ３４９２３に記述されている。これらの植物は、デンプンリン酸を検出することができなかった対応する野生型の植物と比較して、グルコース分子のＣ−６の位置に有意な量のデンプンリン酸を有するデンプンを合成する。
【００１２】
デンプンへ共有結合により結合されたリン酸基を導入する反応を触媒するさらなるタンパク質は、これまでに報告されていない。デンプンのグルコース分子のＣ−３位置および／またはＣ−２の位置に好んでリン酸基を導入する酵素もまた知られていない。したがって、植物中のデンプンリン酸含量の増大は別にして、植物によって合成されたデンプン内のリン酸分配を修飾して、植物中のデンプンのリン酸化に特異的に影響を及ぼし、および／またはデンプンリン酸の含量をさらに増大させるための利用可能な方法もない。
【００１３】
本発明の課題はしたがって、増大したリン酸含量および／または変化したリン酸分布を有する修飾デンプンならびにそのような修飾デンプンを合成する植物細胞および／または植物を提供すること、ならびに前記植物および／または植物細胞を生成する方法および手段を提供することに基づく。
【００１４】
この問題は、特許請求の範囲に記述された実施態様により解決される。
【００１５】
したがって本発明は、植物細胞または植物が、遺伝的に修飾されていない対応する野生型植物細胞または野生型植物と比較して少なくとも１つのＯＫ１タンパク質及び少なくとも１つのＲ１タンパク質の増大した活性を有していることを特徴とする、遺伝的に修飾された植物細胞および遺伝的に修飾された植物に関する。
【００１６】
本発明の第１の局面は、遺伝的に修飾された植物細胞または植物であって、その遺伝的修飾が、遺伝修飾されなかった対応する野生型植物細胞または野生型植物と比較して、少なくとも１つのＯＫ１タンパク質及び同時に、少なくとも１つのＲ１タンパク質の活性の増大をもたらす、遺伝的に修飾された植物細胞または植物に関する。
【００１７】
同時に、遺伝的修飾は、遺伝的に修飾されていない野生型植物細胞または野生型植物と比較して、遺伝的に修飾された植物細胞又は遺伝的に修飾された植物中の少なくとも１つのＯＫ１タンパク質及び同時に少なくとも１つのＲ１タンパク質の活性の増加をもたらす任意の遺伝的修飾でよい。
【００１８】
本発明に関連して、用語「野生型植物細胞」とは、当該植物細胞を本発明による植物細胞作製用の出発物質として用いたことを、すなわちそれらの遺伝子情報が、導入された遺伝的修飾は別にして、本発明による植物細胞の遺伝子情報に一致することを意味する。
【００１９】
本発明に関連して、用語「野生型植物」とは、当該植物を本発明による植物作製に出発物質として用いたことをすなわちそれらの遺伝子情報が、導入された遺伝的修飾は別にして、本発明による植物の遺伝子情報に一致することを意味する。
【００２０】
本発明に関連して、用語「対応する」とは、いくつかの対象の比較において、互いに比較される当該対象が同じ条件に保たれてきたことを意味する。本発明に関連して、遺伝的に修飾された植物細胞又は植物と比較した野生型植物細胞または野生型植物に関連して用語「対応する」とは、互いに比較される植物細胞または植物が、同一の栽培条件下で生育され、およびそれらが同じ（栽培）年齢を有すことを意味する。
【００２１】
ここで、本発明の枠組みの中で、用語「少なくとも１つのＯＫ１タンパク質の増大した活性」とは、ＯＫ１タンパク質をコードする内因性遺伝子の発現の増大、および／または細胞内のＯＫ１タンパク質量の増大、および／または細胞内のＯＫ１タンパク質の酵素活性の増大を意味する。
【００２２】
ここで、本発明の枠組みの中で、用語「少なくとも１つのＲ１タンパク質の増大した活性」とは、Ｒ１タンパク質をコードする内因性遺伝子の発現の増大および／または細胞内のＲ１タンパク質量の増大、および／または細胞内のＲ１タンパク質の酵素活性の増大を意味する。
【００２３】
発現の増加を、例えばＯＫ１タンパク質又はＲ１タンパク質をコードする転写物の量を、例えばノーザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲを用いて測定することにより、決定することができる。増加とは、遺伝的に修飾されていない対応する細胞と比較して、転写物の量の少なくとも５０％の、好ましくは少なくとも７０％の、より好ましくは少なくとも８５％の、および最も好ましくは少なくとも１００％の、増加を意味する。ＯＫ１タンパク質をコードする転写物の量の増加とはまた、ＯＫ１タンパク質をコードする検出可能な量の転写物を示さない植物または植物細胞が、本発明による遺伝的修飾の後に、ＯＫ１タンパク質をコードする検出可能な量の転写物を示すことを意味する。
Ｒ１タンパク質をコードする転写物の量の増大とはまた、検出できる量のＲ１タンパク質をコードする転写物を有しない植物または植物細胞が、本発明による遺伝的修飾の後に、検出できる量のＲ１タンパク質をコードする転写物を有することを意味する。
【００２４】
当該植物細胞中のＯＫ１タンパク質又はＲ１タンパク質の活性増加をもたらすこれらのタンパク質量の増加を、免疫学的方法、例えば、ウエスタンブロット分析、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）またはＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）などにより測定することができる。ここで増加とは、好ましくは、遺伝的に修飾されていない対応する植物細胞と比較した、タンパク質の量の、少なくとも５０％の、特に少なくとも７０％の、好ましくは少なくとも８５％の、および特に好ましくは少なくとも１００％の増加を意味する。ＯＫ１タンパク質の量の増加とはまた、検出可能なＯＫ１タンパク質活性を有しない植物または植物細胞が、本発明による遺伝的修飾の後に、検出できる量のＯＫ１タンパク質を示すことを意味する。Ｒ１タンパク質の量の増大とはまた、検出できる量のＲ１タンパク質を有しない植物または植物細胞が、本発明による遺伝的修飾の後に、検出できる量のＲ１タンパク質を有することを意味する。
【００２５】
指定されたタンパク質と特異的に反応する、即ち特異的に前記タンパク質に結合する抗体を製作する方法は、当業者に公知である（例えば、Lottspeich and Zorbas (Eds.), 1998, Bioanalytik, Spektrum akad, Verlag, Heidelberg, Berlin, ISBN 3-8274-0041-4参照）。いくつかの会社（例えばEurogentec, Belgium）が、契約サービスとしてそのような抗体の製作を行う。ＯＫ１タンパク質と特異的に反応する抗体を作製するための可能な方法の１つについては後述する（実施例１０を参照のこと）。それを用いて免疫学的方法によりＲ１タンパク質の量の増大を測定することができる抗体については、Lorberth et al. (1998, Nature Biotechnology 16, 473-477)およびRitte et al. (2000, Plant Journal 21 , 387-391)に記述されている。
【００２６】
本発明の枠組みの中では、用語「ＯＫ１タンパク質」とは、ＡＴＰのリン酸残基を、既にリン酸化されているデンプン（Ｐ−デンプン）に転移させるタンパク質を意味すると理解するべきである。Arabidopsis thaliana sex1-3突然変異体の葉から単離されたデンプンは、検知可能な量の共有結合で結合したリン酸残基を有せず、ＯＫ１タンパク質によってリン酸化されない、すなわち、本発明によるＯＫ１タンパク質は、さらにリン酸残基を転移するために、基質として既にリン酸化されたデンプンを要求する。
【００２７】
好ましくは、ＡＴＰのβリン酸残基はＯＫ１タンパク質からデンプンに転移され、ＡＴＰのγリン酸残基は水に転移される。追加の反応生成物として、ＡＭＰ（アデノシン一リン酸）が、ＯＫ１タンパク質によって行われるＰ−デンプンリン酸化反応の間に形成される。したがって、ＯＫ１タンパク質を、［リン酸化α−グルカン］−水−ジキナーゼ（［Ｐ−グルカン］−水−ジキナーゼ）または［リン酸化デンプン］−水−ジキナーゼと名付ける。
【００２８】
したがって、ＯＫ１タンパク質は次の式によって反応を触媒する：
Ｐ−グルカン  ＋  ＡＴＰ  ＋  Ｈ２Ｏ  →  Ｐ−グルカン−Ｐ  ＋  ＡＭＰ  ＋  Ｐｉ
【００２９】
好ましくは、ＯＫ１タンパク質によってリン酸化されるＰ−デンプン上で、Ｃ−６位置および／またはＣ−３位置に結合した追加のリン酸モノエステル結合が生成される。特に好ましくは、ＯＫ１タンパク質によって触媒されるＰ−デンプンのリン酸化中に、対応するＰ−デンプンのグルコース分子のＣ−６位置のリン酸モノエステル結合と比較して、いくつかの追加のリン酸モノエステル結合がＣ−３位置に形成される。
【００３０】
ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列は、ホスホヒスチジンドメインを含む。ホスホヒスチジンドメインは例えば、Tien-Shin Yu et al.(2001, Plant Cell 13, 1907-1918)によって記述されている。アミノ酸配列をコードするＯＫ１タンパク質のホスホヒスチジンドメインは、好ましくは２個のヒスチジンを含む。
【００３１】
ＯＫ１タンパク質によるＰ−デンプンリン酸化反応の触媒作用においては、リン酸化ＯＫ１タンパク質が中間生成物として生成され、中間生成物中では、ＡＴＰのリン酸残基がＯＫ１タンパク質のアミノ酸に共有結合により結合されている。中間生成物はＯＫ１タンパク質の自己リン酸化により生成される、即ちＯＫ１タンパク質それ自身が反応を触媒し、それが中間生成物をもたらす。好ましくは、ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列のヒスチジン残基が自己リン酸化過程の結果リン酸化され、それは特に好ましくはホスホヒスチジンドメインの一部であるヒスチジン残基である。
【００３２】
更に本発明によるＯＫ１タンパク質は、Ｐ−デンプンに対して非リン酸化デンプンと比較して増大した結合活性を有する。
【００３３】
Ｐ−デンプンをさらにリン酸化するために、基質としてＰ−デンプンを要求する酵素はこれまでに報告されていなかったので、植物中の既にリン酸化されたデンプンのデンプンリン酸含量を、一定量を越えて増加させることはこれまで不可能であった。これがいまや、本発明によるタンパク質または本発明による植物の遺伝的修飾のための核酸分子を利用することによってのみ可能である。ＯＫ１タンパク質の機能の解明、そしてＯＫ１タンパク質の調製は、修飾された特性を有するデンプンを合成する植物のみがその効果を遺伝的に修飾することができることを意味する。植物によって合成されたデンプン中のリン酸分布を修飾することは、利用できる手段が欠けていたために、いままでは不可能であった。本発明によるタンパク質および本発明による核酸の調製を通じて、いまや自然のデンプン中のリン酸の比率の修飾も同様に可能である。本発明のさらなる利点は、ＯＫ１タンパク質のＲ１タンパク質との同時の協同作用によって、空間的または時間的に互いに分離されたそれぞれのタンパク質がデンプンまたはＰ−デンプンをそれぞれリン酸化する場合よりも高い量のリン酸がデンプンに組み込まれるということである。
【００３４】
本発明の枠組みの中では、用語「Ｒ１タンパク質」とは、リン酸残基をＡＴＰからデンプンに転移させるタンパク質を意味すると理解するべきである。Arabidopsis thaliana sex1-3突然変異体の葉から単離されたデンプンは、検知できる量の共有結合で結合したリン酸残基を有しないが、Ｒ１タンパク質によってリン酸化される。これは、例えばArabidopsis thaliana sex1-3突然変異体の葉から単離した非リン酸化デンプンが、基質としてＲ１タンパク質により触媒されるリン酸化反応中で用いられることを意味する。
【００３５】
好ましくは、ＡＴＰのβリン酸残基はＲ１タンパク質からデンプンに転移され、ＡＴＰのγリン酸残基は水に転移される。ＡＭＰ（アデノシン一リン酸）が追加の反応生成物として生ずる。Ｒ１タンパク質は、したがって、［α−１，４グルカン］−水−ジキナーゼまたはデンプン−水−ジキナーゼ（E.C.: 2.7.9.4; Ritte et al., 2002, PNAS 99, 7166-7171）と命名される。
【００３６】
Ｒ１タンパク質により触媒されるデンプンのリン酸化中に、より多くの追加のリン酸モノエステル結合が、各デンプンのグルコース分子のＣ−３位置のリン酸モノエステル結合と比較して、グルコース分子のＣ−６位置で生成される。Ｒ１タンパク質によって、およそ６０％から７０％のリン酸塩残基がデンプンのグルコース分子のＣ−６位置に導入され、およそ３０％から４０％のリン酸塩残基がデンプンのグルコース分子のＣ−３位置に導入される（Ritte et al., 2002, PNAS 99, 7166- 7171）。
【００３７】
Ｒ１タンパク質によりデンプンのリン酸化反応が触媒される間に、ＡＴＰのリン酸残基が共有結合によりＲ１タンパク質のアミノ酸に結合したリン酸化されたＲ１タンパク質が、中間生成物として生ずる（Ritte et al., 2002, PNAS 99, 7166-7171）。中間生成物はＲ１タンパク質の自己リン酸化によって生じる、即ちＲ１タンパク質自身が、中間生成物をもたらす反応を触媒する。Ｒ１タンパク質をコードするアミノ酸配列はホスホヒスチジンドメインを含む。ホスホヒスチジンドメインについてはTien-Shin Yu et al. (2001 , Plant Cell 13, 1907-1918）によって記述されている。Ｒ１タンパク質をコードするアミノ酸配列のホスホヒスチジンドメインは、好ましくは１つのヒスチジンを含む。Ｒ１タンパク質の自己リン酸化によって、Ｒ１タンパク質をコードするアミノ酸配列のホスホヒスチジンドメインのヒスチジン残基がリン酸化される（Mikkelsen et al., 2003, Biochemical Journal Intermediate Publication）；原稿BJ20030999として２００３年１０月に公表；Mikkelsen et al., 2004, Biochemical Journal 377, 525-532）。
【００３８】
Ｒ１タンパク質をコードする核酸配列および対応するアミノ酸配列が様々な種、例えばジャガイモ（ＷＯ ９７ １１１８８、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ：ＡＹ０２７５２２、Ｙ０９５３３）、コムギ（ＷＯ ００ ７７２２９、ＵＳ ６，４６２，２５６、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ：ＡＡＮ９３９２３、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ：ＡＲ２３６１６５）、イネ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ：ＡＡＲ６１４４５、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ：ＡＲ４００８１４）、トウモロコシ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ：ＡＡＲ６１４４４、ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃ：ＡＲ４００８１３）、ダイズ（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ：ＡＡＲ６１４４６、ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃ：ＡＲ４００８１５）、柑橘類（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ：ＡＹ０９４０６２）、およびArabidopsis（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ：ＡＦ３１２０２７）などから記述されている。Ｒ１タンパク質をコードする同定された核酸配列およびアミノ酸配列は、特にＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/）に公表されており、また本出願の明細書に参照により組み入れられる。
【００３９】
本発明に関連して、用語「増大した結合活性」とは、タンパク質の、第２の基質と比較して第１の基質に対する増大した親和性を意味すると理解するべきである。すなわち、同じインキュベーション条件下で、第２の基質と比較して第１の基質により大量に結合するタンパク質の量は、第１の基質に対する増大した結合活性を示す。
【００４０】
本発明に関連して、用語「デンプンリン酸」とは、デンプンのグルコース分子に共有結合により結合しているリン酸基を意味すると理解するべきである。
【００４１】
本発明に関連して、用語「非リン酸化デンプン」とは、検出可能な量のデンプンリン酸を含まないデンプンを意味すると理解するべきである。デンプンリン酸の量の測定のための様々な方法が報告されている。好ましくは、Ritte et al.(2000, Starch/Starke 52, 179-185）によって記述されている方法を、デンプンリン酸量の測定に用いることができる。特に好ましくは、31Ｐ−ＮＭＲによるデンプンリン酸量の測定を、Kasemusuwan and Jane (1996, Cereal Chemistry 73, 702-707）により記述された方法によって実施する。
【００４２】
本発明に関連して、用語「リン酸化デンプン」または「Ｐ−デンプン」とは、デンプンリン酸を含むデンプンを意味すると理解するべきである。
【００４３】
ＯＫ１タンパク質の活性を、例えばβ位置でラベルされたリン酸残基を含むＡＴＰ（ラベルＡＴＰ）を用いて、インビトロでＯＫ１タンパク質をインキュベーションすることにより示すことができる。好ましくは、リン酸残基が特異的にβ位置でラベルされたＡＴＰ、すなわち、β位置のリン塩残基のみが標識を有するＡＴＰを用いる。好ましくは、放射性ラベルされたＡＴＰを用いる。特に好ましくは、リン酸残基が特異的に放射性ラベルされたＡＴＰを用い、とりわけ好ましくは、リン酸残基がβ位置で33Ｐにより特異的にラベルされたＡＴＰを用いる。ＯＫ１タンパク質をラベルＡＴＰおよびリン酸化されていないデンプンとインキュベーションする場合は、リン酸はＯＫ１によってデンプンに転移されない。好ましくは、Arabidopsis thaliana 突然変異体sex1-3の葉デンプン（Tien-Shin Yu et al., 2001, Plant Cell 13, 1907-1918）を用いる。
【００４４】
一方、ＯＫ１タンパク質をＰ−デンプンとラベルＡＴＰの存在下でインキュベーションする場合は、その後でＰ−デンプンに共有結合により結合したラベルされたリン酸を示すことができる。好ましくは、Arabidopsis thalianaの葉からのデンプン、特に好ましくは、Ｒ１タンパク質によって酵素的にリン酸化されたArabidopsis thaliana sex1-3突然変異体からのデンプン（Ritte et al., 2002, PNAS 99, 7166-7171）を用いる。
【００４５】
ＯＫ１タンパク質によってＰ−デンプン中に組み入れたラベル付きリン酸残基を、例えばラベルされたＰ−デンプンの反応混合液の残渣からの分離（例えば、エタノールによる沈澱、濾過、クロマトグラフ法、その他により）、およびその後のＰ−デンプン分画中におけるラベルされたリン酸残基の検出により、示すことができる。また、Ｐ−デンプン分画に結合されたラベルリン酸残基を、例えばＰ−デンプン分画に存在する放射活性の量の測定（例えばシンチレーションカウンターによる）によって、示すことができる。Ｐ−デンプンをリン酸化反応の基質として必要とするタンパク質の検出のための可能な方法がさらに、一般的方法項目１１および実施例６に後述されている。
【００４６】
Ｒ１タンパク質の活性は、文献、例えば（Mikkelsen et al., 2003, Biochemical Journal Intermediate Publication. ２００３年１０月に原稿BJ20030999として出版; Mikkelsen et al., 2004, Biochemical Journal 377, 525-532, Ritte et al., 2002, PNAS 99, 7166-7171）に記述されているように示すことができる。
【００４７】
Ｐ−デンプン中のグルコースモノマーの炭素原子のどの位置（Ｃ−２、Ｃ−３またはＣ−６）がＯＫ１タンパク質によって好んでリン酸化されるかを、Ritte et al.(2002, PNAS 99, 7166-7171)に記述されるように、例えばタンパク質によりリン酸化されたＰ−デンプンを分析して決定することができる。この目的のために、タンパク質によってリン酸化されたＰ−デンプンを、酸を用いて加水分解し、続いて陰イオン交換クロマトグラフィーによって分析する。
【００４８】
Ｐ−デンプン中のグルコースモノマーの炭素原子のどの位置（Ｃ−２、Ｃ−３またはＣ−６）がリン酸化されているか決定するために、好ましくは、ＯＫ１タンパク質によってリン酸化されたＰ−デンプンをＮＭＲによって分析する。デンプンのグルコース分子のＯＫ１タンパク質が触媒する反応によってリン酸化されるＣ−原子位置を同定するための、特に好ましい方法について、後に一般的方法項目１３に記述する。
【００４９】
デンプン中のグルコースモノマーの炭素原子（Ｃ−２、Ｃ−３またはＣ−６）のどの位置がＲ１タンパク質によって好んでリン酸化されるかを、Ritte et al.(2002, PNAS 99, 7166-7171)によって記述されているように、Ｒ１タンパク質によってリン酸化されたＰ−デンプンを分析することにより決定することができる。この目的のために、タンパク質によってリン酸化されたデンプンを酸を用いて加水分解し、続いて陰イオン交換クロマトグラフィーにより分析する。
【００５０】
好ましくは、ＯＫ１タンパク質によりリン酸化されたＰ−デンプンまたはＲ１タンパク質によりリン酸化されたデンプンを、Ｐ−デンプンまたはデンプン中のグルコースモノマーの炭素原子（Ｃ−２、Ｃ−３またはＣ−６）のどの位置がリン酸化されているか決定するために、ＮＭＲにより分析する。ＯＫ１タンパク質またはＲ１タンパク質が触媒する反応によってリン酸化されるデンプンのグルコース分子のＣ−原子位置を同定するための特に好ましい方法について、一般的方法項目１３に後述する。
【００５１】
ＯＫ１タンパク質により促進されるＰ−デンプンのリン酸化において中間生成物として生成されるリン酸化されたタンパク質を、例えばRitte et al.(2002, PNAS 99, 7166-7171）またはMikkelsen et al.(2003, Biochemical Journal Intermediate Publication. ２００３年１０月に原稿BJ20030999として出版；Mikkelsen et al., 2004, Biochemical Journal 377, 525-532)にＲ１タンパク質に対して記述されているように、実証することができる。
【００５２】
自己リン酸化された中間生成物の存在を実証するために、最初にデンプンが存在しない状態で、ＯＫ１タンパク質をラベルＡＴＰと、好ましくは特異的にβリン酸位置にラベルされたＡＴＰと、特に好ましくは33Ｐにより特異的にβリン酸位置にラベルされたＡＴＰとインキュベーションする。これと平行して、ラベルＡＴＰの代わりに対応する量の非ラベルＡＴＰを含む反応調製物２を、それ以外は同じ条件下でインキュベーションする。続いて、非ラベルＡＴＰを反応混合物１に過剰に加え、非ラベルＡＴＰおよびラベルＡＴＰの混合物（反応混合物１中で以前に用いたラベルＡＴＰと同じ量および反応混合物１に過剰に加えた非ラベルＡＴＰと同じ量）を反応混合液２に加えて、これをさらにインキュベーションし、その後Ｐ−デンプンを反応混合液１の部分Ａ（部分１Ａ）または反応混合液２の部分Ａ（部分２Ａ）に、それぞれ加える。反応混合物の残存部分１Ｂおよび部分２Ｂの反応を、タンパク質を変性させることにより止める。反応混合液の部分Ｂを、タンパク質の変性をもたらす当業者に公知の方法により、好ましくはラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を加えることにより止めることができる。反応混合物の部分１Ａおよび部分２Ａを、少なくともさらに１０分間インキュベーションしてから、これらの反応も止める。それぞれの反応混合液の部分Ａまたは部分Ｂ中に存在するデンプンを、反応混合物のそれぞれの残りから分離する。例えば、それぞれのデンプンを遠心分離によって分離する場合は、遠心分離の完了時に、反応混合物のそれぞれの部分Ａまたは部分Ｂのデンプンは、沈殿したペレット中に見出され、またそれぞれの反応混合物中のタンパク質はそれぞれの遠心分離の上清で見出される。次に反応混合物の部分１Ａまたは２Ａ、および部分１Ｂまたは２Ｂの上清を、変性クリルアミドゲル電気泳動で、続いて得られたアクリルアミドゲルのオートラジオグラフィを行って分析することができる。アクリルアミドゲル電気泳動によって分離された放射性ラベルタンパク質の量を計るために、例えば当業者に公知の、いわゆる「ホスホイメージング」法を用いることができる。もし反応混合物１の部分Ｂの遠心上清中のタンパク質のオートラジオグラフィまたは「ホスホイメージング装置」による分析が、反応混合物１の部分Ａの遠心分離上清に比較して、有意に増大した信号を示すならば、これはデンプンのリン酸化を促進するタンパク質が自己リン酸化された中間生成物として存在することを示す。反応混合物２の部分ＡおよびＢは対照として役立ち、したがって、オートラジオグラフィまたは「ホスホイメージング装置」による分析において、遠心分離上清において有意に増大した信号を示さないに違いない。
【００５３】
さらに、必要ならばそれぞれのデンプンを洗浄した後、使用したラベルＡＴＰに対応する標識を有するデンプンリン酸の存在について、それぞれの沈殿したペレット中に残存している反応混合物１および２のそれぞれの部分Ａのデンプンを調べることができる。もし反応混合物１の部分Ａのデンプンがラベルされたリン酸基を含んでおり、かつ反応混合液１の部分Ｂの遠心分離上清のオートラジオグラフィが、反応混合物１の部分Ａの遠心分離上清のオートラジオグラフィに比較して有意に増大した信号を示す場合は、これはデンプンのリン酸化を促進するタンパク質が自己リン酸化された中間生成物として存在することを示す。反応混合物２の部分ＡおよびＢは対照として役立ち、したがって、α−１，４−グルカンを含む沈殿ペレット中のたとえば33Ｐでラベルされたα−１，４−グルカンの有意に増大した信号は示さないに違いない。リン酸化されたＯＫ１タンパク質中間生成物を実証する可能な方法について、後に一般的方法項目１２、および実施例７に述べる。
【００５４】
ＯＫ１タンパク質が、Ｐ−デンプンに対して非リン酸化デンプンと比較して増大した結合活性を有することを、ＯＫ１タンパク質を、別々の調製物中でＰ−デンプンおよび非リン酸化デンプンとインキュベーションすることにより実証することができる。
【００５５】
すべての非リン酸化デンプンは、基本的に、ＯＫ１タンパク質を非リン酸化デンプンとインキュベーションするために適している。好ましくは非リン酸化植物デンプン、特に好ましくはコムギデンプン、およびとりわけ好ましくはArabidopsis thaliana突然変異体sex1-3の葉の粒状デンプンを用いる。
【００５６】
例えば植物からデンプンを単離する方法は、当業者に公知である。当業者に公知のすべての方法は、適当な植物種から非リン酸化デンプンを単離するために基本的に適する。好ましくは、後に述べる非リン酸化デンプンを単離するための方法を用いる（一般的方法項目２を参照のこと）。
【００５７】
デンプンリン酸を含むすべてのデンプンは、ＯＫ１タンパク質をＰ−デンプンとインキュベーションするために基本的に適する。化学的にリン酸化されたデンプンもまたこの目的に用いることができる。好ましくは、Ｐ−デンプン、特に好ましくは予め酵素的にリン酸化された植物デンプン、とりわけ好ましくはArabidopsis thaliana sex-1突然変異体から分離されて予め酵素的にリン酸化された植物デンプンを、ＯＫ１タンパク質とインキュベーションするために用いる。
【００５８】
ＯＫ１タンパク質の、非リン酸化デンプンと比較してＰ−デンプンへの増大した結合活性を実証するために、ＯＫ１タンパク質を別々の調製物中で、Ｐ−デンプン（調製物Ａ）、および非リン酸化デンプン（調製物Ｂ）とインキュベーションする。インキュベーション完了時に、調製物ＡおよびＢの適切なデンプンに結合していないタンパク質を、デンプンおよびそれが結合するタンパク質から分離する。続いて調製物Ａ中のタンパク質とＰ−デンプン間の結合、および調製物Ｂ中のタンパク質と非リン酸化デンプン間の結合を除去する、即ちそれぞれのタンパク質を溶解する。次に、調製物Ａおよび調製物Ｂの溶解したタンパク質を、それぞれの調製物中に存在する当該デンプンから分離することができる。これに続いて、単離した調製物ＡのＰ−デンプン結合タンパク質、および単離した調製物Ｂの非リン酸化デンプン結合タンパク質を、当業者に公知の方法、例えばゲルろ過、クロマトグラフ法、電気泳動、ＳＤＳアクリルアミドゲル電気泳動など、の助けを借りて、分離することができる。分離された調製物Ａのタンパク質の量を、対応する分離された調製物Ｂのタンパク質の量と比較することにより、タンパク質が、非リン酸化デンプンと比較してＰ−デンプンについて増大した結合活性を有するかどうかを決定することができる。非リン酸化デンプンと比較してＰ−デンプンへのタンパク質の優先的結合を実証するために用いることができる方法を、後に実施例８に記述する。
【００５９】
配列番号２に示すアミノ酸配列は、Arabidopsis thalianaからのＯＫ１タンパク質をコードし、また配列番号４に示すアミノ酸配列は、Oryza sativaからのＯＫ１タンパク質をコードする。
【００６０】
本発明のさらなる実施態様において、ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列は配列番号２または配列番号４に指定された配列と、少なくとも６０％の、特に少なくとも７０％の、好ましくは少なくとも８０％の、特に好ましくは少なくとも９０％の、およびとりわけ好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する。
【００６１】
本発明のさらなる実施態様において、ＯＫ１タンパク質はホスホヒスチジンドメインを有する。ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列は、配列番号５で指定されたArabidopsis thaliana由来のＯＫ１タンパク質のホスホヒスチジンドメインのアミノ酸配列と、少なくとも６０％の、特に少なくとも７０％の、好ましくは少なくとも８０％の、特に好ましくは少なくとも９０％の、とりわけ好ましくは少なくとも９５％の同一性を示すホスホヒスチジンドメインを含む。
【００６２】
本発明のさらなる実施態様は、遺伝的修飾が植物ゲノム中への少なくとも１つの外来性核酸分子の導入である、本発明による遺伝的に修飾された植物細胞または本発明による遺伝的に修飾された植物に関する。
【００６３】
この文脈において、用語「遺伝的修飾」とは、植物細胞のゲノムまたは植物のゲノムの中への、相同のおよび／または非相同の外来性核酸分子の導入であって、それらの分子の前記導入がＯＫ１タンパク質の活性の増大及びＲ１タンパク質の活性の増大をもたらすものを意味する。
【００６４】
本発明による植物細胞または本発明による植物は、外来性核酸分子の導入により、それらの遺伝子情報に関して修飾される。外来性核酸分子の存在または発現が、表現型の変化をもたらす。ここで「表現型の」変化とは、好ましくは、１以上の細胞の機能の測定可能な変化を意味する。例えば、本発明による遺伝的に修飾された植物細胞および本発明による遺伝的に修飾された植物は、導入された核酸分子の存在またはその発現により、ＯＫ１タンパク質の活性の増大及びＲ１タンパク質の活性の増大を示す。
【００６５】
本発明に関連して、用語「外来性核酸分子」とは、対応する野生型植物細胞には自然には存在しないような、または野生型植物細胞中の実在する空間的配置には自然には存在しないような分子、または植物細胞ゲノム中の、野生型植物細胞においてはそれが自然には存在しない場所に局在している分子、を意味するものと理解する。好ましくは、外来性核酸分子は、種々の要素、植物細胞中に自然には存在しない組合せまたは特異的な空間的配置、から成る組換え分子である。
【００６６】
原則として、外来性核酸分子は、植物細胞または植物中のＯＫ１タンパク質及びＲ１タンパク質の活性の増加をもたらす任意の核酸分子でよい。
【００６７】
本発明に関連して、用語「ゲノム」とは、植物細胞中に存在する遺伝物質の全体を意味すると理解するべきである。細胞核に加えて、他のコンパートメント（例えばプラスチド、ミトコンドリア）もまた遺伝物質を含んでいることは当業者に公知である。
【００６８】
さらなる実施態様において、本発明による植物細胞および本発明による植物は、少なくとも１つの外来性核酸分子がＯＫ１タンパク質、好ましくはArabidopsis thalianaからのＯＫ１タンパク質、またはOryza sativaからのＯＫ１タンパク質をコードすることを特徴とする。
【００６９】
さらなる実施態様において、外来性核酸分子は、配列番号２または配列番号４で特定されるアミノ酸配列を有するＯＫ１タンパク質をコードする。
【００７０】
さらなる実施態様において、本発明による植物細胞および本発明による植物は、少なくとも１つの外来性核酸分子がＲ１タンパク質、好ましくはジャガイモからのＲ１タンパク質またはOryza sativaからのＯＫ１タンパク質、をコードすることを特徴とする。
【００７１】
さらなる実施態様において、外来性核酸分子は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．：Ｙ０９５３３（22-JUL- 2003 Rel. 76, Last updated, Version 2）で特定されたアミノ酸配列を有するジャガイモからのＲ１タンパク質をコードする。ジャガイモからのＲ１タンパク質をコードする核酸分子およびアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｅ.：Ｙ０９５３３）は、参照により本出願の明細書に明確に組み込まれる。
【００７２】
さらなる実施態様において、本発明による植物細胞および本発明による植物は、第１の外来性核酸分子がＲ１タンパク質を、第２の外来性核酸分子がＯＫ１タンパク質をコードすることを特徴とする。
【００７３】
植物細胞または植物中に遺伝的修飾のために組み入れられた外来性核酸分子は、単一の核酸分子または複数の核酸分子でよい。したがって、それは、ＯＫ１タンパク質をコードする核酸配列およびＲ１タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子であってよく、またＯＫ１タンパク質をコードする核酸配列およびＲ１タンパク質をコードする核酸配列が様々な核酸分子中に存在する核酸分子であってもよい。ＯＫ１タンパク質をコードする核酸配列およびＲ１タンパク質をコードする核酸配列は、例えば１つのベクター、プラスミド、または直鎖状核酸分子中に同時に含まれることができるが、しかし、それぞれ互いに分離された２つのベクター、プラスミドまたは直鎖状の核酸分子の要素であってもよい。
【００７４】
ＯＫ１タンパク質をコードする核酸配列およびＲ１タンパク質をコードする核酸配列が、互いに分離された２つの核酸分子に存在する場合は、それらを同時に（「同時形質転換」）、または続けて、即ち連続的に（「逐次形質転換」）、植物細胞または植物のゲノムへ導入することができる。互いに分離された核酸分子を、1つの種の様々な個々の植物細胞または植物へ導入してもよい。それによって、少なくとも１つのＯＫ１タンパク質の、または少なくとも１つのＲ１タンパク質のいずれかの活性が増大している植物細胞または植物を生成することができる。そのような植物を、続いてＯＫ１タンパク質の活性が増大している植物をＲ１タンパク質の活性が増大している植物と交雑することにより、生成することができる。
【００７５】
さらに、ＯＫ１タンパク質の増大した活性またはＲ１タンパク質の増大した活性を既に有することを特徴とする突然変異細胞または突然変異体を、野生型植物細胞または野生型植物の代わりに、外来性核酸分子の導入のために用いることができる。突然変異体は、自然に（天然に）存在する突然変異体であっても、または変異原（例えば化学薬品、電離放射線など）または遺伝子工学的方法（例えばＴ−ＤＮＡ活性化タギング、トランスポゾン活性化タギング、インサイチュー活性化、インビボ突然変異誘発）の標的指向的使用により生成されたものであってもよい。
【００７６】
したがって、Ｒ１タンパク質の活性の増大をもたらす外来性核酸分子を、既にＯＫ１タンパク質の増大した活性を有する突然変異細胞または突然変異体に導入することにより、本発明よる植物細胞および本発明による植物を生成することもできる。本発明よる植物細胞および本発明による植物をまた、ＯＫ１タンパク質の活性の増大をもたらす外来性核酸分子を、既にＲ１タンパク質の増大した活性を有する突然変異細胞または突然変異体に導入することによっても、生成することができる。
【００７７】
本発明よる植物細胞または本発明による植物をまた、ＯＫ１タンパク質の活性が増大している突然変異体を、外来性核酸分子の導入によりＲ１タンパク質の増大した活性を有する植物と交雑することによっても、生成することができる。同様に、本発明よる植物細胞または本発明による植物を、Ｒ１タンパク質の活性が増大している突然変異体を、外来性核酸分子の導入によりＯＫ１タンパク質の増大した活性を有する植物と交雑することによって生成することが可能である。
【００７８】
多数の技術をＤＮＡの植物宿主細胞中への導入に利用することができる。これらの技術には、形質転換媒体としてAgrobacterium tumefaciensまたはAgrobacterium rhizogenes を用いたＴ−ＤＮＡによる植物細胞の形質転換、プロトプラストの融合、注入、ＤＮＡのエレクトロポレーション、バイオリスティックによるＤＮＡの導入、ならびに他の可能性が含まれる。アグロバクテリウムを介する植物細胞の形質転換の使用は、集中的に研究され、ＥＰ １２０５１６、Hoekema, in: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V、Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci. 4, 1-46およびAn et al. EMBO J. 4, (1985), 277-287 に十分に記述されている。ジャガイモの形質転換については、例えばRocha-Sosa et al., EMBO J. 8, (1989), 29-33を参照のこと。
【００７９】
Agrobacteriumの形質転換に基づいた、ベクターによる単子葉植物の形質転換についてもまた記述されている(Chan et al., Plant Mol. Biol. 22, (1993), 491-506; Hiei et al., Plant J. 6, (1994) 271-282; Deng et al, Science in China 33, (1990), 28-34; Wilmink et al., Plant Cell Reports 11, (1992), 76-80; May et al., Bio/Technology 13, (1995), 486-492; Conner and Domisse, Int. J. Plant Sci. 153 (1992), 550-555; Ritchie et al, Transgenic Res. 2, (1993), 252-265) 153 (1992), 550- 555; Ritchie et al, Transgenic Res. 2,(1993), 252-265)。単子葉植物の形質転換の別のシステムは、バイオリスティックによる形質転換(Wan and Lemaux, Plant Physiol. 104, (1994), 37-48; Vasil et al., Bio/Technology 11 (1993), 1553-1558; Ritala et al., Plant Mol. Biol. 24, (1994), 317- 325; Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79, (1990), 625-631)、プロトプラスト形質転換、部分的に透過性を与えられた細胞のエレクトロポレーション、およびガラス繊維によるＤＮＡの導入である。特にトウモロコシの形質転換については、文献に幾度も記述された（例えば、Ｗ０９５／０６１２８、ＥＰ０５１３８４９、ＥＰ０４６５８７５、ＥＰ０２９２４３５；Fromm et al., Biotechnology 8, (1990), 833-844; Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2, (1990), 603-618; Koziel et al., Biotechnology 11 (1993), 194-200; Moroc et al., Theor. Appl. Genet. 80, (1990), 721-726参照）。
【００８０】
他の型の穀類の成功した形質転換についても、既に例えばオオムギについて(Wan and Lemaux,上記; Ritala et al.,上記; Krens et al., Nature 296, (1982), 72-74)およびコムギについて (Nehra et al., Plant J. 5, (1994), 285-297; Becker et al., 1994, Plant Journal 5, 299-307）記述されている。上記の方法はすべて本発明の枠組み内において適当である。
【００８１】
とりわけ、ＯＫ１タンパク質及び／又はＲ１タンパク質の導入により遺伝的に修飾された植物細胞および植物を、野生型植物細胞および野生型植物それぞれから、それらが野生型植物細胞または野生型植物に自然には存在しない外来性核酸分子を含むという点で、あるいはそのような分子が、本発明による植物細胞のゲノム中のまたは本発明による植物のゲノム中の、野生型植物細胞または野生型植物中には存在しない場所に、即ち異なるゲノム環境に、組入れられて存在するという点で、区別することができる。さらに、この型の本発明による植物細胞および本発明による植物は、それらがゲノム内に安定して組入れられた外来性核酸分子の少なくとも１つのコピーを、おそらくは野生型植物細胞または野生型植物中で自然に存在するそのような分子のコピーに加えて、含むという点で、野生型植物細胞および野生型植物とそれぞれ異なる。もし本発明による植物細胞または本発明による植物へ導入した外来性核酸分子が、野生型植物細胞または野生型植物にそれぞれ既に自然に存在している分子の付加的なコピーである場合は、本発明による植物細胞および本発明による植物と野生型植物細胞および野生型植物それぞれとを、特にこのまたはこれらの追加のコピーがゲノム中のそれが（あるいは、それらが）野生型植物細胞または野生型植物では生じない場所に局在しているという点で、区別することができる。例えばこれを、サザンブロット分析を用いることにより確認することができる。
【００８２】
更に、本発明による植物細胞また本発明による植物を、野生型植物細胞または野生型植物それぞれから、好ましくは次の特徴の少なくとも１つによって区別することができる：導入された外来性核酸分子が、植物細胞または植物に関して異種の場合は、本発明による植物細胞または本発明による植物は、導入された核酸分子の転写物を有する。これらを例えばノーザンブロット分析、またはＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応）によって確認することができる。アンチセンスのおよび／またはＲＮＡｉの転写物を発現する本発明による植物細胞および本発明による植物を、例えばタンパク質をコードするＲＮＡ（植物細胞に自然に生ずる）に相補的な特異的核酸プローブの助けを借りて、確認することができる。好ましくは本発明による植物細胞および本発明による植物は、導入された核酸分子によってコードされるタンパク質を含む。これを、例えば免疫学的方法、特にウエスタンブロット分析によって実証することができる。
【００８３】
もし導入された外来性核酸分子が植物細胞または植物に関して同種である場合は、本発明による植物細胞あるいは本発明による植物を野生型植物細胞または野生型植物それぞれから、例えば導入された外来性核酸分子の追加の発現により、区別することができる。本発明による植物細胞および本発明による植物は、好ましくは外来性核酸分子の転写物を含む。これを、例えばノーザンブロット分析、またはいわゆる定量ＰＣＲを用いることにより実証することができる。
【００８４】
さらなる実施態様では、本発明による植物細胞および本発明による植物は、それぞれ遺伝子組換え植物細胞または遺伝子組換え植物である。
【００８５】
さらなる実施態様において、本発明は、本発明による植物細胞におよび本発明による植物であって、ＯＫ１タンパク質をコードする外来性核酸分子が：
ａ）  配列番号２または配列番号４に与えられたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸分子；
ｂ）  プラスミドＡ．ｔ．−ＯＫ１−ｐＧＥＭ中の挿入またはプラスミドｐＭＩ５０中の挿入によってコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸分子；
ｃ）  配列番号２または配列番号４に与えられるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性がある配列を有するタンパク質をコードする核酸分子；
ｄ）  プラスミドＡ．ｔ．−ＯＫ１−ｐＧＥＭ中の挿入のコード領域またはプラスミドｐＭＩ５０中の挿入のコード領域によってコードされるアミノ酸配列と、少なくとも６０％の同一性がある配列を有するタンパク質をコードする核酸分子；
ｅ）  配列番号１または配列番号３に示されたヌクレオチド配列または相補的配列を含む核酸分子；
ｆ）  プラスミドＡ．ｔ．−ＯＫ１−ｐＧＥＭまたはプラスミドｐＭＩ５０に含まれる挿入ヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｇ）  ａ）、ｂ）、ｅ）またはｅ）に記述された核酸配列と少なくとも６０％の同一性を有する核酸分子；
ｈ）  ストリンジェントな条件下で、ａ）、ｂ）、ｅ）またはｆ）に記述された核酸分子の少なくとも１つの鎖とハイブリダイズする核酸分子；
ｉ）  ヌクレオチド配列が、遺伝子コードの縮退により、ａ）、ｂ）、ｅ）またはｆ）で同定された核酸分子の配列と相違している核酸分子；および
ｊ）  ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）、またはｉ）で同定された核酸分子の断片、対立遺伝子変異体、および／または誘導体、に相当する核酸分子、
から成る群より選ばれる植物細胞または植物に関する。
【００８６】
配列番号１に示された核酸配列は、Arabidopsis thalianaからのＯＫ１タンパク質のコード領域を含むｃＤＮＡ配列であり、また配列番号３に示された核酸配列は、Oryza sativaからのＯＫ１タンパク質のコード領域を含むｃＤＮＡ配列である。
【００８７】
Arabidopsis thalianaからの本発明によるタンパク質（Ａ．ｔ．−ＯＫ１）をコードするｃＤＮＡを含むプラスミド（Ａ．ｔ．−ＯＫ１−ｐＧＥＭ）が、ブダペスト条約によりthe German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germanyに、番号ＤＳＭ１６２６４の下に２００４年３月８日に寄託され、Oryza sativaからの本発明によるさらなるタンパク質（Ｏ．ｓ．−ＯＫ１）をコードするｃＤＮＡを含むプラスミド（ｐＭ１５０）が、２００４年３月２４日に番号ＤＳＭ１６３０２の下に寄託された。
【００８８】
配列番号２に示されるアミノ酸配列はプラスミドＡ．ｔ．−ＯＫ１−ｐＧＥＭに組み込まれたｃＤＮＡ配列のコード領域から導出することができ、Arabidopsis thalianaからのＯＫ１タンパク質をコードする。配列番号４に示されるアミノ酸配列は、プラスミドｐＭＩ５０に組み込まれたｃＤＮＡ配列のコード領域から導出することができ、Oryza sativaからのＯＫ１タンパク質をコードする。したがって、本発明はまた、プラスミドＡ．ｔ．−ＯＫ１−ｐＧＥＭ中の挿入またはプラスミドｐＭＩ５０中の挿入によってコードされるアミノ酸配列を含むＯＫ１タンパク質の酵素活性を有するタンパク質をコードする核酸分子であって、コードされるタンパク質は、Ａ．ｔ．−ＯＫ１−ｐＧＥＭまたはｐＭＩ５０中の挿入から導くことができるアミノ酸配列と、少なくとも７０％の、好ましくは少なくとも８０％の、特に好ましくは少なくとも９０％の、また、特に好ましくは９５％の同一性を有する核酸分子に関する。
【００８９】
本発明はまた、ＯＫ１タンパク質をコードし、かつ配列番号１または配列番号３に示されたヌクレオチド配列のコード領域またはそれに相補的な配列を含む核酸分子、プラスミドＡ．ｔ．−ＯＫ１−ｐＧＥＭまたはプラスミドｐＭＩ５０に含まれる挿入のヌクレオチド配列のコード領域を含む核酸分子、および前記核酸分子と少なくとも７０％の、好ましくは少なくとも８０％の、特に好ましくは少なくとも９０％の、およびとりわけ好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する核酸分子、に関する。
【００９０】
当業者にとって、本発明による核酸分子の配列情報を利用して、または本発明による核酸分子を利用して、他の植物種から、好ましくはデンプン貯蔵植物から、好ましくはOryza属の植物種から、特にOryza sativaから、またはArabidopsis thalianaから、相同の配列を単離することが可能である。例えば適当なハイブリダイゼーション試料のｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーの調査のような従来の方法を利用して、これを実施することができる。当業者は、（縮重した）オリゴヌクレオチドの利用およびＰＣＲに基づいた方法の使用により相同の配列を単離することができることを知っている。
【００９１】
例えばＥＭＢＬ（http://www.ebi.ac.uk/Tools/index.htm）またはＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）などにより利用可能となるデータベースの調査もまた、ＯＫ１タンパク質をコードする相同配列の同定のために用いることができる。この場合、１つ以上の配列をいわゆるクエリーとして指定する。このクエリー配列を、次に、統計的コンピュータープログラムによって選択されたデータベースに含まれる配列と比較する。そのようなデータベースクエリー（例えばｂｌａｓｔまたはｆａｓｔａ検索）は当業者に公知であり、様々なプロバイダーによって実施することができる。
【００９２】
そのようなデータベースクエリーを、例えばＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）で実行する場合は、個別比較調査のために指定される標準設定を用いるべきである。タンパク質配列比較（blastp）に対しては、これらは次の設定である：Limit entrez = not activated; Filter = low complexity activated; Expect value = 10; word size = 3; Matrix = BLOSUM62; Gap costs: Existence = 11, Extension = 1.
【００９３】
核酸配列比較（blastn）については、次のパラメーターを設定しなければならない：Limit entrez = not activated; Filter = low complexity activated; Expect value = 10; word size = 11.
【００９４】
そのようなデータベース検索で、本発明に記述された配列を、さらなるＯＫ１タンパク質をコードする核酸分子および／またはタンパク質を同定するためのクエリー配列として用いることができる。
【００９５】
上記方法を利用して、配列番号１または配列番号３に指定された配列にハイブリダイズし、ＯＫ１タンパク質をコードする本発明による核酸分子を同定しおよび／または単離することがさらに可能である。
【００９６】
本発明の枠組みの内では、用語「ハイブリダイズすること」とは、従来のハイブリダイゼーション条件下の、好ましくは、例えばSambrock et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY., ISBN: 0879695773, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons; 5th edition (2002), ISBN: 0471250929に記述されているような、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションを意味する。特に好ましくは、「ハイブリダイズすること」とは、下記の条件下のハイブリダイゼーションを意味する：
ハイブリダイゼーション緩衝液：
２×ＳＳＣ；１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液（フィコール４００＋ＰＥＧ＋ＢＳＡ；比率  １：１：１）；０．１％ＳＤＳ；５mMＥＤＴＡ；５０ｍMＮａ2ＨＰＯ4；２５０μg/mlニシン精子ＤＮＡ；５０μg/ml ｔＲＮＡ；または２５Mリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．２；１ｍM ＥＤＴＡ；７％ＳＤＳ
ハイブリダイゼーション温度：Ｔ＝６５〜６８℃
洗浄緩衝液：０．１×ＳＳＣ；０．１％ＳＤＳ
洗浄温度：Ｔ＝６５〜６８℃
【００９７】
原則として、本発明による核酸分子とハイブリダイズする核酸分子は、適切なタンパク質をコードする任意の植物種に由来するものでよく、好ましくはデンプン貯蔵植物に、好ましくは（系統上の）Poacea科の種に、特に好ましくはOryza属の種に由来することができる。本発明による分子にハイブリダイズする核酸分子は、例えばゲノムの、またはｃＤＮＡのライブラリーから特定することができる。この型の核酸分子の同定および単離を、本発明よる核酸分子またはこれらの分子の部分またはこれらの分子の逆相補体を用いて、例えば標準法によるハイブリダイゼーション（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. ISBN: 0879695773, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons; 5th edition (2002), ISBN: 0471250929を参照のこと）またはＰＣＲを用いる増幅により実施することができる。
【００９８】
配列番号１または配列番号３によって指定されるヌクレオチド配列またはこれらの配列の部分のヌクレオチド配列を、正確にまたは本質的に有する核酸分子を、ハイブリダイゼーション試料として用いることができる。ハイブリダイゼーション試料として用いられる断片は、確立した合成技術を用いて製造され、その配列が本発明による核酸分子の配列に本質的に一致する合成断片またはオリゴヌクレオチドでもよい。もし本発明による核酸配列にハイブリダイズする遺伝子を同定および単離した場合は、この配列の決定およびこの配列によってコードされるタンパク質の特性の分析を、ＯＫ１タンパク質が含まれているかどうかを確証するために実施するべきである。核酸またはアミノ酸配列のレベルの相同性比較および酵素活性の測定が、この目的に特に適する。ＯＫ１タンパク質の活性は、例えば上に述べたように一般的方法項目１１に記述されるようにして生起することが可能である。ＯＫ１タンパク質の非リン酸化デンプンと比較してＰ−デンプンへの選択的な結合親和性および自己リン酸化を、既に記述され、また一般的方法項目８および１２に記述される方法を用いて実証することができる。
【００９９】
本発明による核酸分子にハイブリダイズする分子は特に、植物由来の、好ましくはデンプ貯蔵植物由来の、好ましくは系統的Poacea科の植物種由来の、特に好ましくはOryza属由来のＯＫ１タンパク質をコードする本発明による核酸分子の断片、誘導体および対立遺伝子変異体を含む。本発明に関連して用語「誘導体」とは、これらの分子の配列が、上に記述された核酸分子の配列とは１つ以上の位置で異なり、またこれらの配列と高度の同一性を有することを意味する。ここで、上に記述された核酸分子からの偏異は、例えば欠失、付加、置換、挿入または組換えによって起こった可能性がある。
【０１００】
本発明に関連して、用語「同一性」とは、コード領域の全長に渡る少なくとも６０％の配列同一性、特に少なくとも８０％の、好ましくは８０％を越える、特に好ましくは９０％を越える、およびとりわけ少なくとも９５％の同一性を意味する。本発明に関連して、用語「同一性」を、パーセンテージとして表現される、他のタンパク質／核酸と一致するアミノ酸／ヌクレオチドの数（同一性）を意味すると理解するべきである。好ましくは同一性を、アミノ酸に対して配列番号２または配列番号４を、または核酸に対して配列番号１または配列番号３を、他のタンパク質／核酸と、コンピュータープログラムを利用して比較することにより決定する。互いに比較する配列が異なる長さを有する場合は、同一性は、長い配列と共通の短い配列を有するアミノ酸の数が、同一性のパーセンテージ率を決定するようにして、決定することになる。好ましくは同一性を、周知であり公に利用可能であるコンピュータープログラムＣｌｕｓｔａｌＷによって決定する（Thompson et al., Nucleic Acids Research 22 (1994), 4673-4680）。ＣｌｕｓｔａｌＷ は、Julie Thompson (Thompson@EMBL-Heidelberg.DE)およびToby Gibson(Gibson@EMBL-Heidelberg.DE), European Molecular Biology Laboratory, Meyerhofstrasse 1, D 69117 Heidelberg, Germanyによって公に利用できるようにされている。ＣｌｕｓｔａｌＷはまた、ＩＧＢＭＣ（Institut de Genetique et de Biologie Moleculaire et Cellulaire, BP.163, 67404 Illkirch Cedex, France; ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/）およびＥＢＩ（ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/）、ならびにＥＢＩ（European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK）のすべてのミラーインターネットサイトを含む、種々のインターネットサイトからダウンロードすることもできる。
【０１０１】
好ましくは、ＣｌｕｓｔａｌＷコンピュータープログラムのバージョン１．８を本発明によるタンパク質と他のタンパク質の間の同一性を決定するために用いる。それを行う際に、次のパラメーターを設定しなければならない：
KTUPLE=1, TOPDIAG=5, WINDOW=5, PAIRGAP=3, GAPOPEN=10, GAPEXTEND=0.05, GAPDIST=8, MAXDIV=40, MATRIX=GONNET, ENDGAPS(OFF), NOPGAP, NOHGAP
【０１０２】
好ましくは、ＣｌｕｓｔａｌＷコンピュータープログラムのバージョン１．８を、本発明による核酸分子のヌクレオチド配列と、例えば他の核酸分子のヌクレオチド配列の間の同一性を決定するために用いる。それを行う際に、次のパラメーターを、加重なしで設定しなければならない：
KTUPLE=2, TOPDIAGS=4, PAIRGAP=5, DNAMATRIX:IUB, GAPOPEN=10, GAPEXT=5, MAXDIV=40, TRANSITIONS:
【０１０３】
さらに、同一性とは、機能的なおよび／または構造的な等価性が、当該核酸分子間あるいはそれらによってコードされるタンパク質間に存在することを意味する。上記の分子に相同であり、これらの分子の誘導体を構成する核酸分子は、一般にこれらの分子の変異体であって一時変異を構成し、同じ生物学的機能を遂行する。同時に、その変異体は自然に存在する可能性が、例えばそれらが他の植物種由来の配列である可能性があり、あるいは、自然に生じたまたは目的を持って突然変異誘発で導入された突然変異体である可能性がある。変異体はまた合成的に作製された配列である可能性がある。対立遺伝子変異体は、自然発生の変異体、および合成的に作製された変異体または組換えＤＮＡ技術によって生成された変異体のいずれでもあり得る。遺伝子コードの縮退により本発明による核酸分子と相違する核酸分子は、誘導体の特別な形を構成する。
【０１０４】
本発明による核酸分子の種々の誘導体によってコードされるタンパク質は、ある共通の特性を有する。これらには、例えば、生物活性、基質特異性、分子量、免疫反応、コンフォメーションなどが、並びに、例えばゲル電気泳動における走行性、クロマトグラフィーの挙動、沈降定数、溶解度、分光学的特性、安定性、最適ｐＨ、最適温度などのような物理的特性が含まれ得る。ＯＫ１タンパク質の好ましい特性については、既に詳細に上述しており、従ってここでそれを用いる。
【０１０５】
本発明による核酸分子は任意の核酸分子、特に、例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡなどのＤＮＡまたはＲＮＡ分子でよい。それらは、自然発生の分子、または遺伝子工学または化学合成法によって作製された分子でよい。それらは、コード鎖または非コード鎖を含む一本鎖分子、または二重鎖分子であってよい。
【０１０６】
さらなる実施態様において、本発明は、本発明による植物細胞におよび本発明による植物であって、Ｒ１タンパク質をコードする外来性核酸分子が：
ａ）  配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、または配列番号１７に与えられたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸分子；
ｂ）  配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、または配列番号１６に示されたヌクレオチド配列、または相補的配列を含む核酸分子；
ｃ）  そのヌクレオチド配列が、遺伝子コードの縮退により、ａ）またはｂ）に特定された核酸分子の配列と相違する核酸分子；
ｄ）  ａ）またはｂ）に記述された核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する核酸分子；
ｅ）  厳格な条件下で、ａ）またはｂ）に記述された核酸分子の少なくとも１つの鎖とハイブリダイズする核酸分；
からなる群より選ばれる植物細胞および植物に関する。
【０１０７】
さらなる実施態様において、本発明は、本発明による植物細胞におよび本発明による植物であって、外来性核酸分子が：
ａ）  植物ゲノムへの組込みによりＯＫ１遺伝子および／またはＲ１遺伝子の発現の増大をもたらすＴ−ＤＮＡ分子（Ｔ−ＤＮＡ活性化タギング）；
ｂ）  植物ゲノムへの組込みにより、ＯＫ１遺伝子および／またはＲ１遺伝子の発現の増大をもたらすトランスポゾンを含むＤＮＡ分子（トランスポゾン活性化タギング）；
ｃ）  ＯＫ１タンパク質および／またはＲ１タンパク質をコードし、また調節配列（植物細胞中の転写を保証し、細胞中でＯＫ１タンパク質活性および／またはＲ１タンパク質活性の増大をもたらす）と連結されているＤＮＡ分子；
ｄ）  ＯＫ１タンパク質をコードする少なくとも１つの内在性遺伝子中に突然変異または非相同配列の挿入をもたらす（突然変異または挿入はＯＫ１タンパク質をコードする遺伝子の発現を増大させる効果を有する）、インビボの突然変異誘発によって導入された核酸分子；
ｅ）  Ｒ１タンパク質をコードする少なくとも１つの内在性遺伝子中に突然変異または非相同配列の挿入をもたらす（突然変異または挿入はＲ１タンパク質をコードする遺伝子の発現を増大させる効果を有する）、インビボの突然変異誘発によって導入された核酸分子；
からなる群より選ばれる、植物細胞および植物に関する。
【０１０８】
本発明に関連して、本発明による植物細胞および植物をまた、いわゆる挿入突然変異誘発（概説論文：Thorneycroft et al., 2001, Journal of experimental Botany 52 (361), 1593-1601）の使用によって作製することもできる。本発明に関連して、挿入突然変異誘発とは、特にトランスポゾンまたはいわゆるトランスファーＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）の、ＯＫ１タンパク質および/またはＲ１タンパク質をコードする遺伝子中への、または遺伝子の近くへの挿入であって、その結果当該細胞のＯＫ１タンパク質および／またはＲ１タンパク質の活性が増大するものを意味すると理解するべきである。
【０１０９】
トランスポゾンは、細胞に自然に存在するもの（内在性トランスポゾン）および、さらに前記細胞に自然には存在せず、例えば細胞の形質転換などの遺伝子工学的方法によって細胞へ導入されるもの（異種トランスポゾン）のいずれであってもよい。トランスポゾンにより遺伝子の発現を変更することは当業者に公知である。植物バイオテクノロジーの道具としての、内在的および非相同トランスポゾンの使用の概説が、Ramachandran and Sundaresan (2001 , Plant Physiology and Biochemistry 39, 234-252)に提示されている。
【０１１０】
Ｔ−ＤＮＡ挿入突然変異誘発は、アグロバクテリウム由来のＴｉプラスミドのある一部分（Ｔ−ＤＮＡ）が植物細胞のゲノムへ組み込まれることができるという事実に基づく。植物染色体中の組込み場所は一定せず、どの位置にでも起こることが可能である。Ｔ−ＤＮＡが、遺伝子機能を構成する染色体の一部へ、または染色体の一部の近くへ組み込まれる場合は、遺伝子発現の増大、したがって当該遺伝子によってコードされるタンパク質の活性の変化をもたらす場合がある。
【０１１１】
ここで、ゲノムに挿入された配列（特にトランスポゾンまたはＴ−ＤＮＡ）は、ＯＫ１遺伝子の調節配列の活性化をもたらす配列（「活性化タギング」）を含むという事実により顕著である。
【０１１２】
本発明による植物細胞および植物は、いわゆる「活性化タギング」法（例えばWalden et al., Plant J. (1991), 281-288; Walden et al., Plant Mol. Biol. 26 (1994), 1521-1528を参照のこと）によって生成することができる。これらの方法は、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓ ＲＮＡプロモーターのエンハンサーまたはオクトピン合成酵素エンハンサーなどの「エンハンサー」配列による内在的なプロモーターの活性化に基づく。
【０１１３】
本発明に関連して、用語「Ｔ−ＤＮＡ活性化タギング」とは、「エンハンサー」配列を含み、植物細胞のゲノムへの組込みによって少なくとも１つのＯＫ１タンパク質及び／又は少なくとも１つのＲ１タンパク質の活性の増加をもたらすＴ−ＤＮＡ断片を意味すると理解するべきである。
【０１１４】
本発明に関連して、用語「トランスポゾン活性化タギング」とは、「エンハンサー」配列を含み、植物細胞のゲノムへの組込みによって少なくとも１つのＯＫ１タンパク質及び／又は少なくとも１つのＲ１タンパク質の活性の増加をもたらすトランスポゾンを意味すると理解するべきである。
【０１１５】
別の実施態様において、ＯＫ１タンパク質及び／又はＲ１タンパク質をコードする本発明によるＤＮＡ分子を、植物細胞中で転写を開始し（プロモーター）細胞のＯＫ１タンパク質活性及び／又はＲ１タンパク質活性の増加をもたらす調節配列と連結させる。この場合、本発明による核酸分子は、調節配列に対して「センス」配向に存在する。
【０１１６】
ＯＫ１タンパク質及び／又はＲ１タンパク質をコードする本発明による核酸分子を発現させるために、好ましくはこれらを、植物細胞中の転写を保証する調節ＤＮＡ配列と連結する。特にこれらはプロモーターを含む。一般に、植物細胞中で活性を有する任意のプロモーターは発現に対して適格である。
【０１１７】
同時に、プロモーターを選択することにより、発現が、構成的にまたはある組織のみに、植物発生のある段階でまたは外部の影響によって決定されるある時に、起こるようにすることができる。プロモーターは、植物に関しておよび核酸分子に関して、同種であってもまたは異種であってもよい。
【０１１８】
適当なプロモーターは、例えばカリフラワーモザイクウィルスの３５ＳＲＮＡプロモーター、および構成的発現のためのトウモロコシのユビキチンプロモーター、ジャガイモの塊茎の特異的発現のためのパタチンプロモーターＢ３３（Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29）、または光合成活性を有する組織における発現のみを保証するプロモーター、例えばＳＴ−ＬＳ１プロモーター（Stockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-2451）、または、胚乳に特異的な発現のためのコムギからのＨＭＧプロモーター、ＵＳＰプロモーター、ファゼオリンプロモーター、トウモロコシからのゼイン遺伝子のプロモーター（Pedersen et al., Cell 29 (1982),1015-1026; Quatroccio et al., Plant Mol.Biol. 15 (1990), 81-93）、グルテリンプロモーター（Leisy et al., Plant Mol. Biol. 14 (1990), 41-50; Zheng et al., Plant J. 4 (1993), 357-366; Yoshihara et al., FEBS Lett. 383 (1996), 213-218）、あるいはｓｈｒｕｎｋｅｎ−１プロモーター（Werr et al., EMBO J. 4 (1985), 1373-1380）である。しかし、外部的影響によって決定された時にのみ活性化されるプロモーターもまた用いることができる（例えばＷＯ９３０７２７９を参照のこと）。単純な誘導が可能である熱ショックタンパク質のプロモーターは、ここで特に興味深い。さらに、Vicia fabaおよび他の植物の種子特異的な発現を保証するVicia fabaからのＵＳＰプロモーター（Fiedler et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 669-679; Baeumlein et al., Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 459-467）などの、種子特異的なプロモーターを用いることができる。
【０１１９】
さらに、転写物にポリＡテールを加えるために用いられる終結配列（ポリアデニル化信号）が存在することが可能である。転写物の安定化の機能がポリＡテールに帰されている。この型の要素については文献に記載されており（Gielen et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29を参照のこと）、任意に交換することができる。
【０１２０】
イントロン配列がさらに、プロモーターとコード領域の間に存在することもできる。そのようなイントロン配列は植物中で発現の安定性および発現の増加をもたらすことができる（Callis et al., 1987, Genes Devel. 1, 1183-1200; Luehrsen, and Walbot, 1991, Mol. Gen. Genet. 225, 81-93; Rethmeier, et al., 1997; Plant Journal. 12(4):895-899; Rose and Beliakoff, 2000, Plant Physiol. 122 (2), 535-542; Vasil et al., 1989, Plant Physiol. 91 , 1575-1579; XU et al., 2003, Science in China Series C Vol.46 No.6, 561-569）。適当なイントロン配列は、例えばトウモロコシのｓｈ１遺伝子の第１イントロン、トウモロコシのポリユビキチン遺伝子１の第１イントロン、イネのＥＰＳＰＳ遺伝子の第１イントロン、またはアラビドプシスのＰＡＴ１遺伝子の２つの第１イントロンの１つである。
【０１２１】
さらに、本発明による植物細胞および本発明による植物を、いわゆる「インサイチュー活性化」により作製することができる。この場合、導入された遺伝的修飾が、内在的なＯＫ１遺伝子の調節配列に変化をもたらし、それがＯＫ１遺伝子及び／又はＲ１遺伝子の増大した発現を引き起こす。好ましくは、ＯＫ１遺伝子及び／又はＲ１遺伝子の活性化が、内在的なＯＫ１遺伝子及び／又はＲ１遺伝子のプロモーターのまたは「エンハンサー」配列の「インビボの」突然変異誘発によって起こる。そうする際に、例えば、プロモーターまたは「エンハンサー」配列を、生成された突然変異が、野生型植物細胞または野生型植物中のＯＫ１遺伝子及び／又はＲ１遺伝子の発現と比較して、本発明による植物細胞または本発明による植物中のＯＫ１遺伝子及び／又はＲ１遺伝子の増大した発現をもたらすように変更することができる。プロモーターまたは「エンハンサー」配列の突然変異はまた、野生型植物細胞または野生型植物中では発現されないであろう時に発現される本発明による植物細胞または本発明による植物中のＯＫ１遺伝子及び／又はＲ１遺伝子をもたらすことができる。
【０１２２】
本発明に関連して、用語「ＯＫ１遺伝子」とは、ＯＫ１タンパク質、好ましくはデンプン貯蔵植物からの、より好ましくはArabidopsis thalianaからの、および最も好ましくはイネからのＯＫ１タンパク質をコードする核酸分子（ｃＤＮＡ、ＤＮＡ）を意味すると理解する。
【０１２３】
本発明に関連して、用語「Ｒ１遺伝子」とは、Ｒ１タンパク質、好ましくはデンプン貯蔵植物からの、特に好ましくはArabidopsis thalianaからの、とりわけ好ましくはイネからのＲ１タンパク質をコードする核酸分子（ｃＤＮＡ、ＤＮＡ）を意味すると理解するべきである。
【０１２４】
いわゆる「インビボ突然変異誘発」中に、ハイブリッドＲＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチド（「キメロプラスト」）が、植物細胞へ形質転換により導入される（Kipp, P.B. et al., Poster Session at the "5th International Congress of Plant Molecular Biology, September 21-27, 1997, Singapore; R. A. Dixon and CJ. Amtzen, Meeting report on "Metabolic Engineering in Transgenic Plants", Keystone Symposia, Copper Mountain, CO, USA, TIBTECH 15, (1997), 441-447; international patent WO 9515972; Kren et al., Hepatology 25, (1997), 1462-1468; Cole-Strauss et al., Science 273, (1996), 1386-1389; Beetham et al., 1999, PNAS 96, 8774-8778）。
【０１２５】
ＲＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドのＤＮＡ成分の一部は、内在的なＯＫ１遺伝子及び／又はＲ１遺伝子の核酸配列に相同である、しかしそれは、内在的なＯＫ１遺伝子及び／又はＲ１遺伝子の核酸配列と比較して、相同領域に囲まれた突然変異を有するかまたは非相同部位を含む。
【０１２６】
ＲＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドの相同領域と内在的な核酸分子との塩基対合、それに続く相同組換えにより、ＲＮＡ−ＤＮＡオリゴヌクレオチドのＤＮＡ成分または非相同領域に含まれていた突然変異を、植物細胞のゲノムへ移入することができる。これが１つ以上のＯＫ１タンパク質の活性の増加をもたらす。
【０１２７】
これらの方法はすべて、外来性核酸分子の植物細胞または植物のゲノム中への導入に基づいており、したがって本発明による植物細胞および本発明による植物の作製に基本的に適している。
【０１２８】
驚いたことに、本発明による植物細胞および本発明による植物が、遺伝的に修飾されていない対応する野生型植物細胞または野生型植物のデンプンと比較して修飾されたデンプンを合成することが見出された。
【０１２９】
本発明による植物細胞および本発明による植物は、物理的・化学的特性、特にデンプンリン酸含量またはリン酸の分布が、野生型植物細胞または植物中の合成されたデンプンと比較して変更されている修飾デンプンを合成し、これは特別の応用によく適している。
【０１３０】
Ｐ−デンプンのみをリン酸化する酵素はこれまでに報告されていなかったので、植物中の既にリン酸化されたデンプンのデンプンリン酸濃度を、一定量を越えて増大させることは以前は不可能であった。これは、ＯＫ１タンパク質の機能を有する酵素を用いることによって、または植物の遺伝的修飾のためにＯＫ１タンパク質をコードする核酸分子を調製することによってのみ可能である。
【０１３１】
植物によって合成されたデンプンのリン酸分布は、利用できる手段が不足していたために、以前は不可能であった。自然のデンプン中のリン酸の比率を変化させることもまた現在では、本発明によりＯＫ１タンパク質の機能を有する酵素の調製、およびＯＫ１タンパク質をコードする核酸分子の調製により可能である。
【０１３２】
したがって、本発明及び本発明の植物はまた、遺伝的に修飾されていない対応する野生型植物細胞または野生型と比較して修飾されたデンプンを合成する本発明による植物細胞および植物も含む。
【０１３３】
本発明に関連して、用語「修飾デンプン」とは、対応する野生型植物細胞または野生型植物から得ることができる非修飾デンプンと比較して、デンプンが変化した物理的・化学的特性を示すことを意味すると理解するべきである。
【０１３４】
本発明の追加の実施態様では、本発明による植物細胞または植物が、対応する野生型植物細胞および野生型から単離したデンプンと比較して、高いデンプンリン酸含量および／または変更されたリン酸分布を含むデンプンを合成する。
【０１３５】
この発明に関連して、用語「リン酸分布」とは、デンプン中の全デンプンリン酸含量に対して、グルコース分子のＣ−２位置、Ｃ−３位置、またはＣ−６位置に結合したデンプンリン酸の割合を意味すると理解するべきである。
【０１３６】
本発明の追加の実施態様では、本発明による植物細胞または植物が、遺伝的に修飾されていない野生型植物からのデンプンと比較して、Ｃ−３リン酸のＣ−６リン酸に対する比率が変更されたデンプンを合成する。ここで好ましいのは、遺伝的に修飾されていない野生型植物細胞および野生型植物からのデンプンと比較して、Ｃ−６位置に結合したデンプンリン酸と比較してＣ−３位置に結合したデンプンリン酸の割合が増加しているデンプンである。
【０１３７】
本発明に関連して、用語「Ｃ−３リン酸とＣ−６リン酸の比率」とは、Ｃ−３位置でまたはＣ−６位置でデンプンに結合したデンプンリン酸が、それぞれＣ−３位置でおよびＣ−６位置で当該デンプンに結合したデンプンリン酸の全量（Ｃ−３位置＋Ｃ−６位置）に寄与する、デンプンリン酸の割合を意味すると理解するべきである。
【０１３８】
デンプンリン酸量を測定する様々な方法が記述されている。好ましくは、Ritte et al.(2000, Starch/Starke 52, 179-185）によって記述されたデンプンリン酸の量を測定する方法を用いることができる。特に好ましくは、31Ｐ−ＮＭＲによるデンプンリン酸量の測定がKasemusuwan and Jane(1996, Cereal Chemistry 73, 702-707）に記述された方法に従い実施される。
【０１３９】
さらに、本発明による植物細胞を含む遺伝的に修飾された植物が、本発明の課題の１つである。これらの型の植物を本発明による植物細胞から再生によって生成することができる。
【０１４０】
原則として本発明による植物は任意の植物種の植物、即ち単子葉および双子葉植物の両方でよい。好ましくはそれらは有用植物、即ち人々により食用のまたは技術的な目的のために、特に工業的目的のために栽培される植物である。
【０１４１】
さらなる実施態様では、本発明による植物はデンプン貯蔵植物である。
【０１４２】
本発明に関連して用語「デンプン貯蔵植物」とは、例えばトウモロコシ、イネ、コムギ、ライムギ、エンバク、オオムギ、キャッサバ、ジャガイモ、サゴ、リョクトウ、エンドウ、またはモロコシなどの、貯蔵デンプンを含む植物部分を有する全ての植物を意味する。
【０１４３】
本発明に関連して用語「ジャガイモ植物」または「ジャガイモ」とは、Solanum属の植物種、特にSolanum属の塊茎生成種、特にSolanum tuberosumを意味する。
【０１４４】
本発明に関連して用語「コムギ植物」とは、Triticum属の植物種またはTriticum属の植物との交雑から得られた植物、特に商業目的の農業に用いられる、Triticum属の植物種またはTriticum属の植物とのとの交雑から得られる植物、特に好ましくはTriticum aestivumを意味する。
【０１４５】
本発明に関連して用語「トウモロコシ植物」とは、Zea属の植物種、特に商業目的の農業に用いられるZea属植物種、特に好ましくはZea maisを意味する。
【０１４６】
追加の実施態様において、本発明は（系統上）Poaceae科の本発明によるデンプン貯蔵植物に関する。これらは好ましくはトウモロコシまたはコムギの植物である。
【０１４７】
本発明はまた、本発明による植物細胞を含む本発明による植物の繁殖材料に関する。
【０１４８】
ここで用語「繁殖材料」は、栄養的または実生的手段により子孫を生成することに適する植物の構成要素を含む。挿し木、カルス培養、根茎または塊茎が例えば栄養繁殖に適する。他の繁殖材料には、例えば、果実、種子、実生、プロトプラスト、細胞培養その他が含まれる。好ましくは繁殖材料は塊茎であり、特に好ましくは胚乳を含む穀粒である。
【０１４９】
さらなる実施態様において、本発明は果物、貯蔵根、根、花、芽、枝または茎、好ましくは種子、穀粒または塊茎のような本発明による植物の収穫可能な植物部分に関し、その場合、これらの収穫可能な部分は本発明による植物細胞を含む。
【０１５０】
さらに、本発明はまた、本発明による遺伝的修飾植物の作製のための方法であって：
ａ）  植物細胞を遺伝的に修飾し、その遺伝的修飾が遺伝的に修飾されていない対応する野生型植物細胞と比較したＯＫ１タンパク質及びＲ１タンパク質の活性の増加をもたらし；
ｂ）  工程ａ）から得られる植物細胞から植物を再生し；および
ｃ）  必要ならば、工程ｂ）によって得られる植物を利用してさらなる植物を生成する、
方法に関する。
【０１５１】
工程ａ）により植物細胞へ導入される遺伝的修飾は、基本的に、ＯＫ１タンパク質活性及びＲ１タンパク質活性の増加をもたらす任意の型の遺伝的修飾であってよい。
【０１５２】
工程ｂ）による植物の再生を、当業者に公知の方法（例えば、"Plant Cell Culture Protocols", 1999, edt. by R.D. Hall, Humana Press, ISBN 0-89603-549-2に記載の）を用いて実施することができる。
【０１５３】
本発明による方法の工程ｃ）によるさらなる植物の生成を、例えば栄養繁殖（例えば挿し木、塊茎を用いるまたはカルス培養および全植物体の再生による）または実生繁殖によって行なうことができる。ここで、実生繁殖は好ましくは制御された条件下で行われる、すなわち、特定の特性を有する選択された植物同士を交雑させ繁殖させる。この場合の選択を、好ましくは工程ｃ）によって得られるさらなる植物が、工程ａ）で導入された遺伝的修飾を示すように行なう。
【０１５４】
本発明による植物細胞生成のための遺伝的修飾は、同時に、または連続する工程によって生ずることができる。また、遺伝的修飾は、少なくとも１つのＯＫ１タンパク質および／または少なくとも１つのＲ１タンパク質の活性の増加をもたらす任意の遺伝的修飾でよい。それは、少なくとも１つのＯＫ１タンパク質またはＲ１タンパク質の活性を低下させる遺伝的修飾が以前に全く生じていない野生型植物ならびに野生型植物細胞から、あるいは既に遺伝的修飾により少なくとも１つのＯＫ１タンパク質または少なくとも１つのＲ１タンパク質の活性が増大するように遺伝的に修飾された植物細胞または植物から、生ずることが可能である。Ｒ１タンパク質の活性増大をもたらす遺伝的修飾に用いる方法と同じ方法をＯＫ１タンパク質の活性増大をもたらす遺伝的修飾に用いるかどうかは、両方の遺伝的修飾が、共に同じ植物細胞中でＯＫ１タンパク質およびＲ１タンパク質の活性増大をもたらす限り、重要ではない。
【０１５５】
本発明による遺伝的修飾植物の作製のための本発明による方法のさらなる実施態様においては、遺伝的修飾は、植物細胞ゲノム中への少なくとも１つの外来性核酸分子の導入であって、外来性核酸分子の有効性または発現が、細胞のＯＫ１タンパク質およびＲ１タンパク質の活性増大をもたらす。
【０１５６】
本発明による遺伝的修飾植物の作製のための本発明による方法のさらなる実施態様においては、遺伝的修飾は、植物細胞ゲノム中への少なくとも１つの外来性核酸分子の導入であって、外来性核酸分子は、ＯＫ１タンパク質および／またはＲ１タンパク質をコードする配列を含む。
【０１５７】
植物細胞または植物中に遺伝的修飾のために組み入れられた外来性核酸分子について既に上述したように、本発明による遺伝的に修飾された植物の作製のための本発明による方法の工程ａ）には、単一の核酸分子または複数の核酸分子が含まれる可能性がある。上に与えられた実施態様を、ここに記述した本発明による方法に、準用する。
【０１５８】
本発明による遺伝的修飾植物の作製のための本発明による方法のさらなる実施態様において、その方法の工程ａ）における遺伝的修飾は、Ｒ１タンパク質をコードする少なくとも１つの配列およびＯＫ１タンパク質をコードする少なくとも１つの配列を含む外来性核酸分子の導入である。
【０１５９】
本発明による遺伝的修飾植物の作製のための本発明による方法のさらなる実施態様において、その方法の工程ａ）における遺伝的修飾は、複数の外来性核酸分子の導入であって、少なくとも１つの第１の核酸分子はＲ１タンパク質をコードする配列を含み、少なくとも１つの第２の核酸分子はＯＫ１タンパク質をコードする配列を含む。
【０１６０】
さらに、野生型植物細胞または野生型植物の代わりに、既にＯＫ１タンパク質の増大した活性またはＲ１タンパク質の増大した活性を有することを特徴とする突然変異細胞または突然変異体を、本発明による方法を実施するために外来性核酸分子を導入するために、用いることができる。本発明による植物細胞または植物の作製用に突然変異体を使用するために上に提供された追加の情報を、ここで準用することになる。
【０１６１】
本発明による遺伝的に修飾された植物の作製のための本発明による方法のさらなる実施態様において、少なくとも１つの外来性核酸分子が：
ａ）  配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸分子；
ｂ）  プラスミドＡ．ｔ．−ＯＫ１−ｐＧＥへの挿入またはプラスミドｐＭＩ５０への挿入によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸分子；
ｃ）  配列番号２または配列番号４に示されるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列のタンパク質をコードする核酸分子；
ｄ）  プラスミドＡ．ｔ．−ＯＫ１−ｐＧＥＭへの挿入またはプラスミドｐＭＩ５０への挿入によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有する配列のタンパク質をコードする核酸分子；
ｅ）  配列番号１または配列番号３に示されるヌクレオチド配列または相補的配列を含む核酸分子；
ｆ）  プラスミドＡ．ｔ．−ＯＫ１−ｐＧＥＭまたはプラスミドｐＭＩ５０に含まれる挿入のヌクレオチド配列を含む核酸分子；
ｇ）  ａ）、ｂ）、ｅ）またはｆ）に記述される核酸配列と少なくとも７０％の同一性を有する配列の核酸分子；
ｈ）  ストリンジェント条件下でａ）、ｂ）、ｅ）またはｆ）に記述される核酸分子の少なくとも１つの鎖とハイブリダイズする核酸分子；
ｉ）  遺伝子コードの縮退によりａ）、ｂ）、ｅ）、またはｆ）で特定される核酸分子の配列と相違したヌクレオチド配列を有する核酸分子；および
ｊ）  ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｅ）、ｆ）、ｇ）、ｈ）またはｉ）で特定される核酸分子の断片、対立遺伝子変異体、および／または誘導体に相当する核酸分子；
からなる群より選ばれる。
【０１６２】
本発明による遺伝的に修飾された植物の作製のための本発明による方法のさらなる実施態様において、ジャガイモ、コムギ、イネ、トウモロコシ、ダイズ、柑橘類、またはArabidopsisからのＲ１タンパク質が、少なくとも１つの外来性核酸分子をコードする。同定された植物からのＲ１タンパク質をコードする同定された核酸配列に対する参考文献は、既に、さらに上に明記した。
【０１６３】
本発明のさらなる実施態様はまた、本発明による遺伝的に修飾された植物の作製のための方法であって：
ａ）  植物細胞を遺伝的に修飾し（遺伝的修飾は遺伝的に修飾されていない対応する野生型植物細胞と比較してＯＫ１タンパク質の酵素活性の増大をもたらす）；
ｂ）  工程ａ）により得られる植物細胞から植物を再生し；
ｃ）  必要ならは、工程ｂ）による植物を利用して、さらに植物を生成し；および
ｄ）  工程ｂ）またはｃ）によって得られた植物を、遺伝的に修飾されていない対応する野生型植物細胞と比較してＲ１タンパク質の増大した酵素活性レベルを有する植物と交雑させる、
方法に関する。
【０１６４】
本発明のさらなる実施態様は、本発明による遺伝的に修飾された植物の作製のための方法であって：
ａ）  植物細胞を遺伝的に修飾し（遺伝的修飾は遺伝的に修飾されていない対応する野生型植物細胞と比較してＲ１タンパク質の酵素活性の増大をもたらす）；
ｂ）  工程ａ）により得られる植物細胞から植物を再生し；
ｃ）  必要ならば、工程ｂ）による植物を利用してさらに植物を生成し；および
ｄ）  工程ｂ）またはｃ）によって得られた植物を、遺伝的に修飾されていない対応する野生型植物細胞と比較してＯＫ１タンパク質の増大した酵素活性レベルを有する植物と交雑させる、
方法に関する。
【０１６５】
また、工程ａ）による植物を、既に上述したようにして遺伝的に修飾することができる。工程ｂ）による植物の再生、および工程ｃ）による追加の植物の生成もまた、既にさらに上に提示した。
【０１６６】
２つの最も近くに示した実施態様の工程ｄ）による、工程ｂ）またはｃ）で得られた植物または植物の子孫と交雑する植物は、対応する野生型植物と比較して、ＯＫ１タンパク質またはＲ１タンパク質の増大した活性を有する任意の植物でよい。ＯＫ１タンパク質またはＲ１タンパク質の活性の増大を、対応する植物の当該タンパク質の活性の増加をもたらす任意の修飾を通じて、引き起こすことができる。これらの植物は、遺伝子工学方法によって修飾された突然変異体または植物でよい。突然変異体は、自発的に（自然に）生じる突然変異体、ならびに変異原（例えば化学剤、電離放射線など）の標的指向性の使用または遺伝子工学的方法（例えばトランスポゾン活性化タギング、Ｔ−ＤＮＡ活性化タギング、インビボ突然変異誘発）により生成されたものでよい。好ましくは、遺伝子工学的方法によって生成された植物は、挿入突然変異誘発により作製された突然変異体、特に好ましくは外来性核酸分子を発現する遺伝的に修飾された植物、とりわけ好ましくは外来性核酸分子がＯＫ１タンパク質またはＲ１タンパク質をコードする遺伝的に修飾された植物である。
【０１６７】
さらなる実施態様においては、本発明による方法を、デンプン貯蔵植物を生成するために、本発明による遺伝的に修飾された植物を作製するために用いる。
【０１６８】
さらなる実施態様においては、本発明による方法を、本発明によるトウモロコシまたはコムギの植物を生成するために、本発明による遺伝的に修飾された植物を作製するために用いる。
【０１６９】
さらなる実施態様において、本発明は、本発明による遺伝的に修飾された植物を作製するための本発明による方法であって、遺伝的に修飾された植物が、遺伝的に修飾されていない野生型植物と比較して修飾されたデンプンを合成する方法に関する。
【０１７０】
遺伝的に修飾された植物を作製するための本発明による方法のさらなる実施態様において、本発明による植物は、対応する野生型植物から単離したデンプンと比較してデンプンリン酸の増大した濃度および／または変更されたデンプンリン酸分布を有する修飾デンプンを合成する。
【０１７１】
本発明による方法のさらなる実施態様において、本発明による植物が、遺伝的に修飾されていない野生型植物からのデンプンと比較して、Ｃ−３リン酸のＣ−６リン酸に対する修飾された比率を有する修飾デンプンを合成する。ここで特に好ましいのは、遺伝的に修飾されていない野生型植物から得られるデンプンと比較して、Ｃ−３位置に結合したデンプンリン酸がＣ−６位置に結合したデンプンリン酸と比較して増大した割合を有するデンプンである。
【０１７２】
本発明はまた、本発明による方法によって得ることが出来る植物に関する。
【０１７３】
驚くべきことに、ＯＫ１タンパク質の増大した活性及びＲ１タンパク質の増大した活性を有する本発明による植物細胞および本発明による植物から単離したデンプンが、修飾デンプンを合成することが見出された。
【０１７４】
特に、本発明によるデンプン中のデンプンリン酸の量の増大は、デンプンに驚くべきまた有利な特性を与える。デンプンリン酸の割合の増大により、本発明によるデンプンは、荷電基の割合が増大しており、それがデンプンの機能持性に有意に影響する。荷電性官能基を保持するデンプンは、製紙業において特に適切であり、紙のコーティングに用いられる。コートされると、荷電分子により他の点でも良好な粘着特性を有する紙は、特にインク、印刷色などの染料の吸収に適している。
【０１７５】
本発明はまた、本発明による植物細胞または本発明による植物から、本発明による繁殖材料から、あるいは本発明による収穫可能な植物部分から得ることのできる修飾デンプンに関する。
【０１７６】
さらなる実施態様において、本発明は、デンプン貯蔵植物からの、好ましくは（系統上の)イネ科デンプン貯蔵植物からの、特に好ましくはトウモロコシまたはコムギの植物からの本発明による修飾デンプンに関する。
【０１７７】
さらに本発明は、本発明による植物細胞または本発明による植物から、そのような植物の本発明による繁殖殖材料から、および／またはそのような植物の本発明による収穫可能な植物部分から、好ましくはそのような植物の本発明によるデンプン貯蔵部分から、デンプンを抽出する工程を含む、修飾デンプンの作製のための方法に関する。好ましくは、そのような方法はまた、デンプンを抽出する前に栽培された植物または植物部分および／またはこれらの植物の繁殖材料を収穫する工程も含み、さらに特別に好ましくは収穫前に本発明による植物を栽培する工程を含む。
【０１７８】
植物または植物のデンプン貯蔵部分からデンプンを抽出する方法は当業者に公知である。さらに、種々のデンプン貯蔵植物からデンプンを抽出する方法については、例えば：デンプン：Chemistry and Technology （Publisher: Whistler, BeMiller and Paschall (1994), 2nd Edition, Academic Press Inc. London Ltd; ISBN 0-12-746270-8; 例えば、Chapter XII, Page 412-468：トウモロコシおよびモロコシのデンプン：作製；by Watson; Chapter XIII, Page 469-479: タピオカ、クズウコンおよびサゴデンプン：作製；by Corbishley and Miller; Chapter XIV, Page 479-490: ジャガガイモデンプン：作製および使用；by Mitch; Chapter XV, Page 491 to 506: コムギデンプン：作製、修飾および使用；by Knight and Oson; and Chapter XVI, Page 507 to 528: 米澱粉：作製および使用； by Rohmer and Klem; トウモロコシデンプン：by Eckhoff et al., Cereal Chem. 73 (1996), 54-57；工業規模のトウモロコシデンプンの抽出は、一般にいわゆる「ウェットミリング」により行われる）に記述されている。植物材料からデンプンを抽出するための方法において慣用されている装置は、セパレーター、デカンター、液体サイクロン、噴霧乾燥器および流動床乾燥器である。
【０１７９】
本発明に関連して、用語「デンプン貯蔵部分」とは、植物の一過性葉デンプンとは対照的に、長期間生存するための備蓄としてデンプンを貯蔵するような部分を意味すると理解するべきである。好ましいデンプン貯蔵植物部分は、例えば塊茎、貯蔵根および穀粒、特に好ましいのは胚乳を含む穀粒、とりわけ好ましいのはトウモロコシまたはコムギの植物の胚乳を含む穀粒である。
【０１８０】
修飾デンプンを製造するための本発明による方法によって入手することができる修飾デンプンもまた、本発明の目標である。
【０１８１】
本発明のさらなる実施態様において、本発明による修飾デンプンはネイティブのデンプンである。
【０１８２】
本発明に関連して、用語「ネイティブのデンプン」とは、本発明による植物、本発明による収穫可能な植物、本発明によるデンプン貯蔵部分、または本発明による植物の繁殖材料から、当業者に公知の方法によってデンプンが単離されることを意味する。
【０１８３】
さらに、本発明による植物細胞または本発明による植物の、修飾デンプンを作製するための使用が、本発明の課題である。
【０１８４】
当業者には、デンプンの特性が、例えば熱的、化学的、酵素的な、または機械的な誘導により変更できることは、公知である。誘導デンプンは、食料および／または非食料産業分野における種々の応用に特に適する。本発明によるデンプンは、高いデンプンリン酸含量のため、より高い割合の反応性官能基を示すので、誘導デンプン作製用の出発物質として従来のデンプンよりもよく適している。
【０１８５】
したがって本発明はまた、本発明による修飾デンプンが前もって導出されている誘導デンプンの作製に関する。
【０１８６】
本発明に関連して、用語「誘導デンプン」とは、植物細胞からの単離後に、化学的、酵素的、熱的、または機械的方法を利用してその特性が変更された、本発明による修飾デンプンを意味すると理解するべきである。
【０１８７】
本発明のさらなる実施態様において、本発明による誘導デンプンは熱および／または酸で処理されたデンプンである。
【０１８８】
さらなる実施態様において、誘導デンプンはデンプンエーテル、特にデンプンアルキルエーテル、Ｏ−アリルエーテル、ヒドロキシアルキルエーテル、Ｏ−カルボキシルメチルエーテル、窒素含有デンプンエーテル、リン酸含有デンプンエーテル、または硫黄含有デンプンエーテルである。
【０１８９】
さらなる実施態様において、誘導デンプンは架橋されたデンプンである。
【０１９０】
さらなる実施態様において、誘導デンプンはデンプングラフトポリマーである。
【０１９１】
さらなる実施態様において、誘導デンプンは酸化されたデンプンである。
【０１９２】
さらなる実施態様において、誘導デンプンは、デンプンエステル、特に有機酸を用いてデンプンの中へ導入されたデンプンエステルである。特に好ましくは、これらは、リン酸、硝酸、硫酸、キサントゲン酸、酢酸、またはクエン酸デンプンである。
【０１９３】
本発明による誘導デンプンは、医薬品工業および食料および／または非食料分野での種々の応用に適する。本発明による誘導デンプンを作製する方法は当業者に公知であり、一般的な文献に十分に記述されている。誘導デンプンの作製についての概説は、例えば、Orthoefer（in Corn, Chemistry and Technology, 1987, eds. Watson und Ramstad, Chapter 16, 479-499）に見出すことができる。
【０１９４】
誘導デンプンを作製するための本発明による方法により入手可能な誘導デンプンもまた、本発明の課題である。
【０１９５】
さらに、誘導デンプンを作製するために本発明による修飾デンプンを使用することが、本発明の課題である。
【０１９６】
植物のデンプン貯蔵部分は、しばしば穀粉へ加工される。穀粉が生成される植物部分の例は、例えばジャガイモ植物の塊茎、また穀類植物の穀粒である。穀類植物から穀粉を作製するために、これらの植物の胚乳を含む穀粒を挽いて篩にかける。デンプンが胚乳の主成分である。胚乳を含まず、代わりに塊茎または根のような他のデンプン貯蔵部分を含む他の植物については、通常は、当該貯蔵器官を細かくして乾燥し、続いて磨砕することにより穀粉を作製する。植物の胚乳の、あるいはデンプン貯蔵部分内に含まれるデンプンは、当該植物部分から作製される穀粉の重要な部分である。したがって、穀粉の特性は、当該穀粉中に存在するデンプンの影響を受ける。本発明よる植物細胞および本発明による植物は、対応する遺伝的に修飾されていない野生型植物細胞または遺伝的に修飾されていない野生型植物と比較して、修飾されたデンプンを合成する。本発明による植物細胞、本発明による植物、本発明による繁殖材料、または本発明による収穫可能部分から作製された穀粉は、したがって、修飾された特性を示す。穀粉の特性は、デンプンを穀粉と混合することにより、または種々の特性を有する穀粉を混合することにより影響をうける。
【０１９７】
したがって、本発明のさらなる課題は、本発明によるデンプンを含む穀粉に関する。
【０１９８】
本発明のさらなる課題は、本発明による植物細胞から、本発明による植物から、本発明による植物のデンプン貯蔵部分から、本発明による繁殖材料から、または本発明による収穫可能植物部分から生成される穀粉に関する。本発明による植物の好ましいデンプン貯蔵部分は、塊茎、貯蔵根、および胚乳を含む穀粒である。塊茎は、好ましくはジャガイモ植物に由来し、また穀粒は好ましくは（系統上の）Poaceae科植物に由来し、一方穀粒は特に好ましくはトウモロコシまたはコムギの植物由来である。
【０１９９】
本発明に関連して、用語「穀粉」とは、植物部分を磨砕することにより得られる粉末を意味する。必要であれば、植物部分を磨砕の前におそらく乾燥させ、細断および／または磨砕の後に漉す。
【０２００】
本発明による穀粉は、修飾されたリン酸含量および／または修飾されたリン酸分布を有するデンプンが存在することによる増大した水結合能力により特に優れている。これが例えば、食品産業における多くの用途のための穀粉の加工に、特に焼き菓子の作製において、望ましい。
【０２０１】
本発明のさらなる課題は、本発明による植物細胞、本発明による植物、本発明による植物の部分、本発明による植物のデンプン貯蔵部分、本発明による繁殖材料、あるいは本発明による収穫可能な材料を磨砕する工程を含む、穀粉作製のための方法である。
【０２０２】
穀粉を、本発明による植物のデンプン貯蔵部品を摩砕することにより、作製することができる。穀粉を作製する方法は当業者に公知である。好ましくは穀粉の作製のための方法はまた、栽培された植物または植物部分および／またはこれらの植物の繁殖材料またはデンプン貯蔵部分を、摩砕の前に収穫する工程、および特に好ましくは、さらに収穫する前に本発明による植物を栽培する工程、を含む。
【０２０３】
本発明に関連して、用語「植物の部分」とは、全体として完全な植物を構成する構成要素としての植物のすべての部分を意味すると理解するべきである。植物の部分は、シュート、葉、根茎、根、こぶ、塊茎、さや、種子または穀粒である。
【０２０４】
本発明のさらなる課題は、穀粉作製のための、摩砕の前における、本発明による植物の、本発明による植物のデンプン貯蔵部分の、本発明による繁殖材料の、または本発明による収穫可能材料の加工方法を含む。
【０２０５】
また、加工は、例えば熱処理および／または乾燥することであり得る。例えば熱処理およびそれに続く熱処理された材料の乾燥が、例えばジャガイモ塊茎のような貯蔵根または塊茎から穀粉を作製するために用いられる。その前に摩砕が行われる。摩砕前に、本発明よる植物、本発明による植物のデンプン貯蔵部分、本発明による繁殖材料または本発明による収穫可能な材料を細かくすることが、同様に本発明に関して加工に相当することができる。摩砕前の、例えば穀粒の殻などの植物組織の除去もまた、本発明に関して摩砕前の加工に相当する。
【０２０６】
本発明のさらなる実施態様には、製粉用穀物加工生成物の摩砕後の、穀粉の作製のための方法が含まれる。また、製粉用穀物を例えば様々な型の穀粉を作製するために、摩砕後に例えば篩にかけることができる。
【０２０７】
本発明のさらなる課題は、本発明による遺伝的に修飾された植物細胞の、本発明による植物の、本発明による植物の部分の、本発明による植物のデンプン貯蔵部分の、本発明による繁殖材料の、または本発明による収穫可能な材料の、穀粉の作製のための使用である。
【０２０８】
例えば本発明による植物細胞および本発明による植物の生成のために、ＤＮＡ分子などの、遺伝的に修飾されていない修飾野生型植物細胞または野生型と比較して、修飾されたデンプンを合成する手段を提供することも本発明の課題である。提供されるＤＮＡ分子は、ＯＫ１タンパク質をコードする核酸配列を含む。ＯＫ１タンパク質の酵素活性を有するタンパク質は、以前は当業者に知られていなかった。また、したがって本発明による植物細胞および本発明による植物、それらから合成されたデンプン、およびそれらから抽出された穀粉を生成することを可能にするＤＮＡ分子を提供することはできない。
【０２０９】
したがって、本発明はまた、ＯＫ１タンパク質をコードする核酸配列、およびＲ１タンパク質をコードする核酸配列を含む組換え核酸分子に関する。
【０２１０】
本発明に関連して、用語「組換え核酸分子」とは、ＯＫ１タンパク質をコードする核酸配列ならびにＲ１タンパク質をコードする核酸配列の両方を含み、ＯＫ１タンパク質およびＲ１タンパク質をコードする核酸配列が、生物体のゲノム中に自然には存在しない配置で存在する核酸分子を意味すると理解するべきである。ＯＫ１タンパク質をコードする核酸配列およびＲ１タンパク質をコードする核酸配列に加えて、組換えの核酸分子はさらに、自然には、本発明による組換え核酸分子中にそれらが存在するような１つの配置中には存在しない追加の配列を含むことができる。また、前記追加の配列は、任意の配列であってよく、好ましくは調節配列（プロモーター、終結シグナル、エンハンサー）であり、特に好ましくは植物組織において活性を有する調節配列であり、またとりわけ好ましくはデンプン貯蔵植物組織において活性を有する調節配列でよい。本発明による組換え核酸分子生成のための方法は当業者に公知であり、例えば、核酸分子のライゲーションによる連結、遺伝的組換え、または核酸分子の再合成などの遺伝子工学的方法を含む（例えば、Sambrok et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition (2001) Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY. ISBN: 0879695773, Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons; 5th edition (2002), ISBN: 0471250929を参照のこと）。
【０２１１】
本発明による組換え核酸分子の本発明のさらなる実施態様は、上に記述した本発明による核酸分子を含むベクター、特にプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、および遺伝子工学における他の慣習的なベクターを含む。
【０２１２】
さらなる実施態様では、ベクターに含まれる本発明による核酸分子を、原核生物または真核細胞において発現を開始する調節配列と連結する。また用語「発現」とは、転写、ならびに転写および翻訳の両方を意味する場合がある。この場合、本発明による核酸分子は、調節配列に対して「センス」配向および／または「アンチセンス」配向で存在することができる。また本発明による組み換え核酸分子は、まとまって単一の調節因子の管理下にあるか、または各々自分の個別の調節因子を有することができる。
【０２１３】
原核生物、例えばE. coli中の、および真核生物中の発現用調節配列は、例えばSaccharomyces cerevisiaeなどの酵母中の発現用調節配列は、十分に文献に記載されている。種々の宿主生物中のタンパク質の発現用の様々なシステムの概説が、例えばMethods in Enzymology 153 (1987), 383-516 および Bitter et al.(Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544)に見出される。
【０２１４】
本発明のさらなる課題は、宿主細胞、特に本発明による核酸分子および／または本発明によるベクターにより遺伝的に修飾された原核または真核細胞、ならびにこれらの型の宿主細胞起源であって本発明による遺伝的修飾を含む細胞である。
【０２１５】
さらなる実施態様において本発明は、宿主細胞、特に本発明による核酸分子または本発明によるベクターによって形質転換された原核または真核細胞、ならびにこれらの型の宿主細胞起源であって本発明による記述された核酸分子またはベクターを含む宿主細胞に関する。
【０２１６】
宿主細胞は、バクテリア細胞（例えばE. coli、Agrobacterium属のバクテリア、特にAgrobacterium tumefaciensまたはAgrobacterium rhizogenes）または真菌細胞（例えば酵母，特にS. cerevisiae、Agaricus、特にAgaricus bisporus、Aspergillus、Trichoderma）、ならびに植物または動物細胞でよい。ここで用語「形質転換」とは、本発明による細胞が、そのネイティブのゲノムに加えて少なくとも１つの本発明による核酸分子を含むために、本発明による核酸分子によって遺伝的修飾されることを意味する。これは、恐らく自己複製分子として細胞中に自由な形で存在するか、または宿主細胞のゲノムへ安定して組み込まれることができる。
【０２１７】
微生物の宿主細胞が好ましい。本特許出願の枠組み内では、これは、例えばSchlegelの"General Microbiology" (Georg Thieme Verlag (1985), 1-2）に定義されているように、すべてのバクテリアおよびすべての原生生物（例えば真菌、特に酵母および藻類）を含んでいると理解する。
【０２１８】
本発明による宿主細胞は植物細胞であることが好ましい。原則として、これらは任意の植物種からの、即ち単子葉植物および双子葉植物の両方からの植物細胞であってよい。これらには、農業上の有用植物からの、即ち栄養上の、技術上の、または特に産業上の目的のために人間により栽培される植物からの植物細胞が好ましい。本発明は、好ましくはデンプン貯蔵植物（トウモロコシ、イネ、コムギ、ライムギ、エンバク、オオムギ、キャッサバ、ジャガイモ、サゴ、リョクトウ、エンドウ、またはモロコシ）からの植物細胞および植物に関し；特に（系統上の）Poacea科植物からの植物細胞、特に好ましくはトウモロコシまたはコムギの植物からの植物細胞に関する。
【０２１９】
さらに、本発明の課題は、本発明による組換え核酸分子または本発明によるベクターを含む組成物である。好ましいのは、本発明による組換え核酸分子または本発明によるベクターおよび宿主細胞を含む、本発明による組成物である。宿主細胞が植物細胞であれば特に好ましく、それがトウモロコシまたはコムギの植物の細胞であれば、とりわけ好ましい。
【０２２０】
本発明のさらなる課題は、ＯＫ１タンパク質をコードする核酸配列およびＲ１タンパク質をコードする核酸配列を含む、組成物に関する。
【０２２１】
また、ＯＫ１タンパク質をコードするまたはＲ１タンパク質をコードする核酸配列は、一緒に単一の核酸分子中に、または互いに分離された核酸分子中に存在することができる。
【０２２２】
本発明による組成物のさらなる局面は、本発明による宿主細胞を生成するために、好ましくは本発明による植物細胞を生成するために、用いることができる組成物に関する。好ましくは、これはＯＫ１タンパク質をコードする核酸配列およびＲ１タンパク質をコードする核酸配列、本発明による組換え核酸分子または本発明によるベクター、および宿主細胞への核酸分子の導入に適しているバイオリスティックの担体、を含む組成物に関する。好ましいバイオリスティックの担体は、タングステン、金または合成材料の粒子である。
【０２２３】
本発明による組成物のさらなる実施態様は、ＯＫ１タンパク質をコードする核酸配列およびＲ１タンパク質をコードする核酸配列、本発明による組換え核酸分子または本発明によるベクター、および植物細胞および合成栽培媒体を含む組成物に関する。好ましくは、そのような組成物はまた、植物細胞および合成栽培媒体に加えてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。これらの組成物については、組換え核酸分子は植物細胞の外部に存在する、即ち細胞膜によって囲まれている植物細胞の細胞内部の外側に位置している。
【０２２４】
植物細胞の栽培および／または形質転換に適している合成栽培媒体は当業者に公知であり、例えば文献に十分に記載されている。様々な合成栽培媒体が、専門の業者（例えばDUCHEFA Biochemie B.V., Belgium）から購入できる。
【０２２５】
さらに、本発明は、植物細胞の形質転換のための本発明による組成物の使用に関する。
【０２２６】
配列の記述
配列番号１：  Arabidopsis thalianaのＡ．ｔ．−ＯＫ１タンパク質のコード領域を含む核酸配列。この配列を、ベクターＯＫ１−ｐＧＥＭ−ＴおよびＯＫ１−ｐＤＥＳＴ（商標）１７に挿入する。
配列番号２：  Arabidopsis thalianaのＡ．ｔ．−ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列。この配列は、配列番号１に示された核酸配列から導出することができる。
配列番号３：  Oryza sativaのＯ．ｓ．−ＯＫ１タンパク質のコード領域を含む核酸配列。この配列をベクターＰＭＩ５０に挿入する。
配列番号４：  Oryza sativaのＯ．ｓ．−ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列。この配列は、配列番号３に示された核酸配列から導出することができる。
配列番号５：  Arabidopsis thalianaおよびOryza sativaのＯＫ１タンパク質のホスホヒスチジンドメインをコードするペプチド配列。
配列番号６：  Citrus reticulataからのＣ．ｒ．−Ｒ１タンパク質のコード領域を含む核酸配列。
配列番号７：  Citrus reticulataからのＣ．ｒ．−Ｒ１タンパク質をコードするアミノ酸配列。
配列番号８：  Arabidopsis thalianaからのＡ．ｔ．−Ｒ１タンパク質のコード領域を含む核酸配列。
配列番号９：  Arabidopsis thalianaからのＡ．ｔ．−Ｒ１タンパク質をコードするアミノ酸配列。
配列番号１０：  Solanum tuberosumからのＳ．ｔ．−Ｒ１タンパク質のコード領域を含む核酸配列。
配列番号１１：  Solanum tuberosumからのＳ．ｔ．−Ｒ１タンパク質をコードするアミノ酸配列。
配列番号１２：  Oryza sativaからのＯ．ｓ．−Ｒ１タンパク質のコード領域を含む核酸配列。
配列番号１３：  Oryza sativaからのＯ．ｓ．−Ｒ１タンパク質をコードするアミノ酸配列。
配列番号１４：  Glycine maxからのＧ．ｍ．−Ｒ１タンパク質のコード領域を含む核酸配列。
配列番号１５：  Glycine maxからのＳ．ｔ．−Ｒ１タンパク質をコードするアミノ酸配列。
配列番号１６：  Zea maysからのＺ．ｍ．−Ｒ１タンパク質のコード領域を含む核酸配列。
配列番号１７：  Zea maysからのＺ．ｍ．−Ｒ１タンパク質をコードするアミノ酸配列。
【０２２７】
一般的方法
下記に本発明による方法を実施するために用いることができる方法について記述する。これらの方法は、本発明の特別の実施態様を構成するが、本発明はこれらの方法に制限されない。記述された方法を変更することによりおよび／または方法の個々の部分を方法の別の部分に置換することにより、同じように本発明を実施できることは、当業者に知られている。
【０２２８】
１．  植物組織からのタンパク質抽出物の作製
【０２２９】
ａ）  植物組織からのタンパク質抽出物の作製
葉材料を収穫直後に液体窒素で凍結し、続いて液体窒素下乳鉢中で均質化する。縮小させた葉材料を約３．５倍の体積（用いる葉材料の重量に対して）の冷却した（４℃）結合用緩衝液と混合し、Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘを用いて、２×１０秒間浸軟した（最高速度）。Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘによる第１の処理の後、第２の処理を実行する前に縮小させた葉材料を氷上で冷却する。その後、処理した葉材料を、１００μmのナイロンメッシュを通し、２０分間遠心した（５０ml遠心管、２０，０００×ｇ、４℃）。
【０２３０】
ｂ）  タンパク質抽出物に含まれるタンパク質の沈澱
工程ａ）による遠心分離によって得られた上清を取り出し、その体積を測定した。タンパク質を沈殿させるために、硫酸アンモニウムを上清に、３０分間かけて氷上で撹拌しながら、７５％（重量／体積）の最終濃度になるまで連続的に加える。上清を続いてもう１時間氷上で撹拌しながらインキュベーションする。上清から沈殿させたタンパク質を、２０，０００×ｇおよび４℃１０分間でペレット化し、続いてペレットを５mlの結合用緩衝液に吸収させる、すなわちペレット中に存在するタンパク質を溶解させる。
【０２３１】
ｃ）  沈殿したタンパク質の脱塩
溶解したタンパク質を、セファデックスＧ２５(Amersham Bioscience, Freiburg, Prod. No. columns: 17-0851-01, Prod. No. Sephadex G25-M: 17-0033-01)を詰めたＰＤ１０カラムを用いて温度４℃で脱塩する、すなわち工程ｂ）の沈澱に用いられた硫酸アンモニウムを溶解したタンパク質から分離する。工程ｂ）に従って溶解されたタンパク質を加える前に、ＰＤ１０カラムを結合用緩衝液と平衡にする。この目的のために、各々５回、５mlの結合用緩衝液をカラム上に散布する。続いて、工程ｂ）に従って得られたタンパク質溶液の２．５mlを各カラムへ加え、次に３．５mlの結合用緩衝液によりカラムからタンパク質を溶出させる。
【０２３２】
ｄ）  タンパク質濃度の決定
タンパク質濃度を、ブラッドフォード分析（Biorad, Munich, Prod. No.500-0006（Bradford, 1976, Anal. Biochem. 72, 248-254)）により決定する。
【０２３３】
ｅ）  結合用緩衝液の組成
結合用緩衝液：    ５０mM        ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ（またはＫＯＨ）、ｐＨ７．２
１mM        ＥＤＴＡ、
２mM        ジチオエリトリトール（ＤＴＥ）、
２mM        ベンズアミジン、
２mM        ε−アミノカプロン酸、
０．５mM    ＰＭＳＦ、
０．０２％  トリトンＸ−１００。
【０２３４】
２．  葉のデンプンの単離
【０２３５】
ａ）  植物組織からのデンプン粒の単離
葉材料を収穫直後に液体窒素中で凍結する。葉材料を小分けして乳鉢中で液体窒素下均質化し、全体で約２．５倍の体積（重量／体積）のデンプン緩衝液中に吸収させる。さらにこの懸濁液を、ワーリングブレンダー中最高速度で２０秒間再び均質化する。ホモジネートをナイロンメッシュ（メッシュ幅１００μm）に通し、５分間１，０００×ｇで遠心する。可溶性タンパク質を含む上清を捨てる。
【０２３６】
ｂ）  植物組織から単離されたデンプンの精製
デンプンの上にある緑の物質を、デンプン緩衝液で緑の物質をすすぎ落とすことによって除去した後、工程ａ）から得られたデンプンを含むペレットをデンプン緩衝液に吸収させ、種々のメッシュ幅（６０μm、３０μm、２０μmの順に）のナイロンメッシュに次々と通す。濾液を、１０mlのパーコール・クッション（９５％（v/v）パーコール（Pharmacia, Uppsala, Sweden)、５％（v/v）０．５Ｍ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ７．２）（Ｃｏｒｒｅｘチューブ、１５min、２，０００×ｇ）を用いて、遠心分離する。この遠心分離後に得られた沈殿物をデンプン緩衝液に一度再懸濁し、再び遠心分離する（５min、１，０００×ｇ）。
【０２３７】
ｃ）  デンプンに結合したタンパク質の除去。
工程ｂ）に従って、デンプンに結合したタンパク質を含むデンプン粒を得る。デンプン粒の表面に結合したタンパク質を４回、各回に０．５％ＳＤＳ（ラウリル硫酸ナトリウム）と１０〜１５分間室温で攪拌下インキュベーションすることにより、除去する。各洗浄工程の次に、洗浄緩衝液からデンプン粒を分離するために遠心分離（５min、５，０００×ｇ）を行う。
【０２３８】
ｄ）  タンパク質を除去されたデンプンの精製
工程ｃ）から得た、表面へ結合したタンパク質を除いたデンプンを、続いて洗浄緩衝液と４回、各場合に室温で攪拌下１０〜１５分インキュベーションすることにより除く。各洗浄工程に続いて、それぞれの洗浄緩衝液からデンプン粒を分離するために遠心分離（５分、１，０００×ｇ）を行う。これらの精製工程は、主として工程ｃ）でインキュベーション中に用いられるＳＤＳを除去する役割を果たす。
【０２３９】
ｅ）  単離したデンプンの濃度の決定
工程ｄ）で分離されたデンプンの量を光度計で決定する。適当な希釈の後、デンプン懸濁液の光学密度を検量線に対して６００nmの波長で測定する。検量線が直線状である範囲は、０〜０．３消光単位の間に存在する。
【０２４０】
検量線を生成するために、例えばArabidopsis thaliana sex1-3突然変異体の葉から分離されたデンプンを真空下で乾燥させ、重さを量り、規定体積の水に吸収させる。このようにして得られた懸濁液を、水の１ml当たり約５μgのデンプン懸濁液を得るまで、数工程で、各工程において水で１対１の比率で希釈する。個々の希釈工程によって得られた懸濁液を光度計により６００nmの波長で測定する。各懸濁液について得られた吸収値を、各懸濁液のデンプン濃度に対してプロットする。得られた検量線は、水ml当たり０μｇのデンプン〜水ml当たり０．３μgのデンプンの範囲で線形の数学関数に従うはずである。
【０２４１】
ｆ）  単離したデンプンの貯蔵
デンプンをそれ以上貯蔵しないでさらなるテストに直接用いてもよいし、または１．５mlエッペンドルフ管に分注して−２０℃で貯蔵してもよい。冷凍デンプンおよび非貯蔵の新鮮に分離されたデンプンの両方を、もし必要なら、例えばインビトロのリン酸化および／または結合テストに関する本発明に記述された方法に用いることができる。
【０２４２】
ｇ）  用いられる緩衝液の組成
１×デンプン緩衝液：  ２０mMＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ８．０、
０．２mMＥＤＴＡ、
０．５％トリトンＸ−１００
洗浄緩衝液：          ５０mMＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ７．２
【０２４３】
３．  同定されたデンプンリン酸化タンパク質の組換え発現
【０２４４】
ａ）  デンプンリン酸化タンパク質をコードするｃＤＮＡを含むバクテリアの発現ベクターの作製
デンプンリン酸化タンパク質をコードするｃＤＮＡを、例えば「鋳型」として植物組織のｍＲＮＡまたはポリＡ−プラス−ｍＲＮＡを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅することができる。この目的のために、先ず、逆転写酵素を用いてデンプンリン酸化タンパク質をコードするｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ鎖を作製し、その後当該ｃＤＮＡ鎖をＤＮＡポリメラーゼにより増幅する。ＰＣＲ反応を実施するための物質、酵素および指示を含むいわゆる「キット」を、購入することができる（例えば、SuperScript（商標）One-Step RT-PCR System, Invitrogen, Prod. No.: 10928-034）。デンプンリン酸化タンパク質をコードする増幅されたｃＤＮＡを、その後、バクテリアの発現ベクター、例えばｐＤＥＳＴ（商標）１７（Invitrogen）中にクローニングすることができる。ｐＤＥＳＴ（商標）１７は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの転写を開始するために用いられるＴ７プロモーターを含む。更に、発現ベクターｐＤＥＳＴ（商標）１７は、Ｔ７プロモーターの５’方向にシャイン・ダルガルノ配列を含み、その後に開始コドン（ＡＴＧ）および、いわゆるＨｉｓタグが続く。このＨｉｓタグは直接連続する６つのコドンから成り、各々はアミノ酸ヒスチジンをコードし、また前記開始コドンの読枠中に位置する。デンプンリン酸化タンパク質をコードするｃＤＮＡのｐＤＥＳＴ（商標）１７中へのクローニングを、翻訳の融合が、開始コドン、Ｈｉｓタグ、およびデンプンリン酸化タンパク質をコードするｃＤＮＡのコドン間に生じるように行なう。この結果として、Ｔ７プロモーター上で開始される転写およびその後の翻訳に続いて、そのＮ末端にＨｉｓタグを含む追加のアミノ酸を含むデンプンリン酸化タンパク質が得られる。
【０２４５】
しかし、微生物中での発現に適している他のベクターもまた、デンプンリン酸化タンパク質の発現に用いることができる。発現ベクターおよび関連する発現株は当業者に公知であり、また適当な組合せで適当な業者から購入することができる。
【０２４６】
ｂ）  Escherichia coli中の発現クローンの作製
まず第一に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを染色体的にコードする適切な形質転換受容性E.coli菌株を工程ａ）で作製された発現プラスミドにより形質転換し、続いて寒天で固めた培地上終夜３０℃でインキュベーションする。適切な発現菌株は、例えば、ＢＬ２１菌株（Invitrogen Prod. No.: C6010-03）であり、これは、ＩＰＴＧ誘導が可能なプロモーター（ｌａｃＺ）の制御下にあるＴ７ＲＮＡポリメラーゼを染色体的にコードする。
【０２４７】
形質転換の結果得られたバクテリアコロニーは、当業者に公知の方法により、それらがデンプンリン酸化タンパク質をコードするｃＤＮＡを含む必要な発現プラスミドを有しているかどうかを確かめるために調べることができる。同時に、発現クローンが得られる。
【０２４８】
ｃ）  Escherichia coliにおけるデンプンリン酸化タンパク質の発現
まず第一に、予備培養を生成する。このために、工程ｂ）に従って得られた発現クローンを、発現プラスミドの存在を選択するための抗生物質を含む３０mlのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地（ＴＢ培地）に播種し、終夜３０℃で攪拌下（２５０rpm）インキュベーションする。
【０２４９】
デンプンリン酸化タンパク質発現用の本培養を次に生成する。これを行うために、各々３０℃に予熱された３００mlのＴＢ培地および発現プラスミドの存在を選択するための抗生物質を含む１L エルレンマイヤーフラスコに、各々１０mlの適切な予備培養を播種し、（６００nmの波長で測定した）光学密度（ＯＤ600）が約０．８になるまで、３０℃で攪拌下（２５０rpm）インキュベーションした。
【０２５０】
もし、デンプンリン酸化タンパク質の発現のために、デンプンリン酸化タンパク質の発現が誘導可能なシステム（例えばＩＰＴＧにより誘導可能なＢＬ２１ E.coli菌株中の発現ベクターｐＤＥＳＴ（商標）１７）を用いて開始されるような発現プラスミドを用いる場合は、約０．８のＯＤ600に達したときに、当該（例えばＩＰＴＧ）誘導物質を本培養に加える。誘導物質を加えた後に、本培養液を３０℃で攪拌下（２５０rpm）約１．８のＯＤ600までインキュベーションする。本培養を次に氷上で３０分間冷却し、続いて本培養の細胞を遠心分離（１０分間４，０００×ｇ、４℃）により、培地から分離する。
【０２５１】
４．  デンプンリン酸化タンパク質の精製
【０２５２】
ａ）  デンプンリン酸化タンパク質を発現している細胞の破砕
一般的方法項目３の工程ｃ）の遠心後に得た細胞を、溶解緩衝液中に再懸濁する。その際、約４mlの溶解緩衝液を約１gの細胞へ加える。次に再懸濁した細胞を氷上で３０分間インキュベーションし、その後、超音波プローブ（Baudelin Sonoplus UW 2070, Baudelin electronic, Berlin、設定：サイクル６、７０％、１分間）を用いて、氷による連続冷却下で破砕する。ここで、細胞懸濁液を超音波処理の間に熱しすぎないことを確実にするように注意しなければならない。超音波処理の結果得られた懸濁液を遠心し（１２分２０，０００×ｇ、４℃）、遠心分離の後に得られた上清を、４５μmのポアサイズを有するフィルターを用いて濾過する。
【０２５３】
ｂ）  デンプンリン酸化タンパク質の精製
もしE.coli細胞中に発現したデンプンリン酸化タンパク質がＨｉｓタグとの融合タンパク質である場合は、Ｈｉｓタグが非常に大きな親和性で結合するニッケルイオンを用いて精製することができる。これを行うために、工程ｄ）で得られた２５mlの濾液を１mlのＮｉ−アガローススラリー（Qiagen, Prod. No.: 30210）と混合し、氷上で１時間インキュベーションする。Ｎｉ−アガローススラリーと濾液の混合物を、続いてポリスチレンカラム（Pierce, Prod. No.:29920）上で展開する。カラムを通過する生成物を捨てる。次に８mlの溶解緩衝液を加えることによりカラムを洗浄し、カラムを通過する生成物を再び捨てる。デンプンリン酸化タンパク質の溶出は、次に、１mlのＥ１緩衝液を２回、続いて１mlのＥ２緩衝液を１回、また続いて１mlＥ３緩衝液を５回、カラムへ区分けして加えることにより起こる。カラムへ適切な溶出緩衝液（Ｅｌ、Ｅ２、Ｅ３緩衝液）の個々の分画を加えることにより生成される、カラムを通過する生成物を、別々の分画に集める。これらの分画の小部分を、次に変性ＳＤＳアクリルアミドゲル電気泳動とそれに続くクマシーブルー染色により分析する。十分な量および満足すべき純度のデンプンリン酸化タンパク質を含む分画を、加圧濾過を用いて４℃で精製し濃縮する。加圧濾過を、例えばＡｍｉｃｏｎセル（Amicon Ultrafiltration Cell, Model 8010, Prod. No.: 5121）を用いて、ＤｉａｆｌｏＰＭ３０膜（Millipore, Prod. No.: 13212）を使用して４℃で実施することができる。しかし、当業者に公知の他の方法も濃縮に用いることができる。
【０２５４】
ｃ）  用いられる緩衝液の組成
溶解緩衝液：      ５０mM      ＨＥＰＥＳ、
３００mM    ＮａＣｌ、
１０mM      イミダゾール、
ｐＨ８．０（ＮａＯＨで調節する）、
１mg/mlリゾチーム（緩衝液を用いる直前に加える）
１０ml当たり１／４錠の完全ＥＤＴＡフリープロテアーゼ阻害剤（Roche Product No.:1873580）(緩衝液を用いる直前に加える）。
溶出緩衝液Ｅ１：  ５０mM      ＨＥＰＥＳ、
３００mM    ＮａＣｌ、
５０mM      イミダゾール、
ｐＨ８．０（ＮａＯＨで調節する）
溶出緩衝液Ｅ２：  ５０mM      ＨＥＰＥＳ、
３００mM    ＮａＣｌ、
７５mM      イミダゾール、
ｐＨ８．０（ＮａＯＨで調節する）
溶出緩衝液Ｅ３：  ５０mM      ＨＥＰＥＳ、
３００mM    ＮａＣｌ、
２５０mM    イミダゾール、
ｐＨ８．０（ＮａＯＨで調節する）
【０２５５】
５．  Ｒ１タンパク質の組換え発現
Ｒ１タンパク質の組換え発現については、文献（Ritte et al., 2002, PNAS 99, 7166-7171; Mikkelsen et al., 2004, Biochemical Journal 377, 525-532）に記載されているが、しかしまた、一般的方法項目３の下に上に記述されたデンプンリン酸化タンパク質のデンプン発現の組換え発現に関する方法に従って実施することもできる。
【０２５６】
６．  Ｒ１タンパク質の精製
Ｒ１タンパク質の精製については、文献（Ritte et al., 2002, PNAS 99, 7166-7171; Mikkelsen et al., Biochemical Journal 377, 525-532）に記述されているが、しかし、E. coli細胞のＲ１の発現によってＨｉｓタグを含むＲ１融合タンパク質が生成される場合は、一般的方法項目４の下に上に記述された、デンプンリン酸化タンパク質の精製に関する方法に従って実施することもできる。
【０２５７】
７．  非リン酸化デンプンから始まるリン酸化デンプンのインビトロにおける作製
【０２５８】
ａ）  非リン酸化デンプンのインビトロにおけるリン酸化
１ml当たり２５mgのデンプン含量を生成するために、デンプンリン酸を含まないデンプン（例えば、一般的方法項目２、の下で上に記述された方法を用いて、Arabidopsis thaliana sex1-3突然変異体の葉から単離された）を、Ｒ１緩衝液および精製されたＲ１タンパク質（１mgデンプン当たり約０．２５μgのＲ１タンパク質）と混合する。この反応調製物を、終夜（約１５ｈ）攪拌下室温でインキュベーションする。反応調製物中に存在するデンプンに結合しているＲ１を、反応の完了時に４回、各回約８００μlの０．５％ＳＤＳで洗浄することにより除去する。続いてインビトロでリン酸化されたデンプン中にまだ存在するＳＤＳを５回、各回１mlの洗浄緩衝液で洗うことにより、除去する。すべての洗浄工程を室温で１０〜１５分間攪拌下行なう。各洗浄工程に続けて、それぞれのＳＤＳ緩衝液または洗浄緩衝液からデンプン粒を分離するために、遠心分離（２分間、１０，０００×ｇ）を行う。
【０２５９】
ｂ）  用いられる緩衝液の組成
Ｒ１緩衝液：      ５０mM        ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ７．５、
１mM          ＥＤＴＡ、
６mM          ＭｇＣｌ２、
０．５mM      ＡＴＰ
洗浄緩衝液：      ５０mM        ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ７．２
【０２６０】
８．  リン酸化デンプンまたは非リン酸化デンプンへのタンパク質の結合
【０２６１】
ａ）  Ｐ−デンプンタンパク質複合体または非リン酸化デンプンタンパク質複合体の単離
約５０mgのＰ−デンプンまたは約５０mgの非リン酸化デンプンを、個別の調製物中の各タンパク質抽出物約８００μlに再懸濁する。タンパク質抽出物のタンパク質濃度は、各々１ml当たり約４mg〜５mgとするべきである。Ｐ−デンプンまたは非リン酸化デンプンとタンパク質抽出物のインキュベーションを攪拌下室温１５分間４℃で実施する。インキュベーションの完了時に、反応調製物をパーコールクッション（４ml）を用いて遠心する（１５分、３，５００rpm、４℃）。遠心分離の後、リン酸化デンプン即ちＰ−デンプンに結合していないタンパク質は上清で見つかり、パスツールピペットで除去ことができる。上清を捨てる。遠心分離後に得られたＰ−デンプンおよび非リン酸化デンプンを含み、またそれぞれのデンプンに結合したタンパク質（それぞれ、Ｐ−デンプンタンパク質複合体または非リン酸化デンプンタンパク質複合体）を含む沈殿したペレットを２回、各回１mlの洗浄緩衝液で（上記、一般的方法項目７．ｂ）を参照のこと）、３分間４℃攪拌下でインキュベーションすることにより、洗浄した。洗浄工程の次に、洗浄緩衝液からＰ−デンプンまたは非リン酸化デンプンをそれぞれ分離するために、遠心分離（５分、８０００rpm、４℃で卓上遠心機Hettich EBA 12Rで）を行った。
【０２６２】
ｂ）  Ｐ−デンプンタンパク質複合体または非リン酸化デンプンタンパク質複合体それぞれ中の結合したタンパク質の溶解
工程ａ）で得られたＰ−デンプンタンパク質複合体または非リン酸化デンプンタンパク質複合体をそれぞれ約１５０μlＳＤＳテスト緩衝液中に再懸濁し、室温１５分間攪拌下でインキュベーションする。続いてＰ−デンプンまたは非リン酸化デンプンを、それぞれ溶解されたタンパク質から遠心分離により（１分、１３，０００rpm、室温、Eppendorf 卓上遠心機）、取り除く。Ｐ−デンプンまたは非リン酸化デンプンの残りをそれぞれすべて除去するために、遠心分離後に得られた上清を再び遠心し（１分、１３，０００rpm、室温、Eppendorf卓上遠心機）、除去する。その結果、Ｐ−デンプンまたは非リン酸化デンプンにそれぞれ結合する溶解されたタンパク質が得られる。
【０２６３】
ｃ）  用いる緩衝液の組成
ＳＤＳテスト緩衝液：  １８７．５mM    トリス／ＨＣl、ｐＨ６．８、
６％            ＳＤＳ、
３０％          グリセリン、
〜０．０１５％    ブロモフェノールブルー、
６０mM          ＤＴＥ（新たに添加）
パーコール：    パーコールを、および２５mMＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．０）から構成される溶液に対して終夜透析する。
【０２６４】
９．  Ｐ−デンプンおよび／または非リン酸化デンプンに結合するタンパク質の分離
タンパク質のそれぞれＰ−デンプンまたは非リン酸化デンプンへの結合に関する一般的方法項目８工程ｃ）で得られた溶解されたタンパク質を、各々５分間９５℃でインキュベーションし、続いて変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動法を用いて分離する。その際、Ｐ−デンプンに結合することにより得られた溶解されたタンパク質および非リン酸化デンプンに結合することにより得られた溶解されたタンパク質の等しい体積を、各々アクリルアミドゲルに加える。電気泳動の完了時に得られたゲルを少なくとも終夜コロイド状クマシーで染色し（Roth, Karlsruhe, Roti-Blue Rod. No.: A152.1）、続いて３０％メタノール、５％酢酸、または２５％メタノール中で脱色する。
【０２６５】
１０．  Ｐ−デンプンおよび／または非リン酸化デンプンに結合するタンパク質の同定および単離
【０２６６】
ａ）  非リン酸化デンプンと比較してＰ−デンプンに対して増加した結合活性を有するタンパク質の同定
アクリルアミドゲル電気泳動による分離およびそれに続く染色による可視化（上記一般的方法項目９を参照のこと）の後に、非リン酸化デンプンに結合した後の対応する信号と比較して、Ｐ−デンプンに結合した後に増加した信号を示すタンパク質は、非リン酸化デンプンと比較してＰ−デンプンに対して増大した結合活性を有する。この手段によって、非リン酸化デンプンと比較してＰ−デンプンに対して増大した結合活性を有するタンパク質を同定することができる。非リン酸化デンプンと比較してＰ−デンプンに対して増大した結合活性を有するタンパク質を、アクリルアミドゲルから切り出す。
【０２６７】
ｂ）  非リン酸化デンプンと比較してＰ−デンプンに対して増大した結合活性を有するタンパク質の同定
工程ａ）に従って同定されたタンパク質をトリプシンにより消化し、得られたペプチドをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって分析して、得られたペプチドの質量を決定する。トリプシンは配列特異的なプロテアーゼである、即ちトリプシンは、タンパク質があるアミノ酸配列を含んでいる場合に、特異的位置でのみ当該タンパク質を分割する。Ｎ末端からスタートして、アミノ酸アルギニンおよびリジンが互いに続く場合トリプシンは常にペプチド結合を分割する。したがって、アミノ酸配列のトリプシン消化後に生成されることになるペプチドをすべて理論的に決定することが可能である。理論的に決定されたペプチドをコードするアミノ酸についての知識から、理論的なトリプシン消化後に得られるペプチドの質量を決定することができる。したがって、理論的なトリプシン消化後のペプチドの質量に関する情報を含むデータベース（例えば、NCBInr http://prospector. ucsf.edu/ucsfhtml4.0/msfit.htm; Swissprot http://cbrg.inf.ethz.ch/Server/ MassSearch.html）を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって得られた未知のタンパク質のペプチドの実際の質量と比較することができる。理論的および／または現実のトリプシン消化の後に同じペプチド質量を有するアミノ酸配列は、同一であると見なされる。当該データベースは、既にその機能が示されているタンパク質のペプチド質量、および配列決定計画により得られた核酸配列から出発したアミノ酸配列から導出された、今までのところ単に仮説的に存在するタンパク質のペプチド質量の両方を含む。そのような仮説タンパク質の実際の存在および機能が示されたことは希であり、また何らかの機能が存在するとしても、これは通常予測のみに基づいていて、実際の機能の実証には基づいていない。
【０２６８】
工程ａ）に従って得られたタンパク質を含むバンドをアクリルアミドゲルから切り出し；切り出されたアクリルアミド片を、約３０分間３７℃で、約１mlの６０％５０mMＮＨ４ＨＣＯ３４０％アセトニトリル中でインキュベーションすることにより、還元して脱色する。続いて脱色溶液を除き、残ったゲルを真空下（例えばSpeedvac）で乾燥させる。乾燥後、トリプシン溶液を加えて、当該ゲル片に含まれるタンパク質を消化する。消化は、３７℃で終夜行う。消化の後、小量のアセトニトリルを加えて（アクリルアミドゲルが白く染まるまで）、調製物を真空下（例えばSpeedvac）で乾燥させる。乾燥が完了したとき、乾いた内容物を被うためにちょうど十分な５％ギ酸を加え、数分間３７℃でインキュベーションする。アセトニトリル処理とそれに続く乾燥をもう一度繰り返す。続いて、乾燥した内容物を０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸、５μl〜１０μl）に吸収させ、担体上に約０．５μlずつ滴下する。等量のマトリックス（ε−シアノ−４−ヒドロキシ−桂皮酸）を担体に加える。マトリックスを結晶化させた後に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ−ＭＳ（例えばBurker Reflex（商標） II, Bruker Daltonic, Bremen）によってペプチドの質量を決定する。得られた質量についてデータベースを探索して、理論的トリプシン消化後に同じ質量を与えるアミノ酸配列を求める。このようにして、好んでリン酸化α−１，４−グルカンに結合する、および／または基質としてＰ−α−１，４−グルカンを必要とするタンパク質をコードするアミノ酸配列を同定することができる。
【０２６９】
１１．  タンパク質のデンプンリン酸化活性を実証する方法
【０２７０】
ａ）  タンパク質のＰ−デンプンおよび／または非リン酸化デンプンとのインキュベーション
タンパク質がデンプンリン酸化活性を有するかどうかを実証するために、調べるべきタンパク質をデンプンおよび放射性ラベルされたＡＴＰとインキュベーションすることができる。これを行うために、約５mgのＰ−デンプンまたは約５mgの非リン酸化デンプンを、調べるタンパク質（用いるデンプン１mg当たり０．０１μg〜５．０μg）と５００μlリン酸化緩衝液中で１０分〜３０分間室温で攪拌下インキュベーションする。続いて反応を、ＳＤＳの２％（重量／体積）濃度までの添加によって止める。それぞれの反応混合物中のデンプン粒を遠心（１分間、１３，０００×ｇ）し、９００μlの２％ＳＤＳ溶液で１回および各々９００μlの２mMＡＴＰ溶液で４回洗浄する。各洗浄工程を、１５分間室温で撹拌下行なう。各洗浄工程の後、デンプン粒をそれぞれの洗浄緩衝液から遠心分離（１分間、１３，０００×ｇ）により分離する。
【０２７１】
さらに、タンパク質のデンプンリン酸化活性を実証する実験を実施するときは、タンパク質を含んでいないかまたは不活性化されたタンパク質を含むが、それ以外は記述した反応調製物と同じ方法で処理されるさらなる反応調製物を、いわゆる対照として処理するべきである。
【０２７２】
ｂ）  酵素活性によりＰ−デンプンおよび／または非リン酸化デンプンに取り込まれたリン酸残基の量の決定。
工程ａ）に従って得られたデンプン粒を、放射性ラベルされたリン酸残基の存在について調べることができる。これを行うために、それぞれのデンプンを１００μlの水に再懸濁し、それぞれ３mlのシンチレーションカクテル（例えばReady Safe（商標）, BECKMANN Coulter）と混合し、次にシンチレーションカウンター(例えば、LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter, BECKMANN COULTER（商標））を用いて分析する。
【０２７３】
ｃ）  基質としてＰ−デンプンを好んで用いるタンパク質の同定
もしタンパク質をＰ−デンプンと共に一度、および非リン酸化デンプンと共に一度、別々の調製物中でａ）に記述した方法に従いインキュベーションするならば、工程ｂ）によって得られたデンプンリン酸の存在量を比較することよって、当該タンパク質が非リン酸化デンプンと比較してＰ−デンプンにより多くのリン酸を取込んだかどうかを決定することができる。したがって、Ｐ−デンプンへリン酸を導入することができるが、非リン酸化デンプンへはできないタンパク質を同定することが出来る。即ちさらなるリン酸化反応用基質として既にリン酸化されているデンプンを要求するタンパク質を同定することができる。
【０２７４】
ｄ）  用いられる緩衝液の組成
リン酸化緩衝液：    ５０mM              ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ  ｐＨ７．５、
１mM                ＥＤＴＡ、
６mM                ＭｇＣｌ２、
０．０１〜０．５mM  ＡＴＰ、
１ml当たり０．２〜２pCiの無作為化33Ｐ−ＡＴＰ（あるいは、ガンマ位置に特異的にラベルされたリン酸残基を含むＡＴＰを用いることもできる）。
【０２７５】
本発明に関連しては、用語「無作為化ＡＴＰ」とはγ位置およびβ位置の両方にラベルされたリン酸残基を含むＡＴＰを意味すると理解するべきである（Ritte et al. 2002, PNAS 99, 7166-7171）。無作為化ＡＴＰはまた科学文献にβ／γＡＴＰとして記述されている。無作為化ＡＴＰを作製する方法について下記に記述する。
【０２７６】
ｉ）  無作為化ＡＴＰの作製
ここで記述する、酵素触媒反応を用いる無作為化ＡＴＰの作製のための方法は、次の反応機構に基づく：
反応工程１
33Ｐ−ＡＴＰ＋ＡＭＰ＋ミオキナーゼ  →  33Ｐ−ＡＤＰ＋ＡＤＰ
（アデノシン−Ｐ−Ｐ−33Ｐ＋アデノシン−Ｐ  →  
アデノシン−Ｐ−Ｐ＋アデノシン−Ｐ−33Ｐ）
反応工程２
33Ｐ−ＡＤＰ＋ＡＤＰ＋２ＰＥＰ＋ピルビン酸キナーゼ  →
33Ｐ−ＡＴＰ＋ＡＴＰ＋２ピルビン酸
（アデノシン−Ｐ−Ｐ＋アデノシン−Ｐ−33Ｐ＋２ＰＥＰ  →
アデノシン−Ｐ−Ｐ−Ｐ  ＋  アデノシン−Ｐ−33Ｐ−Ｐ＋２ピルビン酸）
反応平衡が生成物側に存在するにもかかわらず、この反応は、主として33Ｐ−ＡＴＰおよびいくらかの33Ｐ−ＡＴＰからなる混合物を生成する。
【０２７７】
ii）  第１の反応工程の実施
33Ｐでラベルされたリン酸残基をγ位置に含むＡＴＰ(Hartmann Analytic,10μCi/μl)（１００μCi、３０００Ci/mmol）を、２μlミオキナーゼ（ウサギ筋肉のＡＭＰホスホトランスフェラーゼ；SIGMA, Prod. No.: M3003、３．８mg/ml、１，６２６単位/mg）と９０μlの無作為化緩衝液中１時間３７℃でインキュベーションする。１２分間９５℃でインキュベーションすることにより反応を停止し、その後、反応調製物をＭｉｃｒｏｃｏｎ ＹＭ１０フィルタ（Amicon, Millipore Prod. No. 42407）を用い、１４，０００×ｇで少なくとも１０分間遠心濾過することにより精製した。
【０２７８】
iii）  第２の反応工程の実施
２μlのピルビン酸キナーゼ（適切な溶液を作製する方法については下を参照）および３μlの５０mMＰＥＰ（ホスホエノールピルビン酸）を工程ii）で得られた濾液に加える。この反応混合物を４５分間３０℃でインキュベーションしてから、９５℃で１２分間インキュベーションすることにより反応を止める。続いて反応混合物を遠心する（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ卓上遠心機で２分間、１２，０００rpm）。遠心分離後に得られた無作為化ＡＴＰを含む上清を取り出して、小分けにし、−２０℃で貯蔵することができる。
【０２７９】
ピルビン酸キナーゼ溶液の作製
１５μlピルビン酸キナーゼ（ウサギ筋肉、Roche, Prod. No.12815,１０mg/ml, ２００単位/mg，２５℃で）を遠心し、上清を捨て、またペレットを２７μlピルビン酸キナーゼ緩衝液に吸収した。
【０２８０】
iv）  用いられる緩衝液
ピルビン酸キナーゼ緩衝液：  ５０mM      ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ７．５、
１mM        ＥＤＴＡ
無作為化緩衝液：            １００mM    ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ  ｐＨ７．５、
１mM        ＥＤＴＡ、
１０％      グリセリン、
５mM        ＭｇＣｌ２、
５mM        ＫＣｌ、
０．１mM    ＡＴＰ、
０．３mM    ＡＭＰ
【０２８１】
１２．  タンパク質の自己リン酸化の実証
タンパク質が自己リン酸化活性を有するかどうかを実証するために、調べたいタンパク質を放射性ラベルされたＡＴＰとインキュベーションすることができる。これを行うために、調べたいタンパク質（５０μg〜１００μg）を、２２０μlリン酸化緩衝液（上記の一般的方法、項目１２ｄ）を参照のこと）の中で３０分〜９０分間室温で撹拌下インキュベーションする。その後、反応を最終濃度０．１１MまでのＥＤＴＡを加えることによって止める。その後、約２μg〜４μgのタンパク質を、変性ポリアクリルアミド電気泳動（７．５％アクリルアミドゲル）を用いて分離する。ポリアクリルアミドゲル電気泳動法後に得られたゲルをオートラジオグラフィに付す。オートラジオグラフィで信号を示すタンパク質は放射性リン酸残基を保持している。
【０２８２】
１３．  デンプンリン酸化タンパク質によりリン酸残基を導入されるα−１，４−グルカンのグルコース分子のＣ−原子位置の同定
α−１，４−グルカンのグルコース分子のどのＣ−原子位置がタンパク質によりリン酸化されるかを、制御された様式で、適切なタンパク質を用いて得られたリン酸化グルカンのインビトロの加水分解、それに続く加水分解後に得られたグルコースモノマーの分離、およびそれに続く、適切なタンパク質によりグルコース分子の一定の分画に組み入れられたリン酸の測定、により実証することができる。
【０２８３】
ａ）  α−１，４−グルカンの全加水分解
α−１，４−グルカンを含む水懸濁物を遠心し、続いて沈殿したペレットを０．７MのＨＣl（Baker、解析用）に再懸濁して、撹拌下２時間９５℃でインキュベーションする。インキュベーションの完了後、試料を短時間冷却し、遠心する（例えば２分間、１０，０００×g）。得られた上清を新しい反応容器に移し、２M ＮａＯＨ（Baker、解析用）を添加して中和する。ペレットが残っている場合は、それを１００μlの水に再懸濁し、そこに存在するラベルされたリン酸の量を対照として測定する。
【０２８４】
続いて中和した上清を１０kDaフィルタに載せて遠心する。得られた濾液の小分画を、例えば、シンチレーションカウンターを用いて測定して、濾液中のラベルされたリン酸の量を決定する。
【０２８５】
ｂ）  加水分解生成物の分別およびリン酸化されたＣ−原子位置の決定
工程ａ）によって得られた加水分解生成物の中和された濾液を、例えば高圧陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥ）を用いて、分離することができる（約３０００cpmの放射性ラベルＡＴＰを用いる場合）。ＨＰＡＥに必要な体積を得るために中和された濾液をＨ２０で薄めることができる。さらに、グルコース−６−リン酸（約０．１５mM）およびグルコース−３−リン酸（約０．３mM）を、適切な濾液に各々内部対照として加える。ＨＰＡＥによる分離を例えば、ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ １００カラム（適切なプレカラムを備えた）およびパルスアンペロメトリック検出器（ＥＤ ５０）を用いるＤｉｏｎｅｘ ＤＸ ６００ ＢｉｏＬｃシステムを用いて、行なうことができる。そうする際に、試料を注入する前に、カラムをまず１０分間９９％溶出液Ｃおよび１％溶出液Ｄで濯ぐ。その後、６０μlの試料体積を注入する。試料の溶出は下記条件下で起こる：
流量：１ml／分
勾配：０分〜３０分まで直線的に増加する
溶出液Ｃ    溶出液Ｄ
０分    ９９％        １％
３０分      ０％    １００％
３５分      ０％    １００％
溶出終了。
【０２８６】
カラムから溶出した加水分解生成物を、各々１mlの分画毎に集める。毎回非ラベルグルコース−３−リン酸（Ritte et al. 2002, PNAS 99, 7166-7171）および非ラベルグルコース−６−リン酸（Sigma, Prod. No.: G7879）を、注入された加水分解生成物の試料に内部基準として加えておくので、グルコース−３−リン酸またはグルコース−６−リン酸のいずれかを含む分画を、パルスアンペロメトリック検出により決定することができる。個々の分画中のラベルされたリン酸の量を測定し、続いてグルコース−３−リン酸またはグルコース−６−リン酸を含む分画と比較することにより、これをラベルされたグルコース−６−リン酸またはラベルされたグルコース−３−リン酸を含む分画を決定するために用いることができる。当該分画中のラベルされたリン酸の量を決定する。個々の加水分解生成物中でラベルされたリン酸について測定されたグルコース−３−リン酸のグルコース−６−リン酸に対する量比から、α−１，４−グルカンリン酸化酵素がどのＣ−原子位置を好んでリン酸化するかをここで決定することができる。
【０２８７】
ｃ）  用いる緩衝液
溶出液Ｃ：１００mM  ＮａＯＨ
溶出液Ｄ：１００mM  ＮａＯＨ、
５００mM  酢酸ナトリウム
【０２８８】
１４．  イネ植物の形質転換
イネ植物を、Hiei et al.（1994, Plant Journal 6(2), 271-282）によって記述された方法に従って形質転換した。
【０２８９】
１５．  コムギ植物の形質転換
コムギ植物をBecker et al.(1994, Plant Journal 5, 299-307）により記述された方法に従って形質転換した。
【０２９０】
１６．  トウモロコシ植物の形質転換
系統Ａ１８８のトウモロコシ植物の未成熟胚をlshida et al. (1996, Nature Biotechnology 14, 745-750）により記述された方法に従って形質転換した。
【０２９１】
１７．  デンプンリン酸含量の決定
【０２９２】
Ｃ−６リン酸含有量の決定
デンプンにおいては、グルコース単位のＣ２、Ｃ３およびＣ６位置がリン酸化される可能性がある。デンプンのＣ６−Ｐ含量を決定するために、５０mgのデンプンを、５００μlの０．７M ＨＣｌ中４時間９５℃で加水分解した。その後、調製物を１５，５００ｇで１０分間遠心し、上清を取り出した。上清７μlを１９３μlのイミダゾール緩衝液（１００mM イミダゾール、ｐＨ７．４；５mM ＭｇＣｌ2、１mM ＥＤＴＡおよび０．４mM ＮＡＤ）と混合した。光度計を用いて３４０nmで測定を行った。基礎吸収を確定した後、２単位のグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（Leuconostoc mesenteroidesの, Boehringer Mannheim）を加えることにより、酵素反応を開始した。吸収の変化は、デンプン中のＧ−６−Ｐ含量の濃度に正比例する。
【０２９３】
ｂ）  全リン酸含量の決定
全リン酸含量の決定をエームズ法（Methods in Enzymology VIII, (1966), 115-118）を用いて行う。
【０２９４】
約５０mgのデンプンを３０μlのエタノール硝酸マグネシウム溶液と混合し、マッフル炉中３時間５００℃で灰化する。残渣を３００μlの０．５M塩酸と混合し、３０分間６０℃でインキュベーションする。次に、一部分を０．５M塩酸で３００μlまで増加させ、１００μlの１０％アスコルビン酸および６００μlの２M硫酸中の０．４２％モリブデン酸アンモニウムの混合物に加えて、２０分間４５℃でインキュベーションする。
【０２９５】
ｃ）  Ｃ−６リン酸およびＣ−３リン酸の含量の決定
α−１，４−グルカンのグルコース分子のＣ−６位置およびＣ−３位置に結合したリン酸の含量を決定するために、一般的方法項目１３に記載されたＨＰＡＥ法による全加水分解を用いて各グルカンを分離することができる。グルコース−６−リン酸およびグルコース−３−リン酸の量を、ＨＰＥＡ分離の後に得られる個々のピーク面積の積分により決定することができる。未知の試料で得られたグルコース−６−リン酸に対するピーク面積を、既知量のグルコース−６−リン酸およびグルコース−３−リン酸を有するＨＰＡＥ分離後のピーク面積と比較することにより、調査する試料中のグルコース−６−リン酸およびグルコース−３−リン酸の量を決定することができる。
【０２９６】
実施例
１．Arabidopsis thalianaからの非リン酸化デンプンと比較してＰ−デンプンに対して増加した結合活性を有するタンパク質の単離
【０２９７】
ａ）  Arabidopsis thalianaからのタンパク質抽出物の作製
タンパク質抽出物を、Arabidopsis thaliana（Ecotype Columbia, Col-O）の約７ｇの葉（生体重）から、一般的方法項目１に記述された方法に従って作製した。
【０２９８】
ｂ）  Arabidopsis thaliana sex1-3突然変異体の葉からのデンプン粒の単離
デンプン粒を、Arabidopsis thaliana sex1-3突然変異体の約２０gの葉（生体重量）から、一般的方法項目２に記述された方法に従って単離した。
【０２９９】
ｃ）  Arabidopsis thaliana sex1-3突然変異体から単離されたデンプンの、精製されたＲ１タンパク質によるインビトロのリン酸化
Arabidopsis thaliana sexl-3突然変異体から単離された約３０mgの非リン酸化デンプンを、一般的方法項目７に記述された方法に従って、E. coli中で組換え発現され精製されたＲ１タンパク質によってリン酸化した。Ritte et al.（2002, PNAS 99, 7166- 7171）に記述された方法を、E. coli中のＲ１タンパク質の発現、およびそれに続く精製に用いた。
【０３００】
ｄ）  Ｐ−デンプンおよび／または非リン酸化デンプンに結合するタンパク質の単離
工程ａ）に従って得られたArabidopsis thalianaのタンパク質抽出物を、５０mgの工程ｃ）に従って作製されたインビトロでリン酸化されたデンプンと、一般的方法項目８ａ）に記述された方法を用いて、調製物Ａ中でインキュベーションし洗浄した。
【０３０１】
第２の調製物Ｂ中で、工程ａ）に従って得られたArabidopsis thalianaのタンパク質抽出物を、工程ｂ）に従って作製された５０mgの非リン酸化デンプンと、一般的方法項目８ａ）に記述された方法を用い、インキュベーションし洗浄した。
【０３０２】
続いて、調製物ＡのＰ−デンプンに、および調製物Ｂの非リン酸化デンプンに結合したタンパク質を、一般的方法項目８ｂ）に記述された方法に従って溶解した。
【０３０３】
第３の調製物Ｃ中で、工程ｃ）に従って作製された５０mgのインビトロでリン酸化されたデンプンを、一般的方法項目８ａ）に記述された方法を用いて、インキュベーションし洗浄した。しかし、調製物Ｃはタンパク質抽出物を含まなかった。
【０３０４】
ｅ）  工程ｄ）に従って得られたタンパク質のアクリルアミドゲル電気泳動による分離
工程ｄ）中で得られた調製物Ａ、Ｂ、およびＣのタンパク質を、一般的方法項目９に記述された方法を用いて、変性条件（ＳＤＳ）下の９％アクリルアミドゲルによって分離し、続いてクマシーブルーで染色した。染色されたゲルを図１に示す。変性アクリルアミドゲル中で、タンパク質標準マーカー（トレースＭ）と照合して約１３０kDaの分子量を有するタンパク質が、非リン酸化デンプン（Ｋ）と比較して好んでリン酸化デンプン（トレースＰ）に結合することを、はっきり見ることができる。
【０３０５】
ｆ）  非リン酸化デンプンと比較してＰ−デンプンに好んで結合するタンパク質の同定
工程ｅ）で同定された約１３０kDaの分子量を有するタンパク質のバンドをゲルから切り出した。一般的方法１０ｂ）に記述したように、続いてタンパク質をアクリルアミドから放出させ、トリプシンで消化し、得られたペプチドの質量をＭＡＬＤ−ＴＯＦ−ＭＳによって決定した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによって得られたいわゆる「フィンガープリント」を、データベース（Mascot: http://www.matrixscience. com/search form_select.html; ProFound: http://129.85.19.192/profound_bin/ WebProFound.exe; PepSea: http://195.41.108.38/PepSeaIntro.html）中の理論的に消化されたアミノ酸分子のフィンガープリントと比較した。このようなフィンガープリントはタンパク質に非常に特異的であるため、アミノ酸分子を同定することができた。このアミノ酸分子の配列を用いて、ＯＫ１タンパク質をコードする核酸配列を、Arabidopsis thalianaから特定することができた。この方法を用いて同定したタンパク質をＡ．ｔ．−ＯＫ１と名付けた。Arabidopsis thalianaからのアミノ酸配列を分析した後に、これがデータベース中に存在する配列（ＮＰ １９８００９、ＮＣＢＩ）と相違することが判明した。配列番号２に示されるアミノ酸配列が、Ａ．ｔ．−ＯＫ１タンパク質をコードする。配列番号２には、データベース中の配列（Ａｃｃ．：ＮＰ １９８００９．１，ＮＣＢＩ）と比較すると、差異が含まれる。配列番号２に含まれるアミノ酸５１９〜５２３（ＷＲＬＣＥ）および７６２〜７６６（ＶＲＡＲＱ）は、データベースに存在する配列（ＡＣＣ．：ＮＰ １９８００９．１）．ＮＰ  １９８００９．１）中にはない。データベース配列のバージョン２（Ａｃｃ．：ＮＰ １９８００９．２）と比較して、配列番号２中に示されるアミノ酸配列は追加のアミノ酸５１９〜５２３（ＷＲＬＣＥ）を含む。
【０３０６】
２．同定されたＯＫ１タンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニング
Ａ．ｔ．−ＯＫ１ｃＤＮＡを、Arabidopsis thalianaの葉から単離したｍＲＮＡを用い、逆ＰＣＲ法を使用して単離した。これを行うために、逆転写酵素（SuperScript（商標）First-Strand Synthesis System for RT PCR, Invitrogen Prod. No.: 11904-018）によってｃＤＮＡ鎖を合成し、その後ＤＮＡポリメラーゼ（Expand High Fidelity PCR Systems, Roche Prod. No.: 1732641）を用いてこれを増幅した。このＰＣＲ反応から得られて増幅された生成物を、ベクターｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔ（Invitrogen Prod.No.: A3600）へクローニングした。得られたプラスミドをＡ．ｔ．−ＯＫ１−ｐＧＥＭ（登録商標）−Ｔと名付け、Ａ．ｔ．−ＯＫ１タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列を決定し、配列番号１（登録商標）に示す。
【０３０７】
配列番号１に示された配列は、データベースに含まれている配列と同じではない。これは既に、Ａ．ｔ．−ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列に対して議論した。
【０３０８】
Ａ．ｔ．−ＯＫ１タンパク質をコードするｃＤＮＡの増幅に用いた条件
【０３０９】
第１鎖の合成：
メーカーによって指定された条件および緩衝液を用いた。さらに、第１鎖合成用の反応調製物は次の物質を含んでいた：
３μg        全ＲＮＡ、
５μM        ３’−プライマー（ＯＫ１逆方向１：５’−ＧＡＣＴＣＡＡＣＣＡＣＡＴＡＡＣＡＣＡＣＡＡＡＧＡＴＣ）
０．８３μM    ｄＮＴＰ混合物。
反応調製物を５分間７５℃でインキュベーションし、続いて室温に冷却した。その後第１鎖緩衝液、ＲＮａｓｅ阻害剤およびＤＴＴを加えて２分間４２℃でインキュベーションし、その後１μlのSuperScript ＲＴ ＤＮＡポリメラーゼを加え、反応調製物を５０分間４２℃でインキュベーションした。
【０３１０】
第１鎖のＰＣＲによる増幅の条件：
１μl        第１鎖合成の反応調製物
【表１】
0005623002.tif 000002
【０３１１】
反応条件：
工程１  ９５℃    ２分間
工程２  ９４℃  ２０秒間
工程３  ６２℃  ３０秒間
工程４  ６８℃    ４分間
工程５  ９４℃  ２０秒間
工程６  ５６℃  ３０秒間
工程７  ６８℃    ４分間
工程８  ６８℃  １０分間
まず反応を工程１〜４に従って行なった。工程４と工程２の間で１０回の繰返し（サイクル）を実施し、工程３の温度を各サイクルの後に０．６７℃だけ低下させた。次に、これに続けて工程５〜８で指定された条件に従う反応を行った。工程７と工程５の間で２５回の繰返し（サイクル）を実施し、工程７の時間を各サイクルで５秒ずつ増加させた。反応完了後すぐに、反応物を４℃に冷却した。
【０３１２】
３．ＯＫ１タンパク質のｃＤＮＡの組換え発現のためのベクターの作製
鋳型としてプラスミドＡ．ｔ．−ＯＫ１−ｐＧＥＭ（登録商標）を用い、ゲートウェイ技術(Invitrogen)を用いるＰＣＲによる増幅に続いて、Arabidopsis thalianaのＯＫ１タンパク質をコードする配列を先ずベクターｐＤＯＮＯＲ（商標）２０１（Invitrogen Prod. No.: 11798-014）へクローニングした。続いて、得られたベクターのＯＫ１タンパク質のコード領域を、配列特異的組換えによって発現ベクターｐＤＥＳＴ（商標）１７（Invitrogen Prod. No.: 11803-014）中へクローニングした。得られた発現ベクターをＡ．ｔ．−ＯＫ１−ｐＤＥＳＴ（商標）１と名付ける。クローニングは、その結果として、Ａ．ｔ．−ＯＫ１タンパク質をコードするｃＤＮＡの、発現ベクターｐＤＥＳＴ（商標）１７中に存在するヌクレオチドとの翻訳的融合を引き起こした。ベクターｐＤＥＳＴ１７（商標）１７起源のヌクレオチドはＡ．ｔ．−ＯＫ１タンパク質をコードするｃＤＮＡと翻訳的に融合され、２１個のアミノ酸をコードする。これらの２１個のアミノ酸は、とりわけ、開始コドン（ＡＴＧ）およびいわゆるＨｉｓタグ（直接連続する６個のヒスチジン残基）を含む。翻訳的に融合した配列の翻訳の後、これは、Ｎ末端にベクター起源のヌクレオチドによりコードされる追加の２１個のアミノ酸を有するＡ,ｔ.−ＯＫ１タンパク質をもたらす。したがって、このベクターに起因する組換えＡ．ｔ．−ＯＫ１タンパク質は、そのＮ末端にベクターｐＤＥＳＴ（商標）１７起源の２１個の追加のアミノ酸を含む。
【０３１３】
４．E. coli中のＯＫ１タンパク質の非相同発現
実施例３に従って得た発現ベクターＡ．ｔ．−ＯＫ１−ｐＤＥＳＴ（商標）１７を、E.coli菌株ＢＬ２１ Ｓｔａｒ（商標）(ＤＥ３）（Invitrogen, Prod. No. C6010-03）中に形質転換した。この発現系の記述は既に上に与えた（一般的方法項目３を参照）。形質転換の結果得られたベクターＡ．ｔ．−ＯＫ１−ｐＤＥＳＴ（商標）１７を含むバクテリアのクローンを、まず予備培養の作製に使用し、それを、続いて本培養（一般的方法項目３ｃ）を参照のこと）へ接種するために用いた。予備培養および本培養を各々３０℃で撹拌下（２５０rpm）インキュベーションした。本培養が約０．８のＯＤ600に達した時、組換えＡ．ｔ．−ＯＫ１タンパク質の発現を、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を最終濃度１mMに達するまで加えることにより誘導した。ＩＰＴＧの添加後、本培養を３０℃撹拌下（２５０rpm）でＯＤ600が約１．８に達するまでインキュベーションした。本培養をその後３０分間氷上で冷却し、次に本培養の細胞を遠心分離（１０分間４，０００×ｇ、４℃）により培地から分離した。
【０３１４】
５．組換え発現されたＯＫ１タンパク質の精製
実施例４に従って得られた細胞のＡ．ｔ．−ＯＫ１タンパク質の精製および濃縮を、一般的方法項目４に記述された方法を用いて実施した。
【０３１５】
６．ＯＫ１タンパク質のデンプンリン酸化活性の実証
Ａ．ｔ．−ＯＫ１タンパク質のデンプンリン酸化活性を、一般的方法項目１１に記述された方法に従って実証した。その際に、実施例５に従って作製された精製Ａ．ｔ．−ＯＫ１タンパク質５μgを各々調製物Ａでは実施例１ｂ）に従ってArabidopsis thaliana sex1-3突然変異体から単離された５mgのデンプンと、および調製物Ｂでは実施例１ｃ）に従って酵素的リン酸化によって得られた５mgのデンプンと、それぞれ０．０５mM放射性（33Ｐ）ラベル無作為化ＡＴＰ（全体で１，１３０，００cpm、約０．５５μCi）を含むリン酸化緩衝液５００μl中で、３０分間室温で撹拌下インキュベーションした。調製物Ｂに対応し、ＯＫ１タンパク質を含んでいないがそれ以外は標品ＡおよびＢと同じ方法で処理された調製物Ｃを、対照として用いた。すべての調製物（Ａ、Ｂ、Ｃ）について、各々互いに独立に２つのテストを行なった。
【０３１６】
シンチレーションカウンターを用い、調製物Ａ、ＢおよびＣから得られたデンプンを、放射性ラベルされたリン酸の存在について調べた（一般的方法項目１１ｂ）を参照）。結果を表１および図３に示す。
【０３１７】
【表２】
0005623002.tif 000003
【０３１８】
ＯＫ１タンパク質により非リン酸化デンプンに転移されたリン酸基の分量（cpmで測定した）は、調製物Ｃ（対照）における放射性ラベルリン酸基の分量を超えないので、得られた結果から、基質として非リン酸化デンプンが与えられた場合は、ＯＫ１タンパク質はＡＴＰからデンプンにリン酸基を転移しないことが分かる。他方で、基質としてＰ−デンプンが与えられた場合は、ＡＴＰからＰ−デンプンへ転移される放射性リン酸基の分量（cpmで測定した）が、有意に高い。このことから、ＯＫ１タンパク質は基質としてＰ−デンプンを要求すること、またＯＫ１タンパク質は非リン酸化デンプンを基質として受け入れないことがわかる。
【０３１９】
もし上記のテストが、33Ｐによりγ位置に特異的にラベルされたＡＴＰを用いて行われた場合は、放射性ラベルされたリン酸のデンプン中への取り込みは、まったく確立することができない。これにより、ＡＴＰのβリン酸残基がＯＫ１タンパク質からデンプンへ転移されることがわかる。そのようなテストの結果を図６に示す。
【０３２０】
７．自己リン酸化の実証
Ａ．ｔ．−ＯＫ１タンパク質の自己リン酸化が上記の方法により実証された（一般的方法項目１２を参照のこと）。ここで、５０μgの精製されたＡ．ｔ．−ＯＫ１タンパク質を放射性ラベルされた無作為化ＡＴＰと、２２０μlのリン酸化緩衝液（上記一般的方法項目１２ｄ）を参照のこと）中で、室温６０分撹拌下でインキュベーションした。続いて、インキュベーション調製物から各々１００μlを取り出し、４つの新鮮な反応容器に移した。反応容器１では、４０μlの０．１１M ＥＤＴＡの添加により反応を停止した。反応容器２を９５℃で５分間インキュベートした。反応容器３にＨＣｌを最終濃度０．５M まで加え、反応容器４にＮａＯＨを最終濃度０．５Mまで加えた。反応容器３および４を各々２５分間３０℃でインキュベーションした。続いて、反応容器１、２、３および４から各々５０μlを取り出し、ＳＤＳテスト緩衝液と混合して、ＳＤＳアクリルアミドゲル電気泳動（７．５％アクリルアミドゲル）によって分離した。この目的のために、反応容器からの試料を各々２つの同一のアクリルアミドゲルのそれぞれに添加した。電気泳動を完了して得られたゲルのうちの１つをオートラジオグラフィに付し、もう１つのゲルをクマシーブルーで染色した。
【０３２１】
クマシーブルーで染色したゲル中で（図２Ａを参照のこと）、０．５MのＮａＯＨによる処理がＯＫ１タンパク質の分解をもたらすことがはっきり分かる。したがって、ＯＫ１タンパク質はＮａＯＨに対して不安定であると言わなければならない。３０℃、９５℃および０．５M ＨＣｌでのインキュベーションは、ＯＫ１タンパク質が述べたインキュベーション条件下で比較的安定していることを示す。これを、これらのインキュベーション条件下では、いずれもクマシーブルー染色後の当該ゲル中でほぼ同じ量のＯＫ１タンパク質を実証することができるという事実から結論することができる。
【０３２２】
オートラジオグラフィ（図２Ｂを参照）において、３０℃でインキュベーションしたリン酸化ＯＫ１タンパク質と比較してリン酸化ＯＫ１タンパク質の９５℃でのインキュベーションが、ＯＫ１タンパク質に結合したリン酸の有意な減少をもたらすことがわかる。したがって、リン酸残基とＯＫ１タンパク質のアミノ酸の間の結合は熱に不安定であると言わなければならない。更に、ＯＫ１タンパク質に結合したリン酸のわずかな減少が、０．５M ＨＣｌおよび０．５M ＮａＯＨとのインキュベーションについて、３０℃でインキュベーションしたリン酸化ＯＫ１タンパク質と比較して見られる。ＯＫ１タンパク質のＮａＯＨに対する不安定性のために、オートラジオグラフィ中の、０．５M ＮａＯＨ処理後のＯＫ１タンパク質の量が、熱と酸で処理された試料より有意に少ないという事実を考慮に入れるならば、リン酸残基とＯＫ１タンパク質のアミノ酸の間の結合は、塩基に関しては比較的安定しているだろうと結論付けることができる。酸で処理された試料が、３０℃および９５℃でインキュベーションした試料とほぼ同じ量のタンパク質を含んでおり、しかし３０℃で処理された試料よりオートラジオグラフィ中で有意に低い信号を有するので、酸とのインキュベーション条件は、リン酸残基とＯＫ１タンパク質のアミノ酸の間の結合もある程度切断すると考えなければならない。したがって、リン酸残基とＯＫ１タンパク質のアミノ酸の間の結合の不安定性を、行なわれたテストにより確立することができた。同時に、酸に関する不安定性は熱に関する不安定性より有意に小さいと分類される。
【０３２３】
アミノ酸のヒスチジンおよびリン酸間の結合は、熱に不安定であり、酸に不安定であるが、しかし塩基に安定である（Rosenberg, 1996, Protein Analysis and Purification, Birkhaeuser, Boston, 242-244）。上述の結果は、したがってホスホヒスチジンがＯＫ１タンパク質の自己リン酸化によって生成されることを示す。
【０３２４】
組換え発現されたＯＫ１タンパク質を、上述のようにγ位置を33Ｐで特異的ラベルされたＡＴＰとインキュベーションする場合は、自己リン酸化を立証することはできない。図５Ａ）は、適切なインキュベーション工程の後にウエスタンブロット解析によりそれぞれの反応調製物中で検出されるタンパク質の量を示す。図５Ｂ）は、個々の反応調製物からのタンパク質のオートラジオグラフィを示す。γ位置で特異的にラベルされたＡＴＰを用いる場合ＯＫ１タンパク質の自己リン酸化を実証することができないが、しかし無作為化されたＡＴＰを用いる場合、自己リン酸化を実証することができる。これは、ＯＫ１タンパク質が自己リン酸化される場合、ＡＴＰのβ位置のリン酸残基が共有結合でＯＫ１タンパク質のアミノ酸へ結合することを意味する。
【０３２５】
８．ＯＫ１タンパク質によってリン酸化されるデンプンのグルコース分子のＣ−原子位置の実証
【０３２６】
ａ）  リン酸化デンプンの作製
リン酸化デンプンを一般的方法項目７に従って作製した。これを行うために、Arabidopsis thaliana sex1-3突然変異体の葉から単離された５mgの非リン酸化デンプンを、調製物Ａ中で２５μgの精製されたＡ．ｔ．−ＯＫ１タンパク質と共に用い、また別の調製物Ｂ中で、元はArabidopsis thaliana sex1-3突然変異体の葉から単離され、インビトロでリン酸化されたデンプン５mgを、５μgの精製されたＲ１タンパク質と共に用いた。反応を、各場合に33ＰラベルＡＴＰ（約２．５×１０６cpm）を各々含む各５００μlのリン酸化緩衝液中で、室温で１時間撹拌下インキュベーションすることにより実施した。さらに、Arabidopsis thaliana sex1-3の突然変異体の葉から単離された５mgのデンプンおよび前記リン酸化緩衝液を含み、しかしタンパク質を含まない対照調製物を用いた。対照調製物を正確に調製物ＡおよびＢと同じ方法で処理した。個々の反応物を、各々１２５μlの１０％ＳＤＳを加えることにより止め、２％ＳＤＳで１回、２mM ＡＴＰで５回、およびＨ２Ｏで２回、各回に９００μlを用いて、洗浄を実施した。各洗浄工程の後に遠心分離（各回２分間Eppendorf卓上遠心機で１３，０００rpm）を実施した。得られたデンプンペレットを１mlのＨ２Ｏに各々再懸濁し、各調製物の１００μlを３mlのシンチレーションカクテル（Ready Safer（商標）, BECKMANN）を加えた後に混合し、続いて、シンチレーションカウンター（LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter, BECKMANN COULTER（商標））を用いて測定した。
【０３２７】
測定は次の結果を与えた：
対照：                    ６３cpm／１００μl        ６３０cpm／１０００μl
調製物Ａ（ＯＫ１）：  １３５１cpm／１００μl    １３５１２cpm／１０００μl
調製物Ｂ（Ｒ１）：    ３８５３cpm／１００μl    ３８５２６cpm／１０００μl
ｂ）  Ｐ−デンプンの全加水分解
工程ａ）に従って得られた調製物Ａ、Ｂ、およびＣの懸濁液を再び遠心（５分間Eppendorf卓上遠心機で１３，０００rpm）して、得られたペレットを９０μlの０．７M ＨＣｌ（Baker、解析用）に再懸濁し、続いて２時間９５℃でインキュベーションした。調製物Ａ、Ｂ、およびＣを再び遠心（５分間Eppendorf卓上遠心機で１３，０００rpm）して、上清を新しい反応容器に移した。調製物の沈殿残渣を各々１００mlのＨ２Ｏ中に再懸濁し、３mlのシンチレーションカクテル（Ready Safe（商標）, BECKMANN）を加えた後にシンチレーションカウンター（LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter, BECKMANN COULTER（商標））を用いて測定した。残渣の何れにも有意な量の放射活性は証明できなかったが、これは放射性リン酸でラベルされた加水分解生成物はすべて上清に存在することを意味する。
【０３２８】
これに続いて、加水分解生成物を含む個々の上清に、各々３０μlの２M ＮａＯＨを加えて中和した（中和に必要なＮａＯＨの量を予めブランクの試料でテストしておいた）。中和した加水分解生成物を、前もって２回、各回に２００μlのＨ２Ｏで濯いでおいた１０kDa Microconフィルタ上に置き、Eppendorf卓上遠心機で１２，０００rpm約２５分間遠心した。得られた濾液（各約１２０μl）から１０μlを採取し、３mlのシンチレーションカクテル（Ready Safer（商標）, BECKMANN）を加えた後にシンチレーションカウンター（LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter, BECKMANN COULTER（商標））を用いて測定した。個々の調製物中に存在する活性を決定して次の結果を得た：
調製物Ａ（ＯＫ１）：  ９３４cpm／１０μl    １１，２０８cpm／１２０μl、
９３cpm／μl
調製物Ｂ（Ｒ１）：  ２５１８cpm／１０μl    ３０，２１６cpm／１２０μl、
２５２cpm／μl
【０３２９】
ｃ）  加水分解生成物の分離
工程ｂ）に従って得られた加水分解生成物を、上述の条件下で（一般的方法項目１３ｃ）を参照のこと）Dionexシステムを用いてＨＰＡＥにより、分離した。工程ｂ）に従って得られた調製物ＡおよびＢのろ過された上清を分離するための試料は以下の構成であった：
調製物Ａ（ＯＫ１）：工程ｂ）に従って得られた４３μlの調製物Ａの上清（約４，０００cpmに等価）、３２μlのＨ２０、２．５μlの２．５mMグルコース−６−リン酸および２．５μlの５mMグルコース−３−リン酸（体積＝８０μl）。
調製物Ｂ（Ｒ１）：工程ｂ）に従って得られた調製物Ｂの上清１６μl（約４，０００cpmに等価）、５９μlのＨ２０、２．５μlの２．５mMグルコース−６−リン酸および２．５μlの５mMグルコース−３−リン酸（体積＝８０μl）。
【０３３０】
それぞれの場合に、６０μlの約３，０００cpmを含む対応する試料を、ＨＰＡＥを用いて分離するために注入した。一般的方法項目１３ｃ）に指定された条件に従ってＨＰＡＥを実施した。ＨＰＡＥカラムを通した後、各々１mlの分画に溶出緩衝液を集めた。試料を注入して１０分後に分画の収集を開始した。用いたＰＡＤ検出器から受取った信号に基づいて、グルコース−６−リン酸の溶出を分画１５へ、およびグルコース−３−リン酸の溶出を分画１７へ割当てた。各々、個々の分画の５００μlを３mlのシンチレーションカクテル（Ready Safe（商標）, BECKMANN）と混合し、続いてシンチレーションカウンター（LS 6500 Multi-Purpose Scintillation Counter, BECKMANN COULTER（商標））を用いて測定した。個々の分画について次の測定が得られた：
【０３３１】
【表３】
0005623002.tif 000004
表４：ＯＫ１タンパク質またはＲ１タンパク質によってリン酸化されたデンプンの加水分解によって得られた加水分解生成物の、個々の分画中の測定された放射活性量［cpm］。
結果を図５にグラフでも示す。
【０３３２】
Ｒ１タンパク質により触媒されたデンプンのリン酸化後、デンプンを加水分解した後に、分析した分画中の全測定放射性リン酸のうち約６６％の放射性ラベルされたリン酸が、標準としてグルコース−６−リン酸を含む分画と共に、また約２７％が標準としてグルコース−３−リン酸を含む分画と共に、溶出した。ＯＫ１タンパク質により触媒されたデンプンのリン酸化後、デンプンを加水分解した後に、分析した分画中の全測定放射性ラベルリン酸のうち、約６７％の放射性ラベルされたリン酸が標準としてグルコース−６−リン酸を含む分画と共に、また約８％が標準としてグルコース−３−リン酸を含む分画と共に、溶出された。これから、グルコース分子は、Ｒ１タンパク質によってＣ−６位置で好んでリン酸化され、一方グルコース分子は、ＯＫ１タンパク質によってＣ−３位置で好んでリン酸化されると結論付けることができる。
【０３３３】
９．Ｒ１タンパク質およびＯＫ１タンパク質がリン酸化反応を同時に触媒することによるリン酸化速度の増大
【０３３４】
ａ）  コムギデンプンのインビトロのリン酸化
反応調製物１ml当り３５mgのコムギデンプン（Sigma, prod. no.: S-5127）を、一般的方法項目７に記載された方法に従ってインビトロでリン酸化した。デンプン１mg当り０．２３μgの濃度の精製されたＲ１タンパク質および２５μM濃度のＡＴＰを、この目的に用いた。反応時間は総計で室温１時間であった。ＡＴＰの代わりに無作為化33Ｐ−ＡＴＰを含む平行した反応調製物において、デンプン中へ取込まれたリン酸の量（デンプン１mg当り０．００５４nmol）、および用いられたＲ１タンパク質の比活性（（mgタンパク質×分）につき０．４１nmol）を測定した。無作為化ＡＴＰを用いたことを、この測定に対して考慮しなかった。無作為化ＡＴＰはβ位置でラベルされたリン酸残基だけでなくγ位置でラベルされリン酸残基も含むため、得られた値は実際に存在する値より低い。
【０３３５】
ｂ）  Ｒ１および／またはＯＫ１タンパク質による、自然のコムギデンプンおよびインビトロでリン酸化されたコムギデンプンのリン酸化
１５mgのコムギデンプン（Sigma, prod. no.: S-5127、またはａ）に記述した方法に従ってインビトロでリン酸化されたコムギデンプン）を、精製されたデンプンリン酸化酵素と、一般的方法項目１１に記述された１１nmolの無作為化33Ｐ−ＡＴＰ（約１．５×１０６cpm）を含む緩衝液４３０μl中で、１時間撹拌下室温でインキュベーションした。個々の反応調製物は次のタンパク質および基質を含んでいた：
【０３３６】
【表４】
0005623002.tif 000005
【０３３７】
各調製物を、各々３回繰返して実施した。
【０３３８】
反応時間１時間の後の個々の反応調製物の処理、および当該基質中に取込まれたリン酸量の測定を、一般的方法項目１１に記載された方法に従って実施した。
【０３３９】
次の結果を得た：
【０３４０】
【表５】
0005623002.tif 000006
表５：個々の反応調製物の個々の繰返し中の放射活性の測定量［cpm］。明記した測定値を、各々の実測値からその対照の測定値を引くことにより、決定した。
【０３４１】
表から、自然のコムギデンプン（Sigma, prod. no.: S-5127）はＯＫ１タンパク質の基質にならないこと、インビトロでリン酸化されたコムギデンプンはＯＫ１タンパク質によりリン酸化されることができることが明らかである。さらに、Ｒ１タンパク質およびＯＫ１タンパク質が反応混合液中に同時に存在する場合、活性が対応する個々の活性の合計より有意に高いことが分かる。
【０３４２】
ｃ）  インビトロでリン酸化されたコムギデンプンの、Ｒ１および／またはＯＫ１タンパク質によるリン酸化
リン酸化されたコムギデンプンを、ａ）に記述した方法に従って作製した。デンプンに結合したリン酸の量は、デンプン１mg当り０．００４８mgのリン酸となった。さらにａ）にも記述したように、無作為化ＡＴＰを用いたことをこの測定には考慮しなかった。
【０３４３】
１５mgのインビトロでリン酸化されたコムギデンプンを、デンプンリン酸化酵素とｂ）に記述した方法に従ってインキュベーションした。個々の反応調製物は次のタンパク質および基質を含んでいた：
【０３４４】
【表６】
0005623002.tif 000007
【０３４５】
各調製物を、各々２回繰返して実施した。各反応調製物について、０、１０、および３０分間の反応時間の後に、試料を止め、各反応条件下において取込まれたリン酸量を、一般的方法項目１１に記載された方法に従って測定した。
【０３４６】
対照として、自然のコムギデンプンを、Ｒ１タンパク質と、放射性ラベルされていないＡＴＰの存在下でインキュベーションした。続いて、反応混合液を無作為化33Ｐ−ＡＴＰおよび緩衝液に加えた後、反応を止めた。
【０３４７】
次の結果を得た：
【０３４８】
【表７】
0005623002.tif 000008
表６：個々の反応調製物の個々の繰返し中の放射活性の測定量［cpm］。明記した測定値は、２つの独立な測定の平均値からその対照の測定値を差し引くことにより、決定した。
【０３４９】
１０．イネの中のＯＫ１タンパク質の同定
一般的方法項目１〜１３に記述された方法を用いて、Oryza sativa（品種Ｍ２０２）から、リン酸残基をＡＴＰからＰ−デンプンへ転移するタンパク質を同定することもできた。そのタンパク質をＯ．ｓ．−ＯＫ１と名付けた。非リン酸化デンプンは、基質としてＯ．ｓ．−ＯＫ１タンパク質に使用されない、即ちＯ．ｓ．−ＯＫ１タンパク質もまたＰ−デンプンを基質として必要としない。同定されたＯ．ｓ．−ＯＫ１タンパク質を規定する核酸配列を配列番号３に示し、Ｏ．ｓ．−ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列を配列番号４に示す。配列番号４に示すＯ．ｓ．−ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列は、配列番号２に示すＡ．ｔ．−ＯＫ１タンパク質をコードするアミノ酸配列と、５７％の同一性を有する。配列番号３に示すＯ．ｓ．−ＯＫ１タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１に示すＡ．ｔ．−ＯＫ１タンパク質をコードする核酸配列と、６１％の同一性を有する。
【０３５０】
Oryza sativaのＯＫ１タンパク質をコードする核酸配列を含むプラスミドｐＭＩ５０の作製
ベクターｐＭＩ５０は、イネの品種Ｍ２０２の完全なＯＫ１タンパク質をコードするＤＮＡ断片を含む。
【０３５１】
イネからのＤＮＡの増幅を、５つの副工程により実施した。
【０３５２】
１．  配列番号３に指定された配列の位置１１から位置２８８までの読取枠の部分を、逆転写酵素および合成オリゴヌクレオチドＯｓ＿ｏｋ１−Ｒ９（ＧＧＡＡＣＣＧＡＴＡＡＴＧＣＣＴＡＣＡＴＧＣＴＣ）及びＯｓ＿ｏｋ１−Ｆ６（ＡＡＡＡＣＴＣＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＡＡＴＧＡＣＧＴＣＧＣＴＧＣＧＧＣＣＣＣＴＣ）を、未熟な種もみのＲＮＡ上のプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を利用して、増幅した。増幅されたＤＮＡ断片をベクターｐＣＲ２．１（Invitrogen catalogue number K2020-20）へクローニングした。得られたプラスミドをｐＭＬ１２３と名付けた。
【０３５３】
２．  配列番号３に指定された配列の位置２５０から位置９４９までの読取枠の部分を、逆転写酵素および合成オリゴヌクレオチドＯｓ＿ｏｋ１−Ｆ４（ＣＣＡＧＧＴＴＡＡＧＴＴＴＧＧＴＧＡＧＣＡ）及びＯｓ＿ｏｋ１−Ｒ６（ＣＡＡＡＧＣＡＣＧＡＴＡＴＣＴＧＡＣＣＴＧＴ）を、未熟な種もみのＲＮＡ上のプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅した。増幅されたＤＮＡ断片をベクターｐＣＲ２．１（Invitrogen catalogue number K2020-20）へクローニングした。得られたプラスミドをｐＭＬ１２０と名付けた。
【０３５４】
３．  配列番号３に指定された配列の位置８３９から位置１７６１までの読取枠の部分を、逆転写酵素および合成オリゴヌクレオチドＯｓ＿ｏｋ１−Ｆ７（ＴＴＧＴＴＣＧＣＧＧＧＡＴＡＴＴＧＴＣＡＧＡ）及びＯｓ＿ｏｋ１−Ｒ７（ＧＡＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＡＡＧＡＧＴＡＧＴＡＴＣ）を、未熟な種もみのＲＮＡ上のプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を利用して増幅した。増幅されたＤＮＡ断片をベクターｐＣＲ２．１（Invitrogen catalogue number K2020-20）へクローニングした。得られたプラスミドをｐＭＬ１２１と名付けた。
【０３５５】
４．  配列番号３に指定された配列の位置１５７１から位置３２４１までの読取枠の部分を、逆転写酵素および合成オリゴヌクレオチドＯｓ＿ｏｋ１−Ｆ８（ＡＴＧＡＴＧＣＧＣＣＴＧＡＴＡＡＴＧＣＴ）及びＯｓ＿ｏｋ１−Ｒ４（ＧＧＣＡＡＡＣＡＧＴＡＴＧＡＡＧＣＡＣＧＡ）を、未熟な種もみのＲＮＡ上のプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を利用して増幅した。増幅されたＤＮＡ断片をベクターｐＣＲ２．１（Invitrogen catalogue number K2020-20）へクローニングした。得られたプラスミドをｐＭＬ１１９と名付けた。
【０３５６】
５．  位置２７７７から位置３６２１までの読取枠の部分を、合成オリゴヌクレオチドＯｓ＿ｏｋ１−Ｆ３（ＣＡＴＴＴＧＧＡＴＣＡＡＴＧＧＡＧＧＡＴＧ）及びＯｓ＿ｏｋ１−Ｒ２（ＣＴＡＴＧＧＣＴＧＴＧＧＣＣＴＧＣＴＴＴＧＣＡ）をイネのゲノムＤＮＡ上のプライマーとして用いるポリメラーゼ連鎖反応を利用して増幅した。増幅されたＤＮＡ断片をベクターｐＣＲ２．１（Invitrogen catalogue number K2020-20）へクローニングした。得られたプラスミドをｐＭＬ１２２と名付けた。
【０３５７】
ＯＫ１の読取枠のサブパーツを一緒にクローニングすることを次のようにして実施した。
【０３５８】
ＯＫ１の読取枠の一部を含むｐＭＬ１２０の７００塩基対の長さのＡｐａＩ断片をｐＭＬ１２１のＡｐａＩ部位にクローニングした。得られたプラスミドをｐＭＩ４７と名付けた。
【０３５９】
ｐＭＬ１２０およびｐＭＬ１２３由来のベクターのＯＫ１をコードする領域を含む９６０塩基対の長さの断片を、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅した。それを行うために、各々５０nMの濃度のプライマーＯｓ_ｏｋ１−Ｆ４（上記参照）およびＯｓ_ｏｋ１−Ｒ９（上記参照）、ならびに各々５００nMの濃度のプライマーＯｓ_ｏｋ１−Ｆ６およびＯｓ_ｏｋｌ−Ｒ６を用いた。増幅されたＤＮＡ断片を、ベクターｐＣＲ２．１（Invitrogen catalogue number K2020-20）へクローニングした。得られたプラスミドをｐＭＩ４４と名付けた。
【０３６０】
８４５塩基対の長さのｐＭＬ１２２の断片を、停止コドンの後にＸｈｏＩ部位を導入するために、プライマーＯｓ＿ｏｋ１−Ｆ３（上記参照）及びＯｓ＿ｏｋ１−Ｒ２Ｘｈｏ  （ＡＡＡＡＣＴＣＧＡＧＣＴＡＴＧＧＣＴＧＴＧＧＣＣＴＧＣＴＴＴＧＣＡ）によって再増幅し、ベクターｐＣＲ２．１（Invitrogen catalogue number K2020-20）へクローニングした。得られたプラスミドをｐＭＩ４５と名付けた。
【０３６１】
ＯＫ１の読取枠の一部を含む１６７１塩基対の長さの断片を、ｐＭＬ１１９から制限酵素ＳｐｅＩおよびＰｓｔＩで消化することにより得た。断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋（Genbank Acc.: X52328）へクローニングした。得られたプラスミドをｐＭＩ４６と名付けた。
【０３６２】
ＯＫ１の読取枠の一部を含む１７０６塩基対の長さの断片を制限酵素ＳｐｅＩおよびＸｈｏＩによりｐＭＩ４６から切り出し、同じ制限酵素で切断しておいたベクターｐＭＩ４５へクローンニングした。得られたプラスミドをｐＭＩ４７と名付けた。
【０３６３】
ＯＫ１の読取枠の一部を含む１４６塩基対の長さの断片を制限酵素ＡｆｌII／ＮｏｔＩによりｐＭＩ４３から切り出し、同じ制限酵素で切断しておいたベクターｐＭＩ４４へクローンニングした。得られたプラスミドをｐＭＩ４９と名付けた。
【０３６４】
ＯＫ１の読取枠の一部を含む１６５７塩基対の長さの断片を制限酵素ＮｏｔＩおよびＮａｒＩによりベクターｐＭＩ４９から切り出し、同じ制限酵素で切断しておいたベクターｐＭＩ４７へクローンニングした。得られたプラスミドはｐＭＩ５０と名付けられ、イネで同定されたＯＫ１タンパク質の全コード領域を含む。
【０３６５】
１１．特異的にＯＫ１タンパク質を検出する抗体の作製
抗原として、約１００μgの精製されたＡ．ｔ．−ＯＫ１タンパク質をＳＤＳゲル電気泳動によって分離し、Ａ．ｔ．−ＯＫ１タンパク質を含むタンパク質バンドを切り取って、EUROGENTEC S.A.社（ベルギー）へ送り、同社が請負により抗体の作製を行なった。次に、ウサギの免疫前血清を検査して、組換えＯＫ１で免疫化する前に既にＡ．ｔ．全抽出物から得たタンパク質を認識するかどうかを確かめた。２匹のウサギの免疫前血清が、１００〜１５０kDaの範囲のタンパク質を何も認識しなかったので、免疫化のために選択した。１００μgのタンパク質を４回（０、１４、２８、５６日目）各ウサギに注射した。各ウサギから４つの血液試料を採取した：（３８日、６６日、８７日目、および最後の採血）。最初の採血後に得られた血漿は、既に特異的な反応をＯＫ１抗原に対してウエスタンブロットで示した。しかしながら、それ以上のすべてのテストでは、ウサギの最終採血を用いた。
【０３６６】
１２．ＯＫ１タンパク質およびＲ１タンパク質の増大した活性を有する遺伝子組換えトウモロコシ植物の作製
【０３６７】
ａ）  Ｒ１タンパク質を過剰発現するトウモロコシ植物の形質転換のためのコンストラクトの作製
プラスミドｐＭＺ１２を、トウモロコシ植物の形質転換に使用したプラスミドの作製のための出発のプラスミドとして用いた。このプラスミドは、プラスミドｐＢＲ３２２のＣｏｌＥ１複製起点（Bolivar et al, 1977, Gene 2, 95-113）および抗生物質ゲンタマイシンに対する抵抗性を促進するバクテリアの選択マーカー（Wohlleben et al., 1989 MGG 217, 202-208）を含む。さらにこのプラスミドは、右および左のＴ−ＤＮＡ境界配列を含む。これらのＴ−ＤＮＡ境界配列の間に、プラスミドは、除草剤グルホシネートに対する抵抗性を促進するStreptomyces hygroscopicusからのｂａｒ遺伝子（White et al.,1990, NAR 18, 1062; EMBL Ace: X17220）を含む。ｂａｒ遺伝子の発現が、イネからのアクチン遺伝子のプロモーターによって開始される（McElroy et al., 1990, Plant Cell 2, 163.171）。ｂａｒ遺伝子の発現を安定化するために、イネからのアクチン遺伝子の第１イントロンを、アクチンプロモーターとｂａｒタンパク質をコードする配列の間に挿入する（McElroy et al.,1990, Plant Cell 2,163.171）。Agrobacterium tumefaciensからのノパリン合成酵素遺伝子のポリアデニル化信号が、ｂａｒタンパク質をコードする配列の後に続く（Depicker et al., 1982 J MoI. Appl. Gent. 1, 561-573）。
【０３６８】
プラスミドｐＭＺ１２の左および右のＴ−ＤＮＡ境界配列（Christensen et al., 1992, Plant MoI. Bio 18, 675-689）の間に、Zea maysからのユビキチンプロモーターを、続いてZea maysからのユビキチン遺伝子の第１イントロン（Christensen et al.,1992, Plant Mol. Bio 18, 675-689）を、続いてSolanum tuberosumからのＲ１遺伝子のコード配列（配列番号１０を参照）を、続いてAgrobacterium tumefaciensからのノパリン合成酵素遺伝子のポリアデニル化信号（Depicker et W al.,1982, J Mol. Appl. Gent. 1 , 561-573）を挿入した。得られたプラスミドをｐＨＮ３−１４６と名付けた。
【０３６９】
ｂ）  プラスミドｐＨＮ３−１４６によるトウモロコシ植物の形質転換
トウモロコシ植物の未成熟胚を受粉１０日後に単離し、共挿入としてプラスミドｐＨＮ３−１４６を含むAgrobacterium tumefaciensを利用して、lshida et al.（1996, Nature Biotechnology 14, 745-750）によって記述された方法にしたがって形質転換した。この形質転換から得られたいわゆるＴ０植物を温室で栽培した。
【０３７０】
ｃ）  Solanum tuberosumからのＳ．ｔ．−Ｒ１タンパク質の発現が増大しているトウモロコシ植物の同定
定量ＲＴ ＰＣＲ分析によって、Ｓ．ｔ．−Ｒ１タンパク質をコードするｍＲＮＡを発現していた植物を同定することができた。
【０３７１】
ｄ）  プラスミドｐＵｂｉ−Ａ．ｔ．−ＯＫ１の作製
最初に、プラスミドｐｌＲ９６を作製した。２つのオリゴヌクレオチドＸ１（ＴＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＴＣＣＴＡＧＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＣＡＣＴＡＧＴＡＡＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＴＡＴＣＡＴＴＴＡＣ）及びＸ２（ＡＡＴＴＧＴＡＡＡＴＧＡＴＡＴＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＣＴＴＡＣＴＡＧＴＧＴＴＡＡＣＴＣＧＡＧＣＣＴＡＧＧＡＧＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡ）から成る合成のＤＮＡ片を、ＳｄａＩおよびＭｕｎＩで切ったベクターｐＧＳＶ７１中にクローニングすることにより、プラスミドｐＩＲ９６を得た。得られたプラスミドをＳｄａＩで切断し、突出した３’−端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼによって平滑化した。得られたプラスミドをＳｄａＩで切断し、突出３’−端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、Agrobacterium tumefaciensからのオクトピン合成酵素遺伝子の終結シグナルを含むｐＢｉｎＡＲ（Hoefgen and Willmitzer, 1990, Plant Science 66, 221-230）からの１９７塩基対のサイズの滑らかにされたＨｉｎｄIII／ＳｐｈＩ断片を挿入した。得られたプラスミドをｐＩＲ９６と名付けた。
【０３７２】
ｐＧＳＶ７１は中間ベクターｐＧＳＶ１に由来するプラスミドｐＧＳＶ７の誘導体である。ｐＧＳＶ１は、ｐＧＳＣ１７００の誘導体を構成し、そのコンストラクションについてはCornelissen and Vanderwiele(Nucleic Acid Research 17, (1989),19-25)によって記述されている。ｐＧＳＶ１はｐＧＳＣ１７００から、カルベニシリン抵抗性遺伝子の欠失およびプラスミドｐＴｉＢ６Ｓ３のＴＬ−ＤＮＡ領域のＴ−ＤＮＡ配列の欠失によって得られた。
【０３７３】
ｐＧＳＶ７は、プラスミドｐＢＲ３２２（Bolivar et al., Gene 2, (1977), 95-113）の複製起点、ならびにPseudomonasのプラスミドｐＶＳ１（Itoh et al., Plasmid 11, (1984), 206）の複製起点を含む。ｐＧＳＶ７はまた、Klebsiella pneumoniae由来のトランスポゾンＴｎ１３３１から得られた選択可能なマーカー遺伝子ａａｄＡを含み、それが抗生物質スペクチノマイシンおよびストレプトマイシンに対する抵抗性を与える（Tolmasky, Plasmid 244 (3), (1990),218-226; Tolmasky and Crosa, Plasmid 29(1),(1993), 31-40）。
【０３７４】
プラスミドｐＧＳＶ７１は、キメラのｂａｒ遺伝子をｐＧＳＶ７の境界領域の間にクローニングすることにより得られた。キメラのＢａｒ遺伝子は、転写を開始するためのカリフラワーモザイクウィルスのプロモーター配列（Odell et al., Nature 313, (1985), 180）、Streptomyces hygroscopicusのＢａｒ遺伝子（Thompson et al., 1987, EMBO J. 6, , 2519-2523）、ならびに転写終了およびポリアデニル化ためのｐＴｉＴ３７のＴ−ＤＮＡのノパリン合成遺伝子の３’−非翻訳領域を含む。Ｂａｒ遺伝子は、除草剤グルホシネートアンモニウムに対する耐性を与える。
【０３７５】
トウモロコシからのポリユビキチン遺伝子のプロモーターを含む１９８６塩基対の長さの断片（EMBL Acc.: 94464, Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675-689）を、ＰｓｔＩ断片としてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋中へクローニングした。得られたプラスミドをｐＳＫ−ｕｂｑと名付けた。
【０３７６】
プラスミドＡ．ｔ．−ＯＫ１−ｐＧＥＭを制限酵素Ｂｓｐ１２０Ｉで切断し、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、ＳａｃＩで切断した。Arabidopsis thaliana由来のＯＫ１タンパク質をコードするＤＮＡ断片を、ＳｍａＩおよびＳａｃＩにより切断したプラスミドｐＳＫ−ｕｂｑへクローニングした。得られたプラスミドをｐＳＫ−ｕｂｑ−ｏｋ１と名付けた。
【０３７７】
トウモロコシからのユビキチンプロモーターおよびArabidopsis thalianaからのＡ．ｔ．−ＯＫ１タンパク質の全読取枠を含む断片を、プラスミドｐＳＫ−ｕｂｑ−ｏｋ１から単離した。このために、プラスミドを制限酵素Ａｓｐ７１８１で切断し、末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで再充填し、それをＳｄａＩで切断した。得られた５７９９塩基対の大きさの断片を、ＥｃｏＲＶおよびＰｓｔＩによって切断されたプラスミドｐＩＲ９６中へクローニングした。このクローニングによって得られたプラスミドを、ｐＵｂｉ−Ａ．ｔ．−ＯＫ１と名付けた。
【０３７８】
ｅ）  トウモロコシ植物の、プラスミドｐＵｂｉ−Ａ．ｔ．−ＯＫ１による形質転換
受粉１０日後にトウモロコシ植物の未成熟の胚を単離し、共挿入としてプラスミドｐＵｂｉ−Ａ．ｔ．−ＯＫ１を含むAgrobacterium tumefaciensを利用して、lshida et al.(1996, Nature Biotechnology 14, 745-750）によって記述された方法にしたがって、形質転換した。この形質転換から得られたいわゆるＴ０植物を温室で栽培した。
【０３７９】
ｆ）  Arabidopsis thalianaからのＡ．ｔ．−ＯＫ１タンパク質の発現が増大しているトウモロコシ植物の同定
定量ＲＴ−ＰＣＲ分析により、Ａ．ｔ．−ＯＫ１タンパク質をコードするｍＲＮＡを発現していた植物を同定することができた。
【０３８０】
ｇ）  Ｓ.ｔ−Ｒ１タンパク質またはＡ．ｔ．−ＯＫ１タンパク質の発現が増大している同型接合体植物の生成
Ｓ．ｔ．−Ｒ１タンパク質またはＡ．ｔ．−ＯＫ１タンパク質を発現しているＴ１植物のために、個々の植物の種子を収穫し、１植物当り各々約３０個の種子を播き、温室で栽培した。このＴ１世代の植物の三葉期に、０．５％のＢａｓｔａ（登録商標）を含む溶液を噴霧した。Ｂａｓｔａ（登録商標）溶液を噴霧した後に各植物について３０個ずつ栽培した植物の約２５％だけが枯死したＴ１植物の群を、これらの植物は、関連するプラスミドｐＨＮ３−１４６またはｐＵｂｉ−Ａ．ｔ．−ＯＫ１のＴ−ＤＮＡがゲノム中の座位に組込まれている植物であるので、さらに追跡した。Ｂａｓｔａ（登録商標）溶液の噴霧に対して生き残った約７５％の植物から得た葉材料からゲノムＤＮＡを単離し、それぞれに存在するコピー数をＩｎｖａｄｅｒ（登録商標）技術（Pielberg et al. 2003, Genome Res.;13, 2171-2177）によって調べた。Ｉｎｖａｄｅｒ（登録商標）技術による分析において、同じＴ０植物の残りの子孫よりおよそ２倍強い信号を示したＴ０植物の子孫群中のＴ１植物は、当該プラスミドのＴ−ＤＮＡが組込まれている座位に関して同型接合体である。Ｂａｓｔａ（登録商標）溶液による処理に対して生き残ったＴ０植物の子孫の約３０％が、Ｉｎｖａｄｅｒ技術による分析において、同じＴ０植物の子孫の残りの約７０％と比較しておよそ２倍強い信号を示すならば、これはさらにＴ−ＤＮＡが単一の座位に組込まれていることを示す。
【０３８１】
ｈ）  Ｓ．ｔ．−Ｒ１タンパク質の発現の増大ならびにＡ．ｔ．−ＯＫ１タンパク質の発現の増大の両方を有する植物の生成
Ｓ．ｔ．−Ｒ１タンパク質の発現が増大しており、ｇ）に記述した分析によるプラスミドｐＨＮ３−１４６のＴ−ＤＮＡの組込みに関して同型接合体であって、また組込みが植物ゲノム中の座位に存在するＴ１植物を、Ａ．ｔ．−ＯＫ１タンパク質の発現が増大しており、プラスミドｐＵｂｉ−Ａ．ｔ．−ＯＫ１のＴ−ＤＮＡの組込みに関して同型接合体であり、また組込みが植物ゲノム中の座位に存在するＴ１植物と交雑させる。これらの交雑の子孫は、Ｓ．ｔ．−Ｒ１タンパク質の発現の増大ならびにＡ．ｔ．−ＯＫ１タンパク質の発現の増大の両方を有する。
【０３８２】
ｉ）  遺伝子組換えトウモロコシ植物の穀粒およびそれらにより合成されたデンプンの分析
ｈ）に記述した交雑の結果得られた当該トウモロコシ植物の穀粒からデンプンを単離した。Ｓ．ｔ．−Ｒ１タンパク質の発現の増大、ならびにＡ．ｔ．−ＯＫ１タンパク質の発現の増大を有する穀粒からのデンプンは、形質転換されていない野生型植物から単離したデンプンよりも、共有結合によりデンプンに結合したリン酸を多く含む。
【０３８３】
Ｓ．ｔ．−Ｒ１タンパク質の発現の増大、ならびにＡ．ｔ．−ＯＫ１タンパク質の発現の増大を有する穀粒から単離されたデンプンは、同様に、Ｓ．ｔ．−Ｒ１タンパク質の発現の増大のみ、またはＡ．ｔ．−ＯＫ１タンパク質の発現の増大のみを有する植物から単離されたデンプンよりも、共有結合によりデンプンに結合したリン酸を多く含む。
【０３８４】
１３．ＯＫ１タンパク質およびＲ１タンパク質の発現が増大した遺伝子組換えコムギ植物の作製
【０３８５】
ａ）  Ｒ１タンパク質を過剰発現する遺伝子組換えコムギ植物の作製
ジャガイモ由来のＲ１タンパク質の発現が増大しているコムギ植物の作製は、ＷＯ ０２ ３４９２３に記述されている。そこに記述された植物を、ＯＫ１タンパク質およびＲ１タンパク質の発現が増大している植物の作製のための出発物質として部分的に用いた。
【０３８６】
ｂ）  ＯＫ１タンパク質を過剰発現するコムギ植物の形質転換のためのプラスミドの作製
ｐＭＣＳ５（Mobitec, www.mobitec.de）をＢｇIIIおよびＢａｍＨＩで消化し、再ライゲーションした。得られたプラスミドをｐＭＬ４と名付けた。
【０３８７】
Agrobacterium tumefaciensからのｎｏｓ終止コドン（Depicker et al.,1982, Journal of Molecular and Applied Genetics 1: 561-573）をプライマーＰ９（ＡＣＴＴＣＴｇＣＡｇＣｇｇＣＣｇＣｇＡＴＣｇＴＴＣＡＡＡＣＡＴＴＴｇｇＣＡＡＴＡＡＡｇＴＴＴＣ）及びＰ１０（ＴＣＴＡＡｇＣＴＴｇｇＣｇＣＣｇＣＴＡｇＣＡｇＡＴＣＴｇＡＴＣＴＡｇＴＡＡＣＡＴＡｇＡＴｇＡＣＡＣＣ）（２５サイクル、３０秒９４℃、３０秒５８℃、３０秒７２℃）によって増幅し、ＨｉｎｄIIIおよびＰｓｔIで消化して、同じ酵素で切断されたプラスミドｐＭＬ４へクローニングした。得られたプラスミドをｐＭＬ４−ｎｏｓと名付けた。トウモロコシからのポリユビキチン遺伝子のプロモーター（Ｇｅｎｂａｎｋ Ａｃｃ．：９４４６４，Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol.18: 675-689）、およびＣｌａＩによる消化および再挿入を通じて短縮された同じ遺伝子の第１イントロンを含む１９８６塩基対の長さの断片を、クローニングした。得られたプラスミドをｐＭＬ８と名付けた。
【０３８８】
Arabidopsis thalianaからのＯＫ１の全読取枠を、プラスミドｐＭＬ８へクローニングした。この目的のために、対応する断片をＢｓｐ１２０／ＮｏｔＩによりＡ．ｔ．−ＯＫ１−ｐＧＥＭから切り出し、センス配向でＮｏｔＩ部位へライゲーションした。制限酵素ＡｖｒIIおよびＳｗａＩによって、トウモロコシからのポリユビキチン遺伝子のプロモーター、Arabidopsis thalianaからのＯＫ１の全読取枠、およびAgrobacterium tumefaciensからのｎｏｓ終止コドンを含むコムギ植物の形質転換のための断片を、得られたベクターｐＭＬ８−Ａ．ｔ．−ＯＫ１から、切り出すことができる。
【０３８９】
ｃ）  Ｒ１タンパク質を過剰発現するコムギ植物の生成用のプラスミドの作製
ジャガイモからの完全なＲ１タンパク質をコードするＤＮＡ断片が、制限酵素ＰａｃＩの２つの検出部位の間に存在するプラスミドを、作製した。この目的のために、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ＋からの複数クローニング部位を、ポリメラーゼ連鎖反応および両オリゴヌクレオチドＭＣＳ１−１（ＴＴＴＴＴＧＣＧＣＧＣＧＴＴＡＡＴＴＡＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＡ）及びＭＣＳ１−２（ＴＴＴＴＴＧＣＧＣＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＡＣＡＡＡＡＧ）を利用して増幅し、制限酵素ＢｓｓＨIIで切り出し、ＢｓｓＨIIで切断した脱リン酸化されたベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔII ＳＫ＋（Invitrogen）中にクローンニングした。得られたプラスミドをｐＳＫ−Ｐａｃと名付けた。
【０３９０】
クローンｐＲＬ２（ＷＯ ９７１１１８８）から得たＮｏｔＩ断片をベクターｐＳＫ−Ｐａｃ中にクローニングした。ＮｏｔＩ断片は、ジャガイモからのＲ１タンパク質の全読取枠を含む。得られたプラスミドをｐＩＲ１と名付けた。
【０３９１】
ユビキチンプロモーターおよび短縮された第１イントロンを含み、プラスミドのＥｃｏＲＶ部位にクローニングされた断片を、ｐＳＫ−ｕｂｑ（上記参照）から制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＳｍａＩにより切り出した。得られたプラスミド中に、ｐＩＲ１からのＰａｃＩ断片（ジャガイモからのＲ１タンパク質をコード化する全読取枠を含む）を、プロモーターに対してセンス配向にクローニングした。得られたプラスミドをｐＭＬ８２と名付けた。
【０３９２】
ｄ）  ＯＫ１タンパク質の過剰発現のためのコムギ植物の形質転換
Florida品種のコムギ植物を、バイオリスティック法により、Becker et al.(1994, Plant Journal 5, 299-307)により記述された方法に従って、アガロースゲルから切り出した断片（制限酵素ＡｖｒIIおよびＳｗａＩでプラスミドｐＭＬ８−Ａ．ｔ．−ＯＫ１から切り出され、トウモロコシからのポリユビキチン遺伝子のプロモーター、Arabidopsis thalianaからのＯＫ１の全読取枠およびAgrobacterium tumefaciensからのｎｏｓ終止コドンを含む）およびプラスミドｐＧＳＶ７１を用いて形質転換した。得られた植物をＴＡ−ＯＫ１と名付けた。
【０３９３】
ｅ）  Ｒ１タンパク質の過剰発現のためのコムギ植物の形質転換
Florida品種のコムギ植物を、プラスミドｐＭＬ８２で、バイオリスティック法により、Becker et al.（1994, Plant Journal 5, 299-307）によって記述された方法に従って、形質転換した。得られた植物をＴＡ−Ｒ１と名付けた。
【０３９４】
ｆ）  ＯＫ１タンパク質およびＲ１タンパク質の過剰発現のためのコムギ植物の共形質転換
Florida品種のコムギ植物を、バイオリスティック法によりBecker et al.（1994, Plant Journal 5, 299-307）によって記述された方法に従って、プラスミドｐＭＬ８２およびＨＰＬＣによって精製された断片（プラスミドｐＭＬ８−Ａ．ｔ．−ＯＫ１から制限酵素ＡｖｒIIおよびＳｗａｌにより切り出され、トウモロコシからのポリユビキチン遺伝子のプロモーター、Arabidopsis thalianaからのＯＫ１の全読取枠およびAgrobacterium tumefaciensからのｎｏｓ−終止コドンを含む）を含むＤＮＡ混合物によって、形質転換した。ＲＴ−ＰＣＲを利用してＡ．ｔ．−Ｏｋ１タンパク質の発現ならびにＳ．ｔ．−Ｒ１タンパク質の発現の両方を有する植物を同定した。得られた植物をＴＡ−Ｒ１と−ＯＫ１と名付けた。
【０３９５】
ｇ）  遺伝子組換えコムギ植物の同定
系統ＴＡ−Ｒ１およびＴＡ−ＯＫ１のＴ１植物を温室で栽培し、開花前にＢａｓｔａ（登録商標）（０．５％溶液）を噴霧した。Ｂａｓｔａ（登録商標）が媒介する抵抗性遺伝子を発現しない植物は枯死した。
【０３９６】
ｈ）  Ｓ．ｔ．−Ｒ１タンパク質の発現およびＡ．ｔ．−ＯＫ１タンパク質の発現を有するコムギ植物の、交雑による作製
Ｂａｓｔａ（登録商標）処理で生き残ったＴＡ−ＯＫ１植物を、Ｂａｓｔａ（登録商標）処理で生き残ったＴＡ−Ｒ１植物またはＷＯ ０２ ０３４９２３に記載されている系統４０Ａ−１１−８の同型接合体植物のどちらかと交雑させた。得られた子孫を、ＴＡ−ＯｋＩ×ＴＡ−Ｒ１あるいはＴＡ−ＯＫ１×４０Ａ−１１−８とそれぞれ名付けた。
【０３９７】
ｅ）  遺伝子組換えコムギ植物およびこれから合成されたデンプンの分析
系統ＴＡ−Ｏｋ１およびＴＡ−Ｒ１、またはＴＡ−ＯＫ１および４０Ａ−１１−８それぞれの交雑から得られた穀粒について、それぞれデンプンを単離し、デンプンに共有結合で結合したリン酸含量を測定した。交雑ＴＡ−Ｏｋ１およびＴＡ−Ｒ１、または交雑ＴＡ−ＯＫ１および４０Ａ−１１−８から得られた穀粒から単離したデンプンのリン酸含量は、いくつかの植物については、対応する野生型植物からの、または系統４０Ａ−１１−８の植物からの穀粒より単離したデンプンよりも有意に高かった。
【０３９８】
様々なＴＡ−Ｒ１−ＯＫ１系統からのデンプンを分析するために、それぞれの植物の穀粒を収穫し、単離したデンプンのＣ−６リン酸含量およびＣ−３リン酸含量を分析した。Ｃ−６リン酸プラスＣ−３リン酸の含量が、系統ＴＡ−Ｒ１または４０Ａ−１１−８の穀粒から単離したデンプンのＣ−６リン酸プラスＣ−３リン酸の含量と比較して明らかに高い、いくつかの植物を同定することができた。
【０３９９】
１４．ＯＫ１タンパク質およびＲ１タンパク質の増大した発現を有する遺伝子組換えイネ植物の作製
【０４００】
ａ）  プラスミドｐＧｌｏ−Ａ．ｔ．−ＯＫ１の作製
イネからのグロブリン遺伝子のプロモーターを、品種Ｍ２０２のイネのゲノムＤＮＡ上でプライマーｇｌｂ１−Ｆ２（ＡＡＡＡＣＡＡＴＴＧＧＣＧＣＣＴＧＧＡＧＧＧＡＧＧＡＧＡ）及びｇｌｂ１−Ｒ１（ＡＡＡＡＣＡＡＴＴＧＡＴＧＡＴＣＡＡＴＣＡＧＡＣＡＡＴＣＡＣＴＡＧＡＡ）によるHigh Fidelity Taq Polymerase(Invitrogen, catalogue number 11304-011)を用いたポリメラーゼ連鎖反応（３０×２０秒９４℃、２０秒６２℃、１分６８℃、４mM Ｍｇ２ＳＯ４）を行って増幅し、ｐＣＲ２．１（Invitrogen catalogue number K2020-20）中にクローニングしてプラスミドｐＩＲ９４を得た。
【０４０１】
２つのオリゴヌクレオチドＸ１（ＴＧＣＡＧＧＣＴＧＣＡＧＡＧＣＴＣＣＴＡＧＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＡＣＡＣＴＡＧＴＡＡＧＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＴＡＴＣＡＴＴＴＡＣ）及びＸ２（ＡＡＴＴＧＴＡＡＡＴＧＡＴＡＴＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＣＴＴＡＣＴＡＧＴＧＴＴＡＡＣＴＣＧＡＧＣＣＴＡＧＧＡＧＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＴＧＣＡ）から成る合成ＤＮＡ片をＳｄａＩおよびＭｕｎＩで切断したベクターｐＧＳＶ７１中にクローニングすることにより、プラスミドｐIＲ１１５を得た。
【０４０２】
得られたプラスミドｐｌＲ１１５を、ＳｄａＩで切断し、突出している３’−端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼによって平滑化し、そして１９７塩基対のサイズのｐＢｉｎＡＲからのＨｉｎｄIII／ＳｐｈＩ断片（Hofgen and Willmitzer, 1990, Plant Science 66, 221-230）（Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化され、Agrobacterium tumefaciensからのオクトピン合成酵素遺伝子の終結シグナルを含む）を挿入した。得られたプラスミドをｐＩＲ９６と名付けた。
【０４０３】
９８６塩基対の長さのｐＩＲ９４からクローニングされたＤＮＡ断片（イネのグロブリン遺伝子のプロモーターを含む）をプラスミドｐＩＲ９６中にクローニングして、プラスミドｐＩＲ１０３を得た。
【０４０４】
ｐＧＳＶ７１は、中間ベクターｐＧＳＶｌに由来するプラスミドｐＧＳＶ７の誘導体である。ｐＧＳＶ１は、ｐＧＳＣ１７００の誘導体を構成し、そのコンストラクションについてはCornelissen and Vanderwiele(Nucleic Acid Research 17, (1989),19-25)により記述されている。ｐＧＳＶ１は、ｐＧＳＣ１７００からカルベニシリン抵抗性遺伝子の欠失およびプラスミドｐＴｉＢ６Ｓ３のＴＬ−ＤＮＡ領域のＴ−ＤＮＡ配列の欠失により得られた。
【０４０５】
ｐＧＳＶ７は、プラスミドｐＢＲ３２２の複製起点（Bolivar et al., Gene 2, (1977), 95-113）、ならびにPseudomonasのプラスミドｐＶＳ１の複製起点（Itoh et al., Plasmid 11, (1984), 206）を含む。ｐＧＳＶ７はまた、Klebsiella pneumoniae由来のトランスポゾンＴｎ１３３１からの選択可能なマーカー遺伝子ａａｄＡを含み、それが、抗生物質スペクチノマイシンおよびストレプトマイシンに対する抵抗性を与える（Tolmasky, Plasmid 24 (3), (1990),218-226; Tolmasky and Crosa, Plasmid 29(1),(1993), 31-40）。
【０４０６】
プラスミドｐＧＳＶ７１は、キメラのｂａｒ遺伝子をｐＧＳＶ７の境界領域の間にクローニングすることにより得られた。キメラのＢａｒ遺伝子は、転写を開始するためのカリフラワーモザイクウィルスのプロモーター配列（Odell et al., Nature 313, (1985), 180）、Streptomyces hygroscopicusのＢａｒ遺伝子（Thompson et al., Embo J. 6, (1987), 2519-2523）、および転写終了およびポリアデニル化のためのｐＴｉＴ３７のＴ−ＤＮＡのノパリン合成遺伝子の３’−非翻訳領域を含む。Ｂａｒ遺伝子は、除草剤グルホシネートアンモニウムに対する耐性を与える。
【０４０７】
ArabidopsisからのＯＫ１タンパク質の全読取枠の配列を含むＤＮＡ断片をベクターＡ．ｔ．−ＯＫ１−ｐＧＥＭから切り出し、ベクターｐＩＲ１０３中へクローニングした。この目的のために、プラスミドＡ．ｔ．−ＯＫ１−ｐＧＥＭを、制限酵素Ｂｓｐ１２０Ｉで切断し、末端をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑化し、ＳａｃＩで切断した。Arabidopsis thalianaからのＯＫ１タンパク質をコードするＤＮＡ断片を、Ｅｃｌ１３６IIおよびＸｈｏＩで切断されたベクターｐＩＲ１０３中にクローニングした。得られたプラスミドをｐＧｌｏ−Ａ．ｔ．−ＯＫ１と名付けた。
【０４０８】
ｂ）  プラスミドｐＧｌｏ−Ａ．ｔ．−ＯＫ１によるイネ植物の形質転換
イネ植物（品種Ｍ２０２）を、Agrobacterium（プラスミドｐＧｌｏ−Ａ．ｔ．−ＯＫ１を含む）により、Hiei et al.(1994, Plant Journal 6(2), 271-282）により記述された方法を使用して形質転換した。
【０４０９】
ｃ）  プラスミドｐＧｌｏ−Ａ．ｔ．−ＯＫ１によって形質転換された遺伝子組換えイネ植物の分析
定量ＲＴ ＰＣＲ分析により、Ａ．ｔ．−ＯＫ１タンパク質をコードするｍＲＮＡを発現する植物を同定することができた。Ｔ１世代の同型接合体植物を、上の実施例１１ｇ）にトウモロコシ植物によって記述したようにして、同定した。得られた植物をＯＳ−ＯＫ１と名付けた。
【０４１０】
ｄ）  プラスミドｐＭＬ８２によるイネ植物の形質転換
イネ植物（品種Ｍ２０２）を、Agrobacterium（プラスミドｐＭＬ８２を含む）により、Hiei et al.(1994, Plant Journal 6(2), 271-282）により記述された方法を使用して形質転換した。
【０４１１】
ｅ）  プラスミドｐＧｌｏＭＬ８２によって形質転換された遺伝子組換えイネ植物の分析
定量ＲＴ ＰＣＲ分析により、Ｓ．ｔ．−Ｒ１タンパク質をコードするｍＲＮＡの発現を示す植物を同定することができた。Ｔ１世代の同型接合体植物を、上の実施例１１ｇ）にトウモロコシ植物によって記述したようにして、同定した。得られた植物をＯＳ−Ｒ１と名付けた。
【０４１２】
ｆ）  Ｓ．ｔ．−Ｒ１タンパク質の発現ならびにＡ．ｔ．−ＯＫ１タンパク質の発現の両方を有するイネ植物の、交雑による作製
同型接合体のＯＳ−ＯＫ１植物を同型接合体のＯＳ−Ｒ１植物と交雑した。得られたプラスミドをＯＳ−Ｏｋ１×ＯＳ−Ｒ１と名付けた。
【０４１３】
ｇ）  遺伝子組換えイネ植物およびそれによって合成されたデンプンの分析
ＯＳ−Ｏｋ１×ＯＳ−Ｒ１の交雑から得られた穀粒について、デンプンを単離し、デンプンに共有結合で結合しているリン酸含量を測定した。系統ＯＳ−Ｏｋ１およびＯＳ−Ｒ１の交雑から得られた穀粒から単離したデンプンのグルコース分子のＣ−６位置およびＣ−３位置のリン酸含量は、いくつかの系統については、対応する野生型植物からのまたは系統ＯＳ−Ｒ１の植物からの穀粒から単離したデンプンよりも、明らかに高かった。
【図面の簡単な説明】
【０４１４】
【図１】Arabidopsis thaliana由来の、リン酸化デンプンと比較して非リン酸化デンプンに好んで結合するタンパク質を同定するための変性アクリルアミドゲル。標準タンパク質分子量マーカーを、トレース「Ｍ」に示す。実施例１ｄ）からの対照調製物Ｃのインキュベーション後に得られたタンパク質を、トレース「−」に示す。Arabidopsis thaliana sex1-3突然変異体（実施例１ｄ）の調製物Ｂ）の葉から単離された非リン酸化デンプンとのインキュベーション後に得られた、Arabidopsis thalianaのタンパク質抽出物を、トレース「Ｋ」に示す。予めインビトロでＲ１タンパク質によりリン酸化されていたArabidopsis thaliana sex1-3の葉から分離されたデンプンとインキュベーションした後に得られたArabidopsis thalianaのタンパク質抽出物（実施例１ｄ）の調製物Ａ）を、トレース「Ｐ」に示す。電気泳動の完了後、アクリルアミドゲルをクマシーブルーで染色した。
【図２】ＯＫ１タンパク質の自己リン酸化活性の実証。図２Ａ）は電気泳動完了後にクマシーブルーで染色した変性（ＳＤＳ）アクリルアミドゲルを示す。図２Ｂ）は、変性（ＳＤＳ）アクリルアミドゲルのオートラジオグラフィを示す。同じ量の同じ試料を２つの各ゲルに加えた。Ｍ：標準タンパク質分子量マーカー；Ｒ１：実施例７による反応容器１からの試料（ＯＫ１タンパク質をＡＴＰとインキュベーションした後）；Ｒ２：実施例７による反応容器２からの試料（ＯＫ１タンパク質をＡＴＰとインキュベーションした後に、タンパク質を９５℃に熱した）；Ｒ３：実施例７による反応容器３からの試料（ＯＫ１タンパク質をＡＴＰとインキュベーションした後に、タンパク質を０．５M ＨＣｌ中でインキュベーションした）；Ｒ４：実施例７による反応容器４からの試料（ＯＫ１タンパク質をＡＴＰとインキュベーションした後に、タンパク質を０．５MのＮａＯＨ中でインキュベーションした）。
【図３】ＯＫ１タンパク質のデンプンリン酸化活性の実証（実施例６を参照のこと）。ＯＫ１タンパク質を、Arabidopsis thaliana sex1-3突然変異体の葉から単離された非リン酸化デンプン（調製物Ａ）、および予めインビトロでＲ１タンパク質によりリン酸化されていた、Arabidopsis thaliana sex1-3突然変異体の葉から分離されたデンプン（調製物Ｂ）とインキュベーションした。調製物Ｃは、ＯＫ１タンパク質なしでこの調製物Ｃをインキュベーションした以外は、調製物Ｂと同じである。２つの独立したテストを各調製物（Ａ、Ｂ、Ｃ）について行なった（テスト１およびテスト２）。それぞれの量を、非リン酸化デンプン（調製物Ａ）およびリン酸化デンプン（調製物Ｂ）へ導入した33Ｐラベルリン酸のcpm（カウント／分）で測定して示す。
【図４】Ｒ１タンパク質およびＯＫ１タンパク質によりそれぞれリン酸化されたデンプンのグルコース分子のＣ−原子位置の比較（実施例９を参照のこと）。ＯＫ１タンパク質（調製物Ａ）を33ＰラベルＡＴＰ存在下でArabidopsis thaliana sex1-3突然変異体の葉から単離された、予めＲ１タンパク質によりインビトロでリン酸化されていたデンプンとインキュベーションした。Ｒ１タンパク質（調製物Ｂ）を、Arabidopsis thaliana sex1-3突然変異体の葉から分離されたデンプンと、33ＰラベルＡＴＰ存在下でインキュベーションした。インキュベーションが完了した後、デンプンの全加水分解を実行し、得られた加水分解生成物を、ＨＰＡＥクロマトグラフィーを用いて分離した。標準として、加水分解生成物にグルコース−６−リン酸およびグルコース−３−リン酸を分離の前に加えた。ＨＰＡＥクロマトグラフィーによって分離された加水分解生成物を個々の分画に集めた。加えたグルコース−６−リン酸が分画１５に、また加えたグルコース−３−リン酸が分画１７に溶出された。得られた分画を、続いて放射性ラベルされたリン酸の存在について調べた。個々の分画で測定されたcpm（カウント／分）で測った33Ｐラベルリン酸（それはＯＫ１タンパク質またはＲ１タンパク質によってリン酸化デンプンの加水分解生成物へ導入されたリン酸である）の量をグラフに示す。
【図５】ＯＫ１タンパク質の自己リン酸化の実証。図５Ａ）は、ウエスタンブロットを示す。図５Ｂ）は、変性（ＳＤＳ）アクリルアミドゲルのオートラジオグラフィを示す。同じ量の同じ試料を２つのゲル各々に添加した。ＯＫ１タンパク質を、無作為化放射性ラベルＡＴＰと、または特異的にγ位置に放射性ラベルされたＡＴＰとインキュベーションした。インキュベーションの完了後、タンパク質を３０℃または９５℃に熱するか、または０．５MのＮａＯＨまたは０．５MのＨＣｌ中でそれぞれインキュベーションした。
【図６】ＯＫ１タンパク質によって触媒された反応における、ＡＴＰのβリン酸残基のデンプンへの転移の実証。特異的に33Ｐでγ位置をラベルされたＡＴＰまたは無作為33Ｐ−ＡＴＰのいずれかを用いて、インビトロでＲ１タンパク質によりリン酸化されていた、Arabidopsis thaliana sex1-3突然変異体の葉から分離されたデンプンを、ＯＫ１タンパク質によってリン酸化した。「対照」として指定された実験のいずれにもＯＫ１タンパク質を加えなかった。調製物をそれぞれ２回、互いに独立にテストした。両方のテストの結果を示す。
【図７】Ｒ１タンパク質およびＯＫ１タンパク質が同時に反応物に含まれている場合の、リン酸化反応におけるリン酸化活性の増大の実証  表示されているのは、放射性ラベルされたＡＴＰ（無作為化33Ｐ−ＡＴＰ）から出発した、種々のデンプン中の放射活性（cpm）測定による当該デンプン中のリン酸の取込みである。この目的のために、コムギデンプンを自然の形で、Ｒ１タンパク質（調製物１−２(注１−１)、調製物１−２）と、またはＯＫ１タンパク質（調製物２）と、またはインビトロでリン酸化されたコムギデンプンの形でＯＫ１タンパク質（調製物３）と、インキュベーションした。調製物４は、自然のコムギデンプンを含み、Ｒ１タンパク質およびＯＫ１タンパク質と同時にインキュベーションした。各調製物を３回繰り返して行なった。比較のために、調製物１−２および調製物３それぞれの合計を表示する。
【図８】Ｒ１タンパク質およびＯＫ１タンパク質の協同作用による活性増大の実証  Ｒ１タンパク質によって、インビトロでリン酸化されたコムギデンプンを、別々の反応調製物中で、無作為化□／□−Ｐ33ＡＴＰを用いて１０分間または３０分間、精製されたＲ１タンパク質（調製物１）、または精製されたＯＫ１タンパク質（調製物２）とそれぞれインキュベーションした。平行した調製物中で、同じリン酸化されたコムギデンプンをＲ１タンパク質およびＯＫ１タンパク質と同時にインキュベーションした（調製物３）。すべての反応調製物について、それぞれの反応調製物中のデンプンに結合したリン酸の量を、インキュベーションの完了後に、シンチレーションカウンター測定によって測定した。さらに図中に表示されているのは、２つの酵素のうちの１つだけをそれぞれリン酸化反応のために導入した反応調製物に対する合計である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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