(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的遺伝子を含むＤＮＡと混合して用いるためのトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）と、目的遺伝子を含むＤＮＡとｔＲＮＡとの混合液に添加するためのリポフェクション試薬とを含有することを特徴とする、インビトロにおいて哺乳動物細胞へ遺伝子導入効率を向上させる向上剤。
【請求項２】
さらにポリエチレングリコールを併用することを特徴とする請求項１記載の向上剤。
【請求項３】
ポリエチレングリコールの分子量が、２０００〜６０００の範囲内であることを特徴とする請求項２に記載の向上剤。
【請求項４】
ポリエチレングリコールの分子量が、３０００〜５０００の範囲内であることを特徴とする請求項２に記載の向上剤。
【請求項５】
リポフェクション溶液中のｔＲＮＡ濃度が３〜５０μｇ／ｍＬの範囲内となるように用いることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の向上剤。
【請求項６】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を順次備えることを特徴とする、インビトロにおいて哺乳動物細胞への遺伝子導入効率を向上させる方法。
（ａ）目的遺伝子を含むＤＮＡと、ｔＲＮＡとを混合する工程；
（ｂ）前記工程（ａ）により作製された混合液に、リポフェクション試薬を添加する工程；
（ｃ）前記工程（ｂ）により作製されたリポフェクション溶液を、インビトロにおいて哺乳動物細胞に添加する工程；
【請求項７】
工程（ｂ）において、ポリエチレングリコールを併用することを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項８】
以下の工程（ａ）〜（ｃ）を順次備えることを特徴とする、インビトロにおける哺乳動物細胞の形質転換方法。
（ａ）目的遺伝子を含むＤＮＡと、ｔＲＮＡとを混合する工程；
（ｂ）前記工程（ａ）により作製された混合液に、リポフェクション試薬を添加する工程；
（ｃ）前記工程（ｂ）により作製されたリポフェクション溶液を、インビトロにおいて哺乳動物細胞に添加し、目的遺伝子を哺乳動物細胞へリポフェクションする工程；
【請求項９】
工程（ｂ）において、ポリエチレングリコールを併用することを特徴とする請求項８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物細胞への遺伝子導入効率の向上剤や、哺乳動物細胞への遺伝子導入効率の向上方法や、哺乳動物細胞の形質転換方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞への遺伝子導入方法には様々なものが知られている。例えば、生物学的方法としては、ウイルスベクターを利用する方法、特異的受容体を利用する方法、細胞融合法が知られており、物理的方法としては、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、遺伝子銃法、超音波遺伝子導入法が知られており、化学的方法としては、リン酸カルシウム共沈殿法、リポソーム法、リポフェクション法、ＤＥＡＥデキストラン法、アルカリ金属法が知られている。上記リポフェクション法は、陽性荷電脂質等からなる脂質二重膜小胞（リポソーム）と、導入するＤＮＡとの間の電気的な相互作用によって、リポソーム−ＤＮＡ複合体を形成させ、その複合体を貪食や膜融合によって宿主細胞に取り込ませる方法である。ＤＮＡを必ずしもリポソーム内に封入しない点で、リポフェクション法は、リポソーム法と区別される。一般的に、遺伝子導入を行う場合には簡便さの点から、まずはリポフェクション法がおこなわれる。リポフェクション法は、汎用性及び簡便性が高く、また、多サンプル処理に適しているというメリットを有しているため、比較的広く用いられている。しかし、このリポフェクション法は、遺伝子導入効率の点で、エレクトロポレーション法や、ウイルスベクターを利用する方法に劣っているというデメリットもあった。一方、ウイルスベクターを利用する方法には、高い遺伝子導入効率を有するといったメリットがある反面、１）ウイルスベクターに目的遺伝子を入れた後、かかるウイルスベクターをウイルス産生細胞に導入し、その後目的遺伝子を含むウイルスを産生し、かかるウイルスを細胞に感染させるまで１週間程度もの時間が必要、２）ウイルスベクターを扱う施設が必要、３）ウイルスベクターを扱うのに十分な熟練の技術者が必要、４）ウイルスベクターが体細胞ゲノムに挿入され、残ってしまう場合があること、などの問題があった。したがって、ウイルスベクターを利用せずに、効率よく遺伝子導入する方法を開発できれば、有用な方法となる。【０００３】
本発明者らは、これまでに、酵母への遺伝子導入効率を向上させる研究を行ってきた。例えば特許文献１には、酵母培養液に直接、該酵母細胞に導入するＤＮＡ、アルカリ金属イオンおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含有する溶液を混合して、形質転換を行なうことを特徴とする酵母の形質転換法が記載されている。また、特許文献１には、上記の混合溶液に、キャリアＤＮＡやキャリアＲＮＡをさらに用いることが記載されている。しかし、この特許文献１の方法は、酵母細胞を対象とし、また、アルカリ金属法に基づいた方法である。一方、本願発明の方法は、哺乳動物細胞を対象とし、また、リポフェクション法に基づいた方法であるため、特許文献１の方法とは全く異なる。加えて、特許文献１は、ｔＲＮＡについて何ら教示していない。なお、酵母細胞は細胞壁を有するため、リポフェクション法は通常用いられない。【０００４】
ところで、特許文献２には、哺乳動物細胞を宿主細胞とし、遺伝子導入効率が高い形質転換法が記載されている。特許文献２の形質転換法は、哺乳動物複製開始領域と、哺乳動物核マトリックス結合領域とを含む第１ベクター、および哺乳動物細胞内において機能するプロモーターと、分泌タンパク質をコードする目的遺伝子とを含む第２ベクターを、第２ベクターに対する第１ベクターのモル比が０．３〜５の範囲となるように、哺乳動物細胞へ同時に導入することを特徴としている。また、非特許文献１や非特許文献２には、特定の分子量のポリエチレングリコールを用いると、遺伝子導入効率が向上することが開示されている。しかし、上記のいずれの文献にも、哺乳動物細胞の遺伝子導入の際に、ｔＲＮＡを用いることについて、何ら教示はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００５−２６９９２０号公報
【特許文献２】特開２００９−１９５１９７号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Journal of Applied Polymer Science, 114,2221-2225, 2009
【非特許文献２】The Journal of Gene Medicine, 3, 115-124, 2001
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、哺乳動物細胞への遺伝子導入効率の向上剤や、哺乳動物細胞への遺伝子導入効率の向上方法や、哺乳動物細胞の形質転換方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、リポフェクション法による哺乳動物細胞への遺伝子導入の効率を向上させるべく、導入遺伝子の濃度、リポフェクション試薬の濃度、宿主細胞数などについて至適条件を検討したが、遺伝子導入効率をそれほど向上させることはできなかった。本発明者らは、さらに鋭意研究を続けた結果、ｔＲＮＡをリポフェクション試薬と併用すると、哺乳動物細胞への遺伝子導入効率を顕著に向上させ得ることを見いだし、本発明を完成するに至った。【０００９】
すなわち、本発明は、（１）目的遺伝子を含むＤＮＡと混合して用いるためのトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）と、目的遺伝子を含むＤＮＡとｔＲＮＡとの混合液に添加するためのリポフェクション試薬とを含有することを特徴とする、インビトロにおいて哺乳動物細胞へ遺伝子導入効率を向上させる向上剤や、（２）さらにポリエチレングリコールを併用することを特徴とする上記（１）記載の向上剤や、（３）ポリエチレングリコールの分子量が、２０００〜６０００の範囲内であることを特徴とする上記（２）に記載の向上剤や、（４）ポリエチレングリコールの分子量が、３０００〜５０００の範囲内であることを特徴とする上記（２）に記載の向上剤や、（５）リポフェクション溶液中のｔＲＮＡ濃度が３〜５０μｇ／ｍＬの範囲内となるように用いることを特徴とする上記（１）〜（４）のいずれかに記載の向上剤に関する。
【００１０】
また、本発明は、（６）以下の工程（ａ）〜（ｃ）を順次備えることを特徴とする、インビトロにおいて哺乳動物細胞への遺伝子導入効率を向上させる方法；（ａ）目的遺伝子を含むＤＮＡと、ｔＲＮＡとを混合する工程；（ｂ）前記工程（ａ）により作製された混合液に、リポフェクション試薬を添加する工程；（ｃ）前記工程（ｂ）により作製されたリポフェクション溶液を、インビトロにおいて哺乳動物細胞に添加する工程；や、（７）工程（ｂ）において、ポリエチレングリコールを併用することを特徴とする上記（６）記載の方法や、（８）以下の工程（ａ）〜（ｃ）を順次備えることを特徴とする、インビトロにおける哺乳動物細胞の形質転換方法；（ａ）目的遺伝子を含むＤＮＡと、ｔＲＮＡとを混合する工程；（ｂ）前記工程（ａ）により作製された混合液に、リポフェクション試薬を添加する工程；（ｃ）前記工程（ｂ）により作製されたリポフェクション溶液を、インビトロにおいて哺乳動物細胞に添加し、目的遺伝子を哺乳動物細胞へリポフェクションする工程；や、（９）工程（ｂ）において、ポリエチレングリコールを併用することを特徴とする上記（８）記載の方法に関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の遺伝子導入効率の向上剤や、遺伝子導入効率の向上方法によると、哺乳動物細胞への遺伝子導入効率を顕著に向上させることができる。また、本発明の哺乳動物細胞の形質転換方法によると、哺乳動物細胞の形質転換を高効率で行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】［実施例１  遺伝子導入効率に対するｔＲＮＡの影響］の結果を示す図である。
【図２】［実施例２  各生物種由来のｔＲＮＡの効果］の結果を示す図である。
【図３】［実施例３  リポフェクション試薬の種類による効果］の結果を示す図である。
【図４】［実施例４  宿主細胞の種類による効果］の結果を示す図である。
【図５】［実施例５  リポフェクション試薬及びｔＲＮＡに、ＰＥＧをさらに添加することによる相乗効果］の結果を示す図である。左のグラフはＨＥＫ２９３細胞を用いた結果を示し、右のグラフはＨｅＬａ細胞を用いた結果を示す。
【図６】［リポフェクション試薬及びｔＲＮＡに、ＰＥＧをさらに添加することによる相乗効果］の結果を示す図である。ＥＢ５細胞を用いた結果を示す。
【図７】［参考例１  リポフェクション試薬にＰＥＧを添加することによる効果］の結果を示す図である。
【図８】［参考例２  リポフェクション試薬の種類の影響］の結果を示す図である。
【図９】［参考例３  宿主細胞の種類による影響］の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１．本発明の哺乳動物細胞への遺伝子導入効率の向上剤
本発明の哺乳動物細胞への遺伝子導入効率の向上剤（以下、「本発明の向上剤」とも表示する。）は、ｔＲＮＡを含有し、かつ、リポフェクション試薬と併用することを特徴とする。ｔＲＮＡを含有する本発明の向上剤を、リポフェクション試薬と併用すると、哺乳動物細胞への遺伝子導入効率を顕著に向上させることができる。なお、リポフェクション試薬と併用してリポフェクションを行ったときに、哺乳動物細胞への遺伝子導入効率を向上させ得る効果を、本明細書において「本発明の遺伝子導入効率向上効果」とも表示する。本発明の遺伝子導入効率向上効果の作用機作は明確ではないが、ｔＲＮＡをリポフェクション試薬と併用すると、哺乳動物細胞への遺伝子の取り込み効率が向上すると考えられる。
【００１４】
本明細書における「ｔＲＮＡ」としては、本発明の遺伝子導入効率向上効果を有するｔＲＮＡである限り特に制限されず、仔ウシ肝臓（calf liver；Bovine）由来のｔＲＮＡ（例えば配列番号１記載の配列からなるロイシンｔＲＮＡ）、酵母（Yeasts；Saccharomyces cerevisiae）由来のｔＲＮＡ（例えば配列番号２記載の配列からなるロイシンｔＲＮＡ）、小麦胚芽（wheat germ；Wheat）由来のｔＲＮＡ（例えば配列番号３記載の配列からなるフェニルアラニンｔＲＮＡ）、大腸菌（E. coli）由来のｔＲＮＡ（例えば配列番号４記載の配列からなるロイシンｔＲＮＡ）を好適に例示することができ、中でも、本発明の遺伝子導入効率向上効果の程度が高いことから、酵母由来のｔＲＮＡをより好適に例示することができる。
【００１５】
本明細書における「ｔＲＮＡ」には、本発明の遺伝子導入効率向上効果を有している限り、ｔＲＮＡの変異体（以下、単に「ｔＲＮＡ変異体」と表示する。）も含まれる。かかるｔＲＮＡ変異体とは、配列番号１〜４のいずれかに示されるポリリボヌクレオチドの変異体であって、かつ、いずれかの哺乳動物細胞において本発明の遺伝子導入効率向上効果を有するポリリボヌクレオチドを意味する。
かかるｔＲＮＡ変異体としては、
（ａ）配列番号１〜４のいずれかに示されるポリリボヌクレオチドに対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有し、かつ、いずれかの哺乳動物細胞において本発明の遺伝子導入効率向上効果を有するポリリボヌクレオチド：
（ｂ）配列番号１〜４のいずれかに示されるポリリボヌクレオチドにおいて、１若しくは２個以上のリボヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたポリリボヌクレオチドからなり、かつ、いずれかの哺乳動物細胞において本発明の遺伝子導入効率向上効果を有するポリリボヌクレオチド：
（ｃ）配列番号１〜４のいずれかに示されるポリリボヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、いずれかの哺乳動物細胞において本発明の遺伝子導入効率向上効果を有するポリリボヌクレオチド：
【００１６】
上記（ｂ）における「１若しくは２個以上のリボヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたポリリボヌクレオチド」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜１５個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、中でも１〜３個の任意の数のリボヌクレオチドが欠失、置換若しくは付加されたポリリボヌクレオチドを意味する。
【００１７】
上記（ｃ）における「ストリンジェントな条件下」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、具体的には、８０％以上、好ましくは８５％以上の同一性を有するＤＮＡ同士（又はＤＮＡとＲＮＡ）がハイブリダイズし、それより同一性が低いＤＮＡ同士（又はＤＮＡとＲＮＡ）がハイブリダイズしない条件あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６５℃、１×ＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ、又は０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件を挙げることができる。ハイブリダイゼーションは、モレキュラークローニング第２版等に記載されている方法に準じて行うことができる。上記（ｃ）における「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリリボヌクレオチド」としては、プローブとして使用するポリヌクレオチドと一定以上の同一性を有するポリリボヌクレオチドが挙げることができ、例えば８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の同一性を有するポリリボヌクレオチドを好適に例示することができる。
【００１８】
上記の配列番号１〜４のいずれかに示されるポリリボヌクレオチドは、化学合成法や、ＲＮＡポリメラーゼを利用した遺伝子工学的手法などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。
【００１９】
また、前述のポリリボヌクレオチドの変異体は、化学合成法、遺伝子工学的手法、突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法により作製することもできる。具体的には、配列番号１〜４のいずれかに示されるポリリボヌクレオチドに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的な手法等を用いて、これらポリリボヌクレオチドに変異を導入することにより、ポリリボヌクレオチドの変異体を取得することができる。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、モレキュラークローニング第２版、Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載の方法に準じて行うことができる。
【００２０】
本発明におけるポリリボヌクレオチドとしては、一次構造として、一本鎖であるポリリボヌクレオチドを好適に例示することができ、二次構造として、Ｄアーム、アンチコドンアーム及びＴアームを持つクローバーリーフ構造を有するポリリボヌクレオチドを好適に例示することができる。
【００２１】
本発明の向上剤と併用するリポフェクション試薬としては、本発明の遺伝子導入効率向上効果が得られる限り、特に制限されず、市販のリポフェクション試薬を用いることができる。市販のリポフェクション試薬としては、Fugene（登録商標）HD transfection reagent（Roche Applied Science社製）、Lipofectamine（登録商標）2000（invitrogen社製）、Lipofectamine（登録商標）LTX（invitrogen社製）、Lipofectamine（登録商標）LTX plus（invitrogen社製）、JetPEI（登録商標）（Polyplus-transfection社製）、GeneJuice（登録商標）（Takara Bio社製）、Turbofect（登録商標）（Fermentas社製）などを好適に例示することができ、中でも、より優れた本発明の遺伝子導入効率向上効果が得られることから、Fugene（登録商標）HD transfection reagent、Lipofectamine（登録商標）2000をより好適に例示することができる。
【００２２】
本発明において併用するｔＲＮＡとリポフェクション試薬の好適な組合せとしては、酵母由来のｔＲＮＡとFugene（登録商標）HD transfection reagentとの組合せ、仔ウシ肝臓由来のｔＲＮＡとFugene（登録商標）HD transfection reagentとの組合せ、麦胚芽由来のｔＲＮＡとFugene（登録商標）HD transfection reagentとの組合せ、大腸菌（E. coli）由来のｔＲＮＡとFugene（登録商標）HD transfection reagentとの組合せ、酵母由来のｔＲＮＡとFugene（登録商標）HD transfection reagentとの組合せ、仔ウシ肝臓由来のｔＲＮＡとLipofectamine（登録商標）2000との組合せ、麦胚芽由来のｔＲＮＡとLipofectamine（登録商標）2000との組合せ、大腸菌（E. coli）由来のｔＲＮＡとLipofectamine（登録商標）2000との組合せを挙げることができ、中でも、酵母由来のｔＲＮＡとFugene（登録商標）HD transfection reagentとの組合せ、仔ウシ肝臓由来のｔＲＮＡとFugene（登録商標）HD transfection reagentとの組合せをより好適に挙げることができる。
【００２３】
本発明の向上剤をリポフェクション試薬と併用する方法としては、通常のリポフェクション法において、リポフェクション試薬と共に本発明の向上剤を用いる方法である限り特に制限されず、より詳細には、リポフェクションを行う際に、本発明の向上剤と、導入する遺伝子と、リポフェクション試薬とが、宿主である哺乳動物細胞に共に接触している工程を含んでいる限り特に制限されず、該工程としては、蒸留水等の溶媒に、本発明の向上剤と、導入する遺伝子と、リポフェクション試薬とを添加、混合することによって作製したリポフェクション溶液を、哺乳動物細胞に添加する工程を好適に例示することができる。
【００２４】
本発明の向上剤をリポフェクション試薬と併用する際の、本発明の向上剤の濃度としては、本発明の遺伝子導入効率向上効果が得られる限り特に制限されず、用いるｔＲＮＡの種類や宿主細胞の種類に応じて適宜調節することができるが、リポフェクションのリポフェクション溶液のｔＲＮＡの濃度で換算して、例えば１〜１００μｇ／ｍＬの範囲内、好ましくは３〜５０μｇ／ｍＬの範囲内、より好ましくは５〜２５μｇ／ｍＬの範囲内で用いることを好適に例示することができる。本明細書において「リポフェクション溶液中の濃度」とは、目的遺伝子を宿主細胞にリポフェクションする際に用いる、リポフェクション試薬とＤＮＡを混合した状態の溶液（リポフェクション溶液）中の濃度を意味する。なお、リポフェクションする際に用いるリポフェクション溶液の量としては、宿主細胞に接触する溶液に、リポフェクション溶液を添加することにより、リポフェクション溶液が５〜１５倍、好適には７〜１３倍、より好適には９〜１１倍、特に好適には１０倍に希釈されるような量を例示することができる。
【００２５】
上記の宿主である哺乳動物細胞としては、本発明の遺伝子導入効率向上効果が得られる限り特に制限されないが、ヒト、サル、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウシ、ブタ、ウマ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ等の哺乳動物由来の細胞を好適に例示することができ、中でも、ヒト、サル又はマウス由来の細胞をより好適に例示することができる。ヒト由来の細胞としては、２９３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）、ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）を好適に例示することができ、サル由来の細胞としては、ＣＯＳ７細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５１）を好適に例示することができ、マウス由来の細胞としては、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）やＥＢ５細胞（ＲＩＫＥＮ  ＢＲＣ  ＡＥＳ０１５１）を好適に例示することができる。これらの哺乳動物細胞は、例えば２９３細胞、ＨｅＬａ細胞及びＣＯＳ７細胞はＡＴＣＣから、前述のＡＴＣＣ番号に基づいて入手することができ、ＥＢ５細胞は、前述のＲＩＫＥＮ番号に基づいて独立行政法人理化学研究所から入手することができる。
【００２６】
哺乳動物細胞にリポフェクションする目的遺伝子は、宿主細胞内で発現可能なプロモーターの制御下に作動可能に配置されていることが好ましい。ここで、目的遺伝子が該プロモーターの制御下に作動可能に配置されているとは、該プロモーターに転写因子が結合することにより、その目的遺伝子の発現が誘導されるように、該プロモーターと、その目的遺伝子とが連結されていることを意味する。かかるプロモーターとしては、ヒトサイトメガロウィルスプロモーター（ＣＭＶプロモーター）、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＲαプロモーター、ヒト伸長因子１−αプロモーター、ウシ成長ホルモンプロモーター、β−アクチン遺伝子プロモーター等を好適に例示することができる。上記「目的遺伝子」としては、任意の遺伝子であればよいが、なんらかの有用なタンパク質をコードする有用タンパク質遺伝子を好適に例示することができる。有用タンパク質遺伝子としては、エリスロポエチン等のサイトカイン遺伝子、抗体をコードする遺伝子や 、ウイルスワクチンタンパク質の遺伝子を好適に例示することができる。また、上記目的遺伝子やプロモーターは、宿主細胞内で複製し得るベクターに挿入して用いることが好ましく、かかるベクターとしては、宿主細胞内で複製し得るプラスミドを好適に例示することができ、中でも、ＣＭＶプロモーターを持つｐＣＭＶベクターを好適に例示することができる。
【００２７】
上記の目的遺伝子が宿主細胞内に導入されたかどうかは、目的遺伝子と共にマーカー遺伝子を導入し、形質転換体におけるそのマーカー遺伝子の発現を確認するなどして容易に確認することができる。
【００２８】
本発明の向上剤は、本発明の遺伝子導入効率向上効果を有する。あるｔＲＮＡが本発明の遺伝子導入効率向上効果を有するかどうかは、例えば、ガウシア由来の分泌型ルシフェラーゼ（Gaussia Luciferase：ＧＬｕｃ）がＣＭＶ（Cytomegalovirus）プロモーターの支配下に配置されたプラスミドであるｐＣＭＶ−ＧＬｕｃを用意する工程、蒸留水１００μＬに、０．５μｇのｐＣＭＶ−ＧＬｕｃ、０．１〜１０μｇの範囲内のｔＲＮＡ、１μＬのFugene（登録商標）HD transfection reagent（Roche Applied Science社製）添加した後、２８℃で３０分間静置してリポフェクション溶液を作製する工程、いずれか１種の哺乳動物細胞を９６ウエル平底プレートに２００μＬ／ウエル（２×１０３細胞／ウエル）ずつ播種して、２０時間培養する工程、各ウエルの培地を取り除き、新たな培地を１８０μＬ／ウエルずつ添加する工程、その直後に、前述のリポフェクション溶液を、１ウエルにつき２０μＬずつ添加し、リポフェクションを行う工程、リポフェクション溶液の添加から２４時間経過後に、各ウエルについて、ルシフェラーゼ活性を測定する工程、及び、０．１〜１０μｇの範囲内のｔＲＮＡを用いた場合におけるルシフェラーゼ活性の測定値（ＲＬＵ（count/sec・μL））の最大値と、ｔＲＮＡを用いないこと以外は同様のアッセイにより測定したルシフェラーゼ活性の測定値（ＲＬＵ（count/sec・μL））（コントロール値）とを比較し、コントロール値よりも最大値が高い場合に本発明の遺伝子導入効率向上効果を有すると評価する工程を含むルシフェラーゼアッセイ等により容易に確認することができる。ここで「最大値」とは、０．１〜１０μｇの範囲内の５点以上（好適には８点以上）のｔＲＮＡを用いた場合におけるルシフェラーゼ活性の測定値（ＲＬＵ（count/sec・μL））の最大値を意味し、より好適には０．１μｇ、０．２μｇ、０．３μｇ、０．５μｇ、１μｇ、２．５μｇ、５μｇ、１０μｇの８点のｔＲＮＡを用いた場合におけるルシフェラーゼ活性の測定値（ＲＬＵ（count/sec・μL））の最大値を例示することができる。また、上記の「いずれか１種の哺乳動物細胞」としては、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ７細胞、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、及び、ＥＢ５細胞から選択される哺乳動物細胞を好適に例示することができる。
【００２９】
本発明の遺伝子導入効率向上効果の好ましい程度としては、例えば、上記のルシフェラーゼアッセイにおける最大値（ＲＬＵ（count/sec・μL））が、コントロール値（ＲＬＵ（count/sec・μL））に対して、２倍以上、好ましくは３倍以上、より好ましくは５倍以上、さらに好ましくは７倍以上、より好ましくは１０倍以上、さらに好ましくは１５倍以上、より好ましくは２０倍以上、さらに好ましくは３０倍以上、より好ましくは５０倍、さらに好ましくは７５倍以上であることを好適に含む。
【００３０】
本発明の向上剤におけるｔＲＮＡの含有量としては、特に制限されないが、本発明の向上剤に対して本発明におけるｔＲＮＡを例えば０．１〜１００質量％、好適には０．５〜９０質量％、より好適には１〜８０質量％とすることができる。
【００３１】
本発明の向上剤には、ｔＲＮＡの他に、さらにリポフェクション試薬を含有していることが好ましい。かかる本発明の向上剤には、ｔＲＮＡとリポフェクション試薬を同一容器内で含有している場合や、ｔＲＮＡとリポフェクション試薬を別々の容器で備えている場合が含まれる。また、本発明の向上剤は、本発明の遺伝子導入効率向上効果が得られる限り、本発明におけるｔＲＮＡの他に、哺乳動物細胞への遺伝子導入効率の他の向上剤や、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の任意成分を含んでいてもよい。
【００３２】
ポリエチレングリコールをさらに併用すると、本発明の遺伝子導入効率向上効果がより高めることができるので、さらにポリエチレングリコールを併用することが好ましい。ポリエチレングリコールの分子量は特に制限されないが、本発明の遺伝子導入効率向上効果をより高める観点から、２０００〜６０００の範囲内の分子量を好適に例示することができ、３０００〜５０００の範囲内の分子量をより好適に例示することができ、３０００〜４０００の範囲内の分子量をさらに好適に例示することができる。
【００３３】
また、ポリエチレングリコールの使用量としては、リポフェクション溶液中の濃度で３〜３０質量％の範囲内を好適に例示することができ、３〜２０質量％の範囲内をより好適に例示することができ、４〜６質量％の範囲内をさらに好適に例示することができる。ポリエチレングリコールの使用量の別の表現としては、用いるリポフェクション試薬に対して３００〜１０００質量％の範囲内を好適に例示することができ、３００〜７５０質量％の範囲内をより好適に例示することができ、４００〜６００質量％の範囲内をさらに好適に例示することができる。
【００３４】
本発明の向上剤に含有されるｔＲＮＡは、常法によって適宜の製剤とすることができる。製剤の剤型としては、粉剤などの固形製剤、溶液剤などの液剤を例示することができるが、ｔＲＮＡをより安定的に保存し得ることから、固形製剤を好適に例示することができる。本発明におけるｔＲＮＡを製剤とする場合には、製剤上の必要に応じて、適宜の担体、例えば、賦形剤、結合剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、防腐剤、抗酸化剤、滑沢剤、湿潤剤、希釈剤などの任意成分を配合することができる。なお、本発明の哺乳動物細胞への遺伝子導入効率の向上剤は、本発明の哺乳動物への遺伝子導入剤とも表現することができる。
【００３５】
２．本発明の哺乳動物細胞への遺伝子導入効率の向上方法
本発明の哺乳動物細胞への遺伝子導入効率の向上方法は、ｔＲＮＡをリポフェクション試薬と併用することを特徴とする。ｔＲＮＡをリポフェクション試薬と併用する方法としては、前述した本発明の向上剤をリポフェクション試薬と併用する方法と同様の方法を好適に例示することができる。本発明の哺乳動物細胞への遺伝子導入効率の向上方法によれば、哺乳動物細胞への遺伝子導入効率を顕著に向上させることができる。なお、本発明の哺乳動物細胞への遺伝子導入効率の向上方法は、本発明の哺乳動物への遺伝子導入方法とも表現することができる。
【００３６】
３．本発明の哺乳動物細胞の形質転換方法
本発明の哺乳動物細胞の形質転換方法は、ｔＲＮＡをリポフェクション試薬と併用することにより、目的遺伝子を哺乳動物細胞へリポフェクションすることを特徴とする。ｔＲＮＡをリポフェクション試薬と併用する方法としては、前述した本発明の向上剤をリポフェクション試薬と併用する方法と同様の方法を好適に例示することができる。本発明の哺乳動物細胞の形質転換方法によれば、哺乳動物細胞での形質転換を高効率で行うことができる。
【実施例１】
【００３７】
［遺伝子導入効率に対するｔＲＮＡの影響］
遺伝子導入効率に対するｔＲＮＡの影響を調べるために、以下のようなリポフェクション実験を行った。【００３８】
まず、レポータープラスミドとして、ｐＣＭＶ−ＧＬｕｃ（New England  BioLab社製）を用意した。かかるｐＣＭＶ−ＧＬｕｃでは、ガウシア由来の分泌型ルシフェラーゼ（Gaussia Luciferase：ＧＬｕｃ）をコードする遺伝子が、ＣＭＶ（Cytomegalovirus）プロモーターの支配下に配置されている。ＣＭＶプロモーターは、哺乳動物細胞において構成的に発現するプロモーターであるので、リポフェクション実験のレポータープラスミドの作製に適している。【００３９】
次に、仔ウシの肝臓由来のｔＲＮＡ（Sigma Aldrich社製、「Ribonucleic acid, transfer Type VI  From Bovine liver」、Cat#R4752-50UN）と、トータルＲＮＡ（Sigma Aldrich社製、「Ribonucleic acid from calf liver Type IV」、Cat# R7250-100MG）を用意した。なお、トータルＲＮＡのほとんどが、ｒＲＮＡからなる。次いで、蒸留水１００μＬにつき、０．５μｇのｐＣＭＶ−ＧＬｕｃと、所定量のＲＮＡ（ｔＲＮＡ又はトータルＲＮＡ）を添加した。その溶液にリポフェクション試薬の１種であるFugene（登録商標）HD transfection reagent（Roche Applied Science社製）を１μＬ添加して１０μＬとした。この溶液を２８℃で３０分間静置した。この溶液（以下、「リポフェクション溶液」とも表示する。）を合計４０４μＬほど作製した。なお、上記の所定量とは、ＲＮＡがｔＲＮＡ、トータルＲＮＡのいずれの場合も、０μｇ、０．０７８μｇ、０．１５６μｇ、０．３１３μｇ、０．６２５μｇ、１．２５μｇ、２．５μｇ、５μｇ、１０μｇ（リポフェクション溶液における濃度換算で、それぞれ、０μｇ／ｍＬ、１０．７８μｇ／ｍＬ、２１．５６μｇ／ｍＬ、３３．１３μｇ／ｍＬ、５６．２５μｇ／ｍＬ、１０１２．５μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ）であった。【００４０】
一方、マウスの胎児皮膚から分離した培養細胞であるＮＩＨ３Ｔ３（ＮＩＨ−３Ｔ３）細胞を用意し、培地（ＲＰＭＩ１６４０に１０％ＦＣＳを混合した培地）を含む９６ウエル平底プレートに２００μＬ／ウエル（２×１０３細胞／ウエル）ずつ播種して、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を２０時間培養した。その後、各ウエルの培地を取り除き、新たな培地（ＲＰＭＩ１６４０に１０％ＦＣＳを混合した培地）を１８０μＬ／ウエルずつ添加した。その直後に、前述のリポフェクション溶液を、１ウエルにつき２０μＬずつ添加し、リポフェクションを行った。リポフェクション溶液の添加から２４時間経過後に、各ウエルについて、ルシフェラーゼ活性を測定した。その結果を図１に示す。【００４１】
図１の結果から分かるように、０．５〜２．５μｇ（リポフェクション溶液中の濃度で５〜２５μｇ／ｍＬ）のｔＲＮＡを、リポフェクション試薬と併用すると、トータルＲＮＡとリポフェクション試薬とを併用した場合と比べて、遺伝子導入効率が飛躍的に高まることが示された。特に、ｔＲＮＡを１．２５μｇ（リポフェクション溶液中の濃度で１２．５μｇ／ｍＬ）用いたときは、ＲＮＡを用いなかった場合（コントロール）と比較して、遺伝子導入効率が５８倍にも高まっていた。
【実施例２】
【００４２】
［各生物種由来のｔＲＮＡの効果］
実施例１では、宿主細胞としてマウス由来の細胞を用い、及び、仔ウシ由来のｔＲＮＡを用いた。宿主細胞として他の哺乳動物細胞を用い、及び、他の生物種由来のｔＲＮＡを用いた場合であっても、遺伝子導入効率向上効果を有しているかを調べるために、以下のようなリポフェクション実験を行った。【００４３】
ｔＲＮＡとして、仔ウシ肝臓（calf liver）由来のｔＲＮＡの他に、酵母（Yeasts）由来のｔＲＮＡ（Sigma Aldrich社製、「Ribonucleic acid, Type X-SA  transfer from baker's yeast」、Cat#R8759-100UN）、小麦胚芽（wheat germ）由来のｔＲＮＡ（Sigma Aldrich社製、「Ribonucleic acid, Type Ｖ, transfer from Wheat Germ」、Cat# R7876-500UN）、大腸菌（E. coli）由来のｔＲＮＡ（Sigma Aldrich社製、「Ribonucleic acid, transfer Type XX  from Escherichia coli strain W」、Cat#R1753-100UN）を用意した。また、宿主細胞として、サルの腎臓由来の培養細胞であるＣＯＳ７細胞を用意した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞に代えてＣＯＳ７細胞を用い、ｔＲＮＡとして各生物種由来のｔＲＮＡを用いたこと以外は、実施例１におけるリポフェクション実験と同じ方法でリポフェクション実験を行った。また、コントロールとして、ｔＲＮＡを用いない方法でもリポフェクション実験を行った。これらの結果を図２に示す。【００４４】
図２の結果から分かるように、程度に差はあるものの、いずれの生物種由来のｔＲＮＡをリポフェクション試薬と併用した場合であっても、ｔＲＮＡを用いなかった場合（fugene：コントロール）と比較して、遺伝子導入効率の向上効果が見られた。すなわち、リポフェクション溶液中のｔＲＮＡ濃度が１〜１００μｇ／ｍＬの範囲内の濃度における遺伝子導入効率の最大値が、コントロールの遺伝子導入効率の何倍であるかを算出したところ、仔ウシ肝臓由来のｔＲＮＡの場合は２．８倍、酵母由来のｔＲＮＡの場合は１６．５倍、小麦胚芽由来のｔＲＮＡの場合は６．５倍、大腸菌由来のｔＲＮＡの場合は５．２倍であった。また、酵母由来のｔＲＮＡは、０．５〜２．５μｇ（リポフェクション溶液中の濃度で５〜２５μｇ／ｍＬ）において、それ以外の由来のｔＲＮＡは、１．２５〜５μｇ（リポフェクション溶液中の濃度で１２．５〜５０μｇ／ｍＬ）において、遺伝子導入効率がとりわけ向上した。
【実施例３】
【００４５】
［リポフェクション試薬の種類による効果］
実施例１や２では、リポフェクション試薬として、Fugene（登録商標）HD transfection reagent（Roche Applied Science社製）を用いた。そこで、他のリポフェクション試薬を用いた場合であっても、ｔＲＮＡの遺伝子導入効率向上効果が得られるかを調べるために、以下のようなリポフェクション実験を行った。【００４６】
リポフェクション試薬として、Fugene（登録商標）HD transfection reagent、Lipofectamine（登録商標）2000（invitrogen社製）、Lipofectamine（登録商標）LTX （invitrogen社製）、Lipofectamine（登録商標）LTX plus（invitrogen社製）、JetPEI（登録商標）（Polyplus-transfection社製）、GeneJuice（登録商標）（Takara Bio社製）、又は、Turbofect（登録商標）（Fermentas社製）を用い、及び、ｔＲＮＡとして酵母由来のｔＲＮＡ（Sigma Aldrich社製、「Ribonucleic acid, Type X-SA  transfer from baker's yeast」、Cat#R8759-100UN）を０．６２５μｇ（リポフェクション溶液中の濃度で６．２５μｇ／ｍＬ）用いたこと以外は、実施例２の方法と同じ方法でリポフェクション実験を行った。また、コントロールとして、ｔＲＮＡを用いない方法でもリポフェクション実験を行った。これらの結果を図３に示す。【００４７】
図３の結果から分かるように、いずれのリポフェクション試薬を用いた場合も、ｔＲＮＡを併用すると、遺伝子導入効率が飛躍的に向上した。中でも、Fugene（登録商標）HD transfection reagentや、Lipofectamine（登録商標）2000は、遺伝子導入効率の向上の程度が顕著であった。
【実施例４】
【００４８】
［宿主細胞の種類による効果］
実施例１では、宿主細胞としてＮＩＨ３Ｔ３細胞を用い、実施例２〜３では、宿主細胞としてＣＯＳ７細胞を用いた。そこで、宿主細胞として、他の哺乳動物細胞を用いた場合であっても、ｔＲＮＡの遺伝子導入効率向上効果が得られるかを調べるために、以下のようなリポフェクション実験を行った。【００４９】
宿主細胞として、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ７細胞、２９３細胞、又は、ＨｅＬａ細胞を用い、及び、ｔＲＮＡとして酵母由来のｔＲＮＡ（Sigma Aldrich社製、「Ribonucleic acid, Type X-SA  transfer from baker's yeast」、Cat#R8759-100UN）を様々な濃度で用いたこと以外は、実施例２の方法と同じ方法でリポフェクション実験を行った。また、コントロールとして、ｔＲＮＡを用いない方法でもリポフェクション実験を行った。これらの結果を図４に示す。なお、２９３細胞は、ヒト胎児腎細胞由来の培養細胞であり、ＨｅＬａ細胞は、ヒト子宮頸部がん由来の培養細胞である。【００５０】
図４の結果から分かるように、いずれの哺乳動物細胞を用いた場合も、ｔＲＮＡを併用すると、遺伝子導入効率が飛躍的に向上した。具体的には、ＣＯＳ７細胞の場合は、最大値がコントロールと比較して１７倍となり、２９３細胞の場合は、最大値がコントロールと比較して１７倍となり、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の場合は、最大値がコントロールと比較して２２倍となり、ＨｅＬａ細胞の場合は、最大値がコントロールと比較して２７倍となった。
【実施例５】
【００５１】
［リポフェクション試薬及びｔＲＮＡに、ＰＥＧをさらに添加することによる相乗効果］
リポフェクション試薬とｔＲＮＡに加えて、さらにＰＥＧを用いた場合の影響を調べるために、以下のようなリポフェクション実験を行った。【００５２】
ｔＲＮＡとして酵母由来のｔＲＮＡ（Sigma Aldrich社製、「Ribonucleic acid, Type X-SA  transfer from baker's yeast」、Cat#R8759-100UN）を０．６２５μｇ（リポフェクション溶液中の濃度で６．２５μｇ／ｍＬ）用い、哺乳動物細胞として２９３細胞又はＨｅＬａ細胞を用い、及び、リポフェクション溶液にさらにＰＥＧ３３５０（Sigma社製）を５質量％となるように添加したこと以外は、実施例２におけるリポフェクション実験と同じ方法でリポフェクション実験を行った。また、ＰＥＧ３３５０を用いない方法でもリポフェクション実験を行った。さらに、コントロールとして、ｔＲＮＡを用いない方法、及び、ｔＲＮＡを用いないがＰＥＧ３３５０は用いる方法でもリポフェクション実験を行った。これらの結果を図５に示す。【００５３】
図５から分かるように、「リポフェクション試薬及びｔＲＮＡ」に加えて、さらにＰＥＧを用いると、遺伝子導入効率が相乗的にさらに向上することが示された。具体的には、「リポフェクション試薬及びｔＲＮＡ」に加えて、さらにＰＥＧを用いることによって、宿主細胞が２９３細胞の場合は遺伝子導入効率が約５．９倍となり、宿主細胞がＨｅＬａ細胞の場合は遺伝子導入効率が約３．３倍となった。【００５４】
上記図５で実施したリポフェクション実験を、マウスＥ１４ｔｇ２ａ細胞由来のＥＳ細胞、すなわちＥＢ５細胞においても同様に行った。図６から分かるように、「リポフェクション試薬及びｔＲＮＡ」に加えて、さらにＰＥＧを用いると、遺伝子導入効率が相乗的にさらに向上することが示された。具体的には、「リポフェクション試薬及びｔＲＮＡ」に加えて、さらにＰＥＧを用いることによって、ＥＢ５細胞における遺伝子導入効率が約１０倍となった。【００５５】
［参考例１  リポフェクション試薬にＰＥＧを添加することによる効果］
ｔＲＮＡを用いずに、リポフェクション試薬にＰＥＧを添加した場合の影響、及び、ＰＥＧの分子量の影響を調べるために、以下のようなリポフェクション実験を行った。【００５６】
ｔＲＮＡを用いなかったこと、各分子量（６００、１０００、３３５０、６０００、１００００）のＰＥＧをリポフェクション溶液における濃度で０〜３０％（ｗ／ｖ）（リポフェクション溶液中の濃度で０〜３％（ｗ／ｖ））添加したこと以外は、実施例２におけるリポフェクション実験と同じ方法でリポフェクション実験を行った。これらの結果を図７に示す。【００５７】
図７の結果から分かるように、程度に差はあるものの、いずれの分子量のＰＥＧをリポフェクション試薬と併用した場合であっても、ＰＥＧを用いなかった場合（fugene：コントロール）と比較して、遺伝子導入効率の向上効果が見られた。中でも、分子量３３５０のＰＥＧは、リポフェクション溶液における濃度が５％（ｗ／ｖ）のときに、コントロールと比較して２１倍もの遺伝子導入効率を示した。【００５８】
［参考例２  リポフェクション試薬の種類の影響］
参考例１や２では、リポフェクション試薬として、Fugene（登録商標）HD transfection reagent（Roche Applied Science社製）を用いた。そこで、他のリポフェクション試薬を用いた場合であっても、ＰＥＧの遺伝子導入効率向上効果が得られるかを調べるために、以下のようなリポフェクション実験を行った。【００５９】
リポフェクション試薬として、Fugene（登録商標）HD transfection reagent、Lipofectamine（登録商標）2000（invitrogen社製）、Lipofectamine（登録商標）LTX （invitrogen社製）、Lipofectamine（登録商標）LTX plus（invitrogen社製）、Carri Gene（Nitto Denko Tech. corp.社製）、JetPEI（登録商標）（Polyplus-transfection社製）、GeneJuice（登録商標）（Takara Bio社製）、又は、Turbofect（登録商標）（Fermentas社製）を用い、及び、ＰＥＧとして、分子量３３５０のＰＥＧを５％（ｗ／ｖ）で用いたこと以外は、参考例１の方法と同じ方法でリポフェクション実験を行った。また、コントロールとして、ＰＥＧを用いない方法でもリポフェクション実験を行った。これらの結果を図８に示す。【００６０】
図８の結果から分かるように、いずれのリポフェクション試薬を用いた場合も、ＰＥＧを併用すると、遺伝子導入効率が顕著に向上した。【００６１】
［参考例３  宿主細胞の種類による影響］
参考例１〜２では、宿主細胞としてＣＯＳ７細胞を用いた。そこで、宿主細胞として、他の哺乳動物細胞を用いた場合であっても、ＰＥＧの遺伝子導入効率向上効果が得られるかを調べるために、以下のようなリポフェクション実験を行った。【００６２】
宿主細胞として、ＣＯＳ７細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、２９３細胞、又は、ＨｅＬａ細胞を用い、及び、ＰＥＧとして、分子量３３５０のＰＥＧを５％（ｗ／ｖ）で用いたこと以外は、参考例１の方法と同じ方法でリポフェクション実験を行った。また、コントロールとして、ＰＥＧを用いない方法でもリポフェクション実験を行った。これらの結果を図９に示す。【００６３】
図９の結果から分かるように、いずれの哺乳動物細胞を用いた場合も、ＰＥＧを併用すると、遺伝子導入効率が顕著に向上した。具体的には、ＣＯＳ７細胞の場合は、最大値がコントロールと比較して２７倍となり、２９３細胞の場合は、最大値がコントロールと比較して２４倍となり、ＮＩＨ３Ｔ３細胞の場合は、最大値がコントロールと比較して３０倍となり、ＨｅＬａ細胞の場合は、最大値がコントロールと比較して２７倍となった。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明は、哺乳動物細胞への遺伝子導入の分野において、好適に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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