(57)【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）サンプルパッドと（２）検出対象物質と特異的に結合可能な成分が固定化されたメンブレンを有し、上流より（１）、（２）の順で配置されたイムノクロマトグラフ用デバイスを使用する血液検体のイムノクロマトグラフ法において、測定系にヒドロキシエチルデンプンを存在させることを特徴とするイムノクロマトグラフ法。
【請求項２】
血液検体が、全血、血清又は血漿である、請求項１に記載のイムノクロマトグラフ法。
【請求項３】
イムノクロマトグラフ用デバイスが、（３）コンジュゲートパッドをさらに有し、上流より（１）、（３）、（２）の順で配置されている、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ヒドロキシエチルデンプンを測定系に存在させる手段が、（１）サンプルパッド、（２）検出対象物質と特異的に結合可能な成分が固定化されたメンブレン、（３）コンジュゲートパッド、又は（５）血液検体希釈液のいずれか１以上に含有させるものである、請求項１〜３のいずれかに記載のイムノクロマトグラフ法。
【請求項５】
（１）サンプルパッド、（２）検出対象物質と特異的に結合可能な成分が固定化されたメンブレンを有し、上流より（１）、（２）の順で配置されたイムノクロマトグラフ用デバイスにおいて、（１）又は（２）のいずれか１以上にヒドロキシエチルデンプンを含有することを特徴とするイムノクロマトグラフ用デバイス。
【請求項６】
イムノクロマトグラフ用デバイスが、（３）コンジュゲートパッドをさらに有し、上流より（１）、（３）、（２）の順で配置されているものであり、（１）〜（３）のいずれか１以上にヒドロキシエチルデンプンを含有することを特徴とする請求項５に記載のイムノクロマトグラフ用デバイス。
【請求項７】
（１）サンプルパッドと（２）検出対象物質と特異的に結合可能な成分が固定化されたメンブレンを有し、上流より（１）、（２）の順で配置されたイムノクロマトグラフ用デバイスに血液検体を提供するために用いられる、イムノクロマトグラフ用の血液検体希釈液であって、ヒドロキシエチルデンプンを１．０重量％〜２．５重量％含む血液検体希釈液。
【請求項８】
以下の（ａ）および（ｂ）を含むイムノクロマトグラフ用デバイスセット。
（ａ）（１）サンプルパッドと（２）検出対象物質と特異的に結合可能な成分が固定化されたメンブレンを有し、上流より（１）、（２）の順で配置されたイムノクロマト用デバイス
（ｂ）ヒドロキシエチルデンプンを含有するイムノクロマトグラフ用の血液検体希釈液
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イムノクロマトグラフ法に関する。
【背景技術】
【０００２】
臨床検査の分野において、操作が簡便で、測定に要する時間が短く、かつ定量を行う場合においても小型で安価な装置での測定が可能なイムノクロマトグラフ法を用いた測定試薬の普及が著しい。そして、簡便性、迅速性をさらに向上させるため、血液検体（全血、血清又は血漿）を希釈等の前処理をせずにそのまま試料として用いることができるイムノクロマトグラフ法の開発要望が増加している。【０００３】
しかしながらイムノクロマトグラフ法において、血液検体をそのまま試料とするように測定系が設計されている場合であっても、血液検体中の検出対象物質の濃度が測定系の定量上限を超えるほど高濃度の場合には、血液検体を希釈して試料とする必要がある。しかしながら、イムノクロマトグラフ法において、血液検体をそのまま試料とした場合と、血液検体を希釈して試料とした場合の、両試料の測定系における挙動については、十分な検討がなされていない。【０００４】
特許文献１には、イムノクロマトグラフ法における検体希釈液の添加剤として、重量平均分子量が２０００〜９０００の非イオン性水溶性高分子を反応促進剤として使用することが開示されている。当該文献によれば、重量平均分子量が９０００より大きい場合、十分な反応促進効果を得られるまで被検体中の非イオン性水溶性高分子の濃度を高めた場合に、被検液の展開性が悪くなり検出部位の発色が一定となるまでに長時間を要するようになったり、或いはテストストリップ間で標識体の検出強度にバラツキが生じたりするようになると記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２００４−２３３１２７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、血液検体（全血、血清又は血漿）を希釈等の前処理をせずにそのまま試料として用いるよう設計されたイムノクロマトグラフ法において、血液検体を希釈して試料とした場合に生じる、理論値（以下、基準値ということもある）との乖離を低減させた免疫学的測定方法、及び該方法に用いる試薬を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、血液検体（全血、血清又は血漿）をそのまま試料として使用するよう設計されたイムノクロマトグラフ法（以下、無希釈法ということがある）において、試料中の検出対象物質の濃度が測定系の定量上限を超えるほど高濃度の場合に、血液検体を希釈して試料としたところ、その測定値が理論値と乖離する場合があることを経験した。そして、この乖離の低減方法について鋭意検討したところ、無希釈法において希釈した血液検体を測定する際、ヒドロキシエチルデンプンの存在下に測定を行うと、希釈した血液検体を試料として測定した場合においても理論値との乖離を低減できることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
本発明は、以下の構成を有する。
［１］（１）サンプルパッドと（２）検出対象物質と特異的に結合可能な成分が固定化されたメンブレンを有し、上流より（１）、（２）の順で配置されたイムノクロマトグラフ用デバイスを使用する血液検体のイムノクロマトグラフ法において、測定系にヒドロキシエチルデンプンを存在させることを特徴とするイムノクロマトグラフ法。
［２］血液検体が、全血、血清又は血漿である、［１］のイムノクロマトグラフ法。
［３］イムノクロマトグラフ用デバイスが、（３）コンジュゲートパッドをさらに有し、上流より（１）、（３）、（２）の順で配置されている、［１］又は［２］の方法。
［４］ヒドロキシエチルデンプンを測定系に存在させる手段が、（１）サンプルパッド、（２）検出対象物質と特異的に結合可能な成分が固定化されたメンブレン、（３）コンジュゲートパッド、又は（５）血液検体希釈液のいずれか１以上に含有させるものである、［１］〜［３］のイムノクロマトグラフ法。
［５］（１）サンプルパッド、（２）検出対象物質と特異的に結合可能な成分が固定化されたメンブレンを有し、上流より（１）、（２）の順で配置されたイムノクロマトグラフ用デバイスにおいて、（１）又は（２）のいずれか１以上にヒドロキシエチルデンプンを含有することを特徴とするイムノクロマトグラフ用試薬。
［６］イムノクロマトグラフ用デバイスが、（３）コンジュゲートパッドをさらに有し、上流より（１）、（３）、（２）の順で配置されているものであり、（１）〜（３）のいずれか１以上にヒドロキシエチルデンプンを含有することを特徴とするイムノクロマトグラフ用試薬。
［７］ヒドロキシエチルデンプンを含有することを特徴とする、イムノクロマトグラフ用の血液検体希釈液。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により提供されるイムノクロマトグラフ法は、無希釈法において、希釈した血液検体を試料として測定した場合においても、測定値が理論値と乖離することを抑制し、正確性の低下を防止することができる。
従って、本発明のイムノクロマトグラフ法を用いれば、試料中の検出対象物質の濃度が測定系の定量上限を超えるほど高濃度の場合に、希釈した血液検体を試料とした場合でも正確な測定をすることが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明のイムノクロマト用デバイスの一態様を示す図である。
【図２】基準法の測定結果と実施例３の測定結果又は比較例２の測定結果の相関性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明に用いられるヒドロキシエチルデンプン（化学名  ２−Ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ
ｅｔｅｒ  ｓｔａｒｃｈ、以下、ＨＥＳということがある）は、高度に分岐したとうもろこしでんぷん成分のアミロペクチンを加水分解した後、ヒドロキシエチル化することによって得ることができる高重合体の糖化合物である。当該糖化合物は、グルコース分子間のＣ４とＣ１の間でグリコシド結合（α−１，４−グリコシド結合）して主鎖を形成し、さらにＣ６とＣ１の間でもグリコシド結合（α−１，６−グリコシド結合）して分岐鎖を形成している。そして、グルコース分子のＣ２又はＣ６のヒドロキシ基が、ヒドロキシエチル基に置換している。
【００１２】
ＨＥＳの性質は、分子量、ヒドロキシエチル基による置換度、分散度（分子量分布の幅）、Ｃ２／Ｃ６比（ヒドロキシエチル基で置換されたＣ２とＣ６の割合）などを単独あるいは組み合わせて表される。例えば、分子量が７０，０００でヒドロキシエチル基による置換度が０．５の場合、「ＨＥＳ７００００／０．５」などのように表すことがある。  
【００１３】
ＨＥＳは、とうもろこしでんぷんから常法により製造することができるが、代用血漿・体外循環希釈剤として臨床で使用されているＨＥＳ含有輸液を使用することもできる。ＨＥＳ含有輸液の市販品としては、ヘスパンダー（登録商標）輸液（ＨＥＳＰＡＮＤＥＲ（Ｒ）  ｆｌｕｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）、サリンヘス（登録商標）輸液６％（ＳＡＬＩＮＨＥＳ  ｆｌｕｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ６％）（いずれもフレゼニウス  カビ  ジャパン（ＦＲＥＳＥＮＩＵＳ  ＫＡＢＩ  ＪＡＰＡＮ）社製造販売。重量平均分子量：約７０，０００、ヒドロキシエチル基による置換度：０．５０〜０．５５）を挙げることができる。これらのほかにＨＥＳ製剤として、Ｈｅｔａｓｔａｒｃｈ（重量平均分子量：約６７０，０００、ヒドロキシエチル基による置換度：０．７５）、Ｐｅｎｔａｓｔａｒｃｈ（重量平均分子量：約２６０，０００、ヒドロキシエチル基による置換度：０．５）、Ｅｌｏｈｅｓ（重量平均分子量：約２００，０００、ヒドロキシエチル基による置換度：０．６２）、Ｐｒｉｍｍｅｒ（重量平均分子量：約２００，０００、ヒドロキシエチル基による置換度：０．５）、Ｖｏｌｕｖｅｎ（重量平均分子量：約１３０，０００、ヒドロキシエチル基による置換度：０．４）なども単独又は組み合わせて使用することができる。
【００１４】
本発明のイムノクロマトグラフ法において、ＨＥＳを測定系に存在させる方法としては、（Ａ）溶液の状態で予め試料と混合する方法及び（Ｂ）イムノクロマトグラフ用デバイスの部材の１以上に含有させる方法がある。
【００１５】
（Ａ）の方法としては、血液検体希釈液に含有させる方法がある。この場合、希釈液におけるＨＥＳの濃度は１．０重量％〜２．５重量％が好適である。また試料と希釈液の混合比率（希釈倍率）は、試料中の検出対象物質の濃度、イムノクロマトグラフ法の定量上限及びサンプルパッドに添加するサンプル量等を考慮して実験的に設定することができる。例えば血漿中のＢＮＰを検出対象物質とし、イムノクロマトグラフ法の定量下限が１０ｐｇ／ｍＬ、定量上限が８００ｐｇ／ｍＬである場合には、１０倍希釈が好適である。
【００１６】
ＨＥＳは、適当な緩衝液に溶解して使用するのが好ましい。抗原や抗体等の安定性、感度等、イムノクロマトグラフ法の性能に悪影響を与えないことを限度としてリン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、クエン酸緩衝液等イムノクロマトグラフ法に使用される緩衝剤はいずれも使用することができる。この場合の好適なｐＨ範囲は５．５〜９．０である。また、イムノクロマトグラフ法において使用される添加剤（非特異的反応の抑制物質、増感剤、安定化剤、防腐剤）も同様である。
【００１７】
以下、（Ｂ）の方法を、イムノクロマトグラフ用デバイスの説明とあわせて行う。
本発明のイムノクロマトグラフ用デバイスは、（１）サンプルパッド、（２）検出対象物質と特異的に結合可能な成分が固定化されたメンブレンを有し、上流より（１）、（２）の順で配置されている。以下、検出対象物質を抗原、検出対象物質と特異的に結合可能な成分を抗抗原特異抗体（以下、特異抗体ということがある）とし、２以上の特異抗体で抗原−特異抗体複合体を形成させて検出を行うサンドイッチ法を例に、図１を参照しながら説明する。なお、本明細書において「上流」とは、サンプルパッドに添加された試料が、メンブレンを展開して行く方向を下流として定めている。
【００１８】
（１）サンプルパッドは、検出対象物質（抗原）が含まれている可能性がある試料を受容するための部材で、その材質は、グラスファイバーなどが好適に用いられる。
【００１９】
（２）検出対象物質と特異的に結合可能な成分（抗抗原特異抗体（ｂ））が固定化されたメンブレンは、当該特異抗体を含有する溶液を線状に塗布することによって得ることができる。当該線状に塗布された特異抗体は、抗原との間で抗原−特異抗体複合体を形成して抗原をメンブレン上に捕捉、濃縮する役割を担う。使用するメンブレンの材質は、ニトロセルロースなどが好適に用いられる。なお、特異抗体としては、免疫グロブリン分子自体の他、例えば、Ｆ（ａｂ’）2のような抗原に対する結合能を有する断片であってもよい。更に抗体としてはポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のどちらを用いてもかまわない。また遺伝子組み換え技術の利用やＤＮＡ免疫法の採用など、取得方法による制限を受けない。
【００２０】
メンブレン上に捕捉、濃縮された抗原−特異抗体複合体を検出するためには、標識物質で標識された特異抗体が必要でありこれをコンジュゲートと呼ぶ。標識物質としては、酵素（パーオキシダーゼなど）、発色あるいは発光性の色素（フルオレセインなど）、金属コロイド（金コロイドなど）、着色された微粒子（カラーラテックスなど）などが好適に用いられる。
このコンジュゲートを溶液状態で使用する場合には、予め試料と混合してサンプルパッドに添加したり、試料をサンプルパッドに添加した後にサンプルパッドに添加したりすることができる（当該コンジュゲートの溶液がＨＥＳを含有する場合には、上記した（Ａ）の態様に含まれる）。また、イムノクロマト用デバイスが、（３）コンジュゲートパッドを有する場合には、これに含浸させておき、イムノクロマト用デバイスを構成することができる。（３）コンジュゲートパッドを有する態様の場合、試料中の抗原がメンブレン上に捕捉、濃縮される前に、抗原−コンジュゲート複合体が形成されることになる。コンジュゲートパッドの材質としては、グラスファイバーが好適に用いられる。なお、サンプルパッドがコンジュゲートパッドの機能を兼ね備えている場合には、一の部材で（１）及び（３）を有するものとみなす。
【００２１】
本発明のイムノクロマト用デバイスには、全血中の血球を捕捉する目的で（４）血球分離用パッドを有していてもよい。（４）血球分離パッドを有する場合には、上流から（１）、（３）、（４）の順で配置されるのが好ましいが、これに限定されない。血球分離パッドの材質はポリサルフォンが好適である。上記（Ｂ）はイムノクロマトグラフ用デバイスの部材の１以上に含有させる態様であるから、ＨＥＳを（１）、（２）、（３）、（４）のいずれか1以上に含有させた態様であればよく、このうちでも（１）がより好ましい。また、ＨＥＳを（１）、（２）、（３）、（４）のいずれか1以上に含有させる場合は、液状のＨＥＳが各部材に含浸している状態のもの、含浸した後に乾燥させて乾燥状態でＨＥＳ成分が各部材に含まれている状態のもの、のいずれでもよい。ＨＥＳを（１）、（２）、（３）、（４）のいずれか1以上に含有させる場合、イムノクロマト用デバイスにおける各部材の容積と、上記した（Ａ）血液検体希釈液に含有させる方法における好適な濃度や試料との混合比率を勘案して、その濃度を実験的に設定することができる。
【００２２】
イムノクロマトグラフ用デバイスの製造方法は、抗原や抗体等の安定性、感度等、イムノクロマトグラフ法の性能に悪影響を与えないことを限度としてイムノクロマトグラフ法に使用される技術であればいずれも使用することができる（例えばブロッキング）。また、イムノクロマトグラフ法において使用される添加剤（非特異的反応の抑制物質、増感剤、保湿剤、安定化剤、防腐剤）も同様である。また図１に示すように、メンブレンをプラスチック製粘着シート（ａ）に貼付した構成としたり、試料添加操作が実行されたか否かを確認するためのコントロール用抗体（ｃ）をメンブレンに塗布したり、メンブレンの最下流で試料に由来する液性成分を吸収するための吸収パッド（ｄ）などを含む構成としてもよい。
【００２３】
本発明における検出対象物質は、抗原抗体反応に利用できるものであれば制限を受けないが、臨床検査において、全血での測定要望が高い、Ｃ反応性タンパク（ＣＲＰ）、ヒトフィブリノーゲン、ＤＤダイマー、ＢＮＰ（ヒト脳性ナトリウム利尿ペプチド）等が好適に挙げられる。
【００２４】
本発明のイムノクロマトグラフ用デバイスによる検出対象物質の検出方法は、特に制限を受けないが、コンジュゲートの捕捉、濃縮によるメンブレン上での集積を光学的に測定することが好適であり、吸光度や反射光強度を検知する機器を用いた定量法においてその効果を最大に享受することができる。
【実施例】
【００２５】
以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００２６】
［比較例１］  ＜血漿を希釈して試料とした場合の測定への影響の確認＞
血漿を希釈せずにそのまま試料として測定するイムノクロマトグラフ用試薬としてラピッドチップ(登録商標)ＢＮＰ（積水メディカル社製）を使用した。血漿を、生理食塩水あるいは１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含有する１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）（以下、ＰＢＳという）でそれぞれ１０倍希釈し、添付文書に記載の操作によりＢＮＰ濃度の測定を行った。血漿中のＢＮＰ濃度は、ＭＩ０２シオノギＢＮＰ（塩野義製薬株式会社）による測定で５４２ｐｇ／ｍＬであり、これを正確性の基準値とした。【００２７】
生理食塩水で希釈した試料のＢＮＰ濃度は３１６ｐｇ／ｍＬであり、基準値に対する回収率は５３．９％であった。また、ＰＢＳで希釈した試料のＢＮＰ濃度は、３８５ｐｇ／ｍＬであり、基準値に対する回収率は７０．９％であった。【００２８】
［実施例１］＜本発明の添加剤：ＨＥＳの効果確認１＞  
血漿を、表１に記載の濃度でＢＳＡあるいはＨＥＳを含有するＰＢＳで１０倍希釈した以外は比較例１と同様の操作を行った。なおＨＥＳは、ヘスパンダー（登録商標）輸液（フレゼニウス  カビ  ジャパン社製造販売。重量平均分子量：約７０，０００、ヒドロキシエチル基による置換度：０．５０〜０．５５。ＨＥＳ濃度６重量％）を使用した。表１おけるＨＥＳ濃度は希釈液中の実ＨＥＳ濃度を表している。【００２９】
測定結果を表１に示した。
ＢＳＡあるいはＨＥＳを含有するＰＢＳで希釈した場合、基準値に対する回収率の改善が確認された。
検討した濃度範囲では、ＢＳＡの改善効果に比べてＨＥＳの改善効果が大であった。【００３０】
【表１】
0005562508.tif 000002
空欄は試験を実施していない。【００３１】
［実施例２］  ＜本発明の添加剤：ＨＥＳの効果確認２＞
血漿を、表２に記載の濃度でＨＥＳを含有する１．０％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１０倍希釈した以外は比較例１と同様の操作を行った。【００３２】
測定結果を表２に示した。
ＨＥＳにＢＳＡを共存させると基準値に対する回収率はさらに改善した。【００３３】
【表２】
0005562508.tif 000003
【００３４】
［実施例３］  ＜本発明の添加剤：ＨＥＳの効果確認３＞
ＭＩ０２シオノギＢＮＰ（シオノギ）による測定で８００ｐｇ／ｍＬ以上かつ２０００ｐｇ／ｍＬ以下の測定値を示した血漿（９検体）を、ＰＢＳ（比較例２）あるいは１．５％ＨＥＳ、１．０％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（実施例３）で１０倍希釈した以外は比較例１と同様の操作を行った。ＭＩ０２シオノギＢＮＰとの相関性を検討した。【００３５】
測定結果を図２に示した。
全血を１．５％ＨＥＳ、１．０％ＢＳＡ含有ＰＢＳで希釈して測定した場合（実施例３）には、全血をＰＢＳで希釈して測定した場合（比較例２）に対して、基準値に対する相関性が改善した。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明のイムノクロマトグラフ法を用いれば、試料中の検出対象物質の濃度が測定系の定量上限を超えるほど高濃度の場合に、希釈した血液検体を試料とした場合
でも正確な測定をすることが可能になる。
【符号の説明】
【００３７】
(１)サンプルパッド
（２）メンブレン
（３）コンジュゲートパッド
（４）血球分離膜
（ａ）プラスチック製粘着シート
（ｂ）抗抗原特異抗体
（ｃ）コントロール用抗体
（ｄ）吸収パッド
【要約】
血液検体（全血、血清又は血漿）を希釈等の前処理をせずにそのまま試料として用いるよう設計されたイムノクロマトグラフ法において、血液検体を希釈して試料とした場合に生じる、理論値（以下、基準値ということもある）との乖離を低減させた免疫学的測定方法、及び該方法に用いる試薬を提供すること。
（１）サンプルパッドと（２）検出対象物質と特異的に結合可能な成分が固定化されたメンブレンを有し、上流より（１）、（２）の順で配置されたイムノクロマトグラフ用デバイスを使用する血液検体のイムノクロマトグラフ法において、測定系にヒドロキシエチルデンプンを存在させる。【図１】
0005562508.tif 000004
【図２】
0005562508.tif 000005