(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
テロメラーゼ活性を誘導するかまたは活性化する化合物であって、該化合物が塩基配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１で示されるポリヌクレオチドから成る化合物。
【請求項２】
テロメラーゼ活性を誘導するかまたは活性化する化合物であって、該化合物が塩基配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１によってコードされるタンパク質若しくはペプチドから成る化合物。
【請求項３】
哺乳動物の細胞の内部においてテロメラーゼ活性の回復を誘導するタンパク質またはペプチドの発現を可能にするポリヌクレオチドの化合物であって、該化合物が、
ａ）ヒトＧＳＥ２４．２の塩基配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１）から成る塩基配列、
ｂ）ａ）の配列と少なくとも９５％の同一度を有する塩基配列、
ｃ）ａ）およびｂ）の配列のいずれかの断片、
ｄ）ａ），ｂ）およびｃ）に属するいずれかの配列を含む塩基配列
に属するいずれか１つの塩基配列によって示されるポリヌクレオチドから成る化合物。
【請求項４】
ＤＮＡ，ｃＲＮＡまたはｍＲＮＡの塩基配列によって示されるポリヌクレオチドを含む請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
前記ａ）のＧＳＥ２４．２の塩基配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１から成ることを特徴とする請求項３に記載の化合物。
【請求項６】
前記ｂ）のＧＳＥ２４．２の塩基配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１３から成ることを特徴とする請求項３に記載の化合物。
【請求項７】
請求項４ないし６に記載の１つまたは幾つかの化合物を含むことを特徴とする遺伝子構造体。
【請求項８】
請求項５ないし６に記載の化合物を含むことを特徴とする発現ベクター。
【請求項９】
発現ベクターがｐＬＮＣＸ２４．２プラスミドであることを特徴とする請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
哺乳動物の細胞の内部においてテロメラーゼ活性を誘導し、そして以下のグループ、すなわち、
ａ）ヒトＧＳＥ２４．２アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２）から成るアミノ酸配列、
ｂ）ａ）の配列と少なくとも９５％の同一度を有するアミノ酸配列、
ｃ）ａ）およびｂ）の配列のいずれかの断片、
ｄ）ａ），ｂ）およびｃ）に属するいずれかの配列を含むアミノ酸配列
に属するいずれか１つのアミノ酸配列を含むことを特徴とするタンパク質またはペプチド。
【請求項１１】
前記ａ）のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２から成ることを特徴とする請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項１２】
前記ｃ）のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１４からなることを特徴とする請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項１３】
請求項３ないし６に記載の化合物、又は請求項７に記載の遺伝子構造体、又は請求項８および９に記載の発現ベクターを含み、請求項１０ないし１２に記載のペプチドまたはタンパク質が適切に発現され得ることを特徴とする遺伝子的に変性された真核生物または原核生物の細胞。
【請求項１４】
ヒト細胞であることを特徴とする請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
テロメラーゼ活性の変質によって生じる疾病の治療用の薬剤または医薬組成物を調製するために請求項１ないし１４に記載の化合物、遺伝子構造体、発現ベクター、タンパク質または細胞を使用する使用方法。
【請求項１６】
前記疾病が以下のグループ、すなわち、老化または老化促進、神経退化病および先天性角化異常症（ｄｙｓｋｅｒａｔｏｓｉｓ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａ）に属することを特徴とする請求項１５に記載の使用方法。
【請求項１７】
テロメラーゼ活性の変質により発生する疾病、障害または病態を治療するための医薬組成物または薬剤であって、請求項３に記載のテロメラーゼ活性を回復することができる化合物または作用剤を含むことを特徴とする医薬組成物または薬剤。
【請求項１８】
テロメラーゼ活性を誘導する化合物または作用剤が以下のグループ、すなわち、請求項３ないし１４に記載の化合物、遺伝子構造体、発現ベクター、タンパク質または細胞に属することを特徴とする請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記化合物が以下のグループ、すなわち、
ａ）ヒトＧＳＥ２４．２の塩基配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１）から成る塩基配列、
ｂ）ａ）の配列と少なくとも９５％の同一度を有する塩基配列、
ｃ）ａ）およびｂ）の配列のいずれかの断片、
ｄ）ａ），ｂ）およびｃ）に属するいずれかの配列を含む塩基配列
に属するいずれか１つの塩基配列によって示されるポリヌクレオチドから成る請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記ａ）の塩基配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１であることを特徴とする請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記ｃ）の塩基配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１３であることを特徴とする請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記化合物が請求項７に記載の遺伝子構造体であることを特徴とする請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記化合物が請求項８および９に記載の発現ベクターであることを特徴とする請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記ベクターがｐＬＮＣＸ２４．２プラスミドであることを特徴とする請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記化合物が、請求項１０ないし１２に記載のたんぱく質であることを特徴とする請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記タンパク質が以下のグループ、すなわち、
ａ）ヒトＧＳＥ２４．２アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２）から成るアミノ酸配列、
ｂ）ａ）の配列と少なくとも９５％の同一度を有するアミノ酸配列、
ｃ）ａ）およびｂ）の配列のいずれかの断片、
ｄ）ａ），ｂ）およびｃ）に属するいずれかの配列を含むアミノ酸配列
に属することを特徴とする請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記ａ）の配列のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２配列である請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記ｃ）の配列のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１４配列である請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記化合物が請求項３ないし９に記載の化合物、遺伝子構造体または発現ベクターによって形質変換された細胞であることを特徴とする請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
テロメラーゼ活性の変質により発生する疾病、障害または病状に冒されている哺乳動物の治療または予防に用いる薬剤の調合のための医薬組成物の使用方法において、その使用方法が、その細胞の内部でテロメラーゼ活性を回復することができる適切な量の請求項１７ないし２６に記載の医薬組成物を使用する使用方法。
【請求項３１】
テロメラーゼ活性の変質により発生しかつヒトを冒している疾病が以下のグループ、すなわち、老化または老化促進、神経退化病、先天性角化異常症、クリ・デュ・シャ（Ｃｒｉ  ｄｕ  ｃｈａｔ）、運動失調毛細管拡張症、ナイメーヘン破壊症候群（Ｎｉｊｍｅｇｅｎ  Ｂｒｅａｋａｇｅ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ブルーム症候群（Ｂｌｏｏｍ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ウェルナー症候群（Ｗｅｒｎｅｒ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ファンコーニ貧血、潰瘍性大腸炎、血管老化、アテローム性動脈硬化症およびガンに属することを特徴とする請求項３０に記載の、薬剤の調合のための医薬組成物の使用方法。
【請求項３２】
前記神経退化病が以下のグループ、すなわち、アルツハイマー病、パーキンソン病、小脳性運動失調症および脊髄変性症に属することを特徴とする請求項３１に記載の、薬剤の調合のための医薬組成物の使用方法。
【請求項３３】
前記疾病がガンであることを特徴とする請求項３１に記載の、薬剤の調合のための医薬組成物の使用方法。
【請求項３４】
前記先天性角化異常症（Ｄｙｓｋｅｒａｔｏｓｉｓ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａ）がＸ−染色体−連鎖形態の先天性角化異常症または常染色体優性の先天性角化異常症であることを特徴とする請求項３１に記載の、薬剤の調合のための医薬組成物の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はヒトの健康に関連する用途による生物学的分野、特に生物学的化合物、即ちヒトの治療用途に関連するポリヌクレオチド、ペプチドおよび形質変換されたヒト細胞に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ジスケリン（図１）は５８−ｋＤ核酸タンパク質であり、該５８−ｋＤ核酸タンパク質はリボ染色体ＲＮＡをプソイドウリジンする支配下で小さいリボ核酸タンパク質中に存在するＳｎｏＲＮＡｓのＨ／ＡＣＡボックスと関連している。他方、それは染色体の末端にテロメア反復を維持するための原因となるテロメラーゼ複合体の成分である。Ｘ−染色体−連鎖型の先天性角化異常症（マーローン等、２００３；ベッセラー等、２００４「Ｍａｒｒｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｂｅｓｓｅｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４」）は骨髄不全を発生する先天性症候群でありそしてガンに対する大きな罹患性と関連している。この型の先天性角化異常症（Ｄｙｓｋｅｒａｔｏｓｉｓ  ｃｏｎｇｅｍｉｔａ）はジスケリン（Ｄｙｓｋｅｒｉｎ）を符号化するＤＫＣ１遺伝子の特殊な突然変異によって発生する。別の常染色体優性の先天性角化異常症があり、この場合に、疾病はテロメラーゼ（ｈＴＲ）のＲＮＡ成分中の突然変異と関連している（ハイス等、１９９８「Ｈｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８」）。先天性角化異常症を有する患者の繊維芽細胞およびリンパ母細胞はテロメラーゼ活性が少なくそしてテロメア（ｔｅｌｏｍｅｒｅ）は疾病に冒されていない細胞のテロメアより短い（シリニアバン等、１９７５；トローブリッジ等、１９７７「Ｓｉｒｉｎｉａｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５；Ｔｒｏｗｂｒｉｇｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７」）。Ｘ−染色体一連鎖型の先天性角化異常症を有する患者の細胞において、テロメラーゼ欠乏はｈＴＥＲＴを転位的に発現することによって克服される（ミッチェル等、１９９９「Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９」）。ｈＴＲの突然変異によって発生される先天性角化異常症において、テロメラーゼ活性を回復する唯一の方法はｈＴＲを発現することである（フュ等、２００３「Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，」）。
【０００３】
テロメアは染色体３´末端におけるＴＴＡＧＧＧ保持配列の５００-２，０００反復から成りそして連続分割によるそれらの短縮は細胞の増殖能力用の制限となる。テロメアはシスプラチンを含んでいる外因性作用物質によって生じるＤＮＡの損傷を受けやすい。シスプラチンは種々の細胞系においてテロメラーゼ活性を抑制することが可能であることが記載されている（石橋等、１９９８；バーガー等、１９９７「Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｂｕｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７」）。この抑制がどのような方法で発生するかについては複数の仮説がある。１つの可能性はＴＴＡＧＧＧテロメアの反復配列におけるシスプラチンを象徴するＧ−Ｐｔ−Ｇ付加物の形成である。その代りに、メルカプト基とシスプラチンとの相互作用は逆転写酵素触媒サブユニット（ｈＴＥＲＴ）にとって不可欠でありそれは同様にｈＴＥＲＴ発現の減少に起因する（バーガー等、１９９７「Ｂｕｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７」）。
【発明の開示】
【０００４】
本発明の１つの目的は哺乳動物、好ましくはヒトの細胞の内部におけるテロメラーゼ活性を回復することができるジスケリンのＧＳＥ２４．２断片の塩基配列または該塩基配列によってコードされるタンパク質またはペプチド配列に基づいてテロメラーゼ活性を誘導または活性化する化合物、即ち本発明の活性体化合物にある。
【０００５】
本発明の１つの特定の目的は哺乳動物、好ましくはヒトの細胞の内部におけるテロメラーゼ活性を誘導するタンパク質またはペプチドの発現を可能にし、そして以下のグループ、すなわち、
ａ）ヒトＧＳＥ２４．２の塩基配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１）から成る塩基配列、
ｂ）ａ）の配列に類似する塩基配列、
ｃ）ａ）およびｂ）の配列のいずれかの断片、
ｄ）ａ），ｂ）およびｃ）に属するいずれかの配列を含む塩基配列
に属する１つまたは複数のＧＳＥ２４．２の塩基配列からなる化合物、即ち本発明のＧＳＥ２４．２遺伝子配列から成る化合物にある。
【０００６】
本発明に使用されているように、用語「塩基配列」はＤＮＡ，ｃＲＮＡまたはｍＲＮＡ配列に関するものである。
【０００７】
本発明の特定の実施形態は、ａ）のＧＳＥ２４．２の塩基配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１から成る化合物である。
【０００８】
本発明の他の特定の実施形態は、ｂ）ＧＳＥ２４．２の塩基配列が、ＴｒｕｂＩおよびＴｒｕｂＩＩペプチド領域（実施例１．７）をそれぞれコードするＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１３から成る化合物である。
【０００９】
本発明の他の特定の目的はＧＳＥ２４．２の塩基配列を含むＧＳＥ２４．２遺伝子構造体にある。
【００１０】
本発明の他の特定の目的は本発明に記載されたＧＳＥ２４．２の塩基配列またはＧＳＥ２４．２遺伝子構造体を含み、哺乳動物、好ましくはヒトの細胞の内部におけるテロメラーゼ活性を回復することができるタンパク質またはペプチドの発現を可能にするＧＳＥ２４．２発現ベクターにある。この特別な実施形態の１例は本発明のｐＬＮＣＸ２４．２発現ベクターである（実施例参照）。
【００１１】
加えて、本発明の他の特定の目的は哺乳動物、好ましくはヒトの細胞の内部におけるテロメラーゼ活性を回復するのに向けられる活性を備え、かつ以下のグループ、すなわち、
ａ）ヒトＧＳＥ２４．２アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２）から構成されるアミノ酸配列、
ｂ）ａ）の配列に類似するアミノ酸配列、
ｃ）ａ）およびｂ）の配列のいずれかの断片、
ｄ）ａ），ｂ）およびｃ）に属するいずれかの配列を含むアミノ酸配列
に属する１つまたは複数のアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチド、即ち本発明のＧＳＥ２４．２タンパク質にある。
【００１２】
本発明の他の特定の実施形態は前記ａ）のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２から構成されるタンパク質である。
【００１３】
本発明の他の特定の実施形態は前記ｃ）のアミノ酸配列、その断片がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１４から構成されるタンパク質である。
【００１４】
他方で、本発明の他の追加の目的は本発明のＧＳＥ２４．２の塩基配列、又は構造体、又は発現ベクターを含みかつ本発明のＧＳＥ２４．２ペプチドまたはタンパク質が適切に発現され得る遺伝子的に変性された真核生物の−好ましくはヒトの−または原核生物の細胞、即ち本発明のＧＳＥ２４．２細胞にある。
【００１５】
それゆえ、本発明の他の目的は本発明の範囲をこれに限定することなく、以下のグループ、すなわち、老化または老化促進、神経退化病および先天性角化異常症に属するテロメラーゼ活性の変質、好ましくは、減少によって発生される疾病の薬剤または治療用医薬組成物を調製するために本発明のＧＳＥ２４．２活性対化合物を使用する使用方法にある。
【００１６】
本発明の他の目的は任意に１つまたはそれ以上の医薬的に許容し得る補助剤および／または賦形剤と共同してテロメラーゼ活性を回復することができる治療的に有効な量の化合物または作用剤を含みかつテロメラーゼ活性の発生および維持を刺激することができるテロメラーゼ活性の変質、好ましくはその活性の減少により発生する疾病、障害または病態の治療用の医薬組成物または薬剤、即ち本発明の医薬組成物にある。
【００１７】
本発明の他の目的はテロメラーゼ活性を回復することができる化合物または作用剤が以下のグループ、すなわち、哺乳動物、好ましくはヒトの細胞の内部におけるテロメラーゼ活性を回復することができるタンパク質またはペプチドの発現を可能にするＧＳＥ２４．２配列、遺伝子構造体または発現ベクターに属する本発明の医薬組成物にある。
【００１８】
本発明の特定の実施形態はテロメラーゼ活性を回復することができる化合物または作用剤が、以下のグループ、すなわち、
ａ）ヒトＧＳＥ２４．２の塩基配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１）からなる塩基配列、
ｂ）ａ）の配列に類似する塩基配列、
ｃ）ａ）およびｂ）の配列のいずれかの断片、
ｄ）ａ），ｂ）およびｃ）に属するいずれかの配列を含む塩基配列
に属している１つまたは複数のＧＳＥ２４．２配列によって示されるポリヌクレオチドから成る本発明の医薬組成物にある。
【００１９】
本発明の他の特定の実施形態はａ）の塩基配列がＧＳＥ２４．２の塩基配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１）である本発明の医薬組成物である。
【００２０】
本発明の他の特定の実施形態はｃ）の塩基配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１３である本発明の医薬組成物である。
【００２１】
本発明の他の特定の実施形態は塩基配列が発現ベクター、好ましくは、ｐＬＮＣＸ２４．２ベクターである本発明の医薬組成物である。
【００２２】
本発明の他の特定の目的はテロメラーゼ活性を回復することができる化合物または作用剤が本発明のＧＳＥ２４．２配列、遺伝子構造体または発現ベクターによって符号化されたタンパク質またはペプチドである本発明の医薬組成物にある。
【００２３】
本発明の特定の実施形態はＧＳＥ２４．２タンパク質またはペプチドが以下のグループ、すなわち、
ａ）ヒトＧＳＥ２４．２アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２）から構成されるアミノ酸配列、
ｂ）ａ）の配列に類似するアミノ酸配列、
ｃ）ａ）およびｂ）の配列のいずれかの断片、
ｄ）ａ），ｂ）およびｃ）に属するいずれかの配列を含むアミノ酸配列
に属する本発明の医薬組成物である。
【００２４】
本発明の他の特定の実施形態はａ）の配列のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２である本発明の医薬組成物である。
【００２５】
本発明の他の特定の実施形態はｃ）のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１４配列である本発明の医薬組成物である。
【００２６】
本発明の他の特定の目的はテロメラーゼ活性化合物または作用剤がＧＳＥ２４．２配列、遺伝子構造体または発現ベクターによって形質変換された細胞、好ましくはヒト細胞である本発明の医薬組成物にある。
【００２７】
本発明の他の目的は細胞内部のテロメラーゼ活性の回復を可能にする適切な投与量における医薬組成物の投与からなっているテロメラーゼ活性の変質、好ましくは減少により発生する疾病、障害または病態に冒されている哺乳動物、好ましくはヒトの治療または予防方法において本発明の医薬組成物を使用する使用方法にある。
【００２８】
本発明の他の特定の目的はテロメラーゼ活性の変質により発生しかつヒトが有している以下のグループ、すなわち、老化または老化促進、神経退化病、先天性角化異常症（Ｄｙｓｋｅｒａｔｏｓｉｓ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａ）、クリ・デュ・シャ（Ｃｒｉ  ｄｕ  ｃｈａｔ）、毛細管拡張性運動失調、ナイメーヘン遮断症候群（Ｎｉｊｍｅｇｅｎ  Ｂｒｅａｋａｇｅ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ブルーム症候群（Ｂｌｏｏｍ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ウェルナー症候群（Ｗｅｒｎｅｒ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、ファンコーニ貧血（Ｆａｎｃｏｎｅ´ｓ  ａｎａｅｍｉａ）、潰瘍性大腸炎、血管老化、アテローム性動脈硬化症およびガンに属している疾病または障害の治療方法における本発明の医薬組成物の使用にある。
【００２９】
本発明の他の特定の実施形態は以下のグループ、すなわち、アルツハイマー病、パーキンソン病、小脳性運動失調症および脊髄変性症に属している神経退化病の治療方法において本発明の医薬組成物を使用するものである。
【００３０】
本発明の他の特定の実施形態はＸ−染色体−連鎖型先天性角化異常症の治療方法において本発明の医薬組成物を使用するものである。
【００３１】
本発明の他の特定の実施形態は常染色体優性の先天性角化異常症の治療方法において本発明の医薬組成物を使用するものである。
【００３２】
本発明はテロメラーゼ活性の変質により発生する疾病、特に先天性角化異常症の治療用の新規な治療具を提供する課題に取り組んでいる。
【００３３】
本発明は本発明者等がジスケリンの内部配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２）を発現するジスケリンのｃＤＮＡ断片、即ち断片ＧＳＥ２４．２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１）発現が先天性角化異常症を有する患者の細胞中のおよびＶＡ１３細胞（実施例３）中のテロメラーゼ活性の欠乏を補償するということを立証したことに基礎を置いている。特に、先天性角化異常症を有する患者の細胞およびＶＡ１３細胞がＧＳＥ２４．２配列でトランスフェクトされるとき、テロメラーゼ活性を回復することに加えて、ｈＴＥＲＴおよびｈＴＲのレベルの増加がある。実際に、ＧＳＥ２４．２ペプチドの発現がテロメラーゼプロモーターの基本活性を増加し、そしてシスプラチンによる治療後に、２４．２細胞もまた多くの活性を有することが観察された。不思議なことに、コリンズ等（Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．）は、これらの同一の患者の細胞において、テロメラーゼ活性がｈＴＥＲＴ遺伝子を過発現することによってのみ回復されるが、これらの患者において突然変異されるタンパク質、即ちジスケリンを発現することによっては回復されないことを以前に発表した（ミッチェル等、１９９９「Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９」）。
【００３４】
ジスケリンの突然変異がテロメラーゼＲＮＡの蓄積に影響を及ぼすことが文献に記載されており（望月等、２００４「Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４」）、それゆえ、ＧＳＥ２４．２ペプチドによって生じる作用は、ｈＴＥＲＴレベルの増加がテロメラーゼ複合体の形成を安定化させることができるので、ｈＴＥＲＴレベルの増加およびｈＴＲの大きな安定化に起因し、それによってｈＴＲの劣化を阻止する。この関連において、本発明においては、ＧＳＥ２４．２ペプチドによりトランスフェクトされた細胞において、ｈＴＲではなく、ｈＴＥＲＴタンパク質プロモーターがｃ−ｍｙｃ発現に依存する方法において、とくに、プロモーターのプリンの豊富なＰ１領域（ｒｅｇｉｏｎ）に配置されたＮＨＥＩＩＩ領域に対するその結合によって構成的に活性化され（Ｐｕ２７、実施例２参照）、かくして転写因子がＤＮＡをアクセスできる方法において、ＤＮＡの２次的配座の変化を可能にする。その二次的構造を変性するこの領域の配列のあらゆる変化はＧＳＥ２４．２ペプチドの活性を変更する。
【００３５】
同様に、ヒトＧＳＥ２４．２ペプチドと等価の配列（イーストのＣＢＦ５、エス・セレヴシアエ  ＣＢＦ５「ＣＢＦ５  ｏｆ  ｙｅａｓｔ，Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＢＦ５」）はｈＴＥＲＴの活性化と同様な活性（データは示さない）を有し、ジスケリンのこの領域（ｄｏｍａｉｎ）の活性における高度の機能的な保存を指示し、かくして本発明に使用され得るＧＳＥ２４．２と類似する素子または配列の多数の可能性を特定しかつ例示する。
【００３６】
更に、このＧＳＥ２４．２ペプチドは、シスプラチンに対する生存能力を有するヒト細胞系を備えている（実施例１）。２４．２細胞系はテロメラーゼ１の阻害物質の面の生存能力を増加する。この阻害物質はテロメラーゼ中にＧ−四重体（Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘｅｓ）を形成しかつテロメラーゼ活性を減少するシスプラチンと同様の作用メカニズムを有する（サン等、１９９７「Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７」）。ｈＴＥＲＴ介在配列（イントロン）中にＧ−四重体を形成する配列も記載されており、この阻害物質がまたｈＴＥＲＴレベルを減少することが可能であり、それによってまたテロメラーゼ活性を減少する（ルマテルール等、２００４「Ｌｅｍａｔｅｌｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４」）。
【００３７】
シスプラチンとテロメラーゼの阻害物質との双方がテロメラーゼ活性を妨害することができるＧ−四重体の形成を安定化する（レドン等、２００１「Ｒｅｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１」）ことを心に留めて、ＧＳＥ２４．２ペプチドはこれらのＧ−四重体の形成を抑制または減少することによってこれらの阻害物質の抗力を減少することができるか、またはｈＴＥＲＴレベルを増加することができ、かくして他のメカニズムによってテロメラーゼ活性を増加する。
【００３８】
遺伝子抑制素子（ＧＳＥｓ）はペプチドまたはＲＮＡアンチ−センス抑制遺伝子を符号化しかつ哺乳動物の細胞中の遺伝子発現について優性形質方法で作用する生物学的に活性のｃＤＮＡ断片である。ＧＳＥ２４．２はヌクレオチド２６８ないし４３３を含みかつＴＲＵＢ（図２ｂ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１２および１４参照）と呼ばれる異なる種の２つの高度に保存された領域（ドメイン）によって形成される配列に対応する１６５−ｐｂ断片である。これらの領域はｓｎｏＲＮＡｓのプソイドウリジン化において重要な機能を有すると思われ（ズッチーニ等、２００３；パン等、２００３「Ｚｕｃｃｈｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３」）、より意外なことに、個別にクローン化されたかかる領域により調製されたヌクレオチド配列は５５アミノ酸の最初に記載した全体の配列ようにテロメラーゼプロモーターの基本活性を増加した（実施例１．７、図８ｃ）。シスプラチンに対する抵抗を誘導しかつテロメラーゼ活性の欠乏を補償するこの活性は完全なタンパク質（ＳＥＱ  ＩＤ  ４）またはアミノ酸末端断片があらゆる活性を少しも持たないので、ＧＳＥ２４．２配列に見出されるジスケリンの領域に単に配置されている。最後に、これらの結果は、ＧＳＥ２４．２素子又はその誘導体がテロメラーゼ活性を回復する薬剤として使用され得るようにテロメラーゼ複合体の変質（テロメアの短縮及び細胞老化又は幹細胞の疾病）によって発生されるヒト障害または疾病に関する新規な治療的期待を開く。更に、細胞表現型中のテロメアの短縮、骨髄不全、免疫抑制およびガンに対する素因を含むＤＣ以外の異なる症候群が存在する。テロメア遺伝子はそれらのいずれかの突然変異に影響を及ぼされないが、テロメラーゼ置換およびテロメラーゼ活性がある。
【００３９】
それゆえ、本発明の１つの目的はジスケリンのＧＳＥ２４．２断片の塩基配列または哺乳動物、好ましくはヒトの細胞の内部にテロメラーゼ活性を回復することができる前記塩基配列によってコードされるタンパク質又はペプチド配列に基づいてテロメラーゼ活性を誘導又は活性化する化合物、即ち本発明の活性体化合物にある。
【００４０】
本発明に使用される用語「テロメラーゼを誘導又は活性化する化合物」は強さを増強するかまたはその生物学的活性の存続時間を延長する分子に関するものである。この定義は更にＧＳＥ２４．２タンパク質をコードするヌクレオチド配列の発現を可能にするそれらの化合物または分子を包含している。活性体化合物はペプチド、タンパク質またはポリヌクレオチドから構成することができる。
【００４１】
かくして、本発明の特定の目的は哺乳動物、好ましくはヒトの細胞の内部においてテロメラーゼ活性の回復を誘導するたんぱく質またはペプチドの発現を可能にし、かつ以下のグループ、すなわち、
ａ）ヒトＧＳＥ２４．２の塩基配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１）から成る塩基配列、
ｂ）ａ）の配列に類似する塩基配列、
ｃ）ａ）およびｂ）の配列のいずれかの断片、
ｄ）ａ），ｂ）およびｃ）に属するいずれかの配列を含む塩基配列
に属している１つまたは複数のＧＳＥ２４．２の塩基配列から構成される化合物、即ち、本発明のＧＳＥ２４．２遺伝子配列から成る化合物にある。
【００４２】
この記載に使用される意味において、用語「類似する」は本明細書に示される配列に基づいて単離または構成することができるあらゆるヌクレオチド配列を含むこと、例えば、ＧＳＥ２４．２配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２）またはその断片（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１４）の活性を真似ることができるペプチドまたはタンパク質を符号化することができる１つまたはそれ以上のヌクレオチドの挿入、分子の末端のいずれかにおける１つまたはそれ以上のヌクレオチドの追加、または配列の末端またはその配列の内部における１つまたはそれ以上のヌクレオチドの削除を含んでいる保存または非保存のヌクレオチド置換を導入することによって単離または構成することができるあらゆるヌクレオチド配列を包含することを意図している。
【００４３】
ジスケリン酵素は幾つかの有機体中に存在するプソイドウリジン合成酵素のファミリーに属している（図３Ｂ参照、ミッチェル等、１９９９「Ｍｉｔｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９」）。本発明に示された情報及び自然界に認知されている各種の有機体に基づいて、当業者は本発明に示した塩基配列に類似する塩基配列を単離または構成することができる。
【００４４】
一般に、類似の塩基配列は上述した塩基配列と実質上相同である。この記載に使用される意味において、表現「実質上相同」は当該の塩基配列が少なくとも３０％、好ましくは少なくとも８５％、またはより好ましくは少なくとも９５％の同一度を有することを意味する。
【００４５】
本発明に使用される用語「塩基配列」はＤＮＡ，ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列に関するものである。
【００４６】
本発明の特定の実施形態はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１から構成されるａ）のＧＳＥ２４．２配列の塩基配列である。
【００４７】
本発明の他の特定の実施形態はＴｒｕｂＩおよびＴｒｕｂＩＩペプチド領域をそれぞれ符号化するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１３から構成されるｂ）のＧＳＥ２４．２配列の塩基配列である（実施例１．７）。
【００４８】
ｄ）として識別されたＧＳＥ２４．２ヌクレオチド配列はＧＳＥ２４．２遺伝子構造体に対応する。本発明のこのＧＳＥ２４．２遺伝子構造は必要ならばかつ発現されたペプチドの良好な単離、検出または細胞質分泌を可能にするために、前記ペプチドの単離、検出または細胞質分泌のために使用され易いペプチドをコードする塩基配列を含むこともできる。それゆえ、本発明の他の特定の目的はＧＳＥ２４．２塩基配列に加えて、発現されたペプチドの単離、検出または細胞質分泌を許容するペプチドまたはペプチド配列をコードするあらゆる他の塩基配列を含み、例えば、図示のためでかつ本発明の範囲をこれに限定することなく、ポリヒスチジン配列（６ｘＨｉｓ）、単クローン抗体によって識別し得るペプチド配列（例えば、その識別のため）、または免疫親和性クロマトグラフによって生じる溶融タンパク質を純化するのに使用され得るあらゆる他のペプチド、すなわち、ｃ−ｍｙｃ，ＨＡ，Ｅ−ｔａｇのごときｔａｇペプチドを含むＧＳＥ２４．２遺伝子構造体を提供することにある（「使用している抗体、実験マニュアル」、エド・ハーロー、およびデイビッド・レーン著、ニューヨーク州所在のコールド・ハーバー・ラボラトリー・プレス、童、タッギングタンパク質。第３４７頁乃至第３７７頁「“Ｏｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｋｉｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ”，Ｅｄ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  ｄａｎｅ（１９９９）．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．Ｃｈａｐｔｅｒ：Ｔａｇｇｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｐｐ．３４７−３７７」）。
【００４９】
上述したＧＳＥ２４．２の塩基配列およびＧＳＥ２４．２遺伝子構造は従来技術において広く知られている技術を使用することにより当業者によって得ることができる（サムブルック等著、「分子クローニング、実験マニュアル」、第２版、ニューヨーク州に所在のコールド・ハーバー・ラボラトリー・プレス社、１９８９年、第１乃至第３巻「Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，１９８９．ｖｏｌｓ．１−３」）。前記ヌクレオチド配列は細胞の内部における適宜な条件下でのその発現の調整を可能にする遺伝子発現ベクターに統合され得る。
【００５０】
それゆえ、本発明の他の特定の目的は哺乳動物、好ましくはヒトの細胞の内部においてテロメラーゼ活性を回復することができるたんぱく質またはペプチドの発現を可能にする本発明に記載したＧＳＥ２４．２の塩基配列またはＧＳＥ２４．２遺伝子構造体を含むＧＳＥ２４．２発現ベクターを提供することにある。特定の実施形態の１例は本発明のｐＬＮＣＸ２４．２発現ベクターである（実施例１および２参照）。
【００５１】
一般に、発現ベクターは本発明に示されたＧＳＥ２４．２ヌクレオチド配列または
ＧＳＥ２４．２遺伝子構造体に加えて、それに有効に結合されるその転写（例えば、ｐ７７，ｐｌａｃ，ｐｔｒｃ，ｐｔａｃ，ｐＢＡＤ，ｒｅｔ等）を行うプロモーターと、前記転写を制御および調整する他の必要なまたは適切な配列と、妥当ならば、生成物の翻訳、例えば、転写開始及び終了信号（ｔｌｔ２等）、ポリアデニレーション信号（ｐｏｌｙａｄｅｎｙａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ）、複製起源、リボソーム結合配列（ＲＢＳ）、転写調整体符号化配列（エンハンサー）、転写サイレンサー（ｔｒａｎｅｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｓｉｌｅｎｃｅｒｓ）、抑制体等を含んでいる。適切な発現ベクターの例は各特殊な場合の条件および要求を基づいて発現プラスミド、ウイルスベクター（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、コスミド、人工染色体等の中から選択することができ、加えて、重要な１つまたは複数の遺伝子によりトランスフェクトされるかまたは形質転換された細胞を選択するのに使用され得るマーカーを包含してもよい。ベクターの選択はホスト細胞および意図される使用の型に依存する。それゆえ、本発明の特定の実施形態によれば、前記ベクターはプラスミドまたはウイルスベクターである。該ベクターは当業者によって公知の従来の方法によって得ることができ、同様に、微小有機体および真核生物細胞の形質転換に種々の広く知られた方法が使用することができ、それらの方法は化学的形質転換、電気穿孔方法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、顕微鏡注射（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）等であり、これらの方法は種々のマニュアル（サムブルック・ジェイ、フリティッシュ・イー・エフ、およびマニアティス・ティー著、１９８９、分子クローニング：実験マニュアル、第２版、ニューヨーク州、コールド・スプリング・ハーバーに所在のコールド・スプリング・ハーバー研究所「Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｅｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．２ｍｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．」）に記載されている。
【００５２】
加えて、本発明の他の特定の目的は哺乳動物、好ましくはヒトの細胞の内部におけるテロメラーゼ活性を回復することを目的とした活性を有しかつ以下のグループ、すなわち、
ａ）ヒトＧＳＥ２４．２アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２）から構成されるアミノ酸配列、
ｂ）ａ）の配列に類似するアミノ酸配列、
ｃ）ａ）およびｂ）の配列のいずれかの断片、
ｄ）ａ），ｂ）およびｃ）に属するいずれかの配列を含むアミノ酸配列
に属する１つまたは複数のアミノ酸配列を含むタンパク質またはペプチド、即ち本発明のＧＳＥ２４．２タンパク質にある。
【００５３】
この記載に使用される意味において、用語「類似する」は本明細書に示した配列に基づいて単離または構成することができるあらゆるアミノ酸配列を含むこと、例えば、１つまたはそれ以上のアミノ酸の挿入、分子の末端のいずれかにおける１つまたはそれ以上のアミノ酸の追加、または配列のあらゆる末端でのまたは内部における１つまたはそれ以上のアミノ酸の削除を含んでおりかつＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２のテロメラーゼ回復活性を真似る保存または非保存のアミノ酸置換を導入することによって単離または構成されことができるあらゆるアミノ酸配列を包含することを意図している。
【００５４】
ジスケリン酵素は複数の有機体中に存在するプソイドウリジン合成酵素のファミリーに属している（図３Ｂ参照、ミッチェル等、１９９９「Ｍｉｔｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９」）。本発明に示された情報かつ自然界に認められる種々の有機体を基礎にして、当業者は本発明に示されるアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列を単離または構成することができる。
【００５５】
一般に、類似のアミノ酸配列は上述したアミノ酸配列と実質上相同である。この記載に使用される意味において、表現「実質上相同」はアミノ酸配列が少なくとも３０％、好ましくは少なくとも８５％、またはより好ましくは少なくとも９５％の同一度を有することを意味する。
【００５６】
本発明の他の特定の実施形態はａ）のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２から構成されているタンパク質である。
【００５７】
本発明の他の特定の実施形態はｃ）のアミノ酸配列のその断片がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１４から構成されているタンパク質である。
【００５８】
他方において、本発明の他の追加の目的は本発明のＧＳＥ２４．２ヌクレオチド配列、構造体および発現ベクターを含みかつ本発明のＧＳＥ２４．２ペプチドまたはタンパク質が適切に発現され得る遺伝子的に変性された真核生物の−好ましくはヒトの−または原核生物の細胞、即ち本発明のＧＳＥ２４．２細胞を提供することにある。これらの細胞は当業者に知られる遺伝子工学技術を使用するヌクレオチド配列によって形質転換されるか、インフェクトされるかまたはトランスフェクトさせることができ（サムブルック・ジェイ、フリティッシュ・イー・エフ、およびマニアティス・ティー著、１９８９年、分子クローニング、実験マニュアル、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・研究所「Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ」）そして本発明の一部分である。これらの細胞は医薬組成物、即ち前記ヌクレオチド配列の組み換え型の増幅の基礎を形成できるテロメラーゼ活性を回復することができるペプチドの生成に有用であるか、または遺伝子治療等用の細胞としてそれ自体有用である。特定の実施形態はヒトの組織再生用の細胞として使用され得る種々の細胞菌株からこれらのＧＳＥ２４．２ヌクレオチド配列によって形質転換されたヒト細胞である。
【００５９】
遺伝子発現系はホスト細胞ゲノムに新規な遺伝子材料の統合を可能にするかまたは可能にしない。かくして、ＧＳＥ２４．２の塩基配列、遺伝子構造または発現ベクターはテロメラーゼ活性の変質により発生する疾病に冒されているヒトの治療および予防の遺伝子治療方法においてテロメラーゼ活性の変質により冒されたホスト細胞、好ましくはヒト細胞を保護するための薬剤として使用され得る。同様に、本発明のＧＳＥ２４．２細胞はヒトの組織または細胞の再生または移植用薬剤として使用することができる。生物薬剤手段および遺伝子治療方法は、本発明の明細書に記載された情報により、それらが比較的容易に開発され得るように当業者に十分に知られている。そのうえ、タンパク質またはペプチドおよび細胞自体は生物薬剤となる。
【００６０】
それゆえ、本発明の他の目的は図示のためでかつ本発明の範囲を制限することなしに以下のグループ、すなわち、老化または老化促進、神経退化病、先天性角化異常症、クリ・デュ・シャ（ＣｄＣ，ＯＭＩＭ  １２３４５０）、運動失調毛細管拡張症（ＡＴ，ＯＭＩＭ  ２０８９００）、ナイメーヘン破壊症候群（ＮＢＳ，ＯＭＩＭ  ２５１２６０）、ブルーム症候群（ＢＳ，ＯＭＩＭ  １０９００）、ウェルナー症候群（ＷＳ，ＯＭＩＭ２７７９００）、ファンコーニ貧血（ＦＡ，ＯＭＩＭ  ２２７６５０）、潰瘍性大腸炎、血管老化、アテローム性動脈硬化症およびガンに属しているテロメラーゼ活性の変質、好ましくは減少により発生された疾病の治療用の薬剤または医薬組成物の調製における本発明のＧＳＥ２４．２活性体化合物の使用にある。
【００６１】
最近行われた研究はテロメラーゼ活性の維持における欠乏と骨髄不全を有する他の症候群との間の潜在的な関係を際立たせた。先天性角化異常症を有する患者の死亡の主たる原因は日和見感染または出血（原因の７０％において）によって発生される骨髄不全である。他の死亡原因は肺疾患およびガンである。
【００６２】
クリ・デュ・シャ病（ＣｄＣ，ＯＭＩＭ  １２３４５０）は染色体５の短いアームの欠失と関連する先天的な遺伝性症候群であり、そして１：２０，０００および１：５０，０００の頻度で現れ、深刻な精神遅滞（２０以下のＩＱ）に冒された患者の頻度は１％に達する。
【００６３】
運動失調毛細管拡張症（ＡＴ，ＯＭＩＭ  ２０８９００）はＡＴＭ遺伝子の突然変異によって生じる常染色体劣性症候群である。問題は寿命の２ないし５年の間に現れかつ進行性神経退化（大脳運動失調症）、目の毛細管拡張症、免疫不全、性機能低下症、ゲノム不安定性、早老化、軽い糖尿病、小人及びガンに対する素因（リンパ腫および白血病）からなる。
【００６４】
ナイメーヘン遮断症候群（ＮＢＳ，ＯＭＩＭ  ２５１２６０）はニブリン遺伝子の突然変異または損失によって発生される常染色体劣性疾病である。この症候群は小頭症、破壊的顔面外観、知能の遅れた成長、進行性精神遅滞およびリンパ腫および呼吸管感染に対する強力な素因を特徴とする。
【００６５】
ブルーム症候群（ＢＳ，ＯＭＩＭ  ２1０９００）およびウェルナー症候群（ＷＳ，ＯＭＩＭ２７７９００）。ＢＳはｒｅｃＱ遺伝子の突然変異、即ちヘリケース活性を有するタンパク質によって誘導される常染色体劣性症候群である。ＷＳは、また、ヘリケースｒｅｃＱの突然変異によって発生される常染色体劣性症候群である。両疾病は加速された老化を特徴とするものであり、アテローム性動脈硬化症、骨粗鬆症、糖尿病、両眼白内障およびある種の腫瘍、とくに肉腫（ＷＳ）および白血病（ＢＳ）に対する素因を含んでいる。
【００６６】
ファンコーニ貧血（ＦＡ，ＯＭＩＭ  ２２７６５０）は、多数の発育欠乏、骨髄不全症、骨髄白血病の発生率の一千倍の増加および固体腫瘍を発生する強力な素因を特徴とする常染色体劣性疾病である。突然変位担体中の疾病の発生の頻度は１：１００である。
【００６７】
潰瘍性大腸炎は１００人中のスペイン人の１人が冒される疾病である。それは遺伝的かつ環境的要因が介入する自己免疫起源を有すると考えられている。潰瘍性大腸炎は小腸が冒され、その結果の潰瘍化、粘液バリヤの破裂および結腸粘膜の萎縮を有する結腸葉の慢性炎症を特徴とするものである。ガンの危険は疾病の持続時間により増加しそして結腸およびリンパ腫のごとき多数の器官に発生する。
【００６８】
他方では、細胞老化の結果はアテローム性動脈硬化症を含んでいる。一方では、テロメラーゼ機能障害はアテローム性動脈硬化性プラークにより血管内に存在する。血管原種細胞中のテロメラーゼの再活性はこれらの細胞の分化能力および脈管形成を増大する。これらの原種細胞の損失は重大な血管機能障害に寄与し、それゆえ、抗老化治療は老化およびアテローム性動脈硬化症の血管作用を一時的に和らげるような新規のアプローチを提供する。
【００６９】
最後に、本発明のＧＳＥ２４．２素子の他の潜在的な適用に関し、いったん、この素子の生物学的活性を実施し、そのメカニズム、またはメカニズムの１つを知れば、その素子をＮＨＥＩＩＩ領域（ｒｅｇｉｏｎ）に結合することにより非常に幅を広くすることができる。この領域には、他のプロモーターのこのポリプリン配列の幾つかの例が存在するが、しかしこのポリプリン領域はＣＣＲ５およびＰＤＧＦＡ遺伝子のプロモーター領域に配置されている。他方で、ｎｍ２３Ｈ１転移抑制ペプチド（ヨシロウ・オー等、２００１；グラント等、２００４）が存在するけれども、このＮＨＥ領域（ｄｏｍａｉｎ）と互いに影響し合う幾つかの転写因子が知られている。この関連において、本発明のＧＳＥ２４．２素子は腫瘍成長および潰瘍の転移拡散の抑制因子として使用することができ、それは本発明の一部分である。
【００７０】
本発明に使用される用語「神経退化病」は、とくに、図示のために、以下の
グループ、すなわち、アルツハイマー病、パーキンソン病、小脳性運動失調症および脊髄変性症に属している疾病に関するものである。
【００７１】
本発明の他の目的はテロメラーゼ活性の発生および維持を刺激することができる１つまたはそれ以上の治療的に許容できる補助薬および／または賦形剤と結合するテロメラーゼ活性を回復することができる治療的に有効な量の化合物または作用剤を含んでいるテロメラーゼ活性の変質、好ましくは活性の減少により発生する疾病、障害または病態の治療用の医薬組成物または薬剤、即ち本発明の医薬組成物にある。
【００７２】
前記組成物に使用され得る治療的に許容し得る補助薬および賦形剤は治療組成物の調製に習慣的に使用される当業者に知られている補助薬および賦形剤である。
【００７３】
この記載に使用される意味において、表現「治療的に有効な量」は所望の効果を発生するために計算されたテロメラーゼ活性を回復することができる作用剤または化合物の量に関するものであり、一般に、それは他の原因の中で患者の年令および状態、変質または障害の重大さ、および投与のルートおよび頻度を含んでいる化合物の特性によって決定される。
【００７４】
他の特定の実施形態において、前記治療組成物は治療的に許容し得る希釈剤中において固体形状または水性懸濁液で調製される。本発明によって提供される治療組成物は適切な投与ルートによって投与することができ、このため、前記組成物は選択された投与ルートに適切な医薬形状で調合される。特定の実施形態において、本発明によって提供される治療組成物の投与は非経口ルート、経口ルート、腹腔内ルート、皮下ルート等によって実施される。薬剤投与の種々の医薬形状およびそれらを得るのに必要な添加剤の説明は、例えば、「トラタド・デ・ファルマシア・ガレニカ」、シー・ファウリ・イ・トリロ、１９９３、ルサン５、Ｓ．Ａ、エデシオネス、マドリッド（「Ｔｒａｔａｄｏ  ｄｅ  Ｆａｒｍａｃｉａ  Ｇａｌｅｎｉｃａ」，Ｃ．Ｆａｕｌｉ  ｉ  Ｔｒｉｌｌｏ，１９９３，Ｌｕｚａｎ  ５，Ｓ．Ａ．Ｅｄｉｃｉｏｎｅｓ，Ｍａｄｒｉｄ）に見出され得る。
【００７５】
本発明の他の特定の目的はテロメラーゼ活性を回復することができる化合物または作用剤が以下のグループ、すなわち、哺乳動物、好ましくはヒトの細胞の内部におけるテロメラーゼ活性を回復することができるタンパク質またはペプチドの発現を可能にするＧＳＥ２４．２配列、遺伝子構造体またはベクターに属する本発明の医薬組成物にある。
【００７６】
本発明の特定の実施形態はテロメラーゼ活性を回復することができる化合物または作用剤が以下のグループ、すなわち、
ａ）ヒトＧＳＥ２４．２の塩基配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１）から成る塩基配列、
ｂ）ａ）の配列に類似する塩基配列、
ｃ）ａ）およびｂ）の配列のいずれかの断片、
ｄ）ａ），ｂ）およびｃ）に属するいずれかの配列を含む塩基配列
に属する１つまたは複数のＧＳＥ２４．２の塩基配列によって示されるポリヌクレオチドから成る本発明の医薬組成物である。
【００７７】
本発明の他の特定の実施形態はａ）の塩基配列がＧＳＥ２４．２の塩基配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１）である本発明の医薬組成物である。
【００７８】
本発明の他の特定の実施形態はｃ）の塩基配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１３塩基配列である本発明の医薬組成物である。
【００７９】
本発明の他の特定の実施形態は塩基配列がベクター、好ましくはｐＬＮＣＸ２４．２ベクターである本発明の医薬組成物である。
【００８０】
本発明の他の特定の目的はテロメラーゼ活性を回復することができる化合物または
作用剤が本発明のＧＳＥ２４．２配列、遺伝子構造またはベクターによって符号化されるタンパク質またはペプチドである本発明の医薬組成物にある。
【００８１】
本発明の特定の実施形態はＧＳＥ２４．２タンパク質またはペプチドが以下のグループ、すなわち、
ａ）ヒトＧＳＥ２４．２アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２）から成るアミノ酸配列、
ｂ）ａ）の配列に類似するアミノ酸配列、
ｃ）ａ）およびｂ）の配列のいずれかの断片、
ｄ）ａ），ｂ）およびｃ）に属するいずれかの配列を含むアミノ酸配列
に属する本発明の医薬組成物である。
【００８２】
本発明の他の特定の実施形態はａ）のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ２配列である本発明の医薬組成物である。
【００８３】
本発明の他の特定の実施形態はｃ）のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１４配列である本発明の医薬組成物である。
【００８４】
本発明の他の特定の目的はテロメラーゼを活性化する化合物または作用剤がＧＳＥ２４．２配列、構造またはベクターによって形質転換される細胞、好ましくはヒト細胞である本発明の医薬組成物にある。
【００８５】
本発明の他の目的はその細胞の内部においてテロメラーゼ活性の回復を可能にする適切な投与量における医薬組成物の投与からなっているテロメラーゼ活性の変質により発生する疾病、障害または病体に冒されている哺乳動物、好ましくはヒトの治療または予防方法における本発明の医薬組成物の使用、即ち本発明の医薬組成物の使用にある。
【００８６】
本発明の医薬組成物は他の医薬化合物と分離してまたは共同して治療方法に使用することができる。
【００８７】
本発明の他の特定の目的は図示のためでかつ本発明の範囲を制限することなしに、以下のグループ、すなわち、老化または老化促進、神経退化病、先天性角化異常症、クリ・デュ・シャ（ＣｄＣ，ＯＭＩＭ  １２３４５０）、運動失調毛細管拡張症（ＡＴ，ＯＭＩＭ  ２０８９００）、ナイメーヘン破壊症候群（ＮＢＳ，ＯＭＩＭ  ２５１２６０）、ブルーム症候群（ＢＳ，ＯＭＩＭ  ２１０９００）、ウェルナー症候群（ＷＳ，ＯＭＩＭ２７７９００）、ファンコーニ貧血（ＦＡ，ＯＭＩＭ  ２２７６５０）、潰瘍性大腸炎、血管老化、アテローム性動脈硬化症およびガンに属しているテロメラーゼ活性の変化により発生されかつヒトを冒している疾病または障害の治療方法における本発明の医薬組成物の使用にある。
【００８８】
本発明の他の特定の実施形態は以下のグループ、すなわち、アルツハイマー病、パーキンソン病、小脳性運動失調症および脊髄変性症に属している神経退化病の治療方法における本発明の医薬組成物の使用である。
【００８９】
本発明の他の特定の実施形態はＸ−染色体−連鎖型先天性角化異常症の治療方法における本発明の医薬組成物の使用である。
【００９０】
本発明の他の特定の実施形態は常染色体優性の先天性角化異常症の治療方法における本発明の医薬組成物の使用である。
【参考文献】
【００９１】
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【００９４】
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【００９９】
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ライト・ダブリューイー、シェイ・ジェイダブリュー、およびピアティスゼク・エムエー著、１９９５年。テロメラーゼ反復増幅プロトコル（ＴＲＡＰ）の変性は信頼性、直線性および感度の増加を結果として生じる。核酸研究。第２５；２３（１８）巻：第３７９４頁−第３７９５頁。（Ｗｒｉｇｈｔ  ＷＥ，Ｓｈａｙ  ＪＷ，Ｐｉａｔｙｓｚｅｋ  ＭＡ．１９９５．Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ａ  ｔｅｌｏｍｅｒｉｃ  ｒｅｐｅａｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ（ＴＲＡＰ）ｒｅｓｕｌｔ  ｉｎ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ，ｌｉｎｅａｒｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２５；２３（１８）：３７９４−５．）
【０１１４】
ヨシロウ・オー、タナカ・エム、ヨシイ・エス、ナカヤ・エヌケー、およびスギモラ・エッチ著。腫瘍転位抑制体ｎｍ２３Ｈ１はＴｉａｍ１とのＲａｃ１  Ｇ相互作用を調整する。米国国立科学学会会報。２００１年、第９８（８）巻：第４３８５頁−第４３９０頁。（Ｙｏｓｈｉｒｏ  Ｏ，Ｔａｎａｋａ  Ｍ，Ｙｏｓｈｉｉ  Ｓ，Ｎａｋａｙａ  ＮＫ，Ｓｕｇｉｍｏｒａ  Ｈ．Ｔｕｍｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｎｍ２３Ｈ１  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｒａｃ１  Ｇ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｔｉａｍ１．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００１，９８（８）：４３８５−４３８０．）
【０１１５】
ツァン・アールジー、ツァン・アールピー、ワン・エックスダブリュー、およびシエ・エッチ著、２００２年。ＢＥＬ−７４０４ヒト肝臓ガン細胞におけるテロメラーゼ活性およびテロメアの長さについてのシスプラチンの作用。細胞研究。第１２（１）巻：第５５頁−第６２頁。（Ｚｈａｎｇ  ＲＧ，Ｚｈａｎｇ  ＲＰ，Ｗａｎｇ  ＸＷ，Ｘｉｅ  Ｈ．２００２．Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｉｓｐｌａｔｉｎ  ｏｎ  ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｅｌｏｍｅｒｅ  ｌｅｎｇｔｈ  ｉｎ  ＢＥＬ−７４０４  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １２（１）：５５−６２．）
【０１１６】
ズッチーニ・シー、ストリッポリ・ピー、ビオルチ・エー、ソルミ・アール、レンツィ・エル、ダダッボ・ピー、カリンチ・ピー、およびヴァルバッソーリ・エル著、２００３年。先天性角化異常症１遺伝子および新規な構成要素を含んでいるプソイドウリジン合成酵素遺伝子のヒトＴｒｕＢ族。分子医療国際ジャーナル。第１１（６）巻：第６９７頁−第７０４頁。（Ｚｕｃｃｈｉｎｉ  Ｃ，Ｓｔｒｉｐｐｏｌｉ  Ｐ，Ｂｉｏｌｃｈｉ  Ａ，Ｓｏｌｍｉ  Ｒ，Ｌｅｎｚｉ  Ｌ，Ｄ’Ａｄｄａｂｂｏ  Ｐ，Ｃａｒｉｎｃｉ  Ｐ，Ｖａｌｖａｓｓｏｒｉ  Ｌ．２００３．Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＴｒｕＢ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｇｅｎｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｄｙｓｋｅｒａｔｏｓｉｓ  Ｃｏｎｇｅｎｉｔａ  １  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｍｂｅｒ  ＴＲＵＢ１．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．１１（６）：６９７−７０４．）
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１７】
図１はテロメラーゼ複合体の概略構成を示している。ｈＴＲ  ＲＮＡと結合して、ｈＴＥＲＴ、ジスケリン、ｐ２３，ｈｓｐ９０およびＴＥＰ１タンパク質はテロメラーゼのリボ核酸タンパク質複合体を構成する。
【０１１８】
図２は２９３Ｔ細胞系のＪＮＫおよびｐ３８死亡進路の細胞の生存能力及び活性化、すなわちシスプラチンで処理されたｐＬＮＣＸおよび２４．２を示す。Ａ）細胞生存能力。２９３Ｔ細胞を植え付けた後に、すなわち、空のベクター（ｐＬＮＣＸ）およびＧＳＥ２４．２（２４．２）を２４穴を有するプレート中で発現させた後に、それらはシスプラチンの０−１００μｇ／ｍｌ間の濃度により培養された。細胞の生存能力は薬剤に対する７２時間の露出後にクリスタル・バイオレット技術によって測定された。データは４つ一組で実施された２つの実験の平均を示している。Ｂ）活性動力学。シスプラチン濃度での両方の細胞系の処理は６時間にわたって図に示した。次に、ＪＮＫおよびｐ３８の活性が活性形状をとくに認める抗体を使用して研究された。負荷制御として、ＪＮＫ−１のレベルが検出された。
【０１１９】
図３は使用された構造に含まれるＤＳＫ配列およびＤＳＫと同族の遺伝子の配列を示している。Ａ）ヌクレオチド２６８ないし４３３をカバーするＧＳＥ２４．２がそれに対して対応する領域を示すジスケリンのｃＤＮＡの概略図。ＤＳＫ５’構造の場所が同様に示されている。Ｂ）他の有機体からのプソイドウリジン合成酵素配列に対するＧＳＥ２４．２アミノ酸の比較配列。ＴＲＵＢＩおよびＴＲＵＢＩＩ保存のドメインが示されている。
【０１２０】
図４は２９３Ｔ細胞系、すなわち、シスプラチンで処理されたｐＬＮＣＸ，２４．２，ＤＳＫ５’およびＤＳＫの生存能力を示している。上述し細胞系（ｐＬＮＣＸ，２４．２）、先行する図に記載されたジスケリンの断片を過発現するＤＳＫ５’ 細胞系、およびジスケリン（ＤＳＫ）の完全なｃＤＮＡを過発現する第４の細胞系が使用されている。生存能力は図１Ａに示されるように決定された。データは４つ一組で実施された２つの実験の平均を示している。
【０１２１】
図５は２９３Ｔ細胞系のテロメラーゼ活性、すなわち、シスプラチンにより処理されたｐＬＮＣＸおよび２４．２のテロメラーゼ活性を示している。細胞は６０ｍｍのプレートに植え付けられ、３日間０．５μｇ／ｍｌのシスプラチンで予め処理されかつ続いて３μｇ／ｍｌの投与量でシスプラチンにより処理された（予め処理されない細胞）。テロメラーゼ活性はインテルゲンＴＲＡＰｅｚｅアッセイによって測定された。実験は３回実施され、同一の結果であった。
【０１２２】
図６は細胞生存能力及び２９３Ｔ細胞系のテロメラーゼ活性、すなわちテロメラーゼＩの阻害物質で処理されたｐＬＮＣＸおよび２４．２を示している。Ａ）細胞生存能力。２４の穴のプレート中に２９３Ｔ細胞、すなわち、ｐＬＮＣＸおよび２４．２を植え付けた後に、それらはテロメラーゼＩの阻害物質の０−２０μＭ間の濃度で培養された。細胞生存能力は薬剤に対する７２時間の露出後にクリスタル・バイオレット技術によって測定された。データは４つ一組で実施された２つの実験例の平均を示している。Ｂ）テロメラーゼＩの阻害物質の種々の投与量でのテロメラーゼ活性。３日間テロメラーゼＩの阻害物質の種々の濃度の存在における２９３Ｔ細胞、すなわち、ｐＬＮＣＸおよび２４．２テロメラーゼ活性。それらの細胞は６０ｍｍのプレートに植え付けられかつ続いて特定された濃度および時間で処理された。テロメラーゼ活性はインテルゲンＴＲＡＰｅｚｅアッセイによって測定された。Ｃ）テロメラーゼＩの阻害物質による種々の処理時間でのテロメラーゼ活性。１日および５日でのＴＩＩ（５μＭ）の存在におけるテロメラーゼ活性。その細胞はＢにおけるように植え付けられた。続いて、それらは特定の時間において５μＭの阻害物質により処理された。
【０１２３】
図７は２９３Ｔ細胞、すなわち、シスプラチンによる処理に続いて２９３Ｔ細胞、すなわちｐＬＮＣＸおよび２４．２中のテロメラーゼに関連した種々の遺伝子の発現レベルを示している。その細胞は６０ｍｍのプレートに植え付けられ、３日間０．５μｇ／ｍｌのシスプラチンによる予備処理に続いてｃＤＤＰの３μｇ／ｍｌにより処理され、続いて、図に特定された時間（２日および７日間）で集められた。ＲＮＡの抽出に続いて、ＲＴ−ＰＣＲがメッセンジャーＲＮＡｓの発現レベルを研究するためにｈＴＥＲＴ，ｈＴＲおよびジスケリンに特定のオリゴにより実施された。開始ＲＮＡ対照として、ＧＡＰＤＨの増幅用のオリゴが使用された。
【０１２４】
図８は２９３Ｔ細胞系、すなわち、ｐＬＮＣＸおよび２４．２とｐＬＮＣＸ−２４．２構造体およびｐＬＮＣＸのないプラスミドにより一時的にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞とにおけるｈＴＥＲＴプロモーターの活性を示している。Ａ）ｐＬＮＣＸおよび２４．２細胞の両方が０．２５μｇのｈＴＥＲＴ−ｌｕｃリポーターベクターにより一時的にトランスフェクトされた。細胞は６０ｍｍのプレートに植え付けられた。トランスフェクション（核酸挿入）の２４時間後、細胞は溶解されそして１０μｇの合計タンパク質のルシフェラーゼ活性が定量化された。トランスフェクション対照として、それらの細胞はリポーターベクター、ＣＭＶ−Ｒｅｎｉｌｌａと同時にトランスフェクトされた。Ｂ）２９３Ｔ細胞はｐＬＮＣＸベクターおよび２４．２プラスミド（５μｇ）によりトランスフェクトされ、そして両方は０．２５μｇのｈＴＥＲＴ−ｌｕｃリポーターベクターにより同時にトランスフェクトされた。Ａにおけるように細胞を植え付けた後、それらはｐＬＮＣＸおよび２４．２でトランスフェクトされそしてｈＴＥＲＴ−ｌｕｃリポーターベクターにより同時にトランスフェクトされ、続いてそれらはＡにおけるように処理された。トランスフェクション対照として、ＣＭＶ−Ｒｅｎｉｌｌａリポーターベクターが使用された。データは非トランスフェクトの細胞に関連するルシフェラーゼの相対的な単位の比に対応する。各ポイントは、±により、３つの独立した実験例から得られた標準偏差を示している。Ｃ）２９３Ｔ細胞は種々のＧＳＥ２４．２，ＤＳＫ，ＴＲＵＢＩ，ＴＲＵＢＩＩ構造およびｐＬＮＣＸのないプラスミド（５μｇ）によりトランスフェクトされ、そして０．２５μｇのｈＴＥＲＴ−ｌｕｃリポーターベクターにより同時にトランスフェクトされた。細胞は６０ｍｍのプレートに植え付けられ；トランスフェクション（トランスフェクト）の２４時間後、それらの細胞は溶解させられかつ１０μｇの合計タンパク質のルシフェラーゼ活性が定量化された。トランスフェクション対照として、それらの細胞はリポーターベクター、ＣＭＶ−Ｒｅｎｉｌｌａと同時にトランスフェクトされた。データは非トランスフェクトの細胞に関するルシフェラーゼの相対的な単位の比に対応する。各ポイントは、±により、３つの独立した実験から得られた標準偏差を示している。
【０１２５】
図９はシスプラチンによる処理に続くｈＴＥＲＴプロモーターの活性を示している。Ａ）ｐＬＮＣＸ細胞系および２４．２細胞系の両方は０．２５μｇのｈＴＥＲＴ−ｌｕｃリポーターベクターにより一時的にトランスフェクトされた。トランスフェクション（トランスフェクト）の２４時間後、それらは８時間３μｇ／ｍｌのシスプラチンにより処理された。それらの細胞は６０ｍｍのプレートに植え付けられトランスフェクション（核酸挿入）の２４時間後かつｃＤＤＰによる処理に続いて、それらの細胞は溶解されそして１０μｇの合計タンパク質のルシフェラーゼ活性が定量化された。トランスフェクション対照として、それらの細胞はリポーターベクター、ＣＭＶ−Ｒｅｎｉｌｌａと同時にトランスフェクトされた。Ｂ）２９３Ｔ細胞はｐＬＮＣＸおよび２４．２ーにより一時的にトランスフェクトされた後、０．２５μｇのｈＴＥＲＴ−ｌｕｃリポーターベクターによりトランスフェクトされそしてＡにおけるように処理された。Ａにおけるように細胞を植え付けた後、それらはｐＬＮＣＸおよび２４．２でトランスフェクトされそしてｈＴＥＲＴ−ｌｕｃリポーターベクターにより同時にトランスフェクトされ、その後それらはＡにおけるように処理された。トランスフェクション対照として、ＣＭＶ−Ｒｅｎｉｌｌａリポーターベクターが使用された。データは非トランスフェクトの細胞に関するルシフェラーゼの相対的な単位の比に対応する。各ポイントは、±により、３つの独立した実験例から得られた標準偏差を示している。
【０１２６】
図１０は先天性角化異常症を有する患者の細胞と、２４．２プラスミドまたはｐＬＮＣＸがないベクターにより一時的にトランスフェクトされたＶＡ１３細胞とにおけるテロメラーゼ活性およびｈＴＥＲＴおよびｈＴＲの発現レベルを示している。Ａ）テロメラーゼ活性は先天性角化異常症（ＤＣ−１，ＤＣ−２およびＤＣ−３）に罹っている患者の細胞および１５百万個の細胞による４５μｇのｐＬＮＣＸのないプラスミド（−）またはｐＬＮＣＸ  ２４．２ベクター（＋）の電気穿孔法に続いてキャリヤーマザー（ＤＣ−Ｃ）においてＴＲＡＰアッセイによって測定された。Ｂ）先天性角化異常症を有する患者の１人の細胞からのＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ、即ちＤＣ３が空の（ｅｍｐｔｙ）ベクターによりトランスフェクトされそしてｈＴＥＲＴおよびｈＴＲに特有のオリゴを使用して、ＤＣ３が２４．２プラスミドでトランスフェクトされた。開始ＲＮＡ対照として、ＧＡＰＤＨの増幅用のオリゴが使用された。（Ｃ）ＶＡ１３細胞におけるテロメラーゼ活性。それらの細胞は百万個の細胞あたりＤＫＣまたはＧＳＥ２４．２ペプチドを発現している１６μｇの対照ｐＬＮＣＸのないベクターにより一時的にトランスフェクトされた。２４時間後、テロメラーゼ活性が、各トランスフェクト（核酸挿入）からのタンパク質抽出の希釈を使用して、上述されたように分析された。（Ｄ）百万個の細胞あたり１６μｇの種々の構造によりトランスフェクトされたＶＡ１３細胞におけるｈＴＥＲＴおよびｈＴＲの発現レベル。ＲＮＡレベルが上述されたように検出された。ＧＡＰＤＨが対照として使用された。Ａ，Ｂ，Ｃ，およびＤにおいて、実験は同一結果で３回繰り返された。（Ｅ）ＶＡ１３細胞におけるｈＴＥＲＴプロモーターの活性。それらの細胞は特定の構造（百万個の細胞あたり１０μｇ）およびｈＴＥＲＴ−ｌｕｃリポーター（百万個の細胞あたり１μｇ）により同時にトランスフェクトされた。トランスフェクト（核酸挿入）の２４時間後、ルシフェラーゼ活性が上述されたように測定された。ＣＭＶ−Ｒｅｎｉｌｌａ（百万個の細胞あたり０．１μｇ／ｍｌ）がトランスフェクト（核酸挿入）効率用の対照として使用された。データは４つ一組で実施された２つの実験の平均を示している。
【０１２７】
図１１はＧＳＥ２４．２ペプチドがｃ−ＭＹＣによって調整されたｈＴＥＲＴプロモーターの活性を増加することを示している。（Ａ）２９３Ｔ細胞が種々の構造（百万個の細胞あたり１０μｇ／ＤＮＡ）およびｈＴＥＲＴ−ｌｕｃリポーター（百万個の細胞あたり１μｇ）により同時にトランスフェクトされた。（Ｂ）特定の細胞系がｈＴＥＲＴ−ｌｕｃリポーターおよびＭａｄ／ｍｙｃ発現ベクターにより同時にトランスフェクトされた。（Ｃ）特定の細胞系がＨＩＶ−ｌｕｃリポーターおよびＭａｄ／ｍｙｃ発現ベクターにより同時にトランスフェクトされた。トランスフェクト（核酸挿入）の２４時間後、細胞は６時間５０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−αで刺激されそしてルシフェラーゼ活性が上述されたように分析された。ＣＭＶ−Ｒｅｎｉｌｌａ（百万個の細胞あたり１０μｇ）がトランスフェクト（核酸挿入）の効率用の対照として使用された。データは４つ一組で実施された２つの実験の平均を示している。
【０１２８】
図１２はｃ−ＭＹＣのプロモーター活性がＧＳＥ２４．２ペプチドによって誘導されることを示している。（Ａ）実験に使用された種々の構造体を示しているｃ−ＭＹＣプロモーターの概略図を示す。（Ｂ）２９３Ｔ細胞が特定のプラスミド（百万個の細胞あたり１０μｇ／ＤＮＡ）およびｐｘ３．２ｃ−ＭＹＣリポーター（百万個の細胞あたり１μｇ）により同時にトランスフェクト（核酸挿入）された。（Ｃ）特定の細胞系がｐｘ３．２ｃ−ＭＹＣリポーター（百万個の細胞あたり１μｇ）によりトランスフェクトされた。（Ｄ）特定の細胞系がｐｘ３．２ｃ−ＭＹＣリポーター（百万個の細胞あたり１μｇ）の種々の構造によりトランスフェクトされた。トランスフェクト（核酸挿入）の２４時間後、ルシフェラーゼ活性が上述されたように分析された。ＣＭＶ−Ｒｅｎｉｌｌａ（百万個の細胞あたり０．１μｇ／ｍｌ）がトランスフェクト（核酸挿入）の効率用の対照として使用された。データは４つ一組で実施された２つの実験の平均を示している。
【０１２９】
図１３はＧＳＥ２４．２ペプチドによって誘導されたｃ−ＭＹＣのプロモーターの活性がＮＨＥＩＩＩ素子に依存していることを示している。（Ａ）ＮＨＥＩＩＩ素子中に発生された突然変異の概略図を示す。（Ｂ）２９３Ｔ細胞が種々の構造（百万個の細胞あたり１０μｇ／ＤＮＡ）およびｐｘ３．２ｃ−ＭＹＣリポータープラスミド（百万個の細胞あたり１μｇ）により同時にトランスフェクトされた。（Ｃ）図に特定された細胞系がｐｘ３．２ｃリポーター（百万個の細胞あたり１μｇ）の種々の突然変異によりトランスフェクトされた。トランスフェクトの２４時間後、ルシフェラーゼ活性が上述されたように分析された。ＣＭＶ−Ｒｅｎｉｌｌａ（百万個の細胞あたり０．１μｇ／ｍｌ）がトランスフェクト効率用の対照として使用された。データは４つ一組で実施された２つの実験の平均を示している。
【実施例】
【０１３０】
実施例１  ＧＳＥ２４．２配列の識別および生物学的活性
１．１．  ２４．２と呼ばれるＧＳＥ配列の識別
化学療法に対する抵抗はガンの治療における最大の制限の１つである。シスプラチンに対する抵抗のメカニズムを研究するために、シスプラチンに対する耐性を付与するｃＤＮＡライブラリー配列は遺伝子抑制素子を追跡することによって分離された。従前に記載されたこの原理体系（ロニンソン等、１９９５「Ｒｏｎｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５」）は遺伝子発現における存在度（ａｂａｎｄａｎｃｅ）を平均化するために標準化されたヒト胎盤ライブラリーからのｃＤＮＡ構造の発現からなっている。シスプラチンに対する耐性を付与する１００個に近い異なるクローンが分離された。ｃＤＮＡインサートを増幅した後、それらはｐＬＮＣＸプラスミドにサブクローン化されそしてそれらが耐性を付与するのを確実にするために再びトランスフェクトされた。これらのＧＳＥの１つはヒトジスケリンの内部配列に対応する２４．２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１参照）と呼ばれる１６５−ｐｂ断片であった。
【０１３１】
１．２．  シスプラチンに関する２９３Ｔ細胞系、すなわちｐＬＮＣＸおよび２４．２の生存能力および細胞死亡進路を実現しているＪＮＫおよびｐ３８の活性
同一名のＧＳＥを包含しているｐＬＮＣＸ２４−２プラスミドが安定した方法において２９３Ｔ細胞中でトランスフェクトされそして対照として、ｐＬＮＣＸのないベクターがトランスフェクトされた。２４．２細胞系がこのインサート（データを図示せず）を含有するＰＣＲによって確認した後、シスプラチンに対する応答が研究され、この薬剤による生存能力曲線を形成した。図２ａは７２時間後のシスプラチンの種々の投与に応答して２つの細胞系に関する生存能力曲線を示している。そこで、安定した方法においてＧＳＥ２４．２を発現する細胞がＧＳＥ選択投与に近い低い投与において空のベクターを発現する細胞に比してシスプラチンに応答して大きな生存能力を有することを観察することができる。ＪＮＫおよびｐ３８は遺伝子毒作用剤（サンチェス−ペレス、１９９８「Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８」）に応答して活性化されるＭＡＰＫｓである。シスプラチンに応答してこれら２つのタンパク質の活性動力学は細胞死を誘導するような能力に関連しており、このため、２つの細胞系のこれらのキナーゼの活性が研究され（図２ｂ）そしてシスプラチンの大きな投与量が安定した方法においてＧＳＥ２４．２を発現する細胞中の両方のキナーゼを活性化するために必要であったことが観察され、かくしてＧＳＥ２４．２の発現が両方のキナーゼを活性化する細胞損傷信号を減衰することを示唆している。
【０１３２】
１．３．  シスプラチンに応答しての２９３Ｔ細胞系、すなわち、ｐＬＮＣＸ，ＤＳＫ（遺伝子バンクＮＭ００１３６３．２），ＤＳＫ−５’および２４．２の生存能力
ジスケリンの過発現がＧＳＥ２４．２により誘導されたシスプラチンに応答して細胞生存能力の増加を再生することができるかどうかを研究するために、安定した方法において、ジスケリン（ｐＬＮＣＸ  ＤＳＫ）の完全なｃＤＮＡを過発現する細胞系が発生された。その作用が２４．２に包含される領域またはジスケリン（ｐＬＮＣＸ  ＤＳＫ−５’）の大きい領域を除いているかどうかを研究するために、ＧＳＥ２４．２配列を含む図３ａ）に記載されたジスケリンの断片を包含する構造もトランスフェクトされた。図４はシスプラチンの種々の投与量に応答する４つの細胞系についてその能力曲線を示す。そこで安定した方法において２４．２構造（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１）を発現する細胞が空のベクター、完全なジスケリン（ＤＳＫ）またはジスケリン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ３）の５’断片を発現する細胞に比してシスプラチンに応答して大きな生存能力を有することが観察された。それゆえ、シスプラチンに応答して増加した生存能力がＧＳＥ２４．２断片に含有されるｃＤＮＡ配列に制限される。
【０１３３】
１．４．  シスプラチンで処理されたｐＬＮＣＸおよび２４．２細胞系のテロメラーゼ活性
上記で議論されたように、シスプラチンはさらに特定されるメカニズムによってテロメラーゼ活性を抑制する。ＧＳＥ２４．２がジスケリンの内部配列に対応しそしてジスケリンの内部配列がテロメラーゼのリボヌクレオタンパク質複合体の一部であるので、テロメラーゼ活性についてのシスプラチンの作用はＧＳＥ２４．２を発現する細胞系において研究され、同様にこの作用が空のベクターを発現する細胞系に関して変化したかどうかが研究された。
【０１３４】
このため、テロメラーゼ活性のアッセイがｐＬＮＣＸおよびｐＬＮＣＸ２４．２細胞系によりＴＲＡＰ法を使用して行なわれ、それらを０．５μｇ／ｍｌのシスプラチンにより３日間予備処理し、続いてそれらは３日および７日間３μｇ／ｍｌのシスプラチンにより処理された。テロメラーゼの特別な阻害物質が酵素の効果的な抑止のためこの時間中に作動する必要があると記載されている（キム等、２００３；ベドナレク等、１９９９；ゴーワン等、２００２「Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｂｅｄｎａｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｇｏｗａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２」）ため３日間の処理が実施された。２９３ＴｐＬＮＣＸ細胞の７日間の処理はテロメラーゼ活性の抑制を発生し、ところがこの時間中に２４．２細胞系について抑制は観察されなかった（図４）。結論として、ＧＳＥ２４．２の発現がシスプラチンにより発生されたテロメラーゼ活性の抑制に対して抵抗を付与しそしてこの抑制が薬剤に応答してこれらの細胞の大きな生き残り能力についての原因である。
【０１３５】
１．５．  ｐＬＮＣＸおよび２４．２細胞におけるテロメラーゼＩの阻害物質の作用
テロメラーゼＩの阻害物質はテロメラーゼ中にＧ−クァドルプレックス（Ｇ−  ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘｅｓ）を形成する化合物であり、それによりテロメラーゼ活性を抑制する（トンプソン等、１９９７「Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７」）。テロメラーゼＩの阻害物質に応答してＧＳＥ２４．２の作用を研究した。このため、能力曲線が実施され、ｐＬＮＣＸおよび２４．２細胞系が７２時間テロメラーゼＩの阻害物質（０−２０μＭ）の濃度を増大させることにより処理された。図６ａ）は２４．２細胞が親細胞よりテロメラーゼＩの阻害物質に対して多く抵抗することを示している。この保護がテロメラーゼ活性の感度の変化により伴うかどうかを確認するために、該活性は３日間テロメラーゼＩの阻害物質の異なる投与量で処理されたｐＬＮＣＸおよびｐＬＮＣＸ２４．２細胞において研究された（図６ｂ）。ｐＬＮＣＸ細胞系のテロメラーゼ活性の抑制がｐＬＮＣＸ２４．２細胞におけるよりも大きいことを観察された。テロメラーゼ活性はまた１投与量（５μＭ）によりかつ数時間（０−５日。図６ｃ）でｐＬＮＣＸおよびｐＬＮＣＸ２４．２細胞を処理することによって研究された。この場合に、ｐＬＮＣＸ２４．２細胞はテロメラーゼ活性を減少するために阻害物質に対して多くの露出を必要とすることが確認された。それゆえ、テロメラーゼ活性および両方の細胞系における生き残りの細胞に関して観察された作用はシスプラチンおよびテロメラーゼＩの阻害物質に関して共通であり、かくしてＧＳＥ２４．２断片がテロメラーゼＩの阻害物質によって発生された抑制を防止することができるので、少なくとも部分的にテロメラーゼ構造の維持において顕著な役割を有することを示唆している。
【０１３６】
１．６．  ｐＬＮＣＸおよび２４．２細胞系におけるｈＴＲ，ｈＴＥＲＴおよびジスケリンの発現レベルについてのシスプラチンの作用
シスプラチンに対するｐＬＮＣＸ２４．２細胞の低い感度に関しての説明の１つはテロメラーゼ複合体の成分の幾つかのレベルの変化である。それゆえ、テロメラーゼ複合体に含まれる種々の遺伝子の発現レベルおよびシスプラチンがそれらの発現を有する作用が研究された。このため、ｐＬＮＣＸおよびｐＬＮＣＸ２４．２細胞が０．５μｇ／ｍｌで予備処理されそして３日および７日間３μｇ／ｍｌのシスプラチンで処理された。ｈＴＲ，ｈＴＥＲＴおよびジスケリンに特有なオリゴを使用して、これらの遺伝子の発現レベルおよび前記発現についてのシスプラチンの作用が研究された。シスプラチンがジスケリンおよびｈＴＲの発現について影響を及ぼさない（図７）ことが確認され、これに反して、３日間の処理に続いて、ｐＬＮＣＸ細胞中のｈＴＥＲＴにおける発現の減少があり、他方で７日間の処理までｐＬＮＣＸ２４．２細胞における発現の減少はない。それゆえ、ｐＬＮＣＸ２４．２細胞はｈＴＥＲＴの発現の抑制を有するためにシスプラチンの多くの露出を必要とする。シスプラチンに対する感度のこの変化は少なくとも部分的にテロメラーゼ活性アッセイにおける感度の差異を説明することができる。
【０１３７】
１．７．  ｈＴＥＲＴプロモーターの活性についての安定した方法および一時的な方法の両方におけるＧＳＥ２４．２およびＴｒｕｂＩおよびＴｒｕｂＩＩの発現の作用
シスプラチンに応答してＧＳＥ２４．２ペプチドを発現したそれらの細胞におけるｈＴＥＲＴの発現レベルに変化が観察されたので、ＧＳＥ２４．２配列および−ＴｒｕｂＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１１）およびＴｒｕｂＩＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１３）ドメインを含んでいる−その断片の配列の発現がｈＴＥＲＴプロモーターの活性についてどのようなを有するかを研究することを決めた。ジスケリンのプソドウリジン合成酵素ＴＲＵＢドメインが２つの構造的サブドメイン、すなわち、ＴｒｕｂＩおよびＩＩモチーフを含んでいる（ズッチーニ等、２００３）。これらの２つドメインはジスケリンのグローバルタンパク質を維持するのに重要である。そのうえ、モチーフＩＩは酵素活性に必須である少なくとも１つの残留物（ａｓｐ１２５）を含んでいる。このため、ヒトｈＴＥＲＴプロモーターの３，４０２−ｐｂ配列（ソン等、１９９９）を含んでいるｈＴＥＲＴ−ｌｕｃリポーターベクターが細胞系、すなわち、ｐＬＮＣＸ２４．２およびｐＬＮＣＸにおいてトランスフェクトされた。図８ａ）はｐＬＮＣＸ２４．２細胞系において、ｈＴＥＲＴプロモーターが空のベクター（ｐＬＮＣＸ）を発現する細胞中よりも多いことを示している。同一の実験が２９３Ｔ細胞中にＧＳＥ２４．２を一時的に発現することによって行われ（図８ｂ）そしてＧＳＥ２４．２の一時的発現がまた空のベクターによりトランスフェクトされた細胞に比してｈＴＥＲＴプロモーターの活性を増加することが観察された。他方で、この実験はＧＳＥ２４．２断片（図８ｃ）の活性と同じ活性を有する最小の配列を識別するために、それぞれ、ＴｒｕｂＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１１）およびＴｒｕｂＩＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１３）ドメインの各々を含んでいるＧＳＥ２４．２の２つの断片により実施された。結果はＧＳＥ２４．２に含まれる配列、Ｔｒｕｂドメインを有する配列がｈＴＥＲＴプロモーターの発現を活性化することにより作用することを示している。
【０１３８】
加えて、イースト、Ｓ．セレヴィシアＣＢＦ５（ｙｅａｓｔ，Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＣＢＦ５）のＣＢＦ５遺伝子の配列、ＧＳＥ２４．２の配列に等しい配列（図３ｂ）がｐＬＮＣＸベクターにおいてサブクローニングされ、そして前記構造の発現がｈＴＥＲＴの活性を増加するが、ｈＴＲプロモーターの活性を増加しない（データは図示せず）ことが観察され、このジスケリンのドメインの活性における高度な機能的保全を示している。
【０１３９】
１．８．  シスプラチンにより処理された細胞中のｈＴＥＲＴプロモーターについてのＧＳＥ２４．２の発現の作用
ＧＳＥ２４．２の発現がシスプラチンにより誘導されたｈＴＥＲＴの発現の抑制を遅延したことを観察した後、シスプラチンによる処理が前記遺伝子のプロモーターについてのあらゆる効果を有するかどうかおよびＧＳＥ２４．２の発現が前記遺伝子に影響を及ぼすかどうかが研究された。このため、ｐＬＮＣＸおよびｐＬＮＣＸ２４．２細胞がｈＴＥＲＴ−ｌｕｃリポーターベクターによりトランスフェクトされた。トランスフェクトの２４時間後、それらは８時間３μｇ／ｍｌのシスプラチンにより処理されそしてテロメラーゼ活性がアッセイされた（図９ａ）。ｐＬＮＣＸ２４．２細胞において、プロモーターの活性の誘導はシスプラチンによる処理に続いてｐＬＮＣＸ細胞におけるよりも４倍大きいことが観察され得る。同一の実験がＧＳＥ２４．２を一時的に発現しかつそれらをｐＬＮＣＸのないベクターによりトランスフェクト（核酸挿入）された２９３Ｔ細胞に比べることにより行われた。この場合に、ＧＳＥ２４．２を発現する細胞の活性はシスプラチンによる処理に続いて基準活性より大きかった。
【０１４０】
実施例２  ｃＭＹＣ遺伝子のプロモーターのＮＨＥＩＩＩ断片はＧＳＥ２４．２ペプチドのターゲットである。
ｈＴＥＲＴプロモーターは２つのＥ−ｂｏｘ領域（ＣＡＣＧＴＧ）、ｍｙｃ／ｍａｘヘテロダイマーに対する結合場所（オー等、１９９９；ウー等、１９９９）、ならびに５つのｓｐ１領域を含んでいる。ＧＳＥ２４．２ペプチドによるｈＴＥＲＴプロモーターの活性がこのＥ−ｂｏｘを通って行われるかどうかを研究するために、ｃ−ｍｙｃＤＮＡに対するこの結合領域（ドメイン）および激しい転写促進領域を含んでいるハイブリッド分子がトランスフェクトされ、このハイブリッド分子はｃ−ｍｙｃの従属転写を抑制しているこのＥ−ｂｏｘへの結合を禁止することができた。対照細胞およびジスケリンタンパク質（ＤＫＣ）およびＧＳＥ２４．２ペプチドを発現する細胞は前記ハイブリッド分子の増加量によりトランスフェクトされた。ｍａｄ／ｍｙｃ溶融タンパク質の発現は対照グループおよびＤＫＣ細胞の両方において、投与量依存の方法で、ｈＴＥＲＴプロモーターの基準活性を抑制した。そのうえ、ｍａｄ／ｍｙｃ溶融タンパク質の発現はＧＳＥ２４．２細胞中のＧＳＥ２４．２ペプチド−介在転写をブロックすることができ、かくしてＧＳＥ２４．２によって誘導されたｈＴＥＲＴ転写の活性がｃ−ｍｙｃに依存していることを示唆している（図１１ｂ）。ＮＦｋＢ−依存プロモーター（ＨＩＶＬｕｃ）と結合するｍｙｃ／ｍａｄ構造のトランスフェクトが細胞系のいずれにおいてもＴＮＦαによる刺激に続いて転写に影響を及ぼさない（図１１ｃ）ので、この抑制は特別であった。
【０１４１】
ｃ−ｍｙｃ遺伝子の転写は２つの異なるプロモーターによって制御されそしてＰ０とＰ１プロモーター（ＮＨＥＩＩＩ）との間に置かれたＤＮａｓｅに対して過敏性の領域（ドメイン）によって抑制されると思われる。かくして、ルシフェラーゼ遺伝子に結合されたｃ−ｍｙｃの転写開始点の３．２ｋｂを含んだ（図１２ａ）、４つの異なる構造が使用された。このプラスミド（ｐ×３．２ｍｙｃ）が対照細胞およびＧＳＥ２４．２細胞にトランスフェクトされ、そして活性の３倍の増加が最後のグループの細胞に観察された（図１２ｂ）。細胞がｐＬＮＣＸベクターによりまたはｐ×３．２ｍｙｃリポーター（図１２ｃ）と結合してＧＳＥ２４．２ペプチドを発現するプラスミドにより２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトされるとき、同様の結果が得られた。
【０１４２】
両方の結果はジスケリン（ＧＳＥ２４．２）のこの内部断片がｃ−ｍｙｃ遺伝子の転写を活性化することができることを示した。この転写因子、ｃ−ｍｙｃは、それゆえ、ｈＴＥＲＴの転写を活性化する。かくして、ｃ−ｍｙｃプロモーターにおいて欠失された３つの突然変異がその誘導活性を行うためにＧＳＥ２４．２ペプチドに必要な領域を特定するのに使用された。使用されるすべての突然変異に関して、ＮＨＥＩＩＩドメインを含むプロモーターＰ１およびＰ０の末端領域（ｒｅｇｉｏｎ）に含まれる突然変異のみがＧＳＥ２４．２細胞における転写を維持することができるが、対照細胞（図１２ｄ）においては維持できず、かくしてプロモーターＰ２の基部の領域（ｒｅｇｉｏｎ）がＧＳＥ２４．２ペプチドの活性に必要ないことを示している。
【０１４３】
ＮＨＥＩＩＩ領域（ｒｅｇｉｏｎ）がｃ−ｍｙｃの転写の阻害物質として記載されたので、ＮＨＥＩＩＩ領域の幾つかの突然変異がプリンの豊富な領域（ｒｅｇｉｏｎ）のグアニン変性によって構成された。ＮＨＥＩＩＩ領域（ｒｅｇｉｏｎ）に存在する２７グアニン（Ｇｕａｎｉｎｅｓ）はプリンの豊富な領域（Ｐｕ２７）のＧ−クァドルプレックスの２次的構造を維持するのに伴なわれる。以下が、すなわち、第２クァルテットの第２グアニンに配置されたＧ１２Ａ；グアニンの第２トリプレットに配置されたＧ１７Ａ；および最後にプリンの豊富な領域の端部での連続するグアニン（Ｇ２６Ａ／Ｇ２７Ａ）が突然変異させられた（図１３ａ）。これらのプロモーター構造は空のベクター、またはＤＫＣタンパク質またはＧＳＥ２４．２ペプチドを含んでいるベクターを発現する細胞にトランスフェクトされた。結果はＷＴｐ×３．２ｍｙｃプロモーターのみがＧＳＥ２４．２にトランスフェクトされるとき活性化することが可能であることを示している。Ｐｕ２７領域における３つの突然変異は非常に低いレベルではあるがＧＳＥ２４．２によって活性化された（図１３ｂ）。
【０１４４】
興味深いことには、対照細胞またはＤＫＣを発現する細胞中のＧの二重突然変異のトランスフェクト（核酸挿入）はプロモーター中の増加した活性を示すことができ、この領域がプロモーターを抑制する構造を維持するのに重要であることを示している。同様な結果は種々の突然変異体が空のベクター、ＤＫＣタンパク質またはＧＳＥ２４．２ペプチドによりトランスフェクトされるとき（図１３ｃ）２９３Ｔ細胞における一時的なトランスフェクトアッセイにおいて得られた。全体的に、これらの結果はＧＳＥ２４．２ペプチドが活性の構造に対してＰｕ２７領域の２次的構造を変性することができ、かくしてｃ−ｍｙｃ遺伝子の転写を可能にすることを示唆している。
【０１４５】
実施例３．  Ｘ−染色体連鎖型先天性角化異常症を有する患者の細胞およびＶＡ１３細胞におけるＧＳＥ２４．２の発現
Ｘ−染色体連鎖型先天性角化異常症において低レベルのテロメラーゼＲＮＡはテロメラーゼ活性に欠乏があるので、このＧＳＥ２４．２の発現の作用が先天性角化異常症に罹っている患者の細胞において試験された。このため、先天性角化異常症に罹っている患者の細胞（ＤＣ−１，ＤＣ−２，ＤＣ−３）および市場で入手可能なキャリヤーマザー細胞（ＤＣ−Ｃ）がＧＳＥ２４．２ベクターまたは空のベクターによりトランスフェクトされた。これらの細胞は致命的であってかつ培養において通常老化する。トランスフェクト後２４時間にテロメラーゼ活性が測定されそしてＧＳＥ２４．２断片が発現されたときキャリヤーマザー細胞および先天性角化異常症に罹っている患者の細胞の両方においてテロメラーゼ活性の増加が観察された（図１０ａ）。奇妙にも、テロメラーゼ活性の増加は完全なジスケリンの発現では観察されなかった（データは図示せず）。他方において、ｈＴＲのレベルはジスケリン遺伝子の突然変異された形状を発現するＤＣ細胞において低い（モチヅキ等、２００４「Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４」）。この活性の増加がテロメラーゼ複合体、ｈＴＥＲＴおよびｈＴＲの成分のいずれかの発現の増加の結果だったかどうかが調査された。このため、ＲＴ−ＰＣＲアッセイがトランスフェクト後２４時間にｈＴＥＲＴおよびｈＴＲに特有のオリゴを使用して実施され（図１０ｂ）、そして両方の場合において発現レベルの増加がＧＳＥ２４．２の発現につづいて観察された。
【０１４６】
そのうえ、ＶＡ１３テロメラーゼ−欠乏の細胞系（セザールおよびグリフィス、２００４「ｃｅｓａｒａ  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，２００４」）における本発明のＧＳＥ２４．２ペプチドの発現はテロメラーゼ活性（図１０ｃ）、およびｈＴＥＲＴおよびｈＴＲＲＮＡｓ（図１０ｄ）の発現を回復することが可能になった。この細胞系において、ＧＳＥ２４．２ペプチド（より低い効率により）およびイースト（ｙｅａｓｔ）のＣＢＦ５遺伝子の断片のモチーフ１の発現はｈＴＥＲＴプロモーター（図１０ｅ）を付加的に活性化した。全体的に、その結果はＧＳＥ２４．２ペプチドの発現が両方の細胞系においてテロメラーゼ活性を回復することができたことを示している。
【０１４７】
物質および方法
構造および細胞系。Ｘ−染色体連鎖型先天性角化異常症に罹っている患者の細胞系はコリエル細胞貯蔵所（Ｃｏｒｒｉｅｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）から得られかつＲＰＭＩ２０％ＦＢＳに保持された。ＶＡ１３細胞系はドクター・エム・セラーノ（Ｄｒ．Ｍ．Ｓｅｒｒａｎｏ）から得られた。ＤＫＣファミリーは臨床的に記載され（シリナビン等、１９７５；トローブリッジ等、１９７７「Ｓｉｒｉｎａｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５；Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７」）そして影響を及ぼされた個体はＴ６６Ａアミノ酸（データは図示せず）（ＤＣ−１，ＤＣ−２，ＤＣ−３）の置換を有する。キャリヤーマザー細胞系（ＤＣ−Ｃ）は突然変異なし（データは図示せず）にメッセンジャーＲＮＡを発現する。これらの細胞は２０％の胎児の牛の漿液（Ｇｉｂｃｏ）および２ｍＭのグルタミンで補充されたＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）中で成長させた。
【０１４８】
ＤＳＫ構造はヒトジスケリンの完全なｃＤＮＡを含みそしてＤＳＫ５’構造（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５）はヒトジスケリンの最初の５００ヌクレオチドを含んでいる。ＧＳＥ２４．２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１）のような両方の構造はｐＬＮＣＸプラスミドのＣｌａｌ位置においてクローン化された（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）。
【０１４９】
ＤＣ（先天性角化異常症）に罹っている患者から得られた細胞およびそれらの対照は百万個の細胞あたり３μｇのｐＬＮＣＸまたはｐＬＮＣＸ２４．２構造によって一時的にトランスフェクトされた。
【０１５０】
２９３Ｔ細胞系はアメリカ型培養コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から得られそしてその細胞は１０％の胎児の牛の漿液（Ｇｉｂｃｏ）および２ｍＭのグルタミンで補充されたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）（Ｇｉｂｃｏ）中で成長させた。この細胞系は塩化カルシウム方法、即ち百万個の細胞あたり１０μｇのプラスミドを使用する安定した方法においてトランスフェクトされた。これらの細胞はｐＢＡＢＥｐｕｒ、即ち百万個の細胞あたり１μｇのベクターにより同時にトランスフェクトされた。トランスフェクト後２４時間でその細胞は安定したクローンを選択するためにピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）により処理された。その細胞がゲノムＤＮＡのＰＣＲによって安定した方法においてＧＳＥ２４．２断片を発現したことが確認された（データは図示せず）。
【０１５１】
ｈＴＥＲＴ−ｌｕｃ構造がｐＧＬ３基本プラスミド（ｐｒｏｍｅｇａ）においてクローン化されそしてタエ・クック・キム（キム等、１９９９「Ｔａｅ  Ｋｏｏｋ  Ｋｉｍ（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）」）によって提供された。
【０１５２】
薬剤。シスプラチンおよびテロメラーゼＩの阻害物質の両方がカルビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）から得られそして各図に特定された投与量で使用された。
【０１５３】
ＴＲＡＰ方法に基づいたテロメラーゼ活性アッセイ（ライト等、１９９５「Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５」）。テロメラーゼ活性は指示マニュアルに従ってＴＲＡＰｅｚｅテロメラーゼ検出キット（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ）を使用して測定された。各抽出のタンパク質濃度はＢＩＯＲＡＤ試薬を使用してブラッドフォード方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ｍｅｔｈｏｄ）によって定量化され、そして指示マニュアルに従ってＰＣＲを実施した後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動が非変性条件下で反応生成物により実施され、続いてそれは３０分間臭化エチジウムにより色付けされた。
【０１５４】
合計タンパク質抽出。その細胞は媒体から残留物を除去するためにＰＢＳにより洗浄された後に溶解させた。溶解バッファは標準のプロトコルに従って調製されそしてタンパク質阻害物質、すなわち、ＡＢＳＦ、オルソバナデート（ｏｒｔｈｏｖａｎａｄａｔｅ）、ロイペプチン（Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）、ペプスタチンＡ（ｐｅｐｓｔａｔｉｎ  Ａ）、アプロチニン（ａｐｒｏｔｉｎｉｎｅ）およびＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ）が添加された。続いて抽出物は４°Ｃで１０分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離されそして浮遊物が回収された。合計タンパク質含有量がＢＩＯＲＡＤ試薬を使用してブラッドフォード方法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ｍｅｔｈｏｄ）によって測定された。
【０１５５】
ウエスタンブロット法および抗体。２０μｇのタンパク質がＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中で分離され、その後それらは多湿転移によってイモビロン−Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にトランスフェクトされた。膜は５％ＢＳＡ溶液中またはＴＢＳ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＬ，ｐＨ７．５，１５０ｍＭＮａＣｌ）０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０（シグマ）における５％スキムミルク中でブロックされた。膜は対応する抗体により培養された。使用した２次抗体はペロキシダーゼと直接結合されたアンチ−マウス／ラビット（Ｂｉｏｒａｄ）であった。検出は指示マニュアルに特定された通りＥＣＬ方法（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）によって実施された。
【０１５６】
アッセイに使用された抗体はアンチ−ｐＪＮＫ（Ｖ７３９１，Ｐｒｏｍｅｇａ）、アンチ−ｐＪＮＫ（Ｃ−１７、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、アンチｐ３８（Ｃ２０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であった。
【０１５７】
ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子の発現。細胞からの合計ＲＮＡ抽出は製造業者の指示に従ってトリゾル試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実施された。各反応において、２μｇの合計ＲＮＡがＭ−ＭＩｖ逆トランスクリプターゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してｃＤＮＡに転写された。
【０１５８】
以下のオリゴが使用された。
オリゴＡ：ｈＴＥＲＴに関して５’−ＣＧＧＡＡＧＡＧＴＧＴＣＴＧＧＡＧＣＡＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ５）
オリゴＢ：ｈＴＥＲＴに関して５’− ＧＧＡＴＧＡＡＧＡＧＧＡＧＴＣＧＧＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ６）；
オリゴＣ：ｈＴＲに関して５’−ＴＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＴＧＡＧＡＡＧＧＧＣＧＴＡＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ７）
オリゴＤ：ｈＴＲに関して５’−ＧＴＴＴＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＡＡＣＧＧＴＧＧＡＡＧ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ８）
オリゴＥ：ジスケリンに関して５’−ＡＴＧＧＣＧＧＡＴＧＣＧＧＡＡＧＴＡＡＴＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ９）
オリゴＦ：シスケリンに関して５’-ＣＣＣＣＴＴＣＡＡＴＡＧＣＡＴＴＧＴＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ１０）
【０１５９】
ｈＴＥＲＴの増幅に関するＰＣＲ条件は以下の通り、すなわち、３１サイクルに関して９４°Ｃ，４５ｓ；６０°Ｃ，４５ｓ；７２°Ｃ，９０ｓであった。ｈＲＴに関するＰＣＲ条件は２８サイクルに関して９４°Ｃ，４５秒；５５°Ｃ，４５秒；７２°Ｃ，９０秒であった。ジスケリンに関する条件は２８サイクルに関して９４°Ｃ，４０秒；６０°Ｃ，６０秒；７２°Ｃ，１２０秒であった（チャン等、２００２「Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２」）。
【０１６０】
ルシフェラーゼアッセイ（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ）。ｈＴＥＲＴの転写調整はｈＴＥＲＴプロモーターの３，４０２−ｐｂ配列によって先行されるルシフェラーゼリポーター遺伝子によって測定された。トランスフェクトの２４時間後、細胞は市販用のリポーター溶解バッファ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により溶解された。細胞溶菌液は遠心分離されそしてルシフェラーゼの発現がバートホールド・ルミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｉｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）を使用して浮遊物からの１０μｇのタンパク質で定量化された。レニラ（ｒｅｎｉｌｌａ）遺伝子に続くＣＭＶプロモーターの構造がトランスフェクト対照として使用された。ルシフェラーゼ活性はタンパク質のマイクログラムごとに発現されそして同一抽出物中のレニラの発光を使用して標準化された。
【０１６１】
成長曲線。細胞の生存能力がクリスタル・バイオレット技術によって研究された。細胞は２４穴のプレート中に植え付けられそして各図に特定された対応する薬剤の異なる濃度により処理された。培養の７２時間後、細胞は１５分間１％グルタルデヒドにより定着されそしてＰＢＳにより洗浄された後に、それらは１％のクリスタル・バイオレット着色剤により色付けされた。細胞と関連する着色剤は１０％酢酸溶液により除去された。細胞の数は５９５ｎｍで吸光度を評価することによって測定された。図は処理を受けない細胞に関連して％生存能力を示しかつ対応する偏差により４つ一組で実施された２の実験の平均を示している。
【０１６２】
直系突然変異生成。ｃ−ｍｙｃ遺伝子プロモーター、ｐｘ３．２のＮＨＥＩＩＩ領域におけるグアニンの特殊な突然変異が、製造者の指示に従って早変わりＸ−Ｌ直系突然変異生成キット（Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ  Ｘ−Ｌｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ）（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）を使用して行われた。
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１】テロメラーゼ複合体の概略構成を示す図である。
【図２Ａ】２９３Ｔ細胞系のＪＮＫおよびｐ３８死亡進路の細胞の生存能力を示す図である。
【図２Ｂ】２９３Ｔ細胞系のＪＮＫおよびｐ３８死亡進路の細胞の活性を示す図である。
【図３Ａ】使用された構造に含まれるＤＳＫ配列およびＤＳＫと同族の遺伝子の配列を示す図である。
【図３Ｂ】他の有機体からのプソイドウリジン合成酵素配列に対するＧＳＥ２４．２アミノ酸の比較配列を示す図である。
【図４】２９３Ｔ細胞系、すなわち、シスプラチンで処理されたｐＬＮＣＸ，２４．２，ＤＳＫ５’およびＤＳＫの生存能力を示す図である。
【図５】２９３Ｔ細胞系、すなわち、シスプラチンによる処理に続くｐＬＮＣＸおよび２４．２のテロメラーゼ活性を示す図である。
【図６Ａ】２９３Ｔ細胞系、すなわち、テロメラーゼＩの阻害物質により処理されたｐＬＮＣＸおよび２４．２の生存能力を示す図である。
【図６Ｂ】テロメラーゼＩの阻害物質の種々の投与量でのテロメラーゼ活性を示す図である。
【図６Ｃ】テロメラーゼＩの阻害物質による種々の処理時間でのテロメラーゼ活性を示す図である。
【図７】２９３Ｔ細胞、すなわち、シスプラチンによる処理に続くｐＬＮＣＸおよび２４．２中のテロメラーゼに関連する種々の遺伝子の発現レベルを示す図である。
【図８Ａ】ｐＬＮＣＸおよび２４．２細胞がｈＴＥＲＴ−ｌｕｃリポーターベクターにより一時的にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞におけるｈＴＥＲＴプロモーターの活性を示す図である。
【図８Ｂ】２９３Ｔ細胞がｐＬＮＣＸベクターおよび２４．２プラスミドによりトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞におけるｈＴＥＲＴプロモーターの活性を示す図である。
【図８Ｃ】２９３Ｔ細胞がＧＳＥ２４．２、Ｄｓｋ、ＴＲＵＢＩ、ＴＲＵＢＩＩ構造およびｐＬＮＣＸのないプラスミドによりトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞とにおけるｈＴＥＲＴプロモーターの活性を示す図である。
【図９Ａ】ｐＬＮＣＸ細胞および２４．２細胞がｈＴＥＲＴ−ｌｕｃリポーターベクターにより一時的にトランスフェクトされたシスプラチンによる処理に続くｈＴＥＲＴプロモーターの活性を示す図である。
【図９Ｂ】ｐＬＮＣＸ細胞および２４．２細胞がＣＭＣ−Ｒｅｎｉｌｌａリポーターベクターにより一時的にトランスフェクトされたシスプラチンによる処理に続くｈＴＥＲＴプロモーターの活性を示す図である。
【図１０Ａ】先天性角化異常症に罹っている患者の細胞を示す図である。
【図１０Ｂ】２４．２プラスミドまたはｐＬＮＣＸがないベクターにより一時的にトランスフェクトされた先天性角化異常症に罹っている患者の１人、ＤＣ３の細胞を示す図である。
【図１０Ｃ】ＶＡ１３細胞とにおけるテロメラーゼ活性を示す図である。
【図１０Ｄ】種々の構造によりトランスフェクトされたＶＡ１３細胞におけるｈＴＥＲＴおよびｈＴＲの発現レベルを示す図である。
【図１０Ｅ】ＶＡ１３細胞におけるｈＴＥＲＴプロモーターの活性を示す図である。
【図１１Ａ】ｈＴＥＲＴ−ｌｕｃリポーターおよびＭａｄ／ｍｙｃ発現ベクターにより同時にトランスフェクトされたＧＳＥ２４．２ペプチドがｃ−ＭＹＣによって調整されたｈＴＥＲＴプロモーターの活性を増加することを示す図である。
【図１１Ｂ】ＨＩＶ−ｌｕｃリポーターおよびＭａｄ／ｍｙｃ発現ベクターにより同時にトランスフェクトされたＧＳＥ２４．２ペプチドがｃ−ＭＹＣによって調整されたｈＴＥＲＴプロモーターの活性を増加することを示す図である。
【図１２Ａ】ｃ−ＭＹＣのプロモーターの概略図である。
【図１２Ｂ】プラスミドおよびｐｘ３．２ｃ−ＧＳＥ２４．２ペプチドによって誘導されるｃ−ＭＹＣのプロモーターの活性を示す図である。
【図１２Ｃ】ｐｘ３．２ｃ−ＭＹＣリポーターによりトランスフェクトされたＧＳＥ２４．２ペプチドによって誘導されたｃ−ＭＹＣのプロモーターの活性を示す図である。
【図１２Ｄ】ｐｘ３．２ｃ−ＭＹＣリポーターの種々の構造によりトランスフェクトされたＧＳＥ２４．２ペプチドによって誘導されたｃ−ＭＹＣのプロモーターの活性を示す図である。
【図１３Ａ】ＮＨＥＩＩＩに発生された突然変異の概略図である。
【図１３Ｂ】ｐｘ３．２ｃ−ＭＹＣリポータープラスミドによりトランスフェクトされたＧＳＥ２４．２ペプチドによって誘導されたｃ−ＭＹＣのプロモーターの活性がＮＨＥＩＩＩに依存していることを示す図である。
【図１３Ｃ】ｐｘ３．２ｃリポーターの種々の突然変異によりトランスフェクトされたＧＳＥ２４．２ペプチドによって誘導されたｃ−ＭＹＣのプロモーターの活性がＮＨＥＩＩＩに依存していることを示す図である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【配列表】
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